(57)【要約】  本開示は、アセト乳酸合成酵素活性およびアセト乳酸脱炭酸酵素活性を有している組換えシアノバクテリアを提供し、同様に、アセト乳酸合成酵素活性、アセト乳酸脱炭酸酵素活性、および第２級アルコール脱水素酵素活性を有している組換えシアノバクテリアも提供する。当該組換えシアノバクテリアの生産方法も、二酸化炭素および光からアセトインおよび２，３−ブタンジオールを生産するための当該組換えシアノバクテリアを使用する方法と同様に提供される。
2015530116.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）およびアセト乳酸脱炭酸酵素（ＡＬＤＣ）をコードしている組換えポリヌクレオチドを含有しているシアノバクテリアであり、当該ＡＬＳおよび当該ＡＬＤＣの発現は、当該ポリヌクレオチドを欠いている対応するシアノバクテリアと比較して、アセトインの生産における増加をもたらすことを特徴とする、シアノバクテリア。
【請求項２】
アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）、アセト乳酸脱炭酸酵素（ＡＬＤＣ）および第２級アルコール脱水素酵素（ｓＡＤＨ）をコードしている組換えポリヌクレオチドを含有しているシアノバクテリアであり、当該ＡＬＳ、当該ＡＬＤＣおよび当該ｓＡＤＨの発現は、当該ポリヌクレオチドを欠いている対応するシアノバクテリアと比較して、アセトインおよび２，３−ブタンジオール（２３ＢＤ）の内の１種または両方の生産における増加をもたらすことを特徴とする、シアノバクテリア。
【請求項３】
上記ＡＬＳは、細菌のＡＬＳであり、且つ上記ＡＬＤＣは、細菌のＡＬＤＣまたは真菌のＡＬＤＣであることを特徴とする請求項１に記載のシアノバクテリア；または、
上記ＡＬＳは、細菌のＡＬＳであり、上記ＡＬＤＣは、細菌のＡＬＤＣまたは真菌のＡＬＤＣであり、且つ上記ｓＡＤＨは、細菌のｓＡＤＨまたは真菌のｓＡＤＨであることを特徴とする、請求項２に記載のシアノバクテリア。
【請求項４】
上記ＡＬＳは、バチルス  エスピーのＡＬＳであることを特徴とする、請求項３に記載のシアノバクテリア。
【請求項５】
上記ＡＬＤＣは、エンテロバクター  エスピーのＡＬＤＣ、バチルス  エスピーのＡＬＤＣ、アエロモナス  エスピーのＡＬＤＣ、およびグルコンアセトバクター  エスピーのＡＬＤＣからなる群より選択されることを特徴とする、請求項３に記載のシアノバクテリア。
【請求項６】
上記ＡＬＤＣは、エンテロバクター  アエロゲネスのＡＬＤＣ、エンテロバクター  クロアカエのＡＬＤＣ、バチルス  リケニホルミスのＡＬＤＣ、バチルス  サブチリスのＡＬＤＣ、アエロモナス  ヒドロフィラのＡＬＤＣ、およびグルコンアセトバクター  キシリナスのＡＬＤＣからなる群より選択されることを特徴とする、請求項３に記載のシアノバクテリア。
【請求項７】
上記ｓＡＤＨは、カンジダ  エスピーのｓＡＤＨ、ロイコノストック  エスピーのｓＡＤＨ、クロストリジウム  エスピーのｓＡＤＨ、およびサーモアナエロバクター  エスピーのｓＡＤＨからなる群より選択されることを特徴とする、請求項３に記載のシアノバクテリア。
【請求項８】
上記ｓＡＤＨは、カンジダ  パラプシローシスのｓＡＤＨ、ロイコノストック  シュードメセンテロイデスのｓＡＤＨ、クロストリジウム  ベイエリンキイのｓＡＤＨ、およびサーモアナエロバクター  ブロッキイのｓＡＤＨからなる群より選択されることを特徴とする、請求項３に記載のシアノバクテリア。
【請求項９】
上記ＡＬＳおよび上記ＡＬＤＣの上記発現、または上記ＡＬＳ、上記ＡＬＤＣおよび上記ｓＡＤＨの上記発現は、誘導可能なプロモーターによって促進されることを特徴とする、請求項３に記載のシアノバクテリア。
【請求項１０】
上記ポリヌクレオチドは、上記シアノバクテリアのゲノム内に安定的に組み込まれていることを特徴とする、請求項３に記載のシアノバクテリア。
【請求項１１】
上記シアノバクテリアは、ノストック  エスピー、シネココッカス  エスピー、シネコシスティス  エスピー、およびサーモシネココッカス  エスピーからなる群より選択されることを特徴とする、請求項３に記載のシアノバクテリア。
【請求項１２】
上記シアノバクテリアは、シネココッカス  エスピーであることを特徴とする、請求項１１に記載のシアノバクテリア。
【請求項１３】
上記シアノバクテリアは、シネココッカス  エロンゲーテス細胞であることを特徴とする、請求項１２に記載のシアノバクテリア。
【請求項１４】
アセトインおよび２，３−ブタンジオール（２３ＢＤ）の内の１種または両方の上記生産は、上記シアノバクテリアを恒明下において培養した結果として起こることを特徴とする、請求項３に記載のシアノバクテリア。
【請求項１５】
アセトインおよび２，３−ブタンジオール（２３ＢＤ）の内の１種または両方の上記生産は、重炭酸塩の存在下において上記シアノバクテリアを培養した結果として起こることを特徴とする、請求項３に記載のシアノバクテリア。
【請求項１６】
上記ＡＬＤＣは、本質的に酸素に対して非感受性であることを特徴とする、請求項３に記載のシアノバクテリア。
【請求項１７】
上記ｓＡＤＨは、本質的に酸素に対して非感受性であり、且つＮＡＤＰＨ−依存性であることを特徴とする、請求項３に記載のシアノバクテリア。
【請求項１８】
アセトインを生産する方法であって、
当該方法は、
ａ）請求項１に記載のシアノバクテリアを準備する工程と、
ｂ）ＣＯ２および光を含んでいる光合成環境において上記シアノバクテリアを培養し、これによって上記ＡＬＳおよび上記ＡＬＤＣの上記発現がアセトインの生産をもたらす工程と、
を包含していることを特徴とする、アセトインを生産する方法。
【請求項１９】
アセトインの上記生産は、上記ポリヌクレオチドを欠いている上記対応するシアノバクテリアを同一条件下で培養することによって生産されるよりも、より高いレベルで起こることを特徴とする、請求項１８に記載のアセトインを生産する方法。
【請求項２０】
２，３−ブタンジオールを生産する方法であって、
当該方法は、
ａ）請求項２に記載のシアノバクテリアを準備する工程と、
ｂ）ＣＯ２および光を含んでいる光合成環境において上記シアノバクテリアを培養し、これによって上記ＡＬＳ、上記ＡＬＤＣおよび上記ｓＡＤＨの上記発現が２，３−ブタンジオールの生産をもたらす工程と、
を包含していることを特徴とする、２，３−ブタンジオールを生産する方法。
【請求項２１】
２，３−ブタンジオールの上記生産は、上記ポリヌクレオチドを欠いている上記対応するシアノバクテリアを同一条件下で培養することによって生産されるよりも、より高いレベルで起こることを特徴とする、請求項２０に記載の２，３−ブタンジオールを生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔関連出願への相互参照〕
本出願は、２０１２年９月２８日に出願された米国仮出願第６１／７０７，８６６号からの優先権を主張し、全ての目的のために、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
〔分野〕
本開示は、アセト乳酸合成酵素活性およびアセト乳酸脱炭酸酵素活性を有している組換えシアノバクテリアを提供し、さらに、アセト乳酸合成酵素活性、アセト乳酸脱炭酸酵素活性および第２級アルコール脱水素酵素活性を有している組換えシアノバクテリアも提供する。組換えシアノバクテリアの生産のための方法が提供され、さらに、二酸化炭素および光からのアセトインおよび２，３−ブタンジオールの生産のために組換えシアノバクテリアを使用するための方法も提供される。
【０００３】
〔背景〕
世界規模のエネルギー需要の増加の中で、再生可能資源からの燃料および化学物質の生産において、関心が高まっている。石油の消費は、アメリカ合衆国において、２００８年には、３７．１×１０１５ＢＴＵに到達し、その大多数（７１％）は、輸送部門における液体燃料であった。石油および天然ガスは、化学工業におけるプラスチック、化学肥料および調合薬等の化学物質のための原料の内の９９％の割合を占めている（McFarlane et al., “Survey of Alternative Feedstocks for Commodity Chemical Manufacturing,” Oak Ridge National Laboratory, 2007）。急速に増加している世界人口と化石燃料の枯渇とを考慮すると、燃料および化学物質を生産するために、エネルギーおよび炭素捕捉（energy and carbon capture：ECC）のための持続可能な方法を開発することは、人間社会に不可欠である。
【０００４】
エネルギー需要の増加に加えて、再生可能なエネルギー資源は、高まりつつある環境問題に対処するために興味深い。アメリカ合衆国エネルギー情報局（United States Energy Information Administration）（Serferlein, “Annual Energy Review, USEIA 2008）によると、２００６年における世界のエネルギーに関連したＣＯ２の排出は、２９０億メートルトンであった。これは、１９９０年から３５％の増加である。大気中のＣＯ２の加速的な蓄積は、世界の成長および増加している炭素の使用による排出増加に起因するのみならず、世界の自然の二酸化炭素吸収源の能率における減衰の可能性による排出増加にも起因する（Raupach et al., Proc Natl Acad Sci USA, 104:10288-10293, 2007）。結果として、ＣＯ２の大気中のレベルは、過去１５０年間にわたって〜２５％までに増加している。それゆえ、ＣＯ２の排出を低減するための新しい技術を開発することは、ますます重要になっている。
【０００５】
再生可能なエネルギーを生産するための先の方法は、陸生植物のバイオマスを生化学物質に転換することに関係している。しかしながら、これらの方法は、有毒な副産物を生じるバイオマスの厳しい化学的な前処理や、植物を育てるために広大な土地の使用が要求される等の望ましくない複雑な状態を与える。光合成微生物は、生化学的生産に関して、従来の陸生植物よりも多くの利点を有している。例えば、光合成微生物の光合成効率は、植物よりもより高く、そして、光合成微生物は、伝統的な農作物と競合しない場所において培養され得る（Scharlemann et al., Science, 281:237-240, 2008）。
【０００６】
生化学的生産のための可能性を備えている光合成微生物の例は、シアノバクテリアである。シアノバクテリアは、合計して、世界的な光合成の５０％近くに関与し、そして広範囲の環境において見出される（Field et al., Science, 281:237-240, 1998）。シアノバクテリアは、この背景において、藻類と類似の多くの特徴を有しているが、多くのシアノバクテリアの種は、より簡単な遺伝子構造とより早い増殖速度とを特徴としている（Ruffing, Bioeng Bugs, 2:136-149, 2011）。結果として、シアノバクテリアのための遺伝子工学的な方法は、遺伝子操作の取組みに関しては、藻類よりもより進歩している（Golden et al., Methods Enzymol, 153:215-231, 1987; Huang et al., Nucleic Acids Res, 38:2577-2593, 2010; およびHeidorn et al., Methods Enzymol, 497:539-579, 2011）。
【０００７】
シアノバクテリアは、ＣＯ２を固定化するために要求される生化学的な機構を有しているが、燃料や化学物質を効率よく生産するための重要な要素を欠いている。それゆえ、有価な化学物質を生産するために、シアノバクテリアの宿主株は、新規の生合成経路を備えているべきである（Keasling, ACS Chem Biol, 3:64-76, 2008; Ducat et al., Trends Biotechnol, 29:95-103, 2011; およびMachado and Atsumi, J Biotechnol, 2012）。残念ながら、シアノバクテリアにおけるこの取組みは、大腸菌（Escherichia coli）等のモデル生物と比較してほとんど進展していない。さらに、大腸菌（E. coli）における結果は、シアノバクテリアに対して直接的に換言することができない。例えば、１−ブタノール経路を含んでいる操作された大腸菌（E. coli）株は、３０ｇ／Ｌよりも多くの１−ブタノールを生産する（Shen et al., Appl Environ Microbiol, 77:2905-2915, 2011）。一方で、同経路を有しているシアノバクテリア株は、微量の１−ブタノールのみを生産する（Lan et al., Metab Eng, 13:353-363, 2011）。それゆえ、ＣＯ２からの価値のある化学物質の顕著な生産をもたらすシアノバクテリアにおける生合成経路を構築することが必要である。
【０００８】
〔概要〕
本開示は、アセト乳酸合成酵素活性およびアセト乳酸脱炭酸酵素活性を有している組換えシアノバクテリアを提供し、さらに、アセト乳酸合成酵素活性、アセト乳酸脱炭酸酵素活性、および第２級アルコール脱水素酵素活性を有している組換えシアノバクテリアも提供する。組換えシアノバクテリアの生産のための方法が提供され、さらに、二酸化炭素および光からのアセトインおよび２，３−ブタンジオールの生産のために組換えシアノバクテリアを使用するための方法も提供される。
【０００９】
本開示は、アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）およびアセト乳酸脱炭酸酵素（ＡＬＤＣ）をコードしている組換え（例えば、異種の）ポリヌクレオチドを含んでいるシアノバクテリアを提供する。上記シアノバクテリアにおいて、ＡＬＳおよびＡＬＤＣの発現は、これらのポリヌクレオチドを欠いている対応するシアノバクテリアと比較して、アセトインの生産における増加をもたらす。本開示は、さらに、アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）、アセト乳酸脱炭酸酵素（ＡＬＤＣ）および第２級アルコール脱水素酵素（ｓＡＤＨ）をコードしている組換え（例えば、異種の）ポリヌクレオチドを含んでいるシアノバクテリアを提供する。上記シアノバクテリアにおけるＡＬＳ、ＡＬＤＣおよびｓＡＤＨの発現は、これらのポリヌクレオチドを欠いている対応するシアノバクテリアと比較して、アセトインおよび２，３−ブタンジオール（２３ＢＤ）の内の１種または両方の生産における増加をもたらす。いくつかの実施形態において、上記対応するシアノバクテリアは、親のシアノバクテリアまたは同属もしくは同種の細胞等のコントロールのシアノバクテリアである。いくつかの実施形態において、上記ＡＬＳは、細菌のＡＬＳである。いくつかの好ましい実施形態において、上記ＡＬＳは、バチルス  エスピー（Bacillus sp.）のＡＬＳ（例えば、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）のＡＬＳ）である。いくつかの実施形態において、上記ＡＬＤＣは、細菌のＡＬＤＣまたは真菌のＡＬＤＣである。いくつかの好ましい実施形態において、上記ＡＬＤＣは、エンテロバクター  エスピー（Enterobacter sp.）のＡＬＤＣ、バチルス  エスピー（Bacillus sp.）のＡＬＤＣ、アエロモナス  エスピー（Aeromonas sp.）のＡＬＤＣ、およびグルコンアセトバクター  エスピー（Gluconacetobacter sp.）のＡＬＤＣからなる群から選択される。これらの実施形態の一部において、上記ＡＬＤＣは、エンテロバクター  アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）のＡＬＤＣ、エンテロバクター  クロアカエ（Enterobacter cloacae）のＡＬＤＣ、バチルス  リケニホルミス（Bacillus licheniformis）のＡＬＤＣ、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）のＡＬＤＣ、アエロモナス  ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）のＡＬＤＣ、およびグルコンアセトバクター  キシリナス（Gluconacetobacter xylinus）のＡＬＤＣからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、上記ｓＡＤＨは、細菌のｓＡＤＨまたは真菌のｓＡＤＨである。いくつかの実施形態において、上記ｓＡＤＨは、子嚢菌類（ascomycetes）のｓＡＤＨ、ファーミキューテス門菌類（firmicutes）のｓＡＤＨおよびサッカロミセス綱菌類（saccharomycetes）のｓＡＤＨからなる群から選択される。いくつかの好ましい実施形態において、上記ｓＡＤＨは、カンジダ  エスピー（Candida sp.）のｓＡＤＨ、ロイコノストック  エスピー（Leuconostoc sp.）のｓＡＤＨ、クロストリジウム  エスピー（Clostridium sp.）のｓＡＤＨ、およびサーモアナエロバクター  エスピー（Thermoanaerobacter sp.）のｓＡＤＨからなる群から選択される。これらの実施形態の一部において、上記ｓＡＤＨは、カンジダ  パラプシローシス（Candida parapsilosis）のｓＡＤＨ、ロイコノストック  シュードメセンテロイデス（Leuconostoc pseudomesenteroides）のｓＡＤＨ、クロストリジウム  ベイエリンキイ（Clostridium beijerinckii）のｓＡＤＨ、およびサーモアナエロバクター  ブロッキイ（Thermoanaerobacter brockii）のｓＡＤＨからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、上記ＡＬＳおよび上記ＡＬＤＣの発現、または上記ＡＬＳ、上記ＡＬＤＣおよび上記ｓＡＤＨの発現は、誘導可能なプロモーターによって促進される。いくつかの実施形態において、上記ＡＬＳおよび上記ＡＬＤＣの発現、または上記ＡＬＳ、上記ＡＬＤＣおよび上記ｓＡＤＨの発現は、構成的プロモーターによって促進される。いくつかの実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、シアノバクテリアのゲノムに安定に組み込まれれる。いくつかの実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、シアノバクテリア内で、（例えば、プラスミドとして）一過性に維持される。いくつかの実施形態において、上記シアノバクテリアは、クロロコックム目（chroococcales）およびネンジュモ目（nostocales）からなる群から選択される目のシアノバクテリアである。いくつかの好ましい実施形態において、上記シアノバクテリアは、ノストック  エスピー（Nostoc sp.）、シネココッカス  エスピー（Synechococcus sp.）、シネコシスティス  エスピー（Synechocystis sp.）、およびサーモシネココッカス  エスピー（Thermosynechococcus sp.）からなる群から選択される。これらの実施形態の一部において、上記シアノバクテリアは、ノストック  パンクチフォルメ（Nostoc punctiforme） ACCS 074、シネココッカス  エロンゲーテス（Synechococcus elongates） PCC 7942、シネココッカス  エスピー（Synechococcus sp.） WH 8102、シネコシスティス  エスピー（Synechocystis sp.） PCC 6803、およびサーモシネココッカス  エロンゲーテス（Thermosynechococcus elongates） BP-1からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、アセトインおよび２，３−ブタンジオール（２３ＢＤ）の内の１種または両方の生産は、恒明（constant light）下でシアノバクテリアを培養する結果として起こる。いくつかの実施形態において、アセトインおよび２，３−ブタンジオール（２３ＢＤ）の内の１種または両方の生産は、重炭酸塩の存在下においてシアノバクテリアを培養する結果として起こる。いくつかの実施形態において、上記ＡＬＤＣは、本質的に、酸素に対して非感受性（検出できない酸素感受性または低い酸素感受性）である。いくつかの実施形態において、上記ｓＡＤＨは、本質的に、酸素に対して非感受性（検出できない酸素感受性または低い酸素感受性）であり、且つＮＡＤＰＨ依存性である。
【００１０】
さらに、本開示は、アセトインを生産する方法を提供し、当該方法は、シアノバクテリアを準備すること；および当該シアノバクテリアをＣＯ２および光を含んでいる光合成環境において培養し、これによってＡＬＳおよびＡＬＤＣの発現がアセトインの生産をもたらすこと、を包含している。いくつかの実施形態において、アセトインの生産は、上記ポリヌクレオチドを欠いている対応する（例えば、コントロールの）シアノバクテリアを同一条件下において培養することによって生産されるアセトインのレベルよりもより高いレベルにて起こる。本開示は、さらに、２，３−ブタンジオールを生産する方法を提供し、当該方法は、シアノバクテリアを準備すること；および当該シアノバクテリアをＣＯ２および光を含んでいる光合成環境において培養し、これによってＡＬＳ、ＡＬＤＣおよびｓＡＤＨの発現が２，３−ブタンジオール（２３ＢＤ）の生産をもたらすこと、を包含している。いくつかの実施形態において、２３ＢＤの生産は、上記ポリヌクレオチドを欠いている対応する（例えば、コントロールの）シアノバクテリアを同一条件下において培養することによって生産される２３ＢＤのレベルよりもより高いレベルにて起こる。これらの方法の使用を介してアセトインおよび２３ＢＤの内の１種または両方を生産するシアノバクテリアは、前節のシアノバクテリアまたは本開示の説明において別の方法で提示された組換えシアノバクテリアである。
【００１１】
〔図面の簡単な説明〕
〔図１〕図１は、他の工業的に重要な化学物質と同様に、アセトインおよび２，３−ブタンジオールの生物学的な合成において、ＣＯ２がどのようにして使用され得るかを説明している。ＡＬＳ：アセト乳酸合成酵素、ＡＬＤＣ：アセト乳酸脱炭酸酵素、ｓＡＤＨ：第２級アルコール脱水素酵素。
【００１２】
〔図２〕図２は、種々の濃度のアセトインおよび２，３−ブタンジオールが、どのようにしてシネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）の生育速度に影響を与えるかを説明している。
【００１３】
〔図３〕図３Ａは、シネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）の染色体にａｌｓＳ遺伝子およびａｌｓＤ遺伝子を組み込むための組換えの略図を提示している。図３Ｂは、改変された大腸菌（E. coli）細胞の１６時間（暗）にわたる生育および４０時間（明）にわたる生育におけるアセトインの生産量を示している。図３Ｃは、改変されたシネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）細胞の７２時間にわたる生育におけるアセトインの生産量を示している。ａｌｓＳは、（＋）ａｌｓＳ（Ｂ．ｓ．）の含有または（−）ａｌｓＳ（Ｂ．ｓ．）の欠如を示している。ａｌｓＤは、ａｌｓＤ遺伝子のための供給元生物を示している（表１）。図３Ｄは、ＰＬｌａｃＯ１の制御下にａｌｓＳ（Ｂ．ｓ．）およびａｌｓＤ（Ｅ．ａ．）を含んでいるシネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）における、アセトインの生産におけるＩＰＴＧ（１ｍＭ）の効果を示している。エラーバーは、ｓ．ｄ．（ｎ＝３）を示している。
【００１４】
〔図４〕図４Ａは、シネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）の染色体にａｌｓＳ遺伝子、ａｌｓＤ遺伝子、およびａｄｈ遺伝子を組み込むための組換えの略図を提示している。図４Ｂは、改変された大腸菌（E. coli）細胞の４０時間にわたる生育におけるアセトインの生産量を示している。淡色のバーはアセトインを示している。これに対して、濃色のバーはブタンジオール（中央のバー：メソ−２３ＢＤ、右側のバー：（Ｒ，Ｒ）−２３ＢＤ）を示している。ａｌｓＳは、（＋）ａｌｓＳ（Ｂ．ｓ．）遺伝子の含有を示している。ａｌｓＤおよびａｄｈの列は、これらの遺伝子のための供給元生物を示している（表１）。活性は、大腸菌（E. coli）において発現されて、且つ細胞抽出物において測定されたｓＡＤＨの活性である（ｎｍｏｌ ＮＡＤＰＨ 分−１ｍｇ−１）。図４Ｃは、改変されたシネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）細胞の７２時間にわたる生育における２３ＢＤの生産量を示している。図４Ｄは、改変されたシネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）株に由来する細胞抽出物におけるＡＬＳおよびＡＤＨの比活性度を示している。エラーバーは、標準偏差を示している。
【００１５】
〔図５〕図５Ａ〜Ｃは、連続培養における、組換えシネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）による長期間の２，３−ブタンジオールの生産の概要を提示している。四角印：ａｌｓＳ（Ｂ．ｓ．）、ａｌｓＤ（Ａ．ｈ．）およびａｄｈ（Ｃ．ｂ．）を含有しているシネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）。丸印：ａｌｓＳ（Ｂ．ｓ．）、ａｌｓＤ（Ａ．ｈ．）およびａｄｈ（Ｔ．ｂ．）を含有しているシネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）。三角印：ａｌｓＳ（Ｂ．ｓ．）およびａｌｓＤ（Ｅ．ａ．）を含有しているシネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）。菱形印：ａｌｓＳ、ａｌｓＤまたはａｄｈを有していないシネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）。図５Ａは、増殖に関する経時変化を示している。図５Ｂは、全２３ＢＤ生産量を示している。図５Ｃは、光合成効率を示している。図５Ｄは、一日当たりの全バイオマス生産量を示している。エラーバーは、標準偏差（ｎ＝３）を示している。
【００１６】
〔図６〕図６Ａは、ＡＬ７５７（組み込まれたａｌｓＳ、ａｌｓＤ（Ａ．ｈ．）、およびａｄｈ（Ｃ．ｂ．）を有している。）による日単位の２，３−ブタンジオールの生産量を示している。図６Ｂは、長期間の２３ＢＤの生産実験の間のアセトインの濃度を示している。四角印：ＡＬ７５７（組み込まれたａｌｓＳ（Ｂ．ｓ．）、ａｌｓＤ（Ａ．ｈ．）およびａｄｈ（Ｃ．ｂ．）を有している。）。丸印：ＡＬ７５６（組み込まれたａｌｓＳ（Ｂ．ｓ．）、ａｌｓＤ（Ａ．ｈ．）およびａｄｈ（Ｔ．ｂ．）を有している。）。図６Ｃは、ＡＬ７６３（組み込まれたａｌｓＳおよびａｌｓＤ（Ｅ．ａ．）を有している。）による長期間のアセトインの生産を示している。
【００１７】
〔図７〕図７は、シアノバクテリアにおいて外因性の経路から生産された種々の化学物質に関する生産性の比較を示している。元のデータは、以下から取得した：２３ＢＤ（本開示）、イソブチルアルデヒドおよびイソブタノール（Atsumi et al., Nat Biotechnol, 27:1177-1180, 2009）、脂肪酸（Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA, 108:6899-6904, 2011）、エタノール（Dexter and Pengcheng, Energy Environ Sci, 2:857-864, 2009）、アセトン（Zhou et al., Metab Eng, 14:394-400, 2012）、エチレン（Takahama et al., J Biosci Bioeng, 95:302-305, 2003）、ブタノール（Lan and Liao, Proc Natl Acad Sci USA, 109:6018-6023, 2012)、脂肪族アルコール（Tan et al., Metab Eng, 13:169-176, 2011)。詳細な計算は、実施例１に記載する。
【００１８】
〔説明〕
大気中へのＣＯ２の排出を抑制するおよび／または既に大気中にあるＣＯ２濃度を低減する必要性がある。光合成微生物は、大気からこの化合物を取り除く能力を有しているが、一般に、出発物質としてＣＯ２を使用することによって価値のある化学物質を合成する能力を欠いている。有用な価値のある化学物質は、化合物アセトインである。アセトインは、植物精製所（biorefineries）による使用に適した最も価値のあるケミカルビルディングブロック（chemical building blocks）の上位３０の内の一つとして挙げられる（米国エネルギー省（U.S. Department of Energy））。さらに、アセトインは、広く使用されている香水用物質であり、そして食品産業における重要な用途を有している香料である。本開示の開発の前に、ＣＯ２からアセトインを生産するための公知の方法はなく、光合成微生物を用いてＣＯ２および太陽光からアセトインを生産するためのいかなる公知の方法もなかった。
【００１９】
他の有用な価値のある化学物質は、２，３−ブタンジオール（２３ＢＤ）であり、これは、価値のある化学物質の合成のための多用途のビルディングブロック分子である。２３ＢＤは、脱水素化によってメチルエチルケトン（ＭＥＫ）に転換され得る。メチルエチルケトン（ＭＥＫ）は、液体燃料添加物および有用な工業用溶媒である（Tran et al., Biotechnol Bioeng, 29:343-351, 1987）。さらに、重合体原料および共重合体原料の多様性のための前駆物質である１，３−ブタジエンへの２３ＢＤの触媒転換が十分に確立されている（van Haveren et al., Biofuels Bioprod Bioref, 2:41-57, 2008）。２３ＢＤは、可塑剤、インク、燻蒸剤、および爆発物の製造においても使用される（Syu, Appl Microbiol Biotechnol, 55:10-18, 2001）。重要なことに、２３ＢＤは、出発化合物であるアセトインから合成され得る。２３ＢＤの微生物発酵もまた長年開発されてきたが（Ji et al., Biotechnol Adv, 29:351-364, 2011；およびCelinska and Grajek, Biotechnol Adv, 27:715-725, 2009）、既存の方法は、大気からＣＯ２の排出量を低減する要求にさらに取り組むことができない。
【００２０】
光合成生物によるＣＯ２の転換は、化石燃料の埋蔵量に依存しない化学物質の合成の構築にとって魅力的な目標である。本明細書中に記載されたとおり、２，３−ブタンジオール（２３ＢＤ）生合成経路は、シネココッカス  エロンゲータス（Synechococcus elongatus） PCC7942において体系的に開発されている。このモデル系は、シアノバクテリアが価値のある化学物質の効率的な生産のために採用され得ることを実証している。２３ＢＤは、低い宿主毒性を有している標的化学物質として選択された。このことは、２３ＢＤの生産を目指した原動力を作り出すために、酸素に対して非感受性でありコファクターが調和された、不可逆的な酵素的段階と一体となった生合成経路の設計を可能にする。例となる方法は、ＣＯ２からの２３ＢＤの生産を２．３８ｇ／Ｌのレベルでもたらした。これは、シアノバクテリアにおける外因性の経路からの化学物質の生産に関しては、顕著な増加である。
【００２１】
（組換えポリヌクレオチド、ベクター、供給元、および宿主生物）
本開示は、アセトインおよび２，３−ブタンジオール（２３ＢＤ）の生産において使用するためのシアノバクテリアを提供する。これらのシアノバクテリアは、アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）およびアセト乳酸脱炭酸酵素（ＡＬＤＣ）をコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる。ＡＬＳおよびＡＬＤＣの発現は、このポリヌクレオチドを欠いているシアノバクテリアと比較して、アセトインの生産における増加をもたらす。
【００２２】
本開示は、さらに、アセトインおよび／または２，３−ブタンジオールの生産において使用するためのシアノバクテリアを提供する、これらのシアノバクテリアは、アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）、アセト乳酸脱炭酸酵素（ＡＬＤＣ）、および第２級アルコール脱水素酵素（ｓＡＤＨ）をコードしている組換えポリヌクレオチドを含有している。ＡＬＳ、ＡＬＤＣ、およびｓＡＤＨの発現は、これらのポリヌクレオチドを欠いているシアノバクテリアと比較して、アセトインおよび／または２，３−ブタンジオールの生産における増加をもたらす。
【００２３】
本明細書においては、ＡＬＳ、ＡＬＤＣ、およびｓＡＤＨのうちの１つ以上のコード配列を含んでいる、組換えベクター、発現カセット、およびポリヌクレオチドもまた提示される。いくつかの実施形態において、これらの核酸は、細菌（例えば、シアノバクテリア）を生産するために使用され、当該細菌は、次に、アセトインおよび２，３−ブタンジオールの内の１種または両方を生産するために使用され得る。
【００２４】
本明細書において、アセト乳酸合成酵素およびアセト乳酸脱炭酸酵素のためのコード配列を含んでいるポリヌクレオチドが提示される。本明細書において、アセト乳酸合成酵素、アセト乳酸脱炭酸酵素、および第２級アルコール脱水素酵素のためのコード配列を含んでいるポリヌクレオチドもまた提示される。いくつかの実施形態において、上記コード配列は、ベクターまたは発現カセットの一部として、プロ―モーターに動作可能に連結されている。
【００２５】
本明細書において使用される場合、「ベクター」は、ポリヌクレオチド化合物および／または組成物をいう。当該ポリヌクレオチド化合物および／または組成物は、いったん宿主細胞に導入されると、宿主細胞を形質転換し、その結果、上記生物に固有のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド以外のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、いわば、上記生物に固有ではないポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を細胞にもたらす。好ましいベクターは、プラスミドまたは類似の遺伝的構築物であり、特に、制限酵素認識部位を有しているプラスミドまたは類似の遺伝的構築物である。当該制限酵素認識部位は、興味のあるポリヌクレオチド配列をプラスミドに対して導入するクローニング段階を容易にすることが十分に実証されている。そのようなプラスミドは、他のベクターと同様に、当業者に周知であり、そして、本開示の組成物および方法において適切に使用されてもよい。
【００２６】
本明細書において使用される場合、「コード配列」は、発現されたときにポリペプチドに翻訳され得るポリヌクレオチド配列をいう。
【００２７】
本明細書において使用される場合、「動作可能に連結された」は、制御配列がポリヌクレオチドの発現を導くように、当該制御配列が、ポリヌクレオチド配列のコード配列に対して適切な位置に配置されている構造をいう。
【００２８】
好ましい実施形態において、本開示のアセト乳酸合成酵素のコード配列は、ａｌｓＳポリヌクレオチドまたはそのホモログに相当する。好ましい実施形態において、アセト乳酸脱炭酸酵素のコード配列は、ａｌｓＤポリヌクレオチドまたはそのホモログに相当する。好ましい実施形態において、第２級アルコール脱水素酵素のコード配列は、ａｄｈポリヌクレオチドまたはそのホモログに相当する。
【００２９】
好ましい実施形態において、ａｌｓＳポリヌクレオチドは、アセト乳酸合成酵素活性を有しているポリペプチドを生産する。好ましい実施形態において、ａｌｓＤポリヌクレオチドは、アセト乳酸脱炭酸酵素活性を有しているポリペプチドを生産する。好ましい実施形態において、ａｄｈポリヌクレオチドは、第２級アルコール脱水素酵素活性を有しているポリペプチドを生産する。
【００３０】
アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）は、バリン、ロイシン、およびイソロイシンの合成に関与するアミノ酸生合成経路の一部である。概して、アセト乳酸合成酵素は、２つのピルビン酸塩分子の２−アセト乳酸およびＣＯ２への転換を触媒する。具体的には、上記酵素はまた、２分子のピルビン酸塩の２−アセト乳酸へのアルドール縮合を触媒する。ＡＬＳによって触媒される全体的な反応は、ＣＯ２の発生のため、不可逆である。触媒反応における第一段階は、チアミンピロリン酸塩（ＴＰＰ）のチアゾリウム環のイオン化である。概して、ＴＰＰは、２つのピルビン酸塩分子の連結に関与する。高反応性の三環性中間体がまず生じて、そして、これは、第１のピルビン酸塩と反応する。この第１のピルビン酸塩は、その後、脱炭酸化して、比較的非反応性のエナミンを与える。この中間体は安定であるので、ＣＯ２を放出し、且つピルビン酸塩の第２の分子を受け入れる一方で、上記酵素は、触媒サイクルの途中で中断することができる。三環性カルバニオンがその後生じ、その後に、第２のピルビン酸塩との反応が続く。脱プロトン化が完結し、その後炭素−炭素結合の切断が後に続き、その結果、２−アセト乳酸を生産する（例えば、米国特許出願公開第２０１１／０２６２９８２号を参照のこと）。
【００３１】
酵素反応は、その酵素委員会（Enzyme Commission：ＥＣ）番号に従って分類され得る。所定の酵素に関連したＥＣ番号は、所定の酵素が触媒することができる酵素反応のタイプの分類を特定する。ＥＣ番号は、酵素のアイデンティティーを特定しないが、代わりに、所定の酵素が触媒する化学反応のアイデンティティーを特定する。同様に、タンパク質はまた、遺伝子オントロジー（Gene Ontology：ＧＣ）用語を指定され得る。ＧＯ用語は、細胞の成分、生物学的なプロセス、および／または分子の機能に関してタンパク質の機能を特定することによって、生体におけるタンパク質の所定の役割および／または機能をさらに定義づけることを試みる。例えば、同じ化学反応を触媒する異なる種の生物に由来する２つの酵素は、それぞれの酵素は異なる生物に対して内因性であるにも関わらず、同じＥＣ分類およびＧＯ用語注釈を割り当てられ得る。ＮＣＢＩ（全米バイオテクノロジー協議会（National Council for Biotechnology）)識別子のように、そのタンパク質が由来した生物に関してその独特の識別分類を理解することを除けば、ＥＣおよびＧＯ用語分類は、所定のタンパク質の分子機能および／または活性を特定することにおいて、当業者にとって有用である。
【００３２】
アセト乳酸合成酵素は、分類ＥＣ２．２．１．６（アセト乳酸合成酵素活性）且つＧＯ：０００３９８４の遺伝子オントロジー（ＧＯ）用語ＩＤに属している酵素反応を触媒する。このＧＯ用語ＩＤは、この関連したＧＯ用語を有していると特徴づけられた任意のタンパク質が、触媒のアセト乳酸合成酵素活性を有している酵素を符号化していることを指定している。
【００３３】
アセト乳酸合成酵素をコードしている種々のアセト乳酸合成酵素（ａｌｓＳ）遺伝子は、当該技術において知られている。ａｌｓＳ遺伝子の例は、限定されないが、以下を包含している：gi|83644996|ref|YP_433431.1| アセト乳酸合成酵素 [ハヘラ  チェジュエンシス（Hahella chejuensis） KCTC 2396]；gi|32141318|ref|NP_733719.1| アセト乳酸合成酵素 [ストレプトマイセス  セリカラー（Streptomyces coelicolor） A3(2)]；gi|238917299|ref|YP_002930816.1| アセト乳酸合成酵素[ユウバクテリウム  エリゲンス（Eubacterium eligens） ATCC 27750]；gi|312136848|ref|YP_004004185.1| アセト乳酸合成酵素 [メタノサーマス  フェルビダス（Methanothermus fervidus） DSM 2088]：gi|311224567|gb|ADP77423.1| アセト乳酸合成酵素 [メタノサーマス  フェルビダス（Methanothermus fervidus） DSM 2088]；gi|238872659|gb|ACR72369.1| アセト乳酸合成酵素 [ユウバクテリウム  エリゲンス（Eubacterium eligens） ATCC 27750]；gi|119671178|emb|CAL95091.1| アセト乳酸合成酵素 [アゾアルカス  エスピー（Azoarcus sp.） BH72]；gi|384250777|gb|EIE24256.1| アセト乳酸合成酵素 [コッコミクサ  スベリプソイデ（Coccomyxa subellipsoidea） C-169]；gi|365857129|ref|ZP_09397126.1| アセト乳酸合成酵素 [アセトバクテラセアエ  バクテリウム（Acetobacteraceae bacterium） AT-5844]；gi|363716653|gb|EHM00051.1| アセト乳酸合成酵素 [アセトバクテラセアエ  バクテリウム（Acetobacteraceae bacterium） AT-5844]；gi|357547224|gb|EHJ29116.1| アセト乳酸合成酵素 [ラクトバチルス  ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus） ATCC 21052]；gi|312898921|ref|ZP_07758309.1| アセト乳酸合成酵素 [メガスファエラ  ミクロヌシフォルミス（Megasphaera micronuciformis） F0359]；gi|310620083|gb|EFQ03655.1| アセト乳酸合成酵素 [メガスファエラ  ミクロヌシフォルミス（Megasphaera micronuciformis） F0359]；gi|392978028|ref|YP_006476616.1| アセト乳酸合成酵素[エンテロバクター  クロアカエ  サブエスピー  ディソルベンス（Enterobacter cloacae subsp. dissolvens） SDM]；gi|387878229|ref|YP_006308533.1| アセト乳酸合成酵素 [マイコバクテリウム  エスピー（Mycobacterium sp.） MOTT36Y]；gi|387619850|ref|YP_006127477.1| アセト乳酸合成酵素 [大腸菌（Escherichia coli） DH1]；gi|386760231|ref|YP_006233448.1| アセト乳酸合成酵素 [バチルス  エスピー（Bacillus sp.） JS]；gi|386732742|ref|YP_006206238.1| アセト乳酸合成酵素 [リステリア  モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes） 07PF0776]；gi|386035198|ref|YP_005955111.1| アセト乳酸合成酵素 [クレブシエラ  ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae） KCTC 2242]；gi|384259770|ref|YP_005403704.1| アセト乳酸合成酵素 [ラーネラ  アクアティリス（Rahnella aquatilis） HX2]；gi|384267136|ref|YP_005422843.1| アセト乳酸合成酵素 [バチルス  アミロリケファシエンス  サブエスピー  プランタルム（Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum） YAU B9601-Y2]；gi|384170312|ref|YP_005551690.1| アセト乳酸合成酵素 [バチルス  アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens） XH7]；gi|379741437|ref|YP_005333406.1| アセト乳酸合成酵素 [ビブリオ  コレラ（Vibrio cholerae） IEC224]；gi|375364038|ref|YP_005132077.1| アセト乳酸合成酵素 [バチルス  アミロリケファシエンス  サブエスピー  プランタルム（Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum） CAU B946]；gi|375261263|ref|YP_005020433.1| アセト乳酸合成酵素 [クレブシエラ  オキシトカ（Klebsiella oxytoca） KCTC 1686]；gi|375009759|ref|YP_004983392.1| アセト乳酸合成酵素 [ゲオバチルス  サーモレオボランス（Geobacillus thermoleovorans） CCB_US3_UF5]；gi|374323653|ref|YP_005076782.1| アセト乳酸合成酵素[パエニバシラス  テラエ（Paenibacillus terrae） HPL-003]；gi|344207293|ref|YP_004792434.1| アセト乳酸合成酵素 [ステノトロホモナス  マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia） JV3]；gi|338534039|ref|YP_004667373.1| アセト乳酸合成酵素 [ミキソコッカス  フルバス（Myxococcus fulvus） HW-1]；gi|336249979|ref|YP_004593689.1| アセト乳酸合成酵素 [エンテロバクター  アエロゲネス（Enterobacter aerogenes） KCTC 2190]；gi|334144738|ref|YP_004537894.1| アセト乳酸合成酵素 [チオアルカリミクロビウム  サイクリカム（Thioalkalimicrobium cyclicum） ALM1]；gi|333895383|ref|YP_004469258.1| アセト乳酸合成酵素 [アルテロモナス  エスピー（Alteromonas sp.） SN2]；gi|332297456|ref|YP_004439378.1| アセト乳酸合成酵素 [トレポネーマ  ブレナボレンス（Treponema brennaborense） DSM 12168]；gi|330838389|ref|YP_004412969.1| アセト乳酸合成酵素 [セレノモナス  スプチゲナ（Selenomonas sputigena） ATCC 35185]；gi|328950467|ref|YP_004367802.1| アセト乳酸合成酵素 [マリニサーマス  ヒドロサーマリス（Marinithermus hydrothermalis） DSM 14884]；gi|326780667|ref|ZP_08239932.1| アセト乳酸合成酵素 [ストレプトマイセス  グリセウス（Streptomyces griseus） XylebKG-1]；gi|325298954|ref|YP_004258871.1| アセト乳酸合成酵素 [バクテロイデス  サラニトロニス（Bacteroides salanitronis） DSM 18170]；gi|321313145|ref|YP_004205432.1| アセト乳酸合成酵素 [バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis） BSn5]；gi|311070109|ref|YP_003975032.1| アセト乳酸合成酵素 [バチルス  アトロフェウス（Bacillus atrophaeus） 1942]；gi|53721452|ref|YP_110437.1| アセト乳酸合成酵素 [バークホルデリア  シュードマレイ（Burkholderia pseudomallei） K96243]；gi|21221221|ref|NP_627000.1| アセト乳酸合成酵素 [ストレプトマイセス  セリカラー（Streptomyces coelicolor） A3(2)]。前述の受入番号に関連した各配列は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００３４】
アセト乳酸脱炭酸酵素（ＡＬＤＣ）は、カルボキシリアーゼの一群に属している酵素であり、炭素−炭素結合の切断に関与している。アセト乳酸脱炭酸酵素は、２−アセト乳酸（２−ヒドロキシ−２−メチル−３−オキソブタノエートとしても知られている）の２−アセトインへの転換と、ＣＯ２の放出とを触媒する。
【００３５】
アセト乳酸脱炭酸酵素は、分類ＥＣ４．１．１．５（アセト乳酸脱炭酸酵素活性）且つＧＯ：００４７６０５の遺伝子オントロジー（ＧＯ）用語ＩＤに属している酵素反応を触媒する。ＧＯ用語ＩＤは、この関連したＧＯ用語を有していると特徴づけられた任意のタンパク質が、触媒のアセト乳酸脱炭酸酵素活性を有している酵素を符号化していることを指定している。
【００３６】
アセト乳酸脱炭酸酵素をコードしている種々のアセト乳酸脱炭酸酵素（ａｌｓＤ）遺伝子は、当該技術において知られている。ａｌｓＤ遺伝子の例は、限定されないが、以下を包含している：gi|375143627|ref|YP_005006068.1| アセト乳酸脱炭酸酵素 [ニアステラ  コリエンシス（Niastella koreensis） GR20-10]；gi|361057673|gb|AEV96664.1| アセト乳酸脱炭酸酵素 [ニアステラ  コリエンシス（Niastella koreensis） GR20-10]；gi|218763415|gb|ACL05881.1| アセト乳酸脱炭酸酵素 [デスルフィトバクテリウム  アルケニボラム（Desulfatibacillum alkenivorans） AK-01]；gi|220909520|ref|YP_002484831.1| アセト乳酸脱炭酸酵素[シアノセイス  エスピー（Cyanothece sp.）PCC 7425]；gi|218782031|ref|YP_002433349.1| アセト乳酸脱炭酸酵素 [デスルフィトバクテリウム  アルケニボラム（Desulfatibacillum alkenivorans） AK-01]；gi|213693090|ref|YP_002323676.1| アセト乳酸脱炭酸酵素 [ビフィドバクテリウム  ロングム  サブエスピー  インファンティス（Bifidobacterium longum subsp. infantis） ATCC 15697 = JCM 1222]；gi|189500297|ref|YP_001959767.1| アセト乳酸脱炭酸酵素 [クロロビウム  ファオバクテロイデス（Chlorobium phaeobacteroides） BS1]；gi|189423787|ref|YP_001950964.1| アセト乳酸脱炭酸酵素 [ジオバクター  ロブレイ（Geobacter lovleyi） SZ]；gi|172058271|ref|YP_001814731.1| アセト乳酸脱炭酸酵素 [エキシグオバクテリウム  シビリカム（Exiguobacterium sibiricum） 255-15]；gi|163938775|ref|YP_001643659.1| アセト乳酸脱炭酸酵素 [バチルス  ウェイヘンステファネンシス（Bacillus weihenstephanensis） KBAB4]；gi|158522304|ref|YP_001530174.1| アセト乳酸脱炭酸酵素 [デスルホコッカス  オレオボランス（Desulfococcus oleovorans） Hxd3]；gi|157371670|ref|YP_001479659.1| アセト乳酸脱炭酸酵素 [セラチア  プロテアマキュランス（Serratia proteamaculans） 568]；gi|150395111|ref|YP_001317786.1| アセト乳酸脱炭酸酵素 [スタフィロコッカス  アウレウス  サブエスピー  アウレウス（Staphylococcus aureus subsp. aureus） JH1]；gi|150394715|ref|YP_001317390.1| アセト乳酸脱炭酸酵素[スタフィロコッカス  アウレウス  サブエスピー  アウレウス（Staphylococcus aureus subsp. aureus） JH1]；gi|146311679|ref|YP_001176753.1| アセト乳酸脱炭酸酵素 [エンテロバクター  エスピー（Enterobacter sp.） 638]；gi|109900061|ref|YP_663316.1| アセト乳酸脱炭酸酵素 [シュードアルテロモナス  アトランティカ（Pseudoalteromonas atlantica） T6c]；gi|219866131|gb|ACL46470.1| アセト乳酸脱炭酸酵素 [シアノセイス  エスピー（Cyanothece sp.） PCC 7425]；gi|213524551|gb|ACJ53298.1| アセト乳酸脱炭酸酵素 [ビフィドバクテリウム  ロングム  サブエスピー  インファンティス（Bifidobacterium longum subsp. infantis） ATCC 15697 = JCM 1222]；gi|189420046|gb|ACD94444.1| アセト乳酸脱炭酸酵素 [ジオバクター  ロブレイ（Geobacter lovleyi） SZ]；gi|158511130|gb|ABW68097.1| アセト乳酸脱炭酸酵素 [デスルホコッカス  オレオボランス（Desulfococcus oleovorans） Hxd3]；gi|157323434|gb|ABV42531.1| アセト乳酸脱炭酸酵素 [セラチア  プロテアマキュランス（Serratia proteamaculans） 568]；gi|145318555|gb|ABP60702.1| アセト乳酸脱炭酸酵素 [エンテロバクター  エスピー（Enterobacter sp.） 638]；gi|149947563|gb|ABR53499.1| アセト乳酸脱炭酸酵素 [スタフィロコッカス  アウレウス  サブエスピー  アウレウス（Staphylococcus aureus subsp. aureus） JH1]；gi|149947167|gb|ABR53103.1| アセト乳酸脱炭酸酵素 [スタフィロコッカス  アウレウス  サブエスピー  アウレウス（Staphylococcus aureus subsp. aureus） JH1]；gi|163860972|gb|ABY42031.1| アセト��酸脱炭酸酵素 [バチルス  ウェイヘンステファネンシス（Bacillus weihenstephanensis） KBAB4]；gi|109702342|gb|ABG42262.1| アセト乳酸脱炭酸酵素 [シュードアルテロモナス  アトランティカ（Pseudoalteromonas atlantica） T6c]；gi|189495738|gb|ACE04286.1| アセト乳酸脱炭酸酵素 [クロロビウム  ファオバクテロイデス（Chlorobium phaeobacteroides） BS1]；gi|171990792|gb|ACB61714.1| アセト乳酸脱炭酸酵素 [エキシグオバクテリウム  シビリカム（Exiguobacterium sibiricum） 255-15]；gi|223932563|ref|ZP_03624564.1| アセト乳酸脱炭酸酵素 [ストレプトコッカス  スイス（Streptococcus suis） 89/1591]；gi|194467531|ref|ZP_03073518.1| アセト乳酸脱炭酸酵素 [ラクトバチルス  ロイテリ（Lactobacillus reuteri） 100-23]；gi|223898834|gb|EEF65194.1| アセト乳酸脱炭酸酵素 [ストレプトコッカス  スイス（Streptococcus suis） 89/1591]；gi|194454567|gb|EDX43464.1| アセト乳酸脱炭酸酵素 [ラクトバチルス  ロイテリ（Lactobacillus reuteri） 100-23]；gi|384267135|ref|YP_005422842.1| アセト乳酸脱炭酸酵素[バチルス  アミロリケファシエンス  サブエスピー  プランタルム（Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum） YAU B9601-Y2]；gi|375364037|ref|YP_005132076.1| アセト乳酸脱炭酸酵素[バチルス  アミロリケファシエンス  サブエスピー  プランタルム（Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum） CAU B946]；gi|340793231|ref|YP_004758694.1| アセト乳酸脱炭酸酵素[コリネバクテリウム  バリアビル（Corynebacterium variabile） DSM 44702]；gi|336325119|ref|YP_004605085.1| アセト乳酸脱炭酸酵素 [コリネバクテリウム  レジステンス（Corynebacterium resistens） DSM 45100]；gi|148269032|ref|YP_001247975.1| アセト乳酸脱炭酸酵素 [スタフィロコッカス  アウレウス  サブエスピー  アウレウス（Staphylococcus aureus subsp. aureus） JH9]；gi|148268650|ref|YP_001247593.1| アセト乳酸脱炭酸酵素[スタフィロコッカス  アウレウス  サブエスピー  アウレウス（Staphylococcus aureus subsp. aureus） JH9]；gi|148543372|ref|YP_001270742.1| アセト乳酸脱炭酸酵素 [ラクトバチルス  ロイテリ（Lactobacillus reuteri） DSM 20016]；gi|380500488|emb|CCG51526.1| アセト乳酸脱炭酸酵素 [バチルス  アミロリケファシエンス  サブエスピー  プランタルム（Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum）YAU B9601-Y2]；gi|371570031|emb|CCF06881.1| アセト乳酸脱炭酸酵素 [バチルス  アミロリケファシエンス  サブエスピー  プランタルム（Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum） CAU B946]；gi|340533141|gb|AEK35621.1| アセト乳酸脱炭酸酵素 [コリネバクテリウム  バリアビル（Corynebacterium variabile） DSM 44702]；gi|336101101|gb|AEI08921.1| アセト乳酸脱炭酸酵素 [コリネバクテリウム  レジステンス（Corynebacterium resistens） DSM 45100]；gi|148530406|gb|ABQ82405.1| アセト乳酸脱炭酸酵素 [ラクトバチルス  ロイテリ（Lactobacillus reuteri） DSM 20016]；gi|147742101|gb|ABQ50399.1| アセト乳酸脱炭酸酵素 [スタフィロコッカス  アウレウス  サブエスピー  アウレウス（Staphylococcus aureus subsp. aureus） JH9]；gi|147741719|gb|ABQ50017.1| アセト乳酸脱炭酸酵素 [スタフィロコッカス  アウレウス  サブエスピー  アウレウス（Staphylococcus aureus subsp. aureus） JH9]；gi|392529510|ref|ZP_10276647.1| アセト乳酸脱炭酸酵素 [コリネバクテリウム  マルタロマチカム（Carnobacterium maltaromaticum） ATCC 35586]；gi|366054074|ref|ZP_09451796.1| アセト乳酸脱炭酸酵素 [ラクトバチルス  スエビクス（Lactobacillus suebicus） KCTC 3549]；gi|339624147|ref|ZP_08659936.1| アセト乳酸脱炭酸酵素 [フルクトバチルス  フルクトーサス（Fructobacillus fructosus） KCTC 3544]；gi|336393727|ref|ZP_08575126.1| アセト乳酸脱炭酸酵素 [ラクトバチルス  コリニフォルミス  サブエスピー  トルクエンス（Lactobacillus coryniformis subsp. torquens）KCTC 3535]。前述の受入番号に関連した各配列は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００３７】
アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）は、アルデヒドおよび／またはケトンのアルコールへの還元を触媒する。第２級アルコール脱水素酵素は、第２級アルコールを生産することができる基質における触媒活性を特異的に有している。第２級アルコールは、ヒドロキシル（アルコール）基に対する炭素結合が、２つの他の炭素原子に共有結合によって結合されたアルコールである。特定のＡＤＨにより、いくつかのアルコール脱水素酵素は、逆の反応、すなわち、アルコールのアルデヒドおよび／またはケトンへの酸化をも触媒し得る。アルコール脱水素酵素は、通常は、その基質を用いた酵素による酸化還元反応において、コファクターとしてＮＡＤ−含有分子（例えば、ＮＡＰ＋、ＮＡＤＨ、およびＮＡＤＰＨ等）を使用する。本開示の方法に関しては、第２級アルコール脱水素酵素は、アルデヒドおよび／またはケトンのアルコールへの還元を触媒する。
【００３８】
アルコール脱水素酵素は、分類ＥＣ１．１．１．１（アルコール脱水素酵素活性）且つＧＯ：０００４０２５の遺伝子オントロジー（ＧＯ）用語ＩＤに属している酵素反応を触媒する。ＧＯ用語ＩＤは、この関連したＧＯ用語を有していると特徴づけられた任意のタンパク質が、触媒のアルコール脱水素酵素活性を有している酵素を符号化していることを指定している。
【００３９】
アルコール脱水素酵素をコードしている種々のアルコール脱水素酵素（ａｄｈ）遺伝子は、当該技術において知られている。ａｄｈ遺伝子の例は、限定されないが、以下を包含している：gi|223587866|emb|CAX36647.1| アルコール脱水素酵素 [アルスロバクター  エスピー（Arthrobacter sp.） JEK-2009]；gi|343083017|ref|YP_004772312.1| アルコール脱水素酵素 [ミクロバクテリウム  マリヌム（Cyclobacterium marinum） DSM 745]；gi|375146863|ref|YP_005009304.1| アルコール脱水素酵素 [ニアステラ  コリエンシス（Niastella koreensis） GR20 10]；gi|332296134|ref|YP_004438057.1| アルコール脱水素酵素 [サーモデスルフォバクテリウム  ナルジェンス（Thermodesulfobium narugense） DSM 14796]；gi|327403757|ref|YP_004344595.1| アルコール脱水素酵素（ＮＡＤＰ（＋）） [フルビコラ  タフェンシス（Fluviicola taffensis） DSM 16823]；gi|325287739|ref|YP_004263529.1| アルコール脱水素酵素 [セルロファーガ  ライティカ（Cellulophaga lytica） DSM 7489]；gi|325295143|ref|YP_004281657.1| アルコール脱水素酵素 [デスルフォバクテリウム  サーモリソトロファム（Desulfurobacterium thermolithotrophum） DSM 11699]；gi|325289753|ref|YP_004265934.1| アルコール脱水素酵素 [シントロフォボツラス  グリコリカス（Syntrophobotulus glycolicus） DSM 8271]；gi|325289499|ref|YP_004265680.1| アルコール脱水素酵素 [シントロフォボツラス  グリコリカス（Syntrophobotulus glycolicus） DSM 8271]；gi|325110410|ref|YP_004271478.1| アルコール脱水素酵素 [プランクトミセス  ブラシリエンシス（Planctomyces brasiliensis） DSM 5305]；gi|325108594|ref|YP_004269662.1| アルコール脱水素酵素 [プランクトミセス  ブラシリエンシス（Planctomyces brasiliensis） DSM 5305]；gi|319955560|ref|YP_004166827.1| アルコール脱水素酵素 [セルロファーガ  アルギコラ（Cellulophaga algicola） DSM 14237]；gi|325065591|gb|ADY73598.1| アルコール脱水素酵素 [デスルフォバクテリウム  サーモリソトロファム（Desulfurobacterium thermolithotrophum） DSM 11699]；gi|332179237|gb|AEE14926.1| アルコール脱水素酵素 [サーモデスルフォバクテリウム  ナルジェンス（Thermodesulfobium narugense） DSM 14796]；gi|324970678|gb|ADY61456.1| アルコール脱水素酵素 [プランクトミセス  ブラシリエンシス（Planctomyces brasiliensis） DSM 5305]；gi|324968862|gb|ADY59640.1| アルコール脱水素酵素 [プランクトミセス  ブラシリエンシス（Planctomyces brasiliensis） DSM 5305]；gi|324965154|gb|ADY55933.1| アルコール脱水素酵素 [シントロフォボツラス  グリコリカス（Syntrophobotulus glycolicus） DSM 8271]；gi|324964900|gb|ADY55679.1| アルコール脱水素酵素 [シントロフォボツラス  グリコリカス（Syntrophobotulus glycolicus） DSM 8271]；gi|374373821|ref|ZP_09631481.1| アルコール脱水素酵素[ニアベラ  ソリ（Niabella soli） DSM 19437]；gi|373234794|gb|EHP54587.1| アルコール脱水素酵素 [ニアベラ  ソリ（Niabella soli） DSM 19437]；gi|361060909|gb|AEV99900.1| アルコール脱水素酵素 [ニアステラ  コリエンシス（Niastella koreensis） GR20-10]；gi|375144658|ref|YP_005007099.1| アルコール脱水素酵素 [ニアステラ  コリエンシス（Niastella koreensis） GR20-10]；gi|332981006|ref|YP_004462447.1| アルコール脱水素酵素亜鉛結合ドメイン含有タンパク質 [マヘラ  オーストラリエンシス（Mahella australiensis） 50-1 BON]；gi|332666040|ref|YP_004448828.1| アルコール脱水素酵素 [ハリスコメノバクター  ハイドロシス（Haliscomenobacter hydrossis） DSM 1100]；gi|330837587|ref|YP_004412228.1| アルコール脱水素酵素 [スパエロヘータ  コッコイデス（Sphaerochaeta coccoides） DSM 17374]；gi|330837463|ref|YP_004412104.1| アルコール脱水素酵素 [スパエロヘータ  コッコイデス（Sphaerochaeta coccoides） DSM 17374]；gi|330836315|ref|YP_004410956.1| アルコール脱水素酵素 [スパエロヘータ  コッコイデス（Sphaerochaeta coccoides） DSM 17374]；gi|327405514|ref|YP_004346352.1| アルコール脱水素酵素亜鉛結合ドメイン含有タンパク質 [フルビコラ  タフェンシス（Fluviicola taffensis） DSM 16823]；gi|325298359|ref|YP_004258276.1| アルコール脱水素酵素 [バクテロイデス  サラニトロニス（Bacteroides salanitronis） DSM 18170]；gi|325291396|ref|YP_004267577.1| アルコール脱水素酵素 [シントロフォボツラス  グリコリカス（Syntrophobotulus glycolicus） DSM 8271]；gi|325281283|ref|YP_004253825.1| アルコール脱水素酵素（ＮＡＤＰ（＋）） [オドリバクター  スプランキニクス（Odoribacter splanchnicus） DSM 20712]；gi|325299524|ref|YP_004259441.1| アルコール脱水素酵素 [バクテロイデス  サラニトロニス（Bacteroides salanitronis） DSM 18170]；gi|325106236|ref|YP_004275890.1| アルコール脱水素酵素 [シュードバクター  サルタンス（Pedobacter saltans） DSM 12145]；gi|320333315|ref|YP_004170026.1| アルコール脱水素酵素 [デイノコッカス  マリコペンシス（デイノコッカス  マリコペンシス（Deinococcus maricopensis）） DSM 21211]；gi|329749366|gb|AEC02722.1| アルコール脱水素酵素 [スパエロヘータ  コッコイデス（Sphaerochaeta coccoides） DSM 17374]；gi|324319077|gb|ADY36968.1| アルコール脱水素酵素 [バクテロイデス  サラニトロニス（Bacteroides salanitronis） DSM 18170]；gi|324317912|gb|ADY35803.1| アルコール脱水素酵素 [バクテロイデス  サラニトロニス（Bacteroides salanitronis） DSM 18170]；gi|384129895|ref|YP_005512508.1| アルコール脱水素酵素 [ヒドロゲノバクター  サーモフィラス（Hydrogenobacter thermophilus） TK-6]；gi|357419011|ref|YP_004932003.1| アルコール脱水素酵素 [サーモビルガ  リエニ（Thermovirga lienii） DSM 17291]；gi|332981068|ref|YP_004462509.1| アルコール脱水素酵素亜鉛結合ドメイン含有タンパク質 [マヘラ  オーストラリエンシス（Mahella australiensis） 50-1 BON]；gi|330837556|ref|YP_004412197.1| アルコール脱水素酵素 [スパエロヘータ  コッコイデス（Sphaerochaeta coccoides） DSM 17374]；gi|330836856|ref|YP_004411497.1| アルコール脱水素酵素 [スパエロヘータ  コッコイデス（Sphaerochaeta coccoides） DSM 17374]；gi|327398952|ref|YP_004339821.1| アルコール脱水素酵素 [ヒペア  マリチマ（Hippea maritima） DSM 10411]；gi|325290821|ref|YP_004267002.1| アルコール脱水素酵素 [シントロフォボツラス  グリコリカス（Syntrophobotulus glycolicus） DSM 8271]；gi|322833567|ref|YP_004213594.1| アルコール脱水素酵素 [ラーネラ  エスピー（Rahnella sp.） Y9602]；gi|308049202|ref|YP_003912768.1| アルコール脱水素酵素 [フェリモナス  バレアリカ（Ferrimonas balearica） DSM 9799]；gi|302392706|ref|YP_003828526.1| アルコール脱水素酵素 [アセトハロビウム  アラビティカム（Acetohalobium arabaticum） DSM 5501]；gi|302336054|ref|YP_003801261.1| アルコール脱水素酵素 [オルセネラ  ウリ（Olsenella uli） DSM 7084]；gi|302335092|ref|YP_003800299.1| アルコール脱水素酵素 [オルセネラ  ウリ（Olsenella uli） DSM 7084]；gi|152966730|ref|YP_001362514.1| アルコール脱水素酵素 [キネオコッカス  ラジオトレランス（Kineococcus radiotolerans） SRS30216]。前述の受入番号に関連した各配列は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４０】
好ましい実施形態において、アセト乳酸脱炭酸酵素ポリペプチドは、酸素に対して非感受性である。この実施形態において、アセト乳酸脱炭酸酵素は、環境中に酸素が存在しない場合であっても、その基質に対する酵素活性を有しているであろう。いくつかの実施形態において、第２級アルコール脱水素酵素は、本質的に、酸素に対して非感受性である。この実施形態において、第２級アルコール脱水素酵素は、環境中に酸素が存在しない場合であっても、その基質に対する酵素活性を有しているであろう。
【００４１】
いくつかの実施形態において、第２級アルコール脱水素酵素ポリペプチドは、コファクターとしてＮＡＤＰＨを必要とする。これは、第２級アルコール脱水素酵素（ｓＡＤＨ）がＮＡＤＰＨ−依存性であることを意味している。
【００４２】
いくつかの実施形態において、第２級アルコール脱水素酵素ポリペプチドは、その基質においてＳ−配置（S-installing）キラリティーを生じさせる。いくつかの実施形態において、第２級アルコール脱水素酵素ポリペプチドは、その基質においてＲ−配置（R-installing）キラリティーを生じさせる。
【００４３】
本明細書において使用される場合、「キラル」は、その鏡像上に重ね合せることができない分子化合物をいう。当該分子およびその鏡像体は、それゆえに、その「キラリティー」に関して言及され、多くの場合にＳまたはＲといわれる。異なる酵素は、その基質においてＳ構造を生じさせてＳ−産物を形成する能力、またはその基質においてＲ構造を生じさせてＲ−産物を形成する能力を有している。もし、所定の分子が、１つより多い不斉炭素を有している場合は、その後、異なる酵素は、標的分子における異なる不斉炭素において複数のＳ構造およびＲ構造を生じさせ得る。
【００４４】
本開示は、本開示の方法、組成物および生物において有用な特定のポリヌクレオチド／遺伝子を特定する。しかしながら、実質的に類似した機能を果たす実質的に類似したポリヌクレオチド／遺伝子もまた、本開示の組成物および方法において使用され得るので、そのような遺伝子に対する絶対的な同一性は必須ではないことが認識されるべきである。例えば、ポリペプチドまたは酵素をコードしている配列を含んでいる特定の遺伝子またはポリヌクレオチドにおける変更が実施され得、且つ活性に関して選別され得る。通常は、そのような変更は、保存的変異およびサイレント変異を含んでいる。そのような改変されたまたは変異させたポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、当該技術において公知の方法を使用して、酵素の発現または機能に関して選別され得る。さらに、本開示の上記ポリヌクレオチド／遺伝子のホモログは、本明細書において開示された組成物および方法における使用に適している。
【００４５】
遺伝暗号の固有の縮重の理由から、実質的に同じまたは機能的に同等のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、同じポリペプチドまたは酵素をクローニングして発現させるために使用され得る。当業者によって当然理解されることながら、コード配列を改変することは、特定の宿主におけるその発現を増強するために都合がよい。遺伝暗号は、６４個の可能なコドンと重複している。しかし、ほとんどの生物は、通常、これらのコドンの一部を使用している。ある種においてほとんどの場合に使用されるコドンは、最適コドンと称され、そして、何度も使用されないコドンは、レアコドンまたは低使用コドンとして分類される。コドンは、大腸菌（E. coli）またはシネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）の好ましいコドン使用頻度（codon usage）を反映するために置換され得る。この過程は「コドン最適化」または「種のコドンバイアスのための制御」と称されることもある（Murray et al. 1989 Nucl. Acids Res. 17:477-508を参照のこと）。ポリヌクレオチドのコドン最適化の例は、本開示の実施例１において提示している（表４も参照のこと）。
【００４６】
当業者は、遺伝暗号の縮重の性質の理由から、ヌクレオチド配列において異なる種々のＤＮＡ化合物が、本開示の所定のポリペプチドまたは酵素をコードするために使用され得ることを理解するであろう。本開示は、本開示の組成物および方法において使用された酵素のポリペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配列をコードしている任意の配列のＤＮＡ化合物を包含している。同様の方法において、ポリペプチドは、通常は、望ましい活性を失わないまたは有意に失わなければ、そのアミノ酸配列における１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、および挿入を許容し得る。
【００４７】
代謝産物を生産するために有用なポリペプチドまたは酵素のホモログは、本明細書において提供された微生物および方法によって包含される。上記用語「ホモログ」は、第１の族または種の元の酵素または遺伝子に関して使用されて、第２の族または種の酵素または遺伝子を区別するために言及する。当該第２の族または種の酵素または遺伝子は、機能的解析、構造的解析またはゲノム解析によって、上記第１の族または種の元の酵素または遺伝子に対応する第２の族または種の酵素または遺伝子であると決定される。多くの場合に、ホモログは、機能的類似点、構造的類似点またはゲノムの類似点を有しているであろう。酵素または遺伝子のホモログが、遺伝子プローブおよびＰＣＲを用いて容易にクローニングされ得る技術が知られている。ホモログは、機能的な解析の利用および／または遺伝子のゲノムマッピングによって確認され得るので、ホモログは、種々のデータベースおよびクローニングされた配列の同一性を参照することによって特定され得る。
【００４８】
もし、タンパク質をコードしている核酸配列が、第２のタンパク質をコードしている核酸配列に類似した配列を有している場合は、そのタンパク質は、第２のタンパク質に対して「ホモロジー」を有している、または「相同」である。または、もし、２つのタンパク質が、「類似の」アミノ酸配列を有している場合は、あるタンパク質は、第２のタンパク質に対するホモロジーを有している。それゆえ、上記用語「相同タンパク質」は、２つのタンパク質が類似のアミノ酸配列を有していることを意味していると定義付けられる。
【００４９】
本明細書において使用される場合、アミノ酸配列が、少なくとも、およそ３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有しているときに、２つのタンパク質（または、当該タンパク質の領域）は、実質的に相同である。同様に、核酸配列が、少なくとも、およそ３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有しているときに、２つのポリヌクレオチド（または、当該ポリヌクレオチドの領域）は実質的に相同である。２つのアミノ酸配列の同一性の割合、または２つの核酸配列の同一性の割合を決定するために、これらの配列は、最適な比較目的のために位置合わせされる（例えば、最適なアラインメントのために、第１および第２のアミノ酸または核酸配列の内の１種またはその両方において、ギャップが導入され得る。そして、比較目的のために、非相同配列は無視され得る。）対応しているアミノ酸の位置またはヌクレオチドの位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドは、その後、比較される。第１の配列におけるある位置が、第２の配列における対応している位置として同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有されているときに、その結果、これらの分子は、その位置において同一である（本明細書において使用される場合、アミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「ホモロジー」と同義である。）。２つの配列間の同一性の割合は、ギャップの数、各ギャップの長さを考慮して、これらの配列によって共有された同一の位置の数の関数であり、ギャップは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入されることが必要である。
【００５０】
本開示のいくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドのコード配列は、プロモーターに動作可能に連結されている。いくつかの実施形態において、当該プロモーターは、誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、上記プロモーターは、構成的プロモーターである。
【００５１】
本明細書において使用される場合、「誘導可能なプロモーター」は、細胞による刺激の認識に従って、動作可能に連結されているポリヌクレオチドの発現を促進するプロモーターをいう。同様に、誘導可能なプロモーターは、刺激の除去に従って、動作可能に連結されているポリヌクレオチドの発現を終了し得る。本開示における誘導可能なプロモーターの例は、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）誘導性プロモーターである。このプロモーターは、外因性の化学物質であるＩＰＴＧの認識に従って、動作可能に連結されているポリヌクレオチドの発現を促進する。本開示の組成物および方法において使用される任意の適切な誘導可能なプロモーターは、適宜使用されてもよい。当業者は、多くの特徴付けられた誘導可能なプロモーターが存在し、そしてこれらのプロモーターが本明細書において開示された組成物および方法に従って使用され得ることを認識するであろう。
【００５２】
構成的プロモーターは、外的刺激による制御に対して実質的に非感受性であるプロモーターであり、そして、基本的に恒常的な方法において所定のポリヌクレオチドの発現を促進する。
【００５３】
本開示は、シアノバクテリア等の宿主微生物において使用するための、組換えポリヌクレオチドを含んでいる組換えベクターを提供する。
【００５４】
本明細書において使用される場合、「組換えの」または「異種の」または「異種ポリヌクレオチド」または「組換えポリヌクレオチド」は、ポリヌクレオチドの正確なヌクレオチド配列が、所定の宿主にとって異質である（すなわち、その宿主において自然に見出されない）ポリヌクレオチドをいう。これらの用語はまた、所定の宿主において自然に見出されてもよいが、不自然な量（例えば、期待されるよりもより多いまたは少ない量）であるポリヌクレオチド配列のことをいってもよく、または、さらに、ポリヌクレオチドの配列が自然において互いに同じ関係に見られない２つ以上のサブ配列を含んでいる場合のポリヌクレオチド配列のことをいってもよい。例えば、後者に関して、組換えポリヌクレオチドは、関連しないポリヌクレオチドからの２つ以上の配列、または新しいポリヌクレオチドを作製するために準備された相同なヌクレオチドからの２つ以上の配列を有し得る。具体的には、本開示は、組換えベクターの微生物への導入について記載しており、このベクターは、上記微生物において通常見出されないポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含んでいるか、または、宿主生物において通常見出されない実質的に相同なポリヌクレオチドをコードしている外来のポリヌクレオチドを含んでいる。宿主細胞のゲノムを参照して、その結果、ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列は、組換えまたは異種である。
【００５５】
いくつかの実施形態において、本開示の組換えポリヌクレオチドは、宿主生物のゲノムに安定的に取り込まれる。いくつかの実施形態において、当該宿主生物は、シアノバクテリアであり、当該シアノバクテリアは、そのゲノムに安定的に取り込まれた本開示の組換えポリヌクレオチドを有している。本明細書において使用される場合、「安定的に取り込まれた」は、ゲノムへの組換えポリヌクレオチドの安定的な取込みに関して使用される場合、組換えポリヌクレオチドが上記生物のゲノムＤＮＡに物理的に取り込まれている現象をいい、例えば、ゲノムＤＮＡの複製を必要とする有糸分裂イベントおよび生殖イベントが、組換えポリヌクレオチド中に含まれている遺伝情報を宿主ゲノムの物理的な構成単位として伝えるような現象をいう。
【００５６】
他の実施形態において、本開示の組換えポリヌクレオチドは、シアノバクテリア等の宿主生物に安定的に取り込まれない。この意味において、組換えポリヌクレオチドは、宿主のゲノムに安定的に取り込まれることなく、宿主細胞において発現される。
【００５７】
いくつかの実施形態において、組換えベクターまたは発現カセットは、プロモーターに動作可能に連結された、アセト乳酸合成酵素およびアセト乳酸脱炭酸酵素のためのコード配列を含んでいる。好ましい実施形態において、本開示のアセト乳酸合成酵素のコード配列は、ａｌｓＳポリヌクレオチドまたはそのホモログに相当する。好ましい実施形態において、上記アセト乳酸脱炭酸酵素のコード配列は、ａｌｓＤポリヌクレオチドまたはそのホモログに相当する。
【００５８】
組換え分子に関して、ポリヌクレオチドおよびコード配列は、それぞれのポリペプチドに常に関連していることに留意すべきである。アセト乳酸合成酵素のａｌｓＳポリヌクレオチドは、ＡＬＳポリペプチドを生産するであろう。アセト乳酸脱炭酸酵素のａｌｓＤポリヌクレオチドは、ＡＬＤＣポリペプチドを生産するであろう。第２級アルコール脱水素酵素のａｄｈポリヌクレオチドは、ｓＡＤＨポリペプチドを生産するであろう。定義上、所定の生物に由来するポリヌクレオチドまたはコード配列もまた、それぞれのポリペプチドが所定の生物に由来することを暗示している。
【００５９】
好ましい実施形態において、ａｌｓＳポリヌクレオチドは、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）に由来する。いくつかの実施形態において、ａｌｓＤポリヌクレオチドは、エンテロバクター  アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、エンテロバクター  クロアカエ（Enterobacter cloacae）、バチルス  リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）、アエロモナス  ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）、およびグルコンアセトバクター  キシリナス（Gluconacetobacter xylinus）から選択される供給元生物に由来する。
【００６０】
いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドは、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）に由来するａｌｓＳポリヌクレオチドおよびエンテロバクター  アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）に由来するａｌｓＤポリヌクレオチドを含有している。いくつかの実施形態において、組換えベクターは、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）に由来するａｌｓＳポリヌクレオチドおよびエンテロバクター  クロアカエ（Enterobacter cloacae）に由来するａｌｓＤポリヌクレオチドを含有している。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドは、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）に由来するａｌｓＳポリヌクレオチドおよびバチルス  リケニホルミス（Bacillus licheniformis）に由来するａｌｓＤポリヌクレオチドを含有している。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドは、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）に由来するａｌｓＳポリヌクレオチドおよびバチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）に由来するａｌｓＤポリヌクレオチドを含有している。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドは、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）に由来するａｌｓＳポリヌクレオチドおよびアエロモナス  ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）に由来するａｌｓＤポリヌクレオチドを含有している。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドは、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）に由来するａｌｓＳポリヌクレオチドおよびグルコンアセトバクター  キシリナス（Gluconacetobacter xylinus）に由来するａｌｓＤポリヌクレオチドを含有している。
【００６１】
いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドは、アセト乳酸合成酵素、アセト乳酸脱炭酸酵素、および第２級アルコール脱水素酵素のためのコード配列を含有している。好ましい実施形態において、アセト乳酸合成酵素のコード配列は、ａｌｓＳポリヌクレオチドまたはそのホモログに相当する。好ましい実施形態において、アセト乳酸脱炭酸酵素のコード配列は、ａｌｓＤポリヌクレオチドまたはそのホモログに相当する。好ましい実施形態において、第２級アルコール脱水素酵素コード配列は、ａｄｈポリヌクレオチドまたはそのホモログに相当する。
【００６２】
好ましい実施形態において、ａｌｓＳポリヌクレオチドは、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）に由来する。いくつかの実施形態において、ａｌｓＤポリヌクレオチドは、エンテロバクター  アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、エンテロバクター  クロアカエ（Enterobacter cloacae）、バチルス  リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）、アエロモナス  ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）、およびグルコンアセトバクター  キシリナス（Gluconacetobacter xylinus）から選択される供給元生物に由来する。いくつかの実施形態において、ａｄｈポリヌクレオチドは、カンジダ  パラプシローシス（Candida parapsilosis）、ロイコノストック  シュードメセンテロイデス（Leuconostoc pseudomesenteroides）、クロストリジウム  ベイエリンキイ（Clostridium beijerinckii）、およびサーモアナエロバクター  ブロッキイ（Thermoanaerobacter brockii）から選択される供給元生物に由来する。
【００６３】
いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドは、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）に由来するａｌｓＳポリヌクレオチド、エンテロバクター  アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）に由来するａｌｓＤポリヌクレオチドおよびカンジダ  パラプシローシス（Candida parapsilosis）に由来するａｄｈポリヌクレオチドを含有している。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドは、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）に由来するａｌｓＳポリヌクレオチド、エンテロバクター  アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）に由来するａｌｓＤポリヌクレオチド、およびロイコノストック  シュードメセンテロイデス（Leuconostoc pseudomesenteroides）に由来するａｄｈポリヌクレオチドを含有している。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドは、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）に由来するａｌｓＳポリヌクレオチド、エンテロバクター  アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）に由来するaｌｓＤポリヌクレオチド、およびクロストリジウム  ベイエリンキイ（Clostridium beijerinckii）に由来するａｄｈポリヌクレオチドを含有している。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドは、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）に由来するａｌｓＳポリヌクレオチド、エンテロバクター  アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）に由来するａｌｓＤポリヌクレオチド、およびサーモアナエロバクター  ブロッキイ（Thermoanaerobacter brockii）に由来するａｄｈポリヌクレオチドを含有している。
【００６４】
いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドは、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）に由来するａｌｓＳポリヌクレオチド、エンテロバクター  クロアカエ（Enterobacter cloacae）に由来するａｌｓＤポリヌクレオチド、およびカンジダ  パラプシローシス（Candida parapsilosis）に由来するａｄｈポリヌクレオチドを含有している。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドは、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）に由来するａｌｓＳポリヌクレオチド、エンテロバクター  クロアカエ（Enterobacter cloacae）に由来するａｌｓＤポリヌクレオチド、およびロイコノストック  シュードメセンテロイデス（Leuconostoc pseudomesenteroides）に由来するａｄｈポリヌクレオチドを含有している。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドは、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）に由来するａｌｓＳポリヌクレオチド、エンテロバクター  クロアカエ（Enterobacter cloacae）に由来するａｌｓＤポリヌクレオチド、およびクロストリジウム  ベイエリンキイ（Clostridium beijerinckii）に由来するａｄｈポリヌクレオチドを含有している。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドは、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）に由来するａｌｓＳポリヌクレオチド、エンテロバクター  クロアカエ（Enterobacter cloacae）に由来するａｌｓＤポリヌクレオチド、およびサーモアナエロバクター  ブロッキイ（Thermoanaerobacter brockii）に由来するａｄｈポリヌクレオチドを含有している。
【００６５】
いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドは、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）に由来するａｌｓＳポリヌクレオチド、バチルス  リケニホルミス（Bacillus licheniformis）に由来するａｌｓＤポリヌクレオチド、およびカンジダ  パラプシローシス（Candida parapsilosis）に由来するａｄｈポリヌクレオチドを含有している。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドは、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）に由来するａｌｓＳポリヌクレオチド、バチルス  リケニホルミス（Bacillus licheniformis）に由来するａｌｓＤポリヌクレオチド、およびロイコノストック  シュードメセンテロイデス（Leuconostoc pseudomesenteroides）に由来するａｄｈポリヌクレオチドを含有している。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドは、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）に由来するａｌｓＳポリヌクレオチド 、バチルス  リケニホルミス（Bacillus licheniformis）に由来するａｌｓＤポリヌクレオチド、およびクロストリジウム  ベイエリンキイ（Clostridium beijerinckii）に由来するａｄｈポリヌクレオチドを含有している。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドは、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）に由来するａｌｓＳポリヌクレオチド、バチルス  リケニホルミス（Bacillus licheniformis）に由来するａｌｓＤポリヌクレオチド、およびサーモアナエロバクター  ブロッキイ（Thermoanaerobacter brockii）に由来するａｄｈポリヌクレオチドを含有している。
【００６６】
いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドは、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）に由来するａｌｓＳポリヌクレオチド、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）に由来するａｌｓＤポリヌクレオチド、およびカンジダ  パラプシローシス（Candida parapsilosis）に由来するａｄｈポリヌクレオチドを含有している。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドは、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）に由来するａｌｓＳポリヌクレオチド、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）に由来するａｌｓＤポリヌクレオチド、およびロイコノストック  シュードメセンテロイデス（Leuconostoc pseudomesenteroides）に由来するａｄｈポリヌクレオチドを含有している。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドは、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）に由来するａｌｓＳポリヌクレオチド、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）に由来するａｌｓＤポリヌクレオチド、およびクロストリジウム  ベイエリンキイ（Clostridium beijerinckii）に由来するａｄｈポリヌクレオチドを含有している。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドは、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）に由来するalsＳポリヌクレオチド、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）に由来するａｌｓＤポリヌクレオチド、およびサーモアナエロバクター  ブロッキイ（Thermoanaerobacter brockii）に由来するａｄｈポリヌクレオチドを含有している。
【００６７】
いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドは、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）に由来するａｌｓＳポリヌクレオチド、アエロモナス  ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）に由来するａｌｓＤポリヌクレオチド、およびカンジダ  パラプシローシス（Candida parapsilosis）に由来するａｄｈポリヌクレオチドを含有している。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドは、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）に由来するａｌｓＳポリヌクレオチド、アエロモナス  ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）に由来するａｌｓＤポリヌクレオチド、およびロイコノストック  シュードメセンテロイデス（Leuconostoc pseudomesenteroides）に由来するａｄｈポリヌクレオチドを含有している。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドは、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）に由来するａｌｓＳポリヌクレオチド、アエロモナス  ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）に由来するａｌｓＤポリヌクレオチド、およびクロストリジウム  ベイエリンキイ（Clostridium beijerinckii）に由来するａｄｈポリヌクレオチドを含有している。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドは、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）に由来するａｌｓＳポリヌクレオチド、アエロモナス  ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）に由来するａｌｓＤポリヌクレオチド、およびサーモアナエロバクター  ブロッキイ（Thermoanaerobacter brockii）に由来するａｄｈポリヌクレオチドを含有している。
【００６８】
いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドは、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）に由来するａｌｓＳポリヌクレオチド、グルコンアセトバクター  キシリナス（Gluconacetobacter xylinus）に由来するａｌｓＤポリヌクレオチド、およびカンジダ  パラプシローシス（Candida parapsilosis）に由来するａｄｈポリヌクレオチドを含有している。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドは、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）に由来するａｌｓＳポリヌクレオチド、グルコンアセトバクター  キシリナス（Gluconacetobacter xylinus）に由来するａｌｓＤポリヌクレオチ、およびロイコノストック  シュードメセンテロイデス（Leuconostoc pseudomesenteroides）に由来するａｄｈポリヌクレオチドを含有している。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドは、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）に由来するａｌｓＳポリヌクレオチド、グルコンアセトバクター  キシリナス（Gluconacetobacter xylinus）に由来するａｌｓＤポリヌクレオチド、およびクロストリジウム  ベイエリンキイ（Clostridium beijerinckii）に由来するａｄｈポリヌクレオチドを含有している。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドは、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）に由来するａｌｓＳポリヌクレオチド、グルコンアセトバクター  キシリナス（Gluconacetobacter xylinus）に由来するalｓＤポリヌクレオチド、およびサーモアナエロバクター  ブロッキイ（Thermoanaerobacter brockii）に由来するａｄｈポリヌクレオチドを含有している。
【００６９】
いくつかの実施形態において、本開示の組換えポリヌクレオチドは、宿主生物に導入される。いくつかの実施形態において、宿主生物は、大腸菌（E. coli）である。好ましい実施形態において、宿主生物は、シアノバクテリアである。好ましい実施形態において、宿主生物は、シネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）である。組換えポリヌクレオチドの宿主生物への導入は、宿主の形質転換をもたらし、その結果、形質転換生物を生産する。
【００７０】
本明細書において使用される場合、「形質転換された」生物は、組換えポリヌクレオチド分子が供与された生物である。形質転換された生物は、それゆえ、外因性の遺伝情報を含有している点で、野生型の生物とは異なる。形質転換された生物は、この定義上、組換え生物でもある。宿主生物を形質転換する方法は、実施例１において詳細に説明される。しかしながら、当業者は、形質転換の別の方法が存在し、必要に応じて本開示の方法および組成物において使用されてもよいことを認識するであろう。
【００７１】
本開示の好ましい実施形態において、形質転換された生物はアセトインを生産する。好ましい実施形態において、形質転換された生物は、野生型の生物と比較して、より高いレベルのアセトインを生産する。本開示の好ましい実施形態において、形質転換された生物は、２，３−ブタンジオールを生産する。好ましい実施形態において、形質転換された生物は、野生型の生物と比較して、より高いレベルの２，３−ブタンジオールを生産する。
【００７２】
（アセトインおよび２，３−ブタンジオールを生産する方法）
いくつかの実施形態において、アセトインを生産する方法は、本開示中に提示される。この方法は、形質転換されたシアノバクテリアを形成するために、プロモーターに動作可能に連結された、アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）およびアセト乳酸脱炭酸酵素（ＡＬＤＣ）のためのコード配列を含有している組換えベクターを有しているシアノバクテリアを提供する段階を包含している。この方法は、さらに、ＣＯ２および光を含んでいる光合成環境において、形質転換されたシアノバクテリアを培養することを包含している。これによって、ＡＬＳおよびＡＬＤＣの発現は、アセトインの生産をもたらす。
【００７３】
いくつかの実施形態において、２，３−ブタンジオールを生産する方法は、本開示中に提示される。この方法は、形質転換されたシアノバクテリアを形成するために、プロモーターに動作可能に連結された、アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）、アセト乳酸脱炭酸酵素（ＡＬＤＣ）、および第２級アルコール脱水素酵素（ｓＡＤＨ）のためのコード配列を含有している組換えベクターを有しているシアノバクテリアを提供する段階を包含している。この方法は、さらに、ＣＯ２および光を含んでいる光合成環境において、形質転換されたシアノバクテリアを培養することを包含している。これによって、ＡＬＳ、ＡＬＤＣ、およびｓＡＤＨの発現は、２，３−ブタンジオールの生産をもたらす。
【００７４】
いくつかの実施形態において、本開示の組換えポリヌクレオチドにおけるアセト乳酸合成酵素のコード配列、アセト乳酸脱炭酸酵素のコード配列、および第２級アルコール脱水素酵素のコード配列は、細菌の供給元または真菌の供給元に由来する。いくつかの実施形態において、アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）は、細菌のＡＬＳまたは真菌のＡＬＳである。いくつかの実施形態において、アセト乳酸脱炭酸酵素（ＡＬＤＣ）は、細菌のＡＬＤＣまたは真菌のＡＬＤＣである。いくつかの実施形態において、第２級アルコール脱水素酵素（ｓＡＤＨ）は細菌のｓＡＤＨまたは真菌のｓＡＤＨである。
【００７５】
いくつかの実施形態において、ＡＬＳは、細菌起源である。いくつかの実施形態において、ＡＬＳは、バチルス  エスピー（Bacillus sp.）に由来するＡＬＳである。いくつかの実施形態において、ＡＬＳは、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）に由来するＡＬＳである。
【００７６】
「細菌」または「真正細菌」は、原核生物の領域をいう。本開示の組換えポリヌクレオチドおよびコード配列は、細菌起源であってもよい。細菌は、以下のような、少なくとも１１種類の異なる群を包含している：（１）グラム陽性（グラム＋）細菌、これには、以下の２つの主要な細区分がある：（１）高Ｇ＋Ｃ群（放線菌類（Actinomycetes）、マイコバクテリウム（Mycobacteria）、マイクロコッカス属（Micrococcus）、他）（２）低Ｇ＋Ｃ群（バチルス属（Bacillus）、クロストリジウム（Clostridia）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ブドウ球菌（Staphylococci）、連鎖球菌（Streptococci）、マイコプラズマ（Mycoplasmas））；（２）プロテオバクテリア、例えば、紫色光合成＋非光合成のグラム陰性細菌（ほとんどの「一般的な」グラム陰性細菌を含む）；（３）シアノバクテリア、例えば、酸素発生型光合成生物（oxygenic phototrophs）；（４）スピロヘータ類（Spirochetes）および関連する種；（５）プランクトミセス（Planctomyces）；（６）バクテロイデス属（Bacteroides）、フラボバクテリア属（Flavobacteria）；（７）クラミジア属（Chlamydia）；（８）緑色硫黄細菌；（９）緑色非硫黄細菌（嫌気性の光合成生物類も）；（１０）放射線抵抗性のミクロコッカス（micrococci）および関連する種；（１１）サーモトガ（Thermotoga）およびサーモサイホン  サーモフィレス（Thermosipho thermophiles）（例えば、米国特許出願公開第２０１１／０２５００６０号を参照のこと）。
【００７７】
「真菌」または「真菌の」は、酵母類、カビ類、およびキノコ類を含む真核生物の大集団の一員をいう。真菌は、豊富且つ多様な生物であり、真菌類（Eumycota）の分類に該当する。本開示の組換えポリヌクレオチドおよびコード配列は、真菌起源のものであってもよい。組換えポリヌクレオチドの真菌起源は、コウマクノウキン綱（Blastocladiomycetes）、ツボカビ綱（Chytridiomycetes）、グロムス菌綱（Glomeromycetes）、微胞子虫門（Microsporidia）、ネオカリマスティクス菌綱（Neocallimastigomycetes）、子嚢菌類（Ascomycetes）、および担子菌類（Basidiomycetes）の群に由来する種を含んでいる真菌に由来してもよい。
【００７８】
いくつかの実施形態において、ｓＡＤＨは、真菌のｓＡＤＨである。いくつかの実施形態において、ｓＡＤＨは、子嚢菌（Ascomycete）のｓＡＤＨ、ファーミキューテス門（firmicutes）のｓＡＤＨ、またはサッカロミセス綱（saccharomycete）のｓＡＤＨである。
【００７９】
本開示はシアノバクテリアに関し、シアノバクテリアは、光合成独立栄養細菌の一種である。光合成独立栄養細菌は、通常、グラム陰性桿菌であり、光合成の過程を通じて、太陽光からエネルギーを取得する。この過程において、太陽光エネルギーは、炭水化物類の合成において使用され、組換え光合成独立栄養生物は、さらに、生物燃料の合成において、中間体として使用される。他の実施形態において、代謝的に操作された微生物によって生物燃料を生産するために、光合成独立栄養生物は、非光合成微生物（例えば、組換え大腸菌（E. coli））が利用する炭水化物源となる。酸素非発生型光合成独立栄養生物（anoxygenic photoautotrophs）と称されるある種の光合成独立栄養生物は、嫌気性の条件下においてのみ生育し、そして、水素源として水を使用せず、且つ光合成から酸素を生産することもない。他の光合成独立栄養細菌は、酸素発生型光合成独立栄養生物である。これらの細菌は、通常、シアノバクテリアである。これらは、光合成の過程において、藻類および複雑な植物と類似したクロロフィル色素および光合成を利用する。この過程の間に、これらは、水素源として水を使用し、且つ光合成の産物として酸素を生産する（例えば、米国特許出願公開第２０１１／０２５００６０号を参照のこと）。
【００８０】
いくつかの実施形態において、本開示は、アセトインおよび２，３−ブタンジオールの生産において使用するための、組換えポリヌクレオチドを含有しているシアノバクテリアを提供する。いくつかの実施形態において、当該シアノバクテリアは、シネココッカス  エスピー（Synechococcus sp.）である。いくつかの実施形態において、当該シネココッカス  エスピー（Synechococcus sp.）は、シネココッカス  エロンゲータス（Synechococcus elongatus）である。いくつかの実施形態において、上記シネココッカス  エロンゲータス（Synechococcus elongatus）は、シネココッカス  エロンゲータス（Synechococcus elongatus） PCC7942である。当業者は、他のシアノバクテリアが本開示に従って使用され得ることを認識するであろう。他の例となるシアノバクテリアの例は、シネココッカス  エスピー（Synechococcus sp.） WH8102等の海洋性のシアノバクテリア、サーモシネココッカス  エロンゲータス（Thermosynechococcus elongatus） BP-1等の熱安定性のシアノバクテリア、シネコシスティス  エスピー（Synechocystis sp.） PCC6803等の光従属栄養性のシアノバクテリアおよびノストック  パンクチフォルメ（Nostoc punctiforme）等の糸状のシアノバクテリアを包含している。
【００８１】
シアノバクテリアは、特定の糸状の形態のみならず、種々の桿菌および球菌も包含している。この細菌は、チラコイドを含有している。チラコイドは、クロロフィルを含有している細胞質の板状の膜である。この生物は、異質細胞（heterocysts）を生産する。異質細胞とは、窒素化合物の固定において機能すると考えられた特殊化した細胞である（例えば、米国特許出願公開第２０１１／０２５００６０号を参照のこと）。
【００８２】
本明細書において使用される場合、「光合成環境」は、環境の条件が光合成細胞が光合成を行い得るに適切な任意の環境をいう。特に、そのような環境は、光合成が起こり得るに十分な量の二酸化炭素（ＣＯ２）および光を含んでいるであろう。
【００８３】
ＣＯ２は、種々の手段において、生物に供給されてもよい。ＣＯ２は、自然に、大気中に存在している。従って、生物の周囲の環境が光合成生物が光合成を行い得るに十分な量のＣＯ２を含有している限りは、この化合物を生物に対して追加して補給しなくてもよい。この方法は、環境からＣＯ２を取り除き、且つ価値のある化学物質の生物学的な合成における出発分子としてＣＯ２を使用するので、この方法は好ましい。
【００８４】
本開示の方法において使用される光は、光合成生物が光合成を行い得るに十分な、任意の特性、任意の量、および当該技術において公知の任意の供給元に由来するものであってもよい。使用される光の特性は、例えば４００ｎｍ〜８００ｎｍの可視光スペクトルにおける任意の波長であってもよく、または光合成を促進するために適切なその他の特性の光であってもよい。光合成環境における光の量は、光の量が光合成を起こさせるために十分である限りは、任意の量であってもよい。本開示の方法において使用するために適切な光の量は、実施例１において提示される。しかし、これらの光の量は単なる例であり、開示された方法において使用され得る光の量は全く制限されない。当業者は、開示された方法において使用するために適切な光の量の範囲を容易に理解するであろう。
【００８５】
光源は、その光が光光合成生物における光合成を促進するために十分であるような任意の発光源に由来してもよい。光は、蛍光灯または発光ダイオードに由来してもよい。または、光は、自然の太陽光に由来してもよい。当業者は、多くの異なる光源が本開示の方法において使用され得ることを容易に理解するであろう。利用可能な光源は、実施例１において提示されるが、これらは単なる可能性であり、本開示の方法に適用できる光源の範囲は全く制限されない。
【００８６】
いくつかの実施形態において、恒明下において本開示の組換えシアノバクテリアを培養する結果として、アセトインおよび２，３−ブタンジオールの１つ以上の生産が生じる。当業者は、一定の光エネルギーは、光合成を促進するために光を供給する１つの方法に過ぎないことを容易に理解するであろう。他の光持続時間レジメもまた、本開示において使用され、当業者にとって明らかであろう。
【００８７】
いくつかの実施形態において、重炭酸塩の存在下において本開示の組換えシアノバクテリアを培養する結果として、アセトインおよび２，３−ブタンジオールの１つ以上の生産が生じる。
【００８８】
好ましい実施形態において、本開示の方法は、組換えポリヌクレオチドを欠いているコントロールのシアノバクテリアと比較して、同一条件下においてより高いレベルのアセトインを生産する形質転換されたシアノバクテリアを生産する。好ましい実施形態において、本開示の方法は、組換えポリヌクレオチドを欠いているコントロールのシアノバクテリアと比較して、同一条件下においてより高いレベルの２，３−ブタンジオールを生産する形質転換されたシアノバクテリアを生産する。
【００８９】
本明細書において使用される場合、コントロールのシアノバクテリアは、組換えシアノバクテリアと実質的に同じであるシアノバクテリアをいう。しかし、コントロールのシアノバクテリアは、本開示において記載した組換えシアノバクテリアの組換えポリヌクレオチドを欠いている。コントロールのシアノバクテリアの例は、組換えシアノバクテリアとして、同種の野生型のシアノバクテリアを包含している。そのような野生型のシアノバクテリアは、組換えシアノバクテリアの親株を包含し得る。他のコントロールのシアノバクテリアは、本開示のベクターを有しているが、そのベクター内に組換えポリヌクレオチドを備えていないシアノバクテリアを包含している。他の種類のコントロールのシアノバクテリアまたは生物は、当業者にとって明らかであろう。
【００９０】
生物からアセトインおよび２，３−ブタンジオールの濃度を検出する方法の例は、実施例１において提示される。しかしながら、当業者は、代謝産物の濃度を検出する多くの異なる方法が公知であり且つ実施されることを認識するであろう。試料中のアセトインおよび／または２，３−ブタンジオールの濃度を定量化し得る任意の方法は、本開示において利用され得る。
【００９１】
２，３−ブタンジオール分子は、２つの不斉炭素を有しており、それゆえ、各立体中心において異なるキラリティーを有し得る。本開示の方法において生産された２，３−ブタンジオールは、（Ｒ，Ｒ）−２，３−ブタンジオールであってもよく、（Ｓ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールであってもよく、またはメソ−２，３−ブタンジオールであってもよい。メソ−２，３−ブタンジオールは、分子の１つの不斉炭素がＳ−構造を有し、且つ分子の１つの不斉炭素がＲ−構造を有している。
【００９２】
（補足的な情報）
本開示の実行は、他に指示が無い限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来手法を用いるであろう。これらの手法は、当該技術のスキルの範囲内である。そのような手法は、例えば以下の文献において十分に説明されている：Molecular Cloning：A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989)；Oligonucleotide Synthesis (Gait, ed., 1984)；Animal Cell Culture (Freshney, ed., 1987)；Handbook of Experimental Immunology (Weir & Blackwell, eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller & Calos, eds., 1987)；Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)；Current Protocols in Immunology (Coligan et al., eds., 1991)；The Immunoassay Handbook (Wild ed., Stockton Press NY, 1994)；Bioconjugate Techniques (Hermanson, ed., Academic Press, 1996)；およびMethods of Immunological Analysis (Masseyeff, Albert, and Staines, eds., Weinheim: VCH Verlags gesellschaft mbH, 1993)。
【００９３】
２つの配列間の同一性の割合は、ギャップの数、各ギャップの長さを考慮して、これらの配列によって共有された同一の位置の数の関数であり、ギャップは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入されることが必要である。配列比較に関して、通常、１つの配列は参照配列として働き、試験配列は当該参照配列と比較される。配列比較アルゴリズムを用いる場合に、試験配列および参照配列はコンピュータに入力され、サブ配列座標が指定され、必要であれば、配列アルゴリズムプログラムのパラメーターが指定される。初期設定プログラムパラメータが使用され得るか、または代替的なパラメーターが指定され得る。配列比較アルゴリズムは、その後、当該プログラムパラメータに基づき、参照配列に対する試験配列の配列同一性の割合を算出する。同一性に関して２つの配列が比較されるときに、これらの配列が近接していることは必要ではないが、任意のギャップは、全体的な同一性の割合を低下させるペナルティーが伴うであろう。ｂｌａｓｔｎに関して、初期設定パラメーターは、ギャップ開始ペナルティー（Gap opening penalty)＝５であり、且つギャップ拡張ペナルティー（Gap extension penalty）＝２である。ｂｌａｓｔｐに関して、初期設定パラメーターは、ギャップ開始ペナルティー＝１１であり、且つギャップ拡張ペナルティー＝１である。
【００９４】
「比較ウィンドウ」は、本明細書において使用される場合、２０〜６００、通常は約５０〜約２００、より通常は約１００〜約１５０からなる群から選択される複数の連続した位置の内のいずれか１つの断片への言及を含んでおり、そこでは、配列は、２つの配列を最適に配列させた後に同数の連続した位置の参照配列と比較されてもよい。比較のための配列のアラインメントの方法は、当該技術において周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて（例えば、Smith and Waterman, Adv Appl Math, 2:482, 1981の局所相同アルゴリズムによって；Needleman and Wunsch, J Mol Biol, 48:443, 1970の相同アラインメントアルゴリズムによって；Pearson and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA, 85:2444, 1988の類似法に関する研究によって；これらのアルゴリズム（ＦＡＳＴＤＢ（Ｉntelligenetics）、ＢＬＡＳＴ（National Center for Biomedical Information）、Wisconsin Genetics Software Package（Genetics Computer Group, Madison, WI）におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ制御された実施によって）、または手動のアラインメントおよび目視によって実施され得る。
【００９５】
配列同一性の割合および配列類似性の割合を決定するために適切なアルゴリズムの好ましい例は、ＦＡＳＴＡアルゴリズムである（Pearson and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA, 85:2444, 1988；およびPearson, Methods Enzymol, 266:227-258, 1996）。同一性の割合を算出するためにＤＮＡ配列のＦＡＳＴＡアラインメントにおいて使用される好ましいパラメーターは、ＢＬ５０  Ｍａｔｒｉｘ  １５：−５、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２；連結ペナルティー＝４０、最適化＝２８；ギャップペナルティー−１２、ギャップ長ペナルティー＝−２；および幅＝１６に最適化される。
【００９６】
配列同一性の割合および配列類似性の割合を決定するために適切なアルゴリズムの他の好ましい例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムである（それぞれ、Altschul et al., Nuc Acids Res, 25:3389-3402, 1977；およびAltschul et al., J Mol Biol, 215:403-410, 1990）。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０は、本開示の核酸およびタンパク質に関する配列同一性の割合を決定するために、本明細書中に記載したパラメーターを用いて使用される。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）のウェブサイトを介して公に利用できる。このアルゴリズムは、まず、クエリー配列において長さＷの短いワードを特定することによって、ハイスコアの配列ペア（high scoring sequence pairs：ＨＳＰｓ）を特定することを含む。当該クエリー配列は、データベース配列において同じ長さのワードとともに配列されたときに、ある正の数の閾値スコアＴと一致するか、または満足する。Ｔは、近傍ワードスコア閾値（neighborhood word score threshold）として参照される。これらの最初の近傍ワードのヒットは、当該ワードを含んでいるより長いＨＳＰｓを見出すための検索を開始するためのシーズ（seeds）として働く。上記ワードのヒットは、累積のアラインメントスコアが増加し得る限りは、各配列に沿った両方向に拡張される。ヌクレオチド配列に関して、累積のスコアは、パラメーターＭ（一致する残基の対に関するリワードスコア；常に＞０）と、パラメーターＮ（一致しない残基に関するペナルティスコア；常に＜０）とを用いて算出される。アミノ酸配列に関して、採点マトリクスは、累積のスコアを算出するために、使用される。量Ｘにより、累積のアラインメントスコアが達成される最大値から低減したとき；１つ以上の負に採点された残基のアラインメントの累積の結果、累積のスコアがゼロもしくはそれよりも低くなったとき；または、いずれかの配列の末端が到達したときに、各方向におけるワードのヒットの拡張は停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度およびアラインメントの速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列のための）は、初期設定値として、ワード長（Ｗ）  １１、期待値（Ｅ）  １０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両ストランドの比較を用いる。アミノ酸配列に関して、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、初期設定値として、ワード長  ３、期待値（Ｅ）  １０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリクス（Henikoff and Henikoff, Proc Natl Acad Sci USA, 89:10915, 1989）アラインメント（Ｂ）  ５０、期待値（Ｅ）  １０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両ストランドの比較を用いる。
【００９７】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計的解析を実行する（例えば、Karlin and Altschul, Proc Natl Acad Sci USA, 90:5873-5787, 1993を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の測定の１つは、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。当該最小合計確率は、２つのヌクレオチド配列間、または２つのアミノ酸配列間の一致が偶然に生じるであろう確率の目安を提供する。例えば、参照核酸と試験核酸との比較において最小合計確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合に、核酸は、参照配列と類似しているとみなされる。
【００９８】
有用なアルゴリズムの他の例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、配列同一性の関係性および配列同一性の割合を示すために、段階的な対のアラインメントを用いて、関連する配列の群から複数の配列アラインメントを作り出す。ＰＩＬＥＵＰはまた、このアラインメントを作り出すために、クラスタリングの関係性を示している系図または系統樹をプロットする。ＰＩＬＥＵＰは、公開された方法（Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-153, 1989）に類似している方法を用いて、段階的なアラインメント方法（Feng and Doolittle, J Mol Evol, 35:351-360, 1987）の簡素化されたものを用いる。このプログラムは、３００配列まで配列させることができ、当該配列は最長で５，０００ヌクレオチドまたは５，０００アミノ酸である。複数のアラインメント手順は、２つの最も類似している配列のペアワイズアラインメントを用いて開始し、その結果、２つの配列させた配列のクラスターを形成する。このクラスターは、その後、次の最も関連している配列または配列された配列のクラスターに対して配列される。配列の２つのクラスターは、２つの個々の配列のペアワイズアラインメントの単純な拡張によって配列される。最終的なアラインメントは、一連の段階的なペアワイズアラインメントによって達成される。このプログラムは、特定の配列およびそのアミノ酸またはヌクレオチドの配列比較の領域に関する座標を指定することによって、そしてプログラムのパラメーターを指定することによって実行される。ＰＩＬＥＵＰを使用する場合、参照配列は、以下のパラメーター（初期設定のギャップ重さ（３．００）、初期設定のギャップ長さ重さ（０．１０）、および加重された末端ギャップ）を用いて配列の同一性の関係性の割合を決定するために、他の試験配列と比較される。ＰＩＬＥＵＰは、ＧＣＧ配列解析ソフトウェアパッケージ、例えば、バージョン７．０（Devereaux et al., Nuc Acids Res, 12:387-395, 1984）から取得され得る。
【００９９】
複数のＤＮＡおよびアミノ酸配列のアラインメントのために適切なアルゴリズムの他の好ましい例は、ＣＬＵＳＴＡＬＷプログラム (Thompson et al., Nucl Acids. Res, 22:4673-4680, 1994)である。ＣｌｕｓｔａｌＷは、配列の群間で複数の対比較を行い、そして、これらを、ホモロジーに基づいた複数のアラインメントに組み立てる。ギャップオープンペナルティーおよびギャップ拡張ペナルティーは、それぞれ１０および０．０５であった。アミノ酸のアラインメントに関して、ＢＬＯＳＵＭアルゴリズムは、タンパク質重量マトリクスとして使用され得る（Henikoff and Henikoff, Proc Natl Acad Sci USA, 89:10915-10919, 1992）。
【０１００】
本開示のポリヌクレオチドは、さらに、表４のポリペプチドの保存的に改変された変異体をコードしているポリヌクレオチド、および配列番号：１〜２３の核酸およびアミノ酸配列を包含している。「保存的に改変された変異体」は、本明細書において使用される場合、アミノ酸を化学的に類似したアミノ酸と置換する個々の変異を包含している。機能的に類似したアミノ酸を与える保存的置換の表は、当該技術において周知である。そのような保存的に改変された変異体は、本開示の多型変異体、種間のホモログ、および対立遺伝子であるうえに、これらを排除しない。以下の８つの群は、お互いに保存的置換であるアミノ酸を含んでいる：１．アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２．アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３．アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４．アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５．イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６．フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７．セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および８．システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）。
【０１０１】
上記用語「由来する」または「の（ｏｆ）」は、核酸またはタンパク質への言及において使用される場合、その配列が、興味のある生物の配列と同一または実質的に同一であることを表している。
【０１０２】
上記用語「対応する」は、シアノバクテリアへの言及において使用される場合、興味のあるシアノバクテリアとして同属および同種のシアノバクテリアをいう。例えば、ＡＬＳおよびＡＬＤＣをコードしている組換えポリヌクレオチドを含有しているシネココッカス  エロンゲーテス（S. elongates）に関して、「対応するシアノバクテリア」は、上記組換えポリヌクレオチドを欠いているシネココッカス  エロンゲーテス（S. elongates）細胞（野生型、親株、または他の類似のもの）である。
【０１０３】
上記用語「減少する」、「低減する」および「減少」は、生物学的な機能（例えば、酵素活性、化合物の生産、タンパク質の発現等）への言及において使用される場合、好ましくは少なくとも１０％まで、より好ましくは少なくとも５０％まで、さらに好ましくは少なくとも７５％まで、および最も好ましくは少なくとも９０％までの、機能における測定可能な低下をいう。機能によって、上記減少は、１０％〜１００％であってもよい。上記用語「実質的な減少」等は、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％の減少をいう。
【０１０４】
上記用語「増加する」、「上昇する」および「上昇」は、生物学的な機能（例えば、酵素活性、化合物の生産、タンパク質の発現等）への言及において使用される場合、好ましくは少なくとも１０％まで、より好ましくは少なくとも５０％まで、さらに好ましくは少なくとも７５％まで、および最も好ましくは少なくとも９０％までの、機能における測定可能な増加をいう。機能によって、上記上昇は、１０％〜１００％；あるいは、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、または少なくとも１０００倍、最大１００倍、最大１０００倍または最大１０，０００倍もしくはそれ以上であってもよい。上記用語「実質的な上昇」等は、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％の上昇をいう。
【０１０５】
上記用語「単離された」および「精製された」は、本明細書において使用される場合、少なくとも１種の成分から取り除かれる物質をいい、当該成分は、上記物質が天然に関連するものである（例えば、その元の環境から取り除かれる）。上記用語「単離された」は、生合成的に生産された化学物質への言及において使用される場合に、化学物質を生産した細菌の培地から取り除かれた化学物質をいう。そのような単離された化学物質は、外来の化合物または不要な化合物（例えば、基質分子、細菌の成分等）を含んでいない。
【０１０６】
本明細書において使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、特に指定されない限りは、複数形の言及を含んでいる。例えば、「ａｎ」  ＡＬＤは、１つ以上のＡＬＤを含んでいる。
【０１０７】
上記語句「含んでいる」は、本明細書において使用される場合、オープンエンド形式であり、そのような実施形態は、付加的な要素を含んでいてもよいことを示唆している。一方で、上記語句「からなる」は、クローズド形式であり、そのような実施形態は、付加的な要素（微量の不純物を除く）を含まないことを示唆している。上記語句「から本質的になる」は、部分的にクローズド形式であり、そのような実施形態は、そのような実施形態の基本的な特性を物質的に変えない要素をさらに含んでいてもよいことを示唆している。「含んでいる」として本明細書において記載された局面および実施形態は、「からなる」および／または「から本質的になる」局面および実施形態を含んでいることが理解される。
【０１０８】
〔実施例〕
本開示の上記実施形態の理解をより助けるために、以下の実施例を提示する。以下の実施例は単なる実例であり、本開示のあらゆる実施形態を決して限定しない。
【０１０９】
略語：ＡＬＤＣ（アセト乳酸脱炭酸酵素）；ＡＬＳ（アセト乳酸合成酵素）；ｓＡＤＨ（第２級アルコール脱水素酵素）；および２３ＢＤ（２，３−ブタンジオール）。
【０１１０】
（実施例１  −  組換え微生物におけるアセトインおよび２，３−ブタンジオールの生産）
以下の実施例は、二酸化炭素と光エネルギーとからのこれらの価値のある化学物質の成功した生産のみならず、例となる光合成微生物（例えば、シネココッカス  エロンゲータス（Synechococcus elongatus）)における異種のアセトインおよび２，３−ブタンジオールの生合成経路の工業技術を記載する。
【０１１１】
（原料および方法）
試薬。化学物質（Ｒ，Ｒ）−２，３−ブタンジオール、メソ−２，３−ブタンジオール、（Ｓ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールおよびアセトインは、Sigma-Aldrich（St. Louis, MO）から入手した。ＮＡＤＨおよびＩＰＴＧは、Fisher Scientific（Hanover Park, IL）から入手した。Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼは、NEB（Ipswich, MA）から購入した。ＫＯＤポリメラーゼおよびＮＡＤＰＨは、EMD4Biosciences（San Diego, CA）から購入した。ゲンタマイシンは、Teknova（Hollister, CA）から購入した。オリゴヌクレオチドは、Integrated DNA Technologies, Inc.（San Diego, CA）で合成した。
【０１１２】
菌株およびプラスミド。本明細書において記載した菌株は、表１に記載する。一方で、本明細書において記載したプラスミドは、表２に記載する。ｐＡＬ６０を除く全てのプラスミドは、配列およびリガーゼ非依存的クローニング法（sequence and ligase independent cloning：ＳＬＩＣ）（５０）を用いて、大腸菌（E. coli） XL1-Blue（Agilent Technologies, Santa Clara, CA）において構築した。コンストラクションおよび遺伝子型確認のためのプライマーは、表３に記載する。
【０１１３】
【表１】
2015530116.tif 000003
【０１１４】
【表２】
2015530116.tif 000004
【０１１５】
【表３】
2015530116.tif 000005
【０１１６】
シネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）染色体におけるSynpcc7942_0893（903,564−904,283 bp）とSynpcc7942_0894（904,845−905,417 bp）との間に置かれたニュートラルサイト（ＮＳ）は、発現カセットの挿入のために用いた。この領域は、プライマーＭＣ１７３およびプライマーＭＣ１７６を用いて増幅した。ＰＣＲ産物は、ＡａｔＩＩとＡｖｒＩＩとを用いて消化し、且つ同酵素を用いて切断したｐＺＥ１２−ｌｕｃ（５１）にクローニングして、ｐＡＬ６０を作製した。
【０１１７】
ｐＳＡ６９（５２）から、ＰＬｌａｃＯ１遺伝子およびａｌｓＳ（Ｂ．ｓ．）遺伝子を含んでいる断片を、プライマーＩＭ１０３およびプライマーＩＭ１１を用いて増幅し、且つｌａｃＩｑを、プライマーＩＭ３９およびプライマーＡＫ３を用いて増幅した。得られた断片をＳＬＩＣ法によってｐＡＬ６０に挿入して、ｐＡＬ３０１を作製した。
【０１１８】
ａｌｓＤ（Ｅ．ａ．）をクローニングするために、我々は、プライマーＩＭ１６およびプライマーＩＭ１７を用いたＰＣＲの鋳型として、エンテロバクター  アエロゲネス（E. aerogenes） ATCC13048（ＡＴＣＣ）のゲノムＤＮＡを使用した。ａｌｓＤ（Ｅ．ｃ．）をクローニングするために、プライマーＩＭ１９およびプライマーＩＭ２０を用いたＰＣＲの鋳型として、エンテロバクター  クロアカエ（E. cloacae） ATCC 13047（ＡＴＣＣ）のゲノムＤＮＡを使用した。ａｌｓＤ（Ｂ．ｌ．）をクローニングするために、プライマーＩＭ２３およびプライマーＩＭ２４を用いたＰＣＲの鋳型として、バチルス  リケニホルミス（B. licheniformis）ATCC 14580（ＡＴＣＣ）のゲノムＤＮＡを使用した。ａｌｓＤ（Ｇ．ｘ．）をクローニングするために、プライマーＩＭ２１およびプライマーＩＭ２２を用いたＰＣＲの鋳型として、グルコンアセトバクター  キシリナス（G. xylinus）（ＮＢＲＣ３２８８）のゲノムＤＮＡを使用した。ａｌｓＤ（Ｂ．ｓ）およびａｌｓＤ（Ａ．ｈ．）は、シネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）のためのコドン使用頻度を最適化するために、DNA2.0 Inc.（Menlo Park, CA）によって化学的に合成した。それぞれのａｌｓＤ遺伝子は、ＳＬＩＣ法によって、ｐＡＬ３０１におけるａｌｓＳ（Ｂ．ｓ．）の下流にクローニングして、ｐＡＬ３０２、ｐＡＬ３０３、ｐＡＬ３０４、ｐＡＬ３０５、ｐＡＬ３０６およびＡＬ３０７を作製した。プラスミドｐＡＬ３１２を構築するために、我々は、ＰＣＲの鋳型としてのプラスミドｐＡＬ３０１と、プライマーＩＭ１１４およびプライマーＩＭ１１とを用いて、ａｌｓＳ遺伝子を有さない完全なプラスミドを増幅した。得られた断片をＳＬＩＣ法によって組み立てた。全ての４つのａｄｈ遺伝子は、シネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）のためのコドン使用頻度を最適化するために、DNA2.0 Inc.（Menlo Park, CA）によって化学的に合成した。それぞれのａｄｈ遺伝子は、ＳＬＩＣ法によって、ｐＡＬ３０２におけるａｌｓＤ（Ｅ．ａ．）の下流にクローニングして、ｐＡＬ３０８、ｐＡＬ３０９、ｐＡＬ３１０およびｐＡＬ３１５を作製した。ａｄｈ（Ｔ．ｂ．）遺伝子およびａｄｈ（Ｃ．ｂ．）遺伝子は、ＳＬＩＣ法によって、ｐＡＬ３０６におけるａｌｓＤ（Ａ．ｈ．）の下流にクローニングして、ｐＡＬ２９９およびｐＡＬ３００をそれぞれ作製した。
【０１１９】
シネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）の形質転換。シネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）の形質転換は、記載されたとおりに実行した（５３）。菌株は、コロニーを新しい選択的平板培地に移すことによって数回分離した。標的遺伝子の染色体への組込みを確認するために、正確な組換えをＰＣＲによって確認した。使用した菌株および構築した菌株を表１に記載する。シネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）染色体におけるSynpcc7942_0893（903,564−904,283 bp）とSynpcc7942_0894（904,845−905,417 bp）との間に置かれたＮＳは、組換えのための標的部位として使用した。この部位におけるゲンタマイシン耐性遺伝子の挿入は細胞の生育に影響を及ぼさないことを確認した。
【０１２０】
酸素の発生。Ｏ２の発生は、オキシグラフシステム（Hansatech Instruments Ltd, Norfolk, UK）を備えているクラーク型電極を用いて測定した。周囲光条件下において、１ｍｌの細胞を４ｍｌホウケイ酸ガラスチャンバ―に移し、そして、ラバーキャップを有しているセンターボアードコンタクトプランジャを用いてヘッドスペースガスを放出した。細胞を、磁気フリア（magnetic flea）を用いて１００ｒｐｍにて撹拌し、そして、細胞が周囲のウォータージャケットとの平衡を保って２５℃になるように、細胞を暗闇に２分間置いた。少なくとも３０秒間にわたる一定の負の比率が平衡化の後に記録された。細胞を、その後、過剰な光（６０μＥ ｓ−１ ｍ−２）にさらし、そして、一定の比率が少なくとも６０秒間にわたって計測されるまで、少なくとも２分間平衡化させた。
【０１２１】
酵素解析。シネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）細胞を、誘導後７２時間で遠心分離（４０００ｇ、５分間）によって回収し、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中で洗浄し、そして、同緩衝液中に再懸濁した。粗抽出物を、０．１−ｍｍガラスビーズおよびミニビーズビーター（Mini bead beater）（ミニビーズビーター８（BioSpec Products, Inc., Bartlesville, OK））を用いて調製した。総タンパク質量の決定は、Cytoskeleton, Inc.（Denver, CO）から入手した高度タンパク質分析試薬（Advanced Protein Assay Reagent）によって実施した。
【０１２２】
アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）活性は、記載されたとおり測定した（５４）。生産されたアセトインの濃度は、純粋なアセトインを用いた標準曲線によって測定した。ＡｌｓＳ活性のある特定の単位は、１分間に１ｍｇのタンパク質当たり１ｎｍｏｌのアセトインを生成することに相当する。
【０１２３】
アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）活性は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの酸化を測定することによって決定した。反応混合物は、５０ｍＭ  ３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）  ｐＨ７．０、２５ｍＭアセトインおよび０．２ｍＭ  ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを含有していた。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの消費は、３４０ｎｍにて観測した。ＡＤＨ活性のある特定の単位は、１ｍｇのタンパク質当たり１分間に１ｎｍｏｌのＮＡＤ（Ｐ）Ｈを酸化することに相当する。
【０１２４】
生産性の計算。以下の説明は、特定の化合物に関する生産性の計算方法の概要を提示する（図７）。
【０１２５】
２，３−ブタンジオールに関して、１日当たりの生産性を、３日間にわたって平均化した。１日当たりの生産は、２４時間〜４８時間、４８時間〜７２時間、および７２時間〜９６時間の期間について、それぞれ、１７５ｍｇ ｌ−１、２９７ｍｇ ｌ−１、および２３７ｍｇ ｌ−１であった。単位を変換することにより、これは、それぞれ、７２９２μｇ ｌ−１ ｈ−１、１２３７５μｇ ｌ−１ ｈ−１、および９８７５μｇ ｌ−１ ｈ−１となる。これらの割合の平均は、９８４７μｇ ｌ−１ ｈ−１である。
【０１２６】
イソブチルアルデヒドに関して、上記比率は、文献において算出されている（５５）。
【０１２７】
脂肪酸に関して、見かけの最大力価は、１９７ｍｇ ｌ−１であり、これは、最低限の２日間にわたって生産された。単位を変換すると４１０４．２μｇｌ−１ ｈ−１となる（５６）。
【０１２８】
エタノールに関して、見かけの最大値は、１３ミリモル ｌ−１であり、これは、１４５時間において生産された。エタノールのモル質量（４６．０７ｇ ｍｏｌ−１）を使用すると、これは、１４５時間で５７５．９ｍｇ ｌ−１となる。単位を変換すると３９７２μｇ ｌ−１ ｈ−１となる（５７）。
【０１２９】
イソブタノールに関して、公表されている力価は、６日間で４５０ｍｇ ｌ−１である。単位を変換すると３１２５μｇ ｌ−１ ｈ−１となる（５５）。
【０１３０】
アセトンに関して、見かけの最大力価は、４日間で３６ｍｇ ｌ−１であった。単位を変換すると３７５μｇ ｌ−１ ｈ−１となる（５８）。
【０１３１】
エチレンに関して、見かけの最高比率は、２４０ｎｌ ｍｌ−１ ｈ−１であった。これは、周囲温度且つ周囲圧力における理想気体のモル体積（２５℃且つ１ａｔｍにおいて２４．４６５ｌｍｏｌ−１）を用いて且つ単位を変換することにより、９．８１μｍｏｌ ｌ−１ ｈ−１として概算することができる。エチレンのモル質量（２８．０５ｇ ｍｏｌ−１）を用いると、これは、２７５．１７μｇ ｌ−１ ｈ−１となる（５９）。
【０１３２】
１−ブタノールに関して、見かけの最大力価は、１０日間で１９ｍｇ ｌ−１であった。単位を変換すると７９．２μｇ ｌ−１ ｈ−１となる（６０）。
【０１３３】
脂肪族アルコールに関して、見かけの最大力価は、４日間で１３７．６３μｇ ｌ−１であった。単位を変換すると０．４８μｇ ｌ−１ ｈ−１となる（６１）。
【０１３４】
培養条件。特別の定めのない限り、シネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）菌株は、５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３を追加したＢＧ−１１培地（４５）中で培養した。細胞は、回転振盪（１００ｒｐｍ）しながら、且つ細胞培養の５ｃｍ上方の４本の８６ｃｍの２０Ｗ蛍光灯によって供給される光（５５μＥ ｓ−１ ｍ−２）を用いて、３０℃にて生育させた。細胞の生育は、ＯＤ７３０を測定することによって観測した。
【０１３５】
シネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）におけるアセトインおよび２３ＢＤの生産に関して、対数増殖期における細胞を、１２５ｍｌバッフル付振盪フラスコ中で、５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１０ｍｇ／Ｌチアミン、および１０ｍｇ／Ｌゲンタマイシンを含有している２５ｍｌのＢＧ−１１培地中にて、ＯＤ７３０の値が０．１となるように希釈した。培養物は、１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いた誘発の前に、ＯＤ７３０の値が０．４〜０．６となるまで生育させた。２４時間毎に、１０Ｎ  ＨＣｌを用いて、ｐＨを７．５  ＋／−０．４に調整した。培養体積の１０％を取り除き、そして同体積の０．５Ｍ  ＮａＨＣＯ３含有ＢＧ−１１を添加して、培養物において５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３の最終濃度を達成した。
【０１３６】
大腸菌（E. coli）におけるアセトインおよび２，３−ブタンジオールの生産に関して、一夜培養物を、３０ｍｌ試験管中で、５０ｇ／Ｌグルコース、５ｇ／Ｌ酵母抽出物および５ｍｇ／Ｌゲンタマイシンを含有している５ｍｌの改変Ｍ９培地（３３）中に、１：１００の割合で希釈した。細胞は、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧの添加の前に、ＯＤ値が０．２〜０．４となるまで、３７℃にて生育させた。生産は、３０℃にて、回転振盪機（２５０ｒｐｍ）において、４０時間にわたって継続した。
【０１３７】
アセトインの定量化。アセトインは、VogesおよびProskauerの方法（４６〜４７）によって定量化した。この方法は、９６穴プレートにおける小容量に適応している。試料濃度は、検出の直線範囲内で結果を得るために、最終体積の１〜１０％の間に変更した。これは、Ｈ２Ｏ中で１００μｌの初期体積に希釈することによって達成した。２％試料（最も一般的）を含有している分析試料に関して、９８μｌの水および２μｌの上清を穴に添加して混合した。これに対して１００μｌの溶液を添加した。この溶液は、使用時に調製され、２．５Ｎ  ＮａＯＨに希釈した５％ナフトールを１部と、水に希釈した０．５％クレアチンを１部とを含有している。分析試料は、５分毎に観察して、４０分後に最終読込みを行った。このとき、吸光度曲線の傾きは、ナフトールのバックグラウンドの酸化と一致した。３つ以上の基準の３つ組の測定は、全ての分析試料において行われた。この３つ以上の基準は、望ましい範囲より大きい少なくとも１つの値、望ましい範囲よりも小さい少なくとも１つの値および望ましい範囲内の少なくとも１つの値をそれぞれ包含している。
【０１３８】
２，３−ブタンジオールの定量化。培養物からの上清試料は、炎イオン化検出器およびＨＰ−キラル２０ｂカラム（３０ｍ、０．３２−ｍｍ内径、０．２５−ｍｍ膜厚；Agilent Technologies）を備えているガスクロマトグラフィー（ＧＣ）（Shimadzu）を用いて分析した。試料は、９部の上清（必要に応じてＨ２Ｏ中に希釈したもの）を、１部の内部標準と共に混合することによって調製した。それぞれの解析に関して、ＧＣオーブン温度は、４０℃に４分間維持し、１５℃ 分−１の勾配で２３５℃になるまで上昇させ、そして４分間維持した。超高純度ヘリウムを運搬ガスとして使用した。注入器および検出器の温度は、２５０℃に設定した。立体異性体は、（Ｒ，Ｒ）−２３ＢＤ、メソ−２３ＢＤおよび（Ｓ，Ｓ）−２３ＢＤのための基準に保持時間を一致させることによって確認した。
【０１３９】
（結果）
２３ＢＤは、シネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）において低い毒性を示す。力価および化学物質生産の持続時間を向上させるために、低毒性または産出物を持続的に取り除くことが必要である。生産中の持続的な除去および少濃度の精製は、工業規模において費用効率性が高くないため、上記化学標的物が、生産菌株によって、１％より大きい容認できる体積（１０ｇ／Ｌ）にて許容されることがこの研究の必要条件である。
【０１４０】
アセトインおよび２３ＢＤの毒性を評価するために、我々は、２３ＢＤまたはアセトインの存在下において、７２時間にわたってシネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）の増殖を試験した。０．２ｇ／Ｌアセトインの存在下において、増殖は約５０％減少し、１．０ｇ／Ｌでは増殖は停止した（図２Ａ）。これは、この前駆物質に関する深刻な毒性を示唆している。これは、イソブチルアルデヒドおよびイソブタノールに匹敵する。これらの物質は、１ｇ／Ｌにおいてシネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）の増殖を抑制する（１４）。反対に、シネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）の増殖は、１０ｇ／Ｌ  ２３ＢＤの存在下において僅かに阻害され（図２Ｂ）、そして、３０ｇ／Ｌ  ２３ＢＤの存在下において、まだ増殖を示した。これは、生産物の許容に関する我々のベンチマークゴールを上回っている。これらの結果は、有毒な中間体の蓄積を抑制するためにアセトインを介した高い流量（high flux）が維持され得る限りは、２３ＢＤは、高力価且つ長期間のシアノバクテリア性の生産のための適切な標的物であることを示唆している。
【０１４１】
アセトイン生合成経路の構築。アセトインは、２−アセト乳酸の脱炭酸化によって生産され得る。この経路において（図１）、２つのピルビン酸塩分子は、ａｌｓＳによってコードされたアセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）によって、２−アセト乳酸に転換される。２−アセト乳酸は、その後、ａｌｓＤによってコードされた２−アセト乳酸脱炭酸酵素（ＡＬＤＣ）によってアセトインを生じるために脱炭酸化される。ピルビン酸塩は、上記経路のための炭素源であり、カルビン−ベンソン−バッシャム回路における３つのＣＯ２分子の固定を介して必然的に生産される（３２）。ピルビン酸塩の２−アセト乳酸への転換は、少量ではあるが、バリン／ロイシン生合成の間に必然的に起こる（３３）。以前、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）（Ｂ．ｓ．）に由来するＡＬＳをコードしているａｌｓＳ遺伝子が、イソブチルアルデヒドの生産のための２−アセト乳酸に対する炭素流量（carbon flux）を増加させるために過剰発現されて、そして、比較的高い活性を有していることが報告された（１４）。
【０１４２】
有力なＡＬＤＣ候補を同定するために、我々は、バイオインフォマティクス手段であるBRaunschweig ENzyme DAtabase（ＢＲＥＮＤＡ）（３４）と、広範囲の文献レビューとを用いた。我々は、我々の調査を、Ｏ２に対して非感受性の酵素に限定し、そして、強力なアセトイン生産の報告を探した。我々は、先行連鎖している文献報告を年代的に一致した菌株名と適合させる必要性によってさらに制限された。この菌株名は、現在利用できる遺伝子配列と適合している。これらの基準に基づいて、６つのａｌｓＤ遺伝子が選択された（表４）。
【０１４３】
【表４】
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【０１４４】
アセトイン生産を試験するために、それぞれのａｌｓＤ遺伝子を、大腸菌（E. coli）において、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）によって誘導可能なプロモーターＰＬｌａｃＯ１（３５）の制御下においてａｌｓＳ（Ｂ．ｓ．）と共に過剰発現させた。この細胞は、５０ｇ／Ｌのグルコースを含有している改変Ｍ９培地中で、３０℃にて、１６〜４０時間培養した。ａｌｓＳ（Ｂ．ｓ．）のみを発現しているコントロールの菌株は、０．２ｇ／Ｌのアセトインを生産した。これは、少量で、２−アセト乳酸がアセトインに分解することを示唆している。この結果は、過去の観察結果（３６〜３７）と一致している。ａｌｓＤが共発現されたときに、２０ｇ／Ｌより多くのアセトインが生産された。これは、自動脱炭酸化は、２−アセト乳酸の転換に対する主要な原因ではないことを示唆している（図３Ｂ）。エンテロバクター  クロアカエ（Enterobacter cloacae）（Ｅ．ｃ．）に由来するＡＬＤＣを除く全てのＡＬＤＣは、大腸菌（E. coli）において活性を有しており、そして、１６時間の生産および４０時間の生産を通じて矛盾のない活性のパターンを示した（図３Ｂ）。アエロモナス  ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）（Ａ．ｈ．）に由来するａｌｓＤを発現している菌株は、最も高い生産者であり（２１．０ｇ／Ｌ）、続いて、グルコンアセトバクター  キシリナス（Gluconacetobacter xylinus）（Ｇ．ｘ．）に由来するａｌｓＤを発現している菌株（１７．８ｇ／Ｌ）、バチルス  リケニホルミス（Bacillus licheniformis）（Ｂ．ｌ．）に由来するａｌｓＤを発現している菌株（１６．７ｇ／Ｌ）、およびエンテロバクター  アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）（Ｅ．ａ．）に由来するａｌｓＤを発現している菌株（１６．０ｇ／Ｌ）であった（図３Ｂ）。生産オペロンにおいて使用されたａｌｓＳ（Ｂ．ｓ．）に対する天然の遺伝子パートナーであるコドン最適化ａｌｓＤ（Ｂ．ｓ．）を発現している菌株は、最も少ないアセトインを生産した（６．６ｇ／Ｌ）。これは、固有の経路は、新しい宿主に移されたときに必ずしもその完全性を維持しないことを実証した。従って、複数の候補の選別は、それぞれの新しい宿主における経路の最適化にとって最適な遺伝子を明らかにした（図３Ｂ）。
【０１４５】
ＣＯ２からのシネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）におけるアセトイン生産。経路を最適化のための我々のスクリーニング戦略に続いて、異種のａｌｓＳおよびａｌｓＤを発現している間のアセトインの生産に基づき、ココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）の光合成の細胞環境においてＡＬＤＣ活性を比較した。それぞれの菌株は、１２５ｍｌの振盪フラスコ中で、５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３を含有している２５ｍｌのＢＧ−１１を用いて、恒明（５５μＥｓ−１ｍ−２）において、３０℃にて７２時間培養した（図３Ｃ）。Ｅ．ａ．、Ｂ．ｌ．、Ｂ．ｓ．、Ａ．ｈ．、およびＧ．ｘ．に由来するａｌｓＤを発現している菌株は、それぞれ、１０８ｍｇ／Ｌ、６２ｍｇ／Ｌ、３５ｍｇ／Ｌ、２０３ｍｇ／Ｌ、および１４ｍｇ／Ｌを生産した（図３Ｃ）。コントロールの菌株およびａｌｓＤ（Ｅ．ｃ．）を発現している菌株は、この宿主において、測定可能な量のアセトインを生産しなかった。これらの結果に基づいて、我々は、２つのａｌｓＤ遺伝子（Ｅ．ａ．およびＡ．ｈ．に由来）を所有した。これらの遺伝子は、シネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）において、それぞれ、中程度および高度のアセトインの生産が可能である。過剰なアセトインの毒性を回避するために、我々は、ｓＡＤＨ解析のための出発地点として、ａｌｓＤ（Ｅ．ａ．）を選択した。
【０１４６】
誘導可能な発現系を得るために、大腸菌（E. coli）のｌａｃリプレッサーをコードしているｌａｃＩｑを、ＰＬｌａｃＯ１の上流にクローニングした（図３Ａ）。ａｌｓＳ（Ｂ．ｓ）およびａｌｓＤ（Ｅ．ａ．）を含んでいるシネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）菌株におけるＬａｃＩ抑制の効率は、１ｍＭのＩＰＴＧを用いたアセトイン生産または１ｍＭのＩＰＴＧを用いないアセトイン生産を試験することによって調査した（図３Ｄ）。興味深いことに、ＩＰＴＧを用いないアセトイン生産は、ＩＰＴＧを用いたアセトイン生産と類似していた（図３Ｄ）。これは、この構築物において、ＰＬｌａｃＯ１が、ＬａｃＩによって十分に抑制されなかったことを示唆している。ｌａｃＩｑのプロモーター領域およびコーディング領域は、サンガーシークエンシング法によって検証した。この現象は、シネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus） PCC7942（３８−３９）およびシネコシスティス  エスピー（Synechocystis sp.） PCC6803において、他のＩＰＴＧ−誘導可能プロモーターを用いて報告されている（４０）。
【０１４７】
２３ＢＤ生合成経路の構築。アセトインは、第２級アルコール脱水素酵素（ｓＡＤＨ）によって還元されて２３ＢＤを生産する（図１）。有力なｓＡＤＨ候補の同定は、ＡＬＤＣのために使用した同じ方法に従ったが、酸素非感受性に加えて、さらに２つの基準が追加された。第１に、我々は、我々の調査を、ＮＡＤＰＨ−依存性ｓＡＤＨに限定した。このコファクターは、光合成においてより高い生物学的利用可能性を有していることが期待されているためである（２２）。第２に、ｓＡＤＨによるアセトインの還元は、ジアステレオ選択的な反応であり、これは、ＲまたはＳの立体中心のどちらかを導入するために、我々が酵素を選択することを可能にする。Ｒ配置反応部位を有しているｓＡＤＨを利用している２つのＮＡＤＰＨは、大腸菌（E. coli）において既に特性が明らかにされている（４１）。Ｓ配置反応部位を有しているｓＡＤＨおよびコファクターとしてのＮＡＤＰＨの利用可能性は、しかしながら、限られている。結局、我々は、４つのａｄｈ遺伝子、すなわち、Ｒ配置反応部位を有している２つのａｄｈ遺伝子およびＳ配置反応部位を有している２つのａｄｈ遺伝子を選択した（表４）。プラスミドは、ａｌｓＳ（Ｂ．ｓ．）、ａｌｓＤ（Ｅ．ａ．）、およびＰＬｌａｃＯ１の制御下にある４つのａｄｈのそれぞれを含むように構築した（図４Ａ）。
【０１４８】
得られた大腸菌（E. coli）株を、５０ｇ／Ｌグルコースを含有している改変Ｍ９培地中で、３０℃にて４０時間培養した（図４Ｂ）。アセトインの濃度は、４つの菌株の内３株に関して高濃度を維持した。これは、ｓＡＤＨ活性がこの細胞環境において制限されていることを示唆している。第４の菌株は、ａｄｈ（Ｃ．ｂ．）を発現しており、比較的低いアセトイン濃度（全生産量の６％よりも少ない）を維持しており、且つそれぞれが総生産の７４％および２１％である（Ｒ，Ｒ）−２３ＢＤ立体異性体およびメソ−２３ＢＤ立体異性体の混合物として、１３．８ｇ／Ｌの総２３ＢＤを生産した（図４Ｂ）。ａｄｈ（Ｔ．ｂ．）を発現している菌株およびａｄｈ（Ｃ．ｐ．）を発現している菌株は、両異性体がそれぞれにおいて凡そ等しい量にて形成された状態で、それぞれ、２．４ｇ／Ｌおよび１４．２ｇ／Ｌの２３ＢＤを生産した。高い立体選択性は、ａｄｈ（Ｌ．ｐ．）を発現している菌株において達成されて、９．１ｇ／Ｌのメソ−２３ＢＤが独占的に生産された。過剰の基質が使用された場合に、生産の間に単離した粗細胞溶解物から測定した酵素活性は、ｓＡＤＨ（Ｃ．ｐ．）およびｓＡＤＨ（Ｃ．ｂ．）の両方に関して高く、それぞれ、２６５ｎｍｏｌ 分−１ ｍｇ−１および４４０ｎｍｏｌ 分−１ ｍｇ−１であった（図４Ｂ）。しかしながら、ａｄｈ（Ｃ．ｐ．）を発現している菌株に関して、生産の間の上清におけるアセトインの蓄積は、細胞内部に存在している基質濃度における酵素の入れ替わり速度が酵素の分泌速度よりも遅いことを示唆している。相対的に、ｓＡＤＨ（Ｔ．ｂ．）の低い活性は、菌株におけるアセトインの蓄積と一致していた。これは、ｓＡＤＨ活性が、この大腸菌（E. coli）菌における生産のためのボトルネックであることを示唆している（図４Ｂ）。ａｄｈを発現している菌株のそれぞれの主な２３ＢＤ産物は、以前の特徴づけ（４１〜４３）によって予想された立体化学と一致していた。
【０１４９】
ＣＯ２からのシネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）における２３ＢＤ生産。シネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）における２３ＢＤの生産性における違いを選別するために、大腸菌（E. coli）における２３ＢＤの生産のために使用した各プラスミドを、シネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）の形質転換のために使用した。遺伝子操作した菌株は、１２５ｍｌのバッフル付振盪フラスコ中で、５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３を含有している２５ｍｌのＢＧ−１１を用いて、恒明（５５μ Ｅｓ−１ ｍ−２）において、３０℃にて培養した。
【０１５０】
２３ＢＤの生産は、４つのシネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）菌株の内の３つにおいて検出された（図４Ｃ）。シネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）におけるｓＡＤＨの性能の測定は、アセトイン転換が少ない場合により低い毒性になるように、より活性が低いＡＬＤＣ（Ｅ．ａ．）を用いて、７２時間の生育の後に、アセトイン濃度および２３ＢＤ濃度を比較することによって行った。ａｄｈ（Ｔ．ｂ．）を発現している菌株は、微量のメソ−２３ＢＤと共に、３０１ｍｇ／Ｌの（Ｒ，Ｒ）−２３ＢＤを生産したが、アセトインの蓄積も可能であった（図４Ｃ）。ａｄｈ（Ｃ．ｂ．）を発現している菌株は、２７０ｍｇ／Ｌの（Ｒ，Ｒ）−２３ＢＤ（主要）および検出不可能なレベルのアセトインを生産した。これは、中間体を介した高い流量（high flux）を示唆している。ａｄｈ（Ｃ．ｐ．）を発現している菌株は、主要産物としてのメソ−２３ＢＤと共に、６５ｍｇ Ｌ−１の２３ＢＤを生産し、そして、有毒なレベルのアセトインを蓄積した。残存しているＳ−配置ａｄｈ（Ｌ．ｐ．）は、シネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）において活動せず、その結果、アセトインの蓄積のみが生じた。生産の間に分離した粗細胞溶解物において測定した酵素活性は、ａｄｈ（Ｃ．ｂ．）に関しては、ａｄｈ（Ｔ．ｂ．）よりも凡そ１０倍高い活性を示し、それぞれ、５６．３ｎｍｏｌ 分−１ ｍｇ−１および６．３ｎｍｏｌ 分−１ ｍｇ−１であった。これは、低活性菌株におけるアセトインの蓄積を説明することができる（図４Ｃおよび４Ｄ）。ａｄｈ（Ｃ．ｐ．）の活性は、ａｄｈ（Ｃ．ｂ．）よりもさらに、凡そ５倍高かった。しかしながら、大腸菌（E. coli）における結果と類似した、低い生産性およびアセトインの蓄積が観察された。酵素活性は、ａｄｈ（Ｌ．ｐ．）を発現している菌株に関しては検出し得なかった。このことは、ｓＡＤＨ酵素が、生産性の欠如に関与していることを示唆している（図４Ｃおよび４Ｄ）。最も高い生産性を有するｓＡＤＨと、最も低いアセトイン蓄積性を有するｓＡＤＨとの２つのｓＡＤＨは、より強いＡＬＤＣ遺伝子であるａｌｓＤ（Ａ．ｈ．）を用いてさらに試験された。両方の菌株は生産が増加し、ａｄｈ（Ｔ．ｂ．）からは５６８ｍｇ Ｌ−１が、ａｄｈ（Ｃ．ｂ．）からは９５２ｍｇ Ｌ−１が生じた。後者は、７２時間にわたるａｌｓＤ（Ｅ．ａ．）を用いた生産よりも３倍高い（図４Ｃ）。両方の菌株はまた、増加したアセトイン濃度を示したが、どちらも有毒なレベルには到達せず、それぞれ、５９ｍｇ Ｌ−１および６１ｍｇ Ｌ−１を蓄積した。
【０１５１】
シネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）における２３ＢＤの長期間の生産。最も高い生産性の菌株の安定性は、恒明の存在下における３０℃での２５ｍｌの培養物中における持続的な生産の維持によって確認された。ａｄｈ（Ｃ．ｂ．）を含有している菌株は、２．３８ｇ／Ｌの（Ｒ，Ｒ）−２３ＢＤの総生産量および９８４７μｇ Ｌ−１ ｈ−１の最高生産率（３日間平均）に到達した（図５Ｂ）。生産は、２１日間持続された。ａｄｈ（Ｔ．ｂ．）を含有している菌株は、同様の結果を示し、１．９７ｇ Ｌ−１の総生産量、７７５７μｇ Ｌ−１ ｈ−１の最高生産率（３日間平均）および２１日間の持続した生産に達した（図５Ｂ）。２１日後に、両方の培養物における生産は急落し、そして、細胞を新鮮な培地中に再懸濁しても回復しなかった。これは、自然発生突然変異のような培養集団における変化を示唆している。これは、代謝に対する流量（flux）を回復させて、基本的に時間とともに生産を損なう。主要な代謝からの炭素リダイレクション（carbon redirection）の比率を反映していると予測された通り、２３ＢＤ生合成経路を含んでいる菌株は、コントロールの菌株と比較して、増殖が低下した（図５Ａ、５Ｂおよび５Ｄ）。ａｌｓＳ（Ｂ．ｓ．）およびａｌｓＤ（Ｅ．ａ．）のみを含有している第２のコントロールの菌株は、静止期が到達した後に有毒なレベルまでアセトインを生産し、且つ炭素リダイレクションの結果であると考えられる以上に増殖が低下した。
【０１５２】
生産菌株の光合成効率の評価。２３ＤＢの過剰生産経路が光合成系に影響を及ぼし得るかどうかを確認するために、持続的な生産の間の光を照射された細胞からのＯ２の発生を測定した（図５Ｃ）。２３ＢＤ生合成経路を発現している両方の菌株は、コントロールの菌株と比較して、１μｇのクロロフィル当たりのＯ２の発生の比率がわずかに高かった（図５Ｃ）。この比率は、生産の後期の間に増加した。両方のコンロトールの菌株は、それぞれ、生産経路を有していない菌株、または発現されたアセトイン生産経路のみを有している菌株であり、これらの菌株は、類似した比率のＯ２発生を示した（図５Ｃ）。この傾向は、主要な代謝から転用された固定された炭素の量を追従しており、過剰生産による細胞に対する負荷が、細胞の光合成効率においてプラスの作用を促進し得たことを示唆している（図５Ｃおよび５Ｄ）。
【０１５３】
（結論）
初めて本明細書中に記載された通り、ＣＯ２および光からの直接の２３ＢＤおよびアセトインの生産は、シアノバクテリアであるシネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）のエンジニアリングを介して達成された。生産経路を光合成の宿主に適合させるために、経路設計が取り組まれた。設計された菌株は、２１日間にわたる持続した生産を維持しながら、９８４７μｇ ｌ−１ ｈ−１の生産速度且つ２．４ｇ ｌ−１の最終力価を達成した。これらの値は、ＣＯ２および光からの持続的な生産の間に達成され、他の研究と比べて遜色がない。上記速度は、イソブチルアルデヒドの生産速度（６，２３０μｇ ｌ−１ ｈ−１）よりも１．６倍高く、外因性の経路から過剰に生産された他の産物よりも顕著に高かった（図７）。２３ＢＤとして生産されたバイオマスの割合は、３０％〜６０％の範囲である（図５Ｄ）。これは、内因性のショ糖の過剰生産の間に達成された８０％の最高値と比べて遜色がない（３８）。
【０１５４】
２３ＢＤ経路を構築するためには、改善された培養持続力ひいてはシネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）における有用な化学物質生産のために、低い毒性はより重要であった。経路流量（pathway flux）における毒性の負の作用は、ａｄｈの共発現を伴わない２３ＢＤ経路からのアセトインの低い生産によって強められる（図６Ｃ）。アセトインは、シネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）において０．１ｇ／Ｌを超えると有害である（図２Ａ）。アセトインの生産が不可逆的ステップであるのに対して、ａｄｈによる還元は不可逆的ステップではないが、アセトインを２３ＢＤに転換するためのオペロンに対する有力なａｄｈの追加は、経路の総生産量を１０倍に増加させる（図５Ｂおよび６Ｃ）。それゆえ、宿主に適合している遺伝子は、経路の機能を最適化するための手段を提供する。全ての遺伝子は、大腸菌（E. coli）における生産のために、および同時に同一のオペロンを有しているシアノバクテリアを用いた生産のために選別された。これらの遺伝子によって示された生産のパターンは、宿主間で異なっていた。シネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）においてａｌｓＤ（Ｂ．ｌ．）またはａｌｓＤ（Ｇ．ｘ．）を発現している菌株の生産性（それぞれ、最大生産量の３０％および７％）（図３Ｃ）は、大腸菌（E. coli）において同じ遺伝子を過剰発現している菌株の生産性（それぞれ、８０％および８５％の最大生産）（図３Ｂ）よりも、非常に低かった。反対に、ｓＡＤＨ（Ｔ．ｂ．）は、大腸菌（E. coli）においては大幅に弱められた生産性を示し、シネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）においては、顕著な生産性を達成した。さらに、ａｄｈ（Ｌ．ｐ．）によってコードされた酵素は、大腸菌（E. coli）においては９．１ｇ／Ｌのメソ−２３ＢＤを生産したのにもかかわらず、シネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）においては完全に不活性であった。
【０１５５】
モデル系として２３ＢＤ生産を用いることは、経路設計の一端として、立体選択性を含むことを可能にした（図１）。キラリティーは、化学物質の合成において配置することは費用がかかる；しかしながら、生物学的な制御は、これらの生産物に対して非常に単純な経路を提供する。全ての既知の事例において、本来は、アセトインは、Ｒ−立体中心を含んでいる２−アセト乳酸から生成されるので、その結果、（Ｓ，Ｓ）−２３ＢＤは観察されない。しかしながら、２−アセト乳酸の自動脱炭酸化、またはアセトインのエノラートのラセミ化は、場合によっては、細胞において（Ｓ）−アセトインを形成し得、そして、その結果、Ｓ−配置ｓＡＤＨ酵素の存在において、（Ｓ，Ｓ）−２３ＢＤの生産をもたらす。２つの経路が、それぞれの立体異性体につき１つ設計された（表４）。シネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）において、長期間にわたる生産において試験された両方のＲ−配置菌株は、主要な産物として、（Ｒ，Ｒ）−２３ＢＤを連続して生産した。しかし、微量のメソ−２３ＢＤが、ａｄｈ（Ｔ．ｂ．）を発現している菌株による生産において観察された。さらに、ａｄｈ（Ｃ．ｐ．）を発現している菌株は、大腸菌（E. coli）において混合された異性体を生産し、シネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）においてメソ−２３ＢＤのみを生産した。この研究において、（Ｓ，Ｓ）−２３ＢＤの生産は検出されなかった。これは、分解産物が上記経路に有効に寄与しないことを示唆している。
【０１５６】
長期間にわたる生産の間に、１μｇのクロロフィル当たりのＯ２の発生は、組換えカセットを含んでいるが、ａｌｓＳ、ａｌｓＤ、またはａｄｈ遺伝子を含んでいないコントロールと比較して、生産菌株において増加した（図６Ｃ）。これは、生産によって代謝に与えられたストレスが、光合成効率における上昇を誘発することを示している。クロロフィルおよびＯ２の生産は、遺伝子操作されたシネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）におけるショ糖の類似した過剰生産の間に、ほぼ同じ量に増加するようにみえる。光合成生物に関する遺伝子操作の原則を定義づけることは、持続可能な技術のための調査において、重要なランドマークである。天然の発酵性の生産者の存在、並びにプラスチック、溶媒、および燃料のための多用途の炭素原料としての化学物質の可能性のために、従属栄養微生物による２３ＢＤの生物学的な生産は、長年注目されている。本開示の手段を用いて達成された生合成の生産量および力価は、シアノバクテリア性の生産における大幅な増加を示す。
【０１５７】
（参考文献）
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57.  Dexter J & Pengcheng F (2009) Metabolic engineering of cyanobacteria for ethanol production. Energy & Environ. Sci. 2:857-864.
58.  Zhou J, Zhang H, Zhang Y, Li Y, & Ma Y (2012) Designing and creating a modularized synthetic pathway in cyanobacterium Synechocystis enables production of acetone from carbon dioxide.  Metab Eng 14(4):394-400.
59.  Takahama K, Matsuoka M, Nagahama K, & Ogawa T (2003) Construction and analysis of a recombinant cyanobacterium expressing a chromosomally inserted gene for an ethylene-forming enzyme at the psbAI locus.  J Biosci Bioeng 95(3):302-305.
60.   Lan EI & Liao JC (2012) ATP drives direct photosynthetic production of 1-butanol in cyanobacteria.  Proc Natl Acad Sci U S A 109(16):6018-6023.
61.  Tan X, et al. (2011) Photosynthesis driven conversion of carbon dioxide to fatty alcohols and hydrocarbons in cyanobacteria.  Metab Eng 13(2):169-176.
（配列表）
配列番号：１：ＰＬｌａｃＯ１プロモーター
aattgtgagcggataacaattgacattgtgagcggataacaagatactgagcacatcagcaggacgcactgacc 
配列番号：２：バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）  アセト乳酸合成酵素−ａｌｓＳ遺伝子ヌクレオチド配列
atgttgacaaaagcaacaaaagaacaaaaatcccttgtgaaaaacagaggggcggagcttgttgttgattgcttagtggagcaaggtgtcacacatgtatttggcattccaggtgcaaaaattgatgcggtatttgacgctttacaagataaaggacctgaaattatcgttgcccggcacgaacaaaacgcagcattcatggcccaagcagtcggccgtttaactggaaaaccgggagtcgtgttagtcacatcaggaccgggtgcctctaacttggcaacaggcctgctgacagcgaacactgaaggagaccctgtcgttgcgcttgctggaaacgtgatccgtgcagatcgtttaaaacggacacatcaatctttggataatgcggcgctattccagccgattacaaaatacagtgtagaagttcaagatgtaaaaaatataccggaagctgttacaaatgcatttaggatagcgtcagcagggcaggctggggccgcttttgtgagctttccgcaagatgttgtgaatgaagtcacaaatacgaaaaacgtgcgtgctgttgcagcgccaaaactcggtcctgcagcagatgatgcaatcagtgcggccatagcaaaaatccaaacagcaaaacttcctgtcgttttggtcggcatgaaaggcggaagaccggaagcaattaaagcggttcgcaagcttttgaaaaaggttcagcttccatttgttgaaacatatcaagctgccggtaccctttctagagatttagaggatcaatattttggccgtatcggtttgttccgcaaccagcctggcgatttactgctagagcaggcagatgttgttctgacgatcggctatgacccgattgaatatgatccgaaattctggaatatcaatggagaccggacaattatccatttagacgagattatcgctgacattgatcatgcttaccagcctgatcttgaattgatcggtgacattccgtccacgatcaatcatatcgaacacgatgctgtgaaagtggaatttgcagagcgtgagcagaaaatcctttctgatttaaaacaatatatgcatgaaggtgagcaggtgcctgcagattggaaatcagacagagcgcaccctcttgaaatcgttaaagagttgcgtaatgcagtcgatgatcatgttacagtaacttgcgatatcggttcgcacgccatttggatgtcacgttatttccgcagctacgagccgttaacattaatgatcagtaacggtatgcaaacactcggcgttgcgcttccttgggcaatcggcgcttcattggtgaaaccgggagaaaaagtggtttctgtctctggtgacggcggtttcttattctcagcaatggaattagagacagcagttcgactaaaagcaccaattgtacacattgtatggaacgacagcacatatgacatggttgcattccagcaattgaaaaaatataaccgtacatctgcggtcgatttcggaaatatcgatatcgtgaaatatgcggaaagcttcggagcaactggcttgcgcgtagaatcaccagaccagctggcagatgttctgcgtcaaggcatgaacgctgaaggtcctgtcatcatcgatgtcccggttgactacagtgataacattaatttagcaagtgacaagcttccgaaagaattcggggaactcatgaaaacgaaagctctc
配列番号:３：バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）  アセト乳酸合成酵素−ａｌｓＳアミノ酸配列
MLTKATKEQKSLVKNRGAELVVDCLVEQGVTHVFGIPGAKIDAVFDALQDKGPEIIVARHEQNAAFMAQAVGRLTGKPGVVLVTSGPGASNLATGLLTANTEGDPVVALAGNVIRADRLKRTHQSLDNAALFQPITKYSVEVQDVKNIPEAVTNAFRIASAGQAGAAFVSFPQDVVNEVTNTKNVRAVAAPKLGPAADDAISAAIAKIQTAKLPVVLVGMKGGRPEAIKAVRKLLKKVQLPFVETYQAAGTLSRDLEDQYFGRIGLFRNQPGDLLLEQADVVLTIGYDPIEYDPKFWNINGDRTIIHLDEIIADIDHAYQPDLELIGDIPSTINHIEHDAVKVEFAEREQKILSDLKQYMHEGEQVPADWKSDRAHPLEIVKELRNAVDDHVTVTCDIGSHAIWMSRYFRSYEPLTLMISNGMQTLGVALPWAIGASLVKPGEKVVSVSGDGGFLFSAMELETAVRLKAPIVHIVWNDSTYDMVAFQQLKKYNRTSAVDFGNIDIVKYAESFGATGLRVESPDQLADVLRQGMNAEGPVIIDVPVDYSDNINLASDKLPKEFGELMKTKAL
配列番号：４：エンテロバクター  アエロゲネス（Enterobacter aerogenes） KCTC 2190/ ATCC13048  アセト乳酸脱炭酸酵素−ａｌｓＤ遺伝子ヌクレオチド配列
atgaatcatgcttcagattgcacctgtgaagagagtctgtgtgaaacgctacgcgcgttttccgctcagcatcccgatagcgtgctgtatcaaacttcgctgatgagcgccctgctcagcggcgtctacgaaggtaccaccaccattgcggacctgctgaagcacggtgatttcgggctcggcacttttaatgaactcgacggcgagctgatcgcgtttagcagccaggtttatcaactgcgtgccgacggcagcgcgcgtaaagcgcgtccggaacagaaaacgccgtttgcggtgatgacctggtttcagccgcagtaccgtaaaacctttgaccatccggtcagccgccagcagctgcatgaggttattgaccagcaaattccttccgacaatctgttctgcgcgctgcgaatcgatggtcatttccgccacgcccatacccgcaccgtgcctcgtcagacgccgccctaccgggcgatgaccgacgtgctcgacgatcagccggttttccgctttaaccagcgtgacggcgtactggtcggttttcgtaccccgcagcatatgcagggaattaacgtcgccggctatcacgaacacttcattaccgatgaccgccagggcggcggccacctgctggactaccagctcgaccatggggtattgaccttcggcgaaattcataagctgatgatcgaccttcccgccgacagcgcgttcctgcaggccaatttgcatcccgataatctcgatgccgccatccgttcagtagaaagttag
配列番号：５：エンテロバクター  アエロゲネス（Enterobacter aerogenes） KCTC 2190/ ATCC13048  アセト乳酸脱炭酸酵素−ａｌｓＤアミノ酸配列
MNHASDCTCEESLCETLRAFSAQHPDSVLYQTSLMSALLSGVYEGTTTIADLLKHGDFGLGTFNELDGELIAFSSQVYQLRADGSARKARPEQKTPFAVMTWFQPQYRKTFDHPVSRQQLHEVIDQQIPSDNLFCALRIDGHFRHAHTRTVPRQTPPYRAMTDVLDDQPVFRFNQRDGVLVGFRTPQHMQGINVAGYHEHFITDDRQGGGHLLDYQLDHGVLTFGEIHKLMIDLPADSAFLQANLHPDNLDAAIRSVES
配列番号：６：エンテロバクター  クロアカエ  サブエスピー  クロアカエ（Enterobacter cloacae subsp. cloacae） ATCC 13047  アセト乳酸脱炭酸酵素−ａｌｓＤ遺伝子ヌクレオチド配列
Atgagcgccctgctaagcggtgtctacgaaggggacaccaccatcgccgatctgctggcacatggtgattttggtctgggcaccttcaacgagctggacggcgaaatgattgccttcagcagccaggtgtaccagctgcgcgccgacggcagcgcacgcgccgcgaagccagagcagaaaacgccgttcgcggtgatgacctggttccagccgcagtaccgcaaaacctttgatgcgccggtcagccgtcagcagatccacgacgtgatcgaccagcaaattccctcggataacctgttctgcgcgctgcgcatcgacggcaacttccgccacgcccacacccgtaccgtaccgcgtcagacgccgccataccgcgcgatgaccgacgtgctggacgaccagccggtgttccgctttaaccagcgtgaaggggtgctggttgggttccgcacgccgcagcatatgcagggcatcaacgtggccggctatcacgaacatttcattaccgacgaccgtcagggcgggggacatctgctggattaccagctggagagcggcgtgctcacctttggcgaaatacacaagctaatgattgacctgcccgccgacagcgcgtttttacaggccaaccttcaccccagcaaccttgatgcagcgatccgttccgtcgaaaactaa
配列番号：７：エンテロバクター  クロアカエ  サブエスピー  クロアカエ（Enterobacter cloacae subsp. cloacae） ATCC 13047  アセト乳酸脱炭酸酵素−ａｌｓＤアミノ酸配列
MSALLSGVYEGDTTIADLLAHGDFGLGTFNELDGEMIAFSSQVYQLRADGSARAAKPEQKTPFAVMTWFQPQYRKTFDAPVSRQQIHDVIDQQIPSDNLFCALRIDGNFRHAHTRTVPRQTPPYRAMTDVLDDQPVFRFNQREGVLVGFRTPQHMQGINVAGYHEHFITDDRQGGGHLLDYQLESGVLTFGEIHKLMIDLPADSAFLQANLHPSNLDAAIRSVEN
配列番号：８：バチルス  リケニホルミス（Bacillus licheniformis） ATCC 14580  アセト乳酸脱炭酸酵素−ａｌｓＤ遺伝子ヌクレオチド配列
atgaaaagtgcaagcaaacaaaaaataattcagcccgttgataagaacctcgatcaagtctatcaggtctcaacgatggtatctttattggacggaatttacgacggggatttttatatgtccgaagcgaaggagcacggagacttcgggatcggaacgttcaaccggctcgacggcgagctgatcggttttgacggtgagttttaccgtctccgttccgatggaaaagcctacccagttcaaggaagcgattgttctccattttgctcgctggctttcttccggccggatatctatcacgaaatcaagcagcggatgccgcttgaggcgttcgaagaagaaatgaaacggatcatgccgagtgaaaacctgttttacgcgattcgcatggacggaacctttaagaaagtcaaaacgagaacagttgaacttcaggaaaaaccgtatgtgccgatggttgatgcggtaaaatcacagccgatctttgattttaatgatattacggggacgatcgtcggcttttggacaccgcaatatgccaacggaatcgcagtttccggcttccatcttcactttatagatgaagaccgcaatgtcggcggacacgttttcgattatgaaatcgaagaatgcacggtgcaaatttctcaaaaactcaatatgaacctcagattgccgaatacgcaagatttctttcaagcggatttcaataaacacgatcttgcagccggaattgaagcggccgaaggcaatcccgagtaa
配列番号：９：バチルス  リケニホルミス（Bacillus licheniformis） ATCC 14580  アセト乳酸脱炭酸酵素−ａｌｓＤアミノ酸配列
MKSASKQKIIQPVDKNLDQVYQVSTMVSLLDGIYDGDFYMSEAKEHGDFGIGTFNRLDGELIGFDGEFYRLRSDGKAYPVQGSDCSPFCSLAFFRPDIYHEIKQRMPLEAFEEEMKRIMPSENLFYAIRMDGTFKKVKTRTVELQEKPYVPMVDAVKSQPIFDFNDITGTIVGFWTPQYANGIAVSGFHLHFIDEDRNVGGHVFDYEIEECTVQISQKLNMNLRLPNTQDFFQADFNKHDLAAGIEAAEGNPE
配列番号：１０：バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）  アセト乳酸脱炭酸酵素−ａｌｓＤ遺伝子ヌクレオチド配列（コドン使用頻度は、シネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）のために最適化されている。)
atgaaacgtgagtcgaacattcaagtcttgagccgaggccaaaaggaccaaccagtctcccagatctaccaagtgagcactatgacaagtctcttggacggagtctacgatggcgattttgagctctcggaaattccgaaatatggggatttcggcattgggacctttaacaaactggacggtgaactgatcggctttgatggtgagttctaccgcctgcgcagtgatgggaccgccacgccggttcaaaatggcgaccggagcccgttttgcagctttacattcttcacccccgacatgacacacaagattgatgctaaaatgactcgcgaagatttcgagaaagaaatcaattcgatgttgcctagtcgtaatttgttttatgccattcgcatcgacggtctgtttaagaaggtgcagacccgcacggttgaactccaggagaagccgtacgttcctatggtggaagcagtcaagacgcagcccatctttaacttcgacaatgtgcgcgggaccattgtcggcttcctgacgcccgcttatgcgaacggcatcgctgtctctggttaccatctccactttatcgatgaaggccgaaattccggaggccatgtttttgattatgtgctcgaagattgtacggtgaccatcagccagaaaatgaacatgaacttgcggctgccaaataccgcggatttcttcaatgcaaacctggataaccccgattttgccaaagatattgaaacgactgagggttctcccgagtag
配列番号：１１：バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）  アセト乳酸脱炭酸酵素−ａｌｓＤアミノ酸配列
MKRESNIQVLSRGQKDQPVSQIYQVSTMTSLLDGVYDGDFELSEIPKYGDFGIGTFNKLDGELIGFDGEFYRLRSDGTATPVQNGDRSPFCSFTFFTPDMTHKIDAKMTREDFEKEINSMLPSRNLFYAIRIDGLFKKVQTRTVELQEKPYVPMVEAVKTQPIFNFDNVRGTIVGFLTPAYANGIAVSGYHLHFIDEGRNSGGHVFDYVLEDCTVTISQKMNMNLRLPNTADFFNANLDNPDFAKDIETTEGSPE
配列番号:１２：アエロモナス  ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）  アセト乳酸脱炭酸酵素−ａｌｓＤ遺伝子ヌクレオチド配列（コドン使用頻度は、シネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）のために最適化されている。）
atggaaactaatagctcgtgcgattgtgcaatcgaaatctcgcagcaatttgcgcgctggcaggcccgtcaaggtgggggcgaggtctaccagtccagcctgatgtcggcactgctggcgggtgtttacgaaggcgaaaccacaatggccgatctgctccgccacggggactttggtctgggcacgtttaaccggctggacggcgaactcattgcctttgagcggcaaatccatcagttgaaagcggatggatctgcccgacccgctcgcgcagaacagaaaacgccgtttgccgtgatgacgcacttccggccgtgcttgcaacgccggttcgctcatccgctgtcccgcgaagaaattcaccaatgggtcgatcgcctcgtgggcactgacaacgttttcgttgcatttcgactggatggcttgtttgagcaagcgcaggtccgcaccgtcccctgtcagagcccaccctataagcccatgttggaggccattgaagcccagcctctgttcagtttcagtttgcggcgtgggaccctcgtcggctttcgctgcccacccttcgtgcaaggcattaacgtggctggctatcatgaacatttcattaccgaggatcgccgaggtgggggtcatatcttggattacgctatgggacacggccagctccaactgagcgtggttcaacacctcaacatcgagttgcctcgaaatcctgcctttcaacaggcagacctcaatccggcggatctggaccgcgctatccgtgcggctgagggttag
配列番号：１３：アエロモナス  ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）  アセト乳酸脱炭酸酵素−ａｌｓＤアミノ酸配列
METNSSCDCAIEISQQFARWQARQGGGEVYQSSLMSALLAGVYEGETTMADLLRHGDFGLGTFNRLDGELIAFERQIHQLKADGSARPARAEQKTPFAVMTHFRPCLQRRFAHPLSREEIHQWVDRLVGTDNVFVAFRLDGLFEQAQVRTVPCQSPPYKPMLEAIEAQPLFSFSLRRGTLVGFRCPPFVQGINVAGYHEHFITEDRRGGGHILDYAMGHGQLQLSVVQHLNIELPRNPAFQQADLNPADLDRAIRAAEG
配列番号：１４：アセトバクター  アセチ  エスエスピー  キシリナム（Acetobacter aceti, ssp. xylinum）, NBRC 3288（グルコンアセトバクター  キシリナス（Gluconacetobacter xylinus））  アセト乳酸脱炭酸酵素−ａｌｓＤ遺伝子ヌクレオチド配列
atggaaataggctttaatatatattggacgtacgaacctgcctgcatcaccattagtctgcaatcacaaatgaccgggttgaggcgatgccatgtgccgcattgtcccccgatgcaggagactgaggtcgtgaagcttaaatgctactcggtaggggatgttgatacccggtccagcgctgctgattcgactggcgtgcgtccgcgcatgaaccgcctgtaccagacatcgaccatggccgcgctgcttgatgcggtctatgatggcgagaccacgcttgatgaactgctgatgcacggcaatttcgggctgggcacgttcaacggccttgatggcgagatgatcgtcaatgacagcgtaatccaccagttccgtgcagacgggcaggccggtcgtgtgccgggcgacctcaggactccgttcgcctgcgttaccttcttcaacccggagaaggaatacatgatcgacaccgcgcaggataaggaaggcttcgaggcgatcgtggatcacctcgtcaacaatcccaacctgttcgccgccgtgcgctttaccggcatgttcgagcgggtcgagacccgcaccgtgttctgccagtgccagccctacccacccatgctggaagtggtggcccgccagcccaccatgcagcttggtgcctccaccggcaccatgcttggtttccgcacgccgggctacatgcagggcgtgaacgtggcgggttatcacctgcacttcctgactgaggacggacgccgtggcggccatgtgaccgattacggcgtgctgcgcggtcggcttgaggtgggcgtgatttccgatgtggaaatccagctgccccgcaccgaacagttcgcgcgcgccaacctgtcccccgaaaacattcacgaggccattcgcgtggccgagggcggctga
配列番号：１５：アセトバクター  アセチ  エスエスピー  キシリナム（Acetobacter aceti, ssp. xylinum）, NBRC 3288（グルコンアセトバクター  キシリナス（Gluconacetobacter xylinus））  アセト乳酸脱炭酸酵素−ａｌｓＤアミノ酸配列
MEIGFNIYWTYEPACITISLQSQMTGLRRCHVPHCPPMQETEVVKLKCYSVGDVDTRSSAADSTGVRPRMNRLYQTSTMAALLDAVYDGETTLDELLMHGNFGLGTFNGLDGEMIVNDSVIHQFRADGQAGRVPGDLRTPFACVTFFNPEKEYMIDTAQDKEGFEAIVDHLVNNPNLFAAVRFTGMFERVETRTVFCQCQPYPPMLEVVARQPTMQLGASTGTMLGFRTPGYMQGVNVAGYHLHFLTEDGRRGGHVTDYGVLRGRLEVGVISDVEIQLPRTEQFARANLSPENIHEAIRVAEGG
配列番号：１６：カンジダ  パラプシローシス（Candida parapsilosis） M203011  アルコール脱水素酵素−ａｄｈ遺伝子ヌクレオチド配列（コドン使用頻度は、シネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）のために最適化されている。)
atgggggagattgagtcctattgtaacaaagagctaggtcccttacctactaaagcaccgaccctgtccaaaaacgtgctcgatctattctccttgaagggaaaggtggcttcggtgacgggcagcagcggaggcattggttgggccgtagccgaagcatacgcccaggccggtgcagacgtcgcgatttggtacaacagccatcctgcggacgagaaggcggaacacctgcagaaaacttatggcgtgcacagtaaagcctataagtgcaatatcagtgatccgaaaagtgtggaagaaacgatctcacagcaagagaaggattttggcacgatcgacgtgttcgtcgctaatgccggggtcacttggacacagggcccagagatcgatgttgacaactatgattcgtggaacaaaatcattagtgttgatttgaatggcgtttactattgcagccacaatattggcaagatcttcaagaagaatgggaaaggttctctgattatcacgtcgagtatttctgggaaaatcgttaacattccgcagttgcaagcgccctacaataccgcgaaggccgcgtgtacccatctcgcgaaatcgctcgccattgaatgggctccgtttgcacgcgtcaacacgattagccccggatacatcgacaccgatatcaccgattttgcctctaaagacatgaaagctaagtggtggcaacttactccactgggacgggaaggcctcacccaagaactggtcggcggctacttgtatctggctagcaatgcttcgacatttaccaccggttcagatgtcgttatcgatggcggttacacatgcccc
配列番号：１７：カンジダ  パラプシローシス（Candida parapsilosis） M203011  アルコール脱水素酵素−ａｄｈアミノ酸配列
MGEIESYCNKELGPLPTKAPTLSKNVLDLFSLKGKVASVTGSSGGIGWAVAEAYAQAGADVAIWYNSHPADEKAEHLQKTYGVHSKAYKCNISDPKSVEETISQQEKDFGTIDVFVANAGVTWTQGPEIDVDNYDSWNKIISVDLNGVYYCSHNIGKIFKKNGKGSLIITSSISGKIVNIPQLQAPYNTAKAACTHLAKSLAIEWAPFARVNTISPGYIDTDITDFASKDMKAKWWQLTPLGREGLTQELVGGYLYLASNASTFTTGSDVVIDGGYTCP
配列番号：１８：ロイコノストック  シュードメセンテロイデス（Leuconostoc pseudomesenteroides） CHCC2114  アルコール脱水素酵素−ａｄｈ遺伝子ヌクレオチド配列（コドン使用頻度は、シネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）のために最適化されている。)
atgacaaagaaagtggctatggtgacgggtggcgcccaagggatcggagaggccattgtgcgacgtttgtcggcagatggctttgcggtcgcagtggctgatctgaacgaagccaaatccaaggaagtcgccacggacatcgaaaagaatgggggcactgcgattgcggttaagctcgatgtttcagatcgcgaggggtttttcgccgctgttaaagaagtcgcggagaagcttggaggttttgacgtcttggtaaacaacgctgggctcggccccaccacccccatcgatactattaccccggaactatttgataaggtctatcacatcaacgtcgctggcgacatttgggggattcaagcagccgtggagcagttcaagaaaaatggcaacggcggcaaaatcattaacgcgacaagtcaagccggcgtggtcggcaatcctaatttgtctctgtatagctcgactaagttcgcagtgcgcggactgacgcaggtcgcagcgcgcgatctagccgaacagaatatcacggttaatgcgtacgctccaggaattgtgaaaacgccgatgatgtttgatattgcccatgaagttggcaaaaacgccggtaaggatgacgagtggggtatgcaaaccttcgcgaaagatatcgctctcaaacggctgagcgaacccgaggacgtcgccgctgctgttgcgttcttagcaggtcctgacagtaattacatcaccggtcagaccatcgaagtggatggtggcatgcagtttcactag 
配列番号：１９：ロイコノストック  シュードメセンテロイデス（Leuconostoc pseudomesenteroides） CHCC2114  アルコール脱水素酵素−ａｄｈアミノ酸配列
MTKKVAMVTGGAQGIGEAIVRRLSADGFAVAVADLNEAKSKEVATDIEKNGGTAIAVKLDVSDREGFFAAVKEVAEKLGGFDVLVNNAGLGPTTPIDTITPELFDKVYHINVAGDIWGIQAAVEQFKKNGNGGKIINATSQAGVVGNPNLSLYSSTKFAVRGLTQVAARDLAEQNITVNAYAPGIVKTPMMFDIAHEVGKNAGKDDEWGMQTFAKDIALKRLSEPEDVAAAVAFLAGPDSNYITGQTIEVDGGMQFH
配列番号：２０：クロストリジウム  ベイエリンキイ（Clostridium beijerinckii） NRRLB593  アルコール脱水素酵素−ａｄｈ遺伝子ヌクレオチド配列
atgaaaggttttgccatgcttggaatcaataagctaggctggattgaaaaagaacgcccagtggcgggtagttatgatgccatcgttcgcccactggcagtgtcgccctgtacgagcgatatccacaccgtatttgagggcgcgttaggggatcgtaagaatatgattctgggccatgaagcggttggtgaggtcgtagaggtggggtctgaagtgaaagatttcaaacccggcgatcgcgtcatcgttccatgcactacgccggactggcgaagccttgaagtgcaggcgggattccaacagcactcaaacggcatgctcgcggggtggaagttttccaactttaaggacggggtgttcggggaatacttccacgtcaacgatgcggatatgaatttagccattttgcctaaggacatgcccctcgaaaatgctgttatgattaccgatatgatgacaacgggtttccacggcgctgagctcgctgatatccaaatgggcagcagtgtggttgtcatcgggattggtgcagtcggcctgatgggcattgcgggagccaaattgcggggagctggccgcatcattggtgttggtagccggcctatttgtgtcgaagctgcaaagttttatggggccacagacattttgaactacaagaatggtcatattgtggaccaggtgatgaagctcacgaatggcaagggagtcgatcgcgttatcatggctggcggtggctctgaaaccctgagccaagcagtctcgatggtcaaaccgggaggcattatctcgaacatcaactatcatggcagtggcgatgcgctgctgatcccccgagtggagtggggctgcggcatggcccataagaccattaaaggcggcctctgcccgggtggccgtttgcgcgcagagatgctacgcgatatggtggtctacaaccgggtggatctgtccaaactggtcactcacgtttaccatggttttgatcacatcgaagaggccttgttgttgatgaaagacaaaccgaaagacctcattaaagccgtcgtaatcctgtag
配列番号：２１：クロストリジウム  ベイエリンキイ（Clostridium beijerinckii） NRRLB593  アルコール脱水素酵素−ａｄｈアミノ酸配列
MKGFAMLGINKLGWIEKERPVAGSYDAIVRPLAVSPCTSDIHTVFEGALGDRKNMILGHEAVGEVVEVGSEVKDFKPGDRVIVPCTTPDWRSLEVQAGFQQHSNGMLAGWKFSNFKDGVFGEYFHVNDADMNLAILPKDMPLENAVMITDMMTTGFHGAELADIQMGSSVVVIGIGAVGLMGIAGAKLRGAGRIIGVGSRPICVEAAKFYGATDILNYKNGHIVDQVMKLTNGKGVDRVIMAGGGSETLSQAVSMVKPGGIISNINYHGSGDALLIPRVEWGCGMAHKTIKGGLCPGGRLRAEMLRDMVVYNRVDLSKLVTHVYHGFDHIEEALLLMKDKPKDLIKAVVIL
配列番号：２２：サーモアナエロバクター  ブロッキイ（Thermoanaerobacter brockii） HTD4  アルコール脱水素酵素−ａｄｈ遺伝子ヌクレオチド配列
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配列番号：２３：サーモアナエロバクター  ブロッキイ（Thermoanaerobacter brockii） HTD4  アルコール脱水素酵素−ａｄｈアミノ酸配列
MKGFAMLSIGKVGWIEKEKPAPGPFDAIVRPLAVAPCTSDIHTVFEGAIGERHNMILGHEAVGEVVEVGSEVKDFKPGDRVVVPAITPDWRTSEVQRGYHQHSGGMLAGWKFSNVKDGVFGEFFHVNDADMNLAHLPKEIPLEAAVMIPDMMTTGFHGAELADIELGATVAVLGIGPVGLMAVAGAKLRGAGRIIAVGSRPVCVDAAKYYGATDIVNYKDGPIESQIMNLTEGKGVDAAIIAGGNADIMATAVKIVKPGGTIANVNYFGEGEVLPVPRLEWGCGMAHKTIKGGLCPGGRLRMERLIDLVFYKRVDPSKLVTHVFRGFDNIEKAFMLMKDKPKDLIKPVVILA
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】図１は、他の工業的に重要な化学物質と同様に、アセトインおよび２，３−ブタンジオールの生物学的な合成において、ＣＯ２がどのようにして使用され得るかを説明している。ＡＬＳ：アセト乳酸合成酵素、ＡＬＤＣ：アセト乳酸脱炭酸酵素、ｓＡＤＨ：第２級アルコール脱水素酵素。
【図２】図２は、種々の濃度のアセトインおよび２，３−ブタンジオールが、どのようにしてシネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）の増殖速度に影響を与えるかを説明している。
【図３】図３Ａは、シネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）の染色体にａｌｓＳ遺伝子およびａｌｓＤ遺伝子を組み込むための組換えの略図を提示している。図３Ｂは、改変された大腸菌（E. coli）細胞の１６時間（暗）にわたる増殖および４０時間（明）にわたる増殖におけるアセトインの生産量を示している。図３Ｃは、改変されたシネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）細胞の７２時間にわたる増殖におけるアセトインの生産量を示している。ａｌｓＳは、（＋）ａｌｓＳ（Ｂ．ｓ．）の含有または（−）ａｌｓＳ（Ｂ．ｓ．）の欠如を示している。ａｌｓＤは、ａｌｓＤ遺伝子のための供給元生物を示している（表１）。図３Ｄは、ＰＬｌａｃＯ１の制御下にａｌｓＳ（Ｂ．ｓ．）およびａｌｓＤ（Ｅ．ａ．）を含んでいるシネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）における、アセトインの生産におけるＩＰＴＧ（１ｍＭ）の効果を示している。エラーバーは、ｓ．ｄ．（ｎ＝３）を示している。
【図４】図４Ａは、シネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）の染色体にａｌｓＳ遺伝子、ａｌｓＤ遺伝子、およびａｄｈ遺伝子を組み込むための組換えの略図を提示している。図４Ｂは、改変された大腸菌（E. coli）細胞の４０時間にわたる増殖におけるアセトインの生産量を示している。淡色のバーはアセトインを示している。これに対して、濃色のバーはブタンジオール（中央のバー：メソ−２３ＢＤ、右側のバー：（Ｒ，Ｒ）−２３ＢＤ）を示している。ａｌｓＳは、（＋）ａｌｓＳ（Ｂ．ｓ．）遺伝子の含有を示している。ａｌｓＤおよびａｄｈの列は、これらの遺伝子のための供給元生物を示している（表１）。活性は、大腸菌（E. coli）において発現されて、且つ細胞抽出物において測定されたｓＡＤＨの活性である（ｎｍｏｌ ＮＡＤＰＨ 分−１ｍｇ−１）。図４Ｃは、改変されたシネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）細胞の７２時間にわたる増殖における２３ＢＤの生産量を示している。図４Ｄは、改変されたシネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）株に由来する細胞抽出物におけるＡＬＳおよびＡＤＨの比活性度を示している。エラーバーは、標準偏差を示している。
【図５】図５Ａ〜Ｃは、連続培養における、組換えシネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）による長期間の２，３−ブタンジオールの生産の概要を提示している。四角印：ａｌｓＳ（Ｂ．ｓ．）、ａｌｓＤ（Ａ．ｈ．）およびａｄｈ（Ｃ．ｂ．）を含有しているシネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）。丸印：ａｌｓＳ（Ｂ．ｓ．）、ａｌｓＤ（Ａ．ｈ．）およびａｄｈ（Ｔ．ｂ．）を含有しているシネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）。三角印：ａｌｓＳ（Ｂ．ｓ．）およびａｌｓＤ（Ｅ．ａ．）を含有しているシネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）。菱形印：ａｌｓＳ、ａｌｓＤまたはａｄｈを有していないシネココッカス  エロンゲータス（S. elongatus）。図５Ａは、増殖に関する経時変化を示している。図５Ｂは、全２３ＢＤ生産量を示している。図５Ｃは、光合成効率を示している。図５Ｄは、一日当たりの全バイオマス生産量を示している。エラーバーは、標準偏差（ｎ＝３）を示している。
【図６】図６Ａは、ＡＬ７５７（組み込まれたａｌｓＳ、ａｌｓＤ（Ａ．ｈ．）、およびａｄｈ（Ｃ．ｂ．）を有している。）による日単位の２，３−ブタンジオールの生産量を示している。図６Ｂは、長期間の２３ＢＤの生産実験の間のアセトインの濃度を示している。四角印：ＡＬ７５７（組み込まれたａｌｓＳ（Ｂ．ｓ．）、ａｌｓＤ（Ａ．ｈ．）およびａｄｈ（Ｃ．ｂ．）を有している。）。丸印：ＡＬ７５６（組み込まれたａｌｓＳ（Ｂ．ｓ．）、ａｌｓＤ（Ａ．ｈ．）およびａｄｈ（Ｔ．ｂ．）を有している。）。図６Ｃは、ＡＬ７６３（組み込まれたａｌｓＳおよびａｌｓＤ（Ｅ．ａ．）を有している。）による長期間のアセトインの生産を示している。
【図７】図７は、シアノバクテリアにおける外因性の経路から生産された種々の化学物質に関する生産性の比較を示している。元のデータは、以下から取得した：２３ＢＤ（本開示）、イソブチルアルデヒドおよびイソブタノール（Atsumi et al., Nat Biotechnol, 27:1177-1180, 2009）、脂肪酸（Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA, 108:6899-6904, 2011）、エタノール（Dexter and Pengcheng, Energy Environ Sci, 2:857-864, 2009）、アセトン（Zhou et al., Metab Eng, 14:394-400, 2012）、エチレン（Takahama et al., J Biosci Bioeng, 95:302-305, 2003）、ブタノール（Lan and Liao, Proc Natl Acad Sci USA, 109:6018-6023, 2012)、脂肪族アルコール（Tan et al., Metab Eng, 13:169-176, 2011)。詳細な計算は、実施例１に記載する。
【図１】
2015530116.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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