(57)【要約】本発明は、転写増幅方法であって：  ａ）生物学的試料に存在する少なくとも１つのターゲット核酸が：  ・増幅プライマーと、  ・増幅を実行するために必要な、増幅に関与する酵素を含む、全試薬と、  ・増幅を実行するために必要な酵素を安定化させることが可能な、少なくとも１つのポリオールとの存在下に、入れられ、  ｂ）混合物が、４１℃を超える温度で加熱され、  ｃ）ターゲット核酸の転写増幅が、４１℃を超える温度で実行される、転写増幅方法に関する。本発明はまた、増幅方法によって得られるアンプリコンを検出する方法、シークされるターゲット核酸を前処理する方法、これらターゲット核酸の存在の、インビトロでの診断方法に関する。医療診断分野において優先して役立つ。【特許請求の範囲】
【請求項１】
転写増幅方法であって、該方法は
ａ）以下の化合物：
・増幅プライマー、
・前記増幅に関与する酵素を含む、増幅を実行するために必要な全試薬、及び
・前記増幅を実行するために必要な前記酵素を安定化させることが可能な少なくとも１つのポリオールとの存在下に、
生物学的試料に存在する少なくとも１つのターゲット核酸を置くこと、
ｂ）全ての前記化合物の存在下で、４４℃を超える温度で混合物を加熱することによって、前記ターゲットの変性を実行すること、及び
ｃ）前記ターゲット核酸の転写増幅を、４４℃を超える温度で実行することを含む、転写増幅方法。
【請求項２】
前記変性および前記増幅が実行される前記温度は、４４から４９℃である、請求項１に記載の増幅方法。
【請求項３】
前記変性および前記増幅が実行される前記温度は、４６℃以上である、請求項１に記載の増幅方法。
【請求項４】
前記酵素によって付与される酵素活性は：
ｉ．ＲＮＡポリメラーゼ活性（Ｔ７、ＳＰ６等）、
ｉｉ．逆転写酵素活性（ＡＭＶ−ＲＴ、ＭＭＬＶ−ＲＴ等）、及び
ｉｉｉ．ＲＮＡｓｅ  Ｈ活性
である、請求項１から３のいずれか一項に記載の増幅方法。
【請求項５】
前記ポリオールは、以下の化合物：
ｉ．ラクトース、
ｉｉ．ソルビトール、
ｉｉｉ．スクロース、
ｉｖ．マンニトール、及び
ｖ．トレハロース
の１つまたは組合せからなる、請求項１から４のいずれか一項に記載の増幅方法。
【請求項６】
ポリオールの濃度は、０．４から１．５Ｍである、請求項１から５のいずれか一項に記載の増幅方法。
【請求項７】
請求項１から５のいずれか一項に記載の増幅方法によって得られるアンプリコンを検出する方法であって、該検出方法は、請求項１に記載のステップａ）の間に、前記生物学的試料中に存在し得る、探索されるターゲット核酸につき、少なくとも１タイプの検出プローブを加えること及び、以下の：
ｄ）ステップｃ）において実行される前記増幅に由来するアンプリコンの存在の検出が、溶液中の各アンプリコンへの前記プローブのハイブリダイゼーションによって実行される、さらなるステップを実行すること
を含む検出方法。
【請求項８】
請求項１から５のいずれか一項に記載の方法により増幅されるはずの、前記生物学的試料に存在し得る、探索されるターゲット核酸を前処理する方法であって、
該前処理する方法は、請求項１に記載のステップａ）の前に、以下のさらなるステップであって、前記生物学的試料を、ＲＮＡの場合は６５℃又はそれ以下の温度に、及びＤＮＡの場合は９５℃又はそれ以下の温度に供するステップを実行することを含む方法。
【請求項９】
請求項１から５のいずれか一項に記載の方法により増幅されるはずの、前記生物学的試料に存在し得る、探索されるターゲット核酸を前処理する方法であって、
該前処理する方法は、ステップａ）の前に、前記生物学的試料を４９℃又はそれ以下の温度に供する更なるステップを実行することを含む、方法。
【請求項１０】
探索され、かつ生物学的試料中に存在し得る、１種のまたはいくつかの種のターゲット核酸の存在の、インビトロでの診断方法であって：
ａ）前処理または変性方法を実行すること、および請求項１から６のいずれか一項に記載の増幅方法を実行すること、及び
ｂ）請求項７に記載の検出方法を実行することを含む、方法。
【請求項１１】
全てが単一容器内で実行されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
全てが４４℃を超える単一温度で実行されることを特徴とする、請求項１０および１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
全てが４６から４９℃の間の単一温度で実行されることを特徴とする、請求項１０および１１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的試料中に存在する少なくとも１つのターゲット核酸を転写増幅法によって増幅する方法であって、異なる温度のステップ（すなわち、変性および増幅それ自体）を組み合わせることを可能にする方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
先行技術は、酵素におけるポリオールの熱安定化効果を対象とする一定数の学術論文で構成される；これには、具体的に以下のものがある。
−Lee, 1981, J.Biol.Chemistry 256(14):7193-7201, 表題：「Ｔｈｅ  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｓｕｃｒｏｓｅ」、これは、α−キモトリプシン、キモトリプシノーゲンおよびＲＮＡｓｅに及ぼすスクロースの熱安定化効果を記載する。
−Bernier, 1988, J.Biotechnol.7:293-298，表題：「Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  α−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ｂｙ  ｐｏｌｙｈｙｄｒｉｃ  ａｌｃｏｈｏｌｓ」はα−グルコシダーゼに及ぼすポリオールの熱安定化効果を証明する。
−Carninci, 1998, Proc.Natl Acad.Sci.95:520-524, 表題：「Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒｍｏｌａｂｉｌｅ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｂｙ  ｔｒｅｈａｌｏｓｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ  ｃＤＮＡ」は、逆転写酵素および制限酵素の、トレハロースによる熱安定化を提示する。
−Spiess, 2004, Clinical Chemistry 50(7):1256-1259, 表題「Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ  ｉｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ＰＣＲ  ｅｎｈａｎｃｅｒ：ｌｏｗｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｂｙ  ｄｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｔｒｅｈａｌｏｓｅ」は、Ｔａｑポリメラーゼに及ぼすトレハロースの熱安定化効果を証明する。
【０００３】
従って、約３０年間、多くの研究者が、酵素に及ぼすポリオールの熱安定化効果に興味を持っていたことが明らかである。さらに、１５年前に特許出願された欧州特許出願公開第０８２１０５８号明細書は、酵素活性を高温にて向上させる方法を提供する。対応特許は、ポリメラーゼおよび制限酵素を熱安定化させるためのポリオールの使用を特許請求する。
【０００４】
科学者らの関心にもかかわらず、誰もこのアプローチをＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ等（操作のため、複数の異なる酵素活性を利用するタイプ）の転写増幅技術に適合させようとしなかったようだ。第１ステップは、ターゲットである核酸（通常、リボ核酸（ＲＮＡ））の、６５℃にて２分間の変性からなり、そして第２ステップ自体は、４１℃での等温増幅に必要な酵素を加えることからなる。これら２つのステップは、連続的な２つの温度を使用することで、当該方法をユーザーにとって技術的に制限的なものとしている。
【０００５】
さらに、単一温度（４１℃）の利用は現在、グアニンおよびシトシンリッチなターゲットが有する二次構造により、増幅が困難となる等の様々な問題を引き起こしている。これら二次構造の、転写増幅技術を用いた増幅を容易とするための最もよく知られている解決策が、増幅混合物における第５ヌクレオチドの使用であり、これはリボイノシン３リン酸（ｒｉｂｏｉｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）である（K Nakahara et al.Nucleic Acids Res.1998 April 1;26(7):1854-1856）。
【０００６】
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ターゲットは、ＮＡＳＢＡ技術により容易に利用され得る。これを行うためには、例えば、ＤＮＡターゲットの増幅を可能にするために、欧州特許第０３９７２６９号明細書または国際公開第０２／０７０７３５号パンフレットに記載の方法で処理したサンプルに、前もって加えることで事足りる。
【０００７】
当業者は、数十年間、異なる温度の２ステップを有する、このタイプのＤＮＡターゲット転写を使用しているが、用いる酵素の熱安定性を向上させて、このタイプの転写増幅方法の制限を減軽しようとは未だ考えていない。
【発明の概要】
【０００８】
従って、本発明は、簡略化した転写増幅方法を記載するものであり、該方法は、熱安定化化学添加剤の存在下で、ターゲット核酸の添加と、増幅試薬（バッファ、酵素またはヌクレオチド等）の添加を同時にすることにより単一ステップで実行するものであり、これによって、前記ターゲットの変性ステップの温度と一致させた、より高い増幅温度の使用が可能となる。これは、特に予想外の効果であり、従って驚くべきことである。
【０００９】
新規性は、全酵素活性の、特にＮＡＳＢＡ増幅方法において存在する３つの酵素活性の同時熱安定化にあり、これは、化学添加剤（ポリオール等）を使用することで、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡｓｅ  ＨおよびＡＭＶ−ＲＴの活性を、４１℃よりも高い温度で維持することが可能となるので、変性および増幅の実験ステップを組み合わせることが可能となることによるものである。
【００１０】
本発明は、転写増幅方法であって：
ａ）・増幅プライマーと、
・増幅に関与する酵素を含む、増幅を実行するために必要な全試薬と、
・増幅を実行するために必要な酵素を安定化させることが可能な、少なくとも１つのポリオールとの存在下に、
生物学的試料に存在する少なくとも１つのターゲット核酸が置かれ、
ｂ）混合物が、４１℃を超える温度で加熱され、
ｃ）ターゲット核酸の転写増幅が、４１℃を超える温度で実行される、転写増幅方法を提供する。
【００１１】
増幅方法の一実施形態では、増幅が実行される温度は、４１から４９℃である。
【００１２】
増幅方法の別の実施形態では、増幅が実行される温度は、４６℃以上である。
【００１３】
増幅方法の実施形態が何であれ、酵素によって付与される酵素活性は：
・ＲＮＡポリメラーゼ活性（Ｔ７、ＳＰ６等）、
・逆転写酵素活性（ＡＭＶ−ＲＴ、ＭＭＬＶ−ＲＴ等）、及び
・ＲＮＡｓｅ  Ｈ活性  である。
【００１４】
ＲＮＡｓｅ  Ｈ活性は、独立した酵素によって（「個々の」活性が）、または別の酵素活性を有する酵素によって（「組み合わされた」活性が）、付与されることができる。ＲＮＡｓｅ  Ｈと組み合わされるこの他の活性は、逆転写酵素、またはＲＮＡポリメラーゼ、または異なる酵素によって、付与されてよい。
【００１５】
酵素活性は、以下のような等温増幅を実行することを可能とする：
−ＮＡＳＢＡ（核酸配列ベース増幅）、
−ＴＭＡ（転写介在性増幅）、
−３ＳＲ（自立的配列複製）、
−ＳＭＡＲＴ（ＲＮＡ技術のシグナル介在性増幅）、
−ＭＤＡ（多置換増幅）、および
−全ゲノム増幅のために、または、特定のＤＮＡもしくはＲＮＡ配列の増幅のために用いられる、上で言及した３つの活性の少なくとも１つを伴う、任意の他の等温増幅。
【００１６】
増幅方法の実施形態が何であれ、ポリオールは、以下の化合物の１つまたは組合せからなる：
・ラクトース、
・ソルビトール、
・スクロース、
・マンニトール、及び
・トレハロース。
【００１７】
増幅方法の実施形態が何であれ、ポリオールの濃度は、０．４から１．５Ｍである。
【００１８】
本発明は、更に、前述の増幅方法によって得られたアンプリコンを検出する方法に関するものであり、該方法は、ステップａ）の間に、生物学的試料に存在し得る、探索されるターゲット核酸につき、少なくとも１種の検出プローブを加えることと、以下のさらなるステップを実行することを含む：
ｄ）ステップｃ）において実行される増幅に由来するアンプリコンの存在の検出が、溶液中の各アンプリコンへのプローブのハイブリダイゼーションによって、実行される。
【００１９】
本発明は、更に、前述のように増幅されるはずの、生物学的試料中に存在し得る、探索されるターゲット核酸を前処理する方法に関するものであり、これは、ステップａ）の前に、以下のさらなるステップであって、前記生物学的試料が、ＲＮＡの場合は６５℃及びそれ以下の温度に、そしてＤＮＡの場合は９５℃及びそれ以下の温度に供するステップを実行することを含む。
【００２０】
本発明は、また、前述のように増幅されるはずの、生物学的試料中に存在し得る、探索されるターゲット核酸を前処理する方法に関するものであり、これは、ステップａ）の前に、前記生物学的試料が、４９℃及びそれ以下の温度に供される、更なるステップを実行することを含む。
【００２１】
本発明はまた、、探索され、かつ生物学的試料中に存在し得る、１種のまたはいくつかの種のターゲット核酸の存在の、インビトロでの診断方法に関するものであり、これは：
ａ）前述のように、前処理方法を実行することと、
ｂ）前述のように、増幅方法を実行することと、
ｃ）前述のように、検出方法を実行することと
を含む。
【００２２】
診断方法の一実施形態に従えば、本方法の全てが単一容器内で実行される。
【００２３】
上記方法の第１実施形態の変形に従えば、本方法の全てが４１℃を超える単一温度で実行される。
【００２４】
上記方法の第１実施形態の変形に従えば、本方法の全てが４６から４９℃の間の単一温度で実行される。
【００２５】
本明細書に添付される図は、説明のための例として与えられるものであり、限定する性質のものではない。図によって、本発明をより明確に理解することが可能となるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】０．２１Ｍのラクトース濃度における、７．５ｃｐｓ／反応のＨＩＶ−１Ｂ転写産物の存在下での、４６℃でのＮＡＳＢＡ増幅中の、熱安定化化合物の機能性スクリーニング（スクリーニングにつき７レプリカ）を表す図である。
【図１Ｂ】０．９Ｍのマルトース濃度における、７．５ｃｐｓ／反応のＨＩＶ−１Ｂ転写産物の存在下での、４６℃でのＮＡＳＢＡ増幅中の、熱安定化化合物の機能性スクリーニング（スクリーニングにつき７レプリカ）を表す図である。
【図１Ｃ】０．０５Ｍのラフィノース濃度における、７．５ｃｐｓ／反応のＨＩＶ−１Ｂ転写産物の存在下での、４６℃でのＮＡＳＢＡ増幅中の、熱安定化化合物の機能性スクリーニング（スクリーニングにつき７レプリカ）を表す図である。
【図１Ｄ】１．２Ｍのソルビトール濃度における、７．５ｃｐｓ／反応のＨＩＶ−１Ｂ転写産物の存在下での、４６℃でのＮＡＳＢＡ増幅中の、熱安定化化合物の機能性スクリーニング（スクリーニングにつき７レプリカ）を表す図である。
【図１Ｅ】０．６Ｍのスクロース濃度における、７．５ｃｐｓ／反応のＨＩＶ−１Ｂ転写産物の存在下での、４６℃でのＮＡＳＢＡ増幅中の、熱安定化化合物の機能性スクリーニング（スクリーニングにつき７レプリカ）を表す図である。
【図１Ｆ】１．０９Ｍのツラノース濃度における、７．５ｃｐｓ／反応のＨＩＶ−１Ｂ転写産物の存在下での、４６℃でのＮＡＳＢＡ増幅中の、熱安定化化合物の機能性スクリーニング（スクリーニングにつき７レプリカ）を表す図である。
【図２】種々の熱安定化化合物の存在下での、種々の温度での３分のプレインキュベーション後の、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの残存活性（％）を説明する図である。
【図３Ａ】０．４Ｍのトレハロースの存在下、または不在下での、種々の温度での１５分のプレインキュベーション後の、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの残存活性を説明する図である。
【図３Ｂ】０．４Ｍのトレハロースの存在下、または不在下での、種々の温度での２５分のプレインキュベーション後の、ＲＮＡｓｅ  Ｈの残存活性を説明する図である。
【図３Ｃ】０．４Ｍのトレハロースの存在下、または不在下での、種々の温度での２５分のプレインキュベーション後の、ＡＭＶ−ＲＴの残存活性を説明する図である。
【図４】ターゲット変性フェーズのない、５ｃｐｓ／試験のＨＩＶ−１タイプＢ  ＮＡＳＢＡの増幅中の、種々の熱安定化化合物の存在下で得られた感度（％）の測定値（Ｎ＝２４）を示す図である。４６℃では、熱安定化添加剤から利益を得られない対照例は、もはや増幅を得ることができないことに注目されたい。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
酵素を熱安定化させるための糖およびより一般的にはポリオールの使用が、文献において見られ得る情報の一部としてあるが、４１℃を超える、特に４４℃を超える、優先して４６℃を超える（最大４９℃までプレインキュベーション可能である）等温増幅をもたらすための転写増幅（ＮＡＳＢＡ等）における高濃度でのその使用は、エンドユーザーがこのタイプの増幅を技術的に単純化することを可能とする技術的進歩である。
【００２８】
４１から４５℃の間で機能するが、ＮＡＳＢＡ増幅温度を４６℃に上げて、構造化されたターゲットの変性を促進することで、検出性能レベルを向上させることを可能とすることが特に必要である。
【００２９】
以下の実施例は、ＮＡＳＢＡ（核酸配列ベース増幅）転写等温増幅法を用いる。しかしながら、本明細書中に記載されるアプローチは、他の等温増幅法（例えば、ＴＭＡ（転写介在性増幅）または３ＳＲ（自立的配列複製）等）にも適用可能である（Ｇｉｌｌ  ａｎｄ  Ｇｈａｅｍｉ，２００８，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，２７：２２４−２４５；Ｌｅｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９８，ＮＡＲ，２６−９：２１５０−２１５５）。
【００３０】
ＮＡＳＢＡ技術はＰＣＲの代替技術であり、後者とは異なって、ＲＮＡ増幅によって生微生物（細菌、ウイルス等）の遺伝的検出を可能とするものである。この増幅技術は、３つの活性酵素が機能することを必要とし、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡｓｅ  ＨおよびＡＭＶ−ＲＴが挙げられる。これら３つの活性酵素のうち、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼが最も熱感受性酵素である。
【実施例】
【００３１】
実施例１：ＮＡＳＢＡ転写等温増幅法に適合する熱安定化化合物の選択
熱安定化特性を有する、またはそのような特性を有すると推定される各種の化合物を、Ｎｕｃｌｉｓｅｎｓ  ＥａｓｙＱ（商標）増幅プラットホーム（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、Ｍａｒｃｙ  ｌ’Ｅｔｏｉｌｅ、フランス）でのＮＡＳＢＡ  ＨＩＶ−１  ２．０増幅試験において、製造業者の推奨に従って、評価した。５ｃｐｓから３０ｃｐｓのＨＩＶ−１タイプＢ転写産物を、評価するべき化合物の存在下または不在下での各反応におけるターゲットとして用いた。
【００３２】
化合物の存在下で４６℃の温度にて増幅物が得られる場合、化合物は、ＮＡＳＢＡ反応に対して適合性があり、かつ熱安定性があると確認することが可能となる。
【００３３】
図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅおよび図１Ｆの実施例によって示すように、４６℃でのＮＡＳＢＡ増幅物の有無により、熱安定化化合物（スクロース、ソルビトールおよびラクトース等）を容易に選択することが可能となり、これらはほとんどの場合、正確なシグナル（７レプリカのうち、少なくとも４つの陽性シグナル）を有する増幅をもたらす。続いて、このように単離した添加剤をより正確に研究する。
【００３４】
実施例２：ＵＶ分光測定法によるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの熱変性を監視することによる、熱安定化化合物の選択
この実施例において、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ変性温度（Ｔ７  Ｔｍ）は、添加剤のないコントロールと比較して、ある化学添加剤の存在下で、かなり増大することが実証される。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼをモデル酵素として選択した；熱変性に最も感受性であるためである。添加剤のない場合のＴ７  Ｔｍは、４８．５℃である。
【００３５】
ＵＶ分光測定技術を用いて、Ｔ７  Ｔｍ値を測定する。λ＝２８０ｎｍでのタンパク質の吸光度の変化を、温度関数として測定する。酵素が加熱されると、溶液は濁り、変性形態に相当する凝集体が生じる。Ｔｍは、５０％の天然形態および５０％の変性形態が存在する温度に相当する（曲線吸光度の第１導関数（ｆｉｒｓｔ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）＝ｆ（温度））。
【００３６】
ポリプロピレンフラスコにおいて、３００ｍＭのＰＢＳリン酸バッファ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｐ−４４１７、Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ、フランス）の４ｍｌを、１７ｍｇ／ｍｌのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ酵素（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、Ｍａｒｃｙ  ｌ’Ｅｔｏｉｌｅ、フランス）の１２μｌと混合する。すなわち、最終タンパク質濃度は０．０５ｍｇ／ｍｌである。その後、０．０５ｍｇ／ｍｌのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ溶液の５００μｌと、添加剤（Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ、フランス）の濃縮溶液の、または３００ｍＭのコントロールＰＢＳの５００μｌとを、ＵＶ分光測定用のクォーツキュベット中に入れる。均質化の後、λ＝２８０ｎｍでの吸光度の変化を、温度関数として測定し（１℃／分にて３０から６５℃まで）、前述のＴ７  Ｔｍを決定する（Ｃａｒｙ  ＵＶスペクトロフォトメーター、Ｖａｒｉａｎ、Ｌｅｓ  Ｕｌｉｓ、フランス）。
【００３７】
前述の方法に従って得た一部の代表的な結果を、以下の表１に報告する（ΔＴｍ値を、添加剤のタイプの関数として報告する）。
【００３８】
2015502154.tif 000002
【００３９】
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ酵素をある添加剤（ソルビトール、スクロースまたはラクトース等）の存在下で加熱すると、酵素の変性温度を数度ずつかなり増大させることが可能なことが明確に観察され、これによって熱安定化が確認される。
【００４０】
実施例３：Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの４６℃での熱安定性（Ｔ１／２）の測定
この実施例では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのＴ１／２の値を、ポリオールの存在下または不在下で決定する。測定法の記載を以下に示す（種々の試薬を用いている）。
【００４１】
2015502154.tif 000003
【００４２】
溶液Ｗ１：
以下の割合に従って、バッファＢ、バッファＣおよびバッファＤを、以下のＮｕｃｌｉｓｅｎｓ（商標）ＨＩＶ−１  ２．０試薬（ｒｅｆ．：２８５０３３、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、Ｍａｒｃｙ  ｌ’Ｅｔｏｉｌｅ、フランス）と混合する（８反応用）：
−３６．０８μｌバッファＡ
−６．３２μｌバッファＢ
−２５．３６μｌバッファＣ
−１７３．６μｌバッファＤ
−８つの「Ｎｕｃｌｉｓｅｎｓ（商標）ＨＩＶ−１  ２．０  アキュースフィア（ａｃｃｕｓｐｈｅｒｅ）試薬」
−９６０μｌの「Ｎｕｃｌｉｓｅｎｓ（商標）ＨＩＶ−１  ２．０希釈試薬」。
【００４３】
溶液Ｓ（基質混合物）：
−７０ｍＭ、ｐＨ  ８．５のトリス−ＨＣｌ
−それぞれ１．３ｍＭのｄＮＴＰ
−それぞれ２．６ｍＭのｒＡＴＰ、ｒＣＴＰおよびｒＵＴＰ
−２ｍＭのｒＧＴＰ
−０．６ｍＭのｒＩＴＰ
−６０ｍＭのスクロース
−４０ｍＭのマンニトール
−７ｇ／ｌのデキストランＴ−４０
−１６ｍＭのＭｇＣｌ２
−３２０ｍＭのＫＣｌ
−２０ｍＭのＤＴＴ
−３．５ＭのＤＭＳＯ
−０．１から０．３μＭのＭＢ１分子ビーコン
−１０ｎＭから２０ｎＭのＴ７−Ｍｉｎオリゴヌクレオチド
−１０ｎＭから２０ｎＭのＴ７−ｐｌｕｓオリゴヌクレオチド。
【００４４】
用いた配列（５’−３’方向）：
2015502154.tif 000004
【００４５】
１．評価する酵素を、容量活性が１０９ｋＵ／ｍｌとなるように希釈する。
２．評価する酵素の容量２０μｌを、溶液Ｗ１の８４０μｌ中に希釈する。
３．続いて、評価する化合物の１１４μｌを、上のポイント２で記載した酵素混合物の１９３．５μｌに加える。
４．ポイント３で生じた混合物の２０μｌを１２部調製し、０．２ｍｌチューブに分配し、サーモサイクラー中で４６℃の温度にてインキュベートする。１チューブをサーモサイクラーから１０分おきに１１０分間取り出し、残存酵素活性の測定まで４℃で貯蔵する。
５．溶液Ｓの２０μｌを、プレインキュベートした混合物の５μｌに加え、５から１０分間の蛍光の増加率（酵素の残存活性と関連する）を測定する。
６．各Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの残存活性を、以下の計算に従って、プレインキュベートしなかった酵素、および１００％の活性に相当する酵素のフラクションのパーセンテージとして表す：
・ρＮ＝プレインキュベートしなかったＴ７  ＲＮＡポリメラーゼについて、５から１０分間で得た勾配、
・ρＴ＝ポリオールの存在下または不在下で４６℃にてプレインキュベートしたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼについて、５から１０分間で得た勾配、および
・％相対活性＝％（ρＴ／ρＮ）。
７．Ｔ１／２値は、酵素の初期活性が僅か５０％となるのに要する時間に相当する。
【００４６】
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの測定Ｔ１／２の結果を表２に記載する：
【００４７】
2015502154.tif 000005
【００４８】
表２に従えば、評価した全ての化学化合物は、ＮＡＳＢＡに特異的な環境で機能するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ活性に熱安定化効果を及ぼすことが注目される。１．４８Ｍソルビトールが最も大きな熱安定化効果を誘発する一方で、ラクトースがＴ７  ＲＮＡポリメラーゼに及ぼす熱安定化力は弱いが、それでも目に見え、かつ有意である。
【００４９】
実施例４：Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ活性を維持するための最大プレインキュベーション温度の測定
この実施例では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼが、熱安定化化合物の存在下で３分のプレインキュベーションに耐え得る最大温度を決定する。このステップは、ターゲットプレ変性またはプレインキュベーションフェーズに例えられ得る。この実施例で用いたプロトコルは、実施例２のものと同様であるが、温度が可変であり、そしてプレインキュベーション時間が３分に固定されたという事実を除く。図２は、０．７Ｍスクロース、０．４Ｍトレハロース、および１．４Ｍソルビトールが、４８℃の３分間に対して、またはソルビトールでは４９℃の３分間に対してさえ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ活性の１００％維持を可能にすることを示している。
【００５０】
実施例５：０．４Ｍトレハロースの存在下または不在下での、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡｓｅ  ＨおよびＡＭＶ−ＲＴに関する、種々の温度での熱安定性の測定
第１に、そして図３Ａ、図３Ｂおよび図３Ｃに示すように、この実施例は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７）が最も熱感受性であること、そしてトレハロース等の添加剤の使用により、より熱安定化し得ることを実証する。第２に、ＲＮＡｓｅ  Ｈ（ＲＨ）およびＡＭＶ−ＲＴ（ＲＴ）活性に及ぼすトレハロースの熱安定化効果も実証する。
【００５１】
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡｓｅ  ＨおよびＡＭＶ−ＲＴ活性を測定する方法の記載（実施例５について）：
１．Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡｓｅ  ＨおよびＡＭＶ−ＲＴ酵素を、それぞれ１０９ｋＵ／ｍｌ、１ｋＵ／ｍｌおよび２５ｋＵ／ｍｌの容量活性で用いる。
２．Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡｓｅ  ＨおよびＡＭＶ−ＲＴ酵素を、実施例３の溶液Ｗ１中に、それぞれ１／４３、２／１９１および２／２７に従う比率に希釈し、ＮＡＳＢＡ反応の物理化学的環境に似せる。
３．続いて、１．１Ｍトレハロース溶液を上記混合物に加え、最終濃度を０．４Ｍにする。
４．続いて、上記溶液の一部の２０μｌを０．２ｍｌチューブに分配し、種々の温度にて所定時間インキュベートする。
５．続いて、測定する各活性に対応する試薬を含有する溶液Ｓの２０μｌに酵素溶液５μｌを加えることによって、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡｓｅ  ＨまたはＡＭＶ−ＲＴ活性の各残存活性を測定する。
【００５２】
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ活性を測定するための溶液Ｓ：
実施例３と同様である。
【００５３】
ＲＮＡｓｅ  Ｈ活性を測定するための溶液Ｓ：
−それぞれ１．３ｍＭのｄＮＴＰ、
−それぞれ２．６ｍＭのｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＵＴＰ、
−２ｍＭのｒＧＴＰ、
−０．２５ｍＭのｒＩＴＰ、
−６０ｍＭのスクロース、
−４０ｍＭのマンニトール、
−７ｇ／ｌのデキストランＴ−４０、
−１６ｍＭのＭｇＣｌ２、
−４００ｍＭのＫＣｌ、
−２５ｍＭのＤＴＴ、
−８０ｍＭ、ｐＨ  ８．５のトリス−ＨＣｌ、
−４．４ＭのＤＭＳＯ、および
−０．２から２μＭのＲＮＡｓｅ  Ｈプローブ：５’ＦＡＭ−ＡＵＡＡ−ＴＡＭＲＡ  ３’。
【００５４】
ＤＮＡ−依存的ＡＭＶ−ＲＴ活性を測定するための溶液Ｓ：
−それぞれ０．３ｍＭのｄＮＴＰ、
−それぞれ０．６ｍＭのｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＵＴＰ、
−０．５ｍＭのｒＧＴＰ、
−０．２５ｍＭのｒＩＴＰ、
−１５ｍＭのスクロース、
−１０ｍＭのマンニトール、
−１．７ｇ／ｌのデキストランＴ−４０、
−４ｍＭのＭｇＣｌ２、
−８００ｍＭのＫＣｌ、
−５０ｍＭのＤＴＴ、
−１６５ｍＭ、ｐＨ  ８．５のトリス−ＨＣｌ
−８．８ＭのＤＭＳＯ、
−０．２から２μＭのＭＢ２分子ビーコン、式：
５’ＲＯＸ−ＧＡＴＧＣＧＧＡＧＣＧＣＡＧＴＡＧＡＣＡＴＧＣＡＴＣＣＧＡＡＣＡＴＣＡＣＡＧＣＡＧＡＣＡＣＡＧＣＣＴＧＧＴＴＴＴ−ＤＡＢＣＹＬ３’、および
−１から５μＭのＰＲＴオリゴヌクレオチド、式：
５’−ＡＡＡＡＣＣＡＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧ−３’。
【００５５】
６．各ミュータントの残存活性を、以下の計算に従って、プレインキュベートしなかった酵素、および１００％の活性に相当する酵素のフラクションのパーセンテージとして表す：
・ρＮ＝プレインキュベートしなかった酵素について、５から１０分間で得た勾配、
・ρＴ＝研究するポリオールの存在の有無を伴って、種々の温度にてプレインキュベートした酵素について、５から１０分間で得た勾配、および
・パーセンテージ相対活性＝％（ρＴ／ρＮ）。
【００５６】
実施例６：４６℃での、熱安定化化合物の存在下でのＮＡＳＢＡ転写増幅法による、検出感度の研究
この実施例では、４６℃にて、熱安定化化合物の存在下で、そしてターゲットとして５ｃｐｓ／反応の濃度（ＮＡＳＢＡ検出限界である）で用いたＨＩＶ−１Ｂ転写産物の変性フェーズなしで、ＮＡＳＢＡ増幅を実行することが可能なことを実証する。この目的は、酵素および増幅試薬混合物へのターゲットの同時添加によって、本方法を単純化することである。
【００５７】
Ｎｕｃｌｉｓｅｎｓ（商標）ＨＩＶ−１  ２．０増幅キット（ｒｅｆ．：２８５０３３、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、Ｍａｒｃｙ  ｌ’Ｅｔｏｉｌｅ、フランス）を用いて、トレハロース、スクロースまたはソルビトールの存在下で、ＨＩＶ−１タイプＢ転写産物を５ｃｐｓ／試験の検出限界にて、増幅実験を実行した。各増幅を２４回反復し、４６℃での熱安定化化合物の存在下での試験の感度を推定する。
【００５８】
感度を、ＥａｓｙＱ（商標）解析システムによって決定した陽性シグナルの、総反復数に対するパーセンテージとして表す。
【００５９】
図４は、あるポリオール、特にＨＩＶ１−Ｂ転写産物の１００％検出を可能にするソルビトールの存在下で、感度の増大が得られることによる、４１℃よりも高い反応温度を用いることの利点を実証する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【国際調査報告】
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