【手続補正書】
【提出日】平成22年7月12日(2010.7.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１，３−プロパンジオールを生産する能力を有する微生物もしくは培養細胞の培養液を、分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を培養液に追加する連続発酵であって、分離膜として平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の多孔性膜を用い、膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲で濾過処理することを特徴とする連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造方法。
【請求項２】
多孔性膜の純水透過係数が、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下であることを特徴とする請求項１に記載の連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造方法。
【請求項３】
多孔性膜が有機高分子膜であって、その平均細孔径が、０.０１μｍ以上０.２μｍ未満の範囲内にあり、かつ、該細孔径の標準偏差が０.１μｍ以下であることを特徴とする請求項１または２に記載の連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造方法。
【請求項４】
多孔性膜が有機高分子膜であって、その膜表面粗さが０.１μｍ以下の多孔性膜であることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造方法。
【請求項５】
多孔性膜が多孔性樹脂層を含む多孔性膜である請求項１から４のいずれかに記載の１，３−プロパンジオールの製造方法。
【請求項６】
多孔性膜の膜素材にポリフッ化ビニリデン系樹脂を用いていることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造方法。
【請求項７】
１，３−プロパンジオールを生産する能力を有する微生物が（ａ）グリセロールデヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子；（ｂ）グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子をコードする少なくとも１つの遺伝子；及び （ｃ）３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを１，３−プロパンジオールに転換する非−特異的触媒活性をコードする少なくとも１つの遺伝子を含み、グリセロールから１，３−プロパンジオールを合成する能力を有することを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造方法。
【請求項８】
グリセロールから１，３−プロパンジオールを合成する能力を有する微生物が、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、クロスツリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、シトロバクテル（Ｃｙｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、エンテロバクテル（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、アエロバクテル（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ムコル（Ｍｕｃｏｒ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、メチロバクテル（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アエロバクテル（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、エッシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ）及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）より成る群から選ばれる微生物または組換え微生物であることを特徴とする請求項７に記載の１，３−プロパンジオールの製造方法。
【請求項９】
組換え微生物が、さらに： （ａ）グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子；及び （ｂ）グリセロール−３−ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子を含む組換え微生物であることを特徴とする請求項８に記載の連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造方法。
【請求項１０】
グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子がｄｈａレギュロンから単離されるｏｒｆＸ及びｏｒｆＺによりコードされる組換え微生物であることを特徴とする請求項９に記載の連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造方法。
【請求項１１】
組換え微生物が、さらにグリセロールキナーゼ活性および／またはグリセロールデヒドロゲナーゼ活性および／またはトリオースリン酸イソメラーゼ活性を欠失した組換え微生物であることを特徴とする請求項１０に記載の連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
すなわち、本発明は、１，３−プロパンジオールを生産する能力を有する微生物もしくは培養細胞の培養液を分離膜によって濾液と未濾過液に分離し、濾液から所望の発酵生産物を回収するとともに、未濾過液を培養液に保持または還流させる連続発酵方法による１，３−プロパンジオールの製造方法において、分離膜として、平均細孔径が、０.０１μｍ以上１μｍ未満の範囲にある多孔性膜を用い、低い膜間差圧で濾過処理することで、安定に低コストで、発酵生産効率を著しく向上させる１，３−プロパンジオールの製造方法を提供するものである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
本発明は、１，３−プロパンジオールを生産する能力を有する微生物もしくは培養細胞の培養液を、分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を培養液に追加する連続発酵であって、分離膜として平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の多孔性膜を用い、膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲で濾過処理することを特徴とする連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造方法である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
本発明では、グリセロールから１，３−プロパンジオールを合成する能力を有する微生物は、好ましくは、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、クロスツリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、シトロバクテル（Ｃｙｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、エンテロバクテル（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、アエロバクテル（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ムコル（Ｍｕｃｏｒ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、メチロバクテル（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アエロバクテル（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、エッシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ）及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）より成る群から選ばれる組換え微生物で、更に好ましくはエッシェリシア コリである。