(57)【要約】  本発明は、核酸の効率的な標的及び/又はプロセシングを可能にするポリペプチド、より具体的には転写アクチベーター様エフェクター由来タンパク質に関する。特に、本発明は、メチル化DNAを効率的に標的することができるTALE由来タンパク質の特徴づけを報告するものである。本発明は、より具体的には、遺伝子サイレンシングを担うメチル化プロモーターの活性化を可能にするTALE由来タンパク質に関する。【選択図】図１
2015510772.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学的に改変された核酸塩基を含む核酸配列を標的する転写アクチベーター様エフェクター(TALE)タンパク質を合成する方法であって、該方法は、複数のTALE様反復配列を組み立てることを含んでなり、前記複数のTALE様反復配列の各々が前記核酸標的配列の各核酸塩基に特異的な反復可変二残基(RVD)を含み、前記核酸標的配列内の化学的に改変された核酸塩基を特異的に標的するRVDが、Ｘ＊又は＊＊ (ここで、ＸはＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｎ、Ｈ、Ｒ及びＫの群より選択される１つのアミノ酸残基を表し、＊はRVDの１つの位置でのギャップを表す)から選択される、方法。
【請求項２】
以下：
(ａ)細胞のゲノム中で化学的に改変された核酸塩基を含む核酸標的配列を決定し；
(ｂ)以下：
−  Ｃを認識するためのＨＤ；
−  Ｔを認識するためのＮＧ；
−  Ａを認識するためのＮＩ；
−  Ｇ又はＡを認識するためのＮＮ；
−  Ａ又はＣ又はＧ又はＴを認識するためのＮＳ；
−  Ｔを認識するためのＨＧ；
−  Ｔを認識するためのＩＧ；
−  Ｇを認識するためのＮＫ；
−  Ｃを認識するためのＨＡ；
−  Ｃを認識するためのＮＤ；
−  Ｃを認識するためのＨＩ；
−  Ｇを認識するためのＨＮ；
−  Ｇを認識するためのＮＡ；
−  Ｇ又はＡを認識するためのＳＮ；及び
−  Ｔを認識するためのＹＧ；
からなる群より選択される少なくとも１つのRVDを含む反復可変二残基(RVD)をコードすることにより各反復が前記核酸標的配列の各核酸塩基に特異的なTALE様反復ポリヌクレオチド配列であって、核酸標的配列中の化学的に改変された核酸塩基を特異的に標的するRVDがＸ＊及び＊＊のRVD (ここで、ＸはＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｎ、Ｈ、Ｒ及びＫの群より選択される１つのアミノ酸残基を表し、＊はRVDの１つの位置でのギャップを表す)から選択されるTALE様反復ポリヌクレオチド配列を組み立て；
(ｃ)工程(ｂ)で組み立てられたポリヌクレオチド配列を前記細胞中で発現させる
ことを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記化学的に改変された核酸塩基を特異的に標的するRVDがＮ＊、Ｔ＊、Ｑ＊及びＨ＊のRVDから優先的に選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記化学的に改変された核酸塩基が５-メチル-シトシンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
化学的に改変された塩基を含む核酸標的配列で規定される遺伝子座にて核酸をプロセシングするキメラタンパク質を合成する方法であって、
(ａ)以下：
(ｉ)複数のTALE様反復配列を含む転写アクチベーター様エフェクター(TALE)タンパク質であって、該複数のTALE様反復配列の各々が前記核酸標的配列の各核酸塩基に特異的な反復可変二残基(RVD)を含み、核酸標的配列内の化学的に改変された核酸塩基を特異的に標的するRVDが、Ｘ＊又は＊＊、好ましくはＮ＊、Ｑ＊、Ｔ＊又はＨ＊ (ここで、ＸはＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｎ、Ｈ、Ｒ及びＫの群より選択される１つのアミノ酸残基を表し、＊はRVDの１つの位置でのギャップを表す)から選択されるTALEタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド；と
(ii)化学的に改変された核酸塩基を含む前記核酸標的配列内又は該配列近傍の核酸をプロセシングする追加のタンパク質ドメインをコードする第２のポリヌクレオチド
との融合体を含むポリヌクレオチド配列を合成し；
(ｃ)工程(ａ)のポリヌクレオチド配列を宿主細胞中で発現させる
ことを含んでなる、方法。
【請求項６】
前記追加のタンパク質ドメインがエンドヌクレアーゼである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
配列番号38〜配列番号49からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなるTALE-ヌクレアーゼ。
【請求項８】
(ｉ)化学的に改変された核酸塩基を含む核酸標的配列と
(ii)前記核酸標的配列の各核酸塩基に特異的な反復可変二残基(RVD)を含むTALEタンパク質
とを接触させることを含んでなり、前記核酸標的配列内の化学的に改変された核酸塩基を特異的に標的するRVDが、Ｘ＊又は＊＊、好ましくはＮ＊、Ｑ＊、Ｔ＊又はＨ＊ (ここで、ＸはＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｎ、Ｈ、Ｒ及びＫの群より選択される１つのアミノ酸残基を表し、＊はRVDの１つの位置でのギャップを表す)から選択される、少なくとも１つの化学的に改変された核酸塩基を含む核酸標的配列を結合させる方法。
【請求項９】
(ａ)化学的に改変された核酸塩基を含む核酸標的配列を含有する細胞を準備し、
(ｂ)前記核酸標的配列を指向する請求項１〜５のいずれか１項に記載のTALEタンパク質を前記細胞内で合成し、
(ｃ)化学的に改変された核酸塩基を含む核酸標的配列とのTALEタンパク質の結合親和性を試験する
ことを含んでなる、少なくとも１つの化学的に改変された核酸塩基を含む核酸標的配列を結合させる方法。
【請求項１０】
前記核酸標的配列がＣｐＧ、ＣｐＡ、ＣｐＴ、ＣｐＣからなる群より選択される少なくとも１つの化学的に改変されたジヌクレオチドを含む、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
(ａ)化学的に改変された核酸塩基を含む核酸標的配列を含有する細胞を準備し；
(ｂ)前記核酸標的配列を指向し、該核酸標的配列内又は該配列近傍の核酸を前記化学的改変とは独立にプロセシングする請求項５又は６に記載のキメラタンパク質を前記細胞内で合成し；
(ｃ)前記核酸標的配列の遺伝子座での核酸プロセシングを試験する
ことを含んでなる、少なくとも１つの化学的に改変された核酸塩基を含む核酸標的配列をプロセシングする方法。
【請求項１２】
前記タンパク質ドメインがヌクレアーゼ活性、ポリメラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、メチラーゼ活性、トポイソメラーゼ活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、リコンビナーゼ活性からなる群より選択される触媒活性を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記追加のタンパク質ドメインが転写アクチベーターである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記核酸標的配列がメチル化プロモーター配列である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記追加のタンパク質ドメインがエンドヌクレアーゼである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記核酸標的配列の少なくとも一部に相同な配列を含む外因性核酸を細胞に提供することを更に含んでなり、核酸標的配列と外因性核酸との間で相同組換えが生じる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
(ａ)核酸標的配列と、複数のTALE様反復配列を含む転写アクチベーター様エフェクター(TALE)タンパク質であって、前記反復配列の各々が前記核酸標的配列の各核酸塩基に特異的な反復可変二残基(RVD)を含んでなり、少なくとも１つのRVDが以下：
−  Ｃを認識するためのＨＤ；
−  Ｔを認識するためのＮＧ；
−  Ａを認識するためのＮＩ；
−  Ｇ又はＡを認識するためのＮＮ；
−  Ａ又はＣ又はＧ又はＴを認識するためのＮＳ；
−  Ｔを認識するためのＨＧ；
−  Ｔを認識するためのＩＧ；
−  Ｇを認識するためのＮＫ；
−  Ｃを認識するためのＨＡ；
−  Ｃを認識するためのＮＤ；
−  Ｃを認識するためのＨＩ；
−  Ｇを認識するためのＨＮ；
−  Ｇを認識するためのＮＡ；
−  Ｇ又はＡを認識するためのＳＮ；及び
−  Ｔを認識するためのＹＧ；
からなる群より選択されるTALEタンパク質とを結合させ、
(ｂ)同じ核酸標的配列と、工程ａ)で使用したものと類似する、複数のTALE様反復配列を含む別の転写アクチベーター様エフェクター(TALE)タンパク質であって、少なくとも１つのRVDがＸ＊又は＊＊、好ましくはＨ＊、Ｔ＊、Ｑ＊又はＮ＊からなるRVD (ここで、ＸはＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｎ、Ｈ、Ｒ及びＫの群より選択される１つのアミノ酸残基を表し、＊はRVDの１つの位置でのギャップを表す)で置換されているTALEタンパク質とを結合させ、
(ｃ)ａ)及びｂ)の下で前記核酸標的配列との結合親和性を測定し、
(ｄ)ｃ)の下で測定した結合活性の比(ここで、該比は、０に近いとき、前記核酸標的配列中に化学的に改変された核酸が存在することを示し、１に近いとき、該核酸標的配列中に化学的に改変された核酸が存在しないことを示す)を算出する
ことを含んでなる、核酸標的配列中の少なくとも１つの化学的に改変された核酸塩基を検出する方法。
【請求項１８】
結合親和性がヌクレアーゼ活性で測定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
結合親和性が転写活性で測定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
結合親和性が(ａ)及び(ｂ)のTALEタンパク質に融合した蛍光タンパク質のシグナルを検出することにより測定される、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、核酸を効率的に標的し及び/又はプロセシングすることを可能にするポリペプチドに関し、より具体的には転写アクチベーター様エフェクター由来タンパク質に関する。具体的には、本発明は、メチル化DNAを効率的に標的することができるTALE由来タンパク質の特徴づけを報告するものである。本発明は、より具体的には、遺伝子サイレンシングを担うメチル化プロモーターの活性化を可能にするTALE由来タンパク質に関する。本発明はまた、これらタンパク質を使用する方法に関する。本発明はまた、本発明の反復可変二残基(RVD)ドメイン及び転写アクチベーター様エフェクター(TALE)タンパク質を使用するベクター、組成物及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
(細菌性植物病原体タンパク質の一群である)転写アクチベーター様エフェクター(TALE)は、近年、選ばれた特異性を有するオーダーメイドのDNA結合性ドメインを作製するための新たな工学操作可能な足場として浮上してきた(1，2)。TALEのDNA結合性ドメインは、可変数の33〜35アミノ酸反復モジュールにより構成される。これら反復モジュールは、12位及び13位に位置する２つの可変アミノ酸(すなわち、反復可変二残基(Repeat Variable Diredidues)、RVD)を除いて、互いにほぼ同一である。残基12及び13の性質が、個々の反復モジュールの塩基嗜好性を決定する。Moscou M. J and Bogdanove A. J及びBochらは次のコードを記載した：Ｃを認識するためのＨＤ；Ｔを認識するためのＮＧ；Ａを認識するためのＮＩ；Ｇ又はＡを認識するためのＮＮ；Ａ又はＣ又はＧ又はＴを認識するためのＮＳ；Ｔを認識するためのＨＧ；Ｔを認識するためのＩＧ；Ｇを認識するためのＮＫ；Ｃを認識するためのＨＡ；Ｃを認識するためのＮＤ；Ｃを認識するためのＨＩ；Ｇを認識するためのＨＮ；Ｇを認識するためのＮＡ；Ｇ又はＡを認識するためのＳＮ；及びＴを認識するためのＹＧ(国際PCT出願WO 2011/072246及び3，4)。１反復-対-１塩基対のコードから本質的になる、この驚くべきほど単純な暗号鍵(cipher)により、TALエフェクター結合部位の予測及びより重要なことには目的のDNA配列に結合するように仕立て得るカスタムTALエフェクター反復ドメインの構築が可能になった。この前例のない特徴により、標的付けられたゲノム応用のための新たな分子ツールを開発するという刺激的な展望が開かれ、過去２年以内に、TALE由来タンパク質は、転写アクチベーター/リプレッサー又はヌクレアーゼドメインに融合され、選択された遺伝子の転写を特異的に調節するため(5)又は標的付けられた遺伝子改変及び挿入を実行するため(6-9)の使用に成功している。
【０００３】
工学的に操作したTALE由来タンパク質の効率性に欠かせないのは、染色体上の標的部位にアクセスし、効率的に結合する能力である。クロマチンへのDNAのパッケージング、標的部位に対するヌクレオソームタンパク質の位置及び化学的なDNA改変(例えばメチル化)を含む多くの要因が結合を妨げ得る。高等真核生物では、DNAメチル化は、遺伝子発現の調節に関与し、ジヌクレオチド配列ＣｐＧ(10)に見出され、ＣｐＡ、ＣｐＴ及びＣｐＣ(11)にも見出されるシトシンのC5位で優勢に生じる。このような追加のメチル成分の存在は、シトシンを標的するために通常使用されるRVDであるＨＤによる改変シトシンの認識を妨げ得る。この特徴は、TALE由来タンパク質を用いるゲノム工学適用にとって重要なエピジェニックな欠点であり得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
化学的DNA改変を克服して、これら化学的改変を含む核酸を効率的に検出し、標的し、及びプロセシングするために、新たなRVD、反復配列、及びRVDを含むTALE由来タンパク質を設計する必要性が依然として存在する。
予想外にも、本発明者らは、精力的な研究の一環として、アミノ酸12位及び/又は13位にギャップを含む短いTAL反復(これは「不完全なRVD」を形成していると見なすことができる)は、化学的に改変された核酸塩基、特にメチル化塩基に良好に適応できることを見出した。この知見に基づいて、本発明者らは、現行のTALE由来タンパク質の上記制限を克服する方法として、メチル化された核酸標的配列を、より一般的には化学的に改変された塩基を効率的に標的することができるTALEを合成した。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の概要
一般的な観点では、本発明は、化学的改変を含む核酸の効率的な検出、標的及び/又はプロセシングを可能にするポリペプチドに関する。より具体的には、本発明は、化学的改変(例えばシトシンのメチル化)に対するTALE由来タンパク質の感受性の特徴づけを報告し、該感受性を変更する効率的な方法を提供する。この方法は、核酸標的配列内の化学的に改変された核酸塩基に適応するためのRVD「スター」(記号「＊」で表されるギャップを含む不完全RVDを意味する)の使用に依拠している。このギャップは、TAL反復と他の標準的な二残基とをClustalWアラインメントを用いて整列させたときに明らかとなる。より具体的には、本発明は、メチル化塩基、特に５-メチル-シトシンを特異的に標的するように、TALE反復ドメインにＮ＊及びＨ＊又は＊＊のRVDを含ませることに依拠する。本発明はまた、このようなRVDを含む転写アクチベーター様エフェクタータンパク質の使用方法に関する。本発明はまた、本発明のRVD及び転写アクチベーター様エフェクタータンパク質を使用するベクター、組成物及びキットに関する。
【０００６】
図表の簡単な説明
前出の特徴に加えて、本発明は更に、以下の説明及び添付の図面から明らかとなる他の特徴を含む。本発明のより完全な理解及びその付随する利点の多くが、下記の詳細な説明と併せて図に言及することでより十分に理解されるようになるにつれて、より容易に把握される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１：同族標的の８番目のデオキシシチジンと相互作用する(12)、PthXoI TAL反復ドメインの８番目のRVDであるＨＤのクローズアップ構造。デオキシシチジンのC5とアスパラギン酸のCβとの間及びデオキシシチジンのN4とアスパラギン酸のO2との間の距離を示し、水素結合を破線で示す。
【図２】図２：シトシン、５-メチル-シトシンの化学構造
【図３】図３：XPCT1_HD及びXPCT1_N* TALE-ヌクレアーゼの説明。Ａ．xpc1遺伝子座標的の説明。Ｂ．XPCT1_HD及びXPCT1_N* TALE-ヌクレアーゼを創出するために使用したXPCT1L_HD、XPCT1L_N*及びXPCT1R TAL反復アレイの配列。標的DNA配列の最初ヌクレオチド(５'→３')としての「Ｔ」は、(天然TALEのＮ末端ドメインのＣ末端部に仮想された０番目の反復に由来して名付けられた)「RVD0」反復(16)が認識・結合する。
【図４】図４：TAL反復アレイ_HD又はN*アセンブリ並びに酵母及び哺乳動物の発現プラスミド中へのサブクローニング。Ａ．TAL反復アセンブリに使用した材料の説明。Ｂ．ストレプトアビジン被覆固体支持体上への１つめのビオチン化TAL反復フラグメントの固定及びSfaNI適合性オーバーハング(赤色で表示するBbvIオーバーハング)を有する第２のTAL反復へのライゲーション。Ｃ．TAL反復の連続ライゲーション/制限による完全XPCT1L TAL反復アレイの創出。Ｄ．XPCT1L TAL反復アレイのSfaNI消化。Ｅ．XPCT1L TAL反復アレイのBbvI消化及び回収。Ｆ．AvrBs3 TALエフェクターのＮ末端ドメインとFokIタイプIIS制限エンドヌクレアーゼに融合したＣ末端ドメインの最初の11アミノ酸とを有する酵母又は哺乳動物の発現プラスミド中へのXPCT1L TAL反復アレイのサブクローニング。
【図５】図５：非メチル化染色体外DNA標的及びメチル化内因性xpc1遺伝子座に対するXPCT1_HD又はXPCT1_N* TALE-ヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性。Ａ．両TALE-ヌクレアーゼをコードする漸増量のDNAを、「材料及び方法」に記載したプロトコルに従って、CHO KIにトランスフェクトし、プロセシングした。染色体外非メチル化標的に対するXPCT1 TALE-ヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性を示す。Ｂ及びＣ．両TALE-ヌクレアーゼをコードする漸増量のDNAを、293H細胞にトランスフェクトし、トランスフェクションの３日後にゲノムDNAを抽出し、xpc1遺伝子座を増幅し、アンプリコンを、ディープシーケンシングにより分析するか、又はMillerら(6)により記載されたプロトコルに従ってT7ヌクレアーゼアッセイを行うために使用した。Ｂ．T7ヌクレアーゼアッセイから得られた結果。Ｃ．ディープシーケンシング分析から得られた結果。
【図６】図６：５-メチル-シトシンに対するXPCT1 TALE-ヌクレアーゼ感受性を変更する、天然に存在するTAL反復Ｈ＊及びＮＧの能力。Ａ．５-メチル-シトシンに対するTAL DNA結合性ドメインの感受性についてのTAL反復Ｈ＊及びＮＧの影響を調べるために使用したXPCT1 TALE-ヌクレアーゼモデルの概略図。Ｂ．293H細胞において、XPCT1-HD、N*、H*又はNG TALE-ヌクレアーゼをコードするプラスミド５μgにより誘導され、ディープシーケンシングで測定した内因性メチル化XPC1標的の標的付けられた変異誘発(TM)。Ｃ．293H細胞において、XPCT1-HD、N*、H*又はNG TALE-ヌクレアーゼをコードするプラスミド５μgが誘導され、EndoT7アッセイで測定した内因性メチル化XPC1標的の標的付けられた変異誘発(TM)。Ｄ．左のTAL DNA結合性ドメインの＋２位にＨＤ、Ｎ＊、Ｈ＊又はＮＧのいずれかを有するXPCT1 TALE-ヌクレアーゼを用いて得られた毒性アッセイの結果。漸増量のXPCT1 TALE-ヌクレアーゼを、一定量のGFPをコードするプラスミドと共にCHO KI細胞にトランスフェクトした。GFP強度レベルをフローサイトメトリでトランスフェクションの１日後及び６日後にモニターした。比(６日目での、TALE-ヌクレアーゼをトランスフェクトしたGFP発現細胞/６日目での、コントロールのトランスフェクトを行ったGFP発現細胞)(19)として細胞生存率を算出した。
【図７】図７：汎用５-メチル-シトシン結合性モジュールであるTAL反復Ｎ＊。Ａ．５-メチル-シトシンに対するTAL DNA結合性ドメイン感受性を変更するTAL反復Ｎ＊の能力を調べるために使用したXPCT1、T2及びT3 TALE-ヌクレアーゼの概略図。XPC1、XPC2及びXPC3 DNA標的を青色で表し、５-メチル-シトシン(5mC)の位置を点で示す。TAL DNA結合性ドメインを灰色で示し、Ｎ末端ドメイン、Ｃ末端ドメイン及びFokIドメインを黒色で示す。Ｂ．それぞれのTALE-ヌクレアーゼにより誘導され、EndoT7アッセイで測定した内因性メチル化XPC1、XPC2及びXPC3標的の標的付けられた変異誘発(TM)。右(Ｒ)及び左(Ｌ)のDNA結合性ドメインにTAL反復ＨＤ又はＮ＊の異なる組合せを含むTALE-ヌクレアーゼをアッセイした。明確化のための例として、右及び左のDNA結合性ドメインにそれぞれTAL反復ＨＤ及びＮ＊を有するXPCT3を、XPCT3 R-HD、L-N*と示す。Ｃ．左及び右のTAL DNA結合性ドメインの異なる位置にＨＤ又はＮ＊のいずれかを有するXPCT2及びXPCT3 TALE-ヌクレアーゼを用いた毒性アッセイの結果(XPCT3-HDは、左及び右のDNA結合性ドメインにTAL反復ＨＤを有するXPCT3の略号であり、XPCT3-N*は、左及び右のDNA結合性ドメインにTAL反復Ｎ＊を有するXPCT3の略号である)。
【図８】図８：５-メチル化シトシンに対するTAL DNA結合性ドメイン感受性を変更する工学的に操作したTAL反復Ｔ＊及びＱ＊の能力。293H細胞において、XPCT1-HD、NG、HG、N*、H*、Q*及びT* TALE-ヌクレアーゼをコードするプラスミド10μgにより誘導され、ディープシーケンシングで測定した内因性メチル化XPC1標的の標的付けられた変異誘発(TM)の頻度。本図に示した結果は、２回以上の実験から得られた。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
発明の詳細な説明
本明細書において特に定義しない限り、使用する全ての技術的及び科学的用語は、遺伝子治療、生化学、遺伝学及び分子生物学の分野の当業者により通常理解されるものと同義である。
適切な方法及び材料は本明細書に記載されているが、本明細書に記載したものと類似するか又は等価である全ての方法及び材料を本発明の実施及び試験に使用することができる。本明細書で言及する全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。衝突する場合、本明細書(定義を含む)が優先する。更に、本明細書に記載の材料、方法及び実施例は例示目的に過ぎず、特に明記されない限り、限定的な意味を有するものではない。
【０００９】
本発明の実施には、特に示さない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA及び免疫学の従来技法(当業者の能力の範囲内である)が用いられる。このような技法は文献に十分に説明されている。例えば、Current Protocols in Molecular Biology(Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA)；Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition(Sambrookら，2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Oligonucleotide Synthesis(M. J. Gait編，1984)；Mullisら，米国特許第4,683,195号；Nucleic Acid Hybridization(B. D. Harries & S. J. Higgins編 1984)；Transcription And Translation(B. D. Hames & S. J. Higgins編 1984)；Culture Of Animal Cells(R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press, 1986)；B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；シリーズMethods In ENZYMOLOGY(J. Abelson及びM. Simon編集主幹，Academic Press, Inc., New York)、具体的には第154及び155巻(Wuら編)並びに第185巻，「Gene Expression Technology」(D. Goeddel編)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J. H. Miller及びM. P. Calos編，1987, Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker編，Academic Press, London, 1987)；Handbook Of Experimental Immunology 第Ｉ〜IV巻(D. M. Weir and C. C. Blackwell編，1986)；並びにManipulating the Mouse Embryo(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)を参照。
【００１０】
転写アクチベーター様エフェクター由来タンパク質は、最近、ゲノム工学の新たなツールとして浮上している。しかし、ゲノムにおける関連の化学的改変(例えば、非限定例としてDNAメチル化)はTALE遺伝子標的化と干渉する。本研究において、本発明者らは、RVD「スター」が化学的に改変された核酸塩基を標的できることを示した。
一般的観点では、本発明は、化学的に改変された核酸の効率的な標的及び/又はプロセシングを可能にする転写アクチベーター様エフェクター由来タンパク質に関する。より具体的には、本発明は、化学的改変(例えば、非限定例としてアルキル化)を有する核酸の効率的な検出、標的及び/又はプロセシングを可能にする反復可変二残基(RVD)を含んでなる反復モジュール又は配列に関する。本発明は、核酸塩基の化学的改変(例えばシトシンメチル化)に対するTALE由来タンパク質の感受性の特徴づけを報告し、この感受性を変更する効率的方法を提示するものである。この方法は、化学的に改変された塩基に効率的に結合することができる実体として、RVDであるＸ＊又は＊＊ (ここで、ＸはＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｎ、Ｈ、Ｒ及びＫの群より選択される１つのアミノ酸残基を表し、＊はRVDの１つの位置でのギャップを表す)を利用することに依拠する。
【００１１】
最近、出願人は、内部共生体種バークホルデリア・リゾキシニカ(Burkholderia rhizoxinica)のゲノム中に、キサントモナス(Xanthomonas)のTALEと幾らかの類似性を示す新たなクラスのモジュラー塩基対塩基核酸結合性ドメイン(modular base per base nucleic acid binding domain；MBBBD)を見出した。この新たなモジュラータンパク質、及びゲノム中の核酸配列を標的するためのその使用は、2012年７月６日出願の米国出願第61/668,721号及び同第61/675,160号の主題である。このタンパク質のモジュールは、TALE反復とは非常に異なり、50％未満の相同性しか有さず、遥かに大きな個体間変動を示すが、その核酸塩基に対する特異性は、12位及び13位のアミノ酸によって見かけ上類似してもたらされる(RVD様)。MBBBD中の13位は核酸塩基自体の特異性を決定し得る。しかし、これらモジュールにおいて、13位は存在しないことがあり、よって本発明のように「スター」であり得ることが観察された。この事実を前提とすれば、本発明の教示は、この新たなMBBBDドメイン及びRVD様構造を有する他のタンパク質に適用可能であると考えられる。よって、本発明は、キサントモナスTALE中に見出されたRVDに限らず、メチル化核酸配列を標的するためのRVD様構造への「＊」の導入にまで及ぶ。
【００１２】
Ｉ．化学的に改変された塩基に結合し得るTALE由来タンパク質
本発明は、化学的に改変された塩基に効率的に結合することができる反復可変二残基(RVD)であるＸ＊又は＊＊、好ましくはＮ＊、Ｑ＊、Ｔ＊又はＨ＊ (ここで、ＸはＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｎ、Ｈ、Ｒ及びＫの群より選択される１つのアミノ酸残基を表し、＊はRVDの１つの位置でのギャップを表す)に関する。
反復可変二残基(RVD)は、12位及び13位に位置する可変アミノ酸(すなわち、反復可変二残基、RVD)のレベルでの(核酸標的配列中の)核酸塩基の結合を担う反復モジュール又は配列中に含まれる。
【００１３】
本発明において、核酸塩基の結合を担うRVD領域は、12位及び13位に任意の公知のアミノ酸残基を含んでなる。１つの好適な実施形態において、RVDは、アミノ酸一文字表記に従ってＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｎ、Ｈ、Ｒ及びＫからなる群からの１つのアミノ酸残基を12位に含んでなる。別の１つの好適な実施形態において、RVDは、アミノ酸一文字表記に従ってＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｎ、Ｈ、Ｒ及びＫからなる群からの１つのアミノ酸残基13位に含んでなる。別の１つの実施形態において、RVDは、核酸標的配列中の１つの核酸塩基を認識するために、アミノ酸一文字表記に従ってアミノ酸残基Ａ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｎ、Ｈ、Ｒ及びＫの組合せを12位及び13位に含んでなる。１つの好適な実施形態において、改変された核酸塩基の結合を担うRVDは、12位及び/又は13位にギャップを含んでなり、より具体的には、RVDは、Ｘ＊又は＊＊、好ましくはＮ＊、Ｑ＊、Ｔ＊又はＨ＊ (ここで、ＸはＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｎ、Ｈ、Ｒ及びＫの群より選択される１つのアミノ酸残基を表し、＊はRVDの１つの位置でのギャップを表す)を含んでなり、化学的に改変された塩基に効率的に結合することができる。
【００１４】
本発明のRVDは、古典的なプリン及びピリミジン塩基(すなわち、それぞれアデニン、グアニン及びシトシン、ウラシル及びチミジン)とは異なる塩基を含む改変ヌクレオチドに結合することができる。別の１つの観点において、本発明のRVDにより認識される化学的に改変された核酸塩基は、１つ又は数個の追加の化学基(例えば、非限定例として、アルキル又はヒドロキシル)を含むヌクレオチドである。前記追加の基は、ヌクレオチドへの１つの炭素基の移入をいうメチル基であってもよい。アルキル化とは、長鎖炭素基の移入をいう。別の１つの実施形態において、前記化学的に改変されたヌクレオチドは５-メチルシトシン塩基を含んでなる。別の１つの実施形態において、前記改変核酸塩基は、５-ヒドロキシメチルシトシン、５-ホルミルシトシン及び５-カルボキシルシトシンからなる群より選択される塩基を含んでなる。別の１つの実施形態において、本発明のRVDは、分子損傷(例えば、非限定例として、シトシン又はチミジン塩基から光化学反応により形成されるピリミジンダイマー)を含んでなるDNA配列に結合し得る。
【００１５】
本発明はまた、核酸標的配列中の改変核酸塩基の結合を担うRVDを含んでなる、転写アクチベーター様エフェクター(TALE)の反復配列又は反復モジュールに関する。12位及び13位の可変残基について上記した種々の観点に加えて、本発明の(TALE様反復配列と名付けられた)反復配列は、RVDを構成する30〜42アミノ酸、より好ましくは33〜35アミノ酸、より好ましくは33又は34アミノ酸の１又は幾つかに１又は幾つかの追加の変異を含んでなることができる。変異には、一文字表記に従うＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｎ、Ｈ、Ｒ及びＫからなる群からの任意の天然アミノ酸に向けられた置換並びに１又は幾つかのアミノ酸残基の挿入及び欠失が含まれる。
換言すれば、本発明の範囲には、核酸標的配列中の改変核酸塩基の結合を12位及び13位に位置する可変アミノ酸(すなわち、反復可変二残基、RVD)のレベルで担う１つの反復モジュール又は配列が含まれる。具体的には、TALEの反復配列又はモジュールは、化学的に改変された核酸塩基への結合用に、Ｘ＊及び＊＊、好ましくはＮ＊、Ｑ＊、Ｔ＊又はＨ＊ (ここで、ＸはＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｎ、Ｈ、Ｒ及びＫの群より選択される１つのアミノ酸残基を表し、＊はRVDの１つの位置でのギャップを表す)からなる群より選択されるRVDを含んでなる。
【００１６】
本発明はまた、核酸標的配列中の１つの特異的核酸塩基の結合を担う反復可変二残基領域(RVD)を各個が含む複数のTALE反復配列を含んでなる、核酸標的配列に特異的なTALE DNA結合性ドメインであって、化学的に改変された核酸塩基への結合用に、Ｘ＊及び＊＊、好ましくはＮ＊、Ｑ＊、Ｔ＊又はＨ＊ (ここで、ＸはＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｎ、Ｈ、Ｒ及びＫの群より選択される１つのアミノ酸残基を表し、＊はRVDの１つの位置でのギャップを表す)からなる群より選択される１以上のRVDを含んでなるTALE DNA結合性ドメインに関する。１つの好適な実施形態において、前記反復ドメインは、８〜30のTALE由来反復配列、より好ましくは８〜20、より好ましくは５、６、７、８、９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20の反復配列を含んでなる。
【００１７】
II．化学的に改変された塩基をプロセシングし得るTALEキメラタンパク質
本発明はまた、上記のTALE DNA結合性ドメインと、特異的核酸標的配列内又は該配列近傍のDNAをプロセシングするための追加のタンパク質ドメインとの間の融合体に相当するTALE由来キメラタンパク質に関する。換言すれば、本発明の前記ポリペプチドは、以下：
(ａ)核酸標的配列中の１つの特異的核酸塩基の結合を担う反復可変二残基領域(RVD)を各個が含む複数のTALE反復配列を含んでなる、核酸標的配列に特異的なTALE DNA結合性ドメインであって、化学的に改変された核酸塩基への結合用に、Ｘ＊及び＊＊、好ましくはＮ＊、Ｑ＊、Ｔ＊又はＨ＊ (ここで、ＸはＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｎ、Ｈ、Ｒ及びＫの群より選択される１つのアミノ酸残基を表し、＊はRVDの１つの位置でのギャップを表す)からなる群より選択される１以上のRVDを含んでなるTALE DNA結合性ドメイン
(ｂ)特異的核酸標的配列内又は該配列近傍のDNAをプロセシングするための追加のタンパク質ドメイン
を含んでなるTALE由来キメラタンパク質である。
【００１８】
１つの特定の実施形態において、本発明に従うキメラタンパク質は、前記TALE DNA結合性ドメインと、DNAをプロセシングする追加のタンパク質ドメインとを融合する少なくとも１つのペプチド性リンカーを含んでなることができる。１つの好適な実施形態において、前記ペプチド性リンカーは可撓性である。別の１つの好適な実施形態において、前記ペプチド性リンカーは構造化されている。
１つの特定の実施形態において、キメラタンパク質の追加のタンパク質ドメインは、転写アクチベーター若しくはリプレッサー(すなわち、転写調節因子)であるか、又はDNAプロセシングに関わる他のタンパク質と相互作用するか若しくは該タンパク質を改変するタンパク質であり得る。本発明のキメラタンパク質のDNAプロセシング活性の非限定例としては、例えば、エピジェネティック調節エレメントを生成し又は改変すること、DNAに部位特異的な挿入、欠失又は修復をなすこと、遺伝子発現を制御すること、及びクロマチン構造を改変することが挙げられる。
【００１９】
TALE DNA結合性ドメインと融合させる追加のタンパク質ドメインは、ヌクレアーゼ活性、ポリメラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、メチラーゼ活性、トポイソメラーゼ活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、リコンビナーゼ活性からなる群より選択される触媒活性を有していてもよい。１つの好適な実施形態において、前記タンパク質ドメインはエンドヌクレアーゼである；別の１つの好適な実施形態において、前記タンパク質ドメインはエキソヌクレアーゼである。
エンドヌクレアーゼを含むとき、本発明のTALE由来キメラタンパク質はTALE-ヌクレアーゼである；換言すれば、以下：
(ａ)核酸標的配列中の１つの特異的核酸塩基対の結合を担う反復可変二残基領域(RVD)を各個が含む複数のTALE反復配列を含んでなる、核酸標的配列に特異的な転写アクチベーター様エフェクター(TALE) DNA結合性ドメインであって、化学的に改変された核酸塩基への結合用に、Ｘ＊及び＊＊、好ましくはＮ＊、Ｑ＊、Ｔ＊又はＨ＊ (ここで、ＸはＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｎ、Ｈ、Ｒ及びＫの群より選択される１つのアミノ酸残基を表し、＊はRVDの１つの位置でのギャップを表す)からなる群より選択される１以上のRVDを含んでなるTALE DNA結合性ドメイン；
(ｂ)特異的核酸標的配列内又は該配列近傍のDNAをプロセシングするエンドヌクレアーゼドメイン
を含んでなるTALE-ヌクレアーゼは、本発明の範囲内である。
【００２０】
前記TALEヌクレアーゼを構成するエンドヌクレアーゼドメインに依存して、核酸標的配列中の切断は、二本鎖破断又は一本鎖破断のいずれかに相当する。
非限定例として、前記エンドヌクレアーゼは、DNA結合性ドメインとは独立して機能し、ダイマーとして核酸の二本鎖切断を誘導する(Li, Wuら 1992；Kim, Chaら 1996)タイプIIS FokIエンドヌクレアーゼドメイン又はその機能的バリアントであることができる。FokIバリアントのアミノ酸配列は、触媒ドメインをコードするDNAの変異により製造することができる。このようなバリアントとしては、例えば、アミノ酸配列内の残基の欠失、挿入又は置換が挙げられる。欠失、挿入及び置換の任意の組合せを行って、最終構築物に到達してもよい(但し、当該最終構築物が所望の活性を有するという条件で)。本発明に従うFokIバリアントの前記ヌクレアーゼドメインは、FokIのタンパク質配列と少なくとも80％、より好ましくは90％、より好ましくは95％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質配列フラグメントを含んでなる。特定の実施形態において、第１及び第２のキメラタンパク質が、一緒になって特異的核酸標的配列内又は該配列近傍の核酸をプロセシングするダイマーとして作用するモノマーとしてそれぞれ機能することができる。非限定例として、２つのモノマーは、異なる近傍核酸標的配列を認識し、各々がTALE由来キメラタンパク質を構成する２つのタンパク質ドメインは、特異的核酸標的配列内又は該配列近傍の核酸をプロセシングするために相互作用することが必要であるサブドメインとして機能する。
【００２１】
別の１つの特定の実施形態において、キメラタンパク質は、特異的な認識・切断に二量体化を必要としない単量体TALE-ヌクレアーゼである。非限定例として、このような単量体TALE-ヌクレアーゼは、I-TevIの触媒ドメイン又はそのバリアントに融合したTALE DNA結合性ドメインを含んでなる。
１つの好適な実施形態において、本発明に従うTALE-ヌクレアーゼは、TALE DNA結合性ドメインとエンドヌクレアーゼドメインとを融合する少なくとも１つのペプチド性リンカーを含んでなることができる。１つの好適な実施形態において、ペプチド性リンカーは可撓性であるか又は構造化されている。
１つのより具体的な実施形態において、本発明は、配列番号38〜配列番号49からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなるTALE-ヌクレアーゼに関する。
【００２２】
１つのより好適な実施形態において、本発明に従うTALE-ヌクレアーゼのDNA結合性ドメインは、核酸標的配列中の１つの化学的に改変された核酸塩基の結合を担う１以上の反復可変二残基領域(RVD)を含んでなる。TALE-ヌクレアーゼのRVDは、TALEのRVD及び反復配列について上記した種々の観点の１つ又は幾つかを採用することができる。
本発明に従うRVD、DNA結合性ドメイン、TALE-ヌクレアーゼ、キメラタンパク質はまた、当該分野において周知の変異誘発プロセスにより導入された単一又は複数の追加のアミノ酸置換又はアミノ酸挿入又はアミノ酸欠失を含んでなることができると理解される。本発明に従うRVD、DNA結合性ドメイン、TALE-ヌクレアーゼ、キメラタンパク質及びポリペプチドのバリアント、機能的変異体及び誘導体もまた本発明の範囲に含まれる。本発明に従うRVD、DNA結合性ドメイン、TALE-ヌクレアーゼ、キメラタンパク質及びポリペプチドの配列とヌクレオチドレベル又はポリペプチドレベルで高率の同一性又は高率の相同性を有する配列を示すRVD、DNA結合性ドメイン、TALE-ヌクレアーゼ、キメラタンパク質及びポリペプチドもまた、本発明の範囲に含まれる。高率の同一性又は高率の相同性とは、70％、より好ましくは75％、より好ましくは80％、より好ましくは85％、より好ましくは90％、より好ましくは95％、より好ましくは97％、より好ましくは99％又は70％〜99％に含まれる任意の整数を意図する。
【００２３】
本発明の１つの別の観点は、本発明に従うポリペプチド、TALE DNA結合性ドメイン、TALE由来キメラタンパク質及びTALE-ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、又は前記ポリペプチド等をコードする配列を含んでなるポリヌクレオチドである。このポリヌクレオチドを含んでなるベクターもまた含まれる。
本発明に従うポリペプチド、TALE DNA結合性ドメイン、TALE由来キメラタンパク質及びTALE-ヌクレアーゼをコードするベクター及び/若しくは組換えポリヌクレオチドを含んでなるか、又は前記ポリペプチド等をコードする配列を含むベクター及び/若しくは組換えポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞もまた、本発明の範囲に含まれる。
【００２４】
本発明に従うポリペプチド、TALE DNA結合性ドメイン、TALE由来キメラタンパク質及びTALE-ヌクレアーゼをコードするベクター及び/若しくは組換えポリヌクレオチドを含んでなるか、又は前記ポリペプチド等をコードする配列を含むベクター及び/若しくは組換えポリヌクレオチドを含んでなる非ヒトトランスジェニック動物もまた、本発明の範囲に含まれる。本発明に従うポリペプチド、TALE DNA結合性ドメイン、TALE由来キメラタンパク質及びTALE-ヌクレアーゼをコードするベクター及び/若しくは組換えポリヌクレオチドを含んでなるか、又は前記ポリペプチド等をコードする配列を含むベクター及び/若しくは組換えポリヌクレオチドを含んでなるトランスジェニック植物もまた、本発明の範囲に含まれる。
本発明はまた、本発明に従うポリペプチド若しくはTALE DNA結合性ドメイン若しくはTALE由来キメラタンパク質若しくはTALE-ヌクレアーゼ、又はこのような組換え分子をコードするベクター及び/若しくは組換えポリヌクレオチド、又は該分子をコードする配列を含むベクター及び/若しくは組換えポリヌクレオチドと、該キットの使用のための指示書を少なくとも含んでなるキットに関する。
【００２５】
本発明はまた、本発明に従うポリペプチド若しくはTALE DNA結合性ドメイン若しくはTALE由来キメラタンパク質若しくはTALE-ヌクレアーゼ、又はこのような組換え分子をコードするベクター及び/若しくは組換えポリヌクレオチド、又は該分子をコードする配列を含むベクター及び/若しくは組換えポリヌクレオチドとキャリアとを少なくとも含んでなる組成物に関する。組換え分子及び医薬的に活性なキャリアを含んでなる医薬組成物がより好ましい。治療目的には、本発明に従うキメラタンパク質及び医薬的に許容される賦形剤が治療有効量で投与される。この組合せは、投与量が生理学的に有意である場合、「治療有効量」で投与されると言える。薬剤は、その存在がレシピエントの生理に検出可能な変化を生じる場合、生理学的に有意である。これと関連して、薬剤は、その存在が標的疾患の１以上の症状の重篤度の減少及びゲノム損傷又は異常の修正を生じる場合、生理学的に有意である。
【００２６】
III．方法
１．化学的に改変された核酸塩基に結合することができるTALE由来タンパク質の合成方法
別の１つの観点において、本発明はまた、標的化DNA切断から標的化遺伝子調節にわたる種々の適用のための本発明に従うTALE DNA結合性ドメイン(TALEアレイとも呼ばれる)、TALE由来タンパク質、TALE-ヌクレアーゼ及びキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドの合成方法に関する。
本発明の１つの観点は、化学的に改変された核酸塩基を含んでなる核酸標的配列に対する転写アクチベーター様エフェクター(TALE)タンパク質の合成方法である。この方法は、核酸標的配列の各核酸塩基に特異的な反復可変二残基(RVD)を各々含む複数のTALE様反復配列を組み立てることを含んでなる。核酸標的配列に含まれる化学的に改変された核酸塩基を特異的に標的するRVDは、化学的に改変された核酸塩基に適応するために、Ｘ＊又は＊＊ (ここで、ＸはＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｎ、Ｈ、Ｒ及びＫの群より選択される１つのアミノ酸残基を表し、＊はRVDの１つの位置でのギャップを表す)から選択される。
【００２７】
１つの好適な実施形態において、前記方法は、以下の工程：
(ａ)細胞のゲノム中で化学的に改変された核酸塩基を含む核酸標的配列を決定する工程；
(ｂ)以下：
−  Ｃを認識するためのＨＤ；
−  Ｔを認識するためのＮＧ；
−  Ａを認識するためのＮＩ；
−  Ｇ又はＡを認識するためのＮＮ；
−  Ａ又はＣ又はＧ又はＴを認識するためのＮＳ；
−  Ｔを認識するためのＨＧ；
−  Ｔを認識するためのＩＧ；
−  Ｇを認識するためのＮＫ；
−  Ｃを認識するためのＨＡ；
−  Ｃを認識するためのＮＤ；
−  Ｃを認識するためのＨＩ；
−  Ｇを認識するためのＨＮ；
−  Ｇを認識するためのＮＡ；
−  Ｇ又はＡを認識するためのＳＮ；及び
−  Ｔを認識するためのＹＧ
からなる群より選択される少なくとも１つのRVDを含む反復可変二残基(RVD)をコードすることにより各反復が前記核酸標的配列の各核酸塩基に特異的なTALE様反復ポリヌクレオチド配列であって、核酸標的配列内の化学的に改変された核酸塩基を特異的に標的するRVDがＸ＊又は＊＊のRVD (ここで、ＸはＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｎ、Ｈ、Ｒ及びＫの群より選択される１つのアミノ酸残基を表し、＊はRVDの１つの位置でのギャップを表す)から選択されるTALE様反復ポリヌクレオチド配列を組み立てる工程；
(ｃ)工程(ｂ)で組み立てられたポリヌクレオチド配列を前記細胞中で発現させる工程
の少なくとも１つを含んでなる。
１つのより好適な実施形態において、化学的に改変された塩基は、上記の改変核酸塩基に相当し、好ましくはメチル化塩基、具体的には５-メチルシトシンである。
【００２８】
本発明はまた、化学的に改変された塩基を含む核酸標的配列で規定される遺伝子座にて核酸をプロセシングするキメラタンパク質を合成する方法に関し、当該方法は以下：
(ａ)以下：
(ｉ)複数のTALE様反復配列を含む転写アクチベーター様エフェクター(TALE)タンパク質であって、該複数のTALE様反復配列の各々が前記核酸標的配列の各核酸塩基に特異的な反復可変二残基(RVD)を含み、核酸標的配列内の化学的に改変された核酸塩基を特異的に標的するRVDが、Ｘ＊又は＊＊ (ここで、ＸはＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｎ、Ｈ、Ｒ及びＫの群より選択される１つのアミノ酸残基を表し、＊はRVDの１つの位置でのギャップを表す)から選択されるTALEタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド；と
(ii)化学的に改変された塩基を含む前記核酸標的配列内又は該配列近傍の核酸をプロセシングする追加のタンパク質ドメインをコードする第２のポリヌクレオチド
との融合体を含むポリヌクレオチド配列を合成し；
(ｂ)工程(ａ)のポリヌクレオチド配列を宿主細胞中で発現させる
ことをを含んでなる。
別の１つの好適な実施形態において、化学的に改変された塩基を特異的に標的するRVDは、Ｎ＊、Ｔ＊、Ｑ＊及びＨ＊のRVDから優先的に選択される。別の１つの特定の実施形態において、化学的に改変された塩基を特異的に標的するRVDは、ＮＧ及びＨＧのRVDから優先的に選択される。
【００２９】
１つの好適な実施形態において、追加のタンパク質ドメインは、ヌクレアーゼ活性、ポリメラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、メチラーゼ活性、トポイソメラーゼ活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、リコンビナーゼ活性からなる群より選択される触媒活性を有する。別の１つの好適な実施形態において、キメラタンパク質のタンパク質ドメインは、遺伝子サイレンシングを担うメチル化プロモーターの部位特異的活性化を場合により可能にし得る転写アクチベーターであることができる。１つのより好適な実施形態において、追加のタンパク質ドメインはエンドヌクレアーゼであり、よってキメラタンパク質はTALE-ヌクレアーゼである。
非限定例として、各TALE様反復は、図４に示すような連続する制限、ライゲーション、洗浄工程から構成される固相支持体法を用いて一緒に組み立てることができ、その後更にベクター中に配置することができる。他の方法、例えば非限定例としてゴールデンゲートクローニング法及びバリアント又はFLASHアセンブリ法を使用してもよい(5，21，23，24)。
【００３０】
本明細書で使用する場合、用語「発現」とは、ポリヌクレオチド(転写物)又はポリペプチド産物の生成をいう。本発明の方法は、ポリヌクレオチドを細胞に導入することを含む。TALE由来タンパク質又はキメラタンパク質は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入した結果、細胞内でインサイチュに合成されてもよい。或いは、TALE由来タンパク質又はキメラタンパク質を細胞外で製造した後に細胞に導入することもできる。ポリヌクレオチド構築物を細菌、植物、真菌及び動物に導入する方法は、当該分野において公知であり、非限定例として、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムに組み込まれる安定形質転換法、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムに組み込まれない一過性形質転換法、及びウイルス媒介法が挙げられる。ポリヌクレオチドは、例えば組換えウイルスベクター(例えばレトロウイルス、アデノウイルス)、リポソームなどにより細胞に導入されてもよい。例えば、一過性形質転換法としては、例えばマイクロインジェクション、エレクトロポレーション又は微粒子銃が挙げられる。ポリヌクレオチドは、原核又は真核細胞で発現させるという観点から、ベクターに、より具体的にはプラスミド又はウイルスに含ませてもよい。或いは、ポリヌクレオチド転写物を細胞に導入してもよい。
【００３１】
より具体的には、本発明は、シトシンメチル化に非感受性のTALE DNA結合性ドメインをコードする核酸を作製する方法に関し、該方法は、以下の工程：
(ａ)細胞のゲノム中で標的DNA配列を決定する工程；
(ｂ)前記DNA標的配列に特異的であり、該DNA標的配列中の１つの特異的ヌクレオチドの結合を担う反復可変二残基(RVD)を各個が含む複数のTALE反復配列を含むTALE DNA結合性ドメインであって、化学的に改変された核酸塩基への結合用に、Ｘ＊及び＊＊ (ここで、ＸはＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｎ、Ｈ、Ｒ及びＫの群より選択される１つのアミノ酸残基を表し、＊はRVDの１つの位置でのギャップを表す)からなる群より選択される１以上のRVDを含んでなるTALE DNA結合性ドメインをコードする核酸を合成する工程、
(ｃ)前記核酸を前記細胞に導入する工程
を含んでなり、このことにより、適切な条件で発現させたとき、シトシンメチル化状態とは独立に、前記DNA標的配列に結合するTALE DNA結合性ドメインをコードする核酸が取得される。
【００３２】
１つの特定の実施形態において、DNA標的配列に結合するTALE DNA結合性ドメインは、適切な条件で発現させたとき、化学的改変とは独立に、DNA標的配列付近で転写活性化を促進する。
別の１つの実施形態において、本発明は、シトシンメチル化に非感受性のTALE-ヌクレアーゼをコードする核酸を作製する方法に関し、該方法は、以下の工程：
(ａ)細胞のゲノム中でDNA標的配列を決定する工程；
(ｂ)(ｉ)前記DNA標的配列に特異的であり、該DNA標的配列中の１つの特異的ヌクレオチドの結合を担う反復可変二残基(RVD)を各個が含む複数のTALE反復配列を含むTALE DNA結合性ドメインであって、化学的に改変された核酸塩基への結合用に、Ｘ＊及び＊＊ (ここで、ＸはＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｎ、Ｈ、Ｒ及びＫの群より選択される１つのアミノ酸残基を表し、＊はRVDの１つの位置でのギャップを表す)からなる群より選択される１以上のRVDを含んでなるTALE DNA結合性ドメイン及び(ii)特異的DNA標的配列内又は該配列近傍のDNAをプロセシングするエンドヌクレアーゼドメインをコードする核酸を合成する工程、
(ｃ)前記核酸を前記細胞に導入する工程
を含んでなり、このことにより、適切な条件で発現させたとき、シトシンメチル化状態とは独立に、特異的DNA標的配列内又は該配列近傍のDNAをプロセシングするTALE-ヌクレアーゼをコードする核酸が取得される。
【００３３】
１つの好適な実施形態において、本発明に従うTALE-ヌクレアーゼは、TALE DNA結合性ドメインとエンドヌクレアーゼドメインとを融合する少なくとも１つのペプチドリンカーを含んでなることができる。１つの好適な実施形態において、ペプチド性リンカーは可撓性である。別の１つの好適な実施形態において、ペプチド性リンカーは構造化されている。
より具体的には、本発明は、以下の工程：
(ａ)目的のDNA標的配列を決定する工程；
(ｂ)前記DNA標的配列に特異的であり、該DNA標的配列中の１つの特異的ヌクレオチド対の結合を担う反復可変二残基領域(RVD)を各個が含む複数のTALE反復配列を含む反復配列ドメインであって、前記TALE DNA結合性ドメインが化学的に改変された核酸塩基への結合用に、Ｘ＊及び＊＊ (ここで、ＸはＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｎ、Ｈ、Ｒ及びＫの群より選択される１つのアミノ酸残基を表し、＊はRVDの１つの位置でのギャップを表す)からなる群より選択される１以上のRVDを含んでなる、反復配列ドメインを合成する工程；
(ｃ)特異的DNA標的配列内又は該配列近傍のDNAをプロセシングするタンパク質ドメインを準備する工程；
(ｄ)随意に、工程ｂ)及びｃ)で得られたポリペプチドを連結するペプチド性リンカーを設計する工程；
(ｅ)前記キメラタンパク質を組み立てる工程；
(ｆ)前記キメラタンパク質の活性を試験する工程
を少なくとも含んでなる方法により取得可能なキメラタンパク質を包含する。
【００３４】
１つの更なる実施形態において、合成工程ｂ)は、図４及び実施例に示すような連続する制限/ライゲーション/洗浄工程から構成される固相支持体法を用いて行うことができる；工程ｃ)は、目的のタンパク質ドメインをプラスミドベクターにクローニングすることで行うことができる；本発明に従うキメラタンパク質が非限定例としてのTALE-ヌクレアーゼである場合、タンパク質ドメインは、選択したペプチド性リンカーと、更にはRVD用の追加のＮ末端及びＣ末端骨格とも併せて、同じベクターにクローニングすることができる。組立て工程ｅ)は、工程ｂ)の反復配列ドメインを、工程ｅ)から得られるベクターにクローニングすることで行うことができる。試験工程ｆ)は、キメラタンパク質が非限定例としてのTALE-ヌクレアーゼである場合、以前に記載されたようなDNA標的配列を含む酵母標的レポータープラスミドを用いて酵母において行うことができる(国際PCT出願WO 2004/067736並びに[Epinat, Arnouldら 2003(13)；Chames, Epinatら 2005(17)；Arnould, Chamesら 2006(14)；Smith, Grizotら 2006(18)]。TALE-ヌクレアーゼの活性は、以前に記載されたような酵母SSAアッセイにおいて30℃及び37℃にて試験することができる(国際PCT出願WO 2004/067736並びに[Epinat, Arnouldら 2003(13)；Chames, Epinatら 2005(17)；Arnould, Chamesら 2006(14)；Smith, Grizotら 2006(18)]。
【００３５】
２．化学的に改変された核酸塩基を含む核酸標的配列をプロセシングする方法
別の１つの観点において、本発明はまた、本発明に従うTALEドメインを含むタンパク質を、標的化核酸切断から標的化遺伝子調節にわたる種々の適用に使用する方法に関する。
１つの特定の実施形態において、本発明は、少なくとも１つの化学的に改変された核酸塩基を含む核酸標的配列を結合させる方法に関し、該方法は、以下：
(ｉ)化学的に改変された核酸塩基を含む核酸標的配列と、(ii)前記核酸標的配列の各ヌクレオチド塩基に特異的な反復可変二残基(RVD)を含み、前記核酸標的配列内の化学的に改変された核酸塩基を特異的に標的するRVDがＸ＊又は＊＊、好ましくはＮ＊、Ｑ＊、Ｔ＊又はＨ＊ (ここで、ＸはＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｎ、Ｈ、Ｒ及びＫの群より選択される１つのアミノ酸残基を表し、＊はRVDの１つの位置でのギャップを表す)から選択される、TALEタンパク質とを接触させることを含んでなる。
【００３６】
より具体的には、本発明は、少なくとも１つの化学的に改変された核酸塩基を含む核酸標的配列を結合させる方法に関し、該方法は以下：
(ａ)化学的に改変された塩基を含む核酸標的配列を含有する細胞を準備し、
(ｂ)前記核酸標的配列を指向する上記のようなTALEタンパク質を前記細胞内で合成し、
(ｃ)化学的に改変された塩基を含む核酸標的配列とのTALEタンパク質の結合親和性を試験する
ことを含んでなる。
１つの好適な実施形態において、前記特異的DNA配列は、ＣｐＧ、ＣｐＡ、ＣｐＴ、ＣｐＣからなる群より選択される少なくとも１つの化学的に改変されたジヌクレオチドを含む。
【００３７】
別の１つの観点において、本発明は、上記のキメラタンパク質を用いて、少なくとも１つの化学的に改変された核酸塩基を含む核酸標的配列をプロセシングする方法に関する。この方法は、好ましくは、以下の工程：
(ａ)化学的に改変された核酸塩基を含む核酸標的配列を含有する細胞を準備する工程；
(ｂ)前記核酸標的配列を指向し、該記核酸標的配列内又は該配列近傍の核酸を化学的改変とは独立にプロセシングするキメラタンパク質を前記細胞内で合成する工程、及び
(ｃ)前記核酸標的配列の遺伝子座での核酸プロセシングを試験する工程
を含んでなる。
一般には、本発明のキメラタンパク質は、ヌクレアーゼ活性、ポリメラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、メチラーゼ活性、トポイソメラーゼ活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、リコンビナーゼ活性からなる群より選択される触媒活性を有することができる。別の１つの好適な実施形態において、キメラタンパク質のタンパク質ドメインは、遺伝子サイレンシングを担うメチル化プロモーターの部位特異的活性化を場合により可能し得る転写アクチベーターであることができる。別の１つの好適な実施形態において、タンパク質ドメインは、転写リプレッサーであることもできる。
【００３８】
任意の核酸標的配列を本方法でプロセシングすることができる。例えば、核酸標的配列は、染色体のオルガネラ配列、例えばミトコンドリア又は葉緑体の配列であることができる。或いは、核酸標的配列は、プラスミド又はウイルスの配列であることができる。本明細書で使用する場合、用語「プロセシング」は、単にポリペプチドが結合しただけでも配列は改変されたと見なすことを意味する。用語「プロセシング」は、本明細書で使用する場合、例えば、核酸標的配列付近での転写活性化の促進を意味する。例えば、キメラタンパク質は、転写アクチベーター(例えばVP16)に融合した本発明に従うTALEドメインを含んでなることができる。前記方法は、プロモーターがメチル化によりサイレンシングを受けている細胞で当該遺伝子を再活性化することに特に適切である。換言すれば、本発明は、転写が通常はメチル化によりサイレンシングを受けている細胞で遺伝子転写を活性化する方法に関する。１つの好適な実施形態において、細胞は真核細胞又は初代細胞、幹細胞、人工多能性幹(iPS)細胞又は前記のいずれかのタイプの細胞に由来する細胞株である。
【００３９】
非限定例として、結合親和性は、TALEタンパク質に融合したレポータータンパク質(例えば、蛍光タンパク質)のシグナルを検出することにより、又は例えば抗体を用いてTALEタンパク質の存在を検出することにより試験することができる。１つの好適な実施形態において、結合親和性、特に核酸プロセシングは、ヌクレアーゼ活性又は転写活性により試験してもよい。例えば、キメラタンパク質がTALE-ヌクレアーゼである場合、核酸プロセシングは、以前に記載されたような核酸標的配列を含む酵母標的レポータープラスミドを用いて酵母で試験することができる(国際PCT出願WO 2004/067736並びに[Epinat, Arnouldら 2003(13)；Chames, Epinatら 2005(17)；Arnould, Chamesら 2006(14)；Smith, Grizotら 2006(18)]。TALE-ヌクレアーゼの活性は、以前に記載された酵母SSAアッセイにおいて30℃及び37℃にて試験することができる(国際PCT出願WO 2004/067736並びに[Epinat, Arnouldら 2003(13)；Chames, Epinatら 2005(17)；Arnould, Chamesら 2006(14)；Smith, Grizotら 2006(18)。
【００４０】
１つの特定の実施形態において、追加のタンパク質ドメインは、ヌクレアーゼ活性、より好ましくはエンドヌクレアーゼ活性を有する触媒ドメインであり、本発明は、より具体的には、核酸標的配列内又は該配列近傍の細胞の遺伝物質を改変する方法に関する。
エンドヌクレアーゼにより引き起こされる二本鎖破断は、通常、非相同末端連結(NHEJ)により修復される。NHEJは、少なくとも２つの異なるプロセスを含んでなる。機序には、残存している２つのDNA末端を直接再ライゲーション(Critchlow and Jackson 1998)又はいわゆる微小相同性媒介末端連結(Ma, Kimら 2003)により再連結することが含まれる。非相同末端連結(NHEJ)による修復は、しばしば小さな挿入又は欠失を生じ、特異的な遺伝子ノックアウトの創出に使用することができる。本発明は、遺伝情報の喪失に至る核酸切断を可能にする、本発明に従うキメラタンパク質、好ましくはTALE-ヌクレアーゼを用いて核酸標的配列内又は該配列近傍の細胞の遺伝物質をプロセシングする方法に関し、任意のNHEJ経路が標的付けられた変異誘発を生じる。１つの好適な実施形態において、本発明は、核酸標的配列付近で少なくとも１つの核酸切断及び遺伝情報の喪失を生じさせ、よってNHEJによる無痕跡再ライゲーションを予防することで、核酸標的配列内又は該配列近傍の細胞の遺伝物質を改変する方法に関する。改変は、遺伝物質の欠失、遺伝物質におけるヌクレオチドの挿入又はヌクレオチドの欠失及び挿入の両方の組合せであり得る。
【００４１】
本発明はまた、宿主細胞で追加の触媒ドメインを発現させる工程を更に含んでなる、核酸標的配列を改変する方法に関する。１つのより好適な実施形態において、本発明は、追加の触媒ドメインがDNA末端プロセシング酵素である、変異誘発を増大させる方法に関する。DNA末端プロセシング酵素の非限定例としては、5-3'エキソヌクレアーゼ、3-5'エキソヌクレアーゼ、5-3'アルカリエキソヌクレアーゼ、5'フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、ホスファターゼ、ヒドロラーゼ及びテンプレート非依存性DNAポリメラーゼが挙げられる。このような触媒ドメイン非限定例は、hExoI(EXO1_HUMAN)、酵母ExoI(EXO1_YEAST)、E.coli ExoI、ヒトTREX2、マウスTREX1、ヒトTREX1、ウシTREX1、ラットTREX1、TdT(末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ)、ヒトDNA2、酵母DNA2(DNA2_YEAST)からなる群より選択されるタンパク質ドメイン若しくはタンパク質ドメインの触媒的に活性な誘導体を含んでなる。１つの好適な実施形態において、追加の触媒ドメインは3'-5'-エキソヌクレアーゼ活性を有し、１つのより好適な実施形態において、追加の触媒ドメインはTREXエキソヌクレアーゼ活性、より好ましくはTREX2活性を有する。別の１つの好適な実施形態において、触媒ドメインは単鎖TREXポリペプチドによりコードされる。追加の触媒ドメインは、本発明に従うキメラタンパク質と、随意にペプチドリンカーにより、融合されていてもよい。
【００４２】
エンドヌクレアーゼ性破断は、相同組換え率を刺激することが知られている。したがって、別の１つの好適な実施形態において、ヌクレアーゼ活性を有するキメラタンパク質(例えば、TALE-ヌクレアーゼ)を使用するとき、本発明は、核酸標的配列と外因性核酸との間で相同組換えが起きるように核酸標的配列の一部分に相同な配列を少なくとも含む外因性核酸を細胞に提供することを更に含んでなる、核酸標的配列における相同遺伝子標的化を誘導する方法に関する。核酸標的配列の切断後、該核酸標的配列を含むゲノムと外因性核酸との間での相同組換え事象を刺激する。好ましくは、少なくとも50bpの、好ましくは100bpを超える、より好ましくは200bpを超える相同配列を外因性核酸内で使用する。したがって、外因性核酸は、好ましくは200bp〜6000bp、より好ましくは1000bp〜2000bpである。実際、共有される核酸相同性部分は、切断部位の上流及び下流に隣接する領域に位置し、導入核酸配列は、これら２つのアームの間に位置すべきである。
【００４３】
別の１つの実施形態において、外因性核酸は、核酸標的配列に導入すべき配列に隣接する該核酸標的配列の一部分又は近傍部分に相同な２つの配列を含む。具体的には、外因性核酸は、核酸標的の5'側及び3'側の領域にそれぞれ相同な第１及び第２の部分を含む。この実施形態における外因性核酸は、第１の部分と第２の部分との間に位置する、核酸標的配列の5'側及び3'側の領域と相同性がない第３の部分も含むことができる。この場合、外因性配列は、細胞への新たな遺伝物質の導入を可能にする。細胞に導入される新たな遺伝物質は、細胞に選択上の利点又は商業上の利点を付与することができる。別の１つの実施形態において、外因性配列は、細胞における遺伝物質の置換を可能にする。別の１つの実施形態において、外因性配列は細胞における遺伝物質の修復を可能にする。
【００４４】
特定の実施形態において、外因性核酸は、２つの相同性アームの間にポジティブ選択マーカーを含むことができ、更には第１の相同性アームの上流又は第２の相同性アームの下流にネガティブ選択マーカーを含むことができる。マーカーにより、標的部位での相同組換えにより目的の配列が挿入された細胞の選択が可能になる。破断事象が生じている標的化ゲノム配列の位置に依存して、この外因性核酸は、例えば遺伝子のオープンリーディングフレーム内に位置する場合、該遺伝子をノックアウトするために使用することができ、又は目的の新たな配列若しくは遺伝子を導入するために使用することができる。このような外因性核酸を用いる配列挿入は、標的された既存の遺伝子を、該遺伝子の修正若しくは置換により改変するため(非限定例として対立遺伝子取替え)又は標的された遺伝子の発現をアップレギュレート若しくはダウンレギュレートするため(非限定例としてプロモーター取り替え)に使用することができる。
【００４５】
相同組換え事象が生じた細胞は、当該分野において周知の方法により選択することができる。非限定例として、外因性核酸配列内で一致する１つのオリゴヌクレオチドと、該外因性核酸の外側であるが標的された遺伝子座に近い細胞ゲノム核酸内で一致する１つのオリゴヌクレオチドとを用いるPCR分析を行うことができる。したがって、本発明の方法により、変異誘発事象又は相同組換え事象が可能になる細胞を選択することができる。
別の１つの実施形態において、細胞に導入する外因性配列は、最初の二本鎖破断を生じさせるために使用するタンパク質で切断されないように最適化することができる。換言すれば、本発明に従うタンパク質又はキメラタンパク質により生じた二本鎖破断の後に、核酸標的配列を置換で修正しなければならない場合、外因性置換配列は、元のタンパク質又はキメラタンパク質で切断されないように改変することができる。改変としては、非限定例として、標的された配列が遺伝子のコーディング配列に存在する場合のサイレント変異又は標的された配列が非コーディング配列に存在する場合の変異が挙げられる。
【００４６】
換言すれば、本発明は、DNA標的配列への結合についてのTALEアレイのヌクレオチド化学的改変感受性を変更する方法に関し、該方法は以下の工程：
(ａ)細胞のゲノム中で少なくとも１つの化学的に改変された核酸塩基を含むDNA標的配列を決定する工程、
(ｂ)前記DNA標的配列に特異的であり、該DNA標的配列中の１つの特異的ヌクレオチドの結合を担う反復可変二残基領域(RVD)を各個が含む複数のTALE反復配列を含んでなるTALE DNA結合性ドメインであって、化学的に改変された核酸塩基への結合用に、Ｘ＊及び＊＊ (ここで、ＸはＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｎ、Ｈ、Ｒ及びＫの群より選択される１つのアミノ酸残基を表し、＊はRVDの１つの位置でのギャップを表す)からなる群より選択される１以上のRVDを含んでなるTALE DNA結合性ドメインをコードする核酸を合成する工程、
(ｃ)前記核酸を前記細胞に導入する工程
を含んでなり、このことにより、適切な条件で発現させたとき、シトシンメチル化状態とは独立に、前記DNA標的配列に結合するTALE DNA結合性ドメインをコードする核酸が取得される。
【００４７】
より具体的には、本発明は、細胞中で遺伝子物質を標的する方法に関し、該方法は以下：
(ａ)少なくとも１つのＣｐＧ配列を含む標的DNA配列を含有する細胞を準備し、
(ｂ)少なくとも１つの(ｉ)前記標的DNA配列中の１つの特異的ヌクレオチド対の結合を担う反復可変二残基領域(RVD)を各個が含む複数のTALE反復配列を含んでなる転写アクチベーター様エフェクター(TALE)ドメインであって、シトシン又は５-メチル-シトシンへの結合用に、Ｘ＊及び＊＊ (ここで、ＸはＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｎ、Ｈ、Ｒ及びＫの群より選択される１つのアミノ酸残基を表し、＊はRVDの１つの位置でのギャップを表す)からなる群より選択される１以上のRVDを含んでなるTALEドメイン及び(ii)特異的DNA標的配列内又は該配列近傍のDNAをプロセシングする追加のタンパク質ドメインを含んでなるタンパク質を導入する
ことを含んでなり、適切な条件で発現させたとき、TALEドメインは前記標的DNA配列にシトシンメチル化状態とは独立して結合する。
【００４８】
非限定例として、前記タンパク質又はキメラタンパク質は、プラスミドベクターによりコードされる導入遺伝子として導入することができる；プラスミドベクターは、該ベクターが導入された細胞の当該分野において周知の方法による同定及び/又は選択を可能にする選択マーカーを含んでいてもよい。前記タンパク質の発現は、選択細胞で誘導することができ、前記タンパク質のTALEドメインは、選択細胞の標的DNA配列に結合し、このことにより、TALEドメインが特異的標的DNA配列に結合する細胞を取得することができる。別の１つの実施形態において、TALEドメインを含む前記タンパク質又はキメラタンパク質は、当該分野で周知の方法によりタンパク質として細胞に直接導入することができる。
１つの好適な実施形態において、本発明は、細胞の遺伝物質を改変する方法に関し、該方法は以下：
(ａ)少なくとも１つのＣｐＧ配列を含む標的DNA配列を含有する細胞を準備し、
(ｂ)少なくとも以下の(ｉ)及び(ii)：
(ｉ)DNA標的配列に特異的であり、該DNA標的配列中の１つの特異的ヌクレオチドの結合を担う反復可変二残基領域(RVD)を各個が含む複数のTALE反復配列を含む転写アクチベーター様エフェクター(TALE) DNA結合性ドメインであって、シトシン又は５-メチル-シトシンへの結合用に、Ｘ＊及び＊＊ (ここで、ＸはＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｎ、Ｈ、Ｒ及びＫの群より選択される１つのアミノ酸残基を表し、＊はRVDの１つの位置でのギャップを表す)からなる群より選択される１以上のRVDを含んでなるTALE DNA結合性ドメイン
(ii)エンドヌクレアーゼ
を含んでなるタンパク質を導入する
ことを含んでなり、適切な条件で発現させたとき、シトシンメチル化状態とは独立に、TALE DNA結合性ドメインは前記標的DNA配列に結合し、エンドヌクレアーゼは該特異的DNA標的配列内又は該配列近傍に二本鎖破断を生じる。
【００４９】
１つの好適な実施形態において、本発明は、細胞の遺伝物質を改変する方法に関し、該方法は以下：
(ａ)少なくとも１つのＣｐＧ配列を含む標的DNA配列を含有する細胞を準備し、
(ｂ)少なくとも以下の(ｉ)及び(ii)：
(ｉ)DNA標的配列に特異的であり、該DNA標的配列中の１つの特異的ヌクレオチドの結合を担う反復可変二残基領域(RVD)を各個が含む複数のTALE反復配列を含む転写アクチベーター様エフェクター(TALE)DNA結合性ドメインであって、シトシン又は５-メチル-シトシンへの結合用に、Ｘ＊及び＊＊ (ここで、ＸはＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｎ、Ｈ、Ｒ及びＫの群より選択される１つのアミノ酸残基を表し、＊はRVDの１つの位置でのギャップを表す)からなる群より選択される１以上のRVDを含んでなるTALE DNA結合性ドメイン
(ii)エンドヌクレアーゼ,
を含んでなるタンパク質を導入し、
(ｃ)(ｂ)のタンパク質の発現を誘導し；
(ｄ)特異的DNA標的配列内又は該配列近傍に二本鎖破断が生じている細胞を選択する
ことを含んでなる。
【００５０】
非限定例として、エンドヌクレアーゼに融合したTALE DNA結合性ドメインを少なくとも含んでなる前記タンパク質は、プラスミドベクターによりコードされる導入遺伝子として、前記準備された(DNA標的配列を含有する)細胞に導入することができる；プラスミドベクターは、該ベクターが導入された細胞の当該分野において周知の方法による同定及び/又は選択を可能にする選択マーカーを含む。前記タンパク質の発現は、選択細胞で誘導することができ、前記タンパク質のTALEドメインは、選択細胞の標的DNA配列に結合することができ、融合したエンドヌクレアーゼは、特異的DNA標的配列内又は該配列近傍に二本鎖破断を生じさせることができる；このことにより、エンドヌクレアーゼに融合したTALE DNA結合性ドメインを少なくとも含んでなるタンパク質が標的付けられた二本鎖破断を生成している細胞を取得することができる。前記タンパク質が導入された細胞は、当該分野において周知の選択方法で選択する。
切断誘導変異誘発事象、すなわちNHEJ事象に続いて変異誘発事象が生じている細胞は、当該分野において周知の方法で同定及び/又は選択することができる。非限定例として、ディープシーケンシング分析は、標的付けられた遺伝子座の付近の標的付けられた細胞ゲノムから生じさせることができる。したがって、挿入/欠失事象(変異誘発事象)を検出することができる。別の１つの非限定例として、完全には一致していないDNAを認識するT7エンドヌクレアーゼに基づくアッセイを使用して、準備した細胞のゲノムDNAについての遺伝子座特異的PCRにより、再アニールした(切断された/切断されていないDNA分子に由来する)DNA鎖間のミスマッチを定量することができる。
【００５１】
３．化学的に改変された塩基を検出する方法
別の１つの実施形態において、本発明は、細胞のゲノム中の核酸標的配列における化学的に改変された核酸塩基の存在を検出する方法に関する。
更なる１つの観点によれば、本発明は、核酸標的配列中の少なくとも１つの化学的に改変された核酸塩基を検出する方法に関し、該方法は以下：
(ａ)前記核酸標的配列を、該核酸標的配列の各核酸塩基に特異的な反復可変二残基(RVD)を各個が含む複数のTALE様反復配列を含んでなる転写アクチベーター様エフェクター(TALE)タンパク質であって、少なくとも１つのRVDが以下：
−  Ｃを認識するためのＨＤ；
−  Ｔを認識するためのＮＧ；
−  Ａを認識するためのＮＩ；
−  Ｇ又はＡを認識するためのＮＮ；
−  Ａ又はＣ又はＧ又はＴを認識するためのＮＳ；
−  Ｔを認識するためのＨＧ；
−  Ｔを認識するためのＩＧ；
−  Ｇを認識するためのＮＫ；
−  Ｃを認識するためのＨＡ；
−  Ｃを認識するためのＮＤ；
−  Ｃを認識するためのＨＩ；
−  Ｇを認識するためのＨＮ；
−  Ｇを認識するためのＮＡ；
−  Ｇ又はＡを認識するためのＳＮ；及び
−  Ｔを認識するためのＹＧ；
からなる群より選択されるTALEタンパク質と結合させ、
(ｂ)同じ核酸標的配列を、工程ａ)で使用したものと類似する、複数のTALE様反復配列を含む別の転写アクチベーター様エフェクター(TALE)タンパク質であって、少なくとも１つのRVDがＸ＊又は＊＊、好ましくはＨ＊、Ｔ＊、Ｑ＊又はＮ＊からなるRVD (ここで、ＸはＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｎ、Ｈ、Ｒ及びＫの群より選択される１つのアミノ酸残基を表し、＊はRVDの１つの位置でのギャップを表す)で置換されているTALEタンパク質と結合させ、
(ｃ)ａ)及びｂ)の下で前記核酸標的配列との結合親和性を測定し、
(ｄ)ｃ)の下で測定した結合活性の比(ここで、該比は、０に近いとき、前記核酸標的配列中に化学的に改変された核酸塩基が存在することを示し、１に近いとき、該核酸標的配列中に化学的に改変された核酸塩基が存在しないことを示す)を算出する
ことを含んでなる。
【００５２】
別の１つの実施形態において、本発明は、結合親和性がヌクレアーゼ活性又は転写活性により測定される(又は試験される)前記方法に関する。１つの好適な実施形態において、本発明は、結合親和性が前記TALEタンパク質(ａ)及び(ｂ)に融合させたレポータータンパク質(例えば、蛍光タンパク質)のシグナルを検出することにより測定される前記方法に関する。レポータータンパク質は、(非限定例としての)ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ及びβ-ラクタマーゼ又は当該分野において公知のスプリット系のような系で使用可能な他のレポータータンパク質であることができる。
【００５３】
より具体的には、本発明はまた、細胞のゲノム中のDNA標的配列における５-メチル-シトシンの存在を検出する方法に関し、該方法は、以下の工程：
(ａ)細胞のゲノム中で少なくとも１つのＣｐＧ配列を含む第１のDNA標的配列を決定する工程、
(ｂ)(ｉ)前記第１のDNA標的配列に特異的であり、該第１のDNA標的配列中の１つの特異的ヌクレオチドの結合を担う反復可変二残基領域(RVD)を各個が含む複数のTALE反復配列を含んでなるTALEアレイであって、前記TALE DNA結合性ドメインがシトシン又は５-メチル-シトシンへの結合用に、Ｘ＊及び＊＊ (ここで、ＸはＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｎ、Ｈ、Ｒ及びＫの群より選択される１つのアミノ酸残基を表し、＊はRVDの１つの位置でのギャップを表す)からなる群より選択される１以上のRVDを含んでなるTALEアレイ、及び(ii)２つのサブドメインが相互作用するときにのみ活性であるレポータータンパク質の第１のサブドメインをコードする第１の核酸を合成する工程、
(ｃ)(ｉ)前記第１のDNA標的配列に特異的であり、該第１のDNA標的配列中の１つの特異的ヌクレオチドの結合を担う反復可変二残基領域(RVD)を各個が含む複数のTALE反復配列を含んでなるTALEアレイであって、前記TALE DNA結合性ドメインがシトシンへの結合用に、１以上のRVDであるＨＤを含んでなるTALEアレイ、及び(ii)２つのサブドメインが相互作用するときにのみ活性であるレポータータンパク質の第１のサブドメインをコードする第２の核酸を合成する工程、
(ｄ)(ｉ)前記第１のDNA標的配列近傍の第２のDNA標的配列に特異的であり、該第２のDNA標的配列中の１つの特異的ヌクレオチドの結合を担う反復可変二残基領域(RVD)を各個が含む複数のTALE反復配列を含んでなるTALEアレイ、及び(ii)２つのサブドメインが相互作用するときにのみ活性であるレポータータンパク質の第２のサブドメインをコードする第３の核酸を合成する工程、
(ｅ)前記第１及び第３の核酸を前記細胞に導入することにより、適切な条件で発現させたとき前記第１及び第２のDNA標的配列に結合し、該第１のDNA標的のシトシンメチル化状態とは独立にレポータータンパク質のシグナルを発信するTALEアレイをコードする第１及び第３の核酸を取得する工程、
(ｆ)前記第２及び第３の核酸を前記細胞に導入することにより、適切な条件で発現させたとき前記第１及び第２のDNA標的配列に結合し、５-メチル-シトシンが該第１のDNA標的に存在しないときにレポータータンパク質のシグナルを発信するTALEアレイをコードする第２及び第３の核酸を取得する工程、
(ｇ)比：(ｆ)のレポータータンパク質シグナル/(ｅ)のレポータータンパク質シグナル(ここで、該比は、０に近いとき、前記第１のDNA標的配列に５-メチルシトシンが存在することを示し、１に近いとき、該第１のDNA標的配列に５-メチルシトシンが存在しないことを示す)を決定する工程、
の少なくとも１つを含んでなり、このことにより、前記第１のDNA標的配列に含まれる少なくとも１つのＣｐＧ配列のメチル化状態が得られる。
【００５４】
別の１つの実施形態において、２つのＣｐＧが細胞のゲノム中の第１及び第２のDNA標的配列にそれぞれ存在する場合、本発明は、各ＣｐＧのメチル化状態を検出する方法に関し、該方法は以下の工程：
(ａ)(ｉ)前記第１のDNA標的配列に特異的であり、該第１のDNA標的配列中の１つの特異的ヌクレオチドの結合を担う反復可変二残基領域(RVD)を各個が含む複数のTALE反復配列を含んでなるTALEアレイであって、前記TALE DNA結合性ドメインがシトシン又は５-メチル-シトシンへの結合用に、Ｘ＊及び＊＊ (ここで、ＸはＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｎ、Ｈ、Ｒ及びＫの群より選択される１つのアミノ酸残基を表し、＊はRVDの１つの位置でのギャップを表す)からなる群より選択される１以上のRVDを含んでなるTALEアレイ、及び(ii)２つのサブドメインが相互作用するときにのみ活性であるレポータータンパク質の第１のサブドメインをコードする第１の核酸を合成する工程、
(ｂ)(ｉ)前記第１のDNA標的配列に特異的であり、該第１のDNA標的配列中の１つの特異的ヌクレオチドの結合を担う反復可変二残基領域(RVD)を各個が含む複数のTALE反復配列を含んでなるTALEアレイであって、前記TALE DNA結合性ドメインがシトシンへの結合用に、１以上のRVDであるＨＤを含んでなるTALEアレイ、及び(ii)２つのサブドメインが相互作用するときにのみ活性であるレポータータンパク質の第１のサブドメインをコードする第２の核酸を合成する工程、
(ｃ)(ｉ)前記第２のDNA標的配列に特異的であり、該第２のDNA標的配列中の１つの特異的ヌクレオチドの結合を担う反復可変二残基領域(RVD)を各個が含む複数のTALE反復配列を含んでなるTALEアレイであって、前記TALE DNA結合性ドメインがシトシン又は５-メチル-シトシンへの結合用に、Ｘ＊及び＊＊ (ここで、ＸはＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｎ、Ｈ、Ｒ及びＫの群より選択される１つのアミノ酸残基を表し、＊はRVDの１つの位置でのギャップを表す)からなる群より選択される１以上のRVDを含んでなるTALEアレイ、及び(ii)２つのサブドメインが相互作用するときにのみ活性であるレポータータンパク質の第２のサブドメインをコードする第３の核酸を合成する工程、
(ｄ)(ｉ)前記第２のDNA標的配列に特異的であり、該第２のDNA標的配列中の１つの特異的ヌクレオチドの結合を担う反復可変二残基領域(RVD)を各個が含む複数のTALE反復配列を含んでなるTALEアレイであって、前記TALE DNA結合性ドメインがシトシンへの結合用に、１以上のRVDであるＨＤを含んでなるTALEアレイ、及び(ii)２つのサブドメインが相互作用するときにのみ活性であるレポータータンパク質の第２のサブドメインをコードする第４の核酸を合成する工程、
(ｅ)前記第１及び第３の核酸を前記細胞に導入することにより、適切な条件で発現させたとき前記第１及び第２のDNA標的配列に結合し、該第１のDNA標的のシトシンメチル化状態とは独立にレポータータンパク質のシグナルを発信するTALEアレイをコードする第１及び第３の核酸を取得する工程、
(ｆ)前記第２及び第３の核酸を前記細胞に導入することにより、適切な条件で発現させたとき前記第１及び第２のDNA標的配列に結合し、５-メチル-シトシンが該第１のDNA標的に存在しないときにレポータータンパク質のシグナルを発信するTALEアレイをコードする第２及び第３の核酸を取得する工程、
(ｇ)前記第１及び第４の核酸を前記細胞に導入することにより、適切な条件で発現させたとき前記第１及び第２のDNA標的配列に結合し、５-メチル-シトシンが該第２のDNA標的に存在しないときにレポータータンパク質のシグナルを発信するTALEアレイをコードする第１及び第４の核酸を取得する工程、
(ｈ)比：(ｆ)のレポータータンパク質シグナル/(ｅ)のレポータータンパク質シグナル(ここで、該比は、０に近いとき、前記第１のDNA標的配列に５-メチルシトシンが存在することを示し、１に近いとき、該第１のDNA標的配列に５-メチルシトシンが存在しないことを示す)を決定する工程、
(ｉ)比：(ｇ)のレポータータンパク質シグナル/(ｅ)のレポータータンパク質シグナル(ここで、該比は、０に近いとき、前記第２のDNA標的配列に５-メチルシトシンが存在することを示し、１に近いとき、該第２のDNA標的配列に５-メチルシトシンが存在しないことを示す)を決定する工程
の少なくとも１つを含んでなり、このことにより、前記第１及び第２のDNA標的配列に含まれる２つのＣｐＧ配列のメチル化状態が得られる。
【００５５】
別の１つの実施形態において、本発明に従うレポータータンパク質の第１及び第２のサブドメインは、(非限定例としての)蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ及びβ-ラクタマーゼ又は当該分野において公知のスプリット系のような系で使用可能な他のレポータータンパク質のサブドメインであることができる。
別の１つの実施形態において、本発明の方法で標的付けられる又は改変される細胞は、真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞又は植物細胞である。別の１つの実施形態において、本発明の方法で標的付けられる又は改変される細胞は、藻類の細胞である。
別の１つの実施形態において、本発明の方法で標的付けられる又は改変されるDNA配列は、染色体配列又はエピソーム配列である。別の１つの実施形態において、そのような配列はオルガネラ配列である。
別の１つの実施形態において、本発明の前記方法は、標的付けられた二本鎖破断が生じている動物又は植物を創出するために使用することができる。
【００５６】
その他の定義
−ポリペプチド配列中のアミノ酸残基は、本明細書中では一文字コードに従って指称する。一文字コードでは、例えば、ＱはGln又はグルタミン残基を意味し、ＲはArg又はアルギニン残基を意味し、ＤはAsp又はアスパラギン酸残基を意味する。
−アミノ酸置換は、或るアミノ酸残基の別のアミノ酸残基での置き換えを意味し、例えば、ペプチド配列におけるアルギニン残基のグルタミン残基での置き換えがアミノ酸置換である。
−DNA又は核酸プロセシング活性とは、表現「核酸標的配列内又は該配列近傍の核酸をプロセシングするタンパク質ドメイン」中でのように、本発明に従うキメラタンパク質又はポリペプチドに含まれるタンパク質ドメインの特定の/所与の酵素活性をいう。DNA又は核酸プロセシング活性とは、切断活性、クリベース活性又はニッカーゼ活性をいい、より広義にはヌクレアーゼ活性を、また、非限定例としての、ポリメラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、メチラーゼ活性、トポイソメラーゼ活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性又はリコンビナーゼ活性もいうことができる。
【００５７】
−ヌクレオチド又は核酸塩基は下記のとおり指称する：ヌクレオシドの塩基を指称するために一文字コードを使用する：ａはアデニンであり、ｔはチミンであり、ｃはシトシンであり、ｇはグアニンである。縮重ヌクレオチドに関しては、ｒはｇ又はａ(プリンヌクレオチド)を表し、ｋはｇ又はｔを表し、ｓはｇ又はｃを表し、ｗはａ又はｔを表し、ｍはａ又はｃを表し、ｙはｔ又はｃ(ピリミジンヌクレオチド)を表し、ｄはｇ、ａ又はｔを表し、ｖはｇ、ａ又はｃを表し、ｂはｇ、ｔ又はｃを表し、ｈはａ、ｔ又はｃを表し、ｎはｇ、ａ、ｔ又はｃを表す。
−「ペプチドリンカー」又は「ペプチド性リンカー」は、(例えば本発明に従うキメラタンパク質又はポリペプチド中のTALE DNA結合性ドメインとタンパク質ドメインとの間の)融合タンパク質に含まれる異なるモノマー又は異なる部分の接続を可能にし、かつ該キメラタンパク質の活性及び/又は特異性のための正確なコンホメーションの採用を可能するペプチド配列を意味するものとする。ペプチドリンカーは種々のサイズ(非限定的な例示範囲として３アミノ酸〜50アミノ酸)であり得る。ペプチドリンカーはまた、構造体化されているか又は構造体化されていないことができる。ペプチドリンカーは、適切な刺激下で構造的コンホメーションを変化させることができる活性ドメインを含むとき、活性リンカーとして適格化できる。
【００５８】
−  「サブドメイン」により、別のタンパク質サブドメイン又はタンパク質部分と相互作用して、本発明に従うキメラタンパク質又はポリペプチドの核酸又はDNAプロセシング活性を担う活性実体及び/又は触媒活性実体を形成するタンパク質サブドメイン又はタンパク質部分が意図される。
−  「DNA標的」、「DNA標的配列」、「標的DNA配列」、「核酸標的配列」、「標的配列」又は「プロセシング部位」により、本発明に従うTALE由来タンパク質又はキメラタンパク質が結合し及び/又はプロセシングすることができるポリヌクレオチド配列が意図される。これら用語は、細胞中の特異的核酸位置、好ましくはゲノム位置をいうが、その本体とは独立して存在し得る遺伝物質の一部(例えば、非限定例として、プラスミド、エピソーム、ウイルス、トランスポゾン又はオルガネラ(例えばミトコンドリア又は葉緑体))の特異的核酸位置もいう。核酸標的配列は、標的の一方の鎖の5'→3'配列で規定される。
【００５９】
−  「近傍」は、本発明に従うポリペプチド又はキメラタンパク質のTALE DNA結合性ドメインに含まれる特異的RVDのセットが認識・結合する第２の核酸配列を、本発明に従うポリペプチド若しくはキメラタンパク質のTALE DNA結合性ドメインに含まれる特異的RVDの別のセットが認識・結合する第１の核酸配列と比較して規定するために使用する。両配列はスペーサー配列を取り囲むことがあり、この場合、本発明に従うキメラタンパク質のタンパク質ドメインは標的付けられたDNAスペーサーをプロセシングする。核酸配列は、異なるDNA鎖上で近傍に位置することができる。
−「送達ベクター」により、本発明で必要とされる因子/化学物質及び分子(タンパク質又は核酸)を細胞に接触させるか又は細胞内若しくは細胞中の区画内へ送達するために、本発明において使用することができる任意の送達ベクターが意図される。これには、リポソーム送達ベクター、ウイルス送達ベクター、薬剤送達ベクター、化学キャリア、ポリマーキャリア、リポプレックス(lipoplex)、ポリプレックス(polyplex)、デンドリマー、超微粒気泡(超音波造影剤)、ナノ粒子、エマルジョン又は他の適切な移入ベクターが含まれるが、これらに限定されない。これら送達ベクターは、分子、化学物質、高分子(遺伝子、タンパク質)、又は他のベクター、例えばプラスミド、Diatosにより開発されたペプチドの送達を可能にする。これらの場合において、送達ベクターは分子キャリアである。「送達ベクター」により、トランスフェクションを実行するための送達方法もまた意図される。
【００６０】
−用語「ベクター」とは、連結されている別の核酸を輸送し得る核酸分子をいう。本発明における「ベクター」としては、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、又は染色体、非染色体、半-合成若しくは合成の核酸からなり得る線状若しくは環状のDNA若しくはRNA分子が挙げられるが、これらに限定されない。好適なベクターは、自律複製(エピソームベクター)及び/又は連結された核酸の発現(発現ベクター)が可能なものである。多数の適切なベクターが当業者に公知であり、市販されている。
ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス(例えばアデノ関連ウイルス)、コロナウイルス、マイナス鎖RNAウイルス、例えばオルソミクソウイルス(例えば、インフルエンザウイルス)、ラブドウイルス(例えば、狂犬病及び水疱性口内炎ウイルス)、パラミクソウイルス(例えば、麻疹及びセンダイ)、プラス鎖RNAウイルス、例えばピコルナウイルス及びアルファウイルス、及び二本鎖DNAウイルス(アデノウイルス、ヘルペスウイルス(例えば、単純ヘルペスウイルス１型及び２型、エプスタイン-バーウイルス、サイトメガロウイルス)、及びポックスウイルス(例えば、ワクシニア、鶏痘及びカナリア痘)を含む)が挙げられる。他のウイルスとしては、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、及び肝炎ウイルスが挙げられる。レトロウイルスの例としては：トリ白血病-肉腫群、哺乳動物Ｃ-型、Ｂ-型ウイルス、Ｄ型ウイルス、HTLV-BLV群、レンチウイルス、スプマウイルス(Coffin, J. M., Retroviridae：The viruses及びtheir replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fieldsら編, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996)が挙げられる。
【００６１】
−「レンチウイルスベクター」は、比較的大きなパッケージング能力、低い免疫原性及び広範な異なる細胞タイプを高効率で安定的に形質導入する能力のため、遺伝子送達に非常に有望であるHIV-ベースのレンチウイルスベクターを意味する。レンチウイルスベクターは、通常、産生細胞への３つ(パッケージング、エンベロープ及び移入)又はそれより多いプラスミドの一過性トランスフェクション後に生じる。HIVと同様に、レンチウイルスベクターは、ウイルス表面糖タンパク質と細胞表面のレセプターとの相互作用により標的細胞に進入する。進入に際して、ウイルスRNAは、ウイルスの逆転写酵素複合体により媒介される逆転写を受ける。逆転写の産物は二本鎖線状ウイルスDNAであり、これが感染細胞のDNAへのウイルス組込みの基質である。
−「組込みレンチウイルスベクター(又はLV)」は、非限定例として、標的細胞のゲノムに組み込まれ得るベクターを意味する。
−対して、「非組込みレンチウイルスベクター(又はNILV)」は、ウイルスインテグラーゼの作用を通じて標的細胞のゲノムに組み込まれない効率的な遺伝子送達ベクターを意味する。
【００６２】
好適なベクターの１つのタイプは、エピソーム、すなわち、染色体外での複製が可能な核酸である。好適なベクターは、自律複製及び/又は連結された核酸の発現が可能なものである。作動可能に連結された遺伝子の発現を導くことができるベクターは、本明細書中で「発現ベクター」と呼ぶ。本発明によるベクターは、YAC(酵母人工染色体)、BAC(細菌性人工染色体)、バキュロウイルスベクター、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、又は染色体、非染色体、半-合成若しくは合成のDNAからなり得る線状若しくは環状のDNA若しくはRNA分子を含むが、これらに限定されない。一般には、組換えDNA技法に有用な発現ベクターは、しばしば、一般には(ベクター形態では染色体に結合していない)環状二本鎖DNAループをいう「プラスミド」の形態である。多数の適切なベクターが当業者に公知である。ベクターは選択マーカーを含み得る。例えば：真核細胞培養については、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ、ジヒドロフォレートレダクターゼ、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、グルタミンシンセターゼ、及びヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ；S. cerevisiaeについてはTRP1；E. coliにおいてはテトラサイクリン、リファンピシン又はアンピシリン耐性。好ましくは、ベクターは、目的のポリペプチドをコードする配列が該ポリペプチドの産生又は合成を可能にするに適切な転写及び翻訳制御エレメントの制御下に配置されている発現ベクターである。したがって、ポリヌクレオチドは発現カセットに含まれる。より具体的には、ベクターは、複製起点、コーディングポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーター、リボソーム結合部位、RNA-スプライシング部位(ゲノムDNAを使用する場合)、ポリアデニル化部位及び転写終止部位を含んでなる。これはまた、エンハンサー又はサイレンサーエレメントを含んでなり得る。プロモーターの選択は、ポリペプチドを発現させる細胞に依存する。適切なプロモーターとしては、組織特異的及び/又は誘導性プロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターの例は：重金属レベルの増大により誘導される真核生物性メタロチオニンプロモーター、イソプロピル-β-D-チオガラクト-ピラノシド(IPTG)に応答して誘導される原核生物性lacZプロモーター及び温度上昇により誘導される真核生物性熱ショックプロモーターである。組織特異的プロモーターの例は、骨格筋クレアチンキナーゼ、前立腺-特異的抗原(PSA)、α-アンチトリプシンプロテアーゼ、ヒトサーファクタント(SP)Ａ及びＢタンパク質、β-カゼイン及び酸性ホエータンパク質遺伝子である。
【００６３】
−誘導性プロモーターは、病原体又はストレスにより、より好ましくは低温、高温、UV光、又は高イオン濃度のようなストレスにより誘導され得る(Potenza Cら，2004, In vitro Cell Dev Biol 40:1-22で概説される)。誘導性プロモーターは化学物質により誘導され得る((Moore, Samalovaら，2006)；(Padidam 2003)；(Wang, Zhouら，2003)；(Zuo及びChua 2000)で概説される)。
送達ベクター及びベクターは、ソノポレーション(sonoporation)若しくはエレクトロポレーションのような任意の細胞透過技法又はこれら技法の派生法と組み合わされ得る。
−細胞により、任意の原核生物又は真核生物の生存細胞、インビトロ培養用にこれら生物から導いた細胞株、動物又は植物起源の初代細胞が意図される。
−「初代細胞」により、非常に少数のものしか分裂を経験していないので、連続分裂性(continuous tumorigenic)の又は人工的に不死化した細胞株と比較して、由来する組織の主要な機能的構成要素及び特徴をより良く代表する、生存組織(すなわち生検材料)から直接取り出し、インビトロ増殖用に樹立した細胞が意図される。よって、これら細胞は、言及するインビボ状態についてより価値のあるモデルである。
【００６４】
−本発明の枠内で、「真核細胞」とは、真菌、植物若しくは動物細胞、又は下記に列挙する生物に由来しインビトロ培養用に樹立された細胞株をいう。より好ましくは、真菌は、アスペルギルス属(Aspergillus)、ペニシリウム属(Penicillium)、アクレモニウム属(Acremonium)、トリコデルマ属(Trichoderma)、クリソスポリウム属(Chrysoporium)、モルティエレラ属(Mortierella)、クルイベロマイセス属(Kluyveromyces)又はピキア属(Pichia)のものである；より好ましくは、真菌は、アスぺルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)、ペニシリウム・クリソゲナム(Penicillium chrysogenum)、ペニシリウム・シトリヌム(Penicillium citrinum)、アクレモニウム・クリソゲナム(Acremonium Chrysogenum)、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)、モルティエレラ・アルペン(Mortierella alpine)、クリソスポリウム・ルクノウェンス(Chrysosporium lucknowense)、クルイベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)又はピキア・シフェリイ(Pichia ciferrii)である。
【００６５】
より好ましくは、植物は、アラビドプシス属(Arabidospis)、タバコ属(Nicotiana)、ナス属(Solanum)、アキノノゲシ属(lactuca)、アブラナ属(Brassica)、イネ属(Oryza)、アスパラガス属(Asparagus)、エンドウ属(Pisum)、ウマゴヤシ属(Medicago)、トウモロコシ属(Zea)、オオムギ属(Hordeum)、ライムギ属(Secale)、コムギ属(Triticum)、トウガラシ属(Capsicum)、キュウリ属(Cucumis)、カボチャ属(Cucurbita)、スイカ属(Citrullis)、ミカン属(Citrus)、モロコシ属(Sorghum)のものである；より好ましくは、植物は、次の種：シロイヌナズナ(Arabidospis thaliana)、タバコ(Nicotiana tabaccum)、トマト(Solanum lycopersicum)、ジャガイモ(Solanum tuberosum)、ナス(Solanum melongena)、トマト(Solanum esculentum)、レタス(Lactuca saliva)、セイヨウアブラナ(Brassica napus)、ヤセイカンラン(Brassica oleracea)、ブラッシカ・ラパ(Brassica rapa)、アフリカイネ(Oryza glaberrima)、イネ(Oryza sativa)、アスパラガス(Asparagus officinalis)、エンドウ(Pisum sativum)、ムラサキウマゴヤシ(Medicago sativa)、トウモロコシ(zea mays)、オオムギ(Hordeum vulgare)、ライムギ(Secale cereal)、パンコムギ(Triticum aestivum)、デュラムコムギ(Triticum durum)、カプシカム・サティバス(Capsicum sativus)、ペポカボチャ(Cucurbita pepo)、スイカ(Citrullus lanatus)、メロン(Cucumis melo)、ライム(Citrus aurantifolia)、ザボン(Citrus maxima)、シトロン(Citrus medica)、マンダリン(Citrus reticulata)のものである。
【００６６】
より好ましくは、動物細胞は、ヒト属(Homo)、クマネズミ属(Rattus)、ハツカネズミ属(Mus)、イノシシ属(Sus)、ウシ属(Bos)、ダニオ属(Danio)、イヌ属(Canis)、ネコ属(Felis)、ウマ属(Equus)、タイセイヨウサケ属(Salmo)、タイヘイヨウサケ属(Oncorhynchus)、ヤケイ属(Gallus)、シチメンチョウ属(Meleagris)、ショウジョウバエ属(Drosophila)、カエノラブディティス属(Caenorhabditis)のものである；より好ましくは、動物細胞は、次の種：ヒト(Homo sapiens)、ドブネズミ/ラット(Rattus norvegicus)、ハツカネズミ(Mus musculus)、イノシシ(Sus scrofa)、ウシ(Bos taurus)、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)、タイリクオオカミ(Canis lupus)、イエネコ(Felis catus)、ウマ(Equus caballus)、タイセイヨウサケ(Salmo salar)、ニジマス(Oncorhynchus mykiss)、セキショクヤケイ(Gallus gallus)、シチメンチョウ(Meleagris gallopavo)、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)、カエノラブディティス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)のものである。
【００６７】
本発明においては、細胞は、植物細胞、哺乳動物細胞、魚細胞、昆虫細胞、又はインビトロ培養用のこれら生物に由来する細胞株若しくは生存組織から直接採取されインビトロ培養用に樹立された初代細胞であり得る。非限定例として、細胞株は、CHO-K1細胞；HEK293細胞；Caco2細胞；U2-OS細胞；NIH 3T3細胞；NSO細胞；SP2細胞；CHO-S細胞；DG44細胞；K-562細胞、U-937細胞；MRC5細胞；IMR90細胞；Jurkat細胞；HepG2細胞；HeLa細胞；HT-1080細胞；HCT-116細胞；Hu-h7細胞；Huvec細胞；Molt 4細胞からなる群より選択され得る。幹細胞及び人工多能性幹細胞(iPS)もまた本発明の範囲に包含される。
これら全ての細胞株は、本発明の方法により、目的の遺伝子又はタンパク質を産生し、発現し、定量し、検出し、研究するための細胞株モデルを提供するように改変することができる；これらモデルはまた、研究及び製造及び(非限定例として、化学、バイオ燃料、治療薬及び農学のような)種々の分野において、目的の生物学的に活性な分子をスクリーニングするために使用することができる。
【００６８】
−「変異」により、ポリヌクレオチド(cDNA、遺伝子)又はポリペプチド配列中の１又はそれより多いヌクレオチド/アミノ酸の置換、欠失、挿入が意図される。変異は、遺伝子のコーディング配列又はその調節配列に影響することがある。これはまた、ゲノム配列の構造又はコードされるmRNAの構造/安定性に影響し得る。
−本発明の枠内で、表現「二本鎖破断-誘導変異誘発」(DSB-誘導変異誘発)とは、エンドヌクレアーゼの切断部位で挿入/欠失を導く、エンドヌクレアーゼ-誘導DSB後のNHEJ事象に続く変異誘発事象をいう。
−「遺伝子」は、特定のタンパク質又はタンパク質セグメントをコードする、染色体に沿って直鎖状様式で整列したDNAセグメントからなる、遺伝の基本単位を意味する。遺伝子は、代表的には、プロモーター、5'非翻訳領域、１又はそれより多いコーディング配列(エキソン)、任意にイントロン、3'非翻訳領域を含む。遺伝子は、ターミネーター、エンハンサー及び/又はサイレンサーを更に含んでなり得る。
−本明細書中で使用する場合、用語「遺伝子座」は、染色体上での(例えば遺伝子の)DNA配列の特定の物理的位置である。用語「遺伝子座」とは、通常、染色体上でのポリペプチド又はキメラタンパク質の核酸標的配列の特定の物理的位置をいう。この遺伝子座は、本発明に従うポリペプチド又はキメラタンパク質により認識及び/又は切断される標的配列を含んでなることができる。本発明の目的の遺伝子座は、細胞の遺伝物質本体中(すなわち、染色体中)に存在する核酸配列だけでなく、遺伝物質本体とは独立に存在し得る遺伝物質の一部、例えば、非限定例としてプラスミド、エピソーム、ウイルス、トランスポゾン中又はミトコンドリア若しくは葉緑体のようなオルガネラ中に存在する核酸配列をもいうと理解される。
【００６９】
−「融合タンパク質」により、本来は別々のタンパク質又はその部分をコードする２又はそれより多い遺伝子を連結することから本質になる当該分野で周知のプロセスの結果が意図される。「融合遺伝子」の翻訳は、元のタンパク質の各々に由来する機能的特性を有する単一ポリペプチドを生じる。
−  本発明に従う「キメラタンパク質」は、核酸配列に結合するための少なくとも１つのRVD及び結合した核酸配列内又は該配列近傍の核酸標的配列をプロセシングするための少なくとも１つのタンパク質ドメインを含んでなる任意の融合タンパク質を意味する。
−  「タンパク質ドメイン」は、本発明に従うキメラタンパク質の、核酸標的配列をプロセシングする部分を意味する。タンパク質ドメインは、触媒する反応に従って分類され、名付けられた任意の触媒活性を提供することができる[http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/)のEnzyme Commission number(EC number)]。タンパク質ドメインは、単独で触媒的に活性な実体であることもできる。タンパク質ドメインは、二量体のタンパク質ドメイン活性実体を形成するために別のタンパク質サブドメインと相互作用する必要があるタンパク質サブドメインであることもできる。
【００７０】
−  「TALE-ヌクレアーゼ」(TALEN)により、転写アクチベーター様エフェクター(TALE)に由来するDNA結合性ドメインと核酸標的配列を切断する１つのヌクレアーゼ触媒ドメインとからなる融合タンパク質が意図される。TALE-ヌクレアーゼは本発明に従うキメラタンパク質のサブクラスである。
−  「バリアント」により、親分子のアミノ酸配列で少なくとも１つの残基を置換することにより得られるRVDバリアント、キメラタンパク質バリアント、DNA結合性バリアント、TALE-ヌクレアーゼバリアント、ポリペプチドバリアントが意図される。
−  「機能的変異体」により、タンパク質又はタンパク質ドメインの触媒的に活性な変異体が意図される；この変異体は、親のタンパク質又はタンパク質ドメインに匹敵する同じ活性又は追加の特性を有することができる。この定義は、本発明に従うキメラタンパク質又はキメラタンパク質を構成するタンパク質ドメインに適用される。これらタンパク質又はタンパク質ドメインの、他のタンパク質部分又は化学部分(例えば、非限定例としてタグ、抗体、ポリエチレングリコール)に融合したこれらタンパク質又はタンパク質ドメインの全体又は一部を含んでなる「誘導体」もこの定義の範囲に包含される。
−「同一性」とは、２つの核酸分子又はポリペプチド間の配列同一性をいう。同一性は、(比較のために整列させてもよい)各配列中の位置を比較して決定することができる。比較される配列中の位置が同じ塩基で占められる場合、それら分子は、当該位置において同一である。核酸又はアミノ酸配列間の類似性又は同一性の程度は、該核酸配列が共有する位置での同一の又は適合するヌクレオチドの数の関数である。種々のアラインメントアルゴリズム及び/又はプログラム(GCG配列解析パッケージ(University of Wisconsin, Madison, Wis.)の一部として利用可能であるFASTA又はBLASTを含む)を使用して、２つの配列間の同一性を算出してもよく、例えばデフォルト設定で使用することができる。
【００７１】
本発明の上記説明は、当業者が本発明の対象を製造し使用することができるように、その様式及び方法を提供する。この実施可能性は、特に、(願書に最初に添付した明細書等の一部を構成する)添付の特許請求の範囲の主題について提供される。
上記で使用するように、句「からなる群より選択される」、「から選択される」などは、特定されたものの組合せを含む。
本明細書中で数値限定又は範囲に言及する場合には終点は含まれる。また、数値限定内の全ての値又は部分的範囲は、あたかも明示的に記載されているように明確に含まれる。
上記の説明は、当業者が本発明の対象を作製し、使用することができるように提示されており、特定の適用及びその要件に関して提供されている。好適な実施形態の種々の改変が、当業者に容易に明らかとなる。本明細書中で規定される包括的原理は、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、他の実施形態及び応用に適用され得る。よって、本発明は、示された実施形態に限定されることを意図しておらず、本明細書中に開示された原理及び特徴と一致する最も広い範囲を意図される。
本発明を概説してきたので、(例示のためだけに提供され、そうでないと記載されない限り限定を意図していない)或る種の具体例を参照することにより更なる理解を得ることができる。
【実施例】
【００７２】
実施例
実施例１
ＣｐＧメチル化に対するTAL反復ドメインの感受性を調べるため、XPCT1(又はXPC4T3)と呼ぶ工学的に操作したTALヌクレアーゼモデルを、１つのメチル化ＣｐＧを含むxpc1遺伝子座(xpc4とも呼ぶ)(配列番号１)に結合し、これを切断するように特別に設計した。XPCT1 TALE-ヌクレアーゼは、FokI制限酵素の触媒ドメインに融合したTALE由来DNA結合性ドメインを各々含む２つの独立した実体XPCT1L(XPCT4T3.3)及びXPCT1R(XPC4T3.4)から構成されていた。XPCT1L及びXPCT1Rは、11bpスペーサー配列で分離された２つのDNA標的配列(それぞれ左標的及び右標的)に結合するように工学的に操作された(xpc1遺伝子座、図3A及びB)。xpc1遺伝子座へのXPCT1L及びXPCT1Rの結合により、FokIが二量体化しスペーサー内に二本鎖破断を創出することができると予想された。
【００７３】
RVDであるＨＤ及びＮ＊が左標的の＋２位に位置する５-メチル-シトシン(図3A中赤色で示す)に結合する能力を、TALE反復ストレッチの＋２位にRVDであるＨＤ又はＮ＊を含む２つのXPCT1Lバリアントを工学的に創出することにより比較した(図3B)。これら２つのバリアントの各々を対応物であるXPCT1Rと組み合わせて、(XPCT1_HD(XPC4T3_HD)又はXPCT1_N*(XPC4T3_N*)と名付けた)得られるTALE-ヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性を、４つの異なるプロトコールに従って測定した(詳細については、「材料及び方法」を参照)。
簡潔には、第１及び第２のプロトコールは、XPCT1_HD及びXPCT1_N*のヌクレアーゼ活性を、Epinatら(2003)及びArnouldら(2006)にそれぞれ記載されたプロトコールに従って酵母細胞及び哺乳動物細胞において、非メチル化xpc1遺伝子座を含有する染色体外標的を用いて測定することから本質的になった一方、第３及び第４のプロトコールは、哺乳動物細胞において、メチル化された内因性xpc1遺伝子座に対するヌクレアーゼ活性を測定して比較することから本質的になった。ヌクレアーゼ活性はT7ヌクレアーゼアッセイ(6)又はディープシーケンシングで評価した。
【００７４】
材料及び方法
−  TAL反復アレイの組立て並びに酵母及び哺乳動物発現プラスミドへのサブクローニング
TAL反復アレイXPCT1L_HD、XPCT1L_N*及びXPCT1R(配列番号２、配列番号３及び配列番号４、これらはそれぞれ配列番号14、配列番号15及び配列番号16をコードする)を、図４に示すような連続する制限/ライゲーション/洗浄工程によるTAL反復の逐次組立てから本質的になる固相支持体法を用いて合成した。簡潔には、例として、XPCT1L_HD反復アレイを組み立てるには、第１のTAL反復(配列番号５、これは配列番号17をコードする)を、ビオチン/ストレプトアビジン相互作用により固体支持体に不動化し、SfaNIタイプIIS制限エンドヌクレアーゼで消化し、続いて5'末端にSfaNI適合性オーバーハングを有する第２のTAL反復(配列番号５、これは配列番号17をコードする)にライゲートした(図4B)。次いで、得られるTAL反復アレイ(すなわち、TAL反復１及び２を含有)を、その後に適切なTAL反復(配列番号６〜９、これらはそれぞれ、ヌクレオチドＡ、Ｇをそれぞれ標的するＮＩ、ＮＮ並びにヌクレオチドＣを標的するＨＤ、Ｎ＊のための配列番号18〜21をコードする)を付加するためのテンプレートとして使用して、同じプロトコールに従って完全なTAL反復アレイXPCT1L_HD又はN*を作製した(図4C)。この完全なTAL反復アレイを最終的にSfaNIで消化して、3'末端にSfaNIオーバーハングを創出し(図4D)、その後、BbvIタイプIIS制限エンドヌクレアーゼを用いて固体支持体から取り外した(図4E)。消化したTAL反復アレイを回収し、AvrBs3 TALエフェクターのＮ末端ドメイン及びFokIタイプIIS制限エンドヌクレアーゼに融合したそのＣ末端ドメインの最初の11アミノ酸を有する酵母又は哺乳動物発現プラスミド(pCLS 7802及びpCLS 11170、すなわち、配列番号10及び配列番号11、これらはそれぞれ配列番号22及び配列番号23をコードする)にサブクローニングした(図4F)。pCLS7802は、pCLS0542(配列番号24)からNcoI及びXhoI制限部位を用いて誘導し、pCLS11170は、pCLS8391(配列番号25)からNcoI及びEagI制限部位を用いて誘導した。
【００７５】
−  細胞培養及びトランスフェクション
ヒト293H細胞(Life Technologies, Carlsbad, CA)及びハムスターCHO-KI細胞(ATCC)を、それぞれ、２mM Ｌ-グルタミン、100IU/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、0.25μg/mlアンホテリシンＢ(Fongizone, Life Technologies,)及び10％ FBSを補充した完全培地DMEM又はF12-Kにおいて５％ CO2で37℃にて培養した。染色体外アッセイに関しては、CHO-KI細胞を96ウェルプレートに2500細胞/ウェルで配置した。翌日、細胞を、漸増量のDNA(合計0.04〜50ng)で、Polyfectトランスフェクション試薬(Qiagen)を製造業者のプロトコールに従って用いてトランスフェクトした。変異誘発アッセイに関しては、293H細胞を1.2×106細胞/10cmディッシュの密度で配置した。翌日、細胞を、２、５又は10μgのDNAで、Lipofectamine 2000トランスフェクション試薬(Life Technologies)を製造業者のプロトコールに従って用いてトランスフェクトした。
【００７６】
TALE-ヌクレアーゼの染色体外SSA活性のモニタリング
CHO-KI細胞を96ウェルプレートに2500細胞/ウェルで配置した。翌日、XPC TALE-ヌクレアーゼをコードする漸増量(各０〜25ng)のDNA及び一定量(75ng)のXPC染色体外非メチル化標的で、polyfectトランスフェクション試薬(Qiagen)を製造業者のプロトコールに従って用いて細胞を同時トランスフェクトした。TALE-ヌクレアーゼの一本鎖アニーリング(SSA)活性を、(19,20)に記載のプロトコールに従って測定した。
−  XPCT1 TALE-ヌクレアーゼが誘導した標的付けられた改変の、ディープシーケンシング又はT7ヌクレアーゼアッセイによるモニタリング
異なるXPC TALE-ヌクレアーゼが内因性遺伝子座で標的付けられた変異誘発(TM)を誘導する能力を評価するため、293H細胞を、先ず1.2×106細胞/10cmディッシュの密度で配置した。翌日、細胞を、総量２、５又は10μgのTALE-ヌクレアーゼ発現ベクター又は空ベクターで、Lipofectamine 2000トランスフェクション試薬(Life Technologies)を製造業者のプロトコールに従って用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの２又は３日後、ゲノムDNAを抽出し、目的の遺伝子座を、ディープシーケンシング法に必要なアダプター配列に連結した遺伝子座特異的プライマー(それぞれ、XPCMID1_F、配列番号12及びXPC_R、配列番号13)を用いて増幅させた。アンプリコンを、(21)に記載のプロトコールに従うEndoT7アッセイ、又は454 system(Life Sciences)を用いるディープシーケンシングのいずれかで分析した(サンプル当たり平均5000配列を分析した)。
【００７７】
結果
本発明者らの結果は、XPCT1_HD又はXPCT1_N* TALE-ヌクレアーゼが、酵母及び哺乳動物細胞においてXPC1非メチル化染色体外DNA標的に対して類似するヌクレアーゼ活性を示し、XPCT1_HD TALE-ヌクレアーゼが僅かに優れていることを証明した(データは示さず、図5A)。全く対照的に、これら２つのTALE-ヌクレアーゼを内因性のメチル化遺伝子座でアッセイすると、T7ヌクレアーゼ消化バンドの存在により明らかなように、XPCT1_N*のみが検出可能なヌクレアーゼ活性を示した(図5B、赤色星印)。したがって、XPCT1_N*が誘導する標的付けられた改変(TM)の頻度は、XPCT1_HD TALE-ヌクレアーゼが誘導する頻度(本発明者らの最良の実験条件下でほとんど検出不可能であった)より遥かに高かった(それぞれ17.2％及び0.8％、図5C)。この２つのTALE-ヌクレアーゼの間で観察されるヌクレアーゼ活性の差は、TALE-ヌクレアーゼごとのトランスフェクション効率の変動に起因するものではなかった(データは示さず)。まとめると、本発明者らの結果により、シトシンを標的するためにRVDであるＨＤを用いるTAL DNA結合性ドメインは、シトシンメチル化に感受性であり、この感受性はRVDをＨＤからＮ＊に置換することで変更できることが証明された。
【００７８】
実施例２：天然に存在するTAL反復Ｈ＊及びＮＧが５-メチル-シトシンに対するTAL DNA結合性ドメインの感受性を変更する能力
本発明者らは、グリシン13を欠いているか又は同位置に側鎖が小さい残基を有する、TAL反復Ｎ＊以外の天然に存在するTAL反復は、５-メチル-シトシンに効率的に結合できるという仮説を立てた。このことを確証するため、本発明者らは、TAL反復Ｈ＊及びＮＧがXPCT1 TAL DNA結合性ドメインの＋２位においてＨＤに代替し(図6A)、293H細胞中の内因性メチル化遺伝子座(配列番号１)に対する活性を回復(rescue)させる能力を評価した。
【００７９】
材料及び方法
−  材料
TALE-ヌクレアーゼXPCT1L-HD、XPCT1L-N*、XPCT1L-NG、XPCT1L-H*及びXPCT1R(配列番号26〜30、これらはそれぞれ配列番号38〜42をコードする)を、先の実施例に記載した方法に従って取得した。活性TALE-ヌクレアーゼは、１つの「TALE-ヌクレアーゼＬ」(XPCT1L-HD、XPCT1L-N*、XPCT1L-NG又はXPCT1L-H*)及び１つの「TALE-ヌクレアーゼＲ」(XPCT1 R)の組合せにより形成された。
TALE-ヌクレアーゼの染色体外SSA活性のモニタリング及びTALE-ヌクレアーゼにより誘導される標的付けられた変異誘発のモニタリングに関しては実施例１を参照。
−  毒性アッセイ
96ウェルプレートにおいて上記のとおり、CHO-KI細胞株を、漸増量のTALE-ヌクレアーゼ発現ベクター及び一定量の、GFPをコードするプラスミドでトランスフェクトした。GFPレベルを、トランスフェクションの１及び６日後にフローサイトメトリー(Guava EasyCyte, Guava Technologies)でモニターした。細胞生存率を比(６日目のGFP発現TALE-ヌクレアーゼ-トランスフェクト細胞/６日目のGFP発現コントロールトランスフェクト細胞)として算出した。比を１日目に測定したトランスフェクション効率について補正し、トランスフェクトしたDNAの最終濃度の関数としてプロットした。各実験において毒性及び非毒性のコントロールを使用した(19)。
【００８０】
結果
最初にＨＤのＨ＊及びＮＧへの置換がXPCT1の固有ヌクレアーゼ活性に影響するかどうかを調べるため、本発明者らは、非メチル化染色体外XPC1標的(配列番号１)及びコントロールとしてのXPCT1-HD及びN*を用い、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞における一本鎖アニーリング(SSA)アッセイ(19)を行った(図6B)。本発明者らの結果により、XPCT1-N*及びH* TALE-ヌクレアーゼ(配列番号39及び配列番号42、配列番号41及び配列番号42)は類似するSSA活性を示すが、XPCT1-HD(配列番号38及び配列番号42)より僅かに活性が小さいことが証明された(図6B)。他方で、XPCT1-NG(配列番号40及び配列番号42)は、XPCT1-HDと比較して顕著に減少した活性を示した。このことは、ＮＧがシトシンを認識する能力に乏しい(3，4)ことと一致していた。次に、本発明者らは、これらTALE-ヌクレアーゼが、標的付けられた変異誘発(TM)により、293H細胞中の内因性メチル化XPC1標的を崩壊させる能力を評価した。TALE-ヌクレアーゼが誘導するTM(不正確な非相同末端連結により生じる小さなヌクレオチド挿入又は欠失からなる)を、以前(21，22)に記載されたとおりのEndoT7アッセイ及びディープシーケンシングにより測定した。本発明者らの結果により、TAL反復Ｈ＊及びＮＧは共にXPCT1活性を回復させることができ、Ｈ＊は、Ｎ＊とほぼ同程度に効率的であり、明らかに優れていることが証明された(図6C)。よって、本発明者らは、13位の小アミノ酸は、５-メチル-シトシンに適応できるが、このアミノ酸の完全な不在(TAL反復の特徴である「＊」)は、より優れた５-メチル-シトシン認識を導くと結論する。
【００８１】
本発明者らは、XPCT1LのTAL DNA結合性ドメイン内でのＨＤ→Ｎ＊、ＨＤ→Ｈ＊又はＨＤ→ＮＧ置換がCHO細胞においてTALE-ヌクレアーゼ-誘導毒性を増大させないことを、Grizotら(19)が記載するプロトコールを用いて検証した。試験した全てのTALE-ヌクレアーゼについて、本発明者らは、XPCT1LのTAL DNA結合性ドメインの２位におけるTAL反復Ｎ＊、Ｈ＊又はＮＧの存在が、ＨＤ、Ｎ＊、Ｈ＊及びＮＧバリアント間で得られる類似する細胞生存パターンにより明らかなように、毒性に影響しないことを見出した(図6D)。
【００８２】
実施例３：汎用５-メチル-シトシン結合性モジュールであるTAL反復Ｎ＊
TAL反復Ｎ＊が異なる状況(すなわち、他の内因性メチル化標的)で５-メチル-シトシンに対するTAL DNA結合性ドメインの感受性を変更する能力を評価するために、本発明者らは、XPC2及びXPC3(配列番号50及び配列番号51)と呼ばれるメチル化内因性XPC標的をプロセシングするように特別に設計された２つの他のTALE-ヌクレアーゼXPCT2及びXPCT3を工学的に創出した。これら標的は、それぞれ、異なる位置に存在する１つ及び２つの５-メチル-シトシンを含んでいた(図7A)。これにより、TALE DNA結合性ドメイン中のＮ＊反復の数及び位置の影響を評価することができる。
【００８３】
材料及び方法
方法については実施例１及び２を参照。
−  材料
TALE-ヌクレアーゼXPCT2L-HD、XPCT2L-N*、XPCT2R、XPCT3L-HD、XPCT3L-N*、XPCT3R-HD及びXPCT3R-N*(配列番号31〜37、これらはそれぞれ配列番号43〜49をコードする)を、先の実施例に記載の方法に従って取得した。活性TALE-ヌクレアーゼは、実施例１に記載されるように、１つの「TALE-ヌクレアーゼＬ」及び１つの「TALE-ヌクレアーゼＲ」の組合せにより形成された。
【００８４】
結果
XPCT2-N*及びXPCT3-N*のTALE-ヌクレアーゼ活性(図７)を、293H細胞において、実施例１に記載のプロトコールに従って測定し、次いでＨＤ対応物と比較した(図7B)。XPCT1-HD及びN*(実施例２を参照)を下記の実験でコントロールとして用いた。本発明者らのEndoT7アッセイにより、Ｎ＊バリアントが常に最も活性であることが証明され、TAL反復Ｎ＊は異なる状況で５-メチル-シトシンに成功裡に結合できることが示された。興味深いことに、TALE-ヌクレアーゼ-ＨＤの基礎活性及びＨＤ/Ｎ＊置換により達成される誘導倍数(fold induction)は、TALE-ヌクレアーゼごとに異なっており、５-メチル-シトシンにより誘導される結合ペナルティが、TAL DNA結合部位内の位置に依存することが示唆される。
【００８５】
本発明者らは、TAL DNA結合性ドメイン内でのＨＤ/Ｎ＊置換がCHO細胞においてTALE-ヌクレアーゼ-誘導毒性を増大させないことを、Grizotら(19)が記載するプロトコールを用いて検証した。試験した全てのTALE-ヌクレアーゼについて、本発明者らは、XPCT2及びT3のＨＤ及びＮ＊バリアントの間で観察された類似する細胞生存パターンにより明らかなように(それぞれ図7C及び7D)、単一又は複数のTAL N*反復の存在がTALE-ヌクレアーゼ-誘導毒性に影響しないことを見出した。毒性を欠いていることと完全に一致して、TALE-ヌクレアーゼ-N*は、293H細胞においてトランスフェクションの３又は７日後に、類似するTM頻度を示した(データは示さず)。毒性がないことと一致して、天然に存在するTALエフェクターは、高い特異性を保持しつつDNA結合性ドメイン内に20％までのTAL反復N*50を有すると報告された。したがって、まとめると、本発明者らの結果により、TAL反復Ｎ＊は、工学的に操作したTAL DNA結合性ドメインの毒性に影響することなく、汎用５-メチル-シトシン結合性モジュールとして使用可能であることが証明された。
【００８６】
要約すると、本発明者らの研究は、TAL反復Ｎ＊、Ｈ＊及びＮＧによる５-メチル-シトシン認識を支配する隠された暗号(cipher)を解明した。この知見に基づいて、本発明者らは、シトシンメチル化に対するTALE DNA結合性ドメインの感受性を変更する、単純で効率的な汎用方法を提供する。この方法は大きな利点を示す。第１に、細胞工学的及び治療的適用に不適切な内因性標的の化学的脱メチル化の必要性を回避することが可能になる。第２に、全てのTAL由来タンパク質に、特に工学的に操作した転写アクチベーターに容易に適用可能であり、よっておそらく遺伝子サイレンシングを担うメチル化プロモーターの部位特異的活性化が可能になる。第３に、TALE-ヌクレアーゼ技術での工学的操作が可能であると既に示されている広範な細胞系(ES、iPS哺乳動物細胞及び植物細胞を含む)に技術移転可能である。
【００８７】
実施例４：工学的に操作したTAL反復Ｔ＊、Ｑ＊及び天然TAL反復ＨＧが５-mCに対するTALDNA結合性ドメインの感受性を変更する能力
本発明者らは、工学的に操作したTAL反復「＊」(すなわちＴ＊及びＱ＊)及び天然TAL反復ＨＧが５mCに効率的に結合できるという仮説を立てた。この仮説を確証するため、本発明者らは、TAL反復Ｔ＊、Ｑ＊及びＨＧがXPCT1 TAL DNA結合性ドメインの＋２位でＨＤを代替する能力及び293H細胞中の内因性メチル化遺伝子座に対する活性を回復する能力を評価した。
【００８８】
材料及び方法
方法については実施例１〜３を参照
TALE-ヌクレアーゼXPCT1L-T*、XPCT1L-Q*、XPCT1L-HG及びXPCT1R(配列番号52、53、54及び30、これらはそれぞれ配列番号55、56、57及び42をコードする)を、先の実施例ほかに記載された方法に従い、デノボ遺伝子合成により取得した。活性TALE-ヌクレアーゼは、１つの「TALE-ヌクレアーゼＬ」(XPCT1L-T*、XPCT1L-Q*又はXPCT1L-HG)及び１つの「TALE-ヌクレアーゼＲ」(XPCT1 R)の組合せにより形成された。TALE-ヌクレアーゼXPCT1L-HD、N*、NG及びH*(配列番号26〜29、これらはそれぞれ配列番号38〜41をコードする)のヌクレアーゼ活性もまた測定し、本実施例でコントロール実験として使用した。
TALE-ヌクレアーゼにより誘導される標的づけられた変異誘発のモニタリングの概説については実施例１を参照。
【００８９】
結果
XPCT1L-T*、XPCT1L-Q*及びXPCT1L-HGのTALE-ヌクレアーゼ活性を293H細胞において実施例１に記載のプロトコールに従って測定し、次いでＨＤ対応物と比較した(図８)。XPCT1L-HD、N*、NG及びH*(配列番号26〜29、これらはそれぞれ配列番号38〜41をコードする。実施例２を参照)を下記の実験においてコントロールとして使用した。本発明者らのディープシーケンシング結果により、Ｔ＊及びＱ＊バリアントはＨＤバリアントより活性であることが証明され、TAL反復Ｔ＊、Ｑ＊及びＨＧはＨＤより効率的に５-メチル-シトシンに結合できることが示唆される。よって、TAL反復Ｔ＊、Ｑ＊及びＨＧは、おそらく、メチル化内因性遺伝子座を標的するTALE-ヌクレアーゼを設計するために使用できる。
【００９０】
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【図１】
2015510772.tif 000003
【図２】
2015510772.tif 000004
【図３】
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【図４】
2015510772.tif 000006
【図５】
2015510772.tif 000007
【図６−１】
2015510772.tif 000008
【図６−２】
2015510772.tif 000009
【図７−１】
2015510772.tif 000010
【図７−２】
2015510772.tif 000011
【図８】
2015510772.tif 000012
【配列表】
2015510772000001.app
【国際調査報告】
2015510772.tif 000013
2015510772.tif 000014
2015510772.tif 000015
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