(57)【要約】  本発明は、発酵により生成されるメチオニンの結晶化母液に由来する新規の液体メチオニン組成物に関し、それは、３０重量％〜５０重量％のメチオニンを含み、２０重量％〜７５重量％の乾燥物質量を有し、０．５重量％未満のイソロイシン及び０．９％〜１．３％のＮ−アセチル−メチオニンを含むことを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
３０重量％〜５０重量％のメチオニンを含み、乾物量が２０重量％〜７５重量％であることを特徴とする発酵により生成されるメチオニンの結晶化母液に由来する液体メチオニン組成物。
【請求項２】
０．５重量％未満のイソロイシン、及び０．９重量％〜１．３重量％のＮ−アセチル−メチオニンを含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
メチオニン及びイソロイシン以外のアミノ酸を７重量％〜１０重量％含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
糖の含量が５％未満であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
メチオニンを生成する微生物の発酵培地から請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物を調製するための方法であって、
ａ．発酵培地の清澄化し、前記発酵培地から不溶性及び可溶性有機不純物を除去するステップと、
ｂ．任意に、前記発酵培地からカチオン及びアニオンを除去するために前記清澄化された発酵培地を脱塩するステップと、
ｃ．得られた液体溶液からメチオニンを結晶化し、結晶化母液を回収するステップと、
ｄ．ｐＨ＜メチオニンのｐＫａ１、又はｐＨ＞メチオニンのｐＫａ２となるように、前記結晶化母液のｐＨを調整するステップと、
ｅ．任意に、前記溶液の濾過及び濃縮をするステップと、
ｆ．得られたメチオニン組成物を回収するステップと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
動物飼料のための食品添加物又は栄養補助剤としての、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物又は請求項５に記載の方法により得られる組成物の使用。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物又は請求項５の方法により得られる組成物を含むことを特徴とする動物飼料用食品添加物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵により生成されるメチオニンの結晶化母液に由来する新規の液体メチオニン組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
他の含硫アミノ酸のように、メチオニンは細胞代謝に必須のものである。しかしながら、メチオニンは動物により生成されず、その動物の食料に十分な量が含まれていなければならない。
【０００３】
それは、特に動物飼料における栄養補助剤として添加されるために、工業規模で生成される。また、メチオニンは、アレルギー又はリウマチ熱等の種々の病気の治療又は予防の薬剤としても用いられ得る。
【０００４】
メチオニンの通常の源は、動物由来のタンパク質又は化学合成である。しかしながら、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）又は鳥インフルエンザの発生による動物タンパク質の使用が減少し、これにより、合成メチオニンの需要が増大している。
【０００５】
Ｄ，Ｌ−メチオニンは、一般に、化石燃料及び石油化学製品誘導体、特にアクロレイン、メチルメルカプタン及びシアン化物から生成される。より活性なＬエナンチオマーを得るには、製造コストを大幅に増大させるラセミ体の分離といった追加のステップを必要とする。
【０００６】
今日、生体内変換によるメチオニンの生成は、化石燃料の枯渇及び原料コストの上昇のため、石油化学製品を用いるよりも有利である。
【０００７】
しかしながら、これらのプロセスの実施には、炭素源の発酵によるメチオニンの生成のための適当な微生物が利用可能であることが必要である。
【０００８】
第１の工業的に有効な解決法は公開されており、特に特許出願ＷＯ２００５／１１１２０２、ＷＯ２００７／０１７７１０、ＷＯ２００７／０７７０４１及びＷＯ２００９／０４３８０３に記載されている。
【０００９】
メチオニンを生成する他の微生物は、特に特許出願ＷＯ２００４／０３８０１３、ＷＯ２００６／００１６１６、ＷＯ２００６／１３８６８９及びＷＯ２００７／０１２０７８に記載されている。
【００１０】
しかしながら、生合成メチオニンの大規模生成では、発酵槽内の化学分子の回収に特有な問題があり、特に最終製品の精製の問題がある。この場合において、得られた粗製の混合液の質、不純物の含量及びそれらの特性は、極めて重要である。
【発明の概要】
【００１１】
従って、本発明は、直接に動物飼料に利用可能な新規の液体メチオニン組成物に関する。
【００１２】
本発明のメチオニン組成物は、発酵により生成されたメチオニンの結晶化母液由来である。
【００１３】
この発酵は、炭素源を含む適当な培養培地で増殖される微生物により従来法で行われる。
【００１４】
炭素源は、微生物により代謝され得る全ての炭素源から選択され、特に、グルコース、スクロース、単糖類又はオリゴ糖、デンプン及びその誘導体、並びにそれらの混合物から選択される。
【００１５】
本発明に係る組成物は、その特性及び／又は含まれる不純物の含量によって、他のプロセスで得られたメチオニン組成物と区別され得る。
【００１６】
発酵により生成されるメチオニンの結晶化母液由来の本発明に係るメチオニン組成物は、３０重量％〜５０重量％のメチオニン、及び２０重量％〜７５重量％の乾物含量を有する。
【００１７】
本発明の精神において、「２０重量％〜７５重量％の乾物含量を有する組成物」は、該組成物が該組成物の総重量に対して２０重量％〜７５重量％の割合で含まれる乾物を有することを意味する。
【００１８】
組成物が３０重量％〜５０重量％のメチオニンを含むことは、該組成物が該組成物の乾燥残留物（すなわち乾物）の総重量に対して３０重量％〜５０重量％の量でメチオニンを含むことを意味する。他に指示しない限り、本明細書における割合は、組成物の乾燥残留物の総重量に対する重量で表される。特に、イソロイシン、メチオニン、メチオニン及びイソロイシン以外のアミノ酸、又はＮ−アセチル−メチオニンの割合は、組成物の総乾燥残留物の重量に対する重量で表される。
【００１９】
本発明に係る組成物は、メチオニンの発酵プロセス由来の他の残留物、及び特に他のアミノ酸を通常は含む組成物である。
【００２０】
本発明に係る組成物は、０．５重量％未満のイソロイシンを含む。
【００２１】
メチオニン及びイソロイシン以外のアミノ酸の含量は、７重量％〜１０重量％であることが有利である。
【００２２】
Ｎ−アセチル−メチオニンは、０．９重量％〜１．３重量％含まれる。
【００２３】
本発明に係る組成物は、５重量％未満の糖を含むことが有利である。
【００２４】
本発明のメチオニン組成物は、メチオニン生成微生物の発酵培地から以下のステップを含むプロセスにより調製され得る：
１）発酵培地を清澄化し、該発酵培地から不溶性及び可溶性の有機不純物を除去すること、
２）任意に、前記発酵培地からカチオン及びアニオンを除去するために清澄化された発酵培地を脱塩すること、
３）得られた溶液からメチオニンを結晶化し、結晶化母液を回収すること、
４）ｐＨ＜メチオニンのｐＫａ１、又はｐＨ＞メチオニンのｐＫａ２の値を得るために結晶化母液のｐＨを調整すること、
５）任意に、処理された母液を濾過及び濃縮すること、
６）得られたメチオニン組成物を回収すること。
【００２５】
出願人は、このプロセスの最初の３つのステップが国際特許出願ＷＯ２０１１／０４５３７７に既に記載されているステップと共通であることを強調し、この文献はその内容が参照として本明細書に組み込まれる。
【００２６】
本発明に係るメチオニン組成物を調製するためのプロセスの第１ステップは、発酵培地の清澄化と、該発酵培地からの不溶性及び可溶性有機不純物の除去とからなる。
【００２７】
本発明の精神において、「不溶性有機不純物」は、残留不溶性粒子、タンパク質及びバイオマスを意味することが理解される。
【００２８】
「可溶性有機不純物」は、発酵培地に混入する全ての可溶性粒子、特に可溶性タンパク質及び多糖類等の高分子を意味する。
【００２９】
本発明のメチオニン組成物は、細菌、酵母又は真菌（かび）等のメチオニンの合成を促進するために最適化された微生物の培養によるメチオニンの発酵プロセスにより得られる。
【００３０】
微生物は、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）、バシラス科（Bacillaceae）、ストレプトミセス科（Streptomycetaceae）及びコリネバクテリウム科（Corynebacteriaceae）から選択されることが有利である。
【００３１】
特に、微生物は、エシェリキア属（Escherichia）、クレブシエラ属（Klebsiella）、パンテア属（Pantoea）、サルモネア属（Salmonella）又はコリネバクテリウム属（Corynebacterium）から選択される。
【００３２】
特に、微生物は、エシェリキアコリ（Escherichia coli）又はコリネバクテリウムグルタミクム（Corynebacteriumglutamicum）から選択される。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態において、本発明に係るメチオニン組成物は、本明細書に参照として組み込まれる特許出願ＷＯ２００９／０４３８０３に記載された微生物、特に実施例に記載された微生物の培養に由来する。例えば、遺伝子型MG1655 metA*11 Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykAΔpurU (pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11)(pCC1BAC-serB-serA-serC)を有するエシェリキアコリ株を用いて本発明を実施してもよい。
【００３４】
培地の清澄化は、当業者に周知の方法で行われ、例えばフロキュレーション、沈殿法、膜技術（精密濾過、限外濾過、ナノ濾過及び逆浸透圧法）並びに遠心分離法からなる群から選択される方法で行われる。
【００３５】
可溶性有機不純物の除去は、当業者に周知の方法により行われ、例えば限外濾過、加熱処理、活性炭系の吸着剤を用いた処理、及び酵素による加水分解からなる群から選択される方法により行われる。
【００３６】
本発明に係るメチオニン組成物を調製するためのプロセスの第２ステップは、ここでは任意に行われ、前記発酵培地からカチオン及びアニオンを除去するために、前記清澄化された発酵培地を脱塩することからなる。
【００３７】
この場合において、このステップは、従来の電気透析若しくはＥＤＣ（ＥＵＲＯＤＩＡ）によって、及び／又はＨ＋カチオン交換樹脂（ＰＵＲＯＬＩＴＥ（登録商標）Ｃ１２０、ＰＵＲＯＬＩＴＥＣ１５０、ＰＵＲＯＬＩＴＥ Ｃ１６０・・・）及び／又はアニオン交換樹脂（ＬＥＷＡＴＩＴ（登録商標）Ｓ４２２８、ＬＥＷＡＴＩＴ Ｓ４５２８、Ｒｏｈｍ＆Ｈａａｓ ＦＰＡ９１・・・）によって行われ得る。
【００３８】
イオン交換樹脂を用いた処理は、コスト及び塩の有効な低減のためにＥＤＣが好ましい。
【００３９】
本発明に係るメチオニン組成物を調製するためのプロセスの第３ステップは、固形状でメチオニンを回収するために、特に本発明の意味する範囲内では結晶化母液を回収及び再利用するために、最後にメチオニンを結晶化することからなる。
【００４０】
この結晶化ステップは、冷却による結晶化、蒸発による結晶化及び断熱性の結晶化からなる群から選択される方法により行われ得る。
【００４１】
出願人は、蒸発による結晶化を用いることを薦める。
【００４２】
蒸発による結晶化が選択される場合、出願人は、過飽和にするために流下膜式蒸発器を用いた真空蒸発によりメチオニン溶液を前濃縮することを薦める。
【００４３】
前濃縮された溶液は、例えばさらに濃縮され、結晶化されるためにドラフトチューブタイプの晶析装置に移される。
【００４４】
３５℃におけるメチオニンの溶解度は約７０ｇ／Ｌである。３５℃の真空において、約２５０ｇ／Ｌに溶液を濃縮することによって、メチオニンの回収収率は＞７０％となる。
【００４５】
従来、結晶化プロセスにおいて、母液自体は、結晶化の効率を増大するために該結晶化プロセスにおいて濃縮及び再利用がなされる。
【００４６】
出願人の会社自体の国際特許出願ＷＯ２０１１／０４５３７７において、結晶化母液が乾燥残留物の総重量に対して約４０重量％のメチオニンが含まれ、適当な処理の前又は後に、液体の形態で又は第２結晶化の後に、プロセスの上流で母液を完全に又は部分的に再利用することにより、結晶化されたメチオニンの全収率を最適化することを薦めることが示されている。
【００４７】
出願人は、前記母液を再利用するための副産物としてではなく、付加価値を有するメチオニン組成物の直接の源として最大にすることを選択することにより、この技術傾向に逆らう。
【００４８】
従って、本発明に係るメチオニン組成物の調製プロセスは、以下の３つの最終ステップが加えられたプロセスからなる。
【００４９】
第４ステップは、ｐＨ＜メチオニンのｐＫａ１、又はｐＨ＞メチオニンのｐＫａ２となるように結晶化母液のｐＨを調整することからなる。
【００５０】
本発明に係るプロセスの第１の好ましい実施形態において、結晶化母液のｐＨは、母液の酸性化によりｐＨ＜メチオニンのｐＫａ１（ｐＫａ１＝２．２）となるように調整される。
【００５１】
この酸性化は、当業者に周知の方法により行われる。
【００５２】
出願人は、ｐＨ値を２．２（メチオニンの酸基のｐＫａ）未満にするのに、３７％塩酸を用いた酸性化を薦める。
【００５３】
本発明に係るプロセスの第２の好ましい実施形態において、結晶化母液のｐＨは、母液のアルカリ化によりｐＨ＞メチオニンのｐＫａ２となるように調整される。
【００５４】
出願人は、ｐＨ値を９．３（メチオニンのアミン基のｐＫａ）よりも大きくするために、５０％水酸化ナトリウムを用いたアルカリ化を薦める。
【００５５】
第５ステップは、特にキサンチンで構成される沈殿物を除去し、処理された母液を濃縮するために溶液を濾過することからなり得る。
【００５６】
第１の好ましい実施形態において、酸性化溶液は、５μｍの孔を有する膜を用いて濾過され、２０重量％〜７５重量％の乾物量を得るために濃縮される。
【００５７】
第２の好ましい実施形態において、アルカリ化溶液は濾過され、２０重量％〜７５重量％の乾物量を得るために濃縮される。
【００５８】
第６ステップは、本発明に係る液体メチオニン組成物を回収するためのものである。
【００５９】
本発明に係る組成物は、動物に与えられる栄養補助剤又は食品添加物として動物飼料に直接に用いられ、プレミックス若しくは用事調製組成物の形態で、又は他の食料と独立した形態でプレミックスとして各動物に与えられる飼料に混合されるのに有利となり得る。
【００６０】
従って、本発明は、本発明に係るメチオニン組成物を含む食品添加物、好ましくは動物飼料のための食品添加物に関する。
【００６１】
当業者には、各動物に適する飼料に必要なメチオニン量は周知であり、従って、当業者は本発明に係る組成物の使用方法及び量を決定し得る。
【００６２】
特に、本発明に係る組成物は、通常の動物飼料の添加物混合、混合及び水和を容易にするために微量元素及び水を加えるのに適する。
【００６３】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の実施例により明らかとなる。しかしながら、それらは、詳説を目的としており、限定を目的とするものではない。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
特許出願ＷＯ２００９／０４３８０３に記載されているMG1655 metA*11 Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykAΔpurU (pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11)(pCC1BAC-serB-serA-serC)の遺伝子型を有するエシェリキアコリのメチオニン生成株は、上記特許出願に記載された方法に従った発酵培養条件で培養する。
【００６５】
前記株の培養から生じた発酵ブロスは以下のように精製される。
【００６６】
Ａ）不溶性有機不純物（バイオマス）の除去
除去は、４０℃〜８０℃での１００ｎｍの細孔径を有する膜（３．５ｍｍのチャンネル径を有するセラミック型膜）を用いた接線濾過により行われる。
【００６７】
１ｂａｒの膜差圧及び２０％脱イオン水を用いた透析濾過では、温度は４０℃で維持されることが好ましい。
【００６８】
これらの条件下において、平均流量は３０Ｌ／ｈ／ｍ２であり、得られる透過水は澄んでおり透明である。
【００６９】
バイオマス及び不溶性粒子を含まない透過水は、未だ結晶化前に除去されるべき可溶性有機不純物、特に糖及び可溶性タンパク質を含む。
【００７０】
Ｂ）可溶性有機不純物（糖及び可溶性高分子）の除去
このステップは、発酵ブロスに含まれる糖（多糖類）及び高分子の除去を目的とする。
【００７１】
この除去は、５ＫＤａの分離閾値を有するセラミック膜を用いた限外濾過により行われる。
【００７２】
４０℃において、平均濾過流量は２５Ｌ／ｈ／ｍ２であり、約７０％の高分子が被保持物内に留められる。
【００７３】
Ｄ）結晶化
上記溶液は、WIEGAND型の流下薄膜型真空蒸発器を用いた５０℃での水の蒸発によって前濃縮される。
【００７４】
濃縮係数は、Ｌ−メチオニンの初期濃度次第で２〜５のオーダーとなる。
【００７５】
ここで、５０℃で過飽和により近づくためには濃縮係数が３に相当する（８０ｇ／Ｌ）。
【００７６】
前濃縮溶液は、さらに濃縮されるために強制循環蒸発晶析装置に移され、約３５℃の真空下（５０ｍｂａｒ）で結晶化される。
【００７７】
２４０ｇ／Ｌに達するように、この蒸発晶析装置で適応される濃縮係数は約３である。
【００７８】
ポリプロピレン織物を用いたROUSSELET遠心機での分離後（１２０ｍ３／ｍ２／ｈ）、濾塊の体積と同等の体積の脱イオン水で洗浄し、結晶は、４５℃で流動層を用いて乾燥される（AEROMATIC型）。
【００７９】
これらの条件下でＬ−メチオニンの回収収率は、精製により＞８０％となり、乾燥で＞８５％となる。
【００８０】
結晶化母液は、以下の表１に記載された成分を有する。
【００８１】
【表１】
2015500643.tif 000002
【００８２】
母液には乾燥重量で３０％以上のメチオニンが含まれる。
【００８３】
それは、母液を酸性化し、濾過し、濃縮することが選択された：
１）３７％塩酸を加えることによるｐＨを約１．６にする酸性化、
２）５μｍの孔を有する膜を用いた濾過、
３）研究室のロータリーエバポレーターによる濃縮（８０℃の水浴、５０ｍｂａｒの真空下、３５℃の蒸気温度）。
【００８４】
６０％の乾物量を有する本発明に係る母液の成分における結果は、以下の表２に示される。
【００８５】
【表２】
2015500643.tif 000003
【００８６】
このメチオニン組成物は、塩化物イオンが比較的に多いにもかかわらず、動物飼料として利用可能であり、０．５％までの追加メチオニンを典型的に含む組成物を得るために、飼料にメチオニンの栄養補助をできるようにする。
【国際調査報告】
2015500643.tif 000004
2015500643.tif 000005
2015500643.tif 000006
2015500643.tif 000007