(57)【要約】本発明は、Ｒａｆを阻害する化合物、１−（３，３−ジメチルブチル）−３−（２−フルオロ−４−メチル−５−（７−メチル−２−（メチルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル）フェニル）尿素、またはその薬学的に許容可能な塩を提供し、したがって、癌を治療するのに有用であり得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１−（３，３−ジメチルブチル）−３−（２−フルオロ−４−メチル−５−（７−メチル−２−（メチルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル）フェニル）尿素である化合物、またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項２】
１−（３，３−ジメチルブチル）−３−（２−フルオロ−４−メチル−５−（７−メチル−２−（メチルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル）フェニル）尿素である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
１６．０ならびに６．９、７．０、１８．２および２３．２のうちの１つ以上にて生じる、２θ±０．２において、特性ピークを有するＸ線粉末回折パターンによって特徴付けられる結晶形態における１−（３，３−ジメチルブチル）−３−（２−フルオロ−４−メチル−５−（７−メチル−２−（メチルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル）フェニル）尿素である、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
薬学的に許容可能な担体と共に、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を含む、医薬組成物。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物または塩、および薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物または塩、およびポリビニルピロリドン酢酸ビニル（ＰＶＰ−ＶＡ）を含む、医薬組成物。
【請求項７】
ＰＶＰ−ＶＡがＫｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）ＶＡ６４である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物または塩の有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、癌を治療する方法。
【請求項９】
癌が、甲状腺癌、卵巣癌、黒色腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、および結腸直腸癌からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記癌が黒色腫である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記癌が結腸直腸癌である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
治療に使用するための請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物または塩。
【請求項１３】
癌の治療に使用するための請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物または塩。
【請求項１４】
前記癌が、甲状腺癌、卵巣癌、黒色腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、および結腸直腸癌からなる群から選択される、請求項１３に記載の使用のための化合物または塩。
【請求項１５】
前記癌が黒色腫である、請求項１４に記載の使用のための化合物または塩。
【請求項１６】
前記癌が結腸直腸癌である、請求項１４に記載の使用のための化合物または塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＲａｆ阻害剤化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｒａｓ／Ｒａｆ／マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ（ＭＡＰ２Ｋ；ＭＡＰＫキナーゼ；およびＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼまたはＭＥＫとしても知られている）／細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）シグナル伝達カスケード（本明細書で「Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ」または「Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＭＡＰＫ」と称される）は、哺乳動物における発達および組織恒常性において重要な役割を果たす進化的に保存された経路である。このシグナル伝達経路は、遺伝子発現および重要な細胞機能を調節するために核に細胞外シグナルを中継するキナーゼカスケードからなる。Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路により制御される遺伝子発現は、増殖、分化、アポトーシス、および血管形成を含む基礎的細胞プロセスを調節する。Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達のこれらの多様な役割は種々の種類の癌において異常に活性化される。この経路内の遺伝子の変異は、増加した細胞増殖、およびアポトーシスに対する耐性を生じる構成的に活性なタンパク質を導き得る。
【０００３】
Ｒａｆ（セリン／トレオニン−タンパク質キナーゼ）は、３つのＲａｆアイソフォームメンバー（Ｂ−Ｒａｆ、Ｃ−Ｒａｆ（Ｒａｆ−１）およびＡ−Ｒａｆ）を提供する３つの遺伝子からなる遺伝子ファミリーによってコードされる。これらのタンパク質の各々は、高度に保存されたアミノ末端調節領域およびカルボキシ末端において触媒ドメインを共有する。他に示さない限り、Ｒａｆは３つ全てのメンバーを指す。各アイソフォームはＲａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路において役割を果たすが、Ｂ−ＲａｆはＭＥＫの主な活性化因子であることが示されている。Ｂ−Ｒａｆは、Ｂ−Ｒａｆが活性化になる細胞内細胞膜に対してＲａｓ：ＧＴＰにより動員される。次に、Ｂ−ＲａｆはＭＥＫ１／２の活性化に関与し、ＭＥＫ１／２はＥＲＫ１／ＥＲＫ２を活性化する。Ｂ−Ｒａｆ遺伝子の変異は、Ｂ−Ｒａｆが上流のシグナルと独立してシグナル伝達することを可能にする。結果として、変異したＢ−Ｒａｆタンパク質（Ｖ６００Ｅなど）はＭＥＫおよびＥＲＫの過剰な下流のシグナル伝達を引き起こす。これにより過剰な細胞増殖および生存および腫瘍形成が導かれる。変異したＢ−Ｒａｆによるシグナル伝達カスケードの過剰活性化は複数の悪性腫瘍に関与している。
【０００４】
受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）ｃ−Ｋｉｔ（ＣＤ１１７とも呼ばれる）は多種多様の細胞種類で発現される。ｃ−ＫＩＴについてのリガンドは幹細胞因子（ＳＣＦ）である。ｃ−ＫＩＴの細胞外ドメインに対するＳＣＦの結合は、受容体の二量化およびＲＡＳ／ＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路を含む、下流のシグナル伝達経路の活性化を誘導する。変異ｃ−ＫＩＴはいくつかの癌の発病に関与している。
【０００５】
Ｂ−Ｒａｆ特異的阻害剤（ベムラフェニブなど）、ならびに特許文献１および特許文献２に開示されているものなどの化合物にも関わらず、Ａ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ、Ｃ−Ｒａｆ、およびＢ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ変異を含むＲａｆタンパク質の全てのアイソフォームを阻害する際のＲａｆ阻害剤活性についての必要性が存在する。Ｎ−Ｒａｓ変異、Ｋ−Ｒａｓ変異、およびｃＫｉｔ変異による上流経路の活性化と共に腫瘍細胞に対して活性であるＲａｆ阻害剤についてのさらなる必要性が存在する。さらに、癌を治療するための代替のＲａｆ阻害剤を提供する必要性が存在する。また、癌を治療するためのＡ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ、Ｃ−Ｒａｆ、およびＢ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ変異を阻害する際の代替のＲａｆ阻害剤活性を提供する必要性が存在する。したがって、本発明は、Ｒａｆタンパク質の全てのアイソフォームを阻害する際に活性であり得るＲａｆ阻害剤を提供する。また、本発明は、Ｎ−Ｒａｓ変異、Ｋ−Ｒａｓ変異、およびｃＫｉｔ変異により上流経路の活性化と共に腫瘍細胞に対して活性であり得るＲａｆ阻害剤を提供する。さらに、本発明は、Ｒａｆの代替の阻害剤を提供する。さらに、本発明は、癌を治療するのに有用であり得るＲａｆの代替の阻害剤を提供する。本発明はまた、Ａ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ、Ｃ−Ｒａｆ、およびＢ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ変異を阻害する際のＲａｆ活性の代替の阻害剤を提供する。なおさらに、本発明は、癌を治療するのに有用であり得るＡ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ、Ｃ−Ｒａｆ、およびＢ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ変異を阻害する際のＲａｆ活性の代替の阻害剤を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００６／０３９７１８号
【特許文献２】国際公開第２００８／０３４００８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
Ｂ−Ｒａｆ特異的阻害剤（ベムラフェニブなど）、ならびに特許文献１および特許文献２に開示されているものなどの化合物にも関わらず、Ａ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ、Ｃ−Ｒａｆ、およびＢ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ変異を含むＲａｆタンパク質の全てのアイソフォームを阻害する際のＲａｆ阻害剤活性についての必要性が存在する。Ｎ−Ｒａｓ変異、Ｋ−Ｒａｓ変異、およびｃＫｉｔ変異による上流経路の活性化と共に腫瘍細胞に対して活性であるＲａｆ阻害剤についてのさらなる必要性が存在する。さらに、癌を治療するための代替のＲａｆ阻害剤を提供する必要性が存在する。また、癌を治療するためのＡ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ、Ｃ−Ｒａｆ、およびＢ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ変異を阻害する際の代替のＲａｆ阻害剤活性を提供する必要性が存在する。したがって、本発明は、Ｒａｆタンパク質の全てのアイソフォームを阻害する際に活性であり得るＲａｆ阻害剤を提供する。また、本発明は、Ｎ−Ｒａｓ変異、Ｋ−Ｒａｓ変異、およびｃＫｉｔ変異により上流経路の活性化と共に腫瘍細胞に対して活性であり得るＲａｆ阻害剤を提供する。したがって、本発明は、Ｒａｆの代替の阻害剤を提供する。さらに、本発明は、癌を治療するのに有用であり得るＲａｆの代替の阻害剤を提供する。本発明はまた、Ａ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ、Ｃ−Ｒａｆ、およびＢ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ変異を阻害する際のＲａｆ活性の代替の阻害剤を提供する。なおさらに、本発明は、癌を治療するのに有用であり得るＡ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ、Ｃ−Ｒａｆ、およびＢ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ変異を阻害する際のＲａｆ活性の代替の阻害剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、１−（３，３−ジメチルブチル）−３−（２−フルオロ−４−メチル−５−（７−メチル−２−（メチルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル）フェニル）尿素である化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【０００９】
特定の実施形態として、本発明は、１−（３，３−ジメチルブチル）−３−（２−フルオロ−４−メチル−５−（７−メチル−２−（メチルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル）フェニル）尿素である化合物を提供する。
【００１０】
本発明は、薬学的に許容可能な担体と共に、１−（３，３−ジメチルブチル）−３−（２−フルオロ−４−メチル−５−（７−メチル−２−（メチルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル）フェニル）尿素、またはその薬学的に許容可能な塩を含む医薬組成物を提供する。本発明は、薬学的に許容可能な担体と共に、１−（３，３−ジメチルブチル）−３−（２−フルオロ−４−メチル−５−（７−メチル−２−（メチルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル）フェニル）尿素を含む医薬組成物を提供する。
【００１１】
本発明は、１−（３，３−ジメチルブチル）−３−（２−フルオロ−４−メチル−５−（７−メチル−２−（メチルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル）フェニル）尿素、またはその薬学的に許容可能な塩と、薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。本発明は、１−（３，３−ジメチルブチル）−３−（２−フルオロ−４−メチル−５−（７−メチル−２−（メチルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル）フェニル）尿素、および薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００１２】
特定の実施形態として、本発明は、１−（３，３−ジメチルブチル）−３−（２−フルオロ−４−メチル−５−（７−メチル−２−（メチルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル）フェニル）尿素、またはその薬学的に許容可能な塩、およびポリビニルピロリドン酢酸ビニル（ＰＶＰ−ＶＡ）を含む医薬組成物を提供する。本発明はまた、１−（３，３−ジメチルブチル）−３−（２−フルオロ−４−メチル−５−（７−メチル−２−（メチルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル）フェニル）尿素、およびポリビニルピロリドン酢酸ビニル（ＰＶＰ−ＶＡ）を含む医薬組成物を提供する。さらに、本発明は、本明細書に記載される医薬組成物の好ましい実施形態を提供し、ここでＰＶＰ−ＶＡは、Ｋｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）ＶＡ６４およびＰｌａｓｄｏｎｅ（商標）Ｓ−６３０コポピドンからなる群から選択される。好ましくは、ＰＶＰ−ＶＡはＫｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）ＶＡ６４である。
【００１３】
現在好ましい製剤は、Ｋｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）ＶＡ６４（ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製品番号９５４０５−２−４３）、６０：４０比の１−ビニル−２−ピロリドンと酢酸ビニルのコポリマーおよび１〜２％（ｗ／ｗ）ラウリル硫酸ナトリウムと一緒に、１−（３，３−ジメチルブチル）−３−｛２−フルオロ−４−メチル−５−［７−メチル−２−（メチルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル］フェニル｝尿素、またはその薬学的に許容可能な塩を含む。２０％または４０％薬物負荷を含んでもよく、０〜２％のラウリル硫酸ナトリウムまたは適切な量の他の適切な薬学的に許容可能な湿潤剤、可塑剤、加工助剤または他の適切な賦形剤を含んでもよい固体分散物が好ましい。
【００１４】
本発明は、有効量の１−（３，３−ジメチルブチル）−３−（２−フルオロ−４−メチル−５−（７−メチル−２−（メチルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル）フェニル尿素、またはその薬学的に許容可能な塩を、それを必要とする患者に投与することを含む、癌を治療する方法を提供する。本発明は、有効量の１−（３，３−ジメチルブチル）−３−（２−フルオロ−４−メチル−５−（７−メチル−２−（メチルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル）フェニル尿素を、それを必要とする患者に投与することを含む、癌を治療する方法を提供する。
【００１５】
本発明は、治療に使用するための、１−（３，３−ジメチルブチル）−３−（２−フルオロ−４−メチル−５−（７−メチル−２−（メチルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル）フェニル尿素、またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。本発明は、癌の治療に使用するための、１−（３，３−ジメチルブチル）−３−（２−フルオロ−４−メチル−５−（７−メチル−２−（メチルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル）フェニル尿素、またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。本発明は、癌を治療するのに使用するための医薬組成物を提供し、その医薬組成物は１−（３，３−ジメチルブチル）−３−（２−フルオロ−４−メチル−５−（７−メチル−２−（メチルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル）フェニル尿素、またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【００１６】
本発明は、治療に使用するための１−（３，３−ジメチルブチル）−３−（２−フルオロ−４−メチル−５−（７−メチル−２−（メチルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル）フェニル尿素を提供する。本発明は、癌の治療に使用するための１−（３，３−ジメチルブチル）−３−（２−フルオロ−４−メチル−５−（７−メチル−２−（メチルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル）フェニル尿素を提供する。本発明は癌を治療するのに使用するための医薬組成物を提供し、その医薬組成物は、１−（３，３−ジメチルブチル）−３−（２−フルオロ−４−メチル−５−（７−メチル−２−（メチルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル）フェニル尿素を含む。
【００１７】
本発明は、癌を治療するための医薬の製造における、１−（３，３−ジメチルブチル）−３−（２−フルオロ−４−メチル−５−（７−メチル−２−（メチルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル）フェニル尿素、またはその薬学的に許容可能な塩の使用を提供する。本発明はまた、癌を治療するための医薬の製造における１−（３，３−ジメチルブチル）−３−（２−フルオロ−４−メチル−５−（７−メチル−２−（メチルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル）フェニル尿素の使用を提供する。
【００１８】
本発明は、結晶形態の１−（３，３−ジメチルブチル）−３−（２−フルオロ−４−メチル−５−（７−メチル−２−（メチルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル）フェニル尿素を提供する。本発明はまた、２θ±０．２において、１６．０ならびに６．９、７．０、１８．２、および２３．２のうちの１つ以上で発生する特性ピークを有するＸ線粉末回折パターンにより特徴付けられる結晶形態の１−（３，３−ジメチルブチル）−３−（２−フルオロ−４−メチル−５−（７−メチル−２−（メチルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル）フェニル尿素を提供する。
【００１９】
さらに、本発明は、本明細書に記載される方法および使用の好ましい実施形態を提供し、ここで癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ、急性骨髄性白血病）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ芽球性白血病（ＣＬＬ）、骨髄異形成症候群、卵巣癌、黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、結腸直腸癌、膵癌、前立腺癌、肝臓癌または甲状腺癌からなる群から選択される。より好ましくは、癌は、甲状腺癌、卵巣癌、黒色腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ、急性骨髄性白血病）、および結腸直腸癌からなる群から選択される。さらにより好ましくは、癌は黒色腫または結腸直腸癌である。
【００２０】
患者における甲状腺癌、卵巣癌、黒色腫、ＡＭＬまたは結腸直腸癌である癌を治療する方法は、治療有効量の１−（３，３−ジメチルブチル）−３−（２−フルオロ−４−メチル−５−（７−メチル−２−（メチルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル）フェニル尿素、またはその薬学的に許容可能な塩を、それを必要とする患者に投与することを含む。
【００２１】
治療に使用するための化合物は、１−（３，３−ジメチルブチル）−３−（２−フルオロ−４−メチル−５−（７−メチル−２−（メチルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル）フェニル尿素、またはその薬学的に許容可能な塩である。
【００２２】
甲状腺癌、卵巣癌、黒色腫、ＡＭＬまたは結腸直腸癌である癌の治療に使用するための化合物は、１−（３，３−ジメチルブチル）−３−（２−フルオロ−４−メチル−５−（７−メチル−２−（メチルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル）フェニル尿素、またはその薬学的に許容可能な塩である。
【００２３】
甲状腺癌、卵巣癌、黒色腫、ＡＭＬまたは結腸直腸癌である癌を治療するための医薬を製造するための１−（３，３−ジメチルブチル）−３−（２−フルオロ−４−メチル−５−（７−メチル−２−（メチルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル）フェニル尿素、またはその薬学的に許容可能な塩の使用である。
【００２４】
特定の実施形態において、医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体および必要に応じて他の治療成分と一緒に、１−（３，３−ジメチルブチル）−３−｛２−フルオロ−４−メチル−５−［７−メチル−２−（メチルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル］フェニル｝尿素、またはその薬学的に許容可能な塩を含む。
【００２５】
特定の実施形態において、医薬組成物は、特に一般的な癌または特定の癌の種類を治療するための薬学的に許容可能な担体および必要に応じて他の治療成分と一緒に、１−（３，３−ジメチルブチル）−３−｛２−フルオロ−４−メチル−５−［７−メチル−２−（メチルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル］フェニル｝尿素、またはその薬学的に許容可能な塩を含む。
【００２６】
本発明は、以下の式の化合物：
【化１】
2015509536.tif 000002
またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は実施例１についての代表的なＸ線粉末回折パターンである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
「患者」という用語は哺乳動物を意味し、「哺乳動物」は、限定されないが、ヒトを含む。
【００２９】
「治療有効量」または「有効量」は、癌患者におけるＢ−Ｒａｆ、Ｃ−Ｒａｆ、Ａ−Ｒａｆおよび／またはＢ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅシグナル伝達を阻害し、標的癌細胞を破壊するかまたは患者における癌の進行を遅延もしくは停止させるのに必要な、化合物もしくはその薬学的に許容可能な塩、または例示した化合物もしくはその薬学的に許容可能な塩を含有する医薬組成物の投薬量を意味する。例示した化合物、またはその薬学的に許容可能な塩の予想される投薬量は３００〜１５００ｍｇ／患者／日の範囲である。好ましい投薬量は４００〜１４００ｍｇ／患者／日の範囲であると予想される。最も好ましい投薬量は６００〜１２００ｍｇ／患者／日の範囲であると予想される。患者を治療するのに必要とされる正確な投薬量および治療時間の長さは、疾患の段階および重症度ならびに個々の患者の特定の要求および反応ならびに投与される特定の化合物を考慮して医師により決定される。１日当たりの投薬量として表されているが、投薬計画は、より最適な治療的有用性を患者に提供するように調整されてもよい。１日投薬に加えて、１日に２回（ＢＩＤ）または１日に３回（ＴＩＤ）投薬が適切であってもよい。ＢＩＤ投薬が現在好ましい。
【００３０】
「治療」、「治療する」および「治療している」という用語は、癌が実際に排除されないとしても、癌の症状の１つ以上を軽減、遅延または反転させるため、および癌の進行を遅らせるために活性化合物の投与などの、患者が患っている癌についての介入の全範囲を含むことを意味する。
【００３１】
本発明の例示した化合物は、好ましくは、薬学的に許容可能な担体を使用してまたは１種以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、もしくは賦形剤を使用して医薬組成物として製剤化され、種々の経路によって投与される。好ましくは、このような組成物は経口投与用である。このような医薬組成物およびそれらを調製するためのプロセスは当該技術分野において周知である。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ：ＴＨＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＹ（Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏら、ｅｄｓ．、２１ｓｔｅｄ．、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、２００５）を参照のこと。
【００３２】
本発明の例示した化合物は、複数の無機酸および有機酸と反応して薬学的に許容可能な酸付加塩を形成できる。そのような薬学的に許容可能な塩およびそれらを調製するための一般的な方法は当該技術分野において周知である。例えば、Ｐ．Ｓｔａｈｌら、ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＡＬＴＳ：ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，ＳＥＬＥＣＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＵＳＥ、（ＶＣＨＡ／Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、２００２）；Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅら、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｖｏｌ．６６、Ｎｏ．１，１９７７年１月を参照のこと。
【００３３】
１−（３，３−ジメチルブチル）−３−（２−フルオロ−４−メチル−５−（７−メチル−２−（メチルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル）フェニル尿素、またはその薬学的に許容可能な塩は、当該技術分野において公知の種々の手順および以下に記載されている手順により調製され得ることは理解されるべきである。
【００３４】
実施例１は、１−（３，３−ジメチルブチル）−３−｛２−フルオロ−４−メチル−５−［７−メチル−２−（メチルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル］フェニル｝尿素と命名され、また、Ｎ−（３，３−ジメチルブチル）−Ｎ’−［２−フルオロ−４−メチル−５−［７−メチル−２−（メチルアミノ）ピリド［２，３ｄ］ピリミジン−６−イル］フェニル］尿素と命名される場合もあり、実施例１を一義的に識別するために他の命名が使用されてもよい。
【００３５】
１−（３，３−ジメチルブチル）−３−（２−フルオロ−４−メチル−５−（７−メチル−２−（メチルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル）フェニル）尿素の合成において最初の出発物質として利用される化合物は周知であり、市販されていないという点で、当業者に一般に利用される標準的な手順によって、提供される特定の参照を使用して容易に合成されるか、または一般的な参考書に見出される。
【００３６】
公知の手順および方法の例には、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ，１９８９；Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−１０，１９７４−２００２，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，第５版，Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｂ．Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｊｅｒｒｙ  Ｍａｒｃｈ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，２００１；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第４版，Ｐａｒｔ  Ｂ，Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｆｒａｎｃｉｓ  Ａ．Ｃａｒｅｙ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｊ．Ｓｕｎｄｂｅｒｇ，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２０００など、およびそれらに引用されている参考文献などの一般的な参考書に記載されているものが含まれる。
【００３７】
本明細書で使用される場合、以下の用語は示した意味を有する：「ｄ６−ＤＭＳＯ」はヘキサジュウテロ（ｈｅｘａｄｅｕｔｅｒｏ）−ジメチルスルホキシドを指し；「ＤＣＭ」はジクロロメタンを指し；「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシドを指し；「ＥｔＯＡｃ」は酢酸エチルを指し；「ＥｔＯＨ」はエタノールを指し；「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィーを指し；「ＩＰＡＣ」は酢酸イソプロピルを指し；「ＫＦ」はカールフィッシャーを指し；「ＭＳ」は質量分析を指し；「ＭｅＯＨ」はメタノールを指し；「ＭＴＢＥ」はｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルを指し；「ＮＭＲ」は核磁気共鳴を指し；「ＲＴ」は室温を指し；「ＴＨＦ」はテトラヒドロフランを指す。
【００３８】
反対に示されない限り、本明細書に例示した化合物は、ＡＣＤＬＡＢＳまたはＳｙｍｙｘ  Ｄｒａｗ３．２を使用して命名され、番号付けされる。
【実施例】
【００３９】
調製例１
５−ブロモ−２−フルオロ−４−メチルアニリン
【化２】
2015509536.tif 000003
方法Ａ：
１−ブロモ−４−フルオロ−２−メチルベンゼン（３０．０ｇ、１５９ｍｍｏｌ）を濃硫酸（１００ｍＬ）中に合わせ、約−５℃に冷却し、２０分にわたって硝酸（１１．００ｍＬ、１７４ｍｍｏｌ）と共に滴下処理する。反応混合物を室温に加温し、３０分間撹拌する。撹拌しながら粉砕した氷上に注ぎ、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（ＭＴＢＥ）（２００ｍＬ）で分ける。水層を分離し、ＭＴＢＥ（２×５０ｍＬ）で抽出する。有機層を合わせ、乾燥させ、減圧下で濃縮して１−ブロモ−４−フルオロ−２−メチル−５−ニトロベンゼンを橙色の粘性油（３９．０ｇ）として得る。
【００４０】
粗１−ブロモ−４−フルオロ−２−メチル−５−ニトロベンゼン（３２．４ｇ、１３８ｍｍｏｌ）、エタノール（１００ｍＬ）およびラネーニッケル（Ｒａｎｅｙ  Ｎｉｃｋｅｌ）（１．００ｇ、１７．０４ｍｍｏｌ）を振盪フラスコ中に合わせる。フラスコに水素（２７５ｋＰａ）を入れ、水素の吸収が停止するまで撹拌する。反応容器を減圧し、濾過により触媒を除去し、乾燥するまで濾液を蒸発させる。ＭＴＢＥを加え、次いで再び濾過し、濾液を蒸発させる。残渣をヘキサン中で撹拌する。濾過により固体を回収し、冷ヘキサンで洗浄し、真空中で乾燥させて暗色固体として標題化合物（１７．８ｇ、６３％収率）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２０４．０（Ｍ＋１）／２０６．０（Ｍ＋３）。
【００４１】
方法Ｂ：
機械的撹拌器、温度計、氷浴およびＮ２注入口を備えた４つ口丸底フラスコに、１−ブロモ−４−フルオロ−２−メチルベンゼン（１．４ｋｇ、７．４ｍｏｌ）を加え、次いで濃Ｈ２ＳＯ４（６．３ｋｇ）を０〜１０℃にて加える。１０〜２０分間の撹拌後、混合物を−１０〜０℃に冷却し、温度を−１０〜０℃に維持しながらＫＮＯ３（０．８２ｋｇ、７．８ｍｏｌ、１．０５当量）を約６時間で少しずつ加える。添加後、反応混合物を１０〜２０℃に加温し、１−ブロモ−４−フルオロ−２−メチルベンゼンの含有量が＜０．５％になるまでＴＬＣ（ＥＡ：ＰＥ＝１：２０）およびＨＰＬＣによりモニターする。混合物を氷／水混合物（１１．２ｋｇ、氷：水＝１：１）中に注ぎ、ＭＴＢＥ（４．７Ｌおよび１．９Ｌ）で２回抽出する。有機層を合わせ、飽和ブライン（５．６ｋｇ）で洗浄し、減圧下で４５℃以下で１．５〜２Ｖに濃縮する。残渣をＥｔＯＡｃ（５．６Ｌ）で希釈し、得られた溶液を次の工程に直接使用する（１．２２ｋｇ（ｗｔ％に修正）、７０．５％収率、および２１０ｎｍでのＵＶ吸収により検出して６８．３％純度）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．３５（ｓ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），７．２９（ｄ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ，１Ｈ），２．５９（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）。
【００４２】
機械的撹拌器、温度計およびＮ２注入口を備えた４つ口丸底フラスコに、ＥｔＯＡｃ（５Ｌ）中の１−ブロモ−４−フルオロ−２−メチル−５−ニトロベンゼン（１．１６ｋｇ、４．９６ｍｏｌ）の溶液および３６％ＨＣｌ溶液（４．９ｋｇ、４９．６ｍｏｌ、１０．０当量）を加える。２０〜３０℃にて５〜１０分間撹拌した後、２０〜３０℃にて温度を維持しながら、Ｆｅ粉末（１．３４ｋｇ、２４．０ｍｏｌ、４．８当量）を少しずつ加える。反応をＴＬＣ（ＥＡ：ＰＥ＝１：１０）によりモニターする。反応の完了後、ＮａＨＣＯ３を使用してｐＨ値を２〜３に調整し、セライト（登録商標）（０．５６ｋｇ）を加える。混合物を０．５〜１時間撹拌し、濾過する。固体をトルエン（２×２．６Ｌ）で洗浄する。濾液を合わせ、層を分離する前にさらに０．５〜１時間撹拌する。水層をトルエン（２．６Ｌ）で抽出する。有機層を合わせ、ブライン（３Ｌ）で洗浄し、シリカゲルパッド（２〜３ｃｍ）で濾過する。濾液を２〜２．５Ｌに濃縮し、残渣をｎ−ヘプタン（３．３Ｌ）と混合する。再び２〜２．５Ｌに濃縮した後、ｎ−ヘプタン（１．６５Ｌ）を加える。混合物を−１０〜０℃に冷却し、１時間撹拌する。沈殿物を濾過により回収し、ｎ−ヘプタン（０．５Ｌ、−１０〜０℃に予め冷却した）で洗浄し、乾燥させて茶色の固体として標題化合物の粗生成物を得る。ｎ−ヘプタン（３．３Ｌ）を用いた粗生成物の再結晶により、標題化合物の灰色がかった白から茶色の固体を得る（５２７ｇ、５２％収率および２１０ｎｍでのＵＶ吸収により検出して９８％純度）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：δ６．９７（ｍ，２Ｈ），５．１８（ｓ，２Ｈ），２．１６（ｓ，３Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２１．４１，１１６．６０，１１８．３０，１１９．６６，１２７．２２，１３２．８８，（１４９．３７，１５１．１２）；１９ＦＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１５１．１４。
【００４３】
調製例２
２−フルオロ−４−メチル−５−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）アニリン
【化３】
2015509536.tif 000004
方法Ａ：
ジオキサン（４０ｍＬ）中に５−ブロモ−２−フルオロ−４−メチルアニリン（３．１ｇ、１５．２ｍｍｏｌ）、ビス（ピナコラト）ジボロン（４．２４ｇ、１６．７ｍｍｏｌ）、および酢酸カリウム（４．４７ｇ、４５．６ｍｍｏｌ）を合わせ、アルゴンを注入する。［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］−ジクロロパラジウム（ＩＩ）−ジクロロメタン錯体（０．６２０ｇ、０．７６０ｍｍｏｌ）を加え、アルゴンを再び注入し、１００℃にて一晩加熱する。反応混合物を濾過し、真空中で濃縮する。シリカゲルクロマトグラフィー（０〜５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して標題化合物（３．２４ｇ、８５％収率）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２５２．１（Ｍ＋１）。
【００４４】
方法Ｂ：
機械的撹拌器、温度計およびＮ２注入口を備えた４つ口の丸底フラスコに、５−ブロモ−２−フルオロ−４−メチルアニリン（２００ｇ、０．９８ｍｏｌ）、ＣＨ３ＣＯＯＫ（１９２ｇ、１．９５ｍｏｌ、２．０当量）、ビス（ピナコラト）ジボロン（２４８ｇ、０．９８ｍｏｌ、１．０当量）およびＩＰＡＣ（３Ｌ）を加える。３０分間、Ｎ２で脱気した後、混合物を５０℃に加温し、Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２（８ｇ、４ｗｔ％）を加える。出発物質の含有量が≦２％（ＧＣ）になるまで、少なくとも１０時間還流下で反応混合物を加熱する。混合物を２０〜３０℃に冷却し、セライト（登録商標）のパッドで濾過し、ＩＰＡＣ（１Ｌ）でリンスする。濾液を４００〜５００ｍｌ残存するまで濃縮する。残渣をｎ−ヘプタン（７００ｍｌ）と混合し、ＳｉＯ２パッドで濾過し、ＩＰＡＣ／ｎ−ヘプタン（１／５最初、約２Ｌ、および次いで２／５、約３Ｌ）で溶出する。濾液を３５０〜４００ｍｌに濃縮する。ｎ−ヘプタン（３００ｍｌ）を加え、混合物を再び３５０〜４００ｍｌに濃縮する。残渣（懸濁液）を−１０〜−２０℃に冷却し、２〜５時間撹拌後、濾過する。粗生成物を３０〜４０℃にてＭｅＯＨ（２００ｍｌ）中に溶解し、次いでＨ２Ｏ（６００ｍｌ）を０．５〜１時間で滴下してゆっくり加える。懸濁液を２０〜３０℃に冷却し、１〜２時間の撹拌後、濾過する。固体を真空下で乾燥させて灰色がかった固体として標題化合物を得る（１８３ｇ、７４％収率および２１０ｎｍでのＵＶ吸収により検出して９９％純度）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．４２（ｄ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ，１Ｈ），７．０１（ｄ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ，１Ｈ），３．７６（ｓ，２Ｈ），２．６４（ｓ，３Ｈ），１．５５（ｓ，１２Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２０．６６，２０．６７，２４．４０，８２．９３，１１６．２０，１２４．３７，１３０．６４，１３５．０２，（１５１．９３，１５３．３７）；１９ＦＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１４５．７２。
【００４５】
調製例３
プロパ−１−エン−２−イル２−フルオロ−４−メチル−５−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェニルカルバメート
【化４】
2015509536.tif 000005
ＥｔＯＡｃ（６０ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（６０ｍＬ）中の２−フルオロ−４−メチル−５−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）アニリン（５．０ｇ、１９．９１ｍｍｏｌ）およびクロロギ酸イソプロペニル（２．４０ｍＬ、２１．９０ｍｍｏｌ）を加え、室温にて６時間撹拌する。層を分離し、水層をＥｔＯＡｃ（２×）で抽出し、合わせた有機物をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して標題化合物を得る。さらに精製せずに次の反応のために使用する（１００％収率と仮定する）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３３６．２（Ｍ＋１）。
【００４６】
調製例４
３，３−ジメチルブタン−１−アミン塩酸塩
【化５】
2015509536.tif 000006
機械的撹拌器、温度計およびＮ２注入口を備えた４つ口丸底フラスコに、３，３−ジメチルブタナール（２００ｇ、２．０ｍｏｌ）を加える。次いで１−フェニルメタンアミン（２１４ｇ、２．０ｍｏｌ、１．０当量）を滴下して加える。ＧＣにより９９％超の変換まで反応混合物を２〜５時間２０〜３０℃にて撹拌する。ＮａＣｌ（４ｇ）を加え、水相を捨てる。ＴＨＦ（８００ｍｌ）を加え、混合物を４００ｍｌに濃縮する。この操作を、残渣のＫＦが０．２％未満になるまで繰り返す。ＴＨＦ（８００ｍｌ）およびｔ−ＢｕＯＫ（４４．８ｇ、０．４ｍｏｌ、０．２当量）を加える。混合物を６０〜６５℃に加温し、Ｎ−ベンジル−３，３−ジメチル−ブタン−１−イミンの含有量がＧＣにより１％未満になるまで撹拌する。１０〜２０℃に冷却した後、水（１５００ｍｌ）を加え、混合物をＭＴＢＥ（２×１５００ｍｌ）で抽出する。合わせた有機相を飽和ＮａＣｌ（８００ｍｌ）で洗浄し、水分含有量分析のためにサンプリングし、１％〜２％のＫＦ含有量を確保する。Ｎ−（３，３−ジメチルブチル）−１−フェニル−メタンイミンのストリームを次の工程のために直接使用する（ＧＣにより８３％純度；ＧＣ−ＭＳ  ｍ／ｚ  １８８．２［Ｍ−Ｈ］＋）。
【００４７】
機械的撹拌器、温度計およびＮ２注入口を備えた４つ口丸底フラスコに、上記で得たＮ−（３，３−ジメチルブチル）−１−フェニル−メタンイミン溶液（４１２ｇ、２．１８ｍｏｌ、３．２７ＬのＭＴＢＥ、１．３ＬのＴＨＦ）を加え、ＨＣｌ／ＭＴＢＥ溶液（１６％、３９８ｇ、１．７４ｍｍｏｌ、０．８当量）を２０〜３０℃にて滴下して加える。添加の間、白色固体が沈殿した。１〜２時間撹拌した後、懸濁液のアリコートサンプルを濾過した。母液をＧＣにより調べた。Ｎ−（３，３−ジメチルブチル）−１−フェニル−メタンイミンの含有量が３０％より多い場合、Ｎ−（３．３−ジメチルブチル）−１−フェニル−メタンイミンの含有量がＧＣにより２０％〜３０％の間になるまで追加のＨＣｌ／ＭＴＢＥ溶液（４５ｇ、０．１０当量）を加える。固体を濾過により回収し、ＭＴＢＥ（８７０ｍｌ）で洗浄し、Ｎ２下で乾燥させて白色結晶物質（１９５ｇ、６５％収率）として所望の標題化合物を得る。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：δ７．９０（ｓ，３Ｈ），２．７４（ｍ，２Ｈ），１．４７（ｍ，２Ｈ），０．８９（ｓ，９Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：δ２８．９８，２９．３１，３５．４９，４０．３４。
【００４８】
調製例５
１−（３，３−ジメチルブチル）−３−（２−フルオロ−４−メチル−５−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェニル）尿素
【化６】
2015509536.tif 000007
方法Ａ：
ジオキサン（６０ｍＬ）中のプロパ−１−エン−２−イル２−フルオロ−４−メチル−５−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェニルカルバメート（６．６７ｇ、１９．９０ｍｍｏｌ）の溶液を、３，３−ジメチルブタン−１−アミン（２．４２ｇ、２３．９ｍｍｏｌ）および１−メチルピロリジン（０．１６９ｇ、１．９９ｍｍｏｌ）で処理し、７５℃にて一晩加熱する。混合物を室温に冷却し、濾過により固体を回収し、ジエチルエーテルで洗浄して標題化合物（２工程にわたって６．６２ｇ、８８％収率）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３７９．２（Ｍ＋１）。
【００４９】
方法Ｂ：
機械的撹拌器、温度計およびＮ２注入口を備えた４つ口丸底フラスコに、２−フルオロ−４−メチル−５−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）アニリン（４０ｇ、０．１５９ｍｏｌ）、ＴＨＦ（６００ｍｌ）およびＮａＨＣＯ３（１６．０ｇ、０．１９ｍｏｌ、１．２０当量）を加える。混合物を０〜５℃に冷却し、クロロギ酸フェニル（２６．１４ｇ、０．１６７ｍｏｌ、１．０５当量）を滴下して加える。反応混合物を６０℃に加温し、２−フルオロ−４−メチル−５−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）アニリンの含有量が≦２％になるまで撹拌する。混合物を濾過し、固体（塩）をＴＨＦ（１２０ｍｌ）で洗浄する。濾液を６５〜８０ｍｌに濃縮する。残渣に、トルエン（７２０ｍｌ）、３，３−ジメチルブタン−１−アミン（ＨＣｌ塩、２６．１４ｇ、０．１９ｍｏｌ、１．２当量）およびＴＥＡ（２０．８７ｇ、０．２１ｍｏｌ、１．３当量）を加える。得られた混合物を９０℃に加熱し、中間体の含有量が≦２％になるまで撹拌する。混合物を１５〜２０℃に冷却し、２時間撹拌し、濾過する。固体をトルエン（１２０ｍｌ）、Ｈ２Ｏ（２×４００ｍｌ）で洗浄し、高真空下で乾燥させて白色固体として標題化合物を得る（５４．９ｇ、９１．３％収率および２１０ｎｍでのＵＶ吸収により検出して９９％純度）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：δ８．３４（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ），８．０８（ｓ，１Ｈ），６．９８（ｄ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ，１Ｈ），６．４１（ｓ，１Ｈ），３．０８（ｓ，２Ｈ），２．３８（ｓ，３Ｈ），１．３６（ｍ，１４Ｈ），０．９０（ｓ，９Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：δ２１．１２，２４．６５，２９．３７，２９．５８，３５．６５，４３．５０，８３．２５，１０４．３２１１６．０９，１２５．０２，１２８．１９，１３８．７１，（１５２．４０，１５４．３４），１５４．８１；１９ＦＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：δ１３６．３４。
【００５０】
調製例６
エチル４−アミノ−２−（メチルチオ）ピリミジン−５−カルボキシレート
【化７】
2015509536.tif 000008
方法Ａ：
エタノール（ＥｔＯＨ）（４５０ｍＬ）中のエチル４−クロロ−２−（メチルチオ）ピリミジン−５−カルボキシレート（２００ｇ、８６０ｍｍｏｌ）の激しく撹拌した懸濁液に濃水酸化アンモニウム（３３５ｍＬ、８．６０ｍｏｌ）を加え、一晩撹拌する。固体を濾過により回収し、ＥｔＯＨ（２×１００ｍＬ）およびＨ２Ｏ（３×２００ｍＬ）でリンスし、真空オーブン（６５〜７０℃）中で一晩乾燥させて白色固体として標題化合物（１６４．４ｇ、９０％収率）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２１４．１（Ｍ＋１）。
【００５１】
方法Ｂ：
反応容器に１１９０ｇのＴＨＦおよび６６０ｇのエチル４−クロロ−２−（メチルスルファニル）ピリミジン−５−カルボキシレート（１．０当量、２．８４ｍｏｌ）を入れる。１０〜２０℃にて２０〜３０分間撹拌し、次いで９０７ｇのＮＨ３−Ｈ２Ｏおよび９８９ｇのＥｔ３Ｎを混合物に加える。４５〜５５℃に加熱し、４５〜５５℃にて２〜６時間撹拌する。反応が完了した後、８〜１２℃に冷却し、４０００ｇの水を加える。８〜１２℃にて４〜８時間撹拌し、濾過し、２００ｇの水でリンスする。８０℃にて８〜２４時間、真空中でケーキを乾燥させて標題化合物を得る。（５６０ｇ；９２％収率で９８．８％純度；［Ｍ＋１］＝２１３．８，１Ｈ  ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ，４００ＭＨｚ）：δ＝８．５６４（ｓ，１Ｈ），８．２７８（ｓ，１Ｈ），８．０１１（ｓ，１Ｈ），７．６４９（ｓ，１Ｈ），４．２９３−４．２４０（ｄｄ，Ｊ１＝６．８，Ｊ２＝１４，２Ｈ），２．４６２（ｓ，３Ｈ），δ１．３０８−１．２７２（ｍ，３Ｈ））。
【００５２】
調製例７
４−アミノ−２−（メチルチオ）ピリミジン−５−イル）メタノール
【化８】
2015509536.tif 000009
テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（９００ｍＬ）中のエチル４−アミノ−２−（メチルチオ）ピリミジン−５−カルボキシレート（７２．３ｇ、３３９ｍｍｏｌ）の溶液を０℃に冷却する。ＬｉＡｌＨ４（ＴＨＦ中に２Ｍ）（１９５ｍＬ、３９０ｍｍｏｌ）の溶液を１時間にわたって滴下して加える。０℃にて２時間撹拌し、反応物を一晩室温に加温する。混合物を０℃に冷却し、水（１５ｍＬ）、２０％ＫＯＨ水溶液（１５ｍＬ）および水（３０ｍＬ）を連続して加えることによって注意深くクエンチする。得られた混合物を１時間撹拌する。ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、真空下で乾燥させて標題化合物（５５．８５ｇ、９６％収率）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：１７２．１（Ｍ＋１）。
【００５３】
調製例８
４−アミノ−２−（メチルチオ）ピリミジン−５−カルバルデヒド
【化９】
2015509536.tif 000010
方法Ａ：
クロロホルム（８１８ｍＬ）中の４−アミノ−２−（メチルチオ）ピリミジン−５−イル）メタノール（２８ｇ、１６４ｍｍｏｌ）の懸濁液にＭｎＯ２（４９．８ｇ、５７２ｍｍｏｌ）を加え、反応物を５５℃（内部で測定する）にて４時間加熱する。高温の反応混合物を濾過し、高温のクロロホルムおよびＴＨＦで濾過ケーキをリンスする。合わせた濾液を減圧下で濃縮し、真空下で乾燥させて淡黄色の固体として標題化合物（２６．７ｇ、９６％収率）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：１７０．１（Ｍ＋１）。
【００５４】
方法Ｂ：
反応容器に４５０ｇ（２．０８ｍｏｌ、１．０当量）のエチル４−アミノ−２−（メチルチオ）ピリミジン−５−カルボキシレートおよび６７５０ｍＬ（１５．０Ｖ）のＴＨＦを入れる。別の反応容器に８８．１ｇ（１．１当量）のＬｉＡｌＨ４および２２５０ｇ（５．０Ｖ）のＴＨＦを入れる。このＬｉＡｌＨ４混合物を−５〜５℃に冷却する。エチル４−アミノ−２−（メチルチオ）ピリミジン−５−カルボキシレートのＴＨＦ溶液をＬｉＡｌＨ４混合物に１０℃以下で滴下して加える。添加後、５〜１５℃にて２〜３時間混合物を撹拌する。−５〜５℃に冷却し、２７９ｇ（１．５当量）のＥｔＯＡｃを２０℃以下で滴下して加える。混合物を１０〜２０℃にて１〜２時間撹拌する。４５０ｇ（０．６６当量）のＮａ２ＳＯ４．１０Ｈ２Ｏを２０℃以下で少しずつ加える。混合物を１０〜２０℃にて１〜２時間撹拌する。懸濁液を珪藻土で濾過する。ケーキをＴＨＦで洗浄する。７３４ｇ（４．０当量）のＭｎＯ２を、４−アミノ−２−（メチルチオ）ピリミジン−５−イル）メタノール溶液を含有する濾液に入れる。混合物を４０℃で加熱する。混合物を４０〜４５℃にて６〜８時間撹拌する。懸濁液を珪藻土で濾過する。ケーキをＴＨＦで洗浄する。濾液を合わせ、濃縮し、１５３０ｇ（５．０Ｖ）のｎ−ヘプタンを滴下して加える。混合物を１０〜２０℃にて３〜４時間撹拌する。懸濁液を濾過し、ケーキをヘプタンで洗浄する。４０〜５０℃にて１０〜１６時間、減圧下で濾過ケーキを乾燥させて標題化合物を得る（２７６ｇ；７５％収率で９７．９％純度；［Ｍ＋１］＝１７１．８，１Ｈ  ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ，４００ＭＨｚ）：δ＝７．８８７（ｓ，１Ｈ），６．７０４（ｓ，２Ｈ），５．０６６−５．０４２（ｍ，１Ｈ），δ４．２９２−４．２８０（ｄ，２Ｈ），２．３９２（ｓ，３Ｈ）；［Ｍ＋１］＝１６９．８，１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ＝９．７６９（ｓ，１Ｈ），８．４１４（ｓ，１Ｈ），８．１９０（ｓ，１Ｈ），５．７７２（ｓ，１Ｈ），２．５４０（ｓ，３Ｈ））。
【００５５】
調製例９
７−メチル−２−（メチルチオ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−オール
【化１０】
2015509536.tif 000011
方法Ａ：
１−ヒドロキシプロパン−２−オン（２４．３ｍＬ、３５５ｍｍｏｌ）および４−アミノ−２−（メチルチオ）ピリミジン−５−カルバルデヒド（５０ｇ、２９６ｍｍｏｌ）を、水酸化ナトリウム（２３．６４ｇ、５９１ｍｍｏｌ）および水（２００ｍＬ）の溶液に加える。ＥｔＯＨ（６００ｍＬ）を懸濁液に加え、室温にて一晩撹拌する。水（３５０ｍＬ）中の濃ＨＣｌ（５０ｍＬ）の溶液をゆっくり加える。１：１のＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ（１００ｍＬ）を加え、固体を濾過により回収する。固体を１：１のＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ（２５０ｍＬ）、氷冷ＥｔＯＨ（４×２５ｍＬ）およびヘキサン（２×２５０ｍＬ）で洗浄する。３０〜３５℃にて真空オーブン中で乾燥させて黄褐色の固体（３４ｇ、５６％収率）として標題化合物を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２０８．１（Ｍ＋１）。
【００５６】
方法Ｂ：
反応容器に２４００ｇ（８．０Ｖ）のＨ２Ｏおよび１７７．３ｇ（２．５当量）のＮａＯＨおよび３００．０ｇ（１．７７ｍｏｌ、１．０当量）の４−アミノ−２−（メチルチオ）ピリミジン−５−カルバルデヒドおよび１５７．６ｇ（１．２当量）のヒドロキシアセトンを入れる。混合物を３５〜４５℃で加熱し、３５〜４５℃にて１０〜２０時間撹拌する。混合物を５〜１５℃に冷却する。４５００ｍＬの１ＮのＨＣｌを滴下して加え、１５℃以下でｐＨを３〜４に調整する。１０〜１５℃にて１〜２時間撹拌する。濾過し、３００ｇの水でケーキをリンスする。５０〜６０℃にて１６〜２４時間、濾過ケーキを減圧下で乾燥させて標題化合物を得る（３７２ｇの茶色の固体；９８．０％ＨＰＬＣ面積（アッセイ：９０．０％）；９０％収率；１Ｈ  ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ，４００ＭＨｚ）：δ＝１０．８６４（ｓ，１Ｈ），９．２７６（ｓ，１Ｈ），７．５２９（ｓ，１Ｈ），２．５７０（ｓ，６Ｈ））。
【００５７】
調製例１０
７−メチル−２−（メチルチオ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イルトリフルオロメタンスルホネート
【化１１】
2015509536.tif 000012
方法Ａ：
７−メチル−２−（メチルチオ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−オール（２５ｇ、１２１ｍｍｏｌ）、ＤＣＭ（１１００ｍＬ）およびピリジン（９８ｍＬ、１２０６ｍｍｏｌ）を合わせ、内部温度が＜３℃になるまで混合物を氷浴で冷却する。トリフルオロメタンスルホン酸無水物（２４．５ｍＬ、１４５ｍｍｏｌ）を、内部温度を５℃以下に維持するような速度でシリンジによりゆっくり加える。反応混合物を０℃にて２時間撹拌する。水（３×３００ｍＬ）およびブライン（３００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過する。減圧下（水浴温度約３５℃）で濾液を濃縮し、高真空下で２〜３時間室温にて乾燥させる。残渣をＤＣＭに溶解し、シリカゲルクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製する。画分を濃縮して半純粋固体を得る。固体を２０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１００ｍＬ）で粉砕し、濾過により回収し、２０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン（２×１０ｍＬ）でリンスし、室温にて真空下で乾燥させて淡いピンク色の固体（２８．６ｇ、７０％収率）として標題化合物を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３４０．０（Ｍ＋１）。
【００５８】
方法Ｂ：
反応容器に４０００ｍＬ（２０．０Ｖ）のＤＣＭおよび２０８ｇ（１．０ｍｏｌ、１．０当量）の７−メチル−２−（メチルチオ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−オールを入れる。混合物を１０〜２０分間撹拌する。３１２ｇ（４．０当量）のピリジンを２０℃以下で入れる。−５〜０℃に冷却し、ＤＣＭ（２０００ｍＬ、１０．０Ｖ）中の４１６ｇのトリフルオロメタンスルホン酸無水物（１．５当量）の溶液を０℃以下で滴下して加える。添加後、０〜５℃にて２〜３時間撹拌する。反応物を２０００ｍＬの１ＮのＨＣｌ（２×）でクエンチする。５００ｍＬのＨ２Ｏで２回洗浄する。１００．０ｇのシリカゲルを加え、１０〜２０℃にて１〜２時間撹拌する。混合物を珪藻土で濾過する。濾液を濃縮し、１０〜２０℃にて撹拌しながらｎ−ヘプタン１０００ｍＬ（５．０Ｖ）を滴下して加える。混合物を１０〜２０℃にて３〜４時間撹拌する。濾過し、３５〜４０℃にて８〜１２時間減圧下でケーキを乾燥させて、標題化合物を得る（３０７ｇの茶色の固体；９９．１％のＨＰＬＣ面積（アッセイ：９６．８％）；８６％収率；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ＝９．２１６（ｓ，１Ｈ），８．１２０（ｓ，１Ｈ），２．８９０（ｓ，３Ｈ），２．７７３（ｓ，３Ｈ）。
【００５９】
調製例１１
７−メチル−２−（メチルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イルトリフルオロメタンスルホネート
【化１２】
2015509536.tif 000013
方法Ａ：
混合物の７−メチル−２−（メチルチオ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イルトリフルオロメタンスルホネート（２８．６ｇ、８４ｍｍｏｌ）、ジメチルホルムアミド（７４ｍＬ）および氷酢酸（９．６１ｍＬ、１６９ｍｍｏｌ）を４５℃で加熱し、次いで６．１５％のＮａＯＣｌ水溶液（漂白剤、６１２ｇ、５０６ｍｍｏｌ）を２時間にわたって滴下して加える。４５〜５０℃にて２時間加熱し、室温に冷却し、濾過により固体を回収し、水（３００ｍＬ）で洗浄する。ＤＣＭ（２００ｍＬ）を固体に加え、氷水浴中で懸濁液を冷却し、ＴＨＦ（１２６ｍＬ、２５３ｍｍｏｌ）中の２．０ＭのＮ−メチルアミンの溶液で処理する。混合物をゆっくり室温に加温し、２時間撹拌する。減圧下で溶媒を除去し、メタノール（ＭｅＯＨ）（５０ｍＬ）で処理し、室温にて３０分間撹拌する。固体を濾過により回収し、ＭｅＯＨで洗浄する。固体をＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）で処理し、室温にて３０分間撹拌する。固体を濾過により回収し、ＥｔＯＡｃで洗浄して標題化合物（１９．８２ｇ、７３％収率）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３２３．０（Ｍ＋１）。
【００６０】
方法Ｂ：
反応容器に１５０ｇ（０．４４２ｍｏｌ、１．０当量、制限試薬）の７−メチル−２−（メチルチオ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イルトリフルオロメタンスルホネートを入れ、３０００ｍＬのＤＣＭを加えて清浄し、混合物を−５〜５℃に冷却する。１０５ｇ（０．４４２ｍｏｌ、１．０当量）のｍ−ＣＰＢＡを５℃以下で少しずつ加える。混合物を０〜５℃にて３〜４時間（Ｅ／Ａ＝１％）撹拌する。２ＭのＴＨＦ中の６６０ｍＬ（１．３２６ｍｏｌ、３．０当量）のメチルアミンを１０℃以下で滴下して加え、混合物を０〜１０℃にて３〜４時間撹拌する。１５００ｍＬのＤＣＭおよび１０００ｍＬのＨ２Ｏを撹拌しながら加え、水層を分離する。有機層を５００ｍＬのＨ２Ｏで４回洗浄し、４０℃以下で６００ｇに濃縮する。溶媒をｎ−ヘプタンと２回交換し、混合物を１０〜２０℃にて３〜４時間撹拌する。懸濁液を濾過する。１５０ｇのｎ−ヘプタンでリンスし、６５〜７５℃にて１０〜１６時間、減圧下で濾過ケーキを乾燥させて標題化合物を得る（１２９．６ｇ、８２％収率で９６．５％純度；ＬＣ−ＭＳ（ＭＳ＋＝３７１．８）；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ＝８．９３２（ｓ，１Ｈ），７．８６（ｍ，１Ｈ），５．７０７（ｓ，１Ｈ），３．１９２−３．１８０（ｄ，３Ｈ），２．７５４（ｓ，３Ｈ）。
【００６１】
調製例１２
Ｎ，７−ジメチルピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２−アミン
【化１３】
2015509536.tif 000014
アセトン（１００ｍＬ）中の４−アミノ−２−（メチルチオ）ピリミジン−５−カルバルデヒド（１０ｇ、５９．１ｍｍｏｌ）の溶液をＫＯＨ（３．３２ｇ、５９．１ｍｍｏｌ）で処理し、室温にて１０分間撹拌し、次いで濃縮乾固する。残渣をＥｔＯＡｃで処理し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、次いでブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて、濃縮して７−メチル−２−（メチルチオ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジンを得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：１９２．１（Ｍ＋１）。エタノール（３３％、８０ｍＬ）中のメチルアミンの溶液を加え、圧力管中で１１０℃にて一晩加熱する。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（５０〜１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して標題化合物（２工程にわたって６．７３ｇ、６５％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：１７５．１（Ｍ＋１）。
【００６２】
調製例１３
６−ブロモ−Ｎ，７−ジメチルピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２−アミン
【化１４】
2015509536.tif 000015
氷浴中でアセトニトリル（１６０ｍＬ）中のＮ，７−ジメチルピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２−アミン（６．７３ｇ、３８．６ｍｍｏｌ）の溶液を冷却し、アルミニウムホイルで光から保護する。Ｎ−ブロモスクシンイミド（６．８８ｇ、３８．６ｍｍｏｌ）を加え、０℃にて２時間撹拌する。反応物を５℃の冷蔵庫に４日間移す。固体を濾過により回収する。固体をＤＣＭで洗浄し、洗浄物を濃縮して標題化合物（３．０ｇ、３１％収率）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２５３．０／２５５．０（Ｍ＋１）。
【００６３】
実施例１
１−（３，３−ジメチルブチル）−３−（２−フルオロ−４−メチル−５−（７−メチル−２−（メチルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル）フェニル）尿素
【化１５】
2015509536.tif 000016
実施例１は方法Ａ、方法Ｂ、または方法Ｃで調製できる。
【００６４】
方法Ａ：
１，４−ジオキサン（５００ｍＬ）および水（１２５ｍＬ）中に１−（３，３−ジメチルブチル）−３−（２−フルオロ−４−メチル−５−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）尿素（２５．９ｇ、６８．５ｍｍｏｌ）、７−メチル−２−（メチルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イルトリフルオロメタンスルホネート（２２．０９ｇ、６８．５ｍｍｏｌ）、およびＮａＨＣＯ３（１７．２８ｇ、２０６ｍｍｏｌ）を合わせ、２０分間アルゴンを注入する。テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（３．９６ｇ、３．４３ｍｍｏｌ）を加え、次いで５０℃にてアルゴン下で加熱する。さらなる部の７−メチル−２−（メチルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イルトリフルオロメタンスルホネート（３００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）を加え、５０℃にて一晩加熱を継続する。混合物を室温に冷却し、固体を濾過により回収し、水、次いでジエチルエーテルで洗浄する。固体をアセトニトリル（５０ｍＬ）で処理し、スラリーを８０℃にて３０分間加熱する。固体を濾過により回収し、アセトニトリルで洗浄し、真空下で８０℃にて乾燥させて淡黄色の固体を得る。固体をＭｅＯＨ（５０ｍＬ）で処理し、混合物を８０℃にて１時間加熱する。室温に冷却し、濾過により固体を回収し、ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）で洗浄し、真空下で乾燥させて淡黄色の固体として標題化合物（２２．５ｇ、７７％収率）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４２５．２（Ｍ＋１）。
【００６５】
方法Ｂ：
ジオキサン（８０ｍＬ）および水（２０ｍＬ）中の１−（３，３−ジメチルブチル）−３−（２−フルオロ−４−メチル−５−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェニル）尿素（４．４８ｇ、１１．８ｍｍｏｌ）、６−ブロモ−Ｎ，７−ジメチルピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２−アミン（３．０ｇ、１１．８ｍｍｏｌ）およびＫ２ＣＯ３（４．９１ｇ、３５．６ｍｍｏｌ）の懸濁液にアルゴンを注入し、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．６８５ｇ、０．５９３ｍｍｏｌ）で処理し、８５℃にて一晩加熱する。ジオキサンを減圧下で除去し、混合物をＥｔＯＡｃおよびブラインで処理し、層を分離し、有機物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（４０％〜１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１００％のＥｔＯＡｃ、５％のＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ）により精製する。物質をＣＨ３ＣＮで処理し、８０℃にて１時間加熱し、室温に冷却し、固体を濾過により回収して淡黄色の固体として標題化合物（３．５２ｇ、７０％収率）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４２５．２（Ｍ＋１）。
【００６６】
方法Ｃ：
反応容器中で混合物溶媒、１，４−ジオキサン（１２５０ｇ）および水（２００ｇ）をＮ２で泡立てる。混合物を８０〜８５℃で加熱する。１００ｇ（０．３１ｍｏｌ、１．０当量、制限試薬）の７−メチル−２−（メチルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イルトリフルオロメタンスルホネート、１１７．４ｇ（０．３１ｍｏｌ、１．０当量）の１−（３，３−ジメチルブチル）−３−（２−フルオロ−４−メチル−５−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェニル）尿素、１２８．７ｇ（０．９３ｍｏｌ、３．０当量）のＫ２ＣＯ３および６．８１ｇ（０．００９３ｍｏｌ、０．０３当量）のＰｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２を窒素下で入れる。混合物を８０〜９０℃にて４〜６時間撹拌する。混合物を４０〜５０℃に冷却する。濃縮し、２０００ｇの水を３０℃以下で滴下して加える。添加後、混合物を１０〜３０℃にて６〜８時間撹拌する。濾過し、２００ｇの水でリンスし、次いでケーキを洗浄する。６０〜７０℃にて１４〜１６時間、減圧下で濾過ケーキを乾燥させて、Ｔｅｃｈ  Ｇｒａｄｅ  ＡＰＩの標題化合物（１５８ｇ、９０．４％純度、アッセイ：６３．４％、ＫＦ：５％〜６％）を得る。１０〜３０℃にて１０００ｍＬのＤＣＭおよび１０００ｍＬのＥｔＯＨ中にＴｅｃｈ  Ｇｒａｄｅ  ＡＰＩの標題化合物を溶解する。５０ｇのシリカゲル、８０ｇのＮａ２Ｓ２Ｏ３．５Ｈ２Ｏおよび１０ｇの活性炭を加える。混合物を４０〜５０℃に加熱し、３〜５時間撹拌し、１０〜３０℃に冷却する。濾過し、ケーキを２００ｇのＤＣＭ／ＥｔＯＨ（１：１）で洗浄する。４０〜５０℃にて５ｇのシリカチオールで撹拌し、濾過する。溶媒を３９０．０ｇのＥｔＯＨと２回交換する。濃縮し、懸濁液を濾過し、次いでケーキを３９．０ｇのＥｔＯＨで洗浄する。６５〜７５℃にて１４〜１６時間、濾過ケーキを減圧下で乾燥させてＡＰＩの標題化合物を得る（６１ｇ、９８．５％純度、アッセイ：９７．５％、６５％収率；１Ｈ  ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ，４００ＭＨｚ）：δ＝９．０７７（ｓ，１Ｈ），８．２７８（ｓ，１Ｈ），７．９６８−７．９４７（ｄ，１Ｈ），７．８９３（ｓ，１Ｈ），７．６８０（ｓ，１Ｈ），δ７．１９３−７．１６２（ｄ，１Ｈ），６．５１２−６．４８５（ｍ，１Ｈ），３．０８８−３．０３５（ｍ，２Ｈ），２．９２４−２．９１４（ｄ，３Ｈ），２．２９６（ｓ，３Ｈ），１．９５５（ｓ，３Ｈ），１．３４４−１．３０４（ｍ，２Ｈ），０．８７５（ｓ，９Ｈ）。
【００６７】
Ｘ線粉末回折
結晶性固体のＸＲＤパターンは、ＣｕＫａ源λ＝１．５４０６０Å）ならびに３５ｋＶおよび５０ｍＡで作動するＶａｎｔｅｃ検出器を備えたＢｒｕｋｅｒ  Ｄ４  Ｅｎｄｅａｖｏｒ  Ｘ線粉末回折計で得られる。試料を、２θにおいて０．００９°のステップサイズおよび０．５秒／ステップの走査速度で、ならびに０．６ｍｍ発散、５．２８固定散乱防止、および９．５ｍｍ検出器スリットで、２θにおいて４から４０°の間で走査する。乾燥粉末を石英試料ホルダに充填し、平滑面をスライドガラスを使用して得る。結晶形回折パターンを周囲温度および相対湿度にて収集する。結晶学の分野において、任意の所与の結晶形に関して、回折ピークの相対強度は、結晶形態および晶癖などの要因から得られる好ましい配向に起因して変化し得ることは周知である。好ましい配向の効果が存在する場合、ピーク強度は変化するが、多形体の特性ピーク位置は変化しない。例えば、Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ  ＃２３，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ  ＃１８，１８４３−１８４４ページ，１９９５を参照のこと。さらに、また、結晶学の分野において、任意の所与の結晶形に関して、角度ピーク位置はわずかに変化し得ることは周知である。例えば、ピーク位置は、試料が分析される温度もしくは湿度の変化、試料位置または内部標準の存在もしくは非存在に起因して移動し得る。存在する場合、２θにおいて±０．２のピーク位置変動性は、示した結晶形の明確な識別を妨げずにこれらの潜在的な変化を考慮に入れる。結晶形の確認は、識別ピーク（°２θの単位において）、典型的により突出したピークの任意の固有の組合せに基づいてなされてもよい。周囲温度および相対湿度で収集された結晶形回折パターンは、８．８５３および２６．７７４°２θにおいてＮＩＳＴ６７５標準ピークに基づいて調整される。
【００６８】
遊離塩基結晶性固体
したがって、実施例１の遊離塩基結晶固体の調製した試料を、０．２°の回折角についての許容度で以下の表１に記載されている回折ピーク（２θ値）を有するとして、特に６．９、７．０、１８．２および２３．２からなる群から選択されるピークの１つ以上と組み合わせて１６．０におけるピークを有するとしてＣｕＫａ放射線を使用してＸＲＤパターンによって特徴付ける。
【００６９】
【表１】
2015509536.tif 000017
【００７０】
不十分な可溶性化合物の生物学的利用能は、それをポリマーマトリクス中で固体分散物として配合することによって増強され得ることが一般に知られている。そのような固体分散物は、薬物ポリマー混合物を融解（融合）し、続いて急速冷却により（例えば、ホットメルト押出などのプロセスを使用する）均一な溶解混合物を凝固することによって、または適切な有機溶媒中で薬物およびポリマーを溶解し、続いて蒸発（例えば噴霧乾燥）もしくは逆溶剤を使用した沈殿によって溶媒を除去することによって調製される不活性担体マトリクス中の薬物の分散物である。固体分散物は典型的に薬物を非晶形にし、その結果、分散されていない結晶薬物と比べて、不十分な可溶性化合物の増強された経口生物学的利用能を導く、より急速な溶解速度および／または過飽和のより高い程度（範囲）および持続時間を生じる。固体分散物に首尾良く使用されるポリマーには、（限定されないが）ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルピロリドン−酢酸ビニル（ＰＶＰ−ＶＡ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート（ＨＰＭＣＡＳ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ−５５）、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）、およびＥｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）ＥＰＯが含まれる。
【００７１】
固体分散物の物理および化学的安定性はこのような製剤の適合性における要因である。薬物負荷は、薬物の準安定非晶質形の物理的安定性およびそのインビボ性能に影響を与え得る別の可変物である。ヒトに固体分散物を投与するための好ましい方法は、このような剤形の製造および性能に適した、薬学的に許容可能な担体、および任意に他の賦形剤を加えることによって、それをカプセル剤、錠剤、または他の固体投薬形態としてさらに製剤化することによる。固体分散物は、適切なビヒクル中の懸濁剤、または（限定されないが）錠剤、サシェ剤、顆粒、散剤などの任意の他の経口医薬剤形として、粉末または粒状混合物をカプセルに充填することによって投与されてもよい。
【００７２】
その不十分な溶解性から生じる実施例１の低い生物学的利用能に起因して、イヌおよびラットの小さな動物研究においておよび臨床試験について標的露出を達成することが可能な製剤が望まれる。中性ポリマーＰＶＰ−ＶＡ（Ｋｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）ＶＡ６４）は、加速安定性試験下（４０℃；１ヶ月にわたって相対湿度７５％）、および周囲条件下の長期間の保存時（２０％薬物負荷について１１ヶ月および４０％薬物負荷について１０ヶ月）に化学的および物理的の両方で安定な固体分散物を生じた。
【００７３】
組成物実施例１：実施例１：ＰＶＰ−ＶＡ（２０：８０）を含有する２０％固体分散物
結晶性の実施例１を固体分散物の調製のために使用する。ポリビニルピロリドン酢酸ビニル（ＰＶＰ−ＶＡ）は、ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のＫｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）ＶＡ６４という商標名で市販されている。溶媒は、等体積のジクロロメタン（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびメタノール（ＯｍｎｉＳｏｌｖ）を混合することによって調製される１：１のジクロロメタンとメタノールである。ラウリル硫酸ナトリウム（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）は市販されている。
【００７４】
手順：固体分散物が調製され、２つのサブバッチにおいて噴霧乾燥される。第１のサブバッチに関して、実施例１（２２．２２ｇ）は２０００ｍＬボトルに加えられる。１１８０ｍＬの溶媒（ジクロロメタン：メタノール、１：１）が加えられ、全ての化合物が溶解されるまで試料バッチは約２０分間超音波処理され、１９ｍｇ／ｍＬの理論的濃度が得られる。この溶液に、８８．８６ｇのＰＶＰ−ＶＡが加えられ、均一な溶液が得られるまで混合することによって溶解される。ジクロロメタン：メタノール（１：１）中の実施例１およびＰＶＰ−ＶＡ（２０：８０）の溶液は、ミニスプレー乾燥器（Ｂｕｃｈｉ  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｒａｙ  Ｄｒｙｅｒ２９０）を使用して噴霧乾燥される。溶液流速は、３７〜５５℃の排出口温度を生じる１００℃〜１１０℃に設定した注入口温度で９〜１２ｍｌ／分である。第２のサブバッチについて、実施例１（３４．６２ｇ）は２０００ｍＬボトルに加えられる。１８２０ｍＬの溶媒（ジクロロメタン：メタノール、１：１）が加えられ、全ての化合物が溶解されるまで試料バッチは約２０分間超音波処理され、１９ｍｇ／ｍＬの理論的濃度が得られる。この溶液に、１３８．４８ｇのＰＶＰ−ＶＡが加えられ、均一な溶液が得られるまで混合することによって溶解される。ジクロロメタン：メタノール（１：１）中の実施例１およびＰＶＰ−ＶＡ（２０：８０）の溶液はミニスプレー乾燥器（Ｂｕｃｈｉ  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｒａｙ  Ｄｒｙｅｒ２９０）を使用して噴霧乾燥される。溶液流速は、６２〜７０℃の排出口温度を生じる１００℃〜１１０℃に設定した注入口温度で１４〜１５ｍｌ／分である。両方のサブバッチから回収される噴霧乾燥した物質を混合し、４０〜６０℃の真空オーブン中で一晩さらに乾燥させ、次いで室温にて別の日に真空下で保存する。
【００７５】
実施例１：ＰＶＰ−ＶＡ（２０：８０）を含有する２３６．２８ｇの固体分散物に、４．２７８ｇのラウリル硫酸ナトリウムを加え、スパチュラを使用して大きな結晶化ディッシュ中で完全に混合して、９８％固体分散物プラス２％ラウリル硫酸ナトリウムを含有する最終組成物を得る。
【００７６】
この製剤は、混合した粉末をカプセル剤に充填することによって、または例えば、１％ヒドロキシエチルセルロース／０．２５％ポリソルベート８０／０．０５％Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ消泡剤１５１０−ＵＳのビヒクル中に懸濁することによって懸濁剤として投与され得る。
【００７７】
組成物実施例２：実施例１：ＰＶＰ−ＶＡ（４０：６０）を含有する４０％固体分散物
結晶性実施例１、ポリビニルピロリドン酢酸ビニル（ＰＶＰ−ＶＡ）、溶媒、およびラウリル硫酸ナトリウムは、組成物実施例１に記載されている通りである。
【００７８】
手順：固体分散物を、３．７９ｇの実施例１、適切な量の溶媒（ジクロロメタン：メタノール、１：１）を使用して実質的に組成物実施例１について記載されている噴霧乾燥プロセスによって調製して、２０ｍｇ／ｍｌ濃縮液を得る。この溶液に、５．６８ｇのＰＶＰ−ＶＡを加え、均一な溶液が得られるまで混合することによって溶解する。溶液を実質的に組成物実施例１について記載されている通りに噴霧乾燥する。溶液流速は２ｍｍシリコーン管を使用して４０％に設定し、注入口温度は８０℃に設定し、３４℃の排出口温度を生じる。噴霧乾燥した物質を回収し、さらに室温にて１４時間真空オーブン中で乾燥させ、乾燥剤の存在下でゆっくり窒素を供給する。
【００７９】
実施例１：ＰＶＰ−ＶＡ（４０：６０）を含有する６．６４ｇの固体分散物に、０．０６６５ｇのラウリル硫酸ナトリウムを加え、スパチュラを使用してジャー内で完全に混合し、９９：１の比で固体分散物およびラウリル硫酸ナトリウムを含有する最終組成物を生じる。
【００８０】
この製剤は、混合された粉末をカプセル内に充填することによって、または例えば１％ヒドロキシエチルセルロース／０．２５％ポリソルベート８０／０．０５％Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ消泡剤１５１０−ＵＳのビヒクル中に懸濁することによって懸濁剤として投与され得る。
【００８１】
癌は疾患の不均一な集まりとしてますます認識されており、その開始および進行は、ＤＮＡ修復、ゲノム安定性、細胞増殖、細胞死、接着、血管形成、浸潤、ならびに細胞および組織微環境内の転移を調節する１つ以上の遺伝子の異常機能によって誘導される。「癌」遺伝子のバリアントまたは異常機能は、天然に存在するＤＮＡ多型、ゲノムコピー数の変化（増幅、欠失、染色体消失、または複製による）、遺伝子および染色体構造の変化（染色体転座、反転、または無秩序な遺伝子発現を導く他の再配列による）、ならびに点突然変異から生じ得る。癌性腫瘍は、１つの異常な遺伝子機能によって誘導され得、同じ異常遺伝子の機能、または維持および進行によって維持され得、さらなる異常遺伝子機能によって悪化され得る。
【００８２】
上述の遺伝的染色体異常以外に、癌の各々はまた、ＤＮＡメチル化、ゲノムインプリンティングを含むゲノムの後成的修飾、およびアセチル化、メチル化、またはリン酸化によるヒストン修飾を含んでもよい。後成的修飾は悪性腫瘍の誘導および／または維持において役割を果たし得る。
【００８３】
ヒト癌における細胞遺伝学的異常の広範なカタログが蓄積され、維持され、定期的にオンラインでアップデートされている（米国国立癌研究所（ＮＣＩ）のＣａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｔｏｍｙ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  （ＣＧＡＰ）  Ｗｅｂ  ｓｉｔｅ：ｈｔｔｐ：／／ｃｇａｐ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおけるＴｈｅ  Ｍｉｔｅｌｍａｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒを参照のこと）。このデータベースは本発明の悪性腫瘍の少なくとも一部についての染色体異常を含む。Ｔｈｅ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔは、腫瘍形成に原因として関連している全てのヒト遺伝子の詳細なオンライン「Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｃｅｎｓｕｓ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＣＧＰ／Ｃｅｎｓｕｓを参照のこと）およびヒト癌における体細胞変異のＣＯＳＭＩＣ（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｓｔｏｍａｔｉｃ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＣＧＰ／ｃｏｓｍｉｃを参照のこと）を維持している。種々の癌に原因として関連している細胞遺伝学的変化についての豊富な情報を含むさらなるソースは、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  （ｈｔｔｐ：／／ａｔｌａｓｇｅｎｅｔｉｃｓｏｎｃｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ／／Ａｎｏｍａｌｉｅｓ／Ａｎｏｍｌｉｓｔｅ．ｈｔｍｌ＃ＭＤＳ）である。これらのデータベースはまた、本発明の悪性腫瘍の少なくとも一部についての染色体異常を含む。
【００８４】
生検、免疫表現型検査および他の試験による癌性悪性腫瘍の診断は公知であり、慣用的に使用されている。高解像度の染色体分析法および高度染色体画像化技術に加えて、癌の疑似患者における染色体異常が、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、染色体分析、スペクトル核型決定（ＳＫＹ）、マルチプレックスＦＩＳＨ（Ｍ−ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ  Ｃｈｉｐｓ）ならびに当業者に公知であり、使用されている他の診断および分析試験などの細胞遺伝学的解析により決定され得る。
【００８５】
Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＭＡＰＫシグナル伝達経路は細胞外刺激を核に中継し、それにより、細胞増殖、分化およびアポトーシスを含む多様な細胞応答を調節する。遺伝子変化などの異常なＭＡＰＫシグナル伝達によるこれらのプロセスの撹乱は、多くの場合、悪性転換を導く。腫瘍におけるこのシグナル伝達経路の重要性は、種々のヒト悪性腫瘍においてこの経路を活性化する多くの変異対立遺伝子の発見により証明されている。ＥＧＦＲおよびｃＭｅｔなどの受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）における発癌性突然変異、またはＲＴＫの過剰発現およびそれらのリガンドは、Ｒａｓおよびその下流成分を異常に活性化する。Ｒａｓ変異を活性化することは約３０％のヒトの癌において検出されている。これらの変異はＧＴＰａｓｅ活性を著しく減少させ、それによりＲａｓをＧＴＰ結合および活性状態にする。哺乳動物において、Ｒａｓファミリーは３つの遺伝子：Ｋ−Ｒａｓ、Ｎ−ＲａｓおよびＨ−Ｒａｓからなる。Ｋ−Ｒａｓは、多くの場合、膵癌、肺癌および結腸直腸癌などの上皮癌において変異されるのに対して、Ｎ−Ｒａｓ変異は、多くの場合、黒色腫、肝臓および骨髄（ＡＭＬ、ＣＭＬ）悪性腫瘍において発生する。Ｂ−Ｒａｆの変異、Ｒａｆファミリーのメンバーを活性化することは、高い頻度で黒色腫および甲状腺癌において、ならびにより少ない程度で結腸直腸癌、卵巣癌および肺癌において発見されている。ＭＥＫ１およびＭＥＫ２の体細胞変異は黒色腫患者において識別されている。最終的に、Ｓｐｒｏｕｔｙファミリーのメンバー、およびＮＦ１などのＧＡＰ（ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質）などの負の調節因子の損失はこの経路を間接的に活性化し得る。多くの腫瘍は、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＭＡＰＫ経路の調節解除を示し、治療的介入についての魅力的な標的になると考えられている。
【００８６】
Ｒａｆタンパク質は、３つの膜、Ａ−Ｒａｆ、Ｂ−ＲａｆおよびＣ−Ｒａｆ（Ｒａｆ１とも呼ばれる）から構成され、Ｒａｓから下流の成分ＭＥＫ１／２およびＥＲＫ１／ＥＲｋ２にシグナルを伝達する際に極めて重要な役割を果たす。Ｒａｆタンパク質キナーゼは、腫瘍細胞増殖、生存、侵入および血管形成を含む腫瘍形成において役割を果たすことが示されている（Ｓｅｂｏｌｔ−Ｌｅｏｐｏｌｄら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ、２００４、４：９３７−９４７；Ｗｅｌｌｂｒｏｃｋら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２００４、５：８７５−８８５）。ＲＴＫおよびＲａｓ変異の変異または過剰発現などの多重機構による腫瘍細胞におけるＭＡＰＫ経路活性化は全てＲａｆタンパク質を介する。より重要なことに、Ｂ−ＲＡＦの変異の活性化は（Ｄａｖｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、２００２、４１７：９４９−９５４）、多くの場合、黒色腫、結腸直業癌、肺癌、卵巣癌および甲状腺癌を含むいくつかの悪性腫瘍において観察される。Ｂ−Ｒａｆ変異のほとんど９０％はエクソン１５におけるＴ１７９９Ａ変化であり、その結果、ＶａｌをＧｌｕアミノ酸に置換する（Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ）。Ｂ−Ｒａｆにおけるこの変異は、野生型タンパク質、および悪性転換のものより約５００倍高い構成的キナーゼ活性を導く。Ｔ５２９Ｉ、トレオニンからイソロイシンへのＢ−Ｒａｆゲートキーバー変異およびＧ４６８Ａ、エクソン１１におけるＧ１４０３ＣでのＢ−Ｒａｆ二次変異などのさらなる変異もまた知られており、悪性転換を生じ、維持し、または悪化する際に役割を果たすと考えられる（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒら、Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．、２０１０、２（３５）ｒａ４１；Ｗａｎら、Ｃｅｌｌ、２００４、１１６：８５５−８６７）。
【００８７】
最近、Ｂ−Ｒａｆ特異的キナーゼ阻害剤ベムラフェニブ（ＰＬＸ−４０３２とも呼ばれる）は、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ変異を有する黒色腫患者を治療するために米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により承認された。ベムラフェニブは効果的であり、これらの患者において生存利益を提供する。しかしながら、この薬物に反応する患者は一般に、平均７ヶ月で疾患再発を導く薬物耐性を生じる。多くの他の標的治療と同様に、Ｂ−ＲＡＦ阻害に対する獲得耐性はこの患者集団において長期の生存利益に対する治療課題を示す。
【００８８】
Ｂ−Ｒａｆ阻害剤の利点を改善するために、黒色腫細胞を発現する変異Ｂ−ＲＡＦをベムラフェニブに対して耐性にする機構を識別する研究が続けられている。最近の研究により、ＭＡＰＫ経路の再活性化がＢ−ＲＡＦ阻害に対する耐性の機構であることが識別されている。耐性機構は主に、Ｎ−Ｒａｓ活性化などのＲａｓ／ＲＡＦ依存（Ｎａｚａｒｉａｎら、Ｎａｔｕｒｅ．２０１０、４６８：９７３−７）、Ｈ−Ｒａｓ活性化（Ｓｕら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１２、３６６：２０７−２１５）またはＣ−ＲＡＦ上方制御（Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ．２０１０、４６８：９６８−７２；Ｍｏｎｔａｇｕｔら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００８、６８：４８５３−６１）、Ｂ−ＲＡＦ  Ｖ６００Ｅの異常にスプライスされたバリアント（Ｐｏｕｌｉｋａｋｏｓら、Ｎａｔｕｒｅ．２０１１、４８０：３８７−３９０）またはＲａｓ／ＲＡＦ独立（Ｔｐｌ２／ＣＯＴ過剰発現）（Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｅｎ  ｅｔら、Ｎａｔｕｒｅ．２０１０、４６８：９６８−７２）のいずれかであるバイパス機構を介するＥＲＫシグナル伝達の再活性化に関与する。したがって、多重機構はＢ−ＲＡＦ変異癌におけるＭＡＰＫシグナル伝達に対するＢ−ＲＡＦ阻害の効果を減衰できる。ＢＲＡＦ阻害に対して耐性を生じ得るＢ−ＲＡＦのゲートキーパー変異（Ｔ５２９Ｉ）はまだ臨床的に識別されていないが、そのような変異は耐性を引き起こすことが実験的に証明されている（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒら、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１０、２（３５）：ｒａ４１）。最近の研究によりまた、ＩＧＦ−１ＲまたはＰＤＧＦＲβなどのＲＴＫによるＭＡＰＫ冗長シグナル伝達経路の活性化はＢ−ＲＡＦ阻害に対する獲得耐性において役割を果たすことができることが示唆されている（Ｎａｚａｒｉａｎら、Ｎａｔｕｒｅ．２０１０、４６８：９７３−７；Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．２０１０、１８：６８３−９５；Ｓｈｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１１、７１：５０６７−７４）。ＭＡＰＫ再活性化は多くのこれらの耐性機構に関与していることは明確である。ｐａｎ  Ｒａｆ阻害剤はＭＡＰＫ再活性化を遮断することが予想される。
【００８９】
さらに、ベムラフェニブおよびその近い類似体Ｎ−［３−（５−クロロ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−カルボニル）−２，４−ジフルオロフェニル］プロパン−１−スルホンアミド（ＰＬＸ４７２０；市販の選択的Ｂ−Ｒａｆ阻害剤）を含むＢ−Ｒａｆ特異的阻害剤は、Ｂ−Ｒａｆ野生型バックグラウンドにおける他のＲａｆアイソフォームとの二量化によるパラドキシカル（ｐａｒａｄｏｘｉｃａｌ）経路活性化を誘導することが実証された（Ｈａｔｚｉｖａｓｓｉｌｉｏｕ  Ｇら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１０、４６４：４３１−４３５；Ｐｏｕｌｉｋａｋｏｓら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１０、４６４：４２７−４３０；Ｈｅｉｄｏｒｎら、Ｃｅｌｌ、２０１０、１４０：２０９−２２１）。ベムラフェニブは、Ｂ−Ｒａｆ野生型を結合することおよびＢ−Ｒａｆ−Ｃ−Ｒａｆ二量化を刺激することによりＲａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路を活性化すると考えられる。Ｂ−Ｒａｆ特異的阻害によるこのパラドキシカル経路活性化は、ベムラフェニブで治療した一部の黒色腫患者における皮膚副作用（扁平上皮癌など）の主な理由であると考えられる。ベムラフェニブは、この遺伝的背景におけるそのパラドキシカル経路活性化活性に起因するＢ−Ｒａｆ野生型遺伝的背景を有する癌患者の治療のために承認されていない。
【００９０】
試験した例示的な化合物は、Ａ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ、Ｃ−Ｒａｆ、およびＢ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ変異を含むＲａｆタンパク質の全てのアイソフォームを阻害するＲａｆキナーゼ阻害剤である。そのｐａｎ  Ｒａｆ活性に起因して、試験した例示化合物は、Ｎ−Ｒａｓ変異およびＫ−Ｒａｓ変異（両方ともＢ−Ｒａｆ野生型遺伝的背景を有する）などの上流のシグナル伝達によるＭＡＰＫ経路活性化を有する腫瘍細胞に対して活性である。したがって、試験した例示化合物は、Ｂ−Ｒａｆ変異（黒色腫、結腸直腸癌、肺癌、卵巣癌および甲状腺癌など）、Ｎ−Ｒａｓ変異、Ｂ−Ｒａｆ野生型（黒色腫、ＡＭＬ、ＣＭＬ、ＡＬＬ、ＣＬＬ、肝臓癌など）（Ｓｃｈｕｂｂｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ、２００７、７：２９５；Ｐｙｌａｙｅｖａ−Ｇｕｐｔａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ、２０１１、１１：７６１）；またはＫ−Ｒａｓ変異、Ｂ−Ｒａｆ野生型（胆管、頸部、結腸直腸、子宮内膜、肺、卵巣、膵臓、および肝臓など；Ｓｃｈｕｂｂｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ、２００７、７：２９５；Ｐｙｌａｙｅｖａ−Ｇｕｐｔａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ、２０１１、１１：７６１）またはＲＴＫ変異／過剰発現の上流の活性化を含むＲａｆ活性化の他の機構を有する癌患者を治療する可能性を有する。試験した例示化合物はまた、ベムラフェニブに対して耐性を生じる黒色腫細胞に対して活性である。したがって、試験した例示化合物は、ベムラフェニブまたは他のＢ−Ｒａｆ阻害剤を失敗した黒色腫患者に効果的であると考えられる。
【００９１】
試験した例示化合物はまた、ｃ−Ｋｉｔの阻害剤である。Ｃ−Ｋｉｔは、未分化造血細胞、メラニン細胞および胚細胞の機能を正常に制御する受容体チロシンキナーゼである。そのリガンド幹細胞因子（ＳＣＦ）との結合後、ｃ−Ｋｉｔは二量化／オリゴマー化および自己リン酸化を受ける。ｃ−Ｋｉｔを構成的に活性化するｃ−Ｋｉｔの遺伝子変異（Ｌ５７６Ｐ、Ｋ６４２Ｅ、Ｔ６７０Ｉ、およびＶ６５４Ａなど）は、黒色腫、急性骨髄性白血病、および消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）を導き得るので、試験した例示化合物は、黒色腫、急性骨髄性白血病およびＧＩＳＴ患者を治療する可能性を有する（Ｌｅｎｎａｒｔｓｓｏｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ、２００６、６：６５）。
【００９２】
例示化合物は、癌患者を治療するための単一薬剤として、または１種以上の他の承認された薬物と組み合わされて使用され得る。これらの癌患者には、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ変異を有する黒色腫患者、ベムラフェニブまたは他のＢ−Ｒａｆ阻害剤を失敗した黒色腫患者、Ｎ−Ｒａｓ変異Ｂ−Ｒａｆ野生型を有する黒色腫患者、ｃ−Ｋｉｔ過剰発現またはｃＫｉｔ変異を有する黒色腫患者；Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ変異またはＫ−Ｒａｓ変異Ｂ−Ｒａｆ野生型を有する結腸直腸癌患者；Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ変異またはＫ−Ｒａｓ変異Ｂ−Ｒａｆ野生型を有する卵巣癌患者；Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ変異またはＫ−Ｒａｓ変異Ｂ−Ｒａｆ野生型を有する肺癌患者；Ｎ−Ｒａｓ変異Ｂ−Ｒａｆ野生型、またはｃ−Ｋｉｔ過剰発現もしくはｃ−Ｋｉｔ変異を有する骨髄性白血病患者；Ｎ−ＲａｓまたはＫ−Ｒａｓ変異Ｂ−Ｒａｆ野生型を有する肝臓癌患者；Ｋ−Ｒａｓ変異Ｂ−Ｒａｆ野生型を有する膵臓癌患者；Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００ＥまたはＮ−Ｒａｓ変異Ｂ−Ｒａｆ野生型を有する甲状腺癌患者；Ｋ−Ｒａｓ変異Ｂ−Ｒａｆ野生型を有する胆管癌患者；ｃ−Ｋｉｔ変異または過剰発現を有するＧＩＳＴ患者が含まれる。
【００９３】
以下のインビトロおよびインビボ研究により、例示化合物のＲａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路のシグナル伝達阻害活性が実証される。これらのアッセイは一般にヒト臨床的化学療法活性の指標として当業者により認識されている。ｐａｎ  Ｒａｆ阻害および経路シグナル伝達阻害活性を証明するアッセイは、実質的に以下のように、または類似データに影響を与える類似アッセイによって実施され得る。他に記載されない限り、報告されるＩＣ５０値は絶対である。
【００９４】
Ｂ−Ｒａｆ、Ｃ−ＲａｆおよびＢ−Ｒａｆ変異のキナーゼ活性の酵素アッセイ
試験化合物は、ヒト野生型Ｂ−Ｒａｆ、ヒト野生型Ｃ−Ｒａｆ、ヒトＢ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ、ヒトＢ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ＋Ｔ５２９ＩまたはヒトＢ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ＋Ｇ４６８Ａに対するその阻害活性について評価される。Ｔ５２９ＩはトレオニンからイソロイシンのＢ−Ｒａｆゲートキーパー変異であり、Ｇ４６８Ａはエクソン１１におけるＧ１４０３ＣでのＢ−Ｒａｆ二次変異である。Ｂ−Ｒａｆ、Ｃ−ＲａｆおよびＢ−Ｒａｆ変異の酵素アッセイは、ＡＴＰの存在下で、向上したＡＴＰ加水分解を触媒する、ＲａｆおよびＭＥＫ１複合体の特性を評価する（Ｒｏｍｉｎｇｅｒら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２００７、４６４：１３０−１３７；米国特許公開第２００６／０２１１０７３）。形成されるＡＤＰは、３４０ｎｍでの吸光度により分光光度的にモニターされ、検出され得る、ＮＡＤＨ酸化の形態の周知の結合されたＰＫ／ＬＤＨ（ピルビン酸キナーゼ／乳酸脱水素酵素）システムによりモニターされる（Ａ３４０；この方法の原理については、Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０００、２８９：１９３８−１９４２を参照のこと）。Ｒａｆ活性化ＭＥＫ１  ＡＴＰａｓｅ活性はＲａｆタンパク質の全ての形態により共有される特性である。
【００９５】
Ｒａｆタンパク質の発現および精製
一般に、細胞株は、当業者に公知で、慣用的に使用される手順によって市販の物質を使用して生成される。完全長Ｂ−Ｒａｆ野生型ＤＮＡ（国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）、参照配列ＮＣ＿０００００７．１３）、Ｃ−Ｒａｆ（国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）、参照配列ＮＣ＿０００００３．１１）およびＡ−Ｒａｆ（国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）、参照配列ＮＣ＿００００２３．１０）をコードするヌクレオチド配列は公知である。例えば、Ｂ−Ｒａｆに関して：Ｓ．Ｉｋａｗａら、「Ｂ−ｒａｆ，ａ  ｎｅｗ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒａｆ  ｆａｍｉｌｙ，ｉｓ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ」  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，８（６）：２６５１−４（１９８８）；Ｃ−Ｒａｆに関して：Ｍ．  Ｆｕｋｕｉら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｃ−ｒａｆ−１  ｇｅｎｅ」、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，７（５）：１７７６−８１（１９８７）；Ｂｏｎｎｅｒら、「Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｒａｆ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃ−ｒａｆ−１  ｇｅｎｅ」  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１４（２），１００９−１０１５（１９８６）；ＭＥＫ１に関して：Ｃ．Ｆ．Ｚｈｅｎｇら、「Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｈｕｍａｎ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｋｉｎａｓｅｓ，ＭＥＫ１  ａｎｄ  ＭＥＫ２」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８（１５）、１１４３５−１１４３９（１９９３）；ｔａｇ情報に関して：Ｊ．Ｔｓａｉら、「Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  Ｂ−Ｒａｆ  ｋｉｎａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｔｉｍｅｌａｎｏｍａ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１０５（８）、３０４１−３０４６（２００８）；Ｇ．Ｈａｔｚｉｖａｓｓｉｌｉｏｕら、「ＲＡＦ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｐｒｉｍｅ  ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ＲＡＦ  ｔｏ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ｔｈｅ  ＭＡＰＫ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｇｒｏｗｔｈ」  Ｎａｔｕｒｅ、４６４（７２８７）、４３１−４３５（２０１０）も参照のこと。
【００９６】
Ｎ末端精製タグを含有するＢ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ（Ｖ６００Ｅ変異を含有する残基４３３−７２６）は、実質的に上記のように発現され、精製される（Ｗａｎら、Ｃｅｌｌ、２００４、１１６、８５５−８６７）。
【００９７】
二次Ｔ５２９Ｉ変異またはＧ４６８Ａ変異を含有するＢ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ構築物は、基礎ｂＲａｆ（４３３−７２６、Ｖ６００Ｅ）構築物の部位特異的突然変異誘発法（Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）によって生成される。
【００９８】
本明細書に使用される配列は、Ｎ末端精製タグを有さないＢ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ（Ｖ６００Ｅ変異を含有する残基４３３−７２６）；Ｎ末端精製タグを有さないＢ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ（Ｖ６００ＥおよびＴ５２９Ｉ変異を含有する残基４３３−７２６）；Ｎ末端精製タグを有さないＢ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ（Ｖ６００ＥおよびＧ４６８Ａ変異を含有する残基４３３−７２６）；ＢＲＡＦ−Ｖ６００Ｅ；ＢＲＡＦ−Ｖ６００Ｅ＋Ｔ５２９Ｉ；ＢＲＡＦ−Ｖ６００Ｅ＋Ｇ４６８Ａ；ＢＲＡＦ−野生型、完全長；Ｃ−ＲＡＦ；スクリーニングのために使用されるＭＥＫ１タンパク質配列を含む。
【００９９】
Ｒａｆキナーゼ活性を測定する酵素アッセイ
試験化合物を、野生型Ｂ−Ｒａｆ、野生型Ｃ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ＋Ｔ５２９ＩおよびＢ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ＋Ｇ４６８Ａに対するその阻害活性について評価する。Ｔ５２９ＩはＢ−Ｒａｆゲートキーパー変異であり、Ｇ４６８ＡはＢ−Ｒａｆ二次変異である。Ｂ−Ｒａｆ、Ｃ−ＲａｆおよびＢ−Ｒａｆ変異の酵素アッセイは、ＡＴＰの存在下で、向上したＡＴＰ加水分解を触媒する、ＲａｆおよびＭＥＫ１複合体の特性を評価する（Ｒｏｍｉｎｇｅｒら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２００７、４６４：１３０−１３７）。形成されるＡＤＰは、３４０ｎｍでの吸光度によってモニターされ、検出され得る、ＮＡＤＨ酸化の形態において周知の結合したＰＫ／ＬＤＨ（ピルビン酸キナーゼ／乳酸脱水素酵素）系によってモニターされる（Ａ３４０；この方法の原理に関して、Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０００、２８９：１９３８−１９４２を参照のこと）。Ｒａｆ活性化ＭＥＫ１  ＡＴＰａｓｅ活性はＲａｆタンパク質の全ての形態によって共有される特性である。Ｂ−Ｒａｆ野生型酵素アッセイにおいて、反応混合物は、１．２ｎＭのＢ−Ｒａｆ、３０ｎＭのＭＥＫ１、１０００μＭのＡＴＰ、３．５ユニット（１００μｌ当たり）のＰＫ、５ユニット（１００μｌ当たり）のＬＤＨ、１ｍＭのホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、および２８０μｍのＮＡＤＨを含有する。Ｃ−Ｒａｆアッセイにおいて、反応混合物は、０．６ｎＭのＣ−Ｒａｆ、２６ｎＭのＭＥＫ１、２０００μＭのＡＴＰ、ならびに上記と同じ量のＰＫ、ＬＤＨ、ＰＥＰおよびＮＡＤＨを含有する。Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅアッセイにおいて、反応混合物は、１．６μＭのＢ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ、２６ｎＭのＭＥＫ１、２００μＭのＡＴＰならびに上記と同じ量のＰＫ、ＬＤＨ、ＰＥＰおよびＮＡＤＨを含有する。Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ＋Ｔ５２９Ｉアッセイにおいて、反応混合物は、６．２ｎＭのＢ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ＋Ｔ５２９Ｉ、３０ｎＭのＭＥＫ１、２００μｍのＡＴＰならびに上記と同じ量のＰＫ、ＬＤＨ、ＰＥＰおよびＮＡＤＨを含有する。Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ＋Ｇ４６８Ａアッセイにおいて、反応混合物は、３．５ｎＭのＢ−Ｒａｆ、３０ｎＭのＭＥＫ１、２００μＭのＡＴＰならびに上記と同じ量のＰＫ、ＬＤＨ、ＰＥＰおよびＮＡＤＨを含有する。全てのアッセイは、上記の混合物を試験化合物と混合することによって開始され、連続して約５時間、Ａ３４０にてモニターする。３〜４時間の時間枠にて反応データを収集してＩＣ５０値を計算する。
【０１００】
実施例１に関して、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅについての酵素ＩＣ５０の結果は６ｎＭであり、Ｃ−Ｒａｆについては１５ｎＭである。これらのデータにより、これらのアッセイにおいて例示化合物がＢ−Ｒａｆ  Ｖ６００ＥおよびＣ−Ｒａｆを阻害することが証明される。
【０１０１】
実施例１は、上記と実質的に同様の方法によって実施されるさらなる酵素アッセイにおいて評価される。実施例１は、それぞれ９．８、１５．４７および１６．９ｎＭのＩＣ５０値で野生型Ｂ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ＋Ｔ５２９ＩおよびＢ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ＋Ｇ４６８Ａを阻害する。これらのデータにより、これらのアッセイにおいて実施例１がＢ−Ｒａｆ阻害剤であることが証明される。
【０１０２】
ｃ−Ｋｉｔキナーゼ活性の酵素アッセイ
ｃ−Ｋｉｔは重要な癌遺伝子であり、その過剰発現および遺伝子変異は、多くの場合、黒色腫および消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）患者において発生する。ｃ−Ｋｉｔ酵素アッセイにおいて、ヒトｃ−Ｋｉｔによって触媒されるＡＴＰによるポリＥ４Ｙのリン酸化は分光光学的にモニターされる。キナーゼ反応から生成されるＡＤＰは、ＮＡＤがピルビン酸塩およびＮＡＤＨから形成されるピルビン酸キナーゼ／乳酸脱水素酵素（ＰＫ／ＬＤＨ）反応に関連する。ＮＡＤＨは、Ｂ−Ｒａｆ、Ｃ−ＲａｆおよびＢ−Ｒａｆ変異のキナーゼ活性の酵素アッセイについて上記のように３４０ｎｍでの吸光度によって検出され得る。
【０１０３】
ｃ−Ｋｉｔ野生型受容体の発現および精製
一般に、細胞株は、当業者に公知で、慣用的に使用される手順によって市販の物質を使用して生成される。
【０１０４】
完全長ヒト野生型ｃ−Ｋｉｔ受容体ＤＮＡをコードするヌクレオチド配列（国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）、参照配列ＮＣ＿０００００４．１１）は公知である。例えば、ヒトｃＫｉｔタンパク質配列に関して：Ｙ．Ｙａｒｄｅｎ，Ｙ．ら、「Ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｃ−ｋｉｔ：  ａ  ｎｅｗ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｆｏｒ  ａｎ  ｕｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｌｉｇａｎｄ」、ＥＭＢＯ  Ｊ．６（１１）、３３４１−３３５１（１９８７）；ＧＳＴ融合タンパク質に関して：Ｄ．Ｂ．Ｓｍｉｔｈら、「Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｓ  ｆｕｓｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ」、Ｇｅｎｅ  ６７（１９８８）３１−４０；Ｄ．Ｂ．  Ｓｍｉｔｈ、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４（１９９３）２２０−２２９も参照のこと。
【０１０５】
ｃ−Ｋｉｔアッセイ
アッセイ反応混合物は、６ｎＭのヒト野生型ｃ−ＫＩＴ、１ｍｇ／ｍＬのポリ（Ｇｌｕ、Ｔｙｒ）（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭのホスホエノール−ピルビン酸、２８０μＭのＮＡＤＨ、５Ｕ／３．５Ｕ（１００μｌ当たり）のピルビン酸キナーゼ／乳酸脱水素酵素、８５ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、１７ｍＭのＭｇＣｌ２、０．００４２％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、０．００５％のＢＳＡ、１％のＤＭＳＯを含む。試験化合物は、２００μＭのＡＴＰを加える前に０．５時間、反応混合物とインキュベートして３０℃にて反応を開始する。０．５時間から１時間の反応速度を使用して阻害％およびＩＣ５０を計算する。
【０１０６】
本明細書に使用される配列はＮ末端ＧＳＴ融合物を有するｃ−ＫＩＴを含む。
【０１０７】
実施例１について、ヒトｃ−Ｋｉｔ阻害ＩＣ５０結果は２１ｎＭである。このデータにより、このアッセイにおいて試験した例示化合物がヒト野生型ｃ−Ｋｉｔ阻害剤であることが証明される。
【０１０８】
試験化合物をさらに評価するために、それは、黒色腫および／またはＧＩＳＴにおいて通常発生するｃ−Ｋｉｔ変異に対して試験される。Ｂａ／Ｆ３細胞株（ＡＴＣＣ由来）を、野生型（ＷＴ）ｃ−Ｋｉｔ、ｃ−ＫｉｔＬ５７６Ｐ（Ｗｉｌｌｍｏｒｅ−Ｐａｙｎｅら、Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２００５、３６（５）、４８６；Ｗｉｌｌｍｏｒｅ−Ｐａｙｎｅら、Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２００６、３７、５２０）、ｃ−Ｋｉｔ  Ｋ６４２Ｅ（Ｗｉｌｌｍｏｒｅら、Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ、２００４、１２２（２）、２０６；Ｍｏｎｓｅｌら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２０１０、２９、２２７）、ｃ−Ｋｉｔ  Ｔ６７０Ｉ（Ｔａｍｂｏｒｉｎｉら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２００６、２５、６１４０）、またはｃ−Ｋｉｔ  Ｖ６５４Ａ（Ｔａｍｂｏｒｉｎｉら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２００６、２５、６１４０）でトランスフェクトし、それぞれは、当業者に周知で、使用されるレトロウイルストランスフェクション法によって確立される。変異は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）変異生成によって生成され、ＰＣＲ増幅ｃ−Ｋｉｔ発現構築物の自動配列決定によって確認される。Ｂａ／Ｆ３安定細胞株はプラスミドＤＮＡでトランスフェクトすることによって生成される。適切なｃ−Ｋｉｔ変異の発現はウェスタンブロット分析によって確認される。
【０１０９】
野生型Ｂａ／Ｆ３細胞は一般に増殖についてＩＬ−３に依存する。ｃ−Ｋｉｔトランスフェクション後、これらの細胞は、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ｃ−Ｋｉｔのリガンドの存在下で、Ｂａ／Ｆ３ＡＴＣＣ推奨増殖培地中で増殖される。これらの細胞に対する試験化合物の抗増殖活性はＩＬ−３またはＳＣＦの存在下で試験する。
【０１１０】
【表２】
2015509536.tif 000018
【０１１１】
表２におけるデータにより、実施例１が、Ｂａ／Ｆ３細胞中の野生型ｃ−Ｋｉｔおよび識別したｃ−Ｋｉｔ遺伝子変異に対して細胞増殖および生存阻害活性を有することが証明される。
【０１１２】
ＡｃｔｉｖＸ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．のＫｉｔＮａｔｉｖアッセイを使用して未処理の全酵素を用いたＲａｆキナーゼ活性の測定
試験化合物の酵素的ｐａｎ  Ｒａｆ活性をさらに評価するために、それをＡ３７５細胞の全細胞溶解物を使用してＡｃｔｉｖＸ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．によって開発され、実施されるＫｉＮａｔｉｖアッセイにおいて評価する。Ａ３７５細胞は、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ変異、Ａ−Ｒａｆ野生型およびＣ−ｒａｆ野生型を有するヒト黒色腫細胞である。
【０１１３】
試料調製：ＡＴＣＣ由来のＡ３７５（Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ）細胞を、市販の溶解緩衝液中での超音波処理により溶解し、遠心分離により細胞残屑を除去し、得られた上清ゲルを、２０ｍＭのＭｎＣｌ２を含有する市販のキナーゼ反応緩衝液中で濾過する。溶解物の最終タンパク質濃度は１０ｍｇ／ｍＬである。各試験化合物の５μＬを、１μＭ、０．１μＭ、０．０１μＭ、および０．００１μＭの最終濃度についてＤＭＳＯ中の１００μＭ、１０μＭ、１μＭ、または０．１μＭストック溶液から５００μＬの溶解物に二連で加える。５μＬのＤＭＳＯを対照のために四連で５００μＬの溶解物に加える。１５分のインキュベーション後、デスチオビオチン−ＡＴＰアシルホスフェートプローブを５μＭの最終濃度で各試料に加え、１０分間試料とインキュベートする。プローブ反応の後、ＡｃｔｉｖＸ標準プロトコルを使用して標的化質量スペクトル分析のために試料を調製する。手短に述べると、トリプシン消化（アルキレートを変性させ、還元する）のために試料を調製し、トリプシンで消化し、デスチオ−ビオチン化ペプチドをストレプトアビジン樹脂で濃縮する。
【０１１４】
データ収集：濃縮したペプチド試料を、Ａ３７５Ｖ６００Ｅ細胞についてＡｃｔｉｖＸデータ収集法を使用してＴｈｅｒｍｏ−ＬＴＱ  Ｖｅｌｏｓイオントラップ質量分析計でＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析する。
【０１１５】
データ分析：全ての定量は、標的化ＭＳ／ＭＳスペクトルから特徴的断片を、イオン信号を抽出し、対照における信号および処理した試料を比較することによって実施する。ＡｃｔｉｖＸソフトウェアを、データフラグ／フィルタリング手段に基づいて必要に応じて実施されるマニュアルバリデーション／目視検査と共に使用する。全ての阻害データ点を視覚的検証し、全てのデータ点は正常範囲を超えた変動を示す。＞３５％阻害を示すデータ点の有意性は以下の式に従って決定される：｜平均対照ピーク面積−平均処理ピーク面積｜（２＊ＳｔｄＤｅｖ（対照ピーク面積）＋｜処理した複製の１つのピーク面積−処理した複製の２つのピーク面積｜＞０．８。ＩＣ５０値はＩＧＯＲ（登録商標）ソフトウェアを使用して決定する。
【０１１６】
【表３】
2015509536.tif 000019
【０１１７】
表３に示すように、実施例１は、それぞれ４４、３１〜４７および４２ｎＭのＩＣ５０値でＡ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００ＥおよびＣ−Ｒａｆを阻害した。これらのデータにより、全細胞溶解アッセイにおいてＡ−Ｒａｆ、Ｃ−ＲａｆおよびＢ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅの実施例１の阻害が証明される。
【０１１８】
実施例１は細胞性ホスホ−ＥＲＫ活性を阻害する
実施例１のインビトロでの生化学活性が細胞活性に変換するかどうかを調べるために、実施例１を使用して、黒色腫細胞、Ａ３７５Ｖ６００Ｅ、およびＷＭ−２６６−４Ｖ６００Ｅ、Ａ３７５Ｖ６００Ｅ−ＰＬＸ４０３２耐性細胞（Ａ３７５−ｒｅｓ；生成は以下に記載される）およびＨＣＴ−１１６（Ｋ−Ｒａｓ変異Ｂ−Ｒａｆ野生型）細胞、結腸腫瘍細胞をＫ−Ｒａｓ変異を用いて処理する。Ａ３７５Ｖ６００Ｅ、ＷＭ−２６６−４Ｖ６００Ｅ、ＨＣＴ−１１６Ｋ−Ｒａｓ変異Ｂ−Ｒａｆ野生型はＡＴＣＣ由来である。細胞活性をＴＧＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから市販されるＥＬＩＳＡによって評価して、各細胞種類のホスホ−ＥＲＫレベルを測定する。
【０１１９】
Ａ３７５Ｖ６００Ｅ、Ａ３７５Ｖ６００Ｅ−ＰＬＸ４０３２耐性細胞、ＷＭ−２６６−４Ｖ６００Ｅ、またはＨＣＴ−１１６（Ｋ−Ｒａｓ変異Ｂ−Ｒａｆ野生型）細胞を、一晩、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ製の９６ウェルプレート中の増殖培地（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイについて以下に記載される）中で増殖させ、次いで０．１７〜１００００ｎＭの範囲の０および１１の異なる連続希釈濃度にて実施例１を用いて１時間処理する。次いで各ウェル中の細胞をＴＧＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製の５０μｌの溶解緩衝液で溶解する。ホスホ−ＥＲＫ活性を、製造業者の指示書に従ってＴＧＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＳｕｒｅＦｉｒｅホスホ−ＥＲＫ  ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイキットを用いて決定する。
【０１２０】
実施例１は試験した全ての細胞株において用量依存的にホスホ−ＥＲＫレベルを阻害した。Ａ３７５Ｖ６００Ｅ、ＷＭ−２６６−４Ｖ６００Ｅ、Ａ３７５Ｖ６００Ｅ−ｒｅｓおよびＨＣＴ−１１６（Ｋ−Ｒａｓ変異Ｂ−Ｒａｆ野生型）細胞についてのＩＣ５０値はそれぞれ３、４．９、９．７および１３２．８ｎＭである。これらのデータにより、このアッセイにおけるＲａｆ阻害の結果として実施例１がＡ３７５Ｖ６００Ｅ、ＷＭ−２６６−４Ｖ６００Ｅ、Ａ３７５Ｖ６００Ｅ−ｒｅｓおよびＨＣＴ−１１６Ｋ−Ｒａｓ変異Ｂ−Ｒａｆ野生型細胞において下流シグナル伝達を阻害することが証明される。
【０１２１】
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ細胞増殖および生存アッセイ
Ａ３７５細胞増殖アッセイ
Ａ３７５細胞（カタログ番号ＣＲＬ−１６１９）はアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得る。手短に述べると、細胞を、３７℃、５％ＣＯ２、および９５％湿度にて１０％特性付けウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミンを補足したＤＭＥＭ高グルコース中で増殖させる。７０〜９５％コンフルエンシーに到達するまで細胞を増殖させ、その時点でそれらをアッセイ使用のために継代培養または収集する。試験化合物の連続希釈を３連で３８４ウェルブラック透明底プレート内に分配する。６２５個の細胞を１つのウェルにつき３８４ウェルプレート内の５０μＬの完全増殖培地中に加える。プレートを３７℃、５％ＣＯ２、および９５％湿度にて６７時間インキュベートする。インキュベーション時間の終わりに、ＰＢＳ中の１０μＬの４４０μＭレザズリン溶液（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をプレートの各ウェルに加え、プレートを３７℃、５％ＣＯ２、および９５％湿度にてさらに５時間インキュベートする。プレートを、５４０ｎｍの励起および６００ｎｍの発光を使用してＳｙｎｅｒｇｙ２リーダー（Ｂｉｏｔｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）で読み取る。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用してデータを分析してＩＣ５０値を計算する。
【０１２２】
Ｃｏｌｏ−２０５細胞増殖アッセイ
Ｃｏｌｏ２０５細胞（カタログ番号ＨＢ−８３０７）はアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得る。手短に述べると、細胞を、３７℃、５％ＣＯ２、および９５％湿度にて１０％特性付けウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミンを補足したＲＰＭＩ１６４０中で増殖させる。３０〜６０％コンフルエンシーに到達するまで細胞を増殖させ、その時点でそれらをアッセイ使用のために継代培養または収集する。試験化合物の連続希釈を３連で３８４ウェルブラック透明底プレート内に分配する。１２５０個の細胞を１つのウェルにつき３８４ウェルプレート内の５０μＬの完全増殖培地中に加える。プレートを３７℃、５％ＣＯ２、および９５％湿度にて６７時間インキュベートする。インキュベーション時間の終わりに、ＰＢＳ中の１０μＬの４４０μＭレザズリン溶液（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をプレートの各ウェルに加え、プレートを３７℃、５％ＣＯ２、および９５％湿度にてさらに５時間インキュベートする。プレートを、５４０ｎｍの励起および６００ｎｍの発光を使用してＳｙｎｅｒｇｙ２リーダー（Ｂｉｏｔｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）で読み取る。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用してデータを分析してＩＣ５０値を計算する。
【０１２３】
ＨＴ−２９細胞増殖アッセイ
ＨＴ−２９細胞（カタログ番号ＨＴＢ−３８）はアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得る。手短に述べると、細胞を、３７℃、５％ＣＯ２、および９５％湿度にて１０％特性付けウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミンを補足したＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ中で増殖させる。７５〜９０％コンフルエンシーに到達するまで細胞を増殖させ、その時点でそれらをアッセイ使用のために継代培養または収集する。試験化合物の連続希釈を３連で３８４ウェルブラック透明底プレート内に分配する。１２５０個の細胞を１つのウェルにつき３８４ウェルプレート内の５０μＬの完全増殖培地中に加える。プレートを３７℃、５％ＣＯ２、および９５％湿度にて６７時間インキュベートする。インキュベーション時間の終わりに、ＰＢＳ中の１０μＬの４４０μＭレザズリン溶液（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をプレートの各ウェルに加え、プレートを３７℃、５％ＣＯ２、および９５％湿度にてさらに５時間インキュベートする。プレートを、５４０ｎｍの励起および６００ｎｍの発光を使用してＳｙｎｅｒｇｙ２リーダー（Ｂｉｏｔｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）で読み取る。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用してデータを分析してＩＣ５０値を計算する。
【０１２４】
ＨＣＴ−１１６細胞増殖アッセイ
ＨＣＴ−１１６細胞（カタログ番号ＣＣＬ−２４７）はアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得る。手短に述べると、細胞を、３７℃、５％ＣＯ２、および９５％湿度にて１０％特性付けウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミンを補足したＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ中で増殖させる。７５〜９０％コンフルエンシーに到達するまで細胞を増殖させ、その時点でそれらをアッセイ使用のために継代培養または収集する。試験化合物の連続希釈を３連で３８４ウェルブラック透明底プレート内に分配する。６２５個の細胞を１つのウェルにつき３８４ウェルプレート内の５０μＬの完全増殖培地中に加える。プレートを３７℃、５％ＣＯ２、および９５％湿度にて６７時間インキュベートする。インキュベーション時間の終わりに、ＰＢＳ中の１０μＬの４４０μＭレザズリン溶液（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をプレートの各ウェルに加え、プレートを３７℃、５％ＣＯ２、および９５％湿度にてさらに５時間インキュベートする。プレートを、５４０ｎｍの励起および６００ｎｍの発光を使用してＳｙｎｅｒｇｙ２リーダー（Ｂｉｏｔｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）で読み取る。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用してデータを分析してＩＣ５０値を計算する。
【０１２５】
ＳＫ−Ｍｅｌ−２細胞増殖アッセイ
Ｓｋ−Ｍｅｌ−２細胞（カタログ番号ＨＴＢ−６８）はアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得る。手短に述べると、細胞を、３７℃、５％ＣＯ２、および９５％湿度にて１０％特性付けウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミンを補足したＭＥＭ中で増殖させる。７０〜９５％コンフルエンシーに到達するまで細胞を増殖させ、その時点でそれらをアッセイ使用のために継代培養または収集する。試験化合物の連続希釈を３連で３８４ウェルブラック透明底プレート内に分配する。１２５０個の細胞を１つのウェルにつき３８４ウェルプレート内の５０μＬの完全増殖培地中に加える。プレートを３７℃、５％ＣＯ２、および９５％湿度にて６７時間インキュベートする。インキュベーション時間の終わりに、ＰＢＳ中の１０μＬの４４０μＭレザズリン溶液（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をプレートの各ウェルに加え、プレートを３７℃、５％ＣＯ２、および９５％湿度にてさらに５時間インキュベートする。プレートを、５４０ｎｍの励起および６００ｎｍの発光を使用してＳｙｎｅｒｇｙ２リーダー（Ｂｉｏｔｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）で読み取る。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用してデータを分析してＩＣ５０値を計算する。
【０１２６】
Ａ３７５、ＨＴ−２９、およびＣｏｌｏ−２０５細胞（ＡＴＣＣ）はＶ６００Ｅ変異を保有する。ＨＣＴ−１１６細胞（ＡＴＣＣ）はＫ−Ｒａｓ変異Ｂ−Ｒａｆ野生型を保有し、ＳＫ−Ｍｅｌ−２細胞（ＡＴＣＣ）はＮ−Ｒａｓ変異Ｂ−Ｒａｆ野生型を保有する。
【０１２７】
【表４】
2015509536.tif 000020
【０１２８】
表４におけるデータにより、例示化合物がこのアッセイにおいて識別した変異を保有する指定した細胞の増殖および生存を阻害することが証明される。
【０１２９】
増殖および生存阻害アッセイ
実施例１を、ＣｅｔｔＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイにおいてヒト腫瘍細胞株の多様なパネルにわたって増殖および生存阻害活性について試験する。
【０１３０】
一般に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に関して、細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補足したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で培養する。増殖培地中に維持した細胞（５×１０３）を、処理の１日前に９６ウェルプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）においてポリ−Ｄ−リシンでコーティングしたウェル上に播種する。細胞を４８〜７２時間処理し、次いで製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ）の指示書に従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存アッセイおよびＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して増殖および生存について分析する。非線形回帰およびＳ字用量反応曲線を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４ソフトウェアを用いて最大半分阻害濃度（ＩＣ５０）を計算する。
【０１３１】
さらなるＮ−ＲＡＳ変異Ｂ−Ｒａｆ野生型血液癌細胞株を実施例１に対する感受性について試験した。Ｎ−Ｒａｓ活性化突然変異は１０〜３０％の頻度にて発生する血液癌においてよく見られる。２個のＢ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ変異黒色腫細胞株（Ａ−３７５およびＳＫ−Ｍｅｌ−２８）、９個のＮ−Ｒａｓ変異血液細胞株（ＨＬ−６０、ＴＨＰ−１、ＴＡＬＬ−１、Ｃ８１６６、Ｈ９、ＩＭ−９、ＧＡ−１０クローン４、Ｐ３１−ＦＵＪ、ＭＯＬＴ−４）および７個のＮ−Ｒａｓ野生型細胞株（ＬＯＵＣＹ、ＨＥＬ、Ｕ２６６、ＥＢ２、Ｐ３０−ＯＨＫ、ＮＯＭＯ−１、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ）を試験し、ＩＣ５０データを報告した。これらの細胞株の中で様々な感受性が存在したが、Ｎ−Ｒａｓ変異Ｂ−Ｒａｆ野生型を有する９個の血液癌細胞株のうちの７個はマイクロモル以下の濃度の実施例１（ＩＣ５０＜１μＭ）に感受性があった。
【０１３２】
【表５−１】
2015509536.tif 000021
【表５−２】
2015509536.tif 000022
【０１３３】
上記のデータにより、Ａ３７５黒色腫細胞が実施例１に感受性であることが証明される。このスクリーニングにおいて最も感受性の高い細胞株はＨｅｐＧ２およびＴＨＰ−１細胞である。ＨｅｐＧ２は肝細胞株由来であり、ＴＨＰ−１はＡＭＬ細胞株であり、両方は活性化Ｎ−ＲＡＳ変異Ｂ−Ｒａｆ野生型を保有する。このデータにより、このアッセイにおいて実施例１によってｐａｎ  Ｒａｆ阻害活性および上流のシグナル伝達活性化の介入が証明される。
【０１３４】
実施例１はＫ−Ｒａｓ変異を有するＨＣＴ−１１６細胞の細胞増殖を阻害する：
Ｋ−Ｒａｓ変異Ｂ−Ｒａｆ野生型は、膵臓癌、肺癌および結腸直腸癌（Ｂｏｓ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９８９、４９（１７）：４６８２）を含む、多くの癌種において最もよく見られ、最も重要な変異の１つである。Ｋ−Ｒａｓ変異は、細胞形質転換および悪性腫瘍の一因となるＲａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＭＡＰＫカスケードの活性化を導く。Ｋ−Ｒａｓ変異Ｂ−Ｒａｆ野生型細胞における実施例１の抗増殖活性を評価するために、Ｋ−Ｒａｓ変異Ｂ−Ｒａｆ野生型を保有する結腸腫瘍ＨＣＴ−１１６細胞（ＡＴＣＣ）は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ細胞増殖および生存アッセイに使用される。実施例１は、１７８ｎＭのＩＣ５０で用量依存的にＨＣＴ−１１６Ｋ−Ｒａｓ変異Ｂ−Ｒａｆ野生型増殖および生存を阻害した。これらのデータにより、実施例１によるＲａｆ阻害活性が、このアッセイにおいて不適切な活性化された上流のシグナル伝達に介入することが証明される。
【０１３５】
実施例１はＮ−Ｒａｓ変異を有する腫瘍細胞の細胞増殖を阻害する：
Ｎ−Ｒａｓは、多くの場合、黒色腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、および肝臓癌（Ｂｏｓ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９８９、４９（１７）：４６８２）において変異される。Ｎ−Ｒａｓ変異Ｂ−Ｒａｆ野生型は、Ｒａｆタンパク質、特にＣ−Ｒａｆを介してＭＡＰＫ活性化を導く。Ｎ−Ｒａｓ変異Ｑ６１Ｒ、およびＢ−Ｒａｆ野生型（ＡＴＣＣ）を保有するＮ−Ｒａｓ変異Ｂ−Ｒａｆ野生型腫瘍細胞、ヒト黒色腫細胞株ＳＫ−Ｍｅｌ−２における実施例１の抗増殖活性を、細胞増殖および生存阻害についてＣｅｌｌＴｉｔｅ−ｒＧｌｏアッセイにおいて試験し、ウェスタンブロット分析を実施する。
【０１３６】
免疫ブロット（ウェスタンブロット）分析
０、および０．１７〜１００００ｎＭの範囲の１１の連続希釈の用量で試験を実施する。タンパク質溶解物を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製のＲＩＰＡ溶解緩衝液を用いた細胞の処理によって生成する。ウェスタンブロット分析を、実質的にＹａｄａｖら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、２０１１、５０：３４６−５２に記載されているように実施する。手短に述べると、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、４〜２０％のＮｏｖｅｘ（登録商標）トリ−グリシン勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して２０ｕｇの全タンパク質を含有する細胞溶解物で実施する。タンパク質を、１００Ｖ、４℃にて１時間、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）トランスファー緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１０％メタノールを使用して０．４５μＭのニトロセルロース膜上に移す。通常、一次抗体は１：１０００希釈にて使用され、二次抗体は１：２００００希釈にて使用される。Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してタンパク質を検出する。ＥＲＫ１／２、ホスホ−ＥＲＫ１／２、ホスホ−ＭＥＫ１／２およびアクチンに対する抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから得られる。
【０１３７】
実施例１は、ウェスタンブロット分析によって決定されるようにＮ−Ｒａｓ変異Ｑ６１Ｒ、およびＢ−Ｒａｆ野生型を保有するＳＫ−Ｍｅｌ−２細胞において用量依存性ホスホ−ＭＥＫおよびホスホ−ＥＲＫ阻害を示す。ホスホ−ＥＲＫ活性は３７０ｎＭの用量にて実質的になくなる。
【０１３８】
実施例１は、１８８ｎＭのＩＣ５０でＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏアッセイにおいてＳＫ−Ｍｅｌ−２細胞増殖および生存を阻害する。これらのデータにより、実施例１は、このアッセイにおいて野生型Ｂ−ＲａｆおよびＮ−Ｒａｓ変異Ｑ６１Ｒを保有するＳＫ−ＭＥＬ−２細胞において細胞増殖および生存を阻害したことが証明される。
【０１３９】
ベムラフェニブ耐性黒色腫細胞を阻害する際の実施例１の活性：
ベムラフェニブ（ＰＬＸ４０３２）およびＰＬＸ４７２０は、変異Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅの阻害剤である（Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１０、４６８：９６８−７２；Ｍｏｎｔａｇｕｔら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００８、６８：４８５３−６１；Ｗａｇｌｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２０１１、２９：３０８５−９６）。ベムラフェニブ治療に最初に反応する患者の一部は薬物耐性を生じ、平均７ヶ月以内に難治性になる（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒら、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１０、２：３５−４１）。ベムラフェニブ−耐性細胞株は、増加させた濃度のＰＬＸ４７２０を用いた、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ変異を保有するヒト黒色腫細胞株Ａ３７５（ＡＴＣＣ）の長時間処理によって生成される。
【０１４０】
Ｂ−ＲＡＦ阻害に対するＢ−ＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ黒色腫細胞株耐性の生成
耐性細胞を生成するために、Ａ３７５  Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ細胞（ＡＴＣＣ）を、約４ヶ月および３０継代により０．０２〜２μＭの徐々に増加させた濃度のＮ−［３−（５−クロロ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−カルボニル）−２，４−ジフルオロフェニル］プロパン−１−スルホンアミド（ＰＬＸ４７２０；市販されている選択的Ｂ−Ｒａｆ阻害剤）の存在下で、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイについて上記したように増殖培地中で培養して、Ａ３７５ｒｅｓと指定した耐性細胞株を得る。ベムラフェニブおよびＰＬＸ４７２０に対するＡ３７５ｒｅｓの耐性は、ウェスタンブロット分析によるＭＡＰＫ再活性化ならびにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ細胞増殖および生存アッセイにおけるＩＣ５０値の変化によって確認される。
【０１４１】
これらのＡ３７５ｒｅｓ細胞において、ＰＬＸ４０３２は、２５２ｎＭから７μＭ超までほぼ３０倍に変化し、その活性の大部分を損失する。これらの耐性細胞に対する実施例１の活性により、１１ｎＭから３倍のみ変化する３４ｎＭのＩＣ５０が証明される。これらのデータにより、実施例１は、このアッセイにおいてＡ３７５ｒｅｓ細胞内の細胞増殖および生存を阻害することが証明される。
【０１４２】
実施例１は最小パラドキシカル経路活性化を有する：
最近の公開された研究（上記参照）により、ベムラフェニブ（ＰＬＸ−４０３２）などのＢ−Ｒａｆ特異的阻害剤は、Ｂ−Ｒａｆ野生型バックグラウンドにおける他のＲａｆアイソフォームとのＢ−Ｒａｆ二量化による「パラドキシカル経路活性化」を含むことが示唆されている。ベムラフェニブは、Ｂ−Ｒａｆ野生型遺伝的バックグラウンドを有する黒色腫癌患者の治療のために承認されていない。このパラドキシカル経路活性化はまた、ベムラフェニブで治療した一部の黒色腫患者における皮膚副作用（扁平上皮癌など）の原因であると考えられる。
【０１４３】
実施例１を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ生存アッセイにおいてＢ−Ｒａｆ野生型およびＫ−Ｒａｓ変異を保有するＨＣＴ−１１６（ＡＴＣＣ）細胞に対して試験する。試験を０、および０．１７〜１００００ｎＭの範囲の１１の連続希釈の用量で実施する。ホスホ−ＭＥＫおよびホスホ−ＥＲＫ活性を免疫ブロット（ウェスタンブロット）分析によって評価した。
【０１４４】
実施例１により、最小パラドキシカル経路活性化が証明され、Ｂ−Ｒａｆ野生型およびＫ−Ｒａｓ遺伝的バックグラウンドを保有するＨＣＴ−１１６細胞においてホスホ−ＭＥＫおよびホスホ−ＥＲＫ阻害活性を維持する。実施例１は、このアッセイにおいて４１ｎＭ以上の用量でホスホ−ＥＲＫシグナルを実質的に除外する。実施例１はまた、Ｃ−Ｒａｆ阻害（以前のアッセイ、上記）を証明するので、パラドキシカル経路活性化が発生しないはずであると考えられる。
【０１４５】
実施例１はＢ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ変異を有する腫瘍細胞の細胞増殖を阻害する：
ヒト癌におけるＢ−Ｒａｆ変異、特にＢ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅは、多くの場合、黒色腫、結腸直腸癌、肺癌および卵巣癌を含むヒト悪性腫瘍において観察される。Ｂ−Ｒａｆにおけるこの変異は構成的キナーゼ活性および悪性転換を導き得る。実施例１を、３つの黒色腫細胞株Ａ３７５（ＡＴＣＣ）、ＷＭ−２６６−４（ＡＴＣＣ）およびＳＫ−Ｍｅｌ−２８（ＡＴＣＣ）ならびに２つの結腸腫瘍細胞株ＨＴ−２９（ＡＴＣＣ）およびＣｏｌｏ−２０５（ＡＴＣＣ）におけるＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイにおいて試験し；全ての５つの細胞株はＢ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ変異を有する。
【０１４６】
【表６】
2015509536.tif 000023
【０１４７】
実施例１は、それぞれ９．２、５２．９および２９ｎＭのＩＣ５０値で、３つの黒色腫細胞株、Ａ３７５、ＷＭ−２６６−４およびＳＫ−Ｍｅｌ−２８の細胞生存を阻害した。同様に、実施例１は、７．３および２７ｎＭのＩＣ５０値で、２つの結腸細胞株、ＨＴ−２９およびＣｏｌｏ−２０５の細胞生存を阻害した。これらのデータにより、実施例１は、このアッセイにおいてＢ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ変異を有する腫瘍細胞の細胞生存および増殖を阻害する際に活性であることが証明される。
【０１４８】
実施例１はまた、ウェスタンブロット分析によってさらに評価した上記で試験したＡ３７５細胞内のホスホ−ＭＥＫおよびホスホ−ＥＲＫ活性を阻害し、用量依存的に下流のシグナル伝達を阻害することが証明される。ホスホ−ＥＲＫ活性は４１ｎＭにて実質的になくなった。
【０１４９】
インビボ活性
実施例１のインビボ活性を評価するために、Ａ３７５  Ｖ６００Ｅ（ＡＴＣＣ）およびＨＣＴ−１１６Ｋ−Ｒａｓ変異Ｂ−Ｒａｆ野生型（ＡＴＣＣ）異種移植片モデルを使用する。手短に述べると、１：１の培地およびマトリゲルミックス（０．２ｍＬの全体積）中の１０×１０６個の細胞（Ａ３７５）または５×１０６個の細胞（ＨＣＴ−１１６）を、ヌード雌ラット（Ｔａｃｏｎｉｃ製のＮＩＨモデル番号ＮＩＨＲＮＵ−Ｍ）の後肢に皮下注射により注入する。各群において合計８匹のラットを有効性研究のために使用し、各群において合計３〜４匹のラットを薬力学的研究のために使用する。Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ動物実験委員会（Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）は全ての実験プロトコルを承認した。腫瘍サイズが約５００ｍｇに到達する場合、０．６ｍＬ体積の実施例１またはビヒクル（２０％Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）、２５ｍＭリン酸塩、ｐＨ２．０）の経口投与（強制）で治療を開始する。実施例１を、Ａ３７５異種移植片モデルについて２１日間、５、１０、１５、および２０ｍｇ／ｋｇにて、またはＨＣＴ−１１６異種移植片モデルについて２１日間、１５および３０ｍｇ／ｋｇにて、１日に２回経口投与する。腫瘍増殖および体重を経時的にモニターして毒性の活性および兆候を評価する。腫瘍の２次元測定を１週間に２回実施し、腫瘍体積を中間軸長さおよび中間軸幅に基づいて算出する。腫瘍体積データをｌｏｇスケールに変換して、時間および処置群にわたって分散を均質化する。ｌｏｇ体積データを、ＳＡＳ（登録商標）ソフトウェア（バージョン８．２）におけるＭＩＸＥＤ（登録商標）手順を使用して時間および処置によって二元配置反復測定分散分析で分析する。反復測定についての相関モデルは空間電力である。処置群を各時点において対象群と比較する。ＭＩＸＥＤ（登録商標）手順もまた、各処置群について別々に使用して、各時点における調整した平均および標準誤差を算出する。両方の分析は各動物内の自己相関および大きな腫瘍を有する動物が研究初期から除去される場合、生じるデータの損失を考慮する。調整した平均および標準誤差を時間に対して各処置群についてプロットする。
【０１５０】
Ａ３７５異種移植片モデルにおいて、全ての用量群は腫瘍増殖阻害および腫瘍増殖退縮を示し、これらの群のいずれにおいても動物の体重損失はなかった。ＨＣＴ−１１６異種移植片モデルにおいて、３０ｍｇ／ｋｇ群は統計的に有意な腫瘍増殖阻害を示した。これらのデータは実施例１によってインビボ活性を示し、酵素的な細胞溶解物を支持し、細胞増殖データはインビボ活性に相関する。
【０１５１】
Ａ３７５異種移植片モデルにおける実施例１の薬理学的（ＰＤ）効果を評価する別の研究において、３．１２５〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量での単回投与研究を実施する。
【０１５２】
単回治療の２時間後、ウェスタンブロット分析によって証明されるように用量依存的ＰＤ効果が観察される。ホスホ−ＭＥＫおよびホスホ−ＥＲＫ阻害を全ての用量群において観察し、２５ｍｇ／ｋｇでホスホ−ＭＥＫおよびホスホ−ＥＲＫ活性がこのモデルにおいてほぼ完全になくなった。
【図１】
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【国際調査報告】
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