(57)【要約】【課題】  各種の病気を予防するワクチンは、水産動物の養殖において有用であり、注射ワクチンや浸漬ワクチン、経口ワクチンが開発されている。しかし、経口ワクチンは労力がかからず大量投与ができるために有用であるが、その効果がほとんどないために一部の水産動物の病気にのみ使用されているが現状である。本発明は、ワクチンを内水相に封じ込めたＷ／Ｏエマルション又はＷ／Ｏ／Ｗエマルションを安定に調製することにより、保存安定性に優れた水産動物用経口ワクチンを提供することにあり、また、このエマルションの経口ワクチンを水産動物用飼料、栄養補給製剤、免疫賦活製剤に配合することで簡単に経口で摂取させることが可能となり、水産動物の病気を予防することを目的とする。【解決手段】  ポリグリセリン縮合リシノレイン酸エステルを含有させることにより上記課題を解決する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
内水相にワクチンを含有するＷ／Ｏエマルション相からなる水産動物用経口ワクチン。
【請求項２】
乳化剤としてポリグリセリン縮合リシノレイン酸エステルを使用することを特徴とする請求項１記載のＷ／Ｏエマルション相を含有する水産動物用経口ワクチン。
【請求項３】
多価不飽和脂肪酸を含有する油脂を油相とする請求項１または２記載のＷ／Ｏエマルション相を含有する水産動物用経口ワクチン。
【請求項４】
ワクチンを含む水相を、多価不飽和脂肪酸を含有する油脂にポリグリセリン縮合リシノレイン酸エステルを添加した油相に混合してＷ／Ｏエマルションを得、次いでこのＷ／Ｏエマルションを親水性食品用乳化剤を含む水相と混合してＷ／Ｏ／Ｗエマルションとすることを特徴とする請求項１〜３いずれか記載の水産動物用経口ワクチン。
【請求項５】
請求項１〜４いずれか記載の水産動物用経口ワクチンを含有する水産動物用飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクチンをＷ／Ｏエマルションとする水産動物用経口ワクチンに関するものである。さらに詳しくはワクチンを含有する水相Ｗを、ポリグリセリン縮合リシノレイン酸エステルを添加した油脂相に混合してＷ／Ｏエマルションを得、次いでこのＷ／Ｏエマルションを、親水性食品用乳化剤を添加した最外水相Ｗに均一に分散させてＷ／Ｏ／Ｗエマルションとすることにより、経口摂取できる水産動物用経口ワクチン及びワクチンを含有する水産動物用飼料の製造方法に関するものであり、具体的には、製造したＷ／Ｏエマルション又はＷ／Ｏ／Ｗエマルションの経口ワクチンを摂取しやすいペレットや粉末の飼料に配合することを特徴とし、主に養殖魚などの水産動物の飼料分野に利用できるものである。
【背景技術】
【０００２】
従来から養殖魚の病気を予防する方法としてワクチンが知られており、主に不活性化した病原菌から調製される浸漬ワクチン、経口ワクチン、注射ワクチンの３種類がある。この内、注射ワクチンは対象魚の腹腔内にワクチン液を注射する方法であり、他の方法よりも最も高い効果が得られる反面、魚に対するストレスが大きくまた大量処理や稚魚への投与が難しい欠点をもっている。また、この注射ワクチンの内、更に免疫力を増強させるためにアジュバンド（ワクチン効果促進物質）を添加した注射用のＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションワクチンが開発されているが、安全性が問題であるアジュバンドが残留する課題が解決されておらず我が国ではほとんど実用化されていないのが現状である。このために、注射ワクチンよりも労力がかからず大量の魚を処理できる浸漬ワクチンが開発されているが、魚を浸漬処理しなければならない作業を必要とする。
一方、経口ワクチンは、餌に混合して魚に食べさせるために大量投与に優れており最も望まれている方法であるが、注射ワクチンや浸漬ワクチンよりも免疫持続期間が短く効果も低い理由から、ほとんどの病気に対してその効果がないために実用化されていないのが現状である。
これまでのホルマリンなどで不活性化した病原菌からなる経口ワクチンは、経口で摂取しても、ワクチンが体内に吸収されないために免疫効果が出現しないものであった。そのために養殖魚のワクチン投与法は、注射ワクチンや浸漬ワクチンの研究開発が中心であり、一部の病気にしか予防効果が期待できない経口ワクチン法の開発はほとんど行われていない。
ワクチンを乳化させて投与する方法として、オイルアジュバンドを添加した注射用のＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションワクチン（例えば、特許文献１参照。）が知られているが、投与部位においてアジュバンドが残留し、しかも腹壁と内臓の癒着などの副作用があるためにその安全性が問題となっており、特に内臓を食するアユなどの魚には適用できない問題もある。更に、毒性の強く安全性に問題がある細菌由来のリポポリサッカライドなどのアジュバンドを含む注射用のＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションワクチンを経口で投与することは、養殖魚の生存率が低下する問題や副作用のあるアジュバンドの残留した養殖魚を人が食することになるために、応用することができないものであった。また、注射用のＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションワクチンに使用される油は、流動パラフィンなどの鉱物油、オリーブ油やヒマワリ油などの植物油、スクワレン、スクワランなどが用いられているが、過酸化物価が低く、酸化安定性にすぐれたものでなければならない問題があった。また注射用ワクチンは、注射できるような粘度の液体でなければならず、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションワクチンに使用できる油と乳化剤を選定しなければならない問題があった。
【０００３】
【特許文献１】特開２００１−１３１０８７号公報（第４−１４頁）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、水産動物の病気を予防するために、従来経口で吸収されなかったワクチンが体内に吸収されて免疫効果を高めて病気になりにくい経口ワクチンを開発することにある。また、注射用のＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションワクチンが有するアジュバンドに起因する安全性の問題が全くなく、内臓を食する魚にも適用できる経口ワクチン製剤を開発することにある。すなわち、注射用のＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションワクチンに使用されているアジュバンドを実質的に含有しないで、またそれに使用する油としては、不適当であった酸化されやすく、増粘しやすい魚油などの油脂（トリグリセリド）を用いて経口ワクチンを開発することにある。
具体的には、多価不飽和脂肪酸を含有する油脂と食品用乳化剤を用いて、ワクチンを内水相に封じ込めたＷ／Ｏエマルション又はＷ／Ｏ／Ｗエマルションを調製することにより、経口ワクチンを提供することにある。また、これらのＷ／Ｏエマルション又はＷ／Ｏ／Ｗエマルションからなる経口ワクチンを飼料に配合した時に、そのエマルションが破壊されずにワクチンが封入された状態で安定な水産動物用経口ワクチンを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記の目的を達成するために鋭意研究した結果、本発明を完成した。すなわち、本発明ではまず、ワクチンを含む内水相を親油性食品用乳化剤であるポリグリセリン縮合リシノレイン酸エステルを添加した油脂相に分散させてＷ／Ｏエマルションを作成し、得られたＷ／Ｏエマルションを、親水性食品用乳化剤を添加した水相Ｗに均一に分散することによりＷ／Ｏ／Ｗエマルションにすることにあり、これによって得られた極めて安定なＷ／Ｏエマルション又はＷ／Ｏ／Ｗエマルションを経口ワクチンとして水産動物用飼料に配合することにある。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、ワクチンをＷ／Ｏ型エマルション又はＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションの最内水相Ｗ中に、油脂を用いて抱合させることによりワクチン液を安定に封じ込めるために、水産動物用経口ワクチンとすることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明に用いられるワクチンとしては特に限定されるものではないが、種々の水産動物の病気であるビブリオ病、腸球菌症原因菌、イリドウイルス病、レッドマウス病、せっそう病、冷水性ビブリオ病、伝染性膵臓破壊死症、類結節症、α溶血性連鎖球菌症、細菌性冷水病、細菌性出血性腹水病、エドワジェラ症、伝染性造血器壊死症、リンホシスチス病、ウイルス性腹水症、ウイルス性神経壊死症の原因となる細菌やウイルスの病原体を懸濁した水溶液が挙げられ、これらは不活性化した又は活性化しない細菌、ウイルス粒子、マイコプラズマ、サブユニットワクチンといった病原体の感染予防因子などが挙げられ、これらは単独でも数種混合しても使用することができる。
【０００８】
本発明の経口ワクチンを投与する魚類としては特に限定されるものではないが、サケ、ギンザケ、アユ、ブリ、マダイ、クロダイ、スズキ、ニジマス、マス類、ヒラメ、マアジ、シマアジ、マハタ、トラフグ、ウナギ、フナ、イトウ、カレイ、ホンモロコ、ナマズ、カジカ、ハマチ、カンパチ、アマゴ、ヒラマサ、ドジョウ、チョウザメなどの他に金魚、コイ、グッピー、エンゼルフィシュなどの観賞魚やスッポン、クルマエビ、エビ類などにも使用することができる。また、その他のアワビ、アサリ、イカ、タコ、カニなどの水産動物にも使用することができる。
【０００９】
本発明におけるこれらのワクチンを含む水相を分散させる油脂としては、多価不飽和脂肪酸を含有する油脂が好ましく、中でも望ましくはイワシ油、カツオ油、カレイ油、マグロ油、サケ油、サバ油、サンマ油、ニシン油、ボラ油、マアジ油、メンヘンデーン油などの魚油、サメ類の肝油、エイ類の油、イカ油、アザラシ、アシカ、鯨などの海獣油からなる水産動物油脂が挙げられる。また多価不飽和脂肪酸としては、特に限定されるものではないが、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、アラキドン酸などが挙げられ、水産動物に対する摂餌誘因の点よりドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸が好ましい。これらは単品でも、数種類混合して用いることができる。また米油、菜種油、パーム油、ヤシ油、紅花油、乳脂、大豆油、コーン油、綿実油、ヒマワリ油、オリーブ油などの植物油脂、乳脂、牛脂、豚脂、羊脂、馬油、チキン油などの動物油脂が挙げられるが、これらの油脂は水産動物がエサとしての嗜好性が劣るために単品で使用するよりは水産動物油脂と混合して使用することが好ましい。
【００１０】
本発明におけるワクチンを含有する水相Ｗと油脂相からなるＷ／Ｏエマルションの調製には、乳化剤として親油性食品用乳化剤であるポリグリセリン縮合リシノレイン酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステルが挙げられるが、ポリグリセリン縮合リシノレイン酸エステルが好ましい。このポリグリセリン縮合リシノレイン酸エステルは特に限定するものではないが、Ｗ／Ｏ乳化の安定性の点から、好ましくはポリグリセリンのグリセリン縮合度は２量体〜６量体、さらに好ましくは４量体〜６量体であり、縮合リシノレイン酸の縮合度は２〜８、好ましくは６〜８のものを使用すると耐酸性、耐塩性に優れた安定なエマルションを得ることができる。使用するポリグリセリン縮合リシノレイン酸エステルの添加量は特に限定するものではないが油脂に対して０．５〜１０重量％、好ましくは０．５〜５重量％であることが望ましい。
【００１１】
本発明においてＷ／Ｏエマルションの調製にあたっては油脂を５０〜８０℃、好ましくは６０〜８０℃、さらに好ましくは７０〜８０℃に加温して液状にしたものにポリグリセリン縮合リシノレイン酸エステルを加え均一分散後、３０〜８０℃で油脂にワクチンを含有する水溶液を逐次添加して分散させＷ／Ｏエマルションを作成し、Ｗ／Ｏ型経口ワクチンとする。Ｗ／Ｏエマルション作成時の温度については、使用する油脂の融点と凝固点を考慮して、融点又は凝固点より高い温度で行うのが望ましい。Ｗ／Ｏ比については目的に応じて異なるが、水相：油相＝９：１〜１：９程度の混合割合が適している。このＷ／Ｏエマルション作成にはホモミキサー等の攪拌機を用いて、内水相Ｗの平均径が０．１〜５０μｍ、好ましくは１〜１０μｍ程度になるように行うのが望ましく、より好ましくは１〜５μｍ程度になるように行うのが望ましい。ＴＫホモミキサー（特殊機化工業製）を用いて行う場合は５０００ｒｐｍで５分程度でよい。攪拌中の内水相の水滴は光学顕微鏡（倍率１００〜５００倍）で観察し、最も好ましい径になる条件を設定する。
【００１２】
本発明において上述のようにして得られたＷ／Ｏエマルションを外水相に均一に分散させる際の条件としては特に限定するものではないが、使用する油脂の融点と凝固点を考慮して、融点又は凝固点より高い温度で行うのが望ましい。上記で得られたＷ／Ｏエマルションを融点又は凝固点より高い温度に保温し、直ちに親水性食品用乳化剤を添加した水相（外水相）Ｗに混入し、ホモミキサー等の攪拌機もしくはホモジナイザー等の乳化機を用いて混合し、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションを作成し、Ｗ／Ｏ／Ｗ型経口ワクチンとする。本発明で使用される親水性食品用乳化剤とは特に限定するものではないが、シュガーエステル、レシチン、ポリグリセリン脂肪酸エステル、カゼインナトリウム等があげられ、好ましくは親水性食品用乳化剤はあらかじめ水相に添加しておくことが好ましく、Ｗ／Ｏエマルションをこのような外水相に均一に分散させる際には攪拌作用、若しくは乳化作用を強くしすぎるとＷ／Ｏエマルションが過度に破壊されて微細な滴になりワクチンを滴内に封入することができなくなり、ワクチンが外水相に移行するので留意する必要がある。このために、適度な攪拌又はホモジナイズの条件を設定すると良い。具体的に例示すればＴＫホモミキサーを用いて１００００ｒｐｍで１分程度で調製できる。Ｗ／Ｏの平均径が０．１〜６０μｍ、好ましくは１〜２０μｍ程度になるように行うのが望ましく、より好ましくは１〜１０μｍ程度になるように行うのが望ましく、光学顕微鏡（倍率１００〜５００倍）で観察し、最も好ましい径になる条件を設定する。
上述のように、ワクチンを内封したＷ／Ｏエマルション滴の安定したＷ／Ｏ型エマルション又はＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションからなる水産動物用経口ワクチンを得ることができる。
【００１３】
本発明のＷ／Ｏ型エマルション又はＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションからなる経口ワクチンは、水産動物用飼料、ビタミンやミネラルの栄養補給製剤、キノコなどの免疫賦活製剤と混合して経口で水産動物に食べさせることができるために、注射ワクチンなどのように大きな労力を必要としない方法であり、大量投与に優れている最も望ましい方法であることがわかる。
本発明のＷ／Ｏ型エマルション又はＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションからなる水産動物用経口ワクチンは、注射ワクチンと同様な効果をもつことが分かった。この詳細なメカニズムは不明であるが、ワクチンが内封されたＷ／Ｏの形で体内に吸収されるために注射ワクチンと同様な効果を示すものと推測される。
以下に実施例を示して本発明とその効果を具体的に説明するが、本発明はこれに制限さ
れるものではない。
【実施例】
【００１４】
実施例１
ホルマリンによって不活性化したアユビブリオ病原因菌を１％食塩水に懸濁分散させた菌液（１０６／ｍｌ）Ｗを１０ｍｌ調製した。魚油２０ｇに縮合リシノレイン酸ヘキサグリセリン（太陽化学製  サンソフト＃８１８ＳＫ）１ｇを加え、６０℃に加温してホモミキサーで（３０００ｒｐｍ、５分）十分に溶解させた。ビブリオ病原因菌液Ｗを上記の食品用乳化剤を溶解させた魚油に逐次添加し、３０℃にてホモミキサーで（５０００ｒｐｍ、５分）乳化させＷ／Ｏエマルションの経口ワクチンを３０ｇ得た。このＷ／Ｏエマルションの経口ワクチンを４０℃で１ケ月保存しても分離は全く確認されず、光学顕微鏡（倍率３００倍）で観察したところ内相平均径約３μｍのＷ／Ｏ型エマルションを保持していることが確認された。
【００１５】
実施例２
実施例１と全く同様に実施して、アユビブリオ病原因菌液のＷ／Ｏエマルションの経口ワクチンを３０ｇ得た。このＷ／Ｏエマルションの経口ワクチン１０ｇを飼料用魚粉１００ｇにミキサーで混合し、Ｗ／Ｏエマルションの経口ワクチンを均一に分散した魚用飼料を調製した。この魚用飼料を光学顕微鏡（倍率３００倍）で観察したところ、内相平均径約３μｍのＷ／Ｏ型エマルションを保持していることが確認された。
【００１６】
実施例３
ホルマリンによって不活性化したサケビブリオ病原因菌を１％食塩水に懸濁分散させた菌液（１０７／ｍｌ）Ｗを１０ｍｌ調製した。魚油２０ｇに縮合リシノレイン酸ヘキサグリセリン（太陽化学製  サンソフト＃８１８ＳＫ）１ｇを加え、６０℃に加温してホモミキサーで（３０００ｒｐｍ、５分）十分に溶解させた。サケビブリオ病原因菌液Ｗを上記の食品用乳化剤を溶解させた魚油に逐次添加し、３０℃にてホモミキサーで（５０００ｒｐｍ、５分）乳化させＷ／Ｏエマルションを３０ｇ得た。
次いで、ペンタグリセリンモノステアリン酸エステル（太陽化学製  サンソフトＡ−１８１Ｅ）１ｇを添加した水溶液１００ｍｌ（外水相Ｗ）に、３０℃の温度下で上記Ｗ／Ｏエマルション３０ｇを添加しホモミキサーで（１００００ｒｐｍ、１分）乳化を行い、エマルションを１３０ｇ得た。このエマルションを光学顕微鏡（倍率３００倍）で観察したところＷ／Ｏ／Ｗエマルションの経口ワクチンであることが確認された。
このＷ／Ｏ／Ｗエマルションの経口ワクチンを４０℃で１ケ月保存しても分離は全く確認されず、光学顕微鏡（倍率３００倍）で観察したところ、平均粒径約５μｍのＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションを保持していることが確認された。
【００１７】
実施例４
実施例３と全く同様に実施して、サケビブリオ病原因菌液のＷ／Ｏ／Ｗエマルションの経口ワクチンを約１３０ｇ得た。このＷ／Ｏ／Ｗエマルションの経口ワクチン３０ｇを飼料用魚粉１００ｇにホモミキサーで混合し、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションの経口ワクチンを均一に分散した後、減圧乾燥して外水相Ｗの水分を除去して魚用飼料を調製した。この魚用飼料を光学顕微鏡（倍率３００倍）で観察したところ、平均粒径約５μｍのＷ／Ｏ型エマルションを保持していることが確認された。  
【００１８】
実施例５
ホルマリンによって不活性化したアユシュードモナス病原因菌を１％食塩水に懸濁分散させた菌液（１０７／ｍｌ）Ｗを１０ｍｌ調製した。イカ油２０ｇに縮合リシノレイン酸ヘキサグリセリン（太陽化学製  サンソフト＃８１８ＳＫ）１ｇを加え、６０℃に加温してホモミキサーで（３０００ｒｐｍ、５分）十分に溶解させた。アユシュードモナス病原因菌液Ｗを上記の食品用乳化剤を溶解させたイカ油に逐次添加し、３０℃にてホモミキサーで（５０００ｒｐｍ、５分）乳化させＷ／Ｏエマルションを３０ｇ得た。
次いで、ペンタグリセリンモノステアリン酸エステル（太陽化学製  サンソフトＡ−１８１Ｅ）１ｇを添加した水溶液１００ｍｌ（外水相Ｗ）に、３０℃の温度下で上記Ｗ／Ｏエマルション３０ｇを添加しホモミキサーで（１００００ｒｐｍ、１分）乳化を行い、エマルションを１３０ｇ得た。このエマルションを光学顕微鏡（倍率３００倍）で観察したところＷ／Ｏ／Ｗエマルションの経口ワクチンであることが確認された。
このＷ／Ｏ／Ｗエマルションの経口ワクチンを４０℃で１ケ月保存しても分離は全く確認されず、光学顕微鏡（倍率３００倍）で観察したところ、平均粒径約４μｍのＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションを保持していることが確認された。
【００１９】
比較例１
縮合リシノレイン酸ヘキサグリセリンの代わりに大豆レシチン（太陽化学製  サンレシチンＬ−８）を使用した以外は実施例１と同様の調製法を行った。すなわち、不活性化したアユビブリオ病原因菌を１％食塩水に懸濁分散させた菌液（１０６／ｍｌ）Ｗを１０ｍｌ調製した。魚油２０ｇに大豆レシチン（太陽化学製  サンレシチンＬ−８）１ｇを加え、６０℃に加温してホモミキサーで（３０００ｒｐｍ、５分）十分に溶解させた。アユビブリオ病原因菌液Ｗを上記の食品用乳化剤を溶解させた魚油に逐次添加し、３０℃にてホモミキサーで（５０００ｒｐｍ、５分）乳化させＷ／Ｏエマルションの経口ワクチンを３０ｇ得た。
このＷ／Ｏエマルションの経口ワクチンを４０℃で１ケ月保存したところ、下層に分離した水相が観察された。また、光学顕微鏡（倍率３００倍）で観察したところＷ／Ｏ型エマルションが破壊されていることが確認された。
【００２０】
比較例２
比較例１と全く同様に実施して、アユビブリオ病原因菌液のＷ／Ｏエマルションの経口ワクチンを３０ｇ得た。このＷ／Ｏエマルションの経口ワクチン１０ｇを飼料用魚粉１００ｇにミキサーで混合し、Ｗ／Ｏエマルションの経口ワクチンを均一に分散した魚用飼料を調製した。この魚用飼料を光学顕微鏡（倍率３００倍）で観察したところＷ／Ｏ型エマルションがほとんど認められず、破壊されていることが分かった。
【００２１】
比較例３
縮合リシノレイン酸ヘキサグリセリンの代わりに大豆レシチン（太陽化学製  サンレシチンＬ−８）を使用した以外は実施例３と同様の調製法を行った。すなわち、
ホルマリンによって不活性化したサケビブリオ病原因菌を１％食塩水に懸濁分散させた菌液（１０７／ｍｌ）Ｗを１０ｍｌ調製した。魚油２０ｇに大豆レシチン１ｇを加え、６０℃に加温してホモミキサーで（３０００ｒｐｍ、５分）十分に溶解させた。サケビブリオ病原因菌液Ｗを上記の食品用乳化剤を溶解させた魚油に逐次添加し、３０℃にてホモミキサーで（５０００ｒｐｍ、５分）乳化させＷ／Ｏエマルションを３０ｇ得た。
次いで、ショ糖モノステアリン酸エステル（太陽化学製  サンソフトＳＥ−１６）１ｇを添加した水溶液１００ｍｌ（外水相Ｗ）に、３０℃の温度下で上記Ｗ／Ｏエマルション３０ｇを添加しホモミキサーで（１００００ｒｐｍ、１分）乳化を行い、エマルションを１３０ｇ得た。このエマルションを光学顕微鏡（倍率３００倍）で観察したところＷ／Ｏ／Ｗエマルションはほとんど認められず、Ｏ／Ｗエマルションであることが分かった。
【００２２】
比較例４
縮合リシノレイン酸ヘキサグリセリンの代わりにモノステアリン酸グリセリン（太陽化学製  サンソフトＮｏ．８０００）を使用する以外は実施例５と同様の調製法を行った。
すなわち、イカ油２０ｇにモノステアリン酸グリセリン（太陽化学製  サンソフトＮｏ．８０００）１ｇを加え、６０℃に加温してホモミキサーで（３０００ｒｐｍ、５分）十分に溶解させた。不活性化したアユシュードモナス病原因菌を１％食塩水に懸濁分散させた菌液（１０７／ｍｌ）Ｗの１０ｍｌを上記の食品用乳化剤を溶解させたイカ油に逐次添加し、３０℃にてホモミキサーで（５０００ｒｐｍ、５分）乳化させＷ／Ｏエマルションを３０ｇ得た。
次いで、ペンタグリセリンモノステアリン酸エステル（太陽化学製  サンソフトＡ−１８１Ｅ）１ｇを添加した水溶液１００ｍｌ（外水相Ｗ）に、３０℃の温度下で上記Ｗ／Ｏエマルション３０ｇを添加しホモミキサーで（１００００ｒｐｍ、１分）乳化を行い、エマルションを１３０ｇ得た。このエマルションを光学顕微鏡（倍率３００倍）で観察したところＷ／Ｏ／Ｗエマルションは、ほとんど認められずＯ／Ｗエマルションであることが分かった。
【００２３】
本発明の実施例から明らかなように、本発明品は、比較例に比してＷ／Ｏエマルション又はＷ／Ｏ／Ｗエマルションが形成され、安定にワクチン液が封じ込められていることが確認された。ワクチン液が油脂相に封じ込められていることによってＷ／Ｏエマルション相が飼料中でも安定に保持されるものである。
【００２４】
本発明の実施態様をあげれば以下の通りである。
（１）  ワクチンを含有する水相Ｗを、親油性食品用乳化剤のポリグリセリン縮合リシノレイン酸エステルを添加した油脂相に混合してＷ／Ｏ型エマルションにすることを特徴とする水産動物用経口ワクチンの安定化方法。
（２）  ワクチンを含有する水相Ｗを、親油性食品用乳化剤のポリグリセリン縮合リシノレイン酸エステルを添加した油脂相に混合してＷ／Ｏ型エマルションを生成し、次いで得られたＷ／Ｏ型エマルションを、親水性食品用乳化剤を添加した水相に均一に分散させＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションにすることを特徴とする水産動物用経口ワクチンの安定化方法。
（３）  ワクチンを含有する水相Wを、ポリグリセリンが４量体から６量体であるポリグリセリン縮合リシノレイン酸エステルを添加した油脂相に混合してＷ／Ｏ型エマルションにすることを特徴とする水産動物用経口ワクチンの安定化方法。
（４）  ワクチンを含有する水相Ｗを、ポリグリセリンが４量体から６量体であるポリグリセリン縮合リシノレイン酸エステルを添加した油脂相に混合してＷ／Ｏ型エマルションを生成し、次いで得られたＷ／Ｏ型エマルションを、親水性食品用乳化剤を添加した水相に均一に分散させＷ／Ｏ／Ｗ型マルションにすることを特徴とする水産動物用経口ワクチンの安定化方法。
（５）  ワクチンを含有する水相Ｗを、縮合リシノレイン酸の縮合度が６〜８であるポリグリセリン縮合リシノレイン酸エステルを添加した油脂相に混合してワクチンを含有するＷ／Ｏ型エマルションにすることを特徴とする水産動物用経口ワクチンの安定化方法。
（６）  ワクチンを含有する水相Ｗを、縮合リシノレイン酸の縮合度が６〜８であるポリグリセリン縮合リシノレイン酸エステルを添加した油脂相に混合してワクチンを含有するＷ／Ｏ型エマルションを生成し、次いで得られたＷ／Ｏエマルションを、親水性食品用乳化剤を添加した水相に均一に分散させＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションにすることを特徴とする水産動物用経口ワクチンの安定化方法。
（７）  ポリグリセリンが４量体から６量体であり、縮合リシノレイン酸の縮合度が６〜８であるポリグリセリン縮合リシノレイン酸エステルを添加する油脂が多価不飽和脂肪酸を含有する油脂であることを特徴とするＷ／Ｏ型エマルションの水産動物用経口ワクチンの安定化方法。
（８）  ワクチンを含有する水相を、ポリグリセリンが４量体から６量体であり、縮合リシノレイン酸の縮合度が６〜８であるポリグリセリン縮合リシノレイン酸エステルを添加する油脂が多価不飽和脂肪酸を含有する油脂であることを特徴とするＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションの水産動物用経口ワクチンの安定化方法。
（９）  ワクチンを含有する水相と、ポリグリセリンが４量体から６量体であり、縮合リシノレイン酸の縮合度が６〜８であるポリグリセリン縮合リシノレイン酸エステルを添加した多価不飽和脂肪酸を含有する油脂相に混合してＷ／Ｏ型エマルションにした経口ワクチンを水産動物用飼料、栄養補給製剤、免疫賦活製剤に配合することを特徴とする水産動物用経口ワクチンの安定化方法。
（１０）ワクチンを含有する水相を、ポリグリセリンが４量体から６量体であり、縮合リシノレイン酸の縮合度が６〜８であるポリグリセリン縮合リシノレイン酸エステルを添加した多価不飽和脂肪酸を含有する油脂相に混合してＷ／Ｏ型エマルションを生成し、次いで得られたＷ／Ｏ型エマルションを、親水性食品用乳化剤を添加した水相に均一に分散させＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションにした経口ワクチンを水産動物用飼料、栄養補給製剤、免疫賦活製剤に配合することを特徴とする水産動物用経口ワクチンの安定化方法。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
本発明は、ワクチンをＷ／Ｏ型エマルション又はＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションの最内水相Ｗ中に、油脂を用いて抱合させることによりワクチン液を安定に封じ込めるために、水産動物用経口ワクチンとすることが可能となり、これらを水産動物用飼料、栄養補給剤、免疫賦活剤に配合することでいろいろな水産動物の病気を予防することができる。