(57)【要約】  本発明は、オステオポンチン（ＯＰＮ）、ならびにカルシウムおよび／またはストロンチウムを含有する１つまたは複数の粒子を含むナノ粒子凝集体と、バイオフィルムの増殖を低減もしくは防止するためまたはバイオフィルムを除去するためのその使用とに関する。本発明はさらに、バイオフィルム関連疾患を処置、軽減または防止するための、ナノ粒子凝集体の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤として使用するための、ａ）オステオポンチン（ＯＰＮ）と、ｂ）カルシウムおよび／またはストロンチウムを含む第１の粒子とを含むことを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項２】
バイオフィルム関連疾患を治療、軽減および／または防止するための、ａ）ＯＰＮと、ｂ）カルシウムおよび／またはストロンチウムを含む第１の粒子とを含むことを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項３】
請求項２に記載のナノ粒子凝集体において、前記バイオフィルム関連疾患が細菌感染症を含むことを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項４】
請求項２または３に記載のナノ粒子凝集体において、前記バイオフィルム関連疾患が口腔疾患であることを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項５】
請求項４に記載のナノ粒子凝集体において、前記バイオフィルム関連疾患がう歯であることを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項６】
請求項４または５に記載のナノ粒子凝集体において、前記バイオフィルム関連疾患が歯肉炎であることを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項７】
請求項４乃至６の何れか一項に記載のナノ粒子凝集体において、前記バイオフィルム関連疾患が歯周炎であることを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項８】
請求項２または３に記載のナノ粒子凝集体において、前記バイオフィルム関連疾患が、細菌性心内膜炎、慢性創傷感染症、インプラント感染症、中耳炎、嚢胞性線維症、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される疾患であることを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項９】
請求項２に記載のナノ粒子凝集体において、細菌感染症、例えば細菌性創傷感染症を治療、軽減および／または防止するためのものであることを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項１０】
微生物バイオフィルムの増殖を低減もしくは防止するため、または微生物バイオフィルムを除去するための、ａ）ＯＰＮと、ｂ）カルシウムおよび／またはストロンチウムを含む第１の粒子とを含むことを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項１１】
請求項１０に記載のナノ粒子凝集体において、前記バイオフィルムが歯垢であることを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項１２】
請求項２乃至１１の何れか一項に記載のナノ粒子凝集体において、前記バイオフィルムが、細胞１個当たり少なくとも５０個のＯＰＮ分子のＯＰＮ結合能力を有する細菌を含有することを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項１３】
請求項２乃至１２の何れか一項に記載のナノ粒子凝集体において、前記バイオフィルムが、ストレプトコッカス種、スタフィロコッカス種、シュードモナス種、アクチノミセス種、ラクトバチルス種、アグリゲイティバクター種、バクテロイデス種、リステリア種、カンピロバクター種、エイケネラ種、ポルフィロモナス種、プレボテーラ種、トレポネーマ種、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数の細菌を含有するか、あるいはこれらからなることを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項１４】
請求項１乃至１３の何れか一項に記載のナノ粒子凝集体において、前記第１の粒子がカルシウムを含むことを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項１５】
請求項１乃至１４の何れか一項に記載のナノ粒子凝集体において、前記第１の粒子がストロンチウムを含むことを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項１６】
請求項１乃至１５の何れか一項に記載のナノ粒子凝集体において、前記第１の粒子がカルシウムおよびストロンチウムを含むことを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項１７】
請求項１乃至１６の何れか一項に記載のナノ粒子凝集体において、前記第１の粒子がカルシウムおよび／またはストロンチウムの無機塩を含むことを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項１８】
請求項１７に記載のナノ粒子凝集体において、前記無機塩がリン酸塩種、硫酸塩、および／または炭酸塩を含むことを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項１９】
請求項１乃至１８の何れか一項に記載のナノ粒子凝集体において、前記第１の粒子が少なくとも５０％（ｗ／ｗ）のリン酸カルシウムを含むことを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項２０】
請求項１乃至１９の何れか一項に記載のナノ粒子凝集体において、前記第１の粒子がカルシウムおよび／またはストロンチウムを放出可能であることを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項２１】
請求項１乃至２０の何れか一項に記載のナノ粒子凝集体において、前記第１の粒子がナノ粒子であることを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項２２】
請求項１乃至２１の何れか一項に記載のナノ粒子凝集体において、前記第１の粒子と同じタイプの第２の粒子を含むことを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項２３】
請求項１乃至２２の何れか一項に記載のナノ粒子凝集体において、最大で５ミクロンの流体力学的半径を有することを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項２４】
微生物バイオフィルムの増殖を低減もしくは防止するため、または微生物バイオフィルムを除去するための、ａ）ＯＰＮと、ｂ）カルシウムおよび／またはストロンチウムを含む第１の粒子とを含むことを特徴とするナノ粒子凝集体の使用。
【請求項２５】
請求項２４に記載の使用において、前記バイオフィルムが、ストレプトコッカス種、スタフィロコッカス種、シュードモナス種、アクチノミセス種、ラクトバチルス種、アグリゲイティバクター種、バクテロイデス種、リステリア種、カンピロバクター種、エイケネラ種、ポルフィロモナス種、プレボテーラ種、トレポネーマ種、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数の細菌を含有するか、あるいはこれらからなることを特徴とする使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オステオポンチン（ＯＰＮ）、ならびにカルシウムおよび／またはストロンチウムを含有する１つまたは複数の粒子を含むナノ粒子凝集体と、微生物バイオフィルムの増殖を低減もしくは防止するためまたは微生物バイオフィルムを除去するためのその使用とに関する。本発明はさらに、バイオフィルム関連疾患を処置、軽減または防止するための、ナノ粒子凝集体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物バイオフィルムによって莫大な損害が生じる。細菌および真菌バイオフィルムは、細菌性心内膜炎、慢性創傷感染症、インプラント感染症、中耳炎、う蝕、歯周炎および嚢胞性線維症を含む多数のヒト疾患に関与する。さらに、バイオフィルムは、食品腐敗および生物付着において重要な役割を果たし、これらはいずれも世界中で莫大な経済的損失引き起こす。従来の抗バイオフィルムのアプローチはバイオフィルムの機械的な除去および／またはバイオフィルム中の細菌の殺菌を目指しているが、別の戦略は、微生物バイオフィルムの形成に関わるメカニズム（接着、共凝集、バイオフィルム成熟）を標的とする。それにもかかわらず、微生物バイオフィルムの悪影響は依然として世界的な大問題である。例えばう歯は今でも、最も蔓延するヒト疾患である。
【０００３】
国際公開第２００５０５３６２８号パンフレットには、歯のエナメル質における歯垢細菌の増殖を低減するためのＯＰＮの使用と、オステオポンチンを含有する歯科用製剤とが開示されている。
【０００４】
Ｊｅｎｓｅｎら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａ，Ｏｃｔ．２０１１，Ｖｏｌ  ９９Ａ．Ｉｓｓｕｅ  １）は、ＯＰＮがコートされたヒドロキシアパタイトナノ粒子と、インプラントコーティングのためのその使用とを開示している。
【０００５】
Ｈｏｌｔら（ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２７６（２００９），２３０８−２３２３頁）は、リン酸カルシウムコアの成長を制御するためにＯＰＮまたはＯＰＮ断片を用いたリン酸カルシウムナノクラスタの製造を開示している。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の発明者らは、ＯＰＮと、カルシウムを含む粒子とを含むナノ粒子凝集体が、驚くことに、インビトロおよびインビボの両方で口腔バイオフィルムの増殖の大幅な低減を提供することを見出した（例えば、実施例６および８、ならびに図３および６を参照）。ナノ粒子凝集体は、ＯＰＮ単独、またはＯＰＮを伴わないカルシウム含有粒子、または他のモデル粒子の場合よりもはるかに、バイオフィルム形成の低減において非常に効率的である。従って、ＯＰＮとカルシウム含有粒子とを組み合わせることによって明白な相乗効果が得られ、抗バイオフィルム効果の改善がもたらされる。さらに、本発明者らは、カルシウムがストロンチウムによって置換され得ることを示した。
【０００７】
従って、本発明の態様は、薬剤として使用するための、ａ）ＯＰＮと、ｂ）カルシウムおよび／またはストロンチウムを含む第１の粒子とを含むナノ粒子凝集体に関する。
【０００８】
本発明の別の態様は、バイオフィルム関連疾患を治療、軽減および／または防止するための、ａ）ＯＰＮと、ｂ）カルシウムおよび／またはストロンチウムを含む第１の粒子とを含むナノ粒子凝集体に関する。
【０００９】
さらに本発明の態様は、微生物バイオフィルムの増殖を低減もしくは防止するため、または微生物バイオフィルムを除去するための、ａ）ＯＰＮと、ｂ）カルシウムおよび／またはストロンチウムを含む第１の粒子とを含むナノ粒子凝集体の使用に関する。本発明のいくつかの実施形態では、この使用は、治療によるヒトまたは動物の体の処置ではない。バイオフィルムは、例えば、生きているヒトまたは動物と接触しないバイオフィルムであり得る。
【００１０】
本発明の態様は、化学量論式
Ａ’１０−ＸＡＸ（ＰＯ４）６−ＹＢＹ（ＯＨ）２−ｚＣｚ・ＯＰＮｍ・（Ｈ２Ｏ）ｎ
を有するナノ粒子凝集体に関し、式中、Ａ’はＣａ、Ｓｒおよびこれらの混合物からなる群から選択され、ＡはＬｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、Ｂｅ、Ｍｇ、Ｚｎ、Ｂａ、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｘ＝０〜９であり、Ｂは（ＣＯ３）、（ＳＯ４）、（ＨＳＯ４）、（ＨＰＯ４）、（Ｈ２ＰＯ４）、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｙ＝０〜５であり、ＣはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、（ＣＯ３）、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｚ＝０〜２であり、ｎ＝０〜１０であり、ｍ＞０であり、（ＰＯ４）と（ＨＰＯ４）の間のモル比は２．５よりも大きい。
【００１１】
本発明の別の態様は、微生物バイオフィルムの増殖を低減または防止するための、ａ）ＯＰＮと、ｂ）リン酸ストロンチウム、リン酸カルシウムおよびこれらの混合物とを含むナノ粒子凝集体の使用に関する。
【００１２】
本発明のさらに別の態様は、ａ）ＯＰＮと、ｂ）リン酸ストロンチウム、リン酸カルシウムおよびこれらの混合物とを含むナノ粒子凝集体を含むコーティング組成物に関する。
【００１３】
本発明のさらに別の態様は、薬剤として使用するための、化学量論式
Ａ’１０−ＸＡＸ（ＰＯ４）６−ＹＢＹ（ＯＨ）２−ｚＣｚ・ＯＰＮｍ・（Ｈ２Ｏ）ｎ
を有するナノ粒子凝集体に関し、式中、Ａ’はＣａ、Ｓｒおよびこれらの混合物からなる群から選択され、ＡはＬｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、Ｂｅ、Ｍｇ、Ｚｎ、Ｂａ、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｘ＝０〜９であり、Ｂは（ＣＯ３）、（ＳＯ４）、（ＨＳＯ４）、（ＨＰＯ４）、（Ｈ２ＰＯ４）、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｙ＝０〜５であり、ＣはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、（ＣＯ３）、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｚ＝０〜２であり、ｎ＝０〜１０であり、ｍ＞０であり、（ＰＯ４）と（ＨＰＯ４）の間のモル比は２．５よりも大きい。
【００１４】
本発明のさらに別の態様は、細菌感染症を治療、軽減または防止するための薬剤として使用するための、化学量論式
Ａ’１０−ＸＡＸ（ＰＯ４）６−ＹＢＹ（ＯＨ）２−ｚＣｚ・ＯＰＮｍ・（Ｈ２Ｏ）ｎ
を有するナノ粒子凝集体に関し、式中、Ａ’はＣａ、Ｓｒおよびこれらの混合物からなる群から選択され、ＡはＬｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、Ｂｅ、Ｍｇ、Ｚｎ、Ｂａ、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｘ＝０〜９であり、Ｂは（ＣＯ３）、（ＳＯ４）、（ＨＳＯ４）、（ＨＰＯ４）、（Ｈ２ＰＯ４）、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｙ＝０〜５であり、ＣはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、（ＣＯ３）、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｚ＝０〜２であり、ｎ＝０〜１０であり、ｍ＞０であり、（ＰＯ４）と（ＨＰＯ４）の間のモル比は２．５よりも大きい。
【００１５】
本発明のさらに別の態様はナノ粒子凝集体を含む歯科用製剤に関し、ナノ粒子凝集体は、化学量論式
Ａ’１０−ＸＡＸ（ＰＯ４）６−ＹＢＹ（ＯＨ）２−ｚＣｚ・ＯＰＮｍ・（Ｈ２Ｏ）ｎ
を有し、式中、Ａ’はＣａ、Ｓｒおよびこれらの混合物からなる群から選択され、ＡはＬｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、Ｂｅ、Ｍｇ、Ｚｎ、Ｂａ、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｘ＝０〜９であり、Ｂは（ＣＯ３）、（ＳＯ４）、（ＨＳＯ４）、（ＨＰＯ４）、（Ｈ２ＰＯ４）、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｙ＝０〜５であり、ＣはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、（ＣＯ３）、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｚ＝０〜２であり、ｎ＝０〜１０であり、ｍ＞０であり、（ＰＯ４）と（ＨＰＯ４）の間のモル比は２．５よりも大きい。
【００１６】
１つの態様は、ＯＰＮおよびリン酸カルシウムによって形成されるナノ粒子凝集体を製造するための方法に関し、本方法は、
ａ）ＰＯ４３−としてリン酸塩を含む第１の水溶液（ｐＨは６〜１４の範囲内である）を提供するステップと、
ｂ）Ｃａ２＋および／またはＳｒ２＋を含む第２の水溶液（ｐＨは６〜１４の範囲内である）を提供するステップと、
ｃ）前記第１および第２の溶液を混合し、それにより、１）ＯＰＮと、２）リン酸ストロンチウム、リン酸カルシウムまたはこれらの混合物と、３）水溶性電解質とを含むナノ粒子凝集体を含む懸濁液を形成するステップと、
ｄ）場合により、相当な量の前記水溶性電解質を懸濁液から除去するステップと、
ｅ）場合により、前記ナノ粒子凝集体を水相から分離するステップと
を含み、ここで、第１の水溶液、第２の水溶液またはその両方の水溶液はＯＰＮを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】図１Ａは、う蝕モデルバイオフィルムにおける、ＯＰＮの細菌への結合を示す。増殖期の後、バイオフィルムを蛍光標識ＯＰＮと共に３５℃で４５分間インキュベートした。細菌染色を使用しなかったが、細菌、特にストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）の連鎖を認識することができる。細菌表面に対するＯＰＮの強親和性により、ナノ粒子凝集体はバイオフィルムを標的とする。バー＝１０μｍ。
【図１Ｂ】図１Ｂは、インビボで増殖した歯のバイオフィルムに対する、ＯＰＮを含有するリン酸カルシウムナノ粒子凝集体の結合を示す。ＯＰＮを含有するリン酸カルシウムナノ粒子凝集体と共にバイオフィルムを３５℃で３０分間インキュベートして、Ｃ−ＳＮＡＲＦ−４で染色した。ＯＰＮを含有するリン酸カルシウムナノ粒子凝集体は、細菌バイオフィルムの周りで堅固にクラスタ化する。バー＝２０μｍ。
【図２】図２は、細菌の増殖がＯＰＮによって影響を受けないことを示す。０．９ｇ／ｌのＯＰＮを含有するＴＨＢおよびＴＨＢ中でＳ．ミティス（ｍｉｔｉｓ）およびＡ．ネスルンディ（ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）を増殖させた。分光光度法により細菌の増殖をモニターした。エラーバーは標準偏差を示す。ＯＰＮが殺菌または静菌効果を有することは示されなかった。
【図３】図３は、う蝕モデルにおけるバイオフィルム形成に対して、クリスタルバイオレット染色によって測定される種々の薬剤の効果を示す。ＯＰＮを含有するリン酸カルシウムナノ粒子凝集体（ＨＡＰ−ＯＰＮ）は、１０００ｎｍのポリスチレン粒子、シリカ粒子（１５０ｎｍ、５００ｎｍおよび２０００ｎｍ）、ＯＰＮを含まないリン酸カルシウム粒子凝集体および０．９ｇ／ｌのＯＰＮと比較して、フローセル内に形成されるバイオフィルムの量を大幅に低減する。エラーバーは標準偏差を示す。
【図４】図４は、ＯＰＮを含有するリン酸カルシウムナノ粒子凝集体（ＨＡＰ−ＯＰＮ）が、シリカ粒子、ポリスチレン粒子、溶液中のＯＰＮ、およびＯＰＮを含まないリン酸カルシウムナノ粒子凝集体（ＨＡＰ）よりもかなり多くクリスタルバイオレットに結合することを示す。ＯＰＮを含有するナノ粒子凝集体の存在下で形成されるバイオフィルムの量のクリスタルバイオレット定量化（図３に示される）は、フローセル内で形成されるバイオフィルムの実際の量を過大評価する。エラーバーは標準偏差を示す。
【図５】図５は、ＯＰＮを含有するリン酸カルシウムナノ粒子凝集体が、う蝕バイオフィルムのフローセルモデルにおいて増殖されるバイオフィルムの量を低減することを示す。バイオフィルムをＣ−ＳＮＡＲＦ−４で染色し、共焦点顕微鏡でイメージングした。Ａ：ナノ粒子凝集体を用いずに増殖させたバイオフィルム。Ｂ：増殖の間にナノ粒子凝集体にさらしたバイオフィルム。バー＝２０μｍ。
【図６】図６は、ＯＰＮを含有するリン酸カルシウムナノ粒子凝集体が、インビボの口腔バイオフィルムの増殖を大幅に低減することを示す。Ａ：ガラススラブ上で増殖させたバイオフィルムを口腔内で７２時間保持し、１日につき５〜６回のＮａＣｌ浸漬（３０〜６０分間）を実施した。Ｂ：ガラススラブ上で増殖させたバイオフィルムを口腔内で７２時間保持し、１日につき５〜６回、ＯＰＮを含有するリン酸カルシウムナノ粒子凝集体による浸漬（３０〜６０分間）を実施した。いずれのガラススラブも、同時に同じ研究被験者が装着した。バー＝２０μｍ。
【図７ａ】図７ａは、ＯＰＮを含有するリン酸カルシウムナノ粒子凝集体が、プランクトン様培養物において増殖される場合にう蝕モデルの菌種によって生じる酸を緩衝することを示す。
【図７ｂ】図７ｂは、ＯＰＮを含有するリン酸カルシウムナノ粒子凝集体が、プランクトン様培養物において増殖される場合にう蝕モデルの菌種によって生じる酸を緩衝することを示す。
【図７ｃ】図７ｃは、ＯＰＮを含有するリン酸カルシウムナノ粒子凝集体が、プランクトン様培養物において増殖される場合にう蝕モデルの菌種によって生じる酸を緩衝することを示す。
【図７ｄ】図７ｄは、ＯＰＮを含有するリン酸カルシウムナノ粒子凝集体が、プランクトン様培養物において増殖される場合にう蝕モデルの菌種によって生じる酸を緩衝することを示す。
【図７ｅ】図７ｅは、ＯＰＮを含有するリン酸カルシウムナノ粒子凝集体が、プランクトン様培養物において増殖される場合にう蝕モデルの菌種によって生じる酸を緩衝することを示す。
【図８ａ】図８ａは、ＯＰＮを含有するリン酸カルシウムナノ粒子凝集体が、５種のう蝕モデルにおいてバイオフィルムによって生じる酸を緩衝することを示す。バイオフィルムは、グルコースを含有するＴＨＢにおける増殖が終了した後にナノ粒子凝集体と共にインキュベートしただけである。ナノ粒子凝集体にさらしたバイオフィルムでは、ｐＨは、エナメル質溶解の臨界値である５．５より低く降下することはなかった。
【図８ｂ】図８ｂは、ＯＰＮを含有するリン酸カルシウムナノ粒子凝集体が、５種のう蝕モデルにおいてバイオフィルムによって生じる酸を緩衝することを示す。バイオフィルムは、グルコースを含有するＴＨＢにおける増殖が終了した後にナノ粒子凝集体と共にインキュベートしただけである。ナノ粒子凝集体にさらしたバイオフィルムでは、ｐＨは、エナメル質溶解の臨界値である５．５より低く降下することはなかった。
【図８ｃ】図８ｃは、ＯＰＮを含有するリン酸カルシウムナノ粒子凝集体が、５種のう蝕モデルにおいてバイオフィルムによって生じる酸を緩衝することを示す。バイオフィルムは、グルコースを含有するＴＨＢにおける増殖が終了した後にナノ粒子凝集体と共にインキュベートしただけである。ナノ粒子凝集体にさらしたバイオフィルムでは、ｐＨは、エナメル質溶解の臨界値である５．５より低く降下することはなかった。
【図８ｄ】図８ｄは、ＯＰＮを含有するリン酸カルシウムナノ粒子凝集体が、５種のう蝕モデルにおいてバイオフィルムによって生じる酸を緩衝することを示す。バイオフィルムは、グルコースを含有するＴＨＢにおける増殖が終了した後にナノ粒子凝集体と共にインキュベートしただけである。ナノ粒子凝集体にさらしたバイオフィルムでは、ｐＨは、エナメル質溶解の臨界値である５．５より低く降下することはなかった。
【図８ｅ】図８ｅは、ＯＰＮを含有するリン酸カルシウムナノ粒子凝集体が、５種のう蝕モデルにおいてバイオフィルムによって生じる酸を緩衝することを示す。バイオフィルムは、グルコースを含有するＴＨＢにおける増殖が終了した後にナノ粒子凝集体と共にインキュベートしただけである。ナノ粒子凝集体にさらしたバイオフィルムでは、ｐＨは、エナメル質溶解の臨界値である５．５より低く降下することはなかった。
【図９】図９は、ＣｕＫα放射線を用いて記録されたＸ線回折パターンを示す。個々の材料の回折パターンは、明確にするために垂直にシフトされている。ナノ結晶アパタイト材料は、１５ｍｇ／ｍｌの量のＯＰＮが添加される場合に得られる。この濃度よりも高いと、大量のアモルファス材料が観察され、３０および３４ｍｇ／ｍｌでは、アモルファスの大きいバックグラウンド散乱の上にナノ結晶アパタイトに相当する非常に小さい回折ピークが観察される。
【図１０】図１０は、図９のＸ線回折データのリートベルト精密化（Ｒｉｅｔｖｅｌｄ  ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）から導出される平均結晶サイズを示す。ナノ結晶の形状はほぼ針状であり、形態学的な長軸が結晶学的なアパタイトのｃ軸と一致することが見出された。上部のパネルは全てのデータの結果を示し、下部のパネルは非常に低濃度で観察される結晶サイズに対する大きな影響を表し、１２．５および１５ｍｇ／ｍｌのＯＰＮで観察される結晶サイズの増大は、恐らく、ナノ結晶／アモルファス材料混合物の形成によるものである。
【図１１】図１１は、ナノ粒子凝集体の熱重量分析（ＴＧＡ）データをＯＰＮの添加量の関数で示す。データは、明確にするために縦座標軸に沿ってシフトされている。２５〜２００℃の質量損失は水の損失に帰属されるが、２００〜５５０℃の損失は有機材料に対応し、５５０〜１２００℃の損失は炭酸塩の損失に帰属される。
【図１２】図１２は、図１１のＴＧＡデータから導出される水、有機物および炭酸塩の質量分率を示す。有機物および炭酸塩の質量は乾燥材料質量（２００℃における残留質量）に対して基準化されている。
【図１３】図１３は、ナノ粒子凝集体のＦＴＩＲデータをＯＰＮの添加量の関数で示す。データは、明確にするために縦座標軸に沿ってシフトされている。ＯＰＮの濃度が増大すると、１３００、１５５０および１６５０ｃｍ−１付近のアミドピークの強度が増大し、高濃度の合成ではより多くのタンパク質が粒子と関連していることが示される。リン酸塩（９００〜１２００ｃｍ−１）、炭酸塩（８４０〜８９０ｃｍ−１）およびアミド（１５９５〜１７２０ｃｍ−１）に対する特定のピークが観察される。
【図１４】図１４は、リン酸塩（９００〜１２００ｃｍ−１）、炭酸塩（８４０〜８９０ｃｍ−１）およびアミド（１５９５〜１７２０ｃｍ−１）のピーク面積の比率として得られる、ＩＲデータからの有機含量および炭酸塩含量の推定値を示す。図１２のＴＧＡによって得られる結果との良好な一致が注目される。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明はこれから以下においてより詳細に説明されるであろう。
【００１９】
上記のように、本発明の態様は、薬剤として使用するための、ａ）ＯＰＮと、ｂ）カルシウムおよび／またはストロンチウムを含む第１の粒子とを含むナノ粒子凝集体に関する。
【００２０】
従って、ナノ粒子凝集体のそれぞれは、好ましくは、ＯＰＮと、カルシウムおよび／またはストロンチウムを含む第１の粒子との両方を含有する。
【００２１】
カルシウムは、好ましくは、その＋２酸化状態（Ｃａ２＋）で存在する。同様に、ストロンチウムは、好ましくは、その＋２酸化状態（Ｓｒ２＋）で使用される。
【００２２】
本発明との関連では、「Ｙおよび／またはＸ」という語句は、「Ｙ」または「Ｘ」あるいは「ＹおよびＸ」を意味する。同じ論理の方向に沿って、「ｎ１、ｎ２、．．．、ｎｉ−１、および／またはｎｉ」という語句は、「ｎ１」または「ｎ２」または．．．または「ｎｉ−１」または「ｎｉ」あるいは成分ｎ１、ｎ２、．．．ｎｉ−１、およびｎｉの任意の組み合わせを意味する。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「オステオポンチン」または「ＯＰＮ」という用語は乳から得られるオステオポンチンを意味し、乳中でタンパク質切断によってＯＰＮから生じる天然に存在する断片もしくはペプチド、または国際公開第０１／４９７４１号パンフレットにおいて提唱される方法から得られるような遺伝子スプライス（ｇｅｎｅｓｐｌｉｃｅ）、リン酸化、もしくはグリコシル化変異体が含まれる。乳は、ウシ、ヒト、ラクダ、ヤギ、ヒツジ、ヒトコブラクダおよびラマなどの任意の乳生産動物からの乳であり得る。しかしながら、実用性のために現在は牛乳からのＯＰＮが好ましい。全長オステオポンチン（ｆＯＰＮ）は酸性の、高度にリン酸化された、シアル酸が豊富なカルシウム結合タンパク質である。ｆＯＰＮは、１モル当たり２８モルのリン酸および約５０モルのＣａと結合する。ｆＯＰＮの等電点は約３．０である。このタンパク質は体内の多くの組織に存在し、シグナル伝達および調節タンパク質としての役割を果たす。これは、バイオミネラリゼーション過程における活性タンパク質である。ＯＰＮは、骨細胞、平滑筋細胞および上皮細胞を含むいくつかの細胞型によって発現される。
【００２４】
全ての量は天然の牛乳ＯＰＮに基づくが、その活性断片または別の供給源からのＯＰＮの対応する量に容易に修正することができる。ＯＰＮまたはその誘導体は組換えで調製することもできる。
【００２５】
ＯＰＮは、全長ウシＯＰＮの形態（例えば、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ  Ｐ３１０９６の位置１７−２７８、またはＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ  Ｐ３１０９６の位置１７−２７８と少なくとも９５％の配列同一性を有するペプチド）、および全長ウシＯＰＮの長いＮ末端断片の形態（例えば、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ  Ｐ３１０９６の位置１７−１６３、またはＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ  Ｐ３１０９６の位置１７−１６３と少なくとも９５％の配列同一性を有するペプチド）の両方で牛乳中に存在し、例えば、Ｂｉｓｓｏｎｎｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌ．９５  Ｎｏ．２、２０１２が参照される。
【００２６】
本発明との関連では、「配列同一性」という用語は、好ましくは等しい長さの２つのアミノ酸配列間または２つの核酸配列間の同一性の程度の定量的な尺度に関する。比較される２つの配列が等しい長さでない場合、これらは、可能な最良適合にアラインされなければならない。配列同一性は、
（Ｎｒｅｆ−Ｎｄｉｆ）＊１００）／（Ｎｒｅｆ）
で計算することができる。式中、Ｎｄｉｆは、アラインされたときの２つの配列内の非同一残基の総数であり、Ｎｒｅｆは基準配列の残基の数である。従って、ＤＮＡ配列ＡＧＴＣＡＧＴＣは、配列ＡＡＴＣＡＡＴＣと７５％の配列同一性を有するであろう（Ｎｄｉｆ＝２およびＮｒｅｆ＝８）。間隙は特定の残基の非同一性であると数えられ、すなわち、ＤＮＡ配列ＡＧＴＧＴＣは、ＤＮＡ配列ＡＧＴＣＡＧＴＣと７５％の配列同一性を有するであろう（Ｎｄｉｆ＝２およびＮｒｅｆ＝８）。配列同一性は、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ），ＵＳＡによって提供されるＢＬＡＳＴｐアルゴリズムなどの適切なＢＬＡＳＴプログラムを用いて計算することができる。
【００２７】
例えば、本発明で使用されるＯＰＮは実質的に純粋な全長ＯＰＮであってもよいし、実質的に純粋な全長ＯＰＮの断片であってもよいし、そして全長ＯＰＮおよびＯＰＮの１つまたは複数の断片を含む混合物であってもよい。
【００２８】
本発明で使用されるＯＰＮは、実質的に純粋な全長ウシＯＰＮであってもよいし、実質的に純粋な全長ウシＯＰＮの長いＮ末端断片であってもよいし、そして全長ウシＯＰＮおよび全長ウシＯＰＮの長いＮ末端断片を含む混合物であってもよい。このような混合物は、例えば、ＯＰＮの全量に対して５〜４０％（ｗ／ｗ）の量の全長ウシＯＰＮと、ＯＰＮの全量に対して６０〜９５％（ｗ／ｗ）の量の全長ウシＯＰＮの長いｎ末端断片とを含有し得る。
【００２９】
ウシＯＰＮは、通常、牛乳１リットル当たり２０ｍｇのＯＰＮの濃度で入手可能である。
【００３０】
ウシＯＰＮは、特許出願の国際公開第０１／４９７７４１Ａ２号パンフレット、国際公開第０２／２８４１３号パンフレット、国際公開第２０１２／１１７，１１９号パンフレットまたは国際公開第２０１２／１１７，１２０号パンフレットに記載されるように、例えばｐＨ４．５の酸乳清から、アニオン交換クロマトグラフィによって単離することができる。９０〜９５％までのＯＰＮ純度を得ることができる。
【００３１】
ナノ粒子凝集体は、さらに、ＯＰＮに加えて他のカルシウム結合ペプチドを含有し得る。
【００３２】
ナノ粒子凝集体は、ＯＰＮに加えて、フェチュインＡ（ＦＥＴＵＡ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ  Ｐ０２７６５）、プロリンリッチ塩基性リンタンパク質４（ＰＲＢ４）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ  Ｐ１  ０１６３）、マトリックスＧｌａタンパク質（ＭＧＰ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ  Ｐ０８４９３）、分泌型リンタンパク質２４（ＳＰＰ−２４）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ  Ｑ１３１０３）、リボフラビン結合タンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ  Ｐ０２７５２）、インテグリン結合シアロリンタンパク質ＩＩ（ＩＢＳＰ−ＩＩ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ  Ｐ２１８１５）、マトリックス細胞外骨リン糖タンパク質（ＭＥＰＥ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ  Ｑ９ＮＱ７６）、象牙質マトリックス酸性リンタンパク質１（ＯＭＰ１）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ  Ｑ１３３１６）、ヒトベータ−カゼイン、ウシベータ−カゼイン、およびこれらのアイソフォームまたはリンペプチド（ｐｈｏｐｈｏｐｅｔｉｄｅ）断片からなる群から選択される１つまたは複数のリンペプチドを含有し得る。
【００３３】
本発明の別の態様は、バイオフィルム関連疾患を治療、軽減および／または防止するための、ａ）ＯＰＮと、ｂ）カルシウムおよび／またはストロンチウムを含む第１の粒子とを含むナノ粒子凝集体に関する。
【００３４】
ナノ粒子凝集体は、ヒト被験者または動物被験者を処置するために使用され得る。
【００３５】
本発明との関連では、「バイオフィルム関連疾患」という用語は、ヒトまたは動物の体に接触するバイオフィルムによって少なくとも部分的に引き起こされる疾患に関する。バイオフィルム関連疾患は、例えば、細菌感染症を含み得る。
【００３６】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、バイオフィルム関連疾患は口腔疾患である。
【００３７】
バイオフィルム関連疾患は、例えば、う歯、歯肉炎、および／または歯周炎であり得る。
【００３８】
バイオフィルム関連疾患は歯肉炎であり得る。あるいは、バイオフィルム関連疾患は歯周炎である。バイオフィルム関連疾患はう歯であってもよい。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態では、バイオフィルム関連疾患は、細菌性心内膜炎、慢性創傷感染症、インプラント感染症、中耳炎、および嚢胞性線維症、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される疾患である。
【００４０】
ナノ粒子凝集体は、例えば、細菌感染症、例えば細菌性創傷感染症を治療、軽減および／または防止するためのものであり得る。
【００４１】
本発明の態様は、例えば、細菌感染症を治療、軽減および／または防止するためのナノ粒子凝集体に関し得る。
【００４２】
細菌感染症は、例えば、歯肉炎などの口腔細菌感染症であり得る。従って、ナノ粒子凝集体は、歯肉炎を治療、軽減および／または防止するためのものであり得る。
【００４３】
ナノ粒子凝集体は、微生物バイオフィルムの増殖を低減または防止するためのものであり得る。
【００４４】
例えば、ナノ粒子凝集体は、歯垢の形成を低減または防止するためのものであり得る。
【００４５】
微生物バイオフィルムの増殖を低減または防止することに加えて、または代替的に、ナノ粒子凝集体は、例えば歯垢などの微生物バイオフィルムを除去するためのものであり得る。
【００４６】
本発明の１つの態様は、微生物バイオフィルムの増殖を低減または防止するための、ＯＰＮおよびリン酸カルシウムを含むナノ粒子凝集体の使用に関する。
【００４７】
バイオフィルムは、細胞が表面で互いに接着した微生物の群集である。これらの接着細胞は、自己産生した細胞外高分子物質のマトリックス内に埋め込まれていることが多い。
【００４８】
本発明の別の態様は、微生物バイオフィルムの増殖を低減または防止するための、ＯＰＮおよびリン酸ストロンチウム／カルシウムを含むナノ粒子凝集体の使用に関する。
【００４９】
さらに別の態様は、微生物バイオフィルムの増殖を低減または防止するための、ＯＰＮおよびリン酸ストロンチウムを含むナノ粒子凝集体の使用に関する。
【００５０】
また別の態様は、微生物バイオフィルムの増殖を低減または防止するための、ＯＰＮと、リン酸ストロンチウムおよびリン酸カルシウムの混合物とを含むナノ粒子凝集体の使用に関する。
【００５１】
別の態様は、微生物バイオフィルムの増殖を低減または防止するための、ａ）ＯＰＮと、ｂ）リン酸ストロンチウム、リン酸カルシウムおよびこれらの混合物とを含むナノ粒子凝集体の使用に関する。
【００５２】
本発明との関連では、ナノ粒子凝集体はナノ粒子の集合体を意味すると解釈され、前記ナノ粒子は、攪拌または低出力超音波処理などの機械的刺激によって互いに容易に分離しない。一例として、ＯＰＮナノ粒子およびリン酸カルシウムナノ粒子は結合してナノ粒子凝集体を形成する。
【００５３】
種々のサイズのナノ粒子凝集体が本発明において使用され得る。本発明のいくつかの実施形態では、ナノ粒子凝集体は、最大で５ミクロンの流体力学的半径を有する。例えば、ナノ粒子凝集体は、最大で２ミクロンの流体力学的半径を有し得る。ナノ粒子凝集体は、例えば、最大で１ミクロンの流体力学的半径を有し得る。あるいは、ナノ粒子凝集体は、最大で０．７ミクロンの流体力学的半径を有し得る。
【００５４】
さらにより小さいナノ粒子凝集体が好ましいこともある。従って、本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ナノ粒子凝集体は、最大で０．５ミクロンの流体力学的半径を有する。例えば、ナノ粒子凝集体は、最大で０．４ミクロンの流体力学的半径を有し得る。ナノ粒子凝集体は、例えば、最大で０．３ミクロンの流体力学的半径を有し得る。あるいは、ナノ粒子凝集体は、最大で０．２ミクロン、例えば最大で０．１ミクロンなどの流体力学的半径を有し得る。
【００５５】
流体力学的半径は、好ましくは、動的光散乱（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒ）（ＤＬＳ）を用いて決定される。
【００５６】
通常、ナノ粒子凝集体は、少なくとも５ｎｍ、好ましくは少なくとも１０ｎｍの流体力学的半径を有する。
【００５７】
上記のように、第１の粒子はカルシウムおよび／またはストロンチウムを含む。
【００５８】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、第１の粒子はカルシウムを含む。
【００５９】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、第１の粒子はストロンチウムを含む。
【００６０】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、第１の粒子はカルシウムおよびストロンチウムを含む。
【００６１】
第１の粒子は、例えば、カルシウムおよび／またはストロンチウムを含む塩を含むか、あるいはこれらからなることができる。
【００６２】
第１の粒子は、第１の粒子の全重量に対して少なくとも５０％（ｗ／ｗ）のカルシウムおよび／またはストロンチウムの塩を含み得る。例えば、第１の粒子は、少なくとも７０％（ｗ／ｗ）のカルシウムおよび／またはストロンチウムの塩を含み得る。第１の粒子は、例えば、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）のカルシウムおよび／またはストロンチウムの塩を含み得る。あるいは、第１の粒子は、少なくとも９０％（ｗ／ｗ）、例えば、少なくとも９５％（ｗ／ｗ）のカルシウムおよび／またはストロンチウムの塩を含み得る。
【００６３】
塩は、カルシウムおよび／またはストロンチウムと、例えばアニオン有機ポリマーの形態の適切な有機アニオンとを含有する有機塩であってもよい。
【００６４】
あるいは、塩は、カルシウムおよび／またはストロンチウムと、適切な無機アニオンとを含有する無機塩であってもよい。このような無機アニオンの非限定的な例は、リン酸種、硫酸、炭酸、またはこれらの混合物である。従って、無機塩は、リン酸塩種、硫酸塩、および／または炭酸塩を含み得る。
【００６５】
リン酸種は、例えば、リン酸（ＰＯ４３−）、リン酸一水素（ＨＰＯ４２−）、ピロリン酸、または二リン酸（Ｐ２Ｏ７４−）であり得る。リン酸種はリン酸（ＰＯ４３−）であるか、あるいはリン酸（ＰＯ４３−）およびリン酸一水素（ＨＰＯ４２−）の組み合わせであるのが現在好ましい。
【００６６】
従って、本発明のいくつかの好ましい実施形態では、第１の粒子は、カルシウムおよび／またはストロンチウム無機塩を含むか、あるいはこれらからなる。
【００６７】
好ましくは、第１の粒子は、第１の粒子の全重量に対して少なくとも５０％（ｗ／ｗ）のカルシウムおよび／またはストロンチウムの無機塩を含む。例えば、第１の粒子は、少なくとも７０％（ｗ／ｗ）のカルシウムおよび／またはストロンチウムの無機塩を含み得る。第１の粒子は、例えば、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）のカルシウムおよび／またはストロンチウムの無機塩を含み得る。あるいは、第１の粒子は、少なくとも９０％（ｗ／ｗ）、例えば少なくとも９５％（ｗ／ｗ）などのカルシウムおよび／またはストロンチウムの無機塩を含み得る。
【００６８】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、第１の粒子はカルシウムおよび／またはストロンチウムを放出することができる。このカルシウムおよび／またはストロンチウムの放出は、好ましくは、ナノ粒子凝集体がバイオフィルムと接触するか、あるいはその近くにある場合に起こる。例えば、ナノ粒子凝集体は、好ましくは、例えば唾液または口腔バイオフィルムなどの口腔の液体フィルム内に存在する場合に、カルシウムおよび／またはストロンチウムを放出することができる。
【００６９】
本発明のいくつかの現在好ましい実施形態では、第１の粒子はナノ粒子であり、すなわち最大で１ミクロンの流体力学的半径を有する。例えば、第１の粒子の流体力学的半径は最大で０．８ミクロンであり得る。第１の粒子の流体力学的半径は、例えば、最大で０．６ミクロンであり得る。あるいは、第１の粒子の流体力学的半径は最大で０．４ミクロンであり得る。
【００７０】
さらにより小さい粒子が好ましいこともあり、従って、第１の粒子は最大で０．２ミクロンの流体力学的半径を有し得る。例えば、第１の粒子の流体力学的半径は最大で０．１ミクロンであり得る。第１の粒子の流体力学的半径は、例えば、最大で０．０５ミクロンであり得る。あるいは、第１の粒子の流体力学的半径は最大で０．０１ミクロンであり得る。
【００７１】
通常、第１の粒子の流体力学的半径は少なくとも３ｎｍであり、好ましくは少なくとも５ｎｍである。
【００７２】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ナノ粒子凝集体の少なくともいくつかは、１つまたは複数のＯＰＮ分子が結合する単一の第１の粒子を含有する。ナノ粒子凝集体の第１の粒子は、例えば、ＯＰＮの単層によって包囲され得る。このようなナノ粒子凝集体の例は、Ｈｏｌｔら（ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ；ｖｏｌ．２７６；２３０８−２３２３頁；２００９）において見出すことができる。
【００７３】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ナノ粒子凝集体の少なくともいくつかは、第１の粒子と同じタイプの第２の粒子、そして恐らくまたさらなる粒子を含む。従って、このようなナノ粒子凝集体は、多数のＯＰＮ分子に加えてカルシウムおよび／またはストロンチウムを含有する多数の粒子をそれぞれが含有する、より複雑な構造である。
【００７４】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、第１の粒子はリン酸カルシウムを含むか、あるいはリン酸カルシウムから本質的になる。例えば、第１の粒子は、第１の粒子の重量に対して少なくとも５０％（ｗ／ｗ）の全量のリン酸カルシウムを含み得る。第１の粒子は、例えば、第１の粒子の重量に対して少なくとも６０％（ｗ／ｗ）、例えば少なくとも７０％（ｗ／ｗ）、あるいは少なくとも８０％（ｗ／ｗ）などの全量のリン酸カルシウムを含み得る。あるいは、第１の粒子は、第１の粒子の重量に対して少なくとも９０％（ｗ／ｗ）の全量のリン酸カルシウムを含み得る。第１の粒子の残りの部分は、例えば、第１の粒子を調製するために使用されるカルシウムおよびリン酸の供給源からの不純物であり得る。
【００７５】
第１の粒子は、例えば、化学量論式：
Ａ’１０−ＸＡＸ（ＰＯ４）６−ＹＢＹ（ＯＨ）２−ｚＣｚ・（Ｈ２Ｏ）ｎ
を有することができ、式中、Ａ’はＣａ、Ｓｒおよびこれらの混合物からなる群から選択され、ＡはＬｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、Ｂｅ、Ｍｇ、Ｚｎ、Ｂａ、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｘ＝０〜９であり、Ｂは（ＣＯ３）、（ＳＯ４）、（ＨＳＯ４）、（ＨＰＯ４）、（Ｈ２ＰＯ４）、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｙ＝０〜５であり、ＣはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、（ＣＯ３）、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｚ＝０〜２であり、ｎ＝０〜１０であり、（ＰＯ４）と（ＨＰＯ４）の間のモル比は２．５よりも大きい。
【００７６】
本発明の別の態様は、化学量論式
Ａ’１０−ＸＡＸ（ＰＯ４）６−ＹＢＹ（ＯＨ）２−ｚＣｚ・ＯＰＮｍ・（Ｈ２Ｏ）ｎ
を有するナノ粒子凝集体に関し、式中、Ａ’はＣａ、Ｓｒおよびこれらの混合物からなる群から選択され、ＡはＬｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、Ｂｅ、Ｍｇ、Ｚｎ、Ｂａ、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｘ＝０〜９であり、Ｂは（ＣＯ３）、（ＳＯ４）、（ＨＳＯ４）、（ＨＰＯ４）、（Ｈ２ＰＯ４）、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｙ＝０〜５であり、ＣはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、（ＣＯ３）、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｚ＝０〜２であり、ｎ＝０〜１０であり、ｍ＞０であり、（ＰＯ４）と（ＨＰＯ４）の間のモル比は２．５よりも大きい。
【００７７】
本発明との関連では、「空孔」という用語は、鉱物における点欠陥の一種であると理解されるべきである。鉱物結晶は本質的に、「結晶性欠陥」と呼ばれることも多い不完全を有する。格子サイトの１つから原子が欠けている欠陥は、「空孔」欠陥として知られている。
【００７８】
一実施形態では、Ａ’はＣａである。
【００７９】
別の実施形態では、Ａ’はＳｒである。
【００８０】
さらに別の実施形態では、Ａ’はＣａおよびＳｒの混合物である。
【００８１】
一実施形態では、Ａは、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、Ｍｇ、Ｚｎ、Ｂａ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択される。
【００８２】
別の実施形態では、Ａは、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｚｎ、Ｂａ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択される。
【００８３】
また別の実施形態では、Ａは、Ｎａ、Ｋ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択される。
【００８４】
さらに別の実施形態では、Ｂは、（ＣＯ３）、（ＨＰＯ４）、（Ｈ２ＰＯ４）、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択される。
【００８５】
さらに別の実施形態では、Ｃは、Ｆ、Ｃｌ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択される。
【００８６】
一実施形態では、（ＰＯ４）と（ＨＰＯ４）の間のモル比は２．５よりも大きく、例えば、５よりも大きい、１０よりも大きい、１５よりも大きい、２０よりも大きい、２５よりも大きい、３０よりも大きい、３５よりも大きい、４０よりも大きい、４５よりも大きい、５０よりも大きい、１００よりも大きい、２００よりも大きい、３００よりも大きい、４００よりも大きい、５００よりも大きい、１０００よりも大きい、１０，０００よりも大きい、２０，０００よりも大きい、５０，０００よりも大きい、１００，０００よりも大きいなどである。
【００８７】
さらに別の実施形態では、Ａ’はＣａおよびＳｒの混合物であり、ＣａとＳｒの間の比率は１：１０００〜１０００：１の範囲内であり、例えば１：９００〜９００：１の範囲内（例えば、１：８５０または８５０：１）、例えば１：８００〜８００：１の範囲内（例えば、１：７５０または７５０：１）、例えば１：７００〜７００：１の範囲内（例えば、１：６５０または６５０：１）、例えば１：６００〜６００：１の範囲内（例えば、１：５５０または５５０：１）、例えば１：５００〜５００：１の範囲内（例えば、１：４５０または４５０：１）、例えば１：４００〜４００：１の範囲内（例えば、１：３５０または３５０：１）、例えば１：３００〜３００：１の範囲内（例えば、１：２５０または２５０：１）、例えば１：２００〜２００：１の範囲内（例えば、１：１５０または１５０：１）、例えば１：１００〜１００：１の範囲内（例えば、１：７５または７５：１）、例えば１：５０〜５０：１の範囲内（例えば、１：２５または２５：１）、例えば１：１５〜１５：１の範囲内（例えば、１：１０または１０：１）、例えば１：５〜５：１の範囲内（例えば、１：５または５：１）、例えば１：２．５〜２．５：１の範囲内（例えば、１：２．５または２．５：１、例えば、１：１）などである。
【００８８】
一実施形態では、Ｘは０〜９の範囲内であり、例えば、０〜８の範囲内、０〜７の範囲内、０〜６の範囲内、０〜５の範囲内、０〜４の範囲内、０〜３の範囲内、０〜２の範囲内、０〜１の範囲内などである。
【００８９】
別の実施形態では、Ｘは０〜９．５の範囲内であり、例えば、０．１〜９．０の範囲内（例えば、０．２）、例えば０．３〜８．５の範囲内（例えば、０．４）、例えば０．５〜８．０の範囲内（例えば、０．６）、例えば０．７〜７．５の範囲内（例えば、０．８）、例えば０．９〜７．０の範囲内（例えば、１．０）、例えば１．１〜６．５の範囲内（例えば、１．２）、例えば１．３〜６．０の範囲内（例えば、１．４）、例えば１．５〜５．５の範囲内（例えば、１．６）、例えば１．７〜５．０の範囲内（例えば、１．８）、例えば１．９〜４．５の範囲内（例えば、２．０）、例えば２．１〜４．０の範囲内（例えば、２．２）、例えば２．３〜３．５の範囲内（例えば、２．４）、例えば２．５〜３．５の範囲内（例えば、３．０）などである。
【００９０】
一実施形態では、Ｙは０〜５の範囲内であり、例えば、０〜４の範囲内、０〜３の範囲内、０〜２の範囲内、０〜１の範囲内などである。
【００９１】
別の実施形態では、Ｙは０〜４．５の範囲内であり、例えば、０．１〜４．０の範囲内（例えば、０．２）、例えば０．３〜４．０の範囲内（例えば、０．４）、例えば０．４〜４．０の範囲内（例えば、０．５）、例えば０．６〜４．０の範囲内（例えば、０．７）、例えば０．８〜４．０の範囲内（例えば、０．９）、例えば１．０〜３．５の範囲内（例えば、１．２）、例えば１．３〜３．５の範囲内（例えば、１．４）、例えば１．５〜３．５の範囲内（例えば、１．６）、例えば１．７〜３．５の範囲内（例えば、１．８）、例えば１．９〜３．５の範囲内（例えば、２．０）、例えば２．１〜３．０の範囲内（例えば、２．２）、例えば２．３〜３．０の範囲内（例えば、２．４）、例えば２．５〜３．０の範囲内などである。
【００９２】
一実施形態では、Ｚは０〜２の範囲内であり、例えば、０〜１の範囲内などである。
【００９３】
別の実施形態では、Ｚは０〜１．９の範囲内であり、例えば、０．１〜１．９の範囲内（例えば、０．２）、例えば０．３〜１．９の範囲内（例えば、０．４）、例えば０．５〜１．９の範囲内（例えば、０．６）、例えば０．７〜１．９の範囲内（例えば、０．８）、例えば０．９〜１．９の範囲内（例えば、１．０）、例えば１．０〜１．８の範囲内（例えば、１．１）、例えば１．２〜１．７の範囲内（例えば、１．３）、例えば１．４〜１．６の範囲内（例えば、１．５）などである。
【００９４】
一実施形態では、Ｂは、（ＣＯ３）、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択される。
【００９５】
別の実施形態では、Ａは、Ｎａ、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択される。
【００９６】
さらに別の実施形態では、Ｂは（ＣＯ３）、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、ＡはＮａ、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択される。
【００９７】
さらに別の実施形態では、Ｂは（ＣＯ３）、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、ＡはＫ、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択される。
【００９８】
一実施形態では、ｍは１＊１０−１０〜０．２５の範囲内であり、例えば、１＊１０−１０〜０．２０の範囲内、例えば１＊１０−１０〜０．１５の範囲内、例えば１＊１０−１０〜０．１０の範囲内、例えば１＊１０−１０〜０．０９の範囲内、例えば１＊１０−１０〜０．０８の範囲内、例えば１＊１０−１０〜０．０７の範囲内、例えば１＊１０−１０〜０．０６の範囲内、例えば１＊１０−１０〜０．０５の範囲内、例えば１＊１０−１０〜０．０４の範囲内、例えば１＊１０−１０〜０．０３の範囲内、例えば１＊１０−１０〜０．０２の範囲内、例えば１＊１０−１０〜０．０１の範囲内などである。
【００９９】
さらに別の実施形態では、ｍは１＊１０−１０〜０．３０の範囲内であり、例えば、１＊１０−９〜０．２０の範囲内、例えば１＊１０−８〜０．１５の範囲内、例えば１＊１０−７〜０．１０の範囲内、例えば１＊１０−６〜０．０９の範囲内、例えば１＊１０−５〜０．０８の範囲内、例えば１＊１０−４〜０．０７の範囲内、例えば０．００１〜０．０６の範囲内、例えば０．００２〜０．０５の範囲内、例えば０．００３〜０．０４の範囲内、例えば０．００５〜０．０３の範囲内、例えば０．００６〜０．０２の範囲内、例えば０．００７〜０．０１の範囲内などである。
【０１００】
また別の実施形態では、ｍは０．０００１６〜０．０１１の範囲内であり、例えば、０．０００１６〜０．００９、０．０００９〜０．００３５、０．００１８〜０．００３などである。
【０１０１】
別の実施形態では、ｎは０〜１００の範囲内であり、例えば、０．０１〜１００（例えば、０．０５）、例えば０．１〜９０の範囲内（例えば、０．２）、例えば０．３〜８５の範囲内（例えば、０．４）、例えば０．５〜８０の範囲内（例えば、０．６）、例えば０．７〜７５の範囲内（例えば、０．８）、例えば０．９〜７０の範囲内（例えば、１．０）、例えば１．２〜６５の範囲内（例えば、１．４）、例えば１．６〜６０の範囲内（例えば、１．８）、例えば２．０〜５５の範囲内（例えば、２．２）、例えば２．４〜５０の範囲内（例えば、２．４）、例えば２．６〜４５の範囲内（例えば、２．８）、例えば３．０〜４０の範囲内（例えば、３．２）、例えば３．４〜３５の範囲内（例えば、３．６）、例えば３．８〜３０の範囲内（例えば、４．０）、例えば４．２〜２５の範囲内（例えば、４．４）、例えば４．６〜２０の範囲内（例えば、４．８）、例えば５．０〜１５の範囲内（例えば、５．２）、例えば５．４〜１４の範囲内（例えば、５．６）、例えば５．８〜１３の範囲内（例えば、６．０）、例えば６．２〜１２の範囲内（例えば、６．４）、例えば６．６〜１１の範囲内（例えば、６．８）、例えば７．０〜１０の範囲内（例えば、７．２）、例えば７．４〜９の範囲内（例えば、７．６）、例えば７．８〜８．８の範囲内（例えば、８．０）などである。
【０１０２】
本発明のさらに別の態様は、薬剤として使用するための、化学量論式
Ａ’１０−ＸＡＸ（ＰＯ４）６−ＹＢＹ（ＯＨ）２−ｚＣｚ・ＯＰＮｍ・（Ｈ２Ｏ）ｎ
を有するナノ粒子凝集体に関し、式中、Ａ’はＣａ、Ｓｒおよびこれらの混合物からなる群から選択され、ＡはＬｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、Ｂｅ、Ｍｇ、Ｚｎ、Ｂａ、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｘ＝０〜９であり、Ｂは（ＣＯ３）、（ＳＯ４）、（ＨＳＯ４）、（ＨＰＯ４）、（Ｈ２ＰＯ４）、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｙ＝０〜５であり、ＣはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、（ＣＯ３）、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｚ＝０〜２であり、ｎ＝０〜１０であり、ｍ＞０であり、（ＰＯ４）と（ＨＰＯ４）の間のモル比は２．５よりも大きい。
【０１０３】
本発明のさらに別の態様は、細菌感染症を治療、軽減または防止するための薬剤として使用するための、化学量論式
Ａ’１０−ＸＡＸ（ＰＯ４）６−ＹＢＹ（ＯＨ）２−ｚＣｚ・ＯＰＮｍ・（Ｈ２Ｏ）ｎ
を有するナノ粒子凝集体に関し、式中、Ａ’はＣａ、Ｓｒおよびこれらの混合物からなる群から選択され、ＡはＬｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、Ｂｅ、Ｍｇ、Ｚｎ、Ｂａ、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｘ＝０〜９であり、Ｂは（ＣＯ３）、（ＳＯ４）、（ＨＳＯ４）、（ＨＰＯ４）、（Ｈ２ＰＯ４）、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｙ＝０〜５であり、ＣはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、（ＣＯ３）、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｚ＝０〜２であり、ｎ＝０〜１０であり、ｍ＞０であり、（ＰＯ４）と（ＨＰＯ４）の間のモル比は２．５よりも大きい。
【０１０４】
一実施形態では、Ａは、Ｚｎ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択される。
【０１０５】
別の実施形態では、Ｂは、（ＣＯ３）、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択される。
【０１０６】
さらに別の実施形態では、Ｃは、Ｆ、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択される。
【０１０７】
さらに別の実施形態では、Ａは、Ｎａ、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｘ＝０〜９であり、Ｂは（ＣＯ３）であり、Ｙ＝０〜５であり、ＣはＨ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｚ＝０〜２であり、ｎ＝０〜１０であり、ｍ＞０である。
【０１０８】
一実施形態では、Ａは、Ｎａ、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｘ＝０〜２であり、Ｂは（ＣＯ３）であり、Ｙ＝０〜１であり、ＣはＨ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｚ＝０〜２であり、ｎ＝０〜１０であり、ｍ＞０である。
【０１０９】
一実施形態では、Ａは、Ｎａ、Ｚｎ、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｘ＝０〜９であり、Ｂは、（ＣＯ３）、（ＨＰＯ４）、（Ｈ２ＰＯ４）、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｙ＝０〜５であり、Ｃは、Ｆ、（ＣＯ３）、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｚ＝０〜２であり、ｎ＝０〜１０であり、ｍ＞０であり、（ＰＯ４）と（ＨＰＯ４）の間のモル比は２．５よりも大きい。
【０１１０】
別の実施形態では、ナノ粒子凝集体はアモルファスである。第１の粒子は、例えば、実質的にアモルファスであり得る。
【０１１１】
あるいは、第１の粒子は実質的に結晶性であり得る。
【０１１２】
さらに別の実施形態では、ナノ粒子凝集体は、ヒドロキシルアパタイトのＸ線回折パターンと一致する結晶性材料を含有する。
【０１１３】
本発明との関連では、「ナノ結晶性」という用語は、ナノ結晶の少なくとも１つの寸法が１００ｎｍよりも小さい結晶性材料であると理解されるべきである。
【０１１４】
また別の実施形態では、ナノ粒子凝集体は、ヒドロキシルアパタイトのＸ線回折パターンと一致する結晶性材料を含有し、前記結晶性材料はナノ結晶である。
【０１１５】
一実施形態では、ナノ粒子凝集体は、ヒドロキシルアパタイトのＸ線回折パターンと一致する結晶性材料を含有し、前記結晶性材料はナノ結晶であり、前記ナノ結晶は、結晶学的なｃ軸が結晶子の形態学的な最大軸と一致する異方性結晶子サイズを有する。
【０１１６】
別の実施形態では、ナノ粒子凝集体は、ヒドロキシルアパタイトのＸ線回折パターンと一致する結晶性材料を含有し、前記結晶性材料は、ナノ結晶の少なくとも１つの寸法が９０ｎｍよりも小さく、例えば、８０ｎｍよりも小さい、例えば７０ｎｍよりも小さい、例えば６０ｎｍよりも小さい、例えば５０ｎｍよりも小さい、例えば４０ｎｍよりも小さい、例えば３０ｎｍよりも小さい、例えば２０ｎｍよりも小さい、例えば１０ｎｍよりも小さいなどという意味で、ナノ結晶である。
【０１１７】
本発明者らは、本発明のナノ粒子凝集体が、１つまたは複数の種のＯＰＮ結合細菌を含有するバイオフィルムを防止または不安定化するために特に適切であるという徴候を見た。
【０１１８】
本発明のいくつかの実施形態では、バイオフィルムは、細胞１個当たり少なくとも５０個のＯＰＮ分子のＯＰＮ結合能力を有する細菌を含有する。例えば、バイオフィルムは、細胞１個当たり少なくとも１００個のＯＰＮ分子のＯＰＮ結合能力を有する細菌を含有し得る。バイオフィルムは、例えば、細胞１個当たり少なくとも２００個のＯＰＮ分子のＯＰＮ結合能力を有する細菌を含有し得る。あるいは、バイオフィルムは、細胞１個当たり少なくとも４００個のＯＰＮ分子のＯＰＮ結合能力を有する細菌を含有し得る。
【０１１９】
菌種のＯＰＮ結合能力は、牛乳から単離された全長ＯＰＮを用いて、Ｒｙｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８４，３３１−３３６（１９８９）に従って測定される。
【０１２０】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、バイオフィルムは、細胞１個当たり少なくとも８００個のＯＰＮ分子のＯＰＮ結合能力を有する細菌を含有する。例えば、バイオフィルムは、細胞１個当たり少なくとも２，０００個のＯＰＮ分子のＯＰＮ結合能力を有する細菌を含有し得る。バイオフィルムは、例えば、細胞１個当たり少なくとも１０，０００個のＯＰＮ分子のＯＰＮ結合能力を有する細菌を含有し得る。あるいは、バイオフィルムは、細胞１個当たり少なくとも５０，０００個のＯＰＮ分子、例えば、細胞１個当たり少なくとも１００，０００個のＯＰＮ分子、あるいは細胞１個当たり少なくとも５００，０００個のＯＰＮ分子などのＯＰＮ結合能力を有する細菌を含有し得る。
【０１２１】
バイオフィルムは、例えば、細胞１個当たり少なくとも１，０００，０００個のＯＰＮ分子のＯＰＮ結合能力を有する細菌を含有し得る。
【０１２２】
例えば、バイオフィルムは、ストレプトコッカス種、スタフィロコッカス種、シュードモナス種  アクチノミセス種、ラクトバチルス種、アグリゲイティバクター種、バクテロイデス種、リステリア種、カンピロバクター種、エイケネラ種、ポルフィロモナス種、プレボテーラ種、トレポネーマ種、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数の細菌を含有するか、あるいはこれらからなることができる。
【０１２３】
歯肉炎の場合、バイオフィルムは、通常、細菌アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）、バクテロイデス・フォルシサス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｏｒｓｙｔｈｕｓ）、カンピロバクター・レクタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｒｅｃｔｕｓ）、エイケネラ・コローデンス（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ  ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、プレボテラ・ニグレセンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ）、および／またはトレポネーマ・デンチコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）の１つまたは複数を含有する。
【０１２４】
う歯の場合、バイオフィルムは、通常、細菌ストレプトコッカス・オラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ドウネイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｏｗｎｅｉ）、ストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ）、ストレプトコッカス・サングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）およびアクチノミセス・ネスルンディ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）の１つまたは複数を含有する。
【０１２５】
バイオフィルムはさらに、ＯＰＮ結合細菌に加えて、ＯＰＮへの結合がないかまたは少ない細菌を含有し得る。
【０１２６】
１つの態様は、ストレプトコッカス種および／またはアクチノミセス種によって形成される細菌バイオフィルムを低減または防止するための、ＯＰＮおよびリン酸カルシウムを含むナノ粒子凝集体の使用に関する。
【０１２７】
本発明の別の態様は、ストレプトコッカス種および／またはアクチノミセス種によって形成される細菌バイオフィルムを低減または防止するための、ＯＰＮおよびリン酸ストロンチウム／カルシウムを含むナノ粒子凝集体の使用に関する。
【０１２８】
さらに別の態様は、ストレプトコッカス種および／またはアクチノミセス種によって形成される細菌バイオフィルムを低減または防止するための、ＯＰＮおよびリン酸ストロンチウムを含むナノ粒子凝集体の使用に関する。
【０１２９】
また別の態様は、ストレプトコッカス種および／またはアクチノミセス種によって形成される細菌バイオフィルムを低減または防止するための、ＯＰＮと、リン酸ストロンチウムおよびリン酸カルシウムの混合物とを含むナノ粒子凝集体の使用に関する。
【０１３０】
別の態様は、ストレプトコッカス種および／またはアクチノミセス種によって形成される細菌バイオフィルムを低減または防止するための、ａ）ＯＰＮと、ｂ）リン酸ストロンチウム、リン酸カルシウムおよびこれらの混合物とを含むナノ粒子凝集体の使用に関する。
【０１３１】
また別の態様は、ストレプトコッカス種および／またはアクチノミセス種の細菌接着を低減または防止するための、ＯＰＮおよびリン酸カルシウムを含むナノ粒子凝集体の使用に関する。
【０１３２】
歯の手入れに関連して、歯のバイオフィルム（歯垢）の形成、細菌産物による歯の染色、歯石（タータ）の形成、う歯、根管感染症および歯周病などの、美容的にも治療的にも多くの問題が生じる。
【０１３３】
歯垢は、口腔内の硬組織（歯）に蓄積する複雑なバイオフィルムである。歯のバイオフィルムは５００を超える細菌種を保有するが、コロニー形成は組織化されたパターンに従い、最初の生着菌がエナメル質の唾液ペリクルに接着した後、細菌の共接着による二次的なコロニー形成が起こる。様々なストレプトコッカス種およびアクチノミセス種が初期の生着菌に属することはよく知られている。従って、これらの細菌の接着およびそれに続くバイオフィルム形成を制御することが重要である。様々なアドヘシンおよびレセプタが、唾液がコートされた表面への細菌接着、細菌の共凝集、細菌−マトリックス相互作用に関わり、バイオフィルムの発生に寄与し、そして最終的にはう蝕、歯内感染症および歯周病などの疾患の一因となる。
【０１３４】
１つの態様は、口腔バイオフィルムの増殖を低減または防止するための、ＯＰＮおよびリン酸カルシウムを含むナノ粒子凝集体の使用に関する。
【０１３５】
口腔バイオフィルムを処置、防止または低減するために使用される場合、ナノ粒子凝集体は経口投与されるのが好ましい。ナノ粒子凝集体は経口投与に適した製剤中に存在することがさらに好ましい。
【０１３６】
本発明の別の態様は、口腔バイオフィルムの増殖を低減または防止するための、ＯＰＮおよびリン酸ストロンチウム／カルシウムを含むナノ粒子凝集体の使用に関する。
【０１３７】
さらに別の態様は、口腔バイオフィルムの増殖を低減または防止するための、ＯＰＮおよびリン酸ストロンチウムを含むナノ粒子凝集体の使用に関する。
【０１３８】
また別の態様は、口腔バイオフィルムの増殖を低減または防止するための、ＯＰＮと、リン酸ストロンチウムおよびリン酸カルシウムの混合物とを含むナノ粒子凝集体の使用に関する。
【０１３９】
別の態様は、口腔バイオフィルムの増殖を低減または防止するための、ａ）ＯＰＮと、ｂ）リン酸ストロンチウム、リン酸カルシウムおよびこれらの混合物とを含むナノ粒子凝集体の使用に関する。
【０１４０】
さらに別の態様は、口腔バイオフィルムの接着を低減または防止するための、ａ）ＯＰＮと、ｂ）リン酸ストロンチウム、リン酸カルシウムおよびこれらの混合物とを含むナノ粒子凝集体の使用に関する。
【０１４１】
一実施形態では、ＯＰＮおよびリン酸カルシウムを含むナノ粒子凝集体は、化学量論式
Ａ’１０−ＸＡＸ（ＰＯ４）６−ＹＢＹ（ＯＨ）２−ｚＣｚ・ＯＰＮｍ・（Ｈ２Ｏ）ｎ
を有し、式中、Ａ’はＣａ、Ｓｒおよびこれらの混合物からなる群から選択され、ＡはＬｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、Ｂｅ、Ｍｇ、Ｚｎ、Ｂａ、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｘ＝０〜９であり、Ｂは（ＣＯ３）、（ＳＯ４）、（ＨＳＯ４）、（ＨＰＯ４）、（Ｈ２ＰＯ４）、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｙ＝０〜５であり、ＣはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、（ＣＯ３）、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｚ＝０〜２であり、ｎ＝０〜１０であり、ｍ＞０であり、（ＰＯ４）と（ＨＰＯ４）の間のモル比は２．５よりも大きい。
【０１４２】
本発明の別の態様は、本明細書において定義されるナノ粒子凝集体を被験者に投与することによって、動物またはヒト被験者のバイオフィルム関連疾患を治療、軽減および／または防止する方法に関する。
【０１４３】
本発明の態様は、口臭を低減、除去および／または防止するための、本明細書において定義されるナノ粒子凝集体の使用に関する。
【０１４４】
本発明のさらなる態様は、本明細書において定義されるナノ粒子凝集体を被験者に投与することによって、動物またはヒト被験者（の中または上）における微生物バイオフィルムの増殖を低減または防止する方法に関する。
【０１４５】
上記のように、処置、低減または防止すべきバイオフィルムは、例えば、口腔バイオフィルムであり得る。この場合、ナノ粒子凝集体の経口投与が好ましい。
【０１４６】
動物被験者は、例えば、飼われた哺乳類、飼われた魚または飼われた鳥などの家畜であり得る。
【０１４７】
本発明のさらなる態様は、本明細書において定義されるナノ粒子凝集体を被験者に投与することによって、動物またはヒト被験者の口臭を低減、除去および／または防止する方法に関する。ナノ粒子凝集体は、好ましくは、経口投与される。
【０１４８】
また本発明の態様は、微生物バイオフィルムの増殖を低減または防止するための、ａ）ＯＰＮと、ｂ）カルシウムおよび／またはストロンチウムを含む第１の粒子とを含むナノ粒子凝集体の使用に関する。本発明のいくつかの実施形態では、この使用は、治療によるヒトまたは動物の体の処置ではないことが要求される。
【０１４９】
バイオフィルムは、理論的には、本明細書において言及されるバイオフィルムのいずれであってもよく、例えば、以下の細菌：ストレプトコッカス種、スタフィロコッカス種、シュードモナス種  アクチノミセス種、ラクトバチルス種、アグリゲイティバクター種、バクテロイデス種、リステリア種、カンピロバクター種、エイケネラ種、ポルフィロモナス種、プレボテーラ種、トレポネーマ種の１つまたは複数を含有し得る。
【０１５０】
しかしながら、本発明のいくつかの実施形態では、上記の使用は、治療によるヒトまたは動物の体の処置ではない。バイオフィルムは、例えば、生きているヒトまたは生きている動物と接触しないバイオフィルムであり得る。
【０１５１】
本発明のさらに別の態様は、本明細書において定義されるナノ粒子凝集体を含む歯科用製剤に関する。
【０１５２】
歯科用製剤は、例えば、化学量論式
Ａ’１０−ＸＡＸ（ＰＯ４）６−ＹＢＹ（ＯＨ）２−ｚＣｚ・ＯＰＮｍ・（Ｈ２Ｏ）ｎ
を有するナノ粒子凝集体を含むことができ、式中、Ａ’はＣａ、Ｓｒおよびこれらの混合物からなる群から選択され、ＡはＬｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、Ｂｅ、Ｍｇ、Ｚｎ、Ｂａ、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｘ＝０〜９であり、Ｂは（ＣＯ３）、（ＳＯ４）、（ＨＳＯ４）、（ＨＰＯ４）、（Ｈ２ＰＯ４）、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｙ＝０〜５であり、ＣはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、（ＣＯ３）、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｚ＝０〜２であり、ｎ＝０〜１０であり、ｍ＞０であり、（ＰＯ４）と（ＨＰＯ４）の間のモル比は２．５よりも大きい。
【０１５３】
歯科用製剤は、例えば、歯磨き粉、歯磨きジェル、歯磨きバーニッシュ（ｔｏｏｔｈ  ｖａｒｎｉｓｈ）、歯科用マウスウォッシュ、マウススプレーまたはチューインガムなどの、口腔衛生に関連する任意の歯磨剤または関連製品であり得る。
【０１５４】
一実施形態では、歯科用製剤は、歯磨きペースト、歯磨き粉、歯磨きジェル、歯磨きバーニッシュ、歯科用マウスウォッシュ、マウススプレーまたはチューインガムの形態である。
【０１５５】
国際公開第２００５／０５３，６２８号パンフレットに開示されるように、オステオポンチンの量は、通常は、歯科用製剤１ｋｇ当たり約５０ｍｇのＯＰＮ〜約１５００ｍｇのオステオポンチンの間であるが、より少量でも効果を有するであろう。より多くの量を使用することができるが、効果は本質的に増大しないであろう。有用な量は１００〜１０００ｍｇのＯＰＮ／ｋｇであり、好ましくは２００〜５００ｍｇ、最も好ましくは約３５０ｍｇである。量がより多くても恐らくより良い結果を与えることはなく、従って、ＯＰＮはかなり高価な成分であるために推奨されない。驚くことに、本発明の発明者らによって、ＯＰＮおよびリン酸カルシウムを含むナノ粒子凝集体は、微生物バイオフィルムの増殖の低減または防止において相乗効果を有することが示された。従って、本発明は、歯科用製剤１ｋｇ当たりのオステオポンチンの有効量を減少させる。
【０１５６】
本発明との関連では、「口腔バイオフィルムの増殖」という用語は、口腔内の硬組織および軟組織（口腔粘膜、舌、歯の表面）におけるバイオフィルムの増殖と、口腔に挿入された材料（インプラント、歯科矯正用ブラケット、ならびに充填材、クラウンおよび義歯などの修復材料）上のバイオフィルムの増殖とを意味する。
【０１５７】
本発明の好ましい組成物は、既に記載したように、歯磨きペースト、歯磨きバーニッシュ、歯磨きジェルおよび歯磨き粉の形態である。このような歯磨きペーストおよび歯磨きジェルの成分には、以下の：歯科用研磨剤（約１０％〜約５０％）、界面活性剤（約０．５％〜約１０％）、増粘剤（約０．０４％〜約０．５％）、湿潤剤（約０．１％〜約３％）、香味剤（約０．０４％〜約２％）、甘味剤（０．１％〜約３％）、着色剤（約０．０１％〜約０．５％）および水（２％〜４５％）の１つまたは複数が含まれる。
【０１５８】
他に記載されない限り、本発明の組成物または製品の一部を形成する成分の割合は、組成物または製品の全重量に対する重量パーセントである。
【０１５９】
う蝕制御剤は、０．００１％〜約１％の、ＯＰＮおよびリン酸カルシウムを含むナノ粒子凝集体を含有し得る。抗歯石剤は、約０．１％〜約１３％の、ＯＰＮおよびリン酸カルシウムを含むナノ粒子凝集体を含有する。
【０１６０】
歯磨き粉は、当然ながら、実質的に全ての液体成分を含まない。
【０１６１】
本発明の他の好ましい組成物は、マウススプレーを含む歯科用マウスウォッシュである。このようなマウスウォッシュおよびマウススプレーの成分には、通常、以下の：水（約４５％〜約９５％）、エタノール（約０％〜約２５％）、湿潤剤（約０％〜約５０％）、界面活性剤（約０．０１％〜約７％）、香味剤（約０．０４％〜約２％）、甘味剤（約０．１％〜約３％）、および着色剤（約０．００１％〜約０．５％）、ＯＰＮおよびリン酸カルシウムを含むナノ粒子凝集体を含む抗う蝕剤（約０．００１％〜１％）ならびに抗歯石剤（約０．１％〜約１３％）の１つまたは複数が含まれる。
【０１６２】
第３の適用領域は、一般論として種々の組成のチューインガム製剤である。
【０１６３】
ストロンチウム（Ｓｒ）は骨形成を促進することが報告されており、骨粗鬆症の処置として認められている。
【０１６４】
さらに別の態様は、本明細書において定義されるナノ粒子凝集体を含むコーティング組成物に関する。
【０１６５】
コーティング組成物は、例えば、化学量論式
Ａ’１０−ＸＡＸ（ＰＯ４）６−ＹＢＹ（ＯＨ）２−ｚＣｚ・ＯＰＮｍ・（Ｈ２Ｏ）ｎ
を有するナノ粒子凝集体を含有することができ、式中、Ａ’はＣａ、Ｓｒおよびこれらの混合物からなる群から選択され、ＡはＬｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、Ｂｅ、Ｍｇ、Ｚｎ、Ｂａ、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｘ＝０〜９であり、Ｂは（ＣＯ３）、（ＳＯ４）、（ＨＳＯ４）、（ＨＰＯ４）、（Ｈ２ＰＯ４）、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｙ＝０〜５であり、ＣはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、（ＣＯ３）、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｚ＝０〜２であり、ｎ＝０〜１０であり、ｍ＞０であり、（ＰＯ４）と（ＨＰＯ４）の間のモル比は２．５よりも大きい。
【０１６６】
コーティング組成物は、例えば、ＯＰＮおよびリン酸カルシウムを含むナノ粒子凝集体を含み得る。
【０１６７】
コーティング組成物は、骨疾患、骨折またはインプラントに関連して使用され得る。
【０１６８】
１つの態様は、本発明に従うコーティング組成物の、医療機器をコートするための使用に関する。
【０１６９】
別の態様は、本明細書において定義されるナノ粒子凝集体を含む食品または飲料製品に関する。
【０１７０】
食品または飲料製品は、例えば、化学量論式
Ａ’１０−ＸＡＸ（ＰＯ４）６−ＹＢＹ（ＯＨ）２−ｚＣｚ・ＯＰＮｍ・（Ｈ２Ｏ）ｎ
を有するナノ粒子凝集体を含むことができ、式中、Ａ’はＣａ、Ｓｒおよびこれらの混合物からなる群から選択され、ＡはＬｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、Ｂｅ、Ｍｇ、Ｚｎ、Ｂａ、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｘ＝０〜９であり、Ｂは（ＣＯ３）、（ＳＯ４）、（ＨＳＯ４）、（ＨＰＯ４）、（Ｈ２ＰＯ４）、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｙ＝０〜５であり、ＣはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、（ＣＯ３）、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｚ＝０〜２であり、ｎ＝０〜１０であり、ｍ＞０であり、（ＰＯ４）と（ＨＰＯ４）の間のモル比は２．５よりも大きい。
【０１７１】
本発明の目的は、表面におけるバイオフィルムの低減を改善することである。
【０１７２】
１つの態様はバルク部分および表面領域を含む製品に関し、前記表面領域の少なくとも第１の部分に第１の表面領域コーティングがコートされ、前記第１の表面領域コーティングは本明細書において定義されるナノ粒子凝集体を含む。
【０１７３】
第１の表面領域コーティングは、例えば、化学量論式
Ａ’１０−ＸＡＸ（ＰＯ４）６−ＹＢＹ（ＯＨ）２−ｚＣｚ・ＯＰＮｍ・（Ｈ２Ｏ）ｎ
を有するナノ粒子凝集体を含むことができ、式中、Ａ’はＣａ、Ｓｒおよびこれらの混合物からなる群から選択され、ＡはＬｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、Ｂｅ、Ｍｇ、Ｚｎ、Ｂａ、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｘ＝０〜９であり、Ｂは（ＣＯ３）、（ＳＯ４）、（ＨＳＯ４）、（ＨＰＯ４）、（Ｈ２ＰＯ４）、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｙ＝０〜５であり、ＣはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、（ＣＯ３）、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｚ＝０〜２であり、ｎ＝０〜１０であり、ｍ＞０であり、（ＰＯ４）と（ＨＰＯ４）の間のモル比は２．５よりも大きい。
【０１７４】
一実施形態では、表面領域は、金属、金属酸化物、無機材料、有機材料、およびポリマーからなる群から選択される材料を含む。
【０１７５】
別の実施形態では、表面領域は正に帯電されている。
【０１７６】
さらに別の実施形態では、表面領域は負に帯電されている。
【０１７７】
また別の実施形態では、表面領域は帯電されていない。
【０１７８】
本発明との関連では、「抗バイオフィルム剤」という用語は、微生物の表面への接着を防止および／または低減する、かつ／あるいは微生物バイオフィルム形成を防止および／または低減する、かつ／あるいは微生物バイオフィルムを破壊および／または不安定化する薬剤であると理解されるべきである。
【０１７９】
本発明の１つの態様は、ａ）ＯＰＮと、ｂ）カルシウムおよび／またはストロンチウムを含む第１の粒子とを含む抗バイオフィルム剤に関する。
【０１８０】
抗バイオフィルム剤は、例えば、ａ）ＯＰＮと、ｂ）リン酸ストロンチウム、リン酸カルシウムまたはこれらの混合物とを含むナノ粒子凝集体を含み得る。
【０１８１】
抗バイオフィルム剤は、例えば、化学量論式
Ａ’１０−ＸＡＸ（ＰＯ４）６−ＹＢＹ（ＯＨ）２−ｚＣｚ・ＯＰＮｍ・（Ｈ２Ｏ）ｎ
を有するナノ粒子凝集体を含むことができ、式中、Ａ’はＣａ、Ｓｒおよびこれらの混合物からなる群から選択され、ＡはＬｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、Ｂｅ、Ｍｇ、Ｚｎ、Ｂａ、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｘ＝０〜９であり、Ｂは（ＣＯ３）、（ＳＯ４）、（ＨＳＯ４）、（ＨＰＯ４）、（Ｈ２ＰＯ４）、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｙ＝０〜５であり、ＣはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、（ＣＯ３）、Ｈ２Ｏ、空孔およびこれらの混合物からなる群から選択され、Ｚ＝０〜２であり、ｎ＝０〜１０であり、ｍ＞０であり、（ＰＯ４）と（ＨＰＯ４）の間のモル比は２．５よりも大きい。
【０１８２】
本発明の別の態様は、ＯＰＮおよびリン酸カルシウムによって形成されるナノ粒子凝集体を製造するための方法に関し、本方法は、
ａ）ＰＯ４３−としてリン酸塩を含む第１の水溶液（ｐＨは６〜１４の範囲内である）を提供するステップと、
ｂ）Ｃａ２＋および／またはＳｒ２＋を含む第２の水溶液（ｐＨは６〜１４の範囲内である）を提供するステップと、
ｃ）前記第１および第２の溶液を混合し、それにより、１）ＯＰＮと、２）リン酸ストロンチウム、リン酸カルシウムまたはこれらの混合物と、３）水溶性電解質とを含むナノ粒子凝集体を含む懸濁液を形成するステップと、
ｄ）場合により、相当な量の前記水溶性電解質を懸濁液から除去するステップと、
ｅ）場合により、前記ナノ粒子凝集体を水相から分離するステップと
を含み、ここで、第１の水溶液、第２の水溶液またはその両方の水溶液はＯＰＮを含む。
【０１８３】
本発明との関連では、「水溶液」という用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む液体物質であると理解されるべきである。
【０１８４】
本発明との関連では、「懸濁液」という用語は、沈降するために十分に大きい固体粒子を含有する不均一な流体であると理解されるべきである。
【０１８５】
本発明との関連では、「電解質」という用語は、物質を導電性にする自由イオンを含有する物質であると理解されるべきである。本発明において、電解質は水中に溶解しなければならない。
【０１８６】
一実施形態では、懸濁液の水相のｐＨは７よりも高く（例えば、７．４〜１４．０の範囲内など）、例えば７．６よりも高く（例えば、７．８〜１３．５の範囲内など）、例えば８．０よりも高く（例えば、８．５〜１３．０の範囲内など）、例えば９．０よりも高く（例えば、９．５〜１２．５の範囲内など）、例えば１０．０よりも高く（例えば、１０．５〜１２．０の範囲内など）、例えば１１．０よりも高い。
【０１８７】
一実施形態では、プロセスはさらにステップｄ）を含む。
【０１８８】
別の実施形態では、プロセスはさらにステップｄ）を含み、分離は透析によって実施される。
【０１８９】
本発明との関連では、「透析」という用語は、半透膜の細孔を通るこれらの拡散速度が同じでないことを用いた、小さい寸法を有する溶解イオンまたは分子（晶質）からの懸濁コロイド粒子の分離であると理解されるべきである。
【０１９０】
一実施形態では、プロセスはさらにステップｅ）を含む。
【０１９１】
別の実施形態では、第１および第２の水溶液中のオステオポンチンの全濃度は、２．５ｍｇ／ｍｌよりも高く（例えば、３〜１０００ｍｇ／ｍｌの範囲内など）、例えば５ｍｇ／ｍｌよりも高く（例えば、１０〜５００ｍｇ／ｍｌの範囲内など）、例えば１２ｍｇ／ｍｌよりも高く（例えば、１５〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲内など）、例えば１８ｍｇ／ｍｌよりも高く（例えば、２０〜５０ｍｇ／ｍｌの範囲内など）、例えば２５ｍｇ／ｍｌよりも高く（例えば、３０〜４５ｍｇ／ｍｌの範囲内など）、例えば３５ｍｇ／ｍｌよりも高い。
【０１９２】
一実施形態では、プロセスはさらに、ステップｆ）得られたナノ粒子凝集体を滅菌するステップを含む。
【０１９３】
別の実施形態では、プロセスはさらにステップｆ）を含み、滅菌ステップは加熱によって実施される。
【０１９４】
さらに別の実施形態では、プロセスはさらにステップｆ）を含み、滅菌ステップは、８０℃まで加熱し、このレベルの温度を１時間以上保持することによって実施される。
【０１９５】
本発明者らは、約３３ｗｔ％の乾燥質量（すなわち、２００℃での乾燥によって得られる質量を指す）のオステオポンチン濃度の上限が存在することを見出しており、オステオポンチンはナノ粒子凝集体中にそれ以上含まれないと思われる。これは、ＯＰＮの添加量が約２０ｍｇ／ｌであるときに起こる。従って、一実施形態では、第１および第２の水溶液中のオステオポンチンの全濃度は２．５〜３５ｍｇ／ｍｌの範囲内である。しかしながら、この限界は、異なる水溶性電解質の濃度に応じて変化し得る。
【０１９６】
一実施形態では、オステオポンチンは第１の水溶液中にのみ存在する。
【０１９７】
別の実施形態では、オステオポンチンは第２の水溶液中にのみ存在する。
【０１９８】
さらに別の実施形態では、オステオポンチンは、第１および第２の水溶液の両方に存在する。
【０１９９】
一実施形態では、ステップｃ）は、５〜８０セ氏温度の範囲内、例えば、１０〜５０℃の範囲内、例えば２０〜４０℃の範囲内、例えば２２〜２８℃の範囲内などの温度で実施される。
【０２００】
一実施形態では、第１、第２または両方の水溶液は、Ｃａ／Ｓｒ結合蛍光色素を含む。溶液中の付加的なＣａ／Ｓｒ結合色素は、蛍光（蛍光色素の場合）または着色ナノ粒子凝集体をもたらすであろう。
【０２０１】
本発明の態様の１つに関連して記載された実施形態および特徴は、本発明の他の態様にも当てはまることに注目すべきである。
【０２０２】
本出願において引用される全ての特許および非特許参考文献は、参照によってその全体が本明細書に援用される。
【０２０３】
本発明は、以下の非限定的な実施例においてこれからさらに詳細に説明されるであろう。
【実施例】
【０２０４】
実施例１：ナノ粒子凝集体の合成
ナノ粒子凝集体の合成のために、以下の方法を使用した。
１）３つの水溶液を等体積で調製した。１つは０．３６ＭのＮａ３ＰＯ４（０．３６ＭのＮａＨ２ＰＯ４および０．７２ＭのＮａＯＨである溶液を作ることによって便利に作製した）を含有し、２つ目は０．６ＭのＣａＣｌ２を含有し、３つ目は所望の最終量の３倍のＯＰＮを含有した。
２）ＣａＣｌ２およびＯＰＮ溶液をまず混合し、次にＮａ３ＰＯ４溶液を添加した。この混合により、濁ったゲル様懸濁液が生じた。ゲル様構造は、マグネットスターラー上での攪拌下で分解した。特注設計の温度制御水浴を用いて溶液を２５℃で２４時間攪拌した。
３）２４時間後、溶液を透析袋に移し、過剰なＮａＣｌを除去した。マグネティックスターラーによりゆっくり攪拌させた溶液体積の１００倍の水を含有するリザーバー内で透析を２４時間実行した。１２時間の透析の後にリザーバーの水を取り換えた。
４）透析の後、ナノ粒子凝集体を４８００ｒｐｍで遠心分離し、水で２回洗浄した。
５）洗浄の後、分析の前にナノ粒子凝集体を６０℃で乾燥させた。
【０２０５】
以下で議論される結果は２５℃における反応（上記のステップ２）によって得られたが、より高いおよびより低い他の温度でも同等にうまく反応を実施することができる。温度を上昇させると反応が速くなる。リン酸源としてＫ３ＰＯ４を用いる合成も実行した。反応は、より低い（より高い）濃度の試薬を用いて完了させることもでき、その結果、より少ない（より高い）収量になる。
【０２０６】
異なる量のＯＰＮを含むサンプルを作った。０、０．００１、０．００２５、０．０１、０．０２５、０．１、０．２５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１２．５、１５．０、２０．０、２５．０、３０．０および３４．０ｍｇ／ｍＬを含有するサンプルを合成した（全部で１７の異なる濃度）。
【０２０７】
透析リザーバーの液体がｐＨおよび０．９ｗｔ％のＮａＣｌ有する点を変更して上記のように、バイオフィルム実験のためのナノ粒子凝集体を１２．５ｍｇ／ｍｌのＯＰＮの添加量を用いて合成した。２４時間の透析の後、閉鎖容器内の懸濁液を８０℃で１時間加熱することによって、得られた懸濁液を滅菌した。バイオフィルム実験のためのナノ粒子凝集体の作製では、上記のステップ４）および５）を省略した。
【０２０８】
ＸＲＤ、ＦＴＩＲおよびＴＧＡによってナノ粒子凝集体を特徴づけた。ＸＲＤおよびＦＴＩＲ測定のために、測定の前に乾燥粒子を粉砕して微細粉末にした。ＸＲＤは、Ｒｉｇａｋｕ  ＳｍａｒｔＬａｂにおいてＢｒａｇｇ−Ｂｒｅｎｔａｎｏセットアップを用いて測定した。測定のためのパラメータは、６〜１２０°２θ、ステップサイズ０．０２、４°／分であった。２回のスキャンを実施し、各サンプルの平均をとった。図９は、結合されたデータの選択されたセグメントを示す。十分な結晶度を有する全てのサンプルに対してリートベルト精密化を実施した。２０ｍｇ／ｍＬ以上のＯＰＮ含量を有するサンプルは、リートベルト精密化を複雑にする高アモルファス含量を有したので、これらのサンプルは精密化しなかった。リートベルト精密化したサンプルに対して、選択されたパラメータを導出した。これは、図１０に示される。ＦＴＩＲは、Ｎｉｃｏｌｅｔ  ３８０  ＦＴ−ＩＲ，Ｓｍａｒｔ  Ｏｒｂｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）において実行した。測定の直前にサンプルを６０℃で乾燥させた。個々のスペクトルにバックグラウンドを適合させて、差し引いた。補正されたデータは図１３で見ることができる。サンプルのリン酸塩（１２００〜９００ｃｍ−１）、炭酸塩（８９０〜８４０ｃｍ−１）および有機含有物（１７２０〜１５９５ｃｍ−１）間の比較のために、特定のピークの積分を行った。ＦＴＩＲの鉱物：有機物および鉱物：炭酸塩のピーク比の間の比較は図１４に示される。
【０２０９】
ＴＧＡデータは、ＡｒおよびＯ２雰囲気を用いて、Ｎｅｔｚｓｃｈ  ＳＴＡ  ４４９  Ｃ（ＮＥＴＺＳＣＨＧｅｒａｔｅｂａｕ  ＧｍｂＨ，Ｓｅｌｂ，独国）において記録した。ＴＧＡデータは図１１に示され、導出された質量損失は図１２に示される。
【０２１０】
ＸＲＤデータは、結晶性材料が、２０ｍｇ／ｍｌ未満のＯＰＮを有する全てのサンプルに対して形成されることを示した。２０ｍｇ／ｍｌ以上では、非常に大量のアモルファス材料が観察された。３０および３４ｍｇ／ｍｌでは、アモルファス散乱の上に小さいピークを観察した。結晶性材料の回折ピークは、実験的な解明よりもかなり幅広であった。これは、結晶性材料がナノ結晶であることを反映する。１５ｍｇ／ｍｌまで（１５ｍｇ／ｍｌを含む）のＯＰＮのＸ線回折データをリートベルト精密化によりモデル化して、平均ナノ結晶サイズに関する情報を引き出した。ナノ結晶はサイズが異方性であり、形態学的な長軸が結晶学的なｃ軸と一致する針状の形状である。導出された結晶子サイズは図１０に示される。非常に低いＯＰＮ含量では、形態学的な方向の両方において結晶子サイズが急速に降下し（図１０の下側のプロット）、その後約１ｍｇ／ｍｌのＯＰＮ含量までサイズはほぼ一定のままであり、その後１０ｍｇ／ｍｌのＯＰＮ含量まで再度低下した。１２．５および１５ｍｇ／ｍｌの場合、粒子凝集体は、１０ｍｇ／ｍｌの場合よりも大きいナノ結晶を含有したが、バックグラウンドとピーク高さの間の比較は、これらのサンプル中に多量のアモルファス材料が存在することを示した。水、有機成分および炭酸塩の含量は、図１１に示されるようにＴＧＡ測定によって評価した。質量損失は図１２に報告され、有機および炭酸塩含量に相当する質量損失は、乾燥質量に対して補正した（すなわち、水の初期損失の後に残存する質量によって基準化した）。含水量は全ての場合で１５ｗｔ％未満であった。非結晶性材料の場合よりもアモルファス化合物の場合（約１０ｗｔ％）の方が著しく多かった。ナノ結晶材料の場合、３．１＋０．１２  ＯＰＮ（ここで、ＯＰＮは添加されたＯＰＮ（ｍｇ／ｍｌ）である）に続いて、ＯＰＮ含量と共に含水量が直線的に増大することが観察された。炭酸塩含量はそれぞれ、ナノ結晶については約２．４乾燥ｗｔ％、アモルファス材料については４．８乾燥ｗｔ％であった。有機含量はＯＰＮの添加と共に１０ｍｇ／ｍｌまで増大し、１２．５および１５ｍｇ／ｍｌはより小さい有機含量を示し、高濃度では、有機含量は約３３乾燥ｗｔ％で飽和した。図１３および１４に示されるように、ＦＴＩＲによって上記の観察を確認した。
【０２１１】
実施例２：う歯モデルバイオフィルムの増殖
ヒト口腔細菌単離物のストレプトコッカス・オラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｒａｌｉｓ）ＳＫ２４８、ストレプトコッカス・ドウネイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｏｗｎｅｉ）ＨＧ５９４、ストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ）ＳＫ２４、ストレプトコッカス・サングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）ＳＫ１５０およびアクチノミセス・ネスルンディ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）ＡＫ６を実験で使用した。血液寒天（ＳＳＩ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，デンマーク）において生物を好気的に培養し、実験的な使用に先立って中〜後期の対数期まで３５℃のＴＨＢ（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，独国）に移した。
【０２１２】
１／１０  ＴＨＢ（ｐＨ７．０）を用いてフローセル（ｉｂｉＴｒｅａｔ，μ−ｓｌｉｄｅ  ＶＩ，Ｉｂｉｄｉ，Ｍｕｎｉｃｈ，独国）をプレコンディショニングした。５５０ｎｍで０．４の光学濃度（２〜５＊１０９細胞／ｍｌに相当する）に調整した細菌培養物を以下の順でフローチャネルに順次接種した：１．Ｓ．オラリス（ｏｒａｌｉｓ）ＳＫ２４８、２．Ａ．ネスルンディ（ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）ＡＫ６、３．Ｓ．ミティス（ｍｉｔｉｓ）ＳＫ２４、４．Ｓ．ドウネイ（ｄｏｗｎｅｉ）ＨＧ５９４、５．Ｓ．サングイニス（ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）ＳＫ１５０。無菌針（ＢＤ  Ｍｉｃｒｏｌａｎｃｅ，２７Ｇ，Ｄｒｏｇｈｅｄａ，Ｉｒｅｌａｎｄ）を用いて、０．４ｍｌの各生物をシリコーン管からインポートで注入し、注入孔をシリコーン接着剤（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，独国）で密封した。注入の後、３０分間流れを止め、細菌接着を可能にした。次の生物を注入する前に１０分間の流れによって非接着性生物を除去した。接種手順の後、ぜん動ポンプ（Ｗａｔｓｏｎ  Ｍａｒｌｏｗ  ２０５  Ｕ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）により提供される一定流量（２５０μｌ／分、２８．３ｍｍ／分）の１／１０ＴＨＢ（ｐＨ７．０）の下で、バイオフィルムを３５℃で２６時間増殖させた。
【０２１３】
実施例３：う蝕モデルバイオフィルムにおけるＯＰＮの細菌への結合
使用説明書に従ってフルオレセインによりＯＰＮを標識化した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｔａａｓｔｒｕｐ，デンマーク）。増殖期の後、３５℃で１００μｌの標識化タンパク質と共にバイオフィルムを４５分間インキュベートし、４８８ｎｍのレーザー線および５００〜５５０ｎｍのバンドパスフィルタを用いてイメージングした。ＸＹ解像度を０．１μｍ／ピクセルに設定し、Ｚ解像度は１エアリー単位（０．８μｍの光学スライス厚）に相当した（図１Ａ）。
【０２１４】
実施例４：インビボで増殖した歯のバイオフィルムに対する、ＯＰＮを含有するリン酸カルシウムナノ粒子凝集体の結合
インビボで増殖させた歯のバイオフィルムを無菌キュレットで歯の表面から擦り取り、ガラススラブ（４ｘ４ｘ１ｍｍ）上に捕集した。ガラススラブを裏返し、バイオフィルムを、ＯＰＮを含有するリン酸カルシウムナノ粒子凝集体と共に３５℃で３０分間インキュベートした。０．９％のＮａＣｌで洗浄した後、バイオフィルムの細菌およびナノ粒子凝集体の両方を標的とする３０μＭのＣ−ＳＮＡＲＦ−４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｂｒｏｎｄｂｙ，デンマーク）を用いてバイオフィルムを染色した。６３ｘ油浸対物レンズ、開口数１．４（Ｐｌａｎ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ）を有するＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０  ＭＥＴＡ（Ｊｅｎａ，独国）を画像収集のために使用した。５４３ｎｍのレーザー線（２５０〜３００μＷ）をプローブから出し、５７６〜６０８ｎｍの区間内で蛍光放射をモニターし（ＭＥＴＡ検出器）、ピンホールを２エアリー単位（１．６μｍの光学スライス厚さ）に設定した。画像は、サイズが３６４ｘ３６４ピクセル（１４３ｘ１４３μｍ２）であり、ピクセル滞留時間１８μｓ、ライン平均２、０．４μｍ／ピクセル（ズーム１）、１２ビット強度の解像度で得られた（図１Ｂ）。
【０２１５】
実施例５：プランクトン様培養物における細菌増殖に対するＯＰＮの効果
２６．５μｍｏｌ／ｌのＯＰＮを含有するＴＨＢまたはＴＨＢに細菌を移した。１００μｌの一定分量を９６ウェルプレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＮＣ，ＵＳＡ）に移し、分光光度計（ＢｉｏＴｅｋ  ＰｏｗｅｒＷａｖｅ  ＸＳ２，Ｂａｄ  Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈｓｈａｌｌ，独国）を用いて５５０ｎｍのＯＤを測定した。実験を３通りに実行し、１回繰り返した（図２）。
【０２１６】
実施例６：う蝕モデルにおけるバイオフィルムの増殖に対する、ＯＰＮを含有するリン酸カルシウムナノ粒子凝集体の効果
上記のようにバイオフィルムを増殖させ、増殖の間、ＯＰＮを含有するリン酸カルシウムナノ粒子凝集体で３回処理した（接種手順の３時間、９時間および２４時間後）。実施例１から得られたナノ粒子凝集体の懸濁液を勢いよく振とうさせ、１０分間沈降させ、０．４ｍｌを懸濁液の上部から吸引した。吸引した懸濁液は、約３％（ｗ／ｖ）のナノ粒子凝集体含量を有した。次に流れを止め、吸引したナノ粒子凝集体を含む懸濁液を、細菌接種材料について記載したようにチャネルに注入した。１時間のインキュベーションの後、流を再開させた。オステオポンチンを含まないリン酸カルシウムナノ粒子凝集体、種々のサイズの二酸化ケイ素粒子（１００ｎｍ、５００ｎｍおよび２０００ｎｍの直径、０．９％のＮａＣｌ中３．５％（ｗ／ｖ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｂｒｏｎｄｂｙ，デンマーク）、ポリスチレン粒子（１０００ｎｍの直径、蒸留水中３．５％（ｗ／ｖ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、および溶解ＯＰＮ（０．９％のＮａＣｌ中０．９ｇ／ｌ）を用いて同じ方法で対照処理を実施した。０．９％のＮａＣｌと共にインキュベートしたチャネルは、負の対照としての役割を果たした。各実験設定に対して６個の再現バイオフィルムを増殖させた。バイオフィルムの増殖後、ペーパーポイントによる吸引によって、フローチャネルからＴＨＢを除去した。チャネルを蒸留水で洗浄し、再度乾燥させ、１００μＬの２％クリスタルバイオレット溶液で１時間染色した。次に、チャネルを蒸留水で再度洗浄し、乾燥させ、１２０μＬの１００％エタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｂｒｏｎｄｂｙ、デンマーク）を３０分間添加し、バイオフィルムを脱染した。その後、１：８で希釈した１００μＬの染色エタノール溶液を９６ウェルプレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＮＣ，ＵＳＡ）に移し、分光光度計（ＢｉｏＴｅｋ  ＰｏｗｅｒＷａｖｅ  ＸＳ２，Ｂａｄ  Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈｓｈａｌｌ，独国）を用いて５８５ｎｍの光学濃度を測定した。空のフローチャネルを同じ方法で処理し、バックグラウンドを差し引くために使用した（図３）。
【０２１７】
図３は、クリスタルバイオレット染色によって測定される、う蝕モデルにおけるバイオフィルム形成に対する種々の薬剤の効果を示す。ＯＰＮを含有するリン酸カルシウムナノ粒子凝集体（ＨＡＰ−ＯＰＮ）は、１０００ｎｍのポリスチレン粒子、シリカ粒子（１５０ｎｍ、５００ｎｍおよび２０００ｎｍ）、ＯＰＮを含まないリン酸カルシウム粒子凝集体および０．９ｇ／ｌのＯＰＮと比較して、フローセルにおいて形成されるバイオフィルムの量を大幅に低減する。
【０２１８】
従って、実施例６は、カルシウム含有粒子に結合したＯＰＮを用いることにより、相乗的な（ｓｙｎｅｒｇｅｔｉｃ）抗バイオフィルム効果が得られることを実証する、統計的に有意な証拠を提供する。
【０２１９】
実施例７：ＯＰＮを含有するリン酸カルシウムナノ粒子凝集体のクリスタルバイオレット結合
１００μｌのＯＰＮを含有するリン酸カルシウムナノ粒子凝集体をフローセル（ｉｂｉＴｒｅａｔ，μ−ｓｌｉｄｅ  ＶＩ，Ｉｂｉｄｉ，Ｍｕｎｉｃｈ，独国）に注入し、一晩乾燥させた。フローチャネルをクリスタルバイオレットで１５分間染色し、ＰＢＳで２回洗浄し、乾燥させ、１２０μｌの１００％エタノールを１５分間充填した。１：６４で希釈した１００μＬの染色エタノール溶液を９６ウェルプレートに移し、５８５ｎｍの光学濃度を測定した。オステオポンチンを含まないリン酸カルシウムナノ粒子凝集体、二酸化ケイ素粒子（５００ｎｍ直径、０．９％のＮａＣｌ中３．５％（ｗ／ｖ））、ポリスチレン粒子（１０００ｎｍ直径、蒸留水中３．５％（ｗ／ｖ））、溶解ＯＰＮ（０．９％のＮａＣｌ中０．９ｇ／ｌ）および０．９ｇ／ｌのＮａＣｌは対照としての役割を果たした。実験は３通りに実施した（図４）。
【０２２０】
実施例８：インビボの口腔バイオフィルム形成に対する、ＯＰＮを含有するリン酸カルシウムナノ粒子凝集体の効果
１２００グリットの表面粗度を有する特注のガラススラブ（４ｘ４ｘ１ｍｍ）（Ｍｅｎｚｅｌ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，独国）において口腔バイオフィルムを増殖させた。ガラススラブを、個々に設計された口腔内器具の頬側フランジのくぼみに取り付けた。２人の志願者は、歯磨きの間、食物または液体（水以外）の摂取中、およびナノ粒子凝集体に浸漬中を除いて、器具を口腔内で７２時間保持した。０．９％のＮａＣｌと、実施例１で調製した約３％（ｗ／ｖ）のナノ粒子凝集体とを含有する懸濁液中に、器具の片側を毎日５〜６回（３０〜６０分間）浸漬した。同時に、器具の反対側を０．９％のＮａＣｌ中に浸漬し、負の対照とした。７２時間後、ガラススラブを除去し、共焦点顕微鏡分析の前にバイオフィルムをＣ−ＳＮＡＲＦ−４で染色した（図６）。
【０２２１】
図６は、ＯＰＮを含有するカルシウム含有ナノ粒子凝集体が、インビボの口腔バイオフィルムの増殖を大幅に低減することを示す。Ａ：ガラススラブ上で増殖させたバイオフィルムを口腔内で７２時間保持し、毎日５〜６回のＮａＣｌ浸漬（３０〜６０分間）を実施した。Ｂ：ガラススラブ上で増殖させたバイオフィルムを口腔内で７２時間保持した。
【０２２２】
従って、実施例８は、実施例６で観察された抗バイオフィルム効果がインビボでも存在することを確認する。
【０２２３】
実施例９：プランクトン様細菌培養物のｐＨに対する、ＯＰＮを含有するリン酸カルシウムナノ粒子凝集体の効果
中期対数期まで細菌培養物をＴＨＢ中で増殖させ、２回洗浄し、無菌の唾液に移した。ＯＤを１．０（５５０ｎｍ）に調整し、０．４％のグルコース（ｗ／ｗ）を添加し、１ｍｌの細菌懸濁液を１ｍｌのＯＰＮを含有するリン酸カルシウムナノ粒子凝集体または１ｍｌの０．９％のＮａＣｌと混合した。ｐＨを２０時間測定した。実験を２通りに実施し、１回繰り返した（図７ａ〜７ｅ）。
【０２２４】
実施例１０：う蝕モデルバイオフィルムにおけるｐＨに対する、ＯＰＮを含有するリン酸カルシウムナノ粒子凝集体の効果
接種手順を上記のように実行した。次に、１／１０希釈ＴＨＢにおいて３５℃で８時間、流速２５０μＬ／分でバイオフィルムを増殖させた。そのときまでに、安定した薄いバイオフィルムが形成された。次に、培地を、炭水化物を含まない牛肉抽出物（Ｓｃｈａｒｌａｕ，Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，スペイン）に変え、流速を５０μＬ／分に低下させて、フローセル内のせん断力を最小限にした。培地を変えてから１時間、１２時間および１７時間後に、ＨＡＰ−ＯＰＮ粒子を注入し、上記のようにバイオフィルムと共に１時間インキュベートした。対照チャネルを０．９％のＮａＣｌと共にインキュベートした。
【０２２５】
レシオメトリックｐＨ感受性プローブＣ−ＳＮＡＲＦ−４の共焦点顕微鏡キャリブレーション：３０μＭの濃度のＣ−ＳＮＡＲＦ−４を含有するＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ、０．１ｐＨ単位ずつでｐＨ４．５〜８．５に調整）をフローチャネルにおいてイメージングした。６３ｘ油浸対物レンズ、開口数１．４（Ｐｌａｎ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ）を有するＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０  ＭＥＴＡ（Ｊｅｎａ，独国）を画像収集のために使用した。５４３ｎｍのレーザー線（２５０〜３００μＷ）をプローブから出し、５７６〜６０８ｎｍ（緑）および６２９〜６６１ｎｍ（赤）の区間において蛍光放射を同時にモニターし（ＭＥＴＡ検出器）、ピンホールを２エアリー単位（１．６μｍの光学スライス厚さ）に設定した。画像は、サイズが３６４ｘ３６４ピクセル（１４３ｘ１４３μｍ２）であり、ピクセル滞留時間１８μｓ、ライン平均２、０．４μｍ／ピクセル（ズーム１）、１２ビット強度の解像度で得られた。３番目のｐＨ値毎に、バックグラウンドを差し引くために、非染色ＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．５）において測定を実施した。さらに、グルコース（２０％ｗ／ｖ）およびラクテート（２０％ｗ／ｖ）の非染色溶液、１／１０希釈ＴＨＢ（ｐＨ７）、無菌唾液、ＰＢＳ（ｐＨ７．４、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｂｒｏｎｄｂｙ，デンマーク）、非処理バイオフィルムおよびＨＡＰ−ＯＰＮ粒子懸濁液を、同一の顕微鏡およびレーザー設定を用いてイメージングした。５７６〜６０８ｎｍおよび６２９〜６６１ｎｍの波長範囲において、これらの対照のいずれも自己蛍光シグナルを発光しなかった。
【０２２６】
比率の計算のために、各画像内に１００ｘ１００ピクセルの領域を画定し、ＬＳＭ収集ソフトウェアを用いて平均および標準偏差を決定した。続いて、式（１）、（２）および（３）：
2015516949.tif 000002
に従って、比率Ｒ、標準偏差ｓＲおよび標準平均誤差ＳＲを各ｐＨ値に対して計算した。ｇ、ｒ、ｓｇおよびｓｒは、それぞれの緑色および赤色画像において画定された１００ｘ１００ピクセル領域内の平均および標準偏差である。ｂｇ、ｂｒ、ｓｂｇおよびｓｂｒは、バックグラウンド画像の対応する値である。得られたＲの値をＭＡＴＬＡＢ（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ，Ｎａｔｉｃｋ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳ）でプロットし、関数：
2015516949.tif 000003
に適合させた。
【０２２７】
測定を２回実施し、高度に再現可能であることが証明された。
【０２２８】
バイオフィルムｐＨイメージング：３つのバイオフィルムを並行して増殖させ、その１つを上記のようなＯＰＮを含有するリン酸カルシウムナノ粒子凝集体で処理した。その後、バイオフィルムを無菌唾液で２回洗浄し、Ｃ−ＳＮＡＲＦ−４を３０μＭの濃度まで添加した。フローセルを顕微鏡に移し、ＸＬインキュベータ（ＰｅＣｏｎ，Ｅｒｂａｃｈ，独国）を用いてこれを３７℃に保持し、バイオフィルムの最下層のベースラインｐＨ画像を収集した。続いて、３つのチャネルのうちの２つにおいて、０．４％（ｗ／ｖ）のグルコースおよび３０μＭのＣ−ＳＮＡＲＦ−４を含有する唾液溶液によってグルコースを含まない唾液を置換した。３つのバイオフィルムのそれぞれにおいて、ランダムに選択される１６の顕微鏡視野でｐＨ画像を収集した。ＬＳＭソフトウェアでＸＹ位置に印を付け、グルコースの添加の６０分後に、同一の顕微鏡視野を同じ順序で再度イメージングした。バックグラウンドを差し引くために、５４３ｎｍレーザーのスイッチを切って画像を収集した。顕微鏡およびレーザー設定はキャリブレーション測定のものと同一であった。５回の独立した実験の再現を実施した（図８ａ〜８ｅ）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図７ｅ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図８ｄ】
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【図８ｅ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年1月28日(2014.1.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオフィルム関連疾患を治療、軽減および／または防止するための、ａ）オステオポンチン（ＯＰＮ）と、ｂ）カルシウムおよび／またはストロンチウムを含む第１の粒子とを含むことを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項２】
請求項１に記載のナノ粒子凝集体において、前記バイオフィルム関連疾患が細菌感染症を含むことを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項３】
請求項１または２に記載のナノ粒子凝集体において、前記バイオフィルム関連疾患が口腔疾患であることを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項４】
請求項３に記載のナノ粒子凝集体において、前記バイオフィルム関連疾患がう歯であることを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項５】
請求項３または４に記載のナノ粒子凝集体において、前記バイオフィルム関連疾患が歯肉炎であることを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項６】
請求項３乃至５の何れか一項に記載のナノ粒子凝集体において、前記バイオフィルム関連疾患が歯周炎であることを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項７】
請求項１または２に記載のナノ粒子凝集体において、前記バイオフィルム関連疾患が、細菌性心内膜炎、慢性創傷感染症、インプラント感染症、中耳炎、嚢胞性線維症、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される疾患であることを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項８】
請求項１に記載のナノ粒子凝集体において、細菌感染症、例えば細菌性創傷感染症を治療、軽減および／または防止するためのものであることを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項９】
微生物バイオフィルムの増殖を低減もしくは防止するため、または微生物バイオフィルムを除去するための、ａ）ＯＰＮと、ｂ）カルシウムおよび／またはストロンチウムを含む第１の粒子とを含むことを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項１０】
請求項９に記載のナノ粒子凝集体において、前記バイオフィルムが歯垢であることを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項１１】
請求項１乃至１０の何れか一項に記載のナノ粒子凝集体において、前記バイオフィルムが、細胞１個当たり少なくとも５０個のＯＰＮ分子のＯＰＮ結合能力を有する細菌を含有することを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項１２】
請求項１乃至１１の何れか一項に記載のナノ粒子凝集体において、前記バイオフィルムが、ストレプトコッカス種、スタフィロコッカス種、シュードモナス種、アクチノミセス種、ラクトバチルス種、アグリゲイティバクター種、バクテロイデス種、リステリア種、カンピロバクター種、エイケネラ種、ポルフィロモナス種、プレボテーラ種、トレポネーマ種、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数の細菌を含有するか、あるいはこれらからなることを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項１３】
請求項１乃至１２の何れか一項に記載のナノ粒子凝集体において、前記第１の粒子がカルシウムを含むことを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項１４】
請求項１乃至１３の何れか一項に記載のナノ粒子凝集体において、前記第１の粒子がストロンチウムを含むことを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項１５】
請求項１乃至１４の何れか一項に記載のナノ粒子凝集体において、前記第１の粒子がカルシウムおよびストロンチウムを含むことを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項１６】
請求項１乃至１５の何れか一項に記載のナノ粒子凝集体において、前記第１の粒子がカルシウムおよび／またはストロンチウムの無機塩を含むことを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項１７】
請求項１６に記載のナノ粒子凝集体において、前記無機塩がリン酸塩種、硫酸塩、および／または炭酸塩を含むことを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項１８】
請求項１乃至１７の何れか一項に記載のナノ粒子凝集体において、前記第１の粒子が少なくとも５０％（ｗ／ｗ）のリン酸カルシウムを含むことを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項１９】
請求項１乃至１８の何れか一項に記載のナノ粒子凝集体において、前記第１の粒子がカルシウムおよび／またはストロンチウムを放出可能であることを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項２０】
請求項１乃至１９の何れか一項に記載のナノ粒子凝集体において、前記第１の粒子がナノ粒子であることを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項２１】
請求項１乃至２０の何れか一項に記載のナノ粒子凝集体において、前記第１の粒子と同じタイプの第２の粒子を含むことを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項２２】
請求項１乃至２１の何れか一項に記載のナノ粒子凝集体において、最大で５ミクロンの流体力学的半径を有することを特徴とするナノ粒子凝集体。
【請求項２３】
微生物バイオフィルムの増殖を低減もしくは防止するため、または微生物バイオフィルムを除去するための、ａ）ＯＰＮと、ｂ）カルシウムおよび／またはストロンチウムを含む第１の粒子とを含むことを特徴とするナノ粒子凝集体の使用。
【請求項２４】
請求項２３に記載の使用において、前記バイオフィルムが、ストレプトコッカス種、スタフィロコッカス種、シュードモナス種、アクチノミセス種、ラクトバチルス種、アグリゲイティバクター種、バクテロイデス種、リステリア種、カンピロバクター種、エイケネラ種、ポルフィロモナス種、プレボテーラ種、トレポネーマ種、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数の細菌を含有するか、あるいはこれらからなることを特徴とする使用。
【国際調査報告】
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