(57)【要約】  比較的少ない細胞、例えば一次細胞内の特定の分子の代謝産物の具体的な測定を可能にする方法について記載する。当該方法は、細胞に（例えば１３Ｃ、１５Ｎまたは３１Ｐで標識された）標識基質を任意に予め投入するステップを含む。当該方法は、異なる表現型の細胞において異なった形で生成される代謝産物を容易に特定することができる。偏りのない多次元ＮＭＲスクリーニングおよびＮＭＲスクリーニングの高速かつ効率的な分析のための新たな方法は、異なる細胞または組織種類において発現が異なる代謝産物を特定する。発現が異なる代謝産物の分析は、対応するように小分子治療法を設計可能な特有のドラッガブルな標的をもたらし得る。
2015509584.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルにおける所与の種類の細胞内の基質の代謝をモニタリングするための方法であって、
ａ．基質代謝産物への基質の代謝分解を可能にするのに十分な時間にわたって、前記基質を用いて第１のサンプルの所与の種類の細胞を培養するステップを備え、前記基質の少なくとも一部は、核磁気共鳴（nuclear magnetic resonance：ＮＭＲ）安定同位体で任意に標識され、前記方法はさらに、
ｂ．ステップ（ａ）の前記細胞から前記基質代謝産物を採取して、基質代謝産物の第２のサンプルを得るステップと、
ｃ．ステップ（ｂ）の前記第２のサンプルに対して多次元ＮＭＲを実行して、代謝された基質の共鳴スペクトルを求めるステップとを備え、前記共鳴スペクトルは、前記基質の代謝産物を表わし、前記多次元ＮＭＲは、スペクトル幅折返し、ランダム位相サンプリング、不均一サンプリング、およびダイナミックレンジデータ再構築の強化のためのデータ拡張の技術のうちのいずれか１つを含む、方法。
【請求項２】
前記多次元ＮＭＲは、スペクトル幅折返し、ランダム位相サンプリング、不均一サンプリング、およびダイナミックレンジデータ再構築の強化のためのデータ拡張の技術のうちのいずれか２つを任意の組合せで含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記多次元ＮＭＲは、スペクトル幅折返し、ランダム位相サンプリング、不均一サンプリング、およびダイナミックレンジデータ再構築の強化のためのデータ拡張の技術のうちのいずれか３つを任意の組合せで含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記多次元ＮＭＲは、スペクトル幅折返し、ランダム位相サンプリング、不均一サンプリング、およびダイナミックレンジデータ再構築の強化のためのデータ拡張の技術のうちの４つ全てを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記基質は、安定同位体で標識され、前記多次元ＮＭＲは、スペクトル幅折返し、ランダム位相サンプリング、不均一サンプリング、およびダイナミックレンジデータ再構築の強化のためのデータ拡張の技術のうちのいずれか２つを任意の組合せで含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記基質は、安定同位体で標識され、前記多次元ＮＭＲは、不均一サンプリング、およびダイナミックレンジデータ再構築の強化のためのデータ拡張を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記基質は、安定同位体で標識され、前記多次元ＮＭＲは、ランダム位相サンプリング、不均一サンプリング、およびダイナミックレンジデータ再構築の強化のためのデータ拡張を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記基質は、安定同位体で標識され、前記多次元ＮＭＲは、スペクトル幅折返し、ランダム位相サンプリング、不均一サンプリング、およびダイナミックレンジデータ再構築の強化のためのデータ拡張の技術のうちの４つ全てを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記サンプルに存在する前記基質代謝産物は、前記サンプル内の他の分子からは精製されない、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
細胞集団内の基質濃度は、前記細胞に前記ＮＭＲで標識された基質を投入する前に、ある時間にわたって下げられる、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記標識基質の前記代謝産物の共鳴は、前記基質に合わせてカスタマイズされたＮＭＲパルスプログラムまたはフィルタリング技術またはそれら両方を用いて求められる、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
細胞集団内の細胞の数は、２×１０６個未満である、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
細胞集団は、一次細胞集団である、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
第１の細胞集団と第２の細胞集団との間で、発現が異なる基質代謝産物を特定するための方法であって、
ａ．第１および第２の細胞集団に、核磁気共鳴（ＮＭＲ）安定同位体で標識された基質を任意に投入するステップと、
ｂ．基質代謝産物への前記基質の代謝分解を可能にするのに十分な時間にわたって、ステップ（ａ）の前記第１および前記第２の細胞集団を培養するステップと、
ｃ．ステップ（ｂ）の前記第１および前記第２の細胞集団から前記基質代謝産物を採取して、前記第１および前記第２の細胞集団の各々から基質代謝産物のサンプルを得るステップと、
ｄ．前記第１および前記第２の細胞集団の各々についてステップ（ｃ）の前記サンプルに対して多次元ＮＭＲを実行して、前記第１の細胞集団および前記第２の細胞集団の代謝された基質の共鳴スペクトルを求めるステップとを備え、前記共鳴スペクトルは、前記基質の代謝産物を表わし、前記方法はさらに、
ｅ．前記第１の細胞集団の前記共鳴スペクトルと前記第２の細胞集団の前記共鳴スペクトルとを比較して、どの共鳴が発現が異なっているかを判断するステップを備え、発現が異なる共鳴は、発現が異なる代謝産物を表わす共鳴特性をもたらす、方法。
【請求項１５】
前記多次元ＮＭＲは、スペクトル幅折返し、ランダム位相サンプリング、不均一サンプリング、およびダイナミックレンジデータ再構築の強化のためのデータ拡張の技術のうちのいずれか１つを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記多次元ＮＭＲは、スペクトル幅折返し、ランダム位相サンプリング、不均一サンプリング、およびダイナミックレンジデータ再構築の強化のためのデータ拡張の技術のうちのいずれか２つを任意の組合せで含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記多次元ＮＭＲは、スペクトル幅折返し、ランダム位相サンプリング、不均一サンプリング、およびダイナミックレンジデータ再構築の強化のためのデータ拡張の技術のうちのいずれか３つを任意の組合せで含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記多次元ＮＭＲは、スペクトル幅折返し、ランダム位相サンプリング、不均一サンプリング、およびダイナミックレンジデータ再構築の強化のためのデータ拡張の技術のうちの４つ全てを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記基質は、安定同位体で標識され、前記多次元ＮＭＲは、スペクトル幅折返し、ランダム位相サンプリング、不均一サンプリング、およびダイナミックレンジデータ再構築の強化のためのデータ拡張の技術のうちのいずれか２つを任意の組合せで含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記基質は、安定同位体で標識され、前記多次元ＮＭＲは、不均一サンプリング、およびダイナミックレンジデータ再構築の強化のためのデータ拡張を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記基質は、安定同位体で標識され、前記多次元ＮＭＲは、ランダム位相サンプリング、不均一サンプリング、およびダイナミックレンジデータ再構築の強化のためのデータ拡張を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記基質は、安定同位体で標識され、前記多次元ＮＭＲは、スペクトル幅折返し、ランダム位相サンプリング、不均一サンプリング、およびダイナミックレンジデータ再構築の強化のためのデータ拡張の技術のうちの４つ全てを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
前記サンプルに存在する前記基質代謝産物は、前記サンプル内の他の分子からは精製されない、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
各細胞集団内の基質濃度は、前記細胞に前記ＮＭＲ安定同位体で標識された基質を投入する前に、ある時間にわたって下げられる、請求項１４から２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記標識基質の前記代謝産物の共鳴は、特注のＮＭＲ断熱パルスプログラム、特注の取得技術、ならびに特注のＮＭＲ分析およびフィルタリングプログラムのうちのいずれか１つ以上を用いて求められる、請求項１４から２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
各細胞集団内の細胞の数は、２×１０６個未満である、請求項１４から２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１の細胞集団および第２の細胞集団は、一次細胞集団である、請求項１４から２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１の細胞集団および第２の細胞集団の各々における細胞集団は、異種の細胞集団または同種の細胞集団である、請求項１４から２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
ステップ（ｅ）の前記共鳴特性と既知の共鳴特性のデータベースとを比較して、前記共鳴特性が表わす分子構造を求め、それによって、前記第１の細胞集団と前記第２の細胞集団との間で発現が異なる前記基質代謝産物を求めるステップをさらに備える、請求項１４から２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記基質代謝産物の生成に関与する生合成経路を特定し、前記代謝産物の発現差異を調節することによって前記細胞の表現型を調節することに向けられ得る前記経路のタンパク質／酵素を特定するステップをさらに備える、請求項１４から２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１の細胞集団および前記第２の細胞集団は、同系の集団である、請求項１４から２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記第１の細胞集団および前記第２の細胞集団は、異なる表現型を有する、請求項１４から２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１の細胞集団は、対照細胞集団であり、前記第２の細胞集団は、テスト化合物または薬剤と接触させられた、請求項１４から２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記方法は、特定の細胞種類において過剰活性または過少活性の代謝経路を特定するために用いられる、請求項１４から２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記方法は、前記第２の細胞集団内の遺伝子を抑制または過剰発現させるステップをさらに備え、前記方法は、細胞内の遺伝子の過剰発現または抑制の代謝結果を特定するために用いられる、請求項１４から２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
被験者の癌を治療するための方法であって、Ｎ−アシルノイラミン酸シチジリルトランスフェラーゼ（ＣＭＡＳ）の阻害剤、またはＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼ（ＮＡＮＳ）の阻害剤、またはＮ−アセチルノイラミン酸の発現を減少させる分子を、それを必要とする被験者に投与するステップを備える、方法。
【請求項３７】
前記阻害剤は、小分子、リボ核酸、デオキシリボ核酸、タンパク質、ペプチド、および抗体からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記阻害剤は、酵素である、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたＲ２１  ＡＩ０８７４３１のもとで政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
発明の分野
本発明は、ＮＭＲベースのスクリーニングプラットフォームに関する。
【０００３】
発明の背景
細胞の代謝出力は、当該細胞種類を規定する機能的ゲノムネットワーク、トランスクリプトミクスネットワークおよびプロテオミクスネットワークの合計である。メタボロミクスとは、メタボロームにおける代謝産物レベルおよび刺激の結果としての経時的なそれらの変化を包括的かつ同時的に体系的に求めることである。他の分野も例えば所与の遺伝子のコピー数、ｍＲＮＡまたはタンパク質に関する情報を提供し得るが、代謝産物に関する化学的プロセスのこの研究は、全ての異常な遺伝子、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を下流で合計する。この「代謝フィンガープリント」は、特定の細胞種類における全ての機能的または非機能的経路のスナップショットを表わす。
【０００４】
細胞代謝産物を定量化するために、質量分析法、クロマトグラフィおよびＮＭＲ分光法を含むいくつかの分析方法が用いられてきた。質量分析法およびクロマトグラフィは両方とも、必要なサンプル量が少なく、ハイスループット分析に容易に適合可能である。しかし、これらの方法は両方とも、通常、数回とまではいかないまでも少なくとも１回の精製ステップを必要とする。さらに、ほとんどの場合、調査対象の代謝産物は、演繹的に予め選択されなければならない。非標的質量分析アプローチは、可能であるが、数ラウンドの精製およびさらなる特定方法を必要とする。また、ヌクレオチド類似体および脂質を含む代謝産物は全てがイオン化しやすいわけではなく、そのため質量分析法によって全てを検出できるとは限らない。さらに、質量分析法によって生じるフラグメンテーションパターンは、同等の質量を有するが異なる構造を有する糖類などの分子同士を区別することには必ずしも適しておらず、したがって分析が制限されることになる。
【発明の概要】
【０００５】
高速で偏りのない超高分解能の定量的ＮＭＲスクリーニングプラットフォームについて本明細書で説明する。当該ＮＭＲスクリーニングプラットフォームは、所与の細胞サンプルの全ての既知の代謝産物の共鳴を分類して単純な統計分析のための比較に用いる特注の「ＮＭＲ代謝産物アレイ」を生成するために、基質の安定同位体標識法、スペクトル幅折返し、ランダム位相サンプリング、不均一サンプリング、およびダイナミックレンジデータ再構築の強化のためのデータ拡張の技術のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ全てを任意の組合せで利用する。これらの技術を全て組合わせて強固で効率的でハイスループットなＮＭＲ代謝産物スクリーニングプロトコルを提供したのは、これが初めてである。ステップを組合わせることにより、水溶性の代謝産物および脂質ベースの代謝産物の両方の代謝産物の広範囲で偏りのない超高分解能が可能になる。また、本明細書に記載されている新規の「ＮＭＲ代謝産物アレイ」プログラムは、大規模で複雑なＮＭＲデータセットを簡単に分析するための新たな方法を提供する。新たなプラットフォームにより、発現が異なる代謝産物の高速な特定、特定の代謝産物の定量化と、所与の前駆体の代謝フラックスを分析できる能力とが両方とも可能になる。
【０００６】
この新たな方法により、比較的少ない細胞、例えば約２００万〜２０００万個の細胞内の特定の分子の代謝分解を具体的に辿ることができる。当該方法は、細胞に（例えば１３Ｃまたは１５Ｎまたは３１Ｐで標識された）標識前駆体基質を予め投入するステップと、多次元ＮＭＲを使用するステップとを含む。当該方法では、分析の前に対象の個々の代謝産物を精製する必要がなく、さまざまな特性を有する細胞において異なった形で生成される代謝産物の広範囲で偏りのない特定が可能である。
【０００７】
正常状態の細胞および疾患状態の細胞において発現が異なる代謝産物を特定することは、クリニックでは強力なツールであり得る。表現型の異なる細胞からの代謝産物の発現差異をモニタリングするための新たな方法は、表現型を調節するために用いられ得る治療標的の特定に特に役立つ。これは、代謝産物の生合成経路または代謝産物自体に存在する標的を含む。さらに、発現が異なる代謝産物の特定は、正常状態の細胞と疾患状態の細胞とを区別するために使用可能である。したがって、それらは、関連付けられる表現型のバイオマーカの役割を果たす可能性を有し、そのため、本明細書に記載されている方法が、診断マーカ、例えば疾患の診断のためのマーカの特定に役立つことになる。
【０００８】
例えば、本明細書に記載されているのは、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）を乳癌腫瘍始原細胞の新規のバイオマーカとして特定し、その発現をモニタリングすることが乳癌の診断および検出に役立ち得るものであった、ということである。また、ＮＡＮＡ生合成における酵素であるＣＭＡＳのタンパク質レベルは、乳房腫瘍始原細胞において劇的に過剰発現することが分かった。この研究以前は、腫瘍の発生および転移におけるＣＭＡＳの役割は調査されていなかった。本明細書では、ＣＭＡＳの発現が腫瘍の形成および移動に極めて重要であり、ＣＭＡＳが乳癌の新規の正真正銘の標的であることを証明する。
【０００９】
この方法論を個々の患者の細胞分析に適用することにより、患者ケアの「個別化医療」アプローチのための根拠も提供されることになる。
【００１０】
したがって、本開示は、細胞集団、例えば一次細胞集団、組織細胞集団または培養細胞（例えば不死化細胞）内の所与の基質前駆体の代謝をモニタリングするための方法について記載している。本明細書に記載されている方法を用いて、異なる表現型を有する２つ以上の細胞集団間で発現が異なる代謝産物を特定することについて記載されている。また、潜在的な治療標的および診断マーカを特定するための方法についても記載されている。
【００１１】
概して、第１の局面において、本開示は、サンプルにおける所与の種類の細胞内の基質の代謝をモニタリングする新たな方法を特徴としている。上記の新たな方法は、（ａ）基質代謝産物への基質の代謝分解を可能にするのに十分な時間にわたって、上記基質を用いて第１のサンプルの所与の種類の細胞を培養するステップを含み、上記基質の少なくとも一部は、核磁気共鳴（nuclear magnetic resonance：ＮＭＲ）安定同位体で任意に標識され、上記方法はさらに、（ｂ）ステップ（ａ）の上記細胞から上記基質代謝産物を採取して、基質代謝産物の第２のサンプルを得るステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）の上記第２のサンプルに対して多次元ＮＭＲを実行して、代謝された基質の共鳴スペクトルを求めるステップとを含み、上記共鳴スペクトルは、上記基質の代謝産物を表わし、上記多次元ＮＭＲは、スペクトル幅折返し、ランダム位相サンプリング、不均一サンプリング、およびダイナミックレンジデータ再構築の強化のためのデータ拡張の技術のうちのいずれか１つを含む。
【００１２】
別の局面において、本開示は、第１の細胞集団と第２の細胞集団との間で、発現が異なる基質代謝産物を特定するための方法を特徴としている。これらの方法は、（ａ）第１および第２の細胞集団に、核磁気共鳴（ＮＭＲ）安定同位体で標識された基質を任意に投入するステップと、（ｂ）基質代謝産物への上記基質の代謝分解を可能にするのに十分な時間にわたって、ステップ（ａ）の上記第１および上記第２の細胞集団を培養するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）の上記第１および上記第２の細胞集団から上記基質代謝産物を採取して、上記第１および上記第２の細胞集団の各々から基質代謝産物のサンプルを得るステップと、（ｄ）上記第１および上記第２の細胞集団の各々についてステップ（ｃ）の上記サンプルに対して多次元ＮＭＲを実行して、上記第１の細胞集団および上記第２の細胞集団の代謝された基質の共鳴スペクトルを求めるステップとを含み、上記共鳴スペクトルは、上記基質の代謝産物を表わし、上記方法はさらに、（ｅ）上記第１の細胞集団の上記共鳴スペクトルと上記第２の細胞集団の上記共鳴スペクトルとを比較して、どの共鳴が発現が異なっているかを判断するステップを含み、発現が異なる共鳴は、発現が異なる代謝産物を表わす共鳴特性をもたらす。
【００１３】
これらの方法のうちのいずれかにおいて、上記多次元ＮＭＲは、スペクトル幅折返し、ランダム位相サンプリング、不均一サンプリング、およびダイナミックレンジデータ再構築の強化のためのデータ拡張の技術のうちのいずれか２つ、３つまたは４つ全てを任意の組合せで含み得る。これらの方法のうちのいずれかにおいて、上記基質は、ＮＭＲ安定同位体で標識され得て、上記多次元ＮＭＲは、スペクトル幅折返し、ランダム位相サンプリング、不均一サンプリング、およびダイナミックレンジデータ再構築の強化のためのデータ拡張の技術のうちのいずれか２つ、３つまたは４つ全てを任意の組合せで含み得る。
【００１４】
これらの方法のいくつかの実現例において、上記サンプルに存在する上記基質代謝産物は、上記サンプル内の他の分子からは精製されない。いくつかの実現例において、細胞集団内の基質濃度は、上記細胞にＮＭＲで標識された基質を投入する前に、ある時間にわたって下げられ、標識基質の代謝産物の共鳴は、上記基質に合わせてカスタマイズされたＮＭＲパルスプログラムまたはフィルタリング技術またはそれら両方を用いて求められる。細胞集団内の細胞の数は、２×１０６個未満であり得て、細胞集団は、一次細胞集団であり得る。
【００１５】
これらの方法のうちのいずれかは、ステップ（ｅ）の上記共鳴特性と既知の共鳴特性のデータベースとを比較して、上記共鳴特性が表わす分子構造を求め、それによって、上記第１の細胞集団と上記第２の細胞集団との間で発現が異なる上記基質代謝産物を求めるステップをさらに含み得る。
【００１６】
特定の実現例において、上記方法は、上記基質代謝産物の生成に関与する生合成経路を特定し、上記代謝産物の発現差異を調節することによって上記細胞の表現型を調節することに向けられ得る上記経路のタンパク質／酵素を特定するステップをさらに含み得る。いくつかの実施の形態において、上記第１の細胞集団および上記第２の細胞集団は、同系の集団であり、および／または、上記第１の細胞集団および上記第２の細胞集団は、異なる表現型を有する。いくつかの実現例において、上記第１の細胞集団は、対照細胞集団であり、上記第２の細胞集団は、テスト化合物または薬剤と接触させられた。上記方法は、特定の細胞種類において過剰活性または過少活性の代謝経路を特定するために用いられ得る。上記方法は、上記第２の細胞集団内の遺伝子を抑制または過剰発現させるステップをさらに含み得て、上記方法は、細胞内の遺伝子の過剰発現または抑制の代謝結果を特定するために用いられる。
【００１７】
別の局面において、本開示は、被験者の癌を治療するための方法を特徴としている。上記方法は、本明細書に記載されている新たなプラットフォーム方法を用いて求められた結果に基づく。上記癌を治療する方法は、Ｎ−アシルノイラミン酸シチジリルトランスフェラーゼ（ＣＭＡＳ）の阻害剤、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ（ＮＡＮＳ）の阻害剤、またはＮ−アセチルノイラミン酸の発現を減少させる分子を、それを必要とする被験者に投与するステップを含む。例えば、上記阻害剤は、酵素であり得て、または、小分子、リボ核酸、デオキシリボ核酸、タンパク質、ペプチド、および抗体からなる群から選択され得る。
【００１８】
本明細書では、「同系の」という用語は、同一の組織種類（任意の組織、例えば同一の臓器、皮膚、膀胱、肝臓、心臓などの組織）および同一の有機体種類（例えば人間または動物または魚）から分離される同一の遺伝的背景の細胞（任意の細胞種類、例えば上皮細胞または脂肪細胞または幹細胞または筋細胞など）を指す。
【００１９】
本明細書では、「代謝産物」という用語は、代謝の中間生成物または最終生成物を指す。「代謝産物」は、酵素に対してエネルギ源効果、構造的効果、シグナル伝達効果、刺激効果および抑制効果を含む機能を有する。代謝産物はそれ自体、触媒活性も有し得る。代謝産物は、基質‐酵素反応の最終生成物であり得る。
【００２０】
本明細書では、「代謝前駆体」という用語は、化学反応に関与する化合物である。当該用語は、最終生成物が結果として生じる酵素反応の出発化合物または中間化合物である化合物を含むよう意図されている。
【００２１】
「基質」という用語は、酵素が作用した結果、基質を１つ以上の最終生成物に変化させる分子または化合物を指す。最終生成物は、酵素の活性部位から放出される。
【００２２】
「酵素」という用語は、その活性部位に基質を受入れて、当該基質を、活性部位から後に放出される１つ以上の最終生成物に変化させる分子を指す。
【００２３】
本明細書では、「一次細胞」または「一次組織」という用語は、健康な人、または後天性疾患もしくは遺伝性疾患を患う人の生体組織から直接採取され、インビトロで成長するように構築された細胞または組織を指す。
【００２４】
「転移」という用語は、癌が、原発腫瘍として最初に発生した場所から身体内の離れた場所に広がるプロセス、および、前立腺、結腸、肺、胸、骨および肝臓由来のものを含むがそれらに限定されない多数の原発腫瘍タイプから発生し得る「転移性腫瘍」とも呼ばれる新たに構築された腫瘍自体を指す。転移は、例えば原発腫瘍から排出された腫瘍細胞が血管内皮に付着して、周囲の組織に貫入し、成長して、原発腫瘍とは別の部位に独立した腫瘍を形成すると起こる。
【００２５】
「癌」という用語は、自律的成長の能力を有する細胞を指す。その例としては、急速に増殖する細胞の成長によって特徴付けられる異常な状態または状況を有する細胞が挙げられる。当該用語は、組織病理学的タイプまたは侵襲性の段階にかかわらず、癌性増殖、例えば腫瘍（例えば固形腫瘍）、発癌プロセス、転移組織、および悪性形質転換した細胞、組織または臓器を含むよう意図されている。また、呼吸器系、心臓血管系、腎臓系、生殖器系、血液系、神経系、肝臓系、胃腸系および内分泌系などのさまざまな臓器系の悪性腫瘍、ならびに、大半の結腸癌、腎細胞癌、前立腺癌および／または精巣腫瘍、非小細胞肺癌、小腸癌および食道癌などの悪性腫瘍を含む腺癌も含まれる。「自然発生する」癌は、癌細胞を被験者に移植することによって実験的に引起されたのではないいずれの癌も含み、例えば自発的に発生する癌、患者が発癌性物質にさらされることによって引起される癌、トランスジェニック癌遺伝子の挿入または腫瘍抑制遺伝子のノックアウトによって生じる癌、および感染症、例えばウイルス感染によって引起される癌を含む。「癌腫」という用語は、当該技術分野において認識されており、上皮組織または内分泌組織の悪性腫瘍を指す。また、当該用語は、癌性組織および肉腫組織からなる悪性腫瘍を含む癌肉腫も含む。「腺癌」とは、腺組織に由来する癌腫または腫瘍細胞が目に見える腺状構造を形成する癌腫を指す。
【００２６】
本明細書では、「治療する」または「治療」という用語は、本明細書に記載されている化合物のうちの１つ以上を、このような化合物で治療可能な病気を患う被験者および／またはこのような病気の症状を有する被験者および／またはこのような病気になりやすい体質を有する被験者に、治療効果をもたらすこと、例えば当該病気、その症状または体質を治すこと、緩和すること、変化させること、影響を及ぼすこと、改善すること、または減少させることを目的として、投与することを指す。
【００２７】
本明細書では、「有効量」または「有効な量」という用語は、治療を受ける患者に対して治療効果をもたらすために必要な活性化合物の量を指す。当業者によって認識されるように、有効用量は、治療される疾患の種類、投与ルート、賦形剤の使用、および他の治療法とともに使用できる可能性によって異なる。
【００２８】
治療化合物の投与量、毒性および治療効能は、例えばＬＤ５０（母集団のうちの５０％を死に至らせる用量）およびＥＤ５０（母集団のうちの５０％において治療効果のある用量）を決定するための細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順によって求められることができる。毒性と治療効果との用量比率は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比率で表わすことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物が用いられてもよいが、非感染細胞に対する潜在的損傷を最小限に抑えることによって副作用を減少させる目的でこのような化合物を罹患組織の部位に向ける送達システムを設計するに当たって注意を払う必要がある。
【００２９】
特段の規定のない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本発明を実施または試験する上で、本明細書に記載されている方法および材料と類似または等価の方法および材料を用いてもよいが、好適な方法および材料について以下に記載する。本明細書において言及されている出版物、特許出願、特許および他の参考文献は全て、全文が引用によって援用される。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先する。また、材料、方法および実施例は、例示的なものにすぎず、限定的であるよう意図したものではない。
【００３０】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本明細書に記載されているＮＭＲベースの代謝産物スクリーニングプラットフォームの主要なステップを要約したフローチャートである。
【図２Ａ】高速で偏りのない超高分解能代謝産物プロファイリングを可能にするＮＭＲ方法における取得および処理の各ステップを詳述し、スペクトル幅（spectral width：ｓｗ）折返し手法を示し、ここでは、ｓｗを２２０ｐｍから９０ｐｐｍに減少させることによって分解能が２．５倍に増加する。
【図２Ｂ】高速で偏りのない超高分解能代謝産物プロファイリングを可能にするＮＭＲ方法における取得および処理の各ステップを詳述し、スペクトル幅（ｓｗ）折返し手法を示し、ここでは、ｓｗを２２０ｐｍから９０ｐｐｍに減少させることによって分解能が２．５倍に増加する。
【図２Ｃ】高速で偏りのない超高分解能代謝産物プロファイリングを可能にするＮＭＲ方法における取得および処理の各ステップを詳述し、スペクトル幅（ｓｗ）折返し手法を示し、ここでは、ｓｗを２２０ｐｍから９０ｐｐｍに減少させることによって分解能が２．５倍に増加する。
【図２Ｄ】高速で偏りのない超高分解能代謝産物プロファイリングを可能にするＮＭＲ方法における取得および処理の各ステップを詳述し、スペクトル幅（ｓｗ）折返し手法を示し、ここでは、ｓｗを２２０ｐｍから９０ｐｐｍに減少させることによって分解能が２．５倍に増加する。
【図２Ｅ】高速で偏りのない超高分解能代謝産物プロファイリングを可能にするＮＭＲ方法における取得および処理の各ステップを詳述し、分解能の８倍の増加、または、分解能の４倍の増加および時間の４０％の短縮を可能にする不均一サンプリング（non-uniform sampling：ＮＵＳ）手法を要約する。
【図２Ｆ】高速で偏りのない超高分解能代謝産物プロファイリングを可能にするＮＭＲ方法における取得および処理の各ステップを詳述し、順方向最大エントロピ再構築を用いて処理されたＮＵＳ  １３Ｃ−１Ｈ  ＨＳＱＣスペクトル（左側）および分解能を２倍に増加させた再構築におけるデータ拡張ステップ後の同一のＮＵＳ  １３Ｃ−１Ｈ  ＨＳＱＣスペクトル（右側）を示す。
【図３Ａ】同一のｐ５３欠損マウスの肺腫瘍からの水溶性代謝産物の全代謝範囲を示す１３Ｃ−１Ｈ  ＨＳＱＣスペクトルである。
【図３Ｂ】同一のｐ５３欠損マウスの肺腫瘍からの脂質ベースの代謝産物の全代謝範囲を示す１３Ｃ−１Ｈ  ＨＳＱＣスペクトルである。
【図４】高速分析のためのＮＭＲアレイを作成するために用いられる特注のＮＭＲ分析プログラムを要約したフローチャートである。
【図５Ａ】２０００万個の非標識乳房腫瘍始原細胞からの水溶性代謝産物の１３Ｃ−１Ｈ  ＨＳＱＣ共鳴スペクトルの組である。
【図５Ｂ】２０００万個の１３Ｃ−グルタミン培養乳房腫瘍始原細胞からの水溶性代謝産物の１３Ｃ−１Ｈ  ＨＳＱＣ共鳴スペクトルの組である。
【図５Ｃ】２０００万個の１３Ｃ−グルコース培養乳房腫瘍始原細胞からの水溶性代謝産物の１３Ｃ−１Ｈ  ＨＳＱＣ共鳴スペクトルの組である。
【図６】本明細書に記載されているＮＭＲアレイで利用可能な情報を強調している。図５Ａ〜図５Ｃにおける非標識スペクトル、グルタミンスペクトルおよびグルコーススペクトルを用いて、全ての可能な共鳴代謝産物について代謝産物ＩＤを生成するようにマスタールックアップを作成し、これらをＸ軸に記載している。Ｙ軸は、各状態における各共鳴の相対強度を示し、特異なグルコース由来の代謝産物および特異なグルタミン由来の代謝産物を強調している。
【図７Ａ】乳房腫瘍始原ＢＰＬＥＲ細胞における水溶性グルコース由来の代謝産物の１３Ｃ−１Ｈ  ＨＳＱＣ共鳴スペクトルの代表例である。
【図７Ｂ】悪性が低い同系のＨＭＬＥＲ細胞における水溶性グルコース由来の代謝産物の１３Ｃ−１Ｈ  ＨＳＱＣ共鳴スペクトルの代表例である。
【図７Ｃ】全ての可能な代謝産物共鳴（Ｘ軸）の強度（Ｙ軸）が各細胞種類においてどのように変化するかを示す、ＢＰＬＥＲおよびＨＭＬＥＲ  １３Ｃ−１Ｈ  ＨＳＱＣ共鳴スペクトルについてのＮＭＲアレイを要約する。ＢＰＬＥＲ細胞およびＨＭＬＥＲ細胞は、同一の正常な乳房組織に由来し、２つの細胞種類、すなわち化学的に規定されたＷＩＴ媒質において成長するＢＰＥＣ（乳房一次上皮細胞）およびＭＥＧＭ媒質において成長するＨＭＥＣ（ヒト乳房上皮細胞）に成長した。ＢＰＥＣ細胞およびＨＭＥＣ細胞は、ｈＴＥＲＴ（Ｌ）、ＳＶ４０初期領域（Ｅ）およびＨ−ｒａｓ（Ｒ）で形質転換されて、ＢＰＬＥＲ細胞およびＨＭＬＥＲ細胞を発生させた。
【図７Ｄ】ＮＭＲアレイがＢＰＬＥＲ共鳴のみを有すると予測される領域におけるＢＰＬＥＲ（赤）およびＨＭＬＥＲ（青）１３Ｃ−１Ｈ  ＨＳＱＣスペクトルのオーバーレイの領域の拡大表示である。
【図８Ａ】ＢＰＬＥＲ  ＮＭＲアレイにおいて過剰発現した、発現が異なる代謝産物がＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）であることを立証するために用いられるさまざまな方法を要約し、純粋なＮＡＮＡの１３Ｃ−１Ｈ  ＨＳＱＣである。
【図８Ｂ】ＢＰＬＥＲ  ＮＭＲアレイにおいて過剰発現した、発現が異なる代謝産物がＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）であることを立証するために用いられるさまざまな方法を要約し、特注のＮＭＲ  ＨＣＮ（水素−炭素−窒素）実験の結果を示し、ＢＰＬＥＲ細胞が、ＮＡＮＡとの類似の結合性を備えた、発現が異なる共鳴を有することを確認する。
【図８Ｃ】ＢＰＬＥＲ  ＮＭＲアレイにおいて過剰発現した、発現が異なる代謝産物がＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）であることを立証するために用いられるさまざまな方法を要約し、報告される数字がＮＡＮＡピークの下の面積である液体クロマトグラフィ質量分析多重反応モニタリング（ＬＣ／ＭＳ  ＭＲＭ）を用いて、ＨＭＬＥＲ細胞（左側）およびＢＰＬＥＲ細胞（右側）を直接測定するＭ／Ｓ結果を示す。
【図９】ＨＭＬＥＲ細胞（上の列）およびＢＰＬＥＲ細胞（下の列）のそれぞれにおけるＮＡＮＡの発現を示す、ローダミンで標識されたコムギ胚芽凝集素（wheat germ agglutinin：ＷＧＡ）免疫蛍光顕微鏡法の顕微鏡画像の一連の表示である。ＷＧＡは、特にＮＡＮＡに結合する。
【図１０】グルコースをＮＡＮＡに変換するための酵素段階を示す概略図であり、ここでは、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ（ＮＡＮＳ）およびＮ−アシルノイラミン酸シチジリルトランスフェラーゼ（ＣＭＡＳ）が主要な酵素である。
【図１１】ＨＭＬＥＲ細胞およびＢＰＬＥＲ細胞の生存能力に関してｓｉＲＮＡを介してＣＭＡＳ、ＮＡＮＳおよびＰＬＫＩを下方制御することによる増殖に対する効果を示す棒グラフである。
【図１２Ａ】ＢＰＬＥＲ細胞およびＨＭＬＥＲ細胞の細胞移動に対するＮＡＮＡの効果の概要を示す一連の画像であり、ＮＡＮＳおよびＣＭＡＳが無い状態での細胞移動の抑制と、ＨＭＬＥＲ細胞およびＢＰＬＥＲ細胞におけるＮＡＮＡによる移動のレスキューとをそれぞれ示す一連の免疫組織化学画像である。
【図１２Ｂ】ＢＰＬＥＲ細胞およびＨＭＬＥＲ細胞の細胞移動に対するＮＡＮＡの効果の概要を示す一連の画像であり、ＮＡＮＳおよびＣＭＡＳが無い状態での細胞移動の抑制と、ＨＭＬＥＲ細胞およびＢＰＬＥＲ細胞におけるＮＡＮＡによる移動のレスキューとをそれぞれ示す一連の免疫組織化学画像である。
【図１２Ｃ】ＢＰＬＥＲ細胞およびＨＭＬＥＲ細胞の細胞移動に対するＮＡＮＡの効果の概要を示す一連の画像であり、ＮＡＮＳおよびＣＭＡＳが無い状態で移動する細胞の数およびＮＡＮＳの添加後のその後の移動を定量化する棒グラフである。
【図１３Ａ】ＨＭＬＥＲ細胞およびＢＰＬＥＲ細胞におけるＣＭＡＳおよびｃＭＹＣの定量的ＰＣＲ（ｍＲＮＡレベル）を示す棒グラフである。
【図１３Ｂ】ＨＭＬＥＲ細胞およびＢＰＬＥＲ細胞におけるＮＡＮＳおよびＣＭＡＳ発現のウエスタンブロット分析を示す棒グラフである。
【図１４Ａ】細胞移動に対するＣＭＡＳ発現の効果の免疫組織化学画像であり、ＣＭＡＳの過剰発現後のＨＭＬＥＲ細胞の移動の一連の免疫組織化学画像である。
【図１４Ｂ】細胞移動に対するＣＭＡＳ発現の効果の免疫組織化学画像であり、ＢＰＬＥＲ細胞および安定ＣＭＡＳノックダウンＢＰＬＥＲ細胞（ＢＰＬＥＲ−ｓｈＣＭＡＳ１）の一連の免疫組織化学画像である。
【図１５Ａ】インビボでの腫瘍の発生および転移に対するＣＭＡＳレベルの効果を判断するための手法を要約し、免疫化スキームを示す。
【図１５Ｂ】インビボでの腫瘍の発生および転移に対するＣＭＡＳレベルの効果を判断するための手法を要約し、５００，０００個のＢＰＬＥＲ細胞（左側）または５００，０００個のＢＰＬＥＲ−ｓｈＣＭＡＳ１細胞を注射されたＮＯＤ／ＳＣＩＮマウスにおける１日当たりの腫瘍体積成長を示す。
【図１６Ａ】ＣＭＡＳの酵素メカニズムである。
【図１６Ｂ】ＮＡＮＡの構造に基づくＣＭＡＳの合成基質ベースの阻害剤である。
【図１６Ｃ】合成フッ素−ＮＡＮＡ阻害剤による細胞移動の抑制を示す免疫組織化学分析である。
【図１６Ｄ】合成フッ素−ＮＡＮＡ阻害剤による細胞移動の抑制を示す免疫組織化学分析である。
【図１７Ａ】（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−４−グアニジノ−３−（プロプ（prop）−１−エン−２−イルアミノ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２，３−トリヒドロキシプロピル）−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−６−カルボン酸（ザナミビルであり、リレンザ（登録商標）として販売）の化学構造である。
【図１７Ｂ】対照群に対するリレンザ（登録商標）の効果の免疫組織化学分析を示す。これらの薬剤は両方とも、ノイラミニダーゼ阻害剤である。
【図１７Ｃ】エチル（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−アミノ−４−アセトアミド−３−（ペンタン−３−イルオキシ）−シクロヘキサ−１−エン−１−カルボン酸塩（オセルタミビルであり、タミフル（登録商標）として販売）の化学構造である。
【図１７Ｄ】ＢＰＬＥＲ細胞の移動に対するリレンザ（登録商標）の効果の免疫組織化学分析を示す。これらの薬剤は両方とも、ノイラミニダーゼ阻害剤である。
【図１８Ａ】ノイラミニダーゼが無い状態および有る状態でのＨＭＬＥＲ細胞およびＢＰＬＥＲ細胞におけるＮＡＮＡの発現を示す免疫蛍光顕微鏡画像である。
【図１８Ｂ】ノイラミニダーゼが有る状態および無い状態でのＨＭＬＥＲ細胞およびＢＰＬＥＲ細胞の移動の免疫組織化学画像である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
詳細な説明
本開示は、公知のＮＭＲデータ取得の多数の局面を上回る利点を提供し、新規のアプローチを利用して、高速で、偏りのない、広範囲の、定量的な超高分解能ＮＭＲデータ取得および特注のＮＭＲ分析を可能にする新規の方法について記載している。本開示は、特定の分子の代謝分解を特定、追従および特徴付けするため、ならびに、所与の細胞種類に必須の細胞メタボロミクスを分析するために使用可能な新たなＮＭＲスクリーニング方法について記載している。本明細書に記載されている方法は、公知のＮＭＲプロトコルがもたらす障害を回避する。すなわち、本明細書に記載されている方法は、データ取得を実行するために必要なサンプルサイズを縮小化し、分析対象の代謝産物の精製を不要にし、多次元ＮＭＲに必要な実験時間を短縮し、代謝産物の特定に必要な高分解能が得られる。当該方法が必要とする細胞は比較的少なく（２００万個〜２０００万個）、これにより、細胞培養物からでなく一次細胞および組織からの代謝産物を研究するために当該方法を用いることができる。また、開示されている方法は、分析の前に他の細胞代謝産物から対象の個々の代謝産物を精製する必要がない。さらに、当該新たな方法により、任意の細胞種類における所与の前駆体の特定の代謝運命を視覚化して、その結果、同様に本明細書に記載されている新規のデータ分析方法を利用してさまざまな種類の細胞において異なった形で生成される代謝産物を簡単に特定することができる。
【００３３】
新たなプラットフォーム方法のパワーおよび広がりを強調するために、本開示は、悪性が低い同質遺伝子系統のＨＭＬＥＲと比較して非常に侵攻性のトリプルネガティブ乳癌腫瘍始原ＢＰＬＥＲ細胞において発現が異なる代謝産物を特定することについて記載している。癌細胞がグルコース消費を糧にするということは、当該技術分野において広く知られている。本明細書では、グルコース代謝産物であるＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）が、乳癌腫瘍始原ＢＰＬＥＲ細胞において発現が異なる（すなわち発現が増加する）と特定された。また、代謝産物を生成する生合成経路も、代謝産物の合成に必要なタンパク質／酵素を経路内の候補標的として特定して、腫瘍の発生および転移能が増大した表現型を調節するために、特定されて用いられた。
【００３４】
また、主要な酵素であるＮＡＮＳおよびＣＭＡＳを生成する遺伝子を沈黙させるノックダウン実験の結果は、ＮＡＮＡを生成してそれをタンパク質に付着させるというこれらの酵素の正常な機能の低下が、ＢＰＬＥＲ細胞の増殖に対しては影響を及ぼさないが、それらの移動を大きく減少させることを実証した。一方、ＨＭＬＥＲ細胞において同一の酵素を強制的に過剰発現させることによって、それらの移動が増加した。ＢＰＬＥＲ細胞におけるＣＭＡＳの安定したノックダウンは、マウスにおける腫瘍形成を完全に防いだ。したがって、新たな方法を上手く用いて、腫瘍形成性にとって重要な代謝産物（例えばＮＡＮＡ）を特定し、ＮＡＮＡおよびＮＡＮＡの合成に関与するタンパク質が乳房腫瘍形成および腫瘍始原細胞の転移を減少させるための治療的介入の標的の役割を果たし得ることを実証した。また、ＮＡＮＳおよびＣＭＡＳは、インビトロおよびインビボでの腫瘍の発生および転移の抑制の標的として正当性が確認された。したがって、これらの酵素の小分子および他の阻害剤は、乳房腫瘍始原細胞を特に標的とするために使用可能な新たな候補治療薬である。さらに、発現が異なる代謝産物（例えばＮＡＮＡ）も、それらが関連付けられる表現型のバイオマーカの役割を果たし得て、そのため、本明細書に記載されている方法を新たな候補診断マーカの特定に用いることができる。
【００３５】
一般的方法
一般に、所与の種類の細胞内の所与の前駆体分子（すなわち基質）の代謝産物をモニタリングするための本明細書に記載の新たな方法は、（ａ）細胞集団に標識基質、例えば１３Ｃで標識された基質を任意に投入するステップと、（ｂ）基質代謝産物への基質の代謝分解を可能にするのに十分な時間（例えば、実験上の疑問点に応じて、一般に５分〜２４時間）にわたってステップ（ａ）の細胞を培養するステップと、（ｃ）細胞から基質代謝産物を採取して、基質代謝産物のサンプル、例えば基質代謝産物の水溶性サンプルおよび脂質ベースの代謝産物の有機サンプルを得るステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）のサンプルに対して多次元ＮＭＲを実行して、代謝された基質の共鳴スペクトルを求めるステップとを含み、共鳴は、基質の代謝産物の共鳴を表わす。多次元ＮＭＲをいかに実行するかということについて以下でさらに詳細に説明する。
【００３６】
これらの方法では、それらの基質を標識化するために、さまざまな基質およびさまざまなスピン−１/２安定核同位体が使用可能である。例えば、グルコース、グルタミン、脂肪酸、アミノ酸、ピルビン酸塩、薬剤化合物および他の分子が基質として使用可能であり、１３Ｃ、１５Ｎ、２９Ｓｉ、３１Ｐなどの安定同位体が基質を標識化するために使用可能である。癌細胞、筋細胞、脂肪細胞、内皮細胞、上皮細胞、神経細胞、心臓細胞および多くの他の細胞などのいかなる組織、一次細胞または培養細胞株も分析に使用可能である。一般に、癌細胞などの特定の疾患または病気に関連付けられる細胞および健康な被験者からの同一種類の細胞をテストして、示差代謝分析を行いたいと考えるであろう。また、単一遺伝子の突然変異を備えた細胞（すなわち変異細胞対野生型）、または薬剤で治療された細胞もしくは薬剤で治療されていない細胞、またはさまざまな時間にわたって前駆体を用いて培養された同一の細胞をテストするであろう。各サンプルの細胞集団は、同種の細胞集団であり得る。代替的な実施の形態において、各サンプルの細胞集団は、（例えば組織サンプルに由来する）異種の細胞集団であり得る。本明細書に記載されている方法ではいかなる数の細胞も使用可能であるが、さまざまな実施の形態において、各細胞集団内の細胞の数は、１×１０８個未満、８×１０７個未満、７×１０７個未満、６×１０７個未満、５×１０７個未満、２．５×１０７個未満、または２．０×１０７個未満であり得て、細胞の数は、およそ１×１０６個〜１×１０８個、または１×１０６個〜５×１０７個、または１×１０６個〜２．５×１０７個、または１×１０６個〜２．０×１０７個であり得る。
【００３７】
細胞に投入するための方法は当業者に周知であり、例えば標識基質は、ある時間（例えば５分〜２４時間）にわたって細胞培地に添加されることができ、またはトランスフェクション（例えばリポソームまたはリン酸カルシウム）、形質導入（例えば標識基質のウイルス送達）もしくは注入（例えば腫瘍への直接注射）によって投入されてもよい。一実施の形態において、例えば経口で、局所的に、非経口的に、または静脈注射によって、標識前駆体が被験者に投与される。いくつかの実施の形態において、標識基質は動物飼料に添加される。
【００３８】
さまざまな実施の形態において、標識基質を含む培地を添加する前に、いかなる形態の基質も欠いた細胞培地、例えば非標識の形態または標識された形態の基質を欠いた細胞培地を用いて、細胞が培養される。細胞は、数分から数時間にわたってこの媒質の中で培養され得て、細胞は実質的に基質が欠乏している状態である。これは、その後の分析の際にバックグラウンドを減少させることに役立つ。次いで、細胞は、標識基質のみを含む細胞培地を用いて（例えば５分〜２４時間）培養される。任意の基質濃度が使用可能である。さまざまな実施の形態において、濃度は、１ｎｇ／ｍｌ〜＞１ｍｇ／ｍｌである。当業者は、さまざまな濃度範囲をテストすることによって使用すべき最良の濃度を容易に決定することができる。培養後、細胞は、代謝産物を分離するために、短時間の洗浄が行われて直ちに採取される。代謝産物を採取するために、有機層に存在する代謝産物の水溶性サンプルまたは非水溶性サンプルを得ることを目的として、単純なクロロホルム抽出が実行されてもよい。さらなる精製は不要である。
【００３９】
いくつかの核磁気共鳴（ＮＭＲ）技術、好ましくは多次元ＮＭＲが、本発明の方法において使用可能である。例えば、異核単一量子相関（heteronuclear single quantum correlation：ＨＳＱＣ）分光法、ＨＳＱＣの変形体、および他の多次元ＮＭＲ技術が使用可能である。多次元ＮＭＲ（例えば２次元ＮＭＲおよび／または１３Ｃ−１Ｈ  ＨＳＱＣ  ＮＭＲ）を実行するための方法は、当業者に周知である。
【００４０】
標識基質の代謝産物の共鳴スペクトルは、基質に合わせてカスタマイズ可能なＮＭＲパルスプログラムを用いて求められることができる。一般に、ＮＭＲは、均質な外部の静磁場を用いてＮＭＲサンプルを分極させる。この一次場は、通常、「Ｂ０」磁場と呼ばれ、ＮＭＲシステムのための基準軸を規定する。ＮＭＲサンプルは、ある時間（例えば数分）にわたってサンプルをＢ０磁場に置き、サンプルが熱平衡状態に達することを可能にすることによって、Ｂ０磁場の方向に磁化される。また、一次Ｂ０磁場は、通常、サンプルにおけるスピン−１/２核種の共鳴周波数を規定する。例えば、一般に、一次場が強くなると、核スピンの共鳴周波数が増加する。核スピンは、それらのそれぞれの共鳴周波数においてＢ０磁場の周りを「歳差運動する」。大半のＮＭＲシステムでは、核スピンは、無線周波数（radio frequency：ｒｆ）範囲の共鳴周波数を有する。
【００４１】
ＮＭＲ実験では、ＮＭＲサンプルにおける核スピンは、核スピンの共鳴周波数における時変磁場を印加することによって操作される。いくつかの例において（例えば低フリップ角パルスの場合）、高強度無線周波数（ＲＦ）パルスは、核スピンを高速かつ精密に制御する。高強度ＲＦパルスは、パルス時間が短く、パルス中に生じるデコヒーレンスの量を減少させるという利点を有している。いくつかの例において（例えば高フリップ角パルスの場合）、高強度ＲＦパルスは、例えば対象の周波数範囲にわたってパワー出力が不均一であるために、ＲＦ磁場における空間的異質性のために、または他の考慮すべき事項のために、精度が低くなる。
【００４２】
いくつかの実現例において、断熱パルスは、核スピンをより精密に制御することができる。断熱パルスは、通常、強度がより低く、より長いパルス時間を必要とする。いくつかの例において、断熱パルスは、より大きなフリップ角パルス（例えば１８０度のフリップ角）に用いられて、対象の周波数範囲全体にわたってより均一なフリップ角を提供する。断熱パルスは、通常、特定のフリップ角、特定の周波数範囲などについてパラメータ化され得る成形パルス（時変パワープロファイルを有することを意味する）として実現される。
【００４３】
さまざまな実施の形態において、新たなＮＭＲ方法は、分析速度および／または分解能またはそれら両方を上昇させるために、以下の方法および技術、すなわち（ｉ）安定同位体標識法、（ｉｉ）スペクトル幅の折返しおよびピークのエイリアシング、（ｉｉｉ）ランダム位相サンプリング、（ｉｖ）不均一サンプリング、および（ｖ）データ拡張、のうちのいずれか１つ以上を使用することを含む。いくつかの実施の形態において、当該方法は、これらの方法のうちの少なくとも２つまたは３つを任意の組合せで含む。いくつかの実施の形態において、当該方法は、５つ全ての方法を含む。以下の表１では、ＮＭＲ取得およびデータ分解能に対する各ステップの効果が要約されている。これらのステップについて以下でより詳細に説明する。
【００４４】
【表１】
2015509584.tif 000003
【００４５】
安定同位体標識法
従来の２次元ＮＭＲ代謝産物プロファイリングは、１．１％で存在する１３Ｃの天然存在度に依拠する。したがって、いかなる信号も観察するためには、大量のサンプルが必要である（平均して＋２億個の細胞）。これにより、検出が培養細胞株に限定され、最も豊富な代謝産物のみが検出されることになる。必要な材料の量を減少させて、より広い濃度範囲で代謝産物を見るために、サンプル（例えば細胞、組織または腫瘍）には、１３Ｃで標識された前駆体（グルコース、グルタミン、ピルビン酸塩およびアミノ酸が用いられたが、他の基質および他の同位体も可能である）が直接補充された。理論的には、これはサンプル負担を〜９９％減少させるはずである。例えば１ｍＭの代謝産物が、１３Ｃの天然存在度を用いて検出されるために２億個の細胞を必要とする場合、標識を用いて同一の強度を見るのに必要な細胞はわずか２００万個であろう。このステップを我々の方法に含むことにより、サンプル要件がいくつかの質量分析（mass spectrometry：Ｍ／Ｓ）アプローチについての要件と同様の要件に減少することになる。非標的Ｍ／Ｓでは、必要な細胞が少なくとも１００万個であるが、その後に数ラウンドのクロマトグラフィ精製および検出が行われる。我々の方法は、必要な細胞数が少なく、精製が不要である。
【００４６】
スペクトル幅の折返しおよびピークのエイリアシング
原子が強磁場（Ｂ０）に置かれると、その分子内の電子が、印加された磁場の方向に歳差運動する。この歳差運動は、原子核に小さな磁場を作り出す。したがって、原子核における磁場（Ｂ）は、一般に、τだけ外部磁場（Ｂ０）よりも小さい。
【００４７】
【数１】
2015509584.tif 000004
【００４８】
分子内の各々の原子核の周りの電子密度は、分子内の原子核の種類および結合によって異なる。逆磁場、したがって各々の原子核における有効磁場は異なることになる。パルスＮＭＲ分光法では、これらの相違は、測定可能な電流をコイルに引起すように核磁化を振動させる無線周波数パルスを印加することによって、測定可能である。「自由誘導減衰」（free induction decay：ＦＩＤ）として知られているこの信号は、時間に対する電流としてプロットされる。離散フーリエ変換を適用することによって、ＦＩＤは、周波数領域に変換され得て、各々の観察可能な原子核の共鳴周波数は、以下の数式によって化学シフト（δ）に変換され得る。
【００４９】
【数２】
2015509584.tif 000005
【００５０】
式中、ｎは原子核の共鳴周波数であり、ｎＲＥＦは規格の共鳴周波数である。
化学シフトは、原子核の周りの化学的環境の非常に精密な測定基準である。Ｍ／Ｓおよびクロマトグラフィとは異なって、ＮＭＲは、同一の質量を有するが異なる化学結合性を有する分子同士を区別することができる唯一の方法のうちの１つである。しかし、この情報を利用するためには、超高分解能分光法が必要である。
【００５１】
ＮＭＲでは、デジタル分解能は、以下のように、掃引幅（sweep width：ｓｗ）およびデータポイントの総数（total number of data points：ＴＤ）によって求められる。
【００５２】
【数３】
2015509584.tif 000006
【００５３】
ＳＷは、ＮＭＲ信号が検出される周波数の範囲である。代謝産物混合物は多様な分子を含んでおり、全ての潜在的な炭素化学シフトをカバーするために必要なスペクトル幅は、−２２０ｐｐｍにわたる。大きな１３Ｃ−化学シフトウィンドウは、最大分解能を有し、かつ、全ての起こり得る化学シフトを包含するのに十分に広いｓｗを有するためには、非常に多くの数のデータポイントが必要になるであろうというジレンマを引起す。実際問題として、これは時間が法外にかかる。
【００５４】
これを回避するために、我々の方法はｓｗの折返しを含み得る。ｓｗは、より小さな範囲に意図的に設定され、この範囲外でいくつかのピークが生じれば、それらはエイリアス化学シフトにおいて「折返された」状態で現れることになる。折返されたスペクトルは、好適なデータ処理技術によって広げることができる。例えば、共鳴周波数は、周波数スペクトルを拡大して、予め規定された量だけエイリアス周波数をそれらの実際の位置にシフトさせることによって、デエイリアスされ得る。いくつかの例では、データ取得パラメータは、折返されたスペクトルピークと折返されていないスペクトルピークとの間のいかなる重複も減少させるまたは最小化するようにスペクトル折返しウィンドウを規定する。したがって、いくつかの例では、折返されたスペクトルピークは、周波数スペクトル内の他のデータに影響を及ぼすことなくデエイリアスされ得る。スペクトル折返しは、可能な最大分解能を達成するために必要なポイントの総数を減少させる。我々の特注の折返し手法およびデエイリアシングプログラムは、〜４４Ｈｚ／ポイント分離による超高分解能スペクトルを可能にする。
【００５５】
ランダム位相サンプリング
上記のように、ＦＩＤ信号を周波数データに変換するには、フーリエ変換が必要である。しかし、原子核がＺ軸の周りを＋ｘ磁化ベクトルで回転する場合、フーリエ変換は、＋ｖおよび−ｖの両方においてピークを生じさせることになる。これは、フーリエ変換がベクトルの＋ｖ回転と−ｖ回転とを区別することができないからである。周波数の符号を区別するための最も一般的な方法では、２つの異なる受信側の位相（例えば０°および９０°）における信号をサンプリングする必要がある。多次元ＮＭＲの場合、これは実験時間を各次元について２倍に増加させる。我々の分析の速度を上昇させるために、ランダム位相サンプリング（random phase sampling：ＲＰＳ）を利用した。ランダム位相サンプリングでは、単一の位相を用いて各ポイントを検出するが、当該位相は信号内のさまざまなポイントについてランダムに交互にされる。これにより、周波数の位相を分解するが取得時間を半分に削減することができる。
【００５６】
不均一サンプリングおよびデータ拡張
二次元ＮＭＲ技術は、時間領域、すなわち直接的領域および間接的領域においてデータの二次元を生成する。直接的領域データは、実験を行ってＮＭＲ信号（例えばＦＩＤ信号、エコー信号またはストロボ信号）を収集することによって生成される。言い換えれば、直接的領域は、ＮＭＲ実験の時間領域である。間接的領域データは、ＮＭＲ実験の時間パラメータを体系的に変化させ（例えば遅延時間をインクリメントし）、当該パラメータの各値についてＮＭＲ実験を行って、全ての実験からのＮＭＲ信号を組合わせることによって生成される。言い換えれば、間接的領域は、体系的に変化させられるパラメータの時間領域である。
【００５７】
いくつかの例では、不均一サンプリングは、本明細書に記載されている方法のための多次元ＮＭＲにおいて使用可能である。例えば、不均一サンプリングは、特定のスペクトル範囲および周波数分解能を得るために必要なＮＭＲ実験の数を減少させるために、間接的領域において使用可能である。
【００５８】
不均一サンプリング（ＮＵＳ）は、間接的領域時間パラメータを体系的かつ不均一にインクリメントすることによって達成可能である。特に、各々の連続的なＮＭＲ実験について同じ量だけ時間パラメータをインクリメントする代わりに、時間パラメータは、１つ以上の要因によって異なる量だけインクリメントされ得る。例えば、時間遅延パラメータは、実験ごとに変化する（例えば増加したり減少したりする）量だけインクリメントされてもよい。ポアソン分布または別の非線形分布に従って時間遅延を変化させることにより、まばらにサンプリングされた間接的領域データが得られる。「まばらな」データセット内の欠落しているポイントは、再構築方法を用いて計算可能である。順方向最大エントロピ再構築技術は、測定された時間領域データポイントを保存して、欠落しているデータポイントを反復プロセスによって推定し得る。反復プロセスは、まばらな時間領域データセットの離散フーリエ変換、スペクトルエントロピの計算、多次元エントロピ勾配の決定、および共役勾配アプローチによる欠落している時間領域データポイントの新たな値の計算を含み得る。この手順は測定されたデータポイントを変化させないので、高い忠実性で信号強度を再現することができ、ダイナミックレンジの問題を回避することができる。いくつかの例において、我々の方法は、適切なサンプリングスケジュールで、ＮＵＳが弱いピークを検出することができる能力を向上させたことを示す。これは、豊富な代謝産物（ミリモル濃度）と稀な代謝産物（ナノモル濃度）との間に大きなダイナミックレンジがある代謝産物分析にとって極めて重要である。
【００５９】
再構築中に、「データ拡張」を利用して共鳴の分解能をさらに上昇させることが可能である。この方法では、再構築中に、間接次元内のポイントの総数が２倍になる。一実施の形態において、（ＮＵＳでサンプリングされたポイントからなる）時間領域の前半は、標準的な順方向最大エントロピプロトコルに従って解かれ、いかなるサンプリングされたポイントも含まないデータの後半は、反復ソフト閾値法を用いて完全に構築される。いくつかの例では、これは、取得時間に影響を及ぼすことなく分解能を２倍に上昇させることができる。
【００６０】
バックグラウンドを減少させるための任意の強調
一般に、本明細書に記載されている方法を用いる場合、サンプルに存在する基質代謝産物をサンプル内の他の分子から（例えばクロマトグラフィカラム（例えば、シデルマン等、トルフェナム酸薬剤の第二相代謝産物の精製および１Ｈ  ＮＭＲ分光学的同定、Metab Dispos、１９９７年６月１日、２５：７２５−７３１）または当業者に周知の他の手段によって）精製または分離する必要がない。したがって、一般的な実施の形態では、ＮＭＲの前に当該方法において行われる精製のみが、水溶性サンプルまたは非水溶性サンプルへの代謝産物の分離である。
【００６１】
いくつかの実施の形態において、細胞内の非標識基質の濃度は、標識基質を添加する前に、ある時間（例えば１０分〜４時間）にわたって下げられ得る。この技術は、バックグラウンド信号を減少させることに役立ち得る。適切な時間枠は、標識基質を投入されない対照細胞と比較して条件範囲をテストしてバックグラウンドをモニタリングすることによって、決定可能である。
【００６２】
自動ＮＭＲ分析
ＮＭＲ代謝産物分析は、冗長で複雑である。これらの問題を回避するために、特注の「ＮＭＲ代謝産物アレイ」プログラムを作成して、プロセスを自動化した。図４に示されるように、まず、スパイクイン制御を用いて、スペクトルを自動的に位相化し、整列させ、正規化する。例えば、４，４−ジメチル−４−シラペンタン−１−スルホン酸（ＤＳＳ）、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）、プロピオン酸トリメチルシリル（ＴＳＰ）、４，４−ジメチル−４−シラペンタン−１−トリフルオロ酢酸アンモニウム（ＤＳＡ）または他のＮＭＲ標準基準化合物などの公知の材料を各サンプルに添加してもよく、その濃度は、基準として用いられて、サンプル間の相対的定量化比較を可能にし得る。次に、特注の自動ピークピッキングプログラムを用いて、各サンプルについてピークリストを生成し得て、ここで、各共鳴ピークは強度値を用いてＸ、Ｙ座標に変換される。次いで、調査中のスペクトル内の全ての共鳴について「マスター」ルックアップテーブルを生成する「マスターピークリスト」プログラムを実行させ得る。このプログラムは、個々のピークリストファイルから全てのＸ、Ｙポイントを読出し、規定された許容差の範囲内の重複を除去し、調査中の全ての可能な代謝産物共鳴が求められるように、結果として生じたピークの組を標準出力に書込む。分析によっては、ヒト代謝産物データベースからのＨＳＱＣデータ全体をマスターピークリストに入力することが可能である。しかし、このアプローチをとると、必要な計算時間が長くなり、ほとんどの場合不要である。したがって、特に調査されているスペクトルについてマスタールックアップテーブルを作成することが好ましい。
【００６３】
さらに図４に示されるように、マスタールックアップテーブルを作成した後、次に各サンプルについて「ＮＭＲアレイ」を生成する。ＮＭＲアレイは、調査中の各共鳴についての全ての可能な代謝産物および強度値のリストからなる。ＮＭＲアレイは、個々のテストピークリストとマスターピークリストとを組合わせて、全ての可能な代謝産物についての共鳴の強度を埋めることによって作成される。テストサンプル内で代謝産物が発現する場合、プログラムはその強度値を選択する。代謝産物が存在しなければ、強度はゼロまたは任意の数に設定される。次いで、スペクトル間で発現が異なる共鳴を特定するために、従来の統計分析プログラムによってＮＭＲアレイを分析し得る。次いで、どの代謝産物が発現が異なっているかを特定するために、ヒトメタボロームデータベースなどのデータベースに共鳴周波数を直接アップロードし得る。次いで、さらなるＮＭＲまたはＭ／Ｓ実験によって候補代謝産物を確認し得る。
【００６４】
発現差異分析
本明細書では、少なくとも２つの細胞集団、例えば第１の細胞集団および第２の細胞集団によって発現が異なる基質代謝産物を特定するための新規の方法も提供される。細胞集団のうちの一方は、健康な被験者または細胞株からのものであり得て、対照群として使用可能である。当該方法は、本明細書に記載されているさまざまな方法ステップおよび技術のさまざまな特徴を用いることができ、（ａ）第１および第２の細胞集団に標識基質（例えば１３Ｃ、１５Ｎまたは３１Ｐで標識された基質）を投入するステップと、（ｂ）基質代謝産物への標識基質の代謝分解を可能にするのに十分な時間にわたってステップａ）の第１および第２の細胞集団を培養するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）の第１および第２の細胞集団から基質代謝産物を採取して、第１および第２の細胞集団の各々から基質代謝産物のサンプルを得るステップと、（ｄ）第１および第２の細胞集団の各々からのサンプルに対して多次元ＮＭＲを実行して、代謝された基質の共鳴スペクトルを求めるステップとを含み得て、共鳴スペクトルは、基質の代謝産物を表わし、当該方法はさらに、（ｅ）特注の「ＮＭＲアレイ」プログラムを用いて共鳴スペクトルを処理するステップと、（ｆ）第１の細胞集団の共鳴強度と第２の細胞集団の共鳴スペクトルとを比較して、どの共鳴スペクトルが発現が異なっているかを判断するステップとを含み得て、発現が異なる共鳴スペクトルは、発現が異なる代謝産物を表わす。
【００６５】
いくつかの実施の形態において、少なくとも２つの細胞集団の間で発現が異なる基質代謝産物を特定するための方法はさらに、ステップ（ｆ）の共鳴スペクトルと既知の共鳴スペクトルのデータベースとを比較して、共鳴スペクトルが表わす分子構造を求め、それによって、第１および第２の異なる細胞集団の間でどの特定の基質代謝産物が発現が異なっているかを判断するステップを含み得る。特定の代謝産物はこのように特定され得る。
【００６６】
本明細書に記載されている方法は、いかなる細胞種類およびいかなる組織における代謝もモニタリングするのに有用であり（例えば、細胞集団は異種の細胞集団を含み得る）、表現型を示さない細胞と比較して任意の表現型を示す細胞における代謝をモニタリングするのに有用である。
【００６７】
診断的適用
特定された発現が異なる代謝産物は、さまざまな表現型を示し、したがってそれらの発現は、この表現型の診断、例えば転移能の増大の診断、またはインスリン耐性の診断、または疾患の診断などに使用可能である。
【００６８】
乳癌腫瘍始原細胞ではＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）がより高く発現することを我々は発見した。診断的観点から、過剰なＮＡＮＡの存在は、腫瘍形成能のバイオマーカの役割を果たし得る。一旦このような発現差異が観察されると、侵攻性の腫瘍の特定に役立つように（例えば細胞内でまたは細胞外で）ＮＡＮＡの発現をモニタリングするために抗体または質量分析法などの検出方法が利用可能である。要約すれば、本明細書に記載されている方法を乳癌細胞に用いてグルコースの特定の分解を辿り、ＮＡＮＡは、悪性の高い細胞で広く上方制御されることが発見された。ＮＡＮＡ生合成において酵素が新たな治療標的として特定され、分子の発現レベルは、移動能の増大と相関関係があることが分かった。
【００６９】
また、当該新規の方法は、特定の疾患の新規のバイオマーカの役割を果たし得る代謝の相違を発見するために患者の体液（例えば血液、尿、血漿および組織サンプル）に適用可能である。
【００７０】
候補治療薬を決定する方法
さまざまな実施の形態において、少なくとも２つの細胞集団によって発現が異なる基質代謝産物を特定するための方法はさらに、基質代謝産物の生成に関与する生合成経路を特定し、代謝産物の発現差異を調節することに向けられ得る経路のタンパク質／酵素を特定するステップを含み得る。結果として、これらのタンパク質および酵素は、細胞の表現型、例えば疾患表現型、転移能または耐性を調節するための候補標的の役割を果たし得る。したがって、当該新たな方法は、治療標的を特定するための手段を提供する。一旦代謝産物が特定され、所与のサンプルについてＮＭＲ代謝産物アレイが作成されると、代謝産物の合成の経路を特定するように生合成経路のデータベースがスクリーニングされ得る。
【００７１】
例えば、ＮＭＲ代謝産物アレイは、代謝産物生合成経路内の可能な治療標的を選択して、薬剤設計のための主要な足場として代謝産物自体を用いて基質ベースの阻害剤を提案するために、ヒトメタボロームデータベースおよび／またはChemPubに電子的にリンクされ得る。バイオマーカの役割を果たし得る一連の発現が異なる代謝産物が特定され、本明細書に記載された。また、生合成経路内の新規の治療標的、および、クリニックでの新たな適用に速やかに転換可能な、実験室において効能を示すＦＤＡの承認を得た薬剤も特定された。
【００７２】
本明細書に記載されているさまざまな方法で用いられる細胞集団は、健康な被験者または罹患した被験者からのものであり得る。細胞は、同系の集団からのものであり得る。いくつかの実施の形態において、第１の細胞集団および第２の細胞集団は、異なる表現型を有する（例えば転移能の点で異なっているか、インスリンに対する反応の点で異なっているか、または疾患遺伝子の発現の点で異なっている）。任意の表現型で発現した特異な代謝産物は、当該表現型を示さない同系の細胞と比較して評価され得る。表現型は、当業者によって容易に特定され、特定の疾患または病気に関連付けられる表現型を含むが、それらに限定されない。
【００７３】
いくつかの実施の形態において、第１の細胞集団は、対照細胞集団であり、第２の細胞集団は、テスト化合物または薬剤と（例えば当該化合物または薬剤による治療後に）接触させられた。特定の表現型に関連付けられる、発現が異なる代謝産物の消失は、テスト化合物または薬剤が当該表現型の抑制、例えば転移の抑制または疾患遺伝子の発現の効果の抑制の能力を有していることを示す役割を果たす。代替的に、発現が異なる代謝産物（例えば罹患細胞とは対照的に、正常な細胞でのみ発現するもの）の出現は、化合物または薬剤が当該疾患の治療に有用であることを示す役割を果たす。したがって、さまざまな実施の形態において、発現が異なる代謝産物を特定するための方法は、疾患の治療に使用可能な、表現型を調節する化合物または薬剤をスクリーニングするために用いられ得る。
【００７４】
対象の遺伝子の過剰発現または抑制の代謝結果は、本明細書に記載されている新たな方法を用いて特定され得る。一実施の形態において、当該方法はさらに、細胞集団のうちの一方（例えば第２の細胞集団）における遺伝子を抑制または過剰発現させるステップを備える。同様に、例えば毒性を評価するための特定の化合物または薬剤の代謝結果も特定され得る。
【００７５】
テスト化合物または薬剤は、例えば小分子、核酸ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ）、核酸ＤＮＡ、タンパク質、ペプチド、または抗体であり得る。阻害剤は、小分子、核酸ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）、核酸ＤＮＡ、タンパク質、ペプチド、および抗体からなる群から選択され得る。一実施の形態において、阻害剤は、酵素の阻害剤（例えばノイラミニダーゼ阻害剤）である。
【００７６】
治療薬を用いて病気を治療する方法
以下の実施例に記載されているように、本明細書に記載されている方法によって、ＣＭＡＳ、ＮＡＮＳ（シアル酸シンターゼとしても知られている）、およびＮＡＮＡ細胞表面発現が、癌細胞の移動を減少させてインビボでの腫瘍の発生を防ぐ治療標的であると確定された。したがって、別の局面において、本開示は、本明細書に記載されている新たな方法を用いて発見された標的の阻害剤を有効量投与することによって被験者の癌などの病気を（例えば転移を抑制することによって、および／または、腫瘍の発生を阻止することによって）治療するための新たな方法を含む。特に、当該方法は、治療有効量のＣＭＡＳもしくはＮＡＮＳの阻害剤、または、ＮＡＮＡの発現を低下させる治療有効量の阻害剤もしくは薬剤を、それを必要としている被験者に投与するステップを含む。例えば、リレンザおよびタミフルを含む、既にＦＤＡの承認を得ているインフルエンザ薬である、Ｆ−ＮＡＮＡと呼ばれる、我々が設計および合成した分子を含む候補ＣＭＡＳ阻害剤を特定した。インビボマウスモデルでのこれらの薬剤の効能はテスト中であり、リレンザおよびタミフルが人間被験者で安全であることが既に評価されているので、試験中の新たな薬剤についてもＦＤＡが迅速に承認することが予想される。
【００７７】
個別化医療への新たな方法の適用
上記のように、本明細書に記載されている新たな方法は、細胞株および一次組織の両方を用いていくつかの腫瘍学モデルにおいて代謝の相違を特徴付けることが成功裏に示された。当該方法は、新規の治療的介入を設計するための手法に大きく影響する可能性を有しており、「個別化医療」の代謝産物ベースのアプローチの基礎を築き得る。
【００７８】
国立衛生研究所によれば、「個別化医療」は、個人の遺伝子プロファイルを用いて、当該個人の疾患の予防、診断および治療に関してなされるカスタマイズされた決定を導く医療行為である。今まで、大半の取組は、ゲノム情報に依拠して、ＤＮＡの突然変異、増幅または欠損を特定している。しかし、疾患が単一の遺伝子病変の結果であることはめったになく、遺伝的変異がどのように現れるかは多くの場合明らかではない。しかし、エピジェネティックな相違を含む非遺伝的変化も遺伝子発現および細胞特性に大きな影響を及ぼす可能性がある。さらに、癌などの多くの一般に突然変異した遺伝子は、小分子阻害剤をもたず、多くの場合「ドラッガブルでない標的」と呼ばれる。本明細書に記載されている方法を用いて、疾患を患う個人の主要な細胞の代謝プロファイルを構築することにより、個人の疾患状態の診断、治療およびモニタリングに有用な強力な情報を提供することができる。
【００７９】
上記のように、疾患は、非常に複雑で異質であり、誤って調整された遺伝子の影響は必ずしも明らかであるとは限らないため、最良の治療的介入手法を設計することを困難にしている。一方、代謝は、ゲノムの最終生成物である。本明細書に記載されている新たなプラットフォームを用いると、特定の患者における代謝の相違は、当該個人における機能的または非機能的経路を素早く強調することができる。さらに、代謝経路については広範囲にわたって研究されており、多くの場合、天然代謝産物に酷似した構造を有する物質である代謝拮抗物質などの代謝酵素の阻害剤は、既に存在しており、既にクリニックで使用されている。発現差異ＮＭＲ分析に基づくこのような潜在的な治療上の発見の例も、以下の実施例のセクションに詳細に示されている。例えば代謝産物の上記の発現差異は、個人ごとにカスタマイズされたベースで患者の疾患を診断、モニタリングおよび治療するための強力なツールであり得る。このプロトコルを用いて新規の代謝経路および野生型組織と疾患組織との間の代謝産物発現差異を推定する分析の例が、本明細書に記載されている。
【００８０】
実施例
本発明は、以下の実施例にさらに記載される。以下の実施例は、以下の実施例に記載されている本発明の範囲を限定するものではなく、特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲を限定するものではない。
【００８１】
以下の実施例は、正常状態の組織および疾患状態の組織において代謝産物の発現差異を効率的に求めるために用いられる新規のプロトコルおよびそれに続く新規の分析方法について記載している。このような発現差異の結果が本明細書に記載されており、可能な小分子治療の設計および特定に利用されることが示されている。
【００８２】
実施例１：ＮＭＲを利用したスクリーニングプラットフォームのための方法
生体サンプルの調製：図１は、プラットフォームを全体的に説明する。各サンプルについて約２０００万個の細胞を用いた（しかし、わずか２００万個を用いることも可能である）。採取する前に、１３Ｃで標識された前駆体（これらの実施例ではグルコースおよびグルタミン）を媒質に直接添加し、ユーザが規定した時間（この場合４時間）にわたって培養を行った。媒質を吸引して、リン酸緩衝生理食塩水（phosphate-buffered saline：ＰＢＳ）を用いて２度洗浄した後、細胞を再びカウントして、収集した。標識を持たない同数の細胞も採取して、１３Ｃバックグラウンド対照群の役割を果たすようにした。氷のように冷たいメタノールを添加することによって細胞を溶解し、等量の水およびクロロホルムを添加することによって水抽出を行った。遠心分離後、水溶性の有機代謝産物を別個に収集し、乾燥させて、さらなる分析の準備が整うまで保管した。さらなる精製は行わなかった。
【００８３】
ＮＭＲを用いたデータの取得：主に異核単一量子相関（ＨＳＱＣ）に依拠する二次元ＮＭＲ分光法を利用して、代謝産物を特定した。ＨＳＱＣ実験は、異核（以下の実施例では１３Ｃであるが、他の同位体も可能である）と陽子との間の一結合相関関係を提供する。比較的大きな一結合異核結合による移動のためにクロスピークが生じ、これにより、直接付着された原子核のシフトを特定することが可能になる。陽子に対して一対になった各炭素原子の特有の化学的環境は、所与の代謝産物に特有の特徴的な化学シフトを生じさせる。比較する目的で、（一般に入手可能な）精製された代謝産物の基準ＨＳＱＣスペクトルを用いた。例えば、現在のところ、ヒトメタボロームデータベース（Human Metabolome Database：ＨＭＤＢ）は、多くがＨＳＱＣデータを有する４０，２６０の代謝産物入力についての情報を含んでいる。
【００８４】
二次元ＮＭＲ代謝産物プロファイリングの従来の欠点（多くのサンプルを必要とし、取得時間が長いこと）を解消するために、いくつかのさらなる技術を用いて、分解能を向上させ、分析に必要な時間を減少させた。上記のように、最初のステップにおいて、必要な材料の量を減少させるために、１３Ｃで標識された前駆体（グルコース、グルタミン、ピルビン酸塩およびアミノ酸が用いられたが、他の物質および他の同位体も可能である）を細胞に補充した。理論的には、これは、必要な細胞数を〜１００分の１に減少させるはずである。一部にはイオン強度がさまざまであるために、これは必ずしも完全に線形にスケーリングされるとは限らず、サンプルサイズに関する制約がなければ（すなわち、細胞株を用いる場合には）、各分析に約２００万個〜２０００万個の細胞を用いることがここでは推奨される。
【００８５】
実施例２：高速な超高分解能ＮＭＲデータの取得
スペクトルの折返し：上記のサンプル調製はサンプル量に対する物理的要求を軽減したが、高分解能二次元ＮＭＲ分光法を記録するために長い取得時間が必要であることは、依然として問題であった。これに対処するために、複数方向からのアプローチ、すなわち、スペクトル幅を「折返す」こと、ランダム位相サンプリング（ＲＰＳ）を用いること、分析において不均一サンプリング（ＮＵＳ）技術およびデータ拡張を実現すること、がとられた。
【００８６】
上記のように、スペクトル幅（ｓｗ）は、ＮＭＲ信号が検出される周波数の範囲である。代謝産物混合物は多様な分子を含んでおり、全ての潜在的な炭素化学シフトをカバーするために必要なスペクトル幅は、−２２０ｐｐｍにわたる。図２Ａには、ＫＲＡＳ突然変異膵臓癌細胞における全ての水溶性代謝産物についてのＨＳＱＣスペクトルが示されている。この例では、１３Ｃ−ｓｗは２２０ｐｐｍにわたっており、合計１０２４個のポイントが収集された。分解能＝ＳＷ／ＴＤ（式中、ＴＤは合計データポイントである）の数式を解くことによって、分解能が〜１０７Ｈｚ／ポイントに限定されることを観察した。しかし、図２Ａをよく調べてみると、代謝産物の大多数が対角線に沿って広がっており、大半のスペクトルが空の状態である。ｓｗ全体に沿ってポイントを収集することにより、分解能は大きく減少し、取得時間が分解能の逆数であるので、実験時間も無駄になる。したがって、分解能を上昇させるためにｓｗを徐々に減少させた。図２Ｂは、同一のサンプルのＨＳＱＣを示しており、ここではｓｗが１４０ｐｐｍであり、その結果分解能が〜６８Ｈｚ／ポイントである。図２Ｃは、同一のサンプルのＨＳＱＣを示しており、ここではｓｗが１１０ｐｐｍであり、その結果分解能が５４Ｈｚ／ポイントである。図２Ｄは、同一のサンプルのＨＳＱＣを示しており、ここでは９０ｐｐｍのｓｗが〜４４Ｈｚ／ポイントの超高分解能を生成している。折返されたスペクトルの各々において、エイリアスピークは容易に特定可能であり、次の数式（δｏｂｓ＝δ＋ｓｗ）を用いて真の化学シフトを再び計算することができる。注目すべきなのは、Ｃ−Ｃスカラー結合による最大分解能が〜３５Ｈｚであることである。我々の折返し手法を用いて、超高分解能スペクトルを得ることができる。
【００８７】
注目すべきなのは、大きな炭素スペクトル幅にわたって均一に最適なフリップ角をもたらすために、炭素チャネルに沿って全ての１８０度パルスについて、広帯域断熱成形パルスを利用したことである。これは、スカラー結合されたスピン間で効率的なコヒーレンス移動を可能にするために特に重要である。
【００８８】
不均一サンプリングおよびデータの拡張：ＮＭＲサンプルの測定された「自由誘導減衰」（ＦＩＤ）は、全ての磁化結合の歳差運動によって生成される振動電流によって作成される。この信号は、スピン−スピンデコヒーレンスを引起す他の分子内の原子核によって減衰する。これが起こる速度は、横緩和速度（Ｔ２）として知られている。いかなるＮＭＲ実験でも、最大分解能を得るためには、１．２＊Ｔ２に近い間接次元におけるポイントを収集すべきであると広く考えられている。しかし、代謝産物は、平均して１０−１２〜１０−１１秒の分子運動相関時間で高速で移動する。この高速移動のために、多くの代謝産物では、スピン−スピンデコヒーレンスがほとんどなく、Ｔ２速度はほぼ無限に長い。したがって、超高分解能代謝産物データの収集は、理論的には可能であるが、実際には極めて長い測定時間を必要とするであろう。そして、大半の実験では、データのサブセットのみが、速度のために分解能を犠牲にして収集している。
【００８９】
図２Ｅに概説されている不均一サンプリング（ＮＵＳ）技術を利用することによって、我々のデータの分解能を大きく上昇させることができるだけでなく、高分解能スペクトルを記録する速度も上昇させることができた。例えば、同一のサンプルを用いて、１２８個の間接的なポイントを用いて５時間にわたってＸ倍の分解能で、不均一にサンプリングされた実験を行い得た。ＮＵＳを用いて、等価の時間で１０２４個のポイントのうちの１０％を収集して、８倍の分解能でスペクトルを生成し得た。代替的に、５１２個のポイントのうちの１０％をサンプリングして、分解能を４倍に上昇させ、取得時間を〜４０％減少させ得た。
【００９０】
ポアソンギャップ分布がサンプリングスケジュールについて選択され、それに続いて、順方向最大（forward maximum：ＦＭ）エントロピ再構築が行われた。代謝産物混合物は、さまざまな濃度で分子を含んでおり、これは、弱いピークを検出する際の最も効果的な方法であることが分かった。また、我々の分解能をさらに向上させるために、再構築の前に間接次元におけるポイントの総数を人為的に２倍にする「データ拡張」アドオンを作成した。ＮＵＳデータセットの前半は、まばらにサンプリングされたデータを用いて、ＦＭ再構築に従って欠落しているポイントを埋めることで再構築される。データの後半は、反復ソフト閾値法を用いて完全に構築される。図２Ｆに示されるように、これは、取得時間に影響を及ぼすことなく我々の分解能を２倍に上昇させた。
【００９１】
水層および有機層内の代謝産物の分析：各ステップを辿る必要はないが、この方法は、水溶性代謝産物または有機代謝産物の完全な代謝プロファイルを可能にする。図３は、同一の〜２００万個のｐ５３欠損肺癌細胞からの水性代謝産物（図３Ａ）および有機ベースの代謝産物（図３Ｂ）のＨＳＱＣを示し、各実験では必要な取得時間がわずか１時間であった。同一のサンプル量についての１３Ｃ天然存在度を用いた等価のスペクトルおよび標準的なＮＭＲ技術は、数日を必要とするであろう。両方のスペクトルは極めて上手く分解され、代謝産物共鳴ピークを特定することを容易にする。重要なことだが、多くのＭ／Ｓ方法は、脂質を正確に検出しようと懸命に努力してきており、我々の方法を用いて、図３Ｂに示されるように、有機分子からの共鳴は容易に特定可能である。
【００９２】
実施例３：代謝産物ＮＭＲデータの分析
ＮＭＲ分析：図４に要約されているように、本明細書に記載されている方法を用いてＮＭＲ分析プロセスを自動化するために特注の「ＮＭＲ代謝産物アレイ」プログラムを作成した。まず、内部制御を用いて、スペクトルを位相化し、整列させ、スケーリングする。１ｍＭの４，４−ジメチル−４−シラペンタン−１−スルホン酸（ＤＳＳ）を各サンプルに添加し、その濃度を基準として用いて、サンプル間の相対的定量化比較を行った。各サンプルについてピークリストを生成するために自動ピークピッキングプログラムを作成し、ここで、各共鳴ピークは強度値を用いてＸ、Ｙ座標に変換された。次に、調査中のスペクトルにおける全ての共鳴について「マスター」ルックアップテーブルを生成する「マスターピークリスト」プログラムを作成し、その後実行した。
【００９３】
手短に言えば、このプログラムは、個々のピークリストファイルから全てのＸ、Ｙポイントを読出し、規定された許容差の範囲内の重複を除去し、結果として生じるピークの組を標準出力に書込む。分析によっては、ヒト代謝産物データベースからのＨＳＱＣデータ全体をマスターピークリストに入力することが可能である。このアプローチをとることにより、必要な計算時間が長くなり、ほとんどの場合不要である。特に調査されているスペクトルについてマスタールックアップテーブルを作成することが好ましい。
【００９４】
次に、各サンプルについてＮＭＲアレイを生成し、ここで、個々のピークリストおよびマスターピークリストを組合わせて、全ての可能な代謝産物についての共鳴の強度を埋めた。テストサンプル内で代謝産物が発現する場合、プログラムはその強度値を選択する。代謝産物が存在しなければ、強度はゼロまたは任意の数に設定される。ここで、スペクトル間で発現が異なる共鳴を特定するために、従来の統計分析プログラムによってＮＭＲアレイを分析し得る。次いで、どの代謝産物が発現が異なっているかを特定するために、ヒトメタボロームデータベースに共鳴周波数を直接アップロードし得る。次いで、さらなるＮＭＲまたはＭ／Ｓ実験によって候補代謝産物を確認し得る。
【００９５】
実施例４：発現が異なる代謝産物の分析：新規のアプローチ
バックグラウンド補正：所与の前駆体のフラックスをモニタリングするために、標識前駆体を持たない同数の細胞を有する別個のスペクトルを記録した。非標識細胞からのスペクトルは、細胞内の１３Ｃバックグラウンドを表わし、１３Ｃで標識された基質の代謝分解を具体的に辿るためにテストスペクトルから差し引かれ得る。グルコースおよびグルタミンが細胞内の主要なエネルギ源のうちの２つであり、各前駆体の代謝分解が上手く特徴付けられる。特定の経路へのグルコースおよびグルタミンのフラックスを調べるために、標識前駆体を持たない同数の乳房腫瘍始原細胞の１３Ｃ−１Ｈ  ＨＳＱＣスペクトル、および、基質として添加された１３Ｃ−グルタミンまたは１３Ｃ−グルコースのいずれかを記録した。図５Ａに示されるように、この限られた数の細胞では、１３Ｃバックグラウンドからほとんど信号が発生せず、グルタミン（図５Ｂ）およびグルコース（図５Ｃ）スペクトルはかなりはっきりしている。ＮＭＲアレイを作成することによって、複雑なＮＭＲデータを標準的なテキストファイルに変換することができた。非標識サンプルにおける共鳴の強度値は、グルタミンまたはグルコースアレイにおけるマッチング信号から差し引かれた。図６に示されるように、ＮＭＲアレイからの強度値および共鳴代謝産物ＩＤをプロットすることによって、所与のサンプルを通るグルコースまたはグルタミンフラックスに特有の変化を特定することが可能である。Ｘ軸は、図６のＨＳＱＣスペクトルから特定されたあらゆる代謝産物についての全ての共鳴代謝産物ＩＤを記載している。Ｙ軸は、各条件において各共鳴の強度がいかに変化するかを強調している。予想通り、グルタミンおよびグルコースがさまざまな代謝経路へのフラックスを引起すことが明らかである。共鳴代謝産物ＩＤは、特異な代謝産物を特定するためにヒトメタボロームデータベースにアップロード可能な特定の１３Ｃ−１Ｈ化学シフトに対応する。
【００９６】
実施例５：トリプルネガティブ乳癌腫瘍始原細胞における発現が異なる代謝産物の特定
プロトコル：同一の正常な乳房組織に由来して、ＢＰＬＥＲ細胞およびＨＭＬＥＲ細胞を同一の遺伝的要因で形質転換したが、異なる培地において増殖させた。ＢＰＬＥＲは、非常に腫瘍形成性であり、ＨＭＬＥＲ細胞の転移能よりも転移能が大きい。マウスの乳腺脂肪体に注射された５０個未満のＢＰＬＥＲ細胞は腫瘍を発生させるが、インビボで腫瘍を形成するためには１０＾６個以上のＨＭＬＥＲ細胞が必要である（以下の表２）。ＢＰＬＥＲ細胞は、トリプルネガティブ乳癌腫瘍始原細胞のモデル細胞株であり、ＢＰＬＥＲ腫瘍は、トリプルネガティブ乳癌患者のものに組織学的に類似している。プロトコルによれば、均一に標識された１３Ｃ−グルコースが存在する状態で約２０００万個のＢＰＬＥＲ細胞およびＨＭＬＥＲ細胞を培養し、その後、採取して溶解させた。次いで、水層を収集して、乾燥させ、超高純度Ｄ２Ｏに再び溶かして、ＮＭＲ分析に備えた。さらなる調査のために有機層を保管した。
【００９７】
【表２】
2015509584.tif 000007
【００９８】
本明細書に記載されている新たなプラットフォーム方法を用いて、高速で偏りのない超高分解能ＮＭＲ代謝産物スクリーニングを行った。ＢＰＬＥＲ細胞およびＨＭＬＥＲ細胞についての結果として生じた１３Ｃ−１Ｈ  ＨＳＱＣの例が、図７Ａおよび図７Ｂにそれぞれ示されている。
【００９９】
結果：我々の特注のＮＭＲ分析プログラムを用いて、各スペクトルにおける共鳴をＮＭＲアレイに変換した。図７Ｃは、その情報を要約している。両方の細胞株からの全ての複製を組合わせることによって、約〜２１００個の共鳴を特定した。各共鳴の代謝産物ＩＤがＸ軸に記載されている。各共鳴の相対的強度がｙ軸にプロットされている。この分析から、各細胞株の代謝産物共鳴間には高度の類似性があることを観察した（共鳴のうちの＞７５％が両方の細胞株に存在していた）。しかし、両方の細胞株に共通のいくつかの共鳴ピークは、発現がさまざまであり、いくつかのピークはＨＭＬＥＲ細胞に特有であり、他のピークはＢＰＬＥＲに特有であった。ＨＳＱＣデータを正確に反映したアレイを確認するために、図７Ｄに示されるように、ＮＭＲアレイにおいてＢＰＬＥＲ細胞に特有の共鳴を有することが予想されるＨＳＱＣスペクトルの領域を拡大し、実際にＢＰＬＥＲスペクトルにのみ共鳴が見られた。
【０１００】
ＮＭＲアレイを用いて、ＢＰＬＥＲ腫瘍始原細胞に特に豊富に含まれる共鳴を素早く特定することができた。表３は、ＢＰＬＥＲ腫瘍始原細胞に最も豊富に含まれるトップの共鳴を強調している。アレイからの代謝産物ＩＤおよび対応する１３Ｃ−１Ｈデータが示されている。
【０１０１】
【表３】
2015509584.tif 000008
【０１０２】
これらの共鳴をヒトメタボロームデータベースに入力し、黄色で強調された９個の共鳴のうちの６個がＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）からのものであると予想された。これは、ＮＡＮＡが、ＮＭＲアレイにおいて特定された発現が異なる共鳴に対応する代謝産物であることを強く示唆している。
【０１０３】
ＮＡＮＡが実際にＢＰＬＥＲ腫瘍始原細胞において上方制御されることを確認するために、いくつかのさらなるステップを行った。第１に、図８Ａに示される純粋なＮＡＮＡの１３Ｃ−１Ｈ  ＨＳＱＣは、ＢＰＬＥＲスペクトルにおいて過剰表現が見られる位置とほぼ同じ位置にクロスピークを含んでいる。第２に、ＮＡＮＡを具体的に調査するために特注のＮＭＲパルスプログラムを設計した。ＮＡＮＡ生合成では、グルコースのＣ２およびグルタミンの窒素原子が結合されて、炭素−窒素結合を形成する。したがって、１３Ｃ−Ｃ２グルコースおよび１５Ｎ−グルタミンを用いてＢＰＬＥＲ細胞を培養し、ＨＣＮ実験を記録して、炭素に接続され、窒素原子にも接続される水素（ＨＣＮ）を含む代謝産物共鳴を検出した。この実験では、図８Ｂに示されるように、ＢＰＬＥＲ細胞は、ＮＡＮＡ規格において予想されるであろう位置と同じ位置に、発現が異なる共鳴を含んでいる。最後に、図８Ｃに示される質量分析実験は、ネガティブモードでエレクトロスプレーを用いて複数回の反応モニタリングＬＣ／ＭＳを行うことによって、ＮＡＮＡがＢＰＬＥＲ腫瘍始原細胞において約７倍高くなることを確認した。報告される値は、各細胞株におけるＮＡＮＡの発現の曲線の下の領域である。
【０１０４】
診断法を開発するための発現が異なる代謝産物の結果の使用：ＢＰＬＥＲ細胞内のグルコースフラックスを辿る（すなわち、バックグラウンド１３Ｃを差し引いて、グルコースの特定の分解の跡をたどる）ことによって、腫瘍始原細胞がそれらのグルコース代謝の一部をＮＡＮＡの生成に転用することが観察された。ＮＡＮＡは、多くの場合糖タンパク質の細胞表面に組込まれている九炭糖である。従前の報告は、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）が、ＮＡＮＡで修飾されたタンパク質に対する強い親和性を有していることを特定した。ローダミンで標識されたＷＧＡを用いて、図９に示される免疫蛍光顕微鏡法を行って、ＢＰＬＥＲ細胞がそれらの細胞表面でＮＡＮＡの発現を増加させることを観察した。したがって、ＮＡＮＡ自体が、乳房腫瘍始原細胞を具体的に特定するための新規の診断法であり、ＷＧＡ、ならびに、特にＮＡＮＡおよびＮＡＮＡで修飾された分子を認識する類似の分子は、腫瘍始原細胞または悪性度が高い細胞を検出および分離するための新たなツールを提供し得る。
【０１０５】
実施例６：特異なＮＭＲデータを利用した標的の特定
ＮＡＮＡは、多くの場合細胞表面タンパク質に組込まれる糖である。図１０に示されるように、ＮＡＮＡは、主要な酵素であるＮＡＮＳおよびＣＭＡＳを含む約１５個の異なる酵素によってグルコースから抽出される。細胞生存能力の周知の分析であるCelTiterGloを用いて、ＮＡＮＳまたはＣＭＡＳのノックダウンが細胞生存能力または細胞の増殖にほとんどまたは全く影響を及ぼさない（図１１）一方で、ＰＬＫ１酵素のノックダウンが全細胞の死を引起すことが観察された。
【０１０６】
しかし、ＮＡＮＡは、細胞接着に関与するいくつかのタンパク質の細胞表面に組込まれ、ＮＡＮＡの喪失は、細胞運動性に影響を及ぼすことが疑われた。細胞移動分析を用いて、上側のチャンバの下部に小さな孔を含む２つのチャンバ内で細胞を培養した。悪性細胞（特に転移能を有するもの）は、当該孔を通って移動して、コロニーを形成し得る。予想通り、図１２に示されるように、ＢＰＬＥＲは、腫瘍形成特性が増大しているために、ＨＭＬＥＲ細胞と比較して移動速度が速い。しかし、ＮＡＮＳまたはＣＭＡＳのノックダウンは、下側のチャンバに移動することができる細胞の能力を完全に消失させる一方、対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞は通常の移動を維持した。ＮＡＮＡの発現が運動性に直接影響を及ぼすことを確認するために、ＮＡＮＳまたはＣＭＡＳに対してｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞が補充ＮＡＮＡであるレスキュー実験を行った。ＮＡＮＡが存在する状態で、それらは移動表現型を部分的に回復させることができた。図１２Ｂにおいて、いくつかの移動研究のこれらの結果は定量化されている。これらの結果は、ＮＡＮＡの発現が細胞移動にとって非常に重要であり、転移にとって重要であり得ることを示唆している。ＮＡＮＡの発現のモニタリングは、細胞の転移能を予測し得る。また、ＮＡＮＳ／ＣＭＡＳは両方とも、移動および転移を操作するための新規の主要な標的である。
【０１０７】
実施例７：ＣＭＡＳは細胞移動を増大させる
上記のように、ＮＡＮＡを生成してＮＡＮＡをタンパク質に接着させるために用いられる主要な酵素であるＮＡＮＳおよびＣＭＡＳのノックダウンは、細胞増殖に対しては影響を及ぼさなかったが、ＢＰＬＥＲ細胞が移動する能力を大きく減少させた（図１２に示される）。ＣＭＡＳおよびＮＡＮＳのｍＲＮＡレベルはＨＭＬＥＲ細胞およびＢＰＬＥＲ細胞において等価であるが、ＣＭＡＳのタンパク質の発現がＢＰＬＥＲ腫瘍始原細胞において劇的に過剰発現することを観察した（図１３）。ＣＭＡＳの発現が腫瘍始原ＢＰＬＥＲ細胞の悪性表現型に寄与するか否かを判断するために、非侵攻性のＨＭＬＥＲ細胞にプラスミドをトランスフェクトして、ＣＭＡＳを強制的に発現させた。前に記載した細胞移動分析を用いて、図１４Ａに示されるように、ＣＭＡＳの発現が強化されたＨＭＬＥＲ細胞は、対照群と比較して、移動能を数倍に劇的に上昇させた。相互補足実験も行って、安定ＣＭＡＳノックダウンＢＰＬＥＲ細胞（ＢＰＬＥＲ−ｓｈＣＭＡＳ１）を作成した。予想通り、図１４Ｂに示されるように、これらの細胞は同一の移動分析においてコロニーを形成することができなかった。これらの結果は、ＣＭＡＳタンパク質の発現が細胞移動および／または転移において重要であることを示唆している。今まで、癌におけるＮＡＮＳまたはＣＭＡＳの役割については言及されてこなかった。これは、一部には、大半の技術がｍＲＮＡレベルのみを調査するシークエンシングおよび／またはマイクロアレイ実験に依拠しているためであろう。これは、我々の方法の強みを強調する。代謝産物を精査することによって、ＮＡＮＡが乳房腫瘍始原ＢＰＬＥＲ細胞において非常に高く発現することが特定された。その後、その生合成経路内の酵素を精査することによって、腫瘍形成性にとって重要であろう新規の有力な標的が発見された。
【０１０８】
実施例８：ＣＭＡＳは腫瘍形成の開始に影響を及ぼす
ＣＭＡＳ／ＮＡＮＡの発現の喪失がインビボでの腫瘍の発生にいかに影響を及ぼすかを判断するために、図１５Ａに概説されている実験を行った。上記のように、ＣＭＡＳタンパク質を発現しない安定ＣＭＡＳノックダウンＢＰＬＥＲ細胞（ＢＰＬＥＲ−ｓｈＣＭＡＳ１）を作成した。我々の実験では、空ベクトルを過剰に発現させる５００，０００個のＢＰＬＥＲ細胞（対照群）および（ＣＭＡＳを発現させない）５００，０００個のＢＰＬＥＲ−ｓｈＣＭＡＳ１細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの乳腺脂肪体に注射した。この目的は、各グループ間の腫瘍サイズおよび転移数の相違を分析することであった。４５日間にわたって３日ごとに、触知可能な腫瘍についてマウスを調べ、検出されると、腫瘍の高さ、長さおよび幅を直接測定して腫瘍体積を計算した。図１５Ｂに示されるように、４５日以内に、対照マウスの４/４が大きな原発腫瘍を発生させた。驚くべきことに、ＢＰＬＥＲ−ｓｈＣＭＡＳ１マウスはいずれも（０/５）、いかなる触知可能な腫瘍も持たなかった。実際、９０日後、ＢＰＬＥＲ−ｓｈＣＭＡＳ１細胞を注射されたマウスは、腫瘍が無い状態のままであった。総合すると、インビトロおよびインビボデータは、ＣＭＡＳが完全に新規の真正な癌の治療標的であることを示唆している。
【０１０９】
実施例９：乳癌治療のための治療薬を特定および設計するためのＮＭＲデータの使用
ＣＭＡＳなどの酵素は、小分子薬剤阻害のための理想的な候補である。ＣＭＡＳの酵素メカニズムは図１６Ａであり、ＣＭＡＳは、二価陽イオンに依存した態様でＮＡＮＡのヒドロキシ基を活性化させ、その結果、ＣＭＡＳは、後に、入ってくるシチジン三リン酸（ＣＴＰ）分子のアルファ−リン酸塩を攻撃し得て、シチジン一リン酸−ＮＡＮＡ（ＣＭＰ−ＮＡＮＡ）中間体を形成する。ＮＡＮＡ足場を用いて、ヒドロキシル基をフッ素と置換する基質ベースの類似体を設計および合成した（図１６Ｂ）。この置換は、理論的には、ＮＡＮＡがＣＭＡＳを結合させる能力を維持するはずであるが、酵素反応を妨げるはずである。ＣＭＡＳ阻害剤が存在する状態で、前に記載した細胞移動分析を用いて、ＢＰＬＥＲ細胞がもはや移動できないことが分かった（図１６Ｃ）。ＮＡＮＡ足場を用いて、細胞株に影響を及ぼす基質ベースの阻害剤を高速で設計および合成することができた。
【０１１０】
合成されたＦ−ＮＡＮＡ誘導体は、ＦＤＡの承認を得た薬剤であるリレンザおよびタミフルと化学的にわずかに似ていた（図１７）。リレンザおよびタミフルは両方とも、インフルエンザ酵素であるノイラミニダーゼを抑制するように設計されている。ノイラミニダーゼは、特に、細胞表面のＮＡＮＡ分子を切断して、細胞にウイルスが入ることを容易にする。ノイラミニダーゼおよびＣＭＡＳは、基質としてＮＡＮＡを共有し、したがって、これらの公知のインフルエンザ治療薬は、ＣＭＡＳの阻害剤であることが疑われた。図１７Ｂに示されるように、ＢＰＬＥＲ細胞のリレンザ治療は細胞移動を阻止した。リレンザもタミフルも、既にＦＤＡの承認を得た、販売されている治療薬であり、マウスモデルにおいて肯定的な結果が出るまで、癌の適用の臨床試験への早急な入口である。
【０１１１】
ノイラミニダーゼ自体は、細胞表面からＮＡＮＡを除去することが知られている。ノイラミニダーゼを用いて、悪性細胞の表面からＮＡＮＡを除去し、ＣＭＡＳに対するｓｉＲＮＡと同様に移動および腫瘍の発生に対して同様の効果を発揮させることができないかと考えた。活性ノイラミニダーゼ酵素を用いてＢＰＬＥＲ細胞を事前に培養することにより、ローダミンで標識されたコムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）顕微鏡法によって求められるＮＡＮＡの発現が減少した（図１８Ａ）。また、ノイラミニダーゼで処理されたＢＰＬＥＲ細胞は移動分析においてもはや移動することができなかった（図１８Ｂ）。空のビリオンを含むノイラミニダーゼおよびインフルエンザ様分子は、ＮＡＮＡを腫瘍集団から除去することによって、腫瘍始原細胞を検出し（インフルエンザビリオンはＮＡＮＡに対する高い親和性を有する）、腫瘍の発生および転移を抑制するための革新的な方法であり得る。
【０１１２】
他の実施の形態
本発明をその詳細な説明と関連付けて説明してきたが、上記の説明は例示的であるように意図されており、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を限定することを意図したものではないということが理解される。他の局面、利点および変形例は、以下の特許請求の範囲内である。
【図１】
2015509584.tif 000009
【図２Ａ】
2015509584.tif 000010
【図２Ｂ】
2015509584.tif 000011
【図２Ｃ】
2015509584.tif 000012
【図２Ｄ】
2015509584.tif 000013
【図２Ｅ】
2015509584.tif 000014
【図２Ｆ】
2015509584.tif 000015
【図３Ａ】
2015509584.tif 000016
【図３Ｂ】
2015509584.tif 000017
【図４】
2015509584.tif 000018
【図５Ａ】
2015509584.tif 000019
【図５Ｂ】
2015509584.tif 000020
【図５Ｃ】
2015509584.tif 000021
【図６】
2015509584.tif 000022
【図７Ａ】
2015509584.tif 000023
【図７Ｂ】
2015509584.tif 000024
【図７Ｃ】
2015509584.tif 000025
【図７Ｄ】
2015509584.tif 000026
【図８Ａ】
2015509584.tif 000027
【図８Ｂ】
2015509584.tif 000028
【図８Ｃ】
2015509584.tif 000029
【図９】
2015509584.tif 000030
【図１０】
2015509584.tif 000031
【図１１】
2015509584.tif 000032
【図１２Ｃ】
2015509584.tif 000033
【図１３Ａ】
2015509584.tif 000034
【図１５Ａ】
2015509584.tif 000035
【図１５Ｂ】
2015509584.tif 000036
【図１６Ａ】
2015509584.tif 000037
【図１６Ｂ】
2015509584.tif 000038
【図１６Ｃ】
2015509584.tif 000039
【図１６Ｄ】
2015509584.tif 000040
【図１７Ａ】
2015509584.tif 000041
【図１７Ｂ】
2015509584.tif 000042
【図１７Ｃ】
2015509584.tif 000043
【図１２Ａ】
2015509584.tif 000044
【図１２Ｂ】
2015509584.tif 000045
【図１３Ｂ】
2015509584.tif 000046
【図１４Ａ】
2015509584.tif 000047
【図１４Ｂ】
2015509584.tif 000048
【図１７Ｄ】
2015509584.tif 000049
【図１８Ａ】
2015509584.tif 000050
【図１８Ｂ】
2015509584.tif 000051
【配列表】
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【国際調査報告】
2015509584.tif 000052
2015509584.tif 000053
2015509584.tif 000054
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