(57)【要約】  サンプル中の分析対象物を検出及び／又はその量を定量するためのセンサーであって；感知部分、及びＲＯＳ失活剤が吸着されており、活性酸素種（ＲＯＳ）を失活させ、分析対象物を通すことのできる膜を含むバリア層を備え；サンプルが前記バリア層を通ってセンサーの感知部分に入るように構成される、上記センサー。
2015509803.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の分析対象物を検出するための及び／又はその量を定量するためのセンサーであって、
・感知部分；及び
・活性酸素種（ＲＯＳ）を失活させ、分析対象物を通すことのできる膜を含むバリア層を含み、その膜にＲＯＳ失活剤が吸着されており；ここで、該センサーは、サンプルがバリア層を通ってセンサーの感知部分に入るように構成される、上記センサー。
【請求項２】
前記膜が、１０ｐｐｍの濃度を有するＨ２Ｏ２溶液を失活させるのに十分なＲＯＳ失活活性を有する、請求項１に記載のセンサー。
【請求項３】
前記膜が、ＲＯＳを選択的に失活させる、請求項１又は２に記載のセンサー。
【請求項４】
前記膜が、分析対象物の減少を実質上引き起こさない、請求項３に記載のセンサー。
【請求項５】
入射光を感知部分上に導くための光導波路を備えた光学式センサーである、請求項１から４までのいずれか一項に記載のセンサー。
【請求項６】
グルコースに結合するためのボロン酸受容体及び前記受容体と会合したフルオロフォアを含む感知部分を備えた光学式グルコースセンサーである、請求項５に記載のセンサー。
【請求項７】
前記ＲＯＳ失活剤が、遷移金属、遷移金属化合物、又は酵素である、請求項１から６までのいずれか一項に記載のグルコースセンサー。
【請求項８】
前記ＲＯＳ失活剤が、周期表第１０族又は１１族の遷移金属、或いは周期表第１０族又は１１族の遷移金属を含む合金であり、好ましくは、ＲＯＳ失活剤が白金である、請求項７に記載のグルコースセンサー。
【請求項９】
前記ＲＯＳ失活剤が、ナノ粒子形態の白金である、請求項８に記載のグルコースセンサー。
【請求項１０】
活性酸素種（ＲＯＳ）を失活させ、分析対象物を通すことができ、サンプル中の分析対象物を検出するための及び／又はその量を定量するためのセンサー中で使用するのに適した膜であって、１０ｐｐｍの濃度を有するＨ２Ｏ２溶液を失活させるのに十分なＲＯＳ失活活性を有する、上記膜。
【請求項１１】
前記ＲＯＳ失活剤が、請求項７から９までのいずれか一項で規定した通りである、請求項１０に記載の膜。
【請求項１２】
ＲＯＳを選択的に失活させる、請求項１０又は１１に記載の膜。
【請求項１３】
ＲＯＳを失活させ、分析対象物を通すことができ、サンプル中の分析対象物を検出するための及び／又はその量を定量するためのセンサー中で使用するのに適した膜を製造するための方法であって、
（ｉｉｉ）バリア層をＲＯＳ失活剤前駆体及び還元剤と接触させること；
（ｉｖ）ＲＯＳ失活剤前駆体を還元して、バリア層の上又は中にＲＯＳ失活剤を形成すること；
並びに任意選択で、ステップ（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を繰り返すことを含む、上記方法。
【請求項１４】
ステップ（ｉｉｉ）の前に、
（ｉ）バリア層をＲＯＳ失活剤前駆体及び予備還元剤と接触させること；
（ｉｉ）該ＲＯＳ失活剤前駆体を部分還元して、バリア層の上又は中にＲＯＳ失活剤を形成すること；
並びに任意選択で、ステップ（ｉ）から（ｉｖ）を繰り返すことをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記分析対象物がグルコースである、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＲＯＳ失活剤前駆体が、第１０族又は１１族金属含有イオンの塩であり、且つＲＯＳ失活剤が、第１０族又は１１族金属である、請求項１３から１５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
第１０族又は１１族金属が白金である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＲＯＳ失活剤前駆体がテトラクロロ白金酸塩である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記白金が、ナノ粒子の形態で存在する、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記予備還元剤がアスコルビン酸である、請求項１４から２０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記還元剤がヒドラジンである、請求項１４から２０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記還元剤がギ酸である、請求項１３、及び請求項１５から１９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
感知部分を含むセンサーを準備することをさらに含み、センサーが、サンプル中の分析対象物を検出する、及び／又はその量を定量するのに適し；ＲＯＳを失活させ、分析対象物を通すことのできる膜が、感知部分の少なくとも一部の上にバリア層を形成し；及び該センサーが、分析対象物が該バリア層を通ってセンサーの感知部分に入るように構成される、請求項１３から２２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記センサーが、請求項２から９までのいずれか一項で規定された通りである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１３から２２までのいずれか一項に記載の方法によって得ることのできる膜。
【請求項２６】
ＲＯＳを失活させ、分析対象物を通すことのできる前記膜が、請求項２５で規定された通りである、請求項１に記載のセンサー。
【請求項２７】
サンプル中の分析対象物を検出する、及び／又はその量を定量する方法であって、請求項１から９までのいずれか一項又は請求項２６に記載のセンサーをサンプル中に挿入すること、センサーの感知部分に入射光を提供すること、及びフルオロフォアの発光パターンを検出することを含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、センサー、センサー中で使用するための膜、このようなセンサー及び膜の作製方法、並びにサンプル中のグルコースを検出又はその量を測定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ボロナートなどの分子受容体を、生物学的流体中の分析対象物を検出及び／又は測定するためのセンサー中で使用することができる。例えば、センサーは、グルコース受容体（ボロン酸）及びシグナル伝達物質として作用するフルオロフォアを含むことができる。これらの指標用化学物質を、適切な直径の光ファイバー上に容易に固定化し、次いで、該ファイバーを体液又は組織中に配置して、グルコースなどの分析対象物を測定することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
酸化ストレス下で、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）などの活性酸素種（ＲＯＳ）のレベルが上昇する場合のあることが見出されている。酸化ストレスは、虚血性イベント又は敗血症の結果として（例えば、多臓器不全の結果として）発生することがあり、また、多くの疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症、パーキンソン病、心不全、心筋梗塞、アルツハイマー病、統合失調症、双極性障害、脆弱Ｘ症候群及び慢性疲労症候群）に関連しており、そのため、例えば集中治療環境において、グルコースレベルを監視することが必要である可能性のある対象の体液又は組織中のＲＯＳレベルを上昇させる。血中ＲＯＳは、それゆえ、センサーの指標用化学物質を妨害する可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
センサー中にＲＯＳ失活剤を含めることは、血中ＲＯＳのセンサー用化学物質に対する妨害効果を排除又は改善する可能性のあることが見出されている。したがって、サンプル中の分析対象物を検出及び／又はその量を定量するためのセンサーは、
・感知部分、及び
・活性酸素種（ＲＯＳ）を失活させ、分析対象物を通すことのできる膜を含むバリア層を含むことができ、その膜にＲＯＳ失活剤が吸着されており；ここで、センサーは、サンプルがバリア層を通ってセンサーの感知部分に入るように構成される。
【０００５】
センサー中にＲＯＳ失活剤が存在すると、分析対象物を酸化する（又はそうでなければ、減少させる）ことがあり、このことは、センサーの作用に有害な影響を及ぼすことがある。例えば、グルコースは、グルコン酸に酸化される可能性がある。したがって、センサーは、センサー中での分析対象物の酸化の問題に対処するための、ＲＯＳ失活剤をはじめとする手段を含むことができる。したがって、一部の実施形態において、センサーの膜は、分析対象物に優先してＲＯＳを選択的に失活させることができる。
【０００６】
一部の実施形態において、センサーは、サンプル中の分析対象物を検出及び／又はその量を定量するためのセンサー中で使用するのに適した、活性酸素種（ＲＯＳ）を失活させ、分析対象物を通すことのできる膜を含み、該膜は、１００ｐｐｍ以下の濃度を有するＨ２Ｏ２溶液を失活させるのに十分なＲＯＳ失活活性を有する。
【０００７】
サンプル中の分析対象物を検出及び／又はその量を定量するためのセンサー中で使用するのに適した、活性酸素種（ＲＯＳ）を失活させ、分析対象物を通すことのできる膜を製造するための方法も説明される。方法は、
（ｉｉｉ）バリア層をＲＯＳ失活剤前駆体及び還元剤と接触させること；
（ｉｖ）ＲＯＳ失活剤前駆体を還元して、バリア層の上又は中にＲＯＳ失活剤を形成すること；
並びに任意選択で、ステップ（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を繰り返すこと；を含む。この方法によって得ることのできる又は得られた膜も説明される。
【０００８】
一実施形態において、方法は、さらに、ステップ（ｉｉｉ）の前に、
（ｉ）バリア層をＲＯＳ失活剤前駆体及び予備還元剤と接触させること；
（ｉｉ）ＲＯＳ失活剤前駆体を部分的に還元して、バリア層の上又は中にＲＯＳ失活剤を形成すること；
並びに任意選択で、ステップ（ｉ）〜（ｉｖ）を繰り返すこと；を含む。したがって、この実施形態において、方法は、
（ｉ）バリア層をＲＯＳ失活剤前駆体及び第１還元剤と接触させること；
（ｉｉ）ＲＯＳ失活剤前駆体を部分的に還元して、バリア層の上又は中にＲＯＳ失活剤を形成すること；
（ｉｉｉ）バリア層を第２還元剤と接触させること；
（ｉｖ）残存するＲＯＳ失活剤前駆体を完全に還元して、バリア層の上又は中にＲＯＳ失活剤を形成すること；
並びに任意選択で、ステップ（ｉ）〜（ｉｖ）を繰り返すこと；を含む。この方法によって得ることのできる又は得られた膜も説明される。
【発明の効果】
【０００９】
本明細書に記載の方法は、それが、単なる膜の表面上だけではなく、膜の細孔内へのＲＯＳ失活剤の堆積を達成するということにおいて、とりわけ有益である。細孔内へのこのような堆積は、膜が大きなアスペクト比、例えば少なくとも１００、典型的には少なくとも１５０又は２００のアスペクト比を有する場合でさえ達成することができる。膜を通過する流体は、それが細孔を通って移動する間中、ＲＯＳ失活剤と接触状態にあるので、細孔内へのＲＯＳ失活剤の堆積は、膜がＲＯＳを失活させる能力の向上をもたらす。
【００１０】
サンプル中の分析対象物を検出及び／又はその量を定量する方法についても説明する。該方法は、本明細書に記載のようなセンサーをサンプル中に挿入すること、センサーの感知部分に入射光を提供すること、及びフルオロフォアの発光パターンを検出することを含むことができる。
【００１１】
さらなる好ましい特徴及び実施形態は、付随の説明及び添付の特許請求の範囲中で説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】光ファイバーを組み込んだセンサーを示す図である。
【図１ａ】このようなセンサーのためのモニターを示す図である。
【図２】センサーの感知部分の種々の実施形態を示す図である。
【図３】センサーの感知部分の種々の実施形態を示す図である。
【図３ａ】センサーの感知部分の種々の実施形態を示す図である。
【図４】膜に関してＲＯＳを失活させる能力及び／又は分析対象物の減少を測定するのに使用できる装置に関する概略説明を示す図である。
【図５】例２の膜に関するＳＥＭ画像を示す図である。
【図６】センサー及び白金化膜のない対応センサーのインビトロ試験の結果を示す図である。
【図７】例４の結果を示す図である。
【図８】ＲＯＳ失活バリア層を作製するための方法の概要を示す図である。
【図９】センサー（図９ｂ）及び白金化膜のない対応センサー（図９ａ）のインビボ試験の結果を示す図である。
【図１０】例９の結果を示す図である。３種の白金化センサーについての結果をＩＢ０７０−００１、ＩＢ０７０−００２、及びＩＢ０７０−００３として示す。非白金化対照に関する結果をＩＢ０６６−０１１として示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書中で使用する場合、活性酸素種（ＲＯＳ）を失活させ、分析対象物を通すことのできるバリア層とは、分析対象物がその層を通過することを許容するが、典型的には、センサー用化学物質（例えば、ボロン酸／フルオロフォア化学物質）を妨害しない化学種へのＲＯＳの分解を触媒することによって、ＲＯＳが層を通過することを制限又は好ましくは阻止する材料である。
【００１４】
ＲＯＳを失活させ、分析対象物を通すことのできるバリア層は、任意のセンサーでの使用が想定されている。一部の実施形態において、センサーは、グルコースセンサー、好ましくは、グルコース感知用のボロン酸／フルオロフォア化学物質を使用する光学式グルコースセンサーである。センサーは、また、電気化学式センサー又はｐＨセンサーでよい。
【００１５】
ＲＯＳを失活させ、分析対象物を通すことのできるバリア層は、入射光をセンサーの感知部分上に導くための光導波路を有する任意の光学式センサーと共に使用することができる。例えば、光学式センサーは、光ファイバーセンサーでよい。グルコースの感知は、間質組織などの体液又は血液中で実施することができるが、任意の水性溶液の感知を、本明細書に記載のセンサーを使用して実施することができる。本明細書に記載の特定の実施形態は、血管中へ挿入するための侵襲性センサーとしての使用が想定されている。しかし、ＲＯＳを失活させ、分析対象物を通すことのできるバリア層は、このような侵襲性センサーに限定されるものではない。インビトロで使用するための非侵襲性センサー、埋め込み可能なセンサー、及び皮下センサーも、ＲＯＳを失活させ、分析対象物を通すことのできるバリア層を含むことができる。
【００１６】
本明細書中で使用する場合、単語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」及び「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」、並びにその「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」、「ｃｏｎｔａｉｎｓ」「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」及び「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」などの変形体は、包括的意味で使用され、すなわち、言及した特徴の存在を条件として指定はするが、さらなる特徴の存在又は付加を排除するものではない。
【００１７】
＜バリア層＞
バリア層は、ＲＯＳを失活させ、分析対象物を通すことのできる膜であって、そこにＲＯＳ失活剤が吸着されている膜を含む。ＲＯＳ失活剤を、膜の表面に吸着させるか（例えば、膜をＲＯＳ失活剤で被覆する）、或いは膜の細孔に吸着させることができる（例えば、膜をＲＯＳ失活剤で含浸することができる）。
【００１８】
ＲＯＳ失活剤で被覆又は含浸され、センサー中でバリア層として使用することができ、分析対象物を通すことのできる適切な膜は、透析膜及び微孔性中空糸膜などの半透膜を含む。
【００１９】
一部の実施形態において、バリア層は親水性である。
【００２０】
透析膜は、分子をそれらの大きさ、形状、水和及び極性によって分離する半透膜である。透析膜は、通常、中空糸の形態で存在し、ポリアリールエーテルスルホン、ポリアミド、ポリカーカーボナート、ポリアクリロニトリル、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリビニリデンフルオリド、及びセルロース系材料、又はこれらの混合物若しくは改変体などの材料の状態で入手可能である。
【００２１】
微孔性中空糸膜は、当技術分野で公知であり、ポリプロピレン中空糸膜が挙げられる、例えば、０．１〜０．２μｍの細孔径、表面のほぼ４０％の細孔面積、４１６μｍの最小糸内径、及び５１０μｍの最大糸外径を有するポリプロピレン中空糸膜を、ＲＯＳ失活剤で被覆又は含浸し、バリア層として使用することができる。
【００２２】
この実施形態の一態様では、ポリマー、例えば、親水性ポリマー及び／又は負帯電ポリマーが、膜の細孔内に存在する。これは、例えば、１種若しくは複数の親水性モノマー及び／又は１種若しくは複数の負帯電モノマーを含むモノマー混合物の、膜の細孔内でのインサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）重合によって達成することができる。適切なインサイチュ重合技術は、その内容が参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ２０１１／０００２０９号中に記載されている。
【００２３】
他の実施形態において、膜は、その細孔内に親水性ポリマーを有さない。
【００２４】
一部の実施形態において、センサー中のバリア層を形成するのに使用される膜は、透析膜又はポリプロピレン中空糸膜である。
【００２５】
バリア層中で使用される半透膜は、典型的には、１ｎｍ〜１μｍ、例えば１〜２０ｎｍ、又は０．１〜０．５μｍの細孔径を有する。典型的には、本発明のセンサーのバリア層を形成するのに使用される中空糸ポリプロピレン膜は、０．１〜０．５μｍ、例えば０．１〜０．３μｍ、例えば約０．２μｍの細孔寸法を有する。本発明のセンサーのバリア層を形成するのに使用される透析膜は、典型的には、１００ナノメートル以下の細孔寸法を有する。好ましい細孔径は、１〜２０ｎｍ、好ましくは１〜１０ｎｍ、例えば約６ｎｍである。
【００２６】
一部の実施形態において、膜は、少なくとも１００、好ましくは少なくとも１５０、例えば少なくとも２００、又は少なくとも２５０のアスペクト比を有する。本明細書中で使用する場合、アスペクト比は、各細孔の長さ（すなわち、膜の厚さ）を細孔の直径で除算した比率である。有利には、ＲＯＳ失活剤は、細孔の長さに沿って（すなわち、細孔の開口部、又は細孔の開口部に隣接した細孔部分だけではなく）配置される。記載のＲＯＳ失活膜を製造するための技術は、細孔の長さに沿ったＲＯＳ失活剤の配置を促進するうえでとりわけ有効である。膜の厚さは、典型的には、少なくとも約２０μｍ、例えば少なくとも約３０μｍである。厚さは、約５０μｍまで、例えば約４０μｍまででよい。典型的には、この実施形態において、膜は、中空糸ポリプロピレン膜である。
【００２７】
膜の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）値に関連づけて、様々な細孔径の半透膜を入手できる。分子量カットオフ値は、膜の細孔を通過できる分子の最大分子量を示す。本発明のセンサー中で使用される半透膜は、分析対象物が通過できるようなＭＷＣＯ値を有する。本発明のセンサー中で使用される半透膜は、典型的には、分子量が６，０００以上の材料（例えば、タンパク質）の通過を許容しないが、グルコース（ＭＷ１８０）の通過を可能にする、小さなＭＷＣＯ値の材料である。好ましい膜は、少なくとも１，０００で、且つ好ましくは５，０００を超えないＭＷＣＯ値を有する。たとえば、ＭＷＣＯ値は、少なくとも１，５００又は少なくとも２，０００であり、且つ４，０００を超えないものでよい。
【００２８】
センサー中で使用される最終バリア層の有効細孔径及びＭＷＣＯ値（本明細書中で「有効細孔径」、「有効ＭＷＣＯ値」）は、インサイチュ重合の、又はＲＯＳ失活剤を装填した結果として前記の大きさに比べて小さい可能性がある。細孔径に対するインサイチュ重合の効果は、その内容が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＧＢ２０１１／０００２０９（前に参照した）中に記載されている。最終的な膜にとって好ましい有効細孔径は、少なくとも１ｎｍ、例えば、少なくとも２ｎｍ、又は少なくとも４ｎｍであり、且つ２０ｎｍを超えず、例えば１０ｎｍを超えない。好ましいＭＷＣＯ値は、少なくとも１，５００又は少なくとも２，０００であり、且つ６，０００を超えず、例えば５，０００を超えず、好ましくは４，０００を超えない。
【００２９】
細孔径又は有効細孔径の測定は、当業者に公知の任意の方法で実施することができる。典型的には、細孔径は、任意の特定の膜に関するメディアン細孔径として示される。ＭＷＣＯ値は、結合された蛍光性分子を含む既知分子量の単分散性材料の拡散によって測定することができる。徐々に増加する分子量の材料を、膜を通過させ、拡散の急増を、検出器として蛍光計を使用して測定する。適切な単分散性材料の例が、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから種々の分子量で入手可能なフルオレセイン標識化デキストランである。有効細孔径又は有効ＭＷＣＯ値は、最終膜を調製すること及び細孔径又はＭＷＣＯ値を通常の方法で測定することによって求めることができる。
【００３０】
許容される応答時間（例えば、グルコースを連続的に測定する血管内センサーに関して）を提供するために、バリア層は、好ましくは、３分を超えない、好ましくは２分半を超えない、センサーの９０％応答時間を提供するように好ましくは選択されるべきである。
【００３１】
９０％応答時間は、サンプルへ既知量の分析対象物を添加してからセンサーの応答が分析対象物の濃度の９０％に到達するまでに要する時間として求められる。これは、センサーを、分析対象物を含まない水溶液と接触させること、時刻ｔ０の時点で既知量の分析対象物を添加すること、及び時間と共にセンサーの応答を監視することによって測定することができる。センサーの応答は、時間と共に増加し、センサーの読みが、添加した分析対象物の９０％に相当するｔ０後の時間を、９０％応答時間と解釈する。この技術において、分析対象物は、水溶液の濃度変化が実質上瞬間的であり、結果的に、例えば分析対象物の溶解による遅延時間が存在しないような方式で添加される。したがって、分析対象物は、典型的には、液体又は濃厚溶液形態で撹拌しながら添加される。
【００３２】
＜ＲＯＳ失活剤＞
バリア層中で使用されるＲＯＳ失活剤は、Ｈ２Ｏ２などの活性酸素種の分解を触媒する能力のある任意の物質でよい。
【００３３】
Ｈ２Ｏ２の、センサー用化学物質（ボロン酸／フルオロフォア化学物質）を妨害しない化学種への分解は、水及び酸素ガスへの不均化：
２Ｈ２Ｏ２→２Ｈ２Ｏ＋Ｏ２
によって起こり得る。
【００３４】
Ｈ２Ｏ２などのＲＯＳの分解を触媒する能力のある適切な物質としては、遷移金属、遷移金属化合物、及び酵素が挙げられる。
【００３５】
典型的には、ＲＯＳ失活剤として使用される遷移金属は、周期表第１０族又は１１族の金属、例えば、ニッケル、パラジウム、白金、銅、銀、又は金である。好ましくは、ＲＯＳ失活剤として使用される遷移金属は、パラジウム、白金、金、又は銀である。より好ましくは、ＲＯＳ失活剤として使用される遷移金属は、白金である。２種又はそれ以上の金属の合金、例えば、第１０族又は１１族の遷移金属の別の金属との合金、或いは２種若しくはそれ以上の第１０族又は１１族遷移金属の合金も使用することができる。金と銀との合金は、とりわけ想定される。
【００３６】
典型的には、ＲＯＳ失活剤として使用される遷移金属化合物は、周期表第７族の金属の化合物、たとえば、第７族の酸化物、例えば二酸化マンガンである。
【００３７】
典型的には、ＲＯＳ失活剤として使用される酵素は、カタラーゼ又はスーパーオキシドジスムターゼ、好ましくはカタラーゼである。
【００３８】
好ましい実施形態において、ＲＯＳ失活剤は、周期表第１０族又は１１族の金属、或いはこのような金属を含む合金である。とりわけ好ましい実施形態において、ＲＯＳ失活剤は、第１０族の金属、又はこのような金属を含む合金、より好ましくは白金又は金／銀の合金、最も好ましくは白金である。これらの金属は、それらが、デバイス中で極めて長い寿命を有し、且つ分解の懸念がないので、ＲＯＳ失活剤としてとりわけ有用である。また、金属を膜に（表面に又は好ましくは細孔内に）簡単に吸着させることができる。例えば、共有結合による失活剤の固定化は、必要とされない。
【００３９】
ＲＯＳ失活剤が遷移金属又は遷移金属化合物である場合、それは、膜中に、ナノ粒子の形態、すなわち、典型的には１〜１００ｎｍ、例えば、少なくとも５ｎｍ、１０ｎｍ、又は少なくとも２０ｎｍ、且つ例えば９０ｎｍ、８０ｎｍ又は７０ｎｍまでのナノスケールの平均粒子径を有する粒子の形態で典型的には存在する。ナノ粒子状材料は、それらを表面上だけではなく膜の細孔内に準備することができるので、有利である。それらの小さなサイズは、また、粒子の膜細孔中への均一な配置を容易にし、ＲＯＳを失活させる際の効率の向上につながる。
【００４０】
ナノ粒子の場合、粒子は、任意の適切な形態又は結晶構造を有することができる。例えば、白金ナノ粒子は、四面体、立方体、八面体、切頂立方体、立方八面体、切頂八面体、三角形プレート、双角錐、三脚（ｔｒｉｐｏｄ）、十面体、ロッド若しくはワイヤ、又は二十面体の形態で存在できる。白金ナノ粒子は、また、球状粒子、中空構造体、及び樹枝状晶として生成させることができる。種々の構造体及びそれらを調製するための技術は、Ｚｈｅｎｍｅｎｇ  Ｐｅｎｇ、Ｈｏｎｇ  Ｙａｎｇ、Ｎａｎｏ  Ｔｏｄａｙ、２００９，４，１４３〜１６４、及びその中で引用されている参考文献中に示されている。これらの様々な形態の調製に関する簡単な詳細を、下表１に示す。
【表１−１】
2015509803.tif 000003
【表１−２】
2015509803.tif 000004
【００４１】
白金ナノ粒子にとって好ましい形態としては、立方体、立方八面体、樹枝状晶、及び球状粒子が挙げられる。
【００４２】
典型的には、ＲＯＳ失活剤が遷移金属又は遷移金属化合物であるなら、それは、膜の０．０１〜５ｗｔ％、好ましくは０．１〜５ｗｔ％、より好ましくは０．５〜３ｗｔ％の装填量で存在する。装填量は、ＲＯＳ失活剤、未被覆／未含浸膜、及び被覆／含浸膜の密度から計算することができる。
【００４３】
一部の実施形態において、ＲＯＳ失活剤は、膜の表面上に存在する。代わりの実施形態において、ＲＯＳ失活剤は、膜の細孔内に存在する。
【００４４】
＜ＲＯＳ失活活性＞
一部の実施形態において、ＲＯＳ失活バリア層中で使用される膜は、１０ｐｐｍの濃度を有するＨ２Ｏ２溶液を失活させるのに十分なＲＯＳ失活活性を有し、すなわち、それは、少なくとも１０ｐｐｍのＨ２Ｏ２濃度を有する溶液を失活させることができる。膜は、典型的には、２０ｐｐｍ、好ましくは５０ｐｐｍ、より好ましくは７０ｐｐｍ、８０ｐｐｍ、又は１００ｐｐｍの濃度を有するＨ２Ｏ２溶液を失活させるのに十分なＲＯＳ失活活性を有する。
【００４５】
Ｈ２Ｏ２濃度は、典型的には、±２〜５ｐｐｍの精度まで測定される。したがって、本明細書中で使用する場合、Ｈ２Ｏ２濃度が示されているなら、これは、±５ｐｐｍの精度まで言及されていると想定される。３０％過酸化水素溶液（１３３μＬ）をＵＨＰ水（１００ｍＬ）で希釈して４００ｐｐｍのＨ２Ｏ２溶液を調製する。この４００ｐｐｍ溶液を希釈して所望の濃度を得る。かくして、１０ｐｐｍ溶液は、１ｍＬの４００ｐｐｍ溶液を３９ｍＬのＵＨＰ水で希釈することによって得られる。同様に、１００ｐｐｍ溶液は、１０ｍＬの４００ｐｐｍ溶液を３０ｍＬのＵＨＰ水で希釈することによって得られる。
【００４６】
ＲＯＳ失活活性は、既知濃度（例えば、１０ｐｐｍ、上記に示したように調製）を有する１００μＬまで（例えば、１００μＬ）のＨ２Ｏ２溶液を、例えば図４に概略的に示したようなニードルを使用して中空糸膜（糸：内径ほぼ４１０μｍ；外径ほぼ５００μｍ、典型的には長さ２５ｍｍ）を通過させること、及び膜を通過するやいなや溶液のＨ２Ｏ２濃度を測定することによって求めることができる。膜を通過するやいなやの溶液中のＨ２Ｏ２濃度が約０．５ｐｐｍ未満であるなら、溶液は、失活されたと表現される。当技術分野で公知の標準的な試薬ストリップを使用してＨ２Ｏ２濃度を測定する場合、検出限界はほぼ０．５ｐｐｍであり、そのため、検出をこのような標準的な試薬ストリップを使用して実施するなら、失活した溶液は、検出できないＨ２Ｏ２濃度を有する。
【００４７】
＜分析対象物の酸化＞
ＲＯＳ失活膜は、典型的には、分析対象物（例えば、グルコース）を実質上酸化すること（又はそうでなければ減少させること）なしに、ＲＯＳの分解を触媒する能力がある。したがって、好ましいＲＯＳ失活剤は、分析対象物に優先してＨ２Ｏ２などのＲＯＳを選択的に酸化する。したがって、一部の実施形態において、膜は、ＲＯＳを選択的に失活させる。本明細書中で使用する場合、ＲＯＳを選択的に失活させる膜は、典型的には、少なくとも１０ｐｐｍのＨ２Ｏ２濃度を有する溶液を失活させるのに十分なＲＯＳ失活活性を有し、且つ分析対象物を実質上減少させない（例えば、膜は、１ミリモル／時間以下、好ましくは０．０５ミリモル／時間以下の分析対象物の減少速度を有するか、且つ／又は、分析対象物が膜を通過する場合に、分析対象物を多くても８０％まで、好ましくは多くても９５％まで減少させる）。
【００４８】
分析対象物の減少度合は、既知濃度を有する分析対象物の溶液（例えば、１００〜５００μＬ）を、図４に概略的にしめしたようなニードルを使用して膜の壁（糸：内径ほぼ４１０μｍ；外径ほぼ５００μｍ、０．５ｍｍ、典型的な長さ２５ｍｍ）を通過させること、及び膜を通過するやいなや溶液中の分析対象物の濃度を測定することによって求めることができる。分析対象物を実質上減少させることのない膜は、典型的には、膜を通過するやいなや、最初の溶液中の濃度の８０％以上、典型的には８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の溶液中分析対象物濃度をもたらす。
【００４９】
別法として、減少速度は、既知濃度を有する分析対象物溶液中に膜を配置すること、及び分析対象物の濃度を規則的間隔で測定することによって求めることができる。典型的には、分析対象物の濃度は、少なくとも２４時間、好ましくは少なくとも４８時間にわたって、規則的（例えば、８時間毎）に測定される。典型的な手順を、グルコースの減少を測定することに関して、例３に示す。分析対象物の減少を実質上もたらすことのない膜は、典型的には、０．１ミリモル／時間を超えない、好ましくは０．０８ミリモル／時間を超えない、より好ましくは０．０５ミリモル／時間を超えない分析対象物の減少速度を示す。
【００５０】
一部の実施形態において、分析対象物の減少度合又は減少速度は、前記のような適切なＲＯＳ失活剤を選択することによって調節される。
【００５１】
別の実施形態において、分析対象物の減少度合又は減少速度は、前記のような適切なＲＯＳ失活活性を選択することによって調節される。
【００５２】
別の実施形態において、分析対象物の減少度合又は減少速度は、後記のような適切なＲＯＳ失活剤を生成させるための適切な方法を選択することによって調節される。
【００５３】
別の実施形態において、分析対象物の減少度合又は減少速度は、前記のような適切な形態のナノ粒子を選択することによって、及び／又は適切なナノ粒子径を選択することによって調節される。
【００５４】
＜センサー＞
光ファイバーを組み込んだセンサーの例を、図１及び１ａに示す。センサー（１）は、その遠位端に感知部分（３）を含む光ファイバー（２）を備える。侵襲性センサーの場合、ファイバー（２）は、患者への挿入、例えばカニューレを通した血管中への挿入のために構成される。感知部分（３）（図２及び３により詳細に示す）は、指標用化学物質を含むセル又はチャンバー（７）を含む。光ファイバーは、ケーブル（４）を通って適切なモニター（８）と合体するように構成されたコネクター（５）まで伸びる。モニターは、典型的には、（５ａ）でコネクターと合体し、且つ他端で二又に分かれて（ａ）光センサーのための適切な入射光源（９）、及び（ｂ）帰還シグナルのための検出器（１０）に接続する、さらなる光ケーブル（４ａ）を含む。
【００５５】
一部の実施形態において、センサーは、使い捨て式センサーである。センサーは、典型的には、光源（９）及び検出器（１０）を含む非使い捨て式モニターに接続されるように構成される。
【００５６】
図２に示すように、感知部分（３）は、ファイバー内チャンバーの形態でセル（７）を組み込んでいる。セルは、それが、指標用化学物質を導波管（ここではファイバー）によって導かれる入射光の通路中に含めることを可能にする限り、任意の形態を取ることができる。したがって、セルは、ファイバー又は導波管の遠位端に取り付けることができ、或いは任意の所望の形状を有するチャンバーの形態でファイバー内に存在することができる。
【００５７】
セル（７）は、指標用化学物質を含む。グルコースセンサーの場合、この化学物質は、典型的には、グルコースを結合させるためのボロン酸受容体及び該受容体に会合したフルオロフォアである。フルオロフォアの発光パターン（例えば、波長、強度、寿命）は、分析対象物が受容体に結合した場合に変化し、グルコースの光学的検出を可能にする。本明細書中で、センサーに関する説明は、グルコースセンサーに関して詳細に与えられる。しかし、ＲＯＳを失活させ、分析対象物を通すことのできるバリア層は、グルコースセンサー以外のセンサーにも応用できることを認識されたい。
【００５８】
添付の図中に示したものに加えて、又はそれらと異なる設計上の特徴を有するセンサーも、これらのセンサーが、必要とされる感知部分及びバリア層の双方を含むとの条件で、もちろんあり得る。例えば、国際公開第２００８／１４１２４１号、国際公開第２００８／０９８０８７号、及び国際公開第２０１１／１１３０２０号中に記載され、例示されているようなセンサーを使用することができる。
【００５９】
受容体及びフルオロフォアを、受容体−フルオロフォア構造体として互いに直接的に結合することができる。適切なフルオロフォアの例が、その内容が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１０／１１６１４２号中に記載されており、例には、アントラセン、ピレン、及びこれらの誘導体が含まれる。適切なボロン酸受容体の例が、少なくとも１つの、好ましくは２つのボロン酸基を有する化合物である。
【００６０】
好ましい実施形態において、受容体は、式（Ｉ）の基：
【化１】
2015509803.tif 000005
であり、式中、ｍ及びｎは、同一又は異なって、典型的には１又は２、好ましくは１であり；Ｓｐは、脂肪族スペーサー、典型的にはアルキレン部分、例えばＣ１〜Ｃ１２アルキレン部分、例えばＣ６アルキレン部分であり；Ｌ１及びＬ２は、他の部分への、例えばフルオロフォア又はヒドロゲルへの結合可能箇所を表す。例えば、Ｌ１及びＬ２は、官能基に連結されたアルキレン、アルキレン−アリーレン、又はアルキレン−アリーレン−アルキレン部分を表すことができる。別の部分への結合が想定されない場合、官能基は、保護されるか水素原子で置き換えられる。Ｌ１及びＬ２のための典型的なアルキレン基は、Ｃ１〜Ｃ４アルキレン基、例えば、メチレン及びエチレンである。典型的なアリーレン基はフェニレン基である。官能基は、典型的には、例えば、フルオロフォア又はヒドロゲルと反応して結合を形成することのできる任意の基、例えば、エステル、アミド、アルデヒド、又はアジドである。
【００６１】
スペーサーＳｐの長さを変えると、受容体の選択性が変化する。典型的には、Ｃ６アルキレン鎖は、グルコースに対して良好な選択性を有する受容体を提供する。
【００６２】
このような受容体のさらなる詳細は、その内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６３８７６７２号中に見出される。
【００６３】
センサーに適した受容体のさらなる例には、式（ＩＩ）の受容体：
【化２】
2015509803.tif 000006
が含まれ、式中、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ２、又はＣＨＲ３を表し；
ｎは、１〜４であり；
ｍは、１〜４であり、且つｎ＋ｍは５であり；
Ｒ２は、水素又はＣ１〜４アルキルを表し；
各Ｒ１は、同一又は異なって、水素、Ｃ１〜４アルキル又はＣ３〜７シクロアルキルを表すか；
Ｒ１は、隣接するＲ１、Ｒ２又はＲ３基、及びそれらが結合している炭素又は窒素原子と一緒になって、Ｃ３〜７シクロアルキル、又は５若しくは６員のヘテロシクリル基を形成しており；
ＸがＣＨＲ３を表すなら、Ｒ３は、隣接するＲ１基、及びそれらが結合している炭素原子と一緒になって、Ｃ３〜７シクロアルキル基を形成している。このタイプの受容体のさらなる詳細は、その内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許仮出願第６１／４３１７５６号中に見いだされる。
【００６４】
本明細書中で使用する場合、用語「アルキル」又は「アルキレン」は、直鎖又は分枝状のアルキル基又は部分である。アルキレン部分は、例えば、１〜１５個の炭素原子が存在する部分、例えば、Ｃ１〜１２アルキレン部分、Ｃ１〜６アルキレン部分、又はＣ１〜４アルキレン部分、例えば、メチレン、エチレン、ｎ−プロピレン、ｉ−プロピレン、ｎ−ブチレン、ｉ−ブチレン、及びｔ−ブチレンでよい。Ｃ１〜４アルキルは、典型的には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル又はｔ−ブチルである。疑念を回避するために、２つのアルキル基又はアルキレン部分が存在するなら、該アルキル基又はアルキレン部分は同一又は異なっていてもよい。
【００６５】
アルキル基又はアルキレン部分は、非置換でも、置換されていてもよく、例えば、それは、ハロゲン、ヒドロキシル、アミン、（Ｃ１〜４アルキル）アミン、ジ（Ｃ１〜４アルキル）アミン、及びＣ１〜４アルコキシから選択される１つ、２つ又は３つの置換基を所持することができる。好ましくは、アルキル基又はアルキレン部分は非置換である。
【００６６】
本明細書中で使用する場合、アリーレン基は、単環式、二環式でよく、又は３つ若しくは４つの縮合環が存在していてもよい、不飽和基である。典型的には、アリーレン基は、フェニレンである。アリーレン基は、非置換でも、置換されていてもよい。適切な置換基は、Ｃ１〜４アルキル基、例えば、メチル及びエチルである。好ましくは、アリーレン基は非置換である。
【００６７】
本明細書中で使用する場合、Ｃ３〜７シクロアルキル基は、典型的には、シクロペンチル又はシクロヘキシル基である。Ｃ３〜７シクロアルキル基は、非置換でも、置換されていてもよい。適切な置換基は、Ｃ１〜４アルキル基、例えば、メチル及びエチルである。好ましくは、Ｃ３〜７シクロアルキル基は非置換である。
【００６８】
本明細書中で使用する場合、５又は６員のヘテロシクリル基は、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１つ又は複数、典型的には１つ又は２つ、例えば１つのヘテロ原子が存在する５又は６員の飽和環である。好ましいヘテロシクリル基は、その中に窒素原子が存在するもの、例えば、ピペリジニル及びピロリジニルである。ヘテロシクリル基は、非置換でも、置換されていてもよい。適切な置換基は、Ｃ１〜４アルキル基、例えば、メチル及びエチルである。好ましくは、ヘテロシクリル基は非置換である。
【００６９】
受容体及びフルオロフォアは、典型的には、互いに結合されており、さらに、ヒドロゲルなどのポリマーマトリックスに、又はデンドリマーに結合されていてもよい。適切なヒドロゲル及びデンドリマーの例は、その内容が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＧＢ２０１１／０００２０７中に記載のものである。
【００７０】
別法として、第１受容体及び第１フルオロフォアは、直接的に互いに結合されていなくてもよい（例えば、それらは、互いに結合されていなくてもよく、又は、ヒドロゲルマトリックス内に含められたポリマー鎖などのポリマー鎖を介してのみ結合されていてもよい）。第１受容体及び第１フルオロフォアが直接的に互いに結合されていない場合でも、それらは、指標系がグルコースに暴露された場合に、第１フルオロフォアの蛍光挙動が変化するような方式で相互作用する能力を有するべきであることは明らかであろう。例えば、第１フルオロフォア及び第２フルオロフォアは、静電的に（例えば、電荷対として）結合する能力を有する可能性があり、その結合は、グルコースの存在によって少なくとも部分的に妨害される能力を有する。適切な第１フルオロフォアの例には、ピラニン（ＨＰＴＳ）及びその誘導体、例えば、ＨＰＴＳそれ自体、並びにその内容が参照によりその全体で本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９／０１７７１４３号に開示の誘導体ＨＰＴＳ−ＰＥＧ、ＨＰＴＳ−ＭＡ、ＨＰＴＳ−ＣＯ２、ＨＰＴＳ−ＴｒｉＣｙｓ−ＭＡ、及びＨＰＴＳ−ＬｙｓＭＡが含まれる。さらなる適切な第１フルオロフォアとしては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社から市販されているＳＮＡＦ及びＳＮＡＦＬ色素を挙げることができる。適切な第１受容体の例には、窒素含有共役複素環式芳香族ビス−オニウム構造体（例えば、ビオロゲン）に共有結合で結合された芳香族ボロン酸が含まれる。このような第１受容体の例は、その内容が参照によりその全体で本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９／０１７７１４３号中に示されている。１つのとりわけ適切な第１受容体が、米国特許出願公開第２００９／０１７７１４３号に記載のような３，３’−ｏＢＢＶである。
【００７１】
グルコースセンサーの感知部分（３）は、グルコースがセル中に入ることを可能にする、１つ又は複数の開口部（６ａ）、（６ｂ）を有する。試験下のサンプルがバリア層を通ってセルに入るためのこれらの開口部の全域に、バリア層を準備することができる。図２及び３において、バリア層は、感知部分（３）のすべてにわたって準備される。しかし、別法として、バリア層を、感知部分の一部の上にのみ、例えば、開口部（６ａ）及び（６ｂ）にわたってのみ準備することができる。
【００７２】
センサーは、典型的には、試験下のサンプルが通過できる、感知部分中のすべての開口部がバリア層で覆われるように設計される。このことが、感知部分中へのＨ２Ｏ２の移動が、制限又は阻止されることを保証する。一部の実施形態において、試験下のサンプルと接触する予定のすべての感知部分、又はセンサーのすべての表面を、バリア層で被覆又は鎧装する。
【００７３】
図２に示すように、バリア層（ＢＬ）は、感知部分上に、図では光ファイバーの先端上に直接的に張り付けることができる。この実施形態は、例えばバリア層が透析膜である場合に、適している。図３に示す代わりの実施形態において、感知部分（３）は、別個の支持体（１１）上に準備される。別個の支持構造物は、感知部分への直接的なバリア層の張り付けに比較してさらなる強度を提供することができ、それゆえ、この実施形態は、透析膜であるバリア層と共に使用するのにも適している。支持体中に孔又は細孔を準備して、グルコースが感知部分（３）に入ることを可能にする。適切な支持構造物は、例えばレーザーアブレーションによる孔で貫通されているポリマーチューブである。医療用酸素発生器中で一般的に使用され、直径がほぼ０．２μｍの細孔を有する微孔性中空糸は、光ファイバーセンサーで使用するのに適した支持構造物を提供する。代わりの支持構造物は、その内容が参照によりその全体で本明細書に組み込まれる国際公開第２００９／０１９４７０号に記載のような、ポリマー又は金属材量を織った鞘である。
【００７４】
一部の実施形態では、図３ａに示すように、バリア層自体が、支持構造物（ＢＬ／１１）を形成することができる。好ましくは、この実施形態において、バリア層を形成するのに使用される膜は、微孔性中空糸膜である。
【００７５】
所望なら、バリア層を、センサーの表面に、例えば、光ファイバーそれ自体に、又は妥当なら別個の支持構造物に接着することができる。このことは、シアノアクリレートなどの適切な接着剤を塗布することによって達成することができる。別法として、センサーの表面及びバリアの材料が適切であるなら、バリア層とセンサーとの間の接合を、例えば、図２及び３のＪａ、Ｊｂの箇所で熱成形することができる。
【００７６】
＜製造方法＞
センサーは、適切な指標用化学物質（例えば、グルコースセンサーの場合、グルコースに結合するためのボロン酸受容体、及び前記受容体に会合したフルオロフォア）を含む感知部分を準備すること；及び感知部分の少なくとも一部上にＲＯＳを失活させ、分析対象物を通すことのできるバリア層を準備することによって製造され、ここで、センサーは、分析対象物が前記バリア層を通ってセンサーの感知部分に入るように構成される。光センサーの場合、製造方法は、また、入射光をセンサー上に導くための光導波路を準備することを含む。
【００７７】
一部の実施形態において、ＲＯＳを失活させ、分析対象物を通すことのできるバリア層中で使用される膜は、蒸着によって形成される。この実施形態において、ＲＯＳ失活剤は、典型的には、金属又は合金であり、該金属又は合金を真空下に低温でスパッターして、膜構造物の細孔内への堆積も含む、膜表面上への堆積のため、膜に向かって導くことのできる金属蒸気を形成する。
【００７８】
代わりの実施形態において、ＲＯＳを失活させ、分析対象物を通すことのできるバリア層中で使用される膜は、（ｉ）前記のような半透膜をＲＯＳ失活剤で被覆又は含浸すること、（ｉｉ）膜を洗浄すること、及び（ｉｉｉ）膜を乾燥することによって形成される。
【００７９】
一部の実施形態において、ステップ（ｉ）は、膜を適切な水混和性溶媒中で湿潤化し、続いて振盪することを含む。この実施形態の好ましい例において、溶媒は、膜の細孔を溶媒和する能力がある。この実施形態の一部の例において、溶媒は、極性非プロトン性溶媒である。この実施形態の一部の例において、溶媒は、疎水ではであるが水溶性である。膜の細孔を溶媒和する能力のある溶媒の具体例には、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、及びジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）が含まれる。膜の細孔を溶媒和する能力のある溶媒で膜を湿潤化することは、ＲＯＳ失活剤を細孔の長さに沿って分配することを可能にする上でとりわけ効果的である。
【００８０】
一部の実施形態において、ステップ（ｉ）は、膜を、ＲＯＳ失活剤を形成する能力のある種（ＲＯＳ失活剤前駆体）を含む溶液中に浸すこと、続いて膜を、Ｈ２Ｏ２失活剤が膜の上又は中に生じるような条件にさらすことを含む。この実施形態の好ましい例において、Ｈ２Ｏ２失活剤が白金であるなら、ステップ（ｉ）は、膜を、テトラ−又はヘキサ−クロロ白金酸塩、例えばテトラクロロ白金酸ナトリウム若しくはカリウム、又はヘキサクロロ白金酸ナトリウム若しくはカリウムなどの白金含有塩の溶液中に浸漬すること、続いて白金含有塩をギ酸、アスコルビン酸又はヒドラジン、好ましくはギ酸又はアスコルビン酸、より好ましくはギ酸などの還元剤で白金金属に還元することを含む。還元剤としてギ酸を使用する場合、ＲＯＳ失活剤前駆体は、還元されてＲＯＳ失活剤を形成し、ギ酸は、二酸化炭素ガスに酸化される。これは、形成後に、還元剤由来のなんらかの残留物がＲＯＳ失活剤上に残留することを回避する。
【００８１】
一部の実施形態において、還元剤は、アスコルビン酸又はヒドラジン、好ましくはアスコルビン酸でよい。
【００８２】
一部の実施形態において、ステップ（ｉ）は、還元条件下で膜を振盪及び／又は加熱することを含む。したがって、例えば、膜を、還元剤と接触させ、７日間まで、例えば少なくとも２時間、少なくとも１２時間、又は少なくとも２４時間振盪することができる。振盪は、例えば、２００ｒｐｍ以上、例えば４００ｒｐｍまでで実施される。これは、オービタルインキュベーター上で２５ｍｍの振幅で達成することができる。
【００８３】
加熱は、同時に振盪しながら実施することができる。別法として、加熱又は振盪のどちらかが、単独で使用される。膜を還元条件下で加熱する場合、典型的には、加熱は、４５℃までの温度で７日間まで、例えば、少なくとも２時間、少なくとも１２時間、又は少なくとも２４時間である。
【００８４】
ステップ（ｉ）は、さらに、洗浄ステップ（洗浄ステップ（ｉｉ）とは別個に）を含むことができる。ステップ（ｉ）は、１回又は複数回、例えば、１、２又は３回繰り返すことができる。膜を溶液中に浸す場合、超音波処理を適用して、膜の完全湿潤化を確実にすることができる。
【００８５】
ステップ（ｉ）は、さらに、典型的には前記のような洗浄ステップの後に第２の還元を含むことができる。第２の還元に適した還元剤としては、ヒドラジン及び第１３族水素化物の塩、例えば、水素化ホウ素の塩及び水素化アルミニウムの塩、水素化ホウ素ナトリウム及び水素化アルミニウムリチウム、好ましくは水素化ホウ素ナトリウムが挙げられる。好ましくは、第２の還元試薬はヒドラジンである。
【００８６】
ステップ（ｉｉ）は、典型的には、被覆又は含浸された膜を水中に浸漬することを含む。典型的には、膜を、少なくとも１２時間、例えば、少なくとも２４時間、又は少なくとも３６時間浸漬する。典型的には、水は、２７〜４７℃、好ましくは３２〜４２℃、より好ましくは３６〜３８℃、最も好ましくは約３７℃で存在する。ステップ（ｉｉ）は、典型的にはさらに、膜を有機溶媒中に１回又は複数回、例えば、１、２，３、４回又はそれ以上浸すことを含む。好ましくは、有機溶媒は、脂肪族Ｃ１〜Ｃ６アルコール、より好ましくはエタノールである。
【００８７】
一部の実施形態において、ステップ（ｉｉｉ）は、減圧下で、好ましくは真空下で、１時間以上実施される。代わりの実施形態において、ステップ（ｉｉｉ）は、高められた温度、好ましくは４０〜５０℃、例えば、約４５℃で、２時間以上実施される。
【００８８】
一部の実施形態において、方法は、バリア層をＲＯＳ失活剤前駆体及び還元剤と接触させること、並びにＲＯＳ失活剤前駆体を還元してバリア層の上又は中にＲＯＳ失活剤を形成することを含む。任意選択で、方法を１回又は複数回（例えば、１、２又は３回）繰り返して、ＲＯＳ失活剤のさらなる層を準備することができる。
【００８９】
一部の実施形態において、還元剤はギ酸である。
【００９０】
この実施形態の例は、次の通りである。
【００９１】
ポリプロピレン中空糸膜を、適切な水混和性溶媒（例えば、Ｎ−メチルピロリドン、ＮＭＰ）を添加すること、続いて振盪することによって完全に湿潤化する。溶媒を膜から除去し、膜に新たな溶媒（例えば、ＮＭＰ）を添加し、続いて振盪する。除去／置き換え／振盪の工程を、例えば３回又はそれ以上繰り返すことができる。
【００９２】
溶媒を除去し、膜に次のもの：
・適切な水混和性溶媒
・ＵＨＰ水
・０．０５〜０．５０ミリモル（例えば、０．１ミリモル）の白金含有塩（例えば、テトラ−又はヘキサ−クロロ白金酸塩、例えば、テトラクロロ白金酸ナトリウム若しくはカリウム、又はヘキササクロロ白金酸ナトリウム若しくはカリウム）
・ギ酸
を、それぞれの添加の間に振盪しながら添加する。
【００９３】
膜を、溶液中、高められた温度（例えば、３０〜６０℃、典型的には４０〜５０℃）で１２〜２４時間振盪する。
【００９４】
膜を、適切な溶媒系（例えば、水と水混和性有機溶媒、典型的にはＩＰＡとの混合物）中で繰り返し（例えば、少なくても５回）洗浄する。
【００９５】
膜を、空気中、外界温度で少なくとも１時間乾燥する。
【００９６】
一部の実施形態において、方法は、バリア層をＲＯＳ失活剤前駆体及び第１還元剤と接触させること；ＲＯＳ失活剤前駆体を部分的に還元してバリア層の上又は中にＲＯＳ失活剤を形成すること；バリア層を第２の還元剤と接触させること；残存するＲＯＳ失活剤前駆体を完全に還元してバリア層の上又は中にＲＯＳ失活剤を形成することを含む。任意選択で、該方法を、１回又はそれ以上（例えば、１、２又は３回）繰り返して、ＲＯＳ失活剤のさらなる層を準備することができる。
【００９７】
一部の実施形態において、第１還元剤はアスコルビン酸であり、第２還元剤はヒドラジンである。別の実施形態において、第１還元剤はアスコルビン酸であり、第２還元剤は水素化ホウ素塩、例えば水素化ホウ素ナトリウムである。
【００９８】
この実施形態の例は、次の通りである：
【００９９】
ポリプロピレン中空糸膜を、適切な水混和性溶媒（例えば、プロパノール）を添加することによって完全に湿潤化する。溶媒を膜から除去し、水を添加する。このステップを、膜が水中で完全に湿潤化されるまで繰り返す。
【０１００】
膜を含む溶液に、０．０５〜０．１０ミリモル（例えば、０．０６ミリモル）の白金含有塩（例えば、テトラ−又はヘキサ−クロロ白金酸塩、例えば、テトラクロロ白金酸ナトリウム若しくはカリウム、又はヘキササクロロ白金酸ナトリウム若しくはカリウム）、アスコルビン酸、及び濃無機酸（例えば、ＨＣｌ）を添加する。溶液中の膜を、溶液中に高められた温度（例えば、３０〜６０℃、典型的には４０〜５０℃）で少なくとも４日間（例えば、４〜７日間、典型的には約６日間）保持する。
【０１０１】
膜を、適切な溶媒系（例えば、水と水混和性有機溶媒、典型的にはＩＰＡとの混合物）中で繰り返し（例えば、少なくとも５回）洗浄する。適切な溶媒系（例えば、水と水混和性有機溶媒、典型的にはＩＰＡとの混合物）中の膜にＮａＢＨ４を添加する。
【０１０２】
膜をＰｔ含有塩／アスコルビン酸／無機酸溶液中に、高められた温度（例えば、３０〜６０℃、典型的には４０〜５０℃）で１日間保持すること以外は、上記のステップを繰り返す。
【０１０３】
膜を、空気中、外界温度で少なくとも１時間乾燥する。
【０１０４】
この実施形態の別の例は、Ｐｔ含有塩の最初の添加に関して、０．１０〜０．２０ミリモル（例えば、０．１２ミリモル）を使用すること、及びＮａＢＨ４に代わって濃無機酸（例えば、ＨＣｌ）及びヒドラジンの混合物を使用すること以外は、上記の手順に従う。
【０１０５】
＜センサーの使用＞
本発明のセンサーは、センサーをサンプル、例えば、体液又は組織のサンプル、例えば、血液中に挿入すること、入射光をセンサーの感知部分に提供すること、及びフルオロフォアの発光パターンからのフルオロフォアの発光パターンを検出することによって使用することができる。前記のように、グルコースが受容体に結合されると、フルオロフォアの発光パターン（例えば、波長、強度、寿命）が変化し、サンプル中のグルコース量を検出及び又は定量することを可能にする。
【実施例】
【０１０６】
ＲＯＳ失活膜を、下記に示す方法により製造した。
【０１０７】
（例１）
１回目の適用−湿潤化
ポリプロピレン中空糸膜（糸内径４１６μｍ、外径５１０μｍ、長さ２５ｍｍ）を、プロパノール（３ｍＬ）を添加することによって完全に湿潤化した。溶媒を膜から除去し、ＵＨＰ水（３ｍＬ）を添加した。このステップを、膜がＵＨＰ水（３ｍＬ）中で完全に湿潤化されるまで、少なくとも５回繰り返した。
【０１０８】
１回目の適用−第１還元剤
膜を入れたバイアル瓶からＵＨＰ水を除去し、新たなＵＨＰ水（２ｍＬ）、続いてテトラクロロ白金酸カリウム（５０ｍｇ）、アスコルビン酸（３００ｍｇ）、及び３７％ＨＣｌ（０．２５ｍＬ）を添加した。
【０１０９】
１回目の適用−第１還元
膜を、Ｐｔ／アスコルビン酸溶液中に入れて、オーブン中に配置し、４５℃で６日間加熱した。
【０１１０】
１回目の適用−第２還元剤及び第２還元
膜を、ＩＰＡ／ＵＨＰ水溶液（７０：３０ｖ／ｖ、７ｍＬ）中で少なくとも５回洗浄した。ＩＰＡ／ＵＨＰ水溶液（７０：３０ｖ／ｖ、７ｍＬ）中の膜にＮａＢＨ４（５０ｍｇ）を添加した。
【０１１１】
１回目の適用−洗浄
膜を、ＩＰＡ／ＵＨＰ水溶液（７０：３０ｖ／ｖ、７ｍＬ）中で少なくとも５回洗浄した。膜を、プロパノール（３ｍＬ）を添加することによって完全に湿潤化した。膜から溶媒を除去し、ＵＨＰ水（３ｍＬ）を添加した。このステップを、プロパノールが存在しなくなるまで、少なくとも５回繰り返した。
【０１１２】
２回目の適用−第１還元剤
膜を入れたバイアル瓶からＵＨＰ水を除去し、新たなＵＨＰ水（２ｍＬ）、続いてテトラクロロ白金酸カリウム（２５ｍｇ）、アスコルビン酸（３００ｍｇ）、及び３７％ＨＣｌ（０．２５ｍＬ）を添加した。
【０１１３】
２回目の適用−第１還元
膜を、Ｐｔ／アスコルビン酸溶液中に入れ、オーブン中に配置し、４５℃で１日間加熱した。
【０１１４】
２回目の適用−第２還元剤及び第２還元
膜を、ＩＰＡ／ＵＨＰ水溶液（７０：３０ｖ／ｖ、７ｍＬ）中で少なくとも５回洗浄した。膜を入れた溶液にＮａＢＨ４（５０ｍｇ）を添加した。
【０１１５】
２回目の適用−洗浄
膜を、ＩＰＡ／ＵＨＰ水溶液（７０：３０ｖ／ｖ、７ｍＬ）中で少なくとも５回洗浄した。水洗後、膜をエタノール（７ｍＬ）中に浸した。
【０１１６】
乾燥
膜を、室温、大気圧の空気下で少なくとも１時間乾燥した。
【０１１７】
（例２）
ＲＯＳ失活膜を、
（ｖ）１回目の適用−第１還元剤のステップに対して、５０ｍｇのテトラクロロ白金酸カリウムを使用したこと；及び
（ｖｉ）１回目の適用−第２還元剤のステップ、第２還元剤及び第２還元ステップに対して、ＩＰＡ／ＵＨＰ（７０：３０ｖ／ｖ、７ｍＬ）中のＮａＢＨ４水溶液に代わって、３７％ＨＣｌ（０．５ｍＬ）とヒドラジン（１．５ｍＬ）との混合物を使用したこと；以外は、例１の手順に従って製造した。
【０１１８】
膜のＳＥＭ画像を図５に示す。Ａ及びＢは表面画像であり、Ｃ及びＤは断面画像である。
【０１１９】
（例３）
過酸化水素溶液（１０ｐｐｍ）を次のように調製した：３０％過酸化水素溶液（１３３μＬ）をＵＨＰ水（１００ｍＬ）で希釈して４００ｐｐｍの過酸化水素溶液を得た。１０ｐｐｍの過酸化水素溶液を得るために、１ｍＬの４００ｐｐｍ溶液を３９ｍＬのＵＨＰ水で希釈した。
【０１２０】
このようにして調製された１０ｐｐｍ溶液の１００μＬを、図４に概略的に示したような、例１の膜の長さが２５ｍｍの壁を通してポンプで送液した。膜を通って移動した溶液中で過酸化物は検出されなかった。Ｈ２Ｏ２の検出は、０．５ｐｐｍ以上の過酸化物を検出する能力のある過酸化物試験用ストリップ（例えば、ＥＭ  Ｑｕａｎｔ（商標））を使用して実施した。同様の手順を、例２の膜で繰り返すと、膜を通って移動した溶液中の過酸化物レベルは、検出レベル（０．５ｐｐｍ）未満であった。
【０１２１】
膜によるグルコースの減少を次のように試験する：
Ｄ−グルコース溶液（５ｍＭ）を調製し、使用前に、アノマー比を平衡化させる（４０：６０のα／β比）。３．５ｍＬのバイアル瓶中に１０倍長の試験すべき膜を配置し、前以て調製したＤ−グルコース溶液（３ｍＬ）を添加する。対照として、前以て調製したＤ−グルコース溶液（３ｍＬ）を、第２の空の３．５ｍＬバイアル瓶に添加する。双方のバイアル瓶中のグルコース濃度を、ＹＳＩ２３００  Ｓｔａｔ  ｐｌｕｓを使用して測定し、次いで、サンプルを３７℃でインキュベートする。少なくとも２４時間にわたって、Ｄ−グルコース濃度を少なくとも３回測定する。時間対Ｄ−グルコース濃度のグラフをプロットし、Ｄ−グルコースの分解速度を求める。
【０１２２】
（例４）
例２の方法により調製した２０倍長（各長さは２５ｍｍ）の膜を４．２ｍＭグルコース溶液（３ｍＬ）中に配置した。グルコース濃度を時間に対して測定した。７２時間後に、グルコース濃度は７．４ｍＭまで増加した。グルコース濃度の測定結果を図７に示す。垂直の矢印は、グルコース濃度が増加したことを示す。
【０１２３】
結果は、グルコース濃度の低下がないことを示し、グルコースは、膜の存在下で安定であることを示している。
【０１２４】
（例５）
ＲＯＳ失活膜を、Ｐｔの単回適用又はＰｔの２回適用のいずれかを利用して、例１及び２の方法で製造した。Ｐｔを単回適用した膜の場合には、２回目の適用ステップを省略した。膜のＲＯＳ失活活性を、２．５ｃｍ長の膜を３０％過酸化水素溶液中に配置した場合の酸素放出速度を測定することによって求めた。結果を下表１に示す。特定の膜について白金装填量を示す。
【表２】
2015509803.tif 000007
【０１２５】
（例６）インビトロ試験
ジボロン酸及びそれと会合したフルオロフォアを含む指標系を有する光学式グルコースセンサーを、例２により調製された白金化膜を用いて、分析対象物が膜を通過してセンサーに入るように構築した。センサーの感知部分を、例３に記載の手順により調製した１０ｐｐｍ過酸化水素溶液中に挿入した。グルコース濃度を、センサーを使用して連続的基準で監視し、且つまた電気化学式グルコースセンサー（ＹＳＩ２３００ｓｔａｔ）を使用して５分毎に監視した。試験を６０分間継続し、結果を図６（実線）に示した。
【０１２６】
使用する膜が白金化されていないこと以外は同一であるセンサーを使用して対応する実験を実施した。また、結果を図６に示す（点線）。
【０１２７】
（例７）過酸化物への暴露の効果
例６に記載のような白金化及び非白金化センサーを、１０ｐｐｍ過酸化水素溶液へ暴露する前及び後の双方で、グルコースに関して校正した。結果を下表２に示す。白金化センサーの２回のセンサー校正の間で有意な変化は観測されなかった。対照的に、非白金化センサーでは、かなりの分解が観察された。
【表３】
2015509803.tif 000008
【０１２８】
（例８）インビボ試験
ジボロン酸及びそれと会合したフルオロフォアを含む指標系を有する光学式グルコースセンサーを、例２により調製された白金化膜を用いて、分析対象物が膜を通過してセンサーに入るように構築した。センサーの感知部分を、１８Ｇカニューレを介して患者の静脈中に挿入した。センサーにより測定されるようなグルコース濃度を連続的基準で記録した。試験を実施する間に、患者から血液サンプルをほぼ２時間毎又は必要な場合に採取し、各サンプルのグルコース濃度を、電気化学式グルコースセンサー（ＹＳＩ２３００ｓｔａｔ）を使用して測定した。結果を図９ｂに示す。
【０１２９】
使用される膜が白金化されていないこと以外は同一であるセンサーを使用して対応する実験を実施した。結果を図９ａに示す。図から明らかなように、白金化膜を有するセンサーからの結果は、ＹＳＩ  ｓｔａｔからのそれと完全に対応しており、一方、非白金化センサーは、試験期間にわたって、ＹＳＩ  ｓｔａｔとの忠実な対応を示していない。
【０１３０】
（例９）
次の方法により製造される膜を有する３種のセンサーを構築した：
１．長さが２５ｍｍのポリプロピレン中空糸膜（ＭＰＨＦ）を７ｍＬのバイアル瓶中に配置した。
２．ＭＰＨＦ膜を、ＮＭＰ（２ｍＬ）を添加することによって完全に湿潤化し、バイアル瓶を振盪した。この湿潤化工程は瞬間的であり、膜は湿潤化により半透明になった。
３．バイアル瓶中の溶媒を除去し、直ちにＮＭＰ（２ｍＬ）で置き換えた。バイアル瓶を振盪して膜を洗浄した。この除去／置き換え及び振盪工程を少なくとも３回繰り返した。
４．バイアル瓶からＮＭＰを除去し、次のものを、各添加の間に振盪しながら添加した：
・ＮＭＰ（２ｍＬ）
・ＵＨＰ水（４ｍＬ）
・テトラクロロ白金（ＩＩ）酸カリウム（５０ｍｇ／ｍＬ溶液を０．７５ｍＬ）
・ギ酸（０．１ｍＬ）
５．バイアル瓶を加熱式振盪機中に、４５℃で少なくとも１２時間且つ多くても２４時間配置した。
６．バイアル瓶中の溶媒を除去し、７０：３０のＩＰＡ／ＵＨＰ水（７ｍＬ）で置き換えた。この工程を、洗浄液が澄明になるまで少なくとも５回繰り返した。
７．バイアル瓶から膜を取り出し、膜を垂直に保つための直線ワイヤで支持して、外界条件下で少なくとも１時間乾燥した。
【０１３１】
センサーを１０ｐｐｍ過酸化水素溶液に１時間暴露し、非白金化対照センサーについても同様にして、グルコース濃度を測定した（図１０は、白金化センサー１、２及び３についての結果を、それぞれＩＢ０７０−００１、ＩＢ０７０−００２及びＩＢ０７０−００３として示す。非白金化対照についての結果をＩＢ０６６−０１１として示す。
【０１３２】
これらのセンサーを、この試験の前及び後に校正した。表３は、これらの校正の比較である。
【表４】
2015509803.tif 000009
【０１３３】
白金化センサーは、過酸化水素溶液に対して完全に耐性があると思われ、試験の前及び後でそれらの校正定数に有意な変化はなかった。５ｍＭグルコースでの平均モジュレーションは、２７．４７％から２７．５３％に変化した。
【０１３４】
前記の方法により製造された膜のＲＯＳ失活活性を、例３の手順を利用して、１０ｐｐｍＨ２Ｏ２中で測定した。膜を通って移動した溶液中の過酸化物レベルは、検出レベル（０．５ｐｐｍ）未満であった。
【０１３５】
本発明を、いくつかの特定の実施形態及び例を参照して説明してきた。しかし、本発明は、これらの特定の実施形態及び例に限定されるものではない。
【図１】
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【図１ａ】
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【図２】
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【図３】
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【図３ａ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
2015509803.tif 000017
【図５Ｄ】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2015509803.tif 000022
【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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