(57)【要約】本開示の１つの態様によれば、脂肪組織試料から非脂肪細胞を分離するための装置が提供される。この装置は、第１シートの物質、第１シートの物質に結合された第２シートの物質、および第１シートの物質と第２シートの物質との間に画成された複数のチャンバであって、流入口および流出口を含む試料解離チャンバと、試料解離チャンバの流出口に流体連通する流入口を含む廃棄物収集チャンバと、試料解離チャンバに流体連通する流入口および流出口を含む細胞精製チャンバと、を含む複数のチャンバ、を含む。【選択図】図１３Ａ
2015500031.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪組織試料から非脂肪細胞を分離するための装置であって、
第１シートの物質と、
前記第１シートの物質に結合された第２シートの物質と、
前記第１シートの物質と前記第２シートの物質との間で画成された複数のチャンバであって、
流入口および流出口を含む試料解離チャンバ、
前記試料解離チャンバの前記流出口に流体連通する流入口を含む廃棄物収集チャンバ、および
前記試料解離チャンバに流体連通する流入口と、流出口とを含む細胞精製チャンバ
を含む複数のチャンバと
を含む、脂肪組織試料から非脂肪細胞を分離するための装置。
【請求項２】
前記試料解離チャンバは７０μｍ〜３００μｍの範囲の細孔寸法を有する細孔を含むメッシュフィルタをさらに含む、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
２０μｍ〜５０μｍの範囲の細孔寸法を有する細孔を含む前記細胞精製チャンバに含まれたメッシュフィルタをさらに含む、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記試料解離チャンバは第１細孔寸法を有する細孔を含む第１メッシュフィルタをさらに含み、前記細胞精製チャンバは前記第１細孔寸法よりも小さい第２細孔寸法を有する細孔を含む第２メッシュフィルタをさらに含む、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記試料解離チャンバ、前記廃棄物収集チャンバ、および前記細胞精製チャンバの間の流体接続を制御するための手段をさらに含む、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記流体接続を制御するための手段はストップコックを含む、請求項５に記載の装置。
【請求項７】
洗滌溶液および解離溶液のうちの少なくとも１つを前記試料解離チャンバに導入するよう構成され且つ前記試料解離チャンバに流体連通する流出口を有する流れ制御装置をさらに含む、請求項１に記載の装置。
【請求項８】
前記試料解離チャンバおよび前記細胞精製チャンバのうちの１つに圧力を印加するための手段をさらに含む、請求項１に記載の装置。
【請求項９】
前記細胞精製チャンバの前記流出口に流体連通する下流側処理装置であって、前記細胞精製チャンバから出力された流体を、１つまたは複数の対象細胞の第１濃度を有する第１溶液と、前記第１溶液の前記濃度よりも小さい前記１つまたは複数の対象細胞の濃度を有する第２溶液と、に分別するよう構成された少なくとも１つのマイクロ流体装置を含む下流側処理装置をさらに含み、前記対象細胞は脂肪組織試料から分離された非脂肪細胞を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
殺菌され且つ実質的に分離された脂肪組織処理システムであって、
組織処理チャンバであって、流入口、流出口、および前記組織処理チャンバの前記流入口と前記組織処理チャンバの前記流出口との間に配置された少なくとも１つのメッシュフィルタを含む組織処理チャンバと、
前記組織処理チャンバと同一筐体に含まれた廃棄物収集チャンバであって、前記組織処理チャンバの前記流出口に流体連通する流入口を含む廃棄物収集チャンバと、
残渣除去機構を含む残渣除去チャンバ、および前記組織処理チャンバと同一筐体に含まれ且つ前記組織処理チャンバに流体連通する試料収集チャンバのうちの１つと
を含む、システム。
【請求項１１】
組織処理システムにおいて脂肪組織試料を処理する方法であって、
処理対象の脂肪組織試料を第１チャンバの流入ポートを通して前記第１チャンバへと導入することと、
前記第１チャンバにおいて前記脂肪組織試料を処理することと、
細胞を、前記第１チャンバから前記第１チャンバの流出口を通して、前記第１チャンバと同一筐体に含まれた第２チャンバへと前記第２チャンバの流入口を通して搬送することと
を含む、方法。
【請求項１２】
前記脂肪組織試料を処理することは前記脂肪組織試料を解離することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記脂肪組織試料を処理することは前記第１チャンバにおいて前記脂肪組織試料から過剰流体を取り除くことを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記脂肪組織試料を処理することは前記第１チャンバにおいて洗滌溶液を用いて前記脂肪組織試料を洗浄することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記脂肪組織試料を処理することは洗滌溶液を用いて前記第１チャンバにおいて前記脂肪組織試料を洗浄することと、少なくとも１つの酵素を含む解離溶液を用いて前記第１チャンバにおいて前記脂肪組織試料を解離することとを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記解離溶液はコラゲナーゼを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記解離溶液はコラゲナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、およびヒアルロニダーゼを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
解離溶液を用いて脂肪組織試料を解離することは約摂氏３７度で行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２チャンバに含まれたメッシュフィルタを用いて残渣を除去することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記メッシュフィルタは１５マイクロメートル〜１００マイクロメートルの範囲の細孔寸法を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記試料を前記第１チャンバ内に保持し、廃棄流体を前記第１チャンバに含まれたメッシュフィルタおよび前記第１チャンバの第１流出口を通して、前記第１チャンバと同一筐体に含まれた第３チャンバへと、前記第３チャンバの流入口を通して搬送することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】
マイクロ流体装置を用いて非脂肪細胞集団のために高濃度化することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２３】
前記非脂肪細胞は幹細胞を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞を前記組織処理システムから採取することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞を前記第２チャンバの流出口に流体連通する下流側処理装置であって、前記細胞を、非脂肪細胞の第１濃度を有する第１溶液と、前記第１溶液の前記濃度よりも小さい非脂肪細胞の濃度を有する第２溶液と、に分別するよう構成された少なくとも１つのマイクロ流体装置を含む下流側処理装置において、処理することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２６】
前記採取された細胞は間質血管細胞群細胞である、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
生物学および医学における多数の技術（例えば細胞分別、フローサイトメトリー、細胞アッセイ、および細胞療法など）は組織を解離して個々の細胞を分離することに基づくものである。組織試料の処理は多くの場合、複数の操作（例えば細分化、洗浄、酵素消化、解離、培養、混合、凝集、残渣除去、および濃縮など）を伴う。研究室において、これらの操作は多くの場合、開放環境において試料が試験管から試験管へと手動で移送される状態で、手動で実行される。係る手動プロセスは高度に訓練された要員を必要とし、生物学的試料を取り扱うことは汚染および感染の潜在的な危険を生じさせる。
【背景技術】
【０００２】
近年、研究組織および医学組織では脂肪組織から細胞を分離することに関する関心が高まりつつある。脂肪組織の一部を患者または動物から安全に取り出すためのいくつかの技術が開発されてきている。例えば、チューメセント脂肪吸引技術およびウォータージェット脂肪吸引技術が患者から脂肪組織を取り出すために広く用いられている。脂肪組織は脂肪を含む脂肪細胞と組織を保持する他の非脂肪細胞とを含む。脂肪組織の構成細胞、その役割、および相互作用は完全には理解されておらず、これに関する学術的研究および臨床的研究が積極的に行われている。
【０００３】
脂肪組織を研究するにあたり、組織を解離し構成細胞を分離することが望ましいであろう。そのプロセスは、構成細胞の放出、残渣ならびに不要な細胞の除去、対象細胞の濃縮ならびに高濃度化、および細胞の洗浄を伴い得る。係るプロセスは困難であり、高度に訓練された操作員、高価な設備セットアップ、および適切なバイオセーフティ手段を有する研究室が必要となり得る。複数の操作を実施することにより対象細胞が著しく損失されてしまい、珍しく且つ希少な細胞を分離することが困難なものとなり信頼性の低いものとなってしまうこともある。さらにヒトの試料が用いられる場合には、相互汚染および感染のリスクが相当大きくなってしまうこともある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、対象細胞（特に脂肪細胞以外の細胞）を脂肪組織から効果的に分離するための方法を有すること、および脂肪組織から非脂肪細胞を分離することを容易且つ安全たらしめる装置を有することが望まれる。
【０００５】
可撓性プラスチックシートを含むバッグが、生物学的組織試料（例えば末梢血、臍帯血、血液成分、血漿、骨髄、吸引脂肪組織、その他）を収集、処理、および格納するために、広範に用いられている。バッグの利点は、可撓性および拡張性を有することにあり、内部体積を変化させる能力を有するため異なる容積の試料を収容可能であることにある。試料処理を支援するために、多数の個々のバッグがしばしば外部チューブを用いて流体接続され、それによりシステムが形成され得る。係るバッグ・チューブシステムが試料処理（例えば血液分別、細胞分離、その他）において広範に用いられている。一方、より多数の処理操作が統合されると、バッグ・チューブシステムはすぐに長大・複雑化され、使用が困難となり、製造が困難となってしまう。係るシステムは、多くの構成要素が互いから垂れ下がった状態で、スパゲッティ状となり、もつれが生じる傾向を有する。係る装置を用いるにあたっては、操作員は複雑な装置を設定するために高度な訓練と長時間の実地訓練とを必要とする。操作員は、様々な部品を正しい場所に正しい順序で取り付けるためには一層の注意を払う必要もある。さらに、これらの装置およびシステムは、多くの場合、多数のバッグ、構成要素、およびある長さのチューブが個別に作製された後に組み立てられる必要があるために、製造は困難および高価となり得る。係る装置の組み立ては多大な労力を要し、そのために漏出および汚染のリスク、すなわちシステム障害が生じ得る。臨床用途に対して、これらの装置は多くの場合、単回使用であり、その信頼性が重要である。多大な労力を要すること、および装置障害リスクが、これらの従来型スパゲッティ状システムに対する主な障害となっている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示の１つの態様によれば、脂肪組織試料から非脂肪細胞を分離するための装置が提供される。この装置は、第１シートの物質、第１シートの物質に結合された第２シートの物質、および第１シートの物質と第２シートの物質との間に画成された複数のチャンバであって、流入口および流出口を含む試料解離チャンバと、試料解離チャンバの流出口に流体連通する流入口を含む廃棄物収集チャンバと、試料解離チャンバに流体連通する流入口および流出口を含む細胞精製チャンバと、を含む複数のチャンバ、を含む。
【０００７】
いくつかの実施形態によれば、試料解離チャンバは、７０μｍ〜３００μｍの範囲の細孔寸法を有する細孔を含むメッシュフィルタをさらに含む。
【０００８】
いくつかの実施形態によれば、この装置は、細胞精製チャンバに含まれ、且つ２０μｍ〜５０μｍの範囲の細孔寸法を有する細孔を含むメッシュフィルタをさらに含む。
【０００９】
いくつかの実施形態によれば、試料解離チャンバは第１細孔寸法を有する細孔を含む第１メッシュフィルタをさらに含む。なお細胞精製チャンバは、第１細孔寸法よりも小さい第２細孔寸法を有する細孔を含む第２メッシュフィルタをさらに含む。
【００１０】
いくつかの実施形態によれば、この装置は、試料解離チャンバ、廃棄物収集チャンバ、および細胞精製チャンバの間の流体接続を制御するための手段をさらに含む。
【００１１】
いくつかの実施形態によれば、流体接続を制御するための手段はストップコックを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態によれば、この装置は、洗滌溶液および解離溶液のうちの少なくとも１つを試料解離チャンバに導入するよう構成された流れ制御装置であって、試料解離チャンバに流体連通する流出口を有する流れ制御装置をさらに含む。
【００１３】
いくつかの実施形態によれば、この装置は、試料解離チャンバおよび細胞精製チャンバのうちの１つに圧力を印加するための手段をさらに含む。
【００１４】
いくつかの実施形態によれば、この装置は、細胞精製チャンバの流出口に流体連通する下流側処理装置であって、細胞精製チャンバから出力された流体を、１つまたは複数の対象細胞の第１濃度を有する第１溶液と、１つまたは複数の対象細胞の第１溶液の濃度よりも小さい濃度を有する第２溶液と、に分別するよう構成された少なくとも１つのマイクロ流体装置を含む下流側処理装置をさらに含む。なお対象細胞は脂肪組織試料から分離された非脂肪細胞を含む。
【００１５】
本開示の１つの態様によれば、殺菌され且つ実質的に分離された脂肪組織処理システムが提供される。このシステムは、流入口、流出口、および組織処理チャンバの流入口と組織処理チャンバの流出口との間に配置された少なくとも１つのメッシュフィルタを含む組織処理チャンバと、組織処理チャンバと同一筐体に含まれた廃棄物収集チャンバであって、組織処理チャンバの流出口に流体連通する流入口、および、残渣除去機構を含む残渣除去チャンバならびに組織処理チャンバと同一筐体に含まれ且つ組織処理チャンバに流体連通する試料収集チャンバのうちの１つを含む廃棄物収集チャンバと、を含む。
【００１６】
本開示の１つの態様によれば、組織処理システムにおいて脂肪組織試料を処理する方法が提供される。この方法は、処理対象の脂肪組織試料を、第１チャンバへと、第１チャンバの流入ポートを通して導入することと、脂肪組織試料を第１チャンバにおいて処理することと、細胞を、第１チャンバの流出口を通して第１チャンバから、第２チャンバの流入口を通して第１チャンバと同一筐体に含まれた第２チャンバへと搬送することと、を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態によれば、脂肪組織試料を処理することは脂肪組織試料を解離することを含む。
【００１８】
いくつかの実施形態によれば、脂肪組織試料を処理することは第１チャンバにおいて脂肪組織試料から過剰流体を取り除くことを含む。
【００１９】
いくつかの実施形態によれば、脂肪組織試料を処理することは洗滌溶液を用いて第１チャンバにおいて脂肪組織試料を洗浄することを含む。
【００２０】
いくつかの実施形態によれば、脂肪組織試料を処理することは洗滌溶液を用いて第１チャンバにおいて脂肪組織試料を洗浄することと、少なくとも１つの酵素を含む解離溶液を用いて第１チャンバにおいて脂肪組織試料を解離することと、を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態によれば、解離溶液はコラゲナーゼを含む。
【００２２】
いくつかの実施形態によれば、解離溶液はコラゲナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、およびヒアルロニダーゼを含む。
【００２３】
いくつかの実施形態によれば、解離溶液を用いて脂肪組織試料を解離することは約摂氏３７度で行われる。
【００２４】
いくつかの実施形態によれば、この方法は第２チャンバに含まれたメッシュフィルタを用いて残渣を除去することをさらに含む。
【００２５】
いくつかの実施形態によれば、メッシュフィルタは１５マイクロメートル〜１００マイクロメートルの範囲の細孔寸法を有する。
【００２６】
いくつかの実施形態によれば、この方法は、試料を第１チャンバ内に保持し、廃棄流体を第１チャンバに含まれたメッシュフィルタおよび第１チャンバの第１流出口を通して、第１チャンバと同一筐体に含まれた第３チャンバへと、第３チャンバの流入口を通して搬送することをさらに含む。
【００２７】
いくつかの実施形態によれば、この方法は、マイクロ流体装置を用いて非脂肪細胞集団のために高濃度化することをさらに含む。
【００２８】
いくつかの実施形態によれば、非脂肪細胞は幹細胞である。
【００２９】
いくつかの実施形態によれば、この方法は組織処理システムから細胞を採取することをさらに含む。
【００３０】
いくつかの実施形態によれば、この方法は細胞を、第２チャンバの流出口に流体連通する下流側処理装置であって、細胞を、非脂肪細胞の第１濃度を有する第１溶液と、非脂肪細胞の第１溶液の濃度よりも小さい濃度を有する第２溶液と、に分別するよう構成された少なくとも１つのマイクロ流体装置を含む下流側処理装置において、処理することをさらに含む。
【００３１】
いくつかの実施形態によれば、採取された細胞は間質血管細胞群細胞である。
【００３２】
本開示の１つの態様によれば、脂肪組織から細胞を分離するための装置が提供される。この装置は、第１シートの物質、第１シートの物質に結合された第２シートの物質、および第１シートの物質と第２シートの物質との間に画成された複数のチャンバであって、流入口および流出口を含む試料解離チャンバと、組織解離チャンバの流出口に流体連通する流入口を含む廃棄物収集チャンバと、試料解離チャンバに流体連通する流入口および流出口を含む細胞精製チャンバと、を含む複数のチャンバ、を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態によれば、試料解離チャンバは濾過メッシュをさらに含む。
【００３４】
いくつかの実施形態によれば、この装置は細胞精製チャンバに含まれた濾過メッシュをさらに含む。
【００３５】
いくつかの実施形態によれば、試料解離チャンバは第１細孔寸法を有する細孔を含む第１濾過メッシュをさらに含む。なお細胞精製チャンバは第２細孔寸法を有する細孔を含む第２濾過メッシュをさらに含む。
【００３６】
いくつかの実施形態によれば、第２細孔寸法は第１細孔寸法よりも小さい。
【００３７】
いくつかの実施形態によれば、この装置は、試料解離チャンバ、廃棄物収集チャンバ、および細胞精製チャンバの間の流体接続を制御するための手段をさらに含む。
【００３８】
いくつかの実施形態によれば、流体接続を制御するための手段はストップコックを含む。
【００３９】
いくつかの実施形態によれば、この装置は、洗滌溶液および解離溶液のうちの１つを試料解離チャンバに導入するよう構成された流れ制御装置であって、組織解離チャンバに流体連通する流出口を有する流れ制御装置をさらに含む。
【００４０】
いくつかの実施形態によれば、この装置は、試料解離チャンバおよび細胞精製チャンバのうちの１つに圧力を印加するための手段をさらに含む。この手段は第１シートの物質と第２シートの物質との間に配置され得る。この手段は第１シートの物質および／または第２シートの物質の近傍に配置され得る。
【００４１】
いくつかの実施形態によれば、この装置は、細胞精製チャンバの流出口に流体連通する下流側処理装置であって、細胞精製チャンバから出力された流体を、１つまたは複数の対象細胞の第１濃度を有する第１溶液と、１つまたは複数の対象細胞の第１溶液の濃度よりも小さい濃度を有する第２溶液と、に分別するよう構成された少なくとも１つのマイクロ流体装置を含む下流側処理装置をさらに含む。
【００４２】
本開示の１つの態様によれば、実質的に分離された脂肪組織処理システムが提供される。このシステムは、流入口、第１流出口、第２流出口、および脂肪組織処理チャンバの流入口と脂肪組織処理チャンバの第１流出口との間に配置された少なくとも１つの濾過メッシュを含む脂肪組織処理チャンバと、脂肪組織処理チャンバと同一筐体に含まれた廃棄物収集チャンバであって、脂肪組織処理チャンバの第１流出口に流体連通する流入口、および、残渣除去機構を含む残渣除去チャンバならびに脂肪組織処理チャンバと同一筐体に含まれ且つ脂肪組織処理チャンバの第２流出口に流体連通する試料収集チャンバのうちの１つを含む廃棄物収集チャンバと、を含む。
【００４３】
いくつかの実施形態によれば、このシステムは、脂肪組織処理チャンバと同一筐体に配置された流体容積測定チャンバであって、流入口と、脂肪組織処理チャンバの流入口に流体連通する流出口と、を含む流体容積測定チャンバをさらに含む。
【００４４】
いくつかの実施形態によれば、流体容積測定チャンバの流入口および流体容積測定チャンバの流出口のそれぞれはチェックバルブを含む。
【００４５】
いくつかの実施形態によれば、第１流出口および第２流出口は、脂肪組織処理チャンバに流体連通するストップコックの流出口を含む。
【００４６】
本開示の１つの態様によれば、脂肪組織から細胞を分離する方法が提供される。この方法は、処理対象の試料を組織処理チャンバの流入ポートを通して組織処理チャンバへと導入することと、組織処理チャンバにおいて試料を処理することと、細胞を、組織処理チャンバの流出口を通して組織処理チャンバから組織処理チャンバと同一筐体に含まれた試料格納チャンバの流入口を通して試料格納チャンバへと放出することと、を含む。
【００４７】
いくつかの実施形態によれば、この方法は、細胞試料を組織処理チャンバ内に保持し、廃棄流体を組織処理チャンバに含まれたメッシュフィルタおよび組織処理チャンバの第１流出口を通して、組織処理チャンバと同一筐体に含まれた廃棄物収集チャンバへと、廃棄物収集チャンバの流入口を通して搬送することをさらに含む。
【００４８】
いくつかの実施形態によれば、この方法は組織処理システムから細胞試料を抽出することをさらに含む。
【００４９】
いくつかの実施形態によれば、この方法は抽出された細胞試料を、試料格納チャンバの流出口に流体連通する下流側処理装置であって、抽出された細胞試料を、１つまたは複数の対象細胞の第１濃度を有する第１溶液と、１つまたは複数の対象細胞の第１溶液の濃度よりも小さい濃度を有する第２溶液と、に分別するよう構成された少なくとも１つのマイクロ流体装置を含む下流側処理装置において処理することをさらに含む。
【００５０】
いくつかの実施形態によれば、組織処理チャンバにおいて組織試料を処理することは組織洗浄溶液を組織処理チャンバへと導入することを含む。
【００５１】
いくつかの実施形態によれば、組織処理チャンバにおいて組織試料を処理することは組織解離溶液を組織処理チャンバへと導入することをさらに含む。
【００５２】
本開示の１つの態様によれば、脂肪組織から細胞を分離するための方法が提供される。この方法は、処理対象の吸引脂肪組織試料をメッシュを含むチャンバに導入することと、過剰流体をその試料から除去することと、脂肪細胞および残渣を除去するために、解離された試料を少なくとも１つのメッシュに通すことと、試料から実質的に赤血球を除去しマイクロ流体装置を用いて試料を少なくとも３倍に濃縮することと、を含む。
【００５３】
いくつかの実施形態によれば、この方法は洗浄溶液を用いて試料を洗浄することをさらに含む。
【００５４】
いくつかの実施形態によれば、この方法は、試料と、少なくとも１つの酵素を含む解離溶液とを、混合および培養することをさらに含む。
【００５５】
いくつかの実施形態よれば、マイクロ流体装置は、実質的に一定深さを有し、且つ７５０マイクロメートルより小さい少なくとも１つの寸法を有する、複数のマイクロ流体チャネルを含む。なお少なくとも２つのマイクロ流体チャネルは基板の１つの表面上に配置される。
【００５６】
いくつかの実施形態によれば、解離溶液はコラゲナーゼを含み、試料および解離溶液は約摂氏２０度〜約摂氏４０度の範囲で培養される。
【００５７】
いくつかの実施形態によれば、解離溶液はコラゲナーゼおよびデオキシリボヌクレアーゼを含み、試料および解離溶液は約摂氏３７度で培養される。
【００５８】
いくつかの実施形態によれば、マイクロ流体装置は、試料を非脂肪有核細胞分画に分別するよう構成された支柱をさらに含む。
【００５９】
いくつかの実施形態によれば、マイクロ流体装置は、非脂肪細胞を洗浄し、洗浄用溶液を用いて解離溶液中の酵素を実質的に除去するよう、構成される。
【００６０】
本開示の１つの態様によれば、実質的に分離された脂肪組織処理システムが提供される。このシステムは、３つの流入ポート、第１流出ポートならびに第２流出ポート、および３つの流入ポートと第１流出ポートならびに第２流出ポートとの間に配置されたメッシュを含む試料洗浄・解離チャンバと、試料洗浄・解離チャンバの第１流出ポートに流体接続する流入口コネクタ、流出口、および流入口コネクタと流出口との間に配置されたメッシュを含む凝集塊低減チャンバと、凝集塊低減チャンバの流出口に流体連通する流入口を有する解離された細胞およびさらなる残渣除去のための貯蔵槽と、試料洗浄・解離チャンバの第２流出ポートに流体連通する流入口を有する廃棄溶液収集チャンバと、マイクロ流体装置と、を含む。
【００６１】
いくつかの実施形態によれば、マイクロ流体装置は、実質的に一定深さ、および７５０マイクロメートルよりも小さい少なくとも１つの寸法を有する複数のマイクロ流体チャネルを含む。
【００６２】
いくつかの実施形態によれば、複数のマイクロ流体チャネルのうちの少なくとも２つは基板の１つの表面上に配列される。
【００６３】
いくつかの実施形態によれば、試料洗浄・解離チャンバ、凝集塊低減チャンバ、貯蔵槽、および廃棄溶液収集チャンバのそれぞれは同一の密閉済みパッケージ内に含まれる。
【００６４】
添付の図面は一定縮尺での描画を意図するものではない。これらの図面では、様々な図面において図示される同等または略同等の構成要素は類似する番号により表される。簡略化のために、必ずしもすべての構成要素が各図面においてラベル付けされるとは限らない。全部の図面は、特記なき限り、概略図であるとみなされるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１Ａ】本開示の１つの実施形態に係る１つの方法のフローチャートである。
【図１Ｂ】本開示の１つの実施形態に係る１つの方法のフローチャートである。
【図２Ａ】本開示の１つの実施形態に係る試料処理装置の概略図である。
【図２Ｂ】本開示の１つの実施形態に係る流れ制御装置の概略図である。
【図２Ｃ】本開示の１つの実施形態に係る流れ制御装置の概略図である。
【図２Ｄ】本開示の１つの実施形態に係る試料処理装置の概略図である。
【図２Ｅ】本開示の１つの実施形態に係る試料処理装置の概略図である。
【図２Ｆ】本開示の１つの実施形態に係る試料処理装置の概略図である。
【図２Ｇ】本開示の１つの実施形態に係る試料処理装置の概略図である。
【図３Ａ】本開示の１つの実施形態に係る試料処理装置の立面図である。
【図３Ｂ−Ｃ】（図３Ｂ）図３Ａに示す試料処理装置の等角図である。（図３Ｃ）図３Ａに示す装置のチャンバの１部分の分解図である。
【図３Ｄ】図３Ａに示す装置のチャンバの１部分の分解図である。
【図３Ｅ】図３Ａに示す装置のチャンバの１部分を側方から見た断面図である。
【図３Ｆ】所望によるクランプを含む図３Ａに示す試料処理装置の立面図である。
【図４】本開示の１つの実施形態に係る試料処理装置の立面図である。
【図５Ａ】本開示の１つの実施形態に係る試料処理装置の１つのチャンバの立面図である。
【図５Ｂ】図５Ａに示すチャンバの１部分を側方から見た断面図である。
【図６Ａ】本開示の１つの実施形態に係る試料処理装置の１つのチャンバの立面図である。
【図６Ｂ】図６Ａに示すチャンバの１部分を側方から見た断面図である。
【図７】本開示の１つの実施形態に係る試料処理装置の１つのチャンバを側方から見た断面図である。
【図８Ａ】本開示の１つの実施形態に係る試料処理装置の１つのチャンバの立面図である。
【図８Ｂ】図８Ａに示すチャンバの分解図である。
【図９Ａ】本開示の１つの実施形態に係る試料処理装置の１つのチャンバの立面図である。
【図９Ｂ】図９Ａに示すチャンバの分解図である。
【図１０Ａ】本開示の１つの実施形態に係る試料処理装置の１部分の立面図である。
【図１０Ｂ】図１０Ａに示す試料処理装置の部分の分解図である。
【図１１】本開示の１つの実施形態に係る試料処理装置の立面図である。
【図１２】本開示の１つの実施形態に係る試料処理装置の立面図である。
【図１３Ａ】本開示の１つの実施形態に係る試料処理装置の立面図である
【図１３Ｂ】図１３Ａに示す装置のチャンバの１部分の断面図である。
【図１３Ｃ】図１３Ａに示す装置のチャンバの１部分の断面図である。
【図１４】本開示の１つの実施形態に係る試料処理装置の立面図である。
【図１５Ａ】本開示のいくつかの実施形態に含まれるマイクロ流体装置の１部分を示す図である。
【図１５Ｂ】本開示のいくつかの実施形態に含まれるマイクロ流体装置を示す図である。
【図１５Ｃ】本開示のいくつかの実施形態に含まれるマイクロ流体装置を示す図である。
【図１５Ｄ】本開示のいくつかの実施形態に含まれるマイクロ流体装置を示す図である。
【図１５Ｅ】本開示のいくつかの実施形態に含まれるマイクロ流体装置を示す図である。
【図１６】本開示の１つの実施形態に係る試料処理装置の立面図である。
【図１７】本開示のいくつかの実施形態に含まれるマイクロ流体装置を示す図である。
【図１８Ａ】本開示の１つの実施形態において処理された流体の写真である。
【図１８Ｂ】本開示の１つの実施形態において処理された流体の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
本開示は、その適用が、以下の記載で説明するまたは図面に示す構成要素の構築および構成の詳細に限定されない。本開示は、他の実施形態が可能であり、様々な方法で実行または実施されることが可能である。また、本明細書で用いる術語および用語は説明目的で用いられたものであり、限定的な意味で解釈されるべきではない。「を含む」、「を備える」、「を有する」、「を含有する」、「を伴う」、およびこれらの変化物は本明細書では、これらの用語に先行する項目および係る項目の等価物の他に、追加的な項目も含むことを意図するものである。
【００６７】
本明細書で用いられる「試料」、「組織試料」、「脂肪試料」、および「脂肪組織」という用語は、脂肪組織試料（例えば吸引脂肪組織など）を含み得、これらの用語は相互交換可能に用いられる。
【００６８】
本明細書で用いる「マイクロ流体装置」という用語は、実質的に１つの表面上に形成された少なくとも１つの流体チャネル（実質的に平坦であってもよくまたは湾曲していてもよい）と、約１ｍｍより短い少なくとも１つの横方向チャネル寸法と、を有する装置を指し得る。横方向チャネル寸法は例えば、チャネルの幅または深さであり得る。
【００６９】
対象細胞を脂肪組織から効果的に分離するための方法を有すること、および脂肪組織から細胞を分離することを容易且つ安全たらしめる装置を有することが望まれることが見出されている。研究用途および臨床用途に関して、ヒューマンエラーが最小化されるよう脂肪組織試料を処理する複数操作の円滑化が望ましいことが見出されている。さらに、脂肪組織試料が実質的に「分離」された環境で処理されることが重要であることが見出されている。なお係る環境では、外部環境および／または操作要員との直接的物理的接触または例えば濾過されていない空気流を通しての流体接触から脂肪試料が分離されるよう防壁が提供され、それにより汚染および感染のリスクが最小化または回避される。多数の構成要素および隔室が１つの部品として一体化され、それにより試料に対して実質的に分離された環境が提供される脂肪組織処理のためのシステムおよび装置を有することが望ましいことも見出されている。脂肪組織処理のためのシステムおよび装置は、使用および製造が容易であり、故障のリスクが低いことが好ましい。多くの臨床用途および研究用途に関して、脂肪組織試料と直接接触する係る装置およびシステムのいかなる部分も滅菌され且つ使い捨てであることも好適であり得る。
【００７０】
本開示の態様および実施形態は、脂肪組織試料から特定の構成細胞集団を分離するための方法を提供する。本開示の他の態様および実施形態は、統合された、円滑化された、安全な、および使いやすい手法で、脂肪組織試料から特定の構成細胞集団を分離するための方法を可能にするための装置を提供する。
【００７１】
本開示の態様および実施形態は、脂肪組織試料処理ための複数隔室を含む統合された装置を提供する。係る複数隔室は例えば、試料収集、洗浄、成層化、混合、加熱、冷却、濾過、消化、格納、流体の搬送ならびに取り扱い、細胞ラベル化、試料処理、解離、廃棄流体収集、凝集塊除去、残渣除去、細胞濃縮、細胞高濃度化、細胞分離、細胞培養、成長、培養、分化、拡張、その他のために構成および配列された隔室を含むがこれらに限定されない。本開示の実施形態に係る統合された装置は例えば隔室間の流体流を制御するためのバルブも含み得る。係る装置は、脂肪組織試料処理の複数の操作（例えば脂肪組織から細胞を分離することなど）の統合化および合理化のために有用であり得、複数の機能（例えば酵素消化、脂肪組織解離、洗浄、廃棄液体収集、残渣除去、細胞濃縮、抗体を用いることによるラベル化、磁気ビーズを用いることによるラベル化、細胞拡張、その他など）を支援し得る。係る装置は特に安全性、容易な使用、容易な製造が重要となる用途において有用となり得る。本開示のいくつかの態様および実施形態は係る装置を用いるための方法を含む。
【００７２】
脂肪組織から細胞を分離するための本開示の方法の１つの実施形態は、脂肪組織を解離すること、構成細胞を放出すること、放出された細胞を収集すること、および組織残渣を取り除くことを含むが、これらに限定されない。この方法は組織解離の前に脂肪組織清掃操作をさらに含み得る。脂肪組織清掃操作は、脂肪組織試料から不要流体または過剰流体を除去または排出することを含み得る。係る不要流体は、血液、体液、およびチューメセント溶液を含み得る。脂肪組織清掃操作は洗滌溶液を用いて脂肪組織を洗滌または洗浄することをさらに含み得る。この方法は、放出された細胞を高濃度化または精製するための１つまたは複数の操作をさらに含み得る。加えてこの方法は、処理から廃棄流体を収集することをさらに含み得る。脂肪組織から細胞を分離するための本開示の方法の他の実施形態は、脂肪組織から過剰流体を除去すること、脂肪組織を解離し構成細胞を放出すること、および不要な細胞および残渣を除去することを含むがこれらに限定されない。この方法は、脂肪組織試料を洗浄すること、対象細胞を濃縮すること、対象細胞を洗浄すること、および例えば抗体を用いて免疫隔離を実施することのうちの１つまたは複数をさらに含み得る。１つの実施形態において、対象細胞を濃縮および／または洗浄することは、少なくとも１つのマイクロ流体装置を用いて実施され得る。他の実施形態では、１つまたは複数の操作は遠心分離を用い得る。さらに他の実施形態では、１つまたは複数の操作は中空ファイバを利用して実施され得る。
【００７３】
本開示の１つの実施形態では、脂肪組織から非脂肪細胞集団を分離するための方法が提供される。この方法は、脂肪組織から過剰流体を除去すること、緩衝液を用いて脂肪組織を洗浄すること、例えば超音波または酵素を含む解離溶液を用いて脂肪組織を解離すること、脂肪細胞、フリーオイル（ｆｒｅｅ  ｏｉｌ）、マトリクス繊維、ならびに組織残渣を除去すること、赤血球細胞を減少させること、および対象細胞を高濃度化することを含むが、これらに限定されない。細胞高濃度化操作は、遠心分離機、フィルタ、またはマイクロ流体装置を用いて達成が可能となり得る。この方法は、リンパ球低減、細胞洗浄、および免疫隔離のうちの１つまたは複数をさらに含み得る。脂肪組織から過剰流体を除去すること、緩衝液を用いて脂肪組織を洗浄すること、脂肪組織を解離すること、脂肪細胞、フリーオイル、マトリクス繊維、ならびに組織残渣を除去すること、および細胞洗浄は、例えば重力下での沈下、遠心分離、および／またはメッシュフィルタを含むストレーナを用いて実施され得る。
【００７４】
脂肪組織から非脂肪細胞集団を分離するための方法の１つの実施形態のフローチャートが、図１Ａにおいて全般的に参照番号１００で示される。脂肪吸引処置の実施中、チューメセント流体は多くの場合、血液損失を最小化するため、組織を堅固化するため、および局所麻酔を提供するために患者に導入される。チューメセント溶液は、リドカインを０．０５％、およびエピネフリンを１：１，０００，０００の濃度で含み得る。この方法は、吸引脂肪組織から過剰流体を除去する操作（操作１１０）を含む。過剰流体は血液と、しばしばチューメセント液とを含み得る。なおチューメセント液は下流側での処理操作および対象細胞の分離に干渉し得る。１つの実施形態において、除去された過剰流体の試料は、重力沈下または遠心分離を用いて脂肪組織層および過剰流体層に成層化され得る。なぜなら脂肪組織は過剰流体よりも密度が低いためである。次に、脂肪組織層および過剰流体は異なる容器へと分離され、それにより脂肪組織と過剰流体とが分別され得る。例えば食塩水、乳酸リンゲル液、ハンクス平衡塩類溶液、またはリン酸緩衝食塩水を含む洗浄用溶液が脂肪組織を洗浄するために脂肪組織に加えられ得、成層化処理は、より完全に脂肪組織を洗浄し過剰流体を除去するために反復され得る。他の実施形態においては、過剰流体はメッシュを含むストレーナを用いて排出され得る。洗浄用溶液は脂肪組織に加えられ、組織を洗浄するためにストレーナを用いて排出され得る。この洗浄処理は反復されてもよい。いくつかの実施形態では、ストレーナは、約３０マイクロメートル（μｍ）〜約１ミリメートル（ｍｍ）の範囲（例えば約３０μｍ、約５０μｍ、約７０μｍ、約８５μｍ、約１００μｍ、約１２０μｍ、約１４０μｍ、約２００μｍ、約３００μｍ、約５００μｍ、約７００μｍ、または約１ｍｍ）の細孔寸法を有する細孔を含み得る。他の実施形態では、ストレーナは約７０μｍ〜約５００μｍの範囲（例えば約７０μｍ、約１００μｍ、約１４０μｍ、約２００μｍ、約３００μｍ、または約５００μｍ）の細孔寸法を有する細孔を含み得る。さらに詳細には、ストレーナは約７０μｍ〜約２００μｍの範囲（例えば約８０μｍ、約９０μｍ、約１００μｍ、約１２０μｍ、約１４０μｍ、約１７０μｍ、または約２００μｍ）の細孔寸法を有するメッシュフィルタを含み得る。本開示の他の実施形態では、ストレーナは、脂肪組織がストレーナにより保持されるよう、脂肪組織よりも小さい細孔寸法を有する。過剰流体を効果的に除去するために、洗浄用溶液を加えることおよび洗浄用溶液を除去することを含む洗浄操作は約１回〜約１０回（例えば１回、２回、３回、４回、５回、６回、８回、または１０回）だけ適用され得る。脂肪試料の容積と各洗浄で加えられる洗浄用溶液の容積との比は約１：０．２〜約１：１０の範囲（例えば約１：０．２、約１：０．３、約１：０５、約１：０．７、約１：１、約１：２、約１：３、約１：５、または約１：１０）であり得る。例えばチューメセント脂肪吸引を用いて収集された１００ｍｌの吸引脂肪組織は、１００ｍｌの乳酸リンゲル液と混合され、細孔寸法が約１４０μｍの細孔を有するナイロンメッシュを用いて排出され得る。この処理は、完全に過剰流体を除去するために３回実施され得る。他の実施形態では、各洗浄操作は、試料に洗浄用溶液を加えること、および試料から洗浄用溶液を除去することを含む。なお洗浄用溶液は試料の容積の０．６倍〜４倍の範囲（例えば試料容積の０．６、０．８、１、１．２、１．５、１．８、２、２．５、３、または４倍）の容積を有し、洗浄操作は１回、２回、３回、または４回実施され得る。他の実施形態では、過剰流体除去操作は、ストレーナを用いる排出に先行する重力を用いた成層化操作と組み合わされ得る。さらに他の実施形態では、成層化またはメッシュストレーナを用いての流体の排出に先行して、洗浄用溶液が未処理脂肪組織に添加および混合され、それにより過剰流体が希釈され得る。洗浄用溶液を加えることにより、成層化または排出がより効果的となり得る。
【００７５】
本開示の他の実施形態では、過剰流体除去操作はストレーナを用いることなく流出口を有する容器に試料を入れ、次に過剰流体を排出することにより実施されてもよい。１つの実施形態では、容器は流体制御のための手段（例えばピンチバルブ）をさらに含み得る。過剰流体を除去するために、過剰流体は流出口を通して排出され得る。試料が流出口に近づくと、流出口は流体制御手段を用いて閉止され得る。流出口は、脂肪組織試料より小さい寸法を有してもよく、または脂肪組織試料の通過が可能となるようより大きい寸法を有してもよい。この操作は、手動で実施されてもよく、または流出口に対して試料を検出するセンサ（例えば光センサまたは赤外線センサなど）の支援により実施されてもよい。脂肪組織試料を洗浄または洗滌するために、洗浄用溶液が脂肪組織試料に加えられ、過剰流体除去操作は脂肪組織試料を洗浄するために反復され得る。図１Ａに示すこの方法の第２操作（操作１２０）は脂肪組織を解離することである。脂肪組織は超音波を用いて解離され得る。脂肪組織は解離溶液を用いて解離され得る。解離溶液は、脂肪組織の過剰な細胞マトリクスを分解する酵素を含み得る。解離溶液は、コラゲナーゼ、プロティアーゼ、プロテイナーゼ、中性プロティアーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、リパーゼ、トリプシン、リベラーゼ、ディーエヌアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、ペプシン、またはこれらの組合せを含み得る。解離溶液は、０．１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲（例えば約０．１ｍｇ／ｍｌ、約０．２ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ、約０．７５ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌ、約７ｍｇ／ｍｌ、または約１０ｍｇ／ｍｌ）の濃度のコラゲナーゼを含み得る。解離溶液はトリプシンを含み得る。解離溶液はコラゲナーゼおよびデオキシリボヌクレアーゼを含み得る。解離溶液はコラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、およびデオキシリボヌクレアーゼを含み得る。解離溶液は０．２ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの範囲のコラゲナーゼと、０．１ｍｇ／ｍｌ〜４ｍｇ／ｍｌの範囲のヒアルロニダーゼと、１ユニット〜４００ユニットの範囲のデオキシリボヌクレアーゼと、を含み得る。なお１ユニットは、４．２ｍＭのＭｇ＋＋濃度でＤＮＡを基質として用いて摂氏２５度およびｐＨ５．０で１ｍｌあたり毎分０．００１のＡ２６０に変化を生じさせる酵素活性として定義され得る。解離溶液はカルシウムイオンおよび／またはマグネシウムイオンをさらに含み得る。解離溶液は０．１ｍＭ〜１０ｍＭの範囲の濃度（例えば約０．１ｍＭ、約０．２ｍＭ、約０．３ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．７ｍＭ、約１ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、または約１０ｍＭ）のマグネシウムイオンまたはカルシウムイオンを含み得る。
【００７６】
解離溶液を加えた後、脂肪組織は特定の温度（例えば約摂氏３７度）および特定の時間的期間（例えば約５分〜約３０時間）で培養され得る。培養中、脂肪組織および解離溶液は、効率的な反応を支援するために、間欠的および／または連続的に混合され得る。脂肪組織解離操作または培養操作は、摂氏３７度で、および約１０分〜約１２０分の範囲（約１０分、約１５分、約２０分、約３０分、約４５分、約６０分、約７５分、約９０分、または約１２０分）で実施され、解離溶液中の脂肪組織試料は連続的または間欠的に緩やかに攪拌され得る。なお攪拌は３分毎を超える頻度（例えば１秒毎、２秒毎、３秒毎、５秒毎、１０秒毎、２０秒毎、３０秒毎、４５秒毎、６０秒毎、９０秒毎、１２０秒毎、または１８０秒毎）で実施され得る。
【００７７】
解離操作の終了時、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの金属イオンキレート剤が封鎖剤金属イオンに加えられ、解離溶液中の酵素の活性が停止され、温度が約摂氏４度〜３０度の範囲、（例えば、室温、約摂氏２５度、約摂氏２２度、約摂氏１８度、約摂氏１５度、約摂氏１２度、約摂氏８度、または約摂氏４度）、に低下され得る。温度は培養後、例えばおよそ摂氏２５度の室温または摂氏１８度〜摂氏２８度の範囲に保持され得る。他の実施形態では、解離操作の後、解離溶液において酵素を阻害するために血漿、多血小板血漿、または血清が加えられ得る。
【００７８】
図１Ａの方法の第３操作（操作１３０）は、フリーオイル、マトリクス繊維、組織残渣、および不要な細胞（例えば脂肪細胞など）を除去することである。脂肪細胞、マトリクス繊維、および組織残渣は、実質的に約１０μｍ〜７０μｍの範囲（例えば約１０μｍ、約１５μｍ、約２０μｍ、約２５μｍ、約３０μｍ、約３５μｍ、約４０μｍ、約５０μｍ、約６０μｍ、または約７０μｍ）の細孔寸法を有する細孔を含むメッシュストレーナを用いて除去され得る。他の実施形態では、解離された脂肪細胞試料は約２０μｍ〜約５０μｍの範囲（例えば約２０μｍ、約２２μｍ、約２５μｍ、約３０μｍ、約３５μｍ、約４０μｍ、約４５μｍ、および約５０μｍ）の細孔寸法を有するメッシュに通され得る。メッシュストレーナを通過する濾過液が収集され得る。代替的に、脂肪細胞、マトリクス繊維、および組織残渣は遠心分離を用いて実質的に除去され得る。
【００７９】
図１Ａの方法の第４操作、第５操作、および第６操作（操作１４０、１５０、および１６０）は、それぞれ赤血球（ＲＢＣ）を減少させること、対象細胞を濃縮すること、および細胞を洗浄することを含む。これら３つの操作の順序は相互交換可能であり得る。例えば、１つの実施形態では細胞は、最初に濃縮され、洗浄され、次にＲＢＣの減少が実施されてもよい。他の実施形態では、細胞は、最初に洗浄され次に濃縮されてもよい。さらに他の実施形態では細胞は、洗浄と濃縮とが同時に実施されてもよい。濃縮操作は、より小さい容積が望まれる用途で有利に実施され得る。例えば、脂肪組織から分離された細胞を培養することは多くの場合、研究において実施される。細胞培養フラスコにおける播種細胞密度を高めるために、および培養効率を増加させるために、細胞は濃縮され得る。分離された細胞は、ヒトまたは動物に移植または注入するために用いられ得る。その場合、より良好な結果がもたらされるよう、高い細胞濃度がしばしば望まれる細胞を濃縮することにより、以前の操作において用いられた試薬（例えば解離溶液中の酵素）が実質的に取り除かれるという利点ももたらされ得る。係る試薬は、動物またはヒト患者に移植された場合には、細胞成長を阻害し、または有害な結果をもたらし得る。１つの実施形態では対象細胞を濃縮するために、および／または赤血球を除去するために、マイクロ流体装置が用いられ得る。マイクロ流体装置は第４操作、第５操作、および／または第６操作を同時に達成するよう構成され得る。さらにマイクロ流体装置は免疫反応の可能性を小さくするためにリンパ球を除去するよう構成され得る。他の実施形態では、濃縮操作は遠心分離を用いて達成され得る。さらに他の実施形態では、濃縮操作はメンブレンフィルタを用いて達成され得る。さらに他の実施形態では、濃縮操作は中空ファイバ（例えば中空ファイバメンブレンフィルタ）を用いて達成され得る。さらに他の実施形態では、赤血球減少操作は、赤血球溶菌液（例えば塩化アンモニウムなど）を用いて達成され得る。なお係る溶液中で赤血球は選択的に溶解される。
【００８０】
図１Ａに示す実施形態の第６操作（操作１６０）は、対象細胞を洗浄すること、および／または対象細胞を所望の緩衝液に搬送することである。遠心分離、緩衝液交換、および／または透析方法が用いられ得る。代替的に、マイクロ流体装置がこの操作を実行するよう構成され得る。この操作は、以前の操作において用いられた残留試薬をさらに減少させ得、対象細胞が臨床的移植のために用いられる場合に望まれ得る。一方いくつかの実施形態では、操作１４０〜１６０は省略されてもよい。
【００８１】
本開示の１つの実施形態において、方法は、脂肪組織を事前調節することと、脂肪組織を解離することと、放出された細胞を精製することと、を含む。全般的に参照番号２００で示されるこの方法のこの実施形態のフローチャートが図１Ｂに示される。１つの実施形態において、脂肪組織事前調節操作（操作２１０）は、廃棄流体を排出すること、廃棄流体を除去すること、過剰流体を除去すること、脂肪組織試料を洗滌すること、脂肪組織試料を洗浄すること、および／または脂肪組織試料を細分化することを含む。細分化は、酵素を用いて消化または解離することが困難である大きい塊を脂肪組織試料が含む場合に、有利となり得る。脂肪組織事前調節操作は、本開示で開示する脂肪組織から非脂肪細胞集団を分離するための態様および実施形態を用いて達成され得る。例えば、脂肪組織事前調節操作は、脂肪組織試料を第１容器内で保持する一方で過剰流体（例えば血液、チューメセント溶液、または他の体液など）を第２容器へと通すことを含み得る。脂肪組織試料の保持は第１容器におけるメッシュを用いることにより達成され得る。１つの実施形態では、メッシュは約７０μｍ〜約３００μｍの範囲（例えば約８０μｍ、約９０μｍ、約１００μｍ、約１２０μｍ、約１４０μｍ、約１７０μｍ、約２００μｍ、または約３００μｍ）の細孔寸法を有する。代替的に、脂肪組織試料の保持は、第１容器においてメッシュを用いることなく、第１容器に対する脂肪組織試料の位置を検出する検出器またはセンサを用いて達成され得る。脂肪組織事前調節操作は、脂肪組織試料を洗浄するために１回または反復的に洗滌溶液を加えることおよび除去することをさらに含み得る。組織事前調節は遠心分離を用いても達成され得る。この場合、脂肪組織試料は遠心力下で過剰流体および／または廃棄流体から分別される。代替的に脂肪組織事前調節操作は、脂肪組織が解離および精製に対して許容可能な状況にある場合には省略されてもよい。
【００８２】
１つの実施形態において、脂肪組織解離操作（操作２２０）は、少なくとも１つの酵素（例えばコラゲナーゼ、プロティアーゼ、プロテイナーゼ、中性プロティアーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、リパーゼ、トリプシン、パパイン、リベラーゼ、ディーエヌアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、ペプシン、またはこれらの組み合わせ）を含む解離溶液中において酵素消化に好適な温度（例えば約摂氏３２度〜約摂氏３８度の範囲）および約３分〜２０時間の範囲の期間で脂肪組織試料を培養することを含む。他の実施形態では、脂肪組織解離操作は超音波を脂肪組織試料に通すことを含む。細胞は脂肪組織解離操作中に脂肪組織試料から放出される。
【００８３】
放出された細胞の精製（操作２３０）は、フィルタ、メッシュ、中空ファイバ、抗体、マイクロ流体装置、または遠心分離機を用いて、細胞濃縮、細胞洗浄、細胞分別、細胞分離、残渣除去、非対象細胞除去、赤血球減少、またはこれらの操作の組み合わせを含み得る。看護用途および現場用途などの多数の用途に対して、本開示の方法全体が短い時間的期間（例えば１５分、２０分、３０分、４５分、６０分、９０分、または１２０分など）で実施されることが望ましいであろう。
【００８４】
本明細書で開示される非脂肪細胞集団を脂肪組織から分離するための多数の操作および実施形態は、研究調査および薬理学的試験システムにおいて用いられ得る。非脂肪細胞の分離は、生理学的、代謝、および機能的研究、または薬理学的試験システムにおける薬物試験のために実施され得る。本明細書で開示する多数の操作および実施形態は、移植のための再生医学においても用いられ得る。本明細書で開示する方法および／または装置を用いて取得される細胞をインビトロで培養すると、移植のためのインビトロ培養組織が形成され得る。脂肪由来の幹細胞は、機能細胞および組織を生成するために分離され得る。
【００８５】
本開示の１つの実施形態は、図２Ａにおいて全般的に参照番号３００で概略的に示される試料処理装置である。試料処理装置３００は、試料調節チャンバ３１０および廃棄物チャンバ３２０を含む。試料調節チャンバ３１０は、試料３４０（例えば脂肪吸引からの吸引脂肪組織または脂肪組織試料）を受け取るための第１流入口３０５と、洗滌溶液（例えば緩衝液、生理食塩水溶液、その他など）を洗滌溶液供給源３５０から受け取るための第２流入口３１５と、調節済み試料３６０を収集するための第１流出口３２５と、廃棄物容器３２０に接続する第２流出口３３５と、を含む。第２流出口３３５は、流体接続を開放または閉止するための手段３４５（例えばバルブ、ピンチバルブ、ストップコック、その他など）を調節チャンバ３１０と廃棄物容器３２０との間に含み得る。試料調節チャンバ３１０は、試料が、廃棄物容器に過剰流体を排出することと、洗滌溶液を用いて洗浄されることと、を可能にする。調節チャンバは、過剰流体または洗滌溶液が廃棄物容器へと排出されるときに試料が流出口に接近しつつあるかどうかを検出するためのセンサを、好適には第２流出口３３５に近接して、さらに含む。調節チャンバは、試料洗浄の間、試料洗滌の間、および過剰流体除去の間に脂肪組織を保持するよう構成されたストレーナを第１流入口３０５と第２流出口３３５との間にさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ストレーナは約３０μｍ〜約１ｍｍの範囲（例えば約３０μｍ、約５０μｍ、約７０μｍ、約８５μｍ、約１００μｍ、約１２０μｍ、約１４０μｍ、約２００μｍ、約３００μｍ、約５００μｍ、約７００μｍ、または約１ｍｍ）の細孔寸法を有する細孔を含むフィルタを含み得る。他の実施形態では、ストレーナは約７０μｍ〜約５００μｍの範囲（例えば約７０μｍ、約１００μｍ、約１４０μｍ、約２００μｍ、約３００μｍ、または約５００μｍ）の細孔寸法を有する細孔を含み得る。ストレーナは約７０μｍ〜約２００μｍの範囲（例えば約８０μｍ、約９０μｍ、約１００μｍ、約１２０μｍ、約１４０μｍ、約１７０μｍ、または約２００μｍ）の細孔寸法を有するメッシュフィルタを含み得る。他の実施形態では、ストレーナは、脂肪組織片がストレーナにより保持されるよう、脂肪組織片よりも小さい細孔寸法を有する。
【００８６】
洗滌溶液は、調節チャンバに加えられる洗滌溶液の容積を制御する流れ制御装置３３０（例えば蠕動ポンプなど）を介して調節チャンバに進入し得る。流れ制御装置は少なくとも１つのバルブおよび可変容量容器を含み得る。例えば、流れ制御装置は図２Ｂに概略的に示すようにストップコック３７０およびシリンジ３８０を含み得る。測定された容積を吐出するために、ストップコックは最初、流入口がシリンジに流体的に接続される位置へと切り替えられる。シリンジのプランジャを引くと、流体が流入口からシリンジへと引き込まれる。次にストップコックは、流出口が流体的にシリンジに接続される位置に切り替えられる。次にシリンジのプランジャが押されると、流体がシリンジから流出口を介して吐出される。最終的にストップコックが再び切り替えられると、シリンジが流入口に流体的に接続され、ポンプサイクルが完了する。所望容量の洗滌溶液が調節チャンバに加えられるまで、ポンプサイクルは反復され得る。流れ制御装置は、２つのチェックバルブ（すなわち１つの方向における流体流を可能にするバルブ）ＣＶ１およびＣＶ２、および図２Ｃに概略的に示すシリンジも含み得る。測定された容積を吐出するために、シリンジのプランジャをまず引き、引き続き押すと、ポンプサイクルが完了する。第１チェックバルブ（ＣＶ１）は流体が流入口からシリンジに流れることが可能となるよう構成され、第２チェックバルブ（ＣＶ２）は、流体がシリンジから流出口に流れることが可能となるよう構成される。ポンプサイクルは、プランジャを押すこと、および引くことにより、それぞれ流体をシリンジへと押し入れること、およびシリンジから引き出すことを含むものであり、所望容積の洗滌溶液が調節チャンバに加えられるまで反復され得る。代替的に、図２Ｂまたは図２Ｃに示す流れ制御装置におけるシリンジは、膨張および収縮が可能なバッグ、または制御された手法で容積を変化させることが可能である容器と置き換えられ得る。
【００８７】
本開示の他の実施形態は、図２Ｄにおいて全般的に参照番号４００で概略的に示される試料処理装置である。試料処理装置４００は試料解離チャンバ４１０および細胞精製装置４２０を含む。解離チャンバは、試料を受け取るための第１流入口４０５と、解離溶液を解離溶液供給源４３０から受け取るための第２流入口４１５と、細胞精製装置に流体的に接続する少なくとも１つの流出口４２５と、を含む。解離チャンバは、試料をより小さい成分（例えば単一の細胞または小さい細胞集塊）へと解離するよう構成される。解離溶液は試料を分解する酵素を含み得る。例えば、解離溶液は、コラゲナーゼ、プロティアーゼ、プロテイナーゼ、中性プロティアーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、リパーゼ、トリプシン、リベラーゼ、ディーエヌアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、ペプシン、またはこれらの組合せを含み得る。温度は例えば約摂氏３７度に制御され、解離チャンバ内の試料および流体は、効果的な酵素反応および均等な解離が支援されるよう、混合され得る。解離チャンバの１つの実施形態は可撓性バッグである。このバッグをマッサージすること、圧搾すること、丸めること、揺動させること、揺さぶること、部分的な圧搾および弛緩を繰り返すこと、または別様に刺激することにより、混合が支援され得る。解離溶液は洗浄剤（例えばＴｗｅｅｎ２０またはドデシル硫酸ナトリウム）も含み得る。試料を解離するために超音波が用いられる場合、解離溶液は、効果的に超音波を伝導する媒体を含み得る。解離チャンバはストレーナ（例えばメッシュまたはフィルタなど）を含み得る。ストレーナは、効果的な解離のために試料を１つの位置に保持すること、および／または解離された試料から大きい残渣を除去することを行うよう機能し得る。いくつかの実施形態では、ストレーナは約３０μｍ〜約１ｍｍの範囲（例えば約３０μｍ、約５０μｍ、約７０μｍ、約８５μｍ、約１００μｍ、約１２０μｍ、約１４０μｍ、約２００μｍ、約３００μｍ、約５００μｍ、約７００μｍ、または約１ｍｍ）の細孔寸法を有する細孔を含むフィルタを含み得る。他の実施形態では、ストレーナは約７０μｍ〜約５００μｍの範囲（例えば約７０μｍ、約１００μｍ、約１４０μｍ、約２００μｍ、約３００μｍ、または約５００μｍ）の細孔寸法を有する細孔を含み得る。ストレーナは約７０μｍ〜約２００μｍの範囲（例えば約８０μｍ、約９０μｍ、約１００μｍ、約１２０μｍ、約１４０μｍ、約１７０μｍ、または約２００μｍ）の細孔寸法を有するメッシュフィルタを含み得る。他の実施形態では、ストレーナは、脂肪組織がストレーナにより保持されるよう、脂肪組織片よりも小さい細孔寸法を有する。
【００８８】
細胞精製装置は解離チャンバに接続される。いくつかの実施形態において、試料処理装置はバルブ４３５を解離チャンバと細胞精製装置との間にさらに含む。このバルブを閉止すると、解離溶液による試料の培養が可能となり、このバルブを開放すると、放出された細胞が細胞精製装置に進入することが可能となり得る。
【００８９】
細胞精製装置は、放出された細胞を解離チャンバから受け取ることと、放出された細胞を精製することと、を行うよう構成される。いくつかの実施形態では、細胞精製装置は、流入口４４５を介して解離チャンバに流体的に接続されたチャンバと、精製された細胞４４０を採取するための流出口４５５と、解離された試料中の大きい残渣を除去するよう構成されたストレーナと、を含む。ストレーナは約１０μｍ〜１００μｍの範囲（例えば約１０μｍ、約１５μｍ、約２０μｍ、約２５μｍ、約３０μｍ、約３５μｍ、約４０μｍ、約５０μｍ、約７０μｍ、または約１００μｍ）の細孔寸法を有するフィルタを含み得る。ストレーナは約２０μｍ〜６０μｍの範囲（例えば約２０μｍ、約２２μｍ、約２５μｍ、約３０μｍ、約３５μｍ、約４０μｍ、約５０μｍ、および約６０μｍ）の細孔寸法を有するメッシュも含み得る。
【００９０】
本開示の他の実施形態は、図２Ｅにおいて全般的に参照番号５００で概略的に示される試料処理装置である。試料処理装置５００は第１チャンバ５１０、廃棄物容器５２０、および細胞精製装置５３０を含む。細胞精製装置は上記で開示したメッシュを含み得る。第１チャンバは、試料が解離の前に洗浄され得る事前調節チャンバ、および試料がより小さい成分（例えば単一の細胞または小さい細胞集塊など）に解離され得る解離チャンバとして機能し得る。第１チャンバは、試料を受け取るための第１流入口５０５と、洗滌溶液供給源３５０から洗滌溶液を受け取るための第２流入口５１５と、を含む。いくつかの実施形態では、洗滌溶液および解離溶液は同一流入口を介して第１チャンバに進入し得る。他の実施形態では第１チャンバは、解離溶液供給源４３０から解離溶液を受け取るための第３流入口５２５を含む。第１チャンバは、解離チャンバおよび調節チャンバに関して以前の段落で説明したようにストレーナ（例えばメッシュまたはフィルタ）をさらに含み得る。第１チャンバは廃棄物チャンバおよび細胞精製装置に流体的に接続される。流体流を制御するためにバルブＶ１およびＶ２（例えばピンチバルブまたはクランプバルブを含み得る）が用いられ得る。例えば、試料を事前調節する間、過剰流体および洗滌溶液が第１チャンバから廃棄物容器へと流れ込むことが可能となるよう、バルブＶ１は開放され得る。試料解離の間、解離溶液による試料の培養が可能となるよう、Ｖ１およびＶ２の両方は閉止され得る。解離の後、解離された試料が細胞精製装置へ搬送されることが可能となるよう、Ｖ２は開放され得る。
【００９１】
本開示のいくつかの実施形態において、脂肪組織試料は第１チャンバ５１０へと装填される前に特定の温度（例えば摂氏３７度）へと事前昇温される。脂肪組織試料の処理としての事前昇温は組織試料を処理するために要求される時間を短縮し得る。本開示の他の実施形態において、脂肪組織試料は、第１チャンバ５１０へと装填される前に、３００ｎｍ〜７００ｎｍの範囲の平均波長を有する光を用いて光活性化される。光活性化により、組織試料中の細胞の有効性が大きくなり得る。本開示のさらに他の実施形態において、脂肪組織試料は、第１チャンバ５１０へと装填される前に、音響波（すなわち組織を弛緩させ組織試料の解離を容易たらしめる音波）を用いて処理される。
【００９２】
試料処理装置は、洗滌溶液が第１チャンバに進入する流れを制御するために上述の流れ制御装置３３０をさらに含み得る。流れ制御装置３３０Ｂ（流れ制御装置３３０と同様のものであり得る）は、第１チャンバに注入される解離溶液の流れを制御するためにも用いられ得る。いくつかの実施形態では、解離溶液は、第１チャンバに注入される前に、シリンジに装填される。
【００９３】
本明細書で開示する試料処理装置が異なる変化例および組み合わせを有することが理解されるであろう。例えば、図２Ｆに示すように、全般的に参照番号５００Ａで示される試料処理装置の実施形態は、第１チャンバ、廃棄物容器、および細胞精製装置の間の流体流を制御するために２つのバルブ（Ｖ１およびＶ２）を用い得る。流れ制御装置は２つのチェックバルブ（ＣＶ１およびＣＶ２）と容積測定装置５４０（例えばシリンジなど）とを含み得る。解離溶液はチェックバルブＣＶ３を介して第１チャンバに接続され得る。
【００９４】
本開示の試料処理装置の他の実施形態は、図２Ｇにおいて全般的に参照番号５００Ｂで概略的に示される試料処理装置である。この試料処理装置では、少なくとも３つのストップコック（ＳＣ１、ＳＣ２、およびＳＣ３）が流体流を制御するために用いられる。例えば、試料を事前調節する間、過剰流体および洗滌溶液は第１チャンバから廃棄物容器へと搬送され得る。ストップコック（ＳＣ３）が第１チャンバから出る流れを閉止すると、試料解離の間、解離溶液により試料の培養が可能となる。解離の後、解離された試料が細胞精製装置へ搬送されることが可能となるよう、ストップコック（ＳＣ３）は第１チャンバを細胞精製装置に接続し得る。
【００９５】
図３Ａは、図２Ｅに概略的に示される装置の実施形態を示す。この装置は２つのプラスチックシートを含む。これらのプラスチックシートが一緒に接合され、それにより複数のチャンバが形成される。この装置は、本明細書で開示する脂肪組織処理のための方法を、円滑化され、使いやすく、安全で、費用対効果が大きい様式で支援し得る。チャンバ１は特定の容積に膨張され得る測定チャンバである。このチャンバは、流入口（ポート１）および流出口（ポート２）を含む。チャンバ１は、流体を取り入れ、事前決定された特定容積の流体を吐出し、それにより脂肪組織処理のために流入口（ポート３）を通してチャンバ２へと吐出される流体の容積が制御されるよう構成され得る。ポート２およびポート３は１本のチューブにより流体的に接続され得る。ピンチバルブ、クランプバルブ、ストップコック、チェックバルブ、または他のバルブ機構（単数または複数）を用いて係るチューブを締め付けると、ポート２とポート３とが流体的に切断され得る。チャンバ１を動作させるために、ポート２とポート３との間の接続は最初は切断される。流体がポート１を介してチャンバ１へと導入されると、チャンバ１は完全にまたは部分的に膨張される。ポート１は次に例えばピンチクランプ、ピンチバルブ、ストップコック、チェックバルブ、または他のバルブ機構（単数または複数）を用いて閉止される。次にポート２とポート３との間のバルブが開放される。それによりチャンバ１内の流体は、チャンバ１が収縮されると、チャンバ２へと流れ込むことができる。チャンバ１の収縮は、重力、サイフォン作用、または当該技術分野で周知の他の方法を用いてチャンバ１を外的に圧搾および／または圧縮することにより、達成され得る。流体が重力を用いてチャンバ２に吐出されることを支援するために、チャンバ１はチャンバ２よりも高い位置に配置され得る。このプロセスにより事前決定された量の流体がチャンバ２に搬送される。係る量は、チャンバ１の膨張容積と収縮容積との間の差異により決定される。より少量の流体が望まれる場合は、チャンバ１に対して進入および／または流出する流体の容積が制御されるよう、チャンバ１は部分的に圧縮、圧搾、および／または締め付けられ得る。代替的にチャンバ１は、チャンバ１内の流体の１部分が吐出されるよう、部分的にのみ収縮され得る。より大量の容積が望まれる場合には、所望容積の流体がチャンバ２に搬送されるまで、膨張・収縮プロセスが数回反復され得る。
【００９６】
チャンバ１、ポート１、およびポート２は、図２Ｂまたは図２Ｃに概略的に示す流れ制御装置の実施形態であり得る。
【００９７】
ポート１およびポート２は、それぞれ流体がチャンバ１に進入することおよび流出することのみを可能にする逆止め弁としても知られるチェックバルブを含み得る。所定容積の流体を測定および吐出する動作は非常に簡単となる。すなわち、チャンバ１を膨張させると流体がポート１を介して進入することが可能となり、チャンバ１を圧縮すると流体はポート２を介して押し出されることが可能となる。
【００９８】
代替的にチャンバ１は格納チャンバであり得る。格納チャンバを提供することにより、試料処理に対して必要とされる事前パッケージされた溶液が供されることとなる。例えば、乳酸リンゲル液、緩衝塩類溶液、生理食塩水溶液、解離溶液、洗浄用溶液、洗滌溶液、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む溶液、および／または酵素溶液が、本装置の一部としてチャンバ１内にパッケージされ得る。
【００９９】
他の実施形態では、測定チャンバはプランジャを含むシリンジを含み得る。係るシリンジは、プランジャを引き出すことおよび押し込むことにより、事前決定された容積の流体を吸い込むことおよび／または吐出することを行い得る。さらに他の実施形態では、測定チャンバは蠕動ポンプ上に取り付けられた可撓性チューブを含み得る。ここで流体流は蠕動ポンプを用いて制御され得る。
【０１００】
チャンバ２は図２Ｅに概略的に示す第１チャンバ５１０の実施形態であり得る。チャンバ２は、１つまたは複数の流入口および流出口を含む脂肪組織洗浄チャンバであり得る。チャンバ２は解離チャンバとしても作用し得、少なくとも１つのメッシュ（例えばスクリーン、半透過膜、および／または多孔性膜もしくは微孔性膜を含むフィルタ機構）をさらに含み得る。脂肪組織試料（例えば吸引脂肪組織または吸引脂肪組織片など）は流入口（ポート４）を介してチャンバ２へと導入または装填され得る。試料からの過剰流体はメッシュを通してコネクタ１を介して廃棄物収集チャンバ（チャンバ３）へと排出され得る。洗浄用溶液は試料を洗浄および／または洗滌するためにチャンバ２に加えられ得る。洗浄用溶液は測定され、チャンバ１を介してチャンバ２へと吐出され得る。試料を処理するための溶液は、試料を変化させるために加えられ得る。洗滌および洗浄がより効果的となるよう、混合手段がチャンバ２に加えられ得る。例えばチャンバ２は、混合が支援されるよう、マッサージすること、穏やかに圧搾すること、揺動させること、揺さぶること、部分的な圧搾および弛緩を繰り返すこと、または別様に刺激することが行われ得る。次に廃棄流体は廃棄物収集チャンバ（チャンバ３）に排出され得る。チャンバ２の流出口（コネクタ１および２）は、混合中、廃棄流体が排出される前に洗浄用溶液と試料との間の完全な混交が可能となるよう、バルブ手段を用いて閉止され得る。これらのチャンバを締め付けることによりチャンバ間の流体接続を閉止するために、クランプ（例えば図３Ｆに示すクランプ１、２、および／または請求項３）が加えられ得る。洗浄プロセスは数回（例えば２回、３回、４回、または５回）反復され得る。洗浄操作中、脂肪組織試料はチャンバ２内に保持され得る。小さい集塊を含む脂肪組織試料に対しては、試料が効果的に保持されるよう、チャンバ２はメッシュまたはメンブレンフィルタを含み得る。所望の脂肪組織保持がもたらされるよう、複数のメッシュ層および／またはフィルタ層（メッシュ１およびメッシュ２）が組み込まれ得る。
【０１０１】
洗浄後、脂肪組織試料が解離され細胞が放出されるよう、解離溶液がチャンバ２に加えられ得る。試料の解離が支援されるよう、チャンバ２の温度は加熱、冷却、および／または温度制御システムを用いて特定の最適温度に設定され得る。例えば、装置は、最適な酵素消化のために温度が約摂氏３７度に保持されるよう、培養器内、水槽内に配置されてもよく、および／または定温プレートに接触して配置されてもよい。解離溶液は、結合マトリクス（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｍａｔｒｉｘ）、細胞外マトリクス、その他を分解するために１つまたは複数の酵素を含み得る。例えば、膠原線維を分解するためにコラゲナーゼが摂氏３７度で用いられ得る。他の試薬（プロテイナーゼ、プロティアーゼ、トリプシン、プロテイナーゼＫ、リアーゼ、酵素、溶菌液、ヒアルロニダーゼ、リパーゼ、トリプシン、リベラーゼ、ディーエヌアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、ペプシン、またはこれらの組み合わせを含む）も脂肪組織消化のために用いられ得る。解離チャンバ（チャンバ２）における流出口（コネクタ１および／またはコネクタ２）は、消化中、閉止され得る。チャンバ２は、混合が支援され、効果的な脂肪組織解離が促進されるよう、マッサージすること、穏やかに圧搾すること、揺動させること、揺さぶること、部分的な圧搾および弛緩を繰り返すこと、または別様に刺激することが行われ得る。消化が完了するとコネクタ２が開放され、放出された細胞は解離チャンバから出ることができる。チャンバ２における少なくとも１つのメッシュは、大きい残渣を除去または保持するよう作用し得る。洗浄用溶液を加えることを含む１つまたは複数の追跡洗浄（ｃｈａｓｅ  ｗａｓｈ）操作は、消化後にチャンバ２内に捕捉される可能性がある細胞を洗滌するために適用され得る。
【０１０２】
図３Ａに示す試料処理装置は、メッシュ、メンブレンフィルタ、および／または他の残渣除去機構（例えばメッシュ３）を含み得る残渣除去チャンバ（チャンバ４）をさらに含み得る。解離された試料は残渣除去チャンバに搬送され得る。残渣除去チャンバにおいて、大きい凝集塊、不要な細胞（例えば含脂肪細胞など）、および／または残渣が試料から除去され得る。チャンバ４は試料格納チャンバとしても作用し得る。試料格納チャンバにおいて、放出された細胞が、次回の使用時まで、収容される。放出された細胞はポート５を介して収集され得る。チャンバ４は、図２Ｅに概略的に示す細胞精製装置５３０の実施形態であり得る。
【０１０３】
図３Ｂおよび図３Ｃは、メッシュがチャンバ４に組み込まれた実施形態を示す。メッシュは、折り畳まれ、２つの可撓性シートの間で挟持され、および溶接、接着、熱融着、もしくは別様に融合されることにより、チャンバ４が形成され得る。同様にメッシュまたはメンブレンフィルタは、チャンバ２に組み込まれ得る。図３Ｄおよび図３Ｅはそれぞれチャンバ２の１部分の分解図および断面図を含み、１つまたは複数のメッシュがチャンバ２に用いられ得ることを示す。チャンバ２および／またはチャンバ４に含まれるメッシュは、チャンバ２および／またはチャンバ４を通る流体の流路に沿って徐々に小さくなる細孔を含み得る。例えばメッシュ１（図３Ｄ）の公称細孔寸法は約１００μｍ〜約９００μｍの範囲であり得、メッシュ２の公称細孔寸法は約５０〜約２００μｍの範囲であり得、メッシュ３（図３Ｃ）の公称細孔寸法は約１０μｍ〜約６０μｍの範囲であり得る。
【０１０４】
本開示が、図３Ａ〜図３Ｆに示す実施形態の特定構成に限定されないことは理解されるであろう。本開示の実施形態は、図３Ａ〜図３Ｆに示すチャンバの個数よりも、より多数のチャンバを含んでもよく、またはより少数のチャンバを含んでもよい。様々な機能を有するチャンバが用いられ得、係るチャンバは特定順序の操作を含む特定タスクを達成するよう構成され得る。例えば、これらのチャンバは、試料収集、洗浄、洗滌、成層化、混合、加熱、冷却、濾過、消化、格納、バルブ動作、容積測定、ポンプ動作、流体の搬送ならびに操作、細胞ラベル化、試料処理、解離、廃棄流体収集、凝集塊除去、残渣除去、溶解、濃縮、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、培養、ハイブリダイゼーション、細胞培養、細胞膨張、その他を含むがこれらに限定されない機能を有し得る。
【０１０５】
図４において全般的に参照番号６００で概略的に示される本開示の試料処理装置の他の実施形態は、２つのプラスチックシートを用いて形成される。チャンバ１は試料洗浄・解離チャンバであり、３つの流入ポート（ポート１、ポート２、およびポート３）と、メッシュ（メッシュ１）と、２つの流出口コネクタ（コネクタ１およびコネクタ２）と、を含む。チャンバ２は凝集塊低減チャンバであり、流入口コネクタ（コネクタ２）と、流出口／流入口コネクタ（コネクタ３）と、メッシュ（メッシュ２）と、を含む。所望によりメッシュ（メッシュ３）を含むチャンバ３は、分離された細胞のための、さらには残渣除去のための貯蔵槽、または細胞精製チャンバであり得る。チャンバ４は廃棄溶液収集チャンバであり、試料洗浄・解離チャンバ（チャンバ１）の流出口コネクタに流体連通する流入管（コネクタ１）を含む。
【０１０６】
図５Ａおよび図５Ｂは、２つのメッシュを含む本開示の他の実施形態のチャンバ６１０を示す。２つのメッシュは実質的に重なり合わないよう構成される。各メッシュは折り畳まれて、２つの可撓性外側シートの間に挟持される。シートの間に２つの層のメッシュを融合することのみが要求されるため、この実施形態は作製が容易であるという利点を有し得る。
【０１０７】
図６Ａおよび図６Ｂは、２つの可撓性外側シートの間に挟持された少なくとも１つの折り畳まれないメッシュを含む、本開示のさらに他の実施形態のチャンバ６２０を示す。メッシュは、流入ポートと流出ポートとの間に配置され、流入ポートから進入する流体が流出ポートに達するにはメッシュを通過しなければならないよう構成される。流入ポートおよび流出ポートはメッシュを挟んで互いに反対側にある。唯一の層のメッシュが２つのシート間に密閉されることのみが要求されるため、この構成は作製が容易であるという利点を有し得る。
【０１０８】
図７は、２つの可撓性外側シートの間に挟持されたプリーツ付きのメッシュを含む、本開示のさらに他の実施形態のチャンバ６３０を示す。この構成はメッシュ面積が大きくなるという利点を有し得る。
【０１０９】
図８Ａおよび図８Ｂは、本開示のさらに他の実施形態のチャンバ６４０を示す。ここではチャンバへと組み込まれる前に、メッシュは折り畳まれて密閉縁部に沿って密閉され、それによりポーチが形成される。１つのプラスチックメッシュ（例えばポリアミドメッシュ）が折り畳み線に沿って折り畳まれ、例えばヒートシーリングまたは高周波溶接を用いて密閉線に沿って密閉され、それによりメッシュポーチが形成される。次にメッシュポーチが２つの可撓性プラスチックシート（例えばポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）シートなど）間に配置され、例えばヒートシーリングまたは無線周波数溶接を用いて密閉周縁部に沿って密閉されると、それによりチャンバが形成され得る。
【０１１０】
図９Ａおよび図９Ｂは、本開示のさらに他の実施形態のチャンバ６５０を示す。ここではメッシュが折り畳まれ、２つの可撓性プラスチックシート間で挟持され、チャンバへと密閉される。ここでチャンバおよびメッシュは、流入ポートを介してチャンバに進入する試料がメッシュを通過することなく流出ポート１を介して流出する一方で流出ポート２を介して流出する試料の部分はメッシュを通過しなければならないよう、構成される。メッシュの折り畳み線は略垂直である。他の実施形態では、折り畳み線は垂直に対して一定の角度をなし得る。
【０１１１】
図５Ａ〜図９Ｂに示す１つまたは複数のメッシュ構成は、本明細書で開示するいずれかの試料処理装置のいずれかのチャンバ（例えば、試料処理装置５００のチャンバ２またはチャンバ４のうちの１つまたは複数、および／または試料処理装置６００のチャンバ１、チャンバ２、および／またはチャンバ３のうちの１つまたは複数）において利用され得る。
【０１１２】
図１０Ａおよび図１０Ｂは２つのチャンバ間のコネクタを示す。係るコネクタは、本明細書で開示する試料処理装置のいずれかの実施形態に含まれ得る少なくとも１つのチューブ部分を含み得る。プラスチックシートが切断され、チューブは１つのチャンバから他方のチャンバへと切断部を横切って橋渡しされる。この構成は、バルブ手段がチューブにアクセスすることを可能にし得る。例えばチューブを通る流体接続を断続するために、ピンチクランプまたはスライドクランプが用いられ得る。チューブ部分は、信頼性の高い締め付けを支援するために、柔軟性および可撓性を有する区間（図１０Ａおよび図１０Ｂにおけるチューブ２）をさらに含む。これは、ピンチバルブが用いられる場合、利点となり得る。ピンチバルブは、手動により、空気圧により、またはソレノイドを用いて、作動され得る。可撓性チューブは必要時に蠕動ポンプ動作を支援し得る。
【０１１３】
本明細書で開示する試料処理装置の実施形態は、図１１に示す他の部分（例えば洗浄用溶液バッグに挿入可能なスパイク、１つまたは複数のピンチクランプ、Ｙ字形挿入部位、スパイクポート、および／またはシリンジに接続するためのルアーコネクタなど）をさらに含み得、および／またはより大規模なシステムの一体化された部分として他のモジュールに接続され得る。隔壁、注入ポート、スパイクポート、バルブ、チェックバルブ、チューブ、アダプタ、ルアー、雌型ルアーロック、雄型ルアーロック、シリンジ、ストップコック、および／または他の接続機構が本開示の実施形態の部分と他の部分とを相互接続するために用いられ得る。
【０１１４】
本開示の他の実施形態は、試料解離チャンバ（チャンバ１）と、廃棄物容器（チャンバ２）と、細胞精製チャンバ（チャンバ３）と、を含む、図１２で全般的に参照番号７００で示す試料調製装置である。チャンバ１は試料の洗浄、洗滌、および事前調節を支援するために第１フィルタメッシュを所望により含み得る。メッシュは約２０μｍ〜約６００μｍの範囲の細孔寸法を有する細孔を含む。吸引脂肪組織試料を処理するにあたっては、メッシュは約４０μｍ〜約２００μｍの範囲（例えば約４０μｍ、約５０μｍ、約６０μｍ、約７０μｍ、約８０μｍ、約９０μｍ、約１００μｍ、約１２０μｍ、約１４０μｍ、約１７０μｍ、または約２００μｍ）の細孔寸法を有することが好適であろう。ストップコックはポート５における流体接続を制御する。このストップコックは、試料の解離および培養が実行される間は閉止され、試料洗浄が実行される間はポート７を介してチャンバ２に接続され、放出された細胞を収集するためにポート６を介してチャンバ３に接続され得る。チャンバ３は約１５μｍ〜約１５０μｍの範囲の細孔寸法を有する第２フィルタメッシュを含み得る。第２メッシュは解離された試料から残渣を除去し、放出された細胞を精製する。精製済みの細胞はポート８において収集され得る。この装置は、試料を受け取るための開口部（例えばポート４）（この開口部はスパイクポートを含み得る）と、洗滌溶液を受け取るための流入口（例えばポート１）（この流入口はスパイクを含み得る）と、解離溶液を受け取るための少なくとも１つの流入口（例えばポート２）と、をさらに含み得る。
【０１１５】
本開示のさらに他の実施形態は、試料解離チャンバ（チャンバ１）と、廃棄物容器（チャンバ２）と、細胞精製チャンバ（チャンバ３）とを形成するために事前決定されたパターンで接着された２枚の可撓性シートの物質（例えばプラスチック）を含む、図１３で全般的に参照番号８００で示す試料調製装置である。チャンバ１は試料の洗浄、洗滌、および事前調節を支援するために第１メッシュ（メッシュ１）を含み得る。チャンバ３は、第１メッシュの細孔寸法よりも小さい細孔寸法を有する第２メッシュ（メッシュ２）を含み得る。ストップコック１はチャンバ１、チャンバ２、およびチャンバ３の間の流体接続を制御する。チャンバ１は、試料をシリンジ（例えばカテーテル先端部を有するシリンジ）から受け取ることを支援するコネクタを含む流入ポート（ポート１）を含む。チャンバ１は、ストップコック２およびストップコック３を含むストップコックマニホールドに接続される他のポート（ポート２）をさらに含む。洗滌溶液（例えば乳酸リンゲル注射液）がスパイクを介して試料調製装置に接続され得る。シリンジ１およびストップコック２は協働して、定められた量の洗滌溶液がチャンバ１に加えられることを可能にする流れ制御装置として作用し得る。解離溶液がシリンジ２へと装填され、ストップコック３を介して試料調製装置に加えられ得る。解離溶液が濃縮された形態でシリンジ２に装填され、洗滌溶液を用いて通常の実用濃度へと再構築され得る。チャンバ３は、放出された細胞が収集される流出ポートを含む。いくつかの実施形態では、流出ポートにおいて圧力を高めることが望ましい。チャンバ３は加圧チャンバ（チャンバ４）内で気密的な様式で密閉され得る。チャンバ４は圧力ポートを含む。この圧力ポートにおいて、加圧流体（例えば圧縮空気）がチャンバ３の可撓性シートを通して間接的にチャンバ３内の流体を加圧するために加えられ得る。チャンバ３の実施形態が図１３Ｂに示され、チャンバ４を含む加圧チャンバの実施形態が図１３Ｃに示される。チャンバ３は、事前決定された場所において２枚の可撓性シートを一緒に接合することにより形成される（図１３Ｂ）。切断部（切断部１）がシートに作られ、それにより他のシートがチャンバ３を密閉し、チャンバ４を形成することが可能になる。
【０１１６】
本開示の他の実施形態は下流側処理ユニット（図１４に示すＤＰＵ１０００）を含む。下流側処理ユニットは、脂肪組織および／または分離された細胞をさらに処理、精製、培養、膨張、および／または分析し得る。下流側処理ユニットは以下の機能（例えば試料洗浄、試料濃縮、試料分別、試料高濃度化、試料分離、緩衝液交換、試料ラベル化、試料変質、濾過、磁気ラベル化、磁気分別、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、抗体相互作用、抗体を使用するアフィニティーキャプチャ、細胞の撮像、酵素結合免疫吸着測定法（エライサ）、タンパク質調製、タンパク質精製、タンパク質高濃度化、質量分光測定、高速液体クロマトグラフィー、フローサイトメトリー、細胞分類、機能アッセイ、細胞培養、細胞膨張、細胞分化、免疫表現型検査、ラテラルフローアッセイ、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ハイブリダイゼーション、リボ核酸（ＲＮＡ）ハイブリダイゼーション、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）反応、リボ核酸（ＲＮＡ）反応、その他など）のうちの１つまたは複数を支援するよう構成され得る。
【０１１７】
下流側処理ユニットは少なくとも１つのマイクロ流体装置を含むマイクロ流体ユニットを含み得る。マイクロ流体装置は、１ｍｍより小さい少なくとも１つのチャネル寸法（例えば約０．９５ｍｍ、約８００μｍ、約６００μｍ、約５００μｍ、約４００μｍ、約３００μｍ、約２００μｍ、約１５０μｍ、約１００μｍ、約８０μｍ、約６０μｍ、約５０μｍ、約４０μｍ、約３０μｍ、約２０μｍ、および／または約１５μｍ）を含み得る。マイクロ流体装置は少なくとも１つの実質的に一定深さのチャネルも含み得る。例えばマイクロ流体装置は、約１ｍｍ、約８００μｍ、約６００μｍ、約５００μｍ、約４００μｍ、約３００μｍ、約２００μｍ、約１５０μｍ、約１００μｍ、約８０μｍ、約６０μｍ、約５０μｍ、約４０μｍ、約３０μｍ、約２０μｍ、または約１５μｍの深さを有するチャネルを含み得る。マイクロ流体装置のチャネル深さは公称チャネル深さの２０％の範囲内であり得る。マイクロ流体装置は、実質的に平坦であるかまたは湾曲し得る実質的に１つの表面上にチャネルをさらに含み得る。マイクロ流体装置は１つまたは複数の実質的な平坦表面上に形成されたチャネルも含み得る。
【０１１８】
マイクロ流体装置は、光リソグラフィー、エッチング、反応性イオンエッチング、深堀り反応性イオンエッチング、ウェットエッチング、インプリンティング、射出成形、エンボス加工、ソフトエンボス加工、ステレオリソグラフィー、成型、ソフトリソグラフィー、陽極接合、超音波ボンディング、自己組織化、および／または当該技術分野で周知の他の製作技術を含むがこれらに限定されないマイクロ加工、ナノ加工、および／または微細機械加工技術を用いて形成され得る。
【０１１９】
本開示のマイクロ流体ユニットの実施形態は、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１０／０６１８６６号、国際公開第２０１１／０７９２１７（Ａ１）号、米国特許第７，１５０，８１２（Ｂ２）号、米国特許第７，７３５，６５２号、米国特許第８，０２１，６１４号、米国特許第８，１８６，９１３（Ｂ２）号、米国特許出願公開第２０１２／００６３６６４（Ａ１）号、および米国特許出願公開第２０１１／０２９４１８７（Ａ１）号に開示される装置（これらの特許文献はあらゆる目的のために参照することにより本明細書に援用される）と、ディーン流れ、慣性力、遠心力、決定論的横変位、支柱アレイ、標柱アレイ、ピンチフロー、磁気構造、抗体成分、細胞捕捉モイエティ、タンパク質捕捉モイエティ、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）モイエティ、リボ核酸（ＲＮＡ）モイエティ、濾過、タンジェンシャルフロー・フィルトレーション、超音波集束、ピンチフロー、その他を用いる装置と、を含み得る。
【０１２０】
本開示のいくつかの実施形態、特に国際公開第２０１１／０７９２１７（Ａ１）号に開示されるマイクロ流体装置を組み込む実施形態が深刻な目詰まりおよび付着に対する耐性を有する装置を提供することは注目に値する。従来、目詰まりおよび付着は、消化された脂肪組織のタンジェンシャルフロー・フィルトレーションのためにマイクロ流体装置を使用することを妨げる深刻な問題であった。
【０１２１】
本開示の他の実施形態は、分離された細胞を濃縮および／または洗浄するために中空ファイバユニットを含む。
【０１２２】
マイクロ流体装置を含む下流側処理ユニットの他の実施形態では、マイクロ流体装置は細胞を洗浄し、不要な試薬を除去する。下流側処理ユニットは細胞を洗浄するための緩衝液を導入するために緩衝液流入口を含み得る。細胞洗浄は、透析を実行するよう設計されたマイクロ流体装置を用いても達成され得る。
【０１２３】
本開示のさらに他の実施形態では、下流側処理ユニットは、下流側処理ユニットの流出口における酵素濃度を約１／１０より小さくなるよう低下させるマイクロ流体装置を含む。例えば、酵素濃度は約１／１０、約１／２０、約１／３０、約１／４０、約１／５０、約１／７０、約１／１００、約１／１５０、約１／２００、約１／４００、約１／５００、約１／７５０、約１／１，０００、約１／２，０００、約１／５，０００、約１／１０，０００、約１／２０，０００、約１／５０，０００、約１／１００，０００、約１／２００，０００、約１／５００，０００、または約１／１，０００，０００に低下される。係る酵素除去を達成し得るマイクロ流体装置の１つの実施形態は、国際公開第２０１１／０７９２１７（Ａ１）号に開示される。国際公開第２０１１／０７９２１７（Ａ１）号によれば、マイクロ流体装置は支柱を含み、細胞を洗浄するために少なくとも１つの緩衝液ストリーム（すなわち洗滌溶液のストリーム）を利用する。
【０１２４】
本開示のさらに他の実施形態では下流側処理ユニットは、試料解離の間に導入された酵素を８９％を越えて除去するマイクロ流体装置を含む。例えば試料解離の間に導入された酵素の約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％、約９９．８％、約９９．９％、約９９．９５％、約９９．９８％、約９９．９９％、約９９．９９５％、約９９．９９８％、約９９．９９９％、約９９．９９９５％、または約９９．９９９９％が除去される。
【０１２５】
本開示のさらに他の実施形態では下流側処理ユニットは、試料解離の間に導入された酵素の約１００％を除去するマイクロ流体装置を含む。
【０１２６】
本開示のさらに他の実施形態では下流側処理ユニットは約０．１ｍｇ／ｍｌより低い（例えば約０．０９ｍｇ／ｍｌ、約０．０５ｍｇ／ｍｌ、約０．０３ｍｇ／ｍｌ、約０．０２ｍｇ／ｍｌ、約０．０１ｍｇ／ｍｌ、約０．００７ｍｇ／ｍｌ、約０．００５ｍｇ／ｍｌ、約０．００３ｍｇ／ｍｌ、約０．００２ｍｇ／ｍｌ、約０．００１ｍｇ／ｍｌ、約０．０００５ｍｇ／ｍｌ、約０．０００２ｍｇ／ｍｌ、約０．０００１ｍｇ／ｍｌ、約０．００００５ｍｇ／ｍｌ、約０．００００２ｍｇ／ｍｌ、約０．００００１ｍｇ／ｍｌ、約０．０００００１ｍｇ／ｍｌ、または約０．００００００１ｍｇ／ｍｌ）コラゲナーゼ濃度を有する出力を提供するマイクロ流体装置を含む。
【０１２７】
本開示のさらに他の実施形態では下流側処理ユニットは、試料解離の間に導入された酵素を実質的に有さない出力を提供するマイクロ流体装置を含む。本開示のさらに他の実施形態では下流側処理ユニットは、試料解離の間に導入された酵素を有さない出力を提供するマイクロ流体装置を含む。
【０１２８】
本開示のさらに他の実施形態では下流側処理ユニットは、試料解離の間に導入されたコラゲナーゼを実質的に有さない出力を提供するマイクロ流体装置を含む。本開示のさらに他の実施形態では下流側処理ユニットは、試料解離の間に導入されたコラゲナーゼを有さない出力を提供するマイクロ流体装置を含む。
【０１２９】
本明細書で開示した試料処理装置のうちの１つまたは複数において用いられ得るマイクロ流体装置の例が図１５Ａ、図１５Ｂ、図１５Ｃ、図１５Ｄ、および図１５Ｅにおいてそれぞれ全般的に参照番号９１０、９２０、９３０、９４０、および９５０で概略的に示される。
【０１３０】
図１５Ａは細胞流入口と、緩衝液流入口と、細胞流出口と、緩衝液流出口とを有するマイクロ流体チャネル９１０を示す。マイクロ流体チャネルは、非常に小さい（例えば約１００μｍ）幅および／または深さを有するため、細胞試料および緩衝液は、実質的に対流混合することなく互いに対して並列して流れる２つの層流ストリームを形成する。流速は、細胞流ストリームから緩衝液流ストリームへと拡散するための十分な時間が不要な粒子（例えば酵素）に与えられるよう、構成される。細胞は不要な粒子よりも遥かに大きいため、細胞の拡散は非常に小さく、細胞流ストリーム内に留まる。細胞ストリームおよび緩衝液ストリームは異なる出口を介してマイクロ流体チャネルから流出する。それにより、不要な粒子が実質的に除去されることとなる。
【０１３１】
図１５Ｂは、細胞流入口と、２つの緩衝液流入口と、細胞流出口と、２つの緩衝液流出口とを有する、他のマイクロ流体チャネル９２０を示す。これらのチャネルおよび流速は、不要な粒子が細胞ストリームから緩衝液ストリームに拡散することが可能となるよう、構成される。それにより不要な粒子が実質的に取り除かれることとなる。不要な粒子が２つの緩衝液ストリームから除去されるため、この構成は高い除去効率を有し得る。
【０１３２】
細胞ストリームおよび緩衝液ストリームを安定させ、分子拡散を促進し、および／またはマイクロ流体チャネルを支持するために、例えば図１５Ｃに示すマイクロ流体チャネル９３０に示すように柱または支柱がマイクロ流体チャネル内に配置され得る。
【０１３３】
透析のために利用されるマイクロ流体装置は、カスケードを形成するために直列状に構成され得る。１つの事例が図１５Ｄに示される。図１５Ｄにおいて、不要な粒子を担持する緩衝液は緩衝液流出口１から取り出され、新鮮な緩衝液が緩衝液流入口２から導入され得る。その結果、残留する不要な粒子が実質的に除去される。
【０１３４】
図１５Ｅは、チャネルとチャネル内の柱アレイとを含むマイクロ流体装置９５０の他の実施形態を示す。チャネルに導入される流体の流速およびチャネル寸法は、流体ストリームが層流となるよう、設計される。通常、層流および層流状流体ストリームは、マイクロ流体装置内の流体のレイノルズ数が約１より小さいときに生じる。柱アレイの存在により、緩衝液ストリーム内の粒子の実効拡散係数が大きくなり、不要な粒子（例えば酵素など）を細胞ストリームから除去することの効率が改善される。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、マイクロ流体装置内の緩衝液ストリームを形成するために用いられる緩衝液は洗滌溶液である。
【０１３６】
さらに他の実施形態では、下流側処理ユニットは透析膜を含む。
【０１３７】
図１６に概略的に示すさらに他の実施形態の下流側処理ユニット１０００は、分離された細胞を濃縮する少なくとも１つのマイクロ流体装置と、分離された細胞をマイクロ流体装置の出力として受け取るよう構成された少なくとも１つの収集貯蔵槽（例えば収集バッグ）と、を含むマイクロ流体装置ユニットを含む。下流側処理ユニットは前記収集貯蔵槽に接続されたシリンジをさらに含み得る。試料がマイクロ流体装置を用いて処理された後、出力は収集貯蔵槽からシリンジへと引き出され得る。下流側処理ユニットは廃棄物貯蔵槽（例えば廃棄物バッグなど）をさらに含み得る。
【０１３８】
本開示の他の実施形態では下流側処理ユニットは、大量の出力試料を処理するために所望の容量、処理能力、および機能を達成するために複数のマイクロ流体装置を含む。
【０１３９】
流体の搬送は、重力、外部圧力、真空、正圧、負圧、ヘッド高さ、ポンプ（例えば蠕動ポンプ）、バッグを圧搾するよう構成された機構、バッグを圧搾するローラ、バッグを圧搾するプレート、および／または当該技術分野で周知の他の流体搬送機構を用いて達成され得る。１つの実施形態では、流体はシリンジを用いて搬送され得る。他の実施形態では流体は、チャンバ（例えば図１３に示すように細胞を含むバッグ（チャンバ３）を包装するチャンバ４）に印加される外部空気圧を用いて搬送され得る。
【０１４０】
本開示の他の実施形態では下流側処理ユニットは、細胞を培養するための細胞培養チャンバを含む。細胞培養チャンバはコネクタを用いて接続され得る。そのため、細胞培養チャンバは着脱可能である。細胞培養チャンバは培養器内に配置され得る。培養器内では、細胞成長のための温度および状況が最適化され得る（例えば約摂氏３７度および約５％の二酸化炭素濃度において）。細胞培養チャンバは空気に対して透過性を有する物質（例えばフィルタ膜またはシリコーンゴム膜）をさらに含み得る。それにより細胞培養中にガス交換が可能となる。
【０１４１】
本明細書で開示する試料処理装置の１つまたは複数のチャンバは、メッシュ、複数層のメッシュ、およびメッシュのカスケード（図５Ｂ）を含み得る。いくつかの実施形態では、脂肪組織処理のために用いられるメッシュの細孔寸法（例えば、細孔開口部の中央値または平均寸法）は約１μｍ〜約１０ｍｍの範囲（例えば約１μｍ、約３μｍ、約６μｍ、約１０μｍ、約１５μｍ、約２５μｍ、約４０μｍ、約７０μｍ、約１００μｍ、約１４０μｍ、約３００μｍ、約７００μｍ、約１ｍｍ、約２ｍｍ、または約３ｍｍ）であり得る。吸引脂肪組織から非脂肪細胞を分離するために、メッシュ細孔寸法は約１０μｍ〜約２ｍｍの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、約４０μｍ、約７０μｍ、約１００μｍ、約１４０μｍ、約２５０μｍ、および／または約７００μｍの細孔寸法のメッシュ（例えばポリアミド（ナイロン）メッシュ）が用いられ得る。
【０１４２】
本開示の試料処理装置の他の実施形態は、２つのメッシュを含む１つまたは複数のチャンバを含む。ここで第２メッシュは第１メッシュの下流側で流体連通し、第２メッシュの細孔は第１メッシュの細孔よりも実質的に小さい。
【０１４３】
本開示の試料処理装置のさらに他の実施形態は、２つのメンブレンフィルタを含む１つまたは複数のチャンバを含む。第２のメンブレンフィルタは第１のメンブレンフィルタの下流側で流体連通し得る。第２メンブレンフィルタの細孔は第１メンブレンフィルタの細孔よりも実質的に小さくなり得る。
【０１４４】
本開示の試料処理装置のさらに他の実施形態は、トラックがエッチングされたメンブレンフィルタを含む１つまたは複数のチャンバを含む。
【０１４５】
本明細書で開示する試料処理装置の実施形態またはそれらの下位構成要素は、熱可塑性物質、アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン（ＡＢＳ）、アクリル樹脂（ＰＭＭＡ）、セルロイド、セルロースアセテート、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＰ）、エチレンビニルアセテート（ＥＶＡ）、エチレンビニルアルコール（ＥＶＯＨ）、フッ素樹脂（ＦＥＰ、ＰＦＡ、ＣＴＦＥ、ＥＣＴＦＥ、ＥＴＦＥ、ならびにＰＴＦＥ）、イオノマー、液晶ポリマー（ＬＣＰ）、ポリオキシメチレン（ＰＯＭまたはアセタール）、ポリアクリレート（アクリル樹脂）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮまたはアクリロニトリル）、ポリアミド（ＰＡまたはナイロン）、ポリアミドイミド（ＰＡＩ）、ポリアリールエーテルケトン（ＰＡＥＫまたはケトン）、ポリブタジエン（ＰＢＤ）、ポリブチレン（ＰＢ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリクロロトリフルオロエチレン（ＰＣＴＦＥ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリシクロへキシレンジメチレンテレフタレート（ＰＣＴ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリ水酸化アルカノエート（ＰＨＡ）、ポリケトン、ポリエステル、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエーテルケトンケトン（ＰＥＫＫ）、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、塩素化ポリエチレン（ＣＰＥ）、ポリイミド（ＰＩ）、ポリラクチック酸（ＰＬＡ）、ポリメチルペンテン（ＰＭＰ）、ポリフェニレンオキシド（ＰＰＯ）、硫化ポリフェニレン（ＰＰＳ）、ポリフタルアミド（ＰＰＡ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリスルホン（ＰＳＵ）、ポリトリメチレンテレフタレート（ＰＴＴ）、ポリウレタン（ＰＵ）、ポリ酢酸ビニル（ＰＶＡ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリ塩化ビニリデン（ＰＶＤＣ）、スチレンアクリロニトリル（ＳＡＮ）、および／またはアクリロニトリル・ブタジエン・スチレン（ＡＢＳ）を含むがこれらに限定されない物質を用いて構築され得る。医学的用途に対して、可撓性プラスチックシート（例えばポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリウレタン（ＰＵ）、エチレンビニルアセテート（ＥＶＡ）、ポリアミド（ＰＡまたはナイロン）など）がシート物質として用いられ得る。いくつかの実施形態では、本明細書で開示する試料処理装置は、一緒に接合され且つ１つまたは複数のチャンバがそれらの間に画成された２つの可撓性シートを含み得る。他の実施形態では、本明細書で開示する試料処理装置は可撓性シートを含み得る。この可撓性シートは硬質物質または半硬質物質（例えばプラスチックおよび／または上記で開示した物質のうちの任意の１つまたは複数の厚肉シートなど）に接合され、それにより１つまたは複数のチャンバが可撓性シートと硬質物質または半硬質物質との間に画成される。
【０１４６】
シート物質の肉厚はいくつかの実施形態では、約０．１ｍｍ〜約０．８ｍｍ範囲（例えば約０．１ｍｍ、約０．１５ｍｍ、約０．２ｍｍ、約０．２５ｍｍ、約０．３ｍｍ、約０．３５ｍｍ、約０．４ｍｍ、約０．５ｍｍ、約０．６ｍｍ、約０．７ｍｍ、または約０．８ｍｍ）であり得る。シート物質の肉厚は他の実施形態では、約０．２ｍｍ〜約０．４ｍｍ範囲（例えば約０．２ｍｍ、約０．２５ｍｍ、約０．３ｍｍ、約０．３５ｍｍ、または約０．４ｍｍ）であり得る。
【０１４７】
メンブレンフィルタおよび／またはメッシュのための物質は、セルロースアセテート（ＣＡ）、ガラスマイクロファイバ（ＧＭＦ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、再生セルロース（ＲＣ）、ポリアミド（ＰＡまたはナイロン）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＥＥ）、および／またはフッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）を含むがこれらに限定されない。
【０１４８】
メッシュ部材の肉厚は、いくつかの実施形態では、約１０μｍ〜約１，０００μｍの範囲（例えば約１０μｍ、約１５μｍ、約２０μｍ、約２５μｍ、約３０μｍ、約４０μｍ、約５０μｍ、約６０μｍ、約７０μｍ、約８０μｍ、約９０μｍ、約１００μｍ、約１２０μｍ、約１５０μｍ、約１７５μｍ、約２００μｍ、約２５０μｍ、約３００μｍ、約４００μｍ、約５００μｍ、約６００μｍ、約７００μｍ、約８００μｍ、約９００μｍ、または約１ｍｍ）であり得る。メッシュ部材の肉厚は、他の実施形態では、約５０μｍ〜約３００μｍの範囲（例えば約５０μｍ、約６０μｍ、約７０μｍ、約８０μｍ、約９０μｍ、約１００μｍ、約１１０μｍ、約１２５μｍ、約１４０μｍ、約１６０μｍ、約１８０μｍ、約２００μｍ、約２２０μｍ、約２５０μｍ、約２７５μｍ、または約３００μｍ）であり得る。
【０１４９】
本開示の実施形態は、プラスチック溶接、ヒートシーリング、射出成形、エンボス加工、接着剤結合、紫外線光（ＵＶ）硬化接着、溶剤結合、熱風溶接、フリーハンド溶接、スピードチップ溶接、型押し溶接、接点溶接、熱板溶接、高周波溶接、無線周波数溶接、射出溶接、超音波溶接、摩擦溶接、スピン溶接、レーザ溶接、および／または溶剤溶接を含むがこれらに限定されない標準的なプラスチック製造技術を用いて構築され得る。
【０１５０】
本開示の実施形態（例えば図２Ａ〜図２Ｇのいずれかに概略的に示す試料処理装置）は熱可塑性シートの高周波溶接を用いて構築され得る。溶接ダイスは金属（例えばアルミニウム、真鍮、またはステンレス鋼）製であり得る。折畳可能なメッシュ片およびチューブ片は、溶接ダイス上で２つの熱可塑性シートの間に配置される。次に熱可塑性シートは他の溶接ダイスを用いて挟持される。圧力、温度、および無線周波電力が溶接ダイスに印加されると、チャンバが形成される。ポリアミドメッシュでポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）シートを密閉するために、約摂氏２５度〜約摂氏１２０度の範囲（例えば約摂氏２５度、約摂氏５０度、約摂氏６０度、約摂氏７０度、約摂氏８０度、約摂氏９０度、約摂氏１００度、約摂氏１１０度、または約摂氏１２０度）の温度と、約１０ポンド／平方インチ〜約６００ポンド／平方インチの範囲（例えば約１０ポンド／平方インチ、約２０ポンド／平方インチ、約３０ポンド／平方インチ、約４０ポンド／平方インチ、約５０ポンド／平方インチ、約６０ポンド／平方インチ、約８０ポンド／平方インチ、約１００ポンド／平方インチ、約１５０ポンド／平方インチ、約２００ポンド／平方インチ、約３００ポンド／平方インチ、約４００ポンド／平方インチ、約５００ポンド／平方インチ、または６００ポンド／平方インチ）の圧力と、約３００Ｗ〜１０ｋＷの範囲（例えば約３００Ｗ、約５００Ｗ、約６００Ｗ、約７００Ｗ、約８００Ｗ、約９００Ｗ、約１ｋＷ、約１．２ｋＷ、約１．５ｋＷ、約２ｋＷ、約２．５ｋＷ、約３ｋＷ、約４ｋＷ、約５ｋＷ、約６ｋＷ、約７ｋＷ、約８ｋＷ、約９ｋＷ、または約１０ｋＷ）の無線周波電力と、が印加され得る。無線周波電力は約０．５秒〜約１分の範囲（例えば約０．５秒、約１秒、約２秒、約３秒、約４秒、約５秒、約６秒、約７秒、約８秒、約１０秒、約１２秒、約１５秒、約２０秒、約３０秒、約４０秒、約５０秒、および約６０秒）の期間にわたり印加され得る。無線周波電力は、信頼性の高い密閉を形成するために、等しい強度または異なる強度で数回印加され得る。医学的用途に対してこの装置は、制御された清浄環境で製造され、ガンマ線照射、エチレン酸化物（ＥＯ）殺菌、および紫外線光（ＵＶ）照射を含むがこれらに限定されない標準的な殺菌技術を用いて殺菌され得る。
【０１５１】
本開示のいくつかの実施形態では、試料調製装置は殺菌されている。本開示のいくつかの実施形態では、試料調製装置は単回使用である。さらに、本開示のいくつかの実施形態では、試料調製装置は分離された環境を提供する実質的な保護防壁である。係る分離された環境では、汚染および感染のリスクを最小化または回避するために、試料は、外部環境および／または操作要員との、例えば濾過されていない空気流を通じた、直接的な物理的接触または流体接触から、保護される。
【０１５２】
脂肪組織試料と周囲環境との間の直接的な物理的接触、流体接続、および／または空気流接続を実質的に低減または排除する保護防壁として、本開示の実施形態が作用し得ることが理解される。試料との直接的な物理的接触の状態、流体接続の状態、および／または濾過されていない空気流との接続の状態にある本明細書で開示する装置の実施形態のいずれの部分も、殺菌され、および／または単回使用であり得る。本明細書で開示する装置の実施形態が実質的に試料を汚染のリスクから保護し、および操作員を感染のリスクから保護し得ることは理解されるであろう。
【０１５３】
非常に使いやすい脂肪組織処理装置の設計が本開示により可能となることは理解されるであろう。本開示により、係る脂肪組織処理装置の製造プロセスが劇的に簡素化され得ること、および係る脂肪組織処理装置の製造コストが低減され得ることが理解されるであろう。本開示の実施形態により、周囲の実験室または病院環境から試料を実質的に分離する装置を用いることにより、処理対象の脂肪組織試料の処理は、汚染および感染のリスクが実質的に存在しない安全なものとなり得ることが、さらに理解されるであろう。
【実施例】
【０１５４】
実施例１ヒト吸引脂肪組織からの非脂肪細胞分離
ヒトの吸引脂肪組織が、図１に示す操作を含む方法と図３Ａおよび図１１に示す装置とを用いて処理された。この装置は約２５ｃｍの幅および約４０ｃｍの長さである。可撓性プラスチックシートはポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）製であり、メッシュはポリアミド（ナイロン）製である。メッシュ１、２、および３はそれぞれ約１４０μｍ、約７０μｍ、および約３５μｍの公称細孔寸法を有する。約４０ｍｌのヒトの吸引脂肪組織がチューメセント脂肪吸引を用いて承認済みのドナーから収集され、収集から２４時間以内で処理された。試料は輸送され、処理の前に摂氏４度で格納された。
【０１５５】
最初、コネクタ１および２（図３Ｆ）を閉止するためにクランプ１および２が適用された。約１００ｍｌの吸引脂肪組織がスパイクポート（図１１）を介して装置に加えられた。クランプ２が開放されると、血液およびチューメセント溶液を含む過剰流体が重力下でチャンバ３へと搬出されることができた。過剰流体が実質的に取り出された後、クランプ２が閉止されピンチクランプ１が開放され、それにより約５０ｍｌの乳酸リンゲル液が測定チャンバ（チャンバ１）に進入することが可能となった。ピンチクランプ１が閉止され、ピンチクランプ２が開放された。チャンバ１を２つの平坦プレートを用いて圧搾すると、乳酸リンゲル液がチャンバ２へと搬送された。この流体測定および搬送プロセスは、約１００ｍｌの乳酸リンゲル液がチャンバ２に加えられるまで、反復された。チャンバ２を穏やかにマッサージすることにより、乳酸リンゲル液および吸引脂肪組織試料が混合され、それにより試料が洗浄された。クランプ２を開放すると、廃棄流体の排出が可能となった。この洗浄操作はここで３回実施された。
【０１５６】
組織解離操作は、クランプ１および２を閉止し解離溶液をＹ字形挿入部位（図１１）からチャンバ１へと加えることにより開始された。解離溶液は２００ｍｌのコラゲナーゼと５０ｍｇのディーエヌアーゼＩとを含み、２０ｍｌの乳酸リンゲル液中に溶解された。解離溶液を希釈するために、さらなる乳酸リンゲル液がチャンバ１に導入された。次に解離溶液はチャンバ２に搬送された。チャンバ１を洗浄するために乳酸リンゲル液が再びチャンバ１に導入され、残留解離溶液がチャンバ２に搬送された。組織解離操作の実行中、約１００ｍｌの乳酸リンゲル液がチャンバ２に加えられた。装置が摂氏３７度の培養器内に配置され、組織試料と解離溶液とを効率的に混合させるため頻繁にマッサージされた。組織解離操作は約４５分〜６０分を要した。
【０１５７】
解離後、クランプ１を開放すると、放出された細胞が残渣除去チャンバ（図３Ａにおけるチャンバ４）に進入することが可能となった。引き続きクランプ２を開放すると、試料がメッシュ３を通過することが可能となった。組織残渣および脂肪細胞がこの操作の間、実質的に除去された。
【０１５８】
次に、チャンバ４から流出した溶液は重力下でマイクロ流体装置１１００へと供給された。なおマイクロ流体装置１１００は図１７に示され、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１０／０６１８６６号に開示され、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１０／０６１８６６号の全体はあらゆる目的のために参照することにより本明細書に援用される。マイクロ流体装置は、基板の平坦表面上に配置された約１１０のモジュールを含んだ。各モジュールは、４本の行へと構成された約９００本の支柱を含んだ。マイクロ流体チャネルの深さは約３０μｍであった。
【０１５９】
マイクロ流体装置の出力が図１８Ａおよび図１８Ｂに示される。濃縮された非脂肪細胞は実質的に有核細胞生成物フラクションにおいて収集された（図１８Ａ）。有核細胞製品フラクションの容積は、入力に対して約１／８に低減された。次に細胞はアクリジンオレンジ（２ｍｇ／ｌ）で染色され、蛍光顕微鏡を用いて撮像された。脂肪細胞がマイクロ流体装置の製品出力中に実質的に存在しないこと、および非脂肪有核細胞が実質的に有核細胞フラクション中に収集されることが、その画像により示される。細胞が良好な形態にあること、および製品出力が破損した細胞を実質的に有さないことも、その画像は示す。
【０１６０】
開示した方法および装置を用いて分離された細胞は、ＡＤＡＭ  ＭＣ自動哺乳類細胞数測定装置を用いた全有核細胞カウント数および付着性生存可能細胞カウント数に対してさらに特徴付けられた。チャンバ４の出力は、１ｍｌの処理された吸引脂肪組織あたり約６．０×１０５個の全有核細胞を有した。１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）が追加されたＡｌｐｈａ−ＭＥＭは、付着性生存可能有核細胞カウント数のための培養基として用いられた。チャンバ４の出力が試料採取され、細胞培養チャンバ（例えば細胞培養皿または細胞培養フラスコなど）内の培養基において摂氏３７度で３日間培養された。３日後、培養基は廃棄され、細胞培養チャンバはダルベッコ・リン酸塩緩衝剤生理食塩水溶液を用いて洗浄された。次に、培養チャンバに付着する細胞は３分間トリプシンを用いてチャンバ表面から放出された。付着性生存可能有核細胞カウント数は、１ｍｌの処理された吸引脂肪組織あたり約１．５×１０５であった。
【０１６１】
実施例２  試料処理バッグ装置を用いてヒトの吸引脂肪組織から非脂肪細胞を分離するための方法
ヒトの吸引脂肪組織が、図１３に示す試料処理バッグ装置を用いて処理された。この装置は試料解離チャンバ（チャンバ１）と、廃棄物チャンバ（チャンバ２）と、細胞精製チャンバ（チャンバ３）と、を含む。この装置は約２４ｃｍの幅および約３６ｃｍの長さであり、約０．３ｍｍ肉厚の２枚のポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）シートから作られる。試料解離チャンバおよび細胞精製チャンバは第１ナイロンメッシュ（メッシュ１）および第２ナイロンメッシュ（メッシュ２）を含む。第１メッシュの細孔寸法は約１２５μｍであり、第２メッシュの細孔寸法は約２５μｍである。第１メッシュの細孔寸法は代替的に、約７０μｍ〜約１６０μｍの範囲（例えば約７０μｍ、約８０μｍ、約９０μｍ、約１００μｍ、約１１０μｍ、約１２０μｍ、約１３０μｍ、約１４０μｍ、約１５０μｍ、または約１６０μｍ）であり得る。第２メッシュの細孔寸法は代替的には約２０μｍ〜５０μｍの範囲（例えば約２０μｍ、約２２μｍ、約２５μｍ、約３０μｍ、約３５μｍ、約４０μｍ、または約５０μｍ）であり得る。
【０１６２】
ヒトの吸引脂肪組織が承認済みのドナーからチューメセント脂肪吸引を用いて収集され、収集から６時間以内で処理された。試料は輸送され、処理の前に摂氏４度で格納された。
【０１６３】
最初、ストップコック１は、チャンバ１とチャンバ２とを接続する位置に設定された。１００ｍｇのコラゲナーゼ、１００ｍｇのヒアルロニダーゼ、および２０，０００ユニットのデオキシリボヌクレアーゼを含む解離溶液がシリンジ２へと装填された。試料処理バッグ装置はスパイクを用いて乳酸リンゲル注射液を含む洗滌溶液のバッグに接続された。
【０１６４】
約７５ｍｌの吸引脂肪組織試料が、カテーテル先端部を有するシリンジを用いてポート１からチャンバ１へと注入された。
【０１６５】
吸引脂肪組織試料を洗浄するために、洗浄操作が適用された。洗浄サイクルを開始するために、ストップコック１は、チャンバ２およびチャンバ３からチャンバ１を流体的に切断する閉止姿勢に設定された。約１００ｍｌの乳酸リンゲル注射液がシリンジ１およびストップコック２を流れ制御装置として用いてチャンバ１へと注入された。係る注入は、以下の順序の操作、すなわち（ａ）洗滌溶液がシリンジ１に接続されるようストップコック２を切り替えることと、（ｂ）洗滌溶液をシリンジ１に引き込むことと、（ｃ）シリンジ１がチャンバ１に接続されるようストップコック２を切り替えることと、（ｄ）洗滌溶液をシリンジ１からチャンバ１へと注入することと、を用いて実施された。所望容積の溶液が解離チャンバに加えられるまで、この順序は反復され得る。
【０１６６】
次に、チャンバ１をマッサージして洗滌溶液と試料とを混合させ、過剰流体（すなわち廃棄溶液）がチャンバ２へと排出されるよう、ストップコック１を切り替えた。排出後、第１廃棄サイクルが完了した。洗浄サイクルは２回反復された。
【０１６７】
洗浄操作は１回または複数回の洗浄サイクル（例えば１サイクル、２サイクル、３サイクル、４サイクル、または５サイクル）を含み得る。
【０１６８】
洗浄後、解離溶液がチャンバ１に加えられた。約１００ｍｌの洗滌溶液もチャンバ１に加えられた。次に試料処理バッグ装置は摂氏３７度で約６０分の培養時間で培養された。試料と解離溶液とを混合するために、チャンバ１はこの時間の間マッサージされた。いくつかの実施形態では、他の培養時間（例えば約１５分、約２０分、約３０分、約４０分、約５０分、約７５分、約９０分、または約１２０分）も用いられ得る。
【０１６９】
培養後、試料から放出された個々の細胞はストップコック１を通過してチャンバ３に通された。その一方、大きい組織残差はメッシュ１により捕捉されチャンバ１内に残された。チャンバ３内のメッシュ２は、解離された試料から大きい含脂肪細胞および残渣をさらに除去した。次に周皮細胞、脂肪由来の幹細胞、および前駆細胞を含む非脂肪細胞がチャンバ３の流出ポートにおいて収集された。
【０１７０】
放出された細胞、除去された残留赤血球、および残渣を濃縮するために、試料処理バッグ装置のチャンバ３の流出ポートにおいて収集された放出された細胞は、次に、国際公開第２０１１／０７９２１７（Ａ１）号に開示される第１マイクロ流体装置に通された。マイクロ流体装置は、基板の表面上に配列された７３のモジュールを含んだ。各モジュールは、４本の行へと構成された約１，３００本の支柱を含んだ。マイクロ流体装置は実質的に同一深さ（約３５μｍ〜約５０μｍの範囲）のチャネルを含んだ。他の実施形態では、マイクロ流体装置は約３０μｍ〜約８０μｍの範囲（例えば約３０μｍ、約３５μｍ、約４０μｍ、約４５μｍ、約５０μｍ、約６０μｍ、約７０μｍ、または約８０μｍ）の深さを有するチャネルを含み得る。マイクロ流体装置の流出口における細胞は約１／３に濃縮された。本発明の他の実施形態では、マイクロ流体装置は細胞を約１／２．５より小さくなるよう（例えば約１／３、約１／４、約１／５、約１／６、約１／８、約１／１０、約１／１２、約１／１５、約１／２０、約１／２５、約１／３０、約１／４０、約１／５０、約１／６０、約１／８０、約１／１００、または約１／１２５に）濃縮するために用いられ得る。
【０１７１】
酵素を除去するために細胞は、国際公開第２０１１／０７９２１７（Ａ１）号に開示される第２マイクロ流体装置に通して処理された。第２マイクロ流体装置は、基板の表面上に配列された８３のモジュールを含んだ。各モジュールは、４本の行へと構成された約９００本の支柱を含んだ。洗滌溶液のストリームが各モジュールに導入され、細胞は、酵素から分別されて、洗滌溶液へと搬送された。
【０１７２】
第２マイクロ流体装置後のコラゲナーゼの残留量を測定するために、酵素結合免疫吸着測定法（エライサ）が適用された。コラゲナーゼ濃度が１／１，０００に低下し、精製された細胞が０．００１ｍｇ／ｍｌ未満のコラゲナーゼを含んだことを結果は示す。
【０１７３】
少なくとも１つの実施形態のいくつかの態様を説明してきたが、様々な変化例、改変例、組み合わせ、および改善例が当業者には容易に想起されることが理解されるべきである。係る変化例、改変例、組み合わせ、および改善例は本開示の一部であること意図するものであり、本開示の精神および範囲に含まれることを意図するものである。したがって、上記の説明および図面は例示を意図するものである。
【図１Ａ】
2015500031.tif 000003
【図１Ｂ】
2015500031.tif 000004
【図２Ａ】
2015500031.tif 000005
【図２Ｂ】
2015500031.tif 000006
【図２Ｃ】
2015500031.tif 000007
【図２Ｄ】
2015500031.tif 000008
【図２Ｅ】
2015500031.tif 000009
【図２Ｆ】
2015500031.tif 000010
【図２Ｇ】
2015500031.tif 000011
【図３Ａ】
2015500031.tif 000012
【図３Ｂ−Ｃ】
2015500031.tif 000013
【図３Ｄ】
2015500031.tif 000014
【図３Ｅ】
2015500031.tif 000015
【図３Ｆ】
2015500031.tif 000016
【図４】
2015500031.tif 000017
【図５Ａ】
2015500031.tif 000018
【図５Ｂ】
2015500031.tif 000019
【図６Ａ】
2015500031.tif 000020
【図６Ｂ】
2015500031.tif 000021
【図７】
2015500031.tif 000022
【図８Ａ】
2015500031.tif 000023
【図８Ｂ】
2015500031.tif 000024
【図９Ａ】
2015500031.tif 000025
【図９Ｂ】
2015500031.tif 000026
【図１０Ａ】
2015500031.tif 000027
【図１０Ｂ】
2015500031.tif 000028
【図１３Ｂ】
2015500031.tif 000029
【図１３Ｃ】
2015500031.tif 000030
【図１４】
2015500031.tif 000031
【図１５Ａ】
2015500031.tif 000032
【図１５Ｂ】
2015500031.tif 000033
【図１５Ｃ】
2015500031.tif 000034
【図１５Ｄ】
2015500031.tif 000035
【図１５Ｅ】
2015500031.tif 000036
【図１６】
2015500031.tif 000037
【図１７】
2015500031.tif 000038
【図１８Ａ】
2015500031.tif 000039
【図１８Ｂ】
2015500031.tif 000040
【図１１】
2015500031.tif 000041
【図１２】
2015500031.tif 000042
【図１３Ａ】
2015500031.tif 000043
【手続補正書】
【提出日】平成26年7月22日(2014.7.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪組織試料から非脂肪細胞を分離するための装置であって、
第１シートの物質と、
前記第１シートの物質に結合された第２シートの可撓性物質と、
前記第１シートの物質と前記第２シートの物質との間で画成された複数のチャンバであって、
流体溶液を受け取るよう構成された流入口、脂肪組織試料を受け取るよう構成された試料流入口、ならびに流出口を含む第１チャンバ、
廃棄流体を受け取るよう構成された第２チャンバであって、前記第１チャンバの前記流出口に流体連通する流入口を含む第２チャンバ、ならびに
前記第１チャンバに流体連通する流入口および流出口を含む第３チャンバ
を含む複数のチャンバと、
前記第３チャンバの前記流入口と前記流出口との間に配置された第１濾過メッシュと、
前記第１チャンバ、前記第２チャンバ、ならびに前記第３チャンバに流体連通する第１流れ制御装置と
を含む、装置。
【請求項２】
前記第１濾過メッシュは約２０マイクロメートル〜約５０マイクロメートルの範囲の細孔寸法を有する細孔を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記第１流れ制御装置はストップコックを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
滅菌され且つ前記脂肪組織試料を処理するための実質的に分離された環境を提供する、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記第１チャンバに流体連通する流出口を有し且つ洗滌溶液および解離溶液のうちの少なくとも１つを前記第１チャンバに導入するよう構成された第２流れ制御装置をさらに含む、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記試料流入口はシリンジを受け取るよう構成されたコネクタを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
脂肪組織試料から非脂肪細胞を分離するための方法であって、
第１シートの物質、
前記第１シートの物質に結合された第２シートの可撓性物質、
前記第１シートの物質と前記第２シートの物質との間で画成された複数のチャンバであって、
流入口ならびに流出口を含む第１チャンバ、
前記第１チャンバに流体連通する流入口を含む第２チャンバ、ならびに
前記第１チャンバに流体連通する流入口および流出口を含む第３チャンバ、
を含む複数のチャンバ、
前記第３チャンバの前記流入口と前記流出口との間に配置された濾過メッシュ、ならびに
前記第１チャンバ、前記第２チャンバ、ならびに前記第３チャンバに流体連通する流れ制御装置、
を含む組織処理装置を提供することと、
脂肪組織試料を前記第１チャンバへと前記第１チャンバの前記流入口を通して導入することと、
洗滌溶液を前記第１チャンバへと導入することと、
前記洗滌溶液と前記脂肪組織試料とを混合することにより前記脂肪組織試料を洗浄することと、
前記第１チャンバから前記第２チャンバへ廃棄流体を排出することと、
酵素を含む解離溶液を前記第１チャンバへと導入することと、
前記解離溶液と前記脂肪組織試料とを混合することと、
前記脂肪組織試料を前記第１チャンバにおいて１つの時間的期間にわたり第１温度で培養し、前記脂肪組織試料を培養することにより脂肪細胞および非脂肪有核細胞を含む細胞が前記脂肪組織試料から放出されることと、
前記放出された細胞を前記第３チャンバに搬送することと、
前記非脂肪有核細胞を前記第３チャンバの前記流出口から採取することと
を含む、方法。
【請求項８】
前記時間的期間は約１０分〜約１２０分の範囲である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記解離溶液はコラゲナーゼを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記脂肪組織試料は脂肪吸引処置から獲得された、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記非脂肪有核細胞は脂肪由来の幹細胞を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記非脂肪有核細胞を洗浄することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記非脂肪有核細胞を濃縮することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
前記非脂肪有核細胞を前記脂肪細胞から分離することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
前記非脂肪有核細胞を前記脂肪細胞および赤血球細胞から分離することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１６】
前記放出された細胞を前記濾過メッシュに通すことにより前記放出された細胞から脂肪細胞を分別することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
本開示の１つの態様によれば、脂肪組織試料から非脂肪細胞を分離するための装置が提供される。この装置は、第１シートの物質、第１シートの物質に結合された第２シートの物質、および第１シートの物質と第２シートの物質との間に画成された複数のチャンバであって、流入口および流出口を含む試料解離チャンバと、試料解離チャンバの流出口に流体連通する流入口を含む廃棄物収集チャンバと、試料解離チャンバに流体連通する流入口および流出口を含む細胞精製チャンバと、を含む複数のチャンバ、を含む。
好ましい実施形態において、本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
脂肪組織試料から非脂肪細胞を分離するための装置であって、
第１シートの物質と、
前記第１シートの物質に結合された第２シートの物質と、
前記第１シートの物質と前記第２シートの物質との間で画成された複数のチャンバであって、
流入口および流出口を含む試料解離チャンバ、
前記試料解離チャンバの前記流出口に流体連通する流入口を含む廃棄物収集チャンバ、および
前記試料解離チャンバに流体連通する流入口と、流出口とを含む細胞精製チャンバ
を含む複数のチャンバと
を含む、脂肪組織試料から非脂肪細胞を分離するための装置。
（項目２）
前記試料解離チャンバは７０μｍ〜３００μｍの範囲の細孔寸法を有する細孔を含むメッシュフィルタをさらに含む、項目１に記載の装置。
（項目３）
２０μｍ〜５０μｍの範囲の細孔寸法を有する細孔を含む前記細胞精製チャンバに含まれたメッシュフィルタをさらに含む、項目１に記載の装置。
（項目４）
前記試料解離チャンバは第１細孔寸法を有する細孔を含む第１メッシュフィルタをさらに含み、前記細胞精製チャンバは前記第１細孔寸法よりも小さい第２細孔寸法を有する細孔を含む第２メッシュフィルタをさらに含む、項目１に記載の装置。
（項目５）
前記試料解離チャンバ、前記廃棄物収集チャンバ、および前記細胞精製チャンバの間の流体接続を制御するための手段をさらに含む、項目１に記載の装置。
（項目６）
前記流体接続を制御するための手段はストップコックを含む、項目５に記載の装置。
（項目７）
洗滌溶液および解離溶液のうちの少なくとも１つを前記試料解離チャンバに導入するよう構成され且つ前記試料解離チャンバに流体連通する流出口を有する流れ制御装置をさらに含む、項目１に記載の装置。
（項目８）
前記試料解離チャンバおよび前記細胞精製チャンバのうちの１つに圧力を印加するための手段をさらに含む、項目１に記載の装置。
（項目９）
前記細胞精製チャンバの前記流出口に流体連通する下流側処理装置であって、前記細胞精製チャンバから出力された流体を、１つまたは複数の対象細胞の第１濃度を有する第１溶液と、前記第１溶液の前記濃度よりも小さい前記１つまたは複数の対象細胞の濃度を有する第２溶液と、に分別するよう構成された少なくとも１つのマイクロ流体装置を含む下流側処理装置をさらに含み、前記対象細胞は脂肪組織試料から分離された非脂肪細胞を含む、項目１に記載の装置。
（項目１０）
殺菌され且つ実質的に分離された脂肪組織処理システムであって、
組織処理チャンバであって、流入口、流出口、および前記組織処理チャンバの前記流入口と前記組織処理チャンバの前記流出口との間に配置された少なくとも１つのメッシュフィルタを含む組織処理チャンバと、
前記組織処理チャンバと同一筐体に含まれた廃棄物収集チャンバであって、前記組織処理チャンバの前記流出口に流体連通する流入口を含む廃棄物収集チャンバと、
残渣除去機構を含む残渣除去チャンバ、および前記組織処理チャンバと同一筐体に含まれ且つ前記組織処理チャンバに流体連通する試料収集チャンバのうちの１つと
を含む、システム。
（項目１１）
組織処理システムにおいて脂肪組織試料を処理する方法であって、
処理対象の脂肪組織試料を第１チャンバの流入ポートを通して前記第１チャンバへと導入することと、
前記第１チャンバにおいて前記脂肪組織試料を処理することと、
細胞を、前記第１チャンバから前記第１チャンバの流出口を通して、前記第１チャンバと同一筐体に含まれた第２チャンバへと前記第２チャンバの流入口を通して搬送することと
を含む、方法。
（項目１２）
前記脂肪組織試料を処理することは前記脂肪組織試料を解離することを含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記脂肪組織試料を処理することは前記第１チャンバにおいて前記脂肪組織試料から過剰流体を取り除くことを含む、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
前記脂肪組織試料を処理することは前記第１チャンバにおいて洗滌溶液を用いて前記脂肪組織試料を洗浄することを含む、項目１１に記載の方法。
（項目１５）
前記脂肪組織試料を処理することは洗滌溶液を用いて前記第１チャンバにおいて前記脂肪組織試料を洗浄することと、少なくとも１つの酵素を含む解離溶液を用いて前記第１チャンバにおいて前記脂肪組織試料を解離することとを含む、項目１１に記載の方法。
（項目１６）
前記解離溶液はコラゲナーゼを含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記解離溶液はコラゲナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、およびヒアルロニダーゼを含む、項目１５に記載の方法。
（項目１８）
解離溶液を用いて脂肪組織試料を解離することは約摂氏３７度で行われる、項目１５に記載の方法。
（項目１９）
前記第２チャンバに含まれたメッシュフィルタを用いて残渣を除去することをさらに含む、項目１１に記載の方法。
（項目２０）
前記メッシュフィルタは１５マイクロメートル〜１００マイクロメートルの範囲の細孔寸法を有する、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記試料を前記第１チャンバ内に保持し、廃棄流体を前記第１チャンバに含まれたメッシュフィルタおよび前記第１チャンバの第１流出口を通して、前記第１チャンバと同一筐体に含まれた第３チャンバへと、前記第３チャンバの流入口を通して搬送することをさらに含む、項目１１に記載の方法。
（項目２２）
マイクロ流体装置を用いて非脂肪細胞集団のために高濃度化することをさらに含む、項目１１に記載の方法。
（項目２３）
前記非脂肪細胞は幹細胞を含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記細胞を前記組織処理システムから採取することをさらに含む、項目１１に記載の方法。
（項目２５）
前記細胞を前記第２チャンバの流出口に流体連通する下流側処理装置であって、前記細胞を、非脂肪細胞の第１濃度を有する第１溶液と、前記第１溶液の前記濃度よりも小さい非脂肪細胞の濃度を有する第２溶液と、に分別するよう構成された少なくとも１つのマイクロ流体装置を含む下流側処理装置において、処理することをさらに含む、項目１１に記載の方法。
（項目２６）
前記採取された細胞は間質血管細胞群細胞である、項目２４に記載の方法。
【国際調査報告】
2015500031.tif 000044