(57)【要約】  つめの処置を最適化するための方法は、(a)爪の表面から形成され、爪内に伸びる少なくとも2個の間隔が離れた穴を有する爪を準備する工程;および(b)放射標識された医薬組成物を爪に局所的に適用する工程を含む。組成物の少なくとも一部は、少なくとも2個の穴に受け入れられる。方法は、(c)少なくとも2個の穴に近接する爪の一部を複数の切片へ切片化する工程、(d)切片中の放射活性の濃度を少なくとも2個の穴に関する位置の関数として、複数の切片のそれぞれについて決定する工程、および(e)工程(d)における決定に少なくとも部分的に基づいて、少なくとも2個の穴の間の間隔を最適化する工程も含む。最適化された間隔を使用するつめの処置の方法も記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)爪の表面から形成され、爪内に伸びる少なくとも2個の間隔が離れた穴を有する爪を準備する工程;
(b)放射標識された医薬組成物を爪に局所的に適用する工程であって、少なくともその一部が少なくとも2個の穴に受け入れられる工程;
(c)少なくとも2個の穴に近接する爪の一部を複数の切片へ切片化する工程;
(d)切片中の放射活性の濃度を少なくとも2個の穴に関する位置の関数として、複数の切片のそれぞれについて決定する工程;および
(e)工程(d)における決定に少なくとも部分的に基づいて、少なくとも2個の穴の間の間隔を最適化する工程
を含む、つめの処置を最適化するための方法。
【請求項２】
(a)第2の医薬組成物を使用して請求項1に記載の方法により少なくとも2個の穴の間の最適な間隔を予め決定する工程であって、第2の医薬組成物が第1の医薬組成物の放射標識されたバージョンである工程;
(b)予め決定された最適な間隔で間隔が離れた少なくとも2個の穴を患者の爪に形成する工程;および
(c)患者の爪に第1の医薬組成物を局所的に適用する工程
を含む、局所的に適用される第1の医薬組成物を使用して患者におけるつめの感染を処置する方法。
【請求項３】
間隔が離れた少なくとも2個の穴を設けられた感染した爪に抗真菌剤を含む医薬組成物を局所的に適用する工程を含む、患者におけるつめの感染を処置する方法。
【請求項４】
抗真菌剤がテルビナフィンまたはその薬学的塩もしくはエステルである、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも2個の離れた穴が:
(a)爪の表面から形成され、爪内に伸びる少なくとも2個の間隔が離れた穴を有する爪を準備する工程;
(b)放射標識された医薬組成物を爪に局所的に適用する工程であって、少なくともその一部が少なくとも2個の穴に受け入れられる工程;
(c)少なくとも2個の穴に近接する爪の一部を複数の切片へ切片化する工程;
(d)切片中の放射活性の濃度を少なくとも2個の穴に関する位置の関数として、複数の切片のそれぞれについて決定する工程;および
(e)工程(d)における決定に少なくとも部分的に基づいて、少なくとも2個の穴の間の間隔を最適化する工程
を含む方法を適用する工程によって準備される、請求項3または4に記載の方法。
【請求項６】
間隔が離れた少なくとも2個の穴を設けた感染した爪に医薬組成物を局所的に適用する工程を含む、患者におけるつめの感染の処置における使用のための抗真菌剤を含む医薬組成物。
【請求項７】
患者におけるつめの感染の処置における使用のための抗真菌剤を含む、請求項6に記載の医薬組成物であって、抗真菌剤がテルビナフィンまたはその薬学的塩もしくはエステルである医薬組成物。
【請求項８】
患者におけるつめの感染の処置における使用のための抗真菌剤を含む、請求項6または7に記載の医薬組成物であって、少なくとも2個の離れた穴が:
(a)爪の表面から形成され、爪内に伸びる少なくとも2個の間隔が離れた穴を有する爪を準備する工程;
(b)放射標識された医薬組成物を爪に局所的に適用する工程であって、少なくともその一部が少なくとも2個の穴に受け入れられる工程;
(c)少なくとも2個の穴に近接する爪の一部を複数の切片へ切片化する工程;
(d)切片中の放射活性の濃度を少なくとも2個の穴に関する位置の関数として、複数の切片のそれぞれについて決定する工程;および
(e)工程(d)における決定に少なくとも部分的に基づいて、少なくとも2個の穴の間の間隔を最適化する工程
を含む方法を適用する工程によって準備される、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、つめの処置、より詳細には、一般に処置の最適化のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
爪は、しばしば真菌感染(爪真菌症(onychomycosis))、具体的には皮膚糸状菌性もしくはカンジダ性爪真菌症の部位、または乾癬などの他の疾患の部位になる。これらの病態の好ましい処置は経爪的(transungually)に送達される医薬組成物の局所適用を含むが、爪の硬い構造により処置が困難になっている。
【０００３】
爪に局所的に適用される医薬組成物を送達する1つの方法は、薬剤が爪または爪床に拡散できるように爪に通したマイクロ導管(microconduit)の形成を含む。そのようなマイクロ導管を穿孔するためのデバイスおよび方法は(他のデバイスおよび方法がこの目的のために存在するが)、米国特許第7,848,799号に記載されており、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。マイクロ導管または穴は、典型的には爪の厚さの約10%から100%の深さを有し、実際に約0.2から5ミリメートル(mm)である場合がある。穴も典型的には円柱状または円錐状の形状、約400マイクロメートル(μm)から1mmの間、より詳細には約400μmから600μmの間の直径を有する。
【０００４】
医薬組成物が最も効果的に患部を処置できるようにするために、感染の大きさに応じてしばしば複数の穴が爪に形成される必要がある。爪上の穴の間隔および配置は良好な送達のために重要である。したがって、各穴の周囲の爪床レベルで適用された医薬組成物の拡散に依存する、爪に形成される穴について最適な間隔および配置を決定するための方法を提供することが望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第7,848,799号
【特許文献２】国際公開第2011/073395号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
簡潔に述べると、本発明の実施形態はつめの処置を最適化するための方法を含む。方法は、(a)爪の表面から形成され、爪内に伸びる少なくとも2個の間隔が離れた穴を有する爪を準備する工程、および(b)放射標識された医薬組成物を前記爪に局所的に適用する工程を含む。放射標識された医薬組成物の少なくとも一部は、少なくとも2個の穴に受け入れられる。方法は、(c)前記少なくとも2個の穴に近接する前記爪の一部を複数の切片へ切片化する工程、(d)前記切片中の放射活性の濃度を前記少なくとも2個の穴に関する位置の関数として、複数の切片のそれぞれについて決定する工程、および(e)工程(d)における決定に少なくとも部分的に基づいて、前記少なくとも2個の穴の間の間隔を最適化する工程をさらに含む。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の別の実施形態は、局所的に適用される第1の医薬組成物を使用して患者におけるつめの感染を処置する方法を含む。方法は、(a)第2の医薬組成物を使用して上記の方法により少なくとも2個の穴の間の最適な間隔を予め決定する工程を含む。第2の医薬組成物は第1の医薬組成物の放射標識されたバージョンである。方法は(b)前記予め決定された最適な間隔で間隔が離れた少なくとも2個の穴を患者の爪に形成する工程;および
(c)患者の爪に第1の医薬組成物の治療有効量を局所的に適用する工程、をさらに含む。
【０００８】
本発明のさらなる実施形態は、間隔が離れた少なくとも2個の穴を設けた感染した爪に抗真菌剤を含む医薬組成物を局所的に適用する工程を含む、患者におけるつめの感染を処置するための方法を含む。
【０００９】
前述の概要および次の本発明の好ましい実施形態の詳細な記載は、添付の図面を併せて読むと、よりよく理解されよう。説明のために、現在好ましい図面実施形態において示されている。しかし本発明が、示される正確な配列および手段に限定されないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】穿孔前の爪試料4個の写真である。
【図１Ｂ】穿孔前の爪試料4個の写真である。
【図１Ｃ】穿孔前の爪試料4個の写真である。
【図１Ｄ】穿孔前の爪試料4個の写真である。
【図２Ａ】図1Aの爪試料の穿孔および洗浄後の写真である。
【図２Ｂ】図1Bの爪試料の穿孔および洗浄後の写真である。
【図２Ｃ】図1Cの爪試料の穿孔および洗浄後の写真である。
【図２Ｄ】図1Dの爪試料の穿孔および洗浄後の写真である。
【図３Ａ】間隔が2mm離れた穴を有する図2Aの爪試料の[14C]-テルビナフィンの投与後の切片2個のオートラジオグラムである。
【図３Ｂ】間隔が2mm離れた穴を有する図2Aの爪試料の[14C]-テルビナフィンの投与後の切片2個のオートラジオグラムである。
【図４】間隔が2mm離れた穴を有する図2Aの爪試料の[14C]-テルビナフィンの投与後の切片における全放射活性の概要のグラフである。
【図５Ａ】間隔が4mm離れた穴を有する図2Aの爪試料の[14C]-テルビナフィンの投与後の切片2個のオートラジオグラムである。
【図５Ｂ】間隔が4mm離れた穴を有する図2Aの爪試料の[14C]-テルビナフィンの投与後の切片2個のオートラジオグラムである。
【図６】間隔が4mm離れた穴を有する図2Aの爪試料の[14C]-テルビナフィンの投与後の切片における全放射活性の概要のグラフである。
【図７Ａ】間隔が2mm離れた穴を有する図2Bの爪試料の[14C]-テルビナフィンの投与後の切片2個のオートラジオグラムである。
【図７Ｂ】間隔が2mm離れた穴を有する図2Bの爪試料の[14C]-テルビナフィンの投与後の切片2個のオートラジオグラムである。
【図８】間隔が2mm離れた穴を有する図2Bの爪試料の[14C]-テルビナフィンの投与後の切片における全放射活性の概要のグラフである。
【図９Ａ】間隔が4mm離れた穴を有する図2Bの爪試料の[14C]-テルビナフィンの投与後の切片2個のオートラジオグラムである。
【図９Ｂ】間隔が4mm離れた穴を有する図2Bの爪試料の[14C]-テルビナフィンの投与後の切片2個のオートラジオグラムである。
【図１０】間隔が4mm離れた穴を有する図2Bの爪試料の[14C]-テルビナフィンの投与後の切片における全放射活性の概要のグラフである。
【図１１Ａ】間隔が2mm離れた穴を有する図2Cの爪試料の[14C]-テルビナフィンの投与後の切片2個のオートラジオグラムである。
【図１１Ｂ】間隔が2mm離れた穴を有する図2Cの爪試料の[14C]-テルビナフィンの投与後の切片2個のオートラジオグラムである。
【図１２】間隔が2mm離れた穴を有する図2Cの爪試料の[14C]-テルビナフィンの投与後の切片における全放射活性の概要のグラフである。
【図１３Ａ】間隔が4mm離れた穴を有する図2Cの爪試料の[14C]-テルビナフィンの投与後の切片2個のオートラジオグラムである。
【図１３Ｂ】間隔が4mm離れた穴を有する図2Cの爪試料の[14C]-テルビナフィンの投与後の切片2個のオートラジオグラムである。
【図１４】間隔が4mm離れた穴を有する図2Cの爪試料の[14C]-テルビナフィンの投与後の切片における全放射活性の概要のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の詳細な記載
ある種の専門用語は、限定ではなく便宜のためだけに以下の記載で使用される。「右」、「左」、「下」および「上」という用語は、参照される図面における方向を指定する。「内側へ」および「外側へ」という用語は、デバイスおよびその指定された部分の幾何学的中心に向かう方向、および中心から離れる方向をそれぞれ指す。専門用語は、上記に列挙された用語、その派生語および類似の意味の用語を含む。追加的に、特許請求の範囲および明細書の対応する部分において使用される「a」および「an」という用語は、「少なくとも1つの」を意味する。
【００１２】
本明細書において記載される方法は、爪の表面から形成され、爪内に伸びる少なくとも2個(好ましくはそれを超える)の間隔が離れた穴を有する爪の準備を必要とする。試料爪は、爪および爪床が後に分析のために切片化されることから、好ましくは死体から提供される。複数セットの穴が、各セットが穴の間に異なる間隔を有して爪に形成されることは好ましい。例えば図2A〜図2Dでは、各試料爪の穴T1〜T3は間隔が約2mm離され、一方穴T4〜T6は間隔が約4mm離される。他の間隔も実際の患者適用のための最適な間隔の決定を行うために利用できる。穴は、上記のとおり形成できる。
【００１３】
試料爪が調製されると放射標識された医薬組成物は、爪に局所的に適用される。放射標識された医薬組成物は、好ましくは実際の患者に適用されると予測される組成物と同じであるが、組成物中の原子のごく一部、好ましくは組成物の医薬品有効成分(API)中の原子のごく一部が、それらの放射性同位元素で置き換えられている。組成物中の他の成分(活性または不活性)も放射標識の目的のために用いられる場合がある。最も一般的には、炭素-14(14C)が医薬組成物中の非放射性炭素原子のいくつかを置き換えるために使用される。しかし他の放射性同位元素も使用できる。以下に記載の研究例では、テルビナフィン(爪真菌症を処置することにおいて抗真菌剤としての立証された有効性を有する)が医薬組成物中のAPIとして選択された。医薬組成物中のテルビナフィンのごく一部が試料爪への適用の前に炭素標識された。
【００１４】
他のAPIを含む医薬組成物も本発明の実施形態により使用できることは当業者によって容易に理解される。穿孔処理された爪に適用されることが意図される医薬組成物が記載されている、例えば国際公開第2011/073395号を参照されたい。その内容全体は参照により本明細書に組み込まれるが、他の医薬組成物も本発明の実施形態により使用できる。
【００１５】
放射標識された医薬組成物の局所的適用は、試料爪の穴に組成物が流入できるようにする。そこから組成物は、爪床に拡散する。本明細書に記載の方法は、局所的適用後に生じる拡散の量を検出するために設計される。爪床への侵入において組成物がどのように挙動するかを理解することによって、実際の患者の爪の穴の間の適切な間隔を決定できる。
【００１６】
放射標識された医薬組成物の適用後に試料爪は、穴の近接部を複数の切片にミクロトームなどのデバイスを使用して切片化される。切片は、厚さ約数マイクロメートルであり、粘着テープに取られてよい。切片は、後の工程の際の分解を防ぐために好ましくは凍結乾燥される。好ましくは、各切片はセットの各穴に近接する爪床の一部を包含する。例えば図3Aおよび図3Bは、2mm間隔設定の3個の穴T1、T2、T3のそれぞれに近接している図2Aの爪床の切片を示す。切片中に複数の穴を包含することによって、放射活性検出を実施することにおけるより高い効率が達成され、穴の間に拡散した組成物の重複が(存在する範囲で)観察できる。
【００１７】
次いで各切片は、穴に関する位置の関数としての切片中の放射活性の濃度を決定するために分析される。定量的全身オートラジオグラフィー(QWBA)がこの決定を行うために使用されることは好ましいが、組織中の放射活性レベルを定量的に評価するための他の技術も同様に使用できる。例えば切片は、拡散された放射標識された医薬組成物によって放出される放射線からの画像を明らかにするために蛍光体フィルムまたはプレートに長期間曝露されてよい。図3A〜図3B、図5A〜図5B、図7A〜図7B、図9A〜図9B、図11A〜図11Bおよび図13A〜図13Bは、図2A〜図2Cの試料から得られたオートラジオグラフ画像例である。
【００１８】
オートラジオグラフは、画像解析ソフトウェアを使用して走査および定量できる。各切片のオートラジオグラフの分析から決定される放射活性レベルは、次いで、爪の穴の位置に対して評価できる。図4、図6、図8、図10、図12および図14は、図2A〜図2Cに示す試料のそれぞれにおける穴のセットについての放射活性レベルのプロットの例である。放射活性データを分析する際に天然に存在するバックグラウンド放射活性レベルを把握、除去できることは重要である。
【００１９】
このデータにより、穴の間の間隔は最適化できる。例えば図4、図6、図8、図10、図12および図14におけるプロットから観察できるとおり、テルビナフィンの拡散は、爪の穴に特に局所化されている。したがって2mm間隔が4mm間隔より好ましい。感染領域、穿孔能力、適用される組成物の量、審美的に考慮すべき事項などの他に考慮すべき事項との組合せで穴の間隔は最適化される。追加的研究は、つめの感染を効果的に処置するための正確な穴の間隔をさらに明確にするために実行される。
【００２０】
本方法に従って、予め決定された最適化された間隔に従って患者の爪に穴を形成できる。次いで対応する非放射標識医薬組成物の治療有効量が局所的に適用され、前記組成物は好ましくは抗真菌剤を含む。
【００２１】
本発明は、間隔が離れた少なくとも2個の穴を設けた感染した爪に抗真菌剤を含む医薬組成物を局所的に適用する工程を含む、患者におけるつめの感染を処置するための方法にも関する。特に好ましい抗真菌剤は、テルビナフィンまたはその薬学的塩(pharmaceutical salt)もしくはエステルである。少なくとも2個の穴は記載された方法を使用して好ましくは準備される。
【００２２】
以下に記載されるのは、本発明の好ましい実施形態を具体化する研究の結果である。
【００２３】
研究例
本研究は、薬物で爪床を覆うために必要な穴の最適な間隔を判定するために、穿孔された爪に局所的に適用された[14C]-テルビナフィンの爪床での拡散の程度を評価するために定量的全身オートラジオグラフィー法(QWBA)を使用して実行された。
【００２４】
材料および方法
爪を含む凍結ヒト死体の指先4個を使用した。各指爪は、2シリーズの穴3個(1セットは2mm離れており、他のセットは4mm離れている)を含有していた。
【００２５】
試料を、培養培地3ミリリットル(mL)を含有するトランスウェルプレートに置いた。爪3個に放射標識された検査品を1時間適用し;1個には非放射標識の検査品を適用した。製剤の制限された用量(finite dose)(5マイクロリットル(μL))を爪表面に適用した。インキュベーションを37℃、5%CO2および飽和湿度(saturated hygrometry)で1時間実行した。インキュベーションの終了時に、過剰な製剤を爪表面から除去した。
【００２６】
各試料を、適合QWBA手順を使用して支持物の上で凍結した。次いで切片を各指爪からテープに取り、各投与部位から爪床レベルでの放射活性の拡散を判定するためにQWBA法を使用して分析した。次いで放射活性の濃度の3-次元グラフを、爪基質を通じた拡散を可視化するために作出した。
【００２７】
結果および結論
顕著な放射性シグナルが爪甲の表面に観察された。さらにデータは、穴周囲の爪床レベルで放射標識された薬物の拡散があったことを示し、各穴の周囲の拡散の程度を測定した。付加的に、2mm間隔の穴と比較して4mm間隔の穴の間では放射活性の拡散がほとんどなかった。実際に4mm間隔の穴では放射活性の濃度は、穴の間ではバックグラウンド放射線レベルに減少していた。
【００２８】
総合すると、データは、2mm間隔の穴が薬物で爪床を覆うためにより好適であることを示している。この研究では、QWBAは、局所的に適用された放射標識された薬物の爪を通じた浸透を調査するために有効であった。さらにこれは、そのような種類の調査のための、QWBAの最初の適用であると考えられ、QWBAは「非標準的」目的のための通常ではない試料での分布の調査におけるその多用途性を証明した。
【００２９】
研究の記載
[14C]-テルビナフィンの爪床上でのin vitro拡散を穿孔したヒトの手爪で研究した。試料4個を研究を通じて使用し、次のとおり穿孔した:
・各試料について:各穴の間の距離2mmで直径0.6mmの穴3個および各穴の間の距離4mmで直径0.6mmの穴3個
・試料3個を両性溶液中の10%[14C]-テルビナフィンで処置した
・試料1個をプラセボで処置した
・処置継続時間:1時間
・検査品5μLを各爪に適用した
・37℃、5%CO2および飽和湿度で1時間インキュベーション
・インキュベーション期間の終了時に過剰な検査品を除去し、試料をオートラジオグラフィー分析のための加工まで-80℃で保存した。
【００３０】
生物学的試料の保存
処置前は爪試料をおよそ-80℃で保存した。
【００３１】
検査品
質量分析によって決定されたミリモルあたり約59ミリキュリー(mCi/mmol) (約2.18ギガベクレル(GBq)/mmol))の比放射能を有する[14C]-テルビナフィン塩酸塩を使用した。放射化学的純度は、分子量329.8でおよそ99.8%であった。材料をおよそ-20℃で保存した。
【００３２】
放射標識された製剤の調製
本研究を通じて使用する[14C]-テルビナフィン含有製剤を、両性溶液(国際公開第2011/073395号における開示など)中の10%化合物10mLを[14C]-テルビナフィン1mCi(5.78ミリグラム(mg)に相当する)に加えることによって調製した。これらの条件で[14C]-テルビナフィンは全テルビナフィンの0.58%に相当し、無視できると考えられた。
【００３３】
放射性濃度の管理
使用前に、製剤の放射活性を液体シンチレーション計測によって3回重複で次のとおり測定した:製剤100μLを10mLメタノールおよび5mL水中に希釈した。この希釈溶液100μLをPerkin Elmerから入手可能なPICO FLUOR 10mLで液体シンチレーション計測によって直接計測した。製剤で測定された放射性濃度は、1マイクロキュリー(μCi)/10μLであった。
【００３４】
放射性純度の管理
製剤の放射性純度を、放射性検出を伴う高速液体クロマトグラフィー(HPLC)分析によって爪処置の前に確認した。製剤の放射性純度は約92.7%であった。
【００３５】
検査システム
ヒト死体手から得たヒト指爪4個を、本研究全体を通じて使用した。爪試料の識別を下のtable(表1)に示す:
【００３６】
【表１】
2015516215.tif 000002
【００３７】
各指爪は穴(直径0.6mm)3個の2セットを含有し、図1A〜図1Dおよび図2A〜図2Dに例示するとおり1セットは2mm離れており、他のセットは4mm離れている。
【００３８】
処置条件
室温での解凍後、爪試料を次亜塩素酸ナトリウム溶液中で1回、次いで2%ペニシリン-ストレプトマイシン(v/v)を含有するHEPES-緩衝ハンクスの平衡塩類溶液(HHBSS)中で3回洗浄した。HHBSSは、1mM HEPES緩衝液を最終濃度0.025Mに達するまでHBSSに(1M HEPES 25mLをHBSS 1Lに)加えることによって調製した。
【００３９】
次いで各爪試料を細胞培養インサートに置いた。各インサートを6-ウェル培養プレートのレシーバーチャンバーに導入した。レシーバーチャンバーを抗生物質(2%ペニシリン-ストレプトマイシン)を含有するHHBSS 3mLで満たした。
【００４０】
次のとおり爪3個には放射標識された検査品を適用し、一方他の爪には非標識検査品を適用した:
・試料A、BおよびC(処置試料):10%[14C]-テルビナフィンを含有する製剤5μLを各爪試料の表面に適用した。
・試料D(対照試料):10%テルビナフィンを含有する製剤5μLを爪試料の表面に適用した。
【００４１】
爪試料を含有する培養プレートを37℃、5%CO2および飽和湿度に保持した培養インキュベーターに置いた。爪処置の継続時間は1時間であった。
【００４２】
処置期間の終了時に爪上に残っている過剰な製剤を乾いた綿棒1本および無水エタノールで湿らせた綿棒5本を続いて使用して拭き取った。これらの綿棒は廃棄した。次いで爪試料を-80℃で保存し、オートラジオグラフィーによる分析のために凍結のまま発送した。
【００４３】
インキュベーション系の特異性(インサートを通じて適用した製剤の漏出による放射性汚染がないこと)を確認するために、培養培地での放射活性レベルを処置期間の終了時に測定した。各レシーバーチャンバー培地は、液体シンチレーション計測によって次のとおり3回重複で管理された:培養培地100μLをPerkin Elmerから入手可能なHIONIC FLUOR 10mLを使用して液体シンチレーション計測によって直接計測した。以下のtable(表2)に表す結果は、試料Aおよび試料Cの培養培地における非常に低い放射活性レベルを示す。これらの放射活性レベルは、試料Aでは適用された用量の1.6%および試料Cでは適用された用量の0.1%を表すだけであった。これらの放射活性レベルは、無視できると考えられ、本研究の結果を損なわない。
【００４４】
【表２】
2015516215.tif 000003
【００４５】
オートラジオグラフィーのための指爪の調製
試料(ヒト指爪4個)を固体CO2上で十分に凍結し、-80℃の温度を維持するように設定した冷凍庫に直ちに移して保存した。切片化の際に各試料を支持するために支持ブロックを準備した。具体的には、型を2%カルボキシメチルセルロース溶液で満たし、ドライアイスとヘキサンとの混合物中で凍結した。凍結指をコルク円盤にクライオ基質を使用して水平位置で固定し、次いで円盤をさらなるクライオ基質でカルボキシメチルセルロースブロックに固定した。指を、爪が横を向き、穴の各シリーズが(穿孔された穴のアライメントに応じて)可能な限り水平であるように包埋した。さらなるクライオ基質を切片化の際に追加的支持を与えるように各指の周辺に加えた。切片化の前後には凍結ブロックを-20oCの温度を維持するように設定した冷凍庫で保存した。
【００４６】
クライオ切片
各爪を、シリーズの最も上の穴のすぐ隣まで切片化した。次いで水平切片(厚さおよそ30μm)を各指爪から粘着テープに取った。切片30個までを各シリーズの穴から取り、各投与部位からの放射活性の拡散の調査を可能にした。切片は、全身クライオミクロトーム(好ましくは、Leica Instruments GmbHから入手可能なLEICA CM3600)を使用して取った。切片を保存蛍光体クスリーンへの曝露の前に凍結乾燥した。
【００４７】
QWBAまたはオートラジオグラフィー
分析のために、爪切片を蛍光体スクリーンに密接させて置き、7日間そのままにした。各蛍光体スクリーン上に外部標準のセットも曝露した。これらの標準は、14C-標識参照溶液の系列希釈を添加した血液から調製し、カルボキシメチルセルロースのブロックに穿孔した穴に分注し、凍結し、次いで爪試料と同じ方法で切片化した。
【００４８】
曝露した蛍光体スクリーンをFUJIFILM FLA-5000 Image Analyzerおよび、日本のFuji Photo Film Co. Ltd.から入手可能なIMAGEREADER FLA-5000ソフトウェアを使用して走査した。蛍光体スクリーンを走査後、試料中の放射活性の画像をデジタルで記録した。次いで画像をAIDA画像解析ソフトウェア(raytest Isotopenmeβgerate GmbH of Strubenhardt、ドイツから入手可能)ならびに適切な内部および外部校正基準を参照して決定した各レベルでの放射活性レベルを使用して定量した。
【００４９】
定量的分析のために、バックグラウンド領域6個を各保存蛍光体スクリーン画像上に規定した。ソフトウェアは平均バックグラウンドを自動的に算出し、続いてこれを分析した全ての基準および組織から減算した。回帰係数を、各基準の反応と使用した放射性濃度範囲での名目dpm/gとを比較すること、および反応曲線が原点を通るようにすることから導いた。使用した基準濃度は約0.0071から37.1206nmol equiv/gの範囲であった。反応曲線はこれらの濃度において直線であり、決定の信頼限界まで直線であると仮定される。
【００５０】
データ操作
オートラジオグラフィー分析から得られた濃度データをスプレッドシートに出力した。各切片での分布のグラフ表現を得て、分布の概要を提供するためにこれらを重ねた。この概要は、分布の可視化を可能にするために二次および三次元形式の両方で表された。
【００５１】
試料保存
試料は、分析の前後には-20oCの温度を維持するように設定した冷凍庫で凍結して保存した。
【００５２】
結果
爪AからCでの全放射活性の拡散の代表的なオートラジオグラムおよびグラフでの概要を図3A〜図14に表す。縦軸(y)は濃度(nmol equiv/g)および横軸(x)は爪沿いの距離を表す。各「切片」は、分析のために採取された厚さ30μmの薄片である。
【００５３】
爪A
データは、爪Aでの穴の両セットが放射活性の適切な適用を受けたことを示している。穴の間には放射活性の拡散はほとんどなかった。これは、穴の間で放射活性の濃度がバックグラウンドレベルに減少している4mm間隔において特に明らかである。
【００５４】
爪B
爪Bについてのデータは、あまり明瞭ではない(恐らく、各切片の分析を正確に並べることにおいて経験した困難のため)。データは、爪B中の穴の両方のセットが放射活性の適切な適用を受けたことを示している。爪Aについてと同様に、穴の間に放射活性の拡散はほとんどなく、さらにこれは穴の間で放射活性の濃度がバックグラウンドレベルに減少している4mm間隔において特に明らかである。
【００５５】
爪C
爪Cからのデータは、穴のいずれのセットも放射活性の完全な適用を受けなかったことを示している。各シリーズ(2mmおよび4mm間隔の両方)の最初および最後の穴は、真ん中の穴よりも放射活性にあまり曝露されなかったと考えられた。特に最後の穴は非常に少ない放射活性を有した。したがって分布結果は、さらに問題である。しかしながら、再度、穴の間に放射活性の拡散はほとんどないと考えられる。さらにこれは、穴の間で放射活性の濃度がバックグラウンドレベルに減少している4mm間隔において特に明らかである。
【００５６】
爪D
爪Dから得られた画像は、放射活性濃度のバックグラウンドだけを示しているため、分析しなかった。
【００５７】
結論
顕著な放射性シグナルが爪甲の表面に観察された。さらにデータは、穴周囲に爪床レベルでの放射標識された薬物の拡散があることを示し、各穴周囲の拡散の程度を測定した。付加的に、2mm間隔の穴と比較して4mm間隔の穴の間では放射活性の拡散はほとんどなかった。実際に4mm間隔の穴では穴の間で放射活性の濃度はバックグラウンドレベルまで減少する。
【００５８】
総合すると、データは、2mm間隔の穴が爪床を薬物で覆うためにより好適であることを示している。この研究では、QWBAは、局所的に適用された放射標識された薬物の爪を通じた浸透を調査するために有効であった。さらにこれは、そのような種類の調査のためのQWBAの最初の適用であると考えられ、QWBAは「非標準的」目的のための通常ではない試料での分布の調査におけるその多用途性を証明した。
【００５９】
上記の実施形態に、その幅広い発明概念から逸脱することなく変更を加えられることは当業者によって認められよう。したがって、本発明が開示される具体的な実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲内の改変を網羅することが意図されることが理解される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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