(57)【要約】  イヌIgG免疫グロブリン重鎖のFc領域と結合した、イヌTNFレセプターp60又はp80ポリペプチドの細胞外ドメインを含むキメラ融合ポリペプチドが提供される。該キメラ融合ポリペプチドは、TNF発現によって媒介されるイヌの症状の治療又は予防で用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
イヌIgG免疫グロブリン重鎖のFc領域又はそのフラグメントを含むポリペプチドと結合された、イヌTNFレセプターポリペプチドの細胞外ドメイン又は該細胞外ドメインのTNF結合フラグメント、を含むキメラ融合ポリペプチドであって、該Fc領域のフラグメントが少なくともCH2及びCH3定常ドメインを含む、前記キメラ融合ポリペプチド。
【請求項２】
イヌTNFレセプターポリペプチドが、イヌTNFレセプターポリペプチドp80又はそのTNF結合フラグメントを含む、請求項1に記載のキメラ融合ポリペプチド。
【請求項３】
イヌTNFレセプターポリペプチドが、配列番号：14又は前記配列と少なくとも95％の配列同一性を有する配列を含む、請求項2に記載のキメラ融合ポリペプチド。
【請求項４】
イヌTNFレセプターポリペプチドが、イヌTNFレセプターポリペプチドp60又はそのTNF結合フラグメントを含む、請求項1に記載のキメラ融合ポリペプチド。
【請求項５】
イヌTNFレセプターポリペプチドが、配列番号：1又は前記配列と少なくとも95％の配列同一性を有する配列を含む、請求項4に記載のキメラ融合ポリペプチド。
【請求項６】
Fc領域が、ヒンジ領域、CH2定常ドメイン及びCH3定常ドメインを含む、請求項1から5のいずれか1項に記載のキメラ融合ポリペプチド。
【請求項７】
Fc領域が、サブタイプA、サブタイプB、サブタイプC及びサブタイプDから成る群から選択されるIgGサブタイプを含む、請求項1から6のいずれか1項に記載のキメラ融合ポリペプチド。
【請求項８】
Fc領域が、配列番号：2、配列番号：3、配列番号：4及び配列番号：5から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項7に記載のキメラ融合ポリペプチド。
【請求項９】
キメラ融合ポリペプチドが、イヌTNFレセプターポリペプチドとFc領域を含む該ポリペプチドとの間に機能的に差し挟まれたリンカーペプチドを含む、請求項1から8のいずれかに記載のキメラ融合ポリペプチド。
【請求項１０】
キメラ融合ポリペプチドが、配列番号：6、配列番号：7、配列番号：8、配列番号：9及び前述のもののいずれかと少なくとも90％の配列相同性を有する配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項5に記載のキメラ融合ポリペプチド。
【請求項１１】
キメラ融合ポリペプチドが、配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13及び前述のもののいずれかと少なくとも90％の配列相同性を有する配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項5に記載のキメラ融合ポリペプチド。
【請求項１２】
該キメラ融合ポリペプチドが、配列番号：15、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18及び前述のもののいずれかと少なくとも90％の配列相同性を有する配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項3に記載のキメラ融合ポリペプチド。
【請求項１３】
キメラ融合ポリペプチドが、配列番号：19、配列番号：20、配列番号：21、配列番号：22及び前述のもののいずれかと少なくとも90％の配列相同性を有する配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項3に記載のキメラ融合ポリペプチド。
【請求項１４】
キメラ融合ポリペプチドが、1ｘ10-8以下の平衡解離定数（KD）を有する結合親和性でイヌTNF-アルファと結合する、請求項1から13のいずれかに記載のキメラ融合ポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号：14又は前記配列と少なくとも95％の配列相同性を有する配列を含む、単離ポリペプチド。
【請求項１６】
請求項15に記載のポリペプチドをコードする、単離ポリヌクレオチド。
【請求項１７】
配列番号：6、配列番号：7、配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13、配列番号：15、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19、配列番号：20、配列番号：21、配列番号：22及び前述のもののいずれかと少なくとも90％の配列相同性を有する配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むキメラ融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項17に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項１９】
発現プロモーターに隣接しかつ前記の制御下に配置されているか、又は発現プロモーターに機能できるように連結されている、請求項18に記載の組換えベクター。
【請求項２０】
請求項1から14のいずれか1項に記載のキメラ融合ポリペプチド又は請求項17に記載のポリヌクレオチド及び医薬的に許容できる担体又は賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項２１】
配列番号：6、配列番号：7、配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13、配列番号：15、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19、配列番号：20、配列番号：21、配列番号：22及び前述のもののいずれかと少なくとも90％の配列相同性を有する配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するキメラ融合ポリペプチド及び医薬的に許容できる担体又は賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項２２】
少なくとも1つのさらに別のTNFアンタゴニスト化合物及び／又は抗炎症化合物をさらに含む、請求項20又は21に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
TNFアンタゴニスト化合物がメトトレキセートである、請求項22に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
医薬として使用される、請求項1から14のいずれかに記載のキメラ融合ポリペプチド、請求項17に記載のポリヌクレオチド、又は請求項18若しくは19に記載のベクター、又は、請求項20から23のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
TNF発現によって媒介されるイヌの症状の治療又は予防で使用される、請求項1から14のいずれかに記載のキメラ融合ポリペプチド、請求項17に記載のポリヌクレオチド、請求項18又は19に記載のベクター、又は請求項20から23のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
請求項25に記載したように使用される請求項25に記載のキメラ融合ポリペプチドであって、TNF発現により媒介される症状が、炎症媒介症状、慢性炎症性疾患、関節炎、例えば免疫媒介多発性関節炎、慢性関節リウマチ、変形性関節症、多発性関節炎疹、若年性特発性関節炎及び乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、全身性血管炎、アトピー性皮膚炎、うっ血性心不全、難治性ブドウ膜炎、気管支ぜんそく、アレルギー性症状、敗血症、ショック、真性糖尿病、並びに神経変性症状、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、卒中及び筋委縮性側索硬化症から成る群から選択される、前記キメラ融合ポリペプチド。
【請求項２７】
TNF発現によって媒介されるイヌの症状の治療又は予防のための医薬の調製における、請求項1から14のいずれかに記載のキメラ融合ポリペプチド、請求項17に記載のポリヌクレオチド、請求項18又は19に記載のベクター、又は請求項20から23のいずれか1項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２８】
TNF発現により媒介される症状が、炎症媒介症状、慢性炎症性疾患、関節炎、例えば免疫媒介多発性関節炎、慢性関節リウマチ、変形性関節症、多発性関節炎疹、若年性特発性関節炎及び乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、全身性血管炎、アトピー性皮膚炎、うっ血性心不全、難治性ブドウ膜炎、気管支ぜんそく、アレルギー性症状、敗血症、ショック、真性糖尿病、並びに神経変性症状、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、卒中及び筋委縮性側索硬化症から成る群から選択される、請求項27に記載の使用。
【請求項２９】
TNF発現により媒介される症状をその必要があるイヌで治療又は予防する方法であって、請求項1から14のいずれかに記載のキメラ融合ポリペプチド、請求項17に記載のポリヌクレオチド、請求項18又は19に記載のベクター、又は請求項20から23のいずれか1項に記載の医薬組成物を該イヌに投与する工程を含む、前記方法。
【請求項３０】
TNF発現により媒介される症状が、炎症媒介症状、慢性炎症性疾患、関節炎、例えば免疫媒介多発性関節炎、慢性関節リウマチ、変形性関節症、多発性関節炎疹、若年性特発性関節炎及び乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、全身性血管炎、アトピー性皮膚炎、うっ血性心不全、難治性ブドウ膜炎、気管支ぜんそく、アレルギー性症状、敗血症、ショック、真性糖尿病、並びに神経変性症状、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、卒中及び筋委縮性側索硬化症から成る群から選択される、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも1つの追加の医薬組成物を投与する工程をさらに含む、請求項29又は請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
追加の医薬組成物が、TNFアンタゴニスト、抗炎症性化合物、メトトレキセート、イヌTNFに対するキメラ又はイヌ化抗体、抗イヌTNF抗体フラグメント、少なくとも1つの鎮痛剤、サイトカイン抑制性抗炎症薬である化合物、NSAID、オピオイド、コルチコステロイド、ステロイド、及び神経成長因子のアンタゴニストから成る群から選択される医薬を含む、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
医薬として使用される、配列番号：6、配列番号：7、配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13、配列番号：15、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19、配列番号：20、配列番号：21、配列番号：22及び前述のもののいずれかと少なくとも90％の配列相同性を有する配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するキメラ融合ポリペプチド、又は前記アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３４】
TNF発現によって媒介されるイヌの症状の治療又は予防で使用される、配列番号：6、配列番号：7、配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13、配列番号：15、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19、配列番号：20、配列番号：21、配列番号：22及び前述のもののいずれかと少なくとも90％の配列相同性を有する配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するキメラ融合ポリペプチド、又は前記アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３５】
TNF発現により媒介される症状が、炎症媒介症状、慢性炎症性疾患、関節炎、例えば免疫媒介多発性関節炎、慢性関節リウマチ、変形性関節症、多発性関節炎疹、若年性特発性関節炎及び乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、全身性血管炎、アトピー性皮膚炎、うっ血性心不全、難治性ブドウ膜炎、気管支ぜんそく、アレルギー性症状、敗血症、ショック、真性糖尿病、並びに神経変性症状、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、卒中及び筋委縮性側索硬化症から成る群から選択される、請求項34に記載したように使用される請求項34に記載のキメラ融合ポリペプチド。
【請求項３６】
TNF発現によって媒介されるイヌの症状の治療及び／又は予防のための医薬の調製における、配列番号：6、配列番号：7、配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13、配列番号：15、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19、配列番号：20、配列番号：21、配列番号：22及び前述のもののいずれかと少なくとも90％の配列相同性を有する配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するキメラ融合ポリペプチド、又は前記アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの使用。
【請求項３７】
TNF発現により媒介される症状が、炎症媒介症状、慢性炎症性疾患、関節炎、例えば免疫媒介多発性関節炎、慢性関節リウマチ、変形性関節症、多発性関節炎疹、若年性特発性関節炎及び乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、全身性血管炎、アトピー性皮膚炎、うっ血性心不全、難治性ブドウ膜炎、気管支ぜんそく、アレルギー性症状、敗血症、ショック、真性糖尿病、並びに神経変性症状、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、卒中及び筋委縮性側索硬化症から成る群から選択される、請求項36に記載のキメラ融合ポリペプチドの使用。
【請求項３８】
TNF発現により媒介される症状をその必要があるイヌで治療又は予防する方法であって、前記方法が、配列番号：6、配列番号：7、配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13、配列番号：15、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19、配列番号：20、配列番号：21、配列番号：22及び前述のもののいずれかと少なくとも90％の配列相同性を有する配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するキメラ融合ポリペプチド、又は前記アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを、治療的に有効な量で該イヌに投与する工程を含む、前記方法。
【請求項３９】
TNF発現により媒介される症状が、炎症媒介症状、慢性炎症性疾患、関節炎、例えば免疫媒介多発性関節炎、慢性関節リウマチ、変形性関節症、多発性関節炎疹、若年性特発性関節炎及び乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、全身性血管炎、アトピー性皮膚炎、うっ血性心不全、難治性ブドウ膜炎、気管支ぜんそく、アレルギー性症状、敗血症、ショック、真性糖尿病、並びに神経変性症状、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、卒中及び筋委縮性側索硬化症から成る群から選択される、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
少なくとも1つの追加の医薬組成物を投与する工程をさらに含む、請求項38又は請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
追加の医薬組成物が、TNFアンタゴニスト、抗炎症性化合物、メトトレキセート、イヌTNFに対するキメラ又はイヌ化抗体、抗イヌTNF抗体フラグメント、少なくとも1つの鎮痛剤、サイトカイン抑制性抗炎症薬である化合物、NSAID、オピオイド、コルチコステロイド、ステロイド、及び神経成長因子のアンタゴニストから成る群から選択される医薬を含む、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
腫瘍壊死因子レベルをその必要があるイヌで低下させる方法であって、配列番号：6、配列番号：7、配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13、配列番号：15、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19、配列番号：20、配列番号：21、配列番号：22及び前述のもののいずれかと少なくとも90％の配列相同性を有する配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するキメラ融合ポリペプチド、又は前記アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを、治療的に有効な量でイヌに投与する工程を含む、前記方法。
【請求項４３】
少なくとも1つの追加の医薬組成物を投与する工程をさらに含む、請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
追加の医薬組成物が、TNFアンタゴニスト、抗炎症性化合物、メトトレキセート、イヌTNFに対するキメラ又はイヌ化抗体、抗イヌTNF抗体フラグメント、少なくとも1つの鎮痛剤、サイトカイン抑制性抗炎症薬である化合物、NSAID、オピオイド、コルチコステロイド、ステロイド、及び神経成長因子のアンタゴニストから成る群から選択される医薬を含む、請求項43に記載の方法。
【請求項４５】
請求項1から14のいずれか1項に記載のキメラ融合ポリペプチドを製造する方法であって、
（i）請求項1から14のいずれか1項に記載のキメラ融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現することができるベクターを含む組換え宿主細胞を提供する工程；
（ii）該キメラ融合ポリペプチドの発現に適切な条件下で該組換え宿主細胞を培養する工程；及び
（iii）該キメラ融合ポリペプチドを回収する工程を含む、前記方法。
【請求項４６】
イヌIgG免疫グロブリンB型重鎖のFc領域又は少なくともCH2及びCH3定常ドメインを含む前記のフラグメントを含むポリペプチドと結合された、イヌTNFレセプターポリペプチドの細胞外ドメイン又は該細胞外ドメインのTNF結合フラグメントを含むキメラ融合ポリペプチドのダイマー型を精製する方法であって、該キメラ融合ポリペプチドのダイマー型をpH4.7から5.3でプロテインAから溶出させる工程を含む、前記方法。
【請求項４７】
キメラ融合ポリペプチドのダイマー型がpH4.8から5.2でプロテインAから溶出される、請求項46に記載の方法。
【請求項４８】
キメラ融合ポリペプチドのダイマー型がpH4.9から5.1でプロテインAから溶出される、請求項47に記載の方法。
【請求項４９】
キメラ融合ポリペプチドのダイマー型がpH5.0でプロテインAから溶出される、請求項48に記載の方法。
【請求項５０】
イヌTNFレセプターポリペプチドが、イヌTNFレセプターポリペプチドp80又はそのTNF結合フラグメントを含む、請求項46から49のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５１】
イヌTNFレセプターポリペプチドが、配列番号：14又は前記配列と少なくとも95％の配列同一性を有する配列を含む、請求項50に記載の方法。
【請求項５２】
イヌTNFレセプターポリペプチドが、イヌTNFレセプターポリペプチドp60又はそのTNF結合フラグメントを含む、請求項46から49のいずれか1項に記載のキメラ融合ポリペプチド。
【請求項５３】
イヌTNFレセプターポリペプチドが、配列番号：1又は前記配列と少なくとも95％の配列同一性を有する配列を含む、請求項52に記載のキメラ融合ポリペプチド。
【請求項５４】
Fc領域が配列番号：3を含む、請求項46から53のいずれか1項に記載のキメラ融合ポリペプチド。
【請求項５５】
キメラ融合ポリペプチドが、配列番号：7、配列番号：11、配列番号：16、配列番号：20及び前記配列のいずれかと少なくとも90％の配列相同性を有するポリペプチド配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項46から54のいずれか1項に記載のキメラ融合ポリペプチド。
【請求項５６】
キメラ融合ポリペプチドが、配列番号：7又は前記配列と少なくとも90％の配列相同性を有するポリペプチド配列を含む、請求項55に記載のキメラ融合ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イヌ腫瘍壊死因子レセプターポリペプチドの細胞外リガンド結合部分及びイヌ免疫グロブリンFcドメインポリペプチドを含むキメラ融合ポリペプチド（結合してダイマー型融合タンパク質を形成する）に関する。本発明はさらに、それらをコードするポリヌクレオチド、該キメラ融合ポリペプチドの製造方法、及び炎症性疾患（特にTNF関連疾患）の治療及び予防におけるそれらの使用に及ぶ。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）及び腫瘍壊死因子ベータ（TNF-β）は、機能の顕著なオーバーラップを示す。この相同関係の結果、これらのサイトカインは腫瘍壊死因子（TNF）と総称されることとなった。TNFは、前炎症性免疫応答の媒介に強力な多面的役割を示し、さらにまた細胞増殖、分化及びアポトーシスの制御に必要であることが示された。TNFは、I及びII型TNFレセプター（TNFR）と結合することによってこれらの作用を媒介する（前記レセプターはTNF応答細胞で発現される細胞表面レセプターである）。
TNFアンタゴニスト（例えば抗TNF抗体、可溶性TNFレセプタータンパク質及びTNFレセプター融合タンパク質）の使用は、TNFによって媒介される前炎症性作用（例えば前炎症性サイトカイン発現（IL-1、IL-8）及び組織破壊の誘発）が逆転可能であることを示した。さらにまた、組換えTNFR-Fc融合タンパク質（例えばENBREL（エタネルセプト（Etanercept）、Immunex）の使用は、TNFアンタゴニストを用いてTNF関連症状、特に慢性関節リウマチを治療できることを示した。
したがって、腫瘍壊死因子レセプター(TNFR)-免疫グロブリンFcドメイン融合タンパク質又は抗TNF中和モノクローナル抗体は、多様なヒト炎症性疾患（慢性関節リウマチ及び乾癬性関節炎を含む）の治療のための優れた治療アプローチであることが証明された。
【０００３】
コンパニオン動物（例えばイヌ）は、人間で発生する炎症性疾患に類似する疾患、例えば慢性関節リウマチ（RA）、変形性関節症、免疫媒介多発性関節炎疹、血漿性リンパ球性滑膜炎、全身性エリテマトーデス（SLE）、血管炎、及び多様な自己免疫皮膚疾患を生じる。USAでは5匹の成犬のうち1匹が関節炎を有すると概算され、イヌは人間の関節疾患（例えば変形性関節症、前十字靱帯破壊、及び半月板損傷）のモデルとして用いられてきた。
イヌの炎症発生におけるTNFの役割は詳細に記されてきた。例えば、後膝関節の関節炎を示すイヌの滑液の細胞浸潤物にはTNFアルファの分泌増加があることが観察され、さらに広範囲の炎症性応答の部分として緑内障を示すイヌの中心部及び辺縁部網膜ではII型TNFレセプターが顕著に上昇することが示された。ヒトTNFR-Fc融合タンパク質エタネルセプト（huTNFR-Fc（Immunex）、TNFアンタゴニスト）によるイヌの治療は、人間の心臓疾患の閉鎖胸部モデルでバルーン閉鎖によって誘発される虚血再灌流後の心筋損傷を約25−40％減少させ、関連する炎症性マーカー（例えばICAM-1及びNF-kB）の同時低下を示した。同様に、2mg/kgのTNFR-Fcを用いたとき、虚血再灌流の開放イヌ胸部モデルでは梗塞サイズの60％減少もまた示された。しかしながら、イヌの疾患治療のための治療薬としてのhuTNFR-Fcの使用は、イヌに注射したときのヒトタンパク質の免疫原性のために人間の疾患のこのモデル以外には指定されない。さらにまた、エタネルセプトのIgG Fcドメインは補体動員性であり、したがって媒介される免疫応答のために炎症性疾患との関係では望ましくない。
【０００４】
抗TNFモノクローナル抗体を用いたとき、リポ多糖類（LPS）処理イヌPBMCの上清で捕捉ELISAによって低レベルのTNFが検出され、さらにTNFアルファ発現もまた、イヌの血管周囲細胞腫、トリコブラストーマ、脂肪腫及び肥満細胞腫の皮膚サンプルで報告された。TNF-アルファ及びTNFレセプターが変形性関節症誘発モデルの関節軟骨に存在し、一方、アダリムマブ（TNFに対するヒト化モノクローナル抗体）が、表皮剥離性皮膚紅斑性狼瘡（ECLE）を示す2匹のイヌで試験されたが（0.5mg/kgを2週間毎に8週間）、疾患の進行に変化がないことが示され、血清TNF-アルファも変化がなかった。アダリムマブに対する免疫原性はこれらの反復投与実験で有効性の欠如をもたらした可能性があろう。特に、アダリムマブに対して生じ得る中和抗体は反復投与を妨げ、したがってそのような治療アプローチのより長期の有効性を制限しよう。
したがって、イヌの広範囲の炎症媒介症状でTNFは中心的に関与するので、イヌのTNF関連疾患及び炎症症状を治療するために、TNFの長期阻害に用いることができるイヌTNF阻害剤が希求される。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の第一の特徴にしたがえば、イヌIgG免疫グロブリン重鎖のFc領域又はそのフラグメント（該フラグメントは少なくともCH2及びCH3定常ドメインを含む）を含むか、前記Fc領域又はそのフラグメントから成るか又は本質的に前記Fc領域又はそのフラグメントから成るポリペプチドに結合された、イヌTNFレセプターポリペプチドの細胞外ドメイン又はそのTNF結合フラグメント、を含むか、前記から成るか又は本質的に前記から成るキメラ融合ポリペプチドが提供される。
典型的には、該キメラ融合ポリペプチドは特異的にイヌTNFと結合する。典型的には、該キメラ融合ポリペプチドはイヌTNFの生物学的活性を中和する。ある種の実施態様では、TNFはTNF-α及び／又はTNF-βを指す。該キメラ融合タンパク質は安定性及びin vivo半減期の改善を示す。さらにまた、該キメラ融合ポリペプチドは、これまでに知られている抗TNF化合物をイヌに投与することに付随する問題を、もっとも具体的には、イヌに投与した時の前記ポリペプチドに対する中和抗体（特に異種抗体）の生成の制限によって克服する。
典型的には、イヌTNFレセプターポリペプチドの細胞外ドメインは、イヌ腫瘍壊死因子レセプターの切端形を含むか前記切端形から成るか又は本質的に前記切端形から成り、前記切端形は膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインの両方を欠く。典型的には、細胞外ドメイン又はそのフラグメントは、イヌTNFレセプターポリペプチドのリガンド結合部分を含み、TNFと結合する。ある種の実施態様では、該キメラ融合ポリペプチドは、イヌTNFレセプターポリペプチドの細胞外ドメインとつながれたシグナル配列を含む。典型的には、該細胞外ドメイン又はそのフラグメントはイヌTNFの生物学的活性を相殺する。
【０００６】
ある種の実施態様では、該イヌTNFレセプターポリペプチドはイヌTNFレセプターポリペプチドp60（caTNFR p60）である。ある種の実施態様では、したがって該細胞外ドメインは、イヌTNFレセプターのp60可溶型の細胞外ドメインを含むか、イヌTNFレセプターのp60可溶型の細胞外ドメインから成るか、又は本質的にイヌTNFレセプターのp60可溶型の細胞外ドメインから成る。ある種の実施態様では、該細胞外ドメインは細胞外ドメインにつながれたシグナル配列を含む。ある種の実施態様では、caTNF p60ペプチドのフラグメント、特に細胞外ドメインのTNF結合部分を用いることができる。ある種の実施態様では、該イヌTNFレセプターポリペプチドは、配列番号：1（配列番号：23によってコードされる）又は前記配列と少なくとも80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％又は99％の配列同一性を有する配列（前記配列はイヌTNFと結合する）のアミノ酸を含むか、前記配列から成るか、又は本質的に前記配列から成る。典型的には、前記配列はイヌTNFの生物学的活性を相殺する。
【０００７】
ある種のさらに別の実施態様では、イヌTNFレセプターポリペプチドはイヌTNFレセプターポリペプチドp80（caTNFR p80）である。ある種の実施態様では、したがって該細胞外ドメインは、caTNFR p80の細胞外ドメインを含むか、caTNFR p80の細胞外ドメインから成るか、又は本質的にcaTNFR p80の細胞外ドメインから成る。ある種の実施態様では、該細胞外ドメインは細胞外ドメインにつながれたシグナル配列を含む。ある種の実施態様では、caTNF p80ペプチドのフラグメント、特に細胞外ドメインのTNF結合部分を用いることができる。ある種の実施態様では、該イヌTNFレセプターポリペプチドは、配列番号：14又は前記配列と少なくとも80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％又は99％の配列同一性を有する配列（前記配列はイヌTNFと結合する）のアミノ酸を含むか、前記配列から成るか、又は本質的に前記配列から成る。典型的には、前記配列はイヌTNFの生物学的活性を相殺する。
典型的には、該イヌTNFレセプターポリペプチドの細胞外ドメインのフラグメントはイヌTNFと特異的に結合する。典型的には、該フラグメントはイヌTNFの生物学的活性を相殺する。
【０００８】
典型的には、イヌIgG免疫グロブリン重鎖のFc領域又はそのフラグメントを含むか、前記Fc領域又はそのフラグメントから成るか、又は本質的に前記Fc領域又はそのフラグメントから成るポリペプチドは、該イヌIgG免疫グロブリン重鎖の少なくともCH2及びCH3定常ドメインを含むか、前記定常ドメインから成るか、又は本質的に前記定常ドメインから成る。ある種の実施態様では、ヒンジ領域又はそのフラグメントもまた提供される。ある種の実施態様では、イヌIgG免疫グロブリン重鎖由来のFc領域はIgGサブタイプA（例えばcaHCA、配列番号：2）、IgGサブタイプB（例えばcaHCB、配列番号：3）、IgGサブタイプC（例えばcaHCC、配列番号：4）若しくはIgGサブタイプD（例えばcaHCD、配列番号：5）、又はそのフラグメントである。ある種の実施態様では、該Fc領域は、配列番号：2（配列番号：24によってコードされる）、配列番号：3（配列番号：25によってコードされる）、配列番号：4（配列番号：26によってコードされる）、配列番号：5（配列番号：27によってコードされる）、及び前述のもののいずれかと少なくとも90、95、96、97、98若しくは99％の配列相同性を有する配列、又は前記のフラグメントから成る群から選択されるアミノ酸配列を含むか、前記配列から成るか、又は本質的に前記配列から成る。典型的には、該Fc領域若しくはそのフラグメント又はそれらと相同性を有する配列は、安定性が改善された、及びin vivo半減期が改善されたイヌTNFレセプターポリペプチドを提供する。
【０００９】
イヌTNFレセプターポリペプチドの細胞外ドメイン又はそのフラグメントは、イヌIgG免疫グロブリン重鎖のFc領域又はそのフラグメントを含むポリペプチドと共有結合の態様によって結合され得る。ある種の実施態様では、リンカー、例えばポリペプチドリンカーを用いて、イヌTNFR細胞外ドメインポリペプチド及びイヌFcドメインポリペプチド又はそのフラグメントが共有結合されて、キメラ融合ポリペプチドが形成される（融合タンパク質又は免疫複合物としても知られる）。リンカーが用いられる場合、イヌ由来免疫グロブリン成分のFcドメインのヒンジドメインによって付与される構造的可撓性のゆえに、リンカー領域は典型的には要求されないが、このリンカーは少なくとも1つの切断部位を含むことができる。したがって、ある種の実施態様では、キメラ融合ポリペプチドはさらに、イヌTNFレセプターポリペプチドとイヌIgG Fcドメインポリペプチドとの間に機能的に差し挟まれたリンカーペプチドを含む。
【００１０】
ある種の実施態様では、該キメラ融合ポリペプチドは、配列番号：6（配列番号：28によってコードされる）、配列番号：7（配列番号：29によってコードされる）、配列番号：8（配列番号：30によってコードされる）、配列番号：9（配列番号：31によってコードされる）、及び前述のもののいずれかと少なくとも90、95、96、97、98又は99％の配列相同性を有する配列（前記相同な配列はイヌTNFと結合する）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むか、前記配列から成るか、又は本質的に前記配列から成る。典型的には、前記相同な配列はイヌTNFの生物学的活性を相殺する。
ある種の実施態様では、該キメラ融合ポリペプチドは、配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13及び前述のもののいずれかと少なくとも90、95、96、97、98又は99％の配列相同性を有する配列（前記相同な配列はイヌTNFと結合する）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むか、前記配列から成るか、又は本質的に前記配列から成る。典型的には、前記相同な配列はイヌTNFの生物学的活性を相殺する。
ある種の実施態様では、該キメラ融合ポリペプチドは、配列番号：15、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18及び前述のもののいずれかと少なくとも90、95、96、97、98又は99％の配列相同性を有する配列（前記相同な配列はイヌTNFと結合する）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むか、前記配列から成るか、又は本質的に前記配列から成る。典型的には、前記相同な配列はイヌTNFの生物学的活性を相殺する。
ある種の実施態様では、該キメラ融合ポリペプチドは、配列番号：19、配列番号：20、配列番号：21、配列番号：22及び前述のもののいずれかと少なくとも90、95、96、97、98又は99％の配列相同性を有する配列（前記相同な配列はイヌTNFと結合する）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むか、前記配列から成るか、又は本質的に前記配列から成る。典型的には、前記相同な配列はイヌTNFの生物学的活性を相殺する。
【００１１】
ある種のさらに別の実施態様では、本発明のキメラ融合ポリペプチドは、1ｘ10-8以下の平衡解離定数（KD）を有する結合親和性でイヌTNF-アルファと特異的に結合する。さらにまた、本発明のキメラ融合ポリペプチドに対する異種抗体（中和抗体とも称される）は、イヌ対象動物への投与後に生成されないことが好ましい。さらにまた、キメラ融合ポリペプチドのFcドメイン部分は、いずれの下流エフェクター機能（補体の動員、固定及び活性化、ADCC並びにFcレセプター結合及び活性化を含むが、ただしこれらに限定されない）も媒介しないことが好ましい。該イヌIgG Fcドメインポリペプチドのアミノ酸配列に変異、置換及び付加を導入して、Fc媒介下流エフェクター機能が生じないように担保することができる。さらにまた、下流エフェクター機能を媒介しないそれらの望ましい特性を基準に、イヌIgG重鎖の特定のサブタイプに由来するイヌIgG Fcドメインポリペプチドを選択することができる。
ある種の実施態様では、本発明のキメラ融合ポリペプチドのFcドメインのアミノ酸残基のアミノ酸配列に対する改変を実施できる。前記改変は、1つ以上のアミノ酸残基の付加、置換又は欠失を含むことができる。前記アミノ酸の変更は、典型的には該抗体の機能的な特徴を改変するために実施される。例えば、アミノ酸改変を実施して、該キメラ融合ポリペプチドのFcドメイン成分によって媒介される下流のエフェクター機能を、例えばFcレセプターと結合し、補体を活性化し又はADCCを誘発するFcドメイン成分の能力を阻害することによって妨げることができる。さらにまた、改変をFcドメインのアミノ酸残基に実施して、該キメラ融合ポリペプチドの循環半減期を改変することができる。
【００１２】
本発明はさらに、配列番号：1若しくは配列番号：14又は前記配列と少なくとも90、95、96、97、98又は99％の配列相同性を有する配列を含むか、前記配列から成るか又は本質的に前記配列から成る単離ポリペプチド、及び下記に記載する本発明の方法における前記の使用に及ぶ。典型的には、前記相同な配列はイヌTNFと結合する。典型的には、前記相同な配列はイヌTNFの生物学的活性を相殺する。本発明はさらに、該イヌTNFレセプターポリペプチドp80の細胞外ドメインとしての配列番号：14の使用に及ぶ。
多様なさらに別の特徴では、本発明は、本発明のキメラ融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに及ぶ。多様なさらに別の特徴では、本発明は、本発明のキメラ融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのイヌにおける発現に及ぶ。
したがって、本発明のさらに別の特徴は、イヌIgG免疫グロブリン重鎖のFc領域又はそのフラグメントを含むポリペプチドと結合された、イヌTNFレセプターポリペプチドの細胞外ドメイン又はそのフラグメントを含むキメラ融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。ある種の実施態様では、該ポリヌクレオチドは、配列番号：28、配列番号：29、配列番号：30、配列番号：31及び前述のもののいずれかと少なくとも90、95、96、97、98又は99％の配列相同性を有する配列（前記相同な配列は、イヌTNFと結合するポリペプチドをコードする）から成る群から選択される配列を含む。典型的には、前記ポリペプチドはイヌTNFの生物学的活性を相殺する。
【００１３】
ある種の実施態様では、該ポリヌクレオチドは、配列番号：6、配列番号：7、配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13及び前述のもののいずれかと少なくとも90、95、96、97、98又は99％の配列相同性を有する配列（前記相同な配列はイヌTNFと結合する）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むキメラポリペプチドをコードする。典型的には、前記相同な配列はイヌTNFの生物学的活性を相殺する。
ある種の実施態様では、該ポリヌクレオチドは、配列番号：15、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19、配列番号：20、配列番号：21、配列番号：22及び前述のもののいずれかと少なくとも90、95、96、97、98又は99％の配列相同性を有する配列（前記相同な配列はTNFと結合する）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むキメラポリペプチドをコードする。典型的には、前記相同な配列はイヌTNFの生物学的活性を相殺する。
【００１４】
本発明のさらに別の特徴は、配列番号：6、配列番号：7、配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13、配列番号：15、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19、配列番号：20、配列番号：21、配列番号：22及び前述のもののいずれかと少なくとも90、95、96、97、98又は99％の配列相同性を有する配列（前記相同な配列はTNFと結合する）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むキメラ融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供する。典型的には、前記相同な配列はイヌTNFの生物学的活性を相殺する。ある種の実施態様では、該ベクターは発現プロモーターに隣接しかつ前記の制御下に配置されるか、又は発現プロモーターに機能できるように連結される。
イヌTNFレセプターポリペプチドの細胞外ドメインをコードする単離ポリヌクレオチドがさらに提供される。ある種の実施態様では、該ポリヌクレオチドは、配列番号：1のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも90、95、96、97、98又は99％の配列相同性を有する配列（前記相同な配列はTNFと結合する）を含むイヌTNFレセプター（caTNFR）ポリペプチドをコードする。典型的には、前記相同な配列はイヌTNFの生物学的活性を相殺する。ある種の実施態様では、該ポリヌクレオチドは、配列番号：14のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも90、95、96、97、98又は99％の配列相同性を有する配列（前記相同な配列はTNFと結合する）を含むイヌTNFレセプター（caTNFR）ポリペプチドをコードする。典型的には、前記相同な配列はイヌTNFの生物学的活性を相殺する。ある種の実施態様では、該ポリヌクレオチドは、配列番号：23又は前記配列と少なくとも90、95、96、97、98又は99％の配列相同性を有する配列（前記相同な配列は、TNFと結合するポリペプチドをコードする）を含む。典型的には、前記ポリペプチドはイヌTNFの生物学的活性を相殺する。配列番号：23は、配列番号：1のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。本発明はさらに、本明細書に記載するポリヌクレオチドの1つを含む組換えベクターに及ぶ。
【００１５】
多様なさらに別の特徴では、本発明は、TNF発現によって媒介されるイヌの症状を治療及び／又は予防する方法における、該キメラ融合ポリペプチド又はこれをコードするポリヌクレオチドの使用に及ぶ。本発明の方法で使用される、キメラ融合ポリペプチド、ベクター又はポリヌクレオチドは、上記に記載のキメラ融合ポリペプチド、ベクター又はポリペプチドのいずれでもよい。
したがって、本発明のさらにまた別の特徴は、望ましくない炎症応答をその必要があるイヌで予防、軽減又は緩和する方法を提供し、前記方法は以下の工程を含む：
−配列番号：6、配列番号：7、配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13、配列番号：15、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19、配列番号：20、配列番号：21及び配列番号：22又は前記配列と少なくとも90、95、96、97、98又は99％の配列相同性を有するポリペプチド配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するキメラ融合ポリペプチド、又はこれらをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する工程、及び
−前記記載のものを当該イヌに、当該炎症を予防、軽減又は緩和するために十分である治療的に有効な量で投与する工程。
ある種の実施態様では、該相同な配列はTNFと結合する。典型的には、前記相同な配列はイヌTNFの生物学的活性を相殺する。
ある種の実施態様では、前記方法は、少なくとも1つのさらに別のTNFアンタゴニスト又は抗炎症化合物を該キメラ融合ポリペプチドと一緒に投与する工程をさらに含む。
【００１６】
本発明のさらにまた別の特徴は、腫瘍壊死因子（TNF）レベルをその必要があるイヌで低下させる方法を提供し、前記方法は以下の工程を含む：
−配列番号：6、配列番号：7、配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13、配列番号：15、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19、配列番号：20、配列番号：21及び配列番号：22又は前記配列と少なくとも90、95、96、97、98又は99％の配列相同性を有するポリペプチド配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するキメラ融合ポリペプチド、又はこれらをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する工程、及び
−前記キメラ融合ポリペプチド又はベクターを当該イヌに、腫瘍壊死因子レベルを低下させるために十分である治療的に有効な量で投与する工程。
ある種の実施態様では、該相同な配列はTNFと結合する。典型的には、前記相同な配列はイヌTNFの生物学的活性を相殺する。
ある種の実施態様では、前記方法は、少なくとも1つのさらに別のTNFアンタゴニスト又は抗炎症化合物を該キメラ融合ポリペプチドと一緒に投与する工程をさらに含む。
【００１７】
本発明のさらにまた別の特徴は、腫瘍壊死因子（TNF）関連症状をその必要があるイヌで治療又は緩和する方法を提供し、前記方法は以下の工程を含む：
−配列番号：6、配列番号：7、配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13、配列番号：15、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19、配列番号：20、配列番号：21及び配列番号：22又は前記配列と少なくとも90、95、96、97、98又は99％の配列相同性を有するポリペプチド配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するキメラ融合ポリペプチド、又はこれらをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する工程、及び
−前記キメラ融合ポリペプチド又はベクターを当該イヌに、該症状を治療又は緩和するために十分である治療的に有効な量で投与する工程。
ある種の実施態様では、該相同な配列はTNFと結合する。典型的には、前記相同な配列はイヌTNFの生物学的活性を相殺する。
ある種の実施態様では、前記方法は、少なくとも1つのさらに別のTNFアンタゴニスト又は抗炎症化合物を該キメラ融合ポリペプチドと一緒に投与する工程をさらに含む。
【００１８】
ある種の実施態様では、望ましくない炎症応答又はTNF関連症状は慢性炎症性疾患である。前記慢性炎症性疾患は、慢性関節リウマチ（RA）、変形性関節症及び他の多発性関節炎疹、強直性脊椎炎（AS）、クローン病及び潰瘍性大腸炎、乾癬及び乾癬性関節炎（PsA）、全身性血管炎、アトピー性皮膚炎、うっ血性心不全（CHF）、難治性ブドウ膜炎、気管支ぜんそく及びアレルギー性症状から成る群から選択できる（ただしこれらに限定されない）。炎症媒介症状にはまた、敗血症及びショック、真性糖尿病並びに神経変性症状、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、卒中及び筋委縮性側索硬化症が含まれ得る。
さらに別のある種の実施態様では、望ましくない炎症性応答又はTNF関連症状（TNF-α関連症状又はTNF-αが主要な炎症媒介因子である症状とも称され得る）には、ベーチェット病、水疱性皮膚炎、好中球性皮膚炎、中毒性表皮壊死、全身性血管炎、壊疽性膿皮症、膿疱性皮膚炎、脳性マラリア、溶血性尿毒症症候群、子癇前症、異系移植片拒絶、中耳炎、蛇咬傷、結節性紅班、脊椎形成異常症候群、移植片対宿主病、皮膚筋炎及び多発性筋炎が含まれ得るが、ただしこれらに限定されない。
【００１９】
本発明のさらにまた別の特徴にしたがえば、関節炎又は関節炎症状をその必要があるイヌで治療する方法が提供され、前記方法は以下の工程を含む：
−配列番号：6、配列番号：7、配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13、配列番号：15、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19、配列番号：20、配列番号：21及び配列番号：22又は前記配列と少なくとも90、95、96、97、98又は99％の配列相同性を有するポリペプチド配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するキメラ融合ポリペプチド、又はこれらをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する工程、及び
−前記キメラ融合ポリペプチド又はベクターを当該イヌに、当該炎症を予防、軽減又は緩和するために十分である治療的に有効な量で投与する工程。
ある種の実施態様では、該相同な配列はTNFと結合する。典型的には、前記相同な配列はイヌTNFの生物学的活性を相殺する。
ある種の実施態様では、関節炎又は関節炎症状には、免疫媒介多発性関節炎、慢性関節リウマチ、変形性関節症、若年性特発性関節炎、強直性脊椎炎及び関連症状から成る群から選択される症状が含まれる。
典型的には、関節炎又は関節炎症状の治療は、関節炎症状に起因するか、付随するか又は関節炎症状に帰せられる免疫応答を緩和、阻害、軽減又は抑制することを含む。
【００２０】
本発明のさらに別の特徴は、イヌTNFの発現増加又はTNFの感受性増加に起因するか、付随するか又はそれらによってもたらされる症状をイヌ対象動物で治療する方法を提供し、前記方法は以下の工程を含む：
−配列番号：6、配列番号：7、配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13、配列番号：15、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19、配列番号：20、配列番号：21及び配列番号：22又は前記配列と少なくとも90、95、96、97、98又は99％の配列相同性を有するポリペプチド配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するキメラ融合ポリペプチド、又はこれらをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する工程、及び
−前記キメラ融合ポリペプチド又はベクターを当該イヌに、当該炎症を予防、軽減又は緩和するために十分である治療的に有効な量で投与する工程。
ある種の実施態様では、該相同な配列はTNFと結合する。典型的には、前記相同な配列はイヌTNFの生物学的活性を相殺する。
【００２１】
ある種の実施態様では、本発明の前述の方法はさらに、本発明のキメラ融合ポリペプチドの有効性を強化及び／又は補充することができる少なくとも1つのさらに別の薬剤を共投与するさらに別の工程を含む。例えば、キメラ融合ポリペプチドは、1つ以上の追加される医薬組成物と一緒に共投与され得る。前記追加される医薬組成物は、慢性炎症症状、特にTNF-アルファ関連異常の治療に有用な医薬を含むことができる。ある種の実施態様では、該追加の医薬組成物は、TNFアンタゴニスト（例えばメトトレキセート）、イヌTNFに対するキメラ又はイヌ化抗体、抗イヌTNF抗体フラグメント、少なくとも1つの鎮痛剤、サイトカイン抑制性抗炎症薬である化合物、NSAID、オピオイド、コルチコステロイド、ステロイド、又は神経成長因子のアンタゴニストであり得る。
適切な鎮痛剤の例には、ブトルファノール、ブプレノルフィン、フェンタニル、フルニキシンメグルミン、メルジピン、モルヒネ、ナルブフィン及び前記の誘導体が含まれるが、ただしこれらに限定されない。適切なNSAIDには、アセトアミノフェン、アセチルサリチル酸、カルプロフェン、エトドラク、ケトプロフェン、メロキシカム、フィロコキシブ、ロベナコキシブ、デラコキシブなどが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００２２】
ある種のさらに別の実施態様では、少なくとも1つのさらに別の薬剤又は医薬組成物は治療的に活性な薬剤であり、それらは抗生物質、抗真菌剤、抗原虫剤、抗ウイルス剤及び類似の治療薬剤から選択される1つ以上のグループであり得る。さらにまた、該少なくとも1つのさらに別の薬剤は、炎症媒介因子の阻害剤（例えばPGE-レセプターアンタゴニスト）、免疫抑制剤（例えばシクロスポリン）、又は抗炎症性グルココルチコイドであり得る。ある種のさらに別の実施態様では、該少なくとも1つの薬剤は、認知機能不全又は障害（例えば記憶喪失又は関連症状（高齢のイヌでますます一般的となり得る））の治療に用いられる薬剤であり得る。さらにまた別には、該少なくとも1つのさらに別の薬剤は、抗高血圧剤又は心脈管機能不全の治療（例えば高血圧、心筋虚血、うっ血性心不全などの治療）に用いられる他の化合物であり得る。さらにまた別には、該少なくとも1つのさらに別の薬剤は、利尿剤、血管拡張剤、ベータ-アドレナリン作動性レセプターアンタゴニスト、アンギオテンシン-II変換酵素阻害剤、カルシウムチャンネルブロッカー又はHMG-CoAレダクターゼ阻害剤であり得る。
【００２３】
ある種の実施態様では、キメラ融合タンパク質又は抗原結合フラグメントは、前述の方法の部分として当該イヌに、約0.01mg/kg体重から約10mg/kg体重、特に0.03mg/kg体重から約3mg/kg体重の用量範囲で投与される。
本発明のさらに別の特徴は、医薬として使用される、特に上記に記載の症状のいずれかの治療又は予防で使用される、上記に記載のキメラ融合ポリペプチド又はポリヌクレオチドを提供する。本発明は、上記に記載の症状のいずれかの治療又は予防のための医薬の調製における、上記に記載のキメラ融合ポリペプチド又はポリヌクレオチドの使用に及ぶ。
多様なさらに別の特徴では、本発明は、イヌTNFと結合する、本発明の前述の特徴のいずれかに記載のキメラ融合ポリペプチドを含む組成物に及ぶ。本発明の組成物で用いられるキメラ融合ポリペプチドは、上記に記載のキメラ融合ポリペプチドのいずれかであり得る。ある種の実施態様では、該組成物はさらに少なくとも1つの医薬的に許容できる担体を含む。
さらにまた別の特徴では、本発明は、配列番号：6、配列番号：7、配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13、配列番号：15、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19、配列番号：20、配列番号：21、配列番号：22及び前記配列と少なくとも90、95、96、97、98又は99％の配列相同性を有する配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するキメラ融合ポリペプチドを、少なくとも1つの担体、希釈剤又は賦形剤と一緒に含む医薬組成物を提供する。
【００２４】
ある種の実施態様では、該相同な配列はTNFと結合する。典型的には、前記相同な配列はイヌTNFの生物学的活性を相殺する。
ある種の実施態様では、該医薬組成物は、少なくとも1つのさらに別のTNFアンタゴニスト化合物及び／又は抗炎症化合物を含む。ある種の実施態様では、該TNFアンタゴニスト化合物はメトトレキセートである。
ある種の実施態様では、該医薬組成物はさらに少なくとも1つの鎮痛剤、NSAID、オピオイド、コルチコステロイド、ステロイド、又は神経成長因子のアンタゴニストを含む。
本発明のさらにまた別の特徴は、イヌIgG免疫グロブリンのFcドメインと機能的に連結されたTNFレセプターポリペプチドの細胞外ドメインを含むキメラ融合ポリペプチドの製造方法を提供し、前記方法は以下の工程を含む：
（i）本発明のキメラ融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現することができるベクターを含む組換え宿主細胞を提供する工程；
（ii）前記ポリペプチドの発現に適切な条件下で前記宿主細胞を培養する工程；及び
（iii）前記キメラ融合ポリペプチドを回収する工程。
ある種の実施態様では、該宿主細胞は真核細胞である。さらに別の実施態様では、該宿主細胞は原核細胞である。ある種の実施態様では、該ベクターは上記に記載の本発明のベクターである。ある種の実施態様では、該ポリヌクレオチドは上記に記載の本発明のポリヌクレオチドである。
【００２５】
本発明のさらにまた別の特徴にしたがえば、イヌの炎症媒介症状の治療又は予防で使用される、本発明の前述の特徴のいずれかのキメラ融合ポリペプチド、又は本発明の前述の特徴の医薬組成物、又は核酸、又はその核酸を含む本発明の前述の特徴のいずれかのベクターが提供される。
本発明のさらにまた別の特徴は、イヌの関節炎、特に免疫媒介多発性関節炎、慢性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎又は強直性脊椎炎の治療で使用される、本発明の前述の特徴のいずれかのキメラ融合ポリペプチド、又は核酸、又はこの核酸を含む本発明の前述の特徴のいずれかのベクターが提供される。
本発明のさらにまた別の特徴は、イヌの慢性炎症性疾患の治療又は予防用医薬の調製における、本発明の前述の特徴のいずれかのキメラ融合ポリペプチド、又は本発明の前述の特徴の医薬組成物、又は核酸、又はその核酸を含む本発明の前述の特徴のいずれかのベクターの使用を提供する。
本発明のさらにまた別の特徴は、イヌの慢性関節リウマチ又は変形性関節症の治療、抑制、緩和又は予防のための医薬の調製における、本発明の前述の特徴のいずれかのキメラ融合ポリペプチド、又は本発明の前述の特徴の医薬組成物、又は核酸、又はその核酸を含む本発明の前述の特徴のいずれかのベクターの使用を提供する。
さらにまた別の特徴では、本発明のキメラ融合ポリペプチドを産生する細胞株、又はその派生物若しくは子孫細胞が提供される。
本発明のさらにまた別の特徴は、イヌの慢性炎症を治療する、又は痛みに付随する症状を治療する、又はイヌの変形性関節症若しくは慢性関節リウマチに付随する痛みを治療、緩和若しくは抑制するキットを提供し、前記キットは、本発明の前述の特徴のいずれかのキメラ融合ポリペプチド及びその使用のための指示を含む。
【００２６】
多様なさらに別の特徴では、本発明は、本発明のキメラ融合ポリペプチドのある種のものを精製する方法を提供する。特に、本発明者らは、驚くべきことにイヌ由来免疫グロブリン重鎖ドメインのB又はC型を含むキメラ融合ポリペプチドは、A又はD型のものよりも有効に精製されることを確認した。したがって、本発明のキメラ融合ポリペプチドの精製はより高い収量を提供し、ここで前記免疫グロブリン重鎖ドメインはB又はC型である。このことは、プロテインAマトリックスによるタンパク質の精製は、治療的に使用されるタンパク質の商業ベースで対応する収量を得るためにしばしば用いられるという点で重要である。したがって、該免疫グロブリン重鎖ドメインがB又はC型である場合、特に免疫グロブリン重鎖ドメインがB型である場合、キメラ融合ポリペプチドの精製にプロテインA精製を利用することはより高い収量を提供する。この特色は、生じた精製タンパク質をイヌに投与したとき、補体を動員せず、又は下流のエフェクター機能を媒介しないという極めて驚くべき観察と相まって、治療目的でイヌに有利に投与できる本発明の組成物、特にヒト起源のポリペプチドを含むキメラ融合ポリペプチドを凌ぐ極めて有利なタンパク質治療薬を提供する。
したがって、本発明のさらに別の特徴は、本発明のキメラ融合ポリペプチド、特にB型免疫グロブリン重鎖を有するキメラ融合ポリペプチドを精製する方法を提供し、前記方法は、プロテインAを用いてキメラ融合ポリペプチドを精製する工程を含む。ある種の実施態様では、溶出緩衝液はpH5を有する。
【００２７】
本発明のさらに別の特徴は、本発明のキメラ融合ポリペプチド、特にC型免疫グロブリン重鎖を有するキメラ融合ポリペプチドを精製する方法を提供し、前記方法は、プロテインGを用いてキメラ融合ポリペプチドを精製する工程を含む。
本発明のさらにまた別の特徴は、本発明のキメラ融合ポリペプチド、特にB型免疫グロブリン重鎖を有するキメラ融合ポリペプチドの好ましいダイマーの、最適pHでプロテインAカラムから溶出させることによる、CHO細胞発現によって形成される高分子量マルチマーからの選択的精製を提供する。
したがって、本発明のさらに別の特徴は、本発明のキメラ融合ポリペプチド、特にB型免疫グロブリン重鎖を有するキメラ融合ポリペプチドを精製する方法を提供し、前記方法は、4.7より高いpHでキメラ融合ポリペプチドを溶出させる工程を含む。典型的には、pHは4.7から5.3、より典型的には4.8から5.2、より典型的には4.9から5.1であり、もっとも典型的にはpHは5.0である。典型的には、キメラ融合ポリペプチドはCHO細胞発現によって形成される。典型的には、キメラ融合ポリペプチドはプロテインA、例えばプロテインAカラムから溶出され、溶出緩衝液はpH5を有する。
【００２８】
ある種の実施態様では、キメラ融合ポリペプチドは、配列番号：7又は前記配列と少なくとも90、95、96、97、98又は99％の配列相同性を有するポリペプチド配列を含む。ある種の実施態様では、キメラ融合ポリペプチドは、配列番号：11又は前記配列と少なくとも90、95、96、97、98又は99％の配列相同性を有するポリペプチド配列を含む。ある種の実施態様では、キメラ融合ポリペプチドは、配列番号：16又は前記配列と少なくとも90、95、96、97、98又は99％の配列相同性を有するポリペプチド配列を含む。ある種の実施態様では、キメラ融合ポリペプチドは、配列番号：20又は前記配列と少なくとも90、95、96、97、98又は99％の配列相同性を有するポリペプチド配列を含む。
上記方法は、所望のTNFR-Fc融合タンパク質ダイマーを前記の凝集型から精製するために、プロテインAクロマトグラフィーによる標準的精製方法の改変として利用することができる。これによってより高い比活性及び純度をもつ生成物が得られ、さらにまた凝集物の除去は免疫原性の潜在能力を低下させる。免疫グロブリンのプロテインAによる精製の標準的手順は、中性pHでの結合及びpH3での溶出である。
ある種の実施態様では、本方法は、pH4.5−4.7で高分子量マルチマーを溶出させる工程を含む。
本発明の別の特徴は、本発明の上記記載の方法を用いて精製したキメラ融合ポリペプチド及び医薬としての前記の使用（例えば上記に記載の本発明の治療方法における前記の使用）を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】イヌTNFレセプター（TNFR）p60細胞外ドメイン（ECD）フラグメントのアミノ酸配列を示す（配列番号：1）。
【図２】イヌIgG1免疫グロブリンA型（caHCA）のヒンジ領域からC末端までのFcドメインのアミノ酸配列を示す（配列番号：2）。
【図３】イヌIgG1免疫グロブリンB型（caHCB）のヒンジ領域からC末端までのFcドメインのアミノ酸配列を示す（配列番号：3）。
【図４】イヌIgG1免疫グロブリンC型（caHCC）のヒンジ領域からC末端までのFcドメインのアミノ酸配列を示す（配列番号：4）。
【図５】イヌIgG1免疫グロブリンD型（caHCD）のヒンジ領域からC末端までのFcドメインのアミノ酸配列を示す（配列番号：5）。
【図６】配列番号：6のアミノ酸配列を示す。この配列は、配列番号：1のイヌTNFR配列及び配列番号：2のイヌIgG HCA Fcドメインを含むキメラ融合ポリペプチドである。
【図７】配列番号：7のアミノ酸配列を示す。この配列は、配列番号：1のイヌTNFR配列及び配列番号：3のイヌIgG HCB Fcドメインを含むキメラ融合ポリペプチドである。
【図８】配列番号：8のアミノ酸配列を示す。この配列は、配列番号：1のイヌTNFR配列及び配列番号：4のイヌIgG HCC Fcドメインを含むキメラ融合ポリペプチドである。
【図９】配列番号：9のアミノ酸配列を示す。この配列は、配列番号：1のイヌTNFR配列及び配列番号：5のイヌIgG HCD Fcドメインを含むキメラ融合ポリペプチドである。
【図１０】配列番号：10のアミノ酸配列を示す。この配列は、配列番号：1のイヌTNFR配列及び配列番号：2のイヌIgG HCA Fcドメインの非グリコシル型を含むキメラ融合ポリペプチドである。
【図１１】配列番号：11のアミノ酸配列を示す。この配列は、配列番号：1のイヌTNFR配列及び配列番号：3のイヌIgG HCB Fcドメインの非グリコシル型を含むキメラ融合ポリペプチドである。
【図１２】配列番号：12のアミノ酸配列を示す。この配列は、配列番号：1のイヌTNFR配列及び配列番号：4のイヌIgG HCC Fcドメインの非グリコシル型を含むキメラ融合ポリペプチドである。
【図１３】配列番号：13のアミノ酸配列を示す。この配列は、配列番号：1のイヌTNFR配列及び配列番号：5のイヌIgG HCD Fcドメインの非グリコシル型を含むキメラ融合ポリペプチドである。
【図１４】イヌTNFレセプター（TNFR）p80細胞外ドメイン（ECD）のフラグメントのアミノ酸配列である（配列番号：14）。
【図１５】配列番号：15のアミノ酸配列を示す。この配列は、配列番号：14のイヌTNFR配列及び配列番号：2のイヌIgG HCA Fcドメインを含むキメラ融合ポリペプチドである。
【図１６】配列番号：16のアミノ酸配列を示す。この配列は、配列番号：14のイヌTNFR配列及び配列番号：3のイヌIgG HCB Fcドメインを含むキメラ融合ポリペプチドである。
【図１７】配列番号：17のアミノ酸配列を示す。この配列は、配列番号：14のイヌTNFR配列及び配列番号：4のイヌIgG HCC Fcドメインを含むキメラ融合ポリペプチドである。
【図１８】配列番号：18のアミノ酸配列を示す。この配列は、配列番号：14のイヌTNFR配列及び配列番号：5のイヌIgG HCD Fcドメインを含むキメラ融合ポリペプチドである。
【図１９】配列番号：19のアミノ酸配列を示す。この配列は、配列番号：14のイヌTNFR配列及び配列番号：2のイヌIgG HCA Fcドメインの非グリコシル型を含むキメラ融合ポリペプチドである。
【図２０】配列番号：20のアミノ酸配列を示す。この配列は、配列番号：14のイヌTNFR配列及び配列番号：3のイヌIgG HCB Fcドメインの非グリコシル型を含むキメラ融合ポリペプチドである。
【図２１】配列番号：21のアミノ酸配列を示す。この配列は、配列番号：14のイヌTNFR配列及び配列番号：4のイヌIgG HCC Fcドメインの非グリコシル型を含むキメラ融合ポリペプチドである。
【図２２】配列番号：22のアミノ酸配列を示す。この配列は、配列番号：14のイヌTNFR配列及び配列番号：5のイヌIgG HCD Fcドメインの非グリコシル型を含むキメラ融合ポリペプチドである。
【図２３】抗イヌIgGポリクローナル二次抗体-HRP複合物を用いて検出した、イヌTNFR-Fc融合タンパク質発現上清とイヌTNFの結合のELISAによる結果を示すグラフである。配列番号：6（HCA）、配列番号：7（HCB）、配列番号：8（HCC）及び配列番号：9（HCD）をコードする発現プラスミドによるCHO細胞のトランスフェクションは、イヌHCBヒンジ-CH2-CH3にN-末端融合させた等価（配列番号：7との相似融合）のヒトTNFR-Fc細胞外ドメインと比較したとき多様な被検上清をもたらした。
【図２４】プロテインA及びプロテインG縦列セファロースカラムでのアフィニティー捕捉後の精製イヌTNFR-Fc融合タンパク質の結合のELISAを示すグラフである。図から分かるように、イヌTNFレセプター融合タンパク質のHCB及びHCC型はプロテインA又はプロテインGによって効率的に捕捉され、一方、融合タンパク質のHCA及びHCD型の捕捉は貧弱であった。更なる分析（ここには提示されていない）は、イヌTNFR-HCBはプロテインAによって効率的に捕捉されるが、一方、HCC型はプロテインGによって捕捉されることを示した。
【図２５】プロテインA及びプロテインG縦列アフィニティークロマトグラフィーから得られた生成物の非還元SDS-PAGEゲルの結果を示す。この結果によりイヌTNFR融合タンパク質のHCA（配列番号：6）及びHCD（配列番号：9）アイソフォームの回収は貧弱であることが確認された。
【図２６】NF-kB-EGFPレポーター構築物pTRH1（Vince et al, Cell 131, 682, 2007）をトランスフェクトした293-HEK細胞を用いたイヌTNFアルファの生物活性（R&D systems, 1 ng/mL）の阻害を示す。これらの細胞は蛍光によってイヌTNFに応答する。イヌ融合タンパク質のイヌTNFR-HCB（配列番号：7）（図26）及びイヌTNFR-HCC（配列番号：8）（図27）アイソフォームの両方が、ヒトTNFR-イヌHCBコントロール融合タンパク質（図27で定量）と同様にTNF-誘発蛍光を等価に阻害した。アッセイのIC50は約1ng/mLであった。
【図２７】NF-kB-EGFPレポーター構築物pTRH1（Vince et al, Cell 131, 682, 2007）をトランスフェクトした293-HEK細胞を用いたイヌTNFアルファの生物活性（R&D systems, 1 ng/mL）の阻害を示す。これらの細胞は蛍光によってイヌTNFに応答する。イヌ融合タンパク質のイヌTNFR-HCB（配列番号：7）（図26）及びイヌTNFR-HCC（配列番号：8）（図27）アイソフォームの両方が、ヒトTNFR-イヌHCBコントロール融合タンパク質（図27で定量）と同様にTNF-誘発蛍光を等価に阻害した。アッセイのIC50は約1ng/mLであった。
【図２８】補体C1q結合ELISAの結果を示す。イヌTNFR-HCB、イヌTNFR-HCC及びヒトTNFR-イヌHCB融合タンパク質をイヌTNF（4μg/mL）で前被覆したプレートでインキュベートした。比較のために、神経成長因子（NGF）に特異性を有するイヌ化モノクローナル抗体（MAb, イヌアイソタイプHCB）をNGFで前被覆したプレートでインキュベートした。これらのプレートを洗浄し、さらに補体の供給源として正常又は加熱殺滅ヒト血清でインキュベートした。補体C1qの結合は、C1q反応性ポリクローナル抗体-HRP複合物を用いて検出した。これらの結果から分かるように、イヌHCB MAbは補体を動員することができるが、驚くべきことに、イヌTNFR-HCB融合タンパク質もヒトTNFR-HCB融合タンパク質も、又はイヌTNFR-HCC融合タンパク質も補体を動員できなかった（他の実験では、抗NGFモノクローナル抗体のHCCアイソタイプはC1qと結合する（ここではデータは提示されていない））。
【図２９Ａ】イヌTNFR-HCB（配列番号：7）ポリペプチド融合タンパク質ダイマーの、pH5での選択的溶出による前記の高分子量凝集物からの最適化精製の結果を示す。
【図２９Ｂ】イヌTNFR-HCB（配列番号：7）ポリペプチド融合タンパク質ダイマーの、pH5での選択的溶出による前記の高分子量凝集物からの最適化精製の結果を示す。
【図３０】新規なイヌTNFR p80細胞外ドメインアミノ酸配列（配列番号：14）の派生物を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
発明の詳細な説明
本発明者らは、イヌのTNF媒介症状の治療及び予防で使用される組成物並びの方法を提供する。特に、本発明の組成物及び方法は、TNFレベルを全身的に又は特定の解剖学的局部で低下させるために役立つ。
特に、イヌ免疫グロブリン重鎖定常ドメインの補体動員性変種とイヌTNFレセプター細胞外ドメインとの融合にもかかわらず、得られた本発明のキメラ融合ポリペプチドはイヌTNFと高い特異性で結合し、しかも補体C1qを動員しないということが本明細書で示される。さらにまた、結合は、イヌTNFと細胞膜発現TNFレセプターとの結合を阻害することによって、イヌTNFの生物学的活性を停止させる。前記事象は、イヌの炎症媒介疾患（例えば関節炎）のTNF媒介性誘発、発症又は進行の発生を妨げ又は減少させ、しかも補体カスケードの誘発を介して同時発生する損傷をもたらさないであろう。
本発明のレセプター融合タンパク質は組換えDNAの方法を用いて生成され、イヌTNFに対する結合特異性を示すが、一方、前記レセプター融合タンパク質はまたイヌ宿主に投与されたとき、それらの免疫原性を低下させるイヌ定常ドメイン配列を有する。結果として、異種抗体誘発リスクは最少化される。
【００３１】
本発明は組換え融合タンパク質を提供し、前記組換え融合タンパク質は、イヌIgG免疫グロブリンアイソタイプのFcドメインと結合されたイヌTNFレセプターp60（caTNFRp60）の細胞外ドメインを含む。本発明はさらに、イヌIgG免疫グロブリンアイソタイプのFcドメインと結合されたイヌTNFレセプターp80（caTNFRp80）の細胞外ドメインを含む組換え融合タンパク質に及ぶ。生成されるダイマーポリペプチドはキメラFc融合タンパク質である。本発明者らは、caTNFRp:Fc融合タンパク質はイヌTNFに対し結合親和性を有し、TNFアンタゴニストとして作用することを示した。TNFアンタゴニストの使用は、炎症性疾患のTNF媒介進行及び他のTNF媒介症状の作用を逆転させることが示された。
本発明の融合タンパク質組成物は、典型的には外因的に、例えば静脈内又は皮下投与によって投与される。しかしながら、ある種の実施態様では、ベクターを用いて、本発明のキメラ融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをデリバーできる。したがって、本発明は、TNF媒介炎症性疾患並びに他のTNF関連症状及び疾患の効率的で持続的な治療のための組成物及び方法を提供する。
【００３２】
広範囲の実験の後で、本発明者らは、従来イヌTNFに特異的に結合することが知られていなかったレセプターであるヒトTNFレセプター細胞外ドメイン（アクセッション番号AAD01516；Campbell, et al. 2001, Vet Immuno Immunopath 78, 207-214）に対して類似性を有するイヌタンパク質配列を採用し、意外なことであろうが、この配列をアンタゴニスト性レセプター-免疫グロブリン融合タンパク質（融合ポリペプチド）（特異的にイヌTNF-アルファと結合し、しかも補体C1qを動員しない）の作製の土台として用いた。
生成された非免疫原性レセプター融合タンパク質は、イヌTNFに対して高親和性結合を提示することが示される。このレセプター融合タンパク質はイヌTNFの生物学的機能を中和し、極めて具体的に言えばTNFと細胞膜結合レセプターTNFR1との結合を阻害することによってTNFの生物学的機能を中和する。さらにまた、該融合タンパク質はまた、当該定常領域がイヌIgG分子に存在する残基のみを取り込み、その結果、イヌに投与したとき前記融合タンパク質に対する異種抗体が産生されそうもないように設計された。したがって、本発明のイヌ化レセプター融合タンパク質はイヌの慢性炎症性疾患の長期投与に適切である。
【００３３】
驚くべきことに、本発明者らは、完全なイヌp80 TNFレセプター細胞外ドメインをその完全形において初めて同定した。前記同定は、NCBIゲノム参照クローンXP_544562.2の予想されるカルボキシ末端残基を正確なシグナル配列及び部分的イヌcDNAクローンDN368636由来アミノ末端残基と組み合わせることによって達成された（本発明者らは、XP_544562.2はイヌp80の不正確に予想されたシグナル配列及びアミノ末端残基を含むと認定した）。この新規なイヌp80細胞外ドメイン配列（図30）は、本明細書では配列番号:14として示される。結果として、適切で無傷のアミノ末端残基をもつ正確なイヌp80細胞外ドメイン全体を合成することができ、結果として前記細胞外ドメインは、イヌ対象動物に投与されたとき免疫原性を示さないであろう。比較すれば、クローンXP_544562.2に由来する配列は異質で免疫原性のアミノ末端を生じ、イヌに投与されたときにこれに対して中和抗体が産生されよう。同様に、イヌTNFレセプターp80-免疫グロブリンFcドメイン融合タンパク質は、本明細書で決定した修正p80アミノ末端アミノ酸配列（本明細書では配列番号:15−22）を用いて提供することができる。
【００３４】
本発明者らが利用した、本発明のレセプター融合タンパク質作製プロセスは、本発明者らの分析にしたがえば、該レセプターのコンフォーメーションが維持され、したがって結合特異性及びアビジチーが維持され、さらに腎臓で除去されるサイズよりレセプターサイズが増加し、一方、未改変形でイヌに投与されたとしたら該レセプターに対して中和抗体（特に異種抗体）を生じ得る免疫原性エピトープの存在が減少したレセプター細胞外ドメインの提供をもたらす。
さらにまた、該融合タンパク質のFcドメイン成分は、イヌ由来抗体から得られるIgG免疫グロブリン重鎖定常領域を含む（イヌは、本発明の融合タンパク質が投与されるべき標的種である）。該免疫グロブリン重鎖定常ドメインは、それらが下流のエフェクター機能を媒介しないように選択又は改変される。さらにまた、該レセプター細胞外ドメインと免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合は、前記融合がレセプタードメインの三次元コンフォーメーションに影響を及ぼさないような態様で実施されるので、所望の標的との結合特異性に変動は存在しないであろう。
【００３５】
ヒト及びマウスでは4つの主要なIgGアイソタイプが存在し、それらは、呼称は類似するが、細菌生成物（例えばプロテインA及びプロテインG）に対する親和性、並びに補体依存細胞溶解（CDC）の活性化及び抗体依存細胞性細胞傷害（ADCC）の誘発能力を含む、反応態様及び機能において相違する。CDC及びADCC活性を有するか、又はCDC及びADCCで“武装化された”定常ドメインをもつIgGアイソタイプを選択することは、抗体が、例えば腫瘍又は感染制御でそれらの同族抗原を保持する標的細胞を排除するように設計されるときは臨床的に有利であると考えられる（例えば人間用医薬の使用では、IgG1アイソタイプは上記の目的のために好ましい）。対照的に、免疫系の活性化は他の設定、例えば炎症、痛み又は自己免疫の緩和では望ましくないと考えられ、したがって最小限のCDC及びADCC活性をもつIgGアイソタイプが好ましい（例えばそのような人間用医薬の使用では、IgG4アイソタイプがしばしば好まれる）。ただ1つのカッパ及びラムダ定常ドメイン配列に加えて、4つの別個の免疫グロブリンガンマ（IgG）重鎖定常ドメインアイソタイプがイヌ免疫系で記載されている（米国特許第5,852,183号；Tang L. et al. 2001. Veterinary Immunology and Immunopathology, 80. 259-270）。この4つのイヌ重鎖定常ドメインA、B、C及びDは、これらのドメインが媒介する免疫系の機能的活性の関係ではまだ特徴付けは為されていない。該IgGファミリーの全体的な相同性にもかかわらず、イヌIgGをコードするタンパク質は互いに、他の種のファミリーメンバーに対するよりも関係が深く、したがって、相同性だけで上記の機能のいずれが4つのイヌアイソタイプのそれぞれに帰属し得るかを定義するのは不可能であった。しかしながら、本発明者らは驚くべきことに、イヌIgGサブタイプB及びCは下流エフェクター機能（特に補体の固定）を媒介せず、したがってイヌIgGサブタイプB及びC由来のポリペプチドフラグメントは、本発明のキメラ融合ポリペプチドで好ましいことを認定した。
【００３６】
ある種の実施態様では、グリコシル化パターンを変化させたFcドメイン成分を含むレセプター融合タンパク質が製造される。ある種の実施態様では、本発明のTNFレセプター-Fc融合タンパク質は、Fc部分のグリコシル化の程度が増加又は低下するように変異させることができる。ポリペプチドのグリコシル化は典型的にはN-結合又はO-結合である。N-結合は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列、アスパラギン-X-セリン及びアスパラギン-X-スレオニン（Xはプロリンを除く任意のアミノ酸）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的付加のための認識配列である。したがって、あるポリペプチドにおけるこれらトリペプチド配列の存在は潜在的グリコシル化部位をもたらす。O-結合グリコシル化は、糖類（N-アセチルガラクトサミン、ガラクトース又はキシロース）の1つの、ヒドロキシルアミノ酸（もっとも一般的にはセリン又はスレオニンであるが、5-ヒドロキシプロリン又は5-ヒドロキシリジンもまた用いることができる）への付加を指す。
ある種のさらに別の実施態様では、本発明の抗イヌTNFレセプター融合タンパク質は、該レセプター融合タンパク質をポリエチレングリコール（PEG）誘導体と反応させることによってPEG化することができる。ある種の実施態様では、該レセプター融合タンパク質は脱フコシル化され、したがってフコース残基を欠く。
【００３７】
ある種の実施態様では、タンパク質の生物学的特性の改変は、（a）置換領域のポリペプチド骨格の構造（例えばシート又はヘリックスのコンフォーメーションとしての構造）、（b）当該分子の標的部位における荷電又は疎水性、又は（c）側鎖の大きさに影響を与える置換を選択することによって達成できる。アミノ酸は、それらの側鎖の特性における類似性にしたがって以下のように分類できる（A. L. Lehninger, in Biochemistry, 2nd Ed., 73-75, Worth Publishers, New York, 1975）：（1）非極性：Ala（A）、VaI（V）、Leu（L）、Ile（I）、Pro（P）、Phe（F）、Trp（W）、Met（M）；（2）非荷電極性：GIy（G）、Ser（S）、Thr（T）、Cys（C）、Tyr（Y）、Asn（N）、Gln（Q）；（3）酸性：Asp（D）、GIu（E）；及び（4）塩基性：Lys（K）、Arg（R）、His（H）。或いはまた、天然に存在する残基は、以下のように共通の側鎖特性を基準にして分類できる：（1）疎水性：ノルロイシン、Met、Ala、VaI、Leu、Ile；（2）中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；（3）酸性：Asp、Glu；（4）塩基性：His、Lys、Arg；（5）鎖の方向性に影響する残基：Gly、Pro；及び（6）芳香族：Trp、Tyr、Phe。非保存的置換は、これらのクラスの1つのメンバーの別のクラスによる交換を伴うであろう。そのような置換残基はまた、保存的置換部位に又は残存（例えば非保存）部位に導入することができる。
【００３８】
本発明のレセプター融合タンパク質及び結合メンバーは完全に又は部分的に化学合成によって製造され得る。例えば、本発明のイヌTNFレセプター融合タンパク質及び結合メンバーは、当業者に周知の技術、例えば標準的な液体ペプチド合成によって、又は固相ペプチド合成方法によって調製できる。或いはまた、該融合タンパク質は、液相ペプチド合成技術を用いて溶液中で、又は固相、液相及び溶液化学の組合せによって調製することができる。
本発明はさらにまた、キメラ融合ポリペプチド又はその成分をコードするポリヌクレオチドを適切な発現系で発現させることによって、本発明のレセプター融合タンパク質又は結合メンバーを製造することに及ぶ。
本発明のレセプター融合タンパク質をコードする核酸配列は、当業者に周知の技術を用いて当業者によって容易に調製され得る。そのような技術は、例えば以下に記載されている：Sambrook et al. “Molecular Cloning”, A laboratory manual, cold Spring Harbor Laboratory Press, Volumes 1-3, 2001 (ISBN-0879695773)；及びAusubel et al. Short Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, 4th Edition, 1999 (ISBN- 0471250929)。
【００３９】
本発明のレセプター融合タンパク質をコードする核酸配列は、少なくとも1つの核酸を含むプラスミド、ベクター、転写又は発現カセットの形態の構築物として提供され得る。該構築物は、1つ以上の構築物を含む組換え宿主細胞内に含まれ得る。発現は、便利には、適切な核酸配列を含む組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することによって達成され得る。発現に続いて、レセプター融合タンパク質又はレセプター融合タンパク質フラグメントを任意の適切な技術を用いて単離及び／又は精製し、続いて適切に用いることができる。
多様な種々の宿主細胞でポリペプチドをクローニング及び発現する系は周知である。適切な宿主細胞には、細菌、哺乳動物細胞、酵母、昆虫及びバキュロウイルス系が含まれる。異種ポリペプチドの発現のために当業界で利用できる哺乳動物細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓細胞及びNSOマウスミエローマ細胞が含まれる。一般的な好ましい細菌宿主は大腸菌（E. coli）である。原核細胞（例えば大腸菌）でのレセプター融合タンパク質及びレセプター融合タンパク質フラグメントの発現は当業界では十分に確立されている。真核細胞培養での発現もまたポリペプチド製造のための1つの選択肢として当業者には利用可能である。
本発明のレセプター融合タンパク質は、組換え手段によって直接的に製造されるだけでなく異種ポリペプチドを含む融合ポリペプチドとしてもまた製造され得る（前記異種ポリペプチドは、好ましくはシグナル配列又は成熟タンパク質又はポリペプチドのN-末端に固有の切断部位を有する他の配列である）。好ましく選択される異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識及び処理される（すなわちシグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。本来のレセプターシグナル配列を認識及び処理しない原核宿主細胞のために、当該シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、IPP、及び熱安定性エンテロトキシンIIリーダーのグループから選択される原核細胞シグナル配列によって置換される。
【００４０】
“単離された”という用語は、本発明のレセプター融合タンパク質、又は前記レセプター融合タンパク質に由来する結合メンバー、又はそれらをコードするポリヌクレオチドに関して用いられるとき、前記レセプター融合タンパク質又はポリヌクレオチドが単離及び／又は精製された形態で提供され（すなわちそれらはそれらの天然の環境から分離されているか、単離されているか、又は精製されている）、さらに実質的に純粋若しくは均質な形態で提供され、又は、核酸の場合には必要な機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の起源を有する核酸又は遺伝子を含まないか又は実質的に含まない状態を指す。したがって、そのような単離されたレセプター融合タンパク質及び単離された核酸は、それらに天然の状態で付随する物質（例えばそれらがその天然の環境で、又はそのような調製が組換えDNA技術によってin vitro又はin vivoで実施されるときそれらが調製される環境（例えば細胞培養）で一緒に見出される他のポリペプチド又は核酸）を含まないか又は実質的に含まないであろう。
レセプター融合タンパク質及び核酸は、希釈剤又はアジュバントと一緒に処方することができ、さらに実際的な目的のために、単離形で提供できるように考慮される。例えば、免疫アッセイで使用するためにマイクロタイタープレートを被覆するために用いる場合は、レセプター融合タンパク質はゼラチン又は他の担体と混合できる。前記タンパク質及び核酸はまた、診断又は治療で用いられるときは医薬的に許容できる担体又は希釈剤と混合されるであろう。レセプター融合タンパク質は、天然に又は異種真核細胞系（例えばCHO又はNSO細胞）によってグリコシル化され得る。前記レセプター融合タンパク質ははまたグリコシル化されなくてもよい（例えば原核細胞での発現によって製造される場合）。
【００４１】
抗イヌTNFレセプター融合タンパク質分子を含む不均質調製物はまた本発明の部分を形成する。例えばそのような調製物は、C-末端リジンを欠くレセプター融合タンパク質を含む、種々の程度のグリコシル化を含む、及び／又はアミノ酸誘導体を含む（例えばピログルタミン酸残基を形成するためにN-末端グルタミン酸の環状化を含む）レセプター融合タンパク質の混合物であり得る。
典型的には、本発明の医薬組成物は、液体処方物、凍結乾燥処方物、液体として再構成される凍結乾燥処方物、又はエーロゾル処方物として処方される。ある種の実施態様では、処方物中のレセプター融合タンパク質は、約0.5mg/mLから約250mg/mL、約0.5mg/mLから約45mg/mL、約0.5mg/mLから約100mg/mL、約100mg/mLから約200mg/mL、又は約50mg/mLから約250mg/mLの濃度である。
ある種の実施態様では、該処方物はさらに緩衝液を含む。典型的には、該処方物のpHは約5.5から約6.5である。ある種の実施態様では、該緩衝液は、約4mMから約60mMのヒスチジン緩衝液、約5mMから約25mMのコハク酸緩衝液、又は約5mMから25mMの酢酸緩衝液を含むことができる。ある種の実施態様では、該緩衝液は、約10mMから300mMの濃度、典型的にはおよそ125mMの濃度の塩化ナトリウム、及び約5mMから50mM、典型的には25mMの濃度のクエン酸ナトリウムを含む。ある種の実施態様では、該処方物は、0％をわずかに超え約0.2％までの濃度で界面活性剤を含む。ある種の実施態様では、該界面活性剤は、ポリソルベート-20、ポリソルベート-40、ポリソルベート-60、ポリソルベート-65、ポリソルベート-80、ポリソルベート-85、及び前記の組合せから成る群から選択される（ただしこれら限定されない）。好ましい実施態様では、界面活性剤はポリソルベート-20であり、さらに別に塩化ナトリウムを約125mMの濃度で、さらにクエン酸ナトリウムを約25mMの濃度で含むことができる。
【００４２】
本発明のレセプター融合タンパク質は単独で投与できるが、好ましくは医薬組成物として投与されるであろう。前記医薬組成物は、一般的には意図される投与ルートに応じて適切な医薬的に許容できる賦形剤、希釈剤又は担体を含むであろう。適切な医薬担体の例には水、グリセロール、エタノールなどが含まれる。典型的には、組成物は注射又は輸液によって非経口的に投与できる。非経口投与のための好ましいルートの例には、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下又は経粘膜が含まれるが、ただしこれらに限定されない。投与ルートはさらに局所又は経腸投与を含むことができ、前記ルートは例えば粘膜（肺を含む）、口、鼻及び直腸からの投与である。
該組成物が注射可能な組成物として、例えば静脈内、皮内又は皮下適用でデリバーされる実施態様では、活性成分は、非経口的に許容できる水溶液（発熱物質を含まず適切なpH、等張性及び安定性を有する）の形態で存在し得る。例えば、等張なビヒクル、例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、又は乳酸リンゲル注射液を用いて、当業者は適切な溶液を容易に調製できる。必要に応じて、保存料、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤及び／又は他の添加剤を加えることができる。該組成物はまた、微小球、リポソーム、他の微粒子デリバリー系又はある種の組織（血液を含む）に配置される持続放出処方物により投与することができる。
【００４３】
上記に記載の技術及びプロトコル並びに本発明にしたがって用いることができる他の技術及びプロトコルの例は以下で見つけることができる：Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Gennaro, A.R., Lippincott Williams & Wilkins; 20th edition ISBN 0-912734-04-3及びPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems; Ansel, H.C. et al. 7th Edition ISBN 0-683305-72-7。
本発明のレセプター融合タンパク質及び組成物は、典型的には対象動物に、“治療的に有効な量”で投与され、“治療的に有効な量”とは、該組成物が投与される対象動物に利益を示すために十分な量である。実際の投与用量並びに投与速度及びタイムコースは、治療される症状の性質及び重篤度とともに治療される対象動物の年齢、性別及び体重のような要件並びに投与ルートに左右され、さらにそれらを参考にして決定できよう。更なる配慮が、組成物の特性、例えばその結合活性及びin vivo血中寿命、レセプター融合タンパク質又は結合メンバーの処方物中の濃度とともにデリバリーのルート、部位及び速度に対して払われるべきであろう。
【００４４】
投薬スケジュールには本発明のレセプター融合タンパク質又は組成物の1回投与、又は該レセプター融合タンパク質又は組成物の複数回投与が含まれ得る。該レセプター融合タンパク質又はレセプター融合タンパク質含有組成物は、さらに他の抗炎症組成物又はTNFアンタゴニスト組成物と連続して、前記組成物と同時に又は前記組成物と別々に投与され得る。
対象動物に与えることができる投薬スケジュールの例は以下を含む群から選択できる（ただしこれらに限定されない）：1μg/kg/日から20mg/kg/日、1μg/kg/日から10mg/kg/日、及び10μg/kg/日から1mg/kg/日。ある種の実施態様では、投薬量は、約1μg/mLから100μg/mLの血中抗体濃度が得られるようなものであろう。しかしながら実際の組成物投与用量並びに投与速度及びタイムコースは治療される症状の性質及び重篤度に左右されるであろう。治療の指示（例えば投薬量の決定など）は、最終的には獣医業従事者及び他の獣医の責任範囲内でありその自由裁量に任され、典型的には治療される疾患、個々の患畜の状態、デリバリー部位、投与方法及び獣医にとって公知の他の要件が考慮される。
【００４５】
定義
特段の規定がなければ、本明細書で用いられる全ての技術用語及び学術用語は、本発明の分野の業者が一般的に理解する意味を有する。用語の意味及び範囲は明瞭であるべきであるが、何らかのあいまいさが存在する場合には、本明細書で提供する定義が一切の辞書の定義又は外部の定義を超えて優先される。
本明細書を通して、文脈が特段に要求しないかぎり、“comprise”若しくは“include”又はそれらの変型、例えば“comprises”若しくは“comprising”、“includes”若しくは“including”は、記載の整数又は整数群を含むが、任意の他の整数又は整数群も排除しないことを示唆すると理解されよう。
本明細書で用いられるように、例えば“a”、“an”及び“the”という用語は、文脈がそうでないことを明瞭に要求しないかぎり単数及び複数の該当語を含む。したがって、例えば、“an active agent（活性な薬剤）”又は“a pharmacologically active agent（医薬的に活性な薬剤）”と言えば、ただ1つの活性な薬剤と同様に2つ以上の組み合わされた異なる活性な薬剤を含み、一方、“a carrier（担体）”と言えば、ただ1つの担体と同様に2つ以上の担体の混合物も含まれる。さらにまた、文脈がそうでないことを要求しないかぎり、単数用語は複数形を含み、複数用語は単数形を含むであろう。
【００４６】
典型的には、本発明のキメラ融合ポリペプチドは中和性レセプター融合タンパク質である。本明細書で定義するように、“中和性レセプター融合タンパク質”という用語は、TNFの生物活性及びシグナリングを中和することができるレセプター融合タンパク質をいう。該中和性レセプター融合タンパク質（TNFアンタゴニスト融合タンパク質、アンタゴニストレセプター融合タンパク質又は遮断性レセプター融合タンパク質とも称され得る）は、TNFと特異的に及び好ましくは選択的に結合し、TNFの1つ以上の生物学的活性を阻害する。例えば、中和性レセプター融合タンパク質は、TNFとその標的レセプター（例えば細胞膜結合TNFレセプター1（TNFR1）レセプター（CD120a）との結合を阻害できる。
本明細書で用いられるように、“生物学的活性”という用語は、（in vivoで見出されるように天然に存在するか、組換え手段により提供又は与えられるかに関係なく）ある分子の1つ以上の任意の固有の生物学的特性を指す。生物学的特性には、レセプター結合及び／又は活性化、細胞シグナリング又は細胞増殖の誘発、細胞増殖の阻害、サイトカイン産生の誘発、アポトーシスの誘発及び酵素活性が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００４７】
本明細書で用いられる“定常領域（CR）”という用語は、エフェクター機能を付与する抗体分子の部分を指す。本発明では、定常領域は典型的にはイヌ定常領域を意味し、すなわち、該定常領域がイヌ免疫グロブリンに由来するということを意味する。
本明細書で用いられる“免疫原性”という用語は、レシピエントに投与されたときに、免疫応答（液性又は細胞性）を誘引するタンパク質又は治療部分の能力の強さを指す。好ましくは、本発明のキメラ融合ポリペプチドは免疫原性をもたず、すなわち、イヌに投与されたときそれらに対して異種抗体が生じないということである。
本明細書で用いられる“同一性”若しくは“配列同一性”又“相同性”はという用語は、アラインメントを実施した配列の任意の個々のアミノ酸残基位置で、アミノ酸残基が該アラインメント実施配列間で同一であることを意味する。本明細書で用いられる“類似性”又は“配列類似性”という用語は、アラインメントを実施した配列の任意の個々の位置で、アミノ酸残基が該配列間で類似のタイプであることを示す。例えば、イソロイシン又はバリンはロイシンに置換され得る。この置換は保存的置換と称することができる。好ましくは、本発明のアミノ酸配列をその中に含まれるアミノ酸残基のいずれかの保存的置換の態様によって改変するとき、これらの改変は、生じたレセプター融合タンパク質の結合特異性又は機能的活性に対して未改変レセプター融合タンパク質と比較したとき全く影響を示さない。
【００４８】
本発明の（本来の）ポリペプチド及びその機能的誘導体に対する配列同一性は、配列をアラインメントし必要な場合にはギャップを導入して最大相同性パーセンテージを達成した後で、さらに配列同一性の部分として保存的置換を全く考慮しないときに対応する本来のポリペプチドの残基と同一である該候補配列のアミノ酸残基のパーセンテージに関する。N-末端若しくはC-末端伸長も挿入も、配列同一性又は類似性の低下とは解されないであろう。2つ以上のアミノ酸配列のアラインメントを実施し、それらの配列同一性又は相同性を決定する方法及びコンピュータープログラムは当業者には周知である。例えば、2つのアミノ酸配列の同一性又は類似性のパーセンテージは、アルゴリズム、例えばBLAST（Altschul et al. 1990）、FASTA（Pearson & Lipman 1988）、又はスミス-ウォーターマン（Smith-Waterman）アルゴリズム（Smith &  Waterman 1981）を用いて容易に計算することができる。本発明は、本明細書で同定された配列と少なくとも80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％又は99％の配列同一性又は配列相同性を有する配列、及び本明細書に記載した本発明の方法における前記の使用に及ぶ。
【００４９】
本明細書で用いられる“本質的に〜から成る”又は“本質的に〜から成って”という用語は、ポリペプチドが記載されたものの他に追加される特色又は成分を有することができることを意味するが、ただしそのような追加の特色又は成分が、当該レセプター融合タンパク質又はレセプター融合タンパク質フラグメントのイヌTNFに対する結合特異性を有する能力に実質的に影響を及ぼさないことを条件とする。すなわち、該レセプター融合タンパク質又は該ポリペプチドを含むレセプター融合タンパク質フラグメントは、イヌTNFと結合し、さらにイヌTNFの機能的活性と拮抗する該レセプター融合タンパク質又はレセプター融合タンパク質フラグメントの能力に干渉しない追加の特色又は成分を有することができる。そのような改変は、該レセプター融合タンパク質の免疫原性を低下させるためにアミノ酸配列に導入することができる。例えば、本質的に規定された配列から成るポリペプチドは、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つ以上の追加された、欠失された又は置換されたアミノ酸を該配列のどちらかの末端又は両端に含むことができるが、ただしこれらのアミノ酸が、イヌTNFとの結合及びその生物学的機能の停止における該レセプター融合タンパク質又はフラグメントの役割に干渉、阻害、遮断又は中断をもたらさないことを条件とする。同様に、本発明のイヌTNFアンタゴニストレセプター融合タンパク質に寄与するポリペプチド分子は1つ以上の官能基で化学的に改変できるが、ただしそのような官能基が、イヌTNFと結合しその機能と拮抗する該レセプター融合タンパク質又はレセプター融合タンパク質フラグメントの能力に干渉しないことを条件とする。
【００５０】
本明細書で用いられるように、“有効な量”又は“治療的に有効な量”という用語は、イヌTNFとTNFR1レセプターとの結合の抑制に必要な本発明の融合タンパク質の量、及び／又は有益な若しくは所望の臨床的帰結に影響を与えるために十分な本発明のキメラ融合ポリペプチドの量を意味する。本発明の目的のためには、“有効な量”は以下の少なくとも1つを達成する量である：TNFレベルの低下、炎症応答の軽減、又はTNF媒介疾患若しくは症状の軽減、予防又は緩和。
本明細書で用いられる、“キメラポリペプチド”、“融合ポリペプチド”、“融合タンパク質”又は“ダイマーポリペプチド”という用語は、異なるタンパク質に由来する少なくとも2つのドメインを含むポリペプチドである。これらのドメインは、キメラタンパク質、ダイマータンパク質又は融合タンパク質として一緒にして、典型的には、イヌIgG免疫グロブリン重鎖定常領域に由来するFcドメインの全部又は部分と結合したp60イヌTNFレセプター（p60TNFR）又はp80イヌTNFレセプター（p80TNFR）の細胞外ドメイン又はそのフラグメントによる新規なタンパク質を形成する。
“ポリペプチド”、“ペプチド”又は“タンパク質”は本明細書では互換的に用いられ、隣接残基のアルファ-アミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合によって互いに連結された線状の一連のアミノ酸残基を指す。アミノ酸残基は通常は天然の“L”異性体型である。しかしながら、該ポリペプチドが所望の機能的特性を維持するかぎり、“D”異性体型の残基で任意のL-アミノ酸残基を置換することができる。
【００５１】
“ポリヌクレオチド”及び“核酸”は互換的に用いられ、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形を指す。ポリヌクレオチドという用語はまた、互換的に二本鎖及び一本鎖分子を指す。
本明細書に定義するように、“イヌ科の動物”はまたイヌと称することができる。イヌ科の動物は、三命名法のカニス・ルプス・ファミリアリス（Canis lupus familiaris）（Canis familiaris domesticus）又はカニス・ルプス・ディンゴ（Canis lupus dingo）をもつ亜種に属するように分類できる。イヌ科の動物にはイヌの任意の種が含まれ、さらに野生変種及びペット品種が含まれ、後者はまたコンパニオン動物と称される。
“特異的に結合する”という語句は、抗体又はタンパク質と特定のタンパク質又は標的（不均質タンパク質集団中に存在する）との結合を指す。したがって、特異的な免疫アッセイ条件下では、該タンパク質は特定のタンパク質（この場合にはイヌTNF）と結合し、当該サンプル中の他のタンパク質と有意な量では結合しない。
本明細書で定義するように、“異種抗体”という用語は、宿主にとって異質であるエピトープに対し該宿主が生じる抗体を指す。
本発明を以下の実施例を参照しながらこれから説明する。これらの実施例は例証の目的で提供され、本発明を限定するものと解されることを意図しない。本発明の方法及び技術は、特段の指示がなければ、概ね当業界で周知であり、さらに多様な一般的参考文献及びより具体的な参考文献（本明細書中で引用及び考察される）に記載されている通常的な方法にしたがって実施される。
【実施例１】
【００５２】
抗イヌTNFレセプター融合タンパク質をコードするDNAの発現
抗イヌIgGポリクローナル抗体-HRP複合物を用いてELISAを実施し、イヌTNFR-Fc融合タンパク質発現上清のイヌTNF結合を決定した。結果は図23に示されている。
配列番号：6（HCA（caTNFRp50:ca IgGHCA Fc））、配列番号：7（HCB(caTNFRp50:ca IgGHCB Fc））、配列番号：8（HCC(caTNFRp50:ca IgGHCC Fc））及び配列番号：9（HCD（caTNFRp50:ca IgGHCD Fc））をコードする発現プラスミドのCHO細胞へのトランスフェクションは多様な被検上清をもたらし、これらを等価のヒトTNFR-Fcと比較した。前記TNFR-Fcは、配列番号：7との融合と類似する態様で、イヌHCBヒンジ-CH2-CH3とN-末端融合させたヒトTNFR細胞外ドメインを含んでいる。
図24は、プロテインA及びプロテインGの縦列セファロースカラムでのアフィニティー捕捉後の精製イヌTNFR-Fc融合タンパク質による結合のELISAの結果を示す。この図から分かるように、イヌTNFレセプター融合タンパク質のHCB及びHCC型はプロテインA及びプロテインGによって効率的に捕捉されたが、一方、該融合タンパク質のHCA及びHCD型はあまり捕捉されなかった。更なる分析（データは示されていない）は、イヌTNFR-HCBはプロテインAに効率的に捕捉されるが、一方、イヌTNFR-HCC型はプロテインGによって捕捉され得ることを示した。
図25は、プロテインA及びプロテインGの縦列アフィニティークロマトグラフィー生成物の非還元SDS-PAGEの結果を示し、この結果では、イヌTNFR融合タンパク質のHCA（配列番号：6）及びHCD（配列番号：9）アイソフォームの貧弱な回収が確認される。
【実施例２】
【００５３】
イヌTNF活性の阻害
本実験では、本発明の融合ポリペプチドがTNFの生物学的活性のアンタゴニストとして作用するか否かが判定された。図26及び27はイヌTNF-アルファ生物活性（R＆D systems, 1ng/mL）の阻害の結果を示し、NF-kB-EGFPレセプター構築物pTRH1（Vince et al., Cell 131, 682, 2007）をトランスフェクトした293-HEK細胞を用いた（これらの細胞はイヌTNFに蛍光によって応答する）。イヌTNFR融合タンパク質のイヌTNFR-HCB（配列番号：7）（図26）及びイヌTNFR-HCC（配列番号：8）（図27）アイソフォームの両方が、ヒトTNFR-イヌHCBコントロール融合タンパク質（図27で定量）と同様にTNF誘発蛍光を同等に阻害した。このアッセイのIC50は約1ng/mLであった。
【実施例３】
【００５４】
TNFレセプター融合タンパク質は補体活性を欠く
図28は補体C1q結合ELISAの結果を示す。イヌTNFR-HCB、イヌTNFR-HCC及びヒトTNFR-イヌHCB融合タンパク質をイヌTNF前被覆プレートでインキュベートした（4μg/mL）。比較のために、神経成長因子（NGF）に特異性を有するイヌ化モノクローナル抗体（MAb；イヌアイソタイプHCB）をNGF被覆プレートでインキュベートした。前記プレートを洗浄し、補体供給源として正常又は加熱殺滅ヒト血清とともにインキュベートした。補体C1qの結合は、C1q反応性ポリクローナル抗体-HRP複合物を用いて検出した。結果から分かるように、イヌHCBモノクローナル抗体は補体を動員できたが、驚くべきことに完全イヌ又はヒトTNFR-イヌHCB融合タンパク質もイヌTNFR-HCC融合タンパク質も補体を動員できなかった（他の実験では、抗NGF MAbのHCCアイソタイプはC1qと結合する（データは示されていない））。
総合すれば、これらの結果は、本発明のイヌTNFレセプター融合タンパク質とヒトTNFR-イヌFcキメラ構築物はイヌTNFと結合し、さらにELISA及び阻害アッセイの両方によって等しく潜在能力を有することを示し、本融合プロセスは完全に活性なイヌ型TNFレセプター融合タンパク質を生じることを明らかにした。
さらにまた、これらの結果は、プロテインA及びプロテインGによる精製は、イヌIgG重鎖定常ドメインのいずれかとイヌTNFR細胞外ドメインとの単純な融合では達成できないことを示している。なぜならば、予想に反してイヌIgG HCA又はHCD定常ドメインのいずれもこれらの有用な精製材料と結合する能力を付与しなかったからである。したがって、HCB及びHCC IgG定常ドメインがTNFR-Fc融合タンパク質作製のための望ましい融合パートナーであり、前記融合タンパク質は、イヌ疾患治療の獣医学領域における臨床使用規模で実用的に精製できる。
図28は、イヌTNF レセプター融合タンパク質のHCB及びHCCアイソフォームの設計は、予想外に補体動員能力の欠如をもたらすことを示す。したがって、このイヌTNFレセプター融合タンパク質は、ヒトレセプターTNFのそれと等価のイヌTNFとの強力な結合とTNF炎症活性部位への補体損傷補充の望ましい欠如の予想外の組合せを示す。したがって、本発明のイヌTNFレセプター融合タンパク質は、驚くべきことにイヌTNFによって媒介されるイヌ疾患の治療に有用である。
【００５５】
図29は、イヌTNFR-HCB（配列番号：7）ポリペプチド融合タンパク質ダイマーの、pH5での選択的溶出による前記の高分子量凝集物からの最適化精製の結果を示す。免疫グロブリンプロテインA精製の標準的手順は、中性pHでの結合及びpH3での溶出である。本イヌTNFR-HCB融合タンパク質（配列番号：7）はこの方法で捕捉及び溶出できるが、CHO生成物の顕著な部分が高分子量凝集物の形態として存在する（図29B、レーン1；及び図25、レーンHCB（当該図の最上部でまさにゲルに進入しようとしている））。そのような凝集物は免疫原性であり、それらを除去することが所望される。驚くべきことに、該高分子量凝集物は、溶出緩衝液のpHをより高いpHに改変することによって、イヌTNFR-HCB融合タンパク質の好ましいダイマー型から取り除くことができた。図29Aでは、配列番号：7の発現によってCHO細胞で生成されたイヌTNFR-HCBタンパク質は、pH7でプロテインAカラムに結合され、続いてpH5の緩衝液で溶出されて、イヌTNFR-HCB融合タンパク質ダイマーを特異的に溶出させた。イヌTNFR-HCBの高分子量凝集物は続いてpH4.5−4.7で溶出された。この分画をCHO細胞発現TNFR-HCBタンパク質とSDS-PAGEによって比較した（図29B）。ダイマー及び高分子量凝集物を含む、標準的なpH3溶出によって精製される元のTNFR-HCB調製物はレーン1及び4に示されている。本発明にしたがって調製した、精製ダイマーを含むpH5溶出物（図29Aの25−45mLの泳動体積から収集）はレーン2及び5に示され、一方、より低いpHで溶出される凝集型（図29Aの50−60mLの泳動体積から収集）はレーン3及び6に示される。該高分子量凝集物は、還元条件下で観察される同一のバンド形成パターンによってイヌTNFR-HCB融合タンパク質であると確認された（レーン4、5及び6）。イヌTNFR-HCB融合タンパク質ダイマーの純度の改善は、レーン1及び2の比較によって明白である。したがって、本発明の新規なpH5プロテインA溶出条件は、治療薬としての使用に適切な高純度のイヌTNFR-HCB融合タンパク質の調製で有用である。
【実施例４】
【００５６】
新規なイヌTNFR p80細胞外ドメインタンパク質配列
図30は、新規なイヌTNFR p80細胞外ドメインアミノ酸配列の派生物を示す。ヒトp80細胞外ドメイン配列（P20333、シグナル配列には下線が付されている）と比較すれば、イヌTNFR p80の2つの注解付き変種の派生配列であるクローンXP_544562.2及びDN368636は、TNFR p80の不完全型として同定され、そのどちらも哺乳動物細胞で発現され得る完全なイヌTNFR p80細胞外ドメイン配列をコードしない：クローンXP_544562.2（図30に膜貫通ドメインとして可能なかぎりの翻訳が示さる）ではシグナル配列の欠如及びN-末端配列VPGが失われているため、及びクローンDN368636では膜基部細胞外ドメイン配列の欠如及び不正確なC-末端配列（TRRH）のため。これら2つの配列の組合せによって、配列番号：14に示されるイヌTNFR p80 ECDの新規な配列が得られる。
本明細書に引用した全ての文書類は参照により本明細書に含まれる。本発明に記載した実施態様の多様な改変及び変型が、本発明の範囲を逸脱することなく当業者には明白であろう。本発明を具体的な好ましい実施態様との関連で説明してきたが、特許請求の範囲に記載した本発明はそのような個々の実施態様に限定されるべきではないことは理解されよう。実際のところ、本発明の実施に関して記載した態様の当業者に明白な多様な改変が本発明によってカバーされよう。
【００５７】
配列リスト
配列番号：1（イヌTNFR p60シグナル配列及びECD）
MGLPTVPGLLLPLVLLALLLEIYPISVTALVPHPRNRVKRAILCPQGKYIHPQDDSICCTKCHKGTYLYNDCPGPGLDTDCRECENGTFTASENHLRQCLSCSKCRKEMNQVEISPCTVYRDTVCGCRKNQYRFYWSETLFQCNNCSLCLNGTVQISCQEKQNTICTCHAGFFLREHECVSCVNCKKNTECGKLCLPPVETVKVPQDPGST
配列番号：2（イヌIgG HCA重鎖-ヒンジCH2, CH3）
FNECRCTDTPPCPVPEPLGGPSVLIFPPKPKDILRITRTPEVTCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQSREQQFNGTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIDLPSPIERTISKARGRAHKPSVYVLPPSPKELSSSDTVSITCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPERKHRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDPFTCAVMHETLQNHYTDLSLSHSPGK
配列番号：3（イヌIgG HCB重鎖-ヒンジCH2, CH3）
PKRENGRVPRPPDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPGK
配列番号：4（イヌIgG HCC重鎖-ヒンジCH2, CH3）
AKECECKCNCNNCPCPGCGLLGGPSVFIFPPKPKDILVTARTPTVTCVVVDLDPENPEVQISWFVDSKQVQTANTQPREEQSNGTYRVVSVLPIGHQDWLSGKQFKCKVNNKALPSPIEEIISKTPGQAHQPNVYVLPPSRDEMSKNTVTLTCLVKDFFPPEIDVEWQSNGQQEPESKYRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQISLSHSPGK
配列番号：5（イヌIgG HCD重鎖-ヒンジCH2, CH3）
PKESTCKCISPCPVPESLGGPSVFIFPPKPKDILRITRTPEITCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQPREQQFNSTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIGLPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSPKELSSSDTVTLTCLIKDFYPPEIDVEWQSNGQPEPESKYHTTAPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDTFTCAVMHEALQNHYTDLSLSHSPGK
配列番号：6（caTNFrecp60-HCA）
MGLPTVPGLLLPLVLLALLLEIYPISVTALVPHPRNRVKRAILCPQGKYIHPQDDSICCTKCHKGTYLYNDCPGPGLDTDCRECENGTFTASENHLRQCLSCSKCRKEMNQVEISPCTVYRDTVCGCRKNQYRFYWSETLFQCNNCSLCLNGTVQISCQEKQNTICTCHAGFFLREHECVSCVNCKKNTECGKLCLPPVETVKVPQDPGSTFNECRCTDTPPCPVPEPLGGPSVLIFPPKPKDILRITRTPEVTCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQSREQQFNGTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIDLPSPIERTISKARGRAHKPSVYVLPPSPKELSSSDTVSITCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPERKHRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDPFTCAVMHETLQNHYTDLSLSHSPGK**
配列番号：7（caTNFrecp60-HCB）
MGLPTVPGLLLPLVLLALLLEIYPISVTALVPHPRNRVKRAILCPQGKYIHPQDDSICCTKCHKGTYLYNDCPGPGLDTDCRECENGTFTASENHLRQCLSCSKCRKEMNQVEISPCTVYRDTVCGCRKNQYRFYWSETLFQCNNCSLCLNGTVQISCQEKQNTICTCHAGFFLREHECVSCVNCKKNTECGKLCLPPVETVKVPQDPGSTPKRENGRVPRPPDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPGK**
配列番号：8（caTNFrecp60-HCC）
MGLPTVPGLLLPLVLLALLLEIYPISVTALVPHPRNRVKRAILCPQGKYIHPQDDSICCTKCHKGTYLYNDCPGPGLDTDCRECENGTFTASENHLRQCLSCSKCRKEMNQVEISPCTVYRDTVCGCRKNQYRFYWSETLFQCNNCSLCLNGTVQISCQEKQNTICTCHAGFFLREHECVSCVNCKKNTECGKLCLPPVETVKVPQDPGSTAKECECKCNCNNCPCPGCGLLGGPSVFIFPPKPKDILVTARTPTVTCVVVDLDPENPEVQISWFVDSKQVQTANTQPREEQSNGTYRVVSVLPIGHQDWLSGKQFKCKVNNKALPSPIEEIISKTPGQAHQPNVYVLPPSRDEMSKNTVTLTCLVKDFFPPEIDVEWQSNGQQEPESKYRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQISLSHSPGK**
配列番号：9（caTNFrecp60-HCD）
MGLPTVPGLLLPLVLLALLLEIYPISVTALVPHPRNRVKRAILCPQGKYIHPQDDSICCTKCHKGTYLYNDCPGPGLDTDCRECENGTFTASENHLRQCLSCSKCRKEMNQVEISPCTVYRDTVCGCRKNQYRFYWSETLFQCNNCSLCLNGTVQISCQEKQNTICTCHAGFFLREHECVSCVNCKKNTECGKLCLPPVETVKVPQDPGSTPKESTCKCISPCPVPESLGGPSVFIFPPKPKDILRITRTPEITCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQPREQQFNSTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIGLPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSPKELSSSDTVTLTCLIKDFYPPEIDVEWQSNGQPEPESKYHTTAPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDTFTCAVMHEALQNHYTDLSLSHSPGK**
配列番号：10（caTNFrecp60-非グリコシルHCA)
MGLPTVPGLLLPLVLLALLLEIYPISVTALVPHPRNRVKRAILCPQGKYIHPQDDSICCTKCHKGTYLYNDCPGPGLDTDCRECENGTFTASENHLRQCLSCSKCRKEMNQVEISPCTVYRDTVCGCRKNQYRFYWSETLFQCNNCSLCLNGTVQISCQEKQNTICTCHAGFFLREHECVSCVNCKKNTECGKLCLPPVETVKVPQDPGSTFNECRCTDTPPCPVPEPLGGPSVLIFPPKPKDILRITRTPEVTCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQSREQQFAGTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIDLPSPIERTISKARGRAHKPSVYVLPPSPKELSSSDTVSITCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPERKHRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDPFTCAVMHETLQNHYTDLSLSHSPGK**
配列番号：11（caTNFrecp60-非グリコシルHCB）
MGLPTVPGLLLPLVLLALLLEIYPISVTALVPHPRNRVKRAILCPQGKYIHPQDDSICCTKCHKGTYLYNDCPGPGLDTDCRECENGTFTASENHLRQCLSCSKCRKEMNQVEISPCTVYRDTVCGCRKNQYRFYWSETLFQCNNCSLCLNGTVQISCQEKQNTICTCHAGFFLREHECVSCVNCKKNTECGKLCLPPVETVKVPQDPGSTPKRENGRVPRPPDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFAGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPGK**
配列番号：12（caTNFrecp60-非グリコシルHCC）
MGLPTVPGLLLPLVLLALLLEIYPISVTALVPHPRNRVKRAILCPQGKYIHPQDDSICCTKCHKGTYLYNDCPGPGLDTDCRECENGTFTASENHLRQCLSCSKCRKEMNQVEISPCTVYRDTVCGCRKNQYRFYWSETLFQCNNCSLCLNGTVQISCQEKQNTICTCHAGFFLREHECVSCVNCKKNTECGKLCLPPVETVKVPQDPGSTAKECECKCNCNNCPCPGCGLLGGPSVFIFPPKPKDILVTARTPTVTCVVVDLDPENPEVQISWFVDSKQVQTANTQPREEQSAGTYRVVSVLPIGHQDWLSGKQFKCKVNNKALPSPIEEIISKTPGQAHQPNVYVLPPSRDEMSKNTVTLTCLVKDFFPPEIDVEWQSNGQQEPESKYRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQISLSHSPGK**
配列番号：13（caTNFrecp60-非グリコシルHCD）
MGLPTVPGLLLPLVLLALLLEIYPISVTALVPHPRNRVKRAILCPQGKYIHPQDDSICCTKCHKGTYLYNDCPGPGLDTDCRECENGTFTASENHLRQCLSCSKCRKEMNQVEISPCTVYRDTVCGCRKNQYRFYWSETLFQCNNCSLCLNGTVQISCQEKQNTICTCHAGFFLREHECVSCVNCKKNTECGKLCLPPVETVKVPQDPGSTPKESTCKCISPCPVPESLGGPSVFIFPPKPKDILRITRTPEITCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQPREQQFASTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIGLPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSPKELSSSDTVTLTCLIKDFYPPEIDVEWQSNGQPEPESKYHTTAPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDTFTCAVMHEALQNHYTDLSLSHSPGK**
配列番号：14（イヌTNFR p80シグナル配列及びECD）
MAPAALWALLAAGLQLWGAGRAVPGQATQLPYVPDPELGSSCQQSEYFDQRTQMCCSMCPPGSHARLFCTKTSNTVCARCENSTYTQLWNWVPECLSCGSRCGADQVETQACTREQNRICSCKSGWYCTLRRQGGCRLCAPLRRCRPGFGVAKPGTATSDVVCAPCAPGTFSNTTSSTDTCRPHRICSSVAVPGNASVDAVCSPAPPTVRTAPRPASTRQPGSTQPRPAEPTPGPSTPPRTSVLFPAVPSPPAEGLSTGD
配列番号：15（caTNFrecp80-HCA）
MAPAALWALLAAGLQLWGAGRAVPGQATQLPYVPDPELGSSCQQSEYFDQRTQMCCSMCPPGSHARLFCTKTSNTVCARCENSTYTQLWNWVPECLSCGSRCGADQVETQACTREQNRICSCKSGWYCTLRRQGGCRLCAPLRRCRPGFGVAKPGTATSDVVCAPCAPGTFSNTTSSTDTCRPHRICSSVAVPGNASVDAVCSPAPPTVRTAPRPASTRQPGSTQPRPAEPTPGPSTPPRTSVLFPAVPSPPAEGLSTGDFNECRCTDTPPCPVPEPLGGPSVLIFPPKPKDILRITRTPEVTCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQSREQQFNGTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIDLPSPIERTISKARGRAHKPSVYVLPPSPKELSSSDTVSITCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPERKHRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDPFTCAVMHETLQNHYTDLSLSHSPGK**
配列番号：16（caTNFrecp80-HCB）
MAPAALWALLAAGLQLWGAGRAVPGQATQLPYVPDPELGSSCQQSEYFDQRTQMCCSMCPPGSHARLFCTKTSNTVCARCENSTYTQLWNWVPECLSCGSRCGADQVETQACTREQNRICSCKSGWYCTLRRQGGCRLCAPLRRCRPGFGVAKPGTATSDVVCAPCAPGTFSNTTSSTDTCRPHRICSSVAVPGNASVDAVCSPAPPTVRTAPRPASTRQPGSTQPRPAEPTPGPSTPPRTSVLFPAVPSPPAEGLSTGDPKRENGRVPRPPDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPGK**
配列番号：17（caTNFrecp80-HCC）
MAPAALWALLAAGLQLWGAGRAVPGQATQLPYVPDPELGSSCQQSEYFDQRTQMCCSMCPPGSHARLFCTKTSNTVCARCENSTYTQLWNWVPECLSCGSRCGADQVETQACTREQNRICSCKSGWYCTLRRQGGCRLCAPLRRCRPGFGVAKPGTATSDVVCAPCAPGTFSNTTSSTDTCRPHRICSSVAVPGNASVDAVCSPAPPTVRTAPRPASTRQPGSTQPRPAEPTPGPSTPPRTSVLFPAVPSPPAEGLSTGDAKECECKCNCNNCPCPGCGLLGGPSVFIFPPKPKDILVTARTPTVTCVVVDLDPENPEVQISWFVDSKQVQTANTQPREEQSNGTYRVVSVLPIGHQDWLSGKQFKCKVNNKALPSPIEEIISKTPGQAHQPNVYVLPPSRDEMSKNTVTLTCLVKDFFPPEIDVEWQSNGQQEPESKYRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQISLSHSPGK**
配列番号：18（caTNFrecp80-HCD）
MAPAALWALLAAGLQLWGAGRAVPGQATQLPYVPDPELGSSCQQSEYFDQRTQMCCSMCPPGSHARLFCTKTSNTVCARCENSTYTQLWNWVPECLSCGSRCGADQVETQACTREQNRICSCKSGWYCTLRRQGGCRLCAPLRRCRPGFGVAKPGTATSDVVCAPCAPGTFSNTTSSTDTCRPHRICSSVAVPGNASVDAVCSPAPPTVRTAPRPASTRQPGSTQPRPAEPTPGPSTPPRTSVLFPAVPSPPAEGLSTGDPKESTCKCISPCPVPESLGGPSVFIFPPKPKDILRITRTPEITCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQPREQQFNSTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIGLPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSPKELSSSDTVTLTCLIKDFYPPEIDVEWQSNGQPEPESKYHTTAPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDTFTCAVMHEALQNHYTDLSLSHSPGK**
配列番号：19（caTNFrecp80-非グリコシルHCA）
MAPAALWALLAAGLQLWGAGRAVPGQATQLPYVPDPELGSSCQQSEYFDQRTQMCCSMCPPGSHARLFCTKTSNTVCARCENSTYTQLWNWVPECLSCGSRCGADQVETQACTREQNRICSCKSGWYCTLRRQGGCRLCAPLRRCRPGFGVAKPGTATSDVVCAPCAPGTFSNTTSSTDTCRPHRICSSVAVPGNASVDAVCSPAPPTVRTAPRPASTRQPGSTQPRPAEPTPGPSTPPRTSVLFPAVPSPPAEGLSTGDFNECRCTDTPPCPVPEPLGGPSVLIFPPKPKDILRITRTPEVTCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQSREQQFAGTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIDLPSPIERTISKARGRAHKPSVYVLPPSPKELSSSDTVSITCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPERKHRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDPFTCAVMHETLQNHYTDLSLSHSPGK**
配列番号：20（caTNFrecp80-非グリコシルHCB）
MAPAALWALLAAGLQLWGAGRAVPGQATQLPYVPDPELGSSCQQSEYFDQRTQMCCSMCPPGSHARLFCTKTSNTVCARCENSTYTQLWNWVPECLSCGSRCGADQVETQACTREQNRICSCKSGWYCTLRRQGGCRLCAPLRRCRPGFGVAKPGTATSDVVCAPCAPGTFSNTTSSTDTCRPHRICSSVAVPGNASVDAVCSPAPPTVRTAPRPASTRQPGSTQPRPAEPTPGPSTPPRTSVLFPAVPSPPAEGLSTGDPKRENGRVPRPPDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFAGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPGK**
配列番号：21（caTNFrecp80-非グリコシルHCC）
MAPAALWALLAAGLQLWGAGRAVPGQATQLPYVPDPELGSSCQQSEYFDQRTQMCCSMCPPGSHARLFCTKTSNTVCARCENSTYTQLWNWVPECLSCGSRCGADQVETQACTREQNRICSCKSGWYCTLRRQGGCRLCAPLRRCRPGFGVAKPGTATSDVVCAPCAPGTFSNTTSSTDTCRPHRICSSVAVPGNASVDAVCSPAPPTVRTAPRPASTRQPGSTQPRPAEPTPGPSTPPRTSVLFPAVPSPPAEGLSTGDAKECECKCNCNNCPCPGCGLLGGPSVFIFPPKPKDILVTARTPTVTCVVVDLDPENPEVQISWFVDSKQVQTANTQPREEQSAGTYRVVSVLPIGHQDWLSGKQFKCKVNNKALPSPIEEIISKTPGQAHQPNVYVLPPSRDEMSKNTVTLTCLVKDFFPPEIDVEWQSNGQQEPESKYRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQISLSHSPGK**
配列番号：22（caTNFrecp80-非グリコシルHCD）
MAPAALWALLAAGLQLWGAGRAVPGQATQLPYVPDPELGSSCQQSEYFDQRTQMCCSMCPPGSHARLFCTKTSNTVCARCENSTYTQLWNWVPECLSCGSRCGADQVETQACTREQNRICSCKSGWYCTLRRQGGCRLCAPLRRCRPGFGVAKPGTATSDVVCAPCAPGTFSNTTSSTDTCRPHRICSSVAVPGNASVDAVCSPAPPTVRTAPRPASTRQPGSTQPRPAEPTPGPSTPPRTSVLFPAVPSPPAEGLSTGDPKESTCKCISPCPVPESLGGPSVFIFPPKPKDILRITRTPEITCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQPREQQFASTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIGLPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSPKELSSSDTVTLTCLIKDFYPPEIDVEWQSNGQPEPESKYHTTAPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDTFTCAVMHEALQNHYTDLSLSHSPGK**
【図１】
2015509714.tif 000002
【図２】
2015509714.tif 000003
【図３】
2015509714.tif 000004
【図４】
2015509714.tif 000005
【図５】
2015509714.tif 000006
【図６】
2015509714.tif 000007
【図７】
2015509714.tif 000008
【図８】
2015509714.tif 000009
【図９】
2015509714.tif 000010
【図１０】
2015509714.tif 000011
【図１１】
2015509714.tif 000012
【図１２】
2015509714.tif 000013
【図１３】
2015509714.tif 000014
【図１４】
2015509714.tif 000015
【図１５】
2015509714.tif 000016
【図１６】
2015509714.tif 000017
【図１７】
2015509714.tif 000018
【図１８】
2015509714.tif 000019
【図１９】
2015509714.tif 000020
【図２０】
2015509714.tif 000021
【図２１】
2015509714.tif 000022
【図２２】
2015509714.tif 000023
【図２３】
2015509714.tif 000024
【図２４】
2015509714.tif 000025
【図２５】
2015509714.tif 000026
【図２６】
2015509714.tif 000027
【図２８】
2015509714.tif 000028
【図２９Ａ】
2015509714.tif 000029
【図２７】
2015509714.tif 000030
【図２９Ｂ】
2015509714.tif 000031
【図３０】
2015509714.tif 000032
【配列表】
2015509714000001.app
【国際調査報告】
2015509714.tif 000033
2015509714.tif 000034
2015509714.tif 000035