(57)【要約】本明細書で提供されるのは、所定の核酸配列を修飾するための組成物及び方法である。標的細胞にて生体内で集合し、所定の核酸配列と相互作用することが可能である、ポリペプチド部分と特異性付与核酸（ＳＣＮＡ）を含有するプログラム可能なヌクレオタンパク質分子複合体が提供される。プログラム可能なヌクレオタンパク質分子複合体は、標的核酸配列内で標的部位を特異的に修飾し、及び／又は編集することが可能であり、及び／又は標的核酸配列の機能を修飾することが可能である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞における標的核酸配列にて所定の標的部位を修飾するためのヌクレオタンパク質組成物であって、
（ａ）キメラポリペプチドドが（ｉ）特定の核酸結合部位を欠き、標的部位を修飾することが可能である機能性ドメインと
（ｉｉ）特定の核酸結合部位を欠き、特異性付与核酸と相互作用することが可能である連結ドメインを含む、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、
（ｂ）（ｉ）標的部位に隣接する標的核酸の領域に相補性であるヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）ポリペプチドの連結ドメインに特異的に連結することが可能である認識領域を含む特異性付与核酸（ＳＣＮＡ）とを含み、
それによって、標的細胞内でのポリペプチドとＳＣＮＡの集合が、標的部位で前記標的核酸を特異的に修飾することが可能である機能性のヌクレオタンパク質複合体を形成する組成物。
【請求項２】
前記機能性ドメインが触媒ドメインを含む請求項１の組成物。
【請求項３】
標的核酸の前記修飾が、変異、欠失、挿入、置換、結合、消化、二本鎖切断の創製、ニッキング、メチル化、アセチル化、ライゲーション、組換え、螺旋の巻き戻し、化学修飾、標識化、活性化及び不活化から選択される請求項１の組成物。
【請求項４】
前記キメラポリペプチドがさらに細胞内局在化ドメインを含む請求項１の組成物。
【請求項５】
ＳＣＮＡが、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、修飾されたＤＮＡ、修飾されたＲＮＡ、ロックド核酸（ＬＮＡ）及びペプチド核酸（ＰＮＡ）又はそれらの組み合わせから成る群から選択される核酸を含む請求項１の組成物。
【請求項６】
前記標的核酸がＤＮＡである請求項１の組成物。
【請求項７】
ＳＣＮＡの認識領域が、５’末端修飾、３’末端修飾及び内部修飾から成る群から選択される化学修飾を含む請求項１の組成物。
【請求項８】
前記化学修飾が、ヌクレオチドの修飾及び非ヌクレオチド部分の付加から成る群から選択される請求項７の組成物。
【請求項９】
非ヌクレオチド部分が、ビオチン、フルオレセイン、アミドリンカー、オリゴペプチド、アミノアリル、色素分子、蛍光色素分子、ジゴキシゲニン、アクリダイト、アデニル化、アジド、ＮＨＳ−エステル、コレステリル−ＴＥＧ、アルキン、光切断性のビオチン、チオール、ジチオールから選択される請求項８の組成物。
【請求項１０】
ヌクレオチド修飾が、リン酸塩、２−アミノプリン、トリマー−２０、２,６−ジアミノプリン、５−ブロモ−デオキシウリジン、デオキシウリジン、逆位ｄＴ、ジデオキシヌクレオチド、５−メチルデオキシシチジン、デオキシイノシン、５−ニトロインドール、２−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基、イソ-ｄＣ、イソ−ｄＧ、フッ素修飾塩基及びホスホロチオエート結合から成る群から選択される請求項８の組成物。
【請求項１１】
前記修飾と前記連結ドメインの間の結合が、タンパク質／タンパク質、アグロバクテリウムＶｉｒＤ２／ＶｉｒＤ２結合タンパク質、抗体／抗原、単鎖抗体／抗原の相互作用、抗フルオレセイン単鎖可変断片抗体（抗ＦＡＭ-ｓｃＦｖ）／フルオレセイン、抗ＤＩＧ単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）免疫グロブリン（ＤＩＧ−ｓｃＦｖ）／ジゴキシゲニン、及びＩｇＧ／プロテインＡから選択される結合対である請求項１の組成物。
【請求項１２】
ＳＣＮＡの前記認識領域が、キメラタンパク質の連結ドメインに特異的に結合することが可能であるヌクレオチドモチーフを含む請求項１の組成物。
【請求項１３】
ヌクレオチドモチーフと連結ドメインの間の結合が、Ｅボックスドメインとの螺旋ループ螺旋の相互作用；ＶｉｒＥ２との単鎖ＤＮＡの相互作用；ｄｓＤＮＡとのＳｔｉｃｋｙＣ；核酸とのウイルスコーティングタンパク質；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）トランス作用性の応答要素（ＴＡＲ）配列のループ１とのＢＩＶのＴａｔ主要結合ドメインの相互作用；Ｎ−利用（ｎｕｔ）部位におけるボックスＢループヘアピンとのファージラムダＰｈｉ２１タンパク質の相互作用；Ｎ−利用（ｎｕｔ）部位におけるボックスＢループヘアピンとのファージラムダＰ２２Ｎタンパク質の相互作用；及びＨＩＶｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）の幹ＩＩＢとのＨＩＶｒｅｖタンパク質の相互作用から選択される請求項１２の組成物。
【請求項１４】
連結ドメインが、アグロバクテリウムのＶｉｒＤ２タンパク質、ピコナウイルスＶＰｇ、トポイソメラーゼ、ＰｈｉＸ１７４ファージＡのタンパク質、ＰｈｉＸ  Ａ＊のタンパク質、及びそれらの変異体から成る群から選択されるポリペプチドを含む請求項１２の組成物。
【請求項１５】
プログラム可能なヌクレオタンパク質の分子複合体によって標的核酸配列内で所定の標的部位を修飾する方法であって、
（ａ）（ｉ）特定の核酸結合部位を欠き、標的部位を修飾することが可能である機能性ドメインと
（ｉｉ）特定の核酸結合部位を欠き、特異性付与核酸と相互作用することが可能である連結ドメインを含むプログラム可能なキメラポリペプチドをコードする核酸配列を宿主に送達する工程と、
（ｂ）（ｉ）標的部位に隣接する標的核酸の領域に相補性であるヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）ポリペプチドの連結ドメインに高結合親和性で特異的に連結することが可能である認識領域を含む、特異性付与核酸（ＳＣＮＡ）分子又はＳＣＮＡをコードする核酸を前記宿主細胞に送達する工程を含み、
ＳＣＮＡを抱く細胞におけるポリペプチドの発現が前記キメラポリペプチドのＳＣＮＡへの連結を可能にし、活性のあるプログラムされたヌクレオタンパク質複合体を形成し、それによって、宿主細胞内でキメラポリペプチドを所定の標的核酸配列に向け、前記活性のあるプログラムされたヌクレオタンパク質分子複合体による標的核酸配列の所定の標的部位の修飾を可能にする方法。
【請求項１６】
前記標的核酸がＤＮＡである請求項１５の方法。
【請求項１７】
前記標的ＤＮＡがゲノムＤＮＡである請求項１６の方法。
【請求項１８】
前記標的ゲノムＤＮＡが真核細胞起源であるである請求項１７の方法。
【請求項１９】
前記標的核酸配列が、ミトコンドリア、葉緑体、アミロプラスト及び有色体から成る群から選択される染色体外の核酸配列である請求項１５の方法。
【請求項２０】
前記標的核酸配列が、ウイルス核酸配列、原核細胞核酸配列及び合成核酸配列から選択される請求項１５の方法。
【請求項２１】
前記修飾が、変異、欠失、挿入、置換、結合、消化、二本鎖切断の創製、ニッキング、メチル化、アセチル化、ライゲーション、組換え、螺旋の巻き戻し、化学修飾、標識化、活性化及び不活化から選択される請求項１５の方法。
【請求項２２】
キメラタンパク質が核酸機能性修飾因子を有するタンパク質部分を含み、機能的な修飾が、転写の活性化、転写の不活化、ＲＮＡの転写スプライシング、選択的ＲＮＡスプライシング、クロマチンの再構成、細胞の寄生生物及びウイルスの不活化及び前記核酸配列の細胞での局在化又は区画化の変化から成る群から選択される請求項１５の方法。
【請求項２３】
ＳＣＮＡが、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、修飾されたＤＮＡ、修飾されたＲＮＡ、ロックド核酸（ＬＮＡ）及びペプチド核酸（ＰＮＡ）又はそれらの組み合わせから成る群から選択される核酸分子を含む請求項１５の方法。
【請求項２４】
ＳＣＮＡと標的核酸の間の相互作用が、完全な二重螺旋塩基対形成、部分的な二重螺旋塩基対形成、完全な三重螺旋塩基対形成、部分的な三重螺旋塩基対形成、及び前記対形成によるＤループ形態又は分岐形態から成る群から選択される塩基対形成を介する請求項１５の方法。
【請求項２５】
ＳＣＮＡの認識領域が、５’末端修飾、３’末端修飾及び内部修飾から成る群から選択される修飾を含む請求項１５の方法。
【請求項２６】
前記修飾が、ヌクレオチド修飾、ビオチン、フルオレセイン、アミドリンカー、オリゴペプチド、アミノアリル、色素分子、蛍光色素分子、ジゴキシゲニン、アクリダイト、アデニル化、アジド、ＮＨＳ−エステル、コレステリル−ＴＥＧ、アルキン、光切断性のビオチン、チオール、ジチオール、修飾された塩基、リン酸塩、２−アミノプリン、トリマー−２０、２,６−ジアミノプリン、５−ブロモ−デオキシウリジン、デオキシウリジン、逆位ｄＴ、ジデオキシヌクレオチド、５−メチルデオキシシチジン、デオキシイノシン、５−ニトロインドール、２−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基、イソ-ｄＣ、イソ−ｄＧ、フッ素修飾塩基及びホスホロチオエート結合から成る群から選択される請求項２５の方法。
【請求項２７】
修飾と前記連結ドメインの間の会合が、タンパク質／タンパク質、アグロバクテリウムＶｉｒＤ２／ＶｉｒＤ２結合タンパク質、抗体／抗原、単鎖抗体／抗原の相互作用、抗フルオレセイン単鎖可変断片抗体（抗ＦＡＭ-ｓｃＦｖ）／フルオレセイン、抗ＤＩＧ単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）免疫グロブリン（ＤＩＧ−ｓｃＦｖ）／ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、及びＩｇＧ／プロテインＡから選択される結合対の相互作用である請求項２５の方法。
【請求項２８】
ＳＣＮＡの認識領域が、キメラタンパク質の連結ドメインと相互作用することが可能であるヌクレオチドモチーフを含む請求項１５の方法。
【請求項２９】
ヌクレオチドモチーフと連結ドメインの間の相互作用が、Ｅボックスドメインとの螺旋ループ螺旋の相互作用；ＶｉｒＥ２との単鎖ＤＮＡの相互作用；ｄｓＤＮＡとのＳｔｉｃｋｙＣ；核酸とのウイルスコーティングタンパク質；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）トランス作用性の応答要素（ＴＡＲ）配列のループ１とのＢＩＶのＴａｔ主要結合ドメインの相互作用；Ｎ−利用（ｎｕｔ）部位におけるボックスＢループヘアピンとのファージラムダＰｈｉ２１タンパク質の相互作用；Ｎ−利用（ｎｕｔ）部位におけるボックスＢループヘアピンとのファージラムダＰ２２Ｎタンパク質の相互作用；ＨＩＶｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）の幹ＩＩＢとのＨＩＶｒｅｖタンパク質の相互作用、及びアグロバクテリウムＶｉｒＤ２／右境界配列から選択される請求項２８の方法。
【請求項３０】
連結ドメインが、アグロバクテリウムのＶｉｒＤ２タンパク質、ピコナウイルスＶＰｇ、トポイソメラーゼ、ＰｈｉＸ１７４ファージＡのタンパク質、ＰｈｉＸ  Ａ＊のタンパク質、及びそれらの変異体から成る群から選択されるポリペプチドを含む請求項２８の方法。
【請求項３１】
タンパク質部分の連結ドメインと特異性付与核酸部分の認識領域との間の物理的会合が、標的細胞内でプログラムされた機能的複合体を形成する、請求項１５の方法によって形成されるヌクレオタンパク質複合体。
【請求項３２】
タンパク質部分の連結ドメインと特異性付与核酸部分の認識領域との間の物理的会合が、リガンド／受容体、リガンド／基質、水素結合、ファンデルワールス結合、イオン結合及び疎水性相互作用から成る群から選択される親和性相互作用である請求項３１のヌクレオタンパク質複合体。
【請求項３３】
請求項１５の方法によって創られる、所定の標的部位にて所定の遺伝的修飾を有する宿主細胞。
【請求項３４】
前記宿主細胞が、脊椎動物細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞、動物細胞、植物細胞、無脊椎動物細胞、線虫細胞、昆虫細胞及び幹細胞から成る群から選択される請求項３３の宿主細胞。
【請求項３５】
請求項１５の方法によって形成される所定の遺伝的修飾を有するトランスジェニック生物又はノックアウト生物。
【請求項３６】
生物における遺伝性疾患を治療する方法であって、生物の細胞にて請求項１のヌクレオタンパク質のプログラム可能な分子複合体を発現させることを含む方法。
【請求項３７】
（ａ）（ｉ）特定の核酸結合部位を欠き、標的部位を修飾することが可能である機能性ドメインと
（ｉｉ）特定の核酸結合部位を欠き、特異性付与核酸と相互作用することが可能である連結ドメインを含むポリペプチドと、
（ｂ）（ｉ）標的部位に隣接する標的核酸の領域に相補性であるヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）ポリペプチドの連結ドメインに特異的に連結することが可能である認識領域を含む、特異性付与核酸（ＳＣＮＡ）とを含む宿主細胞であって、
宿主細胞内でのポリペプチドとＳＣＮＡの集合が標的部位にて標的核酸を特異的に修飾することが可能である機能的なヌクレオタンパク質複合体を形成する宿主細胞。
【請求項３８】
前記宿主細胞が、脊椎動物細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞、動物細胞、植物細胞、無脊椎動物細胞、線虫細胞、昆虫細胞及び幹細胞から成る群から選択される請求項３７の宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プログラム可能な分子複合体を利用して核酸配列を標的とする及び修飾する組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学及び医学における関心のある主な領域はゲノムのヌクレオチド配列の標的化された改変である。そのような改変には、内在性の染色体核酸配列の挿入、欠失及び置換が挙げられる。様々な技法によってゲノムの配列を変えるために他者によって過去の試みが為されてきた。
【０００３】
遺伝子ターゲッティングは、ゲノムの操作又はゲノムの機能的な修飾のための所望のバイオテクノロジーのツールである。遺伝子ターゲッティングは、コーディング配列に関係してもよく又は関係しなくてもよい特定のゲノムの位置における変化を誘導することができる。
遺伝子ターゲッティングの事象では、予め定義された内在性遺伝子又は別の予め定義された内在性核酸配列が、結果的に欠失、変異、挿入若しくは置換を生じる切断について標的とされ、又は遺伝子／標的とされた機能的修飾による化学修飾について標的とされる。標的とされないトランスジェニック生物の作出に勝る遺伝子ターゲッティングの利点の１つは、異種ＤＮＡを挿入することなく存在するゲノム配列を修飾する又は欠失させる可能性、又は代わりに、予め定義された遺伝子座において挿入若しくは置換によって異種の供与体ＤＮＡを配置する可能性である。こうして余分な配列なしで配列を操作できることは、それらが育種家、農夫、消費者及び規制当局によって望まれていないので有利であり、そのような配列を回避する多数の技法が提案されている一方でそれぞれ、それ自体の欠点に悩まされている。
【０００４】
真核細胞における遺伝子ターゲッティングの戦略は、２つの細胞のｄｓＤＮＡの切断修復メカニズム：相同組換え（ＨＲ）及び非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復経路に左右される。ＮＨＥＪでは、遺伝子挿入は、無作為に生じ得る（たとえば、放射線又は酸化損傷を介して）、又はＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ若しくは亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）のようなヌクレアーゼによって指向され得るｄｓＤＮＡの切断の存在に左右される。ＨＲでは、ｄｓＤＮＡの切断は必須ではないが、組換え部位の近傍に位置すれば、多くは効率性を改善する。
【０００５】
たとえば、細菌、酵母及び原始的な植物、コケ類のような多数の生物で非常に有用に機能するＨＲが介在する遺伝子ターゲッティングに関して鋭意研究が実施されている。ＨＲはショウジョウバエ、マウス及びヒトのような高等生物でも利用されている。これらの生物におけるＨＲの比率は約１０−６であり、ＤＳＢ特異的な遺伝子を創ることによって１０−２を超えるまで高めることができる。低い比率の形質転換体は、これらの方法が遺伝子療法又は育種プログラムにて普及しない理由の１つである。
【０００６】
生体内で核酸を修飾する種々の技法が提案されており、酵素に基づく方法又はヌクレオチドに基づく方法に分けることができる。一般に、酵素に基づく方法は、所望の触媒活性と、制限酵素と同様の方法でタンパク質／核酸の相互作用を介して所望の標的配列に結合する能力の双方を有するＤＮＡ結合タンパク質を使用する。例には、天然に存在する又は操作された稀な配列切断酵素であるメガヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、又は修飾されたＤＮＡ結合ドメインに連結されるＦｏｋ１触媒ヌクレアーゼサブユニットを含有し、所定の配列１つを切断することができる転写活性化因子様のヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が挙げられる。ＺＦＮでは、結合ドメインは特注の亜鉛フィンガードメインに折り畳むアミノ酸の鎖で構成される。ＴＡＬＥＮでは、同様に、転写因子を起源とする３４アミノ酸の反復が巨大なＤＮＡ結合ドメインに折り畳む。遺伝子ターゲッティングの事象では、これらの酵素はゲノムＤＮＡを切断して二本鎖切断（ＤＳＢ）を形成することができ、又は２つの修復経路：非相同末端結合（ＮＨＥＪ）若しくは相同組換え（ＨＲ）の１つによって修復することができるニックを創ることができる。ＮＨＥＪ経路は特定の変異、欠失、挿入又は置換の事象を生じる可能性があり得る。ＨＲ経路は供給された供与体配列による標的化配列の置換を生じる。これらのタンパク質にのみ基づく方法の短所の１つは、所望の標的配列ごとに様々なタンパク質を設計し、供給する長く、手間のかかる必要性である。他の短所には、それぞれＺＦＮ及びメガヌクレアーゼによって認識される核酸三重項又は配列の幾分限定されたサブセットである。さらに、構築するのが非常に難しい６−亜鉛フィンガーＺＦＮでさえ、たった１８ヌクレオチドの結合部位に限定され、１８ヌクレオチドではゲノム全体の配列間隔又は複雑性において配列特異性を付与するには統計的に十分ではないので、これらはヘテロ二量体として供給されなければならない。さらに、ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮの性質は、官能性スクリーニングを必要とし、上手く行ったヌクレアーゼでさえ遺伝子ターゲッティングの効率性は乏しい。
【０００７】
ヌクレオチドに基づく方法については、核酸が生物に供給され、内在性の過程が支援のない相同組換え又はオリゴヌクレオチドのゲノムへの統合を介してＤＮＡ修復又は遺伝子ターゲッティングをもたらす。これらの核酸は、ウイルスベクター、プラスミドベクター、Ｔ−ＤＮＡベクター及び二本鎖ＤＮＡを用いて供給することができる。三重螺旋形成性オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）と呼ばれるさらに短いヌクレオチドはオリゴヌクレオチドに基づくミスマッチ修復に用いられ、点突然変異又は４つまでのヌクレオチド対の修復を達成することができる。これらの方法は、供給される核酸に共有結合する酵素又は反応性化合物を介した酵素修飾又は化学修飾によって無作為であり得る、無作為に誘導され得る又は局所的に誘導され得るＤＳＢの形成に左右されすぎるという十分な証拠がある。ＤＮＡにおける二本鎖切断（ＤＳＢ）はＨＲに必要である。特定の事前に存在するＤＳＢは必須ではないが、効率性を改善する。ＤＮＡにおける天然の切断は無作為に位置し、稀であるので、効率性は低い（１０−６）にちがいない。ＤＳＢはイオン化放射線又は酸化する化合物によって無作為で誘導することができ、遺伝毒性を犠牲にして効率性を改善する。この系の改善では、核酸の末端の化学修飾によって支援された過去使用している非酵素的ＤＮＡ切断において支援されたＨＲ又は修復が行われている。これらの修飾には、ＥＤＴＡ−Ｆｅ又は光活性化可能なソラレンが挙げられ、試験管内で取り込まれて三重螺旋を形成する際、ｄｓＤＮＡにおいて配列特異的なＤＳＢを作出するのに使用された。追加の方法は、さもなければ、「小分子合成一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド」（ＯＤＮ又はｓｓＯＤＮ）として知られる一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に由来するオリゴヌクレオチド又は修飾されたオリゴヌクレオチドを使用する。しかしながら、オリゴヌクレオチドに基づく方法が哺乳類細胞のゲノムにて相対的に効率的な点突然変異を生じ得る一方で、これらは編集のこの方式に拘束される。
【０００８】
オリゴヌクレオチド／酵素の抱合体は、生物に抱合体を供給するのに先立って触媒酵素に試験管内で共有結合する核酸を構成する２つの方法の組み合わせである。これらの方法は、酵素のみに基づく方法とは対照的にモジュール的であり、標的配列の多様性を目的とした抱合体の調製を可能にする。オリゴヌクレオチド／酵素の抱合体の主な短所は、それらが生体内で自己集合することができず、それによって生体内でのゲノム編集に対する有用性を激しく限定していることである。当該技術で既知のそのような系の追加の重大な短所は、これら抱合体の使用において酵素成分は単量体として活性があるので、核酸への酵素の結合は、特異的でも、そうでなくても結果として切断を生じることである。そのような非特異的な切断は、望ましくない位置に望ましくない変化／変異を導入し得るので、そのような系の安全性を激しく低下させる。
【０００９】
抱合されないオリゴヌクレオチド／タンパク質の系はｓｓＤＮＡ基質を切断するのにも使用されている。この系では、ＰｏｌＩｋ酵素及びｄＮＴＰと共に、ＦｏｋＩ認識配列を再構成するヘアピン形成性オリゴヌクレオチドと併せて、認識部位の外側で切断するクラスＩＩＳ制限酵素、ＦｏｋＩを試験管内で使用して、切断されるオリゴヌクレオチドによって感作されるＤＮＡの二本鎖を創った。この系では、意図される配列が切断されるだけでなく、天然に存在するＦｏｋＩ部位も認識され、それに隣接する配列が切断されるであろう。ＦｏｋＩはたった５ヌクレオチド認識部位しか有さないので、これは、ゲノム全体では数千の切断部位がある可能性を示し、この系をゲノム編集には無用にしている。
【００１０】
高等植物やヒトでは、ＨＲを遺伝子ターゲッティングに使用することができる他の生物とは対照的に、ＮＨＥＪ経路が主要な内在性のメカニズムである。植物のＤＮＡ修復機構は、供与体ＤＮＡと染色体ＤＮＡとの間での効率的なＨＲを許容しない。実際、アグロバクテリウム介在性の遺伝子形質転換によって送達されることが多い異種供与体ＤＮＡ分子は、植物の非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）経路によって認識され、宿主ゲノム全体へのその無作為統合をもたらすことは広く受け入れられている。従って、最も最新の植物の形質転換法は、これらの方法では配列が、無作為にゲノムに挿入され、望ましくない副作用として、存在する遺伝子を破壊する可能性があり、多重コピーで挿入されることが多く、望ましくないプラスミド、マーカー又は細菌の配列残部を含有し得るので、遺伝子ターゲッティングとは見なされていない。
【００１１】
支援されたＨＲ及び指示に従うＮＨＥＪに有用な特異的なｄｓＤＮＡ切断の誘導方法は、生体内でのヌクレアーゼの発現を利用する。これらには、ホーミングエンドヌクレアーゼ、特注の組換え亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）又は特注の組換えＴＡＬエフェクターヌクレアーゼに由来するメガヌクレアーゼ又はキメラメガヌクレアーゼのような稀な配列を切断するヌクレアーゼ（レアカッター）が挙げられる。これらの方法では、切断される標的部位の認識は、特定のヌクレオチド配列を天然に認識するタンパク質のドメイン又はサブユニットの相互作用によって達成され、又は特定のヌクレオチド配列を認識するように特異的に操作され、ポリヌクレオチド／ポリヌクレオチドのハイブリッド形成又は塩基対形成に基づかない。たとえば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼは、ＦｏｋＩヌクレアーゼのサブユニットと合成の亜鉛フィンガー（ＺＦ）ドメインの間のハイブリッドとして構築されるキメラタンパク質である。亜鉛フィンガーヌクレアーゼは核酸成分を含有しない。ＺＦＮは、幾つかのＺＦモチーフの組み合わせを介してヌクレオチド三重項を特異的に認識するように設計される。ＺＦＮは、ヌクレオチド三重項の限定されたサブセットのみを認識するその固有の能力のために配列すべてを認識するように構築することはできない。単量体としては不活性である２つの異なるＺＦＮが同時に送達される、ＺＦＮヘテロ二量体の使用は、これが設計をさらに複雑にし、標的配列の選択を減らすけれども、特異性に対して積極的な効果を有する。ＺＦＮはまた、遺伝子調節を変えるための遺伝子の活性化及び抑制の双方のための人工的な転写因子を創るのにも利用されている。しかしながら、転写因子に基づくそのような亜鉛フィンガーは配列すべてを結合できるわけではなく、認識配列の長さで限定され、幾つかの特異的なトリ−ヌクレオチドモチーフに限定されるので、考えられる遺伝子すべてを活性化する又は抑制するのに利用することはできない。
【００１２】
たとえば、Ｓｃｈｉｅｒｌｉｎｇは、配列特異的な切断モジュールを伴った新規の亜鉛フィンガーヌクレアーゼの基本骨格を開示している。たとえば、Ｅｉｓｅｎｓｃｈｍｉｄｔ、Ｋらは、特異性の高いＤＮＡ切断のためのプログラムされた制限エンドヌクレアーゼを開示している。たとえば、ＷＯ２００６／０２７０９９は特異性の高い方法でＤＮＡと反応するプログラム可能な特異性を持つ酵素抱合体を指向する。
【００１３】
たとえば、Ｋｕｂｏらは、ヒト細胞におけるシグナルペプチドによるオリゴヌクレオチドの細胞内送達及び遺伝子発現を開示している。Ｊｉｎｅｋらは、細菌の適応免疫にてプログラム可能な二重ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼを開示している。
【００１４】
たとえば、ＷＯ２０１２／１２９３７３は、複雑なトランスジェニック形質の遺伝子座を作出する方法を指向している。
【００１５】
にもかかわらず、標的核酸配列の生体内での特異的な標的化及び修飾を可能にする安全で信頼できる、モジュール的で安価な組成物及び方法に対して当該技術には満たされないニーズが依然として存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、生体内又は試験管内で核酸配列を標的とし、修飾する組成物及び方法を提供する。一部の実施形態によれば、本明細書で提供される新規の複合プログラム可能な分子複合体（ヌクレオ／タンパク質複合体）を用いて所定の核酸配列標的を正確に、確実に且つコスト効率良く、編集し、機能的に修飾する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
一部の実施形態では、本明細書で開示される分子複合体は、遺伝子の変異、欠失、遺伝子の置換及び異種核酸分子の統合を開始するための一本鎖若しくは二本鎖の標的核酸における切断の生成を含むが、これらに限定されない遺伝子ターゲッティング及び／又は標的化された遺伝子の機能的修飾に使用され、又はその化学的な、立体構造上の又は生物学的な機能的修飾に使用される。
【００１８】
一部の実施形態によれば、本明細書で開示される分子複合体は、（ａ）キメラポリペプチド（ポリヌクレオチド分子によってコードされ得る）と（ｂ）特異性付与核酸（ＳＣＮＡ）を含み、キメラポリペプチドは（ｉ）標的部位を修飾することが可能である機能性（エフェクター）ドメイン（ＦＤ）と（ｉｉ）連結ドメイン（ＬＤ）を含み、ＳＣＮＡは、（ｉ）標的部位に隣接する標的核酸の領域に相補性のヌクレオチド配列と（ｉｉ）ポリペプチドの連結ドメインの特異的に結合することが可能である認識領域を含み、それによって、宿主／標的細胞内でのポリペプチドとＳＣＮＡの集合が、標的部位にて標的核酸を特異的に修飾することが可能である、機能的な、プログラム可能なヌクレオタンパク質分子複合体を形成する。
【００１９】
一部の実施形態では、本発明は、特定の活性のある核酸を修飾する分子ヌクレオタンパク質分子複合体に生体内で自己集合することができるタンパク質のエフェクターモジュール（又はそれをコードする核酸分子）とプログラミング／ターゲッティング核酸モジュールを含む有利な組成物を提供する。この複合体では、本明細書で「プログラミング部分」、「プログラミングオリゴヌクレオチド」又は「特異性付与核酸」（ＳＣＮＡ）とも呼ばれる核酸は、前記特異性付与核酸と標的核酸の塩基対形成を介した標的核酸への分子複合体の特異性及び結合能力を提供する。この複合体のタンパク質エフェクター成分又はモジュールは、オリゴヌクレオチドの結合する化学的部分、オリゴヌクレオチド上のヌクレオチド（単数）若しくはヌクレオチド（複数）の修飾、オリゴヌクレオチド上の特異的な認識配列等、又はそれらの組み合わせによって特異性を決定する核酸に結合する／連結する／結合するように設計される。有利なことに、本明細書で開示される組成物及び方法は、広い範囲の所望の標的配列との高い特異性を付与し、その集合にて遺伝毒性やモジュール性が低く、信頼でき、特注生産することなく単一の基本骨格を利用し、特定のコア施設の外での独立した使用に実践的であり、開発時間が短く且つコストが低い。
【００２０】
タンパク質モジュールの活性は、標的核酸配列の修飾及び／又は標的核酸の機能的修飾を生じ得る。標的核酸の修飾には、変異、欠失、挿入、置換、結合、消化、ニッキング、メチル化、アセチル化、ライゲーション、組換え、螺旋の巻き戻し、化学修飾、標識化、活性化及び不活化、又はそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。標的核酸の機能的修飾は、転写の活性化、転写の不活化、選択的スプライシング、クロマチンの再構成、病原体の不活化、ウイルスの不活化における変化、核酸の細胞での局在化、区画化における変化、又はそれらの組み合わせをもたらし得るが、これらに限定されない。タンパク質部分によって達成される編集作用又は他の修飾は特異性付与核酸への連結によって意図される（予め定義された）特異的な標的核酸に向けられ、又は案内される。有利なことに、各単一タイプのタンパク質成分の使用は、特異性を決定する核酸のヌクレオチド配列の無限の仕分けと同時に又は別々に組み合わせられて意図される核酸の異なる区分における類似の作用を可能にする。これが、所定の核酸配列標的を修飾するための多目的で、信頼できる且つコスト効果のある方法及び組成物を提供することによって技術方法の状態の欠点を克服することを可能にする。従って、１つの容器又は生物で使用されるのであれば、たった１種のタンパク質に特異性を決定する核酸の種類の組み合わせ又は多数の特異性を決定する核酸の種類が提供されるべきである。これにはまた、１を超える種類の特異性を決定する核酸と同時に１を超える種類のタンパク質成分を使用する可能性も含まれる。
【００２１】
一部の実施形態によれば、本明細書で開示される複合体はモジュールであり、生体内又は試験管内のいずれかで標的細胞内にて自己集合することができ、１又は複数の特異性を決定するオリゴヌクレオチドと同時に１種類のタンパク質部分を供給するのを可能にする。さらに一部の実施形態では、タンパク質成分は所望の細胞に送達され、生体内で発現されることができ、その後、適当なＳＣＮＡの送達を待つ。一部の実施形態では、タンパク質成分とＳＣＮＡは同時に又は本質的に同時に送達され得る。従って、好ましくは標的細胞内でのタンパク質成分とＳＣＮＡの組み合わせは、生体内での特定のゲノムの二本鎖の切断（ＤＳＢ）又は他の所望の核酸の修飾の誘導を達成し得る。本発明の方法は、分子複合体が任意の核酸配列又は配列の対を標的とすることができ、その近傍で切る／制限する／切断することができ、その結果、任意の核酸配列の除去又は挿入又は置換を開始するために、小さな又は大きな核酸区分を欠失させ、又は配列を切る／制限する／切断することができるので、標的核酸の点突然変異の導入に限定されない。
【００２２】
有利なことに、本発明は、その実施形態にて、生体内でのタンパク質部分の発現及びタンパク質部分と標的核酸との間で事前の共有化学結合を必要とせずに生体内で分子複合体を形成するための生体内での自己集合によるＳＣＮＡへの結合／連結を初めて開示する。本発明の実施形態によれば、当該技術で既知のオリゴヌクレオチドに基づく方法とは対照的に、タンパク質に結合するＳＣＮＡは、供与体としてではなく、むしろ特異性付与部分として機能することを意図し、修飾された核酸の一部にはならない。さらに、本発明の一部の実施形態では、ＳＣＮＡは、単一の送達事象と共に分子複合体の成分すべての集合を起こすような方法で生体内にて発現させることができる。さらに、一部の実施形態によれば、エフェクタータンパク質は、その二量体化の際にのみ活性があるように設計することができ（すなわち、活性があるには二量体を形成しなければならない）、それによって、活性のある二量体が、それがＳＣＮＡによって標的とされ／プログラムされてその標的に結合する場合、たとえば、二量体の単量体相手間の分子距離が十分に正確である場合にのみ形成できるように二量体化を制御することができる。従って、有利なことに、分子複合体は意図される標的部位でのみ活性化され、それによって特異性及び信頼性を高める。さらなる実施形態によれば、１つのタンパク質成分が発現されて、それぞれ異なる特異性付与オリゴヌクレオチドによってプログラムされ／標的とされるホモ二量体を形成し／作出し得る。さらに、生体内でのタンパク質の発現について当該技術で既知であるウイルスの発現系は、サイズの制約により１つのタンパク質の産生に限定されることが多く、干渉効果のために類似のウイルスに限定されることが多いので、１つのタンパク質成分を使用することは送達のその様式にとって決定的な利点を有する。さらに、認識配列の限定されたサブセットを有する当該技術で既知の他の方法（たとえば、ＺＦＮ及びメガヌクレアーゼ）とは対照的に、本明細書で開示されるプログラミングオリゴヌクレオチド（ＳＣＮＡ）は配列の無限のレパトアを有するので、考える限りでは、高度に複雑なゲノムにて極端な配列特異性を達成する。さらに多数のプログラミングオリゴヌクレオチドが単一のタンパク質エフェクター部分と同時に供給され得るので、同時に１を超える標的を修飾することが可能であり、当該技術で既知の方法を超える追加の利点を提供する。このことは、たとえば、多数の遺伝子を迅速にノックアウトすること、又は異なる位置に幾つかの異なる形質を挿入すること、又は１つの供与体ヌクレオチドのタグで幾つかの異なる位置にタグを付けることに有用であり得る。
【００２３】
一部の実施形態によれば、プログラムされていないタンパク質成分（すなわち、プログラミングオリゴヌクレオチドに結合／連結されていないタンパク質）は標的核酸に親和性を有さない又は非常に低い親和性を有するので、改善された特異性及び安全性及び低下した遺伝毒性が有利に得られる。上記で詳述したように、タンパク質成分のエフェクタードメイン又は触媒ドメインは、二量体化の際のみに活性があり、それによって、少なくとも２つのプログラミングオリゴヌクレオチドが標的隣接配列を結合してタンパク質の二量体化及び活性化を引き起こさなければならない。２つの十分に長いプログラミングオリゴヌクレオチドは、結合部位との広範な相補性を創製することによって高度に複雑なゲノムにて必要とされる非常に高い理論的な特異性を付与することができる。プログラムされていない発現されたタンパク質は、標的核酸に親和性を有さないので、標的核酸を結合せず、及び／又は修飾しない。従って、たとえば、プログラミングオリゴヌクレオチドが標的細胞（プログラムされていないタンパク質成分をすでに発現している）に別々に送達／供給される適用では、又はオリゴヌクレオチドが標的細胞から枯渇される（たとえば、希釈又は分解によって）状態では、非特異的な切断は生じ得ず、それによって安全性を高め、遺伝毒性を低下させる。
【００２４】
従って、本発明の実施形態によれば、指示に従う非相同末端結合（ＮＨＥＪ）及び支援された相同組換え（ＨＲ）の双方は、以下の１以上を達成するために特異的に且つプログラム可能な方法で利用され得る：
（１）その内部で切断し、内在性ヌクレアーゼによって幾分、分解され、内在性のＮＨＥＪのＤＮＡ修復メカニズムによって再連結される二本鎖切断（ＤＳＢ）を創ってＤＮＡのインフレーム欠失及び／又はフレームシフト変異を創ることによってＤＮＡ配列を変異させること。植物におけるＴ−ＤＮＡ又はトランスポゾンの挿入株とは対照的に、内在性遺伝子の欠失又は変異のこの方法は、異種ＤＮＡを残さず、植物は一部の定義によって非トランスジェニックと呼ばれ得る。ＮＨＥＪでは、１以上のヌクレオチドが未だに特徴付けられていない内在性のメカニズムにてＤＳＢに添加されてもよく、フレームシフト又は変異の同じ効果を本質的に達成する。
（２）内在性のＮＨＥＪのＤＮＡ修復メカニズムによって再連結される、それに隣接する２つの配列を切断することによって、又は欠失させる配列で若しくはその近傍で切断し、その後、標的に組換えられ、標的にて欠失させる配列に隣接する配列を含有する供与体ＤＮＡを供給することによる支援型ＨＲによってＤＮＡ配列のストレッチを欠失させること。
（３）標的核酸を切断し、ＮＨＥＪメカニズムによるギャップに直接連結される供与体ＤＮＡを供給することによって、又は好ましくは組み換えられ、支援型ＨＲによるギャップに連結されるギャップの末端に相同性を有する供与体を供給することによって供与体ＤＮＡをＤＳＢに挿入すること。
（４）それに隣接する双方の配列を切断し、ＮＨＥＪによって標的隣接配列の中で挿入され、連結される、又は好ましくはＨＲによって組み換えられ、連結される供与体核酸を供給することによって、供与体の末端で標的核酸に類似する配列又はそれに隣接するものを付加することによって標的核酸配列を置き換えること。
【００２５】
一部の実施形態によれば、理論又はメカニズムに束縛されることを望まないで、本明細書で開示される組成物及び方法の利点には、配列の無制限の選択を標的とすることができる一般的な酵素複合体構築物スキームの創製が挙げられる。特定の目的（たとえば、ｄｓＤＮＡの切断）に対してタンパク質成分がいったん最適化されると、この同じタンパク質をプログラミング核酸（ＳＣＮＡ）配列の無制限の選択と共に使用することができる。従って、影響される標的配列の多様性は、たとえば、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ及びメガヌクレアーゼのような当該技術で既知の他の方法では固有であるタンパク質の再設計及び最適化の困難で時間のかかる必要性なしで、ＳＣＮＡの設計によって達成され、その際、タンパク質自体は、標的配列ごとに変化させ、適応させなければならない。合成ＳＣＮＡを設計し、調製することは相対的に簡単であり、迅速であり、相対的に安価である。本発明の一部の実施形態では、生体内でＳＣＮＡを作出することも可能であり、化学的に合成されたＳＣＮＡを細胞に送達する必要性を回避する。さらに、ＳＣＮＡをほとんど任意の所望の標的配列に対して塩基対に設計することができるので、それは、ほとんど任意の標的配列に分子複合体を向けることができる。さらに、幾つかの標的配列を同一細胞で同時に使用し得る。たとえば、１を超える切断部位を必要とする編集機能にて、４つの異なるＳＣＮＡとタンパク質部分１つを単に提供することによる、たとえば、核酸の特定のストレッチの欠失又は置換。
【００２６】
一部の実施形態によれば、従って、標的細胞にて標的核酸配列における所定の標的部位を修飾するためのヌクレオ／タンパク質の組成物が提供され、組成物は、（ｉ）前記標的部位を修飾することが可能である機能性（エフェクター）ドメイン（ＦＤ）、特定の核酸結合部位を欠いている機能性ドメインと、（ｉｉ）特異性付与核酸（ＳＣＮＡ）と相互作用することが可能である連結ドメイン（ＬＤ）を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子（その際、連結ドメインは特定の核酸結合部位を欠いている）と、（ｂ）特異性付与核酸（ＳＣＮＡ）又はＳＣＮＡをコードする核酸を含み、その際、ＳＣＮＡは（ｉ）標的部位に隣接する標的核酸の領域に相補性のヌクレオチド配列と（ｉｉ）高い結合親和性でポリペプチドの連結ドメインに特異的に結合することが可能である認識領域を含み、それによって、標的細胞内のポリペプチドとＳＣＮＡの集合が、標的部位にて前記標的核酸を特異的に修飾することが可能である機能的なヌクレオタンパク質複合体を形成する。
【００２７】
一部の実施形態では、機能性ドメインは触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドはさらに細胞内局在化ドメインを含む。
【００２８】
一部の実施形態では、標的核酸を修飾することは、変異、欠失、挿入、置換、結合、消化、二本鎖切断の創製、ニッキング、メチル化、アセチル化、ライゲーション、組換え、螺旋の巻き戻し、化学修飾、標識化、活性化及び不活化から選択される。
【００２９】
一部の実施形態によれば、ＳＣＮＡは、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、修飾されたＤＮＡ、修飾されたＲＮＡ、ロックド核酸（ＬＮＡ）及びペプチド核酸（ＰＮＡ）又はそれらの組み合わせから成る群から選択される核酸分子を含む。
【００３０】
一部の実施形態では、ＳＣＮＡの認識領域は５’−末端の修飾、３’−末端の修飾及び内部の修飾から選択される修飾を含む。一部の実施形態では、化学修飾は、ヌクレオチドの修飾、及び非ヌクレオチド部分の付加から成る群から選択される。一部の実施形態では、非ヌクレオチド部分は、ビオチン、フルオレセイン、アミドリンカー、オリゴペプチド、アミノアリル、色素分子、蛍光色素分子、ジゴキシゲニン、アクリダイト、アデニル化、アジド、ＮＨＳ−エステル、コレステリル−ＴＥＧ、アルキン、光切断性のビオチン、チオール、ジチオールから選択される。一部の実施形態では、ヌクレオチドの修飾は、リン酸塩、２−アミノプリン、トリマー−２０、２,６−ジアミノプリン、５−ブロモ−デオキシウリジン、デオキシウリジン、逆位ｄＴ、ジデオキシヌクレオチド、５−メチルデオキシシチジン、デオキシイノシン、５−ニトロインドール、２−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基、イソ-ｄＣ、イソ−ｄＧ、フッ素修飾塩基及びホスホロチオエート結合から成る群から選択される。一部の実施形態では、修飾は、ヌクレオチド修飾、ビオチン、フルオレセイン、アミドリンカー、オリゴペプチド、アミノアリル、色素分子、蛍光色素分子、ジゴキシゲニン、アクリダイト、アデニル化、アジド、ＮＨＳ−エステル、コレステリル−ＴＥＧ、アルキン、光切断性のビオチン、チオール、ジチオール、修飾された塩基、リン酸塩、２−アミノプリン、トリマー−２０、２,６−ジアミノプリン、５−ブロモ−デオキシウリジン、デオキシウリジン、逆位ｄＴ、ジデオキシヌクレオチド、５−メチルデオキシシチジン、デオキシイノシン、５−ニトロインドール、２−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基、イソ-ｄＣ、イソ−ｄＧ、フッ素修飾塩基及びホスホロチオエート結合、及び特定のヌクレオチド配列とのその相互作用によって共有結合したタンパク質から成る群から選択される。一部の実施形態では、特定のヌクレオチド配列とのその相互作用によって共有結合したタンパク質は、アグロバクテリウムＶｉｒＤ２タンパク質、ピコルナウイルスＶＰｇ、トポイソメラーゼ、ＰｈｉＸ１７４ファージＡタンパク質、ＰｈｉＸＡ*タンパク質及びそれらの変異体から選択され得るが、これらに限定されない。
【００３１】
一部の実施形態では、ＳＣＮＡ上の修飾と連結ドメインとの間の連結／結合／会合は、ビオチン／アビジン；ビオチン／ストレプトアビジン；アビジンのビオチンが修飾した形態；タンパク質／タンパク質；タンパク質／核酸の相互作用；リガンド／受容体の相互作用；リガンド／基質の相互作用；抗体／抗原；単鎖抗体／抗原；抗体又は単鎖抗体／ハプテン；ホルモン／ホルモン結合タンパク質；受容体／アゴニスト；；受容体／受容体アゴニスト；ＩｇＧ／プロテインＡ；酵素／酵素補因子；酵素／酵素阻害剤；一本鎖ＤＮＡ／ＶｉｒＥ２；ＳｔｉｃｋｙＣ／ｄｓＤＮＡ；ＲＩＳＣ／ＲＮＡ；ウイルスコートタンパク質／核酸；抗フルオレセイン単鎖可変断片抗体（抗ＦＡＭｓｃＦＶ）／フルオレセイン；抗ＤＩＧ単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）免疫グロブリン（ＤＩＧ−ｓｃＦｖ）／ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）及びアグロバクテリウムＶｉｒ２／Ｖｉｒ２結合タンパク質；及びそれらの変異体から選択されるが、これらに限定されない結合対の非共有結合相互作用から選択される結合対の相互作用を生じる。
【００３２】
一部の実施形態では、ＳＣＮＡの認識部位は、キメラタンパク質の連結ドメインに連結する／結合する／会合することが可能であるヌクレオチドモチーフを含む。一部の実施形態では、ヌクレオチドモチーフと連結ドメインとの間で連結する／結合する／会合することは、亜鉛フィンガータンパク質／亜鉛フィンガーモチーフ；制限酵素認識ドメイン／制限酵素認識配列；転写因子のＤＮＡ結合ドメイン／ＤＮＡモチーフ；リプレッサ／オペレータ；ロイシンジッパー／プロモータ；螺旋ループ螺旋／Ｅボックスドメイン；アルギニンリッチモチーフドメインを含むＲＮＡ結合モチーフ、αβタンパク質ドメイン、ＲＮＡ認識ドメイン（ＲＲＭ）ドメイン、Ｋ−相同性ドメイン、二本鎖ＲＮＡ結合モチーフ、ＲＮＡ結合亜鉛フィンガー、及びＲＮＡターゲッティング酵素／ＲＮＡ配列に特異的な同族体；ＨＩＶｒｅｖタンパク質／ＨＩＶｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）の幹ＩＩＢ；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）Ｔａｔ主要結合ドメイン／ＢＩＶトランス作用性応答要素（ＴＡＲ）配列のループ１；ファージラムダｐｈｉ２１及び２２のＮタンパク質／その各ＲＮＡにおけるＮ利用（ｎｕｔ）部位におけるボックスＢループヘアピンから選択されるが、これらに限定されない。
【００３３】
一部の実施形態によれば、プログラム可能なヌクレオタンパク質分子複合体によって標的核酸配列内で所定の標的部位を修飾する方法が提供され、該方法は、（ａ）プログラム可能なキメラタンパク質（ポリペプチド）又はタンパク質をコードする核酸配列を宿主細胞に送達する工程と、（ｂ）特異性付与核酸（ＳＣＮＡ）又はＳＣＮＡコードする核酸を前記宿主細胞に送達する工程と、（ｃ）前記キメラタンパク質をＳＣＮＡに結合し、それによって宿主細胞内で所定の核酸配列に対してキメラタンパク質を向け、活性のあるプログラムされたヌクレオタンパク質複合体を形成する工程と、（ｄ）前記活性のあるプログラムされたヌクレオタンパク質分子複合体によって標的核酸配列の所定の標的部位の修飾を可能にする工程を含む。
【００３４】
一部の実施形態では、プログラム可能なヌクレオタンパク質分子複合体によって標的核酸配列内で所定の標的部位を修飾する方法が提供され、該方法は、
（ａ）プログラム可能なキメラポリペプチドをコードする核酸配列を宿主細胞に送達する工程と
（キメラポリペプチドは、
（ｉ）前記標的部位を修飾することが可能である機能性ドメイン、特定の核酸結合部位を欠いている機能性ドメインと
（ｉｉ）特異性付与核酸と相互作用することが可能である連結ドメイン（その際、連結ドメインは特定の核酸結合部位を欠いている）を含む）
（ｂ）特異性付与核酸（ＳＣＮＡ）又はＳＣＮＡをコードする核酸を宿主細胞に送達する工程を含み、
その際、ＳＣＮＡは
（ｉ）標的部位に隣接する標的核酸の領域に相補性のヌクレオチド配列と
（ｉｉ）高い結合親和性でポリペプチドの連結ドメインに特異的に結合することが可能である認識領域を含み、
その際、ＳＣＮＡを抱く細胞におけるポリペプチドの発現は、ＳＣＮＡへの前記キメラポリペプチドの結合を可能にし、活性のあるプログラムされたヌクレオタンパク質複合体を形成し、それによって、宿主細胞内で所定の標的核酸配列に対してキメラポリペプチドを向け、前記活性のあるプログラムされたヌクレオタンパク質分子複合体による標的核酸配列の所定の標的部位の修飾を可能にする。
【００３５】
一部の実施形態では、標的核酸はＤＮＡである。一部の実施形態では、標的ＤＮＡはゲノムＤＮＡである。一部の実施形態では、標的核酸配列は染色体外の核酸配列である。一部の実施形態では、染色体外の核酸配列はミトコンドリア、葉緑体、アミロプラスト及び有色体から成る群から選択される細胞小器官に存在する。一部の実施形態では、標的核酸配列はウイルスの核酸配列である。一部の実施形態では、標的核酸配列は原核細胞の核酸配列である。一部の実施形態では、標的核酸配列は合成の核酸配列である。
【００３６】
一部の実施形態では、修飾は、変異、欠失、挿入、置換、結合、消化、二本鎖切断の創製、ニッキング、メチル化、アセチル化、ライゲーション、組換え、螺旋の巻き戻し、化学修飾、標識化、活性化及び不活化から選択される。
【００３７】
一部の実施形態では、キメラタンパク質（ポリペプチド）は、核酸修飾活性を有するタンパク質部分を含む。一部の実施形態では、キメラタンパク質は、核酸の機能的修飾因子を有するタンパク質部分を含み、その際、機能的修飾は、転写の活性化、転写の不活化、ＲＮＡの転写スプライシング、選択的ＲＮＡスプライシング、クロマチンの再構成、細胞の寄生生物及びウイルスの不活化及び前記核酸配列の細胞での局在化又は区画化の変化から成る群から選択される。
【００３８】
一部の実施形態では、ＳＣＮＡは、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、修飾されたＤＮＡ、修飾されたＲＮＡ、ロックド核酸（ＬＮＡ）及びペプチド核酸（ＰＮＡ）又はそれらの組み合わせから成る群から選択される分子を含む。一部の実施形態では、ＳＣＮＡは、標的核酸と特異的に相互作用するように構成された特異性規定配列を含む。ＳＣＮＡと標的核酸との間の相互作用は、完全な二重螺旋塩基対形成、部分的な二重螺旋塩基対形成、完全な三重螺旋塩基対形成、部分的な三重螺旋塩基対形成、及び前記塩基対形成によって形成されるＤループ又は分岐形態から成る群から選択される塩基対形成を介する。
【００３９】
追加の実施形態では、ＳＣＮＡはキメラタンパク質の連結ドメインと会合する／結合する／連結するように構成された認識領域を含む。一部の実施形態では、認識領域は、５’−末端の修飾、３’−末端の修飾及び内部の修飾から成る群から選択される修飾を含む。修飾は、ヌクレオチド修飾、ビオチン、フルオレセイン、アミドリンカー、オリゴペプチド、アミノアリル、色素分子、蛍光色素分子、ジゴキシゲニン、アクリダイト、アデニル化、アジド、ＮＨＳ−エステル、コレステリル−ＴＥＧ、アルキン、光切断性のビオチン、チオール、ジチオール、修飾された塩基、リン酸塩、２−アミノプリン、トリマー−２０、２,６−ジアミノプリン、５−ブロモ−デオキシウリジン、デオキシウリジン、逆位ｄＴ、ジデオキシヌクレオチド、５−メチルデオキシシチジン、デオキシイノシン、５−ニトロインドール、２−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基、イソ-ｄＣ、イソ−ｄＧ、フッ素修飾塩基及びホスホロチオエート結合、及び特定のヌクレオチド配列とのその相互作用によって共有結合したタンパク質から選択されてもよいが、これらに限定されない。特定のヌクレオチド配列とのその相互作用によって共有結合したタンパク質は、アグロバクテリウムＶｉｒＤ２タンパク質、ピコルナウイルスＶＰｇ、トポイソメラーゼ、ＰｈｉＸ１７４ファージＡタンパク質、ＰｈｉＸＡ*タンパク質及びそれらの変異体から選択される。
【００４０】
一部の実施形態では、ＳＣＮＡ上の修飾と連結ドメインとの間の会合／結合／連結は、ビオチン／アビジン；ビオチン／ストレプトアビジン；アビジンのビオチンが修飾した形態；タンパク質／タンパク質；タンパク質／核酸の相互作用；リガンド／受容体の相互作用；リガンド／基質の相互作用；抗体／抗原相互作用；単鎖抗体／抗原；抗体又は単鎖抗体／ハプテン相互作用；ホルモン／ホルモン結合タンパク質；受容体／アゴニスト；受容体／受容体アゴニスト；抗フルオレセイン単鎖可変断片抗体（抗ＦＡＭｓｃＦＶ）／フルオレセイン；抗ＤＩＧ単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）免疫グロブリン（ＤＩＧ−ｓｃＦｖ）／ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）；ＩｇＧ／プロテインＡ；酵素／酵素補因子；酵素／酵素阻害剤；一本鎖ＤＮＡ／ＶｉｒＥ２；ＳｔｉｃｋｙＣ／ｄｓＤＮＡ；ＲＩＳＣ／ＲＮＡ；ウイルスコートタンパク質／核酸；及びアグロバクテリウムＶｉｒ２／Ｖｉｒ２結合タンパク質；及びそれらの変異体から選択される結合対の非共有結合相互作用を生じる。
【００４１】
一部の実施形態では、特異性付与核酸配列とタンパク質部分の連結ドメインとの間の結合／会合は、生体内で共有結合性に創られる。一部の実施形態では、連結ドメインとＳＣＮＡの共有結合はアグロバクテリウムＶｉｒＤ２の右境界配列又はその変異体の生物学的相互作用の結果生じ、アグロバクテリウムを含む細菌にて創られる。
【００４２】
一部の実施形態では、認識領域は、キメラタンパク質の連結ドメインと相互作用する／連結する／結合することが可能であるヌクレオチドモチーフを含む。一部の実施形態では、相互作用の対は、亜鉛フィンガータンパク質／亜鉛フィンガーモチーフ；制限酵素認識ドメイン／制限酵素認識配列；転写因子のＤＮＡ結合ドメイン／ＤＮＡモチーフ；リプレッサ／オペレータ；ロイシンジッパー／プロモータ；螺旋ループ螺旋／Ｅボックスドメイン；アルギニンリッチモチーフドメインを含むＲＮＡ結合モチーフ、αβタンパク質ドメイン、ＲＮＡ認識ドメイン（ＲＲＭ）ドメイン、Ｋ−相同性ドメイン、二本鎖ＲＮＡ結合モチーフ、ＲＮＡ結合亜鉛フィンガー、及びＲＮＡターゲッティング酵素／ＲＮＡ配列に特異的な同族体；ＨＩＶｒｅｖタンパク質／ＨＩＶｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）の幹ＩＩＢ；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）Ｔａｔ主要結合ドメイン／ＢＩＶトランス作用性応答要素（ＴＡＲ）配列のループ１；ファージラムダｐｈｉ２１及び２２のＮタンパク質／その各ＲＮＡにおけるＮ利用（ｎｕｔ）部位におけるボックスＢループヘアピンから選択される。
【００４３】
一部の実施形態によれば、所定の標的核酸配列は遺伝形質に関与し、修飾は、永続的な置換、ノックアウト、一過性の又は永続的な増強、シャットオフ、ノックダウン及びフレームシフトから成る群から選択される技術的手順によって遺伝要素の転写又は翻訳において変化を生じる。一部の実施形態では、遺伝形質は、遺伝要素の配列自体、その調節配列を編集すること、当該遺伝子又は事象の調節鎖における調節配列を遺伝子調節することによって修飾される。
【００４４】
さらなる実施形態によれば、ヌクレオタンパク質複合体が提供され、その際、タンパク質部分と特異性付与核酸部分の間の物理的会合が、プログラムされた機能的複合体を形成する。一部の実施形態では、タンパク質部分の連結ドメインとＳＣＮＡの間の物理的会合は、リガンド／受容体、リガンド／基質、水素結合、ファンデルワールス結合、イオン結合及び疎水性相互作用から成る群から選択される親和性相互作用に基づく。
【００４５】
一部の実施形態によれば、本明細書で開示される方法によって創られる、所定の標的部位にて所定の遺伝的修飾を有する宿主細胞が提供される。一部の実施形態では、宿主細胞は、たとえば、脊椎動物細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞、動物細胞、植物細胞、無脊椎動物細胞、線虫細胞、昆虫細胞及び幹細胞のような、しかし、これらに限定されない任意の種類の細胞であり得る。
【００４６】
一部の実施形態によれば、本明細書で開示される方法によって形成される所定の遺伝的修飾を有するトランスジェニック生物又はノックアウト生物が提供される。一部の実施形態では、生物は植物又は動物である。
【００４７】
一部の実施形態によれば、生物における遺伝病を治療する方法が提供され、該方法は、ヌクレオタンパク質プログラム可能な分子複合体を生物の細胞に導入することを含む。
【００４８】
一部の実施形態によれば、
（ａ）（ｉ）標的核酸配列における標的部位を修飾することが可能であり、特定の核酸結合部位を欠いている機能性ドメインと（ｉｉ）特異性付与核酸と相互作用することが可能であり、特定の標的核酸結合部位を欠くことが可能である連結領域を含むポリペプチドと、
（ｂ）（ｉ）標的部位に隣接する標的核酸の領域に相補性であるヌクレオチド配列と（ｉｉ）ポリペプチドの連結ドメインに特異的に結合することが可能である認識領域を含む特異性付与核酸（ＳＣＮＡ）と
を含む宿主細胞が提供され、
それによって、宿主細胞内でのポリペプチドとＳＣＮＡの集合が、標的部位にて標的核酸を特異的に修飾することが可能である機能的なヌクレオタンパク質複合体を形成する。
【００４９】
一部の実施形態では、（ａ）（ｉ）細胞において標的核酸配列における標的部位を修飾することが可能であり、特定の核酸結合部位を欠いている機能性ドメインと（ｉｉ）特異性付与核酸と相互作用することが可能であり、特定の標的核酸結合部位を欠くことが可能である連結領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子と、（ｂ）（ｉ）標的部位に隣接する標的核酸の領域に相補性であるヌクレオチド配列と（ｉｉ）ポリペプチドの連結ドメインに特異的に結合することが可能である認識領域を含む特異性付与核酸（ＳＣＮＡ）を抱く宿主細胞が提供され、それによって宿主細胞内でのポリペプチドとＳＣＮＡの集合が、標的部位にて標的核酸を特異的に修飾することが可能である機能的なヌクレオタンパク質複合体を形成する。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１Ａ】一部の実施形態に係るプログラム可能な分子複合体の要素／成分を示す模式図である。
【図１Ｂ】一部の実施形態に係るプログラム可能な分子複合体の要素／成分を示す模式図である。
【図２Ａ】一部の実施形態に係るプログラム可能な分子複合体の集合を示す模式図である。
【図２Ｂ】一部の実施形態に係るプログラム可能な分子複合体の集合を示す模式図である。
【図３】一部の実施形態に従って、予め定義された核ｄｓＤＮＡ標的配列の切断のために設計された分子複合体の３Ｄモデル化した例を示す図である。
【図４Ａ】一部の実施形態に係る、標的核酸上でのプログラム可能な分子複合体の成分の集合の例となる様式（正確な縮尺ではない）を示す図である。
【図４Ｂ】一部の実施形態に係る、標的核酸上でのプログラム可能な分子複合体の成分の集合の例となる様式（正確な縮尺ではない）を示す図である。
【図５】一部の実施形態に従って、生体内で生成されたＳＣＮＡを用いて細胞にプログラム可能な分子複合体を送達することを示す模式図である。
【図６】一部の実施形態に従って、生体内で生成されたＳＣＮＡを用いて細胞にプログラム可能な分子複合体を送達することを示す一般的な模式図である。
【図７Ａ】一部の実施形態に従って、アグロバクテリウムにて生成された一本鎖ＤＮＡのＳＣＮＡを用いて細胞に分子複合体のプログラム可能な核酸部分を送達する非限定例を示す模式図である。
【図７Ｂ】一部の実施形態に従って、細菌の分泌系にて生成された一本鎖ＤＮＡのＳＣＮＡを用いて細胞に分子複合体のプログラム可能な核酸部分を送達する非限定例を示す模式図である。
【図８Ａ】一部の実施形態に従って、アグロバクテリウムにて生成されたＲＮＡのＳＣＮＡを用いて細胞にプログラム可能な分子複合体のプログラミング部分を送達することを示す模式図である。
【図８Ｂ】一部の実施形態に従って、ウイルスのような自律的に複製するベクター（図８Ｂ）によって細胞にプログラム可能な分子複合体のプログラミング部分を送達することを示す模式図である。
【図９】一部の実施形態に従って、単一送達事象にて感受性の標的真核細胞にプログラム可能な分子複合体の集合に必要な成分を含む組成物を同時に送達する送達用の媒体又はベクターの非限定例を示す模式図（正確な縮尺ではない）である。
【図１０】一部の実施形態に従って、標的核酸にて変異を創るためのプログラムされた分子複合体の使用を示す模式図（正確な縮尺ではない）である。
【図１１】一部の実施形態に従って、供給された供与体核酸を用いて標的核酸に１又は複数のヌクレオチドを挿入するためのプログラムされた分子複合体の使用を示す模式図（正確な縮尺ではない）である。
【図１２】一部の実施形態に従って、供給された供与体核酸を用いて標的核酸にて１又は複数のヌクレオチドを置換するためのプログラムされた分子複合体の使用を示す模式図（正確な縮尺ではない）である。
【図１３】一部の実施形態に従って、標的核酸から１又は連続する複数のヌクレオチドの欠失を創るためのプログラムされた分子複合体の使用を示す模式図（正確な縮尺ではない）である。
【図１４】一部の実施形態に従って、供給された供与体核酸を用いて標的核酸にて１又は複数のヌクレオチドを置換するためのプログラムされた分子複合体の使用を示す模式図（正確な縮尺ではない）である。
【図１５】一部の実施形態に従って、及び実施例１０にて詳述されるように、その活性を調べるために感受性の標的真核細胞に標的配列と共にプログラム可能な分子複合体を同時に送達するための送達用の媒体又はベクター（正確な縮尺ではない）の非限定例を示す図である。
【図１６】実施例１２にて詳述されるように、ＳＣＮＡ対間の最適な距離を経験的に決定するための及び標的ＤＮＡを特異的に切断する様々な種類のプログラムされた分子複合体の能力を調べるためのパラメータを示す図（正確な縮尺ではない）である。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
一部の実施形態によれば、所定の標的核酸を修飾するための組成物及び方法が提供される。具体的に開示されるのは、プログラム可能な分子複合体を含む組成物を用いて生体内で標的配列を修飾する方法である。プログラム可能な分子複合体（本明細書では「ヌクレオタンパク質複合体」とも呼ばれる）は、タンパク質部分（本明細書では「プログラム可能な部分」とも呼ばれる）と核酸部分（本明細書では「特異性付与核酸（ＳＣＮＡ）」又は「プログラミング核酸」とも呼ばれる）を含む。一部の実施形態によれば、分子複合体の成分は、標的核酸配列の存在下で、分化していてもしていなくても生細胞、生物、組織、臓器又はその一部にて生体内で自己集合し、活性のあるプログラムされた機能的な分子複合体を形成する。
【００５２】
本明細書で使用される専門用語は特定の実施形態を記載する目的のみのためのものであって、限定を意図するものではないことが理解されるべきである。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形態「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は文脈が明瞭に述べない限り、複数参照を含むことが留意されなければならない。
【００５３】
本明細書で数的範囲を引用することについて、同程度の精度でその間に介在する各数が明白に熟考される。たとえば、６〜９の範囲については、６及び９に加えて７及び８が熟考され、６．０〜７．０の範囲については、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９及び７．０の数が明白に熟考される。
定義
【００５４】
約
本明細書で使用されるとき、用語「約」は±１０％を指す。
【００５５】
投与すること
「投与すること」は、対象に医薬剤又は医薬組成物を提供することを指向し、医療専門家によって投与すること及び自己投与することを含むが、これらに限定されない。
「非経口投与」は、腸管を介さない投与を意味する。非経口投与には、皮下投与、静脈内投与、又は筋肉内投与が挙げられるが、これらに限定されない。
「皮下投与」は皮膚直下の投与を意味する。
「静脈内投与」は静脈への投与を意味する。
「腫瘍内投与」は腫瘍の中への投与を意味する。
「化学塞栓」は、腫瘍への血液供給を外科的に又は機械的に遮断し、化学療法剤を直接腫瘍に投与する処置を意味する。
【００５６】
アンチセンス
用語「アンチセンス」は本明細書で使用されるとき、特定のＤＮＡ又はＲＮＡの配列に相補性であるヌクレオチド配列を指す。用語「アンチセンス鎖」は、「センス鎖」に対して相補性である核酸の鎖を参照して使用される。アンチセンス分子は、相補鎖の合成を可能にするウイルスプロモータに逆方向で当該遺伝子を連結することによる合成を含む方法によって作出され得る。いったん細胞に導入されると、この転写された鎖は細胞によって作出された天然の鎖と合せて二本鎖を形成する。これらの二本鎖がさらなる転写又は翻訳のいずれかを阻止する。このようにして変異体の表現型が生成され得る。
【００５７】
自律的に複製するベクター
「自律的に複製するベクター」は、ウイルス、改変ウイルス、特定の組換えベクター及びプラスミド、レプリコン及び細胞内寄生生物を含むが、これらに限定されない宿主の中で複製することが可能である天然の又は非天然の核酸配列を含むようにここでは定義される。
【００５８】
細胞
「細胞」は、単離された若しくはされない、培養された若しくはされない、又は分化した若しくはしない、たとえば、組織、臓器、カルス、生物又はその一部のような細胞のさらに高度なレベルの組織化も含む任意の種類の細胞、原核細胞又は真核細胞を含むようにここでは定義される。例となる細胞には、脊椎動物細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞、植物細胞、動物細胞、無脊椎細胞、線虫細胞、昆虫細胞、幹細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
相補体
「相補体」又は「相補性」は本明細書で使用されるとき、核酸分子のヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の間でのワトソン／クリック（たとえば、Ａ−Ｔ／Ｕ及びＣ−Ｇ）又はフーグスティーンの塩基対形成を意味する。完全な相補体又は完全な相補性は、核酸分子のヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の間での１００％相補性の塩基対形成を意味し得る。部分的な相補性は、１００％未満の相補性、たとえば、８０％の相補性を意味し得る。
【００６０】
送達ベクター
「送達ベクター」（単数）又は「送達ベクター」（複数）は、本発明で必要とされる剤／化学物質及び分子（タンパク質又は核酸）を細胞に接触させる又は細胞内若しくは細胞内区画に送達するのに本発明で使用することができる任意の送達ベクターを指向する。それには、伝達ベクター、リポソーム送達ベクター、プラスミド送達ベクター、ウイルス送達ベクター、細菌送達ベクター、薬剤送達ベクター、化学物質キャリア、高分子キャリア、リポプレックス、ポリプレックス、デンドリマー、微小バブル（超音波造影剤）、ナノ粒子、エマルジョン又は他の適当な移動ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。これらの送達ベクターは、分子、化学物質、高分子（遺伝子、核酸、タンパク質）、又はプラスミド及びＴ−ＤＮＡのような他のベクターの送達を可能にする。
【００６１】
用量
「用量」は本明細書で使用されるとき、単回投与にて提供される医薬剤の特定の量を意味する。特定の実施形態では、用量は２以上のボーラス、錠剤又は注射て投与され得る。たとえば、特定の実施形態では、皮下投与が所望である場合、所望の用量は単回注射によって容易に収容されない容積を必要とする。そのような実施形態では、２回以上の注射を用いて所望の用量を達成してもよい。特定の実施形態では、用量は、２回以上の注射で投与して個体における注射部位の反応をできるだけ抑えてもよい。
【００６２】
投与単位
「投与単位」は本明細書で使用されるとき、医薬剤が提供される形態を意味する。特定の実施形態では、投与単位は凍結乾燥したオリゴヌクレオチドを含有するバイアルである。特定の実施形態では、投与単位は再構成したオリゴヌクレオチドを含有するバイアルである。
【００６３】
供与体核酸
「供与体核酸」は、ＤＮＡ修復メカニズム、相同組換え（ＨＲ）、又は非相同末端結合（ＮＨＥＪ）のいずれかによって標的配列に全体的に又は部分的に挿入される又は組換えられる、生物又は容器に供給される任意の核酸としてここでは定義される。
【００６４】
持続時間
「持続時間」は本明細書で使用されるとき、活性又は事象が継続している間の時間を意味する。特定の実施形態では、治療の持続時間は、医薬剤又は医薬組成物の用量が投与される間の時間である。
【００６５】
発現ベクター
「発現ベクター」は本明細書で使用されるとき、宿主細胞における内在性のタンパク質（単数）又はタンパク質（複数）を人工的にコードするように設計された任意の核酸を意味する。発現ベクターの例は、プラスミドＤＮＡ、Ｔ−ＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ、レプリコン、自律的に複製するベクター、線形ｓｓＤＮＡ、線形ｄｓＤＮＡ、ｐｈｉポリメラーゼ産物、ＲＮＡ転写物、環状ＲＮＡを含み、本発明の一部の適用では、宿主細胞で移入されたゲノム及び細胞小器官のＤＮＡを含む。
【００６６】
断片
「断片」は、核酸又はポリペプチドの完全長ではない部分を指すように本明細書で使用される。従って、断片はそれぞれそれ自体、核酸又はポリペプチドである。
【００６７】
遺伝子
「遺伝子」は本明細書で使用されるとき、転写及び／又は翻訳の調節配列及び／又はコーディング領域及び／又は非翻訳領域（たとえば、イントロン、５’及び３’の非翻訳領域）を含む天然の（たとえば、ゲノムの）又は合成の遺伝子であり得る。遺伝子のコーディング領域は、アミノ酸又は、たとえば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡのような機能的なＲＮＡをコードするヌクレオチド配列であり得る。遺伝子は、任意でそれに連結された５’又は３’の非翻訳配列を含むコーディング領域（たとえば、エクソン及びｍｉＲＮＡ）に相当するｍＲＮＡ又はｃＤＮＡでもあり得る。遺伝子はまた、コーディング領域のすべて又は一部及び／又はそれに連結された５’又は３’の非翻訳配列を含む試験管内で作出された増幅された核酸分子でもあり得る。
【００６８】
遺伝子ターゲッティング
「遺伝子ターゲッティング」は、標的配列におけるヌクレオチドの欠失、挿入、変異及び置換を含む標的核酸配列への永続的な変化を誘導する遺伝的技法として本明細書で使用される。
【００６９】
ゲノム修飾
「ゲノム修飾」は、遺伝子ターゲッティング又は遺伝子の機能的修飾の結果としての生物のゲノム又は染色体又は染色体外ＤＮＡ又は細胞小器官ＤＮＡにて生成される修飾として本明細書で使用される。
【００７０】
宿主細胞
本明細書で使用される「宿主細胞」は、ベクターを含有し得る天然に存在する細胞又は形質転換された細胞であり得る。宿主細胞は、培養された細胞、外植体、生体内の細胞等であり得る。宿主細胞は、たとえば、大腸菌のような原核細胞、又はたとえば、植物、酵母、昆虫、両生類の細胞、又はＣＨＯ及びＨｅＬａのような哺乳類の細胞のような真核細胞であり得る。
一部の実施形態によれば、前記宿主細胞は生物、臓器、組織又はカルスにおける全体の又は部分的な、分化した又は未分化の細胞である。
【００７１】
同一性
「同一の」又は「同一性」は２以上の核酸又はポリペプチドの配列の文脈にて本明細書で使用されるとき、配列が特定された領域のわたって同一である特定された比率の残基を有することを意味する。比率は、２つの配列を最適に並べ、特定された領域にわたって２つの配列を比較し、双方の配列にて同一の残基が存在する位置の数を決定して一致した位置の数を得、特定された領域の位置の総数で一致した位置の数を割り、結果に１００を乗じて配列同一性の比率を得ることによって算出され得る。２つの配列の長さが異なる、又は配列比較が１以上の互い違いの末端を生じ、比較の特定された領域が１本のみの配列を含む場合、１本配列の残基は算出の分母には含まれるが、分子には含まれない。ＤＮＡとＲＮＡを比較する場合、チミジン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）は同等と見なされ得る。同一性は、手動で又はＢＬＡＳＴ若しくはＢＬＡＳＴ２．０のようなコンピュータ配列アルゴリズムを用いて実施され得る。
【００７２】
阻害する
「阻害する」は本明細書で使用されるとき、防ぐ、抑制する、抑える、軽減する又は排除する、を意味する。
【００７３】
試験管内で
「試験管内で」は、全体の又は部分的な、分化した又は未分化の生きている生物、臓器、組織、カルス又は細胞の膜の外側での人工的な環境として本明細書では定義される。一部の実施形態では、用語、試験管内で、は生存能力のある細胞の内側ではない。
【００７４】
生体内で
「生体内で」は、全体の又は部分的な、分化した又は未分化の生物、臓器、組織、カルス又は細胞の内側として本明細書では定義される。
【００７５】
キット
キットは本明細書で使用されるとき、以下：アッセイ試薬、緩衝液、プローブ及び／又はプライマー、及び無菌の生理食塩水又は別の薬学上許容可能なエマルジョン及び懸濁液の基剤のすべて又は一部と一緒に本明細書で記載される組成物を含み得る。加えて、キットは、本明細書で記載される方法を実践するための指示を含有する指示書（たとえば、プロトコール）を含み得る。
【００７６】
標識
「標識」は本明細書で使用されるとき、分光光度法、光化学、生化学、免疫化学、化学又は他の物理学の手段によって検出可能な組成物を意味する。たとえば、有用な標識には、３２Ｐ、蛍光色素、電子密度の高い試薬、酵素（たとえば、ＥＬＩＳＡで汎用されるような）、ビオチン、ジゴキシゲニン、又はハプテン及び検出可能であり得る他の実体が挙げられる。
標識は任意の位置で核酸又はタンパク質に取り込まれ得る。
【００７７】
ミスマッチ
「ミスマッチ」は第２の核酸の相当する位置でヌクレオ塩基対形成をすることが可能ではない第１の核酸のヌクレオ塩基を意味する。
【００７８】
修飾されたオリゴヌクレオチド
「修飾されたオリゴヌクレオチド」は本明細書で使用されるとき、天然に存在する末端、糖、ヌクレオ塩基及び／又はヌクレオシド間結合に対して１以上の修飾を有するオリゴヌクレオチドを意味する。
【００７９】
調節
「調節」は本明細書で使用されるとき、機能及び／又は活性及び／又は構造の搖動を意味する。特定の実施形態では、調節は遺伝子発現の上昇を意味する。特定の実施形態では、調節は遺伝子発現の低下を意味する。
【００８０】
変異体
「変異体」は本明細書で使用されるとき、配列の機能性の少なくとも一部が失われている、たとえば、プロモータ又はエンハンサの領域における配列への変化が生物におけるコーディング配列の発現に少なくとも部分的に影響する配列を指す。本明細書で使用されるとき、用語「変異」は、たとえば、欠失、付加、置換又は再構成を生じ得る核酸配列における配列の変化を指す。変異はまた、配列が関与する１以上の工程に影響を及ぼし得る。たとえば、ＤＮＡ配列における変化は、活性がある、部分的に活性がある又は不活性である変化したｍＲＮＡの合成を招き得る。
【００８１】
核酸
「核酸配列」又は「オリゴヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」は本明細書で使用されるとき、一緒に共有結合した少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。一本鎖の記載は相補鎖の配列も規定する。従って、核酸は記載された一本鎖の相補鎖も包含する。１つの核酸の多数の変異体が所与の核酸として同一目的に使用され得る。従って、核酸は実質的に同一の核酸及びその相補体も包含する。一本鎖はストリンジェントなハイブリッド形成条件下で標的配列とハイブリッド形成し得るプローブを提供する。従って、核酸はまた、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成するプローブも包含する。
核酸は一本鎖であっても又は二本鎖であってもよく、二本鎖配列及び一本鎖配列の双方の部分を含有してもよい。核酸は、ゲノムの及びｃＤＮＡ双方のＤＮＡ、ＲＮＡ又はハイブリッドであってもよく、その際、核酸は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの組み合わせ、及びウラシル、アデニン、チミジン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン及びイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含有し得る。核酸は化学合成法又は組換え法によって入手され得る。少なくとも１つの異なる結合、たとえば、ホスホルアミデート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、又はＯ−メチルホスホロアミダイト結合及びペプチド核酸骨格及び結合を有し得る核酸類似体が含まれ得るが、核酸は一般にホスホジエステル結合を含有するであろう。他の類似体核酸には、参照によって組み入れられる米国特許第５，２３５，０３３号及び同第５，０３４，５０６号に記載されたものを含む陽性の骨格：非イオン性骨格及び非リボース骨格を持つものが含まれる。１以上の天然に存在しない又は修飾されたヌクレオチドを含有する核酸も核酸の定義の１つに含まれ得る。修飾されたヌクレオチド類似体は、たとえば、核酸分子の５’末端及び／又は３’末端に位置し得る。ヌクレオチド類似体の代表的な例は、糖又は骨格が修飾されたリボヌクレオチドから選択され得る。しかしながら、ヌクレオ塩基が修飾されたリボヌクレオチド、すなわち、天然に存在するヌクレオ塩基の代わりに天然に存在しないヌクレオ塩基、たとえば、５位で修飾されたウリジン又はシチジン、たとえば、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ブロモウリジン；８位で修飾されたアデノシン及びグアノシン、たとえば、８−ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド、たとえば、７−デアザ−アデノシン；Ｏ−及びＮ−アルキル化ヌクレオチド、たとえば、Ｎ６−メチルアデノシンを含有するリボヌクレオチドも好適であることが留意されるべきである。２’−ＯＨ基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２又はＣＮから選択される基によって置き換えられてもよく、その際、ＲはＣ１〜Ｃ６のアルキル、アルケニル及びアルキニルであり、ハロはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩである。修飾されたヌクレオチドには、たとえば、ヒドロキシプロリノール結合を介してコレステロールと抱合されるヌクレオチドも含まれる。リボースリン酸骨格の修飾は、たとえば、生理的環境下でそのような分子の安定性及び半減期を高める、細胞膜を横切って拡散を高める、又はバイオチップ上のプローブとしてのような様々な理由で実施され得る。骨格の修飾は、たとえば、細胞の厳しいエンドサイトーシス環境における分解への耐性も高め得る。骨格の修飾は、たとえば、肝臓にて肝細胞による核酸のクリアランスも低減し得る。天然に存在する核酸と類似体の混合物が作製されてもよく、或いは、異なる核酸類似体の混合物及び天然に存在する核酸と類似体の混合物が作製されてもよい。
【００８２】
操作可能に連結される
本明細書で使用される「操作可能に連結される」は、遺伝子の発現が、空間的に接続されるプロモータの制御下にあることを意味する。プロモータはその制御下の遺伝子の５’（上流）又は３’（下流）に位置し得る。プロモータと遺伝子の間の距離は、プロモータとプロモータが由来する遺伝子におけるそれが制御する遺伝子との間の距離にほぼ等しい。当該技術で知られるように、この距離における変動はプロモータ機能を喪失することなく調整され得る。
【００８３】
プロモータ
「プロモータ」は本明細書で使用されるとき、細胞において核酸の発現を付与する、活性化する又は高めることが可能である合成の又は天然に由来する分子を意味し得る。プロモータは、１以上の特定の転写調節配列を含んでその発現をさらに高める及び／又はその空間的発現及び／又は一時的な発現を変えてもよい。プロモータはまた、転写の開始部位から数千塩基対ほど離れて位置することができる遠位のエンハンサ又はリプレッサ要素も含み得る。プロモータはウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、及び動物を含む供給源に由来し得る。プロモータは、発現が生じる細胞、組織又は臓器に関して、発現が生じる発生段階に関して、又は生理的ストレス、病原体、金属イオン若しくは誘導剤のような外部刺激に応答して構成的に又は差次的に遺伝子成分の発現を調節し得る。プロモータの代表的な例には、バクテリオファージＴ７プロモータ、バクテリオファージＴ３プロモータ、ＳＰ６プロモータ、ｌａｃオペレータプロモータ、ｔａｃプロモータ、ＳＶ４０後期プロモータ、ＳＶ４０前記プロモータ、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモータ、ＣＭＶ  ＩＥプロモータ、ＣａＭＶ３５Ｓプロモータ、ＮＯＳプロモータ、熱ショックプロモータ、ステロイド調節性プロモータ、金属調節性プロモータ、種子プロモータ、及び植物ユビキチンプロモータが挙げられる。
【００８４】
組換え宿主細胞
「組換え宿主細胞」は、組換えＤＮＡ法を用いて構築されたベクターで形質転換されている細胞を指す。
【００８５】
選抜可能なマーカー
本明細書で使用される「選抜可能なマーカー」は、遺伝子構築物で形質移入される又は形質転換されるものの特定及び／又は選抜を円滑にするようにそれが発現される宿主細胞、組織、臓器、カルス又は生物における表現型を付与する遺伝子を意味する。選抜マーカーの代表例には、アンピシリン耐性遺伝子（ＡｍｐＲ）、テトラサイクリン耐性遺伝子（ＴｃＲ）、細菌カナマイシン耐性遺伝子（ＫａｎＲ）、ゼオシン耐性遺伝子、抗生剤オーレオバシジンＡに耐性を付与するＡＵＲＩ−Ｃ遺伝子、ホスフィノトリシン耐性遺伝子、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｐｔＩＩ）、ハイグロマイシン耐性遺伝子、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子及びルシフェラーゼ遺伝子が挙げられる。本発明の一部の実施形態では、選抜マーカーは、内在性遺伝子の修飾から、たとえば、この遺伝子の変異がフレームシフト変異を生じ、抗体によって陰性選択される場合、細胞の表面に発現され、提示されるケモカイン受容体の消滅から、又はたとえば、耐性を生じる、除草剤クロロスルフロン及びイマザキンも耐性を生じるタバコアセト乳酸シンターゼ遺伝子におけるＷ５６８Ｌ変異から作出することができる。
【００８６】
ストリンジェントなハイブリッド形成条件
「ストリンジェントなハイブリッド形成条件」は本明細書で使用されるとき、たとえば、核酸の複合体混合物にて第１の核酸配列（たとえば、プローブ）が第２の核酸配列（たとえば、標的）とハイブリッド形成する条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列に依存性であり、異なる状況で異なる。ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度及びｐＨにて特定の配列の融点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低く選択され得る。Ｔｍは、標的に相補性のプローブの５０％が平衡で標的配列とハイブリッド形成する（Ｔｍでは標的配列が過剰に存在するので、プローブの５０％が平衡で占有される）温度（定義されたイオン強度、ｐＨ及び核酸濃度のもとでの）であり得る。ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３にて塩濃度が約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、たとえば、約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（又は他の塩）であり、温度が短いプローブ（たとえば、約１０〜５０ヌクレオチド）のためには少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（たとえば、５０以上のヌクレオチド）のためには少なくとも約６０℃であるものであり得る。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような脱安定化剤の添加によっても達成され得る。選択的な又は特異的なハイブリッド形成については、陽性のシグナルはバックグランドのハイブリッド形成の少なくとも２〜１０倍であり得る。例となるストリンジェントなハイブリッド形成条件には、以下：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ及び１％ＳＤＳにて４２℃でインキュベート；又は５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳにて６５℃でインキュベート、０．２×ＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳで６５℃にて洗浄、が挙げられる。
【００８７】
相補性
「相補性」は本明細書で使用されるとき、第１の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００以上のヌクレオチドの領域にわたる第２の配列の相補体と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％同一である、又は２つの配列がストリンジェントなハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成することを意味する。
【００８８】
実質的に同一の
「実質的に同一の」は本明細書で使用されるとき、第１及び第２の配列が８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００以上のヌクレオチド又はアミノ酸の領域にわたって、又は第１の配列が第２の配列の相補体に対して実質的に相補性であるならば、核酸に関して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％同一であることを意味する。
【００８９】
標的核酸
「標的核酸」又は「標的ヌクレオチド」は本明細書で使用されるとき、コーディング配列又は非コーディング配列、遺伝子、エクソン又はイントロン、調節配列、遺伝子間配列、合成配列及び細胞内寄生生物配列を含むが、これらに限定されない作用させられる所望の所定の核酸配列である。一部の実施形態では、標的核酸は標的の細胞、組織、臓器又は生物の中に存在する。標的核酸は、本明細書で開示される方法及び組成物によってある程度修飾される、標的配列の中にて１以上のヌクレオチドを含む標的部位を含む。たとえば、標的部位は１ヌクレオチドを含み得る。たとえば、標的部位は１〜３００のヌクレオチドを含み得る。たとえば、標的部位は１〜１００のヌクレオチドを含み得る。たとえば、標的部位は１〜５０のヌクレオチドを含み得る。たとえば、標的部位は１〜３５のヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、標的核酸は同一であってもよく又は異なっていてもよい１を超える標的部位を含み得る。
【００９０】
標的とされた遺伝子の機能的な修飾
「標的とされた遺伝子の機能的な修飾」又は「標的遺伝子の修飾」は、標的配列における１以上のヌクレオチドの欠失、挿入、変異、置換、ニッキング、メチル化、アセチル化、ライゲーション、組換え、螺旋の巻き戻し、化学修飾、標識、活性化、不活化、及び抑制を含むが、これらに限定されない標的核酸における永続的な又は一過性の変化を生じる遺伝的技法に向けられる。
【００９１】
治療法
「治療法」は本明細書で使用されるとき、疾患の治療方法を意味する。特定の実施形態では、治療法には、化学療法、外科的切除、移植、及び／又は化学塞栓が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９２】
トランスジェニック生物
該用語は、本明細書で開示される組成物及び方法によって導入される、そのゲノムにおける１以上の遺伝子修飾を有する生物に向けられる。たとえば、修飾は、１以上のヌクレオチドの挿入、変異、置換、ニッキング、メチル化、アセチル化、ライゲーション、組換え、螺旋の巻き戻し、化学修飾、標識、活性化、不活化、及び／又は抑制から選択される。生物は任意の種類の生物であり、たとえば、ヒト、動物、植物等であり得る。
【００９３】
一過性の発現
本明細書で使用される「一過性の発現」又は「一過性に発現する」は、全体の又は部分的な、分化した又は未分化の生物、臓器、組織、カルス又は細胞における提供された核酸からの転写又は翻訳を指してもよく、前記発現は、ゲノムの又は細胞小器官の核酸を含む生物、臓器、組織、カルス又は細胞の安定な核酸に提供された核酸が統合されていないために限定される。一過性の発現用のベクターは、提供された線形又は環状のｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ又はＲＮＡ、プラスミド、自律的に複製するベクター、ウイルス、試験管内の転写物、合成核酸及びその修飾された誘導体を含む。従って、一過性の発現は、その限定によって非遺伝的である一方で、細胞系列で連続して発現され、染色体又は細胞小器官の外側での核酸の複製のために細胞から細胞への自律的に移され得る。
【００９４】
治療する
状態からの対象の保護を指す場合、本明細書で使用される「治療する」又は「治療すること」は、状態を防ぐこと、抑制すること、抑えること又は排除することを意味する。状態を防ぐことには、状態の発症に先立って対象に本明細書で記載される組成物を投与することが関与する。状態を抑制することには、状態の誘導後、しかし、その臨床的出現の前に対象に組成物を投与することが関与する。状態を抑えることには、状態の臨床的出現の後、状態が軽減されるように又は悪化を防ぐように対象に組成物を投与することが関与する。状態の排除には、状態の臨床的出現の後、対象がもはや状態で苦しまないように対象に組成物を投与することが関与する。
【００９５】
変異体
「変異体」は核酸を参照して本明細書で使用されるとき、（ｉ）参照されたヌクレオチド配列の一部、（ｉｉ）参照されたヌクレオチド配列又はその一部の相補体、（ｉｉｉ）参照されたヌクレオチド配列又はその相補体と実質的に同一である核酸、又は（ｉｖ）参照された核酸、その相補体又はそれと実質的に同一の配列とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸を意味する。
【００９６】
ベクター
「ベクター」は本明細書で使用されるとき、核酸の送達を目的として使用される核酸配列を意味する。ベクターは、遺伝的形質転換、タンパク質の発現、ＲＮＡの転写をもたらすように、又は相同組換え若しくは非相同末端結合のための供与体として直接使用されるように本発明では使用され得る。ベクターは、プラスミドＤＮＡ、Ｔ−ＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ、レプリコン、自律的に複製するベクター、線形又は環状のｓｓＤＮＡ、線形又は環状のｄｓＤＮＡ、分岐ｐｈｉポリメラーゼ産物、核酸デンドリマー、ＲＮＡ転写物、環状ＲＮＡ、バクテリオファージ、細菌の人工染色体又は酵母の人工染色体であってもよく、及び本発明の一部の適用では、宿主細胞に形質移入されたゲノム及び細胞小器官のＤＮＡであってもよい。ベクターは、複製しない、自己複製する染色体外のベクター又は宿主ゲノムに統合するベクターのいずれかであり得る。
【００９７】
野生型
本明細書で使用されるとき、「野生型」配列は、その配列の天然の又は正常な機能を実施する配列の対立遺伝子形態であるコーディング配列、非コーディング配列又は接点部分の配列を指す。野生型配列には、同族配列の複数の対立遺伝子形態が含まれ、たとえば、野生型配列の複数の対立遺伝子は、コーディング配列がコードするタンパク質配列に対するサイレント変化又は保存的変化をコードし得る。
【００９８】
一部の実施形態によれば、標的核酸配列の存在下で生きている細胞、生物、組織、カルス、臓器又はその一部にて生体内で自己集合可能なタンパク質（ポリペプチド）部分と核酸部分を含むプログラム可能な分子複合体を含む組成物。
【００９９】
一部の実施形態によれば、種々のプログラムされた分子複合体を構築して、ゲノム、核、染色体、細胞質、細胞小器官又は染色体外の核酸で見られるもののような存在している又は目前に迫る原核細胞の、真核細胞の、合成の、細胞内寄生生物の又はウイルスの標的配列を永続的に又は一過性に修飾することができる。分子複合体の作用によって実施される標的の修飾は、遺伝性の及び非遺伝性の、永続的な及び一過性の遺伝的な変化／修飾を含む。一部の実施形態では、標的は変化するのに有利である当該遺伝形質に関与する核酸から構成される。標的とされた配列における変化には、たとえば、核酸の欠失、変異、挿入、及び別の核酸配列による標的とされた配列の置換、ノックアウト、フレームシフト、又は事象の調節鎖における遺伝子、その調節配列、当該遺伝子若しくはその調節配列を調節する遺伝子の転写若しくは翻訳の様式の変化が挙げられるが、これらに限定されない。標的核酸に対する永続的な変化には、たとえば、核酸の変異、欠失、挿入、置換及び組換えのような遺伝物質の編集又は配列の変化が挙げられる。標的配列に対する一過性の変化には、たとえば、標的核酸の結合、消化、ニッキング、螺旋の巻き戻し、活性化、不活化、化学的修飾、メチル化、アセチル化及び標識が挙げられる。標的の修飾には、たとえば、細胞にて転写の活性化、転写の不活化、ＲＮＡスプライシング、選択的ＲＮＡスプライシング、クロマチンの再構成、細胞内寄生生物の不活化における変化、及び標的核酸の細胞の局在化又は区画化における変化をもたらすことができる標的の機能的な修飾が挙げられる。
【０１００】
一部の実施形態によれば、且つ理論又はメカニズムに束縛されることを望まないで、プログラム可能な分子複合体の設計は、自己集合するその能力、標的核酸上の予め定義された意図する配列を標的とするその能力、及び所定の方法で標的配列に作用するその能力に基づく。複合体の成分は、（１）必要とされる特定の種類の分子作用、（２）標的、及び（３）生体内での発現に使用される所望の核酸送達法に好適であるようにモジュールであり、調整可能である。本開示の方法及び組成物は当該技術で既知の他の方式を超える幾つかの利点を有する。たとえば、複合体のタンパク質部分は、単量体としては不活性であり、所定の配列で標的核酸を結合する２つのＳＣＮＡオリゴヌクレオチドの限定された範囲内で正しい間隔だけが、それらが二量体化され、所望の所定の標的部位に特異的に作用するようにタンパク質部分のエフェクタードメインの配置を生じるであろう。タンパク質部分はそれ自体標的核酸に結合しないし、単量体として作用しないので、そのような設定は、それによってプログラムされた分子複合体の二量体（すなわち、標的核酸に結合するＳＣＮＡに連結されたタンパク質部分を含む複合体）だけが、潜在的なオフサイト又は非特異的な切断を減らす又は完全に排除する。
【０１０１】
一部の実施形態によれば、分子複合体の活性のある部分（機能性ドメイン）は、タンパク質部分の機能性ドメインの二量体化の際のみ活性化されるように設計される。プログラムされないタンパク質成分は、核酸配列及び標的部位に対して低い非特異的な親和性を有する又は特に非特異的な親和性を有さないように設計される。従って、修飾のすべての種類については、タンパク質部分の単一種類の単量体は、たとえば、ヌクレアーゼドメインが介在する点突然変異、又は代わりにメチラーゼドメインが介在する点メチル化のような点修飾の最少限の機能のために発現される必要がある一方で、標的部位に隣接する配列を結合するように設計されたＳＣＮＡが存在してタンパク質の正しい間隔に影響を及ぼし、互いにその結合及びその二量体化を可能にすべきである。これが複合体の配列特異性を有利に高める。一部の実施形態では、欠失及び置換の編集機能については、当該領域に隣接する２つの異なる部位は同時に切断される必要があり得る。そのような実施形態では、この場合でさえ、たった１つの外因性のタンパク質成分が４つのＳＣＮＡと共に発現されることが必要である。オリゴヌクレオチドが希釈又は分解によって激減する場合、プログラムされない発現されたタンパク質は標的核酸に親和性を有さず、作用を止めるであろう（すなわち、この場合、標的核酸を切断するのを止める）
【０１０２】
一部の実施形態によれば、タンパク質（ポリペプチド）部分は、別々のポリペプチドとして又は１つの連続するタンパク質（ポリペプチド）として発現され得る。一部の実施形態では、タンパク質部分（成分）は構造及び／又は機能（有用性）に従って特定可能である１以上の特定可能なドメインを有し得る。一部の実施形態では、構造ドメインの１つは、１を超える有用性ドメインを有してもよく、すなわち、分離可能な構造ドメインは幾つかの機能を有し得る。一部の実施形態によれば、タンパク質部分は、１以上の以下の構造及び／又は有用性のドメイン：（ａ）標的核酸と相互作用し、その結果標的核酸に影響を及ぼすことができる「エフェクタードメイン」（機能性ドメイン）；及び／又は（ｂ）直接的に又は間接的にＳＣＮＡを特異的に結合することができる「連結ドメイン」；及び／又は（ｃ）「細胞局在化ドメイン」及び／又は（ｄ）ドメイン間の接続要素又はスペーサー；及びそれらの組み合わせを有し得る。
【０１０３】
一部の実施形態によれば、「エフェクタードメイン」（本明細書では「機能性ドメイン」とも呼ぶ）は、分子複合体の集合の後、標的核酸と相互作用し、標的配列に対して意図された効果を発揮する。一部の例となる実施形態では、このドメインは核酸修飾活性を含む酵素機能又は触媒機能を有する。一部の施形態では、このドメインは、たとえば、ＤＮＡ結合タンパク質、ヌクレアーゼ、メチラーゼ、メチル化されたＤＮＡ結合因子、転写因子、クロマチンリモデリング因子、ポリメラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ギナーゼ及びヘリカーゼのような既知の機能のタンパク質の全部、又は一部又は修飾された部分に由来する活性のあるドメインに由来し得る。一部の実施形態では、機能性ドメインは、ＤＮＡ結合タンパク質、ヌクレアーゼ、メチラーゼ、メチル化されたＤＮＡ結合因子、転写因子、クロマチンリモデリング因子、ポリメラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ギナーゼ及びヘリカーゼを含む既知の機能のタンパク質の全部、又は一部又は修飾された部分に由来する活性のあるドメインのアミノ酸配列を融合することによって構築され得る。一部の実施形態では、ヌクレアーゼである又はヌクレアーゼに由来するエフェクタードメインについては、ヌクレアーゼのＤＮＡ結合認識ドメインは取り除かれ得る。たとえば、エフェクタードメインがＦｏｋＩヌクレアーゼに由来する場合、ＦｏｋＩ部位認識ドメイン及び結合ドメインはタンパク質部分のエフェクタードメインには存在しない。一部の実施形態では、エフェクタードメインは、特定の標的核酸結合部位を欠いている、すなわち、それは特定の標的配列を特異的に結合することができない。
【０１０４】
一部の実施形態によれば、「連結ドメイン」は、ＳＣＮＡ（及び特にＳＣＮＡ認識領域）を直接的に又は間接的に特異的に結合する／連結するように設計される。連結ドメインとＳＣＮＡの間の結合／連結は、直接的であることができ、又はたとえば、ＳＣＮＡ上の修飾を介して間接的であることができる。連結ドメインとＳＣＮＡの間の連結／結合／連結は、タンパク質部分とＳＣＮＡとの生体内の集合形成を可能にする。一部の実施形態では、連結ドメインは、特異性付与核酸におけるヌクレオチド配列又は化学的な若しくは生物学的な要素を特異的に結合するドメインを組み入れるアミノ酸にタンパク質部分のアミノ酸配列を融合することによって構築される。連結ドメインと特異性付与核酸との間の物理的相互作用は、１以上の以下の種類の相互作用：リガンド／受容体、リガンド／基質、水素結合、ファンデルワールス結合、生体内で形成される共有結合、イオン結合及び疎水性相互作用による親和性により得るが、これらに限定されない。非共有結合の例は、以下：結合対：ビオチン／アビジン；ビオチン／ストレプトアビジン；アビジンのビオチンが修飾した形態；タンパク質／タンパク質；タンパク質／核酸；リガンド／受容体；基質／リガンド；抗原／抗体；抗原／単鎖抗体；ハプテン／抗体又は単鎖抗体；ホルモン／ホルモン結合タンパク質；アゴニスト／受容体；；受容体アゴニスト／受容体；プロテインＡ／ＩｇＧ；酵素補因子／酵素；酵素阻害剤／酵素；一本鎖ＤＮＡ／ＶｉｒＥ２；ｄｓＤＮＡ／ＳｔｉｃｋｙＣ；ＲＮＡ／アルゴノートファミリータンパク質；ｄｓＲＮＡ／ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩファミリータンパク質；核酸／ウイルスコートタンパク質及びアグロバクテリウムＶｉｒ２又はその一部／Ｖｉｒ２結合タンパク質の１以上、又は断片又は部分又は修飾された形態を含み、それによって、特異性付与核酸及び連結ドメインのそれぞれが対メンバーの１つを含む。例となる実施形態では、連結ドメインは、特異性付与核酸の５’末端又は３’末端にリンカーを介して化学的に連結される色素フルオレセインを結合することが可能である単鎖抗体ｓｃＦｖを含有するので、プログラム可能な複合体のタンパク質部分と核酸部分の会合を可能にする。一部の実施形態では、連結ドメインは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのＰＵＦ５結合要素８回の三重螺旋反復に由来し、特異性付与核酸（ＳＣＮＡ）は、その末端の一方で又はそれに十分近傍で配列番号１（ＣＵＣＵＧＵＡＵＣＵＵＧＵ）に示されるようなＲＮＡ配列を含有する。この実施形態では、タンパク質とＳＣＮＡはＳＣＮＡでの化学修飾を必要としないで直接接合し、転写物として生体内でのその生合成を可能にするので、プログラム可能な複合体のタンパク質部分と核酸部分の生体内での会合を可能にする。一部の例となる実施形態では、ＳＣＮＡの内部に位置する、二次構造又は三次構造（たとえば、ヘアピンループ）を形成することが可能であるＲＮＡ配列／分子が、ウイルスＴＡＴタンパク質（たとえば、ＨＩＶ、ＢＩＶ等）に由来するＲＮＡモチーフ結合連結ドメインである、タンパク質部分の連結ドメインと相互作用する。一部の例となる実施形態では、バクテリオファージＰｈｉ２１に由来する２０量体のボックスＢ、ＲＮＡヘアピン結合配列がＳＣＮＡ上に位置し、ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）バクテリオファージＰｈｉ２１のＮタンパク質に由来する、タンパク質部分のその相方連結ドメインを結合する／連結することが可能である。生体内でＳＣＮＡの作出を可能にする別の例となる実施形態では、連結ドメインは、ＶＢＰ１、ＶＢＰ２及びＶＢＰ３を含む細菌で見られるＶｉｒＤ２結合タンパク質を含むアグロバクテリウムＶｉｒＤ２タンパク質及びＶｉｒＤを結合するように設計された単鎖抗体を結合するタンパク質に由来する。この実施形態では、ＳＣＮＡは、アグロバクテリウムにおけるＴ−ＤＮＡからのｓｓＤＮＡとして作出され、その際、それは共有結合に必要とされるＶｉｒＤ２のチロシン２９にその５’末端で共有結合し、それによって共有結合が生体内で生じる。触媒が細菌にて生じ、複合体がその後、細菌の分泌系を介して細菌から全体の又は部分的な植物、動物及びヒトの細胞、組織、カルス及び臓器を構成する真核細胞に運び出される。この実施形態では、連結ドメインにおけるＶｉｒＤ２結合ドメインは、ＳＣＮＡに連結されたＶｉｒＤ２タンパク質を結合するので、プログラム可能な複合体のタンパク質部分と核酸部分の会合を可能にする。この実施形態では、ＤＮＡの統合を減らし、非特異的なＤＮＡの統合を回避するのに役立つ、細菌で発現されるＶｉｒＤ２への修飾を設計することができた。標的生物にて生体内で形成される共有結合の例は、それぞれＳＣＮＡの認識領域にて及び連結ドメインにおいて、斜線記号によって対形成した以下の結合対の例：Ｔ−ＤＮＡ（ＧＴＴＴＡＣＣＣＧＣＣＡＡＴＡＴＡＴＣＣＴＧＴＣＡ）（配列番号）２／アグロバクテリウムＶｉｒＤ２；ピコナウイルスＲＮＡ／ＶＰｇ；ＤＮＡ／トポイソメラーゼ；ｓｓＤＮＡにおけるＰｈｉＸ１７４ファージ起源の配列／ＰｈｉＸ１７４ファージＡタンパク質又はＰｈｉＸＡ＊タンパク質等の１以上、又はその断片又は一部又は修飾された形態を含むが、これらに限定されない。そのような生体内のＳＣＮＡ／連結ドメインの結合の例となる一実施形態では、５’末端にて又はその近傍にてＲＢ配列を含有する合成のｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドは、それがタンパク質部分に遭遇する細胞に送達される。タンパク質はＲＢ配列を切断することが可能であるＶｉｒＤ２の一部を抱き、その後、その５’末端で配列ＴＣＡ、適当なスペーサー及び標的塩基対形成配列を含有するオリゴヌクレオチドの残りを結合するので、分子複合体を生体内で効率的にプログラムする。一部の実施形態では、連結ドメインは特定の標的核酸結合部位を欠いている、すなわち、それは特定の標的配列を特異的に結合することができない。
【０１０５】
一部の実施形態によれば、タンパク質部分又はプログラムされたタンパク質部分又は集合した複合体を生細胞における特定の細胞の又は細胞内の局在に位置付けることができる「細胞局在化ドメイン」は，任意でタンパク質部分の一部であり得る。細胞局在化ドメインは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）；ミトコンドリアリーダー配列（ＭＬＳ）；葉緑体リーダー配列；及び／又は核酸を含有する細胞小器官、細胞の細胞区画又は下位区分にタンパク質を輸送する又はもたらす又は局在化するように設計された任意の配列を含むドメインを組み入れるアミノ酸にタンパク質部分のアミノ酸を融合することによって構築され得る。一部の例となる実施形態では、生物は真核生物であり、細胞局在化ドメインは、タンパク質が核及びその中のゲノムＤＮＡにアクセスするのを可能にする核局在化ドメイン（ＮＬＳ）を含む。前記ＮＬＳの配列は、たとえば、ＳＶ４０ＮＬＳ配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３）を含む正に荷電した機能的なＮＬＳ配列を含み得る。別の例となる実施形態では、このドメインは、タンパク質部分又はプログラムされたヌクレオタンパク質の細胞小器官への侵入を可能にする、複合体による細胞小器官ＤＮＡの所望の修飾を可能にするリーダー配列から構成される。別の例となる実施形態では、酵母のミトコンドリアＣｏｘ４ｐ（ＭＬＳＬＲＱＳＩＲＦＦＫＰＡＴＲＴＬＣＳＳＲＹＬＬ（配列番号４）に由来する配列又はヒトのリンゴ酸脱水素酵素ミトコンドリアリーダー配列（ＭＬＳ）（ＭＬＳＡＬＡＲＰＡＳＡＡＬＲＲＳＦＳＴＳＡＱＮＮＡＫＶＡＶＬＧＡＳ（配列番号５」）に由来する又はシロイヌナズナのリポ酸シンターゼ（配列番号６（ＭＨＳＲＳＡＬＬＹＲＦＬＲＰＡＳＲＣＦＳＳＳＳ）として本明細書で指名されるＮＣＢＩ  Ｒｅｆ．Ｓｅｑ．ＩＤ：  ＮＰ＿１７９６８２．１）に由来する配列を用いて、複合体をミトコンドリアマトリクスに局在させ、ミトコンドリアＤＮＡを修飾し得る。この適用の用途の１つは、種々の真核生物における母性遺伝性のミトコンドリアＤＮＡの欠陥、たとえば、ヒトにおける慢性進行性の外眼筋麻痺症候群の治癒が挙げられ得る。別の例は、ハイブリッド植物生産で使用される植物における雄性不稔をもたらす誘導性欠損である。一実施形態では、ミトコンドリアの標的は、ＡＴＰアーゼであり、ペチュニアにおけるｐｃｆ遺伝子座の機能を再構成する。
【０１０６】
さらなる実施形態によれば、分子アダプタ又はヒンジとして役立つことによって複合体の所望の機能を可能にするように設計された任意の種々のドメイン間の接続要素又はスペーサー。多数のそのような接続要素が当業者によって予測される。接続要素の選択は、機能性ドメインの活性のある部位の範囲にて標的核酸の範囲に影響を及ぼすことによってプログラムされた分子複合体の特異性に影響を及ぼし得る。例となる実施形態では、連結ドメインのＣ’及び機能性ドメインのＮ’は約１５Åにまたがってアミノ酸ＧＧＳＧＧ（配列番号７）によって柔軟に接続される。別の実施形態では、約１６Åにまたがるアミノ酸ＮＩＨＨＶＴＷＨＭＤＦＰ（配列番号８）との強固なα螺旋リンカーが使用される。別の実施形態では、約１６.８８Åにまたがるアミノ酸ＰＮＳＬＩＶＰ（配列番号９）との強固な螺旋リンカーが使用される。別の実施形態では、約１５．５５Åにまたがるアミノ酸ＴＧＬＤＳＰ（配列番号１０）との不規則なコイル状リンカーが使用される。制限酵素部位によってコードされた余分なアミノ酸がドメイン間接続要素にて付加されてタンパク質モジュールを向上させるのを円滑にし得る。（たとえば、ＧＳＬＥ（配列番号１１）をコードするＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ）
【０１０７】
一部の実施形態によれば、本明細書では、「特異性付与核酸」（ＳＣＮＡ）又は「プログラミング核酸」と呼ばれる分子複合体の核酸部分は１以上の部分（領域）及び機能を含む。部分（領域）の１つは作用される標的領域を規定し、特異性規定配列を含有する。ＳＣＮＡにおける特異性規定配列は、塩基対形成によって標的核酸に対するその特異性を規定する。この対形成は、たとえば、完全な又は部分的な二重螺旋、完全な又は部分的な三重螺旋、Ｄ−ループ及び分岐した形態を形成し得るが、これらに限定されず、水素結合又はフーグスティーン水素結合又はそれらの組み合わせの結果であり得る。一部の実施形態では、特異性規定配列は標的部位の近傍である又はそれに隣接する領域で標的核酸と相互作用することが可能である。一部の実施形態では、ＳＣＮＡの特異性規定配列は標的部位と結合／相互作用しない。一部の実施形態では、特異性規定配列は任意の数のヌクレオチドを含み得る。たとえば、特異性規定配列は約３〜２００ヌクレオチドの長さであり得る。たとえば、特異性規定配列は約１０〜１００ヌクレオチドの長さであり得る。たとえば、特異性規定配列は約１５〜５０ヌクレオチドの長さであり得る。たとえば、特異性規定配列は約１８ヌクレオチドを超える長さであり得る。
【０１０８】
一部の実施形態によれば、ＳＣＮＡの第２の部分はタンパク質部分の連結ドメインを特異的に結合する／連結する／認識することができる認識領域（部分）である。一部の実施形態では、この認識領域は、修飾又は連結ドメイン認識配列（本明細書ではＳＣＮＡヌクレオチドモチーフ又はＳＣＮＡ連結ドメイン結合ヌクレオチド配列とも呼ばれる）であり得る及び／又はそれを含み得る。認識領域は不可欠な部分であってもよく、又は特異性規定配列に連結されてもよく（たとえば、共有結合で）、又は上記で詳述されたように、タンパク質部分の連結ドメインへのＳＣＮＡの結合を可能にする配列又は修飾から構成されてもよい。
【０１０９】
一部の実施形態では、ＳＣＮＡは、以下の種類：一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、修飾されたＤＮＡ、修飾されたＲＮＡ、ロックド核酸（ＬＮＡ）及びペプチド核酸（ＰＮＡ）又は上記の組み合わせの分子から構成されるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ＳＣＮＡはさらに、安定性を高める、標的に対する特異性を高める、核酸に対する親和性を修飾する、及び／又は複合体の連結ドメインへの結合を可能にする１又は複数の修飾を含み得る。修飾は、５’末端にて、３’末端にて、スペーサーとして、及び／又はＳＣＮＡ上にて内部的に位置づけられ得る。例となる修飾には、ヌクレオチド、ビオチン、フルオレセイン、アミンリンカー、オリゴペプチド、アミノアリル、色素分子、蛍光色素分子、ジゴキシゲニン、アクリダイト、アデニル化、アジド、ＮＨＳ−エステル、コレステリルＴＥＧ、アルキン、アルキン、光切断性のビオチン、チオール、ジチオール、修飾された塩基、リン酸塩、２−アミノプリン、トリマー−２０、２,６−ジアミノプリン、５−ブロモ−デオキシウリジン、デオキシウリジン、逆位ｄＴ、ジデオキシヌクレオチド、５−メチルデオキシシチジン、デオキシイノシン、５−ニトロインドール、２−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基、イソ-ｄＣ、イソ−ｄＧ、フッ素修飾塩基、ホスホロチオエート結合及びアグロバクテリウムのＶｉｒＤ２タンパク質及び前記ＶｉｒＤ２の一部及びＶｉｒＤ２の修飾が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１０】
一部の実施形態によれば、ＳＣＮＡはさらに、連結ドメインと標的核酸を接合するのに必要な分子距離及び自由度を最適化するのに使用され得る任意のスペーサー配列を含み得る。一部の実施形態では、スペーサー配列は、約０〜１００ヌクレオチドの長さであり得る。たとえば、スペーサーは約０〜６ヌクレオチドの長さであり得る。
【０１１１】
一部の実施形態によれば、ＳＣＮＡは、化学的に及び／又は生物学的に、試験管内で及び生体内で作製されてもよく、修飾は、予め合成されてもよく、又は合成後、付加されてもよい。一部の例となる実施形態では、ＳＣＮＡは化学的に合成され、Ｃ６−フルオレセイン色素分子の連結によってその末端の一方で修飾されるホスホロチオエート修飾されたｓｓＤＮＡから構成される。このＳＣＮＡは、その結果として細胞に送達され（たとえば、粒子衝撃、ポリエチレングリコール形質移入、リポソーム、ウイルス粒子、炭化ケイ素、ウイスカー及び／又はエレクトロポレーションによって）、その際、それは、色素フルオレセインを結合することが可能である単鎖抗体ｓｃＦｖを含む連結ドメインを含む分子複合体のタンパク質成分に遭遇するので、分子複合体をプログラムし、複合体を意図される標的ヌクレオチド配列に送達する／向ける。一部の実施形態によれば、ＳＣＮＡは標的部位と結合／相互作用しない。
【０１１２】
一部の実施形態に従って、プログラム可能な分子複合体の要素／成分を示す模式図（正確な縮尺ではない）である図１Ａ〜Ｂを今や参照する。図１Ａ〜Ｂの模式図（正確な縮尺ではない）は、単量体としてのプログラム可能なタンパク質部分の分子と、特異性付与核酸（ＳＣＮＡ）の２つの分子を示す。図１Ａ〜Ｂに示すように、タンパク質部分は、それぞれ分子複合体におけるその役割によって定義される幾つかの構造的／機能的なドメイン：連結ドメイン（ＬＤ）、機能性又はエフェクタードメイン（ＦＤ）；任意の細胞局在化ドメイン（ＣＬＤ）及び任意のドメイン間接続要素（ＩＤＣ）に配置されるポリペプチド（アミノ酸の鎖）である。連結ドメインの機能はＳＣＮＡを結合することである。エフェクタードメインの機能は、標的核酸と相互作用し、標的部位を構造的に修飾し、及び／又はその機能及び／又は標的核酸全体の機能を修飾することである。任意の細胞局在化ドメインの機能は、タンパク質複合体を標的核酸と同一の細胞区画又は細胞内区画に局在させることである。任意のドメイン間接続要素の機能は、複合体の適切な機能のためにドメイン間の最適な分子距離及び自由度を可能にすることである。ＳＣＮＡは、核酸鎖又は修飾された核酸鎖（櫛形状）から構成され、タンパク質部分又は配列（図１Ｂに示されるＳＣＮＡヌクレオチドモチーフ又は連結ドメイン認識配列又は断片と呼ばれる、矢印は櫛を示した）を結合するための、好ましくは末端の一方で（図１にて黒色の楕円形として示される）、タンパク質部分の連結ドメインを結合することができる修飾を含む。図１Ａ〜Ｂにて提示される非限定例では、ＳＣＮＡの特異性決定部分は一本鎖である。一部の実施形態では、ＳＣＮＡは二本鎖の断片／領域を形成し得る（たとえば、ヘアピンループの形成のような自己アニーリングによって）。所定の標的核酸配列に対するＳＣＮＡの特異性は、たとえば、３〜２００ヌクレオチドのようなヌクレオチドの数及びその範囲を含み得る可変配列とも呼ばれる、核酸又は修飾された核酸の塩基対形成（標的核酸の塩基対形成、櫛形状）のストレッチを介して達成される。たとえば、長さは１０〜１００ヌクレオチドであり得る。たとえば、長さは少なくとも１８ヌクレオチドであり得る。任意のスペーサー配列（スペーサー配列、櫛形状）は、連結ドメインと標的核酸を接合するのに必要な分子距離及び自由度を最適化するために存在し得る。一部の実施形態では、スペーサー配列は約０〜１００ヌクレオチドの長さであり得る。たとえば、スペーサーは約０〜６ヌクレオチドの長さであり得る。ＳＣＮＡ連結ドメインへの結合及び二量体化及びその結果の標的核酸への同時局在化の際に生じるタンパク質部分の機能性ドメインの作用又は効果は稲光記号（「作用／効果」）として表す。
【０１１３】
一部の実施形態に従ってプログラム可能な分子複合体の集合を示す模式図である図２Ａ〜Ｂを今や参照する。図２Ａ〜Ｂの模式図（正確な縮尺ではない）は、標的核酸上でのプログラム可能な分子複合体の成分の集合の様式を明らかにする。図２Ａ〜Ｂで示す例では、２つのタンパク質単量体が２つの異なるＳＣＮＡを結合し、それぞれがその可変配列領域にて異なる特異性決定基を有する。これらのＳＣＮＡは、標的核酸（「標的核酸」として図で印す）上の所定の相同配列と塩基対形成し、結合する。この塩基対形成は、標的が二本鎖か、又は一本鎖か（これらの図ではｄｓＤＮＡとして説明する）によって標的核酸との二重螺旋又は三重螺旋を形成する。双方のＳＣＮＡは、最適化された距離で必要に応じて同じ鎖又は対向する鎖のいずれかを結合する。ＳＣＮＡは、その末端における修飾を介して（図２Ａ）又はＳＣＮＡヌクレオチドモチーフ介して（図２Ｂ）タンパク質連結ドメインを結合することができる。集合の際、機能性ドメインは標的核酸上にて所定の標的部位（「標的部位」として印す）へのその効果を引き起こす。
【０１１４】
一部の実施形態に従って、予め定義した核ｄｓＤＮＡの標的配列の切断のために設計された分子複合体の３Ｄモデル化の例を示す図３を今や参照する。プログラムされ、二量体化されたタンパク質部分がその標的ｄｓＤＮＡとの関連で示される（部分的に示されるＡ）。タンパク質の各単量体は、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットに由来する機能性ドメイン（Ｂ）；ＳＶ４０ＮＬＳに由来する細胞局在化ドメイン（Ｃ）；抗フルオレセイン単鎖可変断片抗体に由来する連結ドメイン（抗ＦＡＭｓｃＦｖ、Ｄ）；及びドメイン間接続要素（Ｅ）から構成される。各連結ドメイン（Ｄ）は、各ＳＣＮＡの末端に共有結合する修飾因子、６−カルボキシフルオレセイン分子（Ｇ）を介して特異性付与核酸、ＳＣＮＡｓｓＤＮＡ（部分的に示されるＦ）に結合することが示される。標的ｄｓＤＮＡ（螺旋骨格におけるボールとして示す）の予想される切断部位（標的部位）は、矢印３００Ａ〜Ｂで示す。各ＳＣＮＡは、ｄｓＤＮＡ標的に隣接する配列の主要な溝を占有する部分的な三重螺旋を形成するようにここでは描かれる。
【０１１５】
一部の実施形態に従って、標的核酸上のプログラム可能な分子複合体の成分の集合の例となる様式の模式図（正確な縮尺ではない）である図４Ａ〜Ｂを今や参照する。図４Ａ〜Ｂに提示される非限定例で示すように、タンパク質部分の２つの単量体が２つの異なるＳＣＮＡ（ＳＣＮＡ１、ＳＣＮＡ２）を結合し、それぞれ可変配列領域で異なる特異性決定基を有する。図に示すように、ＳＣＮＡは双方とも単一の核酸上にあり、ここでは「ＳＣＮＡ接続要素」と呼ばれる、標的とは塩基対形成しない未決定の配列又は長さの配列に接続される。ＳＣＮＡ接続要素には任意の長さ（Ｘ（ｎ））でのヌクレオチドの配列が含まれる。一部の実施形態では、Ｘ（ｎ）は、２つの特異性付与領域を互いに接続するＲＮＡヌクレオチドの未決定の長さを意味する。一部の実施形態では、線形ＤＮＡについては、予想される最適な長さ（ｎ）はたとえば、およそ、１０〜１００ヌクレオチドの間である。たとえば、長さはおよそ３５〜７３ヌクレオチド（ｎｔｓ）である。たとえば、長さはおよそ７０ヌクレオチドを超える。たとえば、長さはおよそ３５ヌクレオチドより短い。これらのＳＣＮＡは、標的核酸上の予め定義した相同の（相当する）配列と塩基対形成し、結合する。この塩基対形成は、標的が二本鎖か、又は一本鎖かによって標的核酸と二重螺旋又は三重螺旋を形成することができる（図４Ａ〜Ｂにて説明される例、ｄｓＤＮＡ）。一部の実施形態では、ＳＣＮＡ双方が、所望の結果を達成するように最適化された距離にて必要に応じて標的核酸の同一鎖又は対向鎖のいずれかを結合することができる。一部の実施形態では、標的部位の両端を隣接させることによって、標的部位を標的とするには、たった１つの二重接続ＳＣＮＡを含有する核酸が必要とされる。一部の実施形態では、ＳＣＮＡは、双方のＳＣＮＡのＳＣＮＡヌクレオチドモチーフ（連結ドメイン結合部位にて示される櫛、図４Ａ）を介して、又は両端の修飾（連結ドメイン結合部位における黒色の楕円、図４Ｂ）を介してタンパク質部分の連結ドメインの結合部位（連結ドメインにおける刻み目）を結合することができる。集合に際して、機能性ドメインは標的核酸上にて標的部位へのその効果を引き起こし得る。
【０１１６】
一部の実施形態によれば、生物又は細胞にＳＣＮＡを送達する方法は、当業者に既知の多数の方法を含み、一般に、関連する状況で使用される生物又は細胞の種類に最適なものである。これらには、分解されたウイルス又は部分的なウイルス、接種、アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ送達、育種、交配、移植、細胞小器官の移動、染色体の移動、細胞融合の使用；形質移入剤、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム、人工脂質、デンドリマー、ポリマー（ＰＥＧ等）、タンパク質／ペプチド、ウイルス様粒子を用いた化学物質が介在する取り込み法；衝撃、注入／微量注入、圧力、ウイスカーの機械的な方法；及びエレクトロポレーションの電気的方法を含む、自律的に複製するベクター、トランスジェニックウイルスの感染又は形質導入用いた感染の生物学的な方法による核酸の送達を挙げることができ、細胞の原形質膜を変化させる方法はいずれも核酸が能動的に又は受動的に核に侵入するのを可能にする。
【０１１７】
一部の実施形態によれば、タンパク質モジュールをコードする核酸を生物又は細胞に送達する方法は、当業者に既知の多数の方法を含み、一般に、関連する状況で使用される生物又は細胞の種類に最適なものである。これらには、遺伝子を運ぶトランスジェニック生物と生物を交配すること若しくは育種することによる、又は分解されたウイルス又は部分的なウイルス、接種、アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ送達、移植、細胞小器官の移動、染色体の移動、細胞融合の使用；形質移入剤、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム、人工脂質、デンドリマー、ポリマー（ＰＥＧ等）、タンパク質／ペプチド、ウイルス様粒子を用いた化学物質が介在する取り込み法；衝撃、注入／微量注入、圧力、ウイスカーの機械的な方法；及びエレクトロポレーションの電気的方法を含む、自律的に複製するベクター、トランスジェニックウイルスの感染又は形質導入用いた感染の生物学的な方法による核酸の送達を挙げることができ、細胞の原形質膜を変化させる方法はいずれも核酸が能動的に又は受動的に核に侵入するのを可能にする。
【０１１８】
一部の実施形態によれば、遺伝子挿入又は遺伝子置換を含むそのようなＤＮＡを必要とする用途の亜群にて「供与体ＤＮＡ」を送達する方法は、タンパク質モジュールをコードする核酸の送達について記載されたものに類似する方法を含む。このＤＮＡは、一本鎖、二本鎖又は部分的に二本鎖、線形又は環状であることができる。このＤＮＡは、分子複合体のタンパク質成分をコードする核酸から及び特異性決定プログラミング核酸から同時に又は別々に単一のベクター又は幾つかのベクターで供給することができる。従って、核酸は、適当な前述の送達方法から選択することによって、植物又は植物の一部に、たとえば、胚、花粉、卵子、葯、花全体、子葉、葉、根、幹、葉柄のような植物の組織又は器官に、たとえば、プロトプラストのような単離された植物細胞に、又は分化した又は未分化の培養した植物の組織、細胞又はカルスに送達することができる。一部の実施形態では、核酸は、単細胞及び多細胞の真菌を含む真菌に、及び無脊椎動物（たとえば、節足動物及び線虫）、脊椎動物（たとえば、鳥類、魚類、哺乳類、爬虫類及び両生類）を含む動物界のメンバーに、及び臓器、培養した臓器、組織、培養した組織、単離した細胞、細胞培養物、細胞株、及びヒト胚性幹細胞又はヒト造血幹細胞のような幹細胞を含むこれらの生物の一部に送達することができる。
【０１１９】
一部の実施形態に従って、試験管内で作出したＳＣＮＡを用いたプログラム可能な分子複合体の細胞への送達選択肢を明らかにする模式図を示す図５を今や参照する。適当な送達法を選択するための一般的な図が示される。タンパク質部分をコードする核酸分子が左側の欄から選択され、次の２つの欄から選択される適当な方法を用いて送達される。合成のＳＣＮＡは２つの右の欄に示されるものから選択される方法を介して供給される。標的細胞の中で、タンパク質をコードする核酸が、鋳型ＲＭＡ分子からの生体内での翻訳によってタンパク質を発現する。送達された核酸分子がｄｓＤＮＡで構成されるのであれば、それは先ず、（指定されたプロモータを介して）ＲＮＡに転写し得る。送達された核酸分子がｓｓＤＮＡで構成されるのであれば、それは先ず、ｄｓＤＮＡに補完され、次いで転写され得る。送達された核酸分子が、ウイルス又は自律的に複製する別のベクターをコードするもののようなＲＮＡで構成されるのであれば、それは翻訳される前に、マイナス鎖を介して複製に進む。翻訳されたタンパク質は次いで、その局在化シグナル（存在すれば）に従って、所望の細胞内区画に局在することができる。ＳＣＮＡは、同一の又は異なる送達方法によって、タンパク質部分をコードする核酸分子から同時に又は別々に送達され得る。ＳＣＮＡ、タンパク質部分及び標的核酸が細胞の中でいったん、同時に局在すると、それらは集合して活性のある二量体の複合体を形成し得る。供与体ＤＮＡも必要に応じて別々に又は同時に送達され得る。
【０１２０】
一部の実施形態に従って、生体内で作出したＳＣＮＡを用いたプログラム可能な分子複合体の細胞への送達を明らかにする一般的な図である図６を今や参照する。タンパク質部分をコードする核酸分子が左側の欄から選択され、次の３つの欄から選択される適当な方法を用いて送達される。生体内で作出されるＳＣＮＡはその目的のために提供される核酸にコードされ、これらの同一の方法を用いて細胞に導入される。タンパク質部分をコードする核酸分子及び／又はＳＣＮＡは別々に又は同時に送達される。細胞では、ＳＣＮＡをコードする核酸が転写又は核酸の切断によってＳＣＮＡを発現する。送達された核酸分子がｓｓＤＮＡで構成されるのであれば、それは先ず、指定されたプロモータを介してＲＮＡに転写され得る。送達された核酸分子がｓｓＤＮＡで構成されるのであれば、それは先ず、ｄｓＤＮＡに補完され、次いで転写され得る。送達された核酸分子が、ウイルス又は自律的に複製する別のベクターをコードするもののようなＲＮＡで構成されるのであれば、それは翻訳される前に、マイナス鎖を介して複製に進む。細胞の中では、タンパク質をコードする核酸は、ＳＣＮＡについて記載されるものに類似して作出されるＲＮＡ分子からの生体内の翻訳を介して発現される。翻訳されたタンパク質は次いで、その局在化シグナル（存在すれば）に従って、所望の細胞内区画に局在することができる。タンパク質部分をコードする核酸分子及び／又はＳＣＮＡをコードする核酸分子は、同一の又は異なる送達方法によって同時に（同じ時に）又は別々に送達され得る。ＳＣＮＡ、タンパク質部分及び標的核酸が細胞の中でいったん、同時に局在すると、それらは集合して活性のある分子二量体の複合体を形成し得る。供与体ＤＮＡも必要に応じて別々に又は同時に送達され得る。
【０１２１】
一部の実施形態によれば、ＳＣＮＡの生体内での生物合成は、以下の（ａ）〜（ｃ）のような、しかし、これらに限定されない幾つかの経路によって実施されてもよい：（ａ）核酸及び連結ドメイン結合部分、この例ではＶｉｒＤ２の双方を合成するための、その共有結合も触媒するアグロバクテリウムの使用。次いでアグロバクテリウムはＶｉｒＤ２に共有結合したｓｓＤＮＡの細胞への移動を円滑にする；（ｂ）Ｔ−ＤＮＡを細胞に移すためのアグロバクテリウムの使用。前記Ｔ−ＤＮＡは、その収束の際、複合体の連結ドメインを結合するＲＮＡドメインを有するＲＮＡのＳＣＮＡの細胞での合成を駆動するプロモータを含むので、標的細胞にて発現される複合体はＲＮＡ／タンパク質の相互作用を介して集合する；（ｃ）ウイルス及びウイルスに基づく発現ベクターを含んで細胞にレプリコンを送達する自律的に複製するベクターの使用。前記レプリコンは、その収束の際、複合体の連結ドメインを結合するＲＮＡドメインを有するＲＮＡのＳＣＮＡの合成を駆動するサブゲノムのプロモータを含む。従って、標的細胞にて発現される複合体はＲＮＡ／タンパク質の相互作用を介して集合する
【０１２２】
アグロバクテリウムにて作出された一本鎖ＤＮＡを用いた細胞へのＳＣＮＡの送達の非限定例を示す模式図（正確な縮尺ではない）である図７Ａ〜Ｂを今や参照する。図７Ａで示されるのは、生体内でその５末端にてタンパク質ＶｉｒＤ２に結合されたｓｓＤＮＡのＳＣＮＡを作出するためのアグロバクテリウムの使用の非限定例である。この例で示されるように、標的とする様々なＳＣＮＡ配列がアグロバクテリウムにて複製することが可能であるプラスミドの多重クローニング部位（ＭＣＳ）に挿入される。次いでこのプラスミドでアグロバクテリウムを形質転換する。プラスミド上のＴｉプラスミドＲｉｇｈｔＢｏｒｄｅｒ（ＲＢ）配列を切断し、細菌のＶｉｒＤ２によってｓｓＤＮＡを結合する。ＲＢ配列の３つのヌクレオチドは切断後の配列の５’で残し、ＴｉプラスミドＬｅｆｔＢｏｒｄｅｒ（ＬＢ）配列の２１ヌクレオチドは配列の３’にて切断後残す。ＬＢ配列はさらにＳＣＮＡの安定化及び望ましくない統合の事象のスクリーニングに役立つ。アグロバクテリウムの変異した形態（たとえば、ＶｉｒＥ１又はＶｉｒＥ２を失くしているもの又は部分的なＶｉｒＤ２の官能性持つもの）は、望ましくない統合の事象の阻害に有用である。次いでアグロバクテリウムは、ＶｉｒＤ２に結合したＳＣＮＡを含むＴ−ＤＮＡを細胞に運び出す。図７Ｂで示されるのは、宿主細胞にＳＣＮＡを送達する細菌の分泌系の使用の非限定例である。異なるＳＣＮＡ配列をコードする異なるＴ−ＤＮＡによって形質転換された１又は複数のアグロバクテリウムが細胞１つを感染させるのに使用される。細菌にてこうして創られ、宿主細胞に運び出された、ＶｉｒＤ２に結合したｓｓＤＮＡのＳＣＮＡは次いで宿主細胞における連結ドメインでのＶｉｒＤ２タンパク質とＶｉｒＤ２結合ドメインの間の相互作用を介してタンパク質部分の連結ドメインに遭遇し、それを結合することができる。そのようなＶｉｒＤ２結合連結ドメインの例は、ＶｉｒＤ２に対して産生される抗体の人工的な単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。従ってＳＣＮＡは、標的核酸上で分子複合体の集合をもたらすことができる。
【０１２３】
アグロバクテリウムが送達するＴ−ＤＮＡから（図８Ａ）又はウイルスのような自律的に複製するベクターによって送達される核酸から（図８Ｂ）宿主細胞の中で作出されるＲＮＡのＳＣＮＡを用いた細胞へのＳＣＮＡの送達を明らかにする模式図である図８Ａ〜Ｂを今や参照する。これらの図で提示されるＲＮＡのＳＣＮＡには、タンパク質部分の連結ドメインの相当するＲＮＡ結合モチーフを結合することができるＳＣＮＡ／ＲＮＡモチーフ（印を付けた櫛）が含まれる。図８Ａで示されるように、ＳＣＮＡ配列は、アグロバクテリウムで複製することが可能であり、感染させた細胞での１又は複数のＲＮＡのＳＣＮＡの転写のための真核細胞の適当なプロモータを含有するプラスミドにおける多重クローニング部位に挿入される。図８Ｂ：ＳＣＮＡ配列は、それぞれ、感染させた細胞での１又は複数のＲＮＡのＳＣＮＡの転写のためのサブゲノム（ｓｇ）のプロモータの制御下でウイルス又はウイルスに由来する自律的に複製するベクターのゲノムに挿入される。図８Ａ〜Ｂで示される非限定例では、タンパク質部分のコーディングをコードする核酸分子は、ＳＣＮＡをコードする核酸分子の送達の前に、一緒に（同時に）、又はその後で標的細胞に送達され得る。細胞においてタンパク質部分とＳＣＮＡが発現されると、標的核酸上での分子複合体の集合が生じる。
【０１２４】
一部の実施形態に従って、単一送達事象にてプログラム可能な分子複合体の集合に必要な成分を含む組成物の感受性標的真核細胞への同時送達のための送達ベクター又はベクターの非限定例の模式図（正確な縮尺ではない）を示す図９を今や参照する。図９で示される非限定例については、所望の作用は、所定の配列「供与体カセット」によるゲノムＤＮＡのストレッチ（標的核酸）の置換である。従って、タンパク質部分のドメインには、ヌクレアーゼに由来し、核酸切断活性を有する機能性ドメイン；核局在化シグナル（ＮＬＳ）である細胞局在化ドメイン；及びＳＣＮＡにおけるＲＮＡモチーフを認識し、結合することが可能である連結ドメインが含まれる。図９に示す例では、生物送達系が使用される。アグロバクテリウムは、種々の機能的／構造的な配列、たとえば、細菌性の選抜可能なマーカー、種々の複製開始点（大腸菌−ｏｒｉ、ｐＳａ  Ｏｒｉ）、ＬＢ配列、プロモータ領域（（Ｐ）と名付けられる）、タンパク質部分を発現する配列（ＡＴＧ開始コドン及びインフレームの停止コドン）、ターミネータ部位（Ｔ）、多重ＳＣＮＡ転写カセット（それぞれプロモータ及びターミネータの配列含む４つのＳＣＮＡ転写カセットとして示される）、供与体カセット、及びＲＢ部位を含有するプラスミド（８００）のようなプラスミドベクターで形質転換される。次いで、プラスミドベクターを標的生物の細胞と接触させる。次いでアグロバクテリウムは、右境界（ＲＢ）と左境界（ＬＢ）の間の領域からＴ−ＤＮＡを形成し、真核細胞にそれを分泌する。Ｔ−ＤＮＡのｓｓＤＮＡを核に送達し、生体内でｄｓＤＮＡになるように補完し、プラスミド上で適合性のプロモータ（Ｐ）からＲＮＡに転写する。こうして形成されたタンパク質部分の転写物を翻訳して指定されたタンパク質を形成する。ＲＮＡモチーフ配列を含むＳＣＮＡカセットからの転写物は、タンパク質部分における特定のＲＮＡ配列結合ドメインによって結合される。供与体カセットは、組換え部位に隣接して形成される二本鎖切断（ＤＳＢ）の存在下で標的核酸と組換えできる十分に長い配列を含有する。ＳＣＮＡは置換される配列に隣接する配列を標的とし、それとハイブリッド形成するように設計される。一部の実施形態では、境界配列を欠く類似のプラスミド又は類似の構築物の線形ＤＮＡをさらに用いて非生物送達系にて同様の効果に対して細胞に形質移入することができる。
【０１２５】
一部の実施形態によれば、及び上記で詳述されたように、標的配列における変化／修飾には、たとえば、核酸の欠失、変異、挿入、及び別の核酸配列による標的化された配列の置換、ノックアウト、フレームシフト、又は事象の調節鎖における遺伝子、その調節配列、当該遺伝子若しくはその調節配列を調節する遺伝子の転写若しくは翻訳の様式の変化が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２６】
一部の実施形態に従って、標的核酸にて変異を創るためのプログラムされた分子複合体の使用を明らかにする模式図（正確な縮尺ではない）である図１０を今や参照する。図１０で提示される非限定例で示されるように、タンパク質部分の機能性ドメインはヌクレアーゼに由来し、標的核酸上の標的部位の変異は、予め定義した位置での標的核酸におけるｄｓＤＮＡ切断の創造を介して達成される。ＳＣＮＡ／プログラムされた分子複合体は、標的核酸上の相当する標的配列とのＳＣＮＡの塩基対形成によって自己集合する。複合体の成分の集合の際、機能性ドメインが二量体化し、ヌクレアーゼが活性化され、この例では２つのＳＣＮＡ分子の中間点に又はその近傍に位置する標的部位を切断し、それによって、ＤＳＢを創る（たとえば、ＤＳＢは制限酵素ＦｏｋＩによって創られたもののように４ヌクレオチドの５’オーバーハングを有することができる）。細胞の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復メカニズムがＤＳＢを修復しようと試みる一方で、そのようにすることは、（１）複合体成分の枯渇まで変異での繰り返される試みについて複合体が同じ配列を再切断し続けながら、完璧なライゲーションを行い得る、（２）１又は複数のヌクレオチドを付加するので、ＳＣＮＡ間の距離を広げ、機能性ドメインの二量体化を失くし、それによって複合体の作用を終わらせ得る、又は（３）１又は複数のヌクレオチドを取り外す（図での「パックマン」）ので、ＳＣＮＡ間の距離を狭め、機能性ドメインの二量体化を失くし、それによって複合体の作用を終わらせ得る。細胞の中で選択肢（２）又は（３）が生じる場合、変異が達成される。
【０１２７】
一部の実施形態に従って、供給された供与体核酸を用いて１又は複数のヌクレオチドを標的核酸に挿入するためのプログラムされた分子複合体の使用を明らかにする模式図（正確な縮尺ではない）である図１１を今や参照する。タンパク質部分の機能性ドメインはヌクレアーゼに由来し、予め定義した位置（標的部位）での標的核酸におけるｄｓＤＮＡの切断（ＤＳＢ）は相同組換え（ＨＲ）の過程を支援する。ＳＣＮＡ／プログラムされた分子複合体は、相当する標的配列とのＳＣＮＡの塩基対形成によって自己集合する。複合体の成分の集合の際、機能性ドメインが二量体化し、ヌクレアーゼが活性化され、それによってこの例では２つのＳＣＮＡ分子の中間点に又はその近傍に位置し得る標的部位で標的核酸を切断し、それによって、ＤＳＢを創る。供与体ＤＮＡは、挿入される配列と、意図されるＤＳＢ点に隣接する標的配列と本質的に同一であるこの配列に隣接するヌクレオチドの十分に長いストレッチを含有する。次いで、これらの隣接配列がＨＲの細胞性過程を介して標的核酸と組換える（Ｘ）ので、標的核酸にてヌクレオチドの所定のストレッチを置き換え、事実上、所望の配列の挿入をもたらす。所定の供与体配列の組換え及び挿入の際、ＳＣＮＡ間の距離が広げられるので、機能性ドメインの二量体化を妨害し、それによって複合体の作用を終わらせる。ＮＨＥＪによる完璧な再ライゲーションが生じる場合、活性化され、プログラムされた複合体は、挿入での反復される試みについて同じ配列を再切断し続け得る。
【０１２８】
一部の実施形態に従って、供給された供与体核酸を用いた１又は複数のヌクレオチドの置換、挿入及び／又は欠失におけるプログラムされた分子複合体の使用を明らかにする模式図（正確な縮尺ではない）である図１２を今や参照する。図１２で提示される非限定例で示されるように、タンパク質部分の機能性ドメインはヌクレアーゼに由来し、予め定義した位置（標的部位）での標的核酸におけるｄｓＤＮＡの切断（ＤＳＢ）は相同組換え（ＨＲ）の過程を支援する。ＳＣＮＡ／プログラムされた分子複合体は、所定の標的配列とのＳＣＮＡの塩基対形成によって自己集合する。複合体の成分の集合の際、機能性ドメインが二量体化し、ヌクレアーゼが活性化され、たとえば、２つのＳＣＮＡ分子の中間点に又はその近傍に位置し得る標的部位で標的核酸を切断し、それによって、ＤＳＢを創る。供与体ＤＮＡは、取り除かれるべき内在性の配列の代わりに挿入されるべき外因性の配列を含有し、同様に取り除かれるように意図される配列に隣接する標的配列と本質的に同一であるこの外因性の配列に隣接するヌクレオチドの十分に長いストレッチを含有する。次いで、これらの隣接配列がＨＲの細胞性過程を介して標的核酸と組換える（Ｘ）ので、標的ＤＮＡにてＤＮＡのストレッチを置き換え、事実上、所望の外因性の配列による望ましくない内在性の配列の置換をもたらす。所望の外因性の配列の思い通りの組換え及び置換の際、標的核酸上のＳＣＮＡ結合部位が消滅するように設計され得るので、複合体の作用を終わらせ得る。ＮＨＥＪによる完璧な再ライゲーションが生じる場合、複合体は、組換えでの反復される試みについて同じ配列を再切断し続け得る。
【０１２９】
一部の実施形態に従って、標的核酸からの１又は連続する複数のヌクレオチドの欠失を創るためのプログラムされた分子複合体の使用を明らかにする模式図（正確な縮尺ではない）である図１３を今や参照する。図１３で提示される非限定例で示されるように、タンパク質部分の機能性ドメインはヌクレアーゼに由来し、欠失は、２つの予め定義した位置での標的核酸における２つのｄｓＤＮＡ切断（ＤＳＢ）の創造を介して達成される。ＳＣＮＡ／プログラムされた分子複合体は、相当する標的配列とのＳＣＮＡの塩基対形成によって自己集合する。複合体の成分の集合の際、機能性ドメインが二量体化し、ヌクレアーゼが活性化され、標的部位にて標的核酸を切断し、それは、ＳＣＮＡ分子の各対間の中間点に又はその近傍に位置し、ＤＳＢを創り得る。双方の部位の同時又は逐次の切断は、中間の配列を本質的に排除し、又は欠失させる。細胞の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復メカニズムがＤＳＢを修復しようと試みる一方で、そのようにすることは、（１）複合体成分の枯渇まで活性化複合体が同じ配列を再切断し続けながら、欠失配列に隣接する標的ＤＮＡの完璧なライゲーションを行い得る（左側のパネル）、（２）複合体成分の枯渇まで欠失での反復される試みについて複合体が同じ配列を再切断し続けながら、各別々のＤＳＢの完璧なライゲーションを行い得る、（３）ＤＳＢギャップにて１又は複数のヌクレオチドを取り外す（図での「パックマン」、右側のパネル）ので、ＳＣＮＡ間の距離を狭め、機能性ドメインの二量体化を失くし、それによって複合体の作用を終わらせ得る、又は（４）ＤＳＢギャップにて１又は複数のヌクレオチドを付加するので、ＳＣＮＡ間の距離を広げ、機能性ドメインの二量体化を失くし、それによって複合体の作用を終わらせ得る。
【０１３０】
一部の実施形態に従って、供給された供与体核酸を用いて標的核酸における１又は複数のヌクレオチドを置換するためのプログラムされた分子複合体の使用を明らかにする模式図である図１４を今や参照する。図１４で提示される非限定例で示されるように、タンパク質部分の機能性ドメインはヌクレアーゼに由来し、置換は、２つの予め定義した位置（標的部位）での標的核酸における２つのｄｓＤＮＡ切断（ＤＳＢ）の創造を介して達成され、欠失を創り、ギャップを満たす線形の又は線形化されたＤＮＡ供与体を供給する。ＳＣＮＡ／プログラムされた分子複合体は、相当する標的配列とのＳＣＮＡの塩基対形成によって自己集合する。複合体の成分の集合の際、機能性ドメインが二量体化し、ヌクレアーゼが活性化され、ＳＣＮＡ分子の各対間の中間点で又はその近傍で標的を切断し、それによってＤＳＢを創る。双方の部位の同時又は逐次の切断は、中間の配列領域を本質的に排除し、又は欠失させる。細胞の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復メカニズムがＤＳＢを修復しようと試みる一方で、そのようにすることは、（１）標的に対する供与体のライゲーションの完璧な対を作り、機能性ドメインの二量体化を消滅させ、それによって複合体の作用を終わらせ得る、（２）複合体成分の枯渇まで置換での反復される試みについて複合体が同じ配列を再切断し続け得るが、欠失配列に隣接する標的ＤＮＡの完璧なライゲーションを行い得る、（３）複合体成分の枯渇まで置換での反復される試みについて複合体が同じ配列を再切断し続け得るが、各別々のＤＳＢの完璧なライゲーションを行い得る、（４）ＤＳＢギャップにて１又は複数のヌクレオチドを取り外すので、ＳＣＮＡ間の距離を狭め、機能性ドメインの二量体化を失くし、それによって複合体の作用を終わらせ得る、又は（５）ＤＳＢギャップにて１又は複数のヌクレオチドを付加するので、ＳＣＮＡ間の距離を広げ、機能性ドメインの二量体化を失くし、それによって複合体の作用を終わらせ得る。
遺伝性疾患
【０１３１】
一部の実施形態によれば、本発明の組成物及び方法を用いて相同で同一ではない配列によって任意のゲノム配列を置き換えることができる。たとえば、変異体のゲノム配列を野生型の相方によって置き換えることができ、それによって、たとえば、遺伝性疾患、遺伝性の障害、癌及び自己免疫疾患を治療する方法を提供する。同様に、本明細書で開示される方法を用いて、遺伝子の一方の対立遺伝子を異なる対立遺伝子によって置き換えることができる。例となる遺伝性疾患には、軟骨形成不全症、色覚異常、酸性マルターゼ欠損症、後天性免疫不全症、アデノシンデアミナーゼ欠損症（ＯＭＩＭ、Ｎｏ．１０２７００）、副腎白質ジストロフィ、アイカルディ症候群、αＩアンチトリプシン欠損症、α−サラセミア、アンドロゲン不感症症候群、アペール症候群、催不整脈性右室異形成、毛細血管拡張性運動失調症、バース症候群、β−サラセミア、青色ゴム乳首様母斑症候群、カナバン病、慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）、ネコ鳴き症候群、嚢胞性線維症、ダーカム病、外胚葉異形成症、ファンコーニ貧血、進行性骨化性線維異形成症、脆弱性Ｘ症候群、ガラクトース血症、ゴーシュ病、全身性ガングリオシド沈着症（たとえば、ＧＭＩ）、血色素症、異常ヘモグロビン症（たとえば、鎌形赤血球貧血、β−グロビンの６.ｓｕｐ．ｔｈコドンにおけるヘモグロビンＣの変異、α−サラセミア、β−サラセミア）、血友病、ハンチントン病、ハーラー症候群、低ホスファターゼ血症、クラインフェルター症候群、クラッベ病、ラｂｂガー・ギデオン症候群、白血球接着欠損症（ＬＡＤ，ＯＭＩＭ、Ｎｏ．１１６９２０）、大脳白質萎縮症、ＱＴ延長症候群、リソソーム蓄積症（たとえば、ゴーシュ病、ＧＭ１、ファブリ病、及びテイ・サックス病）、マルファン症候群、メビウス症候群、ムコ多糖症（たとえば、ハンター病、ハーラー病）、爪膝蓋症候群、腎性尿崩症、神経線維腫症、ネイマン・ピック病、骨形成不全症、ポルフィリン症、プラダー・ウイリー症候群、早老症、プロテウス症候群、網膜芽腫、レット症候群、ルビステイン・テイビ症候群、サンフィリポ症候群、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）、シュバッハマン症候群、鎌形赤血球病（鎌形赤血球貧血）、スミス・マゲニス症候群、スティックラー症候群、テイ・サックス病、血小板減少-橈骨欠損症候群、トリーチャー・コリンズ症候群、トリソミー、結節硬化症、ターナー症候群、尿素サイクル異常症、フォン・ピッペル・リンドウ病、ワーデンブルグ症候群、ウイリアムズ症候群、ウイルソン病、ウィスコット・アルドリッチ症候群、Ｘ連鎖リンパ球増殖症候群（ＸＬＰ，ＯＭＩＭ、Ｎｏ．３０８２４０）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３２】
本発明の一部の実施形態をさらに完全に説明するために以下の実施例が提示される。しかしながら、それらは、本発明の広い範囲を限定するとは決して解釈されるべきではない。
実施例
実施例１：分子複合体の成分を調整するためのバイオアッセイとしての生体内の系
【０１３３】
本実施例は、プログラム可能な分子複合体の設計及び使用において並べ替えを調べ、最適化するのに好適な、たとえば、異なる生物又は細胞にて活性を調べるのに、異なる送達方法を調べるのに、及び変異、置換、欠失及び挿入の機能を調べ、編集するのに好適なバイオアッセイを記載する。
【０１３４】
以下の実施例で示される実験は、タンパク質部分のエフェクタードメインとして修飾されたヌクレアーゼを含む、プログラム可能な分子複合体の組成物による遺伝子ターゲッティング及び特異的な切断の検出のためのものである。
【０１３５】
レポーターのコーディング配列の中に配置される停止コドンの修復に基づく視覚的なレポーター系を使用する。これらの試料におけるレポーターは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。標的とされると、活性化された複合体によって形成された二本鎖切断（ＤＳＢ）は修復され（多分、図１０で例として説明するようにＮＨＥＪ経路を介して）、停止コドンを消滅させ、ＧＦＰ活性を取り戻す。従って、このアッセイは遺伝子ターゲッティングの効率の良好な指標を与え得る。このアッセイは「停止ＧＦＰアッセイ」としても知られる。この視覚的アッセイは、生体内でプラスミドＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを標的とするように設計される。以下の実施例では、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のプロトプラストに基づくバイオアッセイが使用される。記載されるバイオアッセイでは、前述のレポーター系がプラスミドにてプロトプラストに送達され、生体内で分子複合体のタンパク質部分を発現するプラスミドと共に同時送達され、本実施例では、末端（ＮＨＳ−エステル−）−ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）で修飾した１対のｓｓＤＮＡ特異性付与核酸（ＳＣＮＡ）と共に同時送達される。エンドヌクレアーゼ保護のための第２の修飾（ホスホロチオエート）は、反対の末端（ここでは星印で示す）に付加される。本明細書で使用されるプラスミドベクターは植物プロモータを含む。
タンパク質の配列及び特性
【０１３６】
この適用のために設計された分子複合体は、特異性決定のための相同の核酸（ＳＣＮＡ）の２つの配列と生体内でＳＣＮＡに結合するヌクレアーゼを含有するキメラタンパク質成分から構成される。標的核酸（ＧＦＰコーディング配列）の所定の標的部位（停止コドン）の得られる切断は、内在性の過程によって所望の変異を生じる。本実施例のプログラム可能な分子複合体は、タンパク質部分の２つの同一の単量体と２つの異なるＳＣＮＡ分子（図１Ａ及び図１Ｂにて模式的に示す）から成る。本実施例では、タンパク質部分は、機能性ドメインとしての、ＦｏｋＩヌクレアーゼから修飾されたアミノ酸配列と；連結ドメインとしての、Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８に記載されたものに類似する抗ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）免疫グロブリン（ＤＩＧ／ｓｃＦｖ）から適合させたアミノ酸配列と；核局在化ドメインとしてのＳＶ４０ＮＬＳ（配列番号３、ＰＫＫＫＲＫＶ）と約１５Åのドメイン間接続要素（配列番号７、ＧＧＳＧＧ）を含有する。タンパク質部分をコードする核酸配列が、ＮＯＳ又は３５Ｓプロモータを含む好適な発現ベクター（ｐＵＣに基づくベクター（ｐＳＡＴ））に挿入される。
【０１３７】
特異性付与核酸とタンパク質部分の連結ドメインの間での生体内結合は、本実施例では、抗体／抗原相互作用、単鎖抗体／抗原、抗体又は単鎖抗体／ハプテンの相互作用として記載することができる非共有結合の相互作用の結果である。
【０１３８】
本実施例では、ＳＣＮＡの核酸末端の修飾は、ＳＣＮＡオリゴヌクレオチドの５’又は３’の位置に連結されるＮＨＳ−エステル結合したジゴキシゲニン（ＤＩＧ）である。
【０１３９】
分子複合体のタンパク質部分（ジゴキシゲニンｓｃＦｖを伴ったＮＬＳ／ＦｏｋＩヌクレアーゼ配列）のアミノ酸配列（一文字コード）は配列番号１２で示されるようであり、配列番号１３で示されるような配列によってコードされる。
ＳＣＮＡの特性及び配列
【０１４０】
相補性で標的と塩基対形成するオリゴヌクレオチドのＳＣＮＡの長さは、優先的には少なくとも１８塩基である。ＳＣＮＡは、ＤＩＧ−ＮＨＳ末端修飾因子と標的に相補性のヌクレオチドとの間でスペーサーとして役立つ配列組成物の少数（たとえば、一例では１〜６、他の例では２）の標的と塩基対形成しないヌクレオチドも含有することができる。上記で詳述したように、染色体ＤＮＡにおけるＤＮＡの軽微な溝を占有するヒストンのために、ＳＣＮＡスペーサー上で幾つかの制約が存在し得る。従って、ＳＣＮＡは好ましくは、ＳＣＮＡ間の距離を調節することによって標的ＤＮＡの主要な溝に適合して、二量体化されたプログラム可能な分子複合体の連結ドメインが結合するのを可能にする標的螺旋の配向を可能にするように設計される。球形の機能性ドメインと連結ドメイン（ここで示す例では、ＧＳＬＥＧＧＳＧＧ（配列番号１４））の間でのドメイン間接続要素の選択も、それが、２つのドメイン間の「ヒンジ」における動きを制約する又は可能にするので、最適なＳＣＮＡの距離に影響する。標的と塩基対形成しないヌクレオチド（「Ｎ’ｓ」）の付加は、それが、タンパク質及び螺旋に対してＳＣＮＡの柔軟性を変えるので、ＳＣＮＡ間の距離及び標的螺旋における回転配向の双方を変化させる。これらの対形成しないヌクレオチドは標的ＤＮＡの主要な溝に拘束されない。
【０１４１】
本実施例で示すように、ＧＳＬＥＧＧＳＧＧドメイン間リンカーを伴った抗ＤＩＧ−ＳｃＦｖ−ＮＨＳ−Ｅｓｔｅｒ−ＤＩＧ系のコンピュータ化した３Ｄモデルから得られた空間測定の結果は、ＳＣＮＡ間の予想される最適な距離は、ＳＣＮＡにおける２Ｎ’の存在下で約２３〜２６ヌクレオチドであることが分かった。切断は、いずれかの側でＳＣＮＡとの最後のヌクレオチドのハイブリッド形成の後から数え、二量体化した構築物によるｄｓＤＮＡの切断によって創られる４塩基の５’オーバーハングを考慮に入れて、１１番目、１２番目又は１３番目の左及び右に約±２ヌクレオチドで生じるように予測される。この基準は、標的とされた配列がたとえば、この２４ヌクレオチドＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＹＹＹＹＹＹＹＹＹＸＸＸＸＸＸＹＹＹＹＹＹＹＹＹＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣであるならば、Ｙ＋ＸがＳＣＮＡの塩基対形成部位間のヌクレオチドの数を表す場合、設計されたＳＣＮＡは領域Ａ及びＣと塩基対形成し、ＤＳＢを生じる切断はＸ領域の中に又は隣接して存在することを示唆する。ＳＣＮＡはセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかに相補性であることができるが、好ましくはセンス（転写されない）配列と塩基対形成するように選択される。タンパク質部分の位置が「末端近傍」にあるプライマーの５’又は３’修飾によって定義されるように（図２Ａで説明されるように）、ＳＣＮＡの「末端近傍」に位置付けされるので、ＳＣＮＡは双方とも同じ鎖と塩基対形成することができる。ＳＣＮＡ間の距離の最適化は、好まれる鎖と同様にこのバイオアッセイで調べられる幾つかの基準の１つである。
【０１４２】
標的部位（停止コドン、（ＴＡＧ））を含有する標的核酸（ＧＦＰコーディング配列）には、配列番号１５（「停止−ＧＦＰ」）で示されるヌクレオチド配列が含まれ、その際、ＴＡＧ停止コドンはヌクレオチド８７８に位置する。
【０１４３】
実施例１Ｂ及び１ＣのｍＣｈｅｒｒｙ供与体には、配列番号１６で示されるプロモータなしでターミネータなしのコーディング配列が含まれる。
以下の標的部位配列が実施例１Ａ〜１Ｃにて標的とされる。
実施例１Ａ〜Ｃ：「第１の標的」配列
【０１４４】
ＧＴＣＧＡＣＡＡＣＴＡＧＴＣＣＡＧＡＴＣＴ（配列番号１７）
ＳＣＮＡ配列
修飾記号は：ホスホロチオエート結合＝＊；５’ＤＩＧ＝／５ＤｉｇＮ／；３’ＤＩＧ＝／３ＤｉｇＮ／）
１Ａ〜Ｃ：「第１の標的」のために調べられ、対形成したＳＣＮＡの組み合わせ
センスＳＣＮＡ
ＧＦＰ＿９１８＿ＳＲ１：／５ＤｉｇＮ／ＮＮＮＮＮＮＧＴＧＴＣＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧ＊Ｔ；（核酸のみが本明細書では配列番号１８として指定される）
ＧＦＰ＿８９６＿ＳＬ１：Ｔ＊ＴＴＡＣＧＡＡＣＧＡＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＣＮＮＮＮＮＮ／３ＤｉｇＮ／（核酸のみが本明細書では配列番号１９として指定される）
予測結果に従って２４ｂｐの標的ギャップとさらに短いＳＣＮＡリンカーを採用する第２のセンス対形成される組み合わせ
ＧＦＰ＿９２０＿ＳＲ１：／５ＤｉｇＮ／ＮＮＧＴＣＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴ＊Ｃ（核酸のみが本明細書では配列番号２０として指定される）
ＧＦＰ＿８９５＿ＳＬ１：Ａ＊ＴＴＴＡＣＧＡＡＣＧＡＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＮＮ／３ＤｉｇＮ／（核酸のみが本明細書では配列番号２１として指定される）
アンチセンスＳＣＮＡ
ＧＦＰ＿９１８＿ＡＳＲ１：Ｃ＊ＡＧＣＴＣＣＴＣＧＣＣＣＴＴＧｇａｇａｃＮＮＮＮＮＮ／３ＤｉｇＮ／（核酸のみが本明細書では配列番号２２として指定される）
ＧＦＰ＿８９６＿ＡＳＬ１：／５ＤＩＧＮ／ＮＮＮＮＮＮＧＧＣＣＡＴＧＧＣＴＡＴＣＧＴＴＣＧＴＡ＊Ａ（核酸のみが本明細書では配列番号２３として指定される）
予測結果に従って２４ｂｐの標的ギャップとさらに短いＳＣＮＡリンカーを採用する第２のアンチセンス対形成される組み合わせ
ＧＦＰ＿９２０＿ＡＳＲ１：Ｇ＊ＡＡＣＡＧＣＴＣＣＴＣＧＣＣＣＴＴＧＧＡＣＮＮ／３ＤｉｇＮ／（核酸のみが本明細書では配列番号２４として指定される）
ＧＦＰ＿８９５＿ＡＳＬ１：／５ＤｉｇＮ／ＮＮＧＣＣＡＴＧＧＣＴＡＴＣＧＴＴＣＧＴＡＡＡ*Ｔ（核酸のみが本明細書では配列番号２５として指定される）
センスとアンチセンスの対の組み合わせ
ＧＦＰ＿９１８＿ＳＲ１：／５ＤｉｇＮ／ＮＮＮＮＮＮＧＴＧＴＣＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧ＊Ｔ；（核酸のみが本明細書では配列番号１８として指定される）
ＧＦＰ＿８９６＿ＡＳＬ１：／５ＤＩＧＮ／ＮＮＮＮＮＮＧＧＣＣＡＴＧＧＣＴＡＴＣＧＴＴＣＧＴＡ＊Ａ（核酸のみが本明細書では配列番号２３として指定される）
予測結果に従って２４ｂｐの標的ギャップとさらに短いＳＣＮＡリンカーを採用する第２のアンチセンス対形成される組み合わせ
ＧＦＰ＿９２０＿ＳＲ１：／５ＤｉｇＮ／ＮＮＧＴＣＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴ＊Ｃ（核酸のみが本明細書では配列番号２０として指定される）
ＧＦＰ＿８９５＿ＡＳＬ１：／５ＤｉｇＮ／ＮＮＧＣＣＡＴＧＧＣＴＡＴＣＧＴＴＣＧＴＡＡＡ*Ｔ（核酸のみが本明細書では配列番号２５として指定される）
ＧＦＰ＿９１８＿ＡＳＲ１：Ｃ＊ＡＧＣＴＣＣＴＣＧＣＣＣＴＴＧｇａｇａｃＮＮＮＮＮＮ／３ＤｉｇＮ／（核酸のみが本明細書では配列番号２２として指定される）
ＧＦＰ＿８９６＿ＳＬ１：Ｔ＊ＴＴＡＣＧＡＡＣＧＡＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＣＮＮＮＮＮＮ／３ＤｉｇＮ／（核酸のみが本明細書では配列番号１９として指定される）
予測結果に従って２４ｂｐの標的ギャップとさらに短いＳＣＮＡリンカーを採用する第２のアンチセンス対形成される組み合わせ
ＧＦＰ＿９２０＿ＳＬ１：Ａ＊ＴＴＴＡＣＧＡＡＣＧＡＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＮＮ／３ＤｉｇＮ／（核酸のみが本明細書では配列番号２１として指定される）
ＧＦＰ＿８９５ＡＳＲ１：Ｇ＊ＡＡＣＡＧＣＴＣＣＴＣＧＣＣＣＴＴＧＧＡＣＮＮ／３ＤｉｇＮ／（核酸のみが本明細書では配列番号２４として指定される）
実施例１Ｃのための「第１の標的」は１Ａ及び１Ｂの標識と一致する。
実施例１Ｃのための「第２の標的」：ＧＡＣＴＣＴＡＡＧＣＴＴＧＧＧＴＣＴＡＧＡ
実施例１ＣのためのＳＣＮＡ
２４ｂｐの標的ギャップとさらに短いＳＣＮＡリンカーを利用する組み合わせ
センス
ＧＦＰ＿１６５８＿ＳＲ：／５ＤＩＧＮ／ＮＮＴＣＣＧＣＡＡＡＡＡＴＣＡＣＣＡＧＴＣＴＣ*Ｔ（核酸のみが本明細書では配列番号２７として指定される）
ＧＦＰ＿１６３３＿ＳＬ：Ｇ＊ＣＡＴＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＧＴＣＮＮ／３ＤＩＧＮ／（核酸のみが本明細書では配列番号２８として指定される）
アンチセンス
ＧＦＰ＿１６５８＿ＡＳＲ：Ａ＊ＧＡＧＡＣＴＧＧＴＧＡＴＴＴＴＴＧＣＧＧＡＮＮ／３ＤＩＧＮ／（核酸のみが本明細書では配列番号２９として指定される）
ＧＦＰ＿１６３３＿ＡＳＬ：／５ＤＩＧＮ／ＮＮＧＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧ*Ｃ（核酸のみが本明細書では配列番号３０として指定される）
実施例１Ａ〜Ｃの「第１の標的」ＳＣＮＡで見られるように、これら４つの実施例１Ｃの「第２の標的」ＳＣＮＡは上記のリストからの１つ「左」（Ｌ）及び１つ「右」（Ｒ）のＳＣＮＡを用いて対形成され得る。
送達
バイオアッセイの設定：シロイヌナズナのプロトプラストの調製はＷｕら（Wu et. al., 2009）に基づく。
植物材料：２２℃にて１日１６時間最適照明（１５０マイクロアインシュタイン・ｍ−２・ｓ−１）にて生長させたシロイヌナズナ。
葉：３〜５週齢の植物（Ｗ：約２ｃｍ、Ｌ：約５ｃｍ）
操作溶液
酵素溶液：１％セルロース、０．２５％マセロザイム、０．４Ｍのマンニトール、１０ｍＭのＣａＣｌ２、２０ｍＭのＫＣｌ、０．１％ＢＳＡ、２０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ５．７、５５℃にて１０分間、加熱してプロテアーゼを不活化し、次いで濾過する。新鮮なうちに使用する。１０ｍｌ／７〜１０枚の剥がした葉（１〜５ｇ）／皿
改変Ｗ５溶液：１５４ｍＭのＮａＣｌ、１２５ｍＭのＣａＣｌ２、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのグルコース、２ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ５．７。２５ｍｌ／プレートで２回洗浄＋形質転換洗浄のために３ｍｌで２回＋１ｍｌに再懸濁
改変ＭＭｇ溶液：（再懸濁溶液）０．４Ｍのマンニトール、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、４ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ５．７
改変ＴＥＡＭＰ形質移入緩衝液（ＰＥＧ溶液）：４０％ＰＥＧ、ＭＷ４０００、０．１ＭのＣａＣｌ２、０．２Ｍのマンニトール容積＝１：１（ＭＭｇにおける２００μｌのプロトプラスト＋ＤＮＡの容積）
ＢＳＡ：１％ＢＳＡ
操作プロトコール
（１）水槽を５５℃で事前に加熱し、冷却スイングアウト遠心し、Ｗ５及びＭＭｇを冷却し、先端を切る。
（２）新しいＢＳＡをコーティングしたプレート（ウェル当たり１％ＢＳＡ水溶液を１．２５ｍｌ、使用までベンチでインキュベート）を準備する。
（３）１０ｍｌ／処理の新しい酵素溶液を作る。
（４）７〜１０枚の葉を摘み、湿らすべからず。１０枚の葉で約４〜５回形質転換できるはずである。
（５）表皮の上に時間テープを貼り、下に磁気テープを貼る。手袋なしの方が簡単である。葉柄が時間テープにのみに貼り付けば簡単に剥がせる。
（６）１０ｍｌの新しい酵素溶液を０．２２μｍのフィルターで濾過して各ペトリ皿に入れる。
（７）磁気テープを剥がし、捨てる。時間テープをペトリ皿の側面に移す。
（８）プロトプラストが離れるまで（経験的にチェックする）照明の中で４０ｒｐｍにて２０〜６０分間、平板振盪器で穏やかに振盪する。
（９）スイングアウトロータにて１００×ｇで３分間、５０ｍｌの試験管を遠心する。
（１０）２５ｍｌの冷却Ｗ５溶液で２回洗浄する。
（１１）３０分間氷で冷却し、この間に光学顕微鏡を用いて血球計算板にて数を数える。
（１２）遠心し、２〜５×１０５細胞／ｍｌ（約１ｍｌ）にてＭＭｇ溶液に再浮遊する。
形質移入
（１）２ｍｌ試験管内にて形質移入用の新しいＰＥＧ溶液を作る。
（２）６穴プレートからＢＳＡを捨て、乾かす。
（３）１５ｍｌの丸底（スナップ式のキャップ）試験管にてＲＴで、標的プラスミドＤＮＡ、タンパク質部分を発現するプラスミドＤＮＡ及びＳＣＮＡｓｓＤＮＡの総量３０〜４０μｇまでの混合物と０．２ｍｌのＭＭｇ溶液中の約５×１０４（２×１０４〜１×１０５）のプロトプラストを混合する。
（４）等量（０．２ｍｌのプロトプラスト＋ｍｉｄｉｐｒｅｐ容量）の新しいＰＥＧ溶液を加える。
（５）ＲＴで５分間インキュベートする。
（６）３ｍｌのＷ５溶液をゆっくり加えて洗浄し、１度に１ｍｌ加え、混合する。
（７）スイングアウトロータにて１００×ｇで１分間遠心する。
（８）洗浄と遠心を繰り返す。
（９）１ｍｌのＷ５溶液に再浮遊する。
（１０）ＢＡＳをコーティングしたプレートに注ぐ。
（１１）２２℃にて１日１６時間最適照明（１５０マイクロアインシュタイン・ｍ−２・ｓ−１）にてプロトプラストを生長させる。必要に応じて培地を交換する。
自動フローサイトメータ（ＦＡＣＳ）を用いて形質移入の３日後、ＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ活性についてＷ５溶液に浮遊したプロトプラストをスクリーニングする。５３０／３０のフィルターで検出される放射と共に４８８ｎｍでの励起によってＧＦＰは検出される。ｍＣｈｅｒｒｙの励起と放射は５６１ｎｍと６１０／２０のフィルターである。閾値及び補正因子を設定して偽陽性を排除する。
実施例１Ａ：誘導されたＤＳＢによる点突然変異
【０１４５】
本実施例では、標的の切断がプラスミドＤＮＡ標的において二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じる。このＤＳＢは停止コドンに創られるように設計され、それは、図１０（変異）の例示で示されるようにＮＨＥＪ修復メカニズムによって消化され、修復される。ＮＨＥＪは突然変異を起こしやすく、これらの突然変異の幾つかは、停止コドンを消滅させ、活性のあるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を生じるオープンリーディングフレームを復元し得る。次いで顕微鏡又はフローサイトメータ（ＦＡＣＳ）によって、系の効率の測定及びその改善のための変数間の比較を可能にするＧＦＰが検出される。
シロイヌナズナのゲノム（プラスミドの代わりに）に予め安定的に導入された停止／ＧＦＰ導入遺伝子を標的とする場合、ＧＦＰを発現するプロトプラストからゲノムを修飾した植物を再生することができる。
実施例１Ｂ：誘導されたゲノムＤＳＢへの特異的統合
【０１４６】
実施例１Ａに類似して、プログラムされた分子複合体によってインフレームのＧＦＰ停止コドン配列が標的とされる。この適用では、ＣＤＳのみを含有するプロモータのない、ターミネータのないｍＣｈｅｒｒｙレポーター遺伝子を含む線形ｄｓＤＮＡ供与体が加えられる。記載されるような形質転換に続いて、顕微鏡又はフローサイトメータ（ＦＡＣＳ）による赤色蛍光によって、系の効率の測定及びその改善のための変数間の比較を可能にするｍＣｈｅｒｒｙを発現するプロトプラストが検出される。ｍＣｈｅｒｒｙの励起と放射は５６１ｎｍと６１０／２０のフィルターである。供与体ＤＮＡはプロモータのないｍＣｈｅｒｒｙを含有するので、その活性はプロモータ捕捉によって達成することができる。従って、標的とされたＧＦＰカセットは線形ＤＮＡが連結され得るＤＳＢから切断される。過剰のｍＣｈｅｒｒｙＣＤＳ線形ｄｓＤＮＡが供給されるので、それはＤＳＢにて捕捉され、場合によってはｍＣｈｅｒｒｙタンパク質のインフレームでの翻訳を引き起こす。ＧＦＰ標的化配列へのｍＣｈｅｒｒｙのそのような特定に挿入を伴う標的とされたプラスミドはさらに、以下のプライマー：一方は標的プラスミドＤＮＡ配列を結合し、他方は挿入されたＤＮＡを結合する：
３５ＳＦ：ＣＴＡＴＣＣＴＴＣＧＣＡＡＧＡＣＣＣＴＴＣＣ（配列番号３１）
ｍＣｈｅｒｒｙＲ：ＴＴＡＴＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴ（配列番号３２）によるＰＣＲによって解析される。
同様に、細菌性の抗生剤耐性（複製開始点を含まないＮＰＴ−ＩＩコーディングカセット）が線形ｄｓＤＮＡとしてプロトプラストに提供される。このＤＮＡは、実施例１Ｂ及び１ＣのｍＣｈｅｒｒｙの代わりに挿入され、プロトプラストから全ＤＮＡを抽出し、大腸菌への挿入を伴う又は伴わないプラスミドを含むＤＮＡで形質転換し、カナマイシンを含有する培地で増殖させることによってスクリーニングする。耐性の細菌はＮＰＴ−ＩＩカセットを捕捉したプラスミドを有する。所定のＧＦＰ標的への挿入の特異性を評価するために、予想される挿入部位にまたがるプライマーによってＧＦＰ標的部位をＰＣＲ増幅する。特定の挿入物は、アガロースゲル上でＰＣＲ産物のサイズの有意なシフトを生じる。挿入の効率は、２つ組プレート実験にてカナマイシン耐性コロニーの数をアンピシリン耐性コロニーの数（アンピシリン耐性は標的プラスミドにコードされる）で割ることによって算出される。特異性は、プログラム可能な分子複合体（たとえば、ＧＦＰを標的とするＳＣＮＡ）の成分を含めない又は置き換える実験を繰り返し、改変されない実験と比較することによって算出される。
実施例１Ｃ：ＮＨＥＪ修復メカニズムを介した遺伝子置換
【０１４７】
本実施例では、ＧＦＰコーディング配列は内在性のＮＨＥＪを介してｍＣｈｅｒｒｙＣＤＳに置き換えられる。ＮＨＥＪ戦略によって標的ＤＮＡの広範な区分を欠失させるために、ＤＳＢを２つ創る。ＧＦＰ  ＣＤＳの開始と終結を標的とするために、２セットのＳＣＮＡをｍＣｈｅｒｒｙ線形ｄｓＤＮＡ供与体と併せて使用する。供与体ＤＮＡがプロモータのないｍＣｈｅｒｒｙを含有するので、その活性はプロモータ捕捉によって達成される。従って、標的とされたＧＦＰカセットはｍＣｈｅｒｒｙＣＤＳを捕捉することができる。それぞれ５６１ｎｍ及び６１０／２０フィルターで検出される励起及び放射によるＦＡＣＳ又は顕微鏡によってｍＣｈｅｒｒｙを解析する。
【０１４８】
ｍＣｈｅｒｒｙ陽性のプロトプラストをＦＡＣＳによって仕分け、その後、ＤＮＡ抽出、大腸菌へのプラスミドを含む全ＤＮＡの直接形質転換、抗生剤含有培地での増殖、及び２つのプライマーのセット：
３５ＳＦ：  ＣＴＡＴＣＣＴＴＣＧＣＡＡＧＡＣＣＣＴＴＣＣ（配列番号３１）
ｍＣｈｅｒｒｙＲ：  ＴＴＡＴＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴ（配列番号３２）
及び
３５Ｓ−Ｔ−Ｒ−ＳＥＱ：ＣＣＣＴＡＴＡＡＧＡＡＣＣＣＴＡＡＴＴＣＣＣ（配列番号３３）
ｍＣｈｅｒｒｙＦ：  ＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡ（配列番号３４）
による各細菌コロニーの２コロニーＰＣＲ反応の実施に供する。
【０１４９】
双方のＰＣＲにて増幅産物を生じるコロニーは、シロイヌナズナのプロトプラストにて標的とされ、ＮＨＥＪ修復経路を介して正しく向いた置換事象を生じているプラスミドを含有し、検証のためにさらに配列決定する。
シロイヌナズナのゲノム（プラスミドの代わりに）に予め安定的に導入されたＧＦＰ導入遺伝子を標的とする場合、大腸菌のそのような直接的な形質転換は行わない。代わりに、前記プライマーを用いて単一のプロトプラストからＰＣＲによって直接、ゲノムＤＮＡを増幅する。或いは、ＧＦＰを発現しない、ｍＣｈｅｒｒｙを発現しているプロトプラストからゲノムが改変された植物を再生することができ、その一部を同様に解析することができる。
実施例２：単子葉植物穀類植物ゲノムにおける二本鎖切断の誘導、変異及び挿入
ノックアウトのためのトウモロコシにおけるターゲッティングＩＰＫ１
【０１５０】
ＩＰＫ１遺伝子は、トウモロコシ種子におけるフィチン塩の生合成に関与するイノシトール−−１，３，４，５，６−ペンタキスホスフェート２−キナーゼをコードする。フィチン塩は、非反芻家畜が食すると、環境のリン汚染に寄与する反栄養成分である。ＩＰＫ１を標的とすることは種子のリンを７５％減らし得る。９８％の配列同一性を共有する２つのパラロガスなトウモロコシＩＰＫ遺伝子がトウモロコシのゲノムに存在する。この実施例では、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＥＦ４４７２７４に基づくＩＰＫ１配列を標的とする。
標的ヌクレオチド配列における標的部位
ＩＰＫ１におけるエクソン２：ＴＴＣＴＣＡＡＧＴＣＡＴＧＡＧＣＡＡＣＴＣ（配列番号３５）
タンパク質の配列及び特性
【０１５１】
プログラムされた分子複合体によるプログラムされた標的部位ＩＰＫ１の得られる切断は、内在性の過程によって望まれ、支援されるように、プログラムされた複合体によって創られたＤＳＢへの供与体ＤＮＡの変異又は挿入を生じる。プログラム可能な分子複合体はここでは、タンパク質部分の２つの同一の単量体と２つの異なるＳＣＮＡ分子から成る。本実施例では、タンパク質部分は実施例１のそれと同一である。
【０１５２】
本実施例では、ＳＣＮＡの核酸末端修飾は、オリゴヌクレオチドの５’又は３’部分に連結されるＮＨＳ−エステル結合したジゴキシゲニン（ＤＩＧ）である。
ＳＣＮＡの特性及び配列
【０１５３】
ＳＣＮＡの理に適った設計は実施例１で記載されたように必須である。相補性で標的と塩基対形成するオリゴヌクレオチドのＳＣＮＡの長さは、優先的には少なくとも１８塩基である。ＳＣＮＡは、ＤＩＧ−ＮＨＳ末端修飾因子と標的に相補性のヌクレオチドとの間でスペーサーとして役立つ配列組成物の少数（たとえば、１〜６、一例では６、他の例では２）の標的と塩基対形成しないヌクレオチドも含有することができる。
ＩＰＫ１標的部位に隣接するＳＣＮＡのヌクレオチド配列
【０１５４】
２１ｂｐの標的ギャップを採用する以下の「Ｒ」及び「Ｌ」のＳＣＮＡの組み合わせを調べる：
ＩＰＫ１−ＳＲ−１７１０：／５ＤＩＧＮ／ＮＮＮＮＮＮＣＴＧＴＧＧＧＧＣＣＡＴＡＴＣＣＣＡＧＡＡ＊Ｃ（核酸のみが本明細書では配列番号３６として指定される）
ＩＰＫ１−ＳＬ−１６８８：Ｇ＊ＣＧＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＴＧＴＡＴＴＧＴＡＮＮＮＮＮＮ／３ＤＩＧＮ／（核酸のみが本明細書では配列番号３７として指定される）
ＩＰＫ１−ＡＳＲ−１７１０：Ｇ＊ＴＴＣＴＧＧＧＡＴＡＴＧＧＣＣＣＣＡＣＡＧＮＮＮＮＮＮ／３ＤＩＧＮ／（核酸のみが本明細書では配列番号３８として指定される）
ＩＰＫ１−ＡＳＬ−１６８８：／５ＤＩＧＮ／ＮＮＮＮＮＮＴＡＣＡＡＴＡＣＡＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＣＧ＊Ｃ（核酸のみが本明細書では配列番号３９として指定される）
【０１５５】
予想される結果に従って２４ｂｐの標的ギャップとさらに短いＳＣＮＡリンカーを採用する対形成した「Ｒ」及び「Ｌ」のＳＣＮＡの組み合わせの第２のセット
ＩＰＫ１−ＳＲ−１７１２：／５ＤｉｇＮ／ＮＮＧＴＧＧＧＧＣＣＡＴＡＴＣＣＣＡＧＡＡＣ＊Ｔ（核酸のみが本明細書では配列番号４０として指定される）
ＩＰＫ１−ＳＬ−１６８７：Ａ＊ＧＣＧＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＴＧＴＡＴＴＧＴＮＮ／３ＤｉｇＮ／（核酸のみが本明細書では配列番号４１として指定される）
ＩＰＫ１−ＡＳＬ−１６８７：／５ＤｉｇＮ／ＮＮＡＣＡＡＴＡＣＡＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＣＧＣ＊Ｔ（核酸のみが本明細書では配列番号４２として指定される）
ＩＰＫ１−ＡＳＲ−１７１２：Ａ＊ＧＴＴＣＴＧＧＧＡＴＡＴＧＧＣＣＣＣＡＣＮＮ／３ＤｉｇＮ／（核酸のみが本明細書では配列番号４３として指定される）
ＳＣＮＡは修飾されたｓｓＤＮＡを含む。修飾記号は：ホスホロチオエート結合＝＊；５’ＤＩＧ＝／５ＤｉｇＮ／；３’ＤＩＧ＝／３ＤｉｇＮ／である。
実験２Ａ：プロトプラストにおけるＩＰＫ１のノックアウト及びＧＦＰの発現
【０１５６】
この実験では、トウモロコシ植物におけるゲノムＤＳＢ及びノックアウト変異を形成するＩＰＫ１遺伝子へのＧＦＰ配列の特異的な統合及びＩＰＫ１遺伝子座におけるＧＦＰの発現を調べる。プログラムされた分子複合体は、ＩＰＫ１配列にてゲノムＤＢＳを形成し、相同組換えを介してＩＰＫ１配列への供与体ＤＮＡの統合を開始する。
本実施例２Ａは、ＦＡＣＳによってＧＦＰの活性について解析されるトウモロコシのプロトプラストで実施される。
操作プロトコール
プロトプラストの調製
【０１５７】
ポリブレン誘導の送達プロトコール加えて又はその代わりにエレクトロポレーション誘導の核酸送達と共に、トウモロコシの葉肉プロトプラスト（Sheen, 2001）を用いた一過性発現アッセイを用いる。
Ａｎｔｏｎｅｌｌｉ及びＳｔａｄｌｅｒ，１９８９に基づく形質移入
【０１５８】
修飾されたｓｓＤＮＡ  ＳＣＮＡと、タンパク質部分、供与体ＤＮＡ（適用可能であれば）をコードするプラスミドを含む形質転換ＤＮＡを約２０〜５０μｇ及びポリカチオンポリブレン（臭化ヘキサジメトリン）３０μｇと共に、新しく単離されたプロトプラスト（約２×１０６）を６〜１２時間インキュベートする。インキュベート時間の終了時、増殖培地を添加することによって形質転換混合物を希釈し、次いで細胞をさらに３０時間インキュベートした後、一過性の遺伝子発現について以下のようにアッセイする：
（１）プロトプラストを調製し、８％マンニトールを伴った０．５ｍｌのＭｕｒａｓｈｉｇｅ  Ｓｋｏｏｇに基づく増殖培地（ＭＳ２Ｄ８Ｍ）に約２×１０６細胞にて再浮遊する。
（２）各実験について、新しいポリブレン（Ａｌｄｒｉｃｈ）ストック溶液（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．０にて１０ｍｇ／ｍｌ）を調製する。これは、極度に吸湿性の化学物質であり、製造元の安全性の指示書が厳格に適用されなければならない。次いでストック溶液を希釈して０．１ｍｌのＭＳ２Ｄ８Ｍ中、３０μｇのポリブレンの最終濃度を得る。
（３）所望の濃度の形質転換ＤＮＡ（プラスミドＤＮＡと修飾されたｓｓＤＮＡ  ＳＣＮＡ）を０．４ｍｌのＭＳ２Ｄ８Ｍに懸濁する。
（４）再浮遊させたプロトプラストと０．１ｍｌ（３０μｇ）のポリブレンを混合し、６０ｍｍのペトリ皿に移す。
（５）直ちに０．４ｍｌのＤＮＡ懸濁液を加える（一滴ずつ）。プロトプラスト／ポリブレン／ＤＮＡ混合物（総容量１．０ｍｌ）を旋回振盪器にて１５分間、穏やかに回転し（２５ｒｐｍ）、次いで２８℃にて６時間インキュベートする。
（６）６時間のインキュベートの後、４．０ｍｌのＭＳ２Ｄ８Ｍ中で上記混合物を希釈し、ペトリ皿を密閉し、一過性の遺伝子発現のアッセイ又は安定な形質転換体の選抜のための手順に従う。
検出
【０１５９】
ポリブレンによる形質移入の３日後、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を用いたフローサイトメータによって、ＭＳ２Ｄ８Ｍに浮遊させた形質移入されたトウモロコシのプロトプラストを解析する。ＧＦＰは５３０／３０のフィルターによって検出される放射と共に４８８ｎｍでの励起によって検出される。
閾値及び補正因子を設定して偽陽性を排除する。ＦＡＣＳを用いてさらなる解析にために標的とされた細胞を分離する。
プロトプラストを、ゲノムＤＮＡの抽出、及び以下のプライマー１Ｆ及び１Ｒを用いたＰＣＲによるその増幅、及びＰＣＲ産物のＢｓｐＨＩによるその後の消化による解析に供する。野生型に多少類似するサイズのＢｓｐＨＩで切断できない産物は、所望のような標的への挿入の結果生じた不正確な再ライゲーション、さらに大きなサイズのＰＣＲ産物に加えて、正確なターゲッティング事象から生じる。
プライマー１Ｆ：ＧＡＧＣＴＡＧＡＴＡＧＣＡＧＡＴＧＣＡＧＡＴ（配列番号４４）
プライマー１Ｒ：ＣＴＣＣＡＧＡＡＡＡＴＣＣＣＴＡＧＡＡＡＣＡ（配列番号４５）
或いは、ＰＣＲ産物を、ＳＵＲＶＥＹＯＲ変異検出キット（米国、Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ）における指示書に従ってＣＥＬ１酵素変異検出アッセイに供する。このアッセイを用いて、プログラムされた分子複合体による遺伝子ターゲッティングによってＩＰＫ１ＤＮＡの変異の有効性を評価する。
【０１６０】
実験２のための供与体の配列：ＧＦＰはＩＰＫ１配列に融合されるので、ＧＦＰの発現は正確な相同組換え（ＨＲ）によってのみ生じることができる。供与体全体の配列は配列番号４６に示される。組換えに必要なＩＰＫ１に相同の配列は配列番号４６のヌクレオチド１〜６２１及び１９６０〜２６１０であり、ＧＦＰカセットはヌクレオチド６２２〜１９５９によってコードされる。
実験２Ｂ：ＩＰＫのノックアウト及びＢａｒの挿入、カルスへの送達
【０１６１】
この実験では、トウモロコシ植物におけるゲノムＤＳＢ、及びノックアウト変異を形成するビアラホス（ホスフィノトリシン；グルヒシネートアンモニウム；その類似体又はたとえば、Ｂａｓｔａ、Ｂａｙｅｒ  Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉｅｎｃｅのような市販の除草剤）に耐性を付与する除草剤ｂａｒ耐性遺伝子のＩＰＫ１遺伝子への特異的な統合、及びＩＰＫ１遺伝子座におけるｂａｒの発現を調べる。プログラムされた分子複合体は、相同組換えを介した供与体ＤＮＡのＩＰＫ１遺伝子への統合を開始するＩＰＫ１配列におけるゲノムＤＳＢを形成する。
本実施例は、ＤＮＡ衝撃によって形質転換され、次いでビアラホス（Ｂａｓｔａ）選抜下で生長させるトウモロコシのカルスで実施する。
操作プロトコール
【０１６２】
（１）胚性カルスの形成：未成熟の胚１．６ｍｍ〜１．８ｍｍ（植物A１８８ＸＢ７３又はＡ１８８ＸＢ８４）の増殖条件：２ｍｇ／Ｌグリシン、２．９ｇ／ＬのＬ−プロリン、１００ｍｇ／Ｌカゼイン加水分解物、１３．２ｍｇ／Ｌのジカンバ又は１ｍｇ／Ｌの２，４Ｄ、２０ｇ／Ｌスクロース、ｐＨ５．８を含有し、２ｇ／ＬのＧｅｌｇｒｏによって固化されたＮ６培地にて照明、１０マイクロアインシュタイン／ｍ２／秒、２４℃。
（２）Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍら、１９９０によって使用された方法に基づくプラスミドＤＮＡと修飾されたｓｓＤＮＡ−ＳＣＮＡのカルスへの衝撃移入。
（３）培地（B0178 Gold Biotechnology, 1328 Ashby Rd., St. Louis, MO 63132 U.S.A）におけるビアラホスの最終濃度２．５ｍｇ／Ｌと共に実施例２Ａに記載されたようにカルスを増殖培地に移す。
（４）２週間ごとにカルスを新しい培地に移動させる。
（５）ビアラホスにて２ヵ月増殖させたカルスは除草剤に耐性であり、ＰＣＲ解析又は再生に供することができる。
（６）再生された植物は双方ともＢａｓｔａに耐性であり、フィチン酸塩のレベルは低い。
検出及び解析
【０１６３】
修飾されたｓｓＤＮＡ−ＳＣＮＡとプログラム可能な分子複合体タンパク質部分をコードするプラスミドとｂａｒ耐性ＣＤＳ発現カセットを含有する供与体ＤＮＡによって衝撃形質移入されたカルスを、２．５ｍｇ／Ｌのビアラホスを含有する再生培地で増殖させる。ｂａｒ遺伝子コーディング配列がＨＲを介してＩＰＫ１に統合された細胞を含むカルスのみがこれらの条件下で増殖することができるので、１ヵ月後増殖している植物材料は所望のようにゲノムが修飾されていると思われる。
【０１６４】
この設計によって、ｂａｒ耐性カセットがＨＲによってゲノムに統合し、適切に機能する一方で、コリネバクテリウムのジフテリア毒素Ａ（ＤＴ−Ａ）カセットは、熱ショック（ＨＳ）条件下（４２℃）でＤＴ−Ａを発現する自律的なカセットである。従って、さらなる解析については、カルスをＨＳ誘導のカルスと非誘導のカルスに分ける。無作為に統合されたプラスミドを含有し、供与体ＤＮＡとＤＴ−Ａのカセット双方を含有するカルスはＤＴ−Ａを発現し、その結果死ぬ。
さらに、実施例２Ａで示したプライマー１Ｆ及び１Ｒを用いたＰＣＲ解析、その後の上記のようなＢｓｐＨＩによる産物の消化にカルスを供する。
実験２Ｂのための供与体の配列
【０１６５】
供与体プラスミドは、ＩＰＫ１の切断部位を挿入されるべきｂａｒ耐性カセットと非特異的な統合事象のマーカーとしてＩＰＫ１遺伝子座に組み換えるべきではないＤＴ−Ａカセットの双方を含有する。ｂａｒ耐性カセットはＨＲに必要なＩＰＫ１（配列番号４７のヌクレオチド１〜６２１及び２３３８〜２９８８）に相同の配列に隣接する一方で、ＤＴ−Ａカセットは相同配列に隣接する部位の外側に位置する。ｂａｒ耐性カセット（配列番号４７のヌクレオチド６２２〜２３３７）は、ＣａＭｖ３５Ｓの構成的プロモータ；グルフォシネートアンモニウム耐性を付与するホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼのためのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓのｂａｒ遺伝子ＣＤＳ（配列番号４７のヌクレオチド１５２６〜２０７８）；及びｂａｒＣＤＳの下流でのＮＯＳターミネータを含有する。２Ｂ供与体の配列は配列番号４７に示される。
【０１６６】
同一プラスミドにて、熱ショック誘導性のプロモータ（ＧｅｎｂａｎｋからのシロイヌナズナのＨＳプロモータＨＳＰ１８．２：Ｘ１７２９５．１）の制御下でジフテリア毒素Ａ、ＤＴ−Ａ（Ｇｅｎｂａｎｋから：ＡＢ５３５０９６．１）コードし、ＮＯＳターミネータで終結する第２のカセットは配列番号４８で示す配列を有する。
実施例３：シロイヌナズナの生細胞における所定の染色体二本鎖切断（ＤＳＢ）の誘導
【０１６７】
酵素、フィトエン不飽和化酵素（ＰＤＳ）はカロテノイドの生合成におけるフィトエンのゼータ−カロテンへの変換に関与する。シロイヌナズナのフィトエン不飽和化酵素の破壊はアルビノ及び矮小の表現型を生じる。この表現型は、クロロフィル、カロテノイド及びジベレリンの生合成の損傷によって説明される。従って、この遺伝子における変異は表現型で検出可能である。
実験３Ａ
【０１６８】
本実施例では、フレームシフトを介して点突然変異を創るために内在性ＰＤＳ遺伝子における染色体二本鎖切断（ＤＳＢ）を特異的に誘導するので、ＮＨＥＪ内在性経路を利用することによる遺伝子の機能をノックアウトする。
実験３Ｂ
【０１６９】
本実施例では、ｍＣｈｅｒｒｙ供与体配列の内在性ＰＤＳ配列への挿入を創り出してプログラム可能な分子複合体を用いた支援型相同組換えによってＰＤＳをノックアウトするために、内在性ＰＤＳ遺伝子にて染色体二本鎖切断（ＤＳＢ）を特異的に誘導する。
【０１７０】
実施例３Ａ〜３Ｂについては、シロイヌナズナのプロトプラストに基づくバイオアッセイを使用する。このバイオアッセイでは、プロトプラストには、生体内で分子複合体のタンパク質部分を発現するプラスミドが送達され、本実施例では、末端フルオレセイン（６−カルボキシ−フルオレセイン、６−ＦＡＮ）によって修飾されたｓｓＤＮＡの特異性付与核酸（ＳＣＮＡ）の対が同時送達され、各ＳＣＮＡはそのような修飾を３’末端又は５’末端のいずれかで有する（それぞれ、／３６−ＦＡＭ及び／５６ＦＡＭ）。ホスホロチオエートのようなエンドヌクレアーゼ保護のための第２の修飾は、エンドヌクレアーゼ保護のための内部ホスホロチオエート結合はあり得るので、反対側の末端に付加する。本実施例では、タンパク質部分のコーディング配列及び供与体ＤＮＡはＰＥＧ形質移入プロトコール（Wu et al., 2009）を用いて単一プラスミドに同時に送達される。修飾されたｓｓＤＮＡ−ＳＣＮＡは合成で作製し、上記のＰＥＧを用いたプラスミドと一緒に送達される。
タンパク質の配列及び特性
【０１７１】
本実施例では、プラスミドにコードされるタンパク質部分は、機能性ドメインとしてのＦｏｋ１ヌクレアーゼドメインから適合させたアミノ酸配列と；連結ドメインとしての、抗フルオレセイン単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）免疫グロブリン（タンパク質データバンク受入コード１Ｘ９Ｑ、１ＦＬＲ＿Ｈ）から適合させたアミノ酸配列と；核局在化ドメインとしてのＳＶ４０ＮＬＳ（配列番号３、ＰＫＫＫＲＫＶ）と約１５Åのドメイン間接続要素（配列番号７、ＧＧＳＧＧ）を含有する。
従って、本実施例で記載される分子複合体のタンパク質部分は配列番号４９に示されるようなアミノ酸配列を有し、配列番号５０に示されるようなヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１７２】
本実施例の特異性付与核酸（ＳＣＮＡ）は、各ＳＣＮＡの一方の末端でＣ６リンカーを含むフルオレセイン-ｓｃＦｖ／６−ＦＡＭ、６−カルボキシフルオレセイン−フルオレセインｄＴによって修飾される。
ＳＣＮＡの特性及び配列
【０１７３】
ＳＣＮＡの設計は実施例１で記載されたように必須である。相補性で標的と塩基対形成するオリゴヌクレオチドのＳＣＮＡの長さは、優先的には少なくとも１８塩基である。ＳＣＮＡは、６−ＦＡＭ末端修飾因子と標的に相補性のヌクレオチドとの間でスペーサーとして役立つ配列組成物の少数（たとえば、１〜６、一例では６、他の例では２）の標的と塩基対形成しないヌクレオチド（Ｎ’）も含有することができる。
標的配列
【０１７４】
標的配列は、シロイヌナズナのＰＤＳ配列（ＧＩ：５２８０９８５，遺伝子ｄｌ３１４５ｃ，タンパク質ｉｄ＝“ＣＡＢ１０２００．１）のエクソン２に位置するＧＴＣＣＴＧＣＴＡＡＧＣＣＴＴＴＧＡＡＡＧ（配列番号５１）である。
ＳＣＮＡ配列の選択肢
【０１７５】
ＳＣＮＡはいずれかの鎖が標的とされ得るので、示される標的については、４つのＳＣＮＡ対形成の選択肢が存在する：
センス（Ｓ）ＳＣＮＡ：
ＰＤＳ−ＳＬ１−８４６：ＧＣＡＴＣＣＴＴＣＣＧＴＡＧＴＧＣＴＣＣＴＣＮＮＮＮＮＮ／３６−ＦＡＭ／（核酸のみが本明細書では配列番号５２として指定される）
ＰＤＳ−ＳＲ１−８６８：／５６−ＦＡＭ／ＮＮＮＮＮＮＴＴＧＴＡＡＴＴＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＧＴＡＴ（核酸のみが本明細書では配列番号５３として指定される）
アンチセンス（ＡＳ）ＳＣＮＡ：
ＰＤＳ−ＡＳＬ１−８４６：／５６−ＦＡＭ／ＮＮＮＮＮＮＧＡＧＧＡＧＣＡＣＴＡＣＧＧＡＡＧＧＡＴＧＣ（核酸のみが本明細書では配列番号５４として指定される）
ＰＤＳ−ＡＳＲ１−８６８：ＡＴＡＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＡＴＴＡＣＡＡＮＮＮＮＮＮ／３６−ＦＡＭ／（核酸のみが本明細書では配列番号２１７として指定される）
混合された鎖ＳＣＮＡ：
ＰＤＳ−ＳＬ１−８４６：ＧＣＡＴＣＣＴＴＣＣＧＴＡＧＴＧＣＴＣＣＴＣＮＮＮＮＮＮ／３６−ＦＡＭ／（核酸のみが本明細書では配列番号５２として指定される）
ＰＤＳ−ＡＳＲ１−８６８：ＡＴＡＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＡＴＴＡＣＡＡＮＮＮＮＮＮ／３６−ＦＡＭ／（核酸のみが本明細書では配列番号２１７として指定される）
ＰＤＳ−ＳＲ１−８６８：／５６−ＦＡＭ／ＮＮＮＮＮＮＴＴＧＴＡＡＴＴＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＧＴＡＴ（核酸のみが本明細書では配列番号５３として指定される）
ＰＤＳ−ＡＳＬ１−８４６：／５６−ＦＡＭ／ＮＮＮＮＮＮＧＡＧＧＡＧＣＡＣＴＡＣＧＧＡＡＧＧＡＴＧＣ（核酸のみが本明細書では配列番号５４として指定される）
【０１７６】
予想結果に従って２４ｂｐの標的ギャップとさらに短いＳＣＮＡリンカーを採用する対形成した「Ｒ」と「Ｌ」のＳＣＮＡの組み合わせの第２のセット：
ＰＤＳ−ＳＬ2−８４５：ＴＧＣＡＴＣＣＴＴＣＣＧＴＡＧＴＧＣＴＣＣＴＮＮ／３６−ＦＡＭ／（核酸のみが本明細書では配列番号５５として指定される）
ＰＤＳ−ＳＲ2−８７０：／５６−ＦＡＭ／ＮＮＧＴＡＡＴＴＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＧＴＡＴＧＴ（核酸のみが本明細書では配列番号５６として指定される）
ＰＤＳ−ＡＳＬ2−８４５：／５６−ＦＡＭ／ＮＮＡＧＧＡＧＣＡＣＴＡＣＧＧＡＡＧＧＡＴＧＣＡ（核酸のみが本明細書では配列番号５７として指定される）
ＰＤＳ−ＡＳＲ2−８７０：ＡＣＡＴＡＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＡＴＴＡＣＮＮ／３６−ＦＡＭ／（核酸のみが本明細書では配列番号５８として指定される）
ＰＤＳ−ＳＬ2−８４５：ＴＧＣＡＴＣＣＴＴＣＣＧＴＡＧＴＧＣＴＣＣＴＮＮ／３６−ＦＡＭ／（核酸のみが本明細書では配列番号５５として指定される）
ＰＤＳ−ＡＳＲ2−８７０：ＡＣＡＴＡＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＡＴＴＡＣＮＮ／３６−ＦＡＭ／（核酸のみが本明細書では配列番号５８として指定される）
PＤＳ−ＳＲ2−８７０：／５６−ＦＡＭ／ＮＮＧＴＡＡＴＴＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＧＴＡＴＧＴ（核酸のみが本明細書では配列番号５６として指定される）
ＰＤＳ−ＡＳＬ2−８４５：／５６−ＦＡＭ／ＮＮＡＧＧＡＧＣＡＣＴＡＣＧＧＡＡＧＧＡＴＧＣＡ（核酸のみが本明細書では配列番号５７として指定される）
／５６−ＦＡＭは、６−ＦＡＭ（６−カルボキシ−フルオレセイン）から構成されるＳＣＮＡｓｓＤＮＡの５’修飾を記号で示す。／３６−ＦＡＭは、６−ＦＡＭ（６−カルボキシ−フルオレセイン）から構成されるＳＣＮＡｓｓＤＮＡの３’修飾を記号で示す。Ｎは任意のヌクレオチドを記号で示す。
供与体の配列は、配列番号５９で示されるような配列を有するＤＯＮＯＲ  ＰＤ−ＭＣＨＥＲＲＹ−Ｓである（ｍＣｈｅｒｒｙをコードするＯＲＦは配列番号５９のヌクレオチド６６２〜１３７２である）。
送達
【０１７７】
バイオアッセイの設定：シロイヌナズナのプロトプラストの調製はＷｕら、２００９年に基づき、実施例１に類似するが、形質移入工程が異なる。
形質移入
（１）２ｍｌ試験管内にて形質移入用の新しいＰＥＧ溶液を作る。
（２）６穴プレートからＢＳＡを捨て、乾かす。
（３）１５ｍｌの丸底（スナップ式のキャップ）試験管にてＲＴで、供与体プラスミドＤＮＡ（関連する場合）、タンパク質部分を発現するプラスミドＤＮＡ及びＳＣＮＡｓｓＤＮＡの総量３０〜４０μｇまでの混合物と０．２ｍｌのＭＭｇ溶液中の約５×１０４（２×１０４〜１×１０５）のプロトプラストを混合する。或いは、供与体ＤＮＡとタンパク質部分を発現するＤＮＡを構築し、単一プラスミドに供給する。
（４）等量（０．２ｍｌのプロトプラスト＋ｍｉｄｉｐｒｅｐ容量）の新しいＰＥＧ溶液を加える。
（５）ＲＴで５分間インキュベートする。
（６）３ｍｌのＷ５溶液をゆっくり加えて洗浄し、１度に１ｍｌ加え、混合する。
（７）スイングアウトロータにて１００×ｇで１分間遠心する。
（８）洗浄と遠心を繰り返す。
（９）１ｍｌのＷ５溶液に再浮遊する。
（１０）ＢＡＳをコーティングしたプレートに注ぐ。
（１１）２２℃にて１日１６時間最適照明（１５０マイクロアインシュタイン・ｍ−２・ｓ−１）にてプロトプラストを生長させ、必要に応じて培地を交換する。
解析
【０１７８】
実験３Ａでは、プールしたプロトプラストからのＤＮＡをＰＣＲ及びＰＣＲ産物の制限断片解析によって解析する。
ＰＣＲはプライマー：
ＰＣＲプライマー２Ｆ：ＴＧＧＴＴＧＴＧＴＴＴＧＧＧＡＡＴＧＴＴＴＣＴ（配列番号６０）
ＰＣＲプライマー２Ｒ：ＴＡＴＣＣＡＡＡＡＧＡＴＡＴＣＴＴＣＣＡＧＴＡＡＡＣ（配列番号６１）によって実施する。
【０１７９】
増幅したＤＮＡの少なくとも一部における制限酵素ＤｄｅＩによる切断の消滅は少なくとも一部の上手く行った遺伝子ターゲッティング及びゲノム鋳型の部位特異的変異を示す。
【０１８０】
実験３Ｂでは、ｍＣｈｅｒｒｙをコードする供与体ＤＮＡはインフレームで内在性のＰＤＳ遺伝子に融合される。この遺伝子から作出されるｍＲＮＡは、完全なｍＣｈｅｒｒｙと直後に続く停止コドンに融合された、破壊されたＰＤＳ（「ＰＤ−ｍＣｈｅｒｒｙ」）をコードする。Ｗ５溶液に浮遊させたプロトプラストは自動フローサイトメータ（ＦＡＣＳ）機器を用いて形質移入の３日後、ｍＣｈｅｒｒｙ活性についてスクリーニングされる。ＰＤＳを修飾したプロトプラストはＦＡＣＳ解析によって検出され、その際、５６１ｎｍの励起波長を用いたｍＣｈｅｒｒｙの蛍光と５９０〜６３０ｎｍの放射の検出によって検出可能である。閾値及び補正因子を設定して偽陽性を排除する。
【０１８１】
双方の実験におけるさらなる性状分析は、好適な培地にてプロトプラストを再生し、その後の表現型特性を調べることによって達成され、白化した植物又はカルスが成功した遺伝子ターゲッティングを示す。
実施例４：双子葉植物タバコにおける生体内のゲノムＤＮＡターゲッティング及び遺伝子置換
【０１８２】
タバコにおけるＡＬＳの置換及び除草剤耐性植物の作出：アセトラクターゼシンターゼ（ＡＬＳ）は植物におけるバリン、ロイシン及びイソロイシンの生合成経路の酵素である。この遺伝子における変異は幾つかの除草剤への耐性を生じる。たとえば、タバコにおけるＳｕＲＢ遺伝子の変異は、以下の除草剤：Ｓ６４７Ｔ／イマザキン、Ｐ１９１Ａ／クロロスルフロン、Ｗ５６８Ｌ／クロロスルフロン及びイマザキンに対する耐性を提供することが示されている。
【０１８３】
本実施例では、支援型相同組換えが介在する遺伝子置換によって野生型遺伝子を除草剤認容変異型で置き換えるためにＡＬＳを標的とする。
タバコ植物体におけるプログラムされた分子複合体の発現及び集合はここでは２工程で実施する。タンパク質部分の送達は、植物体でのプログラム可能なタンパク質部分の送達及び発現のためのｐＴＲＶ２（Vainstein et. al., 2011）から修飾されたベクターのようなタバコ茎壊疽ウイルス（ＴＲＶ）に基づいたウイルスタンパク質発現ベクターでタバコ植物体を感染させることによって達成される。
【０１８４】
タンパク質部分を発現する植物体へのＳＣＮＡの送達は、ＲＮＡ−ＳＣＮＡの対と供与体配列の双方をコードするＴ−ＤＮＡを運ぶアグロバクテリウムで植物を感染させることによって達成される。
【０１８５】
本実施例のＲＮＡ−ＳＣＮＡは、図１Ｂで模式的に例示した「ＳＣＮＡヌクレオチドモチーフ」としてのバクテリオファージＰｈｉ２１からの２０量体のボックスＢのＲＮＡヘアピン結合配列（配列番号６２：５’−ＵＵＣＡＣＣＵＣＵＡＡＣＣＧＧＧＵＧＡＧ−３’）を用いて分子複合体のタンパク質部分の連結ドメインを結合する。
【０１８６】
本実施例の連結ドメインは、ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）バクテリオファージＰｈｉ２１のＮタンパク質（配列番号６３：Ｎ’−ＧＴＡＫＳＲＹＫＡＲＲＡＥＬＩＡＥＲ−Ｃ’）に由来する。ここで示される本実施例では、ヘアピンは標的上ではなくＳＣＮＡ上にあるので、結合タンパク質は、標的ＲＮＡ自体の特定の認識部位に限定されず、非可変のＲＢＰ結合ヘアピンに隣接する可変ＳＣＮＡ標的塩基対形成配列に専ら応じて、ＤＮＡを含む任意の配列を標的とするのに使用することができる。
【０１８７】
本実施例の標的核酸（遺伝子）はＳｕＲＢ（ＧｅｎＢａｎｋ受入ＧＩ：１９７７８）であり、所望のアミノ酸変異は、クロロスルフロン耐性を付与するＰ１９１Ａである。
従って、
変化しない元々の配列：ＧＧＴＣＡＡＧＴＧＣＣＡＣＧＴＡＧＧＡＴＧ（配列番号６４）
誘導された変異：ＧＧＴＣＡＡＧＴＧＧＣＧＣＧＣＡＧＧＡＴＧ（配列番号６５）
タンパク質部分の成分の配列
【０１８８】
成分
（１）完全長Ｎタンパク質のＮ’末端又はその近傍のバクテリオファージＰｈｉ２１のＮタンパク質（配列番号６３：Ｎ’−ＧＴＡＫＳＲＹＫＡＲＲＡＥＬＩＡＥＲ−Ｃ’）。ＲＮＡ結合タンパク質はＮ末端に位置する。
（２）ＦｏｋＩヌクレアーゼ（ＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＱＲＹＶＥＥＮＱＴＲＮＫＨＩＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＨＩＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦ）（配列番号６６）
（３）ＳＶ４０-ＮＬＳ（配列番号６７：ＭＰＫＫＫＲＫＶ）
（４）ドメイン間の接続要素：種々のポリアミノ酸リンカーがプログラムされた分子複合体の最適な機能について調べられる。
【０１８９】
本実施例では、タンパク質集合について２つの選択肢が調べられる。
（１）Ｐｈｉ２１のＮタンパク質がプログラム可能な分子構築物のタンパク質部分のＮ末端で集合し、核局在化シグナル、ＳＶ４０ＮＬＳがＣ末端に位置し、ドメイン間リンカーがＧＧＳＧＧ（配列番号７）である第１の選択肢（配列番号６８で示されるような）。このタンパク質集合は配列番号６９で示されるような核酸配列によってコードされる。
【０１９０】
本実施例で示すように、ボックスＢのＲＮＡヘアピン系及びＧＧＳＧＧＥＳＫ（配列番号７４）のドメイン間リンカーと併せたＣ’Ｐｈｉ２１ＮＰ型についてのコンピュータ化３Ｄモデルから得られた空間測定によって、ＳＣＮＡ間の予想される最適な距離が、ＳＣＮＡにて単一の「Ｎ」の存在下で約２６〜３０ヌクレオチドであることを得た。切断は、いずれかの側でＳＣＮＡとの最後のヌクレオチドのハイブリッド形成後に数え始め、二量体化構築物によるｄｓＤＮＡの切断によって創られる４塩基の５’オーバーハングを考慮に入れて、１３番目〜１７番目のヌクレオチドの左及び右に約±２ヌクレオチドで生じると予想される。この基準は、標的とされる配列が、本実施例で２８ヌクレオチド：ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＸＸＸＸＸＸＸＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣであるならば、Ｙ＋ＸがＳＣＮＡ塩基対形成部位間でのヌクレオチドの数を表す場合、設計されたＳＣＮＡは領域ＡとＣと塩基対形成し、ＤＳＢを生じる切断はＸ領域にある又は隣接することを示唆している。ＳＣＮＡはセンス鎖又はアンチセンス鎖に相補性であることができるが、好ましくは、センス（転写されない）配列と塩基対形成するように選択される。タンパク質部分の位置が、「末端近傍」にあるプライマーの５’又は３’の修飾によって定義されるようにＳＣＮＡの「末端近傍」に位置するので、ＳＣＮＡは双方とも同一鎖と塩基対形成することができる。
ＳＣＮＡ配列の選択肢
【０１９１】
ＳＣＮＡは、いずれかの鎖で切断されるべきである標的部位に隣接する配列に塩基対形成するので、示される標的については２８ｂｐの標的ギャップを利用する：４つのＳＣＮＡの対形成の選択肢が存在する：
センス（Ｓ）ＳＣＮＡ対
ＳｕＲＢ＿Ｐ１９１＿ＳＲ１５８６：
ＵＵＣＡＣＣＵＣＵＡＡＣＣＧＧＧＵＧＡＧＮＧＧＵＡＣＵＧＡＵＧＣＵＵＵＵＣＡＧＧＡＡＡ（配列番号７０）
ＳｕＲＢ＿Ｐ１９１＿ＳＬ１５５７：
ＡＵＡＧＣＧＵＣＣＣＣＡＵＵＧＵＵＧＣＵＡＵＮＵＵＣＡＣＣＵＣＵＡＡＣＣＧＧＧＵＧＡＧ（配列番号７１）
アンチセンス（ＡＳ）ＳＣＮＡ対
ＳｕＲＢ＿Ｐ１９１＿ＡＳＲ１５８６：
ＵＵＵＣＣＵＧＡＡＡＡＧＣＡＵＣＡＧＵＡＣＣＮＵＵＣＡＣＣＵＣＵＡＡＣＣＧＧＧＵＧＡＧ（配列番号７２）
ＳｕＲＢ＿Ｐ１９１＿ＡＳＬ１５５７：
ＵＵＣＡＣＣＵＣＵＡＡＣＣＧＧＧＵＧＡＧＮＡＵＡＧＣＡＡＣＡＡＵＧＧＧＧＡＣＧＣＵＡＵ（配列番号７３）
【０１９２】
そして、右（Ｒ）１つ及び左（Ｌ）１つのＳＣＮＡを常に選択するセンス及びアンチセンスの対の組み合わせのすべて。
【０１９３】
本実施例で調べられ、タンパク質のＣ’でのＰｈｉ２１Ｎタンパク質及びタンパク質部分のＮ’でのＳＶ４０ＮＬＳと集合するタンパク質集合の第２の選択肢。この構築物では、配列ＧＧＳＧＧＥＳＫ（配列番号７４）のドメイン間接続要素が使用される。
【０１９４】
本実施例の集合したＰｈｉ２１ＮＰに基づくプログラム可能なタンパク質部分は配列番号７５で示されるようなアミノ酸配列を有し、配列番号７６で示されるような核酸配列によってコードされる。
【０１９５】
本実施例で使用されるように、ボックスＢのＲＮＡヘアピン系及びＧＧＳＧＧＥＳＫ（配列番号７４）のドメイン間リンカーと併せたＣ’Ｐｈｉ２１ＮＰ型についてのコンピュータ化３Ｄモデルから得られた空間測定の結果によって、ＳＣＮＡ間の予想される最適な距離が、ＳＣＮＡにて１Ｎの存在下で約２２〜２４ヌクレオチドであることを得た。切断は、いずれかの側でＳＣＮＡとの最後のヌクレオチドのハイブリッド形成後に数え、二量体化構築物によるｄｓＤＮＡの切断によって創られる４塩基の５’オーバーハングを考慮に入れて、１１、１２又は１３番目のヌクレオチドの左及び右に約±２ヌクレオチドで生じると予想される。この基準は、標的とされる配列がこの２３ヌクレオチドの例：ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＹＹＹＹＹＹＹＹＸＸＸＸＸＸＸＹＹＹＹＹＹＹＹＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣであるならば、Ｙ＋ＸがＳＣＮＡ塩基対形成部位間でのヌクレオチドの数を表す場合、設計されたＳＣＮＡは領域ＡとＣと塩基対形成し、ＤＳＢを生じる切断はＸ領域にある又は隣接することを示唆している。ＳＣＮＡはセンス鎖又はアンチセンス鎖に相補性であることができるが、好ましくは、センス（転写されない）配列と塩基対形成するように選択される。タンパク質部分の位置が、「末端近傍」にあるプライマーの５’又は３’の修飾によって定義されるようにＳＣＮＡの「末端近傍」に位置するので、ＳＣＮＡは双方とも同一鎖と塩基対形成することができる。
ＳＣＮＡ配列の選択肢
【０１９６】
ＳＣＮＡは、いずれかの鎖で切断されるべきである標的部位に隣接する配列に塩基対形成し、３１ｂｐの標的ギャップを利用し、結果的に４つのＳＣＮＡの対形成の選択肢を生じる。
センス（Ｓ）ＳＣＮＡ対
ＳｕＲＢ＿Ｐ１９１＿ＳＲ１−５８８：ＵＵＣＡＣＣＵＣＵＡＡＣＣＧＧＧＵＧＡＧＵＡＣＵＧＡＵＧＣＵＵＵＵＣＡＧＧＡＡＡＣＵ（配列番号７７）
ＳｕＲＢ＿Ｐ１９１＿ＳＬ１−５５６：ＧＡＵＡＧＣＧＵＣＣＣＣＡＵＵＧＵＵＧＣＵＡＵＵＣＡＣＣＵＣＵＡＡＣＣＧＧＧＵＧＡＧ（配列番号７８）
アンチセンス（ＡＳ）ＳＣＮＡ対
ＳｕＲＢ＿Ｐ１９１＿ＡＳＲ１−５８８：ＡＧＵＵＵＣＣＵＧＡＡＡＡＧＣＡＵＣＡＧＵＡＵＵＣＡＣＣＵＣＵＡＡＣＣＧＧＧＵＧＡＧ（配列番号７９）
ＳｕＲＢ＿Ｐ１９１＿ＡＳＬ１−５５６：ＵＵＣＡＣＣＵＣＵＡＡＣＣＧＧＧＵＧＡＧＵＡＧＣＡＡＣＡＡＵＧＧＧＧＡＣＧＣＵＡＵＣ（配列番号８０）
センス及びアンチセンスの対の組み合わせ
ＳｕＲＢ＿Ｐ１９１＿ＳＲ１−５８８：ＵＵＣＡＣＣＵＣＵＡＡＣＣＧＧＧＵＧＡＧＵＡＣＵＧＡＵＧＣＵＵＵＵＣＡＧＧＡＡＡＣＵ（配列番号７７）
ＳｕＲＢ＿Ｐ１９１＿ＡＳＬ１−５５６：ＵＵＣＡＣＣＵＣＵＡＡＣＣＧＧＧＵＧＡＧＵＡＧＣＡＡＣＡＡＵＧＧＧＧＡＣＧＣＵＡＵＣ（配列番号８０）
ＳｕＲＢ＿Ｐ１９１＿ＳＬ１−５５６：ＧＡＵＡＧＣＧＵＣＣＣＣＡＵＵＧＵＵＧＣＵＡＵＵＣＡＣＣＵＣＵＡＡＣＣＧＧＧＵＧＡＧ（配列番号７８）
ＳｕＲＢ＿Ｐ１９１＿ＡＳＲ１−５８８：ＡＧＵＵＵＣＣＵＧＡＡＡＡＧＣＡＵＣＡＧＵＡＵＵＣＡＣＣＵＣＵＡＡＣＣＧＧＧＵＧＡＧ（配列番号７９）
予想結果に従って２４ｂｐの標的ギャップとさらに短い（単一Ｎ）ＳＣＮＡリンカーを採用する対形成した「Ｒ」と「Ｌ」のＳＣＮＡの組み合わせの第２のセット：
センス（Ｓ）：
ＳＵＲＢ＿Ｐ１９１＿ＳＲ2−５８４：ＵＵＣＡＣＣＵＣＵＡＡＣＣＧＧＧＵＧＡＧＮＵＣＧＧＵＡＣＵＧＡＵＧＣＵＵＵＵＣＡＧＧＡ（配列番号８１）
ＳＵＲＢ＿Ｐ１９１＿ＳＬ２−５６０：ＧＣＧＵＣＣＣＣＡＵＵＧＵＵＧＣＵＡＵＡＡＣＮＵＵＣＡＣＣＵＣＵＡＡＣＣＧＧＧＵＧＡＧ（配列番号８２）
アンチセンス（ＡＳ）：ＳｕＲＢ＿Ｐ１９１＿ＡＳＲ２−５８４：
ＵＣＣＵＧＡＡＡＡＧＣＡＵＣＡＧＵＡＣＣＧＡＮＵＵＣＡＣＣＵＣＵＡＡＣＣＧＧＧＵＧＡＧ（配列番号８３）
ＳｕＲＢ＿Ｐ１９１＿ＡＳＬ２−５６０：ＵＵＣＡＣＣＵＣＵＡＡＣＣＧＧＧＵＧＡＧＮＧＵＵＡＵＡＧＣＡＡＣＡＡＵＧＧＧＧＡＣＧＣ（配列番号８４）
又は第２のセットからの「Ｒ」と「Ｌ」のＳＣＮＡの組み合わせ
ＵＵＣＡＣＣＵＣＵＡＡＣＣＧＧＧＵＧＡＧ（配列番号６２）は、バクテリオファージＰｈｉ２１に由来する２０量体のボックスＢのＲＮＡヘアピン結合断片であり、ＳＣＮＡの連結ドメイン結合断片（図１Ｂにて「ＳＣＮＡヌクレオチドモチーフ」として模式的に示す）として機能する。
ＡＬＳ  ＳＵＲＢ  ＣＤＳ（変化していない）のコーディング配列は配列番号８５に示される。
ＤＯＮＯＲ１  Ｐ１９１Ａ：供与体はヌクレオチド配列を変えてプロリンからアラニン（Ｐ１９１Ａ）の変異を創り、制限酵素解析を可能にしている。この供与体の配列は配列番号８６で示される。変化した配列は配列番号８６のヌクレオチド５４４〜５９１で示されるとおりである。
方法
【０１９７】
本実施例では、天然の宿主植物、ペチュニア、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ又はＮ．Ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの植物体が先ず、ｐＴＲＶ−系の又はｐＴＲＶｄｅｌｔａ２ｂ系のベクター（Vainstein et. al., 2011）によって植菌され、それは本実施例では、ウイルスのサブゲノムのプロモータの制御下でプログラム可能な分子構築物を発現するように設計される。感染の約５〜２１日後、植物の葉を回収し、任意でＳｉｌｗｅｔＬ−７７（約０．０１５％）のような非イオン性の湿潤剤で補完されたリン酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ６．８）にて葉を粉砕することによって、ここでは植菌材として使用される植物樹液を抽出する。遠心及び／又はチーズクロスによる溶液の透明化の後、任意で０．２２μｍのフィルター濾過を行う。濾過は組織培養で増殖した植物への注入に必要である。付随して、ＲＮＡを抽出し、異種遺伝子挿入部位に由来するプライマー３’を用いてＲＮＡを逆転写し、異種遺伝子挿入部位にまたがるプライマーを用いたＰＣＲによってｃＤＮＡを増幅し、植菌に元々用いた同様にＰＣＲで増幅したｐＴＲＶプラスミドと共に並んで電気泳動することによって、ウイルス構築物の安定性について葉の一部を分析する。次いで炭化ケイ素で葉を軽く摩擦し、葉の表面に樹液を擦り付けることによって、約１ヵ月齢のタバコ植物体に感染させる。これらの植物体を試験管内又はその他で増殖させ得る。プログラム可能な分子複合体を運ぶＴＲＶ系の自己複製するベクターが植物体に感染し、葉、分裂組織、及び植菌していない組織及び器官に全身性に広がる。まだプログラムしていない間、前記複合体はヌクレアーゼとして不活性である。
【０１９８】
ＴＲＶ系の自己複製するベクターがいったん植物体全体に全身性に広がると（約５〜７日）、その後、分子複合体のプログラム可能なタンパク質部分を発現し、無菌条件下で葉ディスクを摘出する。Ｇａｌｌｏｉｓ及びＭａｒｉｎｈｏ、１９９５に類似する方法で葉ディスクでの一過性の発現を実施する。手短には、たとえば、ＣａＭｖ３５Ｓ又はＮＯＳ又はＯＣＳのような２つの同一の又は異なる構成的な植物プロモータの制御下でＲＢとＬＢ配列の間にて上記で示される（模式図については図９及び図８Ａも参照）２つのＳｕＲＢ＿Ｐ１９１  ＳＣＮＡの組み合わせの１つをコードし、供与体１のＰ１９１Ａの配列も運ぶバイナリプラスミド（たとえば、ｐＲＣＳ，ｐＳＯＵＰ＋ｐＧｒｅｅｎ又は他の好適なバイナリベクター）で予め形質転換したアグロバクテリウムの好適な株（たとえば、ＥＨＡ１０５）をディスクに真空浸潤させる。ＳＣＮＡは細胞へのＴ−鎖の移入の際、転写され、プログラム可能なタンパク質と集合し、プログラムされた分子複合体を形成し、それは次いで、タバコのゲノムＤＮＡにおけるＳｕｒＢ遺伝子座でそれがＤＳＢを特異的に切断する核に運び込まれる。次いで、Ｔ−ＤＮＡからの供与体ＤＮＡがこのＤＳＢの近傍のＳｕｒＢ遺伝子と組み換え、所望の変異をもたらす。Ｋｏｃｈｅｖｅｎｋｏ(Kochevenko & Willmitzer, 2003)によって記載され、以下のプロトコールで詳述されるように４２０ｎＭのクロロスルフロンを含有する選抜培地に葉ディスクを入れる。好適な抗生剤（カルベニシリン２５０μｇ／ｍｌ＋バンコマイシン２５０μｇ／ｍｌ）によってアグロバクテリウムを殺し、葉ディスクから発生しているカルスを除草剤耐性のゲノム修飾した植物体に生長させる若芽を形成させる。Ｋｏｃｈｅｖｅｎｋｏらによって記載されたように４２０ｎＭのクロロスルフロンを含有するＭｕｒａｓｈｉｇｅ及びＳｋｏｏｇの培地にてクロロスルフロン耐性について再生している植物体をスクリーニングする。クロロスルフロンで増殖する植物体のみが変化したＡＬＳ遺伝子を有するということは、ＡＬＳがプログラムされた分子複合体によって標的とされ、供与体が正しい位置で正しく組換えられたことを示す。
【０１９９】
上手く行った遺伝子置換事象の決定を可能にする解析は、タバコ再生体の一部から抽出したゲノムＤＮＡでＰＣＲを実施することによって達成される。変化した配列にて、ＡｇｅＩ制限酵素部位は消滅し、ＢｓｓＨＩＩ及びＫｐｎＩ部位が加えられる。従って、ＳｕＲＢ遺伝子における置換部位を含むＰＣＲ断片を増幅すること及びＡｇｅＩ、ＢｓｓＨＩＩ及びＫｐｎＩによるＰＣＲ断片の消化は、上手く行った遺伝子置換の認識を可能にする特徴的なパターンを提供する。これらの植物体をさらにスクリーニングして、ＤＮＡ抽出及びＳＣＮＡをコードするＴ−ＤＮＡの非ＳｕＲＢ領域のＰＣＲ増幅によって統合された望ましくないＴ−ＤＮＡを有するものを排除する。
【０２００】
詳細なアグロバクテリウムの形質転換プロトコール
（１）アグロバクテリウムの一晩培養物（ＳＣＮＡ転写物をコードし、供与体ＤＮＡを運ぶバイナリプラスミドで形質転換された）２ｍｌを回収する。
（２）４ｍｌの誘導培地（１Ｌ：１０．５ｇのＫ２ＨＰＯ４、４．５ｇのＫＨ２ＰＯ４、１ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．５ｇのクエン酸ナトリウム、１ｇのグルコース、４ｇのフルクトース、４ｇのグリセロール、０．１２ｇのＭｇＳＯ４、１．９５ｇのＭＥＳ、ｐＨ５．６）に再懸濁し、最終濃度１００μＭでアセトシリンゴンを加える。
（３）３０℃で６時間、増殖させる。
（４）３０００ｇ、８分間の遠心で細菌を回収する。
（５）２００μＭのアセトシリンゴンを含有する浸潤培地（１０ｍＭのＭｇＳＯ４、１０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ５．６）にて最終ＯＤ６００＝０．４で再懸濁する。
（６）４〜１２ｍｍの葉ディスクを取り、細菌浸潤溶液（工程５）にて３０分間インキュベートする。
（７）再生培地（１Ｌ：４．３ｇのＭＳ、３０ｇのスクロース、１００ｍｇのＭｙｏ−イノシトール、ｐＨ５．６、１０ｇの寒天、最終濃度１００μｇ／ＬのＮＡＡ及び３ｍｇ／ＬのＢＡにてＮＡＡ及びＢＡを添加）に葉ディスクを入れる。２０〜２５℃にて４８時間、インキュベートする。
（８）抗生剤カルベニシリン（０．３ｍｇ）及び除草剤クロロスルフロン（４２０ｎＭ）を含有する新しい再生培地に葉ディスクを移す。２１日ごとに新しい培地に移す。
（９）若芽を約１０ｍｍに切断し、発根のために１／２ＭＳ培地に移す（１Ｌ：ＫＯＨ、１０ｇの寒天を伴った２．１５ｇのＭＳ、１０ｇのスクロース、０．５ｇのＭＥＳ、ｐＨ＝５．７）。
実施例５：プログラムされた分子複合体を用いたＤＮＡの標的とされた化学修飾
【０２０１】
本実施例では、所定の位置におけるＤＮＡの特異的なメチル化を調べる。
【０２０２】
ＤＮＡのメチル化は、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニンからシトシン残基の５位にメチル基を移すＤＮＡメチルトランスフェラーゼによって触媒される。３種の活性のあるＤＮＡメチルトランスフェラーゼＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ及びＤＮＭＴ３Ｂがヒト及びマウスで特定されている。これらの例におけるメチル化はＣｐＧ配列のシトシンでのＤＮＡのものである。これらの酵素は、Ｓ−アデノシルメチオニン依存性のメチルトランスフェラーゼ（ＳＡＭ又はＡｄｏＭｅｔ−ＭＴアーゼ）、クラスＩのクラスに属し、ＡｄｏＭｅｔ−ＭＴアーゼはメチル転移の基質としてＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ又はＡｄｏＭｅｔ）を用いる酵素であり、生成物Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（ＡｄｏＨｃｙ）を創る。
ＤＮＭＴ３Ａ
【０２０３】
メチルトランスフェラーゼのＤＮＭＴ１及びＤＮＭＴ３ファミリーはそのＣ末端で高度に保存されたＣ−５メチルトランスフェラーゼモチーフを含有するが、そのＮ末端領域では配列類似性を示さない。ＤＮＭＴ３Ａも脱アセチル化酵素を結合し、配列特異的なリプレッサによって動員されて転写を抑え込む。ＤＮＭＴ３ＡはそのＡＴＲＸ相同性ドメインを用いてヒストン脱アセチル化酵素ＨＤＡＣ１に会合する。ＤＮＭＴ３Ａのこのドメインはそのサイレント化機能がＨＤＡＣ活性を必要とする独立した転写リプレッサドメインを表す。ＤＮＭＴ３Ａは脱アセチル化酵素を運ぶコリプレッサとして作用し、ＤＮＡ結合転写とのその会合を介して特定の調節性の焦点に向けることができる。ＤＮＭＴ３Ａはまた、ＲＰ５８と共同してメチル化に無関係に転写を抑制する。本実施例では、ＳＣＮＡを用いてメチルトランスフェラーゼ活性を特定の遺伝子座に配置する。
【０２０４】
本実施例では、ＤＮＭＴ３ＡのＣ’の一部を用いてメチルトランスフェラーゼに基づくプログラム可能な分子複合体を構築する。ＤＮＭＴ３Ａを、動原体を挟んだヘテロクロマチンに向けるＰＷＷＰドメイン、亜鉛フィンガードメイン、ＡＤＤドメイン、ヒストン脱アセチル化酵素ＨＤＡＣ１と会合するＡＴＲＸ領域、及びタンパク質の調節性Ｎ’部分全部を取り除き、ＡｄｏＭｅｔ＿ＭＴアーゼ領域（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ、Ｑ９Ｙ６Ｋ１）を含む領域を保持する。ＤＮＭＴ３Ａ及びＢのＣ末端は触媒ドメインを含有する。ＤＮＭＴ３Ａでは、活性部位はＣ７１０（番号付けは、翻訳されたＧｅｎＢａｎｋ受入ＡＦ０６７９７２．２に基づく）である。
【０２０５】
ＤＮＭＴ３Ａは、ＤＮＭＴ３Ｌ：ＤＮＭＴ３Ａ：ＤＮＭＴ３Ａ：ＤＮＭＴ３Ｌヘテロ四量体複合体を形成する。ＤＮＭＴ３Ｌはメチラーゼとしては不活性であり、ＤＮＭＴ３Ａは二量体化することができ、ＤＮＭＴ３Ｌなしで活性がある。ＤＮＭＴ３Ａはホモ二量体の形態で機能的である。複合体は、ＤＮＭＴ３Ａホモ二量体界面（二量体界面）で特異的な接触を示し、二量体化は、Ｂ形態ＤＮＡにておよそ１回の螺旋ターンによって分離される２つの酵素活性部位をもたらす。従って、ＳＣＮＡによって特定の遺伝子座に位置付けされるプログラムされた分子複合体の二量体は、約１０〜１１塩基対離れてＣｐＧ部位にてシトシンのメチル化をもたらす。ＤＮＭＴＬとのＤＮＭＴ３Ａの相互作用をさらに制約するために、Ｃ末端のＡｄｏＭｅｔ＿ＭＴアーゼ領域における変異Ｒ７２９Ａを本実施例では使用する。ＤＮＡ上で四量体の代わりに二量体を形成するＤＮＭＴ３Ａの変異は、 Ｒ７７１Ａ、Ｅ７３３Ａ、Ｒ７２９Ａ、Ｆ７３２Ａ及びＹ７３５Ａである。
【０２０６】
所定のＤＮＡ配列にて部位特異的メチル化を行う本実施例の分子複合体の能力を調べるために、標的核酸としてプラスミドを使用する。メチル化感受性制限解析によってｐＳＡＴ６−ｍＣｈｅｒｒｙプラスミドにて、双方の鎖にｍＣｈｅｒｒｙをコードする遺伝子における異なる位置の指示されたメチル化を調べる。
波長５６１ｎｍの励起及び６１０／２０のフィルターによって検出される放射でのＦＡＣＳ解析によって形質移入された細胞を検出する。
タンパク質部分の構築
【０２０７】
本実施例では、送達されるプラスミドにコードされるタンパク質は、ヒトのＤＮＡ（シトシン−５）メチルトランスフェラーゼ３Ａ（ＤＮＭＴ３Ａ  ＰＤＢアクセッション２ＱＲＶを用いて３Ｄ構造を解明する）に基づくメチルトランスフェラーゼの触媒部位を含有するＡｄｏＭｅｔ＿ＭＴアーゼ領域から適合させるアミノ酸配列を含有する。変異Ｒ７２９及びＲ７７１（翻訳されたＧｅｎＢａｎｋＡＦ０６７９７２．２番号付けに基づく）を付加してＤＮＭＴ３Ａの二量体化を破壊することなく又はＫｃａｔを動員することなく調節性ＤＮＭＴＬと共に四量体化を消滅させる。本実施例のメチルトランスフェラーゼ領域のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋＡＦ０６７９７２．２に従って翻訳された）は配列番号８７（ＤＮＭＴ３Ａ  ＡｄｏＭｅｔ＿ＭＴａｓｅ領域Ｒ７２９Ａ）で示される。
【０２０８】
抗フルオレセイン単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）免疫グロブリン（タンパク質データバンク受入コード１Ｘ９Ｑ、１ＦＬＲ＿Ｈ）から適合させたアミノ酸配列を本実施例では連結ドメインとして使用し；ＳＶ４０ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ、配列番号３）を核局在化ドメインとして使用し、柔軟性のドメイン間接続要素（配列番号１４：ＧＳＬＥＧＧＳＧＧ）のようなドメイン間接続要素を本実施例ではその連結のために使用する。タンパク質部分は、配列番号８９に示される核酸配列によってコードされる配列番号８８で示されるアミノ酸配列を有する。
【０２０９】
メチル化アッセイの標的配列は、ｐＳＡＴ６−ＭＣＳ（ＡＹ８１８３８３．１  ＧＩ：５６５５３５９６）のＭＣＳ部位にクローニングされたｍＣｈｅｒｒｙコーディングカセットに基づき、配列番号９０で示されるヌクレオチド配列を含む。ｍＣｈｅｒｒｙコーディング配列は配列番号９０のヌクレオチド９５２〜１６７１で示される。
本実験で使用されるＳＣＮＡ配列
ＳＬ８９８：ＴＣＧＡＧＣＴＣＡＡＧＣＴＴＣＧＡＡＴＴＣＴＮＮＮＮＮＮ／３６−ＦＡＭ／（核酸のみが本明細書では配列番号９１として指定される）
ＳＲ９５１：／５６−ＦＡＭ／ＮＮＮＮＮＮＧＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧ（核酸のみが本明細書では配列番号９２として指定される）
３’−及び５’−６ＦＡＭ（６カルボキシ−フルオレセイン）連結−ドメイン−結合−部位はそれぞれ、３６−ＦＡＭ／及び／５６−ＦＡＭ／によって標識される。ＤＮＡのメチル化にはＳＣＮＡ１つで十分であるが、タンパク質を二量体化させて特異性を高めるには正しく間隔を空けて１を超えるＳＣＮＡを使用することが可能である。
実験手順
【０２１０】
二重形質移入戦略を利用して、ＳＣＮＡ及び標的ＤＮＡを導入する前に分子複合体のタンパク質部分を発現できるようにする。
シロイヌナズナのプロトプラストの調製はＷｕ（Wu et al., 2009）に基づき、形質移入工程での差異を伴って実施例１に類似する。
形質移入
【０２１１】
（１）２ｍｌ試験管内にて形質移入用の新しいＰＥＧ溶液を作る。
（２）６穴プレートからＢＳＡを捨て、乾かす。
（３）１５ｍｌの丸底（スナップ式のキャップ）試験管にてＲＴで、タンパク質部分を発現するプラスミドＤＮＡ約２０μｇと０．２ｍｌのＭＭｇ溶液中の約５×１０４（２×１０４〜１×１０５）のプロトプラストを混合する。
（４）等量（０．２ｍｌのプロトプラスト＋ｍｉｄｉｐｒｅｐ容量）の新しいＰＥＧ溶液を加える。
（５）ＲＴで５分間インキュベートする。
（６）３ｍｌのＷ５溶液をゆっくり加えて洗浄し、１度に１ｍｌ加え、混合する。
（７）スイングアウトロータにて１００×ｇで１分間遠心する。
（８）洗浄と遠心を繰り返す。
（９）１ｍｌのＷ５溶液に再浮遊する。
（１０）ＢＡＳをコーティングしたプレートに注ぐ。
（１１）２２℃にて１日１６時間最適照明（１５０マイクロアインシュタイン・ｍ−２・ｓ−１）にてプロトプラストを生長させる。必要に応じて培地を交換する。
（１２）約１６時間後、関連するＳＣＮＡ（総量約２０μｇ）を伴ったｍＣｈｅｒｒｙ標的をコードするプラスミドで工程３のプラスミドを置き換えて工程１〜１１を繰り返すことによってこれらの細胞の再形質移入を行う。
（１３）抽出したプラスミドのｍＣｈｅｒｒｙの発現とメチル化の状態を４８時間後解析する。
解析
【０２１２】
標的ＤＮＡのＣｐＧのメチル化状態の解析は２つの方法によって実施される。
（Ａ）プールしたプロトプラストからの消化したＤＮＡをＰＣＲ増幅によって解析する。メチル化感受性の制限酵素ＳｍａＩ（ＣＣＣＧＧＧ）、ＳａｌＩ（ＧＴＣＧＡＣ）又はＳａｃＩＩ（ＣＣＧＣＧＧ）を用いて消化を行う。ＳｍａＩ、ＳａｌＩ及びＳａｃＩＩの群をメチラーゼのためのＣｐＧ部位として使用する。ＣｐＧジヌクレオチドに下線を引いた。メチル化されたＤＮＡはこれらの酵素によって切断されない。従って、これらの酵素の切断部位にまたがるＭＣＳ配列が増幅され、定量ＰＣＲによって測定された産物は、非メチル化を生じる完全な切断のためにほとんど増幅されない、分子複合体の成分を欠く試料又は故意に非特異的なＳＣＮＡを含有する試料に対するメチル化の効率の測定を示す。
（Ｂ）ＰＣＲ増幅、クローニング及び配列決定に先立って、プールしたプロトプラストからのＤＮＡを重亜硫酸塩によって変換し、多数の標的及び非標的の対照の配列のメチル化状態を解析する。メチル化ＤＮＡの検出に好適なＤＮＡメチル化−ゴールドキット（米国、ＺＹＭＯ）に記載されたように重亜硫酸塩配列決定を行い、さらなる解析に使用する。
実施例６：ヒトにおける標的とされたゲノム修飾：ヒト造血幹細胞におけるＣＣ５遺伝子の欠失
【０２１３】
Ｃ−Ｃケモカイン受容体５型（ＣＣＲ５、ＧｅｎＢａｎｋ、Ａｃｃ．Ｎｒ．ＮＴ＿０２２５１７．１８）は、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞及びミクログリアの表面で発現され、提示されるケモカイン受容体である。３２塩基の欠失から成るこの遺伝子の変異、ＣＣＲ５−Δ３２は、切り詰められたタンパク質のＣ’末端に３１の新しいアミノ酸を導入するフレームシフト変異を生じ、天然痘及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の一部の種類に対する耐性を付与する。この対立遺伝子はヨーロッパ人の約１０％に見られるが、他の群では稀である。
以下の例では、この遺伝子のＣＣＲ５又は一部が、Δ３２対立遺伝子を有さないＨＩＶ感染患者から抽出された造血幹細胞（ＨＳＣ）から欠失される。
【０２１４】
タンパク質部分は、ヌクレアーゼに基づく機能性ドメイン（上記のように修飾されたＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン）及びＲＮＡモチーフ結合連結ドメイン（ＢＩＶ  ＴＡＴタンパク質最小ＢＩＶ  ＴＡＴペプチドＳＧＰＲＰＲＧＴＲＧＫＧＲＲＩＲＲ（配列番号９３）ドメインに由来する）から構成され、その際、タンパク質部分の連結ドメインは、ＢＩＶ  ＴＡＴループである特定のＲＮＡ配列ＵＵＣＡＧＣＵＣＧＵＧＵＡＧＣＵＣＡＵＵＡＧＣＵＣＣＧＡＧＣＵ（配列番号９４）を結合する。タンパク質部分をコードする核酸の送達は、一過性の発現のためにアデノウイルスベクターによって、特異性付与核酸（ＳＣＮＡ）の送達と同時に行う。アデノウイルスは宿主ゲノムに統合しない。
【０２１５】
標的細胞（ＨＳＣ）における導入及び発現の際、分子複合体はＣＣＲ５標的遺伝子にて自己集合し、タンパク質部分が二量体化し、ＣＣＲ５配列を切断するのを可能にし、意図したようにこの遺伝子の一部の欠失を生じる。この遺伝的修飾に続いて、こうして創った遺伝子修飾したＨＳＣ又はその子孫を患者に自己再移植する。移植に先立って、ＣＣＲ５を提示している細胞を取り除くことによる選抜によって修飾された細胞を濃縮する。ＣＣＲ５を変異させたＴ細胞及びマクロファージは、ＨＩＶ感染に耐性になっているこれらのＨＳＣから発生する。アデノウイルス及び分子複合体成分のほとんどは移植の前にＨＳＣからなくなり、その機能を完了している。
【０２１６】
ＣＣＲ５の提示を機能的に防ぐことは、以下に詳述するように、異なるＳＣＮＡの型と位置を用いて幾つかの異なる方法でこの系を介して達成することができる。
【０２１７】
Δ３２対立遺伝子では、ＣＣＲ５  ＣＤＳの３’の３２ヌクレオチドがなくなっており、結果的にフレームシフト欠失を生じる。欠失した配列は、ＴＴＣＣＡＴＡＣＡＧＴＣＡＧＴＡＴＣＡＡＴＴＣＴＧＧＡＡＧＡＡ（配列番号９５）である。ＣＣＲ５を発現している細胞からこの配列を欠失させるには、以下の配列（連結ドメイン結合修飾なしで示される）に由来するＳＣＮＡを使用する：
ＡＴＣＡＡＴＴＣＴＧＧＡＡＧＡＡＴＴＴＣＣＡ（配列番号９６）；
ＴＣＡＴＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＧＣＴＣＴＣＡＴ（配列番号９７）。
【０２１８】
本実施例では、転写されたＳＣＮＡにおける連結ドメイン結合修飾がＢＩＶ  ＴＡＲを利用する場合、ＳＣＮＡ配列の完全な配列は、１６ｂｐのギャップを利用し、ＳＣＮＡの内部「Ｎ」リンカーを利用しないＳＣＮＡ距離選択肢１である：
ＣＣＲ５＿Ｄ３２＿ＳＲ＿３３２１：ＵＵＣＡＧＣＵＣＧＵＧＵＡＧＣＵＣＡＵＵＡＧＣＵＣＣＧＡＧＣＵＡＵＣＡＡＵＵＣＵＧＧＡＡＧＡＡＵＵＵＣＣＡ（配列番号９８）
ＣＣＲ５＿Ｄ３２＿ＳＬ＿３３０４：ＵＣＡＵＵＡＣＡＣＣＵＧＣＡＧＣＵＣＵＣＡＵＵＵＣＡＧＣＵＣＧＵＧＵＡＧＣＵＣＡＵＵＡＧＣＵＣＣＧＡＧＣＵ（配列番号９９）
２７ｂｐのギャップと２「Ｎ」リンカーのヌクレオチドを採用するＳＣＮＡ距離選択肢２：
ＣＣＲ５＿Ｄ３２＿ＳＲ＿３３１９：
ＵＵＣＡＧＣＵＣＧＵＧＵＡＧＣＵＣＡＵＵＡＧＣＵＣＣＧＡＧＣＵＮＮＧＵＡＵＣＡＡＵＵＣＵＧＧＡＡＧＡＡＵＵＵＣ（配列番号１００）
ＣＣＲ５＿Ｄ３２＿ＳＬ＿３２９１：
ＣＡＡＡＡＡＧＡＡＧＧＵＣＵＵＣＡＵＵＡＣＡＣＮＮＵＵＣＡＧＣＵＣＧＵＧＵＡＧＣＵＣＡＵＵＡＧＣＵＣＣＧＡＧＣＵ（配列番号１０１）
【０２１９】
これらのＳＣＮＡは、ＴＴＴＣＣＡＴＡＣＡＧＴＣＡＧＴＡＴＣＡＡＴＴＣＴＧＧＡＡＧＡＡ（配列番号１０２）標的配列にて修飾／切断を可能にするように設計される。これらの対のみが介在する切断及びＤＳＢの形成は、場合によっては、内在性のメカニズムを介してフレームシフトをもたらすことができる変異を引き起こすことができる。ＳＣＮＡのＣＣＲ５遺伝子対にてさらに広く欠失させるために、ＣＣＲ５における少なくとも２つの標的のターゲッティングを使用する。
【０２２０】
ＣＣＲ５コーディング配列の実質的にすべての欠失は、ＣＣＲ５−ＡＴＧ領域結合ＳＣＮＡ及びＣＣＲ５−停止コドン領域結合ＳＣＮＡを同時に用いて誘導される。
ＡＴＧＳＣＮＡ：
ＳＣＮＡ間の標的とされる領域（ＡＴＧには下線を引く）
ＣＡＧＧＧＴＧＧＡＡＣＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＡＴＣＡＡＧＴＧＴＣ（配列番号１０３）
３１ｂｐのギャップを利用し、ＳＣＮＡの内部「Ｎ」リンカーを利用しないＳＣＮＡ距離選択肢１
ＣＣＲ５＿ＳＲ＿２７７９：ＵＵＣＡＧＣＵＣＧＵＧＵＡＧＣＵＣＡＵＵＡＧＣＵＣＣＧＡＧＣＵＡＡＧＴＣＣＡＡＴＣＴＡＴＧＡＣＡＴＣＡＡＴ（配列番号１０４）；
ＣＣＲ５＿ＳＬ＿２７４７：ＡＡＧＡＴＣＡＣＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＴＧＣＡＵＵＣＡＧＣＵＣＧＵＧＵＡＧＣＵＣＡＵＵＡＧＣＵＣＣＧＡＧＣＵ．（配列番号１０５）
【０２２１】
２７ｂｐの標的ギャップと２「Ｎ」リンカーのヌクレオチドを採用する、コンピュータの結果に基づくＳＣＮＡ距離選択肢２：
ＣＣＲ５＿ＳＲ＿２７７７：
ＵＵＣＡＧＣＵＣＧＵＧＵＡＧＣＵＣＡＵＵＡＧＣＵＣＣＧＡＧＣＵＮＮＵＣＡＡＧＵＣＣＡＡＵＣＵＡＵＧＡＣＡＵＣＡ（配列番号１０６）
ＣＣＲ５＿ＳＬ＿２７４９：
ＧＡＵＣＡＣＵＵＵＵＵＡＵＵＵＡＵＧＣＡＣＡＮＮＵＵＣＡＧＣＵＣＧＵＧＵＡＧＣＵＣＡＵＵＡＧＣＵＣＣＧＡＧＣＵ（配列番号１０７）
停止ＳＣＮＡｓ：
ＳＣＮＡ間の標的とされる領域（停止コドンに下線を引く）
ＡＴＡＴＣＴＧＴＧＧＧＣＴＴＧＴＧＡＣＡＣＧＧＡＣＴＣＡＡＧＴ（配列番号１０８）
３１ｂｐのギャップを利用し、ＳＣＮＡの内部「Ｎ」リンカーを利用しないＳＣＮＡ距離選択肢１
ＣＣＲ５＿ＳＲ＿３８８４：ＵＵＣＡＧＣＵＣＧＵＧＵＡＧＣＵＣＡＵＵＡＧＣＵＣＣＧＡＧＣＵＧＧＧＣＴＧＧＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＴ（配列番号１０９）；
ＣＣＲ５＿ＳＬ＿３８０２：ＣＣＧＡＴＣＣＡＣＴＧＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＡＵＵＣＡＧＣＵＣＧＵＧＵＡＧＣＵＣＡＵＵＡＧＣＵＣＣＧＡＧＣＵ（配列番号１１０）
２７ｂｐの標的ギャップと２「Ｎ」リンカーのヌクレオチドを採用する、コンピュータの結果に基づくＳＣＮＡ距離選択肢２：
ＣＣＲ５＿ＳＲ＿３８３３：
ＵＵＣＡＧＣＵＣＧＵＧＵＡＧＣＵＣＡＵＵＡＧＣＵＣＣＧＡＧＣＵＮＮＵＧＧＧＣＵＧＧＵＧＡＣＣＣＡＧＵＣＡＧＡＧ（配列番号１１１）
ＣＣＲ５＿ＳＬ＿３８０５：
ＡＵＣＣＡＣＵＧＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＡＡＵＡＮＮＵＵＣＡＧＣＵＣＧＵＧＵＡＧＣＵＣＡＵＵＡＧＣＵＣＣＧＡＧＣＵ（配列番号１１２）
【０２２２】
分子複合体のタンパク質部分は、たとえば、Ａｄｅｎｏ−Ｘ（商標）アデノウイルスシステム３（米国カリフォルニア州、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のようなアデノウイルスに基づく発現系にて運ばれ、製造元の指示書に従って使用されるヌクレオチド配列を介して発現される。或いは、タンパク質部分はネイキッドＲＮＡ形質移入によって送達される。
この実施例のためのタンパク質部分のアミノ酸配列
機能性ドメイン：ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニット（上記のような）に由来する
連結ドメイン：最小ＢＩＶ  ＴＡＴペプチドＳＧＰＲＰＲＧＴＲＧＫＧＲＲＩＲＲ（配列番号９３）ドメイン
細胞局在化ドメイン：ＳＶ４０の核局在化シグナル（ＮＬＳ）ドメイン（ＳＶ４０ＮＬＳ）
ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニット
VＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＱＲＹＶＥＥＮＱＴＲＮＫＨＩＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＨＩＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦ（配列番号６６）；
ＳＶ４０ＮＬＳ：ＭＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６７）；
ＢＩＶ  ＴＡＴペプチド：ＳＧＰＲＰＲＧＴＲＧＫＧＲＲＩＲＲ（配列番号９３）．
ドメイン間接続要素：ＧＳＧＧＳＧＰ（配列番号１１３）
【０２２３】
本実施例の集合したＢＩＶ  ＴＡＴに基づくプログラム可能なタンパク質部分は、配列番号１１４で示されるアミノ酸配列を有し、それは配列番号１１５で示される核酸配列によってコードされる。
【０２２４】
本実施例で使用されるように、ＧＧＳＧＧＧＰ（配列番号１１６）ドメイン間リンカーを伴ったＢＩＶ−ＴＡＴ−ＴＡＲ系についてのコンピュータ化３Ｄモデルから得られた空間測定の結果によって、ＳＣＮＡ間の予想される最適な距離が、ＳＣＮＡにて２Ｎ’の存在下で約２６〜２８ヌクレオチドであることを得た。切断は、いずれかの側でＳＣＮＡとの最後のヌクレオチドのハイブリッド形成後の開始を数え、二量体化構築物によるｄｓＤＮＡの切断によって創られる４塩基の５’オーバーハングを考慮に入れて、１２、１３又は１４番目のヌクレオチドの左及び右に約±２ヌクレオチドで生じると予想される。この基準は、本実施例のように、標的とされる配列が２７ヌクレオチド：ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＸＸＸＸＸＸＸＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣであるならば、Ｙ＋ＸがＳＣＮＡ塩基対形成部位間でのヌクレオチドの数を表す場合、設計されたＳＣＮＡは領域ＡとＣと塩基対形成し、ＤＳＢを生じる切断はＸ領域（標的領域）にある又は隣接することを示唆している。ＳＣＮＡはセンス鎖又はアンチセンス鎖に相補性であることができるが、好ましくは、センス（転写されない）配列と塩基対形成するように選択される。タンパク質部分の位置が、「末端近傍」にあるプライマーの５’又は３’の修飾によって定義されるようにＳＣＮＡの「末端近傍」に位置するので、ＳＣＮＡは双方とも同一鎖と塩基対形成することができる。
【０２２５】
野生型ＣＣＲ５発現細胞に対するＣＣＲ５を発現しない／提示しない細胞の検出及び選択は、マウス抗ヒトＣＣＲ５抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓカタログｎｒ．ＦＡＢＳＰ１）を用いたＦＡＣＳ解析によって実施される。
実施例７：プログラム可能な核酸塩基対形成の標的とされる転写活性化因子
【０２２６】
本実施例では、単子葉植物トウモロコシにおけるプロトプラスト系（Marrs & Urioste, 1995; Rhodes et. al., 1988）をバイオアッセイとして使用する。この系では、一過性発現のためにトウモロコシのプロトプラストにエレクトロポレーションでプラスミドを導入する。次いでこれらのプロトプラストをそのように所望であれば再生し得る。
本実施例では、タンパク質部分は、ＵＡＳ結合ドメインを除くＧａｌ４転写活性化因子及び抗フルオレセインｓｃＦｖから構成される連結ドメインから構成されるタンパク質部分をフルオレセインで修飾したＳＣＮＡと一緒に用いてレポーター遺伝子の発現を活性化する。ここで使用される本実施例では、Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメインが取り除かれ、タンパク質部分の連結ドメインで置き換えられる。
【０２２７】
第１の例では、転写活性化因子がＴＡＴＡボックスから上流の配列に結合する場合にのみＧＦＰ（選択肢１）又はβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ、選択肢２）を発現することができる２つのレポータープラスミドを使用する。この例では、この配列はＧａｌ４タンパク質によって活性化されることが分かっている６Ｘ−ＵＡＳである。
【０２２８】
第２の例では、ＵＡＳ配列を標的核酸から取り除き、ＳＣＮＡがマイナス６２で結合する（ＴＡＴＡボックスから下流の６２ｎｔ）ので、同じ結果を本質的に達成するが、天然のプロモータはない。トウモロコシのプロトプラストでのバイオアッセイ系では、以下に示すタンパク質部分とＳＣＮＡをエレクトロポレーションによって同時形質移入することができる。
【０２２９】
ドメイン間接続要素を介して抗フルオレセインｓｃＦｖに融合されたＮ’核標的化Ｇａｌ４活性化ドメインを含むタンパク質部分のアミノ酸配列は、本明細書では配列番号１３２として指名され、配列番号１５７で示されるようなヌクレオチド配列によってコードされる。
【０２３０】
第１の例は６ＵＡＳの反復を持つ標的プラスミドを利用する。
標的プラスミドは以下の順（５’−＞３’）で６ＵＡＳプロモータ領域、その後のＴＡＴＡボックスを含有し、本明細書では配列番号１８０：
ＧＧＡＣＴＧＴＡＧＡＧＧＴＴＣＣＧＧＧＴＧＡＣＡＧＣＣＣＴＣＣＧＡＣＧＧＧＴＧＡＣＡＧＣＣＣＴＣＣＧＡＣＧＧＧＴＧＡＣＡＧＣＣＣＴＣＣＧＡＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＧＴＧＡＣＡＧＣＣＣＴＣＣＧＡＣＧＧＧＴＧＡＣＡＧＣＣＣＴＣＣＧＡＣＧＧＧＴＧＡＣＡＧＣＣＣＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＴＧＴＣＧＡＣＣＴＣＧＡＴＣＧＡＧＡＴＣＴＴＣＧＣＡＡＧＡＣＣＣＴＴＣＣＴＣＴＡＴＡＴＡとして指定される。
スペーサーは、配列：ＡＧＧＡＡＧＴＴＣＡＴＴＴＣＡＴＴＴＧＧＲＧＡＧＧＡＣＡＣＧＣＴＧＡＡＣＣ（配列番号１９２）を有する。
選択肢１：配列番号１９３で示されるＧＦＰコーディング配列
選択肢２：配列番号１９４で示されるβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）コーディング配列
３５Ｓターミネータの配列：
ＧＴＣＣＧＣＡＡＡＡＡＴＣＡＣＣＡＧＴＣＴＣＴＣＴＣＴＡＣＡＡＡＴＣＴＡＴＣＴＣＴＣＴＣＴＡＴＴＴＴＴＣＴＣＣＡＧＡＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＡＧＴＡＧＴＴＣＣＣＡＧＡＴＡＡＧＧＧＡＡＴＴＡＧＧＧＴＴＣＴＴＡＴＡＧＧＧＴＴＴＣＧＣＴＣＡＴＧＴＧＴＴＧＡＧＣＡＴＡＴＡＡＧＡＡＡＣＣＣＴＴＡＧＴＡＴＧＴＡＴＴＴＧＴＡＴＴＴＧＴＡＡＡＡＴＡＣＴＴＣＴＡＴＣＡＡＴＡＡＡＡＴＴＴＣＴＡＡＴＴＣＣＴＡＡＡＡＣＣＡＡＡＡＴＣＣＡＧＴＧＡＣ（配列番号１９５）。
別々の実験にて２つの異なる配向のＳＣＮＡが供給されて２つのＵＡＳ配列結合ＳＣＮＡのより効果的なものを選択する。
センス：ＣＧＧＧＴＧＡＣＡＧＣＣＣＴＣＣＧＡＮＮＮＮＮＮ／３６−ＦＡＭ／（核酸のみが本明細書では配列番号１９６で示される）
アンチセンス：／５−６ＦＡＭ／ＮＮＮＮＮＮＴＣＧＧＡＧＧＧＣＴＧＴＣＡＣＣＣＧ（核酸のみが本明細書では配列番号１９７で示される）
【０２３１】
ＳＣＮＡの末端修飾は６−カルボキシフルオレセイン（６ＦＡＭ）である。それぞれ ／５−６ＦＡＭ／又は／３−６ＦＡＭ／として示される５’又は３’の修飾。Ｎは任意のヌクレオチドを表す。
【０２３２】
第２の例は報告される遺伝子の発現を制御するプロモータを欠く標的プラスミドを利用する。
標的プラスミドは以下の順でプラスミド骨格、その後にＴＡＴＡボックスを含有する：
ＴＣＴＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＧＣＣＡＧＣＴＧＧＣＧＡＡＡＧＧＧＧＧＡＴＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡＴＴＡＡＧＴＴＧＧＧＴＡＡＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡＣＣＣＡＴＡＡＴＡＣＣＣＡＴＡＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＧＣＣＡＡＣＣＧＧＴＴＣＴＡＴＡＴＡ（配列番号１９８）
スペーサー配列（配列番号１９９）
ＡＧＧＡＡＧＴＴＣＡＴＴＴＣＡＴＴＴＧＧＲＧＡＧＧＡＣＡＣＧＣＴＧＡＡＣＣ
選択肢１：配列番号２００で示されるＧＦＰのＯＲＦ
選択肢２：配列番号２０１で示されるβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）コーディング配列
３５Ｓターミネータの配列（配列番号２０２）
２つの異なる配向のＳＣＮＡを使用する。
ＳＣＮＡ：選択肢（マイナス６２）
ＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＮＮＮＮＮＮ／３６−ＦＡＭ／（核酸のみが本明細書では配列番号２０３で示される）
／５−６ＦＡＭ／ＮＮＮＮＮＮＴＣＧＴＧＡＣＴＧＧＧＡＡＡＡＣＣＣＴＧＧＣ（核酸のみが本明細書では配列番号２０４で示される）
【０２３３】
顕微鏡法又はフローサイトメトリー法を用いてＧＦＰの発現（選択肢１）についてトウモロコシのプロトプラストを調べる。ＧＦＰ陽性細胞は、プログラムされた複合体が機能していることを示す。ＧＦＰ陽性細胞の比率によって系の異なるパラメータを改善するために行われる実験間の相対的な効率を算出するのが可能になる。複合体の適正な成分を失っている細胞におけるＧＦＰの非存在（たとえば、対照の非特異的なＳＣＮＡを用いた）は、特異性の限定を測定するのを可能にする。
【０２３４】
０．４５ＭのマンニトールにおけるＸ−Ｇｌｕｃによって細胞を染色し、３７℃で一晩インキュベートすることによってＧＵＳの発現（選択肢２）についてトウモロコシのプロトプラストを調べ、顕微鏡を用いて検出する。ＧＵＳ陽性細胞（青く染色される）はプログラムされた複合体が機能していることを示す。ＧＵＳ陽性細胞の比率によって系の異なるパラメータを改善するために行われる実験間の相対的な効率を算出するのが可能になる。複合体の適正な成分を失っている細胞におけるＧＵＳの非存在（たとえば、対照の非特異的なＳＣＮＡを用いた）は、特異性の限定を測定するのを可能にする。
実施例８：細胞小器官ＤＮＡにおける遺伝子ターゲッティング
【０２３５】
真核細胞では、ミトコンドリアや色素体のような細胞小器官はそれ自体のゲノムを含有する。さらに、植物では、それらはサブゲノムの環状ＤＮＡも含有し得る。ミトコンドリアＤＮＡを修飾することは、ヒトの疾患の治療及び農業用途等に関わり合いを有することができる。これらの修飾に対する挑戦には、とりわけ、技術的なハードル、遺伝子編集に必要な理に適って効率的な、配列特異的な系の細胞小器官への送達及び活性化が含まれる。
ペチュニアにおけるＰＣＦ
【０２３６】
細胞質の雄性不稔（ＣＭＳ）は、その種子株を保護する方法として種子会社によって広範に用いられる有益な植物形質である。従って、既存の株でＣＭＳを修復する又は新しい株でＣＭＳを創ることは有利である。細胞質の雄性不稔は、特定の核又はミトコンドリアの相互作用の結果として機能的な葯、花粉又は雄性配偶子を生産できないことによる。ここで示す例では、ＡＴＰアーゼのサブユニット９をコードするミトコンドリアＤＮＡにおけるａｔｐ９遺伝子への欠失と挿入の組み合わせが原因で生じる特徴付けられたペチュニアにおける細胞質の雄性不稔を使用する。これは、雄性不稔をもたらすミトコンドリアＡＴＰアーゼの多重タンパク質複合体のプロトンを移行させる機能の破壊を生じる。
【０２３７】
本実施例のプログラム可能な分子複合体のタンパク質部分は、ミトコンドリア内部でプログラムされた分子複合体の局在化を確保するミトコンドリア局在化シグナルを抱くように設計される。核酸をミトコンドリアに転移する他の方法には、リポソームの使用又はエレクトロポレーションが挙げられる。特にペチュニアを含むＳｏｌａｎａｃｅａｅ由来の植物における植物ミトコンドリアは、透過性遷移孔複合体を介してＤＮＡを積極的に運び入れる。その過程は二本鎖ＤＮＡに限定されるが、明白な配列特異性を有さない。供与体の配列は、送達方法に応じて線形の精製ＰＣＲ断片、線形化プラスミド又は環状プラスミドのいずれかとして送達される。単離された小麦ミトコンドリアにエレクトロポレーションされたプラスミドの発現は、Ｈａｎｉｃ−Ｊｏｙｃｅ及びＧｒａｙ，１９９１によって記載された開始領域を含有するＴ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉ  ｃｏｘＩＩミトコンドリアプロモータの８８２ｂｐのようなミトコンドリア適合性のプロモータを使用する場合、非常に効率的である。
置換又は挿入の事象を含有する細胞の選抜は供与体ＤＮＡにコードされるクロラムフェニコール耐性オペロンによって達成することができる。
以下の例（８Ａ〜８Ｃ）において、タンパク質部分は、
アミノ酸配列：ＳＧＰＲＰＲＧＴＲＧＫＧＲＲＩＲＲ（配列番号９３）を含むＢＩＶ  ＴＡＴペプチドに由来する連結ドメインと、
アミノ酸配列：ＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＱＲＹＶＥＥＮＱＴＲＮＫＨＩＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＨＩＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦ（配列番号６６）を含むＦｏｋＩヌクレアーゼに由来する機能性ドメインと、
シロイヌナズナのリポ酸シンターゼに由来し、ミトコンドリアの局在化シグナル（ＭＬＳ）であるアミノ酸配列：ＭＨＳＲＳＡＬＬＹＲＦＬＲＰＡＳＲＣＦＳＳＳＳを含む細胞局在化ドメインと、
ドメイン間接続要素：ＧＳＧＧＳＧＰ（配列番号１１３）を含む。
【０２３８】
本実施例の集合したＢＩＶ  ＴＡＴを基にしたプログラム可能なタンパク質部分は配列番号２０５で示されるアミノ酸配列を有し、それは配列番号２０６で示されるヌクレオチド配列によってコードされる。
【０２３９】
本実施例のＧＧＳＧＧＧＰ（配列番号１１６）ドメイン間リンカーを伴ったＢＩＶ−ＴＡＴ−ＴＡＲ系についてのコンピュータ化３Ｄモデルから得られた空間測定の結果によって、ＳＣＮＡ間の予想される最適な距離が、ＳＣＮＡにて２Ｎ’の存在下で約２６〜２８ヌクレオチドであることを示す。切断は、いずれかの側でＳＣＮＡとの最後のヌクレオチドのハイブリッド形成後の開始を数え、二量体化構築物によるｄｓＤＮＡの切断によって創られる４塩基の５’オーバーハングを考慮に入れて、１２、１３又は１４番目のヌクレオチドの左及び右に約±２ヌクレオチドで生じると予想される。この基準は、標的とされる配列が、たとえば、以下の２７ヌクレオチド：ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＸＸＸＸＸＸＸＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣであるならば、Ｙ＋ＸがＳＣＮＡ塩基対形成部位間でのヌクレオチドの数を表す場合、設計されたＳＣＮＡは領域ＡとＣと塩基対形成し、ＤＳＢを生じる切断はＸ領域にある又は隣接することを示唆している。ＳＣＮＡはセンス鎖又はアンチセンス鎖に相補性であることができるが、好ましくは、センス（転写されない）配列と塩基対形成するように選択される。タンパク質部分の位置が、「末端近傍」にあるプライマーの５’又は３’の修飾によって定義されるようにＳＣＮＡの「末端近傍」に位置するので、ＳＣＮＡは双方とも同一鎖と塩基対形成することができる。
【０２４０】
本実施例で使用されるＳＣＮＡ連結ドメイン結合ＲＮＡ配列は、核酸配列ＵＵＣＡＧＣＵＣＧＵＧＵＡＧＣＵＣＡＵＵＡＧＣＵＣＣＧＡＧＣＵ（配列番号１１７）を含むＢＩＶ  ＴＡＴループ１に由来する。従って、ＳＣＮＡは、単離されたミトコンドリアに直接送達され得る（細菌プロモータのもとでＳＣＮＡをコードするＤＮＡの存在下でのミトコンドリアのエレクトロポレーションによって）、又は細胞質に送達され得る（アグロバクテリウムが介在する一過性の転写）、そして、それに結合し、ＭＬＳを含むタンパク質部分によってミトコンドリアに引き入れられ得る。
【０２４１】
プログラム可能な分子複合体の発現の後、ミトコンドリアを単離し、供与体ＤＮＡを単離されたミトコンドリアに形質移入する。
【０２４２】
ＳＣＮＡの距離について２つの選択肢を有する以下の例を実施する：
（１）供与体ＤＮＡなしでＣＭＳ表現型を形成する（８Ａ）。
（２）ａｔｐ９を標的としてクロラムフェニコール耐性を持つ供与体ＤＮＡを用いてｐｃｆ様の変異を形成する（８Ｂ）。
（３）ｐｃｆ（ＣＭＳ）表現型を修復し、ＡＴＰ９を再形成し、不稔を回復し、同時にクロラムフェニコール耐性を持つ供与体ＤＮＡを使用する（８Ｃ）。
【０２４３】
これらの実験についての標的核酸配列には以下が挙げられる：
「ＡＴＰ９」：Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ×Ｐｅｔｕｎｉａ  ａｘｉｌｌａｒｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｐａｒｏｄｉｉのミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニット９、Ｇｅｎｂａｎｋ、ａｃｃ、Ｎｒ．Ｙ００６０９．１  ＧＩ：２９７４７５。
「ｐｃｆ」：Ｐｅｔｕｎｉａ  ａｘｉｌｌａｒｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｐａｒｏｄｉｉにおける細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）、ＣＭＳ関連の融合タンパク質（ＣＭＳ-ａｆｐ）、ＮＡＤＨ脱水素酵素サブユニット３（ｎａｄ３）及びリボソームタンパク質Ｓ１２（ｒｐｓ１２）遺伝子、完全なｃｄｓ、ミトコンドリア性、ＧｅｎＢａｎｋ、ａｃｃ．Ｎｒ．Ｍ１６７７０．１  ＧＩ：１２５６９４６。
実施例８：細胞小器官を単離しない細胞小器官ＤＮＡにおける指示されたＤＮＡ変異
【０２４４】
ＡＴＰ９を標的として機能のないタンパク質ＡＴＰ９タンパク質を創ることによってＣＭＳを生じる変異を形成する。
ＳＣＮＡは、標的部位にて単一のＤＳＢを形成するように設計され、それは内在性のＮＨＥＪ修復経路によって修復されてコーディング配列の一部にてフレームシフトを創る。
ＡＴＰ９標的部位：ＧＣＡＡＡＡＣＡＡＴＴＡＴＴＴＧＧＴＴＡＴＧＣＣＡＴＴＴＴＧＧ（配列番号１１８）
ＳＣＮＡの距離選択肢１：３１ｂｐの標的ギャップ
ＳＣＮＡに隣接するＡＴＰ９標的部位：
ＡＴＰ９＿ＡＳＬ＿７０５：ＵＵＣＡＧＣＵＣＧＵＧＵＡＧＣＵＣＡＵＵＡＧＣＵＣＣＧＡＧＣＵＣＡＡＵＧＡＵＧＧＡＵＵＵＣＧＣＧＣＣＡＣＧ（配列番号１１９）
ＡＴＰ９＿ＡＳＲ＿７３７：ＵＵＡＧＣＵＵＣＧＧＵＵＡＧＡＧＣＡＡＡＧＣＵＵＣＡＧＣＵＣＧＵＧＵＡＧＣＵＣＡＵＵＡＧＣＵＣＣＧＡＧＣＵ（配列番号１２０）
２７ｂｐの標的ギャップを採用するＳＣＮＡの距離選択肢２
ＡＴＰ９＿ＡＳＬ＿７０７：
ＵＵＣＡＧＣＵＣＧＵＧＵＡＧＣＵＣＡＵＵＡＧＣＵＣＣＧＡＧＣＵＧＣＣＡＡＵＧＡＵＧＧＡＵＵＵＣＧＣＧＣＣＡ（配列番号１２１）
ＡＴＰ９＿ＡＳＲ＿７３５：
ＡＧＣＵＵＣＧＧＵＵＡＧＡＧＣＡＡＡＧＣＣＣＵＵＣＡＧＣＵＣＧＵＧＵＡＧＣＵＣＡＵＵＡＧＣＵＣＣＧＡＧＣＵ（配列番号１２２）
【０２４５】
当該技術で既知のような標準の葉の浸潤法を用いて、タンパク質部分をコードするバイナリベクターとＲＮＡ−ＳＣＮＡに由来するＴ−ＤＮＡ（図８Ａに模式的に示すような）を抱くアグロバクテリウムをペチュニアの葉に植菌する。形質移入の後、プログラムされた分子複合体が細胞質で発現され、自己集合し、次いで、タンパク質部分の表面で提示されるＭＬＳを介してミトコンドリア輸入装置によってミトコンドリアに局在する。次いでプログラムされた分子複合体（タンパク質部分とターゲッティングＳＣＮＡを含む）は、ミトコンドリアＤＮＡにおけるＡＴＰ９を標的とするので、変異させたミトコンドリアを形成する。
解析については、形質移入の４８時間後、植物からＤＮＡを精製し、プライマーを用いたＰＣＲによってＡＴＰ９の配列を増幅する。
ＡＴＰ９ａｔｇＦ：ＡＴＧＴＴＡＧＡＡＧＧＴＧＣＡＡＡＡＴＣＡＡ（配列番号１２３）
ＡＴＰ９ｐ２Ｒ：ＣＴＡＡＣＧＧＡＣＴＴＧＧＡＡＴＡＣＧＡＡＴ（配列番号１２４）
次いで、ＰＣＲ産物をＣＥＬ  Ｉ  酵素変異検出アッセイ（ＳＵＲＶＥＹＯＲ変異検出キット（米国、Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ））に供する。このアッセイを用いて、プログラムされた分子複合体による遺伝子ターゲッティングによるミトコンドリアＤＮＡの変異の有効性を評価する。
実施例８Ｂ：細胞小器官ＤＮＡにおける指示されたＤＮＡ挿入
【０２４６】
本実施例では、ＡＴＰ９が標的とされて、選抜マーカークロラムフェニコールを含有する供与体ＤＮＡをＡＴＰ９遺伝子座に挿入することによってｐｃｆ様の変異を形成する。
方法：実施例８Ａと同様に、標準の葉の浸潤法を用いて、プログラムされた分子複合体のタンパク質部分をコードするバイナリベクタープラスミドとＲＮＡ−ＳＣＮＡに由来するＴ−ＤＮＡを抱くアグロバクテリウムをペチュニアの葉に植菌する。形質移入の後、プログラムされた分子複合体が細胞質で発現され、自己集合し、次いで、タンパク質部分の表面で提示されるＭＬＳを介してミトコンドリア輸入装置によってミトコンドリアに局在する。約１２〜７２時間後、Ｈｒｓが浸潤した葉をミトコンドリアの調製に使用する。本実施例の供与体ＤＮＡを含むプラスミドベクター又は線形ＰＣＲ産物を単離されたミトコンドリアにエレクトロポレーションによって送達する。次いでエレクトロポレーション行ったミトコンドリアを新鮮なペチュニアのプロトプラストに微量注入によって移植する。ＰＣＦ様のミトコンドリアのみが細胞で生き残ることができるクロラムフェニコール選抜培地にて注入されたプロトプラストを再生させる。
８Ｂの供与体ＤＮＡ（ｐｃｆ様に変えられるａｔｐ９）は配列番号１２５で示される。
結果及び解析
【０２４７】
プログラムされた分子複合体は、ｐｃｆに相同な領域の下流でコーディング配列にてａｔｐ９遺伝子を切断する。これによってｐｃｆ様の供与体と切断されたａｔｐ９遺伝子の間で相同組換えを生じる。従って、ミトコンドリアのゲノムにてｐｃｆ雄性不稔の遺伝子型が再生される。さらに、供与体は、クロラムフェニコールに耐性のミトコンドリアの選抜を可能にするクロラムフェニコール耐性カセットを含有する。クロラムフェニコールを含有する選抜培地にて再生することができる注入されたプロトプラストはＤＮＡが修飾された標的化ミトコンドリアを含有する。これらのプロトプラストから生成されるカルスは若芽分化が可能であり、最終的に植物体全体が形成され、標的とされたミトコンドリアのみを含有する再生植物体を生じる。従って、雄性不稔のペチュニアは、クロラムフェニコールに耐性のミトコンドリアを含有するカルスから植物体を再生することによって達成される。
実施例８Ｃ：細胞小器官ＤＮＡにおける指示されたＤＮＡ置換
【０２４８】
本実施例では、ｐｃｆ変異体が標的とされ、クロラムフェニコール耐性を含有する供与体ＤＮＡを用いて活性のある修復されたＡＴＰ９配列を形成する。
【０２４９】
本実施例では、供与体ＤＮＡは、ＨＲによってｐｃｆ遺伝子座に統合され、停止コドンを創ってｐｃｆの障害を引き起こす余分なアミノ酸配列を持たない無傷のＡＴＰ９を再生するように設計される。修復されたミトコンドリアの選抜のために、供与体ＤＮＡにおけるクロラムフェニコール耐性（ＡＹ２３０２１８．１  ＧＩ：３０２６７５０４）を使用する。供与体におけるＣＤＳはオペロンに基づく設計の中にある。クロラムフェニコールの配列は下線を引いた小文字で示す。
方法Ａ：本実施例の供与体ＤＮＡを含むプラスミドベクターと、実施例８Ｃで示すＳＣＮＡと実施例８Ａのタンパク質部分を、エレクトロポレーションによって、本実施例では、図９で模式的に示すものに類似する設計での単一プラスミドにて、単離されたミトコンドリアに送達する。
【０２５０】
実施例８Ｂと同様に、エレクトロポレーションを行ったミトコンドリアを微量注入によってペチュニアのプロトプラストに移植する。プロトプラストをクロラムフェニコール選抜培地に播く。これらのプロトプラストから生成されるカルスは若芽分化が可能であり（Frearson et. al., 1973）、最終的に植物体全体が形成され、標的とされたミトコンドリアのみを含有する再生植物体を生じる。これらのペチュニア植物体を雄性不稔についてスクリーニングする。
８Ｃの配列
ｐｃｆにおける標的配列：ＡＧＡＣＴＴＡＣＡＴＣＡＣＧＡＴＧＴＣＴＴＴＴＴＣＴＴＣＧＴＴ（配列番号１２６）
標的部位に隣接するＳＣＮＡ：
ＳＣＮＡ距離選択肢１：３１ｂｐの標的ギャップ
ＣＭＳ＿ＡＳＬ＿７０４：
ＵＵＣＡＧＣＵＣＧＵＧＵＡＧＣＵＣＡＵＵＡＧＣＵＣＣＧＡＧＣＵＧＵＵＡＵＵＵＧＵＡＵＡＣＣＵＡＡＣＡＣＧＧ（配列番号１２７）．
ＣＭＳ＿ＡＳＲ＿７３６：
ＡＵＡＣＧＡＡＡＡＣＣＡＡＡＡＵＣＡＧＡＡＵＵＵＣＡＧＣＵＣＧＵＧＵＡＧＣＵＣＡＵＵＡＧＣＵＣＣＧＡＧＣＵ（配列番号１２８）．
ＳＣＮＡ距離選択肢２、２７ｂｐの標的ギャップを採用する、コンピュータの結果に基づく：
ＣＭＳ＿ＡＳＬ＿７０６
ＵＵＣＡＧＣＵＣＧＵＧＵＡＧＣＵＣＡＵＵＡＧＣＵＣＣＧａｇｃｕＣＵＧＵＵＡＵＵＵＧＵＡＵＡＣＣＵＡＡＣＡＣ（配列番号１２９）
ＣＭＳ＿ＡＳＲ＿７３４
ＡＣＧＡＡＡＡＣＣＡＡＡＡＵＣＡＧＡＡＵＡＡｕｕｃａｇｃｕＣＧＵＧＵＡＧＣＵＣＡＵＵＡＧＣＵＣＣＧＡＧＣＵ（配列番号１３０）
８Ｃの供与体の配列は配列番号１３１で示される。
実施例９：哺乳類細胞のゲノム修飾：ＦＡＳ受容体が介在する死を防ぐこと
【０２５１】
アポトーシス抗原１（ＡＰＯ−１、ＡＰＴ、ＴＮＦＲＳＦ６、ＣＤ９５）としても知られるＦＡＳ受容体（ＦａｓＲ）は、ヒトの第１０染色体に位置するＴＮＦＲＳＦ６遺伝子にコードされるヒトにおけるタンパク質である（ＧｅｎＢａｎｋ受入ＮＣ＿００００１０領域：９０７５０２８８．．９０７７５５４２  ＧＰＣ＿０００００００３４  ＶＥＲＳＩＯＮ  ＮＣ＿００００１０．１０  ＧＩ：２２４５８９８０１）。Ｆａｓ受容体は、リガンド結合の際、死を誘導するシグナル伝達複合体（ＤＩＳＣ）を形成することによってプログラム細胞死（アポトーシス）を招く細胞の表面に提示される死の受容体である。隣接する細胞の表面における膜に係留されるＦａｓリガンド三量体がＦａｓ受容体の三量体化を引き起こす。Ｆａｓリガンド又はＦａｓＬ（ＣＤ９５）はヘテロ三量体のＩＩ型膜貫通タンパク質である。可溶性のＦａｓＬは膜結合性のものより活性が低く、受容体の三量体化及びＤＩＳＣの形成を誘導しない。死のドメイン（ＤＤ）凝集を確保する際、受容体複合体は内部移行し、カスパーゼを介した事象のカスケードを開始し、最終的には、ＤＮＡの分解、膜のブレブ形成、及びアポトーシスの他の特徴をもたらす。この事象は、ここで実施例にて使用されるアゴニストＦａｓ抗体の結合によって模倣することもできる。
【０２５２】
ＦａｓＲの８つのスプライシング変異体が知られており、それらは７つのタンパク質のアイソフォームに翻訳される。アポトーシス誘導するＦａｓ受容体はアイソフォーム１と呼ばれ、１型の膜貫通タンパク質である。Ｆａｓタンパク質は３１９のアミノ酸を有し、３つのドメイン：細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインに分けられる。細胞外ドメインは１５７のアミノ酸を有し、システイン残基が豊富である。膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインはそれぞれ１７及び１４５のアミノ酸を有する。エクソン１〜５は細胞外領域をコードし、それはＦａｓＲ三量体と相互作用することができる。エクソン６は膜貫通領域をコードする。エクソン７〜９は細胞内領域をコードする。
タンパク質の配列及び特性
【０２５３】
タンパク質部分は実施例３で記載されたとおりである。
従って、本実施例で記載される分子複合体のタンパク質部分は配列番号４９で示されるアミノ酸配列を有する。
【０２５４】
本実施例の特異性付与核酸（ＳＣＮＡ）は、各ＳＣＮＡの一方の末端でＣ６リンカーを含むフルオレセイン−ｓｃＦｖ／６−ＦＡＭ、６−カルボキシ−フルオレセインｄＴの添加によって修飾される。
ＳＣＮＡの特性及び配列
【０２５５】
相補性で標的と塩基対形成するオリゴヌクレオチドのＳＣＮＡの長さは、優先的には少なくとも１８塩基である。ＳＣＮＡは、６−ＦＡＭ末端修飾因子と標的に相補性のヌクレオチドとの間でスペーサーとして役立つ配列組成物の少数（たとえば、１〜６、本実施例では６）の標的と塩基対形成しないヌクレオチドも含有することができる。
本実施例で使用されるようなＧＧＳＧＧ（配列番号７）ドメイン間リンカーを伴った抗フルオレセイン−ｓｃＦｖ−６−ＦＡＭ系についてのコンピュータ化３Ｄモデルから得られた空間測定の結果によって、ＳＣＮＡ間の予想される最適な距離が、ＳＣＮＡにて２Ｎ’の存在下で約２３〜２６ヌクレオチドであることを示す。切断は、いずれかの側でＳＣＮＡとの最後のヌクレオチドのハイブリッド形成後から数え、二量体化構築物によるｄｓＤＮＡの切断によって創られる４塩基の５’オーバーハングを考慮に入れて、１１、１２又は１３番目のヌクレオチドの左及び右に約±２ヌクレオチドで生じると予想される。この基準は、標的とされる配列が、これについて、２４ヌクレオチド：ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＹＹＹＹＹＹＹＹＹＸＸＸＸＸＸＹＹＹＹＹＹＹＹＹＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣであるならば、Ｙ＋ＸがＳＣＮＡ塩基対形成部位間でのヌクレオチドの数を表す場合、設計されたＳＣＮＡは領域ＡとＣと塩基対形成し、ＤＳＢを生じる切断はＸ領域にある又は隣接することを示唆している。ＳＣＮＡはセンス鎖又はアンチセンス鎖に相補性であることができるが、好ましくは、センス（転写されない）配列と塩基対形成するように選択される。タンパク質部分の位置が、「末端近傍」にあるプライマーの５’又は３’の修飾によって定義されるようにＳＣＮＡの「末端近傍」に位置するので、ＳＣＮＡは双方とも同一鎖と塩基対形成することができる。
標的部位の配列
【０２５６】
標的配列の例は以下である
（Ａ）
エクソン１は３４７で開始し、標的配列はＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡＣＣＣＴＣＣＴＡＣＣ（配列番号１３３）である。
ＳＣＮＡｓ：
ＳＣＮＡ距離選択肢１、２１ｂｐの標的ギャップ
ＳＬ３５１：Ａ＊ＧＧＡＴＴＧＣＴＣＡＡＣＡＡＣＣＡＴＧＣＴＮＮＮＮＮＮ／３６−ＦＡＭ／（核酸のみが本明細書では配列番号１３４で示される）
ＳＲ３７３：／５６−ＦＡＭ／ＮＮＮＮＮＮＴＣＴＧＧＴＧＡＧＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＣ＊Ｃ（核酸のみが本明細書では配列番号１３５で示される）
ＳＣＮＡ距離選択肢２、２４ｂｐの標的ギャップ及びさらに短いＳＣＮＡの「Ｎ」リンカーを採用する、コンピュータの結果に基づく
ＳＬ３４９：Ｇ＊ＧＡＧＧＡＴＴＧＣＴＣＡＡＣＡＡＣＣＡＴＧＮＮ／３６−ＦＡＭ／（核酸のみが本明細書では配列番号１３６で示される）
ＳＲ３７４：／５６−ＦＡＭ／ＮＮＣＴＧＧＴＧＡＧＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＣＣ＊Ｇ（核酸のみが本明細書では配列番号１３７で示される）
エクソン２は１２４９９で開始し、標的配列は：ＴＡＣＧＴＣＴＧＴＴＧＣＴＡＧＡＴＴＡＴＣ（配列番号１３８）である。
（Ｂ）
ＳＣＮＡ
ＳＣＮＡ距離選択肢１、２１ｂｐの標的ギャップ
ＳＬ１２５０３：Ａ＊ＴＧＣＴＴＴＴＡＴＴＴＴＡＣＡＧＧＴＴＣＴＮＮＮＮＮＮ／３６−ＦＡＭ／（核酸のみが本明細書では配列番号１３９で示される）
ＳＲ１２５２５：／５６−ＦＡＭ／ＮＮＮＮＮＮＧＴＣＣＡＡＡＡＧＴＧＴＴＡＡＴＧＣＣＣＡ＊Ａ（核酸のみが本明細書では配列番号１４０で示される）
ＳＣＮＡ距離選択肢２、２４ｂｐの標的ギャップ及びさらに短いＳＣＮＡの「Ｎ」リンカーを採用する、コンピュータの結果に基づく
ＳＬ１２５０１：ＴＣＡＴＧＣＴＴＴＴＡＴＴＴＴＡＣＡＧＧＴＴＮＮ／３６−ＦＡＭ／（核酸のみが本明細書では配列番号１４１で示される）
ＳＲ１２５２６：／５６−ＦＡＭ／ＮＮＴＣＣＡＡＡＡＧＴＧＴＴＡＡＴＧＣＣＣＡＡ＊Ｇ（核酸のみが本明細書では配列番号１４２で示される）
制限解析のためのエクソン２標的：ＣＡＧＴＴＧＡＧＡＣＴＣＡＧＡＡＣＴＴＧＧ（配列番号１４３）
（Ｃ）
ＳＣＮＡ
ＳＣＮＡ距離選択肢１、２１ｂｐの標的ギャップ
ＳＬ１２５９５：Ｇ＊ＧＡＡＴＴＧＡＧＧＡＡＧＡＣＴＧＴＴＡＣＴＡＮＮＮＮＮＮ／３６−ＦＡＭ／（核酸のみが本明細書では配列番号１４４で示される）
ＳＲ１２６１７：／５６−ＦＡＭ／ＮＮＮＮＮＮＡＡＧＧＣＣＴＧＣＡＴＣＡＴＧＡＴＧＧＣＣＡＡＴＴＣＴ＊Ｃ（核酸のみが本明細書では配列番号１４５で示される）
ＳＣＮＡ距離選択肢２、２４ｂｐの標的ギャップ及びさらに短いＳＣＮＡの「Ｎ」リンカーを採用する、コンピュータの結果に基づく
ＳＬ１２５９４：Ｇ＊ＧＡＡＴＴＧＡＧＧＡＡＧＡＣＴＧＴＴＡＣＴＮＮ／３６−ＦＡＭ／（核酸のみが本明細書では配列番号１４６で示される）
ＳＲ１２６１９：／５６−ＦＡＭ／ＮＮＧＧＣＣＴＧＣＡＴＣＡＴＧＡＴＧＧＣＣＡＡ＊Ｔ（核酸のみが本明細書では配列番号１４７で示される）
実施例Ｃの解析のためのプライマー
ＦＡＳ＿Ｅ２Ｆ：ＣＡＴＧＣＴＴＴＴＡＴＴＴＴＡＣＡＧ；（配列番号１４８）
ＦＡＳ＿Ｅ２Ｒ：ＣＴＧＴＧＡＣＴＴＴＣＡＣＴＧＴＡＡＴＣ（配列番号１４９）
これらのプライマーによる標的にＰＣＲ増幅は（未修飾ＤＮＡで）２２７ｂｐのＰＣＲ産物を形成し、ＤｄｅＩによる消化によって１２７ｂｐと１００ｂｐの断片を形成する。ＤｄｅＩ消化は正確なターゲッティングによって消滅する。
エクソン９標的：ＣＡＡＴＴＧＴＧＡＡＴＴＣＡＣＡＴＡＧＡＡ（配列番号１５０）
（Ｄ）
ＳＣＮＡ
ＳＬ２４５２４：Ｇ＊ＧＴＧＴＣＡＴＡＴＴＡＴＡＣＡＡＴＡＴＴＴＮＮＮＮＮＮ／３６−ＦＡＭ／（核酸のみが本明細書では配列番号１５１で示される）
ＳＲ２４５４６：／５６−ＦＡＭ／ＮＮＮＮＮＮＡＡＣＡＴＴＡＡＡＴＴＡＴＡＡＴＧＴＴＴＧ＊Ａ（核酸のみが本明細書では配列番号１５２で示される）
ＳＣＮＡ距離選択肢２、２４ｂｐの標的ギャップ及びさらに短いＳＣＮＡの「Ｎ」リンカーを採用する、コンピュータの結果に基づく
ＳＬ２４５２２：Ｔ＊ＴＧＧＴＧＴＣＡＴＡＴＴＡＴＡＣＡＡＴＡＴＮＮ／３６−ＦＡＭ／（核酸のみが本明細書では配列番号１５３で示される）
ＳＲ２４５４７：／５６−ＦＡＭ／ＮＮＡＣＡＴＴＡＡＡＴＴＡＴＡＡＴＧＴＴＴＧＡ＊Ｃ（核酸のみが本明細書では配列番号１５４で示される）
実施例Ｄの解析のためのプライマー：
ＦＡＳ＿Ｅ９Ｆ  ＣＴＴＴＧＴＴＴＡＴＡＡＣＴＣＴＧＡＧＡＡＧ（核酸のみが本明細書では配列番号１５５で示される）
ＦＡＳ＿Ｅ９Ｒ  ＴＣＡＡＡＡＴＧＣＴＴＴＴＧＡＴＧＣＣＴＧＡ（核酸のみが本明細書では配列番号１５６で示される）
これらのプライマーによる標的のＰＣＲ増幅は、ＥｃｏＲＩによって消化されて１３４ｂｐと１０６ｂｐの断片を形成する２４０ｂｐのＰＣＲ産物を（未修飾のＤＮＡで）形成する。ＥｃｏＲＩの消化は正確なターゲッティングによって消滅する。
／５６−ＦＡＭ及び／３６−ＦＡＭは６−ＦＡＭ（６−カルボキシ−フルオレセイン）から構成されるＳＣＮＡｓｓＤＮＡにおけるそれぞれ５’−修飾又は３’−修飾を記号で表す。Ｎは任意のヌクレオチド記号で表す。ホスホロチオエート結合は星印（＊）によって示す。
【０２５７】
各ＳＣＮＡの対がＦＡＳ受容体をノックアウトする変異を生じることができる一方で、遺伝子における１を超える部位を標的とすることから生じるＤＮＡのストレッチ全体の欠失はＦＡＳＲの活性を完全に無効にすることができる。従って、たとえば、実施例Ａ〜ＣにてＳＣＮＡを使用することがＦａｓＲ活性を消滅させる変異を生じ得る一方で、これらのＳＣＮＡのいずれかを実施例ＤのＳＣＮＡと一緒に使用することはＦａｓＲ活性を消滅させる主要なゲノムの欠失をもたらす。
アッセイ
【０２５８】
ヒトのゲノムＤＮＡにて誘導された特定の変異を検出するためのバイオアッセイは以下のとおりである：ＳＣＮＡｓｓＤＮＡを定式化するためのプラスミドＤＮＡ及びＴｒａｎｓＩＴ−オリゴを定式化するための形質移入剤（米国、Ｍｉｒｕｓ）  ＴｒａｎｓＩＴ−ＨｅＬａＭＯＮＳＴＥＲ又はＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１を用いてプログラム可能な分子複合体のタンパク質部分をコードするプラスミドを、関連するｓｓＤＮＡ  ＳＣＮＡと一緒にＨｅＬａ及びＪｕｒｋａｔ細胞に形質移入する。いったん割り当てた時間、インキュベートすると、定式化されたＤＮＡ−形質移入剤混合物を細胞に同時に供給してＦａｓＲを標的とする。遺伝子ターゲッティングの効率を測定するために、Ｋｏｔｌｏら、２００３から改変されたプロトコールにてＦａｓＬに対するその感受性について細胞を調べる：形質移入した細胞を２つ組で２０〜２４時間プレートに入れ、その後、２００ｎｇ／ｍｌの抗Ｆａｓアゴニスト抗体（抗−ＦａｓｍＡｂ，クローン２Ｒ２カタログ番号：ＭＣ−１２１，Ｋａｍｉｙａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，又はモノクローナル抗ＣＤ９５、クローン７Ｃ１１，カタログ番号：ＰＮＩＭ２３８７、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）と任意で、１００μＭのジクマロールのような増感剤の組み合わせで処理する。処理の１７時間後、ＰＢＳですすいだ後、プレートに接着したままである生きている、トリパンブルー色素排除細胞の数を測定し、又はヨウ化プロピジウム排除染色を行ってフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって無傷の生細胞を評価する。ＦＡＳ遺伝子が標的とされ、無効にされる細胞は、死の誘導過程を通らず、染まらず、むしろ増殖する。従って、誘導され、非特異的に標的とされた細胞（たとえば、ＳＣＮＡがない又は非ＦＡＳのＳＣＮＡ）に対する特異的に標的とされた細胞の比較は、ヒト細胞における遺伝子ターゲッティングの成功を評価する。標的とされたＦａｓＲ領域のゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅、その後の制限断片の解析及び配列決定を行って誘導された変異を特定することによって生き残った又はＦＡＣＳで仕分けた細胞株を解析する。
実施例１０：生体内でプラスミドＤＮＡの配列を編集すること。抗生剤耐性修飾
【０２５９】
本実施例は、プログラム可能な分子複合体の基本設計における並べ替えを調べ、微調整を行うのに、異なる生物又は細胞におけるその適用をしらべるのに、異なる送達方法を調べるのに、及び変異、置換、欠失及び挿入の機能を編集することを調べるのに好適なバイオアッセイについてである。
細菌性の選抜可能なマーカー遺伝子を用いてプラスミドＤＮＡを標的とする場合の遺伝子ターゲッティングの効率を測定する。
【０２６０】
これらの実施例では、シロイヌナズナのプロトプラストに基づくバイオアッセイを使用する。このバイオアッセイでは、プロトプラストには、プラスミド上のレポーター系及び分子複合体が送達され、末端ジゴキシゲニン（ＮＨＳエステル）（ＤＩＧ）によって修飾された対形成したｓｓＤＮＡのＳＣＮＡが同時に送達され、一方のＳＣＮＡは３’末端でそのような修飾を有し、他方は５’末端で有する。たとえば、ホスホロチオエートのような、エンドヌクレアーゼ保護のための第２の修飾は反対側の末端で付加され得る。
【０２６１】
タンパク質部分は実施例１に記載されたとおりである。
本実施例では、ＳＣＮＡの核酸末端修飾は、オリゴヌクレオチドの５’又は３’位置に連結されたＮＨＳ−エステル結合したジゴキシゲニン（ＤＩＧ）である。
分子複合体のタンパク質部分のアミノ酸配列（一文字コード）（ジゴキシゲニンｓｃＦｖを伴ったＮＬＳ−ＦｏｋＩヌクレアーゼ配列は配列番号１２で示される）。
ＳＣＮＡの特性及び配列
【０２６２】
相補性で標的と塩基対形成するオリゴヌクレオチドのＳＣＮＡの長さは、優先的には少なくとも１８塩基である。ＳＣＮＡは、ＤＩＧ−ＮＨＳ末端修飾因子と標的に相補性のヌクレオチドとの間でスペーサーとして役立つ配列組成物の少数（たとえば、１〜６、一例では６、他の例では２）の標的と塩基対形成しないヌクレオチドも含有することができる。
【０２６３】
本実施例で示されるようなＧＳＬＥＧＧＳＧＧ（配列番号１４）ドメイン間リンカーを伴った抗ＤＩＧ−ＳｃＦｖ−ＮＨＳ−Ｅｓｔｅｒ−ＤＩＧ系についてのコンピュータ化３Ｄモデルから得られた空間測定の結果によって、ＳＣＮＡ間の予想される最適な距離が、ＳＣＮＡにて２Ｎ’の存在下で約２３〜２６ヌクレオチドであることを示す。切断は、いずれかの側でＳＣＮＡとの最後のヌクレオチドのハイブリッド形成後から数え、二量体化構築物によるｄｓＤＮＡの切断によって創られる４塩基の５’オーバーハングを考慮に入れて、１１、１２又は１３番目のヌクレオチドの左及び右に約±２ヌクレオチドで生じると予想される。この基準は、標的とされる配列が、これについて、２４ヌクレオチド：ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＹＹＹＹＹＹＹＹＹＸＸＸＸＸＸＹＹＹＹＹＹＹＹＹＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣであるならば、Ｙ＋ＸがＳＣＮＡ塩基対形成部位間でのヌクレオチドの数を表す場合、設計されたＳＣＮＡは領域ＡとＣと塩基対形成し、ＤＳＢを生じる切断はＸ領域にある又は隣接することを示唆している。ＳＣＮＡはセンス鎖又はアンチセンス鎖に相補性であることができるが、好ましくは、センス（転写されない）配列と塩基対形成するように選択される。タンパク質部分の位置が、「末端近傍」にあるプライマーの５’又は３’の修飾によって定義されるようにＳＣＮＡの「末端近傍」に位置するので、ＳＣＮＡは双方とも同一鎖と塩基対形成することができる。
検出アッセイ
【０２６４】
標的プラスミドｐＴＧＤ（図１５にて模式的に表される）は４つの主要な区分を含む：
（１）標的のアンピシリン耐性カセット（ＡｍｐＲ）
（２）構成的選抜カナマイシン（Ｋｍ）耐性カセット（ＫａｎＲ）
（３）複製開始点（ｏｒｉ）
（４）試験生物、本実施例では植物に好適なプロモータを含むプログラム可能な分子複合体タンパク質部分をコードする配列カセット
（５）Ｔ１及びＴ２−標的配列１及び２。
【０２６５】
このプラスミドは、たとえば、大腸菌細胞のような細菌細胞にて増殖する。本実施例では、ＳＣＮＡ、プログラム可能な分子複合体タンパク質部分をコードする標的プラスミドｐＴＧＤ及び供与体ＤＮＡ（実施例１０Ｂ、１０Ｃにおける）をシロイヌナズナのプロトプラストに送達する。形質移入の４８時間後、形質移入したプロトプラスト（Ｋｉｔ  Ａ１１２０、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）からＤＮＡを抽出し、大腸菌コンピテント細胞（Ｋｉｔ  Ｌ３００２、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）を形質転換する。１００μｇ／ｍｌの濃度でカナマイシンを含有するＬＢ培地上に形質転換した細菌を広げる。３７℃で約１６時間後、コロニーが増殖する。次いで、コロニーを複製してアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）又はテトラサイクリン（１００μｇ／ｍｌ）ＬＢプレートに移し、３７℃でさらに１６時間増殖させる。
解析
【０２６６】
各複製からのコロニーを数える。カナマイシン耐性コロニーの数は標的総数も表すプラスミドの総数を示唆する。アンピシリンに耐性ではないコロニーは、「変異」又は「欠失」の編集機能を検証する上手く標的とされたプラスミドを含有する。テトラサイクリンに耐性であるが、アンピシリンに耐性ではないコロニーは、「置換」の編集機能を検証するＮＨＥＪによる供与体ＤＮＡの標的プラスミドへの統合を表す。アンピシリン及びテトラサイクリン双方に耐性であるコロニーは、標的とされ、アンピシリン標的配列に統合された供与体を有したが、「挿入」の編集機能を検証するそれを置き換えなかったプラスミドを含有するコロニーである。
次いでプラスミドを以下のプライマーによるＰＣＲ及び結果の検証のための配列解析に供する：
Ａ９６１Ｆ：ＴＡＧＧＧＣＧＣＴＧＧＣＡＡＧＴＧＴＡＧ（配列番号１５８）
Ａ２１６１Ｒ：ＣＡＴＡＡＣＡＣＣＣＣＴＴＧＴＡＴＴＡＣ（配列番号１５９）
実験
実験１０Ａ−ＡＭＰＲカセットにおける標的とされた変異
【０２６７】
以下の追加の詳細と共に上記で記載された（「検出アッセイ」）ように検出アッセイを本質的に実施する：ｐＴＧＤプラスミドは標的配列１（配列番号１６１）に隣接するＳＣＮＡと一緒にシロイヌナズナのプロトプラストに形質移入される。ＤＮＡを精製し、大腸菌のコンピテント細胞を形質転換し、ＬＢ  Ｋａｎ培地に広げる。ＬＢ  ＡＭＰ培地にて複製を作製する。ＡＭＰに対する耐性を失ったコロニーが標的とされたプラスミドを含有する。
実験１０Ｂ
【０２６８】
以下の追加の詳細と共に上記で記載された（「検出アッセイ」）ように検出アッセイを本質的に実施する：ｐＴＧＤプラスミドは、標的配列１に隣接するＳＣＮＡ及びＰＣＲ産物として作出される線形ｄｓＤＮＡテトラサイクリン（Ｔｅｔ）供与体と一緒にシロイヌナズナのプロトプラストに形質移入される。ＤＮＡを精製し、大腸菌のコンピテント細胞を形質転換し、ＬＢ  Ｋａｎ培地に広げる。ＬＢ  ＡＭＰ及びＬＢ  Ｔｅｔのプレート双方で複製を作製する。ＡＭＰに対する耐性を失ったコロニーが標的とされたプラスミドを含有する。Ｔｅｔに耐性のコロニーは特異的に統合された供与体ＤＮＡを含有するプラスミドを表す。
実施例１０Ｃ
【０２６９】
以下の追加の詳細と共に上述のように検出アッセイを本質的に実施する（「検出アッセイ」）：ｐＴＧＤプラスミドを、標的配列１に向けたＳＣＮＡ及び標的配列２（配列番号１７０）に向けたＳＣＮＡと一緒に、テトラサイクリン供与体ＤＮＡと一緒に、シロイヌナズナのプロトプラストに形質移入する。ＤＮＡを精製し、大腸菌のコンピテント細胞を形質転換し、それをＬＢＫｍ培地に広げる。ＬＢ  ＡＭＰプレート及びＬＢ  Ｔｅｔプレートで複製を作る。ＡＭＰに対する耐性を失ったコロニーは標的とされプラスミドを含有する。Ｔｅｔ耐性のコロニーは特異的に統合された供与体ＤＮＡを表す。ＡＭＰ感受性のコロニーをプライマーＡ９６１Ｆ及びＡ１２６１ＲによるＰＣＲ解析に供する。ＡＭＰ（約８６０ｂｐ）標的配列の代わりにＴｅｔ供与体（約１．９Ｋｂ）を取り込んでいるプラスミドを含有するコロニーは遺伝子置換の事象を明らかにする。
ＡＭＰ及びＴｅｔの双方に感受性のコロニーはＮＨＥＪを介した遺伝子の欠失を明らかにする。
Ｔｅｔ及びＡＭＰの双方に耐性のコロニーは、ＡＭＰ耐性カセットを欠失することなくＴｅｔＲ供与体を取り込んでいるプラスミドを含有し、標的とされた供与体の統合又は「挿入」を明らかにする。
送達
【０２７０】
バイオアッセイの設定：シロイヌナズナのプロトプラストの調製はＷｕら（２００９）に基づき、形質移入工程における差異を伴って実施例１の調製に類似する。
形質移入
【０２７１】
（１）２ｍｌ試験管内にて形質移入用の新しいＰＥＧ溶液を作る。
（２）６穴プレートからＢＳＡを捨て、乾かす。
（３）１５ｍｌの丸底（スナップ式のキャップ）試験管にて室温で、標的プラスミドＤＮＡ及びタンパク質部分を発現するＤＮＡを含むプラスミド、ＳＣＮＡｓｓＤＮＡ及び線形ｄｓＤＮＡ供与体の総量３０〜４０μｇまでの混合物と０．２ｍｌのＭＭｇ溶液中の約５×１０４（２×１０４〜１×１０５）のプロトプラストを混合する。
（４）等量（０．２ｍｌのプロトプラスト＋ｍｉｄｉｐｒｅｐ容量）の新しいＰＥＧ溶液を加える。
（５）ＲＴで５分間インキュベートする。
（６）３ｍｌのＷ５溶液をゆっくり加えて洗浄し、１度に１ｍｌ加え、混合する。
（７）スイングアウトロータにて１００×ｇで１分間遠心する。
（８）洗浄と遠心を繰り返す。
（９）１ｍｌのＷ５溶液に再浮遊する。
（１０）ＢＡＳをコーティングしたプレートに注ぐ。
（１１）２２℃にて１日１６時間最適照明（１５０マイクロアインシュタイン・ｍ−２・ｓ−１）にてプロトプラストを生長させる。必要に応じて培地を交換する。
次いでプロトプラストを検出アッセイで記載されたようなＤＮＡ抽出に供する。
標的とされるＡｍｐＲカセットは配列番号１６０で示される。
ＳＣＮＡの対は、センス鎖（Ｓ）又はアンチセンス鎖（ＡＳ）に関わりなく選択された左（Ｌ）１つと右（Ｒ）１つである：ＳＣＮＡ対の組み合わせの選択は実験において調べられたパラメータである。
ＡＭＰＲカセットにおける標的配列Ｔ１：ＴＡＴＧＡＧＴＡＴＴＣＡＡＣＡＴＴＴＣＣＧ（配列番号１６１）（ＡＴＧ開始コドンに下線を引く）
ＡＭＰターゲッティングＳＣＮＡのセット１
選択肢１−２１ｐの標的ギャップを利用する
ｐＴＧＤ＿１３０＿ＳＬ：Ａ＊ＡＴＡＡＴＡＴＴＧＡＡＡＡＡＧＧＡＡＧＡＧＮＮＮＮＮＮ／３ＤｉｇＮ／（核酸のみが本明細書では配列番号１６２で示される）
ｐＴＧＤ＿１５２＿ＳＲ：／５ＤｉｇＮ／ＮＮＮＮＮＮＴＧＴＣＧＣＣＣＴＴＡＴＴＣＣＣＴＴＴＴＴ＊Ｔ（核酸のみが本明細書では配列番号１６３で示される）
ｐＴＧＤ＿１３０＿ＡＳＬ：／５ＤｉｇＮ／ＮＮＮＮＮＮＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＴＡＴ＊Ｔ（核酸のみが本明細書では配列番号１６４で示される）
ｐＴＧＤ＿１５２＿ＡＳＲ：Ａ＊ＡＡＡＡＡＧＧＧＡＡＴＡＡＧＧＧＣＧＡＣＡＮＮＮＮＮＮ／３ＤｉｇＮ／（核酸のみが本明細書では配列番号１６５で示される）
選択肢２−対形成の組み合わせ、予測結果に従って２４ｂｐの標的ギャップとさらに短いＳＣＮＡリンカーを採用する
ＡＭＰ＿１２９＿ＳＬ：Ｃ＊ＡＡＴＡＡＴＡＴＴＧＡＡＡＡＡＧＧＡＡＧＡＮＮ／３ＤＩＧＮ／（核酸のみが本明細書では配列番号１６６で示される）
ＡＭＰ＿１５４＿ＳＲ：／５ＤｉｇＮ／ＮＮＴＣＧＣＣＣＴＴＡＴＴＣＣＣＴＴＴＴＴＴＧ＊Ｃ（核酸のみが本明細書では配列番号１６７で示される）
ＡＭＰ＿１２９＿ＡＳＬ：／５ＤｉｇＮ／ＮＮＴＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＴＡＴＴ＊Ｇ（核酸のみが本明細書では配列番号１６８で示される）
ＡＭＰ＿１５４＿ＡＳＲ：Ｇ＊ＣＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡＡＴＡＡＧＧＧＣＧＡＮＮ／３ＤｉｇＮ／（核酸のみが本明細書では配列番号１６９で示される）
ＡＭＰＲカセットにおける標的配列Ｔ２：ＡＧＣＡＴＴＧＧＴＡＡＣＴＧＴＣＡＧＡＣＣ（配列番号１７０）
ＡＭＰターゲッティングＳＣＮＡのセット２
２１ｐの標的ギャップを利用する選択肢１
ｐＴＧＤ＿９８１＿ＳＬ：Ｇ＊ＡＧＡＴＡＧＧＴＧＣＣＴＣＡＣＴＧＡＴＴＡＮＮＮＮＮＮ／３ＤｉｇＮ／（核酸のみが本明細書では配列番号１７１で示される）
ｐＴＧＤ＿１００３＿ＳＲ：／５ＤｉｇＮ／ＮＮＮＮＮＮＡＡＧＴＴＴＡＣＴＣＡＴＡＴＡＴＡＣＴＴＴ＊Ａ（核酸のみが本明細書では配列番号１７２で示される）
ｐＴＧＤ＿９８１＿ＡＳＬ：／５ＤｉｇＮ／ＮＮＮＮＮＮＴＡＡＴＣＡＧＴＧＡＧＧＣＡＣＣＴＡＴＣＴ＊Ｃ（核酸のみが本明細書では配列番号１７３で示される）
ｐＴＧＤ＿１００３＿ＡＳＲ：Ｔ＊ＡＡＡＧＴＡＴＡＴＡＴＧＡＧＴＡＡＡＣＴＴＮＮＮＮＮＮ／３ＤｉｇＮ／（核酸のみが本明細書では配列番号１７４で示される）
選択肢２−対形成の組み合わせ、予測結果に従って２４ｂｐの標的ギャップとさらに短いＳＣＮＡリンカーを採用する
ＡＭＰ＿９８０＿ＳＬ：Ｔ＊ＧＡＧＡＴＡＧＧＴＧＣＣＴＣＡＣＴＧＡＴＴＮＮ／３ＤＩＧＮ／（核酸のみが本明細書では配列番号１７５で示される）
ＡＭＰ＿１００５＿ＳＲ：／５ＤｉｇＮ／ＮＮＧＴＴＴＡＣＴＣＡＴＡＴＡＴＡＣＴＴＴＡＧ＊Ａ（核酸のみが本明細書では配列番号１７６で示される）
ＡＭＰ＿９８０＿ＡＳＬ：／５ＤｉｇＮ／ＮＮＡＡＴＣＡＧＴＧＡＧＧＣＡＣＣＴＡＴＣＴＣ＊Ａ（核酸のみが本明細書では配列番号１７７で示される）
ＡＭＰ＿１００５＿ＡＳＲ：Ｔ＊ＣＴＡＡＡＧＴＡＴＡＴＡＴＧＡＧＴＡＡＡＣＮＮ／３ＤｉｇＮ／核酸のみが本明細書では配列番号１７８で示される）
供与体：
クローニングベクターｐＳｏｕｐ、ＥＵ０４８８７０．１  ＧＩ：１５５７３３６１４からのテトラサイクリン耐性をコードする供与体の配列は配列番号１７９で示される
実施例１１：接続された一対のＳＣＮＡ配列と共に作用するプログラム可能な分子複合体の構築
【０２７２】
本実施例では、図４Ａ及び４Ｂにて模式的に説明されたような接続された一対の特異性付与核酸配列（ＳＣＮＡ配列）としてここでは指定される、二重の標的配列結合核酸配列を組み入れる単一核酸分子と共に作動するようにプログラム可能な分子複合体を設計する。
【０２７３】
本実施例では、破壊されたＧＦＰ標的配列が停止コドンの除去又は変異によって修復される。所定の標的ＧＦＰの結果として生じる切断はＧＦＰ活性を復活しうる点突然変異をもたらす。
【０２７４】
これらの実施例では、プロトプラストには、レポーター系（標的プラスミド）、タンパク質部分を発現するプラスミドが送達され、たとえば、１２Ａ（図４Ａで模式的に説明される）−ＲＮＡをコードする核酸、本実施例では、バクテリオファージＰｈｉ２１に由来する２０量体のボックスＢのＲＮＡヘアピン結合配列（配列番号６２：５’−ＵＵＣＡＣＣＵＣＵＡＡＣＣＧＧＧＵＧＡＧ−３’）によって修飾された２つのＳＣＮＡ配列から構成されるＲＮＡ、及び「ＳＣＮＡ接続要素」、定義されない配列又は長さの標的とハイブリッド形成しないヌクレオチドのストレッチが同時送達されるシロイヌナズナのプロトプラストに基づくバイオアッセイ。一方のＳＣＮＡはそのような修飾をＲＮＡ分子の３’末端に有し、他方は５’末端に有する。本実施例のＲＮＡ−ＳＣＮＡは、バクテリオファージＰｈｉ２１に由来する２０量体のボックスＢのＲＮＡヘアピン結合配列（配列番号６２：５’−ＵＵＣＡＣＣＵＣＵＡＡＣＣＧＧＧＵＧＡＧ−３’）を用いて２つの分子複合体のタンパク質部分の連結ドメインを結合する、又は：
図４Ｂにて模式的に説明される実施例１１Ｂでは、修飾されたｓｓＤＮＡ−ＳＣＮＡは、本実施例では、末端ジゴキシゲニン（ＮＨＳエステル）（ＤＴＧ）分子の添加による５’及び３’双方の末端で修飾された配列、及び「ＳＣＮＡ接続要素」、定義されない配列又は長さの標的とハイブリッド形成しないヌクレオチドのストレッチを含有する。
タンパク質の配列及び特性
【０２７５】
実施例１１Ａにおけるタンパク質部分は、機能性ドメインとしてのＦｏｋＩヌクレアーゼに由来するアミノ酸配列と、バクテリオファージＰｈｉ２１のＮタンパク質のＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）（配列番号６３：Ｎ’−ＧＴＡＫＳＲＹＫＡＲＲＡＥＬＩＡＥＲ−Ｃ’）に由来する連結ドメインと、核局在化ドメインとしてのＳＶ４０ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ：配列番号：３）と、ドメイン間接続要素（配列番号１４：ＧＳＬＥＧＧＳＧＧ）を含有する。
【０２７６】
実施例１１Ｂにおけるタンパク質部分は、機能性ドメインとしてのＦｏｋＩヌクレアーゼから適合させたアミノ酸配列と、連結ドメインとしての、Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８で記載されたものに類似する抗ＤＩＧ単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）免疫グロブリン（ＤＩＧ−ｓｃＦｖ）から適合させたアミノ酸配列と、核局在化ドメインとしてのＳＶ４０ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ：配列番号：３）と、ドメイン間接続要素（配列番号１４：ＧＳＬＥＧＧＳＧＧ）を含有する。
【０２７７】
ＳＣＮＡの核酸末端修飾は、ＮＨＳ−エステル結合したジゴキシゲニン（ＤＩＧ）であり、オリゴヌクレオチドの５’及び３’双方の末端に連結される。
実施例１１Ａ：Ｐｈｉ２１ＮＰに基づくプログラム可能な分子複合体のタンパク質部分
【０２７８】
配列：
成分
バクテリオファージＰｈｉ２１のＮタンパク質（配列番号６３：ＧＴＡＫＳＲＹＫＡＲＲＡＥＬＩＡＥＲ）完全長のＮタンパク質で見られるようなＮ末端にて又はその近傍で、ＲＮＡ結合ペプチドはＮ末端に位置する。
【０２７９】
ＦｏｋＩヌクレアーゼ
ＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＱＲＹＶＥＥＮＱＴＲＮＫＨＩＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＨＩＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦ（配列番号６６）
【０２８０】
ＳＶ４０ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ：配列番号３）
ドメイン間接続要素：プログラムされた分子複合体の最適な機能について種々のポリアミノ酸リンカーを調べる。
分子複合体のタンパク質部分のアミノ酸配列：本実施例では、Ｐｈｉ２１Ｎタンパク質（配列番号６８で示されるようなアミノ酸配列）はプログラム可能な分子構築物のタンパク質部分のＮ’末端で集合し、核局在化シグナルＳＶ４０ＮＬＳはＣ’末端に位置し、ドメイン間リンカーはＧＧＳＧＧ（配列番号７）である。
実施例１１Ｂ：分子複合体のタンパク質部分のアミノ酸配列（一文字コード）（ジゴキシゲニンｓｃＦｖを伴ったＮＬＳ−ＦｏｋＩヌクレアーゼは配列番号１２で示される）
ＳＣＮＡの特性及び配列
【０２８１】
相補性であり、標的と塩基対形成するオリゴヌクレオチドのＳＣＮＡの長さは任意の所定の長さであり得る。たとえば、長さは少なくとも１８塩基である。ＳＣＮＡはまた、（ａ）実施例１１Ａ若しくは１１ＢにおけるＰｈｉ２１ボックスＢのＲＮＡヘアピン末端修飾因子又は（ｂ）実施例１２ＢにおけるＤＩＧ−ＮＨＳ末端修飾因子と相補性のヌクレオチドとの間でスペーサーとして役立つ配列組成物の少数（好ましくは０〜６、さらに好ましくは１〜２）の標的と塩基対形成しないヌクレオチド（Ｎ’）も含有することができる。これらの実施例では、ＳＣＮＡは、図１４における「ＳＣＮＡ接続要素」と呼ばれる標的と塩基対形成しないヌクレオチド又は本実施例の配列におけるＸ（ｎ）によって接続される。Ｘ（ｎ）は、２つの特異性付与核酸を互いに接続するＲＮＡヌクレオチドの未決定の長さを意味する。線形ＤＮＡについては、予想される最適な長さ（ｎ）は約３５〜７５ヌクレオチド（ｎｔｓ）であるが、さらに長い（約７３ｎｔｓ）又はさらに短い（４〜３４ｎｔｓ）ＳＣＮＡ接続要素が適用可能である。本実施例では、ｎ＝４０ヌクレオチドがここで提供される。
【０２８２】
ＳＣＮＡはセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかに相補性であることができるが、ここでは各実施例について２つの選択肢が示されるけれども好ましくは、センス（転写されない）配列と塩基対形成するように選択される。タンパク質部分の位置が、「末端近傍」にあるプライマーの５’又は３’の修飾によって定義されるようにＳＣＮＡの「末端近傍」に位置するので、ＳＣＮＡは双方とも同一鎖と塩基対形成することができる。
【０２８３】
実施例１１Ａ及び１１Ｂのアッセイのための標的「停止ＧＦＰ」を含有するプラスミドは配列番号１８１で示される核酸配列を含有する。
実施例１１Ａ：（Ｐｈｉ２１ＮＰに基づく）
【０２８４】
センス又はアンチセンスとハイブリッド形成する二重のＳＣＮＡが構築される：
センスと接続されるＳＣＮＡｓ：
ＧＦＰ−９２１ＳＲ−Ｘ（ｎ）−８９２ＳＬボックスＢＰｈｉ
ＵＵＣＡＣＣＵＣＵＡＡＣＣＧＧＧＵＧＡＧＮＵＣＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＵＧＵＵＣＡ（配列番号２０７）−Ｘ（ｎ）−ＡＣＣＡＵＵＵＡＣＧＡＡＣＧＡＵＡＧＣＣＡＵＮＵＵＣＡＣＣＵＣＵＡＡＣＣＧＧＧＵＧＡＧ（配列番号２０８として指定される）．
アンチセンスと接続されるＳＣＮＡｓ：
ＧＦＰ−９２１ＡＳＲ−Ｘ（ｎ）−８９２ＡＳＬボックスＢＰｈｉ
ＵＵＣＡＣＣＵＣＵＡＡＣＣＧＧＧＵＧＡＧＮＡＵＧＧＣＵＡＵＣＧＵＵＣＧＵＡＡＡＵＧＧＵ（配列番号２０９）−Ｘ（ｎ）−ＵＧＡＡＣＡＧＣＵＣＣＵＣＧＣＣＣＵＵＧＧＡＮＵＵＣＡＣＣＵＣＵＡＡＣＣＧＧＧＵＧＡＧ（配列番号２１０）
【０２８５】
２０量体のボックスＢのＰＨＩ配列５’−ＵＵＣＡＣＣＵＣＵＡＡＣＣＧＧＧＵＧＡＧ−３’（配列番号６２）に下線を引く。二重ＳＣＮＡの特異性付与配列は、ＳＣＮＡ１及びＳＣＮＡ２として、図４Ａと４Ｂの模式図にて印を付ける。Ｎ’は任意のヌクレオチドの短いストレッチ（０〜６）を意味し、Ｘ（ｎ）は定義されない配列又は長さのヌクレオチドの標的とハイブリッド形成しないストレッチを意味する（ＳＣＮＡ接続要素）。
実施例１１Ｂ
【０２８６】
センス又はアンチセンスとハイブリッド形成する二重のＳＣＮＡが構築される：
センスと接続されるＳＣＮＡｓ：
ＧＦＰ−９１９ＳＲ−Ｘ（ｎ）−８９４ＳＬ−ＤＩＧ
／５ＤｉｇＮ／ＮＮＴＧＴＣＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴ（核酸のみが配列番号２１１として指定される）
−Ｘ（ｎ）−  ＣＡＴＴＴＡＣＧＡＡＣＧＡＴＡＧＣＣＡＴＧＧＮＮ／３ＤｉｇＮ／（核酸のみが配列番号２１２として指定される）
アンチセンスと接続されるＳＣＮＡｓ：
ＧＦＰ−９１９ＡＳＲ−Ｘ（ｎ）−８９４ＡＳＬ−ＤＩＧ
／５ＤｉｇＮ／ＮＮＣＣＡＴＧＧＣＴＡＴＣＧＴＴＣＧＴＡＡＡＴＧ（核酸のみが配列番号２１３として指定される）−Ｘ（ｎ）−ＡＡＣＡＧＣＴＣＣＴＣＧＣＣＣＴＴＧＧＡＣＡＮＮ／３ＤｉｇＮ／（核酸のみが配列番号２１４として指定される）
【０２８７】
修飾の記号は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙウェブサイトで使用されるものであり（５’ＤＩＧ＝／５ＤｉｇＮ／；３’ＤＩＧ＝／３ＤｉｇＮ／）、Ｘ（ｎ）は定義されない配列又は長さのヌクレオチドの標的とハイブリッド形成しないストレッチを意味する（ＳＣＮＡ接続要素）。
送達
【０２８８】
バイオアッセイの設定：シロイヌナズナのプロトプラストの調製はＷｕら（２００９）に基づき、形質移入工程における差異を伴って実施例１の調製に類似する。
形質移入
【０２８９】
（１）２ｍｌ試験管内にて形質移入用の新しいＰＥＧ溶液を作る。
（２）６穴プレートからＢＳＡを捨て、乾かす。
（３）１５ｍｌの丸底（スナップ式のキャップ）試験管にて室温で、標的プラスミドＤＮＡとタンパク質部分を発現するＤＮＡを含むプラスミド、及び二重ＳＣＮＡを発現するプラスミド（実施例１２Ａについて）又はｓｓＤＮＡを含有する二重ＳＣＮＡ（実施例１２Ｂについて）の混合物３０〜４０μｇと０．２ｍｌのＭＭｇ溶液中の約５×１０４（２×１０４〜１×１０５）のプロトプラストを混合する。
（４）等量（０．２ｍｌのプロトプラスト＋ｍｉｄｉｐｒｅｐ容量）の新しいＰＥＧ溶液を加える。
（５）ＲＴで５分間インキュベートする。
（６）３ｍｌのＷ５溶液をゆっくり加えて洗浄し、１度に１ｍｌ加え、混合する。
（７）スイングアウトロータにて１００×ｇで１分間遠心する。
（８）洗浄と遠心を繰り返す。
（９）１ｍｌのＷ５溶液に再浮遊する。
（１０）ＢＡＳをコーティングしたプレートに注ぐ。
（１１）２２℃にて１日１６時間最適照明（１５０μＥ・ｍ−２・ｓ−１）にてプロトプラストを生長させる。必要に応じて培地を交換する。
次いでプロトプラストを以下で記載されるようなＦＡＣＳ又はＤＮＡ抽出に供する。
結果：誘導されたＤＳＢによる点突然変異
【０２９０】
本実施例では、分子複合体による標的の切断は、プラスミドＤＮＡ標的にて二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じる。このＤＳＢは停止コドンの部位に創られ、それは内在性のＮＨＥＪ修復メカニズムによって消化され、修復される。ＮＨＥＪは突然変異を起こし易く、これらの変異の一部は停止コドンを消滅させ、オープンリーディングフレームを復元し、活性のあるＧＦＰオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を生じ得る。次いでＧＦＰを顕微鏡又はフローサイトメータ（ＦＡＣＳ）によって検出し、系の効率の測定及び改善のための変数間の比較を可能にする。
解析
【０２９１】
遺伝子ターゲッティングの効率は陽性ＧＦＰ細胞の比率として判定される。自動化フローサイトメータ（ＦＡＣＳ）を用いて形質移入の３日後、Ｗ５溶液に浮遊させたプロトプラストをＧＦＰ活性についてスクリーニングする。ＧＦＰは５３０／３０のフィルターで検出される放射と共に４８８ｎｍの励起によって検出される。閾値及び補正因子を設定して偽陽性を排除する。
【０２９２】
標的配列は、ＧＦＰコーディング配列における特徴的制限部位（ＳｐｅＩ  ＡＣＴＡＧＴ、停止、下線）と結合した停止コドンである。上手く標的とされれば、停止コドン及び特徴的制限部位は、欠失、挿入又は点突然変異によって消滅する。特定のフレームにおける修復もＧＦＰの発現を復元することができる。アッセイは、本明細書で記載されるようなＦＡＣＳ又は以下のようなプラスミドミニプレップキット（ＢｉｏｎｅｅｒＫ３０３０）を用いてプロトプラストからプラスミドＤＮＡを精製することによって解析する：２５０μｌの緩衝液１の添加及び製造元の指示書における細菌ペレットのためのプロトコールによる手続きによってＷ５溶液におけるプロトプラストを沈殿させ、溶解する。得られたプラスミド調製物からＳＣＮＡ間の領域をＰＣＲによって増幅する。ＰＣＲ産物をＳｐｅＩによって徹底的に切断する。電気泳動の後、切断されてない産物をゲルから切り出し、Ｔ／Ａクローニングベクター（ｐＵＣ５７／Ｔ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）にクローニングし、各クローンの配列を決定して異なる変異事象を検出する。
実施例１２：最適なＳＣＮＡの距離を決定するためのバイオアッセイ
【０２９３】
潜在的な標的部位からの最適なＳＣＮＡの距離を決定するために、各異なる標的の種類又はプログラム可能な分子複合体の種類について、破壊されたＧＦＰレポーターコーディング配列（停止−ＧＦＰ）を含有する標的プラスミド（ｐＴＡＲＧＥＴ−ＳＴＯＰＧＦＰ（ｎ）、図１６）のセットを創る。人工的なＮ’リーダーにて及びＧＦＰコーディング配列（ＣＤＳ）にて２つのＳＣＮＡ結合配列（ＳＣＮＡｂｓ）を挿入し、それは、ｐＴＡＲＧＥＴ−ＳＴＯＰＧＦＰ（１−８）として指定されるプラスミドのシリーズを形成する種々の長さを持つ標的配列に隣接する。制限酵素ＮｃｏＩ及びＭａｃＩを用いて図１６で概説される挿入物を挿入する。標的配列は、人工的なＮ’リーダーにて特徴的制限酵素（ＳｐｅＩ  ＡＣＴＡＧＴ（配列番号２１５）又はＢｃｌＩ  ＴＧＡＴＣＡ（配列番号２１６）、下線は停止）と結合する停止コドンである。
【０２９４】
プラスミドの他の成分には以下が挙げられる。１）ＧＦＰ配列の操作可能に連結されたプロモータアッセイは異なる真核細胞で実施することができる。本実施例では、ＮｏｓＰのような植物プロモータをシロイヌナズナのプロトプラストで実験を行うのに使用する。２）一対のＳＣＮＡ結合部位（ＳＣＮＡ１ｂｓ及びＳＣＮＡ２ｂｓ）；３）停止コドンを含有する標的；４）ＧＦＰコーディング配列及び５）転写ターミネータ配列、本実施例ではＮｏｓＴ。
【０２９５】
図１６に示す模式図（正確な縮尺ではない）は、破壊された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーターコーディング配列（ＳＴＯＰＧＦＰ）を含有する一連のプラスミドｐＴａｒｇｅｔ−ＳＴＯＰＧＦＰ（ｎ）における８つの例となる構築物のセットを説明し、その際、「ｎ」は図１６の表における連番を意味する。開始コドンを含むＮｃｏＩ制限部位と反対の末端でＭｓｃＩ部位によって、様々な長さと組成の挿入物のセットが描かれる。ＳＣＮＡ１ｂｓはＧＦＰの人工的なＮ’リーダーに位置し、ＳＣＮＡ２ｂｓはＧＦＰコーディング配列に位置する。標的配列は、特徴的制限酵素（ＳｐｅＩ  ＡＣＴＡＧＴ（配列番号２１５）又はＢｃｌＩ  ＴＧＡＴＣＡ（配列番号２１６）、下線は停止）及びフレームシフト（予想ｎ＝５）と結合する停止コドンである。表における「ｎ」はプラスミドの連番を意味する。ＳＣＮＡｂｓ間の距離が塩基対（ｂｐ）で示され、括弧内の特徴的制限酵素部位が続く。予想される４ｂｐの５’オーバーハングのために、上と下の鎖における所望の切断位置が示され、その際、ヌクレオチド間の代わりにヌクレオチド上で触媒位置を位置付けることが原因で生じる不確実性のために、±２の数は偶数挿入であり、±３の数は奇数挿入である。一部の切断事象では、内在性の修復メカニズムは不完全な修復を生じ、鋳型ではないヌクレオチドの欠失、変異又は付加を生じ得る。これらの修復された配列の一部は停止コドンの消滅を生じ、フレームシフトが復元したＧＦＰの発現と一緒に特徴的制限部位の消滅を生じる。ヌクレオチドの最少限の復元事象、付加又は欠失又は点突然変異は表の最も右の欄に示される。
挿入物におけるＳＣＮＡ１結合の認識配列
ＡＴＣＴＣＡＡＧＴＣＴＣＴＡＧＧＡＣＴＧＧＴ（配列番号１８２）
ＧＦＰ配列におけるＳＣＮＡ２結合の認識配列：
ＡＴＣＴＧＴＧＡＧＣＡＡＡＧＧＣＧＡＧＧＡＧ（配列番号１８３）
図１６に概説されるような：
ｎ＝１についてのＮｃｏＩ／ＭｓｃＩ挿入物：
ＣＣＡＴＧＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＴＣＴＣＴＡＧＧＡＣＴＧＧＴＣＴＴＣＡＡＡＡＴＣＴＴＴＣＴＣＡＣＴＡＧＴＴＴＣＴＡＣＧＡＴＣＴＴＧＧＣＣＡ（配列番号１８４）
ｎ＝２についてのＮｃｏＩ／ＭｓｃＩ挿入物：
ＣＣＡＴＧＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＴＣＴＣＴＡＧＧＡＣＴＧＧＴＣＡＡＡＡＴＣＴＴＴＣＴＣＡＣＴＡＧＴＴＴＣＴＡＣＧＣＴＧＧＣＣＡ（配列番号１８５）
ｎ＝３についてのＮｃｏＩ／ＭｓｃＩ挿入物：
ＣＣＡＴＧＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＴＣＴＣＴＡＧＧＡＣＴＧＧＴＡＡＴＣＴＴＴＣＴＣＡＣＴＡＧＴＴＡＣＧＣＴＧＧＣＣＡ（配列番号１８６）
ｎ＝４についてのＮｃｏＩ／ＭｓｃＩ挿入物：
ＣＣＡＴＧＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＴＣＴＣＴＡＧＧＡＣＴＧＧＴＡＡＴＣＴＴＴＣＴＴＧＡＴＣＡＧＴＣＴＧＧＣＣＡ（配列番号１８７）
ｎ＝５についてのＮｃｏＩ／ＭｓｃＩ挿入物：
ＣＣＡＴＧＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＴＣＴＣＴＡＧＧＡＣＴＧＧＴＡＡＴＣＴＴＴＣＴＴＧＡＴＣＡＧＣＴＧＧＣＣＡ（配列番号１８８）
ｎ＝６についてのＮｃｏＩ／ＭｓｃＩ挿入物：
ＣＣＡＴＧＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＴＣＴＣＴＡＧＧＡＣＴＧＧＴＡＡＴＣＴＴＴＣＴＴＧＡＴＣＡＣＴＧＧＣＣＡ（配列番号１８９）
ｎ＝７についてのＮｃｏＩ／ＭｓｃＩ挿入物：
ＣＣＡＴＧＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＴＣＴＣＴＡＧＧＡＣＴＧＧＴＣＴＴＴＣＴＣＡＣＴＡＧＴＴＣＴＧＧＣＣＡ（配列番号１９０）
ｎ＝８についてのＮｃｏＩ／ＭｓｃＩ挿入物：
ＣＣＡＴＧＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＴＣＴＣＴＡＧＧＡＣＴＧＧＴＣＴＴＣＡＣＴＡＧＴＧＧＣＣＡ（配列番号１９１）
【０２９６】
各分子複合体は、以下にて本明細書で記載されるようにシロイヌナズナのプロトプラストに同時形質移入される。
【０２９７】
送達
バイオアッセイの設定：シロイヌナズナのプロトプラストの調製はＷｕら（２００９）に基づき、形質移入工程における差異を伴って実施例１の調製に類似する。
形質移入
【０２９８】
（１）２ｍｌ試験管内にて形質移入用の新しいＰＥＧ溶液を作る。
（２）６穴プレートからＢＳＡを捨て、乾かす。
（３）１５ｍｌの丸底（スナップ式のキャップ）試験管にて室温で、供与体プラスミドＤＮＡ（関連する場合）、タンパク質部分を発現するプラスミドＤＮＡ、及びＳＣＮＡｓｓＤＮＡの総量３０〜４０μｇまでの混合物と０．２ｍｌのＭＭｇ溶液中の約５×１０４（２×１０４〜１×１０５）のプロトプラストを混合する。或いは、供与体ＤＮＡとタンパク質部分を発現するＤＮＡを構築し、単一プラスミドに送達する。
（４）等量（０．２ｍｌのプロトプラスト＋ｍｉｄｉｐｒｅｐ容量）の新しいＰＥＧ溶液を加える。
（５）ＲＴで５分間インキュベートする。
（６）３ｍｌのＷ５溶液をゆっくり加えて洗浄し、１度に１ｍｌ加え、混合する。
（７）スイングアウトロータにて１００×ｇで１分間遠心する。
（８）洗浄と遠心を繰り返す。
（９）１ｍｌのＷ５溶液に再浮遊する。
（１０）ＢＡＳをコーティングしたプレートに注ぐ。
（１１）２２℃にて１日１６時間最適照明（１５０マイクロアインシュタイン・ｍ−２・ｓ−１）にてプロトプラストを生長させる。必要に応じて培地を交換する。
解析
【０２９９】
分子複合体の各形態の遺伝子ターゲッティングの効率をｐＴＡＲＧＥＴ−ＳＴＯＰＧＦＰ（ｎ）プラスミドのシリーズで調べる。
【０３００】
上手く標的とされれば、停止コドン及び特徴的制限部位は、欠失、挿入又は点突然変異によって消滅する（図１６）。特定のフレームにおける修復もＧＦＰの発現を復元することができる（図１６）。アッセイは、ＦＡＣＳ又は以下のようなプラスミドミニプレップキット（ＢｉｏｎｅｅｒＫ３０３０）を用いてプロトプラストからプラスミドＤＮＡを精製することによって解析する：２５０μｌの緩衝液１の添加及び製造元の指示書における細菌ペレットのためのプロトコールによる手続きによってＷ５溶液におけるプロトプラストを沈殿させ、溶解する。得られるプラスミド調製物からＰＣＲによって「スペーサー」領域を増幅する。ＰＣＲ産物を適宜、ＳｐｅＩ（３７℃）又はＢｃｌＩ（５０℃）によって徹底的に切断する。電気泳動の後、切断されない産物をゲルから切り出し、Ｔ／Ａクローニングベクター（ｐＵＣ５７／Ｔ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）にクローニングし、各クローンの配列を決定して異なる変異事象を検出する。
【０３０１】
次いで、遺伝子ターゲッティングの効率は陽性ＧＦＰ細胞の比率として判定される。自動化フローサイトメータ（ＦＡＣＳ）を用いて形質移入の３日後、Ｗ５溶液に浮遊させたプロトプラストをＧＦＰ活性についてスクリーニングする。ＧＦＰは５３０／３０のフィルターで検出される放射と共に４８８ｎｍの励起によって検出される。閾値及び補正因子を設定して偽陽性を排除する。
【０３０２】
実験に含まれる対照は、１）非特異的な切断について照合するための非正統（塩基対形成しない）ＳＣＮＡの使用、２）非二量体の作用について照合するためのｐＴＡＲＧＥＴ−ＳＴＯＰＧＦＰを失っている標的結合部位１つの使用、３）ＧＦＰを破壊する停止コドンを含まないで陽性対照としてのインフレームＧＦＰを有する類似のプラスミドであるｐＴＡＲＧＥＴ-ＧＦＰの使用、４）比較の非相同系の対照としての、植物細胞における核局在Ｉ−ＳｃｅＩ制限酵素を発現するプラスミドであるｐＳＡＴ４−ＮＬＳ−Ｉ−ＳｃｅＩと併せた、ｐＴＡＲＧＥＴ−ＳＴＯＰＧＦＰに類似するが、ＧＦＰを破壊する停止コドンの近傍にＩ−ＳｃｅＩ制限部位を含有するプラスミドであるｐＴＡＲＧＥＴ−ＳＴＯＰ−Ｉ−ＳｃｅＩ−ＧＦＰの使用である。
【０３０３】
特定の実施形態の前述の記載は、他者が、現在の知識を適用することによって、過度の実験を行うことなく及び一般の概念から逸脱することなく容易に改変することができ、特定の実施形態のような種々の適用に適合させることができる本発明の一般的な性質を明らかにするので、そのような適用は、開示される実施形態の同等物の意味及び範囲の中に包含されるべきであり、そのように意図される。本発明は、その特定の実施形態と併せて記載されてきたが、多数の変更、改変及び変異が当業者に明らかであることは明白である。従って、添付の特許請求の範囲の精神及び広い範囲の中に入るそのような変更、改変及び変異のすべてを包含することが意図される。
参考文献
1. Schierling B, Dannemann N, Gabsalilow L, Wende W, Cathomen T, Pingoud A. (2012).  A novel zinc-finger nuclease platform with a sequence-specific cleavage module. Nucleic Acids Res. 2012 Mar;40(6):2623-38.
2. Eisenschmidt K, Lanio T, Simoncsits A, Jeltsch A, Pingoud V, Wende W, Pingoud A. (2005). Developing a programmed restriction endonuclease for highly specific DNA cleavage. Nucleic Acids Res. 2005 Dec 14;33(22):7039-47.
3. Kubo T, Kanno K, Ohba H, Rumiana B, Fujii M. (2004). Control of intracellular delivery of oligonucleotides by signal peptides and genetic expression in human cells. Nucleic Acids Symp Ser (Oxf). 2004;(48):303-4.
4. Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. (2012). A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012 Aug 17;337(6096):816-21.   
5. Hanic-Joyce PJ, Gray MW (1991) Accurate transcription of a plant mitochondrial gene in vitro. Mol Cell Biol 11: 2035-2039
6. Vainstein A, Marton I, Zuker A, Danziger M, Tzfira T (2011) Permanent genome modifications in plant cells by transient viral vectors. Trends in Biotechnology 29: 363-369
7. Gallois P, Marinho P (1995) Leaf disk transformation using Agrobacterium tumefaciens-expression of heterologous genes in tobacco. Methods Mol Biol 49: 39-48
8. Kochevenko A, Willmitzer L (2003) Chimeric RNA/DNA oligonucleotide-based site-specific modification of the tobacco acetolactate syntase gene. Plant Physiol 132: 174-184
9. Marrs KA, Urioste JC (1995) Transient Gene Expression Analysis in Electroporated Maize Protoplasts. Vol. 55, pp 133-145. 
10. Kotlo KU, Yehiely F, Efimova E, Harasty H, Hesabi B, Shchors K, Einat P, Rozen A, Berent E, Deiss LP (2003) Nrf2 is an inhibitor of the Fas pathway as identified by Achilles' Heel Method, a new function-based approach to gene identification in human cells. Oncogene 22: 797-806
11. Huston JS, Levinson D, Mudgett-Hunter M, Tai MS, Novotny J, Margolies MN, Ridge RJ, Bruccoleri RE, Haber E, Crea R, et. al. (1988) Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A 85: 5879-5883
12. Wu FH, Shen SC, Lee LY, Lee SH, Chan MT, Lin CS (2009) Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method. Plant Methods 5: 16.
13. Antonelli NM, Stadler J (1989) Chemical methods for direct gene transfer to maize protoplasts: I. Efficient transient expression after treatment with the polycation Polybrene Maize News letter 63: 21-22
14. Sheen J (2001) Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiol 127: 1466-1475
15. Gordon-Kamm WJ, Spencer TM, Mangano ML, Adams TR, Daines RJ, Start WG, O'Brien JV, Chambers SA, Adams WR, Jr., Willetts NG, Rice TB, Mackey CJ, Krueger RW, Kausch AP, Lemaux PG (1990) Transformation of Maize Cells and Regeneration of Fertile Transgenic Plants. Plant Cell 2: 603-618.
【図１Ａ】
2015500648.tif 000002
【図１Ｂ】
2015500648.tif 000003
【図２Ａ】
2015500648.tif 000004
【図２Ｂ】
2015500648.tif 000005
【図３】
2015500648.tif 000006
【図４Ａ】
2015500648.tif 000007
【図４Ｂ】
2015500648.tif 000008
【図５】
2015500648.tif 000009
【図６】
2015500648.tif 000010
【図７Ａ】
2015500648.tif 000011
【図７Ｂ】
2015500648.tif 000012
【図８Ａ】
2015500648.tif 000013
【図８Ｂ】
2015500648.tif 000014
【図９】
2015500648.tif 000015
【図１０】
2015500648.tif 000016
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2015500648.tif 000021
【図１６】
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【国際調査報告】
2015500648.tif 000023
2015500648.tif 000024
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