(57)【要約】  少なくとも１つのヒドロキシル上にフェニルボロン酸含有基がグラフトされたＰＢＡ修飾ＨＡポリマーと、少なくとも１つのヒドロキシル上にシス−ジオール含有基がグラフトされたシス−ジオール修飾ＨＡポリマーとの混合物を含んでなるポリマー組成物。このポリマー組成物を含んでなる注射可能なまたは移植可能なグルコース感受性ヒドロゲル。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）少なくとも１つのヒドロキシル上にフェニルボロン酸含有基がグラフトされたフェニルボロン酸（ＰＢＡ）修飾ヒアルロン酸（ＨＡ）ポリマー（ここで、前記基は、フェニルボロン酸、３−アミノフェニルボロン酸、４−アミノフェニルボロン酸、４−（アミノエチルカルバモイル）−３−フルオロフェニルボロン酸および４−［（２−アミノエチル）カルバモイル］フェニルボロン酸からなる群の中で選択される）と、
ｂ）少なくとも１つのヒドロキシル上にシス−ジオール含有基がグラフトされたシス−ジオール修飾ヒアルロン酸（ＨＡ）ポリマー（ここで、前記シス−ジオールは、二糖類、ヘキソース、ヘキソースのウロン酸誘導体、ヘキソサミン、ヘキソサミンのＮ−アセチル誘導体、グリセロール、マンニトールおよびシアル酸からなる群の中で選択される）
との混合物を含んでなる、ポリマー組成物。
【請求項２】
７〜１０、好ましくは７〜７．５のｐＨを有する、請求項１に記載のポリマー組成物。
【請求項３】
前記ＰＢＡ修飾ＨＡポリマーの少なくとも１つのヒドロキシル上にアルケン基がさらにグラフトされ、前記シス−ジオール修飾ＨＡポリマーの少なくとも１つのヒドロキシル上にアルケン基がさらにグラフトされた、請求項１または２に記載のポリマー組成物。
【請求項４】
前記アルケン基がペンテノエートおよびマレイミドからなる群の中で選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリマー組成物。
【請求項５】
前記ＰＢＡ修飾ＨＡポリマーと前記シス−ジオール修飾ＨＡポリマーがそれらのフェニルボロン酸含有基およびそれらのシス−ジオール含有基を介して可逆的に、共有結合的に架橋されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリマー組成物。
【請求項６】
前記ＰＢＡ修飾ＨＡポリマーと前記シス−ジオール修飾ＨＡポリマーがそれらのアルケン基を介して化学的に架橋され、かつ、それらのフェニルボロン酸含有基およびそれらのシス−ジオール含有基を介して可逆的に、共有結合的にさらに架橋されている、請求項３または４に記載のポリマー組成物。
【請求項７】
請求項５に記載のポリマー組成物を含んでなる、注射可能なヒドロゲル。
【請求項８】
請求項６に記載のポリマー組成物を含んでなる、移植可能なヒドロゲル。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリマー組成物と前記ポリマー組成物中に含有される薬物とを含んでなる、薬物送達システム。
【請求項１０】
糖尿病の治療方法に使用するための、請求項９に記載の薬物送達システム。
【請求項１１】
前記薬物がインスリンである、請求項９または１０に記載の薬物送達システム。
【請求項１２】
ＨＡポリマー組成物を含んでなる可逆的に架橋されたヒドロゲルを製造するための方法であって、
ａ）少なくとも１つのヒドロキシル上にフェニルボロン酸含有基がグラフトされたフェニルボロン酸（ＰＢＡ）修飾ヒアルロン酸（ＨＡ）ポリマーを作製する工程（ここで、前記基は、フェニルボロン酸、３−アミノフェニルボロン酸、４−アミノフェニルボロン酸、４−（アミノエチルカルバモイル）−３−フルオロフェニルボロン酸および４−［（２−アミノエチル）カルバモイル］フェニルボロン酸からなる群の中で選択される）、
ｂ）ヒドロキシル上にシス−ジオール含有基がグラフトされたシス−ジオール修飾ヒアルロン酸（ＨＡ）ポリマーを作製する工程（ここで、前記シス−ジオールは、二糖類、ヘキソース、ヘキソースのウロン酸誘導体、ヘキソサミン、ヘキソサミンのＮ−アセチル誘導体、グリセロール、マンニトールおよびシアル酸からなる群の中で選択される）；
ｃ）工程ａ）のＰＢＡ修飾ＨＡポリマーの水溶液と工程ｂ）のシス−ジオール修飾ＨＡポリマーの水溶液を、７〜１０、優先的には７．２〜９．５のｐＨで混合して、可逆的に架橋されたヒドロゲルを得る工程
を含んでなる、方法。
【請求項１３】
工程ｃ）において、工程ａ）のＰＢＡ修飾ＨＡポリマーの水溶液と工程ｂ）のシス−ジオールＨＡポリマーの水溶液の混合が薬物の存在下で行われ、それにより、前記薬物を前記ＨＡポリマー組成物に組み込む、請求項１２に記載のヒドロゲルを製造するための方法。
【請求項１４】
ヒアルロン酸（ＨＡ）ポリマー組成物を含んでなる二重架橋ヒドロゲルを製造するための方法であって、
ａ）少なくとも１つのヒドロキシル上にフェニルボロン酸含有基がグラフトされ（ここで、前記基は、フェニルボロン酸、３−アミノフェニルボロン酸、４−アミノフェニルボロン酸、４−（アミノエチルカルバモイル）−３−フルオロフェニルボロン酸および４−［（２−アミノエチル）カルバモイル］フェニルボロン酸からなる群の中で選択される）、かつ、少なくとも１つのヒドロキシル上にアルケン基がグラフトされた、フェニルボロン酸（ＰＢＡ）修飾ヒアルロン酸（ＨＡ）ポリマーを作製する工程、および
ｂ）ヒドロキシル上にシス−ジオール含有基がグラフトされ（ここで、前記シス−ジオールは、二糖類、ヘキソース、ヘキソースのウロン酸誘導体、ヘキソサミン、ヘキソサミンのＮ−アセチル誘導体、グリセロール、マンニトールおよびシアル酸からなる群の中で選択される）、かつ、少なくとも１つのヒドロキシル上にアルケン基がグラフトされた、シス−ジオール修飾ヒアルロン酸（ＨＡ）ポリマーを作製する工程、
ｃ）工程ａ）のＰＢＡ修飾ＨＡポリマーの水溶液と工程ｂ）のシス−ジオール修飾ＨＡポリマーの水溶液を３〜６．５のｐＨで混合して、ＨＡポリマー組成物を得る工程、
ｄ）工程ｃ）で得られたＨＡポリマー組成物を、ＨＡポリマー組成物上のアルケン基へのＰＥＧ−（ＳＨ）２のラジカル付加により光架橋して、化学的に架橋されたＨＡポリマー組成物を得る工程、
ｅ）工程ｄ）のＨＡポリマー組成物を７〜１０、優先的には７．２〜９．５のｐＨで架橋する工程
を含んでなる、方法。
【請求項１５】
工程ｄ）の後、薬物がＨＡポリマー組成物に組み込まれる、請求項１４に記載のポリマー組成物を含んでなる二重架橋ヒドロゲルを製造するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病および関連の態様の治療においてインスリン送達システムとして使用可能な、生体高分子に基づく新規なグルコース感受性ヒドロゲルに関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、血中のグルコース濃度の蓄積を特徴とする、グルコース調節の障害である。このグルコース調節の破綻は、内分泌系の膵臓がインスリンを分泌できないか、または身体がインスリンを適切に使用できないことによるものであり得る。１型糖尿病の場合、通常の治療は、毎日複数回の血糖管理および皮下注射からなる。しかしながら、インスリン用量が血中のグルコースレベルに絶えず適合され、それにより、有害な合併症を招く正常範囲を下回るまたは上回るグルコースレベルを回避することができれば、血糖のより良い管理が達成できる。この関連で、インスリンの閉ループ送達の需要が高い。
【０００３】
グルコース応答性ポリマー、特にヒドロゲルは、グルコースレベルを検知し、それに応じてインスリンを送達するというそれらの両能力のために本分野で大きな注目が寄せられている。血中グルコース濃度に応じた可逆的膨潤の結果としての、これらの極めて膨潤した網状構造の透過性の変動は、それらを、自己調節インスリン送達を達成するために好適なものとする。
【０００４】
この目的で、ポリマー鎖上にグルコースセンサー部分を導入することが必要であり、フェニルボロン酸（ＰＢＡ）が理想的な候補と思われており、これはこの分子が他のグルコース認識要素（グルコースオキシダーゼ、コンカナバリンＡ）に比べて不安定性および免疫応答のリスクに比較的影響を受けにくいためである。フェニルボロン酸は、水性媒体中でジオールと可逆的に結合して環状ボロン酸エステルを形成することが知られている(Kataoka et al., 1998)。いくつかの研究で、ＰＢＡを含有するグルコース応答性ポリマーゲルシステムが確立されている(Kataoka et al., 1998; Ravaine et al., 2008; Samoei et al., 2006; Wang et al., 2010; Wu et al., 2011)。
【０００５】
しかしながら、これらのグルコース応答システムには多くの欠点がある。これらのポリマーは一般に、合成、非生分解性であり、生体適合性がなく、ｉｎ  ｖｉｖｏ適用ができない。
【０００６】
さらに、グルコースセンサーとしてボロン酸（ＰＢＡ）を含んでなる動的マトリックスの形成は、アルカリｐＨでは安定であるが、生理学的条件下では安定でないボロン酸−シス−ジオール複合体の形成に基づいている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、調節型のインスリン送達のための、グルコースに感受性のある新規な生体高分子複合体システムを記載する。この生体高分子複合体は、ＰＢＡで修飾されたヒアルロン酸（ＨＡ）誘導体とマルトースで修飾されたヒアルロン酸（ＨＡ）誘導体を混合することにより得られる。ＨＡは、あらゆる組織に偏在し、そこで重要な構造的および生物学的機能を持つ陰イオン性の直鎖多糖である。従って、ＨＡは生体適合性があり、生物体内の酵素により分解され得る。さらに、ＨＡは細菌発酵により容易に生産できる。ＰＢＡはシス−ジオール単位を有する分子と結合することができるので、ＨＡ鎖の糖単位と複合体を形成することができる。しかしながら、ＨＡの繰り返しの二糖単位の構造（Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンからなる）は、グルコースに比べてＰＢＡとの効率的複合体形成ができないことから、水溶液中でＰＢＡ修飾ＨＡとマルトース修飾ＨＡ（それぞれＨＡ−ＰＢＡとＨＡ−マルトース）を合わせることにより動的網状構造（すなわち、動的共有結合的架橋により形成される網状構造）の形成を促進するためにＨＡ上に末端グルコース単位を含むマルトース部分がグラフトされた。この配合ストラテジーにより、遊離グルコースによるＨＡ−ＰＢＡからのＨＡ−マルトースの競合的排除に基づくグルコース感受性を示す動的ヒドロゲルを得ることが可能となった。有利なことに、動的網状構造の形成は生理学的ｐＨで見られたが、これはアルカリｐＨでのみ安定に存在できる他のボロン酸−シス−ジオール複合体に比べるとまれなことである(Ivanov et al., 2004; Kitano et al., 1992; Matsumoto et al., 2004)。
【０００８】
概要
本発明の第１の目的は、
ａ）少なくとも１つのヒドロキシル上にフェニルボロン酸含有基がグラフトされたＰＢＡ修飾ＨＡポリマーと、
ｂ）少なくとも１つのヒドロキシル上にシス−ジオール含有基がグラフトされたシス−ジオール修飾ＨＡポリマー、前記シス−ジオールは二糖類、ヘキソース、ヘキソースのウロン酸誘導体、ヘキソサミン、ヘキソサミンのＮ−アセチル誘導体、グリセロールおよびマンニトールからなる群の中で選択される、
との混合物を含んでなるポリマー組成物である。
【０００９】
本発明の第１の実施態様では、本ポリマー組成物は、
ａ）少なくとも１つのヒドロキシル上にフェニルボロン酸含有基がグラフトされたＰＢＡ修飾ＨＡポリマー（ここで、前記基は３−アミノフェニルボロン酸、４−アミノフェニルボロン酸、４−（アミノエチルカルバモイル）−３−フルオロフェニルボロン酸および４−［（２−アミノエチル）カルバモイル］フェニルボロン酸からなる群の中で選択される）と、
ｂ）少なくとも１つのヒドロキシル上にシス−ジオール含有基がグラフトされたシス−ジオール修飾ＨＡポリマー（ここで、前記シス−ジオールは二糖類、ヘキソース、ヘキソースのウロン酸誘導体、ヘキソサミン、ヘキソサミンのＮ−アセチル誘導体、グリセロール、マンニトールおよびシアル酸からなる群の中で選択される）
との混合物を含んでなる。
【００１０】
本発明の第２の実施態様では、前記請求項のいずれか一項に記載のポリマー組成物は、
ａ）少なくとも１つのヒドロキシル上に３−アミノフェニルボロン酸含有基がグラフトされたＰＢＡ修飾ＨＡポリマーと、
ｂ）少なくとも１つのヒドロキシル上にマルトース含有基がグラフトされたシス−ジオール修飾ＨＡポリマー
との混合物を含んでなる。
【００１１】
本発明のポリマー組成物では、ＰＢＡ修飾ＨＡポリマーは好ましくは、少なくとも１つのヒドロキシル上にチオール−エンカップリングを介してフェニルボロン酸含有基がグラフトされ、シス−ジオール修飾ＨＡポリマーは好ましくは、少なくとも１つのヒドロキシル上にチオール−エンカップリングを介してシス−ジオール含有基がグラフトされる。
【００１２】
本発明の第３の実施態様では、本ポリマー組成物は、
ａ）少なくとも１つのヒドロキシル上に式（Ｉ）：
【化１】
2015537078.tif 000002
のＰＢＡ基がグラフトされたＰＢＡ修飾ＨＡポリマーと、
ｂ）少なくとも１つのヒドロキシル上に式（ＩＩ）：
【化２】
2015537078.tif 000003
のマルトース基がグラフトされたシス−ジオール修飾ＨＡポリマーとの混合物を含んでなる。
【００１３】
本発明のポリマー組成物では、ＰＢＡ修飾ＨＡポリマーは好ましくは、フェニルボロン酸含有基によるＤＳが０．０２〜０．６、より好ましくは０．０５〜０．２である。
【００１４】
本発明のポリマー組成物では、シス−ジオール修飾ＨＡポリマーは好ましくは、シス−ジオール含有基によるＤＳが０．０２〜０．６、より好ましくは０．０５〜０．２である。
【００１５】
本発明のポリマー組成物では、ＰＢＡ修飾ＨＡポリマーは好ましくは、分子量Ｍｗが１００００ｇ／ｍｏｌ〜３００００００ｇ／ｍｏｌ、より優先的には２００００ｇ／ｍｏｌ〜８０００００ｇ／ｍｏｌであり、シス−ジオール修飾ＨＡポリマーは、分子量Ｍｗが１００００ｇ／ｍｏｌ〜３００００００ｇ／ｍｏｌ、より優先的には２００００ｇ／ｍｏｌ〜８０００００ｇ／ｍｏｌである。
【００１６】
本発明のポリマー組成物では、フェニルボロン酸含有基とシス−ジオール含有基の間のモル比は、好ましくは０．２５／１〜２．５／１、より好ましくは０．５／１〜２／１である。
【００１７】
本発明のポリマー組成物では、組成物は好ましくは７〜１０、好ましくは７〜７．５のｐＨを有する。
【００１８】
本発明のポリマー組成物では、ＰＢＡ修飾ＨＡポリマーは好ましくは少なくとも１つのヒドロキシル上にアルケン基がさらにグラフトされ、シス−ジオール修飾ＨＡポリマーは好ましくは少なくとも１つのヒドロキシル上にアルケン基がさらにグラフトされる。
【００１９】
本発明のポリマー組成物では、アルケン基は好ましくは、ペンテノエートおよびマレイミドからなる群の中で選択される。
【００２０】
本発明のポリマー組成物では、ＰＢＡ修飾ＨＡポリマーは好ましくは、アルケン基によるＤＳが０．０２〜０．６、より好ましくは０．０５〜０．５であり、シス−ジオール修飾ＨＡポリマーは好ましくは、アルケン基によるＤＳが０．０２〜０．６、より好ましくは０．０５〜０．５である。
【００２１】
本発明の好ましい実施態様では、ＰＢＡ修飾ＨＡポリマーとシス−ジオール修飾ＨＡポリマーは、それらのフェニルボロン酸含有基およびそれらのシス−ジオール含有基を介して、可逆的に、共有結合的に架橋される。
【００２２】
いくつかの実施態様では、ＰＢＡ修飾ＨＡポリマーとシス−ジオール修飾ＨＡポリマーは、それらのアルケン基を介して化学的に架橋される。好ましくは、ＰＢＡ修飾ＨＡポリマーとシス−ジオール修飾ＨＡポリマーは、ビスチオール化ポリ（エチレングリコール）Ｐ（ＥＧ−（ＳＨ）２）との光架橋反応により、それらのアルケン基を介して化学的に架橋される。
【００２３】
好ましくは、ＰＢＡ修飾ＨＡポリマーとシス−ジオール修飾ＨＡポリマーは、それらのフェニルボロン酸含有基およびそれらのシス−ジオール含有基を介して、さらに可逆的に、共有結合的に架橋される。
【００２４】
本発明の別の目的は、ＰＢＡ修飾ＨＡポリマーとシス−ジオール修飾ＨＡポリマーが、それらのフェニルボロン酸含有基およびそれらのシス−ジオール含有基を介して、可逆的に、共有結合的に架橋されたポリマー組成物を含んでなる、注射可能なヒドロゲルである。
【００２５】
本発明の別の目的は、ＰＢＡ修飾ＨＡポリマーとシス−ジオール修飾ＨＡポリマーが、それらのアルケン基を介して化学的に架橋され、かつ、それらのフェニルボロン酸含有基およびそれらのシス−ジオール含有基を介してさらに可逆的に、共有結合的に架橋されたポリマー組成物を含んでなる、移植可能なヒドロゲルである。
【００２６】
本発明の別の目的は、
ａ）式（ＩＩＩ）：
【化３】
2015537078.tif 000004
｛式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、Ｈ、式（Ｉ）：
【化４】
2015537078.tif 000005
のＰＢＡ基、および
式（ＩＶ）：
【化５】
2015537078.tif 000006
のアルケン基からなる群の中で独立に選択され、
ｎ１は、２５〜８０００、好ましくは５０〜２０００の整数であり、
式（Ｉ）のＰＢＡ基によるＤＳは、０．０２〜０．６、好ましくは０．０５〜０．２であり、
式（ＩＶ）のアルケン基によるＤＳは、０〜０．６、好ましくは０．０２〜０．６である｝
で示されるＰＢＡ修飾ＨＡポリマーと、
式（Ｖ）：
【化６】
2015537078.tif 000007
｛式中、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、Ｈ、式（ＩＩ）：
【化７】
2015537078.tif 000008
のマルトース基、式（ＩＶ）：
【化８】
2015537078.tif 000009
のアルケン基からなる群の中で独立に選択され、
ｎ２は、２５〜８０００、好ましくは５０〜２０００の整数であり、
マルトース基によるＤＳは、０．０２〜０．６、好ましくは０．０５〜０．２であり、
アルケン基によるＤＳは、０〜０．６、好ましくは０．０２〜０．６である｝
で示されるシス−ジオール修飾ＨＡポリマーとの混合物を含んでなるポリマー組成物である。
【００２７】
本発明では、ポリマー組成物は、好ましくは、ＰＢＡ基とアルケン基の間のモル比が０．２５／１〜２．５／１、好ましくは０．５／１〜２／１である混合物を含んでなる。
【００２８】
本発明では、ポリマー組成物は、好ましくは、７〜１０、好ましくは７〜７．５のｐＨを有する。
【００２９】
本発明のポリマー組成物では、ＰＢＡ修飾ＨＡポリマーとシス−ジオール修飾ＨＡポリマーは、好ましくは、それぞれそれらのＰＢＡ基およびそれらのマルトース基を介して可逆的に、共有結合的に架橋される。
【００３０】
本発明のポリマーでは、ＰＢＡ修飾ＨＡポリマーは、好ましくは、アルケン基によるＤＳが０．０２〜０．６、より好ましくは０．０５〜０．２であり、シス−ジオール修飾ＨＡポリマーは、好ましくは、アルケン基によるＤＳが０．０２〜０．６、好ましくは０．０５〜０．２である。
【００３１】
本発明のポリマー組成物では、ＰＢＡ修飾ＨＡポリマーとシス−ジオール修飾ＨＡポリマーは、好ましくは、それらのアルケン基を介して化学的に架橋される。好ましくは、ＰＢＡ修飾ＨＡポリマーとシス−ジオール修飾ＨＡポリマーは、ＰＥＧ−（ＳＨ）２との光架橋反応により、それらのアルケン基を介して化学的に架橋される。好ましくは、ＰＢＡ修飾ＨＡポリマーとシス−ジオール修飾ＨＡポリマーは、それらのＰＢＡ基およびそれらのマルトース基を介してさらに可逆的に、共有結合的に架橋される。
【００３２】
本発明の別の目的は、ＰＢＡ修飾ＨＡポリマーとシス−ジオール修飾ＨＡポリマーがそれらのフェニルボロン酸含有基およびそれらのシス−ジオール含有基を介して可逆的に、共有結合的に架橋されたポリマー組成物を含んでなる注射可能なヒドロゲルである。
【００３３】
本発明の別の目的は、ＰＢＡ修飾ＨＡポリマーとシス−ジオール修飾ＨＡポリマーがそれらのアルケン基を介して化学的に架橋され、かつ、それらのフェニルボロン酸含有基およびそれらのシス−ジオール含有基を介してさらに可逆的に、共有結合的に架橋されたポリマー組成物を含んでなる移植可能なヒドロゲルである。
【００３４】
本発明の別の目的は、上記のようなポリマー組成物と前記ポリマー組成物に含有される薬物とを含んでなる薬物送達システムである。好ましくは、本発明による薬物送達システムは薬剤として使用するためのものである。好ましくは、本発明による薬物送達システムは、糖尿病の治療方法で使用するためのものである。好ましい実施態様では、薬物はインスリンである。
【００３５】
本発明の別の目的は、少なくとも１つのヒドロキシル上にフェニルボロン酸含有基がグラフトされたＰＢＡ修飾ＨＡポリマーを製造するための方法であって、
ａ）ＨＡポリマーのヒドロキシルにアルケン基をグラフトして、アルケン基で修飾されたＨＡ中間体を得る工程、
ｂ）フェニルボロン酸含有基にチオール基をグラフトして、フェニルボロン酸−チオール誘導体を得る工程、
ｃ）工程ａ）で得られた生成物を工程ｂ）で得られた生成物と反応させてチオエーテル結合を形成する工程
を含んでなる方法である。
【００３６】
好ましくは、工程ａ）において、アルケン基はペンテノエートおよびマレイミドから選択される。
【００３７】
好ましくは、工程ｂ）において、得られるフェニルボロン酸−チオール誘導体は、式（ＶＩ）：
【化９】
2015537078.tif 000010
の化合物である。
【００３８】
本発明の別の目的は、少なくとも１つのヒドロキシル上にシス−ジオール含有基がグラフトされたシス−ジオール修飾ＨＡポリマーを製造するための方法であって、
ａ）ＨＡポリマーのヒドロキシルにアルケン基をグラフトして、アルケン基で修飾されたＨＡ中間体を得る工程、
ｂ）シス−ジオールにチオール基をグラフトしてチオールシス−ジオールを得る工程、
ｃ）工程ａ）で得られた生成物を工程ｂ）で得られた生成物と反応させてチオエーテル結合を形成する工程
を含んでなる方法である。
【００３９】
好ましくは、工程ａ）において、アルケン基はペンテノエートおよびマレイミドから選択される。
【００４０】
好ましくは、工程ｂ）において、シス−ジオールはマルトースであり、得られるチオールシス−ジオールは式（ＶＩＩ）：
【化１０】
2015537078.tif 000011
の化合物である。
【００４１】
本発明の別の目的は、ＨＡポリマー組成物を含んでなる可逆的に架橋されたヒドロゲルを製造するための方法であって、
ａ）少なくとも１つのヒドロキシル上にフェニルボロン酸含有基がグラフトされたＰＢＡ修飾ＨＡポリマーを作製する工程、
ｂ）ヒドロキシル上にシス−ジオール含有基がグラフトされたシス−ジオール修飾ＨＡポリマーを作製する工程（ここで、前記シス−ジオールは二糖類、ヘキソース、ヘキソースのウロン酸誘導体、ヘキソサミン、ヘキソサミンのＮ−アセチル誘導体、グリセロール、マンニトールおよびシアル酸からなる群の中で選択される）、
ｃ）工程ａ）のＰＢＡ修飾ＨＡポリマーの水溶液と工程のシス−ジオール修飾ＨＡポリマーの水溶液を７〜１０の間、好ましくは７．２〜９．５の間を含んでなるｐＨで混合して、可逆的に架橋されたヒドロゲルを得る工程
を含んでなる方法である。
【００４２】
本発明の別の目的は、ＨＡポリマー組成物を含んでなる可逆的に架橋されたヒドロゲルを製造するための方法であって、
ａ）少なくとも１つのヒドロキシル上にフェニルボロン酸含有基がグラフトされたＰＢＡ修飾ＨＡポリマーを作製する工程（ここで、前記基は、フェニルボロン酸、３−アミノフェニルボロン酸、４−アミノフェニルボロン酸、４−（アミノエチルカルバモイル）−３−フルオロフェニルボロン酸および４−［（２−アミノエチル）カルバモイル］フェニルボロン酸からなる群の中で選択される）、
ｂ）ヒドロキシル上にシス−ジオール含有基がグラフトされたシス−ジオール修飾ＨＡポリマーを作製する工程（ここで、前記シス−ジオールは二糖類、ヘキソース、ヘキソースのウロン酸誘導体、ヘキソサミン、ヘキソサミンのＮ−アセチル誘導体、グリセロール、マンニトールおよびシアル酸からなる群の中で選択される）、
ｃ）工程ａ）のＰＢＡ修飾ＨＡポリマーの水溶液と工程ｂ）のシス−ジオール修飾ＨＡポリマーの水溶液を７〜１０の間、好ましくは７．２〜９．５の間を含んでなるｐＨで混合して、可逆的に架橋されたヒドロゲルを得る工程
を含んでなる方法である。
【００４３】
好ましくは、工程ｃ）において、工程ａ）のＰＢＡ修飾ＨＡポリマーの水溶液と工程ｂ）のシス−ジオールＨＡポリマーの水溶液の混合は薬物の存在下で行い、それにより、薬物をＨＡポリマー組成物に組み込む。
【００４４】
本発明の別の目的は、ＨＡポリマー組成物を含んでなる二重架橋ヒドロゲルを製造するための方法であって、
ａ）少なくとも１つのヒドロキシル上にフェニルボロン酸含有基がグラフトされ（ここで、前記基は、フェニルボロン酸、３−アミノフェニルボロン酸、４−アミノフェニルボロン酸、４−（アミノエチルカルバモイル）−３−フルオロフェニルボロン酸および４−［（２−アミノエチル）カルバモイル］フェニルボロン酸からなる群の中で選択される）、かつ、少なくとも１つのヒドロキシル上にアルケン基がグラフトされたＰＢＡ修飾ＨＡポリマーを作製する工程、
ｂ）ヒドロキシル上にシス−ジオール含有基がグラフトされ（ここで、前記シス−ジオールは二糖類、ヘキソース、ヘキソースのウロン酸誘導体、ヘキソサミン、ヘキソサミンのＮ−アセチル誘導体、グリセロール、マンニトールおよびシアル酸からなる群の中で選択される）、かつ、少なくとも１つのヒドロキシル上にアルケン基がグラフトされたシス−ジオール修飾ＨＡポリマーを作製する工程、
ｃ）工程ａ）のＰＢＡ修飾ＨＡポリマーの水溶液と工程ｂ）のシス−ジオール修飾ＨＡポリマーの水溶液を３〜６．５のｐＨで混合して、ＨＡポリマー組成物を得る工程、
ｄ）工程ｃ）で得られたＨＡポリマー組成物を、ＨＡポリマー組成物上のアルケン基へのＰＥＧ−（ＳＨ）２のラジカル付加により光架橋して、化学的に架橋されたＨＡポリマー組成物を得る工程、
ｅ）工程ｄ）のＨＡポリマー組成物を７〜１０の間、優先的には７．２〜９．５の間を含んでなるｐＨで架橋する工程
を含んでなる方法である。
【００４５】
好ましい実施態様では、工程ｄ）の後、薬物がＨＡポリマー組成物に組み込まれる。
【発明の具体的説明】
【００４６】
本発明は、ＰＢＡ（フェニルボロン酸）で修飾されたＨＡ誘導体とシス−ジオールで修飾されたＨＡ誘導体を混合することにより得られるポリマー組成物を記載する。
【００４７】
これらの親水性ＨＡポリマーを架橋することにより、ポリマー鎖の網状構造が得られ、その結果、水吸収性の高いヒドロゲルが形成される。
【００４８】
より詳しくは、７〜１０の範囲のｐＨで、ボロン酸−シス−ジオール複合体によるＨＡ分子の架橋が起こり、本発明の組成物は動的マトリックスまたはヒドロゲルを形成する。驚くことに、通常アルカリｐＨでのみ安定なボロン酸−シス−ジオール複合体は、生理学的ｐＨ（７．４）を含む、より低いｐＨで著しい安定性を示す。
【００４９】
これらの組成物は、遊離グルコースによるＰＢＡ修飾ＨＡからのシス−ジオール修飾ＨＡの競合的排除に基づくグルコース感受性粘度を示す動的ヒドロゲルを形成する。
【００５０】
本発明のヒドロゲルは、それらを注射または移植の両方に好適とする軟質から硬質の範囲の特性を持ち得る。
【００５１】
本発明では、用語「ＨＡ」は、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロナン、ヒアルロン酸またはヒアルロン酸塩、特に、ＣＡＳ番号９００４−６１−９および９０６７−３２−７（ナトリウム塩）を有するヒアルロナンを意味する。
【００５２】
ＨＡグリコサミノグリカンは、下式：
【化１１】
2015537078.tif 000012
により表すことができる。
【００５３】
本発明の組成物は、少なくとも１つのヒドロキシル上にフェニルボロン酸含有基がグラフトされたＰＢＡ修飾ＨＡポリマーと、少なくとも１つのヒドロキシル上にシス−ジオール含有基がグラフトされたシス−ジオール修飾ＨＡポリマーとを含んでなる。ＰＢＡ修  飾ＨＡおよびシス−ジオール修飾ＨＡは、ＨＡポリマーの特にヒドロキシル基上にグラフトされた他のいずれの官能基を含んでなってもよい。
【００５４】
一般に、本発明のポリマー組成物は、ＰＢＡ修飾ＨＡの水溶液とシス−ジオール修飾ＨＡの水溶液を混合することにより得られる。ｐＨ７〜１０、より好ましくは７．２〜９．５で、これらのＨＡ分子を架橋するボロン酸−シス−ジオール複合体を含んでなる動的ヒドロゲルが形成される。ボロン酸−シス−ジオール複合体はグルコース感受性があり、従って、本発明のヒドロゲルの膨潤、粘度および透過性は、媒体中のグルコースの存在および媒体中に存在するグルコースの量によって異なる。
【００５５】
本発明の組成物およびヒドロゲルは、グルコース感受性である。いずれの薬物またはＡＰＩ（有効医薬成分）でも本発明の組成物およびヒドロゲルに組み込むことができる。本発明の組成物およびヒドロゲルは薬物送達システムとして使用可能であり、本ヒドロゲルからの薬物の放出はグルコース濃度によって調節される。
【００５６】
本発明の第１の目的は、
ａ）少なくとも１つのヒドロキシル上にフェニルボロン酸含有基がグラフトされたＰＢＡ修飾ＨＡポリマーと、
ｂ）少なくとも１つのヒドロキシル上にシス−ジオール含有基がグラフトされたシス−ジオール修飾ＨＡポリマー
との混合物を含んでなるポリマー組成物である。
【００５７】
本発明において、フェニルボロン酸含有基（ＰＢＡ）は、シス−ジオール含有基を有するボロン酸−シス−ジオール複合体を形成することができるＰＢＡまたはＰＢＡ誘導体を含んでなるいずれの基であってもよい。
【００５８】
本発明において、シス−ジオール含有基は好ましくは、
・マルトース、ラクトースおよびスクロースなどの二糖類；
・グルコース、ガラクトースおよびマンノースなどのヘキソース；
・グルクロン酸、ガラクツロン酸、およびマンヌロン酸などのヘキソースのウロン酸誘導体；
・ガラクトサミンおよびグルコサミンなどのヘキソサミン；
・Ｎ−アセチル−ガラクトサミンおよびＮ−アセチル−グルコサミンなどのヘキソサミンのＮ−アセチル誘導体；
・グリセロール；
・マンニトール；ならびに
・シアル酸
からなる群の中で選択される。
【００５９】
本発明の第１の実施態様では、ポリマー組成物は、
ａ）少なくとも１つのヒドロキシル上にフェニルボロン酸含有基がグラフトされたＰＢＡ修飾ＨＡポリマー（ここで、前記基は、フェニルボロン酸、３−アミノフェニルボロン酸、４−アミノフェニルボロン酸、４−（アミノエチルカルバモイル）−３−フルオロフェニルボロン酸および４−［（２−アミノエチル）カルバモイル］フェニルボロン酸からなる群の中で選択される）と、
ｂ）少なくとも１つのヒドロキシル上にシス−ジオール含有基がグラフトされたシス−ジオール修飾ＨＡポリマー（ここで、前記シス−ジオールは、二糖類、ヘキソース、ヘキソースのウロン酸誘導体、ヘキソサミン、ヘキソサミンのＮ−アセチル誘導体、グリセロール、マンニトールおよびシアル酸からなる群の中で選択され）
との混合物を含んでなる。
【００６０】
本発明の第２の実施態様では、ポリマー組成物は、
ａ）少なくとも１つのヒドロキシル上に３−アミノフェニルボロン酸含有基がグラフトされたＰＢＡ修飾ＨＡポリマーと、
ｂ）少なくとも１つのヒドロキシル上にマルトース含有基がグラフトされたシス−ジオール修飾ＨＡポリマー
との混合物を含んでなる。
【００６１】
本発明の第３の実施態様では、ポリマー組成物は、
ａ）少なくとも１つのヒドロキシル上に式（Ｉ）：
【化１２】
2015537078.tif 000013
のＰＢＡ基がグラフトされたＰＢＡ修飾ＨＡポリマーと、
ｂ）少なくとも１つのヒドロキシル上に式（ＩＩ）：
【化１３】
2015537078.tif 000014
のマルトース基がグラフトされたシス−ジオール修飾ＨＡポリマー
との混合物を含んでなる。
【００６２】
本発明のポリマー組成物では、ＰＢＡ修飾ＨＡポリマーは好ましくは、チオール−エンカップリングを介して少なくとも１つのヒドロキシル上にフェニルボロン酸含有基がグラフトされ、かつ、シス−ジオール修飾ＨＡポリマーは好ましくは、チオール−エンカップリングを介して少なくとも１つのヒドロキシル上にシス−ジオール含有基がグラフトされる。
【００６３】
本発明者らにより開発されたチオール−エンカップリングに基づく合成ストラテジーは、様々な置換度を有するＰＢＡ修飾ＨＡおよびシス−ジオール修飾ＨＡを提供する。この合成ストラテジーから考えて、これらのＨＡポリマーはまた、ポリマー鎖に沿ったヒドロキシル基上にグラフトされたアルケン基も有し得る。これらのアルケン基は、本発明のグルコース感受性ヒドロゲルを化学的に架橋するために有利に使用することができる。アルケン基はさらに、ＨＡポリマーのさらなる官能基化のためにも使用可能である。この合成ストラテジーは、ＷＯ２０１２／０６６１３３にも記載されている。
【００６４】
本発明のポリマー組成物では、ＰＢＡ修飾ＨＡポリマーは好ましくは、少なくとも１つのヒドロキシル上にアルケン基がさらにグラフトされ、かつ、シス−ジオール修飾ＨＡポリマーは好ましくは、少なくとも１つのヒドロキシル上にアルケン基がさらにグラフトされる。
【００６５】
本発明のポリマー組成物では、アルケン基は好ましくは、ペンテノエートおよびマレイミドからなる群の中で選択される。
【００６６】
本発明のポリマー組成物では、ＰＢＡ修飾ＨＡポリマーは好ましくは、アルケン基によるＤＳが０．０２〜０．６、より好ましくは０．０５〜０．５であり、かつ、シス−ジオール修飾ＨＡポリマーは好ましくは、アルケン基によるＤＳが０．０２〜０．６、より好ましくは０．０５〜０．５である。
【００６７】
本ポリマーのヒドロキシル基を介し、ＨＡ鎖に沿ってＰＢＡ基またはシス−ジオール基をグラフトするために、他のいずれの方法を用いてもよい。
【００６８】
本発明の第４の実施態様では、ポリマー組成物は、
ａ）式（ＩＩＩ）：
【化１４】
2015537078.tif 000015
｛式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、Ｈ、式（Ｉ）：
【化１５】
2015537078.tif 000016
のＰＢＡ基および式（ＩＶ）：
【化１６】
2015537078.tif 000017
のアルケン基からなる群の中で独立に選択され、
ｎ１は、２５〜８０００、好ましくは５０〜２０００の整数であり
式（Ｉ）のＰＢＡ基によるＤＳは、０．０２〜０．６、好ましくは０．０５〜０．２であり、
式（ＩＶ）のアルケン基によるＤＳは、０〜０．６、好ましくは０．０２〜０．６である｝
で示されるＰＢＡ修飾ＨＡポリマーと、
ｂ）式（Ｖ）：
【化１７】
2015537078.tif 000018
｛式中、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、Ｈ、式（ＩＩ）：
【化１８】
2015537078.tif 000019
のマルトース基および式（ＩＶ）：
【化１９】
2015537078.tif 000020
のアルケン基からなる群の中で独立に選択され、
ｎ２は、２５〜８０００、好ましくは５０〜２０００の整数であり、
マルトース基によるＤＳは、０．０２〜０．６、好ましくは０．０５〜０．２であり、
アルケン基によるＤＳは、０〜０．６、好ましくは０．０２〜０．６である｝
で示されるシス−ジオール修飾ＨＡポリマー
との混合物を含んでなる。
【００６９】
本発明のポリマー組成物では、ＰＢＡ修飾ＨＡポリマーは好ましくは、フェニルボロン酸含有基によるＤＳが０．０２〜０．６、より好ましくは０．０５〜０．２である。
【００７０】
本発明のポリマー組成物では、シス−ジオール修飾ＨＡポリマーは好ましくは、シス−ジオール含有基によるＤＳが０．０２〜０．６、より好ましくは０．０５〜０．２である。
【００７１】
本発明のポリマー組成物では、ＰＢＡ修飾ＨＡポリマーは好ましくは、アルケン基によるＤＳが０．０２〜０．６、より好ましくは０．０５〜０．５であり、かつ、シス−ジオール修飾ＨＡポリマーは好ましくは、アルケン基によるＤＳが０．０２〜０．６、より好ましくは０．０５〜０．５である。
【００７２】
本発明のポリマー組成物では、アルケン基は好ましくは、ペンテノエートおよびマレイミドからなる群の中で選択される。
【００７３】
本発明のポリマー組成物では、ＰＢＡ修飾ＨＡポリマーは好ましくは、分子量Ｍｗが１００００ｇ／ｍｏｌ〜３００００００ｇ／ｍｏｌ、より優先的には２００００ｇ／ｍｏｌ〜８０００００ｇ／ｍｏｌであり、かつ、シス−ジオール修飾ＨＡポリマーは、分子量Ｍｗが１００００ｇ／ｍｏｌ〜３００００００ｇ／ｍｏｌ、より優先的には２００００ｇ／ｍｏｌ〜８０００００ｇ／ｍｏｌである。
【００７４】
本発明のポリマー組成物では、フェニルボロン酸含有基とシス−ジオール含有基の間のモル比は、好ましくは０．２５／１〜２．５／１、より好ましくは０．５／１〜２／１である。
【００７５】
本発明のポリマー組成物は好ましくは、７〜１０、好ましくは７．２〜９．５、より好ましくは７．２〜７．５、いっそうより好ましくは７．４（生理学的ｐＨ）のｐＨを有する。
【００７６】
本発明の組成物は、中性またはアルカリｐＨで架橋されたヒドロゲルを形成する。ＰＢＡ修飾ＨＡポリマーとシス−ジオール修飾ＨＡポリマーは、それらのフェニルボロン酸含有基およびそれらのシス−ジオール含有基を介して可逆的に、共有結合的に架橋される。この架橋は、グルコースに応答して変化するので、「動的」または「可逆的」である。
【００７７】
これらの動的ヒドロゲルの膨潤、粘度および透過性はまた、組成物の各修飾ＨＡポリマーのＰＢＡ基またはシス−ジオール基によるＤＳにも依存する。ポリマー組成物中のフェニルボロン酸含有基とシス−ジオール含有基の間のモル比もまた、ＨＡヒドロゲルの特性ならびにＨＡポリマーのＭｗを決定する。
【００７８】
調整可能なグルコース感受性を有するヒドロゲルは、これらの種々のパラメーターを変更することにより得られる。
【００７９】
薬物、ＡＰＩまたは他の任意の有効成分は、ボロン酸−シスジオール複合体の形成によるＨＡポリマーの可逆的架橋前または架橋中にヒドロゲルに組み込むことができる。
【００８０】
ボロン酸−シスジオール複合体の形成を介してＨＡポリマーのＰＢＡ基およびシス−ジオール基を架橋することにより得られたヒドロゲルは、特に、注射可能なヒドロゲルとして使用可能である。
【００８１】
これらのヒドロゲルはまた、５０〜１０００ｎｍの間、好ましくは１００〜５００ｎｍの間を含んでなるサイズを有するナノ粒子として処方することもできる。これらのナノ粒子はまた、注射による投与にも好適である。
【００８２】
よって、本発明の別の目的は、ＰＢＡ修飾ＨＡポリマーとシス−ジオール修飾ＨＡポリマーがそれらのフェニルボロン酸含有基およびそれらのシス−ジオール含有基を介して可逆的に、共有結合的に架橋されたポリマー組成物を含んでなる注射可能なヒドロゲルである。
【００８３】
本発明のポリマー組成物は、当業者に公知の任意の適当な方法によってさらに化学的に  架橋されてもよい。
【００８４】
本発明において、ＨＡポリマー組成物の化学的架橋は、ＨＡポリマー鎖に沿ったヒドロキシル上にグラフトされたアルケン基を介して行われてよい。これらの実施態様では、ＰＢＡ修飾ＨＡポリマーとシス−ジオール修飾ＨＡポリマーは、それらのアルケン基を介して化学的に架橋される。
【００８５】
ＰＢＡ修飾ＨＡとシス−ジオール修飾ＨＡは、当業者に公知のいずれの方法によって、それらのアルケン基を介して化学的にさらに架橋されてもよい。好ましい実施態様では、化学的に架橋されたヒドロゲルの形成は、ラジカル−チオールエン付加反応によって行われる。好ましくは、ＰＢＡ修飾ＨＡポリマーとシス−ジオール修飾ＨＡポリマーは、ビスチオール化ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ−（ＳＨ）２）との光架橋反応により、それらのアルケン基を介して化学的に架橋される。
【００８６】
化学的架橋後、薬物、ＡＰＩまたは任意の有効成分は、ＨＡポリマー鎖に沿ったＰＢＡ基およびシス−ジオール基を介して可逆的および動的グルコース感受性架橋が行われる前に、ヒドロゲルに組み込まれてよい。
【００８７】
好ましくは、ＰＢＡ修飾ＨＡポリマーとシス−ジオール修飾ＨＡポリマーとを含んでなる化学的に架橋されたヒドロゲルは、それらのフェニルボロン酸含有基およびそれらのシス−ジオール含有基を介して、さらに可逆的に、共有結合的に架橋される。
【００８８】
ＰＢＡ修飾ＨＡポリマーとシス−ジオール修飾ＨＡポリマーがそれらのアルケン基を介して化学的に架橋され、かつ、それらのフェニルボロン酸含有基およびそれらのシス−ジオール含有基を介してさらに可逆的に、共有結合的に架橋されたポリマー組成物を含んでなる、これらの二重架橋されたヒドロゲルは、特に、移植可能なヒドロゲルとして使用され得る。
【００８９】
本発明の二重架橋されたヒドロゲルはまた、５０〜１０００ｎｍの間、好ましくは１００〜５００ｎｍの間を含んでなるサイズを有するナノ粒子として処方してもよい。これらのナノ粒子は、注射による投与に好適である。
【００９０】
本発明の別の目的は、ＰＢＡ修飾ＨＡポリマーとシス−ジオール修飾ＨＡポリマーがそれらのアルケン基を介して化学的に架橋され、かつ、それらのフェニルボロン酸含有基およびそれらのシス−ジオール含有基を介してさらに可逆的に、共有結合的に架橋されたポリマー組成物を含んでなる、移植可能なヒドロゲルである。
【００９１】
本発明の別の目的は、上記のようなポリマー組成物と前記ポリマー組成物中に含有される薬物または有効成分とを含んでなる薬物送達システムである。本発明の薬物送達システムは、薬物または有効成分のグルコース感受性放出を提供する。好ましくは、本発明による薬物送達システムは、薬剤として使用するためのものである。好ましくは、本発明による薬物送達システムは、糖尿病の治療方法において使用するためのものである。好ましい実施態様では、薬物はインスリンである。
【００９２】
多様な様式で本発明のヒドロゲルを作製するために、本発明者らは、様々な置換度を有するＰＢＡ修飾ＨＡおよびシス−ジオール修飾ＨＡの合成を可能とする合成ストラテジーを開発した。ヒドロゲルの挙動は、遊離グルコースの不在下および存在下、水溶液中のＨＡ−ＰＢＡ／ＨＡ−シス−ジオール混合物の動的レオロジーを測定することによって定量した。特に、本発明者らは、グルコース応答のタイプがＨＡ結合ＰＢＡとＨＡ結合シス−ジオールの間の比を変更することによって強い影響を受け、有利にはこれを用いて、グルコース感受性を厳密に調整し、ヒドロゲルからの薬物の放出を厳格に制御することができることを示した。これらの考慮事項に基づき、本発明の態様は、化学的に修飾された生体適合性および生分解性天然多糖からの、調整可能なグルコース感受性を有する動的ヒドロゲルの開発に関する。本発明の別の態様は、鎖に沿って様々な置換度（ＤＳ）でＰＢＡ基またはシス−ジオール部分のいずれかを有する多糖誘導体への多様な経路の開発に関する。特に、ＤＳに応じて、これらの多糖はまた、鎖に沿って、グルコース感受性網状構造を化学的に架橋するために使用可能なアルケン基も有し得る。得られた化学的ヒドロゲルは、血糖濃度に応じたそれらの可逆的膨潤の結果としての、例えば、自己調節インスリン送達を達成するための移植可能な材料として使用することができる。
【００９３】
ＨＡ誘導体は、スキーム１に示されるように、鎖に沿ってアルケン官能基を有する一般的な中間体から合成された。
スキーム１：チオール−エン反応に基づくＨＡ上へのフェニルボロン酸部分およびマルトース部分のグラフトのための合成ストラテジー
【化２０】
2015537078.tif 000021
【００９４】
ＰＢＡおよびシス−ジオールによるＨＡの官能基化のためのストラテジーは、その簡単さ、高い反応性、および利用可能な試薬の幅広さからクリック化学として分類されている「チオール−エン反応」による。チオール−エン反応は、チオエーテル結合の形成をもたらす二重結合上のチオールのラジカル付加に基づく。官能性チオールと反応させるために、ＷＯ２０１２／０６６１３３に従前に記載されている手順に従い、ＨＡをまずアルケン基で官能基化した。本発明者らは、実際に、水性有機媒体中で多糖と無水カルボン酸を反応させることによりＨＡをアルケン基で官能基化するための温和な条件を開発した。ＨＡ−アルケンの置換度は、［無水カルボン酸］／［ＨＡ］供給比を変更することによって調節することができる。例えば、［無水ペンテン酸］／［ＨＡ］比１を使用したところ、本発明者らはＤＳが０．２のペンテノエート修飾ＨＡを得、これをチオール−エン反応においてシス−ジオール−チオール誘導体およびＰＢＡ−チオール誘導体とさらに反応させた。
【００９５】
よって、本発明の別の目的は、少なくとも１つのヒドロキシル上にフェニルボロン酸含有基がグラフトされたＰＢＡ修飾ＨＡポリマーを製造するための方法であって、
ａ）ＨＡポリマーのヒドロキシルにアルケン基をグラフトして、アルケン基で修飾されたＨＡ中間体を得る工程、
ｂ）フェニルボロン酸含有基にチオール基をグラフトして、フェニルボロン酸−チオール誘導体を得る工程、
ｃ）工程ａ）で得られた生成物を工程ｂ）で得られた生成物と反応させて、チオエーテル結合を形成する工程
を含んでなる方法である。
【００９６】
好ましくは、工程ａ）において、アルケン基はペンテノエートおよびマレイミドから選択される。
【００９７】
好ましくは、工程ｂ）において、得られるフェニルボロン酸−チオール誘導体は、式（ＶＩ）：
【化２１】
2015537078.tif 000022
の化合物である。
【００９８】
本発明の別の目的は、少なくとも１つのヒドロキシル上にシス−ジオール含有基がグラフトされたシス−ジオール修飾ＨＡポリマーを製造するための方法であって、
ａ）ＨＡポリマーのヒドロキシルにアルケン基をグラフトして、アルケン基で修飾されたＨＡ中間体を得る工程、
ｂ）シス−ジオールにチオール基をグラフトしてチオールシス−ジオールを得る工程、
ｃ）工程ａ）で得られた生成物を工程ｂ）で得られた生成物と反応させて、チオエーテル結合を形成する工程
を含んでなる方法である。
【００９９】
好ましくは、工程ａ）において、アルケン基はペンテノエートおよびマレイミドから選択される。
【０１００】
好ましくは、工程ｂ）において、シス−ジオールはマルトースであり、得られるチオールシス−ジオールは、式（ＶＩＩ）：
【化２２】
2015537078.tif 000023
の化合物である。
【０１０１】
本発明の別の目的は、ＨＡポリマー組成物を含んでなる動的および／または可逆的に架橋されたヒドロゲルを製造するための方法であって、
ａ）少なくとも１つのヒドロキシル上にフェニルボロン酸含有基がグラフトされたＰＢＡ修飾ＨＡポリマーを作製する工程；
ｂ）ヒドロキシル上にシス−ジオール含有基がグラフトされたシス−ジオール修飾ＨＡポリマーを作製する工程；
ｃ）工程ａ）のＰＢＡ修飾ＨＡポリマーの水溶液と工程ｂ）のシス−ジオール修飾ＨＡポリマーの水溶液を７〜１０の間、優先的には７．２〜９．５の間を含んでなるｐＨで混合して、動的にかつ／または可逆的に架橋されたヒドロゲルを得る工程
を含んでなる方法である。
【０１０２】
本発明の別の目的は、ＨＡポリマー組成物を含んでなる可逆的に架橋されたヒドロゲルを製造するための方法であって、
ａ）少なくとも１つのヒドロキシル上にフェニルボロン酸含有基がグラフトされたＰＢＡ修飾ＨＡポリマーを作製する工程（ここで、前記基は、フェニルボロン酸、３−アミノフェニルボロン酸、４−アミノフェニルボロン酸、４−（アミノエチルカルバモイル）−３−フルオロフェニルボロン酸および４−［（２−アミノエチル）カルバモイル］フェニルボロン酸からなる群の中で選択される）、
ｂ）ヒドロキシル上にシス−ジオール含有基がグラフトされたシス−ジオール修飾ＨＡポリマーを作製する工程（ここで、前記シス−ジオールは、二糖類、ヘキソース、ヘキソースのウロン酸誘導体、ヘキソサミン、ヘキソサミンのＮ−アセチル誘導体、グリセロール、マンニトールおよびシアル酸からなる群の中で選択される）、
ｃ）工程ａ）のＰＢＡ修飾ＨＡポリマーの水溶液と工程ｂ）のシス−ジオール修飾ＨＡポリマーの水溶液を７〜１０の間、優先的には７．２〜９．５の間を含んでなるｐＨで混合して、可逆的に架橋されたヒドロゲルを得る工程
を含んでなる方法である。
【０１０３】
ヒドロゲルの可逆的／動的グルコース感受性架橋前または架橋中に、薬物、または他の任意の有効成分を任意の適当な方法によってヒドロゲルに組み込むことができる。架橋工程の前に、薬物または有効成分を一般にＨＡポリマー組成物を含有する水溶液に加え、その組成物中に拡散させるか、またはＨＡ組成物に混合する。あるいは、薬物は可逆的架橋工程中にＨＡ組成物に加えてもよい。
【０１０４】
好ましい実施態様では、工程ｃ）において、工程ａ）のＰＢＡ修飾ＨＡポリマーの水溶液と工程ｂ）のシス−ジオールＨＡポリマーの水溶液の混合は薬物の存在下で行い、それにより、その薬物をＨＡポリマー組成物に組み込む。
【０１０５】
本発明の別の目的は、ＨＡポリマー組成物を含んでなる二重架橋ヒドロゲルを製造するための方法であって、
ａ）少なくとも１つのヒドロキシル上にフェニルボロン酸含有基がグラフトされ（ここで、前記基は、フェニルボロン酸、３−アミノフェニルボロン酸、４−アミノフェニルボロン酸、４−（アミノエチルカルバモイル）−３−フルオロフェニルボロン酸および４−［（２−アミノエチル）カルバモイル］フェニルボロン酸からなる群の中で選択される）、かつ、少なくとも１つのヒドロキシル上にアルケン基がグラフトされたＰＢＡ修飾ＨＡポリマーを作製する工程、
ｂ）ヒドロキシル上にシス−ジオール含有基がグラフトされ（ここで、前記シス−ジオールは、二糖類、ヘキソース、ヘキソースのウロン酸誘導体、ヘキソサミン、ヘキソサミンのＮ−アセチル誘導体、グリセロール、マンニトールおよびシアル酸からなる群の中で選択される）、かつ、少なくとも１つのヒドロキシル上にアルケン基がグラフトされたシス−ジオール修飾ＨＡポリマーを作製する工程、
ｃ）工程ａ）のＰＢＡ修飾ＨＡポリマーの水溶液と工程ｂ）のシス−ジオール修飾ＨＡポリマーの水溶液を３〜６．５の間のｐＨで混合してＨＡポリマー組成物を得る工程、
ｄ）工程ｃ）で得られたＨＡポリマー組成物を、ＨＡポリマー組成物上のアルケン基へのＰＥＧ−（ＳＨ）２のラジカル付加により光架橋して、化学的に架橋されたＨＡポリマー組成物を得る工程、
ｅ）工程ｄ）のＨＡポリマー組成物を７〜１０の間、優先的には７．２〜９．５の間を含んでなるｐＨで架橋する工程
を含んでなる方法である。
【０１０６】
工程ｄ）は化学架橋工程であるが、工程ｅ）は、ボロン酸−シス−ジオール複合体の形成により得られる動的または可逆的架橋工程に相当する。上記のように、この第２の架橋工程は動的または可逆的であり、グルコース濃度に感受性がある。
【０１０７】
ＨＡ組成物の化学的架橋の後、ヒドロゲルの動的グルコース感受性架橋前または架橋中に、薬物または他の任意の有効成分を任意の適当な方法によってヒドロゲルに組み込むことができる。薬物または有効成分は一般にＨＡポリマー組成物を含有する水溶液に加え、その組成物中に拡散させるか、またはＨＡ組成物に混合する。
【０１０８】
化学的架橋工程の後、ＨＡ組成物を対象薬物または有効成分を含有する溶液に浸漬して、その薬物をＨＡ組成物中に拡散させることができる。あるいは、可逆的架橋工程中に、薬物または有効成分を７〜１０の間、優先的には７．２〜９．５の間を含んでなるｐＨでＨＡ組成物に直接加えてもよい。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】多糖（ＨＡ）鎖上にグラフトされたフェニルボロン酸部分およびマルトース部分の可逆的複合体形成に基づくグルコース感受性ヒドロゲル。
【図２】ＰＢＡ修飾ＨＡおよびマルトース修飾ＨＡの合成。Ａ）ＰＢＡ−チオールとアルケン基の供給モル比の関数としての、ＨＡ−ＰＢＡのペンテノエートにおけるＤＳおよびＰＢＡ基におけるＤＳならびに２者のＤＳの合計の変動；Ｂ）ＰＢＡ−チオールとアルケン基の供給モル比の関数としての、ＨＡ−マルトースのペンテノエートにおけるＤＳおよびマルトース基におけるＤＳならびに２者のＤＳの合計の変動。
【図３】Ａ）光開始剤（０．０５％ｗ／ｖ）およびＰＥＧ−（ＳＨ）２（アルケン基に対するチオール基のモル比＝１）の存在下、ＨＡ−ＰＢＡの溶液（ＤＳＰＢＡ＝０．０５、ＤＳｐ＝０．２９、Ｃｐ＝０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４中１５ｇ／Ｌ）（実線）およびＨＡ−マルトースの溶液（ＤＳｍａｌｔｏｓｅ＝０．０５、ＤＳｐ＝０．２９、Ｃｐ＝０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ  ７．４中１５ｇ／Ｌ）（点線）の時間に対する貯蔵弾性率（Ｇ’、黒い線）および損失弾性率（Ｇ’’、グレーの線）依存性。ｔ＝１分に始め、サンプルを２０ｍＷ／ｃｍ２強度のＵＶ照射に曝した（発振周波数は１Ｈｚに固定した）。Ｂ）光開始剤（０．０５％ｗ／ｖ）およびＰＥＧ−ＳＨ２（アルケン基に対するチオール基のモル比＝１）の存在下、ＰＢＡおよびマルトースにおいて種々のＤＳを有するＨＡ−ＰＢＡおよびＨＡ−マルトースの溶液から作製したヒドロゲルの貯蔵弾性率の比較。
【図４】種々のＰＢＡ／マルトースモル比でのＨＡ−ＰＢＡ／ＨＡ−マルトースの混合物、および最初のＨＡ、ＨＡ−ＰＢＡ、ＨＡ−マルトース単独の溶液の動的レオロジー挙動の比較。Ａ）周波数の関数としての、貯蔵弾性率および損失弾性率の変動。Ｂ）周波数の関数としての、複素粘度の変動。総ポリマー濃度Ｃｐは１５ｇ／Ｌに固定した。溶媒：０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４；温度：２５℃。
【図５】種々の［ＰＢＡ］／［マルトース］比を有するＨＡ−ＰＢＡ／ＨＡ−マルトース混合物へのグルコース添加の影響。Ａ）遊離グルコース（１５ｍＭ）の不在下および存在下での、１Ｈｚにおける複素粘度値の比較。総ポリマー濃度Ｃｐは１５ｇ／Ｌに固定した。溶媒：０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４；温度：２５℃。Ｂ）遊離グルコースによるＨＡ鎖の架橋。Ｃ）グラフトされたマルトース部分の競合因子として働く遊離グルコースの添加時の網状構造の解離。
【図６】［ＰＢＡ］／［マルトース］最大比（２．５／１）のＨＡ−ＰＢＡ／ＨＡ−マルトース混合物に１５ｍＭ濃度でグルコースおよびα−Ｄ−ＧｌｕｃＭｅを添加した影響の比較。Ａ）１Ｈｚでの複素粘度値。総ポリマー濃度Ｃｐは１５ｇ／Ｌに固定した。溶媒：０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４；温度：２５℃。Ｂ）ＨＡ−ＰＢＡ／ＨＡ−マルトース複合体形成による網状構造の形成。Ｃ）遊離グルコース複合体形成による網状構造の増強。Ｄ）遊離グルコースの、グラフトされたＰＢＡ基への競合的結合による網状構造の崩壊。
【図７】異なる［ＰＢＡ］／［マルトース］比（１／１および１．５／１）を有するＨＡ−ＰＢＡ／ＨＡ−マルトース混合物から評価したグルコース濃度の関数としての｜η＊｜ｗｉｔｈ  Ｇｌｕｃ／｜η＊｜ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｇｌｕｃ（１Ｈｚにおける値）の変動。総ポリマー濃度Ｃｐは１５ｇ／Ｌに固定した。溶媒：０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４；温度：３７℃。
【図８】二重架橋ヒドロゲル。
【図９】二重架橋ヒドロゲルの形成。
【実施例】
【０１１０】
実施例１：チオール前駆体の合成
ＰＢＡ−ＳＨ
４℃にて超純水（１８ｍＬ）中、３−アミノフェニルボロン酸（ＡＰＢＡ、１ｇ、５．４ｍｍｏｌ）の溶液に、［１−エチル−３−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミド塩酸塩（１．２４ｇ、６．４８ｍｍｏｌ）を加えた。０．５Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨを４．８に調整し、このＡＰＢＡ溶液を窒素で２０分間脱気した。次に、超純水（５ｍＬ）に溶かしたメルカプトプロピオン酸（０．６８８ｍＬ、６．４８ｍｍｏｌ）を前記ＡＰＢＡ溶液に滴下し、反応混合物を窒素下、４℃で１時間撹拌した。窒素下、室温でさらに１２時間撹拌した後、修飾されたＡＰＢＡを酢酸エチルで５回抽出した。溶媒の蒸発後、残渣を水からの再結晶化により精製し、黄色固体として収率１８％で得た（０．２１５ｇ、０．９６ｍｍｏｌ）。
【０１１１】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ(ppm) : 7.83 (s, 1H, Ph), 7.70-7.72 (d, 1H, Ph), 7.45-7.47 (d,1H, Ph), 7.23-7.-7.27 (m,1H, Ph), 2.71-2.76 (m, 2H, CH2), 2.59-2.63 (m, 2H, CH2).
13C NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ(ppm): 20.2 (1C, SH-CH2), 39.8 (1C, CH2-C=O), 121.6, 125.7,128.1 (4C, CH Ph), 129.4 (1C, =C-B Ph), 138.7 (1C, NH-C, Ph), 169.8 (1C, C=O)
【０１１２】
マルトース−シスタミン
室温にて、４０ｍＬの超純水中、マルトース（０．４ｇ、１．１１１ｍｍｏｌ）の水溶液に、Ｏ−（カルボキシメチル）ヒドロキシルアミンヘミ塩酸塩（０．１２１ｇ、１．１１１ｍｍｏｌ）を加えた。０．５Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨを４．８に調整した。反応混合物を室温で２４時間撹拌した後、０．５Ｍ  ＮａＯＨの添加によりｐＨ７に中和した。その後、マルトース−ＣＯＯＨ誘導体を凍結乾燥により白色粉末として収率９１％で回収した（０．４２１ｇ、１．０１ｍｍｏｌ）。乾燥ＤＭＦ（７５ｍＬ）中、マルトース−ＣＯＯＨ（０，７５０ｇ、１．８ｍｍｏｌ）の溶液に、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（０，４８６ｇ、３，６ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（０．９０９ｇ、７．２ｍｍｏｌ）およびシスタミン（０．２０３ｇ、０．９ｍｍｏｌ）を順次加えた。得られた混合物を窒素下、室温で一晩撹拌した。大部分の溶媒の蒸発後、残ったシロップを、撹拌下のアセトン（５００ｍＬ）に滴下した。白色沈殿を濾取し、アセトンで３回洗浄し、乾燥させて、収率９１％で粗生成物（７７８ｇ、０．８ｍｍｏｌ）を得たところ、これは所望の誘導体（６５％）と最初のマルトース（３５％）を含んでいた。ＰＢＡ修飾ＨＡの合成に用いたチオール−エン付加の選択性により、粗生成物をそれ以上精製せずに使用した。
【０１１３】
1H NMR (400 MHz, D2O) d (ppm): 7.75 (1H,結合グルコース単位からのアノマーHβ, N=CHβ-), 7.05 (1H, 結合グルコース単位からのアノマーHα, N=CHα-), 5.4 (1H,ペンダントグルコース単位からのアノマーH), 5.07 (1H, 結合グルコース基からのN=CHα,β-CH(OH)), 4.7 (2H, O-CH2), 4.55 (1H, ペンダントグルコース基からのN=CHα,β-CH(OH)), 3.5-4.3 (結合およびペンダントグルコース基からの8H, H-3, H-4, H-5, H-6), 2.9 (2H, NH-CH2-CH2), 2.82 (2H, NH-CH2-CH2).
【０１１４】
実施例２：ペンテノエート修飾ＨＡの合成
ＨＡ−１００（１ｇ、２．５ｍｍｏｌ、Ｍｗ＝１０００００ｇ／ｍｏｌ）を４℃で超純水（５０ｍＬ）に溶かし、得られた混合物を、完全に溶解させるために連続撹拌下、４℃で一晩維持した。次に、（３／２、ｖ／ｖ）の水／ＤＭＦ比となるようにＤＭＦ（３３ｍＬ）を滴下した。ｐＨを８〜９の間に４時間維持しながら（０．５Ｍ  ＮａＯＨの添加による）無水ペンテン酸（０．４５４ｇ、２．５ｍｍｏｌ）を加えた。この反応物を４℃にて連続撹拌下で一晩維持した。この後、ＮａＣｌを、ＮａＣｌ濃度が０．５Ｍとなるように反応混合物に加えた。エタノールの添加（水／ＥｔＯＨ（ｖ／ｖ）比２／３）によりポリマーを沈殿させた。上清の除去後、沈殿を水／ＥｔＯＨの混合物（３／７、１／４、１／９、ｖ／ｖ）で順次洗浄し、最終的に、超純水を用いたダイアフィルトレーションによる最終精製のために超純水に溶かした。生成物を凍結乾燥により回収した（１．０２４ｇ）。ＨＡ−ペンテノエートの置換度は、１Ｈ  ＮＭＲにより０．２０±０．０１であることが判明した。
【０１１５】
1H NMR (400 MHz, D2O)δ(ppm): 4.55 (N-アセチルグルコサミン単位からのH-1), 4.25 (グルクロン酸からのH-1), 3.9-3.1 (HAのH -2, H-3, H-4, H-5, H-6プロトン), 1.85 (CH3-CO from HA), 5.80 (m,1H,CH=CH2), 4.98 (m,2H,CH=CH2), 2.45 (m,2H,CH2-C=O), 2.29 (m,2H,OCCH2-CH2).
【０１１６】
実施例３：ＨＡ−ＰＢＡの合成
光開始剤としてのＩｒｇａｃｕｒｅ  ２９５９（０．０５％ｗ／ｖ）の存在下、水／ＥｔＯＨ（３／２、ｖ／ｖ）の混合物中ＨＡ−ペンテノエートの溶液に、１ｍｌのＥｔＯＨに溶かしたＰＢＡ−ＳＨを加えた。ＰＢＡ−ＳＨ部分のグラフトは、ＵＶ照射（λ＝３６５ｎｍ）下で行った。生成物を、超純水を用いたダイアフィルトレーションにより精製し、凍結乾燥により回収した（０．２９８ｇ）。ＨＡ−ＰＢＡの置換度は、１Ｈ  ＮＭＲにより０．１２±０．０１であることが判明した。
【０１１７】
1H NMR (400 MHz, D2O) δ (ppm): 4.55 (N-アセチルグルコサミン単位からのH-1), 4.25 (グルクロン酸からのH-1), 3.9-3.1 (HA のH-2, H-3, H-4, H-5, H-6 プロトン), 1.85 (HAからの CH3-CO ), 7.66 (s,1H, Ph からのNH-C-CH-C-B), 7.49 (m,2H, Ph からのC-CH-CH-CH-C-B), 7.37 (m,1H, Ph からのC-CH-CH-CH-C-B), 2.81 (m,2H, CH2-CO), 2.64 (m,2H, S-CH2-CH2-CO), 2.53 (m,2H, CH2-CH2-CH2-S), 1,55 (m, 4H, CH2-CH2-CH2-S).
【０１１８】
実施例４：ＨＡ−マルトースの合成
第１の工程は、マルトース−シスタミンのジスルフィド結合の還元からなる。よって、室温にて、４ｍＬの脱気超純水中、マルトース−シスタミン（０．２ｇ、０．２１１ｍｍｏｌ）の水溶液に、１ｍｌの脱気超純水中、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（９１ｍｇ、０．３１７ｍｍｏｌ）の溶液を加え、ｐＨを５〜５．５に調整した。この混合物を窒素下、室温で１５分間撹拌し、マルトース−ＳＨを得た。０．１Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨを７．４に調整し、この溶液を、光開始剤としてのＩｒｇａｃｕｒｅ  ２９５９（０．０５％ｗ／ｖ）の存在下、ＨＡ−ペンテノエートの水溶液に加えた。マルトース−ＳＨ部分のグラフトは、ＵＶ照射（λ＝３６５ｎｍ）下で行った。生成物を、超純水を用いたダイアフィルトレーションにより精製し、凍結乾燥により回収した（０．１４８ｇ）。ＨＡ−マルトースの置換度は、１Ｈ  ＮＭＲにより０．０６±０．０１であることが判明した。
【０１１９】
1H NMR (400 MHz, D2O) δH (ppm) 4.55 (N-アセチルグルコサミン単位からのH-1), 4.25 (グルクロン酸からのH-1), 3.9-3.1 (HA のH-2, H-3, H-4, H-5, H-6プロトン), 1.85 (HA からのCH3-CO), 1.52 (m,2H,CH2-CH2-CH2-S), 1.62 (m,2H,CH2-CH2-CH2-S), 2.35 (m, 2H, OC-CH2) 2.63 (m,2H, CH2-CH2-CH2-S), 2.82 (m,2H, S-CH2-CH2-NH), 7.63 (m, 1H, マルトースのHアノマー). 
【０１２０】
実施例５：動的ヒドロゲルの形成およびレオロジー挙動
生理学的ｐＨのＨＡ−ＰＢＡ（ＤＳ＝０．１２）水溶液とＨＡ−マルトース（ＤＳ＝０．０６）水溶液を混合することにより動的ヒドロゲルを形成した。これらの混合物は、塩（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）の存在下、総ポリマー濃度１５ｇ／Ｌ（最初のＨＡの臨界重なり濃度Ｃ＊（約３．３ｇ／Ｌ）の約３倍）に関して肉眼的に透明な「ヒドロゲル」の形成をもたらす。このような網状構造の形成は、ＨＡ鎖に沿ってグラフトされたＰＢＡ部分とマルトース部分間で多くの複合体が同時に形成されることによる。興味深いことに、架橋は生理学的ｐＨで見られ、これは、アルカリｐＨでのみ安定に存在し得るこのボロン酸誘導体を含む他のポリマー複合体に比べて異例である。生理学的ｐＨでボロン酸−グルコース複合体形成を達成するには、一般にもっと複雑な化学を要する。以下に示すように、ＰＢＡ誘導体は、水溶液中で両方の荷電状態、親水性でも、非荷電状態でも、比較的疎水性でも存在する。ジオールを添加すると、荷電状態（２）のみが可逆的共有結合を介してジオールと安定な複合体を形成し、中性型（１）は加水分解を極めて受けやすいとされている。本場合には、ＨＡ上に電荷およびジオール基が大過剰で存在するので状況が違うと思われる。これは非荷電三角エステル型のＰＢＡ（３）の形成を促し、本明細書の下記に示す平衡に大きな影響を与え得る。従前に述べたように、平衡に及ぼす中性エステル（３）の影響は、特定のジオールに対する全体的なボロン酸の親和性を評価する上で無視することができない。また、多くの単糖類のボロン酸エステルのｐＫａは、ボロン酸のｐＫａより２〜４単位低いことも報告されている。結果として、ＨＡ上にＰＢＡをグラフトするとＰＢＡの見かけのｐＫａがエステルのｐＫａに近づき、生理学的ｐＨでボロン酸−グルコース複合体の形成を可能とすると想定することができる。
【０１２１】
ジオールの存在下の水溶液中でのフェニルボロン酸(phenyboronic acid)の平衡
【化２３】
2015537078.tif 000024
【０１２２】
図４Ａは、種々のＰＢＡ／マルトースモル比（［ＰＢＡ］／［マルトース］＝０．５、１、１．５、２．１４、２．５）のＨＡ−ＰＢＡ／ＨＡ−マルトース混合物（総ポリマー濃度Ｃｐ＝１５ｇ／Ｌ）の動的レオロジー係数Ｇ’およびＧ’’と最初のＨＡおよびその誘導体（ＨＡ−ＰＢＡ、ＨＡ−マルトース）単独の溶液（Ｃｐ＝１５ｇ／Ｌ）のそれとの周波数依存を比較したものである。この図から、ポリマー濃度は同じであるにも関わらず、混合物の貯蔵弾性率および損失弾性率の値がＨＡおよびその誘導体単独の溶液に関して得られた値よりもはるかに高いことが見て取れる。弾性率は少なくとも２桁高い。さらに、ＨＡ−ＰＢＡ／ＨＡ−マルトース混合物に関しては広範囲の周波数でＧ’がＧ’’よりも大きく、カバーされる全周波数範囲で粘稠な特徴（Ｇ’’＞Ｇ’）示すＨＡ、ＨＡ−ＰＢＡおよびＨＡ−マルトースの溶液とは対照的に粘弾性の挙動を反映している。従って、これらの結果は、グラフトされたＰＢＡ部分とマルトース部分の間の効果的な複合体形成、従って、動的三次元網状構造の創出の証拠を示した。マルトースに対するＰＢＡの量をＰＢＡ／マルトースモル比１．５まで高めると、弾性率（図４Ａ）および複素粘度（図４Ｂ）の増加がもたらされる。ＰＢＡ／マルトース比が１．５を超えても、弾性率および複素粘度は一定のままである。このことは、有効鎖間結合の密度が高いほどＰＢＡ／マルトース複合体形成の確率が高くなることを示す。このような結果は、ＰＢＡがＨＡの糖単位との環状ボロン酸エステルも形成し得るということに関連する可能性があり、より安定な結合点の形成にはマルトースに対して過剰量のＰＢＡが必要とされることを暗示している。
【０１２３】
実施例６：グルコース量の関数としての粘度の測定
これらのデータから、これらの混合物はグルコースの付加に感受性があると思われる。このことを、混合物の複素粘度を加えたグルコースの量の関数として測定することによって確認した（図５）。より重要なこととして、本発明者らは、単にＨＡ−ＰＢＡ／ＨＡ−マルトース比を変更することで応答のタイプを制御できることを示した。図５Ａから見て取れるように、１５ｍＭ濃度のグルコース（糖尿病患者の高血中濃度、すなわち、正常血糖の３倍に相当）を０．２５／１〜１．５／１の範囲のＰＢＡ／マルトース比のＨＡ−ＰＢＡ／ＨＡ−マルトース混合物に付加すると、複素粘度の低下が見られ、遊離グルコースとＨＡ鎖の末端グルコース部分の間の競合的排除機構が働くことを示す。これに対して、より比率の高い（２．１４／１および２．５／１）混合物に同じ濃度のグルコースを加えると、複素粘度の増加が見られる。ある特定の単糖類は、１，２−ジオールと４，６−または５，６−ジオールを用いて２つのボロン酸基に結合可能であることが知られている。Ｄ−グルコースは、高架橋形成能を有するこのような単糖類の１つである。従って、後者の系で、グルコース分子は架橋剤としても働き得ることが合理的に推測できる。この場合、ヒドロゲルはグルコース付加時に収縮を受ける。この挙動もまた、自己調節送達システムにおいてインスリン出力を制御するために有用であり得る。実際に、グルコース感受性ヒドロゲルは、膜孔内に注型またはグラフトされた後にそれらのゲート開閉特性に関して使用することができる。ヒドロゲル収縮は、グルコース濃度の関数として膜の透過性を高める。
【０１２４】
実施例７：１−Ｏ−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシドを用いた競合的排除実験
この仮説は、１−Ｏ−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド（α−Ｄ−ＧｌｕｃＭｅ）を用いた競合的排除実験によってさらに裏付けられた。Ｄ−グルコースとは対照的に、α−Ｄ−ＧｌｕｃＭｅ（１５ｍＭ濃度）を、より高比率（２．５／１）のＨＡ−ＰＢＡ／ＨＡ−マルトース混合物に加えると、複素粘度の低下がもたらされる（図６Ａ）。この結果は、Ｄ−グルコースが架橋剤として働くという仮説を十分に裏付けた。
【０１２５】
実施例８：［ＰＢＡ］／［マルトース］比に応じた粘度
図７は、漸増グルコース含量（５〜５０ｍＭ）を用い、グルコース付加の前後における、
｜η＊｜ｗｉｔｈ  Ｇｌｕｃ／｜η＊｜ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｇｌｕｃ、すなわち、周波数１Ｈｚの、［ＰＢＡ］／［マルトース］比の異なる（１／１および１．５／１）ＨＡ−ＰＢＡ／ＨＡ−マルトース混合物で得られた複素粘度値の比の変動を示す。これら２種類の混合物に関して、５〜５０ｍＭのグルコース範囲で粘度の低下が見られ、本システムのグルコース感受性が確認される。この低下は架橋の損失弾性率を反映し、網状構造のゆるみをもたらす。特に、低下率は２種類の［ＰＢＡ］／［マルトース］比で異なり、動的網状構造のグルコース反応性が容易に最適化され得ることを示す。この特性は、網状構造を通る拡散による高分子の放出を制御するために使用することができる。このようなヒドロゲルにインスリンを付加して、血糖変動の関数としてその送達を達成することはできる。
【０１２６】
実施例９：ラジカル−チオールエン付加反応による化学的ヒドロゲルの形成
恒久的架橋を有する化学的網状構造を作製するために、有利には、チオールとペンテノエート修飾多糖のラジカルカップリングを使用することができる。ＨＡ−ＰＢＡとＨＡ−マルトースの双方を、架橋剤としてビスチオール化ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ−（ＳＨ）２、Ｍｎ＝３４００ｇ／ｍｏｌ）を用い、化学的に架橋した。光架橋反応を光レオメトリーによりｉｎ  ｓｉｔｕにてモニタリングした。図３Ａは、ＰＢＡおよびマルトースにおけるＤＳが０．０５（［ＮａＣｌ＝０．１５Ｍ含有０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４中、Ｃｐ＝１５ｇ／Ｌ）のＨＡ−ＰＢＡ溶液およびＨＡ−マルトース溶液から得られた貯蔵弾性率（Ｇ’）および損失弾性率（Ｇ’’）の経時的掃引プロファイルを示す。なお、光開始剤Ｉｒｇａｃｕｒｅ  ２９５９およびＰＥＧ−（ＳＨ）２を加えた（アルケン基に対するチオール基のモル比＝１）。同じＨＡ−ペンテノエートサンプル（ＤＳは０．３４）から２種類の生成物が作製されたので、両誘導体のペンテノエート基のＤＳは０．２９である。サンプルは、３５分間、２０ｍＷ／ｃｍ２  ＵＶ強度の照射を行う前に１分間平衡化した。最初、Ｇ’’はＧ’より大きく、サンプルの粘稠な挙動を反映している。ＵＶ照射開始後の短い誘導期間の後、弾性のある有効な分子間架橋の形成のために貯蔵弾性率が急激に上昇し、損失弾性率を超える。Ｇ’曲線は２０分の時点で横ばいとなり、ゲル化プロセスの終了を示す。このことから、このＧ’の定常値をヒドロゲル弾性の測定値として用いた。図３Ｂは、ＰＢＡおよびマルトースそれぞれにおいて異なるＤＳを有するＨＡ−ＰＢＡおよびＨＡ−マルトースの溶液から作製されたヒドロゲルの弾性（Ｇ’はｔ＝２０分に測定）を比較したものである。予想されたように、官能性分子におけるＤＳが上昇すると（すなわち、ペンテノエートにおけるＤＳが低下すると）弾性が低下する。ＤＳが０．０５のＨＡ−ＰＢＡおよびＨＡ−マルトースから作製されたヒドロゲルで、弾性に有意な差を見出すことができた。これはＨＡのＰＢＡと糖の間のエステル結合の形成による付加的架橋の存在によるものと思われる。
【０１２７】
実施例１０：インスリンを付加した二重架橋ヒドロゲルの合成
ＨＡ−ｐ−ＰＢＡ（０．００２７ｇ、ＤＳｐ＝０．１６およびＤＳＰＢＡ＝０．１４）およびＨＡ−ｐ−マルトース（０．００３３ｇ、ＤＳｐ＝０．１９およびＤＳｍａｌｔｏｓｅ＝０．１１）をそれぞれ、［ＮａＣｌ］＝０．１５Ｍ含有０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ４に溶かした（［ＨＡ−ｐ−ＰＢＡ］＝［ＨＡ−ｐ−マルトース］＝１５ｇ／Ｌ）。これら２つの溶液を４℃で一晩撹拌する。光開始剤Ｉｒｇａｃｕｒｅ  ２９５９（０．００２ｇ、０．００９ｍｍｏｌ）およびＰＥＧ−（ＳＨ）２（０．００４８ｇ、０．００１４ｍｍｏｌ、アルケン基に対するチオール基のモル比＝１）を、撹拌下でＨＡ−ｐ−ＰＢＡ溶液に加える。次に、両溶液（０．２５０ｍＬのＨＡ−ｐ−ＰＢＡおよび０．１５０ｍＬのＨＡ−ｐ−マルトース）を混合する（［ＰＢＡ］／［マルトース］＝１）。その後、得られた混合物（０．１００ｍＬ）に２０ｍＷ／ｃｍ２  ＵＶ強度を５分間照射し、化学的ゲルを形成する。このゲルディスクを、１．５ｍｇ／ｍＬ濃度のＦＩＴＣ−インスリン（５８００ＭＷ；モノマー）を含有する１ｍＬの０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ４（［ＮａＣｌ］＝０．１５Ｍ含有）に浸漬した。４℃で１時間のインキュベーション後、ＮａＯＨ水溶液（０．１Ｍ）を加えることによりｐＨを７．４に調整し、このディスクを、ＮａＣｌ＝０．１５Ｍを含有する５０ｍＬの０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４（「ＨＥＰＥＳバッファー」と呼称）に浸漬した。二重架橋ヒドロゲル内にＦＩＴＣ−インスリンが組み込まれていることが蛍光顕微鏡により証明された。
【０１２８】
参照文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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