(57)【要約】【課題】本出願は、亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物を含んでいるリポソーム組成物、ならびにそれらの調製および使用のための方法の提供を目的とする。【解決手段】この目的を達成するため、リポソームおよびリポソーム組成物であって、リポソームコアの内側に捕捉された亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物を含んでいる、リポソームおよびリポソーム組成物を採用する。そして、同時にリポソームの内側にカプセル化された亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物を調製する新たなリポソームおよびリポソーム組成物の調製方法、及び、当該リポソームおよびリポソーム組成物を主に医薬として用いるときの使用方法を提供する。【選択図】図１０
2015502400.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソーム組成物であって、少なくとも１つの脂質二重層を有しているリポソーム、および前記リポソームの内側にカプセル化された亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物を含んでおり、前記脂質二重層が、１つ以上の適切な脂質から構成されている、リポソーム組成物。
【請求項２】
前記組成物が、亜塩素酸塩を含み、前記亜塩素酸塩が、安定化された亜塩素酸塩である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物が亜塩素酸塩を含み、前記亜塩素酸塩がＯＸＯ−Ｋ９９３である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記安定化された亜塩素酸塩が、１〜１０％、１０〜２０％、２０〜３０％、３０〜５０％または５０〜９０（ｗ／ｖ）％のＯＸＯ−Ｋ９９３を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が、前記組成物のカプセル化された総イオン含量に基づいて、約０．０１（ｗ／ｗ）％〜約５０（ｗ／ｗ）％、約０．１（ｗ／ｗ）％〜約２０（ｗ／ｗ）％、約０．５（ｗ／ｗ）％〜約１０（ｗ／ｗ）％、約０．３（ｗ／ｗ）％〜約３（ｗ／ｗ）％または約１．０（ｗ／ｗ）％のカプセル化された亜塩素酸塩を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物が、前記組成物のカプセル化された総イオン含量に基づいて、約０．０１（ｗ／ｗ）％〜約５０（ｗ／ｗ）％、約０．１（ｗ／ｗ）％〜約２０（ｗ／ｗ）％、約０．５（ｗ／ｗ）％〜約１０（ｗ／ｗ）％、約０．３（ｗ／ｗ）％〜約３（ｗ／ｗ）％または約１．０％のカプセル化された塩素酸塩を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物が、前記組成物のカプセル化された総イオン含量に基づいて、約０．０１（ｗ／ｗ）％〜約５０（ｗ／ｗ）％、約０．１（ｗ／ｗ）％〜約２０（ｗ／ｗ）％、約０．５（ｗ／ｗ）％〜約１０（ｗ／ｗ）％、約０．３（ｗ／ｗ）％〜約３（ｗ／ｗ）％または約１．０％のカプセル化された亜塩素酸塩および塩素酸塩の混合物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記カプセル化された亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物が、約５を超える、約６を超える、約８を超える、または約１０を超えるｐＨを有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記カプセル化された亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物が、約５〜約１４、約６〜約１３、約８〜約１２．５、または約１０〜約１２であるｐＨを有する請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記リポソーム中に含まれる前記脂質が、約５〜約１４、約６〜約１３、約８〜約１２．５、または約１０〜約１２のｐＨを有している、亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物の取り込みに適切である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記適切な脂質が、リン脂質、スフィンゴ脂質、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記リン脂質が、十分な長さの飽和または不飽和の脂肪アシル鎖を含んでいる、ホスファチジルコリン（ＰＣ）であり、前記スフィンゴ脂質がスフィンゴミエリン（ＳＭ）である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記適切な脂質が、約５℃〜約５０℃の範囲内におさまる保管温度で許容可能な期間にわたって安定なままであるリポソームを形成する脂質から選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記前記適切な脂質が、約５℃の温度でイオンの漏出に対して不浸透性であるリポソームを形成する脂質から選択される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記リポソームが、２種類以上の適切な脂質を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記リポソームが、２種類の適切な脂質を含み、かつ前記脂質が、２０：１〜１：１、１５：１〜５：１または１０：１〜９：１というモル比で存在する、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
剛性を増強し、および／または脂質二重層（単数または複数）の透過性を低減する少なくとも１つの追加の構成要素をさらに含んでいる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの追加の構成要素が、前記総脂質含量の約０．１〜約５０％、約１〜約３０％、約５〜約２５％または約１０〜約２０％の量で存在する、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの追加の構成要素が、コレステロールおよびコレステロール硫酸から選択される、請求項１７または１８に記載の組成物。
【請求項２０】
リポソームの凝集を低減するゼータ電位を有するリポソームを提供する、少なくとも１つの追加の構成要素をさらに含んでいる、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記リポソームの凝集を低減する前記ゼータ電位が、少なくとも＋５ｍＶよりも正であるか、または−５ｍＶよりも負である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
リポソームの凝集を低減するゼータ電位を有するリポソームを提供する、前記少なくとも１つの追加の構成要素が荷電された脂質である、請求項２０または２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記荷電された脂質が負に荷電された脂質である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記負に荷電された脂質が、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、またはホスファチジン酸である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
請求項２４に記載の組成物であって、前記負に荷電された脂質が、１，２，−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＤＰＰＧ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＤＭＰＧ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＤＯＰＧ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＤＳＰＧ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、または１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−メチル−ポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ−ＤＳＰＥ）、およびそれらの混合物の塩から選択される組成物。
【請求項２６】
請求項２５に記載の組成物であって、前記負に荷電された脂質が、１，２，−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＤＰＰＧ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＤＭＰＧ）、１，２，−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＤＳＰＧ）およびそれらの混合物から選択される、組成物。
【請求項２７】
請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の組成物であって、前記荷電された脂質が、２０：１〜１：１、１５：１〜５：１または１０：１〜９：１という非荷電脂質：荷電脂質の比をもたらす量で存在する、組成物。
【請求項２８】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の組成物であって、前記１つ以上の適切な脂質が、１，２−ジパルミトイル−２−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジミリストイル−２−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１−ミリストイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＭＳＰＣ）、１−パルミトイル−２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＭＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、水素添加卵ＰＣ（ＨＥＰＣ）、１−パルミトイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＳＰＣ）、１−ステアロイル−２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＰＣ）、１−ステアロイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＯＰＣ）、１−ステアロイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＰＰＣ）、ジアラキドイルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、１，２−ジベヘノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＢＰＣ）、１，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、水素添加大豆リン脂質、卵黄リン脂質、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、ミルクスフィンゴミエリンおよびそれらの混合物から選択される、組成物。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれか１項に記載の組成物であって、前記１つ以上の適切な脂質が、１，２−ジパルミトイル−２−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジミリストイル−２−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、水素添加大豆リン脂質、卵黄リン脂質、およびそれらの混合物から選択される、組成物。
【請求項３０】
請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の組成物であって、前記１つ以上の適切な脂質が、１，２−ジパルミトイル−２−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）および１，２−ジミリストイル−２−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）が、９：１というモル比；１，２−ジパルミトイル−２−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）および１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＤＭＰＧ）が９：１というモル比；１，２−ジパルミトイル−２−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）および１，２，−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＤＰＰＧ）が９：１というモル比またはＤＰＰＣである、組成物。
【請求項３１】
前記脂質二重層が、親水性を増大する分子で修飾された表面である、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３２】
前記脂質二重層が、特定の細胞または組織型との会合を促進するためにその表面に対して細胞特異的標的部分を結合することによって修飾される、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３３】
リポソームであって、少なくとも１つの脂質二重層、ならびに前記リポソームの内側に捕捉された亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物を含んでおり、前記脂質二重層が、１つ以上の適切な脂質から構成されている、リポソーム。
【請求項３４】
請求項３３に記載のリポソームであって、約８０ｎｍ〜約３００ｎｍ、約９０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約１００ｎｍ〜約１４０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１５ミクロン、約３００ｎｍ〜約１２ミクロンまたは約７ミクロン〜約１０ミクロンの平均直径を有している、リポソーム。
【請求項３５】
請求項３３または３４に記載のリポソームであって、前記亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物が、１％〜約５０％、約２％〜約２５％または約５％〜約１５％という効率または封入率で捕捉される、リポソーム。
【請求項３６】
少なくとも１つの脂質二重層を有しているリポソーム、および前記リポソームの内側にカプセル化された亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物を調製する方法であって、前記脂質二重層が、１つ以上の適切な脂質から構成され、前記方法が以下：
（ａ）内側表面の少なくとも一部の上に１つ以上の脂質のフィルムを有する容器へ亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物の水溶液を添加することと；
（ｂ）前記内面から前記フィルムを全体的にまたは部分的に除去するために十分な条件下で前記容器を撹拌して、前記亜塩素酸塩−捕捉、および／または塩素酸塩−捕捉のリポソームを含んでいる混濁溶液を得ることと；
（ｃ）前記混濁溶液を処理して、前記リポソームの平均直径を所望の値まで下げることと；
（ｄ）必要に応じて前記リポソームを処理して、前記リポームに対して外側の溶液から亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物を除去することと；
を包含する、方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の方法であって、（ａ）における前記亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物に対する前記１つ以上の適切な脂質のモル比が、約０．０１：１〜約１００００：１、約０．１：１〜約５０００：１、約０．５：１〜約２５００：１、約１：１〜約１０００：１、または約０．１：１〜約１００：１である、方法。
【請求項３８】
少なくとも１つの脂質二重層を有しているリポソーム、および前記リポソームの内側にカプセル化された亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物を調製するための方法であって、前記脂質二重層が、１つ以上の適切な脂質から構成され、前記方法が、エタノール注入方法である、方法。
【請求項３９】
前記エタノール注入方法が、直交流技術を用いて行われる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
請求項１〜３２のいずれか１項に記載のリポソーム組成物、または請求項３３〜３５のいずれか１項に記載のリポソームを含んでおり、少なくとも１つの生理学的に許容される担体または賦形剤と混合される、薬学的組成物。
【請求項４１】
請求項１〜３２のいずれか１項に記載のリポソーム組成物、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載のリポソーム、または請求項４０に記載の薬学的組成物の医薬としての使用。
【請求項４２】
医薬としての使用のための、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のリポソーム組成物、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載のリポソーム、または請求項４０に記載の薬学的組成物。
【請求項４３】
亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物の投与が有益である疾患、障害または状態を処置するための方法であって、有効量の請求項１〜３２のいずれか１項に記載のリポソーム組成物、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載のリポソーム、または請求項４０に記載の薬学的組成物を、それを必要とする被験体に対して投与することを包含する、方法。
【請求項４４】
マクロファージ機能を調節するための方法であって、有効量の請求項１〜３２のいずれか１項に記載のリポソーム組成物、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載のリポソーム、または請求項４０に記載の薬学的組成物を、それを必要とする被験体に投与することを包含する、方法。
【請求項４５】
マクロファージ機能を調節することが、不適切な免疫応答の結果として慢性炎症の症状を生じる疾患の処置となる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物の投与が有益である疾患、障害または状態が、自己免疫疾患、不適切な免疫応答によって生じる疾患、創傷治癒、放射線症候群および環境有害物質に対する暴露から選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記疾患、障害または状態が、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、血清病、糖尿病、関節リウマチ、若年性慢性関節リウマチ、リウマチ熱、シェーグレン症候群、全身性硬化症、脊椎関節症、ライム病、サルコイドーシス、自己免疫性溶血、自己免疫性肝炎、自己免疫性好中球減少、自己免疫性多腺病、自己免疫性甲状腺疾患、多発性硬化症、炎症性腸疾患、大腸炎、クローン病、慢性疲労症候群、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、移植片拒絶、移植片対宿主病、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、組織損傷に対する不適切な反応、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、慢性肝炎、閉塞性気管支炎、気腫、腫瘍性障害（癌）、ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、神経変性疾患、ＡＩＤＳ関連の痴呆、微生物感染症、および他のウイルス感染から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記疾患、障害または状態が、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、腫瘍性障害、脊髄病理学、ＨＩＶ感染およびＡＩＤＳから選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記腫瘍性障害が、消化管、頭部、首、胸部または膵臓の癌である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
請求項１〜３２のいずれか１項に記載のリポソーム組成物、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載のリポソーム、または請求項４０に記載の薬学的組成物を、使用者に提供すること、および前記使用者に特定の安全性または臨床効果を情報提供することを包含する、方法。
【請求項５１】
請求項３２のいずれか１項に記載のリポソーム組成物、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載のリポソーム、または請求項４０に記載の薬学的組成物を使用者に提供すること、および前記使用者に対して、前記リポソーム組成物が、同様の治療効果を与えるか、または与えると期待される非リポソーム組成物よりも安定、標的特異的または治療上有効であることを情報提供することを包含する、方法。
【請求項５２】
前記使用者が、公開された材料によって情報提供される、請求項５０または５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記公開された材料が、ラベルまたは添付文書である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
リポソーム組成物であって、１つ以上の内側コア相および外側連続相を含んでおり、前記内側コア相が、亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物を含んでおり、かつ複数のリポソームベシクル中に含まれており、ここで前記ベシクルの壁は、少なくとも１つの脂質二重層を含み、前記リポソーム組成物の前記外側連続相は実質的に亜塩素酸塩および塩素酸塩を含まない、リポソーム組成物。
【請求項５５】
前記外側連続相が塩化ナトリウムを含む、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５６】
前記外側連続相が約５〜８というｐＨを有する、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５７】
前記内側コア相が約８〜１３というｐＨを有する、請求項５４〜５６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５８】
前記内側コア相と外側連続相との間のｐＨの相違が約１〜約７である、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５９】
前記リポソーム組成物が、約３〜４８カ月の間薬学的に許容される安定性を示す、請求項５４に記載の組成物。
【請求項６０】
前記薬学的に許容される安定性が、約５℃〜約５０℃の温度での組成物の保管で達成される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記組成物が、分解産物を実質的に含まない、請求項５９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その内容が、その全体が参照によって本明細書に援用される、２０１１年１２月２２日出願の、同時係属の米国特許仮出願第６１／５７９，３２６号の優先権の恩典を主張する。
【０００２】
本出願の分野
本出願は、亜塩素酸塩、塩素酸塩、またはそれらの混合物を含んでいるリポソーム組成物、それらの調製のための方法および例えば医薬としてのそれらの使用のための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
本出願の背景
［リポソーム］
リポソームは、薬物送達のためのベシクル（小胞）として広く研究されている。薬物およびワクチンの送達のためのリポソームの有効な使用が報告されている（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．ＴＩＢＴＥＣＨ，１９９５，１３：５２７〜５３７，およびそこに引用される引用文献）。例えば、リポソームベースの薬物送達システムは、ＤｏｘｉｌおよびＭｙｏｃｅｔとして市販される、ドキソルビシンＨＣｌのような薬物を投与するための、静脈内の抗癌化学療法に広く用いられている（Ａｂｒａｈａｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２００５，３９１：７１〜９７）。またリポソームは、吸入されたエアロゾル薬物、例えば：ｉ）インスリン（Ｈｕａｎｇら、Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２００６，１１３：９−１４）；ｉｉ）抗生物質、特に肺胞マクロファージ中の結核感染を標的する（Ｖｙａｓら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ．２００５，２９６：１２−２５）；ｉｉｉ）抗癌化学療法薬物（Ｖｅｒｓｃｈｒａｅｇｅｎら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００４，１０：２３１９〜２３２６）；およびｉｖ）その他（米国特許第５，０４９，３８８号を参照のこと）、を送達するためにも用いられ得る。
【０００４】
これは、リポソームに組み込まれるべき特定のサイズの有機分子についてさらに一般的である。より小さい分子、例えば、エタノール、グルコース、アンモニア、および酢酸塩は、リポソームの脂質二重層を通じて透過することが公知である。この挙動は、漏出として公知である。
【０００５】
薬物送達システムとしての、リポソームの首尾よい使用の例があるが、多くの適用について満たすべき課題がさらに存在する。化学的および物理的な安定性、クリアランス、取り込み効率および標的化は、特により小さい分子を取り込むべき場合、最も大きい課題のうちのいくつかである。
【０００６】
［亜塩素酸塩、塩素酸塩およびそれらの混合物］
亜塩素酸塩イオン、ＣｌＯ２−（本明細書においては、亜塩素酸塩と呼ばれる）は、種々の状況で用いられている。亜塩素酸ナトリウムは、強力な酸化剤であり、水の精製、消毒、ならびに漂白および脱臭で用いられている。酸性条件下では、亜塩素酸ナトリウムは、極めて毒性の二酸化塩素ガスを生じ、従って、使用される水溶液は通常は、極めて塩基性（約ｐＨ１３）の溶液として提供され、ｐＨは、水酸化ナトリウムのような塩基性剤を用いて調節される。
【０００７】
また、塩素酸塩は、種々の状況で用いられている。塩素酸塩イオン、ＣｌＯ３−（本明細書においては塩素酸塩と呼ぶ）は、強力な酸化剤であり、かつ花火製造、消毒および殺虫薬に用いられている。さらに、塩素酸塩は、皮膚疾患の処置のための抗菌剤として用いられており（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐａｔｅｎｔ  ５，４２７，８０１）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの感染した細胞でプロテオグリカン硫酸化を可逆的に阻害することが見出されている（Ｊ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００４  第５３巻、２号  ９３〜９５）。
【０００８】
また、亜塩素酸塩および塩素酸塩の混合物を含んでいる組成物は種々の状況で、例えば、種々の疾患または状態を処置するために用いられた。安定化された亜塩素酸塩は、このような組成物の非限定的な例である。例えば、米国特許第４，７２５，４３７号、同第４，５０７，２８５号および同第４，８５１，２２２号は、創傷および感染を処置するため、ならびに骨髄の再生を生じるための安定化された亜塩素酸塩の使用を開示する。抗原特異的免疫応答を阻害するための安定化された亜塩素酸塩の使用は、米国特許出願公開第２０１１／００７６３４４号に記載されている。ＰＣＴ特許出願公開番号２００１／０１７０３０は、安定化された亜塩素酸塩のような酸化剤の投与を通じた広範なマクロファージ関連障害の処置を開示する。米国特許第７，１０５，１８３号は、マクロファージ関連神経変性疾患を処置するための安定化された亜塩素酸塩の使用を記載する。米国特許第５，８７７，２２２号は、ＡＩＤＳ関連痴呆を処置するための安定化された亜塩素酸塩の使用を記載している。ＰＣＴ特許出願番号２００８／１４５３７６は、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎およびアトピー性皮膚炎を処置するための安定化された亜塩素酸塩の使用を報告する。ＰＣＴ特許出願公開番号２００７／００９２４５は、癌の処置のためのフルオロピリミジンと組み合わされた安定化された亜塩素酸塩の使用を開示している。ＰＣＴ特許出願公開番号２００１／０１２２０５は、マクロファージ機能を調節することによって影響される、癌および他の状態を処置するための安定化された亜塩素酸塩の使用を開示する。欧州特許出願番号２５５１４５は、眼科での安定化された亜塩素酸塩の使用を開示する。遅発性出血性放射線膀胱炎および直腸炎を有する患者の処置における安定化された亜塩素酸塩の使用を評価する第ＩＩ相試験が報告された（Ｖｅｅｒａｓａｒｎ，Ｖ．ら、Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２００６，１００：１７９−１８４）。安定化された亜塩素酸塩は、げっ歯類心臓モデルにおいて（Ｈａｎｓｅｎ，Ａ．ら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，２００１，８９：９２−９５）、および他の研究において（Ｋｅｍｐ，Ｅ．ら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，２０００，３２：１０１８−１０１９）、異種移植片生存を延長することが示された。安定化された亜塩素酸塩の抗菌効果も報告されている（Ｓｔｏｌｌ，Ｐ．ら、Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ  ｆｕｅｒ  Ａｎｔｉｍｉｋｒｏｂｉｅｌｌｅ  ｕｎｄ  Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｓｃｈｅ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｉｅ，１９９３，１１：１５−２０；Ｓｔｏｌｌ，Ｐ．ら、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，１９９３，３９：４０−４７；Ｈｏｌｌｆｅｌｄｅｒ，Ｋ．ら、Ｒｅａｋｔ．Ｓａｕｅｒｓｔｏｆｆｓｐｅｚｉｅｓ  Ｍｅｄ．１９８７，２５３−２６２；Ａｄａｍｃｚｙｋ，Ｒ．ら、Ｒｅａｋｔ．Ｓａｕｅｒｓｔｏｆｆｓｐｅｚｉｅｓ  Ｍｅｄ．１９８７，２４７−２５２；Ｇｉｌｌｉｓｓｅｎ，Ｇ．ら、Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ−Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ，１９８６，３６：１７７８−１７８２；Ｕｌｌｍａｎｎ，Ｕ．ら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，１９８５，１３：Ｓ２３６−Ｓ２４０；Ｕｌｌ��ａｎｎ，Ｕ．ら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，１９８４，１２：２２５−２２９）。近年の研究では、安定化された亜塩素酸塩は、安定化された亜塩素酸塩が腫瘍細胞に対する免疫を増強する能力に関連する悪性細胞に対してナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の細胞毒性を刺激できることが示された（Ｋｕｈｎｅ，Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１１，ｐ．４３６５８７）。
【０００９】
上記の刊行物では、亜塩素酸塩は、Ｏｘｏｖａｓｉｎ（商標）（局所処方物）またはＷＦ１０（静脈内投与のための薬物）として公知の、安定化された亜塩素酸塩の市販の処方物の形態である。Ｏｘｏｖａｓｉｎ（商標）およびＷＦ１０は、ＯＸＯ−Ｋ９９３（それ自体が水溶液）の希釈物である。もともとＯＸＯ−Ｋ９９３は、テトラクロロデカオキシゲン（ＴＣＤＯ）と呼ばれる化合物を活性成分として含む溶液であると考えられ、テトラクロロデカオキシゲン、テトラクロロデカオキシドおよびＴＣＤＯという用語が、ＷＦ１０およびオキソフェリン（Ｏｘｏｆｅｒｉｎ）中で活性であるとされて、より古い文献では用いられる場合が多い。しかし、その後の分析試験によって、ＯＸＯ−Ｋ９９３がＴＣＤＯを含まず、それよりも陽イオンとしてナトリウムを含む、亜塩素酸塩、塩化物、素酸塩、および硫酸イオンの水溶液であることが確認された。従って、ある患者へのＷＦ１０の静脈内投与またはＯｘｏｆｅｒｉｎ（商標）の局所適用によって、イオンの混合物の送達が引き起こされる。ＯＸＯ−Ｋ９９３は、Ｎｕｖｏ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ＧｍｂＨ（ドイツ、ヴァンツレーベン）から入手可能である。ＯＸＯ−Ｋ９９３およびその調製は、米国特許第４，５０７，２８５号に記載される。その時点で公知のこの物質の種々の用途を記述する、ＯＸＯ−Ｋ９９３およびＷＦ１０を記載している概説文献が記載されている（Ｄｒｕｇｓ  ｉｎ  Ｒ＆Ｄ，２００４，５：２４２−２４４；ＭｃＧｒａｔｈら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｄｒｕｇｓ，２００２，３：３６５−３７３）。
【００１０】
カプセル化方法
米国特許第５，２６９，９７９は、パッセンジャー分子をカプセル化するための溶媒希釈マイクロキャリア（ｓｏｌｖｅｎｔ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ）（ＳＤＭＣ）と呼ばれるベシクルを形成する方法を開示している。このカプセル化ベシクルは、最初が「形成された溶液」の調製、続いて「形成された溶液」からＳＤＭＣの創出につながる組織化工程を包含する多段階の方法を用いて形成される。この「形成された溶液」は、有機溶媒中に両親媒性物質およびパッセンジャー分子を溶解することによって、続いて、水を添加して、混濁溶液を得て、次いでより有機性の溶媒を添加して、清浄な「形成された溶液」を得る。この形成された溶液は、直ちに用いられてもよいし、または保管されてもよい。ＳＤＭＣは、インサイチュで水系、エアロゾル化、または再水和へ「形成された溶液」を希釈することを包含し得る組織化工程を用いて調製される。ＳＤＭＣでは、パッセンジャー分子は、球状の二重層によって創出される空間の内側ではなく、二重層自体の中に、または二重層の構成要素と会合して組み込まれる。なかでも、ＳＤＭＣ中にカプセル化された担体分子は、テトラクロロデカオキシド（ＴＣＤＯ）であった。本出願に記載されるプロセスは、「精製」工程を含まず、その結果ＳＤＭＣの調製に用いられる全ての物質が、試験に用いられる最終溶液に残っていることが注目される。
【００１１】
カナダ特許出願第２，６３６，８１２号は、水性媒体中に包み込まれた薬剤を放出するための被覆膜を開示している。一例では、この包み込まれた薬剤は、酸化性の塩素−酸素化合物、特に、ＴＣＤＯである。被覆膜は、不溶性であり、かつ天然の水培地には水透過性であり、一般には陽イオンおよび／または陰イオンの水不溶性ポリマーからできている。本出願で調製された組成物は、脂質のおよび基板表面の消毒および精製のために、ならびに水の消毒のために有用である。
【００１２】
韓国特許出願公開番号ＫＲ２００３／０７２７６６は、亜塩素酸塩、特に亜塩素酸ナトリウム、およびリポソーム中にカプセル化された亜鉛イオンを含んでいる経口の衛生組成物を開示する。この組成物はさらに、担体または賦形剤をさらに含んでもよく、二重または単一の相構造、および７〜８．５のｐＨを有してもよい。ある例では、リポソームは、レシチンから調製される。
【００１３】
ＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ００／１９９８１は、ペルオキシ化合物（例えば、過酸化水素）と組み合わせた亜塩素酸塩を含む抗菌調製物、および物体または表面の消毒のためにこれらの調製物を用いるための方法を開示する。この調製は、リポソームとして処方され、６．８〜７．８のｐＨを有してもよい。亜塩素酸塩およびペルオキシ化合物の両方とも、微生物活性に必要である。とりわけ、実際のリポソーム処方物は、本出願で調製された。
【００１４】
米国特許出願公開第２００７／０１４５３２８号は、亜塩素酸塩、例えば、亜塩素酸ナトリウム、非経口、全身または静脈内投与のための処方物（亜塩素酸塩およびｐＨ調整剤を含んでいる）を開示している。このｐＨ調整剤は、処方物のｐＨを、約７〜約１１．５の範囲であるように調節する。この処方物は、ＷＦ１０よりも毒性が低いことが教示される。
【００１５】
Ｐａｎａｓｅｎｋｏら（Ｍｅｍｂｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９７；１１（２）：２５３〜８）は、次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ）、亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ２）、塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ３）および過塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ４）が脂質過酸化を開始する能力を開示する。リポソームは、単純なＮａＣｌおよび緩衝液中で７．４のｐＨで卵ホスファチジルコリンから調製される。オキソ塩素酸塩のみを、外側相に添加する。亜塩素酸塩または塩素酸塩を含むベシクルをロードするため、または外側相からオキソ塩素酸塩を除去するための工程はとらない。
【００１６】
米国特許出願公開第２０１１／００５２６５５号は、原生動物栄養型および嚢胞を水系中で制御するためのマイクロまたはナノカプセル（リポソームを含む）中の殺生物剤のカプセル化を記載している。
【００１７】
米国特許出願公開第２０１１／０１７７１４７号は、工業用水を含む系においてバイオファウリングを除去するための少なくとも１つの安定化剤と組み合わせた抗菌組成物のカプセル化を記載する。抗菌組成物は、非酸化の殺生物化合物、例えば、イソチアゾリンであってもよく、その安定化剤は、塩素酸塩を含む緩衝液であってもよい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本出願の要旨
本出願は、亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物を含んでいるリポソーム組成物、ならびにそれらの調製および使用のための方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
従って、本出願は、少なくとも１つの脂質二重層を有しているリポソーム、およびそのリポソームの内側にカプセル化された亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物を含んでいるリポソーム組成物を包含し、ここで、この脂質二重層は、１つ以上の適切な脂質から構成される。典型的には、複数の分けられたリポソーム（ベシクル（小胞）と呼ばれる）が組成物中に存在する。典型的には、このベシクルは、水相中に分散され、１つ以上の水性組成物をカプセル化する。従って、１つの実施形態によれば、亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物は、複数のベシクル（その壁が１つ以上の脂質二重層を含んでいる）中にカプセル化される。また、本出願は、少なくとも１つの脂質二重層を含んでいるリポソーム、およびそのリポソームの内側に捕捉された亜塩素酸塩もしくは塩素酸塩またはそれらの混合物を包含し、ここでこの脂質二重層は、１つ以上の適切な脂質からなる。
【００２０】
本出願はさらに、カプセル化した、およびカプセル化していない亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物を含んでいるリポソーム組成物を包含し、ここではこのカプセル化された亜塩素酸塩、塩素酸塩、またはそれらの混合物は、組成物の内側相にあり、およびカプセル化されていない亜塩素酸塩、塩素酸塩、またはそれらの混合物は、組成物の外側相にある。あるいは、この外側相は、別の治療剤または塩化ナトリウムのように、亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物以外の物質を含んでもよい。一実施形態では、この内側相および外側相のｐＨは、同じである。別の実施形態では、この内側相および外側相のｐＨは異なり、例えば、内側相のｐＨは、約５〜約１４、約６〜約１３、約８〜約１２．５、または約１０〜約１２のｐＨであってもよく、この外側相のｐＨは、約６〜８のようにほぼ中性であってもよい。本発明の一実施形態では、この内側層および外側相のｐＨは、例えば、炭酸塩緩衝液のような緩衝液によって調節される。
【００２１】
さらなる実施形態では、リポソームは、約５〜約１４、約８〜約１３、約９〜約１２．５、または約１０〜約１２のｐＨを有する亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物の捕捉のために適切な脂質から構成される。ある実施形態では、この脂質は、約５℃以上で亜塩素酸塩および／または塩素酸塩イオンの漏出に対して不浸透性であるリポソームを形成するものから選択される。このような脂質としては、例えば、リン脂質、例えば、ホスファチジルコリン（十分な長さの飽和および／または不飽和の脂肪酸鎖を有する）、および／またはスフィンゴ脂質、例えば、スフィンゴミエリン、あるいは所望の挙動を示すこのような脂質の適切な混合物が挙げられる。
【００２２】
別の実施形態では、亜塩素酸塩は、安定化された亜塩素酸塩組成物、例えば、ＯＸＯ−Ｋ９９３、または１〜１０％、１０〜２０％、２０〜３０％、３０〜５０％もしくは５０〜９０（ｗ／ｖ）％のＯＸＯ−Ｋ９９３を含む組成物である。さらなる実施形態では、安定化された亜塩素酸塩は、１０（ｗ／ｖ）％のＯＸＯ−Ｋ９９３（この方式で希釈されたＯＸＯ−Ｋ９９３  はＷＦ１０として公知）を含む。
【００２３】
ある実施形態では、安定化された亜塩素酸塩は、２（ｗ／ｖ）％のＯＸＯ−Ｋ９９３を含む。さらなる実施形態では、安定化された亜塩素酸塩は、約２（ｗ／ｖ）％のＯＸＯ−Ｋ９９３、約２（ｗ／ｖ）％のグリセロール、および約９６（ｗ／ｖ）％の水を含む。このような相互作用は、Ｏｘｏｖａｓｉｎ（商標）またはＯｘｏｆｅｒｉｎ（商標）（Ｎｕｖｏ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ＧｍｂＨ，ドイツ、ヴァンツレーベン）として市販されている。
【００２４】
さらなる実施形態では、リポソーム組成物は、組成物のカプセル化された総イオン含量の約０．０１（ｗ／ｗ）％〜約５０（ｗ／ｗ）％、約０．１（ｗ／ｗ）％〜約２０（ｗ／ｗ）％または約０．５（ｗ／ｗ）％〜約１０（ｗ／ｗ）％の量で存在する、カプセル化された亜塩素酸塩を含む。
【００２５】
なおさらなる実施形態では、このリポソーム組成物は、組成物のカプセル化された総イオン含量の約０．０１（ｗ／ｗ）％〜約５０（ｗ／ｗ）％、約０．１（ｗ／ｗ）％〜約２０（ｗ／ｗ）％または約０．５（ｗ／ｗ）％〜約１０（ｗ／ｗ）％の量で存在するカプセル化された塩素酸塩を含む。
【００２６】
なおさらなる実施形態では、このリポソーム組成物は、組成物のカプセル化された総イオン含量の約０．０１（ｗ／ｗ）％〜約５０（ｗ／ｗ）％、約０．１（ｗ／ｗ）％〜約２０（ｗ／ｗ）％または約０．５（ｗ／ｗ）％〜約１０（ｗ／ｗ）％の量で存在する塩素酸塩および亜塩素酸塩イオンのカプセル化された混合物を含む。また、亜塩素酸塩および／または塩素酸塩イオンを含んでいる物質の任意の組成物は、電荷を中性に保持するために少なくとも１つの対イオンを有してもよい。従って、本出願の一実施形態によれば、リポソーム組成物は、１つ以上の陽イオンを含む。可能な陽イオンの非限定的な例としては、アルカリ金属陽イオン（例えば、ナトリウムまたはＮａ＋）およびアルカリ土類陽イオンが挙げられる。別の実施形態では、亜塩素酸塩イオン、塩素酸塩イオンまたはそれらの混合物を含んでいるリポソーム組成物は、さらに、ナトリウムおよび／またはカリウムの対イオンを含む。さらなる実施形態では、リポソーム組成物は、被験体の体液に対して等張性である。これに関して等張性を決定することは、当業者の知識の十分に範囲内である。
【００２７】
また、本出願は、少なくとも１つの脂質二重層を有しているリポソーム、およびこのリポソームの内側にカプセル化された亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物を調製する方法を包含し、ここでこの脂質二重層は、天然の、半合成のまたは合成の供給源由来であってもよい１つ以上の適切な脂質から構成される。一実施形態では、この方法は、
（ａ）亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物の水溶液を、内面の少なくとも一部に対して１つ以上の脂質のフィルムを有する容器に添加することと；
（ｂ）この内面からこのフィルムを全体的にまたは部分的に除去するために十分な条件下でこの容器を撹拌して、亜塩素酸塩−捕捉、および／または塩素酸塩−捕捉のリポソームを含んでいる混濁溶液を得ることと；
（ｃ）この混濁溶液を処理して、リポソームの平均直径を所望の値まで下げることと；
（ｄ）必要に応じて、このリポソームを処理して、このリポームに対して外側の溶液から亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物を除去することと；
を包含する。
【００２８】
本出願の方法によれば、ある実施形態では、本発明のリポソームにおける亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物の封入の率は、約０．１％〜約５０％、約０．５％〜約２５％、約１％〜約１５％、約１％〜約１０％、または約１％〜約５％である。
【００２９】
別の実施形態では、本出願のリポソームは、エタノール注入方法を用いて調製される。さらなる実施形態では、このリポソームは、直交流技術を含むエタノール注入方法を用いて調製される。
【００３０】
また、本出願は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体または賦形剤を含むリポソームを含んでいる薬学的組成物を包含する。
【００３１】
また、本出願は、医薬としての本出願の組成物の使用を包含する。本出願の組成物は、それらの意図される用途に応じて無菌であってもよいし、無菌でなくてもよい。また、本発明の組成物は、発熱物質を含まない場合がある。
【００３２】
本出願はさらに、亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物の投与が有益である疾患、障害または状態を処置するための方法であって、その必要な被験体に対して有効量の本出願の組成物を投与することを包含する方法を包含する。
【００３３】
本出願はさらに、亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物の投与が有益である疾患、障害または状態を処置するための本出願の組成物の使用を包含する。
【００３４】
一実施形態では、この組成物を用いる方法は、特定の安全性または臨床効果を使用者に情報提供することを包含する。例えば、使用者は、このリポソーム組成物が、同様の治療効果をもたらすか、またはもたらすと予想される非リポソーム組成物よりも安定、標的特異的または治療有効性であることを情報提供され得る。また、使用者は、この組成物が、同様の治療効果をもたらすか、またはもたらすと予想される非リポソーム組成物よりも、１つ以上の観点で、安全であることも情報提供され得る。例えば、リポソーム組成物での処置は、生じる副作用が低く、例えば、血管刺激（静脈炎）が低い場合があり、それによって患者の耐性およびコンプライアンスが増大し得る。使用者は、さらに、リポソーム組成物がより高速で投与されてもよく（例えば、ＩＶプッシュ対希釈液注入）、または同様の治療効果をもたらすか、またはもたらすと予想される非リポソーム処方物に比較して少ない容積で投与されてもよいと情報提供される場合もある。また、使用者はこのリポソーム組成物が、活性成分のより長期の、制御されたまたは遅延性の放出を提供することも情報提供される場合がある。さらに、使用者は、この延長されたまたは遅延された放出が、リポソーム中の脂質の同一性、および使用者による治療処置に必要なタイミング次第で、カスタマイズされても、調整されてもよいことを情報提供される場合がある。使用者は、ラベルまたは添付文書のような刊行物によって情報提供されてもよい。
【００３５】
本出願の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかし、この詳細な説明および特定の実施例は、本出願の実施形態を示す一方で、例示の目的で示されるに過ぎないことが理解されるべきである。なぜなら本出願の趣旨および範囲内の種々の変化および改変は、この詳細な説明から当業者には明らかであるからである。
【００３６】
本出願の実施形態は、添付の図面を参照してここで詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、サンプル中の亜塩素酸塩／塩素酸塩の検出のための実施例７のｃ−トルディン法Ｂにおける特定の逆希釈係数に対する亜塩素酸塩／塩素酸塩の測定された吸光度に関して用いられるＷＦ１０の希釈曲線を示す。この逆希釈係数を、４４７ｎｍで測定した吸光度に対してプロットする。左側のプロットは、全体的なデータセットを示すが、右側のプロットは、非線形のドメインのみを示す。上下の線は、それぞれ、このデータセットの線形および非線形部分上のフィットに相当する。両方のうち最初の交差位置は、２つのドメインの間の移行を印す。
【図２】図２は、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−３−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）から調製され、５℃、２３℃および３７℃で保管されたリポソームからの亜塩素酸塩および塩素酸塩の漏出を示しているグラフである。
【図３】図３は、スフィンゴミエリン（ＳＭ）から調製され、５℃、２３℃および３７℃で保管されたリポソームからの亜塩素酸塩および塩素酸塩の漏出を示しているグラフである。ほぼ５２２時間におけるグラフの末端の一団のデータポイントは、温度が３７℃まで意図的に上昇された後の測定である。
【図４】図４は、ＰＯＰＣ：ＰＯＰＧ（１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ（１’−ｒａｃ−グリセロール）から３：１の比で調製され、５℃、２３℃および３７℃で保管されたリポソームからの亜塩素酸塩および塩素酸塩の漏出を示しているグラフである。
【図５】図５は、ＰＯＰＣ：ＰＯＰＧから２：１の比で調製され、５℃、２３℃および３７℃で保管されたリポソームからの亜塩素酸塩および塩素酸塩の漏出を示しているグラフである。
【図６】図６は、ＰＯＰＣ：ＰＯＰＧから１：１の比で調製され、５℃、２３℃および３７℃で保管されたリポソームからの亜塩素酸塩および塩素酸塩の漏出を示しているグラフである。
【図７】図７は、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）から調製され、５℃、２３℃および３７℃で、１、５および７日間、保管されたリポソームからの亜塩素酸塩および塩素酸塩の漏出を示しているグラフである。
【図８】図８は、スフィンゴミエリンＳＭから調製されたリポソームからの亜塩素酸塩および塩素酸塩の漏出を示しているグラフである。保管は、５℃（青）、および２３℃（赤）で、続いて温度は、３７℃に上げられ、これによって直ちに漏出がもたらされた。
【図９】図９は、ＤＰＰＣおよびＤＰＰＣ／ＤＭＰＣから調製し、２２℃および３８度で保管したリポソームからの亜塩素酸塩および塩素酸塩の漏出を示しているグラフである。
【図１０】図１０は、ＤＰＰＣおよびＤＰＰＣ／ＤＭＰＣリポソームでの長期安定性研究の概要を示す。各々のバーは、部屋の温度（約２２℃）および冷蔵庫の温度（約６℃）でのサンプルの漏出実験の転帰を示す。ｘ軸は、時間（日数）である。中央の灰色は、リポソームを印しており、ここでは、外側培地中のＷＦ１０の含量は、ＬＯＤ未満であることが見出された。明るい灰色は、外側培地中のＷＦ１０の含量が、ＬＯＱ未満であった期間を印す。最も濃い灰色は、ＷＦ１０含量がＬＯＱを超えることを示す。
【図１１】図１１は、実施例１２に記載の２０１１年１２月１２日にＳＸ１２２で行った高解像度漏出（Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｌｅａｋａｇｅ）（ＨＲＬ）実験の結果を示す。両方のサンプルのグラフがわかる。温度曲線は、右側のｙ軸を参照のこと。漏出した物質の量は、総サンプル容積の画分として示される。実験を用いて、漏出が２〜３時間内に開始する温度を決定した。
【図１２】図１２は、実施例１２に記載の２０１２年１月６日にＳＸ１２２で行ったＨＲＬ実験の結果を示す。両方のサンプルのグラフがわかる。温度曲線は、右側のｙ軸を参照のこと。漏出した物質の量は、総サンプル容積の画分として示される。この実験は、３８℃での漏出挙動を検査する。この実験を数日間行い、この温度での極めて低い漏出を示している。
【図１３】図１３は、実施例１２に記載の２０１２年１月２６日にＳＸ１２６で行ったＨＲＬ実験の結果を示す。両方のサンプルのグラフがわかる。温度曲線は、右側のｙ軸を参照のこと。漏出した物質の量は、総サンプル容積の画分として示される。部分的な漏出がグラフでわかる。
【図１４】図１４は、実施例１２に記載の２０１２年２月２２日にＳＸ１２６で行ったＨＲＬ実験の結果を示す。両方のサンプルのグラフがわかる。温度曲線は、右側のｙ軸を参照のこと。漏出した物質の量は、総サンプル容積の画分として示される。
【図１５】図１５は、実施例１２に記載の２０１２年１月２５日にＳＸ１２６で行ったＨＲＬ実験の結果を示す。両方のサンプルのグラフがわかる。温度曲線は、右側のｙ軸を参照のこと。漏出した物質の量は、総サンプル容積の画分として示される。
【図１６】図１６は、実施例１４に報告された実験について時間に対してプロットした、総サンプル容積の画分として放出された物質の量を示しているグラフである。大きいグラフは、全体的な実験、および漏出の上限を示しており、ここで包み込まれているＷＦ１０は、完全に放出された。これは全サンプル容積の約７．５％であり、従って、またリポソームのカプセルカ能力も示している。小さい方のグラフは、ある程度の漏出が生じる期間をさらに詳細にカバーする。
【図１７】図１７は、本出願の一実施形態におけるエタノール注入法を用いるリポソームの調製の模式図を示す。スチールチャンバを出ていくリポソームは、ＷＦ１０をカプセル化して、ＷＦ１０を含んでいる外側相中に分散される。
【図１８】図１８は、エタノール注入法を用いてリポソームを含んでいるＷＦ１０を調製するためのダイアフィルトレーションプロセスの間に濾液中に収集される亜塩素酸塩の量を示しているグラフである。
【図１９】図１９は、エタノール注入法を用いてリポソームを含んでいるＷＦ１０を調製するためのダイアフィルトレーションプロセスの間に濾液中に収集される亜塩素酸塩の量を示しているグラフである（図１８で報告される実験の繰り返し）。
【図２０】図２０は、エタノール注入法を用いてリポソームを含んでいるＷＦ１０を調製するためのダイアフィルトレーションプロセスの間に濾液中に収集される亜塩素酸塩の量を示しているグラフである。このリポソームは、図１８および１９で報告した実験と比較して二倍の濃度のＷＦ１０を用いて調製した。
【図２１】図２１は、コラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）の誘導後の、ＷＦ１０、ＷＦ１０のリポソーム型またはＮａＣｌ（ｉ．ｐ．）を投与されたマウスのＣＩＡスコアを示しているグラフである。
【図２２】図２２は、ＷＦ１０、ＷＦ１０のリポソーム型またはＮａＣｌ（ｉ．ｐ．）を投与されたマウスの１６日目のＣＩＡスコアを示している棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本出願の詳細な説明
Ｉ．定義
別段示さない限り、ここでおよび他のセクションで記載される定義および実施形態は、当業者によって理解されるように、本明細書で記載される適用（それらが適切である）の全ての実施形態および態様に適用可能であるものとする。
【００３９】
本明細書において用いる場合、「ある、１つの（ａまたはａｎ：不定冠詞）」または「この、その（ｔｈｅ：定冠詞）」という用語は、１つのメンバーによる態様を包含するだけでなく、２つ以上のメンバーを有する態様も包含する。例えば、「リン脂質」を含む実施形態は、１つのリン脂質または２つ以上の追加のリン脂質を有する特定の態様に相当することが理解されるべきである。
【００４０】
「追加」または「第二の」構成要素を含んでいる組成物では、本明細書において用いられるような第二の構成要素は、他の構成要素または第一の構成要素とは化学的に異なる。「第三」構成要素は、他の、第一および第二の構成要素とは異なり、さらに列挙されるか、または「追加の」構成要素は同様に異なる。
【００４１】
本明細書において用いる場合、「薬剤、因子（ａｇｅｎｔ）」という用語は、ある組成物に添加された場合、その組成物の特性に対して特定の効果を生じる傾向の化合物または化合物の混合物を指す。
【００４２】
「亜塩素酸塩」という用語は本明細書において用いる場合、陰イオン「ＣｌＯ２−」を指す。陰イオン種は典型的には、水溶液中に解離型で存在するが、陰イオンは、陰イオンおよび陽イオンを含有している親の塩に由来する場合が多い。
【００４３】
「塩素酸塩」という用語は、本明細書において用いる場合、陰イオン「ＣｌＯ３−」を指す。陰イオン種は典型的には、水溶液中に解離型で存在するが、陰イオンは、陰イオンおよび陽イオンを含有している親の塩に由来する場合が多い。
【００４４】
「安定化された亜塩素酸塩」という用語は、本明細書において用いる場合、亜塩素酸塩イオン（ＣｌＯ２−）を含んでおり、亜塩素酸塩イオンの濃度、ｐＨおよび／または活性が、使用前の許容できる期間にわたって安定なままである、組成物または物質を指す。安定化された亜塩素酸塩では、亜塩素酸塩イオンは、実質的に分解せず、亜塩素酸塩イオンの活性は、実質的に使用前に維持される。安定化された亜塩素酸塩は、緩衝液、例えば、炭酸ナトリウム／水酸化ナトリウム緩衝液系を含んでもよく、これは、処方物のアルカリのｐＨを維持する。亜塩素酸塩イオンの濃度は、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってモニターされ得る。
【００４５】
「ＷＦ１０」とは本明細書において用いる場合、イオン亜塩素酸塩４．２５％、塩素酸塩（１．５％）、塩素イオン（２．０％）、硫酸塩（０．７％）およびナトリウム（４．０％）を含んでいる溶液として分析的に特徴付けられる薬物ＯＸＯ−Ｋ９９３の１０（ｗ／ｖ）％希釈水溶液を指す。
【００４６】
「許容期間」という用語は、本明細書において用いる場合、少なくとも約１日、少なくとも約１週、少なくとも約３０日、少なくとも約６カ月、少なくとも約１年、少なくとも約２年、または少なくとも調製と使用との間のおよその時間を意味する。
【００４７】
「リポソーム」という用語は、本明細書において用いる場合、内側コアの周囲を囲む少なくとも１つの脂質二重層から構成される人工的に調製された小胞（ベシクル）を指す。内側相（ｉｎｎｅｒ  ｐｈａｓｅ）、内部相（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｐｈａｓｅ）または内側コア（ｉｎｎｅｒ  ｃｏｒｅ）（本明細書において交換可能に用いられる）は、亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物のような物質を含む。小胞（ベシクル）を用いて、この物質を、例えば、局所的にまたは身体内に送達してもよい。３種類のリポソーム−ＭＬＶ（多重層ベシクル（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ））、ＳＵＶ（小単層ベシクル−直径２５〜３００ｎｍ）およびＬＵＶ（大単層ベシクル−＞直径３００ｎｍ）がある。ベシクルの外側の物質の容積は、外部相、外側相または連続相と呼ばれてもよい。これらの用語は、本明細書において交換可能に用いられる。リポソーム組成物は、複数の個々の別々のリポソームを含み、内側相および外側相は通常水を含む。
【００４８】
スフィンゴ脂質は、種々の頭部基に結合されたスフィンゴシン（２−アミノ−４−オクタデカン−１，３−ジオール）を骨格として含んでいるクラスの脂質である。
【００４９】
スフィンゴミエリン（ＳＭ）とは、動物の細胞膜に、特にいくつかの神経細胞軸を囲む膜ミエリン鞘に見出される種類のスフィンゴ脂質を指す。スフィンゴミエリンは、セラミドコア（アミド結合を介して脂肪酸に結合されたスフィンゴシン）および極性の頭部基（ホスホコリンまたはホスホエタノールアミンのいずれかである）を有する。
【００５０】
「カプセル化された」または「捕捉された」という用語は、本明細書において用いる場合、言及される薬剤が、リポソームの内側に、または内部相に、またはコアに位置することを意味する。その剤は、外部、外側、または連続相に位置することも可能である。
【００５１】
「封入率」という用語は、本明細書において用いる場合、製造過程の間、出発材料に対するリポソームベシクルへカプセル化された材料または溶液のパーセンテージを指す。
【００５２】
「薬学的組成物」とは、薬学的な使用のための物質の組成を指す。「薬学的組成物」および「処方物」という用語は、交換可能に用いられる。
【００５３】
「多分散性指数」または「ＰｄＩ」とは、溶液中の粒子のサイズ分布に関連する大きさのない数値である。ＰｄＩは、動的光散乱として公知の技術で測定した相関データの分析によって得ることができる。この係数は、相関データに対する単純な２つのパラメーターフィットから算出される数値である（キュムラント分析）。ＰｄＩは、大きさがなく、０．０５未満の値が、高度に単分散の標準以外でまれにみられるように、見積もられる。０．７を超える値は、このサンプルが極めて広範なサイズ分布を有し、動的光散乱（ＤＬＳ）技術によるサイズ分布測定におそらく適切でないことを示す。種々のサイズ分布アルゴリズムは、これらの２つの最後の手段の間におさまるデータと連携する。これらのパラメーターの算出は、ＩＳＯ標準書１３３２１：１９９６ＥおよびＩＳＯ２２４１２：２００８に規定される。
【００５４】
「公表物、公開資料（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｍａｔｅｒｉａｌ）」とは、情報を提供する媒体を意味し、これには、印刷、音声、視覚または電気的な媒体、例えば、チラシ、広告、添付文書、印字ラベル、インターネットのウェブサイト、インターネットのウェブページ、インターネットのポップアップウインドウ、ラジオまたはテレビ放送、コンパクトディスク、ＤＶＤ、ポットキャスト、音響記録、または他の記録もしくは電気的媒体を意味する。
【００５５】
「安全性」とは、患者関連の要因に関連する有害効果を含む、組成物の投与に関連する有害事象の頻度または重篤度を意味する。
【００５６】
「有効量」という用語は、本明細書において用いる場合、所望の結果を達成するために十分な量を意味し、従って、成分とその所望の結果とに依存する。それにもかかわらず、一旦所望の効果が知られれば、有効量は、当業者の技術の範囲内である。
【００５７】
「水」という用語は、本出願の組成物中の成分として本明細書において用いる場合、薬学的に許容される水を指す。
【００５８】
「水溶液」という用語は、本明細書において用いる場合、溶媒が主に水であるが、少量の、例えば、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１（ｖ／ｖ）％未満の非水性の溶媒が存在してもよい溶液を意味する。
【００５９】
「ｗ／ｖ」という用語は、本明細書において用いる場合、１００ｍＬの溶液中の溶質のグラム数を意味する。
【００６０】
「ｗ／ｗ」という用語は、本明細書において用いる場合、１００ｇの溶液中の溶質のグラム数を意味する。
【００６１】
「混濁液」という用語は、個々に一般的には裸眼に対して不可視である、個々の粒子または懸濁固体の存在に起因して外見上、濁ってまたはぼんやりしている溶液を指す。
【００６２】
「相転移温度」という用語は、本明細書において用いる場合、秩序的なゲル相からの液体の物理的状態の変化を誘導するのに必要な温度を指し、ここでは炭化水素鎖は、完全に伸長されて、秩序付けされた液晶相に対して緊密に充填され、ここでは炭化水素鎖は液体中にランダムに位置する。
【００６３】
一般には、グラフ上の「エラーバー」は、平均値の標準誤差に相当するが、塗りつぶした、影付きのバーの頂部は、単一のデータ値に相当し、これは、データ値の分布の平均値である。
【００６４】
「薬学的に許容される」という用語は、動物、特にヒトの処置と適合することを意味する。
【００６５】
「処置する」または「処置」という用語は、本明細書において用いる場合、そして当該分野で十分理解されるとおり、有益、または所望の結果（臨床の結果を含む）を得るためのアプローチを意味する。有益な、または所望の臨床結果としては、限定するものではないが、１つ以上の症状または状態の改善または寛解、疾患の程度の軽減、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しないこと）、疾患の伝播の予防、疾患の進行の遅延または緩徐化、疾患状態の完解または緩和、疾患の再発の軽減、および緩解（部分的または全体的）（分離可能でも分離不能でも）が挙げられる。また「処置する」または「処置」とは、処置を受けていない場合に予想される生存に比較して長期の生存を意味し得る。また、「処置する」または「処置」とは本明細書において用いる場合、予防的な処置を包含する。処置の方法は、被験体に対して治療上有効な量の活性剤を投与することを包含し、これは必要に応じて、単回投与からなるか、あるいは、一連の適応を包含する。処置期間の長さは、種々の要因、例えば、状態の重篤度、患者の年齢、活性剤または薬剤の濃度、本明細書に記載の組成物の活性、および／またはそれらの組み合わせに依存する。また、処置期間は、１サイクルの処置を構成するための、サイクル、例えば、約２〜７日間毎日１回の投与、続いて約１〜２０日間の休止期間を含んでもよい。患者は、２回以上のサイクル、例えば、少なくとも２、３、４または５回のサイクルで処置されてもよい。処置または予防に用いられる薬剤の有効用量は、特定の処置または予防の計画の経過にわたって増大してもまたは減少してもよい。投薬量の変化が生じてもよく、当該分野で公知の標準の診断アッセイによって明らかになり得る。ある場合には、慢性投与が必要であり得る。例えば、この組成物は、ある量で、およびその患者の処置に十分なある期間、被験体に投与される。
【００６６】
本明細書において用いる場合、「被験体」という用語は、哺乳動物を含む動物界の全ての構成要因を包含し、適切はヒトを指す。
【００６７】
「使用者」とは、患者、医療従事者、または薬剤供給業者などの対象者を意味する。
【００６８】
「ゼータ電位」とは、液体中の粒子の表面荷電に関する量であって、液体に分散された固体または液体に分散された液体の潜在的な安定性の指標となる。懸濁物中の全ての粒子が、大きい負のまたは正のゼータ電位を有するならば、それらは、お互いを打ち消す傾向であり、凝集する傾向はない。しかし、粒子が低いゼータ電位値を有するならば、粒子が一緒になることを妨げる力は小さくなる傾向であり、この粒子は、凝集する傾向が大きくなる場合がある。ゼータ電位に関するさらなる情報は、Ｈｕｎｔｅｒ，Ｒ．Ｊ．（１９８８）Ｚｅｔａ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｉｎ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＵＫ．に見ることができる。
【００６９】
本出願の組成物の処置および使用の方法に関して用いる場合、「その必要な」被験体とは、処置されるべき状態を有すると疑われるか、その状態と診断されたか、または以前にその状態について処置された被験体である場合もある。
【００７０】
本開示の範囲を理解するには、「含んでいる」という用語、およびその誘導型は、本明細書において用いる場合、言及される特徴、要素、構成要素、群、整数および／または工程の存在を特定するが、他の述べていない特徴、要素、構成要素、群、整数および／または工程の存在を排除しない、無制限の用語であるものとする。前述はまた、同様の意味を有する言語、例えば、「包含する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する、備える（ｈａｖｉｎｇ）」という用語およびそれらの誘導型などの同様の意味を有する言葉にも当てはまる。「〜からなる」という用語およびその誘導型は、本明細書において用いる場合、言及される特徴、要素、構成要素、群、整数および／または工程の存在を特定するが、他の述べていない特徴、要素、構成要素、群、整数および／または工程の存在を排除しない、閉じた用語であるものとする。「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という用語は、本明細書において用いる場合、言及される特徴、要素、構成要素、群、整数および／または工程の存在、ならびに特徴、要素、構成要素、群、整数および／または工程の基本的かつ新規な特徴（単数または複数）に物質的に影響しないものを特定するものとする。
【００７１】
程度の用語、例えば、「実質的に」、「約」および「ほぼ」とは本明細書において用いる場合、最終の結果が有意に変化されないように修飾された用語の偏差の誘導型の合理的な量を意味する。程度のこれらの用語は、修飾された用語の少なくとも±５％の偏差を含むと解釈されるべきである（この偏差が、その用語が修飾する単語の意味を否定しない場合は）。
【００７２】
ＩＩ．リポソーム組成物
本出願は、亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物を含んでいるリポソーム組成物、ならびにその調製および使用のための方法に関する。
【００７３】
従って、本出願は、少なくとも１つの脂質二重層を有しているリポソーム、およびこのリポソームの内側にカプセル化された亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物を含んでいるリポソーム組成物を包含する（ここでこの脂質二重層は、１つ以上の適切な脂質から構成される）。このリポソーム組成物は、複数のリポソームを含み、これが次に、二重層にカプセル化された、亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物を含む。このリポソームは、適切な脂質、例えば、例としては、リン脂質、例えば、ホスファチジルコリン（十分な長さの飽和および／または不飽和の脂肪酸鎖を有する）、および／またはスフィンゴ脂質、例えば、スフィンゴミエリン、あるいは所望の挙動を示すこのような脂質の適切な混合物を含む。これらの脂質は、天然の供給源、半合成の供給源、または合成の供給源のものであってもよい。このリポソームはさらに、二重層（単数または複数）および／または荷電された脂質の剛性を向上し、透過性を軽減して、リポソームの安定性を増強するための追加の構成要素、例えば、コレステロールまたはコレステロール硫酸を含んでもよい。
【００７４】
本出願の適用はまた、少なくとも１つの脂質二重層を含んでいるリポソーム、およびそのリポソームの内側に捕捉された亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物を含んでいるリポソームを包含し、ここでこの脂質二重層は、１つ以上の適切な脂質からなる。
【００７５】
本出願はさらに、カプセル化されたおよびカプセル化されていない亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物を含んでいるリポソーム組成物であって、ここでこのカプセル化された亜塩素酸塩、塩素酸塩、またはそれらの混合物がリポソームの内側相にあり、かつカプセル化されていない亜塩素酸塩、塩素酸塩、またはそれらの混合物がリポソームの外側相にある、リポソーム組成物を包含する。別の実施形態では、少なくとも１つの脂質二重層内にカプセル化され、外部相に存在する亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物の比は、約１００：１〜約１：１００、または約９０：１０〜１０：９０である。あるいは、この外部相は、亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物以外の物質、例えば、別の治療剤および／または塩化ナトリウムを含んでもよい。
【００７６】
本出願のある実施形態では、この内部相および外部相のｐＨは同じである。別の実施形態では、この内部相および外部相のｐＨは異なり、例えば、内側相のｐＨは、約６〜約１３、約８〜約１２．５、または約１０〜約１２であってもよく、この外部相のｐＨは、ほぼ天然、例えば、約６〜８であってもよい。別の実施形態では、リポソーム組成物は、内側コア相と外側連続相との間で、約１〜約７、約１〜約５または約１〜約３というｐＨの相違を有する。
【００７７】
本出願の別の実施形態では、このリポソームの内部相および外部相は、等浸透性であるか、または同じ浸透性を示す。すなわち、内部相および外部相の浸透性は、お互いの１、２、３、４、５、６または７％内である。ある実施形態では、リポソームの内側溶液および外側溶液が同じまたは同様の浸透圧であることによって、リポソームの内外への物質の漏出の量が減少される。さらなる実施形態では、リポソーム組成物は、被験体の体液に関して等張性であるか、または等浸透性である。
【００７８】
あるいは、一実施形態では、リポソームの内部相および外部相の浸透性は、異なる。例えば、内部相と外部相との間の浸透性の相違は、約８、１０、１５、２０、２５、５０、１００または２００％であってもよい。
【００７９】
ある実施形態では、本出願のリポソーム組成物は、約３〜４８カ月の間、薬学的に許容される安定性を示す。さらに別の実施形態では、この薬学的に許容される安定性は、約５℃〜約５０℃または約５℃〜約３０℃という温度での組成物の保管で達成される。
【００８０】
さらなる実施形態では、このリポソーム組成物は、凍結乾燥されてもよい。リポソーム凍結乾燥のための技術は、周知であり、例えば、Ｃｈｅｎら（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２０１０  Ｍａｒ  １９；１４２（３）：２９９−３１１）は、凍結乾燥されたリポソームの溶解保護効果を決定する重要な要因をまとめている。
【００８１】
さらなる実施形態では、リポソーム組成物は、約８０ｎｍ〜約３００ｎｍ、約９０ｎｍ〜約２００ｎｍまたは約１００ｎｍ〜約１４０ｎｍという平均直径を有する単層および／または多重層のベシクルであるリポソームを含む。別の実施形態では、リポソーム組成物は、約８０ｎｍ〜約１５ミクロン、約３００ｎｍ〜約１２ミクロンまたは約７ミクロン〜約１０ミクロンという平均直径を有する単層および／または多重層のベシクルであるリポソームを含む。粒子サイズ分布の性質は、単峰性であっても、多峰性であってもよく、多分散係数は、当業者に公知のように製造方法によって制御され、所望の送達経路に基づいて決定され得る。
【００８２】
投与経路次第で、特定の直径のベシクルを投与することが所望され得る。例えば、約８０ｎｍ〜約３００ｎｍの直径を有するベシクルは、静脈投与に有用であり得るが、約８０ｎｍ〜約１０ミクロンの直径を有するベシクルは、肺、気管または経鼻経路のような吸引を介した投与に有用であり得る。
【００８３】
さらなる実施形態では、リポソーム組成物は、滅菌されてもよい。適切な滅菌技術の非限定的な例としては、濾過、オートクレーブ、ガンマ線照射、および凍結乾燥（フリーズドライ）が挙げられる。一実施形態では、滅菌は、２２０ｎｍのフィルターを用いて濾過によって行う。
【００８４】
驚くべきことに、亜塩素酸塩および塩素酸塩がそれぞれ３または４個の原子しか含まない場合、リポソームベシクルを形成する脂質二重層が実質的に亜塩素酸塩および／または塩素酸塩に対して不浸透性である（すなわち、このベシクルがイオンタイト（ｉｏｎ−ｔｉｇｈｔ）である）リポソームを開発することが可能であることが発見された。これは、エタノール、グルコース、アンモニアおよび酢酸塩のような他の分子がリポソームの脂質二重層を通じて浸透することが公知であるという事実にかかわらない。従って、本出願の一実施形態では、脂質二重層は実質的に、亜塩素酸塩に対して不浸透性である。本出願の別の実施形態では、この脂質二重層は実質的に、塩素酸塩に対して不浸透性である。さらなる実施形態では、この脂質二重層は実質的に、亜塩素酸塩および塩素酸塩に対して不浸透性である。
【００８５】
本出願のイオンタイト（ｉｏｎ−ｔｉｇｈｔ）リポソームは、単一壁リポソームベシクルで達成され得るイオンで達成され得る。本出願の一実施形態では、イオンタイトリポソームは、市販の許容される保存期間を超える安定性を示す（例えば、室温または冷蔵温度で、約３〜４８カ月）。別の実施形態では、イオンタイトリポソームベシクルが分散される外部（または外側相）は、カプセル化された内部（内側）相とは異なる組成物を含むように操作されてもよい。例えば、内側相および外側相は、異なる濃度の亜塩素酸塩を含んでもよいし、あるいは、いずれの相も、実質的に亜塩素酸塩を含まなくてもよい。別の例では、内側相および外側相は、異なる濃度の塩素酸塩を含んでもよいし、あるいは、いずれかの相も実質的に塩素酸塩を含まなくてもよい。本出願の一実施形態では、イオンタイトリポソーム処方物の内側相および外側相のｐＨは異なる。外部相は、例えば、生理食塩水を含んでもよいし、内部相（亜塩素酸塩および／または塩素酸塩を含んでもよい）とは実質的に異なるｐＨを有してもよい。一実施形態では、この外部相は、塩化ナトリウムを含んでもよく、実質的に亜塩素酸塩および／または塩素酸塩を含まなくてもよく、かつ適切な天然のｐＨを有してもよいが、この内部相は、亜塩素酸塩を含むか、および／または外部相より高いｐＨを有する。従って、リポソームベシクルを形成する脂質二重層はさらに、実質的にＨ＋およびＯＨ−に対して不浸透性であってもよい。理論上、１３Ｃ−ＮＭＲベースの方法を用いてリポソーム中のｐＨを測定することが可能である。本出願のイオンタイトリポソーム組成物は、実質的に塩素酸塩を含まなくてもよく、または外部相とは異なる濃度の塩素酸塩を含んでいるリポソームベシクルを含んでもよい。本出願の別の実施形態では、リポソーム組成物を含んでいるイオンタイトベシクルの直径の分布は、ある範囲の値を有する。別の実施形態では、内部相、外部相または両方とも、複数の物質を含む。さらに他の実施形態では、リポソーム分散中の異なるリポソーム中に捕捉された材料の組成中には変動がある。
【００８６】
ある実施形態では、本出願のリポソーム組成物は、過酸化水素、イソチアゾリンおよび／または亜鉛イオンを含まない。別の実施形態では、このリポソーム組成物は、レシチンから調製されたリポソームを含まない。さらなる実施形態では、このリポソーム組成物は、脂質二重層の２つの脂質の間に単に亜塩素酸塩および／または亜塩素酸塩が捕捉されたリポソームを含まない。さらに別の実施形態では、このリポソーム組成物は、実質的に分解産物を含まない。
【００８７】
さらなる実施形態では、本出願のリポソームは、安定であり、すなわち、亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物は、例えば、食品医薬品局（ＦＤＡ）または他の政府の規制機関が承認する製品の仕様で規定されたような、許容される保存期間にわたって、そのリポソームの内側から漏出しない。一実施形態では、リポソームは、約３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７または６℃より下の温度で、意図される目的の間のそれらの使用を可能にするのに十分な期間安定である。例えば、１分〜１時間、１時間〜２４時間、１日〜３０日、３０日〜２００日、６カ月〜１年またはそれ以上の期間にわたる。
【００８８】
Ａ．亜塩素酸塩、塩素酸塩およびそれらの混合物
本出願のリポソーム組成物は、亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物を含む。一実施形態では、このリポソーム組成物は、亜塩素酸塩を含む。一実施形態では、このリポソーム組成物は、安定化された亜塩素酸塩を含む。一実施形態では、このリポソーム組成物は、塩素酸塩を含む。一実施形態では、このリポソーム組成物は、亜塩素酸塩および塩素酸塩を含む。一実施形態では、このリポソーム組成物は、亜塩素酸塩を含み、かつ実質的に塩素酸塩を含まない。一実施形態では、このリポソーム組成物は、塩素酸塩を含み、かつ実質的に亜塩素酸塩を含まない。一実施形態では、このリポソーム組成物は、塩素酸塩なしの組成物である。別の実施形態では、このリポソーム組成物は、亜塩素酸塩なしの組成物である。
【００８９】
別の実施形態では、このリポソーム組成物は、安定化された亜塩素酸塩を含む。安定化された亜塩素酸塩ベースの組成物の非限定的な例としては、その各々の内容が、全体として参照によって援用される、米国特許第６，３５０，４３８号、同第６，２５１，３７２号、同第６，２３５，２６９号、同第６，１３２，７０２号、同第６，０７７，５０２号、および同第４，５７４，０８４号に記載の組成物が挙げられる。
【００９０】
別の実施形態では、安定化された亜塩素酸塩は、ＯＸＯ−Ｋ９９３（これは、亜塩素酸塩および塩素酸塩の両方を含む）のような、亜塩素酸塩を含んでいる組成物、または約１〜１０％、１０〜２０％、２０〜３０％、３０〜５０％または５０〜９０（ｗ／ｖ）％のＯＸＯ−Ｋ９９３を含んでいる組成物である。さらなる実施形態では、この安定化された亜塩素酸塩は、ＷＦ１０を含んでいる組成物であるか、またはＷＦ１０である。
【００９１】
ある実施形態では、安定化された亜塩素酸塩は、約２（ｗ／ｖ）％のＯＸＯ−Ｋ９９３を含んでいる組成物である。さらなる実施形態では、安定化された亜塩素酸塩は、約２（ｗ／ｖ）％のＯＸＯ−Ｋ９９３、約２（ｗ／ｖ）％のグリセロールおよび約９６（ｗ／ｖ）％の水を含んでいる組成物である。このような組成物は、Ｏｘｏｖａｓｉｎ（商標）およびＯｘｏｆｅｒｉｎ（商標）（Ｎｕｖｏ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ドイツ、ヴァンツレーベン）の名称で市販されており、ここで１ｍｌのＯｘｏｖａｓｉｎ（商標）は、約０．８５ｍｇ（または約０．０８５％（ｗ／ｖ））の亜塩素酸塩を１．０ｍｌの水の中に含む。Ｏｘｏｖａｓｉｎ（商標）のｐＨは、１０．７５〜１１．９０である。
【００９２】
本出願のある実施形態では、ＯＸＯ−Ｋ９９３は、以下の方法を用いて調製される：
【００９３】
亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ２）および次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＯＣｌ）を、注射用水（ＷＦＩ）中で４．８対１のモル比で混合する。この溶液のｐＨは、ｐＨ１１．０よりも大きくなければならない。この混合物への、触媒、クロリルスルフリック酸［ＣｌＯ２＋］［ＨＳＯ４−］の添加後、以下の反応が観察され得る：
【化１】
2015502400.tif 000003
溶液のｐＨは低下する。亜塩素酸塩の一部は、式（１）で記載される酸化還元過程において二酸化塩素（ＣｌＯ２）に酸化される。平衡反応では、発生する二酸化塩素は、式（２）に示されるように、過剰の未酸化の亜塩素酸塩との濃い褐色の荷電移行複合体を形成する：
【化２】
2015502400.tif 000004
【００９４】
次いで、９．６５ミリモル（反応溶液１ｋｇあたり）の炭酸ナトリウム過酸化水素化物（２Ｎａ２ＣＯ３?３Ｈ２Ｏ２）を、溶液に添加する。炭酸ナトリウム過酸化水素化物の添加の際、二酸化塩素の一部を亜塩素酸塩に還元して、同時に酸素を形成する：
【化３】
2015502400.tif 000005
【００９５】
適切な時間、例えば１５分後、１０２ミリモル（反応溶液１ｋｇあたり）の過酸化ナトリウム（Ｎａ２Ｏ２）をこの溶液に添加して、これは、残留する二酸化塩素が完全に亜塩素酸塩に還元されるので、完全に脱色される。過酸化ナトリウムから、酸素は緩徐な過程で発生して、これは典型的には少なくとも４週間を要する（式４）。同時に、ヒドロキシルイオンが形成されて、高いｐＨ値（ｐＨ＞１３）の溶液が生じ、これによって活性な物質である亜塩素酸塩が安定化される。
【化４】
2015502400.tif 000006
この合成から生じる最終反応生成物ＯＸＯ−Ｋ９９３は、安定な水溶液であり、この溶液は、陰イオンである亜塩素酸塩（４．２５％）、塩素イオン（２．０％）、塩素酸塩（１．５％）、および硫酸塩（０．７％）、およびナトリウムを陽イオンとして、ならびに処方物のアルカリのｐＨを維持する炭酸ナトリウム／水酸化ナトリウム緩衝液系を含む。
【００９６】
当業者は、任意の化学的に安定化された亜塩素酸塩溶液（ＯＸＯ−Ｋ９９３、ＷＦ１０、Ｏｘｏｖａｓｉｎ（商標）の誘導体または他の亜塩素酸塩ベースの、もしくは塩素酸塩ベースの溶液およびそれらの誘導体を含む）が、十分に本出願の範囲内であることを認識する。これらの溶液は、本出願の組成物、方法および使用で用いられてもよく、従って、本出願の範囲は、本明細書に記載される生成物の使用に必ずしも限定されない。
【００９７】
また、ＯＸＯ−Ｋ９９３およびその誘導体（ＷＦ１０、Ｏｘｏｆｅｒｉｎ、Ｏｘｏｖａｓｉｎ）は、イオンの混合物を含んでいる組成物の例である。なぜなら、この処方物は、亜塩素酸塩、塩素イオン、塩素酸塩、硫酸塩およびナトリウムイオンの組み合わせを含むからである。本出願の一実施形態では、イオンの混合物を含んでいる組成物は、少なくとも２つの異なる種類のアニオン（塩素酸塩および亜塩素酸塩）を含んでいる組成物である。本出願の別の実施形態では、この組成物は、少なくとも３つの異なる種類の陰イオンを含んでもよい。本出願のさらなる実施形態では、この組成物は、少なくとも４つ、少なくとも５つまたは少なくとも６つの異なる種類の陰イオンを含んでもよい。
【００９８】
さらなる実施形態では、このリポソーム組成物は、組成物のカプセル化された総イオン含量の約０．０１（ｗ／ｗ）％〜約５０（ｗ／ｗ）％、約０．１（ｗ／ｗ）％〜約２０（ｗ／ｗ）％、または約０．５（ｗ／ｗ）％〜約１０（ｗ／ｗ）％の量で存在するカプセル化された亜塩素酸塩を含む。
【００９９】
なおさらなる実施形態では、このリポソーム組成物は、組成物のカプセル化された総イオン含量の約０．０１（ｗ／ｗ）％〜約５０（ｗ／ｗ）％、約０．１（ｗ／ｗ）％〜約２０（ｗ／ｗ）％または約０．５（ｗ／ｗ）％〜約１０（ｗ／ｗ）％の量で存在するカプセル化された塩素酸塩を含む。
【０１００】
なおさらなる実施形態では、このリポソーム組成物は、この組成物のカプセル化された総イオン含量の約０．０１（ｗ／ｗ）％〜約５０（ｗ／ｗ）％、約０．１（ｗ／ｗ）％〜約２０（ｗ／ｗ）％または約０．５（ｗ／ｗ）％〜約１０％（ｗ／ｗ）の量で存在する塩素酸塩および亜塩素酸塩イオンのカプセル化された混合物を含む。また、亜塩素酸塩および／または塩素酸塩イオンを含有する物質の任意の組成物は、少なくとも１つの対イオンを有して、電荷の中立性を維持する。従って、本出願の一実施形態によれば、このリポソーム組成物は、１つ以上の陽イオンを含む。可能性のある陽イオンの非限定的な例としては、アルカリ金属陽イオン（例えば、ナトリウムまたはＮａ＋）およびアルカリ土類陽イオンが挙げられる。別の実施形態では、亜塩素酸塩イオン，塩素酸塩イオンまたはそれらの混合物を含んでいるリポソーム組成物は、さらにナトリウムおよび／またはカリウム対イオンを含む。
【０１０１】
さらなる実施形態では、このリポソーム組成物は、組成物のカプセル化された総陰イオン含量の約０．１（ｗ／ｗ）％〜約１００（ｗ／ｗ）％、約１（ｗ／ｗ）％〜約９０（ｗ／ｗ）％、約２（ｗ／ｗ）％〜約８０（ｗ／ｗ）％、約３（ｗ／ｗ）％〜約７０（ｗ／ｗ）％、約４（ｗ／ｗ）％〜約６０（ｗ／ｗ）％または約５（ｗ／ｗ）％〜約５０（ｗ／ｗ）％の量で存在するカプセル化された亜塩素酸塩を含む。
【０１０２】
なおさらなる実施形態では、このリポソーム組成物は、組成物のカプセル化された総陰イオン含量の約０．１％（ｗ／ｗ）〜約１００（ｗ／ｗ）％、約１（ｗ／ｗ）％〜約９０（ｗ／ｗ）％、約２（ｗ／ｗ）％〜約８０（ｗ／ｗ）％、約３（ｗ／ｗ）％〜約７０（ｗ／ｗ）％、約４（ｗ／ｗ）％〜約６０（ｗ／ｗ）％または約５（ｗ／ｗ）％〜約５０（ｗ／ｗ）％の量で存在する、カプセル化された塩素酸塩を含む。
【０１０３】
なおさらなる実施形態では、このリポソーム組成物は、組成物のカプセル化された総陰イオン含量の約０．１（ｗ／ｗ）％〜約１００（ｗ／ｗ）％、約１（ｗ／ｗ）％〜約９０（ｗ／ｗ）％、約２（ｗ／ｗ）％〜約８０（ｗ／ｗ）％、約３（ｗ／ｗ）％〜約７０（ｗ／ｗ）％、約４（ｗ／ｗ）％〜約６０（ｗ／ｗ）％または約５（ｗ／ｗ）％〜約５０（ｗ／ｗ）％の量で存在する塩素酸塩および亜塩素酸塩イオンのカプセル化された混合物を含む。
【０１０４】
当業者は、リポソーム組成物中の陰イオンの比が、その意図される用途に基づいて定性的にまたは定量的に調節されてもよいことを認識する。例えば、組成物中の陰イオンの比は、特定の疾患、障害または状態の処置のために調節されてもよい。一実施形態では、第二種の陰イオンに対する第一種の陰イオンの比は、約１００：１〜約１：１００、約９０：１０〜１０：９０、約１：１〜約３：１（ｗ／ｗ）または約２：１（ｗ／ｗ）である。ある実施形態では、第一種の陰イオンとは、亜塩素酸塩であり、および第二種の陰イオンとは塩素酸塩である。
【０１０５】
ある実施形態では、亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物のｐＨは約８より大きいか、約９より大きいか、または約１０より大きい。ある実施形態では、このｐＨは約８〜約１４、約８〜約１３、約９〜約１２．５、または約１０〜約１２である。
【０１０６】
別の実施形態では、亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物のｐＨは、約８未満、約７未満、または約６未満である。ある実施形態では、ｐＨは約５〜約８、約６〜約７、または約７〜約７．５である。
【０１０７】
さらなる実施形態では、このリポソーム組成物は、２つのｐＨ値を含む場合があり、この第一の値は、内側、内部またはカプセル化された相のｐＨに関し、この第二の値は、外側または外部相のｐＨに関する。例えば、リポソーム組成物の内部相のｐＨは、約６〜１３であってもよいが、リポソーム組成物の外部相のｐＨは、約６〜８であってもよい。従って、一実施形態では、内部相と外部相との間のｐＨの相違は、約１〜７、約１〜６、約１〜５、約１〜４、約１〜３、約１〜２または約１である。
【０１０８】
本出願における使用のための亜塩素酸塩および塩素酸塩は、任意の利用可能な供給源から得られてもよく、市販されている。ある実施形態では、亜塩素酸塩または塩素酸塩は、ナトリウム塩であるが、当業者は、他の金属塩が用いられてもよいことを理解する。
【０１０９】
本出願のリポソーム組成物中の亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物の量は典型的には、調製方法を用いてリポソーム中に捕捉され得る最大量である。ある実施形態では、この亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物は、約１％〜約５０％、約２％〜約２５％または約５％〜約１５％という効率性または封入率で捕捉される。
【０１１０】
Ｂ．脂質
本出願のリポソーム中に含まれる脂質は、約５〜約１４、約６〜約１３、約８〜約１２．５、または約１０〜約１２というｐＨを有する、イオンの捕捉に適切である脂質から選択される。本出願のリポソームを調製するための脂質の適切性を決定する要因としては以下が挙げられる：（１）水性媒体中で脂質二重層を形成する能力；（２）適切な量のイオンをカプセル化する能力；（３）亜塩素酸塩および／または塩素酸塩イオンの漏出に対して形成されたリポソームが不浸透性であること；（４）アルカリ環境での加水分解に対する形成されたリポソームの抵抗性（例えば、内側ｐＨが８以上である場合）；および／または（５）形成されたリポソームが、約５℃〜約５０℃の範囲内に収まる保管温度で許容可能な期間安定なままである能力。
【０１１１】
本明細書に示される実施例は、全ての脂質が、塩素酸塩または亜塩素酸塩のようなイオンの捕捉に適切なリポソームを調製するために適切なわけではないことを実証する。驚くべきことに、本出願の教示を通じて、一実施形態では、適切な脂質は、リン脂質およびスフィンゴ脂質から選択されることが見出された。別の実施形態では、適切なリン脂質は、十分な長さ、例えば、１２を超える、１３を超える、または１４個を超える炭素原子の飽和または不飽和の脂肪アシル鎖を含むホスファチジルコリン（ＰＣ）から選択され、そして適切なスフィンゴ脂質は、スフィンゴミエリン（ＳＭ）から選択される。別の実施形態では、この適切な脂質は、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、１，２−ジパルミトイル−２−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジミリストイル−２−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、水素添加大豆リン脂質または卵黄リン脂質およびそれらの混合物から選択される。さらなる実施形態では、適切な脂質は、約５℃以上、約２３℃以上、約３７℃以上、または約５０℃以上でイオンの漏出に対して不浸透性であるリポソームを形成する脂質から選択される。別の実施形態では、本出願のリポソームは、それらが形成される脂質の相転移温度（ＰＰＴ）で、またはその付近で不浸透性であっても不浸透性でなくてもよい。種々の脂質のＰＰＴ、例えば、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−３−グリセロ−３−ホスホコリン（−２℃）、１，２−ジミリストイル−２−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（２３℃）、スフィンゴミエリン（３７℃）、１，２−ジパルミトイル−２−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（４１℃）、および水素添加大豆リン脂質または卵黄リン脂質（例えば、水素添加大豆リン脂質について５０℃）のＰＰＴは公知である。
【０１１２】
本出願のリポソームは、２種類以上の適切な脂質を含んでもよい。リポソームが２種類の適切な脂質を含む場合、この脂質は、２０：１〜１：１、１５：１〜５：１または１０：１〜９：１のモル比で存在してもよい。一実施形態では、２種類の適切な脂質は、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、１，２−ジパルミトイル−２−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジミリストイル−２−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、および水素添加大豆リン脂質または卵黄リン脂質から選択される。
【０１１３】
本出願の組成物は、脂質二重層（単数または複数）の剛性を増強するか、および／または透過性を低減するための、少なくとも１つの追加の構成要素、例えば、コレステロールまたはコレステロール硫酸をさらに含んでもよい。少なくとも１つの追加の構成要素が、総脂質含量の約０．１〜約５０％、約１〜約３０％、約５〜約２５％または約１０〜約２０％の量で存在してもよい。
【０１１４】
本出願の組成物は、約＋０．５ｍＶよりも少なくともさらに正であるか、または約−０．５ｍＶよりも負であるゼータ電位のような、リポソームの凝集を低減するゼータ電位を有するリポソームを提供する少なくとも１つの追加の構成要素をさらに含んでいることが別の実施形態である。ある実施形態では、ゼータ電位は、約＋１ｍＶ〜＋５０ｍＶ、約＋１０ｍＶ〜＋４０ｍＶまたは約＋１５ｍＶ〜＋３０ｍＶである。別の実施形態では、ゼータ電位は、約−１ｍＶ〜−５０ｍＶ、約−１０ｍＶ〜−４０ｍＶまたは約−１５ｍＶ〜−３０ｍＶである。さらなる実施形態では、リポソームの凝集を低減するゼータ電位を有するリポソームを提供する少なくとも１つの追加の構成要素は、荷電された脂質である。別の実施形態では、本出願のリポソームを調製するために用いられる脂質としては、少なくとも１つの荷電された脂質が挙げられる。理論によって限定されることは望まないが、荷電された脂質の存在は、それらがお互いに近づくにつれて、隣接するリポソームと反発して、リポソームの間の接触の量を減少し、従って、サイズの増大を生じるリポソームの融合または凝集の量を減少する。従って、それらがお互いを反発することを可能にするゼータ電位（例えば、＋１ｍＶ、＋５ｍＶ、＋１０ｍＶ、＋１５ｍＶ、＋２５ｍＶ、＋３５ｍＶもしくは＋４５ｍＶよりも少なくとも正、または−１ｍＶ、−５ｍＶ、−１０ｍＶ、−１５ｍＶ、−２５ｍＶ、−３５ｍＶもしくは−４５ｍＶよりも負）を提供する荷電された脂質をリポソームが含むことが、本出願のある実施形態である。
【０１１５】
ある実施形態では、荷電された脂質は、負に荷電された脂質、例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、またはホスファチジン酸である。しかし、荷電された脂質は、リン脂質またはスフィンゴ脂質である必要はない。
【０１１６】
負に荷電された脂質が、本出願のリポソームを調製するために好ましいが、本出願のリポソームは、正に荷電された脂質の使用を排除しない。従って、一実施形態では、本出願のリポソームは、少なくとも１つの正に荷電された脂質を含んでもよい。例えば、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン塩素塩ＥＰＣ（塩素塩）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイロイクス（ｄｉｏｌｅｙｌｏｙｘ））プロピル］−Ｎ−Ｎ−Ｎ−トリメチルアンモニアクロライド（ＤＯＴＭＡ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド塩（ＤＤＡＢ）および他のｐＨ−感受性陽イオン性リン脂質。しかし、この荷電された脂質は、リン脂質またはスフィンゴ脂質である必要はない。例えば、他の荷電された脂質、例えば、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチル−硫酸塩（ＤＯＴＡＰ）が、本出願のリポソームを調製するために用いられてもよい。
【０１１７】
一実施形態では、荷電された脂質は、２０：１〜１：１、１５：１〜５：１または１０：１〜９：１という非荷電：荷電脂質のモル比を提供する量で存在する。さらなる実施形態では、リポソーム中の荷電された脂質の存在は、得られたリポソームの安定性を、特に、荷電された脂質を欠いている、それ以外は同一のリポソームと比較して改善する。
【０１１８】
ある実施形態では、本出願のリポソーム中に含まれる適切な脂質は、表１に列挙される脂質から選択される。
【０１１９】
ある実施形態では、適切な脂質は、１，２−ジパルミトイル−２−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジミリストイル−２−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１−ミリストイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＭＳＰＣ），１−パルミトイル−２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＭＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、水素添加卵（Ｅｇｇ）ＰＣ（ＨＥＰＣ）、１−パルミトイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＳＰＣ）、１−ステアロイル−２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＰＣ）、１−ステアロイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＯＰＣ）、１−ステアロイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＰＰＣ）、ジアラキドイルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、１，２−ジベヘノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＢＰＣ）、１，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、水素添加大豆リン脂質または卵黄リン脂質、およびそれらの混合物から選択される。別の実施形態では、この脂質はスフィンゴミエリン（ＳＭ）またはミルクスフィンゴミエリンである。さらなる実施形態では、この脂質は、水素添加大豆リン脂質または卵黄リン脂質である。別の実施形態では、この適切な脂質は、１，２−ジパルミトイル−２−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジミリストイル−２−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、水素添加大豆リン脂質または卵黄リン脂質、およびそれらの混合物から、荷電された脂質または別の脂質と組み合わせて選択される。さらなる実施形態では、この荷電された脂質は、負に荷電されたリン脂質である。なお別の実施形態では、負に荷電されたリン脂質は、ホスファチジルグリセロール、例えば、１，２，−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＤＰＰＧ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＤＭＰＧ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＤＯＰＧ）、または１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＤＳＰＧ）、ホスファチジルエタノールアミンの塩、例えば、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、または１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−メチル−ポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ−ＤＳＰＥ）の塩、またはそれらの混合物である。さらなる実施形態では、このホスファチジルグリセロールは、ＤＰＰＧもしくはＤＳＰＧまたはそれらの混合物である。
【０１２０】
脂質の混合物がリポソーム中で用いられる場合、大量に存在する脂質は、約５℃〜約３０℃より大きいＰＴＴを有する脂質であることが本出願のある実施形態である。このような脂質は、例えば、１２を超える連続炭素原子を含む炭素鎖を含んでいる脂質である。
【０１２１】
本出願の一実施形態では、脂質の特定の比が望ましい。別の実施形態では、この脂質は、１：９というモル比で、１，２−ジパルミトイル−２−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）および１，２−ジミリストイル−２−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）から選択される。さらなる実施形態では、この脂質は、１：９というモル比で、１，２−ジパルミトイル−２−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）および１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＤＭＰＧ）から選択される。さらに別の実施形態では、この脂質は、１：９というモル比で、１，２−ジパルミトイル−２−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）および１，２，−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＤＰＰＧ）から選択される。さらに別の実施形態では、この適切な脂質は純粋なＤＰＰＣである。
【０１２２】
また特定のＰＰＴを有する脂質は、本出願のリポソーム組成物の調製のために選択され得る。従って、リポソームが動物の体温を超えるＰＰＴを有する脂質を含むことが本出願のある実施形態である。このリポソームが、動物の体温未満であるＰＰＴを有する脂質を含むことは、本出願の別の実施形態である。
【０１２３】
このような材料は、例えば、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ａｌａｂａｍａ  ＵＳＡ），ＬＩＰＯＩＤ  ＧｍｂＨ（ドイツ）から市販されているか、または当該分野で公知の方法を用いて調製されてもよい。
【０１２４】
Ｃ．リポソーム表面修飾剤
本出願のリポソームの循環時間を延長するために、ある実施形態では、リポソーム、または脂質二重層の表面を、親水性を向上する分子で、例えば、親水性ポリマーで修飾することがある。
【０１２５】
ある実施形態では、親水性ポリマーは、ポリ−（エチレングリコール）（ＰＥＧ）である。リポソームの表面上のＰＥＧの存在は、血液循環時間を延長する一方で単球食細胞系（ＭＰＳ）取り込みを低減することが示された。
【０１２６】
ＰＥＧによるリポソームの表面修飾は、いくつかの方法で達成され得る：ベシクルの表面上にポリマーを物理的に吸着することによって、リポソーム調製の間にＰＥＧ脂質複合体を取り込むことによって、または事前に形成されたリポソームの表面上に反応性基を共有結合することによって。
【０１２７】
リポソーム上へのＰＥＧをグラフトすることで、いくつかの生物学的および技術的な利点が示された。ＰＥＧ化したベシクルの最も重要な特性は、それらの強力に減少したＭＰＳ取り込み、およびそれらの血液循環の延長であり、従って、灌流組織の分布の改善である。さらに、リポソーム表面上のＰＥＧ鎖は、ベシクルの凝集を回避し、それらの安定性を改善する。また、ＰＥＧ修飾したリポソームは、「シールドされた（ｓｈｉｅｌｄｅｄ）」リポソームと呼ばれる場合が多い。Ｄｏｘｉｌ（商標）（ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射）は、網内系（ＲＥＳ）および長期の薬物循環時間を回避するために利用される付加ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を伴う、リポソーム封入ドキソルビシンである（Ｖａｉｌ  Ｄ  Ｍ，Ａｍａｎｔｅａ  Ｍ  Ａ，Ｃｏｌｂｅｒｎ  Ｇ  Ｔ，ら、「Ｐｅｇｙｌａｔｅｄ  Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ．Ｐｒｏｏｆ  ｏｆ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  Ｓｔｕｄｉｅｓ．」  Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．（２００４）  ３１（補遺１３）：１６−３５を参照のこと）。
【０１２８】
リン脂質およびコレステロールから構成されるリポソームでは、ＰＥＧがベシクルの循環寿命を増大する能力は、グラフト化されたＰＥＧの量およびポリマーの長さまたは分子量の両方に依存することが見出された（Ａｌｌｅｎ  ＴＭ，ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１９８９，９８１：２７−３５）。ほとんどの場合、ＰＥＧの鎖が長ければ、血液残留時間の改善が最大になる。ある実施形態では、ＰＥＧは、約１５００〜約５０００の分子量を有する。
【０１２９】
本出願のリポソームを表面修飾するために用いられ得る、他の親水性ポリマーとしては、水溶性、親水性のポリマーが挙げられ、可塑性の主鎖および生体適合性を有する。ある実施形態では、親水性ポリマーは、ＰＥＧ、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（アクリルアミド）（ＰＡＡ）、ホスファチジルポリグリセロール、ポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］、Ｌ−アミノ酸ベースの生分解性ポリマー、ポリビニルアルコール（例えば、約２０，０００のＭＷを有するＰＶＡ）、ポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）およびそれらの混合物から選択される。
【０１３０】
別の実施形態では、リポソームの表面は、ガングリオシドおよび／またはシアル酸誘導体、例えば、モノシアロガングリオシド（ＧＭ１）で修飾される。いくつかの糖脂質は、ｉｖ注入後のリポソームのＭＰＳ取り込みの研究で試験された：糖脂質ＧＭ１（脳組織由来モノシアロガングリオシド）は、リポソーム表面上に組み込まれた場合、ＭＰＳ取り込みを有意に減少し、処方物は、数時間にわたって血液循環中で保持された。９０〜２００ｎｍの範囲の直径を有するＧＭ１グラフトしたリポソームは、血液保持が長く、このサイズ範囲以外のリポソームよりも、結果的に腫瘍組織で蓄積を伴う。ＧＭコーティングしたリポソームは、経口投与および脳への送達に有用であり得る。具体的には、経口の薬物担体として用いられるリポソーム処方物のうちでも、ＧＭ１およびＧＭＩＩＩ型を含有する処方物は、胃腸管を通じて生存する可能性が高いことが示唆された（Ｔａｉｒａ  ＭＣ，ら、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．２００４；１１：１２３−８）。さらに、両方の脳半球の皮質、脳幹神経節および中脳におけるコントロールのリポソームについてよりもＧＭ１リポソームについて脳のトレーサーによる取り込みが高かった；逆に、トレーサーの肝臓取り込みでも血液濃度でも有意な変化は観察されなかった（Ｍｏｒａ  Ｍ，ら、Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．２００２；１９：１４３０−８）。
【０１３１】
ＰＥＧ修飾リポソームに加えて、研究者らは、種々の他の誘導体化された脂質を開発した。また、これらの誘導体化された脂質は、リポソームに組み込まれてもよい。例えば：国際特許出願ＷＯ９３／０１８２８；Ｐａｒｋ  Ｙ  Ｓ，Ｍａｒｕｙａｍａ  Ｋ，Ｈｕａｎｇ  Ｌ．「いくつかの負に荷電されたリン脂質誘導体は、インビボにおいてリポソーム循環を延長する（Ｓｏｍｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ  ｃｈａｒｇｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｐｒｏｌｏｎｇ  ｔｈｅ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ）」Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（１９９２）  １１０８：２５７−２６０；Ａｈｌら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９９７）１３２９：３７０−３８２を参照。
【０１３２】
Ｄ．標的化部分
所望の組織中でのリポソーム薬物蓄積を増大するために、より高くかつより選択的な治療活性を生じ、本出願のリポソームは、それらの表面に対して細胞特異的標的部分を結合して、特定の細胞または組織型とのそれらの会合を容易にすることによって修飾されることがある実施形態である。標的部分としては、例えば、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）または、それらのフラグメント、ペプチド、成長因子、糖タンパク質、炭水化物もしくはレセプターリガンド、またはそれらの混合物が挙げられる。例示的な標的部分としては、限定するものではないが、トランスフェリン、葉酸、葉酸塩、ヒアルロン酸、糖鎖（例えば、ガラクトース、マンノースなど）、モノクローナル抗体のフラグメント、アシアロ糖タンパク質など、ならびに当業者に公知の他の標的因子、およびそれらの混合物が挙げられる。特定の実施形態では、標的因子は、タンパク質、ペプチド、または細胞表面レセプターに向けられる他の分子（例えば、トランスフェリン、葉酸塩、葉酸、アシアロ糖タンパク質など）である。
【０１３３】
標的因子を含む脂質組成物の例としては、米国特許第５，０４９，３９０号；同第５，７８０，０５２号；同第５，７８６，２１４号；同第６，３１６，０２４号；同第６，０５６，９７３号；同第６，２４５，４２７号；同第６，５２４，６１３号；同第６，７４９，８６３号；同第６，１７７，０５９号；および同第６，５３０，９４４号；米国特許出願公開第２００４／００２２８４２；２００３／０２２４０３７；２００３／１４３７４２；２００３／０２２８２８５；２００２／０１９８１６４；２００３／０２２０２８４；２００３／０１６５９３４；および２００３／００２７７７９；国際公開ＷＯ９５／３３８４１；ＷＯ９５／１９４３４；ＷＯ２００１０３７８０７；ＷＯ９６／３３６９８；ＷＯ２００１／４９２６６；ＷＯ９９４０７８９；ＷＯ９９２５３２０；ＷＯ９１０４０１４；ＷＯ９２／０７９５９；欧州特許第１３６９１３２号；および特開２００１００２５９２号に開示される組成物；ならびにＩｉｎｕｍａ  Ｈ，ら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，２００２，９９：１３０−１３７；Ｉｓｈｉｄａ  ０，ら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００１，１８：１０４２−１０４８；Ｈｏｌｍｂｅｒｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９８９，１６５（３）：１２７２−１２７８；Ｎａｍら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９８，３１（１）：９５−１００；ａｎｄ  Ｎａｇら、Ｊ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ．１９９９，６（６）：４２７−４３８に開示される組成物が挙げられる。
【０１３４】
具体的には、Ｉｉｎｕｍａら、（同書）は、リポソームの表面に結合されたトランスフェリン（Ｔｆ）を有する、Ｔｆ−ＰＥＧ−リポソームを開発し、これによってより多くのリポソームが腫瘍細胞の表面に結合され、ＰＥＧリポソームに比べてＴｆ−ＰＥＧ−リポソームについては腫瘍細胞によるリポソームの取り込みが大きかったことが示された（Ｉｎｕｍａら，同書；Ｉｓｈｉｄａら，同書）。
【０１３５】
特定の標的化部分およびそれらの治療標的の例は以下のとおりである：抗−ＨＥＲ２（トラスツズマブ）−乳癌／卵巣癌；抗−ＥＧＦ−固形腫瘍；抗−ＣＤ１９−リンパ腫；抗−ＣＤ２２−Ｂ−細胞リンパ腫；抗−β１インテグリン−癌細胞；抗−ＧＤ２−神経芽細胞腫；抗−ＧＡＨ−胃癌、結腸癌および乳癌；葉酸−癌細胞；トランスフェリン−癌細胞；アニサミド−乳癌、黒色腫および膵臓癌；血管作動性腸管ペプチド２８−マー−乳癌細胞の画像化；ＲＧＤ−神経芽細胞腫、黒色腫および結腸癌；血管形成ホーミングペプチド−黒色腫、肉腫および結腸癌。
【０１３６】
ある実施形態では、本出願のリポソーム組成物を、被験体に注入して、ベシクル含量の標的化送達を可能にするために関連の身体部分に熱を加える。これは体温で安定なリポソームに特に有用である。癌の温熱療法のような公知の方法は、本出願の組成物の標的送達の利点を受ける場合がある。
【０１３７】
ある実施形態では、本出願のリポソームは、表面修飾の親水性ペプチドおよび標的化部分を含む。別の実施形態では、これらのリポソームは、ＰＥＧ鎖の末端でマレイミド基を含んでいる適切な脂質のＰＥＧ誘導体をリポソーム処方物中に混合することによって調製される。リポソーム調製後、求核性のＮ、Ｏ、および／またはＳ原子を含んでいる標的化部分は例えば、表面結合を介して、上述のＰＥＧ−リポソームのマレイミド基に結合されて、安定な結合が得られる。あるいは、商業上、事前にロードされた長循環性のリポソームは、標的化部分の事後挿入によって修飾される。
【０１３８】
Ｅ．他の構成要素
本出願のさらなる実施形態では、本出願のリポソーム組成物およびリポソームはさらに、特定の適用について所望される他の添加物または薬剤を含む。このような添加物または剤としては限定するものではないが、保湿剤、溶媒、抗生物質、色素、芳香剤、香料などが挙げられる。一実施形態では、この組成物は、抗酸化剤を含む。ある実施形態では、本出願における使用のための抗酸化剤としては、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシアニソール、リノール酸アスコルビル、ジパルミチン酸アスコルビル、マレイン酸アスコルビルトコフェロール、アスコルビン酸カルシウム、カロテノイド、コウジ酸およびその薬学的に許容される塩、チオグリコール酸およびその薬学的に許容される塩（例えば、アンモニウム）、トコフェロール、酢酸トコフェロール、トコフェレス（ｔｏｃｏｐｈｅｒｅｔｈ）−５、トコフェレス−１２、トコフェレス−１８、もしくはトコフェレス−８０、またはそれらの混合物が挙げられる。
【０１３９】
ＩＩＩ．調製の方法
本出願のリポソームは、リポソームの調製のための任意の方法、例えば、薄膜方法、超音波、押し出し成形、高圧／ホモジナイゼーション、マイクロフルイダイゼーション、界面活性剤透析、エタノール注入法、交差流技術を含むエタノール注入法、小リポソームベシクルのカルシウム誘導性融合およびエーテル注入法を用いて調製してもよい。このような方法は、当該分野で周知である（例えば、「Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」，Ｇ．Ｇｒｅｄｏｒｉａｄｉｓ（編集），１９９１，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ：Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．；Ｄ．ＤｅａｍｅｒおよびＡ．Ｄ．Ｂａｎｇｈａｍ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９７６，４４３：６２９−６３４；Ｆｒａｌｅｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９７９，７６：３３４８−３３５２；Ｆ．Ｓｚｏｋａら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１９８０，９：４６７−５０８；Ｈｏｐｅら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９８５，８１２：５５−６５；Ｌ．Ｄ．Ｍａｙｅｒら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９８６，８５８：１６１−１６８；Ｈｏｐｅら，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐ．，１９８６，４０：８９−１−７；Ｋ．Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８８，８５：２４２−２４６；ＷａｇｎｅｒおよびＶｏｒａｕｅｒ−Ｕｈｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２０１１，ｐｐ．１−９；Ｗａｇｎｅｒら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００２，１２（３）：２５９−２７０；Ｗａｇｎｅｒら，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２００２，５４：２１３−２１９、ならびに米国特許第，４，２１７，３４４号；同第４，２３５，８７１号；同第４，２４１，０４６号；同第４，３５６，１６７号；同第４，４８５，０５４号；同第４，５５１，２８８号；同第４，６６３，１６１号；同第４，７３７，３２３号；同第４，７５２，４２５号；同第４，７７４，０８５号；同第４，７８１，８７１号；同第４，８７７，５６１号；同第４，９２７，６３７号；同第４，９４６，７８７号；同第５，１９０，８２２号；同第５，２０６，０２７号；同第５，４９８，４２０号；同第５，５５６，５８０号および同第５，７００，４８２号を参照のこと）。
【０１４０】
一実施形態では、リポソームは、伝統的な薄膜法を用いて調製される。この方法では、この二重層形成構成要素を、揮発性の有機溶媒または溶媒混合物（例えば、クロロホルム、エーテル、メタノール、エタノール、ブタノール、シクロヘキサンなど）と混合する。次いで、溶媒をエバポレートして（例えば、ロータリーエバポレーター、乾燥窒素もしくはアルゴンの蒸気、または他の手段を用いて）、乾燥した脂質フィルムを形成する。次いで、このフィルムを、亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物を含有している水性媒体で水和する。用いられる水和工程は、形成されるリポソームの種類に影響する（例えば、二重層の数、ベシクルの大きさおよび捕捉容積）。この水和された脂質薄膜は、撹拌の間に剥離して、自分で閉じて、異なる大きさの、大型の多重層のベシクル（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）（ＭＬＶ）を形成する。得られた多重層ベシクルのサイズ分布は、より活発な撹拌条件下で脂質を水和することによって、またはデオキシコレートのような可溶化活性剤を添加することによって、さらに小さい大きさに向かって偏向され得る。あるいは、またはさらに、ベシクルのサイズは、超音波、凍結／融解または押出成形によって小さくされてもよい（下を参照のこと）。
【０１４１】
大型の単層ベシクル（Ｌａｒｇｅ  Ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）（ＬＵＶ）は、任意の種々の方法を用いてＭＬＶから調製できる。例えば、フィルターを通じたＭＬＶの押し出しが、ＬＵＶ（そのサイズは、用いられるフィルター細孔サイズに依存する）を提供し得る。このような方法では（例えば、米国特許第５，００８，０５０号に記載）、ＭＬＶリポソーム懸濁物は、押出デバイスを繰り返し通過されて、均一なサイズ分布のＬＵＶの集団が生じる。環境温度を超える液晶転移温度へゲルを有する脂質を使用する場合、加熱されたバレル（またはサーモジャケット）を有する押し出し機を使用してもよい。ＬＵＶは、Ｍａｙｅｒら、（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９８５，８１７：１９３−１９６）に記載されるような押出手順の前に少なくとも１回の凍結解凍サイクルに曝してもよい。
【０１４２】
単層ベシクルの調製のための他の方法は、リポソームの水性分散に対する剪断力の適用に依拠する。このような方法は、超音波およびホモジナイゼーションを含む。浴またはプローブ超音波処理器のいずれかを用いるリポソーム懸濁物の超音波処理は、大きさが５０ｍｍ未満の小さい単層ベシクルへの累進的なサイズの減少をもたらす。リポソームベシクルの大きさは、準弾性光散乱（ＱＥＬ）（Ｖ．Ａ．Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１９８１，１０：４２１−４５０）によって決定され得る。典型的なホモジナイゼーション手順では、多重層ベシクルは、選択されたリポソームの大きさ、典型的には約１００〜５００ｎｍが観察されるまで、３，０００〜１４，０００ｐｓｉ、好ましくは１０，０００〜１４，０００ｐｓｉの圧力で、かつ最高Ｔｃを有する脂質のゲル−液晶転移温度に相当する温度で、標準的なエマルジョンホモジナイザーを通じて繰り返し循環される。
【０１４３】
ＬＵＶを調製するための他の技術としては、逆相エバポレーション（米国特許第４，２３５，８７１号）および封入手順、および界面活性剤希釈が挙げられる。例えば、単層ベシクルは、クロロホルムまたはエタノール中に脂質を溶解すること、次いで、脂質を緩衝液に注入し、この脂質を自然に凝集させて、単層ベシクルを形成することによって生成され得る。あるいは、リン脂質は、界面活性剤（例えば、コール酸塩、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、またはｎ−アルキルグルコシド）中へ溶解され得る。溶解された脂質−界面活性剤ミセルの形成後、界面活性剤を、透析、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー、遠心分離、限外濾過、または任意の他の適切な方法によって除去する。
【０１４４】
一実施形態では、本出願は、少なくとも１つの脂質二重層内に捕捉された亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物を含むリポソームであって、ここで脂質二重層が、１つ以上の適切な脂質から構成されているリポソームを調製する方法を包含し、この方法は：
（ａ）内側表面の少なくとも一部の上に１つ以上の脂質のフィルムを有する容器へ亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物の水溶液を添加することと；
（ｂ）この内面からフィルムを全体的にまたは部分的に除去するために十分な条件下でこの容器を撹拌して、亜塩素酸塩−捕捉、および／または塩素酸塩−捕捉のリポソームを含んでいる混濁溶液を得ることと；
（ｃ）この混濁溶液を処理して、リポソームの平均直径を所望の値、例えば、約５０ｎｍおよび約３００ｎｍまで下げることと；
（ｄ）必要に応じてこのリポソームを処理して、このリポームに対して外側の溶液から亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物を除去することと；
を包含する。
【０１４５】
別の実施形態では、本出願のリポソームは、例えば、ＷａｇｎｅｒおよびＶｏｒａｕｅｒ−Ｕｈｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２０１１，ｐｐ．１−９（その関連部分は、参照によって本明細書に援用される）に記載のように、エタノール注入方法を用いて調製される。さらなる実施形態では、リポソームは、例えば、Ｗａｇｎｅｒら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００２，１２（３）：２５９〜２７０（その関連部分は、参照によって本明細書に援用される）に記載のように、直交流技術によるエタノール注入方法を用いて調製される。
【０１４６】
ある実施形態では、（ａ）における亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物に対する１つ以上の適切な脂質のモル比は、約０．０１：１〜約１００００：１、約０．１：１〜約５０００：１、約０．５：１〜約２５００：１、約１：１〜約１０００：１、または約０．１：１〜約１００：１である。
【０１４７】
本出願のリポソームの調製のために用いられる脂質は、溶液として、特にＡｖａｎｔｉ  Ｌｉｐｉｄｓから購入してもよい。ＬＩＰＯＩＤ  ＡＧは、固体状態で未希釈の脂質を送達する。特定の実施形態では、溶液の濃度は、溶液の１ミリリットルあたり約１０ｍｇ〜約１００ｍｇの脂質である。リポソームの調製のために用いられるこの溶液の量は、必要な脂質の量次第で変化し、必要な脂質の量は、所望のサンプル容積に依存する。純粋な、未希釈の脂質が用いられなければならず、それらは、適切な容積のクロロホルムまたは別の適切な有機溶媒に溶解される。
【０１４８】
内面の少なくとも一部の上に１つ以上の脂質のフィルムを有する容器を得るために、ある実施形態では、この容器を、撹拌しながら、減圧下で、かつ１つ以上の脂質の全ての相転移温度（ＰＰＴ）付近またはそれを超える温度で処理して、溶媒を除去する。エバポレーション工程でＰＴＴを超えたままである必要はないことに注意のこと。クロロホルム溶液については、ＤＰＰＣのＰＴＴ（４１℃）および水素添加大豆リン脂質のＰＴＴ（５０℃）よりも下である３７℃の水浴を適用してもよい。ある実施形態では、溶媒は、１つ以上の脂質の全ての脂質相転移温度を超える温度で維持されている容器でのロータリーエバポレーターを用いて除去される。
【０１４９】
水溶液をこの容器に添加して、この容器を、容器の内面からフィルムを除去するのに十分な条件下で撹拌して、混濁溶液／分散物（リポソームを含んでいる）を得る。ある実施形態では、フィルムを除去するために十分な条件は、容器を振盪すること、および容器を１つ以上の脂質の全ての脂質相転移温度を超える温度まで加熱することを包含する。別の実施形態では、この条件はさらに、１つ以上の脂質の全ての脂質相転移温度を超える温度で、約１分〜約２時間、または約５分〜約１時間振盪することを包含する。この工程では、１つ以上の脂質の再水和は、リポソームの形成と、亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物溶液の捕捉とともに生じる。これらの、いわゆる、一次リポソームは、大型の多重層ベシクル（ＬＭＶ）であって、リポソームの内側（内側相）および外側（外側相）の両方に溶液がある。この段階では、このサンプルは、濁った、乳白色の溶液／分散液である。
【０１５０】
約５０ｎｍ〜約３００ｎｍまでリポソームの平均直径を低下するように混濁溶液を処置することは、リポソームのサイズを低下するための任意の公知の手段を用いて行うことができる。本出願のある実施形態では、凍結解凍サイクルの組み合わせおよび押出方法を用いる。別の実施形態では、押出方法のみを用いる。
【０１５１】
凍結解凍サイクルに関しては、ある実施形態では、このサンプルは、適切な容器（必要な場合）、例えば、冷凍管、および液体窒素に浸漬された容器に移され、引き続き、１つ以上の脂質の全ての脂質相転移温度を超える水浴中で解凍される。ある実施形態では、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０サイクルが行われる。理論で束縛されることは望まないが、凍結は、一次リポソームの破壊を生じ、および１つ以上の脂質の全ての脂質相転移温度を超える解凍は、より小さい平均直径を有するリポソームの自然な再形成を生じる。しかし、凍結解凍方法は、任意である。
【０１５２】
本出願のある実施形態では、押し出し方法は、少なくとも１つの約５０ｎｍ〜約２００ｎｍのフィルターディスクを通してリポソームサンプルを絞り出すことによって行われる。ある実施形態では、絞り出しは、適切なフィルターを備えている押し出し機に圧力を加えることによって行われる。さらなる実施形態では、押し出しは、１つ以上の脂質の全ての脂質相転移温度を超える温度で行い、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回繰り返す。
【０１５３】
ある実施形態では、押し出し方法の使用は、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍまたは約１００ｎｍの平均直径を有する単層リポソームを提供するに過ぎない。別の実施形態では、超音波処理方法を用いて、粒子サイズを低下させるか、またはＭＬＶをＬＵＶ／ＳＵＶに変換してもよい。
【０１５４】
別の実施形態では、本出願の方法は、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによってモニターした場合、分解生成物を実質的に含まないリポソーム組成物を提供する。さらなる実施形態では、本出願の方法は、ＦＤＡまたは他の規制機関によって承認されたガイドラインを満たす分解生成物レベルを含むリポソーム組成物を提供する。
【０１５５】
この段階では、このサンプルは、亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物溶液中に分散されたイオン充填リポソームを含む。ある実施形態では、この溶液を含んでいる外部相は、例えば、生理食塩水と、任意の透析処置を用いて置き換えられる。ある実施形態では、このサンプルを、透析チャンバに充填して、１つ以上の脂質の全てのＰＰＴより下の温度で生理食塩水溶液中に入れる。１時間後、撹拌しながら、過剰の媒体を交換して、その手順を少なくとも１、２、３または４回繰り返す。ある実施形態では、この手順を、亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物の濃度が、ｏ−トリジン方法の検出限界未満になるまで繰り返す。亜塩素酸塩／塩素酸塩分析の方法は、亜塩素酸塩および塩素酸塩（それぞれ、ＣｌＯ２−およびＣｌＯ３−）が、強力な塩酸溶液中でオルト−トリジン（ｏ−トリジン）と反応して、その溶液中に存在するＣｌＯ２−およびＣｌＯ３−の量に大きく依存した色の変化を生じるという事実に基づく。この方法は、別々に両方の種を検出するための２段階のアプローチを提供する。しかし、ＷＦ１０中の塩素酸塩に対する亜塩素酸塩の一定比に起因して、１つの工程のみを用いる必要がある（両方の構成要素が色の変化に寄与した）。ｏ−トリジン法を行うための方法は、実施例７に記載される。
【０１５６】
本出願のある実施形態では、亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物を含んでいるリポソーム、およびこれらのリポソームを含んでいる組成物は、約１０、９、８、７、または６℃より下、適切には約６℃未満の温度で保管される。
【０１５７】
さらなる実施形態では、リポソーム組成物は、滅菌されてもよい。適切な滅菌技術の非限定的な例としては、ろ過、オートクレーブ、γ線照射および凍結乾燥（フリーズドライ）が挙げられる。一実施形態では、滅菌は、２２０ｎｍのフィルターを用いてろ過によって行われる。
【０１５８】
ＩＶ．治療適用
亜塩素酸塩および塩素酸塩は、強力な酸化剤であることが周知である。これらの物質の酸化力は、ｐＨ低下につれて増大する傾向である。従って、医学用途のための市販の安定化された亜塩素酸塩処方物、例えば、ＷＦ１０およびＯｘｏｆｅｒｉｎ（慢性の創傷の処置）は、一般に、高いｐＨの水溶液として提供され、この水溶液は、亜塩素酸塩と反応するか、または高いｐＨ環境のせいで分解する（例えば、エステル基の加水分解に起因する）かのいずれかであり得る有機物質をほとんど、または全く含まない。このストラテジーは、この製品が商業上許容できる保存期間を有することを確実にするために使用され得るが、製品の副作用に関して不利であり、開発できる製品の種類を制限する場合がある。
【０１５９】
例えば、ＷＦ１０のような、極めて塩基性の溶液を、静脈内注入によって投与することは、その注入が緩徐に行われる限り、そしてＷＦ１０が約２５０〜５００ｍＬの生理食塩水を用いて希釈された後にのみ、静脈炎（静脈の炎症）を生じる場合がある。このため、ＷＦ１０注入は、典型的には、１．５時間などの期間にまたがって投与される場合があり、その結果、患者は、不自由でかつ医療資源の利用が大きくなる。同様に、Ｏｘｏｆｅｒｉｎは、創傷の処置について数か国で承認されており、驚くべきことに、そのｐＨが高いことを想定すれば、最も頻繁に観察される有害反応の１つは疼痛である（Ｈｉｎｚ  Ｊ，Ｈａｕｔｚｉｎｇｅｒ  Ｈ，Ｓｔａｈｌ  ＫＷ．Ｒａｔｉｏｎａｌｅ  ｆｏｒ  ａｎｄ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ，ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｄｅｃａｏｘｙｇｅｎ  ａｎｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｉｎ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ．Ｌａｎｃｅｔ．１９８６  Ａｐｒ  １２；１（８４８５）：８２５−８）。また、これによって、ＷＦ１０およびＯｘｏｆｅｒｉｎの高い塩基性の性質によって、肺送達方式で標的される肺胞の繊細な上皮などに対する投与の他の部位についてＷＦ１０およびＯｘｏｆｅｒｉｎは不適切になることも予測され得る。
【０１６０】
また、亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物と多くの有機物質とを同時に製剤化することが難しいことで、望ましくない限界が生じ得るということも、薬剤の剤形開発の当業者には理解される。例えば、いくつかの被覆材料は、Ｏｘｏｆｅｒｉｎで含浸された場合、長期の安定性を示さず、オキソフェリンを事前ロードされている、個々にパウチにされた創傷治癒被覆などの製品を開発することが困難になる。また、これは、２つ以上の活性な薬物成分を含んでいる薬剤を開発するためには一般的な慣習であり、多くの行動は、亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物を含む溶液と混合された場合、商業上許容できる安定性を示さないことが予想される。
【０１６１】
ＷＦ１０は、その治療効果を、マクロファージに対する作用によって発揮すると考えられる（ＭｃＧｒａｔｈ，Ｋｏｄｅｌｊａ，Ｖ．Ｂａｌａｎｃｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ：ａ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｒｕｇｓ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｔ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｔａｔｅｓ．Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ，６７，２７７−２８１（１９９９））。ＷＦ１０のさらなる態様は、毒性の副作用が生じ得る限界にかなり近い用量で投与される場合が多いものである。例えば、進行したＡＩＤＳの患者に対するＷＦ１０のトライアルでは、０．１ｍＬ／ｋｇ〜１．５ｍＬ／ｋｇの範囲の用量を用いた以前の用量設定トライアルでは、０．５ｍｌ／ｋｇを超えて投与された患者で、静脈炎、メトヘモグロビン値増大、赤血球（ＲＢＣ）のグルタチオンレダクターゼ値の低下が示され、従って、０．５ｍｌ／ｋｇが、最大耐容用量とみなされたたため、０．５ｍＬ／ｋｇというＷＦ１０用量を使用した（Ｒａｆｆａｎｔｉ，Ｓ．Ｐ．，Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ，Ｗ．，Ｆｅｄｅｒｓｐｉｅｌ，Ｃ．Ｆ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，Ｒ．Ｂ．，Ａｈ  Ｃｈｉｎｇ，Ｏ．，Ｋｕｈｎｅ，Ｆ．Ｗ．Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｄｏｕｂｌｅ  ｂｌｉｎｄ，ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ  ＷＦ１０  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｂｖａｎｃｅｄ  ＡＩＤＳ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．２６，４，２０１−２０６（１９９８）を参照のこと）。
【０１６２】
また、ＯＸＯ−Ｋ９９３（ＷＦ１０の形態）の効果を、進行した頸部癌を有する患者に対する放射線療法によって生じる合併症の治癒および予防に対しても研究した（Ｒａｔｔｋａ，Ｐ．，Ｈｉｎｚ，Ｊ．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ＴＣＤＯ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｃｏｌｌｕｍ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｓｔａｇｅ  ＩＩＩＢ．Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．ｏｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｐａｉｒ，Ｐａｔｔａｙａ，Ｔｈａｉｌａｎｄ，Ｄｅｃ．６−８（１９９０）：Ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｓ−Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｐａｉｒ，３０−３１（１９９０）を参照のこと）。この研究では、ＷＦ１０を、処置アームにおいて患者に対する照射の１．５時間前に投与して、この文献の著者は、照射前に行ったＷＦ１０処置が照射の間の腫瘍組織に対する生物学的効果を有意に増大するという印象を示した。このような処置に関しては、腫瘍組織に対して安定化された亜塩素酸塩処方物を標的する手段を有することが望ましいが、不幸にも、これは、静脈内に投与されたＷＦ１０のような安定化された亜塩素酸塩の溶液処方物では困難である。
【０１６３】
亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物を処方物中のリポソームにカプセル化する能力（ここで外部相は実質的にこれらの薬剤を含まない）は、多数の利点を有する。例えば、リポソームを含んでいる組成物の外部相は、亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物、例としては、例えば、特定の活性な薬学的成分および賦形剤と適合しない有機物質などの物質も含んでよい。また、リポソーム処方物は固体マトリックス（そうでなければ、創傷への適用のための被覆物質などのような、これらの剤と容易に適合しない）中に分散されてもよい。同様に、適切な中性のｐＨの亜塩素酸塩なし、または塩素酸塩なしの外部相を創出する能力は、高いｐＨ溶液が身体に静脈内にまたは局所に投与され、亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物が肺経路などの新しい投与方式で送達されることを可能にする時に観察された、静脈炎および疼痛のような副作用の出現を減少するために有利に利用され得る。
【０１６４】
リポソーム構造は、亜塩素酸塩または塩素酸塩ベースの薬物の作用部位であると考えられる、マクロファージによって循環から優先的に除去されるように設計され得ることも理解される。例えば、リポソームは、所定の処置効果を達成するために必要な亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物の用量を低下し得、薬剤の安全性の限界を改善し得る。あるいは、このリポソームは、許容できない毒性を誘発することなく、亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物の薬理学的な影響を増大するために用いられ得る。
【０１６５】
あるいは、リポソームは、マクロファージ以外の標的へ送達されるように設計され得る。例えば、化学療法薬物Ｄｏｘｉｌ（ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射物、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ  Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ＬＰ）などのような技術を使用して、患者の身体の腫瘍を標的してもよい。このような標的化は、放射線療法の前の感作物質として、亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物を用いることが所望される場合、有益に使用され得る。
【０１６６】
従って、本出願はさらに、これらを含んでいる本明細書に記載のリポソームおよび組成物の全ての使用、ならびにこれらを含む方法を包含する。特定の実施形態では、本出願のリポソームまたは組成物の医薬としての使用が包含される。
【０１６７】
活性剤の利点は、リポソームへの組み込みによって改善され得る。リポソーム組成物の改善の特徴としては、例えば、亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物の薬物動態の変更、体内分布および／または保護が挙げられる。徐放性処方物を提供することによって、この薬剤の投与の頻度を低減すること、またはより急速な注入速度を得ることも可能である。肺のマクロファージへまたは炎症性組織への亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物の標的化送達は、本出願のリポソーム組成物でも可能である。標的部位への送達を標的することによって、例えば、約１〜約１０００の係数まで投薬を減少することが可能である。また利点としては、高いｐＨの亜塩素酸塩溶液が身体に静脈内にまたは局所に投与され、薬剤が肺経路またはボーラス注射（例えば、短期間に、例えば、３０分未満、１５分未満、５分未満でＩ．Ｖ．で送達される組成物）などの新しい投与方式で送達されることを可能にする時に（典型的には低い用量の容積を要する）観察された、静脈炎および疼痛のような副作用の出現を減少することを挙げることができる。
【０１６８】
本出願のリポソームの１つの特定の利点は、脂質膜の組成を変えることによってカプセル化された薬剤の放出のタイミングを調節する能力である。従って、カプセル化された薬剤（単数または複数）の放出のタイミングは、所望の温度放出プロフィールを有する脂質の組み合わせを選択することによって制御され得る。例えば、創傷治癒の適用では、脂質は放出温度が皮膚温度かその付近になるように、そして、皮膚へのリポソームの投与が、組成物が皮膚温度に達した際（この時点でこの剤バルクが放出される）の最小の放出または徐々の放出を生じるように選択され得る。
【０１６９】
従って、本出願はさらに、亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物の投与が有益である、疾患、障害または状態を処置するための方法であって、その必要な被験体に対して有効量の本出願の組成物を投与することを包含する方法を包含する。
【０１７０】
本出願はさらに、亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物の投与が有益である、疾患、障害または状態を処置するための本出願の組成物の使用、および亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物の投与が有益である、疾患、障害または状態を処置するための使用のための本出願の組成物を包含する。
【０１７１】
一実施形態では、本出願は、マクロファージの機能を調節するための方法であって、その必要な被験体に対して本出願の組成物の有効量を投与することを包含する方法を包含する。本出願はさらに、マクロファージの機能を調節するための本出願の組成物の使用およびマクロファージの機能を調節するための使用のための本出願の組成物を包含する。
【０１７２】
理論で束縛されることはないが、マクロファージ機能の調整は、不適切な免疫応答の結果として慢性炎症の症状を生じる疾患の処置と関連していた（例えば、米国特許出願公開第２０１１／００７６３４４を参照のこと）。従って、ある実施形態では、亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物の投与が有益である、疾患、障害または状態は、抗原特異的免疫応答、例としては、例えば、自己免疫疾患、不適切な免疫応答によって生じる疾患、例えば、重傷筋無力症、全身エリテマトーデス、血清病、糖尿病、慢性関節リウマチ、若年性慢性関節リウマチ、リウマチ熱、シェーグレン症候群、全身性硬化症、脊椎関節症、ライム病、サルコイドーシス、自己免疫溶血、自己免疫肝炎、自己免疫好中球減少、自己免疫性多腺病、自己免疫性甲状腺疾患、多発性硬化症、炎症性腸疾患、大腸炎、クローン病、慢性疲労症候群、などから誘導されるものから選択される。また、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、少なくとも数例の患者では、いくつかの自己免疫病因論を有し得る。自己免疫応答では、患者の身体は、多すぎる細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）または他のサイトカインを生じ、これが次に身体の健康な細胞と敵対して、それらを破壊する。移植または移植片の患者では、免疫系が移植された臓器または移植片の抗原を外来と認識し、それらを破壊するので、不適切な免疫応答が生じる。これによって、移植片拒絶が生じる。同様に、移植および移植片患者は、宿主対移植片応答を生じ得、ここでは移植された臓器または移植片の免疫系は宿主の抗原を外来と認識して、それらを破壊する。この結果として、宿主対移植片病が生じる。他の不適切な免疫応答がアレルギー喘息、アレルギー性鼻炎、およびアトピー性皮膚炎で観察される。さらに、慢性の炎症の症状を生じる疾患はまた、過剰なマクロファージ活性化によって特徴づけられる不適切な免疫応答を生じる。例えば、組織損傷に対する健康な応答、身体的創傷、細菌またはウイルスのような病原性の生物体による浸潤は、マクロファージの活性化（「従来の」炎症促進経路を介する）に関与し、炎症性の応答をもたらす。しかし、この応答は、不適切な方式では「オーバーシュート」である場合があり、炎症促進性の免疫応答が抑制できない場合、慢性の炎症を生じる。疾患、例えば、Ｂ型肝炎、およびＣ型肝炎、慢性肝炎、ならびにＣＯＰＤの顕在化、例えば、閉塞性気管支炎、および肺気腫（非特異的な気管支炎および肺の刺激物に対する長期暴露によって明らかに生じる）は、過剰なマクロファージ活性化によって誘導される慢性炎症（肝炎の肝臓の、およびＣＯＰＤの肺組織の）によって特徴づけられる。
【０１７３】
亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物の投与が有益である、他の疾患、障害または状態は、腫瘍性障害（癌）、ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、神経変性疾患、ＡＩＤＳ関連の痴呆、発作、脊髄病理学、微生物感染症、および他のウイルス感染から選択される。
【０１７４】
神経変性疾患の例としては、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、および多発性硬化症（ＭＳ）が挙げられる。この癌は、限定するものではないが、副腎皮質性癌、肛門癌、無形成性貧血、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨転移、中枢神経系（ＣＮＳ）癌、末梢神経系（ＰＮＳ）癌、乳癌、キャッスルマン病、子宮頸癌、幼児期非ホジキンリンパ腫、結腸および直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイングファミリーの腫瘍（例えば、ユーイングの肉腫）、眼癌、胆嚢癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、ヘアリー細胞白血病、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌および下咽頭癌、急性リンパ性白血病、急性脊髄性白血病、小児白血病、慢性リンパ性白血病、慢性脊髄性白血病、肝癌、肺癌、肺カルチノイド腫瘍、非ホジキンリンパ腫、男性の乳癌、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、脊髄形成異常症候群、脊髄増殖性障害、鼻腔および副鼻腔の癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔および口咽頭の癌、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、陰茎癌、下垂体性腫瘍、前立腺癌、網膜芽腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫（成人軟部組織癌）、黒色腫皮膚癌、非黒色腫皮膚癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮癌（例えば、子宮肉腫）、膣の癌、陰門癌およびワルデンストレームのマクログロブリン血症であり得る。
【０１７５】
ある実施形態では、亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物の投与が有益である、疾患、障害または状態は、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、新生物性の障害、ＨＩＶ感染症、およびＡＩＤＳから選択される。ある実施形態では、この新生物の障害または癌は、消化管、頭部、頸部、乳房または膵臓の癌である。
【０１７６】
亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物の投与が有益である、他の治療適用としては、放射線症候群に罹患しているか、または環境有害物質に対する暴露を受けている患者の処置が挙げられる。放射線症候群としては、急性の放射線症候群、あるいは放射線療法、または、例えば、戦争もしくはテロリストの攻撃で用いられる核兵器によって生じる放射線暴露の遅延効果が挙げられる。創傷治癒のための治療適用、例としては、圧力、術後または外傷後の創傷治癒、または慢性創傷治癒、糖尿病性潰瘍、静脈潰瘍、動脈潰瘍または褥瘡性潰瘍の治癒などにおける慢性創傷治癒も考慮される。
【０１７７】
本出願の組成物、およびその処方物は、任意の適切な経路、例えば、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、関節内投与、くも膜下腔内投与、脳室内投与、直腸投与、眼内投与、経鼻スプレーとして、肺吸入を介して、および経口投与、ならびに当業者に公知の他の適切な投与経路を用いて被験体に投与されてもよい。本出願の方法および使用を用いて処置できる組織としては、限定するものではないが、鼻、肺、肝臓、骨、膵臓、生殖器、軟部組織、筋肉、副腎組織および乳房が挙げられる。処置できる組織としては、癌組織、処置がなければ疾病状態または損なわれた組織、ならびに必要に応じて健常な組織の両方が挙げられる。
【０１７８】
もっと確実にするために、「本出願の組成物（単数または複数）」とは、調製されたままであるか、または追加の担体および／もしくは他の成分と組み合わされた、本明細書に記載のリポソーム組成物を指す。
【０１７９】
本出願の組成物およびその処方物は、単独で、または他の処置方式（例えば、補助的な癌治療、複合撮画処置）と組み合わせて（例えば、前に、同時に、または後に）用いられる。例えば、他の治療剤（例えば、本明細書に記載のおよび当業者に公知の癌の化学療法剤（例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、タキサン類、代謝拮抗物質、抗腫瘍抗生物質、植物アルカロイド、ホルモン療法薬物、分子標的薬物など））、手術および／または放射線療法と組み合わせて。処置されている状態が癌である場合、本明細書に記載の組成物およびその処方物は、本明細書に記載のようなおよび当該分野で公知のような、１つ以上の他の抗癌剤または細胞毒性化合物、有害反応の出現および／もしくは重篤度、ならびに／またはその臨床的な出現を減らす１つ以上の追加の薬剤、手術（例えば、腫瘍またはリンパ節を除去する）、あるいは放射線照射と組み合わせて投与されてもよい。１つ以上の手術または放射線は、処置計画の一部である場合、組成物またはその処方物は、放射線療法または手術の前に、同時に、または後に投与されてもよい。同様に、この組成物および処方物は、本明細書に記載のように、１つ以上の抗癌剤の投与の前に、同時に、または後に投与されてもよい。本明細書に記載の組成物およびその処方物はまた、状態または処置計画と関連する症状を緩和するための薬物（例えば、嘔吐、毛髪の喪失、免疫抑制、下痢、発赤、感覚障害、貧血、疲労、口内炎、手足症候群などを軽減する薬物）と組み合わせて（例えば、前に、同時に、または後に）投与されてもよい。この組成物は、２段階以上の（例としては、全体にわたる）処置計画で投与されてもよい（例えば、手術後、および放射線療法と組み合わせて、その後など）。一実施形態では、本出願のこの組成物またはその処方物は、５−フルオロウラシルおよびそのプロドラッグ、例えば、カペシタビンのうちの一方または両方と組み合わせて投与される。
【０１８０】
本出願のさらなる実施形態では、この組成物およびその処方物を、アレルギー性喘息、またはアレルギー性鼻炎、または他の肺もしくは呼吸器の疾患、障害または状態を処置するために用いる場合、それらは正常には、静脈内経路によって、または経粘膜的に、さらに具体的には、経鼻的に、眼に、または肺に投与される。例えば、本出願の組成物は、経鼻スプレー、経鼻点滴剤および／または点眼剤によって投与される。本出願の組成物を、微細ミストとして、肺へ噴霧によって、任意の電気式または空気式のネブライザーを用いて、投与することも可能である。経鼻投与のためには、水性リポソーム組成物のスプレーを生成するために適切な任意の最先端デバイスを用いてもよい。本出願の組成物および処方物は、単独で、またはアレルギー性喘息もしくはアレルギー性鼻炎のための他の処置様式と組み合わせて（例えば、前に、同時に、または後に）用いられる。例えば、当業者に公知の他の治療剤（例えば、ステロイドおよび抗ヒスタミン剤）と組み合わせて。また、本出願の組成物は、使用前に、例えば、適切な希釈液（例えば、生理食塩水）を用いて、静脈注入による投与の前に、緩衝化または希釈されてもよい。
【０１８１】
本出願のさらなる実施形態では、この組成物およびその処方物を、アトピー性皮膚炎、または他の皮膚の疾患、障害または状態を処置するために用いる場合、それらは正常には、局所的にまたは経皮的に、例えば、ローション、塗布薬、ゼリー、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、クリーム、ペースト、ゲル、ヒドロゲル、エアロゾル、スプレー、粉末、顆粒（ｇｒａｎｕｌｅｓ、ｇｒａｎｕｌａｔｅｓ）、トローチ剤（ｌｏｚｅｎｇｅ）、坐剤、軟膏（ｓａｌｖｅ）、チューイングガム、トローチ（ｐａｓｔｉｌｌｅ）、小袋（ｓａｃｈｅｔ）、口腔洗浄液、錠剤、デンタルフロス、絆創膏、包帯、シート、泡状物、フィルム、スポンジ、被覆材、ドレンチ（ｄｒｅｎｃｈｅ）、生体吸着性パッチ、スティックなどの形態で投与される。本出願の組成物およびその処方物は、単独で用いられるか、または、アトピー性皮膚炎の他の処置方式と組み合わせて（例えば、前、同時、または後に）用いられる。例えば、当業者に公知の他の治療剤と組み合わせて。
【０１８２】
Ｖ．処方物および投薬
以前に注記されたように、本出願の組成物および薬学的処方物は、本明細書に記載の使用の方法と組み合わせて、本明細書に記載のような状態を処置するために、その必要な被験体に投与される。
【０１８３】
リポソーム組成物を、そのままで、または薬学的な組成物もしくは処方物として投与してもよい。従って、また、本出願は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体または賦形剤と混合された亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物を、カプセル化されたリポソームを含んでいる薬学的組成物に包含する。一実施形態では、この薬学的組成物は、徐放性の亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物を提供し、これによって、徐放性の処方物を含む。
【０１８４】
上記で注記されるとおり、リポソーム組成物または薬学的組成物またはそれらの処方物は、任意の適切な経路、例えば、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、経皮投与、経皮投与、関節内投与、くも膜下腔内投与、脳室内投与、経鼻スプレーとして、肺吸入を介して、および経口投与、ならびに当業者に公知の他の適切な投与経路を用いて被験体に投与され、適宜処方される。
【０１８５】
投与の方式次第で、薬学的組成物は、液体、固体または半固体の投薬調製物の形態であってもよい。例えば、組成物は、溶液、分散物、懸濁物、エマルジョン、混合物、ローション、塗布薬、ゼリー、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、クリーム、ペースト（歯磨きペーストを含む）、ゲル、ヒドロゲル、エアロゾル、スプレー（口腔スプレーを含む）、粉末（歯磨き粉を含む）、顆粒（ｇｒａｎｕｌｅｓ、ｇｒａｎｕｌａｔｅｓ）、トローチ剤（ｌｏｚｅｎｇｅ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、チューイングガム、トローチ（ｐａｓｔｉｌｌｅ）、小袋（ｓａｃｈｅｔ）、口腔洗浄液、錠剤、デンタルフロス、絆創膏、包帯、シート、泡状物、フィルム、スポンジ、被覆材、ドレンチ（ｄｒｅｎｃｈｅ）、生体吸着性パッチ、スティック、錠剤、バッカル錠、トローチ（ｔｒｏｃｈ）、カプセル、エリキシル、懸濁物、シロップ、ウェーハ、放出調節錠剤などとして処方されてもよい。
【０１８６】
本出願の薬学的組成物は、一般的な薬務に従って処方してもよい（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２０００−第２０版）および米国薬局方（Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）：国民医薬品集（Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ）（ＵＳＰ  ３４  ＮＦ１９）を参照のこと）。
【０１８７】
本出願の薬学的組成物での使用のための生理学的に許容される担体または賦形剤は、当業者によって用いられる特定の用途のための慣用的に選択され得る。これらとしては限定するものではないが、溶媒、緩衝化剤、不活性な希釈液または充填剤、懸濁剤、分散剤または湿潤剤、防腐剤、安定化剤、キレート剤、乳化剤、消泡剤、ゲル形成剤、軟膏基剤、浸透促進剤、保湿剤、エモリエントおよび皮膚保護剤が挙げられる。
【０１８８】
溶媒の例は、水、アルコール、植物油、海洋油および鉱油、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、および液体ポリアルキルシロキサンである。不活性な希釈液または充填剤は、スクロース、ソルビトール、糖、マンニトール、微結晶性セルロース、デンプン、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、またはリン酸ナトリウムであり得る。緩衝化剤の例としては、クエン酸、酢酸、乳酸、リン酸水素（ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ  ａｃｉｄ）、およびジエチルアミンが挙げられる。適切な懸濁剤は、例えば、天然に存在するガム（例えば、アカシア、アラビック、キサンタンおよびトラガカントガム）、セルロース（例えば、カルボキシメチル−、ヒドロキシエチル−、ヒドロキシプロピル−、およびヒドロキシプロピルメチル−セルロース）、アルギン酸塩およびキトサンである。分散剤または湿潤剤の例は天然に存在するホスファチド（例えば、レシチンまたは大豆レシチン）、脂肪鎖とのまたは長鎖脂肪族アルコールとのエチレンオキシドの縮合生成物（例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、およびポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）である。
【０１８９】
防腐剤は、処方物の安定性に影響し、かつ患者の感染を生じ得る、微生物汚染を防ぐために本出願の薬学的組成物に添加してもよい。防腐剤の適切な例としては、パラベン（例えば、メチル、エチル、プロピル、ｐ−ヒドロキシベンゾエート、ブチル、イソブチル、およびイソプロピルパラベン）、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、安息香酸、安息香酸メチル、フェノキシエタノール、ブロノポール、ボロニドックス、ＭＤＭヒダントイン、ヨードプロピニルブチルカルバメート、塩化ベンザルコニウム、セトリミド、およびベンジルアルコールが挙げられる。キレート剤の例としては、ナトリウムＥＤＴＡおよびクエン酸が挙げられる。
【０１９０】
乳化剤の例は、天然に存在するガム、天然に存在するホスファチド（例えば、大豆レシチン；ソルビタンオモオレエート誘導体）、ソルビタンエステル、モノグリセリド、脂肪アルコール、および脂肪酸エステル（例えば、脂肪酸のトリグリセリド）である。消泡剤は通常は、製造を容易にし、それらは、空気−液体の界面を不安定にすることによって泡を消し、液体が空気のポケットから排出されることを可能にする。消泡剤の例としては、シメチコン、ジメチコン、エタノールおよびエーテルが挙げられる。
【０１９１】
ゲル基剤または増粘剤の例は、流動パラフィン、ポリエチレン、脂肪油、コロイド状シリカ、またはアルミニウム、グリセロール、プロピレングリコール、カルボキシビニルポリマー、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、親水性ポリマー（例えば、デンプン、またはセルロース誘導体など）、水膨潤性親水コロイド、カラギーナン、ヒアルロン酸塩およびアルギン酸塩である。本出願の組成物での使用に適切な軟膏基剤は、疎水性であっても、または親水性であってもよく、そしてパラフィン、ラノリン、液体ポリアルキルシロキサン、セタノール、セチルパルミテート、植物油、脂肪酸のソルビタンエステル、ポリエチレングリコール、ならびに脂肪酸のソルビタンエステル、エチレンオキシド（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、およびポリソルベートの間の縮合生成物が挙げられる。
【０１９２】
保湿剤の例は、エタノール、イソプロパノールグリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール、乳酸および尿素である。適切なエモリエントとしては、コレステロールおよびグリセロールが挙げられる。皮膚保護剤の例としては、ビタミンＥ、アラトイン、グリセリン、酸化亜鉛、ビタミンおよび日焼け止めが挙げられる。
【０１９３】
ある実施形態では、本出願の組成物は、約１０、９、８、７、または６℃未満の温度、適切には約６℃未満の温度で保管される。
【０１９４】
さらなる実施形態では、本出願の組成物は、凍結乾燥またはフリーズドライされる。リポソーム凍結乾燥の技術は周知であり、例えば、Ｃｈｅｎら、（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２０１０  Ｍａｒ  １９；１４２（３）：２９９−３１１）は、フリーズドライリポソームの溶解保護（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）効果を決定する重要な要因をまとめている。
【０１９５】
本出願の組成物は一般には、意図した結果を達成するのに有効な量で、例えば、処置されている特定の状態、疾患または障害を処置または予防するために有効な量で用いられる。本出願の組成物およびリポソームを用いて被験体に投与される、亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物の用量および／または比は当業者によって容易に決定される。一実施形態では、疾患または障害を処置するためにリポソーム処方物中にカプセル化された有効量の亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物の投与は、同じ疾患または障害を処置するために、標準的な投薬計画を用いて投与される、有効量の亜塩素酸塩、塩素酸塩またはそれらの混合物と比較して約１〜約１０００倍の係数まで減少される。
【０１９６】
一実施形態では、本出願の組成物またはその処方物は、長期間にまたがって、例えば、約１分から数時間、例えば、２、３、４、６、２４時間以上にまたがって、静脈内に投与される。
【０１９７】
一実施形態では、この処置は、１日１回施される。別の実施形態では、この処置は、１日２回施される。さらに別の実施形態では、この処置は、１日に３回施される。なお別の実施形態では、この処置は、１日に４回施される。さらなる実施形態では、この処置は、１、２、３、４、５、６または７日間にわたって１日に１〜２回施される。なおさらなる実施形態では、この処置は、長期間、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２週間にわたって１日に少なくとも１回施される。なおさらなる実施形態では、この処置は、その状態が、さらなる処置が不必要に改善されるまで１日に少なくとも１回施される。別の実施形態では、この処置は、活性剤の処方性の放出をもたらし、投与の頻度は少なくてもよく、例えば、週に１回、月に１回、６カ月に１回、毎年１回、２年ごとに１回、または５年ごとに１回。別の実施形態では、この疾患または障害の持続性は、リポソーム組成物の投与後一定期間にわたって、例えば、６カ月、１年または２年の間、低減する。
【０１９８】
別の実施形態では、この処置は、週に少なくとも１回施される。別の実施形態では、この処置は、週に２回施される。なお別の実施形態では、この処置は週に３回施される。さらに別の実施形態では、この処置は週に４回施される。なお別の実施形態では、この処置は週に５回施される。さらに別の実施形態では、この処置は週に６回施される。さらなる実施形態では、この処置は、１週、２週、３週、４週、５週、６週または７週の間に１週あたり１〜６回施される。なおさらなる実施形態では、この処置は、より長期間、例えば、１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週、１１週または１２週の間に１週あたり少なくとも１回施される。なおさらなる実施形態では、この処置は、さらに処置が不要になるまで状態が改善されるまで、週に少なくとも１回施される。
【０１９９】
別の実施形態では、この処置は、インフュージョンポンプを用いて、連続、間欠または患者制御の注入として施され得る。一実施形態では、注入ポンプ（インフュージョンポンプ）を用いて、処置を静脈内に施す。
【０２００】
ＶＩ．実施例
［実施例１：スフィンゴミエリン／ＷＦ１０リポソーム調製］
２７００μｌのスフィンゴミエリン（鶏卵ＳＭ（ＭＷ  ７０３．３），Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｍａ，ＵＳＡ）溶液（２５ｍｇ／ｍＬ溶液がクロロホルム＝６７．５ｍｇ中に、０．０９５ミリモルのＳＭ）を、丸底フラスコ（通常は２５ｍＬ）に添加し、１／３をクロロホルムで満たした。その溶液をエバポレートして乾燥し、フラスコの内面上で薄い透明な可視の脂質フィルムを得る。
【０２０１】
４８００μＬのＷＦ１０（０．０９５ミリモル／４．８ｍＬ）を添加して、フラスコを、ボルテックスミキサー中で、ほぼ４５℃（脂質の相転移温度を超える）で振盪した。このボルテックスは、フィルムが見えなくなったとき停止した。この工程での脂質の再水和によって、大型の多重層ベシクル（ＬＭＶ）であるリポソームの形成が生じる。ＷＦ１０は、リポソームの両側（内側相）およびリポソームの外側（外側相）の両方にある。
【０２０２】
一次リポソームの大きさを小さくするために、混合物を繰り返し凍結して、解凍した。凍結／解凍のサイクルは１０回繰り返し、冷却材として液体窒素を用い、約３０〜４０分という全体的な期間、４５℃で、水浴中で解凍した。凍結の結果として、一次リポソームが破壊される。解凍は、相転移温度より上で行った。この場合、一次リポソームより小さいリポソームは、再度自然に形成される。全てのサンプルは、所定の温度スキーム（−１８０°／４５℃）のせいで、約２０分にわたって室温をかなり超えた．
【０２０３】
次いで、上記の混合物（約５ｍＬ）を１００ｎｍの細孔幅を有する（同じもの）ディスクフィルターを繰り返し通して押し出した。加熱ジャケットと１００ｎｍのディスクフィルターとを二重に備える（ただし単一のフィルターのみを用いることもできる）ステンレス鋼チャンバを用いた。作業温度は、ＳＭに関しては４５℃であった。加圧は、３０ｂａｒで窒素を用いて達成し、押出は、１０回繰り返し、これでは、比較的均一な直径の単層ベシクルが得られることが公知である。封入率は、約２〜３％；理論上は、７％が可能であった。
【０２０４】
押し出された混合物（外側相：ＷＦ１０，内側相：ＷＦ１０）を、３つの透析チャンバに分けた。そのチャンバを、０．９％の塩化ナトリウム溶液中に浮かべておいた。その透析チャンバは、「Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ，２０Ｋ  ＭＷＣＯ」であって、最大２０ｋＤａまでを透過する３ｍＬの最大容積を有した。リポソーム混合物（１ｍＬ）を、内側チャンバに入れて、ＮａＣｌ  ０．９％（生理食塩水、１Ｌ）が外側媒体であった。その過程を新鮮な生理食塩水を用いて４回繰り返した。リポソーム混合物の残り（透析された約５ｍＬ〜３×１ｍＬ）を、リン酸塩決定およびＤＳＣ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ  ⇒  相転移温度の決定）に用いた。
【０２０５】
透析段階の終わりに、リポソーム調製物の外相は、０．９％塩化ナトリウム溶液（＝生理食塩水）から構成された。この目的は、定量に用いられる方法の検出限界未満の外相中の亜塩素酸塩および塩素酸塩の濃度を得ることであった。これを行うことによって、リポソームの漏出挙動は、これらのイオンの再出現をモニターすることによって試験できる。
【０２０６】
［実施例２：ＰＯＰＣ／ＷＦ１０リポソームの調製］
実施例１に記載の手順、および室温（加熱ジャケットは接続しない）の押し出し工程のための作業温度を用いて、ＰＯＰＣからできており、ＷＦ１０を含んでいるリポソームを調製した。
【０２０７】
［実施例３：ＰＯＰＣ：ＰＯＰＧ／ＷＦ１０リポソーム調製］
実施例１に記載の手順、ならびに凍結／３５℃の解凍のため、および２３℃の押し出し工程のための作業温度を用いて、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−３−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）および１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＰＯＰＧ）（３：１、２：１および１：１）からできており、ＷＦ１０を含んでいるリポソームを調製した。ＰＯＰＧは、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｍａ，ＵＳＡから入手した。
【０２０８】
［実施例４：ＤＰＰＣ／ＷＦ１０リポソームの調製］
実施例１に記載の手順、および４５℃の押し出し工程のための作業温度を用いて、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）からできており、ＷＦ１０を含んでいるリポソームを調製した。ＤＰＰＣは、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｍａ，ＵＳＡから入手した。
【０２０９】
［実施例５：ＤＭＰＣ／ＷＦ１０リポソームの調製］
実施例１に記載の手順、および３０℃の押し出し工程のための作業温度を用いて、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）からできており、ＷＦ１０を含んでいるリポソームを調製した。ＤＭＰＣは、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｍａ，ＵＳＡから入手した。
【０２１０】
［実施例６：追加の調製方法］
（ａ）脂質のエバポレーション
クロロホルム中に溶解された脂質を、１００ｍＬの丸底フラスコに添加した。ほとんどの場合、脂質は既に、約２５ｍｇ／ｍＬという典型的な濃度で、溶液中で販売されていた。粉末として送達される脂質は、通常、フラスコへの添加の前に溶解され、同様の濃度になる。次いで、添加された脂質の総量を、容積で制御した。典型的な質量は、４０ｍＭのサンプルの１４ｍＬについて３００〜４００ｍｇであった。その後、フラスコを、Ｂｕｃｈｉ「Ｒｏｔａｖａｐｏｒ（商標）  Ｒ−２１０」回転エバポレーターに装着して、３７℃の水浴中で１５ｒｐｍで回転しながら排出させた。フラスコの圧力は、操作の間に約５〜１５ｍｂａｒの値まで下がった。エバポレーションは、全ての溶媒が除去され、クロロホルムの臭いがフラスコで嗅げなくなったときに、終了とみなした。この段階の結果は、ボトルの壁の上で可視の脂質フィルムであり、（脂質の量に依存して）さらに、フラスコの底でフワフワした粉末を蓄積した。
【０２１１】
（ｂ）水和
水和手順の間、脂質を水性媒体に懸濁し、これを後で、最終のリポソーム中に捕捉した。公知のとおり、このプロセスの間、多重層ベシクル（ＭＬＶ）が形成される。まず、必須の量のＷＦ１０媒体を、丸底フラスコに加えた。その容積は、所望の総サンプル溶液に等しかった（通常は約８〜１４ｍＬ）。その結果は、大きい脂質凝集物を含んでいる混濁溶液であった。次いで、水浴を、脂質の脂質相転移温度（ＰＴＴ）を５Ｋ超える温度で調製し、この間に、フラスコをわずかに振盪した。フラスコ中の温度が一旦、ＰＴＴに達すれば、懸濁物は、均一な乳白色の液体になった。ＰＴＴより上の温度で約５分後、脂質フィルムを、フラスコの壁から外して、底には脂質粉末は残らなかった。最後に、フラスコをボルテックスミキサーを用いて２〜３秒間振盪した。蒸気加熱したサンプルを直ちに、押出デバイスに通して次の調製工程を開始するか、または次の調製工程を行うまで冷蔵温度で保管した。
【０２１２】
（ｃ）押し出し
押し出し過程の間、サンプルを繰り返し、２２０ｎｍのフィルターディスクを通して絞り出した。これによって、大きいベシクルの再構成、および層が少なく小さい構造の形成が強要された。一般には、これは、単層ベシクルだが、比較的大きい細孔サイズ、例えば２２０ｎｍについて生じ、これは、やはり多重層ベシクルを得る可能性はあるが、ただしこれはわずか２〜３の層しかない。押し出し工程の前に、押し出し機には、３つ重なった２２０ｎｍのフィルターディスク（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＧＰＷＰ，直径２５ｍｍ）を装備し、ＬＰＴＴより５Ｋ上で加熱した。押し出しチャンバ中へ脂質懸濁物を充填した後、２５バールの圧力をこのチャンバに加えて、サンプルを、フィルターを通して押し出した。この圧力は、圧縮窒素で加えた。サンプルを、押し出し機の外側で収集した。まるごとの押し出しは、少なくとも１０回行った。
【０２１３】
（ｄ）透析
この段階で、リポソームは、それらの最終状態であったが、ＷＦ１０溶液中に懸濁されたままであった。外側のＷＦ１０媒体を、０．９％の生理食塩水溶液で置き換えるために、一連の連続透析工程を行った。このサンプルを最初に、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（商標）透析フレームに導入した。このフレームの膜は、２０，０００Ｄａという分子量カットオフ、および３〜１２ｍＬの容量を有する。６ｍＬより大きいサンプル容積については、サンプルを分けて、２つのこのようなフレームに分け、両方とも同じビーカーに入れた。透析設定は、磁気撹拌デバイス上に配置した０．９％の生理食塩水溶液を含む１Ｌのガラスビーカーを備えた。生理食塩水溶液は通常、脱イオン水および標準の実験用ＮａＣｌ（最低純度９９％）からできており、容積は約９００〜９５０ｍＬであった。そのフレームを、約１時間の間、透析媒体に浸し、次いでその媒体を、次の工程のための新鮮な媒体で置き換えた。典型的には、透析媒体の小さいサンプルを、通常のｏ−トルイジン分析手順と同様の「ｏ−トリジンのクイックチェック」のためにとった。サンプルが、濃い黄色を呈した場合、媒体は早期に交換した。このようなクイックチェックはまた、透析シリーズの終わりにも決定した。２つの連続透析工程が、試験の間および１時間の透析期間の後に色の視認できる変化を示さなかった時に、透析は完了したとみなした。各々の透析工程の後に、少なくとも５工程が行われるまで、透析媒体を交換した。最終工程の後、サンプルをさらに使用するために約６℃で保管した。
【０２１４】
［実施例７：亜塩素酸塩および塩素酸塩の検出のためのｏ−トリジン法］  
方法Ａ：  このｏ−トリジン方法は、２００ｍＬの水および６７ｍＬの１２Ｍの塩酸の混合物中の１５５ｍｇのｏ−トリジンの５０μｌの溶液を２００μＬの過剰の媒体に添加した。この混合物を２回調製した。それぞれ、２５０μＬの４．８Ｍまたは１２Ｍの塩酸を、添加して、その混合物を５〜１０分間インキュベートした。低濃度の塩酸を用いて、亜塩素酸塩のみの検出を可能にしたが、高濃度を用いれば、さらに、塩素酸塩の検出が可能になった。試験溶液の吸収は、それぞれ４４２ｎｍ（４．８ＭのＨＣｌ）または４４５ｎｍ（１２ＭのＨＣｌ）で測定した。較正曲線は、未処理のＷＦ１０から調製した標準希釈液を用いて確立した。
【０２１５】
方法Ｂ：  方法Ｂは、亜塩素酸塩および塩素酸塩の両方の検出を可能にするという点で方法Ａの改善である。この方法は、１１４ｍｇのｏ−トリジンを１５０ｍＬの水に溶解すること、および５０ｍＬの塩酸（３７％）を添加して、ｏ−トリジン溶液を調製することを包含する。ｏ−トリジン溶液は、最初の適用の少なくとも２４時間前に調製し、２〜３ヵ月間６℃で保管してもよい。分析混合物の調製の直後に生じる漂白の影響を回避するために、分析手順の開始後、全てのサンプルを同時に測定するように注意を払った。分析スキームは、最大９６個のサンプルを同時に分析するように設計し、時間は、それらの能力を保証するように選択した。分析手順の開始の際に、分析すべき４００μＬのサンプルを、標準の２ｍＬの反応容器に充填した。ｔ０の時点で、１００μＬのｏ−トリジン溶液を各々の反応容器に添加した。１０分後（ｔ０＋１０分）、５００μＬの塩酸（３７％）を添加した。さらに１０分後（ｔ０＋２０分）、各々の容器由来の２００μＬのサンプルを、４４７ｎｍの波長での吸光度測定のために標準の９６ウェルプレートに移した。それらの測定は、ＴＥＣＡＮ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  ２００ＰＲＯ（商標）マイクロプレートリーダーで行い、１５分後（ｔ０＋３５分）に開始した。
【０２１６】
計算では、保管媒体中のＷＦ１０の濃度は、逆希釈係数ｄで表した。この量は、保管媒体の容積あたり未希釈のＷＦ１０の容積に相当した。従って、これは、未希釈のＷＦ１０についてはｄ＝１で大きさなしであった。
【０２１７】
特定の逆希釈係数に対して測定した吸光度値を関連付けるために、ＷＦ１０希釈曲線を記録した。その曲線は、図１に示す。このデータによって、約６×１０−５を超えるｄの値についての強力な一次従属が示され、対応する式
ｄ（Ａ）＝ｍＡ＋ｎ  （１）
のパラメーターは、ｍ＝（３．８７±０．０２）×１０−４およびｎ＝（７±２）×１０−６であることが判明した。述べた値未満の濃度についての非線形ドメインは、以下の式
ｄ（Ａ）＝α│Ａ−Ａ０│Ｐ  （２）
を用いてフィットされた。
【０２１８】
ここで、Ａ０＝０．０７８７±０．０００７，α＝（３．３６±０：０５）×１０−４であり、かつｐ＝０．６３１±０．００９であった。両方の場合とも、フィットは、データポイントの不確実性に対して重み付けされた。吸光度値の比較的大きい不確実性を考慮するために、逆のデータセットに対するヒットを、逆関数を用いて同様に行った。示されたパラメーターは、両方の結果についての算術平均であった。
【０２１９】
保管媒体中で決定された逆ＷＦ１０希釈係数ｄから、リポソーム内部から放出されたＷＦ１０の量であるｘＷＦ１０を算出した。サンプルの容積Ｖｓａｍｐｌｅ、および保管媒体Ｖｓｔｏｒａｇｅの容積を考慮して、ｄの値を、以下の式を用いて算出した
【０２２０】
【数１】
2015502400.tif 000007
【０２２１】
当然ながら、これは、漏出した物質がサンプル媒体および保管媒体と完全に混合された後にのみ成り立つ。実験によって、これは、適切な設定が選択された場合は、比較的短時間で生じたことが示される。漏出した物質が、実験の設定から取り出された場合に、問題が生じ、これは、保管媒体の画分が分析のために採取されるとき、常に生じる。しかし、この抜き取りを考慮するために、全ての事前の測定を、現行の希釈係数の算出において考慮する必要がある。このようなインプリシットな決定において、全ての誤差および不確実性は、あらゆる新しい濃度決定とともに蓄積し、その結果、単一の悪いデータポイントが、実験の全ての引き続く測定を変更する。従って、エクスプリシットなアプローチを用いて、ここでは、現行の分析工程のｄおよびＶｓｔｏｒａｇｅのみを考慮して、前の分析工程で抜き取った物質は無視した。しかし、無視できた最大の可能な量を、不確実性に加えた。インプリシットな方法由来のこの単純なエクスプリシットなアプローチの偏差は、通常、他の要因から生じる不確実性と比較して小さかった。それにもかかわらず、あらゆる評価プロセスの経過における別の計算を行って、各々の場合について別々に使用方法を変更する。
【０２２２】
方法Ｃ：  この方法は、亜塩素酸塩の検出は可能にするが、塩素酸塩はできないという意味で、方法Ａの別の改善である。ｏ−トリジン溶液を、その適用の前に少なくとも２４時間調製した。暗所で、６℃で保管して、これは数か月安定であった。最初に、一次ＨＣｌ溶液を、５０ｍＬの濃縮（３７％）塩酸を１５０ｍＬのＨ２Ｏ（高純水をこの段階では用いた）に添加することによって調製した。次に、５８ｍｇのｏ−トリジン（二塩酸塩，Ｈ２Ｏ含量１．５ｍｏｌ／ｍｏｌ、２８５．２ｇ／ｍｏｌ，ＳＩＧＭＡ  Ｐｒｏｄ．Ｎｏ．：Ｔ−６２６９）を、１００ｍＬ測定のフラスコに、一時的ＨＣｌ−溶液を用いてフラッシュした。そのフラスコを完全に濾過した（１００ｍＬ）。この溶液を振盪した後、褐色のガラス瓶に充填した。２４時間後、その溶液は無色で、ある程度の沈殿がフラスコの底で見られた。
【０２２３】
４．８Ｍの塩酸を、測定の直前に調製した。これは、４０ｍＬの濃塩酸（３７％）を６０ｍＬのＨ２Ｏに添加することによって調製した。
【０２２４】
この反応は、吸光度測定によって検出できるサンプルの色の変化を生じる。しかし、退色は、反応発生後ただちに開始し、その結果、この手順では時間が重要なパラメーターである。最大９６個のサンプルの分析を一度に可能とする時間スケジュールに従った。開始時点で、各々４００μＬのサンプルを、１．５ｍＬの反応容器に充填した。その後で、１００μＬのｏ−トリジン溶液をこの容器に添加した。ｏ−トリジン添加開始１５分後、５００μＬの４．８Ｍの塩酸を各々の容器に加えた。次いで、３５０μＬの各々のサンプルを反応容器から、透明な９６ウェルプレート（カバーなし）の空洞に移した。さらに２５分後、サンプルの光度計測定を、４４２ｎｍの吸光度を記録することによって開始した。
【０２２５】
記録された吸光度値を、同じ条件下で記録した公知の濃度の標準曲線と比較した。亜塩素酸塩濃度の吸光度の依存性は、２μＭ〜６０μＭの亜塩素酸塩濃度について直線である。
【０２２６】
漏出モニタリング
全ての漏出モニタリング実験の基本的な目的は、リポソームの内側から放出された物質の検出であった。このような実験の一般的なアプローチは、実施例６（ｄ）に記載の透析手順と同様であった。サンプル中のリポソームから放出された物質は、周囲のサンプル媒体に通過して、透析膜を容易に通過可能であり、その結果、透析フレーム周囲の保管媒体は、漏出した物質を特定の濃度で含んだ。漏出した亜塩素酸塩／塩素酸塩については、上記のｏ−トリジン方法を用いて、漏出を定量的にまたは定性的に決定する。この濃度から、下に記載の計算を用いて、漏出した物質の総量を決定できた。この濃度は、保管溶液の容積の増大につれて低下し、従って、保管溶液は、比較的小さくなるように選択されたことが明らかである。しかし、漏出された物質の濃度を決定するために、１ｍＬの保管媒体が、典型的には、必要であり、従って、少なくとも１０または２０ミリリットルの保管容積が所望された。
【０２２７】
［実施例８：実施例１〜５由来のリポソームの安定性］
リポソームが調製された後、サンプルを、透析フレーム中に残し、次にこれを保管のために１２０ｍＬの生理食塩水溶液中に入れた。１〜３日の間隔で、１ｍＬの過剰の媒体を採取して、ｏ−トリジン方法Ａを用いて分析した（実施例７）。
【０２２８】
漏出は、全ての温度（５℃、２３℃および３７℃）でＰＯＰＣリポソームから検出した（図２を参照のこと）。ＳＭリポソームの場合、漏出は、３７℃でのみ検出された（図３を参照のこと）。さらなる漏出実験を、ＰＯＰＣ／ＰＯＰＧリポソーム、および純粋なＤＭＰＣリポソームで行った。ＰＯＰＣ／ＰＯＰＧ混合物（３：１、２：１および１：１）は、純粋なＰＯＰＣサンプルと同様に挙動して、短時間後に完全な漏出を示した（それぞれ、図４、５および６を参照のこと）。ＤＭＰＣは、５℃および２３℃で保管したサンプルから１、５および７日にとった分光計の読み取りで示されるように、その相転移温度（２３℃）付近で漏出した（図７を参照のこと）。
【０２２９】
さらに、ＳＭ実験を繰り返して、上記されるのと同じ結果を得た（図８を参照のこと）。実験の終わりに、全てのサンプルを、３７℃において、イオンの漏出をモニターした。３７℃に置いた後に、大きい漏出が約２時間で開始し、３７℃に置いた後４時間で完了したことが見出された。
【０２３０】
［実施例９：ＤＰＰＣ、ＤＰＰＣ／ＤＭＰＣ、Ｓ＿ＰＣ３およびＳ＿ＰＣ３／ＤＭＰＣ  ＷＦ１０リポソームの調製］  
実施例１に記載の手順の変化版を用いて（凍結／解凍工程は省略；２２０ｎｍの細孔サイズの膜）、リポソームは、ＤＰＰＣ、ＤＰＰＣ／ＤＭＰＣ、水素添加大豆リン脂質（Ｓ＿ＰＣ３）およびＳ＿ＰＣ３／ＤＭＰＣからできていた。成分および押し出し温度を、表２に示す。ＤＰＰＣは、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｍａ，ＵＳＡから入手したが、Ｓ＿ＰＣ３およびＤＭＰＣは、ＬＩＰＯＩＤ  ＡＧから入手した。
【０２３１】
漏出は、ＤＰＰＣについて４１℃という相転移温度でＤＰＰＣリポソームから検出された（図９を参照のこと）。ＤＰＰＣの相転移温度（４１℃）より３℃下の３８℃で、リポソームはタイトであった。ＤＰＰＣ：ＤＭＰＣの９：１は、ＤＰＰＣについての相転移温度（ＰＴＴ）より下の３８℃で漏出した。さらなる漏出実験を、Ｓ＿ＰＣ３リポソーム、およびＳ＿ＰＣ３：ＤＭＰＣで、３：５で行い、漏出は、Ｓ＿ＰＣ３リポソームから６０℃で検出された（表２）。
【０２３２】
［実施例１０：あり得る分解生成物を見出すためのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ測定］  
調製および実験−サンプル
３つのサンプルを、実施例６に記載の方法を用いて調製した。全てのサンプルについて、１，２−ジアパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）を用いた。このサンプルを、以下のように命名した：
ＳＸ１２３：通常のＷＦ１０
ＳＸ１２４：ＰＢＳで緩衝化したＷＦ１０
ＳＸ１２５：タウリンで緩衝化したＷＦ１０
【０２３３】
ＳＸ１２３：
９：２ｍＬの２５ｍｇ／ｍＬ  ＤＰＰＣ−クロロホルム溶液を、丸底フラスコに添加した。これは、２３３ｍｇの脂質重量に相当する。ＤＰＰＣは、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓから購入した（製品番号：８５０３５５Ｃ）。水和は、ＯＸＯ−Ｋ９９３  ２５．０３ｇ（ＯＸＯ−Ｋ９９３が２５０ｍＬ溶液の中）から調製した７．９２ｍＬのＷＦ１０で行った。水和過程の間、サンプルを４６℃で５分間加熱した。押出は、５０℃で行い、１９分続けた。１０回連続の通過を行った。サンプルを冷蔵庫で、６℃で一晩保管した。透析工程は、５０００ｍＬの溶液あたり４５：００１ｇのＮａＣｌで調製した９００ｍＬの生理食塩水溶液で行った。２２、４０、４７、６１および７１分におよぶ５連続工程を行い、６番目の工程は、６℃の冷蔵庫で一晩行った。
【０２３４】
ＳＸ１２４
「ＷＦ１０／ＰＢＳ」の調製：１０ｇのＯＸＯ−Ｋ９９３を、注射用水（ＷＦＩ）を用いて８０ｇに希釈した。ｐＨは、リン酸二水素ナトリウム一水和物（４．３１ｇ／２５ｍＬ）の水溶液を添加することによって、７．３６のｐＨに調節した。この混合物は、ＷＦＩを用いて１００ｇにして、塩素イオン、亜塩素酸塩、塩素酸塩および硫酸塩を、ＷＦ１０中に存在する濃度に含んだ。
【０２３５】
９．２ｍＬの２５ｍｇ／ｍＬのＤＰＰＣ−クロロホルム溶液を、丸底フラスコに添加した。これは、２３３ｍｇの脂質重量に相当する。ＤＰＰＣは、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓから購入した（製品番号：８５０３５５Ｃ）。水和は、７．９２ｍＬのＷＦ１０／ＰＢＳで行った（使用時ｐＨ７．６３）。水和過程の間、サンプルを５０℃まで２分間加熱した。押し出しは、５０℃で行い、７分続け、連続通過を行った。サンプルを、冷蔵庫中で、６℃で一晩保管した。透析工程は、５０００ｍＬの溶液あたり４５．００１ｇのＮａＣｌを用いて調製した、９００ｍＬの生理食塩水溶液で行った。２２、４０、４７、６１および７１分におよぶ５連続工程を行い、６番目の工程は、６℃の冷蔵庫で一晩行った。
【０２３６】
ＳＸ１２５
「ＷＦ１０／タウリン」の調製：１０ｇのＯＸＯ−Ｋ９９３を、ＷＦＩを用いて８０ｇまで希釈した。ｐＨは、タウリンの水溶液（３．９１ｇ／５０ｍＬ）を用いて８．４９付近のｐＨに調節した。この混合物は、ＷＦＩを用いて１００ｇにして、塩素イオン、亜塩素酸塩、塩素酸塩および硫酸塩を、ＷＦ１０中に存在する濃度に含んだ。
【０２３７】
９．２ｍＬの２５ｍｇ／ｍＬのＤＰＰＣ−クロロホルム溶液を、丸底フラスコに添加した。これは、２３３ｍｇの脂質重量に相当する。ＤＰＰＣは、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓから購入した（製品番号：８５０３５５Ｃ）。水和は、７．９２ｍＬのＷＦ１０／タウリンで行った（使用時ｐＨ８．４７）。水和過程の間、サンプルを５０℃まで４分間加熱した。押し出しは、５０℃で行い、７分続け、１０連続通過を行った。その後に、サンプルを、冷蔵庫中で、６℃で一晩保管した。透析工程は、５０００ｍＬの溶液あたり４４．９９８ｇのＮａＣｌを用いて調製した９００ｍＬの生理食塩水溶液で行った。２２、４０、４７、６１および７１分におよぶ５連続工程を行い、６番目の工程は、６℃の冷蔵庫で一晩行った。
【０２３８】
保管実験
２０１１年１２月１６日に、サンプルを、透析フレームから取り出して、２０１１年１２月１９日まで６℃で保管した。この日に、２ｍＬの各々のサンプルを、別の容器中に６℃で保管するために取り出した。別の２ｍＬを同じ方法で、室温（約２２℃）で保管した。サンプルの残りを異なる目的に用いた。２０１１年１２月１９日、２０１２年１月６日、および２０１２年２月１日に、０．２ｍＬのサンプルを、各々の容器から取り出して、後のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ測定のために−８０℃の冷蔵庫中に置いた。
【０２３９】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ
全部で１８のサンプルを、以下の手順を用いて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ測定のために調製した（３サンプル種類、各々は２つの温度で、３つの異なる日の全てで保管した）：
サンプルを、５６０μＬの０．９％生理食塩水溶液および４０μＬのもとのサンプルを用いて調製前に希釈して、−８０℃で保管した。その後に、脂質抽出手順に従った。従って、１００μＬの事前希釈サンプルを、２００μＬのクロロホルム／メタノール−混合物（１：１）と混合した。次いで、得られた混合物を、８００ｇで５分間遠心分離して、可視の相分離を得る。５０μＬの低い方の相をさらなる調製のために採取した。この容積に、３．７μＬの２５ｍｇ／ｍＬのＤＭＰＣ−クロロホルム溶液および２．５μＬの２５ｍｇ／ｍＬの１４：０−Ｌｙｓｏ  ＰＣ−クロロホルム溶液を標準として添加した。その後に、全ての溶媒を真空遠心分離中で除去した。次いで、１００μＬのＤＨＢ−Ｍａｔｒｉｘ（１５６ｍｇのジヒドロキシ安息香酸，１９９８μＬ，２μＬトリフルオロ酢酸）および１００μＬのクロロホルムを、エバポレートされたサンプルに添加した、最後に、１μＬの調製されたサンプルを、温かい空気の流れの下で金コーティング標的上に置いた。
【０２４０】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ測定は、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｒｏｎｉｃｓ，Ｌｅｉｐｚｉｇによって、ａｕｔｏｆｌｅｘ  ＬＲＦ  ＭＳ分光計で行った。
【０２４１】
結果および考察
１８の例全てにおいて、記録されたスペクトルは、リゾ（ｌｙｓｏ）生成物の兆候を全く示さなかった。「リゾ（ｌｙｓｏ）」という用語は、リン脂質を指して用いられ、ここでは、２つのＯ−アシル鎖のうちの１つが、除去された。２つの追加された標準のシグナルおよびリポソーム調製物に用いられる脂質は、明らかに同一であった。他のシグナルは、スペクトルでは見出されなかった。
【０２４２】
従って、加水分解および／または他の分解過程は、６℃でも室温でも、通常のＷＦ１０の高いｐＨでも、または別の緩衝化バージョンの低いｐＨ値でも生じなかった。
【０２４３】
［実施例１１：ＤＰＰＣおよびＤＰＰＣ／ＤＭＰＣリポソームに対する長期安定性試験］
サンプル
６つのリポソームサンプルをアッセイした。最初の３つのサンプルは、実施例１０に記載のように調製されたＤＰＰＣベースのリポソームサンプルＳＸ１２３、ＳＸ１２４およびＳＸ１２５であった。残りの３つのサンプル（サンプルＳＸ１３０、ＳＸ１３１およびＳＸ１３２）は、下に記載のように、ＤＰＰＣおよびＤＭＰＣの９：１（モル比）混合物で調製されたリポソームを含んだ。
【０２４４】
ＳＸ１３０：通常のＷＦ１０
３．１４ｍＬの８４．３ｍｇ／ｍＬのＤＰＰＣ−クロロホルム溶液および２．００ｍＬの１３．４ｍｇ／ｍＬのＤＭＰＣ−クロロホルム溶液を、丸底フラスコに添加した。これは、それぞれ、２６４ｍｇおよび２７ｍｇの脂質重量に相当する。水和は、１０．００ｍＬのＷＦ１０で行われた。水和過程の間、サンプルを４６±１℃で４分間加熱した。１０連続の押し出し通過は、４６±１℃に従い、全部で２０分持続した。その後にサンプルを冷蔵庫中で、６℃で一晩保管した。透析工程は、５０００ｍＬの溶液あたり４５．００８ｇで調製した、９００ｍＬの生理食塩水溶液中で行った。４６、６５、７５および１７４分におよぶ４連続工程を行い、５番目の工程は、一晩行った。
【０２４５】
ＳＸ１３１：タウリンで緩衝化したＷＦ１０
３．１４ｍＬの８４．３ｍｇ／ｍＬのＤＰＰＣ−クロロホルム溶液および２．００ｍＬの１３．４ｍｇ／ｍＬ  ＤＭＰＣ−クロロホルム溶液を、丸底フラスコに添加した。これは、それぞれ、２６４ｍｇおよび２７ｍｇの脂質重量に相当する。水和は、１０．００ｍＬのタウリン緩衝化ＷＦ１０で行った。水和過程の間、サンプルを４６℃まで４分間加熱した。１０連続の押し出し通過は４６℃にして、全部で１３分続けた。その後に、サンプルを、冷蔵庫の中で、６℃で一晩保管した。透析工程は、５０００ｍＬの溶液あたり４５．０１０ｇのＮａＣｌで調製した、９００ｍＬの生理食塩水溶液中で行った。４６、６５、７５および１７４分続く、４回の引き続く工程を行い、５番目の工程を一晩行った。
【０２４６】
ＳＸ１３２：ＰＢＳで緩衝化したＷＦ１０
３．１４ｍＬの８４．３ｍｇ／ｍＬのＤＰＰＣ−クロロホルム溶液および２．００ｍＬの１３．４ｍｇ／ｍＬのＤＭＰＣ−クロロホルム溶液を、丸底フラスコに添加した。これは、それぞれ、２６４ｍｇおよび２７ｍｇの脂質重量に相当する。水和は、実施例１０で記載されるように調製した、１０．００ｍＬのＰＢＳ緩衝化ＷＦ１０で行った。水和過程の間、サンプルを４６℃まで４分間加熱した。１０連続の押し出し通過は４６℃にして、全部で１１分続けた。その後に、サンプルを、冷蔵庫の中で、６℃で一晩保管した。透析工程は、５０００ｍＬの溶液あたり４５．０１５ｇのＮａＣｌで調製した、９００ｍＬの生理食塩水溶液中で行った。４６、６５、７５および１７４分続く４回の引き続く工程を行い、５番目の工程を一晩行った。
【０２４７】
長期安定性（ＬＴＳ）実験
ＬＴＳ実験を確立して、数週間または数か月にわたってリポソーム漏出をモニターした。従って、この設定は、並行して行う多重の実験を可能にするような方法で設計した。この目的のために、透析フレームを完全に浸すのに比較的小容積の貯蔵媒体が必要であるように、ほぼ（７５×１１０×２５）ｍｍ３という寸法の市販のゲル染色トレイを用いた。目的の適切な条件下でトレイを保管したまま、トレイを緊密にシールするためにカバーを備えた。通常のＬＴＳ設定は、貯蔵媒体として１２０ｍＬの０．９％生理食塩水溶液中に浸漬した１ｍＬのサンプルを含んでいるＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（商標）透析フレームを備えた。この透析フレームは、透析の間に用いられるものと同様である（実施例６（ｄ））が、わずか０．５〜３．０ｍＬの容量しか有さない。
【０２４８】
貯蔵実験
透析手順の後、サンプルを、透析フレームから取り出して、６℃で一晩保管した。ＬＴＳ実験は、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，０．５〜３．０ｍＬ，２０Ｋ  ＭＷＣＯ）および１２０ｍＬの０．９％生理食塩水溶液を標準のポリプロピレンゲル染色トレイ中で用いて、上記のとおり準備した。各々のサンプルについては、各々が１ｍＬのサンプル容積を有する、４つの別々のＬＴＳ設定を準備した。それらの設定のうち２つ、これらは室温で保管し、一方で他の２つは６℃で冷蔵庫中に置いた。他の媒体中でのＷＦ１０濃度を、従って、リポソームから漏出した、塩素酸塩および亜塩素酸塩の量を分析するために、４００μＬの外側生理食塩水媒体を、実施例７の方法Ｂに記載のように、ｏ−トリジン方法でのさらなる分析のために取り出した。以下の表は、分析サンプルを取り出した日を示す。
【０２４９】
【表１】
2015502400.tif 000008
【０２５０】
評価
記録した吸光度データの評価は、吸光度のＷＦ１０希釈係数への変換に関して、実施例７、方法Ｂに記載の手順に従って行った。提示の目的のために、ＷＦ１０希釈係数を、さらに都合の良い量に変換した。総サンプルの容積画分としての漏出されたＷＦ１０の量。従って、１ｍＬのサンプル中の２％漏出という値は、全部で２０μＬのＷＦ１０が、リポソーム内側から放出されたことを意味する。この検出および定量の限界は、下の小区分で規定する。貯蔵容積から生じる不確実性についての考察も下に示される。
【０２５１】
検出限界（ＬＯＤ）
測定値は、検出の限界と規定された。この値は、媒体中の亜塩素酸塩／塩素酸塩  ＷＦ１０の存在が変化するとみなすことができる値より上であるように規定される。ゼロ値の不確実性の範囲をわずかに上回る０．０９５という吸光度値を用いた。このエクスプリシット値は、実施例７、方法Ｂによって行われる測定のためにのみ有効である。
【０２５２】
定量限界
サンプル溶液の画分として漏出されたＷＦ１０の量を算出する場合、ＬＯＤに近い処理データポイントは、不確実性を伴う結果を生じる場合が多い。従って、第二の限界（定量限界（ＬＯＱ））を規定し、これは、最終の結果の算出に寄与する全てのパラメーター（例えば、サンプルおよび外側透析媒体の容積）を考慮した。これらのパラメーターは、実験全体にわたって一定に保持され、従って、単一のＬＯＱを生じ、これは、最終結果の全体の相対的な不確実性が、その値の５０％未満におさまるポイントを示す。本研究では、サンプル容積の０．６１容積％に等しい、漏出したＷＦ１０の量をＬＯＱと規定した。
【０２５３】
結果
全ての結果を、図１０の概観的なバーチャートにまとめる。
【０２５４】
６℃で保管したサンプル
冷蔵庫のサンプルは、全部でＤＰＰＣリポソームについては２００日、およびＤＰＰＣ／ＤＭＰＣリポソームについては１２１日保管した。両方のリポソーム種類とも、亜塩素酸塩／塩素酸塩は、保管媒体中では検出されなかった。
【０２５５】
室温のサンプル
室温サンプルは、全部でＤＰＰＣリポソームについては１５８日間およびＤＰＰＣ／ＤＭＰＣリポソームについては７９日間保管した。全ての場合において、亜塩素酸塩／塩素酸塩が、保管媒体中では検出され、経時的に連続して増大した。
【０２５６】
ＤＰＰＣリポソーム
この結果は、それぞれ、ＳＸ１２３、ＳＸ１２４およびＳＸ１２５について少なくとも１０１、２８および７９日間ＬＯＤの下で維持された。第二測定と第三測定（２８日および７９日）との間の期間は、比較的長く、その結果、ＳＸ１２４は、この期間にＬＯＤを越え、同様にＬＯＱも超えた。ＳＸ１２３は決してＬＯＱを超えることはなかったが、ＳＸ１２５は、貯蔵の７７日目と１０１日目との間で超えた。
【０２５７】
ＤＰＰＣ／ＤＭＰＣリポソーム
純粋なＷＦ１０カプセル化リポソーム（ＳＸ１３０）についての結果は、少なくとも５１日間ＬＯＤより下に維持された。読み取りは、決してＬＯＱを越えなかった。ＳＸ１３２（ＰＢＳ）およびＳＸ１３１（タウリン）については、ＬＯＤは、２２日と５１日との間で超えて、続いて、５１日と７９日との間のＬＯＱのオーバーランが続いた。
【０２５８】
考察および結論
これらのＬＴＳ実験によって、ＷＦ１０リポソームの長期挙動の概要を得ること、および少なくとも２００日間にわたって有意な漏出なしに６℃でＤＰＰＣリポソームが保管できることを示すことが可能になった。同じことが、１２１日間にＤＰＰＣ／ＤＭＰＣリポソームについても当てはまった。室温では、サンプルは、８０日後に漏出を呈した。
【０２５９】
［実施例１２：ＤＰＰＣリポソームの漏出挙動の特徴付け］
脂質相転移温度（ＬＰＴＴ）は、リポソームカプセル化された材料が長期保存される場合の考慮事項である。この温度に関する漏出過程についての情報は、亜塩素酸塩および／または塩素酸塩をカプセル化するための処方物を設計する場合に有用である。この実施例では、純粋なＤＰＰＣリポソームに対する漏出研究の結果を記録する。
【０２６０】
調製および実験
サンプル
２つの同様のサンプルを、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンから、実施例６に記載の調製手順に従って調製した。このサンプルは、ＳＸ１２２およびＳＸ１２６であり、かつ約４０ｍＭという脂質濃度を有する。詳細なパラメーターは以下に示す。
【０２６１】
ＳＸ１２２
１２．０ｍＬの２５ｍｇ／ｍＬのＤＰＰＣ−クロロホルム溶液を丸底フラスコに添加した。これは、３００ｍｇという脂質重量に相当する。ＤＰＰＣは、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓから購入した（製品番号：８５０３５５Ｃ）。水和は、ＯＸＯ−Ｋ９９３  ２５．０３ｇ（ＯＸＯ−Ｋ９９３が２５０ｍＬ溶液の中）から調製した１０．２２ｍＬのＷＦ１０で行った。水和過程の間、サンプルは４２℃へ５分間加熱した。押出は、４５．４℃で行い、２０分続けた。１０連続の通過を行い、そのサンプルを冷蔵庫中で、６℃で保管した。透析工程は、５０００ｍＬの溶液あたり４５．００４ｇのＮａＣｌで調製した、９００ｍＬの生理食塩水溶液中で行った。７４、７３、３８、３９および６９分続く５回の引き続く工程を行った。その後に、サンプルを後の使用のために６℃で保管した。
【０２６２】
ＳＸ１２６
１４ｍＬの２５ｍｇ／ｍＬのＤＰＰＣ−クロロホルム溶液を、丸底フラスコに添加した。これは、３５０ｍｇの脂質質量に相当する。ＤＰＰＣは、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓから購入した（製品番号：８５０３５５Ｃ）。水和は、ＯＸＯ−Ｋ９９３  ２５．０３ｇ（ＯＸＯ−Ｋ９９３が２５０ｍＬ溶液の中）から調製した１１．９ｍＬのＷＦ１０で行った。ＯＫＯ−Ｋ９９３は、Ｎｕｖｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＧｍｂＨから入手した。水和過程の間、サンプルは４６±３へ４分間加熱した。押出は、４６±１℃で行い、１２分続けた。１０連続の通過を行った。その後、サンプルを、週末をまたいで冷蔵庫中で、６℃で保管した。透析工程は、５０００ｍＬの溶液あたり４５．０８ｇのＮａＣｌから調製した、９００ｍＬの生理食塩水溶液（０．９％）中で行った。７８、６８、６８、８５および５１分続く５回の引き続く工程を行った。その後に、サンプルを後の使用のために６℃で保管した。
【０２６３】
ＨＲＬ実験
ＨＲＬ実験では、２〜３時間から最大で２〜３日間の範囲にまたがってリポソーム漏出をモニターするように設計した。５分を超える時間分解能で漏出挙動の変化が理解できた。さらに、目的の温度は、０．１Ｋの工程で室温から６０℃の間で正確に調節できた。
【０２６４】
ＨＲＬ設定は、温度の正確な制御、および保管媒体を撹拌する能力を含んだ。保管容器として、５００ｍＬメスシリンダーを用いて、保管媒体として２００ｍＬの０．９％生理食塩水溶液を満たした。サンプルを、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（商標）透析フレームに導入して、ＬＴＳ設定（実施例１１）で行ったように行い、次にこれを保管溶液中に浸漬した。このフレームを、透析の間にこれも行われたとおり、泡状オートブイ（ｆｏａｍ  ｏａｔ  ｂｕｏｙ）で保持した。磁気スターラーは、保管溶液を一定して撹拌した。メスシリンダーを、Ｊｕｌａｂｏ  Ｕ３／Ｂの熱浴に入れて、これによって、温度を、約０．１Ｋという正確性で１２時間未満の期間、および０．３Ｋという正確性で１２時間を超える期間、制御した。温度は、約０．１Ｋという正確性の公式に較正したサーモメーターでモニターした。この設定によって、別々の保管シリンダー中の２つのサンプルのモニタリングが可能になった。通常は、２つの同一のサンプルを観察して、信頼できるデータを得た。
【０２６５】
以下のＨＲＬ実験を行った：
【０２６６】
【表２】
2015502400.tif 000009
【０２６７】
結果および考察
実験の結果を、図１１〜１５に示す。ここで、ＷＦ１０の漏出された量を、実験の開始から経過した時間に対してプロットする。また、この温度は、右側のｙ軸上にも示す。漏出されたＷＦ１０の量を、総サンプル容積の画分として示し、すなわち、１ｍＬのサンプルについての２％という値は、例えば、サンプルのリポソームからの全体で２０μＬの放出に相当する。
【０２６８】
前に述べたとおり、あらゆる実験は、通常、２つの別の同一のサンプルを同時に用いて行った。このサンプルは、グラフでは、「サンプルＡ」および「サンプルＢ」と呼ぶ。
【０２６９】
３９℃での漏出開始
２〜３時間のスケールでは、３８℃を超える温度で有意な漏出が開始する。図１１は、温度スキャンの結果を示す。温度は、３８℃で約３時間、外側媒体中のＷＦ１０の濃度の測定可能な変化なしで保持した。次に、温度を１Ｋずつ上昇して、わずか２〜３分内でリポソームからＷＦ１０の漏出を誘導した。約５０℃へのさらなる加熱によって漏出の速度が増大した。
【０２７０】
しかし、図１２は、５日間にまたがる３８℃でのＨＲＬ実験の結果を示しており、これは、約２．５％という総サンプル容積のわずかな漏出を示す。このサンプルの最大能力（ＳＸ１２２）は８〜９％の範囲であって、その結果、封入された量のわずか三分の一しかこの時点で放出されなかった。
【０２７１】
３９℃での部分的な漏出
図１３は、３９℃でのＨＲＬ実験を示す。これによって、ＷＦ１０は、総サンプル容積のうち約２％という容積で約４時間後に放出されたことが理解できた。さらに、漏出は、３９℃で一晩おいておいた実験設定の後でさえ、出現しなかった。さらなる加熱後にのみ、サンプル容積のうち約６〜７％の容積が放出されるまで、封入されたＷＦ１０の漏出が残った。
【０２７２】
３９℃を超えての漏出
図１４および図１５は、それぞれ４０℃および４１℃でのＨＲＬ実験の結果を図示する。封入された物質の全量は、約４時間の期間にわたって放出された。
【０２７３】
封入された容積
ＳＸ１２２中のリポソームによって封入される容積は、サンプル容積の約８〜９％であることが見出された。ＳＸ１２６については、これは６〜７％であって、従って、低かった。サンプルが、ほぼ同一のパラメーターで同じ調製手順を通された場合でさえ、相違は無視できなかった。
【０２７４】
安定性
両方のサンプルについて、調製と最後の実験との間の期間は、約１か月であって、その間に、漏出は、６℃の保管容器中では生じなかった。従って、ＤＰＰＣリポソームは、一定の冷却下で少なくとも一か月間安定であると結論できる。
【０２７５】
［実施例１３：４週の安定性研究］
（ａ）溶液の製造および特徴付け
【０２７６】
【表３】
2015502400.tif 000010
【０２７７】
浸透圧ストレスの考慮
理想的でない挙動のせいで、塩溶液の「実際の」（実験の）浸透圧は、必要な正確性ではモル濃度から算出できない。従って、溶液の浸透圧（オスモル濃度）の実験値は、約−５〜−１０％ずつ理論値（オスモル濃度）から逸脱すると予想される。生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム）のオスモル濃度について報告される典型的な理論値は、３０８ｍｏｓｍｏｌ／Ｌである。これは、３１０．８ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇのオスモル濃度に相当するはずである。これは、「実際の」値であることが通常仮定される。
【０２７８】
ＷＦ１０の特定のオスモル濃度は、実験値として２９０〜３３０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇである（平均：３１０）。これは、みかけ上、生理食塩水の値に適合し、３０８ｍｏｓｍｏｌ／Ｌ（オスモル濃度）または３１０．８ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ（オスモル濃度）である。しかし、生理食塩水について、実際の値は、２８７ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ（２９０；２８７；２８４から平均）であることが実験的に確認された。
【０２７９】
浸透圧ストレスを回避するために、製造すべき溶液のオスモル濃度を、理想的なＷＦ１０の値（３１０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇであった）に近くなるように設計して、生理食塩水の値（２８７ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇである）からの相違を最小にするようにした。これは、過度の実験作業によってのみ可能になった。
【０２８０】
サンプル１：  亜塩素酸塩なしの等張性ＷＦ１０（このサンプルで呼ばれるＴＣＤＯは、ＯＸＯ−Ｋ９９３であったことに注意）
【０２８１】
【表４】
2015502400.tif 000011
【０２８２】
７．８４ｇのｙＴＣＤＯを、注射用水に希釈して、５０．０ｍＬの最終容積にした。
【０２８３】
サンプル２：  塩素酸塩なしの等張性ＷＦ１０（このサンプル中で呼ばれるＴＣＤＯはＯＸＯ−Ｋ９９３であったことに注意）
【０２８４】
【表５】
2015502400.tif 000012
【０２８５】
５．４４ｇのｚＴＣＤＯを注射用水に希釈して、５０．０ｍＬの最終容積にした。
【０２８６】
サンプル３：等張性非緩衝化塩素酸塩ＣｌＯ３−
８８３ｍｇのナトリウム塩素酸塩（６６２．２ｍｇの塩素酸塩に等価である）を５０ｇの注射用水に溶解した。
【０２８７】
サンプル４：ｐＨ７．４まで緩衝化した等張性亜塩素酸塩
（ｉ）リン酸塩緩衝液ｐＨ７．２
【０２８８】
溶液１：２．８４ｇのリン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４，無水）を、１００ｇの注射用水に溶解した。
【０２８９】
溶液２：２．７６ｇのリン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４?Ｈ２Ｏ）を、１００ｇの注射用水に溶解した。
【０２９０】
緩衝液ｐＨ７．２：ガラス電極の制御下、溶液２を、ｐＨが７．２１に達するまで溶液１に添加した。
【０２９１】
オスモル濃度：４０３ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ（４００；４０６から平均）。
【０２９２】
（ｉｉ）亜塩素酸ナトリウム溶液
【０２９３】
９．０ｇの市販の亜塩素酸ナトリウム溶液２５（ｗｔ／ｗｔ）％を、９３ｇの注射用水で希釈した。
【０２９４】
オスモル濃度：５０６．５ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ（５０４；５０９から平均）
【０２９５】
（ｉｉｉ）等張性リン酸塩緩衝液ｐＨ７．２
【０２９６】
（ａ）由来の３８．０ｇのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）は、最大５０．０ｇまでの注射用水でできていた。
【０２９７】
オスモル濃度：３１０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ（３０９；３１０；３１１から平均）。
【０２９８】
（ｉｖ）等張性亜塩素酸ナトリウム溶液
【０２９９】
（ｉｉ）由来の３０．３ｇの亜塩素酸ナトリウム溶液は、５０．０ｇの注射用水でできていた。
【０３００】
オスモル濃度：２９４．７ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ（２９３；２９５；２９６から平均）
【０３０１】
（ｖ）ｐＨ７．４で緩衝化した等張性亜塩素酸塩溶液緩衝液
【０３０２】
ガラス電極の制御下で、（ｉｉｉ）由来の等張性リン酸塩緩衝液ｐＨ７．２を、ｐＨが７．３９に達するまで、（ｉｖ）由来の等張性亜塩素酸ナトリウム溶液（５０ｇ）に添加した。
【０３０３】
調製された溶液の分析的な特徴付けは、表３に報告する。
【０３０４】
（ｂ）調製された溶液をカプセルカするリポソームの調製
リポソームサンプルは、以下のリン脂質のうちの１つまたは２つを用いて調製した：
・１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンＤＭＰＣ（粉末としてＬｉｐｏｉｄ  ＧｍｂＨから購入（ＬＩＰＯＩＤ  ＰＣ  １４：０／１４：０））、その８０１ｍｇを６０ｍＬのクロロホルム（１３．３５ｍｇ／ｍＬ）に溶解した
・１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン  ＤＰＰＣ（粉末として、Ｌｉｐｏｉｄ  ＧｍｂＨから購入（ＬＩＰＯＩＤ  ＰＣ  １６：０／１６：０））、その１０．６１７ｇを、１２６ｍＬのクロロホルム（８４．２６ｍｇ／ｍＬ）中に溶解した
・水素添加ホスファチジルコリン（ダイズ）  Ｈｙｄｒｏ  Ｓｏｙ  ＰＣ（粉末としてＬｉｐｏｉｄ  ＧｍｂＨ（ＬＩＰＯＩＤ  Ｓ  ＰＣ−３）から購入）、その１，２０８ｍｇを２５ｍＬのクロロホルムに溶解した（４８．３２ｍｇ／ｍＬ）。
【０３０５】
サンプル１〜４を、上述の脂質中にカプセル化した。浸透圧ストレス（内側対外側）を回避するために、これらの溶液は、等張性にした（約３００ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ）。さらに、１つのサンプルについては、ＷＦ１０のｉ．ｖ．溶液（Ｉｍｍｕｎｏｋｉｎｅ（商標））（Ｐｈａｒｍａ  Ｈａｍｅｌｎ，Ｇｅｒｍａｎｙが製造）を用いた。また、０．９％の生理食塩水溶液を塩化ナトリウムおよび脱イオン水から調製した（ＮａＣｌは、ＶＷＲ，ＧＰＲ  Ｒｅｃｔａｐｕｒｅ）。
【０３０６】
１３のリポソームサンプルを、実験のために調製し、以下のように特定した：
【０３０７】
【表６】
2015502400.tif 000013
【０３０８】
サンプル調製物
サンプルは、実施例６に一般的に記載される手順を（ある程度改変して）用いて、調製した。正確なパラメーターを下の小区分に示す。
【０３０９】
調製の時系列
以下は、全体のサンプル調製の順序を示す：
２０１２年９月５日、サンプル５、６、７、９、１０および１１についてエバポレーション、水和および押し出し
２０１２年９月６日、サンプル８、１２、１３、１４、１５、１６および１７についてエバポレーション、水和および押し出し
２０１２年９月１０日、サンプル５〜８の透析
２０１２年９月１１日、サンプル９〜１２の透析
２０１２年９月１２日、サンプル１３〜１７の透析
２０１２年９月１４日、サンプル１７の透析
【０３１０】
全てのサンプルまたは部分的に仕上げたサンプルを、それぞれ調製の終わりの時点で、または種々の調製工程の間に、冷蔵庫（１〜４℃）に保管した。
【０３１１】
エバポレーションおよび水和
ＤＰＰＣサンプルについて、２０００μＬのＤＰＰＣ−クロロホルム溶液（８４．２６ｍｇ／ｍＬ）をエバポレートして、５７４μＬの対応するイオン−混合物で水和した。
【０３１２】
ＤＰＰＣ／ＤＭＰＣサンプルを、１３００μＬのＤＰＰＣ−クロロホルム溶液および２０００μＬのＤＭＰＣ−クロロホルム溶液（１３．３５ｍｇ／ｍＬ）をエバポレートすることによって調製した。６３９０μＬの対応するイオン−混合物を、水和のために用いた。
【０３１３】
両方の場合とも、水和は４７℃で行い、５分未満継続した。
【０３１４】
ヒドロ・ソイ（ｈｙｄｒｏ  ｓｏｙ）ＰＣサンプルについて、水和温度は６０℃に設定したが、その手順の期間は５分未満であり、同様に、４０００μＬの脂質−クロロホルム溶液（４８．３２ｍｇ／ｍＬ）を水和の前にエバポレートして、水和は６１７０μＬの対応するイオン−混合物で行った。
【０３１５】
押し出し
押し出しは、ＤＰＰＣおよびＤＰＰＣ／ＤＭＰＣサンプルについては４７℃、ならびにヒドロ・ソイ（ｈｙｄｒｏ  ｓｏｙ）ＰＣサンプルについては６０℃の温度で行った。１０連続の押し出し工程を全てのサンプルについて適用したが、ただしサンプル１７では、９連続工程を適用した。これらの工程の全体的な期間は、全てのサンプルについて１５分未満であったが、ただしサンプル１３、１４、および１６では、２５分未満であった。
【０３１６】
透析
透析媒体は、５０００ｍＬのメスフラスコに４５．０ｇのＮａＣｌを添加することによって調製した０．９％の生理食塩水溶液であって、次にこれを、脱イオン水を用いて最終容積にした。
【０３１７】
全てのサンプルは、３〜１２ｍＬの透析フレーム中で透析した。５連続の工程を行った（各々、９００ｍＬの透析媒体および少なくとも４５分の期間を使用）。微小透析を利用する新しい透析方法（Ｒｏｔｈ  Ｍｉｎｉ−Ｄｉａｌｙｚｅｒ）が利用可能であることに注意のこと。これには、わずか１００μＬの範囲のサンプル容積（すなわち、リポソーム調製物）および１〜２ｍＬの範囲の透析容積（すなわち、生理食塩水）しか必要としない。この方法を用いることで、以前の方法に比較して約１０倍の係数で定量限界の増強が得られる。
【０３１８】
４週保管
実施例１１に記載のようなＬＴＳ−設定を、以下の一般的な方法によって置き換えた：透析後、サンプルを、透析フレームから取り出して、適切であると思われるバイアルには何にでも保管した。リポソームをそれらの外側媒体から分離することは、試験日に行われ、ここではサンプルの画分を取り出して、微小透析に供し、続いて透析液中で可能性として漏出された構成要素をモニターした。詳細は以下に示す。
【０３１９】
２０１２年９月１７日に、各々のサンプルの４ｍＬを、等しく、４つの１．５ｍＬの容器に分けた（各々１ｍＬ）。これらの容器のうち２つ（これは次に１〜４℃で冷蔵庫に保管し）、一方で他の２つは、室温に残しておいた。同じ温度で保管した全ての容器を、適切に表示して、５分ごとに温度を記録するようにプログラムした温度自動記録装置と一緒に同じ容器に入れた。その後に、その容器を密閉して、それぞれの温度で保管した。この自動記録装置のデータは、冷蔵庫のサンプルについて１〜４℃と、室温で保管したサンプルについての２１〜２３℃との間の一定温度を記録した。
【０３２０】
実験開始の時点で全てのサンプルが完全であることを確実にするために、次のセクションに記載のように、１００μＬのサンプル容積を取り出して、外側媒体を分けた。次いで、これらのサンプルを、−２５℃で保管して、実験の後に他のサンプルとともにｏ−トリジン−分析を行った。
【０３２１】
容器は、２０１２年１０月２４日に再度開けて、１００ｍＬのサンプルを各々の容器から取り出して、外側サンプル媒体のｏ−トリジン−分析を行った。その手順は以下の小区分に記載する。
【０３２２】
外側媒体の分離および分析
前に述べたように、かつ実施例８および１１に記載のＬＴＳ設定とは対照的に、サンプルは、ＬＴＳ実験の間、透析チャンバには保管せず、適切な容器に保管した。従って、漏出された物質が外側媒体で検出される前に、それらの外側媒体からリポソームを分離することが必要であった。この分離のために、最大容積が１００μＬである小さい透析ユニットを用いた（ＺｅｌｌｕＴｒａｎｓ／Ｒｏｔｈ  Ｍｉｎｉ−Ｄｙａｌｙｚｅｒ，ＭＷＣＯ  １２０００、Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ，製品番号：４７７５．１）。この透析は、透析媒体として１５００μＬの０．９％生理食塩水溶液に対して行い、閉じた２ｍＬの反応容器中で行った。現行の実験については、１００μＬの各々のサンプルを、２０１２年の１０月２４日に透析ユニットに満たして、対応する温度（室温または１〜４℃のいずれか）に、２０１２年１０月２９日までおいておいた。この日に、透析ユニットを、別の２ｍｌの反応容器に移して、１５００μＬの０．９％生理食塩水溶液を満たした。「古い方」の２ｍＬ容器は、次に１〜４℃で一晩保管した。「新しい方」の設定は、６０℃に加熱して一晩おいて、完全に漏出させた。
【０３２３】
最初のサンプルは、２０１２年９月１７日に採取し、この日に一晩の分離手順に供した。翌日、透析ユニットを取り出して、分離した外側媒体を含むバイアルを、他のサンプルとともに分析するために、−２５℃で保管した。
【０３２４】
２０１２年１０月３０日に、透析媒体のｏ−トリジン−分析を、実施例７、方法Ｂのｏ−チトリジン−手順の説明に従って、３つ全ての事例で行った（最初の完全性試験、真ん中の保管後、ならびに真ん中の保管および加熱後）。
【０３２５】
構成要素の濃度は、算出されず、代わりに、漏出したか、しなかったかを決定するために絶対値をモニタリングすることに手順を制限した。これは、全ての定量方法が純粋なＷＦ１０（ほとんどのカプセル化された物質とは異なる亜塩素酸塩／塩素酸塩含量を有する）を参照するという事実に起因する。強制された完全な漏出の前後の測定からの吸収のデータを比較することによって、漏出の程度のおおまかな推測が得られる。
【０３２６】
結果および分析
吸光度の値は、お互いの中で比較可能であったが、１ｃｍという標準の光学経路長に対しては正規化しなかった。吸収の測定のためには、実施例１４で規定した検出限界（ＬＯＤ）（０．０９５）を用いた。吸光度の値がＬＯＤより低い場合、漏出は、検出するには低すぎるか、または、まったく生じなかった。表４は、吸収の測定の数値を示す。
【０３２７】
各々のサンプルの値は、２つの別々に保管された容器の平均であった。強制した漏出による結果が含まれ、これは、全ての他のシグナルと比較して巨大なシグナルを示しており、このことは、全てのサンプルが適切に充填されたリポソームを含んでいたことを示している。全ての最初の測定からのシグナルは、ＬＯＤより低く、従って既に含まれているサンプルは、外側媒体に物質を漏出しなかったことが例示される。個々の結果に関して、以下の３つの視点を考慮しなければならない：保管温度、脂質構成要素、および封入された物質。
【０３２８】
保管温度による結果
保管温度は、サンプルの漏出挙動に対して最強の影響を有した。全ての漏出は、１例を除いて、室温で保管したサンプルで生じ、唯一の漏出している冷蔵庫のサンプルの場合（サンプル８）、室温でのその漏出は、試験した全てのサンプルのうち最強のシグナルを示した。
【０３２９】
封入された物質による結果
ＬＯＤを超えるシグナルを示した全てのリポソームを、亜塩素酸塩または塩素酸塩で充填した。全ての室温シナリオで漏出した塩素酸塩を充填されたサンプル、および冷蔵庫の温度の１サンプル（サンプル８）でさえＬＯＤをわずかに超えていた。亜塩素酸塩については、１つ（サンプル１４）を除いて室温サンプルの全てが超えていた。
【０３３０】
脂質による結果
漏出は、ＤＰＰＣ（４１℃）およびＤＭＰＣ（２３℃）よりも高いＰＴＴ（５５℃）を有するヒドロ・ソイ（ｈｙｄｒｏ  ｓｏｙ）ＰＣ（Ｓ  ＰＣ−３）でできたサンプルではかなり弱かった。ＤＰＰＣ／ＤＭＰＣ混合物の場合、ＰＴＴは、完全には規定されておらず、ＤＰＰＣのＰＴＴとＤＭＰＣのＰＴＴとの間の温度範囲にまたがる。
【０３３１】
［実施例１４：ＷＦ１０カプセル化リポソームに対するオスモル濃度効果］
脂質膜は、特定の程度まで、水のような低分子に透過性であるが、大きい分子および荷電された分子は、このような膜を通過できないか、通過はかなり低い率であることが公知である。浸透圧はこの効果の直接的な結果である。種々の濃度の浸透圧粒子（例えば、より大きい分子）を含む２つの水性リザーバの間に半透過性の境界が存在するようである。このシステムは、両方の濃度を平衡にする傾向であり、これは、低い濃度のリザーバから水分子で高い濃度の方のリザーバを希釈することによってのみ可能である。溶解した粒子を低濃度リザーバに移動することは、粒子が境界を通過できないせいで、不可能な濃度まで上昇させる。「侵入する」水分子の結果によって、高濃度の方のリザーバの容積が増大し、これが、リザーバの壁に対する圧力をもたらす。最終的に、この圧力は、壁が耐えるには高すぎる圧力となり、壁が破裂する。
【０３３２】
リポソームの二重層の外皮（ｈｕｌｌ）は、半透過性膜であり、従って、浸透圧の効果を受け易い。当業者は、浸透圧の勾配が、リポソームの漏出を誘導し得るか、またはリポソームを破裂さえし得ると示唆する。簡易な実験では、ＷＦ１０充填のリポソームの漏出挙動が研究され、ここでは濃縮されたＷＦ１０を用いて、周囲の生理食塩水媒体に対して内側のオスモル濃度を増大した。
【０３３３】
本研究の目的は、浸透圧効果のもとでの漏出パラメーターについて詳細な情報を得ることではなく、このような条件下での漏出の一般的な傾向を見出すことであった。
【０３３４】
サンプル
以下の方法でＮｕｖｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＧｍｂＨから提供されたＯＫＯ−Ｋ９３３溶液（ロット４０５３）で調製した２×濃縮または３×濃縮のＷＦ１０を用いて、２つのサンプルを調製した：
２×ＷＦ１０：１０ｇのＯＸＯ−Ｋ９９３であって、水を用いて５０ｍＬにした
３×ＷＦ１０：１５ｇのＯＸＯ−Ｋ９９３であって、水を用いて５０ｍＬにした
【０３３５】
サンプル調製は、２０１２年７月４日に開始して、通常の手順に従って行った（実施例６）。２．１ｍＬの８４．２６ｍｇ／ｍＬのＤＰＰＣ−クロロホルム溶液を丸底フラスコに添加した。これは、１７７ｍｇという脂質重量に相当する。ＤＰＰＣは、ＬＩＰＯＩＤ  ＧｍｂＨから購入した。水和は、上記のように調製した６．０ｍＬのそれぞれのＷＦ１０濃縮物（２×または３×）を用いて行った。水和過程の間、サンプルを約５分間、４６±３Ｃまで加熱した。押し出しは、５０±３℃で行い、約２０分続け、これには全部で１０連続の通過を含んだ。その後に、サンプルを冷蔵庫の中で、６℃で一晩保管した。透析工程は、５０００ｍＬの溶液あたり９０．０３４ｇのＮａＣｌ（２×ＷＦ１０）および１３５．０６３ｇのＮａＣｌ（３×ＷＦ１０）を用いて調製した、９００ｍＬの生理食塩水溶液中で行った。９５、８０、８０、６０および８０分続く５連続工程を行った。その後に、サンプルを透析フレームから取り出して、６℃で保管した。
【０３３６】
ＨＲＬ漏出
ＨＲＬ漏出試験は、５０００ｍＬの溶液あたり４５．０１６ｇのＮａＣｌを有する０．９％の生理食塩水溶液中で５０分の透析工程で２０１２年７月６日に開始して、リポソームの高濃縮された保管媒体を取り出した。その後に、この手順は、室温２２で行うように、熱浴を用いることなく、実施例１２に記載のように行った。通常どおり、両方のサンプルを、実験の前に分けて、２つの並行したメスシリンダーに処理して、その結果、各々のサンプルについて、２つのデータセットが利用可能となり、結果のセクションにプロットした。
【０３３７】
封入された容積の決定
サンプル中に封入されたＷＦ１０の容積を決定するために、完全な漏出を、上記のＨＲＬ設定を６０℃まで数時間加熱することによって誘導した。次いで、周囲の生理食塩水媒体のｏ−トリジン−分析を用いてＷＦ１０含量を評価した。
【０３３８】
結果＆評価
実験の間に採取した媒体サンプルの評価は、実施例７（方法Ｂ）に記載のとおり行った。実際、ＷＦ１０濃度は、保管媒体中で決定されたＷＦ１０濃度から放出されたＷＦ１０量を算出した場合、通常よりも２または３倍高いと考えられた。図１６は、サンプル全体の容積に関して漏出したＷＦ１０に関する結果を図示する。漏出は１〜２時間後に検出されたことがわかる。全実験期間の間、封入された二倍の濃縮のＷＦ１０のうちおよそ５％および三倍濃縮のＷＦ１０のうちおよそ１８％が放出された。全ての漏出したＷＦ１０のほとんどが、漏出の開始の最初の６時間の間に、放出された。その後の４日の間に、変化は小さく、漏出が停止されるか、または極めて低速で続けられるかについては言及できない。
【０３３９】
［実施例１５：エタノール注入法を用いるリポソームの調製］
リポソームを含有するＷＦ１０を、以下の脂質組成を含む直交流エタノール注入方法を用いて調製した：１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、ＤＰＰＣと、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）の１０％画分、ＤＰＰＣと、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＤＰＰＧ）の１０％画分、およびＤＰＰＣと、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＤＭＰＧ）の１０％画分。荷電された脂質（ＤＰＰＧおよびＤＭＰＧ）を、処理および保管の間にリポソームの凝集を防ぐために添加した。
【０３４０】
図１７は、エタノール注入方法を用いるリポソームの調製の模式図を示す。この方法によって、許容されるサイズ分布を有しており、所望のサイズの小型の単層リポソームの直接形成が生じる。
【０３４１】
適用される直交流エタノール注入方法の特徴としては以下が挙げられる
●バッチサイズが、サンプル容器の容積によって、決定される（限定されない）
●得られたリポソームは、ただちに制御されたサイズおよびサイズ分布のものである。
●最小の熱ストレス
●外側相は、交換されなければならず、かつ残りのエタノールは除去されなければならない：
○限外濾過を行って、一次生成物を濃縮する
○ダイアフィルトレーションは
■生理食塩水で外側相（ＷＦ１０）を交換する
■外側相から、および封入されたＷＦ１０／エタノール混合物からエタノールを除去する
【０３４２】
材料および方法
ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＭＰＧおよびＤＰＰＧは、Ｌｉｐｏｉｄ  ＧｍｂＨ（ドイツ）から供給された。リポソーム構成要素を溶解するための９６％の欧州薬局方の等級のエタノールは、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ（ドイツ）から購入した。
【０３４３】
ベシクル調製のための水相は、ＷＦ１０溶液（Ｎｕｖｏ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ＧｍｂＨの指示による、活性成分ＯＸＯ−Ｋ９９３の水の中の１０％希釈）であった。０．１５４Ｍ（生理学的）ＮａＣｌ溶液を、希釈のための水相として用いた。全ての試薬は、最高の純度で、かつ必要ならばＵＳＰまたは欧州薬局方の等級で購入した。
【０３４４】
リポソームは、Ｗａｇｎｅｒら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００２，１２（３）：２５９−２７０に記載のように、Ｐｏｌｙｍｕｎのリポソーム技術（直交流注入技術）を用いて、生成した。超／ダイアフィルトレーション（小規模）を、Ｓａｒｔｏｃｏｏｎ  Ｓｌｉｃｅ  Ｃａｓｅｔｔｅ  １００ｋＤ  ＵＦ膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ，ドイツ）を用いて行った。
【０３４５】
リポソームサイズの決定のための測定は、Ｄｙｎａｍｉｃ−Ｌａｓｅｒ−Ｌｉｇｈｔ−Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇによって、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏ  ＺＳを用いて行った。このシステムは、６３３ｎｍの波長の４ｍＷ  Ｈｅｌｉｕｍ／Ｎｅｏｎ  Ｌａｓｅｒを装備しており、１７１°の検出角度で非侵襲的な後方散乱技術でリポソームサンプルを測定する。リポソームを水相中で最適のリポソーム濃度に達するまで希釈して、実験を２５℃で行った。結果は、リポソームの均一性を決定するための多分散性指数とともに、リポソーム懸濁物の平均直径（ｚ−平均の平均）で示す。さらに、ゼータ電位の決定はまた、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏ  ＺＳで行った。従って、サンプルは、０．１５４ＭのＮａＣｌ溶液で希釈した。
【０３４６】
ＤＰＰＣの定量は、逆相ＨＰＬＣで行った。
【０３４７】
ＷＦ１０の定量は、４４２ｎｍで吸光度を測定する、ｏ−トリジン方法で行った（実施例７，方法Ｂを参照）。
【０３４８】
実験および結果
全ての実験は、Ｐｏｌｙｍｕｎのリポソーム技術で行った。全ての実験に用いた注入モジュールは、３５０μｍの注入穴直径があった。発達の経過中に、純粋なＤＰＰＣおよびＤＰＰＣ／ＤＭＰＣリポソームは、小さいゼータ電位を示した。従って、２つのさらなる脂質処方物（ＤＰＰＣ／ＤＭＰＧ，ＤＰＰＣ／ＤＰＰＧ）を用いた。いくつかの処理パラメーターを変化させて、リポソーム特性の効果を研究し、最終製品の要件を満たすように処理パラメーターを最適化した。
【０３４９】
純粋なＤＰＰＣおよびＤＰＰＣ／ＤＭＰＣリポソームのためのプロセス開発の出発条件は以下であった：
●水相の温度：４０℃
●脂質−エタノール溶液の温度：４０℃
●ベシクル調製用の水相：ＷＦ１０溶液
●希釈用の水相：０．１５４Ｍ（生理学的）ＮａＣｌ
●エタノール相（脂質−エタノール溶液）：１０００ｍＬの水相について７５ｍＬ（総生成容積：１０７５ｍＬ）
●ＷＦ１０濃度（中間容積）：７９．１μｇ／ｍＬ
【０３５０】
ＤＰＰＣ／ＤＭＰＧおよびＤＰＰＣ／ＤＰＰＧリポソームのためのプロセス開発の出発条件は以下であった：
●水相の温度：５５℃
●脂質−エタノール溶液の温度：５５℃
●ベシクル調製用の水相：ＷＦ１０溶液
●希釈用の水相：０．１５４Ｍ（生理学的）ＮａＣｌ
●エタノール相（脂質−エタノール溶液）：１０００ｍＬの水相について７５ｍＬ（総生成容積：１０７５ｍＬ）
●ＷＦ１０濃度（中間容積）：７９．１μｇ／ｍＬ
【０３５１】
表５は、エタノール注入方法を用いて調製された種々のＷＦ１０−カプセル化リポソームについてのデータを示しており、これには、リポソームのサイズ、多分散性指数（ＰｄＩ）、ＤＰＰＣ定量および亜塩素酸塩定量が含まれる。表６は、表５で報告された実験の繰り返しの実行について同じ結果を示す。図１８および図１９は、それぞれ表５および６で報告された実験についてのダイアフィルトレーション過程の間に濾液中に収集された亜塩素酸塩の量を示す。表７は、エタノール注入方法を用いて調製され、表５および６について調製されたリポソームと比較してＷＦ１０の２×の濃度を含んでいる種々のＷＦ１０カプセル化リポソームについてのデータを示し、このデータとしては、リポソームのサイズ、多分散性指数（ＰｄＩ）、ＤＰＰＣ定量および亜塩素酸塩定量が挙げられ、図２０は、同じ２×のＷＦ１０リポソームについてのダイアフィルトレーション過程の間に濾液中に収集された亜塩素酸塩の量を示す。
【０３５２】
表８は、表６および７で報告されるサンプルで行った長期安定性研究の結果を示す。
【０３５３】
［実施例１６：コラーゲン誘発性動脈炎（ＣＩＡ）動物モデル研究］
雌性ＤＢＡ／１マウスを、０日目にコラーゲンＩＩ溶液で感作して、２１日目にブーストした。動物を、コラーゲン誘発性動脈炎（ＣＩＡ）の臨床兆候について１７日目からスコア付けした。評価されたスコアが５の値を超えた場合、ＣＩＡが樹立されたとみなした。免疫後最初の３５日内にＣＩＡを発症した動物を本研究に含んだ。この時点より後にＣＩＡを発症した動物は除外した。ＣＩＡ発症の日から動物を、ＷＦ１０（０．２５ｍｌ／ｋｇ）、リポソーム型のＷＦ１０（ＬｉｐｏＷＦ１０）、またはＮａＣｌで処置した。スコアリングは、ＣＩＡ発症後全部で２１日間行った。この期間後、動物を屠殺した。
【０３５４】
研究場所：
Ｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈ−Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｅｌｌｅｓ  Ｚｅｎｔｒｕｍ  ｄｅｒ  Ｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅｎ  Ｆａｋｕｌｔａｅｔ  Ｌｅｉｐｚｉｇ，Ｌｉｅｂｉｇｓｔｒａβｅ  ２６ａ，０４１０３  Ｌｅｉｐｚｉｇ；Ｍａｘ−Ｂｕｅｒｇｅｒ−Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｚｅｎｔｒｕｍ（ＭＢＺ），Ｊｏｈａｎｎｉｓａｌｌｅｅ  ３０，０４１０３  Ｌｅｉｐｚｉｇ
【０３５５】
方法：
雌性ＤＡＢ／１マウス（Ｊａｎｖｉｅｒ），７〜８週齢（体重約１７ｇ（±２））を、移送後４週間、施設に順応させた。動物は、専門的で資格条件を満たした施設（Ｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈ−Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｅｌｌｅｓ  Ｚｅｎｔｒｕｍ（ＭＥＺ）  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ  Ｌｅｉｐｚｉｇ，Ｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅ  Ｆａｋｕｌｔａｅｔ）で飼育した。動物は耳のマーキングで特定した。
【０３５６】
全てのマウスは、０日目に１００μｌのコラーゲン−ＣＦＡ−エマルジョンの皮内注射によって免疫した（ＣＦＡは、完全フロイントアジュバンド（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ）を表す）。２１日目に、ＣＩＡを、１００μｌのコラーゲン−ＩＦＡ−エマルジョン（不完全フロイントアジュバントのＩＦＡ標準）を注射することによってブーストした。
【０３５７】
動物が５のスコア閾値を超えた時、ＣＩＡが確立されたとみなした。その日に薬理学的処置を開始して、種々の時間間隔にわたって行った。８匹のマウスが、ＣＩＡの発現から１、３および５日目に体重あたり０．２５ｍｌ／ｋｇの投薬量で１００μｌのｉ．ｖ．のＷＦ１０を与えられた。１１匹のマウスが、１００μｌのｉ．ｖ．のＳ＿ＰＣ−３−ＬｉｐｏＷＦ１０を投与されて、体重あたり約０．２５ｍｌ／ｋｇというＷＦ１０投薬量を与えられ、１２匹のマウスは、１００μｌのｉ．ｖ．のＳ＿ＰＣ−３−ＬｉｐｏＷＦ１０（１：１０希釈）を投与されて、体重あたり約０．０２５ｍｌ／ｋｇのＷＦ１０投薬量を与えられた。コントロールの群は、２００μｌのＮａＣｌを投与された１０匹のマウスから構成された。全ての投薬は、ＣＩＡの発現の１、３および５日目に行われた。リポソーム調製物「Ｓ＿ＰＣ−３−ＬｉｐｏＷＦ１０」は、ＷＦ１０を内部相として、および生理食塩水を外側相として、および水素添加大豆リン脂質を脂質として含んだ（実施例９を参照のこと）。リポソームは、５％というＷＦ１０の封入率を有し、これによって１００μＬの調製物中で５μＬのＷＦ１０というおよその容積が得られる。Ｓ＿ＰＣ−３−ＬｉｐｏＷＦ１０（１：１０希釈）は、もとのリポソーム調製物の倍数１０の希釈であって、結果として、ＷＦ１０の絶対量は減少したが、リポソームベシクルは本質的に純粋なＷＦ１０を含み続けると予想される。免疫後最初の３５日内にＣＩＡを発症した動物は、この研究に含んだ。この時点より後にＣＩＡを発症した動物は排除した。
【０３５８】
最初のコラーゲン注射から測定して１７日目に開始して、全てのマウスを毎日スコア付した。動物のスコアを評価した人は、薬理学的な処置に関しては盲検であった。全ての四肢を赤みと腫脹について検査した。１つの脚あたりの最大スコアは、１５／日であって、１匹の動物あたりの最大スコアは、トータルで６０／日であった。これらのシグナルの値から、平均値を各々の群について算出した。
【０３５９】
結果
最初の免疫後１７日目に開始して、動物をコラーゲン誘発性動脈炎（ＣＩＡ）の兆候についてスコア付けした。動物のスコアが５の値を超えた場合、ＣＩＡが誘発されたとみなし、この日をこの動物のｄ１とした。同様に、ＣＩＡの発現のｎ日後を、各々の動物についてｄｎとした。図２１は、ｄ０（ＣＩＡの発現の１日前）からｄ２２までの実験の間のＣＩＡスコアの平均値を示す。
【０３６０】
ＣＩＡ実験では、処置の効果は通常、ｄ１２あたりで始まり、分離はｄ１５〜ｄ１７あたりで最強である。その後、疾患スコアは、モデルに起因して下がる。図２２は、ｄ１６についての平均値スコアを示す。
【０３６１】
全ての刊行物、特許および特許出願の関連部分は本明細書において、各々の個々の刊行物、特許または特許出願が、参照によって組み込まれるように専門的かつ個々に示されるのと同じ程度まで参照によって本明細書に援用される。本出願における用語が、参照によって本明細書に援用される文献中で異なった定義で見出される場合、本明細書に示される定義がその用語についての定義として機能するものとする。
【０３６２】
【表７】
2015502400.tif 000014
【０３６３】
【表８】
2015502400.tif 000015
【０３６４】
【表９】
2015502400.tif 000016
【０３６５】
【表１０】
2015502400.tif 000017
【０３６６】
【表１１】
2015502400.tif 000018
【０３６７】
【表１２】
2015502400.tif 000019
【０３６８】
【表１３】
2015502400.tif 000020
【０３６９】
【表１４】
2015502400.tif 000021
【０３７０】
【表１５】
2015502400.tif 000022
【０３７１】
【表１６】
2015502400.tif 000023
【図１】
2015502400.tif 000024
【図２】
2015502400.tif 000025
【図３】
2015502400.tif 000026
【図４】
2015502400.tif 000027
【図５】
2015502400.tif 000028
【図６】
2015502400.tif 000029
【図７】
2015502400.tif 000030
【図８】
2015502400.tif 000031
【図９】
2015502400.tif 000032
【図１１】
2015502400.tif 000033
【図１２】
2015502400.tif 000034
【図１３】
2015502400.tif 000035
【図１４】
2015502400.tif 000036
【図１５】
2015502400.tif 000037
【図１６】
2015502400.tif 000038
【図１７】
2015502400.tif 000039
【図１８】
2015502400.tif 000040
【図１９】
2015502400.tif 000041
【図２０】
2015502400.tif 000042
【図２１】
2015502400.tif 000043
【図２２】
2015502400.tif 000044
【図１０】
2015502400.tif 000045
【国際調査報告】
2015502400.tif 000046
2015502400.tif 000047
2015502400.tif 000048
2015502400.tif 000049