(57)【要約】  本発明は、神経毒ポリペプチドの活性を測定するための試験系に関する。具体的には、本発明は、(i) LuxBサブユニット、(ii) 神経毒切断部位を含むリンカー、および(iii) LuxAサブユニットを含む一本鎖ルシフェラーゼ融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドならびに上記のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに関する。本発明により、上記のポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞がさらに提供される。さらに本発明は、サンプル中のタンパク質分解活性を有する神経毒ポリペプチドを測定する方法およびこの方法を実施するためのキットに関する。【選択図】  図１
2015509372.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i) LuxBサブユニット、(ii) 神経毒切断部位を含むリンカー、および(iii) LuxAサブユニットを含む一本鎖ルシフェラーゼ融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記ルシフェラーゼサブユニットLuxAおよび/またはLuxBが、ビブリオ・フィシェリまたはビブリオ・ハーベイに由来する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記神経毒切断部位が、SNAP-25に由来する神経毒切断部位、VAMPに由来する神経毒切断部位、シンタキシンに由来する神経毒切断部位、および神経毒ポリペプチドに由来する自己触媒切断部位からなる群から選択される、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項５】
前記ベクターが発現ベクターである、請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４もしくは５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項７】
前記宿主細胞が、神経毒ポリペプチドをその細胞質に移行させることができる細胞である、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項８】
前記宿主細胞が、神経芽細胞腫細胞株および初代神経細胞からなる群から選択される、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド。
【請求項１０】
サンプル中のタンパク質分解活性を有する神経毒ポリペプチドを測定する方法であって、以下のステップ：
a) 一本鎖ルシフェラーゼ融合タンパク質の、別々のLuxBサブユニットとLuxAサブユニットへのタンパク質分解切断を可能とする条件下で、請求項６〜８のいずれか1項に記載される宿主細胞または請求項９に記載のポリペプチドを、タンパク質分解活性を有する神経毒ポリペプチドを含むことが疑われるサンプルと接触させるステップ；
b) 該LuxBサブユニットとLuxAサブユニットに生物学的に活性なルシフェラーゼを形成させるステップ；ならびに
c) 該ルシフェラーゼを測定するステップ
を含む、前記方法。
【請求項１１】
前記ルシフェラーゼが、ルシフェラーゼ基質の酵素的変換を測定することによって測定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
一本鎖ルシフェラーゼ融合ポリペプチドに含まれる神経毒切断部位が、サンプル中で測定されるタンパク質分解活性を有する神経毒ポリペプチドによって認識される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記神経毒ポリペプチドが、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/GまたはTeNTからなる群から選択される、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
サンプル中のタンパク質分解活性を有する神経毒ポリペプチドをin vitroで測定するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項４または５に記載のベクター、請求項６〜８のいずれか１項に記載の宿主細胞、または請求項９に記載のポリペプチドの使用。
【請求項１５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項４または５に記載のベクター、請求項６〜８のいずれか１項に記載の宿主細胞および/または請求項９に記載のポリペプチド、ならびに好ましくは、ルシフェラーゼ基質の酵素的変換を測定するための検出剤およびルシフェラーゼ基質を含む、サンプル中のタンパク質分解活性を有する神経毒ポリペプチドを測定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経毒ポリペプチドの活性を測定するための試験系に関する。具体的には、本発明は、(i) LuxBサブユニット、(ii) 神経毒切断部位を含むリンカー、および(iii) LuxAサブユニットを含む一本鎖ルシフェラーゼ融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドならびに上記のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに関する。本発明により、上記のポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞がさらに提供される。さらに本発明は、サンプル中のタンパク質分解活性を有する神経毒ポリペプチドを測定する方法および上記の方法を実施するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ボツリヌス菌（クロストリジウム・ボツリナム(Clostridium botulinum)）および破傷風菌（クロストリジウム・テタニ(Clostridium tetani)）は、それぞれ極めて強力な神経毒、すなわちボツリヌス毒素(BoNT)および破傷風毒素(TeNT)を産生する。これらのクロストリジウム神経毒は、神経細胞に特異的に結合し、神経伝達物質の放出を阻害する。各毒素は、不活性な、プロセシングされていない約150kDaの一本鎖タンパク質として合成される。翻訳後プロセシングは、ジスルフィド橋の形成、および細菌プロテアーゼによる限定的なタンパク質分解(ニッキング)を包含する。活性な二本鎖神経毒は、ジスルフィド結合によって連結された約50kDaのN末端軽鎖と約100kDaの重鎖との二本鎖からなる。神経毒は、構造的には3つのドメイン、すなわち、触媒軽鎖、転座ドメインを含む重鎖(N末端半分)および受容体結合ドメイン(C末端半分)からなる（Krieglstein 1990, Eur J Biochem 188, 39; Krieglstein 1991, Eur J Biochem 202, 41; Krieglstein 1994, J Protein Chem 13, 49を参照）。
【０００３】
ボツリヌス菌は、ボツリヌス神経毒（BoNT）のA〜Gと呼ばれる7種類の抗原的に異なる血清型を分泌する。全血清型は、破傷風菌によって分泌される関連する破傷風神経毒（TeNT）と共に、SNAREタンパク質、および特にBoNT/A、BoNT/CまたはBoNT/Eの場合には、SNAP-25を切断することによってシナプスのエキソサイトーシスを遮断する亜鉛(Zn2+)-依存性エンドプロテアーゼである。BoNTはとりわけ、ボツリヌス菌において見られる弛緩性筋麻痺を引き起こす（Fischer 2007, PNAS 104, 10447を参照）。
【０００４】
その毒性作用にも関わらず、BoNTは、多数の疾患において治療剤として使用されてきた。BoNT血清型A(BoNT/A)は、1989年に米国で、斜視、眼瞼けいれん、および他の障害の治療のためにヒトへの使用について認可された。これは、例えば、商品名BOTOX(Allergan Inc.)、商品名DYSPORT(Ipsen Ltd.)の下、タンパク質製剤として市販されている。治療適用のため、この複合体は治療対象の筋肉に直接注射される。生理的pHにおいて、毒素は、タンパク質複合体から放出され、所望の薬理作用を発揮する。錯化タンパク質を含まない改良されたBoNT/A製剤は、商品名XEOMIN(Merz Pharmaceuticals GmbH)として入手可能である。
【０００５】
BoNTは、原理的には随意筋力を弱め、このため斜視、限局性筋失調症(頸部ジストニアなど)、および良性特発性眼瞼けいれんまたは痙縮などの疾患の治療のための有効な治療剤である。これらはさらに、片側顔面けいれん、および限局性けいれんを軽減すること、またさらに、胃腸障害、多汗症、および美容上のしわ取りなどの広範囲の他の適応症において有効であることが示されている（Jost 2007, Drugs 67, 669を参照）。
【０００６】
生物学的活性の測定は、安全対策として、品質管理および定量目的のために重要である。現在、マウスLD50アッセイは、神経毒の生物学的活性を定量し、その治療効果および/または毒性を評価するための唯一の信頼し得るアッセイである。上記のアッセイは、神経毒の製造中の品質管理の目的のためにも認められている。マウスLD50バイオアッセイでは、致死濃度および亜致死濃度の神経毒ポリペプチドを含むサンプルを、少なくとも120匹の動物に注射しなければならない。72時間の観察期間にわたって殺傷される動物の数は、サンプル中の神経毒ポリペプチド濃度の測定を可能とする。このアッセイの明らかな欠点は、多数の動物が犠牲となることと、試験中の上記の動物に対する高レベルのストレスおよび苦痛である。
【０００７】
現在までに提案されているin vitroアッセイは、無細胞系におけるSNAP-25切断の測定または初代神経細胞に対する神経毒の暴露に基づく。しかし、これらのアッセイの信頼性は低く、および/または所望の神経毒機能の全てを考慮に入れてはいない。このため、現在のところ、上記のLD50バイオアッセイはヨーロッパ薬局方(European pharmacopeia)中のBoNT/Aのモノグラフに記載されている唯一の信頼し得るアッセイである。しかし、LD50バイオアッセイの欠点を回避する、神経毒活性を測定するための信頼し得るアッセイに対する必要性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】EP 1 926 744 B1
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Krieglstein 1990, Eur J Biochem 188, 39
【非特許文献２】Krieglstein 1991, Eur J Biochem 202, 41
【非特許文献３】Krieglstein 1994, J Protein Chem 13, 49
【非特許文献４】Fischer 2007, PNAS 104, 10447
【非特許文献５】Jost 2007, Drugs 67, 669
【非特許文献６】Olsson 1989, Gene 81: 335-347
【非特許文献７】Wetzel 2008, J Mol Biol. 376(1): 241-57
【非特許文献８】Michaely 1995, J Biol Chem. 270(52):31298-302
【非特許文献９】Batrukova 2000, Biochemistry (Mosc). 65(4):395-408
【非特許文献１０】Chon 1985, J Biol Chem. 260(10):6139-46
【非特許文献１１】Johnston 1986, J Biol Chem. 261(11):4805-11
【非特許文献１２】Altschul 1990, J Mol Biol 215, 403
【非特許文献１３】Higgins 1989, CABIOS 5, 151
【非特許文献１４】Needleman 1970, J Mol Biol 48; 443
【非特許文献１５】Smith 1981, Adv Appl Math 2, 482
【非特許文献１６】Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.
【非特許文献１７】Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、本発明の根底にある技術的問題は、上記の必要性に応じる手段および方法の提供であると考えることができるだろう。この技術的問題は、特許請求の範囲および本明細書の以下の記載において特徴付けられる実施形態によって解決された。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、(i) LuxBサブユニット、(ii) 神経毒切断部位を含むリンカー、および(iii) LuxAサブユニットを含む一本鎖ルシフェラーゼ融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図1は、本発明の一本鎖ルシフェラーゼ融合ポリペプチドの概略図を示す。(A) サブユニットの特定の順序による上記のサブユニットの自己相互作用の阻止; (B) アンキリン反復による自己相互作用の阻止; (C) 球状タンパク質による自己相互作用の阻止。
【図２Ａ】図2は、22℃における、異なる大腸菌発現株におけるMRZ_LuxAB0とMRZ_LuxBA3の発現を示し、これにより可溶性画分と不溶性画分とを分離させた。1レーンあたりロード：1/6 x OD600単位(1 x OD600単位はOD600が1.0の1mlの培養物として定義される)。選択マーカーのサイズは、左側に示される。図2Aは、大腸菌株BL21およびRosetta(DE3)/pRARE2中のMRZ_LuxAB0とMRZ_LuxBA3の発現の12％SDS-PAGE解析を示す。ゲルは、クーマシーブルーで染色した。
【図２Ｂ】図2は、22℃における、異なる大腸菌発現株におけるMRZ_LuxAB0とMRZ_LuxBA3の発現を示し、これにより可溶性画分と不溶性画分とを分離させた。1レーンあたりロード：1/6 x OD600単位(1 x OD600単位はOD600が1.0の1mlの培養物として定義される)。選択マーカーのサイズは、左側に示される。図2Bは、12％ゲルのウェスタンブロット解析を示す；検出は、抗Strep-tag抗体、二次抗体抗マウス-APを用いて実施し、NBT/BCIPで発色させた。
【図３Ａ】図3は、16℃における、大腸菌発現株BL21におけるMRZ_LuxAB0とMRZ_LuxBA3の発現を示し、これにより可溶性画分と不溶性画分とが分離された。1レーンあたりロード: 1/6 x OD600単位(1 x OD600単位はOD600が1.0の1mlの培養物として定義される)。選択マーカーのサイズは、左側に示される。図3Aは、大腸菌株BL21中のMRZ_LuxAB0とMRZ_LuxBA3の発現の12％SDS-PAGE解析を示す。ゲルは、クーマシーブルーで染色した。
【図３Ｂ】図3は、16℃における、大腸菌発現株BL21におけるMRZ_LuxAB0とMRZ_LuxBA3の発現を示し、これにより可溶性画分と不溶性画分とが分離された。1レーンあたりロード: 1/6 x OD600単位(1 x OD600単位はOD600が1.0の1mlの培養物として定義される)。選択マーカーのサイズは、左側に示される。図3Bは、12％ゲルのウェスタンブロット解析を示す。検出は、抗Strep-tag抗体、二次抗体抗マウス-APを用いて実施し、NBT/BCIPで発色させた。
【図４】図4は、大腸菌株BL21 LuxAB0フェッドバッチ発酵を示す。5L発酵を1回実施し、62g(湿細胞重量(wcw))のバイオマスを生成した。
【図５】図5は、A)大腸菌株BL21 LuxAB0と、B)大腸菌株BL21 LuxBA1の、フェッドバッチ発酵期間を通したOD600を示す。
【図６Ａ】図6Aは、大腸菌株BL21 LuxAB0の、誘導前および回収時に得られたサンプルのSDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングを示す。
【図６Ｂ】図6Bは、大腸菌株BL21 LuxBA1の、誘導前および回収時に得られたサンプルのSDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングを示す。
【図７】図7は、BL21-MRZ-LuxAB0とBL21-MRZ-LuxBA1のStrep-tagアフィニティーバッチ精製を示す。1レーンあたりロードは、Load画分、FT1画分、およびFT2画分の1.25μlの未希釈サンプルと、Pool E1画分、Pool E2画分、およびPool E3画分の2.5μlの未希釈サンプルである。選択マーカーのサイズは、左側に示される。A）SDS-PAGE解析；ゲル12％、クーマシーブルーで染色。B）ウェスタンブロット解析；ゲル12％、抗Strep抗体(StrepMAB-Classic、HRPコンジュゲート、IBA社、カタログNo. 2-1509-001、2％BSAを含むPBS-Tween中で1:10000希釈)を用いて検出。
【図８Ａ】図8は、小規模大腸菌振盪フラスコ培養物中の発現の解析を示す。標的ベクターを、宿主株BL21(DE3)およびBL21(DE3) Rosetta中で発現させ、37℃で培養した。解析用のサンプルを標的発現の誘導の直前ならびに標的発現の誘導の2、4および20時間後に抜き取った。1レーンあたりロード：0.25 x OD600単位(1 x OD600単位はOD600が1.0の1mlの培養物として定義される)。左側はBL21(DE3)を示し、右側はBL21(DE3)Rosettaを示す。図8Aは、LuxBA3-Strep(84.9kDa)を示す。
【図８Ｂ】図8は、小規模大腸菌振盪フラスコ培養物中の発現の解析を示す。標的ベクターを、宿主株BL21(DE3)およびBL21(DE3) Rosetta中で発現させ、37℃で培養した。解析用のサンプルを標的発現の誘導の直前ならびに標的発現の誘導の2、4および20時間後に抜き取った。1レーンあたりロード：0.25 x OD600単位(1 x OD600単位はOD600が1.0の1mlの培養物として定義される)。左側はBL21(DE3)を示し、右側はBL21(DE3)Rosettaを示す。図8Bは、GST-LuxBA3-Strep(111.2kDa)を示す。
【図８Ｃ】図8は、小規模大腸菌振盪フラスコ培養物中の発現の解析を示す。標的ベクターを、宿主株BL21(DE3)およびBL21(DE3) Rosetta中で発現させ、37℃で培養した。解析用のサンプルを標的発現の誘導の直前ならびに標的発現の誘導の2、4および20時間後に抜き取った。1レーンあたりロード：0.25 x OD600単位(1 x OD600単位はOD600が1.0の1mlの培養物として定義される)。左側はBL21(DE3)を示し、右側はBL21(DE3)Rosettaを示す。図8Cは、9 x His-LuxBA3-Strep(86.8kDa)を示す。
【図９】図9は、9xHis-Xa-LuxBA3-Strepタンパク質発現の解析を示す。1Lの振盪フラスコ培養物を25℃で増殖させた(誘導の前後)。12％SDS-PAGEの後、コロイド状クーマシー染色および抗-Strep-tagウェスタンブロッティングを行った。1レーンあたりロード：0.25 x OD600単位(1 x OD600単位はOD600が1.0の1mlの培養物として定義される)。マーカー: Fermentas PageRuler(商標)着色タンパク質ラダー。
【図１０】図10は、最終的なLuxBA3タンパク質サンプルの解析を示す。12％SDS-PAGEおよびコロイド状クーマシー染色。2つの異なるゲルは、2つの独立したFPLCの実行を示すが(左パネル：全1.89mg；右パネル：全1.90mg)、同じ出発物質から開始する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書中で使用される用語「ポリヌクレオチド」は、一本鎖または二本鎖のDNA分子ならびにRNA分子を指す。上記の用語には、ゲノムDNA、cDNA、hnRNA、mRNAならびにこのような分子種の全ての天然のまたは人工的に修飾された誘導体も包含される。一態様において、このポリヌクレオチドは、直鎖分子または環状分子であってよい。さらに、本発明の修飾神経毒ポリペプチドをコードする核酸配列に加えて、本発明のポリヌクレオチドは、適切な転写および/または翻訳に必要とされる付加的配列、例えば5’-または3’-UTR配列を含んでいてもよい。本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、本発明の一本鎖ルシフェラーゼ融合ポリペプチドについて想定されるアミノ酸配列から、当業者が容易に誘導することができる。遺伝子コードの縮重を考慮して、本発明のポリヌクレオチドにおいて、一本鎖ルシフェラーゼ融合ポリペプチドをコードする核酸配列中で最適コドンを用いることができる。これにより、例えば本発明の宿主細胞において、最適な発現を達成することができる。
【００１４】
本明細書中で使用される用語「一本鎖ルシフェラーゼ融合ポリペプチド」は、単一のポリペプチド鎖中にルシフェラーゼのLuxBサブユニットならびにLuxAサブユニットを含むポリペプチドを指す。この2つのサブユニットは、本明細書中の他の箇所で言及される、タンパク質分解活性を有する神経毒ポリペプチドによって特異的に認識されて切断される神経毒切断部位を含むリンカーによって分離されている。一態様において、本発明の一本鎖ルシフェラーゼ融合ポリペプチドは、LuxBサブユニットとLuxAサブユニットが一本鎖ルシフェラーゼ融合ポリペプチドに含まれる場合には、生物学的に活性なルシフェラーゼホロ酵素の形成を阻止しまたは低下させるような様式で配置された、上記サブユニットを有する。このため、一態様において、生物学的に活性なルシフェラーゼホロ酵素は、本発明の神経毒プロテアーゼによる本発明の一本鎖ルシフェラーゼ融合ポリペプチドの切断後にのみ形成され、またはより効率的に形成される。一態様において、一本鎖ルシフェラーゼ融合ポリペプチドが一本鎖状態であるとき、上記の酵素的活性が阻止される場合には、本質的にいかなる活性も生じない。一態様において、本明細書において言及される低下した酵素的活性は、統計的に有意に低下した活性を意味する。一態様において、切断後に形成されるホロ酵素に対する、一本鎖状態における活性の低下は、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％または少なくとも80％である。
【００１５】
一態様において、一本鎖ルシフェラーゼ融合ポリペプチド中のLuxBおよびLuxAサブユニットは、生物学的に活性なルシフェラーゼホロ酵素の形成を阻止しまたは低下させるような様式で、一本鎖ルシフェラーゼ融合ポリペプチド中のサブユニットの順序がN末端からC末端に向かって：(i) LuxBサブユニット、(ii) 神経毒切断部位を含むリンカー、および (iii) LuxAサブユニットとなるように配置される。本発明のサブユニットのこのような順序は、一本鎖融合タンパク質中のルシフェラーゼ活性を効率的に妨げるように記載されている(Olsson 1989, Gene 81: 335-347を参照)。
【００１６】
別の態様において、一本鎖ルシフェラーゼ融合ポリペプチド中のLuxBおよびLuxAサブユニットは、本発明のリンカーに加えて、これらのサブユニットが互いに相互作用する能力を阻止しまたは低下させるさらなるポリペプチド要素によって分離される。一態様において、この分離は、本発明の一本鎖ルシフェラーゼ融合ポリペプチド中、LuxBサブユニットとリンカーの間もしくはLuxAサブユニットとリンカーの間のいずれかまたは両方にアンキリン反復を挿入することによって達成することができる。アンキリン反復は、ポリペプチド鎖の柔軟性を低下させることが知られており、これにより本発明の一本鎖ルシフェラーゼ融合ポリペプチド中の分離されたルシフェラーゼサブユニットが互いに相互作用する能力を低下させる。アンキリンは、当技術分野において周知であり、膜貫通タンパク質と細胞骨格タンパク質の付着を媒介するアダプタータンパク質ファミリーに属する。哺乳動物では、様々なスプライシング形態で生じるANK1、ANK2およびANK3の3つの異なるアンキリンが知られている。上記のアンキリンは、本発明に従って適用されるいわゆるアンキリン反復を含むN末端ドメインを有する(Wetzel 2008, J Mol Biol. 376(1): 241-57; Michaely 1995, J Biol Chem. 270(52):31298-302; Batrukova 2000, Biochemistry (Mosc). 65(4):395-408を参照)。
【００１７】
別の態様において、LuxBサブユニットとリンカーの間、LuxAサブユニットとリンカーの間のいずれかまたは両方に、分子サイズに応じて、本発明のサブユニットの互いの相互作用に立体的に干渉するタンパク質ドメインまたはタンパク質を挿入することにより、本発明のサブユニットが互いに相互作用する能力の阻止または低下を達成することができる。一態様において、この目的のために球状タンパク質またはそのドメインを適用することができる。一態様において、上記の球状タンパク質またはそのドメインは、グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)、マルトース結合タンパク質、小ユビキチン様修飾因子(SUMO)タンパク質、緑色蛍光タンパク質、(GFP)、赤色蛍光タンパク質(RFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、青色蛍光タンパク質(BFP)などからなる群から選択される。別の態様において、蛍光タンパク質を本明細書中の他の箇所で特定される神経毒および/またはルシフェラーゼポリペプチドに結合させ、これにより上記の蛍光タンパク質は、例えば、上記のポリペプチドの発光を改変し、および/または発現、細胞数をモニターするための内部対照、ローディング対照などとして使用される。さらに一態様において、先に記載したとおり、本発明のリンカーを球状タンパク質またはそのドメイン中に含めることができる。
【００１８】
本発明のリンカー中に含まれる神経毒切断部位は、神経毒プロテアーゼが好適な条件下で一本鎖ルシフェラーゼ融合ポリペプチドを認識し、結合し切断することができるように、本発明の一本鎖ルシフェラーゼ融合タンパク質により、神経毒ポリペプチドが利用し得るようにされなければならないことが理解されよう。当業者は、どのようにすれば一本鎖ルシフェラーゼ融合ポリペプチド中に好適な配置を設計することができるのか十分に理解している。さらに、本発明の一本鎖ルシフェラーゼ融合タンパク質は、添付の実施例に記載されるとおり、タンパク質分解活性を有する神経毒ポリペプチドによる切断について試験することができる。一態様において、本発明の一本鎖ルシフェラーゼ融合ポリペプチドは、配列番号1〜3のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を有する。
【００１９】
本明細書において使用される用語「ルシフェラーゼ」は、発光反応を触媒し得る酵素のクラスに属する酵素を指す。ルシフェラーゼは、ホタルまたは細菌のルシフェラーゼとして天然に生じる。このような、酵素的に(生物学的に)活性なホロ酵素としてのルシフェラーゼは、異なるサブユニットで構成される。一態様において、本明細書中で言及されるルシフェラーゼは細菌ルシフェラーゼであり、一本鎖ルシフェラーゼ融合ポリペプチドに挿入されるサブユニットは、LuxAおよびLuxBである。さらに別の態様において、上記のLuxAおよび/またはLuxBサブユニットは、ビブリオ・フィシェリ(Vibrio fischeri)またはビブリオ・ハーベイ(Vibrio harveyi)に由来する。本発明による付加的なリンカーを挿入せずに一本鎖ルシフェラーゼ融合タンパク質中にかかるサブユニットを配置する方法は当技術分野において公知であり、Olsson 1989(上記引用文中)に記載されている。上記のルシフェラーゼおよびそれらのサブユニットの構造ならびにこれらをコードする核酸配列は当技術分野において周知であり、例えば、Chon 1985, J Biol Chem. 260(10):6139-46およびJohnston 1986, J Biol Chem. 261(11):4805-11に記載されている。一態様において、本明細書中で言及されるビブリオ・フィシェリ(Vibrio fischeri)のLuxAサブユニットは、配列番号4に示されるアミノ酸配列またはその変異体を有する。別の態様において、ビブリオ・フィシェリ(Vibrio fischeri)のLuxBサブユニットは、配列番号5に示されるアミノ酸配列またはその変異体を有する。本発明は、このような特定のアミノ酸配列またはそれらをコードする核酸配列の変異体も、これらの変異体配列もまた酵素的に活性なルシフェラーゼホロ酵素の形成を可能とする限り、包含することが理解されるだろう。一態様において、本明細書において使用される配列変異体は、先に特定した特定のアミノ酸配列または特定の核酸配列とは、1つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドの置換、付加および/または欠失によって異なる。別の態様において、上記の変異体配列は、上記の特定の配列と、全長にわたってまたは特定の配列の長さの少なくとも半分のストレッチにわたって、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％同一である。本明細書で用いられる用語「同一である」とは、配列が、最上位の一致が得られるように整列された配列間の同一アミノ酸の数を決定することによって特徴付けられる配列同一性を指す。配列同一性は、公開された技術または、例えば、BLASTP、BLASTNまたはFASTAなどのコンピュータプログラム中で体系化された方法を用いて計算することができる(Altschul 1990, J Mol Biol 215, 403)。1つの態様において、同一性パーセントの値は、全アミノ酸配列またはクエリー配列の少なくとも50％の配列ストレッチにわたって計算される。異なる配列を比較するため、様々なアルゴリズムに基づく一連のプログラムが当業者に利用可能である。これに関連して、NeedlemanおよびWunschまたはSmithおよびWatermanのアルゴリズムが特に信頼できる結果を与える。配列アラインメントを実行するために、GCGソフトウェアパケット(Genetics Computer Group 1991, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)の一部であるPileUpプログラム(Higgins 1989, CABIOS 5, 151)またはGapおよびBestFit��ログラム (Needleman 1970, J Mol Biol 48; 443; Smith 1981, Adv Appl Math 2, 482)を用いることができる。パーセント(％)で上記された配列同一性の値は、本発明の別の態様においては、別途特定しない限り、配列アラインメントのための標準設定として常に用いられなければならない以下の設定：ギャップ重量：50、長さ重量：3、平均一致：10.000および平均不一致：0.000を用いて配列領域全体にわたってGAPプログラムを用いて決定される。
【００２０】
本明細書中で使用される用語「神経毒切断部位」は、神経毒ポリペプチドの内因性プロテアーゼによって認識されて切断される切断部位を指す。神経毒プロテアーゼによって認識される切断部位は当技術分野において周知である(例えばEP 1 926 744 B1を参照)。一態様において、上記の神経毒切断部位は、SNAP-25に由来する神経毒切断部位、VAMPに由来する神経毒切断部位、シンタキシンに由来する神経毒切断部位、および神経毒ポリペプチドに由来する自己触媒切断部位からなる群から選択される。
【００２１】
原理上は、神経毒切断部位は、本発明の神経毒ポリペプチドプロテアーゼによって認識されて切断される、基質中の天然の切断部位であってよく、または人工的に設計される切断部位である。神経毒切断部位の特性が、本発明のポリペプチドを活性化することができる神経毒の種類を規定することが理解されよう。一態様において、本明細書において言及される神経毒ポリペプチドは、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/G、BoNT/FまたはTeNTを包含し、これらは全て当技術分野において周知である。例えば、BoNT/Aによって特異的に認識されて切断される神経毒切断部位が使用される場合、BoNT/Aプロテアーゼのみが、本発明のポリペプチドおよび、特に、そのルシフェラーゼ活性を活性化することが可能であり、他方、BoNT/Eによって特異的に認識されて切断される神経毒切断部位が使用される場合、BoNT/Eプロテアーゼのみが、本発明のポリペプチドおよび、特に、そのカスパーゼ活性を活性化することができるだろう。本発明の一態様において、本発明の神経毒切断部位は成熟BoNTによって切断される。さらに別の態様において、本発明の神経毒切断部位は、BoNTの変異タンパク質によって切断され、一態様において、BoNTプロテアーゼ活性を示すBoNT軽鎖を含む、またはBoNTプロテアーゼ活性を示すBoNT軽鎖からなる変異タンパク質によって切断される。
【００２２】
本発明の一態様において、BoNT/Aプロテアーゼによって認識されて切断される神経毒切断部位は、BoNT/Aによる切断に感受性のタンパク質に由来する。一態様において、このようなタンパク質は、ヒトSNAP-25Aもしくは-25Bあるいは、ラット、マウス、ウシ、ゼブラフィッシュ(ダニオ属(Danio))、フナ(カラシウス属(Carassius))、アフリカツメガエル(クセノプス属(Xenopus))、シビレエイ(トルペド属(Torpedo))、オオバフンウニ(ストロンギロセントロタス属(Strongylocentrotus))、ヤリイカ(ロリゴ属(Loligo))、モノアラガイ(リムナエア属(Lymnaea))またはアメフラシ(アプリシア属(Aplysia))に由来するそれらのホモログ、パラログもしくはオルソログである。
【００２３】
本発明の一態様において、BoNT/Bプロテアーゼによって認識されて切断される神経毒切断部位は、BoNT/Bによる切断に感受性のタンパク質に由来する。一態様において、このようなタンパク質は、ヒトまたはマウスVAMP-1、VAMP-2およびVAMP-3/セルブレビン、ウシVAMP-2、ラットVAMP-2もしくはVAMP-3、ニワトリVAMP-1、VAMP-2もしくはVAMP-3、シビレエイVAMP-1、オオバフンウニVAMP、ショウジョウバエ(ドロソフィラ属(Drosophila))sybA、synB、synC、synD、もしくはsyn、ヒル(ヒルド属(Hirudo))VAMP、アフリカツメガエルVAMP-2もしくはVAMP-3、ゼブラフィッシュVAMP-1もしくはVAMP-2、ヤリイカVAMP、モノアラガイVAMP、アメフラシVAMPまたはカンセンチュウ(カエノラブディティス属(Caenorhabditis))SNB1-様あるいはそれらの任意のオルソログ、パラログまたはホモログである。上記のタンパク質に由来する好適な切断部位は、EP 1 926 744 B1に開示されている。
【００２４】
本発明の一態様において、BoNT/C1プロテアーゼによって認識されて切断される神経毒切断部位は、BoNT/C1による切断に感受性のタンパク質に由来する。一態様において、このようなタンパク質は、ヒトおよびマウスシンタキシン1A、シンタキシン1B1、シンタキシン2-1、シンタキシン2-2、シンタキシン2-3, シンタキシン3Aもしくはシンタキシン1B2、ウシまたはラットシンタキシン1A、シンタキシン1B1もしくはシンタキシン1B2、ラットシンタキシン2もしくはラットシンタキシン3、マウスシンタキシン1A、シンタキシン1B1、シンタキシン1B2、シンタキシン2、シンタキシン3A、シンタキシン3Bもしくはシンタキシン3C、ニワトリシンタキシン1Aもしくはシンタキシン2；アフリカツメガエルシンタキシン1Aもしくはシンタキシン1B、ゼブラフィッシュシンタキシン1A、シンタキシン1Bもしくはシンタキシン3、シビレエイシンタキシン1Aもしくはシンタキシン1B、オオバフンウニシンタキシン1Aもしくはシンタキシン1B、ショウジョウバエシンタキシン1Aもしくはシンタキシン1B、ヒルシンタキシン1Aもしくはシンタキシン1B、ヤリイカシンタキシン1Aもしくはシンタキシン1B、モノアラガイシンタキシン1Aもしくはシンタキシン1B、またはそれらの任意のオルソログ、パラログまたはホモログである。上記のタンパク質に由来する好適な切断部位はEP 1 926 744 B1に開示されている。
【００２５】
本発明の一態様において、BoNT/Dプロテアーゼによって認識されて切断される神経毒切断部位は、BoNT/Dによる切断に感受性のタンパク質に由来する。一態様において、このようなタンパク質は、ヒトまたはマウスVAMP-1、VAMP-2およびVAMP-3/セルブレビン、ウシ VAMP-2、ラットVAMP-2もしくはVAMP-3、ニワトリVAMP-1、VAMP-2もしくはVAMP-3、シビレエイVAMP-1、オオバフンウニVAMP、ショウジョウバエsybA、synB、synC、synD、もしくはsyn、ヒルVAMP、アフリカツメガエルVAMP-2もしくはVAMP-3、ゼブラフィッシュVAMP-1もしくはVAMP-2、ヤリイカVAMP、モノアラガイVAMP、アメフラシVAMPまたはカンセンチュウSNB1-様あるいはそれらの任意のオルソログ、パラログまたはホモログである。上記のタンパク質に由来する好適な切断部位は、EP 1 926 744 B1に開示されている。
【００２６】
本発明の一態様において、BoNT/Eプロテアーゼによって認識されて切断される神経毒切断部位は、BoNT/Eによる切断に感受性のタンパク質に由来する。一態様において、このようなタンパク質は、ヒトSNAP-25AもしくはB、あるいはラット、マウス、ウシ、ゼブラフィッシュ、フナ、アフリカツメガエル、シビレエイ、オオバフンウニ、ヤリイカ、モノアラガイまたはアメフラシに由来するそれらのホモログ、パラログもしくはオルソログである。上記のタンパク質に由来する好適な切断部位は、EP 1 926 744 B1に開示されている。
【００２７】
本発明の一態様において、BoNT/Fプロテアーゼによって認識されて切断される神経毒切断部位は、BoNT/Fによる切断に感受性のタンパク質に由来する。一態様において、このようなタンパク質は、 ヒトまたはマウスVAMP-1、VAMP-2およびVAMP-3/セルブレビン、ウシVAMP-2、ラットVAMP-2もしくはVAMP-3、ニワトリVAMP-1、VAMP-2もしくはVAMP-3、シビレエイVAMP-1、オオバフンウニVAMP、ショウジョウバエsybA、synB、synC、synD、もしくはsyn、ヒルVAMP、アフリカツメガエルVAMP-2もしくはVAMP-3、ゼブラフィッシュVAMP-1もしくはVAMP-2、ヤリイカVAMP、モノアラガイVAMP、アメフラシVAMPまたはカンセンチュウSNB1-様、あるいはそれらの任意のオルソログ、パラログまたはホモログである。上記のタンパク質に由来する好適な切断部位はEP 1 926 744 B1に開示されている。
【００２８】
本発明の一態様において、BoNT/Gプロテアーゼによって認識されて切断される神経毒切断部位は、BoNT/Gによる切断に感受性のタンパク質に由来する。一態様において、このようなタンパク質は、ヒトまたはマウスVAMP-1、VAMP-2およびVAMP-3/セルブレビン、ウシVAMP-2、ラットVAMP-2もしくはVAMP-3、ニワトリVAMP-1、VAMP-2もしくはVAMP-3、シビレエイVAMP-1、オオバフンウニVAMP、ショウジョウバエsybA、synB、synC、synD、もしくはsyn、ヒルVAMP、アフリカツメガエルVAMP-2もしくはVAMP-3、ゼブラフィッシュVAMP-1もしくはVAMP-2、ヤリイカVAMP、モノアラガイVAMP、アメフラシVAMPまたはカンセンチュウSNB1様、あるいはそれらの任意のオルソログ、パラログまたはホモログである。上記のタンパク質に由来する好適な切断部位は、EP 1 926 744 B1に開示されている。
【００２９】
本発明の一態様において、TeNTプロテアーゼによって認識されて切断される神経毒切断部位は、TeNTによる切断に感受性のタンパク質に由来する。一態様において、このようなタンパク質は、ヒトまたはマウスVAMP-1、VAMP-2およびVAMP-3/セルブレビン、ウシVAMP-2、ラットVAMP-2もしくはVAMP-3、ニワトリVAMP-1、VAMP-2もしくはVAMP-3、シビレエイVAMP-1、オオバフンウニVAMP、ショウジョウバエsybA、synB、synC、synD、もしくはsyn、ヒルVAMP、アフリカツメガエルVAMP-2もしくはVAMP-3、ゼブラフィッシュVAMP-1もしくはVAMP-2、ヤリイカVAMP、モノアラガイVAMP、アメフラシVAMPまたはカンセンチュウSNB1様、あるいはそれらの任意のオルソログ、パラログまたはホモログである。上記のタンパク質に由来する好適な切断部位は、EP 1 926 744 B1に開示されている。
【００３０】
本発明の別の態様において、BoNTプロテアーゼによって認識されて切断される神経毒切断部位は、BoNTタンパク質中に見出される自己触媒切断部位に由来する。一態様において、本発明により使用され、所与のBoNTまたはTeNTの自己触媒切断部位に由来する神経毒切断部位は、少なくとも6個、少なくとも8個、少なくとも10個または少なくとも15個の連続残基を含み、例えば、BoNT/A残基250Tyr-251Tyr、BoNT//B残基256Phe-257Phe、BoNT//C1残基257Phe-258Tyr、BoNT//D残基257Phe-258Phe、BoNT//E残基239Pro-240Leu、BoNT//F残基254Pro-255Leu、BoNT//G残基256Phe-257Phe、TeNT残基259Ile-260Tyr、BoNT//A残基Phe266-Gly267、BoNT//B残基Phe272-Gly273、BoNT//C1残基Phe273-Gly274、BoNT//D 残基Phe273-Gly274、BoNT//E残基Phe255-Gly256、BoNT//F残基Phe270-Gly271、BoNT//G残基Phe272-Gly273またはTeNT残基Phe275-Gly276が挙げられる。上記のBoNTおよびTeNTに由来する好適な切断部位は、EP 1 926 744 B1に開示されている。
【００３１】
本発明のさらに一態様において、上記の神経毒切断部位は、配列番号6〜8のいずれか1つに示されるSNAP-25に由来する切断部位である。
【００３２】
有利なことに、本発明の一本鎖ルシフェラーゼ融合ポリペプチドは、細胞培養系または無細胞アッセイにおいて、所与の神経毒ポリペプチドの定性的または定量的プロテアーゼ活性の測定を可能とする。このため、本発明のおかげで、費用が高く不必要な動物試験を回避または低減することができる。さらに、本発明の一本鎖ルシフェラーゼ融合ポリペプチドは、自動ハイスループットスクリーニングアッセイに適用することができる。また本発明の一本鎖ルシフェラーゼ融合ポリペプチドは、初代細胞ではなく、神経芽細胞腫細胞株におけるアッセイの確立も可能とする。従って、他の細胞ベースの神経毒アッセイにおいて必要とされる初代神経細胞の使用を回避することができる。これは、初代神経細胞の調製が煩雑且つ非効率的であるため、別の利点である。
【００３３】
上記の用語の定義および説明は、別段に指示される以下の例外において変更すべきところは変更して、本明細書中に記載される全ての態様に適用されることが理解されよう。
【００３４】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターにも関する。
【００３５】
用語「ベクター」は、好ましくは、ファージ、プラスミド、ウイルスまたはレトロウイルスベクターならびに人工染色体（例えば細菌人工染色体または酵母人工染色体）を包含する。さらに、この用語はまた、標的化構築物のゲノムDNAへのランダム組み込みまたは部位特異的組み込みを可能とする標的化構築物にも関する。このような標的構築物は、一態様において、好ましくは、以下に詳細に記載される同種組み換えまたは異種組み換えに十分な長さのDNAを含む。本発明のポリヌクレオチドを包含するベクターは、一態様において、宿主中の増殖および/または選択のための選択可能なマーカーをさらに含む。このベクターは、当技術分野で周知の様々な技術によって宿主細胞に組み込むことができる。例えば、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物または塩化ルビジウム沈殿物などの沈殿物、または荷電脂質との複合体、またはフラーレンなどの炭素ベースのクラスターに導入することができる。別法として、プラスミドベクターを、ヒートショック技術またはエレクトロポレーション技術によって導入することができる。このベクターがウイルスであれば、適切なパッケージング細胞系を用いて、宿主細胞に適用する前にin vitroでパッケージングすることができる。レトロウイルスベクターは、複製可能であっても、複製欠損であってもよい。後者の場合、ウイルス増殖は、一般的に、相補する宿主/細胞においてのみ生じる。
【００３６】
さらに、本発明の一態様において、本発明のポリヌクレオチドは、上記のベクター中で、原核宿主細胞または真核宿主細胞中での発現を可能にする発現制御配列、またはそれらの単離された断片に機能的に連結される。このため、一態様において、上記のベクターは発現ベクターである。このポリヌクレオチドの発現は、翻訳可能なmRNAへのポリヌクレオチドの転写を含む。宿主細胞中の発現を確保する調節エレメントは、当技術分野で周知である。一態様において、調節エレメントは、転写の開始を確保する調節配列および/または転写の終結および転写産物の安定化を確保するポリ-Aシグナルを含む。付加的な調節エレメントは、転写エンハンサーならびに翻訳エンハンサーを含み得る。原核宿主細胞中での発現を可能とする、可能性のある調節エレメントには、例えば、大腸菌(E. coli)中のlacプロモーター、trpプロモーターまたはtacプロモーターが含まれ、真核宿主細胞中での発現を可能とする調節エレメントの例は、酵母中のAOX1-プロモーターもしくはGAL1-プロモーター、または哺乳動物細胞および他の動物細胞中のCMVプロモーター、SV40プロモーター、RSV-プロモーター(ラウス肉腫ウイルス)、CMVエンハンサー、SV40エンハンサーもしくはグロビンイントロンである。さらに、本発明により包含される発現ベクター中で、誘導性発現制御配列を使用することができる。このような誘導性ベクターは、tetオペレーター配列もしくはlacオペレーター配列またはヒートショックもしくは他の環境因子によって誘導可能な配列を含み得る。好適な発現制御配列は、当技術分野で周知である。転写の開始に関与するエレメントに加えて、このような調節エレメントは、ポリヌクレオチドの下流にSV40-ポリA部位またはtk-ポリA部位などの転写終結シグナルも含み得る。本発明の文脈において、好適な発現ベクターは当技術分野において公知であり、例えば、Okayama-Berg cDNA発現ベクター pcDV1(Pharmacia社)、pBluescript(Stratagene社)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogen社)もしくはpSPORT1(Invitrogen社)が挙げられる。好ましくは、上記のベクターは発現ベクターおよび遺伝子導入ベクターまたは標的化ベクターである。ウイルス（例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、またはウシパピローマウイルス）由来の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターの、標的化細胞集団中への送達に使用することができる。当業者に周知の方法を用いて組換えウイルスベクターを構築することができる；例えば、Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y、およびAusubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994)に記載の技術を参照されたい。
【００３７】
さらに本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞に関する。
【００３８】
本明細書で用いられる用語「宿主細胞」は、原核生物および真核生物の宿主細胞を包含する。一態様において、宿主細胞は細菌細胞である。1つの態様において、上記の細菌宿主細胞は大腸菌宿主細胞である。このような細菌宿主細胞は、例えば、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターの複製に使用することができる。
【００３９】
一態様において、真核宿主細胞は、本発明のポリペプチドと本発明のポリヌクレオチドまたはベクターのいずれかを含む細胞であり、ここで上記のポリヌクレオチドまたはベクターは、本発明のポリペプチドを産生するために本発明の宿主細胞中で発現される。本発明のポリヌクレオチドは、一時的にまたは安定的に宿主細胞に導入することができる。一態様において、本発明の真核宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドを安定的に発現する真核宿主細胞系の細胞であってよい。別の態様において、本発明の宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターで一時的にトランスフェクトされて、本発明のポリヌクレオチドを発現する真核宿主細胞である。一態様において、本発明の宿主細胞は、神経毒ポリペプチドを細胞質に移行させることができる真核宿主細胞である。一態様において、神経毒ポリペプチドを取り込むことができる細胞は、神経毒ポリペプチド取り込みのための全ての必要な成分を内因的に産生する細胞であり得る。一態様において、上記の細胞は神経細胞である。一態様において、上記の細胞は、神経芽細胞腫細胞株、胚性幹細胞, ならびに一態様において、非ヒト胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、および初代神経細胞(ニューロン)、例えば、SH-SY5Y、SiMa、PC12、CHP134、LA-N-5、SK-N-BE(2)などからなる群から選択される。別の態様において、上記の細胞は、神経毒ポリペプチド取り込みに必要な成分を産生するように遺伝子組み換えされている細胞である。このような細胞を分子生物学的技術によって遺伝子組み換えし得る方法は、当業者には周知である。
【００４０】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに関する。
【００４１】
本明細書中で使用される用語「ポリペプチド」は、他の宿主細胞ポリペプチドを本質的に含まない、単離された、または本質的に精製されたポリペプチドを包含する。別の態様において、この用語は、本発明のポリペプチドおよびさらに他のタンパク質を含むポリペプチド調製物を包含する。さらにこの用語は、一態様において、化学的に修飾されたポリペプチドを包含する。このような修飾は、人工的修飾であってもよいし、または天然の修飾であってもよい。本発明のポリペプチドは、上記に言及される生物学的特性を有していなければならない。本発明のポリペプチドは、一態様において、当業者に周知の化学合成技術または組換え分子生物学技術によって製造することができる。一態様において、本発明のポリペプチドのこのような製造方法は、(a) 本明細書中の他の箇所により詳細に記載される本発明の宿主細胞を培養するステップ、および(b) 上記の宿主細胞から本発明のポリペプチドを得るステップを含む。この方法の一態様において、本発明のポリペプチドは、従来の精製技術（例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよび/または予備的ゲル電気泳動）によって宿主細胞溶解液から得ることができる。
【００４２】
本発明は、サンプル中のタンパク質分解活性を有する神経毒ポリペプチドを測定する方法であって、以下のステップ：
a) 本発明の一本鎖ルシフェラーゼ融合タンパク質の、別々のLuxBサブユニットとLuxAサブユニットへのタンパク質分解切断を可能とする条件下で、本発明の宿主細胞または本発明のポリペプチドを、上記のタンパク質分解活性を有する神経毒ポリペプチドを含むことが疑われるサンプルと接触させるステップ；
b) 上記のLuxBサブユニットとLuxAサブユニットに生物学的に活性なルシフェラーゼを形成させるステップ；ならびに
c) 上記のルシフェラーゼを測定するステップを含む、上記方法に関する。
【００４３】
本発明の方法は、自動化によって支援することができる。具体的には、一態様において、ステップa)および/またはb)は、化合物を混合し、ルシフェラーゼ活性を測定するためのロボット装置および自動読み取りシステムによって支援され得る。好適なシステムは当技術分野において公知であり、測定対象の応答の種類に応じて決定される。さらに、この方法は、サンプル調製または本発明のポリペプチドの作製に関するさらなるステップを含み得る。
【００４４】
本明細書中で使用される用語「接触させる」とは、少なくとも2種の異なる化合物を、上記の化合物の物理的および/または化学的相互作用を可能とするように物理的に近接させることを指す。上記の方法において、本発明によるポリペプチドは、生物学的に活性な神経毒ポリペプチドを含むことが疑われるサンプルと接触する。このポリペプチドは、しばらくの間、また本発明のポリペプチド中の神経毒切断部位の、上記のサンプルによって含まれる神経毒ポリペプチドによる切断を可能とするのに十分な条件下で接触させなければならない。一態様において、本明細書中で使用される接触は、本発明のポリペプチドを含有する本発明の宿主細胞中で起こる。このため、一態様において、上記のポリペプチドは宿主細胞に含まれ、また一態様において、本発明の宿主細胞に含まれる。上記の時間および条件は、サンプルに含まれる神経毒ポリペプチドの量ならびに、本発明の宿主細胞による神経毒ポリペプチドの取り込みによって決まる。当業者は、宿主細胞、サンプルの種類、および測定しなければならない神経毒の種類に応じて、どの条件を適用する必要があるのかを十分に理解している。別の態様において、接触は、本発明のポリペプチドならびに本発明のポリペプチドの基質を含む無細胞系中で起こる。上記の無細胞系は、無細胞系とサンプルとを接触させたときに、本発明のポリペプチドの活性(すなわちルシフェラーゼ活性)の測定を可能とし、このようにして上記のサンプル中の神経毒プロテアーゼ活性の測定を可能とするものでなければならない。
【００４５】
一態様において、上記のルシフェラーゼは、ルシフェラーゼ基質の酵素的変換を測定することによって測定される。一態様において、このルシフェラーゼ基質は、変換反応中に発光される光の強度を検出することによって測定することができる。ルシフェラーゼによって触媒される変換反応中に生じる発光を測定するための好適な系は、当技術分野で周知であり、かつ市販されている。さらにまた、本発明のルシフェラーゼに使用することができる好適な基質も周知であり、かつ市販されている。しかし、別の態様において、本発明のルシフェラーゼは、形成されるLuxAおよび/もしくはBサブユニットの量を測定することまたは形成されるホロ酵素の量を測定することのいずれかによって測定することができる。一態様において、この測定は、サブユニットまたは本発明のホロ酵素を特異的に認識する抗体を用いる抗体ベースの免疫アッセイ、例えば免疫ブロット法もしくはELISAによって、またはSDS PAGEによって実施される。
【００４６】
用語「サンプル」は、神経毒ポリペプチドを含むことが疑われるサンプルを指す。一態様において、このサンプルは水溶液である。このようなサンプルは、生物学的サンプルであってもよいし、または人工的に生成された水溶液のサンプルであってもよい。一態様において、このような溶液は、神経毒製造中の異なる段階において、品質管理および/または活性の測定/特定の目的のため、または安全管理のために得られる。上記のサンプル中に含まれる神経毒は、少なくとも神経毒プロテアーゼ活性を示すものであると考えられる。別の態様において、本発明の神経毒は、完全に生物学的に活性である。一態様において、上記の完全に生物学的に活性な神経毒は、上記の細胞に入って、本発明の一本鎖ルシフェラーゼ融合ポリペプチドに基づく読み取りを活性化させるために必要とされる。従って、宿主細胞を本発明の方法によって解析されるサンプルと接触させる場合、このような完全に生物学的に活性な神経毒が適用される。別の態様において、本発明の方法に適用されるサンプルは、単に神経毒プロテアーゼ活性を示す神経毒ポリペプチドまたはその断片を含む。一態様において、このような神経毒ポリペプチドまたは断片は、タンパク質分解活性を有する軽鎖を含む、または本質的にタンパク質分解活性を有する軽鎖からなる神経毒ポリペプチドの変異タンパク質である。上記のサンプルを、本明細書中の他の箇所で詳細に特定される無細胞系に接触させる場合、神経毒プロテアーゼ活性だけを示す神経毒ポリペプチドまたはその断片を含むサンプルを使用しなければならないことが理解されよう。
【００４７】
サンプル中の神経毒ポリペプチドは、定量的または定性的に測定することができる。本発明の一態様において、定性的測定のため、神経毒ポリペプチドの存在または不在が決定される。一態様において、定量的検出のため、神経毒ポリペプチドの量が測定される。定量的測定は、絶対量または相対量(すなわち、異なるサンプルに中に見られる量を互いに比較できるように正規化された量)の測定を包含する。一態様において、この測定は、試験サンプルについて測定されたルシフェラーゼ活性を、一定量の神経毒ポリペプチドを有する較正サンプルを本発明の方法に供することよって確立された較正曲線に対して比較することによって達成することができる。
【００４８】
一態様において、本発明の一本鎖ルシフェラーゼ融合ポリペプチドに含まれる神経毒切断部位が、サンプル中で測定されるタンパク質分解活性を有する神経毒ポリペプチドによって認識されることが理解されるだろう。さらに一態様において、上記の神経毒ポリペプチドは、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/GまたはTeNTからなる群から選択される。
【００４９】
本発明の方法の別の態様において、2つ以上の神経毒ポリペプチドの活性が測定されるものとする。この目的のため、(i) 第1のルシフェラーゼのLuxBサブユニット、(ii) 第1の神経毒ポリペプチドの神経毒切断部位を含むリンカー、および(iii) 上記の第1のルシフェラーゼのLuxAサブユニットを含む第1の一本鎖ルシフェラーゼ融合ポリペプチドをコードする本発明によるポリヌクレオチドと、(i) 第2のルシフェラーゼのLuxBサブユニット、(ii) 第2の神経毒ポリペプチドの神経毒切断部位を含むリンカー、および(iii) 上記の第2のルシフェラーゼのLuxAサブユニットを含む第2の一本鎖ルシフェラーゼ融合ポリペプチドをコードする本発明による別のポリヌクレオチドとを含む宿主細胞を適用することができる。第1の神経毒ポリペプチドと第2の神経毒ポリペプチドとは異なり、異なる切断部位を認識して切断することが理解されるだろう。さらに、一態様において、上記の第1のLuxBサブユニットおよびLuxAサブユニットを含む第1のルシフェラーゼホロ酵素と、上記の第2のLuxBサブユニットおよびLuxAサブユニットを含む第2のルシフェラーゼホロ酵素は、互いに識別し得る異なる発光(例えば、異なる波長における最大発光)の生成を利用することが理解されるだろう。一態様において、上記の第1のルシフェラーゼホロ酵素および/または上記の第2のルシフェラーゼホロ酵素は、蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質(GFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、赤色蛍光タンパク質(RFP)、青色蛍光タンパク質などに結合することができる。一態様において、第1のサブユニットはビブリオ・ハーベイに由来し、先に言及した第2のサブユニットは、ビブリオ・フィシェリに由来する。
【００５０】
このように、本発明の方法は、サンプル中の生物学的に活性な神経毒ポリペプチドの効率的な測定を可能とし、従って、ハイスループットスクリーニングスクリーニングまたは品質管理法に適用することができる。本発明の方法のおかげで、初代神経細胞ではなく細胞培養細胞を使用することにより、神経毒ポリペプチドの測定を自動化することができる。さらに、安定的にトランスフェクトされた宿主細胞系の使用は、同等の品質の読み取り系(readout system)（すなわち、本発明の方法に適用される宿主細胞）を可能にする。従って、本発明の方法は、神経毒ポリペプチドの開発または品質管理の文脈において、動物試験の代替法としての役割を果たし得るか、または少なくとも動物試験を有意に低減することができる。
【００５１】
さらに本発明には、通常、サンプル中のタンパク質分解活性を有する神経毒ポリペプチドをin vitroで測定するための、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞またはポリペプチドの使用が包含される。
【００５２】
最終的に本発明は、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞および/またはポリペプチドならびに、好ましくは、ルシフェラーゼ基質の酵素的変換を測定するための検出剤およびルシフェラーゼ基質を含む、サンプル中のタンパク質分解活性を有する神経毒ポリペプチドを測定するためのキットを想定する。
【００５３】
本明細書中で使用される用語「キット」は、本発明の方法を実施するため、別々に、またはすぐに使用し得る形式で共通のバイアルに入って提供される、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターおよび/または宿主細胞を含む手段の総称である。一態様において、このキットは、本発明の方法を実施するための付加的な手段(一態様において、神経毒ポリペプチドを含む較正標準溶液)および/またはルシフェラーゼ活性を測定するための手段(例えば、ルシフェラーゼ用の検出剤またはルシフェラーゼにより変換される基質)を含む。さらに、一態様において、本発明のキットは、本発明の方法を実施するための説明書を含む。これらの説明書は、マニュアルとして提供されてもよいし、または実行されると本発明の方法の1つ以上のステップを管理することができるデータ記憶媒体上の、コンピューターで実行可能なアルゴリズムの形態であってもよい。一態様において、本発明のキットは、上記に特定される本発明の方法を実施するために使用される。
【００５４】
本明細書中で引用される参考文献は全て、これらの全ての開示内容、および本明細書中で具体的に言及される開示内容について参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００５５】
ここで本発明を実施例により説明するが、本発明の範囲を限定するものと解されてはならない。
【００５６】
実施例1：大腸菌における異なるルシフェラーゼ構築物の発現、発酵および精製
大腸菌中のMRZ_LuxAB0およびMRZ_LuxBA3の発現
構築物MRZ_LuxAB0(配列番号9)およびMRZ_LuxBA3(配列番号10)は、pASK-IBA3-plusベクター構築物であり、いずれもC末端Strep-tag IIを有する2つの異なるルシフェラーゼ標的をコードしている。C末端Strep-tag IIを有するルシフェラーゼAB0の予想分子量は78.6KDaであり、推定pIは5.22である。C末端Strep-tag IIを有するルシフェラーゼBA3の予想分子量は84.9KDaであり、推定pIは5.20である。
【００５７】
22℃におけるMRZ_LuxAB0およびMRZ_LuxBA3の発現
上記の発現を解析するため、MRZ_LuxAB0およびMRZ_LuxBA3(いずれもアンピシリン耐性(AmpR))を、大腸菌株BL21およびRosetta(DE3)/pRARE2(クラリスロマイシン耐性(CamR))に形質転換した。細胞を、37℃にて、200μg/mlのアンピシリン(および各菌株について30μg/mlのクロラムフェニコール)を添加したLB培地中で、OD600が0.4(BL21)またはOD600が0.2(Rosetta(DE3)/pRARE2)に達するまで増殖させた。各培養物を22℃にシフトし、OD600が0.65(BL21)またはOD600が0.3(Rosetta(DE3)/pRARE2)に達するまで増殖させた。培養物を、0.2μg/mlの無水テトラサイクリンを用いて誘導し、22℃においてさらに24時間増殖させた。0、1、3、5および24時間の誘導後、サンプルを取り出し、Bug buster HT溶液(Novagen)で処理して細胞を破壊し、可溶性タンパク質画分と不溶性タンパク質画分とを分離した。図2Aおよび2Bに見られるとおり、12％ゲル上のSDS-PAGE解析により(さらに抗Strep-tag抗体を用いたウェスタンブロットによって)サンプルを解析した。
【００５８】
16℃におけるMRZ_LuxAB0およびMRZ_LuxBA3の発現
発現を解析するため、MRZ_LuxAB0およびMRZ_LuxBA3(いずれもアンピシリン耐性(AmpR))を、大腸菌BL21に形質転換した。細胞を、25℃にて、200μg/mlのアンピシリンを添加したLB培地中で、OD600が0.15に達するまで増殖させた。各培養物を16℃にシフトし、OD600が0.2(MRZ_LuxAB0)またはOD600が0.35(MRZ_LuxBA3)に達するまで増殖させた。培養物を、0.2μg/mlの無水テトラサイクリンで誘導し、16℃においてさらに24時間増殖させた。0、1、3、5および24時間の誘導後、サンプルを取り出し、Bug buster HT溶液(Novagen社)で処理して細胞を破壊し、可溶性タンパク質画分と不溶性タンパク質画分とを分離した。図3Aおよび3Bにみられるとおり、サンプルを、12％ゲル上のSDS-PAGE解析により(さらに抗Strep-tag抗体を用いたウェスタンブロットによって)解析した。
【００５９】
図2Aおよび3Aに示されるクーマシー染色したゲル中のバンドを、ルシフェラーゼAB0およびBA3標的に明確に関連付けるため、さらに不溶性標的と比較した可溶性標的の量を推定するため、抗Strep-tag抗体を用いたウェスタンブロット解析を実施した。このウェスタンブロット解析は、図2Bおよび3Bに示されるとおり、BL21/LuxAB0発現の不溶性タンパク質画分において、75kDaおよび100kDaの分子量マーカーバンドの間を移動するタンパク質(翻訳ルシフェラーゼAB0タンパク質の予想分子量78.6kDaと一致する)の存在を明らかにした。LuxAB0構築物は、16℃における24時間の誘導後にBL21中で最良の可溶性発現を示した。いずれの図においても、LuxBA3発現株において、抗Strep-tag抗体によって特異的ウェスタンブロットシグナルは検出されなかった。しかし、図3Bでは、BL21中の発現の24時間後に、可溶性タンパク質画分中に極めて弱いシグナルを見ることができた。
【００６０】
大腸菌株BL21 LuxAB0およびBL21 LuxBA1の高細胞密度バッチ発酵
大腸菌株BL21 LuxAB0およびBL21 LuxBA1を、バッチ発酵モードで別々に増殖させた。LBプレートから各株の単一コロニーを選択し、2 x 100mlのLB培地に播種し、25℃にて175rpmで16時間増殖させた。これらの前培養物は、4.5Lの発酵培地に播種するために使用した。全ての培養物にアンピシリンを100μg/mlまで加えた。発酵を通して増殖を記録した(図4、5A、および5B)。発酵槽の設定は、表1にまとめられる。
【表１】
2015509372.tif 000003
【００６１】
発酵培地を以下のとおりに作製した(1リットル当たり):YTGベースの培地について、H2O(900ml)にバクトトリプトン(12g)、バクトイーストエクストラクト(24g)、およびグリセロール(4mL)を加える。別のフラスコ中で、H2O(90mL)に、KH2PO4(一塩基)(2.31g)、K2HPO4(二塩基)(12.54g)を溶解し、H2Oで量を100mLに調整する。両溶液を別々にオートクレーブし、60℃未満に冷却した後にはじめて混合した。
【００６２】
23℃(全発酵過程を通して保たれた)において、発酵槽培養物に、開始OD600が約0.1になるまで播種した。大腸菌株BL21 LuxAB0の培養物は、7時間後にOD600が0.96に達し、ここで大腸菌株BL21 LuxBA1の培養物は、8時間後にOD600が1.2に達した。次いで、誘導物質の無水テトラサイクリンを加えた(最終濃度1.0mg/l)。培養物を、さらに18時間(LuxAB0)または15時間(LuxBA1)後に、4℃における8.000gで20分間の遠心分離により回収した。上清を捨て、細胞ペレットを液体窒素中でスナップ凍結し、次いでさらなる使用まで-80℃で保存した。最終OD600は10.8(LuxAB0)および13.5(LuxBA1)であり、培養体積は約5Lであった。バイオマス収量は、62g(wcw、LuxAB0)および70g(wcw、LuxBA1)であった。
【００６３】
発酵中、2つのサンプルを抜き取り(無水テトラサイクリン添加の直前と回収時)、細胞を遠心分離によりペレット化し、次いでまた、さらなる使用まで−80℃で保存した。これらの2つのサンプルを、Bugbuster(Novagen社)を使用して解析用に処理し、可溶性物質を不溶性物質から分離した。同量を、SDS-PAGEおよびそれに続くコロイド状クーマシー染色およびウェスタンブロッティングによって、それぞれ解析した(図6Aおよび6B；1レーンあたりロード：クーマシー染色については0.25 x OD600単位および抗Strep-tagウェスタンブロッティングについては0.5 x OD600単位(1 x OD600単位はOD600が1.0の1mlの培養物として定義される))。
【００６４】
LuxAB0およびLuxBA1のStrep-tagアフィニティーバッチ精製
62g(wcw、LuxAB0)の発酵槽バイオマスまたは70g(wcw、LuxBA1)の発酵槽バイオマスを、150mlの再懸濁緩衝液(100mM Tris/HCl(pH8.0)、150mM NaCl、および1mM EDTA)中で再懸濁した。この細胞を、マイクロフルイダイザーに2回通すことによって破壊した。未破壊細胞を4℃、10000 x gで30分間の遠心分離によって除去した(ペレットは廃棄した。上清 = Load)。1ml(ベッド体積)のStrep-Tactin Superflowマトリックス(IBA社製)を粗抽出物(上清、Load)に加え、4℃で穏やかに振盪しながら30分間結合を実施した。この懸濁液を、4℃において、2000 x gで10分間遠心分離した。上記のマトリックスを重力カラムに移し、フロースルーを回収した(FT1)。カラムを5mlの再懸濁緩衝液で1回洗浄し(洗浄液をFT1に加えた)、その後2.5mM D-デスチオビオチンを含む500μlの再懸濁緩衝液を用いて6回の溶出ステップを実施した(E1-E6、第1溶出)。上記のフロースルー(FT1)をさらにカラムにロードした。このステップのフロースルーをさらに回収した(FT2)。カラムを5mlの再懸濁緩衝液で1回洗浄した(洗浄液をFT2に加えた)。2回目の溶出(2.5mM D-デスチオビオチンを含む500μlの再懸濁緩衝液による6回の溶出ステップからなる)を実施した(E1-E6、第2溶出)。2回目のフロースルー(FT2)をさらにカラムにロードした。3回目の溶出(2.5mMのD-デスチオビオチンを含む500μlの再懸濁緩衝液を用いる6回の溶出ステップからなる)を実施した(E1-E6、第3溶出)。以下の溶出画分をプールした：Pool E1(溶出1から得られたE1-E6)、Pool E2(溶出2から得られたE1-E6)、およびPool E3(溶出3から得られたE1-E6)。図7に示されるとおり、12％SDS-PAGE解析およびStrep-tag抗体(StrepMAB-Classic、HRPコンジュゲート、IBA社製、カタログNo.2-1509-001)を用いたウェスタンブロットによってサンプルを解析した。
【００６５】
Bradford解析を用いて溶出画分のタンパク質濃度を測定した。各溶出画分プールを半分に分け(それぞれ1,5ml)、4℃にて保存した。表2に示されるとおり、溶出画分の全タンパク質収量は、LuxAB0構築物については約6mg(62g(wcw)の発酵槽バイオマスから精製)であり、LuxBA1構築物については約3mg(70g(wcw)の発酵槽バイオマスから精製)であった。
【表２】
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【００６６】
実施例2：異なるLuxBA3-Strep-tag発現ベクターのクローニングおよび大腸菌における発現
発現ベクターのクローニング
鋳型DNA(配列番号10)を用いて標的配列を増幅し、pET-ベースの発現ベクター中にサブクローン化した。結果として得られた標的ベクターに命名した(表3)。大腸菌形質転換体をスクリーニングし、幾つかの候補からプラスミドDNAを単離して配列決定した。これらの標的配列を、DNAシークエンシングによって確認した。
【表３】
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【００６７】
小規模大腸菌振盪フラスコ培養物中の発現
表3に挙げられる3つの各構築物を、2つの異なる宿主株中で発現させた。解析用のサンプルを、4つの時点(IPTG添加の直前ならびに誘導の2、4、および20時間後)で抜き取った。LBプレートから単一コロニーを選択し、5mlのLB培地(適切な抗生物質を含む)に播種し、37℃、175rpmで一晩増殖させた。これらから、新鮮な30mlのLB培養物に、開始OD600が0.1になるまで播種した。培養物が約0.4のOD600に達したとき、各培養物を37℃に保持し、全培養物中で、IPTG(0.5mM)の添加によって標的発現を誘導した。全サンプルを、Bugbuster(Novagen社)を使用して同様に処理し、可溶性物質を不溶性物質から分離した。SDS-PAGEおよびそれに続くコロイド状クーマシー染色および抗-Strepウェスタンブロッティングのそれぞれにより、同量を解析した(図8A-C)。
【００６８】
実施例3：LuxBA3構築物の発現およびLuxBA3タンパク質の精製
LuxBA3構築物の発現
構築物pTZ_E47_LuxBA3(9xHis-Xa-LuxBA3-Strepタンパク質;表3参照)を、大腸菌株BL21(DE3)中で発現させた。LBプレートから単一コロニーを選択し、5mlのLB培地(カナマイシン(25μg/ml)を含む)に播種し、25℃、175rpmで一晩増殖させた。翌朝、100mlのLB振盪フラスコ培養物に、開始OD600が0.1になるまで播種した。培養物が約0.6のOD600に達したとき、全培養物中で、IPTG(それぞれ0.02mM、0.10mM、および0.25mMのIPTG)の添加によって標的発現を誘導した。IPTG添加の直前および誘導の20時間後に、解析用のサンプルを抜き取った。これらの発現条件を用いて、追加のバイオマス(3 x 1 l)を生成した。
【００６９】
全てのサンプルを、Bugbuster(Novagen社)を使用して同様に処理し、可溶性物質を不溶性物質から分離した。SDS-PAGEならびにそれに続くコロイド状クーマシー染色およびウェスタンブロッティングのそれぞれにより、同量を解析した(図9)。サンプリングの時間的経過を過ぎて、誘導の20時間後に、5.000gで15分間の遠心分離によって培養物を回収した。細胞ペレットは-20℃で保存した。
【００７０】
変性条件下における、不溶性画分からの標的タンパク質9xHis-Xa-LuxBA3-Strep (87kDa)の精製-カラム上のリフォールディング
不溶性画分からの精製のため、3つの細胞ペレット(上記参照)を全て混合して、1回で処理した。変性した標的タンパク質をNiNTAクロマトグラフィーカラム上に結合させた後、標的をカラム上でリフォールディングさせ、次いで溶出させた。精製物の最終収量は3.8mgであり、推定純度は90％であった。
【００７１】
以下のプロトコルを使用して不溶性タンパク質画分を可溶化した：上記のバイオマスを、プロテアーゼ阻害剤を含むPBS(pH7.4)中に再懸濁した。再懸濁したバイオマスをマイクロフルイダイザーに通すことによって機械的細胞溶解を実施した。細胞を遠心分離し、不溶性画分と可溶性画分とを分離した。PBS中の遠心分離後、ペレット(不溶性画分)を再懸濁し、尿素を8Mの最終濃度まで添加し、混合物を、室温で撹拌しながら1時間インキュベートした。室温での遠心分離の後、尿素不溶性画分(ペレット)と尿素可溶性画分(上清)が得られた。尿素可溶性画分(上清)を、8M尿素を含むローディング緩衝液を用いてニッケルキレート樹脂(FPLC)上にロードした。次のステップでは、8M尿素から開始して0M尿素までの線形勾配を2時間にわたって続ける。PBS(このステップ以降尿素を含まない)で洗浄した後、PBSと20mMイミダゾールによる2回目の洗浄を行った。20mMイミダゾールから500mMイミダゾール(PBS中)までの線形勾配によってタンパク質を溶出させる。最終サンプルは、SDS-PAGEおよびコロイド状クーマシー染色によって解析された(図10)。精製した標的タンパク質を、PBS(pH7.4、残留イミダゾールが存在する)中で保存した。サンプルを等分した。それぞれ、約半分を＋4℃で保存し、他の半分を凍結させて−20℃で保存した。
【００７２】
さらに、9xHis-Xa-LuxBA3-Strepタンパク質の解析は、このタンパク質がBoNT/A活性によって切断され得るが、この切断は、望まれるルシフェラーゼ活性を全くもたらさなかったことを明らかにした。
【図１】
2015509372.tif 000006
【図２Ａ】
2015509372.tif 000007
【図２Ｂ】
2015509372.tif 000008
【図３Ａ】
2015509372.tif 000009
【図３Ｂ】
2015509372.tif 000010
【図４】
2015509372.tif 000011
【図５】
2015509372.tif 000012
【図６Ａ】
2015509372.tif 000013
【図６Ｂ】
2015509372.tif 000014
【図７】
2015509372.tif 000015
【図８Ａ】
2015509372.tif 000016
【図８Ｂ】
2015509372.tif 000017
【図８Ｃ】
2015509372.tif 000018
【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2015509372.tif 000022