(57)【要約】本発明の技術は、概して、血小板凝固を測定するためのマイクロ流体デバイス、および関連のシステムおよび方法に関する。いくつかの実施形態では、流体デバイスは、概して剛直なブロックおよび概して可撓性のポストの対を備える、微細構造のアレイを備える。この流体デバイスはさらに、このアレイを受容するように構成された少なくとも１つの流体チャネルを備える。この流体チャネルは、このアレイを通じて、全血のような生物学的サンプルの流体フローを誘導するように構成される。この流体デバイスはさらに、このアレイにおける１つまたは複数の可撓性のポストの偏向の程度を測定するように構成された検出構成要素を備えてもよい。いくつかの実施形態では、この流体デバイスは、手持ち式のデバイスを備え、血小板力および凝固のポイント・オブ・ケア検査に使用可能である。
2015516088.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
概して剛直なブロックおよび概して可撓性の構造を含んでいる微細構造のアレイと、
前記アレイを受容するようにサイズ決めされた少なくとも１つの流体チャネルであって、前記流体チャネルが、前記アレイを通じた生物学的サンプルの流体フローを誘導するように構成されており、
前記アレイ中の前記可撓性の構造の１つまたは複数の偏向の程度を検出するための手段
とを備えたことを特徴とする流体デバイス。
【請求項２】
前記アレイが、前記概して剛直なブロックおよび前記概して可撓性の構造の対を含むことを特徴とする請求項１のデバイス。
【請求項３】
前記微細構造が、シリコン、ポリマー、金属、またはセラミックスの少なくとも１つからなることを特徴とする請求項１のデバイス。
【請求項４】
検出のための前記手段が、光学的検出構成要素または磁気検出構成要素の少なくとも１つを備えたことを特徴とする請求項１のデバイス。
【請求項５】
前記磁気検出構成要素が、スピンバルブ、Ｈａｌｌプローブ、またはフラックスゲート磁力計のうちの１つであることを特徴とする請求項４のデバイス。
【請求項６】
個々の概して可撓性の構造が、磁性材料を備えたことを特徴とする請求項４のデバイス。
【請求項７】
前記磁気検出構成要素が、個々のブロックと概して可撓性の構造との間に位置し、かつ前記磁性材料を含む前記概して可撓性の構造の偏向によって生じる前記アレイ中の磁場における変化を検出するように構成された、スピンバルブを備えたことを特徴とする請求項６のデバイス。
【請求項８】
前記光学的検出構成要素が、位相差顕微鏡、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、またはフォトダイオードのうちの１つであることを特徴とする請求項４のデバイス。
【請求項９】
前記生物学的サンプルが、全血、血漿、血漿タンパク質、血液または他の生体液中にあるタンパク質、血小板、内皮細胞、循環腫瘍細胞、癌細胞、繊維芽細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、赤血球、白血球、細菌、巨核球細胞、またはそれらの断片のうちの少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１のデバイス。
【請求項１０】
前記微細構造のうちの少なくともいくつかが、タンパク質、酵素、生理活性ミネラル、グリカン、ポリグリカン、糖タンパク質、コラーゲン、フォンヴィレブランド因子、ビトロネクチン、ラミニン、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、プラスミン、アゴニスト、マトリックスタンパク質、アクチン−ミオシン活性のインヒビターおよびそれらの断片からなる群より選択される少なくとも１つの結合因子で少なくとも部分的にコーティングされることを特徴とする請求項１のデバイス。
【請求項１１】
前記流体デバイスが、手持ちサイズのデバイスを含むことを特徴とする請求項１のデバイス。
【請求項１２】
前記１つまたは複数の概して可撓性の構造の偏向の前記程度に基づいて前記生物学的サンプルの特徴を示すように構成されたディスプレイをさらに備えたことを特徴とする請求項１のデバイス。
【請求項１３】
一対の微細構造が流体フローチャンバ中に配置され、前記対が、概して可撓性の構造に対して近位の概して剛直なブロックを備えていること、
前記微細構造を覆って流体を流すこと、
前記概して可撓性の構造の偏向を測定すること
とを含むことを特徴とする分析方法。
【請求項１４】
前記対の微細構造を前記流体フローチャンバ中に配置することが、酵素、ミネラル、フォンヴィレブランド因子、タンパク質、グリカン、ポリグリカン、糖タンパク質、コラーゲン、ビトロネクチン、ラミニン、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、プラスミン、アゴニスト、マトリックスタンパク質、アクチン−ミオシン活性のインヒビターまたはそれらの断片のうちの少なくとも１つで少なくとも部分的にコーティングされた微細構造を配置することを含むことを特徴とする請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記微細構造を覆って流体を流すことが、前記微細構造を覆って生体液を流すことを含むことを特徴とする請求項１３の方法。
【請求項１６】
前記微細構造を覆って前記生体液を流すことが、血漿タンパク質、ミネラル、フォンヴィレブランド因子、タンパク質、グリカン、ポリグリカン、糖タンパク質、コラーゲン、ビトロネクチン、ラミニン、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、プラスミン、アゴニスト、マトリックスタンパク質、アクチン−ミオシン活性のインヒビターまたはそれらの断片のうちの少なくとも１つを含んでいる生体液を流すことを含むことを特徴とする請求項１５の方法。
【請求項１７】
前記概して可撓性の構造の偏向を測定することが、前記概して可撓性の構造の偏向を測定するために光学的検出構成要素を用いることを含むことを特徴とする請求項１３の方法。
【請求項１８】
前記概して可撓性の構造の偏向を測定することが、前記概して可撓性の構造の偏向を測定するために磁気検出構成要素を用いることを含むことを特徴とする請求項１３の方法。
【請求項１９】
前記磁気検出構成要素を用いることが、前記概して可撓性の構造の偏向によって生じる磁場の変化を測定するために、スピンバルブ、Ｈａｌｌプローブ、またはフラックスゲート磁力計のうちの１つまたは複数を用いることを含むことを特徴とする請求項１８の方法。
【請求項２０】
前記対の微細構造を、前記流体フローチャンバ中に配置することが、前記概して剛直なブロックを、前記概して可撓性の構造に対して上流の位置に配置することを特徴とする請求項１３の方法。
【請求項２１】
血餅形成を誘導することをさらに含むことを特徴とする請求項１３の方法。
【請求項２２】
流体チャンバを通じて流れる生体液サンプル中でせん断勾配を誘導し、前記流体チャンバには複数の微細構造が含まれていること、
少なくとも１つの微細構造上で前記生物学的サンプルの血餅形成に必要なせん断活性の閾値レベルを決定すること、
前記せん断活性閾値レベルに基づいて前記患者の処置を選択すること、
とを含むことを特徴とする患者処置を選択する方法。
【請求項２３】
前記生体液サンプル中でせん断勾配を誘導することが、前記生体液サンプルのインヒビター、アンタゴニスト、またはアゴニストを含んでいる生体液サンプル中でせん断勾配を誘導することを含むことを特徴とする請求項２２の方法。
【請求項２４】
前記患者についての処置を選択することが、前記せん断活性閾値レベルに基づいて、凝固誘導薬または抗凝固薬の用量を選択することを含むことを特徴とする請求項２２の方法。
【請求項２５】
前記生体液サンプル中のせん断勾配を誘導することが、全血、血漿、血漿タンパク質、血小板、内皮細胞、循環腫瘍細胞、癌細胞、繊維芽細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、赤血球、白血球、細菌、巨核球細胞、またはそれらの断片のサンプル中でせん断勾配を誘導することを含むことを特徴とする請求項２２の方法。
【請求項２６】
前記流体チャンバを通じて流れる前記生体液サンプル中でせん断勾配を誘導することが、概して可塑性の構造に対して近位の概して剛直なブロックを備えている微細構造のアレイを有する流体チャンバを通じて流れる流体サンプル中でせん断勾配を誘導することを含むことを特徴とする請求項２２の方法。
【請求項２７】
せん断活性の前記閾値レベルを決定することが、前記微細構造の偏向を測定することを含むことを特徴とする請求項２２の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、以下の係属中の出願の恩典を請求する。
【０００２】
（ａ）２０１２年５月１０日出願の米国特許仮出願第６１／６４５，１９１号。
（ｂ）２０１２年１０月４日出願の米国特許仮出願第６１／７０９，８０９号。
（ｃ）２０１２年１０月２９日出願の米国特許出願公開第１３／６６３，３３９号；および
（ｄ）２０１３年２月５日出願の米国特許仮出願第６１／７６０，８４９号。
【０００３】
前述の出願の全ては、その全体が参照によって本明細書に援用される。さらに、参照によって援用される出願中に開示される実施形態の構成要素および特徴は、開示される種々の構成要素および特徴と組み合わされて、本出願で特許請求される。
【０００４】
連邦政府支援の研究に関する声明
本発明は、ＳＰＡＷＡＲ−スペースアンドナバル（宇宙海軍）戦闘システムセンター（Ｓｐａｃｅ  ａｎｄ  Ｎａｖａｌ  Ｗａｒｆａｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｅｎｔｅｒ）（ＳＳＣ）が授与するＮ６６００１−１１−１−４１２９による政府の支援でなされた。政府は、本発明に特定の権利を有する。
【０００５】
本技術は概して、血小板凝固を測定するためのマイクロ流体デバイス、ならびに関連のシステムおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００６】
血小板は、血液の損失を止めて組織を治癒させるために必須である。創傷部位では、血小板は、活性化、形状変化、分泌および凝集という凝固過程を受け、最終的には、フィブリン鎖および血小板を含んでいる止血性の血餅につながる。血小板は、止血において固有の生体力学的役割を果たす：血小板のアクチン−ミオシン力は、それらのインテグリン接着を増強し、かつフィブリン鎖および血小板を近くに一緒に引き付けることによって繊維素溶解を防ぐ。
【０００７】
血行動態は、血小板の活性に重要な役割を果たす。高いせん断速度勾配は、血管が屈曲するか、分岐するかまたは狭くなる位置で生じ、かつ血管ステントまたは人工弁で生じる。これらのせん断勾配は、血小板を血管壁に結合させることが観察されており、これによってそれらの活性化および凝集がもたらされる。高いせん断勾配は、自立的なプロセスを生じ、ここでは血小板凝集が、局所のせん断勾配を増大し、さらに血小板を接着および凝集させる。
【０００８】
身体が損傷に応答する一次的な方法は、出血を停止するための血餅の形成である。血餅の強度は、その中でトラップされた血小板細胞が力強く接触する能力（破裂を妨ぐために血小板を囲むフィブリン網目構造を硬化させて、創傷に対して血餅を固定する）に大きく依存する。適切な血餅形成は、外傷患者で重要である。なぜなら、血餅形成の障害は、死亡率の有意な増大に関わるからである。例えば、血小板機能不全を有する外傷患者は、損傷の重篤度が増大しショック症状がより悪化する場合がある。それらの患者は、輸血をより多く必要とし、死亡率が高い場合がある。このような状態を有する患者は、損傷した現場からより迅速に搬送される必要があり、低血圧蘇生ストラテジーのような、「ダメージコントロール」介入のトリアージをされる。病院到着の際に、これらの患者は、個別化した血液製剤輸血を含む、早期で、かつより積極的な処置を与えられてもよく、さらに迅速に即時手術に高じられてもよい。
【０００９】
伝統的な診断試験では、血小板が十分凝固されているか否かを決定することは技術的に複雑であり、試験するには十分な量の血液を要する。さらに、このような試験では、最終的な判断を下すには十分な時間を必要とする。この処理時間は、外傷患者が受ける処置技術の遅延を生じ、それによって残念な結果となる機会が増大する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】本技術の実施形態に従って構成されたマイクロ流体フローチャンバの部分的模式図である。
【図１Ｂ】本技術の実施形態による、図１Ａのチャンバ中で流体フローを受けているマイクロポストのアレイの部分的模式図である。
【図２】本技術の実施形態に従って構成されたマイクロポストのアレイの上面図である。
【図３】血小板力を測定するための、本技術の実施形態に従って構成された、血小板試験デバイスの側方等角図である。
【図４】本技術の実施形態による、生物学的サンプル中の血小板凝固を測定する方法を図示しているブロック図である。
【図５】図５Ａ〜図５Ｃは、本技術の実施形態による、３例の代表的な患者においてマイクロポスト偏向が生じ始めるために必要なせん断活性を図示するグラフである。
【図６】本技術の実施形態による、患者のせん断活性閾値に応じて患者処置を選択する方法を示したブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の技術は、概して、血小板凝固を測定するためのマイクロ流体デバイス、ならびに関連のシステムおよび方法に関する。いくつかの実施形態では、流体デバイスは、概して剛直なブロックと概して可撓性のポストの対を含んでいる微細構造のアレイを備える。この流体デバイスはさらに、アレイを受容するように構成された少なくとも１つの流体チャネルを備える。この流体チャネルは、このアレイを通じた、全血のような生物学的サンプルの流体フローを誘導するように構成されている。この流体デバイスはさらに、このアレイ中の１つまたは複数の可撓性のポストの偏向の程度を測定するように構成された検出構成要素を備えてもよい。いくつかの実施形態では、この流体デバイスは、手持ち式のデバイスを備え、血小板力と凝固のポイント・オブ・ケア（ＰＯＣＴ）検査（ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  ｃａｒｅ  ｔｅｓｔｉｎｇ）に使用可能である。
【００１２】
本技術のいくつかの実施形態の特定の詳細は、図１Ａ〜６を参照して下に記載される。細胞研究ツールまたはポイント・オブ・ケア流体デバイスに関連する場合が多い周知の構造およびシステムを記述している他の詳細は、本技術の種々の実施形態の説明を不必要に不明瞭にしないために、以下の開示では示されていない。これらの図に示される詳細、寸法、角度および他の特徴の多くは、本技術の特定の実施形態の単なる例示である。従って、他の実施形態は、本発明の技術の趣旨または範囲から逸脱することなく、他の詳細、寸法、角度および特徴を有してもよい。従って、当業者は結果的に、本技術が、追加の要素を有する他の実施形態を有してもよいこと、または本技術が図１Ａ〜６を参照して下に示されかつ記載されるいくつかの特徴のない他の実施形態を有してもよいことを理解するだろう。
【００１３】
図１Ａは、本技術の実施形態に従って構成された流体フローチャンバ１００の部分的模式図である。このチャンバ１００は、入り口１２２から出口１２４へ流体を流す主要チャネル１０２を備えてもよい。いくつかの実施形態では、この流体は、全血もしくは血小板、または血漿および血漿タンパク質を含む全血の他の画分を含んでもよい。他の実施形態では、この流体は、内皮細胞、循環腫瘍細胞、癌細胞、繊維芽細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、赤血球、白血球、細菌、巨核球細胞、酵素、ミネラル、生体鉱物の少なくとも１つ、またはそれらの断片を含んでもよい。図１Ａは、単一の主要チャネル１０２を図示するが、さらなる実施形態では、このチャンバ１００は、複数の流体チャネルを備えてもよい。複数の流体チャネルを有する実施形態では、ユーザーは、異なる流体、生物学的サンプル、および／または試薬を異なるチャネルに導入してもよい。または、下にさらに詳細に記載されるとおり、チャンバ１００は、並行して作動できて、流体サンプルの異なる特徴を試験できる、複数の流体チャネルを備える。例えば、チャンバ１００は、改変されたサンプルに対してコントロールサンプルを試験してもよいし、またはサンプルを、異なる界面化学を有する複数の流体チャネルに導入してもよい。
【００１４】
この主要チャネル１０２は、マイクロポストのような、微細構造の１つまたは複数のアレイ１１４を受容するように構成されている。いくつかの実施形態では、アレイ１１４は、主要チャネル１０２の基部または底部１１８またはその付近に位置し、その結果、流体は、アレイ１１４の実質的に上部を通って流れる。下にさらに詳細に記載されるとおり、いくつかの実施形態では、アレイ１１４は、微細構造の１つまたは複数の対を備える。ある場合には、微細構造の各々の対は、概して可撓性のポスト１１０に対して近位の概して剛直なブロック１０８を備える。下にさらに詳細に考察されるとおり、いくつかの実施形態では、ポスト１１０の頂部は、磁気チップ１１６を備える。ポスト１１０の頂部の磁気チップ１１６は、鋳型の細孔内に電気化学析出によって成長されるコバルト、ニッケル、サマリウムまたは他の希土類金属からできていてもよい。他の実施形態では、この磁気チップ１１６は、他の金属を含むか、または他の方法で形成もしくは析出される。
【００１５】
いくつかの処方物では、ブロック１０８は、下流のポスト１１０の上流である。いくつかの実施形態では、このブロック１０８およびポスト１１０は、５〜１５μｍ間隔をあけられており、特定の実施形態では、９μｍの間隔である。種々の実施形態では、アレイ１１４は、ブロック１０８とポスト１１０の他の組み合わせを含んでもよい。例えば、ポスト１１０に対するブロック１０８の比は、１：１でなくてもよいが、代わりに、単一ブロック１０８に近位の複数のポスト１１０があってもよい。さらなる実施形態では、この割合は逆になる。またさらなる実施形態では、このポスト１１０は、ブロック１０８の上流である。このポスト１１０は、その上部先端に加えられた力に対する割合で偏向する、弾性のカンチレバービームとして機能する。例えば、偏向は、ポスト１１０の基部から先端への連続体であってもよい。いくつかの実施形態では、ポスト１１０は、ブロック１０８よりも有意に大きく偏向する。いくつかの場合には、ブロック１０８の偏向は、無視できるかまたは存在しない。
【００１６】
アレイ１１４はまた、１つまたは複数のスピンバルブ１２６を、１つまたは複数のポスト１１０またはブロック１０８の下にまたは隣接して備えてもよい。例えば、微細構造の各々のブロック・アンド・ポスト（ｂｌｏｃｋ−ａｎｄ−ｐｏｓｔ）対についてスピンバルブ１２６があってもよく、このスピンバルブ１２６は、ブロック１０８とポスト１１０との間に配置されてもよい。下にさらに詳細に記載されるとおり、このスピンバルブ１２６を用いて、ブロック１０８へ向かって偏向するポスト１１０の磁気チップ１１６によって生じる磁場の変化を測定してもよい。このスピンバルブ１２６は、薄膜において巨大磁気抵抗（ｇｉａｎｔ  ｍａｇｎｅｔｏｒｅｓｔｒｃｔｉｖｅ：ＧＭＲ）効果を用いる。このスピンバルブ１２６は、磁気層および非磁気層の交互のスタックでスパッタリングされた薄膜金属のストリップを備えてもよい。異なる層における電子のスピンの相互作用に起因して、ストリップの抵抗は、面内の磁場の変化に感応する。このスピンバルブ１２６は、１ｎＴのオーダで磁気感受性を有し、これが２０：１というシグナル対ノイズ比を達成する。いくつかの実施形態では、スピンバルブ１２６の抵抗における変化は、ホイートストンブリッジ構成を設定することによって測定できる。
【００１７】
いくつかの実施形態では、フローユニットチャンバ１００は、ポイント・オブ・ケア用にサイズ決めされる。例えば、フローチャンバ１００は、血液のような流体の比較的少量（例えば、３μｌ未満）のサンプルを受容するようにサイズ決めされてもよい。いくつかの実施形態では、１滴の血液で、このデバイスを作動するのに十分である。一実施形態では、主要チャネル１０２は、２ｃｍの長さ、４ｍｍの長さ、および０．５ｍｍの深さを有する。主要チャネル１０２は、他の実施形態では、他の寸法を有してもよい。いくつかの実施形態では、フローチャンバ１００は、密閉されている。図３を参照して下に記載されるとおり、いくつかの実施形態では、チャンバ１００またはアレイ１１４の全てまたは一部は、流体試験を活性化するか、または試験結果（例えば、血小板力の強さ）を表示する、手持ち式のデバイス内に配置されるように構成されたカードを備える。
【００１８】
図１Ｂは、流体フローを受けており、かつ本技術の実施形態によって構成された、図１Ａの微細構造アレイ１１４の部分的模式図である。図１Ａおよび図１Ｂをまとめて参照すれば、作動時には、アレイ１１４は、主要チャネル１０２に配置されており、選択された時間の間、流体フローの状態（例えば、アレイ１１４中でせん断勾配を創出する層流フロー状態）に曝される。例えば、いくつかの実施形態では、アレイ１１４は、チャネル１０２の内側に配置されてもよく、全血の流体フローが１分未満の間連続して加えられてもよい。他の実施形態では、このフローは、間欠的に加えられてもよいし、または１分を超えてもしくは１分未満加えられてもよい。例えば、このフローは、１分または１分未満、５分または５分未満、あるいは１５分または１５分未満提供されてもよい。いくつかの実施形態では、このフローは、ユーザーとの混合または必要な他の介入を要することなく提供されてもよい。
【００１９】
種々の実施形態では、「流体の流れ、流体フロー（ｆｌｕｉｄ  ｆｌｏｗ）」は、ポンピングされるか、そうでなければ機械的に移動される流体、加圧された流体（例えば、シリンジを介して導入される）を指してもよいし、または（ポンピングされない）浸漬を指してもよい。フローユニット（例えば、ポンプ）１０４が、フローチャンバ１００と接続され、かつチャンバ１００を通じて媒体を再循環して、静流、層流および／または乱流フローをフロー矢印の方向に提供するように構成されていると示されているが、他の実施形態では、フローユニット１０４は、存在せず、かつ流体サンプルが入り口１２２を介して主要チャネル１０２に導入される。例えば、流体サンプルは（例えば、ヘパリンまたは他の抗凝固チューブ中で）収集されてもよく、シリンジに充填されて、生理学的正常（２０００ｓ−１）と病理学的高値（１２０００ｓ−１）との間の壁せん断速度で主要チャネル１０２を通じてポンピングされてもよい。いくつかの実施形態では、流体サンプルは、出口１２４を介して主要チャネル１０２から回収されてもよいが、他の実施形態では、流体サンプルは、廃棄の容易さから試験後に主要チャネル１０２内に残される。フローユニット１０４を有する実施形態では、フローユニット１０４は、容積型（移送式）ポンプ、圧電ポンプ、部分真空、隔膜（ダイヤフラム）ポンプ、蠕動ポンプ、静水圧ポンプまたは別のデバイスを備えてもよい。
【００２０】
流体サンプル（例えば、全血）が、主要チャネル１０２内に導入されるにつれて、流れている血小板は、急速に微細構造に接着して（例えば、ブロック１０８とポスト１１０の上およびその間）、マイクロスケールの血餅１２０を形成する。さらに具体的には、血小板は、血餅１２０で凝集し、これが、アレイ１１４においてブロック１０８とポスト１１０構造との間の機械的架橋を形成する。血小板はせん断力のもとで収縮して、これによりポスト１１０が、先端に加えられた力に比例して偏向する弾性のカンチレバービームとして、ブロック１０８に向かって屈曲する。ポスト１１０偏向の程度は、血液中の血小板作用がどのくらいの強さで生じるかを定量するために用いられ、これによって、任意の凝固欠損が適宜特定される。いくつかの実施形態では、ブロック１０８およびポスト１１０は、ブロック１０８とポスト１１０との間の血餅空間に赤血球および白血球の滞留を防げるような程度の近さの距離に隔てられている。
【００２１】
ポスト１１０の偏向を測定するために、その先端と基部の位置の間の相違を、アレイ１１４の先端と底部で撮った位相差蛍光顕微鏡画像から分析してもよい。各々のけん引力（Ｆ）の大きさおよび方向は、以下の関係によって偏向（δ）から計算される：
【００２２】
【数１】
2015516088.tif 000003
【００２３】
アレイ中の微細構造の長さＬおよび直径Ｄは、走査電子顕微鏡を用いて測定できる。いくつかの実施形態では、ポスト１１０の直径は、２．２μｍであって、長さは７μｍである。ポスト材料（例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、Ｅ＝２．５ＭＰａ）のヤング係数は、引張試験によって決定してもよい。
【００２４】
ポスト１１０の上の磁気チップ１１６を用いて、磁気検出構成要素によって血小板力を測定してもよい。例えば、磁気チップ１１６は、スピンバルブ１２６に対して並行に方向付けされた双極子モーメントμ０を有する。ニッケル磁気チップ１１６の場合、最初の双極子モーメントは、４．８ｐＡｍ２である。磁気チップ１１６がセンサーから約６０μｍであると仮定すれば、その双極子モーメントは、μ０＝４．４μＴという面内磁場を生じる。この測定では、非屈曲ポスト１１０についての基準線を読み取る。
【００２５】
血小板力が、ポスト１１０を、ブロック１０８に向けて屈曲させる時、磁気チップ１１６は、角度θ回転する。磁気チップ１１６の双極子モーメントμ’の再方向付けに起因して、スピンバルブ１２６で測定した面内磁場の低下がある。特定の実施形態では、４０ｎＮの力が、血餅１２０によって生じる。そのため、ＳＵ−８製のポスト１１０についての２２１ｎＮ／μｍのバネ定数に基づいて、ポスト１１０の磁気チップ１１６で約０．３°の回転がある。この回転は、磁気チップ１１６の双極子モーメントμ’がその方向を０．３°まで変化させ、同様に、スピンバルブ１２６で測定される面内磁場におけるμ０−μ’＝２０ｎＴの低下を生じる。２０ｎＴの低下は、最も低価格の市販の磁力計（例えば、ホール効果センサーまたはフラックスゲート磁力計）に関しては小さすぎる場合があるが、スピンバルブ１２６は、磁場でこのような変化を検出するには十分に感受性がある。図２を参照して下に考察されるとおり、アレイ１１４はまた、スピンバルブ１２６と、血小板力を検出するための電子機器との間の接続を可能にする導体パッドを備えてもよい。
【００２６】
他の実施形態では、他の磁気構成要素、例えば、磁気ナノワイヤは、ポスト１１０の他の部分に埋め込まれても、またはその中に配置されても、もしくはそれに沿って配置されてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、ナノワイヤは、ポスト１１０の少なくともほぼ頂部２／３に埋め込まれ、磁気検出に用いられる。ナノワイヤを用いるポスト偏向は、磁力計、例えば、帯磁したアレイ１１４に隣接して（例えば、下部に）配置されたスピンバルブまたはＧＭＲセンサーを用いて検出される。またさらなる実施形態では、磁石をポスト１１０から取り除き、ポスト１１０上の血小板力の測定を、光学顕微鏡検査および画像処理を用いて行ってもよい。ポスト１１０上で力を検出するための特定の光学的検出構成要素としては、位相差顕微鏡、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、またはフォトダイオードを挙げることができる。他の光学的検出構成要素がさらなる実施形態で用いられてもよい。
【００２７】
上記で考察されたアレイ１１４は、種々のテンプレートまたは成型技術を用いて製造される。例えば、いくつかの実施形態では、アレイ１１４は、Ｎｏ．２のカバーガラス上で０．２５ｍｍ厚を有するＰＤＭＳまたは同様の材料のフィルムをキャスティングすることによって創出される。他の実施形態では、他の材料および／または材料の厚みを用いてもよい。いくつかの実施形態では、個々の微細構造は、シリコン、ポリマー、金属、またはセラミックスを含む。特定の実施形態では、個々のポスト１１０は、約２２１ｎＮ／μｍというバネ定数を有する、ＳＵ−８フォトレジストを用いて作製される。いくつかの実施形態では、チャンバ１００の微細構造または他の部分は、非ファウリングコーティング（non fouling coating）で実質的にコーティングされてもよい。
【００２８】
微細構造のアレイ１１４は、所望の形状、配列またはパターンに微小成型されてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、個々のブロック１０８は概して長方形の形状であり、高いせん断力を生じるように構成された先鋭な角を有する。他の実施形態では、ブロック１０８は、他の形状、例えば、くさび形、三角形、円柱、球、星形などを有する。特定の実施形態では、ブロック１０８は、約１０〜６０μｍの高さ、１０〜３０μｍの幅、および５〜２０μｍの深さを有する。いくつかの実施形態では、個々のポスト１１０は概して円柱として成形されるが、さらなる実施形態では他の形状を有する。特定の実施形態では、ポスト１１０は、約１０〜６０μｍの高さを有し、かつ約２〜６μｍの直径を有する。いくつかの実施形態では、磁気チップ１１６は、約１μｍ厚、および約３μｍの直径のニッケルの層を含む。さらなる実施形態では、このポスト１１０は、他の寸法を有してもよい。
【００２９】
界面化学または結合剤を用いてデバイス１００の微細構造または他の一部を処理またはコーティングすることが望ましい場合がある。例えば、いくつかの実施形態では、結合構成要素（例えば、フィブロネクチン）は、ＰＤＭＳスタンプの表面上に吸収される。このスタンプは、パターンなしでもよいし（「フラットスタンプ」）、またはポジ型レリーフパターンのアレイを、四角い格子形状にしてもよい（「スクエアスタンプ」）。一旦、結合剤が吸着されれば、このスタンプを、接触領域上にフィブロネクチンを移行するために基板との等角接触に配置してもよい。後で、各々の基板を、０．２％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７または他の適切な材料で処理して、フィブロネクチンがスタンプされた領域に細胞が接着して、主要チャネル１０２上のタンパク質吸着を妨ぎ、血小板接着を阻害することを確実にしてもよい。これは、試験のために血液の他の構成要素から血小板を分離することに役立つ。いくつかの実施形態では、主要チャネル１０２の壁を、蛍光色素でコーティングし、次いでＩ型コラーゲンおよびフォンヴィレブランド因子でコーティングする。
【００３０】
いくつかの実施形態では、個々の微細構造（または微細構造の先端）を、実質的に、少なくとも１つの界面化学または結合要素、例えば、タンパク質、グリカン、ポリグリカン、糖タンパク質、コラーゲン、ビトロネクチン、ラミニン、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、プラスミン、アゴニスト（例えば、トロンビンまたはカルシウム）、マトリックスタンパク質（例えば、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、フォンヴィレブランド因子）、酵素、ミネラル、生体鉱物、アクチン−ミオシン活性のインヒビター（例えば、Ｙ−２７６３２、ＭＬ−７、またはブレビスタチン）、および／またはそれらの断片でコーティングする。いくつかの実施形態では、微細構造が細胞外マトリックスタンパク質でコーティングされており、血小板が、創傷血管壁に対するように結合することを可能にする。いくつかの実施形態では、各々のマイクロチャネル中の微細構造を、フォンヴィレブランド因子を用いて１０〜５０μｇ／ｍｌの範囲の濃度でスタンプしてもよい。
【００３１】
上記で考察されるとおり、いくつかの実施形態では、デバイス１００は、サンプルの異なる特徴を試験するために並行して作動できる複数のチャネルを備える。例えば、いくつかの実施形態では、デバイス１００は、各々が異なる微細構造の界面化学を有する、複数のチャネルを備えてもよい。特定の実施形態では、第一のマイクロチャネルは、コントロールのチャネルとして泳動され、第二のチャネルは、凝固を増強する微細構造界面化学を備え、第三のチャネルは、血小板凝固を阻害する微細構造界面化学を備える。複数のチャネルが、ある範囲の血餅形成構成要素の同時試験を行うために組み合わされてもよい。
【００３２】
図２は、図１の流体フローチャンバ１００中で使用される微細構造のアレイ２１４の上面図である。アレイ２１４は、流体入り口２２２および流体出口２２４を備える、マイクロチャネル２０２中に受容される。このアレイ２１４は、あるパターンの対のブロック２０８と対応する下流のポスト２１０とを備える。この図示された実施形態は、行と列の微細構造の対の格子を備えるが、さらなる実施形態では、その対は、異なる配置で配置されてもよいし、または行および列はより多くても少なくてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、ブロック２０８およびポスト２１０が各々１００ある場合がある。さらに、ブロック２０８およびポスト２１０は、対になる必要はないが、代わりに、１つのブロック２０８あたり複数のポスト２１０があってもよく（例えば、ポスト２１０は、ブロック２０８を取り囲んでもよい）、または１つのポスト２１０あたり複数のブロック２０８があってもよい。
【００３３】
複数のスピンバルブ２２６が、アレイ２１４中に配置され、各々のスピンバルブ２２６がブロック２０８とポスト２１０との間にある。電子機器にスピンバルブ２２６を接続するための１つまたは複数の導体パッド２３０を、アレイ２１４の端部にそって配置する。データ取る装置および信号処理装置を用いて、上記の方式でポスト２１０の偏向を決定してもよい。スピンバルブ２２６を通る電圧の変化は、血液サンプル中の血小板力がどの程度強いかを示している。サンプル中の血小板が損傷している場合、測定される電圧の変化はより小さくなる。
【００３４】
図３は、血小板力を測定するための、かつ本技術の実施形態に従って構成された、血小板試験デバイス３５０の側方等角図である。いくつかの実施形態では、このデバイス３５０は、容易に携行可能な、手持ち式の（例えば、１０ｃｍ×８ｃｍ×５ｃｍまたはそれ未満の寸法を有する）、ポイント・オブ・ケア検査システムを備えてもよい。デバイス３５０は、サンプルカード３００を受容できる受容部分３５４を備えてもよい。サンプルカード３００は、図１を参照して上記で考察したフローチャンバ１００またはアレイ１１４のような、フローチャンバまたはアレイ、またはその一部を備えてもよい。種々の実施形態では、カード３００は、並行して作動できる、異なる試験条件（例えば、異なる微細構造界面化学）を有する１つの流体チャネルまたは複数のチャネルを備えてもよい。さらなる実施形態では、異なるカード３００は、異なる試験条件に用いられる。いくつかの実施形態では、デバイス３５０は、新しいまたは滅菌されたカード３００に配置された新しい流体サンプルで再使用可能である。さらなる実施形態では、試験デバイス３５０は使い捨て可能であり、かつ一回使用のために設計されている。
【００３５】
試験デバイス３５０は、図２を参照して上記された導体パッド２３０に接続されるデータ取る装置、および／または信号処置などの、種々の電子部品を備えてもよい。このような電子部品は、微細構造の偏向データを受容および／または処理する。いくつかの実施形態では、この偏向データは、デバイス３５０内で処置され、血小板機能の出力値が生成される。このような出力データは、デバイス３５０上のディスプレイ３５２またはリモートディスプレイを介してユーザーに中継される。
【００３６】
図４は、本技術の実施形態による、生物学的サンプル中で血小板凝固を測定する方法４００を図示するブロック図である。ブロック４１０では、方法４００は、流体フローデバイス中に微細構造のブロック・アンド・ポストアレイを配置することを包含する。上記で考察されるとおり、いくつかの実施形態では、このブロックは、概して可撓性のポストに対して近位である概して剛直な構造を備える。いくつかの実施形態では、このポストは、磁気チップを備えてもよい。
【００３７】
ブロック４２０では、方法４００はさらに、微細構造を覆って流体を流すことを包含する。いくつかの実施形態では、この流体は、血液サンプルを備え、かついくつかの実施形態では、全血の約３μｌのサンプルである。流体を流す方法は、図１Ａを参照して上記で考察されるチャンバのような流体フローチャンバ中で達成される。いくつかの実施形態では、この流体は、なんらフラッシュ工程も洗浄工程もなしで導入されてもよい。ブロック４３０では、この方法４００は、ブロックとポストとの上部または間の空隙のような微細構造に血餅形成を誘導することを包含する。この工程は、少なくとも１つの微細構造の偏向を生じること、例えば、ブロックに向かうポスト偏向を生じることを包含する。この方法４００はさらに、微細構造の偏向を測定する４４０ことを包含する。いくつかの実施形態では、この偏向は、磁気検出アセブリを介して、例えば、磁場中の変化を測定するためのスピンバルブの使用を通じて測定される。
【００３８】
図５Ａ〜５Ｃは、３例の代表的な患者（血小板ドナー）において、本技術の実施形態によるマイクロポスト偏向が生じ始めるために必要なせん断活性を図示するグラフである。せん断活性の閾値レベルは、図１Ａを参照して上記の流体フローチャンバのような、流体フローチャンバ中のマイクロポストアレイ中でマイクロポスト偏向を生じるのに必要なせん断勾配を観察することによって決定される。示されるとおり、患者は、血小板収縮および対応する血餅形成に必要なせん断活性の可変レベルを有する。ある患者は、活性に関して低いせん断閾値を有するが、他の患者は高いせん断閾値を有した。例えば、図５Ａの患者由来の血小板は、２，０００ｌ／ｓでは不活性であるが、５，０００ｌ／ｓでは力を発揮し始める。図５Ｂでは、患者の血小板は、活性化するのに８，０００ｌ／ｓを要するが、図５Ｃにおける患者の血小板は、活性化するのに１２，０００ｌ／ｓを要した。このことは、集団のうち数例が、ｉｎ−ｖｉｖｏ（生体内）でせん断活性を受けやすいことを意味する。図６を参照して下に考察されるとおり、この特徴は、個別化した治療または処置を行う時に考慮される。これによって、抗血小板処置のため、または術後回復のような場合に、患者の血小板活性に関して医師に情報提供がされる。
【００３９】
図６は、本技術の実施形態による、患者のせん断活性閾値に応じて患者の処置を選択する方法６００を示したブロック図である。ブロック６１０では、この方法は、血液のサンプルのような流体サンプル中でせん断勾配を誘導することを包含する。このせん断勾配は、図１Ａを参照して上記のチャンバのような流体フローチャンバ中で導入される。ブロック６２０では、方法６００はさらに、血餅形成に必要なせん断活性の閾値レベルを決定することを包含する。この閾値レベルは、流体フローチャンバ中のマイクロポストアレイ中でマイクロポスト偏向を生じるのに必要なせん断勾配を観察することによって決定される。ブロック６３０では、方法６００は、せん断活性閾値レベルに基づいて患者の処置を選択することを包含する。例えば、動脈ステントを受けた低せん断閾値を有する患者は、その患者の血小板が容易に結合するので、再閉塞に対するチェックをより頻繁に行う必要がある場合がある。反対の実施例では、高いせん断閾値を有するヒトは、せん断活性に対する生来の抵抗により高用量の抗凝固薬を必要としない場合がある。従って、方法６００は、特定の患者状態について個別化した処置を提供する。
【００４０】
実施例
以下の実施例は、本発明の技術のいくつかの実施形態の例示である。
【００４１】
１．概して剛直なブロックおよび概して可撓性の構造を含んでいる微細構造のアレイと、
上記アレイを受容するようにサイズ決めされた少なくとも１つの流体チャネルであって、上記流体チャネルは、上記アレイを通じた生物学的サンプルの流体を誘導するように構成されており、
上記アレイ中の上記可撓性の構造の１つまたは複数の偏向の程度を検出するための手段
とを備えることを特徴とする流体デバイス。
【００４２】
２．上記アレイが、上記概して剛直なブロックおよび上記概して可撓性の構造の対を含むことを特徴とする実施例１のデバイス。
【００４３】
３．上記微細構造が、シリコン、ポリマー、金属、またはセラミックスの少なくとも１つからなることを特徴とする実施例１のデバイス。
【００４４】
４．検出のための上記手段が、光学的検出構成要素または磁気検出構成要素の少なくとも１つを備えることを特徴とする実施例１のデバイス。
【００４５】
５．上記磁気検出構成要素が、スピンバルブ、Ｈａｌｌプローブ、またはフラックスゲート磁力計のうちの１つであることを特徴とする実施例４のデバイス。
【００４６】
６．個々の概して可撓性の構造が、磁性材料を備えることを特徴とする実施例４のデバイス。
【００４７】
７．上記磁気検出構成要素が、個々のブロックと概して可撓性の構造との間に位置し、かつ上記磁性材料を含む上記概して可撓性の構造の偏向によって生じる上記アレイ中の磁場における変化を検出するように構成された、スピンバルブを備えることを特徴とする実施例６のデバイス。
【００４８】
８．上記光学的検出構成要素が、位相差顕微鏡、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、またはフォトダイオードのうちの１つであることを特徴とする実施例４のデバイス。
【００４９】
９．上記生物学的サンプルが、全血、血漿、血漿タンパク質、血液または他の生体液中にあるタンパク質、血小板、内皮細胞、循環腫瘍細胞、癌細胞、繊維芽細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、赤血球、白血球、細菌、巨核球細胞、またはそれらの断片のうちの少なくとも１つを含むことを特徴とする実施例１のデバイス。
【００５０】
１０．上記微細構造のうちの少なくともいくつかが、タンパク質、酵素、生理活性ミネラル、グリカン、ポリグリカン、糖タンパク質、コラーゲン、フォンヴィレブランド因子、ビトロネクチン、ラミニン、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、プラスミン、アゴニスト、マトリックスタンパク質、アクチン−ミオシン活性のインヒビターおよびそれらの断片からなる群より選択される少なくとも１つの結合因子で少なくとも部分的にコーティングされることを特徴とする実施例１のデバイス。
【００５１】
１１．上記流体デバイスが、手持ちサイズのデバイスを含むことを特徴とする実施例１のデバイス。
【００５２】
１２．上記１つまたは複数の概して可撓性の構造の偏向の上記程度に基づいて上記生物学的サンプルの特徴を示すように構成されたディスプレイをさらに備えたことを特徴とする実施例１のデバイス。
【００５３】
１３． 一対の微細構造が流体フローチャンバ中に配置され、
上記対が、概して可撓性の構造に対して近位の概して剛直なブロックを備えていること、
上記微細構造を覆って流体を流すこと、
上記概して可撓性の構造の偏向を測定すること、
とを備えたことを特徴とする分析方法。
【００５４】
１４．上記対の微細構造を上記流体フローチャンバ中に配置することが、酵素、ミネラル、フォンヴィレブランド因子、タンパク質、グリカン、ポリグリカン、糖タンパク質、コラーゲン、ビトロネクチン、ラミニン、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、プラスミン、アゴニスト、マトリックスタンパク質、アクチン−ミオシン活性のインヒビターおよびそれらの断片のうちの少なくとも１つで少なくとも部分的にコーティングされた微細構造を配置することを含むことを特徴とする実施例１３の方法。
【００５５】
１５．上記微細構造を覆って流体を流すことが、上記微細構造を覆って生体液を流すことを含むことを特徴とする実施例１３の方法。
【００５６】
１６．上記微細構造を覆って上記生体液を流すことが、血漿タンパク質、ミネラル、フォンヴィレブランド因子、タンパク質、グリカン、ポリグリカン、糖タンパク質、コラーゲン、ビトロネクチン、ラミニン、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、プラスミン、アゴニスト、マトリックスタンパク質、アクチン−ミオシン活性のインヒビターまたはそれらの断片のうちの少なくとも１つを含んでいる生体液を流すことを含むことを特徴とする実施例１５の方法。
【００５７】
１７．上記概して可撓性の構造の偏向を測定することが、上記概して可撓性の構造の偏向を測定するために光学的検出構成要素を用いることを含むことを特徴とする実施例１３の方法。
【００５８】
１８．上記概して可撓性の構造の偏向を測定することが、上記概して可撓性の構造の偏向を測定するために磁気検出構成要素を用いること含むことを特徴とする実施例１３の方法。
【００５９】
１９．上記磁気検出構成要素を用いることが、上記概して可撓性の構造の偏向によって生じる磁場の変化を測定するために、スピンバルブ、Ｈａｌｌプローブ、またはフラックスゲート磁力計のうちの１つまたは複数を用いることを含むことを特徴とする実施例１８の方法。
【００６０】
２０．上記対の微細構造を、上記流体フローチャンバ中に配置することが、上記概して剛直なブロックを、上記概して可撓性の構造に対して上流の位置に配置することを含むことを特徴とする実施例１３の方法。
【００６１】
２１．血餅形成を誘導することをさらに含むことを特徴とする実施例１３の方法。
【００６２】
２２．流体チャンバを通じて流れる生体液サンプル中でせん断勾配を誘導し、上記流体チャンバには複数の微細構造が含まれていること、
少なくとも１つの微細構造上で上記生物学的サンプルの血餅形成に必要なせん断活性の閾値レベルを決定すること、
上記せん断活性閾値レベルに基づいて上記患者の処置を選択すること、
とを含むことを特徴とする患者処置を選択する方法。
【００６３】
２３．上記生体液サンプル中でせん断勾配を誘導することが、上記生体液サンプルのインヒビター、アンタゴニスト、またはアゴニストを含んでいる生体液サンプル中でせん断勾配を誘導することを含むことを特徴とする実施例２２の方法。
【００６４】
２４．上記患者についての処置を選択することが、上記せん断活性閾値レベルに基づいて、凝固誘導薬または抗凝固薬の用量を選択することを含むことを特徴とする実施例２２の方法。
【００６５】
２５．上記生体液サンプル中のせん断勾配を誘導することが、全血、血漿、血漿タンパク質、血小板、内皮細胞、循環腫瘍細胞、癌細胞、繊維芽細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、赤血球、白血球、細菌、巨核球細胞、またはそれらの断片のサンプル中でせん断勾配を誘導することを含むことを特徴とする実施例２２の方法。
【００６６】
２６．上記流体チャンバを通じて流れる上記生体液サンプル中でせん断勾配を誘導することが、概して可撓性の構造に対して近位の概して剛直なブロックを備えている微細構造のアレイを有する流体チャンバを通じて流れる流体サンプル中でせん断勾配を誘導することを含むことを特徴とする実施例２２の方法。
【００６７】
２７．せん断活性の上記閾値レベルを決定することが、上記微細構造の偏向を測定することを含むことを特徴とする実施例２２の方法。
【００６８】
本明細書に開示される技術は、既存のシステムを上回るいくつかの利点を提供する。例えば、本明細書に開示されるデバイスは、救急のポイント・オブ・ケアの状況において血小板機能を迅速かつ正確に検出する。このデバイスは携行可能で、充電池で駆動可能であり、かつ起動までに要する時間をほとんどまたは全く必要としない。必要なサンプルはほんの２〜３マイクロリットルだけであり、かつ５分未満で試験できる。さらに、このデバイスは、機械的に機能不全する可動部分はなく、振動もなく、遠心分離も必要がなく、比較的単純である。さらにこのような単純なデバイスは、比較的安価に製造可能である。
【００６９】
前述から、本技術の特定の実施形態は、例示の目的のために本明細書で記載されているが、種々の改変が、本技術の趣旨および範囲から逸脱することなくなされることが理解される。さらに、特定の実施形態の状況で記載される新規な技術の特定の態様は、他の実施形態において組み合わされてもよいし、排除されてもよい。さらに、本技術の特定の実施形態に関連する利点は、これらの実施形態の状況に記載されているが、他の実施形態もこのような利点を示してもよく、かつ全ての実施形態が、このような利点を本技術の範囲内におさまると示す必要は必ずしもない。従って、本開示および関連の技術は、本明細書に明示的に示されていない、あるいは記載されていない他の実施形態を包含する。このように、本開示は、添付の特許請求の範囲によるもの以外には限定されることはない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2015516088.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2015516088.tif 000010
【国際調査報告】
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2015516088.tif 000012
2015516088.tif 000013
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