(57)【要約】脂質ベースの粒子および抗ＥＮＤＯ１８０抗体を含む組成物、ならびに線維症を含む細胞増殖性疾患または障害の治療および腫瘍進行の軽減に有用な、癌および線維症細胞への治療剤の標的化された送達のためにそれを使用する方法を、本明細書に開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）脂質ベースの担体部分と、ｂ）ＥＮＤＯ１８０標的部分と、ｃ）有効量の治療剤もしくは診断剤またはそれらの組み合わせ、を含む、組成物であって、前記担体部分および前記標的部分は、共有結合される、組成物。
【請求項２】
前記担体部分および前記標的部分は、合成ポリマー、天然ポリマー、または半合成ポリマーによる前記担体部分の表面修飾を介して共有結合される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記合成ポリマーは、ＰＥＧ部分を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＰＥＧ部分は、ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ［３−（Ｎ−スクシンイミジルオキシグルタリル）アミノプロピル，ポリエチレングリコール−カルバミルジステアロイルホスファチジル−エタノールアミン］を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記天然ポリマーは、多糖またはグリコサミノグリカンを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
前記グリコサミノグリカンは、ヒアルロン酸を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＥＮＤＯ１８０標的部分は、細胞上に存在するＥＮＤＯ１８０ポリペプチドの細胞外ドメインに結合し、前記ＥＮＤＯ１８０ポリペプチドによって前記細胞内に内部移行される、ＥＮＤＯ１８０結合タンパク質を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＥＮＤＯ１８０結合タンパク質は、ＥＮＤＯ１８０に結合することができるＥＮＤＯ１８０抗体またはその機能的フラグメントを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
ＥＮＤＯ１８０に結合することができる前記ＥＮＤＯ１８０抗体またはその機能的フラグメントは、完全ＩｇＧ、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ヒト化抗原結合フラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、それらの重鎖および／もしくは軽鎖の可変部分、Ｆａｂミニ抗体、ならびにｓｃＦｖ、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ＥＮＤＯ１８０抗体またはその機能的フラグメントは、
ａ．受託番号ＬＭＢＰ  ７２０３ＣＢでＢＣＣＭに寄託されたハイブリドーマ細胞系Ｅ３−８Ｄ８によって生成される、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント、
ｂ．（ａ）の抗体と同じエピトープに結合する抗体またはその抗原結合フラグメント、
ｃ．（ａ）の抗体もしくはその抗原結合フラグメントのヒト化型、または（ｂ）の抗体もしくはその抗原結合フラグメントのヒト化型、
ｄ．（ａ）の抗体もしくはその抗原結合フラグメントのキメラ型、または（ｂ）の抗体もしくはその抗原結合フラグメントのキメラ型、
ｅ．前記ＥＮＤＯ１８０受容体によって細胞内に内部移行される、（ａ）の抗体の抗原結合ドメインを含む組み換えポリペプチドまたはその抗原結合フラグメント、
ｆ．配列番号６に実質的に類似のポリペプチドを含む、抗体の抗原結合フラグメント、ならびに
ｇ．配列番号７および８に記載されるアミノ酸配列に実質的に類似のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む、組み換えポリペプチドからなる群から選択される、請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ＥＮＤＯ１８０抗体またはその機能的フラグメントは、前記単離モノクローナル抗体のヒト化型の抗原結合フラグメントを含む、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記脂質ベースの担体部分は、脂質粒子を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記脂質粒子は、ホスファチジルコリンもしくはその誘導体、ホスファチジルグリセロールもしくはその誘導体、およびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）もしくはその誘導体、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、１つ以上の脂質を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記脂質粒子は、１つ以上の陽イオン性脂質をさらに含む、請求項１２または１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記脂質粒子は、コレステロールをさらに含む、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記脂質粒子は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）およびコレステロールを含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記脂質粒子は、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）をさらに含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記脂質粒子は、ＤＯＰＥ、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、およびＰＥＧ部分ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥを、約４．５：２０：７５：０．５（ＤＯＰＥ：ＨＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）のモル比で含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記脂質粒子は、ＤＯＴＭＡをさらに含む、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記脂質粒子は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、およびコレステロール（Ｃｈｏｌ）を、約４：２：１（ＤＯＰＥ：ＤＯＴＭＡ：Ｃｈｏｌ）のモル比で含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記脂質粒子は、ＤＰＰＥおよびコレステロールを含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２２】
前記脂質粒子は、大豆ＰＣをさらに含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記脂質粒子は、大豆ＰＣ、ＤＰＰＥ、およびコレステロールを、約３：１：１（大豆ＰＣ：ＤＰＰＥ：コレステロール）のモル比で含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記脂質粒子は、直径が約８５〜約２００ｎＭ、好ましくは約８５〜約１３０ｎｍである、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記脂質粒子は、約（−７）〜約（−４０）のゼータ電位を含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記組成物は、放射性同位体、フルオロフォア、発光剤、磁気標識、および酵素標識からなる群から選択される造影剤である診断剤を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物は、核酸化合物および非核酸化合物、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、少なくとも１つの治療剤を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２８】
前記非核酸化合物は、小分子、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣体、糖脂質、および抗体、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記治療剤は、ドキソルビシンまたはマイトマイシンである、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記核酸は、アンチセンス化合物、化学修飾二本鎖ＲＮＡ化合物、非修飾二本鎖ＲＮＡ化合物、化学修飾ｓｈＲＮＡ化合物、非修飾ｓｈＲＮＡ化合物、化学修飾ｍｉＲＮＡ化合物、および非修飾ｍｉＲＮＡ化合物、化学修飾ｓｉＲＮＡ、化学的非修飾ｓｉＲＮＡ、およびリボザイム、またはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３１】
前記治療剤は、化学修飾ｓｉＲＮＡ化合物および非修飾ｓｉＲＮＡ化合物からなる群から選択されるｄｓＲＮＡ分子である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
増殖性障害を患う対象を治療する方法であって、前記対象に、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の組成物の治療有効量を投与することを含む、方法。
【請求項３３】
治療法で使用するための請求項１〜３１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３４】
前記治療法は、増殖性障害の治療を含む、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記組成物は、全身投与される、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項３６】
前記増殖性障害は、固形腫瘍、造血器腫瘍、転移癌、線維症、およびマクロファージ関連障害からなる群から選択される、請求項３２〜３４に記載の方法または組成物。
【請求項３７】
前記増殖性障害は、固形腫瘍または造血器腫瘍である、請求項３６に記載の方法または組成物。
【請求項３８】
前記腫瘍は、卵巣腫瘍、乳房腫瘍、造骨性／骨細胞癌、前立腺癌、頭頸部癌、白血病、腎細胞癌、および移行上皮癌からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法または組成物。
【請求項３９】
前記マクロファージ関連障害は、炎症またはアテローム性動脈硬化症を含む、請求項３６に記載の方法または組成物。
【請求項４０】
対象における増殖性障害を診断するための方法であって、前記対象由来の身体試料を、ａ）担体部分、ｂ）ＥＮＤＯ１８０標的部分、およびｃ）診断剤を含む組成物と接触させ、前記生体試料中の前記診断剤のレベルを、健常対象由来の参照試料のものまたは既知の基準と比較することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１２年１月１日に出願された、表題「ＥＮＤＯ１８０−Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ」の米国仮出願第６１／５８２３７３号の利益を主張し、これは、その全体として、および全ての目的で、参照により本明細書に組み込まれる。  
【０００２】
配列表
本出願は、サイズが３３キロバイトであり、２０１２年１２月３１日にＩＢＭ−ＰＣＴ機形式で作成され、ＭＳ−Ｗｉｎｄｏｗｓとのオペレーティングシステム互換性を有する、ファイル名「２３０−ＰＣＴ１＿ＳＥＱＬＩＳＴＩＮＧ．ＳＴ２５．ｔｘｔ」に存在するヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列を参照により組み込む。  
【０００３】
発明の分野
担体部分（脂質ベースの粒子等）および抗ＥＮＤＯ１８０標的部分（抗ＥＮＤＯ１８０抗体等）を含む組成物、ならびに腫瘍細胞、マクロファージ、内皮細胞、および線維症細胞を含む、ＥＮＤＯ１８０を発現する細胞および組織への治療剤および／または診断剤の送達のためにそれを使用する方法を、本明細書に開示する。本組成物および方法は、細胞増殖性疾患、または線維症、癌、もしくは炎症を含む障害の治療、ならびに腫瘍進行の制御（調節）に有用である。
【背景技術】
【０００４】
ＣＤ２８０、ｕＰＡＲＡＰ（ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体関連タンパク質）、およびマンノース受容体Ｃ２型（ＭＲＣ２）としても知られるＥＮＤＯ１８０受容体は、結合したリガンドをエンドソームにおける分解へと誘導する、リサイクルされるエンドサイトーシス受容体である。それは、ウロキナーゼ型プラスミン活性化因子（ｕＰＡ）およびウロキナーゼ型プラスミン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）との三重複合体の一部であり、プラスミノーゲンからのプラスミンの生成に関与する。また、プラスミンは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の代謝回転、および潜在性ＴＧＦ−βの活性形態へのタンパク質分解性転換の両方において、役割を果たすことが分かっている。
【０００５】
ＥＮＤＯ１８０は、マクロファージマンノース受容体ファミリーであるマンノース受容体、ホスホリパーゼＡ２、およびＤＥＣ−２０５／ＭＲ６と相同性を共有する（Ｉｓａｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：２６０６−２６１８、Ｓｈｅｉｋｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１３：１０２１−１０３２、Ｂｅｈｒｅｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１９９３−２００２）。ＥＮＤＯ１８０は、原形質膜から、後期エンドソーム／リソソーム区画までではなく、リサイクリングエンドソームまでが標的とされるという点で、マンノース受容体のファミリーの中でも特殊であり（Ｈｏｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｉｓａｃｋｅ，２００２．ＪＢＣ  ３５：３２３２０−３１）、細胞遊走、および細胞内分解のためのコラーゲンの取り込みを促進することによって、細胞運動性および細胞外マトリックスの再構築において機能を果たす（Ｂｅｈｒｅｎｄｔ．２００４  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．３８５（２）：１０３−３６、Ｋｊｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００４  Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２９３（ｌ）：１０６−１６、Ｗｉｅｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６７（２１）：１０２３０−４０）。
【０００６】
ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２００４／１００７５９号は、ＥＮＤＯ１８０と関連する疾患を、それぞれ、診断および治療する方法に関する。ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２０１０／１１１１９８号は、抗ＥＮＤＯ１８０抗体、それを含む組成物、およびその使用を提供する。  
【０００７】
脂質複合体
米国第２００９／０２３２７３０号は、免疫リポソームを生成する方法を開示する。米国第２０１０／０００８９３７号は、白血球選択的送達剤を開示する。
【０００８】
治療剤および診断剤の標的化された送達系は、非常に有用であろう。
【発明の概要】
【０００９】
治療剤および診断剤の異常増殖細胞への選択的かつ標的化された送達のための組成物を本明細書に開示する。本組成物は、ＥＮＤＯ１８０受容体を発現する細胞への治療剤または診断剤の標的化送達のため、ＥＮＤＯ１８０標的部分と担体部分とを含み、さらに、治療剤および／または診断剤を含む。本組成物は、オリゴヌクレオチド、抗体もしくはそのフラグメント、ポリペプチドもしくはペプチド、またはそれらの組み合わせ等の小分子を含む、少なくとも１つの診断剤および／または治療剤の、ＥＮＤＯ１８０受容体を発現する細胞の細胞内空間への標的化送達に有用である。理論に束縛されることを望むものではないが、ＥＮＤＯ１８０受容体は、線維症組織および腫瘍内の活性化された筋芽細胞上、ならびに腫瘍細胞のサブセット上、マクロファージ上、および内皮細胞上に特異的に発現する、エンドサイトーシス受容体である。
【００１０】
一態様において、ａ）担体部分、ｂ）ＥＮＤＯ１８０標的部分、ならびにｃ）治療剤および／または診断剤の有効量を含む組成物を、本明細書に開示する。
【００１１】
いくつかの実施形態において、担体部分は、脂質ベースの担体、好ましくは脂質粒子（脂質ベースのナノ粒子とも称される）を含む。いくつかの実施形態において、担体部分および標的部分は、共有結合されるか、または非共有結合で会合される。好ましい実施形態において、担体部分は、標的部分に共有結合される脂質粒子を含む。いくつかの実施形態において、脂質粒子および標的部分は、合成ポリマー、天然ポリマー、または半合成ポリマー（天然および合成の要素を含む）によるリポソームの表面修飾を介して共有結合される。いくつかの実施形態において、合成ポリマーは、ＰＥＧ部分を含む。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ部分は、ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ［３−（Ｎ−スクシンイミジルオキシグルタリル）アミノプロピル，ポリエチレングリコール−カルバミルジステアロイルホスファチジル−エタノールアミン］を含む。いくつかの実施形態において、天然ポリマーは、多糖および／またはグリコサミノグリカンを含む糖を含む。いくつかの実施形態において、グリコサミノグリカンは、ヒアルロン酸を含む。
【００１２】
ポリマーは、最初からリポソーム組成物に組み込まれていてもよく、または調製された脂質粒子と合わされてもよい。
【００１３】
いくつかの実施形態において、ＥＮＤＯ１８０標的部分は、細胞（ｃａｌｌ）上に存在するＥＮＤＯ１８０ポリペプチドの細胞外ドメインに結合し、ＥＮＤＯ１８０ポリペプチドによって細胞内に内部移行される、ＥＮＤＯ１８０結合タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ＥＮＤＯ１８０ポリペプチドは、配列番号１に記載される核酸配列と実質的に同一なポリヌクレオチドによってコードされる、配列番号２に記載されるアミノ酸配列と実質的に同一である。いくつかの実施形態において、ＥＮＤＯ１８０結合タンパク質は、ＥＮＤＯ１８０に結合することが可能なＥＮＤＯ１８０抗体またはその機能的フラグメントを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態において、ＥＮＤＯ１８０を標的とする薬剤は、
ａ．受託番号ＬＭＢＰ  ７２０３ＣＢでＢＣＣＭに寄託されたハイブリドーマ細胞系Ｅ３−８Ｄ８によって生成される、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント、
ｂ．（ａ）の抗体と同じエピトープに結合する抗体またはその抗原結合フラグメント、
ｃ．（ａ）の抗体もしくはその抗原結合フラグメントのヒト化型、または（ｂ）の抗体もしくはその抗原結合フラグメントのヒト化型、
ｄ．（ａ）の抗体もしくはその抗原結合フラグメントのキメラ型、または（ｂ）の抗体もしくはその抗原結合フラグメントのキメラ型、
ｅ．ＥＮＤＯ１８０受容体によって細胞内に内部移行される、（ａ）の抗体の抗原結合ドメインを含む組み換えポリペプチドまたはその抗原結合フラグメント、
ｆ．配列番号６に実質的に類似のポリペプチドを含む、抗体の抗原結合フラグメント、ならびに
ｇ．配列番号７および８に記載されるアミノ酸配列に実質的に類似のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む、組み換えポリペプチドからなる群から選択される。
【００１５】
いくつかの実施形態において、抗体またはそのフラグメントは、ヒト化もしくはキメラ抗体、またはそのフラグメントである。
【００１６】
Ｅ３−８Ｄ８モノクローナル抗体は、８Ｄ８、ｅ３ｂ３、および８Ｄ８Ｅ３Ｂ３としても知られている。好ましい実施形態において、モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗体もしくはその抗原結合フラグメントのヒト化型、またはモノクローナル抗体の抗体もしくはその抗原結合フラグメントのキメラ型は、細胞の表面上のＥＮＤＯ１８０に結合し、細胞内に内部移行される。
【００１７】
いくつかの実施形態において、ＥＮＤＯ１８０抗体は、完全ＩｇＧ、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、それらの重鎖および／もしくは軽鎖の可変部分、Ｆａｂミニ抗体（ＭＢ）、ならびにｓｃＦｖ、またはそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態において、ＥＮＤＯ１８０抗体は、受託番号ＬＭＢＰ  ７２０３ＣＢでＢＣＣＭに寄託されたハイブリドーマ細胞系Ｅ３−８Ｄ８によって生成されるモノクローナル抗体と同じエピトープに結合する抗体またはそのフラグメントであり、いくつかの実施形態において、ＥＮＤＯ１８０抗体は、受託番号ＬＭＢＰ  ７２０３ＣＢでＢＣＣＭに寄託されたハイブリドーマ細胞系Ｅ３−８Ｄ８によって生成されるモノクローナル抗体の抗体のヒト化型、またはそのヒト化抗体もしくはフラグメントである。いくつかの実施形態において、ＥＮＤＯ１８０抗体は、ＥＮＤＯ１８０に特異的に結合する能力を保持する、配列番号７に記載されるアミノ酸配列を有する抗原結合ドメインを含む組み換えポリペプチドまたはその変異体である。いくつかの実施形態において、ＥＮＤＯ１８０抗体は、配列番号７に記載されるアミノ酸配列に実質的に類似するアミノ酸配列を有し、１つ以上の保存的アミノ酸置換を有する、重鎖ＣＤＲ３ドメイン等のＣＤＲを含む組み換えポリペプチドまたはその変異体である。いくつかの実施形態において、変異体は、ＥＮＤＯ１８０に特異的に結合する能力を保持する。いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号８に記載されるアミノ酸配列に実質的に類似するアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３ドメイン等のＣＤＲまたはその変異体をさらに含む。いくつかの実施形態において、変異体は、ＥＮＤＯ１８０に特異的に結合する能力を保持する。
【００１８】
いくつかの実施形態において、ＥＮＤＯ１８０標的部分は、ハイブリドーマ細胞系Ｅ３−８Ｄ８（ＢＣＣＭ  受託番号ＬＭＢＰ  ７２０３ＣＢ）によって生成されるモノクローナル抗体の抗原結合ドメインを含む、ｓｃＦｖ組み換えポリペプチドを含む。
【００１９】
いくつかの実施形態において、ＥＮＤＯ１８０標的部分は、ＥＮＤＯ１８０に特異的に結合する能力を保持する、配列番号６に記載されるアミノ酸配列を有するｓｃＦｖ組み換えポリペプチド（ミニ抗体、ＭＢ）またはその変異体を含む。具体的な実施形態において、ＥＮＤＯ１８０受容体に対する親和性を呈し、配列番号７および８に記載されるＣＤＲ３ドメインを有する抗体は、抗体が受容体と接触すると、受容体によってＥＮＤＯ１８０を発現する細胞内に内部移行される。
【００２０】
いくつかの実施形態において、脂質粒子は、ホホスファチジルコリン（ｐｈｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）もしくはその誘導体、ホスファチジルグリセロールもしくはその誘導体、またはホスファチジルエタノールアミンもしくはその誘導体、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、脂質粒子は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、大豆ホスファチジルコリン（大豆ＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（卵ＰＣ）、水素添加卵ホスファチジルコリン（ＨＥＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジラウリルホスファチジルグリセロール（ＤＬＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）ジミリストイルホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）、ジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）、ジラウリルホスファチジン酸（ＤＬＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、脂質粒子は、ＤＯＴＭＡおよびＤＯＴＰ、またはそれらの組み合わせから選択される陽イオン性脂質のうちの１つ以上といった、陽イオン性脂質を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態において、脂質粒子は、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、大豆ホスファチジルコリン（大豆ＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、脂質粒子は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む。いくつかの実施形態において、脂質粒子は、１，２−ビス（ジフェニルホスフィノ）エタン（ＤＰＰＥ）を含む。いくつかの実施形態において、脂質粒子は、コレステロールをさらに含む。いくつかの実施形態において、脂質粒子は、大豆ＰＣをさらに含む。
【００２２】
いくつかの実施形態において、脂質粒子は、ＤＯＰＥおよびコレステロールを含む。
【００２３】
一実施形態において、脂質粒子は、ＨＳＰＣ、コレステロール、およびＤＯＰＥを含む。他の実施形態において、脂質粒子は、ＤＯＰＥ、コレステロール、およびＤＯＴＭＡを含む。他の実施形態において、脂質粒子は、ＨＳＰＣ、コレステロール、ＤＯＰＥ、およびＤＯＴＭＡを含む。
【００２４】
いくつかの好ましい実施形態において、脂質粒子は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、およびコレステロール（Ｃｈｏｌ）を、約４：２：１（ＤＯＰＥ：ＤＯＴＭＡ：Ｃｈｏｌ）のモル比で含む。
【００２５】
他の好ましい実施形態において、脂質粒子は、ＤＯＰＥ、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、コレステロール、およびＮＨＳ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥを、約４．５：２０：７５：０．５（ＤＯＰＥ：ＨＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）のモル比で含む。いくつかの実施形態において、脂質粒子は、ＤＯＴＭＡをさらに含む。
【００２６】
他の好ましい実施形態において、脂質粒子は、大豆ＰＣ、１，２−ビス（ジフェニルホスフィノ）エタン（ＤＰＰＥ）、およびコレステロールを、約３：１：１（大豆ＰＣ：ＤＰＰＥ：コレステロール）のモル比で含む。
【００２７】
いくつかの実施形態において、脂質粒子は、直径が約８５〜約３００ｎｍであり、好ましくは、直径が、約８５ｎｍ〜約１５０ｎｍ等、２００ｎｍ未満である。
【００２８】
いくつかの実施形態において、脂質粒子は、約（−７）〜約（−６０）、好ましくは約（−７）〜約（−４０）、好ましくは約（−７）〜約（−１８）のゼータ電位を有する。
【００２９】
いくつかの実施形態において、組成物は、診断剤および／または治療剤のうちの少なくとも１つを含む部分を、さらに含む。いくつかの実施形態において、診断剤は、放射性同位体、フルオロフォア、発光剤、磁気標識、および酵素標識からなる群から選択される造影剤等の検出可能な標識を含む。
【００３０】
いくつかの実施形態において、治療剤は、化学療法剤、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはペプチド模倣体、およびそれらの機能的フラグメントの抗体のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、化学療法剤は、小分子である。いくつかの実施形態において、小分子は、ドキソルビシンまたはマイトマイシンである。
【００３１】
いくつかの実施形態において、治療剤は、核酸および非核酸から選択される。
【００３２】
いくつかの実施形態において、非核酸化合物は、小分子、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣体、糖脂質、および抗体、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００３３】
いくつかの実施形態において、治療剤は、アンチセンス化合物、化学修飾ｄｓＲＮＡ化合物、非修飾ｄｓＲＮＡ化合物、化学修飾ｓｉＲＮＡ化合物、非修飾ｓｉＲＮＡ化合物、化学修飾ｓｈＲＮＡ化合物、非修飾ｓｈＲＮＡ化合物、化学修飾ｍｉＲＮＡ化合物、および非修飾ｍｉＲＮＡ化合物、リボザイム、またはそれらの組み合わせから選択される核酸である。種々の好ましい実施形態において、治療剤は、化学修飾ｓｉＲＮＡである。いくつかの好ましい実施形態において、治療剤は、非修飾ｓｉＲＮＡ化合物である。
【００３４】
いくつかの好ましい実施形態において、脂質粒子は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、およびコレステロール（Ｃｈｏｌ）、ヒアルロン酸、抗ＥＮＤＯ１８０抗体、またはヒト化もしくはキメラ抗ＥＮＤＯ１８０抗体の抗原結合フラグメント、ならびにドキソルビシン、マイトマイシンＣ、および治療核酸分子から選択される治療剤を含む。いくつかの実施形態において、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、およびコレステロール（Ｃｈｏｌ）は、約４：２：１（ＤＯＰＥ：ＤＯＴＭＡ：Ｃｈｏｌ）のモル比で存在する。
【００３５】
他の好ましい実施形態において、脂質粒子は、ＤＯＰＥ、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、コレステロール、およびＮＨＳ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ、抗ＥＮＤＯ１８０抗体またはヒト化もしくはキメラ抗ＥＮＤＯ１８０抗体の抗原結合フラグメント、ならびにドキソルビシン、マイトマイシンＣ、および治療核酸分子から選択される治療剤を含む。いくつかの実施形態において、脂質粒子は、ＤＯＴＭＡをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＤＯＰＥ、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、コレステロール、およびＮＨＳ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥは、約４．５：２０：７５：０．５（ＤＯＰＥ：ＨＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）のモル比で存在する。
【００３６】
他の好ましい実施形態において、脂質粒子は、大豆ＰＣ、１，２−ビス（ジフェニルホスフィノ）エタン（ＤＰＰＥ）、およびコレステロール、ヒアルロン酸、抗ＥＮＤＯ１８０抗体またはヒト化もしくはキメラ抗ＥＮＤＯ１８０抗体の抗原結合フラグメント、ならびにドキソルビシン、マイトマイシンＣ、および治療核酸分子から選択される治療剤を含む。いくつかの実施形態において、大豆ＰＣ、１，２−ビス（ジフェニルホスフィノ）エタン（ＤＰＰＥ）、およびコレステロールは、約３：１：１（大豆ＰＣ：ＤＰＰＥ：コレステロール）のモル比で存在する。
【００３７】
別の態様において、増殖性疾患を患う対象を治療する方法であって、対象に、ａ）担体部分、ｂ）ＥＮＤＯ１８０標的部分、およびｃ）治療剤を含む組成物の治療有効量を投与することを含む、方法を本明細書に提供する。
【００３８】
別の態様において、治療法において使用するための、ａ）担体部分、ｂ）ＥＮＤＯ１８０標的部分、およびｃ）治療剤を含む組成物を本明細書に提供する。
【００３９】
別の態様において、増殖性障害の治療に使用するための、ａ）担体部分、ｂ）ＥＮＤＯ１８０標的部分、およびｃ）治療剤を含む組成物を本明細書に提供する。
【００４０】
いくつかの実施形態において、組成物は、全身送達される。
【００４１】
いくつかの実施形態において、増殖性疾患は、固形腫瘍、造血器腫瘍、腫瘍転移、線維症、およびマクロファージ関連疾患から選択される。いくつかの実施形態において、増殖性障害は、固形腫瘍または造血器腫瘍である。
【００４２】
いくつかの実施形態において、腫瘍は、卵巣腫瘍、乳房腫瘍、造骨性／骨細胞癌、前立腺癌、頭頸部癌、白血病、腎細胞癌、または移行上皮癌である。
【００４３】
いくつかの実施形態において、線維症は、肝臓線維症、骨髄線維症、任意の理由による腎線維症（末期腎疾患ＥＳＲＤを含むＣＫＤ）、肺線維症（間質性肺線維症ＩＬＦ）、全ての可能な種類の偶発性および医原性（手術）の皮膚損傷と関連する異常瘢痕（ケロイド）、強皮症、心臓線維症、緑内障濾過手術の失敗、腸管癒着症である。
【００４４】
いくつかの実施形態において、マクロファージ関連疾患は、炎症または粥状動脈硬化である。
【００４５】
疾患および障害の非限定的な例には、次のものが含まれる：
１．腫瘍および腫瘍間質細胞にＥＮＤＯ１８０が発現する軟部組織肉腫（マクロファージ−単球系統の活性化された筋線維芽細胞、新血管細胞、および浸潤細胞）、
２．腫瘍および腫瘍間質細胞にＥＮＤＯ１８０が発現する癌種（マクロファージ−単球系統の活性化された筋線維芽細胞、新血管細胞、および浸潤細胞）、
３．ＥＮＤＯ１８０を発現し、上皮肝葉転換を経たために、高転移能を得た癌種、
４．例えば、マクロファージ−単球系統からＥＮＤＯ１８０を発現する白血病、
５．例えば、活性化された筋線維芽細胞を伴う腎臓、肺、および肝臓の線維性疾患、
６．アテローム性動脈硬化症および慢性炎症を含む、マクロファージと関連する疾患および障害。
【００４６】
別の態様において、対象における増殖性障害を診断する方法であって、対象由来の生体試料を、ａ）担体部分、ｂ）ＥＮＤＯ１８０標的部分、およびｃ）診断剤を含む組成物と接触させ、生体試料中の診断剤のレベルを、健常対象由来の生体試料等の参照試料のものと比較することを含む、方法を、本明細書に提供する。
【００４７】
いくつかの実施形態において、診断のための生体試料は、体液または組織から採取され得る。いくつかの実施形態において、体液は、血液、リンパ液、腹水、漿液、胸水、喀痰液、脳脊髄液、涙液、滑液、唾液、便、精液、血液、および尿からなる体液群から選択される。
【００４８】
本発明は、以下の図面、発明を実施するための形態、および特許請求の範囲に、より詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】核酸（ＮＡ）分子送達のための標的化ナノ粒子を生成するプロセスの概略図を提供する。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、１μｇ／ｍｌの抗ＥＮＤＯ１８０  ｍＡｂ；クローン８Ｄ８、クローン１０Ｃ１２、ミニ抗体、および二次Ａｂ  ＦＩＴＣヤギ抗マウス（１．５μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートしたＮＲＫ−ＥＮＤＯ１８０（２Ａ）、Ａ５４９（２Ｂ）細胞系によるフローサイトメトリー分析を示す。抗ＥＮＤＯ１８０に結合した細胞を示すピークが、明瞭さのためにラベル付けされている。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、１μｇ／ｍｌの抗ＥＮＤＯ１８０  ｍＡｂ；クローン８Ｄ８、クローン１０Ｃ１２、およびミニ抗体、ならびに二次Ａｂ  ＦＩＴＣヤギ抗マウス（１．５μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートしたＬＬＣ  ＥＮＤＯ１８０（３Ａ）、ＤＵ１４５  ＥＮＤＯ１８０（３Ｂ）細胞系によるフローサイトメトリー分析を示す。抗ＥＮＤＯ１８０に結合した細胞を示すピークは、明瞭さのためにラベル付けされている。
【図４】図４Ａ〜４Ｄは、いずれもＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ−６４７で標識化した１μｇ／ｍｌの抗ＥＮＤＯ１８０  ｍＡｂ；クローン８Ｄ８（橙色線、全グラフにおいて一番右のピーク）、およびミニ抗体（新たなバッチ、青色線、全グラフにおいて中央のピーク）とともにインキュベートした、ＤＵ１４５  ＥＮＤＯ１８０（４Ａ）、ＤＵ１４５ナイーブ（４Ｂ）、ＮＲＫ  ＥＮＤＯ１８０（安定にトランスフェクト）（４Ｃ）、およびＡ５４９（４Ｄ）細胞系によるフローサイトメトリー分析を、対照の非染色細胞（赤色線、全グラフにおいて一番左のピーク）との比較で示す。
【図５】図５Ａ〜５Ｄは、ＥＮＤＯ１８０  ｍＡｂ、すなわち８Ｄ８  ｍＡｂをＮＲＫ−ＥＮＤＯ１８０（５Ａ）に、新たなバッチのミニ抗体をＡ５４９細胞系（５Ｂ）に、８Ｄ８  ｍＡｂをＡ５４９（５Ｃおよび５Ｄ）に、共焦点顕微鏡を使用して、内部移行した細胞を示す。Ａｌｅｘａ  ４８８（赤色、左のピーク）（それぞれ５．０μｇ／ｍｌ）、Ｈｏｅｃｈｓｔ（ａｚｕｒｅ，Ｈ  ３３３４２）１：１０，０００、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ（商標）（緑色、ＤｉｌＣ１８（５）−ＤＳ  １：５０００）で標識化したｍＡｂとのインキュベーション時間、３７℃で１時間。図５Ａおよび５cの矢印は、細胞中の標識化抗体の存在を示す蛍光を示す。
【図６】図６Ａ〜６Ｄは、８Ｄ８  ＨＡ−脂質粒子（ローダミン−ＤＰＰＥ、５０μｌで調製）のＡ５４９への内部移行を示し、細胞は、コンカバリンＡ（１．５μｇ／ｍｌ）およびＨｏｅｃｈｓｔ試薬（１：１０，０００）で、それぞれ、膜および核の標識化のために染色した。６Ａ．脂質粒子のみとともに３７℃で１時間インキュベートした細胞。６Ｂ、６Ｃ−８Ｄ８コーティング脂質粒子とともに３７℃で１時間インキュベートしたもの、特異的な内部移行を検出。６Ｄ．４℃での８Ｄ８脂質粒子のインキュベーション（×５２５）−進入は観察されず。
【図７】図７Ａ〜７Ｄは、８Ｄ８  ＨＡ脂質粒子のＮＲＫ細胞への内部移行を示し、細胞は、コンカバリンＡ（１．５μｇ／ｍｌ）およびＨｏｅｃｈｓｔ試薬（１：１０，０００）で、それぞれ、膜および核の標識化のために染色した。７Ａ．脂質粒子のみとともに３７℃で１時間インキュベートしたＮＲＫナイーブ。７Ｂ．８Ｄ８脂質粒子とともに３７℃で１時間インキュベートしたＮＲＫナイーブ。７Ｃ．８Ｄ８脂質粒子とともに３７℃で１時間インキュベートしたＮＲＫ  ＥＮＤＯ１８０。７Ｄ．ＨＡ−脂質粒子のみとともに３７℃で１時間インキュベートしたＮＲＫ−ＥＮＤＯ１８０（×５２５）。＊ＮＲＫ−ＥＮＤＯ１８０細胞にはマイコプラズマを混入させた。
【図８】抗体の脂質への複合体化がＰＥＧスペーサーを介して行われたときの脂質粒子−抗体組成物（８Ｄ８−ＮＰ）のＮＲＫ−ＥＮＤＯ１８０細胞への結合に起因する蛍光シフトを示す。ＩｇＧ−Ｎｐは、ＩｇＧ抗体と複合体化した脂質粒子を指す。
【図９】８Ｄ８−ＮＰを介してドキソルビシン（ＤＯＸ）がＮＲＫ−ＥＮＤＯ１８０細胞に特異的に送達された後の、ＥＮＤＯ１８０発現細胞の細胞生存率の低下を示す。細胞生存率は、ＸＴＴアッセイを使用して測定した。
【図１０】８Ｄ８  ＡＦ  ４８８−ＮＰのＮＲＫ−ＥＮＤＯ１８０への結合を示す。
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、ＮＲＫ−ＥＮＤＯ１８０発現細胞へのＣｙ３−ｓｉＲＮＡの送達を示す。
【図１２】ＮＲＫ５２−ＥＮＤＯ１８０細胞へのＣｙ３−ｓｉＲＮＡの取り込みを示すＺ−Ｓｔａｃｋ画像を示す。
【図１３】ＲＮＡｉ機構もまた存在する核周囲フォーカス（白色矢印）に局在化された、８Ｄ８−ＮＰを介して送達されたＣｙ３−ｓｉＲＮＡを示す。
【図１４】ＭＭＣを封入したＥＮＤＯ１８０標的脂質ナノ粒子を使用した、ＥＮＤＯ１８０＋細胞の細胞生存率の低下を示すグラフである。ＸＴＴアッセイを、インキュベーションの７２時間後に行った。各バーは、１６ウェル／処理の平均を、データ点間の標準偏差とともに表す。示されるデータは、３回の独立した実験の代表である。
【図１５】図１５Ａおよび１５Ｂは、ＲＡＣに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＡＣ１）を封入した８Ｄ８−ＮＰに暴露したＡ５４９細胞系におけるＲａｃ１  ｍＲＮＡ（残留ｍＲＮＡのレベルを示す）のインビトロでのノックダウンを示す。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｄは、マウス癌モデルにおいて、Ｃｙ５−Ｒａｃ１＿２８を封入したＥＮＤＯ１８０コーティングナノ粒子（ＮＰ）で処置したマウスの種々の体器官へのｓｉＲＮＡの生体内分布を示す図を提示する。様々な組成物で処置した動物における組織試料１ｍｇ当たりに存在するｓｉＲＮＡの量（アトモル（ａｔｏｍｏｌｅ））を示す。
【図１７】図１７Ａ〜１７Ｄは、マウス癌モデル由来の腫瘍および腎臓における、Ｒａｃ１＿２８を封入したＥＮＤＯ１８０コーティングナノ粒子（ＮＰ）の生体内分布を示すグラフを提示する。様々な組成物で処置した動物における組織試料１ｍｇ当たりに存在するｓｉＲＮＡの量（アトモル）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
定義
便宜のため、本明細書、実施例、および特許請求の範囲で用いられる特定の用語を、本明細書において説明する。
【００５１】
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別途明示しない限り、複数形を含むことに留意されたい。
【００５２】
態様または実施形態が、マーカッシュ群または他の代替の群に関して記載される場合、当業者であれば、態様または実施形態が、それによって、任意の個々の要素または群の要素の亜群に関しても記載されていることを理解するであろう。
【００５３】
本明細書で互換的に使用される「標的薬剤」または「標的部分」という用語は、特定の細胞種または組織種、例えば受容体を含むタンパク質、感染病原体、または目的とされる他の標的を含み得る、特定の標的と選択的に会合するか、またはそれに結合する、薬剤を指す。本開示の組成物での使用に好適な標的薬剤は、所望の送達方法（例えば、インビボ、インビトロ、エキソビボ）によって、標的を発現する適切な細胞種を選択的に認識し、それに結合するために、生理学的条件下において、標的に対する十分な結合親和性を有する必要がある。標的薬剤の例には、アプタマーを含むオリゴヌクレオチド、抗原、抗体もしくはその機能的フラグメント、リガンド、受容体、特異的結合対の１つのメンバー、生物学的受容体に対する親和性を有するペプチドもしくはペプチド模倣体を含むポリアミド、オリゴ糖、多糖、ステロイドもしくはステロイド誘導体、ホルモン、ホルモン模倣物質、例えば、モルヒネ、または標的に対する結合特異性を有する他の化合物が挙げられる。本明細書に開示される方法において、標的部分は、目的の標的、すなわち、ＥＮＤＯ１８０受容体を発現する細胞への送達系の送達を促進する。
【００５４】
本明細書に開示される送達系は、１つ以上の異なる標的薬剤を利用し得る。それぞれが独自の結合標的を有する、特定の送達剤上の複数の標的薬剤を使用して、より広範囲の細胞種（複数の細胞種）への送達を促進するか、または代替として、標的細胞種を絞ることができる。
【００５５】
所望の結合活性を呈する（所望の細胞表面抗原に特異的に結合する）抗体およびその機能的フラグメントもしくは誘導体は、有用な標的部分である。本明細書に使用される際、「抗体」または抗体の「機能的フラグメント」は、所望される特異的結合活性を呈する抗体およびその誘導体を包含する。これには、限定することなく、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、ならびにハイブリッドもしくはキメラ抗体を含む調製物、例えば、ヒト化抗体、改変抗体、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ａｂ）フラグメント、ＳｃＦｖを含むＦｖフラグメント等の抗体フラグメント、単一ドメイン抗体、二量体および三量体抗体フラグメント構築物、ミニ抗体、ならびに親抗体分子の免疫学的結合特性を呈する、および／または細胞表面抗原、すなわち、ＥＮＤＯ１８０受容体に結合する、それらの機能的フラグメントが含まれる。
【００５６】
本明細書に開示されるように、「脂質粒子」はまた、「担体部分」とも称され得、限定されることなく、非脂質成分を含み得る脂質粒子を指す。脂質粒子を含む組成物を、本明細書に開示する。本明細書に開示される組成物は、標的部分の付着によって修飾された脂質粒子を含む。
【００５７】
本明細書に開示されるように、脂質粒子はまた、本明細書において脂質ベースのナノ粒子とも称される。リポソームは、中に封入された水溶性部分を含有する密封された脂質二重膜である。リポソームは、単一膜の二重層を有する単層ベシクル（ＵＬＶ）、またはそれぞれが水性層によって隣と分離される複数膜の二重層を特徴とするタマネギ様構造の多層ベシクル（ＭＬＶ）であり得る。１つの好ましい実施形態において、本明細書に開示される脂質粒子は、単層ベシクルである。二重層は、疎水性の「尾部」領域と親水性の「頭部」領域とを有する、２つの脂質単層から構成される。膜二重層の構造は、脂質単層の疎水性（非極性）の「尾部」が、二重層の中心に向って配向され、一方で親水性の「頭部」が、水相に向かって配向されるようなものである。
【００５８】
本明細書に開示される脂質ベースのナノ粒子は、当該技術分野において周知でありリポソームの生成に日常的に利用される脂質材料の組み合わせにより生成される。リポソームは、スフィンゴミエリン等の比較的硬質な種類、または不飽和アシル鎖を有するリン脂質等の流動性の種類を包含する。「リン脂質」は、リポソームを形成することができるあらゆるリン脂質またはリン脂質の組み合わせを指す。卵、大豆、もしくは他の植物源から得られるもの、または部分的もしくは全体的に合成であるか、もしくは脂質鎖長が可変であり不飽和のものを含む、ホスファチジルコリン（ＰＣ）は、本明細書に開示されるように、使用に好適である。ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、大豆ホスファチジルコリン（大豆ＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（卵ＰＣ）、水素添加卵ホスファチジルコリン（ＨＥＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、およびジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）を含むがこれらに限定されない、合成、半合成、および天然の生成物であるホスファチジルコリンは、本明細書に開示される組成物での使用に好適なホスファチジルコリンである。これらのリン脂質のすべては、市販入手可能である。さらに、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）およびリン酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｃ  ａｃｉｄ）（ＰＡ）ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）もまた、本明細書に開示される組成物での使用に好適であり、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジラウリルホスファチジルグリセロール（ＤＬＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジミリストイルホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）、ジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）、ジラウリルホスファチジン酸（ＤＬＰＡ）、およびジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）が含まれるが、これらに限定されない。ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）が、組成物に使用する際、好ましい負の電荷を有する脂質である。他の好適なリン脂質には、ラウリン、ミリスチン、ステアロイル、およびパルミチン酸鎖を含有する、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、およびホスファチジン酸が挙げられる。脂質膜を安定化する目的で、コレステロール（Ｃｈｏｌ）等の追加の脂質成分を添加することが好ましい。本明細書に開示される脂質ベースのナノ粒子を生成するためのある特定の好ましい脂質には、コレステロール（ＣＨ）とのさらなる組み合わせでのホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、およびホスファチジルコリン（ＰＣ）が挙げられる。他の好適な脂質には、陽イオン性脂質Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）およびＮ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、ならびにそれらの���似体が挙げられる。
【００５９】
非陽イオン性脂質には、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、およびジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−トランスＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、ステロール（例えば、コレステロール）、ならびにそれらの混合物が挙げられる。
【００６０】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるリポソームを生成するための脂質およびコレステロールの組み合わせは、ＰＥ：ＰＣ：Ｃｈｏｌのモル比が約３：１：１または約４：２：１である。
【００６１】
本発明の脂質ベースのナノ粒子は、当業者に既知の任意の方法によって得ることができる。例えば、本明細書に開示される脂質粒子の調製物は、逆相蒸発（ＲＥＶ）法（米国特許第４，２３５，８７１号を参照されたい）、注入手順、または界面活性剤希釈によって生成することができる。リポソームを生成するためのこれらおよび他の方法の検討は、文献Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，Ｍａｒｃ  Ｏｓｔｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８３，Ｃｈａｐｔｅｒ  １に見出すことができる。Ｓｚｏｋａ  Ｊｒ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８０，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９：４６７）もまた参照されたい。ＵＬＶを形成するための方法は、１９８６年１月１６日の「Ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅｓ」と題されるＣｕｌｌｉｓらのＰＣＴ公開第８７／００２３８号に記載されている。多層リポソーム（ＭＬＶ）は、脂質をクロロホルム−メタノール溶液（３：１、ｖｏｌ／ｖｏｌ）中に溶解し、減圧下で乾燥するまで蒸発させ、膨張溶液で水和する、脂質薄膜法によって調製することができる。次いで、溶液を、例えば３７℃で２時間、広範な振動およびインキュベーションに供する。インキュベーション後、単層リポソーム（ＵＬＶ）を、押出により得る。押出ステップは、好ましくかつ実質的に均一な平均直径に、リポソームの寸法を縮小することによって、リポソームを修飾する。あるいは、所望される寸法のリポソームを、濾過または他の寸法選択技術を使用して選択することができる。寸法を選択した本明細書に開示されるリポソームは、約２００ｎｍ未満の平均直径を有するが、約１５０ｎｍ未満の平均直径を有するように選択することが好ましく、約９０〜１５０ｎｍの平均直径が特に好ましい。本明細書に開示される脂質粒子が単層リポソームである場合、それは、好ましくは、約２００ｎｍ未満の平均直径を有するように選択される。本明細書に開示される最も好ましい単層脂質粒子は、約１５０ｎｍ未満の平均直径を有する。
【００６２】
脂質ベースのナノ粒子の外側表面は、標的部分への付着を促進するように修飾され得る。このような修飾の一例は、天然または合成のポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはヒアルロン酸（ＨＡ）による脂質ベースのナノ粒子の外側表面の修飾である。他のポリマーには、トレハロース、スクロース、マンノース、またはグルコース等の糖が挙げられる。１つの好ましい実施形態において、脂質ベースのナノ粒子は、ＨＡでコーティングされる。理論に束縛されることを望むものではなく、ＨＡは、長期循環剤および抗凍結剤の両方として機能する。ポリマーは、最初からリポソーム組成物に組み込まれてもよく、または調製された脂質ベースのナノ粒子と合わされてもよい。
【００６３】
脂質ベースのナノ粒子の外側表面は、目的の組織への脂質ベースのナノ粒子の取り込みを強化するか、または細胞内皮系への脂質ベースのナノ粒子の取り込みを低減するように、薬剤でさらに修飾されてもよい。長期循環剤としての親水性ポリマーによる脂質ベースのナノ粒子の修飾は、血中における脂質ベースのナノ粒子の半減期を延長させる。好適な親水性ポリマーの例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリメチルエチレングリコール、ポリヒドロキシプロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリメチルプロピレングリコール、およびポリヒドロキシプロピレンオキシドが挙げられる。グリコサミノグリカン、例えば、ヒアルロン酸もまた、長期循環剤として使用することができる。
【００６４】
脂質ベースのナノ粒子は、標的部分の付着によって修飾される。一実施形態において、標的部分は、抗凍結剤、例えばＨＡと、共有結合で複合体化される。これは、架橋試薬（例えば、グルタルアルデヒド（ＧＡＤ）、二官能性オキシラン（ＯＸＲ）、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＥ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、および水溶性カルボジイミド、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を使用して達成することができる。当業者には既知のように、チオエーテル、チオエステル、マルイミドおよびチオール、アミン−カルボキシル、アミン−アミン、ならびにその他のものを含むがこれらに限定されない、任意の架橋的化学特性を用いることができる。架橋により、標的部分および脂質ベースのナノ粒子のアミン残基の連結が確立される。
【００６５】
修飾された脂質ベースのナノ粒子は、当業者に既知の任意の方法によってその時点で既知の任意のリポソーム材料から調製される中空マイクロまたはナノ規模のリポソームから、調製される。脂質ベースのナノ粒子は、好ましくは、共有結合によって第１の層の表面修飾により修飾される。第１の層は、好ましくは、ＰＥＧ、またはヒアルロン酸等のグリコサミノグリカンといった、ポリマーを含む。これに、第２の表面修飾層を、第１の層への共有結合により付加することができる。第２の層は、本明細書に記載される標的薬剤または部分、例えば、抗体またはその機能的フラグメントを含む。さらなる層により、脂質ベースのナノ粒子に追加の薬剤（例えば、追加の標的部分）を付加することができる。あるいは、第２の層は、標的部分の異種混合物を含んでもよい。脂質ベースのナノ粒子組成物は、最後の層を付加した後に凍結乾燥してもよい。目的の治療剤は、治療剤または診断剤を含有する水溶液で脂質ベースのナノ粒子を再水和することにより、脂質ベースのナノ粒子に封入することができる。水溶液にほとんど溶けない治療剤、または疎水性の薬剤は、脂質ベースのナノ粒子の調製中に組成物に添加することができる。脂質ベースのナノ粒子組成物は、場合によっては凍結乾燥され、第１の層の付加後の任意の時点で再構成される。
【００６６】
一実施形態において、目的の２つの薬剤（例えば治療剤）を、脂質粒子によって送達することができる。一方の薬剤は疎水性であり得、他方の薬剤は親水性である。疎水性薬剤は、脂質粒子の形成中に脂質粒子に付加することができる。疎水性薬剤は、脂質粒子の脂質部分と会合する。親水性薬剤は、凍結乾燥した脂質粒子を再水和する水溶液に添加される。凝縮されたｓｉＲＮＡが脂質ベースのナノ粒子に封入され、水溶液にほとんど溶けない薬物が脂質粒子の脂質部分と会合する、２剤送達の例示的な実施形態を以下に記載する。本明細書に使用される際、「水溶液にほとんど溶けない」とは、水への可溶性が約１０％未満である組成物を指す。
【００６７】
脂質に加えて、脂質粒子は、タンパク質または非タンパク質ポリマーを含む、天然または合成のポリマーを含む追加の薬剤をさらに含み得る。このような脂質粒子は、脂質ベースのナノ粒子の担体部分について本明細書に記載される修飾と同様に、修飾および強化されてもよい。脂質粒子は、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）およびポリ（乳酸コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）等の合成ポリマーをさらに含み得る。別の実施形態において、本組成物は、タンパク質（例えば、ポリペプチド）またはタンパク質の核酸結合ドメインをさらに含む。一実施形態において、この結合部分は、プロタミン、ＧＣＮ４、Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、ＴＦＩＩＳ、ＦＭＲＩ、酵母タンパク質ＨＸ、Ｖｉｇｉｌｌｉｎ、Ｍｅｒ１、細菌ポリヌクレオチドホスホリラーゼ、リボソームタンパク質Ｓ３、および熱ショックタンパク質からなる群から選択されるタンパク質中に存在する核酸結合ドメインの群から選択される、タンパク質の核酸結合ドメインである。一実施形態において、結合部分は、タンパク質プロタミンまたはプロタミンのＲＮＡ干渉誘発分子結合フラグメントである。
【００６８】
「阻害剤」とは、遺伝子の発現またはそのような遺伝子の産物の活性を、所望される生物学的または生理学的効果を達成するのに十分な程度まで（部分的または完全に）低減させることができる化合物である。本明細書に使用される「阻害剤」という用語は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、合成ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ、ならびにリボザイムを含む核酸阻害剤のうちの１つ以上を含む。「阻害性核酸」には、アンチセンス化合物、化学修飾ｓｉＲＮＡ化合物、非修飾ｓｉＲＮＡ化合物、化学修飾ｓｈＲＮＡ化合物、非修飾ｓｈＲＮＡ化合物、化学修飾ｍｉＲＮＡ化合物、および非修飾ｍｉＲＮＡ化合物が含まれる。
【００６９】
「ｓｉＲＮＡ阻害剤」は、遺伝子の発現またはそのような遺伝子の産物の活性を、所望される生物学的または生理学的効果を達成するのに十分な程度まで低減させることができる化合物である。本明細書に使用される「ｓｉＲＮＡ阻害剤」という用語は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、合成ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡのうちの１つ以上を指す。阻害は、下方制御、またはＲＮＡｉについてはサイレンシングとも称され得る。
【００７０】
本明細書に使用される「阻害する」という用語は、遺伝子の発現またはそのような遺伝子の産物の活性を、所望される生物学的または生理学的効果を達成するのに十分な程度まで低減させることを指す。阻害は、完全または部分的であり得る。本明細書に使用される際、「ＥＮＤＯ１８０遺伝子」という用語は、配列番号１のアミノ酸コード領域に対して、好ましくは９０％の相同性、より好ましくは９５％の相同性、さらにより好ましくは９８％の相同性を有するＥＮＤＯ１８０遺伝子の任意の相同体として、または高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下においてＥＮＤＯ１８０遺伝子と結合する核酸配列として定義され、これらは当該技術分野で周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８８），ｕｐｄａｔｅｄ  ｉｎ  １９９５  ａｎｄ  １９９８を参照されたい）。
【００７１】
本明細書に記載される際、「ＥＮＤＯ１８０」または「ＥＮＤＯ１８０ポリペプチド」または「ＥＮＤＯ１８０受容体」という用語は、配列番号２に対して、好ましくは少なくとも９０％の相同性、より好ましくは少なくとも９５％の相同性、およびさらに好ましくは少なくとも９８％の相同性、または１００％の同一性を有する、ＥＮＤＯ１８０ポリペプチドの任意の相同体として、その全長またはフラグメントもしくはドメインのいずれかとして、スプライシングされた変異体の核酸配列によってコードされる突然変異体またはポリペプチドとして、他のポリペプチドとのキメラとして定義されるが、ただし、上記のいずれも、ＥＮＤＯ１８０受容体と同じかまたは実質的に同じ生物学的機能を有することを条件とする。ＥＮＤＯ１８０ポリペプチドまたはＥＮＤＯ１８０ポリペプチド相同体は、可溶性タンパク質、膜結合型（精製された膜調製物もしくは細胞表面上のいずれか）、ビーズ結合型、またはＥＮＤＯ１８０タンパク質もしくはそのフラグメントおよびそれに由来するポリペプチドを表す任意の他の形態を含むがこれらに限定されない、異なる形態で存在してもよい。本明細書に使用される「阻害する」という用語は、遺伝子の発現またはそのような遺伝子の産物の活性を、所望される生物学的または生理学的効果を達成するのに十分な程度まで低減させることを指す。阻害は、完全または部分的のいずれかである。
【００７２】
「ｍＲＮＡポリヌクレオチド配列」、「ｍＲＮＡ配列」、および「ｍＲＮＡ」は、互換的に使用される。
【００７３】
本明細書に使用される際、「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、互換的に使用されてもよく、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含むヌクレオチド配列を指す。この用語は、ヌクレオチド類似体から作られるＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかの類似体を均等物として含むことを理解されたい。本出願全体を通して、ｍＲＮＡ配列は、対応する遺伝子を表すものとして記載される。
【００７４】
「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」とは、約２〜約５０個のヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列を指す。各ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドは、独立して、天然もしくは合成、および／または修飾もしくは非修飾であり得る。修飾は、糖部分、塩基部分、および／またはオリゴヌクレオチドにおけるヌクレオチド間の連結に対する変更を含む。本明細書に開示される核酸分子は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、およびそれらの組み合わせを含む分子を包含する。
【００７５】
本明細書に使用される際、「核酸分子」または「核酸」という用語は、互換的に使用され、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、またはポリヌクレオチドを指す。「核酸分子」の変化形を、本明細書にさらに詳細に説明する。核酸分子は、一本鎖分子（すなわち、アンチセンス）および二本鎖分子（すなわち、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）の両方、本明細書に記載の修飾核酸分子および非修飾核酸分子の両方を包含する。核酸分子は、任意の組み合わせで、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、またはヌクレオチド類似体を含み得る。
【００７６】
「実質的に相補的である」とは、別の配列に対する約８４％を上回る相補性を指す。例えば、１９塩基対からなる二重鎖領域において、１つのミスマッチは９４．７％の相補性をもたらし、２つのミスマッチは約８９．５％の相補性をもたらし、３つのミスマッチは約８４．２％の相同性をもたらし、二重鎖領域を実質的に相補性にする。したがって、「実質的に同一である」とは、別の配列に対する約８４％を上回る同一性を指す。
【００７７】
本明細書に開示される「リンカー」とは、例えば、抗体を治療分子に、または抗体を脂質に、または抗体をＧＡＧに、またはＧＡＧを脂質に連結させる、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分である。いくつかの実施形態において、リンカーは、切断可能な部分である。好ましい切断可能な基は、ジスフィルド結合、アミド結合、チオアミド結合、エステル結合、チオエステル結合、隣接ジオール結合、またはヘミアセタールを含む。他の切断可能な結合には、ペプチド結合（ペプチダーゼによって切断される）、リン酸結合（ホスファターゼによって切断される）、核酸結合（エンドヌクレアーゼによって切断される）、および糖結合（グリコシダーゼによって切断される）等、酵素的に切断可能な結合が挙げられる。
【００７８】
いくつかの実施形態において、リンカーは、ペプチドリンカーを含む非ヌクレオチドリンカーである。ペプチド配列の選択は、複合体の成功のために非常に重要である。いくつかの実施形態において、リンカーは、血清プロテアーゼに対して安定しているが、標的細胞中のリソソーム酵素により切断される。非限定的な例において、リンカーは、米国特許第５５７４１４２号に記載されるリンカー、プロタミン、プロタミンのフラグメント、（Ａｒｇ）９、ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジン、およびアンテナペディアペプチドから選択されるペプチドである。例えば、ペプチドリンカーを使用して、抗体を核酸ベースの治療剤に連結させる。他の非ヌクレオチドリンカーは、約５〜約１００個の原子のアルキルまたはアリール鎖を含む。
【００７９】
いくつかの実施形態において、リンカーは、ヌクレオチドリンカーである。特定の実施形態において、核酸リンカーは、２〜１００個、好ましくは２〜５０個または２〜３０個の範囲のヌクレオチドの長さを有する。  
【００８０】
オリゴヌクレオチドの化学修飾
いくつかの実施形態において、治療剤および／または診断剤は、オリゴヌクレオチド分子を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、アンチセンスまたはＲＮＡｉ剤である。
【００８１】
「ヌクレオチド」は、天然もしくは合成、および／または修飾もしくは非修飾であり得る、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを包含することを意味する。修飾は、糖部分、塩基部分、および／またはオリゴリボヌクレオチドにおけるリボヌクレオチド間の連結に対する変更を含む。本明細書に使用される際、「リボヌクレオチド」という用語は、天然および合成の、非修飾または修飾リボヌクレオチドを包含する。修飾は、糖部分、塩基部分、および／またはオリゴヌクレオチドにおけるリボヌクレオチド間の連結に対する変更を含む。
【００８２】
治療剤（すなわち、核酸分子）の調製に有用なヌクレオチドは、天然に存在するか、または合成修飾された塩基を含む。天然に存在する塩基には、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルが挙げられる。ヌクレオチドの修飾塩基には、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル、２−プロピル、および他のアルキルアデニン、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、６−アザシトシン、および６−アザチミン、擬似ウラシル、４−チオウラシル、８−ハロアデニン、８−アミノアデニン、８−チオールアデニン、８−チオアルキルアデニン、８−ヒドロキシルアデニン、および他の８−置換アデニン、８−ハログアニン、８−アミノグアニン、８−チオールグアニン、８−チオアルキルグアニン、８−ヒドロキシルグアニン、および他の置換グアニン、他のアザおよびデアザアデニン、他のアザおよびデアザグアニン、５−トリフルオロメチルウラシル、ならびに５−トリフルオロシトシンが挙げられる。いくつかの実施形態において、オリゴマーにおける１つ以上のヌクレオチドは、イノシンで置換される。
【００８３】
いくつかの実施形態によると、非修飾および修飾ヌクレオチド、ならびに／または非従来的部分を含む、阻害性オリゴヌクレオチド化合物が、本明細書に提供される。ある特定の実施形態において、治療剤は、オリゴヌクレオチド／核酸分子である。種々の好ましい実施形態において、治療剤は、二本鎖オリゴヌクレオチドであり、好ましくはｓｉＲＮＡである。いくつかの実施形態において、化学修飾ｓｉＲＮＡ分子が好ましい。
【００８４】
既知の遺伝子に対応するｓｉＲＮＡの選択および合成は、広く報告されている（例えば、Ｕｉ−Ｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６．Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．；２００６：６５０５２、Ｃｈａｌｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００４．ＢＢＲＣ．３１９（１）：２６４−７４、Ｓｉｏｕｄ&Ｌｅｉｒｄａｌ，２００４．Ｍｅｔ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．；２５２：４５７−６９、Ｌｅｖｅｎｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．２０（３）：４３０−２、Ｕｉ−Ｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４．ＮＡＲ  ３２（３）：９３６−４８を参照されたい）。
【００８５】
修飾ｓｉＲＮＡの使用および生成の例については、例えば、Ｂｒａａｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００３．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４２（２６）：７９６７−７５、Ｃｈｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，ＲＮＡ，９（９）：１０３４−４８、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００４／０１５１０７号（ａｔｕｇｅｎ  ＡＧ）および同第ＷＯ０２／４４３２１号（Ｔｕｓｃｈｌら）を参照されたい。米国特許第５，８９８，０３１号および同第６，１０７，０９４号は、化学修飾オリゴマーについて教示している。米国特許第７，４５２，９８７号は、交互の非修飾および２’糖修飾リボヌクレオチドを有するオリゴマー化合物に関する。米国特許公開第２００５／００４２６４７号は、化学修飾ヌクレオシド連結を有するｄｓＲＮＡ化合物について記載している。
【００８６】
Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉら（２００３，ＮＡＲ，３１（２）：５８９−５９５）は、ｓｉＲＮＡ活性が、２’−Ｏ−メチル修飾の位置に依存することを示した。Ｈｏｌｅｎら（２００３，ＮＡＲ，３１（９）：２４０１−２４０７）は、少数の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオシドを有するｓｉＲＮＡは、野生型と比較して良好な活性を示したが、その活性は２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオシドの数が減少するにつれて減少したことを報告している。ＣｈｉｕおよびＲａｎａ（２００３，ＲＮＡ，９：１０３４−１０４８）は、センスまたはアンチセンス鎖（完全に修飾された鎖）への２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオシドの組み込みが、非修飾ｓｉＲＮＡと比べてｓｉＲＮＡ活性を著しく低減させたことを報告している。アンチセンス鎖の５’−末端への２’−Ｏ−メチル基の配置は、活性を著しく制限することが報告されているが、一方でアンチセンスの３’−末端およびセンス鎖の両端への配置は、許容された（Ｃｚａｕｄｅｒｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，ＮＡＲ，３１（１１），２７０５−２７１６）。
【００８７】
ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＩＬ２００８／０００２４８号および同第ＰＣＴ／ＩＬ２００８／００１１９７号は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、化学修飾ｓｉＲＮＡ化合物の調製に有用なモチーフを開示している。ＰＣＴ特許公開第ＷＯ２００８／０２０４３５号は、本明細書に記載される標的遺伝子に対するいくつかのｓｉＲＮＡ化合物を含む、阻害剤を開示している。
【００８８】
化合物は、糖修飾、塩基修飾、およびヌクレオチド間連結修飾からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含み、ＤＮＡと、ＬＮＡ（ロックド核酸）、ＥＮＡ（エチレン架橋核酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、アラビノシド、ホスホノカルボキシレートもしくはホスフィノカルボキシレートヌクレオチド（ＰＡＣＥヌクレオチド）、ミラーヌクレオチド、または６炭糖を有するヌクレオチド等の修飾ヌクレオチドと、を含み得る。
【００８９】
ヌクレオチド／オリゴヌクレオチドの全ての類似体またはそれに対する修飾が、本明細書に開示される組成物で利用され得るが、ただし、前記類似体または修飾が、ヌクレオチド／オリゴヌクレオチドの機能に実質的に悪影響を及ぼさないことを条件とする。許容可能な修飾には、糖部分の修飾、塩基部分の修飾、ヌクレオチド間連結における修飾、およびそれらの組み合わせが含まれる。
【００９０】
糖修飾は、糖残基の２’部分の修飾を含み、とりわけ、欧州特許第ＥＰ０  ５８６  ５２０  Ｂ１号または同第ＥＰ  ０  ６１８  ９２５  Ｂ１号に記載されるように、アミノ、フルオロ、アルコキシ、例えば、メトキシ、アルキル、アミノ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ＣＮ、ＣＦ、イミダゾール、カルボキシレート、チオエート、Ｃ１−Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリルもしくはアラルキル、ＯＣＦ３、ＯＣＮ、Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ、もしくはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２、Ｎ３；ヘテロジクロアルキル（ｈｅｔｅｒｏｚｙｃｌｏａｌｋｙｌ）；ヘテロジクロアルカリル（ｈｅｔｅｒｏｚｙｃｌｏａｌｋａｒｙｌ）；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ、または置換シリルを包含する。
【００９１】
一実施形態において、ｓｉＲＮＡ化合物は、糖部分に２’修飾（「２’糖修飾」）を含む少なくとも１つのリボヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、化合物は、場合により交互の位置に、２’Ｏ−アルキルもしくは２’−フルオロもしくは２’Ｏ−アリルまたは任意の他の２’修飾を含む。他の安定化修飾（例えば、末端修飾）もまた可能である。いくつかの実施形態において、好ましい２’Ｏ−アルキルは、２’Ｏ−メチル（メトキシ）糖修飾である。
【００９２】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの骨格は修飾され、ホスフェート−Ｄ−リボース実体を含むが、チオホスフェート−Ｄ−リボース実体、トリエステル、チオエート、２’−５’架橋骨格（５’−２’とも称され得る）、ＰＡＣＥ等もまた含有し得る。
【００９３】
本明細書に使用される際、「非対合ヌクレオチド類似体」という用語は、６デスアミノアデノシン（ネブラリン）、４−Ｍｅ−インドール、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、Ｄｓ、Ｐａ、Ｎ３−ＭｅリボＵ、Ｎ３−ＭｅリボＴ、Ｎ３−Ｍｅ  ｄＣ、Ｎ３−Ｍｅ−ｄＴ、Ｎ１−Ｍｅ−ｄＧ、Ｎ１−Ｍｅ−ｄＡ、Ｎ３−エチル−ｄＣ、Ｎ３−Ｍｅ  ｄＣを含むがこれらに限定されない、非塩基対部分を含む、ヌクレオチド類似体を意味する。いくつかの実施形態において、非塩基対合ヌクレオチド類似体は、リボヌクレオチドである。他の実施形態において、それは、デオキシリボヌクレオチドである。さらに、１つ以上のヌクレオチドの構造が本質的に改変されており、治療試薬または実験試薬としてより好適である、ポリヌクレオチドの類似体を調製することができる。ヌクレオチド類似体の例は、ＤＮＡ（またはＲＮＡのデオキシリボース（またはリボース）リン酸骨格が、ペプチドに見られるものと類似のポリアミド骨格と置き換えられた、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ＰＮＡ類似体は、酵素分解に対する耐性を有し、インビボおよびインビトロで向上した安定性を有することが示されている。オリゴヌクレオチドに対して行うことができる他の修飾には、ポリマー骨格、環状骨格、非環状骨格、チオホスフェート−Ｄ−リボース骨格、トリエステル骨格、チオエート骨格、２’−５’架橋骨格、人工核酸、モルホリノ核酸、グリコール核酸（ＧＮＡ）、スレオース核酸（ＴＮＡ）、アラビノシド、およびミラーヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−デオキシリボヌクレオシドの代わりにβ−Ｌ−デオキシリボヌクレオシド）が含まれる。ＬＮＡヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡ化合物の例は、Ｅｌｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（ＮＡＲ  ２００５，３３（１）：４３９−４４７）に開示されている。
【００９４】
オリゴヌクレオチドへのさらなる修飾には、末端のうちの１つ以上におけるヌクレオチドおよび／または非ヌクレオチド部分の存在が含まれる。
【００９５】
本明細書に開示される本核酸分子の化合物は、１つ以上の逆位ヌクレオチド、例えば、逆位チミジンまたは逆位アデニンを使用して合成することができる（例えば、Ｔａｋｅｉ，ｅｔ  ａｌ．，２００２，ＪＢＣ  ２７７（２６）：２３８００−０６を参照されたい）。
【００９６】
本明細書において、ときに「脱塩基ヌクレオチド」または「脱塩基ヌクレオチド類似体」と称されるものは、より正確には、擬似ヌクレオチドまたは非従来的部分と称される。ヌクレオチドは、リボースまたはデオキシリボース糖、リン酸、および塩基（ＤＮＡの場合はアデニン、グアニン、チミン、もしくはシトシン、ＲＮＡの場合はアデニン、グアニン、ウラシル、もしくはシトシン）からなる、核酸のモノマー単位である。修飾ヌクレオチドは、糖、リン酸、および／または塩基のうちの１つ以上に修飾を含む。脱塩基擬似ヌクレオチドは、塩基が欠落しており、したがって、厳密にはヌクレオチドではない。
【００９７】
他の修飾には、ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、脂質、ペプチド、糖、および逆位脱塩基部分から選択される、末端修飾が含まれる。
【００９８】
いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡ治療薬は、キャッピング部分を含む。本明細書に使用される「キャッピング部分」という用語は、脱塩基リボース部分、脱塩基デオキシリボース部分、２’Ｏアルキル修飾を含む修飾脱塩基リボースおよび脱塩基デオキシリボース部分；逆位脱塩基リボースおよび脱塩基デオキシリボース部分ならびにそれらの修飾；Ｃ６−イミノ−Ｐｉ；Ｌ−ＤＮＡおよびＬ−ＲＮＡを含むミラーヌクレオチド；５’Ｏ−Ｍｅヌクレオチド；ならびに４’，５’−メチレンヌクレオチドを含むヌクレオチド類似体；１−（β−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド；４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド；５’−アミノ−アルキルホスフェート；１，３−ジアミノ−２−プロピルホスフェート、３−アミノプロピルホスフェート；６−アミノヘキシルホスフェート；１２−アミノドデシルホスフェート；ヒドロキシプロピルホスフェート；１，５−無水ヘキシトールヌクレオチド；α−ヌクレオチド；スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−逆位脱塩基部分；１，４−ブタンジオールホスフェート；５’−アミノ；ならびに架橋もしくは非架橋メチルホスホネートおよび５’−メルカプト部分を含む、ヌクレオチド類似体を含む。
【００９９】
ある特定の好ましいキャッピング部分は、脱塩基リボースまたは脱塩基デオキシリボース部分、逆位脱塩基リボースまたは脱塩基デオキシリボース部分、Ｃ６−アミノ−Ｐｉ、Ｌ−ＤＮＡおよびＬ−ＲＮＡを含むミラーヌクレオチドである。
【０１００】
いくつかの実施形態において、治療用ｓｉＲＮＡは、ヌクレオチド以外の部分を含む。本明細書に使用される「非従来的部分」という用語は、脱塩基リボース部分、脱塩基デオキシリボース部分、デオキシリボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、ミラーヌクレオチド、非塩基対合ヌクレオチド類似体、ならびに２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合によって隣接するヌクレオチドと接合したヌクレオチド、ＬＮＡおよびエチレン架橋核酸を含む架橋核酸を指す。
【０１０１】
「ミラー」ヌクレオチドは、天然に存在するか、または一般に利用されるヌクレオチドとは逆のキラリティを有するヌクレオチド、すなわち、天然に存在する（Ｄ−ヌクレオチド）の鏡像（Ｌ−ヌクレオチド）であり、ミラーリボヌクレオチドの場合はＬ−ＲＮＡおよび「スピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）」とも称される。ヌクレオチドは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドであり得、少なくとも１つの糖、塩基、および／または骨格の修飾をさらに含み得る。米国特許第６，５８６，２３８号を参照されたい。さらに、米国特許第６，６０２，８５８号は、少なくとも１つのＬ−ヌクレオチド置換を含む核酸触媒を開示している。ミラーヌクレオチドには、例えば、Ｌ−ＤＮＡ（Ｌ−デオキシリボアデノシン−３’−リン酸（ミラーｄＡ）、Ｌ−デオキシリボシチジン−３’−リン酸（ミラーｄＣ）、Ｌ−デオキシリボグアノシン−３’−リン酸（ミラーｄＧ）、Ｌ−デオキシリボチミジン−３’−リン酸（鏡像ｄＴ））、およびＬ−ＲＮＡ（Ｌ−リボアデノシン−３’−リン酸（ミラーｒＡ）、Ｌ−リボシチジン−３’−リン酸（ミラーｒＣ）、Ｌ−リボグアノシン−３’−リン酸（ミラーｒＧ）、Ｌ−リボウラシル−３’−リン酸（ミラーｄＵ）が挙げられる。
【０１０２】
修飾デオキシリボヌクレオチドには、例えば、５’末端位置（１位）のヌクレオチドとして有用であり得る５’ＯＭｅ  ＤＮＡ（５−メチル−デオキシリボグアノシン−３’−リン酸）；ＰＡＣＥ（デオキシリボアデニン３’ホスホノアセテート、デオキシリボシチジン３’ホスホノアセテート、デオキシリボグアノシン３’ホスホノアセテート、デオキシリボチミジン３’ホスホノアセテートが挙げられる。
【０１０３】
架橋核酸には、ＬＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン架橋核酸アデノシン３’一リン酸、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン架橋核酸５−メチル−シチジン３’一リン酸、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン架橋核酸グアノシン３’一リン酸、５−メチル−ウリジン（またはチミジン）３’一リン酸）、およびＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸アデノシン３’一リン酸、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸５−メチル−シチジン３’一リン酸、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸グアノシン３’一リン酸、５−メチル−ウリジン（またはチミジン）３’一リン酸）が含まれる。
【０１０４】
一態様によると、非修飾および修飾ヌクレオチドを含む阻害性オリゴヌクレオチド化合物が、本明細書に提供される。この化合物は、糖修飾、塩基修飾、およびヌクレオチド間連結修飾からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含み、ＤＮＡと、ＥＮＡ（エチレン架橋核酸を含むＬＮＡ（ロックド核酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、アラビノシド、ＰＡＣＥ（ホスホノアセテートおよびその誘導体）、ミラーヌクレオチド、または６炭糖を有するヌクレオチド等の修飾ヌクレオチドと、を含有し得る。いくつかの実施形態において、インビボで標的遺伝子の発現を阻害するための方法および組成物を、本明細書に提供する。一般に、本方法は、送達剤−治療剤の複合体を投与することを含む。特定の実施形態において、複合体は、標的遺伝子から転写されるｍＲＮＡを標的とする低分子干渉ＲＮＡ（すなわち、ｓｉＲＮＡ）を、例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）機構によって標的遺伝子の発現を下方制御する（ｍＲＮＡレベルを低減させる、タンパク質レベルを低減させる）のに十分な量で含む。具体的には、本主題の方法を使用して、疾患の治療のために標的遺伝子の発現を阻害することができる。標的遺伝子に対する核酸分子は、種々の病態を治療するための治療剤として有用である。一実施形態において、核酸分子は、標的ポリペプチドを下方制御し、この標的ポリペプチドの下方制御には、標的ポリペプチドの機能の下方制御（これは、例えば、酵素アッセイまたは天然の遺伝子／ポリペプチドの既知の相互作用物質を用いた結合アッセイによって試験可能である）、標的タンパク質の下方制御（これは、例えば、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、または免疫沈降法によって試験可能である）、および標的ポリペプチドのｍＲＮＡ発現の下方制御（これは、ノーザンブロット、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、インサイツハイブリダイゼーション、ＲＡＣＥによって試験可能である）が含まれる。
【０１０５】
本明細書に記載される核酸分子の合成は、当業者の範囲内である。このような合成は、とりわけ、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ＳＬ  ａｎｄ  Ｉｙｅｒ  ＲＰ，１９９２  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ；４８：２２２３−２３１１、Ｂｅａｕｃａｇｅ  Ｓ．ａｎｄ  Ｉｙｅｒ  ＲＰ，１９９３  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ；４９：６１２３−６１９４、およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ  ＭＨ  ｅｔ．ａｌ．，１９８７  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．；１５４：２８７−３１３に記載されており、チオエートの合成は、とりわけ、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  Ｆ．，１９８５  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．；５４：３６７−４０２に記載されており、ＲＮＡ分子の合成は、Ｓｐｒｏａｔ  Ｂ．，ｉｎ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  ２００５  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ  Ｐ．；Ｋａｐ．２：１７−３１に記載されており、それぞれの後続プロセスは、とりわけ、Ｐｉｎｇｏｕｄ  Ａ．ｅｔ．ａｌ．，ｉｎ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｏｌｉｖｅｒ  Ｒ．Ｗ．Ａ．；Ｋａｐ．７：１８３−２０８およびＳｐｒｏａｔ  Ｂ．，ｉｎ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  ２００５  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ  Ｐ．；Ｋａｐ．２：１７−３１（上記）に記載されている。
【０１０６】
いずれの標的遺伝子に対するｓｉＲＮＡも、標的ｍＲＮＡの既知の配列に基づいて、上述のように当該技術分野で既知の方法を使用して合成され、本明細書に記載される種々の修飾によって、血清および／または細胞ヌクレアーゼに対して安定化される。  
【０１０７】
標的遺伝子
本明細書に開示される送達系は、ＥＮＤＯ１８０を発現する細胞への治療剤および／または診断剤の送達に有用である。いくつかの実施形態において、治療剤は、抗細胞増殖剤を含む。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、治療剤は、標的遺伝子または標的遺伝子の発現を阻害する核酸化合物を含み、この標的遺伝子は、増殖性疾患、転移性疾患、および線維症からなる群から選択される疾患または障害と関連している。
【０１０９】
標的遺伝子には、抗アポトーシス遺伝子、基礎細胞分裂機構に関連する遺伝子、細胞周期制御／細胞増殖に関連する遺伝子、律速代謝（ヌクレオチド／核酸合成、タンパク質合成、エネルギー代謝）に関連する遺伝子、タンパク質輸送（例えば、分泌）に関連する遺伝子、炎症性遺伝子、サイトカイン、ケモカイン、ＮＦｋＢ、成長因子／受容体（ＴＧＦβ１および２、ＣＴＧＦ、ＩＧＦ１、ＰＤＧＦ１、ＰＤＧＦ２、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２等）、線維症に関連する遺伝子（ＨＳＰ４７、ＴＧＦβ１、ＩＬ−１０）が挙げられる。
【０１１０】
ｓｉＲＮＡの合成に有用なセンスおよびアンチセンス配列は、独自のおよび公的に利用可能な方法およびアルゴリズムに従って選択される。
【０１１１】
上に提供された化学修飾は、とりわけ、血清安定性、活性、免疫応答の低減、オフターゲット効果の低減を示す、ヌクレオチド治療薬の合成に有用である。  
【０１１２】
抗体
「抗体」という用語は、とりわけ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ抗体を指す。この定義には、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が含まれる。この用語は、全抗体または抗原結合ドメインを含む抗体のフラグメント、例えば、Ｆｃ部分を含まない抗体、一本鎖抗体、ミニ抗体、本質的に抗体の可変抗原結合ドメインのみからなるフラグメント等を指す。「抗体」という用語はまた、ｃＤＮＡワクチン接種によって得られるポリヌクレオチド配列に対する抗体も指し得る。この用語はまた、それらの抗原または受容体に選択的に結合する能力を保持し、とりわけ、以下のように例示される抗体フラグメントを包含する：
【０１１３】
（１）Ｆａｂ、抗体分子の一価の抗原結合フラグメントを含有するフラグメントであり、全抗体を酵素パパインで消化し、軽鎖および重鎖の一部を生じさせることによって生成することができる、
【０１１４】
（２）（Ｆａｂ’）２、全抗体を酵素ペプシンで処置し、その後に還元を行わずに得ることができる抗体のフラグメントであり、Ｆ（ａｂ’２）は、２つのジスルフィド結合によって一緒に維持される２つのＦａｂフラグメントの二量体である、
【０１１５】
（３）Ｆｖ、２本の鎖として発現される軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作されたフラグメントとして定義される、ならびに、
【０１１６】
（４）一本鎖抗体（ＳＣＡ）、遺伝子的に融合させた一本鎖分子として、好適なポリペプチドリンカーによって連結された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する、遺伝子操作された分子として定義される（ｓｃＦｖを含む）。
【０１１７】
ＣＤＲ移植を、親和性または特異性を含む、抗体分子のある特定の特性を改変するために行ってもよい。ＣＤＲ移植の非限定的な例は、米国特許第５，２２５，５３９号に開示されている。
【０１１８】
単一ドメイン抗体は、ラクダおよびラマを含む、免疫付与したラクダ科の固有の重鎖抗体から単離される。小さい抗体は、非常に強固であり、モノマーの状態で抗原と高親和性で結合する。米国特許第６８３８２５４号は、ラクダ科の重鎖免疫グロブリンに由来する抗体またはそのフラグメントの生成について記載している。
【０１１９】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、特異的な抗原に対する実質的に同種の抗体集団である。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、当業者に既知の方法によって得られる。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９７５）、米国特許第４，３７６，１１０号、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ（１９８７−１９９９）、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）、およびＣｏｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）を参照されたく、これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に開示されるｍＡｂは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびそれらの任意のサブクラスを含む、任意の免疫グロブリンのクラスのものであり得る。ｍＡｂを生成するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボで培養することができる。例えば、プリスティンで予備刺激したＢａｌｂ／ｃマウスに、個々のハイブリドーマ由来の細胞を腹腔内注射して高濃度の所望のｍＡｂを含有する腹水を生成させることにより、インビボで高力価のｍＡｂが得られる。アイソタイプＩｇＭまたはＩｇＧのｍＡｂは、当業者に周知であるカラムクロマトグラフィー法を使用して、そのような腹水から、または培養上清から精製することができる。
【０１２０】
「特異的な結合親和性」とは、抗体が、類似の条件下で別のポリペプチドに結合するよりも高い親和性で、ＥＮＤＯ１８０ポリペプチドまたはそのフラグメントに結合することを意味する。
【０１２１】
「エピトープ」という用語は、抗体が結合することができ、その抗体によって認識もされ得る、分子の部分を指すことを意味する。「抗原」は、抗体が結合することができ、さらに、その抗原のエピトープに結合することができる抗体を生成するように動物を誘導することが可能である、分子または分子の一部分である。抗原は、１つまたは１つを上回るエピトープを有してもよい。上述した特異的な反応は、抗原が、他の抗原によって誘発され得る多数の他の抗体とではなく、それの対応する抗体と、高度に選択的な様式で反応することを意味することを意味する。
【０１２２】
エピトープまたは抗原決定基は、通常、アミノ酸または糖側鎖等の化学的に活性な表面分子群からなり、特定の３次元構造特性ならびに特定の電荷特性を有する。
【０１２３】
一実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体である。一実施形態において、モノクローナル抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、またはＩｇＥモノクローナル抗体である。ＩｇＧのサブクラスもまた、当業者に周知であり、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含むが、これらに限定されない。一実施形態において、モノクローナル抗体は、ＩｇＧモノクローナル抗体である。一実施形態において、モノクローナル抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である。一実施形態において、抗体の部分は、抗体のＦａｂフラグメントである。一実施形態において、抗体の部分は、抗体の可変ドメインを含む。一実施形態において、抗体の部分は、抗体のＣＤＲ部分を含む。他の実施形態において、抗体は、ｓｃＦｖ分子である。抗体は、組み換えによって生成することができ（一般に、Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６"Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｃｏｕｒｓｅ  ｍａｎｕａｌ．”Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６を参照されたい）、類似体は、翻訳後プロセシングによって生成することができる。グリコシル化における差異により、ポリペプチド類似体を提供することができる。
【０１２４】
抗体は、ヒト抗体または非ヒト抗体であり得る。非ヒト抗体は、人間におけるその免疫原性を減少させるために組み換え法によってヒト化されてもよい。抗体をヒト化するための方法は、当業者に周知である。
【０１２５】
本出願は、上記抗体のヒト化形態を提供する。本明細書に使用される際、「ヒト化」とは、ＣＤＲ領域外のアミノ酸のうちのいくつか、ほとんど、または全てが、ヒト免疫グロブリン分子に由来する対応するアミノ酸で置き換えられた抗体を表し、例えば、ヒトフレームワーク領域が、非ヒト領域と置き換わる。抗体のヒト化形態の一実施形態において、ＣＤＲ領域外のアミノ酸のうちのいくつか、ほとんど、または全てが、ヒト免疫グロブリン分子由来のアミノ酸と置き換えられているが、１つ以上のＣＤＲ領域内のアミノ酸のうちのいくつか、ほとんど、または全ては、未変化のままである。抗原ＥＮＤＯ１８０に結合する抗体の能力を無効にしない限り、アミノ酸の少しの付加、欠失、挿入、置換、または修飾が許容される。
【０１２６】
「ヒト化」抗体は、元の抗体と類似の抗原特異性、すなわち、ＥＮＤＯ１８０、具体的にはヒトＥＮＤＯ１８０受容体に結合する能力を保持し、この受容体によって同様に内部移行される。
【０１２７】
当業者は、本主題の発明のヒト化抗体を生成する方法を理解しているであろう。種々の刊行物（そのうちのいくつかは、参照によって本出願に組み込まれる）が、ヒト化抗体の作製方法について記載している。
【０１２８】
例えば、米国特許第４，８１６，５６７号および同第６，３３１，４１５号に記載される方法は、１つの抗体の可変領域と別の抗体の定常領域とを有する、キメラ抗体の生成を含む。
【０１２９】
米国特許第５，２２５，５３９号、同第６，５４８，６４０号、および同第６，９８２，３２１号は、ヒト化抗体が標的抗原を認識するが免疫応答を妨げないように、１つの免疫グロブリンのＣＤＲが、異なる特異性を有する免疫グロブリン由来のＣＤＲと置き換えられた、ヒト化抗体を生成するための組み換えＤＮＡ技術の使用について記載している。具体的には、部位特異的な突然変異生成を用いて、ＣＤＲをフレームワーク領域に導入する。
【０１３０】
抗体をヒト化するための他のアプローチは、ＷＯ９０／０７８６１号、ならびに米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第６，１８０，３７０号、および同第７，０２２，５００号を含む、対応する特許に記載されている。これらの特許は、マウスモノクローナル抗体のＣＤＲを、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域および定常領域と組み合わせることによって、所望の抗原に対する抗体の親和性を増加させる方法について記載している。ヒトフレームワーク領域は、マウス配列との相同性を最大化するように選択することができる。コンピュータモデルを使用して、ＣＤＲまたは特異的抗原と相互作用する可能性の高いフレームワーク領域内のアミノ酸を識別することができ、次いで、マウスアミノ酸を、これらの位置に使用して、ヒト化抗体を作製することができる。
【０１３１】
上記の方法は、当業者がヒト化抗体を作製するために利用することができる方法のうちの一部の例示に過ぎない。
【０１３２】
モノクローナル抗体Ｅ３−８Ｄ８は、本明細書に開示される組成物および方法における使用に好適な抗ＥＮＤＯ１８０抗体を表す。ハイブリドーマ細胞Ｅ３−８Ｄ８は、Ｂｕｄａｐｅｓｔ  Ｔｒｅａｔｙの規約の下に、Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｃｏ−ｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏ−Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＢＣＣＭ）に寄託され、受託番号ＬＭＢＰ  ７２０３ＣＢが付与されている。  
【０１３３】
エピトープマッピング
エピトープマッピング研究により、抗体の結合に重要な残基を識別する。エピトープマッピングのための種々の方法が当該技術分野で既知であり、当業者によって容易に実行される。ある特定の方法は、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｏ．Ｍ．Ｒ．Ｗｅｓｔｗｏｏｄ，Ｆ．Ｃ．Ｈａｙ；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３４】
エピトープマッピング技術の一例は、それぞれがタンパク質抗原の線形配列の小セグメント、すなわち、ＥＮＤＯ１８０の細胞外ドメインに対応する、１組の重複する合成ペプチドを合成して固相に並べる、合成標識ペプチドのエピトープマッピングである。次いで、ペプチドのパネルを試験抗体でプローブし、結合した抗体を、酵素標識した二次抗体を使用して検出する。
【０１３５】
他の技術には、タンパク質抗原の断片化または切断およびゲル分離、膜への輸送、試験抗体によるプローブが挙げられ、結合した抗体を、酵素標識した二次抗体を使用して検出する。  
【０１３６】
抗体薬物の開発
一般に、モノクローナル抗体は、結合特性（選択性、内部移行等）を保存し、レシピエントの免疫応答を低減させるように設計される必要がある。具体的には、ハイブリドーマ３Ｅ−８Ｄ８から分泌されるモノクローナル抗体は、当業者に既知の複数の方法のうちの１つによってヒト治療薬として最適化することができる。１つの方法では、モノクローナル抗体の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）を、配列決定する。アミノ酸配列が判明すると、その相補性決定領域（ＣＤＲ）、重鎖および軽鎖ＣＤＲ３を特定し、変性オリゴヌクレオチドを使用して、合成ＣＤＲ３をベクターにクローニングして、組み換えベクターまたは構築物を生成する。構築物は、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖フラグメント、または全長ＩｇＧ分子であり得る。構築物（複数可）が発現され、ポリペプチドが単離される。いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体は、元のＣＤＲ３に対して実質的な同一性を有するＣＤＲ３ドメインを生成するように、部位特異的な突然変異生成によって最適化された突然変異生成によってさらに最適化されてもよい。  
【０１３７】
治療剤
本明細書に開示される組成物の調製および使用に有用な治療剤または活性剤には、アンチセンス（ＡＳ）、ｍｉＲＮＡ、ならびに非修飾および化学修飾ｓｉＲＮＡ化合物等のオリゴヌクレオチドを含む、ヌクレオチドおよび非ヌクレオチド剤が含まれる。好ましい治療剤は、ｓｉＲＮＡ化合物である。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子を標的とし、ＲＮＡ干渉によってその発現を低減させる。
【０１３９】
本明細書に開示される組成物および方法は、異常な細胞増殖に起因するかまたはそうでなければそれが関与する疾患の治療または診断に有用である。治療剤とは、この用語が本明細書に使用される場合、標的細胞に送達されると、疾患を患う対象の治療、すなわち、レシピエント対象における疾患の症状の緩和または軽減に貢献するように標的細胞に作用する、薬剤である。本明細書に使用される際、疾患を「治療する」またはその「治療」という用語には、疾患の予防、すなわち、疾患を受けるかもしくはそうなる傾向にあり得るが、まだ疾患の症状を経験していないかもしくは呈していない対象における疾患の臨床症状の予防、疾患の阻害、すなわち、疾患もしくはその臨床症状の発症の阻止、または疾患の緩和、すなわち、疾患もしくはその臨床症状の軽減をもたらすこと、が含まれる。治療剤はまた、疾患もしくは疾患の進行、または疾患の治療の効果の診断に有用な薬剤であり得る。
【０１４０】
一実施形態において、本組成物は、１つ以上の器官における異常な細胞増殖を示す対象に投与される。
【０１４１】
有用な治療剤には、核酸、小分子、ポリペプチド、抗体、またはその機能的フラグメントが含まれる。治療剤として重要なこれらの構成要素は、機能または保管を強化する（例えば、細胞取り込みの強化、標的に対する特異性の向上、半減期の増加、生成または保管を容易にする）ように、さらに修飾されてもよい。核酸治療剤は、一本鎖および二本鎖両方のＤＮＡおよびＲＮＡ分子を含む。１つを上回る治療剤を、本明細書に開示される組成物によって送達することができる。
【０１４２】
本明細書に開示される方法によって送達される治療剤には、細胞内シグナル伝達系、酵素（キナーゼ）、プロテオソーム、脂質代謝、細胞周期、膜輸送を阻止するための小分子およびペプチドが含まれる。本明細書に開示される組成物および方法によって送達される治療剤には、化学療法剤が含まれる。
【０１４３】
治療剤は、当業者に既知であり、内側部分への封入、分子の脂質部分との会合、または脂質粒子の外側部分との会合を含むがこれらに限定されない、任意の方法によって脂質粒子と会合させることができる。水溶液に可溶性の小分子薬物は、脂質粒子の内側部分に封入され得る。水溶液にほとんど溶けない小分子薬物は、脂質粒子の脂質部分と会合し得る。核酸ベースの治療剤は、脂質粒子の外側部分と会合し得る。このような核酸は、陽イオン性ポリマー、例えば、ＰＥＩ、または陽イオン性ペプチド、例えばプロタミンとともに凝縮され、脂質粒子の内側部分に封入され得る。治療的ペプチドは、脂質粒子の内側部分に封入され得る。治療的ペプチドは、脂質粒子の外側に共有結合されてもよい。
【０１４４】
治療剤が核酸である実施形態において、脂質粒子が、核酸の輸送に特に好適である。
【０１４５】
一実施形態において、治療剤は、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子（例えば、二本鎖ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド）等の核酸である。有用なＤＮＡ分子は、アンチセンスならびにセンス（例えば、コードおよび／または制御性）ＤＮＡである。アンチセンスＤＮＡ分子は、短いオリゴヌクレオチドを含む。有用なＲＮＡ分子は、ＲＮＡ干渉分子を含み、これには複数の既知の種類がある。ＲＮＡ干渉分子の分野は、近年、著しく拡大している。有用なＲＮＡ干渉分子の例は、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびｍｉＲＮＡを含む、ｄｓＲＮＡである（例えば、低分子一過性ＲＮＡおよび小分子調節性ＲＮＡ（Ｋｉｍ．２００５．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ．１９：１−１５））。本明細書に使用される際、「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」とは、二本の鎖から構成されるＲＮＡ分子を指す。本明細書に開示される治療的オリゴヌクレオチドは、リボ核酸ヌクレオチドまたはデオキシリボ核酸ヌクレオチドについて当該技術分野で既知の任意の方法によって合成される。例えば、市販のポリヌクレオチド合成機（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３８０Ｂ  ＤＮＡ合成機）が使用され得る。フラグメントを使用する場合、２つ以上のこのような配列を、本明細書に開示される組成物で使用するために合成し、一緒に連結させてもよい。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、治療剤は、チオテパおよびＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロホスファミド等のアルキル化剤；ブスルファン、イムプロスルファンおよびピポスルファン等のアルキルスルホネート；ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、およびウレドーパ等のアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、およびトリメチロロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含む、エチレンイミンおよびメチラメラミン；アセトゲニン（特にブラタシンおよびブラタシノン）；δ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；β−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成類似体トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン、および９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼルシン、およびビゼレシン合成類似体を含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコジクチイン；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノヴェムビシン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン、プレドニマスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン等のニトロス尿素（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）；エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特に、カリケアマイシンγ１ＩおよびカリケアマイシンωＩ１（例えば、Ａｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，１９９４．３３：１８３−１８６を参照されたい）；ダイネミシンＡを含むダイネミシン；エスペラマイシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射（ＤＯＸＩＬ（登録商標））、およびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マセロマイシン、マイトマイシンＣ等のマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマ��シン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン等の抗生物質；メトトレキサート、ゲンシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、テガフール（ＵＦＴＯＲＡＬ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、エポチロン、および５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）等の代謝拮抗薬；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、およびトリメトレキセート等の葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン等のプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン等のピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン等のアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン等の抗副腎剤；フロリン酸等の葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルフォルニチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；イタンシンおよびアンサミトシン等のメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２"−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、およびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子組成物（ＡＢＲＡＸＡＮＥ．（商標））、およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））；クロラムブシル；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンおよびカルボプラチン等の白金類似体；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；オキサリプラチン；ロイコボリン；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ノバントロン；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸等のレチノイド；上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体；ならびに、シクロホスファミド、ドキソルビシン、���ンクリスチン、およびプレドニゾロンの併用療法の略称であるＣＨＯＰ、ならびに５−ＦＵおよびロイコボリンと組み合わせたオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標））を用いる治療計画の略称であるＦＯＬＦＯＸといった、上記のうちの２つ以上の組み合わせから選択される。
【０１４７】
また、この定義には、癌の成長を促進し得るホルモンの効果を制御、低減、遮断、または阻害するように作用し、全身性または全身治療薬として投与されることが多い、抗ホルモン剤が含まれる。それらは、ホルモン自体であってもよい。例には、例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェンを含む）、ラロキシフェン（ＥＶＩＳＴＡ（登録商標））、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン、およびトレミフェン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標））を含む、抗エストロゲン剤および選択的エストロゲン受容体調節因子（ＳＥＲＭ）；抗プロゲステロン；エストロゲン受容体下方制御因子（ＥＲＤ）；卵巣を抑制または閉鎖するように機能する薬剤、例えば、酢酸ロイプロリド（ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）およびＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標）、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリン、およびトリプトレリン等の黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト；フルタミド、ニルタミド、およびビカルタミド等の他の抗アンドロゲン剤；ならびに、例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール（ＭＥＧＡＳＥ（登録商標））、エキセメスタン（ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標））、フォルメスタニー、ファドロゾール、ボロゾール（ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標））、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標））、およびアナストロゾール（ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標））等のアロマターゼ阻害剤が挙げられる。さらに、クロドロネート（例えば、ＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）またはＯＳＴＡＣ（登録商標））、エチドロネート（ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標））、ＮＥ−５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート（ＺＯＭＥＴＡ（登録商標））、アレンドロネート（ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標））、パミドロネート（ＡＲＥＤＩＡ（登録商標））、チルドロネート（ＳＫＥＬＩＤ（登録商標））、またはリセドロネート（ＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標））等のビスホスホネート；ならびにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；ｓｉＲＮＡ、リボザイム、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、異常な細胞増殖に関与するシグナル伝達経路において遺伝子の発現を阻害するもの；ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチンおよび遺伝子療法ワクチン等のワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、およびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン等のワクチン；トポイソメラーゼ１阻害剤（例えば、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標））；ｒｍＲＨ（例えば、ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標））；トシル酸ラパチニブ（ＧＷ５７２０１６としても知られるＥｒｂＢ−２およびＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ小分子阻害剤）；セレコキシブ（ＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標）等のＣＯＸ−２阻害剤；４−（５−（４−メチルフェニル）−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）ベンゼンスルホンアミド；ならびに、上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体。
【０１４８】
本明細書に使用される際、「ポリペプチド」という用語は、ポリペプチドに加えて、ペプチドおよび完全なタンパク質を指し、単離および組み換えポリペプチドを含む。本明細書に使用される際、「生物学的機能」とは、分子の生物学的特性を指し、この文脈では、天然に存在するポリペプチドまたは核酸分子によって直接的または間接的に行われるインビボエフェクターまたは抗原の機能または活性を意味する。生物学的機能は、受容体結合、任意の酵素活性もしくは酵素調節活性、任意の担体結合活性、任意のホルモン活性、分子の内部移行もしくは１つの区画から別の区画への転位における任意の活性、細胞外マトリックスもしくは細胞表面分子に対する細胞の付着の促進もしくは阻害における任意の活性、または任意の構造的役割、ならびに機能性タンパク質をコードする核酸配列を有することおよび発現可能であることを含むが、これらに限定されない。抗原機能とは、本質的に、天然に存在するタンパク質に対して生じる抗体と交差反応することが可能なエピトープまたは抗原部位の保有を意味する。生物学的に活性な類似体は、必ずしもそうである必要はないが、さらに抗原機能を保有し得る、天然のポリペプチドのエフェクター機能を共有する。
【０１４９】
ＥＮＤＯ１８０ポリペプチドのレベルの測定は、免疫組織化学、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、抗体マイクロアレイハイブリダイゼーション、および標的分子撮像からなる群から選択される方法によって判定することができる。例えば、免疫組織化学、ウエスタンブロット、抗体マイクロアレイハイブリダイゼーション、および標的分子撮像等、そのような方法は、当該技術分野において周知である。
【０１５０】
ＥＮＤＯ１８０ポリヌクレオチドのレベルの測定は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ分析、インサイツハイブリダイゼーション、ポリヌクレオチドマイクロアレイ、およびノーザンブロットから選択される方法によって判定されてもよい。そのような方法は、当該技術分野において周知である。  
【０１５１】
アンチセンス分子
いくつかの実施形態において、治療剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。「アンチセンス」（ＡＳ）または「アンチセンスフラグメント」という用語は、阻害性アンチセンス活性を有するポリヌクレオチドフラグメント（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、または両方の混合物のいずれかを含む）を意味し、前記活性は、対応する遺伝子の内在性ゲノムコピーの発現における低下をもたらす。ＡＳポリヌクレオチドは、標的遺伝子の配列内に存在する配列に対して、この遺伝子に対するＡＳのハイブリダイゼーションを許容するのに十分な長さおよび相同性の配列を有する連続的なヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドである。多く総説が、アンチセンス（ＡＳ）技術の主な態様およびその治療的可能性について記述している（Ａｂｏｕｌ−Ｆａｄｌ  Ｔ．，Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００５，１２（１９）：２１９３−２１４、Ｃｒｏｏｋｅ  ＳＴ，Ｃｕｒｒ  ＭｏＩ  Ｍｅｄ．２００４，４（５）：４６５−８７、Ｃｒｏｏｋｅ  ＳＴ，Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ．２００４，５５：６１−９５、Ｖａｃｅｋ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  ＭｏＩ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．２００３，６０（５）：８２５−３３、Ｃｈｏ−Ｃｈｕｎｇ  ＹＳ，Ａｒｃｈ  Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．２００３，２６（３）：１８３−９１。ＡＳ技術の化学的態様（Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ．１９９５，９（２）：５９−７２）、細胞に関する態様（Ｗａｇｎｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ．１９９４，３７２（６５０４）：３３３−５）、および治療的態様（Ｓｃａｎｌｏｎ，ｅｔ  ａｌ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１９９５，９（１３）：１２８８−９６）についてのさらなる総説が存在する。特異的な遺伝子の発現におけるアンチセンス介在は、修飾ＡＳオリゴヌクレオチド配列の使用によって達成することができる（最近の報告については、Ｌｅｆｅｂｖｒｅ−ｄ’Ｈｅｌｌｅｎｃｏｕｒｔ  ｅｔ  ａｌ，１９９５、Ａｇｒａｗａｌ，１９９６、ＬｅｖＬｅｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９７を参照されたい）。
【０１５２】
ＡＳオリゴヌクレオチド配列は、典型的には１５〜３０量体であるが７量体程度に小さくてもよく（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９９６，１４（７）：８４０−４）、目的の標的ｍＲＮＡを補完し、ＲＮＡ：ＡＳの二重鎖を形成するように設計される、短いＤＮＡ配列であり得る。この二重鎖の形成により、関連するｍＲＮＡのプロセシング、スプライシング、輸送、または翻訳を阻止することができる。さらに、ある特定のＡＳヌクレオチド配列は、それらの標的ｍＲＮＡとハイブリダイズする際、細胞ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を誘発し、ｍＲＮＡ分解をもたらし得る（Ｃａｌａｂｒｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．１９９６，２３（ｌ）：７８−８７）。その場合、ＲＮａｓｅ  Ｈは、二重鎖のＲＮＡ成分を切断し、標的ＲＮＡの追加の分子とさらにハイブリダイズするようにＡＳを放出し得る可能性がある。さらなる作用様式は、ＡＳとゲノムＤＮＡとの相互作用から生じ、転写的に不活性であり得る三重らせんを形成する。
【０１５３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列標的セグメントは、配列が、それらの相補的鋳型とのオリゴヌクレオチドに重鎖形成に重要な好適なエネルギー関連特性を呈し、自己二量体形成または自己相補性に対する低い可能性を示すように選択される（Ａｎａｚｏｄｏ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，ＢＢＲＣ．２２９：３０５−３０９）。例えば、コンピュータプログラムＯＬＩＧＯ（Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．４）を使用して、アンチセンス配列の融解温度、自由エネルギー特性を判定し、可能性のある自己二量体形成および自己相補性特性を推定することができる。このプログラムは、これらの２つのパラメータ（可能性のある自己二量体形成および自己相補性）の定性的評価の判定を可能にし、「可能性なし」または「いくらかの可能性」または「本質的に完全な可能性」という指標を提供する。このプログラムを使用して、これらのパラメータにおいて可能性なしの評価を有する標的セグメントが一般的に選択される。しかしながら、カテゴリーの１つに「いくらかの可能性」を有するセグメントが使用されてもよい。パラメータのバランスは、当該技術分野において既知のように、選択において使用される。さらに、オリゴヌクレオチドもまた、類似体置換が実質的に機能に影響を及ぼさないよう、必要に応じて選択される。
【０１５４】
ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドは、通常、動物において有効であり十分な薬力学的半減期を呈する濃度で、有意な毒性を示さず（Ａｇｒａｗａｌ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９７，９４（６）：２６２０−５）、ヌクレアーゼ耐性である。分裂促進性および血管新生特性を有する塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害は、飽和的および特異的な方式で、神経膠腫細胞の成長を８０％抑制した（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９１  ２６６（２）：７２８−３４）。疎水性であるため、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リン脂質膜と良好に相互作用する（Ａｋｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ．１９９１，１９：５５５１−５５５９）。細胞の原形質膜との相互作用に続いて、それらは、特定の受容体が関与すると予測される飽和機構において（Ｙａｋｕｂｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９８９  ８６（１７）：６４５４−５８）、生細胞内に能動的（または受動的）に輸送される（Ｌｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １９８９，８６（１０）：３４７４−８）。  
【０１５５】
ｓｉＲＮＡおよびＲＮＡ干渉
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ依存性遺伝子特異的転写後サイレンシングが関与する現象である。この現象を研究し、実験的に哺乳動物の細胞を操作しようとする初期の試みは、長いｄｓＲＮＡ分子に応答して活性化された、活性な非特異的抗ウイルス性防御機構により失敗に終わった（Ｇｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，２０００．５：１０７−１１４）。後に、２１ヌクレオチドのＲＮＡの合成二重鎖が、一般的な抗ウイルス性防御機構を刺激することなく、哺乳動物細胞において遺伝子特異的なＲＮＡｉを媒介し得ることが発見された（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００１，４１１：４９４−４９８およびＣａｐｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ２００１，９８：９７４２−９７４７）。結果として、短い二本鎖ＲＮＡである低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、遺伝子発現の阻害および遺伝子機能の理解のために、広く使用されている。
【０１５６】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  １９９８，３９１：８０６）またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）（Ａｍｂｒｏｓ  Ｖ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００４，４３１：３５０−３５５）、およびＢａｒｔｅｌ  ＤＰ．Ｃｅｌｌ．２００４  １１６（２）：２８１−９７）によって媒介される。対応するプロセスは、一般に、植物において観察される場合には特異的な転写後遺伝子サイレンシングと称され、真菌において観察される場合にはクエリングと称される。
【０１５７】
ｓｉＲＮＡは、内在性または外来性の遺伝子／ｍＲＮＡの発現を下方制御またはサイレンシングする（すなわち、完全にまたは部分的に阻害する）二本鎖ＲＮＡである。ＲＮＡ干渉は、ある特定のｄｓＲＮＡ種が特異的なタンパク質複合体に進入し、次いで相補的な細胞のＲＮＡ（すなわち、ｍＲＮＡ）を標的とし、特異的に分解または切断する能力に基づく。したがって、ＲＮＡ干渉応答は、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を媒介する、ＲＮＡ誘発型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と一般的に称されるｓｉＲＮＡを含有するエンドヌクレアーゼ複合体を特徴とする。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央で起こり得る（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，２００１，１５：１８８）。より詳細には、より長いｄｓＲＮＡは、ＩＩＩ型ＲＮＡｓｅ（ＤＩＣＥＲ、ＤＲＯＳＨＡ等（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００１，４０９：３６３−６およびＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００３，４２５：４１５−９を参照されたい）によって消化され、短い（１７〜２９ｂｐ）ｄｓＲＮＡフラグメント（短い阻害性ＲＮＡまたは「ｓｉＲＮＡ」とも称される）となる。ＲＩＳＣタンパク質複合体は、これらのフラグメントおよび相補的ｍＲＮＡを認識する。全プロセスは、標的ｍＲＮＡのエンドヌクレアーゼ切断によって終結する（ＭｃＭａｎｕｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ，２００２，３：７３７−４７、Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｈａｎｎｏｎ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００３，５（３）：２１７−２４）。（これらの用語および提案される機構に関するさらなる情報については、例えば、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ．２００１，７（１１）：１５０９−２１、Ｎｉｓｈｉｋｕｒａ，Ｃｅｌｌ．２００１，１０７（４）：４１５−８、およびＰＣＴ公開第ＷＯ０１／３６６４６号を参照されたい）。
【０１５８】
研究により、ｓｉＲＮＡは、ヒトを含む哺乳動物においてインビボで有効であり得ることが明らかになった。具体的には、Ｂｉｔｋｏらは、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ヌクレオカプシドＮ遺伝子を対象とする特異的なｓｉＲＮＡが、経鼻的に投与した場合にマウスの治療に有効であることを示した（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００５，１１（１）：５０−５５）。ｓｉＲＮＡの治療用途に関する総説については、例えば、Ｂａｒｉｋ（Ｍｏｌ．Ｍｅｄ  ２００５，８３：７６４−７７３）およびＣｈａｋｒａｂｏｒｔｙ（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ２００７  ８（３）：４６９−８２）を参照されたい。さらに、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）を治療するためにＶＥＧＦＲ１受容体を標的とする低分子ｓｉＲＮＡを用いた臨床研究が、ヒト患者において行われている（Ｋａｉｓｅｒ，Ａｍ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２００６  １４２（４）：６６０−８）。治療剤としてのｓｉＲＮＡの使用に関するさらなる情報は、Ｄｕｒｃａｎ，２００８．Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａ．５（４）：５５９−５６６、Ｋｉｍ&Ｒｏｓｓｉ，２００８．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４４：６１３−６１６、Ｇｒｉｍｍ&Ｋａｙ，２００７，ＪＣＩ，１１７（１２）：３６３３−４１に見出すことができる。
【０１５９】
本明細書に開示されるｄｓＲＮＡは、非修飾であるか、組み換えであるか、または化学修飾されている。ｓｉＲＮＡおよびｓｉＮＡを含むｄｓＲＮＡの合成に有用な化学修飾の例は、ＰＣＴ特許公開第ＷＯ２００９／０４４３９２号、同第ＷＯ２０１１／０６６４７５号、同第ＷＯ２０１１／０８５０５６号に開示され、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１６０】
本明細書における目的のための薬学的「有効量」は、したがって、当該技術分野で知られるような検討項目によって決定される。この量は、生存率の改善もしくはより迅速な回復、または症状の改善もしくは排除、および当業者によって適切な尺度として選択される他の指標を含むが、これらに限定されない改善を達成するのに有効でなければならない。ここで開示される組成物は、従来の任意の投与経路で投与される。組成物は、単独でか、または薬学的に許容される担体、溶媒、希釈剤、賦形剤、アジュバント、およびビヒクルとともに投与してもよいことに留意されたい。化合物は、経口、皮下、または、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、および鼻腔内投与、ならびに髄腔内および注射の手技を含む、非経口投与することができる。化合物の移植片もまた、有用である。液体形態を注射用に調製してもよく、この用語は、皮下、経皮、静脈内、筋肉内、髄腔内、および他の非経口投与経路を含む。液体組成物は、有機共溶媒含有または不含の水溶液、水性または油性の懸濁液、食用油を含むエマルジョン、ならびに同様の薬学的ビヒクルを含む。
【０１６１】
さらに、ある特定の状況下において、本発明の新規な治療において使用するための組成物は、鼻腔内等の投与のためにエアロゾルとして形成されてもよい。治療される患者は、温血動物であり、具体的には、ヒトを含む哺乳動物である。薬学的に許容される担体、溶媒、希釈剤、賦形剤、アジュバント、およびビヒクル、ならびに移植片担体は、一般に、本明細書に開示される活性成分とは反応しない不活性な非毒性の固体または液体の充填剤、希釈剤、および封入材料を指し、それらには、リポソーム、脂質化グリコサミノグリカン、およびミクロスフェアが含まれる。本発明に有用な送達系の例には、米国特許第５，２２５，１８２号、同第５，１６９，３８３号、同第５，１６７，６１６号、同第４，９５９，２１７号、同第４，９２５，６７８号、同第４，４８７，６０３号、同第４，４８６，１９４号、同第４，４４７，２３３号、同第４，４４７，２２４号、同第４，４３９，１９６号、および同第４，４７５，１９６号が挙げられる。多くの他のそのような移植片、送達系、およびモジュールが、当業者に周知である。
【０１６２】
一般に、ヒト用の化合物の活性用量は、１〜２週間またはそれ以上の期間、好ましくは２４〜４８時間にわたる１日１用量、または１日２用量もしくは３用量以上の投与計画で、あるいは１〜２週間またはそれ以上の期間の継続的注入によって、１日に体重１キログラム当たり１ｎｇから約２０〜１００ｍｇの範囲、好ましくは１日に体重１キログラム当たり約０．０１ｍｇから約２〜１０ｍｇの範囲である。
【０１６３】
さらに、標的遺伝子の発現を、対照と比較して少なくとも５０％下方制御する方法であって、この遺伝子のｍＲＮＡ転写産物を本明細書に開示される組成物または核酸のうちの１つ以上と接触させることを含む、方法を本明細書に提供する。
【０１６４】
一実施形態において、治療剤は標的遺伝子を阻害し、この阻害は、遺伝子機能の阻害、ポリペプチドの阻害、およびｍＲＮＡ発現の阻害からなる群から選択される。
【０１６５】
薬学的組成物は、単回投与または複数回投与を提供するように製剤化される。
【０１６６】
種々の実施形態において、薬学的組成物は、静脈内、筋肉内、局所、皮下で対象に投与される。
【０１６７】
本明細書に開示される薬学的組成物はまた、本明細書に開示される疾患の予防および／または治療のための方法に使用することができ、この方法は、本明細書に開示される組成物または医薬品を、本明細書に記載される疾患のいずれかを治療するために、それを必要とする対象に投与することを含む。
【０１６８】
診断剤
本明細書に開示される組成物は、生体試料中のＥＮＤＯ１８０を発現する細胞の診断に有用である。送達系は、正常細胞または罹患細胞において検出可能な部分を含み得る。本明細書に企図される検出可能な部分には、ビオチン、金、フェリチン、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウレアーゼ、フルオレセイン、ローダミン、ならびにトリチウム、１４Ｃ、およびヨウ素化を含む放射性同位体等、蛍光、金属、酵素、および放射性マーカーが含まれるが、これらに限定されない。  
【０１６９】
送達
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組成物は、全身投与によって標的組織に送達される。
【０１７０】
本明細書に開示される組成物は、個々の患者の臨床状態、治療される疾患、投与の部位および方法、投与のスケジュール、患者の年齢、性別、体重、ならびに医療従事者に既知の他の要因を考慮して、医療実施基準に従って、投与および投薬される。
【０１７１】
本明細書における目的のための「治療有効用量」は、したがって、当該技術分野で知られるような検討項目によって決定される。用量は、生存率の改善もしくはより迅速な回復、または症状の改善もしくは排除、および当業者によって適切な尺度として選択される他の指標を含むが、これらに限定されない改善を達成するために有効でなければならない。
【０１７２】
いくつかの実施形態において、本組成物は、「安定」であり、血清または細胞のプロテイナーゼ、リパーゼ、およびヌクレアーゼへの暴露後に著しく分解されない。安定性の判定に好適なアッセイには、当該技術分野で既知の血清安定性アッセイまたは細胞抽出物アッセイが挙げられる。
【０１７３】
本明細書に使用される「全身送達」とは、対象内で組成物の広範な生体内分布をもたらす送達を指す。本明細書に開示される組成物の全身送達は、例えば、静脈内、皮下、または腹腔内投与を含む、当該技術分野で既知の任意の手段によるものであり得る。好ましい実施形態において、組成物は、静脈内送達によって全身送達される。
【０１７４】
好ましい実施形態において、治療される対象は、温血動物であり、具体的には、ヒトを含む哺乳動物である。
【０１７５】
本明細書に開示される組成物を単離細胞に送達するために好適な方法には、とりわけ、トランスフェクション、リポフェクション、およびエレクトロポレーションが挙げられる。
【０１７６】
併用療法
種々の実施形態において、併用療法を提供する。一実施形態において、２つ以上の治療剤の同時投与は、相乗効果、すなわち、その組み合わせの個々の成分の治療効果の合計よりも高い治療効果を達成する。別の実施形態において、２つ以上の治療剤の同時投与は、相加効果を達成する。
【０１７７】
併用療法を構成する活性成分は、単一剤形によって一緒に投与され得るか、または各活性剤の別個の投与によって投与されてもよい。ある特定の実施形態において、第１および第２の治療剤は、単一剤形で投与される。あるいは、第１の治療剤および第２の治療剤は、別個の組成物として投与されてもよい。第１の活性剤は、第２の活性剤と同時に投与され得るか、または第１の活性剤は、第２の活性剤とともに間欠的に投与されてもよい。第１の治療剤および第２の治療剤の投与間の時間の長さは、所望の治療効果を達成するように調節することができる。例えば、第２の治療剤は、第１の治療剤の投与のわずか数分（例えば、１、２、５、１０、３０、もしくは６０分）後または数時間（例えば、２、４、６、１０、１２、２４、もしくは３６時間）後に投与されてもよい。ある特定の実施形態において、第２の治療剤の投与の間に、治療剤のうちの１つを１回以上投与することが有益な場合がある。例えば、第２の治療剤は、第１の治療剤の投与の２時間後に投与され、次いで１０時間後に再び投与されてもよい。あるいは、第２の治療剤の投与の間に、第１の治療剤を１回以上投与することが有益な場合がある。重要なことには、併用療法の全体的な治療効果が、その併用療法の複合効果または相乗効果にある程度起因するように、各活性成分の治療効果が、各治療剤の期間の少なくとも一部の間重複することが好ましい。
【０１７８】
細胞への治療カーゴの標的送達に有用な組成物および組成物の使用を本明細書に開示し、前記組成物は、癌および線維性疾患を含む増殖性疾患を患う対象の治療に有益に利用することができる。  
【０１７９】
治療の方法
本開示の別の態様は、癌、転移性疾患、および線維症を含む、増殖性疾患を患う対象を治療する方法を提供する。制御不能な病的細胞成長と関連する疾患または障害、例えば、癌および器官線維症の治療のための方法を、提供する。具体的には、本明細書に開示される組成物は、ＥＮＤＯ１８０が疾患細胞および／または組織の少なくとも一部分に発現する増殖性疾患の治療に有用である。疾患もしくは状態の発生もしくは重症性の治療もしくは予防、および／または疾患もしくは状態の危険性もしくは重症性の低減を、それを必要とする対象に行うための方法をさらに提供し、この疾患もしくは状態ならびに／またはそれと関連する症状および／もしくは危険性は、ＥＮＤＯ１８０の異常発現と関連する遺伝子の発現と関連する。好ましい実施形態において、対象は、ヒト対象である。  
【０１８０】
癌療法
「癌」または「腫瘍」とは、異常な細胞の増殖を指す。これらの用語は、良性または悪性であり得る原発性腫瘍、ならびに身体の他の部位に広がった二次性腫瘍または転移の両方を含む。増殖性疾患の例には、とりわけ、癌腫（例えば、乳房、結腸、および肺）、Ｂ細胞白血病等の白血病、Ｂ細胞リンパ腫等のリンパ腫、神経芽細胞腫等の芽細胞腫、ならびに黒色腫および肉腫が挙げられる。本明細書に開示される薬学的組成物は、血管新生を含む血管系の望ましくない発達または成長が関与する任意の疾患、ならびに本明細書に記載される疾患および状態のいずれにも、特に異常なＥＮＤＯ１８０発現を示す疾患および障害に、使用される。
【０１８１】
癌細胞がＥＮＤＯ１８０ポリペプチドを発現する、癌性増殖性疾患（例えば、肺癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、胃癌、腎臓癌、白血病、肝臓癌、リンパ腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、皮膚癌、精巣癌、および子宮癌）を含む、増殖性疾患を患う患者の治療のための方法および組成物を本明細書に提供する。１つの特定の実施形態において、癌は、ＲＣＣおよびＴＣＣを含む腎臓癌である。
【０１８２】
「癌」および「癌性疾患」は、互換的に使用され、不適切に高いレベルの細胞分裂、不適切に低いレベルのアポトーシス、またはそれらの両方に起因するか、またはそれを引き起こす疾患を指す。癌性疾患の例には、白血病（例えば、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病、非ホジキン病）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、ならびに肉腫および癌腫等の固形腫瘍（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、ヘパトーム、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫（ｏｌｉｇｏｄｅｎｒｏｇｌｉｏｍａ）、シュワン腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫）が挙げられるが、これらに限定されない。原発性癌の転移の治療が含まれる。いくつかの好ましい実施形態において、本組成物は、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、ならびに肺および骨を含む種々の器官におけるそれらの転移の治療に有用である。
【０１８３】
本明細書に使用される際、「増殖性疾患」という用語は、悪性または良性のいずれかである細胞増殖がその病態に寄与する任意の疾患を指す。このような望ましくない増殖は、癌および多数の慢性炎症性疾患の特徴であり、したがって、「増殖性疾患」の例には、上に列挙した癌、ならびに乾癬、炎症性腸疾患、および関節リウマチ等の慢性炎症性増殖性疾患；再狭窄等の増殖性心血管疾患；糖尿病性網膜症等の増殖性眼障害；ならびに血管腫等の良性の過増殖性疾患が含まれる。  
【０１８４】
線維性疾患
線維性疾患は、組織構造における異常な変化に寄与して正常な器官の機能を妨げる、細胞外マトリックスと称される線維性物質の過剰生成によって特徴付けられる、慢性疾患群である。世界中の何百万という人々が、しばしば生命を脅かすこれらの慢性疾患に罹患している。残念ながら、線維症は、広く蔓延しており、衰弱性であり生命を脅かすことが多いにも関わらず、現在のところ、利用可能な効果的な治療法は存在しない。
【０１８５】
ヒトの体は、瘢痕化により外傷および損傷に応答する。過剰な瘢痕化によって特徴付けられる疾患の一種である線維症は、正常な創傷治癒応答が妨げられた場合に生じる。線維症の間、創傷治癒応答は、コラーゲンの過剰な生成および沈積を起こし続ける。
【０１８６】
線維性障害は急性または慢性であり得るが、この障害は、正常組織が瘢痕組織で置き換えられたときに、過剰なコラーゲン蓄積および関連する機能喪失という、一般的な特徴を共有する。
【０１８７】
線維症は多様な原因から生じ、種々の器官において確認され得る。肝硬変、肺線維症、サルコイドーシス、ケロイド、高血圧症、および腎線維症は全て、組織機能の連続的な喪失を引き起こす進行性の線維症を誘発する慢性疾患である。
【０１８８】
いくつかの実施形態において、好ましい適応症には、肝臓線維症および肺線維症、例えば、肝臓移植後のＣ型肝炎または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に起因する肝硬変；特発性肺線維症；肺線維症を引き起こす放射線肺炎；糖尿病性腎症；継続的な外来腹膜透析（ＣＡＰＤ）に関連する腹膜硬化症、および眼部瘢痕性類天疱瘡が挙げられる。急性線維症（通常、突発的かつ重度の発症を伴い、短期間である）は、偶発的な損傷（特に、脊椎および中枢神経系に対する損傷）を含む種々の形態の外傷、感染、手術（心臓発作後の心臓の瘢痕化）、火傷、環境汚染、アルコールおよび他の種類の毒素、急性呼吸促迫症候群、放射線、ならびに化学療法治療に対する一般的な応答として起こる。外傷によって損傷を受けた全ての組織は、特に、損傷が繰り返されると、瘢痕化して線維性となる傾向がある。器官機能の進行性の喪失が病的状態、入院、透析、障害、時には死亡さえもたらすため、重度の器官の線維症は非常に深刻であることが多い。線維性疾患、または線維症が明らかである疾患には、肺線維症、間質性肺疾患、ヒト線維性肺疾患、肝臓線維症、心臓線維症、黄斑性変性症、網膜および硝子体の網膜症、心筋線維症、グレーヴス眼症、薬物誘発性麦角中毒、心血管性疾患、アテローム性動脈硬化症／再狭窄、ケロイドおよび肥厚性瘢痕、ハンセン病、ならびにコラーゲン性大腸炎を含む炎症性腸疾患が挙げられる。
【０１８９】
異なる種類の線維症に関するさらなる情報は、例えば、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ（２００２），"Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｔｏ  ｈａｌｔ  ｒｅｎａｌ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ"，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２（２）：１７７−８１、Ｋｅａｎｅ  ａｎｄ  Ｌｙｌｅ（２００３），"Ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ａｎｄ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ：ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ＲＥＮＡＡＬ  ｓｔｕｄｙ"，Ａｍ  Ｊ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ．４１（３  Ｓｕｐｐｌ  ２）：Ｓ２２−５、Ｂｏｈｌｅ  ｅｔ  ａｌ（１９８９），"Ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｒｅｎａｌ  ｆａｉｌｕｒｅ"，Ｐａｔｈｏｌ  Ｒｅｓ  Ｐｒａｃｔ．１８５（４）：４２１−４０、Ｋｉｋｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ（１９９７），"Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ  ｔｏ  ｒｅｎａｌ  ｆａｉｌｕｒｅ"，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  Ｓｕｐｐｌ．６２：Ｓ３９−４０、Ｂａｔａｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂｒｅｎｎｅｒ（２００１），"Ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｉｖｅｒ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ"，Ｓｅｍｉｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ．２１（３）：４３７−５１、Ｇｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｈｕｎｎｉｎｇｈａｋｅ（２００１）"Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ"，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３４５（７）：５１７−２５、Ｆｒｏｈｌｉｃｈ（２００１）"Ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｓｃｈｅｍｉａ：ｔｈｅ  ｒｅａｌ  ｒｉｓｋｓ  ｉｎ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ"，Ａｍ  Ｊ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ；１４（６  Ｐｔ  ２）：１９４Ｓ−１９９Ｓに見出すことができる。  
【０１９０】
糖尿病性腎症
糸球体硬化症および腎線維症を特徴とする糖尿病性腎症は、現代社会における末期腎疾患の単一最大の流行原因であり、糖尿病患者は、最大の透析人口を構成する。このような治療は、費用が高く、最適には程遠い。移植は良好な予後を提供するが、ドナー不足が深刻である。これらの病態の根底にある分子機構は大部分が未知であるため、糖尿病性腎症（ならびに他の種類の腎臓の病態）により特化した治療法は開発されていない。疾患において調節され、糖尿病性腎症の予後の重症度に影響を及ぼす、必要不可欠な機能的標的遺伝子の識別は、高い診断価値ならびに治療価値を有する。
【０１９１】
腎臓における多くの病理プロセスは、最終的には、同様のまたは同一の形態学的変化、すなわち糸球体硬化症および線維症に至ることが、当該技術分野において既知である。ヒト腎疾患は、糸球体腎炎、全身性狼瘡と関連する腎炎、癌、物理的閉塞、毒素、代謝性疾患、および免疫学的疾患を含む種々の起源に端を発する可能性があり、これらの全てが、結果的に腎線維症に至る。この現象の意味は、異なる種類の傷害が、線維芽細胞の増殖および線維芽細胞による結合性組織の種々のタンパク質成分の過剰生成という線維症の２つの特徴をもたらす、同じ単一の遺伝的プログラムに集約されるということである。また、糸球体中の基底膜の肥厚化は、間質性線維症を併発し、糸球体硬化症に至る。理論に束縛されることを望むのもではなく、腎線維症および糸球体硬化症に関与するタンパク質をコードする遺伝子は、おおまかには２つの群に分類することができる：
【０１９２】
１．その発現が、結合性組織の種々のタンパク質成分の過剰生成を引き起こす遺伝子。これらは、異なる病態に特異的であり得る、そして、
【０１９３】
２．その発現が、「線維性または硬化性プログラム」の実行をもたらす遺伝子。これらは、線維症および糸球体硬化症につながる全ての腎臓の病態に共通であり得る。
【０１９４】
第２のグループに属する遺伝子の特定は、線維芽細胞およびメサンギウム細胞の増殖ならびに過剰分泌を伴う分子機構の理解に貢献するはずであり、腎不全を予防することを目的とした創薬のための遺伝子標的を構成し得る。このような薬剤の適用は、線維症および糸球体硬化症の進行を抑制、遅延、予防、阻害、または軽減することが予想される。
【０１９５】
キット
組成物の全てまたは一部を含むキットを、さらに提供する。「キット」とは、組成物または組成物の構成要素を含む任意の製品（例えば、パッケージまたは容器）を指す。キットは、治療的処置および診断を含む、本明細書に開示される方法を実施するために使用することができる。さらに、キットは、キット、その内容物、および使用方法について記載した添付文書を含み得る。
【０１９６】
本発明は、例示的な様式で説明されており、使用されている専門用語は、限定ではなく、説明の語句の性質を持つことが意図されることを理解されたい。
【０１９７】
本明細書におけるいかなる文献の引用も、そのような文献が、適切な先行技術であること、または本出願のいずれかの特許請求の範囲の特許性に対して考慮される文献であるということの承認を意図するものではない。いずれの文献の内容または日付に関するいかなる記述も、出願の時点で出願人に入手可能な情報に基づくものであり、そのような記述の正当性に関する承認を構成するものではない。
【実施例】
【０１９８】
分子生物学における一般方法
当該技術分野で既知であり、具体的に記載されていない標準的な分子生物学的な技術は、概して、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）、およびＰｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ&Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）、およびＷａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ａｎｄ  ｉｎ  Ｂｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ（ｅｄｓ）Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｖｏｌｓ．１−４  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）、ならびに米国特許第４，６６６，８２８号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８０１，５３１号、同第５，１９２，６５９号、および同第５，２７２，０５７号に記載される方法論に従い、これらは参照により本明細書に組み込まれる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、概して、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載されるように行った。フローサイトメトリーと組み合わせたインサイツ（細胞内）ＰＣＲを、特定のＤＮＡおよびｍＲＮＡ配列を含有する細胞の検出に使用することができる（Ｔｅｓｔｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｂｌｏｏｄ  ８７：３８２２）。
【０１９９】
免疫学における一般方法：当該技術分野で既知であり、具体的に記載されていない標準的な免疫学における方法は、Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ（ｅｄｓ），Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ&Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）およびＭｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）に従う。
【０２００】
免疫アッセイ：ＥＬＩＳＡ免疫アッセイは、当業者に周知である。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれも、このアッセイに使用することができる。必要に応じて、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）等の他の免疫アッセイを、当業者に既知のように使用してもよい。利用可能な免疫アッセイは、特許文献および科学文献に広範に記載されている。例えば、米国特許第３，７９１，９３２号、同第３，８３９，１５３号、同第３，８５０，７５２号、同第３，８５０，５７８号、同第３，８５３，９８７号、同第３，８６７，５１７号、同第３，８７９，２６２号、同第３，９０１，６５４号、同第３，９３５，０７４号、同第３，９８４，５３３号、同第３，９９６，３４５号、同第４，０３４，０７４号、同第４，０９８，８７６号、同第４，８７９，２１９号、同第５，０１１，７７１号、および同第５，２８１，５２１号、ならびにＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９を参照されたい。
【０２０１】
抗体生成
本明細書に使用される「抗体」という用語は、エピトープ決定基に結合することが可能な、ポリクローナルおよびモノクローナル両方の全抗体、ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、およびＦｖといったそれらのフラグメントを意味する。これらの抗体フラグメントは、その抗原または受容体と選択的に結合する能力を保持し、とりわけ、次のように例示される：
【０２０２】
Ｆａｂ、抗体分子の一価の抗原結合フラグメントを含有するフラグメントであり、全抗体を酵素パパインで消化して、軽鎖および重鎖の一部分を生じさせることによって生成することができる、
【０２０３】
（Ｆａｂ’）２、全抗体を酵素ペプシンで処置し、その後に還元を行わずに得ることができる抗体のフラグメントであり、Ｆ（ａｂ’２）は、２つのジスルフィド結合によって一緒に保持される２つのＦａｂフラグメントの二量体である、
【０２０４】
Ｆｖ、２本の鎖として発現される軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作されたフラグメントとして定義される、ならびに、
【０２０５】
ｓｃＦｖフラグメント（すなわち、一本鎖抗体（「ＳＣＡ」）、遺伝子的に融合させた一本鎖分子として、好適なポリペプチドリンカーによって連結された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する、遺伝子操作された分子として定義される。
【０２０６】
抗体の機能的活性を有するこのようなフラグメントは、当業者に既知の方法によって調製することができる（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６）。（ＭａｂまたはｍＡｂは、モノクローナル抗体の略称として本明細書に使用する。ＭＢは、ミニ抗体の略称として本明細書に使用する。）
【０２０７】
好都合なことに、抗体は、免疫原またはその一部分に対して調製することができ、例えば、配列に基づくかもしくはクローン技術による組換えによって調製された合成ペプチド、または天然の遺伝子産物および／もしくはその部分を、単離して免疫原として使用してもよい。Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、およびＢｏｒｒｅｂａｅｃｋ（１９９２），Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ−Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，ＮＹに一般的に記載されるように、免疫原を使用して、当業者に周知の標準的な抗体生成技術により抗体を生成することができる。
【０２０８】
ポリクローナル抗体の生成については、ウサギまたはヤギ等の宿主を、通常はアジュバントとともに、また必要に応じて担体に結合させて、免疫原または免疫原フラグメントで免疫付与し、免疫原に対する抗体を血清から回収する。さらに、ポリクローナル抗体は、単一特異性になるように吸収させることができる、すなわち、交差反応する抗体が血清中に残らないように、関連する免疫原に対して血清を吸収させて、それを単一特異性にする。
【０２０９】
モノクローナル抗体の生成については、この技術は、免疫原による適切なドナー（一般的にはマウス）の過剰免疫付与、ならびに脾臓の抗体生成細胞の単離を伴う。これらの細胞を、骨髄腫細胞等の不死化細胞と融合させて、不死の、必要な抗体を分泌する融合細胞ハイブリッドを得る。次いで、細胞を大量に培養し、モノクローナル抗体を培養培地から採取して使用する。
【０２１０】
組み換え抗体の生成については、概して、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）"Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ａｎａｌｏｇｓ  ａｎｄ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ”ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（ＪＪ  Ｌａｎｇｏｎｅ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）２０３：４６−８８、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｒｄ（１９９１）"Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖｂ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（ＪＪ  Ｌａｎｇｏｎｅ，ｅｄ．；Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）２０３：８８−９９、Ｍｅｒｎａｕｇｈ  ａｎｄ  Ｍｅｒｎａｕｇｈ（１９９５）”Ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（ＲＰ  Ｓｉｎｇｈ  ａｎｄ  ＵＳ  Ｓｉｎｇｈ，ｅｄｓ．；ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ：３５９−３６５）を参照されたい。さらに、抗体生成Ｂリンパ球またはハイブリドーマ由来のメッセンジャーＲＮＡを、逆転写して、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を得ることができる。完全長または部分長であり得る抗体ｃＤＮＡを、増幅させ、ファージまたはプラスミドにクローニングする。ｃＤＮＡは、分離しているかまたはリンカーによって接続された、重鎖および軽鎖ｃＤＮＡの部分長であり得る。抗体または抗体フラグメントを、好適な発現系を用いて発現させ、組み換え抗体を得る。抗体ｃＤＮＡはまた、適切な発現ライブラリーをスクリーニングすることによっても得ることができる。
【０２１１】
抗体は、当該技術分野で周知のように、固体支持基質に結合させてもよく、または検出可能部分と複合体化させてもよく、または結合および複合体化の両方であってもよい（蛍光または酵素部分の複合体化に関する一般的な考察については、Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ&Ｔｈｏｒｐｅ（１９８２．），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄを参照されたい）。固体支持基質への抗体の結合はまた、当該技術分野で周知である（一般的な考察については、Ｈａｒｌｏｗ&Ｌａｎｅ（１９８８）  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、およびＢｏｒｒｅｂａｅｃｋ（１９９２），Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ−Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．を参照されたい）。本明細書に企図される検出可能な部分または標識には、ビオチン、金、フェリチン、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウレアーゼ、フルオレセイン、ローダミン、トリチウム、１４Ｃ、およびヨウ素等、蛍光、金属、酵素、および放射性マーカーが含まれるが、これらに限定されない。
【０２１２】
組み換えタンパク質の精製：標準的な精製については、Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），"Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｃｏｕｒｓｅ  ｍａｎｕａｌ．”ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ．を参照されたい。  
【０２１３】
実施例１：抗ＥＮＤＯ１８０抗体
ＥＮＤＯ１８０は、Ｃ型マンノース受容体２前駆体としても知られる。ヒトＥＮＤＯ１８０  ｍＲＮＡのポリヌクレオチド配列は、５９８３塩基であり、そのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が４４３９塩基（１１７〜４４４１）である、受託番号ＮＭ＿００６０３９．３に記載されており、１４７９アミノ酸（ａａ）のポリペプチド配列は、遺伝子識別番号ＧＩ：１１０６２４７７４で受託番号  ＮＰ＿００６０３０に記載されている。マウスｍＲＮＡ配列は、５８１８塩基で、ＯＲＦが１４７９ａａの受託番号ＭＭＵ５６７３４である。
【０２１４】
ＥＮＤＯ１８０は、次の通り、複数のタンパク質ドメインを含む：１〜３１ａａ  ＳＰ（シグナルペプチド）；４１〜１６１ａａシステインリッチＮ末端ドメイン；１８０〜２２８ａａ  ＦＮＩＩ（フィブロネクチンＩＩ型）ドメイン；８ＣＤＲ（糖認識ドメイン）ドメイン１ＣＲＤ〜８ＣＲＤ（２３５〜３６０ａａ  １ＣＲＤ、３８２〜５０５ａａ  ２ＣＲＤ、５２１〜６４５ａａ  ３ＣＲＤ、６６９〜８０９ａａ  ４ＣＲＤ、８２５〜９５１ａａ  ５ＣＲＤ、９７２〜１１０８ａａ  ６ＣＲＤ、１１６１〜１２４４ａａ  ７ＣＲＤ、１２６１〜１３９４ａａ  ８ＣＲＤ）；１４１３〜１４３５ａａ  １ＴＭ（膜貫通ドメイン）、１４３７〜１４７９ａａ−細胞質ドメイン。いくつかの実施形態において、ＥＮＤＯ１８０ポリペプチドは、配列番号１に記載される核酸配列（ＮＣＢＩ識別子：ｇｉ｜１１０６２４７７３｜参照番号｜ＮＭ＿００６０３９．３｜）と実質的に同一なポリヌクレオチドによってコードされる、配列番号２に記載されるアミノ酸配列（ＮＣＢＩ識別子：ｇｉ｜１１０６２４７７４｜参照番号｜ＮＰ＿００６０３０．２｜）と実質的に同一である。
【０２１５】
本明細書に開示されるポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、以下に提供する：ＦＬＡＧ配列を有するヒトＥＮＤＯ１８０の細胞外ドメイン（アミノ酸１〜５２２）のポリヌクレオチド配列（ｐｃＤＮＡ３−５’ｈＥＮＤＯ１８０−ＦＬＡＧ構築物、配列番号３）；配列番号３のポリペプチド配列（配列番号４）；ｓｃＦｖクローンＧ７Ｖのポリヌクレオチド配列（配列番号５）；ｓｃＦｖクローンＧ７Ｖのポリペプチド配列（配列番号６、ミニ抗体または「ＭＢ」としても知られる）；Ｇ７Ｖの重鎖ＣＤＲ３（配列番号７）；Ｇ７Ｖの軽鎖ＣＤＲ３（配列番号８）。
【０２１６】
ハイブリドーマ細胞系Ｅ３−８Ｄ８（８Ｄ８またはｅ３ｂ３または８ｄ８ｅ３ｂ３としても知られ、受託番号ＬＭＢＰ  ７２０３ＣＢでＢＣＣＭに寄託されている）から生成される抗体、および本明細書に開示される組み換え抗ＥＮＤＯ１８０抗体は、ＰＣＴ特許公開第ＷＯ２０１０／１１１１９８号に記載され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、好ましいＥＮＤＯ１８０標的薬剤は、
ａ．受託番号ＬＭＢＰ  ７２０３ＣＢでＢＣＣＭに寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生成される、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント、
ｂ．（ａ）の抗体と同じエピトープに結合する抗体またはその抗原結合フラグメント、
ｃ．（ａ）の抗体もしくはその抗原結合フラグメントのヒト化型、または（ｂ）の抗体もしくはその抗原結合フラグメントのヒト化型、
ｄ．（ａ）の抗体もしくはその抗原結合フラグメントのキメラ型、または（ｂ）の抗体もしくはその抗原結合フラグメントのキメラ型、
ｅ．ＥＮＤＯ１８０受容体によって細胞内に内部移行される、（ａ）の抗体の抗原結合ドメインを含む組み換えポリペプチドまたはその抗原結合フラグメント、
ｆ．配列番号６に実質的に類似のポリペプチドを含む、抗体の抗原結合フラグメント、ならびに
ｇ．配列番号７および８に記載されるアミノ酸配列に実質的に類似のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む、組み換えポリペプチドから選択される。
【０２１７】
実施例２．脂質組成物
目的：この研究の主要な目的は、アンチセンスおよびｄｓＲＮＡ等の小分子およびオリゴヌクレオチド含むカーゴを、標的細胞に選択的に送達するためのプラットフォームを開発することであった。具体的には、カーゴを、線維症組織および腫瘍内の活性化された筋芽細胞上、腫瘍細胞の侵襲的サブセット上、ならびに血管新生内皮上で過剰発現されるエンドサイトーシスＥＮＤＯ１８０受容体を発現する細胞に送達した。
【０２１８】
抗ＥＮＤＯ１８０抗体を施した脂質ベースのナノ粒子（「脂質粒子」、「脂質ＮＰ」）の細胞内取り込みの特異性は、ＥＮＤＯ１８０を発現するように安定にトランスフェクトしたＮＲＫ５２（ＮＲＫとしても既知）細胞系（ＮＲＫ−ＥＮＤＯまたはＮＲＫ−ＥＮＤＯ１８０）を使用して達成した。対照として、ｐＩＲＥＳＰｕｒｏ空ベクターを安定にトランスフェクトしたＮＲＫ５２細胞系を使用した。
【０２１９】
材料および方法：  
【０２２０】
組成物および物理化学特性：
脂質およびＥＮＤＯ１８０標的部分を含む、治療および診断カーゴの標的送達のための組成物を、次のように展開した：
【０２２１】
１−小分子を担持する脂質粒子（例えば、小分子親水性モデル薬としてドキソルビシンまたはマイトマイシンを含む癌治療薬）、
【０２２２】
２−ｄｓＲＮＡを担持する脂質粒子（例えば、ｄｓＲＮＡモデルとしてＣｙ３−ｓｉＲＮＡ）。
【０２２３】
Ｃｙ３標識ｓｉＲＮＡは、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、および１８位に非修飾リボヌクレオチド、ならびに１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、および１９位に２’Ｏ−メチル糖修飾リボヌクレオチド、ならびにアンチセンス鎖の３’末端に共有結合したＣｙ３部分を有するアンチセンス鎖；ならびに１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、および１９位に非修飾リボヌクレオチド、ならびに２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、および１８位に２’Ｏ−メチル糖修飾リボヌクレオチドを有するセンス鎖、を含む。材料：高純度水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  ｌｉｐｉｄｓ  Ｉｎｃ．，（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，ＵＳＡ）から購入した。大豆ホスファチジルコリン（大豆−ＰＣ）および１，２−ビス（ジフェニルホスフィノ）エタン（ＤＰＰＥ）は、Ａｖａｎｔｉ  ｐｏｌａｒ  ｌｉｐｉｄｓ，（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，ＵＳＡ）から購入した。  ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ［３−（Ｎ−スクシンイミジルオキシグルタリル）アミノプロピル，ポリエチレングリコール−カルバミルジステアロイルホスファチジル−エタノールアミン］はＮＯＦ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎから入手。高分子量ヒアルロン酸はＧｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）から入手。細胞培養プレートおよび皿はＣｏｒｎｉｎｇ  Ｇｌａｓｓ  Ｗｏｒｋｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡ）から入手。ポリカーボネート膜はＮｕｃｌｅｏｐｏｒｅ（Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）から入手。全ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）のＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニキットを用いて抽出し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩによって逆転写した。定量的ＲＴ−ＰＣＲのためのプライマーは、Ｓｙｎｔｈｅｚａ，Ｉｎｃ．（Ｒｅｈｏｖｏｔ，Ｉｓｒａｅｌ）から入手した。ドキソルビシンおよびマイトマイシンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。全ての他の試薬は、解析品質のものであった。  
【０２２４】
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８による８Ｄ８  ｍＡｂの蛍光色素標識。
１ｍｇのＥ３−８Ｄ８モノクローナル抗体（８Ｄ８）を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８および６４７タンパク質標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ａ１０２３５）を用いた標識化に使用した。標識化手順を製造業者の説明に従って行い、脱塩カラム上で精製して、非結合染料を分離した。
【０２２５】
組成物１．脂質ベースのナノ粒子の調製−ＰＥＧスペーサー、抗ＥＮＤＯ１８０抗体でコーティングされ、治療剤としてドキソルビシンを担持（カーゴ）。
【０２２６】
組成物１は、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、およびＮＨＳ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ［３−（Ｎ−スクシンイミジルオキシグルタリル）アミノプロピル，ポリエチレングリコール−カルバミルジステアロイルホスファチジル−エタノールアミン］（ＮＯＦ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ，Ｔｏｋｙｏ）を、約７５：２０：４．５：０．５（ＨＳＰＣ：ｃｈｏｌ：ＤＯＰＥ：ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）のモル比で含む。
【０２２７】
簡単にいうと、多層ベシクル（ＭＬＶ）を、脂質膜法によって調製し、ｂｕｃｈｉ−ｒｏｔｏｖａｐを使用して蒸発乾燥させた（Ｐｅｅｒ  ａｎｄ  Ｍａｒｇａｌｉｔ，２０００，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙ  ３８３（２）：１８５−９０、Ｐｅｅｒ  ａｎｄ  Ｍａｒｇａｌｉｔ，２００４，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ６（４）：３４３−５３、Ｐｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１９（５８６３）：６２７−６３０）。脂質膜を、ｐＨ７．４の食塩水中に再懸濁したドキソルビシンで水和させて、ＭＬＶを作製した。脂質の質量を、前述のように測定した（Ｐｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００８）。結果として得られたＭＬＶを、３００〜５５０ｐｓｉの窒素圧下、６０℃で、Ｔｈｅｒｍｏｂａｒｒｅｌ  Ｌｉｐｅｘ押出器（Ｌｉｐｅｘ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｃａｎａｄａ）を用いて小さな単層ナノ寸法ベシクル（ＳＵＶ）に押出した。押出は、漸減孔径膜（１、０．８、０．６、０．４、０．２、から０．１μｍ）（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ，Ｗｈａｔｍａｎ）を使用した段階方式で、１孔径につき１０回のサイクルで、行った。  
【０２２８】
抗ＥＮＤＯ１８０をコーティングした脂質ナノ粒子およびアイソタイプ対照粒子の表面修飾および精製
抗ＥＮＤＯ１８０（クローン８Ｄ８）抗体またはアイソタイプ対照（非結合マウスＩｇＧ２ａ）抗体を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｔｕｂｅ（ＭＷのカットオフ１００ＫＤａ）を使用して、ＮａｎｏＤｒｏｐ  １０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた２８０ｎｍでのＩｇＧ吸光度によって判定される１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度に濃縮した。
【０２２９】
抗体と脂質の共有結合を、５０μＬのｍＡｂ（１０ｍｇ／ｍＬ）および９５０μＬで１０ｍｇ／ｍＬの脂質粒子を含む１ｍＬの反応バイアルにおいて、ＰＢＳ中、室温で一晩、ＥＤＣ−ＮＨＳ架橋剤を用いて行った。
【０２３０】
過剰な８Ｄ８  ｍＡｂの精製を、ｐＨ７．４でＨＥＰＥＳ緩衝食塩水により平衡したセファロース  ＣＬ−４Ｂカラムを使用して行った。
【０２３１】
ドキソルビシン（ＤＯＸ）を、各実験のために新たに作成した較正曲線を用いて蛍光により定量化した。  
【０２３２】
組成物２．脂質ベースのナノ粒子調製物−ヒアルロン酸スペーサー、抗ＥＮＤＯ１８０抗体でコーティングされ、標識化ｓｉＲＮＡを担持
全てＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．，（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，ＵＳＡ）から入手した、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）およびコレステロール（Ｃｈｏｌ）を約４：２：１（ＤＯＰＥ：ＤＯＴＭＡ：Ｃｈｏｌ）のモル比で含む多層ベシクル（ＭＬＶ）を、脂質膜法によって調製した（Ｐｅｅｒ  ａｎｄ  Ｍａｒｇａｌｉｔ  ２００４）。脂質膜を、ＤＥＰＣ水中に懸濁したＣｙ３標識ｓｉＲＮＡで水和して、ＭＬＶを作製した。
【０２３３】
ｓｉＲＮＡ封入の効果：カーゴの充填を、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＬａｎｄｅｓｍａｎ−Ｍｉｌｏ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１２，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．ｐｉｉ：Ｓ０３０４−３８３５（１２）００５１２−５）に開示される方法に従って行った。簡単に言うと、ｓｉＲＮＡ封入の効果を、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ＲＮＡアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって判定し、これは、界面活性剤の存在下および不在下におけるＬＮＰ（脂質ナノ粒子）およびＨＡ−ＬＮＰ（ヒアルロン酸結合脂質ナノ粒子）試料中のＲＮＡに結合した染料ＲｉｂｏＧｒｅｅｎの蛍光を比較することによって行った。未処理試料では、蛍光は、封入していないｓｉＲＮＡ（遊離ｓｉＲＮＡ）から測定されるが、界面活性剤処置試料では、蛍光は、全ｓｉＲＮＡから測定される。封入率は、次のように計算する：
【０２３４】
ｓｉＲＮＡ封入％＝［１−（遊離ｓｉＲＮＡ濃度／総ｓｉＲＮＡ濃度）］×１００。
【０２３５】
脂質の質量を、前述のように測定した（Ｐｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００８）。結果として得られたＭＬＶを、３００〜５５０ｐｓｉの窒素圧下、室温で、Ｔｈｅｒｍｏｂａｒｒｅｌ  Ｌｉｐｅｘ押出器（Ｌｉｐｅｘ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｃａｎａｄａ）を用いて単層ナノ寸法ベシクル（ＵＬＶ）に押出した。押出は、漸減孔径膜（１、０．８、０．６、０．４、０．２、から０．１μｍ）（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ，Ｗｈａｔｍａｎ）を使用した段階方式で、１孔径につき１０回のサイクルで、行った。
【０２３６】
抗ＥＮＤＯ１８０でコーティングした脂質ナノ粒子およびアイソタイプ対照粒子の表面修飾および精製。
ＵＬＶを、粒子を安定化させ、ｍＡｂ結合の足場として機能する高分子量ヒアルロン酸（ＨＡ）でコーティングした（Ｐｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。簡単にいうと、ＨＡを水中に溶解し、３７℃で２時間ｐＨ４．０でＥＤＣにより予備活性化した。結果として得られた活性化ＨＡを、ｐＨ８．６、０．１Ｍホウ酸塩緩衝液中のＤＯＰＥ含有ＵＬＶの懸濁液に添加し、穏やかに撹拌しながら３７℃で一晩インキュベートした。結果として得られたＨＡ−ＵＬＶを、遠心分離（１．３×１０５ｇ、４０Ｃ、１時間）によって分離し、４回洗浄した。最終ＨＡ／脂質比は、典型的に、３Ｈ−ＨＡ（ＡＲＣ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＩ）によってアッセイすると、脂質１μモル当たりＨＡ５７〜７０μｇであった。
【０２３７】
ＨＡ修飾ナノ粒子（ＮＰ）を、アミン結合法を使用して抗ＥＮＤＯ１８０または抗ＩｇＧ  ｍＡｂに結合させた。簡単に言うと、５０μＬのＨＡ修飾脂質粒子（４０ｍｇ／ｍＬ）を、４００ｍｍｏｌ／Ｌの１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジミド塩酸塩（ＥＤＡＣ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＩ）２００μＬおよび１００ｍｍｏｌ／ＬのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、Ｆｌｕｋａ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＩ）２００μＬとともに、穏やかに撹拌しながら室温で２０分間インキュベートした。結果として得られたＮＨＳ活性化ＨＡ−ＮＰを、５０μＬのｍＡｂ（ＨＢＳ中１０ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．４、抗ＥＮＤＯ１８０クローン８Ｄ８またはそのアイソタイプ対照であるマウスＩｇＧ２ａのもの）と混合し、穏やかに撹拌しながら室温で一晩インキュベートした。次いで、２０マイクロリットルの１ＭエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８．５）を添加して、反応性残基を遮断した。結果として得られた免疫ＮＰを、セファロースＣＬ−４Ｂビーズ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＩ）を充填し、ｐＨ７．４のＨＢＳで平衡させたサイズ排除カラムを使用して精製して、未付着のｍＡｂを除去した。
【０２３８】
図１は、ＨＡコーティング脂質粒子の生成スキームを示す。  
【０２３９】
組成物３．脂質ベースのナノ粒子の調製−ヒアルロン酸スペーサー、抗ＥＮＤＯ１８０抗体でコーティング
６０％の大豆ホスファチジルコリン（大豆−ＰＣ）、２０％のＤＰＰＥ、および２０％のコレステロール（ｍｏｌ／ｍｏｌ）を、４０ｍｇ／ｍｌの濃度（１０ｍｌのエタノール中大豆ＰＣ−２７３ｍｇ、ＰＰＥ−８１．２ｍｇ、コレステロール−１４５．４ｍｇ）で含む多層ベシクルを、脂質膜法によって調製し、上述のように回転式蒸発器（ＢＵＣＨＩ  Ｒ−２１０）で蒸発乾燥させた。蒸発させた後、乾燥した脂質膜を、１０ｍｌのＨＢＳ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ）（ｐＨ７．４）中で水和させ、溶液を振盪させて（２時間６５℃）、ＭＬＶを作製した。脂質の質量を、前述のように測定した（Ｐｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００８）。結果として得られたＭＬＶを、上述のように、Ｔｈｅｒｍｏｂａｒｒｅｌ  Ｌｉｐｅｘ押出器（Ｌｉｐｅｘ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｃａｎａｄａ）を用いて平均寸法約１５０ｎｍ（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳシステム）の単層ナノ寸法ベシクル（ＵＬＶ）に押出した。  
【０２４０】
抗ＥＮＤＯ１８０でコーティングした脂質ナノ粒子およびアイソタイプ対照粒子の表面修飾および精製。
高分子量ヒアルロン酸（ＨＡ）（７００Ｋｄａ  Ｌｉｆｅｃｏｒｅ）を、０．２Ｍ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）中に５ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで溶解し、１：１：６のモル比でＥＤＣおよびスルホ−ＮＨＳにより活性化させた。３０分間活性化させた後、ＵＬＶを添加し、ｐＨを７．４に調整した。溶液を、室温で（２時間）インキュベートした。遊離ＨＡを、３回の超遠心分離サイクルによって除去した。結果として得られたＨＡ−ＵＬＶは、１３０ｎｍの平均寸法を有した。
【０２４１】
ｍＡｂ結合および精製
抗ＥＮＤＯ１８０  ８Ｄ８  ｍＡｂを、１０ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで濃縮した（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒユニット）。２０μｌの抗体を、１．２μｇのＥＤＣおよび１．４４μｇｒのスルホ−ＮＨＳ（ｐＨ５．５）で活性化させた。室温で３０分間インキュベートした後、０．８ｍｇの脂質粒子を添加し、ｐＨをｐＨ７．４に調整した。脂質粒子を、４℃で一晩インキュベートした。脂質粒子および遊離抗体を、ＣＬ−４Ｂカラム上で分離させた。  
【０２４２】
実施例３：組成物の分析
蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）試験。
結合分析のために、３．５×１０５の細胞をトリプシン化し、沈降させ、ＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ中１％ウシ胎児血清）中に再懸濁させ、抗ＥＮＤＯ１８０  ｍＡｂ（１μｇ）とともに氷上で３０分間インキュベートし、１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。ｍＡｂ試料を、５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中、二次ＦＩＴＣ抱合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（１１５−０９５−０７２）（１：１００、１５０μｇ／ｍｌ）とともに氷上で３０分間インキュベートし、１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを使用して分析した。  
【０２４３】
粒子寸法の分布およびゼータ電位の測定。
ＮＰ、または８Ｄ８コーティングＮＰの粒子寸法の分布および平均直径を、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳゼータ電位および動的光散乱機器（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）上で自動化アルゴリズムを用いて測定し、ＰＣＳ  １．３２ａで分析した。全測定は、室温において、０．０１ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．７で行った。
【０２４４】
８Ｄ８コーティングＮＰの細胞への結合
約０．５×１０６のＥＮＤＯ１８０発現ＮＲＫ５２細胞（ＮＲＫ−ＥＮＤＯ１８０）を、ＦＡＣＳ管毎に沈降させた１ｍＬのＤＭＥＭ培地中に採取し、１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液（９９％ＰＢＳ＋１％ＦＣＳ）中に再懸濁させた。細胞を沈降させた。上清を廃棄し、ペレットを、Ａｌｅｘａ  ４８８標識化８Ｄ８コーティングＮＰまたはＩｇＧ−ＮＰで再懸濁させ（１０〜３０μｇ／ｍＬに対応する１：２５〜１：７５の希釈）、４℃で３０分間インキュベートした。１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液を添加し、細胞を沈降させた。上清を廃棄した。次いで、細胞を、２００ｕＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した（即時分析のため）。フローサイトメトリー分析を、ＦＡＣＳｃａｎ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）上で行い、ｆｌｏｗｊｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ，ＵＳＡ）を使用して分析した。
【０２４５】
共焦点顕微鏡分析
細胞へのｓｉＲＮＡ送達を検出するために、８Ｄ８コーティングＮＰ（組成物２）中に封入したＣｙ５標識ｓｉＲＮＡを使用した。包括的共焦点分析を、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０  ＭＥＴＡのスキャニングモジュールを使用して行った。
【０２４６】
この独自のスキャニングモジュールは、ＬＳＭ  ５１０  ＭＥＴＡの中核である。これは、電動コリメータ、スキャニングミラー、個別に調整可能かつ配置可能なピンホール、およびＭＥＴＡ検出器を含む高感度検出器を含む。これらの全構成要素は、最適な標本照射および反射光または放射光の効果的な収集を確実にするように配設される。高効率の光回折格子により、ＭＥＴＡ検出器における蛍光放出分離の革新的な方法を提供する。回折格子は、ＭＥＴＡ検出器の３２チャネル上に全蛍光スペクトルを投影する。したがって、スペクトルシグネチャが、スキャン画像の各ピクセルに対して取得され、続いて、これを成分色素へのデジタル分離に使用することができる。
【０２４７】
内部移行試験
内部移行アッセイを、２４ウェルプレートにおいて行った。１×１０５のＡ５４９またはＮＲＫ−ＥＮＤＯ１８０またはＮＲＫナイーブ細胞を、それぞれ、抗生物質、Ｌ−グルタミン酸、および１０％ウシ胎児血清（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌ）を補充したＲＰＭＩまたはＤＭＥＭ培地のカバースリップに播種した。
【０２４８】
膜染色のために、細胞を、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）ＤｉｌＣ１８（５）−ＤＳ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）で染色し、ＰＢＳで１：５０００に希釈した。細胞膜標識化のために、コンカナバリンＡ、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ６４７複合体（１０μｇ／ｍｌ）（Ｃ２１４２１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。核染色については、細胞を、Ｈｏｅｃｈｓｔ（ＰＢＳ中１：１０，０００）（３３２５８、Ｓｉｇｍａ）で染色した。細胞を、血清不含培地中の、抗ＥＮＤＯ１８０  ｍＡｂに複合体化された組成物３の脂質粒子（調製方法に従って、ストックから５０μｌ）、組成物３単独の脂質粒子（調製したリポソームストック溶液から５０μｌ）のいずれかに、５％ＣＯ２の加湿雰囲気において３７℃で１時間の間、暴露させた。続いて、細胞を、低温ＰＢＳを使用して２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固着させ、低温ＰＢＳで再度洗浄した。膜および核の染色を、固着後に行った。
【０２４９】
細胞を、蛍光性載置培地（Ｇｏｌｄｅｎ  Ｂｒｉｄｇｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｍｕｋｉｌｔｅｏ，ＷＡ，ＵＳＡ）を用いて載置し、蛍光を、Ａｎｄｏｒ回転ディスク共焦点顕微鏡およびＭｅｔａ  ５１０  Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ共焦点顕微鏡を使用して測定した。４０５、４８８、５６１、６５０ｎｍのレーザー光線を、それぞれ、ＵＶ、ローダミン、コンカバリンＡ、およびＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）のフルオロフォア励起について測定した。細胞の連続的な光学切片を、各処理に対して記録し、画像を、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ画像ブラウザソフトウェアを使用して処理した。
【０２５０】
８Ｄ８−ＮＰに封入したドキソルビシンによるＥＮＤＯ１８０を発現するＮＲＫ細胞の選択的殺滅。
標的送達系の特異性、および小分子実体を選択的に送達する能力を試験するために、ＤＯＸを、上述の実験の項に詳述したように、８Ｄ８−ＮＰまたはＩｇＧ−ＮＰ中に封入した。ＥＮＤＯ１８０受容体を発現する細胞（ＮＲＫ−ＥＮＤＯ１８０＋細胞）およびこの受容体を欠く細胞（ＮＲＫ−ＥＮＤＯ１８０−／−細胞）を、０．５μＭの遊離ＤＯＸまたは８Ｄ８−ＮＰもしくはＩｇＧ−ＮＰ中に封入したＤＯＸ（同じ濃度）中で、３７℃で０．５時間（５％ＣＯ２の加湿雰囲気において）インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、薬物不含培地中でさらに７２時間（３７℃でインキュベーターにおいて）インキュベートし、続いて、ＸＴＴアッセイを行った。
【０２５１】
結果
脂質組成物の構造的および物理化学的特徴
表１は、直径および全てのｍＡｂ複合化ＮＰにおける組成物１および２の表面電荷特性を示す。
【０２５２】
表１
【表１】
2015509085.tif 000002
【０２５３】
ここに示されるデータは、ＰＣ：ＤＰＰＥ：コレステロール（約３：１：１のモル比）の脂質ナノ粒子についての３回の独立したバッチからの平均±標準偏差を示す。Ｘ１  ＨＡ、Ｘ３  ＨＡ、およびＸ６  ＨＡという用語は、ＥＤＣおよびスルホ−ＮＨＳ架橋剤の濃度の関数として、脂質ナノ粒子に結合したＨＡの量を指す。ＨＡの濃度は、製剤化したＨＡ−ＮＰのそれぞれにおいて、５ｍｇ／ｍｌであった。ＥＤＣおよびスルホ−ＮＨＳ架橋剤の濃度、Ｘ１  ＨＡ中：ＥＤＣ−７．２４ｍＭ；スルホ−ＮＨＳ−６ｍＭ（最終濃度、Ｘ３  ＨＡ中：ＥＤＣ−２１ｍＭ；スルホ−ＮＨＳ−１７．６ｍＭ（最終濃度）、およびＸ６  ＨＡ中：ＥＤＣ−４０．８ｍＭ；スルホＮＨＳ−３４ｍＭ（最終濃度）。
【０２５４】
Ｘ１ＨＡ、Ｘ３ＨＡ、またはＸ６ＨＡ  ＮＰのゼータ電位の範囲は、次の通りである：Ｘ１ＨＡ：−２０−（−３０ｍＶ）、Ｘ３ＨＡ：−２８−（−４０ｍＶ）、およびＸ６ＨＡ：−３５−（−６０ｍＶ）。
【０２５５】
粒子の各種類の寸法分布は狭く、表面電荷は負電荷である。陽イオン性脂質ベースのＮＰは、ＴＬＲ４を介して免疫活性化を誘発し得るが、負および中性の電荷の粒子は、誘発しないことが、最近示された（Ｋｅｄｍｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１０，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３１（２６）：６８６７−７５、Ｋｅｄｍｉ  ａｎｄ  Ｐｅｅｒ  ２００９，Ｎａｎｏｍｅｄ  ４（８）：８５３−５）。  
【０２５６】
異なるＥＮＤＯ１８０発現細胞系の異なる抗ＥＮＤＯ１８０  Ａｂに対する結合能力のスクリーニング
異なるＥＮＤＯ１８０受容体レベルを発現する細胞系を試験した：ＮＲＫ＋（正常ラット腎臓）、ＤＵ１４５＋（ヒト前立腺腺癌）、ＬＬＣ＋（マウスルイス肺癌）、ＤＵ１４５−およびＬＬＣ−（対照細胞系、ＥＮＤＯ１８０受容体レベルの低発現体、すなわち、ＰＩＲＥＳ  Ｐｕｒｏ空のプラスミド）、Ａ５４９（ヒト肺癌）、およびＣＴ２６（マウス結腸癌）。ＮＲＫ＋、ＤＵ１４５＋、およびＬＬＣ＋は、ＥＮＤＯ１８０受容体レベルを安定に発現する。Ａ５４９およびＣＴ２６は、自然にはわからないレベルのＥＮＤＯ１８０受容体を発現する。上述の細胞系の結合能力を、４つの異なるＡｂを使用して比較した：ｍＡｂ  ８Ｄ８クローン、ｍＡｂ１０Ｃ１２クローン、ミニ抗体（ＭＢ）、および抗ｗｎｔミニ抗体（陰性対照）。最良の結合作用が、ＮＲＫ−ＥＮＤＯ１８０と８Ｄ８  ｍＡｂの対に観察された（図２Ａ）。ＮＲＫ−ＥＮＤＯ１８０ほど強力ではないが、有意な結合作用が、Ａ５４９と８Ｄ８の対（図２Ｂ）、およびＬＬＣとＥＮＤＯ１８０の対（図３Ａ）にも観察された。弱い結合作用が、Ｄｕ１４５−ＥＮＤＯ１８０と８Ｄ８の対に観察された（図３Ｂ）。
【０２５７】
ＭＢは、試験した細胞系の全てで弱い結合能力を示した。新たなバッチを試験し、二次Ａｂを変更した（ＦＩＴＣ抱合ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ）２フラグメント、１１５−０９５−０７２，Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）。新たなＭＢバッチを、タンパク質標識キットで直接標識化した。結合能力に有意な改善は観察されなかった（図４Ａ〜Ｄ）。さらなる結合実験セットを、Ａｌｅｘａ  ４８８抱合フィストｍＡｂ（クローン８Ｄ８）を用いて行い、これは、第１の非抱合ｍＡｂで得られたものと類似の結合結果を示した（全スキャン４Ａ〜４Ｄにおいて、右のピーク：８Ｄ８、中央のピーク：ミニ抗体、左のピーク：対照非染色細胞。  
【０２５８】
異なる抗ＥＮＤＯ１８０抗体の異なる細胞系への内部移行の比較
上述の細胞内に最も内部移行したＥＮＤＯ１８０Ａｂを特定するために、内部移行試験を、ＭＥＴＡ  ５１０  ＬＳＭ共焦点顕微鏡を使用して、異なる抗体および６つの異なる細胞系のそれぞれを用いて行った。第１の実験セット（まず非抱合Ａｂに暴露し、続いて二次ＦＩＴＣヤギ抗マウスＡｂに暴露した細胞）によると、最良の内部移行作用が、次のものに得られた：ＮＲＫ−ＥＮＤＯ１８０細胞；８Ｄ８  ｍＡｂ−Ａ５４９細胞；およびＤＵ１４５−ＥＮＤＯ１８０；１０Ｃ１２  ｍＡｂ−ＤＵ１４５細胞系の対。しかしながら、ＭＢの内部移行は、試験した細胞系に観察されなかった。さらに、ＭＢおよびｍＡｂ  ８Ｄ８の両方を、タンパク質標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８で標識化した。２つの標識化したｍＡｂを、内部移行について試験した。８Ｄ８のみが、有意な内部移行を示した（図５Ａ〜Ｄ）。
【０２５９】
ｍＡｂ  ８Ｄ８を、ＨＡ−脂質粒子に共有結合でコーティングし、この粒子を、Ａ５４９、ＮＲＫナイーブ、およびＮＲＫ  ＥＮＤＯ１８０細胞とともにインキュベートして、内部移行を達成した。３７℃でＡ５４９とともにインキュベートした８Ｄ８コーティング脂質粒子は、コーティングなしの脂質粒子（図６）および４℃で細胞とともにインキュベートした８Ｄ８コーティング脂質粒子と比較して、細胞内への有意な内部移行を示した。ＮＲＫナイーブ細胞には内部移行は観察されなかった（図７）。
【０２６０】
モデル小分子薬（ＤＯＸ）を封入した８Ｄ８−ＮＰおよびアイソタイプ対照粒子（ＩｇＧ−ＮＰ）を、上に詳述したように調製した（組成物１）。８Ｄ８  ｍＡｂ、および別個にアイソタイプ対照ｍＡｂを、Ａｌｅｘａ  ４８８で標識化し、脱塩カラムを使用して精製した。ｍＡｂを、次いで、ＮＨＳを介してＮＰと複合体化させ、サイズ排除カラムを使用して精製した（実験の項を参照されたい）。ＮＲＫ−ＥＮＤＯ１８０発現細胞への結合を、フローサイトメトリーを使用して判定した。図８に示されるように、８Ｄ８−ＮＰの結合は高度であり、対照粒子（ＩｇＧ−ＮＰ）と比較して、明確な蛍光シフトが観察された。
【０２６１】
８Ｄ８−ＮＰを介したＤＯＸの細胞特異的送達
８Ｄ８−ＮＰを使用した薬物（ドキソルビシン、ＤＯＸ）の選択的送達を試験するために、ＥＮＤＯ１８０を発現する細胞（ＮＲＫ  ＥＮＤＯ１８０＋／＋）およびこの受容体を欠く細胞（ＮＲＫ  ＥＮＤＯ１８０−／−）を培養し、３７℃で３０分間、低用量のＤＯＸとともにインキュベートしたか、または同じ用量を８Ｄ８−ＮＰもしくはＩｇＧ−ＮＰ中に封入したものとともにインキュベートした。細胞を広範囲にわたって洗浄し、薬物不含培地とともにインキュベートして、インビボ条件をシミュレートした。理論に束縛されることを望むものではなく、８Ｄ８−ＮＰは、ＥＮＤＯ１８０受容体に固く結合し、細胞内に内部移行し、対照のように洗い流されない。細胞の生存を、細胞生存アッセイ（ＸＴＴ）を使用して検出した。
【０２６２】
図９に示されるように、ＥＮＤＯ１８０を発現する細胞へのＤＯＸの送達は、８Ｄ８−ＮＰを使用した場合選択的であった。ＥＮＤＯ１８０受容体を欠くＮＲＫ細胞にＩｇＧ−ＮＰまたは８Ｄ８−ＮＰを使用した場合に、最小限の非特異的取り込みが見られた。  
【０２６３】
ＨＡスペーサーを有するＮＰを使用したＮＲＫ  ＥＮＤＯ１８０発現細胞への８Ｄ８−ＮＰの結合。
ｓｉＲＮＡを封入した８Ｄ８−ＮＰおよびアイソタイプ対照粒子（ＩｇＧ−ＮＰ）を、ＨＡスペーサーを使用して調製した（すなわち、組成物１）（図１のスキーム図を参照されたい）。８Ｄ８  ｍＡｂおよびアイソタイプ対照ｍＡｂ各々を、Ａｌｅｘａ  ４８８で標識化し、脱塩カラムを使用して精製した。ｍＡｂを、次いで、ＥＤＣおよびＮＨＳを介してＮＰに複合体化させ、サイズ排除カラムを使用して精製した（実験の項を参照されたい）。ＮＲＫ−ＥＮＤＯ１８０発現細胞への結合を、フローサイトメトリーを使用して判定した（図１０を参照されたい）。図１０に示されるように、ＨＡスペーサーを用いて調製した８Ｄ８−ＮＰの結合は、極めて高度であり、対照粒子（ＩｇＧ−ＮＰ）と比較して、明確な蛍光シフトが観察された。  
【０２６４】
８Ｄ８−ＮＰ（組成物３）は、ｓｉＲＮＡをＮＲＫ−ＥＮＤＯ１８０＋／＋細胞に送達する。
ＮＲＫ−ＥＮＤＯ１８０発現細胞にｓｉＲＮＡを送達する能力を試験するために、ｓｉＲＮＡを、ＨＡスペーサーを介して８Ｄ８  ｍＡｂでコーティングした脂質ナノ粒子中に封入した。細胞を、０、０．１、０．２５、０．５、１、および２μＭのｓｉＲＮＡの範囲に及ぶ異なる濃度のｓｉＲＮＡとともに、１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーに供した（図１１Ａ）。高いｓｉＲＮＡ濃度（２μＭ）に加えて、細胞はまた、蛍光顕微鏡法を用いても確認した（図１１Ｂ）。ＮＲＫ−ＥＮＤＯ１８０発現細胞へのＣｙ３−ｓｉＲＮＡの送達の用量応答曲線を、図１１Ａに示す。送達は、高用量で、高含量（９０％超）のＣｙ３−ｓｉＲＮＡで特異的であった。結果は、８Ｄ８−ＮＰを使用した選択的送達を示す蛍光顕微鏡画像と酷似していた。  
【０２６５】
８Ｄ８−ＮＰは、ＮＲＫ−ＥＮＤＯ１８０発現細胞にＣｙ３−ｓｉＲＮＡを送達し、ｓｉＲＮＡは、核周囲フォーカスに局在化される。
共焦点顕微鏡分析（図１２および１３）は、８Ｄ８−ＮＰを介して送達されたＣｙ３−ｓｉＲＮＡが、実際に細胞内にあり（図１２）、ＲＮＡｉ機構もまた存在する核周囲フォーカスに局在化される（図１３、核周囲フォーカスを指す白色矢印を参照されたい）ことを明らかにした。
【０２６６】
これらの結果は、８Ｄ８−ＮＰが、カーゴ（ＤＯＸによって表される小分子、およびＣｙ３−ｓｉＲＮＡによって表されるｄｓＲＮＡ）を直接ＥＮＤＯ１８０発現細胞に選択的に送達する能力を示す。  
【０２６７】
Ａ５４９細胞における８Ｄ８コーティング粒子の治療的有用性。
Ａ５４９細胞における８Ｄ８コーティング粒子の治療的有用性を、標的化されていない通常のナノ脂質粒子と比較した。マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）を、治療カーゴとして使用した。ＭＭＣを、リポソームおよび他の脂質ベースのナノ粒子の両方について、以前に示されたように、膨潤溶液中の脂質粒子に組み込んだ（Ｐｅｅｒ&Ｍａｒｇａｌｉｔ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ１０８，７８０−７８９（２００４）、Ｂａｃｈａｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３２，４８４０−４８４８（２０１１））。８Ｄ８コーティング粒子（組成物１）、通常の粒子、および遊離ＭＭＣを、全て５０μｇ／ｍＬの濃度で、３７℃で１時間Ａ５４９細胞とともにインキュベートした。１時間後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、薬物不含培地とともにさらに７２時間インキュベートした。図１４は、標的型と遊離薬物、または非コーティングナノリポソームを使用したものとを対比した、治療的有用性を示す。理論に束縛されることを望むものではないが、治療的有用性は、細胞による８Ｄ８コーティング脂質粒子の特異的取り込みおよび標的細胞におけるそれらのＭＭＣペイロードの放出に起因する。これらの細胞に十分に内部移行せず、１時間のインキュベーション後に洗い流される、小さな非コーティングリポソームの作用とは対照的である。ＥＮＤＯ１８０受容体への８Ｄ８コーティングナノ粒子の結合および活性なリサイクルプロセスは、これらの細胞に観察された結果の主要な共通点であると推測される。  
【０２６８】
実施例４：ｓｉＲＡＣ１を担持する８Ｄ８コーティング粒子による標的遺伝子のインビトロノックダウン。
Ａ５４９細胞系を、癌細胞モデルとして使用した。細胞を、抗生物質、Ｌ−グルタミン酸、および１％ウシ胎児血清（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌ）を補充したＲＰＭＩ培地中、７．０×１０５細胞／ウェルで６ウェルの細胞培養プレートに播種した。播種した２４時間後に、培地を除去し、抗生物質なしでグルタミン酸および１０％血清を有するＲＰＭＩ培地と置き換えた。細胞に、ＣＹ５標識化Ｒａｃ１＿２８またはｅＧＦＰ  ｓｉＲＮＡを封入した８ｄ８−ＨＡ−ＮＰまたはＩｇＧＣｔｒｌ−ＨＡ−ＮＰをトランスフェクトした。陽性対照として、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造業者の説明に従って使用した。インキュベーションの１時間後に、培地を除去し、細胞を洗浄し、完全培地を補充した。トランスフェクションの６日後に、細胞を１：３に分けた。脂質ナノ粒子中の細胞に適用した最終ｓｉＲＮＡ濃度は、２０〜１００ｎＭであった。トランスフェクションの６日後に、全ＲＮＡを、ＥｚＲＮＡ  ＲＮＡ精製キット（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌ）を使用して単離した。１μｇのＲＮＡを、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用してｃＤＮＡに逆転写し、ｃＤＮＡの定量化（合計５ｎｇ）を、Ｓｙｂｅｒグリーン（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ステップ１のＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で行った。ＧＡＰＤＨを、ハウスキーピング遺伝子として選択した。
【０２６９】
インビトロでの結果を、図１５Ａ〜１５Ｂに示す。図１５Ａおよび１５Ｂは、ＲＡＣに対するｓｉＲＮＡを封入した８Ｄ８−ＮＰに暴露したＡ５４９細胞系におけるＲａｃ１  ｍＲＮＡ（残留ｍＲＮＡのレベルを示す）のインビトロでのノックダウンを示す。図１５Ａは、２および６日後のノックダウンを示す。図１５Ｂは、６日後のノックダウンを示す。Ｒａｃ１：８ｄ８ｌｉｐは、ｓｉＲＡＣ１を封入した８Ｄ８コーティング脂質ナノ粒子を指す。Ｒａｃ１：ＩｇＧｌｉｐは、ｓｉＲＡＣ１を封入したＩｇＧコーティング脂質ナノ粒子を指す。
【０２７０】
ＥＧＦＰ（強化緑色蛍光タンパク質）ｓｉＲＮＡは、次の構造を有する：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、および１９位に非修飾リボヌクレオチドを有し、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、および１８位に２’Ｏ−メチル糖修飾リボヌクレオチド有するセンス鎖ＧＣＣＡＣＡＡＣＧＵＣＵＡＵＡＵＣＡＵ（配列番号９）、ならびに２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、および１８位に非修飾リボヌクレオチドを有し、１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、および１９位に２’Ｏ−メチル糖修飾リボヌクレオチドを有し、３’末端に共有結合したＣｙ５蛍光部分を有するアンチセンス鎖５’ＡＵＧＡＵＡＵＡＧＡＣＧＵＵＧＵＧＧＣ  ３’（配列番号１０）。
【０２７１】
ＲＡＣ１＿２８＿Ｓ１８４２（ＢｉｏＳｐｒｉｎｇ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，ＤＥ）として識別されるｓｉＲＮＡは、ＲＡＣ１遺伝子を標的とし、次の鎖を有する：２、４、６、７、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、および１９位に非修飾リボヌクレオチドを有し、１、５、１０、１３、１６、および１８位に２’Ｏメチル糖修飾リボヌクレオチドを有する、センス鎖５’ＧＵＧＣＡＡＡＧＵＧＧＵＡＵＣＣＵＡ  ３’（配列番号１１）。２、３、４、５、７、８、１０、１２、１４、１６、および１８位に非修飾リボヌクレオチドを有し、１、６、９、１１、１３、１５、１７、および１９位に２’Ｏメチル糖修飾リボヌクレオチドを有し、３’末端に共有結合したＣｙ５蛍光部分を有するアンチセンス鎖：５’ＵＡＧＧＡＵＡＣＣＡＣＵＵＵＧＣＡＣＧ  ３’（配列番号１２）。  
【０２７２】
実施例５：腫瘍担持無胸腺ヌードマウスにおけるＥＮＤＯ１８０標的ナノ粒子の生体内分布
目的：Ａ５４９（腺癌ヒト肺胞基底上皮細胞）腫瘍担持無胸腺ヌードマウス（ＴＢＭ）における、製剤化されたＣｙ５標識化ＲＡＣ１＿２８＿Ｓ１８４２  ｓｉＲＮＡの生体内分布（ＢＤ）の評価。  
【０２７３】
材料および方法：
試験物質：ＲＡＣ１＿２８＿Ｓ１８４２（ＢｉｏＳｐｒｉｎｇ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，ＤＥ）として識別されたｓｉＲＮＡ３０．１７９ｍｇのｓｉＲＮＡを、１．５０１ｍｌの注射用水（ＷＦＩ，Ｎｏｒｂｒｏｏｋ）に溶解して、２０ｍｇ／ｍｌのストック溶液を得た。０．３５ｍｌのストック溶液を、７ｍｇまで凍結乾燥させ、これを、１４ｍｌのＤＥＰＣ処理水に溶解して、０．５ｍｇ／ｍｌのストック溶液を得た。
【０２７４】
非コーティングＮＰ中に製剤化されたＲＡＣ１＿２８＿Ｓ１８４２：非コーティングＮＰは、純大豆ホスファチジルコリン（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｏｎ  ９０Ｇ，Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ＧＭＢＨ  Ｇｅｒｍａｎｙ）で構成されていた。１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）およびコレステロール（Ｃｈｏｌ）（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ  Ｉｎｃ．（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，ＵＳＡ））。約６０：２０：１９．９のモル比のＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＰＥ脂質を、エタノール中に溶解し、回転式蒸発器で減圧下において蒸発乾燥させた（Ｂｕｃｈｉ  Ｒｏｔａｒｙ  Ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ  Ｖａｃｕｕｍ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｆｌａｗｉｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。蒸発させた後、乾燥した脂質膜を、１０ｍｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中に水和し、続いて、ボルテックスデバイスを用いて広範に振動させ、振盪浴中で２時間６５℃でインキュベートした。ＭＬＶを、６５℃、２００〜５００ｐｓｉの窒素圧下で動作するＬｉｐｅｘ押出デバイス（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＣＡ）を通して押出した。押出は、漸減孔径のポリカーボネート膜（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｉｎｃ，ＵＫ）を用いて、１つの孔径につき複数のサイクルで段階的に行い、直径約１００ｎｍの最終寸法範囲で単層ベシクル（ＵＬＶ）を得た。得られたＮＰを、完全に乾燥するまで凍結乾燥させた（４８時間）。凍結乾燥させた粒子を、０．５ｍｇ／ｍｌのｓｉＲＮＡ  ＲＡＣ１＿２８＿Ｓ１８４２を有するＤＥＰＣ処置水で水和させた。
【０２７５】
ＨＡコーティングＮＰ中に製剤化したＲＡＣ１＿２８＿Ｓ１８４２：高分子量のヒアルロン酸（ＨＡ）、７００ＫＤａ（Ｌｉｆｅｃｏｒｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ＬＬＣ  Ｃｈａｓｋａ，ＭＮ，Ｕ．Ｓ．Ａ）を、０．２ＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）中に、最終濃度５ｍｇ／ｍｌまで溶解した。ＨＡを、１：１：６のモル比で、ＥＤＣおよびスルホ−ＮＨＳにより活性化させた。３０分間活性化させた後、単層ベシクルを添加し、ｐＨを７．４に調整した。溶液を、室温で（２時間）インキュベートした。遊離ＨＡを、３回の遠心分離による反復洗浄サイクルによって除去した（１．３×１０５ｇ、４℃、６０分）。得られたＨＡコーティングＮＰを、完全に乾燥するまで凍結乾燥させた（４８時間）。凍結乾燥させた粒子を、０．５ｍｇ／ｍｌのｓｉＲＮＡ  ＲＡＣ１＿２８＿Ｓ１８４２を有するＤＥＰＣ処理水で水和させた。
【０２７６】
抗ＥＮＤＯ１８０−ＨＡコーティングＮＰ中に製剤化したＲＡＣ１＿２８＿Ｓ１８４２：ＥＮＤＯ１８０  ８Ｄ８抗体およびマウスＩｇＧ対照（Ｉ  ８７６５）を、１０ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで濃縮した（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒユニット）。２０μｌを、１．２μｇのＥＤＣおよび１．４４μｇのスルホ−ＮＨＳ（ｐＨ５．５）で活性化させた。室温で３０分間インキュベートした後、０．８ｍｇのＨＡコーティングＮＰ（上述の凍結乾燥前に添加されたＨＡコーティングＮＰを参照されたい）を、活性化させた選択した抗体（Ａｂ）に添加し、ｐＨをｐＨ７．４に調整した。リポソームを４℃で一晩インキュベートした。リポソームおよび遊離抗体を、ＣＬ−４Ｂカラム上で分離させた。溶液を、室温で（２時間）インキュベートした。遊離ＨＡを、３回の遠心分離による反復洗浄サイクルによって除去した（１．３×１０５ｇ、４℃、６０分）。得られた８Ｄ８−ＨＡコーティングＮＰを、完全な水の除去が確認されるまで凍結乾燥させた（４８時間）。凍結乾燥させた粒子を、０．５ｍｇ／ｍｌのｓｉＲＮＡ  ＲＡＣ１＿２８＿Ｓ１８４２を有するＤＥＰＣ処理水で水和させた。
【０２７７】
ＨＢＳＳは、ビヒクル：１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ＝７．４を指す。
【０２７８】
試験系：種／株：無胸腺ヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ）、１１週齢の雌、体重範囲：２０〜２２グラム、群寸法：１〜３、研究における合計動物数：４０匹中３６匹が腫瘍注入マウス
【０２７９】
動物の管理：動物には市販の齧歯類の通常食を自由に与え、自由に給水させた。
【０２８０】
環境：（ｉ）少なくとも５日間の順応。
【０２８１】
（ｉｉ）全ての動物を、全研究期間を通して、環境を制御した収容条件のアクセスが制限された施設に閉じ込め、承認済みの標準実施手順（ＳＯＰ）に従って維持した。
【０２８２】
細胞：Ａ５４９（腺癌性ヒト肺胞基底上皮細胞）（ＡＴＣＣ＃  ＣＣＬ−１８５）
【０２８３】
到着１週間後。４０匹の無胸腺ヌードマウスに、Ａ５４９細胞を側腹領域に皮下注射した。マウスを、腫瘍進行および不快症状について、毎日視覚的に検査した。おおよそ５ｍｍという十分な腫瘍体積に達したときに、マウスに、以下の表２の研究デザインに応じて、異なる処方のＲＡＣ１＿２８＿Ｓ１８４２  ｓｉＲＮＡを静脈内注射した（非コーティング、ＨＡコーティング、および８Ｄ８−ＨＡ）。
【０２８４】
表２：
【表２】
2015509085.tif 000003
【０２８５】
腫瘍細胞懸濁液の調製：マウス１匹当たり０．５×１０６のＡ５４９細胞（腺癌性ヒト肺胞基底上皮細胞）。
【０２８６】
腫瘍誘発：細胞懸濁液を、２．５×１０６細胞／ｍｌの濃度で、２７Ｇの注射針を使用して、各動物の側腹領域への単回皮下投与（ｓｃ）によって注射した。投与は、細胞透過後できるだけすぐに行った。
【０２８７】
試験物質の調製：実験日に、全ての担体製剤（非コーティング、ＨＡ−コーティング、および８Ｄ８−ＨＡ）を凍結乾燥させ、バッチでガラス瓶中に保管した（−２０℃）。実験の前に、単回用量の凍結乾燥粒子を取り、再水和して、動的光散乱により寸法を確認した。凍結乾燥させた担体を、ＤＥＰＣ処理水中に、ｓｉＲＮＡ対脂質の比率１：２で溶解させたｓｉＲＮＡ（０．５ｍｇ／ｍｌ）で再水和させた。室温でオービタルシェーカー上で３０分間軽く振盪させた後、担体をマウスに静脈内注射した。
【０２８８】
試験物質の投与：単回静脈内（ｉｖ）投与を、腫瘍接種の３０日後に行った。０．５ｍｇ／１ｍｌの用量でｓｉＲＮＡを製剤化、２７Ｇの注射針を使用した注射量２００μＬ。
【０２８９】
細胞注射および担体注射の後、マウスを、損傷および腫瘍成長の兆候について毎日検査した。担体注射の６時間後に安楽死させたマウスの死後創傷試験を、Ｍａｅｓｔｒｏ撮像システムを用いて行い、２４時間後に安楽死させたマウスを、生体内分布分析のために解剖した。
【０２９０】
研究の終了：試験物質注射の６時間後に、マウスの半数をＣＯ２により安楽死させ（大学の規則および規制に従う）、撮像した。注射の約２４時間後に、残りの動物を出血させた後、ＣＯ２により安楽死させた。器官（腫瘍、肺、肝臓、脾臓、および腎臓）を摘出した。１つの腎臓、１つの肝葉、肺の半分、脾臓の半分、および腫瘍を、液体窒素で瞬間凍結させた。残りの器官を、４％ホルムアルデヒド（器官当たり１ｍｌ）中に保存した。  
【０２９１】
評価および結果
組織および腫瘍におけるｓｉＲＮＡ定量化：ＲＡＣ１＿２８＿Ｓ１８４２  ｓｉＲＮＡの量を、ステムおよびループのｑＰＣＲによって試験した。ｓｉＲＮＡが、０．２５％ｔｒｉｔｏｎ中に試料を溶解することにより溶解物中に検出され、続いて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  ７３００  ＰＣＲ  ＳｙｓｔｅｍにおいてＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ法を使用した標準方法に従ってｑＰＣＲを行った。
【０２９２】
全ての凍結組織および細胞から調製したＲＮＡにおけるＲＡＣ１  ｍＲＮＡレベルおよびＲＡＣＥ分析を、ｑＰＣＲを使用して測定した。ｃＤＮＡは、標準方法に従って調製した。ＲＡＣ１切断産物のＲＡＣＥ分析については、ＲＮＡを、全ＲＮＡ単離によって調製する。
【０２９３】
ｓｉＲＮＡの分布もまた、インサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）によって評価した。
【０２９４】
Ｃｙ５標識ｓｉＲＮＡが、腫瘍担持マウスの腫瘍、肝臓、および腎臓に観察された。強いＣｙ５蛍光が、腫瘍および両腎臓に観察されたが、示されない。高レベルのｓｉＲＮＡが、図１６Ａ〜１６Ｄのグラフに示されるように、ヒアルロン酸（ＨＡ）部分を介して抗ＥＮＤＯ１８０抗体（８Ｄ８）に複合体化された脂質ナノ粒子を注射した動物の腫瘍に観察された。図１６Ａ〜１６Ｄは、マウス癌モデルにおいて、Ｃｙ５−Ｒａｃ１＿２８を封入したＥＮＤＯ１８０コーティングナノ粒子（ＮＰ）で処置したマウスの種々の体器官へのｓｉＲＮＡの生体内分布を示す図を提示する。組織試料１ｍｇ当たりに存在するｓｉＲＮＡの量（アトモル）は、腫瘍（１６Ａ）、脾臓（１６Ｂ）、肝臓（１６Ｃ）、および腎臓（１６Ｄ）を、次のように異なる組成物で処置した動物に示される：ｓｉＲＡＣ１（ＮＰｓ−ＲＡＣ１＿２８）を封入したナノ粒子；ｓｉＲＡＣ１（ＨＡ−ＮＰｓ−ＲＡＣ１＿２８）を封入したヒアルロン酸コーティングナノ粒子；ｓｉＲＡＣ１（８ｄ８−ＨＡ−ＮＰｓ−ＲＡＣ１＿２８）を封入した８Ｄ８およびヒアルロン酸コーティングナノ粒子；ｓｉＲＡＣ１単独（ＲＡＣ１＿２８）。脾臓、肝臓、および腎臓は、少なくとも３匹のマウスからの平均である）。  
【０２９５】
実施例６：腫瘍担持無胸腺ヌードマウスにおけるＥＮＤＯ１８０標的ナノ粒子の生体内分布
目的：Ａ５４９（腺癌性ヒト肺細胞基底上皮細胞）腫瘍担持無胸腺ヌードマウス（ＴＢＭ）における、製剤化されたＲＡＣ１＿２８＿Ｓ１９０８  ｓｉＲＮＡの生体内分布（ＢＤ）の評価。
【０２９６】
材料および方法：
試験物質：ＲＡＣ１＿２８＿Ｓ１９０８（ＢｉｏＳｐｒｉｎｇ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，ＤＥ）として識別されたｓｉＲＮＡは、ＲＡＣ１遺伝子を標的とし、次の鎖を有する：
【０２９７】
２、４、６、７、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、および１９位に非修飾リボヌクレオチドを有し、１、３、５、１０、１３、１６、および１８位に２’Ｏメチル糖修飾リボヌクレオチドを有する、センス鎖５’ＧＵＧＣＡＡＡＧＵＧＧＵＡＵＣＣＵＡ  ３’（配列番号９）。
【０２９８】
２、３、４、５、７、８、１０、１２、１４、１６  、および１８位に非修飾リボヌクレオチドを有し、１、６、９、１１、１３、１５、１７、および１９に２’Ｏメチル糖修飾リボヌクレオチドを有する、アンチセンス鎖５’ＵＡＧＧＡＵＡＣＣＡＣＵＵＵＧＣＡＣＧ  ３’（配列番号１０）。
【０２９９】
ｓｉＲＮＡの調製：５ｍｇを５１３μｌのＤＥＰＣ処理水に溶解して、９．７５ｍｇ／ｍｌのストック溶液を得る。
【０３００】
製剤化された化合物、８ｄ８−ＨＡ−ＮＰ中０．４ｍｇ／ｍｌのＲＡＣ１＿２８＿Ｓ１９０８（ＥＮＤＯ１８０−８Ｄ８−ヒアルロン酸−ＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＰＥ）：ＥＮＤＯ１８０  ｍＡｂ  ８Ｄ８を、１０ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで濃縮した（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒユニット）。２０μｌを、１．２μｇのＥＤＣおよび１．４４μｇのスルホ−ＮＨＳ（ｐＨ５．５）で活性化させた。室温で３０分間インキュベートした後、０．８ｍｇのＨＡでＮＰをコーティングした。非コーティングＮＰは、ＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＰＥが約６０：２０：１９．９のモル比であった。脂質をエタノール中に溶解し、回転式蒸発器で減圧下において蒸発乾燥させた。蒸発させた後、乾燥した脂質膜を、１０ｍｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中に水和し、続いて、広範に振動（ボルテックス）し、振盪浴中で２時間６５℃でインキュベートした。ＭＬＶを、６５℃、２００〜５００ｐｓｉの窒素圧下で動作するＬｉｐｅｘ押出デバイスを通して押出した。押出は、漸減孔径のポリカーボネート膜（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｉｎｃ，ＵＫ）を用いて、１つの孔径につき複数のサイクルで段階的に行い、直径約１００ｎｍの最終寸法範囲でＵＬＶを得た。リポソームを、活性化された選択した抗体（Ａｂ）に添加し、ｐＨをｐＨ７．４に調整した。リポソームを４℃で一晩（Ｏ．Ｎ）インキュベートした。リポソームおよび遊離抗体を、ＣＬ−４Ｂカラム上で分離させた。溶液を、室温で２時間インキュベートした。遊離ＨＡを、３回の遠心分離による反復洗浄サイクルによって除去した（１．３×１０５ｇ、４℃、６０分）。８Ｄ８−ＨＡコーティングＮＰを、完全に乾燥するまで凍結乾燥させた（４８時間）。１ｍｇの凍結乾燥させた粒子の一部分を、９．７５ｍｇ／ｍｌ（２００μｇ）のストックＲＡＣ１＿２８＿Ｓ１９０８＿Ｓ１８  ｓｉＲＮＡ２０．５μｌおよびＤＥＰ処理水４７９．５μｌで水和させて、８ｄ８−ＨＡ−ＮＰ中０．４ｍｇ／ｍｌのｓｉＲＮＡ  ５００μｌを得た。この調製したｓｉＲＮＡストックを、２匹のマウスに使用した。この手順を３回繰り返した。
【０３０１】
製剤化された化合物、対照抗体でコーティングしたＮＰ：ＮＭＩｇＧ−ＨＡ−ＮＰ（ＮＭＩｇＧヒアルロン酸−ＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＰＰＥ）中０．４ｍｇ／ｍｌのＲＡＣ１＿２８＿Ｓ１９０８：試験物質の説明：マウスＩｇＧ対照（Ｉ  ８７６５）を、１０ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで濃縮した（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒユニット）。２０μｌを、１．２μｇのＥＤＣおよび１．４４μｇのスルホ−ＮＨＳ（ｐＨ５．５）で活性化させた。室温で３０分間インキュベートした後、０．８ｍｇのＨＡコーティングＮＰを、活性化させた選択した抗体（Ａｂ）に添加し、ｐＨをｐＨ７．４に調整した。リポソームを４℃で一晩（Ｏ．Ｎ）インキュベートした。リポソームおよび遊離抗体を、ＣＬ−４Ｂカラム上で分離させた。溶液を、室温で（２時間）インキュベートした。遊離ＨＡを、３回の遠心分離による反復洗浄サイクルによって除去した（１．３×１０５ｇ、４℃、６０分）。得られたＩｇＧ−ＨＡコーティングＮＰを、完全な水の除去が確認されるまで凍結乾燥させた（４８時間）。１ｍｇの凍結乾燥粒子の一部分を、９．７５ｍｇ／ｍｌ（２００μｇ）のストックＲＡＣ１＿２８＿Ｓ１９０８＿Ｓ１８  ｓｉＲＮＡ  ２０．５μｌおよびＤＥＰＣ処理水４７９．５μｌで水和させて、得た。ＮＭＩｇＧ−ＨＡ−ＮＰ中０．４ｍｇ／ｍｌのｓｉＲＮＡ  ５００μｌに。この調製したｓｉＲＮＡストックを、２匹のマウスに投与した。この手順を３回繰り返した。
【０３０２】
ＨＢＳＳは、ビヒクル：１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ＝７．４を指す。
【０３０３】
試験系：種／株：無胸腺ヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ）、１１週齢の雌、体重範囲：２０〜２２グラム、群サイズ：５〜８、研究における合計動物数１８。
【０３０４】
動物の管理および細胞系：上記実施例５に提供される通り。
【０３０５】
順応の２週間後、無胸腺ヌードマウスに、Ａ５４９細胞を側腹領域に皮下注射した。マウスを、腫瘍進行および不快症状について、毎日視覚的に検査した。おおよそ５ｍｍという十分な腫瘍体積に達したときに、マウスに、表３の研究設計に応じて、４ｍｇ／ｋｇの異なる処方のＲＡＣ１＿２８＿Ｓ１９０８  ｓｉＲＮＡ（８Ｄ８−ＨＡおよびＩｇＧ対照複合製剤）を静脈内注射する（Ｔ＝０）。
【０３０６】
ｓｉＲＮＡ／担体注射の約２４時間後（Ｔ＝２４時間）に、４ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ／担体をもう１用量注射した。１回目のｓｉＲＮＡ／担体注射（Ｔ＝４８時間）の４８時間後に、動物を出血させ、次いでＣＯ２により安楽死させた。器官（腫瘍、肺、肝臓、脾臓、および腎臓）を採取した。
【０３０７】
表３
【表３】
2015509085.tif 000004
【０３０８】
腫瘍細胞の調製：腫瘍細胞懸濁液：マウス１匹当たり２．０×１０６のＡ５４９（腺癌性ヒト肺胞基底上皮細胞）。
【０３０９】
腫瘍誘発：細胞懸濁液を、約１０６細胞／ｍｌの濃度で、２７Ｇの注射針を使用して、０．２ｍｌ／動物の用量体積で各動物の側腹領域へ皮下注射（ｓｃ）した。投与は、細胞透過後できるだけすぐに行った。
【０３１０】
注射した後に監視することで、マウスを、腫瘍進行および不快症状について、毎日視覚的に検査した。腫瘍寸法を監視し、測定し、記録した。腫瘍体積がおおよそ５ｍｍに達したときに、マウスを３つの群に分類した。
【０３１１】
試験物質の調製：実験の前に、全ての担体製剤（ＩｇＧＣｔｒｌ−ＨＡ−コーティングおよび８Ｄ８−ＨＡ−コーティング）を、凍結乾燥させ、バッチでガラス瓶に保管し（−２０℃）、単回用量の凍結乾燥粒子を取り、再水和して、動的光散乱により寸法を確認した。実験日に、１ｍｇの凍結乾燥担体（マウス１匹につき単回用量当たり０．５ｍｇ）を、ｓｉＲＮＡおよびＤＥＰＣ処理水でｓｉＲＮＡと脂質の比率１：１０で再水和させた。完全な溶解を確実にするために室温でオービタルシェーカーにおいて３０分間軽く振盪させた後、担体をマウスに静脈内注射した（２００μｌ、４ｍｐｋ）。
【０３１２】
試験物質の投与：単回静脈内（ｉ．ｖ．）投与を、腫瘍接種の１４日後に行う。０．３２ｍｇ／ｍｌの用量でｓｉＲＮＡを製剤化、２７Ｇの注射針を使用した注射量２５０μＬ。２回目の静脈内投与を、１回目の静脈内投与の２４時間後に同じ様式で行った。
【０３１３】
１回目の試験物質／ビヒクル注射の４８時間後に研究を終了し、全てのマウスを出血させた後、ＣＯ２により安楽死させた。器官（腫瘍、肺、肝臓、脾臓、および腎臓）を採取した。
【０３１４】
血漿分離血液試料を室温において１０００ｇで１５分間遠心分離した。血漿を液体窒素で即座に凍結させた。全ての血漿試料は、ｑＰＣＲまで−８０℃で保管する。
【０３１５】
ｑＰＣＲおよびＩＳＨのための組織採取：凍結組織を、群２および３の両群の６匹、ならびに群１の４匹から採取した。固定組織を、群１の２匹、ならびに群２および３の両群の１匹から採取した。
【０３１６】
凍結組織について：両腎臓、肺、肝臓、脾臓、および腫瘍を摘出し、事前にラベル付けした試験管に採取し、液体窒素で瞬間凍結させた。
【０３１７】
組織病理学のための腫瘍収集（群１〜３）。群１の２匹の動物、群２の１匹の動物、および群３の１匹の動物から腫瘍を採取し、即座にｐＨ７．４の１０％ホルマリン（各腫瘍を１５ｍｌのホルマリン管に別個に）に入れ、スライド調製のためにパラフィン包埋した。これらの動物の他の器官を採取し、液体窒素で瞬間凍結させた。
【０３１８】
評価および結果
組織および腫瘍におけるｓｉＲＮＡ定量化：ＲＡＣ１＿２８＿Ｓ１９０８  ｓｉＲＮＡの量を、ステムおよびループのｑＰＣＲによって試験した。ｓｉＲＮＡが、０．２５％ｔｒｉｔｏｎ中に試料を溶解し、続いて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  ７３００  ＰＣＲシステムにおいてＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ法を使用した標準方法に従ってｑＰＣＲによって組織溶解物中に検出された。
【０３１９】
全ての凍結組織および細胞から調製したＲＮＡにおけるＲＡＣ１  ｍＲＮＡレベルおよびＲＡＣＥ分析を、ｑＰＣＲを使用して測定した。ｃＤＮＡは、標準法に従って調製し、ｑＰＣＲは上述のように行った。ＲＡＣ１切断産物のＲＡＣＥ分析については、ＲＮＡを、ＥＺ  ＲＮＡキットを使用して全ＲＮＡを単離することによって調製した。
【０３２０】
インサイツハイブリダイゼーションｓｉＲＮＡ分布を行って、種々の組織試料中のＲＡＣ１＿２８  ｓｉＲＮＡを検出する。
【０３２１】
ｓｉＲＮＡが、腫瘍担持マウスの腫瘍、肝臓、および腎臓に観察された。高レベルのｓｉＲＮＡが、図１７Ａ〜１７Ｄのグラフに示されるように、ヒアルロン酸（ＨＡ）部分を介して抗ＥＮＤＯ１８０抗体（８Ｄ８）に複合化された脂質ナノ粒子を注射した動物の腫瘍に観察された。図１７Ａ〜１７Ｄは、マウス癌モデル由来の腫瘍および腎臓における、Ｒａｃ１＿２８を封入したＥＮＤＯ１８０コーティングナノ粒子（ＮＰ）の生体内分布を示すグラフを提示する。組織試料１ｍｇ当たりに存在するｓｉＲＮＡの量（アトモル）は、腫瘍（１７Ａおよび１７Ｂ）ならびに腎臓（１７Ｃおよび１７Ｄ）を、次のように異なる組成物で処置した動物において示す：ｓｉＲＡＣ１を封入した８Ｄ８およびヒアルロン酸コーティングナノ粒子（８ｄ８−ＨＡ−ＮＰｓ−ｓｉ）；ｓｉＲＡＣ１（ＩｇＧＣｔｒ−ＨＡ−ＮＰｓ−ｓｉ）を封入したＩｇＧおよびヒアルロン酸コーティングナノ粒子；緩衝液中のｓｉＲＡＣ１＿２８（ＨＢＳＳ）。「ｎ」は、平均に含んだ動物数を指す（１７Ｂおよび１７Ｄ）。
【０３２２】
実施例７：ｓｉＲＮＡ活性
ｓｉＲＮＡを封入した脂質ナノ粒子の、標的遺伝子をノックダウンまたは標的ｍＲＮＡを切断する有効性を、当業者に既知であり、残留ｍＲＮＡレベルおよび残留タンパク質レベルおよびＲＡＣＥ（切断）の測定を含む標準方法を用いて評価する。
【０３２３】
これらの実施例には、限られた数のｓｉＲＮＡ分子を用いたが、本明細書に開示される組成物は、生物における任意の遺伝子、好ましくは疾患と関連する遺伝子を標的とし（すなわち、遺伝子発現を阻害する／遺伝子発現を下方制御する）、このような遺伝子の阻害／下方制御がその生物にとって有益であろう、アンチセンス分子、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ等を含む、オリゴヌクレオチドを包含するように製剤化されることを理解されたい。
【０３２４】
本明細書に開示される方法および組成物を、広く一般的に記載した。包括的な開示の範囲内であるより狭い種および亜属集団のそれぞれもまた、本開示の一部を形成する。これには、その属から任意の対象を除外するという条件または否定的制限による本開示の包括的な説明が、除外した物質が本明細書に具体的に記載されているかどうかに関わらず、含まれる。他の実施形態は、以下の特許請求の範囲に含まれる。
【図１】
2015509085.tif 000005
【図２】
2015509085.tif 000006
【図３】
2015509085.tif 000007
【図４−１】
2015509085.tif 000008
【図５】
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【図６】
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【図７】
2015509085.tif 000011
【図８】
2015509085.tif 000012
【図９】
2015509085.tif 000013
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2015509085.tif 000018
【図１５】
2015509085.tif 000019
【図１６−１】
2015509085.tif 000020
【図１６−２】
2015509085.tif 000021
【図１７−１】
2015509085.tif 000022
【図１７−２】
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【配列表】
2015509085000001.app
【国際調査報告】
2015509085.tif 000024
2015509085.tif 000025
2015509085.tif 000026