【手続補正書】
【提出日】平成22年6月8日(2010.6.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入された酵母。
【請求項２】
前記Ｌ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が、配列番号１に示す核酸配列を有する遺伝子であることを特徴とする、請求項１に記載の酵母。
【請求項３】
前記酵母がサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属することを特徴とする、請求項１または２に記載の酵母。
【請求項４】
前記酵母がサッカロミセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかの項に記載の酵母。
【請求項５】
前記Ｌ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が、該遺伝子の発現を可能とするプロモーターの下流に導入されたことを特徴とする、請求項１〜４のいずれかの項に記載の酵母。
【請求項６】
前記Ｌ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が、染色体上のピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子（ＰＤＣ１遺伝子）のプロモーターの下流に発現可能な状態で導入されたことを特徴とする、請求項１〜５いずれかの項に記載の酵母。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかの項に記載の酵母を培養することを含む、Ｌ−乳酸の製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明者らが鋭意検討した結果、ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入された酵母を培養することにより、従来のウシ由来のＬ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入された酵母を培養することよりも高い対糖収率でＬ−乳酸を製造できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
すなわち、本発明は、ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入された酵母を提供するものである。ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入された酵母は、好ましくは、配列番号１に示す核酸配列を有する遺伝子が導入された酵母である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
本発明の別の好ましい態様によれば、ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入された酵母は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母であり、さらに好ましくはサッカロミセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
本発明の別の好ましい態様によれば、ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が染色体上のピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子（ＰＤＣ１遺伝子）のプロモーターの下流に発現可能な状態で導入された酵母である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
また、本発明は、上記ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−乳酸脱水素酵素が導入された酵母を培養することを含む、Ｌ−乳酸の製造方法を提供するものである。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
本発明で使用するゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子は、好ましくは、配列番号１に示す核酸配列を有するＬ−ｌｄｈ遺伝子である。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
本発明で使用するゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子には、遺伝的多型性や、変異誘発などによる変異型の遺伝子も含まれる。ここでいう遺伝的多型性とは、遺伝子上の自然突然変異により遺伝子の塩基配列が一部変化しているものである。また、変異誘発とは、人工的に遺伝子に変異を導入することをいい、例えば、部位特異的変異導入用キット（Mutan-K（タカラバイオ社製））を用いる方法や、ランダム変異導入用キット（BD Diversify PCR Random Mutagenesis（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製））を用いる方法などがある。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
本発明で使用する酵母は、ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子を導入しうる酵母であれば制限はないが、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クリベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属又はカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する酵母が挙げられる。好ましくは、サッカロミセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であって、具体的には、ＮＢＲＣ１０５０５株、ＮＢＲＣ１０５０６株が好ましい。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
本発明のゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子を酵母に導入する方法としては、例えば、ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子をクローニングし、クローニングした該遺伝子を組み込んだ発現ベクターを酵母に形質転換する方法、クローニングした該遺伝子を染色体上の目的箇所に相同組換えで挿入する方法等が挙げられるが、これらに限られるものではない。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
本発明で使用するゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子をクローニングする方法としては特に制限はなく、既知の手法を用いることができる。例えば、既知の遺伝子情報に基づき、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法を用いて必要な遺伝領域を増幅取得する方法や、ゲノムライブラリーやｃＤＮＡライブラリーより相同性や酵素活性を指標としてクローニングする方法などが挙げられる。また、既知のタンパク質情報に基づき化学合成的又は遺伝子工学的に合成する方法も可能である。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
クローニングしたゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子を組み込む発現ベクターとしては、酵母で汎用的に利用される発現ベクターを用いることができる。酵母で汎用的に利用される発現ベクターとは、酵母細胞内での自立的複製に必要な配列、大腸菌細胞内での自立的複製に必要な配列、酵母選択マーカー及び大腸菌選択マーカーを有しており、また、組み込んだゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子を発現させるために、その発現を調節するオペレーター、プロモーター、ターミネーター又はエンハンサー等のいわゆる調節配列をも有していることが望ましい。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
調節配列としては、ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子を発現可能なものであれば特に制限はないが、一例として酸性フォスファターゼ遺伝子（ＰＨＯ５）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＴＤＨ１，２，３）、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＡＤＨ１，２，３，４，５，６，７）遺伝子、ガラクトース代謝系遺伝子（ＧＡＬ１，７，１０）、シトクロムｃ遺伝子（ＣＹＣ１）、トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子（ＴＰＩ１）、ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（ＰＧＫ１）、ホスホフルクトースキナーゼ遺伝子（ＰＦＫ１）、ピルビンデカルボキシラーゼ遺伝子（ＰＤＣ１，５，６）などのプロモーター配列及びＴＤＨ３遺伝子などのターミネーター配列が挙げられる。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
上記発現ベクターのプロモーター下流にゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子を導入することにより、該遺伝子を発現可能なベクターが得られる。得られたゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子発現ベクターを、後述する方法により酵母に形質転換することにより、ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子を酵母に導入することができる。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
また、ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子を染色体上に挿入することで、ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子を酵母に導入することができる。ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子を染色体中に挿入する方法に特に制限はないが、ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子を含むＤＮＡを後述する方法により酵母に形質転換し、ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子を非相同組み換えによって染色体中のランダムな位置に挿入する方法や、ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子を含むＤＮＡを相同組み換えにより目的とする箇所に挿入する方法などを用いることができる。好ましくは、相同組み換えによる方法である。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子を含むＤＮＡを染色体中の目的箇所に、好ましくはＰＤＣ１遺伝子のプロモーターの下流に相同組み換えで挿入する方法としては、ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子を含むＤＮＡの上流及び下流に、導入目的箇所に相同的な部分を付加するようにデザインしたプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ断片を後述する方法により酵母に形質転換する方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。また、形質転換株の選択を容易にするために、上記ＰＣＲ断片には酵母選択マーカーが含まれることが好ましい。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
（１）ステップ１：ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子の下流にターミネーターがつながったプラスミドを鋳型とし、プライマー１，２をセットとしてゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子及びターミネーターを含む断片をＰＣＲで増幅する。プライマー１は、導入目的箇所の上流側に相同的な配列４０ｂｐ以上を付加するようデザインし、プライマー２は、ターミネーターより下流のプラスミド由来の配列をもとにデザインする。好ましくは、プライマー１に付加する導入目的箇所の上流側に相当する配列は、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子（ＰＤＣ１遺伝子）の上流に相当する配列である。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
上記で得られたゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子発現ベクターまたはＰＣＲ断片を酵母に導入するには、形質転換、形質導入、トランスフェクション、コトランスフェクションまたはエレクトロポレーション等の方法を用いることができる。具体的には、例えば、酢酸リチウムを用いる方法やプロトプラスト法等がある。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
本発明のゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が導入された酵母を培養することにより、培地中にＬ−乳酸を製造することができる。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
（実施例１：ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子発現ベクターの作製）
ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子として、配列番号１に示す核酸配列を有するＬ−ｌｄｈ遺伝子を使用した。ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子のクローニングはＰＣＲ法により行った。ＰＣＲには、ゼノプス・レービスの腎臓由来ｃＤＮＡライブラリー（STRATAGENE社製）より付属のプロトコールに従い調製したファージミドＤＮＡを鋳型とした。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
上記ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が挿入されたｐＵＣ１１８ベクターを制限酵素ＳａｌＩ及びＮｏｔＩで切断し、ＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、定法に従いゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子を含む断片を精製した。得られたＬ−ｌｄｈ遺伝子を含む断片を、図２に示す発現ベクターｐＴＲＳ１１のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部位にライゲーションし、上記と同様な方法でプラスミドＤＮＡを回収し、制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで切断することにより、ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が挿入された発現ベクターを選抜した。以後、このようにして作製したゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子を組み込んだ発現ベクターをｐＴＲＳ１０２とする。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
（実施例２：ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子発現ベクターの酵母への導入）
実施例１のようにして得られたｐＴＲＳ１０２を酵母サッカロミセス・セレビセＮＢＲＣ１０５０５株のｐｄｃ１遺伝子を破壊した株（以下、２９−１Ｂ株と示す。）に形質転換した。形質転換は、YEASTMAKER YEAST Transformation System（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いた酢酸リチウム法により行い、詳細は付属のプロトコールに従った。宿主とする２９−１Ｂ株はウラシル合成能を欠損した株であり、ｐＴＲＳ１０２の持つＵＲＡ３遺伝子の働きにより、ウラシル非添加培地上でｐＴＲＳ１０２の導入された形質転換株の選択が可能である。このようにして得られた形質転換株へのゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子発現ベクター導入の確認は、形質転換株から、ゲノムＤＮＡ抽出キットＧｅｎとるくん（タカラバイオ社製）によりプラスミドＤＮＡを含むゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてPremix Taq（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲにより行った。確認用プライマーには、ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子をクローニングした際に用いたプライマー（配列番号３，４）を使用した。その結果、ｐＴＲＳ１０２を形質転換した株において、ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来Ｌ−ｌｄｈ遺伝子が導入されていることを確認した。以下、上記ｐＴＲＳ１０２が導入された形質転換株を２９−１Ｂ／ｐＴＲＳ１０２株とする。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
（実施例３：ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子のＰＤＣ１遺伝子座への導入）
実施例１で得られたｐＴＲＳ１０２を増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号７，８）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子及びＴＤＨ３ターミネーター配列を含む１．３ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した（図１のステップ１に相当）。ここで配列番号７は、ＰＤＣ１遺伝子の開始コドンから上流６５ｂｐに相当する配列が付加されるようデザインした。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
上記のようにして得られた形質転換株が、ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が染色体上のＰＤＣ１遺伝子プロモーターの下流に導入されている酵母であることの確認は下記のように行った。まず、形質転換株のゲノムＤＮＡをゲノムＤＮＡ抽出キットＧｅｎとるくん（タカラバイオ社製）により調製し、これを増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号１１，１２）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、約２．８ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られることで確認した。なお、非形質転換株では、上記ＰＣＲによって約２．１ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られる。以下、上記ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が染色体上のＰＤＣ１遺伝子プロモーターの下流に導入された形質転換株を、Ｂ２株とする。なお、ＰＤＣ１遺伝子の上流及び下流配列は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（URL: http://www.yeastgenome.org/）より取得することができる。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
表２及び表３の結果から、ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が導入された酵母を培養することにより、ウシ由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が導入された酵母を培養することよりも高い対糖収率でＬ−乳酸を製造することができた。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
（実施例６：ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子のＴＤＨ３遺伝子座への導入）
染色体中に挿入するゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子をＴＤＨ３プロモーターの下流に導入することで乳酸生産性の向上が可能であるか検討を行った。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
実施例３と同様な方法でゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子をＴＤＨ３遺伝子座に導入するために、ｐＴＲＳ１０２のＴＤＨ３ターミネーターをＡＤＨ１ターミネーターに変更したプラスミドを作製した。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
このｐＴＲＳ１５０を鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号８，１５）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子及びＡＤＨ１ターミネーター配列を含む１．３ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。ここで配列番号１５のプライマーは、ＴＤＨ３遺伝子の開始コドンから上流６０ｂｐに相当する配列が付加されるようデザインした。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
それぞれのＰＣＲ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製した。ここで得られた各１．３ｋｂ断片、１．２ｋｂ断片を混合したものを増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号１５，１６）をプライマーセットとしたＰＣＲ法によって、ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子、ＡＤＨ１ターミネーター及びＵＲＡ３遺伝子が連結された約２．５ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
上記のＰＣＲ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製後、ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子がｐｄｃ１遺伝子座に導入されたＢ２株に形質転換し、ウラシル非添加培地で培養することにより、ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が染色体上のＴＤＨ３遺伝子プロモーターの下流に導入されている形質転換株を選択した。
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
上記のようにして得られた形質転換株が、ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が染色体上のＴＤＨ３遺伝子プロモーターの下流に導入されている酵母であることの確認は下記のように行った。まず、形質転換株のゲノムＤＮＡをゲノムＤＮＡ抽出キットＧｅｎとるくん（タカラバイオ社製）により調製し、これを増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号１７，１８）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、約２．８ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られることで確認した。なお、非形質転換株では、上記ＰＣＲによって約２．１ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られる。以下、上記ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が染色体上のＴＤＨ３遺伝子プロモーターの下流に導入された形質転換株をＢ３株とする。なお、ＴＤＨ３遺伝子座の上流及び下流配列は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（URL:http://www.yeastgenome.org/）より取得することができる。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
表４の結果から、ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が染色体上のＰＤＣ１遺伝子のプロモーターの下流に発現可能な状態で導入された酵母を改良することにより、より高い対糖収率でＬ−乳酸を製造可能な酵母が作出できた。
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
また、本発明のゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が導入された酵母を既知の方法で更に改良し、該酵母を培養することでより高い対糖収率でＬ−乳酸を製造することが可能である。
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
（実施例８、比較例６：Ｌ−乳酸脱水素酵素の活性）
実施例２、比較例２で得られた２９−１Ｂ／ｐＴＲＳ１０２株及び２９−１Ｂ／ｐＴＲＳ４９株を用いて、ｐＨ５〜７におけるゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−乳酸脱水素酵素活性及びウシ由来のＬ−乳酸脱水素酵素活性を比較した。
【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９９】
この結果から、ｐＨ５〜７において、ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−乳酸脱水素酵素活性は、ウシ由来のＬ−乳酸脱水素酵素の活性よりも高いことがわかった。また、表２及び表３の結果から、本発明のゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が導入された酵母を培養することにより、ウシ由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が導入された酵母を培養することよりも高い対糖収率でＬ−乳酸を製造することができることがわかった。