【手続補正書】
【提出日】平成21年12月8日(2009.12.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式で表される化合物：
【化１】
2008174507.tif 000001
（式中、
R1〜R4は、少なくとも一つがα結合したグルコース残基又はマルトース残基又はマルトオリゴ糖残基であり、他方はOHであり；
R5は、OH又はHであり；そして
Xは、H又はガロイル基である）。
【請求項２】
下記からなる群より選択されるものである、請求項１に記載の化合物：
5-O-α-D-グルコピラノシル-(+)-カテキン；
5-O-α-D-グルコピラノシル-(-)-エピガロカテキン-3-O-ガレート；
7-O-α-D-グルコピラノシル-(+)-カテキン；
7-O-α-D-グルコピラノシル-(-)-エピガロカテキン-3-O-ガレート；
7-O-(4-O-α-D-グルコピラノシル-α-D-グルコピラノシル)-(-)-エピガロカテキン-3-O-ガレート；
4'-O-(4-O-α-D-グルコピラノシル-α-D-グルコピラノシル)-(+)-カテキン；
4'-O-α-D-グルコピラノシル-(+)-カテキン；
3'-O-(4-O-α-D-グルコピラノシル-α-D-グルコピラノシル)-(+)-カテキン；
3'-O-α-D-グルコピラノシル-(-)-エピガロカテキン-3-O-ガレート；及び
3'-O-(4-O-α-D-グルコピラノシル-α-D-グルコピラノシル)-(-)-エピガロカテキン-3-O-ガレート。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の化合物を含む、食品用、医薬用又は化粧用組成物。
【請求項４】
請求項３に記載の組成物を含む、飲料。
【請求項５】
フラボノイド類と糖供与体とに、Trichoderma属由来（好ましくは、Trichoderma viride由来又はTrichoderma reesei由来）の配糖化活性を有する酵素剤を作用させる工程を含む、フラボノイド類の配糖体の製造方法。
【請求項６】
フラボノイド類が、カテキン類又はそのメチル化体であり；そして
糖供与体が、マルトトリオース残基を含む糖質（好ましくは、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、デキストリン、γ-シクロデキストリン又は可溶性澱粉）である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
フラボノイド類の配糖体が、下式で表されるものである、請求項６に記載の製造方法：
【化２】
2008174507.tif 000002
式中：
R1〜R5は、少なくとも一つが糖残基であり、他はOH若しくはOCH3であるか、又は
R1〜R4は、少なくとも一つが糖残基であり、他はOH若しくはOCH3であり、R5はHであり；そして
Xは、H、CH3、ガロイル基又はメチル化されたガロイル基である。
【請求項８】
フラボノイド配糖体が、式（I）中、R1〜R4は、少なくとも一つがα結合したグルコース残基又はマルトース残基又はマルトオリゴ糖残基であり、他方はOHであり；
R5は、OH又はHであり；そして
Xは、H又はガロイル基である、請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
フラボノイド類の配糖体が、下記からなる群より選択されるものである、請求項８に記載の製造方法：
5-O-α-D-グルコピラノシル-(+)-カテキン；
5-O-α-D-グルコピラノシル-(-)-エピガロカテキン-3-O-ガレート；
7-O-α-D-グルコピラノシル-(+)-カテキン；
7-O-α-D-グルコピラノシル-(-)-エピガロカテキン-3-O-ガレート；
7-O-(4-O-α-D-グルコピラノシル-α-D-グルコピラノシル)-(-)-エピガロカテキン-3-O-ガレート；
4'-O-(4-O-α-D-グルコピラノシル-α-D-グルコピラノシル)-(+)-カテキン；
4'-O-α-D-グルコピラノシル-(+)-カテキン；
3'-O-(4-O-α-D-グルコピラノシル-α-D-グルコピラノシル)-(+)-カテキン；
3'-O-α-D-グルコピラノシル-(+)-カテキン；
3'-O-α-D-グルコピラノシル-(-)-エピガロカテキン-3-O-ガレート；及び
3'-O-(4-O-α-D-グルコピラノシル-α-D-グルコピラノシル)-(-)-エピガロカテキン-3-O-ガレート。
【請求項１０】
酵素が、固定化されている、請求項５〜９のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１１】
フラボノイド類と糖供与体とに、Trichoderma属由来（好ましくは、Trichoderma viride由来又はTrichoderma reesei由来）の配糖化活性を有する酵素剤を作用させる工程を含む、フラボノイド類の改質方法。
【請求項１２】
フラボノイド類が、カテキン類又はそのメチル化体であり；そして
糖供与体が、マルトトリオース残基を含む糖質（好ましくは、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、デキストリン、γ-シクロデキストリン又は可溶性澱粉）である、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
Trichoderma属由来の配糖化活性を有する酵素を含む、フラボノイド類を配糖化するための酵素剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
特許文献2は、カテキン類とグルコース−1−リン酸又はシュークロースとの混合液にシュークロースホスホリラーゼを作用させ、カテキン類配糖体を製造する方法を開示する。ここでは、シュークロースホスホリラーゼの起源として、Leuconostoc mesenteroides、Pseudomonas saccharophila、Pseudomonas putrefaciens、Clostridium pasteurianum、Acetobacter xylinum、Pullularia pullulansが挙げられている。ここでは、受容体として、カテキン類としては、（＋）−カテキン、（−）−エピカテキン、（−）−エピカテキン3-O-ガレート、（−）−エピガロカテキン、及び（−）−エピガロカテキン3-O-ガレートが挙げられているが、実施例として記載されているのは、（＋）−カテキンを受容体に用いて（＋）−カテキン 3'-O-α-D-グルコピラノシドを製造した例のみである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
特許文献5は、3'位、3'と5位及び3'と7位が配糖化されたカテキン類の配糖体を開示する。ここでは、そのための具体的な方法として、特許文献4と同様、カテキン類及びデキストリン、サイクロデキストリン、澱粉又はこれらの混合物に、Bacillus stearothermophilus由来のサイクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼを作用させる方法が記載されている。そして、糖供与体としてデキストリンを用いた上記方法による実施例においては、（-）-エピガロカテキン、（-）-エピガロカテキン3-O-ガレート、（-）-エピカテキン3-O-ガレートの配糖体については、分子吸光係数から、各ポリフェノール1分子当り平均で6〜8個グルコースが結合しているものも得られたと考察している。また、上記方法で得られた配糖体にリゾプス・ニベウス由来のグルコアミラーゼを作用させることで、3'，7-ジ-O-α-D-グルコピラノシル（-）-エピガロカテキン、3'，5-ジ-O-α-D-グルコピラノシル（-）-エピガロカテキン、3'-O-α-D−グルコピラノシル（-）-エピガロカテキン、3'，7-ジ-O-α-D-グルコピラノシル（-）-エピガロカテキン3-O-ガレート、3'-O-α-D-グルコピラノシル（-）-エピガロカテキン3-O-ガレート、3'-O-α-D-グルコピラノシル（-）-ガロカテキン、3'-O-α-D−グルコピラノシル（-）-エピカテキン3-O-ガレートの生成を確認している。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本発明には、フラボノイド類として、単一の化合物を用いることができ、また、2種以上のフラボノイド類の混合物を用いることもできる。
〔酵素剤〕
本発明には、Trichoderma属由来の配糖化活性を有する酵素剤を用いる。Trichoderma属には、Trichoderma viride、Trichoderma reesei、Trichoderma saturnisporum、Trichoderma ghanense、Trichoderma koningii、 Trichoderma hamatum、Trichoderma harzianum及びTrichoderma polysporumが含まれる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
また、当業者であればTrichoderma属に属する菌（例えば、Trichoderma viride、Trichoderma reesei、Trichoderma saturnisporum、Trichoderma ghanense、Trichoderma koningii、 Trichoderma hamatum、Trichoderma harzianum又はTrichoderma polysporum）の培養物から、従来技術を利用して配糖化酵素を単離・精製し、酵素剤として本発明に用いることができる。このような配糖化酵素のうち、特に好ましい例は、Trichoderma virideIAM5141株の培養上清から得られる配糖化酵素（本明細書では、「TRa2」ということもある。）、及びそのホモログ、すなわち下記の（i）、（ｊ）又は（k）を含有するタンパク質（好ましくは、下記の（i）、（ｊ）又は（k）であるタンパク質）である：
（i）配列番号:10に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（j）配列番号:10に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつフラボノイド類の配糖化活性を有するタンパク質；
（k）配列番号:10に記載のアミノ酸配列と少なくとも60％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつフラボノイド類の配糖化活性を有するタンパク質。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
また、下記のタンパク質も、本発明に用いることができる配糖化酵素の例として挙げることができる：
・Trichoderma属由来であり、好ましくはTrichoderma viride、Trichoderma reesei、Trichoderma saturnisporum、Trichoderma ghanense、Trichoderma koningii、 Trichoderma hamatum、Trichoderma harzianum又はTrichoderma polysporum由来であり、配列番号：11〜24のいずれか一に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる、フラボノイド類の配糖化活性を有するタンパク質。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
なお、本明細書で「1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」というときの置換等されるアミノ酸の個数は、そのアミノ酸配列を有するタンパク質が所望の機能を有する限り特に限定されないが、1〜9個又は1〜4個程度であるか、性質の似たアミノ酸への置換であれば、さらに多くの個数の置換等がありうる。このようなアミノ酸配列に係るタンパク質を調製するための手段は、当業者にはよく知られている。ポリヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の同一性に関する検索・解析は、当業者には周知のアルゴリズム又はプログラム（例えば、BLASTN、BLASTX、BLASTP、ClustalW）により行うことができる。プログラムを用いる場合のパラメーターは、当業者であれば適切に設定することができ、また各プログラムのデフォルトパラメーターを用いてもよい。これらの解析方法の具体的な手法もまた、当業者には周知である。また、本明細書において、塩基配列に関し、高い同一性というときは、少なくとも60％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の配列の同一性を指す。また、アミノ酸配列に関し、高い同一性というときは、少なくとも60％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の配列の同一性を指す。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
本発明により、Trichoderma属（例えば、Trichoderma viride、Trichoderma reesei、Trichoderma saturnisporum、Trichoderma ghanense、Trichoderma koningii、 Trichoderma hamatum、Trichoderma harzianum又はTrichoderma polysporum、好ましくはTrichoderma viride）由来の配糖化活性を有する酵素を含む、フラボノイド類を配糖化するための酵素剤も提供される。酵素剤は、１又は2以上の子嚢菌類の糸状菌由来の糖質分解酵素を含み、それ以外の添加物（例えば、酵素を安定化するための成分や、糖供与体成分、他の酵素）を含んでいてもよい。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
5-O-α-D-グルコピラノシル-(-)-エピガロカテキン-3-O-ガレート：m/z  621.0、NMRδppm (D2O)；；2.8- 3.1 (2H, m), 3.52 (1H, t), 3.7-3.8 (4H, m), 3.91 (1H, t), 5.01(1H, s), 5.54 (1H, s), 5.6 (1H, broad s), 6.35 (1H, s), 6.43 (1H, s), 6.57 (2H,s), 6.95 (2H, s)）。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
そこで、トリコデルマと同じ子嚢菌類の糸状菌でゲノム配列が明らかになっている微生
物のうち、Aspergillus nidulans、Neurospora crassa、Magnaporthe grisea、Fusarium graminearumのゲノム情報データベースから、プロテインファミリーデータベース(PFAM)のalpha-amylase, catalytic domain（accession No. PF00128）のモチーフを持つ推定ORFのアミノ酸配列をそれぞれ9個、6個、8個、6個抽出した。これらを配列相同性検索プログラムであるClustalWによりアライメントを作成し、系統樹作成プログラムであるTree viewにより系統樹を作成し、相同性をもとにグループ分けを行った。図2のグループ1の4つのアミノ酸配列（括弧内はGenebank アクセッションNo.）MG02772.4(EAA47529)、MG10209.4(EAA48146)、AN3388.2(EAA63356)、FG03842.1(EAA71544)をアライメントし、保存性の高い部分（図3 下線部）のアミノ酸配列に対応するオリゴDNAを合成した。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
AMY-12f:
5'-TAYTGYGGNGGNACNTTYAARGGNYT-3'（配列番号：1）
AMY-15r:
5'-TTYTCNACRTGYTTNACNGTRTCDAT-3'（配列番号：2）
AMY-17r:
5'-GGTNAYRTCYTCNCKRTTNGCNGGRTC-3'（配列番号：3）
先に培養したT. viride IAM5141菌体約1gの湿菌体よりDNeasy plant Maxi Kit（QIAGEN）により、ゲノムDNAを抽出した。このゲノムDNA 50ngを鋳型として、プライマーAMY-12fとプライマーAMY-15r、又はプライマーAMY-12fとプライマーAMY-17rを用いてPCR反応を行った。すなわち、ExTaq(タカラバイオ社製)を用いて、94℃  2分、（94℃  1分、50℃1分、72℃  1分）を30サイクル、72℃  10分の反応を行った。PCR産物をアガロースゲル電気泳動で分析したところ、プライマーAMY-12fとプライマーAMY-15rの組み合わせで約0.6kbp、プライマーAMY-12fとプライマーAMY-17rの組み合わせで約1.0 kbpの断片が確認できた。そこで、これらのDNA断片をアガロースゲルから切り出し、GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（アマシャムバイオサイエンス）によりDNAを精製した。これをTOPO-TA cloning kit(インビトロジェン)にてクローニングし、塩基配列の解析をABI3100Avant（アプライドバイオシステムズ社製）にて行った。前者で得られた塩基配列は後者で得られた塩基配列に含まれていた。この塩基配列をGenBankに登録されているアミノ酸配列に対してBlastxにより相同性検索を行ったところ、MG10209.4(EAA48146)と最も高い相同性を示した。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
5-O-α-D-グルコピラノシル-(+)-カテキン：m/z 453.2、NMRδppm (D2O)；2.62 (1H, dd), 2.81 (1H, dd), 3.43 (1H, t), 3.45-3.55 (1H, m), 3.6-3.7 (3H, m), 3.83 (1H, t), 4.18 (1H, dd), 4.76 (1H, d), 5.61 (1H, d), 6.09 (1H, d), 6.31 (1H, d), 6.77 (1H, d), 6.8-6.9 (2H, m) 。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
精製
培養液上清をBuffer S1［20 mM NaH2PO4-NaOH (pH 7.4)、10 mM イミダゾール、0.5 M NaCl、15 mM 2-メルカプトエタノール］にて平衡化したNi2+キレート済みのChelating Sepharose Fast Flow (5 ml、Pharmacia Biotech)カラムにアプライし、同バッファー（40 ml）で洗浄した。続いてBuffer E1［20 mM NaH2PO4-NaOH (pH 7.4)、200 mM イミダゾール、0.5 M NaCl、15 mM 2-メルカプトエタノール］によりカラムに結合したタンパク質を溶出した。活性画分を集め、VIVASPIN（30,000 MWCO、VIVASCIENCE）を用いて脱塩、濃縮した。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
【図１】図１は、Trichoderma viride IAM 5141  粗酵素液でカテキンを処理した際の、HPLC分析チャートである。
【図２】図2は、Aspergillus nidulans、Neurospora crassa、Magnaporthe grisea、Fusarium graminearumのゲノム情報データベースから抽出した、alpha-amylase, catalytic domain（accession No. PF00128）のモチーフを持つ推定ORFのアミノ酸配列について、系統樹作成プログラムであるTree viewにより作成した系統樹を示した図である。
【図３】図3は、図2のグループ1の4つのアミノ酸配列をアライメントし、保存性の高い部分（下線部）を示した図である。
【図４】図4は、TRa2のゲノムDNA配列（配列番号：6）とcDNA配列（配列番号：9）を比較した図である。
【図５】図5は、TRa2のcDNA塩基配列、及びそれに対応する推定アミノ酸配列を示した図である。2重下線部は推定分泌シグナル配列。
【図６】図6は、TRa2の推定アミノ酸配列とタカアミラーゼ前駆体アミノ酸配列（GBNo.BAA00336）の一次構造を比較した図である。下線部：TRa2の推定分泌シグナル、破線下線部：タカアミラーゼの分泌シグナル、2重下線部：α‐アミラーゼファミリー酵素で高度に保存されている4つの領域、＊印アミノ酸残基：触媒部位に位置するアミノ酸残基。
【図７】図7は、形質転換体（TRa2-1株）の培養上清の原液、又はその濃縮液に、（+）-カテキン又は（-）-エピガロカテキン-3-O-ガレートと、デキストリンを加えて反応させた際の、反応液のHPLC分析チャートである。
【図８】図8は、形質転換体（TRa2-1株）の培養上清から調製したTRa2の粗酵素溶液に、各糖受容体基質（（+）-カテキン、（-）-エピガロカテキン-3-O-ガレート、エスクレチン、ナリンゲニン、ケルセチン、ダイゼイン、ゲニステイン、ケンフェロール）、デキストリンを加えて反応させた際の、配糖化活性を示したグラフである。
【図９】図9は、酵素剤の配糖化反応における至適ｐH、及び至適温度を示したグラフである。
【図１０】図10は、（+）-カテキン又は4'-O-α-D-グルコピラノシル-(+)-カテキンを含む溶液を4〜100℃の各温度で0〜4時間処理した後の、それぞれの残存量を示したグラフである。
【図１１】図11は、（+）-カテキン及びその配糖体、並びに（-）-エピガロカテキン-3-O-ガレート及びその配糖体の、水への溶解性を示したグラフである。
【図１２】図12は、(-)-エピガロカテキン-3-(3"-O-メチル)ガレート、デキストリン及び酵素剤を混合して反応した際の、反応液のHPLC分析チャートである。
【図１３】図13は、（-）-エピガロカテキン-3-O-ガレートを多く含む緑茶抽出物（TVG-1）、その配糖体画分(BR−1)、及びBR−1に含まれる各配糖体の単一精製物（5-O-α-D-グルコピラノシル-(-)-エピガロカテキン-3-O-ガレート（5G-1）、5-O-(4-O-α-D-グルコピラノシル-α-D-グルコピラノシル)-(-)-エピガロカテキン-3-O-ガレート（5GG-1）、7-O-α-D-グルコピラノシル-(-)-エピガロカテキン-3-O-ガレート（7G-1））についての、味センサーによる味質レーダーチャートである。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図７】
2008174507.tif 000003