(57)【要約】  本発明は、被験者からの試料中の、少なくともHTR5A、MACF1、RBFOX1、ABR、PTPRG、CACNA2D1、GFRA1、DSCAML1、CHRM3、LPPR4、DLG2、SLC9A9およびBASP1の遺伝子座における一塩基多型（SNP）の遺伝子型決定を含む、被験者における自閉症のリスクを決定する、または自閉症の存在もしくは疾病素質を検出する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者からの試料中の、少なくともHTR5A、MACF1、RBFOX1、ABR、PTPRG、CACNA2D1、GFRA1、DSCAML1、CHRM3、LPPR4、DLG2、SLC9A9およびBASP1の遺伝子座における一塩基多型（SNP）の遺伝子型決定を含む、被験者における自閉症のリスクを決定する、または自閉症の存在もしくは疾病素質を検出する方法。
【請求項２】
さらに、KCNIP1、UGCG、NTRK3、PLCB1、NELL1、GPR98、MAGI2、PLAGL1、CNTN6、DLG4、ERC2、TRIM9、SYT14、JARID2、CDH13、SULF2、GRIN2A及びNRG3またはそれらの組み合わせのいずれかまたはすべての遺伝子座におけるSNP、および／またはNRG1、TRIM2、EPHA5、PCDH10、HIP1、APBA1、PDE4DおよびEGLN3、またはそれらの組み合わせのいずれかまたはすべての遺伝子座におけるSNPの遺伝子型決定を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
さらに、ABR、ACCN1、AKAP7、APBA1、ASTN2、BASP1、CACNA2D1、CADM1、CDH13、CHRM3、CNTN6、DCLK1、DCLK2、DLG2、DLG4、DSCAML1、EGLN3、EPHA5の、ERC2、GFRA1、GPR98、GRIN2A、GRIN2B、GRM7、HIP1、HTR5A、JARID2、KCNH5、KCNIP1、LPPR4、MACF1、MAGI2、MAP1S、MAP2K1、NAV2、NELL1、NRG1、NRG3、NTRK3、PAX2、PCDH10、PDE11A、PDE4D、PLAGL1、PLCB1、PTPRD、PTPRG、RBFOX1、RGS6、SLC24A2、SLC9A9、SULF2、SYT14、TRIM2、TRIM9およびUGCG、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される遺伝子座における少なくとも一つのSNPの追加の遺伝子型決定を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
HTR5AにおけるSNPはrs893109(配列番号31の27位)であり、MACF1におけるSNPはrs260969(配列番号15の27位)であり、RBFOX1におけるSNPはrs12925135(配列番号39の27位)であり、ABRにおけるSNPはrs2663327(配列番号40の27位)であり、PTPRGにおけるSNPはrs636624(配列番号22の27位)であり、CACNA2D1におけるSNPはrs2367910(配列番号41の27位)であり、GFRA1におけるSNPはrs10787637(配列番号4の27位)であり、DSCAML1におけるSNPはrs695083(配列番号24の27位)であり、CHRM3におけるSNPはrs10802802(配列番号5の27位)であり、LPPR4におけるSNPはrs712886(配列番号27の27位)であり、DLG2におけるSNPはrs12275631(配列番号51の27位)であり、SLC9A9におけるSNPはrs3928471(配列番号19の27位)であり、BASP1におけるSNPはrs298542(配列番号52の27位)である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
KCNIP1におけるSNPはrs12514116 (配列番号38の27位)であり、 UGCGにおけるSNPはrs16916456 (配列番号11の27位)であり、 NTRK3におけるSNPはrs7172184 (配列番号28の27位)であり、 PLCB1におけるSNPはrs8123323 (配列番号37の27位)であり、 NELL1におけるSNPはrs10766739 (配列番号3の27位)であり、 GPR98におけるSNPはrs16868972 (配列番号42の27位)であり、 MAGI2におけるSNPはrs12535987 (配列番号43の27位)であり、 PLAGL1におけるSNPはrs2076683 (配列番号12の27位)であり、 CNTN6におけるSNPはrs9837484 (配列番号35の27位)であり、 DLG4におけるSNPはrs314253 (配列番号17の27位)であり、 ERC2におけるSNPはrs1485677 (配列番号8の27位)であり、 TRIM9におけるSNPはrs10150121 (配列番号1の27位)であり、 SYT14におけるSNPはrs7534723 (配列番号30の27位)であり、 JARID2におけるSNPはrs9370809 (配列番号33の27位)であり、 CDH13におけるSNPはrs9940922 (配列番号36の27位)であり、 SULF2におけるSNPはrs6063144 (配列番号53の27位)であり、 GRIN2AにおけるSNPはrs4782109 (配列番号21の27位)であり、 NRG3におけるSNPはrs2820100 (配列番号54の27位)である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項６】
NRG3におけるSNPはrs2820100 (配列番号54の27位)または rs7075400 (配列番号55の27位)であり、 NRG1におけるSNPはrs723811 (配列番号44の27位)であり、 TRIM2におけるSNPはrs11942354 (配列番号45の27位)であり、 EPHA5におけるSNPはrs1597611 (配列番号10の27位)であり、 PCDH10におけるSNPはrs4404561 (配列番号20の27位)であり、 HIP1におけるSNPはrs6962352 (配列番号25の27位)であり、 APBA1におけるSNPはrs11139294 (配列番号6の27位)であり、 PDE4DにおけるSNPはrs35284 (配列番号18の27位)であり、 EGLN3におけるSNPはrs946630 (配列番号56の27位)である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項７】
KCNH5におけるSNPはrs1041644 (配列番号2の27位)であり、 MAP1SにおけるSNPはrs12985015 (配列番号7の27位)であり、 GRM7におけるSNPはrs1569284 (配列番号9の27位)であり、 PAX2におけるSNPはrs2077642 (配列番号13の27位)であり、 PTPRDにおけるSNPはrs2382104 (配列番号14の27位)であり、 PDE11AにおけるSNPはrs2695112 (配列番号16の27位)であり、 RGS6におけるSNPはrs6574041 (配列番号23の27位)であり、 ASTN2におけるSNPはrs7021928 (配列番号26の27位)であり、 ACCN1におけるSNPはrs7225320 (配列番号29の27位)であり、 DCLK2におけるSNPはrs9307866 (配列番号32の27位)であり、 SLC24A2におけるSNPはrs957910 (配列番号34の27位)であり、 AKAP7におけるSNPはrs6923644 (配列番号46の27位)であり、 DCLK1におけるSNPはrs1556060 (配列番号47の27位)であり、 MAP2K1におけるSNPはrs1432443 (配列番号48の27位)であり、 CADM1におけるSNPはrs220836 (配列番号49の27位)であり、 GRIN2BにおけるSNPはrs7974275 (配列番号50の27位)および/または NAV2におけるSNPはrs10500866 (配列番号57の27位)である、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
当該SNPは、rs2663327、rs7225320、rs6923644、rs11139294、rs7021928、rs298542、rs2367910、rs220836、rs9940922、rs10802802、rs9837484、rs1556060、rs9307866、rs12275631、rs314253、rs695083、rs946630、rs1597611、rs1485677、rs10787637、rs16868972、rs4782109、rs7974275、rs1569284、rs6962352、rs893109、 rs9370809、rs1041644、rs12514116、rs712886、rs260969、rs12535987、rs12985015、rs1432443、rs10500866、rs10766739、rs723811、rs2820100、rs7075400、rs7172184、rs2077642、rs4404561、rs2695112、rs35284、rs2076683、rs8123323、rs2382104、rs636624、rs12925135、rs6574041、rs957910 、rs3928471、rs6063144、rs7534723、rs11942354、rs10150121、rs16916456であり、前記方法は、好ましくは表１に定義されるリスク関連対立遺伝子の存在を検出することを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
さらに、PITX1、ATP2B2、EN2、JARID2、MARK1、ITGB3、CNTNAP2およびHOXA1またはそれらの組み合わせのいずれかまたはすべての遺伝子座におけるSNPの遺伝子型決定を含み、好ましくは、前記方法はさらに、rs6872664、rs2278556、rs1861972、rs7766973、rs12410279、rs5918、rs7794745、およびrs10951154、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれかまたはすべてのSNPの遺伝子型決定を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
男性被験者における、自閉症のリスク、または、自閉症の疾病素質または存在を検出する方法であって、被験者由来の試料中の、少なくともHTR5A、MACF1、RBFOX1、ABR、PTPRGおよびCACNA2D1の遺伝子座におけるSNPの遺伝子型を決定することを含み、好ましくは当該SNPはrs893109、rs260969、rs12925135、rs2663327、rs636624およびrs2367910である、方法。
【請求項１１】
さらに、KCNIP1、UGCG、NTRK3、PLCB1、NELL1、GPR98、MAGI2、およびPLAGL1、またはそれらの組み合わせのいずれかまたはすべての遺伝子座におけるSNPの遺伝子型決定を含み、好ましくは、さらに、rs12514116、rs16916456、rs7172184、rs8123323、rs10766739、rs16868972、rs12535987およびrs2076683、またはそれらの組み合わせからなる群より選択されるSNPのいずれかまたはすべての遺伝子型決定を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
さらに、NRG1、TRIM2、EPHA5の、PCDH10、およびHIP1、またはそれらの組み合わせのいずれかまたはすべての遺伝子座におけるSNPの遺伝子型決定を含み、好ましくは、さらに、rs723811、rs11942354、rs1597611、rs4404561及びrs6962352、又はこれらの組み合わせからなる群より選択されるSNPのいずれかまたはすべての遺伝子型決定を含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
さらにPDE11A、AKAP7、DCLK1、KCNH5、GRIN2A、ACCN1、DCLK2、ASTN2、GRM7、MAP2K1、CADM1、およびGRIN2B、またはそれらの組み合わせのいずれかまたはすべての遺伝子座におけるSNPの遺伝子型決定を含み、好ましくは、さらに、rs2695112、rs6923644、rs1556060、rs1041644、rs4782109、rs7225320、rs9307866、rs7021928、rs1569284、rs1432443、rs220836、およびrs7974275、またはそれらの組み合わせからなる群より選択されるSNPのいずれかまたはすべての遺伝子型決定を含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
さらに、PITX1、ATP2B2、EN2、JARID2、CNTNAP2およびHOXA1、またはそれらの組み合わせのいずれかまたはすべての遺伝子座におけるSNPの遺伝子型決定も含んでもよく、好ましくは、さらにrs6872664、rs2278556、rs1861972、rs7766973、rs7794745、およびrs10951154、またはそれらの組み合わせからなる群より選択されるSNPのいずれかまたはすべての遺伝子型決定を含む、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
女性被験者における自閉症のリスクを決定するか、または自閉症の疾病素質もしくは存在を検出する方法であって、前記被験者由来の試料中の、少なくともCHRM3、DSCAML1、PTPRG、GFRA1、LPPR4、DLG2、SLC9A9およびBASP1の遺伝子座におけるSNPの遺伝子型決定を含み、好ましくは、当該SNPは、rs10802802、rs695083、rs636624、rs10787637、rs712886、rs12275631、rs3928471およびrs298542である、方法。
【請求項１６】
さらに、CNTN6、NTRK3、DLG4、ERC2、TRIM9、SYT14、JARID2、CDH13、SULF2、GRIN2A及びNRG3、またはそれらの組み合わせのいずれかまたは全ての遺伝子座におけるSNPの遺伝子型決定を含み、好ましくは、さらに、rs9837484、rs7172184、rs314253、rs1485677、rs10150121、rs7534723、rs9370809、rs9940922、rs6063144、rs4782109及びrs2820100、またはそれらの組み合わせからなる群より選択されるSNPのいずれかまたは全ての遺伝子型決定を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
さらに、APBA1、ABR、NRG3、PDE4DおよびEGLN3、またはそれらの組み合わせのいずれかまたは全ての遺伝子座におけるSNPの遺伝子型の決定を含み、好ましくは、さらに、rs11139294、rs2663327、rs7075400、rs35284及びrs946630、又はそれらの組み合わせからなる群より選択されるSNPのいずれかまたはすべての遺伝子型決定を含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
さらに、RGS6、SLC24A2、PTPRD、NAV2、PCDH10、MAP1S、及びPAX2、またはそれらの組み合わせのいずれかまたはすべての遺伝子座におけるSNPの遺伝子型決定を含み、好ましくは、さらに、rs6574041、rs957910、rs2382104、rs10500866、rs4404561、rs12985015、及びrs2077642、又はこれらの組み合わせからなる群より選択されるSNPのいずれかまたはすべての遺伝子型決定を含む請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
さらに、EN2、JARID2、MARK1、ITGB3、およびCNTNAP2、またはそれらの組み合わせのいずれかまたは全ての遺伝子座におけるSNPの遺伝子型決定を含み、好ましくは、さらに、rs1861972、rs7766973、rs12410279、rs5918、およびrs7794745、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるSNPのいずれかまたは全ての遺伝子型決定を含む、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
表１に定義されるいずれかのSNPと連鎖不平衡にあるいずれかのSNPの遺伝子型決定を含み、当該連鎖不平衡にあるSNPは、表１に定義される当該SNPと同じ遺伝子内にあり、好ましくは表１に定義される当該SNPと連鎖不平衡（LD）にあるSNPの存在が、表１に定義される当該SNPの代わりにまたはそれに追加して遺伝子型決定される、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
リスクレベルまたは自閉症の疾病素質または存在の可能性が、検出された、リスクに関連する対立遺伝子の数に応じて、好ましくは、遺伝的スコアを計算することによって、決定される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
遺伝的スコアが一つ以上の閾値と比較される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
被験者が自閉症スペクトラム障害を有する者か自閉症スペクトラム障害（ASDｓ）を有する個体の兄弟とは関係がない、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
プライマーペア(フォワードおよびリバースプライマー)またはトリプレット(２つのフォワードおよび１つのリバースプライマー)および/または少なくともHTR5A、MACF1、RBFOX1、ABR、PTPRG、CACNA2D1、GFRA1、DSCAML1、CHRM3、LPPR4、DLG2、SLC9A9およびBASP1の遺伝子座におけるSNPの特異的検出のためのプローブを含むキットであって、好ましくは、前記SNPはHTR5Aのrs893109(配列番号31の27位)、MACF1のrs260969 (配列番号15の27位)、RBFOX1のrs12925135 (配列番号39の27位)、ABRのrs2663327 (配列番号40の27位)、PTPRGのrs636624 (配列番号22の27位)、CACNA2D1のrs2367910 (配列番号41の27位)、GFRA1のrs10787637 (配列番号4の27位)、DSCAML1のrs695083 (配列番号24の27位)、CHRM3のrs10802802 (配列番号5の27位)、LPPR4のrs712886 (配列番号27の27位)、DLG2のrs12275631 (配列番号51の27位)、SLC9A9のrs3928471 (配列番号19の27位)、およびBASP1のrs298542 (配列番号52の27位)である、キット。
【請求項２５】
プライマーペア(フォワードおよびリバースプライマー)またはトリプレット(２つのフォワードおよび１つのリバースプライマー)および/またはABR、ACCN1、AKAP7、APBA1、ASTN2、BASP1、CACNA2D1、CADM1、CDH13、CHRM3、CNTN6、DCLK1、DCLK2、DLG2、DLG4、DSCAML1、EGLN3、EPHA5の、ERC2、GFRA1、GPR98、GRIN2A、GRIN2B、GRM7、HIP1、 HTR5A、JARID2、KCNH5、KCNIP1、LPPR4、MACF1、MAGI2、MAP1S、MAP2K1、NAV2、NELL1、NRG1、NRG3、NTRK3、PAX2、PCDH10、PDE11A、PDE4D、PLAGL1、PLCB1、PTPRD、PTPRG、RBFOX1、RGS6、SLC24A2、 SLC9A9、SULF2、SYT14、TRIM2、TRIM9及びUGCGまたはそれらの組み合わせのすべての遺伝子座における少なくとも一つのSNPの特異的検出のためのプローブを含み、好ましくは、前記キットは、プライマーペア(フォワードおよびリバースプライマー)またはトリプレット(２つのフォワードおよび１つのリバースプライマー)および/または以下のSNP:  rs2663327、rs7225320、rs6923644、RS11139294、rs7021928、rs298542、rs2367910、rs220836、rs9940922、rs10802802、rs9837484、rs1556060、rs9307866、rs12275631、rs314253、rs695083、rs946630、rs1597611、rs1485677、rs10787637、rs16868972、rs4782109、rs7974275、 rs1569284、rs6962352、rs893109、rs9370809、rs1041644、rs12514116、rs712886、rs260969、rs12535987、rs12985015、rs1432443、rs10500866、rs10766739、rs723811、rs2820100、rs7075400、rs7172184、rs2077642、rs4404561、rs2695112、rs35284、rs20766
83、rs8123323、rs2382104、rs636624、rs12925135、rs6574041、rs957910、rs3928471、rs6063144、rs7534723、rs11942354、rs10150121、rs16916456のすべての特異的検出のためのプローブを含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
さらに、プライマーペア(フォワードおよびリバースプライマー)またはトリプレット(２つのフォワードおよび１つのリバースプライマー)および/またはPITX1、ATP2B2、EN2、JARID2、MARK1、ITGB3、CNTNAP2、及びHOXA1、またはそれらの組合せのいずれかまたはすべての遺伝子座におけるSNPの特異的検出のためのプローブを含み、好ましくは、前記キットはさらにプライマーペア(フォワードおよびリバースプライマー)またはトリプレット(２つのフォワードおよび１つのリバースプライマー)および/またはrs6872664、rs2278556、rs1861972、rs7766973、rs12410279、rs5918、rs7794745、およびrs10951154、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれかまたは全てのSNPの特異的検出のためのプローブを含む、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
(i) それぞれ配列番号31、15、39、40、22、41、4、24、5、27、51、19 および52の、配列番号31の27位付近、配列番号15の27位付近、配列番号39の27位付近、配列番号40の27位付近、配列番号22の27位付近、配列番号41 の27位付近、配列番号4の27位付近、配列番号24の27位付近、SEQ ID NO:5の27位付近、配列番号27の27位付近、配列番号51の27位付近および配列番号19の27位付近、または(ii) 当該配列の相補体、
の少なくとも10個の連続した塩基を含むポリヌクレオチドのセット。
【請求項２８】
(i)各配列番号1から配列番号57の、それぞれ配列番号1から配列番号57の表１に記載された位置の近傍、または(ii) 該配列の相補体、
の少なくとも10個の連続した塩基を含む、請求項２７に記載のポリヌクレオチドのセット。
【請求項２９】
さらに(i) 配列番号58から配列番号65、それぞれ配列番号58から配列番号65の表２に記載された位置の近傍、または(ii) 該配列の相補体、
の少なくとも10個の連続した塩基、好ましくは約10〜約60塩基を含む、請求項２７または２８に記載のポリヌクレオチドのセット。
【請求項３０】
請求項２７〜２９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドのセット、およびその上にポリヌクレオチドのセットが固定化された基板を含む、マイクロアレイ。
【請求項３１】
被験者における自閉症を治療または予防するための方法であって、
a）本明細書に記載の任意の方法により、被験者における、自閉症のリスクを決定する、または自閉症の疾病素質または存在を検出すること、および
b）もし当該被験者が自閉症のリスクがある、自閉症の疾病素質があるまたは自閉症に罹患していると決定される場合、被験者を以下：
i）自閉症診断観察スケジュール-ジェネリック[ADOS-G]等の行動自閉症機器、
ii）改訂自閉症診断インタビュー[ADI-R]等の、第三者との間接インタビューベースの自閉症機器、および/または、
iii）早期集中行動介入（EIBI）
に供すること、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、同時にいくつかの遺伝子におけるリスク対立遺伝子（リスクアレル）の組み合わせを検出することによる、自閉症のリスクを決定する方法、または自閉症の疾病素質若しくは存在を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ここで「自閉症」と呼ばれる広汎性発達障害（PDDs）は、口頭および非言語コミュニケーションにおける欠陥、制限された興味、および反復行動における欠損、社会的相互作用における欠陥、を特徴とする疾患の異成分群である。スペクトルに含まれる障害は、広汎性発達障害、特定不能（PDD-NOS）、自閉性障害、小児期崩壊性障害、アスペルガー症候群、およびレット症候群である。自閉症スペクトラム障害（ASDs）は、自閉性障害（AUT）、アスペルガー症候群（AS）、およびPDD-NOSの３つのPDDを表す。
【０００３】
ASDsは、現在臨床評価によって診断される。自閉症診断観測スケジュール-ジェネリック[ADOS-G]（Autism Diagnostic Observation Schedule-Generic (Gotham et al. 2007)）と改訂自閉症診断インタビュー[ADI-R]（the Autism Diagnostic Interview- Revised [ADI-R]) (Lord et al. 1994)））という二つの標準化された器具が、自閉症の診断評価の「ゴールド標準」と考えられている。ADI-Rは自閉症で変化する三つのドメインの定量的な探索を可能にする、両親と行われる半構造化診断面接である。これは、36ヶ月齢からの診断評価を提供する。ごく最近になって、改訂されたアルゴリズムが、12から47ヶ月齢(Kim および Lord 2012)の幼い子どもたちのために出版された(Kim および Lord 2012)。ADOSは、子供の観察のスケールである。それは、少なくとも36ヶ月の語学年齢と同等の子供たちのために開発された。少なくとも12ヶ月の精神年齢の30ヵ月未満児のためのバージョンは、最近開発された：ADOS-幼児モジュール（the ADOS-Toddler Module (Luyster et al. 2009)）。これらのツールは、訓練を必要とし、通常は精神科医または心理学者によって行われる。
【０００４】
いくつかのスクリーニング・ツールが現在までに確認されている(Barton et al. 2011)。特定のスクリーニング者の、心理的特性に関する限られたデータベースにもかかわらず、スクリーニングの価値が認識されている。しかし、自閉症のための特定のスクリーニングツールは、12ヶ月未満の子供では検証されていない。例えば、M-CHAT(Robins et al., 2001)は、最も広く使用され、18〜24ヶ月の小児で確認されている。
【０００５】
自閉症の有病率は米国では、110の子どもにつき1と推定され（Rice et al.、2009）、自閉症は最も頻度の高い幼年期の神経発達障害の一つとなっており、女性より男性のほうが診断される傾向がある（約4：1の男女比）。自閉症は強い遺伝的要素を有し、自閉症児の兄弟は、有病率と比較しての疾患のリスクが約19％高い（Ozonoff et al.2011）。一卵性と二卵性双生児の研究では、自閉症は、70〜80％と推定される一卵性双生児一致率との間に有意な遺伝的要素を有することが示されている（Hallmayer et al.、2011）。自閉症は、単純なメンデル遺伝パターンには従っておらず、自閉症における性特異的リスク対立遺伝子（リスクアレル）の証拠(Stone et al. 2004)と共に、複数の遺伝子の関与(Veenstra- VanderWeele et al. 2004)によるものと考えられる。
【０００６】
自然突然変異またはまれな遺伝変種が少数ケースの病因を説明するのに役立つことがあり、共通する変異の遺伝パターンは、多重家族の大部分における疾患リスクの中心と考えられている。
【０００７】
自閉症個体の中には、二次症状に対する抗うつ薬（例えばフルオキセチン）で処置されている者もいるが、自閉症のために利用可能な薬物療法は存在しない。提案されている主な治療は、集中的な教育プログラムに基づいている。十分に早く適用されるいくつかの研究では、それらのプログラムに参加している自閉症児の50％もが通常の学校教育と教育に戻ることができることを示している。治療が提案される年齢は非常に重要である。理想的には、プログラムは18ヶ月の年齢で開始する必要がある。しかし、12か月や18ヶ月での初期の症状と親の懸念から、ASDの診断が予測される可能性がある場合（Zwaigenbaum、2010）、文献は、子供が4歳まで自閉症の正式な診断を受けていないことを示唆している(Shattuck et al. , 2009, Chamak et al. , 2011 , CDC, 2012)。
【０００８】
自閉症に関連するいくつかの遺伝子またはSNPが、学術グループによっておよびIntegraGen SA (IntegraGen)での社内の研究努力によって同定されている。例えば、Hussman et al.、2011は、自閉症に関連する数百の候補遺伝子を記載している。Coutihno et al.、2007は、セロトニンの代謝や神経伝達経路における7つの候補遺伝子の自閉症病因における役割を分析し、自閉症におけるHTR5Aの有意な主要効果を報告している。Voineagu et al.、2011とマーティンら、2007は、ニューロンの特定のスプライシング因子A2BP1（FOX1としても知られている）を自閉症感受性遺伝子として記載している。モローら、2008は、自閉症に関連するいくつかの既知の候補遺伝子だけでなく、PCDH10、DIA1(c3orf58)、NHE9(SLC9A9)、CNTN3、SCN7AおよびRNF8を含む自閉症に関連した、新たな候補遺伝子を記載している。Wang et al.、2009（a）は、遺伝子CDH10とCDH9の間に位置するか、または他の遺伝子にある30のSNPを、自閉症に関連するとして記載している。ワイスら、2009は、自閉症感受性遺伝子などの遺伝子SEMA5Aを含む、自閉症に関連するいくつかのSNPを記載している。Anney et al.、2010は、自閉症に関連するとして、SNPと7つの遺伝子を開示している。WO2009/043178、WO2011/031786、およびUS2011/0207124は、さまざまな遺伝子変異体またはSNPsの、自閉症への関連について記載している。これらの出願は、自閉症または自閉症のリスクを診断するための方法をクレームしているが、開示された遺伝子変異またはSNPを分析することによって得ることができるであろう許容可能な感度、特異度、正および負の予測値を伴う真の診断を実証するデータはない。遺伝子変異やSNPの個人的な関連付けしか記載されていない。このように、多くの遺伝子またはSNPが自閉症または自閉症のリスクに関連しているとして個別に記載されている。しかし、識別された各個別の遺伝子の疾病リスクへの寄与は、一般的に低く、リスク対立遺伝子当たりのオッズ比は1.5を超える。このように、各遺伝子の予測力は、個別的には、複雑な疾患において臨床的に応用するには小さすぎる。この点について、エイブラハムズら、2008、Voineagu et al.、2012、およびシェラーら、2011は、自閉症に関連する遺伝子またはSNPを同定するためのさまざまな方法をレビューし、自閉症のリスクを高める遺伝因子の存在と、これらの要因の高い異質性と複雑さを明らかに強調している。
【０００９】
各SNPに関連した自閉症のリスクがささやかなままであっても、複数のリスク関連対立遺伝子の蓄積が顕著に自閉症における多遺伝子成分を支持する自閉症を発病するリスクを増大させる（Carayol et al.、2010年およびCarayol et al.、2011）。そのような多遺伝子モデルは、多くのマーカーが使用されればされるほど、自閉症が、複数のリスク関連SNPの共同効果を反映した遺伝的スコアを用いて予測できるようになると予測している。
【００１０】
4つの異なる遺伝子（PITX1、ATP2B2、SLC25A12、およびEN2）における4つの異なるSNPの解析を組み合わせた最初の複数のバイオマーカーベースのツールが開発され、罹患者の未知のステータスを有する兄弟において自閉症が発病するリスクの予測値を推定することができることが実証された（Carayol J et al.、2010年およびUS2011/0086777）。前回のテストの遺伝子の3つを含む8の異なる遺伝子（PITX1、ATP2B2、EN2、JARID2MARK1、ITGB3、CNTNAP2、およびHOXA1）における別々のSNPの解析を組み合わせた第二の複数のバイオマーカーベースのツールが後に開発され、罹患者の未知のステータスを有する兄弟において自閉症が発病するリスクの予測値を推定することができることが実証された(Carayol J  et al., 2011 および WO2011/138372)。
【００１１】
米国でTransgenomic社が提案したARISk（R）家族性自閉症パネルは、同時に自閉症の発症に関連することが示されている8つの独立した遺伝子中の8個のSNPをテストする。
【００１２】
しかし、それによって実質的に診断から治療までの時間が短縮される、簡単に任意の年齢に適用でき、及びADI-Rの適格性のための個人の事前スクリーニングに適用することができる改良された予測能力を有する遺伝子検査の必要性は依然として存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際特許公報第WO2009/043178号
【特許文献２】国際特許公報第WO2011/031786号
【特許文献３】国際特許公報第US2011/0207124号
【特許文献４】国際特許公報第WO2011/138372号
【００１４】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Autism Diagnostic Observation Schedule-Generic (Gotham et al. 2007)
【非特許文献２】the Autism Diagnostic Interview- Revised [ADI-R]) (Lord et al. 1994)）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、自閉症のリスクを決定する方法、または被験者における自閉症の存在または疾病素質を検出する方法に関し、当該方法は、当該被験者由来の試料中の複数の遺伝子座における、リスクに関連する一塩基多型（SNP）対立遺伝子の存在を検出することを含む。発明者らは、個体が自閉症のリスクがあるかどうかを決定するための遺伝子検査において有用な、遺伝子の新しいセット、より特定すると新しいSNPのセットを同定した。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、より具体的には、被験者からの試料中の、少なくともHTR5A、MACF1、RBFOX1、ABR、PTPRG、CACNA2D1、GFRA1、DSCAML1、CHRM3、LPPR4、DLG2、SLC9A9およびBASP1の遺伝子座におけるSNPの遺伝子型決定を含む、自閉症のリスクを決定する方法または被験者における自閉症の存在もしくは疾病素質を検出する方法を提供する。
【００１８】
特定の実施形態では、前記方法はさらにKCNIP1、UGCG、NTRK3、PLCB1、NELL1、GPR98、MAGI2、PLAGL1、CNTN6、DLG4、ERC2、TRIM9、SYT14、JARID2、CDH13、SULF2、GRIN2A及びNRG3またはそれらの組み合わせのいずれかまたはすべての遺伝子座におけるSNPの遺伝子型を決定することを含む。
【００１９】
別の特定の実施形態において、本方法はさらに、NRG1、TRIM2、EPHA5の、PCDH10、HIP1、APBA1、PDE4DおよびEGLN3、またはそれらの組み合わせのいずれかまたはすべての遺伝子座におけるSNPの遺伝子型決定を含む。
【００２０】
好ましい実施形態において、方法はさらに、ABR、ACCN1、AKAP7、APBA1、ASTN2、BASP1、CACNA2D1、CADM1、CDH13、CHRM3、CNTN6、DCLK1、DCLK2、DLG2、DLG4、DSCAML1、EGLN3、EPHA5の、ERC2、GFRA1、GPR98、GRIN2A、GRIN2B、GRM7、HIP1、HTR5A、JARID2、KCNH5、KCNIP1、LPPR4、MACF1、MAGI2、MAP1S、MAP2K1、NAV2、NELL1、NRG1、NRG3、NTRK3、PAX2、PCDH10、PDE11A、PDE4D、PLAGL1、PLCB1、PTPRD、PTPRG、RBFOX1、RGS6、SLC24A2、SLC9A9、SULF2、SYT14、TRIM2、TRIM9およびUGCG、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子座における少なくとも一つのSNPの追加の遺伝子型決定を含む。
【００２１】
特に、この方法は、以下の遺伝子座：ABR、ACCN1、AKAP7、APBA1、ASTN2、BASP1、CACNA2D1、CADM1、CDH13、CHRM3、CNTN6、DCLK1、DCLK2、DLG2、DLG4、DSCAML1、EGLN3、EPHA5の、ERC2、GFRA1、GPR98、GRIN2A、GRIN2B、GRM7、HIP1、HTR5A、JARID2、KCNH5、KCNIP1、LPPR4、MACF1、MAGI2、MAP1S、MAP2K1、NAV2、NELL1、NRG1、NRG3、NTRK3、PAX2、PCDH10、PDE11A、PDE4D、PLAGL1、PLCB1、PTPRD、PTPRG、RBFOX1、RGS6、SLC24A2、SLC9A9、SULF2、SYT14、TRIM2、TRIM9およびUGCGの全てにおける少なくとも一つのSNPの遺伝子型決定を含むことができる。
【００２２】
上記方法において、好ましくは、HTR5AにおけるSNPはrs893109(配列番号31の27位)であり、MACF1はrs260969(配列番号15の27位)であり、RBFOX1はrs12925135(配列番号39の27位)であり、ABRはrs2663327(配列番号40の27位)であり、PTPRGはrs636624(配列番号22の27位)であり、CACNA2D1はrs2367910(配列番号41の27位)であり、GFRA1はrs10787637(配列番号4の27位)であり、DSCAML1はrs695083(配列番号24の27位)であり、CHRM3はrs10802802(配列番号5の27位)であり、LPPR4はrs712886(配列番号27の27位)であり、DLG2はrs12275631(配列番号51の27位)であり、SLC9A9はrs3928471(配列番号19の27位)であり、BASP1はrs298542(配列番号52の27位)であり、KCNIP1はrs12514116(配列番号38の27位)であり、UGCGはrs16916456(配列番号11の27位)であり、NTRK3はrs7172184(配列番号28の27位)であり、PLCB1はrs8123323(配列番号37の27位)であり、NELL1はrs10766739(配列番号3の27位)であり、GPR98はrs16868972(配列番号42の27位)であり、MAGI2はrs12535987(配列番号43の27位)であり、PLAGL1はrs2076683(配列番号12の27位)であり、CNTN6はrs9837484(配列番号35の27位)であり、DLG4はrs314253(配列番号17の27位)であり、ERC2はrs1485677(配列番号8の27位)であり、TRIM9はrs10150121(配列番号1の27位)であり、SYT14はrs7534723(配列番号30の27位)であり、JARID2はrs9370809(配列番号33の27位)であり、CDH13はrs9940922(配列番号36の27位)であり、SULF2はrs6063144(配列番号53の27位)であり、GRIN2Aはrs4782109(配列番号21の27位)であり、NRG3はrs2820100(配列番号54の27位)またはrs7075400(配列番号55の27位)であり、NRG1はrs723811(配列番号44の27位)であり、TRIM2はrs11942354(配列番号45の27位)であり、EPHA5はrs1597611(配列番号10の27位)であり、PCDH10はrs4404561(配列番号20の27位)であり、HIP1はrs6962352(配列番号25の27位)であり、APBA1はrs11139294(配列番号6の27位)であり、PDE4Dはrs35284(配列番号18の27位)であり、EGLN3はrs946630(配列番号56の27位)であり、KCNH5はrs1041644(配列番号2の27位)であり、MAP1Sはrs12985015(配列番号7の27位)であり、GRM7はrs1569284(配列番号9の27位)であり、PAX2はrs2077642(配列番号13の27位)であり、PTPRDはrs2382104(配列番号14の27位)であり、PDE11Aはrs2695112(配列番号16の27位)であり、RGS6はrs6574041(配列番号23の27位)であり、ASTN2はrs7021928(配列番号26の27位)であり、ACCN1はrs7225320(配列番号29の27位)であり、DCLK2はrs9307866(配列番号32の27位)であり、SLC24A2はrs957910(配列番号34の27位)であり、AKAP7はrs6923644(配列番号46の27位)であり、DCLK1はrs1556060(配列番号47の27位)であり、MAP2K1はrs1432443(配列番号48の27位)であり、CADM1はrs220836(配列番号49の27位)であり、GRIN2Bはrs7974275(配列番号50の27位)であり、および／またはNAV2はrs10500866 (配列番号57の27位)である。最も好ましくは、遺伝子型決定した全てのSNPは、前の文章に挙げたものである。
【００２３】
したがって、特に、本発明は、自閉症のリスクを決定する方法、または被験者における自閉症の疾病素質または存在を検出する方法を提供し、当該方法は当該被験者からの試料中のSNPの遺伝子型決定を含み、SNPはrs2663327、rs7225320、rs6923644、rs11139294、rs7021928、rs298542、rs2367910、rs220836、rs9940922、rs10802802、rs9837484、rs1556060、rs9307866、rs12275631、rs314253、rs695083、rs946630、rs1597611、rs1485677、rs10787637、rs16868972、rs4782109、rs7974275、rs1569284、rs6962352、rs893109、rs9370809、rs1041644、rs12514116、rs712886、rs260969、rs12535987、rs12985015、rs1432443、rs10500866、rs10766739、rs723811、rs2820100、rs7075400、rs7172184、rs2077642、rs4404561、rs2695112、rs35284、rs2076683、rs8123323、rs2382104、rs636624、rs12925135、rs6574041、rs957910、rs3928471、rs6063144、rs7534723、rs11942354、rs10150121、rs16916456である。
【００２４】
前記方法はまた、方法はさらに、PITX1、ATP2B2、EN2、JARID2、MARK1、ITGB3、CNTNAP2およびHOXA1またはそれらの組み合わせのいずれかまたはすべての遺伝子座におけるSNPの遺伝子型決定を含んでもよく、好ましくは、前記方法はさらに、rs6872664、rs2278556、rs1861972、rs7766973、rs12410279、rs5918、rs7794745、およびrs10951154、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される一部またはすべてのSNPの遺伝子型決定を含んでもよい。
【００２５】
本発明はさらに、自閉症のリスクを決定する方法、または、男性被験者における自閉症の疾病素質または存在を検出する方法を提供し、当該方法は少なくともHTR5A、MACF1、RBFOX1、ABR、PTPRG、およびCACNA2D1の遺伝子座におけるSNPの遺伝子型を決定することを含む。好ましくは、HTR5AにおけるSNPはrs893109(配列番号31の27位)、MACF1においてはrs260969(配列番号15の27位)、RBFOX1においてはrs12925135(配列番号39の27位)、ABRにおいてはrs2663327(配列番号40の27位)、PTPRGにおいてはrs636624(配列番号22の27位)、および/またはCACNA2D1においてはrs2367910(配列番号41の27位)である。最も好ましくは、遺伝子型決定した全てのSNPは、前の文章に挙げたものである。したがって、特に、本発明は、男性被験者における自閉症のリスクを決定する方法または自閉症の疾病素質または存在を検出する方法を提供し、前記方法は、当該被験者からの試料中のSNPの遺伝子型決定を含み、当該SNPはrs893109、rs260969、rs12925135、rs2663327、rs636624およびrs2367910である。好ましくは、この方法はさらに、KCNIP1、UGCG、NTRK3、PLCB1、NELL1、GPR98、MAGI2、およびPLAGL1、またはそれらの組み合わせのいずれかまたはすべての遺伝子座におけるSNPの遺伝子型決定を含む。この場合、有利には、KCNIP1におけるSNPはrs12514116(配列番号38の27位)であり、UGCGにおいてはrs16916456(配列番号11の27位)であり、NTRK3においてはrs7172184(配列番号28の27位)であり、PLCB1においてはrs8123323(配列番号37の27位)であり、NELL1においてはrs10766739(配列番号3の27位)であり、GPR98においてはrs16868972(配列番号42の27位)であり、MAGI2においてはrs12535987(配列番号43の27位)であり、および/またはPLAGL1においてはrs2076683(配列番号12の27位)である。最も好ましくは、遺伝子型決定した全てのSNPは、前の文章に挙げたものである。従って、好ましくは、この方法はさらに、rs12514116、rs16916456、rs7172184、rs8123323、rs10766739、rs16868972、rs12535987およびrs2076683、またはそれらの組み合わせからなる群より選択されるSNPのいずれかまたはすべての遺伝子型決定を含む。
【００２６】
より好ましくは、方法はさらに、NRG1、TRIM2、EPHA5の、PCDH10、およびHIP1、またはそれらの組み合わせのいずれかまたはすべての遺伝子座におけるSNPの遺伝子型決定を含む。この場合、有利には、NRG1におけるSNPはrs723811(配列番号44の27位)であり、TRIM2においてはrs11942354(配列番号45の27位)であり、EPHA5においてはrs1597611(配列番号10の27位)であり、PCDH10においてはrs4404561(配列番号20の27位)であり、および／またはHIP1においてはrs6962352(配列番号25の27位)である。最も好ましくは、遺伝子型決定した全てのSNPは、前の文章に挙げたものである。したがって、この方法は、好ましくは、さらに、rs723811、rs11942354、rs1597611、rs4404561およびrs6962352又はこれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれかまたはすべてのSNPを遺伝子型決定することを含む。
【００２７】
さらに好ましくは、前記方法はさらに、PDE11A、AKAP7、DCLK1、KCNH5、GRIN2A、ACCN1、DCLK2、ASTN2、GRM7、MAP2K1、CADM1、およびGRIN2B、またはそれらの組み合わせのいずれか、またはすべての遺伝子座におけるSNPの遺伝子型決定をも含む。この場合、有利には、PDE11AにおけるSNPはrs2695112(配列番号16の27位)であり、AKAP7においてはrs6923644(配列番号46の27位)であり、DCLK1の３’付近はrs1556060(配列番号47の27位)であり、KCNH5においてはrs1041644(配列番号2の27位)であり、GRIN2Aにおいてはrs4782109(配列番号21の27位)であり、ACCN1においてはrs7225320(配列番号29の27位)であり、DCLK2においてはrs9307866(配列番号32の27位)であり、ASTN2においてはrs7021928(配列番号26の27位)であり、GRM7においてはrs1569284(配列番号9の27位)であり、MAP2K1においてはrs1432443(配列番号48の27位)であり、CADM1においてはrs220836(配列番号49の27位)であり、および/またはGRIN2Bにおいてはrs7974275(配列番号50の27位)である。最も好ましくは、遺伝子型決定した全てのSNPは、前の文章に挙げたものである。したがって、この方法は、さらにrs2695112rs6923644、rs1556060、rs1041644、rs4782109、rs7225320、rs9307866、rs7021928、rs1569284、rs1432443、rs220836、およびrs7974275、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるSNPのいずれかまたはすべての遺伝子型決定を含む。
【００２８】
好ましい実施形態において、前記方法はさらに、男性被験者における自閉症のリスクを決定する方法または自閉症の疾病素質または存在を検出する方法を提供し、前記方法は表1または表5に識別される任意のSNP、またはSPNの任意の組み合わせを遺伝子型決定することを含む。
【００２９】
前記方法はまたさらに、PITX1、ATP2B2、EN2、JARID2、CNTNAP2およびHOXA1、またはそれらの組み合わせのいずれかまたはすべての遺伝子座におけるSNPの遺伝子型決定含んでもよく、好ましくは、前記方法はさらにrs6872664、rs2278556、rs1861972、rs7766973、rs7794745、およびrs10951154、またはそれらの組み合わせからなる群より選択されるSNPのいずれかまたはすべての遺伝子型決定含んでもよい。
【００３０】
本発明はさらに、女性被験者における自閉症のリスクを決定する方法または自閉症の疾病素質または存在を検出する方法を提供し、当該方法は前記被験者由来の試料中の少なくともCHRM3、DSCAML1、PTPRG、GFRA1、LPPR4、DLG2、SLC9A9およびBASP1の遺伝子座におけるSNPの遺伝子型を決定することを含む。好ましくはCHRM3におけるSNPはrs10802802(配列番号5の27位)であり、DSCAML1においてはrs695083(配列番号24の27位)であり、PTPRGにおいてはrs636624(配列番号22の27位)であり、LPPR4においてはrs712886(配列番号27の27位)であり、DLG2においてはrs12275631(配列番号51の27位)であり、SLC9A9においてはrs3928471(配列番号19の27位)であり、BASP1においてはrs298542(配列番号52の27位)である。最も好ましくは、遺伝子型決定した全てのSNPは、前の文章に挙げたものである。したがって、本発明は、さらに、女性被験者における自閉症のリスクを決定する方法または自閉症の疾病素質もしくは存在を検出する方法を提供し、当該方法は前記被験者からのサンプル中のSNPの遺伝子型決定を含み、SNPはrs10802802、rs695083、rs636624、rs10787637、rs712886、rs12275631、rs3928471及びrs298542である。
【００３１】
好ましくは、この方法はさらに、CNTN6、NTRK3、DLG4、ERC2、TRIM9、SYT14、JARID2、CDH13、SULF2、GRIN2A及びNRG3、またはそれらの組み合わせのいずれかまたは全ての遺伝子座におけるSNPの遺伝子型決定を含む。この場合、有利には、CNTN6におけるSNPはrs9837484(配列番号35の27位)であり、NTRK3においてはrs7172184(配列番号28の27位)であり、DLG4においてはrs314253(配列番号17の27位)、ERC2においてはrs1485677(配列番号8の27位)であり、TRIM9においてはrs10150121(配列番号1の27位)であり、SYT14においてはrs7534723(配列番号30の27位)であり、JARID2においてはrs9370809(配列番号33の27位)であり、CDH13においてはrs9940922(配列番号36の27位)であり、SULF2においてはrs6063144(配列番号53の27位)であり、GRIN2Aにおいてはrs4782109(配列番号21の27位)であり、および/またはNRG3においてはrs2820100(配列番号54の27位)であるかまたはrs7075400(配列番号55の27位)である。最も好ましくは、遺伝子型決定した全てのSNPは、前の文章に挙げたものである。したがって、好ましくは、この方法はさらに、rs9837484、rs7172184、rs314253、rs1485677、rs10150121、rs7534723、rs9370809、rs9940922、rs6063144、rs4782109及びrs2820100、またはこれらの組み合わせからなる群から選択されるSNPのいずれかまたはすべての遺伝子型決定を含む。
【００３２】
より好ましくは、当該方法はさらに、そのAPBA1、ABR、NRG3、PDE4DおよびEGLN3、またはそれらの組み合わせのいずれかまたは全ての遺伝子座におけるSNPの遺伝子型決定を含む。この場合、有利には、APBA1におけるSNPはrs11139294(配列番号6の27位)であり、ABRにおいてはrs2663327(配列番号40の27位)であり、NRG3においてはrs7075400(配列番号55の27位)であり、PDE4Dにおいてはrs35284(配列番号18の27位)であり、および/またはEGLN3においてはrs946630(配列番号56の27位)である。最も好ましくは、遺伝子型決定した全てのSNPは、前の文章に挙げたものである。したがって、この方法は、好ましくは、そのRS11139294、rs2663327、rs7075400、rs35284及びrs946630、またはこれらの組み合わせからなる群から選択されるSNPのいずれかまたはすべての遺伝子型決定を含む。
【００３３】
さらにより好ましくは、方法はさらに、RGS6、SLC24A2、PTPRD、NAV2、PCDH10、MAP1S、及びPAX2、またはそれらの組み合わせのいずれかまたはすべての遺伝子座においてSNPの遺伝子型決定を含む。この場合、有利には、RGS6におけるSNPはrs6574041(配列番号23の27位)であり、SLC24A2においてはrs957910(配列番号34の27位)であり、PTPRDにおいてはrs2382104(配列番号14の27位)であり、NAV2においてはrs10500866(配列番号57の27位)であり、PCDH10においてはrs4404561(配列番号20の27位)であり、MAP1Sにおいてはrs12985015(配列番号7の27位)であり、および/またはPAX2においてはrs2077642(配列番号13の27位)である。最も好ましくは、遺伝子型決定した全てのSNPは、前の文章に挙げたものである。したがって、この方法は、好ましくは、そのrs6574041、rs957910、rs2382104、rs10500866、rs4404561、rs12985015、およびrs2077642、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるSNPのいずれかまたはすべての遺伝子型決定を含む。
【００３４】
好ましい実施形態において、方法はさらに、女性被験者における自閉症のリスクを決定する方法または自閉症の疾病素質または存在を検出する方法提供し、前記方法は表1または表6に識別される任意のSNPの遺伝子型を決定することを含む。
【００３５】
本方法はさらに、EN2、JARID2、MARK1、ITGB3、およびCNTNAP2、またはそれらの組み合わせのいずれかまたはすべての遺伝子座におけるSNPの遺伝子型決定を含んでいてもよく、好ましくは、当該方法はさらにrs1861972、rs7766973、rs12410279、rs5918、およびrs7794745、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるSNPのいずれかまたは全てのSNPの遺伝子型決定を含む。
【００３６】
本発明の方法において、好ましくは表1に定義される、リスク関連対立遺伝子の組み合わせの存在の検出は、被験者における自閉症のリスク、自閉症に対する疾病素質、または自閉症の存在を示す。実験の項で説明するように、リスクレベルまたは自閉症の疾病素質または存在の可能性は、検出されたリスクに関連する対立遺伝子の数に応じて、好ましくは、遺伝的スコアを計算することによって、決定される。
【００３７】
一つの態様において、本発明の方法は、SNPは、上記の前記特定の遺伝子内にある、上記で同定されているSNPのいずれかと連鎖不平衡にある任意のSNPを遺伝子型決定することを含む、または更に含む。特に、上記の同定されたSNPと連鎖不平衡（LD）のSNPの存在は、当該同定されたSNPの代わりに、またはそれに加えて、遺伝子型を決定してもよい。本発明の文脈において、上記で同定されたSNPと連鎖不平衡にあるSNPは、上記で同定されたSNPと同じ遺伝子内にある。
【００３８】
本願発明はさらに、少なくともHTR5A、MACF1、RBFOX1、ABR、PTPRG、CACNA2D1、GFRA1、DSCAML1、CHRM3、LPPR4、DLG2、SLC9A9およびBASP1の遺伝子座におけるSNPの特異的検出のためのプライマーペア(フォワードおよびリバースプライマー)またはトリプレット(２つのフォワードプライマーおよび一つのリバースプライマー)および/またはプローブを含むキットを提供する。好ましくは、SNPはHTR5Aにおけるrs893109(配列番号31の27位)、MACF1におけるrs260969(配列番号15の27位)、RBFOX1におけるrs12925135(配列番号39の27位)、ABRにおけるrs2663327(配列番号40の27位)、PTPRGにおけるrs636624(配列番号22の27位)、CACNA2D1におけるrs2367910(配列番号41の27位)、GFRA1におけるrs10787637(配列番号4の27位)、DSCAML1におけるrs695083(配列番号24の27位)、CHRM3におけるrs10802802(配列番号5の27位)、LPPR4におけるrs712886(配列番号27の27位)、DLG2におけるrs12275631(配列番号51の27位)、SLC9A9におけるrs3928471(配列番号19の27位)、およびBASP1におけるrs298542(配列番号52の27位)である。
【００３９】
前記キットはさらに、KCNIP1、UGCG、NTRK3、PLCB1、NELL1、GPR98、MAGI2、PLAGL1、CNTN6、DLG4、ERC2、TRIM9、SYT14、JARID2、CDH13、SULF2、GRIN2A及びNRG3のいずれかまたはすべての遺伝子座におけるSNPの特異的検出のためのプライマー対（プライマーフォワードおよびリバース）またはトリプレット（2つのフォワードプライマーと1つのリバースプライマー）および/またはプローブを含み、好ましくは、該キットはさらに、KCNIP1におけるrs12514116(配列番号38の27位)、UGCGにおけるrs16916456(配列番号11の27位)、NTRK3におけるrs7172184(配列番号28の27位)、PLCB1におけるrs8123323(配列番号37の27位)、NELL1におけるrs10766739(配列番号3の27位)、GPR98におけるrs16868972(配列番号42の27位)、MAGI2におけるrs12535987(配列番号43の27位)、PLAGL1におけるrs207668(配列番号12の27位)、CNTN6におけるrs9837484(配列番号35の27位)、DLG4におけるrs314253(配列番号17の27位)、ERC2におけるrs1485677(配列番号8の27位)、TRIM9におけるrs10150121(配列番号1の27位)、SYT14におけるrs7534723(配列番号30の27位)、JARID2におけるrs9370809(配列番号33の27位)、CDH13におけるrs9940922(配列番号36の27位)、SULF2におけるrs6063144(配列番号53の27位)、GRIN2Aにおけるrs4782109(配列番号21の27位)、およびNRG3におけるrs2820100(配列番号54の27位)、またはそれらの組み合わせのいずれかまたはすべての特異的検出のためのプライマー対（プライマーフォワードおよびリバース）またはトリプレット（2つのフォワードプライマーと1つのリバースプライマー）および/またはプローブを含む。
【００４０】
当該キットはさらに、NRG1、TRIM2、EPHA5、PCDH10は、HIP1、APBA1、PDE4DおよびEGLN3、またはそれらの組合せのいずれかまたは全ての遺伝子座におけるSNPの特異的検出のためのプライマー対（プライマーフォワードおよびリバース）またはトリプレット（2つのフォワードプライマーと1つのリバースプライマー）および/またはプローブを含んでもよいか、加えて含み、好ましくは、当該キットはさらに、NRG1におけるrs723811(配列番号44の27位)、APBA1におけるrs11139294(配列番号6の27位)、TRIM2におけるrs11942354(配列番号45の27位)、EPHA5におけるrs1597611(配列番号10の27位)、PCDH10におけるrs4404561(配列番号20の27位)、HIP1におけるrs6962352(配列番号25の27位)、NRG3におけるrs7075400(配列番号55の27位)、PDE4Dにおけるrs35284(配列番号18の27位)およびEGLN3におけるrs946630(配列番号56の27位)、またはそれらの組み合わせのいずれかまたは全ての特異的検出のためのプライマー対（プライマーフォワードおよびリバース）またはトリプレット（2つのフォワードプライマーと1つのリバースプライマー）および/またはプローブを含む。
【００４１】
当該キットはABR、ACCN1、AKAP7、APBA1、ASTN2、BASP1、CACNA2D1、CADM1、CDH13、CHRM3、CNTN6、DCLK1、DCLK2、DLG2、DLG4、DSCAML1、EGLN3、EPHA5の、ERC2、GFRA1、GPR98、GRIN2A、GRIN2B、GRM7、HIP1、HTR5A、JARID2、KCNH5、KCNIP1、LPPR4、MACF1、MAGI2、MAP1S、MAP2K1、NAV2、NELL1、NRG1、NRG3、NTRK3、PAX2、PCDH10、PDE11A、PDE4D、PLAGL1、PLCB1、PTPRD、PTPRG、RBFOX1、RGS6、SLC24A2、SLC9A9、SULF2、SYT14、TRIM2、TRIM9及びUGCG、またはそれらの組合せの遺伝子座における少なくとも一つのSNPの特異的検出のためのプライマー対（プライマーフォワードおよびリバース）またはトリプレット（2つのフォワードプライマーと1つのリバースプライマー）および/またはプローブを含んでもよいか、さらに加えて含み、好ましくは、当該キットは、rs2663327、rs7225320、rs6923644の全て、RS11139294、rs7021928、rs298542、rs2367910、rs220836、rs9940922、rs10802802、rs9837484、rs1556060、rs9307866、rs12275631、rs314253、rs695083、rs946630、rs1597611、rs1485677、rs10787637、rs16868972、rs4782109、rs7974275、rs1569284、rs6962352、rs893109、rs9370809、rs1041644、rs12514116、rs712886、rs260969、rs12535987、rs12985015、rs1432443、rs10500866、rs10766739、rs723811、rs2820100、rs7075400、rs7172184、rs2077642、rs4404561、rs2695112、rs35284、rs2076683、rs8123323、rs2382104、rs636624そのrs12925135、rs6574041、rs95
7910、rs3928471、rs6063144、rs7534723、rs11942354、rs10150121、rs16916456、またはそれらの組み合わせのいずれかまたはすべての特異的検出のためのプライマー対（プライマーフォワードおよびリバース）またはトリプレット（2つのフォワードプライマーと1つのリバースプライマー）および/またはプローブを含む。
【００４２】
特に、当該キットは以下の遺伝子座：ABR、ACCN1、AKAP7、APBA1、ASTN2、BASP1、CACNA2D1、CADM1、CDH13、CHRM3、CNTN6、DCLK1、DCLK2、DLG2、DLG4、DSCAML1、EGLN3、EPHA5の、ERC2、GFRA1、GPR98、GRIN2A、GRIN2B、GRM7、HIP1、HTR5A、JARID2、KCNH5、KCNIP1、LPPR4、MACF1、MAGI2、MAP1S、MAP2K1、NAV2、NELL1、NRG1、NRG3、NTRK3、PAX2、PCDH10、PDE11A、PDE4D、PLAGL1、PLCB1、PTPRD、PTPRG、RBFOX1、RGS6、SLC24A2、SLC9A9、SULF2、SYT14、TRIM2、TRIM9とUGCGにおける少なくとも一つのSNPの特異的検出のためのプライマー対（プライマーフォワードおよびリバース）またはトリプレット（2つのフォワードプライマーと1つのリバースプライマー）および/またはプローブを含んでもよく、好ましくは、当該キットは、以下の全てのSNP:rs2663327、rs7225320、rs6923644、139294をRS11、rs7021928、rs298542、rs2367910、rs220836、rs9940922、rs10802802、rs9837484、rs1556060、rs9307866、rs12275631、rs314253、rs695083、rs946630、rs1597611、rs1485677、rs10787637、rs16868972、rs4782109、rs7974275、rs1569284、rs6962352、rs893109、rs9370809、rs1041644、rs12514116、rs712886、rs260969、rs12535987、rs12985015、rs1432443、rs10500866、rs10766739、rs723811、rs2820100、rs7075400、rs7172184、rs2077642、rs4404561、rs2695112、rs35284、rs2076683、rs8123323、rs2382104、rs636624、rs12925135、rs6574041、rs957910、rs3928471、rs6063144、rs7534723、rs11942354、rs10150121、rs16916456の特異的検出のためのプライマー対（プライマーフォワードおよびリバース）またはトリプレット（2つのフォワードプライマーと1つのリバースプライマー）および/またはプローブを含む。
【００４３】
当該キットはさらにPITX1、ATP2B2、EN2、JARID2、MARK1、ITGB3、CNTNAP2、及びHOXA1、またはそれらの組合せのいずれかまたはすべての遺伝子座におけるSNPの特異的検出のためのプライマー対（プライマーフォワードおよびリバース）またはトリプレット（2つのフォワードプライマーと1つのリバースプライマー）および/またはプローブを含んでもよく、好ましくは、当該キットは、rs6872664、rs2278556、rs1861972、rs7766973、rs12410279、rs5918、rs7794745、およびrs10951154、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれかまたはすべてのSNPの特異的検出のためのプライマー対（プライマーフォワードおよびリバース）またはトリプレット（2つのフォワードプライマーと1つのリバースプライマー）および/またはプローブを含む。
【００４４】
プライマー対（プライマーフォワードおよびリバース）またはトリプレット（2つのフォワードプライマーと1つのリバースプライマー）は、関心のあるSNPを含む標的遺伝子の一部の特異的増幅のために使用することができる。二つのプライマーだけが使用される場合、それらは一般に、関心のある標的SNPの一方の側にそれぞれ配置され、さらなる分析のために標的配列の量を増加させるために使用される。三種類のプライマーが使用される場合、単一のリバースプライマーは、好ましくは、関心のある標的SNPの一方の側に配置されており、二つの対応するプライマーは、SNPの保護またはリスクに関連する対立遺伝子のそれぞれに特異的である。二つのプライマー間で異なる塩基は、好ましくはフォワードプライマーの3'に位置している。プライマーは、約15〜約25ヌクレオチド、好ましくは約18〜約22ヌクレオチドのポリヌクレオチドである。
【００４５】
遺伝子座におけるSNPを特異的に検出するためのプローブは、特に、関心のあるSNPを含む標的遺伝子の一部と相補的な、少なくとも10個の連続した塩基、好ましくは約10〜約60塩基を含むポリヌクレオチドを含むか、またはそれからなっていてもよい。
【００４６】
特に、本発明は、(i)それぞれ配列番号31、15、39、40、22、41、4、24、5、27、51、19および52の、配列番号31の27位付近、配列番号15の27位付近、配列番号39の27位付近、配列番号40の27位付近、配列番号22の27位付近、配列番号41の27位付近、配列番号4の27位付近、配列番号24の27位付近、配列番号5の27位付近、配列番号27の27位付近、配列番号51の27位付近および配列番号19の27位付近、または(ii)当該配列の相補体の少なくとも10個の連続した塩基、好ましくは約10〜約60塩基を含むポリヌクレオチドのセットを提供する。ポリヌクレオチドのこのようなセットは、さらに、(i)それぞれ表１で言及されている配列番号38、配列番号11、配列番号28、配列番号37、配列番号3、配列番号42、配列番号43、配列番号12、配列番号35、配列番号17、配列番号8、配列番号1、配列番号30、配列番号33、配列番号36、配列番号53、配列番号21、配列番号54および配列番号55の位置近傍の配列番号38、配列番号11、配列番号28、配列番号37、配列番号3、配列番号42、配列番号43、配列番号12、配列番号35、配列番号17、配列番号8、配列番号1、配列番号30、配列番号33、配列番号36、配列番号53、配列番号21、配列番号:54および配列番号55、または(ii)当該配列の相補体の少なくとも10個の連続した塩基、好ましくは約10〜約60塩基を含むポリヌクレオチドを含んでいてもよい。ポリヌクレオチドのこのようなセットは、さらに、(i)それぞれ表１で言及されている配列番号44、配列番号45、配列番号10、配列番号20、配列番号25、配列番号6、配列番号18および配列番号56の位置近傍の配列番号44、配列番号45、配列番号10、配列番号20、配列番号25、配列番号6、配列番号18および配列番号56、または(ii)当該配列の相補体の少なくとも10個の連続した塩基、好ましくは約10〜約60塩基を含むポリヌクレオチドを含んでいてもよい。
【００４７】
好ましい実施形態において、本発明は、 (i)それぞれ表１で言及されている配列番号1から配列番号57の位置近傍の配列番号1から配列番号57、または(ii)当該配列の相補体の少なくとも10個の連続した塩基、好ましくは約10〜約60塩基を含むポリヌクレオチドのセットを提供する。
【００４８】
上記ポリヌクレオチドのセットは、さらに(i)それぞれ表２で言及されている配列番号58から配列番号65の位置近傍の配列番号58から配列番号65、または(ii)当該配列の相補体の少なくとも10個の連続した塩基、好ましくは約10〜約60塩基を含む。
【００４９】
本発明のさらなる主題は、ポリヌクレオチドのセットと、任意選択の、その上にポリヌクレオチドのセットが固定化された基板を含むマイクロアレイであり、ポリヌクレオチドのセットは上で定義された通りである。
【００５０】
本発明者らは、これらの遺伝子における多型のリスクに関連する対立遺伝子の組み合わせを検出することによって得られた予測値は、その臨床的有効性を実証し、個別にこれらのリスクに関連する対立遺伝子を考慮したときに得られる予測値よりも優れていることを示した。これらのSNPを遺伝子型決定することは、したがって、罹患した個体の非診断の兄弟においてだけでなく、より一般的ないずれかの個人、特に、いずれかの子供の、自閉症の発症リスクの予測値の推定を可能とする。
【００５１】
この試験の臨床的有用性は、リスクのある個人の、心理プロファイリングテスト（例えばADI-RまたはADOS）を使用した早期の下流の診断のための選択をする能力にある。このテストは、自閉症の診断を立証し、他の精神疾患と区別するための、これらのプロファイリングのテストを伴うために、罹患した個人で使用することもできる。
【００５２】
本発明はさらに、被験者における自閉症を治療または予防するための方法に関し、該方法は、以下：
a）本明細書に記載の本発明の任意の方法により、被験者における、自閉症のリスクを決定する、または自閉症の疾病素質または存在を検出すること、および
b）もし当該被験者が自閉症のリスクがある、自閉症の疾病素質があるまたは自閉症に罹患していると決定される場合、被験者を以下に供する：
i）当該自閉症診断観察スケジュール-ジェネリック[ADOS-G]のような行動自閉症機器、
ii）改訂自閉症診断インタビュー[ADI-R]のような、第三者との間接インタビューベースの自閉症機器、および/または、
iii）早期集中行動介入（EIBI）。
【００５３】
好ましくは、もし被験者が自閉症のリスクがある、自閉症の疾病素質があるまたは自閉症に罹患していると決定される場合、自閉症の診断を確認するために、その後被験者は最初にすぐに行動または間接インタビューベースの自閉症試験、好ましくは改訂自閉症診断インタビュー[ADI-R]に供される。自閉症の診断が確認された場合、早期の介入が自閉症の被験者についての結果を改善することが見出されたので、次に被験者は迅速に、早期集中行動介入（EIBI）に供される。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
特に明記しない限り、用語「自閉症」は自閉症スペクトラム障害(ASDs)をいい、社会的相互作用における欠損、口頭と非言語コミュニケーションにおける不足、および行動、興味及び活動の限定された繰り返しやステレオタイプのパターンを特徴とする疾患の異種群である。自閉症スペクトラム障害（ASD）は好ましくは、典型的な自閉症の形を含む、自閉性障害（AUT）に向けられ、アスペルガー症候群（AS）、小児期崩壊性障害およびPDD-NOSなどの自閉症の主要な症状の分布や数、開始年齢によって異なる形態を含む。本発明の方法は、より好ましくは、自閉症性障害（AUT）を意図している。
【００５５】
本発明は、被験者におけるいくつかの遺伝子の監視に基づいて診断スクリーニング方法を提供する。被験者は、早期、発症前の段階、または後期段階がある。被験者は、任意のヒト男性または女性、好ましくは子供や若い成人であってもよい。被験者は無症候性であってもよい。被験者は、家族歴自閉症を有していても有していなくてもよい。被験者が既に自閉症スペクトラム障害と診断された個体、すなわち自閉症スペクトラム障害を持つ個人の兄弟であるとき、本発明の方法は有用である。しかし、テストの被験者が、自閉症スペクトラム障害者に関係していない場合にも有用であろう。本発明の方法は、出生後の任意の年齢で行われ、ADI-Rによるさらなる評価を必要とする個人の事前スクリーニングに使用することができ、診断から介入までの時間を短縮することができる。
【００５６】
診断方法は、in vitro、ex vivoで、ex vivoまたはin vitroで、好ましくはin vitroまたはex vivoで行うことができる。それらは、被験者からの試料を使用する。試料は、核酸を含む、被験者に由来する任意の生物学的試料であってもよい。このような試料の例には、体液、組織、細胞試料、器官、生検等が含まれる。最も好ましい試料は血液、血漿、唾液、頬骨細胞、尿、精液、等である。特に好ましいサンプルは、唾液である。試料は、従来の技術に従って収集されてよく、診断のために直接使用するか、または保存することができる。試料は、試験のための核酸またはポリペプチドの利用可能性を提供または改善するために、方法の実行に先立って処理することができる。処理は、例えば、溶解（例えば機械的、物理的、化学的等）、遠心分離等を含む。また、核酸は、従来の技術によって事前に精製、または富化することができ、及び/又は複雑さを低減することができる。核酸はまた、そのフラグメントを生成する酵素または他の化学的もしくは物理的処理で処理することができる。特許請求する方法の高い感度を考慮すると、アッセイを行うのに非常に少量の試料で十分である。
【００５７】
試料中の特定の対立遺伝子の発見は、自閉症の進行の存在、疾病素質または段階に相関させることができる、被験者における遺伝子座変異体の存在の指標である。例えば、生殖細胞系変異を有する個体は、自閉症を発症するリスクが高い。被験者における変更された遺伝子座の存在の決定はまた、より効果的でカスタマイズされた、適切な治療的介入の設計を可能にする。また、発症前レベルでのこの決定は、予防レジメンの適用を可能にする。
【００５８】
リスク関連遺伝子およびSNP
本発明は、自閉症のリスクを決定する方法、または被験者における自閉症の存在または疾病素質を検出する方法に関し、当該方法は、当該被験者由来の試料中の複数の遺伝子座における、リスクに関連する一塩基多型（SNP）対立遺伝子の存在を検出することを含む。発明者らは、個体が自閉症のリスクがあるかどうかを決定するための遺伝子検査において有用な、遺伝子の新しいセット、より特定すると新しいSNPのセットを同定した。より具体的には、本発明者らは、選択されたSNPのリスク関連対立遺伝子の特定の組み合わせによって、自閉症のリスクの決定に非常に有用な予測力が得られるようになった。
【００５９】
本発明は、より具体的には、被験者からの試料中の、少なくともHTR5A、MACF1、RBFOX1、ABR、PTPRG、CACNA2D1、GFRA1、DSCAML1、CHRM3、LPPR4、DLG2、SLC9A9およびBASP1の遺伝子座におけるSNPの遺伝子型決定を含む、被験者における自閉症のリスクを決定する方法または自閉症の存在もしくは疾病素質を検出する方法を提供する。ある実施形態では、前記方法は、HTR5Aにおける一塩基多型（SNP)rs893109(配列番号31の27位)の遺伝子型決定、および/またはMACF1における一塩基多型（SNP)rs260969(配列番号15の27位)の遺伝子型決定、および/またはRBFOX1における一塩基多型（SNP)rs12925135(配列番号39の27位)の遺伝子型決定、および/またはABRにおける一塩基多型（SNP)rs2663327(配列番号40の27位)の遺伝子型決定、および/またはPTPRGにおける一塩基多型（SNP)rs636624(配列番号22の27位)の遺伝子型決定、および/またはCACNA2D1における一塩基多型（SNP)rs2367910(配列番号41の27位)の遺伝子型決定、および/またはGFRA1における一塩基多型（SNP)rs10787637(配列番号4の27位)の遺伝子型決定、および/またはDSCAML1における一塩基多型（SNP)rs695083(配列番号24の27位)の遺伝子型決定、および/またはCHRM3における一塩基多型（SNP)rs10802802(配列番号5の27位)の遺伝子型決定、および/またはLPPR4における一塩基多型（SNP)rs712886(配列番号27の27位)の遺伝子型決定、および/またはDLG2における一塩基多型（SNP)rs12275631(配列番号51の27位)の遺伝子型決定、および/またはSLC9A9における一塩基多型（SNP)rs3928471(配列番号19の27位)の遺伝子型決定、および/またはBASP1における一塩基多型（SNP)rs298542(配列番号52の27位)の遺伝子型決定を含む。
【００６０】
特定の実施形態では、前記方法はさらにKCNIP1、UGCG、NTRK3、PLCB1、NELL1、GPR98、MAGI2、PLAGL1、CNTN6、DLG4、ERC2、TRIM9、SYT14、JARID2、CDH13、SULF2、GRIN2A及びNRG3またはそれらの組み合わせのいずれかまたはすべての遺伝子座におけるSNPの遺伝子型を決定することを含む。好ましい実施形態では、前記方法は、KCNIP1におけるSNP rs12514116 (配列番号38の27位)、UGCGにおけるSNP rs16916456 (配列番号11の27位)、NTRK3におけるSNP rs7172184 (配列番号28の27位)、PLCB1におけるSNP rs8123323 (配列番号37の27位)、NELL1におけるSNP rs10766739 (配列番号3の27位)、GPR98におけるSNP rs16868972 (配列番号42の27位)、MAGI2におけるSNP rs12535987 (配列番号43の27位)、PLAGL1におけるSNP rs207668 (配列番号12の27位)、CNTN6におけるSNP rs9837484 (配列番号35の27位)、 DLG4 におけるSNP rs314253 (配列番号17の27位)、ERC2におけるSNP rs1485677 (配列番号8の27位)、TRIM9におけるSNP rs10150121 (配列番号1の27位)、SYT14におけるSNP rs7534723 (配列番号30の27位)、JARID2におけるSNP rs9370809 (配列番号33の27位)、CDH13におけるSNP rs9940922 (配列番号36の27位)、SULF2におけるSNP rs6063144 (配列番号53の27位)、GRIN2AにおけるSNP rs4782109 (配列番号21の27位)、およびNRG3におけるSNP rs2820100 (配列番号54の27位)のいずれかまたは全ての遺伝子型決定を含む。
【００６１】
別の特定の実施形態において、本方法はさらに、NRG1、TRIM2、EPHA5の、PCDH10、HIP1、APBA1、PDE4DおよびEGLN3、またはそれらの組み合わせのいずれかまたはすべての遺伝子座におけるSNPの遺伝子型決定を含む。他の好ましい実施形態では、前記方法は、さらに、NRG1におけるSNP rs723811(配列番号44の27位)、APBA1におけるSNP rs11139294(配列番号6の27位)、TRIM2におけるSNP rs11942354(配列番号45の27位)、EPHA5におけるSNP rs1597611(配列番号10の27位)、PCDH10におけるSNP rs4404561(配列番号20の27位)、HIP1におけるSNP rs6962352(配列番号25の27位)、NRG3におけるSNP rs7075400(配列番号55の27位)、PDE4DにおけるSNP rs35284(配列番号18の27位)およびEGLN3におけるSNP rs946630(配列番号56の27位)のいずれかまたは全ての遺伝子型決定を含む。好ましくは、全ての遺伝子型決定されたSNPは前の文章に挙げたものである。
【００６２】
好ましい実施形態において、方法はさらに、ABR、ACCN1、AKAP7、APBA1、ASTN2、BASP1、CACNA2D1、CADM1、CDH13、CHRM3、CNTN6、DCLK1、DCLK2、DLG2、DLG4、DSCAML1、EGLN3、EPHA5の、ERC2、GFRA1、GPR98、GRIN2A、GRIN2B、GRM7、HIP1、HTR5A、JARID2、KCNH5、KCNIP1、LPPR4、MACF1、MAGI2、MAP1S、MAP2K1、NAV2、NELL1、NRG1、NRG3、NTRK3、PAX2、PCDH10、PDE11A、PDE4D、PLAGL1、PLCB1、PTPRD、PTPRG、RBFOX1、RGS6、SLC24A2、SLC9A9、SULF2、SYT14、TRIM2、TRIM9およびUGCG、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子座における少なくとも一つのSNPの追加の遺伝子型決定を含む。
【００６３】
より好ましくは、この方法はさらにKCNH5、MAP1S、GRM7、PAX2、PTPRD、PDE11A、RGS6、ASTN2、ACCN1、DCLK2、SLC24A2、AKAP7、DCLK1、MAP2K1、CADM1およびNAV2のいずれかまたはすべての遺伝子座におけるSNPの遺伝子型を決定することを含む。なおも好ましい実施形態において、前記発明はさらに、KCNH5はrs1041644(配列番号2の27位)、MAP1Sはrs12985015(配列番号7の27位)、GRM7はrs1569284(配列番号9の27位)、PAX2はrs2077642(配列番号13の27位)、PTPRDはrs2382104(配列番号14の27位)、PDE11Aはrs2695112(配列番号16の27位)、RGS6はrs6574041(配列番号23の27位)、ASTN2はrs7021928(配列番号26の27位)、ACCN1はrs7225320(配列番号29の27位)、DCLK2はrs9307866(配列番号32の27位)、SLC24A2はrs957910(配列番号34の27位)、AKAP7はrs6923644(配列番号46の27位)、DCLK1はrs1556060(配列番号47の27位)、MAP2K1はrs1432443(配列番号48の27位)、CADM1はrs220836(配列番号49の27位)、GRIN2Bはrs7974275(配列番号50の27位)およびNAV2はrs10500866(配列番号57の27位)、からなる群より選択される少なくとも一つのSNPの追加の遺伝子型決定を含む。好ましくは、全ての遺伝子型決定されたSNPは前の文章に挙げたものである。
【００６４】
特に、前記方法はさらに、ABR、ACCN1、AKAP7、APBA1、ASTN2、BASP1、CACNA2D1、CADM1、CDH13、CHRM3、CNTN6、DCLK1、DCLK2、DLG2、DLG4、DSCAML1、EGLN3、EPHA5の、ERC2、GFRA1、GPR98、GRIN2A、GRIN2B、GRM7、HIP1、HTR5A、JARID2、KCNH5、KCNIP1、LPPR4、MACF1、MAGI2、MAP1S、MAP2K1、NAV2、NELL1、NRG1、NRG3、NTRK3、PAX2、PCDH10、PDE11A、PDE4D、PLAGL1、PLCB1、PTPRD、PTPRG、RBFOX1、RGS6、SLC24A2、SLC9A9、SULF2、SYT14、TRIM2、TRIM9およびUGCG、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子座における少なくとも一つのSNPの追加の遺伝子型決定を含んでもよい。
【００６５】
好ましくは、HTR5AにおけるSNPはrs893109(配列番号31の27位)であり、MACF1はrs260969(配列番号15の27位)であり、RBFOX1はrs12925135(配列番号39の27位)であり、ABRはrs2663327(配列番号40の27位)であり、PTPRGはrs636624(配列番号22の27位)であり、CACNA2D1はrs2367910(配列番号41の27位)であり、GFRA1はrs10787637(配列番号4の27位)であり、DSCAML1はrs695083(配列番号24の27位)であり、CHRM3はrs10802802(配列番号5の27位)であり、LPPR4はrs712886(配列番号27の27位)であり、DLG2はrs12275631(配列番号51の27位)であり、SLC9A9はrs3928471(配列番号19の27位)であり、BASP1はrs298542(配列番号52の27位)であり、KCNIP1はrs12514116(配列番号38の27位)であり、UGCGはrs16916456(配列番号11の27位)であり、NTRK3はrs7172184(配列番号28の27位)であり、PLCB1はrs8123323(配列番号37の27位)であり、NELL1はrs10766739(配列番号3の27位)であり、GPR98はrs16868972(配列番号42の27位)であり、MAGI2はrs12535987(配列番号43の27位)であり、PLAGL1はrs2076683(配列番号12の27位)であり、CNTN6はrs9837484(配列番号35の27位)であり、DLG4はrs314253(配列番号17の27位)であり、ERC2はrs1485677(配列番号8の27位)であり、TRIM9はrs10150121(配列番号1の27位)であり、SYT14はrs7534723(配列番号30の27位)であり、JARID2はrs9370809(配列番号33の27位)であり、CDH13はrs9940922(配列番号36の27位)であり、SULF2はrs6063144(配列番号53の27位)であり、GRIN2Aはrs4782109(配列番号21の27位)であり、NRG3はrs2820100(配列番号54の27位)またはrs7075400(配列番号55の27位)であり、NRG1はrs723811(配列番号44の27位)であり、TRIM2はrs11942354(配列番号45の27位)であり、EPHA5はrs1597611(配列番号10の27位)であり、PCDH10はrs4404561(配列番号20の27位)であり、HIP1はrs6962352(配列番号25の27位)であり、APBA1はrs11139294(配列番号6の27位)であり、PDE4Dはrs35284(配列番号18の27位)であり、EGLN3はrs946630(配列番号56の27位)であり、KCNH5はrs1041644(配列番号2の27位)であり、MAP1Sはrs12985015(配列番号7の27位)であり、GRM7はrs1569284(配列番号9の27位)であり、PAX2はrs2077642(配列番号13の27位)であり、PTPRDはrs2382104(配列番号14の27位)であり、PDE11Aはrs2695112(配列番号16の27位)であり、RGS6はrs6574041(配列番号23の27位)であり、ASTN2はrs7021928(配列番号26の27位)であり、ACCN1はrs7225320(配列番号29の27位)であり、DCLK2はrs9307866(配列番号32の27位)であり、SLC24A2はrs957910(配列番号34の27位)であり、AKAP7はrs6923644(配列番号46の27位)であり、DCLK1はrs1556060(配列番号47の27位)であり、MAP2K1はrs1432443(配列番号48の27位)であり、CADM1はrs220836(配列番号49の27位)であり、GRIN2Bはrs7974275(配列番号50の27位)および/またはNAV2はrs10500866(配列番号57の27位)である。最も好ましくは、遺伝子型決定した全てのSNPは、前の文章に挙げたものである。
【００６６】
したがって、特に、本発明は、自閉症のリスクを決定する方法、または被験者における自閉症の疾病素質または存在を検出する方法を提供し、当該方法は当該被験者からの試料中のSNPの遺伝子型決定を含み、SNPはrs2663327、rs7225320、rs6923644、rs11139294、rs7021928、rs298542、rs2367910、rs220836、rs9940922、rs10802802、rs9837484、rs1556060、rs9307866、rs12275631、rs314253、rs695083、rs946630、rs1597611、rs1485677、rs10787637、rs16868972、rs4782109、rs7974275、rs1569284、rs6962352、rs893109、rs9370809、rs1041644、rs12514116、rs712886、rs260969、rs12535987、rs12985015、rs1432443、rs10500866、rs10766739、rs723811、rs2820100、rs7075400、rs7172184、rs2077642、rs4404561、rs2695112、rs35284、rs2076683、rs8123323、rs2382104、rs636624、rs12925135、rs6574041、rs957910、rs3928471、rs6063144、rs7534723、rs11942354、rs10150121、rs16916456である。
【００６７】
別の方法として、この方法は、配列番号1から配列番号57のいずれかの少なくとも一つのSNPの遺伝子型決定を含んでいてもよい。
【００６８】
前記方法はまた、方法はさらに、PITX1、ATP2B2、EN2、JARID2、MARK1、ITGB3、CNTNAP2およびHOXA1またはそれらの組み合わせのいずれかまたはすべての遺伝子座におけるSNPの遺伝子型決定を含んでもよく、好ましくは、前記方法はさらに、rs6872664、rs2278556、rs1861972、rs7766973、rs12410279、rs5918、rs7794745、およびrs10951154、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれかまたはすべてのSNPの遺伝子型決定を含んでもよい。これらの遺伝子およびSNPはCarayol et al.、2011およびWO2011/138372に開示されたものに対応する。実施例に示すように、実際に、遺伝子型決定へのこれらの遺伝子/SNPの添加により、わずかに、テストの信頼性が向上する。
【００６９】
別の実施形態において、上記同定されたSNPと連鎖不平衡（LD）にあるSNPの存在の遺伝子型を、同定されたSNPの代わりに、またはそれに加えて、決定することができる。本発明の文脈において、上記で同定されたSNPと連鎖不平衡にあるSNPは、上記で特定されたSNPと同じ遺伝子内にある。
【００７０】
本発明の方法は、また、「テスト」と呼ばれ、好ましくは、全ての同定されたSNP、またはサブコンビネーションの遺伝子型を決定することを含む。テストは、既知のリスクプロファイルを確認することによって診断を強化するために使用することができる。この場合において、陰性のテスト結果は、自閉症の診断を無効にしない。
【００７１】
あるいはテストは、自閉症と診断された、または自閉症と診断されていない、個体の兄弟でもよい、非診断患者の詳細なリスクプロファイルを確立するために使用することができる。可能性のある結果は、ヘテロ接合性またはホモ接合状態において、1つ以上のSNPにおけるリスク対立遺伝子の存在と定義され、高められたリスクに関係づけられる。
【００７２】
以下の表1には、組み合わせて、またはサブコンビネーションで、本発明において有用であると同定されたSNPおよびそのリスク-/予防-関連の対立遺伝子を記載する。
以下の表2には、Carayol et al.、2011およびWO2011/138372において有用であると同定されたSNPおよびそのリスク-/予防-関連の対立遺伝子を記載する。
【００７３】
表１．自閉症関連のSNPの組み合わせ
「全て」は男性および女性の自閉症に関連するSNPを意味する。「男性」および「女性」はそれぞれ男性または女性における自閉症に関連するSNPを意味する。
【００７４】
【表１−１】
2015510756.tif 000002
【００７５】
【表１−２】
2015510756.tif 000003
【００７６】
【表１−３】
2015510756.tif 000004
【００７７】
【表１−４】
2015510756.tif 000005
【００７８】
【表１−５】
2015510756.tif 000006
【００７９】
【表１−６】
2015510756.tif 000007
【００８０】
【表１−７】
2015510756.tif 000008
【００８１】
【表１−８】
2015510756.tif 000009
【００８２】
表２．Carayol et al.、2011およびWO2011/138372における自閉症関連のSNPの組み合わせ
「全て」は男性および女性の自閉症に関連するSNPを意味する。「男性」および「女性」はそれぞれ男性または女性における自閉症に関連するSNPを意味する。
【００８３】
【表２−１】
2015510756.tif 000010
【００８４】
【表２−２】
2015510756.tif 000011
【００８５】
リスク決定
興味のあるSNPは遺伝子型が決定されると、被験者における自閉症のリスクに対する疾病素質または自閉症の存在が決定される。
【００８６】
本発明の方法において、好ましくは表1に定義されている、リスク関連対立遺伝子の組み合わせの存在の検出は、被験者における自閉症のリスク、自閉症に対する疾病素質、または自閉症の存在を示す。リスクレベルまたは自閉症の疾病素質若しくは存在の可能性は、検出されたリスクに関連する対立遺伝子の数に応じて、好ましくは、遺伝的スコアを計算することによって、決定される。遺伝的スコア（GS）は、1つ以上の閾値（複数可）と比較される。
【００８７】
遺伝的スコアはまず、各遺伝子型を特定したSNPのリスクや予防的性質に基づいて計算される。表1には、本発明において自閉症に関連する、特定の57のSNPのそれぞれのリスクおよび予防的な対立遺伝子が定義されている。
【００８８】
遺伝的スコアは、場合により重みづけした、遺伝子型を決定したリスク関連SNPを合計することによって計算される。
【００８９】
より正確には、n個の異なるSNPが遺伝子型決定されたとき、遺伝的スコアは、以下の式
【００９０】
【数１】
2015510756.tif 000012
【００９１】
〔式中、xi、１≦i≦n、は各遺伝子型決定されたSNPiの重みである。〕
を用いて計算することができる。
【００９２】
いずれかのSNPは、被験者の両方の対立遺伝子について遺伝子型されるため、遺伝的スコアへの各SNPの寄与は、自閉症に対するSNPの関連性の根底にある遺伝モデルに応じて重み付けすることができる。
【００９３】
加法モデル、劣性モデルおよび優性モデルの三つの遺伝モデルが考えられる。劣性モデルでは、2つのリスク対立遺伝子の存在のみが自閉症リスクに影響を与える。優性モデルでは、1つまたは2つのリスク対立遺伝子の存在が、同様に、自閉症のリスクに影響を与える。最後に、加法モデルでは、1つのリスク対立遺伝子の存在は、自閉症のリスクに影響を与え、さらに、第2のリスク対立遺伝子の存在は、さらに自閉症リスクに影響を与える。
【００９４】
一般的に、加法モデルは、統計的な目的のための関連研究（Pereira、Patsopoulos et al.2009）で分析された各SNPについて個体の遺伝子型をモデル化するデフォルトモデルとして想定している。以下のように、このモデルでは、各被験SNPiは、遺伝的スコアに寄与する。xi=0「ノーリスク対立遺伝子」、xi=1「1つのリスク対立遺伝子」、およびxi=2「2つのリスク対立遺伝子」。この場合は、試料中の、遺伝子型決定したリスク対立遺伝子の合計に対応する単純な遺伝的スコアに対応する。
【００９５】
このような加法のデフォルトモデルは、本発明の文脈で使用され、さらにリスク判定の妥当な信頼性（実施例を参照のこと）を可能にすることができる。
【００９６】
しかし、遺伝的スコアにおけるSNPを重み付けし、テストの信頼性を向上させる一つの方法は、真の基礎となる遺伝モデルを使用することにある。SNPiが劣性である場合、個体がリスク対立遺伝子のホモ接合性非キャリア及びヘテロ接合である場合には、遺伝的スコアに0点を加算し（xi=0）、リスク対立遺伝子のホモ接合キャリアである場合には、2点を加算する（xi=2）。同様に、SNPが優性である場合、個体がリスク対立遺伝子のホモ接合性非キャリアである場合は遺伝的スコアに0点を加算し（xi=0）、それ以外の場合には２点を加算する（xi=2）。
【００９７】
実施例に記載のように、与えられたSNPiのための最良の遺伝モデルの選択は、試料のリファレンス（訓練）集団の分析に基づいて行うことができる。 SNPの割合については、すべての3つの遺伝モデルまたは二つの別の遺伝モデルは、試験の信頼性に大きな影響を与えることなく使用することができる。選択された遺伝モデル、および遺伝子型を決定したリスクに関連する対立遺伝子の数（0、1または2）に応じたxiの値は、下の表3にまとめられている。
【００９８】
表３．遺伝モデルの関数としてのSNPiの重みづけおよび対象試料において遺伝子型を決定したリスク関連対立遺伝子の数（0、1または2）。対立遺伝子２はSNPiのリスク対立遺伝子であると思われる。
【００９９】
【表３】
2015510756.tif 000013
【０１００】
ホモ接合型の比キャリアをリファレンスとして用いた、それぞれの遺伝子型についての推定オッズ比を用いることからなるSNPiの他の重みづけ：下の表４に記載したように、OR11＝１はリファレンスの遺伝子型、ORhetはヘテロ接合遺伝子型に関連するオッズ比、ORhomはホモ接合キャリア遺伝子型関連のオッズ比である。オッズ比は、発見（訓練）集団における古典的なロジスティック回帰を用いて推定することができる。
【０１０１】
表４．オッズ比の関数としてのSNPiの重み（xi）  対立遺伝子２はSNPiのリスク対立遺伝子であると思われ、遺伝子型“１１”はリファレンスの遺伝子型である。
【０１０２】
【表４】
2015510756.tif 000014
【０１０３】
この重み付けは、適切な遺伝モデルの単なる選択に反して、いくつかのSNPは他のものよりも自閉症のリスクに影響を与える可能性があることを考慮しているが、導入部で説明したように、それぞれ個別のSNPの、疾患のリスクへの寄与は一般的に低く、オッズ比に基づく重みの使用は、テストの信頼性を改善しない。
【０１０４】
したがって、有利には、n個の別々のSNPが遺伝子型決定される場合、遺伝的スコアは以下の式：
【０１０５】
【数２】
2015510756.tif 000015
【０１０６】
〔式中、それぞれのxi、１≦i≦n、は加法、劣性、または優性遺伝モデル（表３）に基づいて定義される各遺伝子型決定されたSNPiの重みである。〕
を用いて計算することができる。ある実施態様において、それぞれのxi、１≦i≦n、は加法遺伝モデル（表３）に基づいて定義される各遺伝子型決定されたSNPiの重みである。好ましい実施態様において、それぞれのxi、１≦i≦n、は加法、劣性、または優性遺伝モデル（表３）に基づいて定義される各遺伝子型決定されたSNPiの重みであり、当該加法、劣性、または優性遺伝モデルは、サンプルのリファレンス（または発見もしくは訓練）集団の分析に基づいて選択されている（実施例参照）。
【０１０７】
自閉症のリスクレベルを定義するため、得られた遺伝的スコアは、1つ以上の閾値（またはカットオフ値）と比較される。
【０１０８】
閾値の数に依存して、被験者の2つ以上のカテゴリを定義する。好ましくは、閾値の数は、特に、1と4の間に含まれる。具体的には、1、2、3、または4の閾値を用いてもよい。
【０１０９】
1つの閾値について、被験者の2つのカテゴリが定義される。
- しきい値の下には、被験者のリファレンス集団における自閉症の有病率よりも自閉症のリスクが低い被験者のカテゴリ
- しきい値の上には、被験者のリファレンス集団における自閉症の有病率よりも自閉症のリスクが高い被験者のカテゴリ
【０１１０】
「被験者のリファレンス集団」とは、一般集団（いかなる個人も含む）または自閉症スペクトラム障害を持つ兄弟を持つ被験者の集団のいずれかを意味する。リファレンス集団は、テスト被験者の性質に応じて選択される。テスト被験者が、自閉症スペクトラム障害を持つ人に関連していない場合は、リファレンス集団は、自閉症の有病率は子供110人あたり１（すなわち9.1％）である一般集団（いかなる個人も含む）となる。別の方法として、テスト被験者が、自閉症スペクトラム障害を持つ個人の兄弟であれば、その場合、リファレンス集団は、自閉症の有病率が約19％である自閉症スペクトラム障害を持つ兄弟を持つ被験者の集団になる。
【０１１１】
適切な閾値の選択は、サンプルのリファレンス（または検出又はトレーニング）集団の分析に基づいて行われ、およびどのテストの特徴（特異度、感度、陽性予測値、陰性予測値）（単数または複数）が最も重要であると考えられるかに依存する。実際に、定量的遺伝子スコアに基づくテストの特徴は、閾値またはカットオフ値を変更することによって変更することができる。しきい値を下げると感度が向上するが、それはテストのより低い特異度とより多くの偽陽性の結果の代償においてということになる。逆に、カットオフを上げると特異度が向上するが、それは低い感度およびより偽陰性の結果の代償においてである。
【０１１２】
マルチリスククラスのテストは、複数の閾値を用いて構築することができる：
- 二つのしきい値（V1およびV2）は、リスクの3つのクラスを作成するように設定することができる：リスクがある場合、被験者のリファレンス集団における疾患の有病率に等しいかまたは近いリスクであるリファレンスクラス（V1≦GS≦V2）、リスクがリファレンスクラスにおけるリスクよりも低い、低リスククラス（GS＜V1）、およびリスクがリファレンスクラスよりも高い高リスククラス（GS≧V2）
- 3つの閾値（V1、V2及びV3）が、リスクの4つのクラスを作成するように設定されてもよい。リスクがリファレンス集団における疾患の有病率よりも高い、高リスク・クラス（V2≦GS≦V3）、リスクが被験者のリファレンス集団における疾患の有病率よりもはるかに高い、非常に高いリスククラス（GS≧V3）;リスクが被験者のリファレンス集団における疾患の有病率よりも低い、低リスククラス（V1≦GS＜V2）、およびリスクが被験者のリファレンス集団における疾患の有病率よりはるかに低い、非常に低いリスククラス（GS＜V1）
- 4つの閾値（V1、V2、V3およびV4）を、5クラスのリスクを作成するように設定することができる：リスクがリファレンス集団における疾患の有病率に近い、リファレンスクラス（V2≦GS＜V3）、リスクがリファレンスクラスより高い高リスククラス（V3≦GS＜V4）、リスクがリファレンスクラスよりもはるかに高い、非常に高いリスククラス（GS≧V4）;リスクがリファレンスクラスにおけるリスクよりも低い低リスククラス（V1≦GS＜V2）、リスクがリファレンスクラスにおけるリスクよりもはるかに低い、非常に低いリスククラス（GS＜V1）
【０１１３】
異なる閾値の数と値は、クラス、感度および特異度におけるリスクによって定義されたテストに期待される性能や特性に応じて決められる。一つまたは複数の適切な閾値（単数または複数）の決定の具体例は、実験の部に記載されている。
【０１１４】
あるいは、すべての遺伝子型決定されたSNPが、少なくとも1つのリスクに関連する対立遺伝子を含む場合、一般的に、自閉症のリスク、自閉症の疾病素質または自閉症の存在の診断をすることができる。加法デフォルト遺伝モデルが選択されている場合、これは、最大遺伝スコアの少なくとも半分の遺伝的スコアに該当する。
【０１１５】
例えば、遺伝子型が決定されたSNPがrs893109、rs260969、rs12925135、rs2663327、rs636624、rs2367910、rs10787637、rs695083、rs10802802、rs712886、rs12275631、rs3928471及びrs298542の場合、rs893109の少なくとも一つの対立遺伝子がGであるか、rs260969の少なくとも一つの対立遺伝子がTであるか、rs12925135の少なくとも一つの対立遺伝子がCであるか、rs2663327の少なくとも一つの対立遺伝子がCであるか、rs636624の少なくとも一つの対立遺伝子がAであるか、、rs2367910の少なくとも一つの対立遺伝子がCであるか、rs10787637の少なくとも一つの対立遺伝子がGであるか、rs695083の少なくとも一つの対立遺伝子がTであるか、rs10802802の少なくとも一つの対立遺伝子がGであるか、rs712886の少なくとも一つの対立遺伝子がCであるか、rs12275631の少なくとも一つの対立遺伝子がTであるか、少なくともrs3928471の対立遺伝子がTであるか、rs298542の少なくとも一つの対立遺伝子がCである場合、被験者は自閉症のリスクがあるか、自閉症の疾病素質を有するか、自閉症を有する。
【０１１６】
同様に、遺伝子型を決定したSNPがさらにrs12514116、rs16916456、rs7172184、rs8123323、rs10766739、rs16868972、rs12535987、rs2076683、rs9837484、rs314253、rs1485677、rs10150121、rs7534723、rs9370809、rs9940922、rs6063144、rs4782109およびrs2820100を含む場合、上記に加え、rs12514116の少なくとも一つの対立遺伝子がCであり、rs16916456の少なくとも一つの対立遺伝子がCであり、rs7172184の少なくとも一つの対立遺伝子がCであり、rs8123323の少なくとも一つの対立遺伝子はTであり、rs10766739の少なくとも1つの対立遺伝子はAであり、rs16868972の少なくとも一つの対立遺伝子がTであり、rs12535987の少なくとも一つの対立遺伝子がCであり、rs2076683の少なくとも一つの対立遺伝子がTであり、rs9837484の少なくとも一つの対立遺伝子がGであり、rs314253の少なくとも一つの対立遺伝子がGであり、rs1485677の少なくとも一つの対立遺伝子がGであり、rs10150121の少なくとも一つの対立遺伝子がCであり、rs7534723の少なくとも一つの対立遺伝子はAであり、rs9370809の少なくとも一つの対立遺伝子Tであり、rs9940922の少なくとも一つの対立遺伝子がGであり、rs6063144の少なくとも一つの対立遺伝子がCであり、rs4782109の少なくとも一つの対立遺伝子がTであり、rs2820100の少なくとも一つの対立遺伝子がCである場合、被験者は自閉症を有するか、自閉症の疾病素質を有する。
【０１１７】
同様に、遺伝子型を決定したSNPがさらにrs723811、rs11139294、rs11942354、rs1597611、rs4404561、rs6962352、rs7075400、rs35284およびrs946630を含み、上記に加えてrs723811の対立遺伝子がTであり、rs11139294の少なくとも一つの対立遺伝子がGであり、RS11942354の少なくとも一つの対立遺伝子はAであり、rs159761の少なくとも1つの対立遺伝子がGであり、rs4404561の少なくとも一つの対立遺伝子はCであり、rs6962352の少なくとも一つの対立遺伝子がGであり、rs7075400の少なくとも一つの対立遺伝子がTであり、rs35284の少なくとも一つの対立遺伝子はAであり、rs946630の少なくとも一つの対立遺伝子がGである場合、被験者は自閉症を有するか、自閉症の疾病素質を有する。
【０１１８】
同様に、遺伝子型を決定したSNPがさらにrs1041644、rs12985015、rs1569284、rs2077642、rs2382104、rs2695112、rs6574041、rs7021928、rs7225320、rs9307866、rs957910、rs6923644、rs1556060、rs1432443、rs220836、rs7974275およびrs10500866を含む場合、上記に加え、rs1041644の少なくとも一つの対立遺伝子はCであり、自閉症は、rs12985015の少なくとも一つの対立遺伝子がGであり、rs1569284の少なくとも一つの対立遺伝子がGであり、rs2077642の少なくとも一つの対立遺伝子がTであり、rs2382104の少なくとも一つの対立遺伝子がGであり、rs2695112の少なくとも一つの対立遺伝子がAであり、rs6574041の少なくとも一つの対立遺伝子がAであり、rs7021928の少なくとも一つの対立遺伝子がAであり、rs7225320の少なくとも一つの対立遺伝子がTであり、rs9307866の少なくとも一つの対立遺伝子がTであり、rs957910の少なくとも一つの対立遺伝子がTであり、rs6923644の少なくとも一つの対立遺伝子がGであり、rs1556060の少なくとも一つの対立遺伝子がGであり、rs1432443の少なくとも一つの対立遺伝子がTであり、rs220836の少なくとも一つの対立遺伝子がGであり、rs7974275の少なくとも一つの対立遺伝子はGであり、rs10500866の少なくとも一つの対立遺伝子がTである場合、その被験者は自閉症を有するか、自閉症の疾病素質を有する。
【０１１９】
しかし、テストした被験者が自閉症のリスクがあるか、自閉症の疾病素質を有するか、自閉症を有するかは、好ましくは、上述したように、遺伝的スコア（GS）の計算と、GSと一つ以上の閾値との比較に基づいて決定される。
【０１２０】
連鎖不平衡（LD）
最初のSNPが、関心のあるゲノム領域に同定されたならば、当業者の臨床医は容易にこの最初のSNPと連鎖不平衡にある追加のSNPを同定することができる。本発明の文脈において、第一のSNPと連鎖不平衡にある追加のSNPは、当該最初のSNPと同じ遺伝子内にある。
【０１２１】
連鎖不平衡（LD）は、ゲノム上の異なる遺伝子座における対立遺伝子の非ランダム結合として定義される。二つ以上の遺伝子座にある対立遺伝子は、それらの組み合わせが、多かれ少なかれ偶然に予想される以上に頻繁にその集団で発生した場合、LDにある。
【０１２２】
例えば、もし特定の遺伝的要素（例えば、多型マーカーの対立遺伝子、またはハプロタイプ）が0.50（50％）の頻度で集団に生じ、他の要素が、0.50（50％）の頻度で起こると、両方の要素を有する人の予測される発生率は、要素のランダム分布を仮定すると、0.25（25％）である。しかし、もし二つの要素が0.25よりも高い頻度で一緒に発生することが発見された場合は、その要素は、予測されるそれらの独立の発生頻度（例えば、対立遺伝子またはハプロタイプ頻度）より高いレートで一緒に遺伝されている傾向があるので、連鎖不平衡にあると言われる。
【０１２３】
DNA領域中に因果遺伝子座がある場合には、LDによって、近くの一つ以上のSNPが形質と関連しているかもしれない。したがって、自閉症または関連障害に関連する最初のSNPとLDにあるいずれかのSNPが、この形質に関連しているであろう。与えられたSNPと連鎖不平衡にある追加のSNPの同定は以下を含む：（a）複数の個体からの、最初のSNPを含む遺伝子からのフラグメントの増幅；(b)当該最初のSNPを含む遺伝子における第2のSNPの同定；（c）当該最初のSNPと第2のSNPの間の連鎖不平衡分析の実施；および（d）最初のマーカーと連鎖不平衡にあるものとしての、第2のSNPの選択。ステップ（b）および（c）を含むサブコンビネーションもまた企図される。
【０１２４】
当業者は、SNPを同定し、連鎖不平衡解析を実施する方法を、周知の方法を用いて過度の実験なしに実施することができる。
【０１２５】
このように、当業者の施術者は、簡単にリスクSNPの連鎖不平衡におけるハプロタイプ内のSNPやSNPの組み合わせを同定することができる。
【０１２６】
このようなマーカーは、マップされ、当業者によく知られているHapMapのような公共のデータベースにリストされる。ゲノムLDマップは、ゲノムの全域で作製されており、そのようなLDマップは、疾患遺伝子のマッピングのためのフレームワークとして機能させるよう提案されている（リッシュら、1996; Maniatis et al.、2002;ライヒら、2001）。
【０１２７】
もしゲノム中の全ての多型が集団レベル（すなわち、LDなし）で独立していた場合には、それらの一つ一つのものが全て異なる多型状態を評価するために、関連研究において検討する必要がある。しかし、多型間の連鎖不平衡により、緊密にリンクされた多型は強く相関しており、それが、有意な関連を観察するための関連研究において検討する必要がある多型の数を減少させる。LDの別の結果は、多くの多型が原因で、これらの多型が強く相関しているという事実により、関連性シグナルを与える可能性があることである。
【０１２８】
最も一般的にLDを測定するために使用される2つのメトリックは、D'およびr2であり、互いに対立遺伝子頻度の観点から記載することができる。どちらの方法も0（2対立遺伝子は独立性であるか、または平衡状態にある）から1（2対立遺伝子が完全に依存性であるか、または完全な不均衡にある）の範囲であり、しかし解釈は異なる。もしマーカーによって定義可能な最大2つまたは3つの可能性のあるハプロタイプが存在する場合、|D'|は1に等しく、もし、4つのすべての可能なハプロタイプが存在する場合は＜１である。r2は2つのマーカー間の統計的相関を計測し、もし2つのハプロタイプしか存在しない場合、１に等しい。
【０１２９】
ヒトにおける大部分のSNPは、おそらく何度も前に染色体内で起こった単一塩基の変更イベントによって生じたものである。新しく作成された一つの対立遺伝子は、その起源の時点では、対立遺伝子のユニークなグループ化（すなわちハプロタイプ）を確立するSNPのような他の多型遺伝子座での対立遺伝子の一連に囲まれていたであろう。この特定のハプロタイプが次の世代に無傷で送られた場合、完全なLDは新しい対立遺伝子及びこれらの対立遺伝子と近くの多型のそれぞれの間に存在し、これらが新たな対立遺伝子の100％の予測となることを意味している。このようにして、完全なLD（D'=1またはｒ2=1）により、一つの多型マーカーの対立遺伝子は、別の特定の対立遺伝子の代わりとして使用することができる。組み換えのようなイベントは、マーカーの間のLDを減少させ得る。
【０１３０】
しかし、中程度（すなわち0.5≦R2＜0.8）から高い（すなわち0.8≦R2＜1）LDは、マーカーの「代理」のプロパティを保存している。LDに基づく関連研究では、LDがマーカーと未知の病原性対立遺伝子間に存在する場合、すべてのマーカーはその疾患との関連を示す。フィリッピら（2007）による研究では、強いLDにおけるSNPのセットが大幅に自閉症に関連することが示された（フィリッピら（2007）において、表３は関連性の結果、図２はLDプロットについて）ことは、5個のSNPのセット（rs1131611、rs11959298、rs6872664、rs6596188及びrs6596189）が5個のSNPとLDにある未知の病原性対立遺伝子の代理マーカーとして使用することができることを実証している。同様の結果が自閉症での別の関連研究で観察された：EN2遺伝子内の高LDの内の2つのSNP（rs1861972及びrs1861973ではr2>0.8（Gharani et al.（2004））、ASMT遺伝子（rs4446909およびrs5989681でD'=0.94（Melke et al.（2008）））またはNRCAM（0.64と1の間のD'を有する4つのSNP（Marui et al.（2008））。別の方法として、一つのSNPが疾患に関連していなかった場合には、高または中程度のLDのSNPは、関連付けを提供しない：高LDのSP1遺伝子（r2が0.77〜0.91の間）に隣接する4個のSNPと、隣接SUB1遺伝子（r2が0.79〜0.95の間）近傍の4個のSNPの中で、どれも自閉症との関連を示さなかったこと（キャンベルら（2008））は、それらのSNPのLDには、病原性の変異体が存在しないことを示唆する。
【０１３１】
他の近くのSNP対立遺伝子との強いLD（または高LD；R2≧0.80として定義される）を有する、そして、強いLDのゲノム領域、等間隔のSNPの選択、または他のSNP（プロキシSNPまたはタグSNP）とのLDに基づく選択における、多くのSNPは、統計的検出力のわずかな損失によって遺伝子型決定されてないSNPの遺伝情報のほとんどを捕捉することができることは、よく知られている。関連研究では、LDのこの領域が、少数のSNP（タグSNP）でカバーされること、およびSNPと研究中の表現型の間の統計的関連は、そのSNPが原因変異体であるか原因変異体とLDにあることを意味する。プロキシ（またはタグSNP）が、1つ以上の他のSNPとLD（R2≧0.8）にあるSNPとして定義されることは、一般的なコンセンサスである。プロキシSNPの遺伝子型は、LDを介して逆に他のSNPの遺伝子型を予測することができた。特に、本明細書で使用されるSNPの一つとのLDにある任意のSNPは、それらのLDがr2≧0.8であることに従って定義された1つまたは複数のプロキシSNPで置き換えることができる。
【０１３２】
連鎖不平衡にあるこれらのSNPはまた、本発明に係る方法で使用することができる、より具体的には本発明による診断方法において使用することができる。特に、上記の同定されたSNPと連鎖不平衡（LD）にあるSNPの存在は、当該同定されたSNPの代わりに、またはそれに加えて、遺伝子型を決定することができる。本発明の文脈において、上記で同定されたSNPと連鎖不平衡にあるSNPは、上記で同定されたSNPと同じ遺伝子内にある。そこで、本発明では、関心のあるSNPと同じ遺伝子内に位置し、関心のあるSNPと連鎖不平衡（LD）にあるSNPの存在は、当該関心のあるSNPの代わりに、またはそれに加えて、遺伝子型を決定することができる。好ましくは、そのようなSNPと関心のあるSNPは、r2≧0.70であり、好ましくはr2≧0.75であり、より好ましくはr2≧0.80であり、および／またはD’≧0.60であり、好ましくはD’≧0.65、D’≧0.70、D’≧0.75であり、より好ましくはD’≧0.80である。最も好ましくはそのようなSNPおよび関心のあるSNPはr2≧0.80であり、それはSNP間の「LD」を定めるためのリファレンス値として用いられる。
【０１３３】
性別特異性
本発明はさらに、男性被験者における、自閉症のリスク、または、自閉症の疾病素質または存在を検出する方法を提供し、その方法は前記被験者由来の試料中の、少なくともHTR5A、MACF1、RBFOX1、ABR、PTPRGおよびCACNA2D1の遺伝子座におけるSNPの遺伝子型を決定することを含む。好ましくはHTR5AにおけるSNPはrs893109(配列番号31の27位)であり、MACF1ではrs260969(配列番号15の27位)であり、RBFOX1ではrs12925135(配列番号39の27位)であり、ABRではrs2663327(配列番号40の27位)であり、PTPRGではrs636624(配列番号22の27位)であり、および／またはCACNA2D1ではrs2367910(配列番号41の27位)である。最も好ましくは、遺伝子型決定した全てのSNPは、前の文章に挙げたものである。そのため、男性被験者では、この方法は、より具体的には、少なくともrs893109、rs260969、rs12925135、rs2663327、rs636624およびrs2367910の遺伝子型決定を含む。
【０１３４】
好ましくは、この方法はさらに、KCNIP1、UGCG、NTRK3、PLCB1、NELL1、GPR98、MAGI2、およびPLAGL1、またはそれらの組み合わせのいずれかまたはすべての遺伝子座におけるSNPの遺伝子型決定を含む。この場合、有利には、KCNIP1におけるSNPはrs12514116(配列番号38の27位)であり、UGCGではrs16916456(配列番号11の27位)であり、NTRK3ではrs7172184(配列番号28の27位)であり、PLCB1ではrs8123323(配列番号37の27位)であり、NELL1ではrs10766739(配列番号3の27位)であり、GPR98ではrs16868972(配列番号42の27位)であり、MAGI2ではrs12535987(配列番号43の27位)であり、および／またはPLAGL1ではrs2076683(配列番号12の27位)である。したがって、好ましくは、本方法は、男性被験者における、本方法はさらに以下のSNP、rs12514116、rs16916456、rs7172184、rs8123323、rs10766739、rs16868972、rs12535987およびrs2076683、またはそれらの組み合わせのいずれかまたはすべての遺伝子型決定を含む。
【０１３５】
より好ましくは、方法はさらに、NRG1、TRIM2、EPHA5の、PCDH10、およびHIP1、またはそれらの組み合わせのいずれかまたはすべての遺伝子座におけるSNPの遺伝子型決定を含む。この場合、有利には、NRG1におけるSNPはrs723811(配列番号44の27位)であり、TRIM2ではrs11942354(配列番号45の27位)であり、EPHA5ではrs1597611(配列番号10の27位)であり、PCDH10ではrs4404561(配列番号20の27位)であり、および／またはHIP1ではrs6962352(配列番号25の27位)である。最も好ましくは、遺伝子型決定した全てのSNPは、前の文章に挙げたものである。したがって、より好ましくは、本方法はさらに、男性被験者における、下記のSNP、rs723811、rs11942354、rs1597611、rs4404561及びrs6962352、又はこれらの組み合わせのいずれかまたはすべての遺伝子型決定を含む。
【０１３６】
さらに好ましくは、本発明の方法は、さらにPDE11A、AKAP7、DCLK1、KCNH5、GRIN2A、ACCN1、DCLK2、ASTN2、GRM7、MAP2K1、CADM1、およびGRIN2B、またはそれらの組み合わせのいずれかまたはすべての遺伝子座におけるSNPの遺伝子型決定することを含む。この場合、有利には、PDE11AにおけるSNPは、rs2695112(配列番号16の27位)であり、AKAP7ではrs6923644(配列番号46の27位)であり、DCLK1の3’近傍ではrs1556060(配列番号47の27位)であり、KCNH5ではrs1041644(配列番号2の27位)であり、GRIN2Aではrs4782109(配列番号21の27位)であり、ACCN1ではrs7225320(配列番号29の27位)であり、DCLK2ではrs9307866(配列番号32の27位)であり、ASTN2ではrs7021928(配列番号26の27位)であり、GRM7ではrs1569284(配列番号9の27位)であり、MAP2K1ではrs1432443(配列番号48の27位)であり、CADM1ではrs220836(配列番号49の27位)であり、および／またはGRIN2Bではrs7974275(配列番号50の27位)である。最も好ましくは、遺伝子型決定した全てのSNPは、前の文章に挙げたものである。したがって、この方法は、さらにそのrs2695112、rs6923644、rs1556060、rs1041644、rs4782109、rs7225320、rs9307866、rs7021928、rs1569284、rs1432443、rs220836、およびrs7974275、またはそれらの組み合わせからなる群より選択されるSNPのいずれかまたはすべての遺伝子型決定を含む。好ましい実施形態において、本発明は、さらに、男性被験者における自閉症の疾病素質若しくは自閉症の存在の検出または自閉症のリスクを決定する方法を提供し、当該方法は表1または表5に同定される任意のSNPの遺伝子型を決定することを含む。
【０１３７】
表5（下記参照）は、再現性の程度に応じた、男性における自閉症の検出に有用なSNPを記載している。それらのAUC（曲線下面積）および関連するp値もまた提供される。これらの方法において、好ましくは表1に定義されたような、リスク関連対立遺伝子の組み合わせの存在を検出することは、男性被験者における自閉症のリスク、自閉症の疾病素質、または自閉症の存在を示す。より詳細には、自閉症のリスクレベルは、上述のように、遺伝的スコアにリスク関連SNPを組み合わせ、1つまたは複数の閾値と比較することによって決定する。
【０１３８】
これらの方法において、好ましくは表1に定義されたような、リスク関連対立遺伝子の組み合わせの存在を検出することは、男性被験者における自閉症のリスク、自閉症の疾病素質、または自閉症の存在を示す。より詳細には、自閉症のリスクレベルは、上述のように、遺伝的スコアにリスク関連SNPを組み合わせ、1つまたは複数の閾値と比較することによって決定する。具体的には、rs893109についてはG、rs260969についてはT、rs12925135についてはC、rs2663327についてはC、rs636624についてはAおよびrs2367910についてはCの存在の組み合わせが、被験者の自閉症のリスク、自閉症の疾病素質または存在を示す(実施例の項で説明したように、これらの6個のSNPから構築された遺伝的スコアはRI≧0.95、p=5.5×10-8でのAUCが0.64に関連している)。
【０１３９】
方法はまた、さらに、PITX1、ATP2B2、EN2、JARID2、CNTNAP2およびHOXA1、またはそれらの組み合わせのいずれかまたはすべての遺伝子座におけるSNPの遺伝子型決定も含んでもよく、好ましくは、さらにrs6872664、rs2278556、rs1861972、rs7766973、rs7794745、およびrs10951154、またはそれらの組み合わせからなる群より選択されるSNPのいずれかまたはすべての遺伝子型決定を含んでもよい。
【０１４０】
本発明はさらに、女性被験者における自閉症のリスクを決定するか、または自閉症の疾病素質もしくは存在を検出する方法であって、前記被験者由来の試料中の、少なくともCHRM3、DSCAML1、PTPRG、GFRA1、LPPR4、DLG2、SLC9A9およびBASP1の遺伝子座におけるSNPの遺伝子型決定を含む。好ましくは、CHRM3におけるSNPはrs10802802(配列番号5の27位)であり、DSCAML1ではrs695083(配列番号24の27位)であり、PTPRGではrs636624(配列番号22の27位)であり、LPPR4ではrs712886(配列番号27の27位)であり、DLG2ではrs12275631(配列番号51の27位)であり、SLC9A9ではrs3928471(配列番号19の27位)であり、BASP1ではrs298542(配列番号52の27位)である。最も好ましくは、遺伝子型決定した全てのSNPは、前の文章に挙げたものである。そのため、女性被験者では、この方法は、特に少なくともrs10787637、rs636624、rs695083、rs10802802、rs712886、rs12275631、rs3928471及びrs298542の遺伝子型決定を含む。
【０１４１】
好ましくは、この方法はさらに、CNTN6、NTRK3、DLG4、ERC2、TRIM9、SYT14、JARID2、CDH13、SULF2、GRIN2A及びNRG3、またはそれらの組み合わせのいずれかまたは全ての遺伝子座におけるSNPの遺伝子型決定を含む。この場合、有利には、CNTN6におけるSNPはrs9837484(配列番号35の27位)であり、NTRK3ではrs7172184(配列番号28の27位)であり、DLG4ではrs314253(配列番号17の27位)であり、ERC2ではrs1485677(配列番号8の27位)であり、TRIM9ではrs10150121(配列番号1の27位)であり、SYT14ではrs7534723(配列番号30の27位)であり、JARID2ではrs9370809(配列番号33の27位)であり、CDH13ではrs9940922(配列番号36の27位)であり、SULF2ではrs6063144(配列番号53の27位)であり、GRIN2Aではrs4782109(配列番号21の27位)であり、および/またはNRG3ではrs2820100(配列番号54の27位)またはrs7075400(配列番号55の27位)である。最も好ましくは、遺伝子型決定した全てのSNPは、前の文章に挙げたものである。したがって、好ましくは、女性被験者において、本方法はさらに、以下のSNP、rs9837484、rs7172184、rs314253、rs1485677、rs10150121、rs7534723、rs9370809、rs9940922、rs6063144、rs4782109及びrs2820100、またはそれらの組み合わせのいずれかまたは全ての遺伝子型決定を含む。
【０１４２】
より好ましくは、該方法はさらに、APBA1、ABR、NRG3、PDE4DおよびEGLN3、またはそれらの組み合わせのいずれかまたは全ての遺伝子座におけるSNPの遺伝子型の決定を含む。この場合において、有利には、APBA1におけるSNPはrs11139294(配列番号6の27位)であり、ABRではrs2663327(配列番号40の27位)であり、NRG3ではrs7075400(配列番号55の27位)であり、PDE4Dではrs35284(配列番号18の27位)であり、および/またはEGLN3ではrs946630(配列番号56の27位)である。最も好ましくは、遺伝子型決定した全てのSNPは、前の文章に挙げたものである。したがって、より好ましくは、女性被験者において、本方法はさらに以下のSNP、rs11139294、rs2663327、rs7075400、rs35284及びrs946630、又はそれらの組み合わせのいずれかまたはすべての遺伝子型決定を含む。
【０１４３】
さらにより好ましくは、方法はさらに、RGS6、SLC24A2、PTPRD、NAV2、PCDH10、MAP1S、及びPAX2、またはそれらの組み合わせのいずれかまたはすべての遺伝子座におけるSNPの遺伝子型決定を含む。この場合において、有利には、RGS6におけるSNPはrs6574041(配列番号23の27位)であり、SLC24A2ではrs957910(配列番号34の27位)であり、PTPRDではrs2382104(配列番号14の27位)であり、NAV2ではrs10500866(配列番号57の27位)であり、PCDH10ではrs4404561(配列番号20の27位)であり、MAP1Sではrs12985015(配列番号7の27位)であり、および/またはPAX2ではrs2077642(配列番号13の27位)である。最も好ましくは、遺伝子型決定した全てのSNPは、前の文章に挙げたものである。したがって、この方法は、好ましくは、rs6574041、rs957910、rs2382104、rs10500866、rs4404561、rs12985015、及びrs2077642、又はこれらの組み合わせからなる群より選択されるSNPのいずれかまたはすべての遺伝子型決定を含む。好ましい実施形態において、本発明は、さらに、または女性被験者における自閉症の疾病素質若しくは自閉症の存在を検出する方法または自閉症のリスクを決定する方法を提供し、当該方法は表1または表6に同定される任意のSNPの遺伝子型を決定することを含む。
【０１４４】
表6（下記参照）は、再現性の程度に応じて女性における自閉症の検出に有用なSNPを記載している。それらのAUCおよび関連のp値もまた提供される。
【０１４５】
これらの方法は、好ましくは表1に定義されるように、リスク関連対立遺伝子の組み合わせの存在の検出は、女性被験者における自閉症のリスク、自閉症の疾病素質、または自閉症の存在を示す。より具体的には、自閉症のリスクレベルは、上述のように、遺伝的スコアにリスク関連SNPを組み合わせ、それを1つまたは複数の閾値と比較することによって決定する。具体的には、rs10802802についてG、rs695083についてT、rs636624についてA、rs10787637についてG、rs712886についてC、rs12275631についてT、rs3928471についてTおよびrs298542についてCの組み合わせの存在は、自閉症のリスクのある、疾病素質を有するまたは自閉症である被験者を示す（実施例の項で説明したように、これらの8個のSNPから構築された遺伝的スコアはRl≧0.95、p=1.77×10-9での0.69のAUCに関連する）。
【０１４６】
好ましくは、本方法はさらに、EN2、JARID2、MARK1、ITGB3、およびCNTNAP2、またはそれらの組み合わせのいずれかまたは全ての遺伝子座におけるSNPの遺伝子型決定を含んでいてもよく、好ましくは本方法はさらに、rs1861972、rs7766973、rs12410279、rs5918、およびrs7794745、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれかまたは全てのSNPの遺伝子型決定を含む。
【０１４７】
【表５−１】
2015510756.tif 000016
【表５−２】
2015510756.tif 000017
【０１４８】
【表６−１】
2015510756.tif 000018
【表６−２】
2015510756.tif 000019
【０１４９】
遺伝子型決定方法およびキット
用語「遺伝子型決定」は、自閉症リスク関連対立遺伝子の存在を検出することが可能な、列挙されたSNPの対立遺伝子を決定することを意味する。
遺伝子座におけるSNPは、配列決定、選択的ハイブリダイゼーションおよび/または選択的増幅によって遺伝子型を決定することができる。
【０１５０】
配列決定は、自動シーケンサーを使用して、当技術分野において周知の技術を用いて行うことができる。配列決定は、完全な遺伝子または、より好ましくはその特定のドメイン上で行われ、一般的に有害な突然変異または他の変化を及ぼすことが知られているまたは推定されるものについて行われる。
【０１５１】
増幅は、核酸の複製を開始するために役立つ相補的核酸配列の間の特異的ハイブリッドの形成に基づく。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、リガーゼ連鎖反応（LCR）、鎖置換増幅（SDA）、および核酸配列ベース増幅（NASBA）などの当技術分野において公知のさまざまな技術に従って実施することができる。これらの技術は、市販の試薬およびプロトコルを使用して行うことができる。増幅は、通常、反応を開始するために、特異的核酸プライマーの使用を必要とする。
【０１５２】
遺伝子または遺伝子座からの配列を増幅するために有用な核酸プライマーは特異的に前記遺伝子座の標的領域に隣接する遺伝子座の一部とハイブリダイズすることができる、標的領域は、自閉症を有するある被験者において変化している。
【０１５３】
好ましい技術は、対立遺伝子特異的PCR（AS-PCR）を使用する。この技術は、特定の対立遺伝子を標的にした増幅を可能にする。AS-PCRは、三種類のプライマーが、3'方向の、特定の対立遺伝子に対応する一つの塩基を除いて同じヌクレオチド配列を有する2つのプライマーを含んで行われる。さらに、特定のフルオロフォアに結合された2つのユニバーサルプライマーが使用される。それらの2つのプライマーがPCR産物に組み込まれると、信号を送信する（Nazarenko et al.、1997; Myakishev et al.、2001）。
【０１５４】
この技術は、単一のチューブ、マイクロプレートおよび古典的なqPCRシステムで実行することができる。しかし、マイクロ流体の新しいプラットフォームはまた、数十マーカー上の数十サンプルを並列的に調べるために、有利にこの技術を実行するために使用することができる。
【０１５５】
例として、96ウェルプレートと同じ大きのフリューダイナミックアレイ（Fluidigm Dynamic Array）により、96個のサンプル上の96のSNPの研究が可能になる。したがって、PCRの9216反応が並行して行われる。サンプルおよびプライマーは、マイクロ流体工学のシステムにより、数ナノリットルの反応チャンバーに分配される。
【０１５６】
フリューダイナミックアレイ集積流体回路（IFC）は自動的に個別のPCR反応を組み立て、必要とされるピペット操作ステップの数を100倍まで減らす、マイクロ流体チャネル、チャンバおよびバルブのオンチップネットワークを有する。ダイナミックアレイ上に試料とプライマーをロードした後、PCRは、その後、熱サイクルを統合し、統合された流体回路で蛍光を検出する、BioMarkまたはEP1システム上で実行される（Wang et al.、2009（b））。
【０１５７】
ハイブリダイゼーション検出方法は、核酸配列の改変を検出するために役立つ相補的核酸配列間の特異的ハイブリッドの形成に基づく。
【０１５８】
特定の検出技術は、野生型または改変された遺伝子に特異的な核酸プローブの使用を含み、ハイブリッドの存在の検出が続く。プローブは、懸濁液中にあるか、または（核酸アレイまたはチップ技術におけるように）基板又は支持体上に固定化することができる。プローブは、典型的には、ハイブリッドの検出を容易にするために標識される。
【０１５９】
好ましい実施形態では、遺伝子座における変化は、DNAチップ分析により決定される。このようなDNAチップまたは核酸マイクロアレイは、化学的に基板に付着された異なる核酸プローブからなり、マイクロチップ、ガラススライドまたはマイクロスフェアサイズのビーズであってもよい。マイクロチップはポリマー、プラスチック、樹脂、多糖類、シリカまたはシリカ系材料、炭素、金属、無機ガラス、またはニトロセルロースで構成してもよい。プローブは、約10〜約60塩基対であってもよいcDNAまたはオリゴヌクレオチドのような核酸を含む。遺伝子の変化を決定するために、被験者からの試料は、標識し、ハイブリダイゼーション条件下でマイクロアレイと接触させ、マイクロアレイ表面に付着したプローブ配列に相補的である標的核酸との間の複合体の形成に至る。その後、標識されたハイブリダイズした複合体の存在が検出される。マイクロアレイハイブリダイゼーション技術の多くの変形（例えばKidgell＆Winzeler、2005による総説参照）は、当業者に利用可能である。
【０１６０】
本発明はさらに、プライマーペア(フォワードおよびリバースプライマー)またはトリプレット(２つのフォワードおよび１つのリバースプライマー)および/または少なくともHTR5A、MACF1、RBFOX1、ABR、PTPRG、CACNA2D1、GFRA1、DSCAML1、CHRM3、LPPR4、DLG2、SLC9A9およびBASP1の遺伝子座におけるSNPの特異的検出のためのプローブを含むキットを提供し、好ましくは、SNPはHTR5Aのrs893109(配列番号31の27位)であるか、MACF1のrs260969(配列番号15の27位)であるか、RBFOX1のrs12925135(配列番号39の27位)であるか、ABRのrs2663327(配列番号40の27位)であるか、PTPRGのrs636624(配列番号22の27位)であるか、CACNA2D1のrs2367910(配列番号41の27位)であるか、GFRA1のrs10787637(配列番号4の27位)であるか、DSCAML1のrs695083(配列番号24の27位)であるか、CHRM3のrs10802802(配列番号5の27位)であるか、LPPR4のrs712886(配列番号27の27位)であるか、DLG2のrs12275631(配列番号51の27位)であるか、SLC9A9のrs3928471(配列番号19の27位)であるか、およびBASP1のrs298542(配列番号52の27位)である。
【０１６１】
前記キットはさらに、プライマーペア(フォワードおよびリバースプライマー)またはトリプレット(２つのフォワードおよび１つのリバースプライマー)および/またはKCNIP1、UGCG、NTRK3、PLCB1、NELL1、GPR98、MAGI2、PLAGL1、CNTN6、DLG4、ERC2、TRIM9、SYT14、JARID2、CDH13、SULF2、GRIN2A及びNRG3またはそれらの組み合わせのいずれかまたはすべての遺伝子座におけるSNPの特異的検出のためのプローブを含み、好ましくは、前記キットは、さらに、プライマーペア(フォワードおよびリバースプライマー)またはトリプレット(２つのフォワードおよび１つのリバースプライマー)および/またはKCNIP1のrs12514116(配列番号38の27位)であるか、UGCGのrs16916456(配列番号11の27位)であるか、NTRK3のrs7172184(配列番号28の27位)であるか、PLCB1のrs8123323(配列番号37の27位)であるか、NELL1のrs10766739(配列番号3の27位)であるか、GPR98のrs16868972配列番号42の27位)であるか、MAGI2のrs12535987(配列番号43の27位)であるか、PLAGL1のrs207668(配列番号12の27位)であるか、CNTN6のrs9837484(配列番号35の27位)であるか、DLG4のrs314253(配列番号17の27位)であるか、ERC2のrs1485677(配列番号8の27位)であるか、TRIM9のrs10150121(配列番号1の27位)であるか、SYT14のrs7534723(配列番号30の27位)であるか、JARID2のrs9370809(配列番号33の27位)であるか、CDH13のrs9940922(配列番号36の27位)であるか、SULF2のrs6063144(配列番号53の27位)であるか、GRIN2Aのrs4782109(配列番号21の27位)であるか、およびNRG3のrs2820100(配列番号54の27位)であるか、またはそれらの組み合わせのいずれかまたはすべての特異的検出のためのプローブを含む。
【０１６２】
当該キットはさらに、プライマーペア(フォワードおよびリバースプライマー)またはトリプレット(２つのフォワードおよび１つのリバースプライマー)および/またはNRG1、TRIM2、EPHA5、PCDH10、HIP1、APBA1、PDE4DおよびEGLN3またはそれらの組み合わせのいずれかまたはすべての遺伝子座におけるSNPの特異的検出のためのプローブも、または追加的に含み、好ましくは、前記キットは、さらに、プライマーペア(フォワードおよびリバースプライマー)またはトリプレット(２つのフォワードおよび１つのリバースプライマー)および/またはNRG1のrs723811(配列番号44の27位)であるか、APBA1のrs11139294(配列番号6の27位)であるか、TRIM2のrs11942354(配列番号45の27位)であるか、EPHA5のrs1597611(配列番号10の27位)であるか、PCDH10のrs4404561(配列番号20の27位)であるか、HIP1のrs6962352(配列番号25の27位)であるか、NRG3のrs7075400(配列番号55の27位)であるか、PDE4Dのrs35284(配列番号18の27位)およびEGLN3のrs946630(配列番号56の27位)であるか、またはそれらの組合せのいずれかまたはすべての特異的検出のためのプローブを含む。
【０１６３】
当該キットはさらに、プライマーペア(フォワードおよびリバースプライマー)またはトリプレット(２つのフォワードおよび１つのリバースプライマー)および/またはABR、ACCN1、AKAP7、APBA1、ASTN2、BASP1、CACNA2D1、CADM1、CDH13、CHRM3、CNTN6、DCLK1、DCLK2、DLG2、DLG4、DSCAML1、EGLN3、EPHA5の、ERC2、GFRA1、GPR98、GRIN2A、GRIN2B、GRM7、HIP1、HTR5A、JARID2、KCNH5、KCNIP1、LPPR4、MACF1、MAGI2、MAP1S、MAP2K1、NAV2、NELL1、NRG1、NRG3、NTRK3、PAX2、PCDH10、PDE11A、PDE4D、PLAGL1、PLCB1、PTPRD、PTPRG、RBFOX1、RGS6、SLC24A2、SLC9A9、SULF2、SYT14、TRIM2、TRIM9及びUGCGまたはそれらの組み合わせからなる群より選択される遺伝子座における少なくとも一つのSNPの特異的検出のためのプローブも、または追加的に含み、好ましくは、前記キットは、さらに、プライマーペア(フォワードおよびリバースプライマー)またはトリプレット(２つのフォワードおよび１つのリバースプライマー)および/または以下のSNP:rs2663327、rs7225320、rs6923644の全て、RS11139294、rs7021928、rs298542、rs2367910、rs220836、rs9940922、rs10802802、rs9837484、rs1556060、rs9307866、rs12275631、rs314253、rs695083、rs946630、rs1597611、rs1485677、rs10787637、rs16868972、rs4782109、rs7974275、rs1569284、rs6962352、rs893109、rs9370809、rs1041644、rs12514116、rs712886、rs260969、rs12535987、rs12985015、rs1432443、rs10500866、rs10766739、rs723811、rs2820100、rs7075400、rs7172184、rs2077642、rs44045
61、rs2695112、rs35284、rs2076683、rs8123323、rs2382104、rs636624そのrs12925135、rs6574041、rs957910、rs3928471、rs6063144、rs7534723、rs11942354、rs10150121、rs16916456、またはそれらの組み合わせのすべての特異的検出のためのプローブを含む。
【０１６４】
具体的には、前記キットはさらに、プライマーペア(フォワードおよびリバースプライマー)またはトリプレット(２つのフォワードおよび１つのリバースプライマー)および/または以下の遺伝子座：ABR、ACCN1、AKAP7、APBA1、ASTN2、BASP1、CACNA2D1、CADM1、CDH13、CHRM3、CNTN6、DCLK1、DCLK2、DLG2、DLG4、DSCAML1、EGLN3、EPHA5の、ERC2、GFRA1、GPR98、GRIN2A、GRIN2B、GRM7、HIP1、HTR5A、JARID2、KCNH5、KCNIP1、LPPR4、MACF1、MAGI2、MAP1S、MAP2K1、NAV2、NELL1、NRG1、NRG3、NTRK3、PAX2、PCDH10、PDE11A、PDE4D、PLAGL1、PLCB1、PTPRD、PTPRG、RBFOX1、RGS6、SLC24A2、SLC9A9、SULF2、SYT14、TRIM2、TRIM9とUGCGの全てにおける少なくとも一つのSNPの特異的検出のためのプローブを含んでもよく、好ましくは、当該キットはプライマーペア(フォワードおよびリバースプライマー)またはトリプレット(２つのフォワードおよび１つのリバースプライマー)および/または以下のSNP:rs2663327、rs7225320、rs6923644、rs11139294、rs7021928、rs298542、rs2367910、rs220836、rs9940922、rs10802802、rs9837484、rs1556060、rs9307866、rs12275631、rs314253、rs695083、rs946630、rs1597611、rs1485677、rs10787637、rs16868972、rs4782109、rs7974275、rs1569284、rs6962352、rs893109、rs9370809、rs1041644、rs12514116、rs712886、rs260969、rs12535987、rs12985015、rs1432443、rs10500866、rs10766739、rs723811、rs2820100、rs7075400、rs7172184、rs2077642、rs4404561、rs2695112、rs35284、rs2
076683、rs8123323、rs2382104、rs636624、rs12925135、rs6574041、rs957910、rs3928471、rs6063144、rs7534723、rs11942354、rs10150121、rs16916456の特異的検出のためのプローブを含む。
【０１６５】
前記キットはさらに、プライマーペア(フォワードおよびリバースプライマー)またはトリプレット(２つのフォワードおよび１つのリバースプライマー)および/またはPITX1、ATP2B2、EN2、JARID2、MARK1、ITGB3、CNTNAP2、及びHOXA1、またはそれらの組合せのいずれかまたはすべての遺伝子座におけるSNPの特異的検出のためのプローブを含んでもよく、好ましくは、当該キットはプライマーペア(フォワードおよびリバースプライマー)またはトリプレット(２つのフォワードおよび１つのリバースプライマー)および/またはrs6872664、rs2278556、rs1861972、rs7766973、rs12410279、rs5918、rs7794745、およびrs10951154、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれかまたは全てのSNPの特異的検出のためのプローブを含む。これらの遺伝子/SNPはCarayol et al.、2011およびWO2011/138372に記載されているものである。
【０１６６】
プライマーペア(フォワードおよびリバースプライマー)またはトリプレット(２つのフォワードおよび１つのリバースプライマー)は、関心のあるSNPを含む標的遺伝子の一部の特異的増幅のために使用することができる。２つのプライマーだけが使用される場合、それらは一般に、関心のある標的SNPの一方の側にそれぞれ配置され、さらなる分析のために標的配列の量を増加させるために使用される。３つのプライマーが使用される場合、単一のリバースプライマーは、好ましくは、関心のある標的SNPの一方の側に配置され、対応する二つのフォワードプライマーは、SNPの予防またはリスクに関連する対立遺伝子のそれぞれに特異的である。二つのプライマー間で異なる塩基は、好ましくはフォワードプライマーの3'に位置している。プライマーは、約15〜約25ヌクレオチド、好ましくは約18〜約22ヌクレオチドのポリヌクレオチドである。
【０１６７】
一つの遺伝子座における一つのSNPを特異的に検出するためのプローブは、特に、関心のあるSNPを含む標的遺伝子の一部と相補的な、少なくとも10個の連続した塩基、好ましくは約10〜約60塩基、を含むポリヌクレオチドを含むか、またはそれから成っていてもよい。
【０１６８】
具体的には、本発明は、(i)配列番号31、15、39、40、22、41、4、24、5、27、51、19および52であって、それぞれ配列番号31の２７位、配列番号15の２７位、配列番号39の２７位、配列番号40の２７位、配列番号22の２７位、配列番号41の２７位、配列番号4の２７位、配列番号24の２７位、配列番号5の２７位、配列番号27の２７位、配列番号51の２７位、配列番号19の２７位近傍、または(ii)これらの配列の組合せの、10個の連続した塩基、好ましくは約10〜約60塩基、を含むポリヌクレオチドのセットを提供する。そのようなポリヌクレオチドの組合せは(i)配列番号38、配列番号11、配列番号28、配列番号37、配列番号3、配列番号42、配列番号43、配列番号12、配列番号35、配列番号17、配列番号8、配列番号1、配列番号30、配列番号33、配列番号36、配列番号53、配列番号21、配列番号54および配列番号55、それぞれ配列番号38、配列番号11、配列番号28、配列番号37、配列番号3、配列番号42、配列番号43、配列番号12、配列番号35、配列番号17、配列番号8、配列番号1、配列番号30、配列番号33、配列番号36、配列番号53、配列番号21、配列番号54および配列番号55の、表１に記載された位置、または(ii)該配列の相補体の少なくとも10個の連続した塩基、好ましくは約10〜約60塩基、を含むポリヌクレオチドをさらに含んでもよい。そのようなポリヌクレオチドの組合せはさらに、(i) 配列番号38、配列番号11、配列番号28、配列番号37、配列番号3、配列番号42、配列番号43、配列番号12、配列番号35、配列番号17、配列番号8、配列番号1、配列番号30、配列番号33、配列番号36、配列番号53、配列番号21、配列番号54および配列番号55、ならびに、それぞれ配列番号38、配列番号11、配列番号28、配列番号37、配列番号3、配列番号42、配列番号43、配列番号12、配列番号35、配列番号17、配列番号8、配列番号1、配列番号30、配列番号33、配列番号36、配列番号53、配列番号21、配列番号54および配列番号55の、表１に記載された位置の近傍、または(ii)該配列の相補体の少なくとも10個の連続した塩基、好ましくは約10〜約60塩基、を含むポリヌクレオチドをさらに含んでもよい。そのようなポリヌクレオチドの組合せはさらに、(i)配列番号44、配列番号45、配列番号10、配列番号20、配列番号25、配列番号6、配列番号18および配列番号56、ならびに、それぞれ配列番号44、配列番号45、配列番号10、配列番号20、配列番号25、配列番号6、配列番号18および配列番号56の、表１に記載された位置の近傍、または(ii)該配列の相補体の少なくとも10個の連続した塩基、好ましくは約10〜約60塩基、を含むポリヌクレオチドをさらに含んでもよい。
【０１６９】
好ましい実施態様において、(i)配列番号1から配列番号57、ならびに、それぞれ配列番号1から配列番号57の、表１に記載された位置の近傍、または(ii)該配列の相補体の少なくとも10個の連続した塩基、好ましくは約10〜約60塩基、を含むポリヌクレオチドのセットを提供する。
【０１７０】
ポリヌクレオチドの上記のセットは、さらに(i)配列番号58から配列番号65、ならびに、それぞれ配列番号58から配列番号65の、表２に記載された位置の近傍、または(ii)該配列の相補体の少なくとも10個の連続した塩基、好ましくは約10〜約60塩基、を含んでもよい。
【０１７１】
好ましくは、本発明のキットは、関心のある標的SNPの遺伝子型決定に専用される。「専用」とは、プライマーペア(フォワードおよびリバースプライマー)またはトリプレット(２つのフォワードおよび１つのリバースプライマー)および/または本発明のキット中のSNPの特異的検出のためのプローブは、本質的に、関心のあるSNPの特異的検出に必要なものからなり、すなわち、プライマーペア(フォワードおよびリバースプライマー)またはトリプレット(２つのフォワードおよび１つのリバースプライマー)および/または上述した以外の他のSNPの特異的検出のためのプローブの最小限を含むことを意味する。例えば、本発明の専用キットは、好ましくは、50、40、30、25、20以下、好ましくは15以下、14以下、13以下、12以下、11以下、好ましくは10以下、好ましくは9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のプライマーペア(フォワードおよびリバースプライマー)またはトリプレット(２つのフォワードおよび１つのリバースプライマー)および/または上述した以外の他のSNPの特異的検出のためのプローブを含む。本発明の上記専用キットは、好ましくは、100、90、80好ましくは70以下、69以下、68以下、67以下、66以下、好ましくは65以下のプライマーペア(フォワードおよびリバースプライマー)またはトリプレット(２つのフォワードおよび１つのリバースプライマー)および/またはのSNPの特異的検出のためのプローブを含む。しかしながら、ポリメラーゼ、緩衝剤または任意の他の有用な試薬などの追加の試薬を含んでいてもよい。さらに、自閉症のリスク、自閉症の疾病素質または自閉症の存在を決定するための説明書を含むことができる。例えば、それは、遺伝的スコアおよび適切な閾値（単数または複数）を計算するための説明書を含むことができる。
【０１７２】
本発明のさらなる主題は、ポリヌクレオチドのセットを含むマイクロアレイであり、任意選択的に、その上にポリヌクレオチドのセットが固定化された基板を含み、ここで、ポリヌクレオチドのセットは上記に定義される通りである。そのようなマイクロアレイは、好ましくは、関心のある標的SNPの遺伝子型決定専用である。マイクロアレイの場合、これはマイクロアレイの特異的プローブは、本質的に、関心のある標的のSNPに特異的なプローブからなり、他のSNPに特異的なプローブは最小限だけを含むことを意味する。好ましくは、専用のマイクロアレイは50、40、30、25、20以下、好ましくは15以下、14以下、13以下、12以下、11以下、好ましくは10以下、好ましくは9、8、7、6、5、4、3、2、または1の、上記以外のSNPの特異的検出のためのプローブを含む。本発明の専用マイクロアレイは、このように、好ましくは、100、90、80以下、好ましくは70以下、69以下、68以下、67以下、66以下、好ましくは65以下の、SNPの特異的検出のための異なるプローブを含む。
【０１７３】
好ましくは、ポリヌクレオチドは、アミノ-シラン、ポリ-L-リジンおよびアルデヒドからなる群から選択される活性基がコーティングされた基板上に固定化される。
特定の実施形態では、基板は、シリコン、ガラス、石英、金属及びプラスチックからなる群から選択される材料で構成されている。
【０１７４】
治療方法
本発明はさらに、被験者における自閉症を治療または予防するための方法に関し、前記方法は以下：
a）本明細書に記載の本発明の任意の方法により、被験者における、自閉症のリスクを決定する、または自閉症の疾病素質または存在を検出すること、および
b）もし当該被験者が自閉症のリスクがある、自閉症の疾病素質を有するまたは自閉症に罹患していると決定される場合、被験者を以下：
i）当該自閉症診断観察スケジュール-ジェネリック[ADOS-G]のような行動自閉症機器、
ii）改訂自閉症診断インタビュー[ADI-R]のような、第三者との間接インタビューベースの自閉症機器、および/または、
iii）早期集中行動介入（EIBI）
に供することを含む。
【０１７５】
好ましくは、もし被験者が自閉症のリスクがある、自閉症の疾病素質があるまたは自閉症に罹患していると決定される場合、自閉症の診断を確認するために、その後被験者は最初にすぐに行動または間接インタビューベースの自閉症試験、好ましくは改訂自閉症診断インタビュー[ADI-R]に供される。自閉症の診断が確認された場合、早期の介入が自閉症の被験者についての結果を改善することが見出されたので、次に被験者は迅速に、早期集中行動介入（EIBI）に供される。
【０１７６】
本発明による、被験者における、自閉症の疾病素質もしくは自閉症の存在を検出する方法または自閉症のリスクを決定する方法は、主に、若いおよび非常に若い子供たちを自閉症についてスクリーニングするために意図されており、子供の若い兄弟や姉妹が既に自閉症に罹患していると診断された子供であり、行動自閉症テスト（すなわち自閉症診断観測スケジュール-ジェネリック[ADOS-G]）または第三者との間接的なインタビューに基づく自閉症の検査（例えば、改訂自閉症診断インタビュー[ADI-R]）が実行される前であっても、可能な限り早期にスクリーニングするために意図されている。これは、このように早期の治療的介入を可能にする、そのようなテストを実行し、可能な限り早期の自閉症の確認を可能にすることができる。
【０１７７】
実際に、米国小児科学会（AAP）は、すべての18か月および24ヶ月歳児はASDをスクリーニングすべきとの勧告付きの、ASDの早期発見、スクリーニングおよび診断上の診療ガイドラインを公開している（ジョンソンとマイヤーズ2007）。
【０１７８】
スクリーニング結果が肯定的である場合、小児科医は、ピアレビューされた、および/またはコンセンサス形成されたASD材料を提供すべきである。陽性のスクリーニング結果は、ASDの診断を決定するものではないので、子供は早期介入/幼児教育サービスのために、総合的なASDの評価、および聴覚の評価に付されるべきである（ジョンソンとマイヤーズ2007）。
【０１７９】
応用行動分析（ABA）の原理を組み込んだ、早期集中行動介入（EIBI）は、自閉症の幼い子供たちの効果的な介入アプローチであるといういくつかの証拠がある（ドーソンとエステルリング1997;ウォーレンら2011; Reichow et al.2012）。しかし、ランダム化された比較試験がないため、証拠の現在の状態は制限されている。
【０１８０】
経験的に評価されている30未満ヵ月児のために利用可能な唯一の総合的なEIBIプログラムは早期スタートデンバーモデル（ESDM）（ドーソンら2010）である。コミュニティー-介入を受けた子どもたちに比べて集中的な介入の2年間の後、ESDMを受けた子どもたちは、ベースラインスコアと比較群の7.0ポイントと比べて17.6ポイント上昇して大幅に改善されたIQを示した。比較群の子どもたちは、適応行動に大きな遅延を示した。ESDMを受けた子供たちは対照群よりも、特に指定しない広汎性発達障害の自閉症の診断の変化を経験する可能性が高かったが。さらに、著者らは、EIBIは自閉症スペクトラム障害を持つ幼児において、社会的行動の改善と関連している脳活動の正規化されたパターンと関連していることを明らかにした（ドーソンら2012）。
【０１８１】
自閉症の生涯一人当たりの増分社会コストは220万ドルと評価されている（ガンツ2007）。EIBIの費用対効果の研究では、、ヤコブセンらは、正常な機能を実現しているPDDを持つ子供のために55歳の純貯蓄を推定150万ドルとすると、部分的な機能を得ている子供のための純貯蓄はおよそ百万ドルである（ヤコブソンとMulick 2000年）。
【０１８２】
そのため、早期の確証診断および/または介入が続く早期のスクリーニングは、自閉症の被験者の運命を改善し、その管理関連コストを減少させるために非常に有用である可能性がある。
【０１８３】
本発明による試験は、このように初期のスクリーニングのために使用され、自閉症のリスク、自閉症の疾病素質または自閉症の存在が診断された場合、確証診断および/または介入が続いてもよい。
【０１８４】
この場合には、確証診断は、行動自閉症診断機器（例えば、自閉症診断観測スケジュール - ジェネリック[ADOS-G]（ゴッサムら2007））または間接的なインタビューに基づく自閉症の診断機器（例えば、改訂自閉症診断インタビュー[ADI-R]（ロードら、1994））を使用して行うことができる。このような試験は、当業者に周知である。
【０１８５】
自閉症が確認された場合、そのような確証診断を行う前であっても、治療的介入を行うことができる。ASDに関連した中核症状を治療するための、エビデンスに基づく薬物療法はないが、上述のように、応用行動分析（ABA）の原理を組み込んだ、早期集中行動介入（EIBI）は、自閉症の幼い子供たちの効果的な介入アプローチであるといういくつかの証拠がある。
【０１８６】
早期集中行動介入（EIBI）は、ASDのためのよりよく確立された治療法の一つである。EIBIはASDを有する若い子供（通常5歳未満）のための高度に構造化された教育のアプローチであり、それは応用行動分析（ABA）の原則に根ざしている。EIBIの起源は、ロサンゼルス・ヤング自閉症プロジェクトモデル（ロヴァースモデルとも呼ばれる）のカリフォルニア大学につながる（ロヴァース1981ロヴァース1987参照）。
【０１８７】
EIBIの核となる要素は、（a）個別の試行訓練と呼ばれる、特定の教示手順、（b）治療の初期では１：１の大人対子供比が用いられること、（c）家または学校での実施は子供の人生の１〜４歳のうちの1週間20〜40時間の範囲に設定されること、を含む（アイクセス2009およびスミス2010参照）。一般的に、EIBIは、導入され、教えられるべきタスクの範囲及び順序が示されている治療マニュアルに体系的に従ったABAの手順の研修を受けた職員の監督の下で実施される（例えば、ロヴァース1981;モーリス1996）。EIBIの特定の例は、Smith et al.、2008年に記載されている初期のスタートデンバーモデル（ESDM）、である。
【０１８８】
以下の実施例は、その範囲を限定することなく本発明を説明する。
【実施例】
【０１８９】
１．材料および方法
被験者および遺伝子型決定
自閉症の多重家族サンプルの2つの独立したセットを用いた。発見（ディスカバリー）集団はAGREレポジトリから545の多重家族（2010 Lajonchere et al.）からなり、９６４の罹患兄弟（男性773人女性191人、男女比4.41：1）および３１７の非罹患兄弟（男性141女性173人）を含む。検証（バリデーション）集団は、AGREからの339家族の相補的セットで豊富化された完全に独立したコレクションからの288の多重家族からなる。1000の罹患兄弟（男性812女性188、男女比4.3：1）および288の非罹患兄弟（男性141女性147）から構成される。AGREデータ・セットの詳細な診断基準はAGREのウェブサイト上（http://www.agre.org/）で見つけることができる。改訂自閉症診断インタビュー（ADI-R）による自閉症の「厳密な」定義での個人のみ、表現型を均質化することによってGWASの力を向上させるために選択される（シャオら2002およびマッカーシーら2008）。以前に記載されているように、AGREファミリーのメンバーについて、遺伝子型を決定した（Wang et al.、2009）。ハーディワインベルグ平衡テスト（P<10-3）に失敗したか、そのコールレートが90％未満であるか、またはマイナー対立遺伝子頻度が5％未満である、SNPは削除した。対立遺伝子のメンデル移送は、すべてのSNPについてチェックし、メンデル遺伝と矛盾する遺伝子型は、エラーを示す家族のすべてのメンバーでunknownに設定した。以前（Carayol et al.、2011）に記載したように、発見集団において同定されたSNPは、検証コレクションで遺伝子型を決定した。
【０１９０】
関連研究
GWASは追加および劣性/優勢の遺伝モデル下での（メジャー対立遺伝子優性/マイナー対立遺伝子優性の両方の可能な方向での）、家族ベースの関連テスト（FBAT）ソフトウェア（レアードら、2000）を用いて行なわれた。p値が10-3未満を有するSNPについては、非罹患兄弟から自閉症を有する個体を識別する能力について試験した。「ケース-兄弟コントロール」関連解析を実施し、オッズ比は、同じファミリーからの個体の非独立性を考慮して、一般化推定方程式（GEE）モデルを用いて推定した（ジィーガーら、1986）。性別は、階級構造化の変数として使用されなかった場合は、調整共変量として導入した。名目上の閾値（α=0.05）に関連したマーカーを、その後の分析のために選択した。
【０１９１】
SNPの優先順位付け
GWASからの関連信号を抽出し、偽陽性のSNPを最小限にするために、本発明者らは、点が、統計的パラメータ、ゲノムの特性、過去の報告と各選択されたSNPおよびその関連遺伝子（群）のための生理学的特性に割り当てられたスコアリング法を開発した。
【０１９２】
遺伝的モデルの定義と遺伝的スコアの開発
遺伝的モデルの再現性は、発見および検証集団におけるブートストラップリサンプリングを用いて各SNPについて内面および外面的に、再現性指数（RI）の計算によって試験した。（Carayol et al.、2010年およびMa et al.、2006）。再現性指数（RI）は前述のように計算した（Carayol et al.、2011）。
１．ランダムに置換した発見集団の545家族をサンプリングした545家族からなる「疑似サンプル」の構築。
２．テストした各SNPiについて、追加的な有害な対立遺伝子関連（ORAdd,i）モデル、劣性関連（ORRec,i）モデル、および優性関連(ORDom,i)モデルに関連したオッズ比（OR）が推定された。
３．工程１．および２．を1000回繰り返した。
４．テストした各SNPiについて、有害対立遺伝子がそれぞれの遺伝モデル（GM=追加的、劣性、優性）の下でその有害効果を維持した回数を示すMGM,i、すなわち男性および女性で別々に、1000の疑似サンプルにおけるORGM,i>1.00の回数の計算。
５．男性および女性で別々に、各SNPiに対して３つのRI、各遺伝モデル（GM）に対して一つがRIGM,i=MGM,i/1000と計算された。
６．検証集団を使って手順1から5までの繰り返し。
【０１９３】
SNPは、再現性の程度に基づいて、遺伝的スコアに含めた。90％というRIの厳しい閾値を考慮して、特定の遺伝的モデルの下のSNPは、このモデルの推定RIが発見および検証集団の両方において90％を超えた場合遺伝的スコア（GS90％）に含めた。この再現性の高いモデルは、「ベストフィットモデル」であると考えられる。1より多くのモデルがこの基準を満たす場合、検証集団において最も高いRIが見積もられたモデルが選択された。続く遺伝スコアモデル（GS80%からGS0％まで）は、先のSNPのセットに、緩和された閾値80％〜0％を用いたベストフィッティング遺伝モデルの下での新たな遺伝マーカーを追加することによって構築した。検証集団からの、自閉症に罹患した個体および彼らの非罹患兄弟の遺伝的スコアを、先に記載したように（Carayol et al.、2011）、特定の遺伝モデル下での有害対立遺伝子の合計として構築した。GEEモデルは自閉症の遺伝的スコアと5％未満のp値との関連が、有意な関連を示すことの試験に用いられた。罹患個体を非罹患個体から区別するために、遺伝的スコアの能力を定量化する受診者動作特性曲線（AUCｓ）を「ROC」Rパッケージ（www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/ROC）を用いて推定した。経験的な95％信頼区間（Cls）は、リサンプリング単位として各家族を使用して検証サンプルを1000回ブートストラップすることによって決定した。以前記載したように（Carayol et al.、2011）、感度、特異度、および男性では25.9％および女性では9.6％の兄弟再発リスク（Ozonoff et al.、2011）を利用して、陽性の予測値を推定した。
【０１９４】
２．結果
四家族ベースのGWASを、多重自閉症家族の発見集団で、三家族をジェンダー成層のありなしでの罹患個体で、および1家族を非罹患兄弟で実施した。合計で、900のSNPが自閉症に関連していると分かり（家族ベースのGWASでｐ値<10-3）、罹患者を非罹患兄弟から有意に区別した（「ケース-兄弟コントロール」分析においてｐ値<0.05）。具体的には、自閉症の男性および女性において実施されたGWASにおいて、それぞれ149および237のSNPが同定され、全て罹患個体である156が分析され、非罹患兄弟でのGWASからの358が解析された。これらの900SNPの優先順位づけより、自閉症の133の候補遺伝マーカーが同定された。
【０１９５】
遺伝的スコア（GS）の構築
罹患および非罹患兄弟についての性別特異的な遺伝的スコア（GS）が、考慮されたRI閾値に基づいて選択されたベストフィット遺伝モデル下で、SNPを用いて構築された。AUCによって示される、罹患個体を非罹患個体から区別するための遺伝スコアモデルの能力、および自閉症との関連性を異なる遺伝スコアモデルを用いて評価した。すべての同定されたSNP（GS0％）を使用して構築された遺伝的スコアが、男性（P=1.16×10-3）および女性（P=5.97×10-5）において非常に自閉症と関連しており、それぞれ0.59のAUC（95％CI：0.54から0.65）および0.65（95％CI：0.58から0.72）であった。AUC推定値は、遺伝的スコアモデルとともに増加し、その最大値に達し、男性では0.73（95％CI：0.69から0.78）および女性では0.74（95％CI：0.68から0.80）、男性ではGS60％で女性ではGS40％であった。
【０１９６】
AUC推定値は、遺伝的スコアモデルとともに増加し、その最大値に達し、男性では0.73（95％CI：0.69から0.78）および女性では0.74（95％CI：0.68から0.80）、男性ではGS60％で女性ではGS40％であった。
【０１９７】
男性および女性におけるGS80の信頼性と閾値の変数
唯一の閾値でのGS80
先にCarayol et al.（2011）（GS80％）において記載されているように、80％の厳しいRI閾値を考慮すると、57のSNP（表1を参照）が、31個のSNP（5SNPは2つのクラスターに存在する。表5および6参照）の二性特異的クラスターに分布しており、発見サンプルおよび検証サンプル中でそれぞれ平均RIが92％および93％であった。この遺伝モデルのAUCは発見集団(男性で0.70、95% CI: 0.65-0.75、および女性で、0.76、95% CI: 0.71-0.81)と検証集団(男性で0.70、95% CI: 0.65-0.74、および女性で、0.73、95% CI: 0.67- 0.79)で両方同様であり、これはこのモデルが安定であり、すなわち二つの独立した集団において同じ識別能力を有することを示している。
【０１９８】
このような追加的なデフォルトモデルを、すべての男性の遺伝子スコアの31のSNPと女性の遺伝的スコアの31のSNPについて想定した場合、AUCは発見集団で男性と女性でそれぞれ0.68（p=4.9x10-11）および0.72（P=5.1x10-12）と推定され、検証集団で男性0.65（P=1.5x10-7）および女性0.64（P=3.09x10-5）と推定され、低いが、重要な性能が、単純な添加デフォルトモデルを用いて得られることを示している。
【０１９９】
罹患者と検証集団におけるそれらの非罹患兄弟の遺伝的スコアは男性で22から48、女性で22から45の範囲であった。
【０２００】
異なる遺伝的スコアのしきい値について、推定された遺伝的スコアモデルGS80％の弁別性能を評価するために、特異度、感度、および陽性適中率（PPV）が推定された（表7および8参照）。
【０２０１】
男性では、自閉症児の男性兄弟での25.9％の有病率を25.9と仮定すると、27より上（GS≧27）のいかなる閾値もリスクまたは陽性適中率の大幅な増加に関連付けられ（95％信頼区間は25.9％を含まなかった。表7）、閾値として使用することができる。偽陽性の数を20％（すなわち、高い特異度）に制限したい場合は、37以上の閾値は43.7％（GS=37の閾値）またはより高い値（３７より高い任意のGS閾値）の自閉症の危険性（すなわち陽性予測値）の子供を識別することができる。
【０２０２】
37ポイントの閾値では、前記モデルは罹患した個体の半分を識別し（感度=48％、95％CI：44％-51％）偽陽性の数を21％に制限した（特異度=79％、95％CI：70％-86％）。40点の高い遺伝的スコア閾値を使用すると偽陽性の数が劇的に7％に減少され（特異度=93％、95％CI：88％-98％）罹患した子供の20％が同定された（感度=20％、95％CI:17％-23％）。この遺伝的スコアしきい値は51％のPPV（95％CI：38％-73％）と関連しており、報告された25.9％の男性兄弟再発リスク（Ozonoff et al.、2011）の2倍であった。他の単一の閾値についての感度、特異度およびPPVの更なる値は、検証集団での男性におけるGS80について、下の表7に提供されている。
【０２０３】
【表７−１】
2015510756.tif 000020
【表７−２】
2015510756.tif 000021
【０２０４】
男性の場合と同じ理由にしたがって、自閉症児の女性の兄弟での有病率を9.6％と仮定すると、24を超える任意の閾値（GS≧24）は、リスクまたは陽性適中率の大幅な増加に関連付けられ（9.6％は95％信頼区間に含まれなかった。表8）、閾値を使用することができた。偽陽性の数を20％（すなわち高特異度）に制限したければ、36かそれより大きい閾値（36を超える任意のGS閾値）にすることで23.7％（GS=閾値36）以上の自閉症のリスク（すなわち陽性適中率）の子供を識別できるようになる。
【０２０５】
罹患した女性の個体（感度=52％、95％CI：45％-60％）の半分以上が36ポイントより高い遺伝的スコアを有したのに対し、非罹患個体ではこの閾値を超えたのは20％未満だった（特異度=82％、95％ CI：76％-88％）。9.6％の兄弟再発リスク（Ozonoff et al.、2011）の約3倍を示す27％のPPV（95％CI：19％-42％）、が遺伝的スコア閾値３７ポイントで達成され、39％の感度（95％CI：32％-47％）および89％の特異度（95％CI：83％-94％）と関連していた。他の単一の閾値の感度、特異度およびPPVの更なる値は、検証集団の女性のGS80については、以下の表8に記載されている。
【０２０６】
【表８】
2015510756.tif 000022
【０２０７】
遺伝的スコアモデルが偶然に自閉症と関連していなかったことを確認するために、男性の遺伝的スコアモデルは、女性に適用され、その逆も行われた。この構成では、全く関連性は認められず、AUCは情報価値なし（noninformativity）（AUC=0.5）と有意差はなかった。具体的には、同じ80％の厳しいRI閾値を想定すると、AUCは、それぞれ男性と女性で0.47（P=0.30）および0.47（P=0.34）と推定された。
【０２０８】
いくつかの閾値でのGS80
マルチリスククラスのテストは、複数の閾値を用いて構築することができる。二つの閾値は、リスクの3つのクラスを作成するように設定することができ、リスクが疾病の罹患率に近いか同じである、リファレンスクラス、リスクがリファレンスクラスのリスクよりも低い、低リスククラス、リスクがリファレンスクラスのリスクよりも高い、高リスククラスである。
【０２０９】
２つの閾値での女性での例
女性において２つの閾値（GS=32および37）を用いて、３つのクラスが描かれた：最初のクラスはリファレンスクラスと定義され（GS＜37およびGS≧32）、リスクは兄弟における罹患率9.6％と同様であり、低いリスクの２番目のクラス（GS＜32）ではGSが32より低い時の罹患確率は３％であった；そして３番目の高いリスククラスはGSが37より高い場合には27％である。
【０２１０】
次に、３、４またはより多くの閾値も適用することができる。
４つの閾値での男性の例：
４つのGS閾値（30、35、40および45）を用いて５つのクラスが描かれた：リスクが疾病の罹患率に近いか同じである、リファレンスクラス（GS≧35およびGS＜40）、リスクが４９％である高リスククラス（GS≧40およびGS＜45）、リスクが１００％である超高リスククラス、リスクが１６％である低リスククラス（GS≧30およびGS＜35）およびリスクが８％である超低リスククラス（GS＜30）である。
【０２１１】
異なる閾値の数と値は、クラスにおけるリスク、感度および特異度によって定義されたテストに期待される性能や特性に応じて決められる。
【０２１２】
さらなる遺伝的スコア（GS85、GS90、GS95）
サブグループはその後発見集団および検証集団における、ベストフィットした遺伝モデルについてのRI値に従って定義した。遺伝的スコアを構築するために、両方のサンプルで一定値よりも大きい所定の遺伝モデルについてのRIを有するSNPを選択した。一つは男性で、一つは女性で、2つの異なる遺伝的スコアを構築するために、プロセスは男性と女性で別々に適用した。SNPの再現性の三つの異なる程度を定義する三つの異なるRI値が選択された：0.95、0.90および0.85。AUCおよび関連するp値が、男性（表５）および女性（表６）において異なる遺伝的スコアのために提供されている。
【０２１３】
GS80は、以前、それぞれCarayoi et al.2010およびCarayoi et al.2011に記載された4または8のSNPの遺伝子型決定に基づく試験より性能が優れ、信頼性の向上のために、このテストと組み合わせることができる
4および8SNPの遺伝子スコアモデルはCarayoi et al.（2010）とCarayoi et al.（2011）に提案されている。曲線下面積（AUC）は、遺伝的スコアがランダムに選択された非罹患個体よりランダムに選択された罹患患者をより高くランク付けする確率に等しい。AUCは４SNPの遺伝的スコア（Carayoi et al.（2010））について0.59と見積もられ、８SNPの性特異的遺伝モデル（Carayoi et al.（2011））について男性と女性でそれぞれ0.59および0.66と見積もられた。57のSNPを使用すると、AUCは、検証集団における男性で0.7、女性で0.73に上昇した。4および8個のSNPの遺伝子型決定に基づく前述したテストの明確な関心と良好な性能にもかかわらず、57個のSNPの分析に基づいた、本発明による新しいテストは、より一層信頼性が高い。
【０２１４】
また、本発明による新しいテストは、8個のSNPの遺伝子型決定に基づく前述の試験と組み合わせてもよく、その結果、さらにわずかに信頼性が改善される。
【０２１５】
表9および表10は、男性と女性での65個のSNPの性別特異的な遺伝的スコアモデルの正および負の予測値としての、感度、特異度を提供する。男性では、罹患した子どもたちの兄弟での自閉症の有病率は25.9％と推定される。46の遺伝的スコア閾値を用いると、わずか15％の偽陽性の結果とともに、リスク（47.9％陽性適中率）が2倍増加した40％の兄弟（感度）の40％が同定できる。女性における有病率は9.6％と推定される。42の遺伝的スコア閾値を用いると、25％（１マイナス特異度）未満の偽陽性の結果とともに、リスク（22.5％）が2倍増加した兄弟（感度）の65％が同定できる。48の遺伝的スコア閾値では、50％より大きいリスク（陽性適中率）の14％の兄弟が評価され、偽陽性結果はたった３％と期待された（１マイナス特異度）。
【０２１６】
【表９−１】
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【表９−２】
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【０２１７】
【表１０−１】
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【表１０−２】
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【０２１８】
関心のある特定のSNPは、関心のあるこのSNPと連鎖不平衡にある別のSNPで置き換えられていてもよい
SNP rs7172184は、男性と女性の遺伝的スコアに属する。もしこのSNPが、発見集団に基づいて、連鎖不平衡にあるSNP（r2=0.815ハップマップで定義されている）、rs2018052によって置換された場合、AUCは、元のSNP（rs7172184）での0.70と0.76の代わりに、男性で0.70（P=6.06×10-14）、女性で0.75（p=5.7x10-16）と推定される。
【０２１９】
[参考文献]
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【配列表】
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【国際調査報告】
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