(57)【要約】子癇前症に罹患していない妊娠女性の胎盤組織から単離された胎盤間充織幹細胞を、液体培地で培養することにより入手可能な馴化培地（ＣＭ）を記載する。本発明の馴化培地は、少なくともＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＭＣＰ−１タンパク質を含み、子癇前症の治療所値に有効である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
子癇前症に罹患していない妊娠女性の胎盤から得られた胎盤間充織幹細胞を液体培地で培養することによって入手可能な、少なくとも細胞分泌因子インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）および単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）を含む、馴化培地。
【請求項２】
ＥＮＡ−７８、ＧＣＳＦ、ＧＲＯ、ＧＲＯ−アルファ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＳＦ、ＭＤＣ、ＡＮＧＩＯＧＥＮＩＮ、ＯＮＣＯＳＴＡＴＩＮ  ｍ、ＶＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＢＬＣ、ＣＫｂ  ８−１、ＥＯＴＡＸＩＮ  ２、ＥＯＴＡＸＩＮ  ３、ＦＬＴ−３  ＬＩＧＡＮＤ、ＦＲＡＣＴＡＬＫＩＮＥ、ＧＣＰ−２、ＧＤＮＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＰ−１０、ＬＩＦ、ＬＩＧＨＴ、ＭＣＰ−４、ＭＩＦ、ＭＩＰ−３アルファ、ＮＡＰ−２、ＮＴ−３、ＯＳＴＥＯＰＯＮＴＩＮ、ＯＳＴＯＰＲＯＴＥＧＥＲＩＮ、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＬ１ｂ、ＩＬ−３、ＭＩＰ−１ｂ、ＰＩＧＦ、ＩＬ−１ａ、Ｉ３０９、ＦＧＦ９、ＴＡＲＣ、ＰＤＧＦ−ｂｂ、ＬＥＰＴＩＮ、ＴＮＦ−アルファおよびこれらのいかなる組み合わせ、からなる群から選択されるさらなる細胞分泌因子を含む、請求項１に記載の馴化培地。
【請求項３】
さらなる細胞分泌因子が、インターロイキン８（ＩＬ−８）である、請求項２に記載の馴化培地。
【請求項４】
胎盤間充織幹細胞が絨毛膜起源、または羊膜起源である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の馴化培地。
【請求項５】
細胞成分なしである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の馴化培地。
【請求項６】
（ｉ）子癇前症に罹患していない妊娠女性の胎盤からの胎盤間充織幹細胞を、無血清の液体基礎的培地で少なくとも３時間培養する工程；
（ｉｉ）液体培地と細胞画分を分離し、それにより該胎盤間充織幹細胞から分泌された因子の組み合わせを含む馴化培地、該馴化培地は少なくともインターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）および単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）を含む、を得る工程、
を含む、請求項１に記載の馴化培地を調製する方法。
【請求項７】
該馴化培地が、ＥＮＡ−７８、ＧＣＳＦ、ＧＲＯ、ＧＲＯ−アルファ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＳＦ、ＭＤＣ、ＡＮＧＩＯＧＥＮＩＮ、ＯＮＣＯＳＴＡＴＩＮ  ｍ、ＶＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＢＬＣ、ＣＫｂ  ８−１、ＥＯＴＡＸＩＮ  ２、ＥＯＴＡＸＩＮ  ３、ＦＬＴ−３  ＬＩＧＡＮＤ、ＦＲＡＣＴＡＬＫＩＮＥ、ＧＣＰ−２、ＧＤＮＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＰ−１０、ＬＩＦ、ＬＩＧＨＴ、ＭＣＰ−４、ＭＩＦ、ＭＩＰ−３アルファ、ＮＡＰ−２、ＮＴ−３、ＯＳＴＥＯＰＯＮＴＩＮ、ＯＳＴＯＰＲＯＴＥＧＥＲＩＮ、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＬ１ｂ、ＩＬ−３、ＭＩＰ−１ｂ、ＰＩＧＦ、ＩＬ−１ａ、Ｉ３０９、ＦＧＦ９、ＴＡＲＣ、ＰＤＧＦ−ｂｂ、ＬＥＰＴＩＮ、ＴＮＦ−アルファおよびこれらのいかなる組み合わせ、からなる群から選択されるさらなる細胞分泌因子を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
さらなる細胞分泌因子が、インターロイキン８（ＩＬ−８）である、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
子癇前症に罹患していない妊娠女性の胎盤からの胎盤間充織幹細胞の培養時間が、少なくとも６時間、または少なくとも１２時間、または少なくとも４８時間、または少なくとも７２時間である、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
細胞画分が液体培地から、ろ過および／または遠心分離で分離される、請求項６〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
該胎盤間充織幹細胞から分泌された１つ以上の因子の段階（ｉｉｉ）で得られた馴化培地からの分離段階（ｉｖ）をさらに含む、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
段階（ｉｖ）が、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＭＣＰ−１、ＥＮＡ−７８、ＧＣＳＦ、ＧＲＯ、ＧＲＯ−アルファ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＳＦ、ＭＤＣ、ＡＮＧＩＯＧＥＮＩＮ、ＯＮＣＯＳＴＡＴＩＮ  ｍ、ＶＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＢＬＣ、ＣＫｂ  ８−１、ＥＯＴＡＸＩＮ  ２、ＥＯＴＡＸＩＮ  ３、ＦＬＴ−３  ＬＩＧＡＮＤ、ＦＲＡＣＴＡＬＫＩＮＥ、ＧＣＰ−２、ＧＤＮＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＰ−１０、ＬＩＦ、ＬＩＧＨＴ、ＭＣＰ−４、ＭＩＦ、ＭＩＰ−３アルファ、ＮＡＰ−２、ＮＴ−３、ＯＳＴＥＯＰＯＮＴＩＮ、ＯＳＴＯＰＲＯＴＥＧＥＲＩＮ、ＴＧＦ−ｂｅｔａ  ２、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＬ１ｂ、ＩＬ−３、ＭＩＰ−１ｂ、ＰＩＧＦ、ＩＬ−１ａ、Ｉ３０９、ＦＧＦ９、ＴＡＲＣ、ＰＤＧＦ−ｂｂ、ＬＥＰＴＩＮ、ＴＮＦ−ａ因子またはそれらのいかなる組み合わせの単離を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
子癇前症の治療処置の方法に使用するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の馴化培地。
【請求項１４】
全身投与に適した医薬品形態である、請求項１３に記載の馴化培地。
【請求項１５】
注射に適した医薬品形態である、請求項１４に記載の馴化培地。
【請求項１６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の馴化培地を含む薬剤を、それを必要とする対象に投与することを含む、抗炎症処置方法。
【請求項１７】
対象が子癇前症に罹患している、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
子癇前症（ＰＥ）は、すべての妊娠女性の５〜１０％に影響する、重症の妊娠関連症候群であり、それゆえ、全世界において胎児−産婦死亡率および罹患率の主因の一つを示す。子癇前症は、以前に正常血圧である女性の母体高血圧、１日当たり０．３グラムより高いタンパク尿および全身性浮腫、により特徴付けられる症状を示す、妊娠の第三期の３ヶ月間の間に現れる多重全身性疾患（ｍｕｌｔｉ−ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）である。悪化した母体健康状態と共に、子癇前症症候群は、一般的に子宮内胎児成長異常（子宮内胎児成長制限）を伴って、胎児に対していくつかのリスク因子を示す。
【背景技術】
【０００２】
子癇前症は過去１０年間にわたり臨床的−科学的団体による集中的な調査の対象であるにもかかわらず、原因病理論はいまだ不明なままで残っており、唯一の有効な治療的処置は、しばしば早産となる、時期を決めた出産（ｔｉｍｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）である。新生児が早期産で生存した場合でも、この介入は、成人期間にも現れ得る、肺疾患、網膜障害、脳性まひ、精神遅滞、心臓血管および代謝性疾患のようないくつかのリスクを示す。さらに、子癇前症は出産時に胎盤の除去により解消されるが、母体に長期間の重度の合併症が確認され得る。これらのうち、慢性高血圧、糖尿病、慢性腎疾患、および心血管疾患の重篤なより高いリスクが報告されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
これらのことから、この重度の妊娠関連症候群が重要な臨床的および社会的−経済的意義を有することは明白である。したがって、子癇前症に典型的な広範囲の病的原因因子に働くことができる有効な薬理学的処置を開発し、その結果、出産期間を延長し、母体および新生児の両方への重度で恒久的となり得る損傷を避けることを許容することが必要である。
【０００４】
ＰＥは妊娠の第三期の３ヶ月間に突然現れるにもかかわらず、トロホブラスト分化および侵入の繊細な過程が開始される時期である第一期の３ヶ月間に由来しそうである。組織形態学的研究は、子癇前症的妊娠がトロホブラストによる、脱落膜の浅い侵入に起因する、不完全な母胎のらせん動脈再構成のある、異常な胎盤形成の過程で特徴付けられることを強調する。これらの異常は子宮胎盤かん流の長期の減少と、結果として生じる虚血性障害、および悪化した胎盤および母胎の炎症および全身性内皮障害に関与する毒性分子の放出、をもたらす。ＴＮＦ−アルファ（「腫瘍壊死因子アルファ」）は、炎症反応の起動と伝播において極めて重要な役割を果たす。ＴＮＦ−アルファ血清および胎盤発現は、生理的な妊娠女性と比べて、子癇前症に罹患した妊娠女性で有意に増加することが見出された。そのうえ、ＴＮＦ−アルファがこの妊娠関連症候群に典型的な、減少しているトロホブラスト侵入性に共に関与することが知られている。
【０００５】
胎盤は間充組織のような異なった組織で作られた複合器官であり、最も豊富な胎盤細胞成分を示す。最近の研究は、胎盤間充織および羊膜が、間充織幹細胞表現型を有する、特徴的な細胞集団を含むことを示した（Ｈｕａｎｇ  ＹＣ，  Ｙａｎｇ  ＺＭ，  Ｃｈｅｎ  ＸＨ，  Ｔａｎ  ＭＹ，  Ｗａｎｇ  Ｊ，  Ｌｉ  ＸＱ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｄｅｃｉｄｕａ  ｂａｓａｌｉｓ  ａｎｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｈｙｐｏｘｉａ  ａｎｄ  ｓｅｒｕｍ  ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｖ．  ２００９；５（３）：２４７−５５）。胎盤間充織幹細胞（ＰＤＭＳＣ）と名付けられたこれらの細胞は、非常に高い増殖性、分化および自己再生能力ならびに免疫抑制作用および抗炎症作用によって特徴付けられる。そのうえ、ＰＤＭＳＣは、隣接細胞の修復および増殖過程の調節の重要な役割を果たす。Ｒｕｓｔｅｒ  Ｂおよび同僚は、ＭＳＣが修復過程に参加するために損傷組織および器官の方へ自発的に移動する能力があると報告した（Ｒｕｓｔｅｒ  Ｂ，  Ｇｏｔｔｉｇ  Ｓ，  Ｌｕｄｗｉｇ  ＲＪ，  Ｂｉｓｔｒｉａｎ  Ｒ，  Ｍｕｌｌｅｒ  Ｓ，  Ｓｅｉｆｒｉｅｄ  Ｅ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  ｒｏｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｏｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｌｏｏｄ．  ２００６；１０８（１２）：３９３８−４４）。
【０００６】
上記の特徴的な機能的可塑性および分化特性、ならびに胎盤自体の高い入手可能性および使用に基づいて、胎盤間充織幹細胞は主に再生医療の分野で調査の対象となった。そのうえ、この分野でのＰＤＭＳＣの臨床での使用をさらに支持することに、間充織幹細胞は、Ｔリンパ球を直接刺激するために必要なＩＩ型ＨＬＡおよび同時刺激分子（ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０）を発現しないので非免疫原性であり、細胞毒性Ｔリンパ球介在溶解に抵抗性である。これらの細胞の特有の免疫学的特徴は、胎児−母性寛容の維持に重要な役割を果たし得ることを示す。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
下記の実験の節でさらに詳細に記載されるように、発明者らは、液体培地中で胎盤間充織幹細胞を培養することによって得られた馴化培地（ＣＭ）が、子癇前症によって悪化された妊娠から得られた胎盤絨毛状外植片に顕著な抗炎症作用を示すことを観察した。特に、発明者らは、子癇前症に罹患していない女性の胎盤から得られたＰＤＭＳＣによって馴化された培地を使用することによる病的な絨毛状外植片の処置が、ＴＮＦ−アルファ炎症誘発性サイトカインの有意かつ並はずれた遺伝子発現減少を引き起こすことを報告した。
【０００８】
したがって、このことは、液体培地で培養された胎盤間充織幹細胞から得られる馴化培地を、子癇前症の治療処置のために効率的に使用することを許容する。
【０００９】
大部分が、以前に記載されたＣＭの有益な効果に共に寄与するであろう、ＰＤＭＳＣ細胞により分泌されるタンパク質を同定するために、発明者らは、上記のＣＭをいくつかのサイトカイン、ケモカインおよび成長因子を特異的および同時に認識できる抗体を含む市販のアレイを使用してプロテオーム解析に供した。このプロテオーム解析から得られたデータは、いくつかの因子、とりわけ際立ったインターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）および単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）の存在を明らかにした。
【００１０】
したがって、本発明は子癇前症に罹患していない妊娠女性の胎盤から得られた胎盤間充織幹細胞を液体培地で培養することによって入手可能な、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＭＣＰ−１因子を含む馴化培地に関する。この馴化培地は特に子癇前症の治療処置に有用である。また、本発明は、本明細書の不可欠な部分を形成する添付された請求の範囲で定義されるすべて、本発明の馴化培地を作製する方法、子癇前症の治療処置のための薬物を調製するための本発明の馴化培地の使用、および子癇前症に罹患した患者の抗炎症治療処置に関する。
【００１１】
本明細書における、「胎盤間充織幹細胞」なる用語は、子癇前症に罹患していない妊娠女性の胎盤から単離された間充織幹細胞をいう。子癇前症の胎盤から単離した間充織幹細胞を培養することにより得られる馴化培地は、病的な胎盤外植片に少しの抗炎症効果ももたらさないので、これらの細胞の治療有効性は、生理的な胎盤から得られた間充織幹細胞で説明されたことに反して、本当に驚くべきものである。
【００１２】
胎盤組織の起源により、胎盤間充織幹細胞は異なる細胞集団に属し得る。実際に、ヒトの胎盤は、絨毛膜（平滑絨毛膜および繁生絨毛膜）および羊膜などの胎生組織、ならびに脱落膜などの母体組織の両方を含む特徴的な構造を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は遺伝子発現結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
好ましい実施形態において、本発明の馴化培地は絨毛膜起源の胎盤間充織幹細胞を培養することにより得られる。好ましくは、絨毛膜間充織幹細胞は、細胞蛍光分析で検出されるように、下記の表に示される表面抗原を提示する。
【００１５】
【表１】
2015502977.tif 000002
【００１６】
あるいは、本発明の馴化培地を調製するために、上記の表で示された表面抗原を提示する、羊膜由来の間充織幹細胞が使用されるであろう。
【００１７】
本発明の馴化培地は、それ自身が細胞分泌サイトカインとして知られ、有意な抗炎症作用を発揮する因子ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＭＣＰ−１、を少なくとも含む。
【００１８】
特に、ＩＬ−６の抗炎症メカニズムは、ＴＮＦ−アルファ生産の阻害、と同時に、他の炎症サイトカインの合成を阻害できる因子であるインターロイキン−１０の分泌の誘導の両方に関与する。対照的に、ＭＣＰ−１の抗炎症作用は、リンパ球細胞集団への強力な阻害活動により仲介される。
【００１９】
上記のサイトカインに加えて、ＲａｙＢｉｏ（登録商標）  Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｒｒａｙ５キットを使用して実施されたＰＤＭＳＣ馴化培地分析は、胎盤間充織幹細胞によって分泌された他の機能的なモジュレータの存在を明らかにし、その結果、異なるタンパク質発現プロフィールを同定する。
【００２０】
したがって、さらに他の実施形態において、本発明の馴化培地は：ＥＮＡ−７８、ＧＣＳＦ、ＧＲＯ、ＧＲＯ−アルファ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＳＦ、ＭＤＣ、ＡＮＧＩＯＧＥＮＩＮ、ＯＮＣＯＳＴＡＴＩＮ  ｍ、ＶＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＢＬＣ、ＣＫｂ  ８−１、ＥＯＴＡＸＩＮ  ２、ＥＯＴＡＸＩＮ  ３、ＦＬＴ−３  ＬＩＧＡＮＤ、ＦＲＡＣＴＡＬＫＩＮＥ、ＧＣＰ−２、ＧＤＮＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＰ−１０、ＬＩＦ、ＬＩＧＨＴ、ＭＣＰ−４、ＭＩＦ、ＭＩＰ−３アルファ、ＮＡＰ−２、ＮＴ−３、ＯＳＴＥＯＰＯＮＴＩＮ、ＯＳＴＯＰＲＯＴＥＧＥＲＩＮ、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＬ１ｂ、ＩＬ−３、ＭＩＰ−１ｂ、ＰＩＧＦ、ＩＬ−１ａ、Ｉ３０９、ＦＧＦ９、ＴＡＲＣ、ＰＤＧＦ−ｂｂ、ＬＥＰＴＩＮ、ＴＮＦ−アルファおよびこれらのいかなる組み合わせ、からなる群から選択されるさらなる細胞分泌因子を含む。好ましい実施形態において、本発明の馴化培地に存在するさらなる細胞分泌因子は、細胞によって大量に馴化培地中に発現および分泌される、インターロイキン８（ＩＬ−８）である。
【００２１】
好ましい実施形態において、馴化培地は子癇前症の治療処置のために使用される。
【００２２】
したがって、本発明の追加の態様は、子癇前症の治療処置において使用される本発明の馴化培地である。
【００２３】
ＰＤＭＳＣは、非免疫原性であるという特徴的な特性を有するので、本発明の馴化培地は、一の実施形態によると、それが得られた胎盤間充織幹細胞からなる細胞画分を含む。あるいは、馴化培地は細胞成分なしである。
【００２４】
馴化培地の代替として、子癇前症に罹患していない妊娠女性からの胎盤間充織幹細胞、好ましくは絨毛膜起源、または代替としての羊膜起源、が子癇前症の治療処置に使用され得る。
【００２５】
上述したように、「胎盤」なる用語は、本発明の文脈において、子癇前症の影響を受けない生理的な妊娠由来であることを示す。
【００２６】
したがって、本発明のさらなる態様は、子癇前症の治療処置において使用するための、子癇前症に罹患していない妊娠女性から得られた胎盤間充織幹細胞、好ましくは絨毛膜起源、または代替としての羊膜起源、である。
【００２７】
本発明の範囲はまた、以下の段階：
（ｉ）子癇前症に罹患していない妊娠女性の胎盤からの胎盤間充織幹細胞を、無血清の液体基礎的培地で少なくとも３時間培養する工程；
（ｉｉ）液体培地と細胞画分を分離し、それにより該胎盤間充織幹細胞から分泌された因子の組み合わせを含む馴化培地、該馴化培地は少なくともインターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）および単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）を含む、を得る工程、
を含む、上記の馴化培地を調製する方法も含む。
【００２８】
好ましくは、本発明の方法で得られる馴化培地は：ＥＮＡ−７８、ＧＣＳＦ、ＧＲＯ、ＧＲＯ−アルファ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＳＦ、ＭＤＣ、ＡＮＧＩＯＧＥＮＩＮ、ＯＮＣＯＳＴＡＴＩＮ  ｍ、ＶＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＢＬＣ、ＣＫｂ  ８−１、ＥＯＴＡＸＩＮ  ２、ＥＯＴＡＸＩＮ  ３、ＦＬＴ−３  ＬＩＧＡＮＤ、ＦＲＡＣＴＡＬＫＩＮＥ、ＧＣＰ−２、ＧＤＮＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＰ−１０、ＬＩＦ、ＬＩＧＨＴ、ＭＣＰ−４、ＭＩＦ、ＭＩＰ−３アルファ、ＮＡＰ−２、ＮＴ−３、ＯＳＴＥＯＰＯＮＴＩＮ、ＯＳＴＯＰＲＯＴＥＧＥＲＩＮ、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＬ１ｂ、ＩＬ−３、ＭＩＰ−１ｂ、ＰＩＧＦ、ＩＬ−１ａ、Ｉ３０９、ＦＧＦ９、ＴＡＲＣ、ＰＤＧＦ−ｂｂ、ＬＥＰＴＩＮ、ＴＮＦ−アルファおよびこれらのいかなる組み合わせ、からなる群から選択されるさらなる細胞分泌因子を含む。
【００２９】
好ましい実施形態において、本発明の馴化培地に存在するさらなる細胞分泌因子は、細胞によって大量に馴化培地中に発現および分泌される、インターロイキン８（ＩＬ−８）である。
【００３０】
さらなる実施形態において、本発明の方法はまた、胎盤間充織幹細胞から分泌された１つ以上の因子の段階（ｉｉｉ）で得られた馴化培地からの分離段階（ｉｖ）を含む。
【００３１】
本明細書の文脈において、「基礎的」なる用語は、特定の栄養要求性を有しない哺乳動物細胞の増殖を支持するために通常必要な無機塩、アミノ酸およびビタミンを含む培地を示す。特に限定を意図しない例として、異なる塩およびアミノ酸含量を有する以下の液体培地：Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅｓ  （ＢＭＥ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  （ＭＥＭ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ  （ＤＭＥＭ）、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１０  （ＨＡＭ’ｓ  Ｆ−１０）およびＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２  （ＨＡＭ’ｓ  Ｆ−１２）が挙げられる。上記の培地は、本発明の馴化培地の製造における使用に適した培地の説明的な例として挙げられる。
【００３２】
最適な培地の選択は当業者の行為の範囲内である。
【００３３】
本発明の方法によると、血清中に含まれる増殖因子が、ＰＤＭＳＣによって分泌される特定の因子によりもたらされる効果を阻害および改変することを避けるため、培地は血清により補足されない。
【００３４】
馴化培地を回収する前に、胎盤間充織幹細胞は、培養基質へのそれらの付着、それらの増殖、および上記で特徴付けられる成分の分泌を許容するために十分な時間培養され、子癇前症の治療処置に有益で効果的となる。したがって、胎盤間充織幹細胞は少なくとも３時間、好ましくは少なくとも１２、少なくとも２４時間、少なくとも７２時間またはそれ以上培養される。
【００３５】
ＰＤＭＳＣで馴化された培地から細胞画分を単離するため、自体公知の異なる方法が使用され得る。例えば、本発明の馴化培地は懸濁液中に細胞要素およびその残渣の保持を許容する適切な有孔性のフィルターを使用するろ過により処理できる。あるいは、ＰＤＭＳＣからの馴化培地の分離は、遠心分離とそれに続く細胞沈降により達成できる。したがって、好ましい実施形態において、細胞成分からの馴化培地の分離段階は、ろ過、遠心分離またはその両方の組み合わせで実施される。分離方法の選択は当業者の行為の範囲内である。馴化培地に含まれる細胞分泌因子の１つ以上の精製も自体公知の方法で実施され、その選択および正しい使用は当業者の行為の範囲内である。
【００３６】
有効な治療活性を発揮させるために、本発明の馴化培地対象または本発明の幹細胞をこの症候群に罹患する妊娠女性に投与する。したがって、本発明のさらなる目的は、子癇前症の治療処置のための薬物の調製のための、子癇前症に罹患していない妊娠女性から得られた上記で定義される馴化培地または胎盤間充織幹細胞の使用である。
【００３７】
好ましくは、薬剤は循環への拡散を確実にするため、全身投与、より好ましくは注射、に適した医薬品形態である。明確に、その選択が当業者の行為の範囲内である、いかなる型の注入系も本発明の範囲内である。
【００３８】
以下の実施例は、添付の請求の範囲で規定される本発明の範囲の非限定的な説明の目的で提供される。
【実施例】
【００３９】
実施例１：胎盤由来間充織幹細胞（ＰＤＭＳＣ）
胎盤由来間充織幹細胞（ＰＤＭＳＣ）を、生理的な妊娠で健康で正常血圧の妊娠女性から入手した胎盤から分離した。胎盤組織回収および試料採取を、出産およびＯＩＲＭ  Ｓａｎｔ’Ａｎｎａ−Ｏｓｐｅｄａｌｅ  Ｍａｕｒｉｚｉａｎｏ  ｏｆ  Ｔｕｒｉｎの倫理委員会のガイドラインに従ったインフォームド・コンセントを得た後に実施した。先天性奇形、染色体異常（構造または数）、伝染病、糖尿病、心臓血管およびメタボリック症候群に罹患した妊娠を除外した。
【００４０】
胎盤膜（羊膜および平滑絨毛膜）を胎盤から機械的に分離した。
【００４１】
全層組織生検を、胎盤基底板（絨毛膜絨毛により形成され、子宮壁に付着した胎盤の一部）から、基底脱落膜（合胞体栄養細胞との相互作用によって修飾された母体子宮内膜細胞で作られた組織）の機械的な除去のあとに、切除した。
【００４２】
次に、胎盤組織生検を室温で数回、無菌ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，水溶液）（Ｇｉｂｃｏ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、血液残渣を完全に除去するために洗浄した。
【００４３】
生検を次に機械的にホモジナイズし、ＤＭＥＭ  ＬＧ  （Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｌｏｗ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎａ  ａｎｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ−ＦＢＳ）中の１００Ｕ／ｍｌコラゲナーゼＩ、Ｇｉｂｃｏ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５μｇ／ｍｌデオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮＡｓｅ  Ｉ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、振とう恒温槽中で３７℃、３時間酵素消化処理した。
【００４４】
得られた細胞懸濁液を次いで、未消化組織残渣を除去するために４℃、５４０ｇで５秒間遠心分離した。上清を回収し、直径７０ミクロン孔の細胞ストレーナフィルターでろ過した。ろ過の後に、細胞をペレット化するため、溶液を４℃、５４０ｇで５分間遠心分離した。上清をその後廃棄し、無菌ＨＢＳＳ（出発組織３０ｇ毎に３０ｍｌ）に再懸濁した。
【００４５】
一容量のＦｉｃｏｌｌ  Ｐａｑｕｅ  Ｐｒｅｍｉｕｍ１，０７３（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ）を、上記のように得られた溶液の下に、初期容量に対して１：３の割合で、層にした。調製物を２０℃、５４０ｇで２０分間遠心分離し、勾配の中間層に位置する単核細胞リングを回収し、Ｆｉｃｏｌｌの残りを除去するために、ＨＢＳＳ（３０グラム毎の原発組織に対して５０ｍｌ）で再懸濁し、２０℃、５４０ｇで１０分間遠心分離した。
【００４６】
遠心分離の後、上清を廃棄し、細胞を１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および０．１％ゲンタマイシンで補足したＤＭＥＭ  ＬＧに再懸濁した。細胞をその後細胞培養フラスコに置き、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。
【００４７】
細胞を５％ＣＯ２、３７℃の培地で維持した。９０％コンフルエントで、細胞拡大の促進のため、細胞をトリプシンＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（動物派生品のない、植物起源のトリプシン、ＧＭＰ準拠，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）での処置により分割した。
【００４８】
羊膜から間充織幹細胞を分離するため、膜を室温で無菌ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、水溶液）で繰り返し洗浄し、羊膜を絨毛膜から機械的に分離した。羊膜を、その後、胎盤基底板（絨毛膜部分）由来の間充織幹細胞について上述したように、酵素処理、分離および培養により処置した。
【００４９】
実施例２：ＰＤＭＳＣの特性決定
実施例１に記載のように、生理的な胎盤（基底板−絨毛膜部分）から単離された間充織幹細胞を、細胞蛍光分析により、この細胞型に典型的な主要表面抗原マーカーを分析することにより特性付けした。
【００５０】
これらの抗原の存在または不存在を、蛍光色素を結合したモノクローナル抗体（Ｍｙｌｔｅｎｙｉ，  Ｂｏｌｏｇｎａ，  Ｉｔａｌｙ）を用いて評価した。蛍光評価により、すべてのＰＤＭＳＣ細胞株が表面マーカー、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ９０およびＣＤ７３の発現に陽性であり、ＨＬＡＩＩ、ＣＤ３４、ＣＤ１３３、ＣＤ２０、ＣＤ３２６、ＣＤ３１、ＣＤ４５およびＣＤ１４の発現に陰性であることが示され、結果、適切な間充織の表現型を示し、上皮／トロホブラスト細胞および造血系幹細胞からのいかなる汚染も除かれる。そのうえ、細胞表現型分析もまた、ＲＴ−ＰＣＲ実験を実施することにより行われ、それは、また、すべてのＰＤＭＳＣが、胚幹細胞に典型的なＯｃｔ４（８量体結合転写調節因子４）およびＮＡＮＯＧ（ホメオボックスタンパク質ＮＡＮＯＧ）遺伝子を発現することを示した。
【００５１】
ＰＤＭＳＣ幹細胞性を評価するために、第三代継代の培養細胞を３つの異なる系統：造血細胞、脂肪細胞および軟骨芽細胞、における分化能について検査した。特異的誘導培地を使用することにより、ＰＤＭＳＣ分化を得た。造骨分化のため、細胞培養物を２０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、２０ｍＭβリン酸グリセロール、１００ｎＭデキサメタゾン、および２５０μＭのアスコルビン酸２リン酸を補足したα−ＭＥＭで培養した。脂質生成の分化のため、細胞培養物を、２０％  ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５μｇ／ｍｌのインシュリン、５０μＭのインドメタシン、１×１０−６のデキサメタゾンおよび０．５μＭの３−イソブチル−１−メチルキサンチンを補足したα−ＭＥＭで培養した。軟骨細胞分化のため、培養物をＲ３−ＩＧＦ−１  １ｍＬ、ｂＦＧＦ  ２．５ＭＬ、０．５ｍＬトランスフェリン、ウシインシュリン  １Ｍ、２５ｍＬのＦＢＳおよびゲンタマイシン／アンホテリシンＢ  ０．５ｍＬを補足した軟骨細胞基本培地で培養した。３週間、１週間当たり２回、培地を交換した。細胞分化を、適切な色彩を使用することによって、評価した。骨芽細胞分化を、Ａｌｉｚａｒｉｎ  Ｒｅｄ  Ｓ．で染色して、評価した。Ａｌｉｚａｒｉｎは、不溶性および強く着色したカルシウムプラークの形成を測定し、その結果、骨基質を強調することを許容する。軟骨細胞分化を、酸ムコ多糖ポリアニオン間の塩架橋を形成するＡｌｃｉａｎ  Ｂｌｕｅ染色、グルコサミノグリカンを青色に着色する、で評価した。脂質生成の分化を、染色液中に存在する溶媒により可溶化された脂質および赤色に着色された脂肪沈着を強調する、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ染色で検出した。
【００５２】
実施例３：馴化培地作製
本発明の馴化培地を得るため、元の胎盤組織由来のトロホブラストおよび／または造血系の汚染物質の不在で示される、適切な純度に達したときに、ＰＤＭＳＣを３から５継代の間で培養開始した。より具体的に、細胞をウシ胎仔血清（ＦＢＳ）なしのＤＭＥＭ  ＬＬＧ中で１×１０５細胞／ｍｌの密度で３７℃および５％ＣＯ２で培養を開始した。ＰＤＭＳＣを少なくとも３時間から１週間以上培養した。馴化培地を、設定した時点で回収し、汚染物質細胞残渣を除去するために遠心分離および／またはろ過に供した。必要な場合は、上記のように得られた馴化培地を−８０℃で凍結して保存できる。
【００５３】
実施例４：サイトカインアレイによる馴化培地分析
本発明のＰＤＭＳＣ馴化培地に存在する細胞分泌サイトカインを調査するために、商業的に利用可能なＲａｙＢｉｏ（登録商標）  Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｒｒａｙ５を、メーカーの指示に従い使用した。この特異的サイトカインアレイキットは同一試料内に存在する異なる８０のサイトカインを同時に検出できる。具体的に、手順は、膜状にスポットされた抗体に基づいており、分析試料に存在しているとき、サイトカインを認識および捕捉することができる。この実験の文脈において、免疫複合体形成部位のアレイ膜上で生成された信号は、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを使用するデンシトメトリー分析で定量された。同定されたサイトカインのレベルは絶対値で決定されるのではなく、キットに含まれる標準対照群、陽性対照を１００％および陰性対照を０％に割り当てる、と比較した百分率として標準化される。上記の実験結果を以下の表に示す。
【００５４】
【表２】
2015502977.tif 000003
【００５５】
さらに、サイトカインアレイ分析は本発明の馴化培地において、以下のタンパク質：ＧＭ−ＣＳＦ、Ｉ−３０９、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２  ｐ４０ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−ガンマ、ＭＣＰ−３、ＭＩＧ、ＭＩＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＣＦ、ＳＤＦ−１、ＴＡＲＣ、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−ベータ、ＥＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＴＨＲＯＭＢＯＰＯＩＥＴＩＮ、ＰＤＧＦ−ｂｂ、ＬＥＰＴＩＮ、ＥＯＴＡＸＩＮ、ＦＧＦ  ４、ＦＧＦ  ６、ＦＧＦ  ７、ＦＧＦ  ９、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＬ−１６、ＮＴ−４、ＰＡＲＣ、ＰＩＧＦ、ＴＧＦ−ベータ３を、存在しないかまたはアレイシステムの検出限界以下として、検出しなかった
【００５６】
実施例５：ＰＤＭＳＣ培養物から得られた馴化培地の治療有効性の評価
本発明の馴化培地の治療有効性を評価するために、我々は子癇前症および胎児成長制限を患う妊娠群由来の胎盤絨毛状外植片によって代表されるインビトロモデルを使用した一連の研究を行った。特に、本発明の馴化培地が上記の胎盤絨毛状外植片におけるＴＮＦ−アルファ発現レベルを減少させることができるかどうかを確認した。ＴＮＦ−アルファ減少は、有意な抗炎症活性のサインとみなされた。以前に記載されたように、いくつかの臨床および実験的証拠が、この強力な親炎症性サイトカインが子癇前症に罹患した妊娠女性の胎盤および血清の両方で過剰発現されることを示した。
【００５７】
２４の子癇前症の胎盤絨毛状外植片の培養物を、以前に実施例３で記載された生理的な妊娠から単離されたＰＤＭＳＣを４８時間培養することにより得られた馴化培地で４８時間処理した。
【００５８】
胎盤回収および組織試料採取を、出産およびＯＩＲＭ  Ｓａｎｔ’ＡｎｎａおよびＭａｕｒｉｚｉａｎｏ病院（トリノ、イタリア）の倫理委員会のガイドラインに従ったインフォームド・コンセントを得た後に実施した。以下の評価基準に従って子癇前症の診断をした：以前に正常血圧である女性の妊娠２０週後の妊娠高血圧（収縮期≧１４０ｍｍＨＧまたは拡張期≧９０ｍｍＨｇ）またはアルブミン尿症（≧３００ｍｇ／２４時間）の存在。保存された形態および構造および同重量により特徴付けられる絨毛樹部分から形成された、合計で２４の外植片を、胎盤基底板から切除し、出産ストレス後のそれらの状態を釣り合わせるために３７℃および５％ＣＯ２で、ＦＢＳなしの５００μｌのＨＡＭ  Ｆ１２培地で１２時間培養した。１２時間後に、培地を５００μｌの馴化培地（１２の外植片）または５００μｌの無血清ＤＭＥＭ  ＬＧ培地（１２の対照外植片）に置き換えた。外植片培養物を同じ実験条件でさらに４８時間培養した。次に、処置群（１２）および対照群（１２）外植片を回収し、メーカーの指示に従ってＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してｍＲＮＡ単離のために処理した。単離の後、メッセンジャーＲＮＡを、可能性のあるゲノムＤＮＡ汚染を除去するため、ＤＮＡｓｅ処理（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で精製した。ＲＮＡ品質を２６０ｎｍ波長の分光学的分析で評価し、１．８〜２のＡ２６０／Ａ２８０吸収比によってその純度を決定した。
【００５９】
ＴＮＦ−アルファ発現レベルの分析に必要な、ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）を、以前に単離した５μｇの総ＲＮＡから開始するＲＴ−ＰＣＲで合成した。ＲＴ−ＰＣＲを、メーカー指示に従って、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ  Ｈ  Ｍｉｎｕｓ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）でランダムヘキサマー（ｒａｎｄｏｍ  ｈｅｘａｍｅｒ）アプローチを用いて実施した。
【００６０】
絨毛状外植片の、本発明の馴化培地での処理に続くＴＮＦ−アルファ遺伝子発現レベルの変化を、ＴａｑＭａｎプライマーおよびプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を使用するリアルタイムＰＣＲによって評価した。相対的な定量を実施するために、リアルタイムＰＣＲデータを、内部標準として用いられる１８Ｓリボソームサブユニットデータで標準化した処置群および対照群の間で比較した。
【００６１】
図１の棒グラフで表された、遺伝子発現結果は、本発明の馴化培地（ＣＭ）を用いて実施された処理が、対照（Ｃ）と比較して、処理された胎盤絨毛状外植片において、ＴＮＦ−アルファレベルの統計的に有意な減少（ｐ＝０．０１５）を導くことを明らかに示す。
【図１】
2015502977.tif 000004
【国際調査報告】
2015502977.tif 000005
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