(57)【要約】  本開示は、ＮＨＥＪタンパク質又はその機能的断片又はそれらをコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトした宿主細胞であって、前記ポリヌクレオチド配列が適切なプロモーターの制御下にあり、対象の少なくとも１つのタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットでさらにトランスフェクトした宿主細胞、宿主細胞の調製法、調製法において利用するプラスミド及び中間体、並びにタンパク質に発現させるための宿主細胞の使用に関する。
2015530103.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＨＥＪタンパク質又はその機能的断片、又はそれらをコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトした宿主細胞であって、前記ポリヌクレオチド配列が適切なプロモーターの制御下にあり、対象の少なくとも１つのタンパク質をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）配列を含む発現カセットでさらにトランスフェクトした、上記宿主細胞。
【請求項２】
ＮＨＥＪタンパク質又はその機能的断片をコードするポリヌクレオチド配列でトランスフェクトした宿主細胞であって、前記ポリヌクレオチド配列が適切なプロモーターの制御下にあり、対象の少なくとも１つのタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットでさらにトランスフェクトした、上記宿主細胞。
【請求項３】
ＮＨＥＪタンパク質がＫｕ７０又はＫｕ８０又はその機能的断片である、請求項１又は請求項２に記載の宿主細胞。
【請求項４】
２つ以上のＮＨＥＪタンパク質若しくはその機能的断片、又はそれらをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドでトランスフェクトした、請求項１から３までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項５】
Ｋｕ７０及びＫｕ８０若しくはその機能的断片、又はそれらをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドでトランスフェクトした、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項６】
原核生物細胞、真核生物細胞又は酵母である、請求項１から５までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項７】
ＣＨＯ細胞である、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項８】
対象のタンパク質が抗体又はその結合断片である、請求項１から７までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項９】
対象のタンパク質が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ又はそれらの機能的断片などの部位特異的突然変異誘発を引き起こすタンパク質である、請求項１から８までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１から９までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１から９までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
ＮＨＥＪタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列がプラスミドの形態である、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列がプラスミドの形態である、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列が直鎖状ＤＮＡ又はＲＮＡの形態である、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
対象のタンパク質をコードするＤＮＡ配列がプラスミドの形態で提供され、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、及びＫｕ７０とＫｕ８０の組合せ、又はその機能的断片をコードするＤＮＡ配列をプラスミドがさらに含む、請求項１から１０まで、１２及び１３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
プロモーターが強力なウイルスプロモーターである、請求項１から１５までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
プロモーターがＣＭＶプロモーターである、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
ＮＨＥＪタンパク質又はその機能的断片が、ヒト、ハムスター、マウス、酵母又は他の配列起源である、請求項１から１７までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
ＮＨＥＪタンパク質又はその機能的断片をコードするポリヌクレオチド配列及び／又は対象のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現カセットが選択マーカーをさらに含む、請求項１から１８までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
選択マーカーがグルタミンシンテターゼマーカーである、請求項１９に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
対象のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現カセットが細胞のゲノムに安定的に組み込まれている、請求項１から２０までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
ＮＨＥＪタンパク質又はその機能的断片をコードするポリヌクレオチド配列が細胞に一過的にトランスフェクトされた、請求項１から２１までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
ＮＨＥＪタンパク質又はその機能的断片をコードするポリヌクレオチド配列が細胞に安定的にトランスフェクトされた、請求項１から２２までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、それらの組合せ、又はその機能的断片をコードする配列を含むプラスミドＤＮＡであって、前記ＤＮＡ配列が適切なプロモーターの制御下にある、上記プラスミドＤＮＡ。
【請求項２５】
プラスミドが対象のタンパク質をコードするＤＮＡをさらに含み、例えば対象のタンパク質が抗体又はその結合断片である、請求項２４に記載のプラスミドＤＮＡ。
【請求項２６】
ＤＮＡが環状である、請求項２４又は２５に記載のプラスミドＤＮＡ。
【請求項２７】
ＤＮＡが直鎖状である、請求項２４又は２５に記載のプラスミドＤＮＡ。
【請求項２８】
ポリヌクレオチド配列によりコードされる対象のタンパク質を発現することができる宿主細胞を作製する方法であって、
ａ．Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、それらの組合せ若しくはそれらの機能的断片、又はそれらをコードし、適切なプロモーターの制御下にある１つ又は複数のポリヌクレオチド配列、及び
ｂ．対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）配列を含む発現カセット
で細胞をトランスフェクトするステップを含む上記方法。
【請求項２９】
ステップａ）及びｂ）中の構成要素のトランスフェクションがコトランスフェクション（同時トランスフェクション）である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ステップａ）中の構成要素のトランスフェクションをステップｂ）中の構成要素より前に行う、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
ステップｂ）中の構成要素のトランスフェクションをステップｃ）中の構成要素より前に行う、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
ステップａ）中のポリヌクレオチド配列が、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、それらの組合せ又はそれらの機能的断片をコードするＤＮＡ配列である、請求項２８から３１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
ステップａ）中のポリヌクレオチド配列がＫｕ７０をコードするＤＮＡ配列とＫｕ８０をコードするＤＮＡ配列である、請求項２８から３１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
ポリヌクレオチド配列をプラスミドの形で提供する、請求項３２又は請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
プラスミドが請求項２４から２７までのいずれか一項で定義したプラスミドである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
対象のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現カセットをプラスミドに提供する、請求項２８から３５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、それらの組合せ又はそれらの機能的断片をコードするポリヌクレオチド配列が細胞に一過的にトランスフェクトされた、請求項２８から３６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
対象のタンパク質をコードするＤＮＡ配列が細胞のゲノムに安定的に組み込まれている、請求項２８から３６までのいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、対象のタンパク質をコードしそれを発現させることが可能なＤＮＡ配列で安定的にトランスフェクトされた宿主細胞の数を増やす方法に関する。さらに本開示は、本明細書の方法を利用して調製した宿主細胞、及びＲＮＡ又はＤＮＡなどの、方法中で利用するポリヌクレオチド配列、特にプラスミドＤＮＡに関する。
【背景技術】
【０００２】
「培養哺乳動物細胞は、正しいタンパク質のフォールディング、構築及び翻訳後修飾に関する能力をもつので、臨床用途で組換えタンパク質を生産するための主要な系となっている。このようなことから、哺乳動物細胞で発現する際には、細菌、植物及び酵母などの他の宿主に対してタンパク質の質と有効性が優れている可能性がある。
【０００３】
今日、全組換えタンパク質性医薬品の約６０〜７０％が哺乳動物細胞において生産されている。加えて、数百の臨床候補タンパク質が現在企業のパイプラインに存在すると概算されている。これらのタンパク質の多くは不死化チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において発現されているが、マウスミエローマ（ＮＳＯ）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ−２９３）及びヒト網膜細胞由来の細胞系などの他の細胞系が組換えタンパク質生産に関して規制上の承認を得ている。生物製剤生産に関する大部分の今日の哺乳動物細胞培養プロセスは懸濁液中で培養する細胞に基づいているが、実際の製造手法の多様性は相当なものである。
【０００４】
最初に、必要な転写制御エレメントを有する組換え遺伝子を細胞に導入する。加えて、選択的有利性をレシピエント細胞にもたらす第二遺伝子を導入する。遺伝子導入後数日間施す選択作用物質の存在下では、選択マーカー遺伝子を発現する細胞のみが生存する。選択に関して最も一般的な遺伝子は、ヌクレオチド代謝に関与する酵素である、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、及びグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）である。いずれのケースも、適切な代謝産物（ＤＨＦＲのケースではヒポキサンチンとチミジン、ＧＳのケースではグルタミン）の不在下で選択が起こり、非形質転換細胞の増殖が妨げられる。一般に、組換えタンパク質の効率的な発現に関して、生物製剤コード遺伝子と選択マーカー遺伝子が同じプラスミド上に存在するかどうかは重要ではない。
【０００５】
選択後、生存細胞を単一細胞として第二の培養容器に移し、培養物を増大させてクローン集団を作製する。最終的に、個々のクローンを組換えタンパク質発現に関して評価し、最も強力な生産者をさらなる培養及び分析用に保持する。これらの候補から、適切な増殖及び生産特性がある一細胞系を組換えタンパク質の生産用に選択する。次いで、培養プロセスを確定する、これは生産の必要性により決定される。これまで、全ての哺乳動物組換え治療剤は天然分泌タンパク質である、又はタンパク質分泌を仲介する遺伝子構築物から開発されている。」
【０００６】
以上は、２００４年に公開されたＮａｔｕｒｅの総説（Ｆｌｏｒｉａｎ  Ｗｕｒｍ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ２２  Ｎｕｍｂｅｒ１１  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ２００４、ｐａｇｅ１３９３−１３９８）からの抜粋である。２０１２年において、これらのプロセスは、２００４年に公開された前述のプロセスから基本的には変わっていない。
【０００７】
このＮａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙの総説は宿主細胞ゲノムへのランダムな挿入の欠点を論じており、実際、導入遺伝子を、ヘテロクロマチンとして公知の固く凝縮した形態のＤＮＡなどの細胞のゲノムの特定部分に挿入する場合、導入遺伝子の発現はほとんど又は全く得られないことを言及している。
【０００８】
異種遺伝子をゲノムの許容領域、例えば真性クロマチンとして公知の固く凝縮していないＤＮＡに挿入する場合でさえ、近隣遺伝子は依然として負の影響を示す可能性があり、その結果、導入遺伝子が不活化される可能性がある。
【０００９】
Ｎａｔｕｒｅの総説は以下のように続ける。幾つかの戦略が、ランダムな組み込みの負の位置効果を克服するために開発されてきた。防御的シス制御エレメントには、インスレーター、境界エレメント、足場／マトリックス結合領域、遍在性クロマチン開環エレメント及び保存的アンチリプレッサーエレメントがある。これらのエレメントと隣接した導入遺伝子はヘテロクロマチンの影響を低減し、導入遺伝子の安定的発現を可能にする。サイレンシングを阻害するための別の方法は、ブチラートを使用しヒストンの脱アセチル化を遮断することである。ゲノムの転写活性領域に導入遺伝子の組み込みを標的化することは、位置効果を避けるための別の考えられる戦略であり、近年の会議におけるプレゼンテーションは産業界での遺伝子標的化の使用を助言している。」
【００１０】
当技術分野の一部には、時折、相同組換えと呼ばれる標的化組換えに焦点があてられるが、この組換えには宿主細胞ゲノムの充分な知識が必要とされ、またこれらの事象は酵素によるさらなる支援抜きでは比較的希な事象である。
【００１１】
製造目的に適したクローンの作製には、広範囲のスクリーニング及び労力を要する検索が必要とされることが多く、例えば、対象のタンパク質を発現させるのに適した１クローンを同定するのに１，５００クローンの分析を必要とする可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明者らは、対象のタンパク質、及びＮＨＥＪタンパク質、例えばＫｕ７０、Ｋｕ８０、それらの組合せ若しくはその機能的断片をコードするＤＮＡ配列、又はそれらをコードする配列による宿主細胞のコトランスフェクションは、対象のタンパク質を発現することができるさらに多くの細胞の作製をもたらすことを、驚くことに立証している。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
したがって、ＮＨＥＪタンパク質又はその機能的断片、例えばＫｕ７０、Ｋｕ８０、それらの組合せ、又はそれらをコードするポリヌクレオチド配列でトランスフェクトした宿主細胞であって、前記ポリヌクレオチド配列が適切なプロモーターの制御下にあり、対象の少なくとも１つのタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ配列を含む発現カセットでさらにトランスフェクトした宿主細胞を提供する。
【００１４】
一実施形態では、ＮＨＥＪタンパク質又はその機能的断片、例えばＫｕ７０、Ｋｕ８０、それらの組合せをコードするポリヌクレオチド配列でトランスフェクトした宿主細胞であって、前記ＤＮＡ配列が適切なプロモーターの制御下にあり、対象のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現カセットでさらにトランスフェクトした宿主細胞を提供する。
【００１５】
ＮＨＥＪタンパク質又はその機能的断片、例えばＫｕ７０、Ｋｕ８０、それらの組合せをコードする配列を含むプラスミドＤＮＡであって、前記ＤＮＡ配列が適切なプロモーターの制御下にあるプラスミドＤＮＡも提供する。
【００１６】
本開示は、ＤＮＡ配列によりコードされる対象のタンパク質を発現することができる宿主を作製する方法であって、
ａ．Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、それらの組合せ若しくはそれらの機能的断片、又はそれらをコードするポリヌクレオチド配列であって、前記ポリヌクレオチド配列は適切なプロモーターの制御下にある、及び
ｂ．対象のタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ配列を含む発現カセット
で細胞をコトランスフェクトするステップを含む方法をさらに含む。
【００１７】
一実施形態では、ＤＮＡ配列によりコードされる対象のタンパク質を発現することができる宿主細胞を作製する方法であって、
ａ．ＮＨＥＪタンパク質又はその機能的断片、例えばＫｕ７０、Ｋｕ８０、それらの組合せをコードするポリヌクレオチド配列、又はその機能的断片であって、前記ポリヌクレオチド配列は適切なプロモーターの制御下にある、及び
ｂ．対象のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現カセット
で細胞をコトランスフェクトするステップを含む方法を提供する。
【００１８】
有利なことに、ＮＨＥＪタンパク質又はその機能的断片、例えばＫｕ７０及び／又はＫｕ８０コードポリヌクレオチドの利用によって、対象のタンパク質を発現することができる得られる細胞数が増大すると思われる。したがってこれにより、タンパク質発現に適した安定細胞系を同定する確率が増大する。
【００１９】
本発明の方法は、適切な製造クローンを単離するのに必要な尽力及びリソースの量を有意に減らし、本発明の方法を利用するとタンパク質発現クローンの数が大幅に増大するので、例えば２５〜７５％少ないクローンを分析することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
非相同末端結合（ＮＨＥＪ）は、ＤＮＡにおける二本鎖切断を修復する経路である。修復をガイドするために相同配列を必要とする相同組換えと対照的に、切断末端が相同鋳型を必要とせずに直接連結するためＮＨＥＪは「非相同」と呼ばれる。
【００２１】
典型的にはＮＨＥＪは、修復をガイドするためにマイクロホモロジーと呼ばれる短鎖相同ＤＮＡ配列を利用する。これらのマイクロホモロジーは、二本鎖切断両末端における一本鎖オーバーハングに存在することが多い。
【００２２】
ＮＨＥＪは全ての生物界の全体を通じて保存されており、哺乳動物細胞においては主要な二本鎖切断修復経路である。しかしながら、出芽酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）では、この生物が一般的実験条件下で増殖するとき、相同組換えが優位を占める。
【００２３】
ＮＨＥＪタンパク質はＮＨＥＪプロセスに関与する、又はそれを容易にするタンパク質である。
【００２４】
一実施形態では、ＮＨＥＪタンパク質は精製形で利用する。一実施形態では、ＮＨＥＪタンパク質は、精製プロセスを支援するためヒスタグなどの精製タグを含む。
【００２５】
本明細書で利用する宿主細胞は、有効なトランスフェクションが実施された後に、対象のタンパク質を発現させるのに適した、又はその発現を可能にする細胞である。当然ながら発現は、例えばプロモーターなどの適切な機能的エレメントを必要とし得る。
【００２６】
一実施形態では、宿主細胞は原核生物細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌である。
【００２７】
一実施形態では、宿主細胞は真核生物細胞、例えば酵母細胞、昆虫細胞、又は哺乳動物細胞などの動物細胞である。一実施形態では、宿主細胞は、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞から選択される哺乳動物細胞などの動物細胞であるが、マウスミエローマ（ＮＳＯ）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ−２９３）及びヒト網膜細胞由来の細胞系などの、他の細胞系を利用することは可能である。
【００２８】
別の哺乳動物細胞はベロ（ｖｅｒｏ）細胞である。
【００２９】
非哺乳動物細胞系には、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）などの酵母細胞系、又は大腸菌などの細菌細胞系がある。
【００３０】
本明細書で言及し利用するトランスフェクションは、核酸又はポリペプチド、タンパク質などを細胞に意図的に導入するプロセスである。スーパーコイルドプラスミドＤＮＡ、直鎖状ＤＮＡ又はｓｉＲＮＡ構築物などの遺伝物質をトランスフェクトすることができる。一実施形態ではこの用語を、真核生物細胞における非ウイルス的方法に使用する。
【００３１】
典型的には、動物細胞のトランスフェクションは、細胞膜中に一時的な孔又は「穴」を開け物質の取り込みを可能にすることを含む。トランスフェクションは、リン酸カルシウムの使用、エレクトロポレーション、又はカチオン性脂質と物質を混合してリポソームを生成し、それを細胞膜と融合させそれらのカーゴを内部に堆積させることにより実施することができる。
【００３２】
Ｋｕ７０は、ヒトにおいてＸＲＣＣ６遺伝子によりコードされるタンパク質である。Ｋｕ７０とＫｕ８０は、一緒になって、Ｋｕヘテロ二量体を構成し、それはＤＮＡ二本鎖切断末端に結合しＤＮＡ修復の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路に必要とされる。それは、ＮＨＥＪ経路を利用して哺乳動物液性免疫システムにおける抗原多様性を助長する、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えにも必要とされる。
【００３３】
ＮＨＥＪにおけるその役割以外に、Ｋｕはテロメア長維持及びサブテロメア遺伝子サイレンシングにも必要とされる。ヒトタンパク質Ｋｕ７０はＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ１２９５６を有しネズミ（murine）タンパク質は番号Ｐ２３４７５を有する。
【００３４】
本明細書で利用するＫｕ７０タンパク質の機能的断片は、そのタンパク質の必須の生物学的機能、特にＮＨＥＪ機能を保持するタンパク質の断片を指す。
【００３５】
Ｋｕ８０は、ヒトにおいてＸＲＣＣ５遺伝子によりコードされるタンパク質である。ヒトタンパク質はＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ１３０１０を有しネズミタンパク質は番号Ｐ２７６４１を有する。
【００３６】
本明細書で利用するＫｕ８０タンパク質の機能的断片は、そのタンパク質の必須の生物学的機能、特にＮＨＥＪ機能を保持するタンパク質の断片を指す。
【００３７】
ポリヌクレオチドの文脈における機能的断片は、例えば本明細書に記載するタンパク質の機能的断片をコードするポリヌクレオチドを指す。
【００３８】
一実施形態では、利用するＫｕコードポリヌクレオチド（単数又は複数）又はタンパク質は、遺伝子／タンパク質が同じ機能を有するハムスター、マウス、ラット、ヒト種又は他種から独立に選択される。一実施形態では、利用するポリヌクレオチド又はタンパク質は＞５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％の配列同一性などをヌクレオチド／タンパク質レベルで有する。
【００３９】
一実施形態では、本開示中で利用するポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で、Ｋｕタンパク質又はＫｕタンパク質の組合せをコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズする。
【００４０】
利用する宿主細胞系の性質に応じて、任意の適切な種由来の任意の適切なＮＨＥＪタンパク質を使用することができることは理解されよう。一例では、ＮＨＥＪタンパク質はヒトである。一例では、ＮＨＥＪタンパク質はヒトＫｕ７０単独又はヒトＫｕ８０との組合せである。一例では、ＮＨＥＪタンパク質はヒトＫｕ８０単独又はヒトＫｕ７０との組合せである。一例では、ＮＨＥＪタンパク質はハムスターＫｕ７０単独又はハムスターＫｕ８０との組合せである。一例では、ＮＨＥＪタンパク質はハムスターＫｕ８０単独又はハムスターＫｕ７０との組合せである。
【００４１】
一実施形態では、ＮＨＥＪ機能を有するＫｕ７０又はＫｕ８０と別の遺伝子を利用する。
【００４２】
原核生物のＤＮＡ末端結合タンパク質のホモログはＡｒａｖｉｎｄ  ａｎｄ  Ｋｏｏｎｉｎ、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ２００１  Ａｕｇｕｓｔ１１（８）１３６５−１３７４中で論じられている。
【００４３】
一実施形態では、利用するポリペプチドは、哺乳動物タンパク質などの真核生物起源のタンパク質をコードする。
【００４４】
本明細書で利用するプロモーターは、特定遺伝子の転写を開始するＤＮＡの領域を指す。一般にプロモーターは、同じ鎖上のそれらが転写する遺伝子近辺、及び（センス鎖の５’領域に対して）上流に位置する。
【００４５】
本明細書で利用するのに適したプロモーターは、関連遺伝子環境での標的ポリヌクレオチドの転写開始の目的に適合したプロモーターを指す。
【００４６】
一実施形態ではプロモーターは、ウイルスプロモーター、例えば強力なプロモーター、ＣＭＶプロモーターなど、例えばＴｎ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、又は誘導性プロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター、アルコール誘導性プロモーター若しくはグルコース誘導性プロモーターなどである。
【００４７】
テトラサイクリン制御性転写活性化は誘導的発現の方法であり、この場合転写はテトラサイクリン系抗生物質又はその誘導体の１つ（例えばドキシサイクリン）の存在下で可逆的に開始又は終了する。元来ＰｔｅｔプロモーターはＴｅｔＲ、リプレッサー、及びＴｅｔＡ、テトラサイクリン系抗生物質を細胞外に出すタンパク質を発現する。
【００４８】
一実施形態では、ＮＨＥＪタンパク質又はその機能的断片、例えばＫｕ７０、Ｋｕ８０、それらの組合せをコードするポリヌクレオチド配列、又はその機能的断片を、例えば誘導性プロモーターなどの本明細書に記載する適切なプロモーターの制御下において提供する。
【００４９】
本明細書で言及し利用するポリヌクレオチドは、鎖中で共有結合した１３個以上のヌクレオチドモノマーで構成されるバイオポリマーである。ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）とＲＮＡ（リボ核酸）は、別個の生物学的機能を有するポリヌクレオチドの例である。
【００５０】
一実施形態では、ポリヌクレオチドはＤＮＡ、例えば環状（スーパーコイルド、閉環状若しくは弛緩）形又は直鎖形のプラスミドＤＮＡである。
【００５１】
一実施形態では、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。
【００５２】
発現カセットは、細胞の機構を誘導してＲＮＡ及びタンパク質を生産する。同じカセットを容易に改変し異なるタンパク質を生産することができるようにタンパク質コード配列のクローニングを調節するための、幾つかの発現カセットが設計されている。一実施形態では、カセットは１つ又は複数の遺伝子、それらの発現を制御するための配列を含み、例えばカセットは、少なくとも３個の構成要素、即ちプロモーター配列、オープンリーディングフレーム、及び真核生物では通常ポリアデニル化部位を含有する３’非翻訳領域を含む。
【００５３】
一実施形態では、対象のタンパク質は抗体又はその結合断片である。
【００５４】
本明細書で使用する用語「抗体」は、完全長重鎖と軽鎖を有する完全抗体分子を含む免疫グロブリン、及びそれらを含む二重特異性分子を指す。
【００５５】
例えば、抗体はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭ、特にヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４アイソタイプであってよい。
【００５６】
その抗体結合断片は、特異的であるポリペプチドに結合することができる抗体の断片を指し、このような断片には、Ｆａｂ、修飾Ｆａｂ、Ｆａｂ’、修飾Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆａｂ−Ｆｖ、Ｆａｂ−ｄｓＦｖ、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、二価、三価又は四価抗体、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、及び前述の何れかのエピトープ結合断片があるが、これらだけには限られない（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ、２００５、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９）：１１２６−１１３６；Ａｄａｉｒ  ａｎｄ  Ｌａｗｓｏｎ、２００５、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｏｎｌｉｎｅ２（３）、２０９−２１７参照）。これらの抗体断片を作出及び製造するための方法は当技術分野で周知である（例えば、Ｖｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ、１９９８、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１６、１６５−１８１参照）。本発明中で使用するための他の抗体断片には、国際特許出願ＷＯ２００５／００３１６９、ＷＯ２００５／００３１７０及びＷＯ２００５／００３１７１中に記載されたＦａｂ及びＦａｂ’断片がある。
【００５７】
多価抗体は多重特異性、例えば二重特異性を含む可能性があり、又は単一特異性であってよい（例えば、ＷＯ９２／２２８５３及びＷＯ０５／１１３６０５参照）。さらなる例には、ＷＯ２００９／０４０５６２及びＷＯ２０１０／０３５０１２中に記載された二重特異性抗体がある。
【００５８】
抗体可変ドメイン中の残基は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌにより考案されたシステムに従い従来ナンバリングされている。このシステムは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ、１９８７、ｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ、ＵＳＡにおいて言及されている（以後は「Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ（上記）」）。他のシステムを示す場合を除き、本明細書ではこのナンバリングシステムを使用する。
【００５９】
Ｋａｂａｔの残基表示は、アミノ酸残基の直線的ナンバリングに常に直接対応するわけではない。実際の直線的アミノ酸配列は、基本可変ドメイン構造のフレームワークであろうと又は相補性決定領域（ＣＤＲ）であろうと、構造上の構成要素の縮小、又は構造上の構成要素への挿入に対応する厳密なＫａｂａｔナンバリングにおけるよりも少ないアミノ酸又は追加のアミノ酸を含有する可能性がある。残基の正確なＫａｂａｔナンバリングは、「標準」Ｋａｂａｔナンバリング配列での抗体配列における残基ホモロジーのアラインメントにより、所与の抗体に関して決定することができる。
【００６０】
Ｋａｂａｔのナンバリングシステムによれば、重鎖可変ドメインのＣＤＲは残基３１〜３５（ＣＤＲ−Ｈ１）、残基５０〜６５（ＣＤＲ−Ｈ２）及び残基９５〜１０２（ＣＤＲ−Ｈ３）に位置する。しかしながら、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｃ．ａｎｄ  Ｌｅｓｋ、Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、１９６、９０１−９１７（１９８７））によれば、ＣＤＲ−Ｈ１に相当するループが残基２６〜残基３２に延長している。したがって他に示さない限り、ＫａｂａｔのナンバリングシステムとＣｈｏｔｈｉａのトポロジーループ定義の組合せによって記載されるように、本明細書で利用する「ＣＤＲ−Ｈ１」は残基２６〜３５を指すものとする。
【００６１】
Ｋａｂａｔのナンバリングシステムによれば、軽鎖可変ドメインのＣＤＲは残基２４〜３４（ＣＤＲ−Ｌ１）、残基５０〜５６（ＣＤＲ−Ｌ２）及び残基８９〜９７（ＣＤＲ−Ｌ３）に位置する。
【００６２】
一実施形態では、抗体又はその結合断片は、モノクローナル又はポリクローナル、モノクローナルなどである。
【００６３】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技法（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５−４９７）、トリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、４：７２）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、ｐｐ７７−９６、Ａｌａｎ  Ｒ  Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ、１９８５）などの、当技術分野で公知の任意の方法によって調製することができる。
【００６４】
モノクローナル抗体は、例えばプラスマ細胞の可変−遺伝子レパートリーの分析に基づいて、スクリーニングで単離することもできる。例えば、Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２８：９６５−９６９（２０１０）参照。
【００６５】
本発明で使用するための抗体又はその結合断片は、例えばＢａｂｃｏｏｋ、Ｊ．ｅｔ  ａｌ、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３（１５）：７８４３−７８４８１；ＷＯ９２／０２５５１；ＷＯ２００４／０５１２６８及び国際特許出願ＷＯ２００４／１０６３７７により記載された方法によって、特異的抗体の産生用に選択される単一リンパ球から作製した免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡのクローニングと発現により、単一リンパ球抗体法を使用して作製することもできる。
【００６６】
本発明で使用するための抗体又はその結合断片は、当技術分野で公知の様々なファージディスプレイ法を使用して作製することもでき、これらはＢｒｉｎｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５、１８２：４１−５０中）、Ａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５、１８４：１７７−１８６）、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４、２４：９５２−９５８）、Ｐｅｒｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ（Ｇｅｎｅ、１９９７、１８７９−１８）、Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９４、５７：１９１−２８０）並びにＷＯ９０／０２８０９、ＷＯ９１／１０７３７、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９３／１１２３６、ＷＯ９５／１５９８２、ＷＯ９５／２０４０１、並びに米国特許第５，６９８，４２６号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５８０，７１７号、同第５，４２７，９０８号、同第５，７５０，７５３号、同第５，８２１，０４７号、同第５，５７１，６９８号、同第５，４２７，９０８号、同第５，５１６，６３７号、同第５，７８０，２２５号、同第５，６５８，７２７号、同第５，７３３，７４３号及び同第５，９６９，１０８号により開示された方法を含む。
【００６７】
本発明で使用するための抗体又はその結合断片は、例えばＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２００４  Ｊｕｌ；２９０（１−２）：６９−８０中に記載された、当技術分野で公知の様々な酵母ディスプレイ法を使用して作製することもできる。
【００６８】
本発明で使用するための抗体又はその結合断片は、例えばＭａｂｓ２０１０Ｓｅｐ−Ｏｃｔ２（５）：５０８−５１８中に記載された、様々な哺乳動物細胞表面ディスプレイ法を使用して作製することもできる。
【００６９】
一実施形態では、抗体又はその結合断片はヒト化されている。
【００７０】
（ＣＤＲ移植抗体を含む）ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）とヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する抗体分子である（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号、ＷＯ９１／０９９６７参照）。ＣＤＲ全体ではなくＣＤＲの特異性決定残基の導入のみが必要とされ得ることは理解されよう（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ、２００５、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６、２５−３４参照）。ヒト化抗体は、ＣＤＲが由来した非ヒト種由来の１つ又は複数のフレームワーク残基を、場合によってはさらに含み得る。
【００７１】
一実施形態では、抗体又はその結合断片はキメラである。
【００７２】
キメラ抗体は、軽鎖及び重鎖遺伝子が異種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントで構成されるように遺伝子操作された免疫グロブリン遺伝子によりコードされる抗体である。
【００７３】
完全ヒト抗体は、必ずしも同じ抗体由来ではないが、重鎖と軽鎖両方の可変領域及び（存在する場合）定常領域が、全てヒト起源である、又はヒト起源の配列と実質的に同一である抗体である。完全ヒト抗体の例は、例えば一般的観点に関してＥＰ０５４６０７３Ｂ１、米国特許第５，５４５，８０６号、米国特許第５，５６９，８２５号、米国特許第５，６２５，１２６号、米国特許第５，６３３，４２５号、米国特許第５，６６１，０１６号、米国特許第５，７７０，４２９号、ＥＰ０４３８４７４Ｂ１及びＥＰ０４６３１５１Ｂ１中に記載されたように、例えば前に記載したファージディスプレイ法により産生される抗体、及びマウス免疫グロブリン可変及び定常領域遺伝子がそれらのヒト相当物に置換されたマウスにより産生される抗体を含み得る。
【００７４】
完全ヒト抗体は、トランスジェニック動物、例えばトランスジェニックマウス、ウシ、ブタ、ヒツジ、ロバ、並びにラマ及びラクダなどのラクダ科（camelids）において調製することもできる。例えば、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２３、１１１７−１１２５（２００５）中の総説を参照。
【００７５】
一例では、本発明で使用するための抗体又はその結合断片は、ラクダ又はラマなどのラクダ科由来であってよい。ラクダ科は、重鎖抗体と呼ばれる軽鎖を欠く機能クラスの抗体を有する（Ｈａｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ、３６３、４４６−４４８；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ、２００１、Ｔｒｅｎｄｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２６、２３０−２３５）。これらの重鎖抗体の抗原結合部位（antigen-combining site）は、Ｎ末端可変ドメイン（ＶＨＨ）により与えられるわずか３個の超可変ループ（Ｈ１〜Ｈ３）に限られる。ＶＨＨの最初の結晶構造により、Ｈ１及びＨ２ループは、従来型抗体に関して定義された公知の基準的な構造クラスに制限されないことが明らかになった（Ｄｅｃａｎｎｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ、２０００、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、３００、８３−９１）。ＶＨＨのＨ３ループは従来型抗体のそれより平均して長い（Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ、２００１、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、７９、２６１−２９６）。大部分のヒトコブラクダ重鎖抗体は、それらを産生させる酵素の活性部位への結合に関して優先性を有する（Ｌａｕｗｅｒｅｙｓ  ｅｔ  ａｌ、１９９８、ＥＭＢＯ  Ｊ、１７、３５１２−３５２０）。一ケースでは、Ｈ３ループは残存パラトープから突出し、雌鳥卵白由来リゾチームの活性部位に挿入されることが示された（Ｄｅｓｍｙｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ、１９９６、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３、８０３−８１１）。したがって、タンパク質表面上の開裂は従来型抗体により避けられることが多いが、ラクダ科の重鎖抗体は、大部分はＨ３ループにより形成されるＶＨＨのコンパクトな扁長形が原因で、酵素活性部位に進入可能であることが実証されている（Ｄｅ  Ｇｅｎｓｔ  ｅｔ  ａｌ、２００６、ＰＮＡＳ、１０３、１２、４５８６−４５９１及びＷＯ９７０４９８０５）。
【００７６】
一例では、本発明で使用するための抗体又はその結合断片は、サメなどの軟骨魚類由来であってよい。軟骨魚類（サメ、ガンギエイ、エイ及びキメラ）は、ＩｇＮＡＲとして公知の不定型免疫グロブリンアイソタイプを有する。ＩｇＮＡＲは軽鎖と結合しないＨ鎖ホモ二量体である。それぞれのＨ鎖は、１個の可変ドメインと５個の定常ドメインを有する。ＩｇＮＡＲＶドメイン（又はＶ−ＮＡＲドメイン）は、２つの密接に関連した亜型、Ｉ及びＩＩに分類可能な幾つかの非基準システインを保持する。ＩＩ型Ｖ領域はＣＤＲ１と３に追加的システインを有し、これらはラクダ科ＶＨＨドメインで観察されるものと似たドメイン拘束性ジスルフィド結合を形成すると言われている。ＣＤＲ３は次いでさらに延長した立体配座をとり、ラクダ科ＶＨＨと似た抗体フレームワークから突出する。実際、前に記載したＶＨＨドメインと同様に、特定のＩｇＮＡＲ  ＣＤＲ３残基が雌鳥卵白由来リゾチーム活性部位において結合可能であることも実証されている（Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ、２００４、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０５、１７７０−１７７３）。
【００７７】
ＶＨＨ及びＩｇＮＡＲ  Ｖドメインを生産する方法の例は、例えばＬａｕｗｅｒｅｙｓ  ｅｔ  ａｌ、１９９８、ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９８、１７（１３）、３５１２−２０；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ、２００７、ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、７、７８；Ｓａｅｒｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ、２００４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２７９（５）、５１９６５−７２中に記載されている。
【００７８】
本発明で使用するための抗体又はその結合断片は、ＩｇＹ抗体又はそれらの誘導体であってよい。ＩｇＹ抗体は一般に、特定鳥類種、例えばニワトリにより産生される。例えば、Ｌａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｐｏｕｌｔ  Ｓｃｉ  １９９３  Ｏｃｔ；７２（１０）１８０７−１２及びＤａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（２００８）Ａｖｉａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ｐａｇｅ４１８を参照。
【００７９】
一実施形態では、Ｋｕ７０及び／又はＫｕ８０を宿主細胞にトランスフェクトし、対象のタンパク質をコードするＤＮＡは別個の１つ又は複数のプラスミドで細胞にトランスフェクトする。これにより対象のタンパク質をコードするＤＮＡを宿主細胞のゲノムに安定的に組み込むことができ、一実施形態では、Ｋｕ７０及び／又はＫｕ８０を一過的にトランスフェクトされた状態に保つことができる。これは制御の観点から望ましい可能性がある。
【００８０】
一実施形態では、Ｋｕ７０及び／又はＫｕ８０を同じプラスミドで細胞にトランスフェクトする。
【００８１】
一実施形態では、Ｋｕ７０及び／又はＫｕ８０を別個のプラスミドで細胞にトランスフェクトする。
【００８２】
一実施形態では、対象のタンパク質をコードするＤＮＡはプラスミド上に存在し、Ｋｕ７０及び／又はＫｕ８０タンパク質をコードするポリヌクレオチドは含まない。
【００８３】
一実施形態では、対象のタンパク質をコードするＤＮＡはプラスミド上に存在し、Ｋｕ７０及び／又はＫｕ８０タンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。
【００８４】
Ｋｕ７０エレメントとＫｕ８０エレメントの両方を利用することが有利である可能性がある。これにより、高レベルの対象のタンパク質を発現するトランスフェクタント（クローン）を提供することができるからである。
【００８５】
一実施形態では、Ｋｕ７０及び／又はＫｕ８０をコードするポリヌクレオチドは、例えばＲＮＡとして、例えば細胞への導入後に翻訳され得る直鎖状ＲＮＡ断片として提供される。
【００８６】
一実施形態では、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡなどのポリヌクレオチドは裸状態（naked）である。
【００８７】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは直鎖状、例えば直鎖状ＤＮＡ及び／又はＲＮＡである。
【００８８】
一実施形態では、ポリヌクレオチドはスーパーコイルド状態、例えばスーパーコイルドＤＮＡである。
【００８９】
一実施形態では、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡなどのポリヌクレオチドは、１つ又は複数の試薬、例えばリン酸カルシウム又はカチオン性脂質を利用して細胞に導入される。
【００９０】
細胞にトランスフェクトするＫｕ７０コードポリヌクレオチドの量は、１〜１００μｇ、例えば１０〜５０μｇ、２０〜４０μｇなどの範囲であってよい。
【００９１】
細胞にトランスフェクトするＫｕ８０コードポリヌクレオチドの量は、１〜１００μｇ、例えば１０〜５０μｇ、２０〜４０μｇなどの範囲であってよい。
【００９２】
細胞にトランスフェクトするＫｕ７０及びＫｕ８０コードポリヌクレオチドの量は、１〜１００μｇ、例えば１０〜５０μｇ、２０〜４０μｇなどの範囲であってよい。
【００９３】
一実施形態では、細胞にトランスフェクトする対象のタンパク質をコードするＤＮＡの量は、１〜１００μｇ、１０〜３０μｇなど、特に２０μｇの範囲である。
【００９４】
一実施形態では、対象のタンパク質をコードするＤＮＡを含むプラスミドは、選択マーカー、例えば抗生物質耐性マーカー、ジヒドロ葉酸レダクターゼ又はグルタミンシンテターゼをさらに含む。
【００９５】
一実施形態では、本明細書に記載する本発明のエレメントを含む宿主細胞は、選択マーカー、例えば抗生物質耐性マーカー、ジヒドロ葉酸レダクターゼ又はグルタミンシンテターゼをさらに含む。
【００９６】
一実施形態では、対象のタンパク質をコードするＤＮＡは宿主細胞のゲノムに安定的に組み込まれている。
【００９７】
一実施形態では、対象のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えばプラスミドＤＮＡとして、宿主細胞に一過的にトランスフェクトする。
【００９８】
一実施形態では、１つ又は複数のＫｕタンパク質などのＮＨＥＪタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、宿主細胞のゲノムに安定的に組み込む。
【００９９】
一実施形態では、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、それらの組合せ、又はそれらの機能的断片をコードするポリヌクレオチド配列を細胞に一過的にトランスフェクト、本開示による宿主細胞を提供する。
【０１００】
対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、１つ又は複数のＫｕタンパク質などの１つ又は複数のＮＨＥＪタンパク質をコードするポリヌクレオチドは同時に宿主細胞にトランスフェクトすることができる、又は対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを最初にトランスフェクトし、次に１つ又は複数のＫｕタンパク質をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトすることができる、又は１つ又は複数のＫｕタンパク質をコードするポリヌクレオチドを最初にトランスフェクトし、次に対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトすることができることは理解されよう。
【０１０１】
（上に記載した最初の）前のトランスフェクションは、後のトランスフェクションの前に例えば２〜４８時間のトランスフェクションを含む。
【０１０２】
したがって、利用する異なる構成要素のトランスフェクションを行うポイントには時間差が存在し得る。
【０１０３】
本開示は、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、それらの組合せ、又はその機能的断片をコードする配列を含むプラスミドＤＮＡであって、前記ＤＮＡ配列が適切なプロモーターの制御下にあるプラスミドＤＮＡをさらに提供する。
【０１０４】
一実施形態では、プラスミドＤＮＡは対象のタンパク質をコードするＤＮＡをさらに含み、例えば対象のタンパク質は抗体又はその結合断片である。
【０１０５】
一実施形態では、本明細書に記載するプラスミドＤＮＡは環状である。
【０１０６】
一実施形態では、本明細書に記載するプラスミドＤＮＡは直鎖状である。直鎖状プラスミドＤＮＡは、例えば制限酵素などの１つ又は複数の酵素での環状プラスミドＤＮＡの切断によりＤＮＡが直鎖型になった、プラスミド由来のＤＮＡを指す。直鎖型のプラスミドＤＮＡは一般に、例えば複製起点などのプラスミドに特徴的である１つ又は複数のエレメントを含む。
【０１０７】
一実施形態では、ＤＮＡはＰＣＲ断片である。ＰＣＲ断片は、それらが断片を識別するために使用するプライマー配列を含む点で識別可能である。
【０１０８】
一実施形態では、ＤＮＡは制限酵素断片、即ち１つ又は複数の制限酵素での切断によって与えられる断片である。
【０１０９】
さらなる態様では、ＤＮＡ配列によりコードされる対象のタンパク質を発現することができる宿主を作製する方法であって、
ａ．Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、それらの組合せ又はその機能的断片をコードするポリヌクレオチド配列であって、前記ポリヌクレオチド配列は適切なプロモーターの制御下にある、及び
ｂ．対象のタンパク質をコードするＤＮＡ配列、及び場合によっては選択マーカーを含む発現カセット
で細胞をコトランスフェクトするステップを含む方法を提供する。
【０１１０】
一実施形態では方法は、Ｋｕ７０又はその機能的断片をコードするポリヌクレオチドを利用する。
【０１１１】
一実施形態では方法は、Ｋｕ８０又はその機能的断片をコードするポリヌクレオチドを利用する。
【０１１２】
一実施形態では方法は、Ｋｕ７０又はその機能的断片とＫｕ８０又はその機能的断片を独立にコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを利用する。単一のポリヌクレオチド配列が存在する場合、それがタンパク質／断片の両方をコードすることは明らかである。
【０１１３】
一実施形態では、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、それらの組合せ又はその機能的断片をコードするＤＮＡ配列をプラスミドの形態で与える、本開示による方法を提供する。
【０１１４】
一実施形態では、方法中で利用するプラスミドは前に記載されている。
【０１１５】
一実施形態では、ステップｂ）中の対象のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現カセットを１つ又は複数のプラスミドに与える方法を提供する。
【０１１６】
一実施形態では、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、それらの組合せ、又はそれらの機能的断片をコードするポリヌクレオチド配列を細胞に一過的にトランスフェクトした、本明細書に記載の方法を提供する。
【０１１７】
一実施形態では、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、それらの組合せ、又はそれらの機能的断片をコードするポリヌクレオチド配列をスクリーニング又は陽性選択の不在下で細胞にトランスフェクト、本明細書に記載の方法を提供する。
【０１１８】
一実施形態では、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、それらの組合せ、又はそれらの機能的断片をコードするポリヌクレオチド配列が宿主細胞ゲノムに組み込まれておらず、例えば誘導性プロモーターなどの構成性又は誘導性プロモーターの制御下にある、本明細書に記載の方法を提供する。
【０１１９】
一実施形態では、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、それらの組合せ、又はそれらの機能的断片をコードするポリヌクレオチド配列が細胞に安定的にトランスフェクトされており（即ち、宿主細胞ゲノムに組み込まれており）、例えば誘導性プロモーターなどの構成性又は誘導性プロモーターの制御下にある、本明細書に記載の方法を提供する。
【０１２０】
一実施形態では、対象のタンパク質をコードするＤＮＡ配列が細胞のゲノムに安定的に組み込まれた、本明細書に記載の方法を提供する。
【０１２１】
本発明のトランスフェクト宿主細胞を任意の適切な培地で培養して、対象のタンパク質、及び適切なレベルの選択タンパク質を発現可能なクローンを生産することができる。
【０１２２】
本明細書で使用するように、本明細書の文脈での用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」は「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」として解釈すべきである。
【０１２３】
幾つかの実施形態と好ましい実施形態を技術上適切に組合せることができる。
【０１２４】
本明細書の開示は、特定整数を含む実施形態を記載する。本開示は、前記整数からなる又は前記整数から本質的になる同じ実施形態にも及ぶ。
【実施例】
【０１２５】
実施例は、ＣＨＯＫ１又はＣＨＯ−ＤＧ４４細胞系のいずれかの使用に基づく。これらの細胞を、対象のタンパク質（このケースでは、ＭＡｂ）をコードし、選択マーカー（ＭＡｂ１〜４のケースでは、選択マーカーはＧＳであり、ＭＡｂ６〜７に関して選択マーカーはＤＨＦＲである）も含有する直鎖状ＤＮＡの存在下で、ＣＭＶプロモーターの制御下においてヒトＫｕ７０又はＫｕ８０をコードする環状ＤＮＡで一過的にトランスフェクトした。
【０１２６】
ＭＡｂ１に関する方法
ＣＨＯＫ１細胞を、対象のタンパク質及びＧＳ選択マーカーをコードする直鎖状ＤＮＡの存在下で、ＣＭＶプロモーターの制御下においてヒトＫｕ７０又はＫｕ８０をコードする環状ＤＮＡで一過的にトランスフェクトした。
【０１２７】
トランスフェクションの方法
１×１０７個の細胞を６００μｌのＣＤ−ＣＨＯ培養培地に再懸濁した。
【０１２８】
２０μｇの直鎖状ＤＮＡ（ＭＡｂ＋選択マーカー）及び２０μｇの空ベクター又は２０μｇのＫｕ７０若しくはＫｕ８０又は１０μｇのＫｕ７０とＫｕ８０を、８００μｌの最終体積が得られるように細胞に加えた（表１）。
【表１】
2015530103.tif 000003
【０１２９】
細胞をＢｉｏＲＡＤエレクトロポレーターを使用してエレクトロポレーション処理し（条件３００Ｖ、１５ｍｓ、１パルス）、２ｍＭグルタミンを補充した５０ｍｌのＣＤＣＨＯ培地に再懸濁し、一晩インキュベートした（３７℃、８％ＣＯ２、１４０ｒｐｍ）。
【０１３０】
限界希釈
細胞を計数し、２５μＭのＭＳＸを含有するＣＤＣＨＯ培地に希釈し、これらの細胞をウエル当たり２５００細胞で９６ウエルプレートに平板培養した。細胞を４週間インキュベートした（３７℃、８％ＣＯ２）。
【０１３１】
トランスフェクション後４週間で、増殖したコロニーを、プロテインＡ又はプロテインＧ（Ｏｃｔｅｔ）のいずれかを使用しＭＡｂ発現に関して分析した（図１Ａ）。次いでこれらを２４ウエルプレートに移し、この場合１０日間培養を実施し、プロテインＡを使用してＭＡｂ発現を分析した（図１Ｂ）。
【０１３２】
トランスフェクション後６週間で前述の分析を反復した（図２Ａ及び２Ｂ）。
【０１３３】
ＭＡｂ２に関する方法
ＣＨＯＫ１細胞を、対象のタンパク質及びＧＳ選択マーカーをコードする直鎖状ＤＮＡの存在下で、ＣＭＶプロモーターの制御下においてヒトＫｕ７０又はＫｕ８０をコードする環状ＤＮＡで一過的にトランスフェクトした。
【０１３４】
トランスフェクションの方法
１×１０７個の細胞を６００μｌのＣＤ−ＣＨＯ培養培地に再懸濁した。
【０１３５】
２０μｇの直鎖状ＤＮＡ（ＭＡｂ＋選択マーカー）及び２０μｇの空ベクター又は２０μｇのＫｕ７０若しくはＫｕ８０又は１０μｇのＫｕ７０とＫｕ８０を、８００μｌの最終体積が得られるように細胞に加えた（表２）。
【表２】
2015530103.tif 000004
【０１３６】
細胞はＢｉｏＲＡＤエレクトロポレーターを使用してエレクトロポレーション処理し（条件３００Ｖ、１５ｍｓ、１パルス）、２ｍＭグルタミンを補充した５０ｍｌのＣＤ−ＣＨＯ培地に再懸濁し、一晩インキュベートした（３７℃、８％ＣＯ２、１４０ｒｐｍ）。
【０１３７】
限界希釈
細胞を計数し、２５μＭのＭＳＸを含有するＣＤＣＨＯ培地に希釈し、これらの細胞をウエル当たり２５００細胞で９６ウエルプレートに平板培養した。細胞を４週間インキュベートした（３７℃、８％ＣＯ２）。
【０１３８】
トランスフェクション後４週間で、増殖したコロニーを、プロテインＡ又はプロテインＧ（Ｏｃｔｅｔ）のいずれかを使用しＭＡｂ発現に関して分析した（図３Ａ）。次いでこれらを２４ウエルプレートに移し、この場合１０日間培養を実施し、プロテインＡを使用してＭＡｂ発現を分析した（図３Ｂ）。
【０１３９】
プール安定型細胞系
細胞を計数しＰＢＳで洗浄して、４０ｍｌの最終体積中２５μＭのＭＳＸを含有するＣＤ−ＣＨＯ培地に５×１０５個細胞／ｍｌで再懸濁した。
【０１４０】
トランスフェクション後７日で、細胞を計数し遠心分離して、細胞が３×１０５個細胞／ｍｌの密度になるように２５ｕＭのＭＳＸを含有する新たなＣＤ−ＣＨＯ培地に再懸濁した。
【０１４１】
トランスフェクション後１４日又は細胞が生存率７５％を超えたとき、細胞を２５ｍｌの振とうフラスコへと増大させた。
【０１４２】
トランスフェクション後１７日又は細胞が生存率９０％を超えたとき、細胞を計数し５０ｍｌ内に３×１０５個細胞／ｍｌで分けた。
【０１４３】
細胞はプロテインＡ又はＧ（Ｏｃｔｅｔ）を使用してＭＡｂ発現に関してアッセイした（図４）。
【０１４４】
ＭＡｂ３に関する方法
ＣＨＯＫ１細胞を、対象のタンパク質及びＧＳ選択マーカーをコードする直鎖状ＤＮＡの存在下で、ＣＭＶプロモーターの制御下においてヒトＫｕ７０又はＫｕ８０をコードする環状ＤＮＡで一過的にトランスフェクトした。
【０１４５】
トランスフェクションの方法
１×１０７個の細胞を６００μｌのＣＤ−ＣＨＯ培養培地に再懸濁した。
【０１４６】
２０μｇの直鎖状ＤＮＡ（ＭＡｂ＋選択マーカー）及び２０μｇの空ベクター又は２０μｇのＫｕ７０若しくはＫｕ８０又は１０μｇのＫｕ７０とＫｕ８０を、８００μｌの最終体積が得られるように細胞に加えた（表３）。
【表３】
2015530103.tif 000005
【０１４７】
細胞はＢｉｏＲＡＤエレクトロポレーターを使用してエレクトロポレーション処理し（条件３００Ｖ、１５ｍｓ、１パルス）、２ｍＭグルタミンを補充した５０ｍｌのＣＤＣＨＯ培地に再懸濁し、一晩インキュベートした（３７℃、８％ＣＯ２、１４０ｒｐｍ）（表３Ａ）又はそれらをエレクトロポレーション処理し、その後製造者の説明書に従いｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用した脂質ベーストランスフェクション法を施し（１×１０７個の細胞を２０ｕｇのＭＡｂ  ＤＮＡでトランスフェクトし）、ＭＡｂ  ＤＮＡを導入し、次いで一晩インキュベートした（表３Ｂ）。
【０１４８】
限界希釈
細胞を計数し、２５μＭのＭＳＸを含有するＣＤＣＨＯ培地に希釈し、これらの細胞をウエル当たり２５００細胞で９６ウエルプレートに平板培養した。細胞を４週間インキュベートした（３７℃、８％ＣＯ２）。
【０１４９】
全増殖トランスフェクタントを２４ウエルステージ培養に増大し、増殖の１０日後にプロテインＡ又はプロテインＧ（Ｏｃｔｅｔ）を使用しＭＡｂ発現に関して分析した（図５Ａ）。
【０１５０】
一部のケースでは、上位トランスフェクタントを６ウエルプレート及び２５ｍｌに移し、次いで増殖の１２日後にプロテインＡ又はプロテインＧ（Ｏｃｔｅｔ）を使用しＭＡｂ発現に関して評価した（図５Ｂ）。
【０１５１】
ＭＡｂ１、２及び３に関して発現抗体トランスフェクタントの数を分析した（Ｅ＝エレクトロポレーション；Ｅ＋Ｌｉｐｏ＝エレクトロポレーション＋ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００）。ＧＳ選択系を使用すると対照と比較して、Ｋｕタンパク質とコトランスフェクトしたとき１２〜２１％を超える発現トランスフェクタントを得た（図６）。対象のタンパク質用の発現カセットと同時に、ヒト遺伝子Ｋｕ７０及びＫｕ８０などの「非相同末端結合」の正常細胞プロセスに関与するタンパク質因子をコードするヌクレオチド配列のトランスフェクションにより、安定的に組み込まれた発現細胞系を作製するプロセスの有効性が増大することが分かっている。増大した有効性は、対象のタンパク質を発現するトランスフェクタント及び／又は高レベルの対象のタンパク質を発現するトランスフェクタントの数の増大を観察したように、幾つかの有用な方法で証明された。標的収率を発現するトランスフェクタントを発見するのに必要な尽力と時間の量を減らすこと、又は最大産物収率を増大させることにより、これらの効果は有用となり得る。
【０１５２】
ＭＡｂ４に関する方法
ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を、対象のタンパク質及びＤＨＦＲ選択マーカーをコードする直鎖状ＤＮＡの存在下で、ＣＭＶプロモーターの制御下においてヒトＫｕ７０又はＫｕ８０をコードする環状ＤＮＡで一過的にトランスフェクトした。
【０１５３】
トランスフェクションの方法
合計１×１０７個の細胞を、ヌクレオフェクション及びＡｍａｘａエレクトロポレーターを使用して、キュベット当たり１×１０６個の細胞＋１０ｕｇのＤＮＡの濃度でヌクレオフェクト処理した。細胞は溶液Ｌ（条件Ｕ）を使用してヌクレオフェクト処理し、８ｍＭグルタミンを補充した４０ｍｌのＤＧ４４培地に再懸濁し、一晩インキュベートした（３７℃、８％ＣＯ２）。
【表４】
2015530103.tif 000006
【０１５４】
限界希釈
細胞を、８ｍＭグルタミンを加えたＣＤ−ＣＨＯ培地においてウエル当たり２０００、４０００、又は４０００＋５若しくは１０ｎｍ  ＭＴＸで平板培養した。
【０１５５】
トランスフェクション後２〜３週間で、１０％を超えるコンフルエンシーがあったコロニーを１０ｎＭのＭＴＸを含有するプレートから採取した、又は他のトランスフェクタントを廃棄した。これらのトランスフェクタントを２４ウエルプレートに移し、結合率に基づき発現に関してアッセイし、次いで上位２４トランスフェクタントを６ウエルに移し、次いで３０ｍｌ培養に移しピコグラム／細胞／日数値を得た（図７ａ）。ピコグラム／細胞／日数（ＰＣＤ）に基づく各条件からの上位６トランスフェクタントを１４日間１００ｍｌの生産培地で増殖させ発現レベルを得た（図７ｂ）。
【０１５６】
ＭＡｂ５に関する方法
ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を、対象のタンパク質及びＤＨＦＲ選択マーカーをコードする直鎖状ＤＮＡの存在下で、ＣＭＶプロモーターの制御下においてヒトＫｕ７０又はＫｕ８０をコードする環状ＤＮＡで一過的にトランスフェクトした。
【０１５７】
トランスフェクションの方法
１×１０７個の細胞を６００μｌのＣＤ−ＣＨＯ培養培地に再懸濁した。
【０１５８】
２０μｇの直鎖状ＤＮＡ（ＭＡｂ＋選択マーカー）及び２０μｇの空ベクター又は２０μｇのＫｕ７０若しくはＫｕ８０又は１０μｇのＫｕ７０とＫｕ８０を、８００μｌの最終体積が得られるように細胞に加えた（表３Ａ）。
【０１５９】
細胞はＢｉｏＲＡＤエレクトロポレーターを使用してエレクトロポレーション処理し（条件３００Ｖ、１５ｍｓ、１パルス）、２ｍＭグルタミンを補充した５０ｍｌのＣＤＣＨＯ培地に再懸濁し、一晩インキュベートした（３７℃、８％ＣＯ２、１４０ｒｐｍ）。
【０１６０】
限界希釈
細胞を計数し、８ｍＭグルタミンを加えたＣＤＣＨＯ培地においてウエル当たり２０００、４０００、又は４０００＋５、１０ｎｍ又は１５ｎｍのＭＴＸで平板培養した。
【０１６１】
全増殖トランスフェクタントを２４ウエルステージ培養まで増殖させ、増殖の１２日後にプロテインＡ又はプロテインＧ（Ｏｃｔｅｔ）を使用しＭＡｂ発現に関して分析した（図８）。
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１Ａ】トランスフェクション後４週間で９６ウエルプレートから得たＭＡｂ１（ＩｇＧ４形式）を発現するクローン（トランスフェクタント）の発現分析を示す図である。プロテインＡ  Ｏｃｔｅｔを使用して発現レベルを分析した。ＭＡｂ発現トランスフェクタントは、Ｋｕタンパク質（単数又は複数）の一過的発現があるＣＨＯＫ１細胞のコトランスフェクション、及び選択マーカーを用いたＭＡｂ１重鎖と軽鎖ＤＮＡの安定的組み込みの後に得た。トランスフェクション後４週間で、全ての増殖トランスフェクタントをＭＡｂ発現レベルに関して分析した。
【図１Ｂ】９６ウエルステージで分析した全クローン（トランスフェクタント）を２４ウエルステージに増大し、プロテインＡ  Ｏｃｔｅｔを使用して接種後１０日でＭＡｂ１の発現に関して分析した図である。
【図２Ａ】プロテインＡ  Ｏｃｔｅｔを使用して分析した、トランスフェクション後６週間で９６ウエルプレートから得た２４個のランダムに選択したトランスフェクタントの発現分析を示す図である。ＭＡｂ１発現トランスフェクタントは、Ｋｕタンパク質（単数又は複数）、ＭＡｂ１重鎖と軽鎖ＤＮＡ、及びＧＳ選択でのＣＨＯＫ１細胞のコトランスフェクションの後に得た。対照、Ｋｕ８０、Ｋｕ７０、及びＫｕ８０とＫｕ７０のトランスフェクションに関する追加的６１、１０２、１０２及び８２トランスフェクタントは、トランスフェクション後４〜６週間でそれぞれ増殖した。およそ同じ大きさの２４トランスフェクタントを各実験からランダムに選択し、プロテインＡ  Ｏｃｔｅｔを使用してＭＡｂ１発現レベルに関して分析した。対照トランスフェクタントの平均発現レベルと、Ｋｕ７０とＫｕ８０タンパク質のいずれかでトランスフェクトした平均発現レベルの間に統計的差なし−マンホイットニー（Ｔ検定）ｐ＜０．０５ｎｓ。対照トランスフェクタントの平均発現レベルと、Ｋｕ７０タンパク質とＫｕ８０タンパク質でコトランスフェクトした平均発現レベルの間には統計的差あり−マンホイットニー（Ｔ検定）ｐ＜０．０５＊
【図２Ｂ】９６ウエルプレート〜２４ウエルプレートで増大させ発現分析前に１２日間培養した、ＭＡｂ１（ＩｇＧ４形式）を発現する２４個のランダムに選択したトランスフェクタントの発現分析を示す図である。プロテインＡ  Ｏｃｔｅｔを使用して発現レベルを分析した。
【図３Ａ】トランスフェクション後４週間で９６ウエルプレートから得たＭＡｂ２（ＩｇＧ１形式）を発現するクローン（トランスフェクタント）の発現分析を示す図である。プロテインＧ  Ｏｃｔｅｔを使用して発現レベルを分析した。ＭＡｂ２発現トランスフェクタントは、Ｋｕタンパク質（単数又は複数）の一過的発現があるＣＨＯＫ１細胞のコトランスフェクション、及びＧＳ選択マーカーを用いたＭＡｂ２重鎖と軽鎖ＤＮＡの安定的組み込みの後に得た。トランスフェクション後４週間で、全ての増殖トランスフェクタントをＭＡｂ発現レベルに関して分析した。対照トランスフェクタントとＫｕタンパク質トランスフェクタントの間で平均発現レベルの統計的に有意な差を得た−マンホイットニー（Ｔ検定）ｐ＜０．００５＊＊＊
【図３Ｂ】９６ウエルプレート〜２４ウエルプレートで増大させ発現分析前に１０日間増殖させた、ＭＡｂ２（ＩｇＧ１）を発現するトランスフェクタントの発現分析を示す図である。プロテインＧ  Ｏｃｔｅｔを使用して発現レベルを分析した。対照トランスフェクタントとＫｕタンパク質トランスフェクタントの間で平均発現レベルの統計的に有意な差を得た−マンホイットニー（Ｔ検定）ｐ＜０．００５＊＊＊
【図４】プール安定型手法を使用したＭＡｂ２（ＩｇＧ１形式）の発現分析を示す図である。  ＭＡｂ２発現プール安定型を、Ｋｕタンパク質（単数又は複数）の一過的発現、ＭＡｂ２  ＨＣとＬＣ  ＤＮＡ、及びＧＳ選択マーカーでのＣＨＯＫ１細胞のコトランスフェクション後に得た。細胞は放置して回収し、生存率が９０％を超えた後、スピンチューブに接種し、プロテインＧ  Ｏｃｔｅｔを使用して接種後第５日で発現分析を実施した。  トランスフェクション時のＫｕ７０とＫｕ８０の添加によって、プールの発現レベルの１．４〜２．７倍の増大をもたらした。
【図５Ａ】Ｋｕタンパク質（単数又は複数）の一過的発現があるＣＨＯＫ１細胞のコトランスフェクション、及びエレクトロポレーション又はエレクトロポレーションとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の組合せのいずれかを使用しＧＳ選択マーカーを用いたＭＡｂ３重鎖と軽鎖ＤＮＡの安定的組み込みの後の、９６ウエルプレートから得て２４ウエルステージに移したＭＡｂ３を発現するトランスフェクタントの発現分析を示す図である。  トランスフェクション後４週間で、プロテインＧ  Ｏｃｔｅｔを使用し、ＭＡｂ発現レベルに関して全増殖トランスフェクタントを分析した。
【図５Ｂ】１２日間２４ウエルプレートで培養した、２４ウエルステージにおける「上位」６トランスフェクタントの発現分析を示す図である。エレクトロポレーション法から得た上位６対照及びＫｕトランスフェクト型トランスフェクタントを２５ｍｌの培地に移し、１２日間培養し、プロテインＧ  Ｏｃｔｅｔを使用して発現レベルを分析した（Ｃ＝対照；Ｋ＝Ｋｕ）。
【図６】ＭＡｂ１、２及び３に関して発現抗体トランスフェクタントの数を分析した図である（Ｅ＝エレクトロポレーション；Ｅ＋Ｌｉｐｏ＝エレクトロポレーション＋Ｌｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００）。ＧＳ選択系を使用すると対照と比較して、Ｋｕタンパク質とコトランスフェクトしたとき１２〜２１％を超える発現トランスフェクタントを得た（Ｃ＝対照；Ｋ＝Ｋｕ）。
【図７Ａ】ＤＨＦＲ選択系を利用してＭａｂ４を調製し、最高濃度のＭＴＸ（１０ｎＭ）で増殖させ１０％を超えるコンフルエンシーがあったクローンを２４ウエルプレートに、次いで２５ｍｌ培養物におけるＰＣＤに関してアッセイする前に６ウエルプレートに移した。上位２４対照又はＫｕトランスフェクションクローンを２４ウエルプレートにおける結合率に基づいてランク付けし、それらのＰＣＤを計算した（Ｃ＝対照；Ｋ＝Ｋｕ）。
【図７Ｂ】２５ｍｌスケールでのＰＣＤに基づく上位６クローンを１４日間１００ｍｌの生産培地で増殖させ、それらの最終発現レベルを培養期の最後にプロテインＧ  Ｏｃｔｅｔを使用して分析した（Ｃ＝対照；Ｋ＝Ｋｕ）。
【図８】ＤＨＦＲ選択系を利用してＭａｂ５を調製した。９６ウエルプレートステージで増殖させた全トランスフェクタントを２４ウエルステージに移し、１２日間培養した。プロテインＧ  Ｏｃｔｅｔを使用して発現分析を行った。
【図１Ａ】
2015530103.tif 000007
【図１Ｂ】
2015530103.tif 000008
【図２Ａ】
2015530103.tif 000009
【図２Ｂ】
2015530103.tif 000010
【図３Ａ】
2015530103.tif 000011
【図３Ｂ】
2015530103.tif 000012
【図４】
2015530103.tif 000013
【図５Ａ】
2015530103.tif 000014
【図５Ｂ】
2015530103.tif 000015
【図６】
2015530103.tif 000016
【図７Ａ】
2015530103.tif 000017
【図７Ｂ】
2015530103.tif 000018
【図８】
2015530103.tif 000019
【国際調査報告】
2015530103.tif 000020
2015530103.tif 000021
2015530103.tif 000022
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