(57)【要約】  本願は、標的種の電気化学的検出に使用するための電極であって、電極が平面を有し、その上に標的種に選択的に結合可能なプローブ分子が配置され、プローブ分子と標的種との結合前の電極が、電極の面積当たりに、１０メガオームｃｍ−２から９５メガオームｃｍ−２の電子移動抵抗を有する電極に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的種の電気化学的検出に使用するための電極であって、前記電極が平面を有し、前記平面上に前記標的種に選択的に結合可能なプローブ分子が配置され、前記プローブ分子と前記標的種との結合前の前記電極が、前記電極の面積当たりに、１０メガオームｃｍ−２から９５メガオームｃｍ−２の電子移動抵抗を有する、
電極。
【請求項２】
前記標的種が、Ｃ反応性タンパク質を含むか、または、Ｃ反応性タンパク質である、請求項１記載の電極。
【請求項３】
前記プローブ分子が、抗体および／または抗体フラグメントを含むか、または、抗体および／または抗体フラグメントである、請求項１または請求項２記載の電極。
【請求項４】
前記抗体または抗体フラグメントが、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭから選択されるクラスのものである、請求項３記載の電極。
【請求項５】
前記プローブ分子と前記標的種との結合前の前記電極が、前記電極の面積当たりに、５５メガオームｃｍ−２から９５メガオームｃｍ−２の電子移動抵抗を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の電極。
【請求項６】
前記プローブ分子と前記標的種との結合前の前記電極が、前記電極の面積当たりに、６５メガオームｃｍ−２から９０メガオームｃｍ−２の電子移動抵抗を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載の電極。
【請求項７】
前記プローブ分子と前記標的種との結合前の前記電極が、前記電極の面積当たりに、７５メガオームｃｍ−２から８５メガオームｃｍ−２の電子移動抵抗を有する、請求項１から６のいずれか一項に記載の電極。
【請求項８】
前記電極が、遷移金属を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の電極。
【請求項９】
前記電極が、金、レニウム、イリジウム、パラジウム、白金、銅、インジウム、ルビジウムおよび銀から選択される金属を含む、請求項８記載の使用のための電極。
【請求項１０】
前記プローブ分子が、式Ａ−Ｌ−Ｂのものであり、Ａが、前記電極の表面に結合する部分であり、Ｌが、リンカー部分であり、Ｂが、前記標的種に選択的に結合する部分である、請求項１から９のいずれか一項に記載の電極。
【請求項１１】
Ａが、ビオチン、ヒドラジン、アルキニル、アルキルアジド、アミノ、ヒドロキシル、カルボキシ、チオール、アルデヒド、ホスホイノチオエステル、マレイミジル、スクシニル、スクシンイミジル、イソシアネート、エステル、ストレプトアビジン、アビジン、ニューアビジン（ｎｅｕａｖｉｄｉｎ）およびビオチン結合タンパク質から選択される、請求項１０記載の電極。
【請求項１２】
Ｌが、炭化水素部分を含む、請求項１０または請求項１１記載の電極。
【請求項１３】
Ｌが、少なくとも１０個の炭素を含むアルキレン部分を含む、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の電極。
【請求項１４】
Ｌが、式−（ＣＨ２）ｎ−（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−）ｍ−Ｄ−のものであり、式中、ｎが、１から３０であり、ｍが、０から１０であり、Ｄが、Ｂに結合する基である、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の電極。
【請求項１５】
Ｄが、単結合、−（Ｃ＝Ｏ）−、−ＯＣＨ２−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、−ＯＣＨ２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＯＣＨ２−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−および−ＮＨ−から選択される、請求項１４記載の電極。
【請求項１６】
Ｂが、抗体、抗体フラグメント、アプタマー、オリゴ糖、ペプチドおよびタンパク質から選択される、請求項１０から１５のいずれか一項に記載の電極。
【請求項１７】
電気化学的インピーダンス分光技術において標的種を検出するための方法であって、請求項１から１６のいずれか一項に規定の電極を、前記標的種を含むキャリア媒体と接触させる工程と、作用電極において電気信号を検出する工程とを含む、
方法。
【請求項１８】
前記標的種が、Ｃ反応性タンパク質であるか、または、Ｃ反応性タンパク質を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記キャリア媒体が、体液を含む、請求項１７または請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記体液が、血液、尿、涙、唾液、汗および髄液から選択される、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記体液が、未希釈の体液である、請求項１９または請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記キャリア媒体が、さらに、酸化還元プローブを含む、請求項１７から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記方法が、さらに、前記電気信号からＣ反応性タンパク質の濃度を算出する工程を含む、請求項１７から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記方法が、さらに、前記標的種が前記プローブ分子に結合されるように、前記電極と前記標的種を含むキャリア媒体とを接触させる接触工程後に、前記プローブ分子から前記標的種を解離させる工程を含む、請求項１７から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記方法が、前記プローブ分子から前記標的種を解離させる工程後に、前記電極を電気化学的方法において再使用する工程を含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
電気化学的インピーダンス分光計であって、前記分光計が、請求項１から１６のいずれか一項に規定の電極を含む、
分光計。
【請求項２７】
Ｃ反応性タンパク質を検出するための、請求項１から１６に記載の電極または請求項２６記載の電気化学的インピーダンス分光計の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的種、例えば、制限されず、Ｃ反応性タンパク質の電気化学的検出に使用するための電極に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）は、肝臓により合成される急性期タンパク質であり、心血管疾患および炎症用のバイオマーカーとして広く受け入れられている（Ｍａｙ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ  ２００７、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００７、Ｍｙｇｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ．２０１１、Ｐａｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８）。通常、血漿中のレベルは、健康な個体については２．０ｍｇ／Ｌ未満であるが（Ｖｉｋｈｏｌｍ−Ｌｕｎｄｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｂｅｒｓ  ２００６）、炎症の急性期中には１０００倍まで増加する（Ｇａｂａｙ  ａｎｄ  Ｋｕｓｈｎｅｒ  １９９９）。米国心臓協会および米国疾病予防管理センターは、心血管疾患のリスク評価のためのＣＲＰ濃度の３つの分類：低リスクを表わす１．０ｍｇ／Ｌより低いＣＲＰ濃度、１．０から３．０ｍｇ／Ｌの範囲の平均的なリスク、および、高リスクを表わす３．０ｍｇ／Ｌを上回るレベルを提唱している（Ｋｕｓｈｎｅｒ  ａｎｄ  Ｓｅｈｇａｌ  ２００２、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１１）。この標的の信頼できる早期の定量化が可能であれば、適切な介入または処置による心血管疾患または炎症性疾患の転帰を改善する手段として引用される。
【０００３】
現在、数多くのＣＲＰ試験法が、比濁法および比濁分析の技術（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．２０００、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．２００１）または、ヒトＣＲＰ酵素結合免疫吸着アッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）のキットを使用して、臨床研究室において利用可能である。しかしながら、これらの方法は、一般的には、感度が不十分、時間がかかる、偽陰性が生じやすい、または、費用対効果がない、のいずれかであるため、臨床診察用には適していない（Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．２００６、Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００６）、圧電マイクロカンチレバー（Ｗｅｅ  ｅｔ  ａｌ．２００５）、水晶振動子マイクロバランス技術（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．２００９）、微少流体技術（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）および電気化学（Ｂｕｃｈ  ａｎｄ  Ｒｉｓｈｐｏｎ  ２００８、Ｃｅｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．２００９）に基づくＣＲＰ定量法が、過去数年の間に開発されてきた。これらの中でも、電気化学的アッセイが、低コスト、柔軟性および感度の点で最も見込みがある。特に、電気化学的インピーダンス分光法（ＥＩＳ）は、特別に調製された受容性の電極表面において結合する材料に関連する、キャパシタンスまたは電荷移動抵抗の変化を、高感度にモニターすることができ、事前の標識を必要としない（Ｂｏｇｏｍｏｌｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．２００９、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．２００５）。近年、数多くのＥＩＳによるＣＲＰアッセイが報告されてきた。しかしながら、今日まで、これらは、感度に限界がある（Ｖｅｒｍｅｅｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）、明らかに特異性がない（Ｈｅｎｎｅｓｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．２００９）または、臨床的に適切な範囲を包含しない（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００８、Ｑｕｒｅｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）、かのいずれかであった。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の主題は、臨床的に適切な範囲全体おける、全血清および希釈血清におけるＣＲＰについての堅牢で高感度なアッセイの開発に関する。この技術は、他のマーカーにも適用され得る。界面は容易に調製され、非常に良好な選択性を示し、感度の明らかな損失を伴うことなく、アッセイ後に再使用可能である。我々は、さらに、受容層の連続的に観察される感度における初期抵抗の重要性を考慮し、明確な相関だけでなく、調節する能力も説明してきた。このため、受容性のフィルム特性を最適化する。
【０００５】
第１の態様では、標的種の電気化学的検出に使用するための電極であって、標的種に選択的に結合可能なプローブ分子が配置される平面を有し、プローブ分子と標的種との結合前の電極が、電極の面積当たりに、１０メガオームｃｍ−２から９５メガオームｃｍ−２の電子移動抵抗を有する電極が提供される。実施形態では、標的種は、Ｃ反応性タンパク質であるか、もしくは、Ｃ反応性タンパク質を含み、および／または、プローブ分子は、抗体もしくは抗体フラグメントを含む。ただし、他の標的種およびプローブ分子の使用は、以下に記載される。実施形態では、Ｃ反応性タンパク質の電気化学的検出に使用するための電極であって、電極が平面を有し、その上にＣ反応性タンパク質に選択的に結合可能なプローブ分子が配置され、プローブ分子とＣ反応性タンパク質との結合前の電極が、電極の面積当たりに、１０メガオームｃｍ−２から９５メガオームｃｍ−２の電子移動抵抗を有する電極が提供される。
【０００６】
実施形態では、標的種の電気化学的検出に使用するための電極であって、電極が平面を有し、標的種に選択的に結合可能な、抗体または抗体フラグメントを含むプローブ分子が配置され、プローブ分子と標的種との結合前の電極が、電極の面積当たりに、１０メガオームｃｍ−２から９５メガオームｃｍ−２の電子移動抵抗を有する電極が提供される。
【０００７】
第３の態様では、電気化学的インピーダンス分光技術において標的種を検出するための方法であって、第１の態様に規定の電極を、標的種を含むキャリア媒体と接触させる工程と、作用電極において電気信号を検出する工程とを含む方法が提供される。
【０００８】
第３の態様では、電気化学的インピーダンス分光計であって、分光計が、第１の態様に規定の電極を含む分光計が提供される。
【０００９】
第４の態様では、標的種を検出するための、第１の態様に記載の電極または第３の態様に記載の電気化学的インピーダンス分光計の使用が提供される。
【００１０】
本発明者らは、電極の抵抗を制御することを見出してきた。抵抗の制御は、標的に結合する前のプローブ分子の被覆量に関連し、電極の感度が顕著に向上し得る。以前から、表面上のプローブ分子の被覆を増加させることにより、その感度が向上するであろうことが推定されてきた。しかしながら、本発明者らは、（初期抵抗により示される）特定のレベル以下の被覆を維持することにより、電極の感度が向上することを見出した。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、（ａ）むきだしの金電極；（ｂ）自己組織化単分子膜で被覆された金電極；および（ｃ）単分子膜上に固定化されたＣＲＰ抗体を有する金電極についての、１．０ｍＭ  Ｆｅ（ＣＮ）６３−／４−を含むＰＢＳＴ（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）溶液中で記録された種々の電極のＮｙｑｉｓｔプロットを示す。挿入図は、高周波数領域の拡大図である。
【図２】図２は、（Ａ）初期の電荷移動抵抗Ｒｃｔおよびバイオセンサの感度（感度は、初期Ｒｃｔで割られたＲｃｔの変化として決定される。）における、ＣＲＰ抗体固定化時間の効果、ならびに、（Ｂ）初期ＲＣＴと感度との間の相関関係を示す。
【図３】図３は、（Ａ）１．０ｍＭ  Ｆｅ（ＣＮ）６３−／４−を含むＰＢＳＴ（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）における種々の濃度のＣＲＰタンパク質とのインキュベート後における、バイオセンサの記録された電荷移動抵抗（Ｒｃｔ）、および、（Ｂ）種々のＣＲＰ濃度を含むＰＢＳＴ溶液中でのインキュベート後における、バイオセンサに対応するＦａｒａｄａｉｃインピーダンススペクトルを示す（曲線ｉからｖｉｉｉは、それぞれ、０、０．５、１．０、２．０、５．０、１０、２５および５０ｎＭ  ＣＲＰを表わす。）。
【図４】図４は、（Ａ）種々の溶液：  （ｉ）１．０ｍＭ  Ｆｅ（ＣＮ）６３−／４−を含むＰＢＳＴ（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）；  （ｉｉ）１．０ｍＭ  Ｆｅ（ＣＮ）６３−／４−および１０％ヒト血清を含むＰＢＳＴ（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）；  （ｉｉｉ）１．０ｍＭ  Ｆｅ（ＣＮ）６３−／４−および２０％ヒト血清を含むＰＢＳＴ（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）；において行われたＣＲＰバイオセンサについての検量線、ならびに、（Ｂ）種々のＣＲＰ濃度を有する、１．０ｍＭ  Ｆｅ（ＣＮ）６３−／４−および１０％ヒト血清を含むＰＢＳＴ溶液中でのインキュベート後における、バイオセンサに対応するＦａｒａｄａｉｃインピーダンススペクトルを示す（曲線ｉからｖｉｉｉは、それぞれ、０、０．５、１．０、２．０、５．０、１０、２５および５０ｎＭ  ＣＲＰを表わす。）。
【図５】図５は、バッファー溶液および純粋な血清におけるＣＲＰのバイオセンサ分析の比較を示す。バイオセンサを、ＣＲＰ添加バッファー溶液および純粋な血清中でそれぞれインキュベートし、インピーダンス分析を、１．０ｍＭ  Ｆｅ（ＣＮ）６３−／４−を含むＰＢＳＴ溶液中で行った。ＣＲＰを含まないバッファーまたは純粋な血清のインピーダンスレベルを、バックグラウンドとして差し引いた。
【図６】図６は、ＣＲＰバイオセンサの再生を示す。バイオセンサを、６ｍＭ  ＮａＯＨおよび０．６％エタノールに５分間、電極を浸漬することにより再生し、ついで、ＰＢＳＴで洗浄した。インピーダンス測定を、ＰＢＳＴ（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）、１．０ｍＭ  Ｆｅ（ＣＮ）６３−／４−および１０％ヒト血清を含む溶液において行った。
【図７】図７は、ＣＲＰ反応性ＥＩＳ界面の段階的な製作の模式図である。
【図８】図８は、本願明細書に記載の電極の電荷移動抵抗を測定するためのデータ適合に使用され得る等価回路モデルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、本願明細書に記載の第１から第４の態様を提供する。任意および好ましい特徴は、これから記載されるであろう。本願明細書に記載のいずれの特徴も、特に断らない限り、本願明細書に記載のいずれかの他の特徴と組み合わせられてもよい。
【００１３】
プローブ分子と標的種との結合前の電極は、好ましくは、電極の面積当たりに、９５メガオームｃｍ−２以下の電子移動抵抗を有する。プローブ分子と標的種との結合前の電極は、好ましくは、電極の面積当たりに、１０メガオームｃｍ−２以上の電子移動抵抗を有する。プローブ分子と標的種との結合前の電極は、好ましくは、電極の面積当たりに、１０メガオームｃｍ−２から９５メガオームｃｍ−２の電子移動抵抗を有する。
【００１４】
場合により、プローブ分子と標的種との結合前の電極は、電極の面積当たりに、２０メガオームｃｍ−２から９５メガオームｃｍ−２の電子移動抵抗、場合により、電極の面積当たりに、４０メガオームｃｍ−２から９５メガオームｃｍ−２の電子移動抵抗、場合により、電極の面積当たりに、５０メガオームｃｍ−２から９５メガオームｃｍ−２の電子移動抵抗、場合により、電極の面積当たりに、５５メガオームｃｍ−２から９５メガオームｃｍ−２の電子移動抵抗を有する。
【００１５】
電子移動抵抗（電荷移動抵抗と呼ばれるともある）は、公知の技術を使用して測定され得る。実施形態では、電子移動抵抗は、電極についてのインピーダンス情報を取得するための電気化学的インピーダンス分光法を使用し、理想Ｒａｎｄｌｅｓ等価回路を使用することにより測定される。等価回路は、回路の素子として、電荷移動抵抗を含む。このようなＲａｎｄｌｅｓ等価回路は、例えば、Ｖｙａｓ  ＲＮ，Ｌｉ  ＫＹ，Ｗａｎｇ  Ｂ．２０１０．Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  Ｒａｎｄｉｅｓ  Ｃｉｒｃｕｉｔ  ｆｏｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｏｘｏｍｅｔａｌａｔｅ  Ｌａｙｅｒ−ｂｙ−Ｌａｙｅｒ  Ｆｉｌｍｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂ  １１４：１５８１８−１５８２４に記載されており、同文献は、参照により本願明細書に組み込まれる。理想Ｒａｎｄｌｅｓ等価回路の例は、図８に図示される。この図において、Ｒｃｔは、電荷（または電子）移動抵抗を表わし、Ｚｗは、Ｗａｒｂｕｒｇインピーダンスを表わし、Ｒｓは、溶液抵抗であり（Ｒｓｏｌと表わされることもある）、Ｃｄｌは、電極表面と、液体状のキャリア媒体におけるイオンとの間のキャパシタンスである（これは、Ｃｓｕｒｆと表わされることもある。）。電子（または電荷）移動抵抗を取得するための回路に対してインピーダンスデータを適合させることは、当業者に公知である。それは、多くの刊行物、例えば、制限されず、Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ  １９，２００７，Ｎｏ．１２，１２３９−１２５７（Ｄａｎｉｅｌｓ，ｅｔ  ａｌにより著されたＬａｂｅｌ−ｆｒｅｅ  Ｉｍｐｅｄａｎｃｅ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ：Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓと題された文献）に記載されており、同文献は、その内容およびそれに引用された参考文献が参照により本願明細書に組み込まれる。市販のソフトウェア、例えば、Ａｕｔｏｌａｂ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手できる「Ｆｉｔ  ａｎｄ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．７」が、回路適合に利用可能である。ソフトウェアは、ＥＩＳ分光計の（例えば、Ａｕｔｏｌａｂ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓからも入手できる）周波数解析分析モジュールを付随させてもよい。
【００１６】
電極の面積当たりの電子移動抵抗は、（その上にプローブ分子を有する）電極の面積で電極の電荷移動抵抗を割ることにより決定される。この面積は、公知の技術を使用して測定され得る。実施形態では、電極の面積は、電極の有効表面積である。有効表面積は、クーロンのカソードピークの面積を取得し、
【００１７】
【数１】
2015516066.tif 000002
【００１８】
の相関関係を適用し、有効面積で電荷移動抵抗（Ｒｃｔ）を割ることにより算出され得る。Ａは、電極の有効表面積であり、Ｑは、クーロンのカソードピークの面積である（Ｈｏｏｇｖｌｉｅｔ，Ｊ．Ｃ；Ｄｉｊｋｓｍａ，Ｍ．；Ｋａｍｐ，Ｂ．；ｖａｎ  Ｂｅｎｎｅｋｏｍ，Ｗ．Ｐ．Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ２０００，７２，２０１６を参照のこと。同文献は、その内容が参照により本願明細書に組み込まれる。）。
【００１９】
電極は、任意の電気導電性材料を含み得る。作用電極は、金属またはカーボンを含み得る。金属は、元素形態の金属または金属の合金でもよい。場合により、電極全体が、金属またはカーボンを含む。電極は、遷移金属を含んでもよい。電極は、周期表のグループ９から１１のいずれかから選択される遷移金属を含んでもよい。電極は、制限されず、レニウム、イリジウム、パラジウム、プラチナ、銅、インジウム、ルビジウム、銀および金から選択される金属を含んでもよい。電極は、金、銀およびプラチナから選択される金属を含んでもよい。電極は、カーボン含有材料を含んでもよい。カーボン含有材料は縁が平坦な熱分解性グラファイト、基底が平面な熱分解性グラファイト、グラッシーカーボン、ホウ素ドープされたダイアモンド、非常に規則正しい熱分解性グラファイト、カーボン粉末およびカーボンナノチューブから選択され得る。
【００２０】
好ましい実施形態では、電極は、金を含む。
【００２１】
電極の表面は、平坦であり、通常、平面を含み、典型的には、窪み、突起および孔を含まない。このような電極表面は、プローブ分子および任意の関連するリンカー分子が、表面に結合される前に微粒子による磨き、例えば、場合により、微粒子のサイズが各研磨工程において小さくなる連続工程における微粒子によるスプレー等の技術により調製され得る。微粒子は、例えば、炭素系材料、例えば、ダイアモンドを含んでもよく、および／または、１０μｍ以下、場合により５μｍ以下、場合により３μｍ以下、場合により１μｍ以下、場合により０．５μｍ以下、場合により０．１μｍ以下の直径を有する粒子を有してもよい。研磨後に、電極表面は、例えば、超音波的に、場合により、適切な液体媒体、例えば、水中で、例えば、少なくとも１分、例えば、約１分から１０分の期間洗浄されてもよい。場合により、電極表面は、例えば、研磨後、使用される場合、超音波洗浄工程後に、研磨剤、例えば、酸溶液により洗浄されてもよい。研磨剤溶液は、適切な液体媒体、例えば、水における、無機酸、例えば、Ｈ２ＳＯ４および／または、過酸化物、例えば、Ｈ２Ｏ２を含んでもよい。場合により、電極は、電解研磨され得る。電解研磨は、微粒子による研磨、例えば、超音波洗浄、および／または、研磨剤溶液を使用した洗浄の１つ以上を含む任意の工程に続けてもよい。電解研磨は、安定した還元ピークが達成されるまで、例えば、０．５Ｖ以上、場合により１Ｖ以上、場合により１．２５Ｖ以上の上限電位、ならびに、０．５Ｖ以下、場合により０．２５Ｖ以下、場合により０．１Ｖ以下の下限電位の、上限電位と下限電位との間におけるサイクリングを含んでもよい。
【００２２】
プローブ分子は、標的種に対して選択的に結合可能である。標的種は、Ｃ反応性タンパク質でもよいし、または、Ｃ反応性タンパク質を含んでもよい。他の標的種は、以下に記載される。プローブ分子は、好ましくは、抗体、抗体フラグメント、アプタマー、オリゴ糖、ペプチドおよびタンパク質から選択される結合種を含む。好ましくは、プローブ分子は、抗体、核酸およびペプチドの１つ以上から選択される結合種を含む。結合種は、標的種、例えば、Ｃ反応性タンパク質に結合可能である。プローブ部分は、標的種、例えば、Ｃ反応性タンパク質に選択的に結合する。
【００２３】
プローブ分子が抗体または抗体フラグメントを含む場合、抗体または抗体フラグメントは、クラスＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭの１つ以上から選択され得る。好ましい実施形態では、抗体または抗体フラグメントは、ＩｇＧタイプのものである。抗体は、標的種に選択的に結合する。抗体または抗体フラグメントは、哺乳類、例えば、制限されず、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジおよびウマから選択される哺乳類に由来され得る。実施形態では、プローブ分子は、ヤギ由来のＩｇＧタイプの抗体を含む。
【００２４】
プローブ分子がアプタマーを含む場合、アプタマーは、ペプチドアプタマー、ＤＮＡアプタマーおよびＲＮＡアプタマーから選択され得る。
【００２５】
標的種は、制限されず、タンパク質、ポリペプチド、抗体、ナノ粒子、薬物、毒物、有害ガス、有害化学物質、爆発物、ウイルス粒子、細胞、多細胞生物、サイトカインおよびケモカイン、生殖母細胞、小器官、脂質、核酸配列、オリゴ糖、代謝経路の化学中間体、高分子から選択され得る。好ましい実施形態では、標的種は、生体分子、より適切には生体高分子、最も適切にはポリペプチドを含み、生体分子、より適切には生体高分子、最も適切にはポリペプチドを主成分とし、または、生体分子、より適切には生体高分子、最も適切にはポリペプチドからなる。
【００２６】
標的種がタンパク質であるか、または、タンパク質を含む場合、タンパク質は、制限されず、天然のタンパク質、変性タンパク質、タンパク質フラグメントおよび原核生物的または真核生物的に発現されたタンパク質から選択され得る。タンパク質は、当該分野において、その通常の意味を有し得る。最も好ましくは、「タンパク質」は、ポリペプチド分子を意味する。このようなポリペプチドは、グリコシル化、リン酸化等の修飾または他のこのような修飾を含んでもよい。
【００２７】
標的種が抗体である場合、抗体は、クラスＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭの１つ以上から選択され得る。
【００２８】
標的種がナノ粒子である場合、ナノ粒子は、制限されず、絶縁性、金属性または半導体性のナノ粒子の１つ以上から選択され得る。
【００２９】
標的種が薬物である場合、薬物は、制限されず、アルコール（例えば、エタノール）、アンフェタミン、硝酸アミル、ヘロイン、ケタミン、アナボリックステロイド、ＬＳＤ、溶剤、カンナビス、コカイン（例えば、塩酸コカインまたは「ｃｏｋｅ」）、タバコ、トランキライザー、クラック（すなわち、コカイン遊離塩基）、エクスタシーおよび／またはガンマヒドロキシ酪酸（ＧＨＢ）から選択され得る。または、一部の実施形態では、薬物は、医薬品でもよい。
【００３０】
標的種は、候補薬物、例えば、本発明を使用して特定の活性または特性について試験またはスクリーニングされ得る化学的または生物学的成分でもよい。
【００３１】
標的種が毒物である場合、毒物は、制限されず、動物、植物または細菌由来の１つ以上の毒物から選択され得る。
【００３２】
標的種がウイルス粒子である場合、ウイルス粒子は、制限されず、１つ以上の、ゲノムを含むウイルス粒子およびゲノムを含まないウイルス粒子から選択され得る。
【００３３】
標的種が細胞である場合、細胞は、制限されず、多能性前駆細胞、ヒトの細胞（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マスト細胞、食細胞、好中球、好酸球、マクロファージ、内皮細胞）、ガン細胞（例えば、肝臓、頚骨、膵臓、大腸、前立腺、表皮、脳、乳房、肺、精巣、腎臓、膀胱のガンに由来するもの）、非ヒト由来の単細胞生物、藻類、菌類、細菌、植物細胞、虫卵、マラリア原虫およびマイコプラズマの１つ以上から選択され得る。
【００３４】
標的種が小器官である場合、小器官は、制限されず、核、ミトコンドリア、ゴルジ体、小胞体、リソソーム、食胞、細胞内膜、細胞外膜、細胞骨格、核膜、クロマチン、核マトリクスおよびクロロプラストの１つ以上から選択され得る。
【００３５】
標的種が脂質である場合、脂質は、制限されず、シグナル伝達脂質、構造脂質、リン脂質、糖脂質および脂肪酸の１つ以上から選択され得る。
【００３６】
標的種が核酸配列である場合、核酸配列は、制限されず、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｔＲＮＡの１つ以上から選択され得る。
【００３７】
標的種がオリゴ糖である場合、オリゴ糖は、制限されず、ヒト、動物、植物、菌類または細菌由来のオリゴ糖の１つ以上から選択され得る。
【００３８】
好ましい実施形態では、標的種は、タンパク質である。本発明の方法および他の態様が、タンパク質の検出または特定に使用されてもよい。
【００３９】
標的種は、特定の疾患を示す任意の抗原または検体でもよい。標的は、例えば、Ｃ反応性タンパク質、アンジオテンシンＩ変換酵素（ぺプチジル−ジペプチダーゼＡ）１；アディポネクチン；前進性グリコシル化終末産物特異的受容体；アルファ−２−ＨＳ−糖タンパク質；アンギオゲニン、リボヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ  Ａファミリー，５；アポリポタンパク質Ａ−Ｉ；アポリポタンパク質Ｂ（例えば、Ａｇ（ｘ）抗原）；アポリポタンパク質Ｅ；ＢＣＬ２−関連Ｘタンパク質；Ｂ細胞  ＣＬＬ／リンパ腫２；補体Ｃ３；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２；ＣＤ１４，可溶性；ＣＤ４０，可溶性；ｃｄｋ５；，ペントラキシン関連；カテプシンＢ；ジペプチジルペプチダーゼＩＶ；表皮成長因子；エンドグリン；Ｆａｓ；フィブリノゲン；フェリチン；成長ホルモン１；アラニンアミノトランスフェラーゼ；肝細胞成長因子；ハプトグロビン；ヒートショック７０ｋＤａタンパク質１Ｂ；細胞内接着分子１；インスリン様成長因子１（ソマトメジンＣ）；インスリン様成長因子１受容体；インスリン様成長因子結合タンパク質１、インスリン様成長因子結合タンパク質２、インスリン様成長因子結合タンパク質３、インターロイキン１８、インターロイキン２受容体，アルファ；インターロイキン２受容体，ベータ；インターロイキン６（インターフェロン，ベータ２）；インターロイキン６受容体；インターロイキン６シグナルトランスデューサ（ｇｐ１３０、オンコスタチンＭ受容体）；インターロイキン８；アクチビンＡ；レプチン（肥満ホモログ、マウス）；プラスミノーゲンアクチベータ，組織；プロオピオメラノコルチン（アドレノコルチコトロピン／ベータ−リポトロピン／アルファ−メラノサイト刺激ホルモン／ベータ−メラノサイト刺激ホルモン／ベータ−エンドルフィン）；プロインスリン；レジスチン；セレクチンｅ（内皮接着分子１）；セレクチンＰ（顆粒膜タンパク質１４０ｋＤａ，抗原ＣＤ６２）；セルピンペプチダーゼ阻害剤、クレードＥ（ネキシン、プラスミノーゲンアクチベータ阻害剤１型），メンバー１；血清／糖質コルチコイド調節キナーゼ；性ホルモン結合グロブリン；形質転換成長因子，ベータ１（カムラチ−エンゲルマン病）；ＴＩＭＰメタロペプチダーゼ阻害剤２；腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー，メンバー１Ｂ；血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ−１）；血管内皮成長因子；因子ＩＩ、因子Ｖ、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、因子ＸＩ、因子ＸＩＩ、Ｆ／フィブリン分解産物、トロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体、フィブリノゲン、プラスミノーゲン、プロトロンビンおよびフォン・ヴィルブランド因子等から選択され得る。糖尿病に有用なマーカーは、例えば、Ｃ反応性タンパク質；グルコース；インスリン；ＴＲＩＧ；ＧＰＴ；ＨＳＰＡ１  Ｂ；ＩＧＦＢＰ２；ＬＥＰ；ＡＤＩＰＯＱ；ＣＣＬ２；ＥＮＧ；ＨＰ；ＩＬ２ＲＡ；ＳＣｐ；ＳＨＢＧ；およびＴＩＭＰ２を含む。
【００４０】
標的種は、糖尿病をモニターするのに関連する標的でもよい。実施形態では、標的は、グルコース、インスリン、インターロイキン２受容体アルファ（ＩＬ２−ＲＡ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）および糖化ヘモグロビン（ＨｂＡｌｃ）から選択され得る。標的がグルコースである場合、プローブ部分は、例えば、ＧＤＨ−ＦＡＤアッセイの分子認識素子またはグルコース／ガラクトース結合タンパク質（「ＧＧＢＰ」）から選択され得る（Ｓｃｈｏｌｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ  ２０８：２４７−２５３（１９８７））。標的がＩＬ−２ＲＡである場合、プローブ部分は、ＩＬ−２ＲＡに特異的なモノクローナル抗体を含んでもよいし、または、同抗体からなってもよい。標的種がＣ反応性タンパク質であるか、または、Ｃ反応性タンパク質を含む場合、好ましくは、これは、ヒトのＣ反応性タンパク質である。
【００４１】
上記のように、好ましくは、プローブ分子は、抗体、核酸およびペプチドの１つ以上から選択される結合種を含む。結合種は、電極の表面に直接付着されてもよいし、または、リンカー種を介して電極の表面に付着されてもよい。リンカー種が電極の表面上に存在する場合、好ましくは、リンカー種は、自己組織化単分子膜を形成する。
【００４２】
本願明細書に記載の電極は、リンカー種の自己組織化単分子膜を形成し、場合により、リンカー種を活性化し、ついで、少なくとも一部のリンカー種に対する結合種に結合することにより形成されてもよい。
【００４３】
好ましくは、その上のプローブ分子を有する電極表面は、全体として、標的種に選択的である。その上にプローブ分子を有する電極表面が標的種に選択的である場合、このことは、実質的に標的種のみ、または、標的種のみが、表面に結合する（プローブ分子に結合する）であろうことを示す。（例えば、標的種と共にキャリア媒体に存在する）他の種は、結合しないか、または、顕著な度合いで、電極表面の他の部分もしくはその上の他の種に結合しないであろうことを示す。例えば、電極表面は、リンカー分子の自己組織化単分子膜を含んでもよく、その一部は、プローブ部分、例えば、抗体に結合される。プローブ部分は、標的（例えば、Ｃ反応性タンパク質）に選択的に結合する。液体状のキャリア媒体、例えば、血液において、電極表面が、好ましくは、標的種のみに結合する場合、液体状のキャリア媒体に存在する他の種には結合しない。このような選択的な電極表面は、高い選択性の電極表面と呼ばれ得る。
【００４４】
実施形態では、プローブ分子は、式Ａ−Ｌ−Ｂのものであり、Ａは、電極の表面に結合する部分であり、Ｌは、リンカー部分であり、Ｂは、標的種、例えば、Ｃ反応性タンパク質に結合する部分である。
【００４５】
「Ａ」は、電極材料の性質に応じて、適切な結合基から選択され得る。Ａは、制限されず、ビオチン、ヒドラジン、アルキニル、アルキルアジド、アミノ、ヒドロキシル、カルボキシ、チオ、アルデヒド、ホスホイノチオエステル、マレイミジル、スクシニル、スクシンイミジル、イソシアネート、エステル、ストレプトアビジン、アビジン、ニューアビジン（ｎｅｕａｖｉｄｉｎ）およびビオチン結合タンパク質から選択され得る。電極が貴金属、例えば、金、銀またはプラチナを含む場合、Ａは、好ましくは、チオであり、チオは、−ＳＨおよび−Ｓ−から選択され得る。電極がその表面上に酸化物の層を有する金属、例えば、銅を含む場合、Ａは、カルボキシ基でもよい。
【００４６】
Ｌは、ＡとＢとを共有結合させる任意の種であり得る。Ｌは、好ましくは、自己組織化単分子膜を形成可能な種である。Ｌは、少なくとも２つの炭素を含むアルキレン部分を含み得る。アルキレン部分は、Ａに直接付着される。場合により、アルキレン部分は、直鎖状のアルキレン部分である。Ｌは、少なくとも１０個の炭素、場合により１０から３０個の炭素、場合により１０から２０個の炭素、場合により１１から１５個の炭素原子を含むアルキレン部分を含んでもよい。アルキレン部分は、場合により、直鎖状のアルキレン部分であり、アルキレン部分は、Ａに直接付着される。
【００４７】
実施形態では、Ｌは、式−（ＣＨ２）ｎ−（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−）ｍ−Ｄ−のものであり、式中、ｎは、１から３０であり、ｍは、０から１０であり、Ｄは、Ｂに結合する基である。Ｄは、単結合、−（Ｃ＝Ｏ）−、−ＯＣＨ２−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、−ＯＣＨ２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＯＣＨ２−（Ｃ＝Ｏ）−ＯＨ−、−Ｏ−、−ＮＨ−から選択され得る。ｎは、１０から２０であり得る。ｍは、１から５、場合により２から４、場合により３であり得る。場合により、Ｄが、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、−ＯＣＨ２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＯＣＨ２−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−および−ＮＨ−の種のいずれか１つである場合、これらの種における−ＮＨ−または−Ｏ−は、リンカー種Ｌに結合される前のプローブ分子、例えば、抗体に由来し得る。
【００４８】
Ｂは、上記のように、例えば、抗体、抗体フラグメント、アプタマー、オリゴ糖、ペプチド、タンパク質から選択される結合種から選択され得る。標的種、例えば、Ｃ反応性タンパク質に選択的に結合するこのような種は、例えば、ヤギ抗ヒトＣＲＰポリクローナル抗体が市販されている。抗体は、ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃから入手できる。
【００４９】
実施形態では、Ａ−Ｌ−は、式  チオ−（ＣＨ２）ｎ−（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−）ｍ−Ｄ−の種であり、式中、ｎは、１から３０であり、ｍは、０から１０であり、Ｄは、Ｂに結合する基である。場合により、ｎ、ｍおよびＤは、上記規定の通りであり得る。チオは、−Ｓ−およびＨＳ−から選択される。
【００５０】
実施形態では、Ａ−Ｌ−は、式  チオ−（ＣＨ２）ｎ−（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−）ｍ−Ｄ−の種であり、式中、ｎは、１から３０であり、ｍは、０から１０であり、Ｄは、Ｂに結合する基である。場合により、ｎ、ｍおよびＤは、上記規定の通りであり得る。チオは、−Ｓ−およびＨＳ−から選択される。
【００５１】
実施形態では、Ａ−Ｌ−は、式  チオ−（ＣＨ２）ｎ−（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−）ｍ−Ｄ−の種であり、式中、ｎは、１から３０であり、ｍは、０から１０であり、Ｄは、Ｂに結合する基である。場合により、ｎ、ｍおよびＤは、上記規定の通りであり得る。チオは、−Ｓ−およびＨＳ−から選択される。
【００５２】
Ｂは、好ましくは、標的種、例えば、Ｃ反応性タンパク質に選択的に結合可能である。Ｂは、好ましくは、抗体、抗体フラグメント、アプタマー、オリゴ糖、ペプチド、タンパク質から選択される結合種を含むか、または、同結合種である。Ｂは、好ましくは、抗体、抗体フラグメント、核酸およびペプチドの１つ以上から選択される結合種を含むか、または、同結合種である。好ましくは、プローブ部分は、Ｃ反応性タンパク質に選択的に結合する。
【００５３】
Ｂが抗体または抗体フラグメントを含むか、または、抗体または抗体フラグメントである場合、抗体または抗体フラグメントは、クラスＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭの１つ以上から選択され得る。抗体または抗体フラグメントは、好ましくは、Ｃ反応性タンパク質に選択的に結合する。
【００５４】
Ｂがアプタマーを含むか、または、アプタマーである場合、アプタマーは、ペプチドアプタマー、ＤＮＡアプタマーおよびＲＮＡアプタマーから選択され得る。
【００５５】
実施形態では、例えば、その上にプローブ分子を有する本願明細書に記載の電極は、平面を有する電極を提供し、ついで、平面上にリンカー種の自己組織化単分子膜を形成し、少なくとも一部のリンカー種に対する標的種に結合するプローブ部分、例えば、抗体を付着させることにより製造され得る。リンカー種は、場合により、リンカー種に対するプローブ部分の容易な付着を可能にするために、例えば、活性剤、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）との反応により、活性化されてもよい。実施形態では、自己組織化単分子膜を形成するリンカー種は、式Ａ−Ｌ−のものであり、式中、Ａは、電極の表面に結合する部分であり、Ｌは、標的種、例えば、抗体に結合する部分（Ｂと示されてもよい。）に結合可能なリンカー部分である。実施形態では、Ａは、上記規定の通りであり得る。プローブ部分に結合する前に単分子膜を形成するリンカー種Ｌは、式−（ＣＨ２）ｎ−（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−）ｍ−Ｄ−のものであり、式中、ｎは、１から３０であり、ｍは、０から１０であり、Ｄは、Ｂに結合する基である。Ｄは、単結合、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｈ、−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ、−ＯＣＨ２−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ、−ＯＣＨ２−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨＨ、−ＯＣＨ２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ２、−ＯＣＨ２−（Ｃ＝Ｏ）−ＯＨ、−ＯＨ、−ＮＨ２から選択され得る。
【００５６】
本願は、電気化学的インピーダンス分光技術において標的種（例えば、制限されず、Ｃ反応性タンパク質）を検出するための方法であって、第１の態様に規定の電極を、標的種（例えば、制限されず、Ｃ反応性タンパク質）を含むキャリア媒体と接触させる工程と、作用電極において電気信号を検出する工程とを含む方法にも関連する。
【００５７】
電気化学的インピーダンス分光法（ＥＩＳ）は、当業者に公知である。一般的には、可変のａｃ電位が、作用電極と対電極との間のバイアス（またはＤＣ）電位に印加される。一般的には、ＥＩＳは、ａｃ周波数の範囲にわたるスキャンを含む。出力信号（典型的には、可変電流）に対する入力信号（典型的には可変電位）の比により、インピーダンスの算出が可能となる。一般的には、インピーダンスが複素関数として見なされ得るように、入力信号と出力信号との間の位相差が存在する。複素関数は、実数部（Ｚ’とも呼ばれる）と、虚数部（Ｚ’’とも呼ばれる）とを有する。インピーダンスの実数部および虚数部は、例えば、図１に図示されるように、Ｎｙｑｕｉｓｔプロットの形式で、互いにプロットされ得る。インピーダンスデータを仮想の等価回路に適合させることにより、電子移動抵抗が決定され得る。本願において、上記のように、理想Ｒａｎｄｌｅｓ等価回路が、電子移動抵抗を決定するのに使用され得る。印加された可変ａｃ電位の周波数範囲は、０．０５Ｈｚから１０ｋＨｚであり得る。印加されたａｃ電位の振幅は、典型的には、正弦波の形状であり、１ｍＶから１００ｍＶ、場合により５ｍＶから５０ｍＶ、場合により５ｍＶから２０ｍＶ、場合により５ｍＶから１５ｍＶ、場合により８ｍＶから１２ｍＶ、場合により約１０ｍＶであり得る。バイアス電位（または直流電位）は、任意の所望の電位に設定され得る。酸化還元プローブがキャリア媒体に存在する場合、バイアス電位は、方法が行われる条件下における酸化還元プローブの電極電位に設定され得る。
【００５８】
酸化還元プローブは、キャリア媒体に存在し得る。酸化還元プローブは、遷移金属種でもよく、遷移金属は、２つの価数状態をとり得る（例えば、金属イオン（Ｍ）は、Ｍ（ＩＩ）およびＭ（ＩＩＩ）の状態をとり得る。）。実施形態では、酸化還元プローブは、金属イオンを含む。この場合、金属イオンの金属は、鉄、ルテニウム、イリジウム、オスミウム、コバルト、タングステンおよびモリブデンから選択される。実施形態では、酸化還元プローブは、Ｆｅ（ＣＮ）６３−／４−、Ｆｅ（ＮＨ３）６３＋／２＋、Ｆｅ（ｐｈｅｎ）３３＋／２＋、Ｆｅ（ｂｉｐｙ）２３＋／２＋、Ｆｅ（ｂｉｐｙ）３３＋／２＋、Ｒｕ３＋／２＋、ＲｕＯ４３−／２−、Ｒｕ（ＣＮ）６３−／４−、Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋／２＋、Ｒｕ（ｅｎ）３３＋／２＋、Ｒｕ（ＮＨ３）５（Ｐｙ）３＋／２＋、Ｉｒ４＋／３＋、Ｉｒ（Ｃｌ）６２−／３−、Ｉｒ（Ｂｒ）６２−／３−、Ｏｓ（ｂｉｐｙ）２３＋／２＋、Ｏｓ（ｂｉｐｙ）３３＋／２＋、ＯｘＣｌ６２−／３−、Ｃｏ（ＮＨ３）６３＋／２＋、Ｗ（ＣＮ）６３−／４−、Ｍｏ（ＣＮ）６３−／４−、場合により置換されたフェロセン、ポリフェロセン、キノン、例えば、ｐ−ベンゾキノンおよびヒドロキノンならびにフェノールから選択される。実施形態では、酸化還元プローブは、鉄含有種であり、鉄は、Ｆｅ（ＩＩ）および／またはＦｅ（ＩＩＩ）の状態にある。実施形態では、酸化還元プローブは、Ｆｅ（ＣＮ）６３−／４−である。酸化還元プローブは、０．１ｍＭから１００ｍＭ、場合により０．５ｍＭから１０ｍＭ、場合により０．５ｍＭから２ｍＭ、場合により０．５ｍＭから１．５ｍＭ、場合により約１ｍＭの量で、キャリア媒体に存在し得る。
【００５９】
キャリア媒体は、好ましくは、液体状である。キャリア液体は、標的種（例えば、制限されず、Ｃ反応性タンパク質）が懸濁または溶解され得る、任意の液体であり得る。実施形態では、キャリア液体は、水を含む。実施形態では、キャリア液体は、体液を含む。体液は、対象から取得された流体であり得る。対象は、ヒトまたは動物であり得る。実施形態では、キャリア液体は、未希釈の体液を含む。本文脈における未希釈の体液は、対象、例えば、ヒトまたは動物から取得された体液であり、別の液体により希釈されていないが、酸化還元プローブ等の添加剤が、未希釈の体液に存在してもよい。体液は、血液、尿、涙、唾液、汗および髄液から選択され得る。
【００６０】
場合により、キャリア媒体は、対象、例えば、ヒトまたは動物から取得された体液と希釈剤とを含む。希釈剤は、体液が対象から取得された後に、体液に添加されてもよい。希釈剤は、液体媒体、例えば、水およびアルコール、例えば、アルカノール、例えば、エタノールから選択される液体媒体を含み得る。キャリア媒体は、さらに、バッファーを含み得る。バッファーは、リン酸塩を含み得る。
【００６１】
方法は、標的種（例えば、Ｃ反応性タンパク質）の濃度を、電気信号から算出する工程を含んでもよい。電気信号は、インピーダンスデータに変換され、ついで、電気信号から、標的種（例えば、Ｃ反応性タンパク質）の濃度に変換され得る。電気信号は、電荷移動抵抗に変換され、ついで、電気信号から、標的種（例えば、Ｃ反応性タンパク質）の濃度に変換され得る。方法は、標的種（例えば、Ｃ反応性タンパク質）の濃度を取得するために、例えば、電気信号から、電気化学的インピーダンス分光法技術において取得されたデータ、インピーダンスデータまたは電荷移動抵抗データを比較する工程、および、そのデータと、較正工程において取得されたデータとを比較する工程を含んでもよい。方法は、標的種（例えば、Ｃ反応性タンパク質）の濃度と電気化学的インピーダンス分光技術における電気化学信号から取得された電気化学データとの間の相関関係を決定する初期較正工程を含んでもよい。電気化学データは、インピーダンスデータおよび電荷移動抵抗データから選択され得る。相関関係は、電気化学的インピーダンス分光技術において、対象のサンプルから取得された電気化学データを、サンプルにおける標的種（例えば、Ｃ反応性タンパク質）の濃度に変換するのに使用され得る。
【００６２】
キャリア媒体中の標的種（例えば、Ｃ反応性タンパク質）の濃度は、０．１ｎＭ以上、場合により０．１６ｎＭ以上、場合により０．２ｎＭ以上、場合により０．５ｎＭ以上であり得る。キャリア媒体中の標的種（例えば、Ｃ反応性タンパク質）の濃度は、１００ｎＭ以下、場合により８０ｎＭ以下、場合により５０ｎＭ以下、場合により１０ｎＭ以下であり得る。キャリア媒体中の標的種（例えば、Ｃ反応性タンパク質）の濃度は、０．１ｎＭから１００ｎＭ、場合により０．１６ｎＭから１００ｎＭ、場合により、０．１６ｎＭから５０ｎＭであり得る。
【００６３】
キャリア媒体中の標的種（例えば、Ｃ反応性タンパク質）の濃度は、１０μｇ／Ｌ以上、場合により１５μｇ／Ｌ以上、場合により１９μｇ／Ｌ以上、場合により２０μｇ／Ｌ以上、場合により０．１ｍｇ／Ｌ以上、場合により１ｍｇ／Ｌ以上、場合により３ｍｇ／Ｌ以上であり得る。キャリア媒体中の標的種（例えば、Ｃ反応性タンパク質）の濃度は、１００ｍｇ／Ｌ以下、場合により８０ｍｇ／Ｌ以下、場合により５０ｍｇ／Ｌ以下、場合により３０ｍｇ／Ｌ以下であり得る。キャリア媒体中の標的種（例えば、Ｃ反応性タンパク質）の濃度は、１０μｇ／Ｌから１００ｍｇ／Ｌ、場合により１９μｇ／Ｌから１００ｍｇ／Ｌ、場合により１９μｇ／Ｌから５０ｍｇ／Ｌであり得る。
【００６４】
算出工程は、電気信号と理想等価回路の電気信号との１つ以上の比較を含んでもよい。
【００６５】
本発明者らは、電極から結合した標的種（例えば、Ｃ反応性タンパク質）を解離させることにより、標的種（例えば、Ｃ反応性タンパク質）に結合していた電極を再生させ得ることを見出した。方法は、標的種（例えば、Ｃ反応性タンパク質）がプローブ分子に結合されるように、電極を標的種（例えば、Ｃ反応性タンパク質）と接触させ、電気信号を検出した後に、標的種（例えば、Ｃ反応性タンパク質）をプローブ分子から解離させる工程を含み得る。解離工程は、その上に標的種（例えば、Ｃ反応性タンパク質）を有する電極表面を、場合により、８以上のｐＨ、場合により９以上のｐＨ、場合により１０以上のｐＨ、場合により１１以上のｐＨ、場合により８から１２のｐＨ、場合により９から１２のｐＨを有する、アルカリの液体媒体、例えば、アルカリ水溶液媒体と接触させる工程を含んでもよい。アルカリの液体媒体は、塩基性物質を含み得る。塩基性物質は、好ましくは、水に可溶性である。塩基性物質は、制限されず、金属水酸化物、金属炭酸塩、アンモニアから選択され得る。金属水酸化物または金属炭酸塩の金属は、周期表のグループ１およびグループ２から選択され得る。
【００６６】
本発明は、電気化学的インピーダンス分光計であって、分光計が、本願明細書に記載の電極を含む分光計にも関連する。電気化学的インピーダンス分光計は、標準的な設計のものであり得る。電気化学的インピーダンス分光計は、作用電極、対電極および、必要に応じて参照電極として、第１の態様の電極を含んでもよい。電気化学的インピーダンス分光計は、好ましくは、作用電極と対電極との間における電位を印加し、制御し、変動させるための手段、および、得られた電流を測定するための手段を含む。電気化学的インピーダンス分光計は、好ましくは、電位の制御および得られた電流の測定用のポテンシオスタットを含む。電気化学的インピーダンス分光計は、好ましくは、印加電位および得られた電流から、インピーダンスデータを算出するための手段を含む。電気化学的インピーダンス分光計は、作用電極の電子移動抵抗を算出するための手段を含んでもよい。
【００６７】
本発明は、標的種、例えば、Ｃ反応性タンパク質を検出するための、本願明細書に記載の電極または本願明細書に記載の電気化学的インピーダンス分光計の使用にも関連する。使用は、標的種（例えば、Ｃ反応性タンパク質）の存在の検出、および／または、標的種（例えば、Ｃ反応性タンパク質）の濃度の検出を含んでもよい。
【実施例】
【００６８】
以下の実施例において、ヒトＣＲＰ、ヒト血清およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ヤギ抗ヒトＣＲＰポリクローナル抗体を、ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃから購入した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）チオール  ＨＳ−Ｃ１１−（ＥＧ）３−ＯＣＨ２−ＣＯＯＨを、Ｐｒｏｃｈｉｍｉａ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ、Ｐｏｌａｎｄから購入した。超純水（１８．２ＭΩ／ｃｍ）を、Ｍｉｌｌｉ−Ｑシステムから取得し、全体を通して使用した。Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ＰＢＳＴ、１０ｍＭ、ｐＨ７．４）を、ＰＢＳタブレット（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を、０．２％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ−２０を添加した水に溶解することにより調製し、０．２２μｍのメンブレンフィルタを使用してろ過した。全ての他の化学薬品を、分析グレードとした。
【００６９】
２．２．装置
電気化学的実験を、ＦＲＡ２モジュールを備えるＡｕｔｏｌａｂポテンシオスタット１２（Ｍｅｔｒｏｈｍ  Ａｕｔｏｌａｂ  Ｂ．Ｖ．）により行った。金のディスク作用電極（直径１．６ｍｍ、ＢＡＳｉ）、プラチナワイヤの対電極および銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）の参照電極を備える従来の三電極系（ＣＨ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用した。全ての電位を、この参照電極に対して報告する。ＣＲＰストック溶液濃度を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＵＶ分光計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、２８０ｎｍでのＵＶ吸光により算出した（Ｍｏｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）。
【００７０】
２．３．表面調製
金電極を、まず、３，０、１．０および０．１μｍのダイヤモンドスプレー（Ｋｅｍｅｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ）で、連続して研磨し、新鮮に調製したピラニア溶液（濃Ｈ２ＳＯ４：Ｈ２Ｏ２、ｖ／ｖ  ３：１。注記：これは、非常に注意して取り扱わなければならない！）に１５分間浸漬する前に、約５分間水において超音波洗浄した。ついで、−０．１と１．２５Ｖとの間での電位サイクリング（ＣＶ）により、安定した還元ピークが得られるまで、電極を電解研磨した。金電極の有効表面積を、クーロンのカソードピークの面積を取得し、
【００７１】
【数２】
2015516066.tif 000003
【００７２】
の相関関係を適用することにより、この時点で算出し得る（Ｈｏｏｇｖｌｉｅｔ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。報告した電荷移動抵抗（Ｒｃｔ）を、これにより正規化した。
【００７３】
（１）Ｈｏｏｇｖｌｉｅｔ，Ｊ．Ｃ；Ｄｉｊｋｓｍａ，Ｍ．；Ｋａｍｐ，Ｂ．；ｖａｎ  Ｂｅｎｎｅｋｏｍ，Ｗ．Ｐ．Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ２０００，７２，２０１６
ついで、予め処理した金電極を、窒素ガス流中で乾燥させ、直ちに、エタノールにおける１０ｍＭ  ＨＳ−Ｃ１１Ｈ２２−（ＥＧ）３−ＯＣＨ２−ＣＯＯＨの溶液に、室温で１６時間浸漬した。このようなフィルムの生体適合性（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１１、Ｋｌａｐｓｈｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）および防汚特性（Ｈａｒｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９８、Ｓｃｈｉｌｐ  ｅｔ  ａｌ．２００９）は、複雑な体液においてなされる特異的な評価を可能にするのに十分である。ＳＡＭ形成後、金の表面を、特に断らない限り、エタノール、ついで、水で洗浄し、０．４Ｍ  ＥＤＣおよび０．１Ｍ  ＮＨＳを含む溶液での１５分間のインキュベーション（末端カルボキシル基活性化）、およびそれに次ぐ、１０μＭ  ＣＲＰ抗体溶液（ＰＢＳＴ、ｐＨ７．４）での１時間のインキュベーション（図７）前に、窒素ガス流中で乾燥させた。
【００７４】
２．４．電気化学的インピーダンス分光法
ＥＩＳスペクトルを、０．０５Ｈｚから１０ｋＨｚの周波数範囲にわたって記録した。印加した正弦波電位の振幅を、０．２５Ｖでの直流電位設定による１０ｍＶとした（Ｅ０の酸化還元プローブを使用、１．０ｍＭ  Ｆｅ（ＣＮ）６３−／４−）。１０ｍＭ  ＰＢＳＴ溶液において、データを取得し、複素平面ダイアグラムの形式でプロットし（Ｎｙｑｕｉｓｔプロット）、図８に図示した、理想Ｒａｎｄｌｅｓ等価回路（Ｖｙａｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）に適合させた。この図において、Ｒｃｔは、電荷（または電子）移動抵抗を表わし、Ｚｗは、Ｗａｒｂｕｒｇインピーダンスを表わし、Ｒｓは、溶液抵抗であり、Ｃｄｌは、電極表面と、液体状のキャリア媒体における標的種またはイオンとの間のキャパシタンスである。生のインピーダンスデータを、（この場合、Ａｕｔｏｌａｂ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓにより製造された）ＦＲＡ（周波数分解分析機）モジュールにより取得し、ついで、搭載されたソフトウェア（「Ｆｉｔ  ａｎｄ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．７」）を使用して、図８における等価回路に適合させる。ソフトウェアは、エラーを減少させるためにフィッティングの反復を複数回実行し、ついで、Ｒｃｔを含む全ての等価回路成分についての値を出力する。
【００７５】
ＣＲＰ添加ＰＢＳＴ、特定の希釈血清または全血清において電極を、それぞれ室温で３０分間インキュベートすることにより、アッセイを行った。最初の２つの場合において、ＰＢＳＴを、酸化還元プローブにより予めドープした。ＥＩＳ反応を、全（未希釈）血清試験を除いて、同じインキュベーション溶液において標準的に記録した。この場合、電極を、インキュベート後、１．０ｍＭ  Ｆｅ（ＣＮ）６３−／４−を含むＰＢＳＴ中での評価前に、ＰＢＳＴで洗浄した。界面選択性を最初に評価するために、ＢＳＡを使用した。使用した表面を、ＰＢＳＴ洗浄前に、６ｍＭ  ＮａＯＨおよび０．６％エタノールを使用して、５分間再生させた（Ａｌｂｒｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．２００８）。
【００７６】
３．結果および検討
３．１．バイオセンサ製作および初期インピーダンス
ＥＩＳは、受容性の表面の段階的な製作を特徴付ける有用な手段を提供する。Ｎｙｑｕｉｓｔプロットにおいて、低いサンプリング周波数での半円形は、被膜が構築されたために立体的にまたは静電的に課された電荷移動制限において報告される。予想通りに、受容体層が製作された場合、ＲＣＴの急激な上昇が存在する。Ｒｃｔは、ＰＥＧ  ＳＡＭの形成およびさらにその上への抗体の固定化後に、４．５ｋΩ／ｃｍ２未満〜４５ＭΩ／ｃｍ２に特異的に上昇する（図１）。その後、界面の抵抗は、標的タンパク質結合に対して較正可能な方法で応答する。
【００７７】
本発明者らは、電極の初期抵抗、すなわち、ＣＲＰの結合前の抵抗が、続いて観察される感度において役割を果たすことを見出した。この初期抵抗は、抗体表面密度により直接調節可能である。これ自体は、層が構築される場合、インキュベート時間またはインキュベート濃度のいずれかにより制御可能である。図２は、初期の層電荷移動抵抗によるアッセイ感度において観察された傾向を概説する。特に、抗体表面被覆が減少した場合（固定時間を７０分から１０分に減少させた場合）、アッセイ感度は、表面結合の密度としておそらく低下する前に、最初に４００％まで振幅が向上し（この結果、検出限度が下がり）、機能性抗体が、特異的な標的結合が（可能性に関して）有効である点以下に低下する。これらの観察は、複数回の分析にわたって確かであり、再現性を有している。
【００７８】
３．２．バッファー中のＣＲＰの検出
調製された界面を、続けて、ＰＢＳＴ中のＣＲＰをスクリーニングするのに使用した。濃度によるＲＣＴの進行的な向上、ついで、飽和（図３）から、１．１±０．１１ｎＭの解離定数ＫＤ導くことができ、同じポリクローナル抗体による以前の示差パルスボルタンメトリー測定（Ｈｅｎｎｅｓｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．２００９）と優れた一致における値である。
【００７９】
飽和前に、ＲＣＴは、１７６±１８ｐＭの検出限界（ＬＯＤ）を伴って、０．５−５０ｎＭの範囲（６０μｇ／Ｌから６．０ｍｇ／Ｌに相当）にわたるＣＲＰ濃度における直線的な対数感度について報告する。この低い検出限界（〜１９μｇ／Ｌに相当）は、実用化に適切に十分な感度を確証し、臨床的に適切なそれを包含する分析範囲に結び付けられる。その関連した検出限界を伴うこの範囲は、我々の知る限り、いずれの従来報告されたＣＲＰアッセイの臨床的適切性を上回る。調製された界面は、さらに、１００ｎＭまでのＢＳＡレベルに対して非反応性（＜３％の信号変化）である。
【００８０】
３．３．血清中のＣＲＰ検出
診察現場の観点から、血清中のＣＲＰの直接的および容易な評価が必要である。しかしながら、任意の無標識アッセイでは、このことは、極めて厳しい要求である。数多くの電流測定またはサンドイッチ系ＥＩＳ免疫アッセイ法が説明されてきたが（Ｂａｌｋｅｎｈｏｈｌ  ａｎｄ  Ｌｉｓｄａｔ  ２００７ａ，ｂ、Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１０、Ｒｏｓａｌｅｓ−Ｒｉｖｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．２０１１、Ｔｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）、我々の知る限り、未希釈の複雑な生物媒体に有効であると報告されている、非増幅および非標識のインピーダンスアッセイの従来の報告は存在しない。
【００８１】
制御度合いについて確信したことにより、我々は、我々の電極界面を終了し、高レベルのＢＳＡに対しても低レベルで応答する観点から、ここで、我々は、２つの方法において、血清中のＣＲＰについてスクリーニングした。最初の例では、ｉｎ  ｓｉｔｕ評価を、ＰＢＳＴにおける制御可能な希釈において、ＣＲＰ添加血清により行った（図４）。このような環境下において、信頼できる線形評価が、１０％ｖ／ｖまでの血清濃度において、２６２±２８ｐＭのＬＯＤを伴って、臨床的に適切な範囲にわたって可能であった。
【００８２】
後者の分析を、ＣＲＰ添加未希釈血清により行った。抵抗最適化センサ電極を、これらの溶液において、１５分間インキュベートし、ついで、ＰＢＳＴによる洗浄後に測定した。図５に証明されるように、このような分析におけるセンサ応答は、添加したＰＢＳＴにおいて観察されたそれにかなり近い（最も臨床的に適切なより高い濃度範囲である１０−５０ｎＭにおいて、その差は、＜３％である。）。これは、心血管疾患の有用なリスク評価に必要とされるＣＲＰ濃度範囲にわたる、全血清において行われる分析を可能にする。実務上の観点から、これらのアッセイは、わずか５μＬの未希釈の血清で行われ、１０分以内に定量的に報告し得る。使用される電極界面も、続けて、再利用可能である（以下を参照のこと。）。
【００８３】
３．４．バイオセンサの再生
（ＣＲＰの抗体−抗原複合体を解離するために、）６ｍＭ  ＮａＯＨおよび０．６％エタノールに５分間、使用した表面を浸漬し、ついで、ＰＢＳＴで洗浄することにより、表面再生を、高い忠実性で達成した（図６を参照のこと。）。我々は、確かな再生が部分的に可能であると考える。このような免疫アッセイ表面に一般的に使用されるＢＳＡ表面不活性化が存在しないためである。本願明細書における界面は、アッセイの著しい不利益を伴わずに再使用され得る（７回の再生にわたって、最初の界面応答の９７％を保持した。）。この再生は、ＰＢＳ、希釈血清または全血清において行われるアッセイに有効である。
【００８４】
本発明者らは、希釈血清または全血清において、臨床的に適切な範囲にわたって、ＣＲＰの信頼できる検出が可能な、最適化された、再使用可能な電気化学的未標識バイオセンサを見出した。ｉｎ  ｓｉｔｕで測定されたポリクローナル抗体の結合親和性は、比較界面での以前の測定を上回るのに非常に十分マップする。高いアッセイ感度および選択性を容易にすることに加えて、調製されたバイオセンサ界面は、十分な再使用性も示した。抗体表面密度による初期の界面抵抗の最適化において、アッセイ感度は、顕著に向上され得る。
【００８５】
これらのアッセイは、携帯型で、ほんの数μＬの体液を、数分以内にサンプリング可能な複合方式に、容易に一体化される。我々は、提供された結果が、感染、傷害、炎症および心臓病のリスクの高感度なプローブと長い間見なされたマーカー（すなわち、ＣＲＰ）の、便利な診察現場での分析の開発についての重要な基礎としての役割を果たすと考える。
【００８６】
（引用文献）
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Ｍｙｇｉｎｄ  ＮＤ，  Ｈａｒｕｔｙｕｎｙａｎ  ＭＪ，  Ｍａｔｈｉａｓｅｎ  ＡＢ，  Ｒｉｐａ  ＲＳ，  Ｔｈｕｎｅ  ＪＪ，  Ｇｏｔｚｅ  ＪＰ，  Ｊｏｈａｎｓｅｎ  ＪＳ，  Ｋａｓｔｒｕｐ  Ｊ，  Ｇｒｐ  ＣＴ．  ２０１１．  Ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｔａｔｉｎ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ＹＫＬ−４０  ａｎｄ  ＨｓＣＲＰ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｔａｂｌｅ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６０：  ２８１−２８７．
Ｐａｉ  ＪＫ，  Ｍｕｋａｍａｌ  ＫＪ，  Ｒｅｘｒｏｄｅ  ＫＭ，  Ｒｉｍｍ  ＥＢ．  ２００８．  Ｃ−Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＣＲＰ）  Ｇｅｎｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ，  ＣＲＰ  Ｌｅｖｅｌｓ，  ａｎｄ  Ｒｉｓｋ  ｏｆ  Ｉｎｃｉｄｅｎｔ  Ｃｏｒｏｎａｒｙ  Ｈｅａｒｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  Ｔｗｏ  Ｎｅｓｔｅｄ  Ｃａｓｅ−Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ．  Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ  ３．
Ｐａｎ  Ｙ，  Ｓｏｎｎ  ＧＡ，  Ｓｉｎ  ＭＬＹ，  Ｍａｃｈ  ＫＥ，  Ｓｈｉｈ  ＭＣ，  Ｇａｕ  Ｖ，  Ｗｏｎｇ  ＰＫ，  Ｌｉａｏ  ＪＣ．  ２０１０．  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓａｍｐｌｅｓ  ｆｏｒ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｔｒａｃｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ．  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ＆  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  ２６：  ６４９−６５４．
Ｐｅａｒｓｏｎ  ＴＡ，  Ｍｅｎｓａｈ  ＧＡ，  Ｈｏｎｇ  ＹＬ，  Ｓｍｉｔｈ  ＳＣ．  ２００４．  ＣＤＣ／ＡＨＡ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｏｎ  Ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  −  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  −  Ｏｖｅｒｖｉｅｗ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１０：  Ｅ５４３−Ｅ５４４．
Ｑｕｒｅｓｈｉ  Ａ，  Ｇｕｒｂｕｚ  Ｙ，  Ｋａｌｌｅｍｐｕｄｉ  Ｓ，  Ｎｉａｚｉ  ＪＨ．  ２０１０．  Ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ  ＲＮＡ  ａｐｔａｍｅｒ−ｂａｓｅｄ  ｃａｐａｃｉｔｉｖｅ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  １２：  ９１７６−９１８２．
Ｒｏｂｅｒｔｓ  ＷＬ，  Ｓｅｄｒｉｃｋ  Ｒ，  Ｍｏｕｌｔｏｎ  Ｌ，  Ｓｐｅｎｃｅｒ  Ａ，  Ｒｉｆａｉ  Ｎ．  ２０００．  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｕｒ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｈｉｇｈ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ：  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４６：  ４６１−４６８．
Ｒｏｂｅｒｔｓ  ＷＬ，  Ｍｏｕｌｔｏｎ  Ｌ，  Ｌａｗ  ＴＣ，  Ｆａｒｒｏｗ  Ｇ，  Ｃｏｏｐｅｒ−Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｍ，  Ｓａｖｏｒｙ  Ｊ，  Ｒｉｆａｉ  Ｎ．  ２００１．  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｉｎｅ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｈｉｇｈ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ：  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｐａｒｔ  ２．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４７：  ４１８−４２５．
Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ＭＣ，  Ｋａｗｄｅ  ＡＮ，  Ｗａｎｇ  Ｊ．  ２００５．  Ａｐｔａｍｅｒ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｆｏｒ  ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ  ｉｍｐｅｄａｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｃｈａｒｇｅ．  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ：  ４２６７−４２６９．
Ｒｏｓａｌｅｓ−Ｒｉｖｅｒａ  ＬＣ，  Ａｃｅｒｏ−Ｓａｎｃｈｅｚ  ＪＬ，  Ｌｏｚａｎｏ−Ｓａｎｃｈｅｚ  Ｐ，  Ｋａｔａｋｉｓ  Ｉ，  Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ＣＫ．  ２０１１．  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｌｉａｄｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅａｌ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ．  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ＆  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  ２６：  ４４７１−４４７６．
Ｓｃｈｉｌｐ  Ｓ，  Ｒｏｓｅｎｈａｈｎ  Ａ，  Ｐｅｔｔｉｔｔ  ＭＥ，  Ｂｏｗｅｎ  Ｊ，  Ｃａｌｌｏｗ  ＭＥ，  Ｃａｌｌｏｗ  ＪＡ，  Ｇｒｕｎｚｅ  Ｍ．  ２００９．  Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  （Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ）−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ  Ｒｅｌｅｖａｎｔ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｇａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２５：  １００７７−１００８２．
Ｔｒａｎ  ＤＴ，  Ｖｅｒｍｅｅｒｅｎ  Ｖ，  Ｇｒｉｅｔｅｎ  Ｌ，  Ｗｅｎｍａｃｋｅｒｓ  Ｓ，  Ｗａｇｎｅｒ  Ｐ，  Ｐｏｌｌｅｔ  Ｊ，  Ｊａｎｓｓｅｎ  ＫＰＰ，  Ｍｉｃｈｉｅｌｓ  Ｌ，  Ｌａｍｍｅｒｔｙｎ  Ｊ．  ２０１１．  Ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ｄｉａｍｏｎｄ  ｉｍｐｅｄｉｍｅｔｒｉｃ  ａｐｔａｓｅｎｓｏｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＥ．  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ＆  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  ２６：  ２９８７−２９９３．
Ｖｅｒｍｅｅｒｅｎ  Ｖ，  Ｇｒｉｅｔｅｎ  Ｌ，  Ｖａｎｄｅｎ  Ｂｏｎ  Ｎ，  Ｂｉｊｎｅｎｓ  Ｎ，  Ｗｅｎｍａｃｋｅｒｓ  Ｓ，  Ｊａｎｓｓｅｎｓ  ＳＤ，  Ｈａｅｎｅｎ  Ｋ，  Ｗａｇｎｅｒ  Ｐ，  Ｍｉｃｈｉｅｌｓ  Ｌ．  ２０１１．  Ｉｍｐｅｄｉｍｅｔｒｉｃ，  ｄｉａｍｏｎｄ−ｂａｓｅｄ  ｉｍｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ−Ｃｈｅｍｉｃａｌ  １５７：  １３０−１３８．
Ｖｉｋｈｏｌｍ−Ｌｕｎｄｉｎ  Ｉ，  Ａｌｂｅｒｓ  ＷＭ．  ２００６．  Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ＆  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  ２１：  １１４１−１１４８．
Ｖｙａｓ  ＲＮ，  Ｌｉ  ＫＹ，  Ｗａｎｇ  Ｂ．  ２０１０．  Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  Ｒａｎｄｌｅｓ  Ｃｉｒｃｕｉｔ  ｆｏｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｏｘｏｍｅｔａｌａｔｅ  Ｌａｙｅｒ−ｂｙ−Ｌａｙｅｒ  Ｆｉｌｍｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂ  １１４：  １５８１８−１５８２４．
Ｗｅｅ  ＫＷ，  Ｋａｎｇ  ＧＹ，  Ｐａｒｋ  Ｊ，  Ｋａｎｇ  ＪＹ，  Ｙｏｏｎ  ＤＳ，  Ｐａｒｋ  ＪＨ，  Ｋｉｍ  ＴＳ．  ２００５．  Ｎｏｖｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐｉｅｚｏｒｅｓｉｓｔｉｖｅ  ｓｅｌｆ−ｓｅｎｓｉｎｇ  ｍｉｃｒｏ−ｃａｎｔｉｌｅｖｅｒｓ．  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ＆  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  ２０：  １９３２−１９３８．
【図１】
2015516066.tif 000004
【図２】
2015516066.tif 000005
【図３】
2015516066.tif 000006
【図４】
2015516066.tif 000007
【図５】
2015516066.tif 000008
【図６】
2015516066.tif 000009
【図７】
2015516066.tif 000010
【図８】
2015516066.tif 000011
【国際調査報告】
2015516066.tif 000012
2015516066.tif 000013
2015516066.tif 000014