(57)【要約】本発明は、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）前駆細胞およびＢＡＴ前駆細胞を骨格筋から単離する方法に関する。このほか、ＢＡＴ前駆細胞表面マーカーならびに褐色脂肪細胞への細胞分化を誘導する培地および薬剤が提供される。いくつかの実施形態では、ＢＡＴ前駆細胞は内皮細胞に関連する第一の細胞表面マーカーを発現し、第一の細胞表面マーカーが第一の抗体を用いる抗体ベースのアッセイで検出される。さらに、ＢＡＴ前駆細胞は、内皮細胞に関連する第二の細胞表面マーカーを実質的にもたず、第二の細胞表面マーカーが第二の抗体を用いる前記抗体ベースのアッセイで実質的に検出されないものであり得る。このほかＢＡＴ前駆細胞は、さらに別の細胞表面マーカーを実質的にもたないものであり得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
褐色脂肪組織（ＢＡＴ）前駆細胞であって、
前記ＢＡＴ前駆細胞がヒト骨格筋から単離され、褐色脂肪細胞に分化することが可能であり、
前記ＢＡＴ前駆細胞が内皮細胞に関連する第一の細胞表面マーカーを発現し、前記第一の細胞表面マーカーが第一の抗体を用いる抗体ベースのアッセイで検出され、
前記ＢＡＴ前駆細胞が内皮細胞に関連する第二の細胞表面マーカーを実質的にもたず、前記第二の細胞表面マーカーが第二の抗体を用いる前記抗体ベースのアッセイで実質的に検出されない
ＢＡＴ前駆細胞。
【請求項２】
ＢＡＴ前駆細胞が造血細胞に関連する第三の細胞表面マーカーを実質的にもたず、前記第三の細胞表面マーカーが第三の抗体を用いる前記抗体ベースのアッセイで実質的に検出されないこと、
ＢＡＴ前駆細胞が筋原細胞に関連する第四の細胞表面マーカーを実質的にもたず、前記第四の細胞表面マーカーが第四の抗体を用いる前記抗体ベースのアッセイで実質的に検出されないことおよび／または
ＢＡＴ前駆細胞が周皮細胞に関連する第五の細胞表面マーカーを実質的にもたず、前記第五の細胞表面マーカーが第五の抗体を用いる前記抗体ベースのアッセイで実質的に検出されないこと
のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１に記載のＢＡＴ前駆細胞。
【請求項３】
前記第一の細胞表面マーカーがＣＤ３４であり、前記第一の抗体が抗ＣＤ３４抗体である、請求項１または２に記載のＢＡＴ前駆細胞。
【請求項４】
前記第二の細胞表面マーカーがＣＤ３１であり、前記第二の抗体が抗ＣＤ３１抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＢＡＴ前駆細胞。
【請求項５】
前記第三の細胞表面マーカーがＣＤ４５であり、前記第三の抗体が抗ＣＤ４５抗体である、請求項２〜４のいずれか１項に記載のＢＡＴ前駆細胞。
【請求項６】
前記第四の細胞表面マーカーがＣＤ５６であり、前記第四の抗体が抗ＣＤ５６抗体である、請求項２〜５のいずれか１項に記載のＢＡＴ前駆細胞。
【請求項７】
前記第五の細胞表面マーカーがＣＤ１４６であり、前記第五の抗体が抗ＣＤ１４６抗体である、請求項２〜６のいずれか１項に記載のＢＡＴ前駆細胞。
【請求項８】
前記ＢＡＴ前駆細胞が増殖培地で増殖する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＢＡＴ前駆細胞。
【請求項９】
前記増殖培地が骨形成タンパク質−７（ＢＭＰ７）を含む、請求項８に記載のＢＡＴ前駆細胞。
【請求項１０】
前記ＢＡＴ前駆細胞が、分化培地で褐色脂肪細胞に分化する、請求項１〜９のいずれか１項に記載のＢＡＴ前駆細胞。
【請求項１１】
前記分化培地が最少分化培地（ＭＤＭ）である、請求項１０に記載のＢＡＴ前駆細胞。
【請求項１２】
前記分化培地がペルオキシソーム増殖剤活性化受容体ガンマ（ＰＰＡＲγ）アゴニストを含む、請求項１０に記載のＢＡＴ前駆細胞。
【請求項１３】
骨格筋から単離され、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＢＡＴ前駆細胞を少なくとも１つ含む、細胞集団。
【請求項１４】
ＢＡＴ前駆細胞を同定する方法であって、
骨格筋から単離された細胞集団を準備する工程と、
前記細胞集団を、それぞれが内皮細胞に関連する第一の細胞表面マーカーおよび第二の細胞表面マーカーにそれぞれ特異的な第一の抗体および第二の抗体と接触させる工程と、
前記第一の細胞表面マーカーを発現し、前記第二の細胞表面マーカーを実質的に持たないＢＡＴ前駆細胞を抗体ベースのアッセイで判定する工程と
を含む、方法。
【請求項１５】
前記第一の細胞表面マーカーがＣＤ３４であり、前記第一の抗体が抗ＣＤ３４抗体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第二の細胞表面マーカーがＣＤ３１であり、前記第二の抗体が抗ＣＤ３１抗体である、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞集団を造血細胞に関連する第三の細胞表面マーカーに特異的な第三の抗体と接触させる工程であって、前記第三の細胞表面マーカーが前記第三の抗体を用いる前記抗体ベースのアッセイで実質的に検出されない、工程、
前記細胞集団を筋原細胞に関連する第四の細胞表面マーカーに特異的な第四の抗体と接触させる工程であって、前記第四の細胞表面マーカーが前記第四の抗体を用いる前記抗体ベースのアッセイで実質的に検出されない、工程、および／または
前記細胞集団を周皮細胞に関連する第五の細胞表面マーカーに特異的な第五の抗体と接触させる工程であって、前記第五の細胞表面マーカーが前記第五の抗体を用いる前記抗体ベースのアッセイで実質的に検出されない、工程
のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記第三の細胞表面マーカーがＣＤ４５であり、前記第三の抗体が抗ＣＤ４５抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第四の細胞表面マーカーがＣＤ５６であり、前記第四の抗体が抗ＣＤ５６抗体である、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第五の細胞表面マーカーがＣＤ１４６であり、前記第五の抗体が抗ＣＤ１４６抗体である、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記第一の細胞表面マーカーを発現し前記第二の細胞表面マーカーを発現しない細胞を選別することによって前記細胞集団を分離する工程をさらに含む、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記第一の細胞表面マーカーを発現し、前記第二の細胞表面マーカーと前記第三、第四および第五の細胞表面マーカーのうちの少なくとも１つとを発現しない細胞を選別することによって、前記細胞集団を分離する工程をさらに含む、請求項１４〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記選別が、ＣＤ３４を発現しＣＤ３１、ＣＤ４５、ＣＤ５６またはＣＤ１４６を発現しない細胞を選別することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＢＡＴ前駆細胞を単離する工程をさらに含む、請求項１４〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＢＡＴ前駆細胞を増殖培地で培養する工程であって、それによってＢＡＴ前駆細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで拡大する、工程をさらに含む、請求項１４〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
ＢＡＴ前駆細胞から褐色脂肪細胞への分化を誘導する方法であって、
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＢＡＴ前駆細胞を準備する工程と、
前記ＢＡＴ前駆細胞を分化培地に曝露する工程と、
前記ＢＡＴ前駆細胞を前記分化培地で培養する工程であって、それによって前記ＢＡＴ前駆細胞を褐色脂肪細胞に分化させる、工程と
を含む方法。
【請求項２７】
前記分化培地が最少分化培地（ＭＤＭ）である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記分化培地がペルオキシソーム増殖剤活性化受容体ガンマ（ＰＰＡＲγ）アゴニストを含む、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＢＡＴ前駆細胞を増殖培地に曝露する工程をさらに含む、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記増殖培地が骨形成タンパク質−７（ＢＭＰ７）を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
個人の代謝疾患または代謝病態の治療に使用するＢＡＴ前駆細胞であって、
前記個人または提供者の骨格筋から採取され、
培地で培養することにより増殖し、
培養された前記細胞が前記個人に移植される
ＢＡＴ前駆細胞。
【請求項３２】
分化培地でのｅｘ  ｖｉｖｏ培養により褐色脂肪細胞への分化が誘導される、請求項３１に記載のＢＡＴ前駆細胞。
【請求項３３】
前記代謝疾患が肥満、体重過多、耐糖能異常、インスリン抵抗性、２型糖尿病、脂質異常症、高血圧症、心血管疾患、メタボリック症候群、プラダー・ウィリー症候群または１型糖尿病である、請求項３１または３２に記載のＢＡＴ前駆細胞。
【請求項３４】
ＢＡＴ前駆細胞から褐色脂肪細胞への分化を誘導する薬剤を特定する方法であって、
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＢＡＴ前駆細胞を準備する工程と、
前記ＢＡＴ前駆細胞を薬剤と接触させる工程と、
前記ＢＡＴ前駆細胞が褐色脂肪細胞への分化の指標を示すかどうかを判定する工程と
を含む方法。
【請求項３５】
前記分化の指標が、ＵＣＰ１タンパク質またはｍＲＮＡの発現、ＦＡＢＰ４（ａＰ２）タンパク質またはｍＲＮＡの発現、ＰＰＡＲγ２タンパク質またはｍＲＮＡの発現、ｍｔＴＦＡタンパク質またはｍＲＮＡの発現、ＰＧＣ−１αタンパク質またはｍＲＮＡの発現、脱共役呼吸、呼吸速度、代謝率、グルコース利用率、脂肪酸酸化率およびその組合せのうちの１つ以上の増大である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＵＣＰ１の発現または活性レベルを誘導する薬剤を特定する方法であって、
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＢＡＴ前駆細胞を準備する工程と、
前記ＢＡＴ前駆細胞を薬剤と接触させる工程と、
前記ＢＡＴ前駆細胞がＵＣＰ１の発現または活性の増大を示すかどうかを判定する工程と、
を含む方法。
【請求項３７】
請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の方法を用いて特定され、患者の代謝疾患の治療のための薬物の製造に使用される薬剤。
【請求項３８】
請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の方法を用いて特定され、患者の低体温症の治療または予防のための薬物の製造に使用される薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は２０１１年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／５５８，１５２号の優先権および利益を主張するものであり、上記明細書はその全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【０００２】
本発明は、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）前駆細胞および骨格筋からＢＡＴ前駆細胞を単離する方法に関する。本発明はこのほか、ＢＡＴ前駆細胞表面マーカーならびに細胞分化を誘導するための培地および薬剤に関する。本発明は肥満、２型糖尿病、インスリン抵抗性および脂質異常症などの各種代謝疾患の研究、予防および治療に有用である。
【背景技術】
【０００３】
肥満の蔓延は糖尿病、高血圧症、冠動脈心疾患、癌をはじめとする障害の有病率の増大と密接に関係している。白色脂肪組織の役割は脂質の貯蔵であり、これが肥満の原因となっている。褐色脂肪組織（「ＢＡＴ」）は事実上、これと逆である。ＢＡＴは、脂質を燃焼しエネルギーを熱として放散することに特化している。実際、褐色脂肪細胞にはミトコンドリア（ここで細胞内の燃焼が起こる）が多数含まれ、ＢＡＴ脱共役タンパク質−１（「ＵＣＰ１」）が特異的に発現する。ＵＣＰ１は酸化的リン酸化の脱共役剤として作用し、エネルギーを熱として放散する。交感神経系がミトコンドリア新生およびＵＣＰ１の発現と活性を刺激する。げっ歯類では低温に曝露したとき（例えば、低体温症を防ぐため）または過食によってＢＡＴによる熱産生量が増大し、過剰に吸収された脂肪を燃焼させて体重増加を防ぐ。ＢＡＴはこのほか、体重増加に対する感受性を修正し、大量のグルコースを消費することによって、インスリン感受性を向上させる。したがって、ＢＡＴは体温、エネルギーバランスおよびグルコース代謝の維持に重要な役割を果たしている。
【０００４】
トランスジェニック動物を用いた実験により、ＢＡＴに抗肥満性があるという可能性が裏付けられている。例えば、ＢＡＴの遺伝子除去が肥満を引き起こすことが報告されているのに対して、ＢＡＴの量および／または機能（および／またはＵＣＰ１発現）に関する遺伝子が増大すると脂肪の少ない健康的な表現型が促進されることが報告されている。具体的には、ＢＡＴの量が多いマウスの方が対照マウスよりも体重が増加しにくく、インスリン感受性が高い。近年、マウス筋肉内に異所性のＢＡＴ貯蔵の存在が明らかにされ、このようなＢＡＴ貯蔵により、体重増加およびメタボリック症候群を予防する遺伝的機序がもたらされるとする説が提唱されている。
【０００５】
ＵＣＰ１がエネルギーバランスの制御に何らかの役割を果たすことがげっ歯類で報告されており、またＵＣＰ１を発現するＢＡＴがヒト新生児に存在することがわかっているが、ヒト成人には生理学的に関連するＵＣＰ１発現がみられないと長い間考えられてきた。実際、ＵＣＰ１を発現するＢＡＴは若年期に消失すると考えられており、またヒト成人にはＢＡＴがないと考えられてきた。
【０００６】
したがって、肥満、２型糖尿病、インスリン抵抗性脂質異常症および１型糖尿病などの各種代謝疾患の研究、予防および治療のため、成人の体にＢＡＴを増やし、および／またはＵＣＰ１発現を刺激する方法を慎重に特定し研究することが必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
本出願人らは、褐色脂肪細胞の分化することができる細胞が各種組織内に存在することを初めて確認した。一態様では、本出願人らは、本出願人らがＢＡＴ前駆細胞と呼ぶこのような細胞の集団を骨格筋中に同定した。本開示は、各種組織から細胞を分別して、ＢＡＴ前駆細胞を同定し単離する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ヒト骨格筋からＢＡＴ前駆細胞を単離する。ＢＡＴ前駆細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで褐色脂肪細胞に分化させる方法が提供される。いくつかの実施形態では、ヒト対象においてＢＡＴ前駆細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで褐色脂肪細胞に分化させることができる。本発明はほかにも、ＢＡＴ前駆細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ３１およびＣＤ３４）ならびに細胞分化を誘導するための培地および薬剤（例えば、ＰＰＡＲγアゴニストおよびＢＭＰ７）に関する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本開示のＢＡＴ前駆細胞を培養して拡大することができる。別の態様では、分化したＢＡＴ前駆細胞のＵＣＰ１  ｍＲＮＡの発現を細胞透過性ｃＡＭＰ誘導体、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（ＰＰＡＲγなどのＰＰＡＲ）アゴニストなどの薬剤によって増大させる。いくつかの実施形態では、褐色脂肪細胞に分化したＢＡＴ前駆細胞は、ともにミトコンドリア新生およびミトコンドリアマーカーのシトクロームオキシダーゼＩＶ（ＣＯＸ−ＩＶ）の制御に関与するミトコンドリア転写因子Ａ（ｍｔＴＦＡ）およびＰＰＡＲγコアクチベーター−１α（ＰＧＣ−１α）を多量に含み得る。分化したＢＡＴ前駆細胞は、次に挙げる特徴を１つ以上示し得る：高レベルのＵＣＰ１発現、高レベルの脱共役呼吸、高い呼吸速度、高い代謝率。本出願人らは、グルコースを代謝し、脂肪酸を酸化し、酸化的リン酸化の脱共役を介してエネルギーを熱として放散する能力を備えた分化細胞を提供する。
【０００９】
本開示は、ヒト成人の骨格筋においてＵＣＰ１  ｍＲＮＡを検出する方法およびｉｎ  ｖｉｖｏでその発現を増大させる方法を提供する。ヒト成人のＵＣＰ１発現に関するこれまでの研究は白色脂肪組織に焦点を絞ったものであったが、本出願人らは、ＵＣＰ１を発現する可能性を実質的に有する褐色脂肪前駆細胞がヒト骨格筋内に存在し、これをヒト骨格筋から単離することを開示する。いくつかの実施形態では、このＢＡＴ前駆細胞のリザーバーをエネルギー放散の調節、ならびに肥満、糖尿病および代謝疾患の治療に利用することができる。
【００１０】
いくつかの態様では、本開示は、ヒト骨格筋のＢＡＴ前駆細胞を同定する方法およびヒト骨格筋試料からＢＡＴ前駆細胞を単離する方法を提供する。このほか、上記前駆細胞から褐色脂肪細胞への分化をｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはその両方で促進する条件および薬剤（例えば、化合物、タンパク質、生物学的製剤など）を提供する。上記条件および薬剤を用いて肥満、２型糖尿病、インスリン抵抗性、脂質異常症などの代謝疾患を治療する方法を提供する。
【００１１】
本開示は、ＵＣＰ１遺伝子の発現を誘導するか、ＢＡＴ前駆細胞から褐色脂肪細胞への分化をｉｎ  ｖｉｔｒｏで促進するか、ＢＡＴ前駆細胞から褐色脂肪細胞への分化をｉｎ  ｖｉｖｏで促進するか、上記活性の組合せを有する薬剤（例えば、化合物、タンパク質、生物学的製剤など）の特定を可能にするアッセイを提供する。いくつかの実施形態では、この方法で特定された薬剤を用いて、肥満、２型糖尿病、インスリン抵抗性、脂質異常症などの代謝疾患を治療することができる。
【００１２】
一態様では、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）前駆細胞を提供する。ＢＡＴ前駆細胞はヒト骨格筋から単離され、褐色脂肪細胞に分化することが可能なものである。ＢＡＴ前駆細胞は内皮細胞に関連する第一の細胞表面マーカーを発現し、前記第一の細胞表面マーカーは第一の抗体を用いる抗体ベースのアッセイで検出される。さらに、ＢＡＴ前駆細胞は内皮細胞に関連する第二の細胞表面マーカーを実質的にもたず、前記第二の細胞表面マーカーは第二の抗体を用いる前記抗体ベースのアッセイで実質的に検出されない。ある実施形態では、ＢＡＴ前駆細胞は第三、第四および第五の細胞表面マーカーのうちの少なくとも１つを実質的にもたないものであり得る。例えば、ＢＡＴ前駆細胞は、造血細胞に関連する第三の細胞表面マーカーを実質的にもたないものであり得、前記第三の細胞表面マーカーは第三の抗体を用いる前記抗体ベースのアッセイで実質的に検出されない。ＢＡＴ前駆細胞は第三の細胞表面マーカーおよび／または筋原細胞に関連する第四の細胞表面マーカーを実質的にもたないものであり得、前記第四の細胞表面マーカーは第四の抗体を用いる前記抗体ベースのアッセイで実質的に検出されない。ＢＡＴ前駆細胞は第三の細胞表面マーカー、第四の細胞表面マーカーおよび／または周皮細胞に関連する第五の細胞表面マーカーを実質的にもたないものであり得、前記第五の細胞表面マーカーは第五の抗体を用いる前記抗体ベースのアッセイで実質的に検出されない。
【００１３】
また別の態様では、本発明は、骨格筋から単離され、本明細書に記載のＢＡＴ前駆細胞を少なくとも１つ含む細胞集団を特徴とする。
【００１４】
別の態様では、ＢＡＴ前駆細胞を同定する方法が提供される。この方法は、骨格筋から単離された細胞集団を準備する工程；細胞集団を、それぞれが内皮細胞に関連する第一および第二の細胞表面マーカーにそれぞれ特異的な第一および第二の抗体と接触させる工程；ならびに第一の細胞表面マーカーを発現し、第二の細胞表面マーカーを実質的にもたないＢＡＴ前駆細胞を抗体ベースのアッセイで判定する工程を含む。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、次に挙げる工程を少なくとも１つ含み得る：細胞集団を造血細胞に関連する第三の細胞表面マーカーに特異的な第三の抗体と接触させる工程であって、前記第三の細胞表面マーカーが第三の抗体を用いる前記抗体ベースのアッセイで実質的に検出されない、工程；細胞集団を筋原細胞に関連する第四の細胞表面マーカーに特異的な第四の抗体と接触させる工程であって、前記第四の細胞表面マーカーが第四の抗体を用いる前記抗体ベースのアッセイで実質的に検出されない、工程；および／または細胞集団を周皮細胞に関連する第五の細胞表面マーカーに特異的な第五の抗体と接触させる工程であって、前記第五の細胞表面マーカーが第五の抗体を用いる前記抗体ベースのアッセイで実質的に検出されない、工程。ある実施形態では、この方法は、第一の細胞表面マーカーを発現し、第二の細胞表面マーカーを発現しない細胞を選別することによって細胞集団を分離する工程をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、この方法は、第一の細胞表面マーカーを発現し、第二の細胞表面マーカーと第三、第四および第五の細胞表面マーカーのうちの少なくとも１つとを発現しない細胞を選別することによって細胞集団を分離する工程を含み得る。例えば、前記選別は、ＣＤ３４を発現し、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＣＤ５６またはＣＤ１４６を発現しない細胞の選別を含み得る。この方法はほかにも、ＢＡＴ前駆細胞を単離し、および／または増殖培地中でＢＡＴ前駆細胞を培養する工程であって、それによりＢＡＴ前駆細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで拡大する、工程を含み得る。
【００１５】
さらに別の態様では、ＢＡＴ前駆細胞から褐色脂肪細胞への分化を誘導する方法が提供される。この方法は、本明細書に記載のＢＡＴ前駆細胞を準備する工程；ＢＡＴ前駆細胞を分化培地に曝露する工程；およびＢＡＴ前駆細胞を褐色脂肪細胞に分化するよう誘導するために、ＢＡＴ前駆細胞を分化培地で培養する工程を含む。
【００１６】
さらに別の態様では、本発明は、患者の代謝疾患または代謝病態を治療する方法を特徴とする。この方法は、個人または提供者の骨格筋からＢＡＴ前駆細胞を採取する工程；ＢＡＴ前駆細胞を培地で培養することにより増殖させる工程；および培養した細胞を個人に移植する工程を含む。ある実施形態では、この方法は、分化培地におけるｅｘ  ｖｉｖｏ培養によりＢＡＴ前駆細胞から褐色脂肪細胞への分化を誘導する工程をさらに含み得る。各種実施形態では、代謝疾患は肥満、体重過多、耐糖能異常、インスリン抵抗性、２型糖尿病、脂質異常症、高血圧症、心血管疾患、メタボリック症候群、プラダー・ウィリー症候群または１型糖尿病である。
【００１７】
また別の態様では、ＢＡＴ前駆細胞から褐色脂肪細胞への分化を誘導する薬剤を特定する方法が提供される。この方法は、本明細書に記載のＢＡＴ前駆細胞を準備する工程；ＢＡＴ前駆細胞を薬剤と接触させる工程；ＢＡＴ前駆細胞が褐色脂肪細胞への分化の指標を示すかどうかを判定する工程を含む。いくつかの実施形態では、分化の指標は、次に挙げる１つ以上のものが増大することであり得る：ＵＣＰ１タンパク質またはｍＲＮＡの発現、ＦＡＢＰ４（ａＰ２）タンパク質またはｍＲＮＡの発現、ＰＰＡＲγ２タンパク質またはｍＲＮＡの発現、ｍｔＴＦＡタンパク質またはｍＲＮＡの発現、ＰＧＣ−１αタンパク質またはｍＲＮＡの発現、脱共役呼吸、呼吸速度、代謝率、グルコース利用率、脂肪酸酸化率およびその組合せ。
【００１８】
さらにまた別の態様では、ＵＣＰ１の発現または活性レベルを誘導する薬剤を特定する方法が提供される。この方法は、本明細書に記載のＢＡＴ前駆細胞を準備する工程；ＢＡＴ前駆細胞を薬剤と接触させる工程；およびＢＡＴ前駆細胞がＵＣＰ１の発現または活性の増大を示すかどうかを判定する工程を含む。
【００１９】
本発明はほかにも、本明細書に記載のいずれか１つの方法を用いて特定された薬剤を患者の代謝疾患の治療および／または低体温症の治療もしくは予防のための薬物の製造に使用することを含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、第一の細胞表面マーカーがＣＤ３４であり、第一の抗体が抗ＣＤ３４抗体であり得る。一実施形態では、第二の細胞表面マーカーがＣＤ３１であり、第二の抗体が抗ＣＤ３１抗体であり得る。第三の細胞表面マーカーが、例えばＣＤ４５であり、第三の抗体が抗ＣＤ４５抗体であり得る。第四の細胞表面マーカーが、例えばＣＤ５６であり、第四の抗体が抗ＣＤ５６抗体であり得る。第五の細胞表面マーカーが、例えばＣＤ１４６であり、第五の抗体が抗ＣＤ１４６抗体であり得る。
【００２１】
各種実施形態では、ＢＡＴ前駆細胞は分化培地中で褐色脂肪細胞に分化することができる。例えば、分化培地は最少分化培地（ＭＤＭ）であり得る。分化培地はペルオキシソーム増殖剤活性化受容体ガンマ（ＰＰＡＲγ）アゴニストおよび／または骨形成タンパク質−７（ＢＭＰ７）をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ７は、分化培地の添加前に、ＢＡＴ前駆細胞の増殖が可能な増殖培地中に存在し得る。
【００２２】
本発明のさらに別の態様は、単離されたＢＡＴ前駆細胞、その初代培養物、そこから確立または固定化された細胞系、培養されたＢＡＴ前駆細胞または細胞系、遺伝子導入または形質導入または感染または形質転換した細胞または細胞系およびこのようなＢＡＴ前駆細胞もしくは細胞系または形質転換細胞から分化し得る任意の細胞または培養物を含む。上に挙げたものをはじめとする本開示の特徴を本明細書に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ヒト胎児筋肉における免疫組織化学的描写、ＦＡＣＳ解析および間質血管細胞の分別を示す図である。
【図２】ヒト胎児筋肉から分別された細胞の脂肪生成条件下での培養ならびにＣＤ３４＋細胞のＲＴ−ＰＣＲおよびウエスタンブロット分析を示す図である。２Ａ、２Ｂ、２Ｃ：位相差；スケールバー：５０μｍ。
【図３】ヒト胎児筋肉ＣＤ３４＋細胞におけるミトコンドリア呼吸の脱共役およびＵＣＰ１のｍＲＮＡ発現の制御を示す図である。
【図４】脂肪生成培養における成人の筋肉およびＷＡＴ細胞の特徴付けを示す図である。４Ａ、４Ｂ、４Ｃ：位相差；スケールバー：５０μｍ。
【図５】ヒト骨格筋におけるＵＣＰ１のｍＲＮＡ発現に対するロシグリタゾンの効果を示す図である。
【図６】拡大前のＣＤ３１−細胞集団を示す図である（６Ａ：ＥＭＣ３０９、継代２代目；６Ｂ：ＥＭＣ３１４、継代１代目）。
【図７】拡大前のＣＤ３１＋細胞集団を示す図である（７Ａ：ＥＭＣ３０９、継代４代目；７Ｂ：ＥＭＣ３１４、継代３代目）。
【図８】拡大前のＣＤ５６＋細胞集団を示す図である（８Ａ：ＥＭＣ３０９、継代１代目；８Ｂ：ＥＭＣ３１４、継代３代目）。
【図９Ａ】ＣＤ３１−細胞集団が褐色脂肪細胞に分化することを示す図である（ＥＭＣ３０９、第１４日の継代４代目）。
【図９Ｂ】ＣＤ３１−細胞集団が褐色脂肪細胞に分化することを示す図である（ＥＭＣ３０９、第１４日の継代４代目）。
【図９Ｃ】ＣＤ３１−細胞集団が褐色脂肪細胞に分化することを示す図である（ＥＭＣ３０９、第１４日の継代４代目）。
【図９Ｄ】ＣＤ３１−細胞集団が褐色脂肪細胞に分化することを示す図である（ＥＭＣ３０９、第１４日の継代４代目）。
【図９Ｅ】ＣＤ３１−細胞集団が褐色脂肪細胞に分化することを示す図である（ＥＭＣ３１４、第１４日の継代３代目）。
【図９Ｆ】ＣＤ３１−細胞集団が褐色脂肪細胞に分化することを示す図である（ＥＭＣ３１４、第１４日の継代３代目）。
【図９Ｇ】ＣＤ３１−細胞集団が褐色脂肪細胞に分化することを示す図である（ＥＭＣ３１４、第１４日の継代３代目）。
【図９Ｈ】ＣＤ３１−細胞集団が褐色脂肪細胞に分化することを示す図である（ＥＭＣ３１４、第１４日の継代３代目）。
【図１０Ａ】ＣＤ３１＋細胞が脂肪細胞に分化しないことを示す図である（ＥＭＣ３０９、第１４日の継代６代目）。
【図１０Ｂ】ＣＤ３１＋細胞が脂肪細胞に分化しないことを示す図である（ＥＭＣ３０９、第１４日の継代６代目）。
【図１０Ｃ】ＣＤ３１＋細胞が脂肪細胞に分化しないことを示す図である（ＥＭＣ３０９、第１４日の継代６代目）。
【図１０Ｄ】ＣＤ３１＋細胞が脂肪細胞に分化しないことを示す図である（ＥＭＣ３０９、第１４日の継代６代目）。
【図１０Ｅ】ＣＤ３１＋細胞が脂肪細胞に分化しないことを示す図である（ＥＭＣ３１４、第１４日の継代５代目）。
【図１０Ｆ】ＣＤ３１＋細胞が脂肪細胞に分化しないことを示す図である（ＥＭＣ３１４、第１４日の継代５代目）。
【図１０Ｇ】ＣＤ３１＋細胞が脂肪細胞に分化しないことを示す図である（ＥＭＣ３１４、第１４日の継代５代目）。
【図１０Ｈ】ＣＤ３１＋細胞が脂肪細胞に分化しないことを示す図である（ＥＭＣ３１４、第１４日の継代５代目）。
【図１１Ａ】ＣＤ５６＋細胞が脂肪細胞に分化しないことを示す図である（ＥＭＣ３０９、第１４日の継代６代目）。
【図１１Ｂ】ＣＤ５６＋細胞が脂肪細胞に分化しないことを示す図である（ＥＭＣ３０９、第１４日の継代６代目）。
【図１１Ｃ】ＣＤ５６＋細胞が脂肪細胞に分化しないことを示す図である（ＥＭＣ３０９、第１４日の継代６代目）。
【図１１Ｄ】ＣＤ５６＋細胞が脂肪細胞に分化しないことを示す図である（ＥＭＣ３０９、第１４日の継代６代目）。
【図１１Ｅ】ＣＤ５６＋細胞が脂肪細胞に分化しないことを示す図である（ＥＭＣ３１４、第１４日の継代５代目）。
【図１１Ｆ】ＣＤ５６＋細胞が脂肪細胞に分化しないことを示す図である（ＥＭＣ３１４、第１４日の継代５代目）。
【図１１Ｇ】ＣＤ５６＋細胞が脂肪細胞に分化しないことを示す図である（ＥＭＣ３１４、第１４日の継代５代目）。
【図１１Ｈ】ＣＤ５６＋細胞が脂肪細胞に分化しないことを示す図である（ＥＭＣ３１４、第１４日の継代５代目）。
【図１２】ロシグリタゾンまたはＢＭＰ７の有無（＋／−ｃｍｐｄ）に関係なく、脂肪生成分化培地（ＭＤＭ）で培養したＣＤ３１＋細胞およびＣＤ５６＋細胞の方が同培地で培養したＣＤ３１−細胞よりも回収されたＲＮＡ量が有意に少ない（細胞数が少ないことを反映している）ことを示す図である。ＣＤ３１−の試料とＣＤ３１＋およびＣＤ５６＋の試料とで濃色のバー（ＭＤＭ＋／−ｃｍｐｄ）を比較されたい。
【図１３】ＣＤ３１−細胞が脂肪細胞に分化し、ＵＣＰ１を発現することを示す図である。ＣＤ３１−細胞をロシグリタゾンまたはＢＭＰ７に曝露すると、細胞の分化およびＵＣＰ１の発現が大幅に増大する。
【図１４】ｃＡＭＰおよびβ−ＡＲアゴニストにはＵＣＰ１のｍＲＮＡ発現に対するＰＰＡＲγアゴニストとの相乗効果があることを示す図である。ＲＤＭ＝最少分化培地＋ロシグリタゾン、ｉｓｏ＝（−）−イソプロテレノール。
【図１５】分化した褐色脂肪細胞の方が未分化のＢＡＴ前駆細胞よりもＰＰＡＲγ２のｍＲＮＡレベルが有意に上昇していることを示す図である。ＲＤＭ＝最少分化培地＋ロシグリタゾン、ｉｓｏ＝（−）−イソプロテレノール。
【図１６】ＣＤ３１−細胞の呼吸を示す図である。褐色脂肪細胞に分化したＣＤ３１−細胞（灰色のバー）の方が非分化細胞（ＥＧＭ２、白色のバー）よりもミトコンドリアの脱共役またはプロトン漏出（状態４呼吸）のレベルおよび最大（脱共役）呼吸速度（状態３ｕ）が高くなっている。
【図１７】蛍光免疫組織化学法によるＣＤ３１−細胞のＵＣＰ１の定量化を示す図である。
【図１８】未分化のＣＤ３１−細胞（ＥＧＭ２）および分化したＣＤ３１−細胞（ロシグリタゾンまたはＢＭＰ７）における多重リアルタイムＰＣＲによるＵＣＰ１（図１８Ａ、黒色のバー）、ＦＡＢＰ４（図１８Ｂ、灰色のバー）およびシクロフィリンＡのｍＲＮＡの定量化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本開示は、各種組織中にＢＡＴ前駆細胞を同定し、これを組織から単離する方法を提供し、この方法は、いくつかの実施形態では、ヒト骨格筋中の通常の褐色脂肪細胞前駆細胞の同定およびヒト骨格筋試料からのこのような細胞の単離を含む。いくつかの実施形態では、分化／命名クラスター（「ＣＤ」）分子ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ５６およびＣＤ１４６のうちの１つ以上などの細胞表面マーカーの免疫組織化学的分析によって、細胞分別を実施することができる。ＣＤ３１およびＣＤ３４を用いて内皮細胞を同定することができる。細胞表面のＣＤ４５およびＣＤ５６の同定に基づいて、それぞれ造血細胞および筋形成前駆細胞を分別することができる。ＣＤ１４６を用いて周皮細胞を同定することができる。一態様では、ＣＤ３４の発現により、細胞を褐色脂肪細胞の前駆細胞と同定する。また別の態様では、ＣＤ３４＋細胞の亜群が現時点で知られている最も純粋なヒト褐色脂肪細胞前駆細胞の代表的なものである。
【００２５】
各種組織から採取した細胞の分別および他の細胞からのＢＡＴ前駆細胞の分離にフローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別（「ＦＡＣＳ」）をはじめとする当該技術分野で公知の細胞分別技術を用いることができる。ＣＤ３１−ＣＤ３４＋内皮細胞の同定には、当該技術分野で公知の技術の中でも特にマルチカラーＦＡＣＳを用いることができる。さらに、ＣＤ１４６＋周皮細胞、ＣＤ４５＋造血細胞および／またはＣＤ５６＋筋形成前駆細胞のうちの１つ以上を分離し除去することができる。逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（「ＲＴ−ＰＣＲ」）分析を用いて、ＣＤ３４＋細胞およびＣＤ１４６＋細胞の集団に造血細胞および筋形成前駆細胞が存在しないことを確認することができる。
【００２６】
本出願人らは予想外にも、ある前駆細胞集団が骨格筋に存在し、いくつかの実施形態では、この集団が骨格筋には存在するが、白色脂肪組織には存在せず、いくつかの実施形態では、骨格筋にのみ存在する（つまり、他の組織には存在しない）ことを発見した。骨格筋はヒトの骨格筋であっても、任意の動物の骨格筋であってもよく、前駆細胞集団は骨格筋内に拡散して存在していても、別個の領域に集中して存在していてもよい。いくつかの実施形態では、ＢＡＴ前駆細胞は筋線維の間に見られるものであり得る。骨格筋のＢＡＴ前駆細胞は定位置に存在する集団であっても、骨格筋、または組織内および異なる組織間を移動する集団であってもよい。さらに、ＢＡＴ前駆細胞は胎児、幼若体および成体の骨格筋に見られるものであり得る。
【００２７】
本教示は各種組織から単離されたＢＡＴ前駆細胞を提供する。例えば、ヒト骨格筋から単離されたＢＡＴ前駆細胞を提供する。いくつかの実施形態では、ＢＡＴ前駆細胞は骨格筋には見られるが、白色脂肪組織には見られず、および／または骨格筋にのみ見られるものである。一部のＢＡＴ前駆細胞はＵＣＰ１、ミトコンドリア転写因子Ａ（ｍｔＴＦＡ）および／またはＰＰＡＲγコアクチベーター−１α（ＰＧＣ−１α）ならびに１つ以上の対応するｍＲＮＡを発現し得る。本開示は、ヒト成人の骨格筋にＢＡＴ前駆細胞および／またはＵＣＰ１のｍＲＮＡを検出する方法を提供する。ヒト成人のＵＣＰ１発現に関するこれまでの研究は白色脂肪組織に焦点を絞ったものであったが、本出願人らは、ＵＣＰ１を発現する可能性の高い褐色脂肪前駆細胞がヒト骨格筋に存在し、これをヒト骨格筋から単離することを開示する。いくつかの実施形態では、骨格筋内のＢＡＴ前駆細胞のリザーバーにより、肥満、糖尿病などの代謝疾患を治療するためのエネルギー放散の調節機序が得られる。
【００２８】
骨格筋に存在する前駆細胞集団の少なくとも一部は、真の褐色脂肪細胞に分化することが可能であり、いくつかの実施形態では、骨格筋に存在する前駆細胞集団の一部をｉｎ  ｖｉｔｒｏで真の褐色脂肪細胞に分化させることが可能である。本開示は、ＢＡＴ前駆細胞の培養を拡大する方法およびＢＡＴ前駆細胞を真のＢＡＴ細胞に分化させる方法を提供し、これには、予め分別した細胞を脂肪生成培地中で分化させる方法が含まれる。いくつかの実施形態では、白色脂肪細胞分化を維持する条件を用いて、あるいは前駆細胞から褐色脂肪細胞への分化を促進することが明らかになった薬剤の使用によって、分別した前駆細胞から褐色脂肪細胞への分化を実施することができる。
【００２９】
いくつかの実施形態では、ＵＣＰ１、ＦＡＢＰ４（ａＰ２）、ＰＰＡＲγ２、ミトコンドリア転写因子Ａ（ｍｔＴＦＡ）および／またはＰＰＡＲγコアクチベーター−１α（ＰＧＣ−１α）ならびに１つ以上の対応するｍＲＮＡの存在を用いて、少なくとも一部が分化を開始したＢＡＴ前駆細胞を同定する。高い代謝率もしくは高レベルの脱共役呼吸、グルコース利用、脂肪酸の酸化または上記特徴を互いにもしくは他の特徴と組み合わせたものを用いて、少なくとも一部が分化を開始したＢＡＴ前駆細胞を同定する。本開示の目的のために、少なくとも一部が褐色脂肪細胞への分化を開始したＢＡＴ前駆細胞を「分化した褐色脂肪細胞」と呼ぶ。
【００３０】
一例を挙げれば、ＣＤ３４マーカーを発現することが明らかになった細胞（すなわち、ＣＤ３４＋細胞）を０．８６μＭインスリン、１０μｇ／ｍｌトランスフェリン、０．２ｎＭトリヨードチロニン、１μＭロシグリタゾン、１００μＭ  ３−イソブチル−１−メチルキサンチン、１μＭデキサメタゾンおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ−ＨａｍのＦ−１２培地で培養することによって褐色脂肪細胞に分化させることができる。また、他の薬剤を用いて前駆細胞から褐色脂肪細胞への分化を促進してもよい。いくつかの実施形態では、本開示の教示に従って特定された薬剤を用いて、前駆細胞から褐色脂肪細胞への分化を促進する。いくつかの実施形態では、分化した褐色脂肪細胞は高レベルのＵＣＰ１発現、高レベルの脱共役呼吸および／または高い代謝率を示す。
【００３１】
また別の例では、ＣＤ３４マーカーを発現するが、ＣＤ３１マーカーを実質的にもたない細胞（すなわち、ＣＤ３４＋ＣＤ３１−細胞）は、ＣＤ３４＋細胞（すなわち、ＣＤ３４＋ＣＤ３１−細胞とＣＤ３４＋ＣＤ３１＋細胞をともに含む）よりも純粋なＢＡＴ前駆細胞の代表的なものであり得る。ある実施形態では、少なくとも一部の脂肪細胞前駆細胞の分化を誘導するには、ＰＰＡＲγアゴニスト（例えば、ロシグリタゾン）を含有しない最少分化培地（ＭＤＭ）と呼ぶ脂肪生成分化培地で十分であることがわかった。ＭＤＭの組成はＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２  ５０／５０Ｍｉｘ（３．１５１ｇ／ｌ、１７．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、３．６５１ｇ／ｌ  Ｌ−グルタミン）（Ｃｅｌｌｇｒｏ  ＃１０−０９０−ＣＶ）、５μｇ／ｍｌ（０．８６μＭ）インスリン、１０μｇ／ｍｌトランスフェリン、０．２ｎＭ  ３，３’，５−トリヨード−Ｌ−チロニン、１００μＭ  ３−イソブチル−１−メチルキサンチン、１μＭデキサメタゾン、１％ペニシリン−ストレプトマイシンである。
【００３２】
本開示は、ＢＡＴ前駆細胞、分化した褐色脂肪細胞またはその両方のＵＣＰ１  ｍＲＮＡの発現を増大させる方法を提供する。例えば、細胞透過性ｃＡＭＰ誘導体およびペルオキシソーム増殖剤活性化受容体−γ（ＰＰＡＲγ）アゴニストなどの薬剤を用いて、ＢＡＴ前駆細胞、分化した褐色脂肪細胞またはその両方のＵＣＰ１  ｍＲＮＡの発現を増大させることができる。ＵＣＰ１発現の増大は、定量的ＲＴ−ＰＣＲによるＵＣＰ１  ｍＲＮＡの測定を含めた当該技術分野で公知の方法によって判定することができる。ＵＣＰ１  ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析に使用する典型的なプライマーが配列番号：１〜４および１１〜１２として提供される。
【００３３】
脂肪生成培地に曝露したＢＡＴ前駆細胞の方が、脂肪生成培地に曝露しないＢＡＴ前駆細胞よりも高いレベルのＵＣＰ１  ｍＲＮＡを含み得る。シクロフィリンのｍＲＮＡレベルは、細胞中のＵＣＰ１  ｍＲＮＡの存在量を評価するための正規化値（細胞数または総ＲＮＡ量を反映する）としての役割を果たし得る。いくつかの実施形態では、脂肪生成培地に曝露しないＢＡＴ前駆細胞のＵＣＰ１  ｍＲＮＡのレベルがＲＴ−ＰＣＲを用いて検出されないのに対して、分化した褐色脂肪細胞のＵＣＰ１  ｍＲＮＡのレベルは検出可能であり、シクロフィリンのｍＲＮＡレベルに正規化することができる。ＵＣＰ１発現の比較測定として、分化した褐色脂肪細胞のＵＣＰ１  ｍＲＮＡのレベルを培養マウス褐色脂肪細胞のＵＣＰ１  ｍＲＮＡのレベルと比較することができる。本開示では、分化した褐色脂肪細胞のＵＣＰ１  ｍＲＮＡのレベルは培養マウス褐色脂肪細胞のＵＣＰ１  ｍＲＮＡのレベルの約２５％であるが、他の実施形態では、ＵＣＰ１  ｍＲＮＡのレベルが培養マウス褐色脂肪細胞のＵＣＰ１  ｍＲＮＡのレベルの約２５±１０％または約１５％〜約３０％である。本開示は、分化した褐色脂肪細胞のＵＣＰ１  ｍＲＮＡのレベルが培養マウス褐色脂肪細胞のＵＣＰ１  ｍＲＮＡのレベルの約５％〜約１００％の範囲内にあることを考慮する。いくつかの実施形態では、ＵＣＰ１  ｍＲＮＡのレベルは培養マウス褐色脂肪細胞のＵＣＰ１  ｍＲＮＡのレベルの１００％を上回り得る。
【００３４】
分化した褐色脂肪細胞の方が、同種または同個体の成体の骨格筋生検の細胞よりも有意に高いレベルのＵＣＰ１  ｍＲＮＡを含み得る。さらに、分化した褐色脂肪細胞中のＵＣＰ１タンパク質の量は、同種または同個体の胎児ＢＡＴ中のＵＣＰ１タンパク質の量とほぼ同じであり得る。本開示は、分化したヒト褐色脂肪細胞のＵＣＰ１  ｍＲＮＡのレベルがｉｎ  ｖｉｖｏのヒト褐色脂肪細胞のＵＣＰ１  ｍＲＮＡのレベルとほぼ同じであることを考慮する。いくつかの実施形態では、分化したヒト褐色脂肪細胞のＵＣＰ１  ｍＲＮＡのレベルは、ｉｎ  ｖｉｖｏのヒト褐色脂肪細胞のＵＣＰ１  ｍＲＮＡのレベルの約１％からその何倍もの値に至る範囲にあり得る。
【００３５】
本開示は、ＢＡＴ前駆細胞、分化した褐色脂肪細胞またはその両方のＵＣＰ１  ｍＲＮＡのレベルを上昇させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、ＢＡＴ前駆細胞、分化した褐色脂肪細胞またはその両方のＵＣＰ１  ｍＲＮＡのレベルの選択的上昇をもたらす。ＰＰＡＲγアゴニストにより、骨格筋および分化した褐色脂肪細胞のＵＣＰ１  ｍＲＮＡの産生をともに刺激することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ＰＰＡＲγアゴニストのロシグリタゾンにより、骨格筋または分化した褐色脂肪細胞のＵＣＰ１  ｍＲＮＡの産生を選択的に刺激することができる。細胞透過性ｃＡＭＰ誘導体により、骨格筋および分化した褐色脂肪細胞のＵＣＰ１  ｍＲＮＡの産生をともに刺激することができる。例えば、いくつかの実施形態では、細胞透過性ｃＡＭＰ誘導体８−ブロモ−ｃＡＭＰにより骨格筋または分化した褐色脂肪細胞のＵＣＰ１  ｍＲＮＡの産生を選択的に刺激するのに対して、いくつかの実施形態では、細胞透過性ｃＡＭＰ誘導体（４−クロロフェニルチオ）−ｃＡＭＰにより骨格筋または分化した褐色脂肪細胞のＵＣＰ１  ｍＲＮＡの産生を刺激する。例えば、いくつかの実施形態では、ＰＰＡＲγアゴニストのロシグリタゾンと細胞透過性ｃＡＭＰ類似体ジブチリル−ｃＡＭＰまたはβ−ＡＲアゴニスト（−）−イソプロテレノールの両方を組み合せることにより、骨格筋または分化した褐色脂肪細胞のＵＣＰ１  ｍＲＮＡの産生をさらに選択的に刺激することができる（図１４）。
【００３６】
ミトコンドリア転写因子Ａ（「ｍｔＴＦＡ」）およびペルオキシソーム増殖剤活性化受容体−γコアクチベーター−１α（「ＰＧＣ−１α」）はミトコンドリア新生の制御に関与している。分化した褐色脂肪細胞にはｍｔＴＦＡ、ＰＧＣ−１αまたはその両方が多量に含まれ得る。本開示は、ｍｔＴＦＡのｍＲＮＡ、ＰＧＣ−１αのｍＲＮＡまたはその両方のレベルが未分化のＢＡＴ前駆細胞よりも有意に上昇している分化した褐色脂肪細胞を提供する。ミトコンドリアマーカーのシトクロームオキシダーゼＩＶ（ＣＯＸ−ＩＶ）はミトコンドリア呼吸鎖に関与している。本開示は、ＣＯＸ−ＩＶのｍＲＮＡのレベルが未分化のＢＡＴ前駆細胞よりも有意に上昇している分化した褐色脂肪細胞を提供する。脂肪酸結合タンパク質−４（「ＦＡＢＰ４」または「ａＰ２」）およびペルオキシソーム増殖剤活性化受容体−γ２（「ＰＰＡＲγ２」）は脂肪細胞（褐色脂肪細胞および白色脂肪細胞）でのみ発現する遺伝子である。分化した褐色脂肪細胞にはＦＡＢＰ４、ＰＰＡＲγ２またはその両方が多量に含まれ得る。本開示は、ＦＡＢＰ４のｍＲＮＡ、ＰＰＡＲγ２のｍＲＮＡまたはその両方のレベルが未分化のＢＡＴ前駆細胞よりも有意に上昇している分化した褐色脂肪細胞を提供する。例えば、図１５は、ＲＤＭ、ＲＤＭ＋ｃＡＭＰまたはＲＤＭ＋ｉｓｏによって分化を誘導すると、ＰＰＡＲγ２のｍＲＮＡのレベルがそれぞれ１０．４倍、９．２倍および６．８倍になることを示している。
【００３７】
いくつかの実施形態による分化した褐色脂肪細胞では、脱共役呼吸のレベルが高く、および／または代謝率が高くなっている。プロトンがアデノシン三リン酸（「ＡＴＰ」）の産生を駆動するアデノシン三リン酸合成酵素（「ＡＴＰ合成酵素」）を通らず、ミトコンドリア内膜から漏出すると、脱共役呼吸が生じ得る。膜を挟んだ電気化学的プロトン勾配においてプロトンの移動により放出されるエネルギーが、ＡＴＰ生成過程ではなく熱として放散される。脱共役呼吸は、ＡＴＰ合成酵素によるＡＴＰ生成とは無関係に起こる細胞呼吸（例えば、酸素消費）の割合の関数として測定することができる。例えば、ＡＴＰ合成酵素の機能を阻止するオリゴマイシンの存在下での酸化的リン酸化の電子輸送鎖における酸素消費が脱共役呼吸の尺度となる。
【００３８】
本開示は、脱共役呼吸のレベルが未分化のＢＡＴ前駆細胞よりも有意に上昇している分化した褐色脂肪細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、脱共役呼吸のレベルが総呼吸量の５０％である分化した褐色脂肪細胞を提供する。いくつかの実施形態は、総呼吸量の約２０％〜約５０％の範囲内にあるレベルの脱共役呼吸を示す。いくつかの実施形態は、比較のための基準として成体白色脂肪細胞における脱共役呼吸のレベルを用いて、成体白色脂肪細胞の約１．５倍〜約３．５倍の範囲内にある脱共役呼吸を示す。いくつかの実施形態では、脱共役呼吸のレベルが成体白色脂肪細胞の約２．５倍である。本開示は特に、グルコースを代謝し、脂肪酸を酸化し、酸化的リン酸化の脱共役を介してエネルギーを熱として放散する能力を備えた分化した褐色脂肪細胞を提供する。
【００３９】
本開示は、ＢＡＴ前駆細胞から褐色脂肪細胞への分化をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で促進する条件および薬剤（例えば、化合物、タンパク質、生物学的製剤など）を提供する。いくつかの実施形態では、分化促進剤は、ＰＰＡＲγ活性化因子、モジュレーターもしくは阻害剤（例えば、ロシグリタゾン）、ＰＰＡＲα活性化因子もしくはモジュレーター（例えば、クロフィブラート、ＧＷ９５７８）、ＰＰＡＲδ活性化因子もしくはモジュレーター（例えば、ＧＷ５０１５１６もしくはＧＷ０７４２）、ＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲδの二重活性化因子もしくはモジュレーター、ｐａｎ−ＰＰＡＲ（α、δ、γ）活性化因子もしくはモジュレーター（例えば、ＧＷ４１４８）、ＰＤＥ１阻害剤（例えば、ビンポセチンもしくはＩＢＭＸ）、ＰＤＥ３阻害剤（例えば、シグアゾダンもしくはＩＢＭＸ）、ＰＤＥ４阻害剤（例えば、ロリプラムもしくはＩＢＭＸ）、ＰＤＥ７阻害剤（例えば、ＢＭＳ５８６３５３もしくはＢＲＬ５０４８１もしくはＩＢＭＸ）、プロスタグランジンＪ２、９アルファ，１１ベータ−プロスタグランジンＦ２、９ベータ，１１アルファ−プロスタグランジンＦ２、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＡＤＣＹＡＰ１もしくはＰＡＣＡＰ）遺伝子（ＰＡＣＡＰプロペプチド、ＰＡＣＡＰ関連ペプチド、ＰＡＣＡＰ−３８もしくはＰＡＣＡＰ−２７）に由来するペプチド、ジブチリル−ｃＧＭＰ、８−ブロモ−ｃＧＭＰ、ＮＲＩＰ１（ＲＩＰ１４０）阻害剤、ＰＴＥＮ阻害剤（例えば、ビスペルオキソ（ビピリジン）オキソバナジン酸カリウムもしくはビスペルオキソ（５−ヒドロキシピリジン−２−カルボキシル）オキソバナジン酸二カリウム）、α１−アドレナリン完全もしくは部分的アゴニスト（例えば、フェニレフリンもしくはシラゾリン）、α２−アドレナリンアンタゴニスト（例えば、ヨヒンビン）、ＲＸＲα活性化因子もしくはモジュレーター（例えば、ＬＧＤ１０６９（Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ）もしくは９−ｃｉｓレチノイン酸）、ＰＧＣ−１α活性化因子、ＰＧＣ−１β阻害剤もしくは活性化因子、アディポネクチンもしくはアディポネクチン受容体ＡｄｉｐｏＲ１および／またはＡｄｉｐｏＲ２の活性化因子、ＮＯＳ阻害剤もしくは活性化因子（例えば、１４００Ｗ、２−エチル−２−チオプソイド尿素もしくはＮＧ−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ）もしくはアデノシン）、Ｒｈｏキナーゼ−ＲＯＣＫ阻害剤（例えば、ファスジル、ＨＡ１０７７）、ＢＤＮＦ、モノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）Ａ阻害剤および／もしくはＭＡＯ  Ｂ阻害剤（例えば、イソカルボキサジド、モクロベミド、セレギリン）、ＳＲＣの活性化因子、ＥＧＦＲの阻害剤（例えば、ＲＧ−１４６２０、エルロチニブもしくはＺＤ１８３９−ゲフィニチブもしくはＡｒｇｏｓタンパク質）、ＦＡＡＨの阻害剤（例えば、ＵＲＢ５９７）、ＭＡＰＫ１（例えば、ＰＤ９８０５９）もしくは２（例えば、ＰＤ９８０５９）もしくは４もしくは５もしくは７もしくは８（例えば、ＰＤ９８０５９）の阻害剤、ＣＤＫ９の阻害剤（例えば、ｌ，５，６，７−テトラヒドロ−２−（４−ピリジニル）−４Ｈ−ピロロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−オン塩酸塩）、ＴＧＲ５アゴニスト���例えば、オレアノール酸）、ＡＭＰＫ活性化因子（例えば、ＡＩＣＡＲ）、ＢＭＰ−７、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）、アデニル酸シクラーゼ活性化因子（例えば、フォルスコリン）、フォルモテロール，サルブタモール、ブプロピオン、ＲＥＶ−５９０１、２４（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、プロスタグランジンＪ２、１５ｄ−プロスタグランジンＪ２、９アルファ，１１ベータ−プロスタグランジンＦ２、９ベータ，１１アルファ−プロスタグランジンＦ２、ミード酸（２０：３  ｎ−９）、ドコサヘキサエン酸（２２：６  ｎ−３）、ドコサトリエン酸（２２：３  ｎ−３）、ドコサペンタエン酸、リゾホスファチジン酸、ボンクレキン酸、３−ブロモ−７−ニトロインダゾール、プレグネノロン１６ａカルボニトリル、エピバチジン、ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、ＮＳ−３９８）または上記のもののいずれかの組合せである。
【００４０】
いくつかの実施形態では、ヒト対象を含めた対象をロシグリタゾンで処置することにより、対象の骨格筋におけるＵＣＰ１のｍＲＮＡの産生が増大する。いくつかの実施形態では、対象をロシグリタゾンで処置することにより、骨格筋における褐色脂肪細胞の発生または分化を誘発する、骨格筋中の既存の褐色脂肪細胞のＵＣＰ１遺伝子発現を増大させる、あるいはその両方を引き起こすことができる。例えば、いくつかの実施形態では、代謝疾患に罹患している対象に骨格筋における褐色脂肪細胞の発生または分化を誘発することができる。褐色脂肪細胞は、ミトコンドリア呼吸および細胞呼吸ならびに脂肪酸酸化速度の高いグルコースのたまり場となり、エネルギーを熱として放散する（脱共役酸化的リン酸化）ことができる。対象の代謝率を増大させ、体重減少を引き起こすことができる。このほか、褐色脂肪細胞の発生または分化を誘発すると、インスリン感受性、血中グルコース恒常性および心血管疾患危険因子の改善を得ることができる。褐色脂肪細胞はさらに、インスリン感受性の増大に寄与し、血中グルコース恒常性または心血管系の健康を改善する因子を分泌し得る。
【００４１】
本開示はほかにも、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはその両方でＢＡＴ前駆細胞から褐色脂肪細胞への分化を促進し、および／またはＵＣＰ１遺伝子の発現を誘導する薬剤（例えば、化合物、タンパク質、生物学的製剤など）の特定を可能にするアッセイを提供する。このような薬剤は化合物、タンパク質、生物学的製剤などをスクリーニングすることによって特定することができる。例えば、いくつかの実施形態では、単離したＣＤ３４＋細胞を用いて、ＵＣＰ１遺伝子の発現および／またはＣＤ３４＋細胞から褐色脂肪細胞への分化を誘導する能力に関して薬剤をスクリーニングすることができる。この方法で特定された薬物は、例えば肥満、２型糖尿病、インスリン抵抗性、脂質異常症などの代謝疾患の治療を含めた様々な研究、診断および治療を目的に使用することができる。いくつかの実施形態では、本開示によるアッセイによって特定された薬剤を、その物理化学的特性および／または薬物動態特性を向上させるために最適化する。
【００４２】
本開示で提供される方法に従って、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのＢＡＴ前駆細胞でのＵＣＰ１、ＦＡＢＰ４（ａＰ２）、ＰＰＡＲγ２、ｍｔＴＦＡ、ＰＧＣ−１αおよび／またはＣＯＸ−ＩＶの発現を増大させることができる。いくつかの実施形態では、脂肪生成培地への曝露を用いて、ＢＡＴ前駆細胞のＵＣＰ１、ＦＡＢＰ４（ａＰ２）、ＰＰＡＲγ２、ｍｔＴＦＡ、ＰＧＣ−１αおよび／またはＣＯＸ−ＩＶの発現増大を刺激することができる。このほか、ＰＰＡＲγ活性化因子、モジュレーターもしくは阻害剤（例えば、ロシグリタゾン）、ＰＰＡＲα活性化因子もしくはモジュレーター（例えば、クロフィブラート、ＧＷ９５７８）、ＰＰＡＲδ活性化因子もしくはモジュレーター（例えば、ＧＷ５０１５１６もしくはＧＷ０７４２）、ＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲδの二重活性化因子もしくはモジュレーター、ｐａｎ−ＰＰＡＲ（α、δ、γ）活性化因子もしくはモジュレーター（例えば、ＧＷ４１４８）、ＰＤＥ１阻害剤（例えば、ビンポセチンもしくはＩＢＭＸ）、ＰＤＥ３阻害剤（例えば、シグアゾダンもしくはＩＢＭＸ）、ＰＤＥ４阻害剤（例えば、ロリプラムもしくはＩＢＭＸ）、ＰＤＥ７阻害剤（例えば、ＢＭＳ５８６３５３、ＢＲＬ５０４８１もしくはＩＢＭＸ）、プロスタグランジンＪ２、９アルファ，１１ベータ−プロスタグランジンＦ２、９ベータ，１１アルファ−プロスタグランジンＦ２、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＡＤＣＹＡＰ１もしくはＰＡＣＡＰ）遺伝子（ＰＡＣＡＰプロペプチド、ＰＡＣＡＰ関連ペプチド、ＰＡＣＡＰ−３８もしくはＰＡＣＡＰ−２７）に由来するペプチド、ＮＲＩＰ１（ＲＩＰ１４０）阻害剤、ＰＴＥＮ阻害剤（例えば、ビスペルオキソ（ビピリジン）オキソバナジン酸カリウムもしくはビスペルオキソ（５−ヒドロキシピリジン−２−カルボキシル）オキソバナジン酸二カリウム）、α１−アドレナリン完全もしくは部分的アゴニスト（例えば、フェニレフリンもしくはシラゾリン）、α２−アドレナリンアンタゴニスト（例えば、ヨヒンビン）、ＲＸＲα活性化因子もしくはモジュレーター（例えば、ＬＧＤ１０６９（Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ）もしくは９−ｃｉｓレチノイン酸）、ＰＧＣ−１α活性化因子、ＰＧＣ−１β阻害剤もしくは活性化因子、アディポネクチンもしくはアディポネクチン受容体ＡｄｉｐｏＲ１および／またはＡｄｉｐｏＲ２の活性化因子、ＮＯＳ阻害剤もしくは活性化因子（例えば、１４００Ｗ、２−エチル−２−チオプソイド尿素、ＮＧ−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ）もしくはアデノシン）、Ｒｈｏキナーゼ−ＲＯＣＫ阻害剤（例えば、ファスジル、ＨＡ１０７７）、ＢＤＮＦ、モノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）Ａ阻害剤および／もしくはＭＡＯ  Ｂ阻害剤（例えば、イソカルボキサジド、モクロベミド、セレギリン）、ＳＲＣの活性化因子、ＥＧＦＲの阻害剤（例えば、ＲＧ−１４６２０、エルロチニブもしくはＺＤ１８３９−ゲフィニチブもしくはＡｒｇｏｓタンパク質）、ＦＡＡＨの阻害剤（例えば、ＵＲＢ５９７）、ＭＡＰＫ１（例えば、ＰＤ９８０５９）もしくは２（例えば、ＰＤ９８０５９）もしくは４もしくは５もしくは７もしくは８（例えば、ＰＤ９８０５９）の阻害剤��ＣＤＫ９の阻害剤（例えば、ｌ，５，６，７−テトラヒドロ−２−（４−ピリジニル）−４Ｈ−ピロロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−オン塩酸塩）、ＴＧＲ５アゴニスト（例えば、オレアノール酸）、ＡＭＰＫ活性化因子（例えば、ＡＩＣＡＲ）、ＢＭＰ−７、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）、アデニル酸シクラーゼ活性化因子（例えば、フォルスコリン）、フォルモテロール，サルブタモール、ブプロピオン、ＲＥＶ−５９０１、２４（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、プロスタグランジンＪ２、１５ｄ−プロスタグランジンＪ２、９アルファ，１１ベータ−プロスタグランジンＦ２、９ベータ，１１アルファ−プロスタグランジンＦ２、ミード酸（２０：３  ｎ−９）、ドコサヘキサエン酸（２２：６  ｎ−３）、ドコサトリエン酸（２２：３  ｎ−３）、ドコサペンタエン酸、リゾホスファチジン酸、ボンクレキン酸、３−ブロモ−７−ニトロインダゾール、プレグネノロン１６ａカルボニトリル、エピバチジン、ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、ＮＳ−３９８）またはその組合せなどの薬剤を用いて、ＢＡＴ前駆細胞のＵＣＰ１、ＦＡＢＰ４（ａＰ２）、ＰＰＡＲγ２、ｍｔＴＦＡ、ＰＧＣ−１αおよび／またはＣＯＸ−ＩＶの発現増大を刺激することができる。
実施例
【００４３】
以下の実施例を踏まえれば本教示の態様がさらに理解され得るが、これらは本教示の範囲を何ら限定するものではないことを理解するべきである。
【００４４】
実施例１：筋血管細胞の分別および分化
胎児骨格筋では、ＣＤ３４およびＣＤ１４６がそれぞれ内皮細胞および周皮細胞の表面に発現することが免疫組織化学法により明らかになったが、ＣＤ３４はほかにも、筋原線維間の間隙に散在する細胞によって発現された。ＣＤ１４６＋周皮細胞がＣＤ３４＋内皮細胞を取り囲んでいることがわかっている。これと同様なＣＤ３４＋細胞とＣＤ１４６＋細胞の分布が成人骨格筋で観察された。
【００４５】
マルチカラー蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いて、７つの独立した胎児筋肉（妊娠第１６週〜第２４週）の血管細胞を分別した。最初に造血（ＣＤ４５＋）細胞をゲートアウトし、筋形成前駆細胞（ＣＤ５６＋）も同様にゲートアウトした。次いで、内皮細胞（ＣＤ３４＋／ＣＤ１４６−）および周皮細胞（ＣＤ３４−／ＣＤ１４６＋）を分別した。次いで、ＣＤ３４＋／ＣＤ１４６−／ＣＤ４５−／ＣＤ５６−をＣＤ３４＋細胞と命名し、ＣＤ３４−／ＣＤ１４６＋／ＣＤ４５−／ＣＤ５６−をＣＤ１４６＋細胞と命名した。図１ＡにＣＤ３４＋／ＣＤ１４６−細胞およびＣＤ３４−／ＣＤ１４６＋細胞の精製を示す。解離させた細胞をＰＥ−抗ＣＤ３４、ＦＩＴＣ−抗ＣＤ１４６、ＰＥ−Ｃｙ７−抗ＣＤ５６およびＡＰＣ−Ｃｙ７−抗ＣＤ４５の抗体で染色し、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａセルソーターにかけた。ＣＤ４５＋細胞およびＣＤ５６＋（左パネル）を除外した後、ＣＤ３４＋またはＣＤ１４６＋ゲート内の細胞を単離した。ＣＤ３４＋の総細胞数は開始時の筋細胞集団の８＋１％であった。
【００４６】
ＣＤ３４＋／ＣＤ１４６−／ＣＤ４５−／ＣＤ５６−（ＣＤ３４）、ＣＤ３４−／ＣＤ１４６＋／ＣＤ４５−／ＣＤ５６−（ＣＤ１４６）および分別されなかった全細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を図１Ｂに示す。アクチンｍＲＮＡを対照として測定した。ＣＤ３４＋細胞には検出可能なＣＤ４５＋造血細胞もＣＤ５６＋筋原細胞も混入していないことが示された。
【００４７】
分別した細胞をＥＧＭ２培地で４〜６日間、「材料および方法」に記載する脂肪生成培地で８〜１２日間増殖させた。この２つの条件はＷＡＴ初代培養で白色脂肪細胞分化を維持するものである。図２に初代培養（ＰＣ）のＣＤ３４＋細胞（２Ａ）およびＣＤ１４６＋細胞（２Ｂ、２Ｃ）ならびに継代３代目（Ｐ３）まで培養して拡大したＣＤ３４＋細胞（２Ｄ）を示す。実質的には、分別した胎児筋ＣＤ３４＋細胞がすべて脂肪細胞様の多房性細胞に分化した（２Ａ、２Ｄ）。細胞培養中、多房構造が白色脂肪細胞と褐色脂肪細胞に共通して見られたということは注目すべき点である。これ対して、胎児筋ＣＤ１４６＋細胞は上記条件下ではきわめて緩徐に増殖した。この細胞は細胞コンフルエンスに達することはなく、大型で外に広がった形状を呈し、辺縁が不規則であるという特徴をもつ周皮細胞様の外観を示していた（２Ｂおよび２Ｃ）。低頻度で多房性細胞が検出された（２Ｃ）。上記条件下で３代目（４週間）まで培養して拡大したＣＤ３４＋細胞の形態は、初代培養で観察されたものとほぼ同じであったが、成熟脂肪細胞の大きさはこれより小さかった（２Ｄ）。
【００４８】
ある実施形態では、ＣＤ３４＋／ＣＤ１４６−集団中にＣＤ４５＋細胞および／またはＣＤ５６＋細胞を残し得る、すなわち、最初にＣＤ４５＋細胞およびＣＤ５６＋細胞の少なくとも一方をゲートアウトせずにＣＤ３４＋／ＣＤ１４６−細胞を分別する。ＣＤ４５＋集団およびＣＤ５６＋集団は比較的小さい（例えば、各集団が筋肉由来の間質血管細胞全体の５％未満、４％未満、３％未満、２％未満または１％未満）ことが観察されている。したがって、ＣＤ４５＋集団およびＣＤ５６＋集団の少なくとも一方をゲートアウトすることを必要とせずに比較的純粋な褐色脂肪細胞前駆細胞集団を単離することができる。さらに、ＣＤ４５＋細胞は造血前駆細胞であり、脂肪生成培地中で増殖または分化することはほとんどない。ＣＤ５６＋細胞は筋肉前駆細胞であり、脂肪生成培地中で増殖または分化することはほとんどない。したがって、ＣＤ４５＋細胞および／またはＣＤ５６＋細胞の存在がＣＤ３４＋細胞の増殖および／または分化に影響を及ぼすことはほとんどない。
【００４９】
実施例２：培養ＣＤ３４＋細胞のＵＣＰ１発現
胎児筋ＣＤ３４＋細胞に著明な脂肪細胞様の分化がみられたことにより、特徴付けをさらに進めることにした。特筆すべきことに、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、この細胞にはＵＣＰ１のｍＲＮＡが高レベルで存在することが明らかになった。初代培養（ＰＣ）のＣＤ３４＋細胞または継代３代目（Ｐ３）まで拡大したＣＤ３４＋細胞におけるＵＣＰ１  ｍＲＮＡ（白のグラフ棒）およびレプチンｍＲＮＡ（灰色のグラフ棒）発現の定量的ＲＴ−ＰＣＲによる測定結果を２Ｅに示す。シクロフィリンＡに正規化したＵＣＰ１のｍＲＮＡレベルの平均値は１７９７±５１０任意単位であり（すなわち、対応するシクロフィリンＡの値を用いて正規化した任意値の±ｓ．ｅ．ｍ．；ｎ＝４〜７）、この値はアッセイにおけるｃＤＮＡ２５ｎｇのサイクル閾値（Ｃｔ）２２に対応するものであった。
【００５０】
比較のため、培養して分化したマウス褐色脂肪細胞のシクロフィリンＡに正規化したＵＣＰ１のｍＲＮＡレベルの平均値は７７１５±２６４９（ｎ＝１０）任意単位であった。したがって、ヒトＣＤ３４＋細胞におけるＵＣＰ１のｍＲＮＡレベルは培養したマウス褐色脂肪細胞のほぼ４分の１という結果になった。妊娠中絶後の時間の経過によりＲＮＡ分解の危険性が高くなるため、ヒト胎児ＢＡＴを定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析の陽性対照として用いることはしなかった。アンプリコンをクローン化して配列決定し、ヒトＵＣＰ１と１００％一致することがわかった。継代３代目まで拡大した胎児筋ＣＤ３４＋細胞では、初代培養細胞で検出されたＵＣＰ１  ｍＲＮＡの発現の４３％になる高い発現が依然として観察された。初代培養の非分化の胎児筋ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ１４６＋細胞ともにＵＣＰ１  ｍＲＮＡの発現は検出されなかった。レプチンｍＲＮＡのレベルは、初代培養細胞および拡大した細胞でそれぞれ９．９±５．５および７１±５２任意単位であった（２Ｅ）。
【００５１】
実施例３：ＣＤ３４＋細胞のさらなる表現型解析
培養して拡大した胎児筋ＣＤ３４＋細胞の遺伝子発現パターンをさらに特徴付けるため、遺伝子チップ解析を実施した。検出Ｐ値（ｐ＜０．０１）が有意な数種類の代表的な遺伝子ｍＲＮＡの発現レベルを表１に示し、ヒト筋肉生検のものと比較した。次に挙げるタンパク質ｍＲＮＡを選択した：参照遺伝子としてのＵＣＰ１、熱産生およびミトコンドリア新生の制御に関与するミトコンドリア転写因子Ａ（ｍｔＴＦＡ）、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（ＰＰＡＲγ）およびＰＰＡＲγ  コアクチベーター−１α（ＰＧＣ−１α）、ミトコンドリア呼吸鎖の酵素コハク酸デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）およびシトクロームオキシダーゼＩＶ（ＣＯＸ−ＩＶ）、脂肪酸分解経路の酵素カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩＢ（ＣＰＴ１Ｂ）、アシル補酵素Ａデヒドロゲナーゼ長鎖（ＡＣＡＤ）およびＣ−４〜Ｃ−１２直鎖（ＡＣＡＤＭ）ならびに骨格筋マーカーミオゲニン、筋原性因子５（Ｍｙｆ５）および筋原性分化１（ＭｙｏＤ１）。ＢＡＴで高発現し、ＵＣＰ１活性の抑制因子として作用し得るＣｉｄｅａ［１６］をＢＡＴマーカーとして選択した。上に挙げた遺伝子のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号を補足データに示す。
【００５２】
【表１】
2015502742.tif 000002
【００５３】
表１のデータはＩｌｌｕｍｉｎａシグナルの平均値として表されている。検出Ｐ値は＜０．０１である。次に挙げる略語を用いた：ｎ．ｓ．、有意性なし；ｍｔＴＦＡ、ミトコンドリア転写因子Ａ；ＰＰＡＲγ、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体−γ；ＰＧＣ−１α、ＰＰＡＲγコアクチベーター−１α；ＣＯＸ−ＩＶ、シトクロームオキシダーゼＩＶ；ＳＤＨ、コハク酸デヒドロゲナーゼ；ＣＰＴｌＢ、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩＢ；ＡＣＡＤ、アシル補酵素Ａデヒドロゲナーゼ長鎖；ＡＣＡＤＭ、Ｃ−４〜Ｃ−１２直鎖；Ｍｙｆ５、筋原性因子５；ＭｙｏＤ１、筋原性分化１。
【００５４】
胎児筋肉の拡大ＣＤ３４＋細胞にはＵＣＰ１の有意な発現がみられたが、成人筋肉生検（ｐ＝０．１２）にはみられなかった。胎児筋肉由来の拡大ＣＤ３４＋細胞における選択された遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルは、ＰＧＣ−１αおよびＣＰＴ１ＢのｍＲＮＡ（細胞での発現は約５分の１であった）ならびにＰＰＡＲγおよびＡＣＡＤのｍＲＮＡ（筋肉生検での発現はそれぞれ４０分の１および７分の１であった）を除いて、成人筋肉生検と同程度であった。筋肉マーカーのミオゲニン、Ｍｙｆ５およびＭｙｏＤ１のｍＲＮＡは筋肉で有意に発現されたが、細胞では有意に発現されなかったのに対して、ＢＡＴマーカーのＣｉｄｅａのｍＲＮＡは細胞で発現されたが、筋肉では発現しなかった。遺伝子チップ解析では、β３−アドレナリン受容体ｍＲＮＡを検出することができなかった。しかし、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって初代培養の胎児筋ＣＤ３４＋細胞にβ３−アドレナリン受容体ｍＲＮＡが検出された（シクロフィリンＡを参照として任意値０．０８４±０．０４４；ｎ＝４）のは注目すべきことである。遺伝子チップのデータを異なる技術で確認するため、ほかにも定量的ＲＴ−ＰＣＲによるｍｔＴＦＡ、ＰＧＣ−１αおよびＣＯＸ−ＩＶの測定を実施した。結果は、シクロフィリンＡを参照として用いて、初代培養の胎児筋ＣＤ３４＋細胞がｍｔＴＦＡ、ＰＧＣ−１αおよびＣＯＸ−ＩＶのｍＲＮＡを高レベルで発現する［それぞれ３０６±１１７、３８５±２９４および２３，４００±１０，３００任意単位（ｎ＝３〜４）となった］ことが示され、裏付けになるものであった。
【００５５】
ＵＣＰ１タンパク質は、ヒトＵＣＰ１と交差反応する抗マウス抗体（同一性８０％）を用いたウエスタンブロット法によって評価したところ、初代培養の胎児筋ＣＤ３４＋細胞に胎児ＢＡＴと同じく多量に存在していた。組織または全細胞の抽出物中のＵＣＰ１タンパク質およびグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）タンパク質について代表的なウエスタンブロットを図２のＦに示す。１９週齢胎児の肩甲骨間ＢＡＴ（レーン１）、初代培養のＣＤ３４＋細胞（レーン２）およびヒト成人の骨格筋（レーン３）を示す。各レーンにはタンパク質２５μｇを負荷した。
【００５６】
実施例４：酸化的リン酸化の脱共役
筋肉由来細胞において考えられるＵＣＰ１の機能に関する洞察を得るため、単離し培養したヒト胎児筋ＣＤ３４＋細胞とヒト成人白色脂肪細胞のミトコンドリア呼吸を比較した。基礎呼吸を、アンチマイシンＡの影響を受ける酸素消費と定義した。脱共役呼吸（プロトン漏出）を、ＡＴＰ合成酵素遮断剤オリゴマイシンの影響を受けない基礎呼吸の百分率と定義した。
【００５７】
単離した胎児筋ＣＤ３４＋細胞および初代培養で増殖させ新たにトリプシン処理したヒト成人白色脂肪細胞におけるミトコンドリア呼吸の脱共役を図３のＡに示す。結果は平均±ｓ．ｅ．ｍ；＊ｐ＜０．０５．ｎ＝３である。総呼吸量に対する脱共役の割合は、ヒト胎児筋ＣＤ３４＋細胞および成人白色脂肪細胞でそれぞれ４７±１２％および１９±２％であった。
【００５８】
図１６には、ＣＤ３１−細胞が褐色脂肪細胞に分化すると、分化前の同細胞よりも脱共役呼吸が増加し、呼吸能が増大することが示されている。
【００５９】
実施例５：培養ＣＤ３４＋細胞におけるＵＣＰ１発現の調節
胎児筋ＣＤ３４＋細胞のＵＣＰ１  ｍＲＮＡ発現を薬物処置により調節することができた。初代培養した細胞、拡大した細胞ともに、細胞透過性ｃＡＭＰ誘導体によりＵＣＰ１  ｍＲＮＡの発現が強く刺激された（７〜８倍）。初代培養（ＰＣ）のＣＤ３４＋細胞または継代３代目（Ｐ３）まで拡大したＣＤ３４＋細胞のＵＣＰ１  ｍＲＮＡ発現に対するｃＡＭＰ誘導体の８−ブロモ−ｃＡＭＰ（０．２５ｍＭ）または（４−クロロフェニルチオ）−ｃＡＭＰ（０．２５ｍＭ）（ｃＡＭＰ）の効果を図３のＢに示す。細胞はすべて、ＥＧＭ２培地で４〜６日間増殖させた後、「材料および方法」に記載する脂肪生成培地に８〜１２日間置いたものである。結果は対応するシクロフィリンＡの値に正規化した任意値の平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。これらは、それぞれの未処置（対照）の値を１００％として％で表したものである（＊ｐ＜０．０５、ｎ＝３〜６）。
【００６０】
ＰＰＡＲγアゴニストのロシグリタゾンは初代培養細胞には全く効果を示さなかったが、拡大した細胞のＵＣＰ１  ｍＲＮＡ発現を強く刺激した（８倍）。ロシグリタゾン（Ｒｏｓｉ）１μＭのＣＤ３４＋細胞ＰＣまたはＰ３のＵＣＰ１  ｍＲＮＡ発現に対する効果を図３のＣに示す。結果は図３のＢと同様に表してある（＊＊ｐ＜０．０１、ｎ＝４〜７）。
【００６１】
実施例６：ヒト褐色脂肪細胞前駆細胞の筋肉特異性および生涯にわたる存続
ヒト胎児筋肉からＵＣＰ１発現細胞が誘導されたことから、褐色脂肪細胞前駆細胞がこの組織および胎児期に限定されるのかという疑問が浮上した。この問題に取り組むため、ＦＡＣＳによりヒト胎児の膵臓、肺および肝臓から精製したＣＤ３４＋細胞を胎児筋ＣＤ３４＋細胞と同じ脂肪生成条件下で培養した。分別した細胞は増殖が遅く、そのごく一部だけが多房性になった。膵臓および肺の細胞ではＵＣＰ１のｍＲＮＡが発現されなかったが、肝臓の細胞ではわずかに発現が測定され、その発現量は胎児筋ＣＤ３４＋細胞に検出された発現量の２％であった（不掲載）。
【００６２】
成人４例（５０〜７８歳）のヒト骨格筋試料から分別し、脂肪生成条件下、初代培養（ＰＣ）で増殖させたＣＤ３４＋細胞も多房性細胞に分化した。この細胞は他のタイプの細胞と混在し、一部のものは小さい脂肪滴を含んでいた（図４のＡ）。ＵＣＰ１  ｍＲＮＡのレベル（３７０±１３２任意単位）は初代培養の胎児筋ＣＤ３４＋細胞に検出されたレベルの２１％であった。これに対して、レプチン発現（７５±６９任意単位）は胎児細胞の７．６倍であった。図４のＢにＵＣＰ１  ｍＲＮＡ（白のグラフ棒）およびレプチンｍＲＮＡ（灰色のグラフ棒）発現の定量的ＲＴ−ＰＣＲの測定結果を示す。細胞はすべてＥＧＭ２培地で４〜６日間増殖させた後、「材料および方法」に記載する脂肪生成培地に８〜１２日間置いたものである。結果は対応するシクロフィリンＡの値に正規化した任意値の平均±ｓ．ｅ．ｍ．である（ｎ＝４〜５）。このほか、成人４例（４５〜５５歳）のヒトＷＡＴ試料から分別したＣＤ３４＋細胞を脂肪生成条件下、初代培養（ＰＣ）で増殖させた。この細胞は一部が多房性になったが（図４Ｃ）、ＵＣＰ１  ｍＲＮＡは発現しなかった。
【００６３】
実施例７：ｉｎ  ｖｉｖｏでのヒト筋肉におけるＵＣＰ１  ｍＲＮＡ発現の検出およびロシグリタゾンの効果
ヒト成人骨格筋の褐色脂肪細胞前駆細胞はｉｎ  ｖｉｖｏで分化し、ＵＣＰ１発現細胞を生じ得る。高感度のＲＴ−ＰＣＲ技術を用いてヒト成人骨格筋におけるＵＣＰ１  ｍＲＮＡの存在を追跡し、実際、脂肪の少ない対象１０例の腹直筋に低レベルのＵＣＰ１  ｍＲＮＡが検出された（ＵＣＰ１／シクロフィリンＡ比：２４±９）。ＰＣＲ増幅フラグメントの配列を決定したところ、ヒトＵＣＰ１と１００％一致することがわかった。ヒト成人筋肉のＵＣＰ１  ｍＲＮＡのレベルは、培養した胎児筋ＣＤ３４＋細胞の７５分の１であった。
【００６４】
ＰＰＡＲγアゴニストのロシグリタゾンは培養した筋肉ＣＤ３４＋細胞のＵＣＰ１  ｍＲＮＡ発現を継強力に誘導したため、この化合物のヒトに対するｉｎ  ｖｉｖｏでの効果を検討した。メタボリック症候群の管理にロシグリタゾン治療を受けている２型糖尿病の肥満患者７例から採取した外側広筋の生検を用いた。８週間のロシグリタゾン（１日当たり２×４ｍｇ）による治療を受ける前および後に生検を採取した。ロシグリタゾン治療により患者のインスリン抵抗性および糖尿病に有意な改善が得られた。この試験では、ロシグリタゾンによりインスリン感受性の改善がみられるとともに、筋肉のＵＣＰ１の発現レベルが約１．６倍上昇した。図５にＵＣＰ１  ｍＲＮＡ発現の定量的ＲＴ−ＰＣＲによる測定結果を示す。結果は対応するシクロフィリンＡ値を用いて正規化した任意値の平均±ｓ．ｅ．ｍ．である（ｎ＝７、対照に対して＊ｐ＜０．０５）。用いたＲＴ−ＰＣＲの条件が異なるため、この図の任意値を図２〜４の任意値と直接比較することはできない。
【００６５】
図５には１つの患者群（ｎ＝７）から採取した骨格筋生検のＵＣＰ１  ｍＲＮＡのレベルが示されており、この図では「対照」は治療前のレベルに対応し、「Ｒｏｓｉ」はロシグリタゾンによる治療（８週間）後のレベルに対応している。縦断的研究であることから、ロシグリタゾンの各個人のＵＣＰ１レベルに対する効果（「対照」−前および「Ｒｏｓｉ」−後の条件での個々の値の比較）を判定した。ｃＤＮＡ  ２５ｎｇ（ＲＮＡの逆転写により生成）で開始し、リアルタイムＰＣＲ時の検出閾値（Ｃｔ）はＵＣＰ１が約２２、シクロフィリンが約１８であった。ロシグリタゾンの効果（治療前のＵＣＰ１レベルに対する治療後のＵＣＰ１レベル）は以下の通りであった：
患者１：５０％上昇（〜１５０％、対照＝４３７、Ｒｏｓｉ＝６５２任意単位）
患者２：変化無し（〜１００％、対照＝４４４、Ｒｏｓｉ＝４５３任意単位）
患者３：８０％上昇（〜１８０％、対照＝３７８、Ｒｏｓｉ＝６７７任意単位）
患者４：１８０％上昇（〜２８０％、対照＝２６０、Ｒｏｓｉ＝７３０任意単位）
患者５：８％上昇（〜１０８％、対照＝５５３、Ｒｏｓｉ＝６００任意単位）
患者６：３１０％上昇（〜４１０％、対照＝１３５、Ｒｏｓｉ＝５５６任意単位）
患者７：１０％上昇（〜１１０％、対照＝１２８、Ｒｏｓｉ＝１４２任意単位）。
【００６６】
患者７例のうち４例に１．５倍〜４．１倍にわたるロシグリタゾンの強い効果が観察された。この結果は、ロシグリタゾンが患者の骨格筋において褐色脂肪細胞の出現を誘導し、および／または既存の褐色脂肪細胞のＵＣＰ１遺伝子発現を増大させたことを示唆するものである。ＰＰＡＲγアゴニストのこの効果は、この薬剤のインスリン増感剤としての治療効果に重要な役割を果たすと考えられる。
【００６７】
実施例８：ヒトＵＣＰ１プロモーター／エンハンサー領域の潜在的モジュレーターのスクリーニング
同定し単離したＣＤ３４＋細胞は、ＣＤ３４＋細胞から褐色脂肪細胞への分化を誘導する、あるいはＵＣＰ１の発現を調節する薬剤（化合物、タンパク質、生物学的製剤など）を特定するツールとして用いることができる。例えば、ＲＴ−ＰＣＲに基づく方法を用いて、特定の薬剤の影響を受け得るＵＣＰ１  ｍＲＮＡのレベルを測定することができる。あるいは、タグを付けたＵＣＰ１タンパク質をマーカーとして使用し、免疫組織化学（例えば、蛍光）を用いてＵＣＰ１タンパク質レベルの変化を検出し、ＵＣＰ１発現を調節する薬剤をスクリーニングすることができる。
【００６８】
この目的には、例を挙げれば、ヒトＵＣＰ１遺伝子の転写開始部位のＤＮＡ上流（５’）の大きい領域（６ｋｂ）（プロモーター／エンハンサー領域を含む）がレポーター／ＭＡＲ  ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）またはルシフェラーゼ中にクローン化されている。この構築物を用いてＣＤ３４＋細胞に遺伝子導入し、その細胞をマルチウェルプレートで増殖させ、遺伝子発現の誘導（したがって、ＵＣＰ１発現の増大）を反映する細胞の蛍光（ＧＦＰ）または発光（ルシフェラーゼ）を増大させる薬剤がスクリーニングされている。以上のことを実施すれば、ＵＣＰ１遺伝子の転写の増強、ＵＣＰ１転写産物の翻訳の増強および／またはＵＣＰ１転写産物もしくはタンパク質の安定化によりＣＤ３４＋細胞から褐色脂肪細胞への分化および／またはＵＣＰ１の発現を増大させる薬剤を特定することが可能である。
【００６９】
例えば、ロシグリタゾンのようなＰＰＡＲγモジュレーターまたは活性化因子を用いて、ＣＤ３４＋前駆細胞から褐色脂肪細胞への分化を促進することができる（図３のＣおよび図５）。別の例には、８−ブロモ−ｃＡＭＰおよび／または（４−クロロフェニルチオ）−ｃＡＭＰのようなｃＡＭＰ誘導体（図３のＢ）、タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）活性化因子あるいはホスホジエステラーゼ阻害剤の使用がある。また別の例には、トリヨードチロニン（Ｔ３）、その他の甲状腺ホルモン、甲状腺ホルモン受容体ＴＲａおよび／またはＴＲβのアゴニストまたはモジュレーターの使用がある。また別の例として、イソプロテレノール（ｐａｎ−アゴニスト）または特定のβ１−、β２−、β３−アゴニストもしくはモジュレーターのようなβ−アドレナリンアゴニストを単独で、あるいはロシグリタゾンのようなＰＰＡＲγモジュレーターまたは活性化因子と組み合わせて使用することが挙げられる。また別の例には、遺伝子チップ解析によって明らかになった候補受容体のモジュレーターまたはこのような受容体の下流のシグナル伝達経路にある標的遺伝子のモジュレーターの使用がある。
【００７０】
実施例９：遺伝子チップ解析
遺伝子チップ解析を実施して、ＣＤ３４＋前駆細胞から褐色脂肪細胞への分化および／またはＵＣＰ１発現の誘導に何らかの役割を果たす分子経路を特定した。ヒト骨格筋生検からＣＤ３４＋細胞を単離し、次の２種類の試験に用いた：（１）ｃＡＭＰ試験：「材料および方法」に記載する通りに（対照）、またこれに溶媒（対照１試料）またはｃＡＭＰ（ｃＡＭＰ試料）を加えてＣＤ３４＋細胞を分化させた；ならびに（２）ロシグリタゾン試験：脂肪生成培地にロシグリタゾンを含めないこと以外は「材料および方法」に記載する通りにＣＤ３４＋細胞を分化させた（対照２試料）。この試験では２番目試料（ロシグリタゾン試料）にのみロシグリタゾンを加えた。上で述べたように、ここに挙げた化合物はＣＤ３４＋細胞から褐色脂肪細胞への分化およびＵＣＰ１の発現を促進することが示されている（図３のＢおよびＣを参照されたい）。
【００７１】
上記試料から全ＲＮＡを精製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｈｕｍａｎ  ＷＧ−６  ＢｅａｄＣｈｉｐ（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）により転写プロファイルを評価した。結果をＩｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ７．０（試用版）により解析した。その結果を用いて、ＣＤ３４＋細胞から褐色脂肪細胞への分化に関与している分子経路を、さらに重要なものとして、褐色脂肪細胞の出現およびＵＣＰ１の発現を促進する薬剤の開発に使用し得る標的分子を決定した。
【００７２】
この研究によって、次に挙げる作用／薬剤が褐色脂肪細胞の発達を促進する可能性があることが示された：ＰＰＡＲγ活性化因子、モジュレーターもしくは阻害剤（例えば、ロシグリタゾン）、ＰＰＡＲα活性化因子もしくはモジュレーター（例えば、クロフィブラート、ＧＷ９５７８）、ＰＰＡＲδ活性化因子もしくはモジュレーター（例えば、ＧＷ５０１５１６もしくはＧＷ０７４２）、ＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲδの二重活性化因子もしくはモジュレーター、ｐａｎ−ＰＰＡＲ（α、δ、γ）活性化因子もしくはモジュレーター（例えば、ＧＷ４１４８）、ＰＤＥ１阻害剤（例えば、ビンポセチンもしくはＩＢＭＸ）、ＰＤＥ３阻害剤（例えば、シグアゾダンもしくはＩＢＭＸ）、ＰＤＥ４阻害剤（例えば、ロリプラムもしくはＩＢＭＸ）、ＰＤＥ７阻害剤（例えば、ＢＭＳ５８６３５３、ＢＲＬ５０４８１もしくはＩＢＭＸ）、プロスタグランジンＪ２、９アルファ，１１ベータ−プロスタグランジンＦ２、９ベータ，１１アルファ−プロスタグランジンＦ２、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＡＤＣＹＡＰ１もしくはＰＡＣＡＰ）遺伝子（ＰＡＣＡＰプロペプチド、ＰＡＣＡＰ関連ペプチド、ＰＡＣＡＰ−３８もしくはＰＡＣＡＰ−２７）に由来するペプチド、ＮＲＩＰ１（ＲＩＰ１４０）阻害剤、ＰＴＥＮ阻害剤（例えば、ビスペルオキソ（ビピリジン）オキソバナジン酸カリウムもしくはビスペルオキソ（５−ヒドロキシピリジン−２−カルボキシル）オキソバナジン酸二カリウム）、α１−アドレナリン完全もしくは部分的アゴニスト（例えば、フェニレフリンもしくはシラゾリン）、α２−アドレナリンアンタゴニスト（例えば、ヨヒンビン）、ＲＸＲα活性化因子もしくはモジュレーター（例えば、ＬＧＤ１０６９（Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ）もしくは９−ｃｉｓレチノイン酸）、ＰＧＣ−１α活性化因子、ＰＧＣ−１β阻害剤もしくは活性化因子、アディポネクチンもしくはアディポネクチン受容体ＡｄｉｐｏＲ１および／またはＡｄｉｐｏＲ２の活性化因子、ＮＯＳ阻害剤もしくは活性化因子（例えば、１４００Ｗ、２−エチル−２−チオプソイド尿素、ＮＧ−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ）もしくはアデノシン）、Ｒｈｏキナーゼ−ＲＯＣＫ阻害剤（例えば、ファスジル、ＨＡ１０７７）、ＢＤＮＦ、モノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）Ａ阻害剤および／もしくはＭＡＯ  Ｂ阻害剤（例えば、イソカルボキサジド、モクロベミド、セレギリン）、ＳＲＣの活性化因子、ＥＧＦＲの阻害剤（例えば、ＲＧ−１４６２０、エルロチニブもしくはＺＤ１８３９−ゲフィニチブもしくはＡｒｇｏｓタンパク質）、ＦＡＡＨの阻害剤（例えば、ＵＲＢ５９７）、ＭＡＰＫ１（例えば、ＰＤ９８０５９）もしくは２（例えば、ＰＤ９８０５９）もしくは４もしくは５もしくは７もしくは８（例えば、ＰＤ９８０５９）の阻害剤、ＣＤＫ９の阻害剤（例えば、ｌ，５，６，７−テトラヒドロ−２−（４−ピリジニル）−４Ｈ−ピロロ［３，２−ｃ］ピリジン−４−オン塩酸塩）、ＴＧＲ５アゴニスト（例えば、オレアノール酸）、ＡＭＰＫ活性化因子（例えば、ＡＩＣＡＲ）、ＢＭＰ−７、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）、アデニル酸シクラーゼ活性化因子（例えば、フォルスコ��ン）、フォルモテロール，サルブタモール、ブプロピオン、ＲＥＶ−５９０１、２４（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、プロスタグランジンＪ２、１５ｄ−プロスタグランジンＪ２、９アルファ，１１ベータ−プロスタグランジンＦ２、９ベータ，１１アルファ−プロスタグランジンＦ２、ミード酸（２０：３  ｎ−９）、ドコサヘキサエン酸（２２：６  ｎ−３）、ドコサトリエン酸（２２：３  ｎ−３）、ドコサペンタエン酸、リゾホスファチジン酸、ボンクレキン酸、３−ブロモ−７−ニトロインダゾール、プレグネノロン１６ａカルボニトリル、エピバチジン、ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、ＮＳ−３９８）または上記のもののいずれかの組合せ。
【００７３】
実施例１０：追加のマーカーとしてＣＤ３１を用いる筋血管細胞の分別
最も純粋な生理的褐色脂肪細胞前駆細胞を探索するためにＣＤ３４＋細胞をさらに精製する目的で、ヒト胎児骨格筋（妊娠第１８〜１９週）の２つの独立した試料から間質血管細胞を精製した。上記のＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ３４およびＣＤ１４６による分別後、抗ＣＤ３１抗体を用いて追加のＦＡＣＳ段階を実施した。成熟内皮細胞表面マーカーＣＤ３１が存在すること（ＣＤ３１＋）またはそのマーカーが存在しないこと（ＣＤ３１−）に基づいて細胞を分別した。ＣＤ３１−亜群の方がより純粋なヒト褐色脂肪細胞の前駆細胞であるとの仮説を立てた。ＣＤ３１−細胞の割合は骨格筋由来のＣＤ３４＋細胞集団の８０％であった。簡潔にするため、ＣＤ３４＋／ＣＤ４５−／ＣＤ５６−／ＣＤ１４６−／ＣＤ３１−を「ＣＤ３１−」細胞［ＥＭＣ３０９（ＣＤ３１−）およびＥＭＣ３１４（ＣＤ３１−）］と呼ぶ。ＣＤ３４＋／ＣＤ４５−／ＣＤ５６−／ＣＤ１４６−／ＣＤ３１＋を「ＣＤ３１＋」細胞［ＥＭＣ３０９（ＣＤ３１＋）およびＥＭＣ３１４（ＣＤ３１＋）］と呼ぶ。さらに、細胞表面抗原ＣＤ５６（ＣＤ５６＋）を発現する筋原性前駆細胞も分別し培養した。ＣＤ３４＋／ＣＤ４５−／ＣＤ５６＋（ＥＭＣ３１４由来）およびＣＤ４５−／ＣＤ５６＋（ＥＭＣ３０９由来）を「ＣＤ５６＋」細胞［ＥＭＣ３０９（ＣＤ５６＋）およびＥＭＣ３１４（ＣＤ５６＋）］と呼ぶ。
【００７４】
分別した細胞（ＣＤ３１−、ＣＤ３１＋およびＣＤ５６＋細胞集団）を上記の条件と同じ条件下で、すなわち増殖培地（ＥＧＭ２）で２〜４日間、脂肪生成分化培地で１０〜１６日間、増殖させた。拡大前にＥＧＭ２培地で培養した単離細胞の顕微鏡像を図６〜８に示す。
【００７５】
最初にロシグリタゾンの非存在下、脂肪生成分化培地で、ＣＤ３１−、ＣＤ３１＋およびＣＤ５６＋細胞集団が脂肪細胞に分化する能力を試験した。少なくとも一部の脂肪細胞前駆細胞の分化を誘導するには、ＰＰＡＲγアゴニスト（例えば、ロシグリタゾン）を含有しない最少分化培地（ＭＤＭ）と呼ぶ脂肪生成分化培地で十分であることがわかった。ＭＤＭの組成はＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２  ５０／５０  Ｍｉｘ（３．１５１ｇ／ｌ、１７．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、３．６５１ｇ／ｌ  Ｌ−グルタミン）（Ｃｅｌｌｇｒｏ  ＃１０−０９０−ＣＶ）、５μｇ／ｍｌ（０．８６μＭ）インスリン、１０μｇ／ｍｌトランスフェリン、０．２ｎＭ  ３，３’，５−トリヨード−Ｌ−チロニン、１００μＭ  ３−イソブチル−１−メチルキサンチン、１μＭデキサメタゾン、１％ペニシリン−ストレプトマイシンである。
【００７６】
最少分化培地に曝露すると、かなりの割合（約２０％）のＣＤ３１−細胞が脂肪細胞様の多房性細胞に分化し（ＥＭＣ３０９については図９Ｂ、ＥＭＣ３１４については図９Ｆ）、ＰＰＡＲγ活性化因子ロシグリタゾンまたはＢＭＰ７などの褐色脂肪細胞を促進する化合物を含有するＭＤＭに曝露すると、実質的にすべてのＣＤ３１−細胞が脂肪細胞様の多房性細胞に分化した［２６〜２８］（図９Ｃ−Ｄ、９Ｇ−Ｈ）。
【００７７】
このほか、ＰＰＡＲγアゴニスト（例えば、１μＭのロシグリタゾン）を分化開始（第０日）から添加するか、代わりに分化誘導の２日または３日前（第−３または第−２日〜第０日）に開始して２〜３日間のみ添加することにより、ＣＤ３１−細胞から褐色脂肪細胞への分化が強く促進されることがわかった。これと同じように、分化誘導前（第−３日または第−２日〜第０日）に骨形成タンパク質−７（６ｎＭのＢＭＰ７）を添加することにより、ＣＤ３１−細胞から褐色脂肪細胞への分化が強く促進された。
【００７８】
これに対して、ＣＤ３１＋細胞（図１０Ａ〜図１０Ｈ）およびＣＤ５６＋細胞（図１１Ａ〜図１１Ｈ）はＭＤＭでは良好に増殖せず、上記条件下でロシグリタゾンまたはＢＭＰ７を加えても加えなくても、脂肪細胞様の多房性細胞に分化することはなかった。
【００７９】
１２〜２０日間の試験全体を通して、全細胞集団（ＣＤ３１−、ＣＤ３１＋およびＣＤ５６＋）が増殖培地（ＥＧＭ２）で良好に増殖したが（ＣＤ３１−については図９Ａおよび９Ｅ、ＣＤ３１＋については図１０Ａおよび１０Ｅ、ＣＤ５６＋については図１１Ａおよび１１Ｅ）、ＣＤ３１−細胞だけはロシグリタゾンまたはＢＭＰ７を加えても加えなくても、ＭＤＭで脱離することなく増殖した。ＭＤＭで増殖させたときのＣＤ３１−細胞とＣＤ３１＋またはＣＤ５６＋細胞との間にみられる第１４日〜１６日目の細胞密度の差を、図９〜１１の顕微鏡像（図９Ｂ、９Ｆと図１０Ｂ、１０Ｆまたは図１１Ｂ、１１Ｆ；図９Ｃ、９Ｇと図１０Ｃ、１０Ｇまたは図１１Ｃ、１１Ｇ；図９Ｄ、９Ｈと図１０Ｄ、１０Ｈまたは図１１Ｄ、１１Ｈをそれぞれ比較されたい）および培養細胞で第１６日に測定したシクロフィリンｍＲＮＡの量（細胞数を反映する）（図１２のＡおよびＢ）に示す。
【００８０】
ある実施形態では、ＣＤ３１−／ＣＤ３４＋／ＣＤ１４６−集団中にＣＤ４５＋細胞および／またはＣＤ５６＋細胞を残し得る、すなわち、最初にＣＤ４５＋細胞およびＣＤ５６＋細胞の少なくとも一方をゲートアウトせずにＣＤ３１−／ＣＤ３４＋／ＣＤ１４６−細胞を分別する。上で述べたように、ＣＤ４５＋集団およびＣＤ５６＋集団は比較的小さいもの（例えば、各集団が筋肉由来の間質血管細胞全体の５％未満、４％未満、３％未満、２％未満または１％未満）であり得、脂肪生成培地ではほとんど増殖または分化しない。したがって、ＣＤ４５＋集団およびＣＤ５６＋集団の少なくとも一方をゲートアウトすることを必要とせずに比較的純粋な褐色脂肪細胞前駆細胞集団を単離することができる。さらに、ＣＤ４５＋細胞および／またはＣＤ５６＋細胞の存在がＣＤ３４＋細胞の増殖および／または分化に影響を及ぼすことはほとんどない。
【００８１】
実施例１１：培養したＣＤ３１−、ＣＤ３１＋およびＣＤ５６＋細胞におけるＵＣＰ１発現
定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、分化したＣＤ３１−細胞において高レベルのＵＣＰ１  ｍＲＮＡが存在することが明らかになった（シクロフィリンＡのｍＲＮＡにより正規化）。対照条件ＥＧＭ２と比較したところ、ＵＣＰ１発現のレベルがＭＤＭでは１０〜２１倍、ロシグリタゾンを加えると５０７〜５５３倍、ＢＭＰ７を加えると７８〜１２７倍上昇していた（図１３）。
【００８２】
分化した細胞（脂肪細胞）の割合およびＵＣＰ１の発現は、（ａ）第０日から１μＭロシグリタゾン（ＰＰＡＲγアゴニスト）をＭＤＭに加える（ＭＤＭ＋ｒｏｓｉ）（図１３）か、（ｂ）分化誘導の２日または３日前、すなわち、第−２日または第−３日〜第０日に６ｎＭ  ＢＭＰ７（骨形成タンパク質−７）のみを増殖培地（ＥＧＭ２）に加える（図１３）ことによって大きく増大した。
【００８３】
図１３は、ＣＤ３１−細胞をロシグリタゾンまたはＢＭＰ７に曝露することにより、細胞の分化およびＵＣＰ１の発現が大幅に増大することを示している。分化第１６日目のヒト胎児筋肉由来ＣＤ３１−細胞におけるＵＣＰ１  ｍＲＮＡの発現を測定した。
【００８４】
いずれの細胞も増殖培地（ＥＧＭ２）で３日間増殖させた後（第０日）、脂肪生成分化培地（最少分化培地、ＭＤＭ）に１６日間置いた。「ＥＧＭ２」細胞は最初からＥＧＭ２培地で維持した。第０日からロシグリタゾン（１μＭ）を加え、試験終了時までその培地で維持した。第０日の２日前にＢＭＰ７（６ｎＭ）を加え、第０日に除去した。ヒト筋肉由来褐色脂肪細胞前駆細胞（ＣＤ３１−）のＵＣＰ１  ｍＲＮＡ発現に対する分化培地（ＭＤＭとＥＧＭ２）、ロシグリタゾン（ＭＤＭ＋ｒｏｓｉとＭＤＭ）およびＢＰＭ７（ＭＤＭ＋ＢＭＰ７とＭＤＭ）の効果が変化倍数（ＥＧＭ２細胞と比較したもの）で示されている。
【００８５】
結果は対応するシクロフィリンＡの値を用いて正規化した任意値の平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。これらの結果は、それぞれの誘導しなかった場合（ＥＧＭ２）の値を１とし、それに対する変化倍数として表したものである（ｎ＝３）。
【００８６】
これに対して、ＣＤ３１＋細胞集団およびＣＤ５６＋細胞集団では、存在量が分化ＣＤ３１−細胞の少なくとも１，０００分の１（１０サイクル）であった少数の試料を除いて、いずれの試料にもＵＣＰ１のｍＲＮＡが検出されなかった。
【００８７】
実施例１２：ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲによるＵＣＰ１  ｍＲＮＡの定量化
褐色脂肪細胞マーカーＵＣＰ１（図１８Ａ）、脂肪細胞マーカーＦＡＢＰ４（図１８Ｂ）および内部対照として用いた「ハウスキーピング」遺伝子シクロフィリンＡに対応するｍＲＮＡ種を同時に定量化することによって、ＣＤ３１−細胞分化から褐色脂肪細胞への分化を検出する堅固な方法をここに記載する。
【００８８】
本発明のこの方法は、多数の試料を分析して、ＣＤ３１−細胞から褐色脂肪細胞への分化を増強する薬剤を特定することを可能にするものである。ＣＤ３１−細胞が褐色脂肪細胞に分化すると、シクロフィリンＡの所与のレベルに対してはるかに高レベルのＵＣＰ１およびＦＡＢＰ４のｍＲＮＡを発現する。シクロフィリンＡのｍＲＮＡレベルに正規化したＵＣＰ１およびＦＡＢＰ４のｍＲＮＡレベルは、試料中の細胞の総数に関係なくＣＤ３１−細胞から褐色脂肪細胞への分化のレベルの指標となる。
【００８９】
このようにして、多重ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲによるＵＣＰ１、ＦＡＢＰ４およびシクロフィリンＡのｍＲＮＡの定量化を用い、ＣＤ３１−細胞から褐色脂肪細胞への分化を定量化することができる。
【００９０】
実施例１３：蛍光免疫組織化学法（ＩＨＣ）によるＵＣＰ１タンパク質の定量化
蛍光免疫組織化学法（ＩＨＣ）によりＵＣＰ１タンパク質を定量化することによって、ＣＤ３１−細胞から褐色脂肪細胞への分化を検出する別の堅固な方法をここに記載する。
【００９１】
この方法を用いれば、自動化されたハイコンテンツイメージングを使用してＵＣＰ１染色を評価することができる。ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社のＩｎＣｅｌｌ  １０００  Ｈｉｇｈ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  Ｉｍａｇｅｒは自動顕微鏡とハイコンテンツ画像解析ソフトウェア（ＩｎＣｅｌｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  Ｔｏｏｌｂｏｘ）を組み合わせたものである。参照化合物ロシグリタゾンを用いて、ＣＤ３１−細胞の分化を促進し、ＵＣＰ１の発現を増大させた。ＵＣＰ１を認識する一次抗体Ａｂｃａｍ  ａｂ２３８４１および二次抗体Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ウサギ抗体を用いれば、細胞当たりの相対ＵＣＰ１レベルを定量化することができる。本発明者らはこの方法により、ロシグリタゾンがＵＣＰ１タンパク質のレベルを７倍に増大させる（核当たりのＵＣＰ１強度が、ロシグリタゾン有りでは１０５，５４２であるのに対して、ロシグリタゾン無しでは１４，８１５である）ことを明らかにした（図１７のＡとＢ）。このほか、非特異的抗体によるバックグラウンドシグナルがきわめて低く、細胞当たりの平均ＵＣＰ１シグナルの標準偏差がきわめて小さいことがわかり、この事実は、このアッセイがハイコンテンツスクリーニングに適していることを示すものである。
【００９２】
図１７については、脂肪生成培地（ＭＤＭ）にロシグリタゾンを加えずに（図１７のＡ）、あるいは第０日からロシグリタゾン（１μＭ）を加えて（図１７のＢ）、「方法」に記載する通りにＣＤ３１−細胞の培養および褐色脂肪細胞への分化を実施した。細胞を１５日間分化させた後、４％パラホルムアルデヒドＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）で固定し、ＵＣＰ１抗体（Ａｂｃａｍ  ａｂ２３８４１）とインキュベートした。Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ウサギ抗体を用いて相対ＵＣＰ１レベルを定量化した（緑色）。ＤＡＰＩで核を染色した（青色）。ＩｎＣｅｌｌ  １０００  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｈｉｇｈ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  Ｉｍａｇｅｒで収集した画像にＧＥ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  Ｔｏｏｌｂｏｘソフトウェアを用いて、ＵＣＰ１のシグナル強度を測定した。数値データを表形式でエクスポートし、このほか、アルゴリズムが原画像を処理する過程のスクリーンショットを収集した。
【００９３】
このようにして、蛍光ＩＨＣによるＵＣＰ１検出を市販のＵＣＰ１抗体とともに用い、ＵＣＰ１タンパク質およびＣＤ３１−細胞から褐色脂肪細胞への分化を定量化することができる。
【００９４】
「材料および方法」
特に明記されない限り、分析グレートまたは分子生物学グレードの有機および無機化学物質はいずれも、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＩ）およびＧｉｂｃｏ  ＢＲＬ社（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ）から購入したものである。ロシグリタゾンはＣａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（＃７１７４２）から、組換えヒトＢＭＰ７（ｒｈＢＭＰ７）はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社（１００μｇ／ｍｌ、６．３μＭ、＃３５４−ＢＰ−０１０）から購入したものである。
【００９５】
ヒト組織
施設内審査委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ）のプロトコルに従い、ピッツバーグ大学のマギー・ウィメンズ病院（Ｍａｇｅｅ  Ｗｏｍｅｎ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）およびオランダ、ロッテルダムのエラスムス医療センター（Ｅｒａｓｍｕｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）から自然発生、自由意志または治療による妊娠中絶後にヒト胎児組織を匿名で入手した。足長を測定することにより発育齢（妊娠第１６〜２４週または第１８〜１９週）を推定した。いずれの場合も、両親から胎児組織を使用するためのインフォームドコンセントを得た。Ｐｅｔｅｒ  Ｒｕｂｉｎ医師（ピッツバーグ大学形成外科）の厚意により、胃バイパス術の１年後に施行する形成術を受けた４５〜５５歳の患者に由来する廃棄されたヒト成人腹部皮下ＷＡＴの提供を受けた。細胞分別に使用した成人骨格筋組織は、５０〜７８歳の供給者から死亡後に入手したものである。第１群のＲＴ−ＰＣＲ分析に使用した成人骨格筋は、脂肪の少ない男女対象１０例を対象にした腹腔鏡下結紮、鼠径ヘルニアまたは子宮摘出の手術時に腹直筋から入手したものである。全対象が手術時に筋試料を提供することに同意し、プロトコルはディーキン大学の医療倫理審査委員会（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｔｈｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認を受けたものである。平均年齢は４５±３歳、平均体格指数は２２．２±０．８であった。第２群のＲＴ−ＰＣＲ分析に使用した成人骨格筋は、８週間のロシグリタゾン治療（１日当たり２×４ｍｇ）の前および後に、２型糖尿病のある男女の肥満症患者７例の外側広筋から入手したものである。平均年齢は６３±４歳、平均体格指数は２９．９±３．８であった。患者の完全な臨床プロファイルは、以前の刊行物に記載されている［１８］。全対象が筋試料の提供に同意し、プロトコルはマーストリヒト大学の医療倫理審査委員会（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｔｈｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認を受けたものである。
【００９６】
ＣＤ３１−細胞の精製に使用した成人組織
剖検（２５〜８０歳の個人）から得られたヒト骨格筋組織試料は、国立疾病研究互助組織（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ）（ＮＤＲＩ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）から入手し、ＮＤＲＩの実行可能性審査委員会（Ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（プロトコル＃ＢＯＯ１）により承認を受けたものである。
【００９７】
マウス
Ｃｅｎｔｒｅ  Ｍeｄｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｉｒｅ（Ｇｅｎeｖｅ）の施設内ガイドラインに従ってマウスを取り扱った。温度が制御された２４℃の部屋で１２時間の明暗サイクルを保ちながら、マウスを個別に飼育した。水および標準的な実験用固形飼料を自由摂取させた。４〜６週齢の雄１２９Ｓｖ／ｅｖマウスの肩甲骨間ＢＡＴを切り出し、その前駆細胞を既に記載されている通りに単離し培養した［１９］。
【００９８】
免疫組織化学法
新鮮な胎児組織および成人組織を液体窒素で冷却したイソペンタンに浸漬して徐々に凍結させた。クリオスタット（Ｍｉｃｒｏｍ  ＨＭ５０５Ｅ）で５〜７μｍの切片を切り、５０％アセトン／５０％メタノールで固定し、室温（ＲＴ）で５分間乾燥させた後、リン酸緩衝生理食塩水で５分間、３回洗浄した。非特異的結合部位をＲＴで１時間、５％ヤギ血清によりブロックした。切片を４℃で一晩、ＣＤ３４マウス抗ヒト抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃｈ、１：５０）とインキュベートし、次いで洗浄した後、二次ヤギ抗マウスビオチン化抗体（ＤＡＫＯ、１：１０００）とＲＴで１時間インキュベートし、ストレプトアビジン−Ｃｙ３（Ｓｉｇｍａ、１：１０００）とＲＴで３０分間またはコンジュゲートＣＤ１４６−Ａｌｅｘａ４８８マウス抗ヒト抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、１：２００）とＲＴで２時間インキュベートした。核をＲＴで５分間、４’，６−ジアミノ−２−フェニルインドールジヒドロクロリド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、１：２０００）で染色した。各免疫染色について、アイソタイプが一致するネガティブ対照を実施した。
【００９９】
蛍光免疫組織化学法（ＩＨＣ）によるＵＣＰ１タンパク質の定量化
ロシグリタゾンを含まない脂肪生成分化培地（最少分化培地、ＭＤＭ）または１μＭロシグリタゾンを含む脂肪生成分化培地（参照分化培地、ＲＤＭ）を用いて、ＣＤ３１−細胞の培養および褐色脂肪細胞への分化を実施した。分化１５日後、４％パラホルムアルデヒドＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）で細胞を固定し、標準プロトコルに従って、ＵＣＰ１抗体（Ａｂｃａｍ  ａｂ２３８４１）およびＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ウサギ抗体とインキュベートし相対ＵＣＰ１レベル（緑色）を定量化した。細胞を固定する前に、５μＭ  ＤＡＰＩ（青色）で１０分間、核を標識した。各データ項目について計３６０〜４８０個前後の細胞に相当する９６ウェルプレートで、各処置条件を三重反復で評価した。ＩｎＣｅｌｌ  １０００  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  Ｔｏｏｌｂｏｘソフトウェアを用いて自動化細胞検出スクリプトを作成し、核および細胞質の検出アルゴリズムを用いてＵＣＰ１のシグナル強度を測定した。リードアウトには細胞内のＵＣＰ１シグナルの総強度を使用し、細胞数に正規化した。
【０１００】
フローサイトメトリー
胎児の骨格筋、膵臓、肺および肝臓ならびに成人の筋肉およびＷＡＴの血管細胞をフローサイトメトリーにより分析した。新鮮な胎児筋肉または成人筋肉ならびに胎児の膵臓、肺および肝臓組織を２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（ＰＳ）およびコラゲナーゼＩＡ−Ｓ、ＩＩ−ＳおよびＩＶ−Ｓ（Ｓｉｇｍａ、１ｍｇ／ｍＬ）を含有する高グルコースＤｕｌｂｅｃｃｏ変法Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）中、解剖用メスで細切した後、３７℃で７５分間（胎児組織）または９０分間（成人組織）、常時攪拌しながらインキュベートした。すりガラススライドの間で細胞を最終的に解離させた。細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、３５０ｇで５分間遠心分離した。細胞をＤＭＥＭ、２０％ＦＢＳに再懸濁させ、１００μｍでろ過し、トリパンブルーで染色し、死細胞を除外してカウントした。Ｃｈａｍｐｉｇｎｙらに従って、ＷＡＴ間質血管画分をコラゲナーゼ消化により調製した［２０］。
【０１０１】
細胞（解析に１０５個、分別に約３０×１０６個）を、マウス抗ヒト抗体と直接結合させた次のもの：ＣＤ４５−ＡＰＣ  Ｃｙ７（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１：２００）、ＣＤ４５  ＰｅｒＣＰ  Ｃｙ５．５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＃４５−０４５９−７３、１：１０）、ＣＤ５６−ＰＥ  Ｃｙ７（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ  １：１００）、ＣＤ５６  ＡＰＣ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ  ＃５５５５１８、１：５０）、ＣＤ３４−ＰＥ（ＤＡＫＯ、１：１００またはＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ  ＃５５５８２２、１：２０）、非コンジュゲートＣＤ１４６、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ：ＰＥマウス抗ヒトＣＤ１４６（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ  ＃５５０３１５、１：５０）、ＣＤ１４６−ＦＩＴＣ（Ｓｅｒｏｔｅｃ、１：１００）および抗ヒトＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１）ＦＩＴＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＃１１−０３１９−４２、１：１０）のうちの１つとそれぞれ１ｍｌ  ＤＭＥＭ、２０％ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（ＰＳ）中、４℃で１５分間インキュベートした。洗浄および遠心分離の後、細胞を細胞生存率／死細胞除外のために７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ、１：１００）または１μｇ／ｍｌのヘキスト３３５２８色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃Ｈ３５６９）とインキュベートし、７０μｍでろ過し、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａフローサイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にかけた。ネガティブ対照として、一部の細胞と、ＡＰＣ  Ｃｙ７（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ、１：１００）、ＰＥ  Ｃｙ７（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ、１：１００）、ＰＥ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、１：１００）およびＦＩＴＣ（ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１：１００）と結合させたアイソタイプが一致するマウスＩｇＧとを同じ条件下でインキュベートした。
【０１０２】
細胞培養
０．２％ゼラチンでコートしたプレート（２４ウェル、ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ  ＃３５３０４７）に細胞を１ｃｍ２当たり１０，０００個播き、内皮細胞増殖培地−２（ＥＧＭ２）（ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ増殖培地、Ｌｏｎｚａ  ＃ＣＣ−３１６２）中、３７℃で集密状態まで培養し（２〜４日）、分化するまで培養した（さらに１０〜１６日）。ＥＧＭ２培地で２日または３日経過した後、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら［２１］により記載されている培地を改変したもので、分化誘導剤（例えば、ＰＰＡＲγアゴニスト）を含有するまたは含有しない脂肪生成培地に培地を交換することにより、細胞の分化を誘導した。上記ＭＤＭは次のものを含有する：ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２  ５０／５０  Ｍｉｘ（３．１５１ｇ／ｌ、１７．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、３．６５１ｇ／ｌ  Ｌ−グルタミン）（Ｃｅｌｌｇｒｏ  ＃１０−０９０−ＣＶ）、５μｇ／ｍｌ（０．８６μＭ）インスリン、１０μｇ／ｍｌトランスフェリン、０．２ｎＭ  ３，３’，５−トリヨード−Ｌ−チロニン、１００μＭ  ３−イソブチル−１−メチルキサンチン、１μＭデキサメタゾンおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシン。ロシグリタゾンを分化誘導剤として用いる場合、１μＭの濃度またはＢＡＴ前駆細胞から脂肪細胞への分化を誘導するのに十分な他の任意の濃度でロシグリタゾンを補充し得る。
【０１０３】
細胞拡大の試験には、３７℃で３〜５分間、トリプシン−ＥＤＴＡで処理することにより、ＥＧＭ２培地で増殖した集密状態の細胞のみを脱離させた後、１：３または１：４に分割し、上記の通りに培養した。酸素測定試験に用いた初代培養のヒト白色脂肪細胞は、既に記載されている通りに入手したものである［２２］。
【０１０４】
ＲＴ−ＰＣＲ
ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡＩＩキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）、Ｅｘｔｒａｃｔ−ａｌｌ溶液（Ｅｕｒｏｂｉｏ、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、Ｆｒａｎｃｅ）またはＰｕｒｅＬｉｎｋ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１２１８３−０１６）を用いて全細胞ＲＮＡを調製し、バイオフォトメトリー（Ｂｉｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）により定量化した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ  ＲＮａｓｅ  Ｈ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）とオリゴｄＴプライマーまたはＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）とランダムプライマーを用いて、オリゴｄＴをプライマーとする第一鎖ｃＤＮＡを合成した。
【０１０５】
ＡＢＩ高速サーマルサイクラーシステム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）またはＡＢＩ  ７３００  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ機器、ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＃４３６９０１６）ならびにヒト脱共役タンパク質−１（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿０２１８３３）用（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ａｓｓａｙ  ＩＤ  Ｈｓ０１０８４７７２＿ｍ１，ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  ｐａｒｔ  ＃  ４３５１３７２）およびヒトペプチジルプロリルイソメラーゼＡ「シクロフィリンＡ」（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿０２１１３０）用（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ａｓｓａｙ  ＩＤ  Ｈｓ９９９９９９０４＿ｍ１，ＴａｑＭａｎ(商標)  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  ｐａｒｔ  ＃４４４８４８５）のＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｅ−ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ  Ａｓｓａｙｓを用いて、定量的リアルタイムＰＣＲを実施した。逆転写の効率に起因する変動を明らかにするため、シクロフィリンＡを対照として用いた。混入したゲノムＤＮＡの増幅を避けるため、上流および下流のオリゴヌクレオチドプライマーをイントロンの両側に選択した。
【０１０６】
ヒト細胞およびマウス褐色脂肪細胞でのリアルタイム定量的ＰＣＲに使用したプライマーは以下の通りである：
ｈＵＣＰ１
センスプライマー：５’−ＣＣＴＣＡＣＣＧＣＡＧＧＧＡＡＡＧＡＡ−３’（配列番号１）
アンチセンスプライマー：５’−ＣＴＡＡＣＧＡＣＴＧＧＡＧＧＡＧＴＧＧＣＡ−３’（配列番号２）
アンプリコンの位置：４２９〜５０４
アクセション番号：ＮＭ＿０２１８３３
ｍＵＣＰ１
センスプライマー：５’−ＣＧＡＴＧＴＣＣＡＴＧＴＡＣＡＣＣＡＡＧＧＡ−３’（配列番号３）
アンチセンスプライマー：５’−ＴＴＧＴＧＧＣＴＴＣＴｎＴＣＴＧＣＧＡ−３’（配列番号４）
アンプリコンの位置：９９６〜１０６３
アクセション番号：ＮＭ＿００９４６３．２
ｈレプチン
センスプライマー：５’−ＣＣＡＡＡＡＣＣＣＴＣＡＴＣＡＡＧＡＣＡＡＴＴ−３’（配列番号５）
アンチセンスプライマー：５’−ＡＡＧＴＣＡＣＣＧＧＴＴＴＧＧＡＣＴＴＣＡ−３’（配列番号６）
アンプリコンの位置：１４３〜２３８
アクセション番号：ＢＣ０６９３２３
ｈシクロフィリンＡ
センスプライマー：５’−ＣＡＴＣＴＧＣＡＣＴＧＣＣＡＡＧＡＣＴＧＡ−３’（配列番号７）
アンチセンスプライマー：５’−ＧＣＡＡＡＧＴＧＡＡＡＧＡＡＧＧＣＡＴＧＡＡ−３’（配列番号８）
アンプリコンの位置：４６６〜５３７
アクセション番号：ＮＭ＿２０３４３１
ｍシクロフィリンＡ
センスプライマー：Ｓ’−ＣＡＡＡＴＧＣＴＧＧＡＣＣＡＡＡＣＡＣＡＡ−３’（配列番号９）
アンチセンスプライマー：５’−ＣＣＡＴＣＣＡＧＣＣＡＴＴＣＡＧＴＣＴＴＧ−３’（配列番号１０）
アンプリコンの位置：３４３〜４１２
アクセション番号：ＮＭ＿００８９０７
【０１０７】
ヒト骨格筋でのリアルタイム定量的ＰＣＲに使用したプライマーは以下の通りである：
ｈＵＣＰ１
センスプライマー：Ｓ’−ＴＣＣＧＧＣＴＣＣＡＧＧＴＣＣＡＡ−３’（配列番号１１）
アンチセンスプライマー：５’−ＴＧＡＴＴＧＴＴＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＴＴＴ−３’（配列番号１２）
アンプリコンの位置：２４０〜３１１
アクセション番号：ＮＭ＿０２１８３３
ｈシクロフィリンＡ
センスプライマー：５’−ＣＡＴＣＴＧＣＡＣＴＧＣＣＡＡＧＡＣＴＧＡ−３’（配列番号７）
アンチセンスプライマー：５’−ＧＣＡＡＡＧＴＧＡＡＡＧＡＡＧＧＣＡＴＧＡＡ−３’（配列番号８）
アンプリコンの位置：４６６〜５３７
アクセション番号：ＮＭ＿２０３４３１
【０１０８】
分析的ＰＣＲに使用した配列およびプライマーは以下の通りである：
ＣＤ３１
アクセション番号：ＮＭ＿０００４４２
ＣＤ３４
センスプライマー：５’−ＣＡＴＣＡＣＴＧＧＣＴＡＴＴＴＣＣＴＧＡＴＧ−３’（配列番号１３）
アンチセンスプライマー：５’−ＡＧＣＣＧＡＡＴＧＴＧＴＡＡＡＧＧＡＣＡＧ−３’（配列番号１４）
アンプリコンの位置：１１７２〜１５９１
アクセション番号：Ｍ８１１０４
ＣＤ５６
センスプライマー：５’−ＧＴＡＴＴＴＧＣＣＴＡＴＣＣＣＡＧＴＧＣＣ−３’（配列番号１５）
アンチセンスプライマー：５’−ＣＡＴＡＣＴＴＣＴＴＣＡＣＣＣＡＣＴＧＣＴＣ−３’（配列番号１６）
アンプリコンの位置：５４２〜８７３
アクセション番号：ＢＣ０１４２０５
ＣＤ４５
センスプライマー：５’−ＣＡＴＧＴＡＣＴＧＣＴＣＣＴＧＡＴＡＡＧＡＣ−３’（配列番号１７）
アンチセンスプライマー：５’−ＧＣＣＴＡＣＡＣＴＴＧＡＣＡＴＧＣＡＴＡＣ−３’（配列番号１８）
アンプリコンの位置：９４０〜１５７９
アクセション番号．：Ｙ００６３８
ＣＤ１４６
センスプライマー：５’−ＡＡＧＧＣＡＡＣＣＴＣＡＧＣＣＡＴＧＴＣＧ−３’（配列番号１９）
アンチセンスプライマー：５’−ＣＴＣＧＡＣＴＣＣＡＣＡＧＴＣＴＧＧＧＡＣ−３’（配列番号２０）
アンプリコンの位置：１６８〜６０３
アクセション番号：Ｍ２８８８２
β−アクチン
センスプライマー：５’−ＣＣＴＣＧＣＣＴＴＴＧＣＣＧＡＴＣＣ−３’（配列番号２１）
アンチセンスプライマー：５’−ＧＧＡＡＴＣＣＴＴＣＴＧＡＣＣＣＡＴＧＣ−３’（配列番号２２）
アンプリコンの位置：２５〜２２９
アクセション番号：ＮＭ＿００１１０１
【０１０９】
標的ｍＲＮＡのレベルをシクロフィリンｍＲＮＡのレベルに正規化（Ｃｔに基づく）することにより任意単位を決定し、この場合、容易に参照できるよう最初にシクロフィリンレベルを１００，０００で割った。例えば、シクロフィリンｍＲＮＡに対する標的ｍＲＮＡの比が０．０１７９７であれば１７９７と表される。
【０１１０】
また別に、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００リアルタイムＰＣＲ機器（ＳＤＳソフトウェアｖ１．４．０．２５を備えたもの）、ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＃４３６９０１６）ならびにヒト脱共役タンパク質−１「ＵＣＰ１」（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿０２１８３３）用［ＦＡＭ  ＭＧＢプローブ］（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ａｓｓａｙ  ＩＤ  Ｈｓ００２２２４５３＿ｍ１、ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  ｐａｒｔ  ＃４３５１３７０）およびヒトペプチジルプロリルイソメラーゼＡ「シクロフィリンＡ」（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿０２１１３０）用［ＶＩＣ  ＭＧＢ  プローブ］（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ａｓｓａｙ  ＩＤ  Ｈｓ９９９９９９０４＿ｍ１、ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  ｐａｒｔ  ＃４４４８４８５）のＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｅ−ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ  Ａｓｓａｙｓを用いて、定量的リアルタイムＰＣＲを実施した。ヒト脂肪酸結合タンパク質４「ＦＡＢＰ４」（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿００１４４２）を多重化した方法で（ＵＣＰ１およびシクロフィリンＡとともに）同時に測定するため、次に挙げる特注のＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ試薬を作製した：ＴａｑＭａｎ  ＭＧＢプローブ［ＮＥＤ］：ＣＡＧ  ＧＡＡ  ＡＧＴ  ＣＡＡ  ＧＡＧ  ＣＡＣ  ＣＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＃４３１６０３４；配列番号３０）、センスプライマー：ＴＣＡ  ＴＡＣ  ＴＧＧ  ＧＣＣ  ＡＧＧ  ＡＡＴ  ＴＴ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＃４３０４９７１；配列番号３１）およびアンチセンスプライマー：ＴＧＣ  ＡＣＡ  ＴＧＴ  ＡＣＣ  ＡＧＧ  ＡＣＡ  ＣＣ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＃４３０４９７１；配列番号３２）。
【０１１１】
逆転写の効率に起因する変動を明らかにするため、シクロフィリンＡを対照として用いた。標的ｍＲＮＡのレベルをシクロフィリンｍＲＮＡのレベルに正規化（Ｃｔに基づく）することにより任意単位を決定した。
【０１１２】
ヒトＵＣＰ１アンプリコンのバリデーション
ＰＣＲで増幅したフラグメントをＴＯＰＯ−ＴＡクローニングシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によりｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター中にクローン化し、Ｑｉａｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、色で選択されたコロニーの精製を実施した。ＡＢＩ  ３７００自動シーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）にＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅシーケンシングキットを用いて、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターに対するオリゴヌクレオチドＭ１３  Ｒｅｖｅｒｓｅにより配列を決定した。
【０１１３】
ウエスタンブロット法
培養した細胞をＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、０．５％デオキシコール酸Ｎａ、０．１％ＳＤＳ、１：２００プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＩ）および５０ｍＭトリス／ＨＣｌ  ｐＨ８．０）２００μｌ中、ラバーポリスマンを用いて収集した。ヒトＢＡＴおよび骨格筋を上記ＲＩＰＡ緩衝液中でホモジナイズした。Ｌｏｗｒｙの手法［２３］に従ってタンパク質含有量を決定した。既に記載されている通りにウエスタンブロットを実施した［２４］。Ｂ．Ｃａｎｎｏｎ博士（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）の厚意により提供された１／５００希釈のウサギ抗マウスＵＣＰ１ポリクローナル一次抗体を用いて、ＵＣＰ１タンパク質を検出した。この抗体は、ヒトＵＣＰ１と８０％の同一性を共有し、ヒトＵＣＰ２およびＵＣＰ３とそれぞれ０％および１０％の同一性を共有するマウスＵＣＰ１のＣ末端デカペプチドに対して生じさせたものである。１／５０００希釈のマウス抗マウスＧＡＰＤＨモノクローナル一次抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）を用いて、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）タンパク質を検出した。１／５０００希釈のヤギ抗ウサギまたは抗マウスペルオキシダーゼ標識二次抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯまたはＢｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いた。ＳｅｅＢｌｕｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ  ２  Ｐｒｅ−ｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いた。標準的なＥＣＬキットを用いた化学発光によりタンパク質シグナルを検出し、ＥＣＬフィルムに感光させた。
【０１１４】
高分解能Ｏ２消費量測定
Ｐｅｌｔｉｅｒサーモスタットとクラーク型電極と内蔵電磁スターラーとを備えた２注入チャンバの呼吸計（Ｏｒｏｂｏｒｏｓ（登録商標）Ｏｘｙｇｒａｐｈ、Ｏｒｏｂｏｒｏｓ、Ｉｎｎｓｂｒｕｃｋ、Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて酸素消費量を測定した。１０％新生仔ウシ血清を含む２ｍｌのＤＭＥＭ  Ｆ１２中、３７℃で常時攪拌しながら測定を実施した。この条件下で、血清により、ＵＣＰ１脱共役活性を維持するのに必要な脂肪酸が供給された。各Ｏ２消費量測定前に、チャンバ内の培地を空気で３０分間平衡化し、トリプシン処理したばかりの細胞を呼吸計のガラスチャンバに移した。定常状態の呼吸流量を観測した後、オリゴマイシン（０．２５〜０．５ｍｇ／１）によりＡＴＰ合成酵素を阻害し、１〜２μＭの範囲の最適濃度以下の脱共役剤カルボニルシアニド３−クロロ−フェニルヒドラゾンで細胞を滴定した。アンチマイシンＡ（１μｇ／ｍｌ）により呼吸鎖を阻害した。ＤａｔａＧｒａｐｈソフトウェア（Ｏｒｏｂｏｒｏｓソフトウェア）を用いて酸素消費量を計算した。
【０１１５】
ＣＤ３１−細胞の呼吸測定
Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＸＦ２４  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｆｌｕｘ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて、褐色脂肪細胞への分化前および分化後のＣＤ３１−細胞の呼吸速度を測定した。最初に成人由来のＣＤ３１−細胞をＥＧＭ２（すなわち、未分化前駆細胞）またはＭＤＭとロシグリタゾン（１μＭ）＋ＢＭＰ７（６ｎＭ）で３日間（完全に分化した褐色脂肪細胞）中、Ｓｅａｈｏｒｓｅプレートで培養した。次いで、ベースライン、オリゴマイシン（５μＭ）存在下（いわゆる「状態４」の呼吸、すなわちプロトン漏出）およびＦＣＣＰ存在下（用量漸増：０．５μＭ、１μＭおよび５μＭ）（いわゆる「状態３ｕ」の呼吸、すなわち脱共役が最大である）で呼吸を測定した。
【０１１６】
遺伝子チップ解析
継代３代目（４週間）まで培養して拡大した胎児筋ＣＤ３４＋細胞およびヒト筋肉生検の全ＲＮＡを上記の通りに調製した。品質保証測定、ｃＲＮＡ標的の調製および遺伝子チップ解析は、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ社（Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）がＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｈｕｍａｎ  ＷＧ−６  ＢｅａｄＣｈｉｐを用いて実施した。検出Ｐ値の計算にはＢｅａｄＳｔｕｄｉｏによるノンパラメトリック法を用いた。
【０１１７】
統計解析
データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．で表す。独立スチューデントｔ検定を用いて有意性を評価した。対応のあるスチューデントｔ検定を用いて、ヒト骨格筋のＵＣＰ１  ｍＲＮＡレベルに対するロシグリタゾンの効果を判定した。有意性はｐ＜０．０５に設定した。
【０１１８】
ヒトＵＣＰ１プロモーター／エンハンサー領域のクローン化
スクリーニング戦略を開発するため、ヒトＵＣＰ１プロモーター／エンハンサーを以下の通りにサブクローン化した。
【０１１９】
ヒトＵＣＰ１（脱共役タンパク質−１）プロモーター／エンハンサー領域を含むヒトＢＡＣ（細菌の人工染色体）クローン＃ＲＰ１１−５Ｋ１６（ＡＣ１０８０１９）をＣＨＯＲＩ（オークランド小児病院研究所（Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｏａｋｌａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））のＢＡＣ−ＰＡＣリソースサービスから入手した。選択したプロモーター／エンハンサー領域はヒトＵＣＰ１遺伝子（アクセッション番号：ＮＭ＿０２１８３３）の５’ＵＴＲ（非翻訳領域）上流−２５位から始まるものである。全長クローン化したプロモーター／エンハンサー配列は、ヒトＵＣＰ１遺伝子開始コドンを基準として−１４９位と−６２６９位の間に位置する。
【０１２０】
次のいずれかを増幅するようにプライマーセットを設計した：
（ｉ）全長標的化プロモーター／エンハンサー領域（ＵＣＰ１  ５’ＵＴＲの上流−２５位から始まる６１２０ｂｐ）：
左側プライマー：
５’−ＴＣＧＴＡＡＧＣＴＴＡＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＧＣＡＧＡＣＧＧＡＧＣＧＣＧＧＴＧＴＴ−３’（配列番号２３）
右側プライマー：
５’−ＡＣＧＡＡＧＡＴＣＴＣＡＴＴＡＣＣＣＣＡＡＡＴＡＧＣＡＴＣＡＣＡ−３’（配列番号２４）
（ｉｉ）近位標的化プロモーター／エンハンサー領域（ＵＣＰ１  ５’ＵＴＲの−２５ヌクレオチドの上流３６８５ｂｐ）：
左側プライマー：
５’−ＴＣＧＴＡＡＧＣＴＴＡＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＧＣＡＧＡＣＧＧＡＧＣＧＣＧＧＴＧＴＴ−３’（配列番号２５）
右側プライマー：
５’−ＡＣＧＡＡＣＣＧＧＴＣＡＧＡＡＧＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＡＧＣＣＴＧＣ−３’（配列番号２６）
（ｉｉｉ）示される通り、遠位標的化プロモーター／エンハンサー領域（近位標的化プロモーター／エンハンサー領域の上流２４３５ｂｐ）：
左側プライマー：
５’−ＴＣＧＴＡＣＣＧＧＴＡＣＡＧＧＣＴＣＴＧＧＧＡＡＧＴＡＧＧＡＧＡＡＡＧＴ−３’（配列番号２７）
右側プライマー：
５’−ＡＣＧＡＡＧＡＴＣＴＣＡＴＴＡＣＣＣＣＡＡＡＴＡＧＣＡＴＣＡＣＡ−３’（配列番号２８）。
【０１２１】
各プライマーには、続く哺乳動物発現ベクターでのクローン化を容易にする制限部位が含まれている（下記参照）。
【０１２２】
鋳型としてＢＡＣ＃ＲＰ１１−５Ｋ１６を５００ｎｇ、増幅にＴａｋａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、ＰＣＲ反応でのプロモーター／エンハンサーのクローン化を実施した。ＰＣＲプログラムの段階は以下の通りであった：初期段階：９２℃で２分間；次いで、［変性：９２℃、３０秒；アニーリング：５９℃、４０秒；伸長：６８℃、５分３０秒］を２８サイクル；最終伸長段階：６８℃、８分。
【０１２３】
次いで全長プロモーター／エンハンサー、近位または遠位プロモーター／エンハンサーをレポーター／ＭＡＲエレメント含有ベクターｐｌ＿６８＿ＧＦＰのＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にＳＶ４０プロモーターカセットと置き換えてサブクローン化する［２５］。あるいは、サブクローン化を目的に同じＢｇｌＩＩ／ＮｃｏＩ部位を用いて、ルシフェラーゼベースのｐＧＬ３  Ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）も別のタイプのプロモーターとして使用した。
【０１２４】
クローン化したヒトＵＣＰ１プロモーター配列は、スイスのバイオテクノロジー会社Ｆａｓｔｅｎｓ  ＳＡ社で最新技術の配列決定によって確認した。ヒトＵＣＰ１プロモーター配列の配列は配列表に配列番号２９として記載されており、その配列表は全体が参照により組み込まれるものとする。
【０１２５】
細胞形態学のための画像
携帯用デジタルカメラ（Ｎｉｋｏｎ  Ｃｏｏｌｐｉｘ９５０）および細胞培養の観察に使用する倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  ＴＭＳ）を用いて細胞の画像を撮影し、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ８の自動コントラストおよび自動レベル補正の機能を用いて画像を最適化した。
【０１２６】
本明細書に用いられている節の表題および副題は、単に構成を目的としたものであって、記載されている主題を何ら限定するものではないと解釈されるべきである。さらに、本教示は様々な実施形態とともに記載されているが、本教示がこのような実施形態に限定されることを意図するものではない。むしろ、本教示は当業者によって認識される様々な代替物、修正物および均等物を包含するものである。
【０１２７】
その他の実施形態
本発明の各種態様は、単独で用いても、組み合わせて用いても、上記の実施形態で具体的に述べられていない様々な配置で用いてもよく、したがって、上に記載されている、あるいは図面に図示されている構成要素の詳細および配置への応用に制限はない。例えば、ある実施形態に記載されている態様を他の実施形態に記載されている態様と任意の方法で組み合わせることができる。
【０１２８】
クレーム内にあってクレーム要素を修飾する「第一」、「第二」、「第三」などの序数を表す用語自体は、あるクレーム要素の別のクレームに対するいかなる優先性、先行性または序列の意味も、ある方法の操作を実施する時間的順序の意味も含むものではなく、単に特定の名称をもつクレーム要素と同じ名称をもつ（序数を表す用語を用いなければ）別のクレーム要素とを区別して、クレーム要素を区別するために使用されるものである。
【０１２９】
また、本明細書で使用される語法および用語は説明を目的とするものであり、限定するものと見なされるべきではない。本明細書で「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」およびその変化物を使用する場合、それはその後に挙げる項目およびその均等物ならびにさらに別の項目をも包含することを意味する。
【０１３０】
本発明は特に、ＢＡＴ前駆細胞のための新規な方法および組成物を提供するものである。ここまで本発明の具体的な実施形態について述べてきたが、上の詳述事項は例示的なものであり、制限的なものではない。本明細書を再検討すれば、多くの変形形態が当業者に明らかになろう。本発明の全範囲は、特許請求の範囲をその均等物の全範囲とともに参照し、また本明細書をその変形形態とともに参照して決定されるべきである。
【０１３１】
参照による組込み
本明細書で参照されるあらゆる刊行物、特許および特許出願は、あらゆる目的において、個々の刊行物、特許または特許出願が参照により組み込まれることが具体的に明示された場合と同様にその全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【０１３２】
参考文献
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【図６Ａ】
2015502742.tif 000003
【図６Ｂ】
2015502742.tif 000004
【図７Ａ】
2015502742.tif 000005
【図７Ｂ】
2015502742.tif 000006
【図８Ａ】
2015502742.tif 000007
【図８Ｂ】
2015502742.tif 000008
【図１】
2015502742.tif 000009
【図２】
2015502742.tif 000010
【図３】
2015502742.tif 000011
【図４】
2015502742.tif 000012
【図５】
2015502742.tif 000013
【図９Ａ】
2015502742.tif 000014
【図９Ｂ】
2015502742.tif 000015
【図９Ｃ】
2015502742.tif 000016
【図９Ｄ】
2015502742.tif 000017
【図９Ｅ】
2015502742.tif 000018
【図９Ｆ】
2015502742.tif 000019
【図９Ｇ】
2015502742.tif 000020
【図９Ｈ】
2015502742.tif 000021
【図１０Ａ】
2015502742.tif 000022
【図１０Ｂ】
2015502742.tif 000023
【図１０Ｃ】
2015502742.tif 000024
【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１０Ｈ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
2015502742.tif 000031
【図１１Ｃ】
2015502742.tif 000032
【図１１Ｄ】
2015502742.tif 000033
【図１１Ｅ】
2015502742.tif 000034
【図１１Ｆ】
2015502742.tif 000035
【図１１Ｇ】
2015502742.tif 000036
【図１１Ｈ】
2015502742.tif 000037
【図１２】
2015502742.tif 000038
【図１３】
2015502742.tif 000039
【図１４】
2015502742.tif 000040
【図１５】
2015502742.tif 000041
【図１６】
2015502742.tif 000042
【図１７】
2015502742.tif 000043
【図１８】
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【配列表】
2015502742000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年9月10日(2013.9.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
褐色脂肪組織（ＢＡＴ）前駆細胞であって、
前記ＢＡＴ前駆細胞がヒト骨格筋から単離され、褐色脂肪細胞に分化することが可能であり、
前記ＢＡＴ前駆細胞が内皮細胞に関連する第一の細胞表面マーカーを発現し、前記第一の細胞表面マーカーが第一の抗体を用いる抗体ベースのアッセイで検出され、
前記ＢＡＴ前駆細胞が内皮細胞に関連する第二の細胞表面マーカーを実質的にもたず、前記第二の細胞表面マーカーが第二の抗体を用いる前記抗体ベースのアッセイで実質的に検出されない
ＢＡＴ前駆細胞。
【請求項２】
ＢＡＴ前駆細胞が造血細胞に関連する第三の細胞表面マーカーを実質的にもたず、前記第三の細胞表面マーカーが第三の抗体を用いる前記抗体ベースのアッセイで実質的に検出されないこと、
ＢＡＴ前駆細胞が筋原細胞に関連する第四の細胞表面マーカーを実質的にもたず、前記第四の細胞表面マーカーが第四の抗体を用いる前記抗体ベースのアッセイで実質的に検出されないことおよび／または
ＢＡＴ前駆細胞が周皮細胞に関連する第五の細胞表面マーカーを実質的にもたず、前記第五の細胞表面マーカーが第五の抗体を用いる前記抗体ベースのアッセイで実質的に検出されないこと
のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１に記載のＢＡＴ前駆細胞。
【請求項３】
前記第一の細胞表面マーカーがＣＤ３４であり、前記第一の抗体が抗ＣＤ３４抗体である、請求項１または２に記載のＢＡＴ前駆細胞。
【請求項４】
前記第二の細胞表面マーカーがＣＤ３１であり、前記第二の抗体が抗ＣＤ３１抗体である、請求項１または２に記載のＢＡＴ前駆細胞。
【請求項５】
前記第三の細胞表面マーカーがＣＤ４５であり、前記第三の抗体が抗ＣＤ４５抗体である、請求項２に記載のＢＡＴ前駆細胞。
【請求項６】
前記第四の細胞表面マーカーがＣＤ５６であり、前記第四の抗体が抗ＣＤ５６抗体である、請求項２に記載のＢＡＴ前駆細胞。
【請求項７】
前記第五の細胞表面マーカーがＣＤ１４６であり、前記第五の抗体が抗ＣＤ１４６抗体である、請求項２に記載のＢＡＴ前駆細胞。
【請求項８】
前記ＢＡＴ前駆細胞が増殖培地で増殖する、請求項１または２に記載のＢＡＴ前駆細胞。
【請求項９】
前記増殖培地が骨形成タンパク質−７（ＢＭＰ７）を含む、請求項８に記載のＢＡＴ前駆細胞。
【請求項１０】
前記ＢＡＴ前駆細胞が、分化培地で褐色脂肪細胞に分化する、請求項１または２に記載のＢＡＴ前駆細胞。
【請求項１１】
前記分化培地が最少分化培地（ＭＤＭ）である、請求項１０に記載のＢＡＴ前駆細胞。
【請求項１２】
前記分化培地がペルオキシソーム増殖剤活性化受容体ガンマ（ＰＰＡＲγ）アゴニストを含む、請求項１０に記載のＢＡＴ前駆細胞。
【請求項１３】
骨格筋から単離され、請求項１または２に記載のＢＡＴ前駆細胞を少なくとも１つ含む、細胞集団。
【請求項１４】
ＢＡＴ前駆細胞を同定する方法であって、
骨格筋から単離された細胞集団を準備する工程と、
前記細胞集団を、それぞれが内皮細胞に関連する第一の細胞表面マーカーおよび第二の細胞表面マーカーにそれぞれ特異的な第一の抗体および第二の抗体と接触させる工程と、
前記第一の細胞表面マーカーを発現し、前記第二の細胞表面マーカーを実質的に持たないＢＡＴ前駆細胞を抗体ベースのアッセイで判定する工程と
を含む、方法。
【請求項１５】
前記第一の細胞表面マーカーがＣＤ３４であり、前記第一の抗体が抗ＣＤ３４抗体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第二の細胞表面マーカーがＣＤ３１であり、前記第二の抗体が抗ＣＤ３１抗体である、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞集団を造血細胞に関連する第三の細胞表面マーカーに特異的な第三の抗体と接触させる工程であって、前記第三の細胞表面マーカーが前記第三の抗体を用いる前記抗体ベースのアッセイで実質的に検出されない、工程、
前記細胞集団を筋原細胞に関連する第四の細胞表面マーカーに特異的な第四の抗体と接触させる工程であって、前記第四の細胞表面マーカーが前記第四の抗体を用いる前記抗体ベースのアッセイで実質的に検出されない、工程、および／または、
前記細胞集団を周皮細胞に関連する第五の細胞表面マーカーに特異的な第五の抗体と接触させる工程であって、前記第五の細胞表面マーカーが前記第五の抗体を用いる前記抗体ベースのアッセイで実質的に検出されない、工程
のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記第三の細胞表面マーカーがＣＤ４５であり、前記第三の抗体が抗ＣＤ４５抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第四の細胞表面マーカーがＣＤ５６であり、前記第四の抗体が抗ＣＤ５６抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記第五の細胞表面マーカーがＣＤ１４６であり、前記第五の抗体が抗ＣＤ１４６抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記第一の細胞表面マーカーを発現し前記第二の細胞表面マーカーを発現しない細胞を選別することによって前記細胞集団を分離する工程をさらに含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記第一の細胞表面マーカーを発現し、前記第二の細胞表面マーカーと前記第三、第四および第五の細胞表面マーカーのうちの少なくとも１つとを発現しない細胞を選別することによって、前記細胞集団を分離する工程をさらに含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項２３】
前記選別が、ＣＤ３４を発現しＣＤ３１、ＣＤ４５、ＣＤ５６またはＣＤ１４６を発現しない細胞を選別することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＢＡＴ前駆細胞を単離する工程をさらに含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＢＡＴ前駆細胞を増殖培地で培養する工程であって、それによってＢＡＴ前駆細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで拡大する、工程をさらに含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項２６】
ＢＡＴ前駆細胞から褐色脂肪細胞への分化を誘導する方法であって、
請求項１または２に記載のＢＡＴ前駆細胞を準備する工程と、
前記ＢＡＴ前駆細胞を分化培地に曝露する工程と、
前記ＢＡＴ前駆細胞を前記分化培地で培養する工程であって、それによって前記ＢＡＴ前駆細胞を褐色脂肪細胞に分化させる、工程と
を含む方法。
【請求項２７】
前記分化培地が最少分化培地（ＭＤＭ）である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記分化培地がペルオキシソーム増殖剤活性化受容体ガンマ（ＰＰＡＲγ）アゴニストを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＢＡＴ前駆細胞を増殖培地に曝露する工程をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記増殖培地が骨形成タンパク質−７（ＢＭＰ７）を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
個人の代謝疾患または代謝病態の治療に使用するＢＡＴ前駆細胞であって、
前記個人または提供者の骨格筋から採取され、内皮細胞に関連する第一の細胞表面マーカーを発現し、内皮細胞に関連する第二の細胞表面マーカーを実質的にもたず、
培地で培養することにより増殖し、
培養された前記細胞が前記個人に移植される
ＢＡＴ前駆細胞。
【請求項３２】
分化培地でのｅｘ  ｖｉｖｏ培養により褐色脂肪細胞への分化が誘導される、請求項３１に記載のＢＡＴ前駆細胞。
【請求項３３】
前記代謝疾患が肥満、体重過多、耐糖能異常、インスリン抵抗性、２型糖尿病、脂質異常症、高血圧症、心血管疾患、メタボリック症候群、プラダー・ウィリー症候群または１型糖尿病である、請求項３１または３２に記載のＢＡＴ前駆細胞。
【請求項３４】
ＢＡＴ前駆細胞から褐色脂肪細胞への分化を誘導する薬剤を特定する方法であって、
請求項１または２に記載のＢＡＴ前駆細胞を準備する工程と、
前記ＢＡＴ前駆細胞を薬剤と接触させる工程と、
前記ＢＡＴ前駆細胞が褐色脂肪細胞への分化の指標を示すかどうかを判定する工程と
を含む方法。
【請求項３５】
前記分化の指標が、ＵＣＰ１タンパク質またはｍＲＮＡの発現、ＦＡＢＰ４（ａＰ２）タンパク質またはｍＲＮＡの発現、ＰＰＡＲγ２タンパク質またはｍＲＮＡの発現、ｍｔＴＦＡタンパク質またはｍＲＮＡの発現、ＰＧＣ−１αタンパク質またはｍＲＮＡの発現、脱共役呼吸、呼吸速度、代謝率、グルコース利用率、脂肪酸酸化率およびその組合せのうちの１つ以上の増大である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＵＣＰ１の発現または活性レベルを誘導する薬剤を特定する方法であって、
請求項１または２に記載のＢＡＴ前駆細胞を準備する工程と、
前記ＢＡＴ前駆細胞を薬剤と接触させる工程と、
前記ＢＡＴ前駆細胞がＵＣＰ１の発現または活性の増大を示すかどうかを判定する工程と、
を含む方法。
【請求項３７】
請求項３４に記載の方法を用いて特定され、患者の代謝疾患の治療のための薬物の製造に使用される薬剤。
【請求項３８】
請求項３４に記載の方法を用いて特定され、患者の低体温症の治療または予防のための薬物の製造に使用される薬剤。
【国際調査報告】
2015502742.tif 000045
2015502742.tif 000046
2015502742.tif 000047