(57)【要約】  グルコースのような炭素源からエタノールのような化学物質を生成するための酵素的プロセス、特に、供給源炭水化物を中間体であるピルベートに変換し、その後、中間体であるピルベートを標的化学物質に変換する無細胞酵素系を使用して標的化学物質を生成するためのプロセスであって、最小化された数の酵素および１種だけの補因子が使用されるプロセスが提供される。
2015530084.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコースおよび／またはガラクトースを、中間生成物としてピルベートに変換することを含む、無細胞酵素系により、グルコース、ガラクトースまたはグルコースとガラクトースの混合物またはグルコースを含有するオリゴマーもしくはポリマーおよび／またはガラクトースを含有するオリゴマーもしくはポリマーから標的有機化合物を生成するためのプロセスであって、以下のステップ：
（１）グルコースおよび／またはガラクトースをグルコネートおよび／またはガラクトネートに酸化するステップと、
（２）グルコネートおよび／またはガラクトネートをピルベートおよびグリセルアルデヒドに変換するステップと、
（３）グリセルアルデヒドをグリセレートに酸化するステップと
（４）グリセレートをピルベートに変換するステップと、
（５）ステップ（２）および（４）からのピルベートを標的化合物に変換するステップと、
を含み、
ステップ（１）および（３）は１種または複数種の酵素を用いて酵素触媒され、前記ステップは、電子伝達のために添加されたおよび／または存在する単一の補因子を還元するための前記酵素（複数可）の使用を伴い、ステップ（５）が、ステップ（１）および（３）の補因子の還元型が関与する酵素触媒反応を含み、そして、少なくとも４０℃の温度で少なくとも３０分の期間にわたって実施される、プロセス。
【請求項２】
プロセス温度が４０℃〜８０℃の範囲内、好ましくは４５℃〜７０℃の範囲内、より好ましくは５０℃〜６０℃の範囲内、最も好ましくは５０℃もしくは５０℃超に維持される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
少なくとも１時間、好ましくは少なくとも３時間、より好ましくは少なくとも１２時間、なおより好ましくは少なくとも２４時間、最も好ましくは少なくとも４８時間、最も高度に好ましくは少なくとも７２時間、所与の温度に維持される、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項４】
ステップ（１）が、グルコースおよび／またはガラクトースをグルコネートおよび／またはガラクトネートに酸化するために単一のデヒドロゲナーゼを使用することを含む、請求項１〜３のいずれか一つに記載のプロセス。
【請求項５】
ステップ（２）が、グルコネートの２−ケト−３−デオキシグルコネートへの変換、および２−ケト−３−デオキシグルコネートのグリセルアルデヒドおよびピルベートへの変換、ならびに／または、ガラクトネートの２−ケト−３−デオキシガラクトネートへの変換、および２−ケト−３−デオキシガラクトネートのグリセルアルデヒドおよびピルベートへの変換を含む、請求項１〜４のいずれか一つに記載のプロセス。
【請求項６】
ステップ（２）が、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ｄｅｈｙｄｒｏｘｙ  ａｃｉｄ  ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）およびケト−３−デオキシグルコネートアルドラーゼを使用することを含む、請求項１〜５のいずれか一つに記載のプロセス。
【請求項７】
ステップ（３）が、グリセルアルデヒドのグリセレートへの酸化のためにデヒドロゲナーゼを使用することを含む、請求項１〜６のいずれか一つに記載のプロセス。
【請求項８】
ステップ（１）および（３）が、単一のデヒドロゲナーゼを使用して行われる、請求項１〜７のいずれか一つに記載のプロセス。
【請求項９】
ＡＴＰの最終的な生成が起こらない、請求項１〜８のいずれか一つに記載のプロセス。
【請求項１０】
ＡＴＰアーゼまたはアルセネートが添加されない、請求項１〜９のいずれか一つに記載のプロセス。
【請求項１１】
補因子としてのＡＴＰおよび／またはＡＤＰなしで行われる、請求項１〜１０のいずれか一つに記載のプロセス。
【請求項１２】
単一の補因子が、ＮＡＤ／ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨおよびＦＡＤ／ＦＡＤＨ２からなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか一つに記載のプロセス。
【請求項１３】
単一の補因子がＮＡＤ／ＮＡＤＨである、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１４】
各酵素触媒反応ステップの酵素活性が、先のいずれの酵素触媒反応ステップの活性とも同一またはそれより大きくなるように調整されている、請求項１〜１３のいずれか一つに記載のプロセス。
【請求項１５】
グリセルアルデヒドを基質として使用した場合の特異的な酵素活性が、アセトアルデヒドまたはイソブチルアルデヒドのいずれかを基質として使用した場合よりも少なくとも１００倍高い、より好ましくは少なくとも５００倍高い、なおより好ましくは少なくとも８００倍高い、最も好ましくは少なくとも１０００倍高い、請求項１〜１４のいずれか一つに記載のプロセス。
【請求項１６】
−グルコースおよび／またはガラクトースをピルベートに変換するために、デヒドロゲナーゼ、デヒドラターゼおよびアルドラーゼの群から選択される酵素のみが使用され、そして
−１種または複数種の前記酵素が各群から選択される、
請求項１〜１５のいずれか一つに記載のプロセス。
【請求項１７】
グルコースおよび／またはガラクトースのピルベートへの変換が、１種または２種のデヒドロゲナーゼ、１種または２種のデヒドラターゼおよび１種のアルドラーゼを使用することからなる、請求項１〜１６のいずれか一つに記載のプロセス。
【請求項１８】
グルコースおよび／またはガラクトースのピルベートへの変換が、２種のデヒドロゲナーゼ、１種のデヒドラターゼおよび１種のアルドラーゼを使用することからなる、請求項１〜１７のいずれか一つに記載のプロセス。
【請求項１９】
グルコースおよび／またはガラクトースをピルベートに変換するために、表Ｐ−１、表Ｐ−２−ａ、表Ｐ−２−ｂ、表Ｐ−２−ｃ、表Ｐ−２−ｄ、表Ｐ−３−ａ、表Ｐ−３−ｂおよび表Ｐ−３−ｃのいずれか１つに含まれる酵素の組合せの１つが使用される、請求項１〜１８のいずれか一つに記載のプロセス。
【請求項２０】
グルコースおよび／またはガラクトースをピルベートに変換するために使用される酵素が、グルコースデヒドロゲナーゼＧＤＨ（ＥＣ１．１．１．４７）、スルフォロブス・ソルファタリクス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）、ＮＰ３４４３１６．１、配列番号０２；およびジヒドロキシ酸デヒドラターゼＤＨＡＤ（ＥＣ４．２．１．９）、スルフォロブス・ソルファタリクス、ＮＰ３４４４１９．１、配列番号０４；グルコネートデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．３９）、スルフォロブス・ソルファタリクス、ＮＰ＿３４４５０５；グルコネートデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．３９）、スルフォロブス・ソルファタリクス、ＮＰ＿３４４５０５、突然変異Ｉ９Ｌ；グルコネートデヒドラターゼｉｌｖＥＤＤ（ＥＣ４．２．１．３９）、アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｓｏｘｉｄａｎｓ）；グルコネートデヒドラターゼｉｌｖＥＤＤ（ＥＣ４．２．１．３９）、メタロスパエラ・セドゥラ（Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｅｄｕｌａ）  ＤＳＭ５３４８；グルコネートデヒドラターゼｉｌｖＥＤＤ（ＥＣ４．２．１．３９）、テルモプラズマ・アキドピルム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）  ＤＳＭ１７２８；グルコネートデヒドラターゼｉｌｖＥＤＤ（ＥＣ４．２．１．３９）、テルモプラズマ・アキドピルム  ＤＳＭ１７２８；２−ケト−３−デオキシグルコネートアルドラーゼＫＤＧＡ（ＥＣ４．１．２．１４）、スルフォロブス・ソルファタリクス、ＮＰ３４４５０４．１；２−ケト−３−デオキシグルコネートアルドラーゼＫＤＧＡ（ＥＣ４．１．２．１４）、スルフォロブス・アキドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｃｕｓ）、配列番号０６；アルデヒドデヒドロゲナーゼＡＬＤＨ（ＥＣ１．２．１．３）、フラボバクテリウム・フリジディマリス（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｉｇｉｄｉｍａｒｉｓ）、ＢＡＢ９６５７７．１；アルデヒドデヒドロゲナーゼＡＬＤＨ（ＥＣ１．２．１．３）、テルモプラズマ・アキドピルム、配列番号０８；アルデヒドデヒドロゲナーゼＡＬＤＨ（ＥＣ１．２．１．３）、テルモプラズマ・アキドピルム、突然変異Ｆ３４Ｍ＋Ｙ３９９Ｃ＋Ｓ４０５Ｎ、配列番号１０；グリセレートキナーゼ（ＥＣ２．７．１．）、スルフォロブス・ソルファタリクス、ＮＰ＿３４２１８０．１；グリセレート２−キナーゼ（ＥＣ２．７．１．１６５）、スルフォロブス・トコダイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ）、ＵｎｉｐｒｏｔＱ９６ＹＺ３．１；エノラーゼ（ＥＣ４．２．１．１１）、スルフォロブス・ソルファタリクス、ＮＰ３４２４０５．１；ピルベートキナーゼ（ＥＣ２．７．１．４０）、スルフォロブス・ソルファタリクス、ＮＰ３４２４６５．１；グリセレートデヒドロゲナーゼ／ヒドロキシピルベートレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．２９／１．１．１．８１）、ピクロフィルス・トリダス（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ  ｔｏｒｒｉｄｕｓ）、ＹＰ＿０２３８９４．１；セリン−ピルベートトランスアミナーゼ（ＥＣ２．６．１．５１）、スルフォロブス・ソルファタリクス、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎ  ＩＤ：ＮＰ＿３４３９２９．１；Ｌ���セリンアンモニアリアーゼ（ＥＣ４．３．１．１７）、ＥＣ４．３．１．１７、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ＹＰ＿１４４２９５．１およびＹＰ＿１４４００５．１；アラニンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．１）、サーマス・サーモフィルス、ＮＣＢＩ−Ｇｅｎ  ＩＤ：ＹＰ＿００５７３９．１からなる群から選択される、請求項１〜１９のいずれか一つに記載のプロセス。
【請求項２１】
グルコースからピルベートへの変換が、１モルのグルコースから２モルのピルベートへの変換からなる、請求項１〜２０のいずれか一つに記載のプロセス。
【請求項２２】
ピルベートを標的化学物質にさらに変換し、そのような変換の間にピルベート１分子当たり１分子のＮＡＤＨが１分子のＮＡＤに変換され、そのような標的化学物質が好ましくはエタノール、イソブタノール、ｎ−ブタノールおよび２−ブタノールから選択される、請求項１〜２１のいずれか一つに記載のプロセス。
【請求項２３】
ピルベートをそれぞれの標的化学物質に変換するために表Ｅ−１、表Ｉ−１、表Ｎ−１、表Ｔ−１、表Ｔ−２および表Ｔ−２ａのいずれか１つに含まれる酵素の組合せの１つが使用される、請求項１〜２２のいずれか一つに記載のプロセス。
【請求項２４】
標的化学物質がエタノールであり、ピルベートをエタノールに変換するために使用される酵素が、ピルベートデカルボキシラーゼＰＤＣ（ＥＣ４．１．１．１）、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、配列番号２０およびアルコールデヒドロゲナーゼＡＤＨ（ＥＣ１．１．１．１）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、配列番号１８からなる群から選択される、請求項１〜２３のいずれか一つに記載のプロセス。
【請求項２５】
標的化学物質がイソブタノールであり、ピルベートをイソブタノールに変換するために使用される酵素が、アセトラクテートシンターゼＡＬＳ（ＥＣ２．２．１．６）、バチラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、配列番号１２；アセトラクテートシンターゼＡＬＳ（ＥＣ２．２．１．６）、スルフォロブス・ソルファタリクス、ＮＣＢＩ−ＧｅｎＩＤ：ＮＰ＿３４２１０２．１；アセトラクテートシンテターゼＡＬＳ（ＥＣ：２．２．１．６）、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）、ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：ＮＰ＿２２８３５８．１；ケトール酸レダクトイソメラーゼＫＡＲＩ（ＥＣ１．１．１．８６）、メイオサーマス・ルバー（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ）、配列番号１４；ケトール酸レダクトイソメラーゼＫＡＲＩ（ＥＣ１．１．１．８６）、スルフォロブス・ソルファタリクス、ＮＣＢＩ−ＧｅｎＩＤ：ＮＰ＿３４２１００．１；ケトール酸レダクトイソメラーゼＫＡＲＩ（ＥＣ．１．１．１．８６）、サーモトガ・マリティマ、ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：ＮＰ＿２２８３６０．１；分岐鎖−２−オキソ酸デカルボキシラーゼＫＤＣ（ＥＣ４．１．１．７２）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、配列番号１６；α−ケトイソバレレートデカルボキシラーゼＫＤＣ、（ＥＣ４．１．１．−）、ラクトコッカス・ラクチス、ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：ＣＡＧ３４２２６．１；ジヒドロキシ酸デヒドラターゼＤＨＡＤ（ＥＣ４．２．１．９）、スルフォロブス・ソルファタリクス、ＮＰ３４４４１９．１、配列番号０４；ジヒドロキシ酸デヒドラターゼＤＨＡＤ、（ＥＣ：４．２．１．９）、サーモトガ・マリティマ、ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：ＮＰ＿２２８３６１．１；アルコールデヒドロゲナーゼＡＤＨ（ＥＣ１．１．１．１）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス、配列番号１８；アルコールデヒドロゲナーゼＡＤＨ（ＥＣ１．１．１．１）、フラボバクテリウム・フリジディマリス、ＮＣＢＩ−ＧｅｎＩＤ：ＢＡＢ９１４１１．１；およびアルコールデヒドロゲナーゼＡＤＨ（ＥＣ：１．１．１．１）、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からなる群から選択される、請求項１〜２４のいずれか一つ記載のプロセス。
【請求項２６】
生成物が、好ましくは抽出、パーストラクション、蒸留、吸着、ガスストリッピング、パーベーパレーション、膜抽出または逆浸透法により、反応から連続的にまたはバッチ方式で取り出される、請求項１〜２５のいずれか一つに記載のプロセス。
【請求項２７】
それぞれの標的化学物質のために使用される酵素の溶媒耐性が、好ましくは１％（ｗ／ｗ）よりも高い、より好ましくは４％（ｗ／ｗ）よりも高い、なおより好ましくは６％（ｗ／ｗ）よりも高い、最も好ましくは１０％（ｗ／ｗ）よりも高い、請求項１〜２６のいずれか一つに記載のプロセス。
【請求項２８】
ステップ（１）および／または（３）に関与する１種または複数種の酵素が、単一の補因子に対して、前記補因子へのより高い比活性を持たせることによって最適化されている、請求項１〜２７のいずれか一つに記載のプロセス。
【請求項２９】
最適化された酵素が、配列番号８または配列番号２のいずれかと比較して少なくとも５０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、なおより好ましくは９０％、なおより好ましくは９５％、最も好ましくは９７％、最も高度に好ましくは９９％の配列同一性を有し、配列番号８または配列番号２のそれぞれと比較して前記補因子への改善された比活性を有する、請求項２８に記載のプロセス。
【請求項３０】
酵素の前記補因子に対する比活性が、全反応体積０．２ｍｌ中、グリセルアルデヒド／グリセレートを基質として１ｍＭで、および前記補因子を２ｍＭで用いて、５０℃、ｐＨ７．０において０．４Ｕ／ｍｇ以上である、請求項２８または２９に記載のプロセス。
【請求項３１】
比活性が０．６Ｕ／ｍｇ以上、好ましくは０．８Ｕ／ｍｇ以上、より好ましくは１．０Ｕ／ｍｇ以上、最も好ましくは１．２Ｕ／ｍｇ以上、最も高度に好ましくは１．５Ｕ／ｍｇ以上である、請求項３０に記載のプロセス。
【請求項３２】
比活性を３％イソブタノールの存在下で測定する、請求項３１に記載のプロセス。
【請求項３３】
ステップ（１）および／または（３）に関与する酵素がアルデヒドデヒドロゲナーゼである、請求項１〜３２のいずれか一つに記載のプロセス。
【請求項３４】
アルデヒドデヒドロゲナーゼが構造クラスＥＣ１．１．１．４７に属するものである、請求項３３に記載のプロセス。
【請求項３５】
アルデヒドデヒドロゲナーゼが、配列番号１０、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９からなる群から選択される、請求項１〜３４のいずれか一つに記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炭素源から化学物質を生成するための酵素的プロセスに関する。具体的には、供給源炭水化物を中間体であるピルベートに変換し、その後、中間体であるピルベートを標的化学物質に変換する無細胞酵素系を使用して標的化学物質を生成するためのプロセスが開示されている。
【背景技術】
【０００２】
持続可能なバイオマスに基づく生成戦略の開発には、中間体炭水化物への効率的な解重合ならびにそのような中間体炭水化物を化学製品に変換するための柔軟かつ効率的な技術が必要である。現在、バイオマスを化学物質に変換するためのバイオテクノロジーによる手法は、よく確立された微生物発酵プロセスに焦点を当てたものである。
【０００３】
しかし、これらの発酵による手法は、細胞による生成系の生理的な限界に制限されたままである。対費用効果が大きい発酵プロセスに関する重要な障壁は、それらの温度耐性および溶媒耐性が低く、それにより変換効率および収率が低くなることである。さらに、多数の細胞による代謝経路では、多くの場合、意図されたものではない、非生産的経路への基質の方向転換が生じる。遺伝子工学の進歩にもかかわらず、最適な生成物を生物体レベルで形成するためのこれらの代謝的ネットワークの合理化には時間がかかり、また、非常に複雑であるのでかなり予測不可能なままである
【０００４】
顕著な例は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるイソブタノールの組換え発酵生成である。１〜２％（ｖ／ｖ）イソブタノールの力価により早くも生成宿主である微生物において毒作用が誘導され、これにより、生成物の収率が低くなる（Ｎａｔｕｒｅ  ２００８年、４５１巻、８６〜８９頁（非特許文献１））。さらに、脱重合したバイオマスは、多くの場合、微生物の成長および生成物の収率を限定する阻害性または非発酵性の構成成分を含有する。したがって、細胞に基づく生成のそのような限定を克服するための戦略が望まれる。
【０００５】
化学物質の無細胞生成は、早くも１８９７年に示されており、Ｅｄｕａｒｄ  Ｂｕｃｈｎｅｒにより、グルコースをエタノールに変換するために酵母細胞のライセートが使用された（Ｂｅｒ．  Ｄｔｓｃｈ．  Ｃｈｅｍ．  Ｇｅｓ．  １９０１年、３４巻、１５２３〜１５３０頁（非特許文献２））。その後１９８５年にＷｅｌｃｈおよびＳｃｏｐｅｓによってエタノールの無細胞生成が実証されたが、そのプロセスは技術的に有用ではなかった（Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９８５年、２巻、２５７〜２７３頁（非特許文献３））。その系は特異性を欠き、また、ライセート中に酵素の副反応および望ましくない活性が含まれた。
【０００６】
化学物質を生成するための、単離された酵素を使用する技術的なプロセスがいくつも記載されている。例えば、アルコールデヒドロゲナーゼは、例えば、グルコースおよびグルコースデヒドロゲナーゼを添加することによる補因子（ＮＡＤ）の再生を必要とするケトンからのキラルアルコールの生成において使用されている。そのようなプロセスは、化学物質が高い値で生成されるように設計されてきたが、高いエネルギー効率および炭素効率で炭水化物を化学物質に変換する多数の酵素反応を含む酵素系はもたらされていない。
【０００７】
Ｚｈａｎｇら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；２００８年（非特許文献４））により、グルコースからｎ−ブタノールへの無細胞酵素的変換に関する観念が記載された。この概念は、最低１８種の酵素、いくつかの異なる補因子および補酵素（例えば、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤ、フェレドキシンおよび補酵素Ａ）を含む。さらに、仮定されたプロセスでは、ＡＴＰの最終的な生成がもたらされ、したがって、ＡＴＰを除去するためにＡＴＰアーゼ酵素がさらに必要である。実際問題として、バランスのとれたＡＴＰレベルを維持しながらＡＴＰアーゼ添加を制御することは実現するのが非常に難しい。バランスのとれたＡＴＰサイクリングを管理するために、過剰なＡＴＰの加水分解を非常に慎重に調整しなければならない、または毒性が強いアルセネートを使用することによって排除しなければならない。要約すると、記載されているプロセスは費用がかかり、非効率的であり、技術的に不安定であると思われる。
【０００８】
ＥＰ２２０４４５３（特許文献１）には、グルコースをエタノール、ｎ−ブタノールおよび／またはイソブタノールに変換するためのプロセスが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＥＰ２２０４４５３
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ  ２００８年、４５１巻、８６〜８９頁
【非特許文献２】Ｅｄｕａｒｄ  Ｂｕｃｈｎｅｒ、Ｂｅｒ．  Ｄｔｓｃｈ．  Ｃｈｅｍ．  Ｇｅｓ．  １９０１年、３４巻、１５２３〜１５３０頁
【非特許文献３】ＷｅｌｃｈおよびＳｃｏｐｅｓ、Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９８５年、２巻、２５７〜２７３頁
【非特許文献４】Ｚｈａｎｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；２００８年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、炭水化物から化学物質を生成するため、特にピルベートから誘導することができる化学物質、例えば、エタノール、イソブタノールおよび他のＣ４アルコールなどを生成するための、対費用効果が大きいプロセスが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の全般的な目的は、添加する構成成分の数を最小化することによって安定かつ技術的に実行可能な無細胞プロセスを提供することである。本発明は、限られた数の酵素および限られた補因子のセットのみを使用する無細胞酵素系によってこの必要性に対処する。解決法として、本発明では、細胞の必要性が排除される。したがって、細胞に関連するプロセスの限定、例えば、プロセス温度が高いこと、極度のｐＨ、および基質または生成物の毒性などが回避される。酵素活性を反応カスケードに必要なものに限定すること、および十分な反応選択性を有する酵素を選択することにより、基質の代替の反応経路への望ましくない方向転換が排除される。これらは分子の複雑さが軽減し、また、過酷な工業的反応条件に迅速に順応するので、設計された生体触媒的プロセスはそれらの細胞を用いる対応物よりも優れている。
【００１３】
したがって、本発明は、炭水化物であることが好ましい炭素源を酵素的プロセスによって、好ましくは産生性生細胞の不在下で標的化学物質に生物変換するためのプロセスを対象とする。標的化学物質は、疎水性化学化合物、親水性化学化合物または中間化学化合物であることが好ましい。
【００１４】
具体的には、好ましい態様によると、本発明のプロセスではＡＴＰ／ＡＤＰの最終的な生成が生じず、ＡＴＰアーゼおよび／またはアルセネートを伴わない。本発明のプロセスは、補因子ＡＴＰ／ＡＤＰおよび／またはいかなるリン酸化反応も伴わないことが好ましい。
【００１５】
さらに好ましい態様によると、本発明のプロセスでは、プロセス中にレドックス補因子を１種のみ使用する。そのような補因子は、ＮＡＤ／ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨ、ＦＡＤ／ＦＡＤＨ２から選択されることが好ましい。ＮＡＤ／ＮＡＤＨ（すなわち、レドックス対ＮＡＤ＋およびＮＡＤＨ＋Ｈ＋）がプロセスにおける唯一の補因子であることが好ましい。
【００１６】
さらに好ましい実施形態によると、本発明のプロセスは、各酵素触媒反応ステップの酵素活性を、先の酵素触媒反応ステップのいずれの活性とも同一またはそれよりも大きくなるように調整することを含む。
【００１７】
さらに好ましい態様によると、本発明のプロセスでは、単一の補因子を１種のみ必要とすることが好ましい人為的に最小化した反応カスケードを使用する。本発明の結果として、炭水化物から標的化学物質の無細胞生成、特にピルベートへの無細胞生成が実現された。ピルベートをさらに他の化学物質、例えば、エタノールおよびイソブタノールなどに変換することができる。本発明は、微生物による生成が停止した条件下で機能する合理化されたカスケードも包含する。本発明は、工業的に関連する分子のアレイに拡張可能である。溶媒耐性の生体触媒を適用することにより、生成物の高収率が可能になり、下流の生成物の回収が著しく単純化される。
【００１８】
別の好ましい態様によると、本発明では、生成された化学物質が存在することによる不活化に対して抵抗性の酵素のみを使用する。
【００１９】
一態様によると、本発明は、エタノールを生成するためのプロセスに関し、プロセスにおいて使用される酵素は全て、２％（ｗ／ｗ）の濃度の生成物、好ましくは４％（ｗ／ｗ）、より好ましくは６％（ｗ／ｗ）、より好ましくは８％（ｗ／ｗ）、より好ましくは１０％（ｗ／ｗ）、より好ましくは１２％（ｗ／ｗ）、なおより好ましくは１４％（ｗ／ｗ）の濃度の生成物に対して抵抗性である。
【００２０】
別の態様によると、本発明は、イソブタノールを生成するためのプロセスに関し、プロセスにおいて使用される酵素は全て、２％（ｗ／ｗ）の濃度の生成物、好ましくは４％（ｗ／ｗ）、より好ましくは６％（ｗ／ｗ）、より好ましくは８％（ｗ／ｗ）、より好ましくは１０％（ｗ／ｗ）、より好ましくは１２％（ｗ／ｗ）、なおより好ましくは１４％（ｗ／ｗ）の濃度の生成物に対して抵抗性である。
【００２１】
一態様によると、本発明は、無細胞酵素系により、グルコースおよび／もしくはガラクトース、またはグルコースを含有する二量体、オリゴマーもしくはポリマーおよび／またはガラクトースを含有する二量体、オリゴマーもしくはポリマーから標的化学物質を生成するためのプロセスであって、グルコースを、中間生成物としてピルベートに変換することを含み、ＡＴＰの最終的な生成が起こらず、好ましくはリン酸化反応が起こらず、グルコースからピルベートへの変換が、デヒドロゲナーゼ、デヒドラターゼ、およびアルドラーゼの群から選択される３種、４種または５種の酵素を使用することからなり、各群から１種または複数種の酵素が選択されるプロセスに関する。グルコースからピルベートへの変換は３種または４種の酵素によって実現されることが好ましく、最も好ましくは４種の酵素によって実現される。グルコースからピルベートへの変換に関して、このプロセスは、レドックス補因子を１種のみ使用することを含み、好ましくは、そのような補因子を必要とする酵素の１種または複数種が、それぞれの最適化されていない酵素または野生型酵素と比較して、この補因子に対する活性がより大きくなるように最適化されていることがより好ましい。そのようなレドックス補因子はＮＡＤ／ＮＡＤＨであり、１種または複数種の酵素は、それぞれの最適化されていない酵素または野生型酵素と比較して、ＮＡＤ／ＮＡＤＨに対する活性がより大きくなるように最適化されていることがより好ましい。
【００２２】
ピルベートは、中心的な中間体であり、それから少数の追加的な酵素的ステップでエタノールまたはイソブタノールのような分子を生成することができる。新規の無細胞工学的作製手法により、ピルベート、またはピルベートから誘導される標的化学物質を生成することが可能になる。ピルベートから誘導することができる特定の標的化学物質は、細胞に基づく微生物による等価物のいずれでも禁止的な反応条件下で、エタノール、ｎ−ブタノール、２−ブタノールおよびイソブタノールである。反応カスケードはツールボックス−システムとして設計されるので、他の生成物も標的化合物としての役割を果たす。
【００２３】
一般に、好熱菌由来の熱安定性酵素は高プロセス温度および高溶媒濃度に対して耐性である傾向があるので、これが好ましい。したがって、熱安定性の増強により、反応速度の上昇、基質拡散、低粘度、より良好な相分離および反応培地の細菌コンタミネーションの減少が可能になる。基質選択性に対する要求は異なる反応の段階で変動するので、それに応じて酵素の忠実度を選択する必要がある。例えば、グルコースから重要な中間体であるピルベートへの変換では、ＤＨＡＤ（ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ）の非特異性（ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ）により、グルコネートおよびグリセレートを並行して変換することが可能になる（図２）。ＤＨＡＤとは対照的に、グリセルアルデヒドに対して特異的であり、下流の反応中間体であるアセトアルデヒドまたはイソブチルアルデヒドなどの他のアルデヒドは許容しないＡＬＤＨ（アルデヒド脱水素酵素）を選択した。これらの必要条件には、優れた選択性でＤ−グリセルアルデヒドのみをＤ−グリセレートに変換することができたアルデヒドデヒドロゲナーゼが適合した。したがって、さらに好ましい態様によると、本発明のプロセスは、高温で非常に長い期間にわたって、例えば、４０℃〜８０℃の温度範囲で少なくとも３０分にわたって、好ましくは４５℃〜７０℃、およびより好ましくは５０℃〜６０℃、最も好ましくは５０℃以上で実施することができる。特に好ましい実施形態では、本発明のプロセスでは、アセトアルデヒドおよびイソブチルアルデヒドを基質として許容しないＡＬＤＨを使用する。
【００２４】
反応の複雑さを最小化するために、設計された経路を、唯一の電子伝達体として補酵素ＮＡＤＨを使用するようにさらに強化することができる。その後の反応がレドックス中性に維持されるのであれば、ピルベートを、いかなる電子シャトルも連続的に添加することなく工業的なプラットフォーム化学物質のアレイに変換することができる。
【００２５】
本発明の一態様によると、工学的に操作された酵素、例えば、定向進化手法によって生じる、ＮＡＤＨに対する活性がより大きなＡＬＤＨバリアントも使用することができる。特異的な補因子、例えばＮＡＤＨに関するより大きな活性を反映するそのような最適化された酵素は、グルコースからピルベートへの変換の間の最低限の酵素の使用（例えば、グルコースからピルベートへの変換のための３種または４種または５種の酵素の使用）と組合せて適用することができ、それにより、グルコースからピルベートへの変換および炭素源から標的有機化合物への変換全体のどちらについても酵素の使用の強化および効率および生産性のさらなる改善が可能になる。
【００２６】
個々の酵素を分子最適化することにより、提示された無細胞生成系を、活性、熱安定性および溶媒耐性に特に焦点を当てて反復的に改善および拡張することが可能になる。さらに、加水分解したリグノセルロースバイオマスをフィードストックとして使用する場合に存在し、また、細胞に基づく方法には有害であり得る阻害剤に対する抵抗性に関しては、酵素を工学的に操作することによって対処することができる。
【００２７】
本発明に関して、および本発明において反映されている通り、無細胞系の安定性および最小化された複雑さにより、生物に基づくプラットフォーム化学物質の広い工業的活用を妨害する、現行の細胞に基づく生成の障壁が排除される。ピルベートは、他の有用化合物を無細胞生合成するための開始点としての機能を果たし得る中心的な中間体である。本明細書で実証されている酵素的手法は、酵素の数および必要な補酵素が最小化されており、高度に効率的な、対費用効果が大きい生物学的生成系としての機能を果たす。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、無細胞酵素系により、グルコース、ガラクトースまたはグルコースとガラクトースの混合物またはグルコースを含有するオリゴマーもしくはポリマーおよび／またはガラクトースを含有するオリゴマーもしくはポリマーから標的有機化合物を生成するためのプロセスであって、グルコースおよび／またはガラクトースを、中間生成物としてピルベートに変換することを含み、以下のステップ：
（１）グルコースおよび／またはガラクトースを酸化してグルコネートおよび／またはガラクトネートにするステップと、
（２）グルコネートおよび／またはガラクトネートをピルベートおよびグリセルアルデヒドに変換するステップと、
（３）グリセルアルデヒドを酸化してグリセレートにするステップと
（４）グリセレートをピルベートに変換するステップと、
（５）ステップ（２）および（４）で得られたピルベートを標的化合物に変換するステップと、
を含み、
ステップ（１）および（３）を、１種または複数種の酵素を用いて酵素触媒し、前記ステップが、電子伝達のために添加されたおよび／または存在する単一の補因子を還元するために前記酵素（複数可）を使用することを伴い、ステップ（５）が、ステップ（１）および（３）の還元型の補因子が関与する酵素触媒反応を含むプロセスに関する。
【００２９】
このプロセスの好ましい実施形態としては、以下が挙げられる：
【００３０】
少なくとも４０℃の温度で少なくとも３０分にわたって実施される、本発明のプロセス。
【００３１】
プロセス温度が４０℃〜８０℃の範囲内、好ましくは４５℃〜７０℃の範囲内、より好ましくは５０℃〜６０℃の範囲内、最も好ましくは５０℃以上に維持される、本発明のプロセス。
【００３２】
少なくとも３０分、好ましくは少なくとも３時間、より好ましくは少なくとも１２時間にわたって、なおより好ましくは少なくとも２４時間にわたって、最も好ましくは少なくとも４８時間にわたって、最も高度に好ましくは少なくとも７２時間にわたって所与の温度に維持される、本発明のプロセス。
【００３３】
プロセスのステップ（１）が、グルコースおよび／またはガラクトースを酸化してグルコネートおよび／またはガラクトネートにするために単一のデヒドロゲナーゼを使用することを含む、本発明のプロセス。
【００３４】
ステップ（１）が、単一の酵素によって触媒される、本発明のプロセス。
【００３５】
ステップ（１）が、デヒドロゲナーゼを使用することを含む、本発明のプロセス。
【００３６】
ステップ（２）が、グルコネートを２−ケト−３−デオキシグルコネートに変換し、２−ケト−３−デオキシグルコネートをグリセルアルデヒドおよびピルベートに変換することを含む、本発明のプロセス。
【００３７】
ステップ（２）が、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ｄｅｈｙｄｒｏｘｙ  ａｃｉｄ  ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）およびケト−３−デオキシグルコネートアルドラーゼを使用することを含む、本発明のプロセス。
【００３８】
ステップ（３）が、グリセルアルデヒドを酸化してグリセレートにするためにデヒドロゲナーゼを使用することを含む、本発明のプロセス。
【００３９】
ステップ（１）および（３）が、単一のデヒドロゲナーゼを使用することを伴って実施される、本発明のプロセス。
【００４０】
ＡＴＰの最終的な生成が起こらない、本発明のプロセス。
【００４１】
ＡＴＰアーゼまたはアルセネートが添加されない、本発明のプロセス。
【００４２】
補因子としてのＡＴＰおよび／またはＡＤＰなしで起こる、本発明のプロセス。
【００４３】
単一の補因子が、ＮＡＤ／ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨ、およびＦＡＤ／ＦＡＤＨ２からなる群から選択される、本発明のプロセス。
【００４４】
単一の補因子がＮＡＤ／ＮＡＤＨである、本発明のプロセス。
【００４５】
グルコースが好ましい出発材料である、本発明のプロセス。
【００４６】
各酵素触媒反応ステップの酵素活性が、先の酵素触媒反応ステップのいずれの活性とも同等以上になるように調整されている、本発明のプロセス。
【００４７】
グリセルアルデヒドを基質として使用した場合の特異的な酵素活性が、アセトアルデヒドまたはイソブチルアルデヒドのいずれかを基質として使用した場合よりも少なくとも１００倍高い、より好ましくは少なくとも５００倍高い、なおより好ましくは少なくとも８００倍高い、最も好ましくは少なくとも１０００倍高い、本発明のプロセス。
【００４８】
−グルコースおよび／またはガラクトースをピルベートに変換するために、デヒドロゲナーゼ、デヒドラターゼ、およびアルドラーゼの群から選択される酵素のみが使用され、
−各群から前記酵素の１種または複数種が選択される、
本発明のプロセス。
【００４９】
好ましいデヒドロゲナーゼ、デヒドラターゼ、およびアルドラーゼが、ＥＣ１．１．１．４７またはＥＣ１．２．１．３に属するデヒドロゲナーゼ、ＥＣ４．２．１．９または４．２．１．３９に属するデヒドラターゼ、およびＥＣ４．１．２．１４に属するアルドラーゼである。
【００５０】
グルコースおよび／またはガラクトースからピルベートへの変換が、１種または２種のデヒドロゲナーゼ、１種または２種のデヒドラターゼ、および１種のアルドラーゼを使用することからなる、本発明のプロセス。
【００５１】
グルコースおよび／またはガラクトースからピルベートへの変換が、２種のデヒドロゲナーゼ、１種のデヒドラターゼ、および１種のアルドラーゼを使用することからなる、本発明のプロセス。
【００５２】
グルコースおよび／またはガラクトースからピルベートへの変換が、１種のデヒドロゲナーゼ、１種のデヒドラターゼ、および１種のアルドラーゼを使用することからなる、本発明のプロセス。
【００５３】
グルコースおよび／またはガラクトースをピルベートに変換するために、表Ｐ−１、表Ｐ−２−ａ、表Ｐ−２−ｂ、表Ｐ−２−ｃ、表Ｐ−２−ｄ、表Ｐ−３−ａ、表Ｐ−３−ｂ、および表Ｐ−３−ｃのいずれか１つに含まれる酵素の組合せの１つが使用される、本発明のプロセス。
【００５４】
グルコースおよび／またはガラクトースをピルベートに変換するために使用される酵素が、グルコースデヒドロゲナーゼＧＤＨ（ＥＣ１．１．１．４７）、スルフォロブス・ソルファタリクス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）由来、ＮＰ３４４３１６．１、配列番号０２；ジヒドロキシ酸デヒドラターゼＤＨＡＤ（ＥＣ４．２．１．９）、スルフォロブス・ソルファタリクス由来、ＮＰ３４４４１９．１、配列番号０４；グルコネートデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．３９）、スルフォロブス・ソルファタリクス由来、ＮＰ＿３４４５０５；グルコネートデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．３９）、スルフォロブス・ソルファタリクス由来、ＮＰ＿３４４５０５、突然変異Ｉ９Ｌ；グルコネートデヒドラターゼｉｌｖＥＤＤ（ＥＣ４．２．１．３９）、アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｓｏｘｉｄａｎｓ）由来；グルコネートデヒドラターゼｉｌｖＥＤＤ（ＥＣ４．２．１．３９）、メタロスパエラ・セドゥラ（Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｅｄｕｌａ）由来、ＤＳＭ５３４８；グルコネートデヒドラターゼｉｌｖＥＤＤ（ＥＣ４．２．１．３９）、テルモプラズマ・アキドピルム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）由来、ＤＳＭ１７２８；グルコネートデヒドラターゼｉｌｖＥＤＤ（ＥＣ４．２．１．３９）、テルモプラズマ・アキドピルム由来、ＤＳＭ１７２８；２−ケト−３−デオキシグルコネートアルドラーゼＫＤＧＡ（ＥＣ４．１．２．１４）、スルフォロブス・ソルファタリクス由来、ＮＰ３４４５０４．１；２−ケト−３−デオキシグルコネートアルドラーゼＫＤＧＡ（ＥＣ４．１．２．１４）、スルフォロブス・アキドカルダリウス由来、配列番号０６；アルデヒド脱水素酵素ＡＬＤＨ（ＥＣ１．２．１．３）、フラボバクテリウム・フリジディマリス（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｉｇｉｄｉｍａｒｉｓ）由来、ＢＡＢ９６５７７．１；アルデヒド脱水素酵素ＡＬＤＨ（ＥＣ１．２．１．３）、テルモプラズマ・アキドピルム由来、配列番号０８；アルデヒドデヒドロゲナーゼＡＬＤＨ（ＥＣ１．２．１．３）、テルモプラズマ・アキドピルム由来、突然変異Ｆ３４Ｍ＋Ｙ３９９Ｃ＋Ｓ４０５Ｎ、配列番号１０；グリセレートキナーゼ（ＥＣ２．７．１．）、スルフォロブス・ソルファタリクス由来、ＮＰ＿３４２１８０．１；グリセレート２−キナーゼ（ＥＣ２．７．１．１６５）、スルフォロブス・トコダイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ）由来、ＵｎｉｐｒｏｔＱ９６ＹＺ３．１；エノラーゼ（ＥＣ４．２．１．１１）、スルフォロブス・ソルファタリクス由来、ＮＰ３４２４０５．１；ピルベートキナーゼ（ＥＣ２．７．１．４０）、スルフォロブス・ソルファタリクス由来、ＮＰ３４２４６５．１；グリセレートデヒドロゲナーゼ／ヒドロキシピルベートレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．２９／１．１．１．８１）、ピクロフィルス・トリダス（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ  ｔｏｒｒｉｄｕｓ）由来、ＹＰ＿０２３８９４．１；セリン−ピルベートトランスアミナーゼ（ＥＣ２．６．１．５１）、スルフォロブス・ソルファタリクス由来、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎ  ＩＤ：ＮＰ＿３４３９２９．１；Ｌ−セリンアンモニアリアーゼ（ＥＣ４．３．１．１７）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来、ＹＰ＿１４４２９５．１およびＹＰ＿１４４００５．１；ならびにアラニンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．１）、サーマス・サーモフィルス由来、ＮＣＢＩ−Ｇｅｎ  ＩＤ：ＹＰ＿００５７３９．１からなる群から選択される、本発明のプロセス。
【００５５】
グルコースからピルベートへの変換が、１モルのグルコースから２モルのピルベートへの変換からなる、本発明のプロセス。
【００５６】
ピルベートを標的化学物質にさらに変換し、そのような変換の間に、ピルベート１分子当たり１分子のＮＡＤＨが１分子のＮＡＤに変換され、そのような標的化学物質が、エタノール、イソブタノール、ｎ−ブタノールおよび２−ブタノールから選択されることが好ましい、本発明のプロセス。
【００５７】
ピルベートをそれぞれの標的化学物質に変換するために表Ｅ−１、表Ｉ−１、表Ｎ−１、表Ｔ−１、表Ｔ−２、および表Ｔ−２ａのいずれか１つに含まれる酵素の組合せの１つが使用される、本発明のプロセス。
【００５８】
標的化学物質がエタノールであり、ピルベートをエタノールに変換するために使用される酵素が、ピルベートデカルボキシラーゼＰＤＣ（ＥＣ４．１．１．１）、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）由来、配列番号２０；およびアルコールデヒドロゲナーゼＡＤＨ（ＥＣ１．１．１．１）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来、配列番号１８からなる群から選択される、本発明のプロセス。
【００５９】
標的化学物質がイソブタノールであり、ピルベートをイソブタノールに変換するために使用される酵素が、アセトラクテートシンターゼＡＬＳ（ＥＣ２．２．１．６）、バチラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来、配列番号１２；アセトラクテートシンターゼＡＬＳ（ＥＣ２．２．１．６）、スルフォロブス・ソルファタリクス由来、ＮＣＢＩ−ＧｅｎＩＤ：ＮＰ＿３４２１０２．１；アセトラクテートシンテターゼＡＬＳ（ＥＣ：２．２．１．６）、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）由来、ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：ＮＰ＿２２８３５８．１；ケトール酸レダクトイソメラーゼＫＡＲＩ（ＥＣ１．１．１．８６）、メイオサーマス・ルバー（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ）由来、配列番号１４；ケトール酸レダクトイソメラーゼＫＡＲＩ（ＥＣ１．１．１．８６）、スルフォロブス・ソルファタリクス由来、ＮＣＢＩ−ＧｅｎＩＤ：ＮＰ＿３４２１００．１；ケトール酸レダクトイソメラーゼＫＡＲＩ（ＥＣ．１．１．１．８６）、サーモトガ・マリティマ由来、ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：ＮＰ＿２２８３６０．１；分岐鎖−２−オキソ酸デカルボキシラーゼＫＤＣ（ＥＣ４．１．１．７２）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）由来、配列番号１６；α−ケトイソバレレートデカルボキシラーゼＫＤＣ、（ＥＣ４．１．１．−）、ラクトコッカス・ラクチス由来、ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：ＣＡＧ３４２２６．１；ジヒドロキシ酸デヒドラターゼＤＨＡＤ（ＥＣ４．２．１．９）、スルフォロブス・ソルファタリクス由来、ＮＰ３４４４１９．１、配列番号０４；ジヒドロキシ酸デヒドラターゼＤＨＡＤ、（ＥＣ：４．２．１．９）、サーモトガ・マリティマ由来、ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：ＮＰ＿２２８３６１．１；アルコールデヒドロゲナーゼＡＤＨ（ＥＣ１．１．１．１）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス由来、配列番号１８；アルコールデヒドロゲナーゼＡＤＨ（ＥＣ１．１．１．１）、フラボバクテリウム・フリジディマリス由来、ＮＣＢＩ−ＧｅｎＩＤ：ＢＡＢ９１４１１．１；およびアルコールデヒドロゲナーゼＡＤＨ（ＥＣ：１．１．１．１）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来からなる群から選択される、本発明のプロセス。
【００６０】
生成物が、好ましくは抽出、パーストラクション（ｐｅｒｓｔｒａｃｔｉｏｎ）、蒸留、吸着、ガスストリッピング、パーベーパレーション、膜抽出または逆浸透法によって反応系から連続的にまたはバッチ方式で取り出される、本発明のプロセス。
【００６１】
それぞれの標的化学物質のために使用される酵素の溶媒耐性が、好ましくは１％（ｗ／ｗ）よりも高い、より好ましくは４％（ｗ／ｗ）よりも高い、なおより好ましくは６％（ｗ／ｗ）よりも高い、最も好ましくは１０％（ｗ／ｗ）よりも高い、本発明のプロセス。
【００６２】
ステップ（１）および／または（３）に関与する１種または複数種の酵素が、単一の補因子に対して、前記補因子へのより高い特異的活性を持たせることによって最適化されている、本発明のプロセス。
【００６３】
最適化された酵素が、配列番号８または配列番号２のいずれかと比較して少なくとも５０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、なおより好ましくは９０％、なおより好ましくは９５％、最も好ましくは９７％、最も高度に好ましくは９９％の配列同一性を有し、配列番号８または配列番号２のそれぞれと比較して前記補因子への特異的活性が改善されている、本発明のプロセス。
【００６４】
酵素の前記補因子への比活性が、全反応体積０．２ｍｌ中、グリセルアルデヒド／グリセレートを基質として１ｍＭで、および前記補因子を２ｍＭで用いて、５０℃、ｐＨ７．０において０．４Ｕ／ｍｇ以上である、本発明のプロセス。好ましい実施形態では、比活性が０．６Ｕ／ｍｇ以上、より好ましくは０．８Ｕ／ｍｇ以上、なおより好ましくは１．０Ｕ／ｍｇ以上、最も好ましくは１．２Ｕ／ｍｇ以上、最も高度に好ましくは１．５Ｕ／ｍｇ以上である。
【００６５】
比活性が３％イソブタノールの存在下で測定される、本発明のプロセス。
【００６６】
ステップ（１）および／または（３）に関与する酵素がアルデヒドデヒドロゲナーゼである、本発明のプロセス。
【００６７】
アルデヒドデヒドロゲナーゼがクラスＥＣ１．１．１．４７に属する、本発明のプロセス。
【００６８】
アルデヒドデヒドロゲナーゼが、配列番号１０、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９からなる群から選択される、本発明のプロセス。
【００６９】
上記の実施形態を組み合わせて、本発明の別の特定の実施形態をもたらすことができる。
【００７０】
本発明は、供給源炭水化物から標的化学物質、特に、エタノールなどのＣ２アルコール、およびｎ−ブタノール、イソブタノールまたは２−ブタノールなどのＣ４アルコールを含めたアルコールをバイオテクノロジーにより生成するための無細胞プロセスに関する。生成物としては、疎水性化学物質、親水性化学物質、および中間の化学物質が挙げられる。本発明の最も好ましい疎水性化学物質はイソブタノールである。本発明の最も好ましい親水性化学物質および中間の化学物質はエタノールである。
【００７１】
好ましい態様によると、本発明には、無細胞酵素系によって供給源炭水化物から標的化学物質を生成するためのプロセスであって、グルコースを、中間生成物としてピルベートに変換することを含み、リン酸化反応およびＡＴＰの最終的な生成が起こらないプロセスが開示されている。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「酵素」という用語は、「酵素活性」という用語も包含し、これらは互換的に使用することができる。
【００７３】
グルコースをピルベートに変換するための化学的経路の選択：
好ましい態様によると、本発明には、無細胞酵素系により、グルコースおよび／もしくはガラクトースまたはグルコースを含有する二量体、オリゴマーもしくはポリマーおよび／またはガラクトースを含有する二量体、オリゴマーもしくはポリマーから標的化学物質を生成するためのプロセスであって、１分子のグルコースまたはガラクトースが、ＡＴＰの最終的な生成を伴わずに１分子のピルベートおよび１分子のグリセレートに変換され、グリセレートがピルベートに変換されるプロセスが開示されている。そのようなグルコースは、中間体のグルコネート（またはグルコン酸）を経由して２−ケト−３−デオキシ−グルコネート（または２−ケト−３−デオキシ−グルコン酸）に変換されることが好ましい。そのようなガラクトースは、中間体のガラクトネート（またはガラクトン酸）を経由して２−ケト−３−デオキシ−ガラクトネート（２−ケト−３−デオキシ−ガラクトン酸）に変換されることが好ましい。そのような２−ケト−３−デオキシ−グルコネートまたは２−ケト−３−デオキシ−ガラクトネートは１分子のピルベートおよび１分子のグリセルアルデヒドに変換されることが好ましい。そのようなグリセルアルデヒドはグリセレートに変換されることが好ましい。
【００７４】
グリセレートからピルベートへの変換に関しては種々の選択肢が存在する。好ましい一態様では、グリセレートを、グリセレート−２−ホスフェートおよびホスホエノールピルベートを経由してピルベートに変換する。別の好ましい態様では、グリセレートを、ヒドロキシピルベートおよびセリンを経由してピルベートに変換する。別の好ましい態様では、グリセレートを直接ピルベートに変換する。
【００７５】
グルコースをピルベートに変換するための酵素の選択：
好ましい態様によると、本発明には、無細胞酵素系により、グルコースおよび／もしくはガラクトースまたはグルコースを含有する二量体、オリゴマーもしくはポリマーおよび／またはガラクトースを含有する二量体、オリゴマーもしくはポリマーから標的化学物質を生成するためのプロセスであって、グルコースおよび／またはガラクトースを、中間生成物としてピルベートに変換することを含み、ＡＴＰの最終的な生成が起こらず、グルコースおよび／またはガラクトースからピルベートへの変換が、デヒドロゲナーゼ、デヒドラターゼ、およびアルドラーゼの群から選択される３種、４種または５種の酵素、好ましくは３〜４種の酵素、最も好ましくは４種の酵素を使用することからなり、各群から１種または複数種の酵素が選択されるプロセスが開示されている。
【００７６】
グルコースからピルベートへの変換における酵素の数を最小化するための種々の好ましい選択肢が開示されている：
（１）本発明の特に好ましい態様では、前記酵素は、グルコネート／グルコースおよびグリセレート／グリセルアルデヒドを基質として許容するデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４７）、グルコネート／２−ケト−３−デオキシグルコネートおよびグリセレート／ピルベートを基質として許容するジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．９）、ならびに２−ケト−３−デオキシグルコネート／ピルベート／グリセルアルデヒドを基質として許容する２−ケト−３−デオキシグルコネートアルドラーゼ（ＥＣ４．１．２．１４）である（すなわち、３種の酵素）。
（２）本発明の特に好ましい態様では、前記酵素は、グルコネート／グルコースを基質として許容するグルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４７）、グリセレート／グリセルアルデヒドを基質として許容するアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．３）、グルコネート／２−ケト−３−デオキシグルコネートおよびグリセレート／ピルベートを基質として許容するジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．９または４．２．１．３９）、ならびに２−ケト−３−デオキシグルコネート／ピルベート／グリセルアルデヒドを基質として許容する２−ケト−３−デオキシグルコネートアルドラーゼ（ＥＣ４．１．２．１４）である（すなわち、４種の酵素）。
（３）本発明の特に好ましい態様では、前記酵素は、グルコネート／グルコースおよびグリセレート／グリセルアルデヒドを基質として許容するデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４７または１．２．１．３）、グルコネート／２−ケト−３−デオキシグルコネートを基質として許容するもの（ＥＣ４．２．１．３９）とグリセレート／ピルベートを基質として許容するもの（ＥＣ４．２．１．９）の２種の異なるジヒドロキシ酸デヒドラターゼ、ならびに２−ケト−３−デオキシグルコネート／ピルベート／グリセルアルデヒドを基質として許容する２−ケト−３−デオキシグルコネートアルドラーゼ（ＥＣ４．１．２．１４）である（すなわち、４種の酵素）。
（４）本発明の特に好ましい態様では、前記酵素は、グルコネート／グルコースを基質として許容するグルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４７）、グルコネート／２−ケト−３−デオキシグルコネートを基質として許容するものとグリセレート／ピルベートを基質として許容するものの２種の異なるジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．９）、グリセレート／グリセルアルデヒドを基質として許容するアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．３）、ならびに２−ケト−３−デオキシグルコネート／ピルベートおよびグリセルアルデヒドを基質として許容する２−ケト−３−デオキシグルコネートアルドラーゼ（ＥＣ４．１．２．１４）である（すなわち、５種の酵素）。
（５）本発明の特に好ましい態様では、前記酵素は、グルコネート／グルコースを基質として許容するグルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４７）、グルコネート／グルコースおよびグリセレート／グリセルアルデヒドを基質として許容するアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．３）、グルコネート／２−ケト−３−デオキシグルコネートを基質として許容するものとグリセレート／ピルベートを基質として許容するものの２種の異なるジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．９）、ならびに２−ケト−３−デオキシグルコネート／ピルベート／グリセルアルデヒドを基質として許容する２−ケト−３−デオキシグルコネートアルドラーゼ（ＥＣ４．１．２．１４）である（すなわち、５種の酵素）。
【００７７】
大多数の酵素が、反応を非特異的に（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓｌｙ）触媒し、異なる基質に作用し得る。これらの酵素は、１つの特定の反応を触媒するだけでなく、特定の種類の化学結合または官能基に特異的でもある。この非特異性を、本発明の反応カスケードにおいていくつかの基質を１種の酵素によって所望の生成物に変換することで利用することができる。
【００７８】
適切な非特異的（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）酵素を同定するために、関連性のある酵素の基質または補因子に対する活性を決定することができ、この場合、ハイスループットを可能にするためにマイクロタイタープレートにおける測光による酵素アッセイが適用可能である。酵素活性は、毎分１μｍｏｌの基質を所望の生成物に変換するために必要な酵素の量と定義される。試験される基質または補因子に対する酵素１ｍｇ当たりの比活性が０．０１以上、好ましくは０．１以上、より好ましくは１以上、なおより好ましくは１０以上、最も好ましくは１００以上、最も高度に好ましくは１０００以上である酵素が、特定の基質および／または補因子を許容する酵素であるとみなされる。
【００７９】
炭素源および／または供給源炭水化物の選択：
炭素源は、微生物が成長するためまたは化学物質を生成するために利用することができる任意の材料であってよい。これらとしては、炭水化物および誘導体：ポリオース、例えば、セルロース、ヘミセルロース、デンプンなど；ビオース、例えば、スクロース、マルトース、ラクトースなど；ヘキソース、例えば、グルコース、マンノース、ガラクトースなど；ペントース、例えば、キシロース、アラビノースなど；ウロン酸、グルコサミンなど；ポリオール、例えば、ソルビトール、グリセロールなど；脂質および誘導体、リグニンおよび誘導体が挙げられる。特に好ましい炭素源は、グルコース、グルコースを含有するオリゴマーまたはポリマー、非グルコース単量体ヘキソース、またはそれらの混合物などの炭水化物である。
【００８０】
好ましい態様によると、供給源炭水化物は、グルコース、ガラクトース、またはグルコースとガラクトースの混合物、またはグルコースを含有する二糖、オリゴ糖、もしくは多糖および／またはガラクトースを含有する二糖、オリゴ糖、もしくは多糖の加水分解産物である。
【００８１】
特に好ましい態様では、供給源炭水化物はセルロースまたはリグノセルロースであり、その場合、まずセルラーゼを使用することによってセルロースをグルコースに加水分解する、および／または、酵素混合物にセルラーゼ活性を添加する。本発明の一実施形態に関しては、３〜６種の酵素（好ましくは１種または２種または３種のエンドセルラーゼ、１種または２種のエキソセルラーゼ、１種のベータ−グルコシダーゼ）のみを使用してリグノセルロース材料をグルコースに変換する。
【００８２】
特に好ましい態様では、供給源炭水化物はデンプンであり、その場合、まずデンプンを加水分解する、および／または、酵素混合物にアミラーゼおよびグルコアミラーゼ活性を添加する。
【００８３】
別の特に好ましい態様では、供給源炭水化物はスクロースであり、その場合、スクロースを加水分解するためにインベルターゼを酵素混合物に添加し、フルクトースをグルコースに変換するためにイソメラーゼを添加する。
【００８４】
別の特に好ましい態様では、供給源炭水化物はラクトースであり、その場合、まずガラクトシダーゼを用いてラクトースを加水分解する、および／またはガラクトシダーゼを酵素混合物に添加する。
【００８５】
ピルベートから生成することができる生成物の例：
さらに好ましい態様によると、標的化学物質はエタノール、炭素数４の一価アルコール、特にｎ−ブタノール、イソ−ブタノール、２−ブタノール、またはピルベートから、好ましくは酵素経路によって、誘導可能な別の化学物質である。本発明の最も好ましい疎水性化学物質はイソブタノールである。本発明の最も好ましい標的化学物質はエタノールである。
【００８６】
本発明による疎水性化学物質は、これだけに限定することなく、ｎ−ブタノール、２−ブタノール、およびイソブタノールなどのＣ４アルコール、ならびに水との混和性が限定された他の化学物質を含む。混和性が限定されたとは、室温で相分離せずに水と混合できるのが２０％（ｗ／ｗ）以下であることを意味する。本発明による親水性化学物質および中間の化学物質は、これだけに限定することなく、エタノールおよび他の化学物質を含む。
【００８７】
疎水性化学物質は、部分的にしか水に溶けず、外界の圧力および温度において固体または液体の状態で存在する化学物質である。疎水性化学物質の水との混和性は、相分離せずに２０％（ｗ／ｗ）以下と限定されている。本発明による疎水性化学物質の特定の例としては、ｎ−ブタノール、２−ブタノールおよびイソブタノールが挙げられる。
【００８８】
ｎ−ブタノールは、揮発性が中程度である無色で中性の液体であり、水中での混和性が制限されている（２０℃で約７〜８％）。ｎ−ブタノールは、化学物質の生成における中間体として、溶媒として、および化粧品などの製剤化された生成物の成分として使用される。ｎ−ブタノールは、アクリル酸／メタクリル酸エステル、グリコールエーテル、酢酸ｎ−ブチル、アミノ樹脂およびｎ−ブチルアミンの合成において使用される。ｎ−ブタノールは、蒸気圧が低く、エネルギー含量が高く、また、ガソリンと高濃度で混和することが可能であるので、燃焼機関における燃料としても使用することができる。ｎ−ブタノールは、一般にはｎ−ブタノール、アセトンおよびエタノールの混合物を生成するＣ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｙｌｉｃｕｍ）またはＣ．ベイジェリンキ（Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）などの溶媒生成性（ｓｏｌｖｅｎｔｏｇｅｎｉｃ）クロストリジウムを使用して生成することができる。溶媒生成性クロストリジウムを使用したブタノールの生成にはいくつかの欠点がある：（ｉ）希釈水溶液からの生成物の単離が、複雑であるか（例えば、膜プロセスを使用する）、エネルギーを消費する（例えば、蒸留を使用する）ので、非常に費用がかかる。（ｉｉ）基質のかなりの部分がアセトン、エタノール、水素およびバイオマスなどの副生成物の形成に用いられるので収率が低い。（ｉｉｉ）細胞力価が限られているので、ブタノールの生成の生産性が低い。（ｉｖ）代謝が複雑であることにより、生産性および収率を高めるための代謝的な工学的操作が限定される。（ｖ）プロセスの安定性が限定されていることにより、多くの場合、生成の減少が生じ、また滅菌状態を維持するのが難しい。（ｖｉ）クロストリジウムの成長が二相性であることにより、プロセスの柔軟性および生産性が限定される。
【００８９】
２−ブタノールは、中程度の揮発性の無色で中性の液体であり、水中での混和性が制限されている（２０℃で約１２％）。２−ブタノールは、塗料およびコーティング用の溶媒ならびに食物成分として、または１−ブテンの生成において使用される。
【００９０】
イソブタノールは、中程度の揮発性の無色で中性の液体であり、水中での混和性が制限されている（２０℃で約９〜１０％）。イソブタノールは、溶媒として、または可塑剤として使用される。イソブタノールは、ＭＴＢＥまたはＥＴＢＥを生成するための前駆体であるイソブテンの生成においても使用される。
【００９１】
補因子の選択要件：
本発明の好ましい実施形態によると、グルコースから、中間生成物としてピルベートへの変換は、補因子としてのＡＴＰおよび／またはＡＤＰの最終的な生成を完全に伴わずに起こる。炭素源から標的化学物質への変換全体（反応経路）が補因子としてのＡＴＰおよび／またはＡＤＰの最終的な生成を完全に伴わずに起こることがより好ましい。
【００９２】
本発明の好ましい実施形態によると、グルコースから、中間生成物としてピルベートへの変換は、補因子としてのＡＴＰおよび／またはＡＤＰを完全に伴わずに起こる。炭素源から標的化学物質への変換全体（反応経路）が補因子としてのＡＴＰおよび／またはＡＤＰを完全に伴わずに起こることがより好ましい。
【００９３】
本発明の好ましい実施形態によると、グルコースから、中間生成物としてピルベートへの変換は、いかなるリン酸化反応も完全に伴わずに起こる。炭素源から標的化学物質への変換全体（反応経路）がいかなるリン酸化反応も完全に伴わずに起こることがより好ましい。
【００９４】
本発明の好ましい実施形態によると、グルコースから、中間生成物としてピルベートへの変換は、レドックス補因子以外のいかなる補因子の添加も完全に伴わずに起こる。炭素源から標的化学物質への変換全体（反応経路）が、代謝中間体としてレドックス補因子以外はいかなる補因子の添加も完全に伴わずに起こることがより好ましい。好ましいレドックス補因子は、ＦＭＮ／ＦＭＮＨ２、ＦＡＤ／ＦＡＤＨ２、ＮＡＤ／ＮＡＤＨ、および／またはＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨである。
【００９５】
本発明の好ましい実施形態によると、グルコースから、中間生成物としてピルベートへの変換は、グルコースからピルベートへの変換および／または炭素源から標的有機化合物への変換全体のいずれかに関するレドックス反応のための単一のレドックス補因子を添加した場合にのみ起こり、特に好ましい単一の補因子はＮＡＤ／ＮＡＤＨである。
【００９６】
補因子に対する活性がより大きくなるように最適化された酵素：
本発明の一態様によると、グルコースからピルベートへの変換に関して、本発明のプロセスは、レドックス補因子を１種のみ使用することを含み、好ましくは、そのような補因子を必要とする酵素の１種または複数種が、それぞれの最適化されていない酵素または野生型酵素と比較して、この補因子に対する活性がより大きくなるように最適化されていることが好ましい。そのようなレドックス補因子はＮＡＤ／ＮＡＤＨであり、１種または複数種の酵素が、それぞれの最適化されていない酵素または野生型酵素と比較して、ＮＡＤ／ＮＡＤＨに対する活性がより大きくなるように最適化されていることがより好ましく、最適化された酵素が１種または複数種のデヒドロゲナーゼであることがさらに好ましく、最適化された酵素が以下の１つまたは複数であることがさらにより好ましい：
・グルコースまたはガラクトースを基質として許容するグルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４７）、または
・グリセルアルデヒドを基質として許容するアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．３）、または
・グルコースまたはガラクトースを基質として許容し、グリセルアルデヒドを基質として許容するグルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４７）、または
・グルコースまたはガラクトースを基質として許容し、グリセルアルデヒドを基質として許容するアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．３）
【００９７】
補因子活性がより大きくなるように最適化された１種または複数種の酵素を、本明細書に記載の酵素数の減少と組み合わせて使用することにより、グルコースをピルベートに変換するためのプロセスがさらに改善され、したがって、最終的に、標的化学物質を生成するためのプロセスがさらに改善される。
【００９８】
本発明の好ましい態様によると、グルコースからピルベートへの変換は、それぞれの最適化されていない酵素と比較して、補因子活性がより大きくなるように、好ましくはＮＡＤＨ活性がより大きくなるように最適化された１種または複数種の酵素を使用することを含む。より大きな補因子活性としては、例えば、酵素による、補因子の基質としての許容性が改善されることが挙げられる。それぞれの最適化されていない酵素と比較して、補因子活性がより大きくなるように、好ましくはＮＡＤＨ活性がより大きくなるように最適化された酵素は、最適化されていない酵素に対するバリアントとして工学的に操作された、より大きな補因子活性、好ましくはより大きなＮＡＤＨ活性を生じる酵素である。最適化の一例は、定向進化手法を使用することである。より大きな補因子活性、好ましくはより大きなＮＡＤＨ活性を生じる最適化されていない酵素に対するバリアントは、最適化されていない酵素（すなわち、比較対象の酵素）をコードするヌクレオチド配列とは異なる少なくとも１つのヌクレオチドからなるヌクレオチド配列によりコードされる酵素である、または、同様に、より大きな補因子活性、好ましくはより大きなＮＡＤＨ活性を生じる最適化されていない酵素に対するバリアントは、最適化されていない酵素（すなわち、比較対象の酵素）のアミノ酸配列とは異なる少なくとも１つのアミノ酸からなる酵素である。最適化されていない酵素は野生型酵素であってよい。配列番号８は、最適化されていない酵素である野生型酵素の好ましい例である。別の例は、配列番号２の酵素である。
【００９９】
改善された補因子活性は、絶対量で、またはその代わりに相対量によって測定することができる。例えば、精製された形態の酵素の比活性を使用することができる。そのような場合、本発明では、特異的な補因子への酵素の最適化が定義される活性の改善とは、総反応体積０．２ｍｌ中、グリセルアルデヒド／グリセレートを基質として１ｍＭで、および特異的な補因子を２ｍＭで用いて、酵素の前記補因子への比活性が５０℃、ｐＨ７．０で０．４Ｕ／ｍｇ以上である場合のものである。好ましい補因子はＮＡＤ／ＮＡＤＨである。好ましい実施形態では、これらの条件下で比活性が０．６Ｕ／ｍｇ以上、好ましくは０．８Ｕ／ｍｇ以上、より好ましくは１．０Ｕ／ｍｇ以上、最も好ましくは１．２Ｕ／ｍｇ以上、最も高度に好ましくは１．５Ｕ／ｍｇ以上である。さらに好ましい実施形態では、上に示されている比活性が３％イソブタノールの存在下で測定される。あるいは、比活性を測定し、比較対象の野生型（例えば、最適化されていない酵素）に対して正規化し、酵素の最適化が定義される活性の改善とは、野生型値の２倍以上、好ましくは４倍以上、なおより好ましくは８倍以上、最も好ましくは１６倍以上、最も高度に好ましくは３２倍以上に活性が改善されることである。
【０１００】
あるいは、相対値を、標準のプロトコールを使用して作成し、野生型値に対して正規化することができる。例えば、酵素バリアント（例えばデヒドロゲナーゼバリアント；Ｔａ−ＡＬＤＨ）のライブラリーを含有する細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）のコロニーを誘導し、成長させ、収集し、溶解させ、不溶性の細胞片を除去し、バリアントを含有する上清を、標準の条件下で（例えば、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）中２ｍＭのＮＡＤ、１ｍＭのＤ−グリセルアルデヒド、５０℃）相対的な活性について試験することができる。所与の期間（例えば、２０分）後、補因子の形成（例えば、ＮＡＤＨの形成）を分光光度的に検出することができ、野生型と比較して優れた補因子（例えば、ＮＡＤＨの形成）を検出することができ、対象のバリアントの野生型に対する改善された相対的な活性としてもたらされる。特に、酵素の最適化が定義される活性の改善とは、野生型値の２倍以上、好ましくは４倍以上、なおより好ましくは８倍以上、最も好ましくは１６倍以上、最も高度に好ましくは３２倍以上に活性が改善されることである。
【０１０１】
より大きな補因子活性、好ましくはより大きなＮＡＤＨ活性を生じる最適化された酵素は、最適化されていない酵素をコードするヌクレオチド配列に対する置換、付加または欠失からなるヌクレオチド配列によりコードされていてよく、置換、付加または欠失は、１〜６０ヌクレオチド、好ましくは１〜２１ヌクレオチド、より好ましくは１〜９ヌクレオチド、特に好ましくは１〜３ヌクレオチド、最も特に好ましくは１ヌクレオチドを含む。より大きな補因子活性、好ましくはより大きなＮＡＤＨ活性を有する最適化された酵素がもたらされる、最適化されていない酵素をコードするヌクレオチド配列に対する置換、付加または欠失は、最適化されていない酵素に対して８０％のヌクレオチド配列同一性、好ましくは９０％ヌクレオチド配列同一性、より好ましくは９５％ヌクレオチド配列同一性、最も好ましくは９７％ヌクレオチド配列同一性、最も高度に好ましくは９９％ヌクレオチド配列同一性をもたらすと定義することができる。最適化されていない酵素は野生型酵素であってよい。配列番号８は、最適化されていない酵素である野生型酵素の好ましい例である。別の例は、配列番号２の酵素である。
【０１０２】
配列同一性の比較（アラインメント）は、ＣｌｕｓｔａｌＷ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（Ｌａｒｋｉｎ  Ｍ．Ａ．、Ｂｌａｃｋｓｈｉｅｌｄｓ  Ｇ．、Ｂｒｏｗｎ  Ｎ．Ｐ．、Ｃｈｅｎｎａ  Ｒ．、ＭｃＧｅｔｔｉｇａｎ  Ｐ．Ａ．、ＭｃＷｉｌｌｉａｍ  Ｈ．、Ｖａｌｅｎｔｉｎ  Ｆ．、Ｗａｌｌａｃｅ  Ｉ．Ｍ．、Ｗｉｌｍ  Ａ．、Ｌｏｐｅｚ  Ｒ．、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｊ．Ｄ．、Ｇｉｂｓｏｎ  Ｔ．Ｊ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｄ．Ｇ．（２００７年）  ＣｌｕｓｔａｌＷ  ａｎｄ  ＣｌｕｓｔａｌＸ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００７年  ２３巻  （２１号）：  ２９４７〜２９４８年）を使用して実施する。
【０１０３】
同様に、より大きな補因子活性、好ましくはより大きなＮＡＤＨ活性を生じる最適化された酵素は、最適化されていない酵素のアミノ酸配列に対する置換、付加または欠失からなるアミノ酸配列であってよく、置換、付加または欠失は、１〜２０アミノ酸、好ましくは１〜１０アミノ酸、より好ましくは１〜５アミノ酸、特に好ましくは１〜３アミノ酸、最も特に好ましくは１アミノ酸を含む。より大きな補因子活性、好ましくはより大きなＮＡＤＨ活性を有する最適化された酵素がもたらされる、最適化されていない酵素のアミノ酸配列に対する置換、付加または欠失は、最適化されていない酵素に対して８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは９５％のアミノ酸配列同一性、最も好ましくは９７％のアミノ酸配列同一性、最も高度に好ましくは９９％のアミノ酸配列同一性をもたらすと定義することができる。最適化されていない酵素は野生型酵素であってよい。配列番号８は、最適化されていない酵素である野生型酵素の好ましい例である。別の例は、配列番号２の酵素である。
【０１０４】
本発明の非常に好ましい実施形態では、より大きな補因子活性、好ましくはより大きなＮＡＤＨ活性を生じる最適化された酵素は、最適化されていない酵素と比較してアミノ酸配列の１〜１０個の突然変異、好ましくは１〜８個の突然変異、より好ましくは１〜５個の突然変異、より高度に好ましい１〜３個の突然変異、最も好ましくは１〜２個の突然変異、最も高度に好ましくは１個の突然変異からなるアミノ酸配列である。突然変異は、最適化されていない酵素と比較して同じアミノ酸と対応しないアミノ酸とみなされる。最適化されていない酵素は野生型酵素であってよい。配列番号８は、最適化されていない酵素である野生型酵素の好ましい例である。別の例は、配列番号２の酵素である。
【０１０５】
同様に、本発明は、配列番号５６に反映されている通りＦ３４Ｌの突然変異を有する最適化されたアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列ならびに配列番号５７に反映されている通りＦ３４Ｌの突然変異を有する最適化されたアルデヒドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列；配列番号５８に反映されている通りＳ４０５Ｃの突然変異を有する最適化されたアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列ならびに配列番号５９に反映されている通りＳ４０５Ｃの突然変異を有する最適化されたアルデヒドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列；配列番号６０に反映されている通りＦ３４Ｌの突然変異およびＳ４０５Ｃの突然変異を有する最適化されたアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列ならびに配列番号６１に反映されている通りＦ３４Ｌの突然変異およびＳ４０５Ｃの突然変異を有する最適化されたアルデヒドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列；配列番号６２に反映されている通りＦ３４Ｍの突然変異およびＳ４０５Ｎの突然変異を有する最適化されたアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列ならびに配列番号６３に反映されている通りＦ３４Ｍの突然変異およびＳ４０５Ｎの突然変異を有する最適化されたアルデヒドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列；配列番号６４に反映されている通りＷ２７１Ｓの突然変異を有する最適化されたアルデヒドデヒドロゲナーゼならびに配列番号６５に反映されている通りＷ２７１Ｓの突然変異を有する最適化されたアルデヒドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列；配列番号９に反映されている通りＦ３４Ｍの突然変異およびＹ３９９Ｃの突然変異およびＳ４０５Ｎの突然変異を有する最適化されたアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列ならびに配列番号１０に反映されている通りＦ３４Ｍの突然変異およびＹ３９９Ｃの突然変異およびＳ４０５Ｎの突然変異を有する最適化されたアルデヒドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列；配列番号６６に反映されている通りＹ３９９Ｒの突然変異を有する最適化されたアルデヒドデヒドロゲナーゼｗをコードするヌクレオチド配列ならびに配列番号６７に反映されている通りＹ３９９Ｒの突然変異を有する最適化されたアルデヒドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列；配列番号６８に反映されている通りＦ３４Ｍの突然変異およびＷ２７１Ｓの突然変異およびＹ３９９Ｃの突然変異およびＳ４０５Ｎの突然変異を有する最適化されたアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列ならびに配列番号６９に反映されている通りＦ３４Ｍの突然変異およびＷ２７１Ｓの突然変異およびＹ３９９Ｃの突然変異およびＳ４０５Ｎの突然変異を有する最適化されたアルデヒドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列を包含する。これらの特定の実施形態に関連づけられる例示的な技術的効果が表３に含まれている。
【０１０６】
好ましい実施形態として、配列番号２および配列番号８を、それぞれグルコースデヒドロゲナーゼおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼの野生型酵素を表すとみなすことができる。配列番号８は、補因子、特にＮＡＤ／ＮＡＤＨに対する活性が改善されたかどうかを同定するための比較対象配列として使用される好ましい配列である。
【０１０７】
好ましい実施形態として、配列番号２および配列番号８を、それぞれグルコースデヒドロゲナーゼおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼの最適化されていない酵素を表すとみなすことができる。配列番号８は、補因子、特にＮＡＤ／ＮＡＤＨに対する活性が改善されたかどうかを同定するための比較対象配列として使用される好ましい配列である。
【０１０８】
好ましい実施形態として、配列番号１および配列番号７のヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質配列を、それぞれグルコースデヒドロゲナーゼおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼの野生型酵素を表すとみなすことができる。配列番号７は、補因子、特にＮＡＤ／ＮＡＤＨに対する活性が改善されたかどうかを同定するための比較対象配列として使用されるタンパク質配列をコードする好ましいヌクレオチド配列である。
【０１０９】
好ましい実施形態として、配列番号１および配列番号７のヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質配列を、それぞれグルコースデヒドロゲナーゼおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼの最適化されていない酵素を表すとみなすことができる。配列番号７は、補因子、特にＮＡＤ／ＮＡＤＨに対する活性が改善されたかどうかを同定するための比較対象配列として使用されるタンパク質配列をコードする好ましいヌクレオチド配列である。
【０１１０】
本発明は、上記の最適化された酵素それ自体、ならびに、前記最適化された酵素を、グルコースからピルベートへの変換において、記載されている標的化学物質を生成するためのプロセスと組み合わせて使用することのどちらも包含する。例えば、最適化された酵素の１種または複数種を、無細胞酵素系により、グルコースおよび／もしくはガラクトース、またはグルコースを含有する二量体、オリゴマーもしくはポリマーおよび／またはガラクトースを含有する二量体、オリゴマーもしくはポリマーから標的化学物質を生成するためのプロセスであって、グルコースを、中間生成物としてピルベートに変換することを含み、ＡＴＰの最終的な生成が起こらず、好ましくはリン酸化反応が起こらず、グルコースからピルベートへの変換が、デヒドロゲナーゼ、デヒドラターゼ、およびアルドラーゼの群から選択される３種、４種または５種の酵素を使用することからなり、各群から１種または複数種の酵素が選択されるプロセスにおいて使用する。グルコースからピルベートへの変換は３種または４種の酵素によって実現されることが好ましく、４種の酵素によって実現されることが最も好ましい。
【０１１１】
プロセスの条件の選択：
本発明の好ましい実施形態によると、グルコースから、中間生成物としてピルベートへの変換は、１モルのグルコースから２モルのピルベートへの変換からなる。
【０１１２】
本発明のさらに好ましい実施形態によると、また、本発明にさらに記載されている通り、生成プロセスを２つの別個の相を含む液体系において実施し、標的化学物質が別個の相の一方に主に存在するまたはそれを形成し、標的化学物質を別個の相から採取する。本発明のさらに好ましい実施形態によると、また、本発明にさらに記載されている通り、有機溶媒を添加して２つの別個の相を確立する。
【０１１３】
本発明のさらに好ましい実施形態によると、また、本発明にさらに記載されている通り、炭素源化合物をプロセスに連続的に供給し、標的化学物質を連続的に取り出す（流加プロセス）。
【０１１４】
好ましい一態様によると、本発明の生成プロセスは、以下の４つのステップを含む：
ステップＩ：微生物細胞を使用して、炭素源を化学物質（本明細書では「標的化学物質」または「標的有機化合物」とも称される）に変換するための酵素（「標的酵素」）を生成するステップ；
ステップＩＩ：補因子の放出およびさらに非標的な酵素活性の不活化と組み合わせることが好ましい、ステップＩで使用した微生物細胞から標的酵素を放出させるステップ；または補因子の放出と組み合わせることが好ましい、標的酵素を非標的酵素活性から精製するステップ；
ステップＩＩＩ：炭素源を標的化学物質に変換するために適した条件下でステップＩＩの標的酵素と炭素源を接触させるステップ；
ステップＩＶ：標的化学物質を反応混合物から分離するステップ。
【０１１５】
酵素の選択および生成：
ステップＩでは、微生物細胞を使用して標的酵素を生成する。本発明の一実施形態では、酵素生成は、生成経路全体またはその主要な部分が１つの微生物において再構成されないように、２種以上の異なる微生物細胞株において行う。これにより、基質から化学物質への変換の望ましくない開始が回避され、また、より効率的な酵素生成がもたらされる。酵素生成は細胞内であっても細胞外であってもよく、組換えによるものであっても組換えによらないものであってもよい。酵素生成が組換えによるものである場合、相同組換えであっても非相同組換えであってもよい。
【０１１６】
本発明のさらなる実施形態では、標的酵素は、１つの基質および１つの反応に対して選択的である。標的酵素の基質選択性（ｋｃａｔ／ｋＭ）は任意の他の天然に存在する物質と比較して少なくとも１０倍であり、反応選択性が少なくとも９０％であることが好ましい。標的酵素の基質選択性が少なくとも２０倍であり、反応選択性が少なくとも９５％であることがより好ましい。標的酵素の基質選択性が少なくとも１００倍であり、反応選択性が少なくとも９９％であることがなおより好ましい。
【０１１７】
本発明のさらなる実施形態では、多段階反応の基質または生成物または他の中間体による標的酵素の阻害は全くないまたは少ない（フィードバック阻害が全くないまたは少ない）。多段階反応の任意の基質、生成物または中間体の阻害定数（Ｋｉ）も、それぞれの酵素および基質のＫＭ値よりも少なくとも１０倍高いことが好ましい。そのような阻害定数はそれぞれのＫＭよりも１００倍高いことがより好ましい。さらに特に好ましい実施形態では、標的酵素は、多段階反応の任意の基質、中間体または生成物の濃度が１００ｍＭ以上であっても、なおそれらの最大活性の５０％を有する。
【０１１８】
標的酵素のｋｃａｔ値およびＫＭ値は酵素的経路の多段階性に対して調節されたものであることが好ましい。
【０１１９】
本発明のプロセスの一実施形態によると、標的酵素は、上昇したレベルの標的化学物質、および場合によって、標的化学物質の別個の相への分離を補助するために場合によって添加される他の有機溶媒に耐性がある。標的酵素は、２％（ｗ／ｗ）超、より好ましくは４％（ｗ／ｗ）超、より好ましくは６％（ｗ／ｗ）超、なおより好ましくはより好ましくは８％（ｗ／ｗ）超の濃度の標的化学物質に耐性があることが好ましい。特に好ましい実施形態では、標的酵素は、水への最大溶解性に至るまでの濃度の標的化学物質に耐性がある。
【０１２０】
好ましい実施形態では、無細胞酵素系全体が、上昇したレベルのイソブタノール、ブタノール、またはエタノールなどの標的化学物質に耐性がある。特に好ましい実施形態では、無細胞酵素系全体が、２％（ｗ／ｗ）以上、好ましくは４％（ｗ／ｗ）以上、より好ましくは６％（ｗ／ｗ）以上、なおより好ましくは８％（ｗ／ｗ）以上の濃度のイソブタノールに耐性がある。特に好ましい実施形態では、無細胞酵素系全体が、相分離が起こる濃度、すなわち、プロセス温度における標的化学物質の水への最大溶解性に対応する濃度のイソブタノールなどの標的化学物質に耐性がある。
【０１２１】
本発明の好ましい実施形態では、標的酵素は、上昇したレベルのカオトロピック物質および高められた温度に耐性がある。標的酵素は、１Ｍ超、より好ましくは３Ｍ超、最も好ましくは６Ｍ超の濃度の塩化グアニジニウムに耐性があることが好ましい。その代わりに、またはそれと組み合わせて、標的酵素は、４０〜９０℃超、より好ましくは５０〜８０℃超、最も好ましくは５０〜６０℃超の温度に耐性があることが好ましい。そのような好ましい実施形態では、標的酵素の生成は、内在性の酵素活性の大部分が上昇したレベルのカオトロピック物質および／または高められた温度で不活化する宿主生物体において行う。
【０１２２】
標的酵素の生成は、以下の微生物種の１つまたは複数を使用して実施することが好ましい：エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）；シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）；バチラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）；ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）；クリュイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｙｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）；トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）；アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）。標的酵素の生成は、エシェリヒア・コリを宿主生物体として使用して実施することがより好ましい。酵素生成と細胞の成長は別個の成長相に分離することが好ましい。そのため、一般的な代謝活性に対する基質は使用しない。
【０１２３】
本発明の好ましい態様では、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．サブチリス、Ｓ．セレビシエおよび／またはピキア・パストリスを発現宿主として使用し、個々のそれぞれの株において１種または複数種の酵素を組換えにより生成する。別の好ましい態様では、Ｅ．ｃｏｌｉが発現宿主であり、個々の株ごとに１種の酵素を発現させる。そのような酵素の半減期は、少なくとも１０分、好ましくは少なくとも３０分にわたってインキュベートすると発現宿主（すなわち、細胞の成長）が不活化し、発現宿主に由来する酵素活性の少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９９％が不活化し、また、供給源炭水化物（例えば、グルコースまたはガラクトース）由来の中間体がいずれも標的化学物質に基質として許容される温度および／またはｐＨ値の下で、１２時間超であることが好ましい。特に好ましい態様では、そのような温度で３０分インキュベートした後にそのような酵素活性を検出することができない。発現された酵素の半減期は、標準緩衝液中、５０℃、中性のｐＨでインキュベートした場合に少なくとも１２時間であることが最も好ましい。
【０１２４】
本発明のさらに好ましい実施形態では、標的酵素は、上昇したレベルの酸素に耐性がある。標的酵素は、１ｐｐｍ超、より好ましくは７ｐｐｍ超の酸素濃度に耐性があることが好ましい。標的酵素は好気条件下で活性かつ安定であることが最も好ましい。多段階反応は、酸素を必要とせず、酸素により阻害されないことが好ましい。それにより、酸素を排除するために特別な注意を払う必要がなく、それにより、生成環境および／または設備に関する手間を少なくしながらプロセスがより安定したものになる。
【０１２５】
ステップＩＩでは、標的酵素を細胞から放出させる。好ましい実施形態では、標的酵素は高温およびカオトロピック条件に耐性があるが、生成微生物由来のバックグラウンド酵素はこれらの条件に耐性がない。この実施形態によると、標的酵素を微生物細胞において細胞内で生成させ、高温および／またはカオトロピック条件を使用して細胞を溶解させ、それにより、標的酵素は活性型で、場合によって補因子と一緒に放出されるが、望ましくないバックグラウンド酵素活性は不活化される。
【０１２６】
別の好ましい実施形態では、酵素生成は細胞外で行われ、標的酵素は高温およびカオトロピック条件に耐性があり、バックグラウンド酵素活性（非標的酵素）はこれらの条件に耐性がない。この実施形態によると、細胞外生成からの上清を、高温および／またはカオトロピック条件などの条件下で処理する。これにより、望ましくないバックグラウンド酵素活性（非標的酵素）は不活化するが、標的酵素は活性なままになる。
【０１２７】
本発明の一実施形態では、多数の酵素的変換ステップの１つまたは複数に補因子が必要である。本発明の一態様では、そのような補因子を酵素混合物に添加する。この実施形態の別の特に好ましい態様では、そのような補因子も微生物細胞によって細胞内で生成され、標的酵素の放出に関するものと同じ処理によって放出される。本発明の別の好ましい実施形態では、生成される補因子のレベルを最適化するために微生物細胞を工学的に操作する。ステップＩＩの間に微生物細胞を不活化することが好ましい。それにより、プロセスにおいて細胞の成長と酵素活性が分離され、望ましくない細胞の成長による炭素源の消費が起こらない。
【０１２８】
酵素的変換のためのプロセスの設定：
ステップＩＩＩでは、炭素源を、酵素の混合物によって多段階の酵素反応でピルベートに、場合によってさらに標的化学物質に変換する。本発明のプロセスによると、酵素は標的化学物質の変性活性の下で活性である。ステップＩにおいて使用する微生物細胞はステップＩＩＩの反応条件の下で不活性である、かつ／または不活化されることが好ましい。
【０１２９】
標的酵素混合物中の各酵素の濃度は、プロセスの条件下で最適なレベルに調整することが好ましい。特に好ましい実施形態では、プロセスの収率を改善するために、１種または複数種の酵素の濃度を典型的な細胞内濃度よりも上昇させる（古典的なプロセスのように微生物の最大密度によって限定されない）。別の特に好ましい実施形態では、触媒効率を最大にするために、１種または複数種の酵素を工学的に操作する（それにより、反応器のサイズおよびランニングコストが古典的なプロセスと比較して縮小される）。
【０１３０】
標的酵素混合物中の酵素の活性はプロセスの条件下で最適なレベルに調整する。好ましい実施形態では、酵素カスケードの第１の酵素の活性は、そのカスケード内の後の酵素の活性と比較して低いレベルに調整する。そのような酵素活性により、反応内に中間体が蓄積することが防止される。カスケードの２つ以上のステップにおいて１つの酵素を使用する場合、適宜活性を上昇させることができる。特に好ましい実施形態では、酵素カスケードの各酵素の活性は、酵素カスケード内の先行する酵素の活性のいずれも超えるレベルに調整する。そのような酵素活性により、反応内の中間体の蓄積が防止される。
【０１３１】
さらに好ましい実施形態では、標的化学物質は、プロセスの条件下で水と単一の相に混合することができる最大レベルまたはそれをわずかに上回るレベルの濃度で、ステップＩＩＩの反応混合物中に添加するまたはその中に存在する。この実施形態によると、プロセスの間に標的化学物質を第２の相に連続的に分離する。この実施形態の特定の変形では、反応混合物に水溶性物質を添加し、これにより、物質を添加しない場合よりも低濃度で標的化学物質の相分離が生じる。そのような物質の例は塩であり、当業者に公知である。この実施形態の特に好ましい変形では、水相中の標的化学物質の溶解性を低下させるために塩化ナトリウムを添加する。
【０１３２】
別の好ましい実施形態では、それ自体の相を形成する追加的な有機溶媒をプロセスに添加し、生成された疎水性化学物質を水相から抽出する。そのような追加的な溶媒の好ましい例は、ｎ−ヘキサン、シクロヘキサン、オクタノール、酢酸エチル、メチルブチルケトン、またはこれらの組合せを含む。
【０１３３】
別の好ましい実施形態では、所望の反応に特異的な標的酵素を使用することによって副生成物の形成が減少するので、収率が改善される。別の好ましい実施形態では、副反応を触媒すると思われる宿主酵素は、ステップＩＩの間に不活化させる、かつ／またはステップＩＩＩの反応条件下では不活性である。
【０１３４】
本発明のさらに別の好ましい実施形態では、プロセスへの微生物によるコンタミネーションを、典型的な汚染微生物に対して毒性のステップＩＩＩの反応条件を調整することによって回避する。そのような条件は、高められた温度、極度のｐＨ、有機化学物質の添加を含む。本発明の特に好ましい実施形態では、標的化学物質自体がプロセス（生成環境および／または設備に関する手間が少ない、より安定なプロセス）において実現される濃度で毒性である。
【０１３５】
本発明の別の好ましい実施形態によると、反応混合物に、ステップＩにおいて使用する微生物によって生成される補因子およびステップＩＩにおいて生成する細胞ライセート中に含まれる補因子以外の追加的なレドックス補因子は添加しない。そのような補因子の例は、ＦＡＤ／ＦＡＤＨ２、ＦＭＮ／ＦＭＮＨ２、ＮＡＤ／ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨである。この実施形態によると、必要な補因子はステップＩにおいて微生物細胞によって生成され、プロセスの間に再生される（ＮＡＤＨからＮＡＤへ、逆もまた同じ；ＮＡＤＰＨからＮＡＤＰへ、逆もまた同じ）。本発明の一実施形態では、過剰な還元等価物（ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ）またはエネルギー等価物（ＡＴＰ）が追加的な酵素によって再生される（例えば、ＮＡＤＨに対してＮＡＤＨオキシダーゼ；ＮＡＤＰＨに対してＮＡＤＰＨオキシダーゼ）。
【０１３６】
本発明の特に好ましい実施形態では、グルコースからピルベートへの変換においてＡＴＰもＡＤＰも補因子として関与せず、また、この変換に関与する標的酵素はいずれもリン酸化ステップを含まない（非リン酸化ピルベート生成）。
【０１３７】
ステップＩＶでは、１種または複数種の標的化学物質を反応混合物から分離する。本発明の好ましい実施形態では、１種または複数種の標的化学物質は疎水性であり、生成された化学物質を少なくとも実質的な割合で含有することが好ましい別個の相を形成する。特に好ましい実施形態では、１種または複数種の標的化学物質を反応混合物から連続的に取り出す。
【０１３８】
本発明のさらに好ましい実施形態では、炭素源を反応混合物に連続的に供給して標的化学物質に変換されるようにする。同様に、標的化学物質を別個の相として連続的に取り出し、当技術分野で公知の方法によってさらに精製することが好ましい。それにより、生成物を、そこからさらに精製することができる別個の相中に採取することができるので、生成物の単離が簡易化される。それにより、収率が改善され、生成物の精製が簡易化される。
【０１３９】
さらに好ましい実施形態では、本発明のプロセスは、補因子としてのＡＤＰまたはＡＴＰを必要としない。他のプロセス（ＷｅｌｃｈおよびＳｃｏｐｅｓ、１９８５年；ＡｌｇａｒおよびＳｃｏｐｅｓ、１９８５年）では、ＡＤＰ／ＡＴＰおよびＮＡＤ／ＮＡＤＨなどの補因子が必要である。グルコースからブタノールへの仮定される変換（Ｚｈａｎｇら、２００８年）では、補因子であるＡＤＰ／ＡＴＰ、ＮＡＤ／ＮＡＤＨ、フェレドキシンおよび補酵素Ａが必要である。記載されている無細胞の酵素的プロセス（Ｚｈａｎｇら、２００８年、ＷｅｌｃｈおよびＳｃｏｐｅｓ  １９８５年）の主要な問題はＡＴＰの蓄積である。公知のプロセスでは、ＡＴＰアーゼを添加することにより、望ましくないＡＴＰの蓄積を回避する。しかし、ＡＴＰアーゼの的確な濃度は、基質および種々の中間体の濃度ならびに酵素の活性に左右されるので、これを見つけることは難しい。ＡＴＰアーゼが多すぎても少なすぎても、ＡＴＰの不均衡が生じ、変換が完全に止まる（ＷｅｌｃｈおよびＳｃｏｐｅｓ、１９８５年）。ＡＴＰアーゼの代わりにアルセネートも使用することができ、これにはＡＴＰアーゼと同様の不都合が伴う。対照的に、特に好ましい態様によると、本発明の無細胞プロセスでは、ＡＴＰの最終的な生成を伴わず、またＡＴＰアーゼおよび／またはアルセネートなしで、グルコースなどの炭素源をピルベートに変換し、より好ましくはグルコースを標的化学物質に変換する。
【０１４０】
ピルベートの生成
以下にいくつかの好ましい実施形態がグルコースからのピルベートの生成に関して記載されている。１分子のグルコースから２分子のピルベートが生成される。その後、ピルベートをｎ−ブタノール、イソブタノール、エタノールおよび２−ブタノールなどの標的化学物質に変換することができる。
【０１４１】
本発明の一態様によると、以下の酵素を使用することによってグルコースをピルベートに変換する：
【０１４２】
【表１】
2015530084.tif 000003
【０１４３】
本発明の別の好ましい態様によると、以下の酵素を使用することによってグルコースをピルベートに変換する：
【０１４４】
【表２】
2015530084.tif 000004
【０１４５】
本発明の別の好ましい態様によると、以下の酵素を使用することによってグルコースをピルベートに変換する：
【０１４６】
【表３】
2015530084.tif 000005
【０１４７】
本発明の別の好ましい態様によると、以下の酵素を使用することによってグルコースをピルベートに変換する：
【０１４８】
【表４】
2015530084.tif 000006
【０１４９】
本発明の別の好ましい態様によると、以下の酵素を使用することによってグルコースをピルベートに変換する：
【０１５０】
【表５】
2015530084.tif 000007
【０１５１】
本発明の別の好ましい態様によると、以下の酵素を使用することによってグルコースをピルベートに変換する：
【０１５２】
【表６】
2015530084.tif 000008
【０１５３】
本発明の別の好ましい態様によると、以下の酵素を使用することによってグルコースをピルベートに変換する：
【０１５４】
【表７】
2015530084.tif 000009
【０１５５】
本発明の別の好ましい態様によると、以下の酵素を使用することによってグルコースをピルベートに変換する：
【０１５６】
【表８】
2015530084.tif 000010
【０１５７】
酵素の組合せＰ−ｘ（すなわち、Ｐ−１、Ｐ−２−ａ、Ｐ−２−ｂ、Ｐ−２−ｃ、Ｐ−２−ｄ、Ｐ−３−ａ、Ｐ−３−ｂ、およびＰ−３−ｃ）の全てにおいて、２つのＮＡＤ等価物の還元と併せて、１ｍｏｌのグルコースが２モルのピルベートに変換される。天然の経路のリン酸化ステップおよび脱リン酸化ステップを排除し、したがって、必要な酵素の数を減らすために、本発明では、例えば、グリセレートからピルベートへの転換とグルコネートから２−ケト−３−デオキシグルコネートへの転換の両方を触媒する古細菌ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）の基質柔軟な許容性を活用する。ＤＨＡＤの分子効率により、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２００６年、２８１巻、１４７９６〜１４８０４頁）、グルコネート／グリセレート／ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）（Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２００６年、１３９巻、５９１〜５９６頁）、２−ケト−３−デオキシグルコネートアルドラーゼ（ＫＤＧＡ）（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ２００７年、４０３巻、４２１〜４３０頁）およびグリセルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．  ２００６年、３９７巻、１３１〜１３８頁）のただ４種のみの酵素を用いたグルコースからピルベートへの集約された変換が可能になる。ＡＬＤＨはＤＨＡＤと共に、アルドール切断によって生成されるグリセルアルデヒドをピルベートの形成に方向転換させる。無細胞反応カスケードの酵素は、それらの安定性および選択性に基づいて選択される。
【０１５８】
本発明の好ましい実施形態は、ＮＡＤＨ活性を改善するために最適化された酵素の使用である。
【０１５９】
グルコースをピルベートに変換するための酵素は、以下の酵素の一覧（情報：酵素の名称、括弧内にＥ．Ｃ．番号、供給源の生物体、該当する場合には、ＮＣＢＩ／Ｇｅｎｅ番号、該当する場合には、突然変異、該当する場合には、配列番号）から選択されることが好ましい：
・グルコースデヒドロゲナーゼＧＤＨ（ＥＣ１．１．１．４７）、スルフォロブス・ソルファタリクス、ＮＰ３４４３１６．１、配列番号０２
・ジヒドロキシ酸デヒドラターゼＤＨＡＤ（ＥＣ４．２．１．９）、スルフォロブス・ソルファタリクス、ＮＰ３４４４１９．１、配列番号０４
・グルコネートデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．３９）、スルフォロブス・ソルファタリクス、ＮＰ＿３４４５０５
・グルコネートデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．３９）、スルフォロブス・ソルファタリクス、ＮＰ＿３４４５０５、突然変異Ｉ９Ｌ
・グルコネートデヒドラターゼｉｌｖＥＤＤ（ＥＣ４．２．１．３９）、アクロモバクター・キシロソキシダンス
・グルコネートデヒドラターゼｉｌｖＥＤＤ（ＥＣ４．２．１．３９）、メタロスパエラ・セドゥラ  ＤＳＭ５３４８
・グルコネートデヒドラターゼｉｌｖＥＤＤ（ＥＣ４．２．１．３９）、テルモプラズマ・アキドピルム  ＤＳＭ１７２８
・グルコネートデヒドラターゼｉｌｖＥＤＤ（ＥＣ４．２．１．３９）、テルモプラズマ・アキドピルム  ＤＳＭ１７２８
・２−ケト−３−デオキシグルコネートアルドラーゼＫＤＧＡ（ＥＣ４．１．２．１４）、スルフォロブス・ソルファタリクス、ＮＰ３４４５０４．１
・２−ケト−３−デオキシグルコネートアルドラーゼＫＤＧＡ（ＥＣ４．１．２．１４）、スルフォロブス・アキドカルダリウス、配列番号０６
・アルデヒドデヒドロゲナーゼＡＬＤＨ（ＥＣ１．２．１．３）、フラボバクテリウム・フリジディマリス、ＢＡＢ９６５７７．１
・アルデヒドデヒドロゲナーゼＡＬＤＨ（ＥＣ１．２．１．３）、テルモプラズマ・アキドピルム、配列番号０８
・アルデヒドデヒドロゲナーゼＡＬＤＨ（ＥＣ１．２．１．３）、テルモプラズマ・アキドピルム、突然変異Ｆ３４Ｍ＋Ｙ３９９Ｃ＋Ｓ４０５Ｎ、配列番号１０
・グリセレートキナーゼ（ＥＣ２．７．１．）、スルフォロブス・ソルファタリクス、ＮＰ＿３４２１８０．１
・グリセレート２−キナーゼ（ＥＣ２．７．１．１６５）、スルフォロブス・トコダイ、ＵｎｉｐｒｏｔＱ９６ＹＺ３．１
・エノラーゼ（ＥＣ４．２．１．１１）、スルフォロブス・ソルファタリクス、ＮＰ３４２４０５．１
・ピルベートキナーゼ（ＥＣ２．７．１．４０）、スルフォロブス・ソルファタリクス、ＮＰ３４２４６５．１
・グリセレートデヒドロゲナーゼ／ヒドロキシピルベートレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．２９／１．１．１．８１）、ピクロフィルス・トリダス、ＹＰ＿０２３８９４．１
・セリン−ピルベートトランスアミナーゼ（ＥＣ２．６．１．５１）、スルフォロブス・ソルファタリクス、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎ  ＩＤ：ＮＰ＿３４３９２９．１
・Ｌ−セリンアンモニアリアーゼ（ＥＣ４．３．１．１７）、ＥＣ４．３．１．１７、サーマス・サーモフィルス、ＹＰ＿１４４２９５．１およびＹＰ＿１４４００５．１
・アラニンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．１）、サーマス・サーモフィルス、ＮＣＢＩ−Ｇｅｎ  ＩＤ：ＹＰ＿００５７３９．１
【０１６０】
本発明の好ましい実施形態では、グルコースをピルベートに変換するための酵素は、以下の酵素の一覧から選択される：
・グルコースデヒドロゲナーゼＧＤＨ（ＥＣ１．１．１．４７）、スルフォロブス・ソルファタリクス、ＮＰ３４４３１６．１
・ジヒドロキシ酸デヒドラターゼＤＨＡＤ（ＥＣ４．２．１．９）、スルフォロブス・ソルファタリクス、ＮＰ３４４４１９．１
・グルコネートデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．３９）、スルフォロブス・ソルファタリクス、ＮＰ＿３４４５０５、突然変異Ｉ９Ｌ
・ＫＤＧＡ（ＥＣ４．１．２．１４）、スルフォロブス・アキドカルダリウス
・ＡＬＤＨ（ＥＣ１．２．１．３）、テルモプラズマ・アキドピルム
【０１６１】
グルコースからピルベートへの変換に関して上に列挙されている酵素の組合せは、ガラクトースまたはグルコースとガラクトースの混合物をピルベートに変換するためにも使用することができる。それにより、ガラクトースは、ガラクトネート、および２−ケト−３−デオキシ−ガラクトネートを経由してピルベートおよびグリセレートに変換される。次いで、グリセレートが上記の通り変換される。
【０１６２】
ガラクトースからガラクトネートへの変換は、ガラクトースを許容するデヒドロゲナーゼによって、より好ましくはグルコースとガラクトースの両方を許容するデヒドロゲナーゼによって行われることが好ましい。ガラクトネートから２−ケト−３−デオキシ−ガラクトネートへの変換は、ガラクトネートを許容するデヒドラターゼによって、より好ましくは、グルコネートとガラクトネートの両方を許容するデヒドラターゼによって行われることが好ましい。２−ケト−３−デオキシ−ガラクトネートの変換は、２−ケト−３−デオキシ−ガラクトネートを許容するアルドラーゼによって、より好ましくは２−ケト−３−デオキシ−グルコネートと２−ケト−３−デオキシ−ガラクトネートの両方を許容するアルドラーゼによって行われることが好ましい。
【０１６３】
特に好ましい態様では、そのような酵素は、以下の酵素から選択される：
・グルコースデヒドロゲナーゼＧｄｈＡ、ピクロフィルス・トリダス（Ｌｉｅｂｌ、Ｗ．ら、２００５年、ＦＥＢＳ  Ｊ．  ２７２巻  （４号）：  １０５４頁）
・ジヒドロキシ酸デヒドラターゼＤＨＡＤ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔｏｒｉｃｕｓ（Ｋｉｍ、Ｓ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２００６年、１３９巻  （３号）：  ５９１頁）
・ＫＤＧａｌアルドラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ７５６８２）
【０１６４】
ｎ−ブタノールの生成：
特に好ましい実施形態では、ピルベートからｎ−ブタノールを生成する。
【０１６５】
ピルベートからアセチルＣｏＡへの変換に関しては種々の選択肢が存在する。本発明の一実施形態では、変換のために以下の酵素の１種または複数種を使用する：（ｉ）ピルベートオキシドレダクターゼ、フェレドキシンを補因子として使用する；（ｉｉ）ピルベートデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを補因子として使用する；（ｉｉｉ）ピルベートホルメートリアーゼ；（ｉｖ）ピルベートデヒドロゲナーゼ酵素複合体。
【０１６６】
好ましい実施形態では、この変換のための酵素としてピルベートデヒドロゲナーゼを使用し、ＮＡＤＨを補因子として使用する。ピルベートデヒドロゲナーゼは、通常、３つの酵素活性からなり、約１Ｍｉｏ  Ｄａの分子量を有する多酵素複合体（ピルベートデヒドロゲナーゼ複合体、ＰＤＨＣ）の一部である。無細胞反応系に適用するために、小さくロバストな複合体形成していない酵素を有することが有益である。したがって、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）由来のピルベートデヒドロゲナーゼを使用できることが見いだされている。この酵素は単独であり複合体を形成していない。さらに、この酵素はＮＡＤＨを補因子として使用する。
【０１６７】
あるいは、ピルベートホルメートリアーゼを、ＮＡＤＨを補因子として使用するホルメートデヒドロゲナーゼと組み合わせることができる。
【０１６８】
アセチルＣｏＡからｎ−ブタノールへの変換に関しては種々の選択肢が存在し、Ｃ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、Ｃ．サッカロブチリカム（Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、Ｃ．サッカロペルブチルアセトニカム（Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）、Ｃ．ベイジェリンキ（Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）などのｎ−ブタノール生成細菌由来の酵素を使用する。
【０１６９】
本発明の好ましい態様によると、以下の酵素を使用することによってピルベートをｎ−ブタノールに変換する：
【０１７０】
【表９】
2015530084.tif 000011
【０１７１】
ピルベートを生成するための酵素の組合せ（Ｐ−１、Ｐ−２−ａ、Ｐ−２−ｂ、Ｐ−２−ｃ、Ｐ−２−ｄ、Ｐ−３−ａ、Ｐ−３−ｂ、およびＰ−３−ｃ）のいずれかとｎ−ブタノールを生成するための酵素の組合せ（Ｎ−１）のいずれかを組み合わせると、１分子のグルコースから２分子のＣＯ２、１分子の水および１分子のｎ−ブタノールへの最終的な変換が実現される。
【０１７２】
ピルベートをｎ−ブタノールに変換するための酵素は、以下の酵素の一覧（情報：酵素の名称、括弧内にＥ．Ｃ．番号、供給源の生物体、該当する場合には、ＮＣＢＩ／Ｇｅｎｅ番号、該当する場合には、突然変異、該当する場合には、配列番号）から選択されることが好ましい：
・チオラーゼ（ＥＣ２．３．１．１６）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、ＮＣＢＩ−ＧｅｎＩＤ  ＮＰ＿３４９４７６．１
・３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１５７）、ＮＰ＿３４９３１４．１
・クロトナーゼ（ＥＣ４．２．１．５５）、クロストリジウム・アセトブチリカム、ＮＰ＿３４９３１８．１
・ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．３．９９．２）、クロストリジウム・アセトブチリカム、ＮＣＢＩ−ＧｅｎＩＤ  ＮＰ＿３４９３１７．１、
・補酵素Ａアシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．５７）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、ＮＣＢＩ−ＧｅｎＩＤ  ＡＦ１３２７５４＿１）
・ＮＡＤＨ依存性ブタノールデヒドロゲナーゼＢ（ＢＤＨ  ＩＩ）（ＥＣ１．１．１．−）、クロストリジウム・アセトブチリカム、ＮＣＢＩ−ＧｅｎＩＤ  ＮＰ＿３４９８９１．１
・電子伝達フラビンタンパク質（ｅｔｆＡおよび／またはＢ）、クロストリジウム・アセトブチリカム、ＮＣＢＩ−ＧｅｎＩＤ  ＮＰ＿３４９３１５．１およびＮＰ＿３４９３１６．１
【０１７３】
イソブタノールの生成
別の特に好ましい実施形態では、ピルベートからイソブタノールを生成する。ピルベートからイソブタノールへの変換に関しては種々の選択肢が存在する。
【０１７４】
本発明の好ましい態様によると、以下の酵素を使用することによってピルベートをイソブタノールに変換する：
【０１７５】
【表１０】
2015530084.tif 000012
【０１７６】
ピルベートを生成するための酵素の組合せ（Ｐ−１、Ｐ−２−ａ、Ｐ−２−ｂ、Ｐ−２−ｃ、Ｐ−２−ｄ、Ｐ−３−ａ、Ｐ−３−ｂ、およびＰ−３−ｃ）のいずれかとイソブタノールを生成するための酵素の組合せ（Ｉ−１）のいずれかを組み合わせると、１分子のグルコースから２分子のＣＯ２、１分子の水および１分子のイソブタノールへの最終的な変換が実現される。
【０１７７】
ピルベートをイソブタノールに変換するための酵素は、以下の酵素の一覧（情報：酵素の名称、括弧内にＥ．Ｃ．番号、供給源の生物体、該当する場合には、ＮＣＢＩ／Ｇｅｎｅ番号、該当する場合には、突然変異、該当する場合には、配列番号）から選択されることが好ましい：
・アセトラクテートシンターゼＡＬＳ（ＥＣ２．２．１．６）、バチラス・サブチリス、配列番号１２
・アセトラクテートシンターゼＡＬＳ（ＥＣ２．２．１．６）、スルフォロブス・ソルファタリクス、ＮＣＢＩ−ＧｅｎＩＤ：ＮＰ＿３４２１０２．１
・アセトラクテートシンテターゼＡＬＳ（ＥＣ：２．２．１．６）、サーモトガ・マリティマ、ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：ＮＰ＿２２８３５８．１
・ケトール酸レダクトイソメラーゼＫＡＲＩ（ＥＣ１．１．１．８６）、メイオサーマス・ルバー、配列番号１４
・ケトール酸レダクトイソメラーゼＫＡＲＩ（ＥＣ１．１．１．８６）、スルフォロブス・ソルファタリクス、ＮＣＢＩ−ＧｅｎＩＤ：ＮＰ＿３４２１００．１
・ケトール酸レダクトイソメラーゼＫＡＲＩ（ＥＣ．１．１．１．８６）、サーモトガ・マリティマ、ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：ＮＰ＿２２８３６０．１
・分岐鎖−２−オキソ酸デカルボキシラーゼＫＤＣ（ＥＣ４．１．１．７２）、ラクトコッカス・ラクチス、配列番号１６
・α−ケトイソバレレートデカルボキシラーゼＫＤＣ、（ＥＣ４．１．１．−）、ラクトコッカス・ラクチス、ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：ＣＡＧ３４２２６．１
・ジヒドロキシ酸デヒドラターゼＤＨＡＤ（ＥＣ４．２．１．９）、スルフォロブス・ソルファタリクス、ＮＰ３４４４１９．１、配列番号０４
・ジヒドロキシ酸デヒドラターゼＤＨＡＤ、（ＥＣ：４．２．１．９）、サーモトガ・マリティマ、ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：ＮＰ＿２２８３６１．１
・アルコールデヒドロゲナーゼＡＤＨ（ＥＣ１．１．１．１）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス、配列番号１８
・アルコールデヒドロゲナーゼＡＤＨ（ＥＣ１．１．１．１）、フラボバクテリウム・フリジディマリス、ＮＣＢＩ−ＧｅｎＩＤ：ＢＡＢ９１４１１．１
・アルコールデヒドロゲナーゼＡＤＨ（ＥＣ：１．１．１．１）、Ｓ．セレビシエ
【０１７８】
本発明の好ましい実施形態では、ピルベートをイソブタノールに変換するための酵素は、以下の酵素の一覧から選択される：
・アセトラクテートシンターゼＡＬＳ（ＥＣ２．２．１．６）、バチラス・サブチリス、配列番号１２
・ケトール酸レダクトイソメラーゼＫＡＲＩ（ＥＣ１．１．１．８６）、メイオサーマス・ルバー、配列番号１４
・分岐鎖−２−オキソ酸デカルボキシラーゼＫＤＣ（ＥＣ４．１．１．７２）、ラクトコッカス・ラクチス、配列番号１６
・ジヒドロキシ酸デヒドラターゼＤＨＡＤ（ＥＣ４．２．１．９）、スルフォロブス・ソルファタリクス、ＮＰ３４４４１９．１、配列番号０４
・アルコールデヒドロゲナーゼＡＤＨ（ＥＣ１．１．１．１）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス、配列番号１８
【０１７９】
本発明のさらに特に好ましい実施形態では、グルコネートを２−ケト−３−デオキシグルコネートに変換するため、グリセレートをピルベートに変換するため、および２，３−ジヒドロキシイソバレレートを２−ケト−イソバレレートに変換するために単一のデヒドラターゼを使用することができる。したがって、酵素の組合せＰ−１、Ｐ−２−ａ、Ｐ−２−ｂ、Ｐ−２−ｃ、Ｐ−２−ｄ、Ｐ−３−ａ、Ｐ−３−ｂ、およびＰ−３−ｃにおける酵素活性＃２および酵素の組合せＩ−１における酵素活性＃３のために単一の酵素を使用することができる。
【０１８０】
エタノールの生成
本発明の別の実施形態では、標的化学物質はエタノールである。ピルベートからエタノールへの変換に関しては種々の選択肢が存在する。
【０１８１】
本発明の好ましい態様によると、以下の酵素を使用することによってピルベートをエタノールに変換する：
【０１８２】
【表１１】
2015530084.tif 000013
【０１８３】
ピルベートを生成するための酵素の組合せ（Ｐ−１、Ｐ−２−ａ、Ｐ−２−ｂ、Ｐ−２−ｃ、Ｐ−２−ｄ、Ｐ−３−ａ、Ｐ−３−ｂ、およびＰ−３−ｃ）のいずれかとエタノールを生成するための酵素の組合せ（Ｅ−１）のいずれかを組み合わせると、１分子のグルコースから２分子のＣＯ２、および２分子のエタノールへの最終的な変換が実現される。
【０１８４】
本発明の好ましい実施形態は、ＮＡＤＨ活性を改善するために最適化された酵素の使用である。
【０１８５】
ピルベートをエタノールに変換するための酵素は、以下の酵素の一覧（情報：酵素の名称、括弧内にＥ．Ｃ．番号、供給源の生物体、該当する場合には、ＮＣＢＩ／Ｇｅｎｅ番号、該当する場合には、突然変異、該当する場合には、配列番号）から選択されることが好ましい：
・ピルベートデカルボキシラーゼＰＤＣ（ＥＣ４．１．１．１）、ザイモモナス・モビナス、配列番号２０
・アルコールデヒドロゲナーゼＡＤＨ（ＥＣ１．１．１．１）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス、配列番号１８
【０１８６】
２−ブタノールの生成
本発明の別の実施形態では、標的化学物質は２−ブタノールである。ピルベートから２−ブタノールへの変換に関しては種々の選択肢が存在する。
【０１８７】
本発明の好ましい態様によると、以下の酵素を使用することによってピルベートを２−ブタノールに変換する：
【０１８８】
【表１２】
2015530084.tif 000014
【０１８９】
さらに好ましい実施形態では、アセトインならびに２−ブタノンを基質として使用するアルコールデヒドロゲナーゼを使用する。したがって、以下の酵素を使用することによってピルベートを２−ブタノールに変換する：
【０１９０】
【表１３】
2015530084.tif 000015
【０１９１】
【表１４】
2015530084.tif 000016
【０１９２】
ピルベートを生成するための酵素の組合せ（Ｐ−１、Ｐ−２−ａ、Ｐ−２−ｂ、Ｐ−２−ｃ、Ｐ−２−ｄ、Ｐ−３−ａ、Ｐ−３−ｂ、およびＰ−３−ｃ）のいずれかと２−ブタノールを生成するための酵素の組合せ（Ｔ−１、Ｔ−２、Ｔ−２ａ）のいずれかを組み合わせると、１分子のグルコースから２分子のＣＯ２、１分子の水および１分子の２−ブタノールの最終的な変換が実現される。
【０１９３】
本発明の好ましい実施形態は、ＮＡＤＨ活性を改善するために最適化された酵素の使用である。
【図面の簡単な説明】
【０１９４】
【図１】最小化された反応カスケードによるエタノールおよびイソブタノールへの無細胞反応経路の概略図である。反応の最初の部分（上の枠）では、グルコースが２分子のピルベートに変換される。反応カスケードの第２の部分では、所望の最終生成物および適用する酵素に応じて、ピルベートをエタノールに向けることもでき（右下の枠）、イソブタノール合成に向けることもできる（左下の枠）。明確にするために、反応で得られるまたは放出されるプロトンならびにＣＯ２およびＨ２Ｏの分子は示していない。
【図２】エタノールの無細胞合成に関するグラフである。ａ．濃度＞５ｍＭの中間体；黒塗りの丸：グルコース濃度、白抜きの丸：グルコネート濃度、黒塗りの三角：エタノール。ｂ．濃度＜５ｍＭの中間体；黒塗りの丸、破線：ＫＤＧ、白抜きの丸、破線：ピルベート、黒塗りの三角、破線：グリセレート、白抜きの三角形、破線：アセトアルデヒド。（エタノール濃度とのより良好な比較を可能にするために、グルコース、グルコネートおよびＫＤＧの濃度を２倍していることに留意されたい（１ｍｏｌのグルコースが２ｍｏｌのエタノールに変換される）。データポイントは全て３つの独立した実験からの平均値を示す）。
【図３】イソブタノールの無細胞合成に関するグラフである。ａ：濃度＞２ｍＭの中間体；黒塗りの丸：グルコース濃度、白抜きの丸：グルコネート濃度、黒塗りの三角：イソブタノール。ｂ：濃度＜２ｍＭの中間体；黒塗りの丸、破線：ＫＤＧ、点、破線：ピルベート、黒塗りの三角、破線：グリセレート、白抜きの四角、破線：イソブチルアルデヒド；白抜きの丸、破線：ＫＩＶ。ＤＨＩＶは全く検出することができなかった。データポイントは全て３つの独立した実験からの平均値を示す。
【図４】種々のイソブタノール濃度におけるエタノールの生成に関するグラフである。黒塗りのひし形、直線：０％イソブタノール；白抜きのひし形、点線：２％イソブタノール；黒塗りのひし形、破線：４％イソブタノール；白抜きのひし形、一点短鎖線：６％イソブタノール。ｂ：イソブタノール濃度に対してプロットしたエタノールの生成速度（ｍＭ／ｈ）。
【実施例】
【０１９５】
本発明を以下の例でさらに定義する。これらの例は、単に例示として示されており、本発明の範囲を限定しないことが理解されるべきである。上記の考察およびこれらの例から、当業者は、本発明の本質的な特性を確認することができ、また、その主旨および範囲から逸脱することなく本発明の種々の変化および改変を種々の使用および条件に適合させることができる。
【０１９６】
本明細書に記載されている実験における基質および生成物の濃度は同じ程度に低い。プロセスをより経済的にするために、生成物を容易に分離することを可能にするために、生成物の濃度を溶解限度、例えばイソブタノールに関しては２０℃で１．２８Ｍ（約９５ｇ／ｌ）よりも上昇させることができる。生成物の溶解性は、プロセス温度を上昇させることおよび塩濃度を調整することによっても低下させることができる。
【０１９７】
一実施形態では、記載されている系において１ｍｏｌのグルコースまたはガラクトースが１ｍｏｌのイソブタノールに変換され、したがって、基質濃度は、所望の最終濃度（例えば、２３０ｇ／ｌのグルコースまたはガラクトース）またはそれよりも高い濃度に応じて選択する。
【０１９８】
さらに、酵素および補因子が、例えば、固定化によって保持されるとすれば、一定の基質供給（グルコースシロップ）および生成物の取り出し（有機相）を含む連続的に実行されるプロセスがさらに有利である。
【０１９９】
例１（エタノールの合成）
無細胞合成ツールボックスの実現性の一般的な一例では、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、グルコネート／グリセレート／ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）、２−ケト−３−デオキシグルコネートアルドラーゼ（ＫＤＧＡ）およびグリセルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）を含む４種の酵素を用いたグルコースまたはガラクトースからピルベートへの変換の酵素カスケードを使用して、グルコースまたはガラクトースをピルベートに変換する。本例で使用するＡＬＤＨは、例４において確立された配列番号１０によって定義される。
【０２００】
その後の二段階反応において、ピルベートデカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｃａｔａｌ．  Ｂ−Ｅｎｚｙｍ．  ２００９年、６１巻、３０〜３５頁）およびアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  １９９８年、１１巻、９２５〜９３０頁）の作用により、ピルベートをアセトアルデヒドに変換し、次いでエタノールに変換した。ザイモモナス・モビナス由来のＰＤＣは熱耐性および活性が比較的高いので、これを選択した。中温性起源であるにもかかわらず、Ｚ．ｍ．ＰＤＣは、より熱に安定な酵素の温度範囲と一致して５０℃に至るまで熱安定性である（表１０参照）。したがって、５０℃で実験を行った。必要な酵素６種をＥ．ｃｏｌｉにおいて組換えにより発現させ、異なる精製レジメンに供した。この酵素のセットを５ｍＭのＮＡＤと一緒に使用すると、１９時間で２５ｍＭのグルコースが２８．７ｍＭのエタノールに変換された（モル収率５７．４％）（図２）。最初の基質および補因子の濃度に基づいて、これらの結果により、ＮＡＤおよびＮＡＤＨの再利用が上首尾であったこと、ならびに、全体的な生成物の収率が５０％を超えるので、２−ケト−３−デオキシグルコネートの切断によって生じるグリセルアルデヒドがピルベートに首尾よく方向転換されたことが明白に実証される。エタノールおよびグルコースの次に、グルコネート、２−ケト−３−デオキシグルコネート、ピルベート、グリセレートおよびアセトアルデヒドなどの反応中間体を反応過程中にモニターした。特に、ＤＨＡＤの基質であるグルコネートについて、反応の最初の１０時間に８ｍＭに至るまでの一過性の蓄積が検出された。対照的に、グリセレートおよびアセトアルデヒド濃度は４ｍＭを超えず、ピルベートは検出可能でなかった。
【０２０１】
残留する中間体は一般に最後に蓄積するが、グルコネートの最大値は反応過程中の８時間から１０時間の間に測定された。特に、ラクテートおよびアセテートなどの望ましくない副生成物は検出されず、これにより、選択した酵素によって必要な基質特異性がもたらされたことが示される。酵素に触媒される反応は実験の間に完了しなかったが、全ての検出可能な中間体および生成物の累積質量により、８０％を超える収率がもたらされた。
【０２０２】
【表１５】
2015530084.tif 000017
【０２０３】
表１：エタノールの無細胞合成に使用する酵素。ａ：天然の基質に対する活性、基質として、ＤＨＡＤについてはグルコネート、グリセレートおよびジヒドロキシイソバレレート、ＡＤＨについてはアセトアルデヒドおよびイソブチルアルデヒド（ｒｅｓｐ．）；ｂ：溶解性を上回る、ｃ：酵素を工学的に操作した、Ｅ５０：５０％活性減少を引き起こすエタノール濃度。Ｉ５０：５０％活性減少を引き起こすイソブタノール濃度；ｎ．ｄ．：決定されず。（［１］  Ｓ．  Ｗｏｌｔｅｒｉｎｋ−ｖａｎ  Ｌｏｏ、Ａ．  ｖａｎ  Ｅｅｒｄｅ、Ｍ．  Ａ．  Ｊ．  Ｓｉｅｍｅｒｉｎｋ、Ｊ．  Ａｋｅｒｂｏｏｍ、Ｂ．  Ｗ．  Ｄｉｊｋｓｔｒａ、Ｊ．  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｏｏｓｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ２００７年、４０３巻、４２１〜４３０頁；［２］  Ｍ．  Ｒｅｈｅｒ、Ｐ．  Ｓｃｈｏｎｈｅｉｔ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ２００６年、５８０巻、１１９８〜１２０４頁；［３］  Ｇ．  Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎｏ、Ｒ．  Ｃａｎｎｉｏ、Ｍ．  Ｒｏｓｓｉ、Ｓ．  Ｂａｒｔｏｌｕｃｃｉ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  １９９８年、１１巻、９２５〜９３０頁）
【０２０４】
例２（イソブタノールの合成）
この例では、完全に無細胞の環境における、ただ４種の追加的な酵素（図２、表２を参照されたい）を使用したピルベートからイソブタノールへの変換が上首尾であることが実証される。最初に、ピルベート２分子がアセトラクテート合成酵素（ＡＬＳ）によって連結されて（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  ２００７年、２７２巻、３０〜３４頁）アセトラクテートがもたらされ、これがケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）によってさらに変換され（Ａｃｃｏｕｎｔｓ  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．  ２００１年、３４巻、３９９〜４０８頁）、天然のＤＨＡＤの基質であるジヒドロキシイソバレレートが生じる。次いで、ＤＨＡＤによりジヒドロキシイソバレレートが２−ケトイソバレレートに変換される。
【０２０５】
【表１６】
2015530084.tif 000018
【０２０６】
表２：イソブタノールの無細胞合成に使用する酵素。ａ：天然の基質に対する活性、基質として、ＤＨＡＤについてはグルコネート、グリセレートおよびジヒドロキシイソバレレート、ＡＤＨについてはアセトアルデヒドおよびイソブチルアルデヒド（ｒｅｓｐ．）；ｂ：溶解性を上回る、ｃ：酵素を工学的に操作した、Ｅ５０：５０％活性減少を引き起こすエタノール濃度。Ｉ５０：５０％活性減少を引き起こすイソブタノール濃度；ｎ．ｄ．：決定されず。（［１］  Ｓ．  Ｗｏｌｔｅｒｉｎｋ−ｖａｎ  Ｌｏｏ、Ａ．  ｖａｎ  Ｅｅｒｄｅ、Ｍ．  Ａ．  Ｊ．  Ｓｉｅｍｅｒｉｎｋ、Ｊ．  Ａｋｅｒｂｏｏｍ、Ｂ．  Ｗ．  Ｄｉｊｋｓｔｒａ、Ｊ．  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｏｏｓｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ２００７年、４０３巻、４２１〜４３０頁；［２］  Ｍ．  Ｒｅｈｅｒ、Ｐ．  Ｓｃｈｏｎｈｅｉｔ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ２００６年、５８０巻、１１９８〜１２０４頁；［３］  Ｇ．  Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎｏ、Ｒ．  Ｃａｎｎｉｏ、Ｍ．  Ｒｏｓｓｉ、Ｓ．  Ｂａｒｔｏｌｕｃｃｉ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  １９９８年、１１巻、９２５〜９３０頁；［４］  Ｆ．  Ｗｉｅｇｅｓｈｏｆｆ、Ｍ．  Ａ．  Ｍａｒａｈｉｅｌ、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  ２００７年、２７２巻、３０〜３４頁；および［５］  Ｄ．  Ｇｏｃｋｅ、Ｃ．  Ｌ．  Ｎｇｕｙｅｎ、Ｍ．  Ｐｏｈｌ、Ｔ．  Ｓｔｉｌｌｇｅｒ、Ｌ．  Ｗａｌｔｅｒ、Ｍ．  Ｍｕｅｌｌｅｒ、Ａｄｖ．  Ｓｙｎｔｈ．  Ｃａｔａｌ．  ２００７年、３４９巻、１４２５〜１４３５頁）
【０２０７】
酵素２−ケト酸デカルボキシラーゼ（ＫＤＣ）（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｃａｔａｌ．  Ｂ−Ｅｎｚｙｍ．  ２００９年、６１巻、３０〜３５頁）およびＡＤＨ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  １９９８年、１１巻、９２５〜９３０頁）により、イソブチルアルデヒドを経由して、最終生成物であるイソブタノールが生成される。再度、ＤＨＡＤの基質特異性の不明確さ（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ａｍｂｉｇｕｉｔｙ）を活用して、必要な酵素の総数を最小化する。
【０２０８】
エタノールの生成と類似して、一般的なピルベート合成経路の酵素は、以下の３種の生体触媒とは、熱安定性、溶媒耐性および活性プロファイルに関して異なる（表２）。実験の比較を可能にするために、反応条件は、以前に記載されているものと同じままにした。酵素の活性は、反応中のグルコース１ｍＭ当たり、ＧＤＨについては０．１２Ｕ、ＤＨＡＤについては０．６Ｕ、および残りの酵素については０．２Ｕに調整した。測定値により、２３時間以内に１９．１ｍＭのグルコースが１０．３ｍＭのイソブタノールに変換されたことが示され、これはモル収率５３％に対応する（図４）。反応の最初の１０時間、生成物の形成速度は０．７ｍＭ／ｈであり、これは、エタノールの形成速度２．２ｍＭ／ｈと同様である（１ｍｏｌのグルコースから、１ｍｏｌのイソブタノールの代わりに２ｍｏｌのエタノールが生成される）。エタノールの合成とは対照的に、ＤＨＡＤの基質であるグルコネートおよびグリセレートの蓄積はほんの微量のみ検出され、これらの中間体のそれぞれについて最大で１．８ｍＭが生じた。２−ケト−３−デオキシグルコネート、ピルベート、２−ケトイソバレレート、およびイソブチルアルデヒドなどの追加的な反応中間体は低濃度（最大１．２ｍＭ）で測定されたが、測定の終わりに向かってゆっくりと上昇した。再度、基質の変換はモニターした時間内に完了しなかった。無細胞エタノール生合成と同様に、全ての検出可能な中間体を定量化することにより、８０％の収率が得られた。
【０２０９】
グルコースを用いたイソブタノールの生成と類似して、ガラクトースを基質として使用した。実験の比較を可能にするために、反応条件は同じままにした。測定値により、ガラクトースが２３時間以内に７．５ｍＭのイソブタノールに変換されたことが示され、これは、モル収率３８％に対応する。
【０２１０】
例３（溶媒耐性）
無細胞系の重要な特性は、高級アルコールに対する耐性が著しいことである。人工的な酵素カスケードの溶媒耐性を評価するために、グルコースからエタノールへの変換を、漸増濃度のイソブタノールの存在下で例１と同様に行った（図４）。
【０２１１】
おそらく膜完全性が喪失することにより、わずかなイソブタノール濃度（約１％ｖ／ｖ）で早くも生産性の減少が生じる微生物細胞とは対照的に、無細胞エタノールの生産性および反応カイネティクスは４％（ｖ／ｖ）に至るまでのイソブタノール濃度の影響を有意に受けなかった。６％（ｖ／ｖ）のイソブタノールの存在下でのみ、エタノール生産性が急速に減退した（８時間で１．４ｍＭのエタノール）。これにより、無細胞プロセスは、同等の全細胞系よりもはるかに高溶媒濃度に対して耐性である可能性があることが実証される。現行のデータに基づいて、ＡＬＤＨは、３％（ｖ／ｖ）のイソブタノールで早くも活性に対する有害作用が誘導されるので、その溶媒耐性は最低である。対照的に、ＫＤＧＡは、生成物の力価が１２％（ｖ／ｖ）を上回ると自然に形成される二相イソブタノール／水系においてさえ完全に活性なままである（表２参照）。５０％ＤＭＳＯを含有する反応培地において活性なままである、工学的に操作したトランスアミナーゼに関して示されている通り、そのような欠点は、それぞれのタンパク質を工学的に操作することによって対処することができる。比較すると、全細胞を溶媒耐性について工学的に操作するための上首尾の例も簡単な技術も存在しない。無細胞経路において利用される全ての酵素を、ＫＤＧＡと同様の溶媒耐性になるように工学的に操作することもでき、安定な天然に存在する等価物と交換し、したがって、イソブタノールの生成を２相系で実現することもできることが予測される。単純な相分離によって生成物を回収することにより、下流の処理が著しく単純化され（Ｉｎｄ．  Ｅｎｇ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．  ２００９年、４８巻、７３２５〜７３３６頁）、また、これは、無細胞系では予想できるが、微生物発酵によって実現される可能性はほとんどない。
【０２１２】
例４（ＴａＡＬＤＨの定向進化）
ランダム突然変異誘発によるＴａ−ａｌｄｈライブラリーの生成：
Ｊａｅｇｅｒら（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００１年、５５巻  （５号）：  ５１９〜５３０頁）のプロトコールに従い、エラープローン条件下でＰＣＲによってＴａ−ａｌｄｈ遺伝子にランダム突然変異を導入した。突然変異したＴａ−ａｌｄｈ遺伝子を精製し、切り取り、ｐＣＢＲ−Ｃｈｉｓにライゲーションし（ＸｂａＩおよびＢｓａｌによって）、それを使用してＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換して、発現ライブラリーを創出した。ランダム突然変異誘発によって創出されたＴａ−ａｌｄｈライブラリーは、Ｔａ−ａｌｄｈ遺伝子当たり１．３〜３塩基対の変化を有すると算出された。この算出は、ＰＣＲ反応において０．１ｍｍｏｌ／ｌの濃度のＭｎＣｌ２により、１０００塩基当たり約１〜２塩基の突然変異率がもたらされるという参考文献に基づいた。Ｔａ−ａｌｄｈ遺伝子は１５１５塩基を含有する。
【０２１３】
以下のプライマー、反応条件および温度プログラムをＰＣＲ反応に使用した：
・プライマー：
Ｆｗ−Ｍｕｔ（６５℃）      ＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＣＣＣ
Ｒｅｖ−Ｍｕｔ（６５℃）    ＣＴＴＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＣＧＧＡＴＣＴＣ
・ＰＣＲ混合物：
１０×Ｔａｑ緩衝液（ＮＨ４）Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ（登録商標）
５μｌ    （１ｘ）
ｄＮＴＰ−Ｍｉｘ（１０ｍｍｏｌ／ｌ）                  １μｌ    （０．２ｍＭ）
ＭｎＣｌ２（１ｍｍｏｌ／ｌ）                          ５μｌ    （０．１ｍＭ）
ＭｇＣｌ２（２５ｍｍｏｌ／ｌ）                        ８μｌ    （４ｍＭ）
Ｆｗ  Ｍｕｔ  プライマー（ｃ＝１０ｐｍｏｌ／μｌ）    ２．５μｌ（０．５ｍＭ）
Ｒｅｖ  Ｍｕｔ  プライマー（ｃ＝１０ｐｍｏｌ／μｌ）  ２．５μｌ（０．５ｍＭ）
鋳型（ｐＣＢＲ−ｔａＡＬＤＨ−ＣＨ）（５０ｎｇ／μｌ）  １０μｌ（５００ｎｇ）
滅菌ｄｅｓｔ．Ｈ２Ｏ                                    １５μｌ
Ｔａｑ−ポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ（登録商標）
１μｌ  （２．５Ｕ）
全体積                                                  ５０μｌ
【０２１４】
【表１７】
2015530084.tif 000019
【０２１５】
その後、ＭＮ  Ｇｅｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを用いた精製。
【０２１６】
部位特異的な突然変異誘発によるＴａ−ＡＬＤＨライブラリーの生成
性質が改善されたＴａＡＬＤＨバリアントが下記のスクリーニング方法によって見いだされた。Ｔａ−ａｌｄｈ遺伝子（ＧＡＴＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）について配列決定することによってＴａＡＬＤＨの突然変異を検出した。有益なアミノ酸の変化をコードする塩基トリプレットを単離し、ＷａｎｇおよびＭａｌｃｏｌｍ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９９年、２６巻  （４号）：  ６８０〜６８頁））のプロトコールに従い、クイックチェンジＰＣＲ（ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ  ＰＣＲ）によって飽和させた。変性プライマー対を使用してｐＣＢＲ−Ｔａ−ＡＬＤＨ−Ｃｈｉｓに突然変異を挿入した。クイックチェンジＰＣＲ生成物をｐＣＢＲ−Ｔａ−ａｌｄｈ−Ｃｈｉｓ鋳型から精製し、それを使用してＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換して、発現ライブラリーを創出した。
【０２１７】
【表１８】
2015530084.tif 000020
【０２１８】
【表１９】
2015530084.tif 000021
【０２１９】
フォワードプライマーおよびリバースプライマーを使用した試料から各１５μＬをプールした。
【０２２０】
【表２０】
2015530084.tif 000022
【０２２１】
プライマーリスト：
３４位のアミノ酸における飽和突然変異誘発：
Ｆｗ−Ｆ３４（７１℃）        ＣＧＧＴＣＡＧＧＴＴＡＴＴＧＧＴＣＧＴＮＮＫＧＡＡＧＣＡＧＣＡＡＣＣＣＧＴＧ
Ｒｅｖ−Ｆ３４（７１℃）      ＣＡＣＧＧＧＴＴＧＣＴＧＣＴＴＣＭＮＮＡＣＧＡＣＣＡＡＴＡＡＣＣＴＧＡＣＣＧ
【０２２２】
４０５位のアミノ酸における飽和突然変異誘発：
Ｆｗ−Ｓ４０５（６４℃）      ＧＴＡＴＧＡＴＣＴＧＧＣＣＡＡＴＧＡＴＮＮＫＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＣＣＡＧ
Ｒｅｖ−Ｓ４０５（６４℃）    ＣＴＧＧＣＣＡＧＡＣＣＡＴＡＴＴＴＭＮＮＡＴＣＡＴＴＧＧＣＣＡＧＡＴＣＡＴＡＣ
【０２２３】
２７１位のアミノ酸における飽和突然変異誘発：
Ｆｗ−Ｗ２７１（６０℃）      ＧＡＡＡＡＣＣＣＴＧＣＴＧＮＮＫＧＣＡＡＡＡＴＡＴＴＧＧＡＡＴＧ
Ｒｅｖ−Ｗ２７１（６０℃）    ＣＡＴＴＣＣＡＡＴＡＴＴＴＴＧＣＭＮＮＣＡＧＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣ
【０２２４】
３９９位のアミノ酸における飽和突然変異誘発：
Ｆｗ−Ｙ３９９（５９℃）      ＣＧＴＧＧＡＡＧＡＡＡＴＧＮＮＫＧＡＴＣＴＧＧＣＣＡＡＴ
Ｒｅｖ−Ｙ３９９（５９℃）    ＡＴＴＧＧＣＣＡＧＡＴＣＭＮＮＣＡＴＴＴＣＴＴＣＣＡＣＧ
【０２２５】
特異的なバリアントに対するクイックチェンジＰＣＲ：
バリアントＦ３４Ｌ
Ｆｗ−Ｆ３４Ｌ（７５℃）      ＧＧＴＣＡＧＧＴＴＡＴＴＧＧＴＣＧＴＴＴＡＧＡＡＧＣＡＧＣＡＡＣＣＣＧＴＧ
Ｒｅｖ−Ｆ３４Ｌ（７５℃）    ＣＡＣＧＧＧＴＴＧＣＴＧＣＴＴＣＴＡＡＡＣＧＡＣＣＡＡＴＡＡＣＣＴＧＡＣＣ
バリアントＦ３４Ｍ
Ｆｗ−Ｆ３４Ｍ（６８℃）      ＧＴＣＡＧＧＴＴＡＴＴＧＧＴＣＧＴＡＴＧＧＡＡＧＣＡＧＣＡＡＣＣＣＧＴ
Ｒｅｖ−Ｆ３４Ｍ（６８℃）    ＡＣＧＧＧＴＴＧＣＴＧＣＴＴＣＣＡＴＡＣＧＡＣＣＡＡＴＡＡＣＣＴＧＡＣ
バリアントＷ２７１Ｓ
Ｆｗ−Ｗ２７１Ｓ（６５℃）    ＧＡＡＡＡＣＣＣＴＧＣＴＧＴＣＧＧＣＡＡＡＡＴＡＴＴＧＧＡＡＴＧ
Ｒｅｖ−Ｗ２７１Ｓ（６５℃）  ＣＡＴＴＣＣＡＡＴＡＴＴＴＴＧＣＣＧＡＣＡＧＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣ
バリアントＹ３９９Ｃ
Ｆｗ−Ｙ３９９Ｃ（６３℃）    ＣＧＴＧＧＡＡＧＡＡＡＴＧＴＧＴＧＡＴＣＴＧＧＣＣＡＡＴＧ
Ｒｅｖ−Ｙ３９９Ｃ（６３℃）  ＣＡＴＴＧＧＣＣＡＧＡＴＣＡＣＡＣＡＴＴＴＣＴＴＣＣＡＣＧ
バリアントＳ４０５Ｃ
Ｆｗ−Ｓ４０５Ｃ（７３℃）    ＧＴＡＴＧＡＴＣＴＧＧＣＣＡＡＴＧＡＴＴＧＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＣＣ
Ｒｅｖ−Ｓ４０５Ｃ（７３℃）  ＧＧＣＣＡＧＡＣＣＡＴＡＴＴＴＧＣＡＡＴＣＡＴＴＧＧＣＣＡＧＡＴＣＡＴＡＣ
バリアントＳ４０５Ｎ
Ｆｗ−Ｓ４０５Ｎ（６８℃）    ＴＧＡＴＣＴＧＧＣＣＡＡＴＧＡＴＡＡＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＣＣＡ
Ｒｅｖ−Ｓ４０５Ｎ（６８℃）  ＴＧＧＣＣＡＧＡＣＣＡＴＡＴＴＴＧＴＴＡＴＣＡＴＴＧＧＣＣＡＧＡＴＣＡ
【０２２６】
改善されたＴａＡＬＤＨバリアントについてのスクリーニング
Ｔａ−ＡＬＤＨライブラリーを含有するＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）のコロニーを、Ｚｙｍ５０５２自己誘導培地を含有する９６ディープウェルプレート（Ｇａｉｎｅｒ  ＢｉｏＯｎｅ）に移した（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、２００５年、４１巻  （１号）：  ２０７〜２３４頁）。培養物を３７℃、１０００ｒｐｍで一晩成長させた。細胞を２℃、５０００ｇで２分遠心分離することにより収集し、Ｂ−Ｐｅｒ（登録商標）タンパク質抽出試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＵＳＡ）を用いて溶解させた。５０℃で６０分インキュベートした後、不溶性の細胞片を、５０００ｇ、２０℃で３０分遠心分離することによって除去した。ＴａＡＬＤＨのバリアントを含有する上清を、相対的な活性について標準の条件：５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）中２ｍＭのＮＡＤ、１ｍＭのＤ−グリセルアルデヒド、５０℃の下で試験した。２０分後、ＮＡＤＨの形成を３４０ｎｍにおいて分光光度的に検出した。野生型ＴａＡＬＤＨと比較して優れたＮＡＤＨの形成により、ＴａＡＬＤＨバリアントの相対的な活性が改善されていることが示された。
【０２２７】
Ｔａ−ＡＬＤＨバリアントの溶媒中での活性を、追加的な溶媒を含有する標準のアッセイ条件下で試験した。２０分後、ＮＡＤＨの形成を検出し、相対的な活性を比較した。
【０２２８】
Ｔａ−ＡＬＤＨバリアントの補因子許容性の変化を、標準であるが１０ｍＭのＮＡＤを伴うアッセイ条件下で試験した。２０分後、ＮＡＤＨの形成を検出し、相対的な活性を比較した。
【０２２９】
ＴａＡＬＤＨバリアントの特異的活性の決定
Ｔａ−ａｌｄｈ遺伝子を、上記の通りｐＣＢＲ−Ｃｈｉｓ発現ベクターにクローニングした。上記の通りクイックチェンジＰＣＲによって突然変異Ｆ３４Ｌ、Ｆ３４Ｍ、Ｙ３９９Ｃ、Ｓ４０５ＣおよびＳ４０５ＮをＴａ−ａｌｄｈ遺伝子に挿入した。組換え発現のために、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）をｐＣＢＲ−Ｔａ−ａｌｄｈ−Ｃｈｉｓ、ｐＣＢＲ−Ｔａ−ａｌｄｈ−ｆ３４ｌ−ｓ４０５ｃ−Ｃｈｉｓ、ｐＣＢＲ−Ｔａ−ａｌｄｈ−ｆ３４ｍ−ｓ４０５ｎ−ＣｈｉｓまたはｐＣＢＲ−Ｔａ−ａｌｄｈ−ｆ３４ｍ−ｙ３９９ｃ−ｓ４０５ｎ−Ｃｈｉｓで形質転換した。４種のバリアントのそれぞれを、以下のプロトコールを使用して生成した：
【０２３０】
４０ＬのＢｉｏｓｔａｔ  Ｃｐｌｕｓ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）における流加発酵を用いて大量のＴａＡＬＤＨバリアントを生成した。定義済みの培地に３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補充した。接種後、細胞を３０℃で２４時間成長させ、０．３ｍＭのＩＰＴＧを用いて誘導した。酵素発現を３０℃で３時間実施した。１回の発酵により細胞３００ｇ（湿重量）が生成した。細胞を収集し、Ｂａｓｉｃ−Ｚ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ（Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｎｏｒｔｈａｎｔｓ、ＵＫ）を用いてローディング緩衝液（２００ｍＭのＮａＣｌ；２０ｍＭのイミダゾール；２．５ｍＭのＭｇＣｌ２；５０ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ６．２）中に溶解させた。５０℃で３０分加熱処理した後、３０，０００ｇ、２０℃で３０分遠心分離することによって細胞片およびタンパク質凝集体を可溶性画分から分離した（Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ６＋、ＳＳ−３４  ｒｏｔｏｒ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
【０２３１】
Ｈｉｓタグを付けたＴａＡＬＤＨバリアントの可溶性画分を、ＡＥＫＴＡ  ＵＰＣ−９００  ＦＰＬＣ−ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用したＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーによってさらに精製した。上清をＨｉＴｒａｐ  ＦＦ−カラムにローディングし、２カラム体積のローディング緩衝液で洗浄した。イミダゾール緩衝液（２００ｍＭのＮａＣｌ；５００ｍＭのイミダゾール；５０ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ６．２）中に溶離させた後、高度に精製され、濃縮されたＴａＡＬＤＨを分画した。ＨｉＰｒｅｐ  ２６／１０  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  ｃｏｌｕｍｎを用いて緩衝液を２０ｍＭの（ＮＨ４）ＨＣＯ３に変え、Ａｌｐｈａ  ２−４  ＬＤ  Ｐｌｕｓ  ｆｒｅｅｚｅ  ｄｒｙｅｒ（Ｍａｒｔｉｎ  Ｃｈｒｉｓｔ  ＧｍｂＨ、Ｏｓｔｅｒｏｄｅ  ａｍ  Ｈａｒｚ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＴａＡＬＤＨを凍結乾燥した。
【０２３２】
ＴａＡＬＤＨ活性を、５０℃、平底マイクロタイタープレート（Ｇｒａｉｎｅｒ  ＢｉｏＯｎｅ）中、Ｆｌｕｏｒｏｓｔａｒ  Ｏｍｅｇａ  Ｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ、Ｏｒｔｅｎｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて３４０ｎｍにおける補因子の減少の速度を測定することによって分光光度的に決定した。１単位の活性を、毎分１μｍｏｌの補因子の減少と定義した。反応混合物（総体積０．２ｍＬ）は１ｍＭのＤ−グリセルアルデヒドおよび２ｍＭのＮＡＤ、ならびに適量の酵素を１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７中に含有した。
【０２３３】
「ｗｔとの比較」値は、野生型対照値に対して正規化されたｍＵ／ｍＬ値である。
【０２３４】
【表２１】
2015530084.tif 000023
【０２３５】
【表２２】
2015530084.tif 000024
【０２３６】
【表２３】
2015530084.tif 000025
【０２３７】
試薬：
制限酵素、クレノウ断片、Ｔ４リガーゼおよびＴ４キナーゼはＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。ＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼはＦｉｎｎｚｙｍｅｓ（Ｅｓｐｏｏ、Ｆｉｎｌａｎｄ）から得、デオキシヌクレオチドはＲａｐｉｄｏｚｙｍ（Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。酵素は全て、製造者の推奨に従い、提供された緩衝溶液に適用して使用した。オリゴヌクレオチドはＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｕｌｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。全長の遺伝子はＧｅｎｅａｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によりＥ．ｃｏｌｉコドン使用の最適化と共に合成され、同社の標準のプラスミドに入れて送達された。ブタ心臓ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）はＳｅｒｖａ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、アスペルギルス・ニガーグルコースオキシダーゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。化学物質は全て、別段の指定のない限り、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧｍｂＨ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｓｅｒｖａ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ＧｍｂＨおよびＭｅｒｃｋ  ＫＧａＡ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から分析グレードで購入した。
【０２３８】
株およびプラスミド：
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｆ−ｏｍｐＴ  ｈｓｄＳＢ（ｒＢ−  ｍＢ−）ｇａｌ  ｄｃｍ（ＤＥ３））はＮｏｖａｇｅｎ（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ、ＵＫ）から購入し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｒｅｃＡ１  ｅｎｄＡ１  ｇｙｒＡ９６  ｔｈｉ−１  ｈｓｄＲ１７  ｓｕｐＥ４４  ｒｅｌＡ１  ｌａｃ［Ｆ’  ｐｒｏＡＢ  ｌａｃＩｑＺΔＭ１５  Ｔｎ１０（Ｔｅｔｒ）］）はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。ｐＥＴ２８ａ−ＤＮＡはＮｏｖａｇｅｎから提供された。
【０２３９】
ベクターの構築：
プラスミドｐＣＢＲ、ｐＣＢＲＨｉｓＮおよびｐＣＢＲＨｉｓＣをｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に基づいて構築した。対応する新しい多重クローニング部位についてＤＮＡ配列（表６参照）を合成し（Ｇｅｎｅａｒｔ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ｐＥＴ２８ａにＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ（ｐＣＢＲ）、ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ（ｐＣＢＲＨｉｓＮ）またはＸｂａＩ／Ｂｐｕ１１０２Ｉ（ｐＣＢＲＨｉｓＣ）を介してクローニングし、それにより、現存する多重クローニング部位を、ＢｆｕＡＩ配列およびＢｓａＩ配列を含有する新しい制限部位に置き換え、ｐＣＢＲおよびｐＣＢＲＨｉｓＮの場合には終止コドンに置き換えた。
【０２４０】
【表２４】
2015530084.tif 000026
【０２４１】
３種の新しいベクターにより、任意の遺伝子を同じ制限部位を使用して同時にクローニングすることが可能になり、これにより、使用者が、Ｎ末端またはＣ末端のＨｉｓタグを有するまたは有さないそれぞれの遺伝子を発現させることが可能になり、それにより、終止コドンを遺伝子の３’末端に付着させる必要がない。ベクター−ＤＮＡをまずＢｓａＩで制限し、次いで、クレノウ断片を用いて平滑末端を生成する。その後、直線化されたプラスミドをＢｆｕＡＩで消化し、５’突出部を生成する。Ｇｅｎｅａｒｔベクターを鋳型として、および対応するオリゴヌクレオチドを使用して遺伝子を増幅した（表７）。
【０２４２】
【表２５】
2015530084.tif 000027
【０２４３】
ＰＣＲ後、ＤＮＡ断片をＢｓａＩで消化し、３’−リン酸化し（Ｔ４キナーゼ）、その後、適切なベクターにライゲーションした。いくつかの場合には、リン酸化はＰｓｉＩを使用した消化に置き換えることができる。他で記載されている通り、プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ中に導入してそれを形質転換した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｂｏｒ、ＮＹ、１９８９年）。ＧＡＴＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｋｏｎｓｔａｎｚ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により配列解析が実施された。ｐＥＴ２８ａ−ＨｉｓＮ−ＬｌＫｄｃＡを、Ｇｏｃｋｅら（Ａｄｖ．  Ｓｙｎｔｈ．  Ｃａｔａｌ．  ２００７年、３４９巻、１４２５〜１４３５頁）に従ってクローニングした。
【０２４４】
酵素発現：
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＢＬ２１  Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）−ｐＬｙｓＳを宿主株として使用し、振とうフラスコ培養物中または１０ＬのＢｉｏｓｔａｔ  Ｃｐｌｕｓ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中のいずれかで酵素発現を実施した。全ての培地に３０〜５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補充した。ＧＤＨおよびＤＨＡＤはＬＢ培地で発現させ、アセトラクテートシンターゼはＴＢ培地で発現させた。接種後、細胞を、６００ｎｍにおける光学濃度が０．６になるまで３７℃で成長させ、１ｍＭのＩＰＴＧを用いて誘導し、温度を１６〜２０℃まで低下させて１６〜２４時間にわたって発現させた。ＫＤＧＡおよびＡＬＤＨは、Ｎｅｕｂａｕｅｒら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  １９９５年、４７巻、１３９〜１４６頁）の流加培養方法に従って３７℃で発現させた。接種後、細胞を２４時間成長させ、１ｍＭのＩＰＴＧを用いて誘導した。酵素発現をそれぞれ２４時間または３０時間にわたって実施した。ＫＤＣの発現は、Ｚｙｐ−５０５２（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｕｒｉｆ．  ２００５年、４１巻、２０７〜２３４頁）を培地として使用し、３０℃、バッチ方式で２２時間にわたって実施した。ＫＡＲＩは、ＴＢ培地を使用してバッチ発酵法で発現させた。細胞を、光学濃度が５．２になるまで３７℃で成長させ、０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加することによって誘導した。その後、２０℃で２４時間にわたって発現を実施した。
【０２４５】
酵素の精製：
タンパク質の精製ステップは全て、ＨｉＴｒａｐ  ＦＦカラム、ＨｉＰｒｅｐ  ２６／１０脱塩カラムおよびＨｉＴｒａｐ  Ｑ−セファロースＦＦカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を備えたＡＥＫＴＡ  ＵＰＣ−９００  ＦＰＬＣ−ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実施した。Ｂａｓｉｃ−Ｚ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ（Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｎｏｒｔｈａｎｔｓ、ＵＫ）を用いて細胞ライセートを調製し、３５．０００ｇ、４℃で３０分遠心分離することによって細胞片を除去した（Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ６＋、ＳＳ−３４  ｒｏｔｏｒ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。凍結乾燥には、Ａｌｐｈａ  ２−４  ＬＤ  Ｐｌｕｓ  ｆｒｅｅｚｅ  ｄｒｙｅｒ（Ｍａｒｔｉｎ  Ｃｈｒｉｓｔ  ＧｍｂＨ、Ｏｓｔｅｒｏｄｅ  ａｍ  Ｈａｒｚ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。ＧＤＨおよびＤＨＡＤを熱変性によって精製した（それぞれ７０℃で３０分）。その後、ＧＤＨをフリーズドライし（ＳｐｅｅｄＶａｃ  Ｐｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、撹拌したＡｍｉｃｏｎ  ｃｅｌｌ（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＤＨＡＤを濃縮し、−８０℃で保管するか、または実験に直接適用した。ＫＤＧＡ、ＡＬＤＨおよびＫＤＣは以前に記載されている通り精製し（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ２００７年、４０３巻、４２１〜４３０頁；  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ２００６年、５８０巻、１１９８〜１２０４頁；  Ａｄｖ．  Ｓｙｎｔｈ．  Ｃａｔａｌ．  ２００７年、３４９巻、１４２５〜１４３５頁）、凍結乾燥物として保管した。ＡＬＳおよびＫＡＲＩは、２５ｍＭまたは５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７を使用したＩＭＡＣによって精製した。５００ｍＭのイミダゾールを用いて溶離を実現した。酵素を脱塩し、液体ストック（ＡＬＳ）または凍結乾燥物（ＫＡＲＩ）として保管した。
【０２４６】
タンパク質の決定：
タンパク質の濃度を、Ｒｏｔｉ−Ｎａｎｏｑｕａｎｔ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧｍｂＨ）を製造者の推奨に従って用い、ウシ血清アルブミンを標準物質として使用して決定した。
【０２４７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：
タンパク質試料を、Ｌａｅｍｍｌｉ（Ｎａｔｕｒｅ  １９７０年、２２７巻、６８０〜６８５頁）に記載されている通り、Ｂｉｏｒａｄ（Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のＭｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ  ｓｙｓｔｅｍを使用して分析した。
【０２４８】
酵素アッセイ：
測光酵素アッセイは全て、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＭｕｌｔｉｓｋａｎまたはＶａｒｉｏｓｋａｎ光度計を使用してマイクロタイタープレート形式で実施した。必要であれば、正確に温度制御するために反応混合物をウォーターバス（Ｊｕｌａｂｏ、Ｓｅｅｌｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中でインキュベートした。緩衝液をＳｔｏｌｌ（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、４６６巻、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、２００９年、４３〜５６頁）に従い、ｐＨを対応する温度に調整して調製した。ＮＡＤまたはＮＡＤＨを補酵素として使用した反応を３４０ｎｍにおいて観察した（モル吸光係数ＮＡＤＨ＝６．２２Ｌ  ｍｍｏｌ−１  ｃｍ−１）。反応混合物（総体積０．２ｍＬ）は１ｍＭのＤ−グリセルアルデヒドおよび２ｍＭのＮＡＤならびに適量の酵素を１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７中に含有した（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｃａｔａｌ．  Ｂ−Ｅｎｚｙｍ．  ２００９年、６１巻、３０〜３５頁）。１単位の酵素活性は、毎分１μｍｏｌの基質を変換するために必要な酵素の量と定義される。下記の標準の反応条件に加えて、アルコール合成実験の前に反応条件（１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのチアミンピロホスフェート）の下で酵素活性を試験した。
【０２４９】
ＧＤＨ活性：ＧＤＨ活性を、５０℃でＤ−グルコースを酸化してグルコネートにし、それによって補酵素ＮＡＤが還元されてＮＡＤＨになることによってアッセイした。アッセイ混合物は、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）、２ｍＭのＮＡＤおよび５０ｍＭのＤ−グルコースを含有した（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２００６年、２８１巻、１４７９６〜１４８０４頁）。
【０２５０】
ＤＨＡＤ活性：ＤＨＡＤ活性を間接的なアッセイによって測定した。ＤＨＡＤ、２０ｍＭの基質および１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）を含有するアッセイ混合物を５０℃でインキュベートした。その後、それぞれグリセレートからピルベートへの変換、グルコネートから２−ケト−３−デオキシグルコネートへの変換または２，３−ジヒドロキシ−イソバレレートから２−ケトイソバレレートへの変換を下記の通りＨＰＬＣによって決定した。
【０２５１】
ＫＤＧＡ活性：ＫＤＧＡ活性を５０℃で切断方向に観察した。反応混合物は、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）、０．１ｍＭのチアミンピロホスフェート、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ＵのＰＤＣおよび１０ｍＭのＫＤＧを含有した。ＫＤＧの切断後、ＨＰＬＣを下記の通り行った。
【０２５２】
ＡＬＤＨ活性：ＡＬＤＨ活性を、５０℃で、Ｄ−グリセルアルデヒドを酸化させてグリセレートにし、それによって補酵素ＮＡＤが還元してＮＡＤＨになることによってアッセイした。アッセイ混合物は、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＮＡＤおよび１ｍＭグリセルアルデヒドを含有した（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ２００６年、５８０巻、１１９８〜１２０４頁）。
【０２５３】
ＡＬＳ活性：ＡＬＳ活性を、５０℃でピルベートの消費を観察することによって決定した。反応混合物は、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）、０．１ｍＭチアミン−ピロホスフェート、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１５ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含有した。試料中のピルベート濃度は他で記載されている通りラクテートデヒドロゲナーゼによって決定した（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ２００７年、４０３巻、４２１〜４３０頁）。
【０２５４】
ＫＡＲＩ活性：ＫＡＲＩ活性を、５０℃でアセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換と関連するＮＡＤＨの消費を観察することによってアッセイした。アッセイ混合物は、５ｍＭのアセトラクテート、０．３ｍＭのＮＡＤＨ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２および５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７を含有した。
【０２５５】
ＫＤＣ活性：ＫＤＣ活性を、５０℃および３４０ｎｍで２−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの脱カルボキシル化を観察することによってアッセイした。アッセイ混合物は、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）、０．１ｍＭチアミン−ピロホスフェート、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２および６０ｍＭの２−ケトイソバレレートを含有した。脱カルボキシル化速度は、２−ケトイソバレレートのモル吸光係数（ε＝０．０１７Ｌ／ｍｍｏｌ／ｃｍ）を使用して算出した（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｃａｔａｌ．  Ｂ−Ｅｎｚｙｍ．  ２００９年、６１巻、３０〜３５頁）
【０２５６】
ＡＤＨ活性：ＡＤＨ活性を、５０℃でイソブチルアルデヒドからイソブタノールへのＮＡＤＨ依存性還元を観察することによって決定した。アッセイ混合物は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、５ｍＭのイソブタナールおよび０．３ｍＭのＮＡＤＨを含有した。
【０２５７】
グルコース分析：グルコースを数量化するためにグルコースオキシダーゼを使用した。アッセイ混合物は、２０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ６）、０．７５ｍＭの２，２−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン）−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）、２Ｕのグルコースオキシダーゼおよび０．１Ｕのペルオキシダーゼを含有した。試料を添加した後、反応混合物を３０℃で３０分インキュベートし、４１８ｎｍおよび４８０ｎｍにおける吸光を測定した。アッセイの較正を、定義済みのグルコース標準溶液を使用して実施した（Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｃｌｉｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９７９年、１７巻、１〜７頁）。
【０２５８】
ＧＣ−ＦＩＤ分析：
イソブチルアルデヒドおよびイソブタノールまたはアセトアルデヒドおよびエタノールを、水素炎イオン化検出器およびＨｅａｄｓｐａｃｅ  Ｔｒｉ  Ｐｌｕｓ  オートサンプラーを備えたＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｔｒａｃｅ  ＧＣ  Ｕｌｔｒａを使用したＧＣ−ＦＩＤによって数量化した。アルコールおよびアルデヒド化合物を、ＳｔａｂｉｌＷａｘカラム（３０ｍ、内径０．２５ｍｍ、フィルム厚さ０．２５μｍ；Ｒｅｓｔｅｋ、Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ、ＵＳＡ）によって分離し、ヘリウム（毎分０．８ｍｌまたは毎分１．２ｍｌ）をキャリアガスとして使用した。乾燥器の温度は、５０℃で２分間保持され、毎分１０℃の勾配で１５０℃まで上昇し、そこで１分間保持されるようにプログラミングした。注射器および検出器は２００℃に保った。試料をインキュベートした後に、４０℃で１５分にわたって注入した。注入は、ヘッドスペース方式を使用して分割方式で行い、毎分１０ｍｌの流量で７００μｌを注入した。
【０２５９】
ＨＰＬＣ分析：
グルコネート、２−ケト−３−デオキシグルコネート、ピルベート、グリセレート、２，３−ジヒドロキシイソバレレートおよび２−ケトイソバレレートを分離し、オートサンプラーおよびダイオードアレイ検出器を備えたＵｌｔｉｍａｔｅ−３０００  ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｄｉｏｎｅｘ、Ｉｄｓｔｅｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用したＨＰＬＣによって数量化した。グルコネート、２−ケト−３−デオキシグルコネート、ピルベートおよびグリセレートのクロマトグラフィーによる分離は、Ｍｅｔｒｏｓｅｐ  Ａ  Ｓｕｐｐ１０−２５０／４０カラム（２５０ｍｍ、粒径４．６μｍ；Ｍｅｔｒｏｈｍ、Ｆｉｌｄｅｒｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し、６５℃で１２ｍＭの炭酸水素アンモニウム（ｐＨ１０）を用いて定組成溶離し、その後、３０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ１０．４）を用いた洗浄ステップを行うことによって実現した。移動相の流量は毎分０．２ｍｌに調整した。２，３−ジヒドロキシイソバレレートおよび２−ケトイソバレレートは、Ｎｕｃｌｅｏｇｅｌ  Ｓｕｇａｒ８１０Ｈカラム（３００ｍｍ、内径７．８ｍｍ；Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、Ｄｕｅｒｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において、６０℃で、３ｍＭのＨ２ＳＯ４（ｐＨ２．２）を用いて定組成溶離することによって分離した。移動相の流量は毎分０．６ｍｌに調整した。試料体積は、それぞれの場合において１０μｌであった。上記の中間体のそれぞれの外部標準を使用してシステム較正を実施した。試料を濾過によって調製し（１０ｋＤａのＭＷＣＯ、改変ＰＥＳ；ＶＷＲ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、希釈した。
【０２６０】
アルコールの生合成：
全ての反応を、２０ｍｌのＧＣバイアル中で設定した。反応混合物は、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（５０℃でｐＨ７）、０．１ｍＭのチアミン−ピロホスフェート、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２５ｍＭのＤ−グルコースおよび５ｍＭのＮＡＤを含有した。酵素を以下の通り添加した：ＧＤＨ：６Ｕ、ＤＨＡＤ：エタノールの合成のために２０Ｕおよびイソブタノールの合成のために３０Ｕ、他の酵素全て：１０Ｕ。酵素を用いないかまたはＤ−グルコースを用いない対照反応を実施した。反応混合物を５０℃のウォーターバスに入れ、１００ｒｐｍで穏やかに撹拌した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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