(57)【要約】  本発明は、タンパク質凝集性疾患、アミロイド変性、又はタンパク質ミスフォールディング疾患を特徴付ける生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体又はオリゴマーを定量化するための標準物質、並びにこの病原性の凝集体又はオリゴマーを定量化するためのこの標準物質の使用に関する。
2015502968.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質凝集性疾患、又はアミロイド変性、又はタンパク質ミスフォールディング疾患を特徴付ける生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体又はオリゴマーを定量化するための標準物質において、ポリマーがポリペプチド配列から構成されており、このポリペプチド配列は、その配列に関して、相応するサブセグメントにおいて、タンパク質凝集性疾患、又はアミロイド変性、又はタンパク質ミスフォールディング疾患を特徴付ける生体固有のタンパク質と同一であるか、又は、相応するサブセグメントにわたって、この生体固有のタンパク質と少なくとも５０％の相同性を示し、その際、ポリマーが凝集しないことを特徴とする、標準物質。
【請求項２】
プローブの結合のために互いに共有結合している、厳密に定義された数のエピトープを有している、請求項１に記載の標準物質。
【請求項３】
Ａβペプチドのエピトープを含んでいる、請求項１又は２に記載の標準物質。
【請求項４】
Ａβ１−８（配列番号２）、Ａβ１−１１（配列番号３）、Ａβ１−１６（配列番号４）、Ａβ３−１１（配列番号５）、ｐｙｒｏＧｌｕＡβ３−１１（配列番号６）、Ａβ１１−１６（配列番号７）及びｐｙｒｏＧｌｕＡβ１１−１６（配列番号８）からなる群から選択された少なくとも１つのエピトープを含んでいる、請求項３に記載の標準物質。
【請求項５】
水性物質に可溶である、請求項１から４までのいずれか１項に記載の標準物質。
【請求項６】
官能基を有している、請求項１から５までのいずれか１項に記載の標準物質。
【請求項７】
少なくとも１つのスペーサー分子を含んでいる、請求項１から６までのいずれか１項に記載の標準物質。
【請求項８】
分光光度定量のための染料及び／又は芳香族アミノ酸を含んでいる、請求項１から７までのいずれか１項に記載の標準物質。
【請求項９】
ポリペプチド配列が、硫黄原子との結合を介さずに、チオエーテル結合を介さずに、かつ／又はシステインを介さずに、互いに連結しているか、又は標準物質の他の要素と連結しており、特に共有結合している、請求項１から８までのいずれか１項に記載の標準物質。
【請求項１０】
ポリペプチド配列が、直鎖状構造、分岐鎖状構造又は架橋構造で互いに結合しているか、又はデンドリマーとして存在している、請求項１から９までのいずれか１項に記載の標準物質。
【請求項１１】
ポリペプチドを含むデンドリマーにおいて、このポリペプチドが、その配列に関して、相応するサブセグメントにおいて、タンパク質凝集性疾患を特徴付ける生体固有のタンパク質と同一であるか、又は、相応するサブセグメントにわたって、この生体固有のタンパク質と少なくとも５０％の相同性を示し、その際、ポリマーが凝集しないことを特徴とするデンドリマー。
【請求項１２】
請求項２から９までのいずれか１項に記載の特徴を少なくとも１つ有している、請求項１０に記載のデンドリマー。
【請求項１３】
請求項１から６までのいずれか１項に記載の標準物質、又は請求項１１又は１２に記載のデンドリマーの製造法において、ペプチド合成法又は組換え法を用いることを特徴とする方法。
【請求項１４】
タンパク質凝集性疾患を特徴付ける生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体又はオリゴマーを定量化するための、請求項１から９までのいずれか１項に記載の標準物質、又は、請求項１０から１２までのいずれか１項に記載のデンドリマーの使用。
【請求項１５】
Ａβオリゴマーを定量化するための、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
請求項１から９までのいずれか１項に記載の標準物質、又は請求項１１又は１２に記載のデンドリマーを、サーフェスＦＩＤＡ法、Ｅｌｉｓａ、サンドイッチＥｌｉｓａ、又はＦＡＣＳのキャリブレーションに使用する、請求項１４に記載の使用。
【請求項１７】
以下の工程を含む、請求項１４に記載の使用：
−  第一の工程において、請求項１から９までのいずれか１項に記載の標準物質、又は請求項１１又は１２に記載のデンドリマーをプローブでマークし、この標準物質又はデンドリマーに結合しているプローブの数を測定し、
−  第二の工程において、タンパク質凝集性疾患を特徴付ける生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体又はオリゴマーをプローブでマークし、このそれぞれ病原性の凝集体又はオリゴマーに結合しているプローブの数を測定し、
−  第三の工程において、第一の工程からのそれぞれ標準物質又はデンドリマーに結合しているプローブの数を、第二の工程からの数と比較し、さらに
−  第四の工程において、それにより、体液からのオリゴマーの数及びサイズを決定する。
【請求項１８】
タンパク質凝集性疾患を特徴付ける生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体又はオリゴマーを定量化するための、請求項１から９までのいずれか１項に記載の少なくとも１つの標準物質、又は請求項１１又は１２に記載の少なくとも１つのデンドリマーを含む、キット。
【請求項１９】
タンパク質凝集性疾患、又はアミロイド変性、又はタンパク質ミスフォールディング疾患を特徴付ける生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体又はオリゴマーを定量化するための方法において、標準物質としてポリペプチド配列から構成されるポリマーを使用し、このポリペプチド配列は、その配列に関して、相応するサブセグメントにおいて、タンパク質凝集性疾患、又はアミロイド変性、又はタンパク質ミスフォールディング疾患を特徴付ける生体固有のタンパク質と同一であるか、又は、相応するサブセグメントにわたって、この生体固有のタンパク質と少なくとも５０％の相同性を示し、その際、ポリマーが凝集しないことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質凝集性疾患、アミロイド変性、又はタンパク質ミスフォールディング疾患を特徴付ける生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体又はオリゴマーを定量化するための標準物質、並びにこの病原性の凝集体又はオリゴマーを定量化するためのこの標準物質の使用に関する。
【０００２】
多くの場合に（しかしながらこれに限定されるものではないが）、それぞれ特異的なタンパク質がβ折り畳みシート構造の規則的な構造で細胞外、全身又は局所的に堆積することをその共通の診断基準とする臨床症状の異質の群を、タンパク質ミスフォールディング疾患ないしタンパク質凝集性疾患、又はアミロイド変性と称する。この群にはアルツハイマー病（ＡＤ、アルツハイマー型認知症、ラテン語ではMorbus Alzheimer）又はパーキンソン病も含まれる。現代社会では加齢性の認知症がますます大きな問題となっており、それというのも、平均余命が延びているためにますます多くの人が加齢性の認知症を患っており、この疾患が社会保障システムやその財務上の実現可能性に影響を及ぼしているためである。
【０００３】
多くの神経変性疾患において、例えばオリゴマー又はフィブリルのような生体固有のタンパク質からの病理学的な凝集体が生じる。例えば、アルツハイマー型認知症の場合には脳にアミロイドβペプチド堆積物（Ａβペプチド堆積物）が認められ、パーキンソン病の場合にはシヌクレイン堆積物が認められる。しかしながら、アミロイドβペプチド堆積物（又はペプチドフィブリルからなるプラーク）は、ＡＰＰ（アミロイド前駆体タンパク質）からのモノマーアミロイドβペプチドの分解を以て開始し、次いで神経毒性アミロイドβペプチドオリゴマーを形成し、最後にアミロイドβペプチドフィブリルのプラーク状の堆積を以て終了するというプロセスの最終段階に過ぎない。ＡＤの主な病理学的特徴は、Ａβペプチドからなる老人斑又はアミロイドプラークの形成である。さらに、タウタンパク質からの神経原繊維堆積物が生じる。Ａβペプチドの前駆体タンパク質であるＡＰＰは、神経細胞の細胞壁に局在している。タンパク質の分解と場合によりそれに続く変性により、これから、例えばＡβ１−４０、Ａβ１１−４０、Ａβ１−４２、Ａβ１１−４２又はｐｙｒｏＧｌｕＡβ３−４２、ｐｙｒｏＧｌｕＡβ３−４０といった、長さや種類の異なるＡβフラグメントが生じる。モノマーＡβペプチドは、健康な生体においても生涯にわたって生じる。１９９０年代からのアミロイド・カスケード仮説によれば、プラークの形態のＡβ堆積物が疾患症状のトリガである。しかしながら近年、様々な研究によって、特に自由に拡散する小さなＡβオリゴマーは極めて毒性が高く、ＡＤの発症及び進行の原因であることが指摘されている。従って、Ａβペプチドの凝集体はＡＤの病因と直接結びついている。
【０００４】
しかしながら、現在、確実な診断は、顕著な臨床症状が発現した後になって初めて可能であり、その際、信頼性は最高でも９０％と考えられている。従来の唯一の確実な診断は、目下、患者の死亡後に、脳内での様々な変化の組織学的証拠によって初めて可能である。
【０００５】
従って、タンパク質凝集性疾患、アミロイド変性、又はタンパク質ミスフォールディング疾患を引き起こしかつ／又は特徴付ける生体固有のタンパク質の病原性の凝集体又はオリゴマーを同定し、かつ定量的に把握するための方法が求められている。
【０００６】
組織や体液における、タンパク質凝集性疾患、アミロイド変性、又はタンパク質ミスフォールディング疾患を引き起こす生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体又はオリゴマーの特性決定及び定量化のための方法は、これまでごくわずかにしか記載されていない。
【０００７】
そのような方法の開発や、そのような方法により測定された結果を確実に比較し得るようにするためには、厳密に定義された標準物質、即ち厳密に特性決定された（合成）ポリマーが不可欠である。標準物質として使用するためには、このポリマーは種々のサイズや形態で存在しなければならず、このサイズや形態は厳密に定義されている必要がある。
【０００８】
しかしながら、ペプチドの凝集は、例えば温度、サンプルの塩含分、タンパク質の製造会社、純度等といった多数の因子により決定される。そのため、試験の開発や確認のためのモノマーペプチドの凝集による標準物質としてのポリマーの製造は、再現が困難である。さらに、従来、例えば調製されたＡβオリゴマーの安定性は十分でなく、即ち、Ａβオリゴマーを調製物から種々の時点で取り出す際に、常に同一のＡβ凝集体種が存在することを保証することができなかった。従来公知であるオリゴマー調製物は、一般に種々の中間体形からなっており、この中間体形のサイズは不均一であり、よってその再現性は満足のいくものではない。
【０００９】
抗アミロイドモノクローナル抗体に結合する一連の化合物についての記載がなされている。そのような化合物は、例えばManea et al., (Biopolymeres Peptide Science 2004, Vol.76, p.503-511、及びPeptid-Science 2008, Vol.90, No.2, p.94-104)、並びにChafekar et al.(ChemBioChem 2007, 8, 1857-1864)から公知である。これらは、Ａβエピトープ（４−１０）又は（１６−２０）が結合しているポリマーをベースとしている。β−アミロイドペプチドの検出法はＵＳ５，５９３，８４６号から公知であり、その際、ペプチドの１３−２８及び１−１６の位置に結合する抗体が使用されている。しかしながら、ここではＡβオリゴマーのみならずモノマーも検出される。
【００１０】
特に、組織又は体液からのサンプルにおけるＡβオリゴマーの検出の分野では、従来、比較値として、合成により製造されたＡβモノマーから種々のプロトコルで調製されたＡβオリゴマーが用いられてきた。オリゴマー調製物中に存在するオリゴマーのサイズが１つのみであること、そしてこの調製物がＡβモノマー又はＡβフィブリルを含まないことは保証されていなかった。さらに、これらのサンプルが示す貯蔵安定性は十分でなく、そのオリゴマー・モノマー組成に関してその特性は変化する。
【００１１】
これらの欠点に基づき、これまで、オリゴマー検出システムの正確なキャリブレーション及び特性決定は不正確なものであるか、又は不可能であった。特に、様々な研究室においてプロトコルが様々に異なっているため、試験系の世界的な調和、ひいては確立は困難であった。
【００１２】
従って、タンパク質ミスフォールディング疾患、アミロイド変性、又はタンパク質凝集性疾患を引き起こしかつ／又は特徴付ける生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体又はオリゴマーを定量化するための標準物質が求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の課題は、生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体又はオリゴマーの厳密かつ定量的な測定を可能にする標準物質を提供することであった。この標準物質を内部標準物質又は外部標準物質として使用し得ることが望ましい。
【００１４】
さらに、本発明の課題は、生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体又はオリゴマーの定量化のための、厳密に定義された均質でかつ安定な標準物質の調製物を提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
前記課題は、タンパク質凝集性疾患、又はアミロイド変性、又はタンパク質ミスフォールディング疾患を特徴付けるオリゴマー又は病原性の凝集体を定量化するための標準物質において、ポリマーがポリペプチド配列から構成されており、このポリペプチド配列は、その配列に関して、相応するサブセグメントにおいて、タンパク質凝集性疾患、又はアミロイド変性、又はタンパク質ミスフォールディング疾患を特徴付ける生体固有のタンパク質と同一であるか、又は、相応するサブセグメントにわたって、この生体固有のタンパク質と少なくとも５０％の相同性を示し、その際、ポリマーが凝集しないことを特徴とする標準物質により解決される。
【００１６】
本発明の意味での標準物質とは、特性及び／又は量の比較及び測定に、特に生体固有のタンパク質からの病原性凝集体のサイズ及び量の測定に用いられる、一般に有効であり受け入れられる固定の参照量を表す。本発明の意味での標準物質は、機器のキャリブレーション及び／又は測定に使用可能である。
【００１７】
本発明の意味で、アミロイド変性及びタンパク質ミスフォールディング疾患も「タンパク質凝集性疾患」という概念で一括りにすることができる。そのような疾患と、それに関連する生体固有のタンパク質の例は、ＡＤに関してはＡβタンパク質及びタウタンパク質であり、パーキンソン病に関してはα−シヌクレインであり、またプリオン病、例えばヒトのクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、羊のスクレイピー及び牛海綿状脳症（ＢＳＥ）に関してはプリオンタンパク質である。
【００１８】
「相同な配列」とは、本発明の意味で、あるアミノ酸配列が、タンパク質凝集性疾患を引き起こす生体固有の病原性の凝集体又はオリゴマーからのアミノ酸配列と、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を示すことを意味する。本願明細書では、「同一性」という概念に代えて、「相同な」又は「相同性」という概念を同義で用いる。２つの核酸配列又はポリペプチド配列間の同一性は、Smith, T.F.及びWaterman, M.S(Adv. Appl. Math. 2: 482-489(1981))のアルゴリズムに基づくプログラムＢＥＳＴＦＩＴを用いた比較により、アミノ酸に関するパラメータを、ギャップクリエーションペナルティー：８、及びギャップエクステンションペナルティー：２に設定し、核酸に関するパラメータを、ギャップクリエーションペナルティー：５０、及びギャップエクステンションペナルティー：３に設定して算出される。好ましくは、２つの核酸配列又はポリペプチド配列間の同一性は、それぞれの全配列長にわたる核酸配列／ポリペプチド配列の同一性によって定義され、例えばこれは、Needleman, S.B.及びWunsch, C.D.(J. Mol. Biol. 48: 443-453)のアルゴリズムに基づくプログラムＧＡＰを用いた比較により、アミノ酸に関するパラメータを、ギャップクリエーションペナルティー：８、及びギャップエクステンションペナルティー：２に設定し、核酸に関するパラメータを、ギャップクリエーションペナルティー：５０、及びギャップエクステンションペナルティー：３に設定して算出される。
【００１９】
２つのアミノ酸配列が同一のアミノ酸配列を有している場合、これら２つのアミノ酸配列は本発明の意味で同一である。
【００２０】
生体固有のタンパク質の「相応するサブセグメント」という概念は、本発明による定義に従って、本発明による標準物質を構成しているモノマーの、同一の、又は、示されているパーセンテージで相同なペプチド配列を有しているペプチド配列と解釈されるべきである。
【００２１】
本発明による標準物質について重要な点は、好ましくは凝集しないモノマー配列を用いることによって標準物質が凝集しないという点であり、それというのも、生体固有のタンパク質の「相応するサブセグメント」は凝集の原因でないか、もしくは、凝集の原因となる群がブロッキングのために凝集しないためである。
【００２２】
本発明の意味での凝集体とは、以下のものである：
−  互いに共有結合していない、複数の、好ましくは同一の構成単位からなる粒子、及び／又は、
−  複数のモノマーの、共有結合していない集合体。
【００２３】
本発明の一実施態様において、標準物質は厳密に定義された数のエピトープを有しており、このエピトープは、相応するプローブの結合のために、（直接、又は、アミノ酸、スペーサー及び／又は官能基を介して）互いに共有結合している。本発明の意味でのプローブとは、以下のものからなる群から選択される：抗体、ナノボディ及びアフィボディ。さらに、検出すべき凝集体に対して十分な結合特異性を有している分子はいずれもプローブであり、例えば染料（チオフラビンＴ、コンゴーレッド等）である。
【００２４】
エピトープの数は、ポリペプチド配列であって、その配列に関して、エピトープを形成している生体固有のタンパク質のサブセグメントと同一であるか、又はこのサブセグメントと少なくとも５０％の相同性を示し、かつその際、このエピトープの生物学的活性を有しているポリペプチド配列を用いることにより決定される。そのようにして選択されたポリペプチド配列は、所望の数で、本発明による標準物質の合成の際に組み込まれ、かつ／又は、一緒に本発明により結合される。
【００２５】
本発明による標準物質は、上記のポリペプチド配列、好ましくはエピトープから構成されており、場合により他の要素を含むポリマーである。本発明のもう一つの実施態様において、上記のポリペプチド配列、好ましくはエピトープ、及び／又は、相応するエピトープの生物学的活性を有するその相同体は、それぞれ標準物質の残りのモノマー種のうちの１種の数に対して、及び／又は、他の全てのモノマーの数に対して、同じか又はそれよりも大きい数のモノマーを表す。
【００２６】
本発明のもう一つの実施態様において、エピトープは、サブセグメントＡβ１−８（配列番号２）、Ａβ１−１１（配列番号３）、Ａβ１−１６（配列番号４）、Ａβ３−１１（配列番号５）及びｐｙｒｏＧｌｕＡβ３−１１（配列番号６）、Ａβ１１−１６（配列番号７）及びｐｙｒｏＧｌｕＡβ１１−１６（配列番号８）から選択されたＡβペプチドのエピトープ、例えば（以下の配列：ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥ（１−１１；配列番号３に相当）を有する）ヒトＮ末端エピトープである。ｐｙｒｏＧｌｕとは、そのＮ末端にある残基の分離後にＡβペプチドの３位又は１１位のグルタミン酸残基から生じ得るピログルタミン酸の略称である。
【００２７】
本発明による標準物質は、上で定義したポリペプチド配列からのポリマーである。本発明の意味でのオリゴマーとは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個又は２０個のモノマー（モノマーとは、上に挙げたポリペプチド配列と解釈されるべきである。）から形成されているポリマー又はその多量体であり、好ましくは２〜１６個、４〜１６個、８〜１６個、特に好ましくは８個又は１６個のモノマーから形成されているポリマー又はその多量体である。従って、本発明による標準物質は本発明によるオリゴマーないしポリマーである。
【００２８】
本発明の一別法において、標準物質は水溶性である。
【００２９】
本発明の一別法において、本発明による標準物質は同一のポリペプチド配列から構成されている。本発明の一別法において、本発明による標準物質は異なるポリペプチド配列から構成されている。
【００３０】
本発明の一別法において、上で定義したようなポリペプチド配列は直鎖状構造で連結している。本発明の一別法において、上で定義したようなポリペプチド配列が連結して、本発明による分岐鎖オリゴマーを形成している。本発明の一別法において、上で定義したようなポリペプチド配列が連結して、本発明による架橋オリゴマーを形成している。本発明による分岐鎖もしくは架橋オリゴマーは、リシンを用いて、又はクリックケミストリーを用いて、個々の構成単位を結合することによって製造可能である。上記の通り、本発明による標準物質、即ち本発明によるオリゴマーないしポリマーは、厳密に定義された数で存在するポリペプチド配列、好ましくはエピトープに加え、さらに、付加的なアミノ酸、スペーサー及び／又は官能基を含むことができ、これらを介して、ポリペプチド配列、好ましくはエピトープが互いに共有結合している。一別法において、特にシステインによるジスルフィド架橋を用いた、ポリペプチド配列、好ましくはエピトープとシステインとの直接結合は、（還元剤による解架橋を回避するために）排除される。同様に、もう一つの変法において、スペーサーと、一方ではポリペプチド配列との、及び他方ではシステインとの直接結合は排除される。
【００３１】
本発明は、一別法において、サブセグメントＡβ１−８（配列番号２）、Ａβ１−１１（配列番号３）、Ａβ１−１６（配列番号４）、Ａβ３−１１（配列番号５）及びｐｙｒｏＧｌｕＡβ３−１１（配列番号６）、Ａβ１１−１６（配列番号７）及びｐｙｒｏＧｌｕＡβ１１−１６（配列番号８）から選択されたＡβペプチドのアミノ末端部分、例えば（以下の配列：ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥ（１−１１）を有する）ヒトＮ末端エピトープのコピーを含むか又はこれから構成されている標準物質分子に関する。
【００３２】
個々の構成単位の合成の前又は後に、官能基によるエピトープのコピーを行うことができる。本発明による標準物質の特徴は、ポリペプチド配列の共有結合である。
【００３３】
本発明により使用可能なポリペプチド配列は、フルレングスのＡβペプチドの配列と同一のものであってもよいし、フルレングスのＡβペプチドの配列と５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の相同性を示すものであってもよい。
【００３４】
また、フルレングスのＡβペプチドのサブセグメントと同一であるか、又は、フルレングスのＡβペプチドのサブセグメントと５０％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の相同性を示すポリペプチド配列は、本発明による標準物質分子の合成にも用いられる。本発明により使用される配列について重要な点は、凝集しない（又は条件により制御されてのみ凝集する）というその特性、及び／又はエピトープとしてのその活性である。
【００３５】
本発明のもう一つの実施態様において、標準物質はデンドリマーとして構成されている。本発明によるデンドリマーは、本発明により使用され得る上記のポリペプチド配列から構成されており、かつ中心骨格分子を含むことができる。好ましくは、この骨格分子はストレプトアビジンモノマー、特に好ましくはポリマー、特に四量体である。
【００３６】
本発明によるデンドリマーは、一変法において、Ａβペプチドのサブセグメントと同一であるか又は相応するサブセグメントに対して少なくとも５０％の相同性を示す配列を有するポリペプチド配列を含んでいる。
【００３７】
本発明によれば、少なくとも５０％の相同性という概念は、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％からなる群から選択された高い相同性とも解釈されるべきである。
【００３８】
好ましくは生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体又はオリゴマーよりも水性物質中での溶解度が高い標準物質が、本発明の一実施態様において、ＡβペプチドのＮ末端領域と同一であるか又はこれに対して少なくとも５０％の相同性を示すポリペプチド配列から形成されている。本発明によれば、ＡβポリペプチドのＮ末端領域とは、アミノ酸配列Ａβ１−８（配列番号２）、Ａβ１−１１（配列番号３）、Ａβ１−１６（配列番号４）、Ａβ３−１１（配列番号５）及びｐｙｒｏＧｌｕＡβ３−１１（配列番号６）、Ａβ１１−１６（配列番号７）及びｐｙｒｏＧｌｕＡβ１１−１６（配列番号８）と解釈されるべきである。
【００３９】
本発明による標準物質分子は、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又はそれを上回る種々のプローブに対するエピトープを含むことができる。
【００４０】
Ａβペプチドの種々の領域と同一であるか又はこれに対して少なくとも５０％の相同性を示すものの、相応するエピトープの活性を有しているポリペプチド配列を用いることにより、種々のプローブに対して固有のエピトープを本発明による標準物質に組み込むことができる。一実施態様において、このために、ＡβポリペプチドのＮ末端領域と同一であるか又は５０％の相同性を示すポリペプチド配列、並びに、ＡβポリペプチドのＣ末端と同一であるか又は少なくとも５０％の相同性を示すポリペプチド配列が用いられる。
【００４１】
本発明の一実施態様において、標準物質分子はいわゆるスペーサーを含んでいる。スペーサーとは、共有結合を介して標準物質分子に組み込まれており、所定の物理的及び／又は化学的特性を有しており、それによって標準物質分子の特性が変化するような分子と解釈されるべきである。本発明による標準物質の一実施態様において、親水性又は疎水性、好ましくは親水性のスペーサーが用いられる。親水性のスペーサーは、ポリエチレングリコール、糖、グリセリン、ポリ−Ｌ−リシン又はβ−アラニンから形成される分子群から選択される。
【００４２】
本発明による標準物質は、本発明の一実施態様において、（さらなる）官能基を含んでいる。官能基とは、標準物質に共有結合している分子と解釈されるべきである。一変法において、官能基はビオチン基を含んでいる。それにより、ストレプトアビジンとの強力な共有結合が可能となる。そのようにして、ビオチン基を含む標準物質分子はストレプトアビジン基を含む分子に結合できる。本発明による標準物質分子がビオチン基及び／又はストレプトアビジン基を含んでいる場合、比較的大きな標準物質を合成することもできるし、複数の、場合により種々の標準物質分子を骨格に結合させることもできる。
【００４３】
本発明のもう一つの別法において、標準物質分子は、分光光度定量のための染料及び／又は芳香族アミノ酸を含んでいる。芳香族アミノ酸は、例えばトリプトファン、チロシン、フェニルアラニン又はヒスチジンであるか、又はこの群から選択されたものである。トリプトファンを組み込むことによって、溶液中での標準物質の濃度の分光光度定量が可能となる。
【００４４】
本発明のさらなる対象は、ポリペプチドを含むデンドリマーであり、このポリペプチドは、その配列に関して、相応するサブセグメントにおいて、タンパク質凝集性疾患を特徴付ける生体固有のタンパク質と同一であるか、又は、相応するサブセグメントにわたって、この生体固有のタンパク質と少なくとも５０％の相同性を示すものである。
【００４５】
本発明によるデンドリマーは、標準物質の上記の特徴の各々か、又はその各々の任意の組み合わせを有することができる。
【００４６】
本発明の一別法において、以下のものが該当する：
プローブの共有結合のための厳密に定義された数のエピトープを含むデンドリマー、
Ａβペプチドのエピトープを含むデンドリマー、
タンパク質凝集性疾患を特徴付ける生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体よりも水性物質中での溶解度が高いことを特徴とするデンドリマー、
官能基を含むデンドリマー、
少なくとも１つのスペーサー分子を含むデンドリマー、及び／又は
分光光度定量のための染料及び／又は芳香族アミノ酸を含むデンドリマー。
【００４７】
本発明によれば、デンドリマーは放射対称性を有している。一変法において、デンドリマーの第１世代の分岐は、リシン、特に３つのリシンアミノ酸を介して行われる。
【００４８】
本発明のもう１つの別法において、標準物質、特にデンドリマーにおいて、ポリペプチド配列、好ましくはエピトープは、硫黄原子との結合を介さずに、チオエーテル結合を介さずに、かつ／又はシステインを介さずに（場合によりシステインによるジスルフィド架橋を用いて）互いに結合しているか、又は、標準物質の他の要素、例えばアミノ酸、スペーサー及び／又は官能基及び／又は他の上記の要素と結合しており、特に共有結合している。同様に、もう１つの変法において、ポリペプチド配列、好ましくはエピトープと、これに結合しているスペーサーとは、スペーサー上で、硫黄原子との結合を介さずに、チオエーテル結合を介さずに、かつ／又はシステインを介さずに互いに結合しているか、又は、標準物質の他の要素、例えばアミノ酸、さらなるスペーサー及び／又は官能基及び／又は他の上記の要素と結合しており、特に共有結合している。
【００４９】
本発明はさらに、上記のような標準物質の製造法に関する。一実施態様において、本発明による標準物質は、当業者に公知のペプチド合成法又は組換え法により製造される。
【００５０】
本発明のもう１つの対象は、タンパク質凝集性疾患を特徴付ける生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体又はオリゴマーを定量化するための、上記の標準物質又は上記のデンドリマーの使用である。
【００５１】
本発明の一実施態様において、標準物質はＡβオリゴマーの定量化に用いられる。
【００５２】
従って、本発明によるオリゴマーないしポリマーを標準物質として使用する、タンパク質凝集性疾患、又はアミロイド変性、又はタンパク質ミスフォールディング疾患を特徴付ける生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体又はオリゴマーを定量化するための方法も、本発明の対象である。
【００５３】
本発明の一実施態様において、本発明による標準物質は、サーフェスＦＩＤＡ法、Ｅｌｉｓａ（サンドイッチＥｌｉｓａ）又はＦＡＣＳにおけるキャリブレーションに使用される。
【００５４】
もう１つの実施態様において、本発明は、本発明による標準物質を含むキットに関する。本発明のキットの化合物及び／又は構成要素は、容器内に、場合によりバッファー及び／又は溶液と一緒に、あるいはバッファー及び／又は溶液中にパックされていてよい。また、いくつかの構成要素が同じ容器内にパックされていてもよい。これに加えて、又はこの代わりに、１つ以上の構成要素が、例えばガラスプレート、チップ、又はナイロンメンブレンといった固体の支持体に、又はマイクロタイタープレートのウェルに吸収されていてもよい。さらに、キットは、このキットを任意の一態様に用いるための使用説明書を含むことができる。
【００５５】
本発明の一別法において、標準物質は、以下のようにして生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体又はオリゴマーの定量化に用いられる：
第一の工程において、標準物質又はデンドリマーをプローブでマークし、この標準物質又はデンドリマーに結合しているプローブの数を測定し、
第二の工程において、タンパク質凝集性疾患を特徴付ける生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体又はオリゴマーをプローブでマークし、このそれぞれ病原性の凝集体又はオリゴマーに結合しているプローブの数を測定し、
第三の工程において、第一の工程からのそれぞれ標準物質又はデンドリマーに結合しているプローブの数を、第二の工程からの数と比較し、さらに
第四の工程において、それにより、体液からのオリゴマーの数及びサイズを決定する。
【００５６】
本発明の一変法において、本発明による標準物質、好ましくはデンドリマーは、サーフェスＦＩＤＡ法のキャリブレーションに用いられる。第一の工程において、体液からの生体固有の病原性の凝集体、例えばＡβ凝集体は、キャプチャー分子、例えばキャプチャー抗体によりガラス表面上に固定化される。Ａβ凝集体の場合には、このためにＮ末端に結合するキャプチャー抗体を使用することができる。固定化の後、この凝集体は２つの異なるプローブによりマークされる。Ａβ凝集体の場合には、例えば、双方がＮ末端結合エピトープを介して結合するＡβ抗体が使用される。これらの検出プローブは、好ましくは異なる蛍光染料でマークされている。それにより、これらの検出プローブは例えばレーザー走査型顕微鏡のような顕微鏡下での視認が可能となる。
【００５７】
本発明によれば、試験系において、類似もしくは同一のエピトープに結合する３つの異なるプローブか又は３つの異なってマークされたプローブを用いることによって、生体固有のポリペプチドのモノマー検出が排除される。これに代わって、又はこれに加えて、比較的強度の低いシグナルを強度閾値の定義により評価しないことによって、モノマーの検出を排除することができる。これに代わって、又はこれに加えて、比較的大きい凝集体は、異なってマークされた染料を有する２つのプローブに対して複数の結合部位を有しているため、これらのシグナルの相互相関によりモノマーの検出を排除することができる。本発明による標準物質を、測定の際に内部標準物質又は外部標準物質として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】Ａは、トリプルリシンコアに結合した４つのＮ末端Ａβエピトープ１−１１からなる４−ＭＡＰの合成を示す図、Ｂは、ストレプトアビジン四量体への４つの４−ＭＡＰの結合を示す図、Ｃは、１６−ＭＡＰの形成を示す図。
【図２】Ａは、レーザー走査型顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社製  ＬＳＭ  ７１０）による、ＭＡＰ−１６のｓＦＩＤＡ測定結果を示す図、Ｂは、ＴＩＲＦ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ社製）による、ＭＡＰ−１６のｓＦＩＤＡ測定結果を示す図。
【実施例】
【００５９】
１．Ａβオリゴマー標準物質の製造
一実施例において、Ｎ末端に結合するＡβ抗体に対する１６個のエピトープ（エピトープはＡβ１−１１に相当する。配列：ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥ、配列番号３）を有するＡβオリゴマー標準物質を調製した。まず、４つのＮ末端ＡβエピトープＡβ１−１１からなる多抗原ペプチド（ＭＡＰ）を合成した。これらのエピトープは図１Ａに相応してトリプルリシンコア結合しており、このトリプルリシンコアは、ＵＶ／ＶＩＳ分光法によりＭＡＰ濃度を厳密に測定するために２つのトリプトファンを含んでいた。さらに、ビオチンタグをＮ末端につけた。これを、図１のＢに示すように、それぞれ４つの４−ＭＡＰ単位をストレプトアビジン四量体に結合するのに用いた。４−ＭＡＰ及びストレプトアビジンをインキュベーションした後に、図１のＣに示すように１６−ＭＡＰを形成させた。サイズ排除クロマトグラフィーにより、１６−ＭＡＰをインキュベーション混合物の他の成分と分離した。次いで、ＭＡＰ−１６を順にＰＢＳで希釈し、Ａβオリゴマーの検出のためにｓＦＩＤＡ試験で使用した。
【００６０】
２．Ａβオリゴマーの検出
ａ．ガラスプレートの準備
ガラス製のマイクロタイタープレートを超音波浴中で１５分間洗浄し、次いでプラズマ洗浄装置で１０分間処理した。ガラス表面の活性化のために、ウェルを５Ｍ  ＮａＯＨ中で少なくとも３時間インキュベートし、水ですすいだ後、窒素ガス流中で乾燥させた。デキストランで被覆するために、ガラス表面をヒドロキシル化し、次いでアミノ基で活性化させた。このために、ガラスプレートをＤＭＳＯ中の５Ｍエタノールアミンの溶液中で一晩インキュベートした。次いで、このガラスプレートを水ですすぎ、窒素ガス流中で乾燥させた。カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）を２０ｍｇ／ｍｌの濃度で水中に溶解させ、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）（２００ｍＭ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（５０ｍＭ）と混合した。１０分間のプレインキュベーションの後、この溶液を室温でさらに２時間インキュベートした。次いで、このガラスプレートを水で洗浄した。
【００６１】
ｂ．被覆したガラス上へのキャプチャー分子としての抗体の固定化
ＥＤＣ／ＮＨＳの溶液（２００又は５０ｍＭ）で、第二の活性化を５分間行った。抗体の溶液をこれに添加し、４℃で２時間インキュベートした。これにより、抗体を、ＣＭＤで活性化されたガラス表面に共有結合させた。次いで、ＣＭＤスペーサー上の残りの活性カルボキシル末端基を失活させるために、これをＤＭＳＯ中の１Ｍエタノールアミンで５分間インキュベートした。次いで、ガラスをＰＢＳで３回洗浄した。
【００６２】
ｃ．前処理したガラス上へのＭＡＰ−１６の固定化
アッセイを行うべきＭＡＰ−１６を含むサンプルをガラス上で１時間インキュベートし、次いで、ＴＢＳＴ（０．１％）（Ｗ／Ｗ）、（ＴＢＳバッファー中のＴｗｅｅｎ  ２０、ＴＢＳ：５０ｎＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で３回洗浄した。
【００６３】
ｄ．蛍光染料でのプローブの標識
６Ｅ１０−Ａｌｅｘａ４８８抗体及びＩＣ−１６抗体を使用した。ＩＣ−１６抗体を、製造者の使用説明書に従い、キット（蛍光標識キットＡｌｅｘａ−６４７、分子プローブ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ社、ドイツ在）でマーキングした。標識した抗体を、２ｍＭアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中で暗所で４℃で貯蔵した。
【００６４】
ｅ．プローブでの凝集体のマーキング
プローブを添加し、室温で１時間インキュベートし、次いで、ＴＢＳＴで５回、水で２回洗浄した。
【００６５】
ｆ．凝集体標準物質の検出
共焦点レーザー走査型顕微鏡ＬＳＭ  ７１０（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社、Ｊｅｎａ、ドイツ在）を用いて測定を行った。この顕微鏡は、１つのアルゴンイオンレーザーと３つのヘリウムネオンレーザーを具備していた。タイルスキャンモードで測定を行い、その際、１つのウェル内の隣接する面を測定して画像化した。各タイルスキャンは３×２個の各画像を含んでおり、各画像の面積は２１３×２１３μｍであった。また、倒立型顕微鏡ＤＭＩ  ６０００、レーザーボックス及びＨａｍａｍａｔｓｕ−ＥＭ−ＣＣＤ  Ｃ９１００カメラから構成されているＴＩＲＦ顕微鏡（ＴＩＲＦ＝total internal reflection）で測定を行った。タイルスキャンモードで、それぞれ１０９．９×１０９．９μｍのサイズを有する３×３個の各画像が存在していた。
【００６６】
ソフトウェア「Ｉｍａｇｅ  Ｊ」(http://rsbweb.nih.gov/ij/)を用いて評価を行った。様々なプローブを用いることにより、共局在解析を実施することができた。このために、まず、個々のピクセルの強度値から、ＭＡＰ−１６を含まない陰性対照により定義されるカットオフ値を減じた。次いで、強度が０よりも大きい共局在ピクセルの数を加えた。
【００６７】
図２に測定結果を示す。ｓＦＩＤＡシグナル、即ち共局在ピクセルの数がＭＡＰ−１６分子の濃度と相関関係にあることが明らかに認められる。
【００６８】
図の説明
図１：
Ａβの最初の１１個のアミノ酸に相応する（配列：ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥ）Ｎ末端に結合するＡβ抗体に対する１６個のエピトープを有するＡβオリゴマー標準物質の調製。Ａ）ＵＶ／ＶＩＳ分光法により濃度を測定するために２つのトリプトファンを含むトリプルリシンコアに結合した４つのＮ末端Ａβエピトープ１−１１からなる４−ＭＡＰを合成した。Ｂ及びＣ）１６−ＭＡＰを製造するために、それぞれ４つの４−ＭＡＰをストレプトアビジン四量体を介して結合した。サイズ排除クロマトグラフィーにより、ＭＡＰ−１６をインキュベーション混合物の他の成分から分離した。
【００６９】
図２：
ＰＢＳバッファーで希釈した様々な濃度でのＭＡＰ−１６のｓＦＩＤＡ測定。ＭＡＰ−１６を含まないＰＢＳバッファーを陰性対照として使用した。Ａ）レーザー走査型顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社  ＬＳＭ  ７１０）で測定を行った。Ｂ）ＴＩＲＦ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ社）で測定を行った。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
2015502968000001.app
【国際調査報告】
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