(57)【要約】  本発明は、ヒト可変領域を含み、関連する抗体生成脊椎動物中で生成された試験抗体のためのヒト抗原またはエピトープノックインを含むアッセイ脊椎動物を提供する。本発明はまた、これらの脊椎動物および抗体を含むキットおよび方法も提供する。本発明は、ヒト可変領域を含むキメラおよび他の試験抗体の優れたアッセイモデルおよびアッセイ方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトエピトープに結合するヒト可変領域を含む試験抗体をアッセイする方法であって、前記抗体が、前記ヒトエピトープを担持する抗原を用いる免疫化(場合により、前記抗体のその後の誘導体化または成熟化を含む)後に第1のトランスジェニック非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)(抗体生成脊椎動物)から単離され、前記脊椎動物が、前記可変領域をコードする1つまたは複数のトランスジェニック抗体遺伝子座を含み、前記トランスジェニック脊椎動物が、免疫遺伝子レパートリーによりコードされるタンパク質を含む免疫系を有し、前記免疫遺伝子レパートリーが前記トランスジェニック抗体遺伝子座を含み、
(a)前記第1のトランスジェニック非ヒト脊椎動物の改変型である第2のトランスジェニック非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)(アッセイ脊椎動物)を提供するステップであって、アッセイ脊椎動物が、
(iv)抗体生成脊椎動物と実質的に同じ免疫遺伝子レパートリーによりコードされるタンパク質を含む免疫系；
(v)アッセイ脊椎動物が前記ヒトエピトープを担持する抗原を発現することができるような、前記ヒトエピトープのノックインを含むゲノム
を含み、
(vi)場合により、前記ゲノムが前記ヒトエピトープのオルソログまたはホモログである内因性非ヒト脊椎動物エピトープのノックアウトを有し、前記アッセイ脊椎動物が前記内因性エピトープを担持する抗原を発現することができない、ステップ；
(b)前記抗体をアッセイ脊椎動物に導入するステップ；ならびに
(c)前記アッセイ脊椎動物中の前記抗体の効果または挙動をアッセイするステップ
を含む、方法。
【請求項２】
アッセイ脊椎動物ゲノムが前記ノックインを含むことを除いて、抗体生成脊椎動物とアッセイ脊椎動物が実質的に同一のゲノムを有する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
抗体生成脊椎動物とアッセイ脊椎動物のゲノムが前記ノックアウトを含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
ステップ(c)において、前記アッセイするステップが、前記抗体の薬力学、前記抗体の薬物動態、前記抗体の活性、前記抗体のクリアランス、前記抗体の分布、前記抗体の毒性、前記抗体の物理化学的特性もしくは効果、前記抗体の結合特性、前記抗体の生物学的特性もしくは効果、前記抗体の生理学的特性もしくは効果、前記抗体の薬学的特性もしくは効果、およびアッセイ脊椎動物内の別のタンパク質もしくは物質との前記抗体の相互作用、または抗体の免疫原性からなる群から選択される1つまたは複数のアッセイである、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
抗体生成脊椎動物がアッセイ脊椎動物の遺伝的親または祖父母である、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
アッセイ脊椎動物が前記抗体生成脊椎動物の体細胞から誘導され、場合により、アッセイ脊椎動物が前記抗体生成脊椎動物から誘導されたIPS細胞から誘導される、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
請求項1から6のいずれか一項に定義の抗体生成脊椎動物およびアッセイ脊椎動物ならびに場合により試験抗体を含むアッセイキット。
【請求項８】
(i)ヒト可変領域をコードする1つまたは複数のトランスジェニック抗体遺伝子座；
(ii)前記トランスジェニック抗体遺伝子座を含む免疫遺伝子レパートリーによりコードされるタンパク質を含む免疫系；
(iii)アッセイ脊椎動物がヒトエピトープを担持する抗原を発現することができるような、前記ヒトエピトープのノックインを含むゲノム；および
(iv)前記ヒトエピトープのオルソログまたはホモログである内因性非ヒト脊椎動物エピトープのゲノムノックアウトであって、前記アッセイ脊椎動物が前記内因性エピトープを担持する抗原を発現することができない、ゲノムノックアウト；ならびに
(v)場合により、前記ヒトエピトープに結合することができるヒト可変領域を含み、請求項1から6のいずれか一項に定義の抗体生成脊椎動物中で生成された(場合により、前記抗体を生成するためのその後の誘導体化または成熟化を含む)、前記アッセイ脊椎動物内の試験抗体
を含む、非ヒト(例えば、マウスまたはラット)アッセイ脊椎動物。
【請求項９】
ヒト可変領域を含み、ヒトエピトープに結合する試験抗体の効果または挙動をアッセイするための非ヒトアッセイ脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)を作製する方法であって、
(a)非ヒト脊椎動物の子ES細胞を取得するステップであって、ES細胞のゲノムが、下記の(i)の第1の遺伝的親のゲノムと(ii)の第2の遺伝的親のゲノムとの遺伝的交配である、ステップ：
(i)ゲノムが前記試験抗体をコードする非ヒト抗体生成脊椎動物である第1の遺伝的親のゲノムであって、抗体生成脊椎動物がヒト可変領域を含む抗体をコードする1つまたは複数のトランスジェニック抗体遺伝子座を含み、抗体生成脊椎動物が免疫遺伝子レパートリーによりコードされるタンパク質を含む免疫系を有し、前記免疫遺伝子レパートリーが前記トランスジェニック抗体遺伝子座を含む、第1の遺伝的親のゲノム；
(ii)前記抗体生成脊椎動物と同じ種(場合により、同じ株)の非ヒト脊椎動物である第2の遺伝的親のゲノムであって、第2の親が、第1の親と実質的に同じ免疫遺伝子レパートリーによりコードされる免疫系を有する、第2の遺伝的親のゲノム；
(b)子ES細胞のゲノム中に、前記ヒトエピトープをコードするヌクレオチド配列を導入し、場合により、ゲノムから、前記ヒトエピトープのオルソログである内因性非ヒト脊椎動物エピトープをノックアウトすることにより、ヒトエピトープのノックインを含む改変された子ES細胞をin vitroで生成するステップ；および
(c)前記改変された子ES細胞から非ヒトの子脊椎動物を発生させ、前記ヒトエピトープを発現するアッセイ脊椎動物を得るステップ；ならびに
(d)場合により、遺伝的交配により前記アッセイ脊椎動物の子孫を生成するステップであって、前記子孫が、ヒトエピトープノックイン(および場合により、ノックアウト)に加えて前記アッセイ脊椎動物と実質的に同じ免疫遺伝子レパートリーを含む、ステップ
を含む、方法。
【請求項１０】
第1および第2の遺伝的親(a)(i)および(ii)が、同じ非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)の株のものである、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
第1および第2の遺伝的親が、(a)きょうだい、(b)親および子、(c)親および孫、(d)いとこまたは(e)おじ/おばおよび甥/姪として関連する、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
ヒト可変領域を含み、ヒトエピトープに結合する試験抗体の効果または挙動をアッセイするための非ヒトアッセイ脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)を作製する方法であって、
(a)ゲノムが前記試験抗体をコードする非ヒト抗体生成脊椎動物の体細胞(場合により、IPS細胞)から非ヒト脊椎動物の子ES細胞を取得するステップであって、抗体生成脊椎動物が、ヒト可変領域を含む抗体をコードする1つまたは複数のトランスジェニック抗体遺伝子座を含み、抗体生成脊椎動物が、免疫遺伝子レパートリーによりコードされるタンパク質を含む免疫系を有し、前記免疫遺伝子レパートリーが前記トランスジェニック抗体遺伝子座を含む、ステップ；
(b)子ES細胞のゲノム中に、前記ヒトエピトープをコードするヌクレオチド配列を導入し、場合により、ゲノムから、前記ヒトエピトープのオルソログである内因性非ヒト脊椎動物エピトープをノックアウトすることにより、ヒトエピトープのノックインを含む改変された子ES細胞を生成するステップ；および
(c)前記改変された子ES細胞から非ヒトの子脊椎動物を発生させ、前記ヒトエピトープを発現するアッセイ脊椎動物を得るステップ；ならびに
(d)場合により、遺伝的交配により前記アッセイ脊椎動物の子孫を生成するステップであって、前記子孫が、ヒトエピトープノックイン(および場合により、ノックアウト)に加えて前記アッセイ脊椎動物と実質的に同じ免疫遺伝子レパートリーを含む、ステップ
を含む、方法。
【請求項１３】
IPS細胞がマウス胚性線維芽細胞である、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
ヒト可変領域を含み、ヒトエピトープに結合する試験抗体の効果または挙動をアッセイするための非ヒトアッセイ脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)を作製する方法であって、
(e)ゲノムが前記試験抗体をコードする抗体生成脊椎動物から誘導されたES細胞を提供するステップであって、抗体生成脊椎動物が、ヒト可変領域を含む抗体をコードする1つまたは複数のトランスジェニック抗体遺伝子座を含み、抗体生成脊椎動物が、免疫遺伝子レパートリーによりコードされるタンパク質を含む免疫系を有し、前記免疫遺伝子レパートリーが前記トランスジェニック抗体遺伝子座を含む、ステップ；
(f)ES細胞のゲノム中に、前記ヒトエピトープをコードするヌクレオチド配列を導入し、場合により、ゲノムから、前記ヒトエピトープのオルソログである内因性非ヒト脊椎動物エピトープをノックアウトするステップ；および
(g)前記改変されたES細胞から非ヒトの子脊椎動物を発生させ、前記ヒトエピトープを発現するアッセイ脊椎動物を得るステップ；ならびに
(h)場合により、前記ノックインについてホモ接合性である前記アッセイ脊椎動物の子孫を生成するステップであって、前記子孫が、ヒトエピトープノックイン(および場合により、ノックアウト)に加えて前記アッセイ脊椎動物と実質的に同じ免疫遺伝子レパートリーを含む、ステップ
を含む、方法。
【請求項１５】
ヒトエピトープに結合するヒト可変領域を含む試験抗体をアッセイする方法であって、前記抗体が、前記ヒトエピトープを担持する抗原を用いる免疫化(場合により、前記抗体のその後の誘導体化または成熟化を含む)後に第1のトランスジェニック非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)(抗体生成脊椎動物)から単離され、前記脊椎動物が、前記可変領域をコードする1つまたは複数のトランスジェニック抗体遺伝子座を含み、
(a)前記第1のトランスジェニック非ヒト脊椎動物の改変型である第2のトランスジェニック非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)(アッセイ脊椎動物)を提供するステップであって、アッセイ脊椎動物が、以下の(iii)および(iv) を除いて、抗体生成脊椎動物と実質的に同じゲノムを有する、ステップ；
(iii)アッセイ脊椎動物ゲノムが、アッセイ脊椎動物が前記ヒトエピトープを担持する抗原を発現することができるような、前記ヒトエピトープのノックインを含むこと；および
(iv)場合により、前記ゲノムが前記ヒトエピトープのオルソログまたはホモログである内因性非ヒト脊椎動物エピトープのノックアウトを有し、前記アッセイ脊椎動物が前記内因性エピトープを担持する抗原を発現することができないこと；
(b)前記抗体をアッセイ脊椎動物に導入するステップ；ならびに
(c)前記アッセイ脊椎動物中の前記抗体の効果または挙動をアッセイするステップ
を含む、方法。
【請求項１６】
請求項3から6のいずれか一項に記載の特徴に限定される、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
請求項15または16のいずれか一項に定義の抗体生成脊椎動物およびアッセイ脊椎動物ならびに場合により試験抗体を含むアッセイキット。
【請求項１８】
(i)ヒト可変領域をコードする1つまたは複数のトランスジェニック抗体遺伝子座;
(iii)アッセイ脊椎動物がヒトエピトープを担持する抗原を発現することができるような、前記ヒトエピトープのノックインを含むゲノム;および
(iv)前記ヒトエピトープのオルソログまたはホモログである内因性非ヒト脊椎動物エピトープのゲノムノックアウトであって、前記アッセイ脊椎動物が前記内因性エピトープを担持する抗原を発現することができない、ゲノムノックアウト;ならびに
(v)場合により、前記ヒトエピトープに結合することができるヒト可変領域を含み、請求項1から6、15および16のいずれか一項に定義の抗体生成脊椎動物中で生成された(場合により、前記抗体を生成するためのその後の誘導体化または成熟化を含む)、前記アッセイ脊椎動物内の試験抗体
を含む、非ヒト(例えば、マウスまたはラット)アッセイ脊椎動物。
【請求項１９】
ヒトエピトープがヒトCD40リガンドまたはヒトCD40エピトープであり、場合により、ノックインがヒトCD40リガンドまたはヒトCD40のノックインである、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法、脊椎動物またはキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は特に、アッセイモデルとして有用な非ヒト脊椎動物、ならびにキメラ抗体を試験するためのそのような脊椎動物を作製および使用するキットおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物モデルは研究において広く用いられており、研究団体にアクセスできる方法で、およびヒトでの研究よりも倫理的に許容される方法で多用途の実験を提供することなどの多くの利点を与える。そのようなモデルは、臨床試験においてヒトに投与する前にin vivoで薬剤の毒性、薬物動態、効力および他の特徴を評価するために日常的に用いられている。
【０００３】
単一の遺伝子を除去または付加する効果をin vivoで評価することができるノックインおよびノックアウト動物モデルが生成されている。
【０００４】
さらに、胚性幹細胞(ES細胞)技術を用いて、当技術分野は、ヒト抗原でチャレンジした後にin vivoでヒトまたはキメラ抗体を生成することができるトランスジェニックキメラ抗体遺伝子座を担持する、マウスなどの非ヒト脊椎動物を提供してきた。そのような抗体は、ヒト可変領域を有用に担持する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】WO1994004678
【特許文献２】WO2004041862
【特許文献３】WO2004041863
【特許文献４】WO2010109165A2
【特許文献５】WO2011004192
【特許文献６】米国特許第7,501,552号
【特許文献７】米国特許第6,673,986号
【特許文献８】米国特許第6,130,364号
【特許文献９】WO2009/076464
【特許文献１０】米国特許第6,586,251号
【特許文献１１】WO2007069666
【特許文献１２】WO2008118820
【特許文献１３】WO2008124133
【特許文献１４】WO2008151058
【特許文献１５】WO2009006997
【特許文献１６】WO2011027180
【特許文献１７】EP129142
【特許文献１８】EP1204740
【特許文献１９】米国特許6,638,768号
【特許文献２０】米国特許第6,461,818号
【特許文献２１】WO2011044050
【特許文献２２】EP1399559
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】「Manipulating the Mouse Embryo」、第3版、A Nagyら、Cold Spring Harbor Laboratory Press、2003
【非特許文献２】Nature 1993 Jun 3; 363(6428):446〜8頁、「Naturally occuring antibodies devoid of light chains」、Hamers-Casterman C、Atarhouch T、Muyldermans S、Robinson G、Hamers C、Songa EB、Bendahman N、Hamers R
【非特許文献３】Hybridoma 1997 Aug; 16(4):381〜9頁、「Rapid development of affinity matured monoclonal antibodies using RIMMS」、Kilpatrickら
【非特許文献４】http://www.informatics.jax.org/mgihome/nomen/strain 129.shtml
【非特許文献５】New England Journal of Medicine 2007 Dec 13;357(24):2426〜9頁、「Knock out, knock in, knock down -- genetically manipulated mice and the Nobel Prize」、Manis JP
【非特許文献６】Proc Natl Acad Sci 1997 May 27;94(11):5709〜12頁、「The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse」、Brook FA & Gardner RL
【非特許文献７】Proc Natl Acad Sci; 2011 Oct 11、「Rapid and efficient reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells by retinoic acid receptor gamma and liver receptor homolog 1」、Wangら
【非特許文献８】http://bacpac.med.buffalo.edu/11framehmale.htm
【非特許文献９】http://www.tree.caltech.edu/lib status.html
【非特許文献１０】http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clone/library/genomic/16/
【非特許文献１１】http://informa.bio.caltech.edu/idx www tree.html
【非特許文献１２】Osoegawa K、Mammoser AG、Wu C、Frengen E、Zeng C、Catanese JJ、de Jong PJ; Genome Res. 2001 Mar;11(3):483〜96頁、「A bacterial artificial chromosome library for sequencing the complete human genome」
【非特許文献１３】Osoegawa, K.、Woon, P.Y.、Zhao, B.、Frengen, E.、Tateno, M.、Catanese, J.J、およびde Jong, P.J.(1998)、「An Improved Approach for Construction of Bacterial Artificial Chromosome Libraries」、Genomics 52、1〜8頁
【非特許文献１４】http://bacpac.chori.org/hmale11.htm
【非特許文献１５】NHGRI/DOE「Guidance on Human Subjects in Large-Scale DNA Sequencing」
【非特許文献１６】http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/bac clones man.pdf
【非特許文献１７】http://www.genebridges.com
【非特許文献１８】NCBI m37、April 2007 ENSEMBL Release 55.37h
【非特許文献１９】GRCh37、Feb 2009 ENSEMBL Release 55.37
【非特許文献２０】RGSC 3.4 Dec 2004 ENSEMBL release 55.34w
【非特許文献２１】Nikaidoら、Nature 292:845〜848頁(1981)
【非特許文献２２】Harlow, E. & Lane, D. 1998、第5版、Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Lab.Press、Plainview、NY
【非特許文献２３】PasqualiniおよびArap、Proceedings of the National Academy of Sciences (2004) 101:257〜259頁
【非特許文献２４】Sambrook, JおよびRussell, D.(2001、第3版)Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY
【非特許文献２５】Nature Genetics 38、431〜440(2006); Published online: 5 March 2006、doi:10.1038/ng1760、「The Oct4 and Nanog transcription network regulates pluripotency in mouse embryonic stem cells」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ヒト抗原の存在下でin vivoでそのようなヒトおよびキメラ抗体をアッセイするためのモデルとして改善された非ヒト脊椎動物を提供することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この目的のために、本発明は、以下を提供する：
ヒトエピトープに結合するヒト可変領域を含む試験抗体をアッセイする方法であって、前記抗体が、前記ヒトエピトープを担持する抗原を用いる免疫化(場合により、前記抗体のその後の誘導体化または成熟化を含む)後に第1のトランスジェニック非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)(抗体生成脊椎動物)から単離され、前記脊椎動物が、前記可変領域をコードする1つまたは複数のトランスジェニック抗体遺伝子座を含み、前記トランスジェニック脊椎動物が、免疫遺伝子レパートリーによりコードされるタンパク質を含む免疫系を有し、前記免疫遺伝子レパートリーが前記トランスジェニック抗体遺伝子座を含み、
(a)前記第1のトランスジェニック非ヒト脊椎動物の改変型である第2のトランスジェニック非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)(アッセイ脊椎動物)を提供するステップであって、アッセイ脊椎動物が、
(i)抗体生成脊椎動物と実質的に同じ免疫遺伝子レパートリーによりコードされるタンパク質を含む免疫系;
(ii)アッセイ脊椎動物が前記ヒトエピトープを担持する抗原を発現することができるような、前記ヒトエピトープのノックインを含むゲノム
を含み、
(iii)場合により、前記ゲノムが前記ヒトエピトープのオルソログまたはホモログである内因性非ヒト脊椎動物エピトープのノックアウトを有し、前記アッセイ脊椎動物が前記内因性エピトープを担持する抗原を発現することができない、ステップ;
(b)前記抗体をアッセイ脊椎動物に導入するステップ;ならびに
(c)前記アッセイ脊椎動物中の前記抗体の効果または挙動をアッセイするステップ
を含む、方法。
【０００９】
本発明は、以下も提供する:
(i)ヒト可変領域をコードする1つまたは複数のトランスジェニック抗体遺伝子座;
(ii)前記トランスジェニック抗体遺伝子座を含む免疫遺伝子レパートリーによりコードされるタンパク質を含む免疫系;
(iii)アッセイ脊椎動物がヒトエピトープを担持する抗原を発現することができるような、前記ヒトエピトープのノックインを含むゲノム;および
(iv)前記ヒトエピトープのオルソログまたはホモログである内因性非ヒト脊椎動物エピトープのゲノムノックアウトであって、前記アッセイ脊椎動物が前記内因性エピトープを担持する抗原を発現することができない、ゲノムノックアウト;ならびに
(v)場合により、前記ヒトエピトープに結合することができるヒト可変領域を含み、上記に記載の抗体生成脊椎動物中で生成された(場合により、前記抗体を生成するためのその後の誘導体化または成熟化を含む)、前記アッセイ脊椎動物内の試験抗体
を含む、非ヒト(例えば、マウスまたはラット)アッセイ脊椎動物。
【００１０】
本発明は、以下も提供する:
ヒトエピトープに結合するヒト可変領域を含む試験抗体をアッセイする方法であって、抗体が、前記ヒトエピトープを担持する抗原を用いる免疫化(場合により、前記抗体のその後の誘導体化または成熟化を含む)後に第1のトランスジェニック非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)(抗体生成脊椎動物)から単離され、脊椎動物が、前記可変領域をコードする1つまたは複数のトランスジェニック抗体遺伝子座を含み、
(a)前記第1のトランスジェニック非ヒト脊椎動物の改変型である第2のトランスジェニック非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)(アッセイ脊椎動物)を提供するステップであり、アッセイ脊椎動物が、
(i)アッセイ脊椎動物ゲノムが、アッセイ脊椎動物が前記ヒトエピトープを担持する抗原を発現することができるような前記ヒトエピトープのノックインを含むこと;および
(ii)場合により、前記ゲノムが前記ヒトエピトープのオルソログまたはホモログである内因性非ヒト脊椎動物エピトープのノックアウトを有し、前記アッセイ脊椎動物が前記内因性エピトープを担持する抗原を発現することができないこと
を除いて、抗体生成脊椎動物と実質的に同じゲノムを有する、ステップ;
(b)前記抗体をアッセイ脊椎動物に導入するステップ;ならびに
(c)前記アッセイ脊椎動物中の前記抗体の効果または挙動をアッセイするステップ
を含む、方法。
【００１１】
本発明は、以下も提供する:
(i)ヒト可変領域をコードする1つまたは複数のトランスジェニック抗体遺伝子座;
(iii)アッセイ脊椎動物がヒトエピトープを担持する抗原を発現することができるような、前記ヒトエピトープのノックインを含むゲノム;および
(iv)前記ヒトエピトープのオルソログまたはホモログである内因性非ヒト脊椎動物エピトープのゲノムノックアウトであって、前記アッセイ脊椎動物が前記内因性エピトープを担持する抗原を発現することができない、ゲノムノックアウト;ならびに
(v)場合により、前記ヒトエピトープに結合することができるヒト可変領域を含み、請求項1から6、15および16のいずれか一項に記載の抗体生成脊椎動物中で生成された(場合により、前記抗体を生成するためのその後の誘導体化または成熟化を含む)、前記アッセイ脊椎動物内の試験抗体
を含む、非ヒト(例えば、マウスまたはラット)アッセイ脊椎動物。
【００１２】
本発明はまた、非ヒトアッセイ脊椎動物を作製する方法も提供する。
【００１３】
本発明の非ヒト脊椎動物および方法により、抗体と、抗体を試験するために用いられるシステムの免疫設定との間のバックグラウンド可変性を排除するか、または最小化する方法でヒトエピトープに対するヒト抗体可変領域の作製および試験が可能になる。実質的に同じ免疫バックグラウンドにある抗体を作製および試験することにより、試験抗体に対する免疫反応の複雑な問題が、アッセイ脊椎動物において排除または最小化される。さらに、試験および抗体作製を対象のヒトエピトープについて一致させ、対象のヒト抗原に対してin vivoで寛容化されたアッセイ脊椎動物を利用することにより、改善されたアッセイを実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】培養された胚盤胞の形態の進行的変化を示す図である(「Manipulating the Mouse Embryo」、第3版、A Nagyら、Cold Spring Harbor Laboratory Press、2003;そのテキストの図8.2)。
【図２Ａ】ES細胞形態の特徴および実例を示す図である「Manipulating the Mouse Embryo」、第3版、A Nagyら、Cold Spring Harbor Laboratory Press、2003；そのテキストの図8.4から取得)。
【図２Ｂ】以下の実施例に従って作製されたES細胞を示す写真である(KX01.3細胞を示す)。
【図３】正確な遺伝子ノックアウト方法の模式図である。
【図４Ａ】正確な遺伝子ノックアウト方法の模式図である。
【図４Ｂ】正確な遺伝子ノックアウト方法の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、一実施形態においては、ヒト標的上のエピトープであるヒトエピトープに特異的に結合するヒト可変領域を含む試験抗体をアッセイするためのアッセイ脊椎動物および方法を提供する。例えば、ヒト標的全体が用いられるか、またはあるいは、場合により異種タンパク質部分に融合されたそのようなヒト標的の一部が用いられ、前記部分は対象のヒトエピトープを含む。一例においては、異種タンパク質部分は、場合により会合した細胞内ドメインを含む膜貫通ドメインである。異種タンパク質部分は、マウスタンパク質部分(例えば、マウスタンパク質ドメイン、例えば、場合により会合したマウス細胞内ドメインを含むマウス膜貫通ドメイン)または抗体Fc領域(例えば、マウスもしくはヒトFc)であってもよい。一実施形態においては、ヒトエピトープは、ヒト標的の細胞外ドメイン上に提供される。ヒト標的は、例えば、増殖因子、サイトカイン、サイトカイン受容体、酵素、酵素のためのコファクターおよびDNA結合タンパク質からなる群から選択される。一例においては、ヒトエピトープは、受容体(例えば、ダイマーもしくはトリマー受容体)などの多サブユニットタンパク質(例えば、オリゴマー)またはマルチマーリガンド上に提供される。多サブユニットタンパク質は、例えば、ヒトエピトープを担持する第1のサブユニットおよび1つまたは複数の第2のサブユニット(例えば、マウスもしくはヒトサブユニット)を含んでもよい。非ヒト脊椎動物種(例えば、マウスまたはラット)のタンパク質ドメイン、例えば、ヒトエピトープがタンパク質標的の細胞外ドメイン上に存在するタンパク質標的の非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)膜貫通ドメインおよび/または細胞内シグナリングドメインの状況にヒトエピトープを担持することが有利である。これにより、ヒトエピトープが試験抗原により結合した場合の非ヒト脊椎動物(アッセイ脊椎動物)における適切な固定およびシグナリングが可能になる。かくして、この実施形態は、アッセイ脊椎動物内での効率的で代表的なアッセイにとって有用な状況にノックインヒトエピトープを適応させる。
【００１６】
本明細書に記載の抗体は、それらがヒト可変領域を含むという条件で任意の形式のものであってよい。例えば、本発明は、抗体がそれぞれ2つの重鎖および2つの軽鎖を含有する4鎖抗体に適用可能である。あるいは、本発明を、ヒトV領域を担持し、CH1および軽鎖を含まないH2抗体(重鎖抗体)に適用することができる(ラクダ科H2抗体に関して等価である：例えば、Nature 1993 Jun 3; 363(6428):446〜8頁、「Naturally occuring antibodies devoid of light chains」、Hamers-Casterman C、Atarhouch T、Muyldermans S、Robinson G、Hamers C、Songa EB、Bendahman N、Hamers Rを参照されたい)。これらの抗体は、抗原に特異的に結合するように機能し、そのような抗体はラクダ科動物(例えば、ラマ、ラクダ、アルパカ)の血液中に見出されるものと同種である。ヒトVH対を有するそのような抗体を合成的に生成して、治療的および予防的薬剤を提供することができる(例えば、WO1994004678、WO2004041862、WO2004041863を参照されたい)。トランスジェニックマウスもまた、そのような重鎖抗体を生成することができ、抗体のin vivoでの生成により、マウスの免疫系はヒトVH-VH対形成を選択することができ、時には、マウスを対形成に適応させることにより、突然変異がin vivoで導入されたそのような対形成を選択することができる(WO2010109165A2)。かくして、本発明の実施形態においては、重鎖トランスジーンはCH1遺伝子セグメントを含まず、ゲノムは機能的抗体軽鎖遺伝子座を含まない。あるいは、試験抗体は、定常領域とヒト可変領域とを含む抗体セグメント、例えば、FabまたはFab2である。
【００１７】
本文を通して、および本発明の任意の構成、態様、実施形態または実施例への適用に関して、非ヒト脊椎動物または細胞に関連する用語「内因性」(例えば、内因性定常領域)は、定常領域が脊椎動物または細胞中に通常見出される型の定常領域であることを示す(配列がそのような脊椎動物または細胞中には通常見出されない外因性定常領域とは対照的である)。
【００１８】
試験抗体は、前記ヒトエピトープを担持する抗原を用いる免疫化後に第1のトランスジェニック非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)(抗体生成脊椎動物)から単離される。当業者であれば、例えば、初回および追加免疫化プロトコルを用いる、抗原を用いて免疫するための日常的な方法およびプロトコルに精通しているであろう。好適なプロトコルは、RIMMSである(Hybridoma 1997 Aug; 16(4):381〜9頁、「Rapid development of affinity matured monoclonal antibodies using RIMMS」、Kilpatrickらを参照されたい)。抗体生成脊椎動物は、前記可変領域をコードする1つまたは複数のトランスジェニック抗体遺伝子座を含む。好適な非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)は当技術分野で公知であり、例えば、WO2011004192、米国特許第7,501,552号、米国特許第6,673,986号、米国特許第6,130,364号、WO2009/076464および米国特許第6,586,251号(これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい。一例においては、抗体生成脊椎動物は、129マウスの遺伝的バックグラウンドを有するマウスである。一例においては、アッセイ脊椎動物は、129マウスの遺伝的バックグラウンドを有するマウスであり、例えば、抗体生成脊椎動物と同じ遺伝的バックグラウンドであるが、ヒト標的ノックインを有するマウスである。一例においては、抗体生成脊椎動物は、AB2.1マウスの遺伝的バックグラウンドを有するマウスである。別の例においては、抗体生成脊椎動物は、129株、C57BL/6N、C57BL/6J、129S5、129S7もしくは129Svから選択されるマウス株の遺伝的バックグラウンドまたはJM8、AB2.1もしくはAB2.2細胞から選択される細胞の遺伝的バックグラウンドを有するマウスである。一例においては、バックグラウンドは、マウス129株xC57BL/6株交雑種、例えば、129S7xC57BL/6または129S5xC57BL/6である。一例においては、バックグラウンドは、マウスB6バックグラウンドまたはB6由来バックグラウンドである。
【００１９】
好適な129株の例は、以下の通りである(http://www.informatics.jax.org/mgihome/nomen/strain 129.shtmlも参照されたい)
129株の命名
129P1
129P2
129P3
129X1
129S1
129S1
129S2
129S4
129S5
129S6
129S7
129S8
129T1
129T2
129T2。
【００２０】
トランスジェニック脊椎動物は、免疫遺伝子レパートリー(例えば、内因性免疫遺伝子レパートリー)によりコードされるタンパク質を含む免疫系を有し、前記免疫遺伝子レパートリーは前記トランスジェニック抗体遺伝子座および免疫系機能(例えば、ヒト標的エピトープに対する抗体生成脊椎動物の免疫化に対する免疫応答を提供すること)のための遺伝子を含む。一実施形態において、免疫遺伝子レパートリーは、内因性免疫遺伝子レパートリー(すなわち、用いた非ヒト脊椎動物の株にとって内因性である)である。例えば、抗体生成脊椎動物が129、C57BL/6N、C57BL/6J、JM8、AB2.1、AB2.2、129S5、129S7または129Svから選択されるマウス株または細胞の遺伝的バックグラウンドを有するマウスである場合、そのマウスは前記遺伝的バックグラウンドおよび前記トランスジェニック抗体遺伝子座により提供される免疫遺伝子レパートリーを有する。かくして、当業者であれば、抗体生成脊椎動物およびアッセイ脊椎動物の両方を作製するための適切な出発株、細胞または種(例えば、5、4、3、2または1世代以下離れた同じ細胞系または細胞)を選択することができ、そうすることにおいて、所望の免疫遺伝子レパートリーが両脊椎動物について提供される。一実施形態においては、マウスゲノムが、マウス定常領域の上流(5'側)に動作可能に接続されたヒト可変領域(ヒトVH、DおよびJH遺伝子セグメントを有する)を含むトランスジェニックIgH遺伝子座(場合により、ホモ接合性状態にある)を含み、場合により、内因性マウス重鎖発現が不活性であることを除いて、免疫遺伝子レパートリーは、野生型129、C57BL/6、B6または本明細書に開示される他のマウス株もしくはマウス細胞のものである。一例においては、ゲノムはまた、マウス定常領域の上流(5'側)に動作可能に接続されたヒト可変領域(ヒトVκおよびJκ遺伝子セグメントを有する)を含むトランスジェニックIgκ遺伝子座(場合により、ホモ接合性状態にある)を含み、場合により、内因性マウスカッパ鎖発現は不活性である。一例においては、ゲノムはまた、マウス定常領域の上流(5'側)に動作可能に接続されたヒト可変領域(ヒトVλおよびJλ遺伝子セグメントを有する)を含むトランスジェニックIgλ遺伝子座(場合により、ホモ
接合性状態にある)を含み、場合により、内因性マウスラムダ鎖発現は不活性である。かくして、一実施形態においては、マウス重鎖(ならびにカッパおよび/またはラムダ鎖)発現が不活化されており、ゲノムが本発明のように前記トランスジェニックIg遺伝子座および内因性標的ノックアウト(およびまた場合により、ヒト標的ノックイン)を含むことを除いて、本発明の脊椎動物は、野生型129、C57BL、B6または他のマウス株ゲノムを含む。かくして、内因性調節および制御機構ならびに脊椎動物における免疫応答を生成し、調節する機能を有するタンパク質は、免疫化に応答してヒト可変領域を有するキメラ抗体鎖の生成のために保持される。
【００２１】
一実施形態においては、抗体生成脊椎動物は、アッセイ脊椎動物の遺伝的親または祖父母である。一実施形態においては、脊椎動物は、(a)きょうだい、(b)親および子、(c)親および孫、(d)いとこまたは(e)おじ/おばおよび甥/姪として関連する。抗体生成脊椎動物のゲノムを用いる方法において脊椎動物を育種(交配)することにより、これは達成される。この目的のために、本発明はまた、アッセイ脊椎動物を作製するための方法も提供し、これは以下でさらに詳細に説明される。
【００２２】
一実施形態においては、アッセイ脊椎動物は、前記抗体生成脊椎動物の体細胞から誘導される；場合により、アッセイ脊椎動物は、前記抗体生成脊椎動物から誘導されたIPS細胞(誘導多能性幹細胞)から誘導される。IPS技術および好適な方法に関する指針を提供するWO2007069666、WO2008118820、WO2008124133、WO2008151058、WO2009006997およびWO2011027180(これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい。また、IPS細胞を、標準的な方法を用いて抗体トランスジーンを担持する非ヒト脊椎動物(例えば、マウス)に由来する他の体細胞から直接作製することもできる(すなわち、育種する必要がない)。ES細胞誘導の実例は、以下の実施例に提供される。
【００２３】
本発明の方法は、前記第1のトランスジェニック非ヒト脊椎動物(すなわち、抗体生成脊椎動物)の改変型である第2のトランスジェニック非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)(アッセイ脊椎動物)を提供するステップであって、アッセイ脊椎動物が、
(i)抗体生成脊椎動物と実質的に同じ(または同じ)免疫遺伝子レパートリーを含む免疫系；
(ii)アッセイ脊椎動物が前記ヒトエピトープを担持する抗原を発現することができるような、前記ヒトエピトープのノックインを含むゲノム
を含み；
(iii)場合により、前記ゲノムが、前記ヒトエピトープのオルソログまたはホモログである内因性非ヒト脊椎動物エピトープのノックアウトを有し、前記アッセイ脊椎動物が前記内因性エピトープを担持する抗原を発現することができない、ステップを含む。
【００２４】
一態様においては、抗体生成脊椎動物とアッセイ脊椎動物は、アッセイ脊椎動物ゲノムが前記ノックインを含むことを除いて、同一であるか、または実質的に同一である。
【００２５】
かくして、抗体生成脊椎動物がマウスである場合、アッセイ脊椎動物もマウス、例えば、抗体生成脊椎動物と同じ遺伝的バックグラウンドのマウスである(ノックインおよび場合によるノックアウトを除く)。かくして、一実施形態においては、抗体生成脊椎動物とアッセイ脊椎動物は、129遺伝的バックグラウンドを有する。別の実施形態においては、脊椎動物はAB2.1遺伝的バックグラウンドを有する。さらに別の実施形態においては、脊椎動物は、C57BLバックグラウンドを有する。さらなる実施形態においては、脊椎動物はJM8バックグラウンドを有する。
【００２６】
かくして、抗体生成脊椎動物がラットである場合、アッセイ脊椎動物もラット、例えば、抗体生成脊椎動物と同じ遺伝的バックグラウンドのラットである(ノックインおよび場合によるノックアウトを除く)。
【００２７】
一態様においては、抗体生成脊椎動物およびアッセイ脊椎動物のゲノムは、前記ノックアウトを含む。これは、例えば、内因性オルソログ/ホモログエピトープまたは標的タンパク質が、ヒト標的またはエピトープと構造的またはエピトープ的に類似する場合に有用である。オルソログ/ホモログ発現をノックアウトすることにより、抗体生成脊椎動物に注入されたヒトエピトープ/標的に対してのみ、対象の試験抗体が生成され、オルソログ/ホモログ(すなわち、間違った標的)に対して生じた抗体の単離が回避される。有利には、この標的発現プロフィールは、オルソログ/ホモログがそのモデルにおいてもノックアウトされた場合にアッセイ脊椎動物中で再現される。
【００２８】
かくして、一実施形態においては、抗体生成脊椎動物は、前記ヒトエピトープのオルソログまたはホモログであるエピトープのノックアウトを有する。さらに、またはあるいは、一実施形態においては、アッセイ脊椎動物は、前記ヒトエピトープのオルソログまたはホモログであるエピトープのノックアウトを有する。
【００２９】
さらに、本発明において、抗体生成脊椎動物とアッセイ脊椎動物は両方とも、同じ型のヒト可変領域および定常領域を有する抗体を生成する(例えば、脊椎動物は両方ともマウスであり、トランスジェニック遺伝子座はヒト可変領域およびマウス定常領域、例えば、脊椎動物を作製するのに用いられたマウスの株に対して内因性である定常領域を有するキメラ抗体をコードする)。かくして、アッセイ脊椎動物に注入された試験抗体は、その脊椎動物に対して外来のものとして見られず、アッセイ脊椎動物の免疫系によって実質的に免疫学的に拒絶されないか、または攻撃されない。さらに、アッセイ脊椎動物は、「自己」抗原としてヒトエピトープまたは標的を発現し、かくして、マウスの免疫系はアッセイマウスの免疫系の発生中にこの抗原に対して寛容性になっている。これにより、アッセイ脊椎動物自身により生成される任意の抗ヒトエピトープ/標的抗体によるアッセイのin vivoでの干渉が最小化され、それによって、アッセイ脊椎動物中への導入後の試験抗体の効果および/または挙動のより効率的で正確な評価が可能になる。かくして、本発明は、脊椎動物と試験抗体の免疫特性を一致させ、ノックインの存在下でヒトエピトープまたは標的抗原を寛容するアッセイ脊椎動物の能力を利用する。これは、以前に可能であったものよりも優れた試験抗体のin vivoでの前臨床および臨床評価を提供する。
【００３０】
一実施形態においては、アッセイ脊椎動物のトランスジェニック抗体遺伝子座は、ヒト可変および定常領域遺伝子セグメントを含むヒト抗体遺伝子座である。場合により、試験抗体はヒト可変および定常領域を含むヒト抗体であり、これは本実施形態のアッセイ脊椎動物に投与される。場合により、試験抗体は、トランスジェニック抗体遺伝子座がヒト可変および定常領域遺伝子セグメントを含むヒト抗体遺伝子座である抗体生成脊椎動物中で生成される。かくして、モデル動物と試験抗体は、本発明のように一致する。
【００３１】
当業者であれば、胚性幹細胞(ES細胞)中で非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)ゲノムを操作するための従来の技術、ならびにノックイン遺伝子(すなわち、ES細胞のゲノム中に所望の遺伝子を挿入する)およびノックアウト遺伝子(すなわち、ES細胞のゲノムから遺伝子を欠失させる)への適用に精通しているであろう。部位特異的組換え(例えば、Cre/Lox、Frt/Flp、Dre/Roxなどを用いる)および相同組換えなどの手段が標準的である。例えば、およびバックグラウンドとして、ノックアウトマウスの構築について、遺伝子標的化ベクターを構築して、胚性幹細胞中の遺伝子の特定のエクソンを欠失させることができると説明している、New England Journal of Medicine 2007 Dec 13;357(24):2426〜9頁、「Knock out, knock in, knock down -- genetically manipulated mice and the Nobel Prize」、Manis JPを参照されたい。標的遺伝子のいずれかの側の数キロベースのDNAを、薬剤選択マーカーの周囲にクローニングする。クローニングされたDNA(標的化ベクター)を幹細胞に導入した後、陽性および陰性薬剤選択を培養物中で行う。例えば、陽性薬剤選択遺伝子にフランキングするloxP配列を用いて標的化ベクターを構築する。Creリコンビナーゼは、loxP部位間のDNA配列を欠失させることによって、胚性幹細胞中の特定の遺伝子を欠失させることができる。ノックインマウスは、内因性DNA(例えば、内因性標的オルソログ/ホモログ)の同時的欠失を含むか、または含まない対象のDNA(例えば、ヒト標的DNA)の生成された挿入であってもよい。後者については、遺伝子標的化戦略は、置きかえDNAが内因性DNAと交換される点を除いて、ノックアウトマウスのために用いられるものと同様である。Cre-loxP戦略は、標的化ベクターの多くの痕跡を欠失させることができる。一度所望の幹細胞クローンが選択されたら、それを胚盤胞(例えば、マウスC57BL、JM8または129株のもの)中に注入し、これを育ての母親(例えば、マウス母親)の子宮に埋込む。遺伝子標的化された幹細胞がキメラマウス中の生殖細胞に寄与する場合、その後の子孫は遺伝子標的化された突然変異(生殖系列伝達が達成されている)を担持するであろう。子孫間で任意選択のその後の育種を実行して、標準のようにノックインおよびノックアウトを同型接合性まで育種することができる。
【００３２】
任意の態様による本発明のアッセイ脊椎動物において、脊椎動物は第2のヒトノックインヌクレオチド配列を含み、第2の配列は第2のヒトタンパク質をコードする。場合により、第2のヒトタンパク質は、第1のヒトエピトープ/標的を含むカスケードの一部である。場合により、第1および第2のヒトエピトープ/標的は、ヒトリガンドおよび受容体、例えば、ヒトCD40リガンドおよびヒトCD40として関連する。アッセイ生成脊椎動物の免疫化はヒトCD40リガンドまたはCD40を用いるものであってよく、得られた単離抗体(またはその誘導体)を、ヒトCD40リガンドとヒトCD40の両方のノックインを担持するアッセイ脊椎動物において試験することができる。かくして、アッセイ脊椎動物の一実施形態においては、第1のエピトープはヒトCD40リガンドまたはヒトCD40である。
【００３３】
抗体生成脊椎動物から単離された試験抗体を、未改変の形態でアッセイ脊椎動物中に導入(例えば、注入)することができる。あるいは、試験抗体を、例えば、標識もしくは毒素、PEGもしくは他の部分の付加(化学的コンジュゲーションなどによる)により誘導体化した後、アッセイ脊椎動物中に導入することができる。誘導体化は、例えば、試験抗体から開発しようとする薬剤に対してさらなる官能性を付加することが望ましい場合に有用である。例えば、がん適応のためには、細胞殺傷を補助するさらなる部分を付加することが望ましい場合がある。別の実施形態においては、抗体生成脊椎動物から単離された抗体の可変領域を、in vivoまたはin vitroで親和性成熟させ(例えば、ファージ展示、リボソーム展示、酵母展示などによる)、成熟した試験抗体をアッセイ脊椎動物中に導入する。別の実施形態においては、抗体生成脊椎動物から単離された抗体の定常領域を、in vivoまたはin vitroで突然変異させ(例えば、無作為または部位特異的突然変異およびファージ展示、リボソーム展示、酵母展示などによる任意の選択による)、成熟した試験抗体をアッセイ脊椎動物中に導入する。定常領域を突然変異させて、Fc機能(例えば、ADCC)を除去または増強することができる。かくして、誘導体化された、および/または突然変異された抗体は、この文脈において「試験抗体」であると考えられる。定常領域をヒト化することができる(すなわち、ヒト可変領域および非ヒト定常領域を有するアッセイ生成脊椎動物からキメラ抗体が単離される場合、後者をヒト定常領域に交換し、得られるヒト抗体をアッセイ脊椎動物中に導入することができる)。
【００３４】
本発明の方法は、前記アッセイ脊椎動物における前記抗体の効果または挙動をアッセイするステップを必要とする。例えば、前記アッセイするステップは、前記抗体(またはアッセイ脊椎動物により生成されたその代謝物もしくは誘導体)の薬力学、前記抗体(またはアッセイ脊椎動物により生成されたその代謝物もしくは誘導体)の薬物動態、前記抗体(またはアッセイ脊椎動物により生成されたその代謝物もしくは誘導体)の活性、前記抗体(またはアッセイ脊椎動物により生成されたその代謝物もしくは誘導体)のクリアランス、前記抗体(またはアッセイ脊椎動物により生成されたその代謝物もしくは誘導体)の分布、前記抗体(またはアッセイ脊椎動物により生成されたその代謝物もしくは誘導体)の毒性、前記抗体(またはアッセイ脊椎動物により生成されたその代謝物もしくは誘導体)の物理化学的特性または効果、前記抗体(またはアッセイ脊椎動物により生成されたその代謝物もしくは誘導体)の結合特性、前記抗体(またはアッセイ脊椎動物により生成されたその代謝物もしくは誘導体)の生物学的特性または効果、前記抗体(またはアッセイ脊椎動物により生成されたその代謝物もしくは誘導体)の生理学的特性または効果、前記抗体(またはアッセイ脊椎動物により生成されたその代謝物もしくは誘導体)の薬学的特性または効果、およびアッセイ脊椎動物内の別のタンパク質または物質との前記抗体(またはアッセイ脊椎動物により生成されたその代謝物もしくは誘導体)の相互作用からなる群から選択される1つまたは複数のアッセイである。そのようなアッセイは、当業者には周知である。例えば、前記アッセイするステップは、試験抗体の免疫原性のアッセイである。
【００３５】
本発明は、
(i)ヒト可変領域をコードする1つまたは複数のトランスジェニック抗体遺伝子座;
(ii)前記トランスジェニック抗体遺伝子座を含む免疫遺伝子レパートリーによりコードされるタンパク質を含む免疫系;
(iii)アッセイ脊椎動物がヒトエピトープを担持する抗原を発現することができるような、前記ヒトエピトープのノックインを含むゲノム;および
(iv)前記ヒトエピトープのオルソログまたはホモログである内因性非ヒト脊椎動物エピトープのゲノムノックアウトであって、前記アッセイ脊椎動物が前記内因性エピトープを担持する抗原を発現することができない、ゲノムノックアウト;ならびに
(v)場合により、前記ヒトエピトープに結合することができるヒト可変領域を含み、上記に記載の抗体生成脊椎動物中で生成された(場合により、前記抗体を生成するためのその後の誘導体化または成熟化を含む)、前記アッセイ脊椎動物内の試験抗体
を含む、非ヒト(例えば、マウスまたはラット)アッセイ脊椎動物を提供する。
【００３６】
脊椎動物、エピトープ、標的、ノックイン、ノックアウト、試験抗体、免疫遺伝子レパートリーの様々な態様および本明細書に記載の全ての他の態様は、アッセイ脊椎動物自体を提供する本発明のこの構成にも適用される。
【００３７】
一実施形態においては、本発明の任意の態様のトランスジェニック抗体遺伝子座は、WO2011004192、米国特許第7,501,552号、米国特許第6,673,986号、米国特許第6,130,364号、WO2009076464および米国特許第6,586,251号(これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる)のいずれかに記載の遺伝子座に従う。一例においては、抗体生成脊椎動物は、
(a)内因性非ヒト脊椎動物(例えば、内因性マウスまたはラット)定常領域(例えば、Cミューおよび/またはCガンマ)の上流に1つまたは複数のヒト重鎖V遺伝子セグメント、1つまたは複数のヒト重鎖D遺伝子セグメントおよび1つまたは複数のヒト重鎖JH遺伝子セグメントを含む重鎖遺伝子座;
(b)内因性非ヒト脊椎動物(例えば、内因性マウスまたはラット)カッパ定常領域の上流に1つまたは複数のヒトカッパ鎖V遺伝子セグメントおよび1つまたは複数のヒトカッパ鎖JK遺伝子セグメントを含むカッパ軽鎖遺伝子座;ならびに場合により、
(c)ラムダ定常領域の上流に1つまたは複数のヒトラムダ鎖V遺伝子セグメントおよび1つまたは複数のヒトラムダ鎖Jλ遺伝子セグメントを含むラムダ軽鎖遺伝子座
を含み；
(d)脊椎動物は、前記遺伝子座の再配置およびヒトエピトープまたは標的を用いる免疫化後に、キメラ試験抗体を生成することができる。
【００３８】
場合により、内因性重鎖およびカッパ鎖発現は不活性である。一実施形態においては、内因性ラムダ鎖発現も不活性である。
【００３９】
その代わりにまたはそれに加えて、アッセイ脊椎動物は、
(a)内因性非ヒト脊椎動物(例えば、内因性マウスまたはラット)定常領域(例えば、Cミューおよび/またはCガンマ)の上流に1つまたは複数のヒト重鎖V遺伝子セグメント、1つまたは複数のヒト重鎖D遺伝子セグメントおよび1つまたは複数のヒト重鎖JH遺伝子セグメントを含む重鎖遺伝子座；
(b)内因性非ヒト脊椎動物(例えば、内因性マウスまたはラット)カッパ定常領域の上流に1つまたは複数のヒトカッパ鎖V遺伝子セグメントおよび1つまたは複数のヒトカッパ鎖JK遺伝子セグメントを含むカッパ軽鎖遺伝子座；ならびに場合により、
(c)ラムダ定常領域の上流に1つまたは複数のヒトラムダ鎖V遺伝子セグメントおよび1つまたは複数のヒトラムダ鎖Jλ遺伝子セグメントを含むラムダ軽鎖遺伝子座
を含み；
(d)アッセイ脊椎動物はキメラ抗体を生成することができ；
(e)場合により、前記アッセイ脊椎動物遺伝子座が、前記抗体生成脊椎動物遺伝子座(場合により、前記脊椎動物の一方または両方における遺伝子座が再配置された)と実質的に同じヒト抗体遺伝子セグメントのレパートリーを含み、
(f)場合により、内因性重鎖およびカッパ鎖発現が不活性である。一実施形態においては、内因性ラムダ鎖発現も不活性である。
【００４０】
本発明は、場合により、本明細書に記載の試験抗体をも含むキットの一部としての、本明細書に記載の抗体生成脊椎動物を提供する。
【００４１】
本発明は、本明細書で定義された抗体生成脊椎動物およびアッセイ脊椎動物ならびに場合により、試験抗体(またはその誘導体)を含むアッセイキットを提供する。一例においては、試験抗体は、前記抗体生成脊椎動物またはアッセイ脊椎動物から5、4、3、2もしくは1世代以下離れたその親類から単離されたものであり、実質的に同じ免疫遺伝子レパートリーを含む。
【００４２】
本発明のキットは、一態様において、本明細書に記載のアッセイ脊椎動物を用いる試験抗体の投与を指示する指示書を含む。
【００４３】
本発明は、ヒト可変領域を含み、ヒトエピトープに結合する試験抗体の効果または挙動をアッセイするための非ヒトアッセイ脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)を作製する方法であって、
(a)ゲノムが前記試験抗体をコードする抗体生成脊椎動物から誘導されたES細胞を提供するステップであって、抗体生成脊椎動物が、ヒト可変領域を含む抗体をコードする1つまたは複数のトランスジェニック抗体遺伝子座を含み、抗体生成脊椎動物が、免疫遺伝子レパートリーによりコードされるタンパク質を含む免疫系を有し、前記免疫遺伝子レパートリーが前記トランスジェニック抗体遺伝子座を含む、ステップ;
(b)ES細胞のゲノム中に、前記ヒトエピトープをコードするヌクレオチド配列を導入し、場合により、ゲノムから、前記ヒトエピトープのオルソログまたはホモログである内因性非ヒト脊椎動物エピトープをノックアウトするステップ;および
(c)前記改変されたES細胞から非ヒト子脊椎動物を発生させ、前記ヒトエピトープを発現するアッセイ脊椎動物を得るステップ;ならびに
(d)場合により、前記アッセイ脊椎動物の子孫を生成するステップであって、前記子孫が、ヒトエピトープノックイン(および場合によりノックアウト)に加えて前記アッセイ脊椎動物と実質的に同じ免疫遺伝子レパートリーを含み、場合により、前記子孫が、ノックインされたヒトエピトープをコードする前記ヌクレオチド配列にとってホモ接合性である(さらに、場合により、ノックアウトされたオルソロガスまたは相同なエピトープにとってホモ接合性である)、ステップ
を含む、方法を提供する。
【００４４】
実施例は、抗体生成脊椎動物から誘導されたES細胞を取得する方法を例示する。
【００４５】
本発明は、ヒト可変領域を含み、ヒトエピトープに結合する試験抗体の効果または挙動をアッセイするための非ヒトアッセイ脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)を作製する方法であって、
(a)ゲノムが(i)ゲノムが前記試験抗体をコードする非ヒト抗体生成脊椎動物である第1の遺伝的親のゲノムであって、抗体生成脊椎動物がヒト可変領域を含む抗体をコードする1つまたは複数のトランスジェニック抗体遺伝子座を含み、抗体生成脊椎動物が免疫遺伝子レパートリーによりコードされるタンパク質を含む免疫系を有し、前記免疫遺伝子レパートリーが前記トランスジェニック抗体遺伝子座を含む、第1の遺伝的親のゲノムと、(ii)前記抗体生成脊椎動物と同じ種(場合により、同じ株または細胞バックグラウンド、例えば、マウス株129、C57BL/6N、C57BL/6J、JM8、AB2.1、AB2.2、129S5、129S7または129Sv)の非ヒト脊椎動物である第2の遺伝的親のゲノムであって、第2の親が、第1の親と実質的に同じ免疫遺伝子レパートリーによりコードされる免疫系を有する、第2の遺伝的親のゲノムとの間の遺伝的交配である、非ヒト脊椎動物子ES細胞を取得するステップ；
(b)子ES細胞のゲノム中に、前記ヒトエピトープをコードするヌクレオチド配列を導入し、場合により、ゲノムから、前記ヒトエピトープのオルソログまたはホモログである内因性非ヒト脊椎動物エピトープをノックアウトすることにより、ヒトエピトープのノックインを含む改変された子ES細胞をin vitroで生成するステップ;および
(c)前記改変された子ES細胞から非ヒト子脊椎動物を発生させ、前記ヒトエピトープを発現するアッセイ脊椎動物を得るステップ;ならびに
(d)場合により、遺伝的交配により前記アッセイ脊椎動物の子孫を生成するステップであって、前記子孫が、ヒトエピトープノックイン(および場合により、ノックアウト)に加えて前記アッセイ脊椎動物と実質的に同じ免疫遺伝子レパートリーを含む、ステップ
を含む、方法を提供する。
【００４６】
第1(およびまた場合により、第2)の親は、一態様においては、本明細書に記載の任意の抗体生成脊椎動物である。ステップ(a)を、例えば、得られる胚における遺伝的交配を達成するための親間での育種を用いることにより実施することができる。非ヒト子ES細胞を、ES細胞作製のための任意の標準的な技術を用いて胚(例えば、胚盤胞段階)から作製することができる。例えば、Proc Natl Acad Sci 1997 May 27;94(11):5709〜12頁、「The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse」、Brook FA & Gardner RL(この開示は参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい。他の標準的なES細胞作製技術を用いることもできる。以下の例示的な非限定的実施例も参照されたい。
【００４７】
ノックインおよびノックアウト技術は上記で考察されており、これらの方法のいずれかを用いて、ステップ(b)を行うことができる。
【００４８】
ES細胞技術に精通した当業者であれば、in vitroで操作されたトランスジェニックES細胞から子を発生させる方法を容易に知ることができる。例えば、ステップ(b)で得られた非ヒトES細胞を、ドナー胚盤胞(例えば、ES細胞と同じ脊椎動物の株の胚盤胞)に埋込む。次いで、胚盤胞を、育ての母親に埋込み、そこでそれを子に発生させる(アッセイ脊椎動物)。この方法で、それぞれ対応する改変された子ES細胞に由来する複数の子を発生させることができる。きょうだいを一緒に育種して交配を達成し、ヒトノックイン(および場合によりノックアウト)についてホモ接合性である1つまたは複数の得られるアッセイ脊椎動物を提供することができる。あるいは、ノックイン(およびまた場合によりノックアウト)についてヘテロ接合性であるアッセイ脊椎動物を提供することができる。ホモ接合性またはヘテロ接合性アッセイ脊椎動物を用いて、本発明の方法において試験抗体をアッセイすることができる。
【００４９】
一例においては、第1および第2の遺伝的親(a)(i)および(ii)は、同じ非ヒト脊椎動物(例えば、マウスもしくはラット)株または細胞バックグラウンドのものである。
【００５０】
一例においては、第1および第2の遺伝的親は、(a)きょうだい、(b)親および子、(c)親および孫、(d)いとこまたは(e)おじ/おばおよび甥/姪として関連する。
【００５１】
本発明はまた、ヒト可変領域を含み、ヒトエピトープに結合する試験抗体の効果または挙動をアッセイするための非ヒトアッセイ脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)を作製する方法であって、
(a)ゲノムが前記試験抗体をコードする非ヒト抗体生成脊椎動物の体細胞(場合により、ES細胞がIPS細胞である)から非ヒト脊椎動物子ES細胞を取得するステップであって、抗体生成脊椎動物が、ヒト可変領域を含む抗体をコードする1つまたは複数のトランスジェニック抗体遺伝子座を含み、抗体生成脊椎動物が、免疫遺伝子レパートリー(例えば、内因性免疫遺伝子レパートリー)によりコードされるタンパク質を含む免疫系を有し、前記免疫遺伝子レパートリーが前記トランスジェニック抗体遺伝子座を含む、ステップ；
(b)子ES細胞のゲノム中に、前記ヒトエピトープをコードするヌクレオチド配列を導入し、場合により、ゲノムから、前記ヒトエピトープのオルソログまたはホモログである内因性非ヒト脊椎動物エピトープをノックアウトすることにより、ヒトエピトープのノックインを含む改変された子ES細胞を生成するステップ;および
(c)前記改変された子ES細胞から非ヒト子脊椎動物を発生させ、前記ヒトエピトープを発現するアッセイ脊椎動物を得るステップ;ならびに
(d)場合により、遺伝的交配により前記アッセイ脊椎動物の前記子孫を生成するステップであって、前記子孫が、ヒトエピトープノックイン(および場合により、ノックアウト)に加えて前記アッセイ脊椎動物と実質的に同じ免疫遺伝子レパートリーを含む、ステップ
を含む、方法も提供する。
【００５２】
本発明の方法において用いられる抗体生成脊椎動物は、一実施形態においては、本明細書に記載の任意の抗体生成脊椎動物である。ステップ(a)を、例えば、抗体生成脊椎動物と、同じ種の第2の脊椎動物(例えば、実質的に同じ免疫レパートリーおよび/または実質的に同じ遺伝的バックグラウンドを有する別の抗体生成脊椎動物)との間での育種を用いて実施して、得られる胚を生成することができる。マウス胚線維芽細胞を胚から作製した後、任意の標準的な技術を用いてIPS細胞を作製することができる。例えば、Proc Natl Acad Sci; 2011 Oct 11、「Rapid and efficient reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells by retinoic acid receptor gamma and liver receptor homolog 1」、Wangら(この開示は参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい。他の標準的なIPS作製技術を用いることもできる。
【００５３】
ノックインおよびノックアウト技術は上記で考察されており、これらの方法のいずれかを用いて、ステップ(b)を行うことができる。
【００５４】
一実施形態においては、IPS細胞は、マウス胚性線維芽細胞である。
【００５５】
ヒト標的およびエピトープDNA
ヒト標的またはエピトープをコードするDNAは、例えば、ヒトドナーの血液または組織試料に由来するDNAをクローニングすることにより得られた任意の好適な供給源に由来するものであってよい。一実施形態においては、ヒトエピトープまたは標的をコードするcDNAが用いられる。別の実施形態においては、ゲノムDNA、例えば、ヒト標的のための遺伝子が用いられる。一例においては、ヒト標的のためのコード配列が、内因性ヒトシグナル配列(存在する場合)およびプロモーター(および場合により、遺伝子の任意のエンハンサー)と一緒に用いられる。
【００５６】
ヒトDNAは、商業的および学術的ライブラリー、例えば、ヒトDNAを含むBacterial Artificial Chromosome(BAC)ライブラリーから容易に取得可能である。例は、ヒトRPCI-11および-13ライブラリー(Osoegawaら、2001、下記参照；http://bacpac.med.buffalo.edu/11framehmale.htm)およびまた、「CalTech」、ヒトBACライブラリー(CalTech Libraries A、B、Cおよび/またはD、http://www.tree.caltech.edu/lib status.html)である。
【００５７】
CalTechヒトBACライブラリーD：
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clone/library/genomic/16/を参照されたい。
【００５８】
California Institute of TechnologyのHiroaki Shizuya研究室は、3つの異なるヒトBACライブラリー(Open Biosystemsから取得可能)を開発した。Cal Tech B(CTB)およびCal Tech C(CTC)ライブラリーは共に、15Xのゲノムカバー率である。Cal Tech D(CTD)ライブラリーはヒトゲノムの17Xのカバー率である。全集合ならびに個々のクローンが利用可能である。ライブラリーの構築に関する詳細な情報は、http://informa.bio.caltech.edu/idx www tree.htmlに見出すことができる。
【００５９】
ライブラリーの概要
ライブラリー名:CalTechヒトBACライブラリーD
ライブラリー省略形:CTD
生物:ホモサピエンス
販売業者:Invitrogen、Open Biosystems
ベクター型:BAC
クローン番号Clone DB:226,848
末端配列番号Clone DB:403,688
挿入配列番号Clone DB:3,153
両端が配列決定されたクローン番号:153,035
【００６０】
ライブラリーの詳細
【００６１】
【表１】
2015502142.tif 000002
【００６２】
RPCI-11 BAC
参考文献
・Osoegawa K、Mammoser AG、Wu C、Frengen E、Zeng C、Catanese JJ、de Jong PJ; Genome Res. 2001 Mar;11(3):483〜96頁、「A bacterial artificial chromosome library for sequencing the complete human genome」;
・Osoegawa, K.、Woon, P.Y.、Zhao, B.、Frengen, E.、Tateno, M.、Catanese, J.J、およびde Jong, P.J.(1998)、「An Improved Approach for Construction of Bacterial Artificial Chromosome Libraries」、Genomics 52、1〜8頁;
・http://bacpac.chori.org/hmale11.htm(以下のようなBACを記載する)。
【００６３】
RPCI-11ヒト男性BACライブラリー
RPCI-11ヒト男性BACライブラリー(Osoegawaら、2001)を、Kazutoyo Osoegawaにより開発された改良クローニング技術(Osoegawaら、1998)を用いて構築した。ライブラリーを、Kazutoyo Osoegawaにより作製した。構築は、National Human Genome Research Institute (NHGRI、NIH)(#1R01RG01165-03)からの助成により資金提供された。このライブラリーは、新しいNHGRI/DOE「Guidance on Human Subjects in Large-Scale DNA Sequencing」に従って作製された。
【００６４】
男性の血液を、二重盲検選択プロトコルにより取得した。男性血液のDNAを、1人の無作為に選択されたドナー(10人の男性ドナーのうち)から単離し、EcoRIとEcoRIメチラーゼの組合せを用いて部分消化した。サイズ選択されたDNAを、EcoRI部位の間でpBACe3.6ベクター中にクローニングした。セグメント5について、同じ男性ドナーのDNAをMboIで部分消化し、サイズ選択し、BamHI部位でpTARBAC1クローニングベクター中にライゲートした。ライゲーション生成物を、DH10Bエレクトロコンピテント細胞(BRL Life Technologies)中に形質転換した。ライブラリーを384穴マイクロタイター皿中でアッセイし、また、プローブハイブリダイゼーションによるスクリーニングのために22x22cmナイロン高密度フィルター上にグリッド化した。
【００６５】
RPCIヒト男性BACライブラリー:
【００６６】
【表２】
2015502142.tif 000003
【００６７】
【表３】
2015502142.tif 000004
【００６８】
平均挿入サイズを、それぞれのセグメントに由来するプレートから無作為に選択されたクローンのパルスフィールドゲル電気泳動分析により決定した。
【００６９】
BACの入手可能性
RP11 BACは、Invitrogenから購入のために入手可能である(http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/bac clones man.pdfを参照されたい)。
【００７０】
BACまたはPACなどのベクターを、標準的な分子生物学技術、例えば、組換え工学(http://www.genebridges.com; EP129142およびEP1204740を参照されたい)によりin vitroで操作することができる。例えば、組換え工学を用いて、対象のヒト標的またはエピトープをコードするヌクレオチド配列が1つまたは複数の配列、例えば、相同性アームまたは部位特異的組換え部位(例えば、lox、frtもしくはrox)によりフランキングされたベクターを作出することができる。相同性アームは、一実施形態においては、アッセイ脊椎動物を作製するために用いられる非ヒト脊椎動物のゲノムに由来するDNAのストレッチと相同であるか、または同一である。この方法で作出されたベクターは、ヒトDNAを非ヒト脊椎動物ゲノム中に正確に挿入する(例えば、脊椎動物ゲノム中のオルソロガスまたは相同なDNAを正確に置きかえる)方法において相同組換え(例えば、米国特許第6,638,768号(その開示は参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい)を実施するのに有用である。
【００７１】
他の有用なDNAおよびゲノム操作技術は当業者には容易に利用可能であり、例えば、米国特許第6,461,818号(Baylor College of Medicine)、米国特許第6,586,251号(Regeneron)およびWO2011044050(例えば、実施例を参照されたい)に記載の技術が挙げられる。
【００７２】
ゲノムがトランスジーン、例えば、ヒトV、Jおよび場合により、D領域を含有するトランスジェニック抗体遺伝子座を含む非ヒト脊椎動物および脊椎動物細胞を構築するための技術は、当技術分野で周知である。例えば、WO2011004192、米国特許第7,501,552号、米国特許第6,673,986号、米国特許第6,130,364号、WO2009/076464号および米国特許第6,586,251号(これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
【００７３】
マウスに関する全ヌクレオチド座標は、マウスC57BL/6J株に関するNCBI m37、April 2007 ENSEMBL Release 55.37hに由来する。ヒトヌクレオチドは、GRCh37、Feb 2009 ENSEMBL Release 55.37に由来し、ラットはRGSC 3.4 Dec 2004 ENSEMBL release 55.34wに由来する。
【００７４】
本発明の任意の構成における一実施形態においては、抗体生成脊椎動物および/またはアッセイ脊椎動物は、非ヒト哺乳動物である。本発明の任意の構成における一実施形態においては、抗体生成脊椎動物および/またはアッセイ脊椎動物は、マウス、ラット、ウサギ、ラクダ科動物(例えば、ラマ、アルパカもしくはラクダ)またはサメである。
【００７５】
一態様において、トランスジェニック抗体遺伝子座は、宿主調節配列または他の(非ヒト、非宿主)配列の制御下に置かれたヒトV、Dおよび/またはJコード領域を含む。一態様において、ヒトV、Dおよび／またはJコード領域に対する参照は、ヒトイントロンとエクソンの両方を含むか、または別の態様においては、エクソンのみを含み、イントロンを含まず、それはcDNAの形態にあってもよい。
【００７６】
あるいは、組換え工学、または他の組換えDNA技術を用いて、非ヒト脊椎動物(例えば、マウス)プロモーターまたは他の制御領域、例えば、V領域のためのプロモーターを、ヒトIg領域を含有するBAC中に挿入することができる。次いで、組換え工学工程は、ヒトDNAの一部を、マウスプロモーターまたは他の制御領域の制御下に置く。
【００７７】
本発明はまた、本明細書に記載の細胞もしくは脊椎動物から増殖させたか、またはさもなければそれから誘導された細胞系(例えば、ESまたはIPS細胞系)、例えば、不死化細胞系にも関する。この細胞系を腫瘍細胞への融合により不死化して、抗体生成細胞および細胞系を提供するか、または直接的細胞不死化により作製することができる。
【００７８】
一態様において、本発明の任意の構成の非ヒト脊椎動物は、少なくとも1x106個の異なる機能的キメラ抗体配列組合せの多様性を生成することができる。
【００７９】
場合により、本発明の任意の構成において、定常領域は脊椎動物にとって内因性であり、場合により、内因性スイッチを含む。一実施形態において、定常領域は、Cガンマ(Cγ)領域および/またはSミュー(Sμ)スイッチを含む。スイッチ配列は当技術分野で公知であり、例えば、Nikaidoら、Nature 292: 845-848 (1981)ならびにまた、WO2011004192、米国特許第7501552号、米国特許第6673986号、米国特許第6130364号、WO2009/076464および米国特許第6586251号、例えば、米国特許第7501552号に開示された配列番号9〜24を参照されたい。場合により、定常領域は、内因性Sガンマスイッチおよび/または内因性Sミュースイッチを含む。
【００８０】
一態様において、試験抗体は、宿主脊椎動物中に天然に存在する抗体において見られる1つまたは複数のエフェクター機能を提供する、例えば、それらがFc受容体と相互作用する、および/または補体に結合することができるのに十分な非ヒト脊椎動物宿主定常領域の一部を有する。
【００８１】
したがって、本明細書の非ヒト脊椎動物定常領域を有するキメラ抗体または抗体鎖に対する参照は、完全な定常領域に限定されないが、宿主定常領域の全部、または1つもしくは複数のエフェクター機能を提供するのに十分なその一部を有するキメラ抗体または鎖も含む。これはまた、ヒト可変領域DNAを、それが宿主(内因性)定常領域の全部または一部とのキメラ抗体鎖を形成するように宿主ゲノム中に挿入することができる本発明の非ヒト脊椎動物および細胞および方法にも適用される。一態様においては、宿主非ヒト脊椎動物定常領域の全部が、ヒト可変領域DNAに動作可能に連結される。
【００８２】
本明細書に記載の宿主非ヒト脊椎動物定常領域は、場合により、重鎖または軽鎖にとって適切な場合、野生型遺伝子座に位置する内因性宿主野生型定常領域である。例えば、ヒト重鎖DNAは、脊椎動物がマウスである場合、好適にはマウス重鎖定常領域に隣接して、マウス第12染色体上に好適に挿入される。
【００８３】
脊椎動物がマウスである1つの任意選択の態様において、ヒトVDJ領域などのヒト抗体遺伝子の挿入は、マウスゲノムIgH遺伝子座中のJ4エクソンとCμ遺伝子座の間の領域を標的とし、一態様においては、座標114,667,090と114,665,190の間、好適には、座標114,667,091に挿入される。一態様においては、ヒト軽鎖カッパVJなどのヒト抗体DNAの挿入は、座標70,673,899と70,675,515の間、好適には、位置70,674,734のマウス第6染色体に、または第16染色体上のラムダマウス遺伝子座中の同等の位置を標的とする。
【００８４】
一態様においては、キメラ抗体を形成するための宿主非ヒト脊椎動物定常領域は、異なる(内因性ではない)染色体遺伝子座にあってもよい。この場合、挿入されるヒト抗体DNA、例えば、ヒト可変VDJまたはVJ領域を、天然の重鎖または軽鎖定常領域のものとは異なる部位で非ヒトゲノム中に挿入することができる。天然の定常領域が、本発明のキメラ抗体を依然として生成することができるようにヒト可変領域と機能的な配置にあるように、それをゲノム中に挿入するか、または天然の位置に対して異なる染色体遺伝子座でゲノム内で複製させることができる。
【００８５】
一態様においては、ヒト抗体DNAは、宿主定常領域と宿主VDJ領域の間の野生型遺伝子座に位置する内因性宿主野生型定常領域に挿入される。
【００８６】
非ヒト脊椎動物定常領域の上流の可変領域の位置に対する参照は、可変領域と定常領域が脊椎動物中、in vivoでキメラ抗体または抗体鎖を形成することができる、2つの抗体部分、可変および定常領域の好適な相対的位置が存在することを意味する。かくして、挿入されるヒト抗体DNAおよび宿主定常領域は、抗体または抗体鎖生成のために互いに動作可能な接続にある。
【００８７】
一態様においては、挿入されるヒト抗体DNAは、アイソタイプスイッチングを介して異なる宿主定常領域と共に発現され得る。一態様において、アイソタイプスイッチングは、transスイッチングを必要としないか、または含まない。関連する宿主定常領域と同じ染色体上へのヒト可変領域DNAの挿入は、アイソタイプスイッチングをもたらすためにtransスイッチングが必要ないことを意味する。
【００８８】
本発明においては、場合により、宿主非ヒト脊椎動物定常領域は維持され、少なくとも1つの非ヒト脊椎動物エンハンサーまたは他の制御配列、例えば、スイッチ領域が、非ヒト脊椎動物定常領域と共に機能的な配置に維持され、宿主脊椎動物中に見られるように、エンハンサーまたは他の制御配列の効果がトランスジェニック動物において全体的に、または部分的に発揮されるのが好ましい。この手法は、ヒト遺伝子座の完全な多様性をサンプリングすることを可能にする、エンハンサーなどの非ヒト脊椎動物制御配列により達成され、B細胞におけるシグナリング、例えば、スイッチ組換え部位を用いるアイソタイプスイッチングが依然として非ヒト脊椎動物配列を使用するようなものである同じ発現レベルを可能にするように設計される。
【００８９】
そのようなゲノムを有する非ヒト脊椎動物は、ヒト可変および非ヒト脊椎動物定常領域を含むキメラ抗体を生成するが、これらのものは、例えば、マウス定常領域を対応するヒト定常領域に置きかえるクローニングステップにおいて容易にヒト化される(例えば、キメラ抗体がアッセイ脊椎動物において試験された後)。
【００９０】
一態様において、挿入されたヒトIgH VDJ領域は、生殖系列構成において、ヒトに由来するV、DおよびJ領域の全部ならびに介在配列を含む。場合により、非機能的Vおよび/またはDおよび/またはJ遺伝子セグメントは省略される。例えば、逆転されたか、または偽遺伝子であるVHを省略することができる。
【００９１】
一態様において、800〜1000kbのヒトIgH VDJ領域が非ヒト脊椎動物IgH遺伝子座に挿入され、一態様においては、940、950または960kbのフラグメントが挿入される。好適には、これはヒト第14染色体に由来する塩基105,400,051〜106,368,585を含む(全ての座標は、ヒトゲノムについてはNCBI36、マウス株C57BL/6Jに関して、マウスゲノムについてはENSEMBL Release 54およびNCBIM37を指す)。
【００９２】
一態様において、挿入されるIgHヒトフラグメントは、第14染色体に由来する塩基105,400,051〜106,368,585からなる。一態様においては、第14染色体に由来する塩基105,400,051〜106,368,585からなるDNAなどの、挿入されるヒト重鎖DNAは、マウスJ4領域の末端とEμ領域との間、好適には、座標114,667,091と114,665,190との間、好適には、座標114,667,091でマウス第12染色体中に挿入される。
【００９３】
一態様において、挿入されるヒトカッパVJ領域は、生殖系列構成において、ヒトに由来するVおよびJ領域の全部ならびに介在配列を含む。場合により、非機能的Vおよび/またはJ遺伝子セグメントが省略される。
【００９４】
好適には、これは、ヒト第2染色体に由来する塩基88,940,356〜89,857,000、好適には、約917kbを含む。さらなる態様において、軽鎖VJ挿入物は、VセグメントおよびJセグメントの近位クラスターのみを含んでもよい。そのような挿入物は、約473kbのものである。
【００９５】
一態様において、ヒト軽鎖カッパDNA、例えば、ヒト第2染色体に由来する塩基88,940,356〜89,857,000のヒトIgKフラグメントは、座標70,673,899と70,675,515の間、好適には、位置70,674,734でマウス第6染色体中に挿入される。
【００９６】
一態様において、ヒトラムダVJ領域は、生殖系列構成において、ヒトに由来するVおよびJ領域の全部ならびに介在配列を含む。好適には、これは、ヒト第2染色体に由来する、カッパフラグメントのために選択されたものと類似する塩基を含む。場合により、非機能的Vおよび/またはJ遺伝子セグメントが省略される。
【００９７】
本明細書に記載の全ての特異的ヒト抗体フラグメントは、長さにおいて変化してもよく、例えば、上記で定義されたものよりも長いか、または短いもの、例えば、500塩基、1KB、2K、3K、4K、5KB、10KB、20KB、30KB、40KBまたは50KB以上であってもよく、好適には、ヒトV(D)J領域の全部または一部を含むが、最終挿入物が、適切な場合、本明細書に記載のような完全な重鎖領域および軽鎖領域をコードするヒト遺伝子材料を含む要件を保持するのが好ましい。
【００９８】
一態様において、最終的な挿入されるヒト抗体配列の3'末端、一般的には、最終的なヒトJ配列は、ヒト/非ヒト脊椎動物(例えば、ヒト/マウスまたはヒト/ラット)連結領域から2kb未満、好ましくは1KB未満に挿入される。
【００９９】
場合により、ゲノムは、3つの抗体遺伝子座(IgH、IgλおよびIgκ)のうちの1つ、または両方、または全部においてホモ接合性である。
【０１００】
別の態様において、ゲノムは1つまたは複数の抗体遺伝子座においてヘテロ接合性であってよく、例えば、キメラ抗体鎖および天然(宿主細胞)抗体鎖をコードするDNAについてヘテロ接合性であってよい。一態様において、ゲノムは、例えば、2つの異なるキメラ重鎖または2つの異なるキメラ軽鎖を含む、本発明の免疫グロブリントランスジーンによりコードされる2つの異なる抗体鎖をコードすることができるDNAについてヘテロ接合性であってよい。
【０１０１】
本発明の任意の構成における一実施形態においては、脊椎動物のゲノムは、完全に内因性の抗体の発現を防止するか、または低減させるように改変されている。これを行うための好適な技術の例は、WO2011004192、米国特許第7501552号、米国特許第6673986号、米国特許第6130364号、WO2009/076464、EP1399559、および米国特許第6586251号に見出すことができ、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態においては、内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座の非ヒト脊椎動物VDJ領域、および場合により、内因性軽鎖免疫グロブリン遺伝子座(ラムダおよび/またはカッパ遺伝子座)のVJ領域が不活化されている。例えば、非ヒト脊椎動物VDJ領域の全部または一部は、哺乳動物の内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座における逆転により不活化され、場合により、逆転した領域は内因性Ig遺伝子座の上流または下流に移動する。例えば、非ヒト脊椎動物VJ領域の全部または一部は、哺乳動物の内因性カッパ鎖免疫グロブリン遺伝子座における逆転により不活化され、場合により、逆転した領域は内因性Ig遺伝子座の上流または下流に移動する。例えば、非ヒト脊椎動物VJ領域の全部または一部は、哺乳動物の内因性ラムダ鎖免疫グロブリン遺伝子座における逆転により不活化され、場合により、逆転した領域は内因性Ig遺伝子座の上流または下流に移動する。一実施形態においては、内因性重鎖遺伝子座は、内因性カッパおよびラムダ遺伝子座の一方または両方と同様、この方法で不活化される。
【０１０２】
さらに、またはあるいは、脊椎動物は、成熟宿主BおよびTリンパ球の生成を防止する遺伝的背景、場合により、RAG-1欠損および/またはRAG-2欠損背景で作製されたものである。RAG-1欠損動物を作製するための技術については、米国特許第5859301号を参照されたい。
【０１０３】
本発明の任意の構成における一実施形態においては、ヒトV、Jおよび任意選択のD領域は、ヒトIgH遺伝子座の全部または一部により提供される；場合により、前記のIgH遺伝子座の全部または一部は、IgH V、DおよびJ領域ならびに介在配列の実質的に完全なヒトレパートリーを含む。
【０１０４】
ヒトIgH遺伝子座の好適な部分は、WO2011004192に開示されている。一実施形態においては、ヒトIgH部分は、ヒト第14染色体に由来する塩基105,400,051〜106,368,585(NCBI36に由来する座標)を含む(または場合により、それからなる)。さらに、またはあるいは、場合により、脊椎動物がマウスであるか、または細胞がマウス細胞である場合、ヒトV、Jおよび任意選択のD領域は、座標114,667,091と114,665,190との間の位置に対応する位置、場合により、座標114,667,091(マウス株C57BL/6Jに関する、NCBIM37に由来する座標)でマウス第12染色体中に挿入される。
【０１０５】
脊椎動物がマウスである場合の本発明の脊椎動物または細胞(系)の任意の構成の一実施形態においては、(i)マウスは、定常領域がマウスまたはラットSμスイッチおよび場合により、マウスCμ領域を含む、トランスジェニック重鎖遺伝子座を含む。例えば、定常領域は、マウスにとって内因性である定常領域により、例えば、マウスゲノムまたはマウス細胞ゲノムの内因性定常領域との動作可能な連結中にヒトV(D)J領域配列を挿入することにより提供される。
【０１０６】
脊椎動物がラットである場合の本発明の脊椎動物または細胞(系)の任意の構成の一実施形態においては、(i)ラットは、定常領域がマウスまたはラットSμスイッチおよび場合により、ラットCμ領域を含む、トランスジェニック重鎖遺伝子座を含む。例えば、定常領域は、ラットにとって内因性である定常領域により、例えば、ラットゲノムまたはラット細胞ゲノムの内因性定常領域との動作可能な連結中にヒトV(D)J領域配列を挿入することにより提供される。
【０１０７】
本発明の脊椎動物または細胞(系)の任意の構成の一実施形態においては、ラムダ抗体トランスジーンは、少なくとも1つのヒトJλ領域および少なくとも1つのヒトCλ領域、場合により、Cλ6および/またはCλ7を含むヒトIgλ遺伝子座の全部または一部を含む抗体軽鎖トランスジーンを含む。場合により、トランスジーンは、複数のヒトJλ領域、場合により、Jλ1、Jλ2、Jλ6およびJλ7のうちの2つ以上、場合により、Jλ1、Jλ2、Jλ6およびJλ7の全部を含む。ヒトラムダ免疫グロブリン遺伝子座は、連続するJ-Cクラスターから構成されるユニークな遺伝子構造を含む。この特徴を利用するために、本発明は、任意選択の態様において、例えば、定常領域が非ヒト脊椎動物または非ヒト脊椎動物細胞(系)に対して内因性である場合、トランスジーン中の定常領域と動作不可能な連結にある1つまたは複数のそのようなヒトJ-Cクラスターを用いる。かくして、場合により、トランスジーンは、少なくとも1つのヒトJλ-Cλクラスター、場合によっては少なくともJλ7-Cλ7を含む。トランスジーンが生殖系列構成中に1つまたは複数のJ-Cクラスターを含み、有利には、ヒト遺伝子座中のクラスター間および/または隣接するJ領域とC領域の間に介在配列をも含むように、ヒトラムダ遺伝子座の全部または一部を用いることができることにより、そのようなトランスジーンの構築は容易になる。これは、VJおよび/またはJC組換えに関与し得る、ならびにAID(活性化誘導デアミナーゼ)またはAID相同体により認識され得る介在配列内に任意の調節エレメントを保存する。
【０１０８】
内因性調節エレメントが非ヒト脊椎動物におけるCSR(クラススイッチ組換え)に関与する場合、非ヒト脊椎動物に対して内因性である定常領域をトランスジーン中に包含させることにより、これらのものを保存することができる。本発明の第１の構成においては、当業者であれば、脊椎動物に対して内因性であるAIDもしくはAID相同体またはその機能的突然変異体を用いることにより、これを一致させることができる。そのような設計エレメントは、SHM(体細胞超変異)および/またはCSRのための酵素スペクトルを最大化し、かくして、抗体多様性の潜在能力を最大化するのに有利である。
【０１０９】
場合により、ラムダトランスジーンは、ヒトEλエンハンサーを含む。場合により、カッパトランスジーンは、ヒトEκエンハンサーを含む。場合により、重鎖トランスジーンは、重鎖ヒトエンハンサーを含む。
【０１１０】
本発明の任意の構成の一実施形態においては、抗体トランスジーンまたはそれぞれの抗体トランスジーンの定常領域は、非ヒト脊椎動物に対して内因性であるか、またはそのような定常領域から誘導される。例えば、脊椎動物はマウスであるか、または細胞はマウス細胞であり、定常領域はマウスに対して内因性である。例えば、脊椎動物はラットであるか、または細胞はラット細胞であり、定常領域はラットに対して内因性である。
【０１１１】
本発明の任意の構成の一実施形態においては、重鎖トランスジーンは、複数のヒトIgH V領域、複数のヒトD領域および複数のヒトJ領域、場合により、IgH V、DおよびJ領域の実質的に完全なヒトレパートリーを含む。
【０１１２】
本発明の任意の構成の一実施形態においては、脊椎動物または細胞は、重鎖のさらなるトランスジーンを含み、さらなるトランスジーンは少なくとも1つのヒトIgH V領域、少なくとも1つのヒトD領域および少なくとも1つのヒトJ領域、場合により、IgH V、DおよびJ領域の実質的に完全なヒトレパートリーを含む。
【０１１３】
本発明の任意の構成の一実施形態においては、抗体生成脊椎動物および/またはアッセイ脊椎動物について、
(i)重鎖トランスジーンは、IgH V、DおよびJ領域の実質的に完全なヒトレパートリーを含み；
(ii)脊椎動物は、Igκ VおよびJ領域の実質的に完全なヒトレパートリーならびに/またはIgλ VおよびJ領域の実質的に完全なヒトレパートリーを含む。
【０１１４】
一態様は、本発明の任意の構成によるアッセイ脊椎動物から誘導された、B細胞、ハイブリドーマまたは幹細胞、場合により、胚性幹細胞または造血幹細胞を提供する。一実施形態においては、細胞は、B6、BALB/c、JM8またはAB2.1またはAB2.2胚性幹細胞である(参照によりその開示が本明細書に組み込まれるWO2011004192中の、好適な細胞、特に、JM8およびAB2.1細胞の考察を参照されたい)。
【０１１５】
一態様において、ES細胞は、マウスBALB/c、C57BL/6N、C57BL/6J、129S5、129S7または129Sv株から誘導される。
【０１１６】
一態様において、非ヒト脊椎動物は、げっ歯類、好適にはマウスであり、本発明の細胞(細胞系)は、げっ歯類細胞またはES細胞、好適には、マウスES細胞である。
【０１１７】
本発明のES細胞を用いて、胚盤胞へのES細胞の注入、次いで、必要な挿入物を有するホモ接合性組換え体について育種および選択することができる子孫を生成するメスへのキメラ胚盤胞の埋込みを含む、当技術分野で周知の技術を用いて動物を作製することができる。一態様において、本発明は、ES細胞由来組織および宿主胚由来組織から構成されるトランスジェニック動物に関する。一態様において、本発明は、VDJおよび/またはVJ領域に関するホモせ悦合成組換え体を有する動物を含む、遺伝的に変化したその後の世代の動物に関する。
【０１１８】
一態様は、抗体または前記抗体をコードするヌクレオチド配列を単離する方法であって、
(a)脊椎動物が試験抗体を生成するように、本発明の任意の構成または態様による抗体生成脊椎動物を、ヒト標的抗原を用いて免疫するステップ(例えば、Harlow, E. & Lane, D. 1998、第5版、Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Lab.Press、Plainview、NY；ならびにPasqualiniおよびArap、Proceedings of the National Academy of Sciences (2004) 101:257〜259頁を参照されたい)と、
(b)脊椎動物から、前記抗原ならびに/または前記抗体の少なくとも重鎖および/もしくは軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列に特異的に結合する試験抗体を単離するステップと
を含み、
場合により、次いで、前記抗体の可変領域をヒト定常領域に連結する(例えば、本発明のアッセイ脊椎動物における抗体の試験後)、前記方法を提供する。そのような連結を、当業者には明らかであるような従来の組換えDNAおよびRNA技術を用いるなど、当技術分野で容易に利用可能な技術により行うことができる。例えば、Sambrook, JおよびRussell, D.(2001、第3版)Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NYを参照されたい。
【０１１９】
好適には、免疫原性量のヒトエピトープまたは標的抗原が送達される。本発明はまた、上記のように生成された試験抗体を、その抗体の一部を認識する二次検出抗体を用いて検出するステップを含む、ヒトエピトープまたは標的抗原を検出するための方法にも関する。
【０１２０】
工程(b)における抗体の単離を、従来の抗体選択技術、例えば、当業者には容易に明らかであるように、場合により高いストリンジェンシーでの反復ラウンドを用いる、固相支持体上に固定された抗原に対する抗体のパンニング(panning)を用いて実行することができる。
【０１２１】
さらなる任意選択の工程として、工程(b)の後、抗体の重鎖および/または軽鎖可変領域のアミノ酸配列を突然変異させて、前記抗原への結合の親和性を改善する。突然変異を、当業者には容易に明らかであるような従来の技術により、例えば、変異性PCRにより作製することができる。親和性を、当業者には容易に明らかであるような従来の技術により、例えば、表面プラズモン共鳴、例えば、Biacore(商標)を用いることにより決定することができる。
【０１２２】
さらに、またはあるいは、さらなる任意選択の工程として、工程(b)の後、試験抗体の重鎖および/または軽鎖可変領域のアミノ酸配列を突然変異させて、抗体の1つまたは複数の生物物理的特徴、例えば、融点、溶液状態(単量体もしくは二量体)、安定性および発現(例えば、CHOもしくは大腸菌(E coli)中での)のうちの1つまたは複数を改善する。
【０１２３】
一態様は、場合により、医学における使用のため、例えば、患者、例えば、ヒトにおける医学的状態または疾患を処置および/または防止するための本発明の試験抗体を提供する。
【０１２４】
一態様は、場合により、ヌクレオチド配列がベクターの一部である、本発明の試験抗体をコードするヌクレオチド配列を提供する。好適なベクターは、当業者には容易に明らかであり、例えば、1つまたは複数の発現制御エレメントと共に動作可能な連結にあるヌクレオチド配列を含む従来の抗体発現ベクターである。
【０１２５】
一態様は、本発明の試験抗体と、希釈剤、賦形剤または担体とを含む医薬組成物を提供し、場合により、組成物はIV容器(例えば、IVバッグ)またはIVシリンジに接続された容器中に含有される。
【０１２６】
一態様は、患者、例えば、ヒトにおける疾患または状態の処置および/または予防のための薬剤の製造における本発明の試験抗体の使用を提供する。
【０１２７】
さらなる態様において、本発明は、キメラおよび完全ヒト化形態の両方における、本発明に従って生成またはアッセイされたヒト化抗体および抗体鎖、ならびに医学における前記抗体の使用に関する。本発明はまた、そのような抗体と、薬学的に許容される担体または他の賦形剤とを含む医薬組成物にも関する。
【０１２８】
キメラヒト-非ヒト抗体鎖などの、ヒト配列を含有する抗体鎖は、ヒトタンパク質コード領域の存在の理由から、本明細書ではヒト化されていると考えられる。標準的な技術を用いて、本発明のキメラ抗体鎖をコードするDNAから出発して、完全ヒト抗体を生成することができる。
【０１２９】
モノクローナル抗体とポリクローナル抗体の両方の作製のための方法が当技術分野で周知であり、本発明は、本発明の非ヒト脊椎動物中での抗原チャレンジに応答して生成されるキメラまたは完全ヒト化抗体のポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方に関する。
【０１３０】
さらなる態様において、本発明で作製されたキメラ抗体または抗体鎖を、好適にはDNAレベルで操作して、定常領域が存在しない重鎖もしくは軽鎖に由来するヒト可変領域、例えば、ドメイン抗体;または同じか、もしくは異なる種に由来する重鎖もしくは軽鎖に由来する任意の定常領域を含むヒト可変領域;または非天然定常領域を含むヒト可変領域;または任意の他の融合パートナーと一緒のヒト可変領域などの抗体のような特性または構造を有する分子を作製することができる。本発明は、本発明に従って同定、単離またはアッセイされたキメラ抗体から誘導された全てのそのようなキメラ抗体誘導体に関する。
【０１３１】
さらなる態様において、本発明は、ヒト抗体可変領域レパートリー、ヒトエピトープ/標的および試験抗体の文脈での薬剤またはワクチンの相応しい効果の分析における本発明のアッセイ脊椎動物の使用に関する。これは、薬剤を受容する可能性が高いヒト患者におけるin vivoでの環境をシミュレートするのに有用である。
【０１３２】
本発明はまた、薬剤またはワクチンの同定または検証のための方法であって、ワクチンまたは薬剤を本発明のアッセイ脊椎動物に送達し、免疫応答、安全性プロフィール、疾患に対する効果のうちの1つまたは複数をモニタリングするステップを含む前記方法にも関する。一実施形態においては、薬剤は、本明細書で定義された試験抗体であり、別の実施形態においては、そうではないが、アッセイ脊椎動物は薬剤と試験抗体の両方を含有する。これは、試験抗体の存在下での有用な薬剤(および薬剤候補)の相互作用、効果、性能、毒性もしくはPK(または上記のアッセイパラメータのいずれか)を評価するか、または逆に、既知の薬剤の文脈で試験抗体についてこれを評価するのに有用である。後者では、薬剤は、治療剤および/または予防剤として抗体を受容することが予想される型の患者において一般的に見出される薬剤であってよく、抗体が第一(または初期)の処置として前記薬剤を受容する患者において第二(またはその後)の処置であると意図される場合に有用である。
【０１３３】
本明細書に記載の特定の実施形態は、例示のために示されるものであり、本発明の限定として示されるものではないことが理解される。本発明の主な特徴を、本発明の範囲から逸脱することなく様々な実施形態において用いることができる。当業者であれば、日常的なものを超えない試験を用いて、本明細書に記載の特定の手順に対する多くの均等物を認識するか、または確認することができる。そのような均等物は、本発明の範囲内にあると考えられ、特許請求の範囲により包含される。本明細書に記載の全ての刊行物および特許出願は、本発明が属する当業者の知識のレベルを示すものである。全ての刊行物および特許出願は、あたかもそれぞれ個々の刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参照により本明細書に組み込まれたのと同程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。特許請求の範囲および/または明細書において用語「含む(comprising)」と共に用いられる場合、単語「a」または「an」は、「1つ」を意味してもよいが、「1つまたは複数」、「少なくとも1つ」および「1つまたは1つより多い」の意味とも一致する。特許請求の範囲における用語「または」の使用は、選択肢のみを指すことが明示的に示されない限り、または選択肢が相互に排他的でない限り、「および/または」を意味するように用いられるが、本開示は、選択肢のみならびに「および/または」を指す定義を支持する。本出願を通して、用語「約」は、ある値がそれが言及される文脈においてその特徴に関する誤差の固有の変動を含むことを示すために用いられる。ある量、程度または特徴に関して言及する場合、用語「実質的に」(例えば、「実質的に同一である」または「実質的に同じである」)は、それぞれ、「同一」または「同じ」の開示を含み、これは以下の特許請求の範囲へのこれらの正確な用語の挿入のための基礎を提供する。
【０１３４】
本明細書および特許請求の範囲で用いられる単語「含む(comprising)」(および任意の形態のcomprising、例えば、「含む(comprise)」および「含む(comprises)」）、「有する(having)」(および任意の形態のhaving、例えば、「有する(have)」および「有する(has)」)、「含む(including)」(および任意の形態のincluding、例えば、「含む(includes)」および「含む(include)」)または「含有する(containing)」(および任意の形態のcontaining、例えば、「含有する(contains)」および「含有する(contain)」)は、包括的であるか、または非制限的であり、追加の、記載されていない要素または方法工程を排除するものではない。
【０１３５】
本明細書で用いられる用語「またはその組合せ」とは、その用語に先行する列挙された項目の全ての順列および組合せを指す。例えば、「A、B、C、またはその組合せ」は、A、B、C、AB、AC、BC、またはABCのうちの少なくとも1つを含むことが意図され、特定の文脈において順序が重要である場合、BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC、またはCABも含むことが意図される。この例を続ければ、明示的に含まれるのは、1つまたは複数の項目または用語の反復、例えば、BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABBなどを含有する組合せである。当業者であれば、典型的に、別途文脈から明らかでない限り、任意の組合せ中の項目または用語の数に制限はないことを理解する。
【０１３６】
別途文脈から明らかでない限り、本開示の任意の部分を、本開示の任意の他の部分と組合せて読むことができる。
【０１３７】
本明細書に開示され、特許請求される全ての組成物および/または方法を、本開示に照らして過度の実験を行うことなく作製および実行することができる。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態に関して説明してきたが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の組成物および/または方法ならびに方法の工程もしくは方法の一連の工程に変更を加えてもよいことが当業者には明らかである。当業者にとって明らかな全てのそのような類似する置換および改変は、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の精神、範囲および概念の範囲内にあると見なされる。
【０１３８】
本発明を、以下の非限定的な例示においてより詳細に説明する。
【０１３９】
(実施例)
以下の実施例は、本発明を証明するのに有用である。実施例3は、実証例であり、これに由来するデータは、本発明における使用のためにES細胞を誘導する方法の非限定的例示として以下に提供される。
【０１４０】
(実施例1)
トランスジェニック抗体生成マウスの作製
それぞれ、内因性マウス重鎖およびカッパ定常領域のすぐ5'側に動作可能に接続されたヒト抗体重鎖およびカッパ鎖V、DおよびJセグメントを導入するために、ES細胞技術および遺伝子操作を用いて、トランスジェニックマウスを作製する。マウスミュースイッチおよびミュー定常およびガンマ領域を、かくして生成された重鎖トランスジェニック遺伝子座中に提供する。内因性のマウス重鎖およびカッパ鎖発現は不活化される；マウスラムダ鎖発現は、典型的には5%以下であり、従って不活化は任意である。ヒト抗体遺伝子セグメントを、当技術分野で公知のように相同組換えおよび/またはリコンビナーゼ媒介性カセット交換(RMCE)を用いてマウスES細胞中に導入する。ヒトDNAを、当技術分野で公知のようにBACおよび組換え工学技術を用いて操作することができる。ヒト抗体遺伝子DNAを含有するBACは、Invitrogenから入手可能である。好適なES細胞は、129、AB2.1またはAB2.2細胞(Baylor College of Medicineから入手可能)である。
【０１４１】
次いで、トランスジェニックES細胞を、育てのマウス母親(例えば、129またはC57BL/6Nマウス株)に由来する胚盤胞に埋込む。重鎖およびカッパ鎖系を生成、交配して、ヒト可変領域と共にホモ接合性トランスジェニック重鎖およびカッパ鎖を担持する抗体生成マウス(HKマウス)を提供することができる。
【０１４２】
同様のプロトコルを用いて、ラムダ鎖系を生成し、交配することにより、ヒト可変領域と共に、ホモ接合性トランスジェニック重鎖、ラムダ鎖およびカッパ鎖を担持するHKLマウスを作製する。
【０１４３】
さらなる指針は、WO2011004192、米国特許第7,501,552号、米国特許第6,673,986号、米国特許第6,130,364号、WO2009/076464および米国特許第6,586,251号(これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)に開示されている。
【０１４４】
試験抗体の単離
好適な注入媒体(例えば、FreundsまたはTitermax(商標)などのアジュバントを含む)中のヒト標的抗原を用いて、HK抗体生成マウスを免疫する。RIMMSが好適な免疫化プロトコル、または任意の他の標準的な免疫化プロトコルである。
【０１４５】
ヒト可変領域を含み、所望の親和性を有するヒト抗原に結合する試験抗体を単離する。親和性は、表面プラズモン共鳴(例えば、Biacore(商標)を用いる)を用いて試験する。
【０１４６】
ES細胞の回収およびアッセイマウスの生成：
HK抗体生成マウスを、同じ遺伝的バックグラウンドのマウスと交配する；本実施例においては、マウスは129バックグラウンドのものであり、本質的に同じ免疫遺伝子レパートリーを有する。ES細胞を、交配から得られる胚から単離する。そのようなES細胞(H/H; K/K、すなわち、抗体トランスジーンについてホモ接合性)をさらに用いて、免疫化のために以前に用いられたヒト標的に対してオルソロガスまたは相同である内因性標的遺伝子をノックアウトするが、ヒト標的のための遺伝子をES細胞ゲノム中にノックインする。一実施形態においては、ゲノムが内因性遺伝子に関するノックアウトおよびヒト遺伝子に関するノックインを含むように、相同組換えおよびヒト標的のためのDNAを担持するベクターを用いて、内因性遺伝子をヒト遺伝子により置きかえる。好適なベクターは、ES細胞ゲノム中、内因性標的DNAのすぐ5'および3'側のマウス配列である相同性アームによりフランキングされたヒトDNAを有する。
【０１４７】
ES細胞キメラを作製し、生殖系列伝達を示すマウスの生成のために用いる(F1マウス: H/HA; K/KA、ここで、H/HAはヘテロ接合性-トランスジェニック重鎖遺伝子座+不活化内因性重鎖遺伝子座であり、K/KAはヘテロ接合性-トランスジェニックカッパ鎖遺伝子座+不活化内因性カッパ遺伝子座である; KIまたはKO/+)。次いで、F2マウス(H/HAまたはH; K/KAまたはK; KO/KOまたはKI/KI)を、F1マウスを交配することにより作製し、[H/H + K/K + KI/KI]または[H/H + K/K + KI/KI + KO/KO]アッセイマウスを生成する。
【０１４８】
抗体試験
試験抗体をアッセイマウスに注入し、以下の1つまたは複数を決定する：前記抗体(またはアッセイマウスにより生成されたその代謝物もしくは誘導体)の薬力学、前記抗体の薬物動態、前記抗体の活性、前記抗体のクリアランス、前記抗体の分布、前記抗体の毒性、前記抗体の物理化学的特性または効果、前記抗体の結合特性、前記抗体の生物学的特性または効果、前記抗体の生理学的特性または効果、前記抗体の薬学的特性または効果、およびアッセイマウス内の別のタンパク質または物質との前記抗体の相互作用。当業者であれば、そのようなアッセイを実行するための標準的な技術に完全に精通しているであろう。
【０１４９】
試験抗体は、アッセイマウスについて種一致した定常領域を担持し、この抗体はそのマウスによって「自己」として見られ、かくして、寛容される。かくして、さもなければアッセイを妨げ得る抗試験抗体反応の問題には直面しない。抗原生成脊椎動物とアッセイ脊椎動物とを一致させる(およびかくして、試験抗体の定常領域を一致させる)ことにより、本発明は、データセットの抗抗体干渉をより正確で、より低リスクで試験する前臨床および臨床アッセイを提供する。これにより、臨床開発および薬剤生成への進行のためのリード候補のより良好な選択が可能になる。
【０１５０】
試験抗体のヒト化
前記方法を、試験抗体のパネルのために行う。ヒト標的への結合の親和性および上記で考察された1つまたは複数のアッセイパラメータに従って、リード候補を選択する。
【０１５１】
標準的である組換えDNA技術を用いて、リード候補のマウス定常領域を、対応するヒト定常領域と置きかえて、ヒト標的に結合する完全ヒト抗体を生成する。
【０１５２】
(実施例2)
IPS細胞(誘導性多能性細胞)作製をES細胞回収の代わりに実行することを除いて、実施例1を実行する。
【０１５３】
IPS細胞回収:
抗体トランスジーンを担持する親(HKまたはHKLマウス)の交配から誘導された胚から単離されたマウス胚性線維芽細胞(MEF)を、IPS細胞に誘導する。IPS細胞を、抗体トランスジーンを担持するマウスに由来する他の体細胞から直接作製することもできる。そのようなiPS細胞(H/H; K/K)をさらに用いて、ヒト標的遺伝子をノックインする(および場合により、内因性マウスオルソログまたはホモログをノックアウトする)。IPSキメラを作製し、生殖系列伝達マウス(F1マウス: H/HA; K/KA; KIまたはKO/+)の生成に用いる。次いで、F1マウスを交配することにより、F2マウス(H/HAまたはH; K/KAまたはK; KO/KOまたはKI/KI)を作製する。
【０１５４】
(実施例3)
抗体生成非ヒト脊椎動物からのES細胞の誘導
この実験の目的は、ES細胞誘導のための本発明者らのプロトコルを試験すること、本発明者らが、本発明者らが作出したマウスからES細胞を生成することができるかどうかを見ることであった。
【０１５５】
親マウス交配
マウスはS3Fについてヘテロ接合性であった(すなわち、S3F/+)。S3Fは、マウス重鎖定常領域の上流にヒト遺伝子セグメントレパートリーVH2-5、VH7-4-1、VH4-4、VH1-3、VH1-2、VH6-1、D1-1、D2-2、D3-9、D3-10、D4-11、D5-12、D6-13、D1-14、D2-15、D3-16、D4-17、D5-18、D6-19、D1-20、D2-21、D3-22、D4-23、D5-24、D6-25、D1-26、D7-27、JH1、JH2、JH3、JH4、JH5およびJH6(5'から3'の順序に)を含むトランスジェニックIgH遺伝子座を指す。「+」は、野生型マウスIgH対立遺伝子を示す。
【０１５６】
(遺伝的バックグラウンドは、129S7/SvEvBrd、C57BL/6Brd-Tyrc-Brdである)。
【０１５７】
親交配は、
「KMSP95.1b」オス(S3F/+)X「KMSP95.2g」メス(S3F/+)
であった。
【０１５８】
本発明者らは、以下に詳述されるプロトコルを使用し、8つの胚盤胞を得た。
ESC誘導培地:
ノックアウト-DMEM(Gibco)
15%ノックアウト血清置換(Gibco)
5%ESC-グレードFCS(Gibco)
1×NEAA(Gibco)
2mMグルタミン(Gibco)
0.1mM 2-メルカプトエタノール
3000U/Ml LIF(ESGRO)。
【０１５９】
1. 子宮からe3.5胚を洗い流し、上記培地と共にフィーダープレート上に塗布する(後にコロニーを拾うために、6穴プレートが便利であり得る)。
2. 次の48時間、静置する。
3. 1日おきに培地を交換する。およそ5日目に、内細胞塊の生成物、またはICMを見る。
4. およそ7〜10日目にコロニーを拾い、丸底96穴プレート中、単一細胞懸濁液中でトリプシン処理し、6穴プレート上に塗布する。25〜30  の0.25%トリプシン(Sigma)溶液を含有する96穴プレート中に生成物を簡単に拾い、3〜4分インキュベートする。10  ピペットを用いて、ICMを穏やかに3個または4個の細胞のより小さい細胞凝集物に分散させる。96穴プレートに由来する内容物を、それぞれのウェルが1個の6穴に行く、新鮮に調製された6穴プレート上に移す。
5. プレートを毎日検査する。約2日後、細胞の一次コロニーが見えるようになり、いくつかの形態のうちの1つを有し得る：トロホブラスト様細胞、上皮様細胞、内胚葉様細胞、ES細胞様細胞が、本発明者らが探しているものである。プレートがES細胞形態を有する塊を含み、これが大部分の細胞である場合、通常の維持のためのプロトコルに従って細胞を継代し、1日おきにトリプシン処理する。ES細胞形態を有する細胞が非常に少ない場合、これらのものを拾い、ステップ4に記載のようにトリプシン処理する。一度細胞を2x10cm皿に拡張したら、それらを保存のために凍結することができる。
6. 標準的な凍結プロトコルに従って細胞を凍結する。
7. 凍結された細胞を解凍した場合、それらを通常のES細胞培地K0-DMEM + 15%血清 + 1000U/Ml LIF中に塗布することができる。
【０１６０】
ES細胞の同定
ステップ3において、所望の形態のICMを、図1のボックスDに実例により見ることができる。図1は、培養された胚盤胞の形態における進行的変化を示す(「Manipulating the Mouse Embryo」、第3版、A Nagyら、Cold Spring Harbor Laboratory Press、2003；そのテキストの図8.2から取得)。
【０１６１】
ステップ5において、ES細胞は、当業者には公知のように、特徴的な形態を有する。例示を図2Aに示す(「Manipulating the Mouse Embryo」、第3版、A Nagyら、Cold Spring Harbor Laboratory Press、2003；そのテキストの図8.4から取得)。Nagyらは、以下のような説明を提供している：ボックスAは、ICM上での分散の2日後の幹細胞のコロニーを示す；ボックスBは、さらに2日後の同じコロニーを示す。コロニーは、依然として幹細胞の均一な集団から構成され、明らかな細胞分化は起こらなかった。幹細胞は比較的小さく、典型的には、1個または複数の顕著な核小体を含有する大きく明確な核を有し、多層化された一次コロニー内に密に充填されている。ボックスCにおいては、コロニーを新鮮なフィーダーウェル中で二次培養した。2日以内に、幹細胞の多数の小さい巣が培養物中に出現した。
【０１６２】
ES細胞を見るための形態の使用に加えて、またはそれとは別に、当業者であれば、この目的のためのES細胞マーカー(例えば、NanogおよびOct4)の使用を知っているであろう。Oct4およびNanogは、以下の論文に記載のように胚性幹細胞(ES)の多能性および自己再生を維持するのに必要とされる転写因子である: Nature Genetics 38、431〜440(2006); Published online: 5 March 2006、doi:10.1038/ng1760、「The Oct4 and Nanog transcription network regulates pluripotency in mouse embryonic stem cells」。
【０１６３】
本実施例において、本発明者らは、本発明者らの研究のためにこれらのマーカーを使用しなかった；本発明者らは、形態のみに注目した。この方法の後、本発明者らは、顕微鏡下で評価した場合、ES細胞の形態学的特徴を示した3つの別々のクローンを取得した(図2Bを参照されたい)。幹細胞は比較的小さく、典型的には、1個または複数の顕著な核小体を含有する大きく明確な核を有し、多層化された一次コロニー内に密に充填されている。
【０１６４】
一度クローンが2x10cmのプレート上で拡張されたら、それらを通常の凍結プロトコルに従って凍結した。簡単に述べると、細胞を上記のようにトリプシン処理し、今回は20分インキュベートし、等量のES細胞培地を用いてトリプシンを不活化し、細胞をピペッティングしてコロニーを分離する。細胞懸濁液を回収し、遠心分離し、上清を除去し、細胞をES細胞培地中に再懸濁する。等量の凍結培地を添加し(60%DMEM、20%FBS、20%DMSO(Sigma)、新鮮に調製)、1mlを、1個のクローンあたり6個のバイアルの予め標識された滅菌凍結バイアル中にアリコートする。
【０１６５】
クローンを、KX01.1、KX01.2およびKX01.3と命名した。
【０１６６】
遺伝子型決定分析
少量の各クローンを、得られたES細胞が胚盤胞を生成するのに用いられる親動物と同じ遺伝子を担持することを確保するための遺伝子型決定分析に用いるために別に保持した。遺伝子型決定と平行して、本発明者らのES細胞が理想的にはオスであるべきであるので、本発明者らはY染色体について試験した。オスのES細胞ははるかに良好な生殖系列伝達率を提供するため、メスのES細胞よりも好ましい。
【０１６７】
(i)それらは培養物中ではるかにより安定である。メス[XX]のマウスES細胞は、2つの活性なX染色体を有し、これは、Xと常染色体遺伝子産物との量が1:1であるが、全ての他の細胞型においては、それはX不活化のため1:2であることを意味する。この通常ではない1:1の遺伝子量の状況は、良好に寛容されず、一方のX染色体は失われるか、または欠失することが多い。
【０１６８】
(ii)最も多く報告される生殖系列伝達事象は、オスのXY ES細胞がメス胚をオス表現型に転換することが多いため、オスキメラに由来する。結果として、胚盤胞へのオスES細胞の注入後に生まれる大部分のキメラ[75〜80%]は、そのオスES細胞由来ゲノムを伝達するオス表現型である。注入された胚がメスであっても、オスES細胞はキメラを完全に機能的な繁殖力のあるオスに転換することができる。
【０１６９】
(iii)オスキメラを大規模かつ迅速に育種し、必要に応じて数ヶ月のうちに100の子孫を生成することができる。したがって、精子への寄与のレベルが低い場合であっても、迅速に検出することができる。
【０１７０】
(iv)メスES細胞の注入は生殖系列伝達をもたらし得るが、これはメスキメラを介してのみ可能である。同腹子はサイズおよび頻度において限られるため、メスを大規模に育種することは不可能であり、かくして、低レベルの生殖系列キメラ化は確実に検出されないであろう。
【０１７１】
遺伝子型決定プロトコル
ES細胞遺伝子型決定を、以下のプロトコルを用いて行い、これは得られるES細胞が胚盤胞を得るのに用いられる親動物と同じ遺伝子を担持することを確保するためのものであった。
【０１７２】
ES細胞消化
・培地を除去する。
・500μlのPBSで洗浄する。
・ES細胞溶解バッファー(50mM Tris、50mM EDTA、1%SDS、100mM NaCl)を使用し、冷凍庫(Sigma P8044-5g)からPK粉末を添加して1mg/ml濃度にする。
・500μlのPK溶解バッファーを各ウェルに添加する。
・テープでプレートを密閉し、水に浸したペーパータオルも含むプラスチック容器にそれを入れる。
これにより、乾燥からウェルを保護する。
・55℃で一晩インキュベートする。
・試料をエッペンドルフチューブに移し、等量のイソプロパノールを添加する(この場合、500μlを添加する)。
・13000rpmで10min遠心分離して、DNAペレットを形成させる。
・上清を除去し、等量(この場合、1mlの70%エタノール)を添加して洗浄する。
・100μlの水を添加して、DNAを再懸濁し、約1μlのDNAを用いる。
【０１７３】
この調製物について適切なPCRサイクルを用いるPCR反応において適切なプライマー配列を用いた。
【０１７４】
同じ消化されたDNAを、以下のプライマー配列を用いたY染色体PCRのために用いた：
Sry3(配列番号1)
ATGGAGGGCCATGTCAAGCGCCCCATGAA
Sry5(配列番号2)
TTGCTGGTTTTTGGAGTACAGGTGTGCAGC。
【０１７５】
以下のプロトコルは、Y染色体PCRのために行った：
2. 溶解後、1:10希釈し、PCR反応のために1μlを取る；
3. PCR系:
【０１７６】
【表４】
2015502142.tif 000005
【０１７７】
4. PCR反応:
【０１７８】
【表５】
2015502142.tif 000006
【０１７９】
得られた結果:
遺伝子型決定により、以下の結果が示された
KX01.1:S3F/S3F
KX01.2:S3F/+
KX01.3:S3F/+。
【０１８０】
Y染色体PCRの結果:
全クローンがメスES細胞をもたらした。
【０１８１】
(実施例4)
一般的なKOおよびKI戦略
動物系におけるモノクローナル抗体の生成は文書で十分に立証されており、多くの治療抗体の開発の成功をもたらしてきた。所与の標的に対する高品質のモノクローナル抗体の生成をもたらすプロセスは、重要なことに、所与の抗原または標的の免疫原性を含む。例えば、ヒトと動物宿主、例えば、マウスとの間で高度に保存された標的は、自己寛容性のため弱い免疫応答をもたらし、かくして、従来の手法を用いてヒト標的に対する良好な抗体リードを作製するのは困難であろう。
【０１８２】
免疫応答を改善し、アジュバント、様々なtoll様受容体アゴニストを用いて免疫寛容を破壊し、免疫化レジメンを変化させ、および免疫化のために標的特異的遺伝子ノックアウト(KO)マウス系を使用するいくつかの方法が存在する。特異的ノックアウトマウスを作製する後者の手法は、ヒト標的に対する免疫寛容の限界を克服するための都合のよい手法である。しかしながら、ノックアウトマウスの作製は、時間を浪費し、また費用も高くなることがある。この目的のために、特異的KOマウスを作製するための効率化された方法の確立が必須である。特異的KOマウスを作製するための本明細書に記載の方法により、伝統的な遺伝子KO法を用いた場合に通常残されるDNA損傷または任意の外因性DNA材料を残すことなく、対象の遺伝子の正確な欠失が可能になる。このKO法を図3に図示する。
【０１８３】
一度治療抗体リードが作製されたら、関連する前臨床モデルにおいてそれを試験することが重要であるが、そのようなモデルは存在しないことが多い。治療抗体がヒト標的に対して生じたが、マウス対応物と交叉反応しない場合、ノックイン(KI)手法を用いてマウス系にヒト標的を組み込むことにより、マウス前臨床モデルを確立することができる。前臨床モデルをさらに補完するため、および治療標的に応じて、動物モデルにおける天然の細胞タンパク質相互作用をより良好に反映するように、ヒト標的および任意のさらなるヒト相互作用パートナーをKIすることが有益であり得る。例えば、CD40などの受容体の場合、その相互作用リガンドであるCD40Lをマウス宿主中にノックインすることもできる。ヒト標的をマウスモデル中にKIするために当業者が取ることができるいくつかの戦略が存在する。KOマウスの作製について上記された通り、遺伝子のサイズに応じて、マウス標的の全体を最初にKOし、ヒト標的をKIすることができる(例えば、以下に記載の方法におけるランディングパッド(landing pad)の切出しの前に)。代替的な手法は、抗体結合に関与することが知られる関連するヒト遺伝子セグメントのみをノックインするか、またはエクソン特異的ノックインを実行することにより、ヒト化することである。そのような手法は、cis調節エレメント、内因性プロモーターおよび細胞シグナリングにとって必要なマウスまたは他のモデル生物に由来する任意のシグナルペプチドを維持し、かくして、内因性野生型対立遺伝子と同じ制御下で入ってくるヒト遺伝子セグメントの遺伝子発現を維持する。これは順に、前臨床試験を行うためのプラットフォームを提供するであろう。また、これは、標的遺伝子が過剰に大きく、かくして、ES細胞中での遺伝子標的化を用いて完全な遺伝子KOまたはKIを実行するのが困難であり、時間を浪費するか、または費用が高い場合、KO/KIに対する有用な選択肢であろう。さらに、ヒト遺伝子の一部のみをノックインすることは、モデル生物における遺伝子調節を変化させ、順に遺伝子発現プロフィールを変化させる可能性が低い。
【０１８４】
本明細書に記載の方法は、KIに関する当業者の要件に適合する変化を容易に受けやすい、正確な遺伝子KIを作出するプロセスを促進するために設計される。例えば、前記方法を用いて、単一のヒトエクソン、いくつかのエクソンまたはヒト遺伝子全体をKIすることができる。例示的なKI法を図4に概略的に図示する。
【０１８５】
(実施例5)
例示的なKO法
図3は、本発明における使用のための正確な遺伝子ノックアウト戦略の模式図を示す。欠失を運命付けられた領域にフランキングする相同性アームを用いる対象の標的遺伝子に対する標的化ベクター(例えば、細菌人工染色体)が設計される。標的化ベクター中に含まれる特徴としては、PiggyBacトランスポゾンを形成するPBase 5'および3'LTRによりフランキングされるPGKプロモーターの調節下での、loxP部位および突然変異loxP部位であるlox5171によるHPRT遺伝子分割が挙げられる。標的化をES細胞中での相同組換えにより達成し、それによって、標的化されたクローンをヒポキサンチンアミノプテリンチミジン(HAT)培地上で陽性選択する。相同性アーム内のゲノム領域をノックアウトし、トランスポゾンにより置きかえる。次いで、トランスポゾンを一過的に発現させ、6-チオグアニン(6TG)を用いてトランスポゾンの切出しについて陰性選択することにより、トランスポゾンを都合良く除去することができる。これは外因性DNA材料でマークされない正確な欠失を残す。注記：その代わりに、lox部位がヒト遺伝子または遺伝子部分(例えば、エクソン)のその後の標的化のための「ランディングパッド」の一部として保持され得る。かくして、lox部位を、リコンビナーゼ媒介性カセット交換(RMCE)を用いて対象の遺伝子をノックインするための基礎として用いることができ、これは入ってくるDNAのためのランディングパッドとして作用する(以下のKIの例にさらに示される)。
【０１８６】
(実施例6)
例示的なKI法
図4は、正確な遺伝子ノックイン戦略の模式図を示し、それによってマウス遺伝子(黒色のボックス)のエクソン3〜5がヒト等価物(灰色のボックス)で置きかえられる。PiggyBacトランスポゾンを、相同組換えを用いて対象の遺伝子内の規定の領域をノックインする。標的化されたクローンを、ヒポキサンチンアミノプテリンチミジン培地上で陽性選択する。トランスポゾンの標的化は、ヒト等価物をノックインするのに必要とされる遺伝子の領域をKOし、それは対象のDNA材料をノックインするためのランディングパッドとして作用する。等価なヒトエクソン3〜5を、RMCEを用いてlox部位を介してノックインする。これは、それぞれ5'および3'PB LTRによりフランキングされる、2つの独立した機能的トランスポゾンエレメントを作出し、これは最初のランディングパッドで正確に標的化されたES細胞中でPBaseトランスポゾンを一過的に発現させることにより、同時に都合良く切り出される。トランスポゾンの除去およびかくして、ES細胞コロニーにおける正確なエクソン特異的遺伝子KIの生成を、1-(2-デオキシ-2-フルオロ-D-アラビノフラノシル)-5ヨードウラシル(FIAU)を用いて陰性選択する。挿入されたヒトエクソンは、マウス(非ヒト脊椎動物)配列を置きかえ、内因性マウス調節制御下に都合良く置かれる。
【０１８７】
当技術分野で公知のように、いくつかの非ヒト脊椎動物ES細胞がこれらの方法における使用のために利用可能であり、遺伝子操作された(KOおよび/またはKI)ES細胞を胚盤胞に埋込み、ドナーマウスまたは他の適切な代理非ヒト脊椎動物に移すことができる。次いで、所望のKO/KIを担持する非ヒト脊椎動物を、埋込まれた胚盤胞およびその子孫から開発する。
【図１Ａ】
2015502142.tif 000007
【図１Ｂ】
2015502142.tif 000008
【図１Ｃ】
2015502142.tif 000009
【図１Ｄ】
2015502142.tif 000010
【図２Ａ】
2015502142.tif 000011
【図２Ｂ】
2015502142.tif 000012
【図３】
2015502142.tif 000013
【図４Ａ】
2015502142.tif 000014
【図４Ｂ】
2015502142.tif 000015
【配列表】
2015502142000001.app
【国際調査報告】
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