(57)【要約】【解決手段】  少なくとも、(a) Pseudomonas marginalis、(b) Lactobacillus brevis、(c) Leuconostoc citreum、(d) Chryseobacterium sp.、(e) Janthinobacterium lividum、(f) Lactobacillus paracasei subsp. Paracaseiに属する菌、(g) Aureobacterium sp. に属する菌、の７種類の菌を含む乳酸飲料水。【効果】  少なくとも腫瘍性のガンと循環器系のガンの抑制作用を発現し、さらには、血糖値を下げる作用を発現するから、それらの病気の予防に有効である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも、
(a) Pseudomonas marginalis、
(b) Lactobacillus brevis、
(c) Leuconostoc citreum、
(d) Chryseobacterium sp.、
(e) Janthinobacterium lividum、
の５種類の菌を含み、少なくとも腫瘍性のガンの抑制作用および循環器系のガンの抑制作用さらには血糖値を下げる作用を有することを特徴とする乳酸飲料水。
【請求項２】
Lactobacillus paracasei subsp. Paracaseiに属する菌をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の乳酸飲料水。
【請求項３】
Aureobacterium sp. に属する菌をさらに含むことを特徴とする請求項１または２記載の乳酸飲料水。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも腫瘍性のガンの抑制作用および循環器系のガンの抑制作用さらには血糖値を下げる作用のある乳酸飲料水に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
サルモネラ菌に対する感染予防や炎症抑制など、様々なものに有用な乳酸飲料が種々開発されている（例えば、特許文献１参照）。
【特許文献１】特開平１１−４６６５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
この種の乳酸飲料には、様々な種類の菌、微生物が含まれており、それらの組み合わせによって乳酸飲料の効用が明らかに異なっている。本発明者はこのようなところから、乳酸飲料水のための種々の菌とその培養について研究を続けてきた。
そして、種々の菌のうち、少なくとも、
(a) Pseudomonas marginalis、
(b) Lactobacillus brevis、
(c) Leuconostoc citreum、
(d) Chryseobacterium sp.、
(e) Janthinobacterium lividum、
の５種類の菌が乳酸飲料水中に含まれている場合には、少なくとも腫瘍性のガンの抑制作用および循環器系のガンの抑制作用さらには血糖値を下げる作用を発現することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
すなわち、本乳酸飲料水は、少なくとも、
(a) Pseudomonas marginalis、
(b) Lactobacillus brevis、
(c) Leuconostoc citreum、
(d) Chryseobacterium sp.、
(e) Janthinobacterium lividum、
の５種類の菌を含み、少なくとも腫瘍性のガンの抑制作用および循環器系のガンの抑制作用さらには血糖値を下げる作用を有することを特徴とする。
【０００５】
本乳酸飲料水には、Lactobacillus paracasei subsp. Paracaseiに属する菌をさらに含んでいる。また、Aureobacterium sp. に属する菌をさらに含んでいる。
【０００６】
本乳酸飲料水にこれらの菌が含まれていることは、以下の分離結果から明らかである。すなわち、本乳酸飲料水１ｍｌを無菌的に分取し、９ｍｌの滅菌蒸留水に懸濁して１０倍希釈液とする。以下、順次希釈操作を繰り返して希釈列を作成し、各希釈検水の０．１ｍｌを標準寒天培地とＢ.Ｃ.Ｐ加寒天培地に塗末後、４５℃で嫌気的に培養する。それぞれの場合の分離状況を図１と図２に示す。図１では、３種のコロニーが、図２では２種のコロニーが目視的に判別できる。
【０００７】
また、本乳酸飲料水１ｍｌを無菌的に分取し、９ｍｌの滅菌蒸留水に懸濁して１０倍希釈液とする。以下、順次希釈操作を繰り返して希釈列を作成し、各希釈検水の０．１ｍｌを標準寒天培地とＹＭ寒天培地に塗末後、培養する。それぞれの場合の分離状況を図３〜図５に示す。標準寒天培地では３種のコロニー（すなわち、図３において1027-Aで示すものと、図４において1027-B、1027-Cで示す）が、ＹＭ培地では４種のコロニー（すなわち、図５において1027-C、1027-D、1027-E、1027-Fで示す）が目視的に判別できる。
【０００８】
1027-A、1027-D、1027-E、1027-Fで示す菌株を普通寒天培地（日水製薬製）に植菌し、３０℃での培養物を供試菌体とした。また、1027-B、1027-Cで示す菌株をＭＲＳ寒天培地（ＯＸＯＩＤ製）に植菌し、３７℃での培養物を供試菌体とした。そして、それぞれの菌体からゲノムDNAを抽出した。抽出したゲノムDNAを鋳型としてPCRにより16S rRNAの塩基配列約500 bqを増幅し、塩基配列をシーケンスして解析した。それぞれの菌株の16S rRNA 遺伝子塩基配列解析の結果を、表１〜表６に示す。
【０００９】
ゲノムDNAの抽出、PCR、PCR産物の精製、サイクルシークエンスはMicroSeq 500 16S rDNA Bacterial Sequencing Kit（Applied Biosystems社  U.S.）を用い、操作はApplied Biosystems社のプロトコールに従った。DNA解析はABI PRISM 377 DNA Sequencer（Applied Biosystems社 U.S.）を用い、MicroSeqのデータベースにより照合検索を行った（ここに、MicroSeqおよびABI PRISMはいずれも登録商標である）。
なお、菌株1027-AとSIID1027-A、菌株1027-BとSIID1027-B、菌株1027-CとSIID1027-C、菌株1027DとSIID1027-D、菌株1027-EとSIID1027-E、菌株1027-FとSIID1027-Fは、称呼が異なるだけで、いずれも同一のものである。
【００１０】
【表１】
2005126375.tif 000002
【００１１】
【表２】
2005126375.tif 000003
【００１２】
【表３】
2005126375.tif 000004
【００１３】
【表４】
2005126375.tif 000005
【００１４】
【表５】
2005126375.tif 000006
【００１５】
【表６】
2005126375.tif 000007
【００１６】
また、得られた16S rRNAの塩基配列を使って相同性検索、系統樹の作製をし、各菌株の近縁種および帰属分類群について検討した。各菌株の近縁種についての検討結果と帰属分類群についての検討結果を表７〜表１８に順次示す。相同性検索および系統樹の作製には、MicroSeq Microbial Identification System Software V.1.4.1およびMicroSeq Bacteria 1500 Library v. 0023（Applied Biosystems社 U.S.）を用いた（ここに、MicroSeqは登録商標である）。
【００１７】
【表７】
2005126375.tif 000008
【００１８】
【表８】
2005126375.tif 000009
【００１９】
【表９】
2005126375.tif 000010
【００２０】
【表１０】
2005126375.tif 000011
【００２１】
【表１１】
2005126375.tif 000012
【００２２】
【表１２】
2005126375.tif 000013
【００２３】
【表１３】
2005126375.tif 000014
【００２４】
【表１４】
2005126375.tif 000015
【００２５】
【表１５】
2005126375.tif 000016
【００２６】
【表１６】
2005126375.tif 000017
【００２７】
【表１７】
2005126375.tif 000018
【００２８】
【表１８】
2005126375.tif 000019
【００２９】
上記の表から明らかなように、菌株1027-A／SIID1027-Aと菌株1027-E／SIID1027-Eは同一のものであることが分かった。そして、５つの菌株、すなわち菌株1027-A／SIID1027-A、菌株1027-B／SIID1027-B、菌株1027-C／SIID1027-C、菌株1027-D／SIID1027-D、菌株1027-F／SIID1027-Fの同定結果は、以下の通りである。なお、各生物名の右側のカッコ内に、「独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター」に寄託した際の受託番号を合わせて示す。
菌株1027-A／SIID1027-A（菌株1027-E／SIID1027-E）： Pseudomonas marginalis（FERM P- 18433）
菌株1027-B／SIID1027-B ： Lactobacillus brevis（FERM P- 18434）
菌株1027-C／SIID1027-C ： Leuconostoc citreum（FERM P- 18435）
菌株1027-D／SIID1027-D ： Chryseobacterium balustinum（FERM P- 18437）
菌株1027-F／SIID1027-F ： Janthinobacterium lividum（FERM P- 18436）
【００３０】
このうち、菌株1027-D／SIID1027-D（Chryseobacterium balustinum）については、前記MicroSeq（ここに、MicroSeqは登録商標である）のデータベース（Applied Biosystems社 U.S.）を用いて照合した結果、この菌株のみが相同率が９７％以下であったので、それをさらに解析して BLAST Search を用いたデータベース（日本ＤＮＡデータバンク：国立遺伝学研究所生命情報・ＤＤＢＪ研究センター）と照合したところ、最も近縁とされる株菌は表１９に示すように、Chryseobacterium sp.属であると推定することができた（相同率：94.75％）。
【００３１】
【表１９】
2005126375.tif 000020
【００３２】
さらに、菌株1027-D／SIID1027-Dとの相違点に関する検討結果を、表２０に示す。
【００３３】
【表２０】
2005126375.tif 000021
【００３４】
また、BLAST Search において、相同率の高かった上位８株を用いた系統樹を表２１に示す。
【００３５】
【表２１】
2005126375.tif 000022
【００３６】
一方、本乳酸飲料水には、上述した５種類の菌以外にさらに２つの菌が含まれていることが分かった。２つの菌について、菌学的性質を調べた。その結果を表２２に示す。なお、表２２には、２つの菌を検体番号１,２で示してある。
【００３７】
【表２２】
2005126375.tif 000023
【００３８】
表２２から分かるように、同定第一段階において、菌株１は、グラム陽性、無芽胞の非運動性桿菌であり、カタラーゼ陰性、オキシダーゼ陰性、ブドウ糖を醗酵的分解、Ｈ２Ｓ産生陰性等の性状より、Lactobacillus属と推定することができる。また、同定第一段階において、菌株２は、V formを形成する無芽胞のグラム陽性不規則桿菌であり、カタラーゼ陽性、オキシダーゼ陰性を示すことからCoryneform bacterium属と推定することができる。
【００３９】
さらに、菌株１、２の生理性状学的試験を行った。菌株１の生理性状学的試験結果を表２３に、菌株２の生理性状学的試験結果を表２４に示す。
【００４０】
【表２３】
2005126375.tif 000024
【００４１】
【表２４】
2005126375.tif 000025
【００４２】
表２３から分かるように、同定第二段階において、菌株１は、アミグダリン、アルブチン、セルビオース、Ｄ−フルクトース、ガラクトース、グルコース、マルトース、マンニトール、Ｄ−マンノース、メレチトース、Ｎ―アセチルグルコサミン、サリシン、Ｄ−タガトース、トレハロースの資化性が全て陽性であることから、Lactobacillus paracasei subsp. paracasei属と推定することができる。なお、菌株１の顕微鏡拡大写真（倍率：１５００倍）を図６に示す。
【００４３】
また、表２４から分かるように、同定第二段階において、菌株２は、ピラジナミダーゼ、α−グルコシダーゼ、エスクリンが陽性を示すことから、Aureobacterium属に帰属する可能性が示唆された。ただし、コロニーの色素が黄色を示すこと、運動性を有すること、ゼラチンの加水分解陽性等の性状から、Aureobacterium barkeri, Aureobacterium testaceumとの類似性が示唆されたものの、生理性状学的試験のみでこれ以上の判断は困難であるので、一応Aureobacterium sp.属に帰属するものと推定する。なお、菌株２の顕微鏡拡大写真（倍率：１５００倍）を図７に示す。
【００４４】
なお、1027-A／SIID1027-Aおよび菌株1027-E／SIID1027-E、菌株1027-B／SIID1027-B、菌株1027-C／SIID1027-C、菌株1027-D／SIID1027-D、菌株1027-F／SIID1027-Fの５種類の菌について、その概要を示す。
菌株1027-A／SIID1027-Aおよび菌株1027-E／SIID1027-E（Pseudomonas marginalis）：脱窒素細菌といわれ、一般に嫌気性であり、窒素酸化物を用いて硝酸呼吸を行う。そのため、硝酸の一部はこの脱窒素細菌によって窒素に還元される。浄化処理−活性炭素での増殖や流出配管系の腐食を防いだり、オゾンの活性炭素からの流出を防ぐ。０．５〜０．７×１．５〜３．０μｍの桿菌で、通常寒天培地でよく発育し、腸内細菌用マッコンキーなどの培地にも容易に発育する。
【００４５】
菌株1027-B／SIID1027-B（Lactobacillus brevis）：醗酵形式が絶対ヘテロ型であり、サイレージを代表する微生物といえる。サイレージ醗酵では材料の滅菌工程を経ないので、材料に付着する全ての微生物の中から与えられる調整条件に適応した微生物が増殖する。したがって、材料に付着する乳酸菌群の菌数は醗酵の良否に大きな影響を及ぼす。ヘテロ型というのは、醗酵時に消化された糖の全てが乳酸に変換されずに酢酸やエタノールなどを生成する。
【００４６】
菌株1027-C／SIID1027-C（Leuconostoc citreum）：穀物、植物質、ミルクなどの醗酵物に見られる。醗酵形式はヘテロ醗酵で、乳酸、エタノール、ＣＯ１をつくる。好気的な条件下におかれると、エタノールの一部を酢酸にすることがある。また、ジアセチルを強力に作って、漬物などの香りに関与するものがある。
【００４７】
菌株1027-D／SIID1027-D （Chryseobacterium balustinum）：０．５×１．０〜３．０μｍの非運動性、好気性グラム陰性桿菌で、通常寒天培地で発育するが、中には血液寒天を必要とするものがある。土壌や水の常在菌で、一般には人に常在しない。
【００４８】
菌株1027-F／SIID1027-F（Janthinobacterium lividum）：土壌、湖水などから検出されている。キチナーゼを生産したり、ジニトロフェノールの分解に関与することが報告されている。
【００４９】
少なくとも上述した５種類の菌(a)〜(e)を含む乳酸飲料水は、少なくとも腫瘍性のガンの抑制作用および循環器系のガンであるＢ型ろほう性悪性リンパ腫の抑制作用を発現することを確認することができた。腫瘍性のガンの抑制作用に関する患者Ａさんと患者Ｂさんのデータを表２５と表２６に示す。表２５と表２６に記載されたデータは、患者Ａさんと患者Ｂさんが病院に行った以降に腫瘍マーカーＣＥＡを約１ケ月ごとに測定した値である。
この場合において、患者Ａさんは本乳酸飲料水を服用しているのに対し、患者Ｂさんは本乳酸飲料水を服用していない。これらの表に記載されたデータを比べれば、本乳酸飲料水を服用している患者Ａさんの方に腫瘍性のガンの抑制についての有意な差があることが分かる。
【００５０】
【表２５】
2005126375.tif 000026
【００５１】
【表２６】
2005126375.tif 000027
【００５２】
また、循環器系のガンの一つであるＢ型ろほう性悪性リンパ腫の抑制作用に関する患者Ｃさんと患者Ｄさんのデータを表２７と表２８に示す。表２７と表２８に記載されたデータは、患者Ｃさんと患者Ｄさんの血液をそれぞれ採取し、血液検査（腫瘍マーカー名：ＩＬ−２）した場合の血小板の数値である（単位：109/L）。
この場合において、患者Ｃさんは本乳酸飲料水を服用しているのに対し、患者Ｄさんは本乳酸飲料水を服用していない。これらの表に記載されたデータを比べれば、本乳酸飲料水を服用している患者Ｃさんの方に循環器系のガンの一つであるＢ型ろほう性悪性リンパ腫の抑制についての有意な差があることが分かる。
【００５３】
【表２７】
2005126375.tif 000028
【００５４】
【表２８】
2005126375.tif 000029
【００５５】
また、少なくとも上述した５種類の菌(a)〜(e)を含む乳酸飲料水は、血糖値を下げる作用を発現することを確認することができた。血糖値を下げる作用に関する患者Ｅさん、患者Ｆさん、患者Ｇさんのデータを表２９〜表３１に示す。表２９〜表３１に記載されたデータは、３名の患者が朝食前と夕食後の２回、血糖値を測定する器具を用いて自己測定したものである。
この場合において、患者Ｅさん、患者Ｆさんは本乳酸飲料水を服用しているのに対し、患者Ｇさんは本乳酸飲料水を服用していない。これらの表に記載されたデータを比べれば、本乳酸飲料水を服用している患者Ｅさん、患者Ｆさんの方に血糖値を下げる作用についての有意な差があることが分かる。
【００５６】
【表２９】
2005126375.tif 000030
【００５７】
【表３０】
2005126375.tif 000031
【００５８】
【表３１】
2005126375.tif 000032
【００５９】
また、患者Ｅさんは退院後も通院していたので、ヘモグロビンＡ１c の値を合わせて測定してもらっていた。その結果を表３２に示す。この表に記載されたデータからも、本乳酸飲料水を服用している患者Ｅさんに血糖値を下げる作用について有意な結果が出ていることが分かる。
【００６０】
【表３２】
2005126375.tif 000033
【００６１】
一方、本乳酸飲料水中に大腸菌群が認められるか否かを、以下の２通りの方法で検査した。第１の方法は、本乳酸飲料水１ｍｌを無菌的に分取し、９ｍｌの滅菌蒸留水に懸濁して１０倍希釈液とし、以下、順次希釈操作を繰り返して希釈列を作成し、各希釈検水の０．１ｍｌをデスオキシコレート寒天に塗末し、３７℃で４８時間培養する。その場合の分離状況を図８に示す。デスオキシコレート寒天では、大腸菌は赤色コロニーとして検出されることから、本乳酸飲料水に大腸菌群は認められないことを確認できた。
【００６２】
また、第２の方法は、本乳酸飲料水を製造後２週間経過後と１ケ月経過後の本乳酸飲料水を、食品衛生法による指定検査機関において、ＬＢ.ＥＭＢ.ＬＢ.普通寒天斜面培地法に基づいて大腸菌群が認められるか否かを検査してもらった。その結果を表３３と表３４に示す。２つの表からも、本乳酸飲料水に大腸菌群は認められないことを確認できた。なお、本乳酸飲料水を製造してから２週間後の乳酸菌数は１．９×１０8 ／ｍｌ、１ケ月後の乳酸菌数は３００／ｍｌ以下であった。
【００６３】
【表３３】
2005126375.tif 000034
【００６４】
【表３４】
2005126375.tif 000035
【発明の効果】
【００６５】
このように、少なくとも上述した５種類の菌(a)〜(e)を含む本乳酸飲料水は、少なくとも腫瘍性のガンと循環器系のガンの抑制作用を発現し、さらには、血糖値を下げる作用を発現するから、それらの病気の予防に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６６】
本乳酸飲料水の製造方法の概略を説明する。大豆のしぼりかすであるオカラに Lactobacillus fermentum（乳酸菌）と Pichia kluyveri（酵母菌）とを添加し、約１時間練り上げる。しかる後、それを真空密封し、３〜５℃の冷蔵庫で約６ケ月間低温熟成させ、醗酵させる。このようにして作製された種菌を用い、以下(1)〜(3)の工程を経ることによって本乳酸飲料水を製造することができる。
(1) 水深２００ｍより採水した地下水５００Ｌを醗酵釜に入れ、１００℃に加熱（３０分間）し、含まれている雑菌を殺菌する。
(2) 次いで、上記種菌２０Ｋｇを投入し、約１時間攪拌する。その際の温度を約８０℃に保ちながら、攪拌後２４時間静置してそれを熟成させる。
(3) ２４時間経過後液温４０℃になったとき、沈澱物を取り除き、上ずみ液（蒸留水）のみを容器に入れて密封する。そして、その容器を１０℃に保った冷蔵庫にて保管する。
【００６７】
このようにして製造された本乳酸飲料水を、少なくとも朝夕食後１回ずつ同じ量だけ服用し続けることにより、上述したように、少なくとも腫瘍性のガンの予防および循環器系のガンの予防、さらには、糖尿病の予防に有効であることが分かった。朝夕食後だけでなく、昼食後にも服用してもよい。また、出来るだけ服用し続けることが好ましい。さらに、１回に服用する量は患者の症状に応じて適宜異ならしめればよいが、例えば、３０ｃｃあるいは５０ｃｃ程度の比較的少量で十分である。このように、本乳酸飲料水を毎日少量づつ服用し続けることが、少なくとも腫瘍性のガンの予防および循環器系のガンの予防、さらには、糖尿病の予防には最善の治癒方法であると思われる。
【００６８】
なお、血糖値を下げる作用に関する患者Ｅさん、患者Ｆさん、患者Ｇさんが表３７〜表３９に掲げるデータを集めるに際しては、輸入販売元：日本ペクトン・ディッキンソン株式会社（販売元：株式会社三和化学研究所）の採血針と採血補助具を用いてそれぞれが自分で採血し、製造元：株式会社京都第一科学（販売元：株式会社三和化学研究所）の小型血糖測定機とそれ専用の電極（製造元：松下寿電子工業株式会社、発売元：株式会社京都第一科学）を用いてそれぞれが自分で測定した。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】本乳酸飲料水１ｍｌを無菌的に分取し、９ｍｌの滅菌蒸留水に懸濁して１０倍希釈液とし、以下、順次希釈操作を繰り返して希釈列を作成し、各希釈検水の０．１ｍｌを標準寒天培地に塗末後、４５℃で嫌気的に培養した場合の分離状況を示す写真である。
【図２】本乳酸飲料水１ｍｌを無菌的に分取し、９ｍｌの滅菌蒸留水に懸濁して１０倍希釈液とし、以下、順次希釈操作を繰り返して希釈列を作成し、各希釈検水の０．１ｍｌをＢ.Ｃ.Ｐ加寒天培地に塗末後、４５℃で嫌気的に培養した場合の分離状況を示す写真である。
【図３】本乳酸飲料水１ｍｌを無菌的に分取し、９ｍｌの滅菌蒸留水に懸濁して１０倍希釈液とし、以下、順次希釈操作を繰り返して希釈列を作成し、各希釈検水の０．１ｍｌを標準寒天培地に塗末後、培養した場合の分離状況を示す写真である。
【図４】本乳酸飲料水１ｍｌを無菌的に分取し、９ｍｌの滅菌蒸留水に懸濁して１０倍希釈液とし、以下、順次希釈操作を繰り返して希釈列を作成し、各希釈検水の０．１ｍｌを標準寒天培地に塗末後、培養した場合の分離状況を示す写真である。
【図５】本乳酸飲料水１ｍｌを無菌的に分取し、９ｍｌの滅菌蒸留水に懸濁して１０倍希釈液とし、以下、順次希釈操作を繰り返して希釈列を作成し、各希釈検水の０．１ｍｌをＹＭ寒天培地に塗末後、培養した場合の分離状況を示す写真である。
【図６】本乳酸飲料水に含まれているLactobacillus paracasei subsp. paracaseiに属する菌株の顕微鏡拡大写真である。
【図７】本乳酸飲料水に含まれているAureobacterium sp.に属する菌株の顕微鏡拡大写真である。
【図８】本乳酸飲料水１ｍｌを無菌的に分取し、９ｍｌの滅菌蒸留水に懸濁して１０倍希釈液とし、以下、順次希釈操作を繰り返して希釈列を作成し、各希釈検水の０．１ｍｌをデスオキシコレート寒天に塗末し、３７℃で４８時間培養した場合の分離状況を示す写真である。
【図６】
2005126375.tif 000036
【図７】
2005126375.tif 000037
【図１】
2005126375.tif 000038
【図２】
2005126375.tif 000039
【図３】
2005126375.tif 000040
【図４】
2005126375.tif 000041
【図５】
2005126375.tif 000042
【図８】
2005126375.tif 000043
【配列表】
2005126375000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成16年3月4日(2004.3.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
【表５】
2005126375.tif 000050