(57)【要約】  本発明は、植物細胞、植物またはその一部において、EBI1またはEBI2ポリペプチドの量または活性を低減または失わせることを含む、遺伝的に改変されていない対応する野生型植物と比較して改善された成長特性を有する、遺伝的に改変された植物を生産するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対応する遺伝的に改変されていない野生型植物と比較して改善された成長特性を有する、遺伝的に改変された植物を産生するための方法であって、以下の工程：
（a）植物細胞、植物またはその一部でEBI1またはEBI2ポリペプチドの量または活性を低減または失わせる工程、および
（b）対応する遺伝的に改変されていない野生型植物と比較して改善された成長特性を有する、遺伝的に改変された植物を産生および／または選択し、前記植物の発育を可能とする条件下で生育する工程、
を含む、方法。
【請求項２】
当該方法の工程が、さらに、以下の工程：
（c）遺伝学的に改変された植物をそれ自体または別の植物と、それぞれ自系接合または交配し、種子を生産する工程;および
（d）前記種子から改善された成長特性を有する子孫植物を成長させる工程、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
当該ポリペプチドが、少なくとも約161アミノ酸を有し配列番号５として示されるアミノ酸配列と、少なくとも80％同一であるドメインを含むEBI1ポリペプチドである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
当該EBI1ポリペプチドが、配列番号２および４から選択される配列と、少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
当該EBI1ポリペプチドが、配列番号２および４から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
当該ポリペプチドが、少なくとも約191アミノ酸を有し配列番号１０として示されるアミノ酸配列と、少なくとも80％同一であるドメインを含むEBI2ポリペプチドである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
当該EBI2ポリペプチドが、配列番号７および９から選択される配列と、少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
当該EBI2ポリペプチドが、配列番号７および９から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも一つの核酸分子の発現を低減または失わせることを含み、当該分子が以下：
（a）EBI1ポリペプチドまたはEBI2ポリペプチドをコードする核酸分子、および
（b）配列番号１、３、６および８からなる群より選択される核酸配列を有する核酸分子、
から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
以下：
（a）少なくとも1つの植物細胞に、二本鎖リボ核酸分子を形成することができるリボ核酸配列をコードする核酸分子を導入する工程であって、当該二本鎖リボ核酸分子の少なくとも17ヌクレオチドの断片が、請求項９に記載された核酸分子に少なくとも５０％の核酸配列同一性を有する核酸配列を有する工程、
（b）少なくとも1つの植物細胞に、RNAiまたはアンチセンス核酸分子を導入する工程であって、当該RNAiまたはアンチセンス核酸分子が、請求項９に記載された核酸分子に少なくとも５０％の核酸配列同一性を有する核酸配列を有する少なくとも17ヌクレオチドの断片を含む工程、
（c）少なくとも1つの植物細胞に、請求項９に記載された核酸分子を含む内因性遺伝子と組換えることができ、前記遺伝子を発現抑制、不活性化、または活性を削減することができる核酸構築物を導入する工程、
（d）請求項９に記載された核酸分子を含む内因性遺伝子において、非サイレント突然変異を導入または検出する工程、
から選択される少なくとも1つの工程を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
EBI1ポリペプチドまたはEBI2ポリペプチドの量または活性を削減または失わせることが、以下：
（a）植物細胞、植物またはその一部の内因性遺伝子における天然のまたは誘導された突然変異、
（b）内因性遺伝子のT-DNA不活性化、
（c）内因性遺伝子の部位特異的突然変異誘発または特異的育種
のいずれかによって引き起こされ、
ここで、当該内因性遺伝子が請求項９に記載された核酸分子を含む、
請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
以下の工程：
（a）（i）少なくとも1つの植物細胞に導入するための当該核酸分子、
（ii）当該核酸分子と縮合した、当該核酸分子の発現を制御する一つ以上の調節エレメントを含む隣接する核酸分子;
を含むベクターを提供する工程、および
（b）当該植物の少なくとも一つの細胞を前記ベクターで形質転換して、遺伝的に改変されていない対応する野生型植物と比較して改善された成長特性を有する形質転換された植物を産生する工程、
を含む、請求項９または１０に記載の工程。
【請求項１３】
植物が多年生の木本植物である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
植物が、アカシア、ユーカリ、シデ、ブナ、マホガニー、クルミ、オーク、トネリコ、ヤナギ、ヒッコリー、カバ、クリ、ポプラ、ハンノキ、カエデ、シカモア、イチョウ、ヤシの木およびスイートゴムからなる群より選択される広葉樹植物である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法によって産生された、遺伝的に改変された植物。
【請求項１６】
対応する遺伝的に改変されていない野生型植物と比較して改善された成長特性を有する、遺伝的に改変された植物であって、当該植物のゲノムが、以下：
i）EBI1またはEBI2ポリペプチドをコードする核酸分子を含む内因性遺伝子における非サイレント突然変異;
ii）当該ゲノムに挿入される導入遺伝子であって、該導入遺伝子は二本鎖リボ核酸を形成することができるリボ核酸配列をコードする核酸分子を含み、ここで、前記二本鎖リボ核酸分子の少なくとも17ヌクレオチドの断片はEBIlまたはEBI2ポリペプチドをコードする核酸分子に対して少なくとも50％の相同性を有する;
iii）EBI1またはEBI2ポリペプチドをコードする核酸分子を含む内因性遺伝子における突然変異であって、少なくとも一つの植物細胞に当該内因性遺伝子と組換えることができ、前記遺伝子を発現抑制、不活性化、または活性を削減することができる核酸構築物を導入することによって誘導される突然変異、
のいずれか一つから選択される遺伝的改変を含み、
ここで、当該EBI1ポリペプチドは配列番号２、４および５の中から選択される配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するか、または、当該EBI2ポリペプチドは配列番号７、９および１０の中から選択される配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物細胞、植物またはその一部において、EBI1またはEBI2ポリペプチドの量または活性を低減または失わせることを含む、遺伝的に改変されていない対応する野生型植物と比較して改善された成長特性を有する、遺伝的に改変された植物を生産するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物は、自分の身近な環境で自分自身を適応させるため、およびそれに応じて代謝を同期させるために、明暗の手がかりおよび内部24時間（概日リズム）時計を使用する。モデル植物シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の概日時計は、一連の複雑な相互作用フィードバックループで構成されており、それによりタンパク質は、昼と夜の間で自らの発現を調節している。早期（early bird:ebi）はクロックを高速化させる概日リズム突然変異である：ebi植物は、概日周期が短く、クロック遺伝子発現が早期であり、早咲きである。
【０００３】
EBI-1表現型の原因遺伝子、AtNFXL-2は、ジンクフィンガー転写因子であり、ヒトのNF-XLタンパク質のホモログである。ヒトでは、NF-XLは、クラスII MHC遺伝子で見つかったX-boxに結合する。シロイヌナズナはAtNFXL-1活性化およびAtNFXL-2リプレッシングストレス誘導遺伝子を、塩、浸透圧および干ばつストレスに関与する遺伝子を調節するために拮抗的に作用すると考えられている2のNF-XLホモログ、AtNFXL-1とAtNFXL-2を有する。AtNFXL-1はまた、防御関連遺伝子および温度ストレスの負の調節因子であることが示唆されている。このように、AtNFXL-2変異体の表現型クロックは、クロックと生物的および非生物的ストレス反応との間に興味深いリンクを提供している。このリンクは、最近のレビューでは、寒冷ストレス耐性におけるクロックタンパク質GIの可能性のある役割の同定がほのめかされてきた。
【０００４】
EBI-1変異体の概日リズムの表現型は、M.ヨハンソンらによって特徴付けられている。（Johansson, M. et al. (2011) Partners in Time: EARLY BIRD Associates with ZEITLUPE and Regulates the Speed of the Arabidopsis Clock. Plant Physiol. 155(4): 2108-2122）
【０００５】
ポプラ樹木は２つのEBI1遺伝子、EBIIa（配列番号1）およびEBIIb（配列番号3）ならびに2つのEBI2遺伝子：EBI2a（配列番号6）およびEBI2b（配列番号8）を有する（これもヨハンソンらを参照。捕捉表１および捕捉図１）。
【０００６】
特に農林におけるバイオマス、植物生産の増加は食糧のために非常に重要であり、人口増加の要求を満たすエネルギーや材料のための再生可能な資源として、および温室効果ガスの増加レベルのためのCO2削減として非常に重要である。現在、ほとんどの森林生産は、生育期間がかなり短くなるような、昼の長さと温度の大きな季節変動にさらされている北方林の生産に基づいている。これらおよび他の森林の生産性を増やすためには、広範な緯度勾配で繁栄し、最も生産的な時間の間にバイオマスを大量に生産する遺伝資源を取得することが不可欠である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Johansson, M. et al. (2011) Partners in Time: EARLY BIRD Associates with ZEITLUPE and Regulates the Speed of the Arabidopsis Clock. Plant Physiol. 155(4): 2108-2122
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】図1 Aは、リアルタイムPCR生物学的リピート1からのポプラEBI1の日中の発現を示す。Y軸は、相対的発現（PttEBIla/Pttl8S）を表す。
【図１Ｂ】図1Bは、リアルタイムPCR生物学的リピート1からのポプラEBI2の光誘導による日中の発現を示す。Y軸は、相対的発現（PttEBI2a/Pttl8S）を表す。
【図１Ｃ】図１Cは、リアルタイムPCR生物学的リピート2からのポプラEBI1の光誘導による日中の発現を示す。Y軸は相対的発現（PttEBIla / PTTL 8S）を表す。
【図１Ｄ】図1Dは、リアルタイムPCR生物学的リピート2からのポプラEBI2の光誘導による発現を示す。Y軸は、相対的発現（PttEBI2a/Pttl8S）を表す。
【図１Ｅ】図1Eは、ポプラEBIlの日中の発現を示す。2つのY軸は、それぞれ、EBIlaとEBIlbの発現レベルを表す。LDHHデータは、日周データベース[http://diurnal.cgrb.oregonstate.edu/]から得た。
【図１Ｆ】図1FはポプラEBI2aの日中の発現を示す。2つのY軸は、それぞれ、EBI2aとEBI2bの発現レベルを表す。LDHHデータは日周データベースからのものである。図1Aから1Fにおいて、X軸は時間（時間）を表している。サンプルは、一定の温度と、白およびグレーの棒で示される明暗の光周期の間に採取した。
【図１Ｇ】図1Gは、様々なポプラ組織（http://bar.utoronto.ca/のポプラeFPブラウザからのデータ）におけるEBIlの発現を示す。図１Gにおいて、組織は成熟葉（M）、若葉（L）、根（R）、黄化した暗成長実生（S）、暗成長実生、黄化、光に3時間暴露（S3）、連続光成長実生（CS）、雌尾状花序（FC）、雄尾状花序（MC）、および木質部（X）である。Y軸は、発現レベルを表す。
【図１Ｈ】図1Hは、様々なポプラ組織（ポプラEFPブラウザ）でのEBI2の発現を示す。図１Hにおいて、組織は成熟葉（M）、若葉（L）、根（R）、黄化した暗成長実生（S）、暗成長実生、黄化、光に3時間暴露（S3）、連続光成長実生（CS）、雌尾状花序（FC）、雄尾状花序（MC）、および木質部（X）である。Y軸は、発現レベルを表す。
【図２】図2は、形質転換ポプラの樹木の伸びと経方向の成長を示しており、EBII（図2A）およびEBI2（図2（b））が、RNA干渉によりノックアウトされている。T89は、野生型の樹木を示す。左のY軸は、cm単位での高さを表す。右Y軸はmm単位での直径を表す。X軸は時間（日）を表す。
【図３】図3は形質転換樹木におけるポプラEBIl（図３A）およびEBI2（図３B）の発現割合（変異/WT）を示す、ここで、EBIIおよびEBI2はそれぞれRNA干渉によってノックアウトされている。
【図４】図４は形質転換ポプラ樹木における季節的な成長パターン（Y軸の芽セットスコア：３＝アクティブな成長、０＝休眠）を示す、ここで、EBI１（図４（a））およびEBI２（図４（ｂ））はRNA干渉によってノックアウトされている。X軸は、短日下での日単位の時間を表す。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
驚くべきことにEARLY BIRD1（EBI1）とEARLY BIRD2（EBI2）転写産物のレベルが減少した樹木は、野生型の樹木よりも成長が優れることが判明した。成長表現型が、発現された転写産物のレベルに反比例すること（転写産物が少ない時に、より成長する）は、その効果が標的転写産物のダウンレギュレーションによるものであることを示す。これは、EBI遺伝子が、森林樹木の成長の増加およびより多くのバイオマスの生産のための、ダウンレギュレーションの標的として有用であることを示唆している。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
従って、一態様において、本発明は、対応する遺伝的に改変されていない野生型植物と比較して改善された成長特性を有する、遺伝的に改変された植物を産生するための方法を提供し、該方法は：
（a）植物細胞、植物またはその一部でEBI1またはEBI2ポリペプチドの量または活性を低減または失わせること、および
（b）対応する遺伝的に改変されていない野生型植物と比較して改善された成長特性を有する、遺伝的に改変された植物を産生および／または選択し、前記植物の発育を可能とする条件下で生育すること、
を含む。
【００１１】
用語「改善された成長特性」は茎と根の延長を含む一次成長だけでなく、二次的な組織、形成層からの「木」、の生産、および茎と根の胴回りの増加を含めた二次的な成長として理解されるべきである。成長をたどるひとつの方法は、茎の高さと直径を測定し、必要に応じて、ステムの体積を計算し、野生型集団とまたは関心のある植物のペアレンタルコントロールの木と比較することによってもよい。
【００１２】
さらなる態様において、本発明による方法は、追加の工程：
（c）遺伝学的に改変された植物をそれ自体または別の植物と、それぞれ自系接合または交配し、種子を生産する工程;および
（d）前記種子から改善された成長特性を有する子孫植物を成長させる工程
【００１３】
好ましくは、前記EBI1ポリペプチドは、少なくとも約161アミノ酸を有するドメインを含み、当該ドメインは配列番号5として示されるアミノ酸配列と、少なくとも75％、例えば80％、85％、90％、95％または100％同一である。より好ましくは、前記EBI1ポリペプチドは、配列番号２（EBI1a）または配列番号４（EBI1b）として示される配列と少なくとも75％、例えば80％、85％、90％、95％または100％同一であるアミノ酸配列を有する。
【００１４】
好ましくは、前記EBI2ポリペプチドは、少なくとも約191アミノ酸を有するドメインを含み、当該ドメインは配列番号10として示されるアミノ酸配列と、少なくとも75％、例えば80％、85％、90％、95％または100％同一である。より好ましくは、前記EBI2ポリペプチドは、配列番号７（EBI2a）または配列番号９（EBI2b）として示される配列と少なくとも75％、例えば80％、85％、90％、95％または100％同一であるアミノ酸配列を有する。
【００１５】
さらなる態様において、本発明は、（a）EBI1ポリペプチドまたはEBI2ポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸分子、および（b）配列番号１（EBI1a）、配列番号３（EBI1b）、配列番号６（EBI2a）および配列番号８（EBI2b）からなる群より選択される核酸配列を有する核酸分子、から選択される核酸分子の発現を低減または失わせることを含む、上で説明したような方法を提供する。
【００１６】
本発明によれば、方法は、当該核酸構築物または組換えDNA構築物を有する植物の再生可能な細胞を形質転換し、前記形質転換細胞から形質転換植物を再生する工程をさらに含む。植物細胞に前記DNA構築物またはベクターを導入する場合、当業者に周知の特定の考慮事項を考慮しなければならない。挿入される核酸は、上記のように、転写を駆動する有効な調節エレメントを含有する構築物内に組み込まれるべきである。細胞に前記構築物を輸送する利用可能な方法は存在するはずである。前記構築物が細胞中にあれば、内因性染色体物質への組み込みが起こるか、または起こらないであろう。
【００１７】
当業者に公知の形質転換技術は、改善された成長特性を有する、特に形質転換樹木において、形質転換植物を産生する植物細胞にDNA構築物およびベクターを導入するために使用されてもよい。
【００１８】
当業者は、広範な種々の宿主細胞が、本発明に係るDNA構築物およびベクターのレシピエントとして使用され得ることを理解するであろう。宿主細胞の非限定的な例には、胚組織、I型、II型、およびIII型カルス組織、胚軸、分裂組織、根組織、師部における発現のための組織、葉ディスク、葉柄中の細胞および節間の茎が含まれる。
【００１９】
上記のように、アグロバクテリウム形質転換は、広く、例えばポプラなどの広葉樹の特定の種において、樹木種を形質転換するために当業者によって使用される一つの方法である。安定した、肥沃な形質転換植物の生産は、現在、ルーチンになっている。アグロバクテリウム形質転換が、いくつかの裸子植物種において、例えば、非効率的または効果的でない場合、例えば、微粒子または微粒子銃、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、直接DNA取り込み、リポソーム媒介DNA取込み、またはボルテックス法など他の方法を使用してもよい。
【００２０】
あるいは、アグロバクテリウムと共培養した後に創傷誘導するための、アグロバクテリウム被覆微粒子または微粒子銃による衝撃などの、異なる技術の組み合わせを、変換プロセスの効率を向上させるために用いることができる。
【００２１】
形質転換技術の特定の選択は、その特定の植物種を形質転換する効率、ならびに特定の方法論で本発明を実施する者の経験と好みによって決定されることが、理解されるであろう。植物細胞に核酸を導入するための形質転換系の特定の選択は、本発明に不可欠であったり、または本発明を限定するものではなく、また植物再生のための技術の選択でもないことが、当業者には明らかであろう。
【００２２】
形質転換に続いて、形質転換植物は、好ましくは、形質転換ベクターに組み込む優性選択マーカーを用いて選択される。典型的には、このようなマーカーは形質転換体の形質転換植物および選択に抗生物質または除草剤耐性を付与し、形質転換体の選択は、抗生物質または除草剤の適切な濃度に植物を曝露することによって達成することができる。アミノ酸のD体と植物はL型にのみ耐性であり得るという事実に基づいた新規の選択マーカーにより、高速で効率的かつ環境に配慮した選択システムが提供される。この選択システムの興味深い特徴は、それが選択および対抗選択の両方を可能にすることである。
【００２３】
次いで、植物は、当該技術分野において標準的であるように、例えば、単一の細胞、カルス組織または葉ディスクから再生することができる。ほとんどすべての植物は完全に細胞、組織および植物の器官から再生することができる。形質転換植物が選択され成熟するまで栽培された後、変更された成長特性の表現型を示すこれらの植物が特定される。さらに、表現型が本明細書に開示されるポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現レベルまたは活性の変化に起因することを確認するために、ノーザンブロット、RT-PCRまたはマイクロアレイを用いてmRNAの発現を、あるいはイムノブロットまたはウエスタンブロットまたはゲルシフトアッセイを用いてタンパク質発現を分析することによって、決定することができる。
【００２４】
したがって、さらなる態様において、本発明による方法は、以下から選択される少なくとも1つの工程を含む：
（a）少なくとも1つの植物細胞に、二本鎖リボ核酸分子を形成することができるリボ核酸配列をコードする核酸分子を導入する工程であって、当該二本鎖リボ核酸分子の少なくとも17ヌクレオチド（例えば18、19、20または21ヌクレオチド）の断片が、EBI（すなわちEBI1a、EBI1b、EBI2a、EBI2b）の核酸分子に少なくとも５０％（例えば６０％、７０％、８０％、９０％または９５％）の核酸配列同一性を有する核酸配列を有する工程、
（b）少なくとも1つの植物細胞に、RNAiまたはアンチセンス核酸分子を導入する工程、であって、当該RNAiまたはアンチセンス核酸分子が、EBIの核酸分子に少なくとも５０％（例えば６０％、７０％、８０％、９０％または９５％）の核酸配列同一性を有する核酸配列を有する少なくとも17ヌクレオチド（例えば18、19、20または21ヌクレオチド）の断片を含むように、
（c）少なくとも1つの植物細胞にEBI核酸分子を含む内因性遺伝子と組換えることができ、前記遺伝子を発現抑制、不活性化、または活性を削減することができる核酸構築物を導入する工程、
（d）EBI核酸分子を含む内因性遺伝子において、非サイレント突然変異を導入または検出する工程。
【００２５】
別の態様において、本発明は、EBI1ポリペプチドまたはEBI2ポリペプチドの量または活性の削減または失わせることが、以下： 
（a）植物細胞、植物またはその一部の内因性遺伝子における天然のまたは誘導された突然変異、
（b）内因性遺伝子のT-DNA不活性化、
（c）内因性遺伝子の部位特異的突然変異誘発または特異的育種（site-directed mutagenesis or directed breeding）
のいずれかによって引き起こされ、
ここで、当該内因性遺伝子がEBI核酸分子を含む、
方法を提供する。
【００２６】
好ましい態様では、本発明による方法は、
（a）（i）少なくとも1つの植物細胞に導入するための前記核酸分子、
（ii）前記核酸分子と縮合した、前記核酸分子の発現を制御する一つ以上の調節エレメントを含む隣接する核酸分子;
を含むベクターを提供する工程、および
（b）当該植物の少なくとも一つの細胞を前記ベクターで形質転換して、遺伝的に改変されていない対応する野生型植物と比較して改善された成長特性を有する形質転換された植物を産生する工程、
を含む。
【００２７】
さらなる態様において、本発明は、上記のような方法により産生される、遺伝的に改変された、特に、形質転換された植物を提供する。本発明によれば、形質転換植物は、好ましくは、木本植物または木本種である多年生植物であってもよい。有用な実施形態では、木本植物は、アカシア、ユーカリ、シデ、ブナ、マホガニー、クルミ、オーク、トネリコ、ヤナギ、ヒッコリー、カバ、クリ、ポプラ、ハンノキ、カエデ、シカモア、イチョウ、ヤシの木およびスイートゴムからなる群より選択され得る広葉樹植物である。これら二つのグループは、木や特に木材やバイオ燃料を提供するために栽培される木質低木の急成長している種を含むので、ヤナギ、ポプラおよびその変種を含むアスペンなどのヤナギ科の広葉樹の植物は特に重要である。
【００２８】
さらなる実施形態では、木本植物は、イトスギ、ダグラスファー、モミ、セコイア、アメリカツガ、ヒマラヤスギ、ビャクシン、カラマツ、マツ、アメリカスギ、トウヒおよびイチイからなる群から選択されてもよい針葉樹である。有用な実施形態では、木本植物は、リンゴ、プラム、ナシ、バナナ、オレンジ、キーウィ、レモン、サクランボ、ブドウおよびイチジクからなる群から選択されてもよい結実植物である。本発明の方法において有用であり得る他の木本植物は、ワタ、タケおよびゴム植物からなる群から選択され得る。有用であり得る他の植物は、例えば、ススキおよびスイッチグラスのような、バイオマス生産のために生育される草本である。
【００２９】
本発明は、本明細書に記載の方法により得られた前記形質転換植物の任意の植物細胞に関し、それらの植物の収穫可能部分、種子および繁殖体、および植物外植片または植物組織を含むすべての植物の部分に関する。本発明はまた、植物、その一部、植物細胞または本発明によるDNA構築物を含む植物の子孫を包含する。本発明は、上述の方法のいずれかによって産生された、細胞、組織、器官または全植物を形質転換またはトランスフェクトされた最初の子孫を包含するようにさらに関連し、唯一の要件は、子孫が本発明の方法による親においてつくられるのと同じ遺伝子型の特徴および／または表現型の特徴を示すことである。
【００３０】
従って、本発明は、植物の減EBI1またはEBI2ポリペプチドの量または活性が減少し、かつその植物のゲノムが、以下：
EBI1またはEBI2ポリペプチドをコードする核酸分子を含む内因性遺伝子における非サイレント突然変異;
i）EBI1またはEBI2ポリペプチドをコードする核酸分子を含む内因性遺伝子における非サイレント突然変異;
ii）当該ゲノムに挿入される導入遺伝子であって、該導入遺伝子は二本鎖リボ核酸を形成することができるリボ核酸配列をコードする核酸分子を含み、ここで、前記二本鎖リボ核酸分子の少なくとも17ヌクレオチドの断片はEBIlまたはEBI2ポリペプチドをコードする核酸分子に対して少なくとも50％の相同性を有する;
iii）EBI1またはEBI2ポリペプチドをコードする核酸分子を含む内因性遺伝子における突然変異であって、少なくとも一つの植物細胞に当該内因性遺伝子と組換えることができ、前記遺伝子を発現抑制、不活性化、または活性を削減することができる核酸構築物を導入することによって誘導される突然変異、
のいずれか一つから選択される遺伝的改変を含み、
ここで、当該EBI1ポリペプチドは配列番号２、４および５の中から選択される配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するか、または、当該EBI2ポリペプチドは配列番号７、９および１０の中から選択される配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、
遺伝的に改変されていない対応する野生型植物と比較して改善された成長特性を有する、遺伝的に改変された植物を提供する。
【００３１】
別の実施形態において、本発明は、野生型と比較して増加した成長を有する植物を同定するためのEBIlとEBI2遺伝子の使用を提供する。
【００３２】
さらなる実施形態において、本発明は、それによって植物成長を改善するために有用である、EBI1またはEBI2活性を阻害するために有用な薬剤の同定におけるEBI1およびEBI2遺伝子およびポリペプチドの使用を提供する。
【００３３】
さらなる実施形態において、本発明は、マーカー補助育種における候補遺伝子としてのEBI1とEBI2遺伝子の使用を提供する。
【実施例】
【００３４】
[実施例１]   EBI1およびEBI2の発現パターン
例えばEBI2は、EBI1ほどは明確ではないが、18時間明／6時間暗の日長体制（１８℃／１８℃）で夜明け３時間前から開始して（図１、１および２行（row 1 and 2）；リアルタイムPCR生物学的リピート１および２、それぞれ、時間点ごとに４つの異なる樹木の７〜９節間で採取された葉を含む）DIURNAL（図１および３；http://diurnal.cgrb.oregonstate.edu/）において、４時間ごとに４８時間アッセイすると、EBI1とEBI2は概日パターンとともに、光誘導される日中の発現を有するようにみえる。図１、４行に示されるように、EBI1およびEBI2はポプラ eFP Browser（http://bar.utoronto.ca/efppop/cgi-bin/efpWeb.cgi）で見つけられるように、種々の組織で発現している。
【００３５】
[実施例２]  形質転換植物の調製および成長
RNAiのトリガー領域はポプラから増幅したPopulus tremula x tremuloides cDNAからPlatinum pfx DNA ポリメラーゼ（Invitrogen社、カールズバッド、CA、USA）によって、製品マニュアルにしたがって、以下のプライマーセット： 
【００３６】
【化１】
2015509377.tif 000002
【００３７】
を用いたPCRで増幅した。
EBI1構築物はEBI1aおよびEBI1bを下方制御するために用い、EBI2構築物はEBI2aおよびEBI2bを下方制御するために用いた。
【００３８】
PCR産物をpENTRTM/SD/D-TOPO(登録商標)ベクター（Invitrogen社、カールズバッド、CA、USA）にクローニングした。pENTRTM/SD/D-TOPO(登録商標)ベクターからの効果的ではないトリガ領域を削除するため、これらのベクターをNotIで消化し、自己ライゲーションした。これらのエントリーベクターはジデオキシヌクレオチドシーケンシングに供し、デスティネーションベクターpANDA35HKと一緒にLR-Gateway 反応（Invitrogen社、カールズバッド、CA、USA）に用いた。続いてハイブリッドポプラ、Populas tremula L. x P. tremuloides Michを形質転換するためにアグロバクテリウム媒介形質転換を用いた。クローンT89が形質転換され、当分野で既知の方法で再生された。
【００３９】
形質転換ポプラ系統は、成長チャンバー内で、１８時間の光周期および１８℃／１８℃（昼／夜）の温度下で、野生型対照（wt）樹木と一緒に生育した。植物は、Weibulls Rika S NPK 7-1-5 の１対１００希釈（最終濃度  NO3, 55g/l, NH4, 29g/l; P, 12g/l; K, 56g/l; Mg 7.2g/l; S, 7.2g/l; B, 0.18g/l; Cu, 0.02g/l; Fe, 0.84g/l; Mn, 0.42g/l; Mo, 0.03g/l; Zn, 0.13g/L）で施肥した。高さおよび直径を測定し、成長の分析のために使用した。
【００４０】
EBI1とEBI2のノックアウトは、野生型T89と比較して、伸びおよび経方向成長において増加した形質転換樹木となった（図2および表1）。
【００４１】
表１に示すように、EBI1形質転換樹木の中には、25〜28パーセントの体積成長インデックスの増加および5〜13％の高さの増加を示すものがあった。EBI2形質転換樹木の中には、15〜36パーセントの体積成長インデックスの増加および6〜14％の高さの増加を示すものがあった。
【００４２】
【表１】
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【００４３】
遺伝子発現のレベルは観察された表現型とよく一致した（図3）。例えば芽セット（bud set）等、季節的な成長パターンについて、負の影響は観察されなかった（図4）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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