(57)【要約】  有機酸を産生するために、グルコース−６−リン酸脱水素酵素およびリンゴ酸脱水素酵素を同時に発現している組換え微生物を生成した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコース−６−リン酸脱水素酵素およびリンゴ酸脱水素酵素を発現している組換え微生物。
【請求項２】
前記組換え生物がコハク酸産生微生物である、請求項１の組換え微生物。
【請求項３】
アクチノバチルス・サクシノゲネスの１６ＳリボソームＲＮＡの配列と少なくとも９０％の相同性を有する１６ＳリボソームＲＮＡの配列を含んでいる、請求項１の組換え微生物。
【請求項４】
アクチノバチルス・サクシノゲネス、ビスガードタクソン６またはビスガードタクソン１０である、請求項１の組換え微生物。
【請求項５】
異種または過剰発現したグルコース−６−リン酸脱水素酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび異種または過剰発現したリンゴ酸脱水素酵素をコードしているポリヌクレオチドを含んでいる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え微生物。
【請求項６】
前記グルコース−６−リン酸脱水素酵素またはリンゴ酸脱水素酵素がアクチノバチルス・サクシノゲネスの酵素である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換え微生物。
【請求項７】
前記グルコース−６−リン酸脱水素酵素およびリンゴ酸脱水素酵素がアクチノバチルス・サクシノゲネスの酵素である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換え微生物。
【請求項８】
前記グルコース−６−リン酸脱水素酵素またはリンゴ酸脱水素酵素が大腸菌の酵素である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組換え微生物。
【請求項９】
前記グルコース−６−リン酸脱水素酵素およびリンゴ酸脱水素酵素が大腸菌の酵素である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換え微生物。
【請求項１０】
前記グルコース−６−リン酸脱水素酵素が配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約４０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換え微生物。
【請求項１１】
前記リンゴ酸脱水素酵素が配列番号４に示すアミノ酸配列と少なくとも約６０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換え微生物。
【請求項１２】
前記微生物が、グルコース−６−リン酸脱水素酵素またはリンゴ酸脱水素酵素だけを発現している微生物よりも多量の有機酸を産生する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組換え微生物。
【請求項１３】
前記微生物が約５０ｇ／Ｌ〜１５０ｇ／Ｌの濃度でコハク酸を産生することが可能な、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組換え微生物。
【請求項１４】
有機酸を産生するための過程であって、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組換え微生物を発酵培地中で培養することを含む過程。
【請求項１５】
組換え微生物を炭素源と共に、有機酸を産生するのに好ましい条件で培養する工程を含む有機酸の産生方法であって、ここで前記組換え微生物がグルコース−６−リン酸脱水素酵素およびリンゴ酸脱水素酵素のうちの少なくとも１つを発現している、産生方法。
【請求項１６】
前記組換え微生物がグルコース−６−リン酸脱水素酵素およびリンゴ酸脱水素酵素の両方を発現する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組換え微生物を炭素源と共に、有機酸を産生するのに好ましい条件で培養することを含む、有機酸の産生方法。
【請求項１８】
前記有機酸がコハク酸またはプロピオン酸である、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記有機酸がコハク酸である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記炭素源がグルコースまたはソルビトールである、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
米国政府の援助に関する記載
本発明のいくつかの側面は、ＤＥ−ＦＣ３６−０２ＧＯ１２００１を得て、米国政府の援助の下に行われた。
関連出願への相互参照および電子出願書類の参照による組み込み
【０００２】
本出願は、２０１２年１０月２日に出願の米国仮特許出願第６１／７０８，９９８号の優先権を主張し、その開示は全体的に参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本出願は、コンピューターで読み込むことが可能な形式の配列表（ファイル名：４００００Ａ＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、２０１３年１０月２日作成、２０，０６５バイト）を開示の別の部分として含んでおり、この配列表は全体的に参照により組み込まれる。
【０００４】
本発明は、多量の有機酸を産生するように改変した微生物と使用方法に関する。
【背景技術】
【０００５】
有機酸は、様々な産業分野、例えばポリマー、食品、医薬品および化粧品業界において石油化学的に産生されている単量体にとってかわる可能性がある。生物由来の有機酸の使用は、化石燃料への依存を減らすことができ、二酸化炭素の生成という点で環境に優しい。
【発明の概要】
【０００６】
有機酸を産生するための組換え微生物を開示する。開示する組換え微生物は、酵素であるグルコース−６−リン酸−１−脱水素酵素とリンゴ酸脱水素酵素を発現し、その結果、有機酸の産生が高まる。
【０００７】
以下に番号をふったそれぞれの段落では、本発明の１つ以上の例示形態を簡潔に定義する。
【０００８】
１．グルコース−６−リン酸脱水素酵素およびリンゴ酸脱水素酵素を発現している組換え微生物。
【０００９】
２．組換え微生物がコハク酸産生微生物である、１の組換え微生物。
【００１０】
３．アクチノバチルス・サクシノゲネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡの配列と少なくとも９０％の相同性を有する１６ＳリボソームＲＮＡ配列を含んでいる１の組換え微生物。
【００１１】
４．アクチノバチルス・サクシノゲネス、ビスガード・タクソン６（Ｂｉｓｇａａｒｄ  Ｔａｘｏｎ６）およびビスガード・タクソン１０（Ｂｉｓｇａａｒｄ  Ｔａｘｏｎ１０）である、１の組換え微生物。
【００１２】
５．異種または過剰発現したグルコース−６−リン酸脱水素酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび異種または過剰発現したリンゴ酸脱水素酵素をコードしているポリヌクレオチドを含んでいる、１〜４のいずれか１つに記載の組換え微生物。
【００１３】
６．グルコース−６−リン酸脱水素酵素またはリンゴ酸脱水素酵素がアクチノバチルス・サクシノゲネスの複数の酵素である、１〜５のいずれか１つに記載の組換え微生物。
【００１４】
７．グルコース−６−リン酸脱水素酵素およびリンゴ酸脱水素酵素がアクチノバチルス・サクシノゲネスの単一の酵素である、１〜５のいずれか１つに記載の組換え微生物。
【００１５】
８．グルコース−６−リン酸脱水素酵素またはリンゴ酸脱水素酵素が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の複数の酵素である、１〜６のいずれか１つに記載の組換え微生物。
【００１６】
９．グルコース−６−リン酸脱水素酵素およびリンゴ酸脱水素酵素が大腸菌の単一の酵素である、１〜５のいずれか１つに記載の組換え微生物。
【００１７】
１０．グルコース−６−リン酸脱水素酵素が配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約４０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、１〜５のいずれか１つに記載の組換え微生物。
【００１８】
１１．リンゴ酸脱水素酵素が配列番号４に示すアミノ酸配列と少なくとも約６０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、１〜５のいずれか１つに記載の組換え微生物。
【００１９】
１２．微生物が、グルコース−６−リン酸脱水素酵素またはリンゴ酸脱水素酵素のみを発現している微生物よりも多量の有機酸（例えば、コハク酸）を産生する、１〜１１のいずれか１つに記載の組換え微生物。
【００２０】
１３．微生物が、約５０ｇ／Ｌ〜１５０ｇ／Ｌの濃度でコハク酸を産生することが可能な、１〜１２のいずれか１つに記載の組換え微生物。
【００２１】
１４．発酵培地中で１〜１３のいずれか１つに記載の組換え微生物を培養することを含む、有機酸を産生するための過程。
【００２２】
１５．組換え微生物を炭素源と共に、有機酸を産生するのに好ましい条件で培養する工程を含む有機酸の産生方法であって、ここで組換え微生物がグルコース−６−リン酸脱水素酵素およびリンゴ酸脱水素酵素のうちの少なくとも１つを発現する産生方法。
【００２３】
１６．組換え微生物がグルコース−６−リン酸脱水素酵素およびリンゴ酸脱水素酵素の両方を発現する、１５の方法。
【００２４】
１７．１〜１３のいずれか１つに記載の組換え微生物を炭素源と共に、有機酸を産生するのに好ましい条件で培養することを含む、有機酸の産生方法。
【００２５】
１８．有機酸がコハク酸またはプロピオン酸である、１５〜１７のいずれか１つに記載の方法。
【００２６】
１９．有機酸がコハク酸である、１８の方法。
【００２７】
２０．炭素源がグルコースまたはソルビトールである、１５〜１９のいずれか１つに記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１はｐＬ８８ベクターの模式図である。
【図２】図２はｐＩＳＴＯＮＳ１の模式図である。
【図３】図３はｐ８３０．６０の模式図である。
【図４】図４はｐ８５６．７８の模式図である。
【図５】図５は、大腸菌由来のＺｗｆ酵素（「クエリー」）とアクチノバチルス・サクシノゲネス由来のＺｗｆ酵素（「サブジェクト」）のアミノ酸配列の比較である。
【図６】図６は、大腸菌由来のＭｄｈ酵素（「クエリー」）とアクチノバチルス・サクシノゲネス由来のＭｄｈ酵素（「サブジェクト」）のアミノ酸配列の比較である。
【図７】図７は、アルペルギルス・フラーブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）由来のＭｄｈ酵素（「クエリー」）とアクチノバチルス・サクシノゲネス由来のＭｄｈ酵素（「サブジェクト」）のアミノ酸配列の比較である。
【図８】図８は、ｐ８３０．６０に含まれているアクチノバチルス・サクシノゲネスのｚｗｆの核酸配列である。
【図９】図９は、ｐＩＳＴＯＮＳ１に含まれているアクチノバチルス・サクシノゲネスのｍｄｈの核酸配列である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下に記す詳細な説明では、当業者が態様を実施することができるように、態様を十分詳細に説明している。また、当然のことながら、他の態様を利用してもよく、本発明の対照の精神および範囲から逸脱することなく、化学的なおよび手法に対する変更を施してもよいと。そのため、以下の詳細な説明は限定することを意図しているとは見なされず、態様の範囲は添付の請求項によってのみ規定される。
【００３０】
「微生物」という用語は、細菌、真菌または酵母などの単細胞生物を指す。
【００３１】
「組換え微生物」という用語は、天然に存在するまたはそのような微生物の元となった出発微生物と比較して、そのような微生物が変化した、修飾されたまたは異なる遺伝子型または表現型を示すように（例えば、遺伝的修飾が微生物のコード核酸配列に影響を及ぼす場合）、変化させた、修飾したまたは改変した（例えば、遺伝的に改変した）微生物を指す。
【００３２】
遺伝子操作としては、これらには限定されないが、特定の遺伝子の発現に関連がある制御配列または制御部位の変更または修飾（例えば、強力なプロモーター、誘導性プロモーターまたは複数のプロモーターの使用による）；特定の遺伝子の染色体上の位置の改変；特定の遺伝子に隣接した核酸配列（プロモーター活性にとって重要な制御配列を含むプロモーター領域内の配列、リボソーム結合部位、または転写終止因子など）の変更；特定の遺伝子のコピー数を増やすこと；特定の遺伝子産物の転写または翻訳に関わるタンパク質（例えば、制御タンパク質、抑制因子、エンハンサー、転写活性化因子など）の改変；または特定の遺伝子の発現を亢進させる他の標準的な手段のいずれもが挙げられる。
【００３３】
本明細書で使用する場合、「有機酸」とは、少なくとも１つのカルボン酸基を含んでいる酸を含む。場合により、有機酸はＣ1−Ｃ10有機酸であり、場合によってはまた、有機酸は２つのカルボキシラート基を含む。「有機酸」には例えば、コハク酸またはプロピオン酸が含まれる。有機酸の他の例としては、これらには限定されないが、乳酸、リンゴ酸、クエン酸、シュウ酸、および酒石酸が挙げられる。本明細書で使用する場合、有機酸は有機酸アニオンまたはその塩をも含み得る。例えば、「コハク酸」は、「コハク酸塩」を指すことがあり、「プロピオン酸」は「プロピオン酸塩」を指す場合がある。
【００３４】
「異種」とは、発現が所望される特定の細胞または生物にとって、本来のものではないまたは天然のものではない、いかなるポリヌクレオチドまたはポリペプチドをも指す。
【００３５】
「過剰発現」とは、産物を産生するポリヌクレオチド（例えば、ポリペプチドまたはＲＮＡ）の発現量が、その宿主細胞中で通常発現するポリヌクレオチドのレベルよりも高いことを指す。過剰発現しているポリヌクレオチドは通常、宿主細胞にとって天然のポリヌクレオチドであり、そのポリヌクレオチドの産物が、宿主細胞中で通常見られるよりも多量に生成される。例えば、これらには限定されないが、ポリヌクレオチドをそのポリヌクレオチドの天然のプロモーターとは別のプロモーターに操作可能に連結すること、または宿主細胞中にそのポリヌクレオチドのコピーをさらに導入することによって過剰発現はもたらされる。
【００３６】
ある生物「に由来する」ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、その生物の基準となるポリペプチドまたはポリヌクレオチドと同じアミノ酸配列または核酸配列を含む。あるいは、場合により、天然のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列に対して以下に記すような１つ以上の修飾を含み、場合により、天然の酵素の活性よりも高くはなくても同程度の活性（例えば、天然の酵素活性レベルの少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、または少なくとも１１０％）を示す。ある生物「に由来する」ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、特定の宿主生物から物理的に取り出されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドと理解されるが、これらには限定されない。
【００３７】
また本明細書においては、端点による数値範囲の記載は、その範囲に含まれる全ての数字を含む（例えば、１〜５には、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などが含まれる）。さらに、範囲の開示には、より広い範囲に含まれる全ての部分範囲に関する開示も含まれる（例えば、１〜５は１〜４、１．５〜４．５、４〜５などを開示する）。
【００３８】
本発明は、発酵によって有機酸を産生するための改善した材料および方法を提供する。発酵の能力は通常、３つの指標、力価、生産性、および収量によって補えられる。力価は、発酵終了時における発酵培地中の産物（例えば、コハク酸などの有機酸）の濃度を規定する。生産性または産物の割合は、産物の力価に達するまでの時間を表している。収量は、原料（例えば、グルコースなどの糖）の質量当たりの質量の割合である。３つ全ての指標が、発酵生産のプロセスの経済的な面に影響を及ぼす。高力価は産物の回収を促進する；蒸発または除去すべき水分量が少量なため、それに必要とされるエネルギーも少なくて済み、プロセスを稼働するためのコストが抑えられる。生産性は力価に関連し、これに時間という概念を付加したものである。生産性が高いことは発酵プロセルが早いことを意味し、発酵プロセスの回数を増やすことができるため、発酵用の容器の大きさを小さくできる。生産性は主に、発酵生産プロセスの資本コストに影響する。収量はプロセスの運用コストに影響する。つまり収量が多ければ多いほど、産物を得るために必要とされる原材料または原料が少なくてすむ。
【００３９】
力価、生産性、および収量は連動しており、互いに影響し合っている。高力価を短時間で生じる発酵は高い生産性をもたらし、逆もまた同じである。発酵産物の堆積またはより高い力価は生産を遅らせる可能性がある。収量と生産性は逆の相関関係にあり、発酵に用いられる原料は生物の成長、細胞の増殖およびバイオマスの構築を支えるが、原料を所望の産物へと代謝もする。通常、細胞の数が多いほど、産物の量が増え、生産速度が上がり、生産性が高くなるが、収量は低くなる。従って、発酵の最適化では、経済的なプロセスが最も良くなるように、３つの指標のバランスを取る必要がある。最終的な目標は、３つの指標全ての値が高くなるプロセスを達成することである。
【００４０】
意外なことに、本明細書に記載したように、組換え微生物（例えば、アクチノバチルス・サクシノゲネス）中でペントースリン酸経路（またはエントナー・ドゥドルフ（Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ）経路）およびトリカルボン酸サイクルに含まれる酵素を同時に過剰発現させると、発酵プロセスの経済的実行可能性の重要な規定因子であるコハク酸の収量が増えることが分かった。その点に関し、少なくとも部分的には、微生物中でグルコース−６−リン酸脱水素酵素とリンゴ酸脱水素酵素を産生すると、どちらか一方の酵素のみを発現している微生物がもたらす産生レベルよりも多くの有機酸が産生されるという驚くべき発見に基づいて、本発明は予測される。ペントースリン酸サイクル（またはエントナー・ドゥドルフ経路）は、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（例えば、Ｚｗｉｓｃｈｅｎｆｅｒｍｅｎｔ酵素またはＺｗｆとも呼ばれるグルコース−６−リン酸−１−脱水素酵素）；６−ホスホグルコノラクトナーゼ；６−ホスホグルコン酸脱水素酵素、（Ｇｎｄとも四バレル）；リボース−５−リン酸イソメラーゼＡおよびＢ；リブロースリン酸３−エピメラーゼ；トランスケトラーゼＩおよびＩＩ；トランスアルドラーゼＡおよびＢ；６−ホスホグルコン酸脱水酵素（Ｅｄｄ）；および２−ケト−３−デオキシホスホグルコン酸アルドラーゼ（Ｅｄａ）など、複数の酵素を利用する。コハク酸の嫌気性生産に用いられるトリカルボン酸サイクルでは、例えば、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、フマラーゼ、およびフマル酸還元酵素などの酵素が利用される。
【００４１】
一側面において本発明は、様々な態様において、改変していない親微生物よりも多量の有機酸（例えば、コハク酸またはプロピオン酸）を産生する、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（例えば、Ｚｗｆ）とリンゴ酸脱水素酵素（例えば、Ｍｄｈ）の両方を産生する組換え微生物を提供する。グルコース−６−リン酸脱水素酵素（ＥＣ  １．１．１．４９）およびリンゴ酸脱水素酵素（ＥＣ  １．１．１．３７）の活性は、当該分野でよく理解されている。グルコース−６−リン酸脱水素酵素は例えば、Ｄ−グルコース−６−リン酸＋ＮＡＤＰ＋＝＞６−ホスホ−Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン＋ＮＡＤＰＨの反応を触媒する。リンゴ酸脱水素酵素は、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを含むがこれらには限定されない補助因子を利用して基質を還元することで、オキサロ酢酸塩をリンゴ酸塩へ、つまりオキサロ酢酸をリンゴ酸へと変換する。
【００４２】
グルコース−６−リン酸脱水素酵素およびリンゴ酸脱水素酵素は多くの生物種中に存在する。これら酵素のうちの一方または両方が組換え微生物によって天然であってもよいが、それら酵素をコードしているポリヌクレオチドの複数のコピーを、それら酵素の生産量を上げるために宿主細胞中に導入する。いくつかの態様では、組換え微生物は天然のグルコース６−リン酸脱水素酵素および／または天然のリンゴ酸脱水素酵素を、組換えていない微生物または元になった微生物に含まれるレベルよりも高いレベルで発現する（例えば、酵素を「過剰発現」する）。あるいは、これら酵素のうちの一方または両方が、組換え微生物にとって天然のものでない。様々な態様においてポリヌクレオチドは、コハク酸またはリンゴ酸を天然に産生する生物由来のものである。本発明の態様によるが、ポリヌクレオチドは天然の供給源、例えば細菌、藻類、真菌、植物、または動物から単離される；半合成的な手法で産生される（例えば、ポリヌクレオチドの核酸配列を、特定の宿主細胞、例えば大腸菌での発現に合わせてコドン最適化する）；またはデノボで合成される。
【００４３】
リンゴ酸脱水素酵素（例えば、ｍｄｈ遺伝子）をコードしているポリヌクレオチドは例えば、アクチノバチルス・サクシノゲネス（例えば、ＮＣ＿００９６５５）もしくは大腸菌（ＥＧ１０５７６（Ｅｃ℃ｙｃ））、または酵素活性を有していることが分かっている他の好適な供給源に由来するものであってよい。同様に、グルコース６−リン酸脱水素酵素をコードしているポリヌクレオチドは、様々な態様において、大腸菌（例えば、ＥＧ１１２２１（Ｅｃ℃ｙｃ）；受入番号：ＥＣＫ１８５３）またはアクチノバチルス・サクシノゲネス（例えば、ジェンバンク受入番号ＡＢＲ７３６０７．１  ＧＩ：１５０８３９６３６）に由来するものである。必要に応じて、ポリヌクレオチドをコドン最適化して特定の微生物中での発現を促進する。いくつかの態様において組換え微生物は、Ｚｗｆ酵素をコードしている配列番号１の核酸配列を含んでいるポリヌクレオチドを含み、および／またはＭｄｈ酵素をコードしている配列番号３をコードしている核酸配列を含んでいるポリヌクレオチドを含む。本明細書では、配列番号１または配列番号３と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％（または前述のパーセンテージに含まれる全ての範囲）相同の核酸配列を含んでいるポリヌクレオチドも想定する。
【００４４】
いくつかの態様では、変異型ポリヌクレオチドは、ＺｗｆまたはＭｄｈ酵素の生化学的活性の１つ以上を有しているポリペプチドをコードしている。変異型ポリヌクレオチドは例えば、ｚｗｆ遺伝子またはｍｄｈ遺伝子の断片を含み得る。いくつかの態様では、組換え微生物はアクチノバチルス・サクシノゲネス、大腸菌、バスフィア（Ｂａｓｆｉａ）（例えば、バスフィア・サクシニシプロデュセンス（Ｂａｓｆｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｐｒｏｄｕｃｅｎｓ））、マンヘミア（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ）（例えば、マンヘミア・サクシニシプロデュセンス（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ））、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）またはそれらの変異体が発現するｚｗｆまたはｍｄｈ遺伝子を発現していてもよい。
【００４５】
発明者らは、単一の発酵プロセス中でＺｗｆ酵素とＭｄｈ酵素の両方を発現させると、コハク酸またはプロピオン酸などの有機酸の産生量が増えることを発見した。いくつかの態様では、ＺｗｆとＭｄｈを同時に発現する単一の組換え生物を用いてもよい。他の態様では、ｚｗｆとｍｄｈをコードしている遺伝子を別々の生物中で発現させるが、これら両方の酵素の発現を合わせて有機酸を産生する単一の発酵プロセス中で利用する。本発明は、Ｍｄｈ酵素の生化学的活性の１つ以上を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含んでいる、必要に応じて、Ｚｗｆ酵素の生化学的活性、例えばグルコース−６−リン酸脱水素酵素活性および／またはＮＡＤＰ還元酵素活性の１つ以上を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを併せて含んでいる組換え微生物（例えば、そのようなポリヌクレオチドで形質転換した微生物）を想定するものである。例えば、好適なＺｗｆまたはＭｄｈ酵素は大腸菌のＺｗｆもしくはＭｄｈ酵素またはその変異体である。言い換えれば、様々な態様におけるグルコース−６−リン酸脱水素酵素および／またはリンゴ酸脱水素酵素は、大腸菌のまたはアクチノバチルス・サクシノゲネスの酵素である。
【００４６】
代表的なグルコース６−リン酸脱水素酵素のアミノ酸配列を配列番号２として示す。これはアクチノバチルス・サクシノゲネスのＺｗｆのアミノ酸配列である。組換え微生物は、Ｚｗｆ酵素（例えば、配列番号２）のアミノ酸配列と少なくとも約４０％の配列相同性を有する、より好ましくは、Ｚｗｆ酵素のアミノ酸配列（例えば、配列番号２）と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％の配列相同性を有する変異型ポリペプチドを発現してもよい。様々な態様において変異型ポリペプチドは、基準となる配列に対して１つ以上の保存的な変異を含む。つまり、アミノ酸は機能的に類似のアミノ酸と置換されている。言い換えると、保存的置換は、あるアミノ酸残基を似たような側鎖をもつアミノ酸残基で置き換えることを伴う。アミノ酸残基ファミリーは当該分野において定義されている類似の側鎖を有し、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、およびヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸）、無電荷極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、およびシステイン）、無極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、およびトリプトファン）、ベータ分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、およびイソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびヒスチジン）がある。
【００４７】
代表的なリンゴ酸脱水素酵素のアミノ酸配列を配列番号４として示す。これはアクチノバチルス・サクシノゲネスのＭｄｈのアミノ酸配列である。組換え微生物は、Ｍｄｈ酵素のアミノ酸配列（例えば、配列番号４）と少なくとも約５０％または少なくとも約６０％の配列相同性を有する、より好ましくは、Ｍｄｈ酵素のアミノ酸配列（例えば、配列番号４）と少なくとも約７０％または８０％または９０％の配列相同性を有する変異型ポリペプチドを発現してもよい。
【００４８】
アミノ酸配列の実質的な変異型は、組換え微生物の酵素との関連で許容される。例えば、大腸菌およびアクチノバチルス・サクシノゲネス由来のＺｗｆ酵素のアミノ酸配列の相同性は４４％であるが、本発明に関してはこの両方の酵素が適している。図５を参照のこと。同様に、大腸菌およびアクチノバチルス・サクシノゲネス由来のＭｄｈ酵素のアミノ酸配列の相同性は６９％であり、本発明に関してはこの両方の酵素が適している。図６を参照のこと。Ｍｄｈ酵素は一般的に、種々の生物種中でよく保存されている。糸状菌であるアスペルギルス・フラーブス由来のＭｄｈ酵素のアミノ酸配列は、アクチノバチルス・サクシノゲネスのＭｄｈ酵素の配列とおよそ５０％の相同性を示し、かつ、オキサロ酢酸をリンゴ酸に変換する能力を保持している。図７を参照のこと。
【００４９】
好ましくは、変異型ポリペプチドは、ＺｗｆまたはＭｄｈ酵素の生化学的活性、例えば、グルコース−６−リン酸脱水素酵素およびリンゴ酸脱水素酵素活性のうちの１つ以上を有している。変異型ポリペプチドは、ＺｗｆまたはＭｄｈ酵素の断片を含み得る。グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性およびリンゴ酸脱水素酵素活性を評価する方法は当該分野において知られており、かつ、例えば、Ａｂｃａｍ（ケンブリッジ、マサチューセッツ）およびＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ミズーリ）から購入可能である。グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を決定するアッセイの一例が、Ｒｏｗｌｅｙ  ａｎｄ  Ｗｏｌｆ，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  １７３，  ９６８−９７７  （１９９１）  ａｎｄ  Ｗｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  １３９，  １０９３−１０９６  （１９７９）に記載されている。反応条件の例は以下の通りである：５０ｍＭのＴｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．８）、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＮＡＤＰ、１ｍＭのグルコース−６−リン酸と細胞抽出物を含む反応混合物を調製し、吸光度の上昇を３４０ｎｍで測定する。様々な態様において、ポリヌクレオチドによってコードされているグルコース−６−リン酸脱水素酵素は、配列番号２のポリペプチドのグルコース−６−リン酸脱水素酵素活性の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の活性を示す。ポリヌクレオチドによってコードされているグルコース−６−リン酸脱水素酵素は、配列番号２のポリペプチドのグルコース−６−リン酸脱水素酵素活性の１００％を超える活性（例えば、１１０％以上、１２０％以上、または１３０％以上の活性）を示す場合もある。あるいはまたはこれに加えて、組換え微生物によって産生されるリンゴ酸脱水素酵素は、配列番号４のポリペプチドのリンゴ酸脱水素酵素活性の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の活性を示す。ポリヌクレオチドによってコードされているリンゴ酸脱水素酵素が、配列番号４のポリペプチドのリンゴ酸脱水素酵素活性の１００％を超える活性（例えば、１１０％以上、１２０％以上、または１３０％以上の活性）を示す場合もある。リンゴ酸脱水素酵素活性を決定するためのアッセイの一例が、Ｓａｍｕｅｌｏｖ，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  ５７，  ３０１３  （１９９１）に記載されている。反応条件の例は以下の通りである：１００ｍＭのＴｒｉｓ−塩酸（ｐＨ８．１）、５ｍＭのオキサロ酢酸、０．３ｍＭのＮＡＤＨ、２ｍＭのＤＴＴ、および細胞抽出物を含む反応混合物を調製し、ＮＡＤＨの酸化を表す吸光度の低下を３４０ｎｍで測定する。
【００５０】
組換え微生物は細菌細胞や他の原核生物の細胞、および酵母細胞など、好適な微生物であればいずれに由来するものであってよい。一般的には、微生物は商業的な産生に好適なレベルで有機酸を産生することができる。本明細書に記載したように、組換え微生物を調製するのに好適な微生物としては、コハク酸を産生する微生物がある。微生物の例としては、これらには限定されないが、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ）の生物が挙げられる。パスツレラ科のメンバーとしては、アクチノバチルス・サクシノゲネス、ビスガードタクソン６（エーテボリ大学（スウェーデン）の菌株保存機関（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｏｔｅｂｏｒｇ（ＣＣＵＧ））に受入番号１５５６８として寄託されている）、ビスガードタクソン１０（ＣＣＵＧに受入番号１５５７２として寄託）、マンヘミア・サクシニシプロデュセンス、バスフィア・サクシニシプロデュセンス、大腸菌、アナエロビオスピリルム（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）・サクシニシプロデュセンス、ルミノバクター・アミロフィラス（Ｒｕｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ａｍｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）、スクシンビブリオ・デキストリンソルベンズ（Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏｄｅｘｔｒｉｎｏ  ｓｏｌｖｅｎｓ）、プレボテラ・ルミニコラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）、およびコネリ型細菌（例えば、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コネリバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｉｎ）、ブレビバクテリウム・デバリカタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ））などのアクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属のメンバー；ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属のメンバー；酵母（例えば、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属のメンバー）；およびその任意の一部が挙げられる。いくつかの態様では、組換え株は、その微生物の１６Ｓ  ｒＲＮＡがアクチノバチルス・サクシノゲネスの１６Ｓ  ｒＲＮＡと少なくとも約９０％の配列相同性（例えば、少なくとも約９５％の配列相同性）をもつ微生物由来であってよい。例えば、その組換え株は、アクチノバチルス・サクシノゲネス、ビスガードタクソン６、またはビスガードタクソン１０の株に由来するものであってよい。
【００５１】
組換え微生物は、ｚｗｆ遺伝子、またはｍｄｈ遺伝子あるいはその両方を発現し得る。ｚｗｆ遺伝子またはｍｄｈ遺伝子は組換え微生物にとって天然のものであってもよい。他の態様においてｚｗｆ遺伝子またはｍｄｈ遺伝子は異種であってもよい（つまり、その組換え微生物の元になった微生物にとって天然のものでなくてもよい）。いくつかの態様では、グルコース−６−リン酸脱水素酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび／またはリンゴ酸脱水素酵素をコードしているポリヌクレオチド（例えば、ｚｗｆまたはｍｄｈ遺伝子）は、組換え微生物中での発現に対して最適化される。例えば、ｚｗｆまたはｍｄｈ遺伝子を、組換えていない微生物に比べて、遺伝子の過剰発現を促進するプロモーターに操作可能に連結してもよい。プロモーターは、微生物にとって内生のものであっても（例えば、組換え微生物の元になった微生物にとって天然のものであってよい）、微生物にとって異種のものであってもよい。いくつかの態様では、ｚｗｆ遺伝子とｍｄｈ遺伝子は、アクチノバチルス・サクシノゲネスに由来するものであり、それぞれ、アクチノバチルス・サクシノゲネス由来のｚｗｆプロモーターとｍｄｈプロモーターによって制御されている。
【００５２】
グルコース−６−リン酸脱水素酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび／またはリンゴ酸脱水素酵素をコードしているポリヌクレオチド（例えば、ｚｗｆ遺伝子またはｍｄｈ遺伝子）を必要に応じて修飾子、対応するｍＲＮＡの翻訳を促進する。例えば、ｚｗｆ遺伝子またはｍｄｈ遺伝子を修飾して、内生のまたは天然の遺伝子には存在しないコドンを含めてもよい。これらの内生のものではないコドンは、組換え微生物中でのコドン使用頻度を反映するように選択することができる。コドン使用頻度表は多くの微生物に関して作成されており、当該分野において知られている。例えば、グルコース−６−リン酸脱水素酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび／またはリンゴ酸脱水素酵素をコードしているポリヌクレオチド（例えば、ｚｗｆ遺伝子またはｍｄｈ遺伝子）を、その全体が参照により組み込まれる米国特許第８，１１９，３７７号に示されているように、アクチノバチルス・サクシノゲネスのコドン使用頻度を反映するように修飾することができる。
【００５３】
組換え微生物は、コハク酸またはプロピオン酸などの有機酸のうちの１つ以上を高レベルで産生する株に由来するものであってもよく、あるいは組換え微生物は、コハク酸またはプロピオン酸などの有機酸のうちの１つ以上を、組換えていない微生物よりも高いまたは多いレベルで産生するように選択または改変してもよい。
【００５４】
必要に応じて、相対的に高レベルの望ましくない副産物に対して耐性をもつように、または望ましくない副産物を相対的に低いレベルで産生するように組換え微生物を選択または改変する（あるいは選択と改変の両方を行う）。例えば、細胞にグルコース−６−リン酸脱水素酵素をコードしているポリヌクレオチドおよびリンゴ酸脱水素酵素を導入（例えば、形質転換）した後、一群の組換え微生物を必要に応じてモノフルオロ酢酸ナトリウム存在下で生育させ、相対的に高いレベルの酢酸塩に耐性をもつ株または相対的に低いレベルの酢酸塩を産生する株を選択する。望ましくない副産物としては、これらには限定されないが、ギ酸塩（すなわちギ酸）、酢酸塩（すなわち酢酸）、および／またはピルビン酸塩（すなわちピルビン酸）、乳酸塩、１，３−プロパンジオール、およびエタノールが挙げられる。低レベルで酢酸塩を産生する株を選択する方法は当該分野において知られている。例えば、米国特許第５，５２１，０７５号および同第５，５７３，９３１号を参照のこと（これらは参照することで、特に微生物株の選択に関する考察に関して、本明細書に組み込まれる）。例えば、相対的に低レベルの酢酸塩を産生する微生物の株は、微生物を有毒な酢酸塩の存在下で、例えば約１．０〜約８．０ｇ／Ｌの濃度のモノフルオロ酢酸ナトリウム存在下で生育させることで選択することができる。選択された株は、グルコース発酵の過程において、相対的に低いレベルの酢酸塩（例えば、約１０ｇ／Ｌ未満、約７ｇ／Ｌ未満、約５ｇ／Ｌ未満、または約２．０ｇ／Ｌ未満）、ギ酸塩（例えば、約２．０ｇ／Ｌ未満）、および／またはピルビン酸塩（例えば、約３．０ｇ／Ｌ未満）を産生するだろう。組換え微生物または誘導体を生産するのに適したモノフルオロ酢酸耐性株の１種としては、ＡＴＣＣに受入番号５５６１８として寄託されているアクチノバチルス・サクシノゲネスがある。モノフルオロ酢酸耐性の微生物株を調製するのに適した方法を説明している米国特許第５，５７３，９３１号もまた参照のこと。他の適したモノフルオロ酢酸耐性株としては、これもまた米国特許第５，５７３，９３１号に記載されているＦＺ４５およびＦＺ５３が挙げられる。
【００５５】
グルコース−６−リン酸脱水素酵素をコードしているポリヌクレオチドおよびリンゴ酸脱水素酵素をコードしているポリヌクレオチド（またはＺｗｆまたはＭｄｈ酵素の生化学的活性の１つ以上を有しているポリペプチド）は、当該分野において知られている方法（例えば、適したプライマーを用いたＰＣＲ増幅や好適なＤＮＡベクターへのクローニング）を利用することで得ることができる。グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性をコードしている好適なｚｗｆ遺伝子のポリヌクレオチド配列は開示されている（例えば、ジェンバンクを参照のこと）。例えば、アクチノバチルス・サクシノゲネスのｚｗｆ遺伝子のポリヌクレオチド配列は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，１１９，３７７号に記載されている。米国エネルギー省合同ゲノム研究所（Ｊｏｉｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ）のウェブサイト、ＮＣＢＩの受入番号ＮＣ＿００９６５５もまた参照のこと。大腸菌のｚｗｆ遺伝子はジェンバンクに寄託されている（例えば、ジェンバンク受入番号ＮＣ  ０００９１３およびジェンバンク受入番号Ｍ５５００５）。ｚｗｆ遺伝子またはその変異体は、微生物のゲノムＤＮＡを適切なプライマーを利用してＰＣＲ増幅することで得ることができる。
【００５６】
ｍｄｈの配列は、例えば、アクチノバチルス・サクシノゲネス、ジェンバンク  ＮＣ＿００９６５５、または大腸菌  ＥＧ１０５７６（ＥｃｏＣｙｃ）から得ることができる。
【００５７】
ＤＮＡベクターは、組換え微生物中でポリヌクレオチドを発現させるのに好適なベクターであればいずれであってもよい。好適なベクターとしては、プラスミド、人工染色体（例えば、細菌性の人工染色体）、および／または改変したバクテリオファージ（例えば、ファージミド）が挙げられる。後成的な要素を含むようにベクター設計してもよく、および／または微生物のゲノムで組み換えるようにベクター設計してもよい。
【００５８】
ポリヌクレオチドは通常、グルコース−６−リン酸脱水素酵素またはリンゴ酸脱水素酵素をコードしている核酸配列（つまり、ＺｗｆのまたはＭｄｈの酵素活性を有しているポリペプチド）に操作可能に連結したプロモーターを含んでいる。プロモーターは内生のつまり組換え微生物の元になった微生物にとって天然のものであっても、またはその微生物にとって異種のものであってもよい（例えば、組換え微生物とは別の供給源に由来するものであってよい）。さらにプロモーターは、選択したグルコース−６−リン酸脱水素酵素またはリンゴ酸脱水素酵素のコード配列（つまりｚｗｆ遺伝子もしくはｍｄｈ遺伝子）にとって天然のプロモーターであっても、あるいは、選択したグルコース−６−リン酸脱水素酵素またはリンゴ酸脱水素酵素にとって天然のプロモーターでなくてもよい（例えば、ｚｗｆ遺伝子またはｍｄｈ遺伝子のプロモーターでなくてもよい）。いくつかの態様では、組換え微生物はアクチノバチルス・サクシノゲネスの株の一種であり、かつ、アクチノバチルス・サクシノゲネスのｚｗｆまたはｍｄｈのプロモーターを使用する。他の態様では、プロモーターは、アクチノバチルス・サクシノゲネスのホスホエノールピルビン酸（ＰｃｋＡ）カルボキシキナーゼのプロモーター（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，１１９，３７７号で開示されているように、ジェンバンクに受入番号ＡＹ３０８８３２として寄託されたホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼの１〜２５８番目のヌクレオチドを含むプロモーターまたはその変異体）である場合がある。所望の微生物中で所望の配列の発現を誘導できれば、いずれの好適なプロモーター（例えば、誘導性の、恒常的な、強力なプロモーターなど）を使用してもよい。プロモーターは、グルコース−６−リン酸脱水素酵素またはポリヌクレオチドコードしているリンゴ酸脱水素酵素をコードしているポリヌクレオチド（例えば、ｚｗｆ遺伝子またはｍｄｈ遺伝子）に当該分野で知られているクローニング方法によって、操作可能に連結してもよい。例えば、プロモーターとコード配列（例えばｚｗｆ遺伝子およびｍｄｈ遺伝子）を、適合する制限酵素認識部位を含むプライマーを使用してＰＣＲで増幅することができる。その後、増幅したプロモーターとコード配列を酵素で消化し、好適なマルチプルクローニングサイトを含む適切なベクターにクローニングすることができる。
【００５９】
加えて、ポリヌクレオチドまたはベクターは、選択マーカーを含んでいるか、またはコードしていてもよい。選択マーカーは１種類以上の抗生物質に対する耐性を付与し得る。例えば、選択マーカーとしては、アンピシリン耐性、ストレプトマイシン耐性、カナマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、クロラムフェニコール耐性、スルホンアミド耐性に関する遺伝子、またはこれらのマーカーの組み合わせが挙げられ得る。通常、選択マーカーはこのマーカーの発現を促進するプロモーターに操作可能に連結されている。選択マーカーを含んでいるプラスミドおよび他のクローニングベクターは当該分野で知られている。
【００６０】
ポリヌクレオチドを含んでいるベクターを保存または増殖させるために、いかなる好適な宿主細胞をも利用することができる。宿主細胞は必要に応じて、ＤＮＡ分子上のコード配列を発現する。好適な宿主細胞にはまた、発酵プロセス中にコハク酸またはプロピオン酸などの有機酸を商業生産に好適な濃度（例えば、少なくとも約２０ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも約５０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは少なくとも約１００ｇ／Ｌの濃度）で産生することが可能な細胞（つまり有機酸を産生する細胞）が含まれ得る．
【００６１】
本発明においては、有機酸の産生方法は通常、組換え微生物を用いて栄養培地を発酵させることを含む。いくつかの態様では、組換え微生物は発酵培地中でｚｗｆ遺伝子およびｍｄｈ遺伝子を発現する。例えばこの方法は、ｚｗｆ遺伝子およびｍｄｈ遺伝子（例えば、ａ天然のアクチノバチルス・サクシノゲネスのｚｗｆ遺伝子またはｍｄｈ遺伝子）を発現する組換えアクチノバチルス・サクシノゲネスを用いて栄養培地を発酵させることを含み得る。遺伝子と生物の他の組み合わせをしようして培地を発酵させ、有機酸を産生してもよいことも想定できる。例えば異種ｚｗｆ遺伝子と内生ｍｄｈ遺伝子の両方を異種プロモーターから、または任意の他の適した組み合わせを、適切な生物中で発現させてもよい。
【００６２】
従って、一側面において本発明は、本明細書に記載の組換え微生物を炭素源と共に有機酸を産生するのに好ましい条件で培養することを含む有機酸の産生方法を提供する。組換え微生物は例えば、異種または過剰発現したグルコース−６−リン酸脱水素酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび異種または過剰発現したリンゴ酸脱水素酵素をコードしているポリヌクレオチドを含み、かつ、所望の有機酸を産生することができる酵素を生成する。発酵の過程で産生される有機酸としては、例えば、コハク酸またはプロピオン酸、または本明細書で議論される他の任意の有機酸が挙げられ得る。
【００６３】
本明細書に記載の方法に好適な組換え微生物の１種としては、大腸菌のｚｗｆ遺伝子を発現するアクチノバチルス・サクシノゲネスの組換え株がある（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−６２５５）。この生物は、ｍｄｈ遺伝子を発現している別の組換え生物と一緒になって、両方を発酵栄養培地中で生育させて有機酸を産生させることができる。あるいは、ＡＴＣＣに受入番号ＰＴＡ−６２５５として寄託されている株を改変して、ｍｄｈを過剰発現させるか異種のＭｄｈを生成させる。この方法はまた、コハク酸を産生するために、ｚｗｆもしくはｍｄｈまたはその両方の遺伝子（例えば、大腸菌などに由来する異種のｚｗｆ遺伝子またはｍｄｈ遺伝子）を発現するビスガードタクソン６またはビスガードタクソン１０の組換え株を用いて栄養培地を発酵させることも含む場合がある。
【００６４】
栄養培地は通常、発酵可能な炭素源を含んでいる。発酵可能な炭素源は、発酵可能なバイオマスから供給され得る。発酵可能なバイオマスは、様々な作物および／または原料に由来するものであってよく、こられには、糖科作物（例えば、糖、テンサイ、スイートソルガム、サトウキビ、飼料ビート）；デンプン料作物（例えば、トウモロコシ、コムギ、ソルガム、オオムギなどの子実およびジャガイモやサツマイモの塊茎）；セルロース性作物（例えば、トウモロコシ茎葉、トウモロコシ繊維、麦わら、およびスーダングラスやソルガムなどの茎葉飼料）が含まれる。発酵可能な炭素源（例えば糖類）の放出を促進するようにバイオマスを処理してもよい。例えばバイオマスを、単糖を放出するように、セルラーゼおよび／またはキシラナーゼで処理してもよく、および／または、分解が促進されるように熱、蒸気もしくは酸で処理してもよい。発酵可能な炭素源としては、単糖やグルコース、麦芽糖、マンノース、マンニトール、ソルビトール、ガラクトース、キシロース、キシリトール、アラビノース、アラビトール、およびその混合物などの糖アルコールが挙げられ得る。いくつかの態様では、精製していない、処理を最小限に抑えたまたは未精製の炭素源を有機酸の産生に使用することができる。一態様では、炭素源として粗ポリオールを含み得る。粗ポリオールは、本出願が優先権を主張する米国仮特許出願第６１／７０８９９８号と同日に「有機酸を産生するための統合されたシステムおよび方法（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＆  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｓ）」という名称で出願された米国仮特許出願一連番号第６０／７０９，０３６号に記載されおり、この出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。粗ポリオールとしては例えば、例えば、発酵または水素化を介して産生されたか、そうでなければ最小限の加工にかけられたポリオールが挙げられる。例えば、粗ポリオールは固形物を除去するための濾過工程にはかけられていない。つまり、粗ポリオールは精製されたポリオールほどは純度が高くない。
【００６５】
本発明の方法からは、加えた炭素源、例えば糖類（例えば、グルコースまたはソルビトール）に対して相対的に高収量のコハク酸が得られる。例えば、この方法では場合により、加えた炭素源（例えば、グルコース）に対して収量（ｇ）が少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％（または前述したパーセンテージに含まれる任意の範囲）のコハク酸が得られるか、または加えた炭素源（例えば、グルコース）に対して収量（ｇ）が少なくとも５６％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または前述したパーセンテージに含まれる任意の範囲）のプロピオン酸が得られる。いくつかの態様では、収量（％）＝コハク酸またはプロピオン酸（ｍｏｌ）／加えた炭素源（例えば、グルコース）（ｍｏｌ）として収量を算出することができる。すなわちこの方法からは、加えた炭素源（例えば、グルコース）（ｍｏｌ）あたり少なくとも約１５４％の収量のコハク酸またはプロピオン酸（ｍｏｌ）が生じ得る。加えた炭素源（例えば、グルコース）（ｍｏｌ）当たり少なくとも約１３０％または少なくとも約１７０％の収量のコハク酸またはプロピオン酸（ｍｏｌ）を生じ得ることが望ましい。
【００６６】
この方法からは相対的に高濃度の（例えば、発酵の過程で組換えていない微生物を使った方法よりも高濃度の）コハク酸が得られ得る。例えば、この発酵過程においてコハク酸の濃度は、少なくとも約５０ｇ／Ｌ（例えば、少なくとも約６０ｇ／Ｌ、少なくとも約７０ｇ／Ｌ、または少なくとも約８０ｇ／Ｌ）に達し得る。発酵過程におけるコハク酸の濃度が少なくとも約９０ｇ／Ｌ（例えば、少なくとも約１００ｇ／Ｌのコハク酸、少なくとも約１１０ｇ／Ｌのコハク酸、または少なくとも約１２０ｇ／Ｌのコハク酸）以上に達することが望ましく、コハク酸の濃度が少なくとも約１３０ｇ／Ｌに達することがより望ましく、濃度が少なくとも約１４０ｇ／Ｌに達することがさらに望ましい。いくつかの態様では、この発酵過程では通常、酢酸塩、ギ酸塩、ピルビン酸塩、およびその混合物などの望ましくない副産物が実質的なレベルでは産生されない（例えば、酢酸塩が約１１．０ｇ／Ｌ以下、酢酸塩が約１０．０ｇ／Ｌ以下、酢酸塩が約９．０ｇ／Ｌ以下、酢酸塩が約８．０ｇ／Ｌ以下、酢酸塩が約７．０ｇ／Ｌ以下、酢酸塩が約６．０ｇ／Ｌ以下、酢酸塩が約５．０ｇ／Ｌ以下、酢酸塩が約４．０ｇ／Ｌ以下、以下約３．０ｇ／Ｌ、または酢酸塩が約２．０ｇ／Ｌ以下（例えば、１．５ｇ／Ｌ以下または１．０ｇ／Ｌ以下）；ギ酸塩が約２．０ｇ／Ｌ以下（例えば、１．５ｇ／Ｌ以下または１．０ｇ／Ｌ以下）；および／またはピルビン酸塩が約３．０ｇ／Ｌ以下（例えば、２．５ｇ／Ｌ以下または２．０ｇ／Ｌ以下または１．５ｇ／Ｌ以下または１．０ｇ／Ｌ以下）である）。
【００６７】
本明細書に記載の方法は場合によって、相対的に高い生産率をもたらす。様々な態様においてこの方法は、１時間当たり少なくとも約１．０ｇ／Ｌ、１時間当たり少なくとも約１．５ｇ／Ｌ、１時間当たり少なくとも約２．０ｇ／Ｌ、１時間当たり少なくとも約２．５ｇ／Ｌ、１時間当たり少なくとも約３．０ｇ／Ｌ、１時間当たり少なくとも約３．５ｇ／Ｌ、または１時間当たり少なくとも約４．０ｇ／Ｌの生産性を達成する。
【００６８】
一態様において組換え微生物は、異種のｚｗｆ遺伝子およびｍｄｈ遺伝子を発現するアクチノバチルス・サクシノゲネスである。異種のｚｗｆ遺伝子およびｍｄｈ遺伝子をアクチノバチルス・サクシノゲネス中で発現させるために最適化してもよい。異種のｚｗｆ遺伝子およびｍｄｈ遺伝子は大腸菌にコードされているものであってもよい。例えば、組換え生物は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、マナッサス、バージニア、米国）に受入番号ＰＴＡ−６２５５として寄託されているアクチノバチルス・サクシノゲネスであり、これを必要に応じて改変してＭｄｈを過剰生産させる。別の組換え微生物はＡＴＣＣに受入番号ＰＴＡ−１２０４６２として寄託されているアクチノバチルス・サクシノゲネスの株であり、これは親（未改変の）アクチノバチルス・サクシノゲネス株よりも高レベルでＺｗｆとＭｄｈを生産する株である。組換え株は約５０ｇ／Ｌ〜約１５０ｇ／Ｌの濃度でコハク酸またはプロピオン酸を生産することが可能な株であってよい（例えば、好適な炭素源を使用した発酵システムにおいて）。組換え株は少なくとも約１ｇ／Ｌのレベルのモノフルオロ酢酸ナトリウムに対して耐性をもつ株であってもよい。
【００６９】
別の態様では、組換え株はアクチノバチルス・サクシノゲネスであり、この組換え株は、異種ｚｗｆ遺伝子またはｍｄｈ遺伝子に操作可能に連結したアクチノバチルス・サクシノゲネスの転写プロモーター（例えば、Ｚｗｆコード配列に連結させたアクチノバチルス・サクシノゲネスのプロモーターおよびＭｄｈコード配列に連結させたアクチノバチルス・サクシノゲネスのプロモーター）を含んでいるＤＮＡ分子（つまりポリヌクレオチド）を含む。転写プロモーターとしては、米国特許第８，１１９，３７７号でその配列が開示されているアクチノバチルス・サクシノゲネスのホスホエノールピルビン酸（ＰｃｋＡ）カルボキシキナーゼのプロモーターまたはその変異型が挙げられ得る。異種ｚｗｆ遺伝子は、大腸菌のＺｗｉｓｃｈｅｎｆｅｒｍｅｎｔ酵素またはその変異体をコードするものであってよい。異種ｍｄｈ遺伝子は大腸菌のＭｄｈ酵素またはその変異体をコードするものであってよい。必要に応じて、ｚｗｆ遺伝子および／またはｍｄｈ遺伝子をアクチノバチルス・サクシノゲネス中で発現させるために最適化してもよい。ＤＮＡ分子は後成的なものであってもよい（例えば、プラスミドに含まれるものであってよい）。ＤＮＡ分子は選択マーカー（例えば、カナマイシン耐性、アンピシリン耐性、ストレプトマイシン耐性、スルホンアミド耐性、テトラサイクリン耐性、クロラムフェニコール耐性、またはそれらの組み合わせ）を含んでいてもよい。
【００７０】
いくつかの態様では、ＤＮＡ分子（ポリヌクレオチド）は異種ｚｗｆ遺伝子に操作可能に連結されたａコハク酸産生微生物の転写プロモーターを含む。転写プロモーターはｚｗｆプロモーターを含み得る。ＤＮＡ分子はプラスミドに含まれていてもよい。ＤＮＡ分子は宿主細胞内に含まれていてもよい（例えば、コハク酸またはプロピオン酸を約５０ｇ／Ｌ〜約１５０ｇ／Ｌの濃度で産生する宿主細胞）。
【００７１】
一態様では、コハク酸の産生方法を提供する。この方法は、グルコース−６−リン酸脱水素酵素を産生するために、異種ｚｗｆ遺伝子を発現する組換え微生物を使用して栄養培地を発酵させることを含み、必要に応じて、リンゴ酸脱水素酵素を産生するために異種ｍｄｈ遺伝子を発現している第二の組換え微生物を併用する。様々な態様においてこの組換え微生物は、異種ｍｄｈ遺伝子と異種ｚｗｆ遺伝子を発現する。組換え微生物には、アクチノバチルス・サクシノゲネスの組換え株（例えば、ＡＴＣＣに受入番号ＰＴＡ−６２５５として寄託されているアクチノバチルス・サクシノゲネスの組換え株）が含まれ得る。組換え微生物には、ビスガードタクソン６、ビスガードタクソン１０などの組換え株も含まれ得る。異種ｚｗｆ遺伝子には大腸菌のｚｗｆ遺伝子が含まれ得る。異種ｍｄｈ遺伝子には大腸菌のｍｄｈ遺伝子が含まれ得る。必要に応じて、組換え株は少なくとも約１ｇ／Ｌレベルのモノフルオロ酢酸ナトリウムに耐性をもつ。場合により、組換え株はコハク酸またはプロピオン酸を約５０ｇ／Ｌ〜約１５０ｇ／Ｌの濃度で産生することが可能である。栄養培地は発酵可能な糖（例えば、グルコース）を含む場合がある。通常、この方法では、グルコース（ｇ）に対して収量（ｇ）が少なくとも約１００％のコハク酸が得られる。
【００７２】
別の態様では、組換え微生物はコハク酸産生微生物の組換え株である。組換え微生物（例えば形質転換した微生物）は異種のｚｗｆ遺伝子（つまり、異種のグルコース−６−リン酸脱水素酵素をコードしているポリヌクレオチド）を含む。異種ｚｗｆ遺伝子を微生物中で発現させるために最適化してもよい。いくつかの態様では、異種ｚｗｆ遺伝子は大腸菌のＺｗｆ酵素をコードするものであってよい。
【００７３】
別の態様では、組換え微生物は、Ｚｗｆ酵素活性を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドに操作可能に連結させたホスホエノールピルビン酸（ＰｃｋＡ）カルボキシキナーゼの転写プロモーターを含むＤＮＡ分子（ポリヌクレオチド）で形質転換したコハク酸産生微生物の組換え株である。組換え微生物を必要に応じて、Ｍｄｈ酵素活性を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドに操作可能に連結させたホスホエノールピルビン酸（ＰｃｋＡ）カルボキシキナーゼの転写プロモーターを含むＤＮＡ分子（ポリヌクレオチド）で形質転換しておく。転写プロモーターとしてはアクチノバチルス・サクシノゲネスのホスホエノールピルビン酸（ＰｃｋＡ）カルボキシキナーゼのプロモーターが挙げられ得る。別の態様では、組換え微生物は後成的なＤＮＡ分子で形質転換した組換え株である。ＤＮＡ分子はプラスミドに含まれていてもよい。
【００７４】
別の態様では、組換え微生物は、コハク酸またはプロピオン酸を約５０ｇ／Ｌ〜約１５０ｇ／Ｌの濃度で産生することが可能な組換え株である。
【００７５】
組換え株は少なくとも約１ｇ／Ｌのレベルのモノフルオロ酢酸ナトリウムに対する耐性を有していてもよい。いくつかの態様では、組換え株は、ＡＴＣＣに受入番号ＰＴＡ−６２５５として寄託されている組換えアクチノバチルス・サクシノゲネスを用いて作成されるかまたは、組換え株は、ＡＴＣＣに受入番号ＰＴＡ−１２０４６２で寄託されているアクチノバチルス・サクシノゲネスである。
【００７６】
別の態様では、組換え微生物を、組換え微生物を使って栄養培地を発酵させることを含む方法でコハク酸またはプロピオン酸を産生させるために利用する。栄養培地は一般的に、グルコースまたはソルビトールなどの発酵可能な糖を含む。この方法では、グルコース（ｇ）に対して収量（ｇ）が少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％のコハク酸が生じ得る。この方法では、グルコース（ｇ）に対して少なくとも約６２％〜約７２％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％（またはこれらのパーセンテージに含まれる任意の範囲）のプロピオン酸（ｇ）が生じ得る。
【００７７】
有機酸の産生方法は、好適な微生物を、炭素源（例えば、粗ソルビトール）を含有する好適な発酵ブロス中で生育させることを含む場合がある。一態様では、発酵ブロスはさらに、窒素源、無機塩類、ビタミンまたは成長促進因子なども含む。いくつかの態様では、塩類、アンモニア源および栄養培地に必要な他の成分を、トウモロコシの湿潤製粉の副産物であるトウモロコシの浸出液（ＣＳＬ）から得てもよい。塩類に関して言えば、ナトリウム源としては、これらには限定されないが、Ｎａ3ＰＯ4、Ｎａ2ＨＰＯ4、ＮａＨ2ＰＯ4、Ｎａ2ＣＯ3、ＮａＨＣＯ3、ＮａＣｌ、および有機塩類由来のＮａ（例えばモノグルタミン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム）が挙げられる。ナトリウム濃度は約１２００ｍｇ／ｌ〜約６８００ｍｇ／Ｌの範囲であってよい。いくつかの態様では、ナトリウム濃度は約３０００ｍｇ／ｌ〜約３５００ｍｇ／Ｌである。本発明はナトリウム塩には限定されず、他の塩類も本発明の一部と見なされる。
【００７８】
発酵は、任意の好適な発酵槽の中で炭素源と発酵ブロスとを混合し、好適な微生物を播種することで実施することができる。発酵は、微生物の成長と好適な有機酸の産生につながる条件で、好気的または嫌気的のいずれで行ってもよい。一態様では、発酵温度は少なくとも約２５℃で約５０℃未満の範囲に維持される。いくつかの態様では、温度は約３０℃〜約３９℃の間である（例えば、約３８℃）。いくつかの態様では、温度は約３０℃〜約３７℃の間である。
【００７９】
発酵ブロスはさらに、ベタインもしくは付加塩またはその混合物を含んでいてもよい。いくつかの態様においてベタインは、ベタイン−塩酸、ベタイン遊離塩基などである。
【００８０】
他の態様においてベタインは、ベタインを含有する原料の成分として含まれていてもよい。ベタインまたはベタイン含有原料の例と少なくとも１つとしては、ベタイン、アミノ酸発酵副産物可溶分、糖蜜含有ベタイン、濃縮分離副産物、濃縮糖蜜可溶分、蒸留残渣、またはその任意の混合物が挙げられる。ベタイン含有原料の他の例としては濃縮、抽出したグルタミン酸発酵生成物、リシンの発酵産生において出たアミノ酸発酵副産物の可溶分、トレオニンの発酵産生過程において出たアミノ酸発酵副産物の可溶分、またはトリプトファンの発酵産生過程において出たアミノ酸発酵副産物の可溶分がある。ベタインの濃度は約０．０５ｇ／ｌ〜約２ｇ／ｌの範囲であってよい。いくつかの態様では、使用されるベタインの濃度は０．２ｇ／ｌ〜０．５ｇ／ｌであり得る。
【００８１】
一態様では、発酵開始時の発酵ブロスのｐＨは約６〜７または約７〜約８．０の範囲内である（例えば、約ｐＨ８．０）。発酵時のｐＨは塩を加えることで制御することができる。例えば、発酵が進むにつれてｐＨを制御し、約ｐＨ５〜約ｐＨ７、または約ｐＨ６〜約ｐＨ７（例えば、約ｐＨ６．６）、または約ｐＨ４．５〜約６、または約５〜約５．５にすることができる。本発明でｐＨを制御するためにはマグネシウム塩が適している。一態様では、ＭｇＣＯ3を加えて、ＣＯ2雰囲気でのｐＨを、必要に応じて、約６．０〜約７．０（例えば、約６．４〜約６．８のｐＨ）、好ましくは約６．６のｐＨにする。Ｍｇ（ＯＨ）2も適している。ＮＨ4ＯＨ、ＮａＯＨ、気体ＮＨ3、Ｎａ3ＰＯ4、またはそれらの炭酸塩形態も使用することができ、本方法は特定のｐＨ調整剤には依存しない。
【実施例】
【００８２】
実施例１
微生物株およびプラスミド
アクチノバチルス・サクシノゲネスのＦＺ４５株およびＦＺ５３株はアクチノバチルス・サクシノゲネス１３０Ｚの安定な変異体であり、モノフルオロ酢酸ナトリウム耐性である。Ｇｕｅｔｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、ＩＮＴ’Ｌ  Ｊ．ＳＹＳＴ．ＢＡＣＴ．（１９９９）４９：２０７−２１６；および米国特許第５，５７３，９３１号を参照のこと。大腸菌−アクチノバチルス・サクシノゲネスのシャトルベクターｐＬＳ８８（ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に受入番号８６９８０で寄託されている）をＬｅｓｌｉｅ  Ｓｌａｎｅｙ博士（マニトバ大学、カナダ）から提供して頂いた。プラスミドｐＬＳ８８はヘモフィルス・デュクレイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ）から単離され、スルホンアミド、ストレプトマイシン、およびカナマイシンに対する耐性に寄与し得ることが分かっている。
【００８３】
遺伝的操作
組換えＤＮＡの操作は基本的に、当該分野において記述のある方法に従って行った。プラスミドＤＮＡをアルカリ溶解法で調製した。通常、１．５ｍｌの培養から抽出した多コピープラスミドを５０μｌの容量で再懸濁した。より大規模なＤＮＡの調製にはＱｉａｇｅｎプラスミド精製ミディおよびマキシキットを用い、製造業者の説明に従って調製した。制限エンドヌクレアーゼ、分子量マーカー、および予め染色してあるマーカーはＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し、制限消化は、およそ５倍の過剰量の酵素を使用した以外は製造業者の推奨条件に従って行った。ＤＮＡをＴｒｉｓ−酢酸−アガロースゲルで分離し、エチジウムブロマイドで染色した。ＤＮＡをアガロースゲルから抽出し、Ｑｉａｇｅｎのゲル精製キットを用い、製造業者の説明に従って精製した。エビまたはウシのアルカリホスファターゼ（Ｒ℃ｈｅ）と制限消化とを組み合わせてＤＮＡの脱リン酸化を行った。ホスファターゼを７０℃で１５分間加熱することまたはＱｉａｇｅｎの精製カラムを通すことで不活化した。ベクターＤＮＡに対して３〜５倍量（モルで）の過剰の挿入断片と１μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を加え、２０μｌの反応容量で１時間、２５℃で反応させることでライゲーションを行った。大腸菌の形質転換はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した「ライブラリー効率コンピテント細胞（ｌｉｂｒａｒｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ）」を用い、製造業者の説明に従って行った。
【００８４】
ライゲーション混合物を使った形質転換液を希釈せずに、適切な抗生物質を含む標準的なＬＢ培地にプレーティングした。ＰＣＲ増幅を、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒのマニュアルを指針として行った。プライマーは、公開されている配列（全米バイオテクノロジー情報センター、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のデータベースで見られる）に基づいて設計し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。プライマーには改変した制限酵素認識部位を含めた。ベクターＮＴＩプログラムを使い、二量体の形成やヘアピンの形成および融解温度に関してプライマーを分析した。プライマーは全て、Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｓｔａｔｅ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ    Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙから発注した。ＰＣＲによる増幅は、ＥｐｐｅｎｄｏｒｆのＧｒａｄｉｅｎｔ  Ｍａｓｔｅｒ  ＣｙｃｌｅｒかまたはＰｅｒｋｉｎ  ＥｌｍｅｒのＴｈｅｒｍ℃ｙｃｌｅｒを使って行った。各プライマー対の最初のアニーリング温度はベクターＮＴＩプログラムを使って決定した。増幅産物を消化するための制限酵素はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎまたはＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。
【００８５】
エレクトロポレーション用のアクチノバチルス・サクシノゲネスのコンピテント細胞を、細胞をトリプチックソイブロス、ＴＳＢ、グルコース添加培地中、ＭｇＣＯ3存在下で生育させ、対数増殖期の初期から中期に回収することによって調製した。低速で遠心することで、使われなかった炭酸塩を除去した。短時間遠心して細胞を集め、滅菌水で２回洗浄し、１０％（ｖ／ｖ）のグリセロールで２回洗浄し、その後元の培養液の０．０１倍量の１０％グリセロールに再懸濁した。細胞懸濁液を小分けにし、凍結し、−８０°Ｃで保存した。エレクトロポレーションには調製した細胞を４０μｌ使用した。ＢｉｏＲａｄのＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒを４００Ｗ、２５ｍＦ、１．８ｋＶに設定し、０．１ｃｍのキュベットを使って形質転換した。エレクトロポレーションを行ってすぐ、１ｍｌの室温のＴＳＢ培地をキュベットに加え、３７℃で１時間インキュベートした。細胞溶液を適切な抗生物質を含むＴＳＢ寒天培地にプレーティングし、３日間、３７°Ｃ、ＣＯ2雰囲気でインキュベートした。
【００８６】
プラスミド  ｐ８３０．６０
プライマーＴＤ２９９（配列番号５）、およびＴＤ３００（配列番号６）を使い、アクチノバチルス・サクシノゲネスのｚｗｆ遺伝子とプロモーターをアクチノバチルス・サクシノゲネスＦＺ４５のゲノムＤＮＡから増幅し、図３に示すように、ｐＬＳ８８からの派生物であるｐＪＲ７６２．４７のＢａｍＨ１とＳａｌ１部位の間に（ｐＬＳ８８のＥｃｏＲＩとＳｐｈＩ部位の間に挿入したマルチクローニングサイトを利用して）挿入した。
【００８７】
ｐ８３０．６０にクローニングした遺伝子は１７８１塩基対（ｂｐ）で、コード領域は２７２番目から開始し（図８の下線で示したａｔｇ）、１７５７番目で終止する（図８の太字で示したｔａａ）。この配列を配列番号１で示す。プロモーター配列はコード配列の上流で開始し、終止する。
【００８８】
プラスミドｐＩＳＴＯＮＳ１
プライマーＴＤ２２３（配列番号７）およびＴＤ２１８（配列番号８）を使い、アクチノバチルス・サクシノゲネスのＭｄｈ遺伝子とプロモーターをアクチノバチルス・サクシノゲネスＦＺ４５のゲノムＤＮＡから増幅した。増幅したＤＮＡを図２に示すように、ｐＬＳ８８のＥｃｏＲＩ部位の間にＥｃｏＲＩ断片としてクローニングした。ｐＩＳＴＯＮＳ１に挿入されたｍｄｈ遺伝子は１５５８ｂｐで、コード領域は３０３番目から開始し（図９で太字および下線で示したａｔｇ）、１２３９番目で終止する（図９で太字および下線で示したｔａａ）。これを配列番号３として示した。プロモーターはこの配列の最初からで、コード領域の前で終わる。
【００８９】
プラスミドｐ８５６．７８
制限酵素ＥｃｏＲＩを使って、アクチノバチルス・サクシノゲネスのｍｄｈ遺伝子をｐＩＳＴＯＮＳ１から切り出し、末端をクレノウポリメラーゼで埋めて平滑末端とし、この断片を、ＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼで直線化し、クレノウポリメラーゼで末端を埋めておいたプラスミドｐ８３０．６０にライゲーションした。この２つの遺伝子の配置はヘッドトゥーテールとなっている。
【００９０】
実施例２
Ｚｗｆ酵素とＭｄｈ酵素を過剰発現させることによる、ソルビトールからのコハク酸の産生
アクチノバチルス・サクシノゲネスの株（ＦＺ５３；ＦＺ５３／ｐＬＳ８８；ＦＺ５３／ｐ８３０．６０；ＦＺ５３／ｐＰＩＳＴＯＮＳ１およびＦＺ５３／ｐ８５６．７８）を２Ｌの培地の入った発酵ベッセル（Ｂｉｏｆｌｏ  ＩＩＩ、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ）中で培養した。培地には、１２０ｇ／Ｌのソルビトール、３０ｇ／Ｌ（固形）のトウモロコシの浸出液（ＣＳＬ）（ＡＤＭ由来の固形物、１０〜１２％）、１．６ｇ／ＬのＭｇ（ＯＨ）2、０．２ｍｇ／Ｌのビオチン、０．５ｇ／Ｌのベタイン−塩酸、０．２ｍｇ／ＬのＭＳＧ、６．５ｍＭのリン酸ナトリウム、７ｇ／ＬのＮａ２ＣＯ３、０．５ｇ／Ｌの酵母抽出物（ＡＧ９００）を含めた。
【００９１】
発酵槽と同じ培地（Ｍｇ（ＯＨ）2は含んでいない）を入れたベッセルで培養した接種材料（６．２５％）を発酵槽に播種し、１５０ｒｐｍで撹拌しながら３８℃で１３時間インキュベートした。
【００９２】
播種した発酵槽を３８０回／分で撹拌し、ＣＯ2を０．０２５〜０．０５ｖｖｍでスパージしながら３８℃でインキュベートした。発酵培地のｐＨは６ＭのＭｇ（ＯＨ）2加えることまたはＭｇＣＯ3を１２０ｇ／Ｌに加えることで６．８に維持した。
【００９３】
１２〜２２時間の間に炭素源を加えた。この間に、１５ｇの炭素源を発酵ベッセルにさらに加えた。
【００９４】
糖および有機酸の測定
一定の間隔で試料を発酵槽から採取し、１０、０００×ｇで４分間遠心して固形物を除去した。上清を０．２μＭのフィルターで濾過してから解析にかけた。培養上清および濾液の糖および有機酸の濃度をＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００シリーズ）で測定した。Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈ（３００ｍｍ×７．８ｍｍ）カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用し、移動相としては０．０１３ＮのＨ2ＳＯ4を１．４ｍｌ／分の速度で流した。分析物のピークを検出し、屈折率検出器（Ｗａｔｅｒｓ  ２４１４）を使用して定量し、Ｓｉｇｍａから購入した有機酸標準物質の溶液を参照しながらピークの同定を行った。下記表１に、ソルビトール存在下で生育させた複数のアクチノバチルス・サクシノゲネス形質転換体の発酵に関する評価を示す。
【表１】
2015530121.tif 000002
【００９５】
炭素源がソルビトールの場合には、宿主によって過剰発現される遺伝子を含まない「からの」ベクター（ｐＬＳ８８）で形質転換したアクチノバチルス・サクシノゲネスはコハク酸発酵に有意な影響を及ぼさなかった。ｚｗｆ遺伝子またはｍｄｈ遺伝子のどちらかを単一の遺伝子として（それぞれ、ベクターｐ８３０．６０およびｐＰＩＳＴＯＮＳ１）過剰発現させると、コハク酸の収量が増えた。Ｍｄｈ酵素を過剰発現させた場合の収量が最も高かったが、この高収量は生産性の低下の上に成り立っており、この形質転換体の生産性はＺｗｆ発現株、形質転換していない親株、および空のベクターで形質転換した株よりも低かった。
【００９６】
ｚｗｆ遺伝子とｍｄｈ遺伝子を同時に発現させた場合には収量は高くなった上に（ｍｄｈ形質転換体で認められたのと同程度）、生産性も高まった（しかしｚｗｆ形質転換体との有意差はなかった）。
【００９７】
炭素源がソルビトールの場合には、Ｚｗｆ酵素とＭｄｈ酵素を同時に発現させると、高い生産性、収量および力価でコハク酸の生成が促進されることが示された。
【００９８】
実施例３
Ｚｗｆ酵素とＭｄｈ酵素を過剰発現させることによる、グルコースからのコハク酸の産生
実施例１で説明したアクチノバチルス・サクシノゲネスの株（ＦＺ５３；ＦＺ５３／ｐＬＳ８８；ＦＺ５３／ｐ８３０．６０；ＦＺ５３／ｐＩＳＴＯＮＳ１およびＦＺ５３／ｐ８５６．７８）を実施例２で説明したものと同じ培地（ただし培養のｐＨを維持するために容器に６ｇのＭｇＣＯ3を予め加えておくという変更を加えた）を入れた５０ｍＬの嫌気的バイアル中で培養した。同様のシードバイアルから２．５ｍＬを播種した（５％（ｖ／ｖ）の摂取材料）。１５０回／分でバイアルを撹拌しながら３８℃でインキュベートした。
【００９９】
培養濾液の解析を実施例２で記載したのと同様に行った。解析結果の一例を以下に示す（４６時間で算出）。ＦＺ５３  ｐＬＳ８８の力価は８０．０ｇ／Ｌ、生産性は１時間当たり１．７４ｇ／Ｌ、および糖１グラム当たりのコハク酸の収量は０．７６ｇであった；ＦＺ５３  ｐ８３０．６０（Ｚｗｆ）の力価は１００．６ｇ／Ｌ、生産性は１時間当たり２．１９ｇ／Ｌ、および糖１グラム当たりのコハク酸の収量は０．８９ｇであった；ＦＺ５３  ｐＰＩＳＴＯＮＳ１（Ｍｄｈ）の力価は８０．２ｇ／Ｌ、生産性は１時間当たり１．８７ｇ／Ｌ、および糖１グラム当たりのコハク酸の収量は０．７７ｇであった；およびＦＺ５３  ｐ８７８．５６（Ｚｗｆ＋Ｍｄｈ）の力価は１１０．０ｇ／Ｌ、生産性は１時間当たり２．１６ｇ／Ｌ、および糖１グラム当たりのコハク酸収量は０．９６ｇであった。アクチノバチルス・サクシノゲネス形質転換体のグルコース発酵の評価に関する結果をまとめた表２も参照のこと。
【表２】
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【０１００】
Ｚｗｆの過剰発現が生産性およびグルコースからのコハク酸の収量に有益であることを確認したが、Ｍｄｈだけを過剰発現しても有益な効果は何ら認められなかった。ＺｗｆとＭｄｈを同時に発現させると収量が増え、同時にコハク酸の生産性に有意な低下は認められず、Ｚｗｆだけを発現させた場合を上回る効果があった。以下にそのほかの観察結果を示す。
【０１０１】
アクチノバチルス・サクシノゲネスを利用したコハク酸の産生は嫌気的な産生プロセスである。この生物は天然のコハク酸産生生物である。この産生は、Ｈ２か、それ以上に還元された基質（例えば、ソルビトールまたはマンニトール）を培養に添加することで刺激される。このことから、アクチノバチルス・サクシノゲネスにおけるコハク酸産生は還元力（ＮＡＤＰＨ）によって限定されていることが示唆される。このことを念頭において、Ｚｗｆ（ＮＡＤＰＨを直接生成し、グルコースをペントースリン酸経路またはエントナー・ドゥドルフ経路に転用する酵素）をアクチノバチルス・サクシノゲネス中で過剰発現させた。この介入の結果、コハク酸発酵の能力は収量の点で改善された。そのため、ペントースリン酸経路またはエントナー・ドゥドルフ経路を介した解糖系からのグルコースの転換は（および細胞内に蓄えられているＮＡＤＰＨの増加は）、コハク酸の産生に良い影響を与えた。
【０１０２】
アクチノバチルス・サクシノゲネスの生化学的な研究およびコハク酸産生性大腸菌との比較では、ホスホエノールピルビン酸からコハク酸への変換に関わる酵素（ホスホエノールピルビン酸脱炭酸酵素、リンゴ酸脱水素酵素、フマラーゼ、およびフマル酸還元酵素）がアクチノバチルス・サクシノゲネスにおいて高レベルで発現されていることが示され、このことから、アクチノバチルス・サクシノゲネスがコハク酸を蓄積する大きな能力に隠されたメカニズムが示唆された。具体的には、アクチノバチルス・サクシノゲネスのリンゴ酸脱水素酵素活性は大腸菌の活性の１０倍を超える程、非常に大きかった（２１００ｎｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質対１６０ｎｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗｅｒｆ，  Ａｒｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  １６７，  ３３２−３４２  （１９９７））。従って、アクチノバチルス・サクシノゲネスにおけるコハク酸の産生はリンゴ酸脱水素酵素の活性によっては限定されていないと予想された。実際のところ、Ｍｄｈだけを過剰発現させても、異種Ｍｄｈをコードしているポリヌクレオチドを欠いた対照の微生物と比較して、力価、生産性、または収量は有意には改善されなかった。表２を参照のこと。この観察結果から、Ｍｄｈの内生の活性はそもそも高いので、Ｍｄｈはアクチノバチルス・サクシノゲネスにおけるコハク酸産生の律速工程ではないという、アクチノバチルス・サクシノゲネスの生化学的な研究から導きだされた結果が確認されたと考えられる。
【０１０３】
生化学的な解析およびＭｄｈだけの過剰発現に関して報告した表２のデータから、アクチノバチルス・サクシノゲネス中でグルコース−６−リン酸脱水素酵素をコードしているポリヌクレオチド（ｚｗｆ）とリンゴ酸脱水素酵素をコードしているポリヌクレオチド（ｍｄｈ）を同時に発現させることが有効であるとは期待できなかった。
【０１０４】
しかしながら、アクチノバチルス・サクシノゲネスのＺｗｆ過剰発現株の解析を行っている間に、驚くことに、ＨＰＬＣでの副産物のピークプロファイルが、Ｚｗｆの過剰発現に、その増加に、関連があることが認められた。そのピークは、容易に脱炭酸され、二量体化し、リンゴ酸に変換される非常に不安定な化合物のオキサロ酢酸に相当することが分かった。このことから、予期していなかったが、アクチノバチルス・サクシノゲネスでＺｗｆを過剰発現させると、Ｍｄｈがコハク酸産生を制限する酵素になり、その結果、その基質（オキサロ酢酸）が蓄積されたことが示唆された。特定の理論に拘束されることは望まないが、副産物として蓄積されたオキサロ酢酸は炭素の流れを変化させ、発酵におけるコハク酸収量を低下させる。従って、アクチノバチルス・サクシノゲネスではＭｄｈの活性が高いというインビトロでの生化学的研究とは対照的に、インビボでの酵素活性は予想外に制限された。Ｍｄｈの過剰生産をＺｗｆの発現と組み合わせると、この制限が克服され、オキサロ酢酸の蓄積が回避され、そしてコハク酸の収量が高まった。
【０１０５】
この実施例は、炭素源といてグルコースを用いた場合には、ＺｗｆとＭｄｈを同時に発現させると、どちらか一方の酵素を発現させた場合よりも大きな利益がもたらされるということを示している。これまで、Ｍｄｈはアクチノバチルス・サクシノゲネスによるコハク酸産生を制限する活性をもたないと考えられてきた。しかしながら、Ｚｗｆを過剰発現させた上にＭｄｈを過剰発現させると、アクチノバチルス・サクシノゲネスによるコハク酸の産生能力が高まることが発見された。
【０１０６】
本発明をさらに例示するために、さらなる非限定的な態様をいくつか以下に提示する。
【０１０７】
一態様では、組換え微生物はグルコース−６−リン酸脱水素酵素およびリンゴ酸脱水素酵素を発現する。いくつかの態様では、一方の酵素または両方の酵素がその生物にとって異種のものである。様々な態様において、異種ポリヌクレオチドを発現させるか、あるいはグルコース−６−リン酸脱水素酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび／またはリンゴ酸脱水素酵素を過剰発現させると、親（対応する未改変の）微生物で見られる酵素活性と比較して、２倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、または２５０倍、または５００倍高い酵素活性が得られる。
【０１０８】
本発明の微生物は様々な側面において、異種ポリヌクレオチドを含んでいないが他の点では同様の微生物またはこれらのポリヌクレオチドを過剰発現していないが他の点では同様の微生物よりも多くの有機酸を産生する（またはより迅速に、より効率的に有機酸を産生する）。様々な態様においてこの微生物は、異種ポリヌクレオチドを含んでいないが他の点では同様の微生物またはこれらのポリヌクレオチドを過剰発現していないが他の点では同様の微生物と比較して、同じ時間内に、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１５％、少なくとも１７％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、または少なくとも３０％多くの有機酸を産生する。あるいはまたはこれに加えて、この微生物は、改変していない（親）微生物と比較して、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１５％、少なくとも１７％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、または少なくとも３０％良いレベルの生産性を示す。あるいはまたはこれに加えて、この微生物は、改変していない（親）微生物と比較して、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１５％、少なくとも１７％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、または少なくとも３０％高い収量を示す。
【０１０９】
他の態様では、アクチノバチルス・サクシノゲネス由来の両方の酵素を発現させる。その上さらに他の態様では、大腸菌由来の両方の酵素を発現させる。一層さらに他の態様では、グルコース−６−リン酸脱水素酵素は大腸菌によってコードされているものであり、かつ、リンゴ酸脱水素酵素はアクチノバチルス・サクシノゲネスによってコードされているものである。遺伝子の組み合わせは逆転していてもよい。他の態様では、ＺｗｆとＭｄｈを発現している微生物としては、パスツレラ科のメンバーが挙げられる。その上さらに他の態様では、この微生物には、アクチノバチルス・サクシノゲネス、ビスガードタクソン６およびビスガードタクソン１０、またはアクチノバチルス・サクシノゲネスのｒＲＮＡの配列と９０％を上回る配列相同性を有するｒＲＮＡ配列をもつ微生物が含まれる。これら遺伝子を発現している宿主細胞はアクチノバチルス・サクシノゲネスであってよい。その上さらに他の態様では、これら遺伝子は別個の生物中で発現していてもよいが、有機酸を産生するために両方の生物が発酵培地に含まれる。一態様において有機酸はコハク酸またはプロピオン酸である。
【０１１０】
いくつかの態様では、炭素源として粗ポリオールを使用してもよい。他の態様では、微生物を生育させるための発酵ブロスまたは培地には、トウモロコシの浸出液、ベタイン、ナトリウム、マグネシウムイオンおよびそれらの組み合わせが含まれる。
【０１１１】
ペントースリン酸経路（またはエントナー・ドゥドルフ経路）および還元的トリカルボン酸サイクルで利用される複数の酵素を発現させる本開示により、単一の酵素だけを発現させた場合よりも多量の有機酸の産生が達成される。
【０１１２】
この出願は、発明の対象になされるあらゆる変更または修正をも包含することを意図するものである。主にｚｗｆとｍｄｈを同時に発現する単一の組換え生物について説明してきたが、例えば、ｚｗｆとｍｄｈのそれぞれを発現する複数の生物を、有機酸を産生させるための単一の発酵プロセスに含めてもよいということが想定できる。本発明の組換え微生物の表現型に関する特徴を維持している本明細書に記載の微生物の変異体または本明細書に記載の微生物の後代も含まれる。実質的に純粋な、本明細書に記載の微生物の単一培養（つまり所望の微生物を少なくとも８０％または少なくとも９０％含んでいる培養）も提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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