(57)【要約】  本発明は、サブチラーゼ変異体、および、サブチラーゼ変異体の入手方法に関する。本発明はまた、変異体をコードするポリヌクレオチド；このポリヌクレオチドを含む核酸構築物、ベクターおよび宿主細胞；ならびに、この変異体の使用方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応する２つ以上の位置で改変を含むサブチラーゼ変異体であって、各改変が、独立して、置換または挿入であり、および、プロテアーゼ活性を有する、変異体。
【請求項２】
少なくとも１つの改変が挿入である、請求項１に記載の変異体。
【請求項３】
少なくとも１つの改変が置換である、請求項１または２に記載の変異体。
【請求項４】
前記変異体が、位置７５と８２との間に２つの追加のアミノ酸を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項５】
前記変異体が、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域において２つの追加のアミノ酸残基を含み、これにより、前記追加のアミノ酸残基は配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域への２つのアミノ酸残基の挿入に相当し、ここで、前記挿入されたアミノ酸残基が、ＧｌｙおよびＡｓｐからなる群から選択され、および、前記領域が２つのアミノ酸によって延長された、請求項４に記載の変異体。
【請求項６】
前記親プロテアーゼのアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有し、前記親が、配列番号２、４および６の成熟ポリペプチドから構成されるプロテアーゼからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項７】
前記変異体が、１５０〜３５０、例えば、１７５〜３３０、２００〜３１０、２２０〜３００、２４０〜２９０、２６０〜２８０、２７０〜２７５のアミノ酸から構成される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項８】
改変数が、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０などの、例えば１〜１０および１〜５などの１〜２０改変である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項９】
前記配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５に対応する位置に改変を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１０】
前記改変が、ＡｓｐまたはＨｉｓとの置換である、請求項９に記載の変異体。
【請求項１１】
前記配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７６に対応する位置に改変を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１２】
前記改変が、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＴｙｒとの置換である、請求項１１に記載の変異体。
【請求項１３】
前記配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７７に対応する位置に改変を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１４】
前記改変がＡｓｐとの置換である、請求項１３に記載の変異体。
【請求項１５】
前記配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７８に対応する位置に改変を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１６】
前記改変がＧｌｙまたはＧｌｎとの置換である、請求項１５に記載の変異体。
【請求項１７】
前記配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７９に対応する位置に改変を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１８】
前記改変がＡｌａ、ＴｈｒまたはＧｌｎとの置換である、請求項１７に記載の変異体。
【請求項１９】
前記配列番号２の成熟ポリペプチドの位置８２に対応する位置に改変を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項２０】
前記改変がＴｙｒとの置換である、請求項１９に記載の変異体。
【請求項２１】
前記配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２のいずれかに対応する３つの位置で改変を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項２２】
前記配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応する４つの位置に改変を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項２３】
前記配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応する５つの位置に改変を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項２４】
前記配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応する位置の各々に改変を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項２５】
Ｌ７５Ｈ、Ｎ７６Ｓ、Ｎ７７Ｄ、Ｓ７８Ｇ、Ｉ７９ＱおよびＬ８２Ｙからなる群から選択される１つまたは複数の置換を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項２６】
以下の追加の置換Ｙ１６７Ａ、Ｒ１７０Ｓ、Ａ１９１Ｎ、Ｎ２６１Ｄ、Ｌ２６２Ｑのいずれかを含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項２７】
前記親と比して、または、基準プロテアーゼと比して、向上したキレータ安定性を有する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載の変異体を含む組成物。
【請求項２９】
前記組成物がクリーニング組成物および／または洗剤組成物である、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
クリーニングプロセスにおける請求項１〜２９のいずれかの一項に記載の変異体の使用。
【請求項３１】
前記クリーニングプロセスが洗濯である、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
前記クリーニングプロセスが、食器洗浄などの硬質面クリーニングである、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
親サブチラーゼに、前記配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応する２つ以上の位置で改変を導入するステップであって、前記改変が、独立して、置換または挿入であるステップ；前記変異体を回収するステップ、ならびに、前記変異体がプロテアーゼ活性を有するかテストするステップを含むサブチラーゼ変異体の入手方法。
【請求項３４】
前記変異体が：
ａ．前記配列番号２、４または６の成熟ポリペプチドに対して少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド；
ｂ．低ストリンジェンシー条件下で、（ｉ）前記配列番号１、３もしくは５の成熟ポリペプチドコード配列、（ｉｉ）そのｃＤＮＡ配列、または、（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の完全長補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
ｃ．配列番号１、３もしくは５の前記成熟ポリペプチドコード配列に対して少なくとも６０％同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または、そのｃＤＮＡ配列；および
ｄ．プロテアーゼ活性を有する前記配列番号２、４および６の成熟ポリペプチドの断片
からなる群から選択される親サブチラーゼの変異体である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記親サブチラーゼが、前記配列番号２、４または６の成熟ポリペプチドに対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、キレーター安定性、洗浄性能、熱安定性、保管安定性または触媒活性を含む１つまたは複数の特性において、親サブチラーゼと比して変化を示す新規サブチラーゼ変異体に関する。本発明の変異体は、洗濯洗剤組成物、および、自動食器洗浄組成物を含む食器洗浄組成物などの例えばクリーニングもしくは洗剤組成物における使用に好適である。本発明はまた、変異体をコードする単離ＤＮＡ配列、発現ベクター、宿主細胞、ならびに、本発明の変異体の生成方法および使用方法に関する。本発明はさらに、本発明の変異体を含むクリーニングおよび洗剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
配列表の参照
本出願は、コンピュータ読み取り可能な形態の配列表を含んでおり、これは本明細書において参照により援用される。
【０００３】
関連技術の説明
洗剤産業においては、酵素が３０年以上にわたって洗浄配合物において利用されている。このような配合物において用いられる酵素には、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、マンノシダーゼ、ならびに、他の酵素またはこれらの混合物が含まれる。商業的に最も重要な酵素はプロテアーゼである。
【０００４】
商業的にますます多く用いられるプロテアーゼは、天然の野生型プロテアーゼのタンパク質操作変異体である、Ｅｖｅｒｌａｓｅ（登録商標）、Ｒｅｌａｓｅ（登録商標）、Ｏｖｏｚｙｍｅ（登録商標）、Ｐｏｌａｒｚｙｍｅ（登録商標）、Ｌｉｑｕａｎａｓｅ（登録商標）、Ｌｉｑｕａｎａｓｅ  Ｕｌｔｒａ（登録商標）およびＫａｎｎａｓｅ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  ａ／ｓ）、Ｐｕｒａｆａｓｔ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ  ＯＸＰ（登録商標）、ＦＮ３（登録商標）、ＦＮ４（登録商標）およびＥｘｃｅｌｌａｓｅ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）である。さらに、多数の変異体が、例えば洗浄性能、熱安定性、保管安定性または触媒活性において、親サブチラーゼと比して変化を示すサブチラーゼ変異体が記載されている国際公開第２００４／０４１９７９号パンフレット（ＮＯＶＯＺＹＭＥＳ  Ａ／Ｓ）などの技術文献に記載されている。変異体は、例えばクリーニングもしくは洗剤組成物における使用に好適である。
【０００５】
多数の有用なサブチラーゼ変異体が記載されてきており、その多くが向上した活性、安定性および異なる洗剤における溶解度をもたらすとされている。国際公開第２００４／０６７７３７号パンフレットには、領域Ｌ７５〜Ｇ８０における１つまたは複数の欠失、および、同一の領域における１つまたは複数のアミノ酸のその後の挿入を含むサブチラーゼ変異体が記載されている。しかしながら、種々の要因のために、プロテアーゼのさらなる改善が有利である。温度およびｐＨなどの洗浄条件は経時的に変化し、多くの汚れは、従来の洗浄条件下で完全に除去することは未だ困難である。それ故、プロテアーゼの開発における熱心なリサーチにも関わらず、向上した新規のプロテアーゼに対する要求が未だ存在している。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応する２つ以上の位置で改変を含むサブチラーゼ変異体に関し、ここで、各改変は、独立して、置換または挿入であり、また、ここで、この変異体はプロテアーゼ活性を有する。本発明はまた、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応する２つ以上の位置で改変を含むサブチラーゼ変異体に関し、ここで、各改変は、独立して、置換または挿入であり、また、ここで、この変異体はプロテアーゼ活性を有し、また、ここで、変異体は、配列番号２、４または６の成熟ポリペプチドと少なくとも６５％等しいアミノ酸配列を有する。
【０００７】
本発明はまた、変異体をコードする単離されたポリヌクレオチド；このポリヌクレオチドを含む核酸構築物、ベクターおよび宿主細胞；ならびに、この変異体の入手方法に関する。
【０００８】
本発明はまた、親サブチラーゼに配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応する２つ以上の位置で改変を導入するステップであって、改変が置換または挿入であるステップ、変異体を回収するステップ、ならびに、前記変異体がプロテアーゼ活性を有するかテストするステップを含むプロテアーゼ変異体の入手方法に関する。本発明はさらに、クリーニング組成物および洗剤組成物などの組成物、ならびに、洗濯および／または食器洗浄などのクリーニングプロセスにおけるこのような本発明の組成物および変異体の使用に関する。
【０００９】
定義
プロテアーゼ：「プロテアーゼ」という用語は、本明細書において、ペプチド結合を加水分解する酵素として定義されている。プロテアーゼには、ＥＣ３．４酵素群（その１３の下位クラスの各々を含む）に属するいずれかの酵素が含まれる。ＥＣ番号については、それぞれ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９４，２２３，１−５；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９５，２３２，１−６；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９６，２３７，１−５；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９７，２５０，１−６；および、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９９，２６４，６１０−６５０において発行された追補１〜５を含む、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  １９９２，ＮＣ−ＩＵＢＭＢ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａを参照のこと。
【００１０】
プロテアーゼ活性：「プロテアーゼ活性」という用語は、タンパク分解活性（ＥＣ  ３．４）を意味する。本発明のプロテアーゼは、エンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１）である。数種類のプロテアーゼ活性タイプが存在しており：３種の主な活性タイプは：Ｐ１においてＡｒｇまたはＬｙｓに続くアミド基質を切断するトリプシン様活性、Ｐ１において疎水性アミノ酸の１つの後で切断するキモトリプシン様活性、および、Ｐ１においてＡｌａの後で切断するエラスターゼ様活性である。本発明の目的のために、プロテアーゼ活性は、以下の「材料および方法」に記載されている手法に従って測定される。本発明のサブチラーゼ変異体は、少なくとも２０％、例えば、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、および、少なくとも１００％の、配列番号２、４または６の成熟ポリペプチドのプロテアーゼ活性を有する。
【００１１】
突然変異体：「突然変異体」という用語は、同一の染色体座を占める遺伝子の２つ以上の代替形態のいずれかを意味する。突然変異体は突然変異を介して自然に生じ、個体群において多型性をもたらし得る。遺伝子突然変異は、非表現性（コードされるポリペプチドに変化無し）であることが可能であり、または、異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドがコードされ得る。ポリペプチドの突然変異体は、遺伝子の突然変異体によってコードされたポリペプチドである。
【００１２】
ｃＤＮＡ：「ｃＤＮＡ」という用語は、原核細胞または真核細胞から得られたスプライスされた成熟ｍＲＮＡ分子から逆転写によって調製可能であるＤＮＡ分子を意味する。ｃＤＮＡは、対応するゲノムＤＮＡ中に存在し得るイントロン配列を欠いている。元の一次ＲＮＡ転写物は、スプライスされた成熟ｍＲＮＡとして出現する前にスプライシングを含む一連のステップを介して処理されるｍＲＮＡに対する前駆体である。
【００１３】
キレート化剤またはキレータは、一定の金属イオンと共に分子を形成して、他の要素と反応できなくなるようイオンを不活性化させる化学物質であり、それ故、キレートを形成することにより化学的活性を抑制する結合剤である。キレート化は、リガンドと単一の中央原子との間における２つ以上の別個の結合の形成もしくは存在である。リガンドは、いずれかの有機化合物、ケイ酸またはリン酸であり得る。本文脈において、「キレート化剤」という用語は、キレート剤、キレート化剤、錯化剤、または、カルシウムおよびマグネシウムなどの金属イオンと水溶性錯体を形成する金属イオン封鎖剤を含む。キレート効果は、金属イオンに対するキレート化するリガンドの親和性が、一連の同様のキレート化しないリガンドの同一の金属に対する親和性と比較して、高いことを示す。特にカルシウム（Ｃａ2+）イオンなどの金属イオンと結合能を有するキレート化剤が、洗剤において、および、一般的に洗濯または食器洗浄などの洗浄用の組成物において広く用いられている。しかしながら、キレート化剤は、それら自体が酵素活性を阻害してしまうことが分っている。キレート化剤という用語は、本出願において、「錯化剤」または「キレート化剤」または「キレート剤」と同義的に用いられる。
【００１４】
大部分のプロテアーゼがカルシウム感受性であるために、これらのキレート化剤の存在によって酵素活性が損なわれ得る。プロテアーゼのカルシウム感受性は、所与のプロテアーゼを強キレート化剤の存在下でインキュベートし、対象のプロテアーゼの活性に与えるこのインキュベーションの影響を分析することにより判定可能である。カルシウム感受性プロテアーゼは、インキュベーションの最中にその活性の主たる部分もしくはすべてを喪失することとなる。
【００１５】
コード配列：「コード配列」という用語は、そのポリペプチド生成物アミノ酸配列を直接的に特定するポリヌクレオチドを意味する。コード配列の境界は、一般にオープンリーディングフレームによって判定され、通常は、ＡＴＧ開始コドン、または、ＧＴＧおよびＴＴＧなどの代わりの開始コドンで始まり、ＴＡＡ、ＴＡＧおよびＴＧＡなどの終止コドンで終わる。コード配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成または組換えポリヌクレオチドであり得る。
【００１６】
制御配列：「制御配列」という用語は、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドの発現に必要なすべての成分を意味する。各制御配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドに対して自生であっても外来性であってもよく、または、相互に自生であっても外来性であってもよい。このような制御配列としては、これらに限定されないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモータ、シグナルペプチド配列、および、転写ターミネータが挙げられる。制御配列としては、プロモータ、ならびに、転写および翻訳停止シグナルが最低限挙げられる。制御配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドのコード領域との制御配列の連結反応を促進させる特定の制限部位を導入するために、リンカーと共に提供され得る。
【００１７】
洗剤組成物：「洗剤組成物」という用語としては、別段の定めがある場合を除き、顆粒または粉末形態の汎用またはヘビーデューティー洗浄剤、特にクリーニング洗剤；液体、ゲルまたはペースト形態の汎用洗浄剤、特にいわゆるヘビーデューティー液体（ＨＤＬ）タイプ；液体高級織物洗剤；手洗い用食器洗浄剤またはライトデューティー食器洗浄剤、特に高発泡性タイプのもの；家庭用および産業用途の種々の錠剤、顆粒、液体およびすすぎ補助タイプを含む機械用食器洗浄剤；抗菌性手指洗浄タイプ、クリーニングバー、口腔洗浄剤、義歯洗浄剤、車両またはカーペットシャンプー、浴室クリーナを含む液体クリーニングおよび消毒剤；ヘアシャンプーおよびヘアリンス；シャワーゲル、泡風呂；金属クリーナ；ならびに、漂白添加剤および「染み取りスティック」または前処理タイプなどのクリーニング助剤が挙げられる。「洗剤組成物」および「洗剤配合物」という用語は、汚れた対象物のクリーニング用の洗浄媒体における使用が意図される混合物に関して用いられる。いくつかの実施形態において、この用語は、布および／または衣類の洗濯に関して用いられる（例えば、「洗濯洗剤」）。代替的な実施形態において、この用語は、食器、カトラリー等の洗浄に用いられるものなどの他の洗剤（例えば「食器洗浄洗剤」）を指す。本発明がいずれかの特定の洗剤配合物または組成物に限定されることは意図されていない。本発明に係るプロテアーゼ変異体に追加して、この用語は、例えば、界面活性剤、ビルダー、キレータもしくはキレート化剤、漂白剤系もしくは漂白剤成分、ポリマー、柔軟仕上げ剤、気泡増強剤、泡抑制剤、染料、芳香剤、黄変抑制剤、光学増白剤、殺菌剤、殺菌・殺カビ剤、汚染物懸濁剤、耐食剤、酵素抑制剤もしくは安定化剤、酵素活性化剤、トランスフェラーゼ、加水分解酵素、酸化還元酵素、青味剤および蛍光染料、酸化防止剤、ならびに、溶解剤を含有する洗剤を含んでいることが意図されている。
【００１８】
発現：「発現」という用語は、変異体の生成に関与するいずれかのステップを含み、特にこれらに限定されないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾および分泌が挙げられる。
【００１９】
発現ベクター：「発現ベクター」という用語は、変異体をコードするポリヌクレオチドを含み、また、発現をもたらす追加のヌクレオチドに作動可能に結合している直線状または環状のＤＮＡ分子を意味する。
【００２０】
高ストリンジェンシー条件：「高ストリンジェンシー条件」という用語は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブについて、５×ＳＳＰＥにおける４２℃、０．３％  ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片化および修飾サケ精子ＤＮＡ、ならびに、５０％ホルムアミドでのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション、これに続く、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法を意味する。キャリア材料は、最終的に、２×ＳＳＣ、０．２％  ＳＤＳを用いて、１５分間ずつかけて６５℃で３回洗浄される。
【００２１】
宿主細胞：「宿主細胞」という用語は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物または発現ベクターを伴う形質転換、形質移入、形質導入等に対する感受性を有するいずれかの細胞タイプを意味する。「宿主細胞」という用語は、複製の最中に生じる突然変異によって親細胞とは異なっている親細胞のいずれかの子孫を包含する。
【００２２】
向上した特性：「向上した特性」という用語は、親と比較して、または、基準プロテアーゼ（基準プロテアーゼは、本出願の文脈において、配列番号４のアミノ酸１〜２６９に対応する配列番号４の成熟ポリペプチドである。）と比較して、または、同等の前記変異体のアミノ酸配列を有するが１つまたは複数の前記特定の位置で改変を有さないプロテアーゼと比較して向上した、変異体に関連する特徴を意味する。このような向上した特性としては、これらに限定されないが、キレータ安定性、洗浄性能、プロテアーゼ活性、熱活性プロファイル、耐熱性、ｐＨ活性プロファイル、ｐＨ安定性、基質／補因子特異性、向上した表面特性、基質特異性、生成物特異性、前処理されたバイオマスの存在下における高い安定性または溶解度、保管条件下での向上した安定性、および、化学的安定性が挙げられる。
【００２３】
向上した化学的安定性：「向上した化学的安定性」という用語は、本明細書において、親酵素の酵素活性を低減させる天然もしくは合成の化学物質の存在下におけるインキュベーション期間後に酵素活性の保持を示す変異体酵素として定義される。向上した化学的安定性はまた、このような化学物質の存在下において反応をより良好に触媒することが可能である変異体をもたらし得る。本発明の特定の態様において、向上した化学的安定性は、特に液体洗剤などの洗剤における向上した安定性である。向上した洗剤安定性は、変異体がキレート化剤を含む液体洗剤配合物（液体はゲルまたはペーストをも含む）と混合された場合における、特に本発明に係るプロテアーゼ変異体の向上した安定性である。液体洗剤配合物は、洗濯もしくは自動化された食器洗浄プロセスの最中に加えられる濃縮洗剤、または、洗浄溶液などの希釈洗剤、すなわち濃縮洗剤が加えられた水溶液を指し得る。
【００２４】
安定性：「安定性」という用語は、保管安定性および例えば洗浄プロセスの最中などの使用中における安定性を含み、例えば、プロテアーゼが特に洗剤溶液などの溶液中に維持された場合にどの程度の活性が保持されるかなどの、本発明に係るプロテアーゼ変異体の経時的な安定性に反映される。安定性は、例えばｐＨ、温度、洗剤の組成（例えばビルダー、界面活性剤の量）等の多くの要因によって影響される。プロテアーゼ安定性は、実施例１に記載のキレータ安定性アッセイを用いて計測され得る。
【００２５】
向上した安定性：「向上したキレータ安定性」などの「向上した安定性」という用語は、本明細書において、材料および方法において記載されているキレータ安定性アッセイにおける計測で、例えばｐＨ８、ＥＤＴＡの存在下、５０℃で１６分間後に１６％を超える残存活性を有することにより、ＥＤＴＡなどのキレータを含有する溶液中において、親プロテアーゼの安定性と比して、同等の前記変異体のアミノ酸配列を有するが、１つもしくは複数の前記特定の位置で改変を有さないプロテアーゼと比して、または、配列番号４の成熟ポリペプチドと比して高い安定性を示す変異体酵素として定義される。
【００２６】
向上した洗浄性能：「向上した洗浄性能」という用語は、本明細書において、例えば汚れの除去性が高いことにより、親プロテアーゼの洗浄性能と比して、基準プロテアーゼと比して、または、同等の前記変異体のアミノ酸配列を有するが、１つもしくは複数の前記特定の位置で改変を有さないプロテアーゼと比して、プロテアーゼ変異体の洗浄性能に変化を示すプロテアーゼ変異体として定義される。「洗浄性能」という用語は、洗濯における洗浄性能のみならず、例えば食器洗浄における洗浄性能も含む。洗浄性能は、例えば国際公開第１１０３６２６３号パンフレットにおけるＭａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓに記載されているとおり、Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ａｓｓａｙ（ＡＭＳＡ）における記載で定義されているいわゆる強度値（Ｉｎｔ）を算出することにより定量化され得る。
【００２７】
向上したプロテアーゼ活性：「向上したプロテアーゼ活性」という用語は、本明細書において、高いタンパク質転換により、親プロテアーゼの活性と比して（もしくは、比較して）、または、基準プロテアーゼと比較して、または、同等の前記変異体のアミノ酸配列を有するが、１つもしくは複数の前記特定の位置で改変を有さないプロテアーゼと比して、活性に変化を示すプロテアーゼ変異体の改変プロテアーゼ活性（上記に定義されているとおり）として定義される。
【００２８】
単離された変異体：「単離された変異体」という用語は、人工的に修飾された変異体を意味する。一態様において、この変異体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で、例えば、少なくとも５％の純度、少なくとも１０％の純度、少なくとも２０％の純度、少なくとも４０％の純度、少なくとも６０％の純度、少なくとも８０％の純度および少なくとも９０％の純度などの、少なくとも１％の純度である。
【００２９】
単離されたポリヌクレオチド：「単離されたポリヌクレオチド」という用語は、人為的に修飾されたポリヌクレオチドを意味する。一態様において、単離されたポリヌクレオチドは、アガロース電気泳動による測定で、少なくとも１％の純度、例えば、少なくとも５％の純度、少なくとも１０％の純度、少なくとも２０％の純度、少なくとも４０％の純度、少なくとも６０％の純度、少なくとも８０％の純度、少なくとも９０％の純度および少なくとも９５％の純度である。ポリヌクレオチドは、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成由来のもの、または、いずれかのこれらの組み合わせであり得る。
【００３０】
低ストリンジェンシー条件：「低ストリンジェンシー条件」という用語は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブについて、５×ＳＳＰＥにおける４２℃、０．３％  ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片化および修飾サケ精子ＤＮＡ、ならびに、２５％ホルムアミドでのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション、これに続く、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法を意味する。キャリア材料は、最終的に、２×ＳＳＣ、０．２％  ＳＤＳを用いて、１５分間ずつかけて５０℃で３回洗浄される。
【００３１】
成熟ポリペプチド：「成熟ポリペプチド」という用語は、Ｎ−末端処理、Ｃ−末端切断、グリコシル化、リン酸化等などの、翻訳および任意の翻訳後修飾の後におけるその最終形態でのポリペプチドを意味する。一態様において、成熟ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜２７５、配列番号４のアミノ酸１〜２６９、および、配列番号６のアミノ酸１〜２７４に対応する。
【００３２】
成熟ポリペプチドコード配列：「成熟ポリペプチドコード配列」という用語は、プロテアーゼ活性を有する成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。一態様において、成熟ポリペプチドコード配列は、配列番号１のヌクレオチド１〜９０がシグナルペプチドをコードすることを予測するＳｉｇｎａｌＰ（Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０：１−６）に基づく配列番号１のヌクレオチド３２２〜１１４６である。
【００３３】
一態様において、成熟ポリペプチドコード配列は、配列番号３のヌクレオチド１〜８１がシグナルペプチドをコードすることを予測するＳｉｇｎａｌＰ（Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０：１−６）に基づく配列番号３のヌクレオチド５７７〜１１４０である。
【００３４】
一態様において、成熟ポリペプチドコード配列は、配列番号５のヌクレオチド１〜８１がシグナルペプチドをコードすることを予測するＳｉｇｎａｌＰ（Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０：１−６）に基づく配列番号５のヌクレオチド３１０〜１１３１である。
【００３５】
中ストリンジェンシー条件：「中ストリンジェンシー条件」という用語は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブについて、５×ＳＳＰＥにおける４２℃、０．３％  ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片化および修飾サケ精子ＤＮＡ、ならびに、３５％ホルムアミドでのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション、これに続く、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法を意味する。キャリア材料は、最終的に、２×ＳＳＣ、０．２％  ＳＤＳを用いて、１５分間ずつかけて５５℃で３回洗浄される。
【００３６】
中−高ストリンジェンシー条件：「中−高ストリンジェンシー条件」という用語は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブについて、５×ＳＳＰＥにおける４２℃、０．３％  ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片化および修飾サケ精子ＤＮＡ、ならびに、３５％ホルムアミドでのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション、これに続く、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法を意味する。キャリア材料は、最終的に、２×ＳＳＣ、０．２％  ＳＤＳを用いて、１５分間ずつかけて６０℃で３回洗浄される。
【００３７】
ミュータント：「ミュータント」という用語は、変異体をコードするポリヌクレオチドを意味する。
【００３８】
核酸構築物：「核酸構築物」という用語は、一本鎖もしくは二本鎖である核酸分子を意味し、これは、天然遺伝子から単離されるか、または、本来自然には存在し得ないような核酸のセグメント、もしくは、合成された核酸のセグメントを含有するよう修飾されている。核酸構築物という用語は、核酸構築物が本発明のコード配列の発現に必要とされる制御配列を含有する場合には用語「発現カセット」と同義である。
【００３９】
作動可能に結合：「作動可能に結合」という用語は、制御配列がコード配列の発現をもたらすよう、ポリヌクレオチドのコード配列と比して制御配列が適切な位置に位置されている構成を意味する。
【００４０】
親：「親」という用語は、本発明の酵素変異体をもたらすよう改変が行われたプロテアーゼを意味する。それ故、親は、同等の前記変異体のアミノ酸配列を有するが、前記特定の位置の例えば２つ以上などの１つまたは複数個所に改変を有さないプロテアーゼである。本文脈において、「同等のアミノ酸配列を有する」という表記は、１００％の配列同一性に関すると理解されることとなる。親は、天然（野生型）ポリペプチドまたはその変異体であり得る。特定の実施形態において、親は、配列番号２、４または６の成熟ポリペプチドを伴うポリペプチドに対して、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または、１００％同一性などの少なくとも６０％同一性を有するプロテアーゼである。
【００４１】
配列同一性：２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間の関連性が、「配列同一性」というパラメータによって記載される。本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度は、好ましくはバージョン３．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて判定される。用いられる任意のパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティおよびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳボージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長の同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性割合として用いられ、以下のとおり算出される。
（同等の残基×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数）
【００４２】
本発明の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、ＥＭＢＯＳＳ  ｐａｃｋａｇｅ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，ｓｕｐｒａ）、好ましくはバージョン３．０．０以降のＮｅｅｄｌｅ  ｐｒｏｇｒａｍに実装されているＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，ｓｕｐｒａ）を用いて判定される。用いられる任意のパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティ、および、ＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ  ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長の同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性割合として用いられ、以下のとおり算出される。
（同等のデオキシリボヌクレオチド×１００）／（アライメントの長さ−ギャップの総数
【００４３】
実質的に純粋な変異体：「実質的に純粋な変異体」という用語は、元々または組換え的に関連している他のポリペプチド材料を、重量基準で最大で１０％、最大で８％、最大で６％、最大で５％、最大で４％、最大で３％、最大で２％、最大で１％および最大で０．５％で含有する調製物を意味する。好ましくは、変異体は、重量基準で、調製物中に存在するポリペプチド材料の合計の少なくとも９２％の純度、例えば、少なくとも９４％の純度、少なくとも９５％の純度、少なくとも９６％の純度、少なくとも９７％の純度、少なくとも９８％の純度、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％の純度、および、１００％の純度である。本発明の変異体は、実質的に純粋な形態であることが好ましい。これは、例えば、周知の組換え法または従来の精製法によって変異体を調製することにより達成可能である。
【００４４】
実質的に純粋なポリヌクレオチド：「実質的に純粋なポリヌクレオチド」という用語は、他の外来性または不要なヌクレオチドを含まず、および、遺伝的に操作されたポリペプチド産生系における使用に好適な形態のポリヌクレオチド調製物を意味する。それ故、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、元々または組換え的に関連している他のポリヌクレオチド材料を最大で１０重量％、最大で８重量％、最大で６重量％、最大で５重量％、最大で４重量％、最大で３重量％、最大で２重量％、最大で１重量％および最大で０．５重量％含有する。しかしながら、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、プロモータおよびターミネータなどの天然の５’−および３’−非翻訳領域を含み得る。実質的に純粋なポリヌクレオチドは、重量基準で、少なくとも９０％の純度、例えば、少なくとも９２％の純度、少なくとも９４％の純度、少なくとも９５％の純度、少なくとも９６％の純度、少なくとも９７％の純度、少なくとも９８％の純度、少なくとも９９％の純度および少なくとも９９．５％の純度であることが好ましい。本発明のポリヌクレオチドは、実質的に純粋な形態であることが好ましい。
【００４５】
変異体：「変異体」という用語は、１つもしくは複数（または１つもしくはいくつか）の位置で改変（すなわち、置換、挿入および／または欠失）を含むプロテアーゼ活性を有するポリペプチドを意味する。置換とは、ある位置を占めるアミノ酸を異なるアミノ酸で置き換えることを意味し；欠失とは、ある位置を占めるアミノ酸の除去を意味し；ならびに、挿入とは、９つのアミノ酸など、８つのアミノ酸など、７つのアミノ酸など、６つのアミノ酸など、５つのアミノ酸など、４つのアミノ酸など、好ましくは１〜３つのアミノ酸、より好ましくは１〜２つのアミノ酸、および、最も好ましくは２つのアミノ酸などの例えば１〜１０のアミノ酸などのアミノ酸をある位置を占めるアミノ酸の隣に加えることを意味する。欠失は、少なくとも１つのアミノ酸を除去して、変異体を配列その親よりも短くすることである。
【００４６】
超高ストリンジェンシー条件：「超高ストリンジェンシー条件」という用語は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブについて、５×ＳＳＰＥにおける４２℃、０．３％  ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片化および修飾サケ精子ＤＮＡ、ならびに、５０％ホルムアミドでのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション、これに続く、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法を意味する。キャリア材料は、最終的に、２×ＳＳＣ、０．２％  ＳＤＳを用いて、１５分間ずつかけて７０℃で３回洗浄される。
【００４７】
超低ストリンジェンシー条件：「超低ストリンジェンシー条件」という用語は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブについて、５×ＳＳＰＥにおける４２℃、０．３％  ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片化および修飾サケ精子ＤＮＡ、ならびに、２５％ホルムアミドでのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション、これに続く、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法を意味する。キャリア材料は、最終的に、２×ＳＳＣ、０．２％  ＳＤＳを用いて、１５分間ずつかけて４５℃で３回洗浄される。
【００４８】
洗浄性能：「洗浄性能」という用語は、洗濯または硬質面クリーニングなどの例えば洗浄の最中にクリーニングされるべき対象物に存在する汚れを取り除く酵素の能力として用いられる。洗浄性能の向上は、例えば国際公開第１１０３６２６３号パンフレットにおけるＭａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓに記載されているとおり、ＡＭＳＡアッセイにおける記載で定義されているいわゆる強度値（Ｉｎｔ）を算出することにより定量化され得る。
【００４９】
野生型プロテアーゼ：「野生型プロテアーゼ」という用語は、自然界において見出されるバクテリア、古細菌、イースト菌、真菌、植物または動物などの自然に生じる生物により発現されるプロテアーゼを意味する。野生型プロテアーゼの一例は、ＢＰＮ’、すなわち配列番号２のアミノ酸１〜２７５である。
【００５０】
転写プロモータ：「転写プロモータ」という用語は、特定の遺伝子の転写を促進するＤＮＡの領域であるプロモータについて用いられる。転写プロモータは、典型的には、同一のストランドおよび上流（有意鎖の５’領域側）上で制御される遺伝子の近くに位置される。
【００５１】
転写ターミネータ：「転写ターミネータ」という用語は、遺伝子の端部または転写に係るゲノムＤＮＡのオペロンをマーキングするゲノム配列のセクションに用いられる。
【００５２】
従来の変異体の決定
本発明の目的のために、配列番号２において開示されている成熟ポリペプチドは、他のサブチリシン中の対応するアミノ酸残基の判定に用いられ、これは、「ＢＰＮ’番号付け」とも呼ばれる。以下の「〜に対応する」という用語は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置に対応すると理解されるべきであり、すなわち、本書面を通した番号付けはＢＰＮ’に従うものである。
【００５３】
他のサブチリシンのアミノ酸配列が配列番号２の成熟ポリペプチド（配列番号２のアミノ酸１〜２７５）と共にアラインされ、アライメントに基づいて、配列番号２において開示されている成熟ポリペプチド中の任意のアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置番号が、ＥＭＢＯＳＳ  ｐａｃｋａｇｅ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）、好ましくはバージョン５．０．０以降のＮｅｅｄｌｅ  ｐｒｏｇｒａｍに実装されているＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて判定される。用いられるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティ、および、ＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。他のサブチリシンにおける対応するアミノ酸残基の同定は、特にこれらに限定されないが、ＭＵＳＣＬＥ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｂｙ  ｌｏｇ‐ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ；バージョン３．５以降；Ｅｄｇａｒ，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２：１７９２−１７９７）、ＭＡＦＦＴ（バージョン６．８５７以降；Ｋａｔｏｈ  ａｎｄ  Ｋｕｍａ，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０：３０５９−３０６６；Ｋａｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３３：５１１−５１８；Ｋａｔｏｈ  ａｎｄ  Ｔｏｈ，２００７，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２３：３７２−３７４；Ｋａｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５３７：３９−６４；Ｋａｔｏｈ  ａｎｄ  Ｔｏｈ，２０１０，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２６：１８９９−１９００）、および、ＣｌｕｓｔａｌＷを採用するＥＭＢＯＳＳ  ＥＭＭＡ（１．８３以降；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２：４６７３−４６８０）を含むいくつかのコンピュータプログラムを、それぞれのデフォルトパラメータで用いることによる複数のポリペプチド配列のアライメントにより判定可能である。
【００５４】
配列番号２の成熟型ポリペプチドから他の酵素が分化して、従来からの配列に基づく比較による関係の検出ができない場合（Ｌｉｎｄａｈｌ  ａｎｄ  Ｅｌｏｆｓｓｏｎ，２０００，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９５：６１３−６１５）、他の対配列比較アルゴリズムを用いることが可能である。配列に基づくサーチにおける感度は、データベースのサーチにポリペプチドファミリー（プロファイル）の確率表現を利用するサーチプログラムを用いることで高めることが可能である。例えば、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムは、反復データベースサーチプロセスを介してプロファイルを生成し、離れた相同体を検出することが可能である（Ａｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）。ポリペプチドに係るファミリーまたはスーパーファミリーがタンパク質構造データベースにおいて１つまたは複数の表現を有する場合には、感度をさらに高めることが可能である。ＧｅｎＴＨＲＥＡＤＥＲ（Ｊｏｎｅｓ，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：７９７−８１５；ＭｃＧｕｆｆｉｎ  ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ，２００３，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １９：８７４−８８１）などのプログラムは、問い合わせ配列に係るフォールド構造を予想するニューラルネットワークに対する入力として、多様なソース（ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、二次構造予測、構造アラインメントプロファイルおよび溶媒和ポテンシャル）からの情報を利用する。同様に、Ｇｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１３：９０３−９１９による方法が、未知の構造の配列とＳＣＯＰデータベースに存在するスーパーファミリーモデルとのアラインに用いられることが可能である。次いで、これらのアラインメントを用いてポリペプチドに係る相同性モデルを生成することが可能であり、このようなモデルは、その目的のために開発された多様なツールを用いて正確に評価可能である。
【００５５】
公知の構造のタンパク質に関して、数々のツールおよびリソースが、構造アラインメントの検索および生成のために使用可能である。例えばタンパク質のＳＣＯＰスーパーファミリーが構造的にアラインされており、これらのアラインメントはアクセスおよびダウンロードが可能である。２つ以上のタンパク質構造は距離アラインメントマトリックス（Ｈｏｌｍ  ａｎｄ  Ｓａｎｄｅｒ，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ３３：８８−９６）または組み合わせ拡張法（Ｓｈｉｎｄｙａｌｏｖ  ａｎｄ  Ｂｏｕｒｎｅ，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１：７３９−７４７）などの多様なアルゴリズムを用いてアラインすることが可能であり、これらのアルゴリズムを、可能性のある構造相同体を発見するために、対象の構造と共に問い合わせ構造データベースに対して追加的に実行することが可能である（例えば、Ｈｏｌｍ  ａｎｄ  Ｐａｒｋ，２０００，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １６：５６６−５６７）。
【００５６】
本発明の変異体の記載において、以下の命名法が参照を容易とするために採用される。公認されているＩＵＰＡＣの１文字または３文字のアミノ酸略記が利用されている。
【００５７】
置換．アミノ酸置換に関しては以下の命名法が用いられている：元のアミノ酸、位置、置換されたアミノ酸。従って、位置２２６でのスレオニンのアラニンでの置換は、「Ｔｈｒ２２６Ａｌａ」または「Ｔ２２６Ａ」と示される。複数の突然変異は加算記号（「＋」）によって分けられており、例えば、「Ｇｌｙ２０５Ａｒｇ＋Ｓｅｒ４１１Ｐｈｅ」または「Ｇ２０５Ｒ＋Ｓ４１１Ｆ」とされ、それぞれ、グリシン（Ｇ）のアルギニン（Ｒ）による、および、セリン（Ｓ）のフェニルアラニン（Ｆ）による位置２０５および４１１での置換が表されている。
【００５８】
欠失：アミノ酸欠失に関しては以下の命名法が用いられている：元のアミノ酸、位置*。従って、位置１９５でのグリシンの欠失は「Ｇｌｙ１９５*」または「Ｇ１９５*」と示される。複数の欠失は加算記号（「＋」）によって分けられており、例えば、「Ｇｌｙ１９５*＋Ｓｅｒ４１１*」または「Ｇ１９５*＋Ｓ４１１*」とされる。
【００５９】
挿入：Ｇ１９５の後への例えばリシンなどの追加のアミノ酸残基の挿入は：Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓまたはＧ１９５ＧＫと示され得る。あるいは、Ｇ１９５の後へのリシンなどの追加のアミノ酸残基の挿入は：*１９５ａＬと示され得る。例えばＬｙｓ、およびＧ１９５の後のＡｌａなどの２つ以上のアミノ酸残基が挿入される場合、これは：Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓＡｌａまたはＧ１９５ＧＫＡと示され得る。このような場合には、挿入されたアミノ酸残基はまた、挿入されたアミノ酸残基の前のアミノ酸残基の位置番号に小文字を加えることにより番号が付与され得、この例においては：*１９５ａＫ*１９５ｂＡである。上記の例において、配列１９４〜１９６はそれ故、以下のとおりとなろう。
【００６０】
【化１】
2015500006.tif 000002
【００６１】
置換および挿入が同一の位置で生じる場合、これは、Ｓ９９ＳＤ＋Ｓ９９Ａ、または、単にＳ９９ＡＤと示され得る。同一の修飾もまた、Ｓ９９Ａ＋*９９ａＤと示され得る。
【００６２】
既存のアミノ酸残基と同等のアミノ酸残基が挿入される場合、命名法における重複が生じてしまうことが明らかである。例えば上記の例においてグリシンがグリシンの後に挿入される場合、これは、Ｇ１９５ＧＧまたは*１９５ａＧｂＧと示されることとなる。同一の実際の変化は、
【００６３】
【化２】
2015500006.tif 000003
【００６４】
から
【００６５】
【化３】
2015500006.tif 000004
【００６６】
への変化については、単に、Ａ１９４ＡＧまたは*１９４ａＧとも示されることも可能である。
【００６７】
このような事例は当業者にとっては明らかであり、表記Ｇ１９５ＧＧおよびこの種の挿入に係る対応する表記は、それ故、このような同等の重複した表記を含むことが意図されることとなる。
【００６８】
複数の改変．複数の改変を含む変異体は加算記号（「＋」）によって区切られており、例えば、「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ＋Ｇｌｙ１９５Ｇｌｕ」または「Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ」はそれぞれ、位置１７０および１９５のアルギニンおよびグリシンのチロシンおよびグルタミン酸による置換を表す。あるいは、複数の改変は、スペースまたはコンマによって区切られていてもよい（例えば、それぞれ、Ａ１７０Ｙ  Ｇ１９５Ｅ、または、Ａ１７０Ｙ、Ｇ１９５Ｅ）。
【００６９】
異なる改変．異なる改変を１つの位置に導入することが可能である場合、これらの異なる改変はコンマによって区切られ、例えば、「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ，Ｇｌｕ」は、位置１７０におけるアルギニンのチロシンまたはグルタミン酸による置換を表す。それ故、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ，Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ，Ａｌａ」は以下の変異体を表す：
「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」、「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、および「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」。
【００７０】
あるいは、異なる改変または任意の置換は括弧内に示されていてもよく、例えばＡｒｇ１７０［Ｔｙｒ，Ｇｌｕ］もしくはＡｒｇ１７０｛Ｔｙｒ，Ｇｌｕ｝とされるか、または、Ｒ１７０［Ｙ，Ｅ］またはＲ１７０｛Ｙ，Ｅ｝と略記される。
【００７１】
アミノ酸位置／残基の番号付け
他の記載がない場合には、本明細書において用いられるアミノ酸に係る番号付けは、サブチラーゼＢＰＮ’（ＢＡＳＢＰＮ）配列のものに対応している。ＢＰＮ’配列のさらなる説明については、配列番号２（アミノ酸１〜２７５）、または、Ｓｉｅｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｎｇ．４  （１９９１）  ７１９−７３７を参照のこと。
【発明を実施するための形態】
【００７２】
発明の詳細な説明
本発明者らは、配列番号２の成熟ポリペプチドのアミノ酸残基７５〜８２に対応する強カルシウムイオン結合部位における改変を伴うサブチラーゼであって、改変が置換もしくは挿入であるものは、ＥＤＴＡなどのキレータを含む洗剤組成物中において高い安定性を有する変異体をもたらすことを見出した。理論に束縛されることは望まないが、配列番号２を有する成熟ポリペプチドのアミノ酸残基７５〜８２に対応する領域における、ＢＰＮ’（配列番号２のアミノ酸１〜２７５）、サブチリシン３０９（配列番号４のアミノ酸１〜２６９）またはＡｌｃａｌａｓｅ（配列番号６のアミノ酸１〜２７４）などのサブチリシンのカルシウム結合部位における改変により、この領域が、プロテアーゼＴＹ１４５（国際公開第９２／１７５７７号パンフレットに記載のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）由来のサブチラーゼＴＹ１４５、ＮＣＩＭＢ４０３３９）の対応する領域に類似するものとされるか、または、ＴＹ１４５に対して相同性の配列とされ、これにより、例えば配列番号２、４または６の成熟ポリペプチドなどのその親プロテアーゼと比較した場合に、ＥＤＴＡなどのキレータを含有する溶液中におけるサブチラーゼ変異体の安定性が高められると現在は考えられている。特に、本発明者らは、領域７５〜８２の配列番号２の成熟ポリペプチドの残基７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応するカルシウムイオン結合部位の、ＴＹ１４５タイプの残基またはＴＹ１４５に対する相同性配列に由来する残基による交換が、例えば配列番号４の成熟ポリペプチドなどの親と比較した場合に、ＤＴＡなどのキレータを含有する洗剤溶液中における安定性の増大を示すことを見出した。さらに、カルシウム独立領域と既知の安定性突然変異との組み合わせは、変異体の残存活性を親の残存活性と比較した場合、同等の前記変異体のアミノ酸配列を有するが、１つまたは複数の前記特定の位置で１つまたは複数の改変を有さないプロテアーゼと比較した場合、または、基準プロテアーゼと比較した場合に、ＥＤＴＡなどのキレータを含む洗剤中における高い活性を有するきわめて安定で、機能的な組み合わせ変異体をもたらした。特に、配列番号２の成熟ポリペプチドのアミノ酸残基７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸を、ＴＹ１４５の対応する領域と同様のアミノ酸、または、配列番号２の成熟ポリペプチドのアミノ酸残基７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入と組み合わされた相同性配列と置換することにより、ＥＤＴＡなどのキレータを含む洗剤組成物中においてきわめて安定であるカルシウム独立変異体がもたらされる。
【００７３】
それ故、本発明は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応する２つ以上の位置で改変を含むサブチラーゼ変異体に関し、ここで、改変の各々は、独立して、置換または挿入であり、また、ここで、変異体はプロテアーゼ活性を有する。「〜での改変」という用語は、本出願の文脈において、ある位置での置換、および、２つの位置で、または、これらの間での挿入を意味する。好ましい実施形態において、プロテアーゼ変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応する領域における１つまたは複数にアミノ酸の置換を含み、さらに、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応する領域において少なくとも１つのアミノ酸の挿入を含み、ここで、変異体は、配列番号２、４または６の成熟ポリペプチドに対して少なくとも６５％同一性を有する。本発明の一態様は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応する２つ以上の位置で改変を含むサブチラーゼ変異体に関し、ここで、前記２つの改変は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも２つの追加のアミノ酸残基の挿入である。好ましい態様において、本発明に係るサブチラーゼ変異体は、例えば配列番号２の成熟ポリペプチドまたは配列番号４の成熟ポリペプチドなどの親プロテアーゼと比較して少なくとも２つの追加のアミノ酸を含んでおり、これにより、前記追加のアミノ酸残基は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における２つのアミノ酸残基の挿入に相当する。特定の好ましい態様において、前記追加のアミノ酸残基は、ＧｌｙまたはＡｓｐからなる群から選択され、それ故、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域が２つのアミノ酸によって延伸される。それ故、本発明の一態様は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域において２つの追加のアミノ酸残基を含む変異体に関し、これにより、前記追加のアミノ酸残基は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における２つのアミノ酸残基の挿入に相当し、ここで、前記アミノ酸残基はＧｌｙまたはＡｓｐからなる群から選択され、また、ここで、前記領域は２つのアミノ酸によって延伸される。それ故、本発明の特定の態様は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域において少なくとも１つの追加のアミノ酸残基を含むサブチラーゼ変異体に関し、ここで、少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入は、挿入*７５ａＧ、*７５ａＤまたは*７５ａ［Ｇ，Ｄ］  *７５ｂ［Ｇ，Ｄ］（後者は２つのアミノ酸が位置７５と７６との間に挿入されたことを示し、以下のいずれかであり得る：*７５ａＧ＋*７５ｂＧ；*７５ａＤ＋*７５ｂＤ；*７５ａＧ＋*７５ｂＤまたは*７５ａＤ＋*７５ｂＧ）などの位置７５と７６との間であり、および、少なくとも１つの追加の修飾をさらに含む（ＢＰＮ番号付け、すなわち、配列番号２の成熟ポリペプチドに従う番号付け）。特定の態様において、本発明は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領���において少なくとも１つの追加のアミノ酸残基を含むサブチラーゼ変異体に関し、ここで、少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入は、挿入*７６ａＧ、*７６ａＤまたは*７６ａ［Ｇ，Ｄ］  *７６ｂ［Ｇ，Ｄ］などの位置７６と７７との間であり、および、少なくとも１つの追加の修飾をさらに含む（ＢＰＮ番号付け）。特定の態様において、本発明は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域において少なくとも１つの追加のアミノ酸残基を含むサブチラーゼ変異体に関し、ここで、少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入は、挿入*７７ａＧ、*７７ａＤまたは*７７ａ［Ｇ，Ｄ］  *７７ｂ［Ｇ，Ｄ］などの位置７７と７８との間であり、ならびに、少なくとも１つの追加の修飾をさらに含む（ＢＰＮ番号付け）。特定の態様において、本発明は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域において少なくとも１つの追加のアミノ酸残基を含むサブチラーゼ変異体に関し、ここで、少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入は、挿入*７８ａＧ、*７８ａＤまたは*７８ａ［Ｇ，Ｄ］  *７８ｂ［Ｇ，Ｄ］などの位置７８と７９との間であり、ならびに、少なくとも１つの追加の修飾をさらに含む（ＢＰＮ番号付け）。特定の態様において、本発明は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域において少なくとも１つの追加のアミノ酸残基を含むサブチラーゼ変異体に関し、ここで、少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入は、挿入*７９ａＧ、*７９ａＤまたは*７９ａ［Ｇ，Ｄ］  *７９ｂ［Ｇ，Ｄ］などの位置７９と８０との間であり、ならびに、少なくとも１つの追加の修飾をさらに含む（ＢＰＮ番号付け）。特定の態様において、本発明は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域において少なくとも１つの追加のアミノ酸残基を含むサブチラーゼ変異体に関し、ここで、少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入は、挿入*８０ａＧ、*８０ａＤまたは*８０ａ［Ｇ，Ｄ］  *８０ｂ［Ｇ，Ｄ］などの位置８０と８１との間であり、ならびに、少なくとも１つの追加の修飾をさらに含み（ＢＰＮ番号付け）、特定の態様において、本発明は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域において少なくとも１つの追加のアミノ酸残基を含むサブチラーゼ変異体に関し、ここで、少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入は、挿入*８１ａＧ、*８１ａＤまたは*８１ａ［Ｇ，Ｄ］  *８１ｂ［Ｇ，Ｄ］などの位置８１と８２との間であり、ならびに、少なくとも１つの追加の修飾をさらに含む（ＢＰＮ番号付け）。ここで、追加の修飾は、Ｌ７５［Ｄ，Ｈ］、Ｎ７６［Ｓ，Ｄ，Ｙ］、Ｎ７７［Ｄ］、Ｓ７８［Ｑ，Ｇ］、Ｉ７９［Ａ，Ｔ，Ｑ］およびＬ８２［Ｙ］から選択されることが好ましく、また、ここで、変異体は、配列番号２、４または６の成熟ポリペプチドに対する、例えば、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なく���も９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％同一性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％などの、少なくとも７０％などの少なくとも６５％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。
【００７４】
本発明の好ましい態様は、少なくとも１つの置換および少なくとも１つの挿入を、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域に含むサブチラーゼ変異体に関する。さらに好ましい態様において、本発明は、少なくとも１つの置換（ここで、前記置換は、Ｌ７５［Ｄ，Ｈ］、Ｎ７６［Ｓ，Ｄ，Ｙ］、Ｎ７７［Ｄ］、Ｓ７８［Ｑ，Ｇ］、Ｉ７９［Ａ，Ｔ，Ｑ］およびＬ８２［Ｙ］からなる群から選択される）、および、少なくとも１つの挿入を配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域に含むサブチラーゼ変異体に関する。特定の好ましい態様において、本発明に係る変異体は、少なくとも１つの置換（ここで、前記置換は、Ｌ７５［Ｄ，Ｈ］、Ｎ７６［Ｓ，Ｄ，Ｙ］、Ｎ７７［Ｄ］、Ｓ７８［Ｑ，Ｇ］、Ｉ７９［Ａ，Ｔ，Ｑ］およびＬ８２［Ｙ］からなる群から選択される）、および、少なくとも２つの挿入を配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域に含む。特定の好ましい態様において、本発明に係る変異体は、少なくとも１つの置換および少なくとも２つの挿入を配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域に含む。さらに好ましい態様において、本発明に係る変異体は、少なくとも２つの置換を配列番号２の位置７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応する領域に含み、ここで、前記置換は、Ｌ７５［Ｄ，Ｈ］、Ｎ７６［Ｓ，Ｄ，Ｙ］、Ｎ７７［Ｄ］、Ｓ７８［Ｑ，Ｇ］、Ｉ７９［Ａ，Ｔ，Ｑ］およびＬ８２［Ｙ］からなる群から選択され、ここで、変異体は、２つのアミノ酸残基の挿入を配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域にさらに含み、ここで、前記挿入されたアミノ酸残基は、ＧｌｙまたはＡｓｐからなる群から選択され、また、ここで、前記領域は２つのアミノ酸によって延伸される。
【００７５】
それ故、本発明は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応する２つ以上の位置で改変を含むサブチラーゼ変異体に関し、ここで、各改変は独立して置換もしくは挿入であり、また、ここで、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％同一性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％などの、少なくとも７０％などの少なくとも６５％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。本発明は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応する２つ以上の位置で改変を含むサブチラーゼ変異体にさらに関し、ここで、各改変は独立して置換もしくは挿入であり、また、ここで、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％同一性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％などの、少なくとも７０％などの少なくとも６５％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。他の態様において、本発明は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応する２つ以上の位置で改変を含むサブチラーゼ変異体に関し、ここで、各改変は独立して置換もしくは挿入であり、また、ここで、変異体は、配列番号６の成熟ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％同一性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％などの、少なくとも７０％などの少なくとも６５％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。一実施形態において、本発明に係る変異体は、配列番号１、３もしくは５の成熟ポリペプチドコード配列、または、配列番号２、４または６の成熟ポリペプチドをコードする配列に対して少なくとも６０％同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドである。一実施形態において、本発明に係る変異体は、配列番号１、３または５の成熟ポリペプチドに対して、少なくとも６５％同一性、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％同一性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドである。
【００７６】
他の実施形態は、親サブチラーゼに、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応する２つ以上の位置で改変を導入するステップであって、改変が独立して置換または挿入であるステップ；変異体を回収するステップ、ならびに、前記変異体がプロテアーゼ活性を有するかをテストするステップを含むサブチラーゼ変異体の入手方法に関する。特定の態様は、親サブチラーゼに、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応する２つ以上の位置で改変を導入するステップであって、改変が独立して置換または挿入であるステップを含むサブチラーゼ変異体の入手方法に関し、ここで、変異体は：
ａ．配列番号２、４または６の成熟ポリペプチドに対して少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド；
ｂ．低ストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号１、３もしくは５の成熟ポリペプチドコード配列、（ｉｉ）そのｃＤＮＡ配列、または、（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の完全長補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
ｃ．配列番号１、３もしくは５の成熟ポリペプチドコード配列に対して少なくとも６０％同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または、そのｃＤＮＡ配列；および
ｄ．プロテアーゼ活性を有する配列番号２、４または６の成熟ポリペプチドの断片
からなる群から選択される親サブチラーゼの変異体である。
【００７７】
特定の実施形態は、親サブチラーゼに、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応する２つ以上の位置で改変を導入するステップであって、改変が独立して置換または挿入であるステップを含む方法に関し、ここで、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％同一性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、または、１００％などの少なくとも７０％などの少なくとも６５％の配列同一性を有する親サブチラーゼの変異体である。他の特定の実施形態は、親サブチラーゼに、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応する２つ以上の位置で改変を導入するステップであって、改変が独立して置換または挿入であるステップを含む方法に関し、ここで、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％同一性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、または、１００％などの少なくとも７０％などの少なくとも６５％の配列同一性を有する親サブチラーゼの変異体である。さらに他の特定の実施形態は、親サブチラーゼに、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応する２つ以上の位置で改変を導入するステップであって、改変が独立して置換または挿入であるステップを含む方法に関し、ここで、変異体は、配列番号６の成熟ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％同一性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、または、１００％などの少なくとも７０％などの少なくとも６５％の配列同一性を有する親サブチラーゼの変異体である。特定の一実施形態において、プロテアーゼ変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応する領域における２つ以上のアミノ酸の置換を含む配列番号４の成熟ポリペプチドの変異体である。他の実施形態において、本発明は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応する２、３、４または５つのアミノ酸の置換を含む配列番号４の成熟ポリペプチドの変異体に関し、ここで、前記置換は、Ｌ７５［Ｄ，Ｈ］、Ｎ７６［Ｓ，Ｄ，Ｙ］、Ｎ７７［Ｄ］、Ｓ７８［Ｑ，Ｇ］、Ｉ７９［Ａ，Ｔ，Ｑ］およびＬ８２［Ｙ］からなる群から選択される。好ましい実施形態は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応する２、３、４または５つのアミノ酸の置換を含む配列番号４の成熟ポリペプチドの変異体に関し、ここで、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドに対して、少なくとも７０％、例えば、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％同一性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％などの少なくとも６５％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。
【００７８】
特に好ましい実施形態は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応する２、３、４、５または６つのアミノ酸の置換を含む配列番号４の成熟ポリペプチドの変異体に関し、ここで、前記置換は、Ｌ７５［Ｄ，Ｈ］、Ｎ７６［Ｓ，Ｄ，Ｙ］、Ｎ７７［Ｄ］、Ｓ７８［Ｑ，Ｇ］、Ｉ７９［Ａ，Ｔ，Ｑ］およびＬ８２［Ｙ］からなる群から選択され、ここで、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における２つのアミノ酸残基の挿入をさらに含み、ここで、前記挿入されたアミノ酸残基は、ＧｌｙまたはＡｓｐからなる群から選択され、また、ここで、変異体は、少なくとも７０％などの配列番号４の成熟ポリペプチドに対する少なくとも６５％同一性を有し、例えば、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％同一性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列番号４の成熟ポリペプチドに対する配列同一性を有する。
【００７９】
他の実施形態において、本発明は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応する２、３、４または５つのアミノ酸の置換を含む配列番号２の成熟ポリペプチドの変異体に関し、ここで、前記置換は、Ｌ７５［Ｄ，Ｈ］、Ｎ７６［Ｓ，Ｄ，Ｙ］、Ｎ７７［Ｄ］、Ｓ７８［Ｑ，Ｇ］、Ｉ７９［Ａ，Ｔ，Ｑ］およびＬ８２［Ｙ］からなる群から選択され、ここで、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における２つのアミノ酸残基の挿入をさらに含み、ここで、前記挿入されたアミノ酸残基は、ＧｌｙまたはＡｓｐからなる群から選択され、また、ここで、変異体は、少なくとも７０％などの配列番号２の成熟ポリペプチドに対する少なくとも６５％同一性を有し、例えば、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％同一性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列番号２の成熟ポリペプチドに対する配列同一性を有する。
【００８０】
第３の態様は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応する２、３、４または５つのアミノ酸の置換を含む配列番号６の成熟ポリペプチドの変異体に関し、ここで、前記置換は、Ｌ７５［Ｄ，Ｈ］、Ｎ７６［Ｓ，Ｄ，Ｙ］、Ｎ７７［Ｄ］、Ｓ７８［Ｑ，Ｇ］、Ｉ７９［Ａ，Ｔ，Ｑ］およびＬ８２［Ｙ］からなる群から選択され、ここで、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における２つのアミノ酸残基の挿入をさらに含み、ここで、前記挿入されたアミノ酸残基は、ＧｌｙまたはＡｓｐからなる群から選択され、また、ここで、変異体は、少なくとも７０％などの配列番号６の成熟ポリペプチドに対する少なくとも６５％同一性を有し、例えば、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％同一性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列番号６の成熟ポリペプチドに対する配列同一性を有する。
【００８１】
本発明は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応する１つまたは複数（例えばいくつか）の位置で挿入および／または置換を含むサブチラーゼ変異体を提供する。本発明はプロテアーゼ変異体にも関し、ここで、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応する領域は少なくとも１つのアミノ酸によって延伸されている。配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入に加えて、この領域における置換はまた、同等の前記変異体のアミノ酸配列を有するが、１つもしくは複数の前記特定の位置で１つもしくは複数の改変を有さないプロテアーゼと比較して、または、基準プロテアーゼと比較して向上したキレータ安定性をもたらす。それ故、本発明は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応する２つ以上（例えばいくつか）の位置で改変を含むサブチリシン変異体に関し、ここで、変異体はプロテアーゼ活性を有する。本発明の一実施形態は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応する領域において、１つまたは複数のアミノ酸の挿入を少なくとも１つのアミノ酸の置換と共に含むサブチラーゼ変異体に関し、ここで、変異体はプロテアーゼ活性を有する。本発明の特定の実施形態は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応する領域において、１つまたは複数のアミノ酸の挿入を少なくとも１つのアミノ酸の置換と共に含む単離されたプロテアーゼ変異体に関し、ここで、変異体は、配列番号２、４または６の成熟ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％同一性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％などの、少なくとも７０％などの少なくとも６５％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。
【００８２】
一実施形態において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５に対応する位置で置換を含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【００８３】
一実施形態において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７６に対応する位置で置換を含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【００８４】
一実施形態において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７７に対応する位置で置換を含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【００８５】
一実施形態において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７８に対応する位置で置換を含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【００８６】
一実施形態において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７９に対応する位置で置換を含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【００８７】
一実施形態において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置８２に対応する位置で置換を含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【００８８】
一実施形態において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５および７６に対応する位置で２つの置換を含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【００８９】
一実施形態において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５および７７に対応する位置で２つの置換を含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【００９０】
一実施形態において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５および７８に対応する位置で２つの置換を含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【００９１】
一実施形態において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５および７９に対応する位置で２つの置換を含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【００９２】
一実施形態において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５および８２に対応する位置で２つの置換を含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【００９３】
一実施形態において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７６および７７に対応する位置で２つの置換を含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【００９４】
一実施形態において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７６および７８に対応する位置で２つの置換を含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【００９５】
一実施形態において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７６および７９に対応する位置で２つの置換を含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【００９６】
一実施形態において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７６および８２に対応する位置で２つの置換を含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【００９７】
一実施形態において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７７および７８に対応する位置で２つの置換を含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【００９８】
一実施形態において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７７および７９に対応する位置で２つの置換を含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【００９９】
一実施形態において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７７および８２に対応する位置で２つの置換を含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【０１００】
一実施形態において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７８および７９に対応する位置で２つの置換を含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【０１０１】
一実施形態において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７８および８２に対応する位置で２つの置換を含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【０１０２】
一実施形態において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７９および８２に対応する位置で２つの置換を含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【０１０３】
一実施形態において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６および７７に対応する位置で３つの置換を含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【０１０４】
一実施形態において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６および７８に対応する位置で３つの置換を含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【０１０５】
一実施形態において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６および７９に対応する位置で３つの置換を含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【０１０６】
一実施形態において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６および８２に対応する位置で３つの置換を含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【０１０７】
一実施形態において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７６、７７および７８に対応する位置で３つの置換を含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【０１０８】
一実施形態において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７６、７７および７９に対応する位置で３つの置換を含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【０１０９】
一実施形態において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７６、７７および８２に対応する位置で３つの置換を含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【０１１０】
一実施形態において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７７、７８および７９に対応する位置で３つの置換を含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【０１１１】
一実施形態において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７７、７８および８２に対応する位置で３つの置換を含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【０１１２】
一実施形態において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７８、７９および８２に対応する位置で３つの置換を含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【０１１３】
一実施形態において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７および７８に対応する位置で４つの置換を含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【０１１４】
一実施形態において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７および７９に対応する位置で４つの置換を含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【０１１５】
一実施形態において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７および８２に対応する位置で４つの置換を含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【０１１６】
一実施形態において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７６、７７、７８および７９に対応する位置で４つの置換を含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【０１１７】
一実施形態において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７６、７７、７８および８２に対応する位置で４つの置換を含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【０１１８】
一実施形態において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７７、７８、７９および８２に対応する位置で４つの置換を含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【０１１９】
一実施形態において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８および７９に対応する位置で５つの置換を含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【０１２０】
一実施形態において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８および８２に対応する位置で５つの置換を含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【０１２１】
一実施形態において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７６、７７、７８、７９および８２に対応する位置で５つの置換を含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【０１２２】
一実施形態において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応する位置で６つの置換を含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【０１２３】
一態様において、本発明の変異体における改変の総数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０改変などの例えば１〜１０および１〜５などの１〜２０である。
【０１２４】
他の態様において、本発明に係る変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応する１つまたは複数（例えばいくつか）の位置で改変を含む。他の態様において、本発明に係る変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２のいずれかに対応する２つの位置で改変を含む。他の態様において、本発明に係る変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２のいずれかに対応する３つの位置で改変を含む。他の態様において、本発明に係る変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２のいずれかに対応する４つの位置で改変を含む。他の態様において、本発明に係る変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２のいずれかに対応する５つの位置で改変を含む。他の態様において、本発明に係る変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応する各位置で改変を含む。
【０１２５】
一態様において、変異体は、位置７５に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。他の態様において、位置７５に対応する位置のアミノ酸は、ＡｓｐまたはＨｉｓ、好ましくはＨｉｓで置換される。他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドのＬ７５Ｈの置換を含むか、または、この置換から構成される。特定の態様において、変異体はＬ７５Ｈを含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【０１２６】
一態様において、変異体は、位置７６に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。他の態様において、位置７６に対応する位置のアミノ酸は、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＴｙｒ、好ましくはＳｅｒで置換される。他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドのＮ７６Ｓの置換を含むか、または、この置換から構成される。特定の態様において、変異体はＮ７６Ｓを含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【０１２７】
一態様において、変異体は、位置７７に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。他の態様において、位置７７に対応する位置のアミノ酸は、Ａｓｐで置換される。他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドのＮ７７Ｄの置換を含むか、または、この置換から構成される。特定の態様において、変異体はＮ７７Ｄを含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【０１２８】
一態様において、変異体は、位置７８に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。他の態様において、位置７８に対応する位置のアミノ酸は、ＧｌｎまたはＧｌｙ、好ましくはＧｌｙで置換される。他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドのＳ７８Ｇの置換を含むか、または、この置換から構成される。特定の態様において、変異体はＳ７８Ｇを含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【０１２９】
一態様において、変異体は、位置７９に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。他の態様において、位置７９に対応する位置のアミノ酸は、Ａｌａ、ＧｌｎまたはＴｙｒ、好ましくはＧｌｎで置換される。他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドのＩ７９Ｑの置換を含むか、または、この置換から構成される。特定の態様において、変異体はＩ７９Ｑを含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【０１３０】
一態様において、変異体は、位置８２に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。他の態様において、位置８２に対応する位置のアミノ酸は、Ｔｙｒで置換される。他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドのＬ８２Ｙの置換を含むか、または、この置換から構成される。特定の態様において、変異体はＬ８２Ｙを含み、また、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の挿入をさらに含む。
【０１３１】
挿入は以下のいずれかであり得る：位置７５と７６との間の少なくとも１つの挿入（*７５）、位置７６と７７との間の少なくとも１つの挿入（*７６）、位置７７と７８との間の少なくとも１つの挿入（*７７）、７８と７９との間の少なくとも１つの挿入（*７８）、位置７９と８０との間の少なくとも１つの挿入（*７９）、位置８０と８１との間の少なくとも１つの挿入（*８０）、位置８１と８２との間の少なくとも１つの挿入（*８１）（配列番号２の成熟ポリペプチドに従った番号付けの場合）。さらにより好ましくは、挿入は、以下からなる群から選択される：*７５ａＧ、*７５ａＤ、*７５ａＧ＋*７５ｂＤ、*７５ａＤ＋*７５ｂＧ、*７５ａＤ＋*７５ｂＤ、*７５ａＧ＋*７５ｂＧ；*７６ａＧ、*７６ａＤ、*７６ａＧ＋*７６ｂＤ、*７６ａＤ＋*７６ｂＧ、*７６ａＤ＋*７６ｂＤ、*７６ａＧ＋*７６ｂＧ；*７７ａＧ、*７７ａＤ、*７７ａＧ＋*７７ｂＤ、*７７ａＤ＋*７７ｂＧ、*７７ａＤ＋*７７ｂＤ、*７７ａＧ＋*７７ｂＧ；*７８ａＧ、*７８ａＤ、*７８ａＧ＋*７８ｂＤ、*７８ａＤ＋*７８ｂＧ、*７８ａＤ＋*７８ｂＤ、*７８ａＧ＋*７８ｂＧ；*７９ａＧ、*７９ａＤ、*７９ａＧ＋*７９ｂＤ、*７９ａＤ＋*７９ｂＧ、*７９ａＤ＋*７９ｂＤ、*７９ａＧ＋*７９ｂＧ；*８０ａＧ、*８０ａＤ、*８０ａＧ＋*８０ｂＤ、*８０ａＤ＋*８０ｂＧ、*８０ａＤ＋*８０ｂＤ、*８０ａＧ＋*８０ｂＧ；*８１ａＧ、*８１ａＤ、*８１ａＧ＋*８１ｂＤ、*８１ａＤ＋*８１ｂＧ、*８１ａＤ＋*８１ｂＤ、*８１ａＧ＋*８１ｂＧ。
【０１３２】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７５および７６に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１３３】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７５および７７に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１３４】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７５および７８に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１３５】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７５および７９に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１３６】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７５および８２に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１３７】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７６および７７に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１３８】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７６および７８に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１３９】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７６および７９に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１４０】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７６および８２に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１４１】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７７および７８に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１４２】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７７および７９に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１４３】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７７および８２に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１４４】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７８および７９に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１４５】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７８および８２に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１４６】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７９および８２に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１４７】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７５、７６、および７７に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１４８】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７５、７６、および７８に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１４９】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７５、７６、および７９に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１５０】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７５、７６、および８２に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１５１】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７５、７７、および７８に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１５２】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７５、７７、および７９に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１５３】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７５、７７、および８２に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１５４】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７５、７８、および７９に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１５５】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７５、７８、および８２に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１５６】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７５、７９、および８２に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１５７】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７６、７７、および７８に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１５８】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７６、７７、および７９に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１５９】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７６、７７、および８２に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１６０】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７６、７８、および７９に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１６１】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７６、７８、および８２に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１６２】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７６、７９、および８２に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１６３】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７７、７８、および７９に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１６４】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７７、７８、および８２に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１６５】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７７、７９、および８２に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１６６】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７８、７９、および８２に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１６７】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７５、７６、７７、および７８に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１６８】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７５、７６、７７、および７９に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１６９】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７５、７６、７７、および８２に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１７０】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７６、７７、７８および７９に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１７１】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７６、７７、７８および８２に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１７２】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７６、７８、７９および８２に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１７３】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７７、７８、７９および８２に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１７４】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７５、７６、７７、７８および７９に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１７５】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７５、７６、７７、７８および８２に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１７６】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７６、７７、７８、７９および８２に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１７７】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応する位置における改変を含むか、または、この改変から構成される。
【０１７８】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、Ｌ７５［Ｄ，Ｈ］、Ｎ７６［Ｓ，Ｄ，Ｙ］、Ｎ７７［Ｄ］、Ｓ７８［Ｑ，Ｇ］、Ｉ７９［Ａ，Ｔ，Ｑ］およびＬ８２［Ｙ］からなる群から選択される１つもしくは複数（例えば、いくつか）の置換、好ましくは、Ｌ７５Ｈ、Ｎ７６Ｓ、Ｎ７７Ｄ、Ｓ７８Ｇ、Ｉ７９ＱおよびＬ８２Ｙからなる群から選択される置換、ならびに／または、１つもしくは複数（例えば、いくつか）の挿入を含むか、または、これらから構成される。
【０１７９】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈを含むか、または、これから構成される。
【０１８０】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｎ７６Ｓを含むか、または、これから構成される。
【０１８１】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｎ７７Ｄを含むか、または、これから構成される。
【０１８２】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｓ７８Ｇを含むか、または、これから構成される。
【０１８３】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｉ７９Ｑを含むか、または、これから構成される。
【０１８４】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ８２Ｙを含むか、または、これから構成される。
【０１８５】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｎ７６Ｓを含むか、または、これから構成される。
【０１８６】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｎ７７Ｄを含むか、または、これから構成される。
【０１８７】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｓ７８Ｇを含むか、または、これから構成される。
【０１８８】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｉ７９Ｑを含むか、または、これから構成される。
【０１８９】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｌ８２Ｙを含むか、または、これから構成される。
【０１９０】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｎ７６Ｓ＋Ｎ７７Ｄを含むか、または、これから構成される。
【０１９１】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｎ７６Ｓ＋Ｓ７８Ｇを含むか、または、これから構成される。
【０１９２】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｎ７６Ｓ＋Ｉ７９Ｑを含むか、または、これから構成される。
【０１９３】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｎ７６Ｓ＋Ｌ８２Ｙを含むか、または、これから構成される。
【０１９４】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｎ７７Ｄ＋Ｓ７８Ｇを含むか、または、これから構成される。
【０１９５】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｎ７７Ｄ＋Ｉ７９Ｑを含むか、または、これから構成される。
【０１９６】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｎ７７Ｄ＋Ｌ８２Ｙを含むか、または、これから構成される。
【０１９７】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｓ７８Ｇ＋Ｉ７９Ｑを含むか、または、これから構成される。
【０１９８】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｓ７８Ｇ＋Ｌ８２Ｙを含むか、または、これから構成される。
【０１９９】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｉ７９Ｑ＋Ｌ８２Ｙを含むか、または、これから構成される。
【０２００】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｎ７６Ｓ＋Ｎ７７Ｄを含むか、または、これから構成される。
【０２０１】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｎ７６Ｓ＋Ｓ７８Ｇを含むか、または、これから構成される。
【０２０２】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｎ７６Ｓ＋Ｉ７９Ｑを含むか、または、これから構成される。
【０２０３】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｎ７６Ｓ＋Ｌ８２Ｙを含むか、または、これから構成される。
【０２０４】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｎ７７Ｄ＋Ｓ７８Ｇを含むか、または、これから構成される。
【０２０５】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｎ７７Ｄ＋Ｉ７９Ｑを含むか、または、これから構成される。
【０２０６】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｎ７７Ｄ＋Ｌ８２Ｙを含むか、または、これから構成される。
【０２０７】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｓ７８Ｇ＋Ｉ７９Ｑを含むか、または、これから構成される。
【０２０８】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｓ７８Ｇ＋Ｌ８２Ｙを含むか、または、これから構成される。
【０２０９】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｉ７９Ｑ＋Ｌ８２Ｙを含むか、または、これから構成される。
【０２１０】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｎ７６Ｓ＋Ｎ７７Ｄ＋Ｓ７８Ｇを含むか、または、これから構成される。
【０２１１】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｎ７６Ｓ＋Ｎ７７Ｄ＋Ｉ７９Ｑを含むか、または、これから構成される。
【０２１２】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｎ７６Ｓ＋Ｎ７７Ｄ＋Ｌ８２Ｙを含むか、または、これから構成される。
【０２１３】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｎ７６Ｓ＋Ｓ７８Ｇ＋Ｉ７９Ｑを含むか、または、これから構成される。
【０２１４】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｎ７６Ｓ＋Ｓ７８Ｇ＋Ｌ８２Ｙを含むか、または、これから構成される。
【０２１５】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｎ７６Ｓ＋Ｉ７９Ｑ＋Ｌ８２Ｙを含むか、または、これから構成される。
【０２１６】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｎ７７Ｄ＋Ｓ７８Ｇ＋Ｉ７９Ｑを含むか、または、これから構成される。
【０２１７】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｎ７７Ｄ＋Ｓ７８Ｇ＋Ｌ８２Ｙを含むか、または、これから構成される。
【０２１８】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｓ７８Ｇ＋Ｉ７９Ｑ＋Ｌ８２Ｙを含むか、または、これから構成される。
【０２１９】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｎ７６Ｓ＋Ｎ７７Ｄ＋Ｓ７８Ｇを含むか、または、これから構成される。
【０２２０】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｎ７６Ｓ＋Ｎ７７Ｄ＋Ｉ７９Ｑを含むか、または、これから構成される。
【０２２１】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｎ７６Ｓ＋Ｎ７７Ｄ＋Ｌ８２Ｙを含むか、または、これから構成される。
【０２２２】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｎ７７Ｄ＋Ｓ７８Ｇ＋Ｉ７９Ｑを含むか、または、これから構成される。
【０２２３】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｎ７７Ｄ＋Ｓ７８Ｇ＋Ｌ８２Ｙを含むか、または、これから構成される。
【０２２４】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｓ７８Ｇ＋Ｉ７９Ｑ＋Ｌ８２Ｙを含むか、または、これから構成される。
【０２２５】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｎ７６Ｓ＋Ｎ７７Ｄ＋Ｓ７８Ｇ＋Ｉ７９Ｑを含むか、または、これから構成される。
【０２２６】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｎ７６Ｓ＋Ｎ７７Ｄ＋Ｓ７８Ｇ＋Ｌ８２Ｙを含むか、または、これから構成される。
【０２２７】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｎ７７Ｄ＋Ｓ７８Ｇ＋Ｉ７９Ｑ＋Ｌ８２Ｙを含むか、または、これから構成される。
【０２２８】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｎ７６Ｓ＋Ｎ７７Ｄ＋Ｓ７８Ｇ＋Ｉ７９Ｑを含むか、または、これから構成される。
【０２２９】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｎ７６Ｓ＋Ｎ７７Ｄ＋Ｓ７８Ｇ＋Ｌ８２Ｙを含むか、または、これから構成される。
【０２３０】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｎ７６Ｓ＋Ｎ７７Ｄ＋Ｓ７８Ｇ＋Ｉ７９Ｑ＋Ｌ８２Ｙを含むか、または、これから構成される。
【０２３１】
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｎ７６Ｓ＋Ｎ７７Ｄ＋Ｓ７８Ｇ＋Ｉ７９Ｑ＋Ｌ８２Ｙを含むか、または、これから構成される。
【０２３２】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２３３】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｎ７６Ｓ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２３４】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｎ７７Ｄ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２３５】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｓ７８Ｇ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２３６】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｉ７９Ｑ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２３７】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ８２Ｙ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２３８】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｎ７６Ｓ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２３９】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｎ７７Ｄ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２４０】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｓ７８Ｇ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２４１】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｉ７９Ｑ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２４２】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｌ８２Ｙ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２４３】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｎ７６Ｓ＋Ｎ７７Ｄ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２４４】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｎ７６Ｓ＋Ｓ７８Ｇ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２４５】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｎ７６Ｓ＋Ｉ７９Ｑ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２４６】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｎ７６Ｓ＋Ｌ８２Ｙ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２４７】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｎ７７Ｄ＋Ｓ７８Ｇ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２４８】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｎ７７Ｄ＋Ｉ７９Ｑ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２４９】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｎ７７Ｄ＋Ｌ８２Ｙ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２５０】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｓ７８Ｇ＋Ｉ７９Ｑ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２５１】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｓ７８Ｇ＋Ｌ８２Ｙ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２５２】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｉ７９Ｑ＋Ｌ８２Ｙ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２５３】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｎ７６Ｓ＋Ｎ７７Ｄ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２５４】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｎ７６Ｓ＋Ｓ７８Ｇ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２５５】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｎ７６Ｓ＋Ｉ７９Ｑ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２５６】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｎ７６Ｓ＋Ｌ８２Ｙ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２５７】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｎ７７Ｄ＋Ｓ７８Ｇ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２５８】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｎ７７Ｄ＋Ｉ７９Ｑ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２５９】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｎ７７Ｄ＋Ｌ８２Ｙ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２６０】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｓ７８Ｇ＋Ｉ７９Ｑ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２６１】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｓ７８Ｇ＋Ｌ８２Ｙ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２６２】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｉ７９Ｑ＋ＰＬ８２Ｙ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２６３】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｎ７６Ｓ＋Ｎ７７Ｄ＋Ｓ７８Ｇ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２６４】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｎ７６Ｓ＋Ｎ７７Ｄ＋Ｉ７９Ｑ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２６５】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｎ７６Ｓ＋Ｎ７７Ｄ＋Ｌ８２Ｙ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２６６】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｎ７６Ｓ＋Ｓ７８Ｇ＋Ｉ７９Ｑ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２６７】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｎ７６Ｓ＋Ｓ７８Ｇ＋Ｌ８２Ｙ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２６８】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｎ７６Ｓ＋Ｉ７９Ｑ＋Ｌ８２Ｙ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２６９】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｎ７７Ｄ＋Ｓ７８Ｇ＋Ｉ７９Ｑ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２７０】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｎ７７Ｄ＋Ｓ７８Ｇ＋Ｌ８２Ｙ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２７１】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｓ７８Ｇ＋Ｉ７９Ｑ＋Ｌ８２Ｙ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２７２】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｎ７６Ｓ＋Ｎ７７Ｄ＋Ｓ７８Ｇ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２７３】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｎ７６Ｓ＋Ｎ７７Ｄ＋Ｉ７９Ｑ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２７４】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｎ７６Ｓ＋Ｎ７７Ｄ＋Ｌ８２Ｙ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２７５】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｎ７７Ｄ＋Ｓ７８Ｇ＋Ｉ７９Ｑ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２７６】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｎ７７Ｄ＋Ｓ７８Ｇ＋Ｌ８２Ｙ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２７７】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｓ７８Ｇ＋Ｉ７９Ｑ＋Ｌ８２Ｙ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２７８】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｎ７６Ｓ＋Ｎ７７Ｄ＋Ｓ７８Ｇ＋Ｉ７９Ｑ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２７９】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｎ７６Ｓ＋Ｎ７７Ｄ＋Ｓ７８Ｇ＋Ｌ８２Ｙ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２８０】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｎ７７Ｄ＋Ｓ７８Ｇ＋Ｉ７９Ｑ＋Ｌ８２Ｙ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２８１】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｎ７６Ｓ＋Ｎ７７Ｄ＋Ｓ７８Ｇ＋Ｉ７９Ｑ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２８２】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｎ７６Ｓ＋Ｎ７７Ｄ＋Ｓ７８Ｇ＋Ｌ８２Ｙ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２８３】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｎ７６Ｓ＋Ｎ７７Ｄ＋Ｓ７８Ｇ＋Ｉ７９Ｑ＋Ｌ８２Ｙ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２８４】
他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける、配列番号４の成熟ポリペプチドの置換Ｌ７５Ｈ＋Ｎ７６Ｓ＋Ｎ７７Ｄ＋Ｓ７８Ｇ＋Ｉ７９Ｑ＋Ｌ８２Ｙ、および、１つまたは複数（例えばいくつか）の挿入を含むか、または、これから構成される。
【０２８５】
ここで、挿入は以下のいずれかであり得る：位置７５と７６との間の少なくとも１つの挿入（*７５）、位置７６と７７との間の少なくとも１つの挿入（*７６）、位置７７と７８との間の少なくとも１つの挿入（*７７）、７８と７９との間の少なくとも１つの挿入（*７８）、位置７９と８０との間の少なくとも１つの挿入（*７９）、位置８０と８１との間の少なくとも１つの挿入（*８０）、位置８１と８２との間の少なくとも１つの挿入（*８１）（配列番号２の成熟ポリペプチドに従った番号付けの場合）。さらにより好ましくは、挿入は、以下からなる群から選択される：*７５ａＧ、*７５ａＤ、*７５ａＧ＋*７５ｂＤ、*７５ａＤ＋*７５ｂＧ、*７５ａＤ＋*７５ｂＤ、*７５ａＧ＋*７５ｂＧ；*７６ａＧ、*７６ａＤ、*７６ａＧ＋*７６ｂＤ、*７６ａＤ＋*７６ｂＧ、*７６ａＤ＋*７６ｂＤ、*７６ａＧ＋*７６ｂＧ；*７７ａＧ、*７７ａＤ、*７７ａＧ＋*７７ｂＤ、*７７ａＤ＋*７７ｂＧ、*７７ａＤ＋*７７ｂＤ、*７７ａＧ＋*７７ｂＧ；*７８ａＧ、*７８ａＤ、*７８ａＧ＋*７８ｂＤ、*７８ａＤ＋*７８ｂＧ、*７８ａＤ＋*７８ｂＤ、*７８ａＧ＋*７８ｂＧ；*７９ａＧ、*７９ａＤ、*７９ａＧ＋*７９ｂＤ、*７９ａＤ＋*７９ｂＧ、*７９ａＤ＋*７９ｂＤ、*７９ａＧ＋*７９ｂＧ；*８０ａＧ、*８０ａＤ、*８０ａＧ＋*８０ｂＤ、*８０ａＤ＋*８０ｂＧ、*８０ａＤ＋*８０ｂＤ、*８０ａＧ＋*８０ｂＧ；*８１ａＧ、*８１ａＤ、*８１ａＧ＋*８１ｂＤ、*８１ａＤ＋*８１ｂＧ、*８１ａＤ＋*８１ｂＤ、*８１ａＧ＋*８１ｂＧ。
【０２８６】
変異体は、１つまたは複数（例えば、いくつか）の他の位置に１つまたは複数の追加の改変をさらに含み得る。
【０２８７】
アミノ酸の変更は軽微なものであり得、すなわち、タンパク質の折り畳みおよび／または活性に顕著に影響しない保存的アミノ酸置換または挿入；典型的には１〜３０アミノ酸の微小な欠失；アミノ末端メチオニン残基などの微小なアミノ−またはカルボキシル−末端延伸；２０〜２５残基以下の小リンカーペプチド；または、正味の電荷または他の機能を変えることにより精製を容易とする、ポリヒスチジン配列、抗原エピトープもしくは結合ドメインなどの微小な延伸であり得る。
【０２８８】
保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシンおよびヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミンおよびアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシンおよびバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン）、ならびに、低分子アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニンおよびメチオニン）の群に含まれるものによる。一般に比活性を変化させないアミノ酸置換は技術分野において公知であり、例えば、Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ  ａｎｄ  Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，１９７９，Ｉｎ，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。一般的な置換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ａｓｎ／Ｇｌｎ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｇｌｕ／Ｇｌｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／ＧｌｕおよびＡｓｐ／Ｇｌｙである。
【０２８９】
あるいは、アミノ酸の変更は、ポリペプチドの物理化学的特性を変化させるようなものである。例えば、アミノ酸の変更は、ポリペプチドの熱安定性を向上させ、基質特異性を変化させ、最適なｐＨを変化させたりし得る。
【０２９０】
例えば、変異体は、位置７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応する位置に２つの改変を含み得、さらに、位置１６７、１７０、１９１、２６１および２６２からなる群から選択される位置のいずれかに改変を含む（番号付けは、配列番号２の成熟ポリペプチドに準拠）。好ましい実施形態において、１６７、１７０、１９１、２６１および２６２からなる群から選択される位置のいずれかにおける改変は置換である。特定の好ましい実施形態において、本発明に係る変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応する位置に２つの改変を含み、ここで、改変の少なくとも１つは挿入であり、また、ここで、変異体は、Ｙ１６７Ａ、Ｒ１７０Ｓ、Ａ１９１Ｎ、Ｎ２６１ＤおよびＬ２６２Ｑからなる群から選択される１つまたは複数の置換をさらに含む。
【０２９１】
本発明の一実施形態において、本発明に係る変異体は、以下の変異体のいずれかを含むか、または、これらから構成される：
Ｌ７５Ｄ＋*７５ａＧ＋*７５ｂＧ＋Ｎ７６Ｓ＋Ｎ７７Ｄ＋Ｓ７８Ｇ＋Ｉ７９Ａ＋Ｖ８１Ｉ＋Ｌ８２Ｙ
Ｌ７５Ｄ＋*７５ａＧ＋*７５ｂＧ＋Ｎ７６Ｓ＋Ｎ７７Ｄ＋Ｓ７８Ｑ＋Ｉ７９Ａ＋Ｖ８１Ｉ＋Ｌ８２Ｙ
Ｌ７５Ｄ＋*７５ａＧ＋*７５ｂＧ＋Ｎ７６Ｄ＋Ｎ７７Ｎ＋Ｓ７８Ｇ＋Ｉ７９Ｔ＋Ｖ８１Ｉ＋Ｌ８２Ｙ
Ｌ７５Ｈ＋*７５ａＧ＋*７５ｂＧ＋Ｎ７６Ｙ＋Ｎ７７Ｄ＋Ｓ７８Ｇ＋Ｉ７９Ｑ＋Ｖ８１Ｉ＋Ｌ８２Ｙ
Ｌ７５Ｈ＋*７５ａＧ＋*７５ｂＧ＋Ｎ７６Ｓ＋Ｓ７８Ｇ＋Ｉ７９Ｑ＋Ｌ８２Ｙ＋Ｙ１６７Ａ
Ｌ７５Ｈ＋*７５ａＧ＋*７５ｂＧ＋Ｎ７６Ｓ＋Ｓ７８Ｇ＋Ｉ７９Ｑ＋Ｌ８２Ｙ＋Ｑ１９１Ｎ
Ｌ７５Ｈ＋*７５ａＧ＋*７５ｂＧ＋Ｎ７６Ｓ＋Ｓ７８Ｇ＋Ｉ７９Ｑ＋Ｌ８２Ｙ＋Ｙ１６７Ａ＋Ｒ１７０Ｓ
Ｌ７５Ｈ＋*７５ａＧ＋*７５ｂＧ＋Ｎ７６Ｓ＋Ｓ７８Ｇ＋Ｉ７９Ｑ＋Ｌ８２Ｙ＋Ｙ１６７Ａ＋Ｒ１７０Ｓ  Ａ１９４Ｐ
Ｌ７５Ｈ＋*７５ａＧ＋*７５ｂＧ＋Ｎ７６Ｓ＋Ｓ７８Ｇ＋Ｉ７９Ｑ＋Ｌ８２Ｙ＋Ｎ２６１Ｄ＋Ｌ２６２Ｑ
Ｌ７５Ｈ＋*７５ａＤ＋*７５ｂＧ＋Ｎ７６Ｓ＋Ｓ７８Ｇ＋Ｉ７９Ｑ＋Ｌ８２Ｙ
【０２９２】
ここで、*７５ａＤおよび*７５ｂＧは、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応するループにおける位置７５の後、または、位置７５と７６との間へのＡｓｐおよびＧｌｙの挿入である。
【０２９３】
ポリペプチド中の必須アミノ酸は、部位特異的突然変異誘発またはアラニンスキャニング突然変異誘発などの技術分野において公知である手法に準拠して同定することが可能である（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５）。後者の技術においては、単一のアラニン突然変異が分子中のすべての残基に導入され、得られるミュータント分子は、分子の活性に重要であるアミノ酸残基を同定するためにプロテアーゼ活性についてテストされる。また、Ｈｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４６９９−４７０８を参照のこと。酵素の活性部位または他の生物学的相互作用はまた、推定される接触部位アミノ酸の突然変異との組み合わせにより、核磁気共嗚、結晶構造解析、電子回折、または、光親和性標識などの技術によって測定される構造の物理的分析によって判定可能である。例えば、ｄｅ  Ｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６−３１２；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４；Ｗｌｏｄａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０９：５９−６４を参照のこと。必須アミノ酸の同一性はまた、関連するポリペプチドとのアライメントから推定可能である。ＢＰＮ’（配列番号２の成熟ポリペプチド）に関して、アミノ酸Ｓ２２１、Ｈ６４およびＤ３２を含む触媒三残基は酵素のプロテアーゼ活性に必須である。
【０２９４】
変異体は、２００〜９００アミノ酸、例えば、２１０〜８００、２２０〜７００、２３０〜６００、２４０〜５００、２５０〜４００、２５５〜３００、２６０〜２９０、２６５〜２８５、２７０〜２８０または２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９または２８０アミノ酸から構成され得る。
【０２９５】
一実施形態において、変異体は、親酵素と比較して向上した触媒活性を有する。
【０２９６】
一実施形態において、変異体は、親酵素と比較して、または、同等の前記変異体のアミノ酸配列を有するが、１つまたは複数の前記特定の位置で改変を有さないプロテアーゼと比較して、または、基準プロテアーゼと比較して向上したキレータ安定性を有し、ここで、キレータ安定性は、本明細書における「材料および方法」中の実施例２に記載されているとおり計測される。
【０２９７】
親プロテアーゼ
タンパク質基質中のアミド結合を切断する酵素は、プロテアーゼ、または、（同義的に）ペプチダーゼと分類される（Ｗａｌｓｈ，１９７９，Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３を参照のこと）。
【０２９８】
セリンプロテアーゼ
セリンプロテアーゼは、活性部位に必須セリン残基が存在するペプチド結合の加水分解を触媒する酵素である（Ｗｈｉｔｅ，Ｈａｎｄｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，１９７３“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｂｏｏｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＹ，ｐｐ．２７１−２７２）。
【０２９９】
細菌性セリンプロテアーゼは、２０，０００〜４５，０００ダルトン範囲内の分子量を有する。これらは、フルオロリン酸ジイソプロピルによって阻害される。これらは、単純な末端エステルを加水分解し、同様にセリンプロテアーゼである真核性キモトリプシンと活性が類似している。より厳密な用語であるアルカリプロテアーゼは、サブグループをカバーし、いくつかのセリンプロテアーゼの高至適ｐＨ（ｐＨ９．０〜１１．０）に反映される（概説については、Ｐｒｉｅｓｔ（１９７７）Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖ．４１  ７１１−７５３を参照のこと）。
【０３００】
サブチラーゼ
サブチラーゼが仮に指定されたセリンプロテアーゼのサブグループが、Ｓｉｅｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｎｇ．４（１９９１）７１９−７３７およびＳｉｅｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６（１９９７）５０１−５２３によって提言されている。これらは、サブチリシン様プロテアーゼとも称されていたセリンプロテアーゼの１７０アミノ酸超の配列のホモロジー分析によって定義される。従来から、サブチリシンは度々、グラム陽性バクテリアまたは真菌によって生成されるセリンプロテアーゼと定義されており、Ｓｉｅｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．によれば、現在ではサブチラーゼのサブグループである。広く多様なサブチラーゼが同定されており、多数のサブチラーゼのアミノ酸配列が判定されている。このようなサブチラーゼおよびそのアミノ酸配列のより詳細な説明については、Ｓｉｅｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）を参照のこと。
【０３０１】
サブチラーゼの１つのサブグループ（Ｉ−Ｓ１または「真の」サブチリシン）は、サブチリシン１６８（ＢＳＳ１６８）、サブチリシンＢＰＮ’、サブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ（ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）、ＮＯＶＯＺＹＭＥＳ  Ａ／Ｓ）およびサブチリシンＤＹ（ＢＳＳＤＹ）などの「古典的な」サブチリシンを含む。ＢＰＮ’は、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のサブチリシンＢＰＮ’である。ＢＰＮ’は、配列番号２の成熟ポリペプチド、すなわち、配列番号２のアミノ酸１〜２７５に対応する。
【０３０２】
サブチラーゼのさらなるサブグループ（Ｉ−Ｓ２または高アルカリサブチリシン）は、Ｓｉｅｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（前述の）により認知されている。サブグループＩ−Ｓ２プロテアーゼは、高アルカリ性サブチリシンとして記載され、サブチリシンＰＢ９２（ＢＡＡＬＫＰ）（ＭＡＸＡＣＡＬ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．）、サブチリシン３０９（ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）、ＮＯＶＯＺＹＭＥＳ  Ａ／Ｓ）、サブチリシン１４７（ＢＬＳ１４７）（ＥＳＰＥＲＡＳＥ（登録商標）、ＮＯＶＯＺＹＭＥＳ  Ａ／Ｓ）およびアルカリエラスターゼＹａＢ（ＢＳＥＹＡＢ）などの酵素を含む。
【０３０３】
サブチリシン
サブチリシンは、ＭＥＲＯＰＳデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｒｏｐｓ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｆａｍｓｕｍ？ｆａｍｉｌｙ＝Ｓ８）による定義で、ファミリーＳ８由来、特に、サブファミリーＳ８Ａ由来のセリンプロテアーゼである。
【０３０４】
ＢＰＮ’およびＳａｖｉｎａｓｅは、それぞれ、ＭＥＲＯＰＳ番号Ｓ０８．０３４およびＳ０８．００３を有する。
【０３０５】
親サブチラーゼ
「親サブチラーゼ」という用語は、Ｓｉｅｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１および１９９７）に準拠して定義されたサブチラーゼを表す。さらなる詳細については、上記の「サブチラーゼ」の説明を参照のこと。親サブチラーゼはまた、天然のソースから単離されたサブチラーゼであり得、ここで、後の修飾はサブチラーゼの特徴を維持したままになされた。さらに、親サブチラーゼは、Ｊ．Ｅ．Ｎｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，８９３−８９６（１９９９）により記載されているものなどのＤＮＡシャフリング技術によって調製されたサブチラーゼであり得る。
【０３０６】
あるいは、「親サブチラーゼ」という用語は、「野生型サブチラーゼ」とも呼ばれ得る。
【０３０７】
参考のために、本明細書に記載されている種々のサブチラーゼに係るアクロニムの表を提供する。さらなるアクロニムについては、Ｓｉｅｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｎｇ．４（１９９１）７１９−７３７、および、Ｓｉｅｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６（１９９７）５０１−５２３を参照のこと。
【０３０８】
【表１】
2015500006.tif 000005
【０３０９】
サブチラーゼの修飾
本明細書において用いられる「修飾」という用語は、サブチラーゼの化学的修飾、ならびに、サブチラーゼをコードするＤＮＡの遺伝子操作を含むと定義される。修飾は、アミノ酸側鎖の置換、対象のアミノ酸における、または、対象のアミノ酸での置換、欠失および／または挿入であることが可能である。
【０３１０】
サブチラーゼ変異体
「変異体」という用語および「サブチラーゼ変異体」という用語は、上記に定義されている。
【０３１１】
相同サブチラーゼ配列
２つのアミノ酸配列間の相同性は、本発明の目的のために、本文脈において、「同一性」というパラメータにより記載されており、２つのアミノ酸配列間の同一性の程度は、上記のＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを用いて判定される。ルーチンからの出力は、２つの配列間の「同一性割合」のアミノ酸アライメント計算に対する追加のものである。
【０３１２】
この記載に基づき、本発明に従って修飾された可能性がある好適な相同性サブチラーゼを同定することは当業者にとってルーチン的である。
【０３１３】
実質的に相同性の親サブチラーゼ変異体は、１つまたは複数（いくつか）のアミノ酸置換、欠失および／または挿入を有し得、本文脈において、「１つまたは複数」という用語は、用語「いくつか」と同義的に用いられる。これらの変更な軽微なものであることが好ましく、すなわち、上記の保存的アミノ酸置換、および、タンパク質またはポリペプチドの三次元折り畳みまたは活性に顕著に影響をおよぼさない他の置換；典型的には１〜約３０アミノ酸の微小な欠失；ならびに、アミノ−末端メチオニン残基、約２０〜２５残基以下の微小リンカーペプチドなどの微小なアミノ−またはカルボキシル−末端延伸、または、ポリヒスチジン配列もしくはタンパク質Ａなどの精製を容易とする微小な延伸（親和性タグ）である（Ｎｉｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，ＥＭＢＯ  Ｊ．４：１０７５；Ｎｉｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８：３）。また、一般的には、Ｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ２：９５−１０７を参照のこと。
【０３１４】
上記の変更は軽微なものであることが好ましいが、このような変更はまた、アミノ−またはカルボキシル−末端延伸の両方としての３００アミノ酸以下、それ以上の大分子ポリペプチドの融合などの本質的なものであってもよい。
【０３１５】
親サブチラーゼは、配列番号４の成熟ポリペプチドもしくはその突然変異体のアミノ酸配列；または、プロテアーゼ活性を有するその断片を含み得、または、これらから構成され得る。一態様において、親サブチラーゼは、配列番号４の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列を含むか、または、配列番号４の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列から構成される。
【０３１６】
親サブチラーゼは、（ａ）配列番号２、４または６の成熟ポリペプチドに対して少なくとも６５％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）中もしくは高ストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号１、３もしくは５の成熟ポリペプチドコード配列、（ｉｉ）配列番号２、４もしくは６の成熟ポリペプチドをコードする配列、もしくは、（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の完全長補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；または、（ｃ）配列番号１、３もしくは５の成熟ポリペプチドコード配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであり得る。
【０３１７】
一態様において、親は、例えば、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％同一性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％、または、１００％などの少なくとも７０％などの少なくとも６５％の、配列番号２、４または６の成熟ポリペプチドに対する配列同一性を有し、プロテアーゼ活性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号２、４または６の成熟ポリペプチドと、例えば１、２、３、４、５、６、７、８または９などの１０アミノ酸を超えて異なることはない。
【０３１８】
他の態様において、親は、配列番号２、４または６のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成される。他の態様において、親は、配列番号２、４または６の成熟ポリペプチドを含むか、または、これから構成される。他の態様において、親は、配列番号２のアミノ酸１〜２７５を含むか、または、これから構成される。他の態様において、親は、配列番号４のアミノ酸１〜２６９を含むか、または、これから構成される。さらに他の態様において、親は、配列番号６のアミノ酸１〜２７４を含むか、または、これから構成される。
【０３１９】
他の態様において、親は、少なくとも２０２アミノ酸残基を含有する配列番号２、４または６の成熟ポリペプチドの断片（例えば、配列番号２、４または６の成熟ポリペプチドの位置２８〜２３０）である。
【０３２０】
他の実施形態において、親は、配列番号２、４または６の成熟ポリペプチドの突然変異体である。
【０３２１】
他の態様において、親は、超低ストリンジェンシー条件、低ストリンジェンシー条件、中ストリンジェンシー条件、または、高ストリンジェンシー条件、または、超高ストリンジェンシー条件下において、（ｉ）配列番号１、３もしくは５の成熟ポリペプチドコード配列、（ｉｉ）配列番号２、４もしくは６の成熟ポリペプチドをコードする配列、または、（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の完全長補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
【０３２２】
配列番号１、３もしくは５のポリヌクレオチドまたはそのサブ配列、ならびに、配列番号２、４もしくは６のポリペプチドまたはその断片は、技術分野において周知である方法に従って異なる属もしくは種の菌株から親をコードするＤＮＡを同定およびクローン化するよう核酸プローブを設計するために用いられ得る。特に、このようなプローブは、その対応する遺伝子を同定および単離ために、標準的なサザンブロッティング法に続いて、対象細胞のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを伴うハイブリダイゼーションのために用いられることが可能である。このようなプローブは、配列全体よりもかなり短いことが可能であるが、少なくとも１５、例えば、少なくとも２５、少なくとも３５または少なくとも７０ヌクレオチドの長さであるべきである。好ましくは、核酸プローブは、例えば、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチドまたは少なくとも９００ヌクレオチドの長さなどの、少なくとも１００ヌクレオチドの長さである。ＤＮＡおよびＲＮＡプローブの両方が用いられることが可能である。プローブは、典型的には、対応する遺伝子を検出するために標識化される（例えば、32Ｐ、3Ｈ、35Ｓ、ビオチンまたはアビジンで）。このようなプローブは本発明によって包含される。
【０３２３】
このような他の株から調製したゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリは、上記のプローブとハイブリダイズし、親をコードするＤＮＡについてスクリーニングされ得る。このような他の株由来のゲノムまたは他のＤＮＡは、アガロースもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動、または、他の分離技術によって分離され得る。ライブラリからのＤＮＡまたは分離されたＤＮＡは、ニトロセルロースまたは他の好適なキャリア材料に移されて固定され得る。配列番号１、３もしくは５またはそのサブ配列とハイブリダイズするクローンまたはＤＮＡを同定するために、キャリア材料がサザンブロッティングにおいて用いられる。
【０３２４】
本発明の目的のために、ハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドが、（ｉ）配列番号１、３もしくは５；（ｉｉ）配列番号１、３もしくは５の成熟ポリペプチドコード配列；（ｉｉｉ）配列番号２、４もしくは６の成熟ポリペプチドをコードする配列；（ｉｖ）これらの完全長補体；または、（ｖ）これらのサブ配列に対応する標識化核酸プローブと、超低〜超高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることを示す。これらの条件下で核酸プローブがハイブリダイズする分子は、例えば、Ｘ線フィルム、または、技術分野において公知であるいずれかの他の検出手段を用いて検出が可能である。
【０３２５】
一態様において、核酸プローブは、配列番号１、３または５の成熟ポリペプチドコード配列である。他の態様において、ヌクレオチド酸プローブは、例えば９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００または１１００ヌクレオチド長などの、配列番号１、３または５の８０〜１１４０ヌクレオチド長の断片である。他の態様において、核酸プローブは、配列番号２、４または６のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；その成熟ポリペプチド；または、その断片である。他の態様において、核酸プローブは、それぞれ、配列番号１、３もしくは５であり、または、配列番号２、４または６の成熟ポリペプチドをコードする配列である。
【０３２６】
他の実施形態において、親は、少なくとも７０％、例えば、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％同一性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％または１００％の配列番号１、３または５の成熟ポリヌクレオチドコード配列に対する配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる。
【０３２７】
ポリペプチドは、あるポリペプチドの領域が他のポリペプチドの領域のＮ末端またはＣ末端で融合したハイブリッドポリペプチドであり得る。
【０３２８】
親は、他のポリペプチドが本発明のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合した融合ポリペプチドまたは切断可能な融合ポリペプチドであり得る。融合ポリペプチドは、他のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを本発明のポリヌクレオチドに融合させることにより生成される。融合ポリペプチドを生成する技術は技術分野において公知であり、フレーム中にあるよう、また、融合ポリペプチドの発現が同一のプロモータおよびターミネータの制御下にあるよう、ポリペプチドをコードするコード配列を結合するステップが含まれる。融合ポリペプチドはまた、融合ポリペプチドが翻訳後に形成されるインテインテクノロジーを用いて構築され得る（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：２５７５−２５８３；Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７７６−７７９）。
【０３２９】
融合ポリペプチドは、２つのポリペプチド間に切断部位をさらに含んでいることが可能である。融合タンパク質を分泌すると、この部位が切断されて、２つのポリペプチドが放出される。切断部位の例としては、これらに限定されないが、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：５６８−５７６；Ｓｖｅｔｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６：２４５−２５１；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ−Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：３４８８−３４９３；Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：４９８−５０３；および、Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：３７８−３８１；Ｅａｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：５０５−５１２；Ｃｏｌｌｉｎｓ−Ｒａｃｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：９８２−９８７；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：２４０−２４８；および、Ｓｔｅｖｅｎｓ，２００３，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｗｏｒｌｄ  ４：３５−４８において開示されている部位が挙げられる。
【０３３０】
親は、すべての種類の生体から得られてもよい。本発明の目的のために、「〜から得られる」という用語は、本明細書において用いられるところ、所与のソースに関連して、ポリヌクレオチドによってコードされる親は、ソースによって生成されるか、または、ソースからのポリヌクレオチドが挿入された系統によって生成されることを意味すべきである。一態様において、親は、細胞外で分泌される。
【０３３１】
親は、細菌性プロテアーゼであり得る。例えば、親は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オセアノバチルス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）もしくはストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）プロテアーゼなどのグラム陽性細菌性ポリペプチド、または、カムピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター属（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、ネイッセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）もしくはウレアプラズマ属（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）プロテアーゼなどのグラム陰性細菌性ポリペプチドであり得る。
【０３３２】
一態様において、親は、バチルスアルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルスシルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルスクラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルスコアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バシラスフィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）、バチルスラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、バチルスレンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルスメガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルスプミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、またはバチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）プロテアーゼである。
【０３３３】
一態様において、親は、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）プロテアーゼ、例えば、配列番号２のプロテアーゼまたはその成熟ポリペプチドである。一態様において、親は、バチルスレンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）プロテアーゼ、例えば、配列番号４のプロテアーゼまたはその成熟ポリペプチドである。一態様において、親は、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）プロテアーゼ、例えば、配列番号６のプロテアーゼまたはその成熟ポリペプチドである。
【０３３４】
これらの種の系統は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ドイツ微生物細胞培養コレクション（ＤＳＭＺ：Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）、オランダ微生物株保存センター（ＣＢＳ：Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  Ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）、および、農業研究局特許培養物コレクション（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、北方リサーチセンター（ＮＲＲＬ：Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）などの多数の微生物保存機関において公共に容易に利用可能である。
【０３３５】
親は、上記のプローブを用いて、自然（例えば、汚染物、コンポスト、水等）から単離された微生物、または、天然材料（例えば、汚染物、コンポスト、水等）から直接的に得られたＤＮＡサンプルを含む他のソースから同定および得られ得る。微生物およびＤＮＡを自然環境から直接的に単離する技術は技術分野において周知である。次いで、親をコードするポリヌクレオチドは、他の微生物または混合ＤＮＡサンプルのゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリを同じようにスクリーニングすることにより得られ得る。一旦、親をコードするポリヌクレオチドがプローブで検出されたら、ポリヌクレオチドは、当業者に公知の技術（例えば、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９を参照のこと）を利用することにより単離またはクローン化され得る。
【０３３６】
変異体の調製
本発明はまた：（ａ）親サブチラーゼに改変を配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応する２つ以上（例えばいくつか）の位置で導入するステップであって、変異体がプロテアーゼ活性を有するステップ；ならびに、（ｂ）変異体を回収するステップを含むプロテアーゼ活性を有する変異体を得るための方法に関する。
【０３３７】
変異体は、部位特異的突然変異誘発、合成遺伝子構築、半合成遺伝子構築、無作為突然変異誘発、シャッフリング等などの技術分野において公知であるいずれかの突然変異誘発法を用いて調製可能である。
【０３３８】
部位特異的突然変異誘発は、親をコードするポリヌクレオチドにおける１つまたは複数の規定の部位で１つまたは複数（例えば、いくつか）の突然変異を導入する技術である。
【０３３９】
部位特異的突然変異誘発は、所望の突然変異を含有するオリゴヌクレオチドプライマーが使用されるＰＣＲによってインビトロで達成されることが可能である。部位特異的突然変異誘発はまた、親をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドにおける部位が制限酵素により切断され、および、その後、ポリヌクレオチドに突然変異を含有するオリゴヌクレオチドが連結されるカセット式突然変異誘発によってインビトロで行われることが可能である。通常、プラスミドおよびオリゴヌクレオチドを消化する制限酵素は同一であり、プラスミドの付着末端と挿入断片とを互いに連結させる。例えば、Ｓｃｈｅｒｅｒ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：４９４９−４９５５；および、Ｂａｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：７３４９−４９６６を参照のこと。
【０３４０】
部位特異的突然変異誘発はまた、技術分野において公知である方法によってインビボで達成可能である。例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１１５４号明細書；Ｓｔｏｒｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：７７３−７７６；Ｋｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：２８５−２９０；および、Ｃａｌｉｓｓａｎｏ  ａｎｄ  Ｍａｃｉｎｏ，１９９６，Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ．Ｎｅｗｓｌｅｔｔ．４３：１５−１６を参照のこと。
【０３４１】
いずれかの部位特異的突然変異誘発法が本発明において用いられることが可能である。変異体の調製に用いられることが可能である多くの市販のキットが入手可能である。
【０３４２】
合成遺伝子構築には、対象のポリペプチドをコードするための設計されたポリヌクレオチド分子のインビトロ合成が伴う。遺伝子合成は、Ｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４，Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：１０５０−１０５４）により記載されている多重マイクロチップ系テクノロジー、ならびに、オリゴヌクレオチドが合成されると共に光による制御が可能なマイクロ流体チップにアセンブルされる同様のテクノロジーなどの多数の技術を利用して行うことが可能である。
【０３４３】
単一もしくは複数のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入は、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：５３−５７；Ｂｏｗｉｅ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２１５２−２１５６；国際公開第９５／１７４１３号パンフレット；または、国際公開第９５／２２６２５号パンフレットにより開示されているものなどの公知の突然変異誘発方法、組換え法、および／または、シャッフリング法、これに続く関連するスクリーニング法を用いて行い、テストすることが可能である。用いられることが可能である他の方法としては、エラープローンＰＣＲ、ファージディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０８３２−１０８３７；米国特許第５，２２３，４０９号明細書；国際公開第９２／０６２０４号パンフレット）、および、領域特異的突然変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ  ４６：１４５；Ｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，ＤＮＡ  ７：１２７）が挙げられる。
【０３４４】
突然変異誘発／シャッフリング法は、宿主細胞によって発現されたクローン化突然変異誘発ポリペプチドの活性を検出するために、高スループット自動スクリーニング法と組み合わせることが可能である（Ｎｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：８９３−８９６）。活性ポリペプチドをコードする突然変異誘発ＤＮＡ分子は、宿主細胞から回収可能であり、技術分野における標準的な方法を用いて直ぐに配列決定されることが可能である。これらの方法では、ポリペプチドにおける個別のアミノ酸残基の重要性を直ぐに判定することが可能である。
【０３４５】
半合成遺伝子構築は、合成遺伝子構築および／または部位特異的突然変異誘発および／またはランダム突然変異誘発および／またはシャッフリングの態様を組み合わせることにより達成される。半合成構築は、ＰＣＲ技術と組み合わされる、合成されたポリヌクレオチド断片を利用するプロセスに代表される。それ故、遺伝子の定義された領域が新たに合成され得、一方で、他の領域が部位特異的突然変異誘発性プライマーを用いて増幅され得、一方で、さらに他の領域がエラープローンＰＣＲまたは非エラープローンＰＣＲ増幅に供され得る。次いで、ポリヌクレオチドサブ配列がシャッフルされ得る。
【０３４６】
ポリヌクレオチド
本発明はまた、本発明の変異体をコードする単離されたポリヌクレオチドにも関する。
【０３４７】
核酸構築物
本発明はまた、制御配列と適合性のある条件下で好適な宿主細胞においてコード配列の発現をもたらす１つまたは複数の制御配列と作動可能に結合した本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関する。
【０３４８】
ポリヌクレオチドは、変異体の発現をもたらすために多様な方法で操作され得る。ベクターへの挿入に先立つポリヌクレオチドの操作が、発現ベクターに応じて望ましいか、必要であり得る。組換えＤＮＡ法を利用するポリヌクレオチドの改変技術が技術分野において周知である。
【０３４９】
制御配列は、ポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識されるポリヌクレオチドである、プロモータであり得る。プロモータは、変異体の発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモータは、ミュータント、切断型および雑種プロモータを含む宿主細胞において転写活性を示すいずれかのポリヌクレオチドであり得、ならびに、宿主細胞に対して相同性または非相同性である細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られ得る。
【０３５０】
細菌性宿主細胞における本発明の核酸構築物の転写をもたらす好適なプロモータの例は、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトース生成アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）レバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、バチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子（Ａｇａｉｓｓｅ  ａｎｄ  Ｌｅｒｅｃｌｕｓ，１９９４，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １３：９７−１０７）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃオペロン、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｔｒｃプロモータ（Ｅｇｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５）、ストレプトマイセスコエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）および原核β−ラクタマーゼ遺伝子（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：３７２７−３７３１）、ならびに、ｔａｃプロモータ（ＤｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２１−２５）から得られるプロモータである。さらなるプロモータが、“Ｕｓｅｆｕｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ”，Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ２４２：７４−９４；および、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，ｓｕｐｒａに記載されている。タンデムプロモータの例が国際公開第９９／４３８３５号パンフレットに開示されている。
【０３５１】
制御配列は転写ターミネータであってもよく、これは、宿主細胞によって転写の終止と認識される。ターミネータ配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドの３’末端に作動可能に結合する。宿主細胞において機能的であるすべてのターミネータが用いられ得る。
【０３５２】
細菌性宿主細胞について好ましいターミネータは、バチルスクラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）アルカリプロテアーゼ（ａｐｒＨ）、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ（ａｍｙＬ）および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）リボソームＲＮＡ（ｒｒｎＢ）に係る遺伝子から得られる。
【０３５３】
制御配列はまた、プロモータの下流側であって、遺伝子の発現を高める遺伝子のコード配列の上流側のｍＲＮＡスタビライザ領域であり得る。
【０３５４】
好適なｍＲＮＡスタビライザ領域の例は、バチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子（国際公開第９４／２５６１２号パンフレット）および古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＳＰ８２遺伝子（Ｈｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７７：３４６５−３４７１）から入手される。
【０３５５】
制御配列はまた、変異体のＮ−末端にリンクしたシグナルペプチドをコードし、および、変異体を細胞の分泌経路に送るシグナルペプチドコード領域であり得る。ポリヌクレオチドのコード配列の５’−末端は、変異体をコードするコード配列のセグメントと共に、翻訳読み枠に元々リンクしたシグナルペプチドコード配列を本質的に含有し得る。または、コード配列の５’−末端は、コード配列に対して外来性のシグナルペプチドコード配列を含有し得る。コード配列がシグナルペプチドコード配列を元々含有していない場合には、外来性のシグナルペプチドコード配列が必要とされる場合がある。または、外来性のシグナルペプチドコード配列は単に、変異体の分泌を増強するために天然シグナルペプチドコード配列を置き換えてもよい。しかしながら、発現変異体を宿主細胞の分泌経路に送るいずれかのシグナルペプチドコード配列がもちいられてもよい。
【０３５６】
細菌宿主細胞の効果的なシグナルペプチドコード配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＮＣＩＢ１１８３７マルトジェニックアミラーゼ、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）サブチリシン、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）β−ラクタマーゼ、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）α−アミラーゼ、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）および古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｐｒｓＡの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。さらなるシグナルペプチドが、Ｓｉｍｏｎｅｎ  ａｎｄ  Ｐａｌｖａ，１９９３，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５７：１０９−１３７に記載されている。
【０３５７】
制御配列はまた、変異体のＮ末端に位置するプロペプチドをコードするプロペプチドコード配列であり得る。得られるポリペプチドは、酵素原またはプロポリペプチド（または、いくつかの場合においてヂモーゲン）として知られる。プロポリペプチドは一般に不活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒または自己触媒切断によって活性ポリペプチドに転換されることが可能である。プロペプチドコード配列は、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）天然プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、ミセリオフトラテルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ラッカーゼ（国際公開第９５／３３８３６号パンフレット）、リゾムコールミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼおよびサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−因子に係る遺伝子から得られ得る。
【０３５８】
シグナルペプチドとプロペプチド配列との両方が存在する場合、プロペプチド配列は変異体のＮ末端の隣に位置され、シグナルペプチド配列は、プロペプチド配列のＮ末端の隣に位置される。
【０３５９】
宿主細胞の増殖に比した変異体の発現を制御する制御配列を加えることが望ましい場合もある。制御系の例は、化学的刺激または物理的刺激に対して応答して遺伝子の発現をオンオフさせるものであり、制御化合物の存在が含まれる。原核系中の制御系は、ｌａｃ、ｔａｃおよびｔｒｐオペレーター系を含む。
【０３６０】
発現ベクター
本発明はまた、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチド、プロモータ、ならびに、転写および翻訳終止シグナルを含む組換え発現ベクターに関する。種々のヌクレオチドおよび制御配列が一緒になって、このような部位で変異体をコードするポリヌクレオチドの挿入または置換を可能とするために１つまたは複数の好都合な制限部位を含み得る組換え発現ベクターが生成される。または、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む核酸構築物を発現に適切なベクターに挿入することにより発現され得る。発現ベクターの形成において、コード配列は、コード配列が、発現に適切な制御配列と作動可能にリンクするようベクター中に位置されている。
【０３６１】
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ法に簡便に供されることが可能であり、ポリヌクレオチドの発現をもたらすことが可能であるいずれかのベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞に対するベクターの親和性に応じることとなる。ベクターは、直鎖または閉鎖された環状プラスミドであり得る。
【０３６２】
ベクターは、例えばプラスミド、染色体外要素、微小染色体または人工染色体などの、自己複製ベクター（すなわち、染色体外のエンティティとして存在し、その複製が染色体複製とは無関係なベクター）であり得る。ベクターは、自己複製を確実とするための何らかの手段を含有し得る。または、ベクターは、宿主細胞に導入された際に、ゲノム中に統合され、および、中に統合された染色体と一緒に複製されるものであり得る。しかも、単一のベクターもしくはプラスミド、または、一緒になって、宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡを含有する２つ以上のベクターもしくはプラスミド、または、トランスポゾンが用いられてもよい。
【０３６３】
ベクターは、形質転換、形質移入、形質導入等された細胞の選択を容易とする１つまたは複数の選択マーカーを含有することが好ましい。選択マーカーは、その生成物が、殺生剤またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体に対する原栄養性等をもたらす遺伝子である。
【０３６４】
細菌性選択マーカーの例は、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）もしくは古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｄａｌ遺伝子、または、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、ネオマイシン、スペクチノマイシンまたはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を与えるマーカーである。
【０３６５】
ベクターは、宿主細胞のゲノムへのベクターの統合、または、ゲノムとは無関係の細胞中のベクターの自律複製を許容する要素を含有することが好ましい。
【０３６６】
宿主細胞ゲノムへの統合に関して、ベクターは、変異体をコードするポリヌクレオチドの配列、または、相同的もしくは非相同的組換えによるゲノムへの統合に係るベクターのいずれかの他の要素に依存し得る。または、ベクターは、染色体における正確な位置での宿主細胞のゲノムへの相同的組換えによる統合をもたらす追加のポリヌクレオチドを含有していてもよい。正確な位置で統合される可能性を高めるために、統合要素は、相同的組換えの確率を高めるために対応する標的配列に対して高度の配列同一性を有する、１００〜１０，０００塩基対、４００〜１０，０００塩基対および８００〜１０，０００塩基対などの十分な数の核酸を含有しているべきである。統合要素は、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同的であるいずれかの配列であり得る。さらに、統合要素は、非コーディングまたはコーディングポリヌクレオチドであり得る。他方で、ベクターは、非相同的組換えにより宿主細胞のゲノムに統合され得る。
【０３６７】
自律複製に関して、ベクターは、対象の宿主細胞におけるベクターの自律的な複製を可能とする複製起点をさらに含んでいてもよい。複製起点は、細胞において機能する自律複製を媒介するいずれかのプラスミドレプリケータであり得る。「複製起点」または「プラスミドレプリケータ」という用語は、インビボでのプラスミドまたはベクターの複製を可能とするポリヌクレオチドを意味する。
【０３６８】
細菌性複製起点の例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における複製を許容するプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７およびｐＡＣＹＣ１８４の複製起点、ならびに、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）における複製を許容するｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０およびｐＡＭβ１の複製起点である。
【０３６９】
本発明のポリヌクレオチドの２つ以上のコピーが宿主細胞に挿入されて、変異体の生成が高められてもよい。ポリヌクレオチドのコピーの数は、配列の少なくとも１つの追加のコピーを宿主細胞ゲノムに統合することにより、または、増幅可能な選択マーカー遺伝子をポリヌクレオチドに含めることにより増加させることが可能であり、ここで、選択マーカー遺伝子の増幅されたコピー、従って、ポリヌクレオチドの追加のコピーを含有する細胞は、適切な選択可能な薬剤中で細胞を培養することにより選択可能である。
【０３７０】
上記の要素を連結して本発明の組換え発現ベクターを構築するために用いられる手法は、当業者に周知である（例えば、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９を参照のこと）。
【０３７１】
宿主細胞
本発明はまた、本発明の変異体の生成をもたらす１つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクした本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞に関する。ポリヌクレオチドを含む構築物もしくはベクターは、構築物もしくはベクターが染色体性組み込み体として、もしくは、既述の自己複製余剰−染色体性ベクターとして維持されるよう宿主細胞に導入される。「宿主細胞」という用語は、複製の最中に生じる突然変異により親細胞と同等ではない親細胞のいずれかの子孫を包含する。宿主細胞の選択は、変異体をコードする遺伝子およびそのソースに大きく依存することとなる。
【０３７２】
宿主細胞は、例えば、原核生物または真核生物などの、変異体の組換え生成において有用ないずれかの細胞であり得る。
【０３７３】
原核宿主細胞は、グラム陽性またはグラム陰性バクテリアのいずれかであり得る。グラム陽性バクテリアとしては、これらに限定されないが、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オセアノバチルス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。グラム陰性バクテリアとしては、これらに限定されないが、カムピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター属（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、ネイッセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）およびウレアプラズマ属（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）が挙げられる。
【０３７４】
細菌宿主細胞は、特にこれらに限定されないが、バチルスアルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルスシルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルスクラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルスコアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バシラスフィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）、バチルスラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、バチルスレンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルスメガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルスプミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、およびバチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）細胞を含むいずれかのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞であり得る。
【０３７５】
細菌宿主細胞はまた、特にこれらに限定されないが、ストレプトコッカスエクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカスウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ）、およびストレプトコッカスズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ  ｓｕｂｓｐ．Ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）細胞のいずれかのストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞を含むいずれかのストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞であり得る。
【０３７６】
細菌宿主細胞はまた、特にこれらに限定されないが、ストレプトマイセスアウロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセスアベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセスコエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセスグリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、およびストレプトマイセスリビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）細胞を含むいずれかのストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞であり得る。
【０３７７】
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、プロトプラスト形質転換（例えば、Ｃｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，１９７９，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８：１１１−１１５を参照のこと）、コンピテント細胞の形質転換（例えば、Ｙｏｕｎｇ  ａｎｄ  Ｓｐｉｚｉｚｅｎ，１９６１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．８１：８２３−８２９、または、Ｄｕｂｎａｕ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄｏｆｆ−Ａｂｅｌｓｏｎ，１９７１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５６：２０９−２２１を参照のこと）、エレクトロポレーション（例えば、Ｓｈｉｇｅｋａｗａ  ａｎｄ  Ｄｏｗｅｒ，１９８８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：７４２−７５１を参照のこと）、または、接合（例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｎｅ，１９８７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：５２７１−５２７８を参照のこと）により実施され得る。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞へのＤＮＡの導入は、プロトプラスト形質転換（例えば、Ｈａｎａｈａｎ，１９８３，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：５５７−５８０を参照のこと）またはエレクトロポレーション（例えば、Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：６１２７−６１４５を参照のこと）により実施され得る。ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、プロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション（例えば、Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（Ｐｒａｈａ）４９：３９９−４０５を参照のこと）、接合（例えば、Ｍａｚｏｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：３５８３−３５８５を参照のこと）、または、形質導入（例えば、Ｂｕｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：６２８９−６２９４を参照のこと）により実施され得る。シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、エレクトロポレーション（例えば、Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６４：３９１−３９７を参照のこと）、または、接合（例えば、Ｐｉｎｅｄｏ  ａｎｄ  Ｓｍｅｔｓ，２００５，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：５１−５７を参照のこと）により実施され得る。ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、自然の受容能（例えば、Ｐｅｒｒｙ  ａｎｄ  Ｋｕｒａｍｉｔｓｕ，１９８１，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５−１２９７を参照のこと）、プロトプラスト形質転換（例えば、Ｃａｔｔ  ａｎｄ  Ｊｏｌｌｉｃｋ，１９９１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｓ  ６８：１８９−２０７を参照のこと）、エレクトロポレーション（例えば、Ｂｕｃｋｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：３８００−３８０４を参照のこと）または接合（例えば、Ｃｌｅｗｅｌｌ，１９８１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４５：４０９−４３６を参照のこと）により実施され得る。しかしながら、ＤＮＡを宿主細胞に導入するための技術分野において公知であるいずれかの方法を用いることが可能である。
【０３７８】
生成方法
本発明はまた：（ａ）変異体の発現に好適な条件下で本発明の宿主細胞を培養するステップ；および、（ｂ）変異体を回収するステップを含む変異体の生成方法に関する。
【０３７９】
宿主細胞は、技術分野において公知である方法を用いる変異体の生成に好適な栄養培地中で培養される。例えば、細胞は、好適な培地中に、変異体の発現および／または単離が許容される条件下で行われる実験用または産業用発酵槽において、フラスコ振盪培養、または、小規模もしくは大規模発酵（連続、回分、流加または固相発酵を含む）により培養され得る。培養は、技術分野において公知である手法を用いて、炭素および窒素源、および、無機塩を含む好適な栄養培地において行われる。好適な培地は、商業的供給者から入手可能であるか、または、公開されている組成物に従って調製され得る（例えば、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログ中）。変異体が栄養培地に分泌される場合、変異体は培地から直接回収可能である。変異体が分泌されない場合、変異体は細胞可溶化物から回収可能である。
【０３８０】
変異体は、プロテアーゼ活性を有する変異体に特異的である技術分野において公知である方法を用いて検出され得る。これらの検出法としては、これらに限定されないが、特定の抗体の使用、酵素生成物の形成、または、酵素基質の消失が挙げられる。例えば、酵素アッセイを用いて変異体の活性を判定し得る。
【０３８１】
変異体は技術分野において公知である方法を用いて回収され得る。例えば、変異体は、特にこれらに限定されないが、採取、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発または沈殿を含む従来の手法によって栄養培地から回収され得る。
【０３８２】
変異体は、特にこれらに限定されないが、実質的に純粋な変異体を得るための、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシングおよびサイズ排除）、電気泳動法（例えば、分取等電点電気泳動）、吸収率較差溶解度（例えば、硫酸アンモニウム析出）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または、抽出（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒｙｄｅｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９を参照のこと）を含む技術分野において公知である多様な手法によって精製され得る。
【０３８３】
代替的な態様において、変異体は回収されず、変異体を発現する本発明の宿主細胞が変異体ソースとして用いられる。
【０３８４】
組成物
一定の態様において、本発明に係る変異体は、親酵素と比較して、同等の前記変異体のアミノ酸配列を有するが、１つまたは複数の前記特定の位置で改変を有さないプロテアーゼと比較して、または、基準プロテアーゼと比較して向上したキレータ安定性を有し、ここで、キレータに対する安定性は、本明細書における「材料および方法」において記載されている実施例２において計測される。
【０３８５】
それ故、好ましい実施形態において組成物は洗剤組成物であり、本発明の一態様は、洗濯または硬質面クリーニングなどのクリーニングプロセスにおける本発明に係る変異体を含む洗剤組成物の使用に関する。
【０３８６】
追加の成分の選択は、当業者の技能の範囲内であり、以下に記載される例示的な非限定的な成分を含む従来の処方成分が含まれる。成分の選択には、布地の取り扱いに関して、クリーニングされる布地の種類、汚染物の種類および／または程度、クリーニングを行う温度、ならびに、洗剤生成物の配合物の検討が含まれ得る。以下に記載の成分は特定の官能基に従う一般的なヘッダによって分類されるが、これは限定として解釈されるべきではなく、当業者に認識されるであろうとおり追加の官能基が成分中に含まれていてもよい。
【０３８７】
本発明の酵素
本発明の一実施形態において、本発明の変異体は、洗浄液１リットル当たり、０．０１〜１００ｍｇのタンパク質、好ましくは０．００５〜５０ｍｇのタンパク質、より好ましくは０．０１〜２５ｍｇのタンパク質、さらにより好ましくは０．０５〜１０ｍｇのタンパク質、最も好ましくは０．０５〜５ｍｇのタンパク質、および、さらに最も好ましくは０．０１〜１ｍｇのタンパク質などの０．００１〜１００ｍｇのタンパク質に対応する量で洗剤組成物に添加され得る。
【０３８８】
本発明の洗剤組成物の酵素は、例えば、プロピレングリコールもしくはグリセロールなどのポリオール、糖質もしくは糖質アルコール、乳酸、ホウ酸、もしくは、例えば芳香族ホウ酸エステルなどのホウ酸誘導体、または、４−ホルミルフェニルボロン酸などのフェニルボロン酸誘導体などの従来の安定化剤を用いて安定化され得、および、組成物は、例えば、国際公開第９２／１９７０９号パンフレットおよび国際公開第９２／１９７０８号パンフレットに記載されているとおり配合され得、または本発明の変異体は国際公開第２００５／０５８２６号パンフレットおよび国際公開第２００９／１１８３７５号パンフレットに記載されているものなどのペプチドアルデヒドまたはケトンを用いて安定させることができる。
【０３８９】
本発明の変異体はまた、参照により本明細書に援用される国際公開第９７／０７２０２号パンフレットに開示の洗剤配合物に組み込まれてもよい。
【０３９０】
界面活性剤
洗剤組成物は、アニオン性および／またはカチオン性および／またはノニオン性および／または半極性および／または両イオン性またはこれらの混合物であり得る１種または複数種の界面活性剤を含んでいてもよい。特定の実施形態において、洗剤組成物は、１種または複数種のノニオン性界面活性剤および１種または複数種のアニオン性界面活性剤の混合物を含む。界面活性剤は、典型的には、約１％〜約４０％または約３％〜約２０％または約３％〜約１０％などの約０．１％〜６０重量％のレベルで存在する。界面活性剤は所望のクリーニング用途に基づいて選択され、技術分野において公知であるいずれかの従来の界面活性剤を含む。洗剤に用いられ得る技術分野において公知であるいずれかの界面活性剤が利用され得る。
【０３９１】
含まれる場合、洗剤は、通常は、約５％〜約１５％または約２０％〜約２５％を含む約５％〜約３０％などの約１％〜約４０重量％のアニオン性界面活性剤を含有するであろう。アニオン性界面活性剤の非限定的な例としては、硫酸塩およびスルホン酸塩、特に、直鎖アルキルベンゼンスルホネート（ＬＡＳ）、ＬＡＳの異性体、分岐アルキルベンゼンスルホネート（ＢＡＢＳ）、フェニルアルカンスルホネート、α−オレフィンスルホネート（ＡＯＳ）、オレフィンスルホネート、アルケンスルホネート、アルカン−２，３−ジイルビス（硫酸塩）、ヒドロキシアルカンスルホネートおよびジスルホネート、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などのアルキルスルフェート（ＡＳ）、脂肪族アルコールスルフェート（ＦＡＳ）、第１級アルコールスルフェート（ＰＡＳ）、アルコールエーテルスルフェート（アルコールエトキシスルフェートまたは脂肪族アルコールエーテルスルフェートとしても公知であるＡＥＳまたはＡＥＯＳまたはＦＥＳ）、第２級アルカンスルホネート（ＳＡＳ）、パラフィンスルホネート（ＰＳ）、エステルスルホネート、スルホン化脂肪酸グリセロールエステル、メチルエステルスルホネート（ＭＥＳ）を含むα−スルホ脂肪酸メチルエステル（α−ＳＦＭｅまたはＳＥＳ）、アルキル−またはアルケニルコハク酸、ドデセニル／テトラデセニルコハク酸（ＤＴＳＡ）、アミノ酸の脂肪酸誘導体、スルホコハク酸またはセッケンのジエステルおよびモノエステル、ならびに、これらの組み合わせが挙げられる。
【０３９２】
含まれる場合、洗剤は、通常、約１％〜約４０重量％のカチオン性界面活性剤を含むであろう。カチオン性界面活性剤の非限定的な例としては、アルキルジメチルエタノール第４級アミン（ＡＤＭＥＡＱ）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、ジメチルジステアリル塩化アンモニウム（ＤＳＤＭＡＣ）およびアルキルベンジルジメチルアンモニウム、ならびに、これらの組み合わせ、アルキル第４級アンモニウム化合物、アルコキシル化第４級アンモニウム（ＡＱＡ）が挙げられる。
【０３９３】
含まれる場合、洗剤は、通常、約３％〜約５％または約８％〜約１２％などの、例えば約０．５％〜約３０％、特に約１％〜約２０％、約３％〜約１０％などの約０．２％〜約４０重量％のノニオン性界面活性剤を含有するであろう。ノニオン性界面活性剤の非限定的な例としては、アルコールエトキシレート（ＡＥまたはＡＥＯ）、アルコールプロポキシレート、プロポキシル化脂肪族アルコール（ＰＦＡ）、エトキシル化および／またはプロポキシル化脂肪酸アルキルエステルなどのアルコキシル化脂肪酸アルキルエステル、アルキルフェノールエトキシレート（ＡＰＥ）、ノニルフェノールエトキシレート（ＮＰＥ）、アルキルポリグリコシド（ＡＰＧ）、アルコキシル化アミン、脂肪酸モノエタノールアミド（ＦＡＭ）、脂肪酸ジエタノールアミド（ＦＡＤＡ）、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド（ＥＦＡＭ）、プロポキシル化脂肪酸モノエタノールアミド（ＰＦＡＭ）、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、または、グルコサミンのＮ−アシルＮ−アルキル誘導体（グルコサミドＧＡまたは脂肪酸グルカミドＦＡＧＡ）、ならびに、商品名ＳＰＡＮおよびＴＷＥＥＮで入手可能な生成物、ならびに、これらの組み合わせが挙げられる。
【０３９４】
含まれる場合、洗剤は、通常、約１％〜約４０重量％の半極性界面活性剤を含有するであろう。半極性界面活性剤の非限定的な例としては、アルキルジメチルアミンオキシド、Ｎ−（ココアルキル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミンオキシドおよびＮ−（獣脂−アルキル）−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミンオキシドなどのアミンオキシド（ＡＯ）、脂肪酸アルカノールアミドおよびエトキシル化脂肪酸アルカノールアミド、ならびに、これらの組み合わせが挙げられる。
【０３９５】
含まれる場合、洗剤は、通常、約１％〜約４０重量％の両性イオン性界面活性剤を含有するであろう。両性イオン性界面活性剤の非限定的な例としては、ベタイン、アルキルジメチルベタインおよびスルホベタイン、ならびに、これらの組み合わせが挙げられる。
【０３９６】
ヒドロトロープ
ヒドロトロープは、疎水性化合物を水溶液（または、反対に、極性物質を非極性環境）中に可溶化させる化合物である。典型的には、ヒドロトロープは、親水特性および疎水特性の両方を有する（いわゆる、界面活性剤から公知である両親媒性特性）が；しかしながら、ヒドロトロープの分子構造は、一般に、自発的な自己凝集を好まず、例えば、Ｈｏｄｇｄｏｎ  ａｎｄ  Ｋａｌｅｒ（２００７），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  ＆  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １２：１２１−１２８による概説を参照のこと。ヒドロトロープは、ミセル相、層状相または他の良好に画定されたメソ相を形成する界面活性剤および脂質について見出されるような、超えると自己凝集を生じる限界濃度を示さない。代わりに、多くのヒドロトロープは、凝集物の大きさが濃度の増加に伴って大型化する連続タイプの凝集プロセスを示す。しかしながら、多くのヒドロトロープは、水、脂、界面活性剤およびポリマーの混合物を含む、極性および非極性特性の物質を含有する系の相挙動、安定性およびコロイド特性を改変させる。ヒドロトロープは、伝統的に、製薬、パーソナルケア、食品から技術的用途にわたり産業で用いられている。洗剤組成物中においてヒドロトロープを使用することにより、相分離または高粘度などの望ましくない現象を誘起することなく、例えば、界面活性剤のより濃縮された配合物（水を排除することにより液体洗剤をコンパクトにするプロセスのとおり）が可能となる。
【０３９７】
洗剤は、約０．５〜約５％または約３％〜約５％などの０〜５重量％のヒドロトロープを含有し得る。洗剤において用いられる技術分野において公知であるいずれかのヒドロトロープが利用され得る。ヒドロトロープの非限定的な例としては、ベンゼンスルホン酸ナトリウム、ｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム（ＳＴＳ）、キシレンスルホン酸ナトリウム（ＳＸＳ）、クメンスルホン酸ナトリウム（ＳＣＳ）、シメンスルホン酸ナトリウム、アミンオキシド、アルコールおよびポリグリコールエーテル、ヒドロキシナフタレンナトリウム、ヒドロキシナフタレンスルホン酸ナトリウム、エチルヘキシル硫酸ナトリウム、ならびに、これらの組み合わせが挙げられる。
【０３９８】
ビルダーおよびコビルダー
洗剤組成物は、約５％〜約５０％などの約０〜６５重量％の洗剤ビルダーもしくはコビルダー、または、これらの混合物を含有し得る。皿洗浄洗剤において、ビルダーのレベルは、典型的には４０〜６５％、特に５０〜６５％である。ビルダーおよび／またはコビルダーは特に、ＣａおよびＭｇと共に水溶性錯体を形成するキレート化剤であり得る。ランドリー洗剤において用いられる技術分野において公知であるいずれかのビルダーおよび／またはコビルダーが利用され得る。ビルダーの非限定的な例としては、ゼオライト、二リン酸塩（ピロリン酸塩）、三リン酸ナトリウム（ＳＴＰまたはＳＴＰＰ）などの三リン酸塩、炭酸ナトリウムなどの炭酸塩、メタケイ酸ナトリウムなどの可溶性ケイ酸塩、層状ケイ酸塩（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ製ＳＫＳ−６）、２−アミノエタン−１−オール（ＭＥＡ）、イミノジエタノール（ＤＥＡ）および２，２’、２”−ニトリロトリエタノール（ＴＥＡ）などのエタノールアミン、および、カルボキシメチルイヌリン（ＣＭＩ）、ならびに、これらの組み合わせが挙げられる。
【０３９９】
洗剤組成物はまた、約５％〜約４０％などの０〜６５重量％の洗剤コビルダーまたはこれらの混合物を含有し得る。洗剤組成物は、コビルダーを単独で含んでいても、または、例えばゼオライトビルダーなどのビルダーと組み合わせて含んでいてもよい。コビルダーの非限定的な例としては、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）またはコポリ（アクリル酸／マレイン酸）（ＰＡＡ／ＰＭＡ）などのポリアクリレートのホモポリマーまたはそのコポリマーが挙げられる。さらに非限定的な例としては、クエン酸塩、アミノカルボン酸塩、アミノポリカルボン酸塩およびホスホン酸塩などのキレート剤、ならびに、アルキル−またはアルケニルコハク酸が挙げられる。追加の特定の例としては、２，２’，２”−ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、イミノジコハク酸（ＩＤＳ）、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸（ＥＤＤＳ）、メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）、グルタミン酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＧＬＤＡ）、１−ヒドロキシエタン−１，１−ジイルビス（ホスホン酸）（ＨＥＤＰ）、エチレンジアミンテトラキス（メチレン）テトラキス（ホスホン酸）（ＥＤＴＭＰＡ）、ジエチレントリアミンエペンタキス（メチレン）ペンタキス（ホスホン酸）（ＤＴＰＭＰＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸（ＥＤＧ）、アスパラギン酸−Ｎ−一酢酸（ＡＳＭＡ）、アスパラギン酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＡＳＤＡ）、アスパラギン酸−Ｎ−モノプロピオン酸（ＡＳＭＰ）、イミノジコハク酸（ＩＤＡ）、Ｎ−（２−スルホメチル）アスパラギン酸（ＳＭＡＳ）、Ｎ−（２−スルホエチル）アスパラギン酸（ＳＥＡＳ）、Ｎ−（２−スルホメチル）グルタミン酸（ＳＭＧＬ）、Ｎ−（２−スルホエチル）グルタミン酸（ＳＥＧＬ）、Ｎ−メチルイミノ二酢酸（ＭＩＤＡ）、α−アラニン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（α−ＡＬＤＡ）、セリン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＳＥＤＡ）、イソセリン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＩＳＤＡ）、フェニルアラニン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＰＨＤＡ）、アントラニル酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＡＮＤＡ）、スルファニル酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＳＬＤＡ）、タウリン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＴＵＤＡ）およびスルホメチル−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＳＭＤＡ）、Ｎ−（ヒドロキシエチル）−エチリデンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ジエタノールグリシン（ＤＥＧ）、ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸）（ＤＴＰＭＰ）、アミノトリス（メチレンホスホン酸）（ＡＴＭＰ）、ならびに、これらの組み合わせおよび塩が挙げられる。さらなる例示的なビルダーおよび／またはコビルダーは、例えば、国際公開第０９／１０２８５４号パンフレット、米国特許第５９７７０５３号明細書に開示されている。
【０４００】
漂白系
洗剤は、約１％〜約５％などの０〜１０重量の漂白系を含有し得る。ランドリー＋洗剤において用いられるいずれかの技術分野において公知である漂白系が利用され得る。好適な漂白系成分としては、漂白触媒、光漂白、漂白活性化剤、過炭酸ナトリウムおよび過ホウ酸ナトリウムなどの過酸化水素の供給源、事前に形成した過酸、ならびに、これらの混合物が挙げられる。好適な事前に形成した過酸としては、これらに限定されないが、ペルオキシカルボン酸および塩、過炭酸および塩、過イミド酸および塩、ペルオキシ一硫酸および塩、例えば、オキソン（Ｒ）、ならびに、これらの混合物が挙げられる。漂白系の非限定的な例としては、例えば、過ホウ酸（通常は一水和物または四水和物）、過炭酸、過硫酸、過リン酸、過ケイ酸のナトリウム塩などのアルカリ金属塩を含む無機塩を、過酸−形成性漂白活性化剤と組み合わせて含み得るペルオキシド系漂白系が挙げられる。本明細書において漂白活性化剤とは、ペルオキシド漂白剤様過酸化水素と反応して、過酸を形成する化合物を意味する。このようにして形成された過酸は、活性化された漂白剤を構成する。本明細書において用いられる好適な漂白活性化剤は、エステルアミド、イミドまたは無水物の分類に属するものを含み、好適な例は、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）、ナトリウム３，５，５トリメチルヘキサノイルオキシベンゼンスルホネート、ジペルオキシドデカン酸、４−（ドデカノイルオキシ）ベンゼンスルホネート（ＬＯＢＳ）、４−（デカノイルオキシ）ベンゼンスルホネート、４−（デカノイルオキシ）安息香酸塩（ＤＯＢＳ）、４−（３，５，５−トリメチルヘキサノイルオキシ）ベンゼンスルホネート（ＩＳＯＮＯＢＳ）、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）および４−（ノナノイルオキシ）ベンゼンスルホネート（ＮＯＢＳ）、および／または、国際公開第９８／１７７６７号パンフレットに開示されているものである。対象の漂白活性化剤の特定のファミリーは欧州特許第６２４１５４号明細書に開示されており、アセチルトリエチルシトレート（ＡＴＣ）が特に好ましいファミリーである。ＡＴＣまたは短鎖トリグリセリド様トリアシンは、最終的にはクエン酸およびアルコールに分解されるために、環境にやさしいという利点を有する。さらに、アセチルトリエチルシトレートおよびトリアセチンは、保管に際して生成物中における良好な加水分解安定性を有しており、これは効果的な漂白活性化剤である。最後に、ＡＴＣは、ランドリー添加剤に対して良好な補助能を提供する。または、漂白系は、例えば、アミド、イミドまたはスルホンタイプのペルオキシドを含み得る。漂白系はまた、６−（フタロイルアミノ）過カプロン酸（ＰＡＰ）などの過酸を含み得る。漂白系はまた、漂白触媒を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、漂白剤成分は、以下の式を有する有機触媒：
【化４】
2015500006.tif 000006
（ｉｉｉ）およびこれらの混合物（式中、各Ｒ1は、独立して、９〜２４個の炭素を含有する分岐アルキル基または１１〜２４個の炭素を含有する直鎖アルキル基であり、好ましくは、各Ｒ1は、独立して、９〜１８個の炭素を含有する分岐アルキル基または１１〜１８個の炭素を含有する直鎖アルキル基であり、より好ましくは各Ｒ1は、独立して、２−プロピルヘプチル、２−ブチルオクチル、２−ペンチルノニル、２−ヘキシルデシル、ｎ−ドデシル、ｎ−テトラデシル、ｎ−ヘキサデシル、ｎ−オクタデシル、イソ−ノニル、イソ−デシル、イソ−トリデシルおよびイソ−ペンタデシルからなる群から選択される）からなる群から選択される有機触媒であり得る。他の例示的な漂白系は、例えば、国際公開第２００７／０８７２５８号パンフレット、国際公開第２００７／０８７２４４号パンフレット、国際公開第２００７／０８７２５９号パンフレット、国際公開第２００７／０８７２４２号パンフレットに記載されている。好適な光漂白は、例えばスルホン化アエンフタロシアニンであり得る。
【０４０１】
ポリマー
洗剤は、０．５〜５％、２〜５％、０．５〜２％または０．２〜１％などの０〜１０重量％のポリマーを含有し得る。洗剤における使用が技術分野において公知であるいずれかのポリマーが利用され得る。ポリマーは、上記のとおりコビルダーとして機能し得、または、再付着防止、繊維保護、汚染物の遊離、移染防止、油脂クリーニングおよび／もしくは消泡特性をもたらし得る。いくつかのポリマーは、上記の特性を２つ以上および／または下記のモチーフを２つ以上有し得る。例示的なポリマーとしては、（カルボキシメチル）セルロース（ＣＭＣ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（エチレングリコール）またはポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＧ）、エトキシル化ポリ（エチレンイミン）、カルボキシメチルイヌリン（ＣＭＩ）、および、ＰＡＡ、ＰＡＡ／ＰＭＡ、ポリアスパラギン酸などのポリカルボキシレート、および、ラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマー、疎水性修飾ＣＭＣ（ＨＭ−ＣＭＣ）およびシリコーン、テレフタル酸とオリゴマー系グリコールとのコポリマー、ポリエチレンテレフタレートとポリオキシエテンテレフタレート（ＰＥＴ−ＰＯＥＴ）とのコポリマー、ＰＶＰ、ポリ（ビニルイミダゾール）（ＰＶＩ）、ポリ（ビニルピリジン−Ｎ−オキシド）（ＰＶＰＯまたはＰＶＰＮＯ）、ならびに、ポリビニルピロリドン−ビニルイミダゾール（ＰＶＰＶＩ）が挙げられる。さらなる例示的なポリマーとしては、スルホン化ポリカルボキシレート、ポリエチレンオキシドおよびポリプロピレンオキシド（ＰＥＯ−ＰＰＯ）および硫酸ジクオタニウムエトキシ（ｄｉｑｕａｔｅｒｎｉｕｍ  ｅｔｈｏｘｙ  ｓｕｌｆａｔｅ）が挙げられる。他の例示的なポリマーが、例えば、国際公開第２００６／１３０５７５号パンフレットに開示されている。上記のポリマーの塩もまた想定される。
【０４０２】
布地色調剤
本発明の洗剤組成物はまた、染料または顔料などの布地色調剤を含んでいてもよく、これは、洗剤組成物に配合された場合に、前記布地が前記洗剤組成物を含む洗浄液と接触させられる際に布地に付着し、これにより、可視光の吸収／反射を介して前記布地の色合いを変えることが可能である。蛍光性白色化剤は少なくともいくらかの可視光を放つ。対照的に、布地色調剤は、可視光スペクトルの少なくとも一部分を吸収することで表面の色合いを変える。好適な布地色調剤としては、染料および染料−クレイ複合体が挙げられ、また、顔料もまた挙げられ得る。好適な染料としては、微小分子染料および高分子染料が挙げられる。好適な微小分子染料としては、例えば国際公開第２００５／０３２７４号パンフレット、国際公開第２００５／０３２７５号パンフレット、国際公開第２００５／０３２７６号パンフレットおよび欧州特許第１８７６２２６号明細書（本明細書において参照により援用される）に記載されている、Ｄｉｒｅｃｔ  Ｂｌｕｅ、Ｄｉｒｅｃｔ  Ｒｅｄ、Ｄｉｒｅｃｔ  Ｖｉｏｌｅｔ、Ａｃｉｄ  Ｂｌｕｅ、Ａｃｉｄ  Ｒｅｄ、Ａｃｉｄ  Ｖｉｏｌｅｔ、Ｂａｓｉｃ  Ｂｌｕｅ、Ｂａｓｉｃ  ＶｉｏｌｅｔおよびＢａｓｉｃ  Ｒｅｄ、または、これらの混合物の染料索引（Ｃ．Ｉ．）分類に属する染料からなる群から選択される微小分子染料が挙げられる。洗剤組成物は、約０．００００３重量％〜約０．２重量％、約０．００００８重量％〜約０．０５重量％またはさらには約０．０００１重量％〜約０．０４重量％の布地色調剤を含むことが好ましい。組成物は、０．０００１重量％〜０．２重量％の布地色調剤を含み得、これは、組成物が単位用量ポーチの形態である場合に特に好ましい場合がある。好適な色調剤はまた、例えば、国際公開第２００７／０８７２５７号パンフレット、国際公開第２００７／０８７２４３号パンフレットに開示されている。
【０４０３】
（追加の）酵素
一実施形態において、本発明に係る１０Ｒ様変異体は、少なくとも２種の酵素、より好ましくは少なくとも３、４または５種の酵素などの１種または複数種の酵素と組み合わされる。好ましくは、酵素は、例えば、タンパク分解活性、デンプン分解活性、脂肪分解活性、ヘミセルロース分解活性またはペクチン分解活性などの異なる基質特異性を有する。
【０４０４】
洗剤添加剤、ならびに、洗剤組成物は、例えばラッカーゼおよび／またはペルオキシダーゼなどの、タンパク分解酵素、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼなどの１種または複数種［追加］の酵素を含み得る。
【０４０５】
普通、選択された酵素の特性は選択された洗剤と適合性であるべきであり（すなわち、至適ｐＨ、他の酵素的および非酵素的処方成分等との親和性）、酵素は有効量で存在しているべきである。
【０４０６】
セルラーゼ：好適なセルラーゼは、細菌性または真菌性由来のものを含む。化学的に修飾されたミュータントまたはタンパク質改変ミュータントが含まれる。好適なセルラーゼとしては、例えば、米国特許第４，４３５，３０７号明細書、米国特許第５，６４８，２６３号明細書、米国特許第５，６９１，１７８号明細書、米国特許第５，７７６，７５７号明細書および国際公開第８９／０９２５９号パンフレットに開示されている、フミコラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、ミセリオフトラテルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）およびフザリウム  オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から生成された真菌セルラーゼなどの、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）由来のセルラーゼが挙げられる。
【０４０７】
特に好適なセルラーゼは、色の取り扱いに関する有益性を有するアルカリ性または中性セルラーゼである。このようなセルラーゼの例は、欧州特許第０  ４９５  ２５７、欧州特許第０  ５３１  ３７２号明細書、国際公開第９６／１１２６２号パンフレット、国際公開第９６／２９３９７号パンフレット、国際公開第９８／０８９４０号パンフレットに記載されているセルラーゼである。他の例は、国際公開第９４／０７９９８号パンフレット、欧州特許第０  ５３１  ３１５号明細書、米国特許第５，４５７，０４６号明細書、米国特許第５，６８６，５９３号明細書、米国特許第５，７６３，２５４号明細書、国際公開第９５／２４４７１号パンフレット、国際公開第９８／１２３０７号パンフレットおよび国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ９８／００２９９号パンフレットに記載されているものなどのセルラーゼ変異体である。
【０４０８】
市販されているセルラーゼとしては、Ｃｅｌｌｕｚｙｍｅ（商標）およびＣａｒｅｚｙｍｅ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、Ｃｌａｚｉｎａｓｅ（商標）およびＰｕｒａｄａｘ  ＨＡ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．）およびＫＡＣ−５００（Ｂ）（商標）（花王株式会社）が挙げられる。
【０４０９】
プロテアーゼ：
プロテアーゼは、化学的または遺伝的に修飾されたミュータントを含む動物、植物または微生物由来のものであり得る。微生物由来が好ましい。これは、セリンプロテアーゼまたはメタロプロテアーゼなどのアルカリプロテアーゼであり得る。セリンプロテアーゼは、例えば、トリプシンなどのＳ１ファミリー、または、サブチリシンなどのＳ８ファミリーのものであり得る。メタロプロテアーゼプロテアーゼは、例えば、サーモリシンであり得、または、例えばファミリーＭ４、Ｍ５、Ｍ７またはＭ８由来であり得る。
【０４１０】
「サブチラーゼ」という用語は、Ｓｉｅｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｎｇ．４（１９９１）７１９−７３７およびＳｉｅｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６（１９９７）５０１−５２３に従うセリンプロテアーゼのサブグループを指す。セリンプロテアーゼは、基質と共有結合付加物を形成する、活性部位中にセリンを有することにより特徴付けられるプロテアーゼのサブグループである。さらなるサブチラーゼ（および、セリンプロテアーゼ）は、セリン以外の２つの活性部位アミノ酸残基、すなわち、ヒスチジンおよびアスパラギン酸残基を有することにより特徴付けられる。
【０４１１】
サブチリシンの例は、国際公開第８９／０６２７９号パンフレットに記載のサブチリシンｌｅｎｔｕｓ、バチルスレンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、サブチリシンＮｏｖｏ、サブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、サブチリシンＢＰＮ’、サブチリシン３０９、サブチリシン１４７およびサブチリシン１６８などのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来のもの、ならびに、プロテアーゼＰＤ１３８（国際公開第９３／１８１４０号パンフレット）である。追加のセリンプロテアーゼの例は、国際公開第９８／０２０１１５号パンフレット、国際公開第０１／４４４５２号パンフレット、国際公開第０１／５８２７５号パンフレット、国際公開第０１／５８２７６号パンフレット、国際公開第０３／００６６０２号パンフレットおよび国際公開第０４／０９９４０１号パンフレットに記載されている。ＢＬＡＰのアミノ酸配列は米国特許第５，３５２，６０４号明細書の図２９に示されている。
【０４１２】
トリプシン様プロテアーゼの例は、国際公開第８９／０６２７０号パンフレットおよび国際公開第９４／２５５８３号パンフレットに記載のトリプシン（例えばブタまたはウシ由来）およびフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）プロテアーゼである。有用なプロテアーゼの例は、国際公開第９２／１９７２９号パンフレット、国際公開第９８／２０１１５号パンフレット、国際公開第９８／２０１１６号パンフレットおよび国際公開第９８／３４９４６号パンフレットに記載の変異体であって、特に、以下の位置の１つまたは複数に置換を有する変異体である：２７、３６、５７、７６、８７、９７、１０１、１０４、１２０、１２３、１６７、１７０、１９４、２０６、２１８、２２２、２２４、２３５および２７４。
【０４１３】
メタロプロテアーゼの例は、国際公開第０７／０４４９９３号パンフレットに記載の中性メタロプロテアーゼである。
【０４１４】
好ましい市販されているプロテアーゼ酵素としては、Ａｌｃａｌａｓｅ（商標）、Ｃｏｒｏｎａｓｅ（商標）、Ｄｕｒａｚｙｍ（商標）、Ｅｓｐｅｒａｓｅ（商標）、Ｅｖｅｒｌａｓｅ（商標）、Ｋａｎｎａｓｅ（商標）、Ｌｉｑｕａｎａｓｅ（商標）、Ｌｉｑｕａｎａｓｅ  Ｕｌｔｒａ（商標）、Ｏｖｏｚｙｍｅ（商標）、Ｐｏｌａｒｚｙｍｅ（商標）、Ｐｒｉｍａｓｅ（商標）、Ｒｅｌａｓｅ（商標）、Ｓａｖｉｎａｓｅ（商標）およびＳａｖｉｎａｓｅ  Ｕｌｔｒａ（商標）、（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、Ａｘａｐｅｍ（商標）（Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｓｅｓ  Ｎ．Ｖ．）、ＢＬＡＰおよびＢＬＡＰ  Ｘ（Ｈｅｎｋｅｌ  ＡＧ  ＆  Ｃｏ．ＫＧａＡ）、Ｅｘｃｅｌｌａｓｅ（商標）、ＦＮ２（商標）、ＦＮ３（商標）、ＦＮ４（商標）、Ｍａｘａｃａｌ（商標）、Ｍａｘａｐｅｍ（商標）、Ｍａｘａｔａｓｅ（商標）、Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ（商標）、Ｐｕｒａｆａｓｔ（商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ  ＯｘＰ（商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（商標）ＰｒｉｍｅおよびＰｕｒａｍａｘ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．）が挙げられる。
【０４１５】
リパーゼおよびクチナーゼ：好適なリパーゼおよびクチナーゼは、細菌または真菌由来のものを含む。化学的に修飾されたまたはタンパク質改変ミュータントが含まれる。例としては、欧州特許第２５８  ０６８号明細書および欧州特許第３０５  ２１６号明細書に記載されている、例えば、Ｔ．ラヌギノスス（Ｔ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）（過去にはフミコララヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）と呼ばれていた）などのサーモマイセス属（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）由来のリパーゼ、国際公開第９６／１３５８０号パンフレットに記載されている、例えばＨ．インソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）などのフミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）由来のクチナーゼ、例えば、Ｐ．アルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）またはＰ．シュードアルカリゲネス（Ｐ．ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）（欧州特許第２１８  ２７２号明細書）、Ｐ．セパシア（Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ）（欧州特許第３３１  ３７６号明細書）、Ｐ．スツッツェリ（Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ）（独国特許第１，３７２，０３４号明細書）、Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス属の一種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）菌株ＳＤ７０５（国際公開第９５／０６７２０号パンフレットおよび国際公開第９６／２７００２号パンフレット）、Ｐ．ウィスコンシネンシス（Ｐ．ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ）（国際公開第９６／１２０１２号パンフレット）由来のシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）リパーゼ、例えば、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（Ｄａｒｔｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１１３１：２５３−３６０）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（特開昭６４／７４４９９２号公報）またはＢ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）（国際公開第９１／１６４２２号パンフレット）由来のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）リパーゼが挙げられる。
【０４１６】
他の例は、国際公開第９２／０５２４９号パンフレット、国際公開第９４／０１５４１号パンフレット、欧州特許第４０７２２５号明細書、欧州特許第２６０１０５号明細書、国際公開第９５／３５３８１号パンフレット、国際公開第９６／００２９２号パンフレット、国際公開第９５／３０７４４号パンフレット、国際公開第９４／２５５７８号パンフレット、国際公開第９５／１４７８３号パンフレット、国際公開第９５／２２６１５号パンフレット、国際公開第９７／０４０７９号パンフレット、国際公開第９７／０７２０２号パンフレット、国際公開第００／０６００６３号パンフレット、国際公開第２００７／０８７５０８号パンフレットおよび国際公開第２００９／１０９５００号パンフレットに記載のものなどのリパーゼ変異体である。
【０４１７】
好ましい市販されているリパーゼ酵素としては、Ｌｉｐｏｌａｓｅ（商標）、Ｌｉｐｏｌａｓｅ  Ｕｌｔｒａ（商標）およびＬｉｐｅｘ（商標）；Ｌｅｃｉｔａｓｅ（商標）、Ｌｉｐｏｌｅｘ（商標）；Ｌｉｐｏｃｌｅａｎ（商標）、Ｌｉｐｏｐｒｉｍｅ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）が挙げられる。他の市販されているリパーゼとしては、Ｌｕｍａｆａｓｔ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔ  Ｉｎｃ）；Ｌｉｐｏｍａｘ（Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ／Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔ  Ｉｎｃ）、および、Ｓｏｌｖａｙ製のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）リパーゼが挙げられる。
【０４１８】
アミラーゼ：好適なアミラーゼ（αおよび／またがβ）は、細菌性または真菌性由来のものを含む。化学的に修飾されたミュータントまたはタンパク質改変ミュータントが含まれる。アミラーゼとしては、例えば、英国特許第１，２９６，８３９号明細書により詳細に記載されているバチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の特別な系統などの、例えばバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）から得られるα−アミラーゼが挙げられる。
【０４１９】
有用なアミラーゼの例は、国際公開第９４／０２５９７号パンフレット、国際公開第９４／１８３１４号パンフレット、国際公開第９６／２３８７３号パンフレットおよび国際公開第９７／４３４２４号パンフレットに記載の変異体であって、特に、以下の１つまたは複数の位置に置換を伴う変異体である：１５、２３、１０５、１０６、１２４、１２８、１３３、１５４、１５６、１８１、１８８、１９０、１９７、２０２、２０８、２０９、２４３、２６４、３０４、３０５、３９１、４０８および４４４。
【０４２０】
市販されているアミラーゼは、Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ（商標）、Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ（商標）Ｐｌｕｓ，Ｎａｔａｌａｓｅ（商標）、Ｄｕｒａｍｙｌ（商標）、Ｔｅｒｍａｍｙｌ（商標）、Ｆｕｎｇａｍｙｌ（商標）およびＢＡＮ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、Ｒａｐｉｄａｓｅ（商標）、Ｐｏｗｅｒａｓｅ（商標）およびＰｕｒａｓｔａｒ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．製）である。
【０４２１】
ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：好適なペルオキシダーゼ／オキシダーゼは、植物、細菌性または真菌性由来のものを含む。化学的に修飾されたミュータントまたはタンパク質改変ミュータントが含まれる。有用なペルオキシダーゼの例としては、例えば、Ｃ．シネレウス（Ｃ．ｃｉｎｅｒｅｕｓ）などのコプリヌス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）由来のペルオキシダーゼ、および、国際公開第９３／２４６１８号パンフレット、国際公開第９５／１０６０２号パンフレットおよび国際公開第９８／１５２５７号パンフレットに記載されているものなどのその変異体が挙げられる。
【０４２２】
市販されているペルオキシダーゼとしては、Ｇｕａｒｄｚｙｍｅ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）が挙げられる。
【０４２３】
洗剤酵素は、１種または複数種の酵素を含有する個別の添加剤を加えることにより、または、これらの酵素のすべてを含む複合添加剤を加えることにより、洗剤組成物に含まれていてもよい。本発明の洗剤添加剤（すなわち、個別の添加剤または複合添加剤）は、例えば、粒質物、液体、スラリー等として配合されることが可能である。好ましい洗剤添加剤配合物は、粒質物、特に非発塵性粒質物、液体、特に安定化された液体またはスラリーである。
【０４２４】
非発塵性粒質物は、例えば、米国特許第４，１０６，９９１号明細書および米国特許第４，６６１，４５２号明細書に開示のとおり生成され得、任意により、技術分野において公知である方法によりコーティングされてもよい。ワックス状コーティング材の例は、１０００〜２００００の平均モル重量を有するポリ（エチレンオキシド）生成物（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）；１６〜５０個のエチレンオキシドユニットを有するエトキシル化ノニルフェノール；アルコールが１２〜２０個の炭素原子を含有し、および、１５〜８０個のエチレンオキシドユニットが存在するエトキシル化脂肪族アルコール；脂肪族アルコール；脂肪酸；ならびに、脂肪酸のモノ−およびジ−およびトリグリセリドである。流動床技術による用途に対して好適なフィルム形成性コーティング材の例は英国特許第１４８３５９１号明細書に記載されている。液体酵素調製物は、例えば、確立された方法に従って、プロピレングリコールなどのポリオール、糖質または糖質アルコール、乳酸またはホウ酸を添加することにより安定化され得る。保護された酵素は、欧州特許第２３８，２１６号明細書に開示されている方法に従って調製され得る。
【０４２５】
補助材
ランドリー、皿洗浄またはＩ＆Ｉ洗剤において用いられる技術分野において公知であるいずれかの洗剤成分もまた利用され得る。他の任意の洗剤成分としては、単独もしくは組み合わせで、耐食剤、収縮防止剤、再汚染防止剤、しわ防止剤、殺菌剤、バインダ、腐食抑制剤、崩壊剤／分解剤、染料、酵素安定化剤（ホウ酸、ホウ酸塩、ＣＭＣ、および／または、プロピレングリコールなどのポリオールを含む）、クレイを含む布地コンディショナ、充填材／加工助剤、蛍光性白色化剤／光学増白剤、起泡増進剤、起泡（セッケンの泡）調節剤、香料、汚染物−懸濁剤、軟化剤、セッケン泡抑制剤、色あせ防止剤、および、ウィッキング剤が挙げられる。ランドリー、皿洗浄またはＩ＆Ｉ洗剤において用いられる技術分野において公知であるいずれかの処方成分が利用され得る。このような処方成分の選択は十分に当業者の技能の範囲内である。
【０４２６】
分散剤−本発明の洗剤組成物はまた、分散剤を含有することが可能である。特に粉末洗剤が分散剤を含んでいてもよい。好適な水溶性有機材料としては、ホモ−またはコポリマー酸またはその塩が挙げられ、ここで、ポリカルボン酸は、２個以下の炭素原子によって相互に分離された少なくとも２つのカルボキシルラジカルを含む。好適な分散剤は、例えば、Ｐｏｗｄｅｒｅｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ，  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ｓｅｒｉｅｓ  ｖｏｌｕｍｅ  ７１，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．に記載されている。
【０４２７】
移染防止剤−本発明の洗剤組成物はまた、１種または複数種の移染防止剤を含み得る。好適な高分子移染防止剤としては、これらに限定されないが、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドンおよびＮ−ビニルイミダゾールのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドンおよびポリビニルイミダゾールまたはこれらの混合物が挙げられる。主題の組成物中に存在する場合、移染防止剤は、組成物の約０．０００１％〜約１０％、約０．０１％〜約５％、または、さらには約０．１％〜約３重量％のレベルで存在し得る。
【０４２８】
蛍光性白色化剤−本発明の洗剤組成物はまた、好ましくは、蛍光性白色化剤または光学増白剤などのクリーニングされる物品の色合いを変え得る追加の成分を含有するであろう。存在する場合、増白剤は、約０，０１％〜約０，５％のレベルであることが好ましい。ランドリー洗剤組成物における使用に好適ないずれかの蛍光性白色化剤が、本発明の組成物中に用いられ得る。最も一般的に用いられる蛍光性白色化剤は、ジアミノスチルベン−スルホン酸誘導体、ジアリールピラゾリン誘導体およびビスフェニル−ジスチリル誘導体の分類に属するものである。ジアミノスチルベン−スルホン酸誘導体タイプの蛍光性白色化剤の例としては：４，４’−ビス−（２−ジエタノールアミノ−４−アニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２’−ジスルホネート；４，４’−ビス−（２，４−ジアニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２．２’−ジスルホネート；４，４’−ビス−（２−アニリノ−４（Ｎ−メチル−Ｎ−２−ヒドロキシ−エチルアミノ）−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２’−ジスルホネート、４，４’−ビス−（４−フェニル−２，１，３−トリアゾール−２−イル）スチルベン−２，２’−ジスルホネート；４，４’−ビス−（２−アニリノ−４（１−メチル−２−ヒドロキシ−エチルアミノ）−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２’−ジスルホネートおよび２−（スチビル−４”−ナフト−１．，２’：４，５）−１，２，３−トリアゾール−２”スルホネートのナトリウム塩が挙げられる。好ましい蛍光性白色化剤は、Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ  ＡＧ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから入手可能であるＴｉｎｏｐａｌ  ＤＭＳおよびＴｉｎｏｐａｌ  ＣＢＳである。Ｔｉｎｏｐａｌ  ＤＭＳは、４，４’−ビス−（２−モルホリノ−４アニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベンジスルホネートのジナトリウム塩である。Ｔｉｎｏｐａｌ  ＣＢＳは、２，２’−ビス−（フェニル−スチリル）ジスルホネートのジナトリウム塩である。また、好ましい蛍光性白色化剤は、Ｐａｒａｍｏｕｎｔ  Ｍｉｎｅｒａｌｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｕｍｂａｉ，Ｉｎｄｉａ製の市販のＰａｒａｗｈｉｔｅ  ＫＸである。本発明における使用に好適な他の蛍光剤としては、１−３−ジアリールピラゾリンおよび７−アルキルアミノクマリンが挙げられる。好適な蛍光性増白剤レベルは、約０．０１、０．０５、約０．１、または、さらには約０．２重量％の下限レベルから、０．５またはさらには０．７５重量％の上限レベルを含む。
【０４２９】
汚染物遊離ポリマー−本発明の洗剤組成物はまた、綿およびポリエステル系布地などの布地からの汚染物の除去、特にポリエステル系布地からの疎水性汚染物の除去を補助する１種または複数種の汚染物遊離ポリマーを含み得る。汚染物遊離ポリマーは、例えば、ノニオン性またはアニオン性テレフタレート系ポリマー、ポリビニルカプロラクタムおよび関連するコポリマー、ビニルグラフトコポリマー、ポリエステルポリアミドであり得る（例えばＣｈａｐｔｅｒ  ７，Ｐｏｗｄｅｒｅｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ，Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ｓｅｒｉｅｓ  ｖｏｌｕｍｅ  ７１，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．を参照のこと）。他のタイプの汚染物遊離ポリマーは、コア構造と、このコア構造に結合した複数のアルコキシレート基とを含む両親媒性アルコキシル化油脂クリーニングポリマーである。コア構造は、国際公開第２００９／０８７５２３号パンフレット（本明細書において参照により援用されている）に詳述されているとおり、ポリアルキレンイミン構造またはポリアルカノールアミン構造を含み得る。さらに、ランダムグラフトコポリマーは、好適な汚染物遊離ポリマーである。好適なグラフトコポリマーは、国際公開第２００７／１３８０５４号パンフレット、国際公開第２００６／１０８８５６号パンフレットおよび国際公開第２００６／１１３３１４号パンフレット（本明細書において参照により援用されている）により詳細に記載されている。他の汚染物遊離ポリマーは、欧州特許第１８６７８０８号明細書または国際公開第２００３／０４０２７９号パンフレット（共に本明細書において参照により援用されている）に記載されているものなどの変性セルロース誘導体などの特に置換セルロース系構造などの置換多糖類構造である。好適なセルロース系ポリマーとしては、セルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、セルロースアミドおよびこれらの混合物が挙げられる。好適なセルロース系ポリマーとしては、アニオン性変性セルロース、ノニオン性変性セルロース、カチオン性変性セルロース、両性イオン性変性セルロース、および、これらの混合物が挙げられる。好適なセルロース系ポリマーとしては、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシルエチルセルロース、ヒドロキシルプロピルメチルセルロース、エステルカルボキシメチルセルロースおよびこれらの混合物が挙げられる。
【０４３０】
再汚染防止剤−本発明の洗剤組成物としてはまた、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリオキシエチレンおよび／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アクリル酸のホモポリマー、アクリル酸とマレイン酸とのコポリマー、ならびに、エトキシル化ポリエチレンイミンなどの１種または複数種の再汚染防止剤が挙げられ得る。上記の汚染物遊離ポリマーに記載のセルロース系ポリマーは、再汚染防止剤としても機能し得る。
【０４３１】
他の好適な補助材としては、これらに限定されないが、収縮防止剤、しわ防止剤、殺菌剤、バインダ、キャリア、染料、酵素安定化剤、布地軟化剤、充填材、起泡調節剤、ヒドロトロープ、香料、顔料、セッケン泡抑制剤、溶剤、液体洗剤用構造化剤、および／または、構造弾性化剤が挙げられる。
【０４３２】
洗剤生成物の配合物
本発明の洗剤組成物は、例えば、バー、均質な錠剤、２つ以上の層を有する錠剤、通常のもしくは圧縮された粉末、顆粒、ペースト、ゲル、または、通常の圧縮もしくは濃縮液体などのいずれかの簡便な形態であり得る。
【０４３３】
洗剤配合物形態：層（同一のまたは異なる相）、ポーチ、機械用量単位に対応した形態。
【０４３４】
ポーチは、単一または複数のコンパートメントとして構成されることが可能である。例えば水との接触に先だってポーチから組成物が漏れ出るような組成物の漏れが防止される、組成物の保持に好適であれば如何なる形態、形状および材料のものであることも可能である。ポーチは、内部容積を有する水溶性フィルム製のものである。前記内部容積は、ポーチのコンパートメントに分離されていることが可能である。好ましいフィルムは、フィルムまたはシートに形成される好ましくはポリマーである高分子材料である。好ましいポリマー、コポリマーまたはその誘導体は、ポリアクリレート、および、水溶性アクリレートコポリマー、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ナトリウムデキストリン、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、マルトデキストリン、ポリメタクリレート、最も好ましくはポリビニルアルコールコポリマーおよびヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）から選択される。好ましくは、フィルム中のポリマーのレベルは、例えばＰＶＡで少なくとも約６０％である。好ましい平均分子量は、典型的には約２０，０００〜約１５０，０００であろう。フィルムはまた、ポリアクチドおよびポリビニルアルコール（Ｃｈｒｉｓ  Ｃｒａｆｔ  Ｉｎ．Ｐｒｏｄ．Ｏｆ  Ｇａｒｙ，Ｉｎｄ．，ＵＳから市販されている商品名Ｍ８６３０で知られている）などの加水分解的に分解性および水溶性のポリマーブレンドと、グリセロール、エチレングリセロール、プロピレングリコール、ソルビトールおよびこれらの混合物のような可塑剤とを含むブレンド組成物であることが可能である。ポーチは、水溶性フィルムにより分離された固体ランドリークリーニング組成物または部分成分および／または液体クリーニング組成物または部分成分を含んでいることが可能である。液体成分用のコンパートメントは、固形分を含有するコンパートメントとは組成が異なっていることが可能である。参照：（米国特許出願公開第２００９／００１１９７０  Ａ１号明細書）
【０４３５】
洗剤処方成分は、水溶性ポーチ中のコンパートメントにより、または、錠剤の異なる層中において相互に物理的に分離されていることが可能である。これにより、成分間の負の保管相互作用を防止することが可能である。コンパートメントの各々の異なる溶解プロファイルはまた、洗浄溶液中における選択された成分の溶解を遅延させることが可能である。
【０４３６】
形態の定義／特徴：
単位包装されていない液体またはゲル洗剤は水性であり得、典型的には、重量基準で、最大で約７０％の水、最大で約６５％の水、最大で約５５％の水、最大で約４５％の水、最大で約３５％の水など、少なくとも２０％〜最大で９５％の水を含有し得る。特に限定されないが、アルカノール、アミン、ジオール、エーテルおよびポリオールを含む他のタイプの液体が、水性液体またはゲルに含まれていてもよい。水性液体またはゲル洗剤は、０〜３０％の有機溶剤を含有していてもよい。
【０４３７】
液体またはゲル洗剤は非水性であってもよい。
【０４３８】
粒状洗剤配合物
粒状洗剤は、国際公開第０９／０９２６９９号パンフレット、欧州特許第１７０５２４１号明細書、欧州特許第１３８２６６８号明細書、国際公開第０７／００１２６２号パンフレット、米国特許第６４７２３６４号明細書、国際公開第０４／０７４４１９号パンフレットまたは国際公開第０９／１０２８５４号パンフレットに記載されているとおり配合され得る。他の有用な洗剤配合物が、国際公開第０９／１２４１６２号パンフレット、国際公開第０９／１２４１６３号パンフレット、国際公開第０９／１１７３４０号パンフレット、国際公開第０９／１１７３４１号パンフレット、国際公開第０９／１１７３４２号パンフレット、国際公開第０９／０７２０６９号パンフレット、国際公開第０９／０６３３５５号パンフレット、国際公開第０９／１３２８７０号パンフレット、国際公開第０９／１２１７５７号パンフレット、国際公開第０９／１１２２９６号パンフレット、国際公開第０９／１１２２９８号パンフレット、国際公開第０９／１０３８２２号パンフレット、国際公開第０９／０８７０３３号パンフレット、国際公開第０９／０５００２６号パンフレット、国際公開第０９／０４７１２５号パンフレット、国際公開第０９／０４７１２６号パンフレット、国際公開第０９／０４７１２７号パンフレット、国際公開第０９／０４７１２８号パンフレット、国際公開第０９／０２１７８４号パンフレット、国際公開第０９／０１０３７５号パンフレット、国際公開第０９／０００６０５号パンフレット、国際公開第０９／１２２１２５号パンフレット、国際公開第０９／０９５６４５号パンフレット、国際公開第０９／０４０５４４号パンフレット、国際公開第０９／０４０５４５号パンフレット、国際公開第０９／０２４７８０号パンフレット、国際公開第０９／００４２９５号パンフレット、国際公開第０９／００４２９４号パンフレット、国際公開第０９／１２１７２５号パンフレット、国際公開第０９／１１５３９１号パンフレット、国際公開第０９／１１５３９２号パンフレット、国際公開第０９／０７４３９８号パンフレット、国際公開第０９／０７４４０３号パンフレット、国際公開第０９／０６８５０１号パンフレット、国際公開第０９／０６５７７０号パンフレット、国際公開第０９／０２１８１３号パンフレット、国際公開第０９／０３０６３２号パンフレット、および、国際公開第０９／０１５９５１号パンフレット、国際公開第２０１１０２５６１５号パンフレット、国際公開第２０１１０１６９５８号パンフレット、国際公開第２０１１００５８０３号パンフレット、国際公開第２０１１００５６２３号パンフレット、国際公開第２０１１００５７３０号パンフレット、国際公開第２０１１００５８４４号パンフレット、国際公開第２０１１００５９０４号パンフレット、国際公開第２０１１００５６３０号パンフレット、国際公開第２０１１００５８３０号パンフレット、国際公開第２０１１００５９１２号パンフレット、国際公開第２０１１００５９０５号パンフレット、国際公開第２０１１００５９１０号パンフレット、国際公開第２０１１００５８１３号パンフレット、国際公開第２０１０１３５２３８号パンフレット、国際公開第２０１０１２０８６３号パンフレット、国際公開第２０１０１０８００２号パンフレット、国際公開第２０１０１１１３６５号パンフレット、国際公開第２０１０１０８０００号パンフレット、国際公開第２０１０１０７６３５号パンフレット、国際公開第２０１００９０９１５号パンフレット、国際公開第２０１００３３９７６号パンフレット、国際公開第２０１００３３７４６号パンフレット、国際公開第２０１００３３７４７号パンフレット、国際公開第２０１００３３８９７号パンフレット、国際公開第２０１００３３９７９号パンフレット、国際公開第２０１００３０５４０号パンフレット、国際公開第２０１００３０５４１号パンフレット、国際公開第２０１００３０５３９号パンフレット、国際公開第２０１００２４４６７号パンフレット、国際公開第２０１００２４４６９号パンフレット、国際公開第２０１００２４４７０号パンフレット、国際公開第２０１００２５１６１号パンフレット、国際公開第２０１００１４３９５号パンフレット、国際公開第２０１００４４９０５号パンフレット、国際公開第２０１０１４５８８７号パンフレット、国際公開第２０１０１４２５０３号パンフレット、国際公開第２０１０１２２０５１号パンフレット、国際公開第２０１０１０２８６１号パンフレット、国際公開第２０１００９９９９７号パンフレット、国際公開第２０１００８４０３９号パンフレット、国際公開第２０１００７６２９２号パンフレット、国際公開第２０１００６９７４２号パンフレット、国際公開第２０１００６９７１８号パンフレット、国際公開第２０１００６９９５７号パンフレット、国際公開第２０１００５７７８４号パンフレット、国際公開第２０１００５４９８６号パンフレット、国際公開第２０１００１８０４３号パンフレット、国際公開第２０１０００３７８３号パンフレット、国際公開第２０１０００３７９２号パンフレット、国際公開第２０１１０２３７１６号パンフレット、国際公開第２０１０１４２５３９号パンフレット、国際公開第２０１０１１８９５９号パンフレット、国際公開第２０１０１１５８１３号パンフレット、国際公開第２０１０１０５９４２号パンフレット、国際公開第２０１０１０５９６１号パンフレット、国際公開第２０１０１０５９６２号パンフレット、国際公開第２０１００９４３５６号パンフレット、国際公開第２０１００８４２０３号パンフレット、国際公開第２０１００７８９７９号パンフレット、国際公開第２０１００７２４５６号パンフレット、国際公開第２０１００６９９０５号パンフレット、国際公開第２０１００７６１６５号パンフレット、国際公開第２０１００７２６０３号パンフレット、国際公開第２０１００６６４８６号パンフレット、国際公開第２０１００６６６３１号パンフレット、国際公開第２０１００６６６３２号パンフレット、国際公開第２０１００６３６８９号パンフレット、国際公開第２０１００６０８２１号パンフレット、国際公開第２０１００４９１８７号パンフレット、国際公開第２０１００３１６０７号パンフレット、国際公開第２０１００００６３６号パンフレットに記載されている。
【０４３９】
使用
本発明はまた、家庭における洗濯洗浄および産業用洗濯洗浄などの生地および布の洗濯において本発明に係る変異体またはその組成物を使用する方法に関する。
【０４４０】
本発明はまた、自動化食器洗浄（ＡＤＷ）、車洗浄および産業表面のクリーニングなどの硬質面クリーニングにおいて本発明に係る変異体またはその組成物を使用する方法に関する。
【０４４１】
本発明のサブチラーゼ変異体が加えられ得、それ故、洗剤組成物の成分となる。それ故、本発明の一態様は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応する領域において２つ以上のアミノ酸の改変（ここで、改変は置換または挿入であり、また、ここで、変異体は配列番号２、４または６の成熟ポリペプチドに対して少なくとも６０％の同一性を有する）を含むプロテアーゼ変異体を含む洗剤組成物の、洗濯および／または硬質面クリーニングなどのクリーニングプロセスにおける使用に関する。他の態様は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域に１つまたは複数のアミノ酸の挿入を含み、および、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応する位置に１つまたは複数の置換をさらに含む変異体を含む洗剤組成物の使用に関し、ここで、変異体は、少なくとも６０％の配列番号２、４または６の成熟ポリペプチドに対する配列同一性であって、少なくとも６５％など、少なくとも７０％など、例えば、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％同一性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列番号２、４または６の成熟ポリペプチドに対する配列同一性を有する。
【０４４２】
本発明の一実施形態は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置７５〜８２に対応する領域における１つまたは複数のアミノ酸の挿入を含み、および、位置７５、７６、７７、７８、７９および８２に対応する位置に１つまたは複数の置換をさらに含むプロテアーゼ変異体（ここで、変異体は、少なくとも６０％の同一性、少なくとも６５％など、少なくとも７０％など、例えば、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％同一性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列番号２、４または６の成熟ポリペプチドに対する配列同一性を有する）の洗濯および／または硬質面クリーニングなどのクリーニングプロセスにおける使用に関し、ここで、変異体は、「材料および方法」に記載の実施例２におけるテストに際して、親に比して、同等の前記変異体のアミノ酸配列を有するが、前記位置の１つもしくは複数に改変を有さないプロテアーゼ親に比して、または、基準プロテアーゼに比して、高いキレータ安定性を有する。
【０４４３】
本発明に係る洗剤組成物は、例えば、汚れた布の前処理に好適な洗濯添加剤組成物およびすすぎ液添加織物柔軟剤組成物を含む手洗いもしくは機械洗濯洗剤組成物として配合され得、または、通常の家庭用硬質面クリーニング作業で使用される洗剤組成物として配合され得、または、手洗いもしくは機械食器洗浄作業用に配合され得る。
【０４４４】
特定の態様において、本発明は、本明細書に記載の本発明のポリペプチドを含む洗剤添加剤を提供する。
【０４４５】
クリーニングプロセスまたは生地の手入れプロセスは、例えば、洗濯プロセス、食器洗浄プロセス、または、タイル、床、テーブル面、ドレイン、シンク、洗面台および外科用機器などの硬質面のクリーニングであり得る。洗濯プロセスは、例えば家庭における洗濯であることが可能であるが、産業的な洗濯でもあり得る。さらに、本発明は、布および／または衣類の洗濯に係るプロセスに関し、ここで、プロセスは、洗剤組成物および少なくとも１種の本発明のプロテアーゼ変異体を含有する洗浄溶液で布を処理するステップを含む。クリーニングプロセスまたは生地の手入れプロセスは、例えば機械洗浄プロセスまたは手洗い洗浄プロセスにおいて実施されることが可能である。洗浄溶液は、例えば洗剤組成物を含有する水性洗浄溶液であることが可能である。
【０４４６】
本発明の洗浄、クリーニングまたは生地の手入れプロセスに供される布および／または衣類は、従来の洗浄可能な洗濯物、例えば家庭での洗濯物であり得る。好ましくは、洗濯の大部分は衣類および布であり、ニット、織物、デニム、不織物、フェルト、ヤーンおよびタオル地が含まれる。布は、綿、亜麻、リネン、ジュート、ラミー、サイザルもしくはコイヤーを含む天然セルロース系材料、または、ビスコース／レーヨン、ラミー、酢酸セルロース繊維（ｔｒｉｃｅｌｌ）、リオセルを含む人工セルロース系材料（例えば、木材パルプ由来のもの）、または、これらのブレンドなどのセルロース系のものであり得る。布はまた、ウール、ラクダ、カシミア、モヘア、ウサギおよび絹を含む天然ポリアミド、もしくは、ナイロン、アラミド、ポリエステル、アクリル、ポリプロピレンおよびスパンデックス／エラスタンなどの合成ポリマー、または、これらのブレンドなどの非セルロース系のものであり得、ならびに、セルロース系線維および非セルロース系繊維のブレンドであり得る。ブレンドの例は、綿および／またはレーヨン／ビスコースと、ウール、合成繊維（例えば、ポリアミド繊維、アクリル繊維、ポリエステル繊維、ポリビニルアルコール繊維、ポリ塩化ビニル繊維、ポリウレタン繊維、ポリウレア繊維、アラミド繊維）、および、セルロース含有繊維（例えば、レーヨン／ビスコース、ラミー、亜麻、リネン、ジュート、酢酸セルロース繊維、リオセル）などの１種または複数種の対となる材料とのブレンドである。
【０４４７】
過去数年においては、洗浄性能に妥協することなく、石油化学製品由来のものである洗剤中の成分を酵素およびポリペプチドなどの再生可能な生物学的成分で置き換えることにますます関心が集まっている。
【０４４８】
本発明は、たんぱく質性の汚れの除去プロセスにおける本発明のサブチラーゼ変異体の使用にさらに関する。たんぱく質性の汚れは、食品汚れ、例えば、乳児用食品、皮脂、カカオ、卵、血液、乳、インク、草またはこれらの組み合わせなどの汚れであり得る。
【０４４９】
典型的な洗剤組成物は酵素に追加して種々の成分を含んでおり、これらの成分は異なる効果を有し、いくつかの成分は、界面活性剤のように洗剤における表面張力を低減させ、これによりクリーニングされる汚れを浮き上がらせて分散させ、次いで、洗い流し、他の成分は、漂白剤系のように、度々酸化により脱色し、多くの漂白剤は強い殺細菌性特性をも有し、殺菌および消毒に用いられる。さらに他の成分は、ビルダーおよびキレータのように、液体から金属イオンを除去することにより洗浄水を軟化する。
【０４５０】
特定の実施形態において、本発明は本発明のプロテアーゼ変異体を含む組成物の使用に関し、ここで、前記酵素組成物は、以下の界面活性剤、ビルダー、キレータもしくはキレート化剤、漂白剤系または漂白剤成分の少なくとも１種または複数種を洗濯もしくは食器洗浄中にさらに含む。
【０４５１】
本発明の好ましい実施形態において、界面活性剤、ビルダー、キレータまたはキレート化剤、漂白剤系および／または漂白剤成分の量は、本発明のプロテアーゼ変異体を添加せずに用いられる界面活性剤、ビルダー、キレータまたはキレート化剤、漂白剤系および／または漂白剤成分の量と比較して低減されている。好ましくは、界面活性剤、ビルダー、キレータまたはキレート化剤、漂白剤系および／または漂白剤成分である少なくとも１種の成分は、このような成分の従来の量などの本発明のプロテアーゼ変異体が添加されていない系における成分の量よりも、１％少ない、２％少ない等、３％少ない等、４％少ない等、５％少ない等、６％少ない等、７％少ない等、８％少ない等、９％少ない等、１０％少ない等、１５％少ない等、２０％少ない等、２５％少ない等、３０％少ない等、３５％少ない等、４０％少ない等、４５％少ない等、５０％少ない等の量で存在する。一態様においては、本発明のプロテアーゼ変異体が洗剤組成物において用いられており、前記組成物は、界面活性剤、ビルダー、キレータまたはキレート化剤、漂白剤系または漂白剤成分および／またはポリマーである少なくとも１種の成分を含まない。
【０４５２】
本発明を、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない以下の実施例によってさらに説明する。
【実施例】
【０４５３】
材料および方法
一般的な分子生物学的方法：
別段の定めがある場合を除き、ＤＮＡ操作および形質転換は分子生物学の標準的な方法を用いて行った（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）；Ｈａｒｗｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｕｔｔｉｎｇ（１９９０）。
【０４５４】
プロテアーゼアッセイ：
１）Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡアッセイ：
ｐＮＡ基質：Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ（Ｂａｃｈｅｍ  Ｌ−１４００）。
温度：室温（２５℃）
アッセイ緩衝剤：１００ｍＭコハク酸、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＣＨＥＳ、１００ｍＭ  ＣＡＢＳ、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＨＣｌまたはＮａＯＨによるｐＨ値の調整２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０および１１．０。
【０４５５】
２０μｌプロテアーゼ（０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中に希釈）を１００μｌアッセイ緩衝剤と混合した。アッセイを、１００μｌ  ｐＮＡ基質（５０ｍｇを１．０ｍｌ  ＤＭＳＯに溶解し、および、０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で４５×にさらに希釈した）を添加することにより開始した。プロテアーゼ活性の指標としてＯＤ405の増加を監視した。
【０４５６】
２）Ｐｒｏｔａｚｙｍｅ  ＡＫアッセイ：
基質：Ｐｒｏｔａｚｙｍｅ  ＡＫ錠剤（架橋および染色したカゼイン；Ｍｅｇａｚｙｍｅ製）
温度：３７℃（または、他のアッセイ温度に設定）。
アッセイ緩衝剤：１００ｍＭコハク酸、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＣＨＥＳ、１００ｍＭ  ＣＡＢＳ、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ６．５またはｐＨ７．０。
【０４５７】
Ｐｒｏｔａｚｙｍｅ  ＡＫ錠剤を、穏やかに攪拌することにより、２．０ｍｌ  ０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中に懸濁させた。５００μｌのこの懸濁液および５００μｌのアッセイ緩衝剤をマイクロ遠心分離チューブに分取し、氷上に置いた。２０μｌプロテアーゼ溶液（０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中に希釈した）を氷冷した混合物に添加した。チューブを３７℃のｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒに移し、高速で振盪（１４００ｒｐｍ．）することによりアッセイを開始させた。１５分間後、チューブを氷浴に戻した。未反応の基質を除去するために、混合物を氷冷遠心分離器で数分間遠心分離し、２００μｌの上澄をマイクロタイタープレートに移した。６５０ｎｍでの上澄の吸光度を計測した。プロテアーゼ溶液の代わりに２０μｌの０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むサンプルを並行してアッセイし、その値をプロテアーゼサンプルの計測から差し引いた。
【０４５８】
活性部位滴定（ＡＳＴ）
実験の設定：
活性緩衝剤：１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．０２２５％  Ｂｒｉｊ３５、ｐＨ８．６
抑制剤ストック溶液：２．０*１０-4Ｍ  キモトリプシン抑制剤−２（ＣＩ−２）（他のサブチリシン抑制剤もまた活性部位滴定に使用可能であった）
基質ストック溶液：１００ｍｇ／ｍＬ  Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡをＤＭＳＯ基質溶液に溶解：ストック溶液をトリス−緩衝剤中に１．０ｍｇ／ｍＬに希釈
各変異体の希釈物を調製し、これを、９６ウェルマイクロタイタープレートの隣接する２つの列（１＋２、３＋４等）に、２つの列の間で抑制剤溶液の濃度を変化させながら加えた。典型的には、抑制剤は２つの列の２つめにおいては１．５倍濃く希釈して、より広い濃度範囲をカバーした。Ｓａｖｉｎａｓｅ変異体と共に用いた抑制剤は、Ｋi＜１０-10Ｍの阻害定数を有する強結合をＳａｖｉｎａｓｅに対して有することが知られているキモトリプシン抑制剤２である。最初に振盪した後、プレートを室温で１時間インキュベートして、抑制剤結合を完全に均衡化させた。インキュベーションの後、３０μＬの基質溶液を各ウェルに加え、直ぐに振盪した後、吸光度を、分光測光計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４）で３分間にわたって、１０秒毎に計測した。濃度の計測が可能であるよう、酵素は列ＡまたはＢにおいて完全に不活性化されている。各ウェルにおける抑制剤の濃度は既知であるために、酵素の漸次的な阻害により、ＣＩ−２抑制剤は１：１の比でプロテアーゼと結合するという仮定の下で、変異体の濃度を推測することが可能となる。
【０４５９】
活性部位滴定の一般的な法則が、Ｋｅｚｄｙ  ａｎｄ  Ｋａｉｓｅｒ−Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  １９，１９７０，ｐｐ３−２０により説明されている。
【０４６０】
キレータ安定性アッセイ
以下の溶液をサンプルの調製に用いた：
トリス緩衝剤：１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．０４５％  Ｂｒｉｊ−３５、ｐＨ８
ＥＤＴＡストック溶液：ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中の１００ｍＭ  ＥＤＴＡ
プロテアーゼ活性の計測のため：
活性緩衝剤：１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．０２２５％  Ｂｒｉｊ  ３５、ｐＨ８．６
基質ストック溶液：ＤＭＳＯ中に溶解した１００ｍｇ／ｍＬ  Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ
基質溶液：ストック溶液を活性緩衝剤ｐＨ８．６中に０．５ｍｇ／ｍＬに希釈
【０４６１】
微量精製した変異体の濃度を、上記の抑制剤としてキモトリプシン抑制剤２ａを伴う活性部位滴定を用いて測定した。
【０４６２】
プレートに伴う差異を保障するためにインキュベーション時間は同等とし；マザープレートを、微量精製した変異体の各々を基準としてのＳａｖｉｎａｓｅ（配列番号４の成熟ポリペプチド）と一緒に含有する９６ウェルマイクロタイタープレートに用意した。変異体をトリス緩衝剤ｐＨ８を用いて希釈して各ウェルにおいて２．５ｐｐｍの合計濃度とした。０、２５、３５および５０ｍＭと４種のＥＤＴＡ濃度を各変異体について用意し、各ウェルにおける総体積を１００μＬとした。すべての実験は三重に準備し、サンプルは常に氷上に保持した。各マザープレートから、３０μＬを２つの異なる９６ウェルプレートに移し、一方は非ストレス条件下でのサンプルの活性計測用とし、他方は５０℃での明示した時間のインキュベーション用とした。活性計測のために、２．５μＬのサンプルを３８４ウェルプレートに移し、７．５μＬ緩衝剤と共に混合した。４０μＬの基質溶液を高速分取ユニット（Ｔｈｅｒｍｏ  ＭＵＬＴＩＤＲＯＰ  ３８４）により加え、プレートを直ぐに混合し、その後、３８４プレートについて、分光測光計（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｅｎ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅａｄｅｒ）により２０分間にわたって、４０５ｎｍで６０秒吸光度を計測した。最大速度、すなわち、酵素の活性は、吸光度曲線の直線部分における線形回帰によって推測される。加熱ブロック（ポリメラーゼ連鎖反応サイクラーＰＣＲブロック、ＢＩＯＲＡＤ  Ｃ１０００サーモサンプラー）を温度インキュベーションに用いた。ＰＣＲブロックを選択することによりエッジ効果の可能性を低減した。サンプルを入れる前に、ブロックを５０℃に予熱した。１０分間のインキュベーションの後、サンプルをＰＣＲブロックから取り出し、残存活性を上記のとおり計測した。
【０４６３】
実施例１：サブチラーゼ変異体の調製および精製
変異体の調製および発現
古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８の誘導体（Ｆ．Ｋｕｎｓｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ３９０（６６５７）：２４９−２５６（１９９７））をこの研究において用いた。枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の形質転換を既述のとおり行った（Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｌｏｕｓ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｊ．Ｓｐｉｚｉｚｅｎ．１９６１．Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．８１：７４１−７４６）。すべてのルーチン的な分子生物学的手法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）に記載されているプロトコルに従って行った。
【０４６４】
変異体の発酵
発酵は、技術分野において周知である方法により、または、以下のとおり実施し得る。関連する発現プラスミドを有する枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株を２％脱脂乳および９μｇ／ｍｌクロラムフェニコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９））を含むＬＢ（ルリアベルターニ（Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ））寒天プレートにストリークし、３３℃で一晩増殖させた。６μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを１０ｍＬ  ２４ウェルマイクロプレート（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｌｔｄ．）中に含有する３ｍＬのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）増殖培地（ＴＢ−Ｇｌｙ増殖培地）に各プレートから単一のコロニーを播種し、３０℃および２２０ｒｐｍで４日間インキュベートした。ＴＢ−Ｇｌｙ増殖培地は１３，３ｇ／Ｌトリプトン、２６，６ｇ／Ｌイースト菌抽出物、０，４４ｖ／ｖ％グリセロールから構成され、ｐＨ７に調節した。細胞および他の未溶解の材料は２５００ｒｐｍでの１０分間の遠心分離により発酵液体培地から除去し、上澄を微量精製用に採取した。
【０４６５】
精製
以下の溶液を微量精製に用いた：
結合緩衝剤：０．５Ｍ  ＣＨＥＳ、２５ｍＭホウ酸ナトリウム、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ１０．０
洗浄緩衝剤Ａ：０．１Ｍ  ＣＨＥＳ、２５ｍＭホウ酸ナトリウム、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ９．５
洗浄緩衝剤Ｂ：２５ｍＭトリス、２５ｍＭホウ酸ナトリウム、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ９．５
洗浄緩衝剤Ｃ：１０ｍＭトリス、２５ｍＭホウ酸ナトリウム、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ９．５
溶出緩衝剤：５０ｍＭ酢酸ナトリウム、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ４．８
保管緩衝剤：０．５Ｍ  Ｍｅｓ、ｐＨ７．０
再生緩衝剤：０．１Ｍクエン酸、ｐＨ３．５
微量精製は、クロマトグラフィ分離材料を用いる疎水性相互作用に基づいていた（メルカプト−エチル−ピリジン（ＭＥＰ）−ＨｙｐｅｒＣｅｌ，Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）。９６ウェルＷｈａｔｍａｎ  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ  ８００μＬフィルタプレート（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｌｔｄ．）の各ウェルの中に、１００μｌ  ＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌクロマトグラフィ媒体スラリー（ＢｉｏＳｅｐｒａ，１Ｍ  ＮａＣｌ中の懸濁液、２０％  ＥｔＯＨ、約７０〜７５％ｖ／ｖ）を加えた。減圧により液体（Ｗｈａｔｍａｎ，ＵｎｉＶａｃ  ３）を除去し、ＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌを、２００μｌ洗浄緩衝剤Ａで、１０分間かけて、室温で２回洗浄した。用いた洗浄緩衝剤を各ステップ後に減圧により除去した。最初の洗浄ステップの後に、１００μｌの結合緩衝剤を各ウェルに添加した。さらに、４００μｌの上澄を変異体発酵液体培地から各ウェルに添加した。上澄は、既述のとおり採取した。プロテアーゼ変異体をＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌに結合させるために、フィルタプレートを激しく振盪（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ，Ｔｉｔｒａｍａｘ  １０１，１２００ｒｐｍ）してＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌｌ分子を撹拌して結合のための最適なアクセシビリティとしながら、１時間室温でインキュベートした。細胞および未結合の材料を減圧により除去し、回収して、微量精製タンパク質と共に上澄における活性と比較して非結合活性を計測した。結合ステップの後、以下の洗浄ステップを行った。クロマトグラフィ媒体を、洗浄緩衝剤Ａで１回、洗浄緩衝剤Ｂで２回、および、洗浄緩衝剤Ｃで２回洗浄した。各洗浄ステップにおいては、２００μｌ洗浄緩衝剤を添加し、プレートを、振盪下に室温で１０分間インキュベートした。各ステップにおけるインキュベーションの後に、洗浄緩衝剤を減圧により除去した。プロテアーゼ変異体をカラムから遊離させるために、２００μｌ溶出緩衝剤を各ウェルに添加した。フィルタプレート（Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ）を振盪しながら室温で１０分間インキュベートし、結合した変異体をＭＥＰ−ＨｙｐｅｒＣｅｌから溶液中に放出させた。プロテアーゼ変異体を含有する溶出緩衝剤を、１００μｌ保管緩衝剤を含有する９６ウェルプレートに減圧により移した。追加の２００μｌ溶出緩衝剤をプレートに追加することにより溶出ステップを反復した。１０分間のインキュベーションの後、溶出したタンパク質を最初の溶出分とプールした。微量精製した変異体を−１８℃で保管した。
【０４６６】
実施例２：サブチラーゼ変異体のテスト
表１
ＥＤＴＡの存在下および不在下、ｐＨ８、５０℃で行った１０分間のインキュベーションの後におけるＳｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ基質での残存活性を、キレータ安定性アッセイで材料および方法において記載のとおり各変異体について計測した。残存活性を、高ＥＤＴＡ濃度での活性をＥＤＴＡの添加を伴わない活性により除したものとして、各変異体について演算した。ＥＤＴＡを伴わない１０分間後の残存活性割合を基準酵素（配列番号４の成熟ポリペプチド）および変異体について１００％と設定した。
【０４６７】
【表２】
2015500006.tif 000007
【０４６８】
表１から分るとおり、基準酵素は、３種のＥＤＴＡ濃度２５、３５および５０のすべてにおいて不安定である。変異体は、ＥＤＴＡが２５ｍＭとなるまでは受ける影響はごくわずかであり、すべての変異体がＥＤＴＡが３５ｍＭとなるまで顕著に高い活性を有していた。それ故、基準プロテアーゼ（配列番号４のアミノ酸１〜２６９に対応する配列番号４の成熟ポリペプチド）と比較した場合、すべての変異体がＥＤＴＡを含有する溶液において向上した安定性を有する。
【０４６９】
本明細書に記載され、特許請求されている本発明は、本明細書に開示されている特定の態様によって範囲が限定されるべきではなく、これは、これらの態様は本発明の数々の態様の例示であることが意図されているためである。いずれかの同等の態様は本発明の範囲内であることが意図されている。実際に、本明細書に示され、記載されているものに追加した本発明の種々の改変形態が、前述の記載から当業者には明らかとなるであろう。このような改変形態もまた、添付の特許請求の範囲の範囲内に属することが意図されている。競合する場合には、定義を含む本開示が優先されることとなる。
【配列表】
2015500006000001.app
【国際調査報告】
2015500006.tif 000008
2015500006.tif 000009
2015500006.tif 000010
2015500006.tif 000011