(57)【要約】【課題】  環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物が示すマトリックスメタロプロテアーゼ抑制作用を評価することにより、新規なマトリックスメタロプロテアーゼ抑制剤を提供すること。【解決手段】  縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物を含む、マトリックスメタロプロテアーゼ抑制剤。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物を含む、マトリックスメタロプロテアーゼ抑制剤。
【請求項２】
マトリックスメタロプロテアーゼが、マトリックスメタロプロテアーゼ−３（MMP-3）である、請求項１に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ抑制剤。
【請求項３】
ポリ乳酸中における反復単位である乳酸が実質的にＬ−乳酸から成る、請求項１又は２に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ抑制剤。
【請求項４】
マトリックスメタロプロテアーゼの過剰産生に関連する疾患の治療又は予防のために使用する、請求項１から３の何れかに記載のマトリックスメタロプロテアーゼ抑制剤。
【請求項５】
請求項１から４の何れかに記載のマトリックスメタロプロテアーゼ抑制剤を含む飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はマトリックスメタロプロテアーゼ抑制剤、より詳細には、環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物を含むマトリックスメタロプロテアーゼ抑制剤に関する。本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ抑制剤は、マトリックスメタロプロテアーゼの過剰産生に関連する疾患の治療及び／又は予防に有用である。
【背景技術】
【０００２】
マトリックスメタロプロテアーゼ（matrix metalloproteinases）（以下、ＭＭＰと略記する場合がある）は、細胞外マトリックスの構成タンパク質（例えば、関節のライニング、間質性の結合組織、基底膜又は軟骨などに存在するタンパク質であるコラーゲン、ラミニン、エラスチン、フィブロネクチン、又はプロテオグリカンなど）の分解および再構築に関連する一群のタンパク分解酵素である。
【０００３】
ＭＭＰはその一次構造と基質特異性の違いから、コラゲナーゼ群（ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−８およびＭＭＰ−１３）、ゼラチナーゼ群（ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９）、ストロメライシン群（ＭＭＰ−３およびＭＭＰ−１０）、膜結合型マトリックスメタロプロテアーゼ 群（ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、ＭＭＰ−１６およびＭＭＰ−１７）、その他（ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１２）の５つのグループに分類されている。正常組織においては、ＭＭＰの活性は、（１）潜在型酵素（ｐｒｏ−ＭＭＰ）の産生、（２）その潜在型酵素の活性化、及び（３）組織阻害剤（Tissue Inhibitor of Metalloproteinases; ＴＩＭＰｓ）による活性化酵素の制御によって制御され、これにより、ＭＭＰによる結合組織の分解と、新しいマトリックス組織の合成とは平衡が保たれている。
【０００４】
しかしながら、ＭＭＰ活性が上昇する病的条件下では、生体に存在するＴＩＭＰｓでは制御不能となり、細胞外マトリックスの分解が亢進し、動脈硬化、関節炎（例えば、慢性関節リウマチおよび変形性関節症）、歯周疾患、異所性脈管形成、腫瘍性浸潤、腫瘍性転移、組織の潰瘍形成（例えば、角膜潰瘍、胃潰瘍、表皮性潰瘍）、骨疾患（例えば、骨粗しょう症、人工関節置換術後の弛みなどの骨吸収性疾患）、血管再閉塞、血管再狭窄、ＨＩＶ感染および糖尿病合併症などの難治性疾患の治癒を遅延させる主要な原因の一つとなっている。従って、ＭＭＰ抑制剤は、これら難治性疾患の予防および治療剤として有用であると考えられる。
【０００５】
このように病的条件下におけるＭＭＰ活性の上昇を、ＭＭＰ阻害剤により制御することは各種疾患の治療に有用であり、各種のＭＭＰ阻害剤について報告されている。ＭＭＰ阻害剤としては、例えば、ヒドロキサム酸骨格をもつマリマスタット（3R-(2,2-ジメチル-1S-メチルカルバモイル−プロピルカルバモイル)−2S-ヒドロキシ−5-メチル−ヘキサノ−ヒドロキサム酸）、フラボン類およびアントシアニジン、エスクレチン誘導体、スルフォニルアミノ酸誘導体などが知られているが、活性、体内での吸収、毒性などの観点から、新しいＭＭＰｓ阻害剤の開発が望まれている。
【０００６】
これまでの研究により、縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリＬ−乳酸混合物は、抗悪性腫瘍剤として有用であることが報告されている（特開平９−２２７３８８号公報および特開平１０−１３０１５３号公報）。しかしながら、縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物がマトリックスメタロプロテアーゼ産生に及ぼす効果については報告されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物が示すマトリックスメタロプロテアーゼ抑制作用を評価することにより、新規なマトリックスメタロプロテアーゼ抑制剤を提供することを解決すべき課題とした。本発明はまた、上記マトリックスメタロプロテアーゼ抑制剤を利用した飲食品を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、原料として乳酸又はラクチドを使用し、これらを重合させることにより製造されるポリ乳酸混合物を用いてマトリックスメタロプロテアーゼ阻害作用を評価した結果、縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物がマトリックスメタロプロテアーゼ阻害作用を示すことを実証した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【０００９】
即ち、本発明によれば、縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物を含む、マトリックスメタロプロテアーゼ抑制剤が提供される。
好ましくは、マトリックスメタロプロテアーゼは、マトリックスメタロプロテアーゼ−３（MMP-3）である。
好ましくは、ポリ乳酸中における反復単位である乳酸は実質的にＬ−乳酸から成る。
好ましくは、本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ抑制剤は、マトリックスメタロプロテアーゼの過剰産生に関連する疾患の治療又は予防のために使用することができる。
【００１０】
本発明の別の側面によれば、上記した本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ抑制剤を含む、飲食品が提供される。
【００１１】
本発明のさらに別の側面によれば、マトリックスメタロプロテアーゼ抑制剤の製造における、縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物の使用が提供される。
【００１２】
本発明のさらに別の側面によれば、縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物の有効量をヒトなどの哺乳動物に投与することを含む、マトリックスメタロプロテアーゼを抑制するための方法が提供される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、新規なマトリックスメタロプロテアーゼ抑制剤、並びにそれを利用した飲食品を提供することが可能になった。また、本発明において有効成分として用いられるポリ乳酸混合物は、生体成分に由来する乳酸の低縮合体であることから、生体適合性が高く、副作用が少ない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の実施方法及び実施態様について詳細に説明する。
本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ抑制剤は、縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物を有効成分として含むものであり、例えば、マトリックスメタロプロテアーゼの過剰産生に関連する疾患の治療又は予防のために使用することができる。
【００１５】
本明細書で言うマトリックスメタロプロテアーゼ抑制とは、生体内におけるマトリックスメタロプロテアーゼの活性を抑制する全ての場合を包含するが、好ましくは、マトリックスメタロプロテアーゼの発現量を抑制することを意味する。また、マトリックスメタロプロテアーゼの過剰産生に関連する疾患としては、マトリックスメタロプロテアーゼの過剰産生を原因とする疾患、並びにマトリックスメタロプロテアーゼの過剰産生を伴う疾患の両方を包含する。マトリックスメタロプロテアーゼの過剰産生に関連する疾患の具体例としては、関節炎疾患（例えば、慢性関節性リウマチ、骨関節症、変形性関節症）、骨吸収疾患（例えば、骨粗鬆症）、糖尿病に付随するコラーゲン崩壊の増大、動脈硬化症、動脈瘤、肝硬変、肺繊維症、歯周病、組織の潰瘍形成（例えば、角膜潰瘍、胃潰瘍、表皮性潰瘍）、腫瘍浸潤・転移、異所性脈管形成、皮膚の老化、血管再閉塞、血管再狭窄、ＨＩＶ感染、糖尿病合併症等が挙げられる。
【００１６】
本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ抑制剤においては、縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物が有効成分として用いられる。
本明細書で言う「ポリ乳酸混合物」とは、縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸が任意の割合で存在する混合物を意味する。即ち、「混合物」という用語は、縮合度３〜２０の何れかを有するポリ乳酸の混合物であることを意味すると同時に、環状および鎖状のポリ乳酸の混合物を含む概念としても用いられる。このような「ポリ乳酸混合物」は、本明細書中以下に述べるように、乳酸を脱水縮合し、適当な方法で精製することにより得ることができる。なお、本明細書では便宜上「ポリ乳酸混合物」という用語を用いたが、この中には一定の縮合度を有する環状のポリ乳酸または一定の縮合度を有する鎖状のポリ乳酸といった単一成分から成るポリ乳酸も含まれる。
【００１７】
縮合度とは、ポリ乳酸中における反復単位である乳酸単位の数を意味する。例えば、環状のポリ乳酸は下記の構造式を有することが推測されるが、式中のｎが縮合度を表す（即ち、ｎ＝３〜２０）。
【００１８】
【化１】
2005126361.tif 000002
【００１９】
本明細書で単に「乳酸」と称する場合、この乳酸にはＬ−乳酸、Ｄ−乳酸またはこれらの任意の割合の混合物の全てが包含される。本発明においては好ましくは、乳酸は実質的にＬ−乳酸から成る。ここで言う「実質的に」とは、ポリ乳酸混合物中におけるＬ−乳酸単位の比率［即ち、（Ｌ−乳酸単位数／Ｌ−乳酸単位数＋Ｄ−乳酸単位数）×１００］が、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上であることを意味する。なお、ポリ乳酸混合物中におけるＬ−乳酸単位の比率は、出発物質として使用する乳酸中に存在するＬ−乳酸とＤ−乳酸の比率に依存する。
【００２０】
縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物の製造方法は、特に限定されるものではないが、例えば、特開平９−２２７３８８号公報、特開平１０−１３０１５３号公報、または特願平１１−３９８９４号明細書（これらの特許明細書に記載の内容は全て引用により本明細書の開示として含める。）などに記載の製造方法により得ることができる。
より具体的には、例えば、縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物は、下記の方法Ａにより得ることができる。
【００２１】
方法Ａ：
先ず、乳酸（好ましくは、実質的にＬ−乳酸から成る乳酸）を不活性雰囲気下で脱水縮合させる。不活性雰囲気としては、例えば、窒素ガス、アルゴンガスなどが挙げられるが、窒素ガスを用いるのが好ましい。
【００２２】
脱水縮合反応は、常圧〜１ｍｍＨｇ程度の減圧下、１１０〜２１０℃、好ましくは１３０〜１９０℃の温度で行われるが、段階的減圧および段階的昇温によって行うのが特に好ましい。反応時間は適宜設定できるが、例えば１〜２０時間反応を行うことができる。段階的減圧および段階的昇温を用いる場合には、反応時間を２以上から成る部分的な反応時間に分け、それぞれの部分において圧力と温度を設定して反応を行う。段階的減圧を用いる場合は、例えば、常圧→１５０ｍｍＨｇ→３ｍｍＨｇと減圧することができ、段階的昇温を用いる場合は、例えば、１４５℃→１５５℃→１８５℃と昇温することができる。実際には、これらを組み合わせて、例えば、１４５℃で常圧で３時間、１４５℃で１５０ｍｍＨｇで３時間、１５５℃で３ｍｍＨｇで３時間そして１８５℃で３ｍｍＨｇで１．５時間反応を行うことができる。
【００２３】
次いで、この脱水縮合反応により得られた反応混合物にエタノールおよびメタノールを加え、濾過して濾液を乾燥してエタノールおよびメタノール可溶分が得られる。即ち、本明細書で言う「エタノールおよびメタノール可溶分」とはエタノールとメタノールの混合液に可溶な画分を意味する。なお、エタノールおよびメタノール可溶分を得る際には、脱水縮合反応の反応混合物をエタノールおよびメタノールと混合するが、その際のエタノールとメタノールの比率は適宜設定することができ、例えばエタノール：メタノール＝１：９である。なお、反応混合物にエタノールとメタノールを添加する順番、方法などは限定されず、適宜選択することができ、例えば、脱水縮合反応の反応混合物に先ずエタノールを添加し、次いでメタノールを添加することができる。
【００２４】
上記で得られたエタノール・メタノール可溶分を逆相カラムクロマトグラフィー、特にオクタデシルシラン（ＯＤＳ）カラムを用いたクロマトグラフィーに付し、まずｐＨ２〜３の２５〜５０重量％のアセトニトリル水溶液で溶離する画分を除去し、次いでｐＨ２〜３の９０重量％以上のアセトニトリル水溶液、好ましくは９９重量％以上のアセトニトリル水溶液で溶離してくる画分を採取すると、縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物が得られる。
上記のようにして得られた環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物は、水酸化ナトリウムなどのアルカリ物質で中和し、減圧乾燥後、常法により下記に述べるような所望の形態に製剤化することができる。
【００２５】
本発明で用いる縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物を製造するための別法としては、例えば、特願平１１−２６５７１５号明細書に記載された方法（方法Ｂとする）または特願平１１−２６５７３２号明細書に記載された方法（方法Ｃとする）を挙げることができる（これらの特許明細書に記載の内容は全て引用により本明細書の開示として含める。）。以下、方法Ｂおよび方法Ｃについて具体的に説明する。
【００２６】
方法Ｂ：
この方法は、ラクチドをＲＹＬｉ（式中、Ｒは脂肪族基又は芳香族基を示し、Ｙは酸素原子又はイオウ原子を示す）で表されるリチウム化合物の存在下で重合させることによって乳酸オリゴマーを製造する方法である。重合反応を実施する場合、リチウム化合物（ＲＹＬｉ）の使用割合は、ラクチド１モル当たり、１〜０．１モル、好ましくは０．２〜０．３モルの割合である。反応温度は−１００〜０℃、好ましくは−７８〜−５０℃である。反応は、−７８〜−５０℃の温度で開始し、徐々に室温にまで昇温させるように実施するのが好ましい。反応は、好ましくは反応溶媒の存在下で実施される。反応溶媒としては、テトラヒドロフラン等の環状エーテルの他、ジエチルエーテル、ジメトキシエタン等を用いることができる。反応雰囲気としては、窒素ガスやアルゴン等の不活性ガス雰囲気が用いられる。反応圧力は特に制約されず、好ましくは常圧である。
【００２７】
なお、上記のようにして得られる乳酸オリゴマーの組成（即ち、環状乳酸オリゴマーと鎖状乳酸オリゴマーの混合比率）は、反応助剤として用いるリチウム化合物によって変動する。
【００２８】
方法Ｃ：
この方法は、（ｉ）乳酸を３５０〜４００ｍｍＨｇの圧力条件で１２０〜１４０℃の範囲の温度に加熱し、脱水縮合反応させるとともに、ラクチドを留出させずに副生水のみを留出除去する第１加熱工程、
（ｉｉ）該第１加熱工程終了後、反応生成物を１５０〜１６０℃の温度に加熱し、該反応圧力を降圧速度０．５〜１ｍｍＨｇ／分で１５〜２０ｍｍＨｇまで降下させるとともに、その降圧に際し、ラクチドの留出を回避させながら副生水のみを留出除去し、該反応圧力が１５〜２０ｍｍＨｇに降下後、同圧力条件及び反応温度１５０〜１６０℃においてさらに反応を継続して鎖状乳酸オリゴマーを主成分とする脱水縮合物を生成させる第２加熱工程、
（ｉｉｉ）該第２加熱工程終了後、０．１〜３ｍｍＨｇの圧力条件で１５０〜１６０℃で加熱して該鎖状乳酸オリゴマーを環化させ、環状オリゴマーを生成させる第３加熱工程、
からなることを特徴とする方法である。
【００２９】
この方法では先ず、第１加熱工程において、減圧下において乳酸を加熱し、脱水縮合反応させる。この場合の反応時間は３〜１２時間、好ましくは５〜６時間である。この第１加熱下での反応は、その反応を円滑に進行させるために、乳酸の脱水縮合により生成する副生水を留去させるが、この場合、乳酸２分子の脱水縮合物であるラクチドが留去しないように実施する。このためには、反応圧力を減圧、好ましくは３００〜５００ｍｍＨｇ、より好ましくは３５０〜４００ｍｍＨｇに保持し、この圧力条件下において、１００〜１４０℃、好ましくは１３０〜１４０℃の範囲に加熱するのがよい。この第１加熱工程での反応により、主に、乳酸の３〜２３分子の脱水縮合物を主成分とする反応生成物が生じる。
【００３０】
上記第１加熱工程の終了後、第２加熱工程において、高められた平均重合度のオリゴマーが得られるように、前記第１加熱工程における反応温度よりも高められた温度、好ましくは１４５〜１８０℃、より好ましくは１５０〜１６０℃の温度に加熱するとともに、反応圧力を１０〜５０ｍｍＨｇ、好ましくは１５〜２０ｍｍＨｇの圧力に降下させてさらに脱水縮合反応を継続する。
【００３１】
この反応も、前記第１加熱工程の反応の場合と同様に、反応を円滑に進行させるために副生水を留去させるが、ラクチドが留去しない条件で実施する。反応圧力を前記範囲の圧力にまで降下させる速度（降圧速度）は、ラクチドの留出を回避し、且つ反応効率を高めるためには、０．２５〜５ｍｍＨｇ／分、好ましくは０．５〜１ｍｍＨｇ／分の範囲に保持することが通常は必要である。前記範囲より低い降圧速度では、その所定圧まで降圧させるのに必要な時間が長くなるため好ましくなく、一方、前記範囲より高い降圧速度では、ラクチドが副生水とともに留去するようになるので好ましくない。
【００３２】
反応圧力が所定圧力にまで降下後、この反応圧力において、さらに反応を継続する。この場合の加熱時間は、３〜１２時間、好ましくは５〜６時間である。
前記第２加熱工程での反応により、平均重合度が３〜３０、好ましくは３〜２３の乳酸オリゴマーが得られるが、この場合のオリゴマー中の環状オリゴマーの割合は、通常、７０〜８０重量％程度である。
【００３３】
上記第２加熱工程終了後、第３加熱工程において、反応圧力を０．２５〜５ｍｍＨｇ、好ましくは０．５〜１ｍｍＨｇに保持し、１４５〜１８０℃、好ましくは１５０〜１６０℃の温度でさらに反応を継続する。反応時間は３〜１２時間、好ましくは５〜６時間である。この場合に生じる副生水も留去させる。この場合、ラクチドの留去も回避させることが好ましいが、反応生成物にはラクチドは殆んど含まれないので、その降圧速度を格別遅くする必要はない。
前記第３加熱工程での反応により、平均重合度３〜３０、好ましくは３〜２３で、かつ環状オリゴマーの割合が９０重量％以上、好ましくは９９重量％以上の乳酸オリゴマーが生成される。
【００３４】
方法Ｄ：
本発明の特に好ましい態様では、ラクチドを式（３）：Ｍｅ−Ｎ（Ｒ1）（Ｒ2）で表されるアルカリ金属化合物の存在下で反応させる。以下、式（３）：Ｍｅ−Ｎ（Ｒ1）（Ｒ2）について説明する。
【００３５】
式（３）において、Ｍｅはアルカリ金属を示し。Ｒ1及びＲ2は各々独立に脂肪族基又は芳香族基を示す。
ここで脂肪族基としては、炭素数１から１２、好ましくは１から６の直鎖状、分枝状、環状又はそれらの組み合わせの飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基が挙げられ、具体的には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル、オクチル、ドデシル等のアルキル基、シクロプロピル、シクロブチル、シクロオクチル、シクロドデシル等のシクロアルキル基が挙げられる。脂肪族基は二重結合または三重結合を有する不飽和の炭化水素基でもよい。
【００３６】
ここで芳香族基としては、炭素数は６〜３０、好ましくは６〜２０、より好ましくは６〜１２、さらに好ましくは６〜１０のアリール基及びアリールアルキル基が挙げられる。アリール基としては、フェニル、トリル、ナフチル等が挙げられ、アリールアルキル基としては、ベンジル、フェネチル、ナフチルメチル等が挙げられる。
【００３７】
脂肪族基および芳香族基は１以上の置換基を有していてもよい。置換基の種類は特に限定されないが、例えば、直鎖または分岐、鎖状または環状のアルキル基、直鎖または分岐、鎖状または環状のアルケニル基、直鎖または分岐、鎖状または環状のアルキニル基、アリール基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アリールオキシカルボニルオキシ基、カルバモイルオキシ基、カルボンアミド基、スルホンアミド基、カルバモイル基、スルファモイル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アリールオキシカルボニル基、アルコキシカルボニル基、Ｎ−アシルスルファモイル基、Ｎ−スルファモイルカルバモイル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、アルコキシカルボニルアミノ基、アリールオキシカルボニルアミノ基、アミノ基、アンモニオ基、シアノ基、ニトロ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、スルホ基、メルカプト基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、アルキルチオ基、アリールチオ基、ウレイド基、複素環基（例えば、窒素、酸素およびイオウ等を少なくとも１個以上含み、３ないし１２員環の単環、縮合環）、複素環オキシ基、複素環チオ基、アシル基、スルファモイルアミノ基、シリル基、ハロゲン原子などが挙げられる。上記においてアルキル、アルケニル、アルキニル及びアルコキシの炭素数は一般的には１から１２であり、好ましくは１から６であり、アリールの炭素数は一般的には６から２０であり、好ましくは６から１０である。
【００３８】
式（３）おいて、Ｍｅはアルカリ金属を示す。アルカリ金属としては、例えば、Ｌｉ、Ｎａ又はＫが挙げられ、好ましくはＬｉである。
式（３）で表される化合物で不斉炭素を有するものは、各々（Ｒ）体、（Ｓ）体、（Ｒ）,（Ｓ）体の何れでもよい。
【００３９】
式（３）で表されるアルカリ金属化合物の入手方法は特に限定されず、当業者であれば適宜入手できる。ジイソプロピルアミン等のジアルキルアミンとｎ−ブチルリチウム等のアルキル化アルカリ金属を反応させることによって得ることができる。より具体的には、この反応は、例えば、窒素雰囲気下などの反応に不活性な条件下において、ＴＨＦ等の不活性溶媒中にジアルキルアミンを含む溶液と、ヘキサン等の不活性溶媒中にアルキル化アルカリ金属を含む溶液とを混合して攪拌することで行うことができる。反応温度は、反応が進行する限り特に限定されないが、好ましくは−７８℃から室温である。反応時間は適宜設定できる。
【００４０】
ラクチドを式（３）の化合物の存在下で重合させる場合、式（３）の化合物（Ｍｅ−Ｎ（Ｒ1）（Ｒ2））の使用量は、ラクチド１モル当たり好ましくは１〜０．１モルであり、より好ましくは０．２〜０．３モルである。
【００４１】
ラクチドの重合反応を行う際の反応温度は、反応が進行する限り特に限定されないが、好ましくは−１００℃〜室温であり、より好ましくは−７８℃〜室温である。
【００４２】
ラクチドの重合反応は、好ましくは反応溶媒の存在下で実施される。反応溶媒は反応に不活性な溶媒であれば特に制限されないが、好ましくはテトラヒドロフラン等の環状エーテル、ジエチルエーテル、ジメトキシエタン等を用いることができる。反応雰囲気としては、窒素ガスやアルゴンガス等の不活性ガス雰囲気を使用することができる。反応圧力は特に制約されず、好ましくは常圧である。
【００４３】
上記方法で得られる鎖状及び環状の乳酸オリゴマー混合物の組成は、反応助剤として用いる式（３）の化合物の種類や反応条件などによって変化するが、好ましくは、環状乳酸オリゴマーよりも鎖状乳酸オリゴマーの含有量が高い。
【００４４】
上記した方法によれば、下記式（１）又は（２）：
【００４５】
【化２】
2005126361.tif 000003
【００４６】
（式中、ｍは１〜１８の整数を示し、ｎは１〜１８の整数を示す）
で表される鎖状及び環状の乳酸オリゴマー混合物が製造される。
【００４７】
なお、上記方法Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは本発明で用いるポリ乳酸混合物の製造方法の具体例の一部を示したものにすぎず、本発明においては他の方法で製造されたポリ乳酸混合物を用いることもできる。
【００４８】
本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ抑制剤は、前記の必須成分に加えてさらに必要に応じ、本発明の効果を損なわない範囲内で、医薬品類、医薬部外品類などの製剤に使用される成分や添加剤を任意に選択・併用して製造することができる。本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ抑制剤は、単独の医薬品類として使用できる以外に、医薬品類や医薬部外品類などに配合して用いることもできる。
【００４９】
本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ抑制剤の形態は特に限定されず、経口投与又は非経口投与用の製剤形態の中から目的に最も適した適宜の形態のものを選択することが可能である。
経口投与に適した製剤形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、ドリンク剤、顆粒剤、細粒剤、シロップ剤、溶液剤、乳剤、懸濁剤、チュアブル剤などを挙げることができ、非経口投与に適する製剤形態としては、例えば、注射剤（皮下注射、筋肉内注射、又は静脈内注射など）、外用剤、点滴剤、吸入剤、噴霧剤などが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００５０】
経口投与に適当な液体製剤、例えば、溶液剤、乳剤、又はシロップ剤などは、水、ショ糖、ソルビット、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを用いて製造することができる。また、カプセル剤、錠剤、散剤、又は顆粒剤などの固体製剤の製造には、乳糖、ブドウ糖、蔗糖、マンニットなどの賦形剤、澱粉、アルギン酸ソーダなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを用いることができる。
【００５１】
非経口投与に適当な注射用又は点滴用の製剤は、好ましくは、受容者の血液と等張な滅菌水性媒体に有効成分である上記の物質を溶解又は懸濁状態で含んでいる。例えば、注射剤の場合、塩溶液、ブドウ糖溶液、又は塩水とブドウ糖溶液との混合物からなる水性媒体などを用いて溶液を調製することができる。腸内投与のための製剤は、例えば、カカオ脂、水素化脂肪、又は水素化カルボン酸などの担体を用いて調製することができ、座剤として提供される。また、噴霧剤の製造には、有効成分である上記の物質を微細な粒子として分散させることができ、受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ有効成分の吸収を容易ならしめる担体を用いることができる。担体としては、具体的には、乳糖又はグリセリンなどが例示される。有効成分である物質及び使用する担体の性質に応じて、エアロゾル又はドライパウダーなどの形態の製剤が調製可能である。これらの非経口投与用製剤には、グリコール類、油類、フレーバー類、防腐剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤などから選択される１種又は２種以上の飲食品を添加することもできる。
【００５２】
本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ抑制剤の投与量及び投与回数は、投与の目的、投与形態、摂取者の年齢、体重又は性別などの条件などを含む種々の要因により適宜設定することができるが、一般的には、有効成分の投与量として一日当り１〜１０，０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１０〜２０００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１０〜２００ｍｇ／ｋｇである。上記投与量の製剤を一日１〜４回程度に分けて投与することが好ましい。
【００５３】
本発明はさらに、縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物を含むマトリックスメタロプロテアーゼ抑制のための飲食品にも関する。即ち、本発明で用いる縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物は、上記したような単独の製剤の形態で使用するのみならず、飲食品の中に配合して用いることができる。
本発明の飲食品は、ポリ乳酸混合物を分解させることなく配合し得るものであれば、その配合形態には特に制限はない。
【００５４】
本発明の飲食品の製品の具体例としては、清涼飲料、ドリンク剤、健康食品、特定保健用食品、機能性食品、機能活性型食品、栄養補助食品、サプレメント、飼料、飼料添加物などと一般に呼称される、飲料を含む健康食品または補助食品が挙げられる。
【００５５】
飲食品の具体例としては、例えば、チューインガム、チョコレート、キャンディー、錠菓、ゼリー、クッキー、ビスケット、ヨーグルト等の菓子類、アイスクリーム、氷菓等の冷菓類、茶、清涼飲料（ジュース、コーヒー、ココア等を含む）、栄養ドリンク剤、美容ドリンク剤等の飲料、パン、ハム、スープ、ジャム、スパゲティー、冷凍食品など任意の飲食品を挙げることができる。あるいは、本発明で用いるポリ乳酸混合物は調味料又は食品添加剤などに添加して用いることもできる。本発明の飲食品を摂取することによりマトリックスメタロプロテアーゼ抑制効果が発揮され、実質的に有害な副作用を示さない安全な飲食品を提供することができる。
本発明の飲食品は、ポリ乳酸混合物を、食品に使われる一般的な原料に直接混合、分散したのち、公知の方法により所望の形態に加工することによって得ることができる。
【００５６】
本発明の飲食品はあらゆる形態の飲食品を包含するものであり、その種類は特に制限されず、上記したような各種飲食物、あるいは各種栄養組成物、例えば各種の経口又は経腸栄養剤や飲料等に、本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ抑制剤を配合して飲食品として提供することができる。このような飲食品の組成としては、縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物の他に、蛋白質、脂質、糖質、ビタミン及び／又はミネラル類などを含めることができる。飲食品の形態は特に限定されず、摂取しやすい形態であれば、固形、粉末、液体、ゲル状、スラリー状等のいずれであってもよい。
【００５７】
飲食品中におけるポリ乳酸混合物の含有量は特には限定されないが、一般的には０．１〜２０重量％、より好ましくは０．１〜１０重量％程度である。
飲食品に含まれるポリ乳酸混合物の量は、本発明の目的とするマトリックスメタロプロテアーゼ抑制作用を発揮できる程度に含まれることが好ましく、好ましくは摂取される飲食物１食中に０．１ｇから１０ｇ程度、より好ましくは０．５ｇから３ｇ程度である。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によっていかなる点においても限定されることはない。
【実施例】
【００５８】
合成例１：ポリ乳酸混合物（以下、Ｘ０１とも称する）の製造
マントルヒーターに収めたセパラブルフラスコにＬ−乳酸（Ｄ−乳酸も混入しているもの）５００ｍｌを入れた。窒素ガス３００ｍｌ／分の流入及び撹拌を行い、溜出水は保温した下降型接続管を経て還流冷却器付フラスコに導きながら、１４５℃で３時間加熱した。更に１５０ｍｍＨｇに減圧して同温度で３時間加熱した後、３ｍｍＨｇの減圧下１５５℃で３時間、最後に３ｍｍＨｇの減圧下１８５℃で１．５時間加熱し、反応生成物であるポリ乳酸を得た。
【００５９】
得られたポリ乳酸は１００℃に保ち、エタノール１００ｍｌに続いてメタノール４００ｍｌをそれぞれ加えた後放冷した。これをメタノール５００ｍｌ中に加え、よく撹拌して静置した後濾過して精製した。その濾液を減圧乾燥してアセトニトリルに溶解し、全量を２００ｍｌ（原液）とした。
【００６０】
この原液を、予め平衡化した逆相ＯＤＳカラム（TSK ｇｅｌ  ODS−８０TM）にかけ、０．０１Ｍ塩酸を含む３０％、５０％および１００％アセトニトリル（ｐＨ２．０）でステップワイズに溶離し、アセトニトリル１００％溶出画分であるポリ乳酸（縮合度３〜２０）を得た。得られた物質の質量スペクトルを図１に示す。図１中の規則的なフラグメントイオンピークから明らかなように、得られたポリ乳酸の混合物は、環状縮合体と直鎖状縮合体とが混在した状態になっている。
【００６１】
合成例２：環状ポリ乳酸混合物（以下、Ｘ０２とも称する）の製造
（ｓ）−（＋）−乳酸１０．０ｇを内容積１００ｍｌのナス型フラスコに入れ、これをロータリーエバポレータにセットする。フラスコ内の圧力を３５０〜４００ｍｍＨｇに調節し、１４０℃まで加熱し、同圧力及び同温度で６時間反応を続ける（第１加熱工程）。この反応により生成した副生水はこれを留去した。また、前記反応条件下では、ラクチドは殆んど系外へ留去しなかった。
次に、反応温度を１５０〜１６０℃に上昇させ、反応圧力を約６時間かけて４００ｍｍＨｇから徐々に下げ、１５〜２０ｍｍＨｇまで降下させた（降圧速度：１ｍｍＨｇ／分）。この降圧速度の条件では、副生水は留去されたが、ラクチドは殆んど留去されなかった。その後、圧力を１５〜２０ｍｍＨｇに保ち、６時間反応を継続した（第２加熱工程）。
【００６２】
次に、圧力を３０分かけて１〜３ｍｍＨｇにまで下げ、１６０℃の反応温度で５時間反応を続けた（第３加熱工程）。
前記反応終了後、反応生成物を分析した結果、平均重合度が３〜２１の環状オリゴマー６．８０ｇ（収率８５％）が得られた。
合成例２で得られた反応生成物のＭＳスペクトルを図２に示す。また、合成例２で得られた反応生成物のＮＭＲの全体図を図３に、図３の一部分の拡大図を図４及び図５に示す。
【００６３】
合成例３：乳酸オリゴマー混合物（以下、Ｘ０３とも称する）の製造
窒素雰囲気下、０℃でジイソプロピルアミン０．１０１ｇ（１ｍｍｏｌ）の５ｍＬ ＴＨＦ溶液にｎ−ブチルリチウム（１．６Ｍヘキサン溶液）０．６３ｍＬ（１ｍｍｏｌ）を加え、１０分間攪拌し、リチウムジイソプロピルアミド（ＬＤＡ）とした後、Ｌ−（−）−ラクチド０．５７７ｇ（４ｍｍｏｌ）の４ｍＬ ＴＨＦ溶液を加え、１５分間攪拌し反応させた。この反応混合物に飽和塩化アンモニウム水溶液２０ｍＬを加え、反応を処理し、さらに水１０ｍＬを加えた。ＴＨＦ（５０ｍＬ）で５回抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。無水硫酸ナトリウムを濾別した後、有機溶媒を減圧濃縮し、粗生成物０．５３ｇを得た。得られた粗生成物にエーテル６ｍＬを加え、超音波洗浄器にて１０分間浸漬し、濾過し、融点１２５〜１２９℃の白色固体生成物０．３９ｇを得た。
【００６４】
得られた生成物の物性データを図６から図１２に示す。図６から図１２に示したＦＡＢＭＳ及びＮＭＲデータから、固体生成物中に３量体から２１量体の環状乳酸オリゴマーと３量体から２７量体の鎖状乳酸オリゴマーが存在することが確認された。
【００６５】
試験例１：
（１）マウスＢ１６メラノーマ細胞の培養
マウスＢ１６メラノーマ細胞株(RCB 0557)はRIKEN Cell Bank（つくば）から入手した。
直径１０ｃｍのプレートにおいて、Ｂ１６メラノーマ細胞（１×１０5の初期細胞数）を、fetal bovine serum(10％)、L-glutamine（0.3mg/ml）、ペニシリン(100unit/ml）、およびストレプトマイシン(0.1mg/ml)を含むＤＭＥＭ培養液20mlを用いて、37℃で48時間培養した。細胞増殖によりConfluentとなったところで、細胞をphosphate-buffered salineを用いて２回洗った後、fetal bovine serumの代わりにlactoalbumin hydrolysateを含む上記の培養液により、さらに37℃で48時間培養を継続した。最終過程の48時間の培養においては、合成例１〜３で製造したＸ０１、Ｘ０２、及びＸ０３をそれぞれ100μg/mlと500μg/mlの濃度で添加した。対照実験では、これらの薬物が溶解している溶媒のみを添加した。薬物存在下あるいは不在下で48時間培養したＢ１６メラノーマ細胞を回収した。
【００６６】
（２）トータルＲＮＡの調整
上記（１）により得られたマウスＢ１６メラノーマ細胞から、ISOGEN(RNA抽出用試薬、ニッポンジーン社)を用いてトータルRNAを調製した。すなわち、直径10cmのプレートから回収したＢ１６メラノーマ細胞に、１mlのISOGENを加えてピペットで吸い出して溶解した。室温に5分間放置した後、0.2mlのクロロホルムを加えて15秒間激しく振盪し、その後3分間室温に放置した。4℃で12,000rpmで15分間遠心を行い、水相を回収した。回収したサンプルに0.5mlのイソプロパノールを加えて室温に10分間放置した後、4℃で12,000rpmで15分間遠心した。ここで生じた沈殿画分に70％エタノールを加えてvortexした後、4℃で7,500rpmで5分間遠心をした。沈殿画分を失わないように70%エタノール層を捨て、さらに残存する70%エタノールを乾燥により完全に除いた後、沈殿画分を44μlのMilli-Q水に溶解した。得られたサンプルからゲノム由来のDNAを完全除去するために以下のようにDNase処理を行った。すなわち、Milli-Q水(44μl)に溶解した粗トータルRNA画分に、１μlのDNase(１unit/μl、プロメガ社製)と5μlのDNase添付緩衝液を加えて37℃で1時間反応させた。反応終了後、50μlのフェノール液と50μlのCIAA液を加えて激しく振盪し、室温にて、13,000rpmで5分間遠心した。水相を集め、これに50μlのCIAA液を加えて激しく振盪し、再度、室温にて13,000rpm、5分間の遠心により水相を集めた。回収した水相に125μlの100%エタノールと5μlの3M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.2)を加えて−80℃で15分間放置後、4℃で13,000rpmで10分間遠心して沈殿画分を得た。得られた沈殿画分に4℃の70％エタノールを400μl加えて遠心(4℃、13,000rpm、5分間)した。上清のエタノールを捨て、さらに乾燥によって完全にエタノールを除去した後、沈殿画分を300μlのmilli-Q水に溶解した。この一連の操作によって、ゲノムDNAを含まない高品質のトータルRNAを約１mg/mlの濃度で得られた。
【００６７】
（３）逆転写酵素によるcDNA合成
上記（２）により得られたマウスＢ１６メラノーマ細胞由来のトータルRNAを鋳型として、Superscript First Strand Synthesis System for RT-PCR（インビトロゲン社）を用いて１本鎖DNAの合成を行った。すなわち、まずRNA/プライマー混合液を以下の組成で作製した。
トータルRNA溶液(１mg/ml)         2μl(2μg)
oligo(dT)12-18溶液(0.5μg/ml)     1μl(0.5μg)
DEPC処理済みmilli-Q水            9μl         
全量  12μl
【００６８】
上記混合物を、70℃で10分間加温した。氷上に1分間置き、以下の試薬を順に加えた。
RNA/プライマー混合液             12μl
10×PCR緩衝液                     2μl
25 mM MgCl2                       2μl
10 mM dNTPミックス                1μl
0.1 M DTT                         2μl     
全量   19μl
【００６９】
上記混合物を、42℃で5分間プレインキュベートした。次いでSUPERSCRIPT II(逆転写酵素)を1μl(200 units)加えよく混合後、42℃で60分間インキュベートした。次いで70℃で15分間インキュベートし反応を停止させた。氷上で冷やした後、RNaseHを1μl(2 units)加え、37℃で20分間インキュベートすることにより鋳型RNAを分解し、一本鎖cDNAを得た。
【００７０】
（４）MMP-3特異的プライマーの合成
すでに公共のデータベースにおいて公開されているマウスMMP-3のヌクレオチド配列(Accession No.NM_010809)から、PCRによって当該遺伝子のみを特異的に増幅するためプライマーとして、以下のヌクレオチドを合成した。すなわち、5'センスプライマーとして、5'-TGGGACTCTACCACTCAGCCAAGG-3'(24-mer)（配列番号１）を、3'アンチセンスプライマーとして、5'-CCAGGGTGTGAATGCTTTTAGG-3'(22-mer)（配列番号２）を合成した。なお、合成オリゴヌクレオチドは、全自動DNA合成機（Applied Biosystems社）を使用して化学合成した。
【００７１】
（５）MMP-3 cDNA断片のPCR増幅
上記（３）で作製したcDNAを鋳型として、上記（４）で作製したプライマーを用いてPCRを行った。PCR反応液の組成は以下の通りである。
cDNA溶液                                    1μl
Milli-Q水                                34.5μl
10×PCR緩衝液(15 mM MgC12含む、TAKARA社)    5μl
10 mM dNTPミックス                          4μl
10 μMプライマー(センス)                  2.5μl
10 μMプライマー(アンチセンス)            2.5μl
Ex taq ポリメラーゼ(5 units/μl,Takara社) 0.5μl   
全量   50μl   
【００７２】
上記反応液をよく混合後、PCR反応を行った。PCRは、最初に94℃で3分間熱した後、94℃で30秒間の熱変性、55℃で30秒間のアニーリング、72℃で30秒間の伸長反応の条件を１サイクルとして、30サイクル行った。反応終了後、このPCR産物を1.5％アガロースゲル電気永動に供試した。PCR産物は、電気泳動のゲルを、エチジウムプロマイドを加えた緩衝液に30分間浸した後に、UV照射により検出した。増幅された産物は、約470ヌクレオチドからなるDNAであった。マウスＢ１６メラノーマ細胞培養において、培養液にX01、X02、及びX03を500μg/mlの濃度で添加することによって、PCR産物良は顕著に減少した。(図１３)。
【００７３】
（６）PCR産物の抽出とヌクレオチド配列決定
上記（５）で増幅されたPCR産物を、ジーンクリーンキット(Q-BIO gene社)を用いて、アガロースゲルから切り出し精製を行った。次いで、このPCR産物を、T-Vectorに連結し、この組換えプラスミドを大腸菌(JM109)に形質転換した。単一コロニーをTerrific Broth培地中で培養し、プラスミドを精製して、ABI PRISM Big-Dye Terminator Cycle Sequence Kit Version 1.1(Applied Biosystems社)を用い、蛍光自動DNAシークエンサー(Applied Biosystems社、373型)により解析した。これによって、PCR産物が、マウスMMP-3遺伝子の断片(468塩基、Accession No.NM_010809における配列番号753-1220に相当)であることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図１は、合成例１で得られたポリ乳酸混合物の質量スペクトルを示す。
【図２】図２は、合成例２で得られた反応生成物のＭＳスペクトルを示す。
【図３】図３は、合成例２で得られた反応生成物のＮＭＲの全体図を示す。
【図４】図４は、図３の一部分の拡大図を示す。
【図５】図５は、図３の一部分の拡大図を示す。
【図６】図６は、合成例３で得た生成物のpositiveモードＦＡＢＭＳスペクトルの全体図を示す。Range: m/z 10.0000〜1305.5900
【図７】図７は、合成例３で得た生成物のnegativeモードＦＡＢＭＳスペクトルの全体図を示す。Range: m/z 10.0000〜2000.0000
【図８】図８は、合成例３で得た生成物のnegativeモードＦＡＢＭＳスペクトルの拡大図を示す。Range: m/z 10.0000〜501.9260
【図９】図９は、合成例３で得た生成物のnegativeモードＦＡＢＭＳスペクトルの拡大図を示す。Range: m/z 490.2980〜1003.7700
【図１０】図１０は、合成例３で得た生成物のnegativeモードＦＡＢＭＳスペクトルの拡大図を示す。Range: m/z 999.9500〜1504.3400
【図１１】図１１は、合成例３で得た生成物のnegativeモードＦＡＢＭＳスペクトルの拡大図を示す。Range: m/z 1484.5300〜2000.0000
【図１２】図１２は、合成例３で得た生成物のＮＭＲスペクトルの全体図を示す。
【図１３】図１３は、マウスB16メラノーマ細胞のMMP-3発現に及ぼすＸ０１、Ｘ０２及びＸ０３の影響を示す図である。（Ａ）はＰＣＲによるMMP-3フラグメントの増幅を示す。（Ｂ）はＰＣＲ産物の定量化したデータを示す。
【図１】
2005126361.tif 000004
【図２】
2005126361.tif 000005
【図３】
2005126361.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
2005126361.tif 000009
【図７】
2005126361.tif 000010
【図８】
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【図９】
2005126361.tif 000012
【図１０】
2005126361.tif 000013
【図１１】
2005126361.tif 000014
【図１２】
2005126361.tif 000015
【図１３】
2005126361.tif 000016
【配列表】
2005126361000001.app