(57)【要約】本発明は、ウイルス侵入補助因子、特にホスファチジルセリン保有ウイルス感染、例えばフラビウイルス感染を予防または治療するためのホスファチジルセリンとＴＡＭレセプターとの間の相互作用の阻害剤の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス感染を予防または治療するための使用のための、ホスファチジルセリンとＴＡＭレセプターとの間の相互作用の阻害剤であって、該阻害剤が、
（ｉ）ＴＡＭレセプター阻害剤、
（ｉｉ）Ｇａｓ６阻害剤、および／または
（ｉｉｉ）ホスファチジルセリン結合タンパク質
である阻害剤。
【請求項２】
前記ＴＡＭレセプターが、ＴＹＲＯ３、ＡＸＬまたはＭＥＲである、請求項１（ｉ）記載の使用のための阻害剤。
【請求項３】
前記ＴＡＭレセプター阻害剤が、抗ＴＡＭレセプター抗体、アンチセンス核酸、模倣体または変異型ＴＡＭレセプターである、請求項１（ｉ）または２記載の使用のための阻害剤。
【請求項４】
前記Ｇａｓ６阻害剤が、抗Ｇａｓ６抗体、アンチセンス核酸、模倣体または変異型Ｇａｓ６タンパク質である、請求項１（ｉｉ）または２記載の使用のための阻害剤。
【請求項５】
前記ホスファチジルセリン結合タンパク質が、抗ホスファチジルセリン抗体またはアネキシン５である、請求項１（ｉｉｉ）記載の使用のための阻害剤。
【請求項６】
前記ＴＡＭレセプター阻害剤が、配列番号１、２、３、または４の配列のｓｉＲＮＡである、請求項３記載の使用のための阻害剤。
【請求項７】
前記Ｇａｓ６阻害剤が、配列番号１９の配列の変異型Ｇａｓ６タンパク質Ｇａｓ６ΔＧｌａである、請求項４記載の使用のための阻害剤。
【請求項８】
前記ウイルスが、ホスファチジルセリン保有ウイルスである、請求項１記載の使用のための阻害剤。
【請求項９】
前記ホスファチジルセリン保有ウイルスが、アルファウイルスまたはフラビウイルスである、請求項１〜８のいずれか一項記載の使用のための阻害剤。
【請求項１０】
前記アルファウイルスが、チクングニヤウイルスである、請求項９記載の使用のための阻害剤。
【請求項１１】
前記フラビウイルスが、ウエストナイルウイルス、黄熱ウイルスまたはデング熱ウイルスである、請求項９記載の使用のための阻害剤。
【請求項１２】
前記阻害剤が、少なくとも１種の他の抗ウイルス化合物と組み合わせて経時または同時のいずれかでの投与用である、請求項１〜８のいずれか一項記載の使用のための阻害剤。
【請求項１３】
前記他の抗ウイルス化合物が、ホスファチジルセリンとＴＩＭレセプターとの相互作用の阻害剤である、請求項９記載の使用のための阻害剤。
【請求項１４】
前記阻害剤が、薬学的に許容されうる組成物に製剤化される、請求項１〜１０のいずれか一項記載の使用のための阻害剤。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれか一項記載の阻害剤および追加的に少なくとも１種の他の抗ウイルス化合物を含む薬学的組成物。
【請求項１６】
前記少なくとも１種の抗ウイルス化合物が、ホスファチジルセリンとＴＩＭレセプターとの相互作用の阻害剤である、請求項１２記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
細胞へのホスファチジルセリン保有ウイルス、特にフラビウイルスの侵入を阻害するin vitro方法における、請求項１〜８のいずれか一項記載の阻害剤の使用。
【請求項１８】
ウイルス感染、特にＰｔｄＳｅｒ保有ウイルス感染、例えばフラビウイルス感染を予防または治療するための方法であって、それを必要とする個体に、ホスファチジルセリンとＴＡＭレセプターとの間の相互作用の阻害剤の治療有効量を投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ウイルス感染を予防または治療するための、ホスファチジルセリンとＴＡＭレセプターとの間の相互作用の阻害剤の使用に関する。
【０００２】
発明の背景
ウイルス感染は、公衆衛生にとっての大きな脅威である。ウイルスによって引き起こされる生死に関わる疾患（例えば出血熱および脳炎）の出現および拡大は、まだ対処されていない従来の予防アプローチ（例えばワクチン）と共に、これらの致命的な病原体をターゲティングする新しい戦略を探究する必要性を浮き彫りにしている。
【０００３】
例えばフラビウイルス属は、単一のプラス鎖ＲＮＡゲノムを収容している７０種を超える小型エンベロープウイルスを包含している。デングウイルス（ＤＶ）、黄熱ウイルス（ＹＦＶ）、およびウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）などのこの属のいくつかのメンバーは、出血熱および脳炎を含めた多様な医学的に関連するヒト疾患を引き起こす蚊媒介ヒト病原体である（Gould and Solomon, 2008, Lancet, 371:200-509; Gubler et al., 2007, Fields Virology, 5th Edition, 1153-1252）。抗原的に関係する４つの血清型（ＤＶ１〜ＤＶ４）によって引き起こされるデング病は、この数十年間の世界的な健康問題として出現し、最も医学的に関連するアルボウイルス疾患の一つである。年間５０００万〜１億のデング症例が発生し、２５億人を超える人々が感染のリスクに曝されていると推定されている。４つの血清型のどれによる感染も、軽い発熱から生死に関わるデング出血熱（ＤＨＦ）およびデングショック症候群（ＤＳＳ）にわたる疾患を引き起こす。ヒト病原体としてのＤＶの重要性および増え続ける発生率にかかわらず、現在のところＤＶに対して利用できる認可されたワクチンはなく、抗ウイルス薬の欠如が治療法の選択肢をひどく制限している。
【０００４】
デング病と闘うための今後の取り組みは、ＤＶの生活環をよりよく理解することを必要とする。標的細胞内へのＤＶの侵入は、宿主の範囲、細胞親和性およびウイルスの病原性の主な決定因子であるので、予防的抗ウイルス戦略と同様に治療的抗ウイルス戦略のための有望な標的である。ＤＶは、一次感染時に、ウイルス糖タンパク質（Ｅタンパク質）と細胞レセプターとの間の相互作用によって駆動される過程であるクラスリン媒介性エンドサイトーシスによって宿主細胞に侵入する。エンドソーム内で酸性環境がＥタンパク質の不可逆的三量体化をトリガーし、それがウイルス膜と細胞膜との融合を招き、サイトゾル内にウイルスキャプシドおよびゲノムＲＮＡを放出させる。現在までにウイルス侵入に至るＤＶ−宿主相互作用の分子的基盤はあまり理解されておらず、ＤＶ細胞レセプター（一つまたは複数）の独自性に関してほとんど分かっていない。ＤＶは広範囲の細胞型に感染することが分かっている。したがって、ＤＶは標的細胞に応じて異なるレセプターを活用するか、または広く発現されている侵入分子を利用する可能性がある。初期の研究から、ＤＶビリオンが細胞膜上のヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合することによって宿主と最初の接触を行うことが示された。これらの分子は、Ｅタンパク質表面の正荷電した残基を認識する。そして、これらの分子は、標的細胞の表面にウイルスを集め、その後ウイルスが侵入因子と相互作用すると考えられている。熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）、ＨＳＰ９０、ＧＲＰ７８／Ｂｉｐ、リポ多糖レセプターＣＤ１４または３７／６７kDa高親和性ラミニンなどの数多くの細胞タンパク質が推定上のＤＶ侵入レセプターとして提唱されている。しかし、ウイルス侵入に果たすそれらの機能はあまり特徴づけられていないままであり、生理学的関連性が不明である。現在までに唯一はっきりと特徴づけられた、ＤＶ侵入プログラムに能動的に関与する因子は、樹状細胞上に発現されるＤＣ−ＳＩＧＮ、肝臓類洞内皮細胞上に発現されるＬ−ＳＩＧＮおよびマクロファージ上に発現されるマンノースレセプター（ＭＲ）である。これらの分子はＣ型レクチンレセプターファミリーに属し、ＤＶのＥタンパク質上に発現した富マンノースＮ結合型グリカンと結合する。しかし、ＤＶがＤＣ−ＳＩＧＮ、ＭＲまたはＬ−ＳＩＧＮを発現しない細胞型に感染することは、他の関連侵入レセプター（一つまたは複数）が存在し、依然として特定されていないことを示している。
【０００５】
細胞表面レセプターとＥタンパク質の相互作用によって媒介される古典的細胞侵入経路に加えて、体液および組織中に存在する可溶性成分がＤＶ粒子と相互作用してウイルスの内部移行を増強しうるというのが妥当であるように思われる。この仮説を裏付けるものとして、最近の研究から、蚊細胞へのＷＮＶの取り込みが分泌型のＣ型レクチンｍｏｓＧＴＬＣ−１によって媒介されることが示された。この可溶性因子は高い親和性でＷＮＶ粒子と結合し、推定によると、ＷＮＶ粒子をその細胞レセプターｍｏｓＰＴＰ−１に架橋することでウイルスの侵入を促進する。別の例は、ヒトアデノウイルス（ＨＡｄＶ）Ｖ５によって代表され、そのウイルスはヒト血液凝固因子Ｘ（ＦＸ）と相互作用する結果として、ＨＡｄＶ５ベクター粒子の大規模な肝臓取り込みを担う主要なパラメーターであるＦＸ−ＨＡｄＶ５複合体の形成を招く。上述の情報に基づくと、ＤＶ侵入過程はおそらく以前に考えられていたよりも複雑である可能性がある。ＤＶの付着および内部移行が、いくつかのレセプターと、可能性があることにはＤＶの細胞結合およびウイルス親和性に有利に働きうる体液中に循環する可溶性成分とを要する多段階過程であると仮定することが合理的である。
【０００６】
現在、ＤＶは世界的な問題になり、１１０ヶ国よりも多い国で地方病である。したがって、ＤＶ感染の予防的処置または治療的処置の開発が必要とされる。
【０００７】
そのうえ、ＤＶの内部移行機構を明らかにすることも、他のウイルス感染の処置を開発する道を開く可能性がある。
【０００８】
発明の説明
本発明者らは、ＤＶ感染がＤＶウイルスエンベロープ表面に存在するホスファチジルセリン（ＰｔｄＳｅｒ）と宿主細胞表面に存在するＴＡＭレセプターとの間の相互作用によって媒介されること、および当該相互作用を遮断することによって宿主細胞内へのＤＶ侵入を阻害してＤＶ感染を予防できることを見いだした。
【０００９】
さらに本発明者らは、ホスファチジルセリン（ＰｔｄＳｅｒ）とＴＡＭレセプターとの間のこの相互作用が、黄熱ウイルス（ＹＦＮ）およびウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）などの他のフラビウイルスによってだけでなく、例えばチクングニヤウイルスによっても利用されることを見いだし、これは、この相互作用が膜内にホスファチジルセリン（ＰｔｄＳｅｒ）を組み入れているウイルスによって活用される一般メカニズムを表しうることを示している。
【００１０】
したがって本発明は、ウイルス感染、特にフラビウイルス感染などのホスファチジルセリン（ＰｔｄＳｅｒ）保有ウイルス感染を予防または治療するための使用のための、ホスファチジルセリンとＴＡＭレセプターとの間の相互作用の阻害剤に関し、ここで該阻害剤は、好ましくは（ｉ）ＴＡＭレセプター阻害剤、（ｉｉ）Ｇａｓ６阻害剤、および／または（ｉｉｉ）ホスファチジルセリン結合タンパク質である。好ましくは、該相互作用は間接相互作用である。「ホスファチジルセリン保有ウイルス感染」は、特に「フラビウイルス感染」を意味する。「フラビウイルス感染」は、デングウイルス（ＤＶ）、ウエストナイルウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルスまたは黄熱ウイルスの感染を意味する。好ましくは、該ＴＡＭレセプターはＴＹＲＯ３、ＡＸＬまたはＭＥＲである。好ましくは、該ＴＡＭレセプター阻害剤は抗ＴＡＭレセプター抗体、アンチセンス核酸、模倣体または変異型ＴＡＭレセプターであり、より好ましくは、該ＴＡＭレセプター阻害剤はｓｉＲＮＡである。好ましくは、該Ｇａｓ６阻害剤は抗Ｇａｓ６抗体、アンチセンス核酸、模倣体または変異型Ｇａｓ６タンパク質である。好ましくは、該ホスファチジルセリン結合タンパク質は抗ホスファチジルセリン抗体またはアネキシン５である。
【００１１】
ホスファチジルセリンとＴＡＭレセプターとの間の相互作用の阻害剤および追加的に少なくとも１種の他の抗ウイルス化合物を含む薬学的組成物も提供される。好ましくは、該少なくとも１種の他の抗ウイルス化合物は、ホスファチジルセリンとＴＩＭレセプターとの間の相互作用の阻害剤である。
【００１２】
細胞へのウイルス、特にフラビウイルスなどのＰｔｄＳｅｒ保有ウイルスの侵入を阻害する方法における、ホスファチジルセリンとＴＡＭレセプターとの間の相互作用の阻害剤の使用がさらに提供される。
【００１３】
ウイルス感染、特にフラビウイルス感染などのＰｔｄＳｅｒ保有ウイルス感染を予防または治療するための方法であって、それを必要とする個体に、ホスファチジルセリンとＴＡＭレセプターとの間の相互作用の阻害剤の治療有効量を投与することを含む方法も提供される。
【００１４】
ウイルス感染、特にＰｔｄＳｅｒ保有ウイルス感染、特にフラビウイルス感染を予防または治療するための医薬を製造するための、ホスファチジルセリンとＴＡＭレセプターとの間の相互作用の阻害剤の使用も提供される。
【００１５】
定義
「ホスファチジルセリン保有ウイルス感染」は、その膜にＰｔｄＳｅｒを発現または組み入れているエンベロープウイルスの感染を意味する。感染前に、ウイルス膜上のＰｔｄＳｅｒが宿主細胞のレセプターに曝される。ＰｔｄＳｅｒを保有するエンベロープウイルスの例には、非限定的にフラビウイルス（デングウイルス、ウエストナイルウイルス、黄熱ウイルスなど）、アルファウイルス（例えばチクングニヤウイルス）、フィロウイルス（例えばエボラウイルス）、ポックスウイルス（Poxivirus）（例えば牛痘ウイルス）およびアレナウイルス（例えばラッサウイルス）が含まれる。
【００１６】
「ホスファチジルセリン保有ウイルス感染」には、例えば「フラビウイルス感染」が含まれうる。「フラビウイルス感染」は、デングウイルス（ＤＶ）、ウエストナイルウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルスまたは黄熱ウイルスの感染を意味する（Sabin et al., 1952, A.B. Am. J. Trop. Med. Hyg. 1:30-50; Hammon et al., 1960, Trans. Assoc. Am. Physicians 73:140-155; Smithburn, 1940, Am. J. Trop. Med., 20:471-492; Monath and Heinz, 1996, Flaviviruses, Fields Virology, 3rd edition, p.961-1034; Gould and Solomon, 2008, Lancet, 371:500-509）。デングウイルスは、任意の血清型、すなわち血清型１、２、３または４でありうる。
【００１７】
「ホスファチジルセリンとＴＡＭレセプターとの間の相互作用」は、好ましくはＰｔｄＳｅｒ保有ウイルスの表面に存在するホスファチジルセリンと宿主細胞の表面に存在するＴＡＭレセプターとの間の間接相互作用を意味する。実際に、本発明者らは、ホスファチジルセリンとＴＡＭレセプターとの間の相互作用が、例えばＧａｓ６タンパク質でありうる架橋分子によって媒介されること、およびこの間接相互作用が宿主細胞へのＰｔｄＳｅｒ保有ウイルスの感染または侵入を許すことを見いだした。
【００１８】
「阻害剤」は、ホスファチジルセリンとＴＡＭレセプターとの間の相互作用を減少または消失させることができる薬剤を意味する。該阻害剤は、また、ＴＡＭレセプターおよび／またはＧａｓ６などの架橋分子の発現を減少または消失させることができる場合がある。本発明によると、該阻害剤は、例えば（ｉ）ＴＡＭレセプター阻害剤、（ｉｉ）Ｇａｓ６もしくは他の架橋分子の阻害剤、および／または（ｉｉｉ）ホスファチジルセリン結合タンパク質でありうる。
【００１９】
好ましくは、該阻害剤は、ホスファチジルセリンとＴＡＭレセプターとの間の相互作用、ならびに／またはＴＡＭレセプターおよび／もしくは架橋分子の発現を、少なくとも１０、２０、３０、４０％、より好ましくは少なくとも５０、６０、７０％、最も好ましくは少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％減少または消失させることができる。
【００２０】
本明細書におけるポリペプチドおよび核酸への言及には、本明細書において開示されたアミノ酸配列および核酸配列と該配列の変異体との両方が含まれる。
【００２１】
変異型タンパク質は、スプライス変異体、アレルおよびアイソフォームなどの天然変異体の場合があり、またはそれらは組み換え手段によって産生されうる。アミノ酸配列内の変異は、タンパク質のアミノ酸配列に変化を招く、タンパク質をコードする核酸配列への一つまたは複数のコドンの置換、欠失または挿入によって導入することができる。場合により、変異は、タンパク質中の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれよりも多いアミノ酸を任意の他のアミノ酸で置換することによる。追加的にまたは代替的に、変異は、タンパク質内に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれよりも多いアミノ酸を追加または欠失させることによる場合がある。
【００２２】
変異型核酸配列には、中または高ストリンジェンシー条件で配列番号１〜４、６、９、１０、１２、１６〜１８、２１、２３〜２５、２８、３１、３２、３３〜３６の配列に特異的にハイブリダイゼーションする能力がある配列が含まれる。ストリンジェントな条件または高ストリンジェンシー条件は：（１）洗浄に低イオン強度および高温、例えば０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを５０℃で採用する；（２）ハイブリダイゼーションの際にホルムアミドなどの変性剤、例えば０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／５０mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を７５０mM塩化ナトリウム、７５mMクエン酸ナトリウムと共に、５０％(v/v)ホルムアミドを４２℃で採用する；または（３）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μg/ml）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを４２℃で採用し、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中、４２℃でおよび５０％ホルムアミド中５５℃で洗浄し、続いてＥＤＴＡ含有０．１×ＳＳＣから成る高ストリンジェンシー洗浄を５５℃で行う条件によって特定することができる。中ストリンジェント条件は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989によって記載されたように特定することができ、その条件は上記の条件よりもストリンジェントではない洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば温度、イオン強度および％ＳＤＳ）の使用を含んでいる。中ストリンジェント条件の一例は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０mM ＮａＣｌ、１５mMクエン酸三ナトリウム）、５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０mg/ml変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中３７℃で一晩インキュベーションに続き、約３７〜５０℃の１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することである。
【００２３】
本明細書において開示されたタンパク質および変異型タンパク質のフラグメントもまた、本発明によって包含される。そのようなフラグメントは、例えば全長タンパク質に比べて、Ｎ末端もしくはＣ末端で切断されている場合があり、または内部残基を欠如している場合がある。ある種のフラグメントは、酵素活性に不可欠ではないアミノ酸残基を欠如している。好ましくは、該フラグメントは、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１５０、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００またはそれよりも多いアミノ酸長である。
【００２４】
本明細書において開示された核酸配列および変異体のフラグメントもまた、本発明によって包含される。そのようなフラグメントは、例えば全長核酸配列に比べて、３’もしくは５’末端で切断されている場合があり、または内部塩基を欠如している場合がある。好ましくは、該フラグメントは、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１５０、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００またはそれよりも多い塩基長である。
【００２５】
変異型タンパク質には、本明細書において開示されたポリペプチド配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質が含まれうる。好ましくは、変異型タンパク質は、本明細書において開示されたような全長ポリペプチド配列またはポリペプチド配列のフラグメントと少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のアミノ酸配列同一性を有する。アミノ酸配列同一性は、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮せずに、最大の配列同一率（％）を達成するために配列をアライメントし、必要に応じてギャップを導入した後に、参照配列中のアミノ酸残基と同一な変異型配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。配列同一性は、変異型配列の全長、参照配列の全長、またはその両方にわたり決定することができる。
【００２６】
変異型核酸配列には、本明細書において開示された核酸配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する核酸配列が含まれうる。好ましくは、変異型核酸配列は、本明細書において開示された全長核酸配列または核酸配列のフラグメントと少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のアミノ酸配列同一性を有する。核酸配列同一性は、最大の配列同一率（％）を達成するために配列をアライメントし必要に応じてギャップを導入した後に、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮せずに参照配列中の核酸残基と同一な変異型配列中の核酸のパーセンテージとして定義される。配列同一性は、変異型配列の全長、参照配列の全長、またはその両方にわたり決定することができる。
【００２７】
本発明の問い合わせアミノ酸配列と少なくとも例えば９５％「同一な」アミノ酸配列を有するポリペプチドは、対象ポリペプチドのアミノ酸配列が問い合わせ配列と同一であるが、但し、対象ポリペプチド配列が問い合わせアミノ酸配列のアミノ酸１００個あたり最大５個のアミノ酸変化を含みうることを意味する。言い換えると、問い合わせアミノ酸配列と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、対象配列中のアミノ酸残基の最大５％（１００個中５個）は挿入されている、欠失している、または別のアミノ酸によって置換されている場合がある。
【００２８】
本出願に関連して、同一パーセンテージはグローバルアライメント（すなわち２個の配列をそれらの全長にわたり比較する）を用いて計算される。２個以上の配列の同一性を比較するための方法は、当技術分野において周知である。２個の配列の全長を考慮する場合、それらの最適なアライメント（ギャップを含む）を見いだすために、例えばNeedleman-Wunschグローバルアライメントアルゴリズムを使用している「needle」プログラム（Needleman and Wunsch, 1970 J. Mol. Biol. 48:443-453）を使用することができる。needleプログラムは、例えばウェブサイトebi.ac.ukから入手することができる。本発明による同一パーセンテージは、好ましくはEMBOSS::needle（グローバル）プログラムを使用して、「ギャップオープン」パラメーター＝１０．０、「ギャップ伸長」パラメーター＝０．５、およびBlosum62マトリックスで計算される。
【００２９】
参照配列に「少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一な」アミノ酸配列から成るタンパク質は、参照配列に比べて欠失、挿入および／または置換などの突然変異を含みうる。置換の場合、参照配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なアミノ酸配列から成るタンパク質は、参照配列と別の種から得られた相同配列に該当しうる。
【００３０】
アミノ酸置換は、保存的または非保存的でありうる。好ましくは、置換は保存的置換であり、保存的置換では、アミノ酸１個を類似の構造的および／または化学的性質を有する別のアミノ酸の代わりに置換する。置換は、好ましくは下表に示されるような保存的置換に該当する。
【００３１】
【表１】
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【００３２】
用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、すなわち抗原と免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を表す。このように、抗体という用語は、抗体分子全体だけでなく抗体フラグメントおよびヒト化抗体などの誘導体を含めた抗体変異体も包含する。天然抗体では、２本の重鎖がジスルフィド結合によって相互に結合し、各重鎖がジスルフィド結合によって軽鎖に結合している。軽鎖にはラムダ（λ）およびカッパ（κ）の２種類がある。抗体分子の機能的活性を決定する５種の主要重鎖クラス（またはアイソタイプ）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥがある。各鎖は、別個の配列ドメインを含有する。軽鎖は、２個のドメイン、すなわち可変ドメイン（ＶＬ）および定常メイン（ＣＬ）を含む。重鎖は、４個のドメイン、すなわち可変ドメイン（ＶＨ）および３個の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３、まとめてＣＨと呼ばれる）を含む。軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）の両方の可変領域は、抗原への結合認識および特異性を決定する。軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ）の定常領域ドメインは、抗体鎖の会合、分泌、経胎盤移動性、補体結合、およびＦｃレセプター（ＦｃＲ）との結合などの重要な生物学的性質を付与する。Ｆｖフラグメントは、免疫グロブリンのＦａｂフラグメントのＮ末端部分であり、１本の軽鎖および１本の重鎖の可変部分から成る。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基との間の構造相補性にある。抗体結合部位は、主に超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基から構成される。時に、非超可変領域またはフレームワーク領域（ＦＲ）由来の残基は、全体的なドメイン構造に、それ故に結合部位に影響する。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、一緒になってネイティブな免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性および特異性を定義するアミノ酸配列を表す。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は、それぞれが各々Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３およびＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３と称される３個のＣＤＲを有する。したがって、抗原結合部位は、重鎖Ｖ領域および軽鎖Ｖ領域のそれぞれ由来のＣＤＲセットを含む６個のＣＤＲを含む。
【００３３】
Kabatら（Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991）によって定義されたように、フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲの間に介在するアミノ酸配列を表し、すなわち単一種において異なる免疫グロブリンの間で相対的に保存されている、免疫グロブリン軽鎖および重鎖の可変領域の部分を表す。本明細書に使用される「ヒトフレームワーク領域」は、天然ヒト抗体のフレームワーク領域に実質的に（約８５％以上、特に９０％、９５％、または１００％）同一なフレームワーク領域である。
【００３４】
本明細書に使用される用語「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」は、特異的抗原に対する単一アミノ酸組成の抗体分子であって、単一クローンのＢ細胞またはハイブリドーマによって産生されうる抗体分子を表す。モノクローナル抗体は、また、リコンビナントの場合があり、すなわちタンパク質工学によって産生される場合がある。
【００３５】
用語「キメラ抗体」は、非ヒト動物から得られた抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインが、別の抗体、特にヒト抗体のＣＨドメインおよびＣＬドメインと結合したものを含む加工抗体を表す。非ヒト動物として、マウス、ラット、ハムスター、ウサギなどの任意の動物を使用することができる。キメラ抗体は、また、少なくとも２種の異なる抗原に対して特異性を有する多重特異性抗体を意味しうる。
【００３６】
用語「ヒト化抗体」は、フレームワーク領域または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が改変されて、親免疫グロブリンのＣＤＲと異なる特異性のドナー免疫グロブリン由来ＣＤＲを含むようになった抗体を表す。好ましい一態様では、「ヒト化抗体」を調製するために、マウスＣＤＲがヒト抗体のフレームワーク領域に接ぎ合わされる。
【００３７】
「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の部分、好ましくはインタクトな抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、二重特異性抗体および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が含まれる。
【００３８】
用語「Ｆａｂ」は、分子量約５０，０００および抗原結合活性を有する抗体フラグメントであって、ＩｇＧをプロテアーゼであるパパインで処理することによって得られたフラグメントのうちＨ鎖のＮ末端側の約半分およびＬ鎖全体がジスルフィド結合を介して一緒に結合している抗体フラグメントを意味する。
【００３９】
用語「Ｆ（ａｂ’）２」は、分子量約１００，０００および抗原結合活性を有する抗体フラグメントであって、ＩｇＧをプロテアーゼであるペプシンで処理することによって得られたフラグメントのうち、Ｆａｂよりもわずかに大きな抗体フラグメントがヒンジ領域のジスルフィド結合を経由して結合している抗体フラグメントを表す。
【００４０】
用語「Ｆａｂ’」は、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによって得られる、分子量約５０，０００および抗原結合活性を有する抗体フラグメントを表す。
【００４１】
単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、通常、ペプチドをコードするリンカーによって結合されたＶＨコード遺伝子およびＶＬコード遺伝子を含む遺伝子融合体から発現された共有結合型ＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。本発明のヒトｓｃＦｖフラグメントには、好ましくは遺伝子組換え技法を用いることによって適切なコンフォメーションに保持されたＣＤＲが含まれる。「ｄｓＦｖ」はジスルフィド結合によって安定化されたＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。２価および多価抗体フラグメントは、１価ｓｃＦｖの会合によって自然に形成させることができ、または２価ｓｃ（Ｆｖ）２のようにペプチドリンカーによって１価ｓｃＦｖを結合させることによって発生させることができる。
【００４２】
用語「二重特異性抗体」は、２個の抗原結合部位を有する小型抗体フラグメントであって、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合して同じポリペプチド鎖になったものを含む抗体フラグメント（ＶＨ−ＶＬ）を表す。同じ鎖上の２個のドメインの間で対形成させるには短すぎるリンカーを使用することによって、これらのドメインは別の鎖の相補的ドメインと対形成するよう強制され、２個の抗原結合部位を創出する。
【００４３】
「アンチセンス核酸」は、ＲＮＡ−−ＲＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−ＰＮＡ（タンパク質核酸; Egholm et al., 1993, Nature, 365: 566）相互作用により標的ＲＮＡに結合し、標的ＲＮＡの活性を変化させる非酵素的核酸分子を意味する（総説についてはStein and Cheng, 1993, Science, 261, 1004およびWoolfら、米国特許第５，８４９，９０２号を参照されたい）。典型的には、アンチセンス分子は、アンチセンス分子の単一連続配列に沿って標的配列と相補的である。しかし、ある態様では、アンチセンス分子は、基質分子がループもしくはヘアピンを形成するように基質に結合することができ、かつ／またはアンチセンス分子がループもしくはヘアピンを形成するように結合することができる。したがって、アンチセンス分子は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくはそれよりも多い非連続基質配列に相補的な場合があり、またはアンチセンス分子の２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくはそれよりも多い非連続配列部分が標的配列に相補的な場合があり、またはその両方である（例えばCrooke, 2000, Methods Enzymol., 313: 3-45参照）。加えて、アンチセンスＤＮＡはＤＮＡ−ＲＮＡ相互作用によりＲＮＡをターゲティングすることによってＲＮａｓｅ Ｈ（二本鎖の標的ＲＮＡを消化する）を活性化するために使用することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡのＲＮＡｓｅ Ｈ切断を活性化する能力がある１個または複数のＲＮＡｓｅ Ｈ活性化領域を含みうる。
【００４４】
アンチセンス核酸は、導入されると、通常ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路と呼ばれる細胞経路に入る。用語「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」は、遺伝子サイレンシングとも呼ばれるＲＮＡの選択的細胞内分解を表す。ＲＮＡｉには、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）による翻訳抑制も含まれる。ＲＮＡｉは、長二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）もしくはｓｉＲＮＡの導入、または例えばプラスミドもしくは導入遺伝子からのｓｉＲＮＡの細胞内産生により開始して、１つ以上の標的遺伝子の発現をサイレンシングすることができる。または、ＲＮＡｉは細胞内で自然に生じ、外来ＲＮＡ、例えばウイルスＲＮＡを除去する。自然ＲＮＡｉは、ｄｉｃｅｒが前駆ｄｓＲＮＡのフラグメント化を指揮し、分解メカニズムを他の同族ＲＮＡ配列に向けることを介して進行する。
【００４５】
いくつかの態様では、アンチセンス核酸は、長二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および／または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）でありうる。
【００４６】
本明細書に使用される「長二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」は、ゲノムもしくは合成起源の、またはベクターの発現から得られた、改変または非改変のオリゴリボヌクレオチドまたはポリリボヌクレオチド、およびそのフラグメントまたは部分であって、部分二本鎖または完全二本鎖の場合があり、かつ平滑末端であるか、または５’および／もしくは３’オーバーハングを含む場合があり、また、二つ折りになって二本鎖領域が得られる１本鎖オリゴリボヌクレオチドを含むヘアピン形態でもありうるものを表す。いくつかの態様では、ｄｓＲＮＡは、１５０bpから３０００bpに及ぶ、好ましくは２５０bpから２０００bpに及ぶ、いっそうより好ましくは３００bpから１０００bpに及ぶ大きさを有する。いくつかの態様では、該ｄｓＲＮＡは、少なくとも１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１５００bpの大きさを有する。いくつかの態様では、該ｄｓＲＮＡは、最大で３０００、２５００、２０００、１５００、１０００、９５０、９００、８５０、８００、７５０、７００、６５０、６００、５５０、５００、４５０、４００、３５０、３００bpの大きさを有する。
【００４７】
「低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」は、関心がもたれる遺伝子にターゲティングされたＲＮＡ二本鎖のヌクレオチドである。ＲＮＡ二本鎖は、ＲＮＡ分子の２領域の間の相補的対形成によって形成される構造を表す。ｓｉＲＮＡは、その二本鎖部分のヌクレオチド配列が、ターゲティングされた遺伝子のヌクレオチド配列と相補的であるような遺伝子にターゲティングされる。いくつかの態様では、ｓｉＲＮＡの二本鎖長は、ヌクレオチド１５個からヌクレオチド５０個に及び、好ましくはヌクレオチド２０個からヌクレオチド３５個に及び、いっそうより好ましくはヌクレオチド２１個からヌクレオチド２９個に及ぶ。いくつかの態様では、二本鎖は、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド長でありうる。いくつかの態様では、二本鎖は、最大で４５、４０、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５ヌクレオチド長でありうる。ｓｉＲＮＡのＲＮＡ二本鎖部分は、ヘアピン構造の部分でありうる。二本鎖部分に加えて、ヘアピン構造は、二本鎖を形成する二つの配列の間に位置するループ部分を含有しうる。ループは、様々な長さでありうる。いくつかの態様では、ループは５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３ヌクレオチド長である。ヘアピン構造は、また、３または５オーバーハング部分を含有しうる。いくつかの態様では、オーバーハングは０、１、２、３、４、または５ヌクレオチド長の３’または５’オーバーハングである。
【００４８】
細胞および生物へのアンチセンス核酸の注入およびトランスフェクションが、主な送達方法である。しかし、一過性および安定トランスフェクションされた哺乳動物細胞においてアンチセンス核酸を連続的に発現させるために、発現ベクターも使用することができる。（例えば、Brummelkamp et al., 2002, Science, 296:550-553; Paddison et al., 2002, Genes & Dev, 16:948-958参照）。
【００４９】
アンチセンス核酸は、化学合成することができ、または例えばCaruthers et al., 1992, Methods in Enzymology, 211:3-19；国際ＰＣＴ公報である国際公開公報第９９／５４４５９号; Brennan et al., 1998, Biotechnol Bioeng. 61:33-45、および米国特許第６，００１，３１１号に記載されている当技術分野において公知のプロトコールを用いて、一本鎖ＤＮＡ発現ベクターもしくはその同等物の使用により発現させることができる。非限定的な一例では、394 Applied Biosystems, Inc.合成装置で小規模合成を行う。または本発明のアンチセンス核酸分子を別々に合成し、合成後に、例えばライゲーションによって一緒につなぎ合わせることができる（国際ＰＣＴ公報である国際公開公報第９３／２３５６９号、Bellon et al., 1997, Bioconjugate Chem, 8:204）。
【００５０】
本発明のアンチセンス核酸は、標的遺伝子、例えばＴＡＭレセプターまたはＧａｓ６タンパク質の発現を少なくとも１０、２０、３０、４０％、より好ましくは少なくとも５０、６０、７０％、最も好ましくは少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、１００％低下させることができうる。
【００５１】
「変異型ＴＡＭレセプター」または「変異型Ｇａｓ６タンパク質」または「変異型ＴＩＭレセプター」は、それぞれＴＡＭレセプターまたはＧａｓ６タンパク質またはＴＩＭレセプターと１個または数個のアミノ酸が異なるレセプターまたはタンパク質を意味する。例えば、該変異型ＴＡＭレセプターは、例えば突然変異Ｅ６３Ｒ、Ｅ６６ＲもしくはＴ８４７Ｒを保有する配列番号７もしくは８の配列のＡＸＬレセプターのように、もはやＧａｓ６タンパク質と結合できない点で、または例えば突然変異Ｋ５５８Ｍを保有する配列番号７の配列のＡＸＬレセプターもしくは突然変異Ｋ５６７Ｍを保有する配列番号８の配列のＡＸＬレセプターのように、もはやそのキナーゼ活性を有することができない点で、ＴＡＭレセプターと異なりうる。例えば、該変異型Ｇａｓ６タンパク質は、もはやホスファチジルセリンおよび／またはＴＡＭレセプターに結合できない点でＧａｓ６タンパク質と異なりうる。例えば、該変異型Ｇａｓ６タンパク質は、配列番号１９の配列のＧａｓ６Δｇｌａ（ｒｍＧａｓ６Δｇｌａとも呼ばれる）でありうる。例えば、該変異型ＴＩＭレセプターは、もはやホスファチジルセリンに結合できない点で、またはもはやそのキナーゼ活性を有することができない点で、ＴＩＭレセプターと異なりうる。
【００５２】
用語「対象」、「個体」または「宿主」は、互換的に使用され、例えばヒトまたは非ヒト哺乳動物でありうる。例えば対象は、コウモリ；フェレット；ウサギ；ネコ科動物（ネコ）；イヌ科動物（イヌ）；霊長類（サル）、ウマ科動物（ウマ）；男性、女性、子供を含めたヒトである。
【００５３】
ホスファチジルセリンとＴＡＭレセプターとの間の相互作用の阻害剤
ホスファチジルセリンは、リン酸基がセリンアミノ酸と結合しているリン脂質であって、ＣＡＳ番号８００２−４３−５で参照されるリン脂質である。
【００５４】
「ＴＡＭレセプター」は、Ｔｙｒｏ３／Ａｘｌ／Ｍｅｒファミリーのチロシンキナーゼレセプターを意味する。好ましい態様では、該ＴＡＭレセプターはＴＹＲＯ−３、ＡＸＬまたはＭＥＲレセプターである。
【００５５】
好ましくは、ＴＹＲＯ−３レセプターは、
ａ）配列番号５の配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００６２８４．２、２０１１年１１月１４日更新）、
ｂ）配列番号６の配列の核酸（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００６２９３．３、２０１２年１月１４日更新）によってコードされる配列、
ｃ）ａ）またはｂ）の配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％同一な配列
を含む、またはそれから成る。
【００５６】
好ましくは、ＡＸＬレセプターは、
ａ）配列番号７の配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１６９０．２、２０１１年１１月２６日更新）、
ｂ）配列番号８の配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０６８７１３．２、２０１１年１１月２６日更新）、
ｃ）配列番号９の配列の核酸（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０２１９１３．３、２０１２年１月１５日更新）によってコードされる配列、
ｄ）配列番号１０の配列の核酸（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１６９９．４、２０１２年１月１５日更新）によってコードされる配列、
ｅ）ａ）〜ｄ）の配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％同一な配列
を含む、またはそれから成る。
【００５７】
好ましくは、ＭＥＲレセプターは、
ａ）配列番号１１の配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００６３３４．２、２０１１年１２月２４日更新）、
ｂ）配列番号１２の配列の核酸（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００６３４３．２、２０１１年１２月２４日更新）によってコードされる配列、
ｃ）ａ）またはｂ）の配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％同一な配列
を含む、またはそれから成る。
【００５８】
Ｇａｓ６タンパク質は、ホスファチジルセリンとＴＡＭレセプターとの間の相互作用を媒介する架橋分子である。
【００５９】
好ましくは、Ｇａｓ６タンパク質は、
ａ）配列番号１３の配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０００８１１．１、２０１１年１２月２４日更新）、
ｂ）配列番号１４の配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１３７４１７．１、２０１１年１２月２４日更新）、
ｃ）配列番号１５の配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１３７４１８．１、２０１１年１２月２４日更新）、
ｄ）配列番号１６の配列の核酸（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０００８２０．２、２０１２年１月１５日更新）によってコードされる配列、
ｅ）配列番号１７の配列の核酸（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１４３９４５．１、２０１２年１月１５日更新）によってコードされる配列、
ｆ）配列番号１８の配列の核酸（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１４３９４６．１、２０１２年１月１５日更新）によってコードされる配列、
ｇ）ａ）〜ｆ）の配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％同一な配列
を含む、またはそれから成る。
【００６０】
いくつかの態様では、ＴＡＭレセプター阻害剤は、抗ＴＡＭレセプター抗体、アンチセンス核酸、模倣体または変異型ＴＡＭレセプターである。
【００６１】
好ましくは、該ＴＡＭレセプター阻害剤はアンチセンス核酸であり、より好ましくは、該ＴＡＭレセプター阻害剤はｓｉＲＮＡである。該アンチセンス核酸は、配列番号５、７、８、もしくは１１の配列のＴＡＭレセプターまたは配列番号６、９、１０、もしくは１２の核酸によってコードされる配列のＴＡＭレセプターの発現を阻害または減少させることができる配列を含むまたはそれから成りうる。該アンチセンス核酸は、ＴＡＭレセプターまたはそのフラグメントをコードする核酸、例えば配列番号６、９、１０、または１２の配列の核酸に相補的な配列を含むまたはそれから成りうる。一態様では、該ｓｉＲＮＡは、配列番号１、２、３、または４の配列の少なくとも１種のｓｉＲＮＡを含むまたはそれから成る。一態様では、該ｓｉＲＮＡは、配列番号１、２、３、および４から成る群より選択される少なくとも２、３、または４種のｓｉＲＮＡを含むまたはそれから成る。一態様では、該ｓｉＲＮＡは、配列番号１、２、３、および４から成る群より選択される最大で４、３、または２種のｓｉＲＮＡを含むまたはそれから成る。一態様では、該ｓｉＲＮＡは、配列番号１、２、３、および４の配列の４種のｓｉＲＮＡを含むまたはそれから成る。
【００６２】
好ましくは、該模倣体は、ＴＡＭレセプターの細胞外ドメインを含むまたはそれから成る。例えば、該模倣体は、配列番号７または配列番号８のアミノ酸２６〜４５１番を含むまたはそれから成りうる。
【００６３】
いっそうより好ましくは、該模倣体は、可溶性形態のＴＡＭレセプター細胞外ドメインを含むまたはそれから成る。例えば該模倣体は、配列番号５のアミノ酸４１〜４２８番の配列、または配列番号７もしくは配列番号８のアミノ酸３３〜４４０番の配列を含むまたはそれから成りうる。
【００６４】
好ましくは、該抗ＴＡＭレセプター抗体は、Ｇａｓ６タンパク質へのＴＡＭレセプターの結合部位に対する抗体である。好ましくは、該抗ＴＡＭレセプター抗体は、配列番号７または配列番号８の配列のアミノ酸６３〜８４番に対するものである。
【００６５】
いくつかの態様では、Ｇａｓ６阻害剤は、抗Ｇａｓ６抗体、アンチセンス核酸、模倣体または変異型Ｇａｓ６タンパク質である。
【００６６】
好ましくは、該Ｇａｓ６阻害剤はアンチセンス核酸であり、より好ましくは該Ｇａｓ６阻害剤はｓｉＲＮＡである。該アンチセンス核酸は、配列番号１３、１４、もしくは１５の配列のＧａｓ６タンパク質または配列番号１６、１７、もしくは１８の核酸によってコードされる配列のＧａｓ６タンパク質の発現を阻害または減少させることができる配列を含むまたはそれから成りうる。該アンチセンス核酸は、Ｇａｓ６またはそのフラグメントをコードする核酸、例えば配列番号１６、１７、または１８の配列の核酸に相補的な配列を含むまたはそれから成りうる。
【００６７】
好ましくは、該Ｇａｓ６阻害剤は、配列番号１９の配列の変異型Ｇａｓ６タンパク質Ｇａｓ６ΔＧｌａである。
【００６８】
好ましくは、該Ｇａｓ−６模倣体は、配列番号１３の残基５３〜９４番のアミノ酸配列を含むもしくはそれから成りうるホスファチジルセリン認識部位を含むもしくはそれから成り、または該模倣体は、配列番号１３の残基２９８〜６７０番のアミノ酸配列を含むもしくはそれから成りうるレセプター結合部位を含むもしくはそれから成る。
【００６９】
好ましくは、該抗Ｇａｓ６抗体は、ＴＡＭレセプターへのＧａｓ６タンパク質の結合部位に対する抗体である。好ましくは、該抗Ｇａｓ６抗体は、配列番号１３の配列のアミノ酸３０４〜３１２番、配列番号１４の配列のアミノ酸３１〜３９番、または配列番号１５の配列のアミノ酸５〜１３番に対するものである。
【００７０】
ホスファチジルセリン結合タンパク質は、ホスファチジルセリンに結合することができるが、Ｇａｓ６タンパク質に結合できないタンパク質でありうる。好ましくは、該ホスファチジルセリン結合タンパク質は、抗ホスファチジルセリン抗体またはアネキシンＶである。
【００７１】
好ましくは、該抗ホスファチジルセリン抗体は、Ｇａｓ６タンパク質へのホスファチジルセリンの結合部位に対する抗体である。例えば該抗体は、抗ホスファチジルセリン抗体クローン１Ｈ６（Upstate（登録商標））でありうる。
【００７２】
好ましくは、該アネキシンＶタンパク質は、
ａ）配列番号２０の配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１４５．１、２０１２年２月１日更新）、
ｂ）配列番号２１の配列の核酸（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１５４．３、２０１１年１２月１８日更新）によってコードされる配列、
ｃ）ａ）またはｂ）の配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％同一な配列
を含むまたはそれから成る。
【００７３】
抗ウイルス化合物
好ましい一態様では、本発明による阻害剤は、少なくとも１種の他の抗ウイルス化合物と組み合わせて、経時または同時のいずれかでの投与用である。
【００７４】
経時的投与は、異なる（それでもなお重複しうる）時間または時点で成分が投与されることを示す。同時投与は、成分が同時に投与されることを示す。
【００７５】
抗ウイルス化合物には、非限定的にノイラミニダーゼ阻害剤、ウイルス融合阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤、シグナル伝達阻害剤、逆転写酵素阻害剤、インターフェロン、ヌクレオシドアナログ、インテグラーゼ阻害剤、チミジンキナーゼ阻害剤、ウイルス糖または糖タンパク質合成阻害剤、ウイルス構造タンパク質合成阻害剤、ウイルス付着および吸着阻害剤、ウイルス侵入阻害剤およびそれらの機能的アナログが含まれうる。
【００７６】
ノイラミニダーゼ阻害剤には、オセルタミビル、ザナミビルおよびペラミビルが含まれうる。ウイルス融合阻害剤には、シクロスポリン、マラビロク、エンフビルチド（enfuviritide）およびドコサノールが含まれうる。
【００７７】
プロテアーゼ阻害剤には、サキナビル、インジナビル、アンプレナビル、ネルフィナビル、リトナビル、チプラナビル、アタザナビル、ダルナビル、ザナミビルおよびオセルタミビルが含まれうる。
【００７８】
ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤には、イドクスウリジン、ビダラビン、ホスホノ酢酸、トリフルリジン、アシクロビル、ホスカルネット（forscarnet）、ガンシクロビル、ペンシクロビル、シドクロビル（cidoclovir）、ファムシクロビル、バラシクロビルおよびバルガンシクロビルが含まれうる。
【００７９】
シグナル伝達阻害剤には、レスベラトロールおよびリバビリンが含まれる。ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）には、ジドブジン（ＺＤＶ、ＡＺＴ）、ラミブジン（３ＴＣ）、スタブジン（ｄ４Ｔ）、ザルシタビン（ｄｄＣ）、ジダノシン（２’，３’−ジデオキシイノシン、ｄｄＩ）、アバカビル（ＡＢＣ）、エミリビン（emirivine）（ＦＴＣ）、テノホビル（ＴＤＦ）、デラビルジン（delaviradine）（ＤＬＶ）、フゼオン（Ｔ−２０）、インジナビル（ＩＤＶ）、ロピナビル（ＬＰＶ）、アタザナビル、コンビビル（ＺＤＶ／３ＴＣ）、カレトラ（ＲＴＶ／ＬＰＶ）、アデホビルジピボキシルおよびトリジビル（ＺＤＶ／３ＴＣ／ＡＢＣ）が含まれうる。非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）には、ネビラピン、デラビルジン、ＵＣ−７８１（チオカルボキサニリド）、ピリジノン、ＴＩＢＯ、カラノリドＡ、カプラビリンおよびエファビレンツが含まれうる。
【００８０】
ウイルス侵入阻害剤には、フゼオン（Ｔ−２０）、ＮＢ−２、ＮＢ−６４、Ｔ−６４９、Ｔ−１２４９、ＳＣＨ−Ｃ、ＳＣＨ−Ｄ、ＰＲＯ１４０、ＴＡＫ７７９、ＴＡＫ−２２０、ＲＡＮＴＥＳアナログ、ＡＫ６０２、ＵＫ−４２７，８５７、関連レセプターに対するモノクローナル抗体、シアノビリン−Ｎ、シクロデキストリン、カラゲナン（carregeenan）、硫酸化またはスルホン化ポリマー、マンデル酸縮合ポリマー、ＡＭＤ−３１００、およびその機能的アナログが含まれうる。
【００８１】
好ましくは、該少なくとも１種の他の抗ウイルス化合物は、ホスファチジルセリンとＴＩＭレセプターとの間の相互作用の阻害剤である。
【００８２】
「ＴＩＭレセプター」は、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−３またはＴＩＭ−４レセプターを意味する。
【００８３】
いくつかの態様では、ＴＩＭ−１レセプターは、
ａ）配列番号２２の配列（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＡＨ１３３２５．１、２００３年１０月４日更新）、
ｂ）配列番号２３の核酸（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０１２２０６．２、２０１１年１１月２６日更新）によってコードされる配列、
ｃ）配列番号２４の核酸（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１０９９４１４．１、２０１１年１１月２６日更新）によってコードされる配列、
ｄ）配列番号２５の核酸（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１７３３９３．１、２０１１年１２月４日更新）によってコードされる配列、
ｅ）ａ）〜ｄ）の配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％同一な配列
を含むまたはそれから成る。
【００８４】
いくつかの態様では、ＴＩＭ−３レセプターは、
ａ）配列番号２６の配列（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＡＨ２０８４３．１、２００３年９月１６日更新）、
ｂ）配列番号２７の配列（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＡＨ６３４３１．１、２００６年７月１５日更新）、
ｃ）配列番号２８の核酸（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０３２７８２．４、２０１１年１２月２５日更新）によってコードされる配列、
ｄ）ａ）〜ｃ）の配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％同一な配列
を含むまたはそれから成る。
【００８５】
いくつかの態様では、ＴＩＭ−４レセプターは、
ａ）配列番号２９の配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿６１２３８８．２、２０１１年１２月２４日更新）、
ｂ）配列番号３０の配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１４０１９８．１、２０１１年１２月２５日更新）、
ｃ）配列番号３１の核酸（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿１３８３７９．２、２０１１年１２月２４日更新）によってコードされる配列、
ｄ）配列番号３２の核酸（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１４６７２６．１、２０１１年１２月２５日更新）によってコードされる配列、
ｅ）ａ）〜ｄ）の配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％同一な配列
を含むまたはそれから成る。
【００８６】
いくつかの態様では、該ホスファチジルセリンとＴＩＭレセプターとの相互作用の阻害剤は、ＴＩＭレセプター阻害剤である。好ましくは、該ＴＩＭレセプター阻害剤は、抗ＴＩＭレセプター抗体、アンチセンス核酸、模倣体または変異型ＴＩＭレセプターである。好ましくは、該ＴＩＭレセプター阻害剤はアンチセンス核酸であり、より好ましくは該ＴＩＭレセプター阻害剤はｓｉＲＮＡである。該アンチセンス核酸は、配列番号２２、２６、２７、２９、もしくは３０の配列のＴＩＭレセプターまたは配列番号２３、２４、２５、２８、３１、もしくは３２の核酸によってコードされる配列のＴＩＭレセプターの発現を阻害または減少させることができる配列を含むまたはそれから成りうる。該アンチセンス核酸は、ＴＩＭレセプターをコードする核酸、例えば配列番号２３、２４、２５、２８、３１、もしくは３２の配列の核酸に相補的な配列を含むまたはそれから成りうる。一態様では、該ＴＩＭレセプター阻害剤は、配列番号３３、３４、３５または３６の配列の少なくとも１種のｓｉＲＮＡを含むまたはそれから成る。一態様では、該ｓｉＲＮＡは、配列番号３３、３４、３５、および３６からなる群より選択される少なくとも２、３、または４種のｓｉＲＮＡを含むまたはそれから成る。一態様では、該ｓｉＲＮＡは、配列番号３３、３４、３５、および３６から成る群より選択される最大で４、３、２、または１種のｓｉＲＮＡを含むまたはそれから成る。一態様では、該ｓｉＲＮＡは、配列番号３３、３４、３５、および３６の配列の４種のｓｉＲＮＡを含むまたはそれから成る。
【００８７】
好ましくは、該抗ＴＩＭレセプター抗体は、Kondratowicz et al., 2011, PNAS, 108:8426-8431に記載されている抗ＴＩＭ１レセプター抗体ＡＲＤ５またはSonar et al., 2010, The Journal of Clinical investigation, 120: 2767-2781に記載されている抗ＴＩＭ１抗体Ａ６Ｇ２である。
【００８８】
好ましくは、該模倣体は、ＴＩＭレセプターの細胞外ドメインを含むまたはそれから成る。例えば該模倣体は、配列番号２２のＴＩＭ−１についての残基２１〜２９５番のアミノ酸配列を含むもしくはそれから成りうるか、該模倣体は、配列番号３７のＴＩＭ−１についての残基２１〜２９０番のアミノ酸配列を含むもしくはそれから成りうるか、または該模倣体は、配列番号２９のＴＩＭ−４についての残基２５〜３１４番のアミノ酸配列を含むもしくはそれから成りうる。
【００８９】
好ましくは、該抗ＴＩＭレセプター抗体は、ホスファチジルセリンへのＴＩＭレセプターの結合部位に対する抗体である。好ましくは、該ホスファチジルセリンへのＴＩＭレセプターの結合部位に対する抗体は、ＴＩＭレセプターの金属イオン依存性リガンド結合部位（ＭＩＬＩＢ）に対するものである。いっそうより好ましくは、該抗ＴＩＭレセプターは、配列番号２２の配列のアミノ酸１１１〜１１５番、または配列番号２９もしくは配列番号３０の配列のアミノ酸１１９〜１２２番に対するものである。
【００９０】
細胞へのホスファチジルセリン保有ウイルスの侵入を阻害するための方法
本発明による阻害剤は、細胞へのＰｔｄＳｅｒ保有ウイルスの侵入を阻害する方法に使用することができる。
【００９１】
該方法は、in vitroもしくはex vivo方法、または本明細書記載のＰｔｄＳｅｒ保有ウイルス感染の予防もしくは治療方法でありうる。
【００９２】
したがって、本発明は、細胞へのＰｔｄＳｅｒ保有ウイルスの侵入を阻害するためのin vitroまたはin vivo方法における、本明細書に定義される阻害剤の使用を提供する。細胞へのＰｔｄＳｅｒ保有ウイルスの侵入を阻害するためのin vitroまたはin vivo方法における使用のための本明細書に定義される阻害剤も提供される。
【００９３】
いくつかの態様では、該阻害剤は、本明細書上述に定義される少なくとも１種の他の抗ウイルス化合物と組み合わせた使用である。
【００９４】
該方法は、例えば該阻害剤に該細胞および／または該ＰｔｄＳｅｒ保有ウイルスを曝露することを含みうる。方法がin vivo方法の場合、その方法は、該阻害剤を対象、好ましくはそれを必要とする患者に投与することを含みうる。
【００９５】
いくつかの態様では、該細胞は、樹状細胞、内皮細胞、星状膠細胞、肝細胞、ニューロン、クッパー細胞、および／またはマクロファージでありうる。
【００９６】
薬学的組成物
本発明による阻害剤は、単独で、または少なくとも１種の他の抗ウイルス化合物と組み合わせて、薬学的に許容されうる組成物に製剤化することができる。
【００９７】
したがって本発明は、本発明による阻害剤および追加的に少なくとも１種の他の抗ウイルス化合物を含む薬学的組成物を提供する。
【００９８】
該少なくとも１種の他の抗ウイルス化合物は、上記に定義された化合物でありうる。
【００９９】
一態様では、該阻害剤は、配列番号１、２、３、および４の配列のｓｉＲＮＡから成る群より選択される少なくとも１、２、３、もしくは４種、または最大で４、３、２、もしくは１種のｓｉＲＮＡ、ならびに／あるいは本明細書上述に定義されるアネキシンＶを含むまたはそれから成り、少なくとも１種の他の抗ウイルス化合物は、配列番号３３、３４、３５、および３６の配列のｓｉＲＮＡから成る群より選択される少なくとも１、２、３、もしくは４種、または最大で４、３、２、もしくは１種のｓｉＲＮＡならびに／あるいは本明細書上述に定義される配列番号１９の配列の変異型Ｇａｓ６タンパク質Ｇａｓ６Δｇｌａを含むまたはそれから成る。一態様では、該阻害剤は、配列番号１、２、３、および４の配列の４種のｓｉＲＮＡならびに／または本明細書上述に定義されるアネキシンＶを含むまたはそれから成り、少なくとも１種の他の抗ウイルス化合物は、配列番号３３、３４、３５、および３６の配列の４種のｓｉＲＮＡならびに／または本明細書上述に定義される配列番号１９の配列の変異型Ｇａｓ６タンパク質Ｇａｓ６Δｇｌａを含むまたはそれから成る。
【０１００】
本発明による薬学的組成物は、適切な薬学的単位投与剤形の形態で経口投与することができる。本発明の薬学的組成物は、錠剤、ゼラチン硬または軟カプセル、液剤、懸濁剤、ならびにリポゾームおよび成形ポリマーゲル剤などの他の徐放製剤が含まれる多数の剤形に調製することができる。
【０１０１】
投薬様式および投与剤形は、所与の処置適用に望ましく有効な治療剤または組成物の性質に密接に関係する。適切な投薬剤形には、非限定的に、経口、静脈内、直腸、舌下、粘膜、経鼻、眼、皮下、筋肉内、経皮、脊髄、髄腔内、関節内、動脈内、クモ膜下、気管支、およびリンパ投与、ならびに活性成分の全身送達のための他の投薬剤形が含まれる。
【０１０２】
本発明の薬学的組成物は、非限定的に、経皮（パッチ、ゲル、クリーム、軟膏またはイオン泳動による受動的）；静脈内（ボーラス、注入）；皮下（注入、デポー）；経粘膜（バッカルおよび舌下、例えば口腔内分散錠（orodispersible tablet）、ウエファース、フィルム、および発泡製剤；結膜（点眼剤）；直腸（坐剤、浣腸））；または皮内（ボーラス、注入、デポー）を含めた当技術分野において公知の任意の方法により投与することができる。
【０１０３】
経口液体薬学的組成物は、例えば、水性もしくは油性懸濁剤、液剤、乳剤、シロップ剤もしくはエリキシル剤の形態の場合があり、または使用前に水もしくは他の適切なビヒクルで構成するための乾燥製品として提示される場合がある。そのような液体薬学的組成物は、懸濁化剤、乳化剤、非水性ビヒクル（食用油が含まれうる）、または保存料などの通常の添加剤を含有しうる。
【０１０４】
本発明の薬学的組成物は、また、非経口投与（例えば注射、例えばボーラス注射または連続注入による）用に製剤化される場合があり、アンプル、プレフィルドシリンジ、少量注入容器中の単位投与剤形で、または保存料を添加された多回容器に入れて提示される場合がある。薬学的組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁剤、液剤、または乳剤などの形態を取る場合があり、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤化剤（formulating agent）を含有しうる。または、本発明の薬学的組成物は、無菌固体の無菌的単離または溶液からの凍結乾燥によって得られた、使用前に適切なビヒクル、例えば無菌無発熱物質水で構成するための粉末形態でありうる。
【０１０５】
直腸投与に適した、担体が固体の薬学的組成物は、最も好ましくは単位用量坐剤として提示される。適切な担体には、カカオ脂および当技術分野において一般に使用されている他の物質が含まれ、坐剤は、薬学的組成物を軟化または融解した担体（１種または複数）と混合し、続いて冷却し、型に入れて成形することによって好都合に形成することができる。
【０１０６】
吸入による投与のために、本発明による薬学的組成物は、吹入器、ネブライザーもしくは加圧パック、またはエアロゾルスプレーを送達する他の好都合な手段から好都合に送達される。加圧パックは、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切な気体などの適切な噴射剤を含みうる。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は、定量を送達するためにバルブを提供することによって決定することができる。または、吸入または吹入による投与のために、本発明の薬学的組成物は、乾燥粉末組成物、例えば薬学的組成物と乳糖またはデンプンなどの適切な粉末基剤との粉末混合物の形態を取りうる。粉末組成物は、例えば、カプセルまたはカートリッジまたは例えば吸入器もしくは吹入器の助けを借りて粉末を投与することができるゼラチンもしくはブリスターパックに入れた単位投薬剤形で提示することができる。
【０１０７】
鼻腔内投与のために、本発明の薬学的組成物は、プラスチックボトルアトマイザーなどの液体スプレーを介して投与することができる。これらのうちMistometerg（イソプロテレノール吸入器、Wintrop）およびMedihaler（登録商標）（イソプロテレノール吸入器、Riker）が典型的である。
【０１０８】
アンチセンス核酸の投与のために、本発明の薬学的組成物は、リポゾーム、ミクロパーティクル、ミクロカプセル、脂質系担体システム内への被包が含まれる形態に調製することができる。本発明における使用に適する代替的な脂質系担体システムの非限定的な例には、ポリカチオンポリマー核酸複合体（例えば米国特許出願公開第２００５０２２２０６４号参照）、シクロデキストリンポリマー核酸複合体（例えば米国特許出願公開第２００４００８７０２４号参照）、生分解性ポリ３アミノエステルポリマー核酸複合体（例えば米国特許出願公開第２００４００７１６５４号参照）、ｐＨ感受性リポゾーム（例えば米国特許出願公開第２００２０１９２２７４号参照）、アニオン系リポゾーム（例えば米国特許出願公開第２００３００２６８３１号参照）、カチオン系リポゾーム（例えば米国特許出願公開第２００３０２２９０４０号参照）、可逆マスクリポプレックス（reversibly masked lipoplex）（例えば米国特許出願公開２００３０１８０９５０号参照）、細胞型特異的リポゾーム（例えば米国特許出願公開２００３０１９８６６４号参照）、ポリマーマトリックス含有ミクロパーティクル（例えば米国特許出願公開２００４０１４２４７５号参照）、ｐＨ感受性リポプレックス（例えば米国特許出願公開２００２０１９２２７５号参照）、遊離可能な親水性ポリマーで誘導体化された脂質を含有するリポゾーム（例えば米国特許出願公開第２００３００３１７０４号参照）、脂質に封入された核酸（例えばＰＣＴ特許公報である国際公開公報第０３／０５７１９０号参照）、脂質に被包された核酸（例えば米国特許出願公開第２００３０１２９２２１号参照）、ポリカチオン系ステロール誘導体核酸複合体（例えば米国特許第６，７５６，０５４号参照）、他のリポソーム組成物（例えば米国特許出願公開第２００３００３５８２９号参照）、他のミクロパーティクル組成物（例えば米国特許出願公開第２００３０１５７０３０号参照）、ポリプレックス（例えばＰＣＴ特許公報である国際公開公報第０３／０６６０６９号参照）、エマルション組成物（例えば米国特許第６，７４７，０１４号参照）、縮合核酸複合体（例えば米国特許出願公開第２００５０１２３６００号参照）、他のポリカチオン系核酸複合体（例えば米国特許出願公開第２００３０１２５２８１号参照）、ポリビニルエーテル核酸複合体（例えば米国特許出願公開第２００４０１５６９０９号参照）、多環状アミジニウム核酸複合体（例えば米国特許出願公開第２００３０２２０２８９号参照）、ナノカプセルおよびミクロカプセル組成物（例えばＰＣＴ特許公報である国際公開公報第０２／０９６５５１号参照）、リポゾームとエマルションとの安定化混合物（例えばEP1304160参照）、ポルフィリン核酸複合体（例えば米国特許第６，６２０，８０５号参照）、脂質核酸複合体（例えば米国特許出願公開第２００３０２０３８６５号参照）、核酸ミクロエマルション（例えば米国特許出願公開第２００５００３７０８６号参照）、カチオン脂質系組成物（例えば米国特許出願公開第２００５０２３４２３２号参照）が含まれる。当業者は、本発明の改変ｓｉＲＮＡがネイキッドなｓｉＲＮＡ分子としても送達できることを認識している。
【０１０９】
本発明の薬学的組成物は、また、着香料、着色料、抗菌剤、または保存料などの他の佐剤を含有する場合がある。
【０１１０】
さらに、処置への使用に必要とされる薬学的組成物の量は、選択された治療剤だけでなく、投与経路、処置される状態の性質ならびに患者の年齢および状態に応じて変動し、最終的に主治医または臨床医の判断に任されることが、認識されている。
【０１１１】
投与および処置方法
本発明は、また、本発明による阻害剤の治療有効量を投与することを含む、それを必要とする個体におけるＰｔｄＳｅｒ保有ウイルス感染を予防または治療するための方法に関する。
【０１１２】
「治療」は治療的使用（すなわち所与の疾患を有する患者に対する）を意味し、「予防」は予防的使用（すなわち所与の疾患を発生しやすい個体に対する）を意味する。用語「治療」には、疾患の完全治癒に至る治療だけでなく、疾患の進行を減速する、および／または患者の生存期間を延長する治療も含まれる。
【０１１３】
「有効量」は、所望の治療的または予防的結果を達成するために必要な薬用量および時間で有効な量を表す。
【０１１４】
本発明の阻害剤の治療有効量は、病状、年齢、性別、および個体の体重、ならびにタンパク質が所望の治療的結果を誘起する能力などの要因に応じて変動しうる。治療有効量は、阻害剤の任意の毒性作用または有害作用に治療的有益効果が勝る量を包含する。治療有効量は、また、有益性、例えば臨床的有益性を付与するために十分な量を包含する。
【０１１５】
本発明に関連して、「ホスファチジルセリン保有ウイルス感染を予防する」は、ＰｔｄＳｅｒ保有ウイルスの感染または宿主細胞への侵入の予防を意味しうる。
【０１１６】
本発明に関連して、「ホスファチジルセリン保有ウイルス感染を治療する」は、ホスファチジルセリン保有ウイルスの感染または宿主細胞への侵入を後退、軽減、または阻害することを意味しうる。
【０１１７】
本発明に関連して、ホスファチジルセリン保有ウイルス感染は、少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％減少しうる。
【０１１８】
いくつかの態様では、本発明の方法は、上記に定義される少なくとも１種の他の抗ウイルス化合物と組み合わせて上記に定義される阻害剤を経時または同時のいずれかでの投与することを含む。例えば、該少なくとも１種の他の抗ウイルス化合物は、本明細書上述に定義されるホスファチジルセリンとＴＩＭレセプターとの間の相互作用の阻害剤である。
【０１１９】
別の態様では、該方法は、本発明による薬学的組成物の投与を含む。
【０１２０】
投与方法は全身方式でありうる。投薬様式および投与剤形は、所与の処置適用に望ましく有効な治療剤または組成物の性質に密接に関係する。適切な投与剤形および投薬経路には、非限定的に、経口、静脈内、直腸、舌下、粘膜、経鼻、眼、皮下、筋肉内、経皮、脊髄、髄腔内、関節内、動脈内、クモ膜下、気管支、およびリンパ投与、ならびに／または活性成分の全身送達のための他の投薬剤形および投与経路が含まれる。好ましい一態様では、投与剤形は非経口投与用である。
【０１２１】
投与方法は、例えば少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００日間でありうる。
【０１２２】
用量範囲は、０．１mg/kg/日から１００mg/kg/日の間でありうる。より好ましくは、用量範囲は０．５mg/kg/日から１００mg/kg/日の間である。最も好ましくは、用量範囲は１mg/kg/日から８０mg/kg/日の間である。最も好ましくは、用量範囲は５mg/kg/日から５０mg/kg/日の間または１０mg/kg/日から４０mg/kg/日の間である。
【０１２３】
いくつかの態様では、用量は、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０mg/kg/日でありうる。いくつかの態様では、用量は最大で５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、２５、１５、１０、５、１、０．５、０．１mg/kg/日でありうる。
【０１２４】
用量範囲は、また、１０から１００００UI/kg/日の間でありうる。より好ましくは、用量範囲は５０から５０００UI/kg/日の間または１００から１０００UI/kg/日の間である。
【０１２５】
いくつかの態様では、用量は、少なくとも１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１００００UI/kg/日でありうる。いくつかの態様では、用量は最大で１００００、９５００、９０００、８５００、８０００、７５００、７０００、６５００、６０００、５５００、５０００、４５００、４０００、３５００、３０００、２５００、２０００、１５００、１０００、９００、８００、６００、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００UI/kg/日でありうる。
【０１２６】
以下の図面および実施例を参照して、これから本発明をより詳細に説明する。本明細書に引用される全ての文献および特許文書は、本明細書によって参照により組み入れられる。
【０１２７】
配列リスト
配列番号１にＡＸＬに対するｓｉＲＮＡの配列５’−ＡＣＡＧＣＧＡＧＡＵＵＵＡＵＧＡＣＵＡ−３’を示す。
配列番号２にＡＸＬに対するｓｉＲＮＡの配列５’−ＧＧＵＡＣＣＧＧＣＵＧＧＣＧＵＡＵＣＡ−３’を示す。
配列番号３にＡＸＬに対するｓｉＲＮＡの配列５’−ＧＡＣＧＡＡＡＵＣＣＵＣＵＡＵＧＵＣＡ−３’を示す。
配列番号４にＡＸＬに対するｓｉＲＮＡの配列５’−ＧＡＡＧＧＡＧＡＣＣＣＧＵＵＡＵＧＧＡ−３’を示す。
配列番号５にＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００６２８４．２で参照されるＴＹＲＯ−３レセプターのアミノ酸配列を示す。
配列番号６にＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００６２９３．３で参照されるＴＹＲＯ−３レセプターの核酸配列を示す。
配列番号７にＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１６９０．２で参照されるＡＸＬレセプターのアミノ酸配列を示す。
配列番号８にＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０６８７１３．２で参照されるＡＸＬレセプターのアミノ酸配列を示す。
配列番号９にＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０２１９１３．３で参照されるＡＸＬレセプターの核酸配列を示す。
配列番号１０にＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１６９９．４で参照されるＡＸＬレセプターの核酸配列を示す。
配列番号１１にＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００６３３４．２で参照されるＭＥＲレセプターのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２にＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００６３４３．２で参照されるＭＥＲレセプターの核酸配列を示す。
配列番号１３にＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０００８１１．１で参照されるＧａｓ６タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号１４にＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１３７４１７．１で参照されるＧａｓ６タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号１５にＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１３７４１８．１で参照されるＧａｓ６タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号１６にＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０００８２０．２で参照されるＧａｓ６タンパク質の核酸配列を示す。
配列番号１７にＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１４３９４５．１で参照されるＧａｓ６タンパク質の核酸配列を示す。
配列番号１８にＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１４３９４６．１で参照されるＧａｓ６タンパク質核酸配列を示す。
配列番号１９に変異型Ｇａｓ６ΔＧｌａタンパク質の配列を示す。
配列番号２０にＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１４５．１で参照されるアネキシン５のアミノ酸配列を示す。
配列番号２１にＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１５４．３で参照されるアネキシン５の核酸配列を示す。
配列番号２２にＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＡＨ１３３２５．１で参照されるＴＩＭ−１レセプターのアミノ酸配列を示す。
配列番号２３にＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０１２２０６．２で参照されるＴＩＭ−１レセプターの核酸配列を示す。
配列番号２４にＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１０９９４１４．１で参照されるＴＩＭ−１レセプターの核酸配列を示す。
配列番号２５にＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１７３３９３．１で参照されるＴＩＭ−１レセプターの核酸配列を示す。
配列番号２６にＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＡＨ２０８４３．１で参照されるＴＩＭ−３レセプターのアミノ酸配列を示す。
配列番号２７にＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＡＨ６３４３１．１で参照されるＴＩＭ−３レセプターのアミノ酸配列を示す。
配列番号２８にＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０３２７８２．４で参照されるＴＩＭ−３レセプターの核酸配列を示す。
配列番号２９にＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿６１２３８８．２で参照されるＴＩＭ−４レセプターのアミノ酸配列を示す。
配列番号３０にＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１４０１９８．１で参照されるＴＩＭ−４レセプターのアミノ酸配列を示す。
配列番号３１にＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿１３８３７９．２で参照されるＴＩＭ−４レセプターの核酸配列を示す。
配列番号３２にＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１４６７２６．１で参照されるＴＩＭ−４レセプターの核酸配列を示す。
配列番号３３にＴＩＭ−１に対するｓｉＲＮＡの配列５’−ＡＡＡＣＵＣＡＡＣＵＧＵＵＣＣＵＡＣＡ−３’を示す。
配列番号３４にＴＩＭ−１に対するｓｉＲＮＡの配列５’−ＣＧＧＡＡＧＧＡＣＡＣＡＣＧＣＵＡＵＡ−３’を示す。
配列番号３５にＴＩＭ−１に対するｓｉＲＮＡの配列５’−ＧＣＡＧＡＡＡＣＣＣＡＣＣＣＵＡＣＧＡ−３’を示す。
配列番号３６にＴＩＭ−１に対するｓｉＲＮＡの配列５’−ＧＧＵＣＡＣＧＡＣＵＡＣＵＣＣＡＡＵＵ−３’を示す。
配列番号３７にＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ９６Ｄ４２で参照されるＴＩＭ−１レセプターのアミノ酸配列を示す。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】ＴＹＲＯ３およびＡＸＬの異所性発現がＤＶ感染を増強する。親２９３Ｔ、ＴＹＲＯ３発現２９３ＴおよびＡＸＬ発現２９３ＴをＤＶ２ ＪＡＭ（ＭＯＩ＝１０）と共に３時間インキュベーションした。４８時間後に上清を収集し、Ｃ６／３６を用いたプラークアッセイによりウイルス力価を決定し、プラーク形成単位/mlで表現した。データは、２回の独立した実験を代表するものである。データを平均±ＳＤとして示す。
【図２】ＴＹＲＯ３およびＡＸＬの異所性発現がＤＶ感染を増強する。親２９３Ｔ、ＴＹＲＯ３発現２９３ＴおよびＡＸＬ発現２９３ＴにＤＶ２ ＪＡＭ（ＭＯＩ＝１０）、ＤＶ２ ＮＧＣ（ＭＯＩ＝０．０５）、ＤＶ２ １６６８１（ＭＯＩ＝０．０５）、ＤＶ１ ＴＶＰ（ＭＯＩ＝５０）、ＤＶ３ ＰＡＨ８８１（ＭＯＩ＝５）、ＤＶ４ １０８６（ＭＯＩ＝５０）を感染させた。４８時間後に感染細胞のパーセントを定量した。データを平均±ＳＤとして示す。
【図３】ＴＹＲＯ３およびＡＸＬの異所性発現がＤＶ感染を増強する。親２９３Ｔ、ＴＹＲＯ３発現２９３ＴおよびＡＸＬ発現２９３ＴにＤＶ２ ＪＡＭ（ＭＯＩ＝１０）、ＷＮＶ（ＭＯＩ＝０．０００８）、ＹＦＶ−１７Ｄ（ＭＯＩ＝０．００５）、インフルエンザウイルスＡ／ＷＳＮ／３３株（１：５，０００）またはＶＳＶシュードタイプ化ＨＩＶウイルス粒子（１００ngのｐ２４）を感染させた。４８時間後にＦＡＣＳによって感染を判定し、親２９３Ｔ細胞での感染に対して標準化した。データを平均±ＳＤとして示す。
【図４】ＴＹＲＯ３およびＡＸＬの異所性発現がＤＶ感染を増強する。親ＨｅＬａ細胞、ＴＹＲＯ３発現ＨｅＬａ細胞およびＡＸＬ発現ＨｅＬａ細胞にＶ３（ＭＯＩ＝３０）およびＷＮＶ（ＭＯＩ＝０．００１）を感染させ、４８時間後に２Ｈ２ ｍＡｂまたは抗ＷＮＶ Ｅタンパク質であるＥ１６ ｍＡｂを使用するＦＡＣＳによって感染をスコア化した。データを平均±ＳＤとして示す。
【図５】Ａ５４９のＤＶおよびＷＮＶ感染がＡＸＬのダウンレギュレーションによって阻害される。ｓｉＲＮＡをトランスフェクションしたＡ５４９細胞にＤＶ３（ＭＯＩ＝２０）またはＷＮＶ（ＭＯＩ＝０．０５）を感染させた。２４時間後にＦＡＣＳによって感染細胞のパーセントを定量した。データを平均±ＳＤとして示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図６】初代星状膠細胞のＤＶおよびＷＮＶ感染がＡＸＬのダウンレギュレーションによって阻害される。ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした初代星状膠細胞にＤＶ３（ＭＯＩ＝５）またはＷＮＶ（ＭＯＩ＝０．０００１）を感染させた。４８時間後に感染細胞のパーセントを定量した。データを平均±ＳＤとして示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図７】ポリクローナル抗ヒトＡＸＬ ＡｂがＤＶ感染を阻害する。ＤＶ３（ＭＯＩ＝１０）と共に３時間インキュベーションする間およびその３０分前に、２９３Ｔ−ＡＸＬ、Ａ５４９および初代星状膠細胞を対照ヤギＩｇＧ抗体またはヤギ抗ヒトＡＸＬ（１０μg/ml）抗体のいずれかと共にインキュベーションした。ＦＡＣＳによって感染レベルを定量した。データを平均±ＳＤとして示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図８】抗ヒトＴＹＲＯ３ Ａｂおよび抗ヒトＡＸＬ ＡｂがＤＶ感染の初期段階を阻害する。親２９３Ｔ、ＴＹＲＯ３発現２９３ＴおよびＡＸＬ発現２９３ＴにＤＶ２−ＪＡＭ（ＭＯＩ＝５）を感染させた。表示の抗体（１０μg/ml）を感染の３０分前および感染の全体を通して添加する（−３０分）か、または感染の２時間後に添加した。４８時間後にＦＡＣＳによって感染細胞のパーセントを定量した。データを平均±ＳＤとして示す。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図９】ＴＹＲＯ３およびＡＸＬがＤＶ ＲＮＡの取り込みを増強する。親２９３Ｔ、ＴＹＲＯ３発現２９３ＴおよびＡＸＬ発現２９３ＴをＤＶ２ ＪＡＭ（ＭＯＩ＝２０）と共に３７℃で４時間インキュベーションした。ＤＶ２のウイルスＲＮＡレベルは、内因性対照としてのヒトＧＡＰＤＨとの比較ＣＴ法（ΔΔＣＴ法）を用いたリアルタイム定量ＰＣＲによって決定した。結果を検量用試料値としての２９３Ｔ感染細胞での発現を用いて倍率の差として表現する。実験を２回繰り返し、類似の結果を得た。データを平均±ＳＤとして示す。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１０】ＴＹＲＯ３およびＡＸＬはクラスリン依存性経路を経由する侵入を媒介する。ＨｅＬａ−ＴＹＲＯ３細胞およびＨｅＬａ−ＡＸＬ細胞に表示のｓｉＲＮＡプール（２０nM）を逆トランスフェクションし、トランスフェクションの３日後にＤＶ３（ＭＯＩ＝３０）を感染させた。４８時間後にＦＡＣＳによって感染細胞のパーセントを定量した。データを平均±ＳＤとして示す。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１１】可溶性ＴＹＲＯ３細胞外ドメインおよび可溶性ＡＸＬ細胞外ドメインが２９３Ｔ−ＴＹＲＯ３および２９３Ｔ−ＡＸＬのＤＶ感染を阻害する。ＤＶ２ ＪＡＭ（ＭＯＩ＝１０）をＩｇＧ１−Ｆｃ（対照）、ＴＹＲＯ３−ＦｃまたはＡＸＬ−Ｆｃ（１０μg/ml）と共に３０分間インキュベーションし、感染のために使用した。４８時間後に感染細胞のパーセントをＦＡＣＳによって定量した。データを平均±ＳＤとして示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１２】ＦＢＳ成分（１種または複数）がウイルス感染を増強する。異なる濃度のＦＢＳの存在下で２９３Ｔ−ＴＹＲＯ３、２９３Ｔ−ＡＸＬおよび２９３Ｔ−ＤＣ−ＳＩＧＮにＤＶ２−ＪＡＭ（ＭＯＩ＝１０）を感染させた。３時間インキュベーションした後に、培地を１０％ＦＢＳ補充培地に交換した。４８時間後に感染細胞のパーセントをＦＡＣＳによって定量し、１０％感染条件に対して標準化した。データを平均±ＳＤとして示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１３】ｒｍＧａｓ６がＴＹＲＯ３発現細胞およびＡＸＬ発現細胞へのＤＶの結合を増強する。親２９３Ｔ、ＴＹＲＯ３発現２９３ＴおよびＡＸＬ発現２９３Ｔを、ｒｍＧａｓ６（１μg/ml）を含有する無血清培地または等体積のＰＢＳ（モック）中でＤＶ３（ＭＯＩ＝３０）と共に４℃で９０分間インキュベーションした。平均蛍光強度をＦＡＣＳにより測定し、非感染細胞でのＭＦＩに対して標準化した。データを平均±ＳＤとして示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１４】ｒｍＧａｓ６がＴＹＲＯ３およびＡＸＬによって媒介されるＤＶ感染を増強する。２９３Ｔ−ＴＹＲＯ３および２９３Ｔ−ＡＸＬを、ｒｍＧａｓ６（１μg/ml）を含有する無血清培地または等体積のＰＢＳ（モック）中でＤＶ２ ＪＡＭ（ＭＯＩ＝５）と共にインキュベーションした。３時間インキュベーション後に、培地を１０％ＦＢＳ補充培地に交換した。４８時間後に感染細胞のパーセントをＦＡＣＳによって定量し、ｒｍＧａｓ６の不在下での感染に対して標準化した。データを平均±ＳＤとして示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１５】ｒｍＧａｓ６がそのＧｌａドメインを介してＤＶと相互作用する。被覆されたＤＶ２ ＪＡＭ（１０７ＦＩＵ）をｒｍＧａｓ６またはｒｍＧａｓ６ΔＧｌａ（２μg/ml）と共に１時間インキュベーションした。結合したＧａｓ６は、ヤギポリクローナル抗Ｇａｓ６（１０μg/ml）およびＨＲＰコンジュゲーション型ロバ抗ヤギＩｇＧを使用するＥＬＩＳＡによって検出した。データを平均±ＳＤとして示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１６】アネキシンＶがＤＶ感染のＴＡＭ媒介性増強を阻害する。無血清培地中でＤＶ２ ＪＡＭ（ＭＯＩ＝５）をアネキシンＶ（２５μg/ml）と共にインキュベーションし、ＴＹＲＯ３発現細胞、ＡＸＬ発現細胞およびＤＣ−ＳＩＧＮ発現細胞に感染させるために使用した。４８時間後に感染細胞のパーセントをＦＡＣＳによって定量し、アネキシンＶの不在下での感染に対して標準化した。データを平均±ＳＤとして示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１７】Ｇａｓ６ΔＧｌａがＤＶをＴＹＲＯ３およびＡＸＬに架橋しない。被覆されたＤＶ２ ＪＡＭ粒子（１０７ＦＩＵ）を、ｒＧａｓ６（２μg/ml）の存在下または不在下で表示のヒトＦｃ−キメラ（２μg/ml）と共にインキュベーションした。ＨＲＰコンジュゲーション型ウサギ抗ヒトＩｇＧを使用して結合型Ｆｃ−キメラを検出した。データを平均±ＳＤとして示す。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１８】Ｇａｓ６ΔＧｌａがＴＹＲＯ３およびＡＸＬによって媒介されるＤＶ感染増強を阻害する。細胞をＤＶ２ ＪＡＭ（ＭＯＩ＝５）と共に３時間インキュベーションする３０分前およびインキュベーションする全体にわたり、ｒｍＧａｓ６（１０μg/ml）またはｒｍＧａｓ６（１μg/ml）と共にインキュベーションした。４８時間後に感染細胞のパーセントを定量した。データを平均±ＳＤとして示す。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１９】Ｇａｓ６ΔＧｌａがＴＡＭ発現ＣＨＯ−７４５細胞へのＤＶ−３結合を阻害する。データを平均±ＳＤとして示す。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図２０】ＤＶのＧａｓ６媒介性結合の図式モデルおよび感染増強の可能なメカニズムを示す図である。Ｇａｓ６は、ＤＶウイルスエンベロープ上に露出したＰｔｄＳｅｒにＧｌａドメインを介して、およびＴＡＭレセプターにＣ末端ＳＨＧＢ様ドメインを介して、同時に結合することによって架橋分子として機能する。ＤＶ−Ｇａｓ６複合体は「スーパー」ＴＡＭレセプターアゴニストとして作用することができ、自然免疫の阻害またはウイルスの内部移行を増強するエンドサイトーシスエフェクターの動員のいずれかを招くシグナル伝達カスケードをトリガーする。第二に、ＴＡＭレセプターは付着因子（attachment factor）として作用することができ、ＤＶ濃度を局所的に増加させてＥタンパク質とウイルス真性（bona fide）レセプター（１種または複数）との相互作用を促進する。最後に、ＤＶ−Ｇａｓ６は、また、ＴＹＲＯ３またはＡＸＬとのヘテロタイプ二量体化によりウイルス真性レセプターのリクルートメントを誘導することができ、それによってＤＶ粒子のクラスリン媒介性エンドサイトーシスに必要な三量体性侵入複合体を形成する。
【図２１】ＴＩＭレセプターがフラビウイルス感染を媒介する。ＴＩＭレセプターは、ＤＶ２−ＪＡＭ、ウエストナイルウイルスおよび黄熱ウイルスにより利用される。親２９３Ｔ細胞およびＴＩＭレセプターを発現している２９３Ｔ細胞にＤＶ２−ＪＡＭ、ＷＮＶ（Israeli IS_98-STI株）、黄熱ウイルスワクチン株（ＹＦＶ−１７Ｄ）および単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）を感染させた。２日後に特異的抗体を使用するフローサイトメトリーによってウイルス感染を定量した。データは、少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＥＭである。
【図２２】ＴＹＲＯ３およびＡＸＬがＤＶおよび他のフラビウイルスによる感染を増強する。親２９３Ｔ、ＴＹＲＯ３発現２９３ＴおよびＡＸＬ発現２９３ＴをＤＶ２−Ｊａｍ、ＷＮＶ、ＹＦＶ−１７ＤおよびＨＳＶ−１で攻撃した。２４時間後にフローサイトメトリーによって感染を評価した。データを３回の独立した二つ組の実験からの平均±ＳＥＭとして表す。
【図２３】ＴＩＭ−１およびＴＩＭ−４の異所性発現がチクングニヤによる感染を増強する。ＴＩＭ１発現２９３Ｔ細胞、ＴＩＭ４発現２９３Ｔ細胞および親２９３Ｔ細胞にチクングニヤ（Chick）を感染させた。４８時間後にＥ２エンベロープ糖タンパク質に対するマウスモノクローナル抗体（３Ｅ４）を使用するフローサイトメトリーによって感染を定量した。
【図２４】ＴＹＲＯ３およびＡＸＬの異所性発現がチクングニヤによる感染を増強する。ＴＹＲＯ発現２９３Ｔ細胞、ＡＸＬ発現２９３Ｔ細胞および親２９３Ｔ細胞にチクングニヤ（Chik）を感染させた。４８時間後にＥ２エンベロープ糖タンパク質に対するマウスモノクローナル抗体（３Ｅ４）を使用するフローサイトメトリーによって感染を定量した。
【図２５】内因性ＴＩＭ−１分子および内因性ＡＸＬ分子がＤＶ感染を媒介する。抗ＴＩＭ−１ ＩｇＧ、抗ＡＸＬ ＩｇＧまたは対照ＩｇＧの存在下でＡ５４９細胞に表示のＤＶ株またはＨＳＶ−１を感染させた。２４時間後にフローサイトメトリーによって感染のレベルを定量し、対照ＩｇＧの存在下での感染に対して標準化した。データは少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＤである。＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図２６】内因性ＴＩＭ−１分子および内因性ＡＸＬ分子がＤＶ感染を媒介する。表示のＡｂの存在下でのＤＶ２−ＪＡＭ感染Ａ５４９の代表的な免疫蛍光分析。緑色：抗ＰｒＭ ２Ｈ２、青色：ＤＡＰＩ。スケールバー：１００μm。データは少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＤである。＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図２７】内因性ＴＩＭ−１および内因性ＡＸＬがＤＶ感染を媒介する。Ａ５４９細胞にＤＶ３−ＰＡＨ８８１（ＭＯＩ＝１０）を感染させた。感染前に、細胞を表示の抗ＴＩＭ−１ポリクローナル抗体と抗ＡＸＬポリクローナル抗体との組み合わせと共にインキュベーションした。２４時間後にフローサイトメトリーによって感染レベルを定量し、ＩｇＧ対照抗体の存在下での感染レベルに対して標準化した。３回の独立した二つ組の実験からの平均±ＳＤを示す。
【０１２９】
実施例
材料および方法
ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
ｃＤＮＡの選別のために、バイオインフォマティクスアプローチに基づき、アレイ化された全長ｃＤＮＡライブラリーから推定上の細胞レセプターをコードする１７２８種の遺伝子を選択した（Porcel et al., 2004, Genome Res, 14:463-471）。第１ラウンドについて、リポフェクタミンＬＴＸ（Life Technologies, Carlsbad, CA）を製造業者の説明書により使用して、個別のｃＤＮＡ（１μg）８種のプール２１６個を２９３Ｔ細胞に一過性トランスフェクションした（２４ウェルプレートの形式）。陽性対照として、等しい量のＤＣ−ＳＩＧＮ ｃＤＮＡ希釈物（空のプラスミドの１／８）をトランスフェクションした。陰性対照として空のプラスミドを使用した。トランスフェクションの２４時間後に、異所性発現したＤＣ−ＳＩＧＮの免疫染色によりトランスフェクション効率を評価した。次に、トランスフェクション後の２９３Ｔ細胞をＤＶ２ ＪＡＭ初代株（ＭＯＩ＝２）と共に４８時間インキュベーションし、感染細胞のパーセントをフローサイトメトリーによって測定した。第２ラウンドでは、各陽性ｃＤＮＡプールおよび対応する個別のｃＤＮＡ８種（６００ng）を２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、ＤＶ２ ＪＡＭを感染させて個別の陽性ｃＤＮＡを特定した。
【０１３０】
Ｅｌｉｓａ結合アッセイ
９６ウェルMaxisorp NUNC-IMMUNOプレート（NUNC, Roskidle, Denmark）に二つ組でＤＶウイルス粒子（１０７ＦＩＵ）を４℃で一晩被覆した。３７℃のＰＢＳ ＣａＣｌ２／ＭｇＣｌ２中に入れた２％のＢＳＡで１時間ブロッキング後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎおよび１０mM ＣａＣｌ２を補充したＴＢＳ中でウェルをｒＧａｓ６タンパク質（２μg/ml）と共に３７℃で１時間インキュベーションした。ウェルを徹底的に洗浄し、結合しているＧａｓ６タンパク質をヤギ抗Ｇａｓ６ポリクローナルＡｂでラベルし、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲーション型ロバ抗ヤギＩｇＧ抗体（Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Germany）（１：２，０００希釈）およびｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）（Thermo scientific）基質を用いて検出した。架橋実験のために、Ｆｃ−キメラタンパク質（２μg/ml）のインキュベーションの間にｒＧａｓ６タンパク質（２μg/ml）を同時に添加した。ウェルを徹底的に洗浄し、結合しているＦｃ−キメラを、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲーション型ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Dako）（１：１，０００希釈）およびＯＰＤを用いて検出した。
【０１３１】
細胞結合アッセイ
１％ＢＳＡまたは５％ＦＢＳを含有する結合緩衝液（０．０５％ ＮａＮ３を補充したＤＭＥＭ）中で、ＴＹＲＯ３、ＡＸＬおよびＤＣ−ＳＩＧＮを発現している２９３Ｔ細胞およびＣＨＯ７４５細胞（４×１０５個）を表示のＭＯＩのＤＶと共に４℃で９０分間インキュベーションした。２９３Ｔについて、細胞をヘパリン１００Ｕと共に室温で３０分間インキュベーションし、その後ウイルスと共にインキュベーションした。細胞を冷結合緩衝液で２回、冷無血清ＤＭＥＭ培地で１回洗浄し、ＰＢＳ−ＰＦＡ ２％中に入れて４℃で２０分間固定した。細胞表面に吸収されたＤＶ粒子を抗汎フラビウイルスエンベロープ抗体（４Ｇ２、５μg/ml）で染色し、前述のようにフローサイトメトリーによって分析した（Fernandez-Garcia et al., 2011, J Virol, 85:2980-2989）。結合増強・阻害アッセイでは、細胞をウイルスおよびｒＧａｓ６（１０μg/ml）と共に同時インキュベーションした。
【０１３２】
ウイルスおよび細胞
限られた細胞継代をされた後の蚊（Aedes pseudoscutellaris）ＡＰ６１細胞単層中でＤＶ−１−ＴＶＰ株、ＤＶ２−ＪＡＭ株（Jamaica）、ＤＶ２−ニューギニアＣ株、ＤＶ２−１６８８１株、ＤＶ３−ＰＡＨ８８１株（Thailand）およびＤＶ４−１０８６株を増殖させた。注目すべきことに、哺乳動物細胞中で産生されたＤＶは、昆虫細胞起源のウイルスと類似の結果を与えた。ウイルス力価はＣ６／３６細胞を用いたフローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）によって評価し、ＦＡＣＳ感染単位（ＦＩＵ）として表現した。ＨＥＫ ２９３Ｔ、Ａ５４９、ＶＥＲＯ、およびＨｕｈ７ ５．１細胞（贈与：C.Rice, New York, USA）を、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で維持した。
【０１３３】
上記の蚊（Aedes pseudoscutellaris）ＡＰ６１細胞単層中でＤＶ２−ＪＡＭ（Jamaica）およびＷＮＶ（Israeli ＩＳ−９８−ＳＴＩ株を増殖させた。ＹＦＶ（ＹＦＶ Ｄ１７株）を成長させ、Ｖｅｒｏ細胞で力価決定した。ＨＳＶ−１（Ｆ）を増殖させ、他に記載されたようにＶｅｒｏ細胞で力価決定した（Taddeo et al. 2004）。チクングニヤ（ＣＨＩＫＶ−２１株）を昆虫細胞Ｃ６／３６中で成長させた。
【０１３４】
フローサイトメトリー分析
冷ＰＢＳ中に入れた０．０２％ ＮａＮ３および５％ ＦＢＳの存在下で、以下の従来プロトコールによりフローサイトメトリー分析を行った。感染アッセイのために、感染細胞を２％(v/v)パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）加ＰＢＳで固定し、０．５％(w/v)サポニンで透過処理し、続いてＤＶ ｐｒＭを検出するマウス２Ｈ２ ｍＡｂ（２μg/ml）または非構造タンパク質−１を検出するマウスＮＳ１ ｍＡｂ（１μg/ml）を用いて染色した。抗ＩＣＰ４マウスｍＡｂ（クローン１０Ｆ１、０．３μg/ml; Santa Cruz Biotechnology）を用いてＨＳＶ−１感染を検出した。ＷＮＶ、ＹＦＶおよびチクングニヤ感染を抗タンパク質Ｅ抗体（４Ｇ２）およびＥ２エンベロープ糖タンパク質に対するマウスモノクローナル抗体（３Ｅ４）で検出した。４５分後に、一次抗体をポリクローナルヤギ抗マウス免疫グロブリン／ＲＰＥ（DakoCytomation）でラベルした。最後に、感染細胞のパーセンテージを、CellQuestソフトウェアを備えるＬＳＲ（Becton Dickinson）を用いるフローサイトメトリーによって評価した。FlowJoソフトウェア（Tree Star）を使用することによってデータを解析した。
【０１３５】
統計解析
グラフ表示、統計解析およびカーブフィッティングはPrism5ソフトウェア（GraphPad software, San Diego, CA）を使用して行った。特に述べない限り、全ての結果を３回の独立した実験の平均±標準偏差（ＳＤ）として示す。対応のある両側ｔ検定を用いて、有意性について結果を検定した。
【０１３６】
結果
ｃＤＮＡ選別はＤＶ２感染を増強する細胞表面レセプターとしてＴＹＲＯ３およびＡＸＬを特定する
新しいＤＶ侵入レセプター（１種または複数）を特定しようとして、低感受性細胞系２９３ＴをＤＶ２株ＪＡＭに感染可能にするヒト遺伝子についての機能獲得ｃＤＮＡ選別を実施した。このために、配列データベース（Swiss Prot、Uniprot、Human Protein Reference Database）と、約１００００種のｃＤＮＡから成るアレイ化されたｃＤＮＡライブラリーから選択された、細胞膜レセプターをコードする１７２８種の全長ｃＤＮＡを、ＣＭＶが駆動する発現ベクターｐＣＭＶＳＰＯＲＴ６にクローニングしたものとを使用した。第１ラウンドのスクリーニングで、８種のｃＤＮＡのプール２１６個を２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。高い感染多重度（ＭＯＩ）であってもわずかな感染細胞しか観察されなかったので、２９３Ｔは蚊由来ＤＶ初代株による感染に低感受性であることが以前に示されている。しかし、Ｃ型レクチンレセプターＤＣ−ＳＩＧＮをトランスフェクションされたこれらの細胞から感染性粒子が効率的に回収されたので、ウイルス複製段階、粒子集合段階または放出段階ではなくウイルス侵入段階で制限が起こることが示された。次に、トランスフェクション後の細胞を、蚊の中で成長したＤＶ２ ＪＡＭ粒子（ＭＯＩ＝２）で攻撃した。２日後に、ＤＶ ｐｒＭタンパク質を認識する２Ｈ２ ｍＡｂを使用するＦＡＣＳによって感染をスコア化した。２９３Ｔ細胞をｐｒＭタンパク質細胞内染色に陽性にしたｃＤＮＡのプールを第２ラウンドのスクリーニングに入れ、第２ラウンドのスクリーニングでは各プールを構成している単一のｃＤＮＡを個別に検査した。この選別の結果として、３種の主要タンパク質、すなわちＤＶの侵入を媒介することが以前から分かっているＣ型レクチンレセプターであるＬ−ＳＩＧＮ、ＴＹＲＯ３およびＡＸＬを特定した。ＴＹＲＯ３およびＡＸＬは、天然リガンドである成長停止特異的タンパク質６（Growth-arrest-specific 6）（Ｇａｓ６）およびプロテインＳ（ＰｒｏＳ）が結合すると活性化されるチロシンキナーゼ分子群であるＴＡＭ（ＴＹＲＯ３／ＡＸＬ／ＭＥＲ）レセプターファミリーの２メンバーである。ＴＡＭレセプターは、細胞外ドメインリガンド結合ドメイン（２個の免疫グロブリン様リピートおよび２個のフィブロネクチンＩＩＩ型リピートを含む）、１回膜貫通ドメイン、およびキナーゼ活性を担う細胞質ドメインを共有する。それらは広く発現され、細胞トランスフォーメーション、食作用、アポトーシス細胞体の浄化および自然免疫に関与する多様なシグナル伝達カスケードをレギュレーションする。興味深いことに、ＴＡＭレセプターファミリーの１メンバーであるＡＸＬがエボラウイルスおよびワクシニアウイルス感染を容易にすることが見いだされた。
【０１３７】
ＴＹＲＯ３およびＡＸＬの異所性発現は標的細胞のＤＶ１〜ＤＶ４感染を増強する
ＴＡＭレセプターファミリーの第３のメンバーであるＭＥＲでＤＶ２ ＪＡＭの感染性の増強は検出されなかった。したがって、研究をＴＹＲＯ３およびＡＸＬに集中させた。次に、ＴＹＲＯ３を非常に低レベル発現し、ＡＸＬの発現を欠如している２９３Ｔ細胞に、ヒトＴＹＲＯ３またはＡＸＬをコードするレンチウイルスベクターをトランスダクションした。細胞を特異的ｍＡｂで染色し、高レベルの表面発現についてソーティングした。免疫蛍光研究から、２９３Ｔ−ＴＹＲＯ３細胞または２９３Ｔ−ＡＸＬ細胞のＤＶ２ ＪＡＭ感染が、親２９３Ｔ細胞に比べてｐｒＭタンパク質の細胞内産生の顕著な増加を招いたことが示された。これに一致して、活動的複製時のみに産生されるＤＶの非構造タンパク質であるＮＳ１の発現のＦＡＣＳ分析から、ＤＶ２ ＪＡＭで攻撃された２９３Ｔ−ＴＹＲＯ３細胞および２９３Ｔ−ＡＸＬ細胞は増殖性感染することが実証された。異所性ＡＸＬ発現または異所性ＴＹＲＯ３発現は、２９３Ｔ細胞のＤＶ２感染をそれぞれ２０倍および５０倍に増強する。ＤＶ２ ＪＡＭで攻撃された細胞から回収された無細胞上清の力価決定から、ＴＹＲＯ３発現細胞およびＡＸＬ発現細胞が親対応物よりも大量の感染性ウイルス粒子を放出したことが示された（図１）。
【０１３８】
次に、ＴＹＲＯ３およびＡＸＬが４種のＤＶ血清型のいずれかによるヒト細胞の感染を容易にするかどうかを検査した。２９３Ｔ−ＴＹＲＯ３細胞、２９３Ｔ−ＡＸＬ細胞および２９３Ｔ細胞にＤＶ１〜ＤＶ４株のパネルを感染させた。４８時間後に、細胞を２Ｈ２ ｍＡｂで染色し、ＦＡＣＳによって分析した。実験室適応株ＤＶ２ ＮＧＣまたは１６８８１、および初代ＤＶ１、ＤＶ３およびＤＶ４株による感染は、ＴＹＲＯ３またはＡＸＬのいずれかによって有意に増強された（図２）。したがって、ＴＹＲＯ３およびＡＸＬの異所性発現は、４種のＤＶ血清型の感染を増強する。
【０１３９】
次に、フラビウイルス属の他のメンバーであるＷＮＶおよびＹＦＶ−１７Ｄ、ならびにインフルエンザ（Ｆｌｕ）および水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質を担持するＨＩＶシュードパーティクル（ＶＳＶｐｐ）などの他のエンベロープウイルスを検査することによって、ＴＹＲＯ３およびＡＸＬが媒介する感染性増強の特異性を調査した。ＴＹＲＯ３およびＡＸＬは、ＷＮＶ感染を強く増強し、より少ない程度にＹＦＶ−１７Ｄ感染を増強した。対照的に、ＦｌｕおよびＶＳＶｐｐではウイルス感染性の増強が起こらなかった（図３）。したがって、ＴＹＲＯ３およびＡＸＬは異なる病原性フラビウイルスによって感染のために活用されている。
【０１４０】
ＴＡＭレセプターの発現が他のヒト細胞系をＤＶ感染に感受性にするかどうかを判定するために、ＴＹＲＯ３またはＡＸＬを安定的に発現しているＨｅＬａ細胞を発生させた。親ＨｅＬａ細胞はＤＶ３粒子に低感受性であるが、ＴＹＲＯ３またはＡＸＬの異所性発現後に効率的な感染が起こった（図４）。ＷＮＶで類似の結果が得られた（図４）。さらに、内因性ＡＸＬを発現するマクロファージ様系統であるＣＨＭＥ細胞へのＴＹＲＯ３の付加はＤＶ感染を強く増強する。したがって、少なくとも３種のヒト細胞系統へのＴＹＲＯ３またはＡＸＬの付加は、ＤＶ感染を増強する。
【０１４１】
ＴＡＭレセプターのサイレンシングまたは阻害は許容性細胞におけるＤＶ感染を減少させる
フローサイトメトリー実験から、ＤＶ感染に感受性のある広範囲のヒト細胞からＡＸＬの発現が検出されたことが示された。ＡＸＬはＡ５４９細胞および初代ヒト星状膠細胞（in vivoでＤＶの重要な標的であると提唱されている）中に特に豊富である。対照的に、ＴＹＲＯ３は全ての被験細胞から検出可能に発現されているわけではなかった。次に、ＤＶがＡ５４９細胞および初代ヒト星状膠細胞において内因性ＡＸＬを利用するかどうかを研究した。このために、フローサイトメトリーによって決定される内因性ＡＸＬの発現を、両細胞型においてｓｉＲＮＡによってダウンレギュレーションした。ＡＸＬがサイレンシングされた細胞では、無関係のｓｉＲＮＡを受け取った細胞に比べてＤＶ３感染およびＷＮＶ感染に対する感受性が有意に低下した。フラビウイルスのｐＨ依存性融合に必要な液胞ＡＴＰａｓｅのサブユニットであるＡＴＰ６Ｖ１Ｂ２のサイレンシングは、ＡＸＬ ｓｉＲＮＡと同じように効率的にＤＶ３感染およびＷＮＶ感染を障害した（図５および６）。ＤＶ２ ＪＡＭで類似の結果が得られた。次に、ＡＸＬエクトドメインに対する抗体がＤＶ感染を阻害する能力を研究した。抗ＡＸＬ Ａｂを用いた２９３Ｔ−ＡＸＬ、Ａ５４９または初代星状膠細胞の前処理は、ＤＶ３感染およびＤＶ２感染を有意に阻害した一方で、対照Ａｂは作用を有さなかった（図７）。同様に、抗ＴＹＲＯ３ Ａｂは２９３Ｔ−ＴＹＲＯ３細胞のＤＶ感染を阻害した（図８）。まとめると、これらの結果は、ＡＸＬの細胞表面発現が最適なＤＶ感染に必要であることを示している。
【０１４２】
ＴＹＲＯ３レセプターおよびＡＸＬレセプターはＤＶの内部移行を増強する
最初に、ＤＶの生活環のどの段階でＴＹＲＯ３およびＡＸＬが作用するかを決定するために、抗ＴＡＭ Ａｂを様々な時点で添加したときに抗ＴＡＭ ＡｂがＤＶ感染を阻害する能力を検討した（図８）。抗ＴＹＲＯ３ Ａｂおよび抗ＡＸＬ Ａｂは、ウイルス攻撃の３０分前にそれぞれ２９３Ｔ−ＴＹＲＯ３または２９３Ｔ−ＡＸＬと共にインキュベーションしたとき、ＤＶ感染を強く阻害した（図８）。Ａｂは感染の２時間後に添加したときにその中和能を失った（図８）が、これは、ＴＡＭレセプターがＤＶの生活環の初期段階で作用することを示唆している。次に、ＴＹＲＯ３およびＡＸＬがＤＶの内部移行を促進するかどうかを研究した。ＤＶ２ ＪＡＭでＴＹＲＯ３発現細胞およびＡＸＬ発現細胞を３７℃で４時間攻撃した。総ＲＮＡを抽出し、ウイルスＲＮＡレベルをｑＰＣＲにより定量した（図９）。ＴＡＭレセプターは、２９３Ｔ細胞へのＤＶ ＲＮＡの取り込みを強く増加させた（ＴＹＲＯ３およびＡＸＬで、それぞれ３０倍および１０倍に増強）（図９）。第２のアプローチでは、細胞表面ヘパラン硫酸を欠如するＣＨＯ−７４５細胞内でＴＹＲＯ３およびＡＸＬを発現させた。ＴＡＭ発現細胞、または対照としてのＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＨＯ−７４５細胞をＤＶ２ ＪＡＭ粒子と共に４℃で１時間インキュベーションし、３７℃で４５分間に変えてエンドサイトーシスさせた。抗ＤＶ Ｅ ｍＡｂである４Ｇ２を使用する蛍光顕微鏡法によりウイルスの取り込みをモニターした。ＤＣ−ＳＩＧＮと同様に、ＴＹＲＯ３またはＡＸＬを発現している細胞中にＤＶ Ｅタンパク質の強い細胞内蓄積を見いだした。したがって、ＴＹＲＯ３またはＡＸＬが発現すると、ＤＶ粒子は標的細胞に効率的に内部移行される。これらの結果は、ＴＡＭレセプターであるＴＹＲＯ３およびＡＸＬがＤＶに対する新規な細胞侵入補助因子であることを示している。
【０１４３】
次に、ＴＡＭ発現細胞へのＤＶ侵入が機能的なクラスリン依存性エンドサイトーシス経路を必要とするかどうかを研究した。ＴＹＲＯ３またはＡＸＬを発現しているＨｅＬａ細胞に、被覆ピット形成を促進する細胞因子であるクラスリン重鎖（ＣＨＣ）をターゲティングするｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。ＷＢおよび機能的アッセイによりサイレンシングを検証し、前記のようなトランスフェリンのクラスリン媒介性取り込みの阻害を実証した。ＣＨＣのサイレンシングは、ＴＹＲＯ３発現細胞およびＡＸＬ発現細胞のＤＶ感染を強力に阻害した（図１０）。陽性対照としてのＡＴＰ６Ｖ１Ｂ２サイレンシングもＤＶ感染を遮断した。まとめると、これらの結果からＴＡＭ媒介性のＤＶ侵入増強がｐＨ依存性であり、クラスリン経路を必要とすることが示された。
【０１４４】
可溶性Ｇａｓ６はＤＶエンベロープ上に発現されたＰｄｔＳｅｒと相互作用し、ウイルス粒子をＴＹＲＯ３およびＡＸＬに架橋する
ＴＹＲＯ３およびＡＸＬがＤＶ侵入を増強するメカニズムを解明するために、可溶性キメラＴＹＲＯ３−Ｆｃ分子および可溶性キメラＡＸＬ−Ｆｃ分子を用いて阻害感染アッセイを行った。親２９３Ｔ−ＴＹＲＯ３細胞および親２９３Ｔ−ＡＸＬ細胞に、ＴＹＲＯ３−Ｆｃ分子、ＡＸＬ−Ｆｃ分子または対照Ｆｃ分子と共に予備インキュベーションしたＤＶ２ ＪＡＭ粒子を感染させた（図１１）。ＤＶ感染は可溶性ＴＹＲＯ３−Ｆｃまたは可溶性ＡＸＬ−Ｆｃによって顕著に遮断されたが、これはＤＶビリオンがＴＡＭレセプターに結合することを示唆している。しかし、可溶性ＴＹＲＯ３−Ｆｃまたは可溶性ＡＸＬ−Ｆｃを使用するプルダウン実験では、インタクトなＤＶ粒子からＤＶ−Ｅタンパク質を免疫沈降することができなかった。これは、ＴＹＲＯ３またはＡＸＬのエクトドメインがＤＶと直接には相互作用しないことを示している。ＴＡＭレセプターがＤＶとどのように結合するかをさらに研究するために、高レベル（約３００nM）のＴＡＭリガンドＰｒｏＳを含有するウシ胎児血清（ＦＢＳ）の存在下または不在下でウイルス付着アッセイを行った。５％ＦＢＳの存在下または不在下で親２９３Ｔ細胞、ＴＹＲＯ３ ２９３Ｔ細胞、ＡＸＬ ２９３Ｔ細胞をＤＶ粒子と共に４℃でインキュベーションした。細胞表面に結合しているＤＶ粒子は、抗Ｅタンパク質４Ｇ２ ｍＡｂを使用するＦＡＣＳによって検出した。ＴＹＲＯ３およびＡＸＬへのウイルス結合の顕著な増加は、ＦＢＳの存在下でのみ検出された。ＴＹＲＯ３またはＡＸＬがＣＨＯ７４５細胞上に発現しているとき、および様々なＤＶ株を用いた場合に、類似の結果が得られた。ＦＢＳの存在下で、ＴＡＭ陽性細胞へのＤＶの結合は特異的であった。というのは、抗ＴＹＲＯ３ Ａｂまたは抗ＡＸＬ Ａｂによって結合が阻害されたからである。重要なことに、ＦＢＳの不在下で感染を行うと、ＤＶに対するＴＡＭの効果は打ち消された（図１２）。ＦＢＳ濃度を１０％に増加させると、ＤＣ−ＳＩＧＮ発現細胞ではなく、ＴＹＲＯ３またはＡＸＬ発現細胞のＤＶ感染が増強された（図１２）。まとめると、これらのデータは、ＦＢＳの因子がＴＡＭレセプターへのＤＶの結合を容易にしてウイルス侵入を増強しうることを示している。
【０１４５】
ＴＡＭレセプターへのＤＶの結合が全長マウスＧａｓ６（ｒｍＧａｓ６）によってモデュレーションされるかどうかを研究した。モック対照ではなくｍＧａｓ６と共にウイルス粒子を予備インキュベーションしたとき、ＴＹＲＯ３発現細胞およびＡＸＬ発現細胞へのＤＶの結合は、有意に増加した（図１３）。これに一致して、全長ｒｍＧａｓ６は、対照細胞ではなくＴＹＲＯ３発現細胞およびＡＸＬ発現細胞のＤＶ感染を強烈にブーストした（図１４）。ヒト全長Ｇａｓ−６を使用して類似の結果が得られた。これにより、ＤＶと複合体を形成したＧａｓ６がＴＡＭレセプターと相互作用してＤＶの侵入を増強することが強く示唆された。Ｇａｓ６がＤＶビリオン上に発現されたＰｄｔＳｅｒを認識するかどうかを知るために、ウェル上に被覆されたＤＶを様々なＧａｓ６分子と共にインキュベーションするＥＬＩＳＡアッセイを行った（図１５）。全長Ｇａｓ６はＤＶ粒子と効率的に結合した。対照的に、Ｎ末端Ｇｌａドメインを欠如することでＰｄｔＳｅｒと結合できないＧａｓ６分子（ｒｍＧａｓ６ΔＧｌａ）は、ＤＶ粒子と相互作用する能力が障害していた。
【０１４６】
次に、ＤＶ粒子上に発現されたＰｄｔＳｅｒがＴＡＭ陽性細胞の感染に必要かどうかを研究した。ＴＹＲＯ３細胞およびＡＸＬ細胞に、文書により十分に立証されたＰｄｔＳｅｒ結合タンパク質であるアネキシンＶ（ＡＮＸ５）と共に予備インキュベーションされたＤＶを感染させた。ＡＮＸ５はＤＣ−ＳＩＧＮを介したＤＶ侵入に効果をもたない。対照的に、ＡＮＸ５は、ＦＢＳ中で培養されたＴＹＲＯ３またはＡＸＬを発現する２９３Ｔ細胞のＤＶ感染を、おそらくＰｄｔＳｅｒへのアクセスを遮断することによって有意に阻害した（図１６）。まとめると、これらの結果からＧａｓ６がＤＶ侵入を増強したことが示された。この分子は、ＤＶビリオン上に露出したＰｄｔＳｅｒをＴＡＭレセプターＴＹＲＯ３およびＡＸＬに架橋することによって作用する。
【０１４７】
ＤＶ粒子をＴＹＲＯ３およびＡＸＬに架橋することができないＧａｓ６分子の抗ウイルス活性
次に、全長ｍＧａｓ６およびＧｌａドメインを欠如する市販のＧａｓ６誘導体（ｒｍＧａｓ６ΔＧｌａ）がＴＹＲＯ３発現細胞およびＡＸＬ発現細胞のＤＶ結合および感染をモデュレーションする能力を比較した。２種のＧａｓ６タンパク質がＤＶをＴＹＲＯ３およびＡＸＬに架橋する能力を検査した。ＥＬＩＳＡプレート上に被覆されたＤＶ粒子を、Ｇａｓ６分子の存在下で可溶性ＴＹＲＯ３−Ｆｃ、可溶性ＡＸＬ−Ｆｃまたは対照としての無関係なＦｃ分子と共にインキュベーションした。このアッセイでは、全長ｒｍＧａｓ６はＤＶ架橋活性を示したが、これはｒｍＧａｓ６ΔＧｌａおよび驚くことにｒｈＧａｓ６にはあてはまらなかった（図１７）。対照として検査したＧａｓ６分子のどれもＤＣ−ＳＩＧＮ−ＦｃへのＤＶの結合をモデュレーションしなかった。ＦＢＳの存在下であっても全長ｒｍＧａｓ６がＤＶ感染を増強したことが観察された（図１８）。これは、ほとんど全てが可溶性Ａｘｌエクトドメインと複合体を形成している非常に低血清濃度のＧａｓ６（０．２〜０．５nM）の結果に一致する。興味深いことに、ＴＹＲＯ３発現２９３Ｔ細胞またはＡＸＬ発現２９３Ｔ細胞をｒｍＧａｓ６ΔＧｌａで前処理するとＤＶ２感染の増強が打ち消された（図１８）。これらの結合実験から、ｒｍＧａｓ６ΔＧｌａによるＴＡＭレセプター媒介感染の阻害が、この分子がＴＡＭ発現ＣＨＯ７４５細胞へのＤＶ３の結合を遮断する能力と相関したことが示された（図１９）。まとめると、これらの結果は、ＤＶをＴＡＭレセプターに付着させることができないＧａｓ６分子が抗ウイルス化合物として機能することを示している。
【０１４８】
ＴＩＭレセプターおよびＴＡＭレセプターは他のフラビウイルスによる感染を媒介する
ＴＩＭレセプターおよびＴＡＭレセプターが他のウイルス種による感染を媒介するかどうかを判定するために、ＴＩＭ−１発現細胞およびＴＩＭ−４発現細胞をＤＶ２−Ｊａｍウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）、黄熱ウイルスワクチン株（ＹＦＶ−１７Ｄ）、および単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）で攻撃した。特異的抗体を使用するフローサイトメトリーによってウイルス感染を定量した（図２１）。データは、ＴＩＭ−１およびＴＩＭ−４がＷＮＶ感染を大きく増強し、ＹＦＶ−１７Ｄに対する感受性をわずかにアップレギュレーションしたが、ＨＳＶ−１に効果をもたなかったことを示している。ＴＹＲＯ３発現細胞およびＡＸＬ発現細胞について類似の結果が得られた（図２２）。まとめると、これらのデータは、ＰｔｄＳｅｒレセプターであるＴＩＭおよびＴＡＭが両方ともフラビウイルス感染を促進する細胞因子であることを示している。
【０１４９】
ＴＩＭおよびＴＡＭの異所性発現はチクングニヤによる感染を増強する
さらに、このメカニズムが、膜内にＰｔｄＳｅｒを発現するまたは組み入れているウイルスによって活用される一般メカニズムを表すかどうかに関心がもたれた。親２９３Ｔ細胞、ＴＩＭ−１発現２９３Ｔ細胞およびＴＩＭ−４発現２９３Ｔ細胞にチクングニヤ（Chick）を感染させた。４８時間後にＥ２エンベロープ糖タンパク質に対するマウスモノクローナル抗体（３Ｅ４）を使用するフローサイトメトリーによって感染を定量した。結果（図２３）は、ＴＩＭ−１およびＴＩＭ−４がチクングニヤ感染を大きく増強することを示している。ＴＹＲＯ３発現細胞およびＡＸＬ発現細胞について類似の結果が得られたが、それらの異所性発現は同様にチクングニヤ感染を増強する（図２４）。
【０１５０】
これらのデータは、ＴＩＭおよびＴＡＭのウイルス感染助長が、膜にＰｔｄＳｅｒを発現または組み入れているウイルスによって最適な感染のために活用される一般メカニズムを表すことを示している。
【０１５１】
内因性ＴＩＭ−１分子および内因性ＡＸＬ分子はＤＶ感染を媒介する
Ａ５４９細胞系はＴＩＭ−１およびＡＸＬの両方を発現する。ＤＶ２感染は、単独で投与された抗ＴＩＭ−１ Ａｂまたは抗ＡＸＬ Ａｂで部分的に減少するが、これら２種のＡｂの組み合わせは、ＨＳＶ−１感染ではなくＤＶ２感染（図２５および２６）、ＤＶ３感染（図２７）を完全に阻害した。ＴＩＭ−１およびＡＸＬを発現しているＶｅｒｏ細胞で類似の結果が得られた。これらの結果は、ＴＩＭレセプターおよびＴＡＭレセプターが自然に協同してＤＶ感染を促進すること、ならびにそれらのレセプターを内因性発現している細胞においてＰｔｄＳｅｒが感染を媒介していることを示している。
【０１５２】
考察
本研究は、ＤＶ侵入のための分子メカニズムおよび細胞要件に重要な洞察を加えるものである。機能獲得ｃＤＮＡスクリーニングを用いて、本発明者らは新規なＤＶ侵入補助因子としてＴＹＲＯ３およびＡＸＬを特定した。ＴＹＲＯおよびＡＸＬは、ＭＥＲと共にＴＡＭファミリーのレセプター型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を構成し、このファミリーは、興味をそそる過程の混合をレギュレーションし、アポトーシス細胞の食作用に不可欠である。ＴＹＲＯ３およびＡＸＬは、ＤＶビリオンを宿主細胞に架橋しウイルスの内部移行を増強する天然リガンドであるＧａｓ６およびＰｒｏＳを介してウイルスエンベロープ上に露出しているＰｄｔＳｅｒを認識する。したがって、これらの結果は、ＤＶが、アポトーシス細胞体の浄化に関与する宿主レセプターをその感染性侵入のために操ることを示しており、ＤＶが、ヒト宿主において増殖性感染を確実に確立できるように複数の細胞レセプター系を活用することを示唆している。
【０１５３】
本研究により、ＤＶ粒子がＴＡＭレセプターと直接には相互作用しないことが実証された。それどころか、ＴＹＲＯ３発現細胞およびＡＸＬ発現細胞でのＤＶ感染および吸収の増強は、血清の存在にほぼ完全に依存した。血清は、血漿中にそれぞれ０．２５nMおよび３５０nMの生理学的濃度で存在するビタミンＫ依存性タンパク質Ｇａｓ６および近縁の抗凝固因子プロテインＳである２種のＴＡＭレセプターリガンドを含有する。両方の分子は、アポトーシス細胞をＴＡＭレセプターに架橋することを担っており、Ｇａｓ６は、最近、ＡＸＬにより媒介されるレンチウイルスシュードタイプウイルスのトランスダクションを増強すると報告された。興味深いことに、ＦＢＳ存在下のこれらの結果に類似して、Ｇａｓ６は血清の不在下でＴＡＭ発現細胞でのＤＶの感染および吸収を増強した。それどころか、Ｇｌａドメインを欠如するＧａｓ６は、血清の存在下で感染およびＴＡＭレセプターの結合を低下させた。これらの実験は、血清中に存在する成分が類似のメカニズムを利用し、Ｇａｓ６と共通または重複するＴＡＭレセプタードメインに結合することを示唆している。したがって、血清中に存在するＧａｓ６および／またはＰｒｏＳは、そのＧｌａドメインを介してウイルスに付着すると、同時にそのＳＨＢＧドメインを介してＴＡＭレセプターに結合する可能性がある。本発明者らの観察から、フラビウイルスと細胞レセプターとの相互作用が架橋分子を必要としうるという新しい証拠が挙げられ、蚊細胞レセプターｍｏｓＰＴＰ−１へのＷＮＶの間接結合に関する最近の研究が補強された。ＷＮＶの場合、可溶性Ｃ型レクチンｍｏｓＧＣＴＬ−１はＷＮＶエンベロープタンパク質をｍｏｓＰＴＰ−１に架橋し、続いて感染を容易にした。
【０１５４】
いくつかの証拠は、観察されたＦＢＳの効果が確かにＧａｓ６よりもＰｒｏＳによるものであると示唆している。第１に、Ｇａｓ６の血漿中濃度は非常に低く、ほぼ全てのＧａｓ６が可溶性ＡＸＬエクトドメイン（ｓＡＸＬ）と複合体を形成している。一方、ＰｒｏＳ濃度は非常に高く、ＰｒｏＳの６０％だけがＣ４ＢＰ（Ｃ４ｂ結合タンパク質）と複合体を形成している。第２に、Ｇａｓ６はin vitroで３種のＴＡＭレセプター全てに結合し（ＡＸＬ≧ＴＹＲＯ３≫ＭＥＲ）、実際に図１１〜１６に認められるように、Ｇａｓ６はＴＹＲＯ３発現細胞およびＡＸＬ発現細胞へのＤＶ結合を同様に増強した。対照的に、ＰｒｏＳはＡＸＬよりもＴＹＲＯ３に対して強力なin vitroリガンドであり、それは、ＦＢＳがＴＹＲＯ３発現細胞への、そしてより低い程度にＡＸＬ発現細胞への、ＤＶの結合を強く増強することに一致する。
【０１５５】
Ｇａｓ６およびプロテインＳの架橋活性がＧｌａドメインとウイルス粒子との相互作用を示唆したので、本発明者らは、ＰｔｄＳｅｒ残基がＤＶウイルスエンベロープ上に露出しているという仮説を立てた。実際に、本明細書記載のＥＬＩＳＡ実験から、Ｇａｓ６のＧｌａドメインがウイルスと結合すること、およびウイルス粒子を結合タンパク質アネキシンＶと共に予備インキュベーションすることにより血清の増強作用が競合的に消失することを明らかにした。興味深いことに、ＰｔｄＳｅｒはいくつかのエンベロープビリオン上に露出しているように見え、以前の刊行物から、アネキシンＶがＨＩＶ−１、ワクシニアウイルス、ＣＭＶ、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２に結合することが示された。ＤＶは、ＤＶの生活環に一致して、小胞体（ＥＲ）の内腔に出芽した間にＰｔｄＳｅｒを獲得したと推定される。細胞膜およびＥＲの２分子膜は、２葉から構成され、休止細胞ではＰｔｄＳｅｒはそれらの内葉（inner leaflet）に局在し、豊富に存在する。サイトゾルから出芽する間に、ヌクレオカプシドはＥＲ膜の内向き陥入を誘導した。この過程の際に、ＥＲ膜の内葉およびＥＲの内腔側にアンカーしたｐｒＭ−Ｅヘテロ二量体は、エンベロープウイルスの未熟粒子表面に露出される。
【０１５６】
ＤＶ侵入へのＴＹＲＯ３およびＡＸＬの関与は、ウイルス−リガンド複合体が結合するとこれらの分子がどのように感染を容易にするかについての興味深い問題を提起している。図２０に示すように、ＤＣ−ＳＩＧＮが媒介するＤＶ侵入に類似するモデルにおいて、ＴＹＲＯ３タンパク質およびＡＸＬタンパク質は、ウイルスエンベロープタンパク質とその一次レセプターとの相互作用を、例えば細胞表面ウイルス濃度を増加させることによって容易にすることができよう。さらに、ＴＡＭレセプターは非ＴＡＭレセプターとヘテロタイプな二量体化により物理的に結合することができるので、ＴＹＲＯ３およびＡＸＬは真のレセプターをリクルートすることができると考えられる。この相互作用は、クラスリンが媒介するＤＶの内部移行を増強する下流のシグナル経路の活性化につながりうる。別の魅力のある仮説は、ＤＶ−ＴＡＭリガンド複合体の結合が、下流のエフェクターのレセプター活性化をトリガーしてウイルス感染を容易にすることができるというものである。この仮説は：（ｉ）ＴＡＭレセプターへのＧａｓ６の結合が、多様な細胞依存性の生物学的結果を有するシグナル伝達カスケードをトリガーすること；（ｉｉ）細胞質尾部の欠失およびチロシンリン酸化を消失させるＡＴＰ結合部位の突然変異（Ｋ５６７Ｍ）が、ＺＥＢＯＶ−ＧＰのトランスダクションのＡＸＬ媒介性増強を減少させたという実証；（ｉｉｉ）ホスホリパーゼＣ経路の活性化がＺＥＢＯＶ−ＧＰでシュードタイプにされたウイルスによるＡＸＬ依存性細胞トランスダクションに必要であることによって裏付けられている。したがって、下流の経路の活性化がＴＹＲＯ３／ＡＸＬ媒介性のＤＶ感染増強に必要であると考えられる。
【０１５７】
実際に、これらの下流経路の一つは、自然免疫の負のレギュレーションでありうる。最近、Ｇａｓ６が、マクロファージおよび樹状細胞においてＴｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）およびサイトカインレセプターによって誘導される炎症阻害剤としてのＴＡＭレセプターの機能を活性化したと報告されている。炎症の際に、ＴＬＲおよびサイトカインシグナル伝達はＡＸＬ発現のアップレギュレーションを駆動し、それが炎症促進性ＩＮＦＡＲ／ＳＴＡＴ１シグナル伝達経路を破壊してＳＯＣＳ（suppressor of cytokine signaling）１およびＳＯＣＳ３遺伝子の転写を誘導し、自然免疫および炎症の負のレギュレーションを行った。ＡＸＬへのＧａｓ６の結合はＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡの発現が１０倍に増加することを誘導し、ＴＬＲ誘導性サイトカイン産生を阻害した。ＤＶ−ＴＡＭリガンド複合体がＴＡＭレセプターのスーパーアゴニストとして作用することで、ＳＯＣＳ遺伝子発現およびその後のＴＬＲ阻害を刺激する強力なレセプター活性化を誘導することで、感染の初期段階を容易にしたと推定することができる。
【０１５８】
ＤＶがウイルスエンベロープ上に存在するＰｔｄＳｅｒ残基を介して血清成分によりアポトーシス小体として認識されることによって、細胞表面ＴＹＲＯ３およびＡＸＬに結合する能力を有する複合体を形成するというモデルが予測されている。ＤＶはアポトーシス小体を模倣することによって、ＴＡＭレセプターのアポトーシス浄化機能を打倒して感染を容易にする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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