(57)【要約】  本明細書には、少なくとも１つのポリアルキレングリコールポリマーは甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の糖質部位に結合している、ＴＳＨの組成物が記載されている。また、突然変異した甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）と少なくとも１つのポリアルキレングリコールポリマーとの組成物であって、ここで、突然変異したＴＳＨは、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基がシステイン残基で置換されているＴＳＨを含み、ポリアルキレングリコールポリマーは、置換されたシステイン残基の部位で突然変異したＴＳＨに結合している組成物も記載されている。これらのＴＳＨ組成物を含む医薬組成物と、有効量の該医薬組成物を患者に投与することによって、それを必要とする患者において甲状腺の状態を治療する方法もまた記載されている。
2015502363.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのポリアルキレングリコールポリマーは甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の糖質部位に結合している、ＴＳＨを含む組成物。
【請求項２】
ＴＳＨは哺乳動物から単離されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
哺乳動物はヒトである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
ＴＳＨは組換え哺乳動物ＴＳＨである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
ＴＳＨは組換えヒトＴＳＨ（ｒｈＴＳＨ）である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
糖質部位はシアル酸である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
シアル酸基は、ｒｈＴＳＨαサブユニットのＡＳＮ５２、ｒｈＴＳＨαサブユニットのＡＳＮ７８、およびｒｈＴＳＨβサブユニットのＡＳＮ２３またはこれらの組合せからなる群から選択されるＴＳＨ上の部位に位置している、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
糖質部位はガラクトースである、請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
ガラクトースは、ｒｈＴＳＨαサブユニットのＡＳＮ５２、ｒｈＴＳＨαサブユニットのＡＳＮ７８、ｒｈＴＳＨβサブユニットのＡＳＮ２３またはこれらの組合せに位置している、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
ポリアルキレングリコールポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
ＰＥＧは、約３，０００から約１００，０００ｋＤａの平均分子量を有する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
１つのＰＥＧはＴＳＨに結合している、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
１つを超えるＰＥＧはＴＳＨに結合している、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
ＴＳＨは、対照と比較して延長されたＴ４応答を示す、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
突然変異した甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）と少なくとも１つのポリアルキレングリコールポリマーとを含む組成物であって、ここで、該突然変異したＴＳＨは、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基がシステイン残基で置換されているＴＳＨを含み、該ポリアルキレングリコールポリマーは、システイン残基で該突然変異したＴＳＨに結合し、該突然変異したＴＳＨは生物学的に活性である上記組成物。
【請求項１６】
システインで置換されているアミノ酸残基は、ＴＳＨのアルファサブユニット上に位置している、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
システインで置換されているアミノ酸残基は、ＡＳＮ５２、ＡＳＮ７８、ＭＥＴ７１、ＡＳＮ６６、ＴＨＲ６９およびＧＬＹ２２、ならびにこれらの組合せからなる群から選択される組換えヒトＴＳＨのアミノ酸位に位置している、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
システインで置換されているアミノ酸残基は、ＴＳＨのベータサブユニット上に位置している、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１９】
システインで置換されているアミノ酸残基は、ＡＳＮ２３、ＶＡＬ１１８、ＴＨＲ２１、ＧＬＵ６３およびＡＳＰ５６、ならびにこれらの組合せからなる群から選択される組換えヒトＴＳＨのアミノ酸位に位置している、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
ポリアルキレングリコールポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２１】
ＰＥＧは、約３，０００から約１００，０００ｋＤａの平均分子量を有する、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
１つのＰＥＧはＴＳＨに結合している、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
１つを超えるＰＥＧはＴＳＨに結合している、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２４】
少なくとも１つのポリアルキレングリコールポリマーを甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の糖質部位に結合させる工程を含む、ＰＥＧ化された、生物学的に活性なＴＳＨを生成する方法。
【請求項２５】
ａ）１つまたはそれ以上の追加のシステイン残基を甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）に導入し、それによって突然変異したＴＳＨを生成する工程と；ｂ）１つまたはそれ以上のポリアルキレングリコールポリマーを、工程ａ）において導入された１つまたはそれ以上のシステイン残基に結合させ、それによってＰＥＧ化された、生物学的に活性な突然変異したＴＳＨを生成する工程とを含む、ＰＥＧ化された、生物学的に活性な突然変異したＴＳＨを生成する方法。
【請求項２６】
システイン残基はＴＳＨにおいて内因性アミノ酸残基を置き換える、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＴＳＨは哺乳動物から単離されている、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
哺乳動物はヒトである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＴＳＨは組換え哺乳動物ＴＳＨである、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
ＴＳＨは組換えヒトＴＳＨ（ｒｈＴＳＨ）である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ポリアルキレングリコールポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
ＰＥＧは、約３，０００から約１００，０００ｋＤａの平均分子量を有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
１つのＰＥＧはＴＳＨに結合している、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
１つを超えるＰＥＧはＴＳＨに結合している、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
システインはＴＳＨのアルファサブユニット上に位置している、請求項２５に記載の方法。
【請求項３６】
システインは、ＡＳＮ５２、ＡＳＮ７８、ＭＥＴ７１、ＡＳＮ６６、ＴＨＲ６９およびＧＬＹ２２、ならびにこれらの組合せからなる群から選択される組換えヒトＴＳＨのアミノ酸位に位置している、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
システインはＴＳＨのベータサブユニット上に位置している、請求項２５に記載の方法。
【請求項３８】
システインは、ＡＳＮ２３、ＶＡＬ１１８、ＴＨＲ２１、ＧＬＵ６３およびＡＳＰ５６、ならびにこれらの組合せからなる群から選択される組換えヒトＴＳＨのアミノ酸位に位置している、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
有効量のＰＥＧ化された、生物学的に活性な甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）を投与する工程を含む、それを必要とする対象において甲状腺の状態を治療する方法。
【請求項４０】
ＴＳＨは哺乳動物から単離されている、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
哺乳動物はヒトである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ＴＳＨは組換え哺乳動物ＴＳＨである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
ＴＳＨは組換えヒトＴＳＨ（ｒｈＴＳＨ）である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ポリアルキレングリコールポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
ＰＥＧは、約３，０００から約１００，０００ｋＤａの平均分子量を有する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
１つのＰＥＧはＴＳＨに結合している、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
１つを超えるＰＥＧはＴＳＨに結合している、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
治療有効量の請求項１〜２３のいずれか１項に記載の組成物と医薬として許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項５０】
有効量の請求項４９に記載の医薬組成物を患者に投与する工程を含む、それを必要とする患者において甲状腺の状態を治療するための方法。
【請求項５１】
医薬組成物は、対照と比較して増強されたＴ４応答を示す、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
甲状腺の状態は、甲状腺癌からなる群から選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
医薬組成物は筋内注射を介して送達される、請求項５０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビボにおいて甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）作用の持続時間を延長させる、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの（１つまたはそれ以上の）ポリアルキレングリコールポリマーとコンジュゲートさせたＴＳＨの組成物に関する。さらに、本発明は、突然変異ＴＳＨ組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
甲状腺癌は、甲状腺由来細胞の増殖が制御不能である一群の疾患である。甲状腺癌は、一般的に、乳頭癌、濾胞腺癌およびヒュルトレ細胞癌を含む分化型甲状腺癌、ならびに髄様癌および未分化癌を含む他の甲状腺癌として分類されている。経時的に、一部の分化型甲状腺癌はあまり分化しなくなり、脱分化または低分化型癌として分類される場合がある。患者への甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の投与は、甲状腺腫および甲状腺癌を含む様々な甲状腺疾患の診断または治療アプローチにおいて役割を果たすことができる。これらの疾患について、投与されたＴＳＨの薬物動態プロファイルは、診断または治療手順の最適な成功にとって重要であり得る。
【０００３】
組換えヒトＴＳＨ（ｒｈＴＳＨ）は、ＴＨＹＲＯＧＥＮ（登録商標）甲状腺刺激ホルモン（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｒｐ．、ＮＤＡ  ２−８９８）として市販され、連続した日数、複数回の注射により投薬され、続いて３日目と５日目に、腫瘍診断のためにＲＡＩ投薬され、採血される。この厳密な投薬計画は、ＴＳＨの比較的短い作用持続時間のために必要とされ、これはまた、効能の減少および副作用をもたらす。作用持続時間が長いＴＳＨ組成物は、様々な甲状腺疾患の治療および検出を改善し、副作用を減らす可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
このように、ＴＳＨ放出の薬物動態を最適化し、複数回注射の必要性を減らす、改善されたＴＳＨ含有組成物が必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、インビボにおいて甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）作用の持続時間を延長させる、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの（１つまたはそれ以上の）ポリアルキレングリコールポリマーとコンジュゲートさせたＴＳＨの組成物に関する。さらに、本発明は、突然変異ＴＳＨ組成物に関し、ここで、ＴＳＨは、ポリアルキレングリコールポリマーとコンジュゲートされ得る付加部位を導入するように突然変異されている。本明細書に記載されている本発明のＴＳＨ組成物は、医薬組成物の調製に有用であり、それを必要とする、甲状腺の状態を患っている患者の治療に用いることができる。
【０００６】
一実施形態によれば、本発明は、少なくとも１つのポリアルキレングリコールポリマーはＴＳＨの糖質部位に結合している、ＴＳＨを含む組成物に関する。ある特定の態様において、組成物のＴＳＨは、哺乳動物から、例えばヒトから単離され、またはＴＳＨは、組換え哺乳動物ＴＳＨ、例えば組換えヒトＴＳＨ（ｒｈＴＳＨ）である。
【０００７】
ある特定の実施形態において、ＴＳＨの糖質部位は、アミノ酸、例えば、ｒｈＴＳＨαサブユニットのアスパラギン残基ＡＳＮ５２、ｒｈＴＳＨαサブユニットのＡＳＮ７８、またはｒｈＴＳＨβサブユニットのＡＳＮ２３上のシアル酸およびこれらの組合せである。
【０００８】
さらに他の実施形態において、ＴＳＨ上の糖質部位は、アミノ酸、例えば、アスパラギン上のガラクトースである。特定の実施形態において、ガラクトース基は、ＴＳＨ上の部位、例えば、ｒｈＴＳＨαサブユニットのアミノ酸ＡＳＮ５２、ｒｈＴＳＨαサブユニットのアミノ酸ＡＳＮ７８またはｒｈＴＳＨβサブユニットのアミノ酸ＡＳＮ２３およびこれらの組合せに位置している。
【０００９】
本発明の関連する態様において、本発明の組成物は、対照と比較して増強されたＴ４応答を示す。
【００１０】
本発明の他の関連する態様において、ＴＳＨの糖質部位に結合しているポリアルキレングリコールポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。特定の実施形態において、ＰＥＧは、約３，０００から約１００，０００ダルトンの平均分子量を有する。他の実施形態において、１つまたはそれ以上の直鎖状または分枝鎖状ＰＥＧ分子がＴＳＨに結合している。
【００１１】
本発明のさらに別の関連する実施形態において、突然変異した甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）と少なくとも１つのポリアルキレングリコールポリマーとを含む組成物であって、ここで、突然変異したＴＳＨは、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基がシステイン残基で置換されているＴＳＨを含み、ポリアルキレングリコールポリマーは、システイン残基で突然変異したＴＳＨに結合し、突然変異したＴＳＨは生物学的に活性である組成物が記載されている。
【００１２】
ある特定の実施形態において、システインで置換されているアミノ酸残基は、ＴＳＨのアルファサブユニット上に位置している。特定の実施形態において、システインで置換されているアミノ酸残基は、ＡＳＮ５２、ＡＳＮ７８、ＭＥＴ７１、ＡＳＮ６６、ＴＨＲ６９およびＧＬＹ２２、ならびにこれらの組合せからなる群から選択される組換えヒトＴＳＨのアミノ酸位に位置している。
【００１３】
さらに他の実施形態において、システインで置換されているアミノ酸残基は、ＴＳＨのベータサブユニット上に位置している。特定の実施形態において、システインで置換されているアミノ酸残基は、ＡＳＮ２３、ＶＡＬ１１８、ＴＨＲ２１、ＧＬＵ６３およびＡＳＰ５６、ならびにこれらの組合せからなる群から選択される組換えヒトＴＳＨのアミノ酸位に位置している。ある特定の態様において、システイン修飾を有する突然変異されたＴＳＨは、ポリアルキレングリコールポリマーとしてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を結合している。特定の実施形態において、ＰＥＧは、約３，０００から約１００，０００ダルトンの平均分子量を有する。他の実施形態において、ＰＥＧの分子の１つまたはそれ以上の直鎖状もしくは分枝鎖状またはこれらの組合せは、ＴＳＨに結合している。
【００１４】
本発明の他の実施形態によれば、治療有効量の本発明の組成物を医薬として許容される担体とともに含む医薬組成物が記載されている。
【００１５】
これらの医薬組成物は、有効量の本発明の医薬組成物を患者に投与することによって、それを必要とする患者において甲状腺の状態を治療する方法において使用される。特定の実施形態において、甲状腺の状態は甲状腺癌である。他の実施形態において、組成物は筋内注射によって送達される。
【００１６】
本発明はまた、少なくとも１つのポリアルキレングリコールポリマーを甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の糖質部位に結合させる工程を含む、ＰＥＧ化された、生物学的に活性なＴＳＨを生成する方法に関する。
【００１７】
別の関連する態様において、本発明は、（ａ）１つまたはそれ以上の追加のシステイン残基を甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）のアミノ酸配列に導入し、それによって突然変異したＴＳＨを生成する工程と；（ｂ）１つまたはそれ以上のポリアルキレングリコールポリマーを、工程（ａ）において導入された１つまたはそれ以上のシステイン残基に結合させ、それによってＰＥＧ化された、生物学的に活性な突然変異したＴＳＨを生成する工程とを含む、ＰＥＧ化された、生物学的に活性な突然変異したＴＳＨを生成する方法に関する。特定の実施形態において、システイン残基は、ＴＳＨにおいて内因性アミノ酸残基を置き換える。
【００１８】
本発明はまた、有効量のＰＥＧ化された、生物学的に活性な甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）を投与する工程を含む、それを必要とする対象において甲状腺の状態を治療する方法に関する。
【００１９】
同様の参照文字は、異なる図を通じて同じ部分を指す添付の図面に示されるように、前述のものは、本発明の例示的な実施形態の以下のより詳細な説明から明らかになる。図面は、必ずしも縮尺通りではないが、その代わりに本発明の実施形態を例示することに重点が置かれている。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】Ｎ末端でのＰＥＧ化標的、リジンアミノ酸残基および天然の糖質部位を有するＴＳＨサブユニットの構造モデリングを示す直線状（図１Ａ）および三次元（図１Ｂ）模式図である。
【図２】リジンおよびＮ末端のＰＥＧ化反応を示す図である。異なるＰＥＧ：タンパク質比を有するリジンＰＥＧ化のＰＥＧ化反応混合物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図２Ａ（クマシーブルー染色）および図２Ｂ（ＰＥＧ染色）に示す。１：１のＰＥＧ：タンパク質比を有する反応混合物がボックスで強調され、ＳＥＣ−ＨＰＬＣでさらに分析された（図２Ｃ）。図２Ｄは、２：１のＰＥＧ：タンパク質比でのＮ末端ＰＥＧ化反応のＳＥＣ−ＨＰＬＣプロファイルである。
【図３】３つの異なる糖質ＰＥＧ化経路を示す模式図である。
【図４】選択された突然変異体のベータ炭素位置を示している構造モデルを示す図である。
【図５】突然変異体の発現レベルとオリゴマー化を評価するための銀染色された非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図６】３つのシステイン部位特異的突然変異体のＰＥＧ化を示しているゲルを示す図である。
【図７】図７は、突然変異ＴＳＨのいくつかのＰＥＧ化反応のＳＥＣ−ＨＰＬＣプロファイルの一連のクロマトグラムを示す図である。
【図８】αＧ２２Ｃ  ＴＳＨ  ＰＥＧ化条件の最適化を示す図である。
【図９】Ｇ２２Ｃ  ＴＳＨについてのサブユニットおよび部位特異的コンジュゲーションの確認を示す図である。
【図１０】糖質ＰＥＧ化反応混合物と精製された糖質ＰＥＧ化ｒｈＴＳＨコンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。様々な（ＰＥＧ：タンパク質）モル比を有するＧＡＭ（＋）およびＧＡＭ（−）反応混合物をそれぞれ図１０Ａと図１０Ｂに示す。精製された糖質ＰＥＧ化ｒｈＴＳＨコンジュゲートを図１０Ｃ（ＰＥＧ染色）と図１０Ｄ（クマシーブルー染色）に示す。
【図１１】４０ｋＤ  ＳＡＭ反応混合物（図１１Ａ）と精製された糖質ＰＥＧ化ｒｈＴＳＨコンジュゲート（図１１Ｂ）のＳＥＣ−ＨＰＬＣプロファイルを示す図である。
【図１２】実施例１０で説明されている、精製された、モノＰＥＧ化された４０ｋＤのＳＡＭコンジュゲートのトリプシンペプチドマップおよび回収された、ＰＥＧ化されたトリプシン断片のＮ末端配列決定の結果を示す図である。
【図１３】実施例１１で説明されている、精製された糖質ＰＥＧ化されたｒｈＴＳＨコンジュゲートのそれぞれのサブユニット上のＰＥＧ化の相対量の決定を示す図である。
【図１４】様々なサイズのＰＥＧを有するＰＥＧ化ＳＡＭ、ＧＡＭ（＋）、ＧＡＭ（−）の受容体結合アッセイの結果を示すグラフである。
【図１５】実施例１３で説明されている、ｒｈＴＳＨ対照と比較した、Ｔ４レベル（μｇ／ｄＬ）における経時的な効果を示す様々なＰＥＧ化ＴＳＨの薬力学的データのグラフである。
【図１６】実施例１３で説明されている、対照と比較した、経時的な、血清中の様々なＰＥＧ化されたＴＳＨの濃度を示すグラフである。
【図１７】実施例１４で説明されている、対照と比較した、経時的な、血清中の様々なＰＥＧ化されたＴＳＨの濃度を示すグラフである。
【図１８】実施例１６で説明されている、対照と比較した、経時的な、様々なＰＥＧ化されたＴＳＨについての血清中のＴ４濃度を示すグラフである。
【図１９】実施例１７で説明されている、対照と比較した、経時的な、４０ｋＤのＳＡＭの種々の用量についての血清中のＴ４濃度を示すグラフである。
【図２０】実施例１８で説明されている、対照と比較した、経時的な、様々なＰＥＧ化されたＴＳＨについての血清中のＴ４濃度を示すグラフである。
【図２１】実施例１９で説明されている、対照と比較した、経時的な、様々なＰＥＧ化されたＴＳＨについての血清中のＴ４濃度を示すグラフである。
【図２２】実施例１９で説明されている、対照と比較した、経時的な、様々なＰＥＧ化されたＴＳＨについての血清中のＴ４濃度を示すグラフである。
【図２３】実施例２０で説明されている、経時的な、１０ｋＤのマルチＳＡＭと４０ｋＤのＳＡＭについての血清中のＴ４濃度を示すグラフである。
【図２４】実施例２１で説明されている、対照と比較した、経時的な、４０ｋＤのＳＡＭと４０ｋＤのＧ２２Ｃについての血清中のＴ４濃度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
ＴＨＹＲＯＧＥＮ（登録商標）は甲状腺刺激ホルモン（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｒｐ．、ＮＤＡ  ２−８９８）であり、甲状腺癌の診断および／または治療用に現在市販されている組換えヒトＴＳＨ（ｒｈＴＳＨ）である。これは、筋内投与前に、水で再構成される凍結乾燥粉末として販売されている。
【００２２】
ＴＳＨのこのような既存の製剤は、厳格な投薬計画を有し、複数回の注射を必要とし、薬物動態プロファイルが制限され、吐き気などの副作用がある。これらの欠点は、本発明のＴＳＨ組成物および突然変異したＴＳＨ組成物によって対処される。注射の頻度を減らし、柔軟な投与計画を提供し、治療指数を改善し、甲状腺組織への刺激により良好な効能を有する、より長時間作用する甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）組成物が本明細書に記載されている。さらに、他の有効性パラメータは、本発明のより長時間作用するＴＳＨ組成物によって正に影響され、ＴＳＨの半減期の延長およびＴ４放出の持続時間の増大が挙げられる。
【００２３】
本明細書に示されるように、ＴＳＨにポリアルキレングリコールポリマー、例えば、ポリエチレングリコールをコンジュゲートさせることによって、ＴＳＨの薬物動態プロファイルおよび薬力学的プロファイルが有益に変更された。以下により詳細に記載されるように、ＴＳＨのＮ末端ＰＥＧ化、リジンＰＥＧ化および糖質ポリマー結合を研究した。ＴＳＨのＮ末端ＰＥＧ化は、作用持続時間が延長されたＴＳＨをもたらし、一方、ＴＳＨのリジンＰＥＧ化と糖質ＰＥＧ化がＴＳＨの有効性において深刻な減少をもたらすことが予期された。本明細書に記載されている研究結果は、ＴＳＨの糖質ＰＥＧ化がＴＳＨの有効性に好ましい効果を有し、ＴＳＨのＮ末端ＰＥＧ化とリジンＰＥＧ化はともに、ＴＳＨの有効性を非常に低下させたことを示す。
【００２４】
従って、一態様において、本発明は、少なくとも１つのポリアルキレングリコールポリマーは甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の糖質部位に結合している、ＴＳＨを含む組成物を対象とする。また、本明細書において、ＴＳＨの有効性に好ましい効果をもたらすＰＥＧ化について標的としたシステイン残基を導入するように突然変異されているＴＳＨの部位特異的なＰＥＧ化が示されている。このようにして、別の態様において、本発明は、突然変異した甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）と少なくとも１つのポリアルキレングリコールポリマーとを含む組成物であって、ここで、突然変異したＴＳＨは、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基がシステイン残基で置換されているＴＳＨを含み、ポリアルキレングリコールポリマーは、システイン残基で突然変異したＴＳＨに結合し、突然変異したＴＳＨは生物学的に活性である組成物を対象とする。本明細書において提供されるＰＥＧ化されたＴＳＨ組成物は、ポリエチレングリコールポリマーにコンジュゲートされていないＴＳＨと比較して、以下の改善された治療指数の効果の１つまたはそれ以上を有する：溶解度の増大、タンパク質分解の低下、免疫原性の低下、腎クリアランス速度の減少、血液循環寿命の延長、作用持続時間の増加ならびに分布および吸収の変更。
【００２５】
ＴＳＨは、２つのサブユニットであるアルファおよびベータサブユニットを有する糖タンパク質である。α（アルファ）サブユニット（すなわち、絨毛性ゴナドトロピンアルファ）は、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、黄体形成ホルモンおよび卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のαサブユニットと同一である。β（ベータ）サブユニットはＴＳＨに固有であり、その機能を決定する。
【００２６】
ｒｈＴＳＨは、組換え的に合成されたＴＳＨを指す。本明細書に記載されている組換えＤＮＡ法は、一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｔｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年、および／またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．、ならびにＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ  １９９４年、追補を含む）に記載されている方法である。用語「組換え」とは、インビトロにおいて合成されたまたは他には操作されたポリヌクレオチド（例えば、「組換えポリヌクレオチド」）、および細胞または他の生物学的システムにおける遺伝子産物を生成させるために組換えポリヌクレオチドを用いる方法、および組換えポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド（「組換えタンパク質」）を指す。
【００２７】
本明細書に記載されている方法および組成物において使用されるＴＳＨは、米国特許第５，８４０，５６６号および第６，３６５，１２７号において記載されている方法などの当該技術分野において公知の方法を用いて、ウシ、ブタ、霊長類またはヒトなどの天然に存在する哺乳動物源から精製されてもよく、あるいは天然に存在しない供給源由来の組換え形態で単離されてもよい。
【００２８】
ポリマー（例えば、多糖類、シアル酸のポリマー、ヒドロキシエチルデンプンおよびポリアルキレングリコール（例えば、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、ポリエチレングリコール）および他に同様の部分）への巨大分子のコンジュゲーションは、これらの薬力学的特性と薬物動態学的特性との間の均衡を変化させることによって、薬物のインビボでの効能を効果的に変更するために用いることができることは公知である。しかしながら、このようなコンジュゲーションは、多くの場合、薬物の結合親和性の喪失、実際には有効性の喪失をもたらす。限定された場合において、有効性の減少は、得られた薬物動態（ＰＫ）プロファイルと薬力学的（ＰＤ）プロファイルを療法に有用なものにするポリマー修飾された薬物のより長い循環半減期によって相殺される。
【００２９】
ＰＥＧ化と呼ばれる、ある特定の巨大分子へのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のコンジュゲーションは、大部分の活性を保持する一方で、活性が、一般的に、細胞表面受容体との高い親和性相互作用を必要とするＰＥＧ化されたホルモンおよびサイトカインは、活性の有意な減少を示す。しばしば、ホルモンへのＰＥＧ化は、ホルモンのＰＤプロファイルおよびＰＫプロファイルに悪影響を及ぼす。
【００３０】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、体内でのタンパク質循環時間を延長させることが示されている非抗原性の不活性ポリマーである。典型的には、これらの一般的なＰＥＧ試薬は、タンパク質上の第一級アミンと第二級アミン、一般にはリジン残基および／またはＮ末端のアミノ酸に結合する。ＰＥＧは、様々なサイズで市販され、一旦結合すると、サイズのバリエーションの使用、および単一の薬物分子への複数の結合によって、個々の適応症に適合され得る。ＰＥＧは、注入されたＰＥＧ化タンパク質の血漿半減期を改善することが示されているが、上述したように、有効性はＰＥＧによる立体障害のために失われる場合がある（Ｆｉｓｈｂｕｒｎ，Ｃ．Ｓ．、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ９７：４１６７（２００８年））。有効性の問題を回避し、所望のＰＤおよびＰＫプロファイルを生じさせるために、ＰＥＧ化されるべき標的タンパク質の構造−機能関係の詳細な理解は、最大の機能的活性を保持するＰＥＧ化された産物の生成に役立つ。
【００３１】
最近、成長ホルモンスーパーファミリーメンバーの構造の決定が進み、潜在的な治療法をもたらしている。これらのタンパク質が構造情報と相まって、タンパク質の標的とどのように相互作用するかを理解することにより、タンパク質のそれぞれの標的におけるタンパク質の治療上の利点を最大限にするためのポリマーコンジュゲートを設計するために構造情報を用いることによって効果的な薬物を生じさせている。残念ながら、ＴＳＨ受容体とのＴＳＨの複合体構造に関する構造情報を利用することができない；しかしながら、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）受容体（ＦＳＨＲ）と複合化した関連タンパク質のＦＳＨの結晶構造が解析されている（ＦａｎおよびＨｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ４３３：２６９（２００４年））。ＴＳＨは、ＦＳＨと高い相同性を有し、同一のアルファサブユニットと類似のベータサブユニットを共有している。同様に、ＴＳＨ受容体およびＦＳＨ受容体は相同性が高い。このようにして、ＦＳＨ−ＦＳＨ受容体複合体は、ＴＳＨ受容体とのＴＳＨ相互作用についての初期モデルとして役立つ場合がある。
【００３２】
本明細書に示されるように、ＴＳＨ配列をＦＳＨ−ＦＳＨＲ複合体の３Ｄ構造モデル上に重ね合わせた場合（ＰＤＢ座標１ＸＷＤ）、Ｎ末端は、受容体相互作用領域から最も遠いように見え、従って、ＰＥＧ化後の受容体結合の喪失を最小限にするために、ＰＥＧ結合にとって理想的な部位である可能性がある（図１Ｂを参照されたい）。ＴＳＨにおいてリジンが多数存在し、これらのいくつかは受容体結合部位の近傍にあるため、リジンでのＰＥＧ結合は、受容体結合に干渉することが予期された。
【００３３】
ＴＳＨはグリコシル化されたタンパク質である。糖鎖は、その１５〜２５重量％を構成し、３つのアスパラギン連結型糖鎖を含む。これらの鎖のうちの２つは、ＴＳＨのアルファサブユニット上に見出され、それぞれアスパラギン５２（ＡＳＮ５２）とアスパラギン７８（ＡＳＮ７８）に連結し、３番目はＴＳＨのベータサブユニット上に見出され、アスパラギン２３（ＡＳＮ２３）に連結している。アスパラギン連結型糖鎖は潜在的なＰＥＧコンジュゲーション部位であるが、しかしながら、ＴＳＨタンパク質上では、受容体相互作用領域、特にＡＳＮ５２への糖鎖のそれぞれの近接は、このような部位でのＰＥＧコンジュゲーションが受容体結合に負の効果を有する可能性があることを示唆している。このようにして、ＴＳＨへのポリマーのコンジュゲーションについて潜在的な部位を選択することは、多くの不確実性を示した。
【００３４】
さらに、ＴＳＨの脱グリコシル化は、受容体結合時に効率的なシグナル伝達の喪失をもたらすことが長く知られている（Ｓｚｋｕｄｌｉｎｓｋｉら、Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ．８２：４７３（２００２年））。ＴＳＨの糖質からの末端シアル酸の除去により、インビトロにおいて活性が改善されたが、おそらく肝臓のアシアロ糖タンパク質受容体によるクリアランスに起因して、インビボにおいて循環時間の大幅な減少が観察された。Ｔｈｏｔａｋｕｒａ，Ｎ．Ｒ．、Ｓｚｋｕｄｌｉｎｓｋｉ，Ｍ．Ｗ．およびＷｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．Ｄ．、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ４、５２５〜５３３（１９９４年）。また、個々の糖質部位の欠失は、特にアルファ鎖のアミノ酸の５２位について、インビトロでの機能的活性を増大させ、重ねて、糖質が、シアル酸の負電荷と受容体上の負電荷の間の静電反発に関して、受容体に十分に近い可能性があることを示唆する。全てを合わせると、ＴＳＨのこの構造機能分析は、Ｎ末端ＰＥＧ化は、機能的有効性における効果を最小限にするために、糖質ＰＥＧ化よりもはるかに好ましいことを示した。本明細書に記載されているように、Ｎ末端ＰＥＧ化、リジンＰＥＧ化および糖質ポリマー結合を研究した。
【００３５】
従って、ポリマーをコンジュゲートしたＴＳＨを生成する糖質ポリマー法は、本発明の一態様である。一実施形態において、ポリマーは、ポリアルキレングリコールである。本明細書で使用するとき、「ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）」には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリブチレングリコールなどが挙げられる。ポリマーは、直鎖状または分枝鎖状であってもよい。ＰＡＧは分子に共有結合される。本文脈において使用するとき、用語「結合」または「結合した」とは、ＴＳＨタンパク質の部位または部分とポリマー、例えばポリアルキレングリコールとのカップリングまたはコンジュゲーションを指し、例えば、互いに直接的に共有結合的に接続されるまたは他には、架橋、スペーサーもしくは連結部分（単数または複数）などの介在部分（単数または複数）を介して互いに間接的に共有結合的に接続される。ＴＳＨに結合またはコンジュゲートしたポリマーは、ＴＳＨと混合され、混和され（ｃｏｍｍｉｎｇｌｅ）またはそれとともに溶液中に存在するポリマーとは区別される。
【００３６】
「糖質部位」とはＴＳＨ上に見出される糖質側鎖を指す。この部位は、自然にグリコシル化された部位であってもよくまたは酵素的に提供された部位であってもよい。ある特定の実施形態において、糖質部位は、受容体との最適なＴＳＨ相互作用のための所望の基準を満たすようにまたはタンパク質の折りたたみまたは移動度のような他の機能要件に対して特異的に選択される。糖質部位は、ＰＥＧなどのポリマー部分の結合のために利用可能である。タンパク質上の典型的な糖質部位はアスパラギン、セリンまたはスレオニンである。ＴＳＨは３つのアスパラギン連結型糖鎖を有する。
【００３７】
ある特定の実施形態において、１つのポリマーがＴＳＨに結合している。他の実施形態において、複数のポリマーがＴＳＨに結合している。複数の結合したポリマーは、一種または複数種のものであってもよい。例えば、１つのＰＥＧ分子がタンパク質に結合している場合において、タンパク質は、「モノＰＥＧ化されている」と呼ばれ、１つを超えるＰＥＧ分子がタンパク質に結合している場合において、タンパク質は、「マルチＰＥＧ化されている」と呼ばれる。タンパク質がマルチＰＥＧ化される場合、（他の結合したＰＥＧに相対して）タンパク質に結合した個々のＰＥＧは、同じまたは異なる分子量を有することができ、直鎖状または分枝鎖状構造であってもよい。ＰＥＧ分子の分子量範囲は、３，０００〜１００，０００ダルトンである。ある特定の実施形態において、結合したＰＥＧの分子量は、５ｋＤ、１０ｋＤ、２０ｋＤ、３０ｋＤ、４０ｋＤもしくは６０ｋＤまたはこれらの組合せである。
【００３８】
本明細書において、ＴＳＨの糖質ＰＥＧ化に関する３つの代替スキームが提供される：（ｉ）シアル酸媒介ＰＥＧ化（「ＳＡＭ」と称する）、（ｉｉ）ガラクトース媒介ＰＥＧ化（「ＧＡＭ（−）」と称する）および（ｉｉｉ）ガラクトース媒介ＰＥＧ化とカップリングされたシアル酸除去（「ＧＡＭ（＋）」と称する）。要約すると、図３に示されるように、シアル酸媒介ＳＡＭ  ＰＥＧ化において、シアル酸が酸化され、次に、ＰＥＧの化学結合が行われる。ＧＡＭ（−）ＰＥＧ化において、ガラクトース部分が酸化され、次に、ＰＥＧの化学結合が行われる。さらに、ＧＡＭ（＋）において、シアル酸部分が酵素的に除去され、続いて、露出されたガラクトース残基が酸化され、次に、ＰＥＧの化学結合が行われる。
【００３９】
ＴＳＨへのＰＥＧ化の部位特異的な方法もまた本発明に含まれる。このような方法の１つは、システイン反応性ＰＥＧを用いてシステイン残基にＰＥＧを結合させる。異なる反応性基（例えば、マレイミド、ビニルスルホン）と異なるサイズのＰＥＧ（２〜４０ｋＤａ）を有する多数の非常に特異的なシステイン反応性ＰＥＧが市販されている。中性ｐＨで、これらのＰＥＧ試薬は、「遊離の」システイン残基、すなわち、標的タンパク質においてジスルフィド結合に関与していないシステイン残基に選択的に結合する。あるいは、天然のジスルフィド結合に関与する２つのシステインのうちの１つは、欠失されまたは別のアミノ酸に置換されてもよく、遊離し、化学修飾に利用可能な天然のシステイン（通常、欠失されまたは置換されたシステイン残基とジスルフィド結合を形成するタンパク質中のシステイン残基）は残る。好ましくは、システインと置換するアミノ酸は、セリンまたはアラニンなどの中性アミノ酸である。
【００４０】
組換えＤＮＡ技術を用いたインビトロでの突然変異誘発を通じて、追加のシステイン残基をタンパク質上の任意の有用な位置に導入することができる。次に、新たに付加された「遊離の」システインは、システイン反応性ＰＥＧを用いたＰＥＧ分子の特異的結合のための部位として機能することができる。付加されたシステイン残基は、タンパク質中の既存のアミノ酸の置換である。システイン残基は、タンパク質のカルボキシ末端の後に、タンパク質のアミノ末端の前に付加されまたはタンパク質中の２つのアミノ酸の間に挿入され得る。用語「突然変異ＴＳＨ」とは、本明細書で使用するとき、野生型ＴＳＨの１つまたはそれ以上のアミノ酸が、ＴＳＨ分子上の１つまたはそれ以上のグリコシル化部位の形成を可能にする別のアミノ酸で置換されているＴＳＨを指す。従って、ＴＳＨのアミノ酸置換は、ポリアルキレングリコールなどの少なくとも１つのポリマーの部位特異的カップリングを可能にする。例えば、突然変異ＴＳＨへのＰＥＧ分子を用いた部位特異的カップリングは、ポリエチレン−グリコシル化されたＴＳＨの薬力学的および薬物動態学的な利点を有するＴＳＨの生成を可能にする。
【００４１】
特定の実施形態において、システインによるアミノ酸置換は、表１および２における突然変異体について示されている位置で行うことができる。
【００４２】
好ましい実施形態において、置換は、天然のＴＳＨの構造的特徴を実質的に変化させない。ある特定の実施形態において、システインで置換されているアミノ酸残基は、ＴＳＨのアルファサブユニットまたはベータサブユニット上に位置している。特定の実施形態において、システインで置換されているアミノ酸残基は、ＡＳＮ５２、ＡＳＮ７８、ＭＥＴ７１、ＡＳＮ６６、ＴＨＲ６９およびＧＬＹ２２、ならびにこれらの組合せからなる群から選択される組換えヒトＴＳＨのアルファサブユニット上のアミノ酸位に位置し、またはＡＳＮ２３、ＶＡＬ１１８、ＴＨＲ２１、ＧＬＵ６３およびＡＳＰ５６、ならびにこれらの組合せからなる群から選択される組換えヒトＴＳＨのベータサブユニット上のアミノ酸位に位置している。
【００４３】
本明細書に記載されているＴＳＨ組成物は生物学的に活性である。「生物学的に活性な」とは、本発明のＴＳＨ組成物が以下の効果：より長い作用持続時間、半減期の延長、Ｔ４放出の持続時間の増大、より高いＡＵＥＣ、Ｔｍａｘの正シフトおよび副作用を減少させ得る、より低い最高最低間の露出、のうち１つまたはそれ以上を有することを意味する。ある特定の実施形態において、組成物は、対照と比較され、効果は、実質的に同様である、幾分小さいもしくは幾分大きいまたは実質的に大きい。本発明に従って生成されるＴＳＨ組成物の生物学的活性は、当業者に公知の様々な技術を用いて評価することができる。
【００４４】
本発明のＴＳＨ組成物の生物学的活性を評価する場合、生物学的活性は、対照と比較され得る。当業者によって理解されるように、様々な好適な対照を用いることができる。一実施形態において、「対照」とは、本明細書で使用するとき、天然（野生型）のＴＳＨまたはｒｈＴＳＨを指す。
【００４５】
本発明の組成物は、それを必要とする患者（例えば、ほぼ全体のまたは全体の甲状腺摘出術が行われた甲状腺癌患者）に投与された場合、指示された使用のために適合されているＴＳＨの血清濃度を提供する。ある特定の実施形態において、本明細書に記載されている組成物の作用持続時間は、ｒｈＴＳＨと比較して少なくとも２倍に増加する。別の実施形態において、ＴＳＨ組成物の作用持続時間は、ｒｈＴＳＨと比較して少なくとも３倍に増加する。作用持続時間が増大したこのような実施形態は、ｒｈＴＳＨの現在の製剤に匹敵する効能を維持しながら、投与頻度を効果的に減少させる。
【００４６】
一実施形態において、組成物は、ｒｈＴＳＨと比較して、より長い半減期（ｔ１／２）を提供する。特定の実施形態において、ｔ１／２は、ラットにおいて、ｒｈＴＳＨと比較して最大２３倍長い。
【００４７】
別の実施形態において、Ｔ４レベルは、ｒｈＴＳＨと比較して、より大きな持続効果を有することが示される。ラットにおいて、ｒｈＴＳＨ群におけるＴ４レベルは、投薬後４８時間までにビヒクルレベルに戻った一方、一実施形態において、Ｔ４は、投薬後１６８時間持続した。
【００４８】
「有効Ｔｍａｘ」とは、本明細書で使用するとき、参照する組成物に特徴的である「ピーク高濃度の時間」を指す。「有効Ｃｍａｘ」とは、本明細書で使用するとき、参照する組成物に特徴的である「ピーク高濃度」を指す。多くの状況において、有効ＴｍａｘおよびＣｍａｘは、薬物の濃度が治療範囲にある血液（または血清もしくは血漿）濃度時間曲線を提供する。「ｔ１／２」とは、薬物の作用持続時間が知られ、体内での該薬物の濃度または量が２分の１に減少するのに必要とされる時間を指す。
【００４９】
ヒトＴＳＨのアルファサブユニットの核酸配列は
ｇｃｔｃｃｔｇａｔｇｔｇｃａｇｇａｔｔｇｃｃｃａｇａａｔｇｃａｃｇｃｔａｃａｇｇａａａａｃｃｃａｔｔｃｔｔｃｔｃｃｃａｇｃｃｇｇｇｔｇｃｃｃｃａａｔａｃｔｔｃａｇｔｇｃａｔｇｇｇｃｔｇｃｔｇｃｔｔｃｔｃｔａｇａｇｃａｔａｔｃｃｃａｃｔｃｃａｃｔａａｇｇｔｃｃａａｇａａｇａｃｇａｔｇｔｔｇｇｔｃｃａａａａｇａａｃｇｔｃａｃｃｔｃａｇａｇｔｃｃａｃｔｔｇｃｔｇｔｇｔａｇｃｔａａａｔｃａｔａｔａａｃａｇｇｇｔｃａｃａｇｔａａｔｇｇｇｇｇｇｔｔｔｃａａａｇｔｇｇａｇａａｃｃａｃａｃｇｇｃｇｔｇｃｃａｃｔｇｃａｇｔａｃｔｔｇｔｔａｔｔａｔｃａｃａａａｔｃｔ（配列番号１）
である。
【００５０】
ヒトＴＳＨのアルファサブユニットのアミノ酸配列は
ＡＰＤＶＱＤＣＰＥＣＴＬＱＥＮＰＦＦＳＱＰＧＡＰＩＬＱＣＭＧＣＣＦＳＲＡＹＰＴＰＬＲＳＫＫＴＭＬＶＱＫＮＶＴＳＥＳＴＣＣＶＡＫＳＹＮＲＶＴＶＭＧＧＦＫＶＥＮＨＴＡＣＨＣＳＴＣＹＹＨＫＳ（配列番号２）
である。
【００５１】
ヒトＴＳＨのベータサブユニットの核酸配列は
ｔｔｔｔｇｔａｔｔｃｃａａｃｔｇａｇｔａｔａｃａａｔｇｃａｃａｔｃｇａａａｇｇａｇａｇａｇｔｇｔｇｃｔｔａｔｔｇｃｃｔａａｃｃａｔｃａａｃａｃｃａｃｃａｔｃｔｇｔｇｃｔｇｇａｔａｔｔｇｔａｔｇａｃａｃｇｇｇａｔａｔｃａａｔｇｇｃａａａｃｔｇｔｔｔｃｔｔｃｃｃａａａｔａｔｇｃｔｃｔｇｔｃｃｃａｇｇａｔｇｔｔｔｇｃａｃａｔａｔａｇａｇａｃｔｔｃａｔｃｔａｃａｇｇａｃｔｇｔａｇａａａｔａｃｃａｇｇａｔｇｃｃｃａｃｔｃｃａｔｇｔｔｇｃｔｃｃｃｔａｔｔｔｔｔｃｃｔａｔｃｃｔｇｔｔｇｃｔｔｔａａｇｃｔｇｔａａｇｔｇｔｇｇｃａａｇｔｇｃａａｔａｃｔｇａｃｔａｔａｇｔｇａｃｔｇｃａｔａｃａｔｇａａｇｃｃａｔｃａａｇａｃａａａｃｔａｃｔｇｔａｃｃａａａｃｃｔｃａｇａａｇｔｃｔｔａｔｃｔｇｇｔａｇｇａｔｔｔｔｃｔｇｔｃ（配列番号３）
である。
【００５２】
ヒトＴＳＨのベータサブユニットのアミノ酸配列は
ＦＣＩＰＴＥＹＴＭＨＩＥＲＲＥＣＡＹＣＬＴＩＮＴＴＩＣＡＧＹＣＭＴＲＤＩＮＧＫＬＦＬＰＫＹＡＬＳＱＤＶＣＴＹＲＤＦＩＹＲＴＶＥＩＰＧＣＰＬＨＶＡＰＹＦＳＹＰＶＡＬＳＣＫＣＧＫＣＮＴＤＹＳＤＣＩＨＥＡＩＫＴＮＹＣＴＫＰＱＫＳＹＬＶＧＦＳＶ（配列番号４）
である。
【００５３】
本明細書において使用するとき、用語「ＴＳＨのサブユニットのアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基」は、配列を整列させたとき、野生型ＴＳＨサブユニット（配列番号２および４）の配列に対応するアミノ酸残基を示すことを意図している。アミノ酸配列の相同性／同一性は、配列整列のための好適なコンピュータプログラム、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷプログラム、バージョン１．８、１９９９年（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２：４６７３〜４６８０）などを用いて、整列された配列から好都合に決定される。
【００５４】
〔実施例１〕
ｒｈＴＳＨのシアル酸媒介（ＳＡＭ）ＰＥＧ化
過ヨウ素酸ナトリウム酸化：１００ｍＭ酢酸ナトリウム中の２５ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、３１１４４８）（ｐＨ５．６）を、アルミホイルで包んだガラスバイアル中で、最終濃度が０．２ｍＭから２ｍＭの範囲になるように１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．６）中の４．５ｍｇ／ｍｌのＴＳＨに添加した。暗所にて３０分間、混合物を氷上で穏やかに振とうした。３０分後、３％の反応体積に５０％グリセロールを添加し、次に、１５分間振とうした。次に、混合物を１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．６）に緩衝液交換し、ＰＥＧ化を行うために、少なくとも４．３ｍｇ／ｍｌのＴＳＨ濃度に濃縮した。
【００５５】
ＰＥＧ化：適切なサイズのアミノキシＰＥＧ（ｄＨ２Ｏ中の１００ｍｇ／ｍｌ）を様々な（ＰＥＧ：タンパク質）モル比に酸化したＴＳＨに添加した。４ｍｇ／ｍｌの最終ＴＳＨ濃度になるように、１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．６）を用いて反応体積を調整した。次に、穏やかに振とうしながら、２５℃にて１６時間または８℃にて１６時間、混合物をインキュベートした。インキュベーション後、５０モル過剰の０．０５Ｍヒドロキシルアミンを添加して、反応ミックスをクエンチし、穏やかに振とうしながら、２５℃にて６時間インキュベートした。
【００５６】
〔実施例２〕
ガラクトース媒介（ＧＡＭ（＋））脱シアル化されたｒｈＴＳＨのＰＥＧ化
ノイラミニダーゼ処理：２０ｍＵノイラミニダーゼ（Ｈｉｓ６−クロストリジウムノイラミニダーゼ（５２０ｍＵ／ｕｌ））を１ｍｇのＴＳＨあたり添加し、３７℃にて６時間インキュベートした。
【００５７】
カタラーゼ／ガラクトースオキシダーゼ処理：１ｍｇのＴＳＨあたり２Ｕのカタラーゼ（Ｓｉｇｍａ  ４４２Ｕ／μｌ）をノイラミニダーゼ処理されたＴＳＨに添加した。１ｍｇのＴＳＨあたり４μｇのガラクトースオキシダーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  ＧＡＯ、１．２ｍｇ／ｍｌ）を混合物に添加し、次に３７℃にて１６時間インキュベートした。インキュベーション後、混合物を緩衝液交換し、ＰＥＧ化を行うために、少なくとも５．５ｍｇ／ｍｌの濃度に、１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．６）中に濃縮した。
【００５８】
ＰＥＧ化：適切なサイズのアミノキシＰＥＧ（ｄＨ２Ｏ中の１００ｍｇ／ｍｌ）を１：１の（ＰＥＧ：タンパク質）モル比に酸化し、緩衝液交換したＴＳＨに添加した。反応物中の最終ＴＳＨ濃度が５ｍｇ／ｍｌになるように、１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．６）を用いて反応体積を調整した。次に、穏やかに振とうしながら、２５℃にて１６時間、混合物をインキュベートした。次に、５０モル過剰の０．０５Ｍヒドロキシルアミン（分子量６９．４９）を反応ミックスに添加し、穏やかに振とうしながら、２５℃にて６時間インキュベートした。
【００５９】
〔実施例３〕
ガラクトース媒介（ＧＡＭ（−））ｒｈＴＳＨのＰＥＧ化
カタラーゼ／ガラクトースオキシダーゼ処理：１ｍｇあたり２Ｕのカタラーゼ（Ｓｉｇｍａ  ４４２Ｕ／μｌ）および１ｍｇあたり４μｇのガラクトースオキシダーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  ＧＡＯ、１．２ｍｇ／ｍｌ）をＴＳＨに添加した。次に、混合物は、３７℃にて１６時間インキュベートした。インキュベーション後、混合物を緩衝液交換し、ＰＥＧ化を行うために、少なくとも５．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度に、１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．６）中に濃縮した。
【００６０】
ＰＥＧ化：適切なサイズのアミノキシＰＥＧ（ｄＨ２Ｏ中の１００ｍｇ／ｍｌ）を１：２の（ＰＥＧ：タンパク質）モル比に酸化し、緩衝液交換したＴＳＨに添加した。反応物中の最終ＴＳＨ濃度が５ｍｇ／ｍｌになるように、１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．６）を用いて反応体積を調整した。次に、穏やかに振とうしながら、２５℃にて１６時間、混合物をインキュベートした。次に、５０モル過剰の０．０５Ｍヒドロキシルアミン（分子量６９．４９）を反応ミックスに添加し、穏やかに振とうしながら、２５℃にて６時間インキュベートした。
【００６１】
〔実施例４〕
ｒｈＴＳＨのＮ末端ＰＥＧ化
２０ｍＭのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを含む１００ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５またはｐＨ５．６）中で、様々な（ＰＥＧ：タンパク質）比で、最終濃度が５ｍｇ／ｍｌであるｒｈＴＳＨに適切なサイズのアルデヒドＰＥＧ（反応緩衝液中の１００ｍｇ／ｍｌ）を添加した。２５℃にて１６時間または８℃にて最大２日間インキュベーションを行い、その後、０．１体積の１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）を用いて３時間２５℃にて反応をクエンチした。
【００６２】
Ｎ末端のＰＥＧ化により、糖質コンジュゲーションよりも大きなＴＳＨ受容体結合親和性を喪失したコンジュゲートを得た。４０ｋＤのＰＥＧを有するＮ末端モノＰＥＧ化は、ｒｈＴＳＨ対照と比較して、インビトロでのＴＳＨ受容体結合親和性を１１．１倍減少させた。
【００６３】
〔実施例５〕
ｒｈＴＳＨのリジンＰＥＧ化
ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）緩衝液（ｐＨ７．２）中で、様々な（ＰＥＧ：タンパク質）比（例えば、（０．５：１）、（１：１）、（２：１）、（４：１）、（８：１））で、最終濃度が０．８ｍｇ／ｍｌであるｒｈＴＳＨに適切なサイズのＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）ＰＥＧ（ｄＨ２Ｏ中の５０ｍｇ／ｍｌ）を添加した。インキュベーションは、２５℃にて１．５時間行った。
【００６４】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）ＰＥＧとのリジンコンジュゲーションを調査した。４０ｋＤａのＰＥＧについて、種々の（ＰＥＧ：タンパク質）比および種々のインキュベーション時間をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）緩衝液（ｐＨ７．２）中で試験した。最終ＴＳＨ濃度は、１ｍｌあたり０．８ｍｇであった。ＰＥＧ化は、２５℃または３７℃にて１．５時間または１９．５時間、行われた。試験された短いインキュベーション時間（１．５時間）は、長いインキュベーション時間（１９．５時間）と同じ結果を示した。これは、水溶液中でのＮＨＳ  ＰＥＧの急速な加水分解によるものと考えられた。ＰＥＧ化の程度は、（ＰＥＧ：タンパク質）モル比に依存し、より高いＰＥＧモル過剰がより多くのマルチＰＥＧ化されたコンジュゲートを生成させた。
【００６５】
モノＰＥＧ化種のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）画分を回収し、インビトロＴＳＨ受容体結合アッセイに供した。インビトロＴＳＨ受容体結合アッセイの結果は、モノ４０ｋＤａのＮＨＳ  ＰＥＧ−ＴＳＨ（リジンＰＥＧ化）が、出発物質である対照ＴＳＨと比較して３１．２倍低い親和性を有し、一方、モノ４０ｋＤａアミノキシＰＥＧ−ＴＳＨ（ＳＡＭ  ＰＥＧ化）が５．３倍低い親和性を有することを示した。
【００６６】
〔実施例６〕
部位特異的コンジュゲーションのためのシステイン突然変異体の生成
ＴＳＨ単一突然変異体を設計および調製し、部位特異的ＰＥＧ化のためにシステインを導入した。これらの突然変異体は、タンパク質の折り畳み、受容体結合における効果を最小限にするように、また効果的にコンジュゲートされるそれらの可能性について設計された。
【００６７】
以下の検討事項は、ＴＳＨ／ＴＳＨ受容体の構造モデルに基づいて、システイン突然変異体を導入する部位を設計するために適用された：１）突然変異部位は、受容体結合部位に位置または隣接すべきではない；２）突然変異部位は、アルファ／ベータサブユニットの二量体化界面に位置または隣接すべきではない；３）突然変異部位は、ジスルフィド結合に位置または隣接すべきではない；４）突然変異した場合、報告されている文献に基づいて、比活性の劇的な喪失をもたらす部位を避ける；５）突然変異部位は、その後のＰＥＧ化のために溶媒に曝露されるべきである；６）それぞれの領域でのＰＥＧ化の実行可能性を十分に評価するために、受容体結合部位と反対側のＴＳＨ表面の大部分を均等に覆う部位を選択する。これらの検討事項のいくつかを表１にまとめる。選択された突然変異体のベータ−炭素位置は、図４に示されるように、本発明者らの構造モデルにおいて溶媒に曝露された。これは、システインに突然変異した場合、これらの位置が、ＰＥＧ化試薬に接近可能である可能性があることを予測する。表１に選択された最初の３つの部位は、ＴＳＨにおける天然のグリコシル化部位であった。
【００６８】
【表１】
2015502363.tif 000003
【００６９】
ｒｈＴＳＨ遺伝子をコードするＤＮＡ（そのシグナルペプチドを含む）を合成し、Ｇａｔｅｗａｙエントリーベクター（例えば、ｐＤＯＮＯＲ２２１）にクローニングした。オリゴヌクレオチドに基づく部位特異的突然変異誘発は、両方のＴＳＨサブユニット上の複数の部位でＣｙｓ突然変異を導入するために使用された。得られた野生型および突然変異ベクターは、Ｇａｔｅｗａｙクローニングを介した発現ベクター（例えば、ｐＣＥＰ４．ＤＥＳＴ）中にシャッフルされた。タンパク質は、一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の培地から調製され、生化学的アッセイおよび細胞ベースアッセイ、例えば、ゲル電気泳動、ウェスタンブロッティング、ＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラフィー、ＰＥＧ修飾収量および細胞受容体アッセイによって特徴付けられた。
【００７０】
結果が評価され、ＴＳＨ機能に対して、発現レベル、凝集（二量体化）傾向、ＰＥＧ化の効能および摂動について比較された。例えば、精製された突然変異ＴＳＨの銀染色分析により、突然変異体ＴＳＨ  Ｎ６６Ｃ（アルファ）、ＴＳＨ  Ｇ２２Ｃ（アルファ）、ＴＳＨ  Ｍ７１Ｃ（アルファ）、ＴＳＨ  Ｔ６９Ｃ（アルファ）およびＴＳＨ  Ｖ１１８Ｃ（ベータ）が最良の発現レベルを有することが明らかになった（図５を参照されたい）。ＰＥＧ化実験は、ＴＳＨ  Ｇ２２Ｃ（アルファ）、ＴＳＨ  Ｎ６６Ｃ（アルファ）、ＴＳＨ  Ｔ６９Ｃ（アルファ）およびＴＳＨ  Ｖ１１８Ｃ（ベータ）が効果的にＰＥＧ化されることを示唆した（典型的なＰＥＧ化結果について、図６を参照されたい）。Ｍ７１Ｃ（アルファ）は、ＰＥＧ化インキュベーション中に凝集体を形成するように見えた。（データ示さず）。大規模生成およびインビボ研究に向けて、選択された突然変異体（例えば、Ｇ２２Ｃ）を移動させるように決定された（表２を参照されたい）。
【００７１】
【表２】
2015502363.tif 000004
【００７２】
大規模Ｃｙｓ突然変異体をＣＨＯプールから調製した。野生型（ＷＴ）および突然変異ｒｈＴＳＨ遺伝子をコードするＤＮＡは、コドン最適化され、合成された。これらの遺伝子は、ＣＨＯ細胞に一過性トランスフェクションを行うために、ＣＨＯ発現ベクター（例えば、ｐＧＥＮ６００、ｐＧＥＮ６２０）にクローニングされた。メトトレキサート（ＭＴＸ）選択を用いて、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞を増幅した。得られたＣＨＯプールは、拡大されたタンパク質生成のために使用された。
【００７３】
システインＴＳＨ突然変異体は、発現および精製後に導入されたシステインでキャップされることが見出され、従って、追加の還元方法が、ＰＥＧ化された突然変異ＴＳＨを作成するために必要とされた。突然変異ＴＳＨは、最初に、タンパク質を不活性化する天然のジスルフィド結合を不可逆的に破壊することなしに、導入されたシステインからキャップを放出させるために穏やかな還元剤で還元される必要があった。
【００７４】
従って、複数の方法が、キャップされたシステインを還元する目的で採用された。例えば、様々な濃度のＴＣＥＰ（Ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィンＨＣｌ）溶液が、還元のためにｒｈＴＳＨ突然変異体とともにインキュベートされた。システインキャップの除去は、この方法を用いて効果的であったが、一方、後の非特異的ＰＥＧ化をもたらした他のジスルフィド結合のいくつかの還元があるようにも見えた。ＴＣＥＰとともに固定化されたビーズを用いた別の還元方法がｒｈＴＳＨの還元により穏やかであるように見えたが、しかしながら、この方法はまたジスルフィド還元の幾分低いレベルをもたらした。本発明者らは、１〜１０ｍＭのシステイン（還元剤として）が、ｒｈＴＳＨにおいて既存のジスルフィド結合を破壊することなしに、キャップされたＣｙｓを還元するために特に効果的であることを見出した。
【００７５】
システイン還元剤は、ジスルフィドを再形成させるためにキャップと一緒に除去された。次に、「脱キャップ化された」導入されたシステインは、システイン反応性ＰＥＧ試薬に選択的にコンジュゲートされた。この方法は、他のタンパク質、例えば、ＦＶＩＩＩ（Ｍｅｉら、Ｂｌｏｏｄ  １１６：２７０〜９（２０１０年））および抗体断片（Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １６：７６１〜７７０（２００３年））において実証されているが、しかしながら、システインノット含有タンパク質においてこれを試みた報告は知られていない。以前に報告された例は、ほんの１〜２％のシステイン含量を有したが、ＴＳＨは１１％のシステイン含量を有し（２３／２１０アミノ酸）、これは、天然のジスルフィドをスクランブルすることなしに（従って、受容体結合親和性を劇的に低下させることなしに）、ＴＳＨへの２４番目のシステインの導入を特に困難にさせる。その結果、本発明者らは、システイン突然変異を導入するために複数の位置をスクリーニングしなければならず、ほんの少数がＰＥＧに首尾よくコンジュゲートすることができた。
【００７６】
部位特異的なＣｙｓ  ＰＥＧ化：部位特異的なＰＥＧ化のために、Ｇ２２Ｃ  ｒｈＴＳＨをＣＨＯ細胞から生成した。システインをＧ２２Ｃ  ｒｈＴＳＨ（１〜２ｍｇ／ｍｌ）に添加し、図８に示される最適化実験後に最終濃度を２ｍＭとした。タンパク質を一晩４℃にてインキュベートし、Ｃｙｓ２２上のキャップを除去した。混合物をＰＥＧ化緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）に透析ろ過した。５倍モル過剰量を得るためにタンパク質にＰＥＧを添加し、２５℃にて２時間インキュベートした。ＰＥＧ化は、２倍システインを用いて停止させ、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって収量を確かめた。作用混合物のｐＨをｐＨ５．０に下げ、次に、精製のためにｍｏｎｏＳカラムに装填した。
【００７７】
いくつかのＰＥＧ化反応のＳＥＣ−ＨＰＬＣプロファイルを図８に示す。約７５％のモノＰＥＧ化されたＧ２２Ｃ  ＴＳＨを得、これは、非常に効果的なコンジュゲーションである。Ｇ２２Ｃのサブユニットおよび部位特異的コンジュゲーションの確認を図９Ａ〜図９Ｂに示す。
【００７８】
〔実施例７〕
ＰＥＧ化されたｒｈＴＳＨのｍｏｎｏＳ  ＡＫＴＡ精製
ｍｏｎｏＳカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で試料を精製し、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）および１０ｍＭの酢酸ナトリウム、１Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ５）による勾配を用いて、流速４ｍｌ／分にて溶出させた。勾配は、０％移動相Ｂ（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ５））で開始し、次に、２５カラム体積にわたって５０％移動相Ｂに増大させ、続いて、１００％移動相Ｂにしてカラムを洗浄した。
【００７９】
〔実施例８〕
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析および染色
予め注いだ勾配ゲル（４〜１２％Ｂｉｓ  Ｔｒｉｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に４〜５μｇのＴＳＨを装填した。ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）泳動緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を調製した。電気泳動装置を、氷を入れた氷のバケツに設置した。ゲルは、約５０分間、２００Ｖで泳動され、次に、蒸留水で３回、それぞれ５分間濯がれた。５０ｍｌの５％塩化バリウムをゲルに添加し、次に、１０分間振とうした。塩化バリウムは、蒸留水で５分間、ゲルを濯ぐことによって除去された。次に、蒸留水を除去し、バンドが視認できるまで、最初に、１×ヨウ化カリウム／ヨウ素溶液でＰＥＧについてゲルを染色した。次に、ゲルを蒸留水で脱色し、すぐにスキャンした。タンパク質染色について、クマシー脱色（１０％酢酸、２０％メタノール）を用いて、ＰＥＧ染色の全ての痕跡を除き、次に、ゲルをクマシーブルー染色で染色した。精製された糖質ＰＥＧ化されたｒｈＴＳＨコンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を図１０Ｃ（ＰＥＧ染色）および図１０Ｄ（クマシー染色）に示す。
【００８０】
〔実施例９〕
ＰＥＧ化されたｒｈＴＳＨのＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析
試料をＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で泳動し、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）中で、流速０．４ｍｌ／分にて溶出させた。４０ｋＤのＳＡＭ反応物と精製されたＰＥＧ化されたｒｈＴＳＨコンジュゲートの典型的なＳＥＣ−ＨＰＬＣプロファイルをそれぞれ図１１Ａおよび図１１Ｂに示す。
【００８１】
〔実施例１０〕
ＰＥＧ化されたｒｈＴＳＨのペプチドマッピングとＮ末端配列決定
２０μｇの試料それぞれは、窒素で重層された、６Ｍ塩酸グアニジンと３８ｍＭジチオスレイトールを含有する０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）中に希釈され、２５℃にて一晩インキュベートされた。インキュベーション後、ヨードアセトアミドを５０ｍＭで添加した。次に、窒素を試料に重層し、２５℃にて２時間インキュベートした。アルキル化反応は、１／１（ｖ／ｖ）の０．２５％トリフルオロ酢酸を添加することによってクエンチされ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）中に、３，５００ＭＷＣＯ  Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒミニ透析ユニット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて試料を透析した。試料は、１：２５（酵素：試料）の比で３７℃にて一晩消化された。消化反応物は、１／１（ｖ／ｖ）の０．２５％トリフルオロ酢酸を用いてクエンチされた。トリプシン消化された試料は、自動化されたインジェクターと画分コレクター、バイナリー溶媒ポンプ、サーモスタット付きカラムコンパートメント、および可変波長検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣを用いて分画された。試料は、５０℃に保持されたＰｏｒｏｓｈｅｌｌ  ３００ＳＢ−Ｃ８カラム（２．１×７５ｍｍ、５μｍ粒子、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡ）に装填され、９８％溶媒Ａ（水中の０．１％トリフルオロ酢酸）および２％溶媒Ｂ（アセトニトリル中の０．０８％トリフルオロ酢酸）中で予め平衡化された。トリプシンペプチドは、流速０．４ｍｌ／分にて、２５分間かけて、２％から６０％の溶媒Ｂの直線勾配を用いて溶出させた。ＰＥＧ化された断片は、ＰＥＧ化されていない断片よりも大きな％Ｂで溶出し、回収され、遠心濃縮器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ）中で乾燥させた。自動化されたＮ末端配列分析は、Ｐｒｏｃｉｓｅプロテインシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡ）を用いて行われた。２００ｐｍｏｌの試料と対照は、予めプログラムされたパルス液体法を用いて、自動化された１８回のＥｄｍａｎ分解に供された。図１２は、４０ｋＤのＳＡＭコンジュゲートのペプチドマップとＮ末端配列決定の結果を示す。たった３つのトリプシン糖ペプチド（ＡＴ９、ＡＴ６、ＢＴ３）が検出され、糖質ＰＥＧ化の部位特異性を示した。下線のＮは、Ｎ連結型グリコシル化部位に対応する。
【００８２】
〔実施例１１〕
それぞれのサブユニットにおけるＰＥＧ化の相対量の決定
サブユニット特異的なＰＥＧ化は、２つの連続した逆相ＨＰＬＣ稼働を用いて、ＰＥＧ化されたサブユニットからＰＥＧ化されていないαおよびβサブユニットを単離した後、それらの相対量を測定することによって計算された。ＰＥＧ化されたαおよびβサブユニットを分離するクロマトグラフィー条件を同定することができなかったため、この推定法を用いた。遠心限外ろ過によって試料（１００μｇ）を２０μｌに濃縮し、次に、６Ｍ塩酸グアニジン、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中で変性させた。２５℃にて一晩インキュベートした後、７５％溶媒Ａ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５）および２５％溶媒Ｂ（４０％の１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５、６０％アセトニトリル）を用いて予め平衡化されたＰｏｒｏｓｈｅｌｌ  ３００ＳＢ−Ｃ８カラム（２．１×７５ｍｍ、５μｍ粒子、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡ）に試料を装填した。５分間の２５〜５０％Ｂ、続く２０分間の５０〜７５％Ｂを用いて、０．４ｍｌ／分、２５℃にてカラムを溶出した。ＰＥＧ化されていないＴＳＨサブユニットに対応するピーク画分（約９．５〜１２．５分）は、その全体で回収され（図１３Ｂ）、遠心限外ろ過によって５０μｌ未満に濃縮された。水を用いて試料を５０μｌに調整し、次に、４．７μｌの２Ｍジチオスレイトールおよび１５０μｌの６Ｍ塩酸グアニジン、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）の添加によって還元し、窒素で重層し、２５℃にて一晩インキュベートした。次に、遊離したチオールは、９．３μｌの２Ｍヨードアセトアミドを添加し、窒素を重層し、２時間２５℃にてインキュベートすることによってアルキル化された。アルキル化反応は、１５０μｌの０．２５％トリフルオロ酢酸を添加することによってクエンチされた。還元およびアルキル化されたＰＥＧ化されていないＴＳＨサブユニットは、第２の逆相ＨＰＬＣ稼働によってプロファイリングされた。ＨＰＬＣカラムのセットアップは、水中の０．１％トリフルオロ酢酸からなる溶媒Ａとアセトニトリル中の０．０８％トリフルオロ酢酸からなる溶媒Ｂおよびカラムが５０℃に保持されることを除いて、上記に指示されたものと同一であった。カラムは、０．３ｍｌ／分で１５分間、２〜７５％Ｂの直線勾配により溶出された。ＰＥＧ化されていないα対βサブユニットの相対的割合は、試料あたり、三重の注入からの得られたＡ２１４ｎｍのクロマトグラム（図１３Ｃ）の積分により決定された。次に、ＰＥＧ化されたα対βサブユニットの相対的割合は、これらの値の逆数とした。この分析は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１３Ａ）によって得られた結果と一致して、４０ｋＤのモノＰＥＧ化されたＧＡＭ−、ＧＡＭ＋およびＳＡＭコンジュゲートにおいて修飾されたαサブユニットの画分がそれぞれ７７％、６６％および５８％であることを示した。
【００８３】
〔実施例１２〕
インビトロ受容体結合アッセイ
精製された、ＰＥＧ化されたコンジュゲートは、ＲＳＲ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｋｒｏｎｕｓ、Ｓｔａｒ、ＩＤ）のＴＳＨ受容体自己抗体の第２世代ＥＬＩＳＡキットを用いたインビトロでのブタＴＳＨ受容体結合アッセイによって分析された。キットが提供するＴＳＨ受容体に対するビオチン化ヒトモノクローナル自己抗体を用いる代わり、本発明者らは、ＴＳＨ受容体への競合結合阻害に使用するために、Ｔｈｙｒｏｇｅｎ（登録商標）（ｒｈＴＳＨ）をビオチン化した。固定化されたブタＴＳＨ受容体へのビオチン化ｒｈＴＳＨの結合は、ｒｈＴＳＨ対照またはＰＥＧ化されたｒｈＴＳＨコンジュゲートのいずれかによって阻害され、ＩＣ５０値を測定した。
【００８４】
製造業者のプロトコール（ＱＥＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に従って、ＣｈｒｏｍａＬｉｎｋ（商標）ビオチン標識試薬を用いて、タンパク質あたり１．７から１．８個のビオチンでＴｈｙｒｏｇｅｎ（登録商標）をビオチン化し、Ｚｅｂａ（商標）脱塩スピンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）に緩衝液交換した。受容体結合のインビトロ測定は、ＲＳＲ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｋｒｏｎｕｓ、Ｓｔａｒ、ＩＤ）のＴＳＨ受容体自己抗体の第２世代ＥＬＩＳＡキットが補足された９６ウェルプレート上に固定化されたブタＴＳＨ受容体への結合について、ビオチン化されたＴｈｙｒｏｇｅｎ（登録商標）とＰＥＧ−ｒｈＴＳＨコンジュゲートの競合によって実施された。ＰＥＧ−ｒｈＴＳＨコンジュゲートは、アッセイ緩衝液（１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭのＥＤＴＡ、１％ＢＳＡ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中で１６μＭから４１ｐＭまで連続して１：５に希釈され、アッセイ緩衝液中で１０００倍に希釈したビオチン化されたＴｈｙｒｏｇｅｎ（登録商標）と１：１に混合された。受容体で被覆されたウェルのそれぞれに混合物を添加し、２５℃にて２５分間インキュベートした。未結合のｒｈＴＳＨを洗い流し、ＲＳＲ  Ｌｉｍｉｔｅｄ  ＥＬＩＳＡプロトコールに従って、２５℃にて２０分間、ストレプトアビジンペルオキシダーゼを添加し、プレートに結合したビオチン化されたＴｈｙｒｏｇｅｎ（登録商標）の量を決定した。次に、プレートを３回洗浄し、過剰の未結合のストレプトアビジンペルオキシダーゼを除去し、次に、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）をそれぞれのウェルに添加し、２５℃にて３０分間、暗所でインキュベートした。０．５Ｍの硫酸停止緩衝液を用いて反応をクエンチし、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）３４０ｐｃプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて、それぞれのウェルの吸光度を４５０ｎｍで読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄプリズムソフトウェアにより、データをシグモイド用量応答式を用いてフィットさせ、ＩＣ５０値を生じさ
せた。
【００８５】
Ｎ末端とリジンのＰＥＧ化により、糖質コンジュゲーションよりも低いＴＳＨ受容体親和性を有するコンジュゲートを得た。４０ｋＤのＰＥＧを有するＮ末端モノＰＥＧ化は、ＴＳＨ対照と比較して、１０．８倍低い受容体結合親和性をもたらした。４０ｋＤのＰＥＧを有するリジンＰＥＧ化は、ＴＳＨ対照と比較して、３１．２倍低い受容体結合親和性をもたらした。対照的に、ＧＡＭ＋モノＰＥＧ化は、２０ｋＤのＰＥＧコンジュゲーションについて２．２倍低い受容体結合親和性と４０ｋＤのＰＥＧコンジュゲーションについて３．６倍低い受容体結合親和性をもたらした。また、ＳＡＭモノＰＥＧ化は、コンジュゲートされたＰＥＧのサイズに依存して、２．１から５．３倍の減少幅で、Ｎ末端ＰＥＧ化と比較して、インビトロＴＳＨ受容体結合親和性の緩やかな減少をもたらした。ＧＡＭ（−）モノＰＥＧ化は、全ての糖質ＰＥＧ化戦略の中で最大の喪失を引き起こし、インビトロＴＳＨ受容体結合親和性において、２０ｋＤのＰＥＧコンジュゲーションは２．７倍の減少を引き起こし、４０ｋＤのＰＥＧコンジュゲーションは８．０倍の減少を引き起こした。（表３ａと３ｂおよび図１４を参照されたい）。
【００８６】
【表３】
2015502363.tif 000005
【００８７】
〔実施例１３〕
単回筋内（ＩＭ）注射後の雄性および雌性Ｓｐｒａｇｕｅ  ＤａｗｌｅｙラットにおけるＰＥＧ化されたｒｈＴＳＨの薬物動態学的および薬力学的分析
ｒｈＴＳＨおよびＰＥＧ化されたｒｈＴＳＨ（２０ｋＤのＳＡＭ、２０ｋＤのＧＡＭ（−）、２０ｋＤのＧＡＭ（＋）、４０ｋＤのＧＡＭ（＋））の薬物動態について、単回筋内（ＩＭ）注射後の雄性および雌性ラットにおいて評価した。
【００８８】
頸静脈にカニューレ挿入された絶食の雄性および雌性ラットに、ｒｈＴＳＨまたはＰＥＧ化されたｒｈＴＳＨ（２０ｋＤのＳＡＭ、２０ｋＤのＧＡＭ（−）、２０ｋＤのＧＡＭ（＋）、４０ｋＤのＧＡＭ（＋））の単回用量を０．５ｍｇ／ｋｇの用量でＩＭ投与した。投薬体積の制限のため、動物は、大腿四頭筋に２回または３回の筋内注射の形態で試験物を受けた。脚は、投薬に対して交互に行った。投薬前ならびに投与後の以下の時間点：０．５、１、２、４、８、２４および４８時間にて動物から血液試料を回収した。試験物投与の前の晩に、動物のケージから餌を取り除いた。動物は、この期間中に水に近づけた。投薬前の試料回収後および試験物の投与後に、餌をケージに戻した。投薬後、試料回収してから２４時間、動物を絶食にするために、当日の終わりに餌を再び取り除いた。試料回収後に餌をケージに戻し、投薬後、試料回収してから４８時間、動物を絶食にするために、当日の終わりに餌を再び取り除いた。シングルポートの頸静脈カニューレから血液を回収した。約４００μｌの全血を血清分離管に回収し、血清について処理した。血清を２つの管（約１００μｌずつ）に分けた。ＴＳＨ  ＥＬＩＳＡによって、ｒｈＴＳＨまたはＰＥＧ化されたｒｈＴＳＨの濃度について分析するまで、全ての試料を−８０℃に保存した。最後の試料を回収した後、動物をＣＯ２で安楽死させた。
【００８９】
【表４】
2015502363.tif 000006
【００９０】
【表５】
2015502363.tif 000007
【００９１】
ＰＫデータは、２０ｋＤのＳＡＭと２０ｋＤのＧＡＭ（−）が、ｒｈＴＳＨ対照と比較して、＞５倍延長されたｔ１／２、延長されたＴｍａｘおよび露出増加（曲線下面積、ＡＵＣ）を有することを示した。２０ｋＤのＧＡＭ（＋）のＰＫプロファイルは、２０ｋＤのＳＡＭと２０ｋＤのＧＡＭ（−）と比較して小さな改善を示し、４０ｋＤのＧＡＭ（＋）は中程度の改善を示しただけである。Ｖｚ（見かけの分布体積）値の増加は、ＧＡＭ（＋）コンジュゲートが受容体によって媒介されるクリアランスを受けることがあることを示した。（図１６および表５を参照されたい）。血清Ｔ４濃度は、製造業者のプロトコールに従って、ＡＣＥ臨床化学システム（Ａｌｆａ  Ｗａｓｓｅｒｍａｎｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＬＬＣ）を用いて、薬力学的データ（図１５を参照されたい）を回収するために測定された。
【００９２】
〔実施例１４〕
単回ＩＭ注射後の雄性と雌性Ｓｐｒａｇｕｅ  ＤａｗｌｅｙラットにおけるＰＥＧ化されたｒｈＴＳＨの薬物動態分析
単回筋内（ＩＭ）注射後の雄性と雌性ラットにおいて、ＰＥＧ化されたｒｈＴＳＨ（１０ｋＤのマルチＳＡＭ、１０ｋＤのＳＡＭ、４０ｋＤのＳＡＭ、４０ｋＤのＧＡＭ（−））の薬物動態を評価した。
【００９３】
頸静脈にカニューレ挿入された絶食の雄性および雌性ラットに、ｒｈＴＳＨまたはＰＥＧ化されたｒｈＴＳＨ（１０ｋＤのマルチＳＡＭ、１０ｋＤのＳＡＭ、４０ｋＤのＳＡＭ、４０ｋＤのＧＡＭ（−））の単回用量を０．５ｍｇ／ｋｇの用量でＩＭ投与した。投薬体積の制限のため、動物は、大腿四頭筋に２回または３回の筋内注射の形態で試験物を受けた。脚は、投薬に対して交互に行った。血液試料は、投薬前ならびに投与後の以下の時間点：０．５、１、３、６、２４、４８、７２および９６時間の動物からのものであった。試験物投与の前の晩に、動物のケージから餌を取り除いた。動物は、この期間中に水に近づけた。投薬前の試料回収後および試験物の投与後に、餌をケージに戻した。翌日の朝、投薬後の試料回収に関して動物を絶食にするために、毎日の終わりに餌を再び取り除いた。それぞれの投薬後の試料回収後に、餌をケージに戻した。シングルポートの頸静脈カニューレから血液を回収した。約４００μｌの全血を血清分離管に回収し、血清について処理した。血清を２つの管（約１００μｌずつ）に分けた。ＴＳＨ  ＥＬＩＳＡによって、ｒｈＴＳＨまたはＰＥＧ化されたｒｈＴＳＨの濃度について分析するまで、全ての試料を−８０℃に保存した。最後の試料を回収した後、動物をＣＯ２で安楽死させた。
【００９４】
【表６】
2015502363.tif 000008
【００９５】
【表７】
2015502363.tif 000009
【００９６】
ＰＫデータは、１０ｋＤのマルチＳＡＭ、４０ｋＤのＳＡＭおよび４０ｋＤのＧＡＭ（−）が、ｒｈＴＳＨ対照と比較して、１４から２３倍延長されたｔ１／２、延長されたＴｍａｘおよび露出増加（曲線下面積、ＡＵＣ）を有することを示した。（図１７および表７を参照されたい）４０ｋＤのＳＡＭおよび４０ｋＤのＧＡＭ（−）のＰＫプロファイルにおいて観察された改善は、実施例１３における２０ｋＤのＳＡＭおよび２０ｋＤのＧＡＭ（−）のプロファイルよりも大きい。
【００９７】
ＰＥＧコンジュゲートのインビボでのラット薬物動態研究（実施例１３および１４）：全体的に、血漿半減期は、予期された通り、ｒｈＴＳＨにコンジュゲートされたＰＥＧのサイズに比例し増加した。同じＰＥＧサイズのＳＡＭとＧＡＭ（−）コンジュゲートについて、受容体結合親和性とは異なり、ＰＫパラメータの改善についての２つのＰＥＧ化戦略間に明らかな違いはなく、これは、ＰＫにおける効果が、ＰＥＧサイズのみに依存し、ＰＥＧ化の部位に依存しないことを示唆している。例えば、４０ｋＤのＳＡＭと４０ｋＤのＧＡＭ（−）はともに、血漿半減期が、ｒｈＴＳＨ対照（３．４２±０．６１時間）と比較して２３倍増加したことを示し、それぞれ７７．９±１６．９時間と８０．１±１６．１時間になった。マルチＰＥＧ化（１０ｋＤのマルチＳＡＭ）は、同じサイズのＰＥＧ（１０ｋＤのＳＡＭ）のモノＰＥＧ化と比較して、血漿半減期の大きな増加を示した。１０ｋＤのマルチＳＡＭは、ｒｈＴＳＨ対照と比較して、４６．８±１０．４時間になって１３．７倍増加し、一方、１０ｋＤのＳＡＭは、１５．８±１．２３時間になって、僅かに４．６倍増加した。（表７を参照されたい）濃度ピーク時間（Ｔｍａｘ）におけるＰＥＧサイズ依存的遅延も観察された。例えば、１０ｋＤ、２０ｋＤおよび４０ｋＤのＳＡＭは、２．００±０．００時間または１．５０±１．１８時間のｒｈＴＳＨ対照と比較して、それぞれ５．４０±１．３４時間、１６．０±８．７６時間および３０．０±１２．０時間のＴｍａｘを示した。（表５および表７を参照されたい）。
【００９８】
〔実施例１５〕
薬物動態アッセイ：ｒｈＴＳＨまたはＰＥＧ化されたｒｈＴＳＨのＥＬＩＳＡによる血清試料中のタンパク質濃度の測定
高結合の９６ウェルＥＬＩＳＡプレートは、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．２）中に希釈され、ウェルあたり１００μＬで添加された１．３３μｇ／ｍＬのマウス抗ｈＣＧ捕捉抗体で被覆された。標準のｒｈＴＳＨまたはＰＥＧ化されたｒｈＴＳＨ曲線は、精製されたタンパク質から調製され、１×プレート洗浄液中の１．０％ｗ／ｖのＢＳＡからなる試料希釈緩衝液（ＳＤＢ）において希釈された。標準は、アッセイごとにｒｈＴＳＨまたはＰＥＧ化されたｒｈＴＳＨ種の限定された線形範囲に依存して、２：３の連続希釈スキームを用いて、２５〜１．４６３ｎｇ／ｍＬ、８．３３４〜０．４８８ｎｇ／ｍＬまたは５．５５６〜０．３２５ｎｇ／ｍＬから希釈された。１：１０希釈を下回らないように、試料をＳＤＢに希釈した。正常なラット血清中に調製された５００ｎｇ／ｍＬと２５ｎｇ／ｍＬのｒｈＴＳＨ対照は、ＳＤＢ中にそれぞれ１：１００と１：１０に希釈される。ＳＤＢ中に調製された０．５ｎｇ／ｍＬのｒｈＴＳＨ対照は、希釈せずに添加された。被覆されたプレートを洗浄し、１００μＬの試料、標準および対照をプレートに添加し、１時間３７℃にてインキュベートした。
【００９９】
それぞれのロットに固有の適切な希釈に従って、ビオチン化抗ｒｈＴＳＨモノクローナル検出抗体（クローンＴＳ８）をＳＤＢに希釈した。プレートを洗浄し、１００μＬの希釈されたビオチン化検出抗体をウェルに添加し、１時間３７℃にてインキュベートした。
【０１００】
それぞれのロットに固有の適切な希釈に従って、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（ＳＡ−ＨＲＰ）をＳＤＢに希釈した。プレートを洗浄し、１００μＬの希釈されたＳＡ−ＨＲＰをウェルに添加し、１５分間２５℃にてインキュベートした。
【０１０１】
プレートを洗浄し、１００μＬのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を全てのウェルに添加し、２０分間２５℃にてインキュベートした。
【０１０２】
１００μＬのＴＭＢ停止緩衝液を全てのウェルに添加し、プレートを４５０ｎｍで読み取った。
【０１０３】
〔実施例１６〕
ＰＥＧ化されたｒｈＴＳＨ薬力学のマウスＴ４バイオアッセイ評価
ＰＥＧ化されたｒｈＴＳＨの薬力学は、Ｔ３ペレット移植の３日後、単回ＩＰ注射後の雄性マウスにおいて評価された。このマウスＰＤモデルにおいて、内因性マウスＴ４は、投薬の３日前に、徐放Ｔ３ペレットの移植によって研究期間中に抑制された（図１８Ａ〜図１８Ｄにおけるビヒクル群を参照されたい）。従って、ｒｈＴＳＨ対照またはＰＥＧ化されたｒｈＴＳＨコンジュゲートによって放出されたＴ４量だけを測定した。マウスの限定された血液体積のため、投薬の６、２４、４８および７２時間後の４つの時間点で回収した。
【０１０４】
イソフルランを用いて動物を麻酔し、トロカールを用いて、０．１ｍｇのＴ３ペレット（Ｔ−２６１、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）を皮下に移植した。ペレット移植の３日後に、雄性マウス（ＩＣＲ系、６週齢、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ）に単回用量のｒｈＴＳＨ（０．４もしくは４．０ｍｇ／ｋｇ）またはＰＥＧ化されたｒｈＴＳＨ（４ｍｇ／ｋｇ）をＩＰ投与した。イソフルランを用いて動物を麻酔し、血液試料を後眼窩静脈叢から回収した。群１の血液試料は、投薬前（動物１〜４）、試験物投与後の６（動物５〜８）、２４、４８および７２時間で回収された。他の全ての群からの血液試料は、試験物投与後の６、２４、４８および７２時間で回収された。約６０μｌの全血をマイクロヘマトクリット毛細管に回収し、血清について処理した。最後の試料を回収した後、動物をＣＯ２で安楽死させた。ＡＣＥ（登録商標）臨床化学Ｔ４アッセイによって、Ｔ４濃度について分析するまで、全ての血清試料を−８０℃に保存した。血清Ｔ４濃度は、製造業者のプロトコールに従って、ＡＣＥ臨床化学システム（Ａｌｆａ  Ｗａｓｓｅｒｍａｎｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＬＬＣ）によって測定された。
【０１０５】
【表８】
2015502363.tif 000010
【０１０６】
皮下のＴ３ペレットを介した研究期間中のＴ４抑制により、ビヒクル処理された動物からのデータは、モデル妥当性を示した。６時間で、ビヒクルと比較して、全ての処理は、Ｔ４を有意に（ｐ＜０．００１）増加させた（図１８Ａ）。２４時間で、０．４ｍｇ／ｋｇのｒｈＴＳＨは、Ｔ４のビヒクル様レベルまで戻り始め、一方、残りの処理は、ビヒクルと比較して、有意に（ｐ＜０．００１）上昇した状態であった（図１８Ｂ）。４８時間までに、両方の（０．４ｍｇ／ｋｇと４ｍｇ／ｋｇ）ｒｈＴＳＨ処理は、Ｔ４のビヒクル様レベルまで戻り、３つのＰＥＧコンジュゲートは緩やかに減少したが、４ｍｇ／ｋｇのｒｈＴＳＨと比較して有意に（ｐ＜０．００１）上昇した（図１８Ｃ）。７２時間で、４０ｋＤのＳＡＭと１０ｋＤのマルチＳＡＭは上昇を維持し（４８時間の時間点と類似している）、一方、１０ｋＤのマルチＧＡＭ（＋）は緩やかに下降した（図１８Ｄ）。全てのコンジュゲートは、４ｍｇ／ｋｇのｒｈＴＳＨと比較して上昇を維持し、さらに、４０ｋＤのＳＡＭと１０ｋＤのマルチＳＡＭは１０ｋＤのマルチＧＡＭ（＋）と比較して上昇した（ｐ＜０．００１）。
【０１０７】
１０ｋＤのマルチＳＡＭおよび４０ｋＤのＳＡＭは、ＰＫデータ（実施例１４）およびＰＤデータ（実施例１６）に基づいて、有望な候補であるようであった。１０ｋＤのマルチＧＡＭ（＋）も同様に有望のようであったが、もう２つの有望な候補と比較して、それほど改善された作用持続時間を有さなかった。
【０１０８】
〔実施例１７〕
ＰＥＧ化されたｒｈＴＳＨ薬力学の用量応答曲線の研究評価（４０ｋＤのＳＡＭ）
ＰＥＧ化されたｒｈＴＳＨ（４０ｋＤのＳＡＭ）の薬力学は、Ｔ３ペレット移植の３日後、単回腹腔内（ＩＰ）注射後の雄性マウスにおいて、３つの異なる投薬レベルで評価された。
【０１０９】
イソフルランを用いて動物を麻酔し、トロカールを用いて、０．１ｍｇのＴ３ペレット（Ｔ−２６１、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）を皮下に移植した。ペレット移植の３日後に、雄性マウス（ＩＣＲ系、６週齢、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ）に単回用量のｒｈＴＳＨまたはＰＥＧ化されたｒｈＴＳＨ（４０ｋＤのＳＡＭ）を０．０４ｍｇ／ｋｇ（図１９Ａ）、０．４ｍｇ／ｋｇ（図１９Ｂ）または４ｍｇ／ｋｇ（図１９Ｃ）の用量でＩＰ投与した。イソフルランを用いて動物を麻酔し、血液試料を後眼窩静脈叢から回収した。群１の血液試料は、試験物投与後の６（動物１〜４）、２４、４８、７２および９６時間（動物５〜８）で回収された。他の全ての群からの血液試料は、試験物投与後の６、２４、４８および７２時間で回収された。約６０μｌの全血をマイクロヘマトクリット毛細管に回収し、血清について処理した。最後の試料を回収した後、動物をＣＯ２で安楽死させた。ＡＣＥ（登録商標）臨床化学Ｔ４アッセイによって、Ｔ４濃度について分析するまで、全ての血清試料を−８０℃に保存した。血清Ｔ４濃度は、製造業者のプロトコールに従って、ＡＣＥ臨床化学システム（Ａｌｆａ  Ｗａｓｓｅｒｍａｎｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＬＬＣ）によって測定された。
【０１１０】
【表９】
2015502363.tif 000011
【０１１１】
【表１０】
2015502363.tif 000012
【０１１２】
皮下のＴ３ペレットを介した研究期間中のＴ４抑制により、ビヒクル処理された動物からのデータは、モデル妥当性を示した。全ての用量のｒｈＴＳＨは、同等のＡＵＥＣを示し、用量応答曲線の上部にある見かけの最大効果を発揮した。４０ｋＤのＳＡＭは、効果なしから、中程度の効果、見かけの最大効果まで、総用量応答曲線を表すＡＵＥＣを示した。ｒｈＴＳＨ処理は、全ての用量で６時間にてＴ４レベルを増加させ、次に、投薬後４８時間でビヒクルレベルにＴ４レベルを戻すことを示した最高用量である４ｍｇ／ｋｇを除いて、２４時間にてＴ４のビヒクル様レベルまで減少させた。４０ｋＤのＳＡＭを用いた効果の延長は、このマウスのＰＤモデルにおいて用量に依存していたが、４ｍｇ／ｋｇの用量レベルで最も有意であった。効果の軽度な増強だけが０．４ｍｇ／ｋｇのレベルで見られた。
【０１１３】
〔実施例１８〕
Ｔ３ペレット移植の３日後、単回ＩＭ注射後の雄性および雌性Ｓｐｒａｇｕｅ  ＤａｗｌｅｙラットにおけるＰＥＧ化されたｒｈＴＳＨの薬力学的分析
ＰＥＧ化されたｒｈＴＳＨの薬力学は、Ｔ３ペレット移植の３日後、単回筋内（ＩＭ）注射後の雄性および雌性ラットにおいて評価された。
【０１１４】
イソフルランを用いて動物を麻酔し、トロカールを用いて、１．５ｍｇのＴ３ペレット（Ｔ−２６１、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）を皮下に移植した。ペレット移植の３日後に、頸静脈にカニューレ挿入された雄性および雌性のラットに単回用量のｒｈＴＳＨまたはＰＥＧ化されたｒｈＴＳＨを０．０ｍｇ／ｋｇ（ビヒクル）、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇまたは０．６５ｍｇ／ｋｇの用量でＩＭ投与した。４０ｋＤのマルチＳＡＭと５０ｋＤのマルチＳＡＭについて、０．６５ｍｇ／ｋｇの用量は、モノＰＥＧ化された種の含有量に基づいて決定された。投薬体積の制限のため、動物は、大腿四頭筋に２回の筋内注射の形態で試験物を受けた。脚は、投薬に対して交互に行った。投薬前ならびに投与後の以下の時間点：１、３、６、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４および１６８時間にて動物から血液試料を回収した。シングルポートの頸静脈カニューレから血液を回収した。約２５０μｌの全血を血清分離管に回収し、最小３０分間、血液を凝固させた。管を１０，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離器で回転し、血清を２つの管に分けた（それぞれ約５０μｌ）。ＡＣＥ（登録商標）臨床化学Ｔ４アッセイによって、Ｔ４濃度について分析するまで、全ての試料を−８０℃に保存した。最後の試料を回収した後、動物をＣＯ２で安楽死させた。血清Ｔ４濃度は、製造業者のプロトコールに従って、ＡＣＥ臨床化学システム（Ａｌｆａ  Ｗａｓｓｅｒｍａｎｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＬＬＣ）によって測定された。
【０１１５】
【表１１】
2015502363.tif 000013
【０１１６】
【表１２】
2015502363.tif 000014
【０１１７】
皮下のＴ３ペレットを介した研究期間中のＴ４抑制により、ビヒクル処理された動物からのデータは、モデル妥当性を示した。ｒｈＴＳＨのＴｍａｘは、投薬後６時間で発生し、投薬後７２時間までにベースライン（すなわち、ビヒクル群レベル）に戻った。１０ｋＤのマルチＳＡＭ  Ｔｍａｘは、投薬後２４時間で発生し、０．０４ｍｇ／ｋｇ用量については投薬後７２時間、および０．４ｍｇ／ｋｇ用量については投薬後９６時間でベースラインに戻った。低用量データは、このモデルにおいてｒｈＴＳＨと比較して、１０ｋＤのマルチＳＡＭの有効性が減少したことを示し、これは、ＴＳＨ受容体結合親和性の減少を反映している可能性がある。高用量データは、投薬後４８時間および７２時間で１０ｋＤのマルチＳＡＭにより、薬力学的効果が増強されたことを確認した。４０ｋＤのマルチＳＡＭと５０ｋＤのマルチＳＡＭを含む全ての候補は、０．４ｍｇ／ｋｇのｒｈＴＳＨと比較して増強されたＴ４応答を示し、これは、部分的に、投薬後２４時間まで、Ｔｍａｘにおけるシフトによって媒介されている可能性があった。延長された薬力学的活性は、投薬後９６〜１２０時間にわたって観察された。（４０ｋＤのマルチＳＡＭと５０ｋＤのマルチＳＡＭについて、０．６５ｍｇ／ｋｇの用量は、これらのコンジュゲート中のモノＰＥＧ化された種の含有率に基づいて、０．４ｍｇ／ｋｇに等しかった。）全ての試験物について、薬力学的効果の約９５％が、筋内投与後の投薬後９６時間以内に観察された。ＰＥＧ化されたコンジュゲートを用いて観察されたより高いＡＵＥＣは、投薬後２４〜９６時間で、より高いＴ４レベルによって駆動される。０〜９６時間の期間について、１０ｋＤのマルチＳＡＭは、ｒｈＴＳＨ  ＡＵＥＣの１．３倍、４０ｋＤのＳＡＭは１．５倍、４０ｋＤのマルチＳＡＭは１．７倍、５０ｋＤのマルチＳＡＭは１．９倍を示した。（表１２、図２０）。
【０１１８】
〔実施例１９〕
Ｔ３ペレット移植の３日後、単回ＩＭ注射後の雄性および雌性Ｓｐｒａｇｕｅ  ＤａｗｌｅｙラットにおけるＰＥＧ化されたｒｈＴＳＨの薬力学的分析
ＰＥＧ化されたｒｈＴＳＨの薬力学は、Ｔ３ペレット移植の３日後、単回筋内（ＩＭ）注射後の雄性および雌性ラットにおいて評価された。
【０１１９】
イソフルランを用いて動物を麻酔し、トロカールを用いて、１．５ｍｇのＴ３ペレット（Ｔ−２６１、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）を皮下に移植した。ペレット移植の３日後に、頸静脈にカニューレ挿入された雄性および雌性のラットに単回用量のｒｈＴＳＨまたはＰＥＧ化されたｒｈＴＳＨを０．０ｍｇ／ｋｇ（ビヒクル）、０．４ｍｇ／ｋｇまたは０．６５ｍｇ／ｋｇの用量でＩＭ投与した。５０ｋＤのマルチＳＡＭについて、０．６５ｍｇ／ｋｇの用量は、モノＰＥＧ化された種の含有量に基づいて決定された。投薬体積の制限のため、動物は、大腿四頭筋に２回の筋内注射の形態で試験物を受けた。脚は、投薬に対して交互に行った。投薬前ならびに投与後の以下の時間点：６時間（図２１Ａ）、２４時間（図２１Ｂ）、４８時間（図２１Ｃ）、７２時間（図２１Ｄ）、９６時間（図２１Ｅ）および１６８時間（図２１Ｆ）にて動物から血液試料を回収した。シングルポートの頸静脈カニューレから血液を回収した。約２５０μｌの全血を血清分離管に回収し、最小３０分間、血液を凝固させた。管を１０，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離器で回転し、血清を２つの管に分けた（それぞれ約５０μｌ）。ＡＣＥ（登録商標）臨床化学Ｔ４アッセイによって、Ｔ４濃度について分析するまで、全ての試料を−８０℃に保存した。最後の試料を回収した後、動物をＣＯ２で安楽死させた。血清Ｔ４濃度は、製造業者のプロトコールに従って、ＡＣＥ臨床化学システム（Ａｌｆａ  Ｗａｓｓｅｒｍａｎｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＬＬＣ）によって測定された。
【０１２０】
【表１３】
2015502363.tif 000015
【０１２１】
【表１４】
2015502363.tif 000016
【０１２２】
皮下のＴ３ペレットを介した研究期間中のＴ４抑制により、ビヒクル処理された動物からのデータは、モデル妥当性を示した。（図２２を参照されたい）。延長された薬力学的効果は、それぞれの試験物に関する群内で一致していた。作用持続時間とＡＵＥＣはともに、ｒｈＴＳＨ＜１０ｋＤのマルチＳＡＭ＜４０ｋＤのＳＡＭ≦５０ｋＤのマルチＳＡＭから順位付けされ、実施例１８と一致していた。
【０１２３】
〔実施例２０〕
ＰＥＧ化されたｒｈＴＳＨ（１０ｋＤのマルチＳＡＭと４０ｋＤのＳＡＭ）の薬力学的評価
ＰＥＧ化されたｒｈＴＳＨ（１０ｋＤのマルチＳＡＭと４０ｋＤのＳＡＭ）の薬力学は、Ｔ３ペレット移植の３日後、単回筋内（ＩＭ）注射後の雄性および雌性ラットにおいて評価された。
【０１２４】
イソフルランを用いて動物を麻酔し、トロカールを用いて、１．５ｍｇのＴ３ペレット（Ｔ−２６１、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）を皮下に移植した。表１５において特定されているように、ペレット移植の３日後に、頸静脈にカニューレ挿入された雄性および雌性のラットに単回用量のビヒクルまたはＰＥＧ化されたｒｈＴＳＨ（１０ｋＤのマルチＳＡＭと４０ｋＤのＳＡＭ）を０．０ｍｇ／ｋｇ（ビヒクル）、０．１、０．２、０．４または１．０ｍｇ／ｋｇの用量でＩＭ投与した。投薬体積の制限のため、動物は、大腿四頭筋に２回の筋内注射の形態で試験物を受けた。脚は、投薬に対して交互に行った。投薬前ならびに投与後の以下の時間点：６、２４、４８、７２、９６および１６８時間にて動物から血液試料を回収した。シングルポートの頸静脈カニューレから血液を回収した。約２５０μｌの全血を血清分離管に回収し、最小３０分間、血液を凝固させた。管を１０，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離器で回転し、血清を２つの管に分けた（それぞれ約５０μｌ）。ＡＣＥ臨床化学Ｔ４アッセイによって、Ｔ４濃度について分析するまで、全ての試料を−８０℃に保存した。最後の試料を回収した後、動物をＣＯ２で安楽死させた。血清Ｔ４濃度は、製造業者のプロトコールに従って、ＡＣＥ臨床化学システム（Ａｌｆａ  Ｗａｓｓｅｒｍａｎｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＬＬＣ）によって測定された。
【０１２５】
【表１５】
2015502363.tif 000017
【０１２６】
【表１６】
2015502363.tif 000018
【０１２７】
皮下のＴ３ペレットを介した研究期間中のＴ４抑制により、ビヒクル処理された動物からのデータは、モデル妥当性を示した。（図２３を参照されたい）。１０ｋＤのマルチＳＡＭは、０．４ｍｇ／ｋｇで最大ＰＤ応答を生じさせず、１ｍｇ／ｋｇでより顕著なＴ４応答（程度および期間において）をもたらした。０．２ｍｇ／ｋｇでの４０ｋＤのＳＡＭは、中程度のＰＤ応答を示し、一方、０．１ｍｇ／ｋｇはほとんど効果がないまたは全く効果がなかった。興味深いことに、１０ｋＤのマルチＳＡＭと４０ｋＤのＳＡＭは、０．２ｍｇ／ｋｇでほぼ同一のＰＤを示した。しかしながら、０．４ｍｇ／ｋｇで、４０ｋＤのＳＡＭは、１０ｋＤのマルチＳＡＭよりも強い薬力学的効果を発揮した。全体的に、３つの別々の研究（実施例１８、１９および２０）からのデータは、１０ｋＤのマルチＳＡＭと４０ｋＤのＳＡＭについて一致している。
【０１２８】
〔実施例２１〕
Ｔ３ペレット移植の３日後、単回ＩＭ注射後の雄性および雌性Ｓｐｒａｇｕｅ  ＤａｗｌｅｙラットにおけるＰＥＧ化されたｒｈＴＳＨ（４０ｋＤのＳＡＭ）の２つの用量レベルと比較したＰＥＧ化されたＣｙｓ突然変異ＴＳＨ（４０ｋＤのＧ２２Ｃ）の薬力学的（ＰＤ）評価
ＰＥＧ化されたＣｙｓ突然変異ＴＳＨ（４０ｋＤのＧ２２Ｃ）の薬力学を評価し、Ｔ３ペレット移植されたＳｐｒａｇｕｅ  ＤａｗｌｅｙラットにおけるｒｈＴＳＨと４０ｋＤのＳＡＭ、ＰＥＧ化されたｒｈＴＳＨの薬力学と比較した。
【０１２９】
イソフルランを用いて動物を麻酔し、トロカールを用いて、１．５ｍｇのＴ３ペレット（Ｔ−２６１、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）を皮下に移植した。ペレット移植の３日後に、頸静脈にカニューレ挿入された雄性および雌性のラットに単回用量のビヒクル、ｒｈＴＳＨ、ＰＥＧ化されたｒｈＴＳＨ（４０ｋＤのＳＡＭ）またはＰＥＧ化されたＣｙｓ突然変異ＴＳＨ（４０ｋＤのＧ２２Ｃ）を０．０ｍｇ／ｋｇ（ビヒクル）、０．２または０．４ｍｇ／ｋｇの用量でＩＭ投与した。投薬体積の制限のため、動物は、大腿四頭筋に２回の筋内注射の形態で試験物を受けた。脚は、投薬に対して交互に行った。投薬前ならびに投与後の以下の時間点：６、２４、４８、７２、９６および１６８時間にて動物から血液試料を回収した。シングルポートの頸静脈カニューレから血液を回収した。約２５０μｌの全血を血清分離管に回収し、最小３０分間、血液を凝固させた。管を１０，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離器で回転し、血清を２つの管に分けた（それぞれ約５０μｌ）。ＡＣＥ臨床化学Ｔ４アッセイによって、Ｔ４濃度について分析するまで、全ての試料を−８０℃に保存した。最後の試料を回収した後、動物をＣＯ２で安楽死させた。血清Ｔ４濃度は、製造業者のプロトコールに従って、ＡＣＥ臨床化学システム（Ａｌｆａ  Ｗａｓｓｅｒｍａｎｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＬＬＣ）によって測定された。
【０１３０】
【表１７】
2015502363.tif 000019
【０１３１】
【表１８】
2015502363.tif 000020
【０１３２】
皮下のＴ３ペレットを介した研究期間中のＴ４抑制により、ビヒクル処理された動物からのデータは、モデル妥当性を示した。（図２４を参照されたい）薬力学的観点から、４０ｋＤのＧ２２ＣのＣｙｓ突然変異体は、４０ｋＤのＳＡＭよりも優れているようではなかった。４０ｋＤのＳＡＭは、４０ｋＤのＧ２２ＣのＣｙｓ突然変異体と比較して、作用持続時間の増加を示すようであった。
【０１３３】
本明細書において引用されている全ての特許、公開された出願および参照文献の教示は、全体として参照によって組み入れる。
【０１３４】
本発明は、その例示的な実施形態に関連して具体的に示され、記載されているが、形態および詳細の点で様々な変化が、添付の特許請求の範囲によって包含される発明の範囲から逸脱することなしに、そこでなされてもよいことは、当業者に理解される。
【図１】
2015502363.tif 000021
【図２】
2015502363.tif 000022
【図３】
2015502363.tif 000023
【図４】
2015502363.tif 000024
【図５】
2015502363.tif 000025
【図６】
2015502363.tif 000026
【図７】
2015502363.tif 000027
【図８】
2015502363.tif 000028
【図９】
2015502363.tif 000029
【図１０】
2015502363.tif 000030
【図１１】
2015502363.tif 000031
【図１２】
2015502363.tif 000032
【図１３】
2015502363.tif 000033
【図１４】
2015502363.tif 000034
【図１５】
2015502363.tif 000035
【図１６】
2015502363.tif 000036
【図１７】
2015502363.tif 000037
【図１８】
2015502363.tif 000038
【図１９】
2015502363.tif 000039
【図２０】
2015502363.tif 000040
【図２１】
2015502363.tif 000041
【図２２】
2015502363.tif 000042
【図２３】
2015502363.tif 000043
【図２４】
2015502363.tif 000044
【配列表】
2015502363000001.app
【国際調査報告】
2015502363.tif 000045
2015502363.tif 000046
2015502363.tif 000047