(57)【要約】  本発明は、植物における糖化能力を増加させるための方法であって、前記植物における少なくとも1種の細胞型において、アセチルキシランエステラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを過剰発現させる工程を含む方法に関する。本発明は、アセチルキシランエステラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを過剰発現する遺伝子組換え植物を作出するための方法および係る方法によって作出された遺伝子組換え植物にさらに関する。
2015509737.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物における糖化能力を増加させるための方法であって、前記植物における少なくとも1種の細胞型において、アセチルキシランエステラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを過剰発現させる工程を含む方法。
【請求項２】
前記植物におけるグルコース収量を改善するための、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
遺伝子組換え植物を作出するための方法であって、前記植物における少なくとも1種の細胞型において、アセチルキシランエステラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを過剰発現させる工程を含む方法。
【請求項４】
前記植物が、対応する非遺伝子組換え野生型植物と比較して増加した糖化能力を有する、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
植物細胞において機能的なプロモーターであって、アセチルキシランエステラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結し、過剰発現を調節するプロモーターを含む発現カセットにより、前記細胞型を形質転換する工程を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記プロモーターが、CaMV 35Sプロモーターである、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドが、
(a)配列番号1のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
(b)ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、(a)に定義されているポリヌクレオチドのポリペプチドコード領域に相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができ、生物活性を有するアセチルキシランエステラーゼポリペプチドまたはその機能的に均等な改変型をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、および
(c)(a)または(b)に定義されているヌクレオチド配列に対する遺伝暗号の結果としての縮重であり、生物活性を有するアセチルキシランエステラーゼポリペプチドまたはその機能的に均等な改変型をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド
から選択される、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記アセチルキシランエステラーゼポリペプチドが、
(a)配列番号2、3、4または5として示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(b)配列番号2、3、4または5として示すアミノ酸配列から本質的になるポリペプチド、および
(c)配列番号2、3、4または5として示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
から選択される、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
植物が、その細胞壁にアセチル化キシランを有する被子植物および他の植物から選択される、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
植物が、ヤナギ科（family Salicaceae）のものである、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
植物または植物の部分が、酵素による加水分解の前に、酸またはアルカリ等の適した薬剤で前処理される、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記植物における病原体に対する抵抗性を増加させるための、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項3から12のいずれか一項に記載の方法により作出された遺伝子組換え植物。
【請求項１４】
前記植物における少なくとも1種の細胞型において、アセチルキシランエステラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを過剰発現する遺伝子組換え植物。
【請求項１５】
対応する非遺伝子組換え野生型植物と比較して増加した糖化能力を有する、請求項14に記載の遺伝子組換え植物。
【請求項１６】
対応する非遺伝子組換え野生型植物と比較して増加したグルコース収量を有する、請求項13から15のいずれか一項に記載の遺伝子組換え植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物における糖化能力を増加させるための方法であって、前記植物における少なくとも1種の細胞型において、アセチルキシランエステラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを過剰発現させる工程を含む方法に関する。本発明は、アセチルキシランエステラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを過剰発現する遺伝子組換え植物を作出するための方法および係る方法によって作出された遺伝子組換え植物にさらに関する。
【背景技術】
【０００２】
キシランは、リグノセルロースの主要化合物の1種であり、人間の利用に供することができるバイオマスの大部分を構成する。様々な種由来の広葉樹キシランおよび飼料作物のキシランは通常、高度にアセチル化されている。アセチル基の存在は、架橋結合および抽出性および反応性等、リグノセルロースの多くの特性に影響を与える。さらに、キシロースを得るためのキシラン加水分解は、キシラン骨格におけるアセチル基の存在により著しく妨害され、事前のアセチル除去のために酵素的または化学的処理のいずれかを必要とし、高コストおよび/または環境ハザードの原因となる。
【０００３】
キシランは、地球上に存在する3番目に豊富なバイオポリマーであり、人間の利用に供することができる大量のバイオマスに寄与する。キシラン骨格は、4-O-メチル-D-グルクロン酸/グルクロン酸で置換されたβ-(1→4)結合したD-キシロピラノシル残基からなる。キシロピラノシル残基は、C-2および/またはC-3位が部分的にアセチル化されている。キシランアセチル化は、バイオ燃料生産における重大な工程である、リグノセルロース由来のバイオマスから発酵性糖への変換に影響を与え得る、また、糖を発酵させてエタノールに変える微生物に影響を与え得る。これは、キシラン細胞壁の物理化学的特性にも重要となり得る。アスペン材における総アセチル含量は、約3%〜5%であり、その大部分は、キシランと会合している。コムギの麦藁、バガスおよびスイッチグラスにおけるアセチル含量は、約2%〜3%である。
【０００４】
化学的前処理によるアセチル含量の減少は、糖収量を改善する。ヨーロッパヤマナラシ(P. tremula)の研究において、KOH処理による木材の脱アセチル化は、12%から42%に糖収量を増加させた。アメリカヤマナラシ(P. tremuloides)の同様の研究において、アセチル含量の本来の値からの85%低下は、グルカン変換の倍加および8倍高いキシラン変換をもたらした。さらに、リグノセルロースが脱アセチル化されると、効果的な糖化のためにより穏やかな脱リグニン処理を適用することができる。イネ科草本および穀類の麦藁の場合においても同様の観察が得られた。リグノセルロースにおけるアセチル基の存在は、バイオ燃料生産の糖化のみならず続く発酵においても不利である。高すぎる酢酸濃度は、微生物発酵を阻害する。
【０００５】
木材脱アセチル化は、化学-熱-機械的パルプ化において重要な役割を果たす。これは、繊維膨張および繊維の効果的な毛管現象を増加させつつ、細胞壁の構造を有利に変化させる。脱アセチル化は、ヘミセルロースの溶解性を実質的に低下させ、セルロース繊維におけるその吸着を増加させ、これにより、繊維の結合能を改善し、その収量を増加する。
【０００６】
よって、これらの適用において、アセチルは、リグノセルロースから除去される必要がある。アセチルを除去するための一般戦略は、塩基による前処理である。完全脱アセチル化のためには、100gの木材におよそ4gのKOHが必要とされることが示された。希塩基前処理は、キシランまたはリグニンに影響を与えることなく特異的にアセテートを除去するであろうが、この処理は、全体的な生産コストを増加させるであろう。例えば、現在の見積もりによると、リグノセルロースアセチル化における20%の差は、エタノール価格における10%の差に転換される。
【０００７】
多糖アセチル化に関与するRWA遺伝子に変異導入することにより、キシランのアセチル含量がWTよりも40%低いシロイヌナズナ植物を得た(Leeら(2011)、Plant and Cell Physiology 52:1289〜1301)。このような低下は、前処理なしの糖化におけるセルロース消化性を増加させなかった。
【０００８】
Pogorelkoら(2011)、Plant Mol Biol 77:433〜445は、カリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター、シロイヌナズナ(Arabidosis thaliana)β-エクスパンシンシグナルペプチドおよび蛍光マーカータンパク質YFPで構成された発現カセットを構築した。本著者らは、3種のアスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)加水分解酵素、β-キシロシダーゼ/α-アラビノシダーゼ(arabinosidase)、フェルロイルエステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ(AnAXE)、およびイネ白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae)推定a-L-アラビノフラノシダーゼ(arabinofuranosidase)をコロンビア(Colombia)-0植物に導入した。AnAXE植物におけるアセチル含量は、Col-0植物と比較して23%低下した。酸前処理後の糖化の増加は見られなかった。
【０００９】
YFPとの融合は、形質転換体の迅速かつ容易なスクリーニング、アポプラスト局在化の検出およびタンパク質サイズの確認を可能にした。野生型Col-0と比較して、全トランスジェニック系統は、アポプラストにおける対応する加水分解活性の有意な増加と、細胞壁組成の変化を示した。トランスジェニック植物における加水分解活性の検査は、初めて、イネ白葉枯病菌(X. oryzae)遺伝子が、α-L:-アラビノフラノシダーゼ活性を有する酵素を実際にコードしたことも示した。トランスジェニック植物のいずれも、目に見える表現型を示さなかった。しかし、誘導された組成上の変化は、フェルロイルエステラーゼおよびβ-キシロシダーゼ/α-アラビノシダーゼを発現する植物由来のバイオマスの分解性を増加させた。本出願人らの結果は、細胞壁組成がどのように不応性に寄与し、植物適応度に影響を与えるかに関する調査のツールセットとして用いるための、改変された細胞壁を有するトランスジェニックシロイヌナズナ(A. thaliana)植物のセットの作製の実現可能性を実証する。
【００１０】
過剰に高度な脱アセチル化が、ポリマー溶解性低下による不応性を誘導し得ることの徴候がある(Poutanenら(1990)、Appl Microbiol Biotechnol 33:506〜510)。
【００１１】
クロコウジカビ(Aspergillus niger)由来のアセチルキシランエステラーゼ(axe A)遺伝子(配列番号1)は、GenBank受託番号A22880.1およびNCBI参照配列XM_001395535.2により開示されている。対応するポリペプチドは、配列番号2として示されている。他種由来のアセチルキシランエステラーゼは、本技術分野において公知のものである。例えば、アスペルギルス属(Aspergillus)種のフィクウム(ficuum)、カワチ(kawachii)およびアワモリ(awamori)由来のアセチルキシランエステラーゼは、それぞれ配列番号3、4および5として示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Leeら(2011)、Plant and Cell Physiology 52:1289〜1301
【非特許文献２】Pogorelkoら(2011)、Plant Mol Biol 77:433〜445
【非特許文献３】Poutanenら(1990)、Appl Microbiol Biotechnol 33:506〜510
【非特許文献４】Karimi、Mら(2002)、Trends Plant Sci.7(5):193〜195
【非特許文献５】Clough and Bent(1998)、Plant J 16:735〜743
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
抽出性、反応性、酵素消化性、糖化および発酵挙動を改善するために、植物におけるキシラン脱アセチル化のための改善された方法の必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、植物細胞壁においてキシランエステラーゼ活性を発現するために、真菌(クロコウジカビ)キシランエステラーゼ遺伝子を用いた。驚くべきことに、アセチルキシランエステラーゼの過剰発現が、その成長およびセルロース含量を損なうことなく、トランスジェニック植物におけるリグノセルロースアセチル化を減少させること、また、前処理なしの糖化においてのみならず、アルカリおよび酸前処理が適用された場合にも、野生型と比較してトランスジェニック植物からより高い糖化収量が得られることが示された。したがって、このトランスジェニック植物は、バイオエネルギー作物として、あるいはバイオエネルギー作物の開発において有用である。加えて、より優れた繊維パルプ化が予想される。
【００１５】
予想外なことに、本発明は、草本植物(シロイヌナズナ)の場合、同一種類の未改変植物に照らして約12%(0〜34%の間)の脱アセチル化低下は、植物における不応性なしで、化学的前処理なしの糖化およびアルカリ前処理ありの糖化を改善するであろうことを示す。この結果は、図7および図10に示されており、Table 1(表1)にまとめられている。さらに本発明は、木本植物(アスペン)の場合、未改変木本植物と比較して約13%(11〜16%の間)のアセチル化の低下が、前処理なしおよび酸前処理ありの糖化を改善したことも示す。この結果は、図16、図20および図22に実証されており、Table 2(表2)にまとめられている。
【００１６】
結果的に、第1の態様において、本発明は、植物における糖化能力を増加させる方法であって、前記植物における少なくとも1種の細胞型において、アセチルキシランエステラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを過剰発現させる工程を含む方法を提供する。
【００１７】
用語「糖化」は、加水分解により複雑な炭水化物または多糖を単純な単糖構成成分(例えば、グルコース)へと変換する過程を意味する。用語「糖化能力」は、多糖から放出され得る単糖の量を意味する。特に、本発明の方法は、植物におけるグルコース収量を改善するのに有用である。
【００１８】
さらに別の一態様において、本発明は、遺伝子組換え植物を作出するための方法であって、前記植物における少なくとも1種の細胞型において、アセチルキシランエステラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを過剰発現させる工程を含む方法を提供する。本発明において、前記植物は、対応する非遺伝子組換え野生型植物と比較して糖化が増加されている。
【００１９】
好ましくは、前記方法は、植物細胞において機能的なプロモーターであって、アセチルキシランエステラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結し、過剰発現を調節するプロモーターを含む発現カセットにより、前記細胞型を形質転換する工程を含む。
【００２０】
前記プロモーターは、好ましくは、CaMV 35Sプロモーター、ユビキチンプロモーター等の異所的発現プロモーターまたは4CL1等、二次細胞壁を有する細胞において発現するいずれかの種類のプロモーターである。
【００２１】
本発明の好ましい形態において、前記ポリヌクレオチドは、配列表の配列番号1と同一のヌクレオチド配列を有する。しかし、ポリヌクレオチドは、配列番号1として示す配列に厳密に限定されるべきではない。むしろ、本発明は、置換、小さい欠失、挿入または逆位等の改変を有するにもかかわらず、本発明に係るアセチルキシランエステラーゼポリペプチドの生化学的活性を実質的に有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを網羅する。例えば、ポリヌクレオチドは、配列表における配列番号1として示すヌクレオチド配列と少なくとも60%、70%、80%、90%または95%相同となり得る。
【００２２】
結果的に、本発明に係る方法において、前記ポリヌクレオチドは、好ましくは、
(a)配列番号1のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
(b)ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、(a)に定義されているポリヌクレオチドのポリペプチドコード領域に相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができ、生物活性を有するアセチルキシランエステラーゼポリペプチドまたはその機能的に均等な改変型をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、および
(c)(a)または(b)に定義されているヌクレオチド配列に対する遺伝暗号の結果としての縮重であり、生物活性を有するアセチルキシランエステラーゼポリペプチドまたはその機能的に均等な改変型をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド
から選択される。
【００２３】
用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、標準プロトコールによる本技術分野において公知のものであり、例えば、0.5M NaHPO4、7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、1mM EDTAにおけるフィルター結合したDNAへの+65℃のハイブリダイゼーションと、0.1×SSC/0.1%SDSにおける+68℃の洗浄として理解することができる。
【００２４】
語句「遺伝暗号の結果としての縮重」は、本技術分野においてよく知られている。配列上にグループ化された3個のヌクレオチド(コドン)は、1個のアミノ酸をコードする。64種の可能なコドンが存在するが、天然アミノ酸は20種しか存在しないため、大部分のアミノ酸は、2種以上のコドンにコードされる。この現象は、遺伝暗号の天然の「縮重性」または「冗長性」と称される。よって、配列表に示すヌクレオチド配列は、アセチルキシランエステラーゼポリペプチドをコードする配列の大きいが確定的なグループ内の単なる一例であることが認識されよう。
【００２５】
本発明に係る方法の一実施形態において、前記アセチルキシランエステラーゼポリペプチドは、
(a)配列番号2、3、4または5として示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(b)配列番号2、3、4または5として示すアミノ酸配列から本質的になるポリペプチド、および
(c)配列番号2として示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
から選択される。
【００２６】
しかし、当業者であれば、アスペルギルス属以外の種由来のアセチルキシランエステラーゼも、本発明に係る方法において有用となり得ることを理解されよう。例えば、本発明は、置換、小さな欠失、挿入または逆位等の改変を有するにもかかわらず、アセチルキシランエステラーゼの生物活性を実質的に有するポリペプチドの使用を網羅する。本発明において、結果的に、そのアミノ酸配列が、配列表における配列番号2、3、4または5として示すアミノ酸配列と少なくとも60%、70%、80%、85%、90%または95%相同であるポリペプチドの使用が包含されている。
【００２７】
トランスジェニック植物は、好ましくは、ポプラ、ユーカリノキ、ヤナギおよびイネ科草本等、細胞壁にアセチル化キシランを保有する被子植物および他の植物から選択される。
【００２８】
アカシア、シデ(hornbeam)、ブナ、マホガニー、クルミ、オーク、セイヨウトネリコ、ヒッコリー、カバノキ、クリ、ハンノキ、カエデ、アメリカスズカケノキ(sycamore)、イチョウ、ヤシ、モミジバフウ、イトスギ、ベイマツ、モミ、セコイア、ツガ(hemlock)、ヒマラヤスギ、ビャクシン、カラマツ、マツ、アメリカスギ(redwood)、エゾマツ、イチイ、タケ、スイッチグラス、クサヨシ(red canary grass)、ススキ属(Miscantus)の種およびゴムノキ(rubber plant)も包含されている。
【００２９】
より好ましくは、植物は、ヤナギ科、例えば、ヤナギ属またはポプラ属に由来する。これらの属のメンバーは、その一般名、ヤナギ、ポプラおよびアスペンで知られている。
【００３０】
本発明において、植物または植物の部分が、酵素による加水分解の前に、酸またはアルカリ等の適した薬剤で前処理される方法が包含されている。
【００３１】
本発明は、上述の方法により作出された遺伝子組換え(トランスジェニック)植物をさらに含む。特に、前記遺伝子組換え植物は、前記植物における少なくとも1種の細胞型において、アセチルキシランエステラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを過剰発現する。本発明において、係る植物は、対応する非遺伝子組換え野生型植物と比較して増加した糖化能力を有する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】キシランエステラーゼ(導入遺伝子)を発現するトランスジェニックシロイヌナズナ系統を示す図である。アクチン発現(AT3G18780.2)は、WT(Col 0)およびトランスジェニック系統の均一なcDNAローディングを示す。トランスジェニック系統の正常な成長に留意されたい。2体の異なる植物から得た種子を用いて、系統6cを2連で解析した。
【図２】トランスジェニック系統およびWTの茎組織から得たタンパク質抽出物におけるキシランアセチルエステラーゼ活性を示す図である。総活性、可溶性(S)および壁結合(W)の平均ならびに複製物当たりプールした10本の茎の2つの生物学的複製物のSE。WTと比較したトランスジェニック系統における総活性の統計的に有意な増加を星印で示す。*=P≦10%;**=P≦5%、(t検定)。Y軸:nmol/分/mg単位の比活性。
【図３】トランスジェニック植物の形態および成長。
【図３Ａ】パネルA:様々な植物部分のグラム単位の乾燥重量(Y軸)。L+S;葉+茎、R+R;ロゼット+根。
【図３Ｂ】パネルB:様々な植物部分の含水量(%Y軸)。L+S;葉+茎、R+R;ロゼット+根。  植物部分は、(i)茎および葉;ならびに(ii)根およびロゼットである。値は、30体の植物の平均値±標準誤差SEである。WTと比較したトランスジェニック系統における統計的に有意な変化は、星印により示される。*=P≦10%;**=P≦5%、(t検定)。
【図４】トランスジェニック系統6cおよびWTの生体栄養性病原体ヒアロペロノスポラ・アラビドプシス(Hyaloperonospora arabidopsidis)に対する感受性(Suseptibility)を示す図である。y軸は、胞子数/mg新鮮重を表す。10実験の平均±SE。差は、P≦0.0522(ANOVA)において有意であった。
【図５】真菌CE1を過剰発現するトランスジェニック系統およびWTにおける木材細胞のサイズおよび形状の形態を示す図である。一体にプールした系統当たり5体の植物の胚軸から作製した浸解物(macerate)における細胞の寸法を決定した。N=200細胞、バー=SE。2体の異なる植物から得られた種子を用いて、系統6cを2連で解析した。WTと比較したトランスジェニック系統における統計的有意差を星印で示す。*=P≦10%;**=P≦5%、(スチューデントt検定)。
【図５Ａ】図5Aは繊維の長さを表している。
【図５Ｂ】図5Bは繊維の幅を表している。
【図５Ｃ】図5Cは導管要素の長さを表している。
【図５Ｄ】図5Dは導管の幅を表している。
【図６】キシランエステラーゼを発現するシロイヌナズナ系統およびWTのFT-IR解析を示す図である。
【図６Ａ】パネルA:トランスジェニック系統およびWTの分離を示すOPLS-DA解析。
【図６Ｂ】パネルB:分離に寄与するスペクトルを示すローディングプロット。アセテートおよび吸着水に関連するスペクトルを示す。解析は、WTにおけるより多くのアセテートおよびより少ない吸着水を示す。データ点は、9体の植物から得られた茎を粉砕した粉末のスペクトルである。
【図７】細胞壁アセチル含量を示す図である。各トランスジェニック系統における3つの生物学的複製物およびWTにおける5つの生物学的複製物を用いて、茎粉末において解析を行った。バー=SE。WTと比較したトランスジェニック系統におけるアセチル含量の統計的に有意な減少を星印で示す。*=P≦10%;**=P≦5%、(スチューデントt検定)。Y軸は、mg/g単位の酢酸含量を表している。
【図８】トランスジェニック系統およびWTの細胞壁調製物のキシラナーゼ消化によって得られた中性キシロオリゴ糖のMALDI-AP解析を示す図である。          パネルA:トランスジェニック系統におけるキシランのアクセシビリティの増加は、キシラナーゼ消化物におけるキシロテトラオース(xylotetraose)(xyl4)のより低い含量または欠如により示される。Y軸は、%表記のキシロオリゴ糖シグナル、強度分布を表している。          パネルB:アセチル基を含有するオリゴ糖を同定した。総シグナルにおける、所定のオリゴ糖のDAを乗じたキシロース当たりの規定数のアセチル基を有するアセチル化オリゴ糖の強度のパーセンテージとして、アセチル化指数を計算した。この指数は、WTと比較してトランスジェニック系統におけるより低い相対含量のアセチル化キシロオリゴ糖(xylo-oligasaccharide)を示した。3つの生物学的複製物の平均およびSEを示す。各生物学的複製物は、3体の植物からなった。
【図９】トランスジェニック系統およびWTの細胞壁調製物のキシログルカナーゼ消化により放出されたキシログルコ(xylogluco)オリゴ糖のMALDI-TOF解析を示す図である。値は、相対含量を表す。
【図９Ａ】ガラクトース(図9A)を含有するアセチル化オリゴの含量は、WTと比較して系統6cにおいて低下した。
【図９Ｂ】一方、係るオリゴの非アセチル化(図9B)オリゴの含量は増加した。  N=6、バー=SE。
【図１０】前処理なし(A)、アルカリ前処理あり(B)および酸前処理あり(C)のトランスジェニックシロイヌナズナ系統およびWTにおける糖化率を示す図である。図示されているパーセンテージによるデータは、P≦5%(スチューデントt検定)においてWTと有意に異なる個々の系統に対応する。全トランスジェニック系統対WTの対比の有意性をバーの上に示す。各系統は、30体の植物により表された。4つの技術的複製物の平均およびSE。
【図１１】キシランエステラーゼを発現するトランスジェニックシロイヌナズナ系統およびWTにおける、熱分解-GCにより決定された相対炭水化物(A)および相対リグニン(B)含量を示す図である。トランスジェニック系統の3つの生物学的複製物またはWTの6つの生物学的複製物の平均+/-SE。各生物学的複製物は、3体の植物からなった。S-リグニン(S)、G-リグニン(G)およびH-リグニン(H)。2体の異なる植物から得られた種子を用いて、系統6cを2連で解析した。系統間の差は、ANOVA(P<10%)により統計的に有意ではなかった。AIR2は、デンプン除去(de-starch)されたアルコール不溶性残渣である。
【図１２】キシランエステラーゼを発現するトランスジェニックシロイヌナズナ系統およびWTにおける、アップダグラフ(Updegraff)セルロース(A)およびクラーソン(Klason)リグニン(B)含量を示す図である。AIR1 -  アルコール不溶性残渣;AIR2 -  デンプン除去されたアルコール不溶性残渣。トランスジェニック系統の3つの生物学的複製物またはWTの6つの生物学的複製物の平均+/-SE。各生物学的複製物は、10体の植物からなった。系統間の差は、ANOVA(P<10%)により統計的に有意ではなかった。
【図１３】in vitroで成長した茎組織のRT-PCRにより検出された、35S::CE1構築物を有するアスペン系統およびWTにおける導入遺伝子転写物の存在を示す図である。ローディング参照としてユビキチン転写物を示す。
【図１４】基質としてp-ナフチル(Napthyl)アセテートを用いて測定した、トランスジェニックアスペン系統およびWTアスペンの発達中の木材におけるエステラーゼ活性を示す図である。トランスジェニック系統およびWT当たり6体の樹木の総活性(可溶性、Sおよび壁結合、W)の平均、バー=SE。WTと比較したトランスジェニック系統における活性の統計的に有意な増加を星印で示す。*=P≦10%;**=P≦5%、(スチューデントt検定)。Y軸は、nmol/分/mg単位の比活性を表している。
【図１５】温室におけるトランスジェニックアスペン系統およびWTの高さ(図A)および直径(図B)の成長を示す図である。バー=SE。トランスジェニック系統当たり10体の植物およびWT当たり21体の植物の平均。系統5、8および11は、WTよりも有意に高く、系統4は、有意に短かった(スチューデントt検定、P≦5%)。節間部直径に有意差は観察されなかった。
【図１６】トランスジェニック系統およびWTアスペンの木材における総細胞壁アセチル含量を示す図である。トランスジェニック系統当たり6つの生物学的複製物およびWT当たり10の生物学的複製物の平均。全系統は、WTと比較してアセチル含量の有意な減少を示し(スチューデントt検定)、系統4においてWTレベルの85%まで減った。
【図１７】トランスジェニック系統およびWTアスペンの木材の細胞壁調製物のキシラナーゼ消化により得られた中性キシロオリゴ糖のMALDI-AP解析を示す図である。A.WTと比較したトランスジェニック系統におけるキシランのアクセシビリティの増加は、キシラナーゼ消化物におけるより低い含量のキシロテトラオースおよびより高い含量のキシロビオースにより示される。B.アセチル基を含有する中性オリゴ糖を同定した。総シグナルにおける、所定のオリゴ糖のDAを乗じたキシロース当たりの規定数のアセチル基を有するアセチル化オリゴ糖の強度のパーセンテージとして、アセチル化指数を計算した。この指数は、WTと比較してトランスジェニック系統におけるより低い相対含量のアセチル化キシロオリゴ糖(xylo-oligasaccharide)を示した。2つの生物学的複製物の平均およびSD。
【図１８】トランスジェニック系統およびWTアスペンにおける木材のFTIR解析を示す図である。トランスジェニック系統およびWTの間を識別するスペクトルを示すローディングプロット。識別スペクトルが、WTと比較してトランスジェニック系統における減少を示す1240、1370および1740cm-1におけるアセチル基由来のシグナルならびに増加を示す1659cm-1由来のシグナルを包含したことに留意されたい。
【図１９】キシランエステラーゼを発現するトランスジェニックアスペン系統およびWTにおける、熱分解-GCにより決定された相対炭水化物(A)および相対リグニン(B)含量を示す図である。トランスジェニック系統の8つの生物学的複製物またはWTの21の生物学的複製物の平均+/-SE。系統間の差は、炭水化物含量に関してANOVA(P<10%)により統計的に有意ではなかった。SおよびGリグニン含量は、P≦5%(スチューデントt検定)においてWTと比較して系統4においてそれぞれ減少または増加し、他の系統においては未変化であった。H=H-リグニン。
【図２０】酸前処理後のトランスジェニック35S::CE1アスペン系統およびWTアスペンのイオンクロマトグラフィーを用いることにより決定された糖収量を示す図である。糖収量:72時間の加水分解後の木材1g当たりの各単糖のg数。エラーバーは、標準偏差を示す。系統4、5、8、11、17: 5種のプールした試料の平均。WT: 5種の試料の平均。図示されているパーセンテージによるデータは、P≦5%(スチューデントt検定)においてWTと有意に異なる個々の系統に対応する。全トランスジェニック系統の組み合わせ対WTのP値をバーの上に示す。            図20Aは、前処理液体における糖収量を表す。アラビノースおよびガラクトースの収量は、<0.01g/gであった。平均すると、トランスジェニック系統のグルコースの収量は、WTの収量よりも75%高かった。系統11、17およびWTの加水分解産物におけるマンノースの収量は、<0.01g/gであった。系統4、5および8のマンノース収量は、WTの収量よりも有意に高かった(P<0.05)。            図20Bは、加水分解産物における糖収量を表す。アラビノース、ガラクトースおよびキシロースの収量は、<0.01g/gであった。平均すると、トランスジェニック系統のグルコースの収量は、WTの収量よりも10%高かった。
【図２１】酸前処理後のトランスジェニック35S::CE1アスペン系統およびWTアスペンの総糖収量(前処理および酵素による加水分解の後)を示す図である。糖収量:72時間の加水分解後の木材1g当たりの各単糖のg数。エラーバーは、標準偏差を示す。系統4、5、8、11、17:5種のプールされた試料の平均。WT:5種の試料の平均。図示されているパーセンテージによるデータは、P≦5%(スチューデントt検定)においてWTと有意に異なる個々の系統に対応する。全トランスジェニック系統の組み合わせ対WTのP値をバーの上に示す。図Aは、各単糖の総収量を表す。アラビノースおよびガラクトースの収量は、<0.01g/gであった。平均すると、トランスジェニック系統のグルコースの収量は、WTの収量よりも13%高かった。系統11、17およびWTの加水分解産物におけるマンノースの収量は、<0.01g/gであった。系統4、5および8のマンノース収量は、WTの収量よりも有意に高かった(P<0.05)。図Bは、ヘキソースおよびペントースの形態における総糖収量を表す。ヘキソースの値は、ガラクトース、グルコースおよびマンノースの総収量を示す。ペントースの値は、アラビノースおよびキシロースの総収量を示す。平均すると、トランスジェニック系統のヘキソースの収量は、WTの収量よりも14%高かったが、一方、トランスジェニック系統のペントース収量は、WTの収量とほぼ等しかった。
【図２２】トランスジェニック35S::CE1アスペン系統およびWTアスペン由来の酢酸の収量(g/g)を示す図である。酢酸の収量:72時間の加水分解後の木材1g当たりの酢酸のg数。エラーバーは、標準偏差を示す。系統4、5、8、11、17:5種のプールされた試料の平均。WT:5種の試料の平均。図示されているパーセンテージによるデータは、P≦5%(スチューデントt検定)におけるWTと有意に異なる個々の系統に対応する。全トランスジェニック系統の組み合わせ対WTのP値をバーの上に示す。図Aは、酸前処理後の前処理液体における酢酸収量を示す。平均すると、系統における酢酸の収量は、WTの収量よりも4%低かった。系統4の収量は、WTの収量よりも13%低かった。図Bは、前処理なしの加水分解産物における酢酸収量を示す。平均すると、トランスジェニック系統の酢酸の収量は、WTの収量よりも4%低かった。系統4の収量は、WTの収量よりも11%低かった。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
(実施例)
(実施例1)
アセチルキシランエステラーゼ遺伝子による植物の形質転換
次のプライマーを用いて、クロコウジカビアセチルキシランエステラーゼをコードするcDNA(配列番号1)を増幅した。
5'Fc2fuf(caccATGCTATCAACCCACCTCCTCTCGC)(配列番号6)および
3'Fc2rls(TCAAGCAAACCCAAACCACTCCATATCCTTATC)(配列番号7)
【００３４】
得られたPCR産物を、TOPO(登録商標)クローニングシステム(Invitrogen、米国カリフォルニア州カールスバッド、K2400-20)を用いてpENTR(商標)/D-TOPO(登録商標)プラスミドにクローニングし、続いて、Gateway(登録商標)クローニングシステム(Invitrogen、米国カリフォルニア州カールスバッド)を用いてpK2GW7(Karimi、Mら(2002)、Trends Plant Sci.7(5):193〜195)に移した。得られたベクターを、エレクトロポレーションによりアグロバクテリウム株GV3101(pMP90RK)に形質転換し、プラスミドを含有するコロニーを、次の抗生物質を含むLBプレートにおいて選択した。リファンピシン(10μg/mL-1)、ゲンタマイシン(30μg/mL-1)、カナマイシン(30μg/mL-1)およびスペクチノマイシン(50μg/mL-1)。Clough and Bent(1998)、Plant J 16:735〜743に記載されている通り、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)のアグロバクテリウム媒介性形質転換を行った。形質転換された植物を、1%スクロースおよびカナマイシン(50μg/mL-1)を含む1/2MS培地において選択した。本技術分野において公知の通り、茎および葉柄セグメントを用いて、アスペン植物を同一アグロバクテリウム株で形質転換した。
【００３５】
(実施例2)
シロイヌナズナにおけるCE1発現の効果
シロイヌナズナにおいて、4種の独立的な、単一挿入のホモ接合体系統を解析した。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)により、導入遺伝子の発現を検出した。系統6cは、最高の転写物レベルを有していた(図1)。
【００３６】
トランスジェニック系統は、成熟まで正常に成長した(図1)。プレート(MS+スクロース)における初期実生成長は、有意に影響を受けなかった。
【００３７】
pNP基質を用いて、トランスジェニック系統におけるキシラン酢酸エステラーゼ活性を決定した。トランスジェニック系統の可溶性および壁結合タンパク質画分の両方は、WTと比較してより高いエステラーゼ活性を有していた(図2)。
【００３８】
トランスジェニック植物の形態および成長は、WT植物の形態および成長と目に見えて異ならなかった。本出願人らは、最も高度に発現している系統6cのバイオマスを測定した。バイオマスは異ならなかったが、茎からロゼット葉および根への小さな有意なシフトが存在した。茎の含水量は、僅かに増加した(図3)。
【００３９】
導入された導入遺伝子が生物的ストレスに対する感受性の増加をもたらすか点検するため、最も高度に発現している系統6cにおいて、シロイヌナズナの生体栄養性病原体ヒアロペロノスポラ・アラビドプシスに対する感受性を検査した。植物を接種菌液に曝露し、植物の葉における病原体により産生された胞子数を記録した。トランスジェニック植物は、WT植物よりも少ない数の胞子を呈し(図4)、病原体に対するその抵抗性の増加を示した。
【００４０】
数種のキシラン欠損突然変異体は、不規則な木部表現型を有するため、本出願人らは、木部細胞浸漬物を用いて、トランスジェニック系統およびWTにおける木部細胞形態を解析した(図5)。繊維または導管要素サイズおよび形状のいずれにおいても、有意な効果は観察されなかった。
【００４１】
トランスジェニック系統は、FT-IR解析により実証される通り、変更された茎化学的性質を有していた(図6)。トランスジェニック系統からWTの分離に寄与するスペクトルは、酢酸エステルに相当する3種の波数を包含した:C-Oおよび/またはC-O-Cに相当する1240cm-1、CH3/CH屈曲(bending)に相当する1370cm-1、およびC=Oに相当する1730cm-1。これらの波数におけるシグナルは、野生型(WT)植物と比較してトランスジェニック系統において少ないアセテートが存在することを示す。
【００４２】
NaOHによる鹸化による酢酸の放出を解析することにより、茎における総細胞壁アセチル含量を決定した。高度に発現している系統6cは、WTと比較して酢酸放出の30%減少を示した(図7)。
【００４３】
キシランアセチル化における導入遺伝子の効果を調べるため、キシラナーゼ加水分解後にトランスジェニック系統およびWTの細胞壁から得られたキシランオリゴ糖のMALDI-AP解析を行った。図8は、キシラナーゼによって遊離された異なる中性オリゴ糖を示す。アセチル側鎖が存在する場合、一部のキシランは、キシロビオースまたはキシロトリオース(xylotriose)へと消化され得ないが、その代わりに、図8Aに示す通り、キシロテトラオースが遊離される。よって、アセチル化が高度な程、キシロビオースおよびキシロトリオースと比較してより多くのキシロテトラオースが存在する。この解析によると、WT茎材料は、最も弱いトランスジェニック系統(1a)よりも少なくとも2倍多いキシロテトラオースを有していた。最も強いトランスジェニック系統6cは、キシロテトラオースが全くなかった。
【００４４】
異なるアセチル化キシロオリゴマーが検出され、オリゴマーの総含量に対するその総相対含量をアセチル化指数として計算した(図8B)。この数値は、トランスジェニック系統においてキシランアセチル化の程度が低下し、最も影響を受けた系統が系統6cであったことを示す。
【００４５】
CE1酵素を過剰発現している植物におけるアセチル化の低下が、キシランに加えて他のポリマーにも関係したか検証するため、本出願人らは、キシログルカン特異的グルカナーゼで消化した細胞壁材料のオリゴ糖組成をMALDI-TOFにより解析した(図9)。キシログルカンにおいて、アセチルエステル基は、側鎖の一部に存在するガラクトピラノース残基に存在する。解析は、WTが、系統6cよりも、ガラクトースを含有するより多くのアセチル化キシログルコオリゴ糖を含有したことを示した。結果は、CE1酵素を過剰発現しているトランスジェニック系統の細胞壁におけるアセチル含量の低下が、キシランに加えてキシログルカンに関係することを示す。この結果は、トランスジェニック系統に用いたCE1酵素の広範な特異性を示唆する。
【００４６】
3種の異なる種類の前処理シナリオ適用を用いて、シロイヌナズナの茎リグノセルロースの糖化を行った:0.5M NaOHによる化学的前処理(アルカリ前処理)、1%H2SO4による化学的前処理(酸前処理)および糖化前のみに温水が用いられる場合の化学的前処理なし(水前処理)(図10)。アルカリおよび水前処理の場合、トランスジェニック系統は、WTよりも多くの糖を放出している。
【００４７】
系統6cの植物またはWT植物のいずれかから調製されたリグノセルロースによる、真菌カワラタケ(Trametes versicolor)によるエタノール生産。この真菌は、数日間の期間にわたる液体培養における糖化-発酵サイクルにおいてリグノセルロースを消化および発酵する。両方の種類のリグノセルロースからエタノールを生産し、5日間の培養後に培地においてこれを検出した。エタノール収量は、系統6c由来のリグノセルロースを用いた場合、WT材料由来の生産と比較して30%〜50%増加した。同時に、培地は、発酵および微生物成長の公知の阻害剤である酢酸の含有レベルが低下していた。
【００４８】
熱分解-GCにより茎の化学組成を解析した。この解析は、トランスジェニック系統およびWTの間で炭水化物またはリグニン含量における統計的有意差を示さなかった(図11)。2種の選択された系統、系統4aおよび6cにおけるアップダグラフセルロース解析およびクラーソンリグニン解析により、これらのデータをさらに確認した(図12)。これらのデータは共に、トランスジェニック系統におけるより高い糖化値が、より高い糖変換によるものである、即ち、同様の炭水化物およびリグニン含量を有する材料の、より効果的な糖化過程によるものであることを示す。
【００４９】
要約すると、シロイヌナズナにおけるファミリーCE1由来の真菌アセチルキシランエステラーゼの過剰発現は、キシランアセチル化が低下された植物をもたらした。シロイヌナズナにおける少なくとも2種のマトリックスポリマー、キシランおよびXGにおいてアセチルは低下し、過剰発現した酵素の幅広い作用スペクトルを示唆する。結果的に、化学的前処理なしおよびアルカリ前処理ありで、より高い糖化が観察された。よって、トランスジェニック植物は、より高いエタノール生産能力(但し、正常な成長)と、正常なセルロースおよびリグニン含量と、検査した生体栄養性病原体に対する抵抗性の増加とを組み合わせた。
【００５０】
(実施例3)
雑種アスペンにおけるCE1発現の効果
雑種アスペン(ヨーロッパヤマナラシ(Populus tremula)×アメリカヤマナラシ(tremuloides))、クローンT89において、同一真菌構築物による同様の実験を行った。キシランエステラーゼ転写物が存在するトランスジェニック系統を得て(図13)、繁殖させ、温室内に植えた。本出願人らが、基質として基質p-ナフチルアセテートを用いてトランスジェニック系統におけるエステラーゼ活性を検査したとき、全系統は、WTと比較して酵素活性の増加を示し、活性の増加は、壁結合画分に見られた(図14)。一部の系統において、植物成長は少々影響されていた(図15)。高さ成長は、酵素活性とは全く関係なく、系統5、8および11で増加し、系統4で減少した。直径成長は、有意に影響されなかった。
【００５１】
木材における総細胞壁アセチル含量は、WTと比較して全トランスジェニック系統において減少し、系統4においてWTレベルの85%まで減った(図16)。
【００５２】
MALDI-APによりキシランアセチル化を解析した。解析は、全トランスジェニック系統において、キシランにおけるアセチル化レベルが低下したことを示す(図17)。
【００５３】
FT-IRにより木材の化学的性質をさらに解析した。WTからトランスジェニック系統を分離するスペクトルを示すローディングプロットを、図18に示す。主要な差は、WTにおいてより豊富なヘミセルロースおよびセルロースにおける899cm-1バンド-C-H屈曲の強度と、WTにおいてより少ない吸着水に相当する1650cm-1の強度に見出された。アセチル基(1240、1370および1740cm-1)に相当するスペクトルは、WTにおいてより著しく、トランスジェニック系統と比較してより高含量のアセチルを示す。
【００５４】
アスペン材の熱分解-MS解析は、トランスジェニック系統における炭水化物スペクトルのいかなる変化も明らかにしなかった(図19A)。S、GおよびHリグニンのスペクトルは、WTと比較してGの僅かな増加およびSリグニンの減少を示した系統4を除き、未変化であった(図19B)。
【００５５】
2種の異なるアプローチ、(1)前処理なし、酵素による加水分解(図20A)および(2)酸前処理、続いて酵素による加水分解(図20B)を用いることにより、アスペンの木材の糖化を調査した。イオンクロマトグラフィーを用いて、単糖収量(アラビノース、ガラクトース、グルコース、キシロースおよびマンノース)を決定した。トランスジェニックアスペン系統は、野生型と比較して、グルコース生産速度の改善およびグルコース収量の改善を示した(図20)。トランスジェニック系統4、5および8は、野生型と比較して有意により高いマンノース収量も示した(図21A)。
【００５６】
酸前処理アスペンによる実験は、高収量のグルコースをもたらし、トランスジェニック系統は、これらの条件下においても同様に、より高い糖化能力を有していた(図20および図21)。55%前後のグルカン含量を想定すると、理論上の最大グルコース収量は、木材1g(乾燥重量)当たり0.61g前後のグルコースとなり、該レベルにおける収量は達成可能であった(図21)。平均すると、トランスジェニック系統のグルコースの総収量は、WTよりも13%高かった(図21)。産業上の観点から、高い総糖収量を達成することは重大な意味を持ち、したがって、トランスジェニック植物が、この種の実験において優れた性能を示したことは注目に値する。
【００５７】
トランスジェニック系統および野生型アスペンの前処理なしおよび酸前処理ありの酢酸の収量を調査した(図22)。系統4は、野生型よりも有意に低い収量の酢酸を示した。
【００５８】
【表１】
2015509737.tif 000003
【００５９】
【表２】
2015509737.tif 000004
【００６０】
要約すると、その成長および発達を損なうことなく、植物におけるキシランのアセチル化を減少させることが可能であると示された。シロイヌナズナおよびアスペントランスジェニック植物において、アセチル含量の変化を除き、細胞壁組成における大きな効果は示されなかった。前処理なしおよび希酸前処理ありで、アスペン材の糖化における大きな改善が観察され(最大>40%)、放出された異なる単糖の変化および酢酸放出の軽微な変化が見られた。
【図１】
2015509737.tif 000005
【図２】
2015509737.tif 000006
【図３Ａ】
2015509737.tif 000007
【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
2015509737.tif 000013
【図６Ａ】
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【図７】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図６Ｂ】
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【図８】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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