(57)【要約】  本発明は、式（Ｉ）の化合物：2015509917.tif 000022またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。また、本発明は、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。本発明はさらに、治療有効量の式（Ｉ）の化合物もしくはその薬学的に許容可能な塩または薬学的に許容可能な担体および治療有効量の式（Ｉ）の化合物もしくはその薬学的に許容可能な塩を含む医薬組成物を投与することを含む、腹部大動脈瘤またはアテローム性動脈硬化症を治療する方法を提供する。
2015509917.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物
【化１】
2015509917.tif 000021
またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項２】
ナトリウム４−［［３−［３−［２−エチル−４−（４−フルオロフェニル）−５−ヒドロキシ−フェノキシ］プロポキシ］−２−プロピル−フェニル］アミノ］−２，２−ジメチル−４−オキソ−ブタノエートである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の化合物および薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項４】
治療有効量の請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を患者に投与することを含む、それを必要とする患者において、腹部大動脈瘤、アテローム性動脈硬化症またはその両方を治療する方法。
【請求項５】
治療有効量の請求項２に記載の化合物を患者に投与することを含む、それを必要とする患者において、腹部大動脈瘤、アテローム性動脈硬化症またはその両方を治療する方法。
【請求項６】
治療に使用するための請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項７】
治療に使用するための請求項２に記載の化合物。
【請求項８】
腹部大動脈瘤、アテローム性動脈硬化症またはその両方の治療に使用するための請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項９】
腹部大動脈瘤、アテローム性動脈硬化症またはその両方の治療に使用するための請求項２に記載の化合物。
【請求項１０】
腹部大動脈瘤、アテローム性動脈硬化症またはその両方を治療するための医薬を製造するための請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩の使用。
【請求項１１】
腹部大動脈瘤、アテローム性動脈硬化症またはその両方を治療するための医薬を製造するための請求項２に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はロイコトリエンＢ４アンタゴニスト化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）は、酵素５−リポキシゲナーゼおよびロイコトリエンＡ４ヒドロラーゼの下流の経路により生成されるエイコサノイド炎症性脂質メディエータである。ＬＴＢ４は、細胞動員、反応性酸素種の生成および遺伝子発現の誘導を導く複数の白血球サブセットを活性化する。ＬＴＢ４は、主にその高い親和性のＧタンパク質共役受容体、ＢＬＴ１およびより少ない程度でその低い親和性のＢＬＴ２受容体を介して伝達する。ＢＬＴ１受容体は、循環末梢血白血球の特異的サブセットにおいて、同様に内皮細胞および平滑筋細胞を含む非白血球上で高度に発現される。ＬＴＢ４は、腹部大動脈瘤（ＡＡＡ）およびアテローム性動脈硬化症を含むいくつかの炎症状態の血管病変に関与する。
【０００３】
変性疾患、ＡＡＡは、大動脈壁の炎症の継続的進行、破壊的プロテアーゼの制御されていない局所産生、構造タンパク質の破壊、および中間平滑筋細胞の枯渇により特徴付けられる。早期または急性期は炎症細胞の動員により開始する。局所的反応性酸素、ロイコトリエン、ケモカインおよびマトリクス分解産物が、種々のプロテアーゼ系を活性化するために協働して作用する場合、損傷が生じる。腹部大動脈の細胞外マトリクスもまた、ＡＡＡとして知られている病態を導く過剰な分解により弱体化され得る。
【０００４】
大動脈内膜の動脈硬化性プラークの形成における脂質沈着の役割は十分に証明されている。アテローム発生における別の主要な要因は血管内膜病変に対する炎症細胞動員である。高脂質および炎症細胞内容物の両方を有するプラークは破裂ならびに心筋梗塞および脳虚血を含む後発事象に対して脆弱である。
【０００５】
現在、ＡＡＡは、５５歳を超える男性における死因の第１０番目である。ＡＡＡについて示されている公知の承認された医薬品治療は存在しない。また、高コレステロールレベルおよび高血圧を扱う医薬品治療の利用可能性にも関わらず、アテローム性動脈硬化症はさらなる医学的に必要な領域が存在する。さらに、特許文献１および特許文献２におけるものなどのロイコトリエンアンタゴニストの有望性にも関わらず、ＬＴＢ４アンタゴニストは炎症性の兆候について承認されていない。ＬＴＢ４アンタゴニスト化合物はまた、抗炎症薬としてペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）の発達を制限すると考えられるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）のリガンドであることが示されている。有意なＰＰＡＲ結合を有さないＬＴＢ４の拮抗作用は、ＡＡＡ、アテローム性動脈硬化症またはその両方を治療するための医学的必要性を扱うための選択を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５，４６２，９５４号
【特許文献２】国際公開第９８／４２３４６号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は式（Ｉ）の化合物：
【化１】
2015509917.tif 000003
またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。式（Ｉ）の化合物は、Ｓｙｍｙｘ（登録商標）Ｄｒａｗバージョン３．２．ＮＥＴにおけるＩＵＰＡＣ命名特性に従って４−［［３−［３−［２−エチル−４−（４−フルオロフェニル）−５−ヒドロキシ−フェノキシ］プロポキシ］−２−プロピル−フェニル］アミノ］−２，２−ジメチル−４−オキソ−ブタン酸と命名される。
【０００８】
本発明の第２の態様は、ナトリウム４−［［３−［３−［２−エチル−４−（４−フルオロフェニル）−５−ヒドロキシ−フェノキシ］プロポキシ］−２−プロピル−フェニル］アミノ］−２，２−ジメチル−４−オキソ−ブタノエートである式１の化合物のナトリウム塩を提供する。
【０００９】
本発明の第３の態様は、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。
【００１０】
本発明の第４の態様は、ナトリウム４−［［３−［３−［２−エチル−４−（４−フルオロフェニル）−５−ヒドロキシ−フェノキシ］プロポキシ］−２−プロピル−フェニル］アミノ］−２，２−ジメチル−４−オキソ−ブタノエートおよび薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。
【００１１】
本発明の第５の態様は、治療有効量の式（Ｉ）の化合物、もしくはその薬学的に許容可能な塩、または薬学的に許容可能な担体および治療有効量の式（Ｉ）の化合物もしくはその薬学的に許容可能な塩を含む医薬組成物を患者に投与することを含む、それを必要とする患者において、ＡＡＡ、アテローム性動脈硬化症またはその両方を治療するための方法を提供する。
【００１２】
本発明の第６の態様は、治療有効量のナトリウム４−［［３−［３−［２−エチル−４−（４−フルオロフェニル）−５−ヒドロキシ−フェノキシ］プロポキシ］−２−プロピル−フェニル］アミノ］−２，２−ジメチル−４−オキソ−ブタノエートである化合物または薬学的に許容可能な担体および治療有効量のナトリウム４−［［３−［３−［２−エチル−４−（４−フルオロフェニル）−５−ヒドロキシ−フェノキシ］プロポキシ］−２−プロピル−フェニル］アミノ］−２，２−ジメチル−４−オキソ−ブタノエートである化合物を含む医薬組成物を患者に投与することを含む、それを必要とする患者において、ＡＡＡ、アテローム性動脈硬化症またはその両方を治療する方法を提供する。
【００１３】
本発明の第７の態様は、治療に使用するための式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【００１４】
本発明の第８の態様は、治療に使用するためのナトリウム４−［［３−［３−［２−エチル−４−（４−フルオロフェニル）−５−ヒドロキシ−フェノキシ］プロポキシ］−２−プロピル−フェニル］アミノ］−２，２−ジメチル−４−オキソ−ブタノエートである化合物を提供する。
【００１５】
本発明の第９の態様は、ＡＡＡ、アテローム性動脈硬化症またはその両方の治療に使用するための式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【００１６】
本発明の第１０の態様は、ＡＡＡ、アテローム性動脈硬化症またはその両方の治療に使用するためのナトリウム４−［［３−［３−［２−エチル−４−（４−フルオロフェニル）−５−ヒドロキシ−フェノキシ］プロポキシ］−２−プロピル−フェニル］アミノ］−２，２−ジメチル−４−オキソ−ブタノエートである化合物を提供する。
【００１７】
本発明の第１１の態様は、ＡＡＡ、アテローム性動脈硬化症またはその両方を治療するための医薬を製造するための、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩の使用である。
【００１８】
本発明の第１２の態様は、ＡＡＡ、アテローム性動脈硬化症またはその両方を治療するための医薬を製造するための、ナトリウム４−［［３−［３−［２−エチル−４−（４−フルオロフェニル）−５−ヒドロキシ−フェノキシ］プロポキシ］−２−プロピル−フェニル］アミノ］−２，２−ジメチル−４−オキソ−ブタノエートである化合物の使用である。
【００１９】
本発明の別の態様は、薬学的に許容可能な担体、および任意に１種以上の他の治療剤と組み合わせて、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む医薬組成物を提供する。
【００２０】
本発明のさらなる態様は、薬学的に許容可能な担体、および任意に１種以上の他の治療剤と組み合わせて、ナトリウム４−［［３−［３−［２−エチル−４−（４−フルオロフェニル）−５−ヒドロキシ−フェノキシ］プロポキシ］−２−プロピル−フェニル］アミノ］−２，２−ジメチル−４−オキソ−ブタノエートである化合物を含む医薬組成物を提供する。
【００２１】
本発明のさらに別の態様は、ＡＡＡもしくはアテローム性動脈硬化症またはその両方の治療に使用するための、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【００２２】
本発明のさらなる態様は、ＡＡＡもしくはアテローム性動脈硬化症またはその両方の治療に使用するための、ナトリウム４−［［３−［３−［２−エチル−４−（４−フルオロフェニル）−５−ヒドロキシ−フェノキシ］プロポキシ］−２−プロピル−フェニル］アミノ］−２，２−ジメチル−４−オキソ−ブタノエートである化合物を提供する。
【００２３】
本発明のさらに別の態様は、ＡＡＡもしくはアテローム性動脈硬化症またはその両方を治療するための医薬を製造するための、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩の使用を提供する。
【００２４】
本発明のなおさらなる態様は、ＡＡＡもしくはアテローム性動脈硬化症またはその両方を治療するための医薬を製造するためのナトリウム４−［［３−［３−［２−エチル−４−（４−フルオロフェニル）−５−ヒドロキシ−フェノキシ］プロポキシ］−２−プロピル−フェニル］アミノ］−２，２−ジメチル−４−オキソ−ブタノエートである化合物の使用を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
上記および本発明の明細書全体を通して使用する場合、以下の用語は、他に示されない限り、以下の意味を有する。
【００２６】
本明細書で使用される「腹部大動脈瘤」（または「ＡＡＡ」）という用語は、腹部大動脈の限局性の拡張または膨張を意味し、一般に、腹部大動脈の少なくとも一部のサイズが、そうでない場合にみなされる２ｃｍの正常な状態のサイズを超える、哺乳動物における横隔膜の下の大動脈のその部分であると理解される。腹部大動脈は、限定されないが、外径、内腔径、内腔周囲および内腔領域を含む、任意の測定次元に関して測定され、比較され得る。測定および診断のための手段は、超音波、ＣＴスキャンまたは他のイメージング技術の使用を介してでもよい。例えば、ＡＡＡは、外側大動脈直径が３ｃｍより大きくなる場合にヒトに存在する。しかしながら、外側大動脈直径が５ｃｍより大きくなる場合、即時手術または血管内修復（ステントまたは移植）が、破裂および可能性のある致死を防ぐ治療標準である。しかしながら、このような治療が、いくらかの理由、例えば年齢に起因して利用できないかまたは選択肢にならない場合、この集団はまた、本発明を使用して治療され得る。
【００２７】
本明細書で使用される「アテローム性動脈硬化症」という用語は、動脈内膜における脂質の多いプラークまたは病変を意味する。
【００２８】
本明細書に使用される「それを必要とする」という用語は、治療を必要とする病態、ＡＡＡまたはアテローム性動脈硬化症を有するまたは診断されていることを意味する。
【００２９】
本明細書に使用される「患者」という用語は、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタまたはヒトなどの哺乳動物を意味する。
【００３０】
「その薬学的に許容可能な塩」という用語は本発明の化合物の塩を指す。それらを調製するための例および方法は当業者の知識の十分な範囲内である。例えば、Ｓｔａｈｌら、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ」、ＶＣＨＡ／Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、２００２；およびＳ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅら、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｖｏｌ．６６、Ｎｏ．１、１９７７年１月、１−１９ページを参照のこと。特定の薬学的に許容可能な塩としては、ナトリウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウムが挙げられる。本発明の好ましい薬学的に許容可能な塩はナトリウムである。
【００３１】
「治療有効量」という用語は、治療を達成するための、式（Ｉ）の化合物もしくはその薬学的に許容可能な塩、または式（Ｉ）の化合物もしくはその薬学的に許容可能な塩を含む組成物の量または用量を指す。式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩の予想される投薬量は６０〜１０００ｍｇ／患者／日の範囲である。好ましい投薬量は１００〜８００ｍｇ／患者／日の範囲であると予想される。最も好ましい投薬量は１３０〜６５０ｍｇ／患者／日の範囲であると予想される。治療有効量は、当業者などの担当医により、例えば、体重、身長、年齢、全体的な健康、病態の重症度、投与様式、投与計画などの当業者に公知の多くの要因を考慮することにより容易に決定され得る。１日当たりに基づいた投薬量として表されるが、投与計画はより最適な治療有効性を患者に提供するために調節されてもよい。毎日の投薬に加えて、１日に２回の投薬（ＢＩＤ）または１日に３回の投薬が適切であってもよい。ＢＩＤの投与計画が現在好適であると意図される。
【００３２】
本明細書に使用される「治療」という用語は、疾患状態の速度または進行を遅延させること意味する。それは疾患状態を停止させることを含んでもよい。この用語はさらに、疾患を停止させるだけでなく、既に発生している疾患状態を減少させることを含んでもよい。例えば、ＡＡＡに関して、「治療」という用語は腹部大動脈瘤の膨張速度を遅延させることを意味し得る。それはまた、腹部大動脈瘤の膨張を中断させることを含んでもよい。さらに、それは既に発生している膨張を減少させることを含んでもよい。アテローム性動脈硬化症に関して、「治療」という用語はアテローム動脈硬化性プラークの進行を遅延させることまたは中断させることを意味し得る。それはまた、既存のプラークを減少させることを含んでもよい。
【００３３】
本発明の化合物は、好ましくは、医薬組成物として製剤化され、様々な経路により投与される。好ましくは、このような組成物は経口投与用である。それらを調製する例および方法は当業者の知識の十分な範囲内である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏら、ｅｄｓ．１９ｔｈ  ｅｄ．、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、１９９５）を参照のこと。
【００３４】
本発明の化合物およびその薬学的に許容可能な塩は、当該技術分野において公知の種々の手順ならびに以下のスキーム、調製例および実施例に記載されている手順により調製され得る。しかしながら、以下の説明は本発明の範囲を限定するものと決して意図されない。例えば、記載されている経路の各々についての特定の合成工程は、本発明の化合物および薬学的に許容可能な塩を調製するために、異なる方法で組み合わされてもよいか、または異なるスキームからの工程と組み合われてもよい。スキーム２は本発明の化合物を合成するための代替プロセスを例示する。
【００３５】
以下の調製例および実施例は本発明をさらに例示し、任意の新規の中間化合物を含む、式（Ｉ）の化合物の典型的な合成を表す。試薬および出発物質は、当業者にとって容易に入手可能であるか、または公知の構造的に類似した化合物の合成と同様の技術である、有機および複素環化学の標準的な技術、ならびに任意の新規の手順を含む、以下の実施例に記載されている手順から選択される手順により作製され得る。
【００３６】
公知の手順および方法の例は、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ、１９８９；Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−１０、１９７４−２００２、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｂ．Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｊｅｒｒｙ  Ｍａｒｃｈ、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、２００１；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｐａｒｔ  Ｂ、Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｆｒａｎｃｉｓ  Ａ．Ｃａｒｅｙ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｊ．Ｓｕｎｄｂｅｒｇ、Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、２０００およびそれらに引用されている参考文献などの一般的な参考文献に記載されているものを含む。
【００３７】
以下の調製例および実施例の命名は一般に、Ｓｙｍｙｘ（登録商標）Ｄｒａｗバージョン３．２．ＮＥＴにおけるＩＵＰＡＣ命名特性を使用して行われる。異なる命名法を使用する代替の命名が、調製例および式（Ｉ）の化合物を明確に識別するために使用されてもよい。
【００３８】
本明細書で使用する場合、以下の用語は示した意味を有する：「Ｂｎ」はベンジルを指し；「ＤＢＵ」は１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エンを指し；「ＤＭＦ」はジメチルホルムアミドを指し；「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシドを指し；「ＥｔＯＡｃ」は酢酸エチルを指し；「ＥｔＯＨ」はエタノールを指し；「ＭｅＯＨ」はメタノールを指し；「ＮＢＳ」はＮ−ブロモスクシンイミドを指し；「ＴＨＦ」はテトラヒドロフランを指す。
【００３９】
【化２】
2015509917.tif 000004
スキーム１において、中間体２−プロピルアニリン（６）の形成が示される。
【００４０】
工程１において、メチル３−ヒドロキシ−２−プロピル−ベンゾエート（２）は、１−ベンジルオキシ−５−（３−クロロプロポキシ）−４−エチル−２−（４−フルオロフェニル）ベンゼン（１）（Ｏｒｇ．Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．（２００９）、１３：２６８−２７５に従って調製した）でアルキル化されて、メチルプロポキシベンゾエート（３）が得られる。当業者は、このようなアルキル化をもたらす種々の反応条件が存在することを認識するであろう。例えば、反応は、約５０〜９０℃にて２〜４日間、塩基として炭酸カリウムと共にＮ，Ｎ−ジメチルピリジン−４−アミンの存在下で、ＤＭＳＯなどの不活性溶媒中で実施されてもよい。あるいは、反応は、炭酸カリウムまたは好ましくは炭酸セシウムなどの無機塩基と共にヨウ化カリウムの存在下で、ＤＭＦ中で実施されてもよい。反応は、８〜２４時間、５０〜１１０℃の温度で実施される。使用され得る他の塩基としては、例えば、水素化ナトリウムが挙げられる。
【００４１】
工程２において、９０〜１４０℃の温度にて、Ｎ−メチルピロリドン中のＫＯＨを使用して安息香酸メチル（３）が安息香酸に加水分解される（示さず）。この後、工程３において、塩化チオニルで処理して、ハロゲン化アシルを生成し、水酸化アンモニウムと反応させてベンズアミド（４）を得る。
【００４２】
工程４において、ベンズアミド（４）はホフマン転移を受けてイソシアネートを生じ、溶媒としてＭｅＯＨの存在下でカルバメート（５）が得られる。反応は、ＤＢＵなどの塩基およびＮＢＳなどの臭素化剤の存在下で行われる。使用される溶媒はＭｅＯＨであり、反応は、１２〜３０時間の間、−１０〜１０℃の温度にて進行する。
【００４３】
工程５において、カルバメート（５）は、１〜８時間、９０〜１４０℃の温度にて、Ｎ−メチルピロリドンなどの不活性溶媒中の固体水酸化カリウムを使用して２−プロピルアニリン（６）に加水分解される。
【００４４】
メチル３−ヒドロキシ−２−プロピル−ベンゾエート（２）は２，３−ジメトキシ安息香酸から調製される。安息香酸はハロゲン化アシルによりｔｅｒｔ−ブチル２，３−ジメトキシベンゾエートに変換される。グリニヤール試薬、塩化プロピルマグネシウムでの処理により、オルトメトキシ基の置換がもたらされて、ｔｅｒｔ−ブチル３−メトキシ−２−プロピル−ベンゾエートが得られる。ＢＢｒ３による脱保護により、３−ヒドロキシ−２−プロピル−安息香酸が得られ、次いでそれをエステル化してメチル３−ヒドロキシ−２−プロピルベンゾエート（６）が得られる。３−ベンジルオキシベンズアルデヒドで開始する代替の合成が文献において利用可能である（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９８、６、５９５−６０４）。
【００４５】
【化３】
2015509917.tif 000005
スキーム２において、中間体２−アリルアニリン（１０）の形成が示されている。
【００４６】
工程１において、Ｎ−３（−アリルオキシフェニル）アセトアミド（７）はクライゼン転移を受けてＮ−（２−アリル−３−ヒドロキシ−フェニル）アセトアミド（８）が得られる。反応は、１２〜２４時間、溶媒の還流温度にてジメチルアニリンなどの高沸点の不活性溶媒中で実施される。
【００４７】
工程２において、スキーム１、工程１について以前に記載した条件を使用して、Ｎ−（２−アリル−３−ヒドロキシ−フェニル）アセトアミド（８）はベンジルオキシ−５−（３−クロロプロポキシ）−４−エチル−２−（４−フルオロフェニル）ベンゼン（１）でアルキル化されてフェノキシアセトアミド（９）が得られる。
【００４８】
工程３において、フェノキシアセトアミド（９）は加水分解されて２−アリルアニリン（１０）が得られる。反応は、約１〜１２時間、５０℃の温度から溶媒の還流温度にて、６Ｎ  ＨＣｌ／エタノールの溶媒混合物中で進行する。
【００４９】
Ｎ−３（−アリルオキシフェニル）アセトアミド（７）は、３−ヨードプロペンを用いたアセトアミドフェノールのアルキル化により調製される。
【００５０】
【化４】
2015509917.tif 000006
スキーム３において、本発明の化合物（１３）の合成が示される。
【００５１】
工程１において、式（１１）（Ｙ＝アリルまたはプロピル）のアニリンは３，３−ジメチルテトラヒドロフラン−２，５−ジオンでアシル化されてアミド（１２）が得られる。反応はジクロロメタンまたはＴＨＦなどの不活性溶媒中で実施される。Ｎ−メチルモルホリンまたはジイソプロピルエチルアミンなどの有機塩基が加えられてもよい。反応は、６〜７２時間、１０〜４０℃の温度にて進行する。
【００５２】
工程２において、化合物（１２）のベンジル保護基は水素化を使用して除去されて本発明の化合物（１３）が得られる。反応は、ＴＨＦ、ＥｔＯＨ／ＴＨＦ、ＥｔＯＨ、ＭｅＯＨまたはＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨなどの溶媒または溶媒の混合物中で５または１０％パラジウム炭素を使用して水素雰囲気下で進行する。Ｙ＝アルキルである場合、アリル基は反応条件下でプロピル基に還元される。所望の場合、生成物はＮａＯＨ水溶液（１ｅｑ）を使用し、真空下で濃縮してカルボン酸ナトリウム塩に変換され得る。
【実施例】
【００５３】
調製例１
ｔｅｒｔ−ブチル２，３−ジメトキシベンゾエート
【化５】
2015509917.tif 000007
塩化チオニル（６７．６ｍＬ、９２８ｍｍｏｌ）を、４０℃に維持したトルエン（５２８ｍＬ）中の２，３−ジメトキシ安息香酸（１３２ｇ、７１４ｍｍｏｌ）およびＤＭＦ（１．３２ｍＬ）の溶液に滴下して加える。添加が完了した後、溶液を４０℃にて１時間撹拌する。真空中で混合物を濃縮し、残渣をジクロロメタン（５２８ｍＬ）中に溶解する。混合物を還流まで加温し、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール（２０３．４ｍＬ）を加える。ピリジン（８６．６ｍＬ）を５分にわたって滴下して加え、続いてＮ，Ｎ−ジメチルピリジン−４−アミン（４．３６ｇ、３５．７ｍｍｏｌ）を添加し、室温まで冷却しながら混合物を１時間撹拌する。混合物を水（２００ｍＬ）で希釈し、混合物（ｐＨ＝２）を２Ｎの塩酸で酸性にする。相を分離し、有機相を０．５Ｎの塩酸（２×３０ｍＬ）で洗浄する。有機相を１５％の炭酸カリウム、水およびブラインで洗浄する。有機相を真空中で濃縮して白色固体として標題化合物（１４１．２ｇ、８３％）を得る。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  １６５［Ｍ−（Ｃ４Ｈ９Ｏ）］＋。
【００５４】
調製例２
ｔｅｒｔ−ブチル３−メトキシ−２−プロピル−ベンゾエート
【化６】
2015509917.tif 000008
ＴＨＦ（８５５ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル２，３−ジメトキシベンゾエート（１７１ｇ、７１８ｍｍｏｌ）の冷却した溶液（−３４℃）に、エーテル（４４８．５ｍＬ、８９７ｍｍｏｌ）中の２Ｍの塩化プロピルマグネシウムを、−１０℃以下の内部温度を維持するのに十分な速度で滴下して加える。−１２℃付近に温度を維持しながら混合物を３．５時間撹拌する。−１０℃以下に温度を維持しながら酢酸（５１．４ｍＬ）を混合物に滴下して加え、次いで水（３４０ｍＬ）で希釈する。相を分離し、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル（３×１００ｍＬ）で水相を抽出する。合わせた有機抽出物をブラインで洗浄し、真空中で有機相を濃縮して、微量のＴＨＦおよびメチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテルを含有する無色の油として標題化合物（１９０ｇ、定量的）を得る。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．２４−７．１４（ｍ，２Ｈ），６．９３（ｄｄ，Ｊ＝１．４，８．０Ｈｚ，１Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），２．８４−２．７９（ｍ，２Ｈ），１．５９（ｍ，１１Ｈ），０．９７（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ）。
【００５５】
調製例３
３−ヒドロキシ−２−プロピル−安息香酸
【化７】
2015509917.tif 000009
三臭化ホウ素（３０５．６ｍＬ、３０５．６ｍｍｏｌ）を、０℃以下の温度に維持しながら、−２５℃に冷却されたトルエン（４２８ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル３−メトキシ−２−プロピル−ベンゾエート（６１．２ｇ、２４４ｍｍｏｌ）の溶液に滴下して加える。−５℃にて３時間撹拌する。水（１００ｍＬ）を滴下して加え、温度を７℃まで上げ、３０分撹拌する。混合物を真空中で濃縮し、次いで水（２００ｍＬ）中に半固体を懸濁する。１時間撹拌し、ガラスフリットで懸濁液を濾過する。回収した固体を水で洗浄し、固体を乾燥させて標題化合物（４３．１ｇ、９８％）を得る。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．５８（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）；７．１６（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）；６．９９（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ）；５．０（ｂｓ，２Ｈ）；２．９８（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），１．６４（ｍ，２Ｈ）；１．０２（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ）。
【００５６】
調製例４
メチル３−ヒドロキシ−２−プロピル−ベンゾエート
【化８】
2015509917.tif 000010
ＭｅＯＨ（５９８ｍＬ）中の３−ヒドロキシ−２−プロピル−安息香酸（５９．７９ｇ、３３２ｍｍｏｌ）の溶液を−１０℃で冷却し、３５分にわたってシリンジポンプを使用して塩化チオニル（３６．２６ｍＬ、４９７．１ｍｍｏｌ）を加える。３５時間にわたって撹拌しながら混合物を室温まで加温する。混合物を真空中で濃縮し、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル（３６０ｍＬ）で残渣を希釈す  る。得られた混合物を真空中で乾燥するまで濃縮して黄褐色の固体として標題化合物（６４．４ｇ、８７％）を得る。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．３８（ｄｄ，Ｊ＝８．０，０．８Ｈｚ，１Ｈ）；７．１０（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）；６．９３（ｄｄ，Ｊ＝８．０，０．８Ｈｚ，１Ｈ）；５．１（ｂｓ，１Ｈ）；３．８９（ｓ，３Ｈ）；２．９８（ｍ，２Ｈ），１．６１（ｍ，２Ｈ）；１．００（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ）。
【００５７】
調製例５
メチル３−［３−［５−ベンジルオキシ−２−エチル−４−（４−フルオロフェニル）フェノキシ］プロポキシ］−２−プロピル−ベンゾエート
【化９】
2015509917.tif 000011
ジメチルスルホキシド（２４０ｍＬ）中のメチル３−ヒドロキシ−２−プロピル−ベンゾエート（４０．０ｇ、２０６ｍｍｏｌ）および１−ベンジルオキシ−５−（３−クロロプロポキシ）−４−エチル−２−（４−フルオロフェニル）ベンゼン（Ｏｒｇ．Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．（２００９）、１３：２６８−２７５に従って調製した）（８２．１５ｇ、２０６ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（３０．２ｇ、２１９ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジメチルピリジン−４−アミン（２．０ｇ、１６ｍｍｏｌ）を連続して加える。６０℃にて８７時間、懸濁液を撹拌し、次いでそれを冷却する。混合物を水（６００ｍＬ）およびメチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル（１００ｍＬ）で希釈し、１５分間撹拌する。相を分離し、水性部分をメチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル（３×３０ｍＬ）で洗浄する。合わせた有機抽出物を水およびブラインで洗浄する。有機部分を真空中で濃縮して、褐色油として標題化合物（１２３．０ｇ、定量的）を得る。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ５５７（Ｍ＋１）。
【００５８】
調製例６
３−［３−［５−ベンジルオキシ−２−エチル−４−（４−フルオロフェニル）フェノキシ］プロポキシ］−２−プロピル−安息香酸
【化１０】
2015509917.tif 000012
Ｎ−メチルピロリドン（４７６ｍＬ）中のメチル３−［３−［５−ベンジルオキシ−２−エチル−４−（４−フルオロフェニル）フェノキシ］プロポキシ］−２−プロピル−ベンゾエート（１１９ｇ、１８１ｍｍｏｌ）の溶液に、水酸化カリウム（２１．２ｇ、３７８ｍｍｏｌ）を加え、１２０℃にて２５分撹拌する。混合物を冷却し、次いで水（２４０ｍＬ）およびメチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル（１００ｍＬ）で希釈する。１２Ｎの塩酸でｐＨ＝２．５に調整する。相を分離し、水相をメチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル（３×３５ｍＬ）で洗浄する。合わせた有機抽出物を水で２回およびブラインで１回洗浄する。有機抽出物を真空中で濃縮する。得られた残渣をアセトニトリルから再結晶化し、濾過し、乾燥させて白色固体（７８ｇ、６７％）として得る。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．６０−７．４７（ｍ，３Ｈ）；７．３７−７．２０（ｍ，６Ｈ）；７．１２−７．０２（ｍ，４Ｈ）；６．６０（ｓ，１Ｈ）；５．００（ｓ，２Ｈ）；４．２０（ｍ，４Ｈ）；３．００（ｍ，２Ｈ）；２．６１（ｑ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ）；２．３３（ｍ，２Ｈ）；１．５９（ｍ，２Ｈ）；１．１８（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，３Ｈ）；０．９８（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，３Ｈ）。
【００５９】
調製例７
３−［３−［５−ベンジルオキシ−２−エチル−４−（４−フルオロフェニル）フェノキシ］プロポキシ］−２−プロピル−ベンズアミド
【化１１】
2015509917.tif 000013
塩化チオニル（８．２２ｍＬ、１１３ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（２５０ｍＬ）中の３−［３−［５−ベンジルオキシ−２−エチル−４−（４−フルオロフェニル）フェノキシ］プロポキシ］−２−プロピル−安息香酸（５０．０ｇ、９２ｍｍｏｌ）およびＤＭＦ（２．５ｍＬ、３２ｍｍｏｌ）の溶液に滴下して加える。１時間撹拌し、次いで反応物を水酸化アンモニウム溶液（１０２．５ｍＬ、１．５２ｍｏｌ）に０〜５℃にて加える。ＭｅＯＨ（２５０ｍＬ）および水（５００ｍＬ）を滴下方式で加える。真空中でほぼ半分の体積に濃縮し、得られた懸濁液を０〜５℃にて３０分撹拌する。懸濁物をガラスフリットで濾過し、得られた固体を真空下で乾燥させて灰色がかった固体として標題化合物（５０．３ｇ、定量的）を得る。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ５４２（Ｍ＋１）。
【００６０】
調製例８
メチルＮ−［３−［３−［５−ベンジルオキシ−２−エチル−４−（４−フルオロフェニル）フェノキシ］プロポキシ］−２−プロピル−フェニル］カルバメート
【化１２】
2015509917.tif 000014
１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（５１．６ｍＬ、３４５ｍｍｏｌ）およびＮ−ブロモスクシンイミド（３４．６ｇ、１９４ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ（６２０ｍＬ）中の３−［３−［５−ベンジルオキシ−２−エチル−４−（４−フルオロフェニル）フェノキシ］プロポキシ］−２−プロピル−ベンズアミド（６２．０ｇ、１１４ｍｍｏｌ）の機械的に撹拌した懸濁液に連続して加え、この時間の間、１分にわたって温度が−４．１℃から−３．２℃に上昇する。反応物を−５℃〜−１０℃にて２２時間撹拌する。撹拌しながら亜硫酸水素ナトリウム溶液（２５ｍＬ水中に２５．１ｇ、２０９ｍｍｏｌ）を加える。水（６２０ｍＬ）を滴下して加え、１０℃にて３０分撹拌する。懸濁液をガラスフリットで濾過し、回収した固体を水で洗浄し、真空下で乾燥させて、灰色がかった粉末として標題化合物（６５．８ｇ、定量的）を得る。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ５７２（Ｍ＋１）。
【００６１】
調製例９
３−［３−［５−ベンジルオキシ−２−エチル−４−（４−フルオロフェニル）フェノキシ］プロポキシ］−２−プロピル−アニリン塩酸塩
【化１３】
2015509917.tif 000015
Ｎ−メチルピロリドン（２０３ｍＬ）中のメチルＮ−［３−［３−［５−ベンジルオキシ−２−エチル−４−（４−フルオロフェニル）フェノキシ］プロポキシ］−２−プロピル−フェニル］カルバメート（６５．８ｇ、１１５ｍｍｏｌ）の溶液に水酸化カリウム（１２．９７ｇ、２３１ｍｍｏｌ）を加え、１１０〜１２０℃にて２時間撹拌する。混合物を冷却し、次いでそれを水（４５０ｍＬ）およびメチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル（１８０ｍＬ）の混合物中に注ぐ。混合物を２０分撹拌し、相を分離する。水相を追加のメチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル（３×５０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機抽出物をガラスフリットで濾過し、濾液を１５％ブライン溶液で洗浄する。濾液を真空中で濃縮し、残渣を、酢酸エチル（３００ｍＬ）およびメチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル（３００ｍＬ）の混合物中に溶解する。得られた懸濁液を氷／塩浴で撹拌し、冷却しながら、４Ｎの塩酸（４３．１ｍＬ）をこの溶液に滴下して加える。ガラスフリットでの濾過により固体を回収し、冷メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテルで洗浄し、真空下で乾燥させて灰色がかった固体として標題化合物（５７．８ｇ、９１％）を得る。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ５１４（Ｍ＋１、遊離塩基）。
【００６２】
調製例１０
４−［［３−［３−［５−ベンジルオキシ−２−エチル−４−（４−フルオロフェニル）フェノキシ］プロポキシ］−２−プロピル−フェニル］アミノ］−２，２−ジメチル−４−オキソ−ブタン酸
【化１４】
2015509917.tif 000016
ジイソプロピルエチルアミン（５７ｍＬ、３２７ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（４５０ｍＬ）中の３−［３−［５−ベンジルオキシ−２−エチル−４−（４−フルオロフェニル）フェノキシ］プロポキシ］−２−プロピル−アニリン塩酸塩（９０ｇ、１７５ｍｍｏｌ）の懸濁液に加える。この混合物にジヒドロ−３，３−ジメチル−２，５−フランジオン（３２．１ｇ、２５１ｍｍｏｌ）を加え、５％の開始物質が残存していることをＬＣＭＳが示すまで３５℃にて撹拌する。混合物を真空中で濃縮し、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（１００ｍＬ）および水（７５ｍＬ）を加える。リン酸でｐＨ＝２〜３に調整し、相を分離する。水相を追加のメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（２×５０ｍＬ）で洗浄する。合わせた有機抽出物をブラインで洗浄し、真空中で濃縮する。粗残渣をメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（１８０ｍＬ）中に溶解し、ヘキサン（４５０ｍＬ）を加えて懸濁液を得、３０分間撹拌する。懸濁液を濾過により回収し、乾燥させて白色固体として標題化合物（９２．５ｇ、８８％）を得る。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ６４２（Ｍ＋１）。
【００６３】
実施例１
４−［［３−［３−［２−エチル−４−（４−フルオロフェニル）−５−ヒドロキシ−フェノキシ］プロポキシ］−２−プロピル−フェニル］アミノ］−２，２−ジメチル−４−オキソ−ブタン酸
【化１５】
2015509917.tif 000017
１０％のパラジウム炭、５０％の湿潤物（重量に基づき水を有する）（１３ｇ）およびＴＨＦ（１５６０ｍＬ）中の４−［［３−［３−［５−ベンジルオキシ−２−エチル−４−（４−フルオロフェニル）フェノキシ］プロポキシ］−２−プロピル−フェニル］アミノ］−２，２−ジメチル−４−オキソ−ブタン酸（２６０ｇ、４０５ｍｍｏｌ）のスラリーを９００ｐｓｉの水素圧力で開始して水素化する。さらなる水素を加えずに、２０時間水素化を継続する。２００ｐｓｉの水素圧力を維持しながらさらに２日水素化する。混合物を珪藻土で濾過し、濾液を真空中で濃縮して固体として標題化合物（２５１ｇ、定量的）を得る。過剰な重量はＴＨＦの存在に起因する。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ５５２（Ｍ＋１）。
【００６４】
実施例２
ナトリウム４−［［３−［３−［２−エチル−４−（４−フルオロフェニル）−５−ヒドロキシ−フェノキシ］プロポキシ］−２−プロピル−フェニル］アミノ］−２，２−ジメチル−４−オキソ−ブタノエート
１Ｎの水酸化ナトリウム（４０４ｍＬ）を、ＴＨＦ（１１１５ｍＬ）中の４−［［３−［３−［２−エチル−４−（４−フルオロフェニル）−５−ヒドロキシ−フェノキシ］プロポキシ］−２−プロピル−フェニル］アミノ］−２，２−ジメチル−４−オキソ−ブタン酸（２２３ｇ、４０４ｍｍｏｌ）の溶液に滴下して加え、周囲温度にて１５分間撹拌する。真空中で体積を減少させ、水（１３００ｍＬ）を加える。溶液を加熱することを回避するために膜ポンプを使用してさらなる溶媒を除去して１２５０ｍＬの最終体積を得る。バッチ中で残存溶液を凍結乾燥させて、灰色がかった固体として標題化合物（２３０ｇ、９９％）を得る。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ５５２（Ｍ＋１、遊離塩基）。
【００６５】
動物研究はますます、アテローム性動脈硬化症およびＡＡＡを含む、慢性炎症性疾患におけるロイコトリエン合成経路に関与している。Ｐｏｅｃｋｅｌら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１０）、８６：２４３−２５３。アテローム性動脈硬化症は、アテローム動脈硬化性プラークまたは病変が動脈内膜中に形成し、増大する病態である。それは、マクロファージ白血球の蓄積により主に引き起こされ、機能的高密度リポタンパク質によりマクロファージから脂肪およびコレステロールを適切に除去せずに低密度リポタンパク質により促進される動脈の壁の慢性炎症反応である。動脈は炎症を起こす。ＬＴＢ４は、内皮を横切る白血球の付着および走化性を促進するその能力のために、アテローム性動脈硬化症においてアテローム生成促進的役割を果たす。Ｂａｃｋ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  Ｒｅｐｏｒｔｓ（２００８）、１０：２４４−２５１；Ａｉｅｌｌｏら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．（２００２）２２：４４３−４４９；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．（２００２）２２：３６１−３６３。コレステロールプラークは、筋細胞を増大させ、罹患した領域上に硬い覆いを形成する。Ｓｐａｎｂｒｏｅｋら、ＰＮＡＳ、（２００３）、１００（３）：１２３８−１２４３。
【００６６】
無症状性の傾向である安定なアテローム性動脈硬化症プラークは細胞外マトリクスおよび平滑筋細胞において豊富にある。安定なプラークはマクロファージおよび泡沫細胞において豊富にあり、動脈内腔（線維性被膜）から病変を分離する細胞外マトリクスは典型的に弱く、破裂する傾向がある。線維性被膜の破裂は、循環に対してコラーゲンなどの血栓形成物質を曝露し、最終的に内腔において血栓形成を誘導する。形成時に、管腔内血栓は動脈を完全に塞ぐ場合があるか、または分離し、循環内に移り、最終的に血栓塞栓症を引き起こす小さな下流の動脈枝を塞ぐ場合がある（Ｒｏｓｓ、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（１９９９）、３４０（２）：１１５−１２６）。
【００６７】
変性疾患、ＡＡＡは、１）大動脈壁の炎症；２）破壊性プロテアーゼの抑制されていない局所産生；３）構造タンパク質の破壊；および４）中央平滑筋細胞の枯渇の絶え間なく続く進行により特徴付けられる。初期または急性期は中膜および外膜における炎症細胞の動員で開始する。局所反応性酸素、ロイコトリエン、ケモカインおよびマトリクス分解産物が、種々のプロテアーゼ系を活性化するように協働して作用する場合、壁内損傷が生じる。大動脈壁におけるこれらの病理変化は、部分的弱体化、進行性膨張および自然断裂を導く（Ｎａｎｄａら、Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐａｔｅｎｔｓ  ｏｎ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（２００９）、４：１５０−１５９）。
【００６８】
慢性貫壁性炎症は、確立されたＡＡＡの主要な組織学的特徴のうちの１つである。この炎症反応は、単核食細胞、リンパ球および血漿細胞からなる。ＡＡＡにおける慢性炎症反応の性質はアテローム性動脈硬化症において観察されたものと異なるように見える。ＡＡＡにおける炎症反応は、通常、中膜外層および外膜に主に集中する高密度の浸潤物を有して、貫壁性で分布している。アテローム性動脈硬化症において、浸潤性炎症細胞は主に病変した内膜に制限され、それらはＡＡＡにおけるように集中してまたは広範囲に分布しないように見える。一般的な慢性炎症成分にもかかわらず、外側大動脈壁における構造タンパク質の破壊は、アテローム性動脈硬化症において見られず、動脈瘤変性に関与しているようである（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｂｌ．Ｓｕｒｇ．（２００２）、３９（２）：１１０−２３０、１１５、１３７および１４２において）。
【００６９】
それとは反対に公開された研究（例えば、Ｃａｏら、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ  ＆  ｏｔｈｅｒ  Ｌｉｐｉｄ  Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ、（２００７）８４：３４−４２を参照のこと）が存在するが、多数の公開された研究は、ＡＡＡ病因における５−リポキシゲナーゼ経路、およびＬＴＢ４の役割を支持すると考えられる。好中球由来の上昇したレベルのＬＴＢ４はＡＡＡの病因の重要な役割を果たす（Ｈｏｕａｒｄら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（２００９）、２３：１３７６−１３８３；Ａｈｌｕｗａｌｉａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００７）、１７９：６９１−６９７；Ｋｒｉｓｔｏら、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、（２０１０）、２１０：１０７−１１３）。
【００７０】
以下のインビトロおよびインビボ研究は、ＬＴＢ４を拮抗することによりアテローム性動脈硬化症およびＡＡＡを治療する際の式（Ｉ）の化合物またはそのナトリウム塩の活性および効果を実証している。これらのアッセイは一般にヒト臨床治療活性の指標として当業者により認識される。ＬＴＢ４シグナル伝達拮抗活性および効果を証明するアッセイは、実質的に以下のようにまたは類似のデータを与える類似のアッセイにより実施され得る。
【００７１】
インビトロアッセイ手順：
ＬＴＢ４によるＢＬＴ１結合および活性化は、細胞内カルシウム放出を導く細胞内イノシトール１，４，５−トリホスファーゼ（ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｓｅ）レベルを増加させ、カルシウム流入は、特異的Ｇタンパク質共役シグナル変換経路サブユニットと結合することにより、およびこれを介してシグナル伝達することにより媒介される（Ｇａｕｄｒｅａｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（１９９８）、３３５（Ｐｔ  １）：１５−１８）。以下は、ＢＬＴ１近位シグナル伝達カスケード事象の実施例２の拮抗作用を実証するために使用される２つのインビトロアッセイ：ＢＬＴ１およびＢＬＴ２安定細胞株から生成された膜調製物を使用した［３Ｈ］−ＬＴＢ４リガンド置換アッセイならびに全細胞カルシウム動員アッセイである。
【００７２】
ＬＴＢ４リガンド置換アッセイ
［３Ｈ］−ＬＴＢ４ならびに公知のＢＬＴ１およびＢＬＴ２アンタゴニストを、本発明の化合物のためのＬＴＢ４置換曲線およびＩＣ５０値を生成するために使用する。本発明の化合物による受容体阻害は、有効性パーセントを得るためにＢＬＴ１阻害剤およびＢＬＴ２阻害剤参照分子に対して決定される。
【００７３】
ｈＢＬＴ１試験化合物調製：ｈＢＬＴ１アッセイに関して、１０ｍＭのストック溶液を作製するためにＤＭＳＯ中で試験化合物を調製する。ストック溶液は、緩衝液Ａ（５０ｍＭの４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）ｐＨ７．４、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール（ｖ／ｖ）、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ｗ／ｖ））中で最初に１：１０に希釈し、続いて緩衝液Ｂ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール（ｖ／ｖ）、１％のＢＳＡ（ｗ／ｖ）、１０％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ））中で３倍連続希釈して、１０点希釈曲線を作成する。インビトロアッセイを実施するために３０μＭ〜１．５２ｎＭの範囲の最終化合物濃度を９６ウェル丸底プレート中に播種する。
【００７４】
ｈＢＬＴ２試験化合物調製：ｈＢＬＴ２アッセイに関して、１０ｍＭのストック溶液を作製するためにＤＭＳＯ中で試験化合物を調製する。ストック溶液は、緩衝液Ａ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール（ｖ／ｖ）、１％のＢＳＡ（ｗ／ｖ））中で最初に１：１０に希釈し、続いて緩衝液Ｂ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール（ｖ／ｖ）、１％のＢＳＡ（ｗ／ｖ）、１０％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ））中で３倍連続希釈して、１０点希釈曲線を作成する。インビトロアッセイを実施するために３００μＭ〜１５．２ｎＭの範囲の最終化合物濃度を９６ウェル丸底プレート中に播種する。
【００７５】
ＢＬＴ１／ＣＨＯ−Ｋ１およびＢＬＴ２／ＣＨＯ−Ｋ１安定細胞株を生成する方法：
一般に、これらの細胞株は、市販の物質を使用して、当業者に公知の手順により生成される。
【００７６】
ｈＢＬＴ１／ＣＨＯ−Ｋ１安定ｘ細胞株調製：ヒトＢＬＴ１受容体ＤＮＡ（国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）、参照配列ＮＭ＿１８１６５７）を合成し、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｖ８７０２０）内でクローニングする。ｃＤＮＡ発現ベクター構築物を、トランスフェクション試薬としてリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ−Ｋ１）細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）ＣＣＬ−６１）内にトランスフェクトする。２４時間のトランスフェクション後、２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを含有する選択ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で細胞を培養する。単一コロニーを単離し、ウェスタンブロット解析および蛍光イメージングプレートリーダ（ＦＬＩＰＲ（登録商標））カルシウム放出アッセイを使用してＢＬＴ１発現および機能についてスクリーニングする。
【００７７】
ｈＢＬＴ２／ＣＨＯ−Ｋ１安定細胞株調製：ヒトＢＬＴ２短形態受容体ＤＮＡ（国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）、参照配列ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＢ０２９８９２（これはＮ末端における長形態ＢＬＴ２より３２アミノ酸短い）、Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０００）、２７５（５２）：４０６８６−４０６９４）を合成し、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｖ８７０２０）内でクローニングする。ｃＤＮＡ発現ベクター構築物を、トランスフェクション試薬としてリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）内にトランスフェクトする。トランスフェクションの４８時間後、２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを含有する選択ＤＭＥＭ培地中で細胞を培養する。単一クローンを単離し、ウェスタンブロット解析およびＦＬＩＰＲ（登録商標）カルシウム放出アッセイを使用してＢＬＴ２発現および機能についてスクリーニングする。
【００７８】
ｈＢＬＴ１膜調製：ｈＢＬＴ１トランスフェクトＣＨＯ−Ｋ１細胞を、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液中で懸濁し、超音波処理し、分画遠心法により濃縮する。つまり、超音波処理後、ホモジネートを１０分間、１０００×ｇで遠心分離する。上清を回収し、再び６０分間、５０，０００×ｇにて遠心分離する。ペレットを回収し、ｐＨ７．４にて５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロールを含有する緩衝液中で再懸濁し、ｈＢＬＴ１膜として使用する。
【００７９】
ｈＢＬＴ２膜調製：ｈＢＬＴ２トランスフェクトＣＨＯ−Ｋ１細胞を、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液中で懸濁し、超音波処理し、分画遠心法により濃縮する。つまり、超音波処理後、ホモジネートを１０分間、１０００×ｇで遠心分離する。上清を回収し、再び６０分間、５０，０００×ｇにて遠心分離する。ペレットを回収し、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロールを含有する緩衝液中で再懸濁し、ｈＢＬＴ２膜として使用する。
【００８０】
ｈＢＬＴ１を含有する膜における［３Ｈ］−ＬＴＢ４結合アッセイ：
［３Ｈ］−ＬＴＢ４（３０μＬの１．３ｎＭ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＮＥＴ−８５２）を、緩衝液Ａ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、１％のＢＳＡ）で予め湿潤させた９６ウェルＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ−フィルタ結合プレート（カタログ番号ＭＡＦＢＮＯＢ１０）中にアリコートする。試験化合物の以前に調製した用量反応範囲（１０μＬ）を次いで、３μＭ〜１５２ｐＭの範囲の最終化合物濃度を有するカラム２〜１１に添加する。結合対照のために、ナトリウム２−［３−［３−［（５−エチル−４’−フルオロ−２−ヒドロキシ［１，１’−ビフェニル］４−イル）オキシ］プロポキシ］−２−プロピルフェノキシ］−ベンゾエート（ＬＹ２９３１１１  Ｎａ、市販の公知のｈＢＬＴ１阻害剤；Ｓａｗｙｅｒら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９９５）、３８：４４１１−４４３２、化合物４３ｂ）（１０μＬの３μＭ、最終濃度）のアリコートを、選択したウェルに（陽性対照として）加えるか、または１０μｌの緩衝液Ｂ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、１％のＢＳＡ、１０％のＤＭＳＯ）（陰性対照）を選択したウェルに加える。ｈＢＬＴ１膜タンパク質（０．７μｇ）を、１００μＬの全体積としてマイクロタイタープレートの適切なウェルに加える。プレートを低速にてプレートミキサ上に置き、１時間インキュベートする。インキュベーション後、プレートを吸引し、次いで２００μＬの氷冷緩衝液Ｃ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＮａＣｌ）で洗浄し、続いてさらに２×１００μＬで洗浄し、洗浄の間で吸引する。プレートを空気乾燥させ、次いでＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ（登録商標）２０（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）（１００μＬ）を加える。プレートを１６時間静置させ、次いで１分間、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｔｏｐｃｏｕｎｔ（登録商標）で読み取る。ＣＰＭ（カウント毎分）を阻害剤濃度に対してプロットし、一定の底部を有する３−パラメータロジスティックフィットを用いて曲線をフィッティングし、ＩＣ５０値を得る。２．７（以前に計算した）で割ることによりＩＣ５０をＫｉ値に変換する（２．７は、［３Ｈ］−ＬＴＢ４およびｈＢＬＴ１を用いて飽和結合曲線を作成し、式Ｋｉ＝ＩＣ５０／１＋［基質］／ＫＭを使用してＫＭを決定し、Ｋｉ＝ＩＣ５０／２．７を簡略化することにより以前に決定した定数である）。
【００８１】
実質的に上記のプロトコルに従って、実施例２の化合物は、これらの条件下で５．５ｎＭの絶対Ｋｉ（１０．４ｎＭの相対Ｋｉ）を示した。これらのデータは、高親和性ＬＴＢ４受容体にて実施例２の化合物によるＬＴＢ４の有効な拮抗作用を証明している。
【００８２】
ｈＢＬＴ２を含有する膜における［３Ｈ］−ＬＴＢ４結合アッセイ：
［３Ｈ］−ＬＴＢ４（３０μＬの２．８ｎＭ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＮＥＴ−８５２）をＦａｌｃｏｎ（登録商標）３０７２マイクロタイタープレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の各ウェルにアリコートする。次いで試験化合物（１０μＬ）の以前に調製した１０点用量反応範囲を、３０μＭ〜１．５ｎＭの範囲の最終化合物濃度でカラム２〜１１に加える。結合対照のために、１−（５−エチル−２−ヒドロキシ−４−（６−メチル−６−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）へプチルオキシ）フェニル）エタノン（ＬＹ２５５２８３、市販されている公知のｈＢＬＴ２阻害剤）（１０μＬの１００μＭ、１０μＭの最終濃度）のアリコートを、選択したウェルに（陽性対照として）加えるか、または１０μＬの緩衝液Ｂ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、１％のＢＳＡ、１０％のＤＭＳＯ）（陰性対照）を選択したウェルに加える。ｈＢＬＴ２膜タンパク質（７．５μｇ）を、１００μＬの全体積でマイクロタイタープレートの適切なウェルに加える。プレートを低速でプレートミキサに置き、１時間インキュベートする。インキュベーション後、反応混合物の各ウェルから９０μＬを９６ウェルＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ−フィルタ結合プレート（カタログ番号ＭＡＦＢＮＯＢ１０）に移し、それを緩衝液Ａ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、０．０３％のＢＳＡ）で予め湿潤させる。プレートを吸引し、次いで３００μＬの氷冷緩衝液Ｃ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＮａＣｌ）で３回洗浄し、各洗浄工程の後、吸引する。プレートを空気乾燥させ、次いでＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ（登録商標）２０（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）（１００μＬ）を加える。プレートを１６時間静置させ、次いで１分間、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｔｏｐｃｏｕｎｔ（登録商標）で読み取る。ＣＰＭ（カウント毎分）を阻害剤濃度に対してプロットし、曲線を、一定の底部を有する３−パラメータロジスティックフィットを用いてフィッティングさせてＩＣ５０値を得る。
【００８３】
実質的に上記のプロトコルに従って、実施例２の化合物はこれらの条件下で１６．５μＭの絶対ＩＣ５０（１５．４μＭの相対ＩＣ５０）を示した。これらのデータは、低親和性ＬＴＢ４受容体にて実施例２の化合物によりＬＴＢ４の統計的に有意でない拮抗作用を証明する。
【００８４】
ＦＬＩＰＲ（登録商標）カルシウム放出アッセイ：
高親和性（ＢＬＴ１）ＬＴＢ４受容体を安定に発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ−Ｋ１）細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（３：１）ｗ／ｏフェノールレッド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および４０μｇ／ｍＬのＬ−プロリン（Ｓｉｇｍａ）を含有する増殖培地入りの９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に１０，０００細胞／ウェルにて播種する。次いでプレートを３７℃、５％ＣＯ２にて２２〜２４時間インキュベートし、増殖培地を、Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）ＲＰＭＩ−１６４０ｗ／ｏフェノールレッド、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（両方Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）、および０．２％ｗ／ｖのウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）を含有する５０μＬ／ウェルの試験培地と置き換える。３７℃、５％ＣＯ２にて３０〜６０分のインキュベーション後、５ｍＭのプロベネシド（Ｓｉｇｍａ）を含有する５０μＬの希釈したＦＬＩＰＲカルシウム３アッセイキット試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）をウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ２にてさらに１．２５時間、プレートをインキュベートする。プレートをＦＬＩＰＲ（登録商標）機器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）に置き、５０μＬの４％ｖ／ｖのＤＭＳＯまたは化合物を加え、６分後、５０μＬのビヒクルまたはＬＴＢ４を加える。最終濃度のＬＴＢ４は８ｎＭである。０．５秒の曝露長さおよび０．６ワットのレーザ出力を使用してプレートを読み取る。
【００８５】
実施例２の化合物は、ＬＴＢ４誘導性カルシウム動員（有効性および選択性）の阻害、０．９８（２のｎ；＋／−１．６４）のＫｂ（ｎＭ）および６．４８（２のｎ；＋／−１０．８）の相対ＩＣ５０（ｎＭ）を証明した。
【００８６】
さらに、以下は、マウスおよびヒト血液における関連細胞種類における単球内の細胞外シグナル調節キナーゼ１および２（ＥＲＫ）のリン酸化（Ｌｉｎｄｓａｙら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．（１９９８）、６４：５５５−５６２）および好中球内のＣＤ１１ｂの誘導、ならびにペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）の核内受容体サブファミリーに対するＬＴＢ４結合親和性を含む、ＢＬＴ１に対するＬＴＢ４結合により誘導される下流の事象を測定するために使用されるいくつかのさらなるアッセイである。
【００８７】
ヒトリン酸化細胞外関連キナーゼ（ｐＥＲＫ）アッセイ：
ＢＬＴ１を介するＬＴＢ４誘導性シグナル伝達を遮断する実施例２の化合物の能力を、健康なヒトボランティアからおよび前臨床ＡＡＡ有効性評価についてのモデル株である１２９ＳｖＥｖマウスから得た全血中で評価した。
【００８８】
１０ｍＬのＫ２エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）バキュテナーチューブ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で全血をヒトドナーから回収する。全血のアリコートを３７℃にて２０分間予め加温する。試験化合物の１０点用量反応曲線を２０ｎＭ〜１０μＭの最終濃度にてアッセイする。１０００倍の最終アッセイ濃度にて化合物の１０点１／２連続希釈をＤＭＳＯ中で調製する。次いで化合物をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（ＤＭＳＯ濃度はここで１％）中で１０倍に希釈する。１０μＬの化合物希釈（ＤＰＢＳ中に１０倍にて）またはＤＰＢＳ中の１％のＤＭＳＯを、２．０ｍＬ体積の９６ディープウェルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェルに加え、３７℃の加熱ブロックに入れる。
【００８９】
その後すぐに、８０μＬの全血を加え、３７℃にて２０分間インキュベートする（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製の１０μＬの抗ヒトＣＤ１４−ＦＩＴＣを最後の１０分間加える）。Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製の１１μＬの予め加温した１０×ＬＴＢ４（最終濃度１０ｎＭ）を加え、３７℃にて１分間インキュベートする。ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製の１．５ｍＬの１×Ｐｈｏｓｆｌｏｗ  Ｌｙｓｅ／Ｆｉｘ（３７℃で予め加温した）で反応を停止させる。プレートをシールし、ボルテックスし、３７℃にて１０分間インキュベートする。１．５ｍＬのＤＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）で細胞を１回洗浄し、次いで３０分間氷上で１００μＬの２％Ｃｙｔｏｆｉｘ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）＋９００μＬの冷メタノールで透過処理する。１ｍＬの洗浄緩衝液（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）＋５％ＦＢＳ）で細胞を１回洗浄し、次いで室温にて１時間１００μＬのｐＥＲＫ抗体（１：１００希釈したＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）とインキュベートする。洗浄緩衝液で細胞を１回洗浄し、次いで室温にて３０分間暗所で１００μＬの２μｇ／ｍＬ抗ウサギＩｇＧ−ＰＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とインキュベートする。洗浄緩衝液で細胞を再び洗浄し、次いで４００μＬの１％Ｃｙｔｏｆｉｘ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に固定する。細胞を１２×７５チューブに移し、次いで分析まで冷蔵する。試料を室温に加温し、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＦＣ５００フローサイトメーターで分析する。ヒト単球を、ゲーティングストラテジー側方散乱対ＣＤ１４−ＦＩＴＣ陽性により単離する。ＷｉｎＬｉｓｔソフトウェア（Ｖｅｒｉｔｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｈｏｕｓｅ）によりデータを分析して、単球集団由来のｐＥＲＫ−ＰＥについて平均および中央蛍光強度値を決定する。
【００９０】
実施例２の化合物が種々の濃度でヒト全血に加えられる場合、単球におけるＥＲＫのＬＴＢ４誘導性リン酸化は８１４ｎＭのＩＣ５０で遮断され、実施例２の化合物による下流のシグナル伝達事象の拮抗作用が証明される。
【００９１】
マウスｐＥＲＫアッセイ：
５０ｍＭのＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）中で１２９ＳｖＥｖマウスから全血を採取する。インビトロ実験のために、試験化合物の１０点用量反応曲線を２０ｎＭ〜１０μＭの最終濃度にてアッセイする。１０００倍の最終アッセイ濃度にて化合物の１０点１／２連続希釈をＤＭＳＯ中で調製する。次いで化合物をＤＰＢＳ（ＤＭＳＯ濃度はここで１％である）中で１０倍に希釈する。１０μＬの化合物希釈（ＤＰＢＳ中で１０倍に希釈）またはＤＰＢＳ中の１％ＤＭＳＯを９６ディープウェルプレートのウェルに加える。８０μＬの全血を加え、室温にて２０分間インキュベートする（１μｇ／ｍＬ最終濃度にて１０μＬの抗マウスＬＹ６Ｇ−ＦＩＴＣ抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および１０μｌの抗マウスＣＤ１１ｂ−ＡＰＣ  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓを最後の１０分間加える）。１１μＬの１０倍の予め加温したＬＴＢ４（最終濃度２０ｎＭ）を加え、３７℃にて２分間インキュベートする。ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製の１．５ｍＬの１×Ｐｈｏｓｆｌｏｗ  Ｌｙｓｅ／Ｆｉｘ（３７℃に予め加温した）で反応を停止させる。プレートをシールし、ボルテックスし、３７℃にて１０分間インキュベートする。１．５ｍＬのＤＰＢＳで細胞を１回洗浄し、次いで室温にて１０分間、１ｍＬのＢＤ  Ｐｅｒｍ／洗浄緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で透過処理する。１ｍＬのＰｅｒｍ／洗浄緩衝液で細胞を１回洗浄し、次いで室温にて１時間、１００μｌのｐＥＲＫ抗体（１：１００に希釈したＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）とインキュベートする。Ｐｅｒｍ／洗浄緩衝液で細胞を再び洗浄し、次いで室温にて３０分間、暗所で１００μＬの２μｇ／ｍＬ抗ウサギＩｇＧ−ＰＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とインキュベートする。Ｐｅｒｍ／洗浄緩衝液で細胞を再び洗浄し、次いで４００μｌの１％のＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ中で固定する。マウス単球をゲーティングストラテジーＬＹ６Ｇ−ＦＩＴＣ陰性／ＣＤ１１ｂ−ＡＰＣ陽性により単離する。
【００９２】
実施例２の化合物は２４３ｎＭのＩＣ５０でマウス全血単球中のＥＲＫのＬＴＢ４誘導性リン酸化を遮断し、下流のシグナル伝達事象の拮抗作用が証明される。
【００９３】
ＣＤ１１ｂアッセイ：
炎症はバイオマーカーの開発を受け入れやすい１つの病態生理学的プロセスである。例えば、簡単な血液検査は好中球活性化をモニターするための組織生検に対する代理として役立ち得る。好中球活性化は血液から組織損傷部位までそれらの移動をもたらし、炎症プロセスの中心となり（Ｂｕｓｓｅ、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．（１９９８）、１５７：Ｓ２１０−２１３）、好中球は典型的に健康な組織に存在しない。血液中の好中球活性化に特異的なバイオマーカーに基づいたアッセイは組織内の炎症反応の低侵襲性指標である。好中球表面上のβ２インテグリンＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８（Ｍａｃ−１）、糖タンパク質の増加した発現は炎症領域内の好中球の移動における最初のステップである（Ｐａｒｋｏｓ、ＢｉｏＥｓｓａｙｓ（１９９７）、１９：８６５−８７３）。ＢＬＴ１受容体拮抗作用の前臨床および臨床バイオマーカーとしてのＣＤ１１ｂの有用性は、ＬＴＢ４有効性が好中球上でＣＤ１１ｂ発現を上方制御し（Ｔｕｒｎｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９６）、９７：３８１−３８７）、ＬＴＢ４によるＣＤ１１ｂの刺激が、ＬＴＢ４受容体のアンタゴニストにより顕著に減少することが示されている（Ａｌｌｅｎら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．（１９９６）、２７７：３４１−３４９；Ｄａｖｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０００）、２４０：１２５−１３２；Ｍａｒｄｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９５）、４９：１６８３−１６９０）という事実に基づく。
【００９４】
ＥＤＴＡ抗凝固血液は上記のようにヒトドナーまたはマウスから採取する。インビトロ実験のために、試験化合物の８または１０点用量反応曲線をそれぞれ７８ｎＭ〜１０μＭまたは２０ｎＭ〜１０μＭの最終濃度にてアッセイする。１０００倍の最終アッセイ濃度にて化合物の１／２連続希釈をＤＭＳＯ中で調製する。次いで化合物をＤＰＢＳ中で１０倍に希釈する（ＤＭＳＯ濃度はここで１％である）。１０μＬの化合物希釈（ＤＰＢＳ中に１０倍にて）またはＤＰＢＳ中の１％ＤＭＳＯを９６ディープウェルプレートのウェルに加える。９０μＬの全血を加え、室温にて２０分インキュベートする。１１μＬの１０×ＬＴＢ４（最終濃度、マウスについて２５ｎＭまたはヒトについて１０ｎＭ）を加え、３７℃にて３０分間インキュベートする。５分間氷上でプレートをインキュベートすることによって反応を停止させる。１０μＬの抗マウスまたは抗ヒトＣＤ１１ｂ−ＰＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、マウスについて１：２０希釈し、ヒトについて未希釈）で細胞を染色し、暗所にて氷上で３０分間インキュベートする（マウスの実験について、１：２５に希釈した１０μＬの抗マウスＬＹ６Ｇ−ＦＩＴＣ抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を最後の１０分間加える）。１．５ｍＬの１×ＢＤ  ＦＡＣＳｌｙｓｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を加えることにより赤血球（ＲＢＣ）を溶解し、暗所で室温にて１０分間インキュベートする。１．５ｍＬのＤＰＢＳで細胞を１回洗浄し、次いで４００μＬの１％Ｃｙｔｏｆｉｘ中で固定する。ゲーティングストラテジーＬＹ６Ｇ−ＦＩＴＣ陽性によりマウス好中球を単離し、光散乱特性によりヒト好中球を単離する。ＷｉｎＬｉｓｔソフトウェア（Ｖｅｒｉｔｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｈｏｕｓｅ）を用いてデータを分析して、好中球集団からのＣＤ１１ｂ−ＰＥについての平均および中央蛍光強度値を決定する。
【００９５】
好中球におけるＬＴＢ４誘導性ＣＤ１１ｂ発現は実施例２の化合物によりこの前臨床モデルにおいて用量依存的に阻害され、実施例２はマウスおよびヒト全血好中球におけるＬＴＢ４誘導性ＣＤ１１ｂ発現を遮断する。ヒト全血好中球におけるＣＤ１１ｂのＬＴＢ４誘導性発現は１９３ｎＭのＩＣ５０で遮断される。同様に、実施例２の化合物は１．４５μＭのＩＣ５０でマウス全血好中球におけるＣＤ１１ｂ発現を阻害する。
【００９６】
リガンド活性化ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体アルファ、デルタおよびガンマ（ＰＰＡＲα、δ、γ）結合アッセイ：
ＬＴＢ４およびＢＬＴ受容体アンタゴニストは、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）の核内受容体サブファミリーのリガンドであると示されており、それらの開発機会を制限していると考えられる（Ｄｅｖｃｈａｎｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９９）、２７４：２３３４１−２３３４８；Ｄｅｖｃｈａｎｄら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９６）、３８４：３９−４３）。
【００９７】
ＰＰＡＲ機能的溶解物調製：
一般に、これらの細胞株は、市販の物質を使用して当業者に公知の手順により生成される。
【００９８】
完全長ＰＰＡＲα受容体ＤＮＡ（国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）参照配列ＮＭ＿００５０３６．４）、ＰＰＡＲδ受容体ＤＮＡ（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００６２３８．４）、ＰＰＡＲγ受容体ＤＮＡ（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０１５８６９．４）およびレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）αＤＮＡ（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００２９５７．４）をコードするヌクレオチド配列を合成し、ベクター由来のＮ末端ＨＩＳタグがインフレームされているｐＦａｓｔＢａｃＨＴｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクター内に挿入する。組換えｂａｃｍｉｄ（バキュロウイルスシャトルベクタープラスミド）は、ＤＨ１０Ｂａｃ細胞を形質転換し、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現系の製造業者のプロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎユーザーマニュアル、バージョンＦ、２０１０年９月０４日付け；およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ機器マニュアル２００２年２月２７日付けも参照のこと）に従って白いコロニーからＤＮＡを単離することにより作製される。Ｓｆ９細胞を、ＣｅｌｌＦｅｃｔｉｎ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して０．９×１０６個細胞／ウェルにて６ウェルプレート中にトランスフェクトする。Ｐ０ウイルスをトランスフェクションの７２時間後に収集し、１．５×１０６個細胞／ｍＬにて５０ｍＬの細胞当たり１００μＬのＰ０ウイルスにて懸濁液中でＳｆ９昆虫細胞を感染させるために使用する。Ｐ１ウイルスを９６時間後に収集する。タンパク質産生のために、１ＬのＳｆ９細胞を１．５×１０６個細胞／ｍＬにて５ｍＬのＰ１ウイルスで感染させ、細胞を４８時間後に収集する。細胞溶解物を調製するために、１Ｌ培養物からの細胞ペレットを、ＰＰＡＲについて１２．５ｍＬの氷冷溶解緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．８、１６０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１％の３−［（３−クロロアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、４０％グリセロール、１×Ｒｏｃｈｅプロテアーゼ阻害剤カクテル）またはＲＸＲαについて溶解緩衝液Ｂ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、５０％グリセロール、１×Ｒｏｃｈｅプロテアーゼ阻害剤カクテル）で再懸濁し、次いでホモジナイズし、氷上で超音波処理する。４℃にて４５分間１６，５００ｒｐｍにてＢｅｃｋｍａｎ  ＪＡ１８ローターでの遠心分離後、上清をアリコートし、−８０℃にて凍結する。タンパク質濃度は、標準物としてＢＳＡを使用したＢｒａｄｆｏｒｄアッセイにより決定する。
【００９９】
ＰＰＡＲα、δ、γ受容体についての化合物の結合親和性は、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）技術を使用して評価する。
ビオチン化オリゴヌクレオチド（ＤＲ２）
ケイ酸イットリウムストレプトアビジンでコーティングしたＳＰＡビーズ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）に対する受容体の結合のために５’ＴＡＡＴＧＴＡＧＧＴＡＡＴＡＧＴＴＣＡＡＴＡＧＧＴＣＡＡＡＧＧＧ３’（配列番号１）を使用する。ＰＰＡＲα、δ、γおよびレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）α受容体（ヘテロ二量体として内因的に発現された）は、Ｓｆ９細胞におけるバキュロウイルス発現系由来の細胞溶解物である。ＤＲ２を、ｐＨ７．８にて１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、８０ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、０．５％のＣＨＡＰＳおよび１６．６μｇのウシ血清アルブミンを含有する結合緩衝液中で室温にて３０分にわたって混合することによりストレプトアビジンＳＰＡビーズに付着させる。ビーズ−オリゴミックスをペレットにするために混合物を３分間２０００ｒｐｍにて回転させる。上清を除去し、ビーズ−オリゴペレットを上記と同じ結合緩衝液中に再懸濁する。細胞溶解物を、上記の結合緩衝液プラス１４％グリセロールおよび５μｇの剪断したサケ精子ＤＮＡ中で、アルファおよびデルタ受容体について約０．０３３８μＣｉのトリチウム化したＧＷ２３３１（ラセミ体２−［４−［２−［［（２，４−ジフルオロフェニル）カルバモイル］（ヘプチル）アミノ］エチル］フェノキシ］−２−メチルブタン酸）およびガンマ受容体について約０．０３７３μＣｉのトリチウム化した２−メチル−［４−［３−［プロピル［（５−ピリジン−２−イルチオフェン−２−イル）スルホニル］アミノ］プロピル］フェノキシ］プロパン酸、１１０．３μｇのＳＰＡストレプトアビジンでコーティングしたビーズ、０．１２６ｎＭのＨＤオリゴＤＲ２、ならびに０．５μｇのＲＸＲαと共に０．３μｇのＰＰＡＲα、０．５μｇのＲＸＲαと共に０．５μｇのＰＰＡＲδまたは３．０３μｇのＲＸＲαと共に１．２５μｇのＰＰＡＲγのいずれかの存在下で０．１７〜１０，０００ｎＭの範囲の１１の濃度の化合物のうちの１つで各ウェル中でインキュベートする。非特異的結合を、アルファおよびデルタ受容体について１００００ｎＭの非標識ＧＷ２３３１（Ｋｌｉｅｗｅｒ，Ｓ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９７）、９４：４３１８−４３２３）ならびにガンマ受容体について２−メチル−２−［４−［３−［プロピル［（５−ピリジン−２−イルチオフェン−２−イル）スルホニル］アミノ］−プロピル］フェノキシ］プロパノイック（ＷＯ２００４／０７３６０６）の存在下で決定する。結合反応物（９６ウェル［Ｃｏｓｔａｒ３６３２］プレート中の１００μＬ／ウェル）を１０時間インキュベートし、Ｗａｌｌａｃ  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔｅｒで分解／分（ｄｐｍ）としてカウントする。化合物についての受容体結合親和性（ＩＣ５０）を、４−パラメータロジスティック式を用いて１１点濃度反応曲線をフィッティングすることにより決定する。チェン−プルソフ式および飽和結合により決定したＫｄを使用してＩＣ５０からＫｉを決定する。
【０１００】
トリチウム化したＧＷ２３３１は、トリチウム化していない物質を得るためにｇｅｍ−ジメチル類似体の合成についての文献（ＷＯ９２／１０４６８；Ｈａｗｋｅ，Ｒ．Ｌら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．１９９７、３８：１１８９−１２０３）における一般的な以下の手順により得られ得る。トリチウム化は、トリチウムをジフルオロフェニルのオルト位に配置するトリチウムガスおよびクラブトリー触媒（Ｈｅｙｓ，Ｊ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｌａｂｅｌｌｅｄ  Ｃｐｄ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．（１９９９）、４２：７９７−８０７）を使用して達成され得る。あるいは、トリチウムは、ヘプテニル類似体のトリチウムガスを用いたパラジウム触媒還元による分子のヘプチル位に配置されてもよい（前出、Ｋｌｉｅｗｅｒ，Ｓ．Ａ）。
【０１０１】
トリチウム化した２−メチル−２−［４−［３−［プロピル［（５−ピリジン−２−イルチオフェン−２−イル）スルホニル］アミノ］プロピル］フェノキシ］プロパン酸は、トリチウムガスを用いたアリル（ａｌｌｙ）前駆体の触媒還元により作製できる。アリル前駆体（２−［４−［３−［アリル−［［５−（２−ピリジル）−２−チエニル］スルホニル］アミノ］プロピル］フェノキシ］−２−メチル−プロパン酸）は一般に、アリルアミンとの反応、続いて５−（２−ピリジニル）−２−チオフェンスルホニルクロリドでのスルホニル化およびエチルエステルの加水分解においてエチル２−メチル−２−［４−［３−（ｐ−トリルスルホニルオキシ）プロピル］フェノキシ］プロパン酸で開始する、ＷＯ２００４／０７３６０６における以下の手順により作製できる。
【０１０２】
２つの放射性リガンドの使用は文献（Ｂｕｒｒｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２００４  ６７：９４８−９５４およびＸｕら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００４、４７：２４２２−２４２５）に見出され得る。
【０１０３】
実質的に上記のプロトコルに従って、実施例２の化合物は、ＰＰＡＲα、δ、γ結合アッセイにおいて約６１７ｎＭ（ｎ＝３）、＞８８３０ｎＭ（ｎ＝４）、および１３８０ｎＭ（ｎ＝２）のＫｉをそれぞれ示した。これらのデータは、実施例２の化合物がＰＰＡＲ受容体と弱くのみ相互作用することを実証している。活性は、選択的で、開発の制限を示さないことが証明されると考えられる。
【０１０４】
インビボアッセイ手順：
ＣａＣｌ２誘導性ＡＡＡ動物有効性モデル：
マウス大動脈に対する塩化カルシウム溶液の標的適用は血管拡張を誘発する（Ｃｈｉｏｕら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．（２００１）、９９：３７１−３７６；Ｌｏｍｇｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（２００２）、１１０：６２５−６３２）。処置の２週間後、元の血管径と比較した血管拡張は、４週後に大動脈内腔周囲が７５％まで増加し、統計的に有意である。カルシウム沈殿物は媒体の弾力網内に主に局在化する。カルシウム−弾性組織複合体によるこの構造の破壊は、血管壁を弱体化し、動脈瘤形成の原因となる。この損傷はまた、炎症刺激として機能し、好中球、リンパ球、単球および肥満細胞を動員する。
【０１０５】
動物：
マウス：１２９ＳｖＥｖオス、７週齢は、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＵＳＡから獲得する。
ラット：Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット、７〜８週齢は、Ｈａｒｌａｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ、ＵＳＡから獲得する。
【０１０６】
動脈瘤誘導モデル：全ての手順は、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅガイダンスに従って実施する。それらの到着時に、動物を１週間順化させ、その間、標準的な齧歯動物の餌（Ｐｕｒｉｎａ＃２０１４）および家庭用水をそれらに自由にとらせる。順化期間の後、動物をイソフルランで麻酔し、腹部大動脈瘤（ＡＡＡ）のＣａＣｌ２で刺激する誘導のために開腹を実施する。腎動脈のレベルから腸骨分岐までの腹部大動脈を、外科用顕微鏡技術を使用して下大静脈および周囲結合組織から単離する。一旦、単離すると、腹部大動脈の対象の領域（ＲＯＩ）を、０．２５ＭのＣａＣｌ２溶液中に予め浸した滅菌綿ガーゼで覆う。偽対照動物において、０．９％の生理食塩水をＣａＣｌ２と置き換える。７分後、ガーゼを除去し、２回目のＣａＣｌ２を浸したガーゼを再び適用する。２回目の７分後、ガーゼを除去し、０．９％の生理食塩水で大動脈をリンスし、腹部を閉じる。それらの手術日の終わりに動物を通常の居住に戻す。
【０１０７】
化合物投与：１０ｍＬ／ｋｇ体重の用量体積にて経口強制投与によりマウスに試験化合物（実施例２）を与え、２．５ｍＬ／ｋｇ体重の用量体積にて経口強制投与によりラットに試験化合物（実施例２）を与える。化合物投与はＢＩＤ（ａ．ｍ．およびｐ．ｍ．）であり、手術の前日（ｐ．ｍ．）に最初の用量を与え、手術の午前中に２回目の用量を与える。動物は手術日のｐ．ｍ．に用量を受けない。手術日後、投薬を２８日間ＢＩＤで継続する。
【０１０８】
超音波による大動脈測定：手術の２８日後、動物を麻酔し、７．５ＭＨｚプローブを備えたｅＳａｏｔｅ  ＭｙＬａｂ３０Ｇｏｌｄ  Ｂｉｏｓｏｕｎｄ  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ装置を使用して腹部超音波測定に供する。前臨床ＣａＣｌ２齧歯動物モデルにおけるＡＡＡの非対称発達に起因して、動脈測定を長手方向および断面軸の両方に沿ってピーク心収縮の間、外径および内（内側）径から行い、ＲＯＩ内で最も拡張した部分を識別する。内部断面内腔周囲測定（ｍｍ）をその点で収集し、効果を評価し、ＪＭＰ（登録商標）７ソフトウェア（Ｃａｒｙ、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ）を用いて統計的に解析する。
【０１０９】
統計的解析：内腔周囲の測定は平均値±ＳＥとして表す。薬物で処置した群についてのＡＡＡ阻害のパーセントを決定するために、ビヒクルで処置した偽対照群からの測定をＡＡＡ発症の１００％阻害と表し、一方、ビヒクルで処置したＣａＣｌ２群からの測定をＡＡＡ発症の０％阻害と表す。ＪＭＰ（登録商標）７ソフトウェア（Ｃａｒｙ、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ）を用いて統計的解析を実施し、処置群にわたる統計比較のためにダネット検定を使用する。統計的有意性はＰ＜０．０５にて容認される。
【０１１０】
ＣａＣｌ２誘導性腹部大動脈瘤モデルにおける有効性シグナルウインドウを、生理食塩水を浸したガーゼで処置し、続いて、ビヒクルを４週間投与したマウスにおける大動脈の内腔周囲を１００％有効性（「偽ビヒクル」）と決定し、ＣａＣｌ２を浸したガーゼで処置し、続いてビヒクル（「ビヒクル」）を４週間投与したマウスにおける大動脈の内腔周囲は０％有効性と決定する。
【０１１１】
実質的に上記のプロトコルに従って、１２９ＳｖＥｖマウスを使用した、大動脈の内腔周囲は、実施例２の化合物を使用したビヒクルで処置したマウスと比較して統計的に減少し（表１）、実施例２の化合物がこの動物モデルにおいてＡＡＡを減少させることを証明する。
【０１１２】
【表１】
2015509917.tif 000018
【０１１３】
同様の研究設計において、ＣａＣｌ２誘導性損傷後に大動脈瘤拡張を調節する実施例２の化合物の能力を、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて評価する。大動脈の内腔周囲はビヒクルで処置したラットと比較して統計的に減少し（表２）、実施例２の化合物はＡＡＡを減少させることが証明される。
【０１１４】
【表２】
2015509917.tif 000019
【０１１５】
ＬＤＬｒ  ＫＯマウス腕頭アーチアテローム性動脈硬化症モデル：
実施例２の化合物を、アテローム性動脈硬化症の低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体ノックアウト（ＬＤＬｒ  ＫＯ）マウスモデルにおいて試験する。ＬＤＬ受容体（ＬＤＬｒ  ＫＯ）をコードし、合成する能力の欠損したマウスは、特に高いコレステロール食餌で維持した場合、高コレステロール血症になる（Ｉｓｈｉｂａｓｈｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９４）、９３：１８８５−１８９３）。大動脈において、ＬＤＬｒ  ＫＯマウスは、ヒト病変の細胞、脂質および細胞外マトリクス組成物の主な特徴を模倣する自然に発生するアテローム性動脈硬化症を発症する。ヒトおよびマウスの両方の病変の重要な構成要素は、動脈内皮下層における脂質を持ったマクロファージまたは「泡沫細胞」である。マクロファージにより保存されたエステル化されたコレステロールは病変発生の代わりである。（ＬＣ／ＭＳにより）マウス動脈組織から直接エステル化されたコレステロールのアッセイは病変負荷の迅速な指標を与える。本発明の研究に使用したＬＤＬｒ  ＫＯモデルは腕頭動脈（ＢＣＡ）において成熟アテローム動脈硬化性プラークの迅速な発生を利用する。この研究についての主要エンドポイントは、動脈コレステリルエステル含有量および動脈の連続断面における病変の光学顕微鏡測定により得られる病変寸法である。
【０１１６】
ＬＤＬｒ  ＫＯマウス（ＪＡＸ＃００２２０７）、７週齢のオスは、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ）から得た。試験施設に到着すると、合計１０週間存続させ、マウスを個々に収容し、アテローム生成食餌ＴＤ．８８１３７（Ｔｅｋｌａｄ）を自由に与えた。最初の６週の間、マウスをそれらのケージに平穏に置いた。最後の４週の間、経口強制投与により１日に２回、マウスに試験化合物を与えた。その評価からのデータを以下の表３に報告する。
【０１１７】
【表３】
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【０１１８】
表３は、３０ｍｇ／ｋｇ  ｂ．ｉ．ｄ投薬において実施例２の化合物が、ビヒクルで処置した群と比較してＢＣＡコレステリルエステル（ＣＥ）含有量を２３％減少させることを示す（ｐ＜０．０４）。３０ｍｇ／ｋｇ  ｂ．ｉ．ｄにおいてより低い有効性であるが、１０ｍｇ／ｋｇ  ｂ．ｉ．ｄにおいて実施例２の化合物は、ビヒクル処置と比較してＣＥ含有量を１８％減少させた（ｐ＜０．０９）。これらの代理データにより支持されるＢＣＡアテローム性動脈硬化症の有意な減少の傾向は、ＢＣＡ病変の直接測定により確認され、示される。表３は、３０ｍｇ／ｋｇ経口ｂ．ｉ．ｄ投薬における実施例２の化合物により生成される病変領域の有意な減少を示す。この用量における処置の結果、ビヒクル単独での処置と比較して６６％の病変領域の減少がもたらされる（ｐ＜０．０１７）。１０ｍｇ／ｋｇ  ｂ．ｉ．ｄおよび３ｍｇ／ｋｇ  ｂ．ｉ．ｄ投薬のそれぞれにおける実施例２の化合物により生成される病変領域の５８％および５３％の減少は、ＢＣＡ  ＣＥ含有量に対する効果と比較して同様の用量反応効果を示す。
【配列表】
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【国際調査報告】
2015509917.tif 000023
2015509917.tif 000024