(57)【要約】【目的】  新規で副作用の少ない脳神経細胞活性化剤を提供する。【構成】  哺乳動物生体内に存在し、非還元末端に遊離状態にあるGalNAcを有する糖化合物を有効成分として含む。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物生体内に存在し、非還元末端に遊離状態にあるGalNAcを有する糖化合物を有効成分として含む、脳神経細胞活性化剤。
【請求項２】
糖化合物が、GM2ガングリオシド又はアシアロGM2ガングリオシドの糖鎖部分である請求項１に記載の脳神経細胞活性化剤。
【請求項３】
脳神経細胞活性化が、脳神経細胞の樹状突起の伸長及び／又は分岐を生じるものである請求項１又は２に記載の脳神経細胞活性化剤。
【請求項４】
樹状突起の伸長及び／又は分岐が、プロテインキナーゼＡの活性化に基づくものである請求項３に記載の脳神経細胞活性化剤。
【請求項５】
脳神経細胞活性化剤が、脳神経障害治療剤である請求項１〜４のいずれかに記載の脳神経細胞活性化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な脳神経細胞活性化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞表面糖鎖は、細胞内の情報伝達系を活性化し、細胞間情報伝達を介在すると考えられている（非特許文献１参照）。糖脂質であるGM2ガングリオシド（以下、これを「GM2」と略称することがある）も、そのような生物学的活性を有する細胞表面糖鎖のひとつである。GM2は、種々の動物において正常な樹状突起伸展部位に特徴的に発現されるとともに、GM2が病的に蓄積する疾患であるGM2ガングリオシドーシス等において病的な樹状突起成長と関連しているとの報告がなされている（非特許文献２、３参照）。このような多数の報告から、GM2は、正常あるいは病的な樹状突起成長に関与していると考えられる。
【０００３】
しかしながら、このGM2がどのように樹状突起成長を来すかという分子機構は不明であった。そこで、この機構におけるGM2の機能や樹状突起伸長のメカニズムの解明が強く求められていた。もしこの機構が解明され、樹状突起の伸展を制御すること等が可能になれば、神経疾患、神経障害等の治療に有益な情報を与えると強く期待されていた。
一方、GM2と同じ糖脂質であるGM1ガングリオシド（以下、これを「GM1」と略称することがある）については、脳障害モデルやパーキンソン病モデルへの投与実験が多数報告されている（非特許文献４参照）。例えば、機械的に大脳灰白質に損傷を与えたモデルや、人工的に虚血性障害を起こしたモデルにGM1を投与すると、神経細胞の萎縮軽減や、神経伝達物質量の改善等が観察されることが報告されている。また、パーキンソン病モデルにGM1を投与すると、線条体ドーパミン量の回復等が観察されることが報告されている。しかし、これらの報告においても、神経細胞等におけるGM1の機能やそのメカニズムは未だ解明されておらず、また、これらの機能が前記GM2の機能やそのメカニズムと同一であるかどうかについても不明であった。
【０００４】
本発明者らは、先に、GM2の機能を解明するために、培養神経細胞にGM2を添加する実験を行っている。そしてその結果、数分以内というごく短時間のうちに糸状突起が形成されることを報告している（非特許文献５参照）。しかし、一般に、糸状突起が形成されたからと言ってそれに引き続いて樹状突起の形成が起こるとは言えず、GM2による樹状突起伸長のメカニズムの解明には到らなかった。
【０００５】
そこで、本発明者らは、さらに、培養神経細胞にN-アセチルガラクトサミン（以下、これを「GalNAc」と略称することがある）が10個連結された合成糖鎖GalNAc10（以下同様に、糖鎖の連結数を下付き数字で表す）を培養神経細胞に添加する実験を行った。そしてその結果、2〜数日のうちに樹状突起の伸長が観察されたことを報告した（非特許文献６参照）。しかし、この合成糖鎖による樹状突起伸長のメカニズムの解明は不十分であった。また、GM2以外の糖脂質や他の糖化合物、特に、ヒト生体内にもともと存在するような糖化合物を用いてこれらの効果が得られるか否か等の検討もなされておらず、さらに詳細な解析が望まれていた。
【非特許文献１】Hakomori and Igarashi, J.Biochem., 118, 1091-1103 (1995)
【非特許文献２】Purpura and Suzuki, Brain Res., 116, 1-21 (1976)
【非特許文献３】Goodman and Walkley, Dev.Brain Res., 93, 162-171 (1996)
【非特許文献４】安藤進著、「脳機能とガングリオシド−新たに登場したニューロンの活性物質」、共同出版株式会社刊、142-155ページ（1997）
【非特許文献５】東秀好ら、第21回日本糖質学会年会要旨集、73ページ（2000）
【非特許文献６】東秀好ら、第22回日本糖質学会年会要旨集、10ページ（2001）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、新規で副作用の少ない脳神経細胞活性化剤を提供するためになされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を達成するために鋭意検討を進めた結果、哺乳動物生体内に存在し、非還元末端に遊離状態にあるGalNAcを有する糖化合物を用いれば、神経細胞に樹状突起の伸長及び／又は分岐を促すことができることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
すなわち本発明によれば、
（１）哺乳動物生体内に存在し、非還元末端に遊離状態にあるGalNAcを有する糖化合物を有効成分として含む、脳神経細胞活性化剤、
（２）糖化合物が、GM2ガングリオシド又はアシアロGM2ガングリオシドの糖鎖部分である上記（１）に記載の脳神経細胞活性化剤、
（３）脳神経細胞活性化が、脳神経細胞の樹状突起の伸長及び／又は分岐を生じるものである上記（１）又は（２）に記載の脳神経細胞活性化剤、
（４）樹状突起の伸長及び／又は分岐が、プロテインキナーゼＡの活性化に基づくものである上記（３）に記載の脳神経細胞活性化剤、及び、
（５）脳神経細胞活性化剤が、脳神経障害治療剤である上記（１）〜（４）のいずれかに記載の脳神経細胞活性化剤
が提供される。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、新規で副作用の少ない脳神経細胞活性化剤が提供される。該脳神経細胞活性化剤は、ヒト等の哺乳動物において脳神経障害等の治療に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を更に詳細に説明する。
なお、本明細書において、いくつかの糖化合物について略称することがあるが、それらの化学構造式は、次のとおりである。また、本明細書において、「Gal」はガラクトース、「Glc」はグルコース、「Man」はマンノース、「Fru」はフルクトース、「GalNAc」はN-アセチルガラクトサミン、「GlcNAc」はN-アセチルグルコサミン、「Neu5Ac」はシアル酸（5-アセチルノイラミン酸）をそれぞれ示す。これらの糖が化合物中に組み込まれて存在する場合には、それらの糖の残基を示す。また、「Cer」はセラミドを示す。
略称            化学構造式
(1) GalNAcn   (GalNAc(α1-4))n-1GalNAc  （ｎは１〜100の整数である）
(2) Gb4       GalNAc(β1-3)Gal(α1-4)Gal(β1-4)GlcCer
(3) Gb5       GalNAc(α1-3)GalNAc(β1-3)Gal(α1-4)Gal(β1-4)GlcCer
(4) GD1a      Neu5Ac(α2-3)Gal(β1-3)GalNAc(β1-4) (Neu5Ac(α2-3))Gal(β1-4)GlcCer
(5) GD1b      Gal(β1-3)GalNAc(β1-4) (Neu5Ac(α2-8)Neu5Ac(α2-3))Gal(β1-4)GlcCer
(6) GD2       GalNAc(β1-4) (Neu5Ac(α2-8)Neu5Ac(α2-3))Gal(β1-4)GlcCer
(7) GD3       Neu5Ac(α2-8)Neu5Ac(α2-3)Gal(β1-4)GlcCer
(8) Gg3       GalNAc(β1-4)Gal(β1-4)GlcCer
(9) GM1       Gal(β1-3)GalNAc(β1-4) (Neu5Ac(α2-3))Gal(β1-4)GlcCer
(10) GM2      GalNAc(β1-4) (Neu5Ac(α2-3))Gal(β1-4)GlcCer
(11) GM3      Neu5Ac(α2-3)Gal(β1-4)GlcCer
(12) GQ1b     Neu5Ac(α2-8)Neu5Ac(α2-3)Gal(β1-3)GalNAc(β1-4) (Neu5Ac(α2-8)Neu5Ac(α2-3))Gal(β1-4)GlcCer
(13) GT1b     Neu5Ac(α2-3)Gal(β1-3)GalNAc(β1-4) (Neu5Ac(α2-8)Neu5Ac(α2-3))Gal(β1-4)GlcCer
【００１０】
１．本発明の脳神経細胞活性化剤に有効成分として含まれる糖化合物
本発明の脳神経細胞活性化剤は、哺乳動物生体内に存在し、非還元末端に遊離状態にあるGalNAc（N-アセチルガラクトサミン）を有する糖化合物を有効成分として含むことを特徴としている。
哺乳動物とは、例えば、ヒト、サル、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス等が挙げられるが、特に好ましくはヒトである。本発明の脳神経細胞活性化剤は、このような哺乳動物生体内に存在し得る糖化合物を有効成分として用いることにより、該薬剤がヒト又は他の哺乳動物に用いられた際の副作用が小さい等の優れた効果を有している。
糖化合物としては、例えば、糖鎖、糖脂質、糖アミノ酸、糖蛋白質、糖ヌクレオチド、プロテオグリカン等が挙げられる。本発明においては、これらのうち、哺乳動物生体内に存在し、かつ、非還元末端に遊離状態にあるGalNAcを有するものが用いられる。
【００１１】
ここで、GalNAcが「遊離状態にある」とは、種々の障害等なく生体反応にあずかることができ、生理活性を有する状態にあることを意味する。具体的には、例えば、GalNAcが化学的又は物理的な修飾等を受けていない状態、立体的に障害を受けていない状態等を意味するが、生理活性を有するものであれば修飾や立体的な影響を受けていてもよい。より具体的には、GalNAcの2位のアセチルアミノ（-NHAc）基、3、4、6位の水酸（-OH）基が遊離状態にあることが好ましい。
【００１２】
ここで、生理活性を有する状態とは、生体に何らかの反応を生じさせる活性であって、例えば、受容体との反応活性等を有する状態を意味する。受容体との反応活性を有する程度に遊離の状態とは、例えば、非還元末端のGalNAcが水溶性を損なわれるような修飾等を受けておらず、また、受容体との結合にあずかれる程度に空間的に自由な状態等を意味する。例えば、非還元末端のGalNAcに硫酸基等の小さな官能基が結合していても、GalNAcの水溶性が維持され、立体的にも大きな障害とならず、生理活性が損なわれない場合には、これを用いることができる。しかし、例えば、非還元末端のGalNAcにGal（ガラクトース）等の糖やその他の大きな官能基等が結合した場合には、GalNAcの水溶性が低下したり、立体的に大きな障害となって、GalNAcの反応性を低下させ、生理活性が損なわれることがある。このような糖化合物は、本発明の糖化合物として用いることができない。
【００１３】
前記したような立体的な障害は、GalNAcの還元末端に結合した分子（糖、アミノ酸、脂質、ヌクレオチド等）に大きな分子量を有する分子が側鎖として結合している場合や、電荷を有する分子が結合している場合等にも生じ得る。大きな分子量を有する分子とは、例えば、分子量500以上の分子等が挙げられる。2以上の分子が結合している場合には、その総分子量で判断することができるが、一般に1分子の場合よりも結合距離が長く、分子の自由度が高くなるため、立体障害を生じやすくなる傾向がある。電荷を有する分子としては、例えば、糖としては、シアル酸、ウロン酸、硫酸化糖等が挙げられる。
【００１４】
このような性質を有する、本発明の脳神経細胞活性化剤に含まれる糖化合物は、脳神経細胞を活性化し、樹状突起の伸長及び／又は分岐を促進する。この作用は、該糖化合物の有する非還元末端の遊離状態にあるGalNAcにより、カルシウム非依存性アデニレートサイクラーゼが活性化され、続いて細胞内プロテインキナーゼA（以下、これを「PKA」と称することがある）が活性化されることに基づいている。細胞内PKAは、さらに低分子量でGTPaseであるcdc42を活性化し、このcdc42が糸状突起の形成を促進し、続いて樹状突起の伸長及び／又は分岐を促進する。本発明において用いられる糖化合物は、すなわち、哺乳動物の生体内に存在する糖化合物のうち、このようなシグナルカスケードを活性化する能力を有する糖化合物である。
【００１５】
従って、本発明の脳神経細胞活性化剤に用いるために、上記のような特徴を有するとして選択されたある糖化合物について、以下に示すような手法により本発明の糖化合物として用い得るかどうかをより確実に確認することができる。その方法としては、例えば、培養神経細胞を用いて、これに対象とする糖化合物を添加して培養し、該培養神経細胞の反応や変化を解析することにより該糖化合物の生理活性を確認する方法等が挙げられる。より具体的には、例えば、PKAの活性化、糸状突起や樹状突起の伸長及び／又は分岐、cdc42のGTP化等を指標にする方法が挙げられる。
【００１６】
例えば、PKAの活性化を指標として用いる場合には、培養液中に糖化合物を添加することにより培養神経細胞を処理し、糖化合物による刺激を受けた細胞の変化を解析する。ここで用いられる培養神経細胞としては、例えば、初代培養神経細胞、神経芽細胞腫（neuroblastoma）と神経膠腫（glioma）のハイブリドーマ、神経芽細胞腫等が挙げられる。初代培養神経細胞としては、例えば、海馬、小脳、大脳皮質等の初代培養神経細胞等が挙げられる。神経芽細胞腫と神経膠腫のハイブリドーマとしては、例えば、マウス神経芽細胞腫N18TG2とラット神経膠腫C6-BU-1のハイブリドーマであるNG108-15細胞（Hamprecht B. et al., Methods Enzymol., 109, 316-341(1985)；Amano T. et al., Exp.Cell Res., 85, 399-408(1974)）等が挙げられる。解析方法としては、例えば、直接的にPKAを解析する方法として、イメージング法（Higashi et al., FEBS Lett., 414, 55-60 (1997)）等が挙げられ、間接的に解析する方法としては、例えば、cAMPを測定する方法等が挙げられる。cAMP測定法としては、イメージング法、酵素免疫測定法、放射免疫測定法等が挙げられ、いずれも市販のキット（例えば、酵素免疫測定法の場合、The Biotrak cAMP EIA System（アマシャム社製））等を用いて行うことができる。これらの中でも、PKAを直接イメージング法により解析する方法が好ましく用いられる。解析の結果、PKAの活性化が観察された場合に、該糖化合物が本発明の糖化合物として用い得ることを確認することができる。
【００１７】
また、糸状突起や樹状突起の伸長及び／又は分岐を指標として確認する場合には、上記したPKAの活性化を指標として用いる場合と同様に、培養神経細胞を対象とする糖化合物で刺激し、その結果生じる突起の伸長及び／又は分岐を観察すればよい。一般に、糸状突起の伸長は刺激後ごく短時間で生じるが、さらに培養を行い、樹状突起の伸長及び／又は分岐を観察することが好ましい。また、樹状突起は伸長が観察されればよいが、伸長及び分岐の両方が観察されることが特に好ましい。ここで用いられる培養神経細胞としては、例えば、前記PKAの解析を行う場合と同様に、初代培養神経細胞、神経芽細胞腫（neuroblastoma）と神経膠腫（glioma）のハイブリドーマ、神経芽細胞腫等が挙げられるが、樹状突起の伸長及び／又は分岐の観察を行う場合には、特に初代培養神経細胞が好ましく用いられる。糸状突起の観察は、例えば、蛍光標識ファロイジンによる染色法等により行うことができる。ファロイジン染色法はアクチン重合体を染色するのに好適な手法であり、標識として用いる蛍光物質は、ローダミン、フルオレセイン、オレゴングリーン等から目的に適ったものを選択すればよい。樹状突起の観察は、好ましくは3日間以上、より好ましくは5日間以上の培養後に行われる。観察は、アクチン重合体を染色する蛍光標識ファロイジン、神経細胞を特異的に染色する抗MAP2抗体等による免疫染色法等により行うことができる。小脳プルキンエ細胞の場合には、抗カルビンジン抗体等による免疫染色法等の方法も用いることができる。用いた培養神経細胞に応じて、これらの手法の中から適宜選択すればよい。
【００１８】
さらに、PKAにより活性化されるcdc42のGTP（guanosine 5'-triphosphate）化を指標とすることもできる。細胞内で活性を有する状態のcdc42はGTPと結合している（GTP結合型）ことから、細胞内cdc42がGTPと結合しているか否かを解析することにより活性化されているか否かを判定することができる。好ましくは、対象とする糖化合物を添加した細胞と、添加していない細胞との両方についてGTP結合型cdc42量を解析し、結果を比較する。cdc42のGTP化は、例えば、市販のキット（cdc42 Activation Assay Kit：Upstate Biotechnology社製）等により解析することができる。
【００１９】
以下に、かくして選択される糖化合物について、さらに具体的に詳述する。
本発明の脳神経細胞活性化剤に含まれる糖化合物として用いられる糖鎖としては、例えば、糖が2個以上結合したものが挙げられるが、好ましくは3個以上である。上限は、糖鎖が水溶性を有する限りいかなる長さでもよいが、好ましくは100個以下、より好ましくは50個以下、特に好ましくは10個以下である。また、水溶性を有し、かつ前記立体障害を生じない限り、構造に分岐を有していてもよいし、構成糖に修飾等があってもよい。
【００２０】
生体内に含まれる糖としては、例えば、ガラクトース（Gal）、グルコース（Glc）、マンノース（Man）、フルクトース（Fru）、N-アセチルガラクトサミン（GalNAc）、N-アセチルグルコサミン（GlcNAc）、シアル酸（Neu5Ac）等が挙げられる。本発明において用いられる糖鎖は、哺乳動物生体内に存在し、非還元末端に遊離状態にあるGalNAcを有するものであれば、これらの糖がいかなる順序で連結されたものでもよい。
【００２１】
具体的には、例えば、非還元末端のGalNAcの次（還元末端側）には、Gal、GalNAc、GlcNAc、又はManが連結されたものが好ましく、その中でもGal又はGalNAcが連結されたものがより好ましい。ここで、例えば、2番目の糖としてGalが結合した場合には、3番目の糖としてはGlc又はGlcNAcが好ましい。2番目のGalには、側鎖としてシアル酸が結合されていてもよいが、シアル酸が2分子になると前記したような立体障害を生じやすい。また、例えば、2番目の糖としてGalNAcが結合した場合には、3番目の糖としてはGal又はGalNAcが好ましい。
【００２２】
このような糖鎖の具体例として、例えば、GM2ガングリオシド（以下、これを「GM2」と略称することがある）の糖鎖部分、又は、アシアロGM2ガングリオシド（以下、これを「アシアロGM2」又は「Gg3」と略称することがある）の糖鎖部分が好ましく用いられる。なお、ここで「アシアロGM2ガングリオシド」とは、GM2ガングリオシドからシアル酸が脱離したものを意味する。
【００２３】
本発明の脳神経細胞活性化剤に含まれる糖化合物として用いられる糖脂質としては、哺乳動物生体内に存在する糖脂質であって、非還元末端に遊離状態にあるGalNAcを有するものであればいかなるものでも用い得る。糖脂質とは、分子内に糖と脂質とを有する両親媒性物質であって、これに含まれる糖又は糖鎖としては、例えば、前記したようなもの等が挙げられる。脂質としては、セラミド、アシルグリセロール、アルキルグリセロール等が挙げられる。これらの組み合わせより成る糖脂質の中でも、本発明においては、例えば、GM2、アシアロGM2（Gg3）等が好ましく用いられる。
【００２４】
また、糖アミノ酸としては、哺乳動物生体内に存在する糖アミノ酸であって、非還元末端に遊離状態にあるGalNAcを有するものであればいかなるものでも用い得るが、例えば、セリン、スレオニン、又はアスパラギン等にo-グリコシド結合により糖又は糖鎖が結合したものが好ましく用いられる。ここで用いられる糖又は糖鎖としては、例えば、前記したようなもの等が挙げられる。
【００２５】
糖蛋白質としては、哺乳動物生体内に存在する糖蛋白質であって、非還元末端に遊離状態にあるGalNAcを有するものであればいかなるものでも用い得るが、具体的には、例えば、構成アミノ酸として前記したような糖アミノ酸を含む任意の蛋白質又はペプチド等が挙げられる。
糖ヌクレオチドとしては、例えば、UDP-GalNAc等が挙げられる（UDP：uridine 5'-diphosphate）。
【００２６】
プロテオグリカンとしては、哺乳動物生体内に存在するものであって、非還元末端に遊離状態にあるGalNAcを有するプロテオグリカンが用いられる。プロテオグリカンとは、グリコサミノグリカンと蛋白質との共有結合化合物の総称であって、特異な繰り返し構造を有する生体高分子である。プロテオグリカンは、繰り返し構造を有するために、合成がどの状態で停止するかにより非還元末端に露出する糖の種類が異なることがある。本発明においては、例えば、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸等のプロテオグリカンのうち、非還元末端にGalNAcを有するものが好ましく用いられる。
【００２７】
このような糖化合物の中でも、本発明の脳神経細胞活性化剤に用いられる糖化合物としては、糖鎖又は糖脂質が好ましく、糖鎖が特に好ましい。糖鎖は、脂質や蛋白質等と比べて免疫原性が低い、水溶性が高いために凝集しにくい、取り扱いやすい等の利点を有しており、ヒト又は他の哺乳動物に投与されて用いられる場合に特に効果が高く副作用が小さいこと等が期待できる。また、反応部位からこれを取り除いた際に、反応が可逆的であり、その反応速度が速いことから、薬物治療において制御しやすいという利点をも有している。
【００２８】
さらに、上記したような種々の糖化合物は、神経細胞の膜付近において局所的に効果を有する。このことは、該糖化合物が、細胞内の遊離のPKAは活性化せず、膜付近に結合したPKAのみを限定的に活性化することに基づいている。本発明の脳神経細胞活性化剤の効果は、このような局所的な作用に基づいていることから、ごく低濃度で効果を発揮し、また、細胞内の他のシグナルカスケードに対する影響が小さいために副作用が小さいという利点を有する。本発明において用いられる糖化合物の有効濃度は、具体的には、例えば、GM2又はアシアロGM2の糖鎖部分を用いる場合、0.5〜200nM、好ましくは1〜100nM程度である。また、GM2の場合も同様である。
【００２９】
上記糖化合物は、いずれも、合成又は哺乳動物からの抽出・精製等の手段により取得することができる。合成方法としては、それ自体公知の通常用いられる方法の中から任意に選んで行うことができる。哺乳動物からの抽出・精製についても、それ自体公知の通常用いられる方法の中から任意に選択して行うことができるが、例えば、GM2の場合には、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ウサギ等の主に脳からガングリオシドの混合物を抽出・精製し、これをシアリダーゼ、β-ガラクトシダーゼ等で限定酵素消化することにより取得することができる。特異的なシアリダーゼを用いることにより、同様にしてアシアロGM2も取得可能である。また、例えば、GM2又はアシアロGM2の糖鎖部分は、かくして取得したGM2又はアシアロGM2を、エンドグリコセラミダーゼ等を用いて酵素消化することにより調製することができる。
【００３０】
また、これらの糖化合物は、その生理活性が維持されている限り、誘導体として調製してもよい。誘導体の調製方法としては、それ自体公知の通常用いられる方法の中から任意に選択して行うことができる。誘導化は、例えば、用いる糖化合物の安定化、水溶性の改善等を目的としたものが好ましく行われる。また、該糖化合物をヒト又は他の哺乳動物に投与した際の有効性を向上させたり、副作用を軽減させるための誘導化も好ましく行われる。例えば、経口投与、静脈注射、筋肉注射、腹腔投与等の方法により投与された該糖化合物が血中に取り込まれた後、血液−脳関門を通過して患部に到達し得るための誘導化等が挙げられる。このような誘導化の具体例としては、例えば、エステル化、アルキル化等が挙げられる。
【００３１】
２．本発明の脳神経細胞活性化剤の利用
かくして調製される糖化合物を含む本発明の脳神経細胞活性化剤は、これをヒト又は他の哺乳動物に投与したときに、該ヒト又は他の哺乳動物の脳において脳神経細胞を活性化し、樹状突起の伸長及び／又は分岐を促進するという顕著な効果を有する。その結果、神経細胞の分化、成熟を促進させることができる。
【００３２】
すなわち、本発明の脳神経細胞活性化剤は、脳神経障害治療剤として用いることができる。脳神経障害としては、例えば、事故等による損傷、脳梗塞、脳血管性痴呆等による虚血性損傷等が挙げられるが、その他に、脳神経細胞の変性をきたすような種々の疾患にも用い得る。そのような疾患の例としては、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、癲癇、鬱病、統合失調症等が挙げられる。本明細書において脳神経障害という場合には、このような神経細胞変性をも含む。
【００３３】
本発明の脳神経細胞活性化剤を脳神経障害治療剤として用いる場合には、例えば、比較的低容量を長期にわたって投与する方法等が好ましく用いられる。このような手法を用いることにより、着実に樹状突起の伸長及び／又は分岐を促し、神経ネットワークの再構成を促して、脳神経障害を改善させることが期待される。上記した各種の糖化合物のうち、ごく低濃度で高い効果を発揮し、副作用が小さく、また反応が可逆的であるものを選択すれば、このような長期投与に特に好適である。
【００３４】
３．本発明の脳神経細胞活性化剤の調製方法
上記１に詳述したような糖化合物を有効成分として含む本発明の脳神経細胞活性化剤は、それ自体公知の通常用いられる方法により調製することができる。
本発明の脳神経細胞活性化剤に含まれる糖化合物は、生理学的に許容されるそれらの塩、水和物並びに溶媒和物等であってもよい。該糖化合物の塩としては、例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などの薬学的に許容し得る塩などがあげられる。無機塩基との塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、ならびにアルミニウム塩、アンモニウム塩などがあげられる。有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、2,6-ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、N,N'-ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩あげられる。無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などとの塩があげられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸などとの塩があげられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルチニンなどとの塩があげられ、酸性アミノ酸との好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩があげられる。
【００３５】
該糖化合物は、それ自体単独で脳神経障害等の患者に投与することもできるが、これらの有効成分の１種又は２種以上を含むこともできる。また、薬理学的に許容される製剤用添加物等を用いて医薬品組成物として調製し、これを投与するのが好ましい。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、丸剤、マイクロカプセル剤、リポソーム製剤、トローチ、舌下剤、液剤、エリキシル剤、乳剤、懸濁剤等として経口的に、あるいは無菌の水性液もしくは油性液として製造した注射剤や、座剤、軟膏、貼付剤等として非経口的に使用できる。これらは例えば、該化合物を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和し、充填又は打錠等の当業界で周知の方法を用いて製造することができる。これらの医薬品組成物における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
【００３６】
例えば、錠剤、カプセル剤等に混和することができる添加剤としては、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴム等の結合剤、結晶性セルロース等の賦形剤、セルロース、マンニトール、又はラクトース等の充填剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸等の膨化剤、澱粉、ポリビニルポリピロリドン、澱粉誘導体、又はナトリウム澱粉グリコラート等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、ラウリル硫酸ナトリウム等の湿潤剤、ショ糖、乳糖又はサッカリン等の甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリー等の香味剤等が用いられる。また、錠剤は必要に応じて腸溶性コーティング剤等を用いてコーティングを施すこともできる。カプセルについては、前記の添加剤にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。
【００３７】
また例えば、注射剤として用いる無菌医薬品組成物は、注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油等の天然産出植物油等を溶解又は懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（D-ソルビトール、D-マンニトール、塩化ナトリウム等）等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート80TM、HCO-50等）等と併用することができる。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等と併用することができる。また、上記の医薬品組成物には、例えば、緩衝剤（リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等）、無痛化剤（塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン等）、安定剤（ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール等）、保存剤（ベンジルアルコール、フェノール等）、及び酸化防止剤等を配合してもよい。かくして調製される注射用の水性液は、通常、該化合物を上記のような媒体に溶解させて濾過滅菌してから、適当な滅菌済みバイアル又はアンプルに充填して製造される。安定性を高めるために、該医薬品組成物を凍結させた後にバイアル中の水を真空下で除去してもよい。油性液についても水性液の場合と実質的に同様に製造できるが、該化合物を上記媒体に懸濁させた後にエチレンオキシド等により滅菌することによって好適に製造できる。
【００３８】
かくして得られる医薬品組成物は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや、ヒト以外の哺乳動物に対して脳神経障害等の予防又は治療薬として投与することができる。該組成物に含まれる前記化合物の投与量は、対象疾患、症状、対象臓器、投与対象、投与方法等により差異はあるが、例えば、脳神経障害治療の目的で該化合物を経口投与する場合は、一般的に成人（体重60kgとして）においては、一日につき約0.01〜10mg、好ましくは約0.1〜5mg、より好ましくは約0.1〜2mgである。また、非経口的に投与する場合、例えば、注射剤の形で通常成人（60kgとして）に投与する場合は、一日につき約0.01〜3mg程度、好ましくは約0.01〜2mg程度、より好ましくは約0.01〜1mg程度を静脈注射により投与するのが好ましい。  また、一日の投与量を一〜数回に分けて投与するのが望ましい。他の動物の場合も、60kg当たりに換算した量を同様に投与することができる。
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３９】
培養細胞にある種の糖化合物を添加した場合に引き起こされる現象を解明するために、まず、細胞内PKAの変化を解析した。
（１）培養細胞
培養細胞の調製は次のとおり行った。
ラット海馬初代培養神経細胞は、Kudo and Ogura, Br.J.Pharmacol., 89, 191-198 (1986)の記載に従って培養し、調製した。マウス神経芽細胞腫N18TG2とラット神経膠腫C6-BU-1のハイブリドーマであるNG108-15細胞は、Higashi et al., FEBS Lett., 414, 55-60 (1997)に記載の方法に従って培養し、調製した。
【００４０】
（２）糖化合物
糖化合物の調製は、次のとおり行った。
ｉ）糖及び糖質
GM2は、ヤトロン社製 (GSL-102A, >99 % pure)、または、シグマ社製(G8397, approx. 95% pure)のものを購入して用いた。アシアロGM2（Gg3）は、理化学研究所の平林義雄博士から供与された。その他の糖脂質（GM1、GD1a、GD1b、GT1b）は、既報と同様に入手、調製した(Higashi et al., FEBS Lett., 414, 55-60 (1997)、Higashi et al., Biochem.Biophys.Acta, 963, 333-339 (1988))。
【００４１】
GM2の糖鎖部分は、エンドグリコセラミダーゼを用いて調製した (Higashi et al., Anal.Biochem., 186, 355-362 (1990))。GalNAc(α1-4) oligomers (GalNAc(α1-4)GalNAc、GalNAc5、又はGalNAc10)は、カビpaecilomyces sp.I-1の産生多糖より調製されたものをフナコシより購入した（ヒゲタ醤油社製：Takagi H. et al., Agric.Biol.Chem., 49, 3159-3164(1985)）。GlcNAcがβ1-4結合で5個連結したGlcNAc(β1-4) pentamer(GlcNAc5）は、和光純薬より購入した。
【００４２】
Gb5（フォルスマン抗原）は、ヒツジ赤血球を用いて、Naiki M. et al., Jpn.J.Exp.Med., 42, 205-19(1972)に記載の方法に従って調製した。Gb4は、ヒト赤血球を用いて、Gb5と同様にして調製した。GD2は、ウシ脳から、Hirabayashi Y. et al., J.Chromatogr., 445, 377-84(1988)に記載の方法に従って調製した。
なお、糖脂質はセラミド部が不均一であるため、それぞれ濃度のnM表示は概数である。
【００４３】
ｉｉ）ネオ糖蛋白質
オリゴ糖含有ネオ糖蛋白質として、約200分子のGalNAc5を有する多価のネオ糖蛋白質、Maltopentaose又はisomaltopentaoseで作製したネオ糖蛋白質、シアリルネオラクトテトラオースで合成したネオ糖蛋白質を用いた。Maltopentaoseとisomaltopentaoseは、生化学工業製を用いた。シアリルネオラクトテトラオースはSigma社製のもの(A4814)を用いた。これらは、既報に従って調製した(Hashimoto et al., J.Biochem., 123, 468-478 (1998))。
【００４４】
（３）その他の試薬
DRIIは、（株）同仁化学研究所製のものを用いた。
P32-Bは、DAPP32のPKAリン酸化部位のペプチド（配列番号：１）を合成し、これをBODIPY FL C1-IA（Molecular Probes社製）で蛍光標識して調製した（特開2001-19700号公報）。
【００４５】
（４）PKA活性の解析方法
PKA活性の解析は、Higashi et al., FEBS Lett., 414, 55-60 (1997)に詳述されているイメージング法を用いて行った。上記（１）で調製したNG108-15細胞とラット海馬初代培養神経細胞に、上記（２）で調製した各種の糖化合物を添加して、PKA活性の変化を調べた。
イメージング法は、DRII及びP32-Bの2種の蛍光ペプチド基質を用いて行った。これらはいずれもそのアミノ酸配列中にPKA特異的なリン酸化部位を有するペプチドである。DRIIは、PKAの調節ドメイン内の一部の配列（RII）を改変して脂溶性を高めたペプチド（配列番号：２）に、DACM（dimethylaminocoumarin maleimide）を結合させた蛍光ペプチド基質である。P32-Bは、PKAでリン酸化される公知の蛋白質DAPP32のPKAリン酸化部位の配列を有する蛍光ペプチド基質である。
【００４６】
上記（１）で調製した各種の糖化合物は、1000倍濃度の水溶液の原液から調製して用いた。各糖化合物の添加濃度は、GM2は72nM、GM2の糖鎖部分は24nM、Gg3は9nM、GM1は65nM、GD1aは54nM、GD1bは54nM、GT1bは47nM、Gb5は6.5nM、GalNAc10は49nM、GalNAc5は97nMとした。Maltopentaose又はisomaltopentaoseで作製したネオ糖蛋白質は200pM、GalNAc5で作製したネオ糖蛋白質は20又は200pM、シアリルネオラクトテトラオースで作製したネオ糖蛋白質は200pMとした。Gb4は75nM、GD2は60nM、GalNAc(α1-4)GalNAcは240nM、GlcNAc5は97nMとした。
【００４７】
まず、各細胞を、25μg/mlのDRIIまたは6μg/mlのP32-Bを含む等張緩衝液(BSS：pH 7.3, 130mM NaCl, 5.4mM KCl, 20mM HEPES, 5.5mM glucose, 0.8mM MgSO4, 1.8mM CaCl2）中で、25℃、30分間保持して、基質を取り込ませた。その細胞を、30℃のBSS(1.4ml/minで循環)中で安定化した後、糖化合物をそれぞれBSSに加えて各細胞を刺激した。細胞の蛍光は、DRIIは400nm、P32-Bは480nmで励起し、画像解析（Argus100又は50：浜松ホトニクス社製）した。2分間の刺激後、糖化合物を含まないBSSに戻した。計測用のシャーレの液量は1mlに保持した。
【００４８】
さらに、細胞に取り込まれた基質がリン酸化されているか否かを確認するために、各細胞の50%酢酸抽出物を調製し、これをHPLCによって分析した(Higashi et al., FEBS Lett., 414, 55-60 (1997))。各細胞の50%酢酸抽出物は、細胞外液を除去した後、0.4mlの50%酢酸を加え、抽出物中の不溶物を遠心分離し、沈殿を除去した。これを100μl分取してそれぞれHPLCに供した。分析の結果得られたピークを、糖化合物を加えた細胞と加えていない細胞との間で比較し、ピークにリン酸化特異的なシフト（移動）が見られた場合に、細胞に取り込まれた蛍光ペプチド基質がリン酸化されたと判断した。
【００４９】
（５）解析結果
まず、PKA特異的なリン酸化部位を持つ2種類の異なる蛍光ペプチド基質を用いた解析の結果、各種の糖化合物による刺激によっていずれを用いても同じ結果が観察されたことから、活性化されたキナーゼがPKAであることが確認された。また、HPLCによる分析によって、いずれの基質においても細胞内に取り込まれたペプチドはリン酸化されていることが確認された。さらに、NG108-15細胞とラット海馬初代培養神経細胞との間に、各種の糖化合物に対する反応の差はないことがわかった。PKAの活性化はいずれも細胞膜近傍で起こっており、糖化合物の添加から数秒以内でPKAの活性化が確認され、糖鎖を除去することにより元のレベルに戻った。
【００５０】
添加実験に用いた各種の糖化合物の中には、細胞内PKAを活性化するものと、活性化しないものがあることがわかった。まず、β-GalNAcを非還元末端に有するGM2、GM2の糖鎖部分、アシアロGM2（Gg3）は、いずれも顕著にPKAを活性化した。これらは、7-70nMという非常に低い濃度でも効果を示した。一方、非還元末端にGalNAcを有していないGM1、GD1a、GD1b、GT1bのガングリオシドは、PKAを活性化する効果がなかった。これらのことから、非還元末端にGalNAcを有する糖化合物が顕著な効果を有することが確認された。また、GM1にPKAを活性化する効果が見られなかったことから、非還元末端のGalNAcの3位の-OH基がGalにより置換されると、活性が阻害されることがわかった。
【００５１】
さらに、α-GalNAcを非還元末端に有するGb5や、GalNAcがα1-4結合で10個又は5個連結された合成糖鎖であるGalNAcα1-4デカマー(GalNAc10)及びGalNAcα1-4ペンタマー（GalNAc5）も、前記GM2等と同じレベルの濃度でPKAを活性化した。これらのことから、非還元末端にGalNAcを有してさえいれば、α又はβの構造の違いは区別されないことが確認された。
【００５２】
一方、Gb4や、GD2では、非還元末端にGalNAcを有しているにも関わらず、PKAを活性化する効果が見られなかった。これらの糖鎖では、GalNAcが非還元末端に存在してはいても、近傍の糖によって空間的に隠ぺいされ、反応が阻害されていると考えられる。すなわち、Gb4では、GalNAcがβ1-3結合によりGalに結合しているため、Galによる立体障害を受けやすくなり、非還元末端のGalNAcが自由に反応にあずかれない状態にあると考えられる。また、GD2の場合には、GalNAcが結合しているGalにシアル酸が2分子連続して結合しており、これらの大きさ及び電荷の影響により障害を受けているため、同様の阻害が生じていると考えられる。これらのことから、非還元末端にGalNAcを有していても、それが遊離の状態になければ効果を得られないことがわかる。
【００５３】
また、2糖から成るGalNAc(α1-4)GalNAcも、PKAを活性化する効果を有していなかった。このような2糖から成る糖化合物では効果が見られず、GM2又はアシアロGM2の糖鎖部分のように3又は4糖から成る糖化合物で顕著な効果が見られたことから、PKAを活性化するためには、糖鎖の場合、3糖以上であることが好ましいことがわかった。
約200分子のGalNAc5を有する多価のネオ糖蛋白質も、PKAを活性化した。その一方で、Glcのペンタマーであるmaltopentaoseやisomaltopentaoseで作製したネオ糖蛋白質、シアリルネオラクトテトラオースで合成したネオ糖蛋白質、GlcNAcがβ1-4結合で5個連結したGlcNAcβ1-4ペンタマー (GlcNAc5)は、PKAを活性化しなかった。以上の結果から、糖蛋白質の場合でも、非還元末端にGalNAcを有するものだけがPKAを活性化しうることが示された。
【００５４】
以上のことから、非還元末端に遊離状態のGalNAcを有する糖化合物が、効果的にPKAを活性化することが示された。特に、GM2の糖鎖部分がGM2と同様の効果を示したことから、従来重要視されてきた脂質部分は本反応には不要であることがわかり、糖が関与するシグナルカスケードの重要性が確認された。
【実施例２】
【００５５】
上記実施例１において、ある種の糖化合物によって細胞内PKAが活性化されることが確認されたことから、次に、このPKAをメンバーとするシグナルカスケードを解析するため、阻害剤を用いた実験を行った。
（１）阻害剤を用いた実験
まず、活性化されたのがPKAであることをより確かにするため、PKA選択的な阻害剤を用いた実験を行った。実験は、上記実施例１と同様にして、培養細胞系を用いた添加実験とし、イメージング法により解析した。糖化合物としては上記実施例１でPKAを活性化する効果が確認された72nM GM2及び49nM GalNAc10を用い、阻害剤としては、2つの異なるPKA特異的阻害剤であるH-89（1μM：生化学工業社製）及びRpcAMPS（100μM：Research Biochemicals International社製）を用いた。
【００５６】
次に、同様にして、アデニレートサイクラーゼの阻害剤であるMDL-12,330A （1mM：Calbiochem社製）を用いた添加実験を行った。
また、さらに、細胞外液からカルシウムを除いて同様のイメージング法によるPKAの解析を行った。すなわち、細胞外液として用いるBSS中にカルシウムを添加しないこと以外は、すべて上記実施例１と同様にして解析を行った。
【００５７】
なお、GalNAc10は哺乳動物生体内には存在しない合成糖鎖であるが、上記実施例１において本発明において用いられる他の糖化合物と同様の効果が確認されたので、簡便のため細胞実験に用いた。
【００５８】
（２）結果
実験の結果、GM2及びGalNAc10によるPKAの活性化は、2種のPKA阻害剤によって阻害され、GM2及びGalNAc10が確かにPKAを活性化していることが示された。
【００５９】
また、アデニレートサイクラーゼの阻害剤であるMDL-12,330A によってもPKAの活性化が阻害された。このことから、アデニレートサイクラーゼが活性化されてcAMPの濃度が上昇し、これによりcAMP依存性のPKAが活性化されていることが示唆された。このことは、cAMPの誘導体であるRpcAMPSが前記のとおりPKAの活性化を阻害していることからも、確認できる。すなわち、PKAは、このシグナルカスケードにおいてアデニレートサイクラーゼの下流に位置することが確認された。
【００６０】
また、さらに、前記糖化合物によってPKAの活性化を生じた神経細胞において、細胞内カルシウムイオン濃度には変化がなく、かつ、細胞外液からカルシウムイオンを除いても反応は阻害されないことがわかった。すなわち、細胞の内外において、PKAの活性化に伴うカルシウムの動きは見られなかった。アデニレートサイクラーゼには、カルシウム非依存性に機能するG蛋白質依存性アデニレートサイクラーゼ、カルシウム依存性に機能するCaM依存性アデニレートサイクラーゼ等のサブタイプがあるが、この結果から、上記シグナルカスケードでは、カルシウムイオンに非依存性のアデニレートサイクラーゼが関与していることが示された。
【実施例３】
【００６１】
上記実施例１及び２において、非還元末端に遊離状態のGalNAcを有する糖化合物がアデニレートサイクラーゼ及び細胞内PKAを活性化することが確認された。次に、このPKA活性化のシグナルカスケードが、アクチン重合や、神経細胞の糸状突起の伸長に関係しているかどうかについて検討した。
（１）神経細胞におけるアクチン重合体の検出
細胞骨格に存在するアクチンの形態変化を解析するために、NG108-15細胞を用いてファロイジン染色法を行い、糸状突起の伸長について解析した。また、検出される変化が神経細胞でのみ生じる現象であるか否かを確認するために、海馬初代培養神経細胞を用いてファロイジンと抗MAP2抗体による二重染色を行った。さらに、NG108-15細胞の親細胞のひとつであるC6グリオーマ（神経膠腫C6-BU-1：Amano T. et al., Exp.Cell Res., 85, 399-408(1974)；Hamprecht B. et al., Methods Enzymol., 109, 316-341(1985)）を用いて、同様にファロイジン染色によるアクチン重合体の検出を行った。
【００６２】
上記実施例１と同様にして調製したNG108-15細胞及び培養1、2、3、6日目の海馬初代培養神経細胞を、BSSで3回洗浄後、37℃に加温した糖化合物を含むBSSを加えて2分間刺激した。糖化合物としては、GM2、GM2の糖鎖部分、及び、GalNAc(α1-4)オリゴマー（GalNAc5又は GalNAc10）、GM1、GM3、GlcNAc5を用いた。各糖化合物の添加濃度は、下記表１に示した。C6グリオーマについては、前記論文等に記載の方法に従って調製し、49nMのGalNAc10による処理を行った。
【００６３】
さらに、上記実施例２で用いたPKA阻害剤H-89、及びアデニレートサイクラーゼの阻害剤であるMDL-12,330Aの阻害効果を検討するため、これらの添加実験を行った。実験はすべて上記と同様の方法で行い、糖化合物としてはGalNAc10を用いた。また、比較のために、CaM-Kの阻害剤であるKN-93（生化学工業社製）を用いて、同じ実験を行った。さらに、PKAのregulatory subunitII (RII)とA-キナーゼアンカータンパク質(AKAP)の結合を阻害する作用を有するペプチドSt-Ht31（Promega社製）についても、GalNAc10と同時に添加する実験を行った(Vijayaraghavan et al., J.Biol.Chem., 272, 4747-4752(1997)) 。St-Ht31の効果を確認するためのコントロール実験として、前記阻害作用を有さないコントロールペプチドSt-Ht31P（Promega社製）の添加実験も行った。また、同時に、細胞内cAMPを上昇させる作用を有するフォルスコリン（和光純薬社製）及びジブチルcAMP（生化学工業社製）の添加実験も行った。これらの薬剤についても、添加濃度は下記表１に示した。なお、表中に記載のないKN-93については、10μMで用いた。
【００６４】
各糖化合物又は薬剤による処理後、細胞を直ちに100mMリン酸緩衝液中4%パラホルムアルデヒドで25℃、15分間処理し、固定した。固定した細胞を、0.1％Triton X-100を含むPBSで、5分間、3回室温で処理し、次いで、5％ヤギ血清と0.1％Triton X-100を含むPBSで20分間、室温で処理した(Ono et al., Cell Struct.Funcu., 21, 491-499 (1996))。
続いて、海馬初代培養神経細胞については、一次抗体として、抗MAP2抗体(mouse monoclonal, MAB364：Chemicon International Inc.社製(Temecula, CA, USA))をPBSで希釈して細胞に加え、4℃で16時間反応させた。反応後、PBSで5分間、3回洗浄した。次に、二次抗体としてfluorescence-labeled anti-mouse IgG：Cappel社製(Durham, NC, USA)をPBSに希釈して細胞に加え、これと同時にRhodamine-phalloidin(Molecular Probes Inc.社製)を加えて、室温で60分間反応させることにより、ファロイジンと抗MAP2抗体による二重染色を行った。NG108-15細胞については、ファロイジン染色のみを行った。
【００６５】
最後に、細胞をPBSで5分間、3回洗浄して、共焦点蛍光顕微鏡（LSM5 Pascal：カールツァイス社製）で観察した。細胞の辺縁部に生じたアクチン重合体により形成されるマイクロスパイク（針状構造体）は、その形態と大きさから、Albrecht-Buehlerによって定義された糸状突起(Albrecht-Buehler, J.Cell Biol., 69, 275-286 (1976))であるかどうかを検定した。その上で、糸状突起を5本以上有する細胞を、糸状突起を持つ細胞として計測した。
【００６６】
一方、GalNAc10で処理された細胞における総cAMP濃度の変化を解析するため、The Biotrak cAMP EIA System（アマシャム社製）を用いてcAMP濃度の測定を行った。上記と同様にして調製したNG108-15細胞にGalNAc10を添加し、該キットに収載の方法に従って細胞抽出液を調製し、これを試料とした。GalNAc10処理を行っていない細胞についても同様に測定を行い、結果を比較して糖化合物による変化を解析した。
（２）結果
結果を、表１に示した。
【００６７】
【表１】
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【００６８】
免疫染色による解析の結果、NG108-15細胞を非還元末端にGalNAcを有するGM2、GM2の糖鎖部分、及びGalNAcオリゴマー（GalNAc5又は GalNAc10）で刺激すると、2分以内に明らかなアクチン重合とマイクロスパイクの形成が起きた。この細胞辺縁部のマイクロスパイクは、Albrecht-Buehlerにより糸状突起として記載されているものと、大きさ、形態、動態とも一致した。複数の糸状突起を有する細胞の数も、刺激によって有意に増加した。一方、非還元末端にGalNAcを持たない糖化合物である、GM1、GM3、及びGlcNAc5は、効果を示さなかった。これらのことから、PKAを活性化する糖化合物が、糸状突起の形成を引き起こしたことが確認された。
【００６９】
培養3日目の海馬初代培養神経細胞も、同じ処理により同様に糸状突起を形成した。培養6日目の成熟した細胞では、MAP2陽性の神経細胞の細胞体とそのほぼすべての突起にアクチン線維の形成が認められたが、MAP2陰性の非神経細胞にはそのような効果は認められなかった。このことから、この反応は神経細胞に特異的であることが確認された。培養1日目と2日目の海馬初代培養神経細胞においても、MAP2陽性の細胞の細胞体と突起にアクチンの重合が促進され、こうした幼弱な神経細胞でも、非還元末端にGalNAcを有する糖化合物に対する反応性を有することが示された。これらすべての反応は、刺激から2分以内に起こった。
【００７０】
一方、NG108-15細胞の親細胞のひとつであるC6グリオーマでは上記のようなアクチン重合は観察されず、この糖化合物によるシグナルカスケードは神経細胞に特異的であることが示された。
また、PKA阻害剤H-89及びアデニレートサイクラーゼの阻害剤MDL-12,330Aを用いた阻害実験の結果、NG108-15細胞や海馬初代培養神経細胞におけるGalNAc10による糸状突起形成は、これらの阻害剤により阻害されることが確認された。一方で、CaM-Kの阻害剤であるKN-93は糸状突起の形成を阻害しなかった。このことは、上記実施例２における結果と同様に、このシグナルカスケードでは、CaM-Kは関与せず、cAMP生成によるPKAの活性化が生じることを意味している。
【００７１】
これらの結果から、非還元末端にGalNAcを有する糖化合物によるアクチン重合や糸状突起の形成は、前記PKA活性化のシグナルカスケードの下流にある現象であることが確認された。
一方、PKA無関係に細胞内の総cAMP濃度を有意に上昇させるフォルスコリン（Forskolin）やジブチルcAMP（DbcAMP）による処理を行うと、細胞に糸状突起形成が引き起こされることが確認された。しかし、cAMP測定を行ったところ、細胞全体のレベルではcAMPの変化の検出は困難であり、糖化合物によるcAMP生成は非常に少ないことがわかった。このことから、この反応は細胞膜付近などの限局された部位で起こっていることが予測された。
【００７２】
そこで、regulatory subunitII (RII)とA-キナーゼアンカータンパク質(AKAP)の結合を阻害するペプチドSt-Ht31の添加効果を検討したところ、RIIとAKAPの結合を阻害すると、糖化合物によるNG108-15細胞の糸状突起形成が阻害された。また、コントロールペプチドSt-Ht31Pでは、糸状突起形成は阻害されなかった。このことは、糖化合物により活性化されるPKAが、細胞内に広く存在している遊離のPKAではなく、AKAPによって細胞膜近傍に固定されているPKAであることを意味している。
【００７３】
これらの結果から、非還元末端に遊離状態のGalNAcを有する糖化合物は、細胞膜近傍のごく限局された部位のアデニレートサイクラーゼを活性化し、限局された部位のPKAを活性化する作用を有することがわかった。このことは、上記実施例１において詳述したPKAのイメージング法による解析において、PKAの活性化が細胞膜近傍で観察されたこととも一致している。
【実施例４】
【００７４】
上記実施例において、非還元末端にGalNAcを有する糖化合物によるアクチン重合や糸状突起の形成は、前記PKA活性化のシグナルカスケードの下流にある現象であることが確認された。
PKAは、マスト細胞、CHO-K1細胞、COS-7細胞等においてcdc42を活性化することが知られている(Feoktistov et al., Mol.Pharmacol., 58, 903-910(2000))。RhoファミリーのGTPaseであるcdc42、Rho、及びRacは、NG108-15細胞を含む神経細胞において発現され、それぞれ、特徴的なアクチンの再構成に関与しているとの報告がある(Wilk-Blaszczak et al., J.Neurosci., 17, 4094-4100(1997))。さらに、cdc42は、アクチンの重合による糸状突起形成に関与すると言われている(Nobes and Hall, Cell, 81, 53-62(1995))。
【００７５】
これらのことから、前記糖化合物によるPKA活性化のシグナルカスケードにcdc42が関与するかどうかについて、ウエスタンブロット法及びドミナントネガティブ変異体を用いた細胞免疫染色法により、解析を行った。なお、GTPはguanosine 5'-triphosphate、GDPはguanosine 5'-diphosphateを意味する。
【００７６】
（１）ウエスタンブロット法による解析
上記実施例３と同様に、NG108-15細胞を培養し、これに49nMのGalNAc10を添加して2分間刺激した。cdc42 Activation Assay Kit（Upstate Biotechnology社製）を用いて、キットに収載の方法に従って、該細胞の可溶化画分を調製し、該画分中のGTP結合型cdc42（Cdc42-GTP）及びGTP結合型rac1（Rac1-GTP）を、GTP結合型とのみ反応性を有するPAK-1 agaroseを用いて沈殿させた。GTP結合型cdc42は、活性型である。ここで得られた沈殿物を試料として、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）及びウエスタンブロット法により分離・解析した。ウエスタンブロット法では、キットに収載の抗cdc42抗体及び抗Rac1抗体を用いて発現された蛋白質の検出を行った。
【００７７】
また同時に、GalNAc10を添加していない細胞についても、コントロールとして、同様にキットにより試料を調製した。さらに、該細胞にGDP（cdc42又はrac1と結合して不活性型であるGDP結合型を形成する：ネガティブコントロール）を添加したもの、及び、GTPγS（cdc42又はrac1と不可逆的に結合してGTP結合型を形成する：ポジティブコントロール）を添加したものについても、同様に調製して試料とした。また、1mMジブチルcAMP（PKA非依存的に細胞内総cAMP濃度を上昇させる）による処理を2分間行った細胞についても、同様に試料として調製した。さらに、上記実施例３で使用したSt-Ht31（10μM）及びそのコントロールペプチドSt-Ht31P（50μM）については、GalNAc10（49nM）と同時に添加して細胞を処理し、試料を調製した。
【００７８】
ここで、SDS-PAGEには、Novex NuPAGE 10% Bis-Tris pre-cast gels using MOPS SDS running buffer (Invitrogen Corporation社製)を用いた。ウエスタンブロットには、PVDF膜を用い、ゲルから膜への蛋白質の転写は、transfer buffer（48 mM Tris, 39 mM glycine, 0.037% SDS and 20% methanol）中で、160mA/80cm2で30分間、セミドライ法で行った。抗体反応後のバンドの検出は、ECL Plus (Amersham Biosciences Corporation社製)で行った。
【００７９】
（２）ドミナントネガティブ変異体を用いた細胞免疫染色法による解析
ドミナントネガティブ変異体を用いた実験では、トランスフェクトされた変異遺伝子が発現されることによって、本来その細胞で発現している蛋白質の機能が失われ、その機能を確認することができる。
【００８０】
実験に用いたドミナントネガティブ変異体（HA-RhoAN19/pEF-BOS、 HA-Rac1N17/pEF-BOS、及びHA-cdc42N17/pEF-BOS(Katoh et al., Mol.Cell Biol., 20, 7378-7387(2000)）は、京都大学の根岸学博士から供与された。これらは、cdc42と、これと同じRhoファミリーに属するrhoA及びrac1の3種の遺伝子にそれぞれ変異を入れ、GTP結合性を失わせたものである。さらに、タグ蛋白質としてHAを融合蛋白質として発現するように設計されている。この各変異遺伝子を含むプラスミド各1μgを、それぞれLipofectamine 2000 (Invitrogen Corporation社製(Carlsbad,CA, USA)）を用いてNG108-15細胞にトランスフェクトした。
【００８１】
トランスフェクト後、この細胞にGalNAc10を添加して2分間刺激し、上記実施例３と同様にファロイジン染色を行った。なお、ドミナントネガティブ変異体が発現していることを確認するため、タグ蛋白質として用いたHAに対する抗HA抗体(mouse monoclonal, 12CA5：Roche Diagnostics社製(Basel, Switzerland)）による免疫染色をあわせて行った。二次抗体としては、fluorescence-labeled anti-mouse IgG（Cappel社製(Durham, NC, USA)）を用いた。
【００８２】
（３）結果
ウエスタンブロット法による解析の結果を、図１に示した。
【００８３】
解析の結果、GalNAc10で2分間処理したNG108-15細胞において、GTP結合型cdc42の増量が見られ、cdc42の活性化が確認された。一方、Rac1やRhoAの活性化は認められなかった。更に、cdc42の活性化は、St-Ht31によって阻害された。これらのことから、該細胞におけるPKAの活性化が、cdc42の活性化を引き起こすことを確認した。
さらに、cdc42のドミナントネガティブ変異体を発現させた細胞では、GalNAc10による糸状突起形成が阻害された。一方、Rac1やRhoAのドミナントネガティブ変異体を発現させた細胞では、阻害は起こらなかった。このことは、糸状突起の形成がcdc42により特異的に引き起こされることを意味している。
【００８４】
これらの結果より、PKA依存性のcdc42活性化が、GalNAc10によるNG108-15細胞の糸状突起形成に関与していることが示された。
【実施例５】
【００８５】
上記実施例１〜４において、非還元末端にGalNAcを有する糖化合物が、アデニレートサイクラーゼ、PKA、およびcdc42を含むシグナルカスケードを活性化することがわかった。また、この機構が、アクチン重合や糸状突起の形成に関与していることも確認された。
次に、これらの糖化合物による処理を長期に行った場合に、糸状突起の形成に引き続いて樹状突起の伸長及び／又は分岐が生じるかどうかについて解析した。
【００８６】
（１）樹状突起の伸長及び／又は分岐の免疫染色による観察
上記実施例１と同様にして調製した海馬初代培養神経細胞に、100nMのGM2の糖鎖部分を添加し、3日間培養した。
この細胞を、一次抗体として抗MAP2B抗体(mouse monoclonal, M41420：Transduction Laboratories社製(Lexington, KY))、二次抗体としてAlexa Fluor 488 anti-mouse IgG（Molecular Probes Inc.社製）を用いて免疫染色した。免疫染色は、上記実施例３と同様にして行った。なお、MAP2Bは、MAP2のサブタイプであり、抗MAP2B抗体は樹状突起の免疫染色に特に適していることで知られている。
【００８７】
（２）神経突起の分岐と長さの数値化
小脳プルキンエ細胞を含むラット小脳初代培養細胞を用いて、樹状突起の分岐及び長さの数値化を行った。
該細胞は、Furuya et al., Brain Res.Protoc., 3, 192-198 (1998)に記載の方法に従って調製した。10日間培養したこの細胞に、1、10、30、100nMのGalNAc10をそれぞれ添加し、さらに4日間培養した。
また、同様に、15日間培養した細胞にGalNAc10を加え、さらに6日間培養した細胞も調製した。さらに、GalNAc10と同時にPKA阻害剤であるH-89を1μM添加した細胞も、同様にして調製した。
【００８８】
3種類の培養を行った細胞を、それぞれ、上記実施例３と同様にして固定化し、プルキンエ細胞を抗calbindin D-28K抗体（Calbiochem-Novabiochem.Corp.製）で抗体染色した。抗カルビンジン抗体は、小脳プルキンエ細胞を特異的に染色するのに好適な抗体である。抗体染色の方法は、上記実施例３及び前記論文に記載の方法と同様にして行った。
次に、顕微鏡に取り付けたデジタルカメラを用いて、染色されたプルキンエ細胞のデジタル写真を撮影した。これを、Macintosh computer program「ColorIt! Plus R」(MicroFrontier Inc社製)に供し、樹状突起をトレースして、その分岐数と長さをMacintosh computer program「NIH Image」を用いて計測した。
【００８９】
（３）結果
海馬初代培養神経細胞は、GM2の糖鎖部分による刺激によって、アクチン線維に富むMAP2B陽性の樹状突起の成長が促進された。疎水性のセラミド部分を必要としないことは、この反応が、糖鎖が細胞膜に挿入されることによるものではないことを示している。
さらに、小脳プルキンエ細胞を含むラット小脳初代培養細胞を用いた樹状突起の伸長及び分岐の数値化の結果、GalNAc10は、樹状突起の伸長と分岐数の両方を増加させることがわかった（図２）。糖化合物の効果は濃度に依存性があったが、1nMにおいても明瞭な効果を認めた。この樹状突起伸長の促進効果は、培養15日目から6日間 GalNAc10を加えたものについても同様に認められた。このことは、小脳プルキンエ細胞が、幼弱なものであっても比較的成熟したものであっても、同じようにGalNAc10に反応し得ることを意味する。
【００９０】
また、この樹状突起伸長の促進効果は、PKA阻害剤H-89を加えることで阻害された。このことから、PKA活性化によるシグナルカスケードが、この樹状突起成長に関与していることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明の脳神経細胞活性化剤は、哺乳動物生体内に存在し、非還元末端に遊離状態にあるGalNAcを有する糖化合物を有効成分として含むことを特徴としている。該糖化合物は、例えば、糖鎖のみでも顕著な効果を有しており、抗原性が低く、薬剤として調製しやすい等の利点を有する。また、該糖化合物の作用はごく低濃度でも生じ、細胞膜近傍の限局された部位において生じる反応に基づくため、脳神経細胞全体やその他の部位に大きな変化をもたらして副作用を生じる可能性が非常に低いという利点も有している。
【００９２】
このような本発明の脳神経細胞活性化剤は、脳神経細胞を活性化し、樹状突起の伸長及び／又は分岐を促進する効果を有する。従って、事故等による損傷、脳梗塞、脳血管性痴呆等による虚血性損傷、また、脳神経細胞の変性をきたすような種々の疾患に対する脳神経障害治療剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】非還元末端にGalNAcを有する糖化合物のcdc42又はrac1に対する効果を、ウエスタンブロット法により解析した結果をを示す写真である。図中、写真Ａは抗cdc42抗体により免疫染色を行ったウエスタンブロットの写真であり、Ｂは抗rac1抗体及び抗cdc42抗体により免疫染色を行った写真である。
【図２】非還元末端にGalNAcを有する糖化合物による、樹状突起の伸長及び分岐促進効果を表したグラフである。図中、グラフＡはGalNAc10の添加濃度による分岐数の変化を示す。縦軸は分岐数、横軸は添加濃度である。グラフＢはGalNAc10の添加濃度による突起伸長の変化を示す。縦軸は突起伸長の長さ（mm）、横軸は添加濃度である。グラフＣはGalNAc10による刺激を行っていない細胞（Non）・刺激した細胞（GalNAc10）・阻害剤を加えた細胞（GalNAc10+H89）の3種の細胞間における分岐数の比較を示す。縦軸は細胞の種類、横軸は分岐数である。グラフＤは、グラフＣと同じ3種の細胞間における突起伸長の比較を示す。縦軸は細胞の種類、横軸は突起伸長の長さ（mm）である。図中にはtテストの結果が示され、「**」はP<0.01を、「***」はP<0.001を意味する。
【図２】
2005126337.tif 000003
【図１】
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【配列表】
2005126337000001.app