(57)【要約】【課題】脂腺細胞の培養及び使用方法の提供。【解決手段】脂腺細胞の培養方法、脂腺細胞の単離された集団、及び、脂質生成を阻害又は活性化する化合物をスクリーニングするための培養脂腺細胞の使用方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂腺細胞の培養に適した細胞培地中でガラス片の間に挟んだ皮脂腺を該皮脂腺上に脂腺細胞が形成されるのに充分な時間培養することを含む、
初代脂腺細胞を培養する方法。
【請求項２】
前記ガラス片が細胞外マトリックスタンパク質で被覆されている、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞外マトリックスタンパク質がフィブロネクチンである、
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記皮脂腺がヒト小児ドナー由来である、
請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記皮脂腺を培養する前に、皮膚のサンプルを得ること、及び、該皮膚サンプルから皮脂腺を取り出すことをさらに含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記皮膚のサンプルがヒト小児ドナー由来である、
請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞培地が、基本培地、上皮成長因子、コレラ毒素、アデニン、インスリン、ヒドロコルチゾン、ウシ胎児血清、及び、抗生物質／有糸分裂阻害薬を含有する、
請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記皮脂腺から前記脂腺細胞を取り出すこと、及び、脂腺細胞の培養に適した培地中で細胞外マトリックスタンパク質で被覆されたガラス上に前記脂腺細胞を培養することをさらに含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記培地が、基本培地、上皮成長因子、コレラ毒素、アデニン、インスリン、ヒドロコルチゾン、ウシ胎児血清、及び、抗生物質／有糸分裂阻害薬を含有する、
請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞外マトリックスタンパク質がフィブロネクチンである、
請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
基本培地、上皮成長因子、コレラ毒素、アデニン、インスリン、ヒドロコルチゾン、ウシ胎児血清、及び、抗生物質／有糸分裂阻害薬を含有する培地中でフィブロネクチンで被覆されたガラス上に初代脂腺細胞を培養することを含む、
初代脂腺細胞を培養する方法。
【請求項１２】
前記初代脂腺細胞がヒト小児ドナー由来である、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法により得られる培養脂腺細胞の単離された集団。
【請求項１４】
請求項１１に記載の方法により得られる培養脂腺細胞の単離された集団。
【請求項１５】
ａ）請求項１３に記載の培養脂腺細胞の集団に試験化合物を添加すること、及び、
ｂ）前記脂腺細胞における脂質産生に対する前記試験化合物の効果を測定すること
を含む、脂質生成を調節する化合物を同定する方法。
【請求項１６】
前記培養脂腺細胞の集団の一部が、前記試験化合物を添加する前にリノール酸で誘導される、
請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記試験化合物の効果の測定において、ＦＡＤＳ２又はＰＰＡＲγ又は両方の発現を測定する、
請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
ａ）請求項１４に記載の培養脂腺細胞の集団に試験化合物を添加すること、及び、
ｂ）前記脂腺細胞における脂質産生に対する前記試験化合物の効果を測定すること
を含む、脂質生成を調節する化合物を同定する方法。
【請求項１９】
前記培養脂腺細胞の集団の一部が、前記試験化合物を添加する前にリノール酸で誘導される、
請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記試験化合物の効果の測定において、ＦＡＤＳ２又はＰＰＡＲγ又は両方の発現を測定する、
請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、脂腺細胞の培養方法、及び、脂質生成を阻害又は活性化する化合物をスクリーニングするための培養脂腺細胞の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトにおいて皮脂腺は皮膚全体に分布しており、顔面と頭皮で最も多く見られ、存在しないのは手のひらと足の裏だけである。皮脂腺は微視的な腺であり、毛包中で油性物質（皮脂）を分泌して動物の皮膚及び毛髪を潤滑させる［１（＝非特許文献１）］。皮脂腺の表皮での機能は、皮膚の乾燥を防ぎ、感染並びに環境の物理的、化学的及び熱的な攻撃から身体を保護することである。ヒト皮脂の主成分はトリグリセリド及び脂肪酸（５７．５％）、ワックスエステル（２６％）並びにスクアレン（１２％）である［２（＝非特許文献２）］。皮脂産生は生涯を通じて調節され、加齢に伴い急激に減少する［３（＝非特許文献３）］。これに伴い、皮膚は乾燥しやすくなり、脆弱性が増す。また、例えば尋常性座瘡、アトピー性皮膚炎、脂漏性皮膚炎及び原発性瘢痕性脱毛症など、皮脂腺の調節不全に関連すると考えられるヒトの疾患がある［２、４、５（＝非特許文献２、４、５）］。
【０００３】
脂腺細胞の機能異常により毛包構造が変質し［５、６（＝非特許文献５、６）］、皮膚バリアが不充分になることから、皮脂腺は毛包及び表皮と極めて強く相互依存している。これは、脂肪酸を不飽和化する酵素を欠失したアセビア（ａｓｅｂｉａ）変異体マウスにおいて実証されている。この変異体は皮脂腺が未発達であり、皮膚表面脂質のプロファイルが変化しており、その結果、慢性炎症反応、脱毛及び皮膚の瘢痕化が生じる。［６（＝非特許文献６）］。
【０００４】
ヒト初代細胞の増殖が成功した場合、臨床上重要な意義を有するヒト生物学の特定の分野において大きな進歩となることが多い。これまで数十年にわたって血液や皮膚表皮などの組織幹細胞が臨床現場で使用されており、成功を収めている［７、８（＝非特許文献７、８）］。特に、表皮細胞（ケラチノサイト）はインビトロでの培養が可能であり、効率的に操作して３次元の表皮を形成することができる［９、１０（＝非特許文献９、１０）］。このモデルは、重度の皮膚損傷を有する患者を治療するツールとして役立つだけでなく、ヒト表皮の再生及び分化を調節する分子メカニズムを研究するための基本的手段も提供する。
【０００５】
このような他の細胞型を使用した進歩にもかかわらず、ヒト初代脂腺細胞の培養方法について成功例は得られていない。過去これまでに成人の顔面皮膚及び耳周辺の領域からヒト皮脂腺細胞株が樹立されているが［１１〜１４（＝非特許文献１１〜１４）］、ｐ５３及び網膜芽細胞腫タンパク質が介在する制限点を迂回するシミアンウイルス−４０ラージＴ抗原又はＨＰＶ１６／Ｅ６Ｅ７遺伝子でそれらの細胞株を不死化すると、細胞形質転換が起こって、それらの細胞株の用途がそれらの細胞周期及び分化の調節を分析することに限定されてしまう。そのため、依然としてヒト初代脂腺細胞の培養方法が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｍｉｔｈ  ＫＲ，Ｔｈｉｂｏｕｔｏｔ  ＤＭ：“Ｔｈｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ  ｓｅｒｉｅｓ：ｓｋｉｎ  ｌｉｐｉｄｓ．Ｓｅｂａｃｅｏｕｓ  ｇｌａｎｄ  ｌｉｐｉｄｓ：ｆｒｉｅｎｄ  ｏｒ  ｆｏｅ？”Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ２００８，４９（２）：２７１−２８１．
【非特許文献２】Ｐｉｃａｒｄｏ  Ｍ，Ｏｔｔａｖｉａｎｉ  Ｍ，Ｃａｍｅｒａ  Ｅ，Ｍａｓｔｒｏｆｒａｎｃｅｓｃｏ  Ａ：“Ｓｅｂａｃｅｏｕｓ  ｇｌａｎｄ  ｌｉｐｉｄｓ”．Ｄｅｒｍａｔｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ２００９，１（２）：６８−７１．
【非特許文献３】Ｐｏｃｈｉ  ＰＥ，Ｓｔｒａｕｓｓ  ＪＳ，Ｄｏｗｎｉｎｇ  ＤＴ：“Ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｓｅｂａｃｅｏｕｓ  ｇｌａｎｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ”．Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １９７９，７３（１）：１０８−１１１．
【非特許文献４】Ｈｕａｎｇ  ＪＴ，Ａｂｒａｍｓ  Ｍ，Ｔｌｏｕｇａｎ  Ｂ，Ｒａｄｅｍａｋｅｒ  Ａ，Ｐａｌｌｅｒ  ＡＳ：“Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｔｏｐｉｃ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ  ｄｅｃｒｅａｓｅｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ”．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  ２００９，１２３（５）：ｅ８０８−８１４．
【非特許文献５】Ｓｔｅｎｎ  ＫＳ：“Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ａｓｅｂｉａ  ｍｏｕｓｅ：ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｅｂａｃｅｏｕｓ  ｇｌａｎｄ  ｄｅｆｅｃｔ  ｌｅａｄｉｎｇ  ｔｏ  ｃｉｃａｔｒｉｃｉａｌ  ａｌｏｐｅｃｉａ”．Ｊ  Ｃｕｔａｎ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００１，２８（９）：４４５−４４７．
【非特許文献６】Ｚｈｅｎｇ  Ｙ，Ｅｉｌｅｒｔｓｅｎ  ＫＪ，Ｇｅ  Ｌ，Ｚｈａｎｇ  Ｌ，Ｓｕｎｄｂｅｒｇ  ＪＰ，Ｐｒｏｕｔｙ  ＳＭ，Ｓｔｅｎｎ  ＫＳ，Ｐａｒｉｍｏｏ  Ｓ：“Ｓｃｄ１  ｉｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｓｅｂａｃｅｏｕｓ  ｇｌａｎｄｓ  ａｎｄ  ｉｓ  ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｓｅｂｉａ  ｍｏｕｓｅ”．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １９９９，２３（３）：２６８−２７０．
【非特許文献７】Ｓｈｉｚｕｒｕ  ＪＡ，Ｎｅｇｒｉｎ  ＲＳ，Ｗｅｉｓｓｍａｎ  ＩＬ：“Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ：ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｍａｔｏｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ．”Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ  ２００５，５６：５０９−５３８．
【非特許文献８】Ｒｏｎｆａｒｄ  Ｖ，Ｒｉｖｅｓ  ＪＭ，Ｎｅｖｅｕｘ  Ｙ，Ｃａｒｓｉｎ  Ｈ，Ｂａｒｒａｎｄｏｎ  Ｙ：“Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ  ｏｎ  ｔｈｉｒｄ  ｄｅｇｒｅｅ  ｂｕｒｎｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ｇｒｏｗｎ  ｏｎ  ａ  ｆｉｂｒｉｎ  ｍａｔｒｉｘ”．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２０００，７０（１１）：１５８８−１５９８．
【非特許文献９】Ｂａｒｒａｎｄｏｎ  Ｙ，Ｇｒｅｅｎ  Ｈ：“Ｔｈｒｅｅ  ｃｌｏｎａｌ  ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｃａｐａｃｉｔｉｅｓ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ”．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８７，８４（８）：２３０２−２３０６．
【非特許文献１０】Ｂａｒｒａｎｄｏｎ  Ｙ：“Ｃｒｏｓｓｉｎｇ  ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ：ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，ｈｏｌｏｃｌｏｎｅｓ，ａｎｄ  ｔｈｅ  ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｒｅｎｅｗａｌ”．Ｃｏｒｎｅａ  ２００７，２６（９  Ｓｕｐｐｌ  １）：Ｓ１０−１２．
【非特許文献１１】Ｚｏｕｂｏｕｌｉｓ  ＣＣ，Ｓｅｌｔｍａｎｎ  Ｈ，Ｎｅｉｔｚｅｌ  Ｈ，Ｏｒｆａｎｏｓ  ＣＥ：“Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｂａｃｅｏｕｓ  ｇｌａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ（ＳＺ９５）”．Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １９９９，１１３（６）：１０１１−１０２０．
【非特許文献１２】Ｔｈｉｂｏｕｔｏｔ  Ｄ，Ｊａｂａｒａ  Ｓ，ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ  ＪＭ，Ｓｉｖａｒａｊａｈ  Ａ，Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ  Ｋ，Ｃｏｎｇ  Ｚ，Ｃｌａｗｓｏｎ  Ｇ：“Ｈｕｍａｎ  ｓｋｉｎ  ｉｓ  ａ  ｓｔｅｒｏｉｄｏｇｅｎｉｃ  ｔｉｓｓｕｅ：ｓｔｅｒｏｉｄｏｇｅｎｉｃ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｆａｃｔｏｒｓ  ａｒｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ，ｎｏｒｍａｌ  ｓｅｂｏｃｙｔｅｓ，ａｎｄ  ａｎ  ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ  ｓｅｂｏｃｙｔｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ（ＳＥＢ−１）”．Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２００３，１２０（６）：９０５−９１４．
【非特許文献１３】Ｌｏ  Ｃｅｌｓｏ  Ｃ，Ｂｅｒｔａ  ＭＡ，Ｂｒａｕｎ  ＫＭ，Ｆｒｙｅ  Ｍ，Ｌｙｌｅ  Ｓ，Ｚｏｕｂｏｕｌｉｓ  ＣＣ，Ｗａｔｔ  ＦＭ：“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｂａｃｅｏｕｓ  ｇｌａｎｄ：ｃｏｎｔｒａｓｔｉｎｇ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｃ−Ｍｙｃ  ａｎｄ  ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ”．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００８，２６（５）：１２４１−１２５２．
【非特許文献１４】Ｘｉａ  Ｌ，Ｚｏｕｂｏｕｌｉｓ  ＣＣ，Ｊｕ  Ｑ：“Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｂｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ”．Ｄｅｒｍａｔｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ２００９，１（２）：９２−９５．
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、脂腺細胞の培養に適した細胞培地中でガラス片の間に挟んだ皮脂腺を該皮脂腺上に脂腺細胞が形成されるのに充分な時間培養することを含む、初代脂腺細胞を培養する方法を提供する。本方法は、上記皮脂腺から上記脂腺細胞を取り出すこと、及び、脂腺細胞の培養に適した培地中で細胞外マトリックスタンパク質で被覆されたガラス上に上記脂腺細胞を培養することをさらに含んでいてもよい。
【０００８】
初代脂腺細胞を培養するための本開示の別の方法は、基本培地、上皮成長因子、コレラ毒素、アデニン、インスリン、ヒドロコルチゾン、ウシ胎児血清、及び、抗生物質／有糸分裂阻害薬を含有する培地中でフィブロネクチンで被覆されたガラス上に初代脂腺細胞を培養することを含む。
【０００９】
本開示の他の態様は、本開示の方法により得られる培養脂腺細胞の単離された集団を提供する。
【００１０】
本開示のさらに別の態様は、ａ）本開示の方法により得られる培養脂腺細胞の集団に試験化合物を添加すること、及び、ｂ）上記脂腺細胞における脂質産生に対する上記試験化合物の効果を測定することを含む、脂質生成を調節する化合物を同定する方法、又は、脂質生成に対する試験化合物の効果を決定する方法を提供する。
【００１１】
本開示のこれら及び他の態様は添付の特許請求の範囲に記載されており、本開示の詳細な説明においてより詳しく説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１ａ〜１ｃは皮脂腺の写真を示し、図１ｄは単離方法を示す。
【図２】図２ａ〜ｈは脂質分析に関わる遺伝子発現のグラフを示す。
【図３】図３ａ〜３ｃは皮脂腺の写真を示す。
【図４】図４ａ〜４ｆは脂腺細胞分化に対するＴＧＦβシグナル伝達の効果を表すグラフを示す。
【図５】図５ａ〜５ｄは、ＴＧＦβＲＩＩに対するｓｈＲＮＡを安定して発現する脂腺細胞におけるＴＧＦβシグナル伝達阻害作用を表す写真を示す。
【図６】ヒト皮脂腺及び毛包の概略図を示す。
【図７】図７ａ〜７ｇは、ヒトの頭皮、乳房、胸部及び顔面の組織における皮脂腺分化のマーカーの発現を表す写真を示す。
【図８】図８ａ〜８ｃは、リノール酸処理前及び処理後の初代脂腺細胞及び脂質含量を表す写真を示す。
【図９】図９ａ及び９ｂは、乳房又は顔面の皮膚に由来する脂腺細胞における脂肪酸デサチュラーゼ２（ＦＡＤＳ２）及びＰＰＡＲγの発現を表すグラフを示す。
【図１０】図１０ａ及び１０ｂは初代ＳＳＧ３細胞におけるＴＧＦβシグナル伝達の阻害を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本開示は、形質転換することなく、フィーダー細胞層を含まない培養システムを用いてヒト初代脂腺細胞を培養する方法を提供する。ヒト初代脂腺細胞を培養して継代に成功する新規方法によって、上皮細胞培養分野における大きな問題を克服できる。
【００１４】
本開示の方法の実施においては、ドナーの皮膚サンプルから皮脂腺を切り出し、皮脂腺上に脂腺細胞が形成されるまで充分な時間培養する。
【００１５】
皮脂腺は、あらゆる好適な方法によって皮膚サンプルから切り出すことができる。例えば、皮膚サンプルを小片に切断し、ディスパーゼで処理して、真皮から表皮を分離してもよい。ディスパーゼ処理後、解剖顕微鏡下で顕微手術用器具を用いて無傷の皮脂腺を単離する。皮脂腺周辺の微小環境を保存するために、皮脂腺と共に毛幹及び少量の組織を保持することが好ましい。
【００１６】
本開示の方法で使用される皮膚サンプルは、皮膚が皮脂腺を含む人体上のあらゆる場所から得ることができる。頭皮、乳房、胸部及び顔面の皮膚に由来する初代脂腺細胞培養物が樹立された。脂腺細胞は、ヒト小児ドナー（年齢が新生児から約１５歳未満までのドナー）由来であることが好ましい。
【００１７】
次いで、図１ｄに示されるように、皮脂腺を含む外植片をガラス製カバースリップなどのガラス片の間に挟む。ガラスは細胞外マトリックスタンパク質で被覆されていることが好ましい。好ましい細胞外マトリックスタンパク質はフィブロネクチンであり、好ましくはヒトフィブロネクチンである。
【００１８】
フィブロネクチンで被覆されたガラス製カバースリップ（本明細書ではフィブロネクチン被覆ガラス及び類似の用語で呼ぶ場合もある）は、従来の方法を用いて作製される。被膜する際のヒトフィブロネクチンの量は様々であるが、好ましくは約１０μｇ／ｍｌである。カバースリップ上にフィブロネクチンを添加し、カバースリップを室温で１時間又は４℃で一晩放置することによって、カバースリップをフィブロネクチンで被覆することができる。次いで、カバースリップを１×ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、４℃で１週間を超えない期間保存する。
【００１９】
その後、皮脂腺から脂腺細胞が成長するまで、ガラス製カバースリップの間に挟んだ皮脂腺外植片を脂腺細胞培地中で培養する。外植片を約１〜２週間培養した後、脂腺細胞が皮脂腺小葉の周縁部から顕在化する。その細胞を二酸化炭素５％の３７℃インキュベーターで培養する。
【００２０】
脂腺細胞培地は、脂腺細胞の培養に適した細胞培地であり、当該分野で公知の脂腺細胞培地などが挙げられる。
【００２１】
好ましい脂腺細胞培地は、［１２］で説明されるように、上皮成長因子（３ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、Ａｕｓｔｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、コレラ毒素（１．２×１０−１０Ｍ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）、アデニン（２４μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）、インスリン（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）、ヒドロコルチゾン（４５．２ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（２．５％Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、Ｕｔａｈ）、抗生物質／有糸分裂阻害薬（ペニシリン／ストレプトマイシン）（１００×、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）が添加された基本培地ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２（３：１）を含む。
【００２２】
抗生物質のペニシリン及びストレプトマイシンの組み合わせを使用して、それらのグラム陽性細菌及びグラム陰性細菌それぞれに対する有効な作用によって細胞培養の細菌汚染を防ぐ。アンホテリシンＢを使用して、多細胞真菌及び酵母を阻害することによって細胞培養の真菌汚染を防ぐ。
【００２３】
皮脂腺外植片上に脂腺細胞が形成された後、外植片から脂腺細胞を取り出し、ガラス製カバースリップなどのガラスをフィブロネクチンで被覆したものの上で単離された細胞を培養する。細胞を増殖させるために、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して、細胞を剥離した。１２ｍｍプレートに対して１０μｇ／ｍｌのフィブロネクチンで被覆した新しいプレートで脂腺細胞を培養した。細胞は約１０回まで継代することができ、その後、細胞は老化することになる。本明細書に開示された方法においては、継代数の少ないＰ２〜Ｐ６細胞が使用されるのが好ましい。脂腺細胞を増殖させる際には、脂腺細胞を必ずしも２枚のカバースリップの間に置かなくてもよい。細胞が８０〜９０％コンフルエントに達すると、細胞を増殖させることができる。細胞の培養には２０〜３０％の密度が好ましい。脂腺細胞は、わずかに継代した後、フィブロネクチン被覆カバースリップを使用しなくともプラスチック上で増殖可能であるが、フィブロネクチン被覆カバースリップ上で細胞を培養することが好ましい。
【００２４】
したがって、本開示は、脂腺細胞の培養に適した細胞培地中でガラス片の間に挟んだ皮脂腺を該皮脂腺上に脂腺細胞が形成されるのに充分な時間培養することを含む、初代脂腺細胞を培養する方法を提供する。本方法は、上記皮脂腺から上記脂腺細胞を取り出すこと、及び、脂腺細胞の培養に適した培地中で細胞外マトリックスタンパク質で被覆されたガラス上に上記脂腺細胞を培養することをさらに含んでいてもよい。
【００２５】
本方法はまた、皮膚のサンプルを得る工程、及び、該皮膚サンプルから皮脂腺を取り出す工程を含んでもよく、これらの工程は皮脂腺を事前培養する前に行われる。
【００２６】
本開示はまた、基本培地、上皮成長因子、コレラ毒素、アデニン、インスリン、ヒドロコルチゾン、ウシ胎児血清、及び、抗生物質／有糸分裂阻害薬を含有する培地中でフィブロネクチンで被覆されたガラス上に初代脂腺細胞を培養することを含む、初代脂腺細胞を培養する方法も提供する。
【００２７】
本開示の他の態様は、本開示の方法により得られる脂腺細胞の単離された集団を提供する。本明細書において、脂腺細胞の単離された集団とは、皮脂腺中のそれらの天然に存在する場所から取り出された脂腺細胞を指す。脂腺細胞の集団は培養され、好ましくは未分化及び／又は分化脂腺細胞のみを含む。
【００２８】
実施例で開示され以下で論じられるマーカーや、当該技術分野で公知の他のマーカーを使用して脂腺細胞の性質を評価することができる。頭皮由来の初代培養物の１つ（ＳＳＧ３と呼ばれる）はその性質が広く評価されている。この細胞は、皮脂腺分化のマーカー、例えばＰＰＡＲγ［２６］及び［２３］、Ｂｌｉｍｐ１［２６］、ｃ−Ｍｙｃ、ケラチン７並びに上皮膜抗原ＥＭＡ／Ｍｕｃ１などを発現する。培養脂腺細胞は、リノール酸処理後にインビトロで分化できる。未処理の細胞において細胞質脂肪滴が検出されたが、リノール酸処理後により高い電子密度で脂肪滴が増加することが電子顕微鏡検査で容易に検出された。リノール酸代謝及び皮脂産生に関与する特有のΔ６デサチュラーゼ［２９］である脂肪酸デサチュラーゼ２（ＦＡＤＳ２）は、ヒトケラチノサイトＮＩＫＳと比較して、形質転換脂腺細胞であるＳＥＢ−１及びＳＳＧ３細胞においてｍＲＮＡレベルで高度に発現される。ＦＡＤＳ２は、主として脂質合成能を獲得した分化脂腺細胞において検出可能であり、脂腺細胞における活性及び分化の機能的なマーカーを提供する［４９］。リノール酸処理により培養脂腺細胞の分化が誘導されると、有意な変化を全く示さないヒトケラチノサイト及びＳＥＢ−１とは対照的に、ＰＰＡＲγ及びＦＡＤＳ２の発現が増加する。さらにこれらの結果は、初代ＳＳＧ３細胞における中性脂質及び極性脂質の分析によって確認された。予想通り、細胞膜の主成分であるリン脂質の組成は、ＮＩＫＳとＳＳＧ３細胞とで類似している。しかしながら、脂肪酸の組成には差がある。異なる２つのデサチュラーゼであるΔ６／ＦＡＤＳ２及びΔ９によりそれぞれ合成される２つの特異的な酸のサピエン酸及びパルミトレイン酸［３１］の組成を分析した。サピエン酸は、インビボで皮脂に優勢に見出されるが、ＮＩＫＳ（０．７９％）と比較して専らＳＳＧ３細胞（２．１５％）で検出される。それに対して、ＮＩＫＳで見られる主要な脂肪酸は、ＳＳＧ３細胞（１．２％）と比較した場合、パルミトレイン酸（６．９５％）である。また、脂腺細胞成熟の指標［３２］であるΔ６／Δ９デサチュラーゼの比率（サピエン酸％／パルミトレイン酸％）は、ＳＳＧ３細胞において、ＮＩＫＳケラチノサイトと比べて大幅に高く（それぞれ１７８．９及び１１．４２）、これは頭皮由来の脂腺細胞の機能性を反映している。本開示の方法によって得られる脂腺細胞の集団は、皮脂産生及び脂質合成に関与する遺伝子を発現するだけでなく、皮脂に特徴的な脂質も産生できる。
【００２９】
本明細書で示す通り、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）のシグナル伝達は、脂腺細胞を未分化状態で維持するのに重要な役割を果たす。ＴＧＦβのシグナル伝達経路を活性化することによって、特徴的な皮脂腺脂質（ＰＰＡＲγ及びＦＡＤＳ２）の産生に関与する遺伝子の発現が下方制御されるが、ヒト脂腺細胞の増殖には影響が及ぼされない。また、ナイルレッド及びオイルレッドＯ染色により検出される細胞において、ＴＧＦβ受容体ＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩ）のノックダウンによりＴＧＦβシグナル伝達を抑制すると、脂質産生が増加する。ＴＧＦβシグナル伝達ブロック後のこの脂質産生の増加は、電子顕微鏡検査で確認された。これらの観察結果から、ヒト皮脂腺生物学においてこのようなこれまでに同定されていない経路の関連性が強調される。
【００３０】
初代ＳＧ細胞は、すでに不死化された脂腺細胞とは対照的にケラチン８を発現しない。ケラチン８はインビボにおいて正常な皮脂腺では通常は発現されないが［２５］、この結果は、不死化細胞株での形質転換プロセスによって、いくつかの基本的な細胞マーカーの発現が恐らく変化したことを示している。また、初代脂腺細胞及び不死化細胞は、リノール酸及びＴＧＦβ１処理に対して異なる応答性を示したことから、これらの細胞の細胞特性は実質的に異なっていることが示唆される。
【００３１】
いかなる特定の理論又は作用機序にも縛られるつもりはないが、現在のところ、ＴＧＦβシグナル伝達は、ＦＡＤＳ２及びＰＰＡＲγの発現を減少させることで脂腺細胞を未分化状態で維持し、その結果、ＴＧＦβＲＩＩ−Ｓｍａｄ２依存性経路を介した脂質の蓄積が減少すると考えられる（図５）。真皮と上皮細胞との分子クロストークは、毛包の惹起及び維持に重要である［３７］。脂腺細胞と周囲の皮膚組織の間に同様な伝達メカニズムが存在する可能性はかなり高いように思われる。マウスにおいては、毛包の内毛根鞘がＴＧＦβ１を放出したため、脂腺細胞と毛包上皮との双方向性相互作用が想定された［１７］。真皮では、ヒト線維芽細胞がＴＧＦβを分泌し［３８、３９］、続いてＴＧＦβがケラチノサイト及び脂腺細胞に作用し得る（図６）。同様にこのクロストークの一部になり得る微小環境の他の構成要素は、近年マウスにおいてバルジ幹細胞により制御されることが示された立毛筋細胞である［４０］。立毛筋は、皮脂腺に極めて近接して存在しているため、皮膚表面への皮脂の放出を促進した［４１］。
【００３２】
細菌の定着や炎症に関連した皮脂産生の調節不全による皮膚バリアの低下は、ヒトにおいて重篤な皮膚疾患の原因となり得る。例えば、高脂漏症（ｈｙｐｅｒｓｅｂｏｒｒｈｅａ）にプロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）の存在及び炎症が組み合わさると尋常性座瘡に至る可能性があり［２］、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）はアトピー性皮膚炎を悪化させる可能性がある［４］。脂腺細胞は、プロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）又はリポ多糖類に曝露されるとデフェンシン−１及び−２などの抗菌性ペプチドを産生して［４２、４３］、細菌の定着［４４］及び皮脂産生の上方制御［４５］を防止できる。研究の結果、ＴＧＦβは内皮細胞でヒトβ−デフェンシン−２の発現を誘導し［４６］、炎症反応に影響を与える［４７］ことが明らかになった。本明細書に記載の脂腺細胞の新規培養方法を用いれば、微小環境との様々な相互作用の調査が可能となる。
【００３３】
本開示の別の態様は、脂質生成を調節する化合物を同定する方法、又は、脂質生成に対する試験化合物の効果を決定する方法を提供する。本方法は、ａ）本明細書に開示された方法により得られる培養脂腺細胞の集団に試験化合物を添加すること、及び、ｂ）上記脂腺細胞における脂質産生に対する上記試験化合物の効果を測定することを含む。初代脂腺細胞を使用して、脂質生成の阻害剤又は活性化剤であることが知られている試験化合物の効果を測定し、脂質生成を阻害又は活性化する試験化合物を同定したり、脂質生成の阻害剤又は活性化剤の効果を変化させたりすることができる。試験化合物はどのような種類の化学物質であってもよい。公知の脂質生成の阻害剤又は活性化剤の例としては、５α−ＤＨＴ（ジヒドロテストステロン）、５−ＤＨＥＡ（５−デヒドロエピアンドロステロン）、酢酸シプロテロン、エストラジオール、デキサメタゾン、イソトレチノイン及びロシグリタゾンが挙げられる。好適な試験化合物としては、アンドロゲン、抗アンドロゲン薬、エストロゲン、コルチコイド、レチノイド、ＰＰＡＲアゴニスト、５α−レダクターゼ阻害剤及びＴＧＦβ１リガンドが挙げられる。
【００３４】
脂質産生に対する効果は、例えば、実施例３で説明される方法や、脂質産生を検出するための当該技術分野で公知の他のあらゆる方法に従って測定できる。
【００３５】
本開示の方法に従って得られる脂腺細胞の集団に試験化合物を添加し、脂質生成に対する該化合物の効果を決定する。脂質産生を決定するのに好適なマーカーとしては、実施例３で説明されるように、細胞をリノール酸で処理した後のＦＡＤＳ２及びＰＰＡＲγの発現の分析、中性脂質（代表的な皮脂脂質）の蓄積の定量化、並びに、極性脂質（代表的なリン脂質）の有無が挙げられる。図５Ｄに示すようなＦＡＣＳ分析は、中性脂質の定量に使用できる。
【００３６】
本開示の方法を用いて同定された化合物は、皮膚疾患を治療するために、脂質生成に影響を与える当該技術分野で公知の化合物と同様に使用できる。
【００３７】
また本開示は、脂腺細胞の増殖、脂腺細胞の分化、脂腺細胞の細胞周期又は脂腺細胞の生存を調節する化合物を同定する方法も提供する。本方法は、ａ）本明細書に開示された方法により得られる培養脂腺細胞の集団に試験化合物を添加すること、及び、ｂ）上記脂腺細胞の増殖、上記脂腺細胞の分化、上記脂腺細胞の細胞周期又は上記脂腺細胞の生存に対する上記試験化合物の効果を測定することを含む。初代脂腺細胞を使用して、脂腺細胞の増殖、分化、細胞周期又は生存を調節することが知られている試験化合物の効果を測定し、脂腺細胞の増殖、脂腺細胞の分化、脂腺細胞の細胞周期又は脂腺細胞の生存を調節する試験化合物を同定することができる。試験化合物はどのような種類の化学物質であってもよい。増殖させた後に、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）及びＫｉ６７による標識化、免疫蛍光分析並びにフローサイトメトリー分析を行ってもよい。細胞周期分析は、７ＡＡＤ及びＢｒｄｕを使用して行ってもよく、フローサイトメトリーにより分析してもよい。生存させた後に、細胞の計数を行ってもよい。
【００３８】
以下の実施例は本開示をさらに理解しやすくするために示すものであるが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【実施例】
【００３９】
実施例１  脂腺細胞の培養方法
年齢が９カ月から１２歳までの男性ドナー及び女性ドナーの両方のヒト頭皮（ＳＳＧ３）、顔面及び乳房から皮脂腺集団を作製した。皮膚サンプルは、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒでの治験審査委員会（ＩＲＢ）の承認のもとでドナーの年齢及び性別に関して提供された情報と共に手術廃棄物として回収されたものである。
【００４０】
皮膚サンプルを小片に切断した後、該サンプルを１×ディスパーゼ（１×ＰＢＳ中２ｍｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１７１０５−０４；Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）により４℃で一晩処理した後、解剖した。ディスパーゼは、真皮から表皮を分離して表皮細胞汚染を回避するために使用される。
【００４１】
皮膚を１×ディスパーゼで処理した後（図１）、解剖顕微鏡下で顕微手術用器具を用いて無傷の皮脂腺を単離した。皮脂腺周辺の微小環境を保存するために、皮脂腺と共に毛幹及び少量の組織を保持した。
【００４２】
皮脂腺の微小環境を模倣するために、ヒトフィブロネクチン（１０μｇ／ｍｌ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で被覆されたガラス製カバースリップの間に外植片を挟んだ。
【００４３】
カバースリップを被覆するために、カバースリップ上にフィブロネクチンを１０μｇ／ｍｌで室温で１時間又は４℃で一晩添加した。その後、カバースリップを１×ＰＢＳで３回洗浄し、４℃で１週間を超えない期間保存する。
【００４４】
［１２］で説明されているような脂腺細胞培地（ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２（３：１）、上皮成長因子（３ｎｇ／ｍｌＥＧＦ、Ａｕｓｔｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、コレラ毒素（１．２×１０−１０Ｍ、Ｓｉｇｍａ）、アデニン（２４μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）、インスリン（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）、ヒドロコルチゾン（４５．２ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）、ＦＢＳ（２．５％Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、Ｕｔａｈ）、抗生物質／有糸分裂阻害薬（１００×、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）中で外植片を培養した。
【００４５】
１〜２週間培養して増殖させた後、腺小葉の周縁部から細胞の成長が顕在化した（図３）。外植片を取り出し、単離した細胞をフィブロネクチン被覆カバースリップ上で培養した。外植片の周縁部から成長した細胞を単離し、フィブロネクチン被覆カバースリップ上で培養した。細胞を増殖させるために、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して細胞を剥離した。次いで１２ｍｍプレートに対して１０μｇ／ｍｌのフィブロネクチンで被覆した新しいプレートで細胞を培養した。
【００４６】
実施例２−培養脂腺細胞の性質評価
方法
ウェスタンブロット法
１０〜１２％アクリルアミドゲルでの電気泳動によってタンパク質を分離し、ニトロセルロース膜に移し、免疫ブロットを行った。０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ中の５％無脂肪乳又は５％ＢＳＡで膜を１時間ブロックした。一次抗体は概して１／１，０００の濃度で使用し、ＨＲＰ結合二次抗体は５％無脂肪乳中１／２，０００の濃度で使用した。標準的なＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）並びにＬｕｍｉｎａｔａ（商標）ｃｒｅｓｃｅｎｄ及びｃｌａｓｓｉｃｏ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して免疫ブロットを展開した。ＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙ  ＣＬｘ（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、Ｎｅｂｒａｓｋａ）を使用して免疫ブロットの２色検出を行った。Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキングバッファ（ＬＩ−ＣＯＲ）中で膜をブロックし、ＩＲＤｙｅ６８０ＬＴ及び８００ＣＷとコンジュゲートした二次抗体を使用した（１／１０，０００；ＬＩ−ＣＯＲ）。Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線イメージングシステム（ＬＩ−ＣＯＲ）を使用してタンパク質濃度を定量した。
【００４７】
レトロウイルス感染
ＳＳＧ３細胞のＴＧＦβＲＩＩを除去するために、ＣＣＨＭＣ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのレンチ−ｓｈＲＮＡライブラリーコアから入手したｓｈＲＮＡベクター（ｓｈＲＮＡ  ＴＧＦβＲＩＩ番号１９７０３１及び１９４９９２並びにｓｈＲＮＡ対照）を使用した。ヒトライブラリーはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ＭＩＳＳＩＯＮ  ｓｈＲＮＡ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から購入した。Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）においてウイルスベクターコアによってウイルスベクターを作製した。細胞を６ウェルプレート中で８０％コンフルエントになるまで増殖させた後、レンチウイルスを４８時間感染させた。１ｐｇ／ｍｌピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ）を４８時間使用して感染細胞を選択した。選択後、ＴＧＦβＲＩＩノックダウン細胞を通常の培地中で４８時間増殖させ、その後５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１で２４時間活性化させた。
【００４８】
組織診断及び免疫蛍光分析
凍結切片作製のため、ＯＣＴ化合物（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ、Ｓａｋｕｒａ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）中で固定せずにヒト組織を凍結した。以前に報告された方法と同様に免疫染色を行った［４８］。
【００４９】
抗体
以下のタンパク質：ＰＰＡＲｙ（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ、免疫蛍光分析ではＨ−１００  １／２５０、ウェスタンブロットでは１／５００）、Ｂｌｉｍｐ１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｄａｎｖｅｒｓ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、免疫蛍光分析では１／５００、ウェスタンブロットでは１／１，０００）、フィブロネクチン（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ＥＰ５  １／１５０）、Ｍｕｃ１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１／５００）、ｃＭｙｃ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、免疫蛍光分析では１／８００、ウェスタンブロットでは１／１，０００）、ＴＧＦβＲＩＩ（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ｓｃ−２２０  １／１，０００）、ｐ−Ｓｍａｄ２（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、免疫蛍光分析では１／１００、ウェスタンブロットでは１／１，０００）、Ｓｍａｄ２／３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、１／５００）、ａ６インテグリン（ＣＤ４９ｆ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、１／１００）、ブロモデオキシウリジンＢｒｄＵ（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、１／５００）、ケラチン８（この抗体は、Ｄｒ．Ｂｒｕｌｅｔ及びＤｒ．Ｋｅｍｌｅｒにより開発されたものであり、アイオワ大学で維持されているＮＩＣＨＤ発生研究ハイブリドーマバンクから入手した；１／１，０００）、８−アクチン（Ｓｉｇｍａ、１／２，０００）、ケラチン７（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１／１，０００）に対する一次抗体を記載した希釈率で使用し、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を細胞核のマーカーとして利用した（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、１／５，０００）。二次抗体Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８又は５５５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を１／１，０００の希釈率で使用した。蛍光顕微鏡Ａｘｉｏｌｍａｇｅｒ  Ｍ１（Ｚｅｉｓｓ）を用いて蛍光画像を取得し、ａｘｉｏＣａｍ  ＭＲｍカメラ（Ｚｅｉｓｓ、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を用いて写真を撮影した。
【００５０】
リアルタイムＰＣＲ
Ｒｎｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）を使用して全ＲＮＡを単離し、これを使用してｃＤＮＡを作製した（Ｍａｘｉｍａ第一鎖ｃＤＮＡ合成キット、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）。逆転写（ＲＴ）反応物を１０ｎｇ／ｐｌに希釈し、１ｐｌの各ＲＴをリアルタイムＰＣＲに使用した。ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲシステム、ＣＦＸマネージャーソフトウェア及びＳｓｏＦａｓｔ  ＥｖａＧｒｅｅｎスーパーミックス試薬（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用してリアルタイムＰＣＲを行った。全ての反応は三連で行い、ＧＡＰＤＨを標準とした相対的発現量を用いるＡＡＣＴ法によって分析した。
【００５１】
使用したプライマー：
ＧＡＰＤＨ−Ｆ：ＡＣＡＴＣＧＣＴＣＡＧＡＣＡＣＣＡＴＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、
ＧＡＰＤＨ−Ｒ：ＴＧＴＡＧＴＴＧＡＧＧＴＣＡＡＴＧＡＡＧＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、
ＰＰＡＲγ−Ｆ：ＧＡＧＣＣＣＡＡＧＴＴＴＧＡＧＴＴＴＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、
ＰＰＡＲγ−Ｒ：ＧＣＡＧＧＴＴＧＴＣＴＴＧＡＡＴＧＴＣＴＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、
ＦＡＤＳ２−Ｆ：ＴＧＴＣＴＡＣＡＧＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＴＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、
ＦＡＤＳ２−Ｒ：ＴＧＴＧＧＡＡＧＡＴＧＴＴＡＧＧＣＴＴＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、
ＴＧＦβＲＩＩ−Ｆ：ＣＴＧＴＧＧＡＴＧＡＣＣＴＧＧＣＴＡＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）及び
ＴＧＦβＲＩＩ−Ｒ：ＣＡＴＴＴＣＣＣＡＧＡＧＣＡＣＣＡＧＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）。
【００５２】
脂質生成アッセイ
ナイルレッド染色のため、細胞又はＯＣＴ切片を４％ホルムアルデヒド中で室温で１０分間固定した。１×ＰＢＳで３回洗浄後、０．１ｐｇ／ｍｌのナイルレッド（Ｓｉｇｍａ）での染色を０．１５Ｍ  ＮａＣｌ中で室温で１５分間行った。オイルレッドＯ染色のため、細胞を１０％ホルマリン中で１５分間固定し、水で１０分間及び６０％イソプロパノールで洗浄し、その後、オイルレッドＯ（６０％イソプロパノール中０．７％）で４５分間染色した。細胞を６０％イソプロパノールで洗滌し、細胞核をヘマトキシリンで染色した。インビトロで脂腺細胞の分化を誘発するために、脂腺細胞培地に直接リノール酸（Ｓｉｇｍａ、０．１ｍＭ）を添加した。細胞を脂質を抽出できるように調製するために、２，０００〜３，０００万個の細胞をペレット化し、１×ＰＢＳで洗浄してから、脂質を分析を行うまでアルゴン下、−８０℃の暗所で保存した。ＳＰＥカートリッジ（固相抽出）を取り付けたＡｇｉｌｅｎｔ５９７３Ｎガスクロマトグラフ／マススペクトロメーターを用いて頭皮由来のヒト脂腺細胞における脂質の定性的及び定量的な組成を決定した。この決定はＳｙｎｅｌｖｉａ  Ｓ．Ａ．Ｓ（Ｌａｂｅｇｅ、Ｆｒａｎｃｅ）によって行われた。
【００５３】
ＦＡＣＳによるナイルレッド分析
以前に報告された方法と同様に、細胞を６ウェルプレート中で８０％コンフルエントで培養し、ｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスを感染させた。４８時間ピューロマイシンによる選択を行った後、１×ＰＢＳ中で細胞を洗浄し、リノール酸（０．１ｍＭ）含有又は非含有の作用培地で２４時間処理した。細胞をトリプシン処理し、１×ＰＢＳで１回洗浄し、中性脂質を蛍光色素のナイルレッド（ＰＢＳ中１ｐｇ／ｍｌ）で標識した。青色レーザー（４８８ｎｍで励起）を備えたＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  Ｉ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してサンプル１つあたり１０，０００個の細胞を分析した。
【００５４】
電子顕微鏡検査
脂腺細胞培地中で細胞を８０％コンフルエントで増殖させ、０．１７５Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液で１回洗滌した。３％グルタルアルデヒド／０．１７５Ｍカコジル酸塩緩衝液中で細胞を４℃で１時間固定した。培養皿を０．１７５Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液で２回洗浄した。細胞を１％四酸化オスミウム／カコジル酸塩緩衝液中で１時間４℃で後固定した後、０．１７５Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液で３回洗浄した。１．５ｍｌでの最後の洗浄の後、細胞を掻き取り、１０Ｋで５分間遠心分離した。次いで、細胞ペレットを１ｍｌの１％アガロース（タイプＩＸ超低温ゲル化温度、Ｓｉｇｍａ）に４℃で一晩再懸濁した。その後、サンプルを段階的濃度のアルコールで処理し、ＬＸ−１１２樹脂（Ｌａｄｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｉｌｌｉｓｔｏｎ、Ｖｅｒｍｏｎｔ）を浸透させ包埋した。６０℃で３日間重合させた後、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ−ＪｕｎｇウルトラカットＥミクロトームを使用して超薄切片（１００ｎｍ）を切り出し、２％酢酸ウラニル水溶液及びレイノルズクエン酸鉛溶液で対比染色した。デジタルカメラ（ＡＭＴ  ２ｋｘ２Ｋ  ｔｅｍ  ＣＣＤ）を備えた透過型電子顕微鏡（日立Ｈ−６７５０）によって画像を撮影した。
【００５５】
統計
データは平均±ＳＤとして表す。対応のない両側スチューデントｔ検定を用いて２種の細胞型の比較を行った。同じ細胞型に対する処理の効果を比較する際には対応のある両側スチューデントｔ検定を用いた。Ｐ＜０．０５を有意とみなした。
【００５６】
結果
Ａ．１：小児ドナーから樹立された初代脂腺細胞は皮脂腺分化のマーカーを発現する
初代ヒト脂腺細胞の増殖及び分化を調節する経路を決定するために、脂腺細胞を単離し、インビトロで皮脂腺の微小環境を模倣することにより増殖させた。年齢が９か月から１２歳までのドナー由来の皮膚外植片を顕微解剖し、皮脂腺をフィブロネクチン被覆ガラス製カバースリップの間に置いてインビボの環境を再現した。この方法を用いて、８人のドナーから４種の皮膚組織型：頭皮５点、乳房１点、胸部１点及び顔面１点のサンプルとして初代脂腺細胞培養物を得た。全ての実験は、細胞外マトリックスや、支持体として放射線照射した線維芽細胞を使用せずに、継代２世代目及びそれ以降の世代（３〜５世代目）について行った。
【００５７】
細胞培養物が実際に脂腺細胞であることを検証するために、公知の脂腺細胞マーカーの発現を試験した。免疫蛍光染色及びウェスタンブロットの結果、これらの細胞は、インビトロ及びインビボにおいて分化脂腺細胞で発現されるが［２３］、ヒトケラチノサイト（ＮＩＫＳ）では発現されない［２４］脂肪生成転写因子であるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）を一様に発現することが実証された。ＳＳＧ３細胞は、この脂腺細胞マーカーを発現する。リアルタイムＰＣＲの結果、初代ＳＳＧ３は、不死化脂腺細胞株ＳＥＢ−１［１２］と同様のレベルのＰＰＡＲγを発現したことが確認された。しかしながら、ＳＥＢ−１とは対照的に、ＳＳＧ３細胞は、典型的にはインビボにおいて皮脂腺では発現されないケラチン８［２５］を発現しない。さらに、ＳＳＧ３細胞は、Ｂｌｉｍｐ１や上皮膜抗原ＥＭＡ／Ｍｕｃ１などの他の脂腺細胞マーカーを発現する。近年の報告［１３、２６］と一致して、ＳＳＧ３細胞が由来するヒト頭皮切片において、Ｂｌｉｍｐ１は皮脂腺の最終分化細胞及び毛包の内毛根鞘で発現される。頭皮由来の脂腺細胞で示された結果は全て、乳房及び顔面由来の脂腺細胞においても同様であることが確認された。唯一の例外は未分化脂腺細胞のマーカーであるケラチン７の発現であり、頭皮及び乳房と比較して顔面由来の脂腺細胞のタンパク質溶解物においてより多くの発現量で検出された。ケラチン７発現の差は、細胞が由来する場所に依存する可能性がある。実施例１で樹立された初代ヒト脂腺細胞は、典型的な脂腺細胞マーカーを発現し、脂腺細胞機能を研究するための良好なモデルとなる。
【００５８】
Ａ．２：初代脂腺細胞はインビトロで分化できる
初代ヒト脂腺細胞がインビトロで機能性を有することを確認するために、該細胞が分化してヒト特異的な脂質を産生する能力を分析した。親油性色素のナイルレッドを使用して最終分化脂腺細胞を染色できる［２７］（図８ａ）。リノール酸は、数種類のプロスタグランジン及び他のポリ不飽和脂肪酸の生合成に使用される必須のポリ不飽和脂肪酸であり、インビトロで脂腺細胞の分化を誘発する［２８］。故に、生理学的なレベルでリノール酸処理してから２日後にナイルレッド染色によって細胞の脂質分布を分析したところ、ＳＳＧ３は実際に脂質を産生していたことが示された（図８ｂ）。また、未処理の細胞において電子顕微鏡検査により細胞質脂肪滴が検出され（図８ｃ）、さらにリノール酸処理後により高い電子密度で脂肪滴が増加することも検出された（図８ｃ”）。ヒトは、リノール酸代謝及び皮脂産生に関与する特有のΔ６デサチュラーゼ／ＦＡＤＳ２遺伝子［２９］を有する。ＦＡＤＳ２は、主として脂質合成能を獲得した分化脂腺細胞で検出可能であり、脂腺細胞における活性及び分化の機能的なマーカーを提供する。本開示によれば、ＦＡＤＳ２は、ＳＥＢ−１と比較してＳＳＧ３細胞で高度に発現されることが見出された（図２ｃ）。これらの結果から、ＳＳＧ３細胞が、脂腺細胞分化に関与する細胞の遺伝子発現パターンの特徴を示すことが実証された。また、ＳＳＧ３細胞においてリノール酸処理により分化が誘導されると、有意な変化を全く示さないＳＥＢ−１とは対照的に、ＳＳＧ３ではＰＰＡＲγが増加し（図２ｄ）、ＦＡＤＳ２も増加する（図２ｅ）ことが示された。
【００５９】
さらにこれらのデータは、初代ＳＳＧ３細胞における脂質の分析によって確認された。脂肪酸、特に、インビボで皮脂に優勢に見出されるサピエン酸［２９］及びパルミトレイン酸の組成に差があることが見出された。これらはそれぞれ２種のデサチュラーゼＡ６／ＦＡＤＳ２及びＡ９によって合成される［３１］（図２ｆ）。Ａ９の代わりにＡ６の位置で不飽和化が起こるのは、ヒト皮脂に特異的である［３１］。サピエン酸は、ＮＩＫＳ（０．７９５％）と比較して専らＳＳＧ３細胞（２．１５０％）で検出される。それに対して、パルミトレイン酸は、ＳＳＧ３細胞（１．２０２％）と比較してＮＩＫＳ（６．９５９％）で優勢に見出される（図２ｇ及び２ｈ）。次に、ＳＳＧ３細胞の機能性を決定するために、脂腺細胞成熟及び関連する代謝プロセスの指標である１６／１９デサチュラーゼの比率［３２］を定量した。ＳＳＧ３細胞におけるこの比率は、ＮＩＫＳより大幅に高いことが見出され（それぞれ１７８．８６８及び１１．４２４）、これは頭皮由来の脂腺細胞の機能性を反映している（図２ｇ）。また脂質分析からも、インビボでの皮脂と同様にＳＳＧ３には偶数炭素鎖の脂肪酸だけが存在することが明らかになった（図２ｈ）。本開示に従って樹立された初代ヒト脂腺細胞培養物は、皮脂産生及び脂質合成に関与する遺伝子を発現するだけでなく、皮脂特異的な脂質も産生できると結論付けることができる。次に、初代ヒト脂腺細胞において分化及び脂質産生を調節するメカニズムを調べた。
【００６０】
Ｂ．１：ＴＧＦβシグナル伝達はインビボ及びインビトロの皮脂腺において活性である
ある研究によれば、ヒト脂腺細胞を調節できる可能性のある候補としてＴＧＦβが示唆されている［１６］。ＴＧＦβリガンドは、ＴＧＦβＲ１とＴＧＦβＲＩＩで構成される二量体型受容体複合体に結合することにより、受容体結合Ｓｍａｄ（Ｓｍａｄ２／３）転写因子をリン酸化し活性化して細胞核中に移動できるようにし、ＴＧＦβ応答遺伝子を調節する［３３］。ＴＧＦβＲＩＩは、Ｓｍａｄ２経路の活性化に必須である［２０、３４］。故に、ＴＧＦβ活性化に関する読み出しとしてリン酸化Ｓｍａｄ２／３の有無によってインビボ及びインビトロでのＴＧＦβＲＩＩの有無及び上記経路の機能性を分析した。免疫蛍光分析の結果、皮脂腺の中心部に存在する脂質が充満した分化脂腺細胞を除いて、ＴＧＦβＲＩＩは皮脂腺全体で発現されることが示された（図３ａ及び３ａ’）。さらに、細胞核でのリン酸化Ｓｍａｄ２の発現が腺の周縁部及び中心部で検出されるが、最終分化脂腺細胞では検出されないことから、ＴＧＦβ経路はインビボにおいて腺中で活性であると判定された（図３ｂ及び３ｂ’）。インビトロでは、ＳＳＧ３脂腺細胞は、外因的に組換えＴＧＦβ１で刺激した場合、ＳＥＢ−１及びＮＩＫＳと同様にＳｍａｄ２を活性化する（図３ｃ）。
【００６１】
Ｂ．２：脂腺細胞の分化遺伝子に対するＴＧＦβシグナル伝達の効果
次に、ＴＧＦβ１で処理した際の脂質生成に関与する遺伝子の発現を試験することによって、脂腺細胞分化に対するＴＧＦβシグナル伝達の効果を探索した。図３ａ及びｂに示すように、細胞をＴＧＦβ１で２４時間刺激すると、ＦＡＤＳ２及びＰＰＡＲγのｍＲＮＡ発現はＳＥＢ−１と比較してＳＳＧ３細胞において有意に減少することから、ＴＧＦβ１は細胞分化を防止する可能性があることが示唆され、乳房及び顔面由来の初代脂腺細胞の場合も同様である（図９）。この効果が、ＴＧＦβＲＩＩ−Ｓｍａｄ２に依存するものかどうかを試験するために、ｓｈＲＮＡを使用してＴＧＦβ受容体ＩＩをノックダウンしたところ、Ｓｍａｄ２のリン酸化が効果的に阻害された［２０］。
【００６２】
２つの独立したＴＧＦβＲＩＩ  ｓｈＲＮＡを使用して同様の結果を得た。すなわち、ＴＧＦβＲＩＩ発現はＳＳＧ３細胞で低下し（図４ｃ）、リン酸化Ｓｍａｄ２も、予想した通り、ＴＧＦβ活性化後にｓｈＲＮＡ発現細胞において対照と比べて減少した（図４ｄ）。ＴＧＦβで２４時間処理した対照細胞においてもＴＧＦβＲＩＩの減少が検出されたが（図４ｃ）、これは受容体が分解した可能性を反映している［３５］。ＴＧＦβＲＩＩ発現が低下すると、細胞をＴＧＦβで処理した際にＦＡＤＳ２及びＰＰＡＲγの遺伝子発現を有意に減少させるＳＳＧ３細胞の能力が阻害されることが示された（図４ｅ及びｆ）。
【００６３】
次に、ＴＧＦβＲＩＩが低下したＳＳＧ３  ｓｈＲＮＡ発現細胞において細胞質脂質の有無を分析することによって、ＴＧＦβシグナル伝達の阻害が細胞レベルでどのようにＳＳＧ３細胞の機能性に影響を与えるかを決定する。ＴＧＦβＲＩＩの枯渇に伴い、ナイルレッド、オイルレッドＯで陽性染色される脂質内包物が増加するが、これはｓｈＲＮＡ対照を発現するＳＳＧ３細胞と比較して電子顕微鏡検査により確認される（図５ｂ及びｃ並びに図１０）。また、ナイルレッドで標識した脂肪滴をフローサイトメトリーによって分析した（図５ｄ）。リノール酸で処理した細胞と同様に、ｓｈＲＮＡ対照と比較して、ＴＧＦβＲＩＩが低下したＳＳＧ３  ｓｈＲＮＡ発現細胞において細胞の蛍光及び粒度（脂肪滴を示す）の増加が検出された。
【００６４】
また、ＴＧＦβ１処理は、ｓｈＲＮＡ細胞における脂質産生に対して効果を示さないものの（図５ｂ）、非標的ｓｈＲＮＡ対照を感染させたＳＳＧ３において脂質内包物の減少を誘導する（図５ａ）ことも見出された。これらの結果から、転写レベルでのＦＡＤＳ２及びＰＰＡＲγの阻害には古典的Ｓｍａｄシグナル伝達が介在することが示唆される。まとめると、これらのデータから、ＴＧＦβシグナル伝達は、特徴的な皮脂腺脂質の産生に関わる遺伝子に関与する脂腺細胞分化の阻害剤と評価される（図６）。
【００６５】
Ｃ．考察
いくつかの一連の証拠から、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）はヒト脂腺細胞を調節できる可能性のある候補であることが示唆されているが［１５、１６］、初代ヒト培養物がないために、ＴＧＦβシグナル伝達が皮脂腺分化を制御する分子メカニズムの徹底した調査がなされてこなかった。ＴＧＦβ経路は広範に分布しており、複数の細胞型及び組織型の増殖及び分化の制御に関与する。ＴＧＦβシグナル伝達経路の２つの主要な受容体であるＴＧＦβ受容体Ｉ（ＴＧＦβＲＩ）及びＴＧＦβ受容体ＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩ）はマウス皮脂腺で発現されることが報告されている［１７、１８］。ヒト及びマウス上皮細胞株において、ＴＧＦβは、ｃ−Ｍｙｃ発現の下方制御が少なくとも部分的に介在する強力な増殖阻害剤として作用する［１９、２０］。興味深いことに、マウスにおけるｃ−Ｍｙｃ過剰発現は、毛髪分化を犠牲にして脂腺細胞分化を活性化することにより皮脂腺サイズの増加を誘導した［１３、２１］。また、ＴＧＦβシグナル伝達の一般的なメディエイターである表皮Ｓｍａｄ４が破壊されると、ｃ−Ｍｙｃ上方制御を介して毛包間表皮、毛包及び皮脂腺の過形成が起こる［２２］。
【００６６】
脂腺細胞分化に対するＴＧＦβシグナル伝達の効果を決定するために、本開示の新たな初代ヒト脂腺細胞に対するＴＧＦβリガンドの効果を調べた。その結果から、ＴＧＦβシグナル伝達経路の活性化によって、特徴的な皮脂腺脂質の産生に関与する遺伝子の発現が下方制御されることが示された。Ｓｍａｄ２経路の活性化に必須のＴＧＦβＲＩＩ遺伝子は初代ヒト脂腺細胞において脂質産生を制限することが見出された。まとめると、これらの結果から、未分化状態でのヒト脂腺細胞の維持におけるＴＧＦβの役割が示され、ヒト皮脂腺生物学におけるこの経路の関連性が強調される。
【００６７】
Ｄ．図面の考察
図１：フィブロネクチンは微小環境を模倣し、脂腺細胞がインビトロで増殖できるようにする。（ａ）顕微解剖前の頭皮サンプル（９カ月齢）。（ｂ）単離された皮脂腺。（ｃ）ヒト頭皮組織のＯＣＴ切片での免疫蛍光染色であり、皮脂腺周囲の細胞外マトリックスでフィブロネクチン（（ｃ）において白色矢印で示した赤色部分）が発現されることが示された。α６−インテグリン（（ｃ’）において白色矢印で示した緑色部分）は腺の基底層を標識した。囲み領域は（ｃ’）に拡大表示する。スケールバー：２０μｍ（ｃ、ｃ’）。（ｄ）脂腺細胞を単離して培養する新規方法の概略図。頭皮外植片をフィブロネクチンで被覆されたカバースリップの間に置いた。外植片から皮脂腺細胞ＳＳＧ３が成長する（倍率１００倍）。略語：ＳＧ（皮脂腺）、ＨＦ（毛包）、ＦＮ（フィブロネクチン）。
【００６８】
図２：頭皮皮脂腺から単離した初代脂腺細胞はインビトロで分化し、皮脂に特徴的な脂質を産生できる。（ａ）ＳＳＧ３は、ＳＥＢ−１とは対照的に、ＰＰＡＲγを発現するがケラチン８は発現しない。（ｂ〜ｃ）リアルタイムＰＣＲの結果、ＰＰＡＲγはＳＥＢ−１及びＳＳＧ３で等しく発現されるが、それに対してＦＡＤＳ２はＳＥＢ−１よりもＳＳＧ３細胞でより高度に発現されることが示された。継代３世代目の頭皮外植片由来のＳＥＢ−１及びＳＳＧ３のＲＮＡはＧＡＰＤＨ発現を標準とした。示されたデータは、それぞれ三連で行った３つの独立した実験を表す（平均±ＳＤ、ｎ＝３）。＊ｐ値＜０．０５（対応のない両側スチューデントｔ検定）。（ｄ）０．１ｍＭのリノール酸（ＬＡ）存在下又は非存在下で細胞を４８時間培養した。ＳＳＧ３細胞においてＬＡ活性化による分化に続いてＰＰＡＲγ発現の増加が起こる。＊ｐ値＜０．０５（対応のある両側スチューデントｔ検定）。（ｅ）２４時間及び４８時間のＬＡ処理によって、ＳＳＧ３細胞においてＦＡＤＳ２発現の有意な増加が誘導される。＊ｐ値＜０．０５（対応のある両側スチューデントｔ検定）。（ｆ）Δ６デサチュラーゼ／ＦＡＤＳ２はパルミチン酸からサピエン酸への変換を触媒する。（ｇ）脂質分析は、ＮＩＫＳ及びＳＳＧ３のペレット中のΔ９及びΔ６のパーセンテージ並びにΔ６／Δ９の比率を示す。（ｈ）ＳＳＧ３ではサピエン酸（＊）がインビボ皮脂として検出できるが、それに対してＮＩＫＳではパルミトレイン酸（＊＊）が検出される豊富な脂質である。
【００６９】
図３：ＴＧＦβシグナル伝達はインビボ及びインビトロの皮脂腺において活性である。皮脂腺を水平面で切断した（概略図中、赤色の線）。（ａ）ＴＧＦβＲＩＩで染色したヒト頭皮組織のＯＣＴ切片（白色矢印で示した赤色部分）は、中心部にある分化細胞を除いて、皮脂腺全体で受容体の発現を示す。囲み領域は（ａ’）に拡大表示する。（ｂ）細胞核でのリン酸化Ｓｍａｄ２の発現（白色矢印で示した赤色部分）によって示されるように、ＴＧＦβ経路はインビボで活性である。α６：α６−インテグリンは皮脂腺の基底層を緑色に染色する（白色矢印で示す）。スケールバー：５０μｍ（ａ）、２０μｍ（ａ’、ｂ、ｂ’）。略語：Ｅｐｉ（表皮）；ＨＦ（毛包）；ＳＧ（皮脂腺）。（ｃ）記載した脂腺細胞培養物を５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１リガンドで１時間処理し、免疫ブロットで全細胞抽出物を試験してＴＧＦβ経路の活性化を判定した。
【００７０】
図４：ＴＧＦβシグナル伝達はＴＧＦβＲＩＩ−Ｓｍａｄ２依存性経路を介した脂質生成遺伝子発現の減少を誘発した。（ａ、ｂ）ＳＳＧ３細胞を５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１で２４時処理し、ｑＰＣＲに使用した。データはＧＡＰＤＨ発現を標準とし、基準として未処理の細胞を使用して相対的発現量を決定した。ＳＳＧ３細胞においてＦＡＤＳ２及びＰＰＡＲγの発現はＴＧＦβ１処理に応答して有意に下方制御されることが分かった。（ｃ）ＴＧＦβＲＩＩ  ｓｈＲＮＡ１及び対照ｓｈＲＮＡ（Ｃｔｒ）を発現するＳＳＧ３細胞におけるＴＧＦβＲＩＩ発現によってノックダウンの効率が示される。（ｄ）免疫ブロットの結果、５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１で１時間刺激したｓｈＲＮＡ発現細胞におけるｐ−Ｓｍａｄ２活性の減少が確認される。免疫ブロットの下に記載した値は、各条件から得られるｐ−Ｓｍａｄ２／Ｓｍａｄ２／３の比率を使用してＩｍａｇｅＪで定量した相対密度を示す。（ｅ、ｆ）転写レベルでのＦＡＤＳ２及びＰＰＡＲγの減少には古典的Ｓｍａｄシグナル伝達が介在する。発現量は未処理の対照（Ｃｔｒ）を標準とした。ＴＧＦβ１処理後の対照ＳＳＧ３細胞におけるＰＰＡＲγ及びＦＡＤＳ２遺伝子の有意な減少はＴＧＦβＲＩＩ欠損ＳＳＧ３細胞では検出されない。＊ｐ値＜０．０５、＊＊ｐ値＜０．００１（対応のある両側スチューデントｔ検定）。
【００７１】
図５：ＴＧＦβシグナル伝達の阻害は初代ＳＳＧ３細胞において脂質生成を誘導する。（ａ、ｂ）ＴＧＦβＲＩＩに対するｓｈＲＮＡを安定して発現するＳＳＧ３細胞は、明視野像（スケールバー：２０μｍ）においてナイルレッド染色（スケールバー：２０μｍ）及びオイルレッドＯ染色（スケールバー：１０μｍ）によって脂肪滴の蓄積を示す。白色矢印は、対照（Ｃｔｒ）と比較してｓｈＲＮＡ発現細胞において複数の脂肪滴が存在することを示す。主にオイルレッドＯにより示されるように、２４時間のＴＧＦβ１（５ｎｇ／ｍｌ）処理によって、対照細胞では脂質産生の基底レベルが減少するが、ＴＧＦβＲＩＩ  ｓｈＲＮＡを発現する細胞には影響が及ぼされない。（ｃ）ｓｈＲＮＡを発現するＳＳＧ３細胞（白色矢印で示す）において脂肪滴が対照と比較して増加していることを示す電子顕微鏡検査。スケールバー：２μｍ。ＬＤ（脂肪滴）。Ｎ（細胞核）。（ｄ）ナイルレッドで標識したｓｈＲＮＡを発現するＳＳＧ３細胞のフローサイトメトリー。ＦＬ−１は中性脂質を測定し、ＳＳＣは細胞の粒度を反映する。各条件において１０，０００個の細胞を取得した。陽性対照として０．１ｍＭリノール酸（ＬＡ）で２４時間処理したＳＳＧ３は、脂肪滴を示す蛍光及び粒度の増加を示す。ｓｈＲＮＡ対照を発現する細胞と比較してｓｈＲＮＡ発現ＴＧＦβＲＩＩにおいて蛍光が増加し、粒度が増加していることに注目されたい。異なる２種のｓｈＲＮＡ発現ＴＧＦβＲＩＩの場合にも同様の結果が得られた（図１０を参照）。
【００７２】
図６：ヒト脂腺細胞分化におけるＴＧＦβシグナル伝達の役割に関するモデル。皮脂腺は、腺の外部にある増殖性脂腺細胞と、完全に成熟した段階に達した際に腺の中心部において脂質で充満される分化脂腺細胞とで構成される。皮脂腺周囲の細胞環境は多様であり、皮膚線維芽細胞や、脂質合成に関与する遺伝子の発現を減少させることにより脂腺細胞を未分化状態で維持するＴＧＦβリガンド源になり得る脂肪細胞が含まれる。ＡＰＭ：立毛筋、ＩＲＳ：内毛根鞘、ＯＲＳ：外毛根鞘。
【００７３】
図７：頭皮、乳房、胸部及び顔面の組織由来の初代ヒト脂腺細胞は典型的な脂腺細胞マーカーを発現する。（ａ）頭皮サンプルのヘマトキシリン及びエオシン染色。スケールバー：５０μｍ。（ｂ）免疫蛍光染色の結果、ＰＰＡＲγ（（ｂ’）において白色矢印で示した赤色部分）は、頭皮外植片のヒト皮脂腺においてα６−インテグリンで染色された周縁部（白色矢印で示した緑色部分）及び腺の中心部で発現されることが示された。スケールバー：５０μｍ。囲み領域は（ｂ’）に拡大表示する。（ｃ）Ｂｌｉｍｐ１（白色矢印で示した赤色部分）発現は大部分が皮脂腺の分化細胞及び毛包の内毛根鞘で見られる。α６−インテグリン（白色矢印で示した緑色部分）は腺の基底層を標識した。（ｄ）ケラチン７（白色矢印で示した赤色部分）発現は、免疫蛍光分析で示されるように、腺の場所（頭皮、乳房及び胸部）によって様々である。（ｅ〜ｇ）頭皮、乳房、胸部及び顔面の外植片由来の脂腺細胞は２色免疫ブロットにより脂腺細胞マーカーを発現した（Ｂｌｉｍｐ１、ｃ−Ｍｙｃ、Ｍｕｃ１、ＰＰＡＲγ及びＫ７）。ＳＳＧ４は４歳の頭皮サンプル由来の初代脂腺細胞を表す。スケールバー：５０μｍ（ｂ）、５０μｍ（ｃ及びｄ）。略語：ＳＧ（皮脂腺）；ＨＦ（毛包）；α６（α６−インテグリン）；Ｋ７（ケラチン７）。
【００７４】
図８：初代脂腺細胞はインビトロで分化できる。（ａ）脂質蓄積の証拠（ナイルレッド染色）を示すヒト頭皮切片。スケールバー：５０μｍ。（ｂ）頭皮外植片由来のＳＳＧ３細胞を０．１ｍＭリノール酸（ＬＡ）で４８時間処理して細胞を分化させ、ナイルレッドで染色して脂質を検出した。未処理条件及びリノール酸処理条件に同じ曝露時間供して画像を撮影した。明視野写真は、黒色矢印で示されるようにリノール酸処理後に細胞質脂肪滴の蓄積を示した。スケールバー：５０μｍ。（ｃ）頭皮外植片由来の未処理の脂腺細胞ＳＳＧ３における細胞質脂肪滴を示す電子顕微鏡検査。スケールバー：２０μｍ。囲み領域は（ｃ’）に拡大表示する。スケールバー：５００ｎｍ。（ｃ”）リノール酸処理後、ＳＳＧ３細胞において高電子密度の脂肪滴の増加が検出されるが、ｃ’’’において拡大する。ｃ”及びｃ’’’のスケールバーは２μｍである。略語：ＨＦ（毛包）、ＳＧ（皮脂腺）、ＬＤ（脂肪滴）、Ｎ（細胞核）、Ｍｉ（ミトコンドリア）、ＲＥＲ（粗面小胞体）、ＳＥＲ（滑面小胞体）。
【００７５】
図９：ＴＧＦβシグナル伝達は乳房及び顔面由来の脂腺細胞において脂質生成遺伝子の発現の減少を誘発した。５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１で２４時間処理した又は未処理の乳房及び顔面由来の脂腺細胞からＲＮＡを単離し、リアルタイムＰＣＲに使用した。２つの実験を行い、全てのｑＰＣＲ反応を三連で行った。各細胞集団でのデータはＧＡＰＤＨ発現を標準とし、基準点として未処理の細胞を使用して相対的発現量の変化を求めた。頭皮由来の脂腺細胞で示されるように（図４ａ〜ｂ）、（ａ）ＦＡＤＳ２及び（ｂ）ＰＰＡＲγ発現はＴＧＦβ１処理に応答して有意に減少することが分かったが、これはＴＧＦβの阻害作用が皮膚組織型によるものではないことを示唆している。＊ｐ値＜０．０５（対応のある両側スチューデントｔ検定）。
【００７６】
図１０：ＴＧＦβシグナル伝達の阻害は初代ＳＳＧ３細胞において脂質生成を誘導する。（ａ）ＴＧＦβＲＩＩに対するｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ１）を安定して発現するＳＳＧ３細胞は、ｓｈＲＮＡ対照を感染させた細胞と比較して、明視野像（白色矢印）においてナイルレッド染色（緑色で示す）によって脂肪滴の蓄積を示す。スケールバー：２０μｍ。（ｂ〜ｃ）対照と比較して、ＴＧＦβＲＩＩに対するｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ２）を発現するＳＳＧ３細胞における脂肪滴の増加（白色矢印で示す）を示す電子顕微鏡検査。脂質合成を示すミエリン像が、ｓｈＲＮＡを発現するＳＳＧ３細胞で検出される。略語：Ｎ（細胞核）、ＬＤ（脂肪滴）。ｂ及びｃのスケールバーは２μｍであり、ｃ’のスケールバーは５００ｎｍである。
【００７７】
実施例３−化合物のスクリーニング
初代脂腺細胞を使用して、脂質生成の阻害剤又は活性化剤であることが知られている化合物を試験し、脂質生成を阻害又は活性化する試験化合物を同定したり、脂質生成の阻害剤又は活性化剤の効果を変化させたりする。
【００７８】
公知の脂質生成の阻害剤又は活性化剤は以下の通りである。
アンドロゲン：皮脂産生はアンドロゲンの制御下であり、アンドロゲンに対する毛嚢脂腺単位の異常な応答は座瘡の病因に関与するようである。
５α−レダクターゼ阻害剤（アンドロゲン性脱毛症の治療に使用）：脂質生成を低下させる。
５α−ＤＨＴ（ジヒドロテストステロン）（アンドロゲンはインビボで皮脂腺の活性を刺激する）：増殖を促進し、脂質生成を増加させる。
ＤＨＥＡ（５−デヒドロエピアンドロステロン）（副腎の主要なステロイド分泌物であり、アンドロゲン受容体に作用し、皮脂腺活性にアンドロゲン作用を示す）：脂質生成を増加させる。
酢酸シプロテロン（抗アンドロゲン薬）：脂質生成を減少させる。
エストロゲン類：エストラジオール：脂質生成を減少させる。
コルチコイド類：デキサメタゾン：脂質生成を減少させる。
レチノイド類：イソトレチノイン（１３−シスレチノイン酸）：脂腺細胞に対する増殖抑制効果、細胞周期停止、アポトーシス作用。
ＰＰＡＲアゴニスト：ロシグリタゾン：脂質生成を減少させる。
【００７９】
【表１】
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【００８０】
ＴＧＦβ１リガンド（１０ｎｇ／ｍｌ）を試験してもよく、この場合、ＴＧＦβＲＩＩに対するｓｈＲＮＡを使用した結果を模倣して、ＴＧＦβ阻害後に脂質産生の増加が起こるはずである。
【００８１】
材料及び方法：実験は実施例１及び２で説明した初代ＳＳＧ３細胞において行われる。実施例２で説明されるように、実験は初代ＳＳＧ３細胞において０．１ｍＭリノール酸で４８時間誘導下及び非誘導下で行われる。２つの処理時間、すなわち２４時間及び４８時間のリノール酸後処理後に異なる３つの濃度の各活性化合物を試験する。活性化合物を添加するときにリノール酸処理を止める。
【００８２】
処理後、脂質産生に対する効果を２つの方法で分析する。第一の方法では、ｍＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲを行ってＦＡＤＳ２及びＰＰＡＲγの発現を分析すると、ＳＳＧ３において４８時間のリノール酸処理後に発現の増加が示される。第二の方法では、脂腺細胞をナイルレッドで染色する。ＦＡＣＳ分析により変化を定量する。中性脂質の蓄積（代表的な皮脂脂質）の定量化及び極性脂質（代表的なリン脂質）の存在確認を可能にするであろう異なる２つの波長（５６４ｎｍ及び６０４ｎｍ）で対応する蛍光を測定する。それを励起させる黄色から緑色のレーザーを備えた機器においてデフォルトフィルターを使用して蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）により定量化を行う。
【００８３】
対照として、ＳＳＧ３をＴＧＦβ１で２４時間処理すると、ナイルレッド発色の減少が検出されるはずである。実験は有意なデータを得るために三連で行う。
【００８４】
対応のある両側スチューデントｔ検定を用いて２つの群（未処理群及び処理群）を比較する。ｐ値＜０．０５を有意とみなす。
【００８５】
本開示の典型的な実施形態として以下のものが挙げられる。
【００８６】
実施形態１：脂腺細胞の培養に適した細胞培地中でガラス片の間に挟んだ皮脂腺を該皮脂腺上に脂腺細胞が形成されるのに充分な時間培養することを含む、初代脂腺細胞を培養する方法。
【００８７】
実施形態２：上記ガラス片が細胞外マトリックスタンパク質で被覆されている、実施形態１に記載の方法。
【００８８】
実施形態３：上記細胞外マトリックスタンパク質がフィブロネクチンである、実施形態１又は２に記載の方法。
【００８９】
実施形態４：上記皮脂腺がヒト小児ドナー由来である、実施形態１〜３のいずれか一つに記載の方法。
【００９０】
実施形態５：上記皮脂腺を培養する前に、皮膚のサンプルを得ること、及び、該皮膚サンプルから皮脂腺を取り出すことをさらに含む、実施形態１〜４のいずれか一つに記載の方法。
【００９１】
実施形態６：上記皮膚のサンプルがヒト小児ドナー由来である、実施形態１〜５のいずれか一つに記載の方法。
【００９２】
実施形態７：上記細胞培地が、基本培地、上皮成長因子、コレラ毒素、アデニン、インスリン、ヒドロコルチゾン、ウシ胎児血清、及び、抗生物質／有糸分裂阻害薬を含有する、実施形態１〜６のいずれか一つに記載の方法。
【００９３】
実施形態８：上記皮脂腺から上記脂腺細胞を取り出すこと、及び、脂腺細胞の培養に適した培地中で細胞外マトリックスタンパク質で被覆されたガラス上に上記脂腺細胞を培養することをさらに含む、実施形態１〜７のいずれか一つに記載の方法。
【００９４】
実施形態９：上記培地が、基本培地、上皮成長因子、コレラ毒素、アデニン、インスリン、ヒドロコルチゾン、ウシ胎児血清、及び、抗生物質／有糸分裂阻害薬を含有する、実施形態１〜８のいずれか一つに記載の方法。
【００９５】
実施形態１０：上記細胞外マトリックスタンパク質がフィブロネクチンである、実施形態１〜９のいずれか一つに記載の方法。
【００９６】
実施形態１１：基本培地、上皮成長因子、コレラ毒素、アデニン、インスリン、ヒドロコルチゾン、ウシ胎児血清、及び、抗生物質／有糸分裂阻害薬を含有する培地中でフィブロネクチンで被覆されたガラス上に初代脂腺細胞を培養することを含む、初代脂腺細胞を培養する方法。
【００９７】
実施形態１２：上記初代脂腺細胞がヒト小児ドナー由来である、実施形態１１に記載の方法。
【００９８】
実施形態１３：請求項１〜１３のいずれか一つに記載の方法により得られる培養脂腺細胞の単離された集団。
【００９９】
実施形態１４：ａ）実施形態１３に記載の培養脂腺細胞の集団に試験化合物を添加すること、及び、ｂ）上記脂腺細胞における脂質産生に対する上記試験化合物の効果を測定することを含む、脂質生成を調節する化合物を同定する方法。
【０１００】
実施形態１５：上記培養脂腺細胞の集団の一部が、上記試験化合物を添加する前にリノール酸で誘導される、実施形態１４に記載の方法。
【０１０１】
実施形態１６：上記試験化合物の効果の測定において、ＦＡＤＳ２又はＰＰＡＲγ又は両方の発現を測定する、実施形態１４又は１５に記載の方法。
【０１０２】
本明細書において、「含む（含有する）（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（及びその文法上の変化形）という語は、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」又は「含む（包含する）（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という非限定的な意味で使用されており、「のみからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｎｌｙ  ｏｆ）」という排他的な意味では使用されていない。本明細書において、特に断りのない限り、“ａ”及び“ｔｈｅ”という語は単数だけでなく複数も包含すると理解される。
【０１０３】
上述の説明は本開示を例示し説明する。また、本開示は好ましい実施形態のみを示して説明しているが、上述したように、様々な他の組合せ、改変例及び環境で用いることができ、さらに、本明細書で示した本発明の概念の範囲内で、上記教示及び／又は関連技術の技能や知識に沿った変更又は改変を行うことができることが理解されるべきである。さらに、上述の実施形態は、出願人が認識している最良の形態を説明するものであり、当業者が本開示をそのまま又は他の実施形態で、特定の用途又は使用において必要とされる様々な改変を施して利用できるようにするものである。したがって、上記説明は、本明細書に開示された形態に発明を限定するものではない。また、添付の特許請求の範囲は代替の実施形態も含むと解釈されることを意図している。
【０１０４】
請求項はそれぞれ別個の発明を定義しており、侵害目的では、請求項で特定された様々な要素又は限定の均等物も含むものであると認められる。
【０１０５】
本明細書で引用した全ての出版物及び特許出願は、ありとあらゆる目的で、それぞれ個々の出版物又は特許出願が具体的かつ個別に示されて参照により援用されるものとして、本明細書に参照により援用される。本開示と、本明細書に参照により援用される出版物又は特許出願との間に矛盾がある場合には、本開示に従う。
【０１０６】
参考文献
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３７．Ｒｅｎｄｌ  Ｍ，Ｌｅｗｉｓ  Ｌ，Ｆｕｃｈｓ  Ｅ：“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ−ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈａｉｒ  ｆｏｌｌｉｃｌｅ”．ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ  ２００５，３（１１）：ｅ３３１．
３８．Ｗｏｎｇ  Ｔ，ＭｃＧｒａｔｈ  ＪＡ，Ｎａｙｓａｒｉａ  Ｈ：“Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ”．Ｂｒ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２００７，１５６（６）：１１４９−１１５５．
３９．Ｎｏｌｔｅ  ＳＶ，Ｘｕ  Ｗ，Ｒｅｎｎｅｋａｍｐｆｆ  ＨＯ，Ｒｏｄｅｍａｎｎ  ＨＰ：“Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ−−ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｎ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｓｋｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”．Ｃｅｌｌｓ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  Ｏｒｇａｎｓ  ２００８，１８７（３）：１６５−１７６．
４０．Ｆｕｊｉｗａｒａ  Ｈ，Ｆｅｒｒｅｉｒａ  Ｍ，Ｄｏｎａｔｉ  Ｇ，Ｍａｒｃｉａｎｏ  ＤＫ，Ｌｉｎｔｏｎ  ＪＭ，Ｓａｔｏ  Ｙ，Ｈａｒｔｎｅｒ  Ａ，Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ  Ｋ，Ｒｅｉｃｈａｒｄｔ  ＬＦ，Ｗａｔｔ  ＦＭ：“Ｔｈｅ  ｂａｓｅｍｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｏｆ  ｈａｉｒ  ｆｏｌｌｉｃｌｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ａ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌ  ｎｉｃｈｅ”．Ｃｅｌｌ  ２０１１，１４４（４）：５７７−５８９．
４１．Ｐｏｂｌｅｔ  Ｅ，Ｊｉｍｅｎｅｚ  Ｆ，Ｏｒｔｅｇａ  Ｆ：“Ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｒｒｅｃｔｏｒ  ｐｉｌｉ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｎｄ  ｓｅｂａｃｅｏｕｓ  ｇｌａｎｄｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ｕｎｉｔ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ”．Ｊ  Ａｍ  Ａｃａｄ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２００４，５１（２）：２１７−２２２．
４２．Ｃｈｒｏｎｎｅｌｌ  ＣＭ，Ｇｈａｌｉ  ＬＲ，Ａｌｉ  ＲＳ，Ｑｕｉｎｎ  ＡＧ，Ｈｏｌｌａｎｄ  ＤＢ，Ｂｕｌｌ  ＪＪ，Ｃｕｎｌｉｆｆｅ  ＷＪ，ＭｃＫａｙ  ＩＡ，Ｐｈｉｌｐｏｔｔ  ＭＰ，Ｍｕｌｌｅｒ−Ｒｏｖｅｒ  Ｓ：“Ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ  ｄｅｆｅｎｓｉｎ−１  ａｎｄ  −２  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｉｌｏｓｅｂａｃｅｏｕｓ  ｕｎｉｔｓ：ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｃｎｅ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｌｅｓｉｏｎｓ”．Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２００１，１１７（５）：１１２０−１１２５．
４３．Ｎａｇｙ  Ｉ，Ｐｉｖａｒｃｓｉ  Ａ，Ｋｉｓ  Ｋ，Ｋｏｒｅｃｋ  Ａ，Ｂｏｄａｉ  Ｌ，ＭｃＤｏｗｅｌｌ  Ａ，Ｓｅｌｔｍａｎｎ  Ｈ，Ｐａｔｒｉｃｋ  Ｓ，Ｚｏｕｂｏｕｌｉｓ  ＣＣ，Ｋｅｍｅｎｙ  Ｌ：“Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ  ａｎｄ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｉｎｄｕｃｅ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ／ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｂｏｃｙｔｅｓ”．Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ  ２００６，８（８）：２１９５−２２０５．
４４．Ｌｅｅ  ＤＹ，Ｙａｍａｓａｋｉ  Ｋ，Ｒｕｄｓｉｌ  Ｊ，Ｚｏｕｂｏｕｌｉｓ  ＣＣ，Ｐａｒｋ  ＧＴ，Ｙａｎｇ  ＪＭ，Ｇａｌｌｏ  ＲＬ：“Ｓｅｂｏｃｙｔｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｃａｎ  ａｃｔ  ｔｏ  ｋｉｌｌ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ”．Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２００８，１２８（７）：１８６３−１８６６．
４５．Ｚｏｕｂｏｕｌｉｓ  ＣＣ：“Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ  ａｎｄ  ｓｅｂａｃｅｏｕｓ  ｌｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ：ａ  ｌｏｖｅ−ｈａｔｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ？”，Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２００９，１２９（９）：２０９３−２０９６．
４６．Ｋａｗｓａｒ  ＨＩ，Ｇｈｏｓｈ  ＳＫ，Ｈｉｒｓｃｈ  ＳＡ，Ｋｏｏｎ  ＨＢ，Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  Ａ，Ｊｉｎ  Ｇ：“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ−ｄｅｆｅｎｓｉｎ−２  ｉｎ  ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ  ａｎｄ  ｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ”．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ２０１０，３１（２）：１９５−２０１．
４７．Ｉｓｈｉｎａｇａ  Ｈ，Ｊｏｎｏ  Ｈ，Ｌｉｍ  ＪＨ，Ｋｗｅｏｎ  ＳＭ，Ｘｕ  Ｈ，Ｈａ  ＵＨ，Ｋｏｇａ  Ｔ，Ｙａｎ  Ｃ，Ｆｅｎｇ  ＸＨ，Ｃｈｅｎ  ＬＦ  ｅｔ  ａｌ：“ＴＧＦ−ｂｅｔａ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｐ６５  ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＮＦ−ｋａｐｐａＢ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ”．ＥＭＢＯ  Ｊ  ２００７，２６（４）：１１５０−１１６２．
４８．Ｒｕｎｃｋ  ＬＡ，Ｋｒａｍｅｒ  Ｍ，Ｃｉｒａｏｌｏ  Ｇ，Ｌｅｗｉｓ  ＡＧ，Ｇｕａｓｃｈ  Ｇ：“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｌａｂｅｌ−ｒｅｔａｉｎｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ａｎａｌ  ｃａｎａｌ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｅｃｔｕｍ  ｉｎ  ｍｉｃｅ”．Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ２０１０，９（１５）：３０３９−３０４５．
４９．Ｓｔｏｆｆｅｌ  Ｗ，Ｈｏｌｚ  Ｂ，Ｊｅｎｋｅ  Ｂ，Ｂｉｎｃｚｅｋ  Ｅ，Ｇｕｎｔｅｒ  ＲＨ，Ｋｉｓｓ  Ｃ，Ｋａｒａｋｅｓｉｓｏｇｌｏｕ  Ｉ，Ｔｈｅｖｉｓ  Ｍ，Ｗｅｂｅｒ  ＡＡ，Ａｒｎｈｏｌｄ  Ｓ，Ａｄｄｉｃｋｓ  Ｋ．“Ｄｅｌｔａ６−ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ（ＦＡＤＳ２）ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｕｎｖｅｉｌｓ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｏｍｅｇａ３−  ａｎｄ  ｏｍｅｇａ６−ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ”．ＥＭＢＯ  Ｊ  ２００８；２７：２２８１−９２．
【図１】
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【図２】
2015530122.tif 000004
【図３】
2015530122.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
2015530122000001.app
【国際調査報告】
2015530122.tif 000013