(57)【要約】ポリポーシスまたは結腸直腸癌を低減または抑制する方法が提供される。この方法は、細胞表面上のリポテイコ酸の提示を低減するように改変された細菌を哺乳動物に投与することを含む。組換え細菌の投与は、所望の治療反応を促進する。組換え細菌は、単回投与または一連の投与で投与され得る。この方法は、様々なポリープ関連疾患、例えば治療またはリンチ症候群、家族性腺腫性ポリポーシス、および結腸直腸癌の治療または予防で使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌表面上のリポテイコ酸（ＬＴＡ）の提示を低減するように遺伝的に改変された前記細菌を治療有効量で哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物におけるポリポーシスを低減する方法。
【請求項２】
前記哺乳動物が、ポリポーシスまたは結腸直腸癌を発症する危険因子を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記危険因子が、腫瘍抑制遺伝子における突然変異である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記腫瘍抑制遺伝子が、大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）遺伝子である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記哺乳動物が、少なくとも１つのポリープを有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記哺乳動物が、胃腸管に少なくとも１つのポリープ、または直腸に少なくとも１つのポリープを有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記哺乳動物が、少なくとも１つの腫瘍性ポリープを有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記腫瘍性ポリープが、腺腫性ポリープである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記腺腫性ポリープが、前記哺乳動物の胃腸管に位置するか、または前記哺乳動物の直腸に位置する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリープが悪性ポリープである、請求項５または６に記載の方法。
【請求項１１】
治療有効量の細菌の前記投与が、ポリープ内有糸分裂活性を低減する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ポリープ内有糸分裂活性の前記低減が、Ｋｉ−６７＋またはＴＵＮＥＬ＋細胞の低減を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリープが、健康な隣接組織と比較した場合にポリープ内炎症を特徴とする、請求項５〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
治療有効量の細菌の前記投与が、前記ポリープ内炎症を低減する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ポリープ内炎症の前記低減が、マスト細胞、マクロファージ、Ｆ４／８０＋マクロファージ、好中球、Ｇｒ１＋顆粒球、樹状細胞、および炎症誘発性調節性Ｔ細胞からなる群から選択される、少なくとも１種類の細胞型の密度の低減を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
治療有効量の細菌の前記投与が、ポリープ内骨髄細胞密度、ポリープ内マスト細胞数、ポリープ内マクロファージ数、ポリープ内好中球数、ポリープ内樹状細胞数、またはポリープ内好中球数を低減する、請求項５〜１０または１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
治療有効量の細菌の前記投与が、脾臓サイズ、脾臓マクロファージ数、または脾臓顆粒球数を低減する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
細胞表面上のリポテイコ酸（ＬＴＡ）の提示を低減するように遺伝的に改変された前記細菌を治療有効量で哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物におけるポリポーシスを抑制する方法。
【請求項１９】
前記哺乳動物が、ポリポーシスまたは結腸直腸癌を発症する危険因子を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記危険因子が、腫瘍抑制遺伝子における突然変異である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記腫瘍抑制遺伝子が、大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）遺伝子である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記対象がヒトである、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記対象が家畜である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記対象が農耕動物である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記細菌が共生細菌である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記共生細菌が乳酸菌である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記乳酸菌がラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）がラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１１５８７で寄託された、ラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＮＣＫ２０２５である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細菌が、少なくとも１種類の他の菌株と併せて投与される、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記少なくとも１種類の他の菌株が共生細菌である、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリポーシスおよび結腸直腸癌を低減する方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
腸内の病原性炎症に対して防御性炎症を高める細菌成分および最終産物の同定は、胃腸（ＧＩ）慢性炎症性疾患および悪性疾患におけるホメオスタシスのバランスを再びとるのに重要である。片利共生のラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）は、ヒト胃腸管内における天然微生物叢の共生生物であり、その表面層タンパク質の相互作用によって、生得的細胞を刺激して、炎症性サイトカインと調節性サイトカインの両方を産生することができる。リポテイコ酸は、ラクトバシラスおよび他の乳酸菌の主要な細胞壁成分であり、ＴＬＲ２などの特異的パターン認識受容体を介して樹状細胞（ＤＣ）を刺激し、その結果、サイトカインが放出されると報告されている。アシドフィルス菌（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＮＣＦＭのホスホグリセロールトランスフェラーゼ遺伝子の欠損によるＬＴＡ合成の破壊によって、マウスにおいて腸管免疫細胞に作用して、ＩＬ−１０の産生を増大し、ＩＬ−１２レベルをダウンレギュレートし、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）に誘発され、かつＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＴ細胞に仲介される大腸炎が著しく緩和する、菌株（ＮＣＫ２０２５）が産生された（ＰＣＴ出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１１／０４０６７４号明細書およびＭｏｈａｍａｄｚａｄｅｈ，ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ（２０１１）１０８  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １：４６２３−４６３０）。これらの観察に基づいて、ＬＴＡ欠損アシドフィルス菌（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）は、炎症を減弱することによって細菌宿主相互作用を変化させることが示された。
【０００３】
結腸直腸癌は、３番目に最も一般的な癌であり、世界における癌による死亡の４番目に多い死因である（Ｗｅｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｌａｎｃｅｔ３６５：１５３−６５）。すべての結腸直腸癌のおよそ５〜１０％が遺伝性であり、主要な形態のうちの１つが家族性大腸腺腫性ポリポーシス（ＦＡＰ）、常染色体優性疾患であり、罹患者の約８０％が、大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）遺伝子の生殖細胞系列変異を含有する。さらに、炎症は、ポリポーシスを有するマウスおよびヒト結腸癌において腫瘍を促進する役割を有することが分かっている。Ｔ調節細胞（Ｔｒｅｇ）は、炎症の強力な抑制因子であり、ポリポーシスおよび結腸癌におけるその防御的役割についての証拠がある。しかしながら、炎症誘発性細胞およびそのサイトカインとのＴｒｅｇの慢性的な相互作用は、Ｔｒｅｇの抗炎症性を逆にし、炎症誘発性を付与する。リンパ球と骨髄性細胞との相互作用は、腫瘍誘発（ｐｒｏ−ｔｕｍｏｒ）対抗腫瘍（ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ）免疫を調節するというのが一致した見解である。しかしながら、ポリポーシスおよび関連する結腸直腸癌に対する腸内ミクロフローラ成分の相互作用は明らかになっていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ポリポーシスの治療を改善するため、かつ結腸直腸癌の発生を低減するために、更なる方法および組成物が当技術分野で必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ポリポーシスまたは結腸直腸癌を低減または抑制する方法が提供される。この方法は、細胞表面上のリポテイコ酸の提示（ｄｉｓｐｌａｙ）を低減するように改変された細菌を哺乳動物に投与することを含む。改変された細菌の投与は、目的の治療反応を促進する。改変細菌は、単回投与で、または一連の投与で投与され得る。この方法は、様々なポリープ関連疾患の治療または予防、例えばリンチ症候群、家族性腺腫性ポリポーシス、および結腸直腸癌の治療または予防における使用が見出される。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】ＰＢＳ、ＮＣＫ５６、またはＮＣＫ２０２５で処置したポリープを有するマウスにおけるポリープの状態を報告する。ＰＢＳ，ｎ＝６。ＮＣＫ５６およびＮＣＫ２０２５，ｎ＝５。（ａ）回腸および結腸におけるポリープをカウントし、ボックスおよびウィスカプロットを用いて結果を示す。（ｂ）ＰＢＳ（上）またはＮＣＫ２０２５（下）で処置したマウスの結腸を表す写真。（ｃ）ＰＢＳ、ＮＣＫ５６またはＮＣＫ２０２５で処置したマウスのポリープにおけるＫｉ−６７＋細胞およびＴＵＮＥＬ＋細胞の定量化。（ｄ）Ｋｉ−６７（上のパネル）およびＴＵＮＥＬ（下のパネル）の結腸ポリープの染色；ＰＢＳ、ＮＣＫ５６またはＮＣＫ２０２５で処置されたマウスのパラフィン包埋組織からの６μｍ切片。棒は５０μｍを表す。（＊＊＊ｐ＜０．０００１；＊＊ｐ＜０．００４；＊ｐ＜０．０１７６）。
【図２】アシドフィルス菌（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）株による、ＴＳ４Ｃｒｅ  ｘ  ｃＡＰＣｌｏｘ４６８におけるポリープ内炎症の減弱を示す。（ａ）ＣＡＥ＋マスト細胞，ｎ＝４（マウス）、（ｂ）Ｇｒ１＋好中球および顆粒球，ｎ＝５以上、（ｃ）Ｆ４／８０＋マクロファージ，ｎ＝５以上、（ｄ）ポリープ内ＣＡＥ＋細胞の頻度，＊＊＊ｐ＜０．０００１、（ｅ）ポリープ内Ｇｒ１＋細胞の頻度，＊＊＊ｐ＜０．０００５、（ｆ）ポリープ内Ｆ４／８０＋細胞の頻度，＊＊ｐ＜０．００６。黒色の縮尺棒は５０μｍを表し、黒色の矢印はマスト細胞を示し、矢印の頭はＦ４８０＋細胞またはＧｒ１＋細胞を示し、対照およびＮＣＫ２０２５群については、ｎ＝３であり；Ｎｃｋ５６群については、ｎ＝５である。ＳＥＭ誤差の棒を示す。
【図３】免疫抑制性および炎症誘発性サイトカインを発現するＤＣによる、ポリープおよび隣接正常組織における浸潤の定量化を表す。（ａ）ＣＤ１１ｃ＋ＩＬ−１０＋，＊＊＊ｐ＜０．０００１，＊＊ｐ＜０．００１、（ｂ）ＣＤ１１ｃ＋ＩＬ−１２＋，＊＊ｐ＜０．００６，（＊＊）ｐ＜０．００４、（ｃ）ＣＤ１１ｃ＋ＴＮＦα＋，＊＊＊ｐ＜０．０００５，＊ｐ＜０．０１（ｄ）ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１０３＋＊＊＊ｐ＜０．０００９，＊ｐ＜０．０５。ポリープ外ＣＤ１０３＋ＤＣと比べて、ポリープ内の有意な増加，＊＊ｐ＜０．００１４。白色の縮尺棒は５０μｍを表し、白色の矢印の頭はダブルポジティブ細胞を示す。
【図４】ポリープ浸潤ＴｒｅｇおよびヘルパーＣＤ４Ｔ細胞の質の変化を示す。（ａ）抗炎症性サブセットと炎症誘発性サブセットの両方を包含する、ポリープ浸潤ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの提示、（ｂ）抗炎症性Ｔｒｅｇと炎症誘発性Ｔｒｅｇ、ならびに炎症誘発性Ｔ細胞を包含する、ＲＯＲγｔおよび／またはＦｏｘｐ３の細胞発現、（ｃ）ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋炎症誘発性Ｔ細胞；マウスは未処置であるか、または示されるように、ＰＢＳ、ＮＣＫ５６またはＮＣＫ２０２５でマウスを処置した。（ｄ）抗炎症性サブセットと炎症誘発性サブセットの両方を包含する、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇのポリープおよび隣接正常組織における定量化，＊ｐ＜＊０．００４、（ｅ）ＲＯＲγｔ−Ｆｏｘｐ３＋抗炎症性Ｔｒｅｇ，＊＊ｐ＜０．００２ｎ＝５，＊ｐ＜０．０４ｎ＝５、（ｆ）ＲＯＲγｔ＋Ｆｏｘｐ３＋炎症誘発性Ｔｒｅｇ，＊＊ｐ＜０．００８ｎ＝３  ＰＢＳ＆５  ＮＣＫ２０２５、（ｇ）ＲＯＲγｔ＋Ｆｏｘｐ３−炎症誘発性Ｔ細胞，傾向は統計学的に有意ではない、（ｈ）ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋炎症誘発性エフェクターＴ細胞，＊ｐ＜０．０１６ｎ＝５。縮尺棒は５０μｍを表し、白色の矢印の頭はＦ４／８０＋細胞またはＧｒ１＋細胞を表す。
【図５】アシドフィルス菌（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）株による、ポリープを有するマウスにおける全身性炎症の減弱を示す。（ａ）アシドフィルス菌（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）株で未処置の、または処置された、ポリープを有するマウスにおける脾臓重量；＊ｐ＜０．０２６。（ｂ）ポリープを有する未処置および処置マウスの脾臓およびＭＬＮにおけるＤ４＋Ｆｏｘｐ３−エフェクターＴ細胞およびＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の頻度；脾臓ＣＤ４＋＊ｐ＜０．０６５，脾臓Ｔｒｅｇ  ｐ＜０．０２６，ＰＢＳ  ｎ＝３，ＮＣＫ５６  ｎ＝５，ＮＣＫ２０２５  ｎ＝３。（ｃ）未処置または処置マウスの脾臓由来ＭＮＣの中での、ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋マクロファージ、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋好中球／顆粒球、およびＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞の頻度；脾臓ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋細胞＊＊＊ｐ＜０．０００１，脾臓ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞＊＊＊ｐ＜０．０００４，ＰＢＳ  ｎ＝３，ＮＣＫ５６  ｎ＝５，ＮＣＫ２０２５  ｎ＝３。（ｃ）腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）由来ＭＮＣの中での同一頻度。ヒストグラムは、ＳＥＭと共に編集された結果を示し：示される傾向は統計学的に有意ではなかった。黒色の棒は未処置マウスであり、灰色棒はＮＣＫ５６処置マウスであり、白色棒はＮＣＫ２０２５処置マウスである。
【図６】アシドフィルス菌（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）株による、マウスにおける血清サイトカインレベルに対する、ポリープを有するマウスの処置の影響を示す。以下の順序：ＮＣＫ２０２５／ＮＣＫ５６／ＰＢＳでデータを示す。ＩＬ−６：２３．１６±３．０３／４５．６０±２．２１／８２．７２±３２．０６，ＰＢＳと比較してＮＣＫ２０２５はｐ＝０．０３９，ＮＣＫ５６と比較してＮＣＫ２０２２５はｐ＝０．００９；ＩＦＮ−ｇ：５．１１±２．１３／２．７９±１．３９／９．０８±３．１７；ＴＮＦ−α：１０．３３±２．６６／１６．７９±４．０２／１６．１９±１．７７；ＩＬ−１０：１８．９５±９５／１６．０７±４．８９／３９．１４±４．３１，ＰＢＳと比較してＮＣＫ２０２５はｐ＝０．００２，ＰＢＳと比較してＮＣＫ５６はｐ＝０．０３；ＶＥＧＦ：３．１９±１．１３／１８．１１±９．９８／１２．４６±７．４２，ＮＣＫ５６と比較してＮＣＫ２０２５はｐ＝０．００８；Ｇ−ＣＳＦ：５７３．３±１０９．１／９３６１±６３８．８／７６８９±１４３６，ＰＢＳおよびＮＣＫ５６と比較してＮＣＫ２０２５はｐ＜０．０００１；ＩＬ−１２ｐ７０：３４．１５±１５．４６／６９．７６±８．６０／２４．６４±３．５０，ＰＢＳと比較してＮＣＫ５６はｐ＝０．００１；ＩＬ−２２：５９．５７±５．６５／３１．８５±４．１８／１９．８９±１２．６０，ＰＢＳと比較してＮＣＫ２０２５はｐ＝０．００５；ｐ値は、統計的有意性が達成された場合に示した。ＮＣＫ２０２５，ｎ＝マウス５匹；ＮＣＫ５６，ｎ＝マウス２匹；ＰＢＳ，ｎ＝マウス３匹；それぞれ、２回繰り返して試験した。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明は、本発明のすべての実施形態を示していないが、本発明の一部の実施形態が示されている、添付の図面を参照しながら、以下でより完全に説明される。実際には、これらの発明は、多くの異なる形態で具体化することができ、本明細書に記載の実施形態に限定されると解釈すべきではない；むしろ、これらの実施形態は、この開示内容が該当する法律上の条件を満たすように提供される。数などは、全体を通して要素などを意味する。
【０００８】
本明細書に記載される、本発明の多くの修正形態および他の実施形態が、上記の説明および関連する図面に示される教示の利点を有することは、これらの発明に関係する当業者であれば思いつくであろう。したがって、本発明は開示される特定の実施形態に限定されず、かつ修正形態および他の実施形態が、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されることを理解されたい。特定の用語が本明細書で用いられるが、それらは、単に一般的かつ説明的意味で使用されており、限定するものではない。
【０００９】
概要
結腸直腸癌を治療または予防する方法を含む、対象においてポリポーシスを低減する方法が提供される。かかる方法を用いて、細菌細胞表面上のＬＴＡの提示を低減するように改変された細菌を使用して、胃腸管における炎症を低減することができる。腸管の炎症は、後に結腸直腸癌に進行し得るポリポーシスの原因となる因子である。したがって、ポリポーシスおよび結腸直腸癌を予防または治療するために、本明細書で提供される方法には、先天および適応免疫応答を正常化するため改変菌株が用いられる。
【００１０】
ポリポーシスを治療する方法、またはポリポーシスの発生率を低減する方法
哺乳動物におけるポリポーシスを治療する、またはポリポーシスの発生率を低減する方法であって、細菌表面上のＬＴＡの提示を低減するように改変されている細菌の投与を含む方法が提供される。一部の実施形態において、ＬＴＡの提示が低減された菌株は、確立されたポリポーシスの症状を寛解し、結腸直腸癌の発症を予防することができる。一部の実施形態において、ポリープ内の有糸分裂活性を低減する、ポリープ内マスト細胞数を低減する、かつ骨髄性細胞のポリープ内密度を低減する方法が提供される。
【００１１】
「処置（治療）」または「低減」または「減少」とは、本明細書においてポリポーシスまたは結腸直腸癌を有する哺乳動物の状態または症状を治す、治癒する、緩和する、軽減する、変化させる、治療する、寛解させる、改善する、または影響を及ぼすことと定義される。したがって、ポリポーシスの減少は、ポリポーシスの少なくとも１つの症状またはマーカーにおける、例えば、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の減少を含み得る。ポリポーシスの症状またはマーカーとしては、限定されないが、ポリープ内有糸分裂活性、骨髄細胞密度（Ｇｒ１＋顆粒球など）、ポリープ内マスト細胞数、ポリープ内マクロファージ数（Ｆ４／８０＋マクロファージなど）、ポリープ内好中球数、ポリープ内樹状細胞数、ポリープ内炎症（炎症誘発性細胞）、脾臓サイズ、脾臓マクロファージ数、脾臓顆粒球数、炎症誘発性Ｔｒｅｇ細胞数、結腸または腸管の炎症、および腸管、結腸または直腸におけるポリープ数が挙げられる。ポリポーシスの症状およびマーカーをアッセイする方法は当技術分野で公知であり、本明細書において他に記述されている。治療されるべき哺乳動物は、ポリポーシスまたは結腸直腸癌に罹患している、または発症するリスクがある、例えば、リンチ症候群（遺伝性非ポリポーシス）、家族性腺腫性ポリポーシス（ＦＡＰ）、ＭＵＴＹＨ関連ポリポーシス、肥満細胞症、脾腫、糖尿病、または自己免疫疾患（例えば、シェーグレン症候群）に罹患している、またはそれを発症するリスクがある。
【００１２】
ＬＴＡ欠損細菌の投与は、予防または治療目的のいずれかであることができる。「予防」または「抑制」とは、組換え細菌が予防的に投与される、つまりその細菌がいずれかの症状に先立って投与されることが意図される。細菌の予防的投与は、ポリポーシスまたは結腸直腸癌のその後の症状を予防または弱める役割をする。一部の実施形態において、ポリポーシスの予防または抑制は、ＬＴＡ欠損細菌の最初の投与から少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１４日、２１日、３０日、または３０日を超える間、ポリープが形成しない状態を含む。一部の実施形態において、ポリポーシスの予防または抑制は、ＬＴＡ欠損細菌の最後の投与から少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１４日、２１日、３０日、または３０日を超える間、ポリープが形成しない状態を含む。ポリポーシスを低減するために投与される場合、症状の発生時（または発生直後）、またはポリープの形成時に細菌が提供される。細菌の投与は、ポリープの増殖または分裂などの任意の実際の症状を弱める役割を果たすことができる。
【００１３】
「対象」とは、哺乳動物が意図される。特定の実施形態において、対象哺乳動物は霊長類またはヒトである。他の実施形態において、対象は、家庭内の哺乳動物、例えばネコまたはイヌ、または農耕動物、例えば反すう動物、ウマ、ブタ、家禽、またはヒツジを含む。特定の実施形態において、本明細書に記載の菌株によって、治療または予防を受ける対象はヒトである。一部の実施形態において、治療を受けるヒトは、新生児、乳児、幼児、前青年期、青年期または成人であることができる。本発明の対象は、ポリポーシスまたは結腸直腸癌に罹患している、またはポリポーシスを発症するリスクのある対象であり得る。
【００１４】
ポリポーシス
本明細書に記載の方法は、ポリポーシスの治療および予防に関する。本明細書で使用される、「ポリポーシス」という用語は、少なくとも１つのポリープの存在を特徴とする状態を意味する。一部の実施形態において、ポリポーシスは、リンチ症候群（遺伝性非ポリポーシス、ＨＮＰＣＣ）、家族性腺腫性ポリポーシス（ＦＡＰ）、ＭＵＴＹＨ関連ポリポーシス（ＭＡＰ）など遺伝性または家族性因子を有する。一部の実施形態において、ポリポーシスとは、結腸直腸癌または結腸癌を意味する。
【００１５】
「ポリープ」または「新形成」という用語は、粘膜から隆起する組織の異常増殖を意味する。本明細書に記載のポリープは、過形成性ポリープ、腺腫性ポリープ（腺腫）、炎症性ポリープ、または他のいずれかの種類のポリープであり得る。本明細書で使用される、腫瘍性ポリープは、腺腫性ポリープまたは悪性ポリープであり得る。結腸直腸腺腫（腺腫性ポリープ）の場合には、異常増殖は粘膜に限局する。この異型増殖が粘膜筋板、粘膜下の筋肉層まで及び、かつ解剖学的壁がダメージを受けている場合には、その異常増殖は結腸直腸癌腫、または悪性ポリープと呼ばれる。
【００１６】
本明細書で使用される、「結腸直腸癌」または「結腸癌」は、少なくとも１つの結腸直腸癌腫を有することを特徴とする状態を意味する。結腸直腸癌は、胃腸管または結腸の癌のすべての形態を含み得る。結腸直腸癌は、散発性および遺伝性結腸直腸癌を含み得る。結腸直腸癌は、悪性結腸腫瘍、上皮内癌、一般的なカルチノイド腫瘍、および異型カルチノイド腫瘍を含み得る。結腸直腸癌はさらに、腺癌、扁平上皮癌、および腺扁平上皮癌を含み得る。結腸直腸癌は、遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌、家族性腺腫性ポリポーシス、ガードナー症候群、ポイツ‐ジェガーズ症候群、ターコット症候群および若年性ポリポーシスからなる群から選択される遺伝的症候群と関連し得る。本明細書で使用される、結腸癌は、遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌、家族性腺腫性ポリポーシス、ガードナー症候群、ポイツ‐ジェガーズ症候群、ターコット症候群および若年性ポリポーシスからなる群から選択される遺伝的症候群によって発症し得る。
【００１７】
一部の実施形態において、ポリープは、胃腸管または直腸において見つけられる。本明細書で使用される、「胃腸管」とは、幽門洞、十二指腸、空腸、回腸および結腸を含む。
【００１８】
一部の実施形態において、本明細書に記載の細菌が、ポリポーシスまたは結腸直腸癌を発症する危険因子を有する哺乳動物に投与される。本明細書で使用される、ポリポーシスまたは結腸直腸癌を発症する危険因子とは、遺伝的危険因子または生活習慣危険因子を含む。遺伝的危険因子としては、限定されないが、大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）遺伝子などの腫瘍抑制遺伝子の突然変異を有すること、またはＳＣＨ２、ＭＬＨ１、ＭＳＨ６、およびＰＭＳ２遺伝子などのミスマッチ修復（ＭＭＲ）遺伝子の突然変異を有することが挙げられる。生活習慣危険因子としては、限定されないが、高い肥満度指数（ＢＭＩ）、肥満、低い身体活動度、赤身の肉および加工肉の高い消費量、精製穀物、甘い物、およびアルコール、および果物および野菜の低い消費量が挙げられる。
【００１９】
一部の実施形態において、ポリポーシスの低減は、ポリープ内有糸分裂活性の低減を特徴とする。本明細書で使用される、「ポリープ内有糸分裂活性」とは、ポリープにおける細胞の分裂または増殖を意味する。例えば、ポリープ内有糸分裂活性は、Ｋｉ−６７＋またはＴＵＮＥＬ＋細胞の集団または密度を定量化することによって測定することができる。Ｋｉ−６７＋またはＴＵＮＥＬ＋細胞についてアッセイする方法は当技術分野で公知であり、本明細書の他の場所で記述される。
【００２０】
一部の実施形態において、ポリポーシスの低減は、ポリープ内炎症の低減を特徴とする。本明細書で使用される、「ポリープ内炎症」とは、少なくとも１つのポリープ内の組織の炎症を意味する。ポリープ内炎症の低減は、ＬＴＡ欠損細菌の投与後に、抗炎症性サイトカインレベルの増加、または炎症誘発性サイトカインレベルの減少、またはそのいずれかの組み合わせを同定することによって測定することができる。一部の実施形態において、ポリープ内炎症の減少は、ＬＴＡ欠損細菌の投与後に、炎症誘発性Ｔｒｅｇに対する抗炎症性Ｔｒｅｇの割合の増加を測定することによって同定される。
【００２１】
本明細書で使用される、「炎症性サイトカイン」という用語は、炎症に有利に働く免疫調節性サイトカインを意味する。本発明の炎症性サイトカインとしては、ＩＬ１−α、ＩＬ１−β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−α、ＬＴ、ＬＩＦ、オンコスタチン、またはＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γが挙げられる。
【００２２】
本明細書で使用される、「抗炎症性サイトカイン」という用語は、そのサイトカインの受容体を有する細胞における抗炎症反応を誘発する、天然または組換えタンパク質、その類似体または断片を意味する。本発明の抗炎症性サイトカインは、炎症性サイトカイン応答を制御する免疫調節性分子であり得る。本発明の抗炎症性サイトカインとしては、インターロイキン（ＩＬ）−１受容体アンタゴニスト、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、およびＩＬ−１３、ＩＬ−１６、ＩＦＮ−α、ＴＧＦ−β、Ｇ−ＣＳＦが挙げられる。
【００２３】
本明細書で使用される、「抗炎症性調節性Ｔ細胞」、または「抗炎症性Ｔｒｅｇ」または「天然調節性Ｔ細胞」または「ｎＴｒｅｇ」または「ｂｏｎａ  ｆｉｄｅ  Ｔｒｅｇ」という用語は、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇなどの抗炎症性サイトカインを発現する調節性Ｔ細胞を意味する。抗炎症性Ｔｒｅｇは、ＲＯＲγｔの発現およびＦｏｘｐ３の喪失によってその抗炎症性を失い、ＴＨ１７細胞への変換が起こる。その代わりに、抗炎症性Ｔｒｅｇは、Ｆｏｘｐ３およびＲＯＲγｔを共発現し、Ｔ細胞抑制性を維持するが、炎症誘発機能を獲得する。どちらの場合にも、Ｔｒｅｇの抗炎症性の喪失は、病原性炎症の増大およびポリポーシスの進行の原因となり得る。抗炎症性調節性Ｔ細胞は、ＩＬ−１０などの抗炎症性サイトカインを産生し得る。本明細書で使用される「炎症誘発性調節性Ｔ細胞」という用語は、Ｆｏｘｐ３＋ＲＯＲγｔ＋Ｔｒｅｇなどの炎症誘発性サイトカインを発現する調節性Ｔ細胞を意味する。
【００２４】
治療有効量
「治療上有効な用量」、「治療有効量」または「有効量」とは、対象に投与した場合に、ポリポーシスを低減する、またはポリポーシスの発症、増加または進行を防ぐ、ＬＴＡ欠損細菌の量を意味する。「ポジティブな治療反応」とは、例えば、ポリポーシスまたは結腸直腸癌の症状またはマーカーの少なくとも１つの状態を改善することを意味する。
【００２５】
有効量の治療薬は、意図する目的に基づいて決定される。「単位用量（ｕｎｉｔ  ｄｏｓｅ）」という用語は、対象において使用するのに適した物理的に分離した単位を意味し、それぞれの単位が、その投与、つまり適切な経路および治療計画に関連して、目的の反応をもたらすために計算された治療用組成物の所定の量を含有する。治療回数および単位用量の両方に従って投与されるべき量は、治療される対象、対象の状態および望まれる防御に依存する。治療用組成物の正確な量も、医師の判断に依存し、各個体に特有である。一般に、ＬＴＡ欠損細菌の投与量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全体的な健康状態および以前の病歴などの因子に応じて異なる。具体的な実施形態において、およそ１０４〜約１０１２ＣＦＵ、１０５〜１０１１ＣＦＵ、１０６〜１０１０ＣＦＵ、１０８〜１０１０ＣＦＵまたは１０８〜１０１２ＣＦＵ／１回用量の範囲で細菌を投与することが望ましい。
【００２６】
一部の実施形態において、この方法は、細菌の複数回用量の投与を含む。この方法は、本明細書に記載の細菌を含む組成物の治療上有効な１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０回以上の用量の投与を含み得る。一部の実施形態において、用量は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１４日、２１日、３０日または３０日以上の過程にわたって投与される。一部の実施形態において、この方法は、細菌の連続的な投与を含む。組成物の複数回用量の投与の回数または期間は、炎症反応を低減または予防し、それによって胃腸疾患が治療または予防されるような、回数または期間である。さらに、本発明の治療有効量の組換え細菌での対象の治療は、１回の治療または一連の治療を含む。治療に使用される細菌の有効な投与量は、特定の治療の過程にわたって増加または減少してもよいことは理解されよう。投与量の変化は生じてもよく、当技術分野で公知であり、かつ本明細書に記載のポリポーシスを検出するための診断アッセイの結果から明らかとなり得る。
【００２７】
医薬組成物
一部の実施形態において、ＬＴＡの提示の低減を有する菌株が、栄養補助食品および／または食品添加物などの栄養補助組成物の形で対象に投与される。特定の実施形態において、医薬または栄養補助組成物は、ホスホグリセロールトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を低減するように改変されているＬＴＡ欠損細菌を含む。他の実施形態において、抽出物が、医薬組成物の形で対象に投与される。投与は、本明細書において他の場所に記載のように、単回用量投与または複数回用量投与を含み得る。
【００２８】
この医薬組成物は、液体配合物または固形配合物であり得る。医薬組成物が固形配合物である場合には、錠剤、吸収錠剤（ｓｕｃｋｉｎｇ  ｔａｂｌｅｔ）、チューイング錠剤（ｃｈｅｗｉｎｇ  ｔａｂｌｅｔ）、チューイングガム、カプセル、サッシェ、粉末、顆粒、被覆粒子、被覆錠剤、腸溶錠剤、腸溶カプセル、融解ストリップまたはフィルムとして配合され得る。医薬組成物が液体配合物である場合には、経口溶液、懸濁液、エマルジョンまたはシロップとして配合され得る。医薬組成物は、経鼻、経口、経膣、または経肛門経路によって投与され得る。経肛門経路については、坐剤を使用してもよい。坐剤は、結合剤および担体、例えばポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドなどを含み得る。この組成物はさらに、局所製剤または静脈内投与形態で送達され得る。前記組成物はさらに、限定されないが、乳酸発酵食品、発酵乳製品、耐性デンプン、食物繊維、炭水化物、タンパク質、およびグリコシル化タンパク質からなる群から独立して選択される担体材料を含み得る。
【００２９】
本明細書で使用される、「医薬組成物」という用語は、必要な効果、つまりポリポーシスまたは結腸直腸癌の治療または予防が達成される限り、食品組成物、栄養補助食品、機能性食品、医療食または栄養補給食品として配合することができる。前記食品組成物は、飲料、ヨーグルト、ジュース、アイスクリーム、パン、ビスケット、クラッカー、穀類、シリアルバー、スプレッド（ｓｐｒｅａｄｓ）および栄養補給食品からなる群から選択され得る。食品組成物はさらに、担体材料を含んでもよく、前記担体材料は、乳酸発酵食品、発酵乳製品、非発酵乳製品（例えば、牛乳）  耐性デンプン、食物繊維、炭水化物、タンパク質およびグリコシル化タンパク質からなる群から選択される。
【００３０】
本発明に従って使用される、または本発明に従って製造される、本発明による医薬組成物は、不活性賦形剤、または薬学的に許容される補助剤、担体、保存剤等の、よく知られている他の物質も含んでもよい。
【００３１】
本発明の開示内容は、組換え細菌の互いの組み合わせ、および／または組み替え細菌と、ポリポーシスまたは結腸直腸癌の治療において有用な１種または複数種の他の作用物質との組み合わせも含む。例えば、本発明の細菌は、化学療法薬、ＦＯＬＦＯＸ（ロイコボリン［ホリン酸］、５−ＦＵ、およびオキサリプラチン）、ＦＯＬＦＯＸ（ロイコボリン［ホリン酸］、５−ＦＵ、およびオキサリプラチン）、ＣａｐｅＯＸ（カペシタビンおよびオキサリプラチン）、ベバシズマブ、セツキシマブ、５−ＦＵおよびロイコボリン、ＦＯＬＦＯＸＩＲＩ（ロイコボリン、５−ＦＵ、オキサリプラチン、およびイリノテカン）、イリノテカンなど、セツキシマブ、セツキシマブ、またはパニツムマブと共に、またはそれらなしで、ポリポーシスまたは結腸直腸癌の治療のために、従来の抗炎症剤の有効用量と併せて投与され得る。「併せて投与」という用語は、作用薬の同時および逐次投与の両方を意味する。併用療法は当然のことながら、本明細書で提供される作用物質に限定されないが、ポリポーシスまたは結腸直腸癌の治療のための組成物を含む。
【００３２】
ＬＴＡの提示が低減された、改変細菌細胞
本明細書に記載のポリポーシスを治療、低減、または予防する様々な方法では、細胞表面上のＬＴＡ提示が低減された改変細菌細胞が用いられる。本明細書で使用される、細胞の表面または細胞表面上のＬＴＡ提示の低減は、適切な対照と比較して、細胞表面上に提示されるＬＴＡのレベルの統計学的に有意な低減を含む。かかる低減は、例えば、細胞表面上に提示されるＬＴＡの量の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の低減を含み得る。細胞表面上のＬＴＡの量についてアッセイする方法としては、例えば、ブタノールおよび疎水性相互作用クロマトグラフィー（Ｍｏｒａｔｈ  Ｓ，Ｇｅｙｅｒ  Ａ，＆  Ｈａｒｔｕｎｇ  Ｔ（２００１）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９３（３）：３９３−３９７）または酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）（Ｔａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ａｎａｌ．１９８９；３（１）：２１）が挙げられる。本明細書で使用される、「ＬＴＡ提示の低減」とは、細胞表面上のＬＴＡの提示の変化を包含する。細胞表面上のＬＴＡの提示の変化は、野生型細菌の表面上のＬＴＡの構造と異なる、ＬＴＡの構造を包含することを意味する。したがって、本明細書で使用される「ＬＴＡ欠損」細菌とは、細胞表面上のＬＴＡ提示の変化または低減を有する細菌を意味する。一部の実施形態において、本明細書に記載の方法で使用されるＬＴＡ欠損細菌は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４０６７４およびＭｏｈａｍａｄｚａｄｅｈ，ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ（２０１１）１０８  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １：４６２３−４６３０に詳述される、アシドフィルス菌（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＮＣＫ２０２５である。
【００３３】
本明細書で使用される、「表面」、「細胞表面」または「細菌表面」という用語は、原形質膜を含み、かつ原形質膜の外側にある細菌細胞の領域を意味する。グラム陽性菌は、その中にテイコ酸が散在する、原形質膜の外側にあるペプチドグリカンの層を含有する。グラム陰性菌はさらに、ペプチドグリカン層を覆う外膜を含有する。したがって、本発明による表面上のＬＴＡの提示は、グラム陽性菌の原形質膜またはペプチドグリカン層における、または上の提示であるか、あるいはグラム陰性菌の原形質膜、ペプチドグリカン層、または外膜における、または上の提示であり得る。
【００３４】
本明細書で開示される方法で用いられる細菌細胞は、細胞表面上のＬＴＡの提示を低減するように遺伝子改変されている。本明細書で使用される、「組換え細菌」または「組換え細菌細胞」という用語は、少なくとも１つの遺伝的改変が対象の遺伝子に関して行われている、細菌または細菌細胞、あるいはそのように改変された細胞に由来し、かつ遺伝的改変を含む細胞を意味する。したがって、本明細書で使用される、「遺伝子改変された」または「遺伝子修飾」という用途は、対象の遺伝子または核酸配列に関して行われた、欠失、付加または置換などの遺伝的改変を意味する。一部の実施形態において、遺伝的改変は、人の手による突然変異または組換え技術によって生じる改変である。一部の実施形態において、人の手により用いられる突然変異技術は、選択をベースとする変異生成技術であり、選択された細菌は遺伝子修飾およびＬＴＡ提示の低減または改変を有する。
【００３５】
一部の実施形態において、遺伝的改変は、細菌細胞のゲノムへの異種ポリヌクレオチドの導入を含む。本明細書で使用される、配列に関する「異種」は、外来種から生じる配列であるか、あるいは同一種から生じる場合には、計画的な人の介入によって、組成および／またはゲノム遺伝子座がその天然形から実質的に改変されている。例えば、異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターは、そのポリヌクレオチドがそれに由来する種と異なる種からのプロモーターであるか、あるいは同一／類似種からのプロモーターである場合には、一方または両方が、その元の形および／またはゲノム遺伝子座から実質的に改変されており、あるいはそのプロモーターは、作動可能に連結されたポリヌクレオチドの天然プロモーターではない。
【００３６】
本明細書に記載の方法において、対象のいずれの細菌も使用することができる。特定の実施形態において、細菌は、共生細菌を含む。本明細書で使用される「共生」という用語は、適切な量で投与した場合に、宿主に健康上の利益を付与する「生きている微生物」（ＦＡＯ２００１：ｉｓａｐｐ．ｎｅｔ／ｄｏｃｓ／ＰｒｏｂｉｏｔｉｃＤｅｆｉｎｉｔｉｏｎ．ｐｄｆのウェブサイトを参照）、あるいは対象の腸管の健康およびバランスに寄与する少なくとも１種類の生物を意味する。特定の実施形態において、対象により摂取された場合に、腸管の健康を維持する助けとなり、かつ病気および／または疾患の１つまたは複数の症状を一部または完全に軽減するのを助ける、「優しい」、「有益な」または「良い」細菌とも呼ばれる。本明細書で使用される、「共生特性」は、腸の機能および安定性の向上；感染症および非感染症に対する防御の向上；免疫システムの調節；乳糖不耐症の軽減；消化および栄養素吸収の向上；血中コレステロールの低減；アレルギーリスクの低減；および尿路染症のリスクの低減；を含む。一部の実施形態において、共生特性は、共生細菌を投与された対象における抗炎症性サイトカイン産生の増加、共生細菌を投与された対象における炎症誘発性サイトカイン産生の低減、または共生細菌を投与された対象における炎症誘発性サイトカイン産生に対する抗炎症性サイトカイン産生の割合の増加を含む。
【００３７】
一部の実施形態において、本明細書に記載の細菌は、１つまたは複数の共生特性を高めるように改変または選択されている。例えば、一部の実施形態において、この方法で用いられる細菌は、胃腸上皮への付着を高めるように改変されており、さらに細胞表面上のＬＴＡ提示を低減するように改変されている。他の実施形態において、この方法で用いられる細菌は、酸または胆汁に対する耐性を高めるように、あるいは胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を高めるように改変されており、さらに細胞表面上のＬＴＡ提示を低減するように改変されている。他の実施形態において、この方法で用いられる細菌は、食物成分からの微生物代謝産物、例えばエコールまたは他の有益なアグリコンを産生するように改変されており、さらに細胞表面上のＬＴＡ提示を低減するように改変されている。一部の実施形態において、この方法で用いられる細菌は、ＤＮＡの損傷を低減するように、または化学発癌性物質に対する抗遺伝毒性を高めるように改変されており、さらに細胞表面上のＬＴＡ提示を低減するように改変または選択されている。一部の実施形態において、この方法で用いられる細菌は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、グルタチオン、グルタチオンレダクターゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、シュウ酸の利用、または酪酸の産生を増加するように改変または選択されている。
【００３８】
特定の実施形態において、その細菌は乳酸菌である。本明細書で使用される、「乳酸菌」とは、以下の：アエロコッカス属（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、オエノコッカス属（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ペジオコックス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、メリソコッカス属（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ）、アロイオコッカス属（Ａｌｌｏｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ドロシグラヌルム属（Ｄｏｌｏｓｉｇｒａｎｕｌｕｍ）、ラクトスフェアエラ属（Ｌａｃｔｏｓｐｈａｅｒａ）、テトラジェノコッカス属（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、バゴコッカス属（Ｖａｇｏｃｏｃｃｕｓ）、およびワイセラ属（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）（Ｈｏｌｚａｐｆｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．７３：３６５Ｓ−３７３Ｓ；Ｓｎｅａｔｈ，ｅｄ．（１９８６）Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ  ２，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｈａｇｅｒｓｔｏｗｎ，ＭＤ）から選択される属からの目的の細菌である。
【００３９】
一部の実施形態において、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）が使用される。「ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）」とは、限定されないが、Ｌ．カセイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）、Ｌ．パラカゼイン（Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ）、Ｌ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）、Ｌ．ラムノサス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、Ｌ．ジョンソンニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｎｉ）、Ｌ．ガセリ（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ）、Ｌ．アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、Ｌ．ファーメンタム（Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、Ｌ．サリヴァリゥス（Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、Ｌ．イネルス（Ｌ．ｉｎｅｒｓ）、Ｌ．ブルガリクス（Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、およびＷｏｏｄら（Ｈｏｌｚａｐｆｅｌ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄ，ｅｄｓ．（１９９５）Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｒａ  ｏｆ  Ｌａｃｔｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，Ｖｏｌ．２．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記載の多くの他の種など、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属の任意の細菌を意味する。特定の実施形態において、その細菌はアシドフィルス菌（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＮＣＫ２０２５である。
【００４０】
ＬＴＡ提示が低減された細菌の産生、かかる細菌の出発培養物の調製、および基質を発酵させる方法、特に牛乳およびプレバイオティック・オリゴ糖（例えば、ガラクト−オリゴ糖またはフルクト−オリゴ糖）などの食物基質を発酵させる方法は、限定されないが、Ｍａｅｙｒａｅ−Ｍａｅｋｉｎｅｎ  ａｎｄ  Ｂｉｇｒｅｔ（１９９３）Ｌａｃｔｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｓａｌｍｉｎｅｎ  ａｎｄ  ｖｏｎＷｒｉｇｈｔ  ｅｄｓ．Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．６５−９６．；Ｓａｎｄｉｎｅ（１９９６）Ｄａｉｒｙ  Ｓｔａｒｔｅｒ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  Ｃｏｇａｎ  ａｎｄ  Ａｃｃｏｌａｓ  ｅｄｓ．ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．１９１−２０６；Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ（１９８５）Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｓｔａｒｔｅｒ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｆｏｏｄ．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａに記載の技術など既知の技術に従って行うことができる。一部の実施形態において、ＬＴＡ欠損細菌は、一般に安全と認められている（ＧＲＡＳ）。
【００４１】
本明細書に記載の細菌細胞は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に一般に記載の適切な培地で培養することができる。
【００４２】
一部の実施形態において、本明細書に記載の菌株は、本明細書に記載の細胞表面上でのＬＴＡの提示を減少を生じさせる、少なくとも１つの遺伝的改変を含む細菌の生物学的に純粋な培養物である。更なる実施形態において、細菌は、１つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失および／または置換を含む。これらの株としては、限定されないが、ラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｌ．ガセリ（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ）、Ｌ．ジョンソンニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、およびエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種が挙げられる。「生物学的に純粋」とは、他の細菌細胞を９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％含有しないことを意図する。他の実施形態において、本明細書に記載の菌株は、混合培養物を生成するために、他の菌株と併せて見つけられる。
【００４３】
「対照」または「対照細胞」または「対照細菌」は、組換え細菌細胞の表現型の変化を測定するための参照ポイントを提供する。対照細菌は、例えば：（ａ）野生型細菌、つまり、対象細菌を生じる遺伝的改変のための出発原料と同じ遺伝子型の細菌；または（ｂ）ヌル（ｎｕｌｌ）構築物（つまり、対照の形質に既知の影響を及ぼさない構築物、例えばマーカー遺伝子を含む構築物など）で形質転換されているが、出発原料と同じ遺伝子型の細菌；を含み得る。
【００４４】
表面上のＬＴＡ提示の低減または改変を有する組換え生物は、様々な技術を用いて作製することができる。本発明において、ＬＴＡアセンブリ経路の１つの酵素、例えば、ホスホグリセロールトランスフェラーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼの少なくとも１つをコードするポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現が、本明細書に記載のように低減され得る。
【００４５】
一実施形態において、ホスホグリセロールトランスフェラーを含むＬＴＡ関連ポリペプチドのレベルが低減される。ホスホグリセロールトランスフェラーゼは、Ｇｒｏ−Ｐ単位の糖脂質への導入を伴うポリペプチドであり、それによってＬＴＡ鎖が延長する。種々のホスホグリセロールトランスフェラーゼポリペプチドおよびポリペプチドをコードする遺伝子が知られている。本明細書で使用される、ホスホグリセロールトランスフェラーゼは、ＬＴＡシンターゼ（ＬｔａＳ）、グリセロールホスホトランスフェラーゼ、グリセロホスホトランスフェラーゼ、およびＬＴＡのポリグリセロリン酸主鎖の形成のために、Ｇｒｏ−Ｐ単位の導入を触媒する他の任意のポリペプチドを包含する。ホスホグリセロールトランスフェラーゼは、アルカリホスファターゼスーパーファミリーのメンバーである（ＭｄｏＢ［ＣＯＧ１３６８］ホスホグリセロールトランスフェラーゼ）。例えば、ＮＣＢＩ受入番号ＮＺ＿ＡＣＧＸ０１００００６８．１およびＮＣ＿０１０６０９．１参照。これらの参考のそれぞれが、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４６】
他の実施形態において、細胞表面上のＬＴＡ提示が低減または改変された細菌は、グリコシルトランスフェラーゼの発現の低減を有することができる。この実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼのレベルは、本明細書における他の場所に記載のポリヌクレオチドまたはポリペプチドのレベルを低減する方法のいずれかを用いて低減される。グリコシルトランスフェラーゼは、ＬＴＡの糖脂質および脂質アンカーの合成に関与するポリペプチドである。グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドおよびそのポリペプチドをコードする遺伝子は公知である。本明細書で使用される、「グリコシルトランスフェラーゼ」という用語は、ＬＴＡの糖脂質および脂質アンカーの合成を触媒する任意のポリペプチド、例えばＹｇｐＰ、Ｕｇｔ、ＢｇｓＡ、ＩａｇＡ、ＬａｆＡ、またはＬａｆＢなどを意味する。グリコシルトランスフェラーゼは、グリコシルトランスフェラーゼ＿ＧＴＢ＿型スーパーファミリー［ｃｌ１００１３］のメンバーである。種々のグリコシルトランスフェラーゼが知られている。例えば、ＮＣＢＩ受入番号ＮＣ＿０１０６０９．１およびＥＦ１３８８３５．１を参照のこと。これらの参考のそれぞれが、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４７】
テイコ酸上のＤ−Ａｌａ置換の質およびレベルによって、細胞表面上のＬＴＡ提示が低減または改変され得る。Ｄ−アラニル−ＬＴＡの合成には、ｄｌｔオペロンによってコードされる４種のタンパク質、ＤｌｔＡ、ＤｌｔＢ、ＤｌｔＣ、またはＤｌｔＤが必要である。したがって、一部の実施形態において、ＬＴＡ関連ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、配列番号：９〜１６などの、Ｄｌｔオペロンにおいて記載されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含み得る。したがって、他の実施形態において、ＤｌｔＡ、ＤｌｔＢ、ＤｌｔＣ、またはＤｌｔＤのレベルが低減される。ｄｌｔオペロンの種々のメンバーが知られている。例えば、ＮＣＢＩ受入番号ＡＡＦ０９２０１（ＤｌｔＡ）；ＮＣＢＩ受入番号ＡＡＢ１７６５８．１（ＤｌｔＢ）；ＮＣＢＩ受入番号ＣＡＲ８６６７４．１（ＤｌｔＣ）；およびＮＣＢＩ受入番号ＣＡＱ６５９８１．１（ＤｌｔＤ）を参照のこと。これらの参考のそれぞれが、参照により本明細書に組み込まれる。ＬＴＡの構造は、公知の技術を用いてＮＭＲおよびＭＳによって測定することができる。例えば、Ｍｏｒａｔｈ  Ｓ，Ｇｅｙｅｒ  Ａ，＆Ｈａｒｔｕｎｇ  Ｔ（２００１）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ１９３（３）：３９３−３９７を参照のこと。
【００４８】
寄託
出願人は、２０１１年１月１０日に、米国菌株保存機関（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ２０１１０  ＵＳＡ）にＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１１５８７でラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＮＣＫ２０２５を寄託した。２０１１年１月１０日にＡＴＣＣに寄託された細菌培養物は、本出願の出願日より前に、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，１００  Ｓｃｈａｕｂ  Ｈａｌｌ，Ｃａｍｐｕｓ  Ｂｏｘ  ７６２４，Ｒａｌｅｉｇｈ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ，２７６９５によって維持された寄託物から受け継がれた。特許商標庁長官、および請求時に権利が与えられる検査官によって決定される人物が、特許出願中にこの寄託へのアクセスを利用できる。本出願における特許請求の範囲を考慮に入れて、出願人は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８０８に準拠して寄託物を一般に利用可能にする。ラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＮＣＫ２０２５の寄託は、公共寄託機関であるＡＴＣＣ寄託機関で、３０年間、または最後の請求後５年間、またはその特許の実施可能な期間、どちらが長かろうと保持され、その期間中に生育不能となれば、交換される。さらに、出願人は、寄託時に試料の生存度の指標を提供することなど、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８０１−１．８０９の条件のすべてを有する、または満たす。出願人は、通商での生体物質の移動またはその輸送に対して法律によって課されるいずれの規制も放棄する権限はない。
【００４９】
上述の説明に照らして、以下の番号付けされた実施形態が提供される：
１．細菌表面上のリポテイコ酸（ＬＴＡ）の提示を低減するように遺伝的に改変または選択された前記細菌を治療有効量で哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物におけるポリポーシスを低減する方法。
【００５０】
２．前記哺乳動物が、ポリポーシスまたは結腸直腸癌を発症する危険因子を有する、実施例１に記載の方法。
【００５１】
３．前記危険因子が腫瘍抑制遺伝子における突然変異である、実施形態２に記載の方法。
【００５２】
４．前記腫瘍抑制遺伝子が大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）遺伝子である、実施形態３に記載の方法。
【００５３】
５．前記哺乳動物が少なくとも１つのポリープを有する、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【００５４】
６．前記哺乳動物が、胃腸管に少なくとも１つのポリープ、または直腸に少なくとも１つのポリープを有する、実施形態１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【００５５】
７．前記哺乳動物が少なくとも１つの腫瘍性ポリープを有する、実施形態１〜６のいずれか１つに記載の方法。
【００５６】
８．前記腫瘍性ポリープが腺腫性ポリープである、実施形態７に記載の方法。
【００５７】
９．前記腺腫性ポリープが、前記哺乳動物の胃腸管に位置するか、または前記哺乳動物の直腸に位置する、実施形態８に記載の方法。
【００５８】
１０．前記ポリープが悪性ポリープである、実施形態５または６に記載の方法。
【００５９】
１１．治療有効量の細菌の前記投与によって、ポリープ内有糸分裂活性が低減される、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
【００６０】
１２．ポリープ内有糸分裂活性の前記低減が、Ｋｉ−６７＋細胞またはＴＵＮＥＬ＋細胞の低減を含む、実施形態１１に記載の方法。
【００６１】
１３．前記ポリープが、健康な隣接組織と比較した場合にポリープ内炎症を特徴とする、実施形態５〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【００６２】
１４．治療有効量の細菌の前記投与によって、前記ポリープ内炎症が低減される、実施形態１３に記載の方法。
【００６３】
１５．ポリープ内炎症の前記低減が、マスト細胞、マクロファージ、Ｆ４／８０＋マクロファージ、好中球、Ｇｒ１＋顆粒球、樹状細胞、および炎症誘発性調節性Ｔ細胞からなる群から選択される少なくとも１種類の細胞型の密度の低減を含む、実施形態１４に記載の方法。
【００６４】
１７．治療有効量の細菌の前記投与によって、ポリープ内骨髄細胞密度、ポリープ内マスト細胞数、ポリープ内マクロファージ数、ポリープ内好中球数、ポリープ内樹状細胞数、またはポリープ内好中球数が低減される、実施形態５〜１０または１３〜１５のいずれか１つに記載の方法。
【００６５】
１８．治療有効量の細菌の前記投与によって、脾臓サイズ、脾臓マクロファージ数、または脾臓顆粒球数を低減される、実施形態１〜１７のいずれか１つに記載の方法。
【００６６】
１９．細胞表面上のリポテイコ酸（ＬＴＡ）の提示を低減するように遺伝的に改変された前記細菌を治療有効量で哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物におけるポリポーシスを抑制する方法。
【００６７】
２０．前記哺乳動物が、ポリポーシスまたは結腸直腸癌を発症する危険因子を有する、実施形態１９に記載の方法。
【００６８】
２１．前記危険因子が、腫瘍抑制遺伝子における突然変異である、実施形態２０に記載の方法。
【００６９】
２２．前記腫瘍抑制遺伝子が、大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）遺伝子である、実施形態２１に記載の方法。
【００７０】
２３．前記対象がヒトである、実施形態１〜２２のいずれか１つに記載の方法。
【００７１】
２４．前記対象が家畜である、実施形態１〜２２のいずれか１つに記載の方法。
【００７２】
２５．前記対象が農耕動物である、実施形態１〜２２のいずれか１つに記載の方法。
【００７３】
２６．前記細菌が共生細菌である、実施形態１〜２２のいずれか１つに記載の方法。
【００７４】
２７．前記共生細菌が乳酸菌である、実施形態２６に記載の方法。
【００７５】
２８．前記乳酸菌がラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）である、実施形態２７に記載の方法。
【００７６】
２９．前記ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）がラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）である、実施形態２８に記載の方法。
【００７７】
３０．前記ラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１１５８７で寄託された、ラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＮＣＫ２０２５である、実施形態２９に記載の方法。
【００７８】
３１．前記細菌が、少なくとも１種類の他の菌株と併せて投与される、実施形態１〜３０のいずれか１つに記載の方法。
【００７９】
３２．前記少なくとも１種類の他の菌株が共生細菌である、実施形態３１に記載の方法。
【実施例】
【００８０】
実験
実施例１
結腸ポリポーシスマウスモデルを用いて、胃腸の免疫バランスのコントロールにおける腸内微生物叢の役割を調べた。ＮＣＫ２０２５の免疫調節性を分析するために、月齢５ヶ月のポリープ保持マウスを、ＮＣＫ２０２５  ５×１０８ｃｆｕの用量で経口的に毎日処置するか、または対照として４週間水を与えた。特にＬＴＡの役割に取り組むために、同様な手法で親（ｐａｒｅｎｔａｌ）アシドフィルス菌（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ＮＣＫ５６でマウスの第３群を処置した。処置から４週間後、すべてのマウスを安楽死させ、分析した。対照のＰＢＳ処置マウスと比較して、ＮＣＫ５６処置マウスのポリポーシスの変化はほとんどなかった。それと対照的に、ＮＣＫ２０２５処置マウスでは、小腸ポリープの数が減少し（図１Ａ）、結腸ポリープの数が有意に減少した（図１Ａ、Ｂ）。ＰＢＳ処置およびＮＣＫ５６処置マウスと比較して、ＮＣＫ２０２５処置マウスのポリープでは、有糸分裂活性およびアポトーシス活性が有意に減少した（図１Ｃ、Ｄ）。総合して、これらの観察から、予め確立された結腸ポリポーシスを有するマウスにおけるＮＣＫ２０２５経口的治療の治療特性、およびこのモデルにおける親アシドフィルス菌（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）株の刺激活性が実証された。Ｔｉｓｓｕｅ  Ｇｎｏｓｔｉｃｓを用いて、画像を獲得し、Ｉｍａｇｅ．Ｊを使用して解析した。独立ｔ検定によって、データを統計学的に分析した。製造元の説明書に従って、Ｋｉ−６７（ｉＨｉｓｔｏｃｈｅｍ）およびＴＵＮＥＬ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）染色を行った。
【００８１】
実施例２
結腸全体にわたるパラフィン切片の免疫蛍光染色を行い、ＮＣＫ２０２５処置マウスにおける炎症が抑制された証拠を得た。以前に、その腫瘍を促進する役割についての証拠と共に、腺腫性ポリープにおけるマスト細胞の増殖および活性化が報告された（Ｋｈａｚａｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ  ３０：４５）。炎症に対する腸内ミクロフローラの影響を評価するために、親アシドフィルス菌（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ＮＣＫ５６が与えられたマウスと比較して、ＮＣＫ２０２５で処置されたポリポーシスを有するマウスにおけるポリープ内マスト細胞密度を定量化した。ＮＣＫ２０２５が与えられたマウスにおいて、ポリポーシスを持たないマウスの結腸と同等なレベルに達する、ポリープ内マスト細胞数の有意な減少が確認されたが、ＰＢＳ処置マウスと比較して、ＮＣＫ５６処置マウスにおける変化はほとんどなかった（図２Ａ、Ｄ）。相対的に高密度のマクロファージ、好中球、および骨髄由来サプレッサー細胞でポリープは浸潤され、定量化され、したがって、Ｆ４／８０＋マクロファージおよびＧｒ１＋顆粒球のポリープ内密度に対する処置の影響が評価された。ＮＣＫ２０２５で処置した結果、Ｆ４／８０＋およびＧｒ１＋細胞のポリープ内密度は有意に減少し、健康な腸に特有のレベルに近づいた（図２Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ）。これらの細胞の密度はＮＣＫ５６処置マウスでは変化しなかった。未処置マウスと比較して、スチューデントｔ検定（両側検定，タイプ２）によってデータを分析した。以前に記述されているように（Ｇｏｕｎａｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０４：１９９７７）、凍結結腸組織の切片（厚さ５μｍ）を特異的抗体のクロロアセテートエステラーゼ（ＣＡＥ）で染色した。免疫染色一次抗体について：核を明らかにするために、ラット抗マウスＦ４／８０（Ａｂｃａｍ）、ビオチン抗マウスＧｒ１、ハムスター抗マウスＣＤ１１ｃ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ハムスターＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ５９４、抗ラットＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ストレプトアビジン４８８、および４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールジヒドロクロリド（ＤＡＰＩ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。ＴｉｓｓｕｅＧｎｏｓｔｉｃｓ  Ｔｉｓｓｕｅ／Ｃｅｌｌ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して画像を獲得し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて解析した。
【００８２】
粘膜の免疫は樹状細胞（ＤＣ）によって刷り込まれる。処置の影響を明らかにするために、常在するＤＣによってＩＬ−１０、ＩＬ−１２またはＴＮＦ−αのポリープ内での発現を決定した。ポリープ内ＤＣは全体的に、健康な隣接組織に比べてポリープ内の数が多い傾向があったが、ポリープ内で有意に高いＣＤ１０３＋ＤＣ（図３Ｄ）を除いては、この差は統計学的に有意ではなかった（図３Ａ〜Ｃ）。ＮＣＫ２０２５での処置によって、健康な野生型マウスのレベルに近いレベルにＤＣ数が下がったが、ＮＣＫ５６はほとんど影響しなかった（図３Ａ〜Ｄ）。したがって、ＤＣおよび炎症誘発性細胞のポリープ内密度の低減から、ＮＣＫ２０２５によって、ポリープ保持マウスにおける腸の病原性免疫環境をその生理学的状態へと戻すことに成功したことが示唆される。未処置マウスと比較して、スチューデントｔ検定（両側検定，タイプ２）によってデータを分析した。図２について記述されるように、免疫染色、獲得および分析を行った。抗体：ハムスター抗マウスＣＤ１１ｃ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ラット抗マウスＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ハムスターＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、抗ラットＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８。
【００８３】
実施例３
本発明者らは以前に、ポリポーシスに関連する炎症は、遺伝性ポリポーシスのマウスモデルにおいて全身性炎症となり、脾腫を発症し、かつ高レベルの血清中炎症誘発性サイトカインを発生することを報告した（Ｇｏｕｎａｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ３：ｅ２９１６）。老齢のポリープ保持マウスも脾腫を発症した（図５Ａ）。ＮＣＫ２０２５での処置によって、脾臓サイズが著しく減少し、ＮＣＫ５６での処置も同様な傾向を示したが、統計学的に有意ではなかった（図５Ａ）。脾臓サイズの減少は、ＣＤ４エフェクターＴ細胞の相対度数の増加、およびＴｒｅｇの減少（図５Ｂ）、および脾臓におけるマクロファージおよび顆粒球の減少（図５Ｃ）と相関した。ＭＬＮにおいて、類似しているが有意ではない傾向も見られた（図５Ｂ、Ｃ）。これらの変化は、血清中のＩＬ−１０ならびに炎症誘発性サイトカインのレベルの有意な低下に一致するが、ＩＬ−２２の増加に一致する（図６）。単細胞浮遊液を濾過し（４０μｍ）、Ａｃｋ溶解バッファー（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）を使用して赤血球（ＲＢＣ）を溶解した。次いで、細胞を洗浄し、次いでＦｃ  ｂｌｏｃｋ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と共にインキュベートした。死細胞を除外した（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｖｉｏｌｅｔ死細胞染色キット；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。抗体：ＣＤ１１ｃ  ＦＩＴＣ（ＨＬ３）、ＧＲ１  ＡＰＣ（ＲＢ６−８Ｃ５）、ＣＤ４  Ｐｅｒｃｐ（ＲＭ４−５）、ＣＤ２５ビオチン（７Ｄ４）、およびストレプトアビジンＦＩＴＣをＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手した；Ｆ４／８０Ｐｅｒｃｐ（ＢＭ８）およびＣＤ１１ｂＰＥ−Ｃｙ７（Ｍ１／７０）をＢｉｏｌｅｇｅｎｄから入手した。ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩでデータを獲得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を使用して解析した。製造元の説明書（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に従って、濾過した（０．２２ｍｍ）血清について、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＥＬＩＳＡを行った。Ｌｕｍｉｎｅｘ１００  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを使用して結果を得て、ｘｐｏｎｅｎｔソフトウェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して解析した。総合して、本発明者らの発見から、確立されたポリープを有するマウスにＮＣＫ２０２５を投与すると、炎症が減少し、局所性および全身性免疫のどちらもリセットされると同時に、親ＮＣＫ５６株がこのモデルにおいて中間反応をもたらしたことが実証されている。
【００８４】
実施例４
Ｔｒｅｇは、総数を増加し、かつ防御Ｔ細胞免疫を高めるが、炎症の抑制を介して癌に対して保護する、癌における２つの役割を果たす。癌および慢性的炎症において、Ｔｒｅｇは、その抗炎症性を失う。これは、ＲＯＲγｔの発現およびＦｏｘｐ３の喪失によって起こり得、ＴＨ１７細胞への変換が起こる。その代わりに、Ｔｒｅｇは、Ｆｏｘｐ３およびＲＯＲγｔを共発現し、Ｔ細胞抑制性を維持するが、炎症誘発機能を獲得する。どちらの場合にも、Ｔｒｅｇの抗炎症性の喪失は、病原性炎症の増大に寄与する重要な因子である（Ｂｌａｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０７：６４３０）。ＮＣＫ２０２５で処置されたマウスにおける炎症の減少を考慮して、本発明者らは、ＮＣＫ２０２５での処置は、Ｔｒｅｇ抗炎症性の回復に寄与すると仮定した。腸組織の免疫染色から、ＮＣＫ２０２５処置マウスのポリープにおけるＦｏｘｐ３＋細胞密度の低減が明らかとなった（図４Ｄ）。これは必ずしも、Ｔｒｅｇの防御サブセットに対する病原性サブセットの相対的比率を伝えるものではない。実際に、ＮＣＫ２０２５処置マウスは、ポリープ浸潤性Ｆｏｘｐ３＋ＲＯＲγｔ−ｂｏｎａ  ｆｉｄｅ  Ｔｒｅｇの密度の有意な増加（図４Ｅ）、およびＦｏｘｐ３＋ＲＯＲγｔ＋炎症誘発性Ｔｒｅｇの密度の相当する低下（図４Ｆ）を示し；親ＮＣＫ５６で処置されたマウスは中間反応を示した（図４Ｅ、Ｆ）。ＲＯＲγｔ発現性非Ｔｒｅｇのレベルは、ＮＣＫ２０２５と共に変化せず、炎症誘発性ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋Ｔ細胞は減少した（図４Ｇ、Ｈ）。これらの観察から、ＮＣＫ２０２５処置マウスのポリープ微小環境における炎症性Ｔｒｅｇから抗炎症性Ｔｒｅｇへのバランスのシフト、それに相当する炎症性ヘルパーＴ細胞の低減がはっきりと示されている。本発明者らの発見は、Ｔｒｅｇサブセットを個々に分析する重要性を強調し、ポリポーシスのマウスにおけるＴｒｅｇ防御機能の向上においてＮＣＫ２０２５を関係づける。未処置マウスと比較して、スチューデントｔ検定（両側検定，タイプ２）によってデータを分析した。図３について記述されるように、免疫染色、獲得および分析を行った。抗体：マウス抗マウスＣＤ４（Ａｂｃａｍ）、ラット抗マウスＩＦＮ−γ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ラット抗マウスＦｏｘｐ３（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ウサギ抗マウスＲｏＲγ、抗ラットＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、抗マウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ５９４、抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８。
【００８５】
したがって、前癌性結腸ポリープを有するマウスにおける病的炎症は、有益な微生物での経口的処置によって防御モードにリセットされ得る。健康な腸の免疫は、病原性炎症プロセスを縮小しながら、病原体に対する正確かつ迅速な防御反応を可能にする平衡状態で保たれる。このバランスは、微生物叢により誘発される炎症、およびＴｒｅｇによる炎症のＩＬ−１０依存性抑制を介して達成される。炎症誘発性および抗炎症性ＣＤ４＋Ｔ細胞のどちらも、ＣＤ１１ｃ＋ＤＣとの相互作用によって分化し、活性化される。調節性または炎症誘発性ＤＣは、胸腺外Ｔｒｅｇの産生を誘発するＩＬ−１０などのサイトカイン、およびＴＨ１またはＴＨ１７系統にＴ細胞を委ねるＩＬ−１２およびＴＮＦ−αなどの炎症誘発性サイトカインのその発現によって認識される（３６、３７）。腸由来のＤＣは、ＣＤ１０３およびレチノイン依存性様式においてこれらのＴ細胞への腸ホーミング性のインプリントにおいて重要な役割を果たす（Ｍｏｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  ４２４：８８）。ホスホグリセロールトランスフェラーゼの遺伝子の欠失によるＬＴＡの減少によって、アシドフィルス菌（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）の相互作用の免疫刺激成分が除去され、炎症および免疫の質の変化が腸に生じる。腸ならびに脾臓における炎症誘発性細胞の密度が減少すると同時に、エフェクターＴ細胞の相対密度が増加し、Ｔｒｅｇが減少する。これらの変化は、ＮＣＫ２０２５処置マウスにおける健康な免疫のリセットを反映する。この処置の興味深い成果は、ポリープ浸潤性Ｔｒｅｇサブセットの変化であった。癌の炎症はＴｒｅｇによって調節され、ポリポーシスおよび癌において、Ｔｒｅｇは炎症誘発性表現型に戻る傾向がある（Ｇｏｕｎａｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６９：５４９０）。本発明の研究において、ＮＣＫ２０２５での経口的処置によって、炎症誘発性Ｔｒｅｇに対して抗炎症性Ｔｒｅｇの割合が有意に増加した。本発明者らは、この変化が、病原性炎症から、腸内の健康なレベルの炎症に戻すのに重要であると予想する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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