(57)【要約】  本発明は、癌患者の再発のリスクを予測するための方法、ならびにＴＧＦ−β刺激に応答して発現が誘導される種々の遺伝子の発現レベルに基づいて前記患者に個別化医療を提供するための方法に関する。本発明はまた、診断および予測的医療法を行うためのキットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
結腸直腸癌に罹患している患者の転帰を予測するため、結腸直腸癌に罹患している患者において好適な処置を選択するため、または結腸直腸癌の外科的切除後の補助療法から利益を受ける可能性のある患者を選択するための方法であって、前記患者由来のサンプルにおけるＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＣＤＫＮ２ＢおよびＦＬＴ１遺伝子の発現レベルの決定を含んでなり、
前記遺伝子の参照値に比べての前記遺伝子の発現レベルの増大が、前記患者の不良な転帰の見込みの増大、前記患者が外科的処置後の療法を受ける候補であること、または前記患者が外科的処置後の療法から利益を受ける可能性があることを示し、
前記遺伝子の参照値に比べての前記遺伝子の発現レベルの減少が、前記患者の良好な転帰の見込みの増大、前記患者が外科的処置後の療法を受ける候補ではないこと、または前記患者が外科的処置後の療法から利益を受ける可能性がないことを示す、
方法。
【請求項２】
ＦＲＭＤ６、ＩＧＦＢＰ３、ＥＳＭ１、ＦＧＦ１、ＧＥＭ、ＭＥＸ３Ｂ、ＷＮＴ２、ＮＧＦ、ＭＳＣ、ＳＥＴＢＰ１、ＦＬＪ１０３５７、ＤＡＣＴ、ＭＵＲＣおよびＣｏｌ１０Ａ１からなる群から選択される１以上の遺伝子の発現レベルの決定をさらに含んでなり、
前記遺伝子の参照値に比べての前記遺伝子の発現レベルの増大が、前記患者の不良な転帰の見込みの増大、前記患者が外科的処置後の療法を受ける候補であること、または前記患者が外科的処置後の療法から利益を受ける可能性があることを示し、
前記遺伝子の参照値に比べての前記遺伝子の発現レベルの減少が、前記患者の良好な転帰の見込みの増大、前記患者が外科的処置後の療法を受ける候補ではないこと、または前記患者が外科的処置後の療法から利益を受ける可能性がないことを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＣＤＫＮ２Ｂ、ＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＦＬＴ１、ＦＲＭＤ６、ＩＧＦＢＰ３およびＥＳＭ１遺伝子の発現レベルが測定され、かつ、前記患者が病期ＩＩ結腸直腸癌に罹患している患者である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＣＤＫＮ２Ｂ、ＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＦＬＴ１、ＦＧＦ１、ＧＥＭ、およびＭＥＸ３Ｂ遺伝子の発現レベルが測定され、前記患者が病期ＩＩＩ結腸直腸癌に罹患している患者である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ＡＮＧＰＴＬ２、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＰＢＢ２、ＢＭＰＲ２、ＢＰＧＭ、Ｃ１３ｏｒｆ３３、Ｃ５ｏｒｆ１３、ＮＰＲ／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＣＡＣＨＤ１、ＣＡＬＤ１、ＣＤＨ６、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＩＬＰ、ＣＮＴＮ１、ＣＯＬ１０Ａ１、ＣＯＬ１２Ａ１、ＣＯＬ２７Ａ１、ＤＡＣＴ１、ＤＩＸＤＣ１、ＤＮＡＪＢ５、ＤＮＡＪＣ１８、ＥＬＴＤ１、ＥＰＨＡ４、ＥＳＭ１、ＦＡＰ、ＦＧＤ６、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＬＪ１０３５７、ＦＬＴ−１、ＦＮ１、ＦＲＭＤ４Ａ、ＦＲＭＤ６、ＧＡＳ１、ＧＥＭ、ＧＦＰＴ２、ＧＰＲ１６１、ＨＡＳ２、ＨＥＹ１、ＨＩＣ１、ＨＳ３ＳＴ３Ａ１、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ７、ＩＬ１１、ＩＮＨＢＡ、ＫＡＬ１、ＫＩＡＡ１７５５、ＫＬＦ７、ＬＡＲＰ６、ＬＭＣＤ１、ＬＭＯ４、ＬＯＣ１００１２８１７８、ＬＯＣ６４４２４２、ＬＯＣ７２８２６４、ＬＯＨ３ＣＲ２Ａ、ＬＲＲＣ８Ａ、ＭＥＯＸ１、ＭＥＸ３Ｂ、ＭＦＡＰ２、ＭＧＣ１６１２１、ＭＳＣ、ＭＵＲＣ、ＮＥＤＤ９、ＮＧＦ、ＮＯＸ４、ＮＰＲ２、ＮＵＡＫ１、ＯＳＧＩＮ２、ＰＡＬＬＤ、ＰＡＬＭ２、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＣ、ＰＤＬＩＭ４、ＰＤＰＮ、ＰＧＭ２Ｌ１、ＰＫＮＯＸ２、ＰＭＥＰＡ１、ＰＯＤＸＬ、ＰＰＭ１Ｅ、ＰＴＨＬＨ、ＲＡＳＤ１、ＲＡＳＧＲＰ３、ＲＡＳＬ１２、ＲＧＳ４、ＲＮＦ１５０、ＲＵＮＸ１、Ｓ１ＰＲ５、ＳＥＭＡ６Ｄ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＥＴＢＰ１、ＳＨＩＳＡ２、ＳＬＣ４６Ａ３、ＳＮＣＡＩＰ、ＳＮＯＲＤ１１４−３、ＳＯＸ６、ＳＰＳＢ１、ＳＴＫ３８Ｌ、ＳＹＮＥ１、ＳＹＴＬ４、ＴＣＦ４、ＴＧＦＢ２、ＴＩＭＰ３、ＴＭＥＭ８８、ＴＮＣ、ＴＮＳ１、ＴＰＭ１、ＴＳＨＺ３、ＴＳＰＡＮ２、ＶＥＰＨ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ９ＡおよびＺＥＢ１遺伝子、および配列番号１〜１３の配列を有するプローブと特異的にハイブリダイズする遺伝子の発現レベルの決定を含んでなり、
前記遺伝子の参照値に比べての前記遺伝子の発現レベルの増大が、前記患者の不良な転帰の見込みの増大、前記患者が外科的処置後の療法を受ける候補であること、または前記患者が外科的処置後の療法から利益を受ける可能性があることを示し、
前記遺伝子の参照値に比べての前記遺伝子の発現レベルの減少が、前記患者の良好な転帰の見込みの増大、前記患者が外科的処置後の療法を受ける候補ではないこと、または前記患者が外科的処置後の療法から利益を受ける可能性がないことを示す、
方法。
【請求項６】
患者の腫瘍病期が付加的に決定され、
高い腫瘍病期が、不良な転帰の見込みの増大、前記患者が外科的処置後の補助療法を受ける候補であること、または前記患者が外科的処置後の療法から利益を受ける可能性があることを示し、
低い腫瘍病期が、良好な転帰の見込みの増大、前記患者が外科的処置後の補助療法を受ける候補ではないこと、または前記患者が外科的処置後の療法から利益を受ける可能性がないことを示す、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記療法が化学療法、放射線療法および／またはＴＧＦ−β阻害剤を含んでなる療法からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
予測される転帰が再発または転移の発生である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記転移が肝臓転移である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記サンプルが腫瘍生検または体液からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記体液が血液、血漿および血清からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法により選択された患者における、癌の外科的処置後の結腸直腸癌の処置に使用するための療法。
【請求項１３】
前記療法が、化学療法、放射線療法および／またはＴＧＦ−β阻害剤を含んでなる療法からなる群から選択される、請求項１２に記載の使用のための療法。
【請求項１４】
ＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＣＤＫＮ２ＢおよびＦＬＴ１遺伝子の発現レベルを決定するために十分な試薬と、場合により１以上のハウスキーピング遺伝子の発現レベルの決定のための試薬とを含んでなる、キット。
【請求項１５】
ＦＲＭＤ６、ＩＧＦＢＰ３、ＥＳＭ１、ＦＧＦ１、ＧＥＭ、ＭＥＸ３Ｂ、ＷＮＴ２、ＮＧＦ、ＭＳＣ、ＳＥＴＢＰ１、ＦＬＪ１０３５７、ＤＡＣＴ１、ＭＵＲＣおよびＣｏｌ１０Ａ１からなる群から選択される１以上の遺伝子の発現レベルの決定に十分な試薬をさらに含んでなる、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記試薬が、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＦＬＴ１、ＦＲＭＤ６、ＩＧＦＢＰ３およびＥＳＭ１遺伝子、またはＣＤＫＮ２Ｂ、ＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＦＬＴ１、ＦＧＦ１、ＧＥＭ、およびＭＥＸ３Ｂ遺伝子の発現レベルの決定に十分である、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記試薬が、ＡＮＧＰＴＬ２、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＰＢＢ２、ＢＭＰＲ２、ＢＰＧＭ、Ｃ１３ｏｒｆ３３、Ｃ５ｏｒｆ１３、ＮＰＲ／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＣＡＣＨＤ１、ＣＡＬＤ１、ＣＤＨ６、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＩＬＰ、ＣＮＴＮ１、ＣＯＬ１０Ａ１、ＣＯＬ１２Ａ１、ＣＯＬ２７Ａ１、ＤＡＣＴ１、ＤＩＸＤＣ１、ＤＮＡＪＢ５、ＤＮＡＪＣ１８、ＥＬＴＤ１、ＥＰＨＡ４、ＥＳＭ１、ＦＡＰ、ＦＧＤ６、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＬＪ１０３５７、ＦＬＴ−１、ＦＮ１、ＦＲＭＤ４Ａ、ＦＲＭＤ６、ＧＡＳ１、ＧＥＭ、ＧＦＰＴ２、ＧＰＲ１６１、ＨＡＳ２、ＨＥＹ１、ＨＩＣ１、ＨＳ３ＳＴ３Ａ１、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ７、ＩＬ１１、ＩＮＨＢＡ、ＫＡＬ１、ＫＩＡＡ１７５５、ＫＬＦ７、ＬＡＲＰ６、ＬＭＣＤ１、ＬＭＯ４、ＬＯＣ１００１２８１７８、ＬＯＣ６４４２４２、ＬＯＣ７２８２６４、ＬＯＨ３ＣＲ２Ａ、ＬＲＲＣ８Ａ、ＭＥＯＸ１、ＭＥＸ３Ｂ、ＭＦＡＰ２、ＭＧＣ１６１２１、ＭＳＣ、ＭＵＲＣ、ＮＥＤＤ９、ＮＧＦ、ＮＯＸ４、ＮＰＲ２、ＮＵＡＫ１、ＯＳＧＩＮ２、ＰＡＬＬＤ、ＰＡＬＭ２、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＣ、ＰＤＬＩＭ４、ＰＤＰＮ、ＰＧＭ２Ｌ１、ＰＫＮＯＸ２、ＰＭＥＰＡ１、ＰＯＤＸＬ、ＰＰＭ１Ｅ、ＰＴＨＬＨ、ＲＡＳＤ１、ＲＡＳＧＲＰ３、ＲＡＳＬ１２、ＲＧＳ４、ＲＮＦ１５０、ＲＵＮＸ１、Ｓ１ＰＲ５、ＳＥＭＡ６Ｄ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＥＴＢＰ１、ＳＨＩＳＡ２、ＳＬＣ４６Ａ３、ＳＮＣＡＩＰ、ＳＮＯＲＤ１１４−３、ＳＯＸ６、ＳＰＳＢ１、ＳＴＫ３８Ｌ、ＳＹＮＥ１、ＳＹＴＬ４、ＴＣＦ４、ＴＧＦＢ２、ＴＩＭＰ３、ＴＭＥＭ８８、ＴＮＣ、ＴＮＳ１、ＴＰＭ１、ＴＳＨＺ３、ＴＳＰＡＮ２、ＶＥＰＨ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ９ＡおよびＺＥＢ１遺伝子、ならびに配列番号１〜１３の配列を有するプローブと特異的にハイブリダイズする遺伝子の発現レベルの決定に十分である、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
結腸直腸癌に罹患している患者の転帰を予測するため、結腸直腸癌に罹患している患者における好適な処置を選択するため、または結腸直腸癌の外科的切除後の補助療法から利益を受ける可能性がある患者を選択するための、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載のキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、診断の分野、より詳しくは、癌患者の再発のリスクを予測するための方法、ならびに前記患者に個別化医療を提供するための方法に関する。本発明はまた、診断および予測的医療法を行うためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
結腸直腸癌（ＣＲＣ）は、西洋世界で最も多い新生物の１つであり、男性では肺癌および前立腺癌に次いで３番目の死因であり、女性では乳癌に次いで２番目に多い。結腸直腸癌は、世界において、男性では３番目に多い癌（６６３０００例、全体の１０．０％）であり、女性では２番目に多い（５７１０００例、全体の９．４％）。世界では、結腸直腸癌からの死者は約６０８０００人と推計され、癌による死亡全体の８％を占め、４番目に多い癌からの死因となっている(GLOBOCAN.iarc.fr)。
【０００３】
結腸直腸癌の主要な治療選択肢は手術であり、個々の患者の病期分類およびその他の医学的因子に応じて補助化学療法および／または放射線療法を伴う場合と伴わない場合がある。
【０００４】
適当な治療の選択は、患者と経済的理由の両方にとって重要である。患者の生存のためには、悪性結腸直腸癌の拡大を防ぐために強い侵襲的な治療プロトコールを即使用するのがいつかを知ることが不可欠である。そうでなければ、患者の生存は脅かされることになるであろう。これに対して、必要とされない場合に強い侵襲的な治療を行うことは、患者によって極めて不利である。このような治療は患者に、患者の生活の質に大きな影響を及ぼし得る有害な毒性からもたらされる一定の程度の苦痛および不自由さを課す。注目すべきは、各患者は、４００回のうち１回、療法が致命的な毒性をもたらすという状況を被る。さらに、強い侵襲的な治療は、通常、極めてコストがかかるので、必要な場合にのみ行うべきである。
【０００５】
現在、治療選択は腫瘍病期分類に基づき、通常、米国癌合同委員会（ＡＪＣＣ）からの腫瘍／リンパ節／転移（ＴＮＭ）検査を用いて行われる。このＴＮＭ体系では、３つのカテゴリーに基づいて数字を割り当てる。「Ｔ」は腸管壁の浸潤の程度を表し、「Ｎ」はリンパ節関与の程度を表し、「Ｍ」は転移の程度を表す。より広い癌の病期は、通常、予後により分類されたＴＮＭ値から導かれたＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶの数字で示され；数字が大きいほどより進行した癌およびおそらくは不良の転帰を示す。この体系の詳細を下表１に示す。
【０００６】
【表１】
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【０００７】
ＡＪＣＣ分類は結腸直腸癌が診断された際の病期に関する有用ないくつかの情報を提供するが、腫瘍悪性度に関する情報は与えず、予後に関するその有用性は限られたものとなる。病期ＩＶの患者の予後は不良であることは明らかであるが、早期の病期の結腸直腸癌の診断が、腫瘍がさらに極めて急速に発達する可能性を阻むものではない。特に、病期ＩＩ結腸直腸癌（すなわち、診断時に転移もリンパ節浸潤もない初期癌）を有する患者の２０〜４０％がなぜ急速に悪化して死に至るのかは全く分かっていない。高リスク病期ＩＩ結腸癌を有する患者のサブグループが補助療法から利益を受け得ることを示唆する研究がいくつかある(Quasar collaborative group et al., Lancet 2007; 370:2020-2029)。依然として、病期ＩＩ疾患の高リスク特徴などの組織病理学的変量が、療法を階層化する際の唯一の指示因子である。リンパ節に腫瘍細胞が浸潤している場合、ＴＮＭ検査では予後不良と判定され、その患者には通常、手術と、その後に強い化学療法が施される。臨床試験は、高リスク病期ＩＩ  ＣＲＣと同定された全２５名の患者で、処置を受けたかどうかにかかわらず２０名が治癒することを示している(Quasar collaborative group et al., Lancet 2007; 370:2020-2029)。同様に、手術による処置を受けただけの病期ＩＩＩ結腸癌を有する患者のサブグループは、補助療法を行わなくても５年間再発しなかった(Ranghammar et al., Acta Oncologica 2001; 40: 282-308)。補助化学療法は病期ＩＩＩ  ＣＲＣの標準的な推奨であるが、病期ＩＩＩ結腸癌を有する患者のこのサブグループの予測的同定は療法を割愛することができる。従って、最大および最小リスク（例えば、「高リスク」病期ＩＩおよび「低リスク」病期ＩＩＩ結腸癌）の患者を同定する正確かつ信頼性のある方法は、これらの群内での個別化療法の選択を改善することができる。
【０００８】
このために、分子マーカーの発現レベルに基づいて結腸直腸癌に罹患している患者の転帰を予測するためのいくつかの方法が記載されている。
【０００９】
Jorissen et al. (Clin. Cancer Res., 2009, 15 :7642-7651)は、病期Ａ  ＣＲＣ（病期Ｉに相当）および病期Ｄ（病期ＩＶに相当）に罹患している患者間に再現性のあるバリエーションを示す１２８の遺伝子により形成される分類子を記載している。さらに、この分類子の少なくとも２つの遺伝子（ＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３およびＦＬＴ１）は、疾患の再発を受けた患者でアップレギュレートされる。
【００１０】
ＷＯ２０１００４２２２８号には、発現レベルがＣＲＣの予後と相関する１７６の遺伝子により形成されるサインの同定が記載されている。
【００１１】
ＷＯ２０１０１２４２２２号には、ＦＬＴ−１（ＶＥＧＦＲ−１としても知られる）の発現レベルが参照値よりも高い結腸癌患者は、外科的切除後に腫瘍の再発を示す高い可能性を示すことが記載されている。
【００１２】
ＵＳ７６９５９１３号明細書には、ＩＮＨＢＡ、ＭＹＢＬ２、ＦＡＰおよびＫｉ６７遺伝子の正規化発現レベルの決定を含んでなる、ＣＲＣ患者の予後を推定する方法が記載され、この方法では、ＩＮＨＢＡおよびＦＡＰの発現の増大は、良好な予後の確率の増大と負の相関を示し、ＭＹＢＬ２およびＫｉ６７遺伝子の発現は、良好な予後の可能性の増大と正の相関を示す。この文献に記載されている方法は、Ｏｎｃｏｔｙｐｅ  ＤＸキットの基礎をなすが、このキットは、ＩＮＨＢＡ、ＭＹＢＬ２、ＦＡＰおよびＫｉ６７遺伝子を含む１２の遺伝子の決定を含む。
【００１３】
ＷＯ０２０５７７８７号には、再発性結腸直腸癌を原因とする死亡を予測するためにサバイビンｍＲＮＡが使用可能であるかどうかを判定するよう設計された研究の結果が報告されている。この試験は、１４４名の患者の冷凍腫瘍生検から得られたデータに基づくものであった。報告によると、この試験は、サバイビンの発現が、病期ＩＩ結腸直腸癌を有する患者における再発癌による死亡の有意に高いリスクと関連していることを示す。
【００１４】
Rosati et al. (Tumour Biol, 2004, 25:258-63)は、結腸直腸腺癌におけるチミジル酸シンターゼ（ＴＳ）、ｐ５３、ｂｃｌ−２、Ｋｉ−６７およびｐ２７タンパク質の発現が無病生存期間または全生存期間の指標となるかどうかを判定するよう設計された研究の結果を報告している。１０３名の患者からの検体が免疫組織化学で検査された。この参照文献によれば、ＴＳ、ｐ５３、ｂｃｌ−２、Ｋｉ−６７およびｐ２７のいずれかの発現と臨床転帰の間には統計学的に有意な関連はないが、不利な転帰とｐ５３陰性発現、Ｋｉ−６７陽性発現および病期Ｃの癌の組合せとの間には統計学的に有意な関連が見られた。
【００１５】
しかしながら、この主題で行われた研究にもかかわらず、今日、ＣＲＣの診断およびＣＲＣ癌の病期の決定の両方の臨床的見地から有用な腫瘍マーカーは極めて少ない。治療のためにより正確に病期ＩＩＩの患者を同定することを目的に、化学療法からの患者利益の見込みを定量することができる検査は極めて有用となる。病期ＩＩの患者と類似の低い再発リスクを有し、化学療法からの利益の見込みが低い患者は、化学療法を見送ることを選択することができる。再発リスクが高く、化学療法に基づく５−ＦＵからの利益に見込みが低い患者は、別の治療を選択することができる。
【発明の概要】
【００１６】
よって、当技術分野では、ＣＲＣの診断および結腸直腸癌の病期分類を高い信頼性で可能とするマーカーまたはマーカーパネルの必要がある。
【００１７】
従って、最大および最小リスク（例えば、「高リスク」病期ＩＩおよび「低リスク」病期ＩＩＩ結腸癌）の患者を同定する正確かつ信頼性のある方法は、これらの群内での個別化療法の選択を改善することができる。
【００１８】
発明の概要
第１の態様において、本発明は、結腸直腸癌に罹患している患者の転帰を予測するため、結腸直腸癌に罹患している患者において好適な処置を選択するため、または結腸直腸癌の外科的切除後の補助療法から利益を受ける可能性のある患者を選択するための方法であって、前記患者由来のサンプルにおけるＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＣＤＫＮ２ＢおよびＦＬＴ１遺伝子の発現レベルの決定を含んでなり、
前記遺伝子の参照値に比べての前記遺伝子の発現レベルの増大が、前記患者の不良な転帰の見込みの増大、前記患者が外科的処置後の療法を受ける候補であること、または前記患者が外科的処置後の療法から利益を受ける可能性があることを示し、
前記遺伝子の参照値に比べての前記遺伝子の発現レベルの減少が、前記患者の良好な転帰の見込みの増大、前記患者が外科的処置後の療法を受ける候補ではないこと、または前記患者が外科的処置後の療法から利益を受ける可能性がないことを示す、
方法に関する。
【００１９】
別の態様において、本発明は、結腸直腸癌に罹患している患者の転帰を予測するため、または患者において結腸直腸癌の好適な処置を選択するための方法であって、前記患者由来のサンプルにおける、ＴＧＦ−β２および／またはＴＧＦ−β３遺伝子の発現レベルの決定を含んでなり、
前記遺伝子の参照値に比べての前記遺伝子の発現レベルの増大が、前記患者の不良な転帰の見込みの増大、前記患者が外科的処置後の療法を受ける候補であること、または前記患者が外科的処置後の療法から利益を受ける可能性があることを示し、
前記遺伝子の参照値に比べての前記遺伝子の発現レベルの減少が、前記患者の良好な転帰の見込みの増大、前記患者が外科的処置後の療法を受ける候補ではないこと、または前記患者が外科的処置後の療法から利益を受ける可能性がないことを示す、
方法に関する。
【００２０】
別の態様において、本発明は、ＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＣＤＫＮ２ＢおよびＦＬＴ１遺伝子の発現レベルを決定するために十分な試薬と、場合により１以上のハウスキーピング遺伝子の発現レベルの決定のための試薬とを含んでなるキットに関する。
【００２１】
さらに別の態様では、本発明は、結腸直腸癌に罹患している患者の転帰を予測するため、結腸直腸癌に罹患している患者における好適な処置を選択するため、または結腸直腸癌の外科的切除後の補助療法から利益を受ける可能性がある患者を選択するための、本発明に記載のキットの使用に関する。
【００２２】
さらに別の態様では、本発明は、結腸直腸癌に罹患している患者の転帰を予測するため、結腸直腸癌に罹患している患者における好適な処置を選択するため、または結腸直腸癌の外科的切除後の補助療法から利益を受ける可能性がある患者を選択するための、ＴＧＦ−β２および／またはＴＧＦ−β３遺伝子の発現レベルを決定するために十分な試薬と、場合により１以上のハウスキーピング遺伝子の発現レベルの決定のための試薬とを含んでなるキットに使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ＴＧＦ−βシグナル伝達は、ＣＲＣ進行中の腺腫−癌腫移行過程で増大する。この図は、ＣＲＣサンプル（●）および腺腫（○）におけるＴＧＦＢ１、２および３  ｍＲＮＡレベルを示す。
【図２】ＴＧＦ−βシグナル伝達は、ＣＲＣ関連線維芽細胞（ＣＡＦ）の寄与を受ける。新しく切り出した一次ＣＲＣ腫瘍を解離させ、表面マーカーの組合せを用いてＦＡＣＳにより特定の腫瘍細胞集団を精製したもの。ＣＡＦは、上皮細胞および白血球に比べて、ＴＧＦＢ２およびＴＧＦＢ３の高い相対的ｍＲＮＡレベルを示す。ＴＧＦＢ１  ｍＲＮＡレベルは、ＣＡＦと白血球の間では同等であるが、上皮細胞におけるレベルよりも高い。結果はマイクロアレイ分析により得られたものである（ｎ＝８名のＣＲＣ患者）。
【図３】ＴＧＦ−βシグナル伝達は、ＣＲＣの間質成分で優先的に働く。上皮細胞および間質細胞における核ｐ−ＳＭＡＤ３反応性の分布および強度に従って分析した腺腫（ｎ＝２５）およびＣＲＣサンプル（ｎ＝３０）の分類。ほとんどの腺腫の間質はｐ−ＳＭＡＤ３高陽性細胞をほとんど含まず、全体的に染色が弱かったが、大きな割合のＣＲＣ（６３％）が、強い核ｐ−ＳＭＡＤ３染色を有する（これらの細胞における活性なＴＧＦ−βシグナル伝達の指標となる）間質細胞が多いことを特徴とする。
【図４】Ｆ−ＴＢＲＳがどのように誘導されたかを示す。ＴＧＦ−β誘導遺伝子は、ＴＧＦＢで処理したまたは非処理の培養ＣＣＤ−１８Ｃｏ正常結腸線維芽細胞のマイクロアレイ分析により得られた。本発明者らはさらに、患者からのＦＡＣＳ精製ＣＲＣ細胞集団におけるそれらの差次的発現を分析することにより分類子を精密化した（ベン図）。Ｆ−ＴＢＲＳは、ＣＡＦ富化細胞集団では、他の２つの画分に比べて特異的にアップレギュレートされた（＞２倍、ｐ＜０．０５）１７５のプローブから構成される。ＣＣＤ−１８ＣｏにおいてＴＧＦ−βにより誘導された６５のプローブは、これら３つの細胞集団のいずれにおいても有意に富化されていなかった。
【図５】Ｆ−ＴＢＲＳサインの発現は、再発リスクに対して増大効果を示す。
【図６】カプラン・マイヤー曲線は、Ｆ−ＴＢＲＳの平均発現レベルに応じた、療法時に無病を維持する推定確率を示す。
【図７】カプラン・マイヤー曲線は、ＡＪＣＣ病期に従って予め分類した患者サンプルにおけるＦ−ＴＢＲＳの平均発現レベルに応じた、療法時に無病を維持する推定確率を示す。Ｐ値は、これら３群間の全体的な違いを意味する。
【図８】カプラン・マイヤー曲線は、全患者（Ａ）、または病期ＩＩの患者（Ｂ）または病期ＩＩＩの患者（Ｃ）に関する、３つの予測子、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＦＬＴ−１の平均発現に応じた生存期間を示す。
【図９】３つの予測子、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＦＬＴ−１の発現と再発リスクとの間の増分および近似直線的相関を示す。
【図１０】Ａ．カプラン・マイヤー曲線は、病期ＩＩの患者に関する６つの予測子、ＦＲＭＤ６、ＥＳＭ１、ＩＧＦＢＰ３、ＦＬＴ１、ＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３およびＣＤＫＮ２Ｂの平均発現に応じた生存期間を示す。Ｂ．全患者における６つの予測子、ＦＲＭＤ６、ＥＳＭ１、ＩＧＦＢＰ３、ＦＬＴ１、ＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３およびＣＤＫＮ２Ｂの発現と再発リスクとの間の増分および近似直線的相関を示す。
【図１１】Ａ．カプラン・マイヤー曲線は、病期ＩＩＩの患者における６つの予測子、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＦＬＴ１、ＧＥＭ、ＦＧＦ１およびＭＥＸ３Ｂの平均発現に応じた生存期間を示す。Ｂ．全患者における６つの予測子、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＦＬＴ１、ＧＥＭ、ＦＧＦ１およびＭＥＸ３Ｂの発現と再発リスクとの間の増分および近似直線的相関を示す。
【図１２】ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏバリデーション。病期ＩＩ  ＣＲＣ患者の完全に独立したセット（ＧＳＥ３３１１３）における結腸病期ＩＩ予測子の性能。Ａ．−カプラン・マイヤー曲線は、結腸病期ＩＩ予測子の平均発現に応じた、療法時に無病を維持する確率を示す。Ｂ．結腸病期ＩＩ予測子の平均発現の一増分（＋１ＳＤ）につき、再発を受けるリスクには１．４７の増加が見られる。
【図１３】ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏバリデーション。病期ＩＩおよび病期ＩＩＩ  ＣＲＣ患者の完全に独立したデータセット（ＧＳＥ３７８９２）における結腸病期ＩＩＩサインの性能。Ａ．−カプラン・マイヤー曲線は、結腸病期ＩＩＩ予測子の平均発現に応じた、療法時に無病を維持する確率を示す。Ｂ．結腸病期ＩＩＩ予測子の平均発現の一増分（＋１ＳＤ）につき、再発を受けるリスクには１．５２の増加が見られる。
【図１４】腫瘍におけるＴＧＦＢ２およびＴＧＦＢ３  ｍＲＮＡレベルがＣＲＣの再発を予測することを示す。Ａ．カプラン・マイヤー曲線は、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２およびＴＧＦＢ３  ｍＲＮＡの中程度（グレーの破線）または低（グレーの実線）発現に比べて高い平均発現（黒い線）を有するＣＲＣ保持患者に関する低い無再発生存率を経時的に示す。（右下：総合ｐ値）。Ｂ．低と中、低と高、および中と高のＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２およびＴＧＦＢ３発現を有する患者を比較する、経時的無再発生存率の、ハザード比（ＨＲ）およびｐ値。ＴＧＦＢ２およびＴＧＦＢ３発現レベルは、無病生存率に関して統計学的に有意な予測力を有する。
【図１５】全患者のＴＧＦ−β２および−β３発現レベルに応じたＳＣＡＤ係数に従うＣＲＣ患者の分布。
【発明の詳細な説明】
【００２４】
本発明の予後法
Ｆ−ＴＢＲＳに基づく、および３または６個の遺伝子を含んでなるミニサインに基づく予後法
本発明の著者らは、再発を受けている最大および最小リスク（例えば、「高リスク」病期ＩＩおよび「低リスク」病期ＩＩＩ結腸癌）のＣＲＣ患者を同定するために信頼性のある方法を提供する遺伝子セットを特定した。例えば、本出願の実施例２に示すように、正常結腸線維芽細胞（ＣＣＤ−ｃｏ−１８）においてＴＧＦ−βシグナル伝達により誘導される１２７個の遺伝子のセットは、ＴＧＦ−βシグナル伝達に応答した癌関連線維芽細胞では、結腸直腸腫瘍から精製された上皮細胞および白血球とは違った発現を示す。この遺伝子セットは、ＡＪＣＣ病期分類よりも優れた感受性で患者の再発を予測することを可能とする。さらに、上記のサインをさらに精密化することにより、本発明の著者らは、１２７遺伝子のサインから、再発リスクを予測可能とする遺伝子の小サブセットを選択した。よって、第１の態様において、本発明は、結腸直腸癌に罹患している患者の転帰を予測するための方法（以下、本発明の第１の予後法）であって、前記患者由来のサンプルにおけるＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＣＤＫＮ２ＢおよびＦＬＴ１遺伝子の発現レベルの決定を含んでなる方法に関し、ここで、前記遺伝子の参照値に比べての前記遺伝子の発現レベルの増大は、前記患者の不良な転帰の見込みの増大を示し、または前記遺伝子の参照値に比べての前記遺伝子の発現レベルの減少は、前記患者の良好な転帰の見込みの増大を示す。
【００２５】
用語「転帰を予測する」は、本発明において、患者が、正であれ負であれ、特定の臨床転帰を有する見込みを意味して用いられる。本発明の予測方法は、任意の特定の患者にとって最も適当な治療法を選択することによって治療判断を下すために臨床使用することができる。本発明の予測方法は、患者が化学療法などの治療計画に有利に奏功する可能性があるかどうかを予測する上で有用なツールとなる。予測は予後因子を含み得る。
【００２６】
当業者によって理解されるように、予測は、診断または評価対象の１００％に対して正確であることが好ましいが、必ずしも必要ではない。しかしながら、この用語は、対象の統計学的に有意な部分が、ある転帰を有する高い確率を持つと特定できることを必要とする。ある対象が統計学的に有意かどうかは、当業者であれば、例えば、信頼区間の決定、ｐ値の決定、クロスバリデーション分類率などの様々な周知の統計評価ツールを用いて、容易に決定することができる。詳細は、Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983に示されている。好ましい信頼区間は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％である。ｐ値は、好ましくは、０．０１、０．００５またはそれ未満である。
【００２７】
本発明で用いる場合、用語「患者」は、哺乳動物として分類される総ての動物を意味し、限定されるものではないが、飼育動物および農用動物、霊長類およびヒト、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、または齧歯類を含む。好ましくは、患者は、年齢または人種によらず、男性または女性である。
【００２８】
用語「結腸直腸癌」は最も広い意味で用いられ、（１）大腸および／もしくは直腸の上皮細胞から生じるあらゆる病期およびあらゆる形態の癌、ならびに／または（２）大腸および／または直腸の内層を侵すあらゆる病期およびあらゆる形態の癌を意味する。結腸直腸癌の分類に用いられている病期分類法では、結腸および直腸は１つの器官として扱われる。
【００２９】
好ましい実施形態では、患者は、病期Ｉ、病期ＩＩ、病期ＩＩＩまたは病期ＩＶの腫瘍を有し、ここで、病期Ｉは、Ｔ１  Ｎ０  Ｍ０またはＴ２  Ｎ０  Ｍ０のいずれかとして定義され；病期ＩＩは、Ｔ３  Ｎ０  Ｍ０またはＴ４  Ｎ０  Ｍ０のいずれかとして定義され；病期ＩＩＩは、任意のＴ、Ｎ１〜２、Ｍ０として定義され；病期ＩＶは、任意のＴ、任意のＮ、Ｍ１に相当する。米国癌合同委員会（ＡＪＣＣ）の腫瘍、リンパ節、転移（ＴＮＭ）病期分類法(Greene et al. (eds.), AJCC Cancer Staging Manual. 6th Ed. New York, N.Y.: Springer; 2002)によれば、結腸直腸癌の様々な病期は次のように定義される。
・腫瘍：Ｔ１：腫瘍は粘膜下に浸潤；Ｔ２：腫瘍が固有筋層に浸潤；Ｔ３：腫瘍が固有筋層から漿膜下層(subserose）へ、または結腸周囲もしくは直腸周囲組織へ浸潤；Ｔ４：腫瘍が他の器官または構造へ直接浸潤、および／または穿通。
・リンパ節：Ｎ０：所属リンパ節への転移無し；Ｎ１：１〜３の所属リンパ節への転移；Ｎ２：４以上の所属リンパ節への転移。
・転移：Ｍ０：ｍｐ遠隔転移；Ｍ１：遠隔転移の存在。
【００３０】
好ましい実施形態では、転帰が予測される患者は、結腸直腸癌を有すると診断され、かつ、癌の外科的切除を受けた患者である。好ましい実施形態では、患者は、病期Ｉの腫瘍、病期ＩＩの腫瘍、病期ＩＩＩの腫瘍または病期ＩＶの腫瘍の外科的切除を受けている。
【００３１】
本発明において、用語「サンプル」または「生体サンプル」は、被験体から単離された生体材料を意味する。生体サンプルは、所望のバイオマーカーの検出に好適な任意の生体材料を含むことができ、被験体の細胞および／または非細胞材料を含んでなり得る。サンプルは任意の好適な組織または体液、例えば、前立腺組織、血液、血漿、血清、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）または糞便から単離することができる。マーカー遺伝子の決定に使用されるサンプルは、好ましくは、生検により得られる結腸直腸組織サンプルである。
【００３２】
あるいは、サンプルは体液サンプルである。用語「体液(biological fluid)」および「体液(biofluid)」は、本明細書では互換的に使用され、生物起源の水性流体を意味する。
【００３３】
体液は、いずれの場所から得られるものでもよく（例えば、血液、血漿、血清、尿、胆汁、脳脊髄液、水性体液もしくは硝子体液、または任意の体分泌液）、滲出液（膿瘍または他の任意の感染もしくは炎症部位から得られる流体）、または関節（例えば、正常関節または関節リウマチなどの疾患に侵された関節）から得られる流体であり得る。
【００３４】
第１の工程において、本発明の第１の方法は、前記患者由来のサンプルにおけるＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＣＤＫＮ２ＢおよびＦＬＴ１遺伝子の発現レベルの決定を含んでなる。
【００３５】
用語「ＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３」は、本発明で用いる場合、第５染色体に見られるオープンリーディングフレーム２３を意味し、ＦＬＪ１４０５４または推定タンパク質ＬＯＣ７９６１４としても知られるＮＰＲ３ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（心房性ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ）に相当する。ヒトＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースで受託番号ＮＧ＿０２８１６２．１として示されている。
【００３６】
用語「ＣＤＫＮ２Ｂ」は、本明細書において、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ｂを意味し、ｐ１５、ＭＴＳ−２２、ＭＴＳ２１、ｐ１５  ＣＤＫ阻害剤、ＩＮＫ４Ｂ１、Ｐ１５、ｐ１４＿ＣＤＫ阻害剤、ＴＰ１５、ｐ１５ＩＮＫ４ｂ、ＣＤＫ阻害タンパク質、ＣＤＫ４Ｉ１、ｐ１４＿ＩＮＫ４Ｂ２、多重腫瘍サプレッサー２、サイクリン依存性キナーゼ４および６結合タンパク質、ｐ１４−ＩＮＫ４ｂ、ｐ１５＿ＩＮＫ４Ｂ２、ｐ１５−ＩＮＫ４ｂまたはｐ１５ＩＮＫ４Ｂ３としても知られる。ヒトＣＤＫＮ２Ｂ  ｍＲＮＡの種々のアイソフォームが、ＧｅｎＢａｎｋデータベースで受託番号ＮＭ＿０７８４８７．２およびＮＭ＿００４９３６．３として示されている。
【００３７】
用語「ＦＬＴ１」は、本明細書において、ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１を意味し、血管内皮増殖因子受容体、血管透過性因子受容体またはＶＥＧＦＲ−１としても知られる。ＦＬＴ１をコードするヒト遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースで受託番号ＮＧ＿０１２００３．１として示されている。
【００３８】
さらに、上述のマーカーの決定に加え、本発明による方法は、ＦＲＭＤ６、ＩＧＦＢＰ３、ＥＳＭ１、ＦＧＦ１、ＧＥＭ、ＭＥＸ３Ｂ、ＷＮＴ２、ＮＧＦ、ＭＳＣ、ＳＥＴＢＰ１、ＦＬＪ１０３５７、ＤＡＣＴ、ＭＵＲＣおよびＣｏｌ１０Ａ１からなる群から選択される１以上のマーカーの決定をさらに含んでなってもよく、参照値に比べての前記遺伝子の１以上の発現レベルの増大が、前記患者が高い再発リスクを呈することを示し、または参照値に比べての前記遺伝子の１以上の発現レベルの減少が、前記患者が低い再発リスクを呈することを示す。
【００３９】
用語「ＦＲＭＤ６」は、本明細書において、ＦＲＭＤ６ドメイン含有６を意味し、ＥＸ１、Ｗｉｌｌｉｎ、Ｃ１４ｏｒｆ３１、ＭＧＣ１７９２１、ｃ１４＿５３２０としても知られる。ヒトＦＲＭＤ６遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースで受託番号ＡＬ０７９３０７．７として示されている。
【００４０】
用語「ＩＧＦＢＰ３」は、本明細書において、インスリン様増殖因子結合タンパク質３を意味し、ＩＢＰ３またはＢＰ−５３としても知られる。ヒトＩＧＦＢＰ３遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースで受託番号ＮＧ＿０１１５０８．１（５００１〜１４０２８位）として示されている。
【００４１】
用語「ＥＳＭ１」は、本明細書において、内皮細胞特異的分子１を意味し、エンドカン(endocan)としても知られる。ヒトＥＳＭ１遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースで受託番号ＮＣ＿０００００５．９（５４２７３６９５〜５４２８１４１４位の相補物）として示されている。
【００４２】
用語「ＦＧＦ１」は、本明細書において、線維芽細胞増殖因子１（酸性）を意味し、ＡＦＧＦ、ＥＣＧＦ、ＦＧＦＡ、ＥＣＧＦＡ、ＥＣＧＦＢ、ＨＢＧＦ１、ＧＬＩＯ７０３、ＥＣＧＦ−βまたはＦＧＦ−αとしても知られる。ヒトＦＧＦ１遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースで受託番号ＮＣ＿０００００５．９（１４１９７１７４３〜１４２０７７６３５位の相補物）で示されている。
【００４３】
用語「ＧＥＭ」は、本明細書において、骨格筋で過剰発現するＧＴＰ結合タンパク質を意味し、ＫＩＲまたはＭＧＣ２６２９４としても知られる。ヒトＧＥＭ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースで受託番号ＮＣ＿０００００８．１０（９５２６１４８１〜９５２７４５４７位の相補物）として示されている。
【００４４】
用語「ＭＥＸ３Ｂ」は、本明細書において、ＲＮＡ結合タンパク質を意味し、ＲＫＨＤ３、ＭＥＸ−３Ｂ、ＲＮＦ１９５、ＭＧＣ１１７１９９またはＤＫＦＺｐ４３４Ｊ０６１７としても知られる。ヒトＭＥＸ３Ｂ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースで受託番号ＮＣ＿００００１５．９（８２３３４１２８〜８２３３８３６１位の相補物）として示されている。
【００４５】
用語「ＷＮＴ２」は、本明細書において、ウィングレス型ＭＭＴＶ組込み部位ファミリーメンバー２を意味し、ＩＲＰまたはＩＮＴ１Ｌ１としても知られる。ヒトＷＮＴ２遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースで受託番号ＮＣ＿０００００７．１３（１１６９１６６８５〜１１６９６３３４３位の相補物）として示されている。
【００４６】
用語「ＮＧＦ」は、本明細書において、神経成長因子を意味し、ＮＧＦＢ、ＨＳＡＮ５、β−ＮＧＦ、ＭＧＣ１６１４２６またはＭＧＣ１６１４２８としても知られる。ヒトＮＧＦ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースで受託番号ＮＧ＿００７９４４．１（５００１〜５７３２１位の相補物）として示されている。
【００４７】
用語「ＭＳＣ」は、本明細書において、ムスカリン遺伝子を意味し、ＡＢＦ１、ＭＹＯＲ、ＡＢＦ−１またはｂＨＬＨａ２２としても知られる。ヒトＭＳＣ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースで受託番号ＮＣ＿０００００８．１０（７２７５３７７７〜７２７５６７３１位の相補物）として示されている。
【００４８】
用語「ＳＥＴＢＰ１」は、本明細書において、ＳＥＴ結合タンパク質１を意味し、ＳＥＢ、ＫＩＡＡ０４３７またはＤＫＦＺｐ６６６Ｊ１２１０としても知られる。ＳＥＴＢＰ１をコードするヒト遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースで受託番号Ｇ＿０２７５２７．１（５００１〜３９３３３８位）として示されている。
【００４９】
用語「ＦＬＪ１０３５７」は、本明細書において、Ｒｈｏグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）４０を意味し、ＡＲＨＧＥＦ４０、ＳＯＬＯまたはプロテインＳＯＬＯとしても知られる。ＦＬＪ１０３５７をコードするヒト遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースで受託番号ＮＣ＿００００１４．８（２１５３８５２７〜２１５５８０３６位）として示されている。遺伝子ＦＬＪ１０３５７はまた、ＡＲＨＧＥＦ４０としても知られる。
【００５０】
用語「ＤＡＣＴ１」は、本明細書において、ｄａｐｐｅｒ、β−カテニンアンタゴニスト同族体１を意味し、ＤＡＰＰＥＲ１、ＦＲＯＤＯ、ＤＰＲ１、ＨＤＰＲ１、ＴＨＹＥＸ３、ＤＡＰＰＥＲ、肝細胞癌新規遺伝子３タンパク質、ＨＮＧ３、またはｈＤＰＲ１としても知られる。ＤＡＣＴ１をコードするヒト遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースで受託番号ＮＣ＿００００１４．８（５９１０４７５７〜５９１１５０３９位）として示されている。
【００５１】
用語「ＭＵＲＣ」は、本明細書において、筋肉関連コイルドコイルタンパク質を意味する。ＭＵＲＣをコードするヒト遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースで受託番号ＮＣ＿０００００９．１１（１０３３４０３３６〜１０３３５０１８０位）として示されている。
【００５２】
用語「Ｃｏｌ１０Ａ１」は、本明細書において、Ｘ型コラーゲンα１を意味する。Ｃｏｌ１０Ａ１をコードするヒト遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースで受託番号ＮＧ＿００８０３２．１（５００１〜１２２１２位）として示されている。
【００５３】
本発明による方法は、上記遺伝子の１以上の天然に存在する多型変異体の決定を含んでもよいと理解される。
【００５４】
好ましい実施形態では、本発明の第１の方法で使用するマーカー遺伝子は、ＦＲＭＤ６、ＥＳＭ１、ＩＧＦＢＰ３、ＦＬＴ１、ＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３およびＣＤＫＮ２Ｂであり、患者は病期ＩＩ  ＣＲＣ患者である。
【００５５】
好ましい実施形態では、本発明の第１の方法で使用するマーカー遺伝子は、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＦＬＴ１、ＧＥＭ、ＦＧＦ１およびＭＥＸ３Ｂであり、患者は病期ＩＩＩ  ＣＲＣ患者である。
【００５６】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、遺伝子ＦＲＭＤ６、ＩＧＦＢＰ３、ＥＳＭ１、ＦＧＦ１、ＧＥＭ、ＭＥＸ３Ｂ、ＷＮＴ２、ＮＧＦ、ＭＳＣ、ＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＳＥＴＢＰ１、ＦＬＪ１０３５７、ＤＡＣＴ、ＭＵＲＣ、ＦＬＴ１およびＣｏｌ１０Ａ１の発現レベルの決定を含んでなる。
【００５７】
本発明による方法は、Ｆ−ＴＢＲＳを形成する遺伝子、すなわち、癌関連線維芽細胞が富化された細胞集団（富化ＣＡＦ；ＥＰＣＡＭ−  ＣＤ４５−）とＥＰＣＡＭ＋細胞集団およびＥＰＣＡＭ−  ｃｄ４５＋細胞集団との間で差次的に発現され、かつ、第２および第３の細胞集団に比べて第１の細胞集団で少なくとも２倍の増加を有する遺伝子の１以上の発現レベルの決定をさらに含んでもよく、前記遺伝子の参照値に比べての前記遺伝子の発現レベルの増大が、前記患者が高い再発リスクを呈することを示し、または前記遺伝子の参照値に比べての前記遺伝子の発現レベルの減少が、前記患者が低再発リスクを呈することを示す。
【００５８】
好ましい実施形態では、結腸直腸癌に罹患している患者の転帰を予測するための方法は、遺伝子ＡＮＧＰＴＬ２、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＰＢＢ２、ＢＭＰＲ２、ＢＰＧＭ、Ｃ１３ｏｒｆ３３、Ｃ５ｏｒｆ１３、ＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＣＡＣＨＤ１、ＣＡＬＤ１、ＣＤＨ６、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＩＬＰ、ＣＮＴＮ１、ＣＯＬ１０Ａ１、ＣＯＬ１２Ａ１、ＣＯＬ２７Ａ１、ＤＡＣＴ１、ＤＩＸＤＣ１、ＤＮＡＪＢ５、ＤＮＡＪＣ１８、ＥＬＴＤ１、ＥＰＨＡ４、ＥＳＭ１、ＦＡＰ、ＦＧＤ６、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＬＪ１０３５７、ＦＬＴ−１、ＦＮ１、ＦＲＭＤ４Ａ、ＦＲＭＤ６、ＧＡＳ１、ＧＥＭ、ＧＦＰＴ２、ＧＰＲ１６１、ＨＡＳ２、ＨＥＹ１、ＨＩＣ１、ＨＳ３ＳＴ３Ａ１、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ７、ＩＬ１１、ＩＮＨＢＡ、ＫＡＬ１、ＫＩＡＡ１７５５、ＫＬＦ７、ＬＡＲＰ６、ＬＭＣＤ１、ＬＭＯ４、ＬＯＣ１００１２８１７８、ＬＯＣ６４４２４２、ＬＯＣ７２８２６４、ＬＯＨ３ＣＲ２Ａ、ＬＲＲＣ８Ａ、ＭＥＯＸ１、ＭＥＸ３Ｂ、ＭＦＡＰ２、ＭＧＣ１６１２１、ＭＳＣ、ＭＵＲＣ、ＮＥＤＤ９、ＮＧＦ、ＮＯＸ４、ＮＰＲ２、ＮＵＡＫ１、ＯＳＧＩＮ２、ＰＡＬＬＤ、ＰＡＬＭ２、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＣ、ＰＤＬＩＭ４、ＰＤＰＮ、ＰＧＭ２Ｌ１、ＰＫＮＯＸ２、ＰＭＥＰＡ１、ＰＯＤＸＬ、ＰＰＭ１Ｅ、ＰＴＨＬＨ、ＲＡＳＤ１、ＲＡＳＧＲＰ３、ＲＡＳＬ１２、ＲＧＳ４、ＲＮＦ１５０、ＲＵＮＸ１、Ｓ１ＰＲ５、ＳＥＭＡ６Ｄ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＥＴＢＰ１、ＳＨＩＳＡ２、ＳＬＣ４６Ａ３、ＳＮＣＡＩＰ、ＳＮＯＲＤ１１４−３、ＳＯＸ６、ＳＰＳＢ１、ＳＴＫ３８Ｌ、ＳＹＮＥ１、ＳＹＴＬ４、ＴＣＦ４、ＴＧＦＢ２、ＴＩＭＰ３、ＴＭＥＭ８８、ＴＮＣ、ＴＮＳ１、ＴＰＭ１、ＴＳＨＺ３、ＴＳＰＡＮ２、ＶＥＰＨ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ９ＡおよびＺＥＢ１遺伝子、ならびに配列番号１〜１３の配列を有するプローブと特異的にハイブリダイズする遺伝子の発現レベルの決定を含んでなり、前記遺伝子の参照値に比べての前記遺伝子の発現レベルの増大が、前記患者の不良な転帰の見込みの増大を示し、または前記遺伝子の参照値に比べての前記遺伝子の発現レベルの減少が、前記患者の良好な転帰の見込みの増大を示す。
【００５９】
用語「特異的にハイブリダイズする」とは、本明細書において、高ストリンジェント条件または中ストリンジェント条件下で２つのポリヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを可能とする条件を意味する。「高ストリンジェント条件」および「中ストリンジェント条件」という表現は、本発明のキットに関して以下に定義され、本方法に関して等しく適用可能である。
【００６０】
事実上、従来のいずれの方法も、前記マーカー遺伝子を検出し、そのレベルを定量するために、本発明の範囲内で使用可能である。限定されない例を挙げれば、発現レベルは、前記遺伝子によりコードされているｍＲＮＡのレベルの定量の手段またはそれらのタンパク質レベルの定量の手段によって決定される。
【００６１】
ｍＲＮＡの量を決定するための方法は当技術分野で周知である。例えば、まず、サンプル（例えば、患者から調製された細胞または組織）中に含まれる核酸を、標準的な方法に従い、例えば、溶解酵素もしくは化学溶液を用いて抽出するか、または製造者の説明書に従って核酸結合樹脂によって抽出する。抽出されたｍＲＮＡを次に、ハイブリダイゼーション（例えば、ノーザンブロット分析、またはｍＲＮＡを標識ｃＤＮＡに変換した後のオリゴヌクレオチドマイクロアレイによる）および／または増幅（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）によって検出する。好ましくは、定量的または半定量的ＲＴ−ＰＣＲを行う。リアルタイム定量的または半定量的ＲＴ−ＰＣＲが特に有利である。好ましくは、推定されるゲノム混入からのｃＤＮＡ増幅を識別するために、プライマー対は、イントロンが重複するように設計した。好適なプライマーは当業者ならば容易に設計することができる。他の増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写を介する増幅（ＴＭＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）および核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）が挙げられる。好ましくは、ｍＲＮＡの量は、定量的もしくは半定量的ＲＴ−ＰＣＲまたはリアルタイム定量的もしくは半定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定される。
【００６２】
あるいはまた、遺伝子の発現が増加すれば、対応するタンパク質の量の増加が起こるはずであることから、マーカー遺伝子の発現レベルは、前記遺伝子によりコードされているタンパク質の発現レベルの決定の手段によって決定することもできる。種々のタンパク質の発現レベルの決定は、従来のいずれの方法を用いて行ってもよい。限定されない例を挙げれば、前記決定は、決定対象のタンパク質（または抗原決定基を含有するそのフラグメント）に特異的に結合する能力を有する抗体を用い、その後、生じた抗原−抗体複合体の定量により行うことができる。このタイプのアッセイにおいて使用が意図される抗体は、例えば、ポリクローナル血清、ハイブリドーマ上清またはモノクローナル抗体、抗体フラグメント、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディーおよびヒト化抗体であり得る。同時に、これらの抗体は標識してもしなくてもよい。使用可能な、限定されるものではないが例示的なマーカーの例としては、放射性同位元素、酵素、蛍光団、化学発光試薬、酵素補因子または基質、酵素阻害剤、粒子、色素などが挙げられる。非標識抗体（一次抗体）および標識抗体（二次抗体）を用いて、本発明で使用可能な周知のアッセイには多様なものがあり、これらの技術としては、ウエスタンブロットまたは免疫ブロット、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、競合的ＥＩＡ（酵素イムノアッセイ）、ＤＡＳ−ＥＬＩＳＡ（二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学および免疫組織化学技術、特異的抗体を含むバイオチップもしくはタンパク質マイクロアレイの使用に基づく技術、または試薬ストリップなどの形式におけるコロイド沈殿に基づくアッセイが挙げられる。タンパク質を検出および定量する他の形式としては、アフィニティークロマトグラフィー技術、リガンド結合アッセイなどが挙げられる。
【００６３】
患者由来のサンプル中の上記遺伝子の発現レベルが決定されれば、次に、それらのレベルを前記遺伝子のそれぞれの参照値と比較する。一般に、参照値は、参照サンプルにおける比較する遺伝子の発現レベルである。
【００６４】
「参照サンプル」は、本明細書において、病態または特定の表現型を持たない健常な被験体のプールから得られるサンプルを意味する。例えば、参照サンプルは、結腸癌に罹患していないか、または結腸癌の病歴のない患者の結腸粘膜からのサンプルを含んでなり得る。あるいは、参照サンプルは、低い再発リスクを有する結腸癌のサンプルまたはサンプルプールであり得る。このサンプルまたはサンプルプールは、腫瘍の外科的切除を受け、かつ、好ましくは補助化学療法の不在下で再発を受けていない患者から得ることができる。別の実施形態では、参照サンプルは、Ｉ型ＣＲＣまたはＩ型ＣＲＣプール由来のサンプルである。
【００６５】
遺伝子の好適な参照発現レベルは、複数の好適な被験体で前記遺伝子の発現レベルを測定することによって決定することができ、このような参照レベルは、特定の被験体集団に対して補正することができる（例えば、ある年齢の被験体のサンプルにおける発現レベルと、ある年齢群における特定の病態、表現型またはその不在に関する参照レベルとの間の比較を行うことができるように、参照レベルを年齢と連関させることができる）。好ましい実施形態では、参照サンプルは、複数の健常な被験体から、またはそれまでに結腸直腸癌の病歴のない被験体から得られる。あるいは、参照サンプルは、腫瘍の外科的切除を受け、かつ、好ましくは補助化学療法の不在下で再発を受けていない患者の結腸癌のサンプルまたはサンプルプールである。当業者ならば、このタイプの参照サンプルが実施される具体的な方法によって異なり得ることを認識するであろう。よって、疾患の診断または予後が行われる場合、参照サンプルは、結腸直腸癌の病歴のない個体もしくは個々の腫瘍組織に対して遠位の非腫瘍組織のプールのいずれかに由来する非腫瘍結腸直腸組織サンプルのプール、または腫瘍の外科的切除を受け、かつ、好ましくは補助化学療法の不在下で再発を受けていない患者由来の結腸癌のサンプルもしくはサンプルプールであり得る。本発明の方法が患者において療法の効果を決定することを目的とする場合、参照サンプルは好ましくは、治療を開始するために前記患者から得たサンプルである。
【００６６】
参照サンプルにおける遺伝子の発現プロフィールは好ましくは、２以上の個体の集団から作製することができる。集団は、例えば、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０またはそれを超える個体を含んでなり得る。さらに、参照サンプルおよび本発明の方法に従って診断しようとする個体のサンプルにおける遺伝子の発現プロフィールは、アッセイされるプロフィールと参照プロフィールが異なる時点で採取された生体サンプルから作製され、互いに比較される限り、同じ個体から作製することができる。例えば、個体のサンプルは試験期間の開始時に得ることができる。次に、このサンプルからの参照バイオマーカープロフィールを、同じ個体のその後のサンプルから作製されたバイオマーカープロフィールと比較することができる。好ましい実施形態では、参照サンプルは、複数個体からのサンプルプールであり、腫瘍領域から離れた、好ましくは、同じ生検で得られたものであるが腫瘍組織のいずれの解剖病理学的特徴も持たない、結腸直腸組織の一部に相当する。
【００６７】
前記遺伝子の参照値に比べてのマーカー遺伝子の発現レベルが決定されれば、前記遺伝子の発現に変化（発現の増大または減少）が存在するかどうかを特定することが必要である。遺伝子の発現は、そのレベルが参照サンプルに比べて少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、またはそれより大きく増大する場合に、試験下の被験体のサンプルにおいて増大とみなされる。同様に、遺伝子の発現は、そのレベルが参照サンプルに比べて少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％（すなわち、存在しない）減少する場合に、減少とみなされる。
【００６８】
最後に、患者は、その後、マーカー遺伝子が参照サンプルに比べて発現レベルの増大を示せば不良な転帰の高いリスクを有する、また、マーカー遺伝子が参照サンプルに比べて発現レベルの減少を示せば不良な転帰の低いリスクを有すると分類される。好ましい実施形態では、患者は、その後、その遺伝子の発現レベルが、腫瘍の外科的切除を受け、かつ、好ましくは補助化学療法の不在下で再発を受けていない患者由来の結腸癌のサンプルまたはサンプルプールにおける同じ遺伝子の発現レベルよりも高ければ、不良な転帰の高いリスクを有すると分類される。
【００６９】
ＣＲＣに関して用語「良好な転帰」は、無再発期間（ＲＦＩ）の延長、全生存期間（ＯＳ）の延長、無病生存期間（ＤＦＳ）の延長、無遠隔再発期間（ＤＲＦＩ）の延長などの当技術分野で慣用される尺度を含む、患者状態の任意の尺度の改善を意味する。良好な臨床転帰の見込みの増大は、癌再発の見込みの減少に相当する。
【００７０】
ＣＲＣに関して用語「不良な転帰」は、無再発期間（ＲＦＩ）の短縮、全生存期間（ＯＳ）の短縮、無病生存期間（ＤＦＳ）の短縮、無遠隔再発期間（ＤＲＦＩ）の短縮などの当技術分野で慣用される尺度を含む、患者状態の任意の尺度の悪化を意味する。不良な臨床転帰の見込みの増大は、癌再発の見込みの増大に相当する。
【００７１】
好ましい実施形態では、ある患者における転帰は、転移リスクまたは再発リスクとして評価される。
【００７２】
用語「転移リスク」は、本明細書において、被験体または個体が定義された期間内に解剖学的に離れた場所に、その被験体または個体がそれに関して処置または診断を受けたものと類似または同じ新生物性疾患を発症する機会または確率に関する、尤度または確率の評価を意味する。
【００７３】
用語「転移」は、本明細書において、原発癌性腫瘍の器官と直接接続されていない器官または身体部分における癌性腫瘍の成長を意味する。転移は微小転移を含むと理解され、この微小転移では、原発癌性腫瘍の器官と直接接続されていない器官または身体部分に検出できない量の癌性細胞が存在する。好ましい実施形態では、転移は肝臓転移である。
【００７４】
用語「再発リスク」は、本発明で用いる場合、被験体または個体が定義された期間内に、その被験体または個体がそれに関して処置または診断を受けたものと類似または同じ新生物性疾患（同じ解剖学的場所または解剖学的に離れた場所におけるイベントのいずれか）に侵されているか、または前記疾患を発症する機会または確率に関する、尤度または確率の評価を意味する。
【００７５】
本発明による方法は、上述の種々のマーカー遺伝子の発現レベルと１以上の臨床予後因子を組み合わせて患者の転帰を予測する可能性をさらに企図する。
【００７６】
予後因子は、患者がひと度結腸直腸癌を発症した場合に患者の再発率および転帰に影響を及ぼす、結腸直腸癌の自然経過に関する変数である。不良な予後と関連づけられている臨床パラメーターには、例えば、リンパ節の関与、高悪性度腫瘍が含まれる。予後因子は、患者を種々の基準再発リスクを有するサブグループに分類するためによく用いられる。好ましい実施形態では、本発明の方法で使用される臨床的予後因子は腫瘍病期であり、高い腫瘍病期は高い再発リスクを示し、または低い腫瘍病期は、その患者が低い再発リスクを呈することを示す。
【００７７】
好ましい実施形態では、臨床的予後因子は、ＡＪＣＣ分類（例えば、引用することにより本明細書の一部とされるSpringer-Verlag New Yorkにより発行されたAJCC Cancer Staging Manual, Seventh Edition (2010)参照）に従う、また、上記で定義したような、腫瘍病期である。用語「腫瘍病期」は、前述のように、腫瘍のＴＮＭ値に基づいて決定される値である。よって、病期Ｉは、Ｔ１  Ｎ０  Ｍ０またはＴ２  Ｎ０  Ｍ０に相当し；病期ＩＩは、Ｔ３  Ｎ０  Ｍ０またはＴ４  Ｎ０  Ｍ０に相当し；病期ＩＩＩは、任意のＴ、Ｎ１〜２、Ｍ０に相当し；病期ＩＶは、任意のＴ、任意のＮかつＭ１に相当する。
【００７８】
よって、好ましい実施形態では、本発明は、患者の腫瘍病期の決定をさらに含んでなり、この場合、高い腫瘍病期は高い再発リスクを示し、または低い腫瘍病期は低い再発リスクを示す。
【００７９】
用語「低い腫瘍病期」は、本発明で用いる場合、ＡＪＣＣ病期ＩまたはＩＩを意味する。
【００８０】
用語「高い腫瘍病期」は、本発明で用いる場合、ＡＪＣＣ病期ＩＩＩまたはＩＶを意味する。
【００８１】
本発明に従って分析される患者は、その決定の前に腫瘍サイズの縮小を目的に１以上の療法で処置されていてもされていなくてもよい。よって、好ましい実施形態では、患者は、本発明による種々の遺伝子の発現レベルの決定の前に処置されていない。別の実施形態では、患者は、本発明による種々の遺伝子の発現レベルの決定の前に、化学療法、放射線療法または手術からなる群から選択される療法により処置される。
【００８２】
用語「化学療法」、「放射線療法」および「手術」は以下に詳細に定義され、本発明に関して同じ意味で使用される。
【００８３】
ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３の発現レベルに基づく予後法
本発明の発明者らはまた、ＴＧＦ−β２および／またはＴＧＦ−β３の発現レベルがＣＲＣに罹患している患者の転帰の良好な予測子でもあることを見出した。ＴＧＦ−β２および／またはＴＧＦβ３が分泌分子であるということを考えれば、この知見は、体液中のＴＧＦ−β２および／またはＴＧＦ−β３の発現レベルを決定することにより患者の予後の決定を可能とし、本発明による予測方法に非侵襲的手段を提供する。
【００８４】
よって、別の態様において、本発明は、結腸直腸癌に罹患している患者の転帰を予測するための方法（以下、本発明の第２の予後法）であって、前記患者由来のサンプルにおける、ＴＧＦ−β２および／またはＴＧＦ−β３遺伝子の発現レベルの決定を含んでなる方法に関し、ここで、各遺伝子の参照値に比べての前記の１または複数の遺伝子の発現レベルの増大は、不良な転帰の見込みの増大を示し、または各遺伝子の参照値に比べての前記の１または複数の遺伝子の発現レベルの減少は、良好な転帰の見込みの増大を示す。
【００８５】
用語および表現「転帰を予測する」、「結腸直腸癌」、「サンプル」、「患者」、「発現レベルの増大」、「発現レベルの減少」、「参照値」、「良好な転帰」および「不良な転帰」は、本発明の第１の予後法に関して詳細に記載しており、本方法に関しても同じ意味で使用される。
【００８６】
好ましい実施形態では、転帰が予測される患者は、結腸直腸癌と診断され、かつ、その癌の外科的切除を受けた患者である。
【００８７】
第１の工程において、本発明の第２の予後法は、患者由来のサンプルにおける、ＴＧＦ−β２および／またはＴＧＦ−β３遺伝子の発現レベルの決定を含んでなる。
【００８８】
用語「ＴＧＦβ２」は、本発明で用いる場合、ＮＢＣＩデータベースで、ヒト相同分子種では受託番号ＮＰ＿００１１２９０７１（アイソフォーム１）またはＮＰ＿００３２２９（アイソフォーム２）、ラット相同分子種ではＣＡＢ４２００３、およびマウス相同分子種ではＡＡＨ１１１７０として示されているトランスフォーミング増殖因子β２を意味する。用語「ＴＧＦβ２」はまた、上記配列のいずれかの天然変異体および多型形態も意味する。
【００８９】
用語「ＴＧＦβ３」は、本発明で用いる場合、ＮＣＢＩデータベースで受託番号ＮＰ＿００３２３０として示されているヒトＴＧＦ−β３プレプロタンパク質相同分子種のアミノ酸３０１〜４１２、受託番号ＮＰ＿０３７３０６として示されているラットＴＧＦ−β３プレプロタンパク質相同分子種のアミノ酸３０１〜４１２に相当するトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）β３を意味する。用語「ＴＧＦβ３」はまた、上記配列のいずれかの天然変異体および多型形態も意味する。
【００９０】
ＴＧＦ−β２および／またはＴＧＦ−β３遺伝子の発現レベルの決定は、前記遺伝子のｍＲＮＡレベルを決定することによって、または前記遺伝子によりコードされているタンパク質のレベルを決定することによって行うことができる。あるｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルを決定するのに好適な手順は、上記で本発明の第１の予後法に関して記載されている。
【００９１】
さらに別の実施形態では、本発明による方法は、腫瘍生検または体液からなる群から選択されるサンプルにおいて行われる。別の実施形態では、サンプルが体液である場合、体液は血液、血漿および血清からなる群から選択される。
【００９２】
好ましい実施形態では、ＴＧＦ−β２および／またはＴＧＦ−β３の発現レベルの決定はＲＴ−ＰＣＲにより行われる。サンプルが腫瘍サンプルである場合のさらに別の実施形態では、ＴＧＦ−β２および／またはＴＧＦβ３の発現レベルはＲＴ−ＰＣＲにより行われる。サンプルが体液である場合の、別の実施形態では、発現レベルは、対応するＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３ポリペプチドのレベルを測定することによって決定される。
【００９３】
本方法は、上記遺伝子の発現レベルの決定に加えて、腫瘍病期の決定をさらに含んでなり、高い腫瘍病期は高い再発リスクを示し、または低い腫瘍病期は、その患者が低い再発リスクを呈することを示す。用語「高い腫瘍病期」および「低い腫瘍病期」は、上記で詳細に記載しており、本方法に関しても同じ意味で使用される。
【００９４】
好ましい実施形態では、予後法は、結腸直腸癌に罹患している患者由来のサンプルにおいて行われ、ここで、結腸直腸癌は病期ＩＩまたは病期ＩＩＩ結腸直腸腫瘍である。別の実施形態では、本方法は、腫瘍の外科的切除を受けた患者において行われる。
【００９５】
さらに別の実施形態では、本方法による患者の転帰の決定は、診断時のまたは再発リスクとしての、転移リスクを決定することにより行われる。
【００９６】
本発明による個別化治療法
上記で定義した予後法はまた、結腸直腸癌に罹患している患者に個別化療法を提供することも可能とする。特に、高い再発リスクを有するとみなされる患者は、手術後の付加的療法から利益を受ける可能性が最も高い。逆に、低い再発リスクを示す患者は、手術後の治療的処置を見送ることができる。
【００９７】
Ｆ−ＴＢＲＳおよびミニサインの発現レベルに基づく個別化医療
よって、別の態様において、本発明は、患者の結腸直腸癌に好適な処置を選択するための方法（以下、本発明の第１の個別化治療法）であって、前記患者由来のサンプルにおけるＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＣＤＫＮ２ＢおよびＦＬＴ１遺伝子の発現レベルの決定を含んでなる方法に関し、ここで、前記遺伝子の参照値に比べての前記遺伝子の発現レベルの増大は、前記患者が外科的処置後の放射線療法もしくは化学療法を受ける候補であることを示し、または前記遺伝子の参照値に比べての前記遺伝子の発現レベルの減少は、前記患者が外科的処置後の放射線療法もしくは化学療法を受ける候補ではないことを示す。
【００９８】
本発明で用いる場合、「処置」は、疾患もしくは障害、または再発性の疾患もしくは障害の１以上の症状を予防する、治癒させる、遅延させる、その重篤度を軽減する、または改善することを試みる、あるいは患者の生存をこのような処置の不在下で予想される期間を超えて延長するための、臨床介入を意味する。
【００９９】
用語「結腸直腸癌」は、本発明の予後法に関して詳細に記載されており、本発明による個別化方法に関しても同じ意味で使用される。
【０１００】
第１の工程において、本発明による第１の個別化治療法は、前記患者由来のサンプルにおけるＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＣＤＫＮ２ＢおよびＦＬＴ１遺伝子の発現レベルの決定を含んでなる。
【０１０１】
用語「結腸直腸癌」、「患者」、「ＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３遺伝子」、「ＣＤＫＮ２Ｂ遺伝子」、「ＦＬＴ１遺伝子」、「発現レベル」、「サンプル」は上記に詳細に記載されており、本方法による方法に等しく適用される。
【０１０２】
さらに、上述のマーカーの決定に加えて、本発明による第１の個別化治療法は、ＦＲＭＤ６、ＩＧＦＢＰ３、ＥＳＭ１、ＦＧＦ１、ＧＥＭ、ＭＥＸ３Ｂ、ＷＮＴ２、ＮＧＦ、ＭＳＣ、ＳＥＴＢＰ１、ＦＬＪ１０３５７、ＤＡＣＴ、ＭＵＲＣおよびＣｏｌ１０Ａ１からなる群から選択される１以上のマーカーの決定をさらに含んでなってもよく、参照値に比べての前記遺伝子の１以上の発現レベルの増大は、前記患者が外科的処置後の療法を受ける候補であることを示し、または前記遺伝子の参照値に比べての前記遺伝子の発現レベルの減少は、前記患者が外科的処置後の療法を受ける候補ではないことを示す。
【０１０３】
好ましい実施形態では、本発明による第１の個別化治療法は、遺伝子ＣＤＫＮ２Ｂ、ＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＦＬＴ１、ＦＲＭＤ６、ＩＧＦＢＰ３およびＥＳＭ１の発現レベルの決定を含んでなり、この決定は、病期ＩＩ結腸直腸癌に罹患している患者由来のサンプルで行われる。
【０１０４】
別の好ましい実施形態では、本発明による第１の個別化治療法は、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＦＬＴ１、ＦＧＦ１、ＧＥＭ、およびＭＥＸ３Ｂ遺伝子のレベルの決定を含んでなり、前記決定は、病期ＩＩＩ結腸直腸癌に罹患している患者において行われる。
【０１０５】
さらに別の実施形態では、本発明による第１の個別化治療法は、表１に示される、ＣＡＦ富化対ＥＰＣＡＭ＋欄に２より高いＦＣ値を有することを特徴とする１以上の遺伝子の発現レベルの決定をさらに含んでなり、前記遺伝子の参照値に比べての前記遺伝子の発現レベルの増大は、前記患者が外科的処置後の補助療法を受ける候補であることを示し、または前記遺伝子の参照値に比べての前記遺伝子の発現レベルの減少は、前記患者が外科的処置後の療法を受ける候補ではないことを示す。
【０１０６】
好ましい実施形態では、本発明による第１の個別化治療法は、遺伝子ＡＮＧＰＴＬ２、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＰＢＢ２、ＢＭＰＲ２、ＢＰＧＭ、Ｃ１３ｏｒｆ３３、Ｃ５ｏｒｆ１３、ＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＣＡＣＨＤ１、ＣＡＬＤ１、ＣＤＨ６、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＩＬＰ、ＣＮＴＮ１、ＣＯＬ１０Ａ１、ＣＯＬ１２Ａ１、ＣＯＬ２７Ａ１、ＤＡＣＴ１、ＤＩＸＤＣ１、ＤＮＡＪＢ５、ＤＮＡＪＣ１８、ＥＬＴＤ１、ＥＰＨＡ４、ＥＳＭ１、ＦＡＰ、ＦＧＤ６、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＬＪ１０３５７、ＦＬＴ−１、ＦＮ１、ＦＲＭＤ４Ａ、ＦＲＭＤ６、ＧＡＳ１、ＧＥＭ、ＧＦＰＴ２、ＧＰＲ１６１、ＨＡＳ２、ＨＥＹ１、ＨＩＣ１、ＨＳ３ＳＴ３Ａ１、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ７、ＩＬ１１、ＩＮＨＢＡ、ＫＡＬ１、ＫＩＡＡ１７５５、ＫＬＦ７、ＬＡＲＰ６、ＬＭＣＤ１、ＬＭＯ４、ＬＯＣ１００１２８１７８、ＬＯＣ６４４２４２、ＬＯＣ７２８２６４、ＬＯＨ３ＣＲ２Ａ、ＬＲＲＣ８Ａ、ＭＥＯＸ１、ＭＥＸ３Ｂ、ＭＦＡＰ２、ＭＧＣ１６１２１、ＭＳＣ、ＭＵＲＣ、ＮＥＤＤ９、ＮＧＦ、ＮＯＸ４、ＮＰＲ２、ＮＵＡＫ１、ＯＳＧＩＮ２、ＰＡＬＬＤ、ＰＡＬＭ２、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＣ、ＰＤＬＩＭ４、ＰＤＰＮ、ＰＧＭ２Ｌ１、ＰＫＮＯＸ２、ＰＭＥＰＡ１、ＰＯＤＸＬ、ＰＰＭ１Ｅ、ＰＴＨＬＨ、ＲＡＳＤ１、ＲＡＳＧＲＰ３、ＲＡＳＬ１２、ＲＧＳ４、ＲＮＦ１５０、ＲＵＮＸ１、Ｓ１ＰＲ５、ＳＥＭＡ６Ｄ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＥＴＢＰ１、ＳＨＩＳＡ２、ＳＬＣ４６Ａ３、ＳＮＣＡＩＰ、ＳＮＯＲＤ１１４−３、ＳＯＸ６、ＳＰＳＢ１、ＳＴＫ３８Ｌ、ＳＹＮＥ１、ＳＹＴＬ４、ＴＣＦ４、ＴＧＦＢ２、ＴＩＭＰ３、ＴＭＥＭ８８、ＴＮＣ、ＴＮＳ１、ＴＰＭ１、ＴＳＨＺ３、ＴＳＰＡＮ２、ＶＥＰＨ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ９ＡおよびＺＥＢ１遺伝子、および配列番号１〜１３の配列を有するプローブと特異的にハイブリダイズする遺伝子の発現レベルの決定を含んでなり、前記遺伝子の参照値に比べての前記遺伝子の発現レベルの増大は、前記患者が外科的処置後の補助放射線療法もしくは化学療法を受ける候補であることを示し、または前記遺伝子の１以上の参照値に比べての前記遺伝子の発現レベルの減少は、前記患者が外科的処置後の放射線療法もしくは化学療法を受ける候補ではないことを示す。
【０１０７】
用語「特異的にハイブリダイズする」は、本発明で用いる場合、高ストリンジェント条件または中ストリンジェント条件下で２つのポリヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを可能とする条件を意味する。「高ストリンジェント条件」および「中ストリンジェント条件」という表現は、以下で本発明のキットに関して定義され、本方法に関して等しく適用可能である。
【０１０８】
本発明の第１の個別化治療法に使用される種々の遺伝子の発現レベルは、前記遺伝子によりコードされているｍＲＮＡのレベルを決定することにより、または前記遺伝子によりコードされているポリペプチドのレベルを決定することによって決定することができる。
【０１０９】
第２の工程において、本発明による第１の個別化治療法は、前記遺伝子の参照値に比べて前記遺伝子の発現レベルの増大を示す患者を、外科的処置後の補助放射線療法もしくは化学療法を受ける候補と特定し、または参照値に比べて前記遺伝子の発現レベルの減少を示す患者を、手術後の放射線療法もしくは化学療法を受ける候補ではない患者として特定することを含んでなる。
【０１１０】
用語「手術」は、本発明で用いる場合、治療または矯正をもたらすためのヒトまたは他の哺乳動物の身体に対する手または器具を使った手の方法論的行為を含むいずれの治療的手法も意味する。
【０１１１】
本発明で用いる場合、用語「化学療法」、「化学療法薬」は、広義には、癌、腫瘍または悪性新生物の処置のための、細胞傷害薬または細胞増殖抑制薬の療法を含む化学的薬物またはそれらの組合せの使用を意味する。本発明に従い得る化学療法薬の例としては、
・アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イフォスファミド、ストレプトゾシン、カルムスチン、ロムスチン、メルファラン、ブスルファン、ダカルバジン、テモゾロミド、チオテパまたはアルトレタミン）；
・白金薬（例えば、シスプラチン、カルボプラチンまたはオキサリプラチン）；
・代謝拮抗薬（例えば、５−フルオロウラシル、カペシタビン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン、フルダラビンまたはペメトレキセド）；
抗腫瘍抗生物質（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、アクチノマイシン−Ｄ、ブレオマイシン、マイトマイシン−Ｃまたはミトキサントロン）；
・有糸分裂阻害剤（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、イキサベピロン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ビンデシンまたはエストラムスチン）；および
・トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシド、テニポシド、トポテカン、イリノテカン、ジフロモテカンまたはエロモテカン）
が挙げられる。
【０１１２】
用語「放射線療法」は、内部および外部照射療法または放射免疫治療を含む多種の放射線療法、ならびにＸ線、γ線、α粒子、β粒子、光子、電子、中性子、放射性同位元素、および他の形態の電磁放射線を含む様々な種類の放射線の使用を意味して、当技術分野で慣用される用語である。
【０１１３】
好ましい実施形態では、療法は術前補助療法または補助化学療法である。
【０１１４】
用語「術前補助療法」は、本発明で用いる場合、癌に罹患している患者において、原発腫瘍の外科的切除の前に施される任意のタイプの癌処置を意味する。術前補助療法の最も一般的な理由は、より効果的な手術を助長するために腫瘍のサイズを縮小することである。術前補助療法は、放射線療法、ならびにホルモン療法、化学療法、免疫療法およびモノクローナル抗体療法などの療法、好ましくは、全身療法を含んでなる。
【０１１５】
用語「補助療法」は、本明細書において、転移のリスクおよび／または再発の可能性のある癌に罹患している患者において、通常は原発腫瘍の外科的切除後に付加的処置として施される任意のタイプの癌処置（例えば、化学療法または放射線療法）を意味する。このような補助療法の目的は、予後を改善することである。補助療法は、放射線療法、ならびにホルモン療法、化学療法、免疫療法およびモノクローナル抗体療法などの療法、好ましくは、全身療法を含んでなる。
【０１１６】
好ましい実施形態では、化学療法は、１以上のＴＧＦ−β阻害剤の使用を含んでなる。
【０１１７】
本発明において「ＴＧＦβ阻害剤」は、ＴＧＦβとその受容体との間の相互作用により引き起こされるシグナル伝達を妨げることができる任意の化合物として理解される。本発明に従って使用可能なＴＧＦβ１阻害剤としては、ＴＧＦβのその受容体への競合的またはアロステリック的結合を妨げる化合物、ＴＧＦβに結合する化合物およびＴＧＦβの細胞内シグナル伝達を阻害する化合物が含まれる。ＴＧＦβ阻害剤の阻害能を決定するために適切なアッセイとしては、Ｍｖ−１−Ｌｕ細胞増殖アッセイにおいて阻害剤を使用することによるＴＧＦβ生物活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ阻害、ならびにＣＣｌ４により誘発される急性肝臓傷害のモデル（ＷＯ２００５１９２４４号に開示）を用いた阻害剤によるＴＧＦβ生物活性のｉｎ  ｖｉｖｏ阻害が含まれる。ＴＧＦ−βアンタゴニストに関してより詳しくは、Wojtowicz-Praga (2003)も参照。
【０１１８】
本発明における使用に好適なＴＧＦβ阻害剤としては、限定されるものではないが、以下のものが挙げられる。
・ＴＧＦβと本来結合し阻害する可溶性タンパク質（ＬＡＰ、デコリン、フィブロモジュリン、ルミカン、エンドグリン、α２−マクログロブリン）。
・リガンドとの結合をめぐってＴＧＦβ内因性受容体と競合する、ＢＡＭＢＩとしての受容体。本発明では、ＴＧＦβ可溶性受容体は、生理学的にエンドグリンまたはベタグリカン（ＩＩＩ型受容体）のタンパク質分解性プロセシングにより、またはＩ型およびＩＩ型ＴＧＦβ受容体の細胞外ドメインのみを発現させることによる組換え技術により得ることができる、ＴＧＦβ受容体の細胞外ドメインと理解される。
・限定されるものではないが、多重特異性、ポリクローナル、モノクローナル抗体およびそのＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂフラグメント、例えば、ＥＰ１１７５４４号明細書、Ling et al., (J. Amer. Soc. Nephrol. 14: 377-388 (2003)), McCormick et al (J. Immunol., 1999, 163:5693-5699) および Cordeiro (Curr. Opin. MoI. Ther., 2003, 5:199-203)に記載されているものを含む、阻害性抗ＴＧＦβ抗体。
・ＴＧＦβ受容体およびＴＧＦβ受容体可溶性型に特異的なモノクローナルおよびポリクローナル抗体。
・例えば、DaCosta Bayfield (Mol. Pharmacol., 2004, 65:744-52), Laping (Curr. Opin. Pharmacol., 2003, 3:204-8)およびLaping (Mol. Pharmacol., 2002, 62:58-64)に記載されているＴＧＦ−β受容体Ｉ型キナーゼ阻害剤。
・小分子、例えば、トラニラスト（Ｎ−［３，４−ジメトキシシンナモイル］−アントラニル酸）(Wilkenson, K. A. 2000)、ＳＢ−４３１５４２（ＴＧＦ−β受容体ＩＩの阻害剤）；４−（５−ベンゾール［１，３］ジオキソール−５−イル−４−ピリジン(pyrldin)−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−ベンズアミド水和物、４−［４−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−５−（２−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミド水和物、４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミド水和物）；ＮＰＣ−３０３４５（ＴＧＦ−β受容体Ｉの阻害剤）；ＬＹ３６４９４７（ＴＧＦ−β受容体Ｉの阻害剤；４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−キノリン）；Ａ−８３−０１（ＴＧＦ−β受容体Ｉ型の阻害剤；３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１−フェニルチオカルバモイル−４−キノリン−４−イルピラゾール）；ＬＹ２１５７２９９（ＴＧＦ−β受容体Ｉ型の阻害剤；Lilly Research）；ＬＹ５５０４１０（ＴＧＦ−β受容体Ｉ型の阻害剤；Lilly Research）；ＬＹ５８０２７６（ＴＧＦ−β受容体Ｉ型の阻害剤；Lilly Research）；ＬＹ５６６５７８（ＴＧＦ−β受容体Ｉ型の阻害剤；Lilly Research）；ＳＢ−５０５１２４（ＴＧＦ−β受容体Ｉ型の選択的阻害剤；２−（５−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−２−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジン塩酸塩）；ＳＤ−０９３（ＴＧＦ−β受容体Ｉ型の阻害剤；Scios Inc）；またはＳＤ−２０８（ＴＧＦ−β受容体Ｉ型の阻害剤）。
・Mittl (1996)に公開されているようなＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２またはＴＧＦ−β３の一部であるペプチド。
・ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２またはＴＧＦ−β３ペプチドの末端から数えて１１２個のアミノ酸を含んでなるペプチド。これらのペプチドの開始部はＲＸＸＲモチーフの後にあり、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２またはＴＧＦ−β３ペプチドの末端までの１１３個のアミノ酸で終わり、ここで、Ｒはアミノ酸アルギニンであり、ＸＸは任意のアミノ酸を表すか、またはアミノ酸無しであってもよい。
・ＴＧＦ−β特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ。
【０１１９】
他の好適なＴＧＦ−β阻害剤は、Kelly and Morris  (J. Immunotoxicol., 2010, 7: 15-26)に示されているように、表２に定義されているものである。
【０１２０】
【表２】
2015500010.tif 000003
【０１２１】
好ましい実施形態では、療法は、術前補助化学療法または補助化学療法である。
【０１２２】
用語「術前補助療法」は、本発明で用いる場合、癌に罹患している患者において原発腫瘍の外科的切除前に施される任意のタイプの癌処置を意味する。術前補助療法の最も一般的な理由は、より効果的な手術を助長するために腫瘍のサイズを縮小することである。術前補助療法は、放射線療法、ならびにホルモン療法、化学療法、免疫療法およびモノクローナル抗体療法などの療法、好ましくは、全身療法を含んでなる。
【０１２３】
用語「補助療法」は、本発明で用いる場合、転移のリスクおよび／または再発の可能性のある癌に罹患している患者において、通常は原発腫瘍の外科的切除後に付加的処置として施される任意のタイプの癌処置（例えば、化学療法または放射線療法）を意味する。このような補助療法の目的は、予後を改善することである。補助療法は、放射線療法、ならびにホルモン療法、化学療法、免疫療法およびモノクローナル抗体療法などの療法、好ましくは、全身療法を含んでなる。
【０１２４】
別の態様において、本発明は、結腸直腸癌の外科的切除後の補助療法から利益を受ける可能性のある患者を選択するための方法（以下、「本発明の第２の個別化治療法」）であって、前記患者由来のサンプルにおけるＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＣＤＫＮ２ＢおよびＦＬＴ１の発現レベルの決定を含んでなる方法に関し、ここで、前記遺伝子の参照値に比べての前記遺伝子の発現レベルの増大は、前記患者が外科的処置後の療法から利益を受ける可能性があることを示し、または前記遺伝子の参照値に比べての前記遺伝子の発現レベルの減少は、前記患者が外科的処置後の療法から利益を受ける可能性がありことを示す。
【０１２５】
本発明で用いる場合、用語「処置」または「療法」は区別無く使用することができ、疾患もしくは障害、または再発性の疾患もしくは障害の１以上の症状を予防する、治癒させる、遅延させる、その重篤度を軽減する、または改善することを試みる、あるいは患者の生存をこのような処置の不在下で予想される期間を超えて延長するための、臨床介入を意味する。
【０１２６】
用語「結腸直腸癌」は、本発明の予後法に関して詳細に記載されており、本発明による個別化方法に関しても同じ意味で使用される。
【０１２７】
第１の工程において、本発明による第２の個別化治療法は、前記患者由来のサンプルにおけるＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＣＤＫＮ２ＢおよびＦＬＴ１遺伝子の発現レベルの決定を含んでなる。
【０１２８】
用語「結腸直腸癌」、「患者」、「ＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３遺伝子」、「ＣＤＫＮ２Ｂ遺伝子」、「ＦＬＴ１遺伝子」、「発現レベル」、「サンプル」、および「療法」は上記で詳細に記載されており、本方法による方法に等しく適用される。
【０１２９】
さらに別の好ましい方法では、本発明による第２の個別化治療法は、ＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＣＤＫＮ２ＢおよびＦＬＴ１遺伝子の発現レベルの決定に加えて、ＦＲＭＤ６、ＩＧＦＢＰ３、ＥＳＭ１、ＦＧＦ１、ＧＥＭ、ＭＥＸ３Ｂ、ＷＮＴ２、ＮＧＦ、ＭＳＣ、ＳＥＴＢＰ１、ＦＬＪ１０３５７、ＤＡＣＴ、ＭＵＲＣおよびＣｏｌ１０Ａ１からなる群から選択される１以上の遺伝子の発現レベルの決定をさらに含んでなり、ここで、前記遺伝子の１以上の参照値に比べての前記遺伝子の１以上の発現レベルの増大は、前記患者が外科的処置後の補助療法を受ける候補であることを示し、前記遺伝子の１以上の参照値に比べての前記遺伝子の発現レベルの減少は、前記患者が外科的処置後の放射線療法または化学療法を受ける候補ではないことを示す。
【０１３０】
好ましい実施形態では、本発明による第２の個別化治療法は、遺伝子ＣＤＫＮ２Ｂ、ＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＦＬＴ１、ＦＲＭＤ６、ＩＧＦＢＰ３およびＥＳＭ１の発現レベルの決定を含んでなり、前記決定は、病期ＩＩ結腸直腸癌に罹患している患者由来のサンプルで行われる。
【０１３１】
別の好ましい実施形態では、本発明による第２の個別化治療法は、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＦＬＴ１、ＦＧＦ１、ＧＥＭ、およびＭＥＸ３Ｂ遺伝子のレベルの決定を含んでなり、前記決定は、病期ＩＩＩ結腸直腸癌に罹患している患者において行われる。
【０１３２】
これらの各遺伝子に関する用語は上記で詳細に記載され、本方法による方法に等しく適用される。
【０１３３】
さらに別の実施形態では、本発明による第２の個別化治療法は、表１に示される、ＣＡＦ富化対ＥＰＣＡＭ＋欄に２より高いＦＣ値を有する遺伝子の発現レベルの決定を含んでなり、前記遺伝子の参照値に比べての前記遺伝子の発現レベルの増大は、前記患者が外科的処置後の療法から利益を受ける可能性があることを示し、または前記遺伝子の参照値に比べての前記遺伝子の発現レベルの減少は、前記患者が外科的処置後の療法から利益を受ける可能性がないことを示す。
【０１３４】
よって、別の実施形態では、本発明による第２の個別化治療法は、ＡＮＧＰＴＬ２、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＰＢＢ２、ＢＭＰＲ２、ＢＰＧＭ、Ｃ１３ｏｒｆ３３、Ｃ５ｏｒｆ１３、ＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＣＡＣＨＤ１、ＣＡＬＤ１、ＣＤＨ６、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＩＬＰ、ＣＮＴＮ１、ＣＯＬ１０Ａ１、ＣＯＬ１２Ａ１、ＣＯＬ２７Ａ１、ＤＡＣＴ１、ＤＩＸＤＣ１、ＤＮＡＪＢ５、ＤＮＡＪＣ１８、ＥＬＴＤ１、ＥＰＨＡ４、ＥＳＭ１、ＦＡＰ、ＦＧＤ６、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＬＪ１０３５７、ＦＬＴ−１、ＦＮ１、ＦＲＭＤ４Ａ、ＦＲＭＤ６、ＧＡＳ１、ＧＥＭ、ＧＦＰＴ２、ＧＰＲ１６１、ＨＡＳ２、ＨＥＹ１、ＨＩＣ１、ＨＳ３ＳＴ３Ａ１、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ７、ＩＬ１１、ＩＮＨＢＡ、ＫＡＬ１、ＫＩＡＡ１７５５、ＫＬＦ７、ＬＡＲＰ６、ＬＭＣＤ１、ＬＭＯ４、ＬＯＣ１００１２８１７８、ＬＯＣ６４４２４２、ＬＯＣ７２８２６４、ＬＯＨ３ＣＲ２Ａ、ＬＲＲＣ８Ａ、ＭＥＯＸ１、ＭＥＸ３Ｂ、ＭＦＡＰ２、ＭＧＣ１６１２１、ＭＳＣ、ＭＵＲＣ、ＮＥＤＤ９、ＮＧＦ、ＮＯＸ４、ＮＰＲ２、ＮＵＡＫ１、ＯＳＧＩＮ２、ＰＡＬＬＤ、ＰＡＬＭ２、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＣ、ＰＤＬＩＭ４、ＰＤＰＮ、ＰＧＭ２Ｌ１、ＰＫＮＯＸ２、ＰＭＥＰＡ１、ＰＯＤＸＬ、ＰＰＭ１Ｅ、ＰＴＨＬＨ、ＲＡＳＤ１、ＲＡＳＧＲＰ３、ＲＡＳＬ１２、ＲＧＳ４、ＲＮＦ１５０、ＲＵＮＸ１、Ｓ１ＰＲ５、ＳＥＭＡ６Ｄ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＥＴＢＰ１、ＳＨＩＳＡ２、ＳＬＣ４６Ａ３、ＳＮＣＡＩＰ、ＳＮＯＲＤ１１４−３、ＳＯＸ６、ＳＰＳＢ１、ＳＴＫ３８Ｌ、ＳＹＮＥ１、ＳＹＴＬ４、ＴＣＦ４、ＴＧＦＢ２、ＴＩＭＰ３、ＴＭＥＭ８８、ＴＮＣ、ＴＮＳ１、ＴＰＭ１、ＴＳＨＺ３、ＴＳＰＡＮ２、ＶＥＰＨ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ９ＡおよびＺＥＢ１遺伝子、ならびに配列番号１〜１３の配列を有するプローブと特異的にハイブリダイズする遺伝子の発現レベルの決定をさらに含んでなり、ここで、前記遺伝子の参照値に比べての前記遺伝子の発現レベルの増大は、前記患者が外科的処置後の療法から利益を受ける可能性があることを示し、または前記遺伝子の参照値に比べての前記遺伝子の発現レベルの減少は、前記患者が外科的処置後の療法から利益を受ける可能性がないことを示す。
【０１３５】
用語「特異的にハイブリダイズする」は、本発明で用いる場合、高ストリンジェント条件または中ストリンジェント条件下で２つのポリヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを可能とする条件を意味する。「高ストリンジェント条件」および「中ストリンジェント条件」という表現は、本発明のキットに関して以下に定義され、本方法に関して等しく適用可能である。
【０１３６】
本発明の第２の個別化治療法に使用される種々の遺伝子の発現レベルは、前記遺伝子によりコードされるｍＲＮＡのレベルを決定することにより、または前記遺伝子によりコードされているポリペプチドのレベルを決定することによって決定することができる。
【０１３７】
第２の工程において、本発明による個別化治療法は、前記遺伝子の参照値に比べて前記遺伝子の発現レベルの増大を示す患者を、外科的処置後の療法から利益を受ける可能性のある患者と特定し、または前記遺伝子の参照値に比べて前記遺伝子の発現レベルの減少を示す患者を、外科的処置後の療法から利益を受ける可能性がない患者として特定することを含んでなる。
【０１３８】
用語「利益」は、患者の病態を改善することを意味する。有益なまたは所望の臨床結果としては、限定されるものではないが、検出可能なものと検出可能でないものの両方の、症状の解除、疾患期間の短縮、病的状態の安定化（特に、非悪化）、疾患の進行の緩徐化、病的状態の改善、処置が適用されない場合に予想される生存期間に比べての生存期間の延長、および緩解（部分的および完全の両方）が含まれる。
【０１３９】
特定の実施形態では、患者が候補となるまたはならない外科的処置後の療法は、化学療法、放射線療法および／またはＴＧＦ−β阻害剤を含んでなる療法からなる群から選択される療法である。
【０１４０】
用語「手術」または「外科的処置」、「化学療法」、「化学療法薬」、「放射線療法」、および「ＴＧＦ−β阻害剤を含んでなる療法」は上記に詳細に記載されており、本方法による方法に等しく適用される。
【０１４１】
ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３の発現レベルに基づく個別化医療
さらに別の態様では、本発明は、患者において結腸直腸癌の好適な処置を選択するための方法（以下、「本発明の第３の個別化治療法」）であって、前記患者由来のサンプルにおけるＴＧＦ−β２および／またはＴＧＦ−β３遺伝子の発現レベルの決定を含んでなる方法に関し、ここで、前記遺伝子の参照値に比べての前記１または複数の遺伝子の発現レベルの増大は、前記患者が外科的処置後の補助放射線療法もしくは化学療法を受ける候補であることを示し、または各遺伝子の参照値に比べての前記１または複数の遺伝子の発現レベルの減少は、前記患者が外科的処置後の補助放射線療法もしくは化学療法を受ける候補ではないことを示す。
【０１４２】
用語「処置を選択する」、「結腸直腸癌」、「サンプル」、「患者」、「ＴＧＦ−β２」、「ＴＧＦ−β３」、「発現レベルの増大」、「補助療法」、「放射線療法」、「化学療法」は上記に本発明による予後法および個別化に関して記載されており、本方法に等しく適用される。
【０１４３】
好ましい実施形態では、本発明による第３の個別化治療法は、患者が化学療法または放射線療法を受ける候補であるかどうかを決定するために行われる。さらに別の実施形態では、化学療法は、上記のようにＴＧＦ−β阻害剤の使用に基づく。
【０１４４】
好ましい実施形態では、本発明による第３の個別化治療法は、患者の腫瘍病期を決定することをさらに含んでなり、高い腫瘍病期は、前記患者が外科的処置後の補助放射線療法もしくは化学療法を受ける候補であることを示し、または低い腫瘍病期は、前記患者が低い再発リスクを呈することを示す。
【０１４５】
さらに別の実施形態では、本発明による第３の個別化治療法は、結腸直腸癌が病期ＩＩまたは病期ＩＩＩの結腸直腸腫瘍である患者において行われる。
【０１４６】
さらに別の実施形態では、ＴＧＦ−β２および／またはＴＧＦ−β３遺伝子の発現レベルは、前記遺伝子のｍＲＮＡレベルを決定することにより決定される。さらにより好ましい実施形態では、ｍＲＮＡレベルの決定はＲＴ−ＰＣＲにより行われる。別の実施形態では、ＴＧＦ−β２および／またはＴＧＦ−β３遺伝子の発現レベルの決定は、前記遺伝子によりコードされるタンパク質のレベルを決定することにより行われる。
【０１４７】
別の実施形態では、前記遺伝子の発現レベルの決定が行われるサンプルは、腫瘍生検または体液からなる群から選択される。サンプルが体液である、さらにより好ましい実施形態では、体液は血液、血漿および血清からなる群から選択される。
【０１４８】
さらに別の実施形態では、化学療法はＴＧＦ−β阻害剤に基づく。用語「ＴＧＦ−β阻害剤」は上記に定義されている。
【０１４９】
本発明の個別化療法
上記で定義した予後法および個別化治療法はまた、結腸直腸癌に罹患している患者に個別化療法を提供することを可能とする。特に、高い再発リスクを有すると見なされる患者は、手術後の付加的療法から利益を得る可能性が最も高い。逆に、低い再発リスクを示す患者は、手術後の付加的治療処置をなしで済ますことができる。
【０１５０】
よって、別の態様において、本発明は、癌の外科的除去後に患者の結腸直腸癌の処置に使用するための療法に関し、この場合、患者は、本発明の第１、第２または第３の個別化治療法により選択される。
【０１５１】
特定の実施形態では、療法は、化学療法、放射線療法および／またはＴＧＦ−β阻害剤を含んでなる療法からなる群から選択される。
【０１５２】
用語「療法」、「処置」、「結腸直腸癌」、「患者」、「放射線療法」、「手術」または「外科的処置」、「化学療法」、「化学療法薬」、「放射線療法」、および「ＴＧＦ−β阻害剤を含んでなる療法」は上記に詳細に記載されており、本発明の個別化療法にも等しく適用される。
【０１５３】
本発明のキット
別の実施形態では、本発明は、Ｆ−ＴＢＲＳサイン、Ｆ−ＴＢＲＳに由来するミニサインを形成する遺伝子の発現レベルまたはＴＧＦ−β２および／もしくはＴＧＦ−β３の発現レベルの決定に有用なキットに関する。よって、好ましい実施形態では、本発明のキットは、ＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＣＤＫＮ２ＢおよびＦＬＴ１遺伝子の発現レベルの決定に十分な試薬を含んでなる。
【０１５４】
別の実施形態では、本発明のキットは、ＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＦＬＴ１遺伝子、ならびにＦＲＭＤ６、ＩＧＦＢＰ３、ＥＳＭ１、ＦＧＦ１、ＧＥＭ、ＭＥＸ３Ｂ、ＷＮＴ２、ＮＧＦ、ＭＳＣ、ＳＥＴＢＰ１、ＦＬＪ１０３５７、ＤＡＣＴ、ＭＵＲＣおよびＣｏｌ１０Ａ１遺伝子からなる群から選択される１以上の付加的遺伝子の発現レベルの決定に十分な試薬を含んでなる。
【０１５５】
別の実施形態では、本発明によるキットは、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＦＬＴ１、ＦＲＭＤ６、ＩＧＦＢＰ３およびＥＳＭ１遺伝子の発現レベルの決定に十分な試薬を含んでなる。
【０１５６】
別の実施形態では、本発明によるキットは、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＦＬＴ１、ＦＧＦ１、ＧＥＭ、およびＭＥＸ３Ｂ遺伝子の発現レベルの決定に十分な試薬を含んでなる。
【０１５７】
別の実施形態では、本発明によるキットは、表１に示される、癌関連線維芽細胞が富化された細胞集団（富化ＣＡＦ）とＥＰＣＡＭ＋との間で差次的に発現され、かつ、前記第１の細胞集団において少なくとも２倍の増加を有する遺伝子の１以上の発現レベルの決定に十分な試薬をさらに含んでなる。
【０１５８】
別の実施形態では、前記キットは、ＡＮＧＰＴＬ２、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＰＢＢ２、ＢＭＰＲ２、ＢＰＧＭ、Ｃ１３ｏｒｆ３３、Ｃ５ｏｒｆ１３、ＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＣＡＣＨＤ１、ＣＡＬＤ１、ＣＤＨ６、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＩＬＰ、ＣＮＴＮ１、ＣＯＬ１０Ａ１、ＣＯＬ１２Ａ１、ＣＯＬ２７Ａ１、ＤＡＣＴ１、ＤＩＸＤＣ１、ＤＮＡＪＢ５、ＤＮＡＪＣ１８、ＥＬＴＤ１、ＥＰＨＡ４、ＥＳＭ１、ＦＡＰ、ＦＧＤ６、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＬＪ１０３５７、ＦＬＴ−１、ＦＮ１、ＦＲＭＤ４Ａ、ＦＲＭＤ６、ＧＡＳ１、ＧＥＭ、ＧＦＰＴ２、ＧＰＲ１６１、ＨＡＳ２、ＨＥＹ１、ＨＩＣ１、ＨＳ３ＳＴ３Ａ１、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ７、ＩＬ１１、ＩＮＨＢＡ、ＫＡＬ１、ＫＩＡＡ１７５５、ＫＬＦ７、ＬＡＲＰ６、ＬＭＣＤ１、ＬＭＯ４、ＬＯＣ１００１２８１７８、ＬＯＣ６４４２４２、ＬＯＣ７２８２６４、ＬＯＨ３ＣＲ２Ａ、ＬＲＲＣ８Ａ、ＭＥＯＸ１、ＭＥＸ３Ｂ、ＭＦＡＰ２、ＭＧＣ１６１２１、ＭＳＣ、ＭＵＲＣ、ＮＥＤＤ９、ＮＧＦ、ＮＯＸ４、ＮＰＲ２、ＮＵＡＫ１、ＯＳＧＩＮ２、ＰＡＬＬＤ、ＰＡＬＭ２、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＣ、ＰＤＬＩＭ４、ＰＤＰＮ、ＰＧＭ２Ｌ１、ＰＫＮＯＸ２、ＰＭＥＰＡ１、ＰＯＤＸＬ、ＰＰＭ１Ｅ、ＰＴＨＬＨ、ＲＡＳＤ１、ＲＡＳＧＲＰ３、ＲＡＳＬ１２、ＲＧＳ４、ＲＮＦ１５０、ＲＵＮＸ１、Ｓ１ＰＲ５、ＳＥＭＡ６Ｄ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＥＴＢＰ１、ＳＨＩＳＡ２、ＳＬＣ４６Ａ３、ＳＮＣＡＩＰ、ＳＮＯＲＤ１１４−３、ＳＯＸ６、ＳＰＳＢ１、ＳＴＫ３８Ｌ、ＳＹＮＥ１、ＳＹＴＬ４、ＴＣＦ４、ＴＧＦＢ２、ＴＩＭＰ３、ＴＭＥＭ８８、ＴＮＣ、ＴＮＳ１、ＴＰＭ１、ＴＳＨＺ３、ＴＳＰＡＮ２、ＶＥＰＨ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ９ＡおよびＺＥＢ１遺伝子、ならびに配列番号１〜１３の配列を有するプローブと特異的にハイブリダイズする遺伝子の発現レベルの決定に十分な試薬を含んでなる。
【０１５９】
さらに別の実施形態では、本発明のキットは、ＴＧＦ−β２および／またはＴＧＦ−β３遺伝子の発現レベルの決定に十分な試薬を含んでなる。
【０１６０】
好ましい実施形態では、１以上の遺伝子の発現レベルの決定に十分な試薬は、そのキットを形成する遺伝子の発現レベルの決定に十分な試薬の総量の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％を占める。よって、ＮＰＲ３／Ｃ５ＯＲＦ２３、ＣＤＫＮ２ＢおよびＦＬＴ１遺伝子の発現レベルの決定のための試薬を含んでなるキットの特定の場合では、前記遺伝子に特異的な試薬（例えば、ＮＰＲ３／Ｃ５ＯＲＦ２３遺伝子、ＣＤＫＮ２ＢおよびＦＬＴ１遺伝子とストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができるプローブ）は、そのキット中に存在するプローブの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％を占める。
【０１６１】
さらなる実施形態では、１以上の遺伝子の発現レベルの決定に十分な試薬は、そのキットを形成する試薬の総量の少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を占める。
【０１６２】
本発明に関して、「キット」は、輸送および保存を可能とするために梱包された、本発明の方法を実施するのに必要な種々の試薬を含有する製品と理解される。キットの成分を梱包するのに好適な材料としては、水晶、プラスチック（ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネートなど）、ボトル、バイアル、紙、エンベロープなどが含まれる。さらに、本発明のキットは、キット内にある種々の成分の同時、逐次または個別使用に関する説明書を含み得る。前記説明書は、印刷文書の形態であっても、または電子保存媒体（磁気ディスク、テープなど）、光媒体（ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ）など、被験体により読み取りが可能であるような、説明書を保存することができる電子支援の形態であってもよい。加えて、またはその代わりに、媒体は、前記説明書を提供するインターネットアドレスを含むこともできる。
【０１６３】
「遺伝子の発現レベルの決定を可能とする試薬」という表現は、ｍＲＮＡレベルの決定の手段によるか、またはタンパク質レベルの決定の手段によるかの両方で、遺伝子の発現レベルの決定を可能とする化合物または化合物セットを意味する。よって、第１のタイプの試薬は、前記遺伝子によりコードされているｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるプローブを含む。第２のタイプの試薬は、マーカー遺伝子によりコードされているタンパク質と特異的に結合する化合物を含み、特異的アプタマーであってもよいが、好ましくは抗体を含む。
【０１６４】
本発明のキットの特定の実施形態では、キットの試薬は、上述の遺伝子のｍＲＮＡレベルおよび／または上述の遺伝子の１以上によりコードされているタンパク質のレベルを特異的に検出することができる核酸である。上述の遺伝子と特異的にハイブリダイズすることができる核酸は、前記遺伝子のｍＲＮＡ（またはそれらの対応するｃＤＮＡ）のフラグメントの特異的増幅のための１対以上のプライマーオリゴヌクレオチドであり得る。
【０１６５】
好ましい実施形態では、本発明のキットの第１の成分は、上述の遺伝子と特異的にハイブリダイズすることができるプローブを含んでなる。
【０１６６】
用語「特異的にハイブリダイズする」は、本発明で用いる場合、高ストリンジェント条件または中ストリンジェント条件下で２つのポリヌクレオチドのハイブリダイズを可能とする条件と意味する。
【０１６７】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者ならば容易に決定することができ、一般に、プローブ長、洗浄温度、および塩濃度に応じた経験的計算である。一般に、長いプローブほど適切なアニーリングに高温を要し、短いプローブほど低温を要する。ハイブリダイゼーションは一般に、相補鎖がそれらの融点よりも低い環境に存在する場合の、変性したＤＮＡの再アニーリング能に依存する。プローブとハイブリダイズ可能配列との間に望まれる相同性の程度が高いほど、使用可能な相対温度は高くなく。結果として、相対温度が高いほど反応条件をよりストリンジェントとする傾向があり、温度が低いほどストリンジェンシーは小さくなるということになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーについてのさらなる詳細および説明としては、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照。
【０１６８】
「ストリンジェント条件」または「高ストリンジェンシー条件」は、本明細書で定義される場合、一般に、（１）洗浄に低いイオン強度および高温、例えば、５０℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを用い；（２）ハイブリダイゼーション中に、４２℃で、変性剤、例えば、ホルムアミド、例えば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドを、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５、７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム含有）とともに用い；または（３）４２℃で、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、音波処理済みサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％デキストラン硫酸を用い、４２℃、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５０％ホルムアミド中で洗浄した後、５５℃、ＥＤＴＡ含有０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄を行う。
【０１６９】
「中ストリンジェント条件」は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989に記載の通りに特定することができ、上記のものより低いストリンジェントの洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度および％ＳＤＳ）の使用を含む。中ストリンジェント条件の一例は、３７℃、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％デキストラン硫酸、および２０ｍｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含んでなる溶液中での一晩のインキュベーションと、その後の約３７〜５０℃、１×ＳＳＣ中でのフィルターの洗浄である。当業者ならば、プローブ長などの因子を適合させるために必要に応じて温度、イオン強度などをどのように調整すればよいかを認識している。
【０１７０】
本発明において同定する複数の遺伝子の発現レベルを同時に決定する場合、その発現をマイクロアレイハイブリダイゼーションで決定する総ての遺伝子のプローブを含むことが有用である。
【０１７１】
マイクロアレイは、支持体（例えば、バイオチップ）に空間的に分布させ、安定に結合させた複数の核酸を含んでなる。これらの核酸は、発現を検出する遺伝子の特定の部分配列に相補的な配列を有し、従って、前記核酸とハイブリダイズすることができる。本発明の方法において、核酸アレイを含んでなるマイクロアレイを、試験対象の患者から単離した核酸調製物と接触させる。ハイブリダイゼーションに好適な条件で、マイクロアレイと核酸調製物とのインキュベーションを行う。次に、支持体に保持されなかった核酸を排出した後、ハイブリダイゼーションパターンを検出し、これらは分析サンプルの遺伝学的プロフィールに関する情報を提供する。これらのマイクロアレイは、サンプル中に存在する核酸の定性的および定量的両方の情報を提供することができるが、本発明は、定量的情報を提供することができるアレイおよび方法論の使用を必要とする。
【０１７２】
本発明は、プローブのタイプに関して、また、使用する支持体のタイプに関して様々なアレイを企図する。アレイに含まれる、核酸とハイブリダイズすることができるプローブは、ハイブリダイゼーション能を維持する核酸またはそれらの類似体、例えば、ホスホジエステル結合がホスホロチオエート、メチルイミン、メチルホスホネート、ホスホルアミダート、グアニジン結合などで置換されている核酸、ヌクレオチドのリボースが別のヘキソースで置換されている核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）であり得る。プローブ長は、５〜５０ヌクレオチド、好ましくは、７、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、１００ヌクレオチドであり得、１０〜１０００ヌクレオチドの範囲、好ましくは１５〜１５０ヌクレオチドの範囲、より好ましくは１５〜１００ヌクレオチドの範囲で可変であり、一本鎖核酸であっても二本鎖核酸であってもよい。アレイは、ある特定の長さのある特定のｍＲＮＡの特異的プローブを総て含むこともできるし、またはｍＲＮＡの異なる領域から選択されたプローブを含むこともできる。各プローブは、荷電塩基を、好ましくはプローブの中央部分に有するプローブを用いて並行アッセイを行う。アレイを、アレイのプローブに相補的な配列を有する核酸を含有するサンプルと接触させ、各プローブとの、および対応するハイブリダイゼーション対照とのハイブリダイゼーションシグナルを決定する。プローブとそのハイブリダイゼーション対照のハイブリダイゼーションシグナル間に大きな違いが見られるプローブを選択する。最適化プロセスは、ハイブリダイゼーションアレイを、そのアレイのプローブに相補的な配列を含まないサンプルとハイブリダイズさせる第２ラウンドの最適化を含むことができる。この第２ラウンドの選択の後、閾値レベルよりも低いハイブリダイゼーションシグナルを有するプローブが選択される。従って、両方の制御を通過する、すなわち、最小レベルの非特異的ハイブリダイゼーションを示し、かつ、標的核酸と最大レベルの特異的ハイブリダイゼーションを示すプローブが選択される。
【０１７３】
種々の標的遺伝子に特異的なプローブの選択は、それらが標的核酸と特異的に結合し、無関連の遺伝子とは最小のハイブリダイゼーションとなるように行う。しかしながら、２０ヌクレオチドのプローブも存在し、これらは特定のｍＲＮＡにユニークなものではない。従って、前記配列に対するプローブは、無関連の遺伝子のｍＲＮＡに見られるものと同一の配列と交差ハイブリダイゼーションを示すことになる。さらに、使用する条件では標的遺伝子と特異的にハイブリダイズしないプローブも存在する（二次構造またはアレイの基質との相互作用のため）。このタイプのプローブはアレイに含まれてはならない。従って、当業者ならば、ある特定のアレイに組み込もうとするプローブは、それらをアレイに組み込む前に最適化しなければならないことを見て取るであろう。プローブの最適化は一般に、ある特定の標的ポリヌクレオチドの異なる領域に対する複数のプローブを含有するアレイを作製することによって行われる。このアレイをまず、標的核酸を単離された形態で含有するサンプルと接触させ、次に、核酸の複合体混合物と接触させる。従って、標的核酸と特異性の高いハイブリダイゼーションを示すが、複合体サンプルとのハイブリダイゼーションが高いかまったくハイブリダイズしないプローブが、本発明のアレイへの組み込みのために選択される。さらに、このアレイに、試験しようとする各プローブのハイブリダイゼーション対照を含むことができる。好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーション対照は、プローブの中央領域に変異箇所を含む。試験プローブとそのハイブリダイゼーション対照との間に高レベルのハイブリダイゼーションが見られる場合にが、そのプローブはアレイに含まれない。
【０１７４】
本発明のマイクロアレイは、確定された病態生理学的状況を示す、ポリヌクレオチドに対する特異的プローブを含むだけでなく、一連の対照プローブも含み、これらのプローブは、正規化対照、発現レベル対照およびハイブリダイゼーション対照という３つのタイプであり得る。
【０１７５】
正規化対照は、分析する核酸調製物に加える、標識参照配列に完全に相補的なオリゴヌクレオチドである。ハイブリダイゼーション後に正規化対照から得られるシグナルは、ハイブリダイゼーション条件、マーカー強度、検出効率、および異なるマイクロアレイ間でハイブリダイゼーションシグナルの変動をもたらし得る別の系列の因子における変動の示唆を与える。アレイの残りのプローブから検出されるシグナルは、好ましくは対照プローブにより発せられたシグナルで割って、測定値を正規化する。事実上、いずれのプローブも正規化対照として使用可能である。しかしながら、ハイブリダイゼーション効率は、ヌクレオチド組成およびプローブ長によって変動することが知られている。よって、正規化プローブはアレイ中に存在する残りのプローブを反映する範囲の長さを含むように選択することができるが、好ましい正規化プローブは、アレイ中に存在するプローブの平均長を表すものである。正規化プローブは、アレイ中に存在する残りのプローブの平均ヌクレオチド組成を反映するように設計することができる。限られた数の正規化プローブは好ましくは、それらが適切にハイブリダイズするように、すなわち、それらが二次構造を持たず、かつ、使用するアレイのいずれのプローブとも配列類似性を示さないように選択される。正規化プローブは、アレイのいずれの場所に位置していてもよく、またはアレイの構造に関連するハイブリダイゼーション効率の変動を効率的に制御するためにアレイの複数の場所に位置していてもよい。正規化対照は好ましくは、アレイの隅および／またはアレイの中央に位置する。
【０１７６】
発現対照レベルは、分析するサンプル中で構成的に発現される遺伝子と特異的にハイブリダイズするプローブである。発現レベル対照は、細胞の生理学的状態および代謝活性の対照となるように設計される。発現レベル対照と標的核酸の発現レベルの共分散を調べることで、発現レベルの変動が発現レベルの変化によるものか、または細胞の全体的な転写速度もしくはその全般的代謝活性の変化によるものかが示される。従って、細胞の生存力に不可欠なある種の代謝産物に欠乏がある細胞の場合、対照の発現レベルと同様に標的遺伝子の発現レベルにも減少が見られることが予想される。他方、標的遺伝子と対照遺伝子の発現に関して発現増が見られる場合には、それはおそらく細胞の代謝活性の増加によるものであって、標的遺伝子の発現における差次的増加によるものではない。発現対照として使用するのに好適なプローブは、β−２−ミクログロブリン、ユビキチン、リボゾームタンパク質１８Ｓ、シクロフィリンＡ、トランスフェリン受容体、アクチン、ＧＡＰＤＨ、チロシン３−モノオキシゲナーゼ／トリプトファン５−モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質（ＹＷＨＡＺ）およびβ−アクチンなどの、必須細胞機能を発揮するタンパク質をコードする遺伝子にような構成的に発現される遺伝子に相当する。
【０１７７】
ハイブリダイゼーション対照は、標的遺伝子に対するプローブと発現レベル対照または正規化対照に対するプローブの両方に関するものを含めることができる。エラー対照は、１または数個のヌクレオチドに突然変異を含む、すなわち、ある特定の場所に、標的遺伝子の対応するヌクレオチドとはハイブリダイズしないヌクレオチドを含むこと以外は、標的遺伝子に対するプローブと同一のオリゴヌクレオチドであるプローブである。ハイブリダイゼーション対照は、好適なハイブリダイゼーション条件を適用して、標的遺伝子が特異的プローブとハイブリダイズするが、ハイブリダイゼーション対照とはハイブリダイズしないか、または低い効率でしかハイブリダイズしないように選択される。ハイブリダイゼーション対照は好ましくは、プローブの中央に１または数個の改変部位を含む。従って、ハイブリダイゼーション対照は、サンプルの核酸の、非特異的ハイブリダイゼーションまたは正確な相補配列を含有するものとは異なるプローブへの交差ハイブリダイゼーションの程度に関する示唆を提供する。
【０１７８】
本発明のアレイはまた、選択された対照遺伝子の部分配列に相補的なプローブである増幅対照およびサンプル調製対照も含むことができるが、これは細菌遺伝子に対するプローブなど、試験下の生物サンプル対象には通常見られないためである。ＲＮＡサンプルに、選択された対照プローブとハイブリダイズする既知量の核酸を添加した。前記プローブに対するハイブリダイゼーションの決定は、調製中の核酸の回収程度ならびにサンプルの処理中に核酸に生じた変化の評価を示す。
【０１７９】
ひと度、好適な特異性を示すプローブセットおよび対照プローブセットが得られれば、それらをアレイの既知の場所に配置し、これにより、ハイブリダイゼーション工程および検出工程の後に、ハイブリダイゼーションの陽性シグナルと特定の遺伝子の間の相関を、そのハイブリダイゼーションの陽性シグナルが検出されるアレイの座標から確立することが可能となる。
【０１８０】
マイクロアレイは、フォトリソグラフィーｉｎ  ｓｉｔｕ合成法(Fodor et al., 1991, Science, 767-773)の手段による何千ものオリゴヌクレオチドを備えた高密度アレイであり得る。このタイプのプローブは通常、冗長であり、すなわち、それらは検出する各ｍＲＮＡについて数個のプローブを含む。好ましい実施形態では、アレイは低密度アレイ、または１平方センチメートル当たり１００００未満のプローブを含むＬＤＡである。前記低密度アレイでは、固相支持体（例えば、水晶表面、膜）の異なる場所に異なるプローブをピペットで手作業により適用する。これらのプローブを固定するために使用する支持体は、プラスチック、セラミックス、金属、ゲル、膜、水晶などを含む多様な材料から得ることができる。マイクロアレイは、当業者に公知の任意の方法論を用いて得ることができる。
【０１８１】
ハイブリダイゼーション後、非ハイブリダイズ核酸が検出段階でシグナルを発し得る場合、このような非ハイブリダイズ核酸を除去するために洗浄工程が必要である。洗浄工程は、当業者に公知の方法および溶液を用いて行われる。
【０１８２】
核酸の標識が直接検出できない場合には、アレイに結合した標的核酸を含んでなるマイクロアレイに、検出可能なシグナルを生じる反応を起こすのに必要な系の他の成分を結合させることができる。例えば、標的核酸がビオチンで標識されている場合、このアレイを好適な条件で、蛍光試薬コンジュゲートストレプトアビジンと接触させて、ビオチンとストレプトアビジンの間の結合が生じるようにする。このマイクロアレイを、検出可能なシグナルを生じる系とともにインキュベートした後、このアレイに非特異的に結合した分子を総て除去するために洗浄工程を行う必要がある。洗浄条件は、検出可能なシグナルを生じる、当業者に周知の系に従って、好適な条件を用いて当業者により決定される。
【０１８３】
得られたハイブリダイゼーションパターンはいくつかの異なる方法で可視化または検出することができ、前記検出はマイクロアレイで使用される系のタイプによって決定される。よって、ハイブリダイゼーションパターンの検出は、シンチレーション計数、オートラジオグラフィー、蛍光シグナルの測定、熱量計測定、光シグナルの検出などの手段によって行うことができる。
【０１８４】
ハイブリダイゼーションと、存在し得るその後の洗浄および処理プロセスの後、ハイブリダイゼーションパターンを検出および定量し、それに関して、アレイにおけるハイブリダイゼーションの各点に対応するシグナルを、既知数の末端標識核酸により発せられるシグナルに対応する参照値と比較して、マイクロアレイのある点でハイブリダイズされる各核酸のコピー数の絶対値を得る。
【０１８５】
本発明の遺伝子の発現レベルが、前記１または複数の遺伝子によりコードされている１または複数のポリペプチドのレベルを測定することにより決定される場合、本発明によるキットは、前記１または複数のポリペプチドと特異的に結合することができる試薬を含んでなる。よって、一実施形態では、本発明は、ＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＣＤＫＮ２ＢおよびＦＬＴ１遺伝子によりコードされているポリペプチドに特異的な抗体を含んでなるキットに関する。
【０１８６】
別の実施形態では、本発明のキットは、ＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＦＬＴ１遺伝子に、ならびにＦＲＭＤ６、ＩＧＦＢＰ３、ＥＳＭ１、ＦＧＦ１、ＧＥＭ、ＭＥＸ３Ｂ、ＷＮＴ２、ＮＧＦ、ＭＳＣ、ＳＥＴＢＰ１、ＦＬＪ１０３５７、ＤＡＣＴ、ＭＵＲＣおよびＣｏｌ１０Ａ１遺伝子によりコードされているポリペプチドからなる群から選択される１以上の付加的ポリペプチドに特異的な抗体を含んでなる。
【０１８７】
別の実施形態では、本発明によるキットは、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＦＬＴ１、ＦＲＭＤ６、ＩＧＦＢＰ３およびＥＳＭ１遺伝子に特異的な抗体を含んでなる。
【０１８８】
別の実施形態では、本発明によるキットは、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＦＬＴ１、ＦＧＦ１、ＧＥＭ、およびＭＥＸ３Ｂ遺伝子に特異的な抗体を含んでなる。
【０１８９】
別の実施形態では、本発明によるキットは、表１に示される、癌関連線維芽細胞が富化された細胞集団（富化ＣＡＦ）とＥＰＣＡＭ＋との間に差次的に発現され、かつ、前記第１の細胞集団で少なくとも２倍の増加を有する遺伝子によりコードされているポリペプチドに特異的な抗体をさらに含んでなる。
【０１９０】
別の実施形態では、本発明によるキットは、ＡＮＧＰＴＬ２、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＰＢＢ２、ＢＭＰＲ２、ＢＰＧＭ、Ｃ１３ｏｒｆ３３、Ｃ５ｏｒｆ１３、ＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＣＡＣＨＤ１、ＣＡＬＤ１、ＣＤＨ６、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＩＬＰ、ＣＮＴＮ１、ＣＯＬ１０Ａ１、ＣＯＬ１２Ａ１、ＣＯＬ２７Ａ１、ＤＡＣＴ１、ＤＩＸＤＣ１、ＤＮＡＪＢ５、ＤＮＡＪＣ１８、ＥＬＴＤ１、ＥＰＨＡ４、ＥＳＭ１、ＦＡＰ、ＦＧＤ６、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＬＪ１０３５７、ＦＬＴ−１、ＦＮ１、ＦＲＭＤ４Ａ、ＦＲＭＤ６、ＧＡＳ１、ＧＥＭ、ＧＦＰＴ２、ＧＰＲ１６１、ＨＡＳ２、ＨＥＹ１、ＨＩＣ１、ＨＳ３ＳＴ３Ａ１、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ７、ＩＬ１１、ＩＮＨＢＡ、ＫＡＬ１、ＫＩＡＡ１７５５、ＫＬＦ７、ＬＡＲＰ６、ＬＭＣＤ１、ＬＭＯ４、ＬＯＣ１００１２８１７８、ＬＯＣ６４４２４２、ＬＯＣ７２８２６４、ＬＯＨ３ＣＲ２Ａ、ＬＲＲＣ８Ａ、ＭＥＯＸ１、ＭＥＸ３Ｂ、ＭＦＡＰ２、ＭＧＣ１６１２１、ＭＳＣ、ＭＵＲＣ、ＮＥＤＤ９、ＮＧＦ、ＮＯＸ４、ＮＰＲ２、ＮＵＡＫ１、ＯＳＧＩＮ２、ＰＡＬＬＤ、ＰＡＬＭ２、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＣ、ＰＤＬＩＭ４、ＰＤＰＮ、ＰＧＭ２Ｌ１、ＰＫＮＯＸ２、ＰＭＥＰＡ１、ＰＯＤＸＬ、ＰＰＭ１Ｅ、ＰＴＨＬＨ、ＲＡＳＤ１、ＲＡＳＧＲＰ３、ＲＡＳＬ１２、ＲＧＳ４、ＲＮＦ１５０、ＲＵＮＸ１、Ｓ１ＰＲ５、ＳＥＭＡ６Ｄ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＥＴＢＰ１、ＳＨＩＳＡ２、ＳＬＣ４６Ａ３、ＳＮＣＡＩＰ、ＳＮＯＲＤ１１４−３、ＳＯＸ６、ＳＰＳＢ１、ＳＴＫ３８Ｌ、ＳＹＮＥ１、ＳＹＴＬ４、ＴＣＦ４、ＴＧＦＢ２、ＴＩＭＰ３、ＴＭＥＭ８８、ＴＮＣ、ＴＮＳ１、ＴＰＭ１、ＴＳＨＺ３、ＴＳＰＡＮ２、ＶＥＰＨ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ９ＡおよびＺＥＢ１遺伝子、ならびに配列番号１〜１３の配列を有するプローブと特異的にハイブリダイズする遺伝子によりコードされているポリペプチドに特異的な抗体を含んでなる。
【０１９１】
さらに別の実施形態では、本発明のキットは、ＴＧＦ−β２および／またはＴＧＦ−β３遺伝子に特異的な抗体を含んでなる。
【０１９２】
この目的で、De Wildt et al. (2000) Nat. Biotechnol. 18:989-994; Lueking et al. (1999) Anal. Biochem. 270:103-111; Ge et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28, e3, I-VII; MacBeath and Schreiber (2000) Science 289:1760-1763;ＷＯ０１／４０８０３号およびＷＯ９９／５１７７３Ａ１号に記載されているものなどの抗体のアレイが有用である。アレイの抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを含む、高親和性を有するリガンドと結合することができる任意の免疫薬剤、ならびにＦａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、シングルドメイン抗体またはＤＡＢＳ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなど、抗原結合部位を有する抗体と類似の分子を含む。前記抗体を調製するための技術は当業者に非常によく知られており、Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al, John Wiley & Sons (1992))が記載している方法を含む。
【０１９３】
アレイの抗体は、例えば、市販のロボットシステム（例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃ  ＭｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓまたはＢｉｏｒｏｂｏｔｉｃｓにより作製されたもの）を用いて、高速で適用することができる。アレイの基質はニトロセルロース、プラスチック、水晶であり得、または多孔質材料、例えば、アクリルアミド、アガロースもしくは別のポリマーであり得る。別の実施形態では、アレイフィルターでそれらを培養する手段により本発明のタンパク質を検出するために、特異的抗体を産生する細胞を使用することができる。抗体の発現を誘導した後、それらをフィルターの、産生細胞が位置していたアレイの場所に固定化した。抗体のアレイを標識標的と接触させることができ、標的の固定化抗体への結合レベルを決定することができる。標的が標識されない場合には、サンドイッチ型アッセイを使用することができ、この場合、支持体に固定化されたポリペプチドに結合する、ポリペプチドに特異的な第２の標識抗体が使用される。アレイの各点において、サンプル中に存在するポリペプチドの量の定量値を発現プロフィールとしてデータベースに保存することができる。抗体のアレイは２反復で作製することができ、これらを用いて２つの異なるサンプルの結合プロフィールを比較することができる。
【０１９４】
別の態様において、本発明は、結腸直腸癌に罹患している患者の転帰を予測するため、または結腸直腸癌に罹患している患者が手術後の化学療法または放射線療法の候補であるかどうかを決定するための、本発明のキットの使用に関する。好ましい実施形態では、本発明によるキットの使用は、病期ＩＩまたは病期ＩＩＩ  ＣＲＣに罹患している患者において行われる。
【０１９５】
本発明のさらなる態様
［１］結腸直腸癌に罹患している患者の転帰を予測するため、結腸直腸癌に罹患している患者において好適な処置を選択するため、または結腸直腸癌の外科的切除後の補助療法から利益を受ける可能性のある患者を選択するための方法であって、前記患者由来のサンプルにおける、ＴＧＦ−β２および／またはＴＧＦ−β３遺伝子の発現レベルの決定を含んでなり、
前記１または複数の遺伝子の参照値に比べての前記１または複数の遺伝子の発現レベルの増大が、不良な転帰の見込みの増大、前記患者が外科的処置後の補助療法を受ける候補であること、または前記患者が外科的処置後の補助療法から利益を受ける可能性があることを示し、
各遺伝子の参照値に比べての前記１または複数の遺伝子の発現レベルの減少が、良好な転帰の見込みの増大、前記患者が外科的処置後の補助療法を受ける候補ではないこと、または前記患者が外科的処置後の補助療法から利益を受ける可能性がないことを示す、方法。
【０１９６】
［２］患者の腫瘍病期が付加的に決定され、
高い腫瘍病期が、不良な転帰の見込みの増大、前記患者が外科的処置後の補助療法を受ける候補であること、または前記患者が外科的処置後の療法から利益を受ける可能性があることを示し、
低い腫瘍病期が、良好な転帰の見込みの増大、前記患者が外科的処置後の補助療法を受ける候補であること、または前記患者が外科的処置後の療法から利益を受ける可能性がないことを示す、態様［１］に記載の方法。
【０１９７】
［３］前記療法が化学療法、放射線療法および／またはＴＧＦ−β阻害剤を含んでなる療法からなる群から選択される、態様［１］または［２］のいずれかに記載の方法。
【０１９８】
［４］前記サンプルが腫瘍生検または体液からなる群から選択される、態様［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
【０１９９】
［５］前記体液が血液、血漿および血清からなる群から選択される、態様［４］に記載の方法。
【０２００】
［６］ＴＧＦ−β２および／またはＴＧＦ−β３遺伝子の発現レベルを決定するために十分な試薬と、場合により１以上のハウスキーピング遺伝子の発現レベルの決定のための試薬とを含んでなる、キット。
【０２０１】
［７］結腸直腸癌に罹患している患者の転帰を予測するため、結腸直腸癌に罹患している患者において好適な処置を選択するため、または結腸直腸癌の外科的切除後の補助療法から利益を受ける可能性のある患者を選択するための、態様［６］に記載のキットの使用。
【０２０２】
以下、下記の実施例により本発明を詳細に説明するが、これらの実施例は単に例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０２０３】
材料および方法
臨床材料
ヒト組織サンプルは、スペイン倫理基準に従い腫瘍バンク委員会の承認を受けてデルマール病院の病理部から入手した。本試験はヘルシンキ宣言のガイドラインに従い、本試験に関しては病理検体の患者の識別は匿名を維持した。ヒト結腸正常線維芽細胞（ＣＣＤ−１８Ｃｏ）はＡＴＣＣから入手し、試験までに１０代未満の培養とした。
【０２０４】
ｐ−Ｓｍａｄ３染色に従う腫瘍サンプルの分類
デルマール病院で常法により採取した腺腫（ｎ＝２５）およびＣＲＣ（ｎ＝３０）サンプルを抗ｐ−ＳＭＡＤ３抗体で染色した。腫瘍関連間質および上皮癌細胞における総合ｐ−ＳＭＡＤ３強度または染色に従ったサンプルの定性的分類は専門の病理学者（Ｍ．Ｉ）により行った。平均染色レベルを、高、中および低の３つのカテゴリーにまとめた。腫瘍関連間質については、総ての細胞種を考慮に入れた。
【０２０５】
腫瘍の解離および染色
デルマール病院（バルセロナ、スペイン）で処置されたＣＲＣ患者（ｎ＝８）から新たに得た腫瘍を無菌レーザーメスで細断し、１００倍ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）；０．１％ヒアルロニダーゼおよび０．１％コラゲナーゼ１Ａ（両方ともＳｉｇｍａから）を含有する５０％ＤＭＥＭ／５０％Ｆ１２（両方ともＧｉｂｃｏから）中、３７℃で１５〜２０分間、旋回させながらインキュベートした。次に、細片をピペット操作によりホモジナイズし、連続的に１８Ｇおよび２１Ｇ針に通した。１０％ＦＢＳを加えることによって酵素反応を停止させ、１００μｍ→７０μｍ→４０μｍのセルストレーナー（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）で順次濾過することによって単細胞を採取した。細胞を遠心分離し、５ｍｌの塩化アンモニウム（０．１５Ｍ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）に再懸濁させ、室温で５分間インキュベートして赤血球を溶解させた。ＨＢＳＳ（Ｌｏｎｚａ）で２回洗浄した後、細胞を１ｍｌのブロッキング溶液：染色バッファー（ＳＢ）（ＨＢＳＳ＋５％ＦＢＳ）；１％ＢＳＡ；５％マウス血清中で５分間インキュベートした。次に、細胞をＳＢ中、抗ｈＥｐｃａｍ／ＴＲＯＰ１−ＡＰＣコンジュゲート抗体（３０分；１／５０；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）および抗ＣＤ４５−ＰＥコンジュゲート抗体（２０分；１／１０；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で染色した。死細胞をヨウ化プロピジウムで標識した。
【０２０６】
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いて細胞を分離した。ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＮＡを抽出した。ＨＧ−Ｕ１３３Ａ  ２．０遺伝子発現チップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）に対するサンプルの標識およびハイブリダイゼーションは、標準的な方法論を用い、ＩＲＢトランスクリプトーム中核施設により行った。データ分析はＰａｒｔｅｋソフトウエアを用いて行った。
【０２０７】
Ｆ−ＴＢＲＳ遺伝子発現サインの作製
ＣＣＤ−１８Ｃｏ線維芽細胞を集密度６０％で播種し、ＴＧＦＢ１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；５ｎｇ／ｍｌ）で８時間処理した。遺伝子発現プロフィールはＨＧ−Ｕ１３３および２．０  Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘアレイを用いて測定し、ＲＭＡにより正規化した。２反復の実験においてＴＧＦ−βで処理した線維芽細胞において少なくとも２倍アップレギュレートされた（ｐ＜０．０５）遺伝子を含んだ第１のサインを作製した。このリストをＣＲＣ患者から精製された細胞集団の発現プロフィールをフィルターにかけることによってさらに精密化した：［ＣＤ４５（＋）、Ｅｐｃａｍ（−）：白血球画分］、［ＣＤ４５（−）Ｅｐｃａｍ（＋）；上皮画分］および［ＣＤ４５（−）Ｅｐｃａｍ（−）；ＣＡＦ富化画分］。Ｆ−ＴＢＲＳは、ＣＡＦ富化画分において他の２つの集団に比べてアップレギュレートされている（＞２倍、ｐ＜０．０５）遺伝子に相当する。富化倍率に関するｐ値は総て、モデレートｔ検定により得られたものである。
【０２０８】
データセット
ヒト結腸腺腫および癌腫に相当するデータセットは従前に記載されている(Sabates-Bellver et al., 2007; Mol. Cancer Res., 5, 1263-1275; van der Flier et al., 2007; Gastroenterology, 132, 628-632)。Ｆ−ＴＢＲＳの発現を臨床疾病進行と相関させるために、本発明者らは、Gene Expression Omnibus, www.ncbi.nlm.nih.gov/geoで入手可能な、臨床追跡調査が利用可能であった原発ＣＲＣに相当する２セットのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘトランスクリプトームプロフィール（ＧＳＥ１７５３７およびＧＳＥ１４３３３）をプールした。ＧＳＥ１７５３７２９は、ヴァンダービルト大学医療センター（ヴァンダービルト、ＵＳＡ）で治療を受けた５５名の結腸癌患者から構成される。ＧＳＥ１４３３３３０は、２つの異なる病院ピーター・マッカラム癌センター（オーストラリア）およびＨ．リー・モフィット癌センター（ＵＳＡ）で治療を受けた２９０名のＣＲＣ患者のプールを含む。ＧＳＥ１７５３７およびＧＳＥ１４３３３データセットに関して利用可能な注釈臨床データには、ＡＪＣＣ病期分類、年齢、性別および無病生存期間が含まれた。これらのコホートの種々のＡＪＣＣ病期における腫瘍サンプルの表示は、上述の病院で標準治療を受けているＣＲＣ患者の自然分布に従う。データセット間の系統的バイアスを除去するために、プールを行う前に、全遺伝子の発現レベルをｚ−スコアに変換した。
【０２０９】
ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏバリデーション試験のため、データセットＧＳＥ３３１１３およびＧＳＥ３７８９２の、２つのさらなるコホートを用いた。ＧＳＥ３３１１３は、オランダ、アムステルダムのアカデミック・メディカル・センター（ＡＭＣ）で収集された９０名のＡＪＣＣ病期ＩＩ  ＣＲＣ患者材料のセットを含んでいた。これらの患者では広範な医療記録が保持されており、大多数で長期臨床追跡調査が利用可能であった。ＧＳＥ３７８９２のコホートは、１３０名の結腸癌サンプルシリーズを含んでいた（病期ＩＩおよび病期ＩＩＩ両方のＣＲＣ患者が存在していた）。
【０２１０】
Ｆ−ＴＢＲＳと臨床転帰の関連付け
Ｆ−ＴＢＲＳと無病生存期間の関連付けに関して、本発明者らは病期ＩＶ  ＣＲＣを考慮に入れなかったが、これはこれらの場合の再発が転移部位における腫瘍の不完全な外科的切除と関連していることが多いためである。本発明者らは、本発明者らのサインと関連の変数の間の関連程度を評価するためにgene set enrichment analysis（ＧＳＥＡ）を用いた。ＧＳＥＡは、疾患再発に関してはそれらのハザード比（Ｃｏｘモデルにより評価）に従い、残りの変数に関しては変化倍率に従った遺伝子のランク付けに基づいた。ＧＳＥＡの出力は、エンリッチメントスコア(enrichment score)（ＥＳ）、検定する遺伝子の大きさを説明する正規化エンリッチメントスコア(normalized enrichment score)（ＮＥＳ）、Ｐ値および推定偽陽性率(False Discovery rate)（ＦＤＲ）である。ＥＳ、ＮＥＳおよびＦＤＲは、Subramanian et al (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 2005, 102:15545-15550)で提示されている通りに得た。Ｐ値は、各サインについて１０，０００通りの並べ替えを用いて計算し、それらをＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｙｅｋｕｔｉｅｌｉ法((Behav. Brain Res., 2001, 125, 279-284))で補正した。再発に関するこのサインの予測力を評価するために、本発明者らは平均サイン発現を計算し、その有意性を単変量Ｃｏｘ比例ハザードモデル尤度比検定で検定した。平均サイン発現は、各遺伝子のｚ−スコアを得、そのサインの全遺伝子のｚ−スコアの平均を求めることによって計算した。それらの平均Ｆ−ＴＢＲＳ発現に従って患者を３群に分けた：Ｆ−ＴＢＲＳ低（発現＜Ｍ−ＳＤ）、Ｆ−ＴＢＲＳ中（発現＞Ｍ−ＳＤおよび＜Ｍ）およびＦ−ＴＢＲＳ高（発現＞Ｍ）（ここで、Ｍは全患者の平均であり、ＳＤは標準偏差である）。本発明者らは低、中および高平均サインスコアを有する患者に関してカプラン・マイヤー生存曲線を得た。多変量Ｃｏｘモデルにはまた、年齢、性別およびＡＪＣＣ病期も含んだ。総ての変数が統計学的に有意となるまで、有意でない変数をモデルから段階的に排除した。統計的有意性は０．０５水準で定義した。全ＣｏｘモデルのＰ値は、尤度比検定に基づいた。
【０２１１】
患者の年齢、性別、病期分類および遺伝子発現に基づいて再発イベントを予測するために、ＳＣＡＤに基づくロジスティック回帰モデルを当てはめ(Fan & Li, 1999, Journal of the American Statistical Association, 1999, 96, 1348-1360)、非ゼロ係数の推定を用いて変数を選択した。ＳＣＡＤペナリゼーションパラメーターを、Ｒパッケージｎｃｖｒｅｇに実装されているような１０倍クロスバリデーションにより設定した。本発明者らは、病期ＩＩ、ＩＩＩ、また全患者についてこの分析を行ったところ、いくつかの短くかつ高い予測的遺伝子サインが得られた。
【０２１２】
遺伝子サインと病生存期間の関連性をさらに評価するために、平均サイン発現を計算し（すなわち、そのサインの全遺伝子に関する）、補正変数として病期分類を含めた多変量Ｃｏｘ比例ハザードモデルを当てはめた。結果を可視化するために、本発明者らは、患者をそれらの平均サイン発現に従って階層化し、カプラン・マイヤープロットを得、ハザード比に対する効果をＲパッケージｐｓｐｌｉｎｅに実装されているような四次罰則付きスプラインを用いた平滑関数(Eilers et al, 1996, Statistical Science, 11, 89-121)として評価した。
【０２１３】
免疫組織化学
免疫組織化学法は、パラフィン切片に対して、ホスホ−ＳＭＡＤ３に対して作製された一次抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を用いて行った。簡単に述べると、切片をクエン酸バッファーｐＨ６中で１０分間オートクレーブ処理した後、抗ホスホ−ｓｍａｄ  ３（１／１００）とともにインキュベートした。ビオチン化二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ）を１：２００希釈で用い、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣキット（Ｖａｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ）を用い、供給者の推奨の通りに検出した。
【０２１４】
実施例１
ＣＲＣ進行中のＴＧＦ−βシグナル伝達
ＣＲＣ進行中のＴＧＦ−βシグナル伝達を調べた。結腸腫瘍サンプルの遺伝子発現プロフィールから、ＣＲＣのあるサブセットで、高いレベルのＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２およびＴＧＦＢ３  ｍＲＮＡが確認されたが、総ての腺腫がこれら３つのＴＧＦ−βアイソフォームに低いレベルを示した（図１）。腺腫−ＣＲＣ移行の特徴には間質線維化反応、炎症および新血管新生の増大が含まれ、それらは総て、腫瘍間質内に滞留するいくつかの非癌性細胞種を含む。
【０２１５】
ＴＧＦ−βアイソフォームの細胞種特異的発現を検討するために、原発ＣＲＣから精製した特異的腫瘍細胞集団のプロフィールを得た（ｎ＝８  患者）。マーカー遺伝子発現の分析を行ったところ、ＥＰＣＡＭ＋細胞集団は上皮癌細胞が大幅に富化されており、ＥｐＣＡＭ−／ＣＤ４５＋細胞集団は白血球が富化され、ＥＰＣＡＭ−／ＣＤ４５−細胞集団は癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）が富化されていることが示された（データは示されていない）。ＴＧＦＢ１発現は非上皮細胞（ＣＤ４５＋およびＣＤ４５−の両方）で高かったが、高いＴＧＦＢ２およびＴＧＦＢ３  ｍＲＮＡレベルはＣＡＦ富化細胞集団にのみ存在した（図２）。
【０２１６】
腺腫およびＣＲＣにおいてＴＧＦ−βにより標的化される細胞集団を特定するために、ＳＭＡＤ３のリン酸化（ｐ−ＳＭＡＤ３）をＴＧＦ−β経路活性化のマーカーとして用いた。臨床材料に対する免疫組織化学分析により、腺腫の４０％の上皮癌細胞にｐ−ＳＭＡＤ３の顕著な核蓄積が明らかになったが、ＣＲＣでは７％に過ぎなかった（図３）。この知見は、ＣＲＣ進行中に、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路成分における不活性化突然変異が頻繁に獲得されることを表していると思われる。さらに、上皮ｐ−ＳＭＡＤ３＋  ＣＲＣ細胞は、ＳＭＡＤ４における遺伝的変化のためにＴＧＦ−β転写応答が損なわれている可能性がある(Liu et al., 1997, Genes dev., 11: 3157-3167 and Alarcon, C., 2009, Cell, 139: 757-769)。ＣＲＣにおける上皮ＴＧＦ−βシグナル伝達の欠如と同時に、腫瘍間質細胞は高レベルのｐ−ＳＭＡＤ３を示した（図３）。ほとんどの腺腫の間質にはｐ−ＳＭＡＤ３高陽性細胞がほとんど含まれておらず、全体的に染色が弱かったが、大きな割合のＣＲＣ（６３％）が、強いｐ−ＳＭＡＤ３の核染色を伴う間質細胞が多いことを特徴としていた。これらの所見を考え合わせると、結腸腫瘍の一部は、は腺腫−癌移行時にＴＧＦ−βの発現増を受け、腫瘍間質成分がこの増加の主要な担い手であることが示唆される。ＣＲＣにおける高レベルのＴＧＦ−βは、癌細胞よりも腫瘍関連間質細胞を優先的に標的とする。
【０２１７】
実施例２
ＣＲＣの転帰を予測可能な線維芽細胞特異的ＴＧＦ−β応答サイン（Ｆ−ＴＢＲＳ）の同定
実施例１に示されるように、ｐ−ＳＭＡＤ３は、リンパ球および内皮細胞を含む種々の腫瘍間質関連細胞の核に蓄積した。さらに、ＣＲＣにおいて最も多い間質ｐ−ＳＭＡＤ３＋細胞種は、線維芽細胞に特徴的な多か所の膜伸長を伴う、薄く、細長い形状を呈した。癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）は、反応性癌間質の最大の集団であり、それらはいくつか癌腫で腫瘍の成長、浸潤および転移に関与している。ＣＲＣにおけるＴＧＦ−βにより刺激される線維芽細胞の役割を検討するため、まず、これらの細胞においてＴＧＦ−βにより調節される遺伝子セットを同定した。正常結腸線維芽細胞（ＣＣＤ−１８Ｃｏ）をＴＧＦ−βの存在下および不在下で培養し、全遺伝子発現プロフィールを、マイクロアレイを用いて評価した。ＴＧＦ−βシグナル伝達は、これらの細胞中の２８０の遺伝子の発現レベルをアップレギュレートしていた（３９１のプローブ；＞２倍、ｐ＜０．０５）。この遺伝子セットの細胞種特異性を、実施例１に記載の精製腫瘍細胞集団を用いて評価した。ＣＣＤ−１８Ｃｏ線維芽細胞においてＴＧＦ−βにより誘導された３９１プローブのうち、１２７の遺伝子（１７５のプローブにより検出）がＣＡＦ富化細胞集団で差次的にアップレギュレートされていた（図４；表１）。これらの１７５のプローブ（１２７の遺伝子）を線維芽細胞特異的ＴＧＦ−β応答サイン（Ｆ−ＴＢＲＳ）と呼称した。注目すべきことに、Ｆ−ＴＢＲＳは、腺腫に比べてＣＲＣで発現が高かった（データは示されていない）。この所見は、ＴＧＦＢ１、２および３の高いレベル、ならびにＣＲＣ進行中のｐ−ＳＭＡＤ３＋  ＣＡＦ量の増大と一致している（図１）。
【０２１８】
表１：ＴＧＦ−β刺激結腸線維芽細胞において差次的に調節される遺伝子のリスト。ここで、「ＣＣＤ＋対ＣＣＤ−倍率変化」は、ＴＧＦ−β刺激ＣＡＦと正常結腸線維芽細胞の間の遺伝子発現レベルの倍率変化を意味し、「ＣＤ４５−／Ｅｐｃａｍ−対ＣＤ４５＋およびＥｐｃａｍ＋倍率変化」は、ＴＧＦ−β刺激ＣＡＦの遺伝子発現と、Ｅｐｃａｍ＋（上皮）細胞およびＥｐｃａｍ−Ｃｄ４５＋細胞（白血球）における平均遺伝子発現の間の倍率変化を意味する。ＮＡ：注釈無し。
【表３】
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【０２１９】
上記のデータは、腺腫からＣＲＣへの転換が、ＣＡＦにおけるＴＧＦ−βにより駆動される転写プログラムの発現の開始が同時に起こることを示す。次に、ＣＲＣにおける間質ＴＧＦ−βシグナル伝達の程度の違いが臨床疾病進行に関連するかどうかを検討した。原発腫瘍のトランスクリプトームプロフィールおよび臨床追跡調査が公的に利用可能であった、３つの異なる病院で治療を受けた３４０のＣＲＣ症例の代表的なプールコホート（方法を参照）調べた。gene set enrichment analysis（ＧＳＥＡ）により、Ｆ−ＴＢＲＳと、２つの最も関連のある臨床進行パラメーター、すなわち、診断時の転移性播種（ＡＪＣＣ病期ＩＩＩ＋ＩＶの組合せ  対  病期Ｉ＋ＩＩ；ＦＤＲ＜１０−６）および結果としての癌再発（ＦＤＲ＜１０−６）との強い関連が明らかになった（データは示されていない）。これらのデータは、初期から後期ＣＲＣへの移行が、ＣＡＦにおける高レベルのＴＧＦ−β誘導遺伝子を特徴とすることを暗示する。
【０２２０】
ＣＡＦにおけるＴＧＦ−βシグナル伝達と腫瘍再発の間の関連をさらに調べるために、ＣＲＣ患者コホートを、Ｆ−ＴＢＲＳ遺伝子の平均発現が低か中か高かに従って、３群に階層化した（図６）。これら３群の間で、相対的癌再発リスクに大きな違いが見られた。１０年の追跡調査中に、Ｆ−ＴＢＲＳ高陽性原発腫瘍を有するＣＲＣ患者の５５％が腫瘍再発を受けたが、Ｆ−ＴＢＲＳ低腫瘍を有する患者は全員が無病を維持した（図６）。
【０２２１】
癌は、対象とする治療的療法を受けている病期ＩＩ  ＣＲＣ患者のおよそ２０〜３０％、病期ＩＩＩ  ＣＲＣ患者の３０〜５０％に、一般には遠隔転移の形態で再発する。Ｆ−ＴＢＲＳレベルは病期ＩＩおよび病期ＩＩＩの患者における再発に強く関連しており、両群（Ｆ−ＴＢＲＳ低）において、再発が見られなかった少数の患者（１０％）を特定した（図７）。もちろん、病期Ｉ  ＣＲＣに見られる再発が稀であったとしても（この群では、患者４５名のうち２名）、高レベルの線維芽細胞特異的ＴＧＦ−β駆動遺伝子を伴っていた。Ｃｏｘ比例ハザード多変量分析（表２）により、Ｆ−ＴＢＲＳ発現が、療法時に無病を維持するＣＲＣ患者の同定においてＡＪＣＣ病期分類法より優れた、癌再発の非依存的予測子であることが証明された。
【０２２２】
【表４】
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【０２２３】
実施例３
ＣＲＣの転帰を予測することができるミニサインの同定
無病生存期間の良好な予測を提供する遺伝子の最小サブセットを同定するために、材料および方法に記載の通りに、Ｆ−ＴＢＲＳをさらに分析した。ＣＤＫＮ２Ｂ、ＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３、およびＦＬＴ−１遺伝子により構成される３遺伝子のサブセット（ミニサイン）を、分析した全患者ならびに病期ＩＩおよび病期ＩＩＩサブグループの患者において、再発までの期間に統計学的に有意に関連していたものとして同定した。図８はカプラン・マイヤー曲線を示し、全患者（パネルＡ）、病期ＩＩの患者（パネルＢ）または病期ＩＩＩの患者（パネルＣ）において、患者の生存期間をＣＤＫＮ２Ｂ、ＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３およびＦＬＴ−１遺伝子の平均発現に応じてプロットしたものである。
【０２２４】
さらに、図９に示されるように、３遺伝子発現サインの傾きは、再発リスクとの近似増分直線関係を示す。
【０２２５】
これらの患者を腫瘍病期に応じて階層化したところ、２つのさらなるサインが、再発までの期間の統計学的に有意な予測を提供するものとして同定された。病期ＩＩの患者では、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＦＬＴ−１、ＦＲＭＤ６、ＩＧＦＢＰ３およびＥＳＭ１により構成される発現サインが、ｐ＜０．００３９で再発までの期間の予測を可能とした（図１０）。病期ＩＩＩの患者では、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＦＬＴ−１、ＦＧＦ１、ＧＥＭおよびＭＥＸ３Ｂにより構成される発現サインが、ｐ＜０．０００１で再発までの期間の予測を可能とした（図１１）。両場合とも、サイン発現は、再発リスクに対して増分および近似直線的効果を示した（図１０Ｂおよび１１Ｂ）。
【０２２６】
さらに、本発明者らは、病期ＩＩのＣＲＣ患者を含むＧＳＥ３３１１３（図１２）と病期ＩＩおよび病期ＩＩＩの両方のＣＲＣ患者を含むＧＳＥ３７８９２（図１３）の、２つの独立した患者コホートにおいて、６遺伝子の予測子の関連を検討した。図１２はカプラン・マイヤー曲線を示し、ＧＳＥ３３１１３の全患者（病期ＩＩ）において、患者の生存期間をＣＤＫＮ２Ｂ、ＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＦＬＴ−１、ＦＲＭＤ６、ＩＧＦＢＰ３およびＥＳＭ１遺伝子の平均発現に応じてプロットしたものである（図１２Ａ）。結腸病期ＩＩ予測子の平均発現の一増分（＋１ＳＤ）につき、再発を受けるリスクには１．４７の増加が見られる（図１２Ｂ）。
【０２２７】
図１３はカプラン・マイヤー曲線を示し、ＧＳＥ３７８９２の全患者において、患者の生存期間をＣＤＫＮ２Ｂ、ＮＰＲ３／Ｃ５ｏｒｆ２３、ＦＬＴ−１、ＦＧＦ１、ＧＥＭおよびＭＥＸ３Ｂ遺伝子の平均発現に応じてプロットしたものである（図１３Ａ）。結腸病期ＩＩＩ予測子の平均発現の一増分（＋１ＳＤ）につき、再発を受けるリスクには１．５２の増加が見られる（図１３Ｂ）。
【０２２８】
実施例４
ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３は結腸直腸癌の再発を予測することができる
ＴＧＦＢ２およびＴＧＦＢ３の発現レベルは、疾病再発に対して、Ｆ−ＴＢＲＳを構成する遺伝子の発現レベルと同等の予測力を持っていた（図１４）。
【０２２９】
ＴＧＦＢ２およびＴＧＦＢ３は、結腸直腸癌の再発に関する非依存的予測子である。図１５に示されるように、ＳＣＡＤ係数と再発パーセンテージの間には相関が見られた。
【０２３０】
腫瘍病期は、腫瘍学者にとって診断時に得られる情報であるので、ＴＧＦＢ２およびＴＧＦＢ３レベルの予後値を病期分類と組み合わせて評価した。この場合にも、これは、両群において、疾病再発（限局的または遠隔）のリスクが極めて低い患者群の同定を可能とする。
【０２３１】
【表５】
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【０２３２】
この所見を裏付けるデータは図１５に示されており、−１．５未満のＳＣＡＤ係数を有する患者は疾病再発を生じるリスクが低いことが示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2015500010.tif 000026
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