(57)【要約】本発明は、脳卒中に罹患したことが疑われる患者において脳卒中を診断するための、および虚血性脳卒中と一過性脳虚血発作との区別もするためのバイオマーカーに基づく方法を提供する。本発明の方法に有用であるバイオマーカーの特定の組み合わせのためのプローブを含む基材についても記載する。
2015500464.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳卒中を有する疑いのある患者において脳卒中の診断を行うための方法であって、前記患者から得られた生体外サンプル中の少なくとも２つのバイオマーカーの濃度を特定すること、および各バイオマーカーの前記濃度値を対応するコントロール値と比較することによって前記バイオマーカーの前記濃度の有意性を確立することを含み、ここで、前記少なくとも２つのバイオマーカーは、ＩＣＡＭ‐１、Ｌ‐セレクチン、Ｐ‐セレクチン、ＶＣＡＭ‐１、ＩＬ‐６、ｓＴＮＦＲ１、Ｄ‐ダイマー、およびＣＲＰから選択され、ならびにここで、前記２つのバイオマーカーのうちの少なくとも１つは、ＩＣＡＭ‐１、Ｌ‐セレクチン、Ｐ‐セレクチン、およびＶＣＡＭ‐１から選択される、方法。
【請求項２】
前記少なくとも２つのバイオマーカーが、（ｉ）ＩＣＡＭ‐１またはＶＣＡＭ‐１、および（ｉｉ）Ｌ‐セレクチンまたはＰ‐セレクチンから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも２つのバイオマーカーが、ＩＣＡＭ‐１およびＬ‐セレクチンである、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＩＬ‐６、ｓＴＮＦＲ１、Ｄ‐ダイマー、およびＣＲＰから選択される１つ以上のバイオマーカーのサンプル濃度を特定することをさらに含む、請求項２または請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ｈ‐ＦＡＢＰのサンプル濃度を特定することをさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記患者およびコントロールのバイオマーカー濃度値の各々が、１もしくは複数の統計アリゴリズムに入力されて、脳卒中が起こったかどうかを示す出力値が得られる、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記統計アルゴリズムが、ロジスティック回帰式を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記２つ以上のバイオマーカーの組み合わせが、表１および２に挙げるバイオマーカーの組み合わせのいずれかに対応する、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
脳卒中が診断された場合、請求項１６から１９のいずれか一項に記載の方法が、脳卒中タイプを区別して診断する目的で実施される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか一項に記載の患者において脳卒中を診断するための方法で用いられる、ＩＣＡＭ‐１、Ｌ‐セレクチン、Ｐ‐セレクチン、ＶＣＡＭ‐１、ＩＬ‐６、ｓＴＮＦＲ１、Ｄ‐ダイマー、およびＣＲＰから選択される少なくとも２つのバイオマーカーのためのプローブを含む基材であって、ここで、前記基材は、ＩＣＡＭ‐１、Ｌ‐セレクチン、Ｐ‐セレクチン、およびＶＣＡＭ‐１のうちの少なくとも１つのためのプローブを含む、基材。
【請求項１１】
ｈ‐ＦＡＢＰのためのプローブをさらに含む、請求項１０に記載の基材。
【請求項１２】
前記基材が、前記基材上に固定された少なくとも２つのプローブを有する、請求項１０または請求項１１に記載の基材。
【請求項１３】
前記基材が、バイオチップである、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の基材。
【請求項１４】
請求項１から９のいずれか一項に記載の患者において脳卒中を診断するための方法での、ＩＣＡＭ‐１、Ｌ‐セレクチン、Ｐ‐セレクチン、ＶＣＡＭ‐１、ＩＬ‐６、ｓＴＮＦＲ１、Ｄ‐ダイマー、およびＣＲＰから選択される少なくとも２つのバイオマーカーのためのプローブを含む基材の使用であって、ここで、前記基材は、ＩＣＡＭ‐１、Ｌ‐セレクチン、Ｐ‐セレクチン、およびＶＣＡＭ‐１のうちの少なくとも１つのためのプローブを含む、使用。
【請求項１５】
前記基材が、ｈ‐ＦＡＢＰのためのプローブをさらに含む、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
脳卒中を有することが疑われる患者における虚血性脳卒中の診断を補助する方法であって、
ｉ）前記患者から得られた生体外サンプル中のＶＣＡＭ‐１、ならびにｈ‐ＦＡＢＰ、ＩＬ‐６、およびＣＲＰから選択される１つ以上のバイオマーカーの濃度を特定すること；ならびに、
ｉｉ）各バイオマーカーの前記濃度値を対応するコントロール値と比較することによって前記バイオマーカーの濃度の有意性を確立すること、を含み、ここで、前記対応するコントロール値は、一過性脳虚血発作の１もしくは複数の患者から得られた生体外サンプルから特定された対応するバイオマーカーの濃度値である、
方法。
【請求項１７】
前記方法が、虚血性脳卒中と一過性脳虚血発作とを区別して診断するために用いられる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記患者およびコントロールのバイオマーカー濃度値の各々が、１もしくは複数の統計アリゴリズムに入力されて、虚血性脳卒中が起こったかどうかを示す出力値が得られる、請求項１６または請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記統計アルゴリズムが、ロジスティック回帰式を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１６から１９のいずれか一項に記載の患者において虚血性脳卒中の診断を補助するための方法で用いられる、ＶＣＡＭ‐１、ならびにｈ‐ＦＡＢＰ、ＩＬ‐６、およびＣＲＰから選択される少なくとも１つの他のバイオマーカーのためのプローブを含む基材。
【請求項２１】
前記基材が、前記基材上に固定された前記プローブを有する、請求項２０に記載の基材。
【請求項２２】
前記基材が、バイオチップである、請求項２０または２１に記載の基材。
【請求項２３】
請求項１６から１９のいずれか一項に記載の患者において虚血性脳卒中の診断を補助するための方法での、ＶＣＡＭ‐１、ならびにｈ‐ＦＡＢＰ、ＩＬ‐６、およびＣＲＰから選択される少なくとも１つの他のバイオマーカーのためのプローブを含む基材の使用。
【請求項２４】
虚血性脳卒中のバイオマーカーとしての、および／または虚血性脳卒中と一過性脳虚血発作との区別因子としての、ＶＣＡＭ‐１、ならびにｈ‐ＦＡＢＰ、ＩＬ‐６、およびＣＲＰの１つ以上の使用。
【請求項２５】
前記サンプルが、血液、血清、または血漿サンプルである、請求項１〜９および１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
脳卒中は、全世界で３番目に多い死因であり、脳への血液供給の遮断に起因して急速に発生する（１もしくは複数の）脳機能の喪失として定義され得る。世界保険機構によると、全世界で毎年１５００万人が脳卒中に罹患しており、５００万人が死亡し、さらに５００万人が恒久的な障害を受けている。これら１５００万ケースの脳卒中のうち、１２７０万ケースで、高血圧が寄与因子であると推定されている。英国では、毎年およそ１５万人が脳卒中を起こし、１年に約５３，０００人が脳卒中で死亡している。脳卒中は、イングランド単独で、毎年８０億ポンドと推定されるコストを経済にかけており、脳卒中患者は、救急病院の全ベッドのおよそ２０パーセント、長期入院用ベッドの２５パーセントを占めている。脳卒中は、３つのサブタイプに分類され得る：
ｉ）虚血性脳卒中（ＩＳ）は、脳への血液供給が減少する場合に発生し、脳が損傷を受ける結果となる。虚血性脳卒中は、通常は血餅により、血管が閉塞された場合に発生する。この血餅は、動脈硬化プラークにて局所的に形成される場合があり（血栓性脳卒中）、または、別の選択肢として、血流中に運ばれる他所を起源とする粒子もしくはデブリに起因して発生する場合もある（塞栓性脳卒中）；
ｉｉ）一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）は、脳への血液供給が一時的に減少される場合に発生する、「ミニ脳卒中」である。症状が急速に消散される（２４時間以内に個人が正常な健康状態に戻る）場合に、ＴＩＡと診断される；ならびに、
ｉｉｉ）出血性脳卒中（ＨＳ）は、血液が頭蓋冠内に蓄積される場合に、通常は、弱化した血管が破裂した場合に発生する。出血性脳卒中は、２つの主たるサブタイプに分類され得るものであり、すなわち、脳内（脳組織内）およびくも膜下（脳の表面の周囲およびその保護層下）である。
【０００２】
ＩＳおよびＴＩＡは、全脳卒中ケースのおよそ８５％を占め、ＨＳは、１５％を占める。脳卒中後の神経損傷を最小限に抑えるためには、適切な治療を施すことができるように、脳卒中患者を迅速かつ正確に診断することが極めて重要である。例えば、血餅を分解するためには、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）などの血栓溶解療法が施され得る。しかし、そのような治療法は、ＩＳの場合にのみ必要とされるものであり、ＨＳでは有害である。ＴＩＡではその性質からそのような治療法は必要ではなく、その様なケースでは、ワルファリンおよびアスピリンなどの抗凝血剤が処方される。
【０００３】
現時点では、脳卒中が疑われる場合、身体的症状の評価が行われ、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンが通常は実施される。ＣＴスキャンは、ＨＳ患者の識別には良好な感度（およそ９０％の感度）を有するが、ＩＳおよびＴＩＡの患者の識別の感度は悪い（およそ２０％の感度）。実際、ＴＩＡの場合、その一過性の性質のために、組織損傷は最小限であるか、またはまったくなく、従って、ＣＴスキャンは、診断技術としては効果的で
はない。磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）では、ＩＳ診断の感度が改善されている（最大でおよそ８０％）が、要する時間の増加、機器の利用可能度、および高コストにより、脳卒中診断へのその使用は限られてきた。ＩＳおよびＴＩＡの検出のためのＣＴスキャンが低感度であることは、ＩＳおよびＴＩＡの検出のための生体液に基づく診断バイオマーカー試験が、医師が脳卒中のサブタイプを診断する際の極めて貴重なツールとなることを意味している。生体液に基づく診断バイオマーカーは、脳卒中診断を促進し、その正確性を高める可能性を有している。
【０００４】
脳卒中および脳卒中サブタイプを示す診断のための様々なバイオマーカー候補が提案されており、ＥＰ１２３８２８４、ＷＯ２０１０／０８６６９７、ＷＯ２０１０／０１２８３４、およびＷＯ２００２／０１２８９２を例とする先行技術には、ＩＳ／ＴＩＡ対ＨＳの区別についてのいくつかの記述が存在する。
【０００５】
ＥＰ１４１９３８８には、ＨＳからＩＳを、および非脳卒中コントロールから全脳卒中タイプを区別するデータが開示されている。しかし、これまでのところ、いずれも臨床実践にて有用ではなく、正確な診断を可能とする高い感度および特異性を有する３つすべての脳卒中サブタイプのバイオマーカーが実際に臨床的に求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
さらに、ＴＩＡからＩＳを示すバイオマーカーは、現在のところ存在しない。血液検査を用いてＴＩＡからＩＳを示すことは、より多くの情報に基づく臨床判断を容易とし、高価で迅速性に欠ける神経画像処理診断を不要とする可能性を有し、血栓溶解療法による介入を必要とする可能性のある患者の識別を改善する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第一の態様によると、本発明は、脳卒中を有する疑いのある患者において脳卒中の診断を行うための方法を提供し、その方法は、その患者から得られた生体外サンプル中の少なくとも２つのバイオマーカーの濃度を特定すること、および各バイオマーカーの濃度値を対応するコントロール値と比較することによってバイオマーカーの濃度の有意性を確立することを含み、ここで、少なくとも２つのバイオマーカーは、ＩＣＡＭ‐１、Ｌ‐セレクチン、Ｐ‐セレクチン、ＶＣＡＭ‐１、ＩＬ‐６、ｓＴＮＦＲ１、Ｄ‐ダイマー、およびＣＲＰから選択され、ならびにここで、２つのバイオマーカーのうちの少なくとも１つは、ＩＣＡＭ‐１、Ｌ‐セレクチン、Ｐ‐セレクチン、およびＶＣＡＭ‐１から選択される。
【０００８】
第二の態様によると、本発明は、本発明の第一の態様に従う方法で用いられる、ＩＣＡＭ‐１、Ｌ‐セレクチン、Ｐ‐セレクチン、ＶＣＡＭ‐１、ＩＬ‐６、ｓＴＮＦＲ１、Ｄ‐ダイマー、およびＣＲＰから選択される少なくとも２つのバイオマーカーのためのプローブを含む基材を提供し、ここで、基材は、ＩＣＡＭ‐１、Ｌ‐セレクチン、Ｐ‐セレクチン、およびＶＣＡＭ‐１のうちの少なくとも１つのためのプローブを含む。
【０００９】
第三の態様によると、本発明は、第一の態様に従う脳卒中を診断するための方法における、第二の態様に従う基材の使用に関する。
【００１０】
第四の態様によると、本阻害は、脳卒中を有することが疑われる患者における虚血性脳卒中の診断を補助する方法を提供し、その方法は、
ｉ）その患者から得られた生体外サンプル中のＶＣＡＭ‐１、ならびにｈ‐ＦＡＢＰ、ＩＬ‐６、およびＣＲＰから選択される１つ以上のバイオマーカーの濃度を特定すること；ならびに、
ｉｉ）各バイオマーカーの濃度値を対応するコントロール値と比較することによってバイオマーカーの濃度の有意性を確立すること、を含み、ここで、対応するコントロール値は、一過性脳虚血発作の１もしくは複数の患者から得られた生体外サンプルから特定された対応するバイオマーカーの濃度値である。この方法を用いることで、虚血性脳卒中と一過性脳虚血発作とを区別して診断することができる。
【００１１】
第五の態様によると、本発明は、本発明の第四の態様に従う方法にて用いるための、ＶＣＡＭ‐１、ならびにｈ‐ＦＡＢＰ、ＩＬ‐６、およびＣＲＰから選択される少なくとも１つの他のバイオマーカーのためのプローブを含む基材を提供する。
【００１２】
第六の態様によると、本発明は、第四の態様に従う脳卒中を診断するための方法における、第五の態様に従う基材の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、全脳卒中患者、各脳卒中サブタイプ、およびコントロール対象におけるＶＣＡＭ‐１の濃度を示すグラフである。
【図２】図２は、全脳卒中患者、各脳卒中サブタイプ、およびコントロール対象におけるＩＣＡＭ‐１の濃度を示すグラフである。
【図３】図３は、全脳卒中患者、各脳卒中サブタイプ、およびコントロール対象におけるＥ‐セレクチンの濃度を示すグラフである。
【図４】図４は、全脳卒中患者、各脳卒中サブタイプ、およびコントロール対象におけるＰ‐セレクチンの濃度を示すグラフである。
【図５】図５は、全脳卒中患者、各脳卒中サブタイプ、およびコントロール対象におけるＬ‐セレクチンの濃度を示すグラフである。
【図６】図６は、全脳卒中患者、各脳卒中サブタイプ、およびコントロール対象におけるＩＬ‐６の濃度を示すグラフである。
【図７】図７は、全脳卒中患者、各脳卒中サブタイプ、およびコントロール対象におけるｓＴＮＦＲ１の濃度を示すグラフである。
【図８】図８は、全脳卒中患者、各脳卒中サブタイプ、およびコントロール対象におけるＮＧＡＬの濃度を示すグラフである。
【図９】図９は、全脳卒中患者、各脳卒中サブタイプ、およびコントロール対象におけるＤ‐ダイマーの濃度を示すグラフである。
【図１０】図１０は、全脳卒中患者、各脳卒中サブタイプ、およびコントロール対象におけるＴＭの濃度を示すグラフである。
【図１１】図１１は、全脳卒中患者、各脳卒中サブタイプ、およびコントロール対象におけるＣＲＰの濃度を示すグラフである。
【図１２】図１２は、全脳卒中患者、各脳卒中サブタイプ、およびコントロール対象におけるｈ‐ＦＡＢＰの濃度を示すグラフである。
【図１３】図１３は、全脳卒中患者、各脳卒中サブタイプ、およびコントロール対象における希釈ＣＲＰの濃度を示すグラフである。
【図１４】図１４は、ＶＣＡＭ‐１のＲＯＣ曲線である（全脳卒中対コントロール）。
【図１５】図１５は、ＩＣＡＭ‐１のＲＯＣ曲線である（全脳卒中対コントロール）。
【図１６】図１６は、Ｐ‐セレクチンのＲＯＣ曲線である（全脳卒中対コントロール）。
【図１７】図１７は、Ｌ‐セレクチンのＲＯＣ曲線である（全脳卒中対コントロール）。
【図１８】図１８は、ＩＬ‐６のＲＯＣ曲線である（全脳卒中対コントロール）。
【図１９】図１９は、ｓＴＮＦＲ１のＲＯＣ曲線である（全脳卒中対コントロール）。
【図２０】図２０は、ＣＲＰのＲＯＣ曲線である（全脳卒中対コントロール）。
【図２１】図２１は、ＮＧＡＬのＲＯＣ曲線である（全脳卒中対コントロール）。
【図２２】図２２は、Ｄ‐ダイマーのＲＯＣ曲線である（全脳卒中対コントロール）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、脳卒中の迅速な診断に用いることができ、さらには、３つの脳卒中サブタイプ：出血性脳卒中（ＨＳ）、虚血性脳卒中（ＩＳ）、および一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）の区別の補助に用いることができるバイオマーカーに基づく方法、ならびにバイオチップに関する。
【００１５】
特に断りのない限り、本明細書における「脳卒中」の用語への言及はすべて、脳卒中の３つの形態すべてを包含する。
【００１６】
本明細書における「脳卒中を有することが疑われる患者」または「脳卒中を有していたことがある」という言及は、現在脳卒中に罹患していることが疑われる患者、または過去に脳卒中を有していたことが疑われる患者を含む。脳卒中は、個人が臨床的支援を求めるプロセスを開始することになったイベントなど、最近のイベントであってもよい。
【００１７】
「対象」および「患者」の用語は、本明細書にて交換可能に用いられてよく、非霊長類（例：ウシ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、ラット、およびマウス）ならびに霊長類（例：サルおよびヒト）を含む哺乳類を意味する。好ましくは、対象または患者は、ヒトである。
【００１８】
本明細書で用いられる場合、「バイオマーカー」の用語は、患者から得られた生物学的サンプル中に存在し、前記サンプル中の濃度が、病理学的状態を示し得るものである分子を意味する。単独もしくは他の診断方法と組み合わせて、または他のバイオマーカーと組み合わされる補完的バイオマーカーとして、脳卒中および脳卒中サブタイプの診断に有用であることが見出された様々なバイオマーカーについて、本明細書にて記載する。本明細書で用いられる場合、「補完的バイオマーカー」の用語は、診断を補助するために他の脳卒中バイオマーカーと合わせて用いることができるバイオマーカーを意味する。
【００１９】
バイオマーカーの正常または「バックグラウンド」濃度が、例えば年齢、性別、もしくは人種／地理学的ジェノタイプに起因して僅かな変動を示し得ることは、本技術分野にて充分に理解されている。その結果として、本発明の方法で用いられるカットオフ値も、目的の患者／集団に応じた最適化のために、僅かに変動し得る。
【００２０】
患者から得られた生物学的サンプルは、好ましくは、血液、血清、または血漿サンプルである。本明細書で用いられる場合、「生体外」の用語は、本技術分野におけるその通常の意味を有し、患者の体内から取り出されたサンプルを意味する。
【００２１】
分析のために患者から血液サンプルが採取される場合、全血、血清、または血漿が分析される。血液サンプルの分析は、クロマトグラフィーなどの予備分離工程と連結された質量分析などのいくつかの分析法によって行われ得る。好ましい方法は、免疫検出に基づくものである。免疫検出技術はまた、臨床環境外で用いるために、可搬型または携帯型デバイスへ容易に組み込まれる。タンパク質の量の検出には、ウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡなどの定量的免疫アッセイが用いられ得る。分析の好ましい方法は、複数のタンパク質を同時に検出し、定量することを可能とする多成分バイオチップ（multianalyte biochip）の使用を含む。２Ｄゲル電気泳動も、多成分分析に用いられ得る技術である。
【００２２】
本発明の第一の態様は、脳卒中を有する疑いのある患者において脳卒中の診断を行うための方法を提供し、その方法は、その患者から得られた生体外サンプル中の少なくとも２つのバイオマーカーの濃度を特定すること、および各バイオマーカーの濃度値を対応するコントロール値と比較することによってバイオマーカーの濃度の有意性を確立することを含み、ここで、少なくとも２つのバイオマーカーは、ＩＣＡＭ‐１、Ｌ‐セレクチン、Ｐ‐セレクチン、ＶＣＡＭ‐１、ＩＬ‐６、ｓＴＮＦＲ１、Ｄ‐ダイマー、およびＣＲＰか
ら選択され、ならびにここで、２つのバイオマーカーのうちの少なくとも１つは、ＩＣＡＭ‐１、Ｌ‐セレクチン、Ｐ‐セレクチン、およびＶＣＡＭ‐１から選択される。
【００２３】
好ましくは、少なくとも２つのバイオマーカーは、（ｉ）ＩＣＡＭ‐１またはＶＣＡＭ‐１、および（ｉｉ）Ｌ‐セレクチンまたはＰ‐セレクチンから選択され、より好ましくは、それらは、ＩＣＡＭ‐１およびＬ‐セレクチンである。３つ以上のバイオマーカーの組み合わせも、それらが最も高い感度および特異性を示すことから、好ましい。
【００２４】
好ましい実施形態において、この方法は、ＩＬ‐６、ｓＴＮＦＲ１、Ｄ‐ダイマー、およびＣＲＰから選択される１つ以上のバイオマーカーのサンプル濃度を特定することをさらに含む。この方法はまた、ｈ‐ＦＡＢＰのサンプル濃度を特定することをさらに含んでもよい。
【００２５】
誤解を避けるために、本発明の本態様に関して、「脳卒中」は、「全脳卒中」（すなわち、３つの脳卒中サブタイプすべて）を意味する。
【００２６】
好ましいバイオマーカーの組み合わせは、表１または表２に挙げるものである。これらの表は、脳卒中対コントロールにおける種々のバイオマーカーの組み合わせについての感度、特異性、およびＡＵＣデータを提供する。
【００２７】
【表１−１】
2015500464.tif 000003
【００２８】
【表１−２】
2015500464.tif 000004
【００２９】
【表１−３】
2015500464.tif 000005
【００３０】
【表１−４】
2015500464.tif 000006
【００３１】
【表１−５】
2015500464.tif 000007
【００３２】
【表２−１】
2015500464.tif 000008
【００３３】
【表２−２】
2015500464.tif 000009
【００３４】
【表２−３】
2015500464.tif 000010
【００３５】
バイオマーカー濃度は、バイオマーカーの組み合わせに含まれるバイオマーカーの各々に対して特異的であるプローブを有する基材とサンプルを接触させることによって特定することができる。バイオマーカーとその対応するプローブとの間の相互作用は、本技術分野にて公知の種々の技術を用いてモニタリングし、定量することができる。バイオマーカー濃度は、好ましくは、ｎｇ／ｍＬで測定される。
【００３６】
好ましくは、本発明の方法において、固体デバイスが用いられ、好ましくは、Ｂｉｏｃｈｉｐ  Ａｒｒａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのシステム（ＢＡＴ）（ランドックスラボラトリーズ社（Randox Laboratories Limited）より入手可能）である。より好ましくは、サンプル中のバイオマーカーレベルの特定に、Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒの装置（ランドックスラボラトリーズ社より入手可能）が用いられてよい。
【００３７】
コントロール値は、脳卒中を起こしたことのない１もしくは複数の個人から得られた生物学的サンプル中の対応するバイオマーカーの濃度から得られる。脳卒中を起こしたことのないそのような（１もしくは複数の）個人は、例えば、健康な個人、脳卒中以外の疾患に罹患している個人であってよい。別の選択肢として、コントロール値は、脳卒中イベントの前に患者から得られたサンプル中のバイオマーカーの各々の濃度に対応してもよい。
【００３８】
誤解を避けるために、「対応するバイオマーカー」の用語は、患者サンプルに関して特定されたバイオマーカーの同一の組み合わせの濃度が、コントロール値の特定にも用いられることを意味している。例えば、患者サンプル中のＩＣＡＭ‐１およびＬ‐セレクチンの濃度が特定された場合は、コントロールサンプル中のＩＣＡＭ‐１およびＬ‐セレクチンの濃度も特定される。
【００３９】
好ましい実施形態では、患者およびコントロールのバイオマーカー濃度値の各々が、１つ以上の統計アルゴリズムに入力されて、脳卒中が起こったかどうかを示す出力値が得られる。
【００４０】
カットオフ濃度または値は、統計技法を用いて得られ；統計アルゴリズムの開発のための種々の異なる方法が利用可能であり、当業者に公知である。バイオマーカー統計解析の標準的な方法は、単変量法を用いて種々のグループのバイオマーカーレベルを比較し、その濃度がグループ全体、および特定のグループ間にて有意に異なるバイオマーカーをハイライトするものである。
【００４１】
本発明に従って用いられる統計法の正確性は、その受信者動作特性（ＲＯＣ）によって最も良く記述することができる。ＲＯＣ曲線は、試験の感度、真陽性の数、および特異性
、真陰性の数、の両方を扱っている。従って、バイオマーカーの任意の組み合わせについての感度および特異性の値は、アッセイの正確性を示している。例えば、バイオマーカーの組み合わせが、８０％の感度および特異性値を有する場合、脳卒中を有する１００人の患者のうち８０人が、バイオマーカーの特定の組み合わせの存在の特定から脳卒中について陽性であると正しく識別され、一方、脳卒中に罹患したことのない１００人の患者のうち８０人が、その疾患について陰性であると正確に試験されることになる。
【００４２】
２つ以上のバイオマーカーが診断法にて用いられることになる場合、ロジスティック回帰式などの適切な数学モデルが誘導され得る。ロジスティック回帰式は、患者の年齢および性別などのその他の変量を含む可能性がある。ＲＯＣ曲線を用いて、ロジスティック回帰モデルの正確性が評価され得る。臨床的意思決定のために、ロジスティック回帰式は、独立して、またはアルゴリズムとして用いられ得る。ロジスティック回帰式は、そのようなケースで用いられる一般的な数学的／統計的手順であり、本発明に関して好ましいものであるが、その他の数学的／統計的手順も用いられ得る。
【００４３】
例として、脳卒中を有していたことがある、または現在罹患している疑いのある患者において、脳卒中対非脳卒中（コントロール）の識別のために、ＩＣＡＭ‐１、Ｌ‐セレクチン、Ｄ‐ダイマー、およびｓＴＮＦＲ１のバイオマーカーの組み合わせに対して、本発明に適用可能であるロジスティック回帰式は（分類カットオフ値０．５にて）、以下の様に算出され：
【００４４】
【数１】
2015500464.tif 000011
数式中、［ＩＣＡＭ‐１］、［Ｌ‐セレクチン］、［Ｄ‐ダイマー］、および［ｓＴＮＦＲ１］は、患者から採取された血液サンプル中にて測定されたＩＣＡＭ‐１、Ｌ‐セレクチン、Ｄ‐ダイマー、およびｓＴＮＦＲ１の濃度である（ＡＵＣ値は表１の１１８番を参照）。
【００４５】
本発明の方法を行った結果が、脳卒中の陽性診断である場合は、患者はそれに応じて治療されるべきである。しかし、最も適切で効果的である治療は、脳卒中のサブタイプに応じて様々であることから、脳卒中の陽性診断に続いて、３つの異なるサブタイプ間の区別をさらに行うことが可能であることは有用である。例えば、患者がＩＳに罹患した場合、血餅を分解するために、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）などの血栓溶解療法が施され得る。別の選択肢として、患者がＴＩＡに罹患した場合、ワルファリンおよびアスピリンなどの抗凝血剤が処方され得る。
【００４６】
従って、さらなる実施形態によると、本発明の第一の態様に従う方法は、所望に応じて、本発明の第四の態様にて定められるように、ＩＳとＴＩＡとを区別して診断するための追加の工程を実施することを含んでよい。
【００４７】
本発明の第二の関連する態様は、本発明の第一の態様に従う患者の脳卒中を診断するための方法において用いられる、ＩＣＡＭ‐１、Ｌ‐セレクチン、Ｐ‐セレクチン、ＶＣＡＭ‐１、ＩＬ‐６、ｓＴＮＦＲ１、Ｄ‐ダイマー、およびＣＲＰから選択される少なくとも２つのバイオマーカーのためのプローブを含む基材を提供し、ここで、基材は、ＩＣＡＭ‐１、Ｌ‐セレクチン、Ｐ‐セレクチン、およびＶＣＡＭ‐１のうちの少なくとも１つのためのプローブを含む。所望に応じて、基材は、ｈ‐ＦＡＢＰのためのプローブをさら
に含んでよい。
【００４８】
好ましくは、基材は、その上に固定された少なくとも２つのプローブ、より好ましくは、３、４、または５つ以上のプローブを有し、ここで、各プローブは、個別のバイオマーカーに対して特異的である。本明細書で用いられる場合、「特異的」の用語は、プローブが、本発明のバイオマーカーの１つにのみ結合し、本発明のその他のバイオマーカー、または分析される生物学的サンプル中のその他の分析成分との結合は無視できる程度であることを意味する。このことにより、本発明のバイオマーカーを用いた診断アッセイおよびその結果の完全性が、追加の結合イベントによって損なわれないことが確保される。
【００４９】
基材は、１つ以上のプローブを支持することができるいかなる物質であってもよいが、好ましくは、バイオチップである。バイオチップは、平面基材であり、例えば無機物またはポリマーベースであってよいが、好ましくは、セラミックである。本発明の種々のバイオマーカー／タンパク質を識別する際、完全長タンパク質を識別するだけでなく、それがタンパク質の正確な識別を可能とするものである限りにおいては、タンパク質の１もしくは複数の断片の識別も可能であることは当業者にとって明らかである。同様に、本発明の好ましいプローブは、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であるが、アプタマー、分子インプリントポリマー、ファージ、短鎖抗体断片、およびその他の抗体系プローブなどのその他のプローブが用いられてもよい。
【００５０】
本発明の関連する第三の態様では、第二の態様に従う基材が、本発明の第一の態様に従う方法で用いられる。
【００５１】
本発明はまた、ＩＣＡＭ‐１、Ｌ‐セレクチン、Ｐ‐セレクチン、ＶＣＡＭ‐１、ＩＬ‐６、ｓＴＮＦＲ１、Ｄ‐ダイマー、およびＣＲＰから選択される少なくとも２つのバイオマーカーのためのプローブ、追加の試薬、基材／反応表面、および／または使用説明書を含むキットも提供する。そのようなキットを用いて、本発明の第一の態様に従う患者における脳卒中の診断を行うことができる。
【００５２】
本発明の第四の態様は、脳卒中を有することが疑われる患者における虚血性脳卒中の診断を補助する方法を提供し、その方法は、
ｉ）その患者から得られた生体外サンプル中のＶＣＡＭ‐１、ならびにｈ‐ＦＡＢＰ、ＩＬ‐６、およびＣＲＰから選択される１つ以上のバイオマーカーの濃度を特定すること；ならびに、
ｉｉ）各バイオマーカーの濃度値を対応するコントロール値と比較することによってバイオマーカーの濃度の有意性を確立すること、を含み、ここで、対応するコントロール値は、一過性脳虚血発作の１もしくは複数の患者から得られた生体外サンプルから特定された対応するバイオマーカーの濃度値である。
【００５３】
有利には、この方法を用いることで、虚血性脳卒中と一過性脳虚血発作とを区別して診断することができる。
【００５４】
バイオマーカーまたはバイオマーカーの組み合わせの各々は、単独で、または補完的バイオマーカーとして用いられてよい。好ましいバイオマーカーの組み合わせは、表４のデータから識別することができる。
【００５５】
コントロール値は、ＴＩＡを有する、または有したことがあるとして臨床診断された１名以上の患者における、ＶＣＡＭ‐１、ならびにｈ‐ＦＡＢＰ、ＩＬ‐６、およびＣＲＰの１つ以上のバイオマーカー濃度を測定することによって確立することができる。診断は、臨床医による診察、および神経画像処理分析（これはＨＳの可能性を排除する）などの
技術を用いて得られてよい
【００５６】
バイオマーカー濃度は、サンプルを、バイオマーカーの組み合わせに含まれるバイオマーカーの各々に対して特異的であるプローブを有する基材と接触させることによって特定することができる。バイオマーカーとその対応するプローブとの間の相互作用は、本技術分野にて公知の種々の技術を用いてモニタリングおよび定量されてよい。
【００５７】
好ましい実施形態では、患者およびコントロールのバイオマーカー濃度値の各々が、１つ以上の統計アルゴリズムに入力されて、虚血性脳卒中が起こったかどうかを示す出力値が得られる。
【００５８】
例として、以下の濃度（「カットオフ」濃度）が、患者におけるＩＳの診断の補助となる：ｈ‐ＦＡＢＰ≧約１０ｎｇ／ｍＬ；ＶＣＡＭ‐１≧約５７０ｎｇ／ｍＬ；ＣＲＰ≧約３０μｇ／ｍＬ；およびＩＬ‐６≧約１２ｐｇ／ｍＬ。しかし、バイオマーカーの正常または「バックグラウンド」濃度は、例えば年齢、性別、もしくは人種／地理学的ジェノタイプに起因して僅かな変動を示し得る。その結果として、用いられるカットオフ値も、目的の患者／集団に応じた最適化のために、僅かに変動し得る。
【００５９】
カットオフ濃度または値は、通常、統計的技法を用いて得られる。バイオマーカーの統計解析の標準的方法は、単変量法を用いて種々のグループのバイオマーカーレベルを比較し、その濃度が特定のグループ間にて有意に異なるバイオマーカーをハイライトするものである。これに続いて、受信者動作特性（ＲＯＣ）分析が行われる。
【００６０】
本発明の第一の態様に関連して上記で述べたように、ＲＯＣ曲線は、診断試験の正確性を評価する好ましい方法である。これはまた、曲線下面積（ＡＵＣ）の形態で、試験の予測力の測定値も提供し、それは、０．５から１．０の値を有し得る。一般則として、約８０％以上の感度および約８０％以上の特異性を有する試験が、本技術分野にて有用である可能性を有する試験と見なされるが、これらの値は、臨床適用に応じて様々である。
【００６１】
本発明の方法に従ってＩＳとＴＩＡとを区別するためには、高い特異性が極めて重要である。任意の試験において、そのＡＵＣの値が１．０に近い程、その予測力は大きい。２つ以上のバイオマーカーが関与するいずれの試験に対しても、ロジスティック回帰式が誘導され得る。ロジスティック回帰式は、患者の年齢および性別などのその他の変量を含み得る。ＲＯＣ曲線を用いて、ロジスティック回帰モデルの正確性が評価され得る。臨床的意思決定を補助するために、ロジスティック回帰式は、独立して、またはアルゴリズムとして用いられ得る。ロジスティック回帰式は、一般的な数学的／統計的ツールであるが、その他の数学的／統計的手順も本技術分野にて公知であり、本発明に従って用いられ得る。
【００６２】
本発明の本態様に従う方法を実施したことによる結果は、ＩＳまたはＴＩＡのいずれかの診断となり、患者は、次に、それに応じて治療されるべきである。本発明の方法を実施した結果として、患者がＩＳに罹患したと判断される場合、血餅を分解するために、血栓溶解療法（例：組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ））などの適切な治療法が施され得る。これは、医師の判断に従って、その他の適切な治療法と合わせて施されてよい。本発明の方法を実施した結果として、患者がＴＩＡに罹患したと判断される場合、ワルファリンおよびアスピリンなどの抗凝血剤が処方され、投与され得る。
【００６３】
本発明の関連する第五の態様は、患者における虚血性脳卒中の診断を補助するための本発明に従う方法にて用いるための、ＶＣＡＭ‐１、ならびにｈ‐ＦＡＢＰ、ＩＬ‐６、およびＣＲＰから選択される少なくとも１つの他のバイオマーカーのためのプローブを含む
基材を提供する。
【００６４】
基材は、少なくとも２つ、好ましくは、３または４つのプローブを含み、各プローブは、個々のバイオマーカーに対して特異的である。本明細書で用いられる場合、「特異的」の用語は、プローブが、本発明のバイオマーカーの１つにのみ結合し、本発明のその他のバイオマーカー、または分析される生物学的サンプル中のその他の分析成分との結合は無視できる程度であることを意味する。このことにより、本発明のバイオマーカーを用いた診断アッセイおよびその結果の完全性が、追加の結合イベントによって損なわれないことが確保される。
【００６５】
基材は、１つ以上のプローブを支持することができるいかなる物質であってもよいが、好ましくは、バイオチップである。バイオチップは、平面基材であり、例えば無機物またはポリマーベースであってよいが、好ましくは、セラミックである。本発明の種々のバイオマーカー／タンパク質を識別する際、完全長タンパク質を識別するだけでなく、それがタンパク質の正確な識別を可能とするものである限りにおいては、タンパク質の１もしくは複数の断片の識別も可能であることは当業者にとって明らかである。同様に、本発明の好ましいプローブは、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であるが、アプタマー、分子インプリントポリマー、ファージ、短鎖抗体断片、およびその他の抗体系プローブなどのその他のプローブが用いられてもよい。
【００６６】
好ましくは、本発明の方法において、固体デバイスが用いられ、好ましくは、Ｂｉｏｃｈｉｐ  Ａｒｒａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのシステム（ＢＡＴ）（ランドックスラボラトリーズ社より入手可能）である。より好ましくは、サンプル中のバイオマーカーレベルの特定に、Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒの装置（ランドックスラボラトリーズ社より入手可能）が用いられてよい。
【００６７】
本発明の関連する第六の態様では、第五の態様に従う基材が、本発明の第四の態様に従う方法で用いられる。
【００６８】
本発明はまた、ＶＣＡＭ‐１、ならびにｈ‐ＦＡＢＰ、ＩＬ‐６、およびＣＲＰから選択される少なくとも１つの他のバイオマーカーのためのプローブ、追加の試薬、基材／反応表面、および／または使用説明書を含むキットも提供する。そのようなキットを用いて、本発明の第三の態様に従う患者におけるＩＳの診断を行うことができる。
【００６９】
本発明のさらなる態様は、ｈ‐ＦＡＢＰ、ｓＴＮＦＲ１、ＩＬ‐６、Ｄ‐ダイマー、Ｌ‐セレクチン、Ｐ‐セレクチン、ＩＣＡＭ‐１、ＶＣＡＭ‐１、およびＣＲＰの１つ以上の、脳卒中または脳卒中サブタイプの補完的バイオマーカーとしての使用に関する。補完的バイオマーカーとして、それらは、ＤＪ‐１、ＢＮＰ、Ｓ１００β、ＭＭＰ‐９、ＭＣＰ‐１、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＣ３、フォン・ヴィルブランド因子、ＮＭＤＡ受容体、ＡＤＭＡ、およびＬｐ‐ＰＬＡ２などのタンパク質と合わせて、脳卒中／脳卒中サブタイプの診断に用いられ得る。
【００７０】
ここで、本発明について、以下の限定されない実施例を参照してさらに記載する。
【実施例】
【００７１】
患者グループ
この研究は、ギリシャのアテネにあるＫＡＴ総合病院の救急センターに入院した脳卒中の症状を示す９８人の患者から構成した。血液サンプルの採取を、入院時、第１、２、３、および７日に行った。脳卒中の症状の発症から入院までの平均時間は、３．２時間であ
った。患者の平均年齢は、７５．２歳であった（標準偏差９．４）。臨床医による評価（背景技術のセクションで強調した基準を使用）、および神経画像処理技術により、４４人の虚血性脳卒中（ＩＳ）、２５人の出血性脳卒中（ＨＳ）、２９人の一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）を識別し；６０人の健康な対象をコントロール（Ｃ）として用いた。
【００７２】
サンプル分析
以下のタンパク質を、研究グループの患者から得た血液のＥＤＴＡ血漿サンプルに対して試験した：ＩＣＡＭ‐１、ＶＣＡＭ‐１、Ｅ‐セレクチン、Ｌ‐セレクチン、Ｐ‐セレクチン、ＩＬ‐６、ｈ‐ＦＡＢＰ、ＣＲＰ、Ｄ‐ダイマー、ｓＴＮＦＲ１、ＴＭ、およびＮＧＡＬ。タンパク質は、バイオマーカー特異的抗体を組み込んだマルチプレックスバイオチップ（multiplexed biochips）、およびＥｖｉｄｅｎｃｅ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ（ランドックスラボラトリーズ社，クラムリン，英国）を用いて検出および定量した。製造元の説明書に従って同時免疫アッセイを行った。９点検量線および３つのレファレンスコントロールを各バイオマーカーについて分析して、結果を検証した。ＣＲＰでのＩＳ対ＴＩＡの分析では、サンプルを１０倍に希釈した。
【００７３】
統計解析
クラスカル・ワリス検定（有意水準０．０５）を用いて、４つのグループ（ＩＳ、ＨＳ、ＴＩＡ、およびＣ）全体にわたって差異的に発現された分析成分を識別した。異なるグループ間の事後比較を、ホルムの逐次ボンフェローニ補正（Holm's sequential Bonferroni adjustment）を用いて行った。マン・ホイットニー検定を用いて、「全脳卒中」および「コントロール」を比較した。結果を図１〜１３に示す。
【００７４】
単一のバイオマーカーをＲＯＣ曲線分析に掛けて、感度および特異性を評価した。ロジスティック回帰を用いて、バイオマーカーの種々の組み合わせの濃度に対する脳卒中および脳卒中サブタイプの依存性をモデル化し、続いて、ＲＯＣ曲線分析を行って、そのモデルによる分類の正確性を評価した。結果を図１〜２２に示す。
【００７５】
結果
表１および２に、脳卒中の診断（全脳卒中対コントロール）のためのバイオマーカーの代表的な組み合わせの感度、特異性、および統計検定力（ＡＵＣ）を詳細に示す。脳卒中の発生を試験するためにＩＣＡＭ‐１、ＶＣＡＭ‐１、Ｌ‐セレクチン、Ｐ‐セレクチン、ＩＬ‐６、ＣＲＰ、Ｄ‐ダイマー、およびｓＴＮＦＲ１から選択される２つ以上のバイオマーカーを組み合せることにより、高い診断性能を持つ試験が得られる。また、タンパク質ＶＣＡＭ‐１、ＩＬ‐６、ｈ‐ＦＡＢＰ、およびＣＲＰの血中濃度によってＩＳとＴＩＡとを区別することができることが初めて見出された。（１もしくは複数の）バイオマーカーの高い識別力が、本発明の有用性にとって不可欠である。ＴＩＡからのＩＳの区別を目的とする試験は、ＴＩＡが排除されるように、可能な限り高い特異性を有する必要がある。
【００７６】
（１もしくは複数の）バイオマーカーによってＴＩＡを排除することができない場合は、ＩＳまたはＴＩＡのいずれかであるという診断となり、すなわち、これらの２つの脳卒中サブタイプを区別することができないということになる。従って、試験の特異性は、可能な限り１００％に近づけるべきである。試験の感度は、患者にとって価値があり、経済的に成り立つものである充分な大きさを有するべきである。表３は、ＴＩＡ、ＩＳ、およびＨＳに罹患した患者における分析成分濃度の、マン・ホイットニー検定およびクラスカル・ワリス検定を用いた統計解析を示す。表４は、ＩＳ対ＴＩＡについて、個々の、およびグループ化したバイオマーカーのＲＯＣ曲線分析を示す（感度および特異性値）。分かるように、バイオマーカーの各々は、１００％の特異性、および一般的に用いられるＣＡＴスキャンと同等またはそれより高い感度を有している。このことは、臨床診断を容易と
し、および続いて行われる脳卒中が疑われる患者に対する経済的かつ迅速な形での治療判断に充分な情報を与えるものである。
【００７７】
【表３】
2015500464.tif 000012
【００７８】
【表４】
2015500464.tif 000013
【００７９】
本発明の臨床使用
本発明の使用については、脳卒中様イベントを起こした個人に関連する以下のシナリオを想定することができる：
ｉ）病院への搬送途中では、個人から生体液サンプルが採取され、本発明のバイオマーカーを用いた全脳卒中タイプについての試験が行われ  −  脳卒中陽性の結果が確認されると、医師によるその個人の診察およびＣＡＴスキャンを用いた分析の後に、さらにＨＳまたはＩＳ／ＴＩＡに階層化される。ＨＳが排除される場合は、ＩＳ／ＴＩＡを示すためにさらなるバイオマーカー試験が実施される。
ｉｉ）病院では、医師による診察の前に、ＣＡＴスキャン診察と合わせて、個人から採取された生体液サンプルの脳卒中バイオマーカー分析が行われ  −  ＨＳが排除される場合は、ＩＳ／ＴＩＡを示すためにさらなるバイオマーカー試験が実施される。
【００８０】
略語
ＩＬ−６  −  インターロイキン‐６
ＩＣＡＭ−１  −  細胞内接着分子‐１
ＶＣＡＭ−１  −  血管細胞接着分子‐１
ＣＲＰ  −  Ｃ‐反応性タンパク質
ｈ‐ＦＡＢＰ  −  ヒト脂肪酸結合タンパク質
ｓＴＮＦＲ  −  可溶性ＴＮＦα受容体
ＴＭ  −  トロンボモジュリン
ＮＧＡＬ  −  好中球ゲラチナーゼ関連リポカリン
ＭＭＰ‐９  −  マトリックスメタロプロテイナーゼ‐９
ＢＮＰ  −  脳性ナトリウム利尿ペプチド
ＡＤＭＡ  −  非対称性ジメチルアルギニン
Ｌｐ‐ＰＬＡ２  −  リポタンパク質関連ホスホリパーゼＡ２
【図１】
2015500464.tif 000014
【図２】
2015500464.tif 000015
【図３】
2015500464.tif 000016
【図４】
2015500464.tif 000017
【図５】
2015500464.tif 000018
【図６】
2015500464.tif 000019
【図７】
2015500464.tif 000020
【図８】
2015500464.tif 000021
【図９】
2015500464.tif 000022
【図１０】
2015500464.tif 000023
【図１１】
2015500464.tif 000024
【図１２】
2015500464.tif 000025
【図１３】
2015500464.tif 000026
【図１４】
2015500464.tif 000027
【図１５】
2015500464.tif 000028
【図１６】
2015500464.tif 000029
【図１７】
2015500464.tif 000030
【図１８】
2015500464.tif 000031
【図１９】
2015500464.tif 000032
【図２０】
2015500464.tif 000033
【図２１】
2015500464.tif 000034
【図２２】
2015500464.tif 000035
【国際調査報告】
2015500464.tif 000036
2015500464.tif 000037
2015500464.tif 000038
2015500464.tif 000039
2015500464.tif 000040
2015500464.tif 000041
2015500464.tif 000042