(57)【要約】  我々は、誘導多能性幹細胞、及びヒト臍帯組織由来細胞から誘導多能性幹細胞を調製する方法を開示している。より具体的には、我々は、外胚葉、中胚葉、及び内胚葉系統の細胞に分化され得る、ヒト臍帯組織由来ｉＰＳ細胞を開示している。
2015502759.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
再プログラムされたヒト臍帯組織由来細胞を含む、誘導多能性幹細胞であって、前記ヒト臍帯組織由来細胞が、培養において自己複製及び増殖が可能である、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離される、単離された臍帯組織細胞であり、他の表現型の細胞に分化する潜在性を有し、培養において少なくとも４０回の倍加を経ることができ、継代培養時に正常な核型を維持し、以下の特性：ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＰＤ−Ｌ２、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの各々を発現する；ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、又はＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのうちのいずれも発現しない；並びに線維芽細胞、間葉幹細胞、若しくは腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞のものと比較して、インターロイキン８；レチクロン１；及びケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３の各々に対する遺伝子の発現の増加、を有する、誘導多能性幹細胞。
【請求項２】
前記ヒト臍帯組織由来細胞が、以下の特性：因子ＭＣＰ−１、ＭＩＰ１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＲＡＮＴＥＳ、及びＴＩＭＰ１の各々を分泌する；並びに
因子ＳＤＦ−１α、ＴＧＦ−β２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、ＭＩＰ１ａ及びＶＥＧＦのうちのいずれも分泌しない、を更に有する、請求項１に記載の誘導多能性幹細胞。
【請求項３】
前記誘導多能性幹細胞が、ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、及びＮＡＮＯＧを発現する、請求項１に記載の誘導多能性幹細胞。
【請求項４】
前記誘導多能性幹細胞が、アルカリホスファターゼ染色に対して陽性である、請求項１に記載の誘導多能性幹細胞。
【請求項５】
前記誘導多能性幹細胞が、外胚葉、中胚葉、及び内胚葉系統の細胞に分化する、請求項１に記載の誘導多能性幹細胞。
【請求項６】
誘導多能性幹細胞であって、
ヒト臍帯組織由来細胞を提供する工程であって、前記ヒト臍帯組織由来細胞が、培養において自己複製及び増殖が可能である、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離される、単離された臍帯組織細胞であり、他の表現型の細胞に分化する潜在性を有し、培養において少なくとも４０回の倍加を経ることができ、継代培養時に正常な核型を維持し、以下の特性：ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＰＤ−Ｌ２、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの各々を発現する；ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、又はＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのうちのいずれも発現しない；並びに線維芽細胞、間葉幹細胞、若しくは腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞のものと比較して、インターロイキン８；レチクロン１；及びケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３の各々に対する遺伝子の発現の増加、を有する、工程と、
構成的に発現されたヒト転写因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びｃ−ＭＹＣを個々に担持するマウスレトロウイルスで、前記ヒト臍帯組織由来細胞をトランスフェクトする工程と、
前記トランスフェクトされたヒト臍帯組織由来細胞を培養する工程と、
誘導多能性幹細胞を特定する工程と、
前記ヒト臍帯組織由来ＩＰＳ細胞を単離する工程と、
前記誘導多能性幹細胞を継代培養する工程と、
誘導多能性幹細胞を提供する工程と、を含む方法によって調製される、誘導多能性幹細胞。
【請求項７】
前記マウスレトロウイルスが、ｐ５３−ｓｈＲＮＡを更に担持する、請求項６に記載の誘導多能性幹細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、誘導多能性幹細胞に関する。より具体的には、本発明は、ヒト臍帯組織由来細胞（ｈＵＴＣ）の誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞への再プログラミングに関する。
【背景技術】
【０００２】
誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、それらが、細胞療法に対する潜在的価値を有する、体外での患者特異的前駆細胞の生成を可能にするため、再生医療における用途に対する関心を集めている（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．及びＹａｍａｎａｋａ，Ｓ．，Ｃｅｌｌ  １２６，６６３〜７６（２００６））。しかしながら、多くの例において、例えば、急性状態、又は患者の体細胞が慢性疾患若しくは加齢の結果として改変される時の細胞療法に対しては、既製のアプローチが望ましいであろう。
【０００３】
統合的なウイルス方法を使用する多能性因子及び癌遺伝子の異所性発現は、マウス及びヒト線維芽細胞の両方において、多能性を誘導するのに十分である（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．及びＹａｍａｎａｋａ，Ｓ．，Ｃｅｌｌ  １２６，６６３〜７６（２００６）；Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  １３１，８６１〜７２（２００７）；Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ，Ｋ．及びＰｌａｔｈ，Ｋ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３６，５０９〜２３（２００９）；Ｌｏｗｒｙ，Ｗ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  ＮａｔｌＡｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０５，２８８３〜８（２００８））。しかしながら、このプロセスは、遅く、非効率的であり、ベクターのゲノムへの永続的な統合が、治療的用途に対するｉＰＳ細胞の使用を制限する（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．及びＹａｍａｎａｋａ，Ｓ．，Ｃｅｌｌ  １２６，６６３〜７６（２００６））。更なる研究では、年齢、起源、及び使用される細胞タイプが、再プログラミングの効率に重大な影響を及ぼすことを示している。近年、ヒトケラチノサイトのレトロウイルス形質導入が、線維芽細胞と比較した時、１００倍効率的、かつ２倍速い、多能性への再プログラミングをもたらしたことが示された。これらの相違は、開始ケラチノサイト集団におけるＫＬＦ４及びｃ−ＭＹＣの内因性発現並びに／又は再プログラミングをより行いやすいエピジェネティックな状態を提示する未分化前駆細胞のプールの存在に起因し得るという仮定が立てられた（Ｌｏｗｒｙ，Ｗ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  ＮａｔｌＡｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０５，２８８３〜８（２００８））。この後者の仮説は、マウスにおける他の研究によって更に裏付けられている。（Ｓｉｌｖａ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ６，ｅ２５３（２００８）；及びＥｍｉｎｌｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２６，２４６７〜７４（２００８））。しかしながら、幹細胞は、通常、希少であり、かつアクセスすること及び大量に単離することが困難である（例えば、神経幹細胞）（Ｋｉｍ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １３６，４１１〜９（２００９）；Ｋｉｍ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４５４，６４６〜５０（２００８））。
【０００４】
ヒト臍帯組織由来ｉＰＳ細胞は、いくつかの用途に対する多能性細胞の実行可能な供給を表す。臍帯組織は、早期の発生的起源からのものであり、多系統の分化の潜在性を有することが示されているため、再生医療にとって特に関心が高い。加えて、臍帯組織は、皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトといった、若年又は成人ドナー細胞と比較した時、組み込まれた変異を免れる可能性が高い。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
我々は、ヒト臍帯組織由来細胞を再プログラミングすることによって調製される、誘導多能性幹細胞を本明細書において説明する。ヒト臍帯組織由来細胞は、培養において自己複製及び増殖が可能である、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離される、単離された臍帯組織細胞であり、他の表現型の細胞に分化する潜在性を有し、培養において少なくとも４０回の倍加を経ることができ、継代培養時に正常な核型を維持し、以下の特性：ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＰＤ−Ｌ２、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの各々を発現する；ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、又はＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのうちのいずれも発現しない；並びに線維芽細胞、間葉幹細胞、若しくは腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞のものと比較して、インターロイキン８；レチクロン１；及びケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３の各々に対する遺伝子の発現の増加、を有する。ヒト臍帯組織由来細胞は、以下の特性：因子ＭＣＰ−１、ＭＩＰ１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＲＡＮＴＥＳ、及びＴＩＭＰ１の各々を分泌する；並びに因子ＳＤＦ−１α、ＴＧＦ−β２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、ＭＩＰ１ａ、及びＶＥＧＦのうちのいずれも分泌しない、を更に有する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】ｈＵＴＣのヒトＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、並びにｃ−ＭＹＣ及びｐ５３に対するｓｈＲＮＡでの形質導入から得られる、ヒト臍帯組織由来ｉＰＳ細胞、クローンＫ１のモルホロジー。クローンは、継代１において、被照射マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダ層上に示される。
【図２】ＭＥＦフィーダ層上で成長させられ、アルカリホスファターゼに対して染色される（４×倍率）、ヒト臍帯組織由来ｉＰＳ細胞（クローンＫ１）。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
我々は、ｐ５３の下方制御を伴う又は伴わない、４つの（ＯＳＫＭ）転写因子のレトロウイルス形質導入による、ヒト臍帯組織由来細胞（ｈＵＴＣ）の多能性への再プログラミングを本明細書において開示する。本明細書において説明される方法及び組成物を使用して、ｈＵＴＣは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びｃ−ＭＹＣでのレトロウイルス形質導入によって、多能性に再プログラムされる。得られる再プログラムされたｈＵＴＣは、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞の特性を有する。
【０００８】
一実施形態において、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、ヒト臍帯組織由来細胞から調製され、本明細書において、ヒト臍帯組織由来ｉＰＳ細胞と称される。ｈＵＴＣは、ｐ５３に対するｓｈＲＮＡの存在下若しくは不在下で、再プログラミング因子の強制発現によって再プログラムされた。再プログラムされた細胞は、モルホロジー、アルカリホスファターゼに対する染色、多能性マーカーの発現、特異的なプロモータのメチル化、及び特異的な胚葉マーカーの発現に対して特徴付けられた。
【０００９】
ｈＵＴＣは、ヒト臍帯組織から単離される、固有の細胞集団である。ｈＵＴＣを単離するための方法は、その全体として参照することにより本明細書に組み込まれる、米国特許第７，５１０，８７３号において説明される。簡潔に述べると、本方法は、（ａ）ヒト臍帯組織を得ることと、（ｂ）実質的に血液の全てを除去して、実質的に血液不含の臍帯組織を得ることと、（ｃ）機械的若しくは酵素処理、又はその両方によって、組織を解離することと、（ｄ）組織を培養培地に再懸濁することと、（ｅ）培養において自己複製及び増殖が可能であり、他の表現型の細胞に分化する潜在性を有する、ヒト臍帯組織由来細胞の成長を可能にする、成長条件を提供することと、を含む。
【００１０】
好ましい実施形態において、この細胞はテロメラーゼ（ｈＴｅｒｔ）を発現しない。したがって、一実施形態は、テロメラーゼ（ｈＴｅｒｔ）を発現せず、本明細書において開示される特性のうちの１つ以上を有する、ヒト臍帯組織由来細胞である。
【００１１】
一実施形態において、細胞は、実質的に血液を含まない、ヒト臍帯組織から単離され、培養における自己複製及び増殖が可能であり、他の表現型の細胞に分化する潜在性を有し、少なくとも４０回の倍加を経ることができ、以下の特性：（ａ）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＰＤ−Ｌ２、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの各々を発現する；（ｂ）ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、又はＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのうちのいずれも発現しない；並びに（ｃ）線維芽細胞、間葉幹細胞、若しくは腸骨稜骨髄細胞である、ヒト細胞と比較して、インターロイキン−８；レチクロン１；及びケモカイン受容体リガンド（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３の発現の増加、を有する、臍帯組織由来細胞である。一実施形態において、これらの臍帯由来細胞はまた、以下の特性のうちの１つ以上を有し得る；（ａ）因子ＭＣＰ−１、ＭＩＰ１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＲＡＮＴＥＳ、及びＴＩＭＰ１のそれぞれの分泌；（ｂ）因子ＳＤＦ−１α、ＴＧＦ−β２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、ＭＩＰ１ａ、及びＶＥＧＦのいずれの分泌もなし。別の実施形態において、これらの臍帯組織由来細胞は、ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼを発現しない。
【００１２】
別の実施形態において、細胞は、実質的に血液を含まない、ヒト臍帯組織から単離され、培養において自己複製及び増殖が可能であり、他の表現型の細胞に分化する潜在性を有し、ＣＤ１１７を発現せず、テロメラーゼ又はｈＴｅｒｔを発現する、臍帯組織由来細胞である。なお別の実施形態において、細胞は更に、ＣＤ４５を発現しない。代替的な実施形態において、細胞は更に、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、又はＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのうちのいずれも発現しない。別の代替的な実施形態において、細胞は更に、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＰＤ−Ｌ２、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの各々を発現する。本発明のなお別の実施形態において、細胞は更に、少なくとも４０回の倍加を経ることができる。なお別の実施形態において、細胞は更に、線維芽細胞、間葉幹細胞、又は腸骨稜骨髄細胞である、ヒト細胞のものと比較して、インターロイキン−８；レチクロン１；及びケモカイン受容体リガンド（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３の発現の増加を示す。なお別の実施形態において、細胞は更に、以下の特性：（ａ）因子ＭＣＰ−１、ＭＩＰ１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＲＡＮＴＥＳ、及びＴＩＭＰ１の各々の分泌、並びに（ｂ）因子ＳＤＦ−１α、ＴＧＦ−β２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、ＭＩＰ１ａ及びＶＥＧＦのうちのいずれの分泌もなし、の各々を有する。
【００１３】
ｈＵＴＣは、ウイルス再プログラミング方法を使用して再プログラムされた。一実施形態において、ｈＵＴＣは、構成的に発現されたヒト転写因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びｃ−ＭＹＣを個々に担持するレトロウイルスでトランスフェクトされた。簡潔に述べると、ｈＵＴＣは、ｈＦｉｂ培地において、１ウェルあたり１×１０５細胞で、６ウェルプレート上にプレートされ、５％  ＣＯ２及び３７℃で、６時間インキュベートされた。４つのマウスレトロウイルス構造物（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びｃ−ＭＹＣ）並びにトランスフェクションの効率を増加させるための薬剤を、各ウェルに添加した。５％  ＣＯ２及び３７℃で終夜インキュベーションした後、この形質導入工程を繰り返した。２４時間後、培地を吸引し、新しいｈＦｉｂ培地を添加した。更に４８時間後、細胞を採取し、ｈＦｉｂ培地にマウス胚性フィーダ（ＭＥＦ）細胞を事前播種した６０ｍｍ皿上にプレートした。４８時間後、培地をｈＥＳ培地と置き換えた。細胞は、ｈＥＳ培地を毎日置き換えて、３〜４週間インキュベートされた。
【００１４】
別の実施形態において、ｈＵＴＣは、構成的に発現されたヒト転写因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、及びｐ５３−ｓｈＲＮＡを個々に担持するＶＳＶｇマウスレトロウイルスでトランスフェクトさせた。ｐ５３の阻害は、細胞増殖を減速させることによって、推定上、特定の細胞タイプの再プログラミング効率を増強することがこれまでに示されている（Ｚｈａｏ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ３：４７５〜４７９；Ｓａｒｉｇ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０７：２１２７〜２１４０（２０１０））。簡潔に述べると、ｈＵＴＣは、Ｈａｙｆｌｉｃｋ培地において、１ウェルあたり１×１０５細胞で、６ウェルプレート内にプレートされ、５％  ＣＯ２及び３７℃で終夜インキュベートされた。ウイルストランスフェクションに関して、４つのＶＳＶｇマウスレトロウイルス構造物（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びｃ−ＭＹＣ）並びにｐ５３−ｓｈＲＮＡ、並びにトランスフェクションの効率を増加させるための薬剤を有する、形質導入培地が、各ウェルに対して調製された。培地をウェルから吸引し、形質導入培地を添加し、５％  ＣＯ２及び３７℃で終夜インキュベートした。この形質導入工程を翌日繰り返し、終夜インキュベーションした後、形質導入培地をＨａｙｆｌｉｃｋ培地と置き換えた。細胞は、Ｈａｙｆｌｉｃｋ培地を２日おきに置き換えて、更に４日間インキュベートされた。
【００１５】
次いで、トランスフェクトされたｈＵＴＣを培養し、古典的なｉＰＳ細胞モルホロジーの外観に関して観察した。古典的なｉＰＳ細胞モルホロジーは、非常に鋭利で明確に画定されたエッジを伴って、光学顕微鏡検査下で、屈折性であるか又は「光る」、密集された細胞コロニーの形成を指す。古典的なｉＰＳ細胞モルホロジーを呈する細胞を単離し、継代培養し、増殖させて、ヒト臍帯組織由来ｉＰＳ細胞を提供した。
【００１６】
いくつかの基準を使用して、ｉＰＳ細胞が、モルホロジー（上で説明されるような）、アルカリホスファターゼに対する染色、多能性マーカーの発現、特定のプロモータのメチル化、及び特定の胚葉マーカーの発現を含み、完全に再プログラムされるかどうかを評価する。重要な多能性因子、ＮＡＮＯＧ、及び胚性幹細胞特異的表面抗原（ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１）の発現は、完全に再プログラムされたヒト細胞を特定するために日常的に使用されている。機能的なレベルにおいて、ｉＰＳ細胞はまた、全ての３つの胚性胚葉から系統に分化する能力を実証する。
【００１７】
本明細書において説明される方法によって調製されるヒト臍帯組織由来ｉＰＳ細胞は、多能性に関して特徴付けられた。古典的なｉＰＳ細胞モルホロジーを示すこれらの細胞は、自己複製が可能であり、重要な多能性マーカー（ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、及びＮＡＮＯＧ）を発現し、３つの胚葉からの系統への分化を実証し、正常な核型を示す。
【００１８】
ヒト臍帯組織由来ｉＰＳ細胞は、再生医療のための多能性細胞の良好な源を表す。この技術でもって、現在、多能性細胞を大量に生成することが可能である。別の重要な利益は、早期の発生的起源を起源とする組織、及び成人のドナー細胞と比較して組み込まれた変異を恐らく含まない組織からｉＰＳ細胞を得る潜在性である。これらの細胞は、エピジェネティックな再プログラミング、分化能力、得られる系統の安定性、及び関連する異常のリスクの程度に関して、複数の組織に由来するｉＰＳ細胞間の比較に対して有用である。
【００１９】
本発明の異なる実施形態を非限定的な例として示した図面を参照しながら、以下の説明文において本発明を更に説明する。
【実施例】
【００２０】
実施例１．ｉＰＳ細胞へのｈＵＴＣの再プログラミング
米国特許第７，５１０，８７３号において説明される方法に従って得られるｈＵＴＣを、構成的に発現されたヒト転写因子（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びｃ−ＭＹＣ）を個々に担持するマウスレトロウイルスで形質導入した。
【００２１】
ｈＵＴＣを解凍し、形質導入前に一継代培養した。１日目に、ｈＵＴＣをトリプシン処理し、１ウェルあたり、商標ＢＥＮＣＨＭＡＲＫ（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｗｅｓｔ  Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）、カタログ番号１００−１０６、ｖｏｌ／ｖｏｌ）で販売される１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、商標ＧＬＵＴＡＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号３５０５０−０６１）で販売される２ミリモルのＬ−グルタミン、５０単位／ミリリットルのペニシリン、及び５０ミリグラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号１５１４０−１２２）を含有する、２ミリリットルのｈＦｉｂ培地（ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、カタログ番号１１９６５−０９２）において、１ウェルあたり１×１０５細胞で６ウェルプレート上へプレートした。細胞を、６時間、５％  ＣＯ２及び３７℃でインキュベートした。培地を吸引して、生育不能の細胞を除去し、２ミリリットルの新しいｈＦｉｂ培地を添加した。ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びｃ−ＭＹＣ（各々、５のＭＯＩを有する）を個々に担持するレトロウイルス、及び１０マイクロリットル（２００×）の商標ＴＲＡＮＳＤＵＸ（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）、カタログ番号ＬＶ８５０Ａ−１）で販売される感染試薬を、各ウェルに添加し、プレートをかき混ぜることによってやさしく混合した。２日目に、ウイルス形質導入工程を繰り返した。３日目に、形質導入培地を除去し、細胞を洗浄し、培地を２ミリリットルのｈＦｉｂ培地と置き換えた。この同じ日に、１×１０５のマイトマイシンＣで処理したＭＥＦ細胞を、６０ミリメートルの皿（０．１％のゼラチン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）、カタログ番号ＥＳ−００６−Ｂ、ｗｔ／ｖｏｌ）で事前コーティング）上に播種し、５％  ＣＯ２及び３７℃で終夜インキュベートした。
【００２２】
再プログラムされた、又はｉＰＳ細胞コロニーの形成を監視するために、形質導入されたｈＵＴＣを、４日目にトリプシン処理によって採取し、２０％ノックアウト血清（ＫＳＲ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号１０８２８−０２８、ｖｏｌ／ｖｏｌ）、１０ナノグラム／ミリリットルの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、カタログ番号２３３−ＦＢ−０２５）、１ミリモルのＧＬＵＴＡＭＡＸ、０．１ミリモルの非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号１１１４０−０５０）、０．１ミリモルのＭ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、カタログ番号Ｍ７５２２）、５０単位／ミリリットルのペニシリン、及び５０ミリグラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号１５１４０−１２２）を含有する、ｈＥＳ培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号１１３３０−３２）に再懸濁し、次いで、６０ミリメートル皿あたり１×１０６細胞の濃度でマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダプレート上にプレートした。細胞を、３×１０４〜１×１０５細胞の異なる細胞密度でプレートした。６日目に、培地を吸引し、ｈＥＳ培地で置き換えた。培地を、３〜４週間、毎日、新しいｈＥＳ培地で変えた。プレートを毎日チェックして、ｉＰＳ細胞コロニーを特定した。
【００２３】
ｐ５３に対するｓｈＲＮＡの存在下で再プログラミングするために、ｈＵＴＣを、レトロウイルス構造物、具体的には、構成的に発現されたヒト転写因子（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びｃ−ＭＹＣ）を個々に担持するＶＳＶｇマウスレトロウイルス、並びにｐ５３−ｓｈＲＮＡを含有するＶＳＶｇマウスレトロウイルスで形質導入した。
【００２４】
マウスレトロウイルスは、トランスフェクションの１日前に、１皿あたり３×１０６細胞の密度で、６センチメートル皿上にプレートされた、２９３−ｇｐ２レトロウイルスパッケージング細胞を使用して生成され、５％  ＣＯ２及び３７℃で終夜インキュベートされた。次いで、各皿を、３マイクログラムのｐＭＸベクター（Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、ｃＭｙｃ、Ｋｌｆ４、又はｐ５３−ｓｈＲＮＡベクター、１マイクログラムのＶＳＶ−ｇ及び１６マイクロリットルの商標ＦＵＧＥＮＥ  ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、カタログ番号０４７０９７０５００１）で販売されるトランスフェクション薬剤で、製造元の基準プロトコルに従ってトランスフェクトした。次いで、ウイルスをトランスフェクションの４８時間後に収集し、使用前に０．４５ミクロンのフィルタを通して濾過させた。
【００２５】
ｈＵＴＣを解凍し、形質導入前に一継代培養した。形質導入の１日前に、ｈＵＴＣをトリプシン処理し、１ウェルあたり２ミリリットルの腎上皮成長培地（ＲＥＧＭ，Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ．（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ））に、１ウェルあたり１×１０５細胞で６ウェルプレートの２ウェル上にプレートした。細胞を５％  ＣＯ２及び３７℃で終夜インキュベートした。１日目に、２．５ミリリットルの形質導入培地を、５００マイクロリットルの各々新しく作製されたウイルス及び４ナノグラム／ミリリットルのポリブレンを含有する各ウェルに対して調製した。培養培地をウェルから吸引し、形質導入培地を添加し、５％  ＣＯ２及び３７℃で終夜インキュベートした。２日目に、ウイルス形質導入工程を繰り返した。３日目に、形質導入培地を除去し、ＲＥＧＭで置き換えた。培地変更は、７日目まで２日おきに行った。
【００２６】
再プログラムされた、又はｉＰＳ細胞コロニーの形成を監視するために、形質導入されたｈＵＴＣをトリプシン処理によって採取し、追加の２０ナノグラム／ミリリットルのｂＦＧＦ（ｉＰＳ−Ｎｕ培地）、又は２０ナノグラム／ミリリットルのｂＦＧＦ（ｉＰＳ−ＫＳＲ培地）を有する標準的なノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）含有ヒトＥＳ培地で補充された、商標ＳＴＥＭＥＤＩＵＭ  ＮＵＴＲＩＳＴＥＭ（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ，Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、カタログ番号０１−０００５）で販売される培養培地中に再懸濁し、次いで、６ウェルプレート内に１ウェルあたり１×１０４細胞の濃度で、商標ＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）、カタログ番号３５４２７７）で販売される、コーティングされた基底膜マトリクス、又はマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダプレート上にプレートした。培地は、新しいｉＰＳ培地で、１週目は２日おきに、２〜６周目は毎日変えた。プレートを毎日チェックして、ｉＰＳ細胞コロニーを特定した。
【００２７】
「古典的な」再プログラムされた、又はｉＰＳ細胞モルホロジーを呈するコロニーを、ＭＥＦフィーダプレートから手動で採集し、１２ウェルのＭＥＦフィーダプレートの単一ウェル上に播種した。培養培地は、毎日変えた。４〜６日後、コロニーを１２ウェルプレートから手動で採集し、６ウェルプレートに増殖させた。培養培地は毎日変え、４〜６日おきに手動で１：３に分割した。各ウェルからの細胞を、商標ＣＲＹＯＳＴＥＭ（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ，Ｉｎｃ．、カタログ番号０１−００１３）で販売される凍結培地を使用して、種々の段階で凍結させた。
【００２８】
結果
４つの再プログラミング因子を発現するレトロウイルスでのｈＵＴＣの再プログラミングは、ｉＰＳ細胞モルホロジーを呈する再プログラムされたコロニーをもたらした。再プログラムされたコロニーを手動で採集し、これらのコロニーのうちの１２個を増殖させ、凍結した。４つの再プログラミング因子を使用して得られるヒト臍帯組織由来ｉＰＳ細胞は、ＦＦ、続いてコロニー番号として示される。
【００２９】
４つの再プログラミング因子を発現するレトロウイルス、及びｐ５３に対するｓｈＲＮＡでのｈＵＴＣの再プログラミングは、ｉＰＳ細胞モルホロジーを呈する再プログラムされたコロニーをもたらした。２５個の再プログラムされたコロニーを手動で採集し、これらのコロニーのうちの１９個を増殖させ、凍結した。４つの再プログラミング因子及びｐ５３  ｓｈＲＮＡを使用して得られるヒト臍帯組織由来ｉＰＳ細胞は、Ｎ（元はＳＴＥＭＥＤＩＵＭ  ＮＵＴＲＩＳＴＥＭ含有培地において維持）、続いて、コロニー番号又はＫ（元はＫＳＲ含有培地において維持）、続いてコロニー番号として示される（図１）。
【００３０】
実施例２．多能性マーカーの発現
実施例１において調製されたヒト臍帯組織由来ｉＰＳ細胞を、免疫細胞化学によって、多能性マーカーのそれらの発現に関して評価した。４％パラホルムアルデヒド中にコロニーを固定した後、多能性マーカーに対する免疫蛍光染色を、表１に示される抗体試薬を使用して行った（全ての抗体は、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ，Ｉｎｃ．から得た）。
【００３１】
【表１】
2015502759.tif 000003
【００３２】
結果
代表的なヒト臍帯組織由来ｉＰＳ細胞クローン、クローンＫ１を、多能性マーカーの発現に関して評価した。ヒト臍帯組織由来ｉＰＳ細胞、クローンＫ１は、マーカーＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、及びＮＡＮＯＧを発現する。これらのマーカーは、親ｈＵＴＣにおいては検出されなかった。これらのマーカーの発現は、ヒト臍帯組織由来ｉＰＳ細胞の多能性を示す。
【００３３】
実施例３．Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、及びＳｏｘ２プロモータのメチル化分析
実施例１において調製されたヒト臍帯組織由来ｉＰＳ細胞、クローンＮ１は、亜硫酸水素塩シークエンシング法を使用して、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、及びＳｏｘ２プロモータ領域のメチル化状態に関して分析し、Ｓｅｑｗｒｉｇｈｔ，Ｉｎｃ．（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）によって行われた。亜硫酸水素塩法は、ＤＮＡ試料内の特定のメチル化パターンを特定するための最も一般的に使用される技術である。それは、ＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理することからなり、これは、非メチル化シトシンをウラシルに変換するが、メチル化シトシンを変化させない。それは、座位特異的又は全ゲノム分析の両方のために使用される。
【００３４】
Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、及びＳｏｘ２の約１００〜５００ｂｐ長のプロモータ領域が、メチル化パターンに関して検査された。ＤＮＡ（表２を参照）は、商標ＤＮＥＡＳＹ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）、カタログ番号６９５０６）で販売されるＤＮＡ抽出キットを使用して調製され、分析のためにＳｅｑｗｒｉｇｈｔ，Ｉｎｃ．へ送付された。
【００３５】
【表２】
2015502759.tif 000004
【００３６】
結果：
表３は、プロモータ領域の分析から得られる結果を要約する。試験された領域内では、Ｓｏｘ２プロモータ内で検出されたメチル化部位は無かった。Ｏｃｔ４プロモータに関して検出された５つのメチル化部位、及びＮａｎｏｇプロモータに関しては２つのメチル化部位が存在した。親細胞と比較して、臍帯組織由来ｉＰＳ細胞は、Ｏｃｔ４プロモータ内の５つの部位のうちの１つ、及びＮａｎｏｇプロモータに関しては２つの部位のうちの１つにおいて、メチル化パターンの変化を示した。メチル化パターンのこの変化は、ｉＰＳ細胞の特性である。
【００３７】
【表３】
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【００３８】
実施例４．アルカリホスファターゼ染色
実施例１において調製されたヒト臍帯組織由来ｉＰＳ細胞、クローンＫ１の多能性もまた、アルカリホスファターゼ染色（ＡＰ）によって評価され、アルカリホスファターゼ検出キット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）、カタログ番号ＳＣＲ００４）を使用して行われた。ヒト臍帯組織由来ｉＰＳ細胞を、ＭＥＦ播種２４ウェルプレート上にプレートし、３７℃のインキュベータ内で維持した。３〜５日後、培養培地をウェルから吸引し、細胞を１〜２分間、４％パラホルムアルデヒドを使用して固定した。固定剤を除去し、細胞を１ミリリットルの１×すすぎ緩衝液で洗浄した。その後、すすぎ緩衝液を０．５ミリリットルの染色試薬混合物で置き換え、室温で１５分間インキュベートした。染色試薬は、キット構成要素のファーストレッドバイオレット（ＦＲＶ）、及びナフトールＡＳ−ＢＩリン酸塩溶液を、水と２：１：１の比率（ＦＲＶ：ナフトール：水）で、アルミホイルで被覆された管内で混合することによって調製した。染色試薬を除去し、細胞を１ミリリットルの１×すすぎ緩衝液で１回洗浄し、次いで、０．５ミリリットルのＰＢＳにおいてインキュベートした。染色された細胞の画像は、顕微鏡写真機で捕捉した。ＡＰ活性を呈する細胞は、紫に見える。
【００３９】
結果
図２に示されるように、ヒト臍帯組織由来ｉＰＳ細胞、クローンＫ１は、多能性状態を示す、陽性のアルカリホスファターゼ染色を呈した。
【００４０】
実施例５．３つの胚葉の系統への分化
実施例１において調製されたヒト臍帯組織由来ｉＰＳ細胞、クローンＦＦ４４の、外胚葉、中胚葉、及び内胚葉系統への分化能を、３つの胚葉に特異的なマーカーに対する染色によって評価した。
【００４１】
ヒト臍帯組織由来ｉＰＳ細胞を、ＭＥＦ調整培地中のＭＡＴＲＩＧＥＬ基底膜マトリクスでコーティングされたプレート上に７日間播種した。分化したヒト臍帯組織由来ｉＰＳ細胞の免疫細胞化学は、細胞を４％パラホルムアルデヒド中に１０分間、室温で固定することによって行われた。固定された細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、ＰＢＳ＋３％ウシ胎児血清溶液中で、１時間、室温でインキュベートした。その後、細胞を、商標ＢＤ  ＰＥＲＭ／ＷＡＳＨ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）、カタログ番号ＳＩ−２０９１ＫＺ）で販売される洗浄緩衝液で２回洗浄した。細胞を、特定の抗体（表４）において、ＢＤ  ＰＥＲＭ／ＷＡＳＨ中で終夜、４℃でインキュベートした。細胞を、ＢＤ  ＰＥＲＭ／ＷＡＳＨで５回洗浄し、次いで、１．５〜２時間、室温で、暗所で、二次抗体とともにインキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄した後、細胞を０．１〜１マイクログラム／ミリリットルのＡＰＩ（ＤＮＡ染料、１：１００００希釈）中で２分間インキュベートすることによって、細胞核を視覚化した。ＰＢＳでの最終洗浄の後、細胞を免疫蛍光顕微鏡検査法のために処理した。
【００４２】
【表４】
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【００４３】
結果
ヒト臍帯組織由来ｉＰＳ細胞を、Ｎｅｓｔｉｎ、α−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）、及びα−フェトプロテイン１（ＡＦＰ１）に対する抗体で染色して、それぞれ外胚葉、中胚葉、及び内胚葉系統への分化を評価した。ヒト臍帯組織由来ｉＰＳ細胞、クローンＫ１は、これらの胚葉マーカーを発現し、これらの細胞が、これらの胚葉からの細胞への分化能を有することを示した。
【００４４】
概要
全体的に、我々は、統合（ウイルス）方法を使用して、ヒト転写因子の過剰発現による、ヒト臍帯組織由来ｉＰＳ細胞の生成を示してきた。これらの結果は、ヒト臍帯組織由来ｉＰＳ細胞が、多能性マーカーＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、及びＮＡＮＯＧを発現し、陽性アルカリホスファターゼ染色を呈することを実証する。Ｏｃｔ４プロモータの１００〜５００の塩基対領域の検査時、ヒト臍帯組織由来ｉＰＳ細胞は、親ｈＵＴＣ系と比較して、検査された５つのメチル化部位のうちの１つにおいて、メチル化の変化を示す。Ｎａｎｏｇプロモータに関して、ヒト臍帯組織由来ｉＰＳ細胞は、親ｈＵＴＣ系と比較して、検査された２つのメチル化部位のうちの１つにおいて、メチル化の変化を示す。
【００４５】
これらの細胞はまた、外胚葉、中胚葉、及び内胚葉系統に由来する細胞のタンパク質マーカーを示し、これらの再プログラムされた細胞の分化能を示す。
【００４６】
本発明を特定の実施形態及び実施例を参照することにより説明及び例解してきたが、当業者は、本発明に、必ずしも本明細書に例解されない改変を行い得ることを理解するであろう。そのため、発明の真の範囲を決定する目的では添付の特許請求の範囲のみに拠るべきである。
【００４７】
〔実施の態様〕
（１）  再プログラムされたヒト臍帯組織由来細胞を含む、誘導多能性幹細胞であって、前記ヒト臍帯組織由来細胞が、培養において自己複製及び増殖が可能である、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離される、単離された臍帯組織細胞であり、他の表現型の細胞に分化する潜在性を有し、培養において少なくとも４０回の倍加を経ることができ、継代培養時に正常な核型を維持し、以下の特性：ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＰＤ−Ｌ２、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの各々を発現する；ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、又はＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのうちのいずれも発現しない；並びに線維芽細胞、間葉幹細胞、若しくは腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞のものと比較して、インターロイキン８；レチクロン１（reticulon 1）；及びケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３の各々に対する遺伝子の発現の増加、を有する、誘導多能性幹細胞。
（２）  前記ヒト臍帯組織由来細胞が、以下の特性：因子ＭＣＰ−１、ＭＩＰ１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＲＡＮＴＥＳ、及びＴＩＭＰ１の各々を分泌する；並びに
因子ＳＤＦ−１α、ＴＧＦ−β２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、ＭＩＰ１ａ及びＶＥＧＦのうちのいずれも分泌しない、を更に有する、実施態様１に記載の誘導多能性幹細胞。
（３）  前記誘導多能性幹細胞が、ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、及びＮＡＮＯＧを発現する、実施態様１に記載の誘導多能性幹細胞。
（４）  前記誘導多能性幹細胞が、アルカリホスファターゼ染色に対して陽性である、実施態様１に記載の誘導多能性幹細胞。
（５）  前記誘導多能性幹細胞が、外胚葉、中胚葉、及び内胚葉系統の細胞に分化する、実施態様１に記載の誘導多能性幹細胞。
【００４８】
（６）  誘導多能性幹細胞であって、
ヒト臍帯組織由来細胞を提供する工程であって、前記ヒト臍帯組織由来細胞が、培養において自己複製及び増殖が可能である、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離される、単離された臍帯組織細胞であり、他の表現型の細胞に分化する潜在性を有し、培養において少なくとも４０回の倍加を経ることができ、継代培養時に正常な核型を維持し、以下の特性：ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＰＤ−Ｌ２、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの各々を発現する；ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、又はＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのうちのいずれも発現しない；並びに線維芽細胞、間葉幹細胞、若しくは腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞のものと比較して、インターロイキン８；レチクロン１；及びケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３の各々に対する遺伝子の発現の増加、を有する、工程と、
構成的に発現されたヒト転写因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びｃ−ＭＹＣを個々に担持するマウスレトロウイルスで、前記ヒト臍帯組織由来細胞をトランスフェクトする工程と、
前記トランスフェクトされたヒト臍帯組織由来細胞を培養する工程と、
誘導多能性幹細胞を特定する工程と、
前記ヒト臍帯組織由来ＩＰＳ細胞を単離する工程と、
前記誘導多能性幹細胞を継代培養する工程と、
誘導多能性幹細胞を提供する工程と、を含む方法によって調製される、誘導多能性幹細胞。
（７）  前記マウスレトロウイルスが、ｐ５３−ｓｈＲＮＡを更に担持する、実施態様６に記載の誘導多能性幹細胞。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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2015502759.tif 000010
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