(57)【要約】  本発明は、脂肪肝と脂肪性肝炎を区別するためのマーカーとしての、ケラチン２３（ＫＲＴ２３）遺伝子のメチル化の使用を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪肝と脂肪性肝炎を区別するためのマーカーとしての、ケラチン２３（ＫＲＴ２３）ＤＮＡのメチル化の使用。
【請求項２】
ヒト体液のサンプルまたはヒト組織サンプルにおける脂肪性肝炎を診断するための方法であって、このサンプル中のＫＲＴ２３  ＤＮＡのメチル化の決定、および、脂肪性肝炎を有さない人由来のこのヒト体液のサンプルまたは組織サンプルと比較してＫＲＴ２３  ＤＮＡのメチル化が減少している場合に脂肪性肝炎を診断することを含む、方法。
【請求項３】
体液が血液または血液由来サンプル、好ましくは血清または血漿サンプルである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＫＲＴ２３  ＤＮＡが、血液における、特に血漿または血清サンプルにおける、遊離循環ＤＮＡである、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
このサンプルにおけるＫＲＴ２３  ＤＮＡのメチル化が、バイサルファイト処理によって決定される、請求項２−４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
このサンプルにおけるＫＲＴ２３  ＤＮＡのメチル化が、メチル化アレルの絶対定量分析（ＡＱＡＭＡ）によって決定される、請求項２−５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＫＲＴ２３  ＤＮＡのメチル化の決定が、少なくとも５、好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも２０、特に少なくとも３０の連続するメチル化部位のメチル化状態の決定を含む、請求項２−６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
脂肪性肝炎を診断するための方法における使用のための、ＫＲＴ２３  ＤＮＡ、特にメチル化ＫＲＴ２３  ＤＮＡ。
【請求項９】
脂肪性肝炎について組織サンプルまたは体液のサンプルを診断するためのＫＲＴ２３  ＤＮＡのメチル化のためのメチル化決定試薬を含む、サンプルにおけるＫＲＴ２３  ＤＮＡのメチル化状態を決定するためのキットの使用。
【請求項１０】
組織サンプルまたは体液のサンプルにおいて脂肪性肝炎を診断するための診断キットであって、
−ＫＲＴ２３遺伝子におけるメチル化領域を定義するＫＲＴ２３結合プライマー対、好ましくはＣｐＧモチーフが無いプライマー対、特に一塩基多型（ＳＮＰｓ）が無いプライマー対を含む、キット。
【請求項１１】
プライマー対が、少なくとも２０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド、特に少なくとも１００ヌクレオチド長であるＫＲＴ２３  ＤＮＡにおける領域を増幅する、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
プライマー対が、少なくとも５、好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも２０、特に少なくとも３０の、ＫＲＴ２３  ＤＮＡの連続するメチル化部位を含有する、ＫＲＴ２３  ＤＮＡにおける領域を増幅する、請求項１０または１１に記載のキット。
【請求項１３】
バイサルファイトを含有する試薬をさらに含む、請求項１０−１２のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪性肝炎と脂肪肝を区別するためのバイオマーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪肝疾患は、脂肪性肝炎（ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ）上の単純性脂肪肝（ｓｉｍｐｌｅ  ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）から肝硬変および肝細胞癌（ＨＣＣ）に及ぶ重症度スペクトラムを含む。脂肪肝疾患に関する２つの主要な病因が存在する、すなわち、アルコールおよび肥満および２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）などの代謝性疾患である。その高い有病率、およびかなりの割合の罹患者において肝硬変およびＨＣＣなどの重篤な肝臓の転帰となる可能性のため、脂肪肝疾患は、社会およびヘルスケアに関する主要な課題となっている。一般人口の最大３０％が非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を発症しており、糖尿病患者の間では最大７０％に達する。肥満症治療手術を受ける肥満患者における脂肪肝および脂肪性肝炎の有病率は、それぞれ７６％および３７％もの高さである。脂肪性肝炎は、アルコール依存症患者の約２０％、および肥満でもある（ＢＭＩ＞３０）Ｔ２ＤＭの最大５０％において発症する。これは、西洋諸国における大多数の肝硬変およびＨＣＣの主な原因となる２１世紀の最も一般的な肝臓病として、脂肪肝疾患を位置づける。その有病率は、糖尿病および肥満の進行中の蔓延を考慮すれば、さらに上昇すると予想される。
【０００３】
単純性脂肪肝は比較的良性の経過を有し、主に可逆的である一方、脂肪性肝炎は予後不良を伴い、肝硬変およびＨＣＣへ進行する重篤な肝臓損傷を引き起こし得る。血清トランスアミナーゼなどの従来の非侵襲性のマーカーは、肝臓疾患の発症ならびに進行の危険性とは関連性が乏しく、また、現在利用可能な日常的な肝臓検査は、脂肪性肝炎を有するかなりの割合の患者において注目に値するものでない可能性さえある。そのため、現在の標準的な臨床業務では、非侵襲性の血清およびイメージングマーカーでは、比較的良性の脂肪肝と進行性の脂肪性肝炎との区別が可能ではない。この状況は、これらの障害の過小診断および過少治療をもたらす。効率的な診断、予後および治療戦略の開発は、脂肪性肝炎の分子論的病原機構の理解がいまだ不完全であるという事実によって実質的に妨げられてきた。いくつかの研究は、異なる形態の脂肪性肝炎（アルコール性−ＡＳＨ、非アルコール性−ＮＡＳＨ）が形態学的に区別できないことを示し、これは疾患の異なる病因にもかかわらず共通の発症メカニズムを示唆する。現在の概念によると、エネルギー代謝の調節解除が単純性脂肪肝を引き起こす可能性があり、これは、脂肪性肝炎を引き起こすために第二の炎症性傷害を伴うことが必要である。主要な未解決の問題は、脂肪性肝炎を発症させることと肝硬変に進行することの個々のリスクにおける著しい違いである（例えば、大量飲酒家の２０％だけ、あるいは肥満のＩＩ型糖尿病患者の５０％が脂肪性肝炎を発症する；ヒスパニックおよび白人は、アフリカ系アメリカ人よりもより影響を受けやすい）。しかしながら、脂肪肝疾患のスペクトラムにわたる疾患の進行に関与する因子は十分に理解されていない。なぜ一部の患者が脂肪性肝炎または単純性脂肪肝症の発症から保護され、一方で他の人はそうではないのかは、未だ不明である。現在でも、脂肪肝および脂肪性肝炎が２つの連続した病期を表しているのか；あるいは、個々が先天的に、多少良性の脂肪肝または予後不良な脂肪性肝炎のいずれかを発症すると予め決定されている可能性があるのか、議論されている。
【０００４】
脂肪性肝炎の診断は難しく、現在のところ肝生検によってのみ可能である（例えば、ＮＡＳＨは、著しいアルコール消費がない場合での、脂肪性肝炎の患者における肝生検の所見に言及する）。そのため、肝生検は、脂肪性肝炎における特定の壊死性炎症変化および線維症の存在および程度を評価する唯一の手段のままである。しかしながら、日常的な臨床現場において肝生検を実施する場合の確固たる推奨は、まだ開発されていない。アミノトランスフェラーゼおよび線維症マーカーなどの代用マーカーの使用は、臨床研究のために必要であるような疾患をモニタリングするには適切ではない。ＵＳ  ２００９／０３０４７０４  Ａ１では、患者サンプルにおけるＮＡＳＨの発症または進行に関連する３０を超える遺伝子のパネルの発現レベルを決定すること、およびこの遺伝子のパネルにおけるＮＡＳＨ関連遺伝子発現に関する既定値と発現のレベル（表現「プロファイル」）を比較すること、およびＮＡＳＨ疾患状態と発現のレベルを相関させることを含む、患者におけるＮＡＳＨ疾患状態を診断するための、様々な発現マーカーが示唆されている。かかるプロファイル決定は複雑であり、日常的な診断および多数のサンプルを試験することにおいて確立するのは困難である。
【０００５】
Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｓｕａｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  -  Ｃｌｉｎ．  Ａｐｐｌ．  ４  （２０１０），  ３６２−３７１）およびＦｅｌｄｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｈｅｐａｔｏｌ．  ５０  （２００９），  １０７２−１０７８）は、脂肪肝疾患のプロテオーム解析を開示する。Ｂｒａｇｏｓｚｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｐｏｌ．  ５４  （２００７），  ３４１−３４８）は、脂肪肝と脂肪性肝炎を区別するための遺伝子発現解析を開示する。ＷＯ  ２００４／０５５５２０  Ａ１は、ＮＡＳＨを診断する方法を開示する。ＷＯ  ２０１０／０４５４７０  Ａ２は、特定のマーカーの発現レベルを決定することにより肝障害を発症するリスクを決定することを開示する。
【０００６】
脂肪性肝炎を診断するための、特に脂肪肝と脂肪性肝炎を区別するための、プロファイル決定の代わりに用いることができる、さらなる単一のマーカーに対する必要性が依然として存在する。
【０００７】
さらに、かかる単一のマーカーが、生検材料においてだけでなく、血液もしくは尿、または様々な粘膜由来のなすりつけ標本（ｓｍｅａｒ）などの、患者から容易に採取できる体液などの、非侵襲的な検体（ｓｐｅｃｉｍｅｎ）においても有用である場合も望まれる。
【０００８】
したがって、容易に常法に変換できる、適切な組織サンプル検査と適切な血清診断テストのどちらも利用できない。これは、満たされていない医療ニーズが莫大であることを表す（ＵＳ  ２００９／０３０４７０４  Ａ１）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
それゆえ、本発明の目的は、脂肪性肝炎の信頼性の高い非侵襲的な診断、特に脂肪肝と脂肪性肝炎との区別を可能にする、適切なバイオマーカーを提供することである。本発明は、特に、臨床的に「良性」の単純性脂肪肝と、肝硬変および肝癌に進行する可能性がある脂肪性肝炎との区別のための手段および方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
そのため、本発明は、脂肪肝と脂肪性肝炎を区別するためのマーカーとしての、ケラチン２３（ＫＲＴ２３）ＤＮＡのメチル化の使用を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
ＫＲＴ２３遺伝子のメチル化が脂肪肝と脂肪性肝炎を区別するための信頼性の高い分子マーカーであることが、本発明で示される。さらに、ＫＲＴ２３遺伝子のメチル化は、脂肪性肝炎からＨＣＣへの発症をモニタリングするために用いることもできる。ＫＲＴ２３メチル化はまた、脂肪性肝炎および／またはＨＣＣのための他のマーカーと一緒に、そのような肝疾患の診断をさらに最適化するために、用いることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、１ｍｌの患者血漿から抽出することができるＤＮＡ量を示す。
【図２】図２は、領域ｃｈｒ１７：３９，０９２，６７８−３９，０９３，０３２における第一のエクソンにおけるメチル化部位を含むＫＲＴ２３遺伝子を示す。プライマーは、これらのメチル化部位を含むが、ＣｐＧモチーフまたはＳＮＰを含有しないように設計されている。
【図３】図３は、ＰＣＲ産物の精製を示す。（ａ）ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で精製し、分離した。（ｂ）バイオアナライザープロファイルは、正しいＰＣＲ産物の著しい蓄積を示す。
【図４】図４は、肝臓におけるＫＲＴ２３発現とＫＲＴ２３遺伝子座の脱メチル化の相関関係を示す。ＫＲＴ２３発現と脱メチル化は相関し、脂肪性肝炎で最も高い。
【図５】図５は、肝臓における病理学的表現型およびＫＲＴ２３発現とＫＲＴ２３脱メチル化との相関を示す。特定のＣｐＧ部位の評価は、ＫＲＴ２３遺伝子座の脱メチル化と病理学的表現型との正確な相関を可能にする（ＫＯ：コントロール；Ｓ：脂肪肝；ＳＨ：脂肪性肝炎）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
ヒトＫＲＴ２３遺伝子（２つの選択的転写物：ＮＣ＿００００１７．１０、ＮＴ＿０１０７８３．１５；配列番号１）は、１７番染色体上に位置し（１７ｑ２１．２；リバース鎖）、ヌクレオチド３９，０７８，９５２ｂｐから３９，０９９，８３６ｂｐに広がる（ｃｈｒ１７：３９，０７８，９５２−３９，０９９，８３６）。それゆえ、それは２０，８８５塩基の大きさを有する。本発明による方法では、ＫＲＴ２３  ＤＮＡのメチル化状態は、遺伝子配列における任意のＣｐＧモチーフ（「ＣＧ」ジヌクレオチド）でのメチル化の有無を決定することによって決定できる。しかしながら、１より多くのＣｐＧモチーフを含有する領域において、好ましくは少なくとも５を有する領域において、より好ましくは少なくとも１０を有する、特に少なくとも２０のＣｐＧモチーフを有する領域において、メチル化の存在／非存在を決定することが好ましい。本発明によるＫＲＴ２３  ＤＮＡのメチル化状態を決定するための特に好ましい領域は、エクソン領域である。ＫＲＴ２３遺伝子は９個のエクソンを含有する：
【表１】
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【００１４】
本発明に従ってメチル化が決定される好ましい領域は、転写開始の６０００塩基上流の領域として定義されるプロモーター領域である（ヌクレオチド３９，０９３，８３６からヌクレオチド３９，０９９，８３６まで（ｃｈｒ１７：３９，０９３，８３６−３９，０９９，８３６（配列番号２）。
【００１５】
ＫＲＴ２３メチル化レベルが、健常人または脂肪肝を有する個体に比べて、ＮＡＳＨ患者において著しく減少しているため、ＫＲＴ２３メチル化の程度の決定は、ＮＡＳＨを診断するのに特に適している。それゆえ、（健康な人（すなわち、脂肪性肝炎を有していない人）由来のＫＲＴ２３  ＤＮＡと比較した）ＫＲＴ２３  ＤＮＡの脱メチル化は、脂肪性肝炎のための指標である。決定された健康なＫＲＴ２３  ＤＮＡ領域のメチル化されたＣｐＧモチーフの１０％以上、好ましくは２０％以上、特に３０％以上がサンプル中のＤＮＡにおいて脱メチル化される場合、脱メチル化が具体的に存在している。
【００１６】
本発明による方法は、「単純性」脂肪肝と（Ｎ）ＡＳＨとの区別のための診断のゴールドスタンダードとして肝生検に頼る、脂肪性肝炎の現在の診断（活動性（ｇｒａｄｉｎｇ）、線維化（ｓｔａｇｉｎｇ））と比べて有利である。現在利用可能な日常的な生化学血清検査（肝機能検査）は、脂肪性肝炎の発生および重症度を過小評価している。肝線維症の程度は、肝硬変の発症に関するおおよその予測因子ではあり得るが、肝硬変および肝細胞癌の発症に関するより高性能の個々のリスクマーカー／プロファイルが必要とされる。さらに、肝臓関連の罹患率／リスクに対する心血管の相対的な寄与は、個々のＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨ患者間で著しく変化する可能性がある。一般集団における脂肪肝および脂肪性肝炎の高い有病率を考えると、個々の疾患経過ならびに治療の必要性および治療への応答を予測する、診断検査および予後バイオマーカーに対する（特に、非侵襲的な方法で、すなわち肝臓組織サンプルを必要とせずに、診断できるようなマーカーに対する）緊急の必要性がある。
【００１７】
本発明の特定の態様は、ヒト体液のサンプルまたはヒト組織サンプルにおいて脂肪性肝炎を診断するための方法であって、このサンプル中のＫＲＴ２３  ＤＮＡのメチル化の決定、および、脂肪性肝炎を有さない人由来のこのヒト体液のサンプルまたは組織サンプルと比較してＫＲＴ２３  ＤＮＡのメチル化が減少している場合に脂肪性肝炎を診断することを含む、方法に関する。
【００１８】
好ましくは、体液は血液または血液由来サンプル、好ましくは血清または血漿サンプルである。これは、本方法を、生検、特に、ある一定の危険因子を構成し得る肝生検の事前採取をしなくとも用いることができる、適切な非侵襲的な方法にする。血液または血液サンプル由来のサンプルにおけるＤＮＡにおいてＫＲＴ２３メチル化を測定することは、多数のサンプルに容易に適応可能であり、それゆえ、日常的な検査のために、好ましくは、血液における、特に血漿または血清サンプルにおける、遊離循環ＤＮＡ（ｆｒｅｅ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＤＮＡ）におけるＫＲＴ２３遺伝子のメチル化度の決定のために、確立され得る。
【００１９】
一方、本方法はまた、組織サンプル、特に肝臓組織サンプル（例えば、肝臓手術から採取されたもの）または肝生検サンプル（例えば、通常の肝生検針、過去のサンプル、または剖検からのサンプルによって採取されたもの）に、日常的に適用することができる。
【００２０】
ＫＲＴ２３遺伝子のメチル化の決定は、当業者にとって容易に可能である。メチル化の決定のためのサンプルにおけるＤＮＡの調製、ならびにメチル化の量／程度を確立することは、両方とも、本技術分野における日常的な方法である。例えば、血液サンプルからＤＮＡを抽出するための市販のキット、ならびにＤＮＡのメチル化を決定する（例えば、後続のＰＣＲ増幅と共にバイサルファイト処理を用いる）ためのキットが、数個存在する。
【００２１】
本発明は、脂肪性肝炎を診断するための方法における、ＫＲＴ２３遺伝子のメチル化（度）（の決定）の使用に言及する。
【００２２】
ＫＲＴ２３は、広く知られ、調査されている遺伝子／タンパク質である；それゆえ、ＫＲＴ２３  ＤＮＡのメチル化の程度の決定は、当業者が十分に利用可能な標準的な技術を用いて、容易に可能である。
【００２３】
ＫＲＴ２３遺伝子のＤＮＡメチル化は、当分野で一般に用いられる任意の方法、例えば、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、メチル化状態によって支配される活性を備える制限酵素の使用、メチル化ヌクレオチド塩基に特異的な抗体の使用、ポリヌクレオチドシークエンシング、バイサルファイト処理およびシークエンシング、パイロシークエンシング、ならびにメチル化アレルの絶対定量分析（ＡＱＡＭＡ）によって検出でき、定量できる。ＭＳＰは、ＤＮＡのメチル化状態に依存してＤＮＡがＰＣＲにより増幅される技術である。核酸のメチル化状態の決定は、メチル化核酸と非メチル化核酸を区別するオリゴヌクレオチドプライマーによって、核酸を増幅することを含む。ＭＳＰは、メチル化感受性制限酵素の使用とは無関係に、ＣｐＧアイランド内の実質的にいかなる群のＣｐＧ部位のメチル化状態を速やかに評価することができる。このアッセイは、メチル化されているものではなくメチル化されていない全てのシトシンをウラシルに変換する、亜硫酸水素ナトリウムによるＤＮＡの初期修飾、および非メチル化ＤＮＡと比べてメチル化ＤＮＡに特異的なプライマーによる後続の増幅を必要とする。ＭＳＰは、少量のＤＮＡのみを必要とし、所与のＣｐＧアイランド遺伝子座の０．１％のメチル化アレルに感受性である。ＭＳＰは、メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡを区別するために差別的制限酵素切断に依存していた、以前のＰＣＲに基づく手法に固有の偽陽性結果を排除する。この方法は非常に単純であり、少量のサンプルで用いることができる。ＭＳＰ産物は、ゲル電気泳動、ＣＡＥ（キャピラリーアレイ電気泳動）、またはリアルタイム定量ＰＣＲにより検出できる。
【００２４】
バイサルファイトシークエンシングは、ＤＮＡ中の５−ＭｅＣ（５−メチルシトシン）を検出するために広く用いられ、任意の配列構成（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｎｔｅｘｔ）において、単一−分子解像度で任意のメチル化シトシンを検出する、信頼性の高い方法を提供する。バイサルファイト処理の工程は、酸性条件下でのバイサルファイトによる脱アミノ化に対するシトシンと５−ＭｅＣの異なる感度を利用するものであり、ここでシトシンはウラシルへの変換を受ける一方、５−ＭｅＣは反応しないままである。
【００２５】
ＤＮＡメチル化のレベルは、メチル化ＤＮＡコピー数と非メチル化ＤＮＡコピー数の和に対するメチル化ＤＮＡコピー数の割合、非メチル化ＤＮＡコピー数に対するメチル化ＤＮＡコピー数の割合等として、メチル化指数により表してもよい。
【００２６】
試験サンプル中のＫＲＴ２３遺伝子でのメチル化のレベルが正常サンプルにおけるものよりも低い場合、対象は脂肪性肝炎に罹患している可能性が高い。本明細書で用いる場合、「正常サンプル」とは、正常対象から調製されたサンプル、特に、血清または血漿サンプルなどの、正常な体液、正常な血液または血液由来サンプルである。
【００２７】
好ましくは、ＫＲＴ２３  ＤＮＡは、血液における、特に血漿または血清サンプルにおける、遊離循環ＤＮＡである。
【００２８】
好ましいメチル化決定方法は、バイサルファイト処理を用いる方法である。
【００２９】
通常、サンプルにおけるＫＲＴ２３  ＤＮＡのメチル化度は、脂肪性肝炎および／または脂肪肝に関する既知の状態を有するこの量の参照値、すなわち健康な値であると知られている値（すなわち脂肪性肝炎の影響を受けていない値）、あるいは、脂肪性肝炎および／または脂肪肝に関して病的状態であることが知られている値、好ましくは、脂肪性肝炎の所与の／定義されたステージの値と比較される。
【００３０】
かかる参照、標準あるいは対照サンプルは、本発明に従って診断される脂肪性肝炎および／または脂肪肝に関する未確認状態のサンプルとの比較のため、全て、原則として使用可能である。かかる参照、標準あるいは対照サンプルは、例えば、脂肪性肝炎および／または脂肪肝に関して陰性診断である、または検出不可能な進行中の脂肪性肝炎が発症しているヒト対象から採取できる。かかる対照サンプル、標準サンプルまたは参照サンプルが、本発明に従って、進行中の脂肪性肝炎の発症に罹患していると疑われるヒト対象から採取されるサンプルに匹敵すると言える場合、これは、両サンプルが同等に由来し、処置されたことを意味する。それゆえ、両方の場合において、サンプルは、例えば、上述したような診断マーカー遺伝子のメチル化の決定を可能にするための方法でさらに処置された、血液由来サンプルであってもよい。
【００３１】
血漿は、全血における血液細胞が通常懸濁されているであろう、血液の黄色の液体成分である。それは全血液量の約５５％を構成する。それはほとんど水であり（９０容量％）、溶解したタンパク質、グルコース、凝固因子、無機イオン、ホルモンおよび二酸化炭素を含有する。血漿は、血液細胞がチューブの底に落ちるまで、遠心分離にて新鮮な血液のチューブをスピンすることにより調製される。次いで、血漿は注がれる、または流し出される。血漿は、およそ１．０２５ｋｇ／ｌの密度を有する。血清は、フィブリノーゲンまたは他の凝固因子無しの血漿（すなわち、細胞および凝固因子の両方をひいた全血）である。
【００３２】
本発明による診断方法はまた、唾液、膀胱洗浄液、精液または尿サンプル、特に尿サンプルにおいても実行できる。
【００３３】
確立された臨床診療に対する診断的微調整は、本発明に従ってメチル化状態が決定された、ＫＲＴ２３遺伝子の一部分におけるメチル化の違いを定義するための配列表と共に機能するだろうが、本発明に従って解析されるサンプルと既知の状態の同一源のサンプルとの比較を備える診断システムを確立することもまた好ましい。それゆえ、健康なサンプルにおけるＫＲＴ２３  ＤＮＡにおけるメチル化度を用い、調査中のサンプルとこれらを比較することが好ましい。ＫＲＴ２３  ＤＮＡのメチル化が著しく減少している場合は、脂肪性肝炎の診断が示される。サンプルは、好ましくは、血液、血漿、血清、尿、精液または唾液サンプルである：また、本明細書での適切な比較値は、それぞれ、健康な状態を有する患者に由来する、血液、血漿、血清、尿、精液または唾液のサンプル、好ましくは同一患者から（以前に）採取されたサンプルに由来する。一方、採取されたサンプル中のＫＲＴ２３  ＤＮＡの既知のメチル化パターンを確立するために、比較を行ってもよい。ヒトの医学的診断における通常通り、絶対限界値（ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｖａｌｕｅ）をサンプルのそれぞれに対して定義して、健康（脂肪肝）と脂肪性肝炎の間、ならびに異なる段階の脂肪性肝炎またはＨＣＣの間の違いを決定できる。これらの絶対値は、ＫＲＴ２３  ＤＮＡのメチル化および（病的状態を示す）脱メチル化の状態を決定するために適用されるまさしくその方法に依存して、定義し、かつ慎重に確認しなければならない。本発明による実施例のため、信頼性の高い検査システムが確立されている。
【００３４】
本発明に従って評価されるＫＲＴ２３  ＤＮＡのメチル化のレベルは、測定され、他のサンプル由来のＫＲＴ２３  ＤＮＡのメチル化の発現のレベルと比較される。比較は、実際の実験において；または知的に（既知の参照値との比較によって）；または仮想的に（例えばｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで自動的に）行うことができる。メチル化レベル（メチル化パターンまたはメチル化シグネチャー（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）（メチル化プロファイル）ともいう）が測定して異なる場合、本発明によれば、メチル化のレベルの意味のある（すなわち、統計的に有意な）違いが存在する。好ましくは、ＫＲＴ２３  ＤＮＡのメチル化の違いは、少なくとも５％、１０％または２０％、より好ましくは少なくとも３０％であり、あるいは、５０％、７５％または１００％ほど高くてもよい（１００％は、メチル化状態が決定された領域における完全な脱メチル化である；すなわち健康な（脂肪肝）ＤＮＡにおける全てのメチル化部位が脱メチル化されている）。もちろん、診断がより正確であればあるほど、より多くのメチル化部位がメチル化状態の決定に含まれる。それゆえ、本発明による決定において、少なくとも５、好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも２０、特に少なくとも３０のメチル化部位（すなわち健康な人のＫＲＴ２３  ＤＮＡにおいてメチル化されている部位）を含むことが好ましい。好ましくは、これらのメチル化部位は、ＫＲＴ２３遺伝子における連続するメチル化部位である。連続するメチル化部位を有する１より多くの領域を、例えば、プロモーター領域において、および１以上のエクソンにおいて、試験することも可能である。
【００３５】
疾患（脂肪性肝炎）サンプルにおいて、好ましくは少なくとも５％、１０％もしくは２０％、より好ましくは少なくとも３０％または５０％、７５％もしくは１００％ものメチル化部位が脱メチル化される場合、健康で正常な（脂肪肝）サンプルと比較して、本発明によるＫＲＴ２３に関するメチル化レベルは、それゆえ、疾患サンプルにおいて減少する。所与の検出方法においてＫＲＴ２３メチル化レベルが減少するどうかは、好ましくは、所与の検出方法での多数の脂肪性肝炎サンプルの解析によって確立することができる。これは、次いで、例えば上記の％の違いまたは倍率変化により、「減少した」状態が決定できる、適したレベルを形成することができる。ＫＲＴ２３遺伝子のメチル化の減少は、脂肪性肝炎の指標となる。
【００３６】
本発明の過程で、メチオニン代謝が脂肪性肝炎において損なわれていることが示された。この経路は、Ｓ−アデノシル−メチオニンレベルの変化を介して、メチルトランスフェラーゼ活性の改変を介して遺伝子調節に関連し、ヒストン−およびＤＮＡ−メチル化の変化を介して、脂肪性肝炎関連遺伝子の活性の改変をもたらす。細胞死の割合の増加は、ゲノムＤＮＡの放出をもたらす、進行型の脂肪性肝炎における重要な特徴であるので、かかる特徴的なメチル化シグネチャーを有するＤＮＡは循環においても検出可能であるだろう。
【００３７】
これらの２つの知見は、ＫＲＴ２３  ｍＲＮＡの過剰発現が変化したＤＮＡメチル化に起因し、かつＫＲＴ２３プロモーターの変化したメチル化が、血清または血漿における遊離循環ＤＮＡとして検出できるという理論的根拠をここに提供する。
【００３８】
本発明による変化したＫＲＴ２３メチル化のための診断アッセイは、外科的に切除または外植された（ｅｘｐｌａｔｅｄ）ヒト肝臓における、遊離循環ＤＮＡ、ＫＲＴ２３プロモーターのメチル化の検出（単純性脂肪肝および脂肪性肝炎と正常肝臓との比較）に基づくことができる。検出されたメチル化パターンの種類に基づき、遊離循環ＤＮＡのためのアッセイが確立できる（例えば、ＷＯ  ２００８／１０３７６１  Ａ２に一般に開示される）。このアッセイは、例えば、メチル化特異的ＰＣＲまたはバイサルファイトで処理された特異的に濃縮された遊離循環ＤＮＡのシークエンシングとすることができる。
【００３９】
したがって、脂肪性肝炎のためのシグネチャーとしてのＫＲＴ２３メチル化を用いる、血清における診断アッセイが、本発明により提供される。
【００４０】
本発明の別の重要な態様は、脂肪性肝炎の診断における使用のための、および／または脂肪肝と脂肪性肝炎を区別するための、サンプルにおけるＫＲＴ２３  ＤＮＡのメチル化の決定のためのキットである。本発明はまた、脂肪性肝炎について組織サンプルまたは体液のサンプルを診断するために、ＫＲＴ２３遺伝子の脱メチル化の量を健康なメチル化パターンと比較して決定することを含む、サンプルにおけるＫＲＴ２３  ＤＮＡのメチル化レベルを決定するためのキットの使用に関する。本発明に係るキットは、ＫＲＴ２３  ＤＮＡメチル化に適したメチル化決定試薬を含有する。かかる試薬は、当業者にとって十分に利用可能であり、メチル化状態の決定のために適用されるまさしくその方法（例えば、ＭＳＰ、メチル化状態によって支配される活性を備える制限酵素の使用、メチル化ヌクレオチド塩基に特異的な抗体の使用、ポリヌクレオチドシークエンシング、バイサルファイト処理およびシークエンシング、パイロシークエンシング、ならびにＡＱＡＭＡ；上記を参照のこと）によって決まる。
【００４１】
方法がＰＣＲ段階を適用する場合、本発明による組織サンプルまたは体液のサンプルにおいて脂肪性肝炎を診断するための診断キットは：
−ＫＲＴ２３メチル化決定プライマー対、すなわちＫＲＴ２３遺伝子におけるメチル化領域を定義するＫＲＴ２３結合プライマー対、好ましくはＣｐＧモチーフが無いプライマー対、特に塩基多型（ＳＮＰｓ）が無いプライマー対、および、
−任意に（方法がバイサルファイト段階を含む場合）、バイサルファイトを含有する試薬
を含む。
【００４２】
一般に、本発明に係るキットは、ＫＲＴ２３  ＤＮＡに特異的に結合するＫＲＴ２３メチル化決定プライマー対、ならびに、メチル化決定に関連してＰＣＲを実施するための、適切なＰＣＲ  ＤＮＡポリメラーゼおよび試薬（ヌクレオチド、バッファー等）などのＤＮＡ増幅試薬を含む。これらのプライマーはＣｐＧモチーフを含有せず、かつ、そのメチル化状態が決定されるＣｐＧアイランドに隣接する。該プライマーは、それゆえ、Ｋ２３遺伝子のゲノム領域（配列番号１）において、またはＫＲＴ２３遺伝子のプロモーター領域（配列番号２）において結合する。好ましくは、プライマーはＳＮＰ遺伝子座を含有しないように設計される（現在、以下の３８６個のＳＮＰがＫＲＴ２３遺伝子に関して知られている（全ての配列は配列番号１に含まれる；したがって、配列番号１における位置を参照する）：
【表２−１】
2015502755.tif 000003
【表２−２】
2015502755.tif 000004
【表２−３】
2015502755.tif 000005
【表２−４】
2015502755.tif 000006
【表２−５】
2015502755.tif 000007
【００４３】
本発明による好ましいプライマー対は、少なくとも２０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド、特に少なくとも１００ヌクレオチド長（プライマー自身のヌクレオチド無しのヌクレオチド数）である、ＫＲＴ２３  ＤＮＡにおける領域を増幅するように設計される。しかしながら、そのサイズは著しく長くすることもできる；最大長はＰＣＲ法の技術的な実用性（増幅される配列が適切な増幅および／またはシークエンシングにとって長すぎるかどうか）によってのみ定義される。好ましい実施形態によれば、プライマー対は、少なくとも５、好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも２０、特に少なくとも３０のＫＲＴ２３  ＤＮＡのメチル化部位を増幅するように設計される（再び、用語「メチル化部位」は健康なＤＮＡにおいてメチル化される部位を指す）。メチル化はＤＮＡ上のシトシン塩基、通常、グアノシン塩基が続くシトシンで発生する（それゆえ、「ＣｐＧ−モチーフ」である）。可能なメチル化部位は、したがって、ヌクレオチド配列「ＣＧ」を有する全ての部位である。これは両ＤＮＡ鎖について有効である（したがって、センス鎖における「ＧＣ」モチーフは、アンチセンス鎖におけるＣｐＧモチーフを示す。（二本鎖である）ＤＮＡにおける可能なメチル化部位は、したがって、配列番号１および２における全てのＣＧおよびＧＣモチーフである）。既知の好ましいメチル化部位が、配列番号１において太字で示される。
【００４４】
既知の脂肪性肝炎状態のサンプル、例えば健常人由来のサンプルにおけるＫＲＴ２３  ＤＮＡにおけるメチル化と比較した、患者のサンプルにおけるＫＲＴ  ＤＮＡの減少したメチル化は、患者の脂肪性肝炎状態を示す。かかる標準サンプルまたは他のＫＲＴ２３標準は、好ましくは、本発明のキットのさらなる構成要素である。本発明のこの実施形態では、ゲル電気泳動またはシークエンシングデバイスもしくはシステムが、ＰＣＲ増幅から生じる配列を検出する。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態によると、エマルジョンＰＣＲビーズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３  （２００６），  ５４５−５５０）を含む、サンプルにおけるＫＲＴ２３  ＤＮＡのメチル化レベルを検出するためのキットが提供される。エマルジョンＰＣＲは、油相中の水性液滴においてプライマーでコーティングしたビーズと共に個々のＤＮＡ分子を単離する。ＰＣＲは、次いで、クローンコピーのＤＮＡ分子で各ビーズをコートし、その後、後のシークエンシングのための固定化が続く。エマルジョンＰＣＲは４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓによって商業化されており、「Ｐｏｌｏｎｙシークエンシング」および「ＳＯＬｉＤシークエンシング」としても知られ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ、その後Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、現在Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって開発された）、複雑な遺伝子ライブラリーの増幅を可能にする。
【００４６】
キットは、ＫＲＴ２３  ＤＮＡに特異的な適切なプライマー対および／または所与のサンプルにおけるＫＲＴ２３  ＤＮＡのメチル化決定を可能にする試薬を含むことができる。キットはまた、本発明による特定のメチル化度またはパターンの検出に基づいて、脂肪性肝炎診断および予後を決定するための指示書を含有してもよい。本キットは、脂肪性肝炎について、組織サンプルまたは体液のサンプルを診断するのに特に有用である。
【００４７】
このようなキットは、追加のオリゴヌクレオチドもしくはプライマーおよび／または１以上の以下：バッファー、アッセイで用いられる試薬（例えば、洗浄試薬、ポリメラーゼ、または内部標準核酸もしくは細胞、他）、および結合した核酸プローブもしくはプライマーの存在を検出することができる試薬などの、追加の成分をさらに含んでもよい。もちろん、同じまたは異なる容器手段における試薬の分離または組立は、抽出、増幅またはハイブリダイゼーション法の種類、用いられる検出方法、ならびに保存等のために必要な安定性を含む他のパラメーターによって決定される。上記および上述の容器および試薬の様々な置換（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）もまた本発明に含まれることが理解されるであろう。キットはまた、特定の診断、予後、セラノーシス（ｔｈｅｒａｎｏｓｉｓ）または使用と、組み合わせたＫＲＴ２３  ＤＮＡメチル化レベルを相関させることによる、特定の可能な診断、予後、セラノーシス（ｔｈｅｒａｎｏｓｉｓ）または使用の各々に関する説明書、ならびに用いられる実験プロトコルでの情報を含んでもよい。
【００４８】
本発明はさらに、それらに限定されることなく、以下の実施例および図面によって示される。
【実施例】
【００４９】
同時係属中の出願ＥＰ  １１  １９５  ５３７．３（およびこの優先権を基礎とするＰＣＴ出願）において、ＫＲＴ２３の発現が、脂肪肝と脂肪肝炎を区別するのに適したマーカーであることが示された。ＫＲＴ２３の発現は、脂肪性肝炎のみにおいて活性化される；脂肪肝の変化のみを示す肝組織においては発現は検出できない。ＫＲＴ２３発現の測定は、肝臓組織または体液におけるｍ−ＲＮＡまたはタンパク質の量に基づく。
【００５０】
本発明によれば、かかる鑑別診断は、ＤＮＡを含有するサンプル、例えば遊離循環ＤＮＡを含有する血液由来サンプルにおいて、ＫＲＴ２３遺伝子のメチル化状態を決定することによって達成できる。
【００５１】
遺伝子発現は、遺伝子の開始の上流または遺伝子の第一エクソンにおけるＤＮＡのメチル化によって調節されることが多い（Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ．ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  １９８２，  ＰＭＩＤ  ７０７０５０５）。このＤＮＡメチル化はいくつかの方法で、例えばメチル化特異的定量的ＰＣＲにより（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ．ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ，  ２００８，  ＰＭＩＤ  １８５４６２６０）、バイサルファイト処理されたＤＮＡをシークエンシングすることにより（Ｆｒｏｍｍｅｒ  ｅｔ．ａｌ．，  ＰＮＡＳ  １９９２，  ＰＭＩＤ  １５４２６７８）、または抗体プルダウンによるメチル化ＤＮＡの抽出、続いてハイスループットシークエンシングにより（Ｗｅｂｅｒ  ｅｔ．ａｌ，  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ  ２００５，  ＰＭＩＤ  １６００７０８８）、測定できる。
【００５２】
患者血液は、腫瘍または他の組織により血流に流される、少量の遊離ＤＮＡを含有する。この遊離循環ＤＮＡを、本明細書に記載されるメチル化パターンの変化のような、関連するバイオマーカーのために調べることができる。
【００５３】
課題：
遊離循環血清ＤＮＡにおけるＫＲＴ２３のメチル化パターンを測定することによって、脂肪性肝炎への脂肪肝の進行をモニタリングするためのアッセイの開発。
【００５４】
方法：
患者血漿からの遊離ＤＮＡの抽出
遊離ＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐ循環核酸キット、Ｑｉａｇｅｎ  （Ｑｉａｇｅｎ，  Ｈｉｌｄｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて患者血清から抽出した。本プロジェクトで用いられる全ての血清サンプルは、十分な同意の後、かつ地域倫理委員会からの有効なライセンスの下で、患者から採取した。５ｍｌの全血がＥＤＴＡ添加チューブに採取された。遠心分離後、血漿画分を分離し、−８０℃で保存した。１ｍｌのアリコートを解凍し、分析のために使用した。通常、約２０から４０ｎｇの遊離循環ＤＮＡを１ｍｌの血漿から抽出できた（図１）。
【００５５】
メチル化シトシンの変換（バイサルファイト処理）
１ｍｌの患者血漿から抽出されたＤＮＡの全量を、ＥＺ  ＤＮＡメチル化キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ＵＳＡ）を用いて変換した。この処理は、全ての非メチル化シトシンをウラシルに変換する。この変換の過程で、９０％のＤＮＡが分解され、残りのＤＮＡは重度に断片化される。
【００５６】
ＰＣＲによる、ＫＲＴ２３の第一のエクソンからのＣｐＧメチル化部位の増幅
ＫＲＴ２３の６ｋｂ上流の領域およびその完全なコード配列が、ＵＣＳＣゲノムブラウザにてメチル化の部位についてスクリーニングされた。ＫＲＴ２３の第一のエクソンは、ｃｈｒ１７：３９，０９２，６７８−３９，０９３，０３２領域において、複数のメチル化部位を含有する。この標的領域の同定の後、この領域を増幅するプライマーおよび含まれるＣｐＧアイランド（図２）を、ｐｅｒｌｐｒｉｍｅｒソフトウェア（ＰｅｒｌＰｒｉｍｅｒ  ｖ１．１．２１，  著作権（Ｃ）  ２００３−２０１１  Ｏｗｅｎ  Ｍａｒｓｈａｌｌ）を用いて設計した。プライマーは以下の配列を有していた：
ＫＲＴ２３−ｆｗｄ：ＧＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＴＡＧＧＧＡＧＡＴ（配列番号３）
ＫＲＴ２３−ｒｅｖ：ＣＣＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＡＣ（配列番号４）
標的配列は、このプライマー対を用いて、バイサルファイト処理されたＤＮＡから増幅することができた。
【００５７】
ＰＣＲ産物の精製
肝臓組織からのＤＮＡの抽出は、バンドを汚染することなく、特異的なＰＣＲ産物を増幅するのに十分なＤＮＡをもたらした。血漿サンプルから抽出された少量のＤＮＡに起因して、標的配列を増幅するＰＣＲ反応は準最適であり、所望の産物に加えて、プライマー二量体の小さなバンドをもたらした。これらの小さな断片は、標的断片のシークエンシングの前に除去する必要がある。ＤＮＡ断片が２％アガロースゲル上で分離され、標的断片がゲルから切り出され、ＤＮＡがＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｈｉｌｄｅｎ，  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）を用いてアガロースマトリックスから抽出された。Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ＵＳＡ）を用いる最終的な品質管理から、所望のＰＣＲ産物の濃縮が明らかとなった（図３）。
【００５８】
イオントレントパーソナルゲノムマシーン（ＰＧＭ）を用いるＰＣＲ産物のシークエンシング
精製されたＰＣＲ産物をビーズに結合し、イオントレントワンタッチシステムを用いて、エマルジョンＰＣＲにて増幅した。ＰＣＲ反応後、ビーズを有する鋳型が濃縮され、イオントレントＰＧＭに次いで導入される半導体チップ上にロードされ、シークエンシング反応が開始された。
【００５９】
次世代シークエンシングは、単一のシークエンシングの実行において、非常に多くの数の読み取りを生成できる。これは、標的配列における単一のＣｐＧのメチル化状態の強力な統計値を生成することを可能にする。本解析では、１サンプル当たり２０００から６０００の読み取りが解析された。
【００６０】
シークエンシングデータの解析
各サンプルから得られた配列読み取りが、ｐｅｒｌスクリプトとＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｌａｒｋｉｎ  Ｍ．    ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００７，  ＰＭＩＤ：  １７８４６０３６）の組み合わせによって、参照配列と個々に比較された。アラインメントの後、標的読み取りにおける各ＣｐＧ部位の配列が決定された。ＣおよびＴ読み取りの数が全読み取りにわたって要約され、この位置でのチミジンのパーセンテージを決定した。このパーセンテージは、患者血清由来の遊離ＤＮＡにおけるこのＣｐＧアイランドの脱メチル化を表す。
【００６１】
肝組織における、肝臓病変、ＫＲＴ２３発現およびＫＲＴ２３遺伝子座の脱メチル化の相関関係
ＫＲＴ２３  ｍＲＮＡの発現レベルは脂肪肝と脂肪性肝炎で異なり、これは我々の以前の結果を裏付ける（Ｓｔａｒｍａｎｎ  ｅｔ．  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１２，  ＰＭＩＤ  ２３０７１５９２）。上述のアッセイを用いて、肝臓ＤＮＡの解析から同様の結果が得ることができる。ＤＮＡが肝臓組織から抽出され、バイサルファイト処理され、ＫＲＴ２３遺伝子座がシークエンシングされた。ＫＲＴ２３遺伝子座の脱メチル化は、同じ組織におけるＫＲＴ２３の発現レベルと非常によく相関する（図４）。これは、ＤＮＡのメチル化パターンから、ＫＲＴ２３の遺伝子発現値からと同じ病理学的分類を描くことを可能にする。
【００６２】
患者血漿におけるＫＲＴ２３脱メチル化の測定
ｍＲＮＡレベルからＫＲＴ２３発現レベルを測定することは、コストがかかり、合併症の可能性を伴う肝生検を必要とする可能性がある。肝疾患のバイオマーカーとしてＫＲＴ２３を確立するための非侵襲的なアッセイを作成する必要がある。遊離循環血漿ＤＮＡからのＫＲＴ２３遺伝子およびプロモーターのＤＮＡ脱メチル化の測定は、このようなアッセイを提示する。図５に示されるように、選択した、個々のＣｐＧ部位のＫＲＴ２３脱メチル化レベルは、肝臓におけるＫＲＴ２３発現との高レベルの相関関係、それゆえ、病理学的分類を証明する。
【００６３】
概要：
患者血清の遊離循環ＤＮＡにおける、ｃｈｒ１７：３９０９２６７８−３９０９３０３２ゲノム領域（または最大６ｋｂ上流）におけるＫＲＴ２３遺伝子座の脱メチル化を測定することは、特に鈍的な（ｂｌｕｎｔ）脂肪肝と脂肪性肝炎との区別において、肝実質の病態に関する結論を出すことを可能にする。
【００６４】
配列番号１: 
Ｋｒｔ２３遺伝子（ｃｈｒ１７：３９，０７８，９５２−３９，０９９，８３６）；好ましいメチル化領域が太字で示される；本実施例で用いられ、かつ増幅された配列がハイライト表示されている。
【表３−１】
2015502755.tif 000008
【表３−２】
2015502755.tif 000009
【表３−３】
2015502755.tif 000010
【表３−４】
2015502755.tif 000011
【表３−５】
2015502755.tif 000012
【表３−６】
2015502755.tif 000013
【００６５】
配列番号２（ｃｈｒ１７：３９，０９３，８３６−３９，０９９，８３６）：
【表４−１】
2015502755.tif 000014
【表４−２】
2015502755.tif 000015
【表４−３】
2015502755.tif 000016
【図１】
2015502755.tif 000017
【図２】
2015502755.tif 000018
【図３ａ】
2015502755.tif 000019
【図３ｂ】
2015502755.tif 000020
【図４】
2015502755.tif 000021
【図５】
2015502755.tif 000022
【配列表】
2015502755000001.app
【国際調査報告】
2015502755.tif 000023
2015502755.tif 000024
2015502755.tif 000025
2015502755.tif 000026