(57)【要約】本発明は、生体物質の相互作用を検出する方法に関する。より詳細には（ａ）(i)移動モジュール、第１標識物質及び第１媒介物を含む第１構成物、及び(ii)標的物質及び第２標識物質を含む第３構成物を発現する細胞を製造する段階；（ｂ）前記製造された細胞に(iii)目的物質及び前記第１媒介物と結合する第２媒介物を含む第２構成物を投与する段階；（ｃ）標的物質と目的物質間の相互作用がなされるようにする段階；及び（ｄ）第１構成物及び第３構成物の細胞内分布を検出して標的物質と目的物質間の相互作用を確認する段階を含む目的物質と相互作用する標的物質のスクリーニング方法、前記第１構成物及び第３構成物を発現する細胞及び前記細胞と前記第２構成物を含むスクリーニングキットに関するものである。本発明の方法は、従来の生体物質相互作用探索方法が有する不正確性及び複雑性などの短所を克服し、特に、細胞内で遺伝子解読及び発現過程を通じて直接生産できない物質と、細胞内で発現される物質間の相互作用を測定することができ、一層幅広い生体物質の相互作用検出に効果的である。
2015502174.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記段階を含む目的物質と相互作用する標的物質のスクリーニング方法：
（ａ）(i)移動モジュール、第１標識物質及び第１媒介物を含む第１構成物、及び(ii)標的物質及び第２標識物質を含む第３構成物を発現する細胞を製造する段階；
（ｂ）前記製造された細胞に(iii)目的物質及び前記第１媒介物と結合する第２媒介物を含む第２構成物を投与する段階；
（ｃ）標的物質と目的物質間の相互作用がなされるようにする段階；及び
（ｄ）第１構成物及び第３構成物の細胞内分布を検出して標的物質と目的物質間の相互作用を確認する段階。
【請求項２】
前記（ｃ）段階は、シグナル物質を処理して標的物質と目的物質間の相互作用がなされるようにする段階であることを特徴とする請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記移動モジュールは、蛋白質リン酸化酵素Ｃ及びこれの変異体からなる群より選ばれたことを特徴とする請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記蛋白質リン酸化酵素Ｃ及びこれの変異体は、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号７からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記第１標識物質は、GFP(Green  Fluorescent  Protein)、EGFP(Enhanced  Green  Fluorescent  Protein)、RFP(Red  Fluorescent  Protein)、mRFP(Monomeric  Red  Fluorescent  Protein)、DsRed(Discosoma  sp.red  Fluorescent  Protein)、CFP(Cyan  Fluorescent  Protein)、CGFP(Cyan  Green  Fluorescent  Protein)、YFP(Yellow  Fluorescent  Protein)、AzG(Azami  Green)、HcR(HcRed,  Heteractis  crispa  red  Fluorescent  Protein)及びBFP(Blue  Fluorescent  Protein)からなる群より選ばれたことを特徴とする請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項６】
前記第２標識物質は、GFP(Green  Fluorescent  Protein)、EGFP(Enhaced  Green  Fluorescent  Protein)、RFP(Red  Fluorescent  Protein)、mRFP(Monomeric  Red  Fluorescent  Protein)、DsRed(Discosoma  sp.red  Fluorescent  Protein)、CFP(Cyan  Fluorescent  Protein)、CGFP(Cyan  Green  Fluorescent  Protein)、YFP(Yellow  Fluorescent  Protein)、AzG(Azami  Green)、HcR(HcRed,  Heteractis  crispa  red  Fluorescent  Protein)及びBFP(Blue  Fluorescent  Protein)からなる群より選ばれたことを特徴とする請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項７】
前記シグナル物質の処理は、PMA(phorbol  12-myristate  13-acetate,phorbpl  ester)を50nM乃至5μMの濃度で処理することを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項８】
前記第１媒介物はストレプトアビジンであり、第２媒介物はビオチンであることを特徴とする請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項９】
前記第１媒介物はジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR,Dihydrofolate  reductase)であり、第２媒介物はメトトレキセート(MTX,Methotrexate)であることを特徴とする請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項１０】
(i)移動モジュール、第１標識物質及び第１媒介物を含む第１構成物、(ii)標的物質及び第２標識物質を含む第３構成物を発現する細胞。
【請求項１１】
前記細胞は、CHO-k1細胞、HEK293細胞、HeLa細胞、SH-SY5Y細胞、Swiss  3T3細胞、3T3-L1細胞、NIH/3T3細胞、L-929細胞、Rat2細胞、RBL-2H3細胞及びMDCK細胞からなる群より選ばれたことを特徴とする請求項10記載の細胞。
【請求項１２】
前記第１媒介物は、ストレプトアビジン又はジヒドロ葉酸レダクターゼであることを特徴とする請求項10記載の細胞。
【請求項１３】
請求項10の細胞及び(iii)第１媒介物と結合する第２媒介物及び目的物質を含む第２構成物を含む、目的物質と相互作用する標的物質のスクリーニングキット。
【請求項１４】
前記第１媒介物はストレプトアビジンであり、第２媒介物はビオチンであることを特徴とする請求項13記載のキット。
【請求項１５】
前記第１媒介物はジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR,Dihydrofolate  reductase)であり、第２媒介物はメトトレキセート(MTX,Methotrexate)であることを特徴とする請求項13記載のキット。
【請求項１６】
前記キットは、標的物質と目的物質間の相互作用がなされるようにするシグナル物質を含むことを特徴とする請求項13記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2011年12月20日に出願された大韓民国特許出願第10-2011-0137868号に基づき優先権を主張するものであり、前記明細書全体は本出願の参考文献である。
【０００２】
本発明は、生体物質の相互作用を検出する方法に関する。より詳細には、（ａ）(i)移動モジュール、第１標識物質及び第１媒介物を含む第１構成物、及び(ii)標的物質及び第２標識物質を含む第３構成物を発現する細胞を製造する段階；（ｂ）前記製造された細胞に(iii)目的物質及び前記第１媒介物と結合する第２媒介物を含む第２構成物を投与する段階；（ｃ）標的物質と目的物質間の相互作用がなされるようにする段階；及び（ｄ）第１構成物及び第３構成物の細胞内分布を検出して標的物質と目的物質間の相互作用を確認する段階を含む目的物質と相互作用する標的物質のスクリーニング方法、前記第１構成物及び第３構成物を発現する細胞及び前記細胞と前記第２構成物を含むスクリーニングキットに関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞の成長、分化、移動、死などは蛋白質−蛋白質、蛋白質−核酸などの高分子物質間の相互作用によりなされる。細胞外部のシグナルは、細胞膜の受容体を通過して、細胞質内でさまざまな生化学的反応を通じて細胞の核内に伝達され、そこで特定の遺伝子を発現させる。このような外部シグナルの細胞内伝達過程は、さまざまな段階の蛋白質間相互作用によりなされる。例えば、成長調節因子やサイトカインなどは細胞表面の当該受容体に結合し、このような結合は受容体が互いに群れをなすように(clustering)誘導する。このような受容体のリガンドによる群れは、その受容体の細胞質内のドメイン同士も互いに群れをなすようにすることにより、細胞内シグナル伝達過程に関連したさまざまな蛋白質との相互作用を誘発する。このシグナル伝達体系は、蛋白質キナーゼによる蛋白質のリン酸化、蛋白質ホスファターゼによる脱リン酸化などを通じて、さまざまな段階のシグナルを伝達できる中間体蛋白質を作りながら、結局はそのシグナルを転写促進蛋白質に伝達する(Helden,C.H.,Cell  80,213-223(1995))。活性化された転写促進蛋白質はDNAに結合して、mRNAを合成するRNA重合酵素など基本的な転写調節蛋白質と相互作用して、特定遺伝子を活性化させる。従って、このような相互作用は、特定組織、発生学的過程及び外部刺激などに反応して、特異的に転写が起るように調節することによる。この時、外部物質の侵入又は内部活性蛋白質の遺伝的変異などにより、特定蛋白質間の相互作用が変更、抑制、促進など非正常的に生じたものが病気(disorder)の原因と言える。従って、このような相互作用を調節できる物質は、直ぐにそれに起因した病気に対する治療の方法を提供できるので、これに関する研究が継続されてきた。
【０００４】
今まで知られた生体高分子物質間の相互作用、特に、結合特性を分析するための方法として、交叉結合(crosslinking)、親和クロマトグラフィー(affinity  chromatography)、免疫沈降法(immunoprecipitation,IP)などの伝統的なin  vitro法が使用されているが、これらの方法は蛋白質の生産と分離／精製過程が求められ、試験管内の緩衝液の条件と、抽出された蛋白質の２次的な変形などの問題点があり、生体内で起こる実際の相互作用と相異した情報を提供する短所を有している。このようなin  vitro方法の短所を補完するために、細胞内で直接行うイーストツーハイブリッド(yeast  two  hybrid,  Y2H)、蛍光共鳴エネルギー転移(fluorescence  resonance  energy  transfer,  FRET)、分割蛋白質の再結合(bimolecular  fluorescence  complementation,  Bi-FC)方法が開発されているが、これらの方法はそれぞれ次のような長所と短所とを有している。
【０００５】
Ｙ２Ｈ方法は、免疫沈降法と共に現在最も広く使用されている方法で、遺伝子ライブラリーを使用して大量のスクリーニングを行える長所があるが、膜蛋白質や転写酵素のような核蛋白質の探索が難しく、偽陽性(false  positive)が高いという短所を有している。この方法は、蛋白質間の相互作用を調節できる物質を探し出して使用するために、不適当な短所がある。これは、Ｙ２Ｈ方法では二つの蛋白質間の相互作用があればレポーター遺伝子からβ-ガラクシターゼが発現され、培地上のX-gal化合物を分解してコロニーが青色に変わる方法を利用するが、候補物質により青色から再び白色に変わる選別方法そのものは、陰性選別であるため、実際に阻害効果がある物質を見逃すことがあり、又は判断そのものが曖昧模糊である短所があるため、一般的な薬剤選別には好ましくない。
【０００６】
FRET方法の場合、正確度は高いが、蛍光共鳴エネルギーが転移されるために蛍光蛋白質又は蛍光物質の位置を決め難いので、実験成功率が極めて低い短所がある。分割蛋白質の再結合方法の場合、膜蛋白質と核蛋白質などの探索に使用することができる長所があるが、FRET方法と同様に、相補結合が起るために蛋白質の相対的な位置を決め難いので、成功率が低い短所を有している。
【０００７】
従って、前記の方法の短所を克服するために、前記方法の他にさまざまに変形された方法が提案されているが、今まで効率的な生体物質結合探索方法に対する要求が持続しており、特に、目的蛋白質と相互作用する蛋白質を検索できるばかりでなく、先行方法より一層効率的に二つの蛋白質間の相互作用を阻害したり、増進させるなどの調節物質を探し得る探索システムに対する要求が切実に求められている。
【０００８】
本研究陣は、蛋白質リン酸化酵素Ｃ、第１標識物質及び目的物質が含まれた第１構成物と、標的物質及び第２標識物質が含まれた第２構成物を細胞内で発現させて、その発現された目的物質と標的物質の相互作用の可否を確認できるシステムを開発して、特許を受けている（大韓民国登録特許公報第10-0948767号）。しかし、このシステムは相互作用を確認するための目的物質及び標的物質が、全て細胞内で生成される蛋白質の場合に限り可能なシステムであって、目的物質が細胞内で発現される蛋白質でない場合には、適用が不可能である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、二つの蛋白質間の相互作用を阻害したり、増進させるなどの調節物質を探し得る、より効率的な探索システムに関する研究を重ねる中、目的物質を移動モジュール及び第１標識物質から分離させて投与できるシステムを開発して、本発明を完成した。
【００１０】
従って、本発明の目的は、
（ａ）(i)移動モジュール、第１標識物質及び第１媒介物を含む第１構成物、及び(ii)標的物質及び第２標識物質を含む第３構成物を発現する細胞を製造する段階；
（ｂ）前記製造された細胞に(iii)目的物質及び前記第１媒介物と結合する第２媒介物を含む第２構成物を投与する段階；
（ｃ）標的物質と目的物質間の相互作用がなされるようにする段階；及び
（ｄ）第１構成物及び第３構成物の細胞内分布を検出して標的物質と目的物質間の相互作用を確認する段階を含む目的物質と相互作用する標的物質のスクリーニング方法を提供することである。
【００１１】
本発明の他の目的は、(i)移動モジュール、第１標識物質及び第１媒介物を含む第１構成物、及び(ii)標的物質及び第２標識物質を含む第３構成物を発現する細胞を提供することである。
【００１２】
本発明の他の目的は、前記細胞及び(iii)第１媒介物と結合する第２媒介物及び目的物質を含む第２構成物を含む、目的物質と相互作用する標的物質のスクリーニングキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記の目的を達成するために本発明は、
（ａ）(i)移動モジュール、第１標識物質及び第１媒介物を含む第１構成物、及び(ii)標的物質及び第２標識物質を含む第３構成物を発現する細胞を製造する段階；
（ｂ）前記製造された細胞に(iii)目的物質及び第１媒介物と結合する第２媒介物を含む第２構成物を投与する段階；
（ｃ）標的物質と目的物質間の相互作用がなされるようにする段階；及び
（ｄ）第１構成物及び第３構成物の細胞内分布を検出して標的物質と目的物質間の相互作用を確認する段階を含む目的物質と相互作用する標的物質のスクリーニング方法を提供する。
【００１４】
本発明の他の目的を達成するために本発明は、(i)移動モジュール、第１標識物質及び第１媒介物を含む第１構成物、及び(ii)標的物質及び第２標識物質を含む第３構成物を発現する細胞を提供する。
【００１５】
本発明の他の目的を達成するために本発明は、前記細胞及び(iii)第１媒介物と結合する第２媒介物及び目的物質を含む第２構成物をさらに含む、目的物質と相互作用する標的物質のスクリーニングキットを提供する。
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明は、生体物質間の相互作用を直接的に、また実時間で分析することができるようにするために、外部刺戟又は内在的なシグナル伝達機構により発生する蛋白質の細胞内位置移動を利用した。つまり、外部刺戟又は内在的なシグナル伝達機構により位置が移動される移動モジュール、これを追跡できる標識物質及び移動モジュールと目的物質が結合できるようにする、第１媒介物を含む第１構成物をデザインし、相互作用の一つの対象となる目的物質及びこれを第１構成物に結合できるように第１媒介物と結合する第２媒介物を含む第２構成物と、目的物質と相互作用する標的物質及びこれを追跡できる第２標識物質を含む第３構成物をデザインし、第２構成物を投与された環境で前記第１構成物及び第３構成物が細胞内で発現され、第１構成物と第２構成物が結合して、目的物質と標的物質の相互作用を細胞内で直接的、又は実時間で分析することができるようにした。
【００１８】
従って、本発明は（ａ）(i)移動モジュール、第１標識物質及び第１媒介物を含む第１構成物、及び(ii)標的物質及び第２標識物質を含む第３構成物を発現する細胞を製造する段階；
（ｂ）前記製造された細胞に(iii)目的物質及び前記第１媒介物と結合する第２媒介物を含む第２構成物を投与する段階；
（ｃ）標的物質と目的物質間の相互作用がなされるようにする段階；及び
（ｄ）第１構成物及び第３構成物の細胞内分布を検出して標的物質と目的物質間の相互作用を確認する段階を含む目的物質と相互作用する標的物質のスクリーニング方法を提供する。
【００１９】
本発明で目的物質及び標的物質とは、それぞれ相互作用の対象になる物質を示す。前記目的物質及び標的物質はそれぞれ蛋白質、ポリペプチド、小有機物質(small  organic  molecule)、多糖類、ポリヌクレオチドでもあり、好ましくは、蛋白質又はポリペプチドでもある。さらに、自然産物、合成化合物又は化学化合物又は２個以上の物質の組合わせでもある。相互作用の検出又はスクリーニングのために目的物質は、実験者が知っている物質を示し、標的物質は未知の物質を指称して使用することができるが、これに限定はされず、目的物質と標的物質を互いに代えて第２構成物又は第３構成物の一部にし得る。
【００２０】
本発明で第１標識物質及び第２標識物質とは、当業者が互いに別々に（区分して）検出可能なシグナルを生成できる物質を示し、この例には、蛍光物質、リガンド、発光物、微粒子、レドックス分子及び放射性同位元素などを使用することができる。蛍光物にはこれに限定はされないが、蛍光蛋白質、フルオレシン、イソチオシアネート、ロダミン、ピコエリトレン、ピコシアニン、アロピコシアニン、フルオレシンイソチオシアネートなどを使用することができる。その内、蛍光蛋白質には当業界に公知のものを使用することができ、例えば、GFP(Green  Fluorescent  Protein);EGFP(Enhanced  Green  Fluorescent  Protein);RFP(Red  Fluorescent  Protein);mRFP(Monomeric  Red  Fluorescent  Protein);DsRed(Discosoma  sp.  red  fluorescent  protein);CFP(Cyan  Fluorescent  Protein);CGFP(Cyan  Green  fluorescent  protein);YFP(Yellow  Fluorescent  Protein);AzG(Azami  Green),HcR(HCRed,  Heteractis  crispa  red  fluorescent  protein)、BFP(Blue  Fluorescent  Protein)などがある。
【００２１】
発光物には、これに限定はされないが、アクリジニウムエステル、ルシフェリン、ルシフェラーゼなどがある。微粒子には、これに限定はされないが、コロイド金、鉄、着色されたラテックスなどがあり、レドックス分子には、これに限定はされないが、フェロセン、ルテニウム、錯化合物、バイオロゲン、キノン、Ｔｉイオン、Ｃｓイオン、ジイミド、1,4-ベンゾキノン、ヒドロキノンなどがある。放射性同位元素には、これに限定はされないが、3H，  14C,  32P,  35S,  36Cl,  51Cr,  57Co,  58Co,  59Fe,  90Y,  125I,  131I,  186Reなどがある。しかし、前記例示されたものの他に、標識物質の探索に使用可能なものであればどんなものでも使用することができる。
【００２２】
好ましくは、本発明の第１標識物質又は第２標識物質は、蛍光蛋白質でもある。より好ましくは、本発明の第１標識物質又は第２標識物質は、GFP;EGFP,RFP;mRFP;DsRed(Discosoma  sp.red  fluorescent  protein);CFP(Cyan  fluorescent  protein);CGFP(Cyan  Green  fluorescent  protein);YFP(Yellow  fluorescent  protein);AzG(Azami  Green),HcR(Heteractis  crispa  red  fluorescent  protein,  HcRed)又はBFP(Blue  fluorescent  protein)でもある。
【００２３】
本発明で移動モジュールは、第１構成物を細胞内の特定域に移動させる機能をする部位である。前記で細胞内の特定域への移動は、外部シグナルにより、又は内在的に移動することができ、細胞内の特定域は細胞内構造物であって、細胞内に存在する、区分され（separate）、区別され(discreet)、証憑可能な(identifiable)要素を示す。前記細胞内特定域は、好ましくは細胞膜、核膜などの膜構造物又は消泡剤、ゴルジ体、ミトコンドリア、リソソームなどの細胞内小器官及びその他の細胞内特定域でもある。
【００２４】
本発明の移動モジュールは、前記細胞内特定域によって多様に適用することができるが、好ましくは、蛋白質リン酸化酵素Ｃ(protein  kinase  C,PKC)でもあって、当業界に公知のcPKC(classical  PKC;PKC-alpha,  PKC-beta,  PKC-gamma)、nPKC(novel  PKC;  PKC-delta,  PKC-epsilon,  PKC-eta,  PKC-theta)、aPKC(atypical  PKC;PKC-zeta,  PKC-lambda/iota)を始めとしてこれらの変異体でもある。
【００２５】
これらは、全てＣ１ドメイン部分を共通に有していて、Ｃ１ドメインにDAG(diacyl  glycerol)又はTPA(phorbol  ester,PMA)と結合することにより、細胞膜への位置移動が誘導される。本発明の移動モジュールとして、好ましくはPKCの変異体を使用することができ、前記変異体は、内在的なシグナル伝達機構による攪乱現象を最小化するために、PKCの内在的なリン酸化活性を除去した変異体であることがより好ましい。さらに、好ましくは本発明の移動モジュールは、配列番号１(PRKCD)、配列番号３(TMA)、配列番号５(TMB)又は配列番号７(TMD)で表示されるアミノ酸配列又は配列番号２(PRKCD)、配列番号４(TMA)、配列番号６(TMB)又は配列番号８(TMD)で表示される塩基配列を有することができる。
【００２６】
本発明の媒介物は、第１構成物と第２構成物が細胞内結合をなすようにするもので、相互結合特異性及び結合力が高いのが好ましい。第１媒介物は細胞内で遺伝子解読及び発現過程を通じて直接生産が可能であって、第２媒介物は分子量が小さく、細胞内浸透が容易な物質が好ましい。
【００２７】
本発明の媒介物は好ましくは、第１媒介物がストレプトアビジン(Streptavidin)の時、第２媒介物はビオチン(Biotin)でもあり、又は第１媒介物がジヒドロ葉酸レダックターゼ(DHFR,Dihydrofolate  reductase)の時、第２媒介物はメトトレキセート(MTX,Methotrexate)でもあり、又は第１媒介物がヒスチジン重合体(His-tag)の時、第２媒介物はニッケルエヌティエイ(Ni-NTA,Nickle-Nitrilotriacetic  acid)でもある。
【００２８】
一方、本発明の第１構成物と第３構成物の移動は、細胞内で検出することができる。好ましくは、細胞膜で検出することもできる。前記第１構成物と第３構成物は、移動シグナルの不在時、細胞内で検出（細胞質でtargeting)することができ、好ましくは細胞質より検出することができる。前記第３構成物の細胞膜への移動は、第２構成物の目的物質と第３構成物の標的物質の相互作用によりなされる。従って、前記第３構成物の細胞膜への移動は、第２構成物の目的物質と第３構成物の標的物質の相互作用を示す。
【００２９】
その結果、本発明の方法によれば、基本的に生きている細胞内で起る物質間の直接結合又は複合体結合を映像分析を通じて高速で探索することができ、従来の技術に比べて次のような有利な点を有するようになる。
１）生きている細胞内で起る全ての結合分析を対象にすることができる。
２）細胞全体を対象にする他の方法とは異なり、細胞内位置移動変化を分析尺度に使用するため、分析の正確度が高い。
３）生きている細胞内で起る結合を探索することにより、in  vitro方法とは異なり、外部環境に影響を受けない。
４）目的物質と標的物質の実時間結合測定が可能である。
５）単一目的物質と複数個の標的物質間の複合体結合を検証可能である。
６）標的物質の大量標識ライブラリーを使用して、未知の生体物質に対する結合スクリーニングが可能である。
７）HCS(High  Contents  Screening)システムと連係した高効率システムを具現することができる。
８）外部刺戟の種類変更により、シグナル伝達経路別結合特性を分析することができる。
９）第１構成物及び第２構成物全てに、標識物質を使用することにより、目的物質と標的物質の相対的な定量が可能で、標的物質の外部刺戟又は内在的な移動現象による実験的誤謬を同時に確認することができ、偽陰性反応を顕著に減少させる。
【００３０】
特に、移動モジュールと目的物質をそれぞれ別の構成物に位置するように分離して、
10)細胞内で遺伝子解読及び発現過程を通じて直接生産されない物質と、細胞内で発現すされる物質間の相互作用を測定することができる。
【００３１】
前記の通り、本発明は外部シグナルにより、本発明の移動モジュールが細胞内特定域に移動されるようにすることができる。従って、本発明の目的物質と相互作用する標的物質のスクリーニング方法は、シグナル物質を処理することを追加的に含み、
（ａ）(i)移動モジュール、第１標識物質及び第１媒介物を含む第１構成物、及び(ii)標的物質及び第２標識物質を含む第３構成物を発現する細胞を製造する段階；
（ｂ）前記製造された細胞に(iii)目的物質及び前記第１媒介物と結合する第２媒介物を含む第２構成物を投与する段階；
（ｃ）シグナル物質を処理して標的物質と目的物質間の相互作用がなされるようにする段階；及び
（ｄ）第１構成物及び第３構成物の細胞内分布を検出して標的物質と目的物質間の相互作用を確認する段階を含む目的物質と相互作用する標的物質のスクリーニング方法により行える。
【００３２】
前記においてシグナル物質は、本発明の移動モジュールの移動を誘導する外部シグナルを発生させる物質を示す。例えば、本発明の移動モジュールにPKCを使用する場合には前記シグナル物質は、PMA(Phorbol  12-myristate  13-acetate,Phorbol  ester)、TPA(12-otetradecanoylphorbol-13-acetate)、PDBu(phorbol  12,13-dibutyrate)、ATP(Adenosine  triphosphate)、tridecanoic  acid、arachidonic  acid、linoleic  acid、DiC8、130C937及びPKC活性化関連成長因子を初め、その他PKC活性化物質でもあって、好ましくはPMA(Phorbol  12-myristate  13-acetate,Phorbol  ester)でもあり得る。
【００３３】
前記においてPMAの処理濃度は、好ましくは50nM乃至5μMでもあって、より好ましくは1μMで処理することができる。前記PMAの処理濃度が50nM未満の場合には、PKCを使用した移動モジュールの移動が不十分で、5μM超過の場合、化学物質の過多処理による非正常的な現象（細胞死滅、シグナル攪乱など）が発生して好ましくない。
【００３４】
本発明は、(i)移動モジュール、第１標識物質及び第１媒介物を含む第１構成物、及び(ii)標的物質及び第２標識物質を含む第３構成物を発現する細胞を提供する。移動モジュール、第１標識物質、第１媒介物、標的物質及び第２標識物質に関しては前述の通りである。
【００３５】
前記細胞は、動物、植物、酵母及びバクテリアの細胞でもあって、好ましくはバクテリア以外の場合、外部から導入される第１構成物を受け入れることができ、細胞質と核などの細胞内小器官の境界がはっきり区別される細胞が好ましい。
【００３６】
さらに、好ましくはCHO-k1(ATCC  CCL-61,Cricetulus  griseus,hamster,Chinese)、HEK293(ATCC  CRL-1573,Homo  sapiens,human)、HeLa(ATCC  CCL-2,Homo  sapiens,human)、SH-SY5Y(ATCC  CRL-2266,Homo  sapiens,human)、Swiss  3T3(ATCC  CCL-92,Mus  musculus,mouse),3T3-L1(ATCC  CL-173,Mus  musculus,mouse)、NIH/3T3(ATCC  CRL-1658,Mus  musculus,mouse)、L-929(ATCC  CCL-1,Mus  musculus,mouse)、Rat2(ATCC  CRL-1764,rattus  norvegicus,rat)、RBL-2H3(ATCC  CRL-2256,Rattus  norvegicus,rat)、MDCK(ATCC  CCL-34,Canis  familiaris)でもある。その他に各種の幹細胞、各種の組織から抽出された細胞及び人為的に作られた類似細胞膜構造物でもある。
【００３７】
本発明で第１構成物及び第３構成物を含む細胞は当業界に公知の分子生物学的方法を通じて製造することができる。これに制限はされないが、第１構成物及び第３構成物を発現できるそれぞれの発現ベクター又は第１構成物及び第３構成物を全て発現することができる発現ベクターで細胞を形質転換した後、発現ベクターにおいて第１構成物及び第３構成物が発現されるようにする方法が好ましい。
【００３８】
このために、第１構成物の場合、プロモーター及びこれと作動可能に連結された移動モジュール、第１標識物質及び第１媒介物をコードするヌクレオチドを含む発現ベクターを製作し、第３構成物の場合プロモーター及びこれと作動可能に連結された標的物質及び第２標識物質をコードするヌクレオチドを含む発現ベクターを製作して、これを同時に又は順次に一つの細胞に形質転換させた後、発現ベクターで第１構成物及び第３構成物が発現されるようにする方法を使用することができる。この時、移動モジュール、第１標識物質及び第１媒介物をコードするヌクレオチドにおいて、本発明の効果に伴う機能を発揮する限り、移動モジュール、第１標識物質及び第１媒介物の順序は関係無く、これは標的物質及び第２標識物質をコードするヌクレオチドにおいても同様である。
【００３９】
前記プロモーターとは、特定の宿主細胞で作動可能に連結された核酸配列の発現を調節するＤＮＡ配列を意味し、作動可能に連結されると言うことは、一つの核酸断片が他の核酸断片と結合されてその機能又は発現が異なる核酸断片により影響を受けることを意味する。従って、転写を調節するための任意のオペレーター配列、適合したmRNAリボソーム結合部位をコードする配列及び転写及び解読の終結を調節する配列を追加して含み得る。
【００４０】
細胞へのそれぞれの発現ベクターの形質転換は、当業界に公知の形質転換方法、例えば、リン酸カルシウム法、塩化カルシウム法、塩化ルビジウム法、微細射出法(microprojectile  bombardment)、エレクトロポーレーション(electroporation)、粒子銃衝撃(particle  gun  bombardment)、シリコン炭化物ウィスカー(Silicon  carbide  whiskers)、超音波処理(sonication)、PEG-媒介融合法(PEG-mediated  fusion)、微細注入法、リボソーム媒介法、磁性ナノ粒子媒介法などにより行える。
【００４１】
一方、このような本発明の細胞は、目的物質及び第２媒介物を含む第２構成物を細胞に投与すれば、投与された第２構成物が細胞内で発現された第１構成物と結合して、目的物質と標的物質の相互作用可否によって第２構成物と第３構成物が結合するので、第１構成物及び第３構成物に含まれた第１標識物質及び第２標識物質を検出する方法で、目的物質と標的物質の相互作用を検出することができる。これにより、細胞内で遺伝子解読及び発現過程を通じて直接生産されない物質と、細胞内で発現される物質間の相互作用を測定することができる。
【００４２】
一方、本発明で使用された標準組替えＤＮＡ及び分子クローニング技術は、この分野で広く知られており下記の文献に記載されている(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and  Maniatis,T.,Molecular  Cloning:A  Laboratory  Manual,2nd  ed.,Cold  Spring  HarborLaboratory:Cold  Spring  Harbor,NY(1989);by  Silhavy,T.J.,Bennan,M.L.and  Enquist,L.W.,Experiments  with  Gene  Fusions,Cold  Spring  Harbor  Laboratory:Cold  Spring  Harbor,NY(1984);  and  by  Ausubel,F.M.et  ql.,Current  Protocols  in  Molecular  Biology,published  by  Greene  Publishing  Assoc.and  Wiley-lnterscience(1987)。
【００４３】
本発明は、本発明の第１構成物及び第３構成物を含む細胞及び(iii)第１媒介物と結合する第２媒介物及び目的物質を含む第２構成物を含む目的物質と相互作用する標的物質のスクリーニングキットを提供する。
【００４４】
本発明のキットは好ましくは、標的物質と目的物質間の相互作用がなされるようにするシグナル物質を含むことができ、前記シグナル物質は前述した通りであって、好ましくはPMA(Phorbol  12-myristate  13-acetate,Phorbol  ester)でもある。
【００４５】
本発明キットの前記媒介物は好ましくは、第１媒介物はストレプトアビジンであって、第２媒介物はビオチンでもあり、又は第１媒介物はジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR,Dihydrofolate  reductase)であり、第２媒介物はメトトレキセート(MTX,Methotrexate)でもある。
【００４６】
本発明のキットは、前記本発明の第１構成物及び第３構成物を含む細胞及び(iii)第１媒介物と結合する第２媒介物及び目的物質を含む第２構成物の他に標識物質の検出に使用される、当業界に公知の道具及び／又は試薬を追加して含むことができる。本発明のキットは、必要に応じて各成分を混合することに使用されるチューブ、ウェルプレート、使用方法を記載した指示資料を追加して含むことができる。
【００４７】
前記方法で利用できる実験過程、試薬及び反応条件は、従来当業界で一般的に知られているものを利用することができる。
【発明の効果】
【００４８】
本発明は、（ａ）(i)移動モジュール、第１標識物質及び第１媒介物を含む第１構成物、及び(ii)標的物質及び第２標識物質を含む第３構成物を発現する細胞を製造する段階；（ｂ）前記製造された細胞に(iii)目的物質及び前記第１媒介物と結合する第２媒介物を含む第２構成物を投与する段階；（ｃ）標的物質と目的物質間の相互作用がなされるようにする段階；及び（ｄ）第１構成物及び第３構成物の細胞内分布を検出して標的物質と目的物質間の相互作用を確認する段階を含む目的物質と相互作用する標的物質のスクリーニング方法、前記第１構成物及び第３構成物を発現する細胞及び前記細胞と前記第２構成物を含むスクリーニングキットを提供する。本発明の方法は、従来の生体物質相互作用探索方法が有する不正確性及び複雑性などの短所を克服して、特に、細胞内で遺伝子解読及び発現過程を通じて直接生産されない物質と、細胞内で発現される物質間の相互作用を測定することができて、一層幅広い生体物質相互作用検出に効果的である。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１は、本発明の結合検出に対する基本概念図を示す。
【図２】図２は、第１構成物により第２構成物の検出が可能であるかを確認した結果である。(-PMA:シグナル物質(PMA)処理前、；＋PMA:シグナル物質処理後、SA:ストレプトアビジン及びRFPが含まれた第１構成物質検出写真、Oregon  green  biocytin:GFPが含まれた第３構成物質検出写真、Merge:SA及びOregon  green  biocytin検出写真を重畳した写真）。
【図３】図３は、図２で使用された化合物−ビオチンの構造を示す。
【図４】図４は、本発明の検証のために合成されたダサチニブビオチン及びラパマイシンビオチンの合成及び化学構造を示す。
【図５】図５は、第２媒介物に使用されたダサチニブビオチンにより結合が検出されたCSK,SRC,EPHA4及びRIPK2蛋白質に対する結合検出結果を示す。(CSK:C-src  tyrosine  kinase,SRC:Proto-oncogene  tyrosine  -protein  kinase  Src,EPHA4:ephrin  type-A  receptor  4,RIPK2:Receptor-intereracting  serine-threonine  kinase  2,(−):シグナル物質(PMA)処理前、＋PMA:シグナル物質処理後、PKC-mRFP-SA:ストレプトアビジン及びRFPが含まれた第１構成物質検出写真、EGFP-kinase:GFPが含まれた第３構成物質検出写真、Merge:PKC-mRFP-SA及びEGFP-kinase検出写真を重畳した写真）。
【図６】図６は、CSK,SRC及びRIPK2に対する結合検出結果及び細胞質内の蛍光度変化（減少）を数値化したものである。(CSK:C-src  tyrosine  kinase,SRC:Proto-oncogene  tyrosine-protein  kinase  Src,EPHA4:ephrin  type-A  receptor  4,RIPK2:Receptor-intereracting  serine-ethreonine  kinase  2,A1:PMA処理前RFPが含まれた第１構成物質検出写真、A2:PMA処理前GFPが含まれた第３構成物質検出写真、A3:A1及びA2検出写真を重畳した写真、B1:PMA処理後RFPが含まれた第１構成物質検出写真、B2:PMA処理後GFPが含まれた第３構成物質検出写真、B3:B1及びB2検出写真を重畳した写真）。
【図７】図７は、CSK,SRC及びRIPK2に対する結合検出結果及び細胞膜部位の蛍光度変化（増進）を数値化したものである。(CSK:C-src  tyrosine  kinase,SRC:Proto-oncogene  tyrosine  -protein  kinase  Src,EPHA4:ephrin  type-A  receptor  4,RIPK2:Receptor-intereracting  serine-ethreonine  kinase  2,A1:PMA処理前RFPが含まれた第１構成物質検出写真、A2:PMA処理前GFPが含まれた第３構成物質検出写真、A3:A1及びA2検出写真を重畳した写真、B1:PMA処理後RFPが含まれた第１構成物質検出写真、B2:PMA処理後GFPが含まれた第３構成物質検出写真、B3:B1及びB2検出写真を重畳した写真）。
【図８】図８は、ダサチニブと結合するABL  kinase  familyに対する結合検出映像及びこれを検証するための免疫沈降(IP,Immunoprecipitation)結果である。(CSK:C-src  tyrosine  kinase,ABL1:V-abl  Abelson  murine  leukemia  viral  oncogene  homolog  1,A1:PMA処理前RFPが含まれた第１構成物質検出写真、A2:PMA処理前GFPが含まれた第３構成物質検出写真、A3:A1及びA2検出写真を重畳した写真、B1:PMA処理後RFPが含まれた第１構成物質検出写真、B2:PMA処理後GFPが含まれた第３構成物質検出写真、B3:B1及びB2検出写真を重畳した写真）。
【図９】図９は、ダサチニブと結合するSRC  kinase  familyに対する結合検出映像及びこれを検証するための免疫沈降結果である。(SRC:Proto-oncogene  tyrosine  -protein  kinase  Src,LYN:Tyrosine-protein  kinaseLyn,YES1:Proto-oncogene  tyrosine  -protein  kinase  Yes,A1:PMA処理前RFPが含まれた第１構成物検出写真、A2:PMA処理前GFPが含まれた第３構成物検出写真、A3:A1及びA2検出写真を重畳した写真、B1:PMA処理後RFPが含まれた第１構成物検出写真、B2:PMA処理後GFPが含まれた第３構成物検出写真、B3:B1及びB2検出写真を重畳した写真）。
【図１０】図10は、ダサチニブと結合する機能的連関性が知られていないRIPK,MAP4K5及びSAPK2A蛋白質に対する結合検出映像及びこれを検証するための免疫沈降(IP,Immunoprecipitation)結果である。(RIPK2:Receptor-interacting  serine-threonine  kinase  2,MAP4K5:Mitogen-activated  protein  kinase  kinase  kinase  kinase  5,SAPK2A:Stress  Activated  Protein  Kinase  2a,A1:PMA処理前RFPが含まれた第１構成物検出写真、A2:PMA処理前GFPが含まれた第３構成物検出写真、A3:A1及びA2検出写真を重畳した写真、B1:PMA処理後RFPが含まれた第１構成物検出写真、B2:PMA処理後GFPが含まれた第３構成物検出写真、B3:B1及びB2検出写真を重畳した写真）。
【図１１】図11は、原本ダサチニブとビオチンが結合されたダサチニブのリン酸化機能が類似したことを検証した結果である。
【図１２】図12は、ダサチニブ-ビオチンにより膜に移動するCSK蛋白質に対する原本ダサチニブの結合阻害効果を示す(Dasatinib:ビオチンが結合していないダサチニブ）。
【図１３】図13は、ラパマイシン-ビオチンにより結合が検出されるFRB及びFKBP蛋白質の模式図（ａ）、ラパマイシン-ビオチンの構造（ｂ）及び細胞膜への移動及びFK506による移動阻害結果を示す（ｃ）。（横軸の（−）：シグナル物質(PMA)処理前、＋PMA:シグナル物質処理後、縦軸（−）：ラパマイシン-ビオチン未処理群、FK506:tacrolimus,FKBP12:FK506  binding  protein  12,FRB:FKBP12-rapamycin  binding  domain  PCK(C1A)-mRFP-SA:ストレプトアビジン及びRFPが含まれた第１構成物検出写真、EGFP-FRP:GFP及びFRBが含まれた第３構成物検出写真、TagBFP-FKBP12:BFP及びFKBP12が含まれた第３構成物検出写真、Merge:PCK(C1A)-mRFP-SA,EGFP-FRB及びTagBFP-FKBP12検出写真を重畳した写真）。
【図１４】図14は、FRB蛋白質の移動がFK506の濃度による結合阻害効果を検証したものである(FK506:tacrolimus)。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
【００５１】
ただし、下記実施例は本発明を例示するのみであり、本発明の内容は下記実施例に限定されるものではない。
【００５２】
<実施例１>
動物細胞株及び形質転換
<１−１>  動物細胞株及びこれの培養
本発明者らは、CHO-k1(ATCC  CCL-61,Cricetulus  griseus,hamster,Chinese)、HEK293(ATCC  CRL-1573,Homo  sapiens,human)、HeLa(ATCC  CCL-2,Homo  sapiens,human)、SH-SY5Y(ATCC  CRL-2266,Homo  sapiens,human)細胞株を使用し、本発明に使用された動物細胞株の培養条件は、各細胞株の分譲機関であるATCC(American  Type  Culture  Collection)社の細胞株培養方法を利用した。ただし、CHO-k1はF-12培養液を使用し、HEK293,HeLa,SH-SY5Y細胞株はDMEM培養液を使用し、その他の培養条件は同一にした。一方、各細胞の共通の培養方法は下記の通りである（当業者の目的により細部の培養条件は異なることがある）。25mM  HEPES,10%FBS(fetal  bovine  serum,v/v)、100units/ml  penicillin,100ug/ml  streptomycinが含まれているpH7.4の培養液(F-12及びDMEM)の中で、各細胞株を37℃で5%CO2に維持された培養器で培養した。
【００５３】
<１−２>  細胞株の形質転換
本発明の実施例で使用された細胞内遺伝子導入方法は、一般的に使用されるリポソーム基盤方法の内の一つであるExGene  500(Fermentas  Life  Science)を使用し、遺伝子の濃度など、遺伝子導入のための全ての条件は、製造社の指針に従って行った。より具体的には、継代培養されている細胞をカバーガラスが入っている12-プレートに移して分株し、１日培養後、0.9mlの新鮮な培養液に代えた。約1ug程度の形質転換試料を0.1mlの150mM  NaCl溶液に添加後、かき混ぜて3.3ulのExGene試薬を添加して、15秒間ボルテックス(Vortex)してかき混ぜた。この溶液を常温で10分間放置後、細胞が育っているカバーガラスが入っている12-プレートの各ウェル(Well)に添加して、18時間培養して形質転換させた。
【００５４】
<実施例２>
第１構成物、第２構成物及び第３構成物のデザイン及び製作
<２−１>  第１構成物の設計及び製作
本発明で第１構成物とは、細胞質において等しく発現されている蛋白質が細胞膜に移動できる移動モジュール、これを顕微鏡を利用して分析できる第１標識物質、及び最後に第２構成物の第２媒介物と結合できる第１媒介物の融合配列で構成される。
【００５５】
本実施例では移動モジュールに蛋白質リン酸化酵素Ｃを、第１標識物質にmRFPを、さらに、第１媒介物にストレプトアビジン(Streptavidin)を使用した。
【００５６】
移動モジュールは鋳型にpCMV-SPORT6-PRKCDベクター(GenBank  accession  No.BC043350;purchased  from  Openbiosystem(http://www.openbiosystems.com/);Catalog  No.EHS1001-410108-BC043350)を使用してPCR方法でクローニングし、pmRFP-C3ベクター(mRFP;GenBank  accession  No.DQ903889,配列番号14)のNheI/AgeI位置に挿入して製作した。
【００５７】
第１媒介物であるストレプトアビジンは鋳型にGenBank  Acc,No.XO3591(配列番号13)を使用してPCR方法でクローニングし、前記pmRFP-C3ベクター(mRFP;GenBank  accession  No.DQ903889,配列番号14)のEcoRI/BamHI位置に挿入して製作した。
【００５８】
<２−２>  第２構成物の設計及び製作
第２構成物とは、第１構成物の第１媒介物と結合できる第２媒介物と目的物質で構成される。
【００５９】
本実施例ではストレプトアビジンのための第２媒介物にビオチンを、目的物質にダサチニブとラパマイシンを使用した。常用化されたダサチニブとラパマイシンをアミン基に置換して、常用化されたNHS-dPEG12-biotinを化学的に結合させて、それぞれダサチニブ-ビオチンとラパマイシン-ビオチンを合成した（図４参照）。
【００６０】
<２−４>  第３構成物の設計及び製作
第３構成物とは、第２構成物に結合された目的物質と結合する内在的な特性を有する標的物質と、これの移動を分析するための第２標識物質を含む。第３構成物は第１構成物に含まれた標識と異なる蛍光を利用し、緑色蛍光蛋白質(EGFP,AzG)、赤色蛍光蛋白質(mRFP)及び赤外線蛍光蛋白質を利用して、第１構成物と同一の方法を通じて製作した。
【００６１】
この時、第３構成物製造の際、第２標識物質にEGFPを使用する時にはpEGFP-C3ベクター（配列番号15)(clontech)を、mRFP使用時にはpmRFP-C3ベクター、AzGを使用する時にはpAzG-C3ベクター、HcR使用時にはpHcR-C3ベクターを使用し、各原本C3ベクターは、pEGFP-C3ベクターのEGFP遺伝子配列部位のみを各AzG、HcR遺伝子で、次のように置換することにより製作された。
【００６２】
pAzG-C3ベクターの場合、pPM-mAG1ベクター(purchased  from  MBL,catalog  No.AM-V0203;Karasawa,S.,et  al.2003,J.biol.Chem.278,34167-34171)を鋳型に使用して、配列番号16(AzG-F:5'-GGCACCGGTCGCCACCATGGACCCCATGGTGAGTGTGAT-3')及び配列番号17(AzG-R:5'-GGCAGATCTGACAGCTTGGCCTGACTCGGCAGCAT-3')のプライマーを使用してPCR増幅した後、収得物をpEGFP-C3ベクターのEGFP塩基配列と置換して、AgeI/NotI位置に挿入して製作した。
【００６３】
pHcR-C3ベクターの場合、pHcRed-Tandem-N1(purchased  from  Avrogen,catalog  No.FP204;Gurskaya  et  al.,2001,FEBS  Lett.507,16-20)を鋳型に使用して、配列番号18(HcR-F:  5'-GCCACCGGTCGCCACCATGGTGAG-3')及び配列番号19(HcR-R:5'-GCCGCGGCCGCTTATCAGTTGGCCTTCTCGGGCAGGTC-3')のプライマーを使用してPCR増幅した後、収得物をpEGFP-C3ベクターのEGFP塩基配列と置換して、AgeI/NotI位置に挿入して製作した。
【００６４】
<実施例３>
第１構成物、第２構成及び第３構成物の相互作用確認
<３−１>  構成物の発現確認及び移動特性分析
第２構成物が投与された環境で、第１構成物及び第３構成物のベクターが導入された細胞が育っているカバーガラスを流体器(perfusion  chamber)に固定させて、共焦点レーザー蛍光顕微鏡（カルジャイスLSM510）の載物台に取付けて、外部刺戟前と、外部刺戟(1μM  PMA(phorbol  ester)処理）後の構成物ベクターに対する映像を獲得した。
【００６５】
共焦点レーザー蛍光顕微鏡のレーザーは、488nm  Argonレーザー(EGFP又はAzG)、543nm  HeNeレーザー(mRFP)及び561nm  DPSSレーザー(HcR)を使用して蛍光標識を励起(excitation)させ、各蛍光標識から発生する蛍光シグナルは、band  pathフィルターBP505-530(EGFP又はAzG)、Long  pathフィルターLP560又はBP560-630(mRFP)及びLong  pathフィルターLP650(HcR)を使用して、各蛍光間の干渉を完全に除去した後、映像を獲得した。
【００６６】
本発明の基本概念である第２構成物の第２媒介物のビオチンに結合された化合物が、第１構成物に付着された第１媒介物であるストレプトアビジンにより、細胞膜への移動が可能であることを検証するための実験を実施し、その結果、第１構成物の移動により、第２構成物の細胞膜への移動性を映像で獲得できることを確認した（図２参照）。
【００６７】
<実施例４>
第１構成物、第２構成物及び第３構成物を利用した細胞内実時間結合分析
抗ガン剤に使用されるダサチニブの薬剤標的を検証するために、今まで知られているダサチニブに対する蛍光蛋白質CSK,SRC,EPHA4及びRIPK2蛋白質に対する結合分析実験を実施した。
【００６８】
その結果、図５に示した通り、各蛋白質（緑色）は、第１構成物（赤色）と第２構成物（ダサチニブ-ビオチン）が存在する状態で、移動刺戟であるPMAにより、細胞膜に同時に移動することができる。
【００６９】
CSK,SRC,EPHA4及びRIPK2蛋白質に対する細胞内結合を検証するために、第１構成物PKC-mRFP-streptavidin及び第３構成物GFP-蛋白質発現ベクター及び第２構成物ダサチニブ-ビオチンを次のように製造した。第１構成物PKC-mRFP-streptavidinは、前記実施例<2-1>の方法により製作した。第２構成物ダサチニブ-ビオチンは、前記実施例<2-2>の方法により製作した。第３構成物EGFP-蛋白質は、それぞれヒト由来の遺伝子を鋳型に使用してPCR増幅した後、収得物をpEGFP-C3ベクターに挿入して製作した。
【００７０】
前記第１構成物(PKC-mRFP-streptavidin)及び第３構成物(EGFP-蛋白質)を前記実施例<1-2>に記載された方法によりCHO-k1細胞に導入し、第２構成物（ダサチニブ-ビオチン）が投与された環境で発現するようにした。18時間の培養を経て１μM  PMAを５分間処理後、蛍光分布を実施例<3-1>での通り観察した。
【００７１】
第２構成物ダサチニブ-ビオチンは、第１構成物と第２構成物が発現された細胞が育つ培地に最終濃度１μMで投与した後、４時間培養して細胞内に投与されるようにした。
その結果、ダサチニブに結合する標的物質が結合された第３構成物に対する蛍光が、移動モジュールが結合された赤色蛍光と同様に、PMA処理時に、全て細胞膜に移動することが分かった（図5,6,7,8,9,10,12)。
【００７２】
一方、ビオチンが結合されていないダサチニブを濃度別に処理する場合、図12に示した結果の通り、CSK蛋白質の移動はダサチニブの処理濃度が高くなるほど細胞膜への移動が阻害されることを確認することができた。
【００７３】
化合物であるダサチニブに結合する蛋白質を映像分析を通じて確認できることを確認し、これを再検証するために、当業者に知られた方法である免疫沈降法を通じて各結合蛋白質の結合が起りつつあることを確認することができ（図8,9,10下段参照、I:Input,B:ビオチン、D:ビオチンーダサチニブ）、図11を通じてビオチンが結合された化合物と結合していない原本化合物のリン酸化活性度が極めて類似して示されることにより、本発明が、薬剤標的の活性度変化に影響を与えない生理的な条件で標的蛋白質を同定できることを確認した。
【００７４】
<実施例５>
本発明の一般化のための他の化合物-蛋白質結合検証
前記実施例で本発明の有効性を確認したが、別の化合物を利用して、本発明の方法が一般化できることを確認した（図13参照）。さらに、他の抗ガン剤であるパラマイシンにビオチンを結合させて、パラマイシンと結合するものとして知られているFRB,FKBP12蛋白質が同時に検出されたことを確認することができ、これに対する競争的阻害物質として知られた、また別の化合物FK506により結合が阻害されたことを確認し、これは競争的阻害物質の濃度変化により変化されるので、パラマイシン-ビオチンにより標的蛋白質であるFRB,FKBP12が特異的に結合していることが証明された。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
上述した通り、（ａ）(i)移動モジュール、第１標識物質及び第１媒介物を含む第１構成物、及び(ii)標的物質及び第２標識物質を含む第３構成物を発現する細胞を製造する段階；（ｂ）前記製造された細胞に(iii)目的物質及び前記第１媒介物と結合する第２媒介物を含む第２構成物を投与する段階；（ｃ）標的物質と目的物質間の相互作用がなされるようにする段階；及び（ｄ）第１構成物及び第３構成物の細胞内分布を検出して標的物質と目的物質間の相互作用を確認する段階を含む目的物質と相互作用する標的物質のスクリーニング方法、前記第１構成物及び第３構成物を発現する細胞及び前記細胞と前記第２構成物を含むスクリーニングキットを提供する。本発明の方法は、従来の生体物質相互作用探索方法が有する不正確性及び複雑性などの短所を克服し、特に細胞内で遺伝子解読及び発現過程を通じて直接生産できない物質と細胞内で発現される物質間の相互作用を測定することができ、さらに、幅広い生体物質の相互作用検出に効果的であるため、産業上の利用可能性が高い。
【図１】
2015502174.tif 000003
【図２】
2015502174.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2015502174.tif 000009
【図８】
2015502174.tif 000010
【図９】
2015502174.tif 000011
【図１０】
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【図１１ａ）】
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【図１１ｂ）】
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【図１２】
2015502174.tif 000015
【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１４】
2015502174.tif 000019
【配列表】
2015502174000001.app
【国際調査報告】
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