【手続補正書】
【提出日】平成22年5月10日(2010.5.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
未知の量の複数の標的ヌクレオチド配列を含むサンプル中の、標的ヌクレオチド配列における１以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により相違している複数の配列の相対量を決定するための方法であって：
相対量を決定する対象である該複数の標的ヌクレオチド配列を含有するサンプル、および１以上の既知量のマーカー標的ヌクレオチド配列を準備し；
複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを準備し、各セットは（ａ）標的特異的部分と５’上流プライマー特異的部分を保持する第１オリゴヌクレオチドプローブ、および（ｂ）標的特異的部分と３’下流プライマー特異的部分を保持する第２オリゴヌクレオチドプローブを特徴とし（特定セットにおける標的ヌクレオチドプローブは、対応する標的ヌクレオチド配列に互いに隣接してハイブリダイズするときに一緒に連結反応するのに適し、しかし、サンプル中に存在する他のヌクレオチド配列とハイブリダイズするときに、この連結反応を妨害するミスマッチがある）、ここで複数のプローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブ群を構成し、各群は同一の５’上流プライマー特異的部分と同一の３’下流プライマー特異的部分を有する２以上のオリゴヌクレオチドプローブセットから構成される；
リガーゼを準備し；
サンプル、複数のオリゴヌクレオチドプローブセットおよびリガーゼを混合して、リガーゼ検出反応混合物とし；
リガーゼ検出反応混合物を変性処理およびハイブリダイゼーション処理を含む１以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけ（変性処理において、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドは標的ヌクレオチド配列から分離され、ハイブリダイゼーション処理により、オリゴヌクレオチドプローブセットは隣接部位で塩基特異的に、もしサンプル中に存在していればその夫々の標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、互いに連結して、連結反応産物配列を形成し、この産物配列は、（ａ）５’上流プライマー特異的部分、（ｂ）一緒に結合した標的特異的部分および（ｃ）３’下流プライマー特異的部分を含み、各セットの連結反応産物配列は連結検出反応混合物中の他の核酸と識別可能であり、オリゴヌクレオチドプローブセットはその夫々の標的ヌクレオチド配列以外のサンプル中のヌクレオチド配列とハイブリダイズするが、１以上のミスマッチの存在によって連結せず、そして、次の変性処理の際に個々に分離している）；
１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセットを準備する、ここで各プライマーのセットは特定のプローブ群内でオリゴヌクレオチドプローブにより形成された全ての連結反応産物を増幅するのに有用であり、各プライマーセットは、（ａ）連結反応産物配列の５’上流プライマー特異的部分と同じ配列を含有する上流プライマー、および（ｂ）連結反応産物配列の３’下流プライマー特異的部分に相補的な下流プライマーを特徴とし（プライマーの１つは検出可能レポーターを有する）；
ポリメラーゼを準備し；
リガーゼ検出反応混合物を１または複数のオリゴヌクレオチドプライマーセットおよびポリメラーゼと混合して、ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成せしめ；
ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけ（変性処理において、ハイブリダイズ核酸配列が分離され、ハイブリダイゼーション処理において、プライマーが連結反応産物配列の相補的プライマー特異的部分とハイブリダイズし、伸長処理において、ハイブリダイズプライマーが伸長されて、プライマーがハイブリダイズしている配列に相補的な伸長産物を形成し、第１サイクルにおいて、下流プライマーが連結反応産物配列の３’下流プライマー特異的部分にハイブリダイズし、伸長されて連結反応産物配列に相補的な伸長産物を形成し、次のサイクルにおいて、上流プライマーが連結反応産物に相補的な伸長産物の５’上流プライマー特異的部分にハイブリダイズし、３’下流プライマーが連結反応産物配列の３’下流部分にハイブリダイズする）；
レポーター標識を検出し；
伸長産物を識別し；そして
サンプル中の１以上の既知量のマーカー標的ヌクレオチド配列から生成された伸長産物の相対量と、サンプル中の１以上の未知量の標的ヌクレオチド配列から生成された伸長産物の相対量を比較して、該サンプル中の１以上の標的ヌクレオチド配列の定量を行う
ことを含む方法。
【請求項２】
請求項１の方法において、オリゴヌクレオチドが、各セットの連結反応接合部を通してのその連結反応産物配列がユニークであり、ポリメラーゼ連鎖反応混合物中の他の核酸と識別できるように、立体配座されるものであり、該方法がさらに、
相違する特定部位で固定された相違捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支持物を準備し（捕捉オリゴヌクレオチドが与えられたプローブセットの連結接合部を通ってユニークヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有している);
１以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけた後に該ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、伸長産物が捕捉オリゴヌクレオチドに塩基特異的にハイブリダイズするのに効果的な条件で固体支持物に接触せしめ、それによって相補的捕捉オリゴヌクレオチドを有する部位で固体支持物上で伸長産物を捕捉する（該検出は、連結反応接合部のまわりのユニークヌクレオチド配列部分を用いて捕捉され、そして特定部位で固体支持物に固定化された伸長産物の存在を表し、それによってサンプル中の１以上の標的ヌクレオチド配列の存在を検出する）；
ことを含む請求項１の方法。
【請求項３】
請求項１の方法において、各プライマーセットが、１つのプライマーが検出可能レポーター標識を有し、他のプライマーがポリメラーゼ連鎖反応混合物を１以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけた後にこのプライマー５’末に連結するアドレス可能アレイ特異的部分を含有するものであり、該方法がさらに、
相違する特定部位で固定化された相違捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支持物を準備し（捕捉オリゴヌクレオチドは与えられたプライマーセットの連結反応接合部を通してユニークヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を有する）；
１以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけた後に該ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、伸長産物が捕捉オリゴヌクレオチドに塩基特異的にハイブリダイズするのに効果的な条件で固体支持物に接触せしめ、それによって相補的捕捉オリゴヌクレオチドを有する部位で固体支持物上で伸長産物を捕捉する（該検出が連結反応接合部のまわりのユニークヌクレオチド配列を用いて捕捉され、そして特定部位で固体支持物に固定化された伸長産物の存在を表し、それによってサンプル中の１以上の標的ヌクレオチド配列の存在を検出する）；
ことを含む請求項１の方法。
【請求項４】
請求項１の方法において、各セット中のオリゴヌクレオチドプローブの１つが制限部位を含有するものであり、該方法がさらに、
制限部位で各伸長産物を制限消化して、標識伸長産物フラグメントを産生し（制限部位が各オリゴヌクレオチドプローブセットに位置して、該制限消化後にポリメラーゼ連鎖反応混合物における他の核酸と識別され得るように、ユニーク長を有する伸長産物フラグメントを産生する）；
伸長産物フラグメントをサイズまたは電気泳動運動性によって分離する（該識別がサイズの異なる伸長産物フラグメントを区別する）；
ことを含む請求項１の方法。
【請求項５】
請求項１の方法において、同じ群のオリゴヌクレオチドプローブセットが同じ５’上流プライマー特異的部分と同じ３’下流プライマー特異的部分とを有し、そして特定セットにおけるオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列がポリメラーゼ連鎖反応混合物中の他の核酸と識別できるようにユニーク長産物を有するものであり、該方法がさらに、
伸長産物をサイズまたは電気泳動運動性により分離する（該検出および該識別が標識が標識伸長産物中のサイズの相違により実施される）；
ことを含む請求項１の方法。
【請求項６】
請求項１の方法において、特定セットのオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列が、ポリメラーゼ連鎖反応混合物中の他の核酸と識別され得るように、連絡接合部を通ってユニーク配列を含有するものであり、該方法がさらに、
相違する特定部位で固定された相違捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支持物を準備し（捕捉オリゴヌクレオチドが与えられたプローブセットの連結接合部を通ってユニークヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有している);
１以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけた後に該ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、伸長産物が捕捉オリゴヌクレオチドに塩基特異的にハイブリダイズするのに効果的な条件で固体支持物に接触せしめ、それによって相補的捕捉オリゴヌクレオチドを有する部位で固体支持物上で伸長産物を捕捉する（該検出は、連結反応接合部を通ってユニークヌクレオチド配列部分を用いて捕捉され、そして特定部位で固体支持物に固定化された伸長産物の存在を表す）；
ことを含む請求項１の方法。
【請求項７】
複数の標的ヌクレオチド配列に対して１以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により相違している複数の配列の１以上を同定する方法であって、
複数の配列相違を有する１以上の標的ヌクレオチド配列を有する可能性のあるサンプルを準備し、
１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを準備し、各セットは（ａ）標的特異的部分と５’上流プライマー特異的部分を保持する第１オリゴヌクレオチドプローブ、および（ｂ）標的特異的部分と３’下流プライマー特異的部分を保持する第２オリゴヌクレオチドプローブを特徴とし（特定セットにおける標的ヌクレオチドプローブは、対応する標的ヌクレオチド配列に互いに隣接してハイブリダイズするときに一緒に連結反応するのに適し、しかし、サンプル中に存在する他のヌクレオチド配列とハイブリダイズするときに、この連結反応を妨害するミスマッチがある）、ここで特定セットの１つまたは両方のオリゴヌクレオチドプローブがその非連結末端にブロック群を有している；
リガーゼを準備し；
サンプル、複数のオリゴヌクレオチドプローブセットおよびリガーゼを混合して、リガーゼ検出反応混合物とし；
リガーゼ検出反応混合物を変性処理およびハイブリダイゼーション処理を含む１以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけ（変性処理において、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドは標的ヌクレオチド配列から分離され、ハイブリダイゼーション処理により、オリゴヌクレオチドプローブセットは隣接部位で塩基特異的に、もしサンプル中に存在していればその夫々の標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、互いに連結して、連結反応産物配列を形成し、この産物配列は、（ａ）５’上流プライマー特異的部分、（ｂ）一緒に結合した標的特異的部分、（ｃ）３’下流プライマー特異的部分および（ｄ）片方または両端のブロック群を含み、各セットの連結反応産物配列は連結検出反応混合物中の他の核酸と識別可能であり、実質的にエキソヌクレアーゼ消化に対して抵抗性であり、そしてオリゴヌクレオチドプローブセットはその夫々の標的ヌクレオチド配列以外のサンプル中のヌクレオチド配列とハイブリダイズするが、１以上のミスマッチの存在によって連結せず、そして、次の変性処理の際に個々に分離している）；
リガーゼ検出反応混合物を１以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけた後に、リガーゼ検出反応混合物をエクソヌクレアーゼ消化にかけ（エクソヌクレアーゼがブロックされないオリゴヌクレオチドプローブを実質的に破壊し、連結反応産物の実質部分を破壊せず、そして元の標的ヌクレオチド配列の存在を減少する);
エキソヌクレアーゼを不活性化し；
１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセットを準備する、ここで各プライマーのセットは（ａ）連結反応産物配列の５’上流プライマー特異的部分と同じ配列を含有する上流プライマー、および（ｂ）連結反応産物配列の３’下流プライマー特異的部分に相補的な下流プライマーを特徴とする（プライマーの１つは検出可能レポーターを有する）；
ポリメラーゼを準備し；
リガーゼ検出反応混合物を１または複数のオリゴヌクレオチドプライマーセットおよびポリメラーゼと混合して、ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成せしめ；
ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけ（変性処理において、ハイブリダイズ核酸配列が分離され、ハイブリダイゼーション処理において、プライマーが連結反応産物配列の相補的プライマー特異的部分とハイブリダイズし、伸長処理において、ハイブリダイズプライマーが伸長されて、プライマーがハイブリダイズしている配列に相補的な伸長産物を形成し、第１サイクルにおいて、下流プライマーが連結反応産物配列の３’下流プライマー特異的部分にハイブリダイズし、伸長されて連結反応産物配列に相補的な伸長産物を形成し、次のサイクルにおいて、上流プライマーが連結反応産物に相補的な伸長産物の５’上流プライマー特異的部分にハイブリダイズし、３’下流プライマーが連結反応産物配列の３’下流部分にハイブリダイズする）、ここで該エクソヌクレアーゼ処理が連結反応独立伸長産物の形成を、ポリメラーゼ連鎖反応混合物の１以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクル処理の際に減少する：
レポーター標識を検出し；および
サンプル中の１以上の標的ヌクレオチド配列の存在を示す伸長産物を識別する
ことを含む方法。
【請求項８】
請求項７の方法において、特定セットのオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列がユニーク長産物を産生するものであり、該方法がさらに、
伸長産物をサイズまたは電気泳動運動性により分離する（該識別がサイズの相違する伸長産物を分別する）；
ことを含む請求項７の方法。
【請求項９】
請求項８の方法において、１以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により相違する１以上の複数の配列が定量する複数の標的ヌクレオチド配列を有する未知量のサンプル中に存在するものであり、該方法がさらに、
１以上のマーカー標的ヌクレオチド配列の既知量を準備し；
１または複数のオリゴヌクレオチドプローブ群を準備し、各群はマーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブセットを含む２以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを含有し（特定セットの１または両方のオリゴヌクレオチドプローブはその非連結末端でブロックされ、同じ群のオリゴヌクレオチドプローブセットは同じ５’上流プライマー特異的部分または同じ３’下流プライマー特異的部分のいずれか、あるいは同じ５’上流プライマー特異的部分と同じ３’下流プライマー特異的部分の両方を有し、該リガーゼ検出反応混合物はさらにマーカー標的ヌクレオチド配列を含有し、プローブセットはマーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブセットを含む）；
１または複数のオリゴヌクレオチドプライマー群を準備し、各群が２以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットを含有し（各群のオリゴヌクレオチドプライマーセットは同じ５’上流プライマーまたは同じ３’下流プライマーのいずれか、あるいは５’上流プライマーと同じ３’下流プライマーの両方を含有し、オリゴヌクレオチドプライマー群は与えられた群での全連結反応産物配列の増幅に有用である）；
該識別後に伸長産物量を定量し；
未知のサンプルから産生した伸長産物量をマーカー標的ヌクレオチド配列の既知量から産生した伸長産物量と比較して、サンプル中の１以上のヌクレオチド配列レベルを定量する；
ことを含む請求項８の方法。
【請求項１０】
請求項７の方法において、１つのプライマーが検出可能レポーター標識を有し、他のプライマーがポリメラーゼ連鎖反応混合物を１以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけた後にこのプライマー５’末に連結し、単鎖を残すアドレス可能アレイ特異的部分を含有するものであり、該方法がさらに、
相違する特定部位で固定化された相違捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支持物を準備し（捕捉オリゴヌクレオチドがアドレス可能アレイ特異的部分に相補的であるヌクレオチド配列を有す）；
１以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけた後に該ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、伸長産物が捕捉オリゴヌクレオチドに塩基特異的にハイブリダイズするのに効果的な条件で固体支持物に接触せしめ、それによって相補的捕捉オリゴヌクレオチドを有する部位でアドレス可能アレイ特異的部分を固体支持物に捕捉する（該検出がアドレス可能アレイ特異的部分を用いて捕捉され、そして特定部位で個体支持物に固定された伸長産物の存在を表す）；
ことを含む請求項７の方法。
【請求項１１】
請求項１０の方法において、１以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により相違する１以上の複数の配列は、定量する複数の標的ヌクレオチド配列を有する未知量のサンプル中に存在し、１つのプライマーが検出可能レポーター標識を有し、他のプライマーがポリメラーゼ連鎖反応混合物を１以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクル処理した後にそのプライマーの５’末に連結し、そして単鎖を残すアドレス可能アレイ特異的部分を含有し、同じ群のオリゴヌクレオチドプライマーが５’上流プライマーか、同じ３’下流プライマーのいずれかを含有し、オリゴヌクレオチドプライマー群が与えられた群の全連結反応産物配列を増幅するのに用い得るものであり、該方法がさらに、
１以上のマーカー標的ヌクレオチド配列の既知量を準備し；
１または複数のオリゴヌクレオチドプローブ群を準備し、各群はマーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブセットを含む２以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを含有し（同じ群のオリゴヌクレオチドプローブセットの１つまたは両方は、同じ５’上流プライマー特異的部分または同じ３’下流プライマー特異的部分のいずれかを含有する）；
１または複数のオリゴヌクレオチドプライマー群を準備し、各群が２以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットを含有し（同じ群のオリゴヌクレオチドプライマーセットは、同じ５’上流プライマーまたは同じ３’下流プライマーのいずれかを含有し、オリゴヌクレオチドプライマーの１群は群中の全連結反応産物配列の増幅に使用される）；
マーカー標的ヌクレオチド配列とマーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブセットとを連結反応検出反応混合物に混合し；
伸長産物量を定量し；
未知のサンプルから産生した伸長産物量をマーカー標的ヌクレオチド配列の既知量から産生した伸長産物量と比較して、サンプル中の１以上のヌクレオチド配列レベルを定量する
ことを含む請求項１０の方法。
【請求項１２】
標的ヌクレオチド配列に対して１以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により相違している複数の配列の１以上を同定する方法であって、
複数の配列相違を有する１以上の標的ヌクレオチド配列を有する可能性のあるサンプルを準備し、
１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを準備し、各セットは（ａ）標的特異的部分と５’上流プライマー特異的部分を保持する第１オリゴヌクレオチドプローブ、および（ｂ）標的特異的部分と３’下流プライマー特異的部分を保持する第２オリゴヌクレオチドプローブを特徴とし（特定セットにおける標的ヌクレオチドプローブは、対応する標的ヌクレオチド配列に互いに隣接してハイブリダイズするときに一緒に連結反応するのに適し、しかし、サンプル中に存在する他のヌクレオチド配列とハイブリダイズするときに、この連結反応を妨害するミスマッチがある）ここで、特定セットの１または両方のオリゴヌクレオチドプローブがデオキシチミジンの代わりにデオキシウラシルを含有し、これによって該オリゴヌクレオチドプローブがウラシルＮ−グリコシラーゼに実質的に感受性となっている；
リガーゼを準備し；
サンプル、複数のオリゴヌクレオチドプローブセットおよびリガーゼを混合して、リガーゼ検出反応混合物とし；
リガーゼ検出反応混合物を変性処理およびハイブリダイゼーション処理を含む１以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけ（変性処理において、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドは標的ヌクレオチド配列から分離され、ハイブリダイゼーション処理により、オリゴヌクレオチドプローブセットは隣接部位で塩基特異的に、もしサンプル中に存在していればその夫々の標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、互いに連結して、連結反応産物配列を形成し、この産物配列は、（ａ）５’上流プライマー特異的部分、（ｂ）一緒に結合した標的特異的部分および（ｃ）３’下流プライマー特異的部分を含み、各セットの連結反応産物配列は連結検出反応混合物中の他の核酸と識別可能であり、オリゴヌクレオチドプローブセットはその夫々の標的ヌクレオチド配列以外のサンプル中のヌクレオチド配列とハイブリダイズするが、１以上のミスマッチの存在によって連結せず、そして、次の変性処理の際に個々に分離している）；
リガーゼ検出反応混合物の１以上のリガーゼ検出反応サイクル処理の後、リガーゼ検出反応混合物を、連結反応産物配列の３’下流プライマー特異的部分に相補的な１または複数の下流オリゴヌクレオチドプライマーおよびポリメラーゼと混合して、伸長混合物を形成し；
伸長混合物をハイブリダイズ処理にかけ（下流プライマーは連結反応産物配列の３’下流プライマー特異的部分にハイブリダイズし、伸長して、連結反応産物配列に相補的な伸長産物を形成する）；
ポリメラーゼを不活性化し；
該不活性化後に伸長混合物をウラシルＮ−グリコシラーゼと混合して、ウラシルＮ−グリコシラーゼ消化混合物を形成し；
伸長混合物を実質的にウラシルＮ−グリコシラーゼ消化にかけて、オリゴヌクレオチドプローブ、連結反応産物配列、およびプライマーとして５’上流プライマーを用いる元の標的からの伸長産物を破壊し、連結反応産物配列からの下流プライマー伸長産物を破壊せず；
ウラシルＮ−グリコシラーゼを不活性化し；
連結産物配列の５’上流プライマー特異的部位と相補的な１または複数の上流オリゴヌクレオチドプライマーを準備し、ここで上流オリゴヌクレオチドプライマーまたは下流オリゴヌクレオチドプライマーのいずれかは、検出可能なレポーター標識を有する；
該ウラシルＮ−グリコシラーゼ不活性化後にポリメラーゼおよび複数の上流プライマーをウラシルＮ−グリコシラーゼ消化混合物と混合して、ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成し；
ポリメラーゼ連鎖反応混合物を１以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけ、デオキシウラシルの代わりにデオキシチミジンを含むこと以外は実質的に同じ連結反応産物配列である第１サイクルにおいて伸長産物を形成し、続くサイクルにおいて、５’上流プライマーが連結反応産物配列に相補的な伸長産物の５’上流プライマー特異的部分にハイブリダイズし、３’下流プライマーが伸長処理、連結反応産物配列に実質的に同じ伸長産物配列の３’下流部分にハイブリダイズしそれにより、伸長混合物のウラシルＮ−グリコシラーゼ消化処理が、連結反応産物配列、１または２のオリゴヌクレオチドプローブおよびポリメラーゼ連鎖反応混合物の１以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクル処理からの連結反応独立伸長産物の量を減少する；
レポーターラベルを検出し；および
伸長産物を識別して、１以上の標的ヌクレオチド配列がサンプル中にあることを確認する
ことを含む方法。
【請求項１３】
請求項１２の方法において、特定セットのオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列が、プライマーまたは他の連結反応産物配列と識別し得るユニーク長産物を産生するものであり、該方法がさらに、
伸長産物をサイズまたは電気泳動運動性により分離する（該識別がサイズの相違する伸長産物を分別する）；
ことを含む請求項１２の方法。
【請求項１４】
請求項１３の方法において、１以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により相違する１以上の複数の配列は定量する複数の標的ヌクレオチド配列を有する未知量のサンプル中に存在するものであり、該方法はさらに、
１以上のマーカー標的ヌクレオチド配列の既知量を準備し；
１以上のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプライマーセットを準備し、各セットは、（ａ）標的特異的部分および５’上流プライマー特異的部分を有する第１オリゴヌクレオチドプローブおよび（ｂ）標的特異的部分および３’下流プライマー特異的部分を有する第２オリゴヌクレオチドプローブを特徴とし（特定セットの１または２オリゴヌクレオチドプローブはデオキシチミジンの代わりにデオキシウラシルを含有し、特定セットのオリゴヌクレオチドプローブは対応するマーカー標的ヌクレオチド配列に互いに隣接してハイブリダイズするときに一緒の連結反応に適しており、しかし、サンプル中または加えられたマーカー配列中に存在する他のヌクレオチド配列にハイブリダイズするときは、該連結反応を妨害するミスマッチを有し、該オリゴヌクレオチドプローブセットおよび該マーカー特異的オリゴヌクレオチドセットは複数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、特定セットのオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列がユニーク長産物を産生し、そして同じ群または他の群におけるプローブまたは他の連結反応産物配列と識別され得る）；
マーカー標的ヌクレオチド配列およびマーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブをリガーゼ検出混合物に混合し；
１または複数のオリゴヌクレオチドプライマー群を準備し、各群が２以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットを含有し（同じ群のオリゴヌクレオチドプライマーセットは同じ５’上流プライマーまたは同じ３’下流プライマーのいずれか、あるいは５’上流プライマーと同じ３’下流プライマーの両方を含有し、オリゴヌクレオチドプライマーの１群は与えられた群での全連結反応産物配列の増幅に使用される）；
伸長産物をサイズまたは電気泳動運動性により分離し；
該識別後に伸長産物量を定量し；
未知のサンプルから産生した伸長産物量をマーカー標的ヌクレオチド配列の既知量から産生した伸長産物量と比較して、サンプル中の１以上の標的ヌクレオチド配列レベルを定量する；
ことを含む請求項１３の方法。
【請求項１５】
請求項１２の方法において、各プライマーセットにおいて、１つのプライマーが検出可能レポーター標識を有し、他のプライマーがポリメラーゼ連鎖反応混合物を１以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけた後にこのプライマー５’末に連結し、単鎖を残すアドレス可能アレイ特異的部分を含有するものであり、該方法がさらに、
相違する特定部位で固定化された相違捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支持物を準備し（捕捉オリゴヌクレオチドがアドレス可能アレイ特異的部分に相補的であるヌクレオチド配列を有する）；
１以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけた後に該ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、伸長産物が捕捉オリゴヌクレオチドに塩基特異的にハイブリダイズするのに効果的な条件で固体支持物に接触せしめ、それによって相補的捕捉オリゴヌクレオチドを有する部位でアドレス可能アレイ特異的部分を固体支持物に捕捉する（該検出がアドレス可能アレイ特異的部分を用いて捕捉され、そして特定部位で固体支持物に固定された伸長産物の存在を表す）；
ことを含む請求項１２の方法。
【請求項１６】
請求項１５の方法において、１以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により相違する１以上の複数の配列は定量する複数の標的ヌクレオチド配列を有する未知量のサンプル中に存在するものであり、該方法がさらに、
１以上のマーカー標的ヌクレオチド配列の既知量を準備し；
１または複数のオリゴヌクレオチドプローブ群を準備し、各群はマーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブセットを含む２以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを含有し（特定セットのオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列は、同じ群または他の群のプローブまたは他の連結反応産物配列と識別される）；
マーカー標的ヌクレオチド配列およびマーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブをリガーゼ検出混合物に混合し；
１または複数のオリゴヌクレオチドプライマー群を準備し、各群が２以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットを含有し（同じ群のオリゴヌクレオチドプライマーセットは同じ５’上流プライマーまたは同じ３’下流プライマーのいずれかを含有し、オリゴヌクレオチドプライマーの１群は与えられた群での全連結反応産物配列の増幅に使用される）；
該識別後に伸長産物量を定量し；
未知のサンプルから産生した伸長産物量をマーカー標的ヌクレオチド配列の既知量から産生した伸長産物量と比較して、サンプル中の１以上の標的ヌクレオチド配列レベルを定量する；
ことを含む請求項１５の方法。
【請求項１７】
各変性処理が温度約８０−１０５℃である、請求項１、７または１２の方法。
【請求項１８】
変性処理またはハイブリダイゼーション処理を含むリガーゼ検出反応の各サイクルが約３０秒−約５分間の長さである、請求項１、７または１２の方法。
【請求項１９】
リガーゼ検出反応混合物の１以上のリガーゼ検出反応サイクル処理が２−５０サイクルで反復される、請求項１、７または１２の方法。
【請求項２０】
リガーゼ検出反応混合物の１以上のリガーゼ検出反応サイクル処理についての全時間が１−２５０分である、請求項１、７、または１２の方法。
【請求項２１】
リガーゼがThermus aquaticusリガーゼ、Thermus thermophilusリガーゼ、E.coliリガーゼ、Ｔ４リガーゼおよびPyrococcusリガーゼからなる群より選ばれる、請求項１、７または１２の方法。
【請求項２２】
検出レポーター標識が発色団、蛍光分子、酵素、抗原、重金属、磁気プローブ、色素、燐光性基、放射活性物質、化学ルミネセント分子および電気化学的検出分子からなる群より選ばれる、請求項１、７または１２の方法。
【請求項２３】
オリゴヌクレオチドプローブの標的特異的部分各々がハイブリダイゼーション温度５０−８５℃を有する、請求項１、７または１２の方法。
【請求項２４】
オリゴヌクレオチドプローブの標的特異的部分が２０−２８ヌクレオチドの長さである、請求項１、７または１２の方法。
【請求項２５】
オリゴヌクレオチドプローブセットがリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシヌクレオチド、修飾ホスフェート−糖−骨格オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドアナログおよびこれらの混合物からなる群より選ばれる、請求項１、７または１２の方法。