(57)【要約】本発明は、PR駆動性悪性腫瘍を患う患者が抗プロゲスチンである治療化合物による処置に応答する可能性が高いかどうかを示す遺伝子発現プロファイルを提供する。そのような応答性を同定することにより、処置提供者は、そのような処置の恩恵を受けるであろう患者を前もって決定しうると共に、ノンレスポンダーのための代替治療法を同定しうる。また、遺伝子発現プロファイルを使用する方法、および患者における遺伝子発現プロファイルの存在を同定するためのアッセイも提供する。また、野生型プロゲステロン受容体からK388Rプロゲステロン受容体を発現する細胞を区別する遺伝子発現シグネチャも提供する。2015516155.tif 000024
2015516155.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんが活性プロゲステロン受容体（KR）を発現する細胞を含み、かつ抗プロゲスチンによる治療的処置に応答する可能性が高いかどうかを決定するための方法であって、（a）がんと診断された患者から生物学的試料を取得する工程、（b）KBTBD11、RBPMS2、PLA2G48、FL112684、SH2D4B、RASCD2、CLDN8およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の、該生物学的試料の細胞における少なくとも一つの発現試料レベルを決定する工程、および（c）工程（b）における該少なくとも一つの発現試料レベルを、野生型（WT）対照試料の細胞における該少なくとも一つの遺伝子の少なくとも一つの発現レベルと比較する工程を含み、発現試料レベルが該対照試料と比較して減少しているのであれば、前記がんは抗プロゲスチンによる処置に対するレスポンダーである、方法。
【請求項２】
（d）VCX、CHN2、AFAP1L2、PXMP4、THY1、ZNF26、CDH10、ZNF812およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の、生物学的試料の細胞における発現レベルを決定する工程、および（e）工程（d）における発現レベルを、野生型（WT）対照試料における該少なくとも一つの遺伝子の発現レベルと比較する工程をさらに含み、生物学的試料における該少なくとも一つの遺伝子の発現レベルが該WT対照試料と比較して増加しているのであれば、がんは抗プロゲスチンによる処置に対するレスポンダーである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
がんが、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、脳がん、肺がん、前立腺がん、子宮内膜がん、髄膜腫または子宮がんからなる群より選択される、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
がん患者が抗プロゲスチン処置に応答すると考えられるかどうかを決定するための方法であって、
a.患者からの生物学的試料のがん細胞における、KR78D11、RBPMS2、PLA2G48、FL112684、SH2D4B、RASCD2、CLDN8およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現レベルを測定する工程を含み、
b.対照WT試料におけるレベルと比べて、生物学的試料における前記少なくとも一つの遺伝子の減少した発現のレベルは、患者が抗プロゲスチン処置に応答すると考えられることのしるしである、方法。
【請求項５】
（c）VCX、CHN2、AFAP1L2、PXMP4、THY1、ZNF26、CDH10、ZNF812およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の、生物学的試料の細胞における発現レベルを決定する工程、および（d）工程（c）における発現レベルを、野生型（WT）対照試料における該少なくとも一つの遺伝子の発現レベルと比較する工程をさらに含み、生物学的試料における該少なくとも一つの遺伝子の発現レベルが該WT対照試料と比較して増加しているのであれば、患者は抗プロゲスチンによる処置に対するレスポンダーである、請求項4記載の方法。
【請求項６】
遺伝子のmRNAレベルが遺伝子発現レベルの指標として測定される、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
遺伝子KB7BD11の発現がSEQ ID NO:1のプローブへのハイブリダイゼーションによって検出される、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
プローブがデバイスに貼付される、請求項7記載の方法。
【請求項９】
デバイスがマイクロアレイである、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
プローブが、少なくとも2つの前記遺伝子にハイブリダイズする多数の貼付されたプローブの一つである、請求項7記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも一つの前記遺伝子の発現レベルを測定することが、インサイチューハイブリダイゼーション、ノーザンブロット、核酸増幅、マイクロアレイ解析またはそれらの組み合わせを含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
KR78D11、RBPMS2、PLA2G48、FL112684、SH2D4B、RASCD2、CLDN8、VCX、CHN2、AFAP1L2、PXMP4、THY1、ZNF26、CDH10、ZNF812およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも2つの遺伝子の発現が測定される、請求項2〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
KR78D11、RBPMS2、PLA2G48、FL112684、SH2D4B、RASCD2、CLDN8、VCX、CHN2、AFAP1L2、PXMP4、THY1、ZNF26、CDH10、ZNF812およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも3つの遺伝子の発現が測定される、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
KR78D11、RBPMS2、PLA2G48、FL112684、SH2D4B、RASCD2、CLDN8、VCX、CHN2、AFAP1L2、PXMP4、THY1、ZNF26、CDH10、ZNF812およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも4つの遺伝子の発現が測定される、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
KR78D11、RBPMS2、PLA2G48、FL112684、SH2D4B、RASCD2、CLDN8、VCX、CHN2、AFAP1L2、PXMP4、THY1、ZNF26、CDH10、ZNF812およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも6つの遺伝子の発現が測定される、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
KR78D11、RBPMS2、PLA2G48、FL112684、SH2D4B、RASCD2、CLDN8、VCX、CHN2、AFAP1L2、PXMP4、THY1、ZNF26、CDH10、ZNF812およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも7、8、9、10、11、12、13、14または15個の遺伝子の発現が測定される、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
生物学的試料が、組織生検、乳管洗浄液または細針吸引物試料である、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
対照試料が非がん性組織の試料である、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
対照が患者に由来する、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
抗プロゲスチン療法を開始または中止するように医療提供者に助言する工程をさらに含む、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
患者にがんの処置をすることをさらに含む、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
処置が有効量の少なくとも一つの抗プロゲスチンを投与する工程を含む、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
処置が少なくとも一つの追加治療剤を投与する工程をさらに含む、請求項21または22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
がん患者を処置するための方法であって、対照と比較して、KR78D11、RBPMS2、PLA2G48、FL112684、SH2D4B、RASCD2、CLDN8およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子のレベルが減少している、かつ/または、VCX、CHN2、AFAP1L2、PXMP4、THY1、ZNF26、CDH10、ZNF812およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子のレベルが増加している患者に、がん患者が処置されるように、抗プロゲスチンを単独でまたは他の処置と組み合わせて投与する工程を含む、方法。
【請求項２５】
（c）VCX、CHN2、AFAP1L2、PXMP4、THY1、ZNF26、CDH10、ZNF812およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の、生物学的試料の細胞における発現レベルを決定する工程、および（d）工程（a）における発現レベルを、対照における該少なくとも一つの遺伝子の発現レベルと比較する工程をさらに含み、生物学的試料における該少なくとも一つの遺伝子の発現レベルが該対照と比較して増加しているのであれば、患者は抗プロゲスチンによる処置に対するレスポンダーである、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
がんと診断された患者が、活性プロゲステロン受容体（KR）を発現する細胞を含み、かつ抗プロゲスチンによる治療的処置に応答する可能性が高いかどうかを決定するための方法であって、（a）患者から生物学的試料を取得する工程、（b）生物学的試料の細胞における、THY1、KLF9、SPINK5L.3、PHLDA1、MAP1A、SPRYD5、ATG12、PDK4、MSX2、TUBA3E、TSC22D1、TUBA3D、KHDRBS3、UTS2D、SLC35C1、KIAA0513およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現レベルを決定する工程、および（c）工程（b）における発現レベルを、野生型（WT）対照試料における該少なくとも一つの遺伝子の発現レベルと比較する工程を含み、生物学的試料における該少なくとも一つの遺伝子の発現レベルが該WT対照試料と比較して増加しているのであれば、患者は抗プロゲスチンによる処置に対するレスポンダーである、方法。
【請求項２７】
がんが、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、脳がん、肺がん、前立腺がん、子宮内膜がん、髄膜腫または子宮がんである、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
がん患者が抗プロゲスチン処置に応答すると考えられるかどうかを決定するための方法であって、
a.患者からの生物学的試料における、THY1、KLF9、SPINK5L.3、PHLDA1、MAP1A、SPRYD5、ATG12、PDK4、MSX2、TUBA3E、TSC22D1、TUBA3D、KHDRBS3、UTS2D、SLC35C1、KIAA0513およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現のレベルを測定する工程
を含み、
b.WT対照試料におけるその発現レベルと比較して、生物学的試料における前記少なくとも一つの遺伝子の増加した発現のレベルが、対象は抗プロゲスチン処置に応答すると考えられることのしるしである、
方法。
【請求項２９】
mRNAレベルが遺伝子発現レベルの指標として測定される、請求項26〜28のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
遺伝子THY1の発現がSEQ ID NO:16のプローブへのハイブリダイゼーションによって検出される、請求項26記載の方法。
【請求項３１】
プローブがデバイスに貼付される、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
デバイスがマイクロアレイである、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
少なくとも一つの遺伝子の発現レベルを測定することが、インサイチューハイブリダイゼーション、ノーザンブロット、核酸増幅、マイクロアレイ解析またはそれらの組み合わせを含む、請求項26〜32のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
THY1、KLF9、SPINK5L.3、PHLDA1、MAP1A、SPRYD5、ATG12、PDK4、MSX2、TUBA3E、TSC22D1、TUBA3D、KHDRBS3、UTS2D、SLC35C1、KIAA0513およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも2つの遺伝子の発現が測定される、請求項26〜29のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
THY1、KLF9、SPINK5L.3、PHLDA1、MAP1A、SPRYD5、ATG12、PDK4、MSX2、TUBA3E、TSC22D1、TUBA3D、KHDRBS3、UTS2D、SLC35C1、KIAA0513およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも3つの遺伝子の発現が測定される、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
THY1、KLF9、SPINK5L.3、PHLDA1、MAP1A、SPRYD5、ATG12、PDK4、MSX2、TUBA3E、TSC22D1、TUBA3D、KHDRBS3、UTS2D、SLC35C1、KIAA0513およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも4つの遺伝子の発現が測定される、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
THY1、KLF9、SPINK5L.3、PHLDA1、MAP1A、SPRYD5、ATG12、PDK4、MSX2、TUBA3E、TSC22D1、TUBA3D、KHDRBS3、UTS2D、SLC35C1、KIAA0513およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも6つの遺伝子の発現が測定される、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
THY1、KLF9、SPINK5L.3、PHLDA1、MAP1A、SPRYD5、ATG12、PDK4、MSX2、TUBA3E、TSC22D1、TUBA3D、KHDRBS3、UTS2D、SLC35C1、KIAA0513およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも7つの遺伝子の発現が測定される、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
THY1、KLF9、SPINK5L.3、PHLDA1、MAP1A、SPRYD5、ATG12、PDK4、MSX2、TUBA3E、TSC22D1、TUBA3D、KHDRBS3、UTS2D、SLC35C1、KIAA0513およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15または16個の遺伝子の発現が測定される、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
生物学的試料が、組織生検、乳管洗浄液または細針吸引物試料である、請求項26〜39のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１】
対照試料が非がん性組織の試料である、請求項26〜40のいずれか一項記載の方法。
【請求項４２】
対照が患者に由来する、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
抗プロゲスチン療法を開始または中止するために医療提供者に情報を与える工程をさらに含む、請求項26〜42のいずれか一項記載の方法。
【請求項４４】
患者にがんの処置をすることをさらに含む、請求項26〜43のいずれか一項記載の方法。
【請求項４５】
処置が有効量の少なくとも一つの抗プロゲスチンを投与する工程を含む、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
処置が少なくとも一つの追加治療剤を投与する工程をさらに含む、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
がん患者を処置するための方法であって、対照と比較して、THY1、KLF9、SPINK5L.3、PHLDA1、MAP1A、SPRYD5、ATG12、PDK4、MSX2、TUBA3E、TSC22D1、TUBA3D、KHDRBS3、UTS2D、SLC35C1、KIAA0513およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現レベルが増加している患者に、がん患者が処置されるように、抗プロゲスチンを単独でまたは他の処置と組み合わせて投与する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2012年4月27日に出願された米国仮出願第61/639,407号に基づく優先権を主張し、その開示は全て参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府の権利に関する陳述
本発明は、米国国立衛生研究所からの米国助成金番号CA1159712-01の下に政府の支援を受けてなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
最新のmRNA（例えば遺伝子発現ベースの）予後判定乳がんスクリーニング検査（Oncotype DXなど）は、乳がん進行に関与することがそれぞれ公知である限られた数の無関係な遺伝子の発現についてアッセイする。乳がんは非常に不均質な疾患であるため、これらの検査は、急速に拡大しつつある既存薬および新薬のリストを含む所与の標的療法の恩恵を受ける可能性が最も高い患者を選択し損なう。そこで医療提供者は、利用可能な薬物のランダムな組み合わせを、それらの併用処置が臨床的応答または臨床的利益を与えることを期待して、試さざるを得ない。また、これらの戦略は、遺伝子発現データのいかなる集合体の発現も、それらの発現の原因となる何らかの明確な機序に関連付けることができない（すなわちターゲットは不明である）。
【発明の概要】
【０００４】
プロゲステロン受容体は乳がん進行の重要なドライバーとして注目を集めている。閉経後女性における（エストロゲンと組み合わされたホルモン補充療法の一部としての）プロゲスチン処置は、その女性たちの乳がんリスクを有意に増加させる。最近の研究では、実際、エストロゲンのみの補給によって女性を乳がんから保護しうることが示唆されている。本明細書には、プロゲスチン作用の原因となる一つの例示的機序、すなわち活性化脱SUMO化ホスホプロゲステロン受容体転写を記載する。一局面では、主としてプロゲステロン受容体（PR）駆動性の腫瘍を持ち、それゆえに抗エストロゲン（例えばタモキシフェン）、抗プロゲスチン、またはアロマターゼ阻害剤療法に対して感受性である可能性が高い乳がん患者を同定するために使用することができるであろうユニークな遺伝子シグネチャが定義される。もう一つの局面では、PR遺伝子シグネチャが、抗プロゲスチンを含む治療法の適当な候補である女性の集団を同定するために使用される。
【０００５】
抗プロゲスチン処置に関する重要な問題は、関連する臨床的治療ターゲットである活性化PRを同定する方法である。一局面において、本例示的方法は、臨床の場で日常的に得ることができるヒト腫瘍組織中に機能的な（活性化された）状態で存在するPRを特徴付けることを目指している。不活性PRを特異的抗プロゲスチンでアンタゴナイズしても治療的には意味がないので、本例示的方法は、抗プロゲスチンによる患者の処置に指針を与えるための新しい決定的な情報を提供する。そのような予測的診断検査は、（1）抗プロゲスチンに関する治療的意思決定を裏付け、（2）抗プロゲスチン処置に応答する可能性が高い個々の患者および患者集団の選択に指針を与え、そして（3）抗プロゲスチン処置に応答する可能性または抗プロゲスチン処置の恩恵を受ける可能性が最も低い個々の患者を排除するための、一貫した方法を提供する。
【０００６】
本明細書には、高いキナーゼ活性を含有するがん細胞、例えばPR-Bが（Ser294で）リン酸化されかつ/または（Lys388で）脱SUMO化されることで、高転写活性（核内転写因子）受容体を生み出すことができるがん細胞において、プロゲステロン受容体（例えばヒトPRアイソフォームAおよび/またはB）によってアップレギュレートされる遺伝子を同定するための例示的戦略および方法を記載する。PR転写作用の従来の理解は、プロテインキナーゼカスケードとのPR-Bの特異的相互作用の結果として生じるPR-Bの（PR-Aとの比較で）ユニークな転写活性を考慮できなかったことが妨げになっていた。がん細胞において脱SUMO化（そしておそらくリン酸化）PR-Bが特異的にアップレギュレートまたはダウンレギュレートする内在性遺伝子を同定するための本明細書記載の戦略および方法は、この種のものとしては初めての戦略および方法である。
【０００７】
現在、ステロイドホルモン（SR）陽性（ルミナール（luminal））乳がんを持つ全女性の少なくとも半分は、エストロゲン産生またはエストロゲン受容体（ER）作用の遮断を目指す内分泌療法が効かない。SR陽性乳がんまたはルミナール乳がんを持つ患者（全乳がん患者の約70％）のための新規臨床スクリーニング（予後判定）プロトコールの一部として、利用可能な抗エストロゲンおよびアロマターゼ阻害剤処置に応答してPR駆動性の増殖と内分泌療法抵抗性への進行とを起こす可能性が極めて高い腫瘍を持つ患者を同定するために、脱SUMO化ホスホPR駆動性遺伝子シグネチャの発現を使用することができる。そのような患者は、抗プロゲスチンを含有する内分泌療法の候補であるだろう。選択的PR修飾因子は存在し、それらの一部は新しい抗プロゲスチン/選択的PR修飾因子、例えばミフェプリストン（RU486）、ロナプリサン（ZK-230211）、テラプリストン（ProellexまたはCDB-4124）、オナプリストン（ZK-98299）、アソプリスニル、ウリプリスタール酢酸エステル、アグレプリストン、ZM172406、ZM172405およびZM150271などであるが、それらに限定されるわけではない。
【０００８】
本発明は、抗プロゲスチンによる処置に応答する可能性が高い患者（これらの患者を「レスポンダー」という）およびそのような処置の恩恵を受ける可能性が低い患者（これらの患者を「ノンレスポンダー」という）を同定するための遺伝子発現プロファイルおよび方法を提供する。ここで提供される諸局面は、処置提供者が、抗プロゲスチンによる処置に対するレスポンダーである患者とそのような処置に対するノンレスポンダーである患者を、作用物質の投与に先立って同定することを可能にする。
【０００９】
本発明はさらに、がんを患う患者の抗プロゲスチンによる処置に応答する傾向を指示する遺伝子発現プロファイル（「遺伝子シグネチャ」ともいう）を含む。本遺伝子発現プロファイルは、表1aおよび表1bにおいて特定される群から選択される少なくとも一つ、好ましくは多数の遺伝子を含む。この遺伝子の群を本明細書では「抗プロゲスチンレスポンダー遺伝子」という。本発明の諸局面によれば、抗プロゲスチン療法に対するレスポンダーである患者では、これらの遺伝子の一部または全部が差次的に発現（例えばアップレギュレートまたはダウンレギュレート）される。
【００１０】
本発明は、がんを持つ患者が抗プロゲスチンによる処置に対するレスポンダーであるかノンレスポンダーであるかを決定する方法を、さらに含む。一局面において、本方法は、患者から悪性組織または悪性細胞の試料（例えば腫瘍試料、循環腫瘍細胞）を取得する工程、試料の少なくとも一つの遺伝子発現プロファイルを決定する工程、および抗プロゲスチンレスポンダー遺伝子から選択される少なくとも一つの遺伝子が試料中で過剰発現または過小発現しているかどうかを、少なくとも一つの遺伝子発現プロファイルから、例えば対照試料からの少なくとも一つの遺伝子発現プロファイルとの比較によって決定することを含む。この情報から、処置提供者は、患者が抗プロゲスチン療法の恩恵を受ける可能性が高いかどうかを確認することができる。
【００１１】
もう一つの局面において、本発明は、患者の組織試料における遺伝子発現プロファイルを決定するためのアッセイ、およびアッセイの使用説明書を、さらに含む。
【００１２】
一態様は、がんと診断された患者が抗プロゲスチンによる治療的処置に応答する可能性が高いかどうかを決定するためのアッセイであって、（a）該患者から生物学的試料を取得する工程、（b）該生物学的試料における、表1aおよび/または表1bにおいて特定される少なくとも一つの遺伝子の発現レベルを決定する工程、および（c）工程（b）における発現レベルを、対照における同じ遺伝子の発現レベルと比較する工程を含み、表1aおよび/または表1b中の少なくとも一つの遺伝子のレベルが、該生物学的試料からの試料において、該対照と比較して、増加/アップレギュレートしているのであれば、患者は抗プロゲスチンによる処置に対するレスポンダーであるアッセイを提供する。もう一つの態様では、少なくとも一つの遺伝子の発現レベルが、生物学的試料において減少/ダウンレギュレートしている。
【００１３】
もう一つの態様は、乳がん患者が抗プロゲスチン処置に応答すると考えられるかどうかを決定するための方法であって、a.患者からの生物学的試料における、表1aおよび/または表1bにおいて特定される少なくとも一つの遺伝子の発現のレベルを測定する工程を含み、b.生物学的試料における前記少なくとも一つの遺伝子の発現のレベルが、対象が抗プロゲスチン処置に応答すると考えられることのしるしである方法を提供する。
【００１４】
一態様では、mRNAレベルが遺伝子発現レベルの指標として測定される。一態様では、複数のmRNAが個別に測定される。もう一つの態様では、複数のmRNAが同時に測定される。一態様では、少なくとも一つの遺伝子の発現レベルを、インサイチューハイブリダイゼーション、ノーザンブロット、核酸増幅、マイクロアレイ解析またはそれらの組み合わせからなる群より選択される技法のいずれかを使って測定することができる。一態様では、核酸増幅法が、ポリメラーゼ連鎖反応、定量ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される。もう一つの態様では、遺伝子発現レベルがマイクロアレイ解析によって測定される。
【００１５】
一態様では、表1aおよび/または表1bにおいて特定される少なくとも2つの遺伝子の発現が測定される。もう一つの態様では、表1aおよび/または表1bにおいて特定される少なくとも3つの遺伝子の発現が測定される。一態様では、表1aおよび/または表1bにおいて特定される少なくとも4つの遺伝子の発現が測定される。もう一つの態様では、表1aおよび/または表1bにおいて特定される少なくとも6つの遺伝子の発現が測定される。一態様では、表1aおよび/または表1bにおいて特定される少なくとも9つの遺伝子の発現が測定される。もう一つの態様では、表1aおよび/または表1bにおいて特定される少なくとも12個の遺伝子の発現が測定される。もう一つの態様では、表1において特定される少なくとも15個の遺伝子および/または表1bにおいて特定される16個の遺伝子の発現が測定される。
【００１６】
一態様では、遺伝子の発現が対照と比べて増加している。
【００１７】
一態様では、生物学的試料が組織生検、乳管洗浄液、細針吸引物、外科的に切除した腫瘍の切片、循環腫瘍細胞、循環DNAまたは循環エキソソームである。もう一つの態様では、対照が非がん性組織の試料である。一態様では、非がん性組織の対照が患者に由来する。もう一つの態様では、対照が、前記少なくとも一つの遺伝子の前もって決定された対照量または濃度である。一態様では、陰性対照が数値または数値の対照範囲である。
【００１８】
一態様では、患者が哺乳動物である。もう一つの態様では、哺乳動物がヒトである。一態様では、医療提供者に情報が与えられる。一態様では、患者が乳がんの処置を受ける。一態様では、患者に有効量の少なくとも一つの抗プロゲスチンが投与される。もう一つの態様では、処置が、少なくとも一つの追加治療剤を投与する工程を、さらに含む。
【００１９】
一態様は、がん患者を処置するための方法であって、表1aおよび/または表1b中の少なくとも一つの遺伝子の発現レベルが患者からの生物学的試料では対照と比較して増加/アップレギュレートしている患者に、抗プロゲスチンを単独でまたは他の処置と組み合わせて投与する工程を含む方法を提供する。
【００２０】
一態様は、がん患者を処置するための方法であって、表1a中の少なくとも一つの遺伝子の発現レベルが患者からの生物学的試料では対照と比較して減少/アップレギュレートしている患者に、抗プロゲスチンを単独でまたは他の処置と組み合わせて投与する工程を含む方法を提供する。
【００２１】
多くのPR遺伝子は、血液などの生物学的試料中に検出することができる分泌因子である。それゆえに、もう一つの態様では、本明細書において開示する遺伝子アレイまたはその一部を、まだ診断されていない人々におけるがんの早期検出のためのバイオマーカー（例えばmRNAレベルおよびタンパク質レベルでの遺伝子発現を含む）として使用することができる。
【００２２】
一態様は、がんと診断された患者が、活性プロゲステロン受容体（KR）を発現する細胞を含むがんを患っていて、抗プロゲスチンによる治療的処置に応答する可能性が高いかどうかを決定するための方法であって、（a）患者から生物学的試料を取得する工程、（b）生物学的試料の細胞における、KBTBD11、RBPMS2、PLA2G48、FL112684、SH2D4B、RASCD2、CLDN8、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現レベルを決定する工程、および（c）工程（b）における発現レベルを、野生型（WT）対照試料および/または参照試料の細胞における該少なくとも一つの遺伝子の発現レベルと比較する工程を含み、生物学的試料における該少なくとも一つの遺伝子の発現試料レベルが該対照/参照試料と比較して減少しているのであれば、患者は抗プロゲスチンによる処置に対するレスポンダーである方法を提供する。もう一つの態様は、（d）該生物学的試料の細胞における、VCX、CHN2、AFAP1L2、PXMP4、THY1、ZNF26、CDH10、ZNF812、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現レベルを決定する工程、および（e）工程（d）における発現レベルを、野生型（WT）対照試料および/または参照試料における該少なくとも一つの遺伝子の発現レベルと比較する工程をさらに提供し、ここで、生物学的試料における該少なくとも一つの遺伝子の発現レベルが該WT対照試料および/または参照試料と比較して増加しているのであれば、患者は抗プロゲスチンによる処置に対するレスポンダーである。
【００２３】
一態様では、がんが、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、脳がん、肺がん、前立腺がん、子宮内膜がん、髄膜腫または子宮がんである。
【００２４】
もう一つの態様は、がん患者が抗プロゲスチン処置に応答すると考えられるかどうかを決定するための方法であって、a.患者からの生物学的試料において、KR78D11、RBPMS2、PLA2G48、FL112684、SH2D4B、RASCD2、CLDN8およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現の、がん細胞におけるレベルを測定する工程を含み、b.対照WT試料および/または参照試料における該レベルと比べて、生物学的試料における前記少なくとも一つの遺伝子の減少した発現レベルは、対象が抗プロゲスチン処置に応答すると考えられることのしるしである方法を提供する。一態様は、（c）VCX、CHN2、AFAP1L2、PXMP4、THY1、ZNF26、CDH10、ZNF812およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の、該生物学的試料の細胞における発現レベルを決定する工程、および（d）工程（c）における発現レベルを、野生型（WT）対照試料および/または参照試料における該少なくとも一つの遺伝子の発現レベルと比較する工程をさらに含み、ここで、生物学的試料における該少なくとも一つの遺伝子の発現レベルが該WT対照試料および/または参照試料と比較して増加しているのであれば、患者は抗プロゲスチンによる処置に対するレスポンダーである（参照対照が設けられると考えられる。診断装置は参照対照に対して較正される）。
【００２５】
一態様では、少なくとも一つの遺伝子のmRNAレベルが、遺伝子発現レベルの指標として測定される。もう一つの態様では、少なくとも一つの遺伝子の発現レベルが、1回目と2回目に測定される。一態様では、例えば遺伝子KB7BD11の発現が、例えばSEQ ID NO:1のプローブへのハイブリダイゼーションによって検出される。一態様では、複数のmRNAが個別に測定される。もう一つの態様では、複数のmRNAが同時に測定される。一態様では、プローブが、該遺伝子のうちの少なくとも2つにハイブリダイズする多数の貼付されたプローブのうちの一つである。一態様では、該遺伝子の少なくとも一つの発現レベルを測定する工程が、インサイチューハイブリダイゼーション、ノーザンブロット、核酸増幅、マイクロアレイ解析またはそれらの組み合わせを含む。
【００２６】
一態様では、KR78D11、RBPMS2、PLA2G48、FL112684、SH2D4B、RASCD2、CLDN8、VCX、CHN2、AFAP1L2、PXMP4、THY1、ZNF26、CDH10、ZNF812、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも2つの遺伝子の発現が測定される。もう一つの態様では、KR78D11、RBPMS2、PLA2G48、FL112684、SH2D4B、RASCD2、CLDN8、VCX、CHN2、AFAP1L2、PXMP4、THY1、ZNF26、CDH10、ZNF812、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも3つの遺伝子の発現が測定される。もう一つの態様では、KR78D11、RBPMS2、PLA2G48、FL112684、SH2D4B、RASCD2、CLDN8、VCX、CHN2、AFAP1L2、PXMP4、THY1、ZNF26、CDH10、ZNF812、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも4つの遺伝子の発現が測定される。さらなる一態様では、KR78D11、RBPMS2、PLA2G48、FL112684、SH2D4B、RASCD2、CLDN8、VCX、CHN2、AFAP1L2、PXMP4、THY1、ZNF26、CDH10、ZNF812、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも6つの遺伝子の発現が測定される。もう一つの態様では、KR78D11、RBPMS2、PLA2G48、FL112684、SH2D4B、RASCD2、CLDN8、VCX、CHN2、AFAP1L2、PXMP4、THY1、ZNF26、CDH10、ZNF812、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも7、8、9、10、11、12、13、14または15個の遺伝子の発現が測定される。
【００２７】
一態様では、生物学的試料が、組織生検、乳管洗浄液、細針吸引物、外科的に切除した腫瘍の切片、循環腫瘍細胞、循環DNAまたは循環エキソソームである。もう一つの態様では、対照試料が非がん性組織の試料である。一態様では、対照試料が患者に由来する。
【００２８】
一態様は、抗プロゲスチン療法を開始または中止するように医療提供者に助言することを可能にする。もう一つの態様は、例えば有効量の少なくとも一つの抗プロゲスチンを投与することにより、患者にがんの処置をする。一態様では、処置が、少なくとも一つの追加治療剤を、さらに含む。
【００２９】
一態様は、がん患者を処置するための方法であって、対照と比較して、KR78D11、RBPMS2、PLA2G48、FL112684、SH2D4B、RASCD2、CLDN8、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現レベルが減少している、かつ/またはVCX、CHN2、AFAP1L2、PXMP4、THY1、ZNF26、CDH10、ZNF812、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現レベルが増加している患者に、該がん患者が処置されるように、抗プロゲスチンを単独でまたは他の処置と組み合わせて投与する工程を含む方法を提供する。もう一つの態様は、（c）VCX、CHN2、AFAP1L2、PXMP4、THY1、ZNF26、CDH10、ZNF812、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の、該生物学的試料の細胞における発現レベルを決定する工程、および（d）工程（a）における発現レベルを、対照における該少なくとも一つの遺伝子の発現レベルと比較する工程をさらに提供し、ここで、生物学的試料における該少なくとも一つの遺伝子の発現レベルが該対照と比較して増加しているのであれば、患者は抗プロゲスチンによる処置に対するレスポンダーである。
【００３０】
一態様は、がんと診断された患者が、活性プロゲステロン受容体（KR）を発現する細胞を含み、抗プロゲスチンによる治療的処置に応答する可能性が高いかどうかを決定するための方法であって、（a）患者から生物学的試料を取得する工程、（b）生物学的試料の細胞における、THY1、KLF9、SPINK5L.3、PHLDA1、MAP1A、SPRYD5、ATG12、PDK4、MSX2、TUBA3E、TSC22D1、TUBA3D、KHDRBS3、UTS2D、SLC35C1、KIAA0513、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現レベルを決定する工程、および（c）工程（b）における発現レベルを野生型（WT）対照試料および/または参照試料における該少なくとも一つの遺伝子の発現レベルと比較する工程を含み、生物学的試料における該少なくとも一つの遺伝子の発現レベルが該WT対照試料および/または参照試料と比較して増加しているのであれば、患者は抗プロゲスチンによる処置に対するレスポンダーである方法を提供する。
【００３１】
一態様では、がんが、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、脳がん、肺がん、前立腺がん、子宮内膜がん、髄膜腫または子宮がんである。
【００３２】
もう一つの態様は、がん患者が抗プロゲスチン処置に応答すると考えられるかどうかを決定するための方法であって、a.患者からの生物学的試料における、THY1、KLF9、SPINK5L.3、PHLDA1、MAP1A、SPRYD5、ATG12、PDK4、MSX2、TUBA3E、TSC22D1、TUBA3D、KHDRBS3、UTS2D、SLC35C1、KIAA0513、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現のレベルを測定する工程を含み、b.WT対照試料および/または参照試料におけるその発現のレベルと比較して、生物学的試料における前記少なくとも一つの遺伝子の増加した発現のレベルは、対象が抗プロゲスチン処置に応答すると考えられることのしるしである方法を提供する。
【００３３】
一態様では、mRNAレベルが遺伝子発現レベルの指標として測定される。一態様では、遺伝子の発現、例えばTHY1の発現が、例えばSEQ ID NO:16のプローブへのハイブリダイゼーションによって検出される。
【００３４】
一態様では、複数のmRNAが、個別に測定される。もう一つの態様では、複数のmRNAが同時に測定される。一態様では、少なくとも一つの遺伝子の発現レベルを測定する工程が、インサイチューハイブリダイゼーション、ノーザンブロット、核酸増幅、マイクロアレイ解析、またはそれらの組み合わせを含む。
【００３５】
一態様では、THY1、KLF9、SPINK5L.3、PHLDA1、MAP1A、SPRYD5、ATG12、PDK4、MSX2、TUBA3E、TSC22D1、TUBA3D、KHDRBS3、UTS2D、SLC35C1、KIAA0513、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも2つの遺伝子の発現が測定される。もう一つの態様では、THY1、KLF9、SPINK5L.3、PHLDA1、MAP1A、SPRYD5、ATG12、PDK4、MSX2、TUBA3E、TSC22D1、TUBA3D、KHDRBS3、UTS2D、SLC35C1、KIAA0513、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも3つの遺伝子の発現レベルが測定される。もう一つの態様では、THY1、KLF9、SPINK5L.3、PHLDA1、MAP1A、SPRYD5、ATG12、PDK4、MSX2、TUBA3E、TSC22D1、TUBA3D、KHDRBS3、UTS2D、SLC35C1、KIAA0513、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも4つの遺伝子の発現レベルが測定される。もう一つの態様では、THY1、KLF9、SPINK5L.3、PHLDA1、MAP1A、SPRYD5、ATG12、PDK4、MSX2、TUBA3E、TSC22D1、TUBA3D、KHDRBS3、UTS2D、SLC35C1、KIAA0513およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも6つの遺伝子の発現レベルが測定される。もう一つの態様では、THY1、KLF9、SPINK5L.3、PHLDA1、MAP1A、SPRYD5、ATG12、PDK4、MSX2、TUBA3E、TSC22D1、TUBA3D、KHDRBS3、UTS2D、SLC35C1、KIAA0513、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも7つの遺伝子の発現レベルが測定される。もう一つの態様では、THY1、KLF9、SPINK5L.3、PHLDA1、MAP1A、SPRYD5、ATG12、PDK4、MSX2、TUBA3E、TSC22D1、TUBA3D、KHDRBS3、UTS2D、SLC35C1、KIAA0513、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個または16個の遺伝子の発現レベルが測定される。
【００３６】
一態様では、生物学的試料が、組織生検、乳管洗浄液、細針吸引物、外科的に切除した腫瘍の切片、循環腫瘍細胞、循環DNAまたは循環エキソソームである。もう一つの態様では、対照試料が、例えば患者からの、非がん性組織の試料である。
【００３７】
一態様は、抗プロゲスチン処置を開始または中止するために医療提供者に情報を与えることを可能にする。もう一つの態様は、患者にがんの処置をすることを含む。一態様では、処置が、有効量の少なくとも一つの抗プロゲスチンを投与する工程を含む。もう一つの態様では、処置が、少なくとも一つの追加治療剤を投与する工程を、さらに含む。
【００３８】
一態様は、がん患者を処置するための方法であって、THY1、KLF9、SPINK5L.3、PHLDA1、MAP1A、SPRYD5、ATG12、PDK4、MSX2、TUBA3E、TSC22D1、TUBA3D、KHDRBS3、UTS2D、SLC35C1、KIAA0513、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現レベルが、対照と比較して増加している患者に、該がん患者が処置されるように、抗プロゲスチンを単独でまたは他の処置と組み合わせて投与する工程を含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】R5020ありまたはR5020なしで6時間処理した、WT PRまたはSUMO欠損PRを安定に発現するT47D細胞の遺伝子発現プロファイリングを示す。（A）12のヒト乳腺腫瘍における全PRタンパク質およびホスホ-Ser294 PRタンパク質を示すウェスタンブロット（全ERK1/2をローディング対照とした）。（B）PR-Bに関するウェスタンブロッティングに先立って、野生型PR-B（WT）、SUMO欠損変異型K388R PR-B（KR）、または空ベクター（ヌル）対照を安定に発現するT47D細胞を、R5020なしまたはR5020ありで処理した。（C）差次的に発現した転写産物に関する標準化発現値を示すヒートマップ（少なくとも一つの試料において倍率変化＞8.0、BH調整P＜0.001）。各処理群について生物学的二重試料を示し、注目に値する遺伝子発現カテゴリー（右側に1〜4の番号を付す）を記載している（結果、を参照のこと）。（D）プロゲスチン処理後のアップレギュレートまたはダウンレギュレートされたPRターゲット遺伝子を示すベン図（log2倍率変化＞0.6、BH調整P＜0.01;通常倍率変化＞1.5）。（E）PRヌル細胞との比較でアップレギュレートまたはダウンレギュレートされたリガンド非依存性PRターゲット遺伝子の数を表すベン図（D図と同様）。（F）R5020なしまたはR5020ありで6時間処理した、ベクター対照（PRヌル）、WT PRまたはKR PRを安定に発現するT47D細胞における、選択されたPRターゲット遺伝子の相対的mRNA発現（RT-qPCRで決定したもの）;リガンド依存性（LD）またはリガンド非依存性（LI）ベンカテゴリーから選ばれた遺伝子を示す（注:色分けは共通）。データはn＝3の平均±SDを表す。
【図１．１】T47D細胞における誘導性PR発現のアイソジェニックモデルの作製および検証を示す。（A）材料と方法、において述べるようにクローン誘導性細胞株を開発し、誘導因子分子AP21967による2日間の処理およびR5020による1時間の処理後に、ウェスタンブロッティングによってPRタンパク質発現を決定した。プロゲスチン依存性PRリン酸化は、PRホスホ-Ser294特異的抗体を使って測定した。β-アクチンウェスタンブロッティングをローディング対照として行った。R5020による短期間処理により、プロゲスチン依存性の、PRのグローバルなリン酸化（全PRのわずかなゲル上方シフトによって示される）と、等レベルのリガンド依存性Ser294リン酸化とが実証された。（B）2つの独立したモデル系およびプラットフォームから得られた全ゲノム発現プロファイリングデータセットの遺伝子セットエンリッチメント解析（GSEA)比較:（i）Illumina HT-12v4プラットフォームを使ったWT PRおよび変異型KR PRを安定に発現するT47D細胞（−/＋R5020）および（ii）Affymetrix U133A 2.0プラットフォームを使った誘導性WT PRまたは変異型KR PRを発現するT47D細胞（−/＋AP21967、−/＋R5020）。WT ＋R5020（またはKR ＋R5020）によってIlluminaデータセットにおいて最もアップレギュレートされた遺伝子は左端に現れ、WT ＋R5020（またはKR ＋R5020）によって最もダウンレギュレートされた遺伝子は右端に現れる。GSEAアプリケーションを使って、Affymetrix遺伝子（黒い縦棒）を、Illuminaデータセットに沿って位置付け（アップレギュレートされた遺伝子からダウンレギュレートされた遺伝子へ）、統計的エンリッチメントスコアを決定した。AffymetrixとIlluminaの間で全ての処理群が統計的に有意であった（P＜0.001）。（C）iWT PRおよびiKR PRを発現するT47D細胞株において、遺伝子発現レベルを、2つのPRターゲット遺伝子（MSX2およびMAP1A）について検証した。PR発現を誘導するために細胞をAP21967で処理し、RU486および/またはR5020で同時処理してから、RT-qPCR遺伝子発現解析を行った。データをn＝3の平均±SDとして表す。
【図２】PR Ser294のリン酸化は、MCF-7およびT47D細胞において、SUMO欠損PR遺伝子発現およびプロモーター選択性を駆動する。（A）患者コホートからの組織試料におけるPRターゲット遺伝子の相対的発現レベル（コピー数）。（B）空ベクター（PRヌル）、WT PRまたはSUMO欠損K388R PRを安定に発現するMCF-7細胞における、選択されたPRターゲット遺伝子の相対的遺伝子発現レベル。細胞を合成プロゲスチンR5020および/または抗プロゲスチンRU486で6時間、同時処理し、RT-qPCRを使ってmRNAレベルを測定した（方法、参照）。（C）次のPRを安定に発現する5つの同ベクターT47D細胞株において、RT-qPCRを使って、同じPRターゲット遺伝子（図A〜Bと同じ）の相対的遺伝子発現レベルを測定した:空ベクター（ヌル）、野生型（WT）PR、K388R変異型（KR）PR、S294A変異型（SA）PR、ならびにK388RおよびS294A二重変異型（KRSA）PR。細胞をR5020で6時間、処理した。（D）WT PRを発現するT47D細胞を上皮成長因子（EGF）で2日間処理し、R5020で3、24、または48時間処理した。RT-qPCRを使って、相対的MAP1AおよびRGS2 mRNAレベルを測定した。（E）親T47Dco細胞を、24時間のR5020処理に先立って、EGFで20分間、前処理した。RT-qPCRによって相対的RGS2 mRNAレベルを測定した。データをn＝3の平均±SDとして表し、Studentのt検定を使って有意性を計算する。
【図３】プロモーター選択性は、エンハンサー座位へのSUMO欠損KR PR、CBP、MLL2およびヒストンテール修飾H3K4me2の動員が増加することによって達成される。（A）転写開始部位から15,094bp上流にあるMSX2遺伝子PRE含有エンハンサー領域を示す模式図。（B）構成的PRヌル、WT PRまたはKR PRを発現するT47D細胞において、R5020による1時間または4時間の処理後に、MSX2エンハンサー領域へのPRの相対的動員を、ChIP-qPCRアッセイによって測定した。PR動員値をインプットクロマチンDNA値のパーセンテージとして標準化した。バックグランド非特異的抗体結合を調節するために、免疫沈降クロマチンは全ての試料からの混合物をIgG抗体と共に含有した。類似のChIP結果が、誘導性PRを発現するT47D細胞において得られた（右側）。（C）MSX2エンハンサー領域へのCBPの相対的動員を図Bで説明したように測定した。（D）MSX2エンハンサーにおけるH3K4ジメチル化のレベルを誘導性PR発現細胞株（iWTおよびiKR）において測定した。MSX2エンハンサー、PREの上流/下流におけるH3K4me2の存在を、この領域をまたぐオーバーラッピングqPCR産物を使って決定した。（E）MSX2エンハンサー領域へのMLL2動員を、構成的PRを発現するT47D細胞および誘導性PRを発現するT47D細胞の両方において、図Bで述べたように決定した。（F）安定WT PRまたはSUMO欠損KR PRを発現するT47D細胞において、MAT2A遺伝子発現をRT-qPCRによって測定した。加えて、標準ChIP-qPCRアッセイによって測定されるPRおよびMLL2動員も、これらの細胞において定量した。データを、n＝3±SDとして表し、Studentのt検定を使って有意性を計算する。図3.1、3.2も参照されたい。
【図３．１】図3に関連する選択されたPRターゲット遺伝子エンハンサーへのWT PR分子およびSUMO欠損PR分子の相対的動員を示すChIPアッセイ。（A）WT（iWT）受容体およびKR（iKR）受容体を発現するT47D細胞の誘導性モデルにおいて、RGS2、MAP1A、およびPDK4の上流プロモーター/エンハンサー領域中のコンセンサスPRE配列へのPR分子の動員（1時間のR5020ばく露後）を、標準ChIPアッセイによって測定した。HBB遺伝子のイントロン領域へのPRの動員を陰性対照として含めた。（B）WT PRまたはSUMO欠損（KR）PRのいずれかを安定に発現するT47D細胞において、RGS2エンハンサーへの差次的PR動員を実証するために、図Aと同じようにChIPアッセイを行った。データをn＝3の平均±SDとして表す。
【図３．２】ホスホ-Ser5 RNAポリメラーゼIIおよび全RNAポリメラーゼIIの動員に関するMSX2近位プロモーター領域におけるChIP解析。（A）WT（iWT）受容体およびKR（iKR）受容体を発現するT47D細胞の誘導性モデルにおいて、MSX2近位プロモーター領域への全RNAポリメラーゼIIの動員（1時間のR5020ばく露後）を、標準ChIPアッセイによって測定した。（B）CTD Ser5リン酸化の検出によって測定される、機能的に活性なRNAポリメラーゼIIを標的とする抗体を使って、図Aと同様にChIPアッセイを行った。データをn＝3の平均±SDとして表す。
【図３．３】SUMO欠損PRは、Ingenuityパスウェイ解析によって決定される細胞増殖に関与する遺伝子をアップレギュレートする。WT PRまたはKR PRのどちらかを発現する細胞においてプロゲスチンによってアップレギュレートされる遺伝子（log2倍率変化＞1.0、BH調整P＜0.01;通常倍率変化＞2.0）を含んでいる複数の細胞機能（x軸）の有意な発現（y軸）。有意な数のアップレギュレートされた遺伝子を含有する生物学的パスウェイは、BH調整P＜0.05を表す水平線を上回るバーを示す。
【図４】SUMO欠損プロゲステロン受容体は、細胞増殖の増加およびアポトーシスの減少を促進する。（A）誘導性PRを発現するT47D細胞株の増殖能を、プロゲスチン（R5020）および誘導因子AP21967（AP）の存在下で、MTTアッセイを使って測定した。（B）誘導性PR発現が、細胞培養培地へのAP21967の添加後、少なくとも5日間は持続することを示すウェスタンブロット。ERK1/2ウェスタンブロッティングをローディング対照として行った。（C）誘導性PRを発現する細胞で起こっているアポトーシスを、ポリ(ADP)-リボースポリメラーゼ1（PARP）切断に関するウェスタンブロッティングによって検出した。タンパク質を収穫する前に、細胞をプロゲスチンおよび/またはドキソルビシンで処理した。（D）4日目のルミネセンスを0日目に対して標準化する細胞生存率ルシフェラーゼアッセイを使って、PRを構成的に発現する細胞における増殖およびアポトーシスを測定した。プールされたデータをn＝6の平均±SDとして表し、Studentのt検定を使って有意性を計算する。
【図４．１】リガンド依存性（LD）およびリガンド非依存性（LI）KR＞WT遺伝子シグネチャを掲載する。LD（151遺伝子）およびLI（92遺伝子）KR＞WT遺伝子シグネチャリストの全体を各々のプローブIDと共に掲載する。
【図５】SUMO欠損PR遺伝子発現シグネチャはHER2陽性ヒト乳腺腫瘍と関連し、低下した患者生存率を予測する。（A）標準化遺伝子発現レベル（本発明者らのLD KR＞WT遺伝子シグネチャ中の遺伝子について）を、ERBB2ステータスによって整理した患者コホート中の各腫瘍（Bonnefoiら、2007）について表す。（B）BT-474ヒト乳がん細胞において、遺伝子発現レベルを、CHN2およびRGS2（どちらもSUMO欠損PRによってアップレギュレートされ、LD KR＞WT遺伝子シグネチャのメンバーである）と対照遺伝子ACOT6（WT受容体とKR受容体のどちらによっても等しくアップレギュレートされる）について、RT-qPCRで測定した。プロゲスチンまたは抗プロゲスチン同時処理に先立って、細胞をMEKキナーゼ阻害剤U0126で前処理した。タンパク質レベルを、全PR、PR Ser294リン酸化、全ERK1/2、およびERK1/2リン酸化について、ウェスタンブロッティングで評価した。（C）複合T47Dメタ遺伝子（WTまたはKR、−/＋R5020）を発現する腫瘍を持つ患者についての、これらのメタ遺伝子を欠く患者腫瘍との比較での、遠隔転移までの時間に関するKaplan-Meier生存曲線。患者試料は、Loiらのデータセット（Loiら、2007）からの無処置およびタモキシフェン処置ER陽性腫瘍を含む。（D）複合T47Dメタ遺伝子（KR −R5020、またはKR ＋R5020）を発現する腫瘍を持つ患者についての、これらのメタ遺伝子を欠く患者腫瘍との比較での、図Cと同様の生存曲線。図4.1も参照されたい。
【図５．１】この図には、RT-およびChIP-qPCRアッセイで使用した抗体情報およびプライマーセットの全てが含まれている。
【図６】プロゲステロンまたは抗プロゲスチンで処理されたT47D細胞における上位調節遺伝子。考えうる任意の試料比較（例えばプロゲステロン対エタノール）でアップレギュレートまたはダウンレギュレートされた任意の転写産物（＞2倍、BH調整P＜0.01）についての標準化された相対的発現値を示すヒートマップ。試料を6時間処理した。各処理群について生物学的三重試料を示す。遺伝子（行）を、教師なし階層的クラスタリングに基づいてグループ分けした;アップレギュレートされた発現値を赤色で表し、ダウンレギュレートされた発現値を青色で表す。
【図７】上位プロゲステロン調節遺伝子は、SUMO欠損PRを発現する細胞において、抗プロゲスチンRU486およびアグレプリストンによる処理後にもアップレギュレートされるが、オナプリストンではアップレギュレートされない。任意の細胞株においてプロゲステロン処理後にアップレギュレート（すなわちプロゲステロン対エタノール）された任意の転写産物（＞2.5倍、BH調整P＜0.01）について、標準化された相対的発現値を示すヒートマップ。個々のコホートにおいて細胞株を6時間処理した。各処理群について生物学的三重試料を示す。遺伝子（行）を教師なし階層的クラスタリングに基づいてグループ分けした。アップレギュレートされた発現値を赤色で表し、ダウンレギュレートされた発現値を青色で表す。
【図８】オナプリストンで処理した細胞は、PRを発現する細胞における遺伝子発現を刺激しない。図7からの処理群の教師なし階層的クラスタリング（列）。遺伝子（行）も教師なし階層的クラスタリングに基づいてグループ分けした。アップレギュレートされた発現値を赤色で表し、ダウンレギュレートされた発現値を青色で表す。
【図９】WT PRを発現する細胞とKR PRを発現する細胞とを識別することができる15の遺伝子。これら15の遺伝子は、WT細胞またはKR細胞においてユニークに調節されることが、3つの独立した統計学的方法（方法、参照）に合格することによって決定された。各転写産物について、標準化された相対的発現値を示すヒートマップ。試料を6時間処理した。各処理群について生物学的三重試料を示す（エタノール群およびプロゲスチン群についてn＝5）。遺伝子（行）を教師なし階層的クラスタリングに基づいてグループ分けした。アップレギュレートされた発現値を赤色で表し、ダウンレギュレートされた発現値を青色で表す。
【図１０】KRを発現する細胞では、29の遺伝子が特異的にアップレギュレートされることが、オーバーラップする2つの独立したマイクロアレイで同定される。WT PRを発現する細胞と比べて、SUMO欠損PR（KR）を発現する細胞において、プロゲステロン（P4）処理後に特異的にアップレギュレートされた全ての転写産物（＞1.5倍、BH調整P＜0.01）について、標準化された相対的発現値を示すヒートマップ。試料を6時間処理した。各処理群について生物学的三重試料を示す。遺伝子（行）を教師なし階層的クラスタリングに基づいてグループ分けした。アップレギュレートされた発現値を赤色で表し、ダウンレギュレートされた発現値を青色で表す。
【図１１】洗練されたプロゲスチン依存性KR＞WT遺伝子シグネチャ。オナプリストン処理（単独またはP4との組み合わせ）で有意に（BH調整P＜0.01）刺激された図10からの遺伝子を除去して、16遺伝子を得た。WT PRを発現する細胞と比べて、SUMO欠損PR（KR）を発現する細胞において、プロゲステロン処理後に特異的アップレギュレートされたそれら16の転写産物について、標準化された相対的発現値を示すヒートマップ。試料を6時間処理した。各処理群について生物学的三重試料を示す。遺伝子（行）を教師なし階層的クラスタリングに基づいてグループ分けした。アップレギュレートされた発現値を赤色で表し、ダウンレギュレートされた発現値を青色で表す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
発明の詳細な説明
プロゲステロン受容体（PR）は、乳房悪性腫瘍および子宮内膜悪性腫瘍を含む一定のがんの増殖および成長に重要な役割を果たす。乳がん細胞に共通するリン酸化事象は、PRの転写活性に影響を与える。ホスホ-Ser294 PRはリガンド依存性Lys388SUMO化（すなわち抑制的修飾）に対して抵抗性である。プロテインキナーゼによるPR SUMO化のアンタゴニズムは、PR抑制解除（すなわち転写活性化）のための機序になる。野生型またはK388R（SUMO化欠損）PRを発現する乳がん細胞における網羅的遺伝子発現プロファイリングにより、SUMO化欠損PRは、主として、増殖および生存促進シグナリングに必要な遺伝子を調節することが明らかになった。K388R PRは、ステロイド受容体活性化補助因子CBPおよびMLL2（ヌクレオソームリモデリングのメディエーター）と共に、候補「SUMO感受性」遺伝子のエンハンサー領域に優先的に動員される。SUMO欠損（ホスホ-Ser294）PR遺伝子シグネチャは、ERBB2過剰発現乳腺腫瘍と有意に関連し、早期転移および短縮された生存時間を予示する。可逆的なPR SUMO化/脱SUMO化は乳がん細胞におけるターゲット遺伝子選択を大きく変化させると結論される。ホスホPRによって駆動されるER陽性および/またはPR陽性腫瘍を持つ患者は、抗プロゲスチンを含有する内分泌療法の恩恵を受けうる。
【００４１】
本明細書に記載する遺伝子シグネチャは、がん進行の一因になることが公知である関連遺伝子の集合体を含有し、それらの発現は活性化ホスホPR（脱SUMO化PR-B）に直接依存することが、現在、わかっている。関与する機序が本明細書に記載するように決定されたので、（PRの活性およびPRと他の悪性腫瘍成長および増殖パスウェイとの相互作用を遮断することを目指した）抗プロゲスチンの使用を含む処置の恩恵を受けるであろうPR駆動性腫瘍を持つ乳がん患者が、本検査によって同定されるであろう。本明細書において定義される遺伝子発現の明確なパターンは脱SUMO化ホスホPRによるものであり、活性化PR遺伝子発現パターンを持つ人々にとっては、ある薬物選択肢（抗プロゲスチン療法単独、または他の抗がん剤との併用）が、効果的な処置戦略である可能性は高い。この治療法は、抗プロゲスチン薬＋ER＋乳腺腫瘍に対する現在の標準治療である内分泌処置（例えば抗プロゲスチンと組み合わされた抗エストロゲンまたはアロマターゼ（aromastase）阻害剤）または抗プロゲスチン薬＋他の抗がん化合物（例えばエベロリムス、トラスツズマブ、T-DM1、抗HER2薬、m-TOR阻害剤、抗VEGF薬、抗EGF薬、ベバシズマブ、パクリタキセル、ドセタキセル、タキサン、ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、peg化リポソームドキソルビシン、アントラサイクリン、アントラセンジオン、カルボプラチン、シスプラチン、5-FU、ゲムシタビン、シクロホスファミド）を含みうる。こうして、抗プロゲスチン処置により、腫瘍退縮とPR遺伝子シグネチャの復帰とが起こるであろう。
【００４２】
本発明は、遺伝子発現プロファイルと、がん処置に対する患者の応答性を予測するためのそれらの使用を提供する。より具体的には、本遺伝子発現プロファイルは、乳がんを患う患者が抗プロゲスチンを含む内分泌療法による処置に対するレスポンダーであるかノンレスポンダーであるかを指示する。
【００４３】
乳がん処置の転帰は著しく改善されている。しかし、しばしば、正常細胞の成長がこれらの処置による影響を受けて、望まれていないかつ/または不快な効果を引き起こす。これら他の効果には、下痢、発疹、ざ瘡、乾燥肌、悪心（吐き気）および嘔吐、食欲不振および体重減少、無力症およびそう痒、ニューロパシーおよび腹痛などが含まれうる。本発明の諸局面は、抗プロゲスチンによる処置の恩恵を受けると考えられる患者と関連するバイオマーカーを提供する。したがって本発明は、処置提供者が、抗プロゲスチンによる処置の恩恵を受ける可能性が高い乳がん患者を前もって決定すること、およびノンレスポンダーのために代替処置選択肢を検討することを可能にする。
【００４４】
本発明の諸局面は、乳がんを患う患者の、抗プロゲスチンによる処置に応答する傾向を指示する遺伝子発現プロファイルを含む。本遺伝子発現プロファイルは、少なくとも一つの、好ましくは多数の、表1aおよび/または1bにおいて特定される遺伝子を含む。この一群の遺伝子を本明細書では「抗プロゲスチンレスポンダー遺伝子（Antiprogestin Responder Genes）」という。本発明の諸局面によれば、抗プロゲスチン療法に対するレスポンダーである患者では、これらの遺伝子の一部または全部が差次的に発現する（例えばアップレギュレートまたはダウンレギュレートされる）。したがって、ある患者がそのような治療法の恩恵を受ける可能性が高いかどうかは、その患者の組織から遺伝子発現プロファイルを取得し、抗プロゲスチンレスポンダー遺伝子のうちの遺伝子の一つまたは複数がアップレギュレートまたはダウンレギュレートされているかどうかを決定することにより、前もって決定することが可能である。
【００４５】
一態様では、本発明の遺伝子発現プロファイルが、調節される抗プロゲスチンレスポンダー遺伝子のうちの、少なくとも約4個、例えば約4〜約9個、例えば約9〜15個またはそれ以上を含む。一態様において、調節される本遺伝子発現プロファイルは、抗プロゲスチンレスポンダー遺伝子のうちの、少なくとも約4個、例えば約6〜12個を含む。
【００４６】
本発明の遺伝子発現プロファイルは、抗プロゲスチン治療に対する乳がん患者の応答性を予測するために使用することができる。一局面において、本方法は、（a）乳がんを患う患者からの生物学的試料（組織生検、乳管洗浄液、細針吸引物試料、外科的に切除した腫瘍の切片または循環腫瘍細胞）から遺伝子発現プロファイルを取得する工程、（b）遺伝子発現プロファイルから、表1aおよび/または1bにおいて特定される遺伝子のうちの一つまたは複数の発現がアップレギュレートまたはダウンレギュレートされているかどうか（過剰発現または過小発現しているかどうか）を決定する工程を含む。一態様では、これらの化合物に対する応答を決定するための遺伝子プロファイルの予測値が、本発明に従ってアップレギュレートまたはダウンレギュレートされることが見いだされる関連遺伝子の数と共に増加する。
【００４７】
定義
別段の定義がある場合を除き、本明細書において使用する技術用語および科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本発明の実施または試験では本明細書に記載するものと類似するまたは等価な任意の方法および材料を使用することができるが、本明細書には方法と材料に関していくつかの態様を記載する。本明細書において使用する場合、以下の用語はそれぞれこの項でそれに関連付けられる意味を有する。
【００４８】
冠詞「a」および「an」は、本明細書では、一つのまたは一つより多くの（すなわち少なくとも一つの）、その冠詞の文法上の目的語を指すために使用される。例えば「要素（an element）」とは、一つの要素または一つより多くの要素を意味する。
【００４９】
「多数（plurality）」とは少なくとも2つを意味する。
【００５０】
「対象」または「患者」は、ヒトなどの哺乳動物を含む脊椎動物である。哺乳動物には、ヒト、農用動物、競技用動物およびペットが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００５１】
用語「約」は、本明細書において使用する場合、およそ、近辺、ほぼ、または付近を意味する。用語「約」を数値範囲と一緒に使用する場合、これはその範囲を修飾して、記載の数値の上限と下限を拡げる。一般に、用語「約」は、本明細書では、明記した値を上下に10％変動させるために使用される。一局面において、用語「約」は、それを使用した数字の数値の±20％を意味する。したがって、約50％とは45％〜55％の範囲を意味する。本明細書において終点によって説明する数値範囲は、その範囲内に包含される全ての数字および端数を含む（例えば1〜5は1、1.5、2、2.75、3、3.90、4、および5を含む）。また、全ての数字とその端数は、用語「約」によって修飾されると推定されることを理解すべきである。
【００５２】
用語「遺伝子」は、ポリペプチドまたは前駆体を産生するのに必要な制御配列およびコード配列を含む核酸配列を指す。ポリペプチドは完全長コード配列によってコードされてもよいし、コード配列の任意の部分によってコードされてもよい。遺伝子は、植物、真菌、動物、細菌のゲノムまたはエピソーム、真核生物、核またはプラスミドのDNA、cDNA、ウイルスDNA、または化学合成されたDNAを含む、当技術分野において公知の任意の供給源から、全部または一部が由来しうる。遺伝子は、コード領域または非翻訳領域のどちらかに、生物学的活性または発現産物の化学的構造、発現の速度、または発現制御の方法に影響を及ぼしうる、一つまたは複数の修飾を含有しうる。そのような修飾には、一つまたは複数のヌクレオチドの変異、挿入、欠失、および置換などがあるが、それらに限定されるわけではない。遺伝子は中断のないコード配列を構成するか、適当なスプライス接合部に挟まれた一つまたは複数のイントロンを含みうる。
【００５３】
用語「遺伝子発現」は、核酸配列が転写および/または翻訳に成功して検出可能なレベルのヌクレオチド配列を発現させるプロセスを指す。
【００５４】
用語「遺伝子発現プロファイル」または「遺伝子シグネチャ」は、特定の細胞タイプまたは組織タイプによって発現される一群の遺伝子であって、それらの遺伝子全部の存在またはそのような遺伝子の差次的発現が、一定の状態を指示/予示する。
【００５５】
本明細書において使用する用語「核酸」は、一つまたは複数のヌクレオチド、すなわちリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはその両方から構成される分子を指す。この用語は、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドのモノマーおよびポリマーを包含し、ポリマーの場合は、リボヌクレオチドおよび/またはデオキシリボヌクレオチドが、5'→3'結合を介して一つに結合されている。リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドポリマーは一本鎖または二本鎖であり得る。ただし結合には、例えば5'→3'結合を含む核酸を含めて、当技術分野において公知である結合をどれでも含めることができる。さらにまた、用語「核酸配列」は相補的配列も想定しており、具体的には、その核酸配列と実質的に相同な任意の核酸配列およびその相補体と実質的に相同な任意の核酸配列をどちらも包含する。
【００５６】
用語「アレイ」および「マイクロアレイ」は、オリゴヌクレオチドによってアレイ上に表現された遺伝子のタイプを指し、アレイ上に表現される遺伝子のタイプは、そのアレイの使用目的（例えばヒト遺伝子の発現をモニターするため）に依存する。所与のアレイ上のオリゴヌクレオチドは、同じタイプ、カテゴリー、またはグループの遺伝子に対応しうる。遺伝子は、何らかの共通する特徴、例えば起源の種（例えばヒト、マウス、ラット）;疾患状態（例えばがん）;機能（例えばプロテインキナーゼ、腫瘍抑制因子）;または同じ生物学的プロセス（例えばアポトーシス、シグナル伝達、細胞周期調節、増殖、分化）を共有するのであれば、同じタイプであるとみなすことができる。例えば、あるアレイタイプは、アレイオリゴヌクレオチドのそれぞれが、あるがんに関連する遺伝子に対応する「がんアレイ」であることができる。
【００５７】
本明細書において使用する用語「活性化」は、例えば基礎レベルを上回る増加、阻害された状態から基礎レベルへの回復、および基礎レベルを上回るパスウェイの刺激を含む、シグナリングパスウェイまたは生物学的応答の任意の変化を指す。
【００５８】
用語「差次的発現」は、患部組織または罹患細胞における、正常隣接組織と対比した、ある遺伝子の時間的および組織的発現パターンの定量的相違と定性的相違の両方を指す。例えば、差次的発現遺伝子は、正常状態では、疾患状態と対比して、その発現が活性化されているか、部分的または完全に不活化されているかもしれないし、疾患状態では正常状態と対比して、アップレギュレート（過剰発現）またはダウンレギュレート（過小発現）されているかもしれない。そのような定性的に調節される遺伝子は、対照または疾患状態のどちらかにおいて検出できるが、両方に検出することはできない発現パターンを、所与の組織または細胞タイプ内で呈しうる。言い変えると、ある遺伝子の発現が、ある患者の患部組織または罹患細胞において、その患者の正常（無疾患）組織もしくは細胞または対照組織もしくは細胞におけるその発現のレベルとの比較で、高レベルまたは低レベルで起こる場合、その遺伝子は差次的に発現する。
【００５９】
用語「生物学的試料」は、ある生物（例えばヒト患者）またはある生物の構成要素（例えば細胞）から得られた試料を指す。試料は、任意の生物学的組織または液体の試料であることができる。試料は、患者に由来する試料である「臨床試料」であることができる。そのような試料には、喀痰、血液、血球（例えば白血球）、羊水、血漿、精液、骨髄、循環腫瘍細胞、循環DNA、循環エキソソーム、および組織または細針生検試料、尿、腹水、および胸水、またはそこからの細胞などがあるが、それらに限定されるわけではない。生物学的試料には、組織の切片、例えば組織学的目的のために採取された凍結切片またはホルマリン固定パラフィン包埋切片も含めることができる。生物学的試料を「患者試料」ということもできる。
【００６０】
本明細書にいう「医療提供者」には、患者などの対象に予防的、治療的、健康増進的またはリハビリ的医療サービスを提供する個人または施設がどちらも包含される。一態様では、医療提供者には、彼らがその患者の診断/処置に使用しうるように、データが提供される。
【００６１】
用語「標準」は、本明細書において使用する場合、対照または健常対象など、比較に使用されるものを指す。
【００６２】
用語「を含む（comprises）」、「を含んでいる（comprising）」などは、米国特許法においてそれらに与えられた意味を持つことができ、「を包含する（includes）」、「を包含している（including）」などを意味することができる。本明細書において使用する場合、「を包含している（including）」または「を包含する（includes）」は、非限定的に包含していることを意味する。
【００６３】
がん
本明細書において開示する方法は、PR駆動性の増殖および抗エストロゲンまたはアロマターゼ阻害剤処置に対する内分泌療法抵抗性への進行を起こす可能性が高いがんを持つ患者を同定するために使用することができる。そのような患者は、抗プロゲスチンを含有する内分泌療法の候補であるだろう。本明細書に記載する遺伝子シグネチャは多くのがん、例えば肺がん、脳がん、前立腺がん、子宮内膜がん、髄膜腫、前立腺がん、卵巣がん、および子宮肉腫/がんにおいて使用することができる。本明細書に記載する遺伝子シグネチャは、リンパ管平滑筋腫症および子宮平滑筋腫を含む他の障害においても使用することができる。
【００６４】
乳がん
乳がんは女性では最もよく診断されるがんであり、がん関連死の原因の第2位である。乳がん（悪性乳房新生物）は、乳房組織から、最も一般的には乳管の内壁または乳管に乳汁を供給する小葉から派生する、がんの一タイプである。乳管から派生するがんは乳管癌と呼ばれており、小葉から派生するものは小葉癌と呼ばれている。乳がんは、ヒトおよび他の哺乳動物の疾患であり、ヒトにおける症例の圧倒的多数は女性であるが、時には男性も乳がんを発生させる。
【００６５】
腫瘍のサイズ、ステージ、成長速度、および他の特徴が、処置の種類を決定する。処置には、外科手術、薬物（ホルモン療法および化学療法）、放射線および/または免疫療法が含まれうる。腫瘍の外科的切除では、他にはない最大の恩恵が得られ、多くの症例では外科手術だけで治癒をもたらすことができる。長期無病生存期間の見込みを多少増加させるために、外科手術に加えていくつかの化学療法レジメンがよく施行される。ほとんどの形態の化学療法は、体内のどこにおいても急速に分裂している細胞を殺し、その結果として、一時的脱毛、骨髄および免疫系の損傷、ならびに消化器障害を引き起こす。放射線はとりわけ乳房温存術後に適応となり、局所再燃率を実質的に改善し、多くの状況では全生存も改善する。いくつかの乳がんは、エストロゲンおよび/またはプロゲステロンなどのホルモンに感受性であることから、これらのホルモンの効果を遮断することによって、それらを処置することが可能になる。
【００６６】
世界中で、乳がんは、女性における全てのがん（非黒色腫皮膚がんを除く）の22.9％を構成する。2008年に乳がんは世界中で458,503例の死亡を引き起こした（女性のがん死の13.7％）。予後および生存率は、がんのタイプ、病期分類および処置に依存して大きく変動する。
【００６７】
乳がんの症状で最初に気付くのは、典型的には、乳房組織の残りの部分とは異なる感触を持つ塊である。最初期の乳がんはマンモグラムによって検出される。腋窩にあるリンパ節に見いだされる塊も乳がんを示す場合がある。
【００６８】
塊以外の乳がんのしるしとしては、乳房のサイズまたは形状の変化、皮膚陥凹、乳頭陥没、自発的片側乳頭分泌などを挙げることができる。痛み（「乳房痛」）は乳がんの有無を決定する手段としては一般に当てにならないが、他の乳房健康状態は指示しうる。
【００６９】
乳がんは通常、外科手術によって処置され、場合によっては化学療法もしくは放射線、または上記の全てによって処置される。集学的アプローチが好ましい。ホルモン陽性がんは、長期ホルモン遮断療法で処置される。処置は、予後および再発のリスクに応じて積極性を増加させて施行される。ステージ1がん（およびDCIS）は優れた予後を有し、一般的には、乳腺腫瘍摘出術と、時には放射線とで処置される。HER2陽性がんは、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））レジメンで処置することができる。化学療法は、他のタイプのステージ1がんでは珍しい。次第に予後が悪化し、再発のリスクが増すステージ2および3がんは、一般的には外科手術（リンパ節切除を伴うまたはリンパ節切除を伴わない乳腺腫瘍摘出術または乳房切除術）、化学療法（HER2陽性がんの場合は＋トラスツズマブ）、そして時には放射線（特に大きながん、複数の陽性節または乳腺腫瘍摘出術の後）で処置される。ステージ4、転移がん（すなわち遠隔部位への伝播）は予後不良であり、外科手術、放射線、化学療法および標的療法からのあらゆる処置のさまざまな組み合わせによって管理される。10年生存率は、処置がない場合で5％、最適な処置があった場合で10％である。
【００７０】
外科手術後に、外科手術に加えて使用される薬物は、アジュバント療法と呼ばれる。外科手術に先立つ化学療法または他のタイプの治療法は、ネオアジュバント療法と呼ばれる。
【００７１】
現在、アジュバント乳がん処置に使用される薬物療法には、ホルモン遮断療法、化学療法、およびモノクローナル抗体という3つの主なグループがある。
【００７２】
ホルモン遮断療法:一部の乳がんは、成長し続けるためにエストロゲンを必要とする。それらは、その表面のエストロゲン受容体（ER陽性）およびプロゲステロン受容体（PR陽性）（合わせてホルモン受容体という場合もある）の存在によって同定することができる。これらのER陽性がんは、前記受容体を遮断する薬物、例えばタモキシフェン（Nolvadex（登録商標））、ラロキシフェン、オルメロキシフェンまたはトレミフェンで処置するか、あるいは、アロマターゼ阻害剤を使ってエストロゲンの産生を遮断する薬物、例えばアナストロゾール（Arimidex（登録商標））、エクセメスタン、またはレトロゾール（Femara（登録商標））などで処置することができる。加えて、Iressa（登録商標）/ゲフィチニブ、およびラパチニブなどのEGFR阻害剤もある。
【００７３】
抗プロゲスチン剤も治療に使用することができる。抗プロゲスチン（ホルモンアンタゴニスト）は、細胞がプロゲステロン（月経周期および妊娠に役割を果たすホルモン）を作るまたは使用するのを防止する物質である。抗プロゲスチンはいくつかのがん細胞の成長を停止させうる。抗プロゲスチンには、オナプリストン、ロナプリサン、PF-02413873、リロプリストン、ORG2058、ミフェプリストン（RU486）、アソプリスニル、テラプリストン、ウリプリスタール、アグレプリストン、ZM172406、ZM172405およびZM150271などがあるが、それらに限定されるわけではない。
【００７４】
アグレプリストン（8S,11R,13S,14S,17R)-11-(4-ジメチルアミノフェニル)-17-ヒドロキシ-13-メチル-17-[(Z)-プロパ-1-エニル]-1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-デカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン
2015516155.tif 000003
【００７５】
オナプリストン（例えば(8S,11R,13R,14S,17S)-11-[4-(ジメチルアミノ)フェニル]-17-ヒドロキシ-17-(3-ヒドロキシプロピル)-13-メチル-1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-デカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン）は、次の化学構造を有する:
2015516155.tif 000004
【００７６】
他の抗プロゲスチンには、以下に挙げるものがある:プロゲステロン性の3-(6,6-エチレン-17B-ヒドロキシ-3-オキソ-17A-プレグナ-4-エン-17A-イル)プロピオン酸G-ラクトン、3-(6,6-エチレン-17β-ヒドロキシ-3-オキソ-17α-プレグナ-4-エン-17α-イル)プロピオン酸γ-ラクトン、および次に挙げるもの:
ミフェプリストン
(10S,11S,14S,15S,17R)-17-[4-(ジメチルアミノ)フェニル]-14-ヒドロキシ-15-メチル-14-(プロパ-1-イン-1-イル)テトラシクロ[8.7.0.0^{2,7}.0^{11,15}]ヘプタデカ-1,6-ジエン-5-オン
2015516155.tif 000005
リロプリストン
(11-β,17-β,17(z))-ロペニル);エストラ-4,9-ジエン-3-オン,11-(4-(ジメチルアミノ)フェニル)-17-ヒドロキシ-17-(3-ヒドロキシ-1-p;11β-[4-(ジメチルアミノ)フェニル]-17β-ヒドロキシ-17-[(Z)-3-ヒドロキシ-1-プロペニル]エストラ-4,9-ジエン-3-オン
2015516155.tif 000006
ORG2058
(8R,9S,10R,13S,14S,16R,17S)-16-エチル-17-(2-ヒドロキシアセチル)-13-メチル-2,6,7,8,9,10,11,12,14,15,16,17-ドデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン
2015516155.tif 000007
ロナプリサン
(8S,11R,13S,14S,17S)-11-(4-アセチルフェニル)-17-ヒドロキシ-13-メチル-17-(1,1,2,2,2-ペンタフルオロエチル)-1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-デカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン
2015516155.tif 000008
アソプリスニル
(8S,11R,13S,14S,17S)-11-[4-[(E)-ヒドロキシイミノメチル]フェニル]-17-メトキシ-17-(メトキシメチル)-13-メチル-1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-デカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン
2015516155.tif 000009
ウリプリスタール
(8S,11R,13S,14S,17R)-17-アセチル-11-[4-(ジメチルアミノ)フェニル]-17-ヒドロキシ-13-メチル-1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-デカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン
2015516155.tif 000010
PF-2413873
4-[3-シクロプロピル-1-(メシルメチル)-5-メチル-1H-ピラゾール-4-イル]オキシ-2,6-ジメチルベンゾニトリル
2015516155.tif 000011
テラプリストン
[(8S,11R,13S,14S,17R)-11-[4-(ジメチルアミノ)フェニル]-17-(2-メトキシアセチル)-13-メチル-3-オキソ-1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-デカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-17-イル]アセテート
2015516155.tif 000012
【００７７】
さらなる抗プロゲスチンには、次に挙げるものがある:
2015516155.tif 000013
【００７８】
本明細書において開示する例示的システムおよび方法は、抗プロゲスチン（例えばオナプリストン、ロナプリサン、ミフェプリストン、PF-02413873、テラプリストン、リロプリストン、ORG2058、アポプリスニル（apoprisnil）、ウリプリスタール、ZM172406、ZM150271、ZM172405およびアグレプリストン）による成長阻害に対して感受性である悪性腫瘍を持つと疑われる患者を同定し、処置するために使用することができる。一局面では、抗プロゲスチンによる成長阻害に対して感受性である悪性腫瘍（がん）を有すると疑われる患者を、抗プロゲスチンで処置することができる。もう一つの局面では、抗プロゲスチンによる処置に対して感受性である腫瘍が、乳房、脳、髄膜腫、前立腺、卵巣、子宮内膜、子宮肉腫、子宮平滑筋腫、肺、および子宮組織を含むが、それらに限定されるわけではない。さらなる一局面では、抗プロゲスチンを、1日あたり約10mg〜約200mgの量で、患者に投与することができる。任意で、抗腫瘍化合物（例えばエベロリムス、トラスツズマブ、T-DM1、抗HER2薬、m-TOR阻害剤、抗VEGF薬、抗EGF薬、ベバシズマブ、パクリタキセル、ドセタキセル、タキサン、ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、peg化リポソームドキソルビシン、アントラサイクリン、アントラセンジオン、カルボプラチン、シスプラチン、5-FU、ゲムシタビン、シクロホスファミド）、アロマターゼ阻害剤（アナストロゾール、レトロゾール、エクセメスタン、ボロゾール、フォルメスタンおよびファドロゾール）、抗エストロゲン（フルベストラント）、選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ラロキシフェン、タモキシフェン、トレミフェン、ラソフォキシフェン、アフィモキシフェン、アルゾキシフェン、およびバゼドキシフェン）、アンドロゲン受容体遮断薬（エンザルタミド）または17α-ヒドロキシラーゼ/C17,20リアーゼの阻害剤（アビラテロン）も、抗プロゲスチンによる処置と同時に、または抗プロゲスチンによる処置の前もしくは後に、患者に投与することができる。
【００７９】
化学療法:ステージ2〜4疾患に主に使用され、エストロゲン受容体陰性（ER陰性）疾患には特に有益である。通常は3〜6ヶ月間、組み合わせて施行される。最も一般的な処置の一つは、ACと呼ばれているシクロホスファミド＋ドキソルビシン（Adriamycin（登録商標））である。大半の化学療法投薬は、複製または他の機序に対してDNA損傷を引き起こすことで、急速に成長しかつ/または急速に複製するがん細胞を破壊することによって作用するが、これらの薬物は急速に成長する正常細胞にも損傷を与え、そこで重篤な副作用を引き起こす。心筋の損傷はドキソルビシンの最も危険な合併症である。時には、ドセタキセルなどのタキサン薬が加えられ、その場合、そのレジメンはCATと呼ばれ、タキサン（例えばドセタキセルおよびパクリタキセル）はがん細胞中の微小管を攻撃する。等価な結果をもたらすもう一つの一般的処置は、シクロホスファミド、メトトレキサート、およびフルオロウラシル（CMF）である。化学療法は一般に任意の薬物を指すことができる。
【００８０】
モノクローナル抗体:HER2に対するモノクローナル抗体であるトラスツズマブ（Herceptin（登録商標））は、ステージ1〜3のHER2-陽性乳がんの5年無病生存率を約87％（全生存95％）に改善した。しかしトラスツズマブは心臓毒性に関連し、患者の約2％が重大な心臓損傷を負う。他のモノクローナル抗体も臨床試験が行われている。トラスツズマブは、HER2増幅を伴う腫瘍を持つ患者でしか有効でない。
【００８１】
放射線療法は、通常、外科手術を逃れたかもしれない微細な腫瘍細胞を破壊するために、外科手術後に腫瘍床および所属リンパ節の領域に施行される。これは腫瘍微小環境に対する有益な効果も有しうる。放射線療法は体外ビーム放射線療法としてまたは密封小線源治療（体内放射線療法）として実施することができる。従来から、放射線療法は、乳がんの手術後に施行されている。放射線が乳がんの手術時に-手術中に-照射される場合もある。放射線は、再発のリスクを50〜66％低減することができる（1/2〜2/3のリスク低減）。
【００８２】
その起始と進行を駆動する分子因子は完全には理解されていない。Women's Health Initiative（WHI）による無作為化臨床試験では、（エストロゲン単独ではなく）エストロゲンおよびプロゲスチンを含有するホルモン補充療法(HRT）が、閉経後女性において浸潤性乳がんが発生するリスクを有意に増加させることが実証された（Chlebowskiら、2003;LaCroixら、2011）。Million Women観察研究でも同様の結論が下された（Million Women Study Collaborators、2003）。これらの知見がHRTの処方を劇的に減らし、その結果、乳がん発生率はかなり低下した（Chlebowskiら、2009）。WHIデータのさらなる解析により、エストロゲンだけを含有するHRTを処方された女性では、浸潤性乳がんが発生するリスクは低下していることが実証された（Andersonら、2012;LaCroixら、2011）。PR発現は、伝統的に、エストロゲン受容体（ER）機能の臨床的指標として使用されている（すなわちPRはERターゲット遺伝子である）。しかし、議論の余地はあるものの、この驚くべき疫学的証拠は、乳がんの起始および初期進行のメディエーターとしてのプロゲステロン受容体（PR）のユニークな作用のさらなる調査に、強い論理的根拠を与える（（Lange、2008）に総説がある）。
【００８３】
古典的に、PRは、効率のよい転写に必要な共調節分子を動員する能力を有する二量体としてターゲット遺伝子プロモーターまたはエンハンサーに結合する、リガンド活性化転写因子と定義されている。最近、プロテインキナーゼは（ペプチド成長因子への応答の場合と同様に）ステロイドホルモンによって迅速に活性化されることがよく知られるようになった。事実、リン酸化事象はPR作用に調節的インプットを与える（（Danielら、2009）に総説があり、以下に論じる）。PR中のいくつかの変異はがんリスクと関連付けられており、これらはPRの転写活性に影響を与えるというより、むしろ主としてPR発現レベルを変化させるようである（De Vivoら、2002;Pooleyら、2006;Terryら、2005）。胸部組織では、2つのPRタンパク質アイソフォームPR-AとPR-Bが同時発現している。PR-Bは、PR-Aには存在しない164アミノ酸（B上流セグメントまたはBUSと呼ばれる）をN末端に含有する完全長受容体である。どちらのアイソフォームも著しい翻訳後修飾（リン酸化、ユビキチン化、アセチル化）を受ける。PRのN末端は、キー調節リン酸化部位（例えばSer294）と、ここで調べたSUMO化部位（Lys388）とを含有する。PR-B（例えばアクセッション番号NM_000926.4（GI:160358783）としてNCBIデータベースを参照されたい）は、細胞培養およびインビボにおいて、Ser294がリン酸化されるが、PR-A（例えばアクセッション番号NM_001202474.1（GI:321117149）としてNCBIデータベースを参照されたい）はそうではない（Clemmら、2000）。リガンドが結合すると、どちらのPRアイソフォームも迅速（15分）にLys388がSUMO化される（Danielら、2007a）。SUMO化は、主としてコンセンサスSUMO化モチーフ（IKxE）において、ユビキチン化の場合と類似するATP依存性酵素（3段階）機序により、低分子ユビキチン様修飾因子（SUMO）ペプチド（約11.5kD）が基質分子のリジン残基に共有結合することによって起こる（Melchior、2000）。基質SUMO化は、しばしばタンパク質-タンパク質相互作用、細胞内位置、タンパク質安定性（すなわちこれはユビキチン化に対抗することができる）、および/または酵素活性もしくは転写活性を変化させる（Geiss-FriedlanderおよびMelchior、2007）。
【００８４】
最近、Danielらは、活性化されたマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）または細胞周期依存性プロテインキナーゼ-2（CDK2）に応答して起こるSer294におけるPR-Bのリン酸化は、プロゲスチンが誘発するLys388における迅速なSUMO化を妨げることを発見した（Danielら、2007a;DanielおよびLange、2009）。加えて、Ser294リン酸化が誘発するPR SUMO化のアンタゴニズムは、選択された乳がん関連遺伝子プロモーター、すなわちHBEGF（Danielら、2007a）、STC1およびIRS1（DanielおよびLange、2009）におけるPRの転写活性を抑制解除（活性化）し、乳がん関連ドライバーSTC1およびIRSのホスホPR依存性アップレギュレーションが、プロゲスチンの非存在下で起こった（DanielおよびLange、2009）。プロモーター構造（すなわちホルモン応答エレメントの数）は、SUMO化されたグルココルチコイド受容体（GR）によるレポーター-遺伝子プロモーター認識の決定因子になりうるが（Iniguez-LluhiおよびPearce、2000）、ステロイド受容体SUMO化が内在性遺伝子の（すなわちクロマチンにおける）調節を変化させる方法についてわかっていることは、はるかに少ない。今のところ、PR SUMO化に対して感受性であることが示されている内在性遺伝子はわずかに過ぎない（Danielら、2007a;DanielおよびLange、2009）。本明細書では、PRが、ヒト乳がんにおいてしばしば上昇している活性化されたマイトジェンプロテインキナーゼ（すなわちMAPKおよびCDK2）のセンサーとして作用し、上昇したSer294リン酸化の影響下で、PR SUMO化に対して感受性である（すなわち通常はそれによって抑制されている）遺伝子が、むしろ乳がん細胞の増殖および生存促進シグナリングを駆動するのに協力しうることを開示する。ホスホPR（SUMO欠損）遺伝子シグネチャは、選択的抗プロゲスチンを含有する内分泌療法に応答する可能性が高いヒト乳がん患者のサブセットを同定することができる。
【００８５】
本明細書では、ダイナミックな翻訳後事象（すなわちLys388脱SUMO化と共役したPR Ser294リン酸化）に関係するPRプロモーター選択性の機序を扱う。全ゲノム発現解析を使って、野生型（WT）およびSUMO欠損（K388R）PR-Bによって差次的に調節される遺伝子を同定し、変化したPRプロモーター選択の原因となる機序を探索した。これらの知見は、乳がん細胞の増殖と生存促進にとって重要な遺伝子の選択的調節にSUMO欠損ホスホPR-Bを関係づけ、リン酸化および脱SUMO化PRが迅速な（ルミナール）乳がん腫瘍進行と関連するERBB2陽性表現型の重要なドライバーであり得ることを示唆する。
【００８６】
遺伝子発現プロファイル（マーカー）および遺伝子発現プロファイルの決定
一定の遺伝子の発現は、抗プロゲスチンによる乳がんの処置を予示することが、ここに実証された。これらの遺伝子には、次に挙げるもの（またはそれらに相同なもの）が含まれる:
【００８７】
（表１ａ）プロゲスチンで刺激したKR細胞とWT細胞の間で差次的に発現する上位15の最も有意な遺伝子  （＊）各方法の基準に従って統計的に有意である
2015516155.tif 000014
2015516155.tif 000015
【００８８】
本明細書にいう「相同」とは、2つのポリマー分子間、例えば2つの核酸分子、例えば2つのDNA分子もしくは2つのRNA分子間、または2つのポリペプチド分子間の、サブユニット配列の類似性を指す。2つの分子の両方において、あるサブユニット位置が同じモノマーサブユニットで占められている場合、例えば2つのDNA分子のそれぞれにおいて、ある位置がアデニンで占められているならば、それらはその位置で相同である。2つの配列間の相同性は、一致位置または相同位置の数の直接的な関数である。例えば、2つの化合物配列の位置のうちの半分（例えば長さが10サブユニットであるポリマー中の5つの位置）が相同であるなら、それら2つの配列は50％相同であり、位置のうちの90％、例えば10個中の9個が一致するか相同であれば、それら2つの配列は互いに90％の相同性を有する。例えばDNA配列3'ATTGCC5'と3'TATGGCは互いに50％の相同性を有する。
【００８９】
本明細書において使用する「相同性」は「同一性」と同じ意味で使用される。
【００９０】
2つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間の同一性百分率の決定は、数学的アルゴリズムを使って達成することができる。例えば2つの配列を比較するのに役立つ数学的アルゴリズムは、KarlinおよびAltschul（1993）に記載されているように改変されたKarlinおよびAltschul（1990）のアルゴリズムである。このアルゴリズムはAltschulらのNBLASTおよびXBLASTプログラムに組み込まれており、例えばNational Center for Biotechnology Information（NCBI）ワールドワイドウェブで利用することができる。BLASTヌクレオチド検索は、NBLASTプログラム（NCBIウェブサイトでは「blastn」と称されている）で、次のパラメータを使って行うことができる:本明細書に記載する核酸に相同なヌクレオチド配列を得るには、ギャップペナルティ（gap penalty）＝5;ギャップ伸長ペナルティ（gap extension penalty）＝2;ミスマッチペナルティ（mismatch penalty）＝3;マッチリワード（match reward）＝1;期待値（expectation value）10.0;およびワードサイズ（word size）＝11。BLASTタンパク質検索は、XBLASTプログラム（NCBIウェブサイトでは「blastn」と称されている）またはNCBI「blastp」プログラムで、次のパラメータを使って行うことができる:本明細書に記載するタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るには、期待値10.0、BLOSUM62スコアリング行列。比較を目的とするギャップ付きアライメントを得るには、Altschulらに記載されているように、Gapped BLASTを利用することができる。あるいは、分子間の遠い関係および互いに共通するパターンを持つ分子間の関係を検出する反復検索を行うために、PSI-BlastまたはPHI-Blastを使用することもできる。BLAST、Gapped BLAST、PSI-Blast、およびPHI-Blastプログラムを利用する場合は、各プログラム（例えばXBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメータを使用することができる。
【００９１】
2つの配列間の同一性百分率は、ギャップを許してまたはギャップを許さずに、上述の技法と類似する技法を使って決定することができる。同一性百分率の計算では、典型的には、完全な一致が数え上げられる。
【００９２】
本明細書にいう「実質的に相同なアミノ酸配列」または「実質的に同一であるアミノ酸配列」には、参照抗体鎖のアミノ酸配列に対して、少なくとも約92％または少なくとも約95％の相同性または同一性、例えば少なくとも約96％の相同性または同一性、例えば少なくとも約97％の相同性または同一性、例えば少なくとも約98％の相同性または同一性、および少なくとも約99％またはそれ以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列が包含される。アミノ酸配列の類似性および同一性は、BLAST（basic local alignment search tool）2.0.14アルゴリズムを使用するBLASTPおよびTBLASTNプログラムを使うことによって算出することができる。これらのプログラムに使用されるデフォルト設定は、本発明の目的のために実質的に類似するアミノ酸配列を同定するのに適している。
【００９３】
本明細書において使用する用語「保存的アミノ酸置換」は、本明細書では、次の5つのグループのうちの一つの中でのアミノ酸交換と定義される。
I.無極性であるかわずかに極性である小さな脂肪族残基:
Ala、Ser、Thr、Pro、Gly;
II.極性負荷電残基およびそれらのアミド:
Asp、Asn、Glu、Gln;
III.極性正荷電残基:
His、Arg、Lys;
IV.無極性の大きな脂肪族残基:
Met、Leu、Ile、Val、Cys
V.大きな芳香族残基:
Phe、Tyr、Trp。
【００９４】
「実質的に相同な核酸配列」または「実質的に同一である核酸配列」は、参照核酸配列と対応する核酸配列であって、その対応配列が、参照核酸配列によってコードされるペプチドと実質的に同じ構造および機能を有するペプチドをコードするもの、例えばペプチド機能に有意な影響を及ぼさないアミノ酸の変化だけが存在する場合を意味する。一態様では、実質的に同一である核酸配列は、参照核酸配列によってコードされるペプチドをコードする。実質的に類似する核酸配列と参照核酸配列との間の同一性のパーセンテージは、少なくとも約50％、65％、75％、85％、92％、95％、99％またはそれ以上である。核酸配列の実質的同一性は、例えば物理的/科学的方法（すなわちハイブリダイゼーション）によって、またはコンピュータアルゴリズムによる配列アラインメントによって、2つの配列の配列同一性を比較することによって決定することができる。
【００９５】
あるヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列に実質的に類似しているかどうかを決定するための適切な核酸ハイブリダイゼーション条件は、50℃で7％ドデシル硫酸ナトリウムSDS、0.5M NaPO4、1mM EDTAと、2×標準クエン酸食塩水（SSC）、0.1％SDS中、50℃での洗浄;好ましくは50℃で7％SDS、0.5M NaPO4、1mM EDTAと、1×SSC、0.1％SDS中、50℃での洗浄;好ましくは50℃で7％SDS、0.5M NaPO4、1mM EDTAと、0.5×SSC、0.1％SDS中、50℃での洗浄;より好ましくは、50℃で7％SDS、0.5M NaPO4、1mM EDTAと、0.1×SSC、0.1％SDS中、65℃での洗浄である。2つの核酸配列間の実質的類似性を決定するための適切なコンピュータアルゴリズムには、GCSプログラムパッケージがある。これらのプログラムと共に提供されるデフォルト設定は、本発明の目的のために核酸配列の実質的類似性を決定するのに適している。
【００９６】
発現レベルの決定
一態様では、核酸、例えば関心対象の遺伝子のmRNAの発現が決定される。前もって選択されたmRNAの発現レベルは、例えばインサイチューハイブリダイゼーション、ノーザンブロット、核酸増幅技法（例えばPCR、定量PCR、リガーゼ連鎖反応など）、RNA Seqおよびマイクロアレイ解析などといったさまざまな技法のいずれかによって、同定および/または定量することができる。mRNAのレベルはノーザンブロッティングによって定量的に測定することができる。RNAの試料をアガロースゲル上で分離し、ターゲット配列に相補的な放射標識RNAプローブにハイブリダイズさせる。次に、オートラジオグラフによって放射標識RNAを検出する。
【００９７】
mRNAの存在量を測定するためのもう一つのアプローチは、逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応である。RT-PCRは、まず、mRNAから逆転写によって、cDNAと呼ばれるDNAテンプレートを生成させる。次に、このcDNAテンプレートを、プローブの蛍光の変化がDNA増幅プロセスの進行に伴って変化するqPCRに使用する。qPCRは、標準曲線を使って、mRNAのコピー数などの絶対値の測定を、典型的には、ホモジナイズした組織1ナノリットルあたりのコピー数または1細胞あたりのコピー数という単位で、もたらすことができる。qPCRは非常に高感度である（単一mRNA分子の検出が可能である）。
【００９８】
もう一つのアプローチは、直接的なデジタル定量のために一つずつ検出して数え上げることができる蛍光バーコード（ナノストリング）で単一mRNA分子を個別にタグ付けすることである（Krassen Dimitrov、NanoString Technologies）。また、異なるmRNAの細胞濃度の相対的尺度を与えることができる逐次遺伝子解析（Serial analysis of gene expression）法（SAGE）のような「タグベース」の技術も、使用することができる。
【００９９】
また、数多くの遺伝子について転写産物レベルを一度に決定するために（発現プロファイリング）、DNAマイクロアレイを使用することもできる。マイクロアレイ技術の最近の進歩により、ヒトを含むいくつかの生物のゲノムにおけるあらゆる公知遺伝子について、転写産物レベルを一つのアレイ上で定量することが可能になっている。
【０１００】
コンピュータ/プロセッサ
本検出、予後判定および/または診断方法は、プロセッサ/コンピュータシステムを利用することができる。例えば、本明細書に記載する一態様では、本方法を履行するためのコンピュータプログラムコードが格納されたプログラムメモリ、ワーキングメモリ、および従来のコンピュータ画面、キーボード、マウス、およびプリンタなどのインターフェイス、ならびに他のインターフェイス、例えばネットワークインターフェイス、およびデータベースインターフェイスを含むソフトウェアインターフェイスと接続されたプロセッサを含む汎用コンピュータシステムが使用される。
【０１０１】
コンピュータシステムは、キーボード、入力データファイル、もしくはネットワークインターフェイスなどのデータ入力デバイス、または別のシステム、例えばマイクロアレイまたはPCRデータなどを解釈するシステムから、ユーザー入力を受信し、プリンタ、ディスプレイ、ネットワークインターフェイス、またはデータ格納デバイスなどの出力デバイスに出力を与える。入力デバイス、例えばネットワークインターフェイスは、本明細書に記載するタンパク質/核酸の検出および/またはそれらの化合物の定量を含む入力を受け取る。出力デバイスは、出力、例えば化合物の検出および/または定量を表現した一つまたは複数の数字および/またはグラフなどの表示を与える。
【０１０２】
コンピュータシステムは、本明細書に記載する方法によって生成されたデータを格納するデータ記憶装置に接続される。このデータは、測定ごとおよび/または対象ごとに格納され、任意で、これらのデータタイプのそれぞれのセットが、各対象に対応して、多数、格納される。一つまたは複数のコンピュータ/プロセッサが、例えばネットワークを介してコンピュータシステムに接続された個別の機械として使用されるか、またはコンピュータシステム上で作動する個別プログラムまたは統合プログラムを含みうる。どちらの方法を使用するにせよ、これらのシステムはデータを受け取り、代わりに検出/診断に関するデータを与える。
【実施例】
【０１０３】
以下の実施例は、本発明の一定の態様および局面を実証し、さらに例示するために掲載されるものであって、本発明の範囲を限定していると解釈すべきではない。
【０１０４】
実施例I:リン酸化およびSUMO欠損プロゲステロン受容体は乳がん進行中の増殖性遺伝子シグネチャを駆動する
材料と方法
ヒト乳腺腫瘍試料におけるプロゲステロン受容体発現
タンパク質およびmRNA解析のために、匿名化ヒト乳腺腫瘍試料を、University of Minnesota Tissue Procurement FacilityのBiological Materials Procurement Network（BioNet）から入手した。凍結組織試料は管癌、浸潤性管癌、小葉癌、または転移性癌のいずれかと診断された患者に由来した。標本は、University of Minnesotaの臨床病理学部門によって分析され、標準的な臨床組織学的方法を使って、エストロゲン受容体（ER）およびプロゲステロン受容体（PR）発現についてスコア化された。腫瘍試料を、標準的方法（凍結組織粉砕、RIPA緩衝液、tri試薬）を使って、タンパク質用またはmRNA用に個別に収穫し、全PR、ホスホ-Ser294 PR、およびERK1/2のタンパク質発現レベルを、ウェスタンブロッティングによって測定した（後述）。標本は全て、患者の組織試料の研究目的での使用に関してインフォームドコンセントが得られた患者から、University of Minnesota治験審査委員会（Institutional Review Board;IRB）の承認を得て入手した。
【０１０５】
細胞培養、発現ベクターおよびウェスタンブロッティング
T47Dco親細胞株は以前に特徴付けられた（Horwitzら、1982）。WT、K388R、S294A、またはK388R/S294A PRのいずれかをコードするcDNAをpIRES-neo3発現ベクター（Clontech、カタログ番号631621）に分子クローニングした後、FuGENE HD（Roche、カタログ番号04709713001）を使ってベクターをT47D-Y細胞（Sartoriusら、1994）にトランスフェクトすることによって、PRを安定に発現するT47D細胞を作製した。単一細胞クローンを高濃度G418選択下（500μg/ml）で拡大し、低濃度G418選択下（200μg/ml）で維持した（EMD Chemicals、カタログ番号345810）。これらの細胞は、5％ウシ胎児血清（FBS）、1％非必須アミノ酸（NEAA）、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、6ng/mlインスリン（CellGro、カタログ番号10-010-CV）を補足した完全最小必須培地（cMEM）で維持した。誘導性PRを発現するT47D細胞は以前に記述されている（Haganら、2011）。誘導性PR発現は、AP21967（10-9M、Ariad Pharmaceuticals、マサチューセッツ州ケンブリッジ）を細胞培養培地に、2日間の最小処置時間にわたって添加することによって達成した。PRを発現するMCF-7細胞株は、WT PRまたはKR PRのどちらかをコードするcDNAインサートを含有するpIRES-neo3ベクターを、細胞に、FuGENE HDを使ってトランスフェクトすることによって作製した。単一細胞クローンを高濃度G418選択下で拡大し、低濃度G418選択下で維持した。MCF-7細胞は、5％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補足したDMEM（ダルベッコ変法イーグル培地、CellGro、カタログ番号10-013-CV）中で維持した。BT-474細胞（ATCC、バージニア州マナッサス）は、10％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補足したRPMI1640培地（Gibco、カタログ番号11875）中に維持した。SDS-PAGEは8％ゲルを使って行い、ウェスタンブロッティング分析は先に記述されているように行った（Danielら、2007a）。抗体情報については、図5.1を参照されたい。 
【０１０６】
遺伝子発現プロファイリング
pIRES-neo3空ベクター、WT PRまたはKR PRを安定に発現するT47D細胞を、変法IMEM（Gibco、カタログ番号A10488）中で1日間、血清飢餓させ、R5020（10-8M）または媒体対照で6時間処理してから、RNeasyキット（QIAgen、カタログ番号74104）を使ってRNA抽出を行った。6時間のプロゲスチン処理により、以前の研究（Jacobsenら、2005;Richerら、2002）と比較して、実質的なPR依存性遺伝子発現が可能になった。Illumina HT-12v4ビーズプラットフォームを製造者のプロトコールに従って使用する発現解析のために、二重実験から、DNase I処理（QIAgen、カタログ番号79254）RNA試料を調製した。生強度をlog2変換して分位数標準化（quantile normalize）するlumiと呼ばれるBioconductor（Gentlemanら、2004）パッケージを使って、Rソフトウェア内で、データを解析した。経験ベイズ法を使って遺伝子の分散をより良く推定するlimmaパッケージを使用して、差次的発現遺伝子を解析した。提示される遺伝子発現データはlog2標準化強度を含み、提示される生物学的比較（例えばR5020/媒体）はlog2倍率変化をBenjaminiおよびHochberg（BH）調整P値（BenjaminiおよびHochberg、1995）と共に含んでいる。図1Cのヒートマップを作成するために、Rパッケージgplots中のheatmap.2関数を使って、遺伝子の教師なし階層的クラスタリングを行った。クラスタリングはユークリッド距離および完全連結法を使って行った。行を、平均ゼロおよび標準偏差が1になるようにスケーリングした。
【０１０７】
誘導性PRを発現するT47D細胞における遺伝子発現プロファイルはAffymetrixマイクロアレイプラットフォームを使って測定した。AP21967（10-9M）で2日間、PR発現を誘導し、細胞を変法IMEM中で1日間、血清飢餓させ、R5020（10-8M）または媒体対照で6時間処理してから、RNeasyキットを使ってRNA抽出を行った。Affymetrix U133A 2.0マイクロアレイを製造者のプロトコールに従って使用する発現解析のために、DNase I処理試料を調製した。Bioconductor（Gentlemanら、2004）パッケージ、affyおよびaffyQCReportを使って、生Affymetrix CELファイルをR内で処理し、標準化した。affyパッケージ内のRobust Multi-array Average（Irizarryら、2003）アルゴリズムを使ってデータを標準化した。MAS 5.0アルゴリズムの一部としてのWilcoxon符号順位検定（affyパッケージにも含まれている）を使って、プレゼンス（presence）/アブセンス（absence）コール（call）を決定した（Liu、2004）。選択された条件のペアについて標準化発現レベルをlog2比として算出した。全ての遺伝子発現データはNCBI Gene Expression Omnibus（GEO）データベース（アクセッション番号:GSE34149、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE34149）で入手することができる。
【０１０８】
抗プロゲスチンで処理したT47D細胞株における遺伝子発現プロファイルは、これらの顕著な相違を除けば、上記と同一の方法を使って得た。血清飢餓後に、空ベクター、WT PR、またはKR PRを安定に発現する細胞を、8つの考えうる条件のうちの一つの下で、6時間処理した:（1）エタノール（媒体対照）、（2）プロゲステロン（10-8M）、（3）RU486（10-7M）、（4）アグレプリストン（10-7M）、（5）オナプリストン（10-7M）、（6）RU486（10-7M）＋プロゲステロン（10-8M）、（7）アグレプリストン（10-7M）＋プロゲステロン（10-8M）、または（8）オナプリストン（10-7M）＋プロゲステロン（10-8M）。上述の方法を使って、遺伝子発現レベルを測定し、標準化し、解析し、ヒートマップを作成した。
【０１０９】
活性化PRによって駆動される腫瘍中の遺伝子マーカーの同定
2つの独立したマイクロアレイ実験（どちらも上述のIllumina HT-12v4プラットフォームを使って実施したもの）からの生マイクロアレイデータを組み合わせ、生強度をlog2変換して分位数標準化するlumiと呼ばれるBioconductor（Gentlemanら、2004）パッケージを使って、Rソフトウェア内で、一緒に標準化した。
【０１１０】
サンプルサイズおよび比較:第1の解析の場合、第1の実験では合成プロゲスチンR5020で刺激された2つのKR細胞レプリケートを使用し、第2の実験ではプロゲステロンで刺激された3つのKR細胞レプリケートを使用した。同じことを、対応するWT細胞レプリケートに関して遂行した。したがって、第1の解析について言えば、2つの群（KRおよびWT）のそれぞれについて、n＝5のサンプルサイズを使用した。第2の解析については、本発明者らは、第2の実験において、プロゲステロン＋オナプリストンで同時処理した3つのKR細胞レプリケートを使用し、また本発明者らは、第2の実験において、プロゲステロン＋オナプリストンで同時処理した3つのWT細胞レプリケートも使用した（2つの群のそれぞれについてn＝3）。第3の解析については、本発明者らは、第2の実験において、プロゲステロン＋RU486で同時処理した3つのKR細胞レプリケートを使用し、また本発明者らは、第2の実験において、プロゲステロン＋RU486で同時処理した3つのWT細胞レプリケートも使用した（2つの群のそれぞれについてn＝3）。第4の解析については、プロゲステロン＋オナプリストンで同時処理した3つのKR細胞レプリケートが使用され、媒体対照（エタノール）で処理した3つのWT細胞レプリケートが使用された（2つの群のそれぞれについてn＝3）。第5の解析については、プロゲステロン＋オナプリストンで処理した3つのWT細胞レプリケートが使用され、媒体対照（エタノール）で処理した3つのWT細胞レプリケートを使用した（2つの群のそれぞれについてn＝3）。
【０１１１】
対照遺伝子:処理済（標準化）データの品質を評価するために、次の対照遺伝子のリストを使用した:TBP、GAPDH、ACTB、TRAP1、PPIB、FPGS、EEF1A1、UBC、TXN、B2M、HMBS、およびFARP1。詳細に記録されたマイクロアレイ技術の短所を考慮するために、上述の対照遺伝子を標的とするこのチップ（Illumina HT-12v4）中の全てのプローブを同定し、利用した。次に挙げる括弧内の数は、特定対象遺伝子を標的とする異なるプローブの数を示す:TBP（1）、GAPDH（3）、ACTB（3）、TRAP1（1）、PPIB（1）、FPGS（3）、EEF1A1（4）、UBC（3）、TXN（2）、B2M（2）、HMBS（3）、およびFARP1（4）。
【０１１２】
統計的方法:統計的有意性を評価するために、次の3つの異なる独立した方法を使用した。
【０１１３】
1）P値
パラメトリック遺伝子変数（正規性条件と等分散性条件の両方を満たした）には独立t検定を使用し、正規性条件は満たすが等分散性条件を満たさない遺伝子変数にはAspin-Welch不等分散検定（AW）を使用し、ノンパラメトリック遺伝子変数、すなわちi）正規性条件を満たさないか、ii）正規性条件と等分散性条件とを満たさない変数にはMann-Whitney U検定（MW）を使用した。Illumina HT-12v4チップには47,231のプローブセットが存在することを考慮し、ボンフェローニ補正を使用して、研究全体の有意水準をα＝1.06×10-6に設定した。したがって、任意の変数がP値法に従って有意であるとみなされるには、次の条件が満たされなければならない:P＜α。Mann-Whitney U検定（MW）については、ノンパラメトリック変数が関係しない（一方の群からの対象が他方の群からの対象と同じ発現値を有する）場合は、正確確率を使用し、そうでない場合は、補正を伴う近似確率を使用した。
【０１１４】
2）倍率変化（FC）
全ての遺伝子変数について、KR群の平均発現値の方がWT群の平均発現値より大きい場合（過剰発現）は、倍率変化（FC）を KR群の平均発現値／WT群の平均発現値 と定義し、統計的有意性を、log2スケールで≧10％の変化を表すFC≧1.10に設定した。KR群の平均発現値がWT群の平均発現値より低い場合（過小発現）は、FCを、負の WT群の平均発現値／KR群の平均発現値 の比と定義し、統計的有意性を、やはりlog2スケールにおいて≧10％の変化を表すFC≦-1.10に設定した。したがってこの方法によれば、統計的に有意であるとみなされるには、遺伝子変数が|FC|≧1.10でなければならない。
【０１１５】
3）ROC曲線解析
全ての遺伝子変数に対して、2つの群の関するその識別力を評価するために、ROC曲線解析を行った。小さいサンプルサイズの効果を可能な限り相殺するために、統計的有意性をROC AUC＝1.00に設定した。ROC AUC＝1.00である変数は完璧な識別力を有する。言い換えると、2つの群はその変数に関して完全に離れていて、2つの群間にオーバーラップはない。（AUC:曲線下面積）。この解析には実験的ROC曲線を使用した。
【０１１６】
統計的有意性の総合的基準:上記3つの独立した統計的有意性評価方法を組み込んで、総合的な有意性基準を次のように設定した:最も有意な変数の最終リストに含まれるには、どの変数も、i）P＜1.06×10-6、ii）|FC|≧1.10、およびiii）ROC AUC＝1.00である必要があるだろう。さらにまた、第1の方法での偽陰性の数を最小限に抑えるために、所与の変数が、第1の方法の基準（P＜1.06×10-6）を満たせなかったが、他の2つの方法の基準を満たす場合は、log2スケールで20％を上回る変化を表す|FC|≧1.20である場合にのみ、それを統計的に有意であるとみなした。
【０１１７】
プローブ多重度:統計的有意性の基準を3つとも満たし、最終リストに含まれた、全ての遺伝子変数を、複数のプローブが同じ遺伝子変数を標的としている可能性について調べた。所与の遺伝子変数を標的とする複数のプローブ（2つ以上）が存在した場合は、全てのプローブを統計的有意性について評価した。これらのプローブの過半数が有意性の基準を3つとも満たす場合は、当該所与の遺伝子変数を、最も有意な変数の最終リストに残した。同数であって、プローブの半分が（3つ全ての方法によって）有意であると決定され、残りの半分が有意でないと決定された場合は、当該所与の遺伝子変数を最終リストから除外した。
【０１１８】
RT-qPCR
逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応（RT-qPCR）アッセイのために、5×105細胞/ウェルを6ウェルディッシュにプレーティングし、変法IMEM中で1日間、血清飢餓させてから、処理した（個々の図を参照されたい）。TriPure試薬（Roche、カタログ番号11667157001）を使ってRNAを抽出し、Transcriptor cDNA第一鎖cDNA合成キット（Roche、カタログ番号04897030001）を使ってcDNAを作製した。Roche LightCycler IIで、SYBRグリーンマスターミックス（Roche、カタログ番号04887352001）を使って行われるqPCRアッセイによって、相対的発現レベルを決定した。ターゲット遺伝子定量レベルを、標準的なハウスキーパー遺伝子、すなわちTBP、ACTB、および/またはGAPDHの発現に対して標準化した。誘導性PRを発現する細胞の場合、リガンド処理に先だって細胞をAP21967（10-9M）で2日間誘導したことを除けば、プロトコールは上記と同じとした。
【０１１９】
上皮成長因子（EGF）処理を伴うRT-qPCRアッセイの場合は、6ウェルディッシュに5×105細胞/ウェルの密度で細胞をプレーティングし、変法IMEM中で2日間、血清飢餓させた。細胞を100ng/mlのEGF（Sigma、カタログ番号E9644）で前処理してから、R5020（10-8M）で処理した。
【０１２０】
MEK阻害剤を用いる実験の場合は、BT-474細胞を6ウェルディッシュに5×105細胞/ウェルの密度でプレーティングした。1日後に細胞を洗浄し、変法IMEM中で1日間、血清飢餓させた。これらの細胞を、MEK阻害剤U0126（5μM、EMD Chemicals、カタログ番号662005）で30分間前処理した。次に、R5020（10-8M）および/またはRU486（10-7M）を培養培地ウェルに6時間加えてからRNA/タンパク質を単離し、RT-qPCR/ウェスタンブロッティングを上述のように行った。この研究で使用したPCRプライマーセットを図5.1に掲載する。
【０１２１】
Ingenuityパスウェイ解析
Ingenuityパスウェイ解析（IPA）を使って2つの異なる遺伝子リストを比較した:WT PRを発現するT47D細胞においてプロゲスチンによってアップレギュレートされるものと、SUMO欠損PRを発現する細胞においてプロゲスチンによってアップレギュレートされる遺伝子との比較（＋R5020/−R5020 log2倍率変化＞1.0、BH調整P＜0.01）。これらの遺伝子リストをIPAソフトウェアにアップロードし、そこでコア解析を完了することで、各遺伝子のさまざまな生物学的機能またはネットワークパスウェイとの関連を決定した。IPA比較解析を使って、WT PRまたはKR PRを発現する細胞が機能的に異なるパスウェイをアップレギュレートするかどうかを明らかにした。解析を有意性（BH調整P値、複数の仮説検定について補正）に基づいてスコア化し、ある遺伝子リストが特定の生物学的機能に有意に関与するための閾をP＜0.05（または-log10(BH調整P値)＞1.30）とした。
【０１２２】
PR発現メタ遺伝子の同定
媒体またはR5020のどちらかで処理した、空ベクター、WT PR、またはK388R PRを構成的に発現する細胞株からの遺伝子発現マイクロアレイデータを使って、メタ遺伝子解析を行った（図5C〜D）。非負値行列因子分解（GaujouxおよびSeoighe、2010）を使って各試料内でのメタ遺伝子を同定する戦略を使用した。この戦略により、メタ遺伝子の同定と、他のデータセットへの適用が容易になった。変動が大きい遺伝子に研究を限定し、メタ遺伝子フィットの計算に使用されるプローブの数を限定するために、プローブの四分位数間範囲（IQR）が上側第80パーセンタイル内にあることに基づいて、メタ遺伝子解析のためのプローブを考慮した。データの最適ランクは8と計算されたので、8つのメタ遺伝子がデータ中に存在する。これらのメタ遺伝子のうちの3つは、全ての試料中に多量に発現しているか、またはどの試料にも発現していなかったことから、それらはおそらくハウスキーピング遺伝子または連続的に発現される遺伝子に関するメタ遺伝子であるだろう。残り5つのメタ遺伝子は、空ベクターPRヌル試料（-R5020処理と+R5020処理の間で差異なし）、およびR5020ありまたはR5020なしでのWT PRまたはKR PRのペアワイズの組み合わせに対応した。したがって、これらの解析により、生物学的に関連する細胞のサブタイプからメタ遺伝子が同定された。
【０１２３】
Loiらのヒト乳腺腫瘍データセット（Loiら、2007）は、数個のデータセットにわたってタモキシフェン処置試料および無処置試料の両方についての遺伝子発現データを含んでいる。これらのデータは一つに集計され、gene expression omnibus（GEO）（アクセッション番号GSE6532）から入手することができる。このデータセット（Loiら、2007）を処理のためにRed-R（CovingtonおよびParikh、2011）にロードした。メタ遺伝子解析のための基底行列を再構築（reshape）して、遺伝子記号を横切って集計し、遺伝子の各プローブを横切ってメタ遺伝子値を平均した（平均値）。同じ操作を発現データに対して行った。不整合（non-matching）遺伝子（メタ遺伝子データ中に存在するが、臨床発現データには存在しないか、またはその逆であるもの）を解析から除去した。再構築したデータを非負行列因子分解（NMF）パッケージ関数（fcnnls）に供給して（T47D細胞株データへの初期メタ遺伝子フィットを生成するために行われたように）スコアリングした。Loiらのデータはz-スコアとして供給されるので、データを逆対数変換（un-log）し、fcnnlsアルゴリズムで使用した（それらは標準形では負数を含むからである）。試料が、当てはめられた係数行列（fitted coefficient matrix）（スコアリング行列）中で0でない値を示す場合は、メタ遺伝子を表すために、試料をとった。
【０１２４】
新規PRターゲット遺伝子の同定および遺伝子発現プラットフォームの比較解析
先に公表された2つの研究（Jacobsenら、2005;Richerら、2002）からのリガンド依存性およびリガンド非依存性PRターゲット遺伝子リストを合わせた（重複は除去した）。ここで同定された遺伝子は、どちらかのプラットフォーム（IlluminaとAffymetrixを合わせた）を使って測定した場合にアップレギュレートされ（＞1.5倍、BH調整P＜0.01）、バイオインフォマティクスツールVENNY（Oliveros、2007）を使った既知のアップレギュレートされた遺伝子とのベン図比較の前に、重複を除去した。
【０１２５】
遺伝子セットエンリッチメント解析（GSEA）ソフトウェア（Moothaら、2003;Subramanianら、2005）を利用して、WT PRまたはKR PRを安定に発現する細胞においてアップレギュレートまたはダウンレギュレートされる遺伝子を、誘導性iWT PRまたはiKR PRを発現する細胞と比較した。Affymetrix発現データを使って、4つの遺伝子セットを作製した:iWTとR5020によって＞2.0倍アップレギュレートまたはダウンレギュレートされた遺伝子、およびiKRとR5020によって＞2.0倍アップレギュレートまたはダウンレギュレート遺伝子。同様に、2つのGSEAフォーマットデータセットをIllumina発現データから作製した:第1のデータセットは2つの表現型（WT ＋R5020対WT −R5020）を比較し、第2のデータセットは2つの表現型（KR ＋R5020対KR −R5020）を比較する。これらのIlluminaデータセットを使ってGSEAを行い、Affymetrix遺伝子セットのエンリッチメントについてクエリした。GSEAは、パーミュテーションタイプ（permutation type）を1000パーミュテーションでGene_setに設定し、本発明者らのデータセットは対数スケールデータを含んでいたので、遺伝子をランキングするための測定基準（metric for ranking gene）をDiff_of_Classesに設定した点以外は、デフォルト設定を使って実行した。
【０１２６】
クロマチン免疫沈降（ChIP）
ChIPアッセイはChIP-IT Express使用説明書（Active Motif、カタログ番号53008）に従って行った。細胞をcMEM中、15cm培養皿あたり15×106細胞の密度で2日間プレーティングした後、変法IMEM中で2日間、血清飢餓させた。細胞をR5020（10-8M）または媒体で1時間または4時間処理した。誘導性PRを発現するT47D細胞の場合は、飢餓工程中にAP21967（10-9M）を加えた。クロマチンをBioruptorソニケータ（Diagenode、モデルUCB-200）を使って30分間（30秒オン/オフ）せん断した。免疫沈降は60μlのせん断クロマチン、2μgの抗体で調製し、一晩、免疫沈降させた。精製ChIPおよびインプットDNAを使って、相対的動員をqPCRによって三重に決定した。アッセイはRoche LightCycler IIでSYBRグリーンマスターミックスを使って行った。ターゲット座位定量をインプットDNA定量のパーセンテージとして標準化した。
【０１２７】
H3K4me2レベルをアッセイするために、小球菌ヌクレアーゼ（MNase）を使ってヌクレオソームを単離した。15cmディッシュで、cMEM中、12×106細胞をプレーティングし、変法IMEM中で血清飢餓させ、AP21967（10-9M）処理で2日間、誘導した。1日後に、細胞をR5020（10-8M）で4時間処理し、クロマチンを収穫して、先に記述されているように（Verziら）免疫沈降させた。
【０１２８】
細胞増殖およびアポトーシスアッセイ
細胞増殖はMTTアッセイ（3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド、Sigmaカタログ番号M2128）を使って測定した。24ウェルプレートで、cMEM中、1×104細胞/ウェルをプレーティングし（誘導性PR発現はAP21967（10-9M）で2日間誘導した）、細胞を洗浄し、5％デキストラン被覆活性炭処理（DCC）FBSを補足した変法IMEM中で1日間、ステロイド飢餓させてから、R5020（10-8M）を添加した。0、2、4、6日目に、各0.5ml細胞培養ウェルに60μlのMTT（5mg/ml）を3時間添加することによって細胞増殖を決定し、培地を注意深く取り除いて可溶化溶液（90％ v/v DMSO/PBS）を加えることで細胞を溶解した。プレートリーダーを使って溶解物の吸光度（650および570nm）を測定した。650nm測定値を570nm測定値から差し引き、試料平均を0日目に対して標準化した。
【０１２９】
細胞毒性濃度のドキソルビシンによる処理後の細胞培養におけるアポトーシスのレベルを測定するために、ポリ(ADP)-リボースポリメラーゼ1（PARP）切断アッセイを使用した。誘導性PRを発現するT47D細胞を、cMEM中、10cmディッシュにプレーティングし（2×106細胞/ディッシュ）、AP21967（10-9M）で誘導した。細胞を洗浄し、誘導し、4日間、血清飢餓させた。次に、細胞をR5020（10-8M）で6時間処理してから、ドキソルビシン（8μM）をディッシュに24時間添加した。標準的RIPA溶解緩衝液を使ってタンパク質を収穫し、PARP切断産物抗体およびPR抗体を使ったSDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングに付した。試料ローディング対照のためにβ-アクチンウェスタンブロッティングを行った。
【０１３０】
Cell-Titer-Gloバイオルミネセンスアッセイ（Promega、カタログ番号G7571）を使って、生細胞数に正比例するアデノシン三リン酸（ATP）の濃度を測定することにより（Crouchら、1993）、細胞毒性ドキソルビシンによる処理後の細胞生存率を決定した。WT PRまたはKR PRを発現するT47D細胞を、cMEMが入っている24ウェルディッシュにプレーティングした（1×104細胞/ウェル）。細胞を洗浄し、5％DCC FBSを補足した変法IMEM中で1日間、ステロイド枯渇させた。細胞をR5020（10-8M）で6時間処理してから、ドキソルビシン（6μM）をウェルに加えた。4日後に、Cell-Titer-Glo基質を加えることによって細胞生存率を決定し、プレートリーダーを使ってルミネセンスを測定した。試料平均を0日目に対して標準化した（n＝6、±SD）。
【０１３１】
Oncomineデータ解析
Oncomineデータベース（バージョン4.4、2011年10月データ公開）を検索することによって、ヒト乳腺腫瘍試料における個々のPRターゲット遺伝子の相対的発現を決定した。個々のPRターゲット遺伝子（例えばRGS2）をThe Cancer Genome Atlas（TCGA）Breast 2データセットでクエリした。Oncomine出力データをソートして「がん対正常」連関を取り出し、血液、正常乳房および乳癌試料についてのコピー数単位発現値として、箱ひげ図（ドット:最大/最小、ひげ:90/10パーセンタイル、箱:75/25パーセンタイル、線:全試料の中央値）を使って報告した（図2A）。各解析で、各遺伝子について指定された具体的乳癌は、浸潤性小葉乳癌（MSX2）、浸潤性管および小葉癌（RGS2）、管内篩状乳腺癌（MAP1A）、および粘液性乳癌（PDK4）である。
【０１３２】
Oncomineデータベースに記載されている複数の乳がん「コンセプト（concept）」が、リガンド依存性（LD）KR＞WT遺伝子シグネチャと関連した。Oncomineによれば、コンセプトは、腫瘍コホートまたはがん細胞株実験に由来する遺伝子発現マイクロアレイまたは遺伝子コピー数データセットに由来する。具体的には、コンセプトは、何らかの基準（例えばERBB2陽性乳腺腫瘍において発現する遺伝子の上位5％）によって定義された、さまざまな公開データセットからの遺伝子のリストである。R5020処理群における遺伝子発現値を非R5020処理群に対して標準化し、次に、KR PRおよびWT PR発現細胞株間でこれらの標準化された倍率変化値を比較することにより、リガンド依存性（LD）遺伝子シグネチャを作製した。この解析により、WT PR発現細胞との対比でSUMO欠損PRを発現する細胞において＞1.5倍アップレギュレートされる151のLD遺伝子が同定された。WTまたはKR発現細胞において非R5020処理群での遺伝子発現値を、PRヌル発現細胞における非R5020処理群に対して標準化し、次に、KRおよびWT発現細胞株間でこれらの標準化された倍率変化値を比較することにより、リガンド非依存性（LI）遺伝子シグネチャを作製した。この解析により、WT PR発現細胞との対比でSUMO欠損PRを発現する細胞において＞1.5倍アップレギュレートされる92のLI遺伝子が同定された。これらのPR遺伝子シグネチャをOncomine Research Premium Editionソフトウェア（Compendia Bioscience、ミシガン州アナーバー）にアップロードし、関連コンセプトについてデータベースを検索した。
【０１３３】
結果
PR SUMO化はT47D乳がん細胞におけるプロモーター選択を変化させる
理由は不明だが、腫瘍性胸部組織との比較で正常胸部組織におけるPR調節遺伝子にはオーバーラップがほとんどない（Grahamら、2009）。PR機能の明白な相違の一つの機序は、改変されたシグナル伝達など、乳がん発生における早期事象に関係しうる。一部は本発明者らの以前の研究（Danielら、2007a;DanielおよびLange、2009;Danielら、2007b）にも基づいて、SUMO化PRとリン酸化（すなわち脱SUMO化）PRの間のバランスは乳がんではしばしば変化していて、それがPRプロモーター選択性の変化と改変された遺伝子発現パターンをもたらすと予測される。PR陽性と臨床的に定義された10の乳腺腫瘍のスクリーンでは、幅広い全PR mRNA発現（掲載していない）およびタンパク質発現（図1A）が検出された。RT-qPCRでもウェスタンブロッティングでもPR陽性であることが確認された（10中）7つの乳腺腫瘍のうち、少なくとも5つの試料（レーン1、3、6、8、および9）は、明らかに何らかのレベルのホスホ-Ser294 PR-Bも含有していた（図1A）。注目すべきことに、10中2つの腫瘍（レーン1および3）が、豊富なホスホ-Ser294 PR-Bを含有していた。とりわけ、PR-BのSer294は、主としてMAPKおよびCDKファミリー内のプロリン指向性プロテインキナーゼに入力（input）するプロゲスチンまたはペプチド成長因子のどちらかに応答して、迅速にリン酸化されるが、PR-Aはそうではない（Clemmら、2000）。この知見と合致して、EGFは、プロゲスチンが誘導するPR-BのSUMO化を遮断したが、PR-AのSUMO化は遮断しなかった（Danielら、2007a）。
【０１３４】
本明細書では、PRターゲット遺伝子がPR SUMO化ステータスによって異なることを開示する。臨床標本における広範なPR発現（図1Aおよび（Liuら、2010））は、PR依存性遺伝子発現が、乳がん表現型へのPRの寄与の、より正確なマーカーになりうることを示唆している。リン酸化およびSUMO欠損PR-Bのユニークな作用を扱うために、野生型（SUMO化されうる）またはSUMO欠損（K388R変異型/ホスホミミック）PR-B分子のどちらかを安定に発現する乳がん細胞の転写プロファイルを、全ゲノム発現プロファイリングを使って測定した。野生型（WT）PR-BまたはLys388におけるSUMO修飾を起こすことができない変異型K388R（KR）PR-Bのどちらかを発現する同ベクターPRヌルT47D乳がん細胞のクローンを複数、工学的に作製した。このSUMO欠損受容体は、Ser294が永続的にリン酸化されているPR-Bの機能的ミミックである（Danielら、2007a;Langeら、2000）。ホスホ-Ser294およびS294D受容体は、WT PRとの比較で、迅速なリガンド依存性（ユビキチン媒介性）ダウンレギュレーションを起こす高活性転写因子である（Danielら、2007b）。次に、WT PR-BまたはKR PR-Bのどちらかを発現する細胞を合成プロゲスチンR5020（10-8M）で6時間処理した（図1B）。リガンド結合が起こると、わずかなゲル上方シフトによって示されるとおり、PRは複数の部位でグローバルにリン酸化される（Takimotoら、1996）。以前の報告（Danielら、2007a;DanielおよびLange、2009）と合致して、過剰活性化KR PRは、WT PRとの比較で（6時間で明白な）わずかに迅速なリガンド誘発性（ユビキチンプロテアソーム依存性）ダウンレギュレーションを起こす（Langeら、2000）。これらの実験条件を使用し、Illumina HT-12v4全ゲノム遺伝子発現ビーズアレイを使って、網羅的遺伝子発現プロファイルを、同時に測定した（図1C）。アップレギュレートまたはダウンレギュレートされた遺伝子（少なくとも一つの試料で倍率変化＞8.0、BH調整P＜0.001、図1C）を含む上位調節遺伝子をヒートマップによって整理した。プロゲスチン処理を行うと、これらの細胞は、多様な発現パターンを示した:複数のPR調節遺伝子セットが容易にわかるようになった（図1C;無処理対照との比較でリガンド依存性PRによってアップレギュレート（1a）またはダウンレギュレート（1b）されたPR調節遺伝子、PRヌル対照との比較でリガンド非依存性PRによってアップレギュレート（2a）またはダウンレギュレート（2b）された遺伝子、およびWT発現細胞株との比較で主としてKR発現細胞株で（3）またはKR発現細胞との比較で主としてWT発現細胞株で（4）アップレギュレートされたリガンド依存性遺伝子の群を比較されたい）。
【０１３５】
リガンド依存性またはリガンド非依存性にPRによって＞1.5倍アップレギュレートされた遺伝子が同定され、KR受容体またはWT受容体のどちらかを発現する細胞間での遺伝子発現オーバーラップが、ユニークに調節される遺伝子のサブセットと共に見いだされた（図1D〜E）。次に、発現プロファイルを、これらのクラスからの数多くのPRターゲット遺伝子について、RT-qPCRによって検証した（図1F）。とりわけ、RGS2発現（主としてKR受容体によってアップレギュレートされる）は、基底/筋上皮コンパートメントにおいて過剰発現し、大半の乳腺腫瘍において実質的に上昇している（Smalleyら、2007）。対照的に、BCL2L11（BIM）は、ERBB/MAPK依存性管腔細胞クリアリング（Reginatoら、2005）に関与するアポトーシス促進メディエーターであり、その発現は、主としてWT受容体によってアップレギュレートされるが、KR受容体ではアップレギュレートされない。これらの例が示唆するとおり、遺伝子アレイによって、PRターゲット遺伝子の多様なクラスがロバストに同定され、遺伝子アレイは、PR媒介性の細胞増殖および細胞生存の機序を指示する遺伝子発現プロファイルを含んでいる。
【０１３６】
これらの結果は、誘導性ベクター系からWT PRまたはKR PRを発現するように工学的に作製したT47D細胞でも再現された（図1.1）。このモデルでは、PR（iWTまたはiKR）の誘導性発現が、細胞培養培地に添加された低分子ダイメライザーAP21967の存在だけに依存し、AP21967で処理するとiWTまたはiKRのどちらかが等レベルに誘導され、これらの受容体はプロゲスチンに応答してSer294が等しくリン酸化された（図1.1A）。細胞をAP21967（10-9M）およびR5020（10-8M）で処理し、Affymetrix U133A 2.0マイクロアレイプラットフォームを使って、遺伝子発現の変化についてアッセイした。PRを安定に発現するT47D細胞から得られたPR依存性遺伝子発現プロファイル（Illuminaプラットフォームを使ってアッセイしたもの）は、PRを誘導性に発現する同じ親細胞（T47D）から得られた遺伝子アレイデータ（Affymetrixプラットフォームによってアッセイしたもの）と著しく似ていた（図1.1B〜C参照）。総合すると、これらのアレイでは、以前の報告（Jacobsenら、2005;Richerら、2002）より多くのPR調節遺伝子（＞1.5倍、BH調整P＜0.01）が同定された。現在のマイクロアレイプラットフォームは、以前の技術との比較で、何千も多い「レポーター」を含んでいる。以前から公知であったPRターゲット遺伝子の70％が同定されたが、何百という新規PRターゲット遺伝子も明らかになった（非掲載データ）。
【０１３７】
PR Ser294のリン酸化はSUMO欠損PR遺伝子発現を駆動する
「SUMO感受性」PRターゲット遺伝子の調節機序を調べるために、本発明者らは、マイクロアレイ解析から、さらなる研究用に4つの遺伝子（MSX2、RGS2、MAP1AおよびPDK4）を選択した。これらの具体的遺伝子はKR受容体を発現する細胞ではアップレギュレートされたが、WT受容体を発現する細胞ではアップレギュレートされなかった（図1D、197遺伝子カテゴリー）。Oncomineデータベースのクエリにより、4つの遺伝子は全て、正常胸部組織および血液との比較で、乳がんでは増幅されることが実証された（図2A）。PRターゲット遺伝子発現のSUMO依存性変化をさらなる乳がんモデルで検証するために、本発明者らは、低レベルの内在性PRを（エストロゲンの非存在下で）発現するMCF-7細胞にベクター対照、WT受容体またはKR受容体を安定に導入した。これらの細胞を、PRアンタゴニストRU486（10-7M）の非存在下または存在下、媒体対照（エタノール）またはR5020（10-8M）で、6時間処理した（図2B）。MCF-7細胞におけるプロゲスチン誘発性遺伝子発現プロファイルは、本発明者らのT47D細胞モデルで得られたものとほぼ同一であった（MSX2、RGS2、MAP1A、およびPDK4）。さらに、それらのR5020誘導性mRNA発現は、RU486の添加によって完全に消滅したことから、これらの遺伝子の調節は完全にPR依存性であることが示された。
【０１３８】
SUMO欠損KR受容体はホスホ-Ser294（WT）PR種をそっくりに模倣することが、以前に示されている（Danielら、2007a）。同じ遺伝子セット（MSX2、RGS2、MAP1A、およびPDK4）に対するPR調節のリン酸化依存性を実証するために、PRヌルT47D細胞、またはWT、KR、もしくはホスホ-変異型S294A（SA）PR-B（Langeら、2000）を安定に発現するT47D細胞を使用した。PR Ser294の変異は、ルシフェラーゼレポーターアッセイで測定すると、転写抑制的である著しくSUMO化された受容体をもたらす（Danielら、2007a）。この知見と合致して、S294A PRを発現する細胞では、SUMO欠損KR PRを発現する細胞との比較で、内在性PRターゲット遺伝子のプロゲスチン誘発性アップレギュレーションが遮断された（図2C）。Ser294とLys388の両方に点変異を含有するPR二重変異体（KRSA）を発現する細胞では、プロゲスチン誘発性遺伝子発現が復旧した（すなわちR5020処理KR細胞で誘発されるものに匹敵した）ことから、PR脱SUMO化はこれらのリン酸化依存性PRターゲット遺伝子のリガンド依存性アップレギュレーション（抑制解除）に必要な主要事象であることが示唆される。
【０１３９】
EGFによる乳がん細胞の処理はロバストなPR Ser294リン酸化および脱SUMO化を誘発する（Danielら、2007a）。そこで、WT PRを安定に発現するT47D細胞をEGF（100ng/ml）で前処理した後、媒体対照またはR5020（10-8M）で処理した。MAP1AおよびRGS2はどちらも、2日間の時間経過中、EGF単独に対しては非感受性であった（図2D）。しかし、EGF前処理は、プロゲスチンが刺激する両遺伝子のmRNA発現を、有意に増強した（図2D）。6時間処理した親（内在性PR-AアイソフォームとPR-Bアイソフォームをどちらも発現する）T47Dco細胞では、同様の結果が、RGS2発現については観察されたが、MAP1A発現については観察されなかった（図2E）。成長因子で広く刺激された細胞におけるPR調節MAP1A発現の動態には、おそらく複数の要因（すなわちPRリン酸化の強さおよび持続時間、転写活性、およびタンパク質レベル）が影響するのであろう。WT PR-Bを安定に発現するT47D細胞では、プロゲスチン＋ヘレグリン-η1による処理のちょうど3時間後に、MAP1A mRNA発現が相乗的にアップレギュレートされ、プロゲスチン単独での処理は24時間までにこのレベルに近づいた（非掲載データ）。総合すると、これらのデータは、PRが、そのリン酸化およびSUMO化ステータスに応じて、複数の内在性遺伝子をダイナミックに調節することを示唆しており、成長因子は、抑制解除された転写因子として作用するホスホPRに有利である。
【０１４０】
PR SUMO修飾はプロモーター選択の機序になる
遺伝子アレイ解析は、PRのSUMO修飾が選択されたプロモーターに対する転写応答の大きさを変化させると同時に、他のPRターゲット遺伝子の調節はPR SUMO化に対して全く非感受性であることを示した（図1）。PRプロモーター選択の機序を調べるために、差次的に調節されるPRターゲット遺伝子のクロマチンへのPRおよび選択された共調節因子の動員を検討した。まず、実験の焦点をMSX2に置いた。PR-Bと同様に、このホメオボックス転写因子は乳腺発生にとって必須であり、MSX2のトランスジェニック発現はマウスにおいて腺管過形成を引き起こす（Satohら、2007;Satokataら、2000）。機能研究は、MSX2が、サイクリンD1およびE1発現を誘導し（Satohら、2004）、RAS媒介性細胞トランスフォーメーションに関与し（Takahashiら、1997）、上皮マーカーのダウンレギュレーションを介して上皮間葉転換を駆動する（di Bariら、2009）ことを示している。Laniganら（Laniganら、2010）は、MSX2発現が、良好な予後との関連（すなわちERおよびPRと同様）にもかかわらず、ルミナール（luminal）B分子サブタイプの乳がんでもHER2エンリッチ（HER2-enriched）分子サブタイプの乳がんでも、有意に上昇していることを示した。MSX2転写開始部位の上流および下流にある複数のコンセンサスプロゲステロン応答エレメント（PRE）配列が、MatInspectorソフトウェアを使って同定された（Carthariusら、2005）。特に、一つのPREは、PRシストローム（cistrome）（すなわち、Myles Brown（Harvard University、マサチューセッツ州ボストン）によって提供された未公表のChIP-chip実験から導かれるもの）によれば、公知のPR動員の領域と整合していた。MSX2は、SUMO欠損PRを安定にまたは誘導性に（T47D）発現するT47DまたはMCF-7細胞のプロゲスチン処理に応答して転写的にアップレギュレートされるが、WT受容体の場合はそうならない（図2B〜C、1.1C）。MSX2のPREエンハンサー領域へのPRの直接的動員を調べるために（図3A）、WT PRまたはKR PRのどちらかを構成的（または誘導性）に発現する細胞を、R5020（10-8M）で処理し、クロマチン免疫沈降（ChIP）アッセイを行った。WT PRを発現するプロゲスチン処理細胞における転写活性（RT-qPCRによって測定されるmRNAレベル）（図2B〜C、1.1C）は検出されなかったものの、プロゲスチン処理後に、WT PRおよびKR PRはどちらもPREエンハンサー領域に容易に検出された（図3B左）。とりわけ、MSX2エンハンサー座位に動員されるSUMO欠損KR PRは、WT PRとの比較で、有意に多かった。この知見は、誘導性PR（図3B右）を発現する細胞でも、SUMO欠損PRによってアップレギュレートされる他の複数の遺伝子のPRE含有エンハンサーにおけるもの（図3.1）と共に再現された。次に、MSX2エンハンサー座位への、一般的PR転写活性化補助因子であるcAMP応答エレメント結合タンパク質（CREB）結合タンパク質（CBP）の動員を調べた。CBPは複数の核内受容体と相互作用し、転写の足場として機能し、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（HAT）活性を有する（LambertおよびNordeen、2003;Liら、2003;Ogryzkoら、1996）。ChIPアッセイを使って、プロゲスチン処理後に、MSX2座位へのCBP動員が、SUMO欠損KR PRを発現する細胞では有意に上昇するが、WT PRを発現する細胞ではそうでないことが決定された（図3C）。KR PRと関連するこの活性化補助因子の増加した存在と合致して、iWT PRを発現する細胞との比較で、iKR PRを発現するプロゲスチン処理細胞におけるMSX2近位プロモーター領域への全RNAポリメラーゼIIおよび機能的に活性なホスホ-Ser5 RNAポリメラーゼIIの増加した動員が観察された（図3.2）。これらのデータは、プロゲスチンの存在下でWT PRはこの領域に明らかに動員されるのに（図3B）、有意なmRNA発現が起こらない（図2B〜C、1.1C）理由の説明になりうる。内在性遺伝子座位における脱SUMO化PRおよびSRC1の構成的会合は、以前に報告された（DanielおよびLange、2009）。
【０１４１】
ヒストンテール修飾（メチル化、アセチル化、リン酸化など）は、クロマチンダイナミクスに著しい影響を与え、それによって遺伝子発現の変化に影響を及ぼすことが知られているエピジェネティック修飾である（（OngおよびCorces、2011）に総説がある）。一般にヒストンH3Lys4ジメチル化（H3K4me2）は、転写活性化と関連するエピジェネティックマークである（Barskiら、2007;Heら、2010）。H3K4me2は転写因子が助長するペアードヌクレオソームポジショニングの領域をマークし、隣接（nearby）遺伝子活性化の指標である（Heら、2010）。MSX2エンハンサー座位におけるH3K4me2のレベルを測定するために、誘導性PR（iWTおよびiKR）を発現するT47D細胞をR5020（10-8M）で4時間処理し、小球菌ヌクレアーゼ（MNase）消化後にヌクレオソームを単離し、ChIPとそれに続くqPCRによって、ヒストンメチル化を決定した（図3D左）。iKRを発現するプロゲスチン処理細胞では、iWT PRを発現する細胞との比較で、H3K4me2レベルが上昇していた。局所的ヒストンジメチル化パターンを可視化するために、MSX2 PRE座位周辺（オーバーラッピングqPCR産物を使って約500塩基対上流および下流）でのH3K4me2のR5020誘発性倍率変化も測定した（図3D右）。SUMO欠損iKR PRを発現する細胞では、iWTを発現する細胞と比べて、プロゲスチン依存性H3K4me2が濃縮されていた。実際、PRE配列に隣接するヒストンメチル化のレベルが高いのは、おそらく、この機能的エンハンサー領域における転写因子複合体の動員を容易にするヌクレオソームのリモデリングおよび伸展の結果であるだろう（Heら、2010）。
【０１４２】
これらの結果は、iWT PRまたはiKR PRのどちらかを発現する細胞において、一つまたは複数のヒストンメチルトランスフェラーゼがMSX2エンハンサーに差次的に動員されることを示唆している。最近、サブユニットmixed lineage leukemia 2（MLL2）メチルトランスフェラーゼを含むクロマチンリモデリング複合体が、プロゲスチン依存性H3K4トリメチル化に関連付けられた（Vicentら、2011）。加えて、ER-αはそのLXXLLモチーフを介してMLL2と直接的に相互作用し、MLL2はMCF-7細胞においてエストロゲン依存性転写アップレギュレーションを媒介する（Moら、2006）。ここでは、安定T47Dモデルと誘導性T47Dモデルの両方を使用して、SUMO欠損KR PRを発現するプロゲスチン処理細胞ではMLL2がMSX2エンハンサーに有意に動員されるが、WT PRを発現する細胞ではそうではないことを発見した（図3E）。
【０１４３】
最後に、PR SUMO化ステータスに対して非感受性である対照PRターゲット遺伝子MAT2A近くのPRE含有エンハンサー座位へのPRの相対的動員を測定した（図1D、オーバーラップしているベンカテゴリー）。WT PRまたはKR PRのどちらかを発現するプロゲスチン処理細胞においてMAT2A mRNA発現は等しくアップレギュレートされた（図3F左）。また、MAT2Aエンハンサー中の同じPRE含有領域へのPRおよびMLL2のプロゲスチン依存性動員も、WT PRまたはKR PRのどちらかを発現する細胞において、極めて類似していた（図3F中央および右）。総合すると、これらのデータは、（クロマチン中の）エンハンサー/プロモーター構造が、PR SUMO化との組み合わせで、PRと早期クロマチンリモデリングのメディエーター（MLL2）ならびにCBPを含む主要共調節因子の間の重要な相互作用を遮断するように機能することを示唆しており、高レベルのこれらの因子は、SUMO欠損PRを発現する細胞において、「感受性」PRE領域と特異的に会合していた。おそらくSUMO感受性エンハンサー領域は、比較的「閉じた（closed）」領域では（すなわちMSX2のような遺伝子については）、ヌクレオソームポジショニングの変化を開始するために、MLL2のPR依存性動員を必要とするのだろう。対照的に、既存の「開いた（open）」領域は（すなわちMAT2Aのような遺伝子については）、PR SUMO修飾に対して非感受性であるだろう。加えて、SUMO欠損PRと他の因子（すなわちパイオニアタイプの転写因子）との優先的会合は、PRプロモーター選択の一因になりうる;MSX2エンハンサー領域へのKR動員は、プロゲスチンの存在下で、WT受容体との比較で有意に強化される（図3B）。これらの問題には、さらなる詳細で網羅的な遺伝子およびシストローム解析が待たれる（考察、参照）。
【０１４４】
SUMO欠損ホスホPRは、細胞増殖の増加およびアポトーシスの減少を促進する。Ingenuityパスウェイ解析（IPA、Ingenuity Systems）ソフトウェアは、分子的に定義されたパスウェイ、生物学的機能または疾患状態に手作業で割り当てられた、最新の文献に基づく、遺伝子の大きなデータベースを含んでいる。このツールを使って、WT受容体またはKR受容体のどちらかを安定に発現する細胞においてリガンド依存性にアップレギュレートされる遺伝子（＞2倍、BH調整P＜0.01）を比較した。プロゲスチンで処理すると、SUMO欠損PRは、複数の増殖性および生存促進性の生物学的機能に割り当てられた遺伝子セットを有意にアップレギュレートしたが、WTはそうではなかった（図3.3）。SUMO欠損PRを安定に発現する乳がん細胞は、WT PRまたはリン酸化欠損S294A PRのどちらかを安定に発現する細胞との比較で、軟寒天において、増加した成長を呈する（(Danielら、2007a;DanielおよびLange、2009）。ここでは、誘導性モデルを使ってMTT増殖アッセイを行った（図4A）。このアイソジェニック系の利点は、安定細胞株モデルで起こりうる細胞成長/細胞死率のクローン間でのばらつきおよび表現型変動の排除である。細胞を0日目に等密度でプレーティングし、PR発現を誘導するために、AP21967化合物ありまたはAP21967化合物なしで処理してから、媒体（エタノール）またはR5020にばく露した。iWT PRまたはiKR PRを発現するR5020処理細胞は非誘導対応物または非処理対応物より速く成長した。しかし、AP21967とR5020の両方に連続してばく露すると、6日目までに、iKRを発現する培養物に存在する量が、iWT受容体を発現するものとの比較で、有意に多くなり、一方、対照群は全て、よく類似したままであった。ウェスタンブロッティングにより、AP21967を細胞培養培地に添加すると誘導性PR発現が持続すること、ならびに同等レベルのiWT PRおよびiKR PRタンパク質が発現することが実証された（図4B）。
【０１４５】
MTTアッセイでは生（生き残っている）細胞が経時的に測定され、PRは乳がん細胞の生存促進に関連付けられている（Lange, 2008;Mooreら、2000）。そこで、アポトーシスの間接的指標として、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ1（PARP）も測定した。PARPは、活性化カスパーゼ-3によるAsp214における切断の標的となり、コミットされた（committed）アポトーシスシグナリングの高感度な尺度である（Nicholsonら、1995）。PR発現をAP21967処理によって誘導し、それぞれのiWTまたはSUMO欠損iKR遺伝子発現プログラムを活性化するために、細胞を6時間にわたってR5020で前処理した。R5020前処理後に、アポトーシスを誘発するためにドキソルビシンを細胞培養培地に1日間加え、その後、細胞溶解物を収穫し、切断されたPARPの相対レベルをウェスタンブロッティングによって測定した（図4C）。とりわけ、SUMO欠損iKR PRを発現するドキソルビシン処理細胞は、iWT PRを発現する細胞との比較で、R5020で前処理した細胞では特に、PARP切断のレベルが低減していた（レーン4と8を比較されたい）。ドキソルビシン処理はWT PRおよびKR PRタンパク質発現をどちらも低減した（図4C、レーン1と3、またはレーン5と7を比較されたい）。しかし、タンパク質発現変化に対して標準化した複数の反復実験において、iKR PRを発現する細胞は、iWT PRを発現する細胞との比較で、一貫して、低減したPARP切断を呈した。これらの知見を、PRを安定に発現するT47D細胞において検証した。PRヌル細胞およびWT PRまたはKR PRのどちらかを安定に発現する細胞を完全培地にプレーティングし、血清飢餓させ、ドキソルビシンありまたはドキソルビシンなしで、R5020処理した（図4D）。ここでも、SUMO欠損KR PRを発現するプロゲスチン処理細胞では、有意に増加した細胞生存率が観察された。興味深いことに、これらの細胞を細胞毒性濃度のドキソルビシンで攻撃すると、その生存率は、WT PRを発現する細胞との比較で二倍になった（図4D）。これらのデータはSUMO欠損PRが、増加した細胞増殖および生存促進シグナリングの重要なメディエーターであることを示唆し、修飾されたPRを発現する細胞は、それらの関連遺伝子発現プロファイルと合致する生物学的プロセスを起こす（図1）。
【０１４６】
SUMO欠損PR遺伝子シグネチャはERBB2陽性乳がんに関連する
ヒト乳がんはしばしば高レベルのMAPK、AKT、および/またはCDKタンパク質、および/またはキナーゼ活性を含有するので、PR抑制解除に有利である（Danielら、2007a;DanielおよびLange、2009）。ホスホPR駆動性（SUMO欠損）病変を示唆する遺伝子パターンの証拠について、公表されたヒト乳がんデータベースを探るために、KR受容体を発現する細胞において、WT受容体を発現する細胞との比較で、発現量が高い遺伝子（KR対WTで発現＞1.5倍、BH調整P＜0.01）から構成されるユニークなPR遺伝子シグネチャを定義した。これらの遺伝子は、KR受容体を発現する細胞では圧倒的にアップレギュレートされ、かつ/またはWT受容体を発現する細胞だけでダウンレギュレートされた。この解析をリガンド依存性PRターゲット遺伝子とリガンド非依存性PRターゲット遺伝子の両方について行った。これらの基準を使って、ユニークな151遺伝子および92遺伝子のシグネチャが作製され、それぞれリガンド依存性（LD）およびリガンド非依存性（LI）KR受容体によって（WTと比べて）差次的にアップレギュレートされるPRターゲット遺伝子と定義された（図4.1）。
【０１４７】
次に、これらの遺伝子シグネチャを、Oncomine Research Premium Edition（Compendia Bioscience、ミシガン州アナーバー）にアップロードし、関連コンセプトについてデータベースを調べた（（Rhodesら、2007）に総説がある）。Oncomineコンセプトは、特別な基準（例えば特定腫瘍コホートにおける上位過剰発現遺伝子）によって定義された遺伝子リストである。LD 151遺伝子シグネチャは高い有意性（P＜0.0001、FDR＜0.01）で複数の乳がんコンセプトと関連していた（非掲載データ）。注目すべきことに、5つの異なるERBB2陽性乳がんコンセプト（細胞株からの2つと腫瘍コホートからの3つ）が、このLD PR-遺伝子シグネチャと独立して関連した。したがって、SUMO欠損PRを発現する細胞においてプロゲスチンの存在下で特異的にアップレギュレートされる遺伝子は、ERBB2陽性乳がんにおいて高度に過剰発現される（上位5〜10％）同じ遺伝子に含まれる（図5A、非掲載データ）。とりわけ、LI 92遺伝子シグネチャも少なくとも一つのERBB2陽性コンセプト（Bonnefoiら、2007））と有意に関連した。これらのデータは、リガンド依存性およびリガンド非依存性のユニークなPR調節遺伝子セットがどちらも、ERBB2陽性であることが知られているものを含むタンパク質キナーゼ駆動性腫瘍において、特異的にアップレギュレートされることを示している（図5A）。
【０１４８】
これらの関連遺伝子プログラム（SUMO欠損PRおよびERBB2シグナリング）の発現は、乳がん細胞が細胞の増殖および生存を駆動するために利用する独立した手段を表すのかもしれない。実際、HER2エンリッチ乳がんはしばしばステロイドホルモン受容体（SR）陰性である（Perouら、2000;Sorlieら、2001）。あるいは、これらの統計的に有意に関連するコンセプトは機能的につながっているのかもしれない。ルミナール乳がんは主としてSR陽性であるが、ルミナールA腫瘍のおよそ7％およびルミナールB腫瘍のおよそ20％はHER2エンリッチである（Cheangら、2009;PratおよびPerou、2011）。ERBB2過剰発現（図5A）およびSUMO感受性（上記）と同時に関連する選ばれた遺伝子のPRおよびMAPK依存性調節を、構成的に活性化されたMAPKを含有するHER2増幅かつSR陽性BT-474乳がん細胞（Lenferinkら、2001）において試験した。RU486処理は、異種移植モデル（Liangら、2007）におけるBT-474腫瘍成長を劇的に阻害し、インビトロで6日間にわたって実行されたMTTアッセイにおいてBT-474細胞増殖を有意に遮断した。また、類似する結果がMEK阻害剤U0126でも観察された（非掲載データ）。まず、主としてKRによって調節される（そしてERBB2関連である;図5A行）が、WT PRでは調節されないPRターゲット遺伝子（CHN2およびRGS2）の発現を、PR SUMO化に対して感受性でない対照遺伝子（ACOT6;WT PRおよびSUMO欠損PRによって等しくアップレギュレートされる、図1F）との比較で、測定した。注目すべきことに、R5020処理は、PR-B Ser294リン酸化の上昇（レーン2）と、CHN2およびRGS2の両方のロバストなアップレギュレーションを、BT-474細胞において誘導した:それぞれ17倍および26倍（図5B）。RGS2発現は、WT PRを発現するT47D細胞では（約2倍）、KR PRと比べて（約20倍）、R5020処理に対する感受性が弱いことを想起されたい（図1F）。ACOT6発現もR5020によって誘導され、3つの遺伝子の発現はいずれも抗プロゲスチンRU486によって完全に遮断された（図5B）。CHN2およびRGS2 mRNA発現が最も高い時に（＋R5020;レーン1と2を比較）、ホスホ-Ser294 PRは容易に検出されるが、おそらくは活性化PR種のリガンド依存性（プロテアソーム媒介性）ダウンレギュレーションゆえに（Langeら、2000）、全PRレベルは著しく減少していて、検出不可能にみえる（レーン2）ことに注目されたい。これらの細胞をMEKキナーゼ阻害剤U0126で前処理すると、R5020誘発性PR Ser294リン酸化が遮断され、CHN2発現とRGS2発現がどちらも部分的に、ただし有意に減少した（図5B、レーン6）。対照的に、PR SUMOステータスによる影響を受けない対照遺伝子ACOT6の発現は、MEKキナーゼ阻害に対して完全に非感受性であった。これらのデータは、本発明者らの仮説を裏付け、リン酸化事象が、他の点では修飾されていない（すなわちWT PRを含有する）SR陽性乳がん細胞におけるSUMO欠損PR遺伝子シグネチャの発現とPR誘発性増殖との両方の一因であることを実証している。CHN2およびRGS2と同様（図5B）、ERBB2過剰発現ルミナール乳がんにおいてアップレギュレートされるかなりの数の遺伝子は実際にPR駆動性であると予測される。
【０１４９】
上記の知見から、本発明者らの細胞株モデルから導かれたPR遺伝子シグネチャが、公表されたヒト乳腺腫瘍コホートにおける腫瘍グレード、リンパ節陽性、および患者生存率を予示するかどうかの試験を思い立った。例えば、Loiらのデータセット（Loiら、2007）は、その乳腺腫瘍が最初にER陽性/PR陽性であった患者からの生存データの最も大きな集合体の一つに相当する。各試料（PRヌル、WT PR、KR PR;R5020処理ありまたはR5020処理なし）を表す本発明者らのT47Dマイクロアレイデータセットからメタ遺伝子（Huangら、2003）を取り出した。Kaplan-Meier生存解析を使って、PR関連メタ遺伝子（WTまたはKR、−/＋R5020）を発現する患者腫瘍を、他の全ての患者腫瘍と比較した。この解析により、その腫瘍がPR遺伝子シグネチャ（すなわち転写的に活性なPRを指示するもの）を発現するこの腫瘍コホートの患者は、無転移生存期間が有意に低減していることが明らかになった（P＝0.000785;図5C）。とりわけ、PR関連メタ遺伝子を発現しない患者腫瘍（図5C、上側の曲線）は、約80％の長期生存率と関連した。おそらく、この群の腫瘍は、PRを豊富に発現するが、これらの受容体は比較的不活性なのであろう。この考えと合致して、高いPR mRNAレベルが良好な転帰と関連した（Loiら、2007）。この知見は、PRの（活性ではなく）発現に基づく腫瘍の分類は判断を誤らせることを示唆している。興味深いことに、その腫瘍遺伝子シグネチャがKRを発現するT47D細胞＋R5020に似ている患者は転帰が悪化する傾向があった（P＜0.1）。リガンド非依存性（KR）PRターゲット遺伝子の寄与を含めるために、本発明者らは、両KRメタ遺伝子（KR −R5020、またはKR ＋R5020）を発現する腫瘍を持つ患者を合わせた。これらの患者では、その腫瘍が2つのKRメタ遺伝子のどちらも発現しない患者との比較で、生存期間が有意に低減した（P＝0.0261）（図5D）。リンパ節ステータスと原発腫瘍グレードについては、メタ遺伝子の発現との明白な関連はなかった。これらのデータは、PR依存性転写と、特に脱SUMO化（ホスホ-Ser294）受容体の作用とが、（ルミナール）乳がん患者のサブセットにおける腫瘍進行と不良な転帰との一因であることを示唆している。
【０１５０】
PRアンタゴニストであるRU486およびアグレプリストンはSUMO欠損PRを発現する細胞でのみ遺伝子発現を刺激する
リガンド依存性PRプロモーター選択性は受容体のリン酸化およびSUMO化ステータスに依存する。加えて、PRリガンド構造もPR活性に影響を与え、ターゲット遺伝子調節に対するアゴニスト特性またはアンタゴニスト特性を引き起こす。PRリガンド（プロゲステロンおよびR5020）は強いアゴニストであり、一方、PRアンタゴニスト（RU486、アグレプリストン、およびオナプリストン）は一般にPR転写作用を遮断するが、これらのリガンドはユニークな作用機序を有し、異なる細胞状況下で可変的なレベルのアゴニズム/アンタゴニズムの引き金を引きうる（Cadepond、1997）。そこで本発明者らは、遺伝子発現プロファイリングを使って、野生型PR（WT）、SUMO欠損PR（KR）、または空ベクター（PR-ヌル）を発現するT47D乳がん細胞におけるこれらのアンタゴニストの転写効果を調べた。
【０１５１】
網羅的遺伝子発現プロファイルは、各細胞株を8つの考えうる条件:（1）エタノール（媒体対照）、（2）プロゲステロン（10-8M）、（3）RU486（10-7M）、（4）アグレプリストン（10-7M）、（5）オナプリストン（10-7M）、（6）RU486＋プロゲステロン、（7）アグレプリストン＋プロゲステロン、または（8）オナプリストン＋プロゲステロンのうちの一つの下で、6時間処理した後に、Illumina HT-12v4マイクロアレイプラットフォームを使って測定した。ヒートマップ解析は上位アップレギュレートまたはダウンレギュレート遺伝子を示す（図6）（少なくとも一つの試料比較において倍率変化＞2.0、BH調整P＜0.01）。空ベクター（PRヌル）を発現する細胞では、リガンドばく露に依存する遺伝子発現の有意な変化が観察されなかった。したがって、空ベクター細胞における発現プロファイリングは、PRおよび/またはリガンドに依存する発現レベル差を明確に解釈することを可能にする本質的ベースライン対照を与えた。予想どおり、プロゲステロン（P4）処理後はWT細胞でもKR細胞でも、多くの遺伝子が有意にアップレギュレートされた（図6、レーン10、18）。PRアンタゴニストの転写インパクトを理解するために、プロゲステロン処理後にWT細胞またはKR細胞のどちらかでアップレギュレート（倍率変化＞2.5、BH P値＜0.01）される全ての遺伝子を取り出し、ヒートマップを使って全ての試料について発現値を表示した（図7）。ここでは、PRヌル細胞はどのリガンドばく露でも調節されず、媒体対照（エタノール）だけで処理されたWT細胞とKR細胞も調節されなかった。RU486またはアグレプリストンによる処理は、多くのPRターゲット遺伝子が、特にSUMO欠損PR（KR）細胞においてアップレギュレートされる原因になったが、WT細胞ではそうではなかった（図7、レーン11〜14と19〜22を比較されたい）。逆に、KR細胞におけるオナプリストン（またはオナプリストン＋P4）処理は、これらのPRターゲット遺伝子がアップレギュレートされる原因にならなかった（図7、レーン19〜22と23〜24を比較されたい）。図7中の全ての試料の教師なし階層的クラスタリングでは、エタノールまたはオナプリストンで処理されたKR試料がPRヌル試料と最も近い関係に位置付けられたことから、オナプリストンで処理されたKR細胞はPRターゲット遺伝子を有意にアップレギュレートしないことが示された（図8）。全体として、これらのデータは、オナプリストンが、高活性PR（すなわちリン酸化され脱SUMO化されたPR）を発現する細胞におけるPRターゲット遺伝子の発現をうまく阻害できることを示唆している（図7、レーン18と23〜24を比較されたい）。しかし、抗プロゲスチンであるRU486およびアグレプリストンは、高活性PRを発現する細胞において、実質的なアゴニスト活性を有している（図7、レーン18とレーン19〜22を比較されたい）。それゆえに、侵襲性の腫瘍を持つ乳がん患者は、PRアンタゴニスト、とりわけオナプリストンを含む処置の実質的恩恵を受けるであろうと予測される。これらのデータには特別な臨床的意義がある。なぜなら、これらのデータは、RU486を乳がん処置として調べた以前の第II相臨床試験（Perrault、1996）が、おそらくは高活性PRを発現する細胞におけるRU486の実質的アゴニスト特性ゆえに、不成功に終わった理由を説明するのに役立ちうるからである。
【０１５２】
遺伝子マーカーは活性化PRによって駆動される腫瘍を同定することができる
本明細書では、高転写活性PR（すなわちリン酸化され、脱SUMO化されたもの）が乳がん細胞成長のドライバーであり（図4）、上昇したHER2シグナリングと関連し（図5）、低減した無転移生存期間の予測因子である（図5）ことの少なからぬ証拠を挙げた。そこで、高い感度と特異性を保証するために3つの独立した統計的方法を使って、WT PRを発現する細胞と活性化PR（KR）を発現する細胞とを識別することができるPR依存性遺伝子マーカー（遺伝子）を同定しようと努力した。
【０１５３】
上述のように、異なる実験課題を扱うために、2つの独立した遺伝子発現マイクロアレイ実験を行った。第1の実験ではプロゲスチン依存性PRターゲット遺伝子を調べ、第2の実験ではPR発現細胞における抗プロゲスチンの役割を調べた。これにより、各実験からのレプリケート試料を組み合わせて、プロゲスチンばく露下で、WT PRを発現する細胞とKR PRを発現する細胞の間の遺伝的差異を調べることが可能になった。
【０１５４】
WT PRを発現する細胞とKR PRを発現する細胞を識別することができる15の遺伝子（マーカー）が同定された（表1a）。これらの遺伝子を同定するために、WT細胞またはKR細胞において発現する遺伝子についてのレプリケート発現値を比較し、プロゲスチンで処理し（図9、レーン10と18を比較されたい）、P値、倍率変化、および受信者動作特性（ROC）曲線解析に関する予定の有意性閾に合格した遺伝子を取り出した（統計的有意性に要求される基準の詳細な議論については方法を参照されたい）。12の公知ハウスキーピング遺伝子（30プローブセット）が、これらの群間での有意性検定を合格しないことも確認した。これは、これらの細胞間で遺伝子発現の相違がないこと（すなわちアレイ試料間で技術的エラーがないこと）を示している（非掲載データ）。したがって、細胞が「活性化PR」（リン酸化、脱SUMO化PR）によって駆動されるか、WT PRによって駆動されるかを、これら15の遺伝子の発現レベルが正確に予測できることは、大いに確信できる。
【０１５５】
第2の解析では、プロゲステロンと抗プロゲスチンであるオナプリストンとで同時処理されたKR細胞とWT細胞との間で、遺伝子の差次的発現を調べた。表2からわかるように、オナプリストン処理は、一つの遺伝子を例外として、上述した15のバイオマーカー遺伝子の有意な差次的発現を完全に打ち消した。表2は、KR（プロゲステロン＋オナプリストン）細胞とWT（プロゲステロン＋オナプリストン）細胞との間で有意に差次的に発現する8遺伝子だけを示している。元の15遺伝子のなかでは、一つだけ、すなわちCDH10だけが、依然として、2群の間で有意に差次的に発現した。本研究のこの部分についてのハウスキーピング遺伝子の解析（非掲載データ）により、本発明者らの実験方法および解析方法の妥当性が確認された。すなわち、12のハウスキーピング遺伝子を標的とする30のプローブのなかに、本発明者らの研究全体に適用された有意性の基準（方法を参照されたい）に従って有意であると決定されたものはなかった。
【０１５６】
（表２）プロゲスチンで刺激しオナプリストンで処理したKR細胞とWT細胞の間で差次的に発現する上位8つの最も有意な遺伝子  （＊）各方法の基準に従って統計的に有意である
2015516155.tif 000016
【０１５７】
第3の解析では、プロゲステロン＋抗プロゲスチンRU486で同時処理されたKR細胞とWT細胞の間で、遺伝子の差次的発現を調べた。表3からわかるように、RU486処理は、一つの遺伝子を例外として、上述した15のバイオマーカー遺伝子の有意な差次的発現を完全に消失させた。表3は、KR（プロゲステロン＋RU486）細胞とWT（プロゲステロン＋RU486）細胞との間で有意に差次的に発現する7遺伝子だけを示している。元の15遺伝子のなかでは、一つだけ、すなわちCDH10だけが、依然として、2群の間で有意に差次的に発現した。本研究のこの部分についてのハウスキーピング遺伝子の解析（非掲載データ）により、本発明者らの実験方法および解析方法の妥当性が確認された。すなわち、12のハウスキーピング遺伝子を標的とする30のプローブのなかに、本発明者らの研究全体に適用された有意性の基準（方法を参照されたい）に従って有意であると決定されたものはなかった。
【０１５８】
（表３）プロゲスチンで刺激しRU486で処理したKR細胞とWT細胞の間で差次的に発現する上位7つの最も有意な遺伝子  （＊）各方法の基準に従って統計的に有意である
2015516155.tif 000017
【０１５９】
次に、抗プロゲスチンであるオナプリストンによるKR細胞の処理が、上で観察された転写の相違（表1a）を逆転させることができるかどうかを試験した。同じストリンジェントな解析を繰り返して、次の2群を比較した:オナプリストン＋プロゲステロンで処理したKRを発現する細胞と、媒体対照（エタノール）で処理したWTを発現する細胞。これら2つの群は、5つの有意に差次的に発現する遺伝子を別として、遺伝子的に区別できないことがわかった。プロゲスチンが、何百ものPRターゲット遺伝子を活性化できることは明らかであるが、それにもかかわらず、これら2つの群間で有意に相違する遺伝子は5つしか同定されなかった（表4）。これらのデータは、活性化PRを発現する細胞におけるプロゲステロンばく露の効果を、オナプリストン処置が（プロゲステロンばく露の存在下でさえ）、効果的に逆転させうることを示唆している。ここでも、ハウスキーピング対照遺伝子は、これら2つの群間で有意に差次的に発現することはなかった（非掲載データ）。
【０１６０】
（表４）プロゲステロンで刺激しオナプリストンで処理したKR細胞と媒体対照（エタノール）で処理したWT細胞との間で有意に差次的に発現する5つの遺伝子  （＊）各方法の基準に従って統計的に有意である
2015516155.tif 000018
【０１６１】
最後に、抗プロゲスチンであるオナプリストンによるKR細胞の処理が、上で観察された転写の相違（表1a）を逆転させることができるかどうかを調べた。（プロゲステロン＋オナプリストン）で処理したWT細胞とエタノール（媒体対照）で処理しただけのWT細胞との間で比較解析を行った。表5からわかるように、これら2つの群間で依然として有意に差次的に発現する遺伝子は一つしかなかった。これは、抗プロゲスチンであるオナプリストンによる処理が、WT PR受容体を持つ細胞において、プロゲステロンによる刺激によって誘発される転写の相違を、ほとんど完全に逆転させうることを明確に実証している。本研究のこの部分についてのハウスキーピング遺伝子の解析は、12のハウスキーピング遺伝子を標的とする30のプローブのなかに、研究全体に適用された有意性の基準（方法を参照されたい）に従って有意であると決定されたものはないことを示した。
【０１６２】
（表５）プロゲスチンで刺激しオナプリストンで処理したWT細胞と媒体対照（エタノール）で処理したWT細胞との間で有意に差次的に発現する唯一の遺伝子  （＊）各方法の基準に従って統計的に有意である
2015516155.tif 000019
【０１６３】
活性化PRによってアップレギュレートされる遺伝子は抗プロゲスチンによって抑制される
上記の統計的解析により、プロゲスチンの存在下でWT PRを発現する細胞とSUMO欠損PRを発現する細胞とを識別することができる15の遺伝子を確信を持って同定するための、感受性および特異性の強い尺度が得られた。しかし、プロゲスチン処理に応答して（すなわちP4/エタノールの比）特異的にアップレギュレートされるPRターゲット遺伝子は他にも数多く存在する。プロゲスチンにより、WTと比べて、活性化PR（KR）を発現する細胞において特異的に誘導されるPRターゲット遺伝子を調べた。これらの遺伝子産物は、おそらく、活性化PR転写プログラムのドライバーであるだろう。実際、151遺伝子のリガンド依存性「KR＞WT」遺伝子シグネチャ（図2B、4.1）として、これらのタイプのPR遺伝子を記載した。
【０１６４】
上記のマイクロアレイ研究は、それぞれ、直接比較することができる極めてよく似た処理条件を含んでいた:媒体またはプロゲスチンで処理された、WT PRまたはKR PRを発現する細胞。これらの実験間の唯一の相違は、プロゲスチン処理、第1の実験におけるR5020、および第2の実験における天然PRリガンド・プロゲステロン（P4）であった。したがって、ほとんど同一の条件下で第2のマイクロアレイ実験を行うことにより、各実験からの結果を比較し、SUMO欠損PRを発現する細胞において、WT PRと比べて、特異的にアップレギュレートされる、一組の、再現性の高いプロゲスチン依存性PRターゲット遺伝子に集約するための格好の状況があった。結果として、PRがリン酸化され脱SUMO化されている「活性化PR」を発現する乳がん細胞においてアップレギュレートされる遺伝子のロバストなリストが同定された。
【０１６５】
第1のマイクロアレイ実験では、SUMO欠損PRを発現する細胞において、WT-PRと比べて特異的にアップレギュレートされる（倍率変化＞1.5、BH調整P＜0.01）151のプロゲスチン依存性PRターゲット遺伝子が同定された（図4.1）。この解析を第2のマイクロアレイ研究で繰り返し、オーバーラップする遺伝子を両方の実験から取り出した。したがって、151遺伝子からのリストが、WT PRと比べて、SUMO欠損PRを発現する細胞において特異的に、プロゲスチン処理（R5020またはプロゲステロン）に応答してアップレギュレートされる29遺伝子にまでせばめられた（図10、レーン10と18を比較されたい）。これらの29遺伝子は、プロゲスチンに応答して起こるSUMO欠損PR発現の再現性の高いマーカーであると考えられる（すなわち、2つの異なるPRアゴニスト、すなわちR5020およびプロゲステロンで処理された、2回の独立した実験からの、全部で5つのレプリケート）。
【０１６６】
第2のマイクロアレイ実験からの発現データは、RU486およびアグレプリストンがSUMO欠損PRを発現する細胞においてアゴニスト特性を有し、一方、オナプリストンは、WT PRまたはKR PRを発現する細胞において、効果的なアンタゴニストであることを示した。したがって、「活性化PR」遺伝子リストは、これら29遺伝子のうち、オナプリストン処理のみによって（なし）、またはオナプリストン＋P4処理によって（13遺伝子）、中等度にでも刺激されるものを排除することによって、さらにせばめられた。これにより、MSX2、MAP1A、およびPDK4を含む16遺伝子の最終リスト（表1b、図11）が得られた。これら3つの遺伝子は、SUMO欠損PRを発現する細胞におけるそれらの特異的調節を例証する複数の遺伝子発現実験およびChIP実験で、詳細に研究された。実際、これら16遺伝子のうちの7遺伝子は、がん関連機能に関与することが、Ingenuityパスウェイ解析によって決定された。これら16のPRターゲット遺伝子は、PRがリン酸化され脱SUMO化されるとプロゲスチンによってロバストにアップレギュレートされ、それらの遺伝子産物は、腫瘍の増加した侵襲性を駆動すると結論される（図2、4、5）。
【０１６７】
（表１ｂ）
2015516155.tif 000020
【０１６８】
考察
この研究では、PR SUMO修飾がどのように転写活性およびプロモーター選択に影響を与えるかをより良く理解するために、遺伝子発現プロファイリングを行った。新たに工学的に作製した乳がん細胞株モデルを使って、ヒト腫瘍中に存在し、減少した患者生存率と関連する、（脱SUMO化）PR駆動性遺伝子シグネチャを同定した。Ser294におけるPRリン酸化はLys388におけるPR SUMO化をアンタゴナイズすることは、以前に示された（Danielら、2007a）。本明細書では、新規データにより、乳がん細胞はこの機序を利用して、細胞増殖および生存促進パスウェイを駆動するターゲット遺伝子へと、PR転写作用をシフトさせうることが示唆される（図4、5）。バイオインフォマティクスを使って網羅的遺伝子発現レベルを解析することにより（図1）、WT PRと脱SUMO化PRとの間に転写応答の劇的な相違が同定され、それらをプロモーター/エンハンサー選択性の変化としてChIP解析によってさらに特徴付けた（図3、3.1）。加えて、無修飾乳がん細胞（またはWT PR-Bだけを発現する細胞）をEGFで処理することにより、PR Ser294リン酸化（PR脱SUMO化）が、選択されたPRターゲット遺伝子の転写抑制解除に関連付けられた（図2）。とりわけ、SUMO欠損PRによって特異的にアップレギュレートされる（すなわちホスホPR駆動性の）遺伝子は、ERBB2陽性のヒト乳腺腫瘍および細胞株において多量に発現する遺伝子と有意に関連し、これらの研究は、リン酸化（脱SUMO化）PR-B特異的転写作用とERBB2関連遺伝子のサブセットの発現との間の機序的つながりを裏付ける（図5）。全体として、これらのデータは、転写のホスホPR依存性調節の機序および内分泌療法抵抗性への早期のまたは迅速な乳がん進行に対するこの活性の潜在的寄与に関するさらなる研究に、強い論理的根拠を与える。
【０１６９】
遺伝子発現解析によってSUMO化感受性PRターゲット遺伝子が同定される
PR SUMO化が、HBEGF、IRS1、およびSTC1を含む限られた数の内在性遺伝子座位において転写抑制的であることは、以前に報告されており（Danielら、2007a;DanielおよびLange、2009）、3つの遺伝子産物はいずれも、乳がん細胞増殖の一因であることが知られている（BeerliおよびHynes、1996;Byronら、2006;Changら、2003）。ここでは、合成プロゲスチンR5020ありまたはR5020なしの処理を行った、WT PRまたはSUMO欠損変異型K388R PR（ホスホミミック）のどちらかを発現するT47D細胞における全ゲノム発現プロファイリングのために最新のマイクロアレイ技法を使って、内在性PRターゲット遺伝子の調節を測定するための包括的な一組の実験を行った。このマイクロアレイデータセットは、可逆的PR SUMO化の役割の調査の他に、プロゲスチン処理に応答して起こるWT PR-B転写作用の、適切な対照が置かれた最新の解析（新たに作製された同ベクター細胞株）を提供する。構成的（安定）なまたは誘導性のWT PRまたは変異型PRを発現する追加の細胞株および新規細胞株クローンを使って、厳密な独立した実験を行い、異なるマイクロアレイプラットフォーム（IlluminaおよびAffymetrix）を使って遺伝子発現レベルを測定した。実際、分析により、以前に同定されたPRターゲット遺伝子（Jacobsenら、2005;Richerら、2002）のうちの70％が確認されたが、何百という新規PRターゲット遺伝子も明らかになった。それらの多くはリガンド非依存性の例である。このデータセットは、リガンド依存性およびリガンド非依存性PR媒介性転写調節の機序を調べるさらなる研究の強力なリソースになる。
【０１７０】
とりわけ、WT PRが調節する遺伝子とKR PRが調節する遺伝子の比較によって、かなりのオーバーラップが明らかになったことから、PR調節遺伝子の大部分はSUMO化/脱SUMO化によるPR-Bのダイナミックな修飾に対する感受性が比較的低いことが示唆される（図1D〜E、オーバーラップしているベンカテゴリー）。しかし、これらのカテゴリー内では、多くの遺伝子が、WT PRまたはKR PRのどちらかによって調節されると、中間の（さまざまな）発現レベルを示したことから、部分的にはPR SUMO化ステータスに応じて、複数の機序がPR媒介性転写に影響を与えることが示唆される。逆に、PRのSUMO化ステータスに対する感受性が高い遺伝子のサブセットはそれより小さかった（図1D〜E、オーバーラップしている領域を除く全てのベンカテゴリー）。驚いたことに、これらのサブセットには、WT対照との比較でKR PRによってアップレギュレートされる遺伝子もダウンレギュレートされる遺伝子も含まれていたことから、PR-BのSUMO化はプロモーター次第で抑制的にも促進的にもなりうることが示唆される。例えば、脱SUMO化（KR）PRにより、多くの増殖性遺伝子が増加すると同時に、いくつかの公知の腫瘍抑制遺伝子が抑制される。
【０１７１】
以前の研究によれば（Danielら、2007a;DanielおよびLange、2009）、ホスホ-Ser294-PR（すなわち主として脱SUMO化されているもの）は、がん細胞表現型に大きな影響を及ぼす遺伝子調節のシフトを媒介すると予測された。そこで、ここでの目標は、全く新しい乳がん細胞モデルを使って、これらの遺伝子を同定し、（WT PRおよびKR PRによる）それらの差次的調節の機序を理解することであった。S294A PRを安定に発現する細胞では、受容体はSer294でリン酸化されることができず、それゆえに著しいSUMO化を受けて（Danielら、2007a;Langeら、2000）、選択されたKRアップレギュレート遺伝子（例えばMSX2など）の発現が完全にブロックされ、PR K388R/S294A二重変異体（KRSA;図2C）を発現する細胞では、転写アップレギュレーションが復旧した。これらのデータは、PR SUMO修飾が主にPRターゲット遺伝子における転写を抑制し、それはリン酸化事象に応答して効果的に「抑制解除」されることを実証している。例えば、WT PRを発現する細胞をEGFで処理すると、PR依存性MSX2およびRGS2 mRNA発現は著しく増強された（図2D）。PRのリン酸化と脱SUMO化は、乳がん細胞におけるPRの転写活性とプロモーター選択性を劇的に変化させることによって、網羅的遺伝子発現パターンに影響を及ぼすと結論された。
【０１７２】
PRのプロモーター選択性に影響を与える機序
PR SUMO修飾は広範なPRターゲット遺伝子の発現を変化させるが、他の遺伝子には影響を持たないことを、マイクロアレイ研究は明確に実証している。プロモーター選択性の機序についてはほとんどわかっていない。しかしこの問題は、他のSRファミリーメンバーに関して取り組まれている（Tangら、2011）。SRとクロマチンとの相互作用は極めてダイナミックであり、迅速かつ継続的な交換として起こる（Hagerら、2009）。したがって（ChIPによって測定される）転写因子「結合」の集中領域は、実際には、その領域における転写因子占有率が増加する方向への平衡状態のシフトを反映している。この平衡状態には、コンセンサスDNA配列へのSR結合、多タンパク質複合体への共調節因子の参加および/または特異的細胞位置へのSRの隔離、ならびにクロマチンの接近可能性を調節するヒストン修飾など、複数の要因が影響する。加えて、制限酵素の研究により、コンセンサス配列への酵素結合を、拡散だけで可能な速さの最大1000倍まで容易にする機序が明らかになっており、結合を容易にする補助因子の存在が示唆される（HalfordおよびMarko、2004）。また、「パイオニア因子」と呼ばれる特別なタンパク質が、発生組織またはがん特異的状況下で、クロマチンリモデリングと、ゲノム結合部位（エンハンサー）近くへのSRの局在化を助けることが、最近の研究によって決定されている（Carrollら、2005;Hurtadoら、2011;Lupienら、2008）。
【０１７３】
SUMO分子の付加によるタンパク質基質の修飾は、タンパク質-タンパク質相互作用に影響し、かつ/またはタンパク質の安定性、局在化、または転写活性を変化させることができる（（Geiss-FriedlanderおよびMelchior、2007）に総説がある）。（Lys388における）PR SUMO化は、最も高頻度にPR転写活性を抑制し（ただしそれをプロモーター依存的に増加させることもできる;図1F BCL2L11およびDNALI1）、プロテアソーム媒介性ターンオーバーによるリガンド依存性PRダウンレギュレーションの速度を遅くする傾向を示すが（Danielら、2007a）、PRの位置をそれとわかるほど変化させることはない（Manら、2006）。本発明者らの解析では数多くの遺伝子がMSX2のように挙動し、発現はSUMO欠損KR PRによって実質的にアップレギュレートされたが、WT PRではそうならなかった（図2C）。加えて、KR PRは、WT受容体の2〜3倍、MSX2エンハンサーを占有した（図3B）。増加したレベルのKR PRがこの座位に動員され、MSX2 mRNA発現の増加と関連するという知見は、PR SUMO化が（SUMO感受性エンハンサー領域およびクロマチンとの関連において）、PR DNA結合のレベルで起こる補因子相互作用を変化させることを示唆する。この知見に関連して、PR SUMO化E3リガーゼPIAS3は、PRE DNA配列へのPR結合をインビトロで直接阻害する（Manら、2006）。したがって、WT（KRは違うが）PRへのPIAS3媒介性SUMOコンジュゲーションは、選択されたPRE配列への効率のよい受容体結合を妨げ、引き続いて平衡状態をこれらの座位におけるPR占有からシフトさせうる。この機序がどのように配列特異的またはプロモーター特異的であり得るかは、まだ決定されていない。
【０１７４】
プロモーター構造は、PRを含むSUMO化された転写因子によるプロモーター選択の重要な決定因子である可能性が高い。Holmstromら（Holmstromら、2008）は、SUMO化されたGRが、転写を効率よく阻害するために、複数のGR結合部位を含有するDNAとの安定な相互作用を必要とすることを見いだした。興味深いことに、グルココルチコイド受容体（GR）のSUMO化も、連鎖する内在性遺伝子の転写的誘導に、選択的な影響を及ぼす（Holmstromら、2008）。この知見に関連して、最近のクロマチン修飾マッピング研究により、エンハンサーにおけるヒストンH3Lys4モノおよびジメチル化（H3K4me1/2）が転写的に活性な遺伝子と関連することが明らかになっている（Heら、2010;Heintzmanら、2007）。実際に、DNA応答エレメントへの転写因子の接近が可能な領域は、DNaseまたはMNase高感受性部位として同定された。これらの領域は占有されたヌクレオソームが比較的少ないからである（ENCODE Project Consortium、2007）。H3K4me2は、ヌクレオソームリモデリングを促進し、転写因子結合のための領域の接近可能性を助長するために、追加のタンパク質（パイオニア因子）を動員しうる機能的エンハンサーにおけるエピジェネティックマーカーであると考えられる（Heら、2010）。本発明者らはPR動員のためのパイオニア因子を同定していないが、この研究で、本発明者らは、SUMO欠損KR PRを発現細胞において、WT PRと比べて、MSX2エンハンサーにおける上昇したH3K4ジメチル化を観察している。このモデルでは、脱SUMO化PRはヒストンメチルトランスフェラーゼMLL2を優先的に（すなわちMSX2エンハンサーに）動員することで、通常はSUMO化された受容体によって抑制される活性部位における転写複合体の形成を可能にする持続的なH3K4ジメチル化をもたらすことができる。
【０１７５】
最後に、SRに対するDNA結合特異性は、配列組成にも著しく依存する。GRを調べる研究では、コンセンサスGRE/PRE配列中の一塩基対変化が受容体結合および補因子相互作用に劇的な影響を及ぼしうることが実証される（Meijsingら、2009）。したがってDNAそのものが、プロモーター選択性および転写結果に直接的に影響することができるSRにとっての配列特異的アロステリックリガンドであると思われる。SUMO化されたGRは、ほぼ完璧なコンセンサスGR結合部位を好むようである（Holmstromら、2008）。とりわけ、PRの場合と同様に、GRの部位特異的リン酸化もそのプロモーター優先度を変化させる（BlindおよびGarabedian、2008）。SUMO化されたPRと脱SUMO化PRとが異なるPRE配列を差次的に認識するかどうかは、現時点ではまだわかっていない（すなわち本発明者らは全てのPR結合部位を同定するためのChIP-seq実験を行っていない）。しかし、SUMO修飾は基質タンパク質のコンフォメーションを劇的に変化させることができるので、これはあり得そうなことだと思われる。脱SUMO化PRが豊富なPR活性化補助因子（CBP、MLL2）をエンハンサー領域に動員する能力を有することは明らかであり、機能的転写複合体のより迅速なまたはより安定な生成は、WT PRとの比較で、KRによる増加した「サンプリング」または選択されたプロモーターの使用の説明になりうる（図3）。SUMO化されたPRまたは脱SUMO化されたPRによる、他のエンハンサー領域を上回る、選択されたエンハンサー領域の優先的な抑制または活性化の説明になりうるような明白なグローバルシグナルは、この解析では明らかにならなかった。
【０１７６】
脱SUMO化PR遺伝子発現の臨床的意義
選択的ER修飾因子（SERM［例えばタモキシフェン］、抗エストロゲン［例えばフルベストラント］）および/またはアロマターゼ阻害剤（例えばアナストロゾール、レトロゾール、またはエクセメスタン）によるルミナール乳がんにおけるER機能のターゲティングは、大半の女性にとって非常に効果的である（Early Breast Cancer Trialists' Collaborative Group、2005;Gossら、2011）。実際、成長因子シグナリングパスウェイとのSRクロストークは広範囲にわたり、腫瘍は、高まった成長因子シグナリングの影響下で内分泌療法抵抗性へと進行する傾向を示すので、ER受容体とERBB受容体の両方を標的とする併用治療が無増悪生存を強化する（Johnstonら、2009;Kaufmanら、2009）。本明細書では、脱SUMO化（ホスホミミック）PR種によって、リガンド依存性条件下（151遺伝子）およびリガンド非依存性条件下（92遺伝子）の両方で、アップレギュレートまたは抑制解除されるユニークな一組の遺伝子を開示する（図4.1）。これらの遺伝子の上昇した発現は、主として高活性ホスホPR（脱SUMO化）種によって駆動される腫瘍を、特に活性化された成長因子シグナリングカスケードを特徴とするがんにおいて、知らしめることができる。例えば、MAPKおよびCDK2またはCDK4/6は、一部の乳腺腫瘍においておそらく永続的なPR Ser294リン酸化を誘導する乳がん進行の公知のドライバーである（図1A）。この「ホスホ-PR」遺伝子シグネチャを発現するルミナール型（ER陽性/PR陽性）乳腺腫瘍を持つ患者が存在すること（図1Aおよび図4.1参照）、そしてこのサブセットは、もし早期に同定されるのであれば、高選択的抗プロゲスチンの使用を、場合によっては現在使用されている抗エストロゲンもしくはアロマターゼ阻害剤および/または成長因子パスウェイ阻害と組み合わせて含む、内分泌療法の恩恵を受けるであろうことが、予測される。
【０１７７】
実際、PRが、機能的ER発現の臨床マーカーであるだけでなく、腫瘍進行の重要な独立ドライバーでもあることは、多くの研究によって示されている（（Danielら、2011）に総説がある）。とりわけ、SR陽性ルミナールAタイプ腫瘍が、より侵襲性の成長因子-高（growth factor-high）ルミナールBタイプ表現型へと進行するにつれて、PR喪失から始まってSR発現が低下し始める。これらの予後不良なルミナールBタイプ腫瘍は、しばしば臨床的にはER陽性/PR-低またはヌルと特徴付けられ、内分泌療法抵抗性になる可能性が、より高い。脱SUMO化ホスホPRは高活性受容体として機能するだけでなく、ユビキチン-プロテアソームパスウェイによって迅速にターンオーバーすることが、以前に示された（図1Bおよび（Langeら、2000））。実際に、内在性遺伝子のRT-qPCR（図5Bの場合のように、mRNAレベルによる）またはレポーター遺伝子を使った測定で、PR依存性転写がピークに達した時、PRタンパク質レベルは事実上検出不可能である（Danielら、2007b）。この知見は、PR-低またはヌルと臨床的に（すなわち、臨床の場での全タンパク質検出の方法による一般的測定で）定義される乳腺腫瘍のサブセットにおいても、PRがやはり高活性であるかどうかという重要な問題を提起する。興味深いことに、乳腺腫瘍は、成長因子依存性シグナリングによって媒介されるプロセスであるデノボプロゲステロン合成の能力を有する（Lockeら、2008;Suら、2011;Suzukiら、2005）。プロゲステロンの腫瘍細胞（局所）産生は、侵襲性の高いER陽性/PR陽性腫瘍における持続的PR作用（すなわちリガンド依存性遺伝子）の一因になりうる。
【０１７８】
驚くべきことに、本明細書では、脱SUMO化ホスホPRを発現する乳がん細胞が、ERBB/MAPKシグナリングパスウェイの正の調節にその多くが直接関与する細胞増殖遺伝子（図4.1）の発現を駆動することで、腫瘍進行に明確に関与する一種の「フィードフォワード」悪循環を引き起こすことを開示する（Amitら、2007;PratおよびPerou, 2011）。データは、本発明者らのユニークに定義されたPRシグネチャ（図4.1）への有意な類似性によって示されるように、ホスホPRがこの遷移（すなわちSR喪失に先だって起こりうる成長因子駆動性パスウェイの増大への腫瘍進行）のドライバーとして作用しうることを示唆している。これらの知見は、HRTの一部としてプロゲスチンを服用している女性に生じる乳腺腫瘍が、対照群との比較で、より高頻度であり、より大きく、より高いグレードであることを示すWomen's Health InitiativeおよびMillion Women's Studyからの入手可能な臨床データによって裏付けられる（Chlebowskiら、2010;Million Women Study Collaborators、2003）。注目すべきことに、これらのデータの最近の解析では、エストロゲン単独HRTが浸潤性乳がんから女性を実際に保護しうることが実証された（Andersonら、2012;LaCroixら、2011）。他のグループによる研究（Labriolaら、2003;MusgroveおよびSutherland、2009;Salatinoら、2004）と合わせて考えると、このデータは、乳がん患者においてPR作用を標的とすることが、とりわけ抗エストロゲンまたはアロマターゼ阻害剤に対して抵抗性になる患者にとっては、著しく有益であり得るという考えを裏付けている。注目に値することに、患者のほぼ40％は、もっぱらエストロゲン作用を標的とすることを目指す内分泌療法が最初から奏功しないか、最終的にそのような内分泌療法に対する抵抗性を発達させることになり、これは、十分な医療を受けることができていない大きな集団に相当する。
【０１７９】
乳がんの分子サブタイプを取り巻く大規模な研究により、この不均質ながんの遺伝的特徴に関する深い洞察が得られているが（PratおよびPerou、2011）、最新の標的療法は、依然として、少数の臨床病理マーカーに焦点が当てられている。さまざまなマーカー（例えばER、PR、およびHER2）のステータスを知ることに予後判定的価値があって最新の治療法に情報を与えうることは間違いないが、数を拡大した関連遺伝子のmRNAレベルを測定すること（すなわち遺伝子シグネチャ）は、腫瘍中で活性な遺伝子パスウェイに関して、より高い感度と特異性を持つ情報を提供するであろう。この知識は、とりわけ標的療法を考慮している場合に、臨床判断に情報を与えるために使用することができるだろう。そこで、乳腺腫瘍を分類するための予後判定的なmRNA発現ベースのアッセイの急速な拡大があった（Loiら、2007;Paikら、2004;Parkerら、2009;van't Veerら、2002）。しかし、現在利用することができる予後判定シグネチャは、遺伝子発現の変化を所与の腫瘍中に存在する分子ドライバーに関連付けることができない。ここでは、侵襲性腫瘍を特徴付ける可能性がより高いPR依存性遺伝子シグネチャが同定された（図5D、4.1）。これらの研究は、脱SUMO化ホスホPRをこの表現型の主要ドライバーとして関連付ける。動物モデルにおける検証研究は必要であるが（進行中）、本研究は、最新の抗エストロゲンベースの内分泌療法への貴重な追加処置としての抗プロゲスチンの使用を強く裏付ける。PR駆動性腫瘍（活性化PR遺伝子シグネチャを含有するもの）を有する患者の同定は、内分泌療法抵抗性の発生を防止することを目指した介入を可能にし、患者に追加の臨床的利益を与えうる。
【０１８０】
要約
本明細書では、PRがマイトジェン刺激のセンサーであって、それにより、リン酸化事象が受容体を脱SUMO化状態へと駆動して、細胞の増殖および生存を促進する劇的に変化した転写プログラムをもたらす限りにおいて、PR転写作用は当初考えられていたものより複雑であることが示された。乳がん細胞モデルにおいて高活性PRシグナリングのマーカーである公知のPRターゲット遺伝子と新規PRターゲット遺伝子の両方の脱SUMO化ホスホPR遺伝子シグネチャが同定された。このシグネチャは、再発乳がんを持つ患者のサブセットにも実際に存在する（図1Aおよび5D）。このユニークなシグネチャは、進行しかつ/または内分泌療法抵抗性（すなわちエストロゲン標的療法に対して抵抗性）になる可能性が高い腫瘍を持つ患者を同定するための貴重な予後判定尺度を与えることができる。
【０１８１】
文献一覧
2015516155.tif 000021
2015516155.tif 000022
2015516155.tif 000023
【０１８２】
全ての刊行物、アクセッション番号によって特定されたヌクレオチドおよびアミノ酸配列、特許および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。上記の明細では、本発明を、その一定の好ましい態様に関して説明したが、多くの詳細は例示を目的として記載したものであって、本発明にはさらなる態様が可能であること、および本明細書に記載する詳細のいくつかを本発明の基本的原理から逸脱することなくかなり変更させうることは、当業者には明白であるだろう。
【０１８３】
本明細書に記載する具体的方法および組成物は、好ましい態様を代表するものであり、例示的であって、本発明の範囲に対する限定を意図していない。本明細書を考慮すれば、他の目的、局面、および態様も、当業者は思いつくであろうが、それらは、特許請求の範囲によって画定される本発明の思想に包含される。本発明の範囲および思想から逸脱することなく本明細書に開示する発明にさまざまな置換および変更を加えうることは、当業者には容易にわかるだろう。本明細書に例証的に記載する発明は、本明細書において必須であると明確には開示していない任意の要素または限定が存在しなくても適切に実施することができる。本明細書に例証的に記載する方法およびプロセスは異なる工程順序で適切に実施することができ、本方法およびプロセスは、本明細書または特許請求の範囲に示す工程の順序に必ずしも限定されない。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈上そうでないことが明らかである場合を除き、複数の指示を包含する。したがって、例えば「核酸（a nucleic acid）」または「ポリペプチド（a polypeptide）」への言及は、多数のそのような核酸またはポリペプチド（例えば核酸もしくはポリペプチドの溶液または一連の核酸もしくはポリペプチド調製物）を包含する、などである。この文書において用語「または」は非排他的な「または」を指すために使用されるので、「AまたはB」は、別段の表示がある場合を除き、「AであるがBではない」、「BであるがAではない」、「AおよびB」を包含する。
【０１８４】
いかなる場合も、本発明が、本明細書において具体的に開示する具体的実施例または態様または方法に限定されると解釈されうることはない。いかなる場合も、いかなる審査官または他のいかなる当局者もしくは特許庁職員によってなされるいかなる陳述によっても、そのような陳述が個別的である場合を除き、そして出願人による答弁書にはっきりと採用された修正または制限がない限り、本発明が限定されると解釈されうることはない。
【０１８５】
使用した用語および表現は、説明のために使用されるものであって、限定のために使用するものではなく、そのような用語および表現の使用に、表示して説明した特徴の任意の等価物またはその一部を排除する意図はなく、特許請求の範囲に記載する本発明の範囲内でさまざまな変更が可能であると認識される。したがって、本発明を好ましい実施形態および随意の特徴によって具体的に開示したが、当業者は本明細書に開示する概念の変更および変形に頼ることができ、そのような変更および変形が添付の特許請求の範囲および本発明の陳述によって画定される本発明の範囲内にあるとみなされることは、理解されるであろう。
【図１Ａ】
2015516155.tif 000025
【図１Ｂ】
2015516155.tif 000026
【図１Ｃ】
2015516155.tif 000027
【図１Ｄ】
2015516155.tif 000028
【図１Ｅ】
2015516155.tif 000029
【図１Ｆ１】
2015516155.tif 000030
【図１Ｆ２】
2015516155.tif 000031
【図１Ｆ３】
2015516155.tif 000032
【図１Ｆ４】
2015516155.tif 000033
【図１Ｆ５】
2015516155.tif 000034
【図１Ｆ６】
2015516155.tif 000035
【図１Ｆ７】
2015516155.tif 000036
【図１Ｆ８】
2015516155.tif 000037
【図１Ｆ９】
2015516155.tif 000038
【図１Ｆ１０】
2015516155.tif 000039
【図１．１Ａ】
2015516155.tif 000040
【図１．１Ｂ１】
2015516155.tif 000041
【図１．１Ｂ２】
2015516155.tif 000042
【図１．１Ｃ】
2015516155.tif 000043
【図２Ａ１】
2015516155.tif 000044
【図２Ａ２】
2015516155.tif 000045
【図２Ａ３】
2015516155.tif 000046
【図２Ａ４】
2015516155.tif 000047
【図２Ｂ１】
2015516155.tif 000048
【図２Ｂ２】
2015516155.tif 000049
【図２Ｂ３】
2015516155.tif 000050
【図２Ｂ４】
2015516155.tif 000051
【図２Ｃ１】
2015516155.tif 000052
【図２Ｃ２】
2015516155.tif 000053
【図２Ｃ３】
2015516155.tif 000054
【図２Ｃ４】
2015516155.tif 000055
【図２Ｄ】
2015516155.tif 000056
【図２Ｅ】
2015516155.tif 000057
【図３Ａ】
2015516155.tif 000058
【図３Ｂ】
2015516155.tif 000059
【図３Ｃ】
2015516155.tif 000060
【図３Ｄ】
2015516155.tif 000061
【図３Ｅ】
2015516155.tif 000062
【図３Ｆ１】
2015516155.tif 000063
【図３Ｆ２】
2015516155.tif 000064
【図３Ｆ３】
2015516155.tif 000065
【図３．１Ａ１】
2015516155.tif 000066
【図３．１Ａ２】
2015516155.tif 000067
【図３．１Ａ３】
2015516155.tif 000068
【図３．１Ａ４】
2015516155.tif 000069
【図３．１Ｂ】
2015516155.tif 000070
【図３．２Ａ】
2015516155.tif 000071
【図３．２Ｂ】
2015516155.tif 000072
【図３．３】
2015516155.tif 000073
【図４Ａ】
2015516155.tif 000074
【図４Ｂ】
2015516155.tif 000075
【図４Ｃ】
2015516155.tif 000076
【図４Ｄ】
2015516155.tif 000077
【図４．１Ａ１】
2015516155.tif 000078
【図４．１Ａ２】
2015516155.tif 000079
【図４．１Ａ３】
2015516155.tif 000080
【図４．１Ｂ１】
2015516155.tif 000081
【図４．１Ｂ２】
2015516155.tif 000082
【図４．１Ｂ３】
2015516155.tif 000083
【図５Ａ】
2015516155.tif 000084
【図５Ｂ１】
2015516155.tif 000085
【図５Ｂ２】
2015516155.tif 000086
【図５Ｂ３】
2015516155.tif 000087
【図５Ｃ】
2015516155.tif 000088
【図５Ｄ】
2015516155.tif 000089
【図５．１Ａ】
2015516155.tif 000090
【図５．１Ｂ】
2015516155.tif 000091
【図５．１Ｃ１】
2015516155.tif 000092
【図５．１Ｃ２】
2015516155.tif 000093
【図６】
2015516155.tif 000094
【図７】
2015516155.tif 000095
【図８】
2015516155.tif 000096
【図９】
2015516155.tif 000097
【図１０】
2015516155.tif 000098
【図１１】
2015516155.tif 000099
【国際調査報告】
2015516155.tif 000100
2015516155.tif 000101
2015516155.tif 000102
2015516155.tif 000103
2015516155.tif 000104
2015516155.tif 000105
2015516155.tif 000106
2015516155.tif 000107