(57)【要約】  本発明は、ビッグ−エンドセリン−1(「ビッグET−1」)に結合する抗体、及びそれを使用する方法を提供する。本発明の特定の実施態様によれば、抗体はヒトビッグET−1に特異的に結合するが、ヒトスモールET−1(すなわち、エンドセリン変換酵素−1[ECE−1]によるビッグET−1のタンパク質分解切断から生じるエンドセリン−1の活性形態)には結合しない。本発明の特定の実施態様によれば、抗ビッグET−1抗体は、ECE−1によるビッグET−1の切断を遮断することができる。本発明の抗体は、高血圧障害、線維性障害、神経変性障害、網膜障害、疼痛及び癌を含むビッグET−1関連障害の処置に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトビッグＥＴ−１（配列番号４３４）に特異的に結合し、かつスモールＥＴ−１（配列番号４３５）には結合しない、単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、エンドセリン変換酵素−１（ＥＣＥ−１）によるビッグＥＴ−１の切断を遮断する、請求項１に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項３】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、ヒトビッグＥＴ−１に結合するがマウスビッグＥＴ−１には結合しない、請求項１又は２に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項４】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、ヒトビッグＥＴ−１及びマウスビッグＥＴ−１に結合する、請求項１又は２に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項５】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、ヒトビッグＥＴ−１への結合について、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、１４６／１５４、１６２／１７０、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２６６、２７４／２８２、２９０／２９８、３２２／３３０、３３８／３４６、３７０／３７８、及び３８６／３９４からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列対を含む参照抗体と競合する、請求項２に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項６】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、１４６／１５４、１６２／１７０、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２６６、２７４／２８２、２９０／２９８、３２２／３３０、３３８／３４６、３７０／３７８、及び３８６／３９４からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列対を含む参照抗体と同じ、ヒトビッグＥＴ−１上のエピトープに結合する、請求項２に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項７】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号２、１８、３４、５０、６６、１４６、１６２、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３２２、３３８、３７０、及び３８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）、並びに配列番号１０、２６、４２、５８、７４、１５４、１７０、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３３０、３４６、３７８、及び３９４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲを含む、請求項２に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項８】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、１４６／１５４、１６２／１７０、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２６６、２７４／２８２、２９０／２９８、３２２／３３０、３３８／３４６、３７０／３７８、及び３８６／３９４からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列対の重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲを含む、請求項７に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項９】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号４−６−８−１２−１４−１６；２０−２２−２４−２８−３０−３２；３６−３８−４０−４４−４６−４８；５２−５４−５６−６０−６２−６４；６８−７０−７２−７６−７８−８０；１４８−１５０−１５２−１５６−１５８−１６０；１６４−１６６−１６８−１７２−１７４−１７６；１９６−１９８−２００−２０４−２０６−２０８；２１２−２１４−２１６−２２０−２２２−２２４；２２８−２３０−２３２−２３６−２３８−２４０；２４４−２４６−２４８−２５２−２５４−２５６；２６０−２６２−２６４−２６８−２７０−２７２；２７６−２７８−２８０−２８４−２８６−２８８；２９２−２９４−２９６−３００−３０２−３０４；３２４−３２６−３２８−３３２−３３４−３３６；３４０−３４２−３４４−３４８−３５０−３５２；３７２−３７４−３７６−３８０−３８２−３８４；及び３８８−３９０−３９２−３９６−３９８−４００からなる群からそれぞれ選択されるＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３ドメインを含む、請求項８に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、１４６／１５４、１６２／１７０、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２６６、２７４／２８２、２９０／２９８、３２２／３３０、３３８／３４６、３７０／３７８、及び３８６／３９４からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項９に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
請求項７に記載の抗体又は抗原結合フラグメント、及び薬学的に許容しうる担体又は希釈剤を含む、医薬組成物。
【請求項１２】
肺高血圧症、腎疾患、同種移植片拒絶、糖尿病、癌、心不全、及びアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される疾患又は障害を処置するか、予防するか又は寛解させるための方法であって、請求項１１に記載の医薬組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む、上記方法。
【請求項１３】
疾患又は障害が肺高血圧症である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
肺高血圧症が、肺動脈性肺高血圧症、左心疾患に関連する肺高血圧症、肺疾患に関連する肺高血圧症、又は慢性血栓性疾患に起因する肺高血圧症又は塞栓性疾患に起因する肺高血圧症である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
疾患又は障害が癌である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
癌が、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、黒色腫、腎癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、膀胱癌、カポジ肉腫、及び神経膠腫からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
第二の医薬組成物を患者に投与することをさらに含み、ここで該第二の医薬組成物が、エンドセリン−Ａ受容体アンタゴニスト、エンドセリン−Ｂ受容体アンタゴニスト、エンドセリン変換酵素−１（ＥＣＥ−１）阻害剤、ネプリライシン阻害剤、アンギオテンシン−ＩＩ受容体アゴニスト、及びＮＦ−カッパＢ阻害剤からなる群から選択される１つ又はそれ以上の活性成分を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１１に記載の医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、疼痛を処置又は軽減するための方法。
【請求項１９】
疼痛が侵害受容性疼痛又は内臓痛である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
疼痛が、炎症、術後創、神経障害、骨折、熱傷、骨粗鬆症性骨折、骨癌、痛風、片頭痛、及び線維筋痛症からなる群から選択される状態に関連するものである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
疼痛が癌関連痛又は化学療法誘発痛である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１１に記載の医薬組成物を、眼疾患に罹患した被験体に投与することを含む、眼疾患を処置するための方法。
【請求項２３】
眼疾患が、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、滲出性ＡＭＤ、糖尿病性網膜症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、虹彩血管新生、血管新生緑内障、緑内障における術後線維症、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、脈絡膜新生血管、視神経乳頭血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、硝子体血管新生、パンヌス、翼状片、黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、血管性網膜症、網膜変性症、ぶどう膜炎、及び眼の炎症性疾患からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１１に記載の医薬組成物を、線維性状態に罹患した被験体に投与することを含む、線維症を処置するための方法。
【請求項２５】
線維性状態が、肺線維症、眼線維症、皮膚線維症、腎線維症、又は肝線維症である、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトビッグエンドセリン−1（big−endothelin−1）に特異的な抗体及びその抗原結合フラグメントに関する。
【背景技術】
【０００２】
エンドセリン−1(「ET−1」、「スモール−ET−1（small−ET−1）、及び「EDN1」とも呼ばれる)は、最初はブタ大動脈内皮細胞の培地から単離され、そして特徴づけされた２１のアミノ酸の血管収縮剤である(非特許文献１)。ET−1は約２００アミノ酸のプレプロET−1分子から誘導され、この分子はエンドペプチダーゼにより切断されて「ビッグET−1」と呼ばれる(「プロET−1」とも呼ばれる)３８アミノ酸の形態を生じる。ビッグET−1は、エンドセリン変換酵素(ECE−1)によりさらに切断されて、血管作用性の21アミノ酸ET−1ペプチドを生じる。ET−1はエンドセリンA型受容体(「ETaR」)及びB型受容体(「ETbR」)を活性化し得る。平滑筋細胞におけるETaR又はETbRの活性化は血管収縮を生じ、そしてET−1の実験動物モデルへの静脈内投与は動脈圧の持続した上昇を引き起こす。肺において、エンドセリン遺伝子の発現は低酸素により上方調節され、血管平滑筋肥大、血管収縮、炎症及び心肥大、及び肺高血圧症における線維症に対してフィードフォワード（feed−forward）効果をもたらす。
【０００３】
前述の特性と一致して、エンドセリン−1は、例えば、肺高血圧症、心不全、全身性高血圧、線維性疾患、神経変性疾患、及び癌を含む様々な疾患及び障害に関係があるとされている。例えば、ビッグET−1切断の生成物であるET−1は、線維芽細胞増殖を誘導し、さらにはコラーゲン代謝を刺激するその能力に起因して肺線維症の病理に関与すると考えられている(非特許文献２を参照のこと)。上昇したエンドセリン−1レベルはまた、眼疾患(例えば、緑内障[例えば、正常眼圧緑内障、高眼圧緑内障（hypertensive glaucoma）、開放隅角緑内障])にも関連付けられている(非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８)。従って、エンドセリン受容体(ETA及びETB)のいくつかの小分子アンタゴニストが、肺高血圧症、心血管障害、炎症性疾患、腎疾患、癌、及びアルツハイマー病のような障害の処置について試験されたか、又は提案されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Yanagisawa et al. (1988) Nature 332：411−415
【非特許文献２】Fonseca et al. (2011) Am J Respir Cell Mol Biol 44：1−10
【非特許文献３】Sugiyama et al. (1995) Surv Ophthalmol 39 Suppl 1：S49−56
【非特許文献４】Emre et al. (2005) Br J Ophthalmol 89：60−63
【非特許文献５】Galassi et al. (2011) Invest Opthalmol Vis Sci 52：4467−4471
【非特許文献６】Ghanem et al. (2011) Ophthalmic Res 46：98−102
【非特許文献７】Tezel et al. (1997) J. Glaucoma 6：83−89
【非特許文献８】Chauhan (2008) Can J Ophthalmol 43：356−360
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
抗ET−1抗体はEP0406628B1において記述されている；しかし、EP0406628B1の抗体はウシサイログロブリンに結合された合成ET−1(すなわち、スモールET−1)に対して産生されたものであった。スモールET−1が免疫原として使用されたので、EP0406628B1の抗体は、ビッグET−1に結合するとは期待されないであろうし、エンドセリン変換酵素によるビッグET−1の切断を減少又は阻害する能力を有することも期待されない。ビッグET−1のスモールET−1への切断を遮断する治療剤は、エンドセリンシグナル伝達プロセスの初期の時点で作用し、それにより、ET−1それ自体に特異的な抗体よりも強い阻害活性を潜在的に生じるだろう。従って、ヒトビッグET−1に特異的に結合し、そしてスモールET−1の形成を遮断する抗体を含めて、エンドセリンシグナル伝達の新規な阻害剤に対する当該分野における必要性が残る。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の要旨
本発明は、ヒトビッグET−1に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、とりわけ、ET−1媒介シグナル伝達を阻害するため、並びにET−1の活性及び／又はシグナル伝達により引き起こされるか又はそれに関連する疾患及び障害を処置するために有用である。
【０００７】
特定の実施態様によれば、本発明の抗体は、ヒトビッグET−1に特異的に結合するが、ヒトスモールET−1には結合しない。本発明はまた、ビッグET−1のエンドセリン変換酵素−1(ECE−1)媒介切断を遮断する抗体を提供する。本明細書において説明されるように、ビッグET−1のECE−1媒介切断を遮断する抗ビッグET−1抗体は、インビトロ及びインビボの両方でエンドセリン−1活性の強力な阻害剤である。
【０００８】
本発明の抗体は全長(例えば、IgG1又はIgG4抗体)であってもよく、又は抗原結合部分(例えば、Fab、F(ab')2又はscFvフラグメント)のみを含んでいてもよく、そして機能に影響を及ぼすように、例えば残存エフェクター機能を除去するように改変され得る(Reddy et al., (2000) J. Immunol. 164：1925−1933)。
【０００９】
本発明は、配列番号2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、370、386、402、及び418からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％若しくは少なくとも99％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有する重鎖可変領域(HCVR)を含む、抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを提供する。
【００１０】
本発明はまた、配列番号10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、378、394、410、及び426からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％若しくは少なくとも99％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有する軽鎖可変領域(LCVR)を含む、抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを提供する。
【００１１】
本発明はまた、配列番号2／10、18／26、34／42、50／58、66／74、82／90、98／106、114／122、130／138、146／154、162／170、178／186、194／202、210／218、226／234、242／250、258／266、274／282、290／298、306／314、322／330、338／346、354／362、370／378、386／394、402／410、及び418／426からなる群から選択されるHCVR及びLCVR (HCVR／LCVR)配列対を含む、抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１２】
本発明はまた、配列番号8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、328、344、360、376、392、408、及び424からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％若しくは少なくとも99％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有する重鎖CDR3 (HCDR3)ドメイン；並びに配列番号16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304、320、336、352、368、384、400、416、及び432からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％若しくは少なくとも99％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有する軽鎖CDR3(LCDR3)ドメインを含む、抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを提供する。
【００１３】
特定の実施態様において、抗体又は抗体の抗原結合部分は、配列番号8／16、24／32、40／48、56／64、72／80、88／96、104／112、120／128、136／144、152／160、168／176、184／192、200／208、216／224、232／240、248／256、264／272、280／288、296／304、312／320、328／336、344／352、360／368、376／384、392／400、408／416、及び424／432からなる群から選択されるHCDR3／LCDR3アミノ酸配列対を含む。
【００１４】
本発明はまた、配列番号4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、324、340、356、372、388、404、及び420からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％若しくは少なくとも99％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有する重鎖CDR1(HCDR1)ドメイン；配列番号6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、326、342、358、374、390、406、及び422からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％若しくは少なくとも99％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有する重鎖CDR2(HCDR2)ドメイン；配列番号12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、332、348、364、380、396、412、及び428からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％若しくは少なくとも99％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有する軽鎖CDR1(LCDR1)ドメイン；並びに配列番号14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、318、334、350、366、382、398、414、及び430からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％若しくは少なくとも99％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有する軽鎖CDR2(LCDR2)ドメインをさらに含む、抗体又はそのフラグメントを提供する。
【００１５】
特定の非限定的な例となる本発明の抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号4−6−8−12−14−16（例えばH2M6486N)；20−22−24−28−30−32（例えばH2M6490N)；36−38−40−44−46−48（例えばH1M6492N)；52−54−56−60−62−64（例えばH1M6494N)；68−70−72−76−78−80（例えばH2M6495N)；84−86−88−92−94−96（例えばH2M6741N)；100−102−104−108−110−112（例えばH4H6311P)；116−118−120−124−126−128（例えばH4H6316P)；132−134−136−140−142−144（例えばH4H6317P)；148−150−152−156−158−160（例えばH4H6323P)；164−166−168−172−174−176（例えばH4H6327P2)；180−182−184−188−190−192（例えばH4H6328P)；196−198−200−204−206−208（例えばH4H6329P)；212−214−216−220−222−224（例えばH4H6330P)；228−230−232−236−238−240（例えばH4H6332P)；244−246−248−252−254−256（例えばH4H6334P)；260−262−264−268−270−272（例えばH4H6334P2)；276−278−280−284−286−288（例えばH4H6335P)；292−294−296−300−302−304（例えばH4H6337P)；308−310−312−316−318−320（例えばH4H6338P)；324−326−328−332−334−336（例えばH4H6340P)；340−342−344−348−350−352（例えばH4H6343P)；356−358−360−364−366−368（例えばH4H6345P)；372−374−376−380−382−384（例えばH4H6347P)；388−390−392−396−398−400（例えばH4H6353P)；404−406−408−412−414−416（例えばH4H6490N2)；及び420−422−424−428−430−432（例えばH4H6492N2)からなる群から選択されるアミノ酸配列をそれぞれ有するHCDR1−HCDR2−HCDR3−LCDR1−LCDR2−LCDR3ドメインを含む。
【００１６】
関連する実施態様において、本発明はヒトビッグET−1に特異的に結合する抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを含み、ここで抗体又はフラグメントは、配列番号2／10、18
／26、34／42、50／58、66／74、82／90、98／106、114／122、130／138、146／154、162／170、178／186、194／202、210／218、226／234、242／250、258／266、274／282、290／298、306／314、322／330、338／346、354／362、370／378、386／394、402／410、及び418／426からなる群から選択される重鎖及び軽鎖の配列内に含まれる重鎖及び軽鎖CDRドメインを含む。HCVR及びLCVRアミノ酸配列内のCDRを同定するための方法及び技術は当該分野で周知であり、そして本明細書に開示される特定のHCVR及び／又はLCVRアミノ酸配列内のCDRを同定するために使用され得る。CDRの境界を同定するために使用され得る例となる慣例としては、例えばＫａｂａｔの定義、Ｃｈｏｔｈｉａの定義、及びＡｂＭ定義が挙げられる。おおまかに言えば、Ｋａｂａｔの定義は配列可変性に基づき、Ｃｈｏｔｈｉａの定義は構造的ループ領域の位置に基づき、そしてＡｂＭ定義はＫａｂａｔアプローチとＣｈｏｔｈｉａアプローチとの折衷である。例えば、Kabat、「Sequences of Proteins
of Immunological Interest,」 National Institutes of Health、Bethesda、Md. (1991)；Al−Lazikani et al.、(1997) J. Mol. Biol. 273：927−948；及びMartin et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86：9268−9272を参照のこと。公開データベースもまた抗体内のＣＤＲ配列を同定するために利用可能である。
【００１７】
別の局面において、本発明は、抗ヒトビッグET−1抗体又はそのフラグメントをコードする核酸分子を提供する。本発明の核酸を有する組換え発現ベクター、及びこのようなベクターが導入されている宿主細胞もまた本発明により包含され、抗体の産生を可能にする条件下でこれらの宿主細胞を培養し、そして産生された抗体を回収することによる抗体の製造方法もまた同様に包含される。
【００１８】
一実施態様において、本発明は、配列番号1、17、33、49、65、81、97、113、129、145、161、177、193、209、225、241、257、273、289、305、321、337、353、369、385、401、及び417からなる群から選択される核酸配列、又は少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、若しくは少なくとも99％の相同性を有するその実質的に同一の配列によりコードされるHCVRを含む、抗体又はそのフラグメントを提供する。
【００１９】
本発明はまた、配列番号9、25、41、57、73、89、105、121、137、153、169、185、201、217、233、249、265、281、297、313、329、345、361、377、393、409、及び425からなる群から選択される核酸配列、又は少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、若しくは少なくとも99％の相同性を有するその実質的に同一の配列によりコードされるLCVRを含む、抗体又はそのフラグメントを提供する。
【００２０】
本発明はまた、配列番号7、23、39、55、71、87、103、119、135、151、167、183、199、215、231、247、263、279、295、311、327、343、359、375、391、407、及び423からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、若しくは少なくとも99％の相同性を有するその実質的に同一の配列によりコードされるHCDR3ドメイン；並びに配列番号15、31、47、63、79、95、111、127、143、159、175、191、207、223、239、255、271、287、303、319、335、351、367、383、399、415、及び431からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、若しくは少なくとも99％の相同性を有するその実質的に同一の配列によりコードされるLCDR3ドメインを含む、抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを提供する。
【００２１】
本発明はまた、配列番号3、19、35、51、67、83、99、115、131、147、163、179、195、211、227、243、259、275、291、307、323、339、355、371、387、403、及び419からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、若しくは少なくとも99％の相同性を有するその実質的に同一の配列によりコードされるHCDR1ドメイン；配列番号5、21、37、53、69、85、101、117、133、149、165、181、197、213、229、245、261、277、293、309、325、341、357、373、389、405、及び421からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、若しくは少なくとも99％の相同性を有するその実質的に同一の配列によりコードされるHCDR2ドメイン；配列番号11、27、43、59、75、91、107、123、139、155、171、187、203、219、235、251、267、283、299、315、331、347、363、379、395、411、及び427からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、若しくは少なくとも99％の相同性を有するその実質的に同一の配列によりコードされるLCDR1ドメイン；並びに配列番号13、29、45、61、77、93、109、125、141、157、173、189、205、221、237、253、269、285、301、317、333、349、365、381、397、413、及び429からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、若しくは少なくとも99％の相同性を有するその実施的に同一の配列によりコードされるLCDR2ドメインを含む抗体又はそのフラグメントを提供する。
【００２２】
特定の実施態様によれば、抗体又はそのフラグメントは、配列番号  配列番号1及び9（例えばH2M6486N)、17及び25（例えばH2M6490N)、33及び41（例えばH1M6492N)、49及び57（例えばH1M6494N)、65及び73（例えばH2M6495N)、81及び89（例えばH2M6741N)、97及び105（例えばH4H6311P)、113及び121（例えばH4H6316P)、129及び137（例えばH4H6317P)、145及び153（例えばH4H6323P)、161及び169（例えばH4H6327P2)、177及び185（例えばH4H6328P)、193及び201（例えばH4H6329P)、209及び217（例えばH4H6330P)、225及び233（例えばH4H6332P)、241及び249（例えばH4H6334P)、257及び265（例えばH4H6334P2)、273及び281（例えばH4H6335P)、289及び297（例えばH4H6337P)、305及び313（例えばH4H6338P)、321及び329（例えばH4H6340P)、337及び345（例えばH4H6343P)、353及び361（例えばH4H6345P)、369及び377（例えばH4H6347P)、385及び393（例えばH4H6353P)、401及び409（例えばH4H6490N2)、並びに417及び425（例えばH4H6492N2)の核酸配列によりコードされる重鎖及び軽鎖のCDR配列を含む。
【００２３】
本発明は、改変されたグリコシル化パターンを有する抗ビッグET−1抗体を含む。いくつかの適用において、望ましくないグリコシル化部位を除去するための改変、又は例えば抗体依存性細胞傷害性(ADCC)機能を増大させるためにオリゴ糖鎖上に存在するフコース部分を欠いた抗体は有用であり得る(Shield et al. (2002) JBC 277：26733−26740を参照のこと)。他の適用において、ガラクトシル化の改変は、補体依存性細胞傷害(CDC)を改変するために行われ得る。
【００２４】
別の局面において、本発明は、ビッグET−1に特異的に結合する組換えヒト抗体又はそのフラグメント、及び薬学的に許容しうる担体を含む医薬組成物を提供する。関連する局面において、本発明は、エンドセリン−1阻害剤と第二の治療剤との組み合わせである組成物を特徴とする。一実施態様において、エンドセリン−1阻害剤は抗体又はそのフラグメントである。一実施態様において、第二の治療剤は、エンドセリン−1阻害剤と有利に組み合わせられるいずれかの薬剤である。エンドセリン−1阻害剤と有利に組み合わせられ得る例となる薬剤としては、限定することなく、エンドセリン−1とエンドセリン−1受容体との間の相互作用を阻害する他の薬剤(他の抗体又はその抗原結合フラグメント、ペプチド阻害剤、小分子アンタゴニストなどを含む)、及び／又はエンドセリン−1の上流若しくは下流のシグナル伝達を妨害する薬剤が挙げられる。
【００２５】
さらに別の局面において、本発明は、本発明の抗ビッグET−1抗体又は抗体の抗原結合部分を使用して、エンドセリン−1活性を阻害するための方法を提供し、ここで該治療方法は、治療有効量の、本発明の抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を投与することを含む。処置される障害は、エンドセリン−1活性の除去、阻害又は減少によって改善されるか、寛解するか、阻害されるか又は予防されるいずれかの疾患又は状態である。本発明の抗ビッグET−1抗体又は抗体フラグメントは、エンドセリン−1とエンドセリン−1受容体(例えば、ETaR及び／又はETbR)との間の相互作用を遮断するか、又はそうでなければエンドセリン−1のシグナル伝達活性を阻害するように機能し得る。本発明のいくつかの実施態様において、本発明の方法により処置されるか、予防されるか、又は寛解する疾患又は状態としては、肺高血圧症（肺動脈性肺高血圧症、左心疾患に関連する肺高血圧症、肺疾患に関連する肺高血圧症、又は慢性血栓性疾患に起因する肺高血圧症及び塞栓性疾患に起因する肺高血圧症を含む）、腎疾患、同種移植片拒絶、糖尿病、癌(前立腺癌、乳癌、卵巣癌、黒色腫を含む）、心不全、アテローム性動脈硬化症、線維性疾患、眼疾患、及び疼痛(侵害受容性疼痛及び内臓痛を含む)が挙げられる。本発明のいくつかの実施態様において、本発明の方法により処置されるか、予防されるか又は寛解する疼痛としては、炎症、術後創、神経障害、骨折、熱傷、骨粗鬆症性骨折、骨癌、痛風、片頭痛、線維筋痛症に関連する疼痛、癌関連痛又は化学療法誘発痛が挙げられる。本発明のいくつかの実施態様において、本発明の方法により処置されるか、予防される又は寛解する眼の疾患又は状態としては、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、滲出性ＡＭＤ、糖尿病性網膜症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、虹彩血管新生、緑内障（例えば血管新生緑内障）、緑内障における術後線維症、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、脈絡膜新生血管、視神経乳頭血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、硝子体血管新生、パンヌス、翼状片、黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、血管性網膜症、網膜変性症、ぶどう膜炎、及び眼の炎症性疾患が挙げられる。本発明のいくつかの実施態様において、本発明の方法により処置されるか、予防される又は寛解する線維性疾患としては、肺線維症、眼線維症、皮膚線維症、腎線維症、又は肝線維症が挙げられる。
【００２６】
本発明はまた、患者におけるエンドセリン−1活性に関連するか又はそれにより引き起こされる疾患又は障害の処置のための薬剤の製造における本発明の抗ビッグET−1抗体又は抗体の抗原結合部分の使用を含む。
【００２７】
他の実施態様は以下の詳細な説明の検討により明らかとなるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】肺動脈断面積(PA CSA)。H4H6327P2及びボセンタン処置は、慢性低酸素により誘発されるPA CSAの減少を有意に低下させる。ベースライン(すなわち、正常酸素圧)からのPA CSAの維持は、より小さい筋肉壁厚さ(すなわち、血管リモデリング）及び／又はより小さい血管緊張(すなわち、血管収縮)を反映する。#は正常酸素圧に対してP＜0.001を指定する。**、***はそれぞれP＜0.01、及び0.001を示す。
【図２】右心室心拍出量(RV CO)。H4H6327P2はボセンタンより高い有効性でRV COを維持する。慢性低酸素の間のRV COの減少は、肺動脈における上昇した血管抵抗と関連する。H4H6327P2処置動物におけるボセンタン処置動物よりも高いRV COの維持は、H4H6327P2がRV後負荷(すなわち、肺動脈抵抗)の減少においてより高い有効性を有し得るということを示唆する。#は正常酸素圧に対してP＜0.001を指定する。*、**、***はそれぞれP＜0.05、0.01、及び0.001を示す。
【図３】右心室−対−左心室＋中隔(RV／(LV＋S))。慢性低酸素の間のH4H6327P2処置は、RV／(LV＋S)重量比における増加を低下させる。ベースライン(すなわち、正常酸素圧)からの比が高いほど、RV肥大の程度は高くなり、その程度は、より高い血管抵抗にもかかわらず肺動脈を通る血流を維持するために必要とされる代償機構として上昇する。ボセンタン処置からの重量比は、ビヒクル群とアイソタイプコントロール群の両方で同様であり、慢性低酸素への曝露に伴うRV肥大の発達を示す。#は正常酸素圧に対してP＜0.001を示す。*はP＜0.05を指定する。
【図４】右心室自由壁厚、収縮期(RVFW,s)。H4H6327P2処置は慢性低酸素におけるRVFW肥厚を有意に減少させる。RVの壁肥厚(すなわち、肥大)は、より大きな血管抵抗にも関わらず肺動脈を通る血流を維持するために必要な代償機構として起こる。ビヒクル群及びアイソタイプコントロール群におけるより大きなRV壁厚(正常酸素圧と比べて)は、RV肥大の発生を示す；ボセンタン処置は、ビヒクル処置と比較してRVFWの肥厚を減少する傾向がある(有意ではない)。#は正常酸素圧に対してP＜0.001を示す。***はP＜0.001を示す。
【図５】遠位肺細動脈壁肥厚。H4H6327P2及びボセンタンでの処置は、より小さな壁厚−対−血管径比(より少ない平滑筋層増殖及び／又は平滑筋細胞動員(すなわち、より少ない血管リモデリング)を反映する)に示されるように、慢性低酸素により誘導された遠位肺細動脈壁肥厚を有意に逆行させる。血管壁肥厚は、動物が数日間正常酸素圧に戻ると可逆的である。†††は正常酸素圧に対するP＜0.001を指定する。*、***はP＜0.05、0.001を示す[元の図面の説明文からの文章]。
【図６】肺動脈断面積(PA CSA)。H4H6327P2及びボセンタンは、慢性低酸素により誘導された肺動脈断面積(PA CSA)の減少を有意に逆行させる。ベースライン(すなわち、正常酸素圧)からのPA CSAの維持は、より少ない筋肉壁肥厚(すなわち、血管リモデリング)及び／又はより小さい血管緊張(すなわち、血管収縮)を反映する。血管断面積の減少は、動物が数日間正常酸素圧に戻ると可逆的である。†††は正常酸素圧に対してP＜0.001を指定する。**、***はP＜0.01、0.001を示す。
【図７】右心室自由壁(RVFW)肥厚。H4H6327P2処置及びボセンタン処置は、慢性低酸素における右心室自由壁(RVFW)肥厚を有意に逆行させる。RVの壁肥厚(すなわち、肥大）は、より大きな血管抵抗にも関わらず肺動脈を通る血流を維持するために必要な代償機構として発生する。（正常酸素圧と比較して）アイソタイプコントロール群におけるより大きなRV壁肥厚は、RV肥大の発生を示す。心室壁肥厚は、動物が数日間正常酸素圧にもどると可逆的である。††† 正常酸素圧に対してP＜0.001。***はP＜0.001を示す。
【図８】右心室−対−左心室＋中隔[RV／(LV＋S)]重量比。慢性低酸素の間のH4H6327P2処置は、右心室−対−左心室＋中隔[RV／(LV＋S)]重量比に対してほとんど効果を有していない。ベースライン(すなわち、正常酸素圧)からの比率が高いほど、RV肥大（これはより大きな血管抵抗にも関わらず肺動脈を通る血流を維持するために必要な代償機構として生じる）の程度は高くなる。H4H6327P2処置及びボセンタン処置についての重量比はアイソタイプコントロール群と同様であり、慢性低酸素への曝露に伴うRV肥大の発生を示す。†††は正常酸素圧に対してP＜0.001を示す。*、***はP＜0.05、0.001を指定する。
【図９】右心室心拍出量(RV CO)。H4H6327P2は、右心室心拍出量(RV CO)を維持する傾向がある。慢性低酸素の間のRV COの減少は、肺動脈における上昇した血管抵抗性と関連する。抗体で処置された動物に対してボセンタンで処置された動物におけるRV COのより高い維持は、ボセンタンがRV後負荷(すなわち、肺動脈抵抗)の減少においてより高い有効性を有し得るということを示唆する。RV COは、動物が数日間正常酸素圧に戻ると回復する。†††は正常酸素圧に対してP＜0.001を指定する。*、**、***はP＜0.05、0.01、0.001を示す。
【図１０】右心室収縮期圧。H4H6327P2処置は右心室右心室収縮期圧(RVSP)を減少しない。慢性低酸素の間の上昇したRVSPは、肺動脈における増加した血管抵抗性と関連する；これは、肺動脈弁を開くために必要な圧力である。ボセンタンはRVSPを減少させる傾向があるが、一方抗ビッグET−1抗体処置は減少させる傾向がない。動物が数日正常酸素圧に戻った場合、RVSPの上昇はベースライン近くまで回復する。†††は正常酸素圧に対してP＜0.001を指定する。**、***はP＜0.01、0.001を示す。
【図１１】侵害防御機構挙動。侵害防御機構挙動は、抗ビッグET−1抗体H4H6327P2を投与されたマウスにおいて減少する。12週齢C57BL／6雄性マウスを３つの実験コホートに分けた：30mg／kgの非ビッグET−1結合アイソタイプコントロール抗体を投与された(アイソタイプ)対照群(n＝6)(黒色の（solid）バー)；3 mg／kgの抗ビッグET−1抗体H4H6327P2(灰色のバー)を投与された低用量群(n＝7)；及び30mg／kgのH4H6327P2を投与された高用量群(n＝7)(斜交平行線（diagonal cross−hatch）のバー)。*は対照に対してP＜0.05を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
詳細な説明
本発明を記載する前に、当然のことながら、記載される特定の方法及び実験条件は変化し得るので、本発明はこのような方法及び条件に限定されない。また当然のことながら、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書において使用される用語は、特定の実施態様を記載する目的のみのためであり、限定することを意図されない。
【００３０】
別の定義がなければ、本明細書において使用される全ての技術的及び化学的な用語は、本発明が属する分野の当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書で使用される用語「約」は、特定の列挙される数値を参照して使用される場合、その値が列挙された値から１％以下だけ変動し得るということを意味する。例えば、本明細書で使用される表現「約１００」は９９及び１０１、並びにその間の全ての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を含む。
【００３１】
本明細書に記載される方法及び材料と類似するか又はそれらと等価ないずれの方法及び材料も本発明の実施又は試験において使用され得るが、好ましい方法及び材料をここで記載する。本明細書において言及される全ての特許、出願及び非特許刊行物は、それら全体として参照により本明細書に加入される。
【００３２】
定義
本明細書で使用される表現「プレプロエンドセリン−1」、「プレプロET−1」、「プレプロEDN−1」などは、配列番号433に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。
【００３３】
本明細書で使用される表現「ビッグエンドセリン−1」、「ビッグEDN−1」、「ビッグET−1」などは、配列番号434のアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味し、この配列は配列番号433のアミノ酸53〜90と同一である。
【００３４】
本明細書で使用される表現「エンドセリン−1」、「ET−1」、「EDN−1」、「スモールエンドセリン−1」、「スモールET−1」、「スモールEDN−1」などは、配列番号435のアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味し、この配列は配列番号433のアミノ酸53〜73と同一である。(スモールET−1のアミノ酸配列はこのペプチドのマウスバージョンとヒトバージョンで同じである）。
【００３５】
本明細書で使用される前述の表現(例えば、「プレプロET−1」、「ビッグET−1」、「スモールET−1」、「エンドセリン−1」など)は全て、非ヒト種由来である(例えば「マウスプレプロET−1」、「マウスビッグET−1」、「マウススモールET−1」、「マウスエンドセリン−1」など)と特定されていなければ、対応する分子のヒトバージョンを指す。
【００３６】
本明細書で使用される表現「エンドセリン変換酵素−1」、「ECE−1」などは、配列番号434のTrp−21とVal−22との接合点(すなわち、「Tpr21／Val22接合点」)でビッグET−1を特異的に切断して、それによりスモールET−1及び配列番号434のアミノ酸２２〜３８を有する非活性C末端生成物を生成することができる酵素を意味する。例となるECE−1は、配列番号436のアミノ酸配列を有するヒト酵素である。
【００３７】
本明細書で使用される用語「抗体」は、特定の抗原（例えば、ビッグET−1）に特異的に結合するかまたはそれと相互作用する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むいずれかの抗原結合分子又は分子複合体を意味する。用語「抗体」は、４つのポリペプチド鎖、ジスルフィド結合により相互接続した２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子、さらにはそのマルチマー（例えば、ＩｇＭ）を含む。各重鎖は重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲ又はＶHと略される）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣH１、ＣH２及びＣH３を含む。各軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲ又はＶLと略される）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は１つのドメイン（ＣL１）を含む。ＶH及びＶL領域は、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域間に組み入れられた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分され得る。各ＶH及びＶLは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。本発明の異なる実施態様において、抗ビッグET−1抗体（又はその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であってもよく、又は天然若しくは人工的に改変されていてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ又はそれ以上のＣＤＲの比較（ｓｉｄｅ−ｂｙ−ｓｉｄｅ）解析に基づいて規定され得る。
【００３８】
本明細書で使用される用語「抗体」はまた、完全抗体分子の抗原結合フラグメントも含む。本明細書で使用される、抗体の「抗原結合部分」又は抗体の「抗原結合フラグメント」などの用語は、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、いずれかの天然に存在するか、酵素により得られるか、合成又は遺伝的に操作されたポリペプチド又は糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合フラグメントは、例えば完全抗体分子から、いずれかの適切な標準の技術、例えばタンパク質消化、又は抗体の可変ドメイン及び場合により定常ドメインをコードするＤＮＡの操作及び発現を含む組換え遺伝子操作技術を使用して誘導され得る。このようなＤＮＡは公知であるか、かつ／又は例えば商業的供給源、ＤＮＡライブラリ（例えばファージ−抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であるか、又は合成され得る。ＤＮＡは配列決定され、そして例えば、１つ若しくはそれ以上の可変ドメイン及び／若しくは定常ドメインを適切な構成に配置するため、又はコドンを導入し、システイン残基を作製し、アミノ酸を改変、付加若しくは欠失などするために、化学的に、又は分子生物学的技術を使用することにより操作され得る。
【００３９】
抗原結合フラグメントの非限定的な例としては：（ｉ）Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント；（ｉｖ）Ｆｖフラグメント；（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント；及び（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えばＣＤＲ３ペプチド）を模倣したアミノ酸残基からなる最小認識単位、又は拘束性（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチドが挙げられる。他の操作された分子、例えばドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ−グラフト化抗体、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、三重特異性抗体（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）、四重特異性抗体（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）、ミニ抗体（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）、ナノボディ（例えば一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小分子免疫薬（ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（ＳＭＩＰ）、及びサメ可変ＩｇＮＡＲドメインもまた本明細書で使用される表現「抗原結合フラグメント」内に包含される。
【００４０】
抗体の抗原結合フラグメントは、典型的には少なくとも１つの可変ドメインを含む。可変ドメインは、いずれのサイズ又はアミノ酸組成のものでもよく、そして一般的には、１つ又はそれ以上のフレームワーク配列に隣接するか、又はそれらとインフレームである少なくとも１つのＣＤＲを含むだろう。ＶLドメインに伴ってＶHドメインを有する抗原結合フラグメントにおいて、ＶH及びＶLドメインは互いに対していずれかの適切な配置で位置づけられ得る。例えば、可変領域は二量体であり得、そしてＶH−ＶH、ＶH−ＶL又はＶL−ＶL二量体を含み得る。あるいは、抗体の抗原結合フラグメントは、モノマーのＶH又はＶLドメインを含み得る。
【００４１】
特定の実施態様において、抗体の抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合で連結された少なくとも１つの可変ドメインを含み得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメント内に見られ得る可変ドメイン及び定常ドメインの非限定的な例となる構成としては：（ｉ）ＶH−ＣH１；（ｉｉ）ＶH−ＣH２；（ｉｉｉ）ＶH−ＣH３；（ｉｖ）ＶH−ＣH１−ＣH２；（ｖ）ＶH−ＣH１−ＣH２−ＣH３；（ｖｉ）ＶH−ＣH２−ＣH３；（ｖｉｉ）ＶH−ＣL；（ｖｉｉｉ）ＶL−ＣH１；（ｉｘ）ＶL−ＣH２；（ｘ）ＶL−ＣH３；（ｘｉ）ＶL−ＣH１−ＣH２；（ｘｉｉ）ＶL−ＣH１−ＣH２−ＣH３；（ｘｉｉｉ）ＶL−ＣH２−ＣH３；及び（ｘｉｖ）ＶL−ＣLが挙げられる。上に列挙された例となる構成のうちのいずれかを含めて可変ドメイン及び定常ドメインのいずれかの構成において、可変ドメイン及び定常ドメインは、互いに直接連結されていても、又は完全若しくは部分的ヒンジ若しくはリンカー領域によって連結されていてもよい。ヒンジ領域は、少なくとも２つ（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０又はそれ以上）のアミノ酸からなり得、これらは単一のポリペプチド分子中の隣接する可変ドメイン及び／又は定常ドメイン間の可撓性又は半可撓性の連結を生じる。さらに、本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、互いに、かつ／又は１つ若しくはそれ以上のモノマーＶH若しくはＶLドメインと非共有結合結合した（例えば、ジスルフィド結合により）、上で列挙された可変ドメイン及び定常ドメインの構成のいずれかのホモ二量体又はヘテロ二量体（又は他のマルチマー）を含み得る。
【００４２】
完全抗体分子と同様に、抗原結合フラグメントは単一特異性でも多重特異性（例えば、二重特異性）でもよい。抗体の多重特異性抗原結合フラグメントは、典型的には少なくとも２つの異なる可変ドメインを含み、ここで各可変ドメインは別々の抗原に、または同じ抗原上の異なるエピトープに特異的に結合することができる。本明細書に開示される例となる二重特異性抗体形式を含めて、いずれの多重特異性抗体形式も、当該分野で利用可能な慣用の技術を使用して本発明の抗体の抗原結合フラグメントの状況における使用のために適合され得る。
【００４３】
本発明の抗体は、補体依存性細胞傷害(CDC)又は抗体依存性細胞介在性細胞傷害(ADCC)により機能し得る。「補体依存性細胞傷害」(CDC)は、補体の存在下での本発明の抗体による抗原発現細胞の溶解を指す。「抗体依存性細胞介在性細胞傷害」(ADCC)は、Fc受容体(FcR)を発現する非特異的細胞傷害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(NK)細胞、好中球、及びマクロファージ)が標的細胞上の結合した抗体を認識し、それにより標的細胞の溶解をもたらす細胞介在性反応を指す。CDC及びADCCは、当該分野で周知でありかつ利用可能なアッセイを使用して測定され得る。(例えば、U.S.5,500,362及び5,821,337、並びにClynes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95：652−656を参照のこと)。抗体の定常領域は、補体を固定し、細胞依存性細胞傷害を媒介する抗体の能力において重要である。従って、抗体のアイソタイプは、抗体が細胞傷害を媒介することが望ましいかどうかに基づいて選択され得る。
【００４４】
本明細書で使用される用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含むことを意図される。本発明のヒト抗体は、例えばＣＤＲにおいて、特にＣＤＲ３において、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列にコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム若しくは部位特異的変異誘発により導入された変異、又はインビボでの体細胞変異により導入された変異）を含み得る。しかし、本明細書で使用される用語「ヒト抗体」は、別の哺乳動物種（例えばマウス）の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に接合された抗体を含むことを意図されない。
【００４５】
本明細書で使用される用語「組換えヒト抗体」は、組換え手段により製造、発現、作製又は単離された全てのヒト抗体、例えば宿主細胞中にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体（以下にさらに記載される）、組換え体から単離された抗体、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリ（以下にさらに記載される）、ヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックな動物（例えばマウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５を参照のこと）、又はヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを含むいずれかの他の手段により製造、発現、作製若しくは単離された抗体を含むことを意図される。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変領域及び定常領域を有する。しかし特定の実施態様では、このような組換えヒト抗体は、インビトロ変異誘発（又はヒトＩｇ配列に対してトランスジェニックな動物が使用される場合は、インビボ体細胞変異）を受け、従って組換え抗体のＶH及びＶL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶH及びＶL配列由来であるかそれらに関連するが、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー内には天然で存在しないかもしれない。
【００４６】
ヒト抗体は、ヒンジ不均一性に関連する２つの形態で存在し得る。１つの形態において、免疫グロブリン分子は、二量体が鎖間重鎖ジスルフィド結合により結合された約１５０〜１６０ｋＤａの安定な４つの鎖の構築物を含む。２つ目の形態において、二量体は鎖間ジスルフィド結合を介して連結されておらず、共有結合でカップリングされた軽鎖及び重鎖から構成される約７５〜８０ｋＤａの分子が形成される（半抗体）。これらの形態はアフィニティ精製後でも分離することが非常に困難である。
【００４７】
様々なインタクトなＩｇＧアイソタイプにおける２つ目の形態の出現頻度は、限定されないが、抗体のヒンジ領域アイソタイプに関連する構造的差異に起因する。ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域における単一アミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１ヒンジを使用して典型的に観察されるレベルまで第二の形態の出現を有意に減少させ得る（Ａｎｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３０：１０５）。本発明は、ヒンジ、ＣH２又はＣH３領域において１つ又はそれ以上の変異を有する抗体を包含し、これは例えば製造の際に所望の抗体形態の収量を改善するために望ましいかもしれない。
【００４８】
本明細書で使用される「単離された抗体」は、同定され、かつその天然の環境の少なくとも１つの構成要素から分離及び／又は回収された抗体を意味する。例えば、生物の少なくとも１つの構成要素から、又はその抗体が天然に存在するか若しくは天然で産生される組織若しくは細胞から分離されるか又は取り出された抗体は、本発明の目的で「単離された抗体」である。単離された抗体はまた、組換え細胞内のインサイチュの抗体を含む。単離された抗体は、少なくとも１つの精製又は単離工程を受けた抗体である。特定の実施態様によれば、単離された抗体は他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まないものであり得る。
【００４９】
用語「特異的に結合する」又は同種のものは、抗体又はその抗原結合フラグメントが、生理条件下で比較的安定な抗原との複合体を形成するということを意味する。抗体が抗原に特異的に結合するかどうかを決定するための方法は当該分野で周知であり、これらとしては、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴等が挙げられる。例えば、本発明の文脈において使用される、ヒトビッグET−1に「特異的に結合する」抗体は、ビッグET−1又はその部分に、表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定して、約1000nM未満、約500nM未満、約300nM未満、約200nM未満、約100nM未満、約90nM未満、約80nM未満、約70nM未満、約60nM未満、約50nM未満、約40nM未満、約30nM未満、約20nM未満、約10nM未満、約5nM未満、約4nM未満、約3nM未満、約2nM未満、約1nM又は約0.5nM未満のKDで結合する抗体を含む。(例えば、本明細書の実施例３を参照のこと)。しかし、ヒトビッグET−1に特異的に結合する単離された抗体は、他の（非ヒト）種由来のエンドセリン分子のような他の抗原に対して交差反応性を有し得る。
【００５０】
本明細書で使用される「中和」又は「遮断」抗体は、ビッグET−1へのその結合が：(i)エンドセリン変換酵素(例えば、ECE−1)によるビッグET−1の切断を阻害もしく妨害し、かつ／又は(ii)エンドセリン−1の少なくとも１つの生物学的機能の阻害を生じる抗体を指すことを意図される。ビッグET−1中和又は遮断抗体により引き起こされる阻害は、適切なアッセイを使用して検出可能であるかぎりは完全である必要はない。ビッグET−1切断阻害を検出するための例となるアッセイは本明細書の他所に記載される。
【００５１】
本明細書に開示される抗ビッグET−1抗体は、その抗体が由来する対応する生殖系列配列と比較して、重鎖及び軽鎖可変ドメインのフレームワーク及び／又はＣＤＲ領域中に１つ又はそれ以上のアミノ酸の置換、挿入、及び／又は欠失を含み得る。このような変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を、例えば公開抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することにより容易に確認され得る。本発明は、１つ又はそれ以上のフレームワーク及び／又はＣＤＲ領域内の１つ又はそれ以上のアミノ酸が、その抗体が由来する生殖系列配列の対応する残基に、又は別のヒト生殖系列配列の対応する残基に、又は対応する生殖系列残基の保存的アミノ酸置換に変異されている（このような配列変更は本明細書において集合的に「生殖系列変異」と呼ばれる）、本明細書に開示されるアミノ酸配列のいずれかに由来する抗体、及びその抗原結合フラグメントを含む。当業者は、本明細書に開示される重鎖及び軽鎖可変領域配列から始めて、１つ又はそれ以上の個々の生殖系列変異又はその組み合わせを含む多数の抗体及びその抗原結合フラグメントを容易に製造することができる。特定の実施態様において、ＶH及び／又はＶLドメイン内の全てのフレームワーク及び／又はＣＤＲ残基は、その抗体が由来する元の生殖系列配列中に見られる残基へと復帰突然変異される（ｍｕｔａｔｅｄ  ｂａｃｋ）。他の実施態様において、特定の残基のみ、例えば、ＦＲ１の最初の８アミノ酸内若しくはＦＲ４の最後の８アミノ酸内に見られる変異した残基のみ、又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２若しくはＣＤＲ３内に見られる変異した残基のみを元の生殖系列配列へと復帰突然変異させる。他の実施態様において、１つ又はそれ以上のフレームワーク及び／又はＣＤＲ残基は、異なる生殖系列配列（すなわち、その抗体が元々由来する生殖系列配列と異なる生殖系列配列）の対応する残基へと変異される。さらに、本発明の抗体は、フレームワーク及び／又はＣＤＲ領域内に２つ又はそれ以上の生殖系列変異のいずれかの組み合わせを含み得、例えばここで、特定の個々の残基が特定の生殖系列配列の対応する残基に変異されるが、一方で元の生殖系列配列とは異なる特定の他の残基は維持されるか、又は異なる生殖系列配列の対応する残基へと変異される。一旦入手されれば、１つ又はそれ以上の生殖系列変異を含む抗体及び抗原結合フラグメントは、１つ又はそれ以上の所望の特性、例えば、改善された結合特異性、増加した結合親和性、改善又は増強されたアンタゴニスト又はアゴニストの生物学的特性（場合によって）、減少した免疫原性などについて容易に試験され得る。この一般的な方法で得られた抗体及び抗原結合フラグメントは本発明内に包含される。
【００５２】
本発明はまた、１つ又はそれ以上の保存的置換を有する、本明細書で開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列のいずれかの変異体を含む抗体ビッグET−1抗体を含む。例えば、本発明は、例えば、１０又はそれ以下、８又はそれ以下、６又はそれ以下、４又はそれ以下などの、本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列のいずれかに対する保存的アミノ酸置換を含むＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ビッグET−1抗体を包含する。
【００５３】
本明細書で使用される「表面プラズモン共鳴」は、例えばBIAcoreTMシステム(Biacore Life Sciences division of GE Healthcare、Piscataway、NJ)を使用して、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することにより実時間相互作用の分析を可能にする光学現象を指す。
【００５４】
本明細書で使用される用語「KD」は、特定の抗体−抗原相互作用の平衡解離定数を指すことを意図される。
【００５５】
用語「エピトープ」は、パラトープとして知られる抗体分子の可変領域における特異的抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗体は１つより多くのエピトープを有し得る。従って、異なる抗体が抗原上の異なる領域に結合し得、そして異なる生物学的作用を有し得る。エピトープは立体構造的でも線状でもよい。立体構造的エピトープは、線状ポリペプチド鎖の異なるセグメントからの空間的に並置されたアミノ酸により生じる。線状エピトープは、ポリペプチド鎖中の隣接するアミノ酸残基により生じるものである。特定の状況において、エピトープは、抗原上に糖質、ホスホリル基、又はスルホニル基の部分を含み得る。
【００５６】
核酸又はそのフラグメントに言及する場合の用語「実質的同一性」又は「実質的に同一」は、適切なヌクレオチド挿入又は欠失と共に別の核酸（又はその相補鎖）と最適に整列された場合に、以下に考察されるようなＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ又はＧａｐのようないずれかの周知の配列同一性アルゴリズムにより測定して、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９５％、そしてより好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％又は９９％におけるヌクレオチド配列同一性があることを示す。参照核酸分子に対して実質的同一性を有する核酸分子は、特定の場合において、参照核酸分子によりコードされるポリペプチドと同じか又は実質的に類似したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。
【００５７】
ポリペプチドに適用される用語「実質的類似性」又は「実質的に類似」は、２つのペプチド配列が、例えばデフォルトギャップ重み（ｗｅｉｇｈｔｓ）を使用してプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴにより最適に整列された場合に、少なくとも９５％の配列同一性、なおより好ましくは少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換により異なる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似した化学特性（例えば電荷又は疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基で置換されたものである。一般的に、保存的アミノ酸置換はタンパク質の機能的特性を実質的に変更しない。２つ又はそれ以上のアミノ酸配列が保存的置換により互いに異なる場合において、配列同一性パーセント又は類似度は、置換の保存的性質を補正するために上方調整され得る。この調整を行うための手段は当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１（参照により本明細書に加入される）を参照のこと。類似した化学特性を有する側鎖を有するアミノ酸のグループの例としては以下が挙げられる、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；（２）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリン及びスレオニン；（３）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン；（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン；（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、及びヒスチジン；（６）酸性側鎖：アスパラギン酸及びグルタミン酸、並びに（７）硫黄含有側鎖はシステイン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換グループは：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、及びアスパラギン−グルタミンである。あるいは、保存的置換は、Ｇｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３−１４４５において開示されるＰＡＭ２５０対数尤度マトリクスにおいて正の値を有するいずれかの変化である。「中程度に保存的な」置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリクスにおいて負でない値を有するいずれかの変化である。
【００５８】
ポリペプチドについての配列類似性（配列同一性とも呼ばれる）は、典型的には配列解析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、様々な置換、欠失、及び保存的アミノ酸置換を含む他の改変に割り当てられる類似性の尺度を使用して類似した配列を照合する。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、密接に関連したポリペプチド、例えば異なる生物種由来の相同ポリペプチドの間、又は野生型タンパク質とそのムテインとの間の配列相同性又は配列同一性を決定するためにデフォルトパラメータと共に使用され得るＧａｐ及びＢｅｓｔｆｉｔのようなプログラムを含む。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照のこと。ポリペプチド配列はまた、デフォルト又は推奨のパラメータ、ＧＣＧバージョン６．１におけるプログラムを使用してＦＡＳＴＡを使用して比較され得る。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）は、クエリ配列と検索配列との間の最大オーバーラップの領域の整列及び配列同一性パーセントを提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １３２：１８５−２１９（２０００））。本発明の配列を異なる生物由来の多数の配列を含むデータベースと比較する場合に好ましい別のアルゴリズムは、デフォルトパラメータを使用する、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰ又はＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−４０２（それぞれ参照により本明細書に加入される）を参照のこと。
【００５９】
抗体の生物学的特徴
本発明の抗体は、ヒトビッグET−1(配列番号434)に特異的に結合するが、ヒトスモールET−1(配列番号435)には結合しない。抗体と抗原との間の相互作用を定量的又は定性的に測定するいずれかのアッセイ形式を使用して、抗体がヒトビッグET−1及び／又はヒトスモールET−1に特異的に結合するか、又は結合しないかを決定することができる。例えば、表面プラズモン共鳴は、本明細書の実施例３において説明されるように、特定の試験抗体が、ヒトビッグET−1及び／又はヒトスモールET−1に特異的に結合するか、又は結合しないかを決定するために使用され得る。本発明の開示の目的のために、表面プラズモン共鳴アッセイにおいてスモールET−1への結合について試験された場合に、約1.0E−06M(すなわち、＞1000nM)より高いKD値を示すか、又はスモールET−1へのいずれの検出可能な結合も示さない抗体は、ヒトスモールET−1に結合しない」抗体とみなされる。ヒトスモールET−1に結合しない本発明の特定の例となる抗体は、その表現が本明細書において定義されているように、本明細書の実施例３において説明されるように表面プラズモン共鳴アッセイ又は同様のアッセイにおいて、ヒトビッグET−1への結合について試験された場合に、それにもかかわらず、約1.0E−07M未満(例えば、1.0E−08M、1.0E−09M、1.0E−10M、1.0E−11M、1.0E−12M、又はそれ以下)のKD値でヒトビッグET−1への特異的結合を示す。
【００６０】
本発明の特定の例となる抗体の別の特徴は、エンドセリン変換酵素−1(ECE−1)によるビッグET−1(配列番号434)の切断を遮断する能力である。ECE−1によるビッグET−1の切断は２つのフラグメントを生じる：スモールET−1（配列番号434のN末端の２１個のアミノ酸に相当する)、及び非活性C末端生成物(配列番号434のC末端の１７個のアミノ酸に相当する)。従って、ビッグET−1をECE−1と混合した場合、生物学的に活性なスモールET−1の出現及び／又は非活性C末端ペプチドの出現は、ビッグET−1がECE−1により切断された程度の指標として役立つ。
【００６１】
ECE−1によるビッグET−1の切断を検出するいずれかのアッセイ形式を使用して、その表現が本明細書において使用されるように、抗体が「切断を遮断する」かどうかを決定することができる。ECE−1によるビッグET−1の切断を抗体が遮断するかどうかを決定するために使用され得る非限定的な例となるアッセイ形式は本明細書の実施例４に示される。この実施例において、ビッグET−1の切断は、エンドセリン−1(すなわち、スモールET−1、ビッグET−1の切断生成物)の存在にのみ応答してレポーターシグナルを生じる操作された細胞株を使用して間接的に検出される。具体的には、このアッセイ形式は、ヒトエンドセリンA型受容体(ETaR)をルシフェラーゼ受容体要素と共に発現する細胞株を使用する。切断反応は、最初に抗体をビッグET−1に加え、続いてECE−1を加えて準備し、次いで反応させて適切な量の時間、ビッグET−1の酵素切断をもたらす条件下(例えば、37℃で終夜)でインキュベートする。次いでこの切断反応混合物をETaRを発現するレポーター細胞株に加え、そしてレポーター活性(もしあれば)の量を測定する。遮断抗体はビッグET−1の切断を阻害し、従ってスモールET−1の形成を阻害する。遮断抗体を含む反応混合物は、その結果として、レポーター細胞株に加えられた場合に減少したレポーター活性を生じるか、レポーター活性を生じない。このアッセイ形式において使用される抗体の量を変えることにより、ビッグET−1切断を５０％阻害するために必要な抗体の量を計算することができ、そしてIC50値で表すことができる(例えば、実施例４、表４〜５を参照のこと)。本発明によれば、抗ビッグET−1抗体は、抗体が上記のアッセイ形式又は実質的に同様のアッセイで試験された場合に、約1.0E−08M未満のIC50 (例えば、約9.0E−09M、約8.5E−09M、約8.0E−09M、約7.5E−09M、約7.0E−09M、約6.5E−09M、約6.0E−09M、約5.5E−09M、約5.0E−09M、約4.5E−09M、約4.0E−09M、約3.5E−09M、3.0E−09M、約2.5E−09M、約2.0E−09M、約1.5E−09M、約1.0E−09M、約9.0E−10M、約8.5E−10M、約8.0E−10M、約7.5E−10M、約7.0E−10M、約6.5E−10M、約6.0E−10M、約5.5E−10M、約5.0E−10M、約4.5E−10M、約4.0E−10M、約3.5E−10M、3.0E−10M、約2.5E−10M、約2.0E−10M、約1.5E−10M、約1.0E−10M、又はそれ以下のIC50)を示す場合に、「ECE−1によるビッグET−1の切断を遮断する」。
【００６２】
抗体がECE−1によるビッグET−1の切断を遮断するかどうかを決定するために使用され得るさらなる、又は代替の、例となるアッセイ形式を、本明細書の実施例５に示す。このアッセイ形成期において、切断反応は、抗体をビッグET−1に加え、続いてECE−1を加えて準備される。この反応混合物を、ビッグET−1の酵素切断をもたらす条件下(例えば、37℃)でインキュベートさせて、反応の開始後の様々な時点(例えば、0、15、30及び60分)にアリコートを取る。これらのアリコートをマトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間(MALDI−TOF)質量分析にかけて切断生成物の存在又は不在を決定する。ECE−1によるビッグET−1の切断は、特徴的な分子量を有するペプチド生成物を生じる。例えば、ECE−1によるヒトビッグET−1の切断は、2475Daの分子量を有するスモールET−1、及び1809Daの分子量を有する非活性C末端ペプチドを生じる。MALDI−TOFによるこれらのフラグメントのいずれか又は両方の出現は、このアッセイにおいてECE−1によるビッグET−1の切断を示す。しかし、ビッグET−1を抗ビッグET−1抗体と混合した後に、ECE−1を添加しても切断生成物の一方又は両方が生じない(又はネガティブ対照抗体と比較して実質的により少ない切断生成物が生じる）場合、その表現が本明細書で使用されるように、抗体は「ECE−1によるビッグET−1の切断を遮断する」と結論づけられる。
【００６３】
本発明はまた、エンドセリン−1媒介動脈圧増加を阻害するかまたは減少させる抗体を含む。エンドセリン媒介動脈圧増加を評価するために使用され得る例となる動物モデルを本明細書の実施例６において説明する。この実施例において、マウスに抗ビッグET−1抗体を投与し、続いてヒトビッグET−1ペプチドを投与する。ビッグET−1曝露後に動脈圧の変化を実時間で測定する。ビッグET−1のインビボでの生理活性スモールET−1への切断は、平均動脈圧の増加に反映される。遮断抗ビッグET−1抗体がこのアッセイ形式において投与される場合、平均動脈圧は増加しないか、又はアイソタイプコントロール抗体の投与と比較してより低い程度まで増加する。
【００６４】
本発明はまた、様々な動物疼痛モデルにおいて疼痛反応を阻害するか又は減少させる抗体を含む。本発明の抗ビッグET−1抗体を特徴づけるために有用な例となる動物疼痛モデルを本明細書の実施例９において説明する(例えば、侵害防御機構挙動減少)。本発明はまた、内臓痛反応(例えば、マウスモデルにおける酸誘導内臓痛に対する反応)を減弱又は阻害する抗ビッグET−1抗体を含む。具体的には、本発明は、動物モデルにおいて約1又は10mg／kgの用量で投与された場合に、内臓痛反応(例えば、0.6％酢酸の腹腔内注射に対する反応における腹部収縮)の少なくとも20％の阻害を示す抗ビッグET−1を含む。場合によっては、本発明の抗体の投与に起因する疼痛反応における阻害パーセントは、動物モデルにおいて試験された場合に約30％、35％、40％、45％、50％、又はそれ以上ほどの高さになり得る。本発明の抗ビッグET−1抗体を特徴づけるために使用され得るさらなる動物疼痛モデルとしては、例えば、機械的侵害受容疼痛反応モデル、筋肉痛モデル、及び当該分野で利用可能な他の同様の動物モデルが挙げられる。従って本発明は、侵害性機械的刺激及び／又は酸性食塩水誘導若しくはカラゲナン誘導筋肉痛覚過敏に対する疼痛反応を減弱又は阻害することができる抗ビッグET−1抗体を含む。
【００６５】
エピトープマッピング及び関連技術
本発明は、ビッグET−1のECE−1切断部位又はその付近に位置する１つ又はそれ以上のアミノ酸と相互作用する抗体を含む。ECE−1はビッグET−1をビッグET−1(配列番号434)のTrp−21とVal−22との接合点で切断する。従って、本発明は、ビッグET−1(配列番号434)のTrp−21／Val−22接合点の１０アミノ酸以内に位置する１つ又はそれ以上のアミノ酸と相互作用する抗ビッグET−1抗体を含む。抗体が結合するエピトープは、ビッグET−1のECE−1切断部位又はその付近に位置する３つ又はそれ以上(例えば、3、4、5、6、7、8、9、又は10)のアミノ酸の単一の連続した配列からなるものであり得る。あるいは、エピトープは、ビッグET−1のECE−1切断部位又はその付近(例えば、約10アミノ酸以内)に位置する複数の非連続アミノ酸(又はアミノ酸配列)からなるものであり得る。
【００６６】
当業者に公知の様々な技術を使用して、抗体がポリペプチド又はタンパク質内の「１つ又はそれ以上のアミノ酸と相互作用する」かどうかを決定することができる。例となる技術としては、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．、ＮＹ）に記載されるような慣用の交差ブロック（ｃｒｏｓｓ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ）アッセイ、アラニンスキャニング変異解析、ペプチドブロット分析（Ｒｅｉｎｅｋｅ、２００４、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２４８：４４３−４６３）、及びペプチド切断分析が挙げられる。さらに、抗原のエピトープ切除、エピトープ抽出及び化学的修飾のような方法が使用され得る（Ｔｏｍｅｒ、２０００、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９：４８７−４９６）。抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するために使用され得る別の方法は、質量分析法により検出される水素／重水素交換である。大まかにに言えば、水素／重水素交換法は、目的のタンパク質を重水素で標識し、続いて抗体をその重水素標識タンパク質に結合させることを含む。次に、タンパク質／抗体複合体を水に移して、抗体により保護された残基（これは重水素標識されたままである）を除く全ての残基において水素−重水素交換を起こさせる。抗体の解離後、標的タンパク質をプロテアーゼ切断及び質量分光分析にかけて、それにより、抗体が相互作用する特定のアミノ酸に対応する重水素標識された残基を明らかにする。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６７（２）：２５２−２５９；Ｅｎｇｅｎ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ  （２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ−２６５Ａを参照のこと。
【００６７】
本発明はさらに、本明細書に記載される特定の例となる抗体（例えばH2M6486N、H2M6490N、H1M6492N、H1M6494N、H2M6495N、H2M6741N、H4H6311P、H4H6316P、H4H6317P、H4H6323P、H4H6327P2、H4H6328P、H4H6329P、H4H6330P、H4H6332P、H4H6334P、H4H6334P2、H4H6335P、H4H6337P、H4H6338P、H4H6340P、H4H6343P、H4H6345P、H4H6347P、H4H6353P、H4H6490N2、H4H6492N2など)のいずれかと同じエピトープに結合する抗ビッグET−1抗体を含む。同様に、本発明はまた、本明細書に記載される特定の例となる抗体（例えばH2M6486N、H2M6490N、H1M6492N、H1M6494N、H2M6495N、H2M6741N、H4H6311P、H4H6316P、H4H6317P、H4H6323P、H4H6327P2、H4H6328P、H4H6329P、H4H6330P、H4H6332P、H4H6334P、H4H6334P2、H4H6335P、H4H6337P、H4H6338P、H4H6340P、H4H6343P、H4H6345P、H4H6347P、H4H6353P
、H4H6490N2、H4H6492N2など)のいずれかと、ビッグET−1への結合に関して競合する抗ビッグET−1抗体を含む。
【００６８】
当該分野で公知の慣用の方法を使用することにより、抗体が、参照抗ビッグET−1抗体と同じエピトープに結合するか、又は参照抗ビッグET−1抗体と結合について競合するかどうかを容易に決定することができる。例えば、試験抗体が本発明の参照抗ビッグET−1抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定するために、飽和条件下で参照抗体をビッグET−1タンパク質又はペプチドに結合させる。次に、ビッグET−1分子に結合する試験抗体の能力を評価する。試験抗体が参照抗ビッグET−1抗体との飽和結合後にビッグET−1に結合することが出来る場合、その試験抗体は参照抗ビッグET−1抗体と異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。他方で、試験抗体が参照抗ビッグET−1抗体との飽和結合後にビッグET−1分子に結合する事ができない場合、その試験抗体は本発明の参照抗ビッグET−1抗体により結合されるエピトープと同じエピトープに結合するかもしれない。次いでさらなる慣用の実験（例えば、ペプチド変異及び結合解析）を行い、観察された試験抗体の結合の欠如が実際に参照抗体と同じエピトープへの結合に起因するか、又は立体的ブロック（又は別の現象）が観察された結合の欠如の原因であるかどうかを確認する。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、フローサイトメトリー又は当該分野で利用可能ないずれかの他の定量的若しくは定性的な抗体結合アッセイを使用して行われ得る。本発明の特定の実施態様に従って、競合結合アッセイで測定して、１倍、５倍、１０倍、２０倍、又は１００倍過剰の一方の抗体が、他方の結合を少なくとも５０％だけ阻害するが、好ましくは７５％、９０％又は９９％も阻害する場合、２つの抗体は同じ（又は重なっている）エピトープに結合する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９０：５０：１４９５−１５０２を参照のこと）。あるいは、２つの抗体は、一方の抗体の結合を減少させるか又は排除する、抗原における本質的に全てのアミノ酸変異が他方の結合を減少させるか又は排除する場合に、同じエピトープに結合するとみなされる。２つの抗体は、一方の抗体の結合を減少させるか又は排除するアミノ酸変異のサブセットのみが他方の結合を減少させるか又は排除する場合に、「重なった（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）エピトープ」を有するとみなされる。
【００６９】
抗体が結合について参照抗ビッグET−1抗体と競合するかどうかを決定するために、上記の結合方法論を２つの方向性で行う：第一の方向性では、参照抗体を、飽和条件下でビッグET−1分子に結合させ、続いて試験抗体のビッグET−1分子への結合を評価する。第二の方向性では、試験抗体を飽和条件下でビッグET−1分子に結合させ、続いて参照抗体のビッグET−1分子への結合を評価する。両方の方向性で、第一の（飽和）抗体のみがビッグET−1分子に結合することができる場合、試験抗体及び参照抗体はビッグET−1への結合について競合すると結論づけられる。当業者には当然のことながら、参照抗体と結合について競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同じエピトープに結合しないかもしれないが、重なっているかまたは隣接するエピトープに結合することにより参照抗体の結合を立体的にブロックするかもしれない。
【００７０】
ヒト抗体の製造
完全ヒトモノクローナル抗体を含めてモノクローナル抗体を生成するための方法は当該分野で公知である。いずれかのこのような公知の方法を、本発明の状況において使用して、ヒトビッグET−1に特異的に結合するヒト抗体を製造することができる。
【００７１】
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥTM技術又はモノクローナル抗体を生成するためのいずれかの他の公知の方法を使用して、ヒト可変領域及びマウス定常領域を有する、ビッグET−1に対する高親和性キメラ抗体を最初に単離する。以下の実験項のように、抗体を特徴付けし、そして親和性、選択性、エピトープなどの所望の特徴について選択する。マウス定常領域を所望のヒト定常領域と置き換えて、本発明の完全ヒト抗体を生成する（例えば野生型又は改変されたＩｇＧ１又はＩｇＧ４）。選択される定常領域は特定の用途に従って変わり得るが、高親和性抗原結合及び標的特異性の特徴は可変領域にある。
【００７２】
生物学的等価体（Ｂｉｏｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ）
本発明の抗ビッグET−1抗体及び抗体フラグメントは、記載される抗体のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するが、ヒトビッグET−1に結合する能力は保有しているタンパク質を包含する。このような変異体抗体及び抗体フラグメントは、親配列と比較した場合にアミノ酸の１つ又はそれ以上の付加、欠失又は置換を含むが、記載される抗体の生物学的活性と本質的に等価な生物学的活性を示す。同様に、本発明の抗ビッグET−1抗体をコードするＤＮＡ配列は、開示された配列と比較した場合にヌクレオチドの１つ又はそれ以上の付加、欠失、又は置換を含むが、本発明の抗ビッグET−1抗体又は抗体フラグメントと本質的に生物学的に等価な抗ビッグET−1抗体又は抗体フラグメントをコードする配列を包含する。このような変異体アミノ酸及びＤＮＡ配列の例は上で考察される。
【００７３】
２つの抗原結合タンパク質、すなわち抗体は、例えばそれらが、単回用量又は複数回用量のいずれでも同様の実験条件下で同じモル用量で投与された場合に、それらの吸収の速度及び程度が有意な差異を示さない薬学的等価体又は薬学的代替物である場合に、生物学的に等価とみなされる。いくつかの抗体は、それらが吸収の程度において等価であるが、吸収速度は等価ではない場合に等価体又は薬学的代替物とみなされ、そしてこのような吸収速度の差異は意図的であり、そしてラベルに示され、例えば慢性使用での有効な身体薬物濃度を達成するために必須ではなく、そして試験される特定の薬物製品については医学上重要でないと考えられるので、なお生物学的等価であるとみなされ得る。
【００７４】
一実施態様において、２つの抗原結合タンパク質は、それらの安全性、純度、及び効力において臨床的に意味のある差異が無い場合は生物学的に等価である。
【００７５】
一実施態様において、２つの抗原結合タンパク質は、患者が、そのような切り替えをせず継続された治療と比較して、有害作用の危険性の予期される増加（免疫原性の臨床的に有意な変化、又は減少した有効性を含む）を伴わずに参照製品と生物学的製品とを１回又はそれ以上切り替えられ得る場合に、生物学的に等価である。
【００７６】
一実施態様において、２つの抗原結合タンパク質は、それらが両方とも、そのような機構が知られている程度まで、使用条件についての共通の作用機構により作用する場合に生物学的に等価である。
【００７７】
生物学的等価性は、インビボ及びインビトロの方法で実証され得る。生物学的等価性の測定としては、例えば（ａ）抗体又はその代謝物の濃度を血液、血漿、血清又は他の生体液において時間の関数として測定する、ヒト又は他の哺乳動物におけるインビボ試験；（ｂ）ヒトのインビボバイオアベイラビリティーデータと相関性が有り、かつ合理的に予測されるインビトロ試験；（ｃ）抗体（又はその標的）の適切な急性薬理作用が時間の関数として測定される、ヒト又は他の哺乳動物におけるインビボ試験；及び（ｄ）抗体の安全性、有効性又はバイオアベイラビリティー若しくは生物学的等価性を確立する、十分に管理された臨床試験が挙げられる。
【００７８】
本発明の抗ビッグET−1抗体の生物学的に等価な変異体は、例えば、残基若しくは配列の様々な置換又は生物学的活性に必要の無い末端又は内部の残基若しくは配列の欠失を生じることにより構築され得る。例えば、生物学的活性に必須ではないシステイン残基は、再生の際の不必要又は不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止するために、除去されるか又は他のアミノ酸と置き換えられ得る。他の状況において、生物学的に等価な抗体は、抗体のグリコシル化特徴を改変するアミノ酸変化、例えばグリコシル化を排除または除去する変異を含む抗ビッグET−1抗体変異体を含み得る。
【００７９】
種選択性及び種交差反応性
本発明の特定の実施態様によれば、抗ビッグET−1抗体はヒトビッグET−1に結合するが、他の種由来のビッグET−1には結合しない。本発明はまた、ヒトビッグET−1、及び１つ又はそれ以上の非ヒト種由来のビッグET−1に結合する抗ビッグET−1抗体を含む。例えば、本発明の抗ビッグET−1抗体はヒトビッグET−1に結合し得、そして場合によっては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、アレチネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザル又はチンパンジーのビッグET−1の１つ又はそれ以上に結合し得るか、結合しないかもしれない。
【００８０】
免疫複合体
本発明は、治療部分、例えば、細胞毒、化学療法薬、免疫抑制剤又は放射性同位体と複合体化した抗ビッグET−1モノクローナル抗体（「免疫複合体」）を包含する。細胞傷害性薬物は細胞に対して有害な薬剤を含む。免疫複合体を形成するために適した細胞傷害性薬物及び化学療法薬の例は当該分野で公知である（例えば、ＷＯ０５／１０３０８１を参照のこと）。
【００８１】
多重特異性抗体
本発明の抗体は、単一特異性でも、二重特異性でも、多重毒異性でもよい。多重特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに対して特異的であり得、又は１つより多くの標的ポリペプチドに対して特異的な抗原結合ドメインを含んでいてもよい。例えば、Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９；Ｋｕｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００４、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２３８−２４４を参照のこと。本発明の抗ビッグET−1抗体は、別の機能的分子、例えば別のペプチド又はタンパク質に連結されるか又はそれと同時発現されてもよい。例えば、抗体又はそのフラグメントは、１つ又はそれ以上の他の分子実体、例えば別の抗体又は抗体フラグメントに機能的に連結されて（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合又は他の方法により）、第二の結合特異性を有する二重特異性又は多重特異性抗体を生じ得る。例えば、本発明は、免疫グロブリンの１つのアームがヒトビッグET−1又はそのフラグメントに特異的であり、かつ免疫グロブリンの他方のアームが他の治療標的に特異的であるか治療的部分に結合されている二重特異性抗体を含む。
【００８２】
本発明の状況において使用され得る例となる二重特異的抗体形式は、第一の免疫グロブリン(Ig)  CH3ドメイン及び第二のIg  CH3ドメインの使用を含み、ここで第一及び第二のIg  CH3ドメインは少なくとも１つのアミノ酸が互いに異なり、そして少なくとも１つのアミノ酸差異は、アミノ酸差異を有していない二重特異性抗体と比較して、二重特異性抗体のプロテインAへの結合を減少させる。一実施態様において、第一のIg CH3ドメインはプロテインAに結合し、そして第二のIg CH3ドメインはH95R改変(IMGTエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けではＨ４３５Ｒ）のようなプロテインＡ結合を減少させるかまたは消滅させる変異を含む。第二のＣH３はＹ９６Ｆ改変をさらに含み得る（ＩＭＧＴによる；ＥＵではＹ４３６Ｆ）。第二のＣH３内に見出され得るさらなる改変としては以下が挙げられる：ＩｇＧ１抗体の場合、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵではＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、及びＶ４２２Ｉ）；ＩｇＧ２抗体の場合、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵではＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、及びＶ４２２Ｉ）；並びにＩｇＧ４抗体の場合、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵではＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、及びＶ４２２Ｉ）。上記の二重特異性抗体形式の変形は本発明の範囲内に意図される。
【００８３】
治療用製剤及び投与
本発明は、本発明の抗ビッグET−1抗体又はその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、適切な担体、添加剤、及び改善された輸送、送達、忍容性などをもたらす他の薬剤を用いて製剤化される。多数の適切な処方が、全ての製薬化学者に公知の処方集に見出され得る：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ。これらの製剤としては、例えば、散剤、ペースト剤、軟膏、ゼリー、ワックス、オイル、脂質、脂質（カチオン性又はアニオン性）含有ベシクル小胞（例えばＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮTM、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油及び油中水乳剤、エマルションｃａｒｂｏｗａｘ（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固形ゲル、及びｃａｒｂｏｗａｘを含有する半固形混合物が挙げられる。Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」ＰＤＡ  （１９９８）  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  ５２：２３８−３１１も参照のこと。
【００８４】
患者に投与される抗体の用量は、患者の年齢及びサイズ、標的疾患、状態、投与経路などに依存して変わり得る。好ましい用量は、典型的には体重又は体表面に従って計算される。本発明の抗体が成人患者におけるエンドセリン−1活性に関連する状態又は疾患を処置するために使用される場合、通常は約０．０１〜約２０ｍｇ／体重ｋｇ、より好ましくは約０．０２〜約７、約０．０３〜約５、又は約０．０５〜約３ｍｇ／体重ｋｇの単回用量で、本発明の抗体を静脈内投与することが有利であるかもしれない。状態の重症度に依存して、処置の頻度及び期間は調整され得る。抗ビッグET−1抗体の投与についての有効投薬量及びスケジュールは経験的に決定され得；例えば、患者の進行は定期的評価によりモニタリングされ得、そして用量がそれに従って調整され得る。さらに、投薬量の種間スケーリングは、当該分野で周知の方法を使用して行われ得る（例えば、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．８：１３５１）。
【００８５】
様々な送達系が公知であり、本発明の医薬組成物を投与するために使用され得る（例えば、リポソーム中の封入、マイクロパーティクル、マイクロカプセル、変異ウイルスを発現することができる組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２を参照のこと））。導入方法としては、限定されないが、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口経路が挙げられる。組成物は、いずれかの都合のよい経路により、例えば注入又はボーラス注射により、上皮又は皮膚粘膜裏層（ｌｉｎｉｎｇｓ）（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など）を通した吸収により投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与され得る。投与は全身でも局所でもよい。
【００８６】
本発明の医薬組成物は、標準的な針及びシリンジを用いて皮下又は静脈内に送達され得る。さらに、皮下送達に関して、ペン型送達デバイスは、本発明の医薬組成物の送達の際に容易に有用性を有する。このようなペン型デバイスは再使用可能であるか又は使い捨てであり得る。再使用可能なペン型送達デバイスは一般的に、医薬組成物を含む交換可能なカートリッジを利用する。カートリッジ内の全ての医薬組成物が投与されてカートリッジが空になると、この空のカートリッジは容易に廃棄され得、そして医薬組成物を含む新しいカートリッジと交換され得る。次いで、ペン型送達デバイスは再使用され得る。使い捨てペン型送達デバイスでは、交換可能なカートリッジはない。むしろ、使い捨てペン型送達デバイスは、デバイス内のリザーバー中に保持された医薬組成物を充てん済みにされる。リザーバーから医薬組成物が空になると、デバイス全体が廃棄される。
【００８７】
多数の再使用可能なペン型及び自動注入送達デバイスが本発明の医薬組成物の皮下送達において有用性を有する。例としては、限定されないが少数を挙げると、ＡＵＴＯＰＥＮTM（Ｏｗｅｎ  Ｍｕｍｆｏｒｄ、Ｉｎｃ．、Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ、ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣTMペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｅｒｇｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ  ＭＩＸ  ７５／２５TMペン、ＨＵＭＡＬＯＧTMペン、ＨＵＭＡＬＩＮ  ７０／３０TMペン（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、ＮＯＶＯＰＥＮTM  Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ  ＪＵＮＩＯＲTM（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤTMペン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）、ＯＰＴＩＰＥＮTM、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＰＲＯTM、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＳＴＡＲＬＥＴTM、並びにＯＰＴＩＣＬＩＫTM（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が挙げられる。本発明の医薬組成物の皮下送達において有用性を有する使い捨てペン型送達デバイスの例としては、限定されないが少数を挙げると、ＳＯＬＯＳＴＡＲTMペン（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮTM（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、及びＫＷＩＫＰＥＮTM（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫTM自動注入装置（Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ、ＣＡ）、ＰＥＮＬＥＴTM（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ、Ｌ．Ｐ．）、並びにＨＵＭＩＲＡTMペン（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ  ＩＬ）が挙げられる。
【００８８】
特定の状況において、医薬組成物は徐放系で送達され得る。一実施態様において、ポンプが使用され得る（Ｌａｎｇｅｒ、ｓｕｐｒａ；Ｓｅｆｔｏｎ、１９８７、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１を参照のこと）。別の実施態様において、ポリマー材料が使用され得る；Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ  （ｅｄｓ．）、１９７４、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａを参照のこと。さらに別の実施態様において、徐放系はその組成物の標的に近接して配置され得、従って全身用量のわずかしか必要としない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ、１９８４、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、ｓｕｐｒａ、ｖｏｌ．２、ｐｐ．１１５−１３８を参照のこと）。他の徐放系は、Ｌａｎｇｅｒ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３による概説において考察される。
【００８９】
注射可能製剤としては、静脈内、皮下、皮内及び筋内注射、点滴などのための投薬形態が挙げられ得る。これらの注射可能製剤は、公知の方法により製造され得る。例えば、注射可能製剤は、例えば上記の抗体又はその塩を、注射用に従来使用される滅菌水性媒体又は油性媒体中に溶解、懸濁又は乳化させることにより製造され得る。注射用水性媒体として、例えば、生理食塩水、グルコース及び他の補助剤を含有する等張溶液などがあり、これらは、アルコール（例えば、エタノール）、多価アルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（硬化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加体）］などのような適切な可溶化剤と組み合わせて使用され得る。油性媒体として、例えばゴマ油、大豆油などが使用され、これらは安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどのような可溶化剤と組み合わせて使用され得る。このようにして製造された注射は好ましくは適切なアンプル中に充填される。
【００９０】
有利には、上記の経口又は非経口用途のための医薬組成物は、活性成分の用量に合うように適合された単位用量での投薬形態へと製造される。単位用量でのこのような投薬形態としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射（アンプル）、坐剤などが挙げられる。含有される上述の抗体の量は、一般的には単位用量での投薬形態あたり約５〜約５００ｍｇであり；特に注射の形態では、上述の抗体が約５〜約１００ｍｇで含有され、そして他の投薬形態では約１０〜約２５０ｍｇで含有されることが好ましい。
【００９１】
抗体の治療上の使用
本発明の抗体は、とりわけ、エンドセリン−1活性に関連するかエンドセリン−1活性により媒介されるいずれかの疾患若しくは障害、又はビッグET−1のスモールET−1への切断を遮断することにより処置可能ないずれかの疾患若しくは障害の処置、予防及び／又は寛解のために有用である。本発明の抗体及び抗原結合フラグメントは、例えば、線維性疾患[例えば、線維症(例えば、肺線維症])、炎症性状態、肥大(例えば、心筋細胞及び／又は脈管構造における肥大)、血管疾患(例えば、血管収縮を特徴とする疾患及び障害)、眼疾患、癌(例えば、腫瘍増殖阻害)及び疼痛を処置するために使用され得る。本発明の抗ビッグET−1抗体を使用して処置され得る具体的な例となる疾患及び障害としては、例えば、肺高血圧症、動脈性高血圧、腎疾患、同種移植片拒絶、糖尿病、インスリン抵抗性、心不全、アテローム性動脈硬化症、脳卒中、不整脈、喘息、鎌状赤血球貧血、脳血管れん縮、糖尿病性腎症、強皮症、COPD、侵害受容性疼痛及び内臓痛(例えば、炎症性腸疾患／過敏性腸症候群、間質性膀胱炎、膵炎、子宮内膜症、慢性骨盤痛症候群などに由来する疼痛)が挙げられる。本発明の抗体及び抗原結合フラグメントを用いて処置、予防又は寛解され得るさらなる疼痛関連疾患及び障害としては、炎症(例えば、炎症性筋痛)、多発性筋炎、術後創(例えば、術後痛)、神経障害(例えば、糖尿病性神経障害)、坐骨神経痛、帯状疱疹後神経痛、筋筋膜性疼痛症候群(例えば、慢性筋筋膜痛)、関節炎、鎌状赤血球、腸管神経虚血、跛行痛、骨折、熱傷、骨粗鬆症性骨折、痛風、片頭痛、線維筋痛症、複合性局所疼痛症候群、及び急性疱疹性疼痛に関連する疼痛が挙げられる。
【００９２】
本発明の抗ビッグET−1抗体を使用して処置され得る肺高血圧症の下位範疇には、例えば肺動脈性肺高血圧症、左心疾患に関連する肺高血圧症、肺疾患に関連する肺高血圧症、又は慢性血栓性疾患に起因する肺高血圧症又は塞栓性疾患に起因する肺高血圧症が含まれる。
【００９３】
本発明の抗ビッグET−1抗体を投与することにより処置可能な例となる眼疾患としては、加齢性黄斑変性（例えば、「滲出型（wet）」ＡＭＤ、滲出性（exudative）AMD、糖尿病性網膜症（例えば、増殖性糖尿病性網膜症）、網膜静脈閉塞性疾患、例えば網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、虹彩血管新生、血管新生緑内障、緑内障における術後線維症、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、脈絡膜新生血管、視神経乳頭血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、硝子体血管新生、パンヌス、翼状片、黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、血管性網膜症、網膜変性症、ぶどう膜炎、及び眼の炎症性疾患が挙げられる。例えば、本発明の抗ビッグET−1抗体の投与は、ET−1により引き起こされる血管収縮の遮断、さらには星状細胞(例えば、軸索喪失)及び網膜神経節細胞(例えば、アポトーシス)に対するET−1の効果による緑内障に関連する神経変性効果及び視神経損傷を予防及び／又は処置し得る。
【００９４】
本発明の抗ビッグET−1抗体を投与することにより処置可能なさらなる例となる線維性疾患としては、特発性肺線維症、ブレオマイシン誘導肺線維症、アスベスト誘導肺線維症、閉塞性細気管支炎症候群、慢性喘息、急性肺損傷及び急性呼吸促迫に関連する線維症(例えば、細菌性肺炎誘導線維症、外傷誘導線維症、ウイルス性肺炎誘導線維症、人工呼吸器誘導線維症、非肺敗血症誘導線維症及び吸引誘導線維症)、珪肺症、放射線誘導線維症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、眼線維症、皮膚線維症(例えば、強皮症)、肝線維症(例えば、肝硬変、アルコール誘導肝線維症、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、胆管損傷、原発性胆汁性肝硬変、感染又はウイルス誘導肝線維症[例えば、慢性HCV感染]、自己免疫性肝炎)、腎臓(腎)線維症、心線維症、アテローム性動脈硬化症、ステント再狭窄、及び骨髄線維症が挙げられる。
【００９５】
本発明の抗ビッグET−1抗体及びその抗原結合フラグメントはまた、癌(例えば、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、黒色腫、腎癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、膀胱癌、カポジ肉腫、及び神経膠腫)の処置、腫瘍増殖の阻害、腫瘍退縮の促進、転移の阻害、及び／又は病的血管新生(例えば、腫瘍増殖に関連する血管新生)の阻害のために有用である。従って本発明は、本明細書に記載されるとおりの抗ビッグET−1抗体を、そのような処置を必要とする患者に投与することにより、癌を処置し、腫瘍増殖を阻害し、腫瘍退縮を促進し、転移を阻害し、かつ／又は病的血管新生(例えば、腫瘍増殖に関連する血管新生）を阻害する方法を含む。例えば、本発明の抗体及び抗原結合フラグメントは、脳及び髄膜、中咽頭、肺及び気管支樹、胃腸管、男性及び女性生殖器系、筋肉、骨、皮膚及び付属肢、結合組織、脾臓、免疫系、造血細胞及び骨髄、肝臓及び泌尿器、並びに眼のような特殊感覚器において生じる原発性及び／又は転移性腫瘍を処置するために使用され得る。特定の実施態様において、本発明の抗体及び抗原結合フラグメントは、以下の癌の１つ又はそれ以上を処置するために使用される：腎細胞癌、膵癌、乳癌、頭頸部癌(例えば、脳、口腔、中咽頭、上咽頭、下咽頭、鼻腔、副鼻腔、咽頭、口唇などの癌)、前立腺癌、膀胱癌、悪性神経膠腫、骨肉腫、骨芽細胞腫、骨軟骨腫、結腸直腸癌、胃癌(例えば、MET増幅を伴う胃癌)、悪性中皮腫、星状細胞腫、神経膠芽腫、髄芽腫、網膜芽細胞腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、滑膜肉腫、甲状腺癌、結合組織新生物、カポジ肉腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、又は黒色腫。
【００９６】
組み合わせ療法
本発明は、本発明の抗ビッグET−1抗体を、少なくとも１つのさらなる治療活性成分と組み合わせて投与することを含む治療投与計画を含む。このようなさらなる治療活性成分の非限定的な例としては、他のエンドセリン−1アンタゴニスト(例えば、抗エンドセリン−1抗体、異なる抗ビッグET−1抗体、又はエンドセリン−1の小分子阻害剤)、エンドセリン−A受容体アンタゴニスト、エンドセリン−B受容体アンタゴニスト、非選択的エンドセリン受容体アンタゴニスト、プロスタサイクリン、プロスタサイクリン類似体、非プロスタノイドイノシトールリン酸(プロスタサイクリン)受容体アゴニスト、ホスホジエステラーゼ5型阻害剤、可溶性グアニル酸シクラーゼ刺激物質、エンドセリン変換酵素−1(ECE−1)阻害剤、ネプリライシン阻害剤、アンギオテンシン−II受容体アゴニスト、及びNF−カッパB阻害剤が挙げられる。本発明の抗ビッグET−1抗体と組み合わせて投与され得る例となる薬剤としては、例えば、エンドセリン受容体アンタゴニスト、例えばボセンタン(Roche)、アンブリセンタン(Abbott)、シタキセンタン（Sitaxentan）(Encysive)、クラゾセンタン(Chugai)、ダルセンタン(Abbott)、ZD4054 (AstraZeneca)、マシテンタン(Actelion)、アボセンタン（Avosentan）(Roche)、ダグルトリル（Daglutril）(Solvay)、PS433540(Bristol−Myers Squibb)、S0139(Shionogi)、SLV334(Solvay)、TBC3711(Encysive)、ファンドセンタン（Fandosentan）(Pfizer)、PABSA(Shionogi)、YM598(Astellas)及びYM62899(Astellas)；ホスホジエステラーゼ5型阻害剤、例えばシルデナフィル(Pfizer)及びタダラフィル(Lilly ICOS)；可溶性グアニル酸シクラーゼ刺激物質、例えばリオシグアト(Bayer)；並びにプロスタサイクリン、プロスタノイド及びプロスタサイクリン受容体アゴニスト、例えばイロプロスト(Actelion)、トレプロスチニル(United Therapeutics)、ベラプロスト(United Therapeutics)、エポプロステノール(Actelion)、及びセレキシパグ(Actelion)が挙げられる。
【００９７】
本発明の抗ビッグET−1抗体は、例えば、VEGFアンタゴニスト、例えば、アフリベルセプトのような「VEGF−トラップ」又はUS 7,087,411に記載されるような他のVEGF阻害性融合タンパク質、抗VEGF抗体若しくはその抗原結合フラグメント(例えば、ベバシズマブ、ラニビズマブ)、VEGF受容体の小分子キナーゼ阻害剤(例えば、スニチニブ、ソラフェニブ又はパゾパニブ)、又は抗VEGF受容体抗体と同時処方され（co−formulated）ても、かつ／又はこれらと組み合わせて投与されてもよい。抗ビッグET−1抗体はまた、抗PDGFR−ベータ抗体(例えば、2A1E2 [US 7,060,271]；HuM4Ts.22[US 5,882,644]；又は1B3若しくは2C5 [US 7,740,850])、抗PDGFリガンドアンタゴニスト(例えば、抗PDGF−BB抗体、抗PDGF−DD抗体、抗PDGF−CC抗体、抗PDGF−AB抗体、又は他のPDGFリガンドアンタゴニスト、例えばPDGFリガンドに対して特異的なアプタマー、アンチセンス分子、リボザイム、siRNA、ペプチボディ（peptibody）、ナノボディ若しくは抗体フラグメント)と組み合わせられ得る。他の実施態様において、本発明の抗ビッグET−1抗体は、EGFRアンタゴニスト(例えば、抗EGFR抗体[例えば、セツキシマブ又はパニツムマブ]又はEGFRの小分子阻害剤[例えば、ゲフィチニブ又はエルロチニブ])、Her2／ErbB2、ErbB3若しくはErbB4のような別のEGFRファミリーメンバーのアンタゴニスト(例えば、抗ErbB2、抗ErbB3若しくは抗ErbB4抗体又はErbB2、ErbB3若しくはErbB4活性の小分子阻害剤)、EGFRvIIIに特異的なアンタゴニスト(例えば、EGFRvIIIに特異的に結合する抗体)、cMETアンタゴニスト(例えば、抗cMET抗体)、IGF1Rアンタゴニスト(例えば、抗IGF1R抗体)、又はB−raf阻害剤(例えば、ベムラフェニブ、ソラフェニブ、GDC−0879、PLX−4720)と同時処方されても、かつ／又はそれらと組み合わせて投与されてもよい。場合によっては、本発明の抗ビッグET−1抗体は、PDGFR−アルファ阻害剤(例えば、抗PDGFR−アルファ抗体)、DLL4抗体(例えば、REGN421のようなUS 2009／0142354に開示される抗DLL4抗体)、Ang2アンタゴニスト(例えば、H1H685PのようなUS 2011／0027286に開示される抗Ang2抗体)などと混合されるか、同時処方されるか、かつ／又は組み合わせて投与される。本発明はまた、本明細書で言及される抗ビッグET−1抗体と、Ang2、Tie2、VEGF、DLL4、EGFR、又は上述のサイトカインのいずれかの1つ又はそれ以上の阻害剤を含む治療的組み合わせを含み、ここで阻害剤は、アプタマー、アンチセンス分子、リボザイム、siRNA、ペプチボディ、ナノボディ又は抗体フラグメント(例えば、Fabフラグメント；F(ab')2フラグメント；Fdフラグメント；Fvフラグメント；scFv；dAbフラグメント；又は他の操作された分子、例えば二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、ミニボディ（minibodies）及び最小認識単位)である。本発明の抗ビッグET−1抗体と組み合わせて有利に投与され得る他の薬剤としては、IL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−8、IL−9、IL−11、IL−12、IL−13、IL−17、IL−18のようなサイトカイン、又はそれらのそれぞれの受容体に結合する小分子サイトカイン阻害剤及び抗体を含むサイトカイン阻害剤が挙げられる。
【００９８】
本発明の抗ビッグET−1抗体はまた、抗ウイルス薬、抗生物質、鎮痛薬、スタチン系薬剤、利尿薬、抗凝固薬、ジゴキシン、副腎皮質ステロイド、ステロイド薬、酸素、抗酸化剤、金属キレート剤、IFN−ガンマ、及び／又はNSAIDと組み合わせて投与及び／又は同時処方され得る。本発明の抗ビッグET−1抗体はまた、放射線処置及び／又は従来の化学療法(例えば、癌を処置するかまたは腫瘍増殖を阻害する方法の状況で)も含む処置計画の一部として投与され得る。
【００９９】
上述のさらなる治療活性成分のいずれかを、例えば、本明細書中で言及される眼疾患、線維性疾患、血管疾患及び／又は癌のうちのいずれかを含む、抗ビッグET−1抗体の投与が有益であるいずれかの疾患又は障害の処置のために、本発明の抗ビッグET−1抗体のいずれかと組み合わせて投与し得る。例えば、眼疾患(例えば、滲出型AMD、糖尿病性網膜症、CRVO、又は本明細書に記載される他の眼疾患のいずれか)を処置する状況において、本発明の抗ビッグET−1抗体は、VEGFアンタゴニスト、例えば、アフリベルセプトのような「VEGFトラップ」若しくはUS 7,087,411に記載されるような他のVEGF阻害融合タンパク質、又は抗VEGF抗体若しくはその抗原結合フラグメント(例えば、ベバシズマブ、又はラニビズマブ)と同時処方されても、かつ／又はそれらと組み合わせて投与されてもよい。
【０１００】
さらなる治療活性成分は、本発明の抗ビッグET−1抗体の投与の前、同時又は後に投与され得る；(本開示の目的のために、このような投与計画は、さらなる治療活性成分と「組み合わせた」抗ビッグET−1抗体の投与とみなされる)。本発明のいくつかの実施態様において、さらなる治療活性成分は、本発明の抗ビッグET−1抗体の投与前に被験体に投与され得る。例えば、第一の成分が第二の成分の投与の、1週間前、72時間前、60時間前、48時間前、36時間前、24時間前、12時間前、6時間前、5時間前、4時間前、3時間前、2時間前、1時間前、30分前、15分前、10分前、5分前、又は1分未満前に投与される場合に、第一の成分は第二の成分の「前に」投与されるとみなされ得る。他の実施態様において、さらなる治療活性成分は、本発明の抗ビッグET−1抗体の投与後に被験体に投与され得る。例えば、第一の成分が第二の成分の投与の、1分後、5分後、10分後、15分後、30分後、1時間後、2時間後、3時間後、4時間後、5時間後、6時間後、12時間後、24時間後、36時間後、48時間後、60時間後、72時間後に投与される場合、第一の成分は第二の成分の「後に」投与されるとみなされ得る。さらに他の実施態様において、さらなる治療活性成分は、本発明の抗ビッグET−1抗体の投与と同時に被験体に投与され得る。「同時（Concurrent）」投与は、本発明の目的のために、例えば、抗ビッグET−1抗体及びさらなる治療活性成分の単一投薬形態での被験体への投与、又は互いに約３０分若しくはそれ以下以内に被験体に投与される別個の投薬形態での投与を含む。別個の投薬形態で投与される場合、各投薬形態は、同じ経路で投与され得(例えば、抗ビッグET−1抗体及びさらなる治療活性成分の両方が硝子体内、皮下などに投与され得る)；あるいは、各投薬形態は異なる経路で投与され得る(例えば、抗ビッグET−1抗体は硝子体内投与され得、そしてさらなる治療活性成分は全身投与され得る)。成分を単一投薬形態で投与するか、同じ経路で別個の投薬形態で投与するか、又は異なる経路で別個の投薬形態で投与するか、いずれにせよ本開示の目的では全て「同時投与」とみなされる。本開示の目的では、さらなる治療活性成分の投与の「前」、「同時」又は「後」(本明細書の上で定義される用語のとおり)の抗ビッグET−1抗体の投与は、さらなる治療活性成分「と組み合わせた」抗ビッグET−1抗体の投与とみなされる。
【０１０１】
本発明は、本発明の抗ビッグET−1抗体が本明細書の他所に記載される１つ又はそれ以上のさらなる治療活性成分と同時処方される医薬組成物を含む。
【０１０２】
抗体の診断上の使用
本発明の抗ビッグET−1抗体はまた、例えば診断目的のために、サンプル中のビッグET−1を検出及び／又は測定するために使用され得る。例えば、抗ビッグET−1抗体、又はそのフラグメントは、ビッグET−1又はエンドセリン−1の異常な発現(例えば、過剰発現、過小発現、発現の欠如など)を特徴とする状態又は疾患を診断するために使用され得る。ビッグET−1についての例となる診断アッセイは、例えば、患者から得られたサンプルを、本発明の抗ビッグET−1抗体と接触させることを含み得、ここで抗ビッグET−1抗体は、検出可能な標識又はレポーター分子で標識される。あるいは、非標識抗ビッグET−1抗体は、それ自体検出可能に標識された二次抗体と組み合わせて診断適用において使用され得る。検出可能な標識又はレポーター分子は、放射性同位体、例えば3H、14C、32P、35S、若しくは125I；蛍光若しくは化学発光部分、例えばフルオレセイン  イソチオシアネート若しくはローダミン；又は酵素、例えばアルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、若しくはルシフェラーゼであり得る。サンプル中のビッグET−1を検出又は測定するために使用され得る具体例となるアッセイとしては、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、及び蛍光活性化細胞分類(FACS)が挙げられる。
【０１０３】
本発明に従うビッグET−1診断アッセイにおいて使用され得るサンプルには、検出可能な量のビッグET−1タンパク質、又はそのフラグメントを含有する、正常又は病理的状態下で患者から入手可能ないずれかの組織又は流体サンプルが含まれる。一般に、健常患者(例えば、異常なエンドセリン−1レベル又は活性に関連する疾患又は状態に罹患していない患者)から得られた特定のサンプル中のビッグET−1のレベルを、ビッグET−1のベースライン又は標準、レベルを最初に確立するために測定するだろう。次いで、ビッグET−1のこのベースラインレベルを、ビッグET−1に関連する疾患又は状態を有すると疑われる個体から得られたサンプルにおいて測定されたビッグET−1のレベルに対して比較し得る。
【実施例】
【０１０４】
以下の実施例は、本発明の方法及び組成物を製造し使用する方法の完全な開示及び記載を当業者に提供するために提示されるものであり、本発明者らが彼らの発明とみなす範囲を限定することは意図されない。使用される数（例えば、量、温度など）に関して正確さを確実にするよう努力がなされたが、実験誤差及び偏差がいくらかを占めるはずである。そうではないと示されていなければ、部数は質量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、そして圧力は大気圧付近である。
【０１０５】
実施例１.  ヒトビッグエンドセリン−1(ビッグET−1)に対するヒト抗体の生成
ヒトビッグET−1ポリペプチド(配列番号434)を含む免疫原を、免疫応答を刺激するためのアジュバントを用いて、ヒト免疫グロブリン重鎖及びカッパ軽鎖可変領域をコードするDNAを含むVELOCIMMUNE(R)マウスに直接投与した。抗体免疫応答を、ビッグET−1−特異的イムノアッセイによりモニタリングした。所望の免疫応答が達成された場合、脾細胞を採取し、そしてマウス骨髄腫細胞と融合させてそれらの生存能を保存し、そしてハイブリドーマ細胞株を形成した。ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングして選択し、ビッグET−1−特異的抗体を産生する細胞株を同定した。この技術を使用して、いくつかの抗ビッグET−1キメラ抗体(すなわち、ヒト可変ドメイン及びマウス定常ドメインを有する抗体)を得た；この方法で生成された例となる抗体を以下のように指定した：6486N、6490N、6492N、6494N、6495N、6741N、6490N2、及び6492N2。
【０１０６】
抗ビッグET−1抗体はまた、US 2007／0280945A1に記載されるように、骨髄腫細胞への融合なしに抗原陽性B細胞から直接単離された。この方法を使用して、いくつかの完全ヒト抗ビッグET−1抗体(すなわち、ヒト可変ドメイン及びヒト定常ドメインを有する抗体)が得られた；この方法で生成された例となる抗体を以下のように指定した：6311P、6316P、6317P、6323P、6327P2、6328P、6329P、6330P、6332P、6334P、6335P、6337P、6338P、6340P、6343P、6345P、6347P、及び6353P。
【０１０７】
この実施例の方法に従って生成された例となる抗ビッグET−1抗体の特定の構造的及び機能的特性を以下に示される実施例において詳細に記載する。
【０１０８】
実施例２.  重鎖及び軽鎖可変領域アミノ酸配列
表１は、選択された抗ビッグET−1抗体の重鎖及び軽鎖可変領域アミノ酸配列対並びにそれらの対応する抗体識別子を示す。
【０１０９】
【表１】
2015509946.tif 000002
【０１１０】
抗体は、典型的には以下の命名法に従って本明細書中で言及される：Ｆｃ接頭語（例えば「Ｈ４Ｈ」、「Ｈ１Ｍ」、「Ｈ２Ｍ」）、続いて数字識別子（例えば表１に示されるような「６３１１」）、続いて「Ｐ」又は「Ｎ」の接尾語。従って、この命名法によれば、抗体は本明細書において、例えば「Ｈ４Ｈ６３１１Ｐ」のように呼ばれる。本明細書で使用される抗体の表示でのＨ４Ｈ、Ｈ１Ｍ、及びＨ２Ｍの接頭語は、抗体の特定のＦｃ領域を示す。例えば、「Ｈ２Ｍ」抗体はマウスＩｇＧ２  Ｆｃを有し、一方で「Ｈ４Ｈ」抗体はヒトＩｇＧ４  Ｆｃを有する。当業者には当然のことながら。Ｈ１Ｍ又はＨ２Ｍ抗体はＨ４Ｈ抗体に変換され得、そして逆もまた同様であるが、いずれの事象においても、可変ドメイン（ＣＤＲを含む）  −  これは表１に示される数字識別子により示される  −  は同じままである。
【０１１１】
実施例３.  表面プラズモン共鳴により得られたヒトモノクローナル抗ビッグET−1抗体の結合親和性及び速度定数
ヒトモノクローナル抗ビッグET−1抗体の結合親和性及び速度定数を、mAb捕捉形式を使用して３７℃で表面プラズモン共鳴により決定した(表２〜３)。測定はT200 Biacore機器(Biacore Life Sciences division of GE Healthcare、Piscataway、NJ)で行われた。Biacoreセンサー表面を、ハイブリドーマ捕捉のためのウサギ抗マウス(接頭辞H1M又はH2M)又はヒトIgG形式の抗体のためのマウス抗ヒトFc表面(接頭辞H4H)で誘導体化した。様々な濃度のスモール−ET−1(配列番号435)、ヒトビッグET−1 (配列番号434)又はマウスビッグET−1 (配列番号437)を抗ビッグET−1捕捉表面上に100μl／分の流量で注入した。mAb結合ペプチドの解離を４分間HBSTランニングバッファー(0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％体積／体積 Surfactant P20)中でモニタリングしながら、ペプチド結合を３分間モニタリングした。動力学的結合(ka)及び解離(kd)速度定数を、Scrubber 2.0曲線フィッティングソフトウエアを使用して、データ処理して１：１結合モデルに対してフィッティングさせることにより決定した。結合解離平衡定数(KD)及び解離半減期(t1/2)を動力学的速度定数から以下のように計算した：KD(M)＝kd／ka；及びt1/2(分)＝(ln2／(60*kd)。結果を表２及び３に示す(NB＝試験した条件下での非結合)。
【０１１２】
【表２】
2015509946.tif 000003
【０１１３】
【表３】
2015509946.tif 000004
【０１１４】
【表３】
2015509946.tif 000005
【０１１５】
表２及び３に示されるように、例となる抗体のいくつかはヒトビッグET−1 (配列番号434)及びマウスビッグET−1(配列番号437)の両方に結合した。しかし、この実施例において試験された例となる抗体の多くは、マウスビッグET−1よりもヒトビッグET−1に対して優先的な結合を示した。例えば、抗体H2M6490N、H1M6492N、H1M6494N、H2M6495N、H4H6311P、H4H6316P、H4H6317P、H4H6328P及びH4H6335Pはそれぞれ、ヒトビッグET−1に対する高い結合親和性を示したが、この実施例において使用された試験条件下でマウスビッグET−1への結合を示さなかった。抗体H2M6495N、H4H6328P及びH4H6334Pはそれぞれ、50pM未満のKDでヒトビッグET−1に対する高い結合親和性を示した。
【０１１６】
有意には、本発明の抗体はいずれもヒトスモールET−1(配列番号435)に結合しなかった。
【０１１７】
実施例４.  本発明の抗ビッグET−1抗体はインビトロでビッグET−1のECE1媒介切断を遮断する
本発明の例となる抗ビッグET−1抗体がマウス及び／又はヒトビッグET−1のエンドセリン変換酵素−1(ECE−1)媒介切断を遮断することができたかどうかを決定するために、NFATルシフェラーゼレポーターアッセイを利用した。手短には、ルシフェラーゼレポーターエレメント[NFAT(4X)−ルシフェラーゼ]と共に全長ヒトエンドセリンA型受容体(ETaR)を安定に発現するHEK293細胞株を生成した。単一クローンを単離し、そして10％ FBS、DMEM、NEAA、ペニシリン／ストレプトマイシン、及び500μg／ml G418及び100μg／mlハイグロマイシンB中で維持した。
【０１１８】
阻害の有効性を決定するために、抗体(100nM〜0.002nM)を10nM ヒトビッグET−1(配列番号434)又は20nMマウスビッグET−1(配列番号437)のいずれかと共にインキュベートし(1時間；25℃)、続いてそれぞれ3nMヒト又は5nMマウスECE−1を加えた。ヒト及びマウスビッグET−1の両方の遮断実験を終夜インキュベートさせた(37℃；5％CO2)。次の朝にこれらの溶液を293／ETaR／NFAT−Luc細胞(20,000細胞／ウェル)に加え、そしてVictor Xプレートリーダー(Perkin Elmer)を使用してルシフェラーゼ活性を５．５時間後に検出した(37℃；5％CO2)。これらの条件下で観察されるルシフェラーゼ活性の量は、マウス又はヒトビッグET−1のいずれかの切断から生成されたスモールET−1の量を比例して表すものである(スモールET−1はマウスとヒトとの間で同一である）。結果を表４及び５に示す(NB＝試験された条件下で遮断無し；NT＝未試験)。
【０１１９】
【表４】
2015509946.tif 000006
【０１２０】
【表５】
2015509946.tif 000007
【０１２１】
表４に見られるように、本発明のいくつかのハイブリドーマ抗体は、ヒトビッグET−1のECE−1媒介切断を実質的に阻害した(IC50値＜10nM)。さらに、ヒトIgG4形式の選択された抗体は、ヒトビッグET−1切断だけでなく(表５；２列目)、マウスビッグET−1切断(表５；３列目)も遮断する能力を示した。
【０１２２】
実施例５.  MALDI−TOFにより評価したビッグET−1切断の抗体保護
マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間(MALDI−TOF)質量分析を使用して、選択された抗ビッグET−1抗体がマウスエンドセリン変換酵素1(ECE−1)の存在下でヒトビッグET−1(配列番号434)又はマウスビッグET−1(配列番号437)のそのそれぞれのペプチドへの変換を遮断し得るかどうかを決定した。ヒトビッグET−1は、mECE−1によりTrp−21／Val−22で特異的に切断されて生物学的に活性なスモールET−1(配列番号435；MH+ 2474)及び非活性C末端生成物(配列番号434のアミノ酸22〜38；MH+ 1809)の両方を形成する。マウスビッグET−1はTrp−21／Val−22で切断されて、スモールET−1(配列番号435；MH+ 2474)及びその非活性C末端生成物(配列番号437のアミノ酸22〜39；MH+ 1875)となる。抗体の存在下でのこれらの質量の出現又は不在はMALDI−TOFによりモニタリングされ得る。以下の実施例において、C末端生成物の存在又は不在は、これらのペプチドがスモールET−1(配列番号435；MH+ 2474)よりも効率的にイオン化し、それにより感受性の読み出しが得られるので、ビッグET−1切断についての指標として役立つ。
【０１２３】
手短には、ヒト又はマウスビッグET−1(0.5μM)を、リン酸緩衝化食塩水(PBS)中で1：5モル比(ビッグET−1：mAb)で抗体(2.5μM)と混合した。1時間インキュベート(25℃)した後、マウスECE−1(R&D Systems)を40nMで加え、そしてこの溶液を37℃に置いた。質量分析のためのアリコートを0、15、30及び60分に採取した。各アリコートをC18 Ziptip(Millipore)により脱塩し、そしてBruker Ultraflextreme MALDI−TOF機器(Bruker Daltonics)を使用してreflextron−ポジティブモードで分析した。
【０１２４】
抗体の存在下でのヒト又はマウスビッグET−1の切断からのC末端生成物の検出を表６にまとめる。
【０１２５】
【表６】
2015509946.tif 000008
【０１２６】
抗体H2M6490NをヒトビッグET−1及びマウスECE−1と共にインキュベートした場合、C末端生成物は検出されなかった(表６において「−」と示される)。対照的に、マウスFc対照抗体はマウスECE−1の存在下でヒトビッグET−1の切断を防止せず、従ってC末端生成物が０時点を除いて全ての時点で確認された(表６において「＋」で示される)。同様の結果が抗体H4H6334Pについて得られた。しかしH4H6327P2については、C末端生成物が検出されなかったので、この抗体がマウスECE−1の存在下でヒト及びマウスビッグET−1の両方の切断を防止し得るということが明確であった。従って、この実施例は、本発明の抗ビッグET−1抗体(例えば、H2M6490N)がヒトビッグET−1のその生物学的に活性な形態スモールET−1への酵素的変換をインビトロで遮断することができるということを裏付けた。
【０１２７】
実施例６.  抗ビッグET−1抗体は、平均動脈圧のスモールET−1媒介増加を遮断する
この実施例の目的は、例となる抗ビッグET−1抗体(H2M6490N)の動脈圧のスモールET−1媒介増加を遮断する能力を評価することであった。遮断抗ビッグET−1抗体又はアイソタイプコントロール抗体のいずれかを前もって注入されたマウスにビッグET−1ペプチド負荷を行った。ビッグET−1のスモールET−1への内因性変換、又は循環抗ビッグET−1抗体によりその変換を遮断されたことのいずれかに起因する動脈圧変化を測定した。これらの実験の間の動脈圧の実時間測定を容易にするために、標準的なプロトコルを使用してマウ
スにカテーテル挿入した。
【０１２８】
手短には、ナイーブTaconic C57BL／6マウス(8〜10週齢)をイソフルランで麻酔し、そして頸動脈及び頚静脈を覆う皮膚を切開した。右頚静脈及び左頸動脈の両方を、迷走神経又は他の血管を損傷しないように注意して分離した。標準的技術を使用して、頚静脈を退縮させて（retracted）32ゲージ針(９０°に屈曲)を使用して食塩水充てん頚静脈カテーテルの挿入のために静脈を穿刺した。次いで左頸動脈を分離し、そしてMillar Micro−Tip(R)カテーテルを標準的プロトコルを使用して導入した。全ての手順の間、動物の体温をモニタリングするために温度プローブを使用し、Gaymar加熱水循環パッドを使用して３６．５℃付近に維持した。上記の手順により、実時間圧力測定値(収縮期圧、拡張期圧、平均動脈圧、及び体温)を全てのビッグET−1負荷実験の間記録することが可能となった。
【０１２９】
第一の研究において、H2M6490N又はアイソタイプコントロールmAb  150μg(約2mg／kg；1x10-9モル)を、頚静脈ポートを使用して静脈内注射し、続いて食塩水を急速注入（a bolus of saline）してカテーテルを洗い流した。これにより圧力がわずかに一次的にベースラインまで戻り、実験のT＝0と規定した。抗体投薬の３０分後に、ヒトビッグET−1ペプチド(配列番号434)を、平均動脈圧がベースラインよりわずかに増加するまで１５分毎に静脈注射した。結果を表７にまとめる。
【０１３０】
【表７】
2015509946.tif 000009
【０１３１】
表７は、アイソタイプコントロールを投与されたマウスへのヒトビッグET−1の注射が、ビッグET−1が生物活性スモールET−1ペプチド(配列番号435)へと内因的に切断された場合に期待されるような有意に増加した平均動脈圧に応答するということを示す。対照的に、例となる抗ビッグET−1遮断抗体H2M6490Nを投与されたマウスは、ヒトビッグET−1ペプチドの量が提供された抗体のモル当量に近づくまでベースライン平均動脈圧を維持した。
【０１３２】
第二の実験において、H2M6490N(約2mg／kg；1x10-9モル)を、ヒトビッグET−1ペプチドを負荷する２４時間前にマウスに皮下(s.c.)注射したことを除いて同じ実験プロトコルを利用した。第二の実験の結果を表８にまとめる。
【０１３３】
【表８】
2015509946.tif 000010
【０１３４】
表８に示されるように、皮下抗体投与の２４時間後にマウスにビッグET−1負荷した場合に得られた結果は、静脈内抗体投薬の３０分後にマウスにビッグET−1負荷した場合に得られた結果と同様であった(表７)。両方の実験条件下で、抗ビッグET−1抗体H2M6490Nを予め注射されたマウスは、アイソタイプコントロール抗体で処置されたマウスよりも長く正常動脈圧を維持した。
【０１３５】
従ってこれらの研究は、H2M6490Nの投与が動脈圧のエンドセリン−1媒介上昇のインビボでの阻害において有効であったことを示す。ヒトビッグET−1負荷の３０分前又は２４時間前の抗体の投与は、対照と比較して動脈圧応答を有意に減少させた。
【０１３６】
実施例７.  低酸素誘導肺高血圧の抗ビッグET−1抗体を用いた遮断／予防
この実施例において、マウスにおいて低酸素誘導肺高血圧を遮断する抗ビッグET−1抗体H4H6327P2の能力を評価した。低酸素状態の前及び間に、動物に処置薬剤(抗ビッグET−1抗体H4H6327P2又はボセンタン)又は対照薬剤(抗体ビヒクル(50：50 PEG 400(体積／体積))又はアイソタイプコントロール抗体）を投薬し、そして超音波画像並びに心室圧及び心肥大の測定値を使用して、正常酸素圧状態下に維持した対照動物と比較して評価した。
【０１３７】
評価材料及び方法
以下のプロトコルを使用して超音波測定を行った。マウスを麻酔し、加熱した台(THM 100、Indus Instruments)の上に仰臥位で置き、そして肺動脈漏斗部（pulmonary infundibulum）２D画像化(Bモード及びMモード)をVevo 2100超音波システム(VisualSonics)を使用して行った。画像は大動脈弁のレベルでの傍胸骨の短軸像から得た。パルス波ドプラ測定値を、スキャンヘッドが最大層流と整列した時点で肺動脈弁尖（pulmonary valve leaflets）の先端で得た。さらに、右心室のMモード記録を短軸Bモード画像化面で行い、心周期の間の右心室自由壁動態を得た。
【０１３８】
盲検方式で行われた超音波データ解析により以下のパラメーターを解析した：拡張期及び収縮期の右心室自由壁厚(RVFW、短軸Mモード)、収縮末期の肺動脈直径(短軸Bモード)、及び肺動脈血流量(PA血流量、PWドプラ)。これらの測定値から、肺血流量、肺動脈断面積(PA CSA)、及び右心室心拍出量(RV CO)の時間−速度積分を計算した。平均及び平均の標
準誤差を、各時点の各処置群についての測定値について計算した。全ての測定値を３回の心周期で平均した。低酸素２１日目の右心室圧を以下のプロトコルを使用して記録した：マウスを麻酔し、加熱した台(Gaymarヒートポンプで加熱されたウォータージャケットパッド)上に仰臥位で置き、そして右総頸動脈及び未経静脈上を切開し、頸動脈及び／又は迷走神経を損傷しないように注意して右頚静脈を分離した。5−0絹縫合糸片を分離した頚静脈の下に配置して、血管の頭側での退縮を可能にし、次いで30ゲージニードルを使用して頚静脈の遠位セグメントに孔を導入した。高忠実度圧力カテーテル(SPR−1000、Mikro−Tip(R)、Millar Instruments、Inc.)を頚静脈に導入し、そして右心房を越えて右心室(RV)へと前進させた。このカテーテルにより心拍並びに拡張期圧及び収縮期圧の両方の記録が可能となった。PowerLab 4／35コンソール(ADInstruments)を使用してデータをデジタル処理で得た。
【０１３９】
右心室収縮期圧分析を、LabChart Proソフトウェア(ADInstruments)を使用して約60秒間隔の圧力トレース(圧力安定化を可能にする2分間の記録後に）で行った。分析したパラメーターはRV拡張期圧及び収縮期圧、心拍並びに動物体温であった。報告されたRV収縮期圧は最小収縮期圧と最大収縮期圧の差であった(RV圧力値の初期ベースラインの差を説明するため)。
【０１４０】
RV収縮期測定の完了後に、麻酔した動物を安楽死させ、そして胸腔を開いて心臓を切り取った。RVを左心室及び中隔(LV＋S)から注意深く切り離した。心臓の両方の切片を、微量天秤を使用して別々に秤量し、RV肥大の程度[RV／(LV＋S)；Fulton指標]を見積もった。
【０１４１】
実験手順
常圧低酸素雰囲気(10％ O2)を維持しながら動物の取り扱い及び投薬ができる改良チャンバー(Biospherix、Ltd.)を使用して肺高血圧症を引き起こした。C57BL／6雄性マウス(10〜11週齢)を、表９において説明されるように２３日間にわたって継続的に計量し、そして投薬した。ボセンタン及びビヒクルを経口投与し(PO)；抗ビッグET−1抗体H4H6327P2及びアイソタイプコントロール抗体は皮下(SC)投与した。体重はこの研究の期間にわたって群間で一貫していた。エンドセリン受容体−A及び−Bの経口活性選択的アンタゴニストであるボセンタンをポジティブコントロールとして使用し、ビヒクル[50：50 PEG400(体積／体積)]及び無関連アイソタイプ適合抗体はネガティブコントロールとして役立った。全ての手順はRegeneron企業動物管理使用委員会（Institutional Animal Care and Use Committee）(IACUC)により承認された。
【０１４２】
【表９】
2015509946.tif 000011
【０１４３】
非侵襲的超音波走査を低酸素１８日目に行い、肺動脈断面積(PA CSA)、右心室心拍出量(RV CO)及び右心室自由壁厚(RVFW)を決定した。右心室の拡張期圧及び収縮期圧を、右心室における高忠実度圧力カテーテル(Mikro−Tip(R)、Millar Instruments)を使用して得た；さらに、右心室肥大測定値(すなわち、右心室−対−左心室＋中隔の重量比；Fulton指標)を低酸素２１日目に測定した。
【０１４４】
結果
抗ビッグET−1抗体H4H6327P2での処置は、低酸素誘導肺高血圧症の発生をマウスにおいて軽減した。抗体で処置された動物は、アイソタイプコントロール処置マウスと比較して測定されたPA CSAにおいて有意に(P≦0.001)小さい減少を示し(図１)、慢性低酸素への曝露に誘導されるより少ない血管収縮及び／又はより減少した肺動脈リモデリングを示した。げっ歯類において低酸素誘導肺高血圧症に関連する症状を減少させることが知られているボセンタンは、同様であるがより減少した、基礎PA CSAを維持する能力を示した。ボセンタンで処置された動物は、ビヒクルで処置された群と比較してより大きなRV COの維持を示した(図２)。抗ビッグET−1抗体で処置された動物は、ボセンタン処置及びアイソタイプ処置の両方のコホートと比較して統計的により大きな(P≦0.05)RV COの維持を示した。さらに、抗ビッグET−1抗体で処置された動物は、超音波(RVFW)及びFulton指標測定により確認されたとおり、有意により小さいRV肥大を示した(図３)。さらに、減少したRV肥大は、アイソタイプコントロールと比較して、抗ビッグET−1抗体で処置されたマウスにおける心臓の有意により薄い右心室壁により証明された(図４)。
【０１４５】
結論
従ってこの研究は、本発明の抗ビッグET−1抗体が、低酸素誘導肺高血圧症に関連する症状を軽減する際に有効であり、かついくつかの終点においてベンチマーク分子ボセンタンを上回る。
【０１４６】
実施例８.  抗ビッグET−1抗体を用いた低酸素誘導肺高血圧量の処置
この実施例において、マウスにおいて低酸素誘導肺高血圧症を処置する抗ビッグET−1抗体H4H6327P2の能力を評価した。実験群動物を低酸素条件下に２１日間置き(1〜21日目)そして２１日目に開始してH4H6327P2、ボセンタン、又はコントロールアイソタイプ抗体を投薬した。２１日目に、超音波画像並びに心室圧及び心肥大の測定値(実施例７の評価材料及び方法を参照のこと)を使用して動物を評価し、そして対照動物（正常酸素圧条件、１４日間の低酸素、又は１４日間の低酸素に続いて７日間の正常酸素圧下に維持された）と比較した。
【０１４７】
実験手順
肺高血圧症は、改良チャンバー(Biospherix、Ltd.)により常圧低酸素雰囲気(10％ O2)へ曝露させることにより誘導された。C57BL／6雄性マウス(10〜11週齢)を計量し、そして表１０に説明されるように処置するか又は処置及び投薬した。ボセンタンを経口投与し(PO)；抗ビッグET−1抗体H4H6327P2及びアイソタイプコントロール抗体を皮下投与した(SC)。体重はこの研究の間群間で一致していた。エンドセリン受容体−A及び−Bの経口活性非選択的アンタゴニストであるボセンタンをポジティブコントロールとして使用し、無関連アイソタイプ適合抗体はネガティブコントロールとして役立った。全ての手順はRegeneron企業動物管理使用委員会(IACUC)により承認された。
【０１４８】
【表１０】
2015509946.tif 000012
【０１４９】
非侵襲的超音波走査を、低酸素２１日目に行い、肺動脈断面積(PA CSA)、右心室心拍出量(RV CO)及び右心室自由壁厚(RVFW)を決定した。右心室の拡張期圧及び収縮期圧を、右心室における高忠実度圧力カテーテル(Mikro−Tip(R)、Millar Instruments)を使用して得た；さらに、右心室肥大測定値(すなわち、右心室−対−左心室＋中隔の重量比；Fulton指標)を低酸素２１日目に測定した。
【０１５０】
結果
H4H6327P2又はボセンタンでの処置は、一般的に低酸素誘導PHに関連する血管収縮及び平滑筋細胞増殖がより少なかったことを含めて、遠位肺動脈収縮及びリモデリングを軽減した。抗ビッグET−1抗体H4H6327P2での処置は、未処置又はアイソタイプコントロールのコホートと比較して、慢性低酸素誘導細動脈壁肥厚を有意に減少させた(図５)。H4H6327P2及びボセンタンでの処置はまた、肺動脈断面積(PA CSA)の維持により証明されるように、管腔直径喪失を減少させ(図６)、そして右心室自由壁(RVFW)肥厚を軽減した(図７)。抗ビッグET−1抗体処置はまた、右心室心拍出量(RVCO)（これは通常、上昇した肺動脈血管抵抗性に起因して肺高血圧症において減少する）を維持したが、ボセンタンよりは少ない程度であった(図９)。しかし、抗ビッグET−1抗体処置は、右心室肥大（肺動脈への血流を維持するために生じる代償性機構）も(図８)、右心室収縮期圧(RSVP)(図10)も（これらは両方とも、肺高血圧に起因する増加した血管抵抗性に関連するものである）有意に減少させなかった。
【０１５１】
結論
従ってこの研究は、本発明の抗ビッグET−1抗体が、肺高血圧誘導血管リモデングの軽減においてボセンタンと同等に最も高い有効性を示すが、一方でボセンタン処置は心機能の基準の回復においてより高い効果を示すということを実証する。
【０１５２】
実施例９：  抗ビッグET−1抗体の投与に伴う侵害防御機構挙動の減少
この実施例において、マウスにおける疼痛に対するビッグET−1誘導防御応答を遮断する抗ビッグET−1抗体H4H6327P2の能力を評価した。H4H6327P2は、21アミノ酸の生物学的に活性なET−1へのビッグET−1のエンドセリン変換酵素(ECE)媒介切断を遮断する。動物におけるET−1の外因性投与は、顕性痛関連挙動(侵害受容)、例えば腹部ねじり（abdominal writhing）、たじろぎ、かみつき又はなめることを誘導すると記録されている。
【０１５３】
実験手順
この研究において、12週齢C57BL／6雄性マウスを３つの実験コホートに分けた：30mg／kgのビッグET−1非結合アイソタイプコントロール抗体(アイソタイプ)を投与された対照群(n＝6)；3mg／kgの抗ビッグET−1抗体H4H6327P2を投与された低用量群(n＝7)；及び30mg／kgのH4H6327P2を投与された高用量群(n＝7)。全ての抗体を皮下投与した。抗体投薬の約48時間後に、全てのマウスに、リン酸緩衝化食塩水に溶解したビッグhET−1ペプチドの2ug(0.2mg／ml)注射を右後足の足底側に投与した。マウスをすぐに透明シリンダー内に置き、そしてそれらの侵害受容行動を注射後６０分間ビデオ記録した。コホートアイデンティティを知らされていない調査員が６０分間の試験期間にわたって右後足をなめる／かむ行動の合計回数を記録した。データをコホート平均±SEMとして報告する(図11)。
【０１５４】
結果及び結論
H4H6327P2での前処置は、６０分間の試験期間にわたってビッグhET−1ペプチド誘導侵害防御機構を有意に減少させた(繰り返し測定ANOVAによりp＝0.0173)。用量依存性効果は30mg／kg用量群でのみ観察された(p＜0.05、Tukey)。この実施例は、抗ビッグET−1抗体がET−1副生成物の形成及びその後の受容体活性を防止することにより疼痛関連行動を緩和し得るということを示す。
【０１５５】
実施例10：  抗ビッグET−1抗体の予防的投薬は、肺線維症のブレオマイシン誘導モデルにおいて生理的リモデリングを軽減し、肺機能を回復させる
この実施例において、ブレオマイシン誘導肺線維症のための予防的処置として作用する抗ビッグET−1抗体H4H6327P2の能力を評価した。
【０１５６】
実験手順
ブレオマイシン誘導肺損傷を使用して10週齢C57BL／6雄性マウスにおいて肺線維症のモデルを作製した。硫酸ブレオマイシンを単回中咽頭用量（single oropharyngeal dose）(3.2U／kg(2.0mg／kg)で2.0ml／kgの体積）で投与した。未処置対照マウスに滅菌0.9％食塩水(2.0ml／kg)を経口腔（transoral）滴下注入した。エンドセリン受容体−A及び−Bの経口活性非選択的アンタゴニストであるボセンタンを処置のためのポジティブコントロールとして使用し、ビヒクル及び非関連アイソタイプ適合抗体はネガティブコントロールとして役立った。表１１に説明される投薬計画を用いてマウスを処置群又は対照群に割り当てた。
【０１５７】
【表１１】
2015509946.tif 000013
【０１５８】
結果
処置有効性の尺度として、各コホートの右肺重量をブレオマイシン曝露の２１日後に測定した。肺重量の増加は、ブレオマイシン誘導肺線維症の一般的に観察される生理的影響である(表１２；群1  対  群2及び3)。抗ビッグET−1抗体H4H6327P2での処置は、アイソタイプコントロールと比較した場合、肺湿重量、さらには水重量増加(浮腫)のパーセンテージを低下させる傾向を有していた。しかし、ボセンタンでの処置のみ肺湿重量の統計的に有意な減少を示した。
【０１５９】
【表１２】
2015509946.tif 000014
【０１６０】
結論
肺機能の維持に対する抗体処置又はボセンタン処置の効果も評価した。H4H6327P2及びボセンタンは両方とも、動脈血酸素飽和度を、ビヒクル又はアイソタイプコントロール処置されたコホートと比較して、ブレオマイシン投与の２０日後にベースライン近くまで回復させる傾向を有しており、そしてまたブレオマイシン曝露後の肺におけるコラーゲン蓄積を減少させた。
【０１６１】
材料及び方法
動物取扱手順：各ケージを無作為に治療処置群に割り当てたので、ケージ中の全てのマウスが同じ処置を受けた。各処置群についての初期平均体重は類似していた。毎日の体重を研究の間中記録した。群の体重平均及び変化パーセントを分析してグラフにした。研究の間に＞25％の体重減少又は健康の重篤な悪化を示した動物を安楽死させた。
【０１６２】
ブレオマイシンの投与：  ブレオマイシン又は食塩水の投与を、動物を麻酔下にして行った(2リットル／分酸素流量に対して3.5％イソフルラン)。鎮静させたマウスを60度傾いた板上に置き、切歯の周りに弾性のひもを用いて頭部を上げた。小さな綿棒を使用して口から舌を出させ、鉗子を使用して舌を保持し、顎を開かせた。深い吸入の間、液体をマウスにピペットで移した。マウスを傾いた板上に載せたまま舌及び顎の位置を維持した。液体が消えて「喘鳴」が止まるまでピペット操作後約20秒が経過した。処置点滴の後、排泄されたバイオハザードのためにマウスを７日間使い捨てケージ中で処置条件ごとに群飼し(ケージあたり5匹の動物)、次いでホームケージに戻した。使い捨てケージは、Thorenラック給水システムを使用する代わりに水用のケージトップ瓶を使用したことのみがホームケージと異なっていた。全てのマウスを群体で12時間(7am〜7pm)の明−暗周期で飼育した。
【０１６３】
ボセンタンの投与：ボセンタンを経口経管栄養により週の間１日に２回(9：30am及び6：30pm)投与した。初期前処置用量及び週末日用量を単回の合わせた１日２回（BID）用量として投与した。表１１において説明されるように、ボセンタン投薬は２０日の研究の間毎日継続されたが、抗体及びビヒクルは１８日間３日毎に皮下投与された。
【０１６４】
肺機能の測定：肺機能を、Starr Life Sciences、MouseOx小動物バイタルサインモニターを使用して動脈酸素飽和度を測定することにより評価した。１４及び１７日目に除毛した後、頸部領域の周りで測定値を取得した。MouseOxは、赤血球のヘモグロビンに関して組織に運ばれる酸素のレベルを測定することにより心臓−肺の健康及び肺損傷の程度をモニタリングすることができる。首輪（throat collar）センサーを使用して、意識のあるマウスにおいて頸動脈を介して動脈酸素飽和度を測定した。被験体をケージトップ食餌ホッパーに限定し動きを減らすためにマウスの手を軽く拘束した。ソフトウェア(InstCal.を含むMouseOxバージョン6.3.12)により、パルス膨満（pulse distension）、心拍数、酸素飽和度及び呼吸速度を毎秒測定した。連続１５秒のブロックを記録すると、ソフトウェアは上記のパラメーターの平均を計算する。測定時間はマウスの活動性に依存して１〜３分間の範囲に及んだ。各処置群についての平均動脈酸素飽和度を計算し、そして全ての処置群のBonferroni事後検定比較を用いる１要因ANOVAを使用して分析した。
【０１６５】
最終過程／組織学：  21日目に、マウスにケタミン／キシラジンの終末用量(それぞれ120mg／kg／5mg／kg IP)を投与した。鎮静して腹腔を開き、血清用の血液を下大静脈を介してシリンジで集めた。次いで腹部大動脈を切断した。失血の間、胸腔を開いて肺を露出させた。全右肺葉上の右気管支の周りを縫合糸で縛った。全てのマウスについて、上葉、中葉、下葉及び大静脈後葉（Post−Caval lobes）からなる右肺全体を取り出し、計量し、液体窒素中で急速冷凍し、次いでコラーゲン測定のために−80Cフリーザーで保存した。コラーゲン抽出の前に、右肺葉をデシケーター中で乾燥し、そして再計量した。肺の湿重量及び乾燥重量並びに湿重量対乾燥重量比を各処置群について計算した。肺をペプシン−酢酸溶液中でホモジナイズして可溶性コラーゲンを抽出した。BiocolorからのSircolコラーゲンアッセイを使用して、右肺あたりの可溶性コラーゲン及び湿性及び乾性肺組織のｍｇあたりのコラーゲンを定量した。
【０１６６】
各処置群について、左肺葉の使用は無作為に組織学とマイクロアレイとの間で分けた。組織学被験体については、頸部腹側に切開を作製し、顎下腺を分離し、そして周囲の筋繊維を切除することにより気管を露出させた。縫合糸を、口に対して遠位に気管の周りに軽く結んだ。次いで口に対して近位に小さい穴の切り込みを縫合糸上の気管に入れた。チューブ及び10％ NBFで満たされた250ml吸引器に固定された22g鈍針をこの穴に挿入した。次いで縫合糸の結び目を糸を巻いた気管の周りで締めて、開口を密閉し、そして針を適所に保持した。25cmの高さで左肺を約30〜60秒間重力により膨らませた。膨張後に、針を除去し、そして縫合をしっかりと締めた。左肺はなお気管支に付いており、気管、胸腺、食道及び心臓をひとまとめで除去し、そしてホルマリン中に保存した。固定の後に、左肺葉を組織学的処理のために分離して取り出した(Sirius Red、Masson's trichrome and H&E)。マイクロアレイに指定されたマウスは、左肺葉を膨張させることなく室温で２４時間RNA
−Laterに置かれ、次いで遺伝子配列解析まで−20℃冷凍庫中に置かれた。
【０１６７】
本発明は、本明細書中に記載される特定の実施態様により範囲を限定されるべきではない。実際に、本明細書中に記載されるものに加えて、本発明の様々な改変が、前述の記載及び添付の図面から当業者に明らかとなるだろう。このような改変は添付の特許請求の範囲内であることを意図される。
【図１】
2015509946.tif 000015
【図２】
2015509946.tif 000016
【図３】
2015509946.tif 000017
【図４】
2015509946.tif 000018
【図５】
2015509946.tif 000019
【図６】
2015509946.tif 000020
【図７】
2015509946.tif 000021
【図８】
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【図９】
2015509946.tif 000023
【図１０】
2015509946.tif 000024
【図１１】
2015509946.tif 000025
【配列表】
2015509946000001.app
【国際調査報告】
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