(57)【要約】本発明は、血液凝固プロセスを加速させる非抗凝固性の硫酸化またはスルホン酸化多糖（ＮＡＳＰ）を提供する。薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて本発明のＮＡＳＰを含む薬学的製剤も提供され、様々な実施形態では、これらの製剤は単位投与製剤である。本発明は、経口で生物学的に利用可能なＮＡＳＰ製剤を提供する。治療薬および予防薬として生体内で、かつ血液凝固プロセスの研究を助けるものとして生体外で血液凝固を促進する本発明の化合物および製剤を利用するための方法も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非抗凝固性の硫酸化またはスルホン酸化多糖（ＮＡＳＰ）を含む治療上有効な量の組成物を含む組成物であって、前記硫酸化またはスルホン酸化多糖が、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、メレジトース、スタキオース、ラフィノース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース、キシラン、イコデキストリン、６−カルボキシイコデキストリン、および薬学的に許容される賦形剤から選択される構成員である、組成物。
【請求項２】
血液凝固の亢進を必要とする対象を治療するための方法で用いる単位投与製剤であって、前記方法が、非抗凝固性の硫酸化またはスルホン酸化多糖（ＮＡＳＰ）を含む治療上有効な量の組成物を前記対象に投与することを含み、前記硫酸化またはスルホン酸化多糖が、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、メレジトース、スタキオース、ラフィノース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース、キシラン、イコデキストリン、６−カルボキシイコデキストリンから選択される構成員であり、前記単位投与製剤が、約０．５ｍｇ〜約１０００ｍｇの量の前記ＮＡＳＰを含む、単位投与製剤。
【請求項３】
前記ＮＡＳＰが、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの投与量を提供するのに十分な量である、請求項２に記載の単位投与製剤。
【請求項４】
前記ＮＡＳＰが、前記単位投与製剤が投与される対象における血液凝固を亢進するのに十分な量である、請求項２または３に記載の単位投与製剤。
【請求項５】
前記単位投与製剤が、経口単位投与製剤である、請求項２〜４のいずれか１項に記載の単位投与製剤。
【請求項６】
血液凝固の亢進を必要とする対象を治療するための方法であって、非抗凝固性の硫酸化またはスルホン酸化多糖（ＮＡＳＰ）を含む治療上有効な量の組成物を前記対象に投与することであって、前記硫酸化またはスルホン酸化多糖が、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、メレジトース、スタキオース、ラフィノース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース、キシラン、イコデキストリン、６−カルボキシイコデキストリンから選択される構成員である、投与することと、それによって前記対象を治療することと、を含む、方法。
【請求項７】
前記ＮＡＳＰが、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの投与量で投与される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＮＡＳＰが、単位投与製剤として投与される、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＮＡＳＰが、経口投与される、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象が、慢性または急性出血障害、血液因子欠乏に起因する先天性凝固障害、および後天性凝固障害からなる群から選択される出血障害を有する、請求項６〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記血液因子欠乏が、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、プロトロンビン、フィブリノゲン、およびフォンヴィレブランド因子からなる群から選択される１つ以上の因子の欠乏である、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
血液凝固の亢進の必要性の原因が、抗凝固剤の事前投与、手術、または他の侵襲的手技である、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
凝固促進剤、内因性凝固経路の活性化剤、外因性凝固経路の活性化剤、および第２のＮＡＳＰからなる群から選択される作用物質を投与することをさらに含む、請求項６〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記作用物質が、組織因子、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第Ｖａ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩａ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、第ＩＸ因子、第ＩＸａ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩａ因子、第ＸＩＩＩ因子、プレカリクレイン、カリクレイン、およびＨＭＷＫ、ならびにフォンヴィレブランド因子からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗凝固剤が、ヘパリン、クマリン誘導体（ワルファリンまたはジクマロール等）、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、抗トロンビンＩＩＩ、ループス抗凝固剤、ネマトード抗凝固剤ペプチド（ＮＡＰｃ２）、活性部位遮断第ＶＩＩａ因子（第ＶＩＩａｉ因子）、第ＩＸａ因子阻害剤、第Ｘａ因子阻害剤（フォンダパリヌクス、イドラパリヌクス、ＤＸ−９０６５ａ、およびラザキサバン（ＤＰＣ９０６）を含む）、第ＶａおよびＶＩＩＩａ因子の阻害剤（活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）および可溶性トロンボモジュリンを含む）、トロンビン阻害剤（ヒルジン、ビバリルジン、アルガトロバン、およびキシメラガトランを含む）、ならびに凝固因子に結合する抗体からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗凝固剤が、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＩ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、フォンヴィレブランド因子、プレカリクレイン、およびＨＭＷＫからなる群から選択される凝固因子に結合する抗体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
対象における組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）活性を阻害する方法であって、前記方法が、前記ＴＦＰＩを阻害するのに十分な量の非抗凝固性の硫酸化またはスルホン酸化多糖（ＮＡＳＰ）を含む組成物を前記対象に投与することであって、前記ＮＡＳＰが、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、メレジトース、スタキオース、ラフィノース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース、キシラン、イコデキストリン、および６−カルボキシイコデキストリンから選択される構成員である、投与することと、それによってＴＦＰＩを阻害することと、を含む、方法。
【請求項１８】
生体試料における組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）活性を阻害する方法であって、前記方法が、前記生体試料を、前記ＴＦＰＩ活性を阻害するのに十分な量の非抗凝固性の硫酸化またはスルホン酸化多糖（ＮＡＳＰ）と合わせることを含み、前記ＮＡＳＰが、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、メレジトース、スタキオース、ラフィノース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース、キシラン、イコデキストリン、および６−カルボキシイコデキストリンから選択される構成員である、方法。
【請求項１９】
（ａ）α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、メレジトース、スタキオース、ラフィノース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース、キシラン、イコデキストリン、および６−カルボキシイコデキストリンから選択される構成員である、非抗凝固性の硫酸化またはスルホン酸化多糖（ＮＡＳＰ）と、（ｂ）薬学的に許容される賦形剤と、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、プレカリクレイン、ＨＭＷＫ、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＩ因子、およびフォンヴィレブランド因子、組織因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖａ因子、第Ｘａ因子、第ＩＸａ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、および第ＶＩＩＩａ因子からなる群から選択される１つ以上の因子と、を含む、組成物。
【請求項２０】
生体試料における非抗凝固性の硫酸化またはスルホン酸化多糖（ＮＡＳＰ）による血液凝固の加速度を測定する方法であって、前記ＮＡＳＰが、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、メレジトース、スタキオース、ラフィノース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース、キシラン、イコデキストリン、および６−カルボキシイコデキストリンから選択される構成員であり、前記方法が、ａ）前記生体試料を前記ＮＡＳＰを含む組成物と合わせることと、ｂ）前記生体試料の凝固時間を測定することと、ｃ）前記生体試料の前記凝固時間を、前記ＮＡＳＰに曝露されていない対応する生体試料の前記凝固時間と比較することと、を含み、前記ＮＡＳＰに曝露された前記生体試料の前記凝固時間の減少が、前記凝固時間を加速させるＮＡＳＰを示す、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年１月３０日出願の米国仮出願第６１／５９２，５４９号の利益を主張するものであり、この内容は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
正常な血液凝固は、複雑な生理学的および生化学的プロセスであり、凝固因子カスケードの活性化を必要とし、局所血管収縮に加えてフィブリン形成および血小板凝集をもたらす（Ｄａｖｉｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：１０３６３，１９９１により総説される）。凝固カスケードは、正常な凝固開始の主な手段であるとされる「外因性」経路および拡大された凝固反応に寄与する「内在性」経路から成る。出血損傷に対する正常な応答は、外因性経路の活性化を必要とする。外因性経路の活性化は、血液が損傷後に組織上で曝露または発現される第ＶＩＩ因子の共因子である組織因子（ＴＦ）と接触すると始まる。ＴＦは、ＦＶＩＩａの産生を促進するＦＶＩＩと複合体を形成する。次いで、ＦＶＩＩａはＴＦと会合して、ＦＸを、プロトロンビナーゼ複合体の重要な成分であるセリンプロテアーゼＦＸａに変換する。ＦＸａ／ＦＶａ／カルシウム／リン脂質複合体によるプロトロンビンのトロンビンへの変換は、フィブリンの形成および血小板の活性化を刺激し、これらは全て正常な血液凝固に必須である。正常な止血は、同様にＦＸをＦＸａに変換する内因性経路第ＩＸａおよびＶＩＩＩａ因子によってさらに亢進される。
【０００３】
血液凝固は、出血障害においては不十分であり、先天性凝固障害、後天性凝固障害、または外傷によって誘発される出血状態に起因し得る。出血は、疾患の最も深刻で重大な症状の１つであり、局所部位から生じ得るか、または全身性であり得る。局所出血は、病変と関連する場合があり、止血機構不全によってさらに悪化し得る。凝固因子のうちのいずれかの先天性または後天性欠乏症は、出血傾向と関連し得る。先天性凝固障害として、血友病、凝固第ＶＩＩＩ因子（血友病Ａ）または第ＩＸ因子（血友病Ｂ）の欠乏を伴うＸ連鎖劣性疾患、および深刻なフォンヴィレブランド因子の欠乏を伴う希少出血障害であるフォンヴィレブランド疾患が挙げられる。後天性凝固障害は、疾患過程の結果として出血の前歴のない個体に起こり得る。例えば、後天性凝固障害は、第ＶＩＩＩ因子、フォンヴィレブランド因子、第ＩＸ、Ｖ、ＸＩ、ＸＩＩ、およびＸＩＩＩ因子等の血液凝固因子に対する阻害剤または自己免疫性によって、または凝固因子合成の低下に伴い得る肝疾患等に伴う止血障害によって引き起こされ得る。凝固因子欠乏症は、典型的には、高額で不便であり（静脈内）、必ずしも効果的ではない因子を差し替えることによって治療される。
【０００４】
血友病（ｈｅｍ）、重度のフォンヴィレブランド（ｓｖＷＤ）疾患、および重度の第ＶＩＩ因子欠乏症を含む血液凝固障害の治療は、典型的には、（ｈｅｍおよびｓｖＷＤを治療するために使用される）第ＶＩＩＩ因子等の凝固因子で治療される。凝固因子の投与を中心とした治療に関連する不利な面には、それらの高額な費用、これらのタンパク質の静脈内投与の必要性、および凝固因子の作用を中和する抗体の生成が含まれる。長期の因子置換療法を受けている患者の最大約２０％は、置換因子に対する中和抗体を生成し得る。
したがって、出血障害を治療するための新たな治療方法の必要性が未だ存在する。様々な出血障害に安全で使い勝手の良い効果的な単一の医薬品は、臨床実践に好ましい影響を与えるであろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｄａｖｉｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：１０３６３，１９９１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、非抗凝固性の硫酸化またはスルホン酸化多糖（ＮＡＳＰ）を凝固促進剤として使用して、出血障害を治療するための組成物および方法を提供する。ＮＡＳＰは、単一の作用物質として、または互いに合わせて、または他の止血剤とともに投与され得る。具体的には、先天性凝固障害、後天性凝固障害、および外傷誘発性出血状態を含む、出血障害の治療におけるＮＡＳＰの使用が提供される。
【０００７】
本発明は、多数の利点を提供する。例えば、硫酸化またはスルホン酸化のための塩基分子としての多糖は、構造的に明確であり、多くが低分子量であり、商業的に入手可能である。さらに、多糖の化学的硫酸化またはスルホン酸化は、硫酸化またはスルホン酸化の程度および硫酸化またはスルホン酸化のパターンの調節を可能にし、これが硫酸化またはスルホン酸化多糖の構造と活性の関係の特徴付けを可能にする。例示の実施形態では、本発明は、本発明の１つ以上のＮＡＳＰを組み込む経口剤形を提供し、投与の簡便性の向上による患者管理および患者の薬剤服用順守を改善する。
【０００８】
一実施形態では、本発明は、生体内および／または生体外で哺乳類血液の凝固を亢進する能力を有する硫酸化またはスルホン酸化多糖を提供する。様々な実施形態では、この硫酸化またはスルホン酸化多糖は、凝固促進活性を有する。様々な態様では、硫酸化またはスルホン酸化多糖の凝固促進活性は、標準のアッセイ、例えば、トロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）を用いて測定できる十分な規模である。
【０００９】
本発明の例示の硫酸化またはスルホン酸化多糖は、これらの多糖のうちの１つが投与された対象に治療上関連した凝固促進作用を提供することを特徴とする。本発明の例示の硫酸化またはスルホン酸化多糖は、対象への投与時に抗凝固作用も与え、様々な実施形態では、本発明の多糖は、多糖の凝固促進作用を完全に相殺するのに十分な程度の抗凝固作用を誘導しない。
【００１０】
様々な実施形態では、本発明は、塩基多糖が、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、キシロヘキサオース、ラフィノース、メレジトース、スタキオース、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、および６−カルボキシイコデキストリン、イコデキストリン、およびキシランから選択される、硫酸化またはスルホン酸化多糖を提供する。様々な実施形態では、本発明のＮＡＳＰは、ＴＦＰＩ希釈プロトロンビン時間（ＴＦＰＩ−ｄＰＴ）アッセイにおいて試験されるときに血液凝固時間を低減させる。
【００１１】
例示の実施形態では、硫酸化またはスルホン酸化多糖は、血液凝固の亢進を必要とする対象を治療するための方法において使用され、非抗凝固剤、硫酸化またはスルホン酸化多糖を含む、治療上有効な量の組成物を対象に投与することを含む。
【００１２】
様々な態様では、本発明は、血液凝固の亢進を必要とする対象を治療するための方法を提供する。この方法は、本発明の非抗凝固性の硫酸化またはスルホン酸化多糖（ＮＡＳＰ）を含む治療上有効な量の組成物を対象に投与することを含む。
【００１３】
ある実施形態では、本発明は、本発明のＮＡＳＰを含む治療上有効な量の組成物を対象に投与することを含む、出血障害のある対象を治療するための方法を提供する。
【００１４】
ある実施形態では、本発明のＮＡＳＰは、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォンヴィレブランド疾患、特発性血小板減少症、１つ以上の凝固因子（例えば、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、プレカリクレイン、および高分子量キニノゲン（ＨＭＷＫ））の欠乏症、臨床的に有意な出血を伴う１つ以上の因子（例えば、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＩ因子（低プロトロンビン血症）、およびフォンヴィレブランド因子）欠乏症、ビタミンＫ欠乏症、フィブリノゲンの障害（例えば、無フィブリノゲン血症、低フィブリノゲン血症、および異常フィブリノゲン血症）、α２−抗プラスミン欠乏症、および肝疾患、腎疾患、血小板減少症、血小板機能異常症、血腫、内出血、関節血症、手術、外傷、低体温、月経、および妊娠によって引き起こされるような過剰出血からなる群から選択される出血障害を治療するために対象に投与される。
【００１５】
ある実施形態では、ＮＡＳＰは、先天性凝固障害、または血液因子欠乏症に起因する後天性凝固障害を治療するために対象に投与される。血液因子の欠乏は、１つ以上の因子（例えば、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、およびフォンヴィレブランド因子）の欠乏によって引き起こされ得る。
【００１６】
例示の実施形態では、本発明のＮＡＳＰは、１つ以上の異なるＮＡＳＰとともに、かつ／または１つ以上の他の治療薬と組み合わせて共投与され得る。ある実施形態では、出血障害のある対象に、別の治療薬と組み合わせて、本発明のＮＡＳＰを含む治療上有効な量の組成物が投与される。例えば、対象には、本発明のＮＡＳＰおよび１つ以上の因子を含む治療上有効な量の組成物が投与され得る。この実施形態で使用する例示の因子として、制限なく、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、プレカリクレイン、ＨＭＷＫ、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、およびフォンヴィレブランド因子が挙げられる。治療は、トロンビン等の凝固促進剤；第Ｘａ因子、第ＩＸａ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、および第ＶＩＩＩａ因子、プレカリクレイン、およびＨＭＷＫを含む内因性凝固経路の活性剤；または組織因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖａ因子、および第Ｘａ因子を含む外因性凝固経路の活性剤を投与することをさらに含み得る。出血障害のある対象を治療するために使用される治療薬は、同一または異なる組成物中で、本発明のＮＡＳＰの投与と同時、投与前、または投与後に投与され得る。
【００１７】
様々な態様では、本発明は、対象における抗凝固剤の作用を逆転させるための方法を提供し、この方法は、本発明の非抗凝固性の硫酸化またはスルホン酸化多糖（ＮＡＳＰ）を含む治療上有効な量の組成物を対象に投与することを含む。ある実施形態では、対象は、ヘパリン、クマリン誘導体（ワルファリンまたはジクマロール等）、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、抗トロンビンＩＩＩ、ループス抗凝固剤、ネマトード抗凝固剤ペプチド（ＮＡＰｃ２）、活性部位遮断第ＶＩＩａ因子（第ＶＩＩａｉ因子）、第ＩＸａ因子阻害剤、第Ｘａ因子阻害剤（フォンダパリヌクス、イドラパリヌクス、ＤＸ−９０６５ａ、およびラザキサバン（ＤＰＣ９０６）を含む）、第ＶａおよびＶＩＩＩａ因子の阻害剤（活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）および可溶性トロンボモジュリン）、トロンビン阻害剤（ヒルジン、ビバリルジン、アルガトロバン、およびキシメラガトランを含む）を含むが、これらに限定されない抗凝固剤で治療されていてもよい。ある実施形態では、対象における抗凝固剤は、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＩ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、フォンヴィレブランド因子、プレカリクレイン、または高分子量キニノゲン（ＨＭＷＫ）に結合する抗体を含むが、これに限定されない凝固因子に結合する抗体であり得る。
【００１８】
ある実施形態では、本発明のＮＡＳＰは、１つ以上の異なるＮＡＳＰとともに、かつ／または対象における抗凝固剤の作用を逆転させるための１つ以上の他の治療薬と組み合わせて共投与され得る。例えば、対象には、本発明のＮＡＳＰ、および第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、プレカリクレイン、ＨＭＷＫ、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、およびフォンヴィレブランド因子からなる群から選択される１つ以上の因子を含む、治療上有効な量の組成物が投与され得る。治療は、第Ｘａ因子、第ＩＸａ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、および第ＶＩＩＩａ因子、プレカリクレイン、およびＨＭＷＫを含む内因性凝固経路の活性剤等の凝固促進剤；または組織因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖａ因子、および第Ｘａ因子を含む外因性凝固経路の活性剤を投与することをさらに含み得る。対象における抗凝固剤の作用を逆転させるために本発明のＮＡＳＰと併用される治療薬は、同一または異なる組成物中で、本発明のＮＡＳＰの投与と同時、投与前、または投与後に投与され得る。
【００１９】
別の態様では、本発明は、血液凝固の改善が望ましい外科的または侵襲的手技を受ける対象を治療するための方法を提供する。この方法は、本発明の非抗凝固性の硫酸化またはスルホン酸化多糖（ＮＡＳＰ）を含む治療上有効な量の組成物を対象に投与することを含む。ある実施形態では、本発明のＮＡＳＰは、１つ以上の異なるＮＡＳＰとともに、かつ／または本明細書で論じられるそれらの因子および／または凝固促進剤等の１つ以上の他の治療薬と組み合わせて共投与され得る。外科的または侵襲的手技を受ける対象を治療するために使用される治療薬は、同一または異なる組成物中で、本発明のＮＡＳＰの投与と同時、投与前、または投与後に投与され得る。
【００２０】
別の実施形態では、本発明は、対象におけるＴＦＰＩ活性を阻害する方法を提供し、この方法は、本発明のＮＡＳＰを含む治療上有効な量の組成物を対象に投与することを含む。
【００２１】
例示の実施形態では、本発明は、生体試料においてＴＦＰＩ活性を阻害する方法を提供する。この方法は、生体試料（例えば、血液または血漿）を、ＴＦＰＩ活性を阻害するのに十分な量の本発明の非抗凝固性の硫酸化またはスルホン酸化多糖（ＮＡＳＰ）と合わせることを含む。
【００２２】
別の実施形態では、本発明は、本発明のＮＡＳＰを含む組成物を提供する。ある実施形態では、ＮＡＳＰは、塩基多糖が、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、キシロヘキサオース、ラフィノース、メレジトース、スタキオース、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、および６−カルボキシイコデキストリンから選択される、硫酸化またはスルホン酸化多糖であり、ある実施形態では、組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。ある実施形態では、組成物は、１つ以上の異なるＮＡＳＰ、および／または１つ以上の治療薬、および／または試薬をさらに含む。例えば、組成物は、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、プレカリクレイン、ＨＭＷＫ、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＩ因子、およびフォンヴィレブランド因子、組織因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖａ因子、および第Ｘａ因子、第ＩＸａ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、および第ＶＩＩＩａ因子からなる群から選択される１つ以上の因子、および／またはＡＰＴＴ試薬、トロンボプラスチン、フィブリン、ＴＦＰＩ、ラッセルマムシ毒、微粉化シリカ粒子、エラグ酸、スルファチド、およびカオリンからなる群から選択される１つ以上の組成物をさらに含み得る。
【００２３】
対象発明のこれらおよび他の実施形態は、本明細書における開示に照らして、当業者であれば容易に思い当たるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】トロンビンの生成を示すフローチャートである。
【図２】例示の校正自動トロンボグラム（ＣＡＴ）である。
【図３Ａ】セロトリオースを含むＦＶＩＩＩ阻害された血漿のＣＡＴを示す。図３ＡのＮＡＳＰは、７０％非硫酸化、３０％一硫酸化、１％未満Ｓであった。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。オリゴ糖は、３００μｇ／ｍＬ超で凝固促進性であった。図３ＢのＮＡＳＰは、３０％非硫酸化、７０％一硫酸化、２％未満Ｓであった。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、３００μｇ／ｍＬ超で凝固促進性であった。
【図３Ｂ】セロトリオースを含むＦＶＩＩＩ阻害された血漿のＣＡＴを示す。図３ＡのＮＡＳＰは、７０％非硫酸化、３０％一硫酸化、１％未満Ｓであった。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。オリゴ糖は、３００μｇ／ｍＬ超で凝固促進性であった。図３ＢのＮＡＳＰは、３０％非硫酸化、７０％一硫酸化、２％未満Ｓであった。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、３００μｇ／ｍＬ超で凝固促進性であった。
【図４Ａ】セロテトロースを含むＦＶＩＩＩ阻害された血漿のＣＡＴを示す。図４ＡのＮＡＳＰは、８０％非硫酸化、２０％一硫酸化、０．５％未満Ｓであった。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、３００μｇ／ｍＬ超で凝固促進性であった。図４ＢのＮＡＳＰは、４０％非硫酸化、３０％一硫酸化、３０％分解生成物、１％未満Ｓであった。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、３００μｇ／ｍＬ超で凝固促進性であった。
【図４Ｂ】セロテトロースを含むＦＶＩＩＩ阻害された血漿のＣＡＴを示す。図４ＡのＮＡＳＰは、８０％非硫酸化、２０％一硫酸化、０．５％未満Ｓであった。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、３００μｇ／ｍＬ超で凝固促進性であった。図４ＢのＮＡＳＰは、４０％非硫酸化、３０％一硫酸化、３０％分解生成物、１％未満Ｓであった。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、３００μｇ／ｍＬ超で凝固促進性であった。
【図５Ａ】セロペントースを含むＦＶＩＩＩ阻害された血漿のＣＡＴを示す。図５ＡのＮＡＳＰは、９０％非硫酸化、１０％一硫酸化、０．５％未満Ｓであった。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、３００μｇ／ｍＬ超で凝固促進性であった。図５ＢのＮＡＳＰは、８０％非硫酸化、１０％一硫酸化、１０％分解生成物、０．５％未満Ｓであった。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、３００μｇ／ｍＬ超で凝固促進性であった。
【図５Ｂ】セロペントースを含むＦＶＩＩＩ阻害された血漿のＣＡＴを示す。図５ＡのＮＡＳＰは、９０％非硫酸化、１０％一硫酸化、０．５％未満Ｓであった。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、３００μｇ／ｍＬ超で凝固促進性であった。図５ＢのＮＡＳＰは、８０％非硫酸化、１０％一硫酸化、１０％分解生成物、０．５％未満Ｓであった。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、３００μｇ／ｍＬ超で凝固促進性であった。
【図６Ａ】マルトトリオースを含むＦＶＩＩＩ阻害された血漿のＣＡＴを示す。図６ＡのＮＡＳＰは、５０％一硫酸化、２５％二硫酸化、２５％三硫酸化、約４％Ｓであった。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、３００μｇ／ｍＬ超で凝固促進性であった。図６ＢのＮＡＳＰは、６０％一硫酸化、４０％分解生成物、２％未満Ｓであった。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、３００μｇ／ｍＬ超で凝固促進性であった。
【図６Ｂ】マルトトリオースを含むＦＶＩＩＩ阻害された血漿のＣＡＴを示す。図６ＡのＮＡＳＰは、５０％一硫酸化、２５％二硫酸化、２５％三硫酸化、約４％Ｓであった。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、３００μｇ／ｍＬ超で凝固促進性であった。図６ＢのＮＡＳＰは、６０％一硫酸化、４０％分解生成物、２％未満Ｓであった。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、３００μｇ／ｍＬ超で凝固促進性であった。
【図７Ａ】マルトテトロースを含むＦＶＩＩＩ阻害された血漿のＣＡＴを示す。図７ＡのＮＡＳＰは、７０％非硫酸化、３０％一硫酸化、１％未満Ｓであった。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、３００μｇ／ｍＬ超で凝固促進性であった。図７ＢのＮＡＳＰは、５０％非硫酸化、５０％一硫酸化、１％未満Ｓであった。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、３００μｇ／ｍＬ超で凝固促進性であった。
【図７Ｂ】マルトテトロースを含むＦＶＩＩＩ阻害された血漿のＣＡＴを示す。図７ＡのＮＡＳＰは、７０％非硫酸化、３０％一硫酸化、１％未満Ｓであった。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、３００μｇ／ｍＬ超で凝固促進性であった。図７ＢのＮＡＳＰは、５０％非硫酸化、５０％一硫酸化、１％未満Ｓであった。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、３００μｇ／ｍＬ超で凝固促進性であった。
【図８Ａ】マルトペンタオースを含むＦＶＩＩＩ阻害された血漿のＣＡＴを示す。図８ＡのＮＡＳＰは、６０％非硫酸化、４０％一硫酸化、１％未満Ｓであった。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、３００μｇ／ｍＬ超で凝固促進性であった。図８ＢのＮＡＳＰは、５０％非硫酸化、３０％一硫酸化、２０％分解生成物、０．５％未満Ｓであった。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、３００μｇ／ｍＬ超で凝固促進性であった。
【図８Ｂ】マルトペンタオースを含むＦＶＩＩＩ阻害された血漿のＣＡＴを示す。図８ＡのＮＡＳＰは、６０％非硫酸化、４０％一硫酸化、１％未満Ｓであった。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、３００μｇ／ｍＬ超で凝固促進性であった。図８ＢのＮＡＳＰは、５０％非硫酸化、３０％一硫酸化、２０％分解生成物、０．５％未満Ｓであった。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、３００μｇ／ｍＬ超で凝固促進性であった。
【図９Ａ】ラフィノースを含むＦＶＩＩＩ阻害された血漿のＣＡＴを示す。図９ＡのＮＡＳＰは、７０％非硫酸化、３０％一硫酸化、１％未満Ｓであった。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、１００μｇ／ｍＬ超で凝固促進性であった。図９ＢのＮＡＳＰは、２０％非硫酸化、３０％一硫酸化、５０％分解生成物、１％未満Ｓであった。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、１００μｇ／ｍＬ超で凝固促進性であった。
【図９Ｂ】ラフィノースを含むＦＶＩＩＩ阻害された血漿のＣＡＴを示す。図９ＡのＮＡＳＰは、７０％非硫酸化、３０％一硫酸化、１％未満Ｓであった。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、１００μｇ／ｍＬ超で凝固促進性であった。図９ＢのＮＡＳＰは、２０％非硫酸化、３０％一硫酸化、５０％分解生成物、１％未満Ｓであった。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、１００μｇ／ｍＬ超で凝固促進性であった。
【図１０Ａ】メレジトースを含むＦＶＩＩＩ阻害された血漿のＣＡＴを示す。図１０ＡのＮＡＳＰは、４０％非硫酸化、５０％一硫酸化、１０％二硫酸化、２％未満Ｓであった。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、１００μｇ／ｍＬ超で凝固促進性であった。図１０ＢのＮＡＳＰは、２５％非硫酸化、５０％一硫酸化、２５％一硫酸化、３％未満Ｓであった。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、３０μｇ／ｍＬ超で凝固促進性であった。
【図１０Ｂ】メレジトースを含むＦＶＩＩＩ阻害された血漿のＣＡＴを示す。図１０ＡのＮＡＳＰは、４０％非硫酸化、５０％一硫酸化、１０％二硫酸化、２％未満Ｓであった。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、１００μｇ／ｍＬ超で凝固促進性であった。図１０ＢのＮＡＳＰは、２５％非硫酸化、５０％一硫酸化、２５％一硫酸化、３％未満Ｓであった。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、３０μｇ／ｍＬ超で凝固促進性であった。
【図１１Ａ】α−シクロデキストリンを含むＦＶＩＩＩ阻害された血漿のＣＡＴを示す。図１１ＡのＮＡＳＰは、４５％非硫酸化、５０％一硫酸化、５％二硫酸化、１％未満Ｓであった。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、３００μｇ／ｍＬ超で凝固促進性であった。図１１ＢのＮＡＳＰは、５０％非硫酸化、５０％一硫酸化、１％未満Ｓであった。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、３００μｇ／ｍＬ超で凝固促進性であった。
【図１１Ｂ】α−シクロデキストリンを含むＦＶＩＩＩ阻害された血漿のＣＡＴを示す。図１１ＡのＮＡＳＰは、４５％非硫酸化、５０％一硫酸化、５％二硫酸化、１％未満Ｓであった。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、３００μｇ／ｍＬ超で凝固促進性であった。図１１ＢのＮＡＳＰは、５０％非硫酸化、５０％一硫酸化、１％未満Ｓであった。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、３００μｇ／ｍＬ超で凝固促進性であった。
【図１２Ａ】β−シクロデキストリンを含むＦＶＩＩＩ阻害された血漿のＣＡＴを示す。図１２ＡのＮＡＳＰは、７０％非硫酸化、３０％一硫酸化、０．５％未満Ｓであった。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、３００μｇ／ｍＬ超で凝固促進性であった。図１２ＢのＮＡＳＰは、６０％非硫酸化、４０％一硫酸化、０．５％未満Ｓであった。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、３００μｇ／ｍＬ超で凝固促進性であった。
【図１２Ｂ】β−シクロデキストリンを含むＦＶＩＩＩ阻害された血漿のＣＡＴを示す。図１２ＡのＮＡＳＰは、７０％非硫酸化、３０％一硫酸化、０．５％未満Ｓであった。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、３００μｇ／ｍＬ超で凝固促進性であった。図１２ＢのＮＡＳＰは、６０％非硫酸化、４０％一硫酸化、０．５％未満Ｓであった。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、３００μｇ／ｍＬ超で凝固促進性であった。
【図１３】α−シクロデキストリンを含むＦＶＩＩＩ阻害された血漿のＣＡＴを示す。図１３のＮＡＳＰは、１５．３％Ｓ、約６４％硫酸化、約１１硫酸塩であった。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、０．５μｇ／ｍＬ超で凝固促進性であった。
【図１４Ａ】β−シクロデキストリンを含むＦＶＩＩＩ阻害された血漿のＣＡＴを示す。図１４Ａは、１３．５％Ｓ、約５６％硫酸化、約１２硫酸塩を持つＮＡＳＰを示す。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、２．１μｇ／ｍＬのＥＣ５０で凝固促進性であった。図１４Ｂは、１８．９％Ｓ、約２．９ｋＤａを持つＮＡＳＰを示す。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、０．７μｇ／ｍＬのＥＣ５０で凝固促進性であった。
【図１４Ｂ】β−シクロデキストリンを含むＦＶＩＩＩ阻害された血漿のＣＡＴを示す。図１４Ａは、１３．５％Ｓ、約５６％硫酸化、約１２硫酸塩を持つＮＡＳＰを示す。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、２．１μｇ／ｍＬのＥＣ５０で凝固促進性であった。図１４Ｂは、１８．９％Ｓ、約２．９ｋＤａを持つＮＡＳＰを示す。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、０．７μｇ／ｍＬのＥＣ５０で凝固促進性であった。
【図１５】メレジトースを含むＦＶＩＩＩ阻害された血漿のＣＡＴを示す。ＮＡＳＰは、１８．７％Ｓ、約７３％硫酸化、約８硫酸塩を含有した。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、１３．５μｇ／ｍＬのＥＣ５０で凝固促進性であった。
【図１６】スタキオースを含むＦＶＩＩＩ阻害された血漿のＣＡＴを示す。ＮＡＳＰは、１８．４％Ｓ、約７３％硫酸化、約１０硫酸塩を含有した。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、２．３μｇ／ｍＬのＥＣ５０で凝固促進性であった。
【図１７】ラフィノースを含むＦＶＩＩＩ阻害された血漿のＣＡＴである。ＮＡＳＰは、１４．９％Ｓ、約５８％硫酸化、約６硫酸塩を含有した。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、７．４μｇ／ｍＬのＥＣ５０で凝固促進性であった。
【図１８】マルトトリオースを含むＦＶＩＩＩ阻害された血漿のＣＡＴである。ＮＡＳＰは、１５．７％Ｓ、約６１％硫酸化、約７硫酸塩を含有した。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、２０．６μｇ／ｍＬのＥＣ５０で凝固促進性であった。
【図１９】マルトテトラオースを含むＦＶＩＩＩ阻害された血漿のＣＡＴを示す。ＮＡＳＰは、１３．８％Ｓ、約５５％硫酸化、約８硫酸塩を含有した。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、５．０μｇ／ｍＬのＥＣ５０で凝固促進性であった。
【図２０】マルトペントースを含むＦＶＩＩＩ阻害された血漿のＣＡＴを示す。ＮＡＳＰは、１３．９％Ｓ、約５６％硫酸化、約９硫酸塩を含有した。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、２．１μｇ／ｍＬのＥＣ５０で凝固促進性であった。
【図２１】セロトリオースを含むＦＶＩＩＩ阻害された血漿のＣＡＴを示す。ＮＡＳＰは、１２．８％Ｓ、約５０％硫酸化、約５硫酸塩を含有した。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、３０．９μｇ／ｍＬのＥＣ５０で凝固促進性であった。
【図２２】セロテトラオースを含むＦＶＩＩＩ阻害された血漿のＣＡＴを示す。ＮＡＳＰは、１３％Ｓ、約５１％硫酸化、約７硫酸塩を含有した。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、４．８μｇ／ｍＬのＥＣ５０で凝固促進性であった。
【図２３】セロペンタオースを含むＦＶＩＩＩ阻害された血漿のＣＡＴを示す。ＮＡＳＰは、１８％Ｓ、約７２％硫酸化、約１２硫酸塩を含有した。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、１．９μｇ／ｍＬのＥＣ５０で凝固促進性であった。
【図２４】キシロヘキサオースを含むＦＶＩＩＩ阻害された血漿のＣＡＴを示す。ＮＡＳＰは、１３．９％Ｓ、約５９％硫酸化、約８硫酸塩を含有した。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、４．８μｇ／ｍＬのＥＣ５０で凝固促進性であった。
【図２５】マルトペントースを含むＦＶＩＩＩ阻害された血漿のＣＡＴを示す。分子量１．４ｋＤおよび１５％Ｓの硫酸化マルトペンタオースを分析した。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、２．４μｇ／ｍＬのＥＣ５０で凝固促進性であった。
【図２６】マルトペントースまたはβ−シクロデキストリンを含むＦＶＩＩＩ阻害された血漿中のＣＡＴの比較である。マルトペンタオースは、１３．９％Ｓを含有し、β−シクロデキストリンは、１８．９％Ｓおよび分子量２．９ｋＤを有する。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。多糖は、約２μｇ／ｍＬのＥＣ５０で凝固促進性であった。
【図２７】マルトペントース（１３．９％Ｓ）およびマルトペントース（１％未満Ｓ）を含むＦＶＩＩＩ阻害された血漿中のＣＡＴの比較である。この比較は、硫酸化の凝固促進活性との関係を実証する。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。
【図２８】α−シクロデキストリン（１８．１％  Ｓ）、β−シクロデキストリン（１８．９％Ｓ）、およびγ−シクロデキストリン（２０．０％  Ｓ）を含む、ＦＶＩＩＩ阻害された血漿中のＣＡＴの比較である。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。この比較は、分子量の凝固促進活性との関係を実証する。
【図２９】β−シクロデキストリン、α−シクロデキストリン、およびメレジトースを用いたａＰＴＴアッセイの比較である。この比較は、化合物の抗凝固活性を実証する。凝固時間が正常な血漿対照よりも５０％増加する濃度を決定した。オリゴ糖は、それらの最適な凝固促進濃度で抗凝固性になる。
【図３０】ＦＶＩＩＩ阻害されたヒト全血（０．０４４ｐＭ  ＴＦ）中の硫酸化マルトペントース（１５％  Ｓ）の回転トロンボエラストグラム（ＲＯＴＥＭ）であり、硫酸化マルトペントースが、ＦＶＩＩＩ阻害された血液中の凝固を回復することを示す。
【図３１】ＦＶＩＩＩ阻害されたヒト全血（０．０４４ｐＭ  ＴＦ）中の硫酸化β−シクロデキストリン（１８．９％  Ｓ）のＲＯＴＥＭであり、硫酸化β−シクロデキストリンが、ＦＶＩＩＩ阻害された血液中の凝固を回復することを示す。
【図３２】正常血漿中の硫酸化マルトペンタオース（１５％  Ｓ）のＣＡＴであり、硫酸化マルトペンタオースが、ＣＴＩの不在下で、３３μｇ／ｍＬまで接触経路を活性化しないことを示す。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦ、４μＭ  ＰＬ、および±４１μｇ／ｍＬ  ＣＴＩを用いて取った。
【図３３】正常な血漿中の硫酸化β−シクロデキストリン（２．９ｋＤａ、１８．９％  Ｓ）のＣＡＴであり、硫酸化β−シクロデキストリンが、３３μｇ／ｍＬまで接触経路を活性化しないことを示す。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦ、４μＭ  ＰＬ、および±４１μｇ／ｍＬ  ＣＴＩを用いて取った。
【図３４】正常なヒト血漿中のＴＦＰＩ−ｄＰＴ対ログ濃度の硫酸化マルトペンタオース（１５％  Ｓ）を示すプロットであり、硫酸化マルトペンタオースが血漿中の組み換え完全長組織因子経路阻害剤（ｒｅｃ．ＦＬ−ＴＦＰＩ）の作用を逆転させることを示す。この化合物のＥＣ５０は０．１５μｇ／ｍＬである。
【図３５】正常なヒト血漿中のＴＦＰＩ−ｄＰＴ対ログ濃度の硫酸化βシクロデキストリン（２．９ｋＤａ、１８．９％  Ｓ）を示すプロットであり、硫酸化βシクロデキストリンが血漿中のｒｅｃ．ＦＬ−ＴＦＰＩの作用を逆転させることを示す。この化合物のＥＣ５０は０．０８μｇ／ｍＬである。
【図３６】硫酸化フコースオリゴ糖のデノボ合成の経路を示す合成スキームである。
【図３７】ＦＶＩＩＩ阻害された血漿中のＣＡＴであり、フコシル多糖が３００μｇ／ｍＬまで凝固促進活性を有しないことを示す。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。
【図３８Ａ】ＦＶＩＩＩ阻害された血漿中のＣＡＴであり、フコシル多糖が２００μｇ／ｍＬ超で抗凝固性になることを示す。（Ａ）トリフコシル糖、（Ｂ）ペンタフコシル糖。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。
【図３８Ｂ】ＦＶＩＩＩ阻害された血漿中のＣＡＴであり、フコシル多糖が２００μｇ／ｍＬ超で抗凝固性になることを示す。（Ａ）トリフコシル糖、（Ｂ）ペンタフコシル糖。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。
【図３９】イコデキストリン／６−カルボキシ−イコデキストリンおよびキシランの構造を示す。
【図４０】ＦＶＩＩＩ阻害剤血漿中のＣＡＴであり、硫酸化キシラン（１４．７％  Ｓ、２２ｋＤ）が低濃度で凝固促進性であることを示す。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。
【図４１】ＦＶＩＩＩ阻害された血漿中のＣＡＴであり、２つの解重合（６．５ｋＤａ、１３％  Ｓおよび２．８ｋＤａ、１５．５％  Ｓ）硫酸化キシランの比較を示す。キシランの解重合は、凝固促進活性を低減する。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。
【図４２】ＦＶＩＩＩ阻害された血漿中のＣＡＴであり、非硫酸化イコデキストリンおよび６−カルボキシイコデキストリンの比較を示す。非硫酸化イコデキストリンは、凝固促進性でない。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。
【図４３】ＦＶＩＩＩ阻害された血漿中のＣＡＴであり、非常に低濃度で凝固促進性である、硫酸化６−カルボキシイコデキストリン（２１．６ｋＤａ、１０．６％  Ｓ）の凝固促進活性を示す。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。この化合物のＥＣ５０は０．０４μｇ／ｍＬである。
【図４４】ＦＶＩＩＩ阻害された血漿中のＣＡＴであり、非常に低濃度で凝固促進性である、硫酸化６−カルボキシイコデキストリン（３５ｋＤａ、１０．１％  Ｓ）の凝固促進活性を示す。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。この化合物のＥＣ５０は０．０７μｇ／ｍＬである。
【図４５】ＦＶＩＩＩ阻害された全血中の硫酸化６−カルボキシ−イコデキストリン（３５ｋＤａ、１０．１％  Ｓ）のＲＯＴＥＭであり、硫酸化６−カルボキシイコデキストリンが、ヒトＦＶＩＩＩ阻害された血液中の凝固を回復することを示す。
【図４６】正常な血漿中の硫酸化６−カルボキシ−イコデキストリン（３５ｋＤａ、１０．１％  Ｓ）のＣＡＴであり、硫酸化６−カルボキシ−イコデキストリンが、３３μｇ／ｍＬで接触経路を活性化することを示す。測定値は、１ｐＭ  ｈＴＦ、４μＭ  ＰＬ、および±４１μｇ／ｍＬ  ＣＴＩを用いて３７℃で取った。
【図４７】正常なヒト血漿中のＴＦＰＩ−ｄＰＴ対ログ濃度の硫酸化６−カルボキシ−イコデキストリン（２１．６ｋＤａ、１０．６％  Ｓ）を示すプロットであり、硫酸化６−カルボキシ−イコデキストリンが、血漿中のｒｅｃ．ＦＬ−ＴＦＰＩの作用を逆転させることを示す。この化合物のＥＣ５０は０．２６μｇ／ｍＬである。
【図４８】６−カルボキシ−イコデキストリンの分別のための例示のプロセス図を示す。
【図４９】分別された硫酸化６−カルボキシ−イコデキストリンのサイズ排除クロマトグラムを示す。
【図５０】ＦＶＩＩＩ阻害された血漿中の硫酸化６−カルボキシ−イコデキストリン分画（１０ｋＤａ超、３〜１０ｋＤａ、３ｋＤａ未満）の凝固促進活性を示すＣＡＴである。低分子量硫酸化６−カルボキシ−イコデキストリンさえも凝固促進性であった。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。
【図５１】分別された硫酸化イコデキストリンのサイズ排除クロマトグラムを示す。分別は、異なる分子量分布の試料をもたらす。
【図５２】硫酸化６−カルボキシ−イコデキストリンの分画についてＥＣ５０およびａＰＴＴ／ＣＡＴの比を示す表である。
【図５３】ＦＶＩＩＩ阻害された血漿中の硫酸化イコデキストリン分画（１０ｋＤａ超、３〜１０ｋＤａ、３ｋＤａ未満）の凝固促進活性を示すＣＡＴである。低分子量硫酸化イコデキストリンさえも凝固促進性であった。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。
【図５４】本発明の代表的なＮＡＳＰおよびＣＡＴアッセイに由来するそれらのＥＣ５０値の表である。
【図５５】６−カルボキシ−イコデキストリンの硫酸化のための例示の合成経路である。
【図５６】本発明の硫酸化キシランの治療域および最適濃度の表である。
【図５７】異なる条件下でキシランを硫酸化することが、凝固促進活性に及ぼす作用を比較するＣＡＴを示す。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。
【図５８】異なる条件下でキシランを硫酸化することが、凝固促進活性に及ぼす作用を比較するＣＡＴを示す。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。
【図５９】ＦＶＩＩＩ阻害された血漿中のＣＡＴであり、より長い硫酸化反応時間が、ＮＡＳＰの凝固促進特性を改変しないことを示す。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。
【図６０】ＦＶＩＩＩ阻害された血漿中のＣＡＴであり、６−カルボキシ−イコデキストリンの硫酸化が、非常に低濃度の化合物で凝固促進活性を付与することを示す。測定値は、３７℃で１ｐＭ  ｈＴＦおよび４μＭ  ＰＬを用いて取った。
【図６１】ａＰＴＴアッセイ対ＮＡＳＰ濃度によって決定される凝固時間のプロットであり、本発明の硫酸化ＮＡＳＰが、対照（フコイダン）より抗凝固性が高いことを示す。
【図６２】硫酸化キシランのＣＡＴおよびａＰＴＴデータを比較し、硫酸化キシランが、それらの最適な凝固促進濃度で抗凝固性でないことを示す。
【図６３】硫酸化６−カルボキシ−イコデキストリン（１１％  Ｓ）のＣＡＴおよびａＰＴＴ結果を示し、このＮＡＳＰが、その最適な凝固促進濃度で非抗凝固性であることを示す。測定値は３７℃で取った。
【図６４】本発明の選択されたＮＡＳＰについて、抗凝固活性が開始する濃度、および最大凝固時間の表である。
【図６５】硫酸化キシランの合成のための例示の合成経路である。
【図６６Ａ】ある種のＮＡＳＰ（それらの塩基多糖に基づく）と、追加の作用物質との例示の組み合わせを示す、マトリックス表である。
【図６６Ｂ】ある種のＮＡＳＰ（それらの塩基多糖に基づく）と、追加の作用物質との例示の組み合わせを示す、マトリックス表である。
【図６７Ａ】図６６Ａ〜Ｂにおいて特定される各組み合わせにおけるそれぞれのＮＡＳＰの例示の投与量を示す、マトリックス表である。
【図６７Ｂ】図６６Ａ〜Ｂにおいて特定される各組み合わせにおけるそれぞれのＮＡＳＰの例示の投与量を示す、マトリックス表である。
【図６７Ｃ】図６６Ａ〜Ｂにおいて特定される各組み合わせにおけるそれぞれのＮＡＳＰの例示の投与量を示す、マトリックス表である。
【図６７Ｄ】図６６Ａ〜Ｂにおいて特定される各組み合わせにおけるそれぞれのＮＡＳＰの例示の投与量を示す、マトリックス表である。
【図６７Ｅ】図６６Ａ〜Ｂにおいて特定される各組み合わせにおけるそれぞれのＮＡＳＰの例示の投与量を示す、マトリックス表である。
【図６７Ｆ】図６６Ａ〜Ｂにおいて特定される各組み合わせにおけるそれぞれのＮＡＳＰの例示の投与量を示す、マトリックス表である。
【図６７Ｇ】図６６Ａ〜Ｂにおいて特定される各組み合わせにおけるそれぞれのＮＡＳＰの例示の投与量を示す、マトリックス表である。
【図６８】本発明の併用療法における追加の作用物質の例示の投与量を示す表である。
【図６９】透過亢進剤の有無によるＣａｃｏ−２細胞モデル中の硫酸化マルトペントースの吸収である。細胞の基底外側の上に輸送されるＮＡＳＰの量は、ＦＶＩＩＩ阻害されたヒト血漿中の活性に基づくトロンビン生成アッセイによって決定された。
【図７０】透過亢進剤の有無によるＣａｃｏ−２細胞モデル中の硫酸化β−シクロデキストリンの吸収である。細胞の基底外側の上に輸送されるＮＡＳＰの量は、ＦＶＩＩＩ阻害されたヒト血漿中の活性に基づくトロンビン生成アッセイによって決定された。
【図７１】透過亢進剤の有無によるＣａｃｏ−２細胞モデル中の分別硫酸化６−カルボキシ−イコデキストリン（ロット１３７）の吸収である。細胞の基底外側の上に輸送されるＮＡＳＰの量は、ＦＶＩＩＩ阻害されたヒト血漿中の活性に基づくトロンビン生成アッセイによって決定された。
【図７２】透過亢進剤の有無によるＣａｃｏ−２細胞モデル中の非分別硫酸化６−カルボキシ−イコデキストリン（ロット１７１Ａ）の吸収である。細胞の基底外側の上に輸送されるＮＡＳＰの量は、ＦＶＩＩＩ阻害されたヒト血漿中の活性に基づくトロンビン生成アッセイによって決定された。
【図７３】ＴＥＧアッセイであり、硫酸化６−カルボキシ−イコデキストリンをＦＶＩＩＩ阻害されたモルモットに静脈内投与した後、凝固時間（Ｒ時間）が減少することを示す。抗ＦＶＩＩＩ阻害剤血漿で処理されたモルモットに、４用量の硫酸化６−カルボキシ−イコデキストリン、生理食塩水、またはＦＥＩＢＡを注入した（それぞれ重複でＮ＝５）。投与の５分後に、クエン酸化全血を用いてＴＥＧ測定を行い、Ｒ時間を記録した。Ｒ時間の減少によって反映されるように、媒体対照よりも優れた凝固促進作用は、０．１５および０．４５ｍｇ／ｋｇでＮＡＳＰ、および正の対照ＦＥＩＢＡの場合に観測された。グラフは、中央値および個別の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
序文
血友病（Ｈｅｍ）ＡおよびＨｅｍ  Ｂ、深刻なフォンヴィレブランド（ｓｖＷＤ）疾患、および深刻な第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）欠乏症を含む血液凝固障害は、典型的には、因子補充、例えば、第ＶＩＩＩ因子をＨｅｍ  ＡおよびｓｖＷＤ、第ＩＸ因子をＨｅｍ  Ｂ、第ＶＩＩ（ａ）因子をＦＶＩＩ欠乏およびその他によって治療される（Ｂｉｓｈｏｐ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．，３：６８４−６９４；Ｃａｒｃａｏ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｖ．，１８：１０１−１１３；Ｒｏｂｅｒｔｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ  １００：７２２−７３０；およびＬｅｅ（２００４）Ｉｎｔ．Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．，４２：５９−７６において検討される）。そのような治療は、有効である場合が多いが、汎用性を制限する特徴として、高額な費用、不便性（すなわち、静脈内投与）、および中和抗体生成が挙げられる（Ｂｉｓｈｏｐ，ｅｔ  ａｌ．，上記；Ｃａｒｃａｏ，ｅｔ  ａｌ．，上記；Ｒｏｂｅｒｔｓ，ｅｔ  ａｌ．，上記；Ｌｅｅ，上記；およびＢｏｈｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ  １０  Ｓｕｐｐｌ．，１：２−８）。ＦＶＩＩａは、様々な出血障害において益々利用されているが（Ｒｏｂｅｒｔｓ，ｅｔ  ａｌ．，上記）、前述の制約がなく、広い適用を持つ代替単一化合物凝固促進療法が関心対象である。
【００２６】
出血障害のある個体における止血を改善する１つの一般的な方法は、血液凝固の外因性経路を上方規制することによって凝固の開始を改善することである。凝固の内因性および外因性経路は、トロンビン生成およびフィブリン凝固形成に起因するが（Ｄａｖｉｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：１０３６３−１０３７０）、外因性または組織因子（ＴＦ）媒介経路は、開始に重要であり、生体内の凝固の伝播に寄与する（Ｍａｎｎ（２００３）Ｃｈｅｓｔ，１２４（３  Ｓｕｐｐｌ）：１Ｓ−３Ｓ；Ｒａｐａｐｏｒｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，７４：７−１７）。外因性経路活性を上方規制するための１つの潜在的な機構は、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）の減衰である。ＴＦＰＩは、外因性経路活性の等張下方規制を提供するＦＶＩＩａ／ＴＦのＫｕｎｉｔｚ型プロテイナーゼ阻害剤である（検討のためＢｒｏｚｅ（１９９２）Ｓｅｍｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２９：１５９−１６９；Ｂｒｏｚｅ（２００３）Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，１：１６７１−１６７５；およびＪｏｈｎｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃｏｒｏｎ．Ａｒｔｅｒｙ  Ｄｉｓ．，９（２−３）：８３−８７参照）。実際に、マウスにおけるヘテロ接合ＴＦＰＩ欠乏症は、トロンバス形成の悪化をもたらし得（Ｗｅｓｔｒｉｃｋ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０３：３０４４−３０４６）、およびＴＦＰＩ遺伝子変異は、ヒトにおける血栓症のリスク因子である（Ｋｌｅｅｓｉｅｋ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，８２：１−５）。ＴＦＰＩの標的を介して血友病における凝固を規制することは、Ｎｏｒｄｆａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．およびＷｕｎ，ｅｔ  ａｌ．により説明され、抗ＴＦＰＩ抗体が血友病血漿の凝固時間を短縮し得ること（Ｎｏｒｄｆａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，６６：４６４−４６７；Ｗｅｌｓｃｈ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．，６４：２１３−２２２）および抗ＴＦＰＩ  ＩｇＧが、第ＶＩＩＩ因子を欠乏するウサギの出血時間を改善したことを示した（Ｅｒｈａｒｄｔｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌ．Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ，６：３８８−３９４）。
【００２７】
クラスとして、硫酸化多糖は、動物およびヒトにおいて多くの場合好ましい耐性プロファイルを伴う、過度の生物活性を特徴とする。これらの多陰イオン分子は、多くの場合、植物および動物組織に由来し、ヘパリン、グリコサミノグリカン、フコイダン、カラゲナン、ペントサン多硫酸塩、およびデルマタンまたはデキストラン硫酸塩を含む広域のサブクラスを包含する（Ｔｏｉｄａ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５：２９−４６）。より低い分子量、不均質性が低く、化学的に合成された硫酸化多糖が報告されており、様々な段階の薬物開発に到達している（Ｓｉｎａｙ（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ，３９８：３７７−３７８；Ｂａｔｅｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃｏｒｏｎ．Ａｒｔｅｒｙ  Ｄｉｓ．，９：６５−７４；Ｏｒｇｕｅｉｒａ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９：１４０−１６９；ＭｃＡｕｌｉｆｆｅ（１９９７）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｍａｇａｚｉｎｅ，３：１７０−１７４；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｇｅｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，３０：３３７−３４１）。ヘパリン様硫酸化多糖は、抗トロンビンＩＩＩおよび／またはヘパリン共因子ＩＩ相互作用を通して媒介される差異的抗凝固活性を呈する（Ｔｏｉｄａ，ｅｔ  ａｌ．，上記）。特に、天然由来または化学的に修飾されたある化合物は、抗凝固活性が相当でない濃度（または用量）で他の生物活性を呈する（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ｅｔ  ａｌ．１９９８）Ｇｅｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，３０：３３７−３４１；Ｗａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｒｅｓ．，５１：４３５−４４３；Ｂｏｕｒｉｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２８９（Ｐｔ２）：３１３−３３０；ＭｃＣａｆｆｒｅｙ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１８４：７７３−７８１；Ｌｕｙｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，３０５：２４−３０）。さらに、ヘパリン硫酸は、ＴＦＰＩとの強力な相互作用を呈することが示された（Ｂｒｏｚｅ（１９９２）Ｓｅｍｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２９：１５９−１６９；Ｂｒｏｚｅ（２００３）Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，１：１６７１−１６７５；Ｊｏｈｎｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃｏｒｏｎ．Ａｒｔｅｒｙ  Ｄｉｓ．，９：８３−８７；Ｎｏｖｏｔｎｙ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｌｏｏｄ，７８（２）：３９４−４００）。
【００２８】
本明細書に記載されるとおり、ある硫酸化またはスルホン酸化多糖はＴＦＰＩと相互作用し、抗凝固と関連付けられるものより低い濃度でその活性を阻害する。そのような分子は、血栓形成が損なわれる設定において使用され得る。
【００２９】
本発明を詳細に説明する前に、本発明が、特定の製剤またはプロセスパラメータに限定されず、したがって、言うまでもなく、変化し得ることを理解されたい。本明細書に使用される用語は、本発明の特定の実施形態を説明する目的のみであり、制限するように意図するものではないことも理解されたい。
【００３０】
本明細書に記載の方法および物質と同様もしくは同等の多数の方法および物質を本発明の実践において使用することもできるが、好ましい物質および方法は、本明細書に説明される。
定義
【００３１】
本発明を説明する際、以下の用語が用いられ、以下に示されるとおり定義されるように意図する。
【００３２】
本明細書および添付の特許請求の範囲に使用される、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、内容によりそうでないことが明確に示されない限り、複数形の指示対象を含む。したがって、例えば、「ＮＡＳＰ」に対する言及は、２つ以上のそのような作用物質等の混合物を含む。
【００３３】
本明細書において使用される場合、「ＮＡＳＰ」は、希釈プロトロンビン時間（ｄＰＴ）または活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）凝固アッセイにおいて抗凝固活性を呈する硫酸化またはスルホン酸化多糖を指し、非分別ヘパリンの抗凝固（凝固時間の増加）活性のわずか３分の１、および好ましくは１０分の１未満である（例えば、μｇ／ｍＬ当たりの増加により測定される）。本発明のＮＡＳＰは、天然源（例えば、褐藻類、樹皮、動物組織）から精製および／または修飾され得るか、または新たに合成され得て、１００ダルトン〜１，０００，０００ダルトンの分子量の範囲であり得る。本発明のＮＡＳＰは、出血障害、特に凝固因子の欠乏と関連付けられるものを治療する際に止血を改善するため、または抗凝固剤の作用を逆転させるために、本発明の方法において使用され得る。凝固を促進し、出血を低減する本発明のＮＡＳＰの能力は、様々な生体外全止血および凝固アッセイ（例えば、ＴＦＰＩ−ｄＰＴ、ａＰＴＴ、ＣＡＴ、およびＲＯＴＥＭアッセイ）および生体内出血モデル（例えば、血友病マウスまたはイヌにおける尾部の切除および／もしくは切断、全凝固時間または表皮出血時間の決定）を使用して容易に決定される。例えば、ＰＤＲ  Ｓｔａｆｆ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ′Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ．２００４，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９７６）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．，９：５７５−５８０；Ｎｏｒｄｆａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．，６６：４６４−４６７；Ｗｅｌｓｃｈ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６４：２１３−２２２；Ｂｒｏｚｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ，８５：７４７−７４８；Ｓｃａｌｌａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ，１０２：２０３１−２０３７；Ｐｉｊｎａｐｐｅｌｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，５５：７０−７３；およびＧｉｌｅｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｂｌｏｏｄ，６０：７２７−７３０を参照されたい。
【００３４】
「凝固促進剤」は、血栓形成を開始または加速させることができる任意の因子または試薬を指すように、その従来の意味において本明細書に使用される。例示の凝固促進剤として、ＮＡＳＰ、第Ｘａ因子、第ＩＸａ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、および第ＶＩＩＩａ因子、プレカリクレイン、ＨＭＷＫ、組織因子、第ＶＩＩａ因子、および第Ｖａ因子からなる群から選択される凝固因子等の内因性または外因性凝固経路の任意の活性剤が挙げられる。凝固を促進する他の試薬として、カリクレイン、ＡＰＴＴ開始剤（すなわち、リン脂質および接触活性剤を含有する試薬）、ラッセルマムシ毒（ＲＶＶ）、およびトロンボプラスチン（ｄＰＴ）が挙げられる。凝固促進試薬としての本発明の方法に使用され得る接触活性剤として、当業者に既知の微粉化シリカ粒子、エラグ酸、スルファチド、カオリン等が挙げられる。凝固促進剤は、粗天然抽出物、血液または血漿試料、単離および実質的に精製された、合成物質または組み換え体に由来し得る。凝固促進剤は、天然に存在する凝固因子もしくは断片、変異体、または生物活性を保持する（すなわち、凝固を促進する）その共役修飾された誘導体を含み得る。選択された疾患を治療するための最適な凝固促進剤の濃度および投与量は、当業者によって決定され得る。
【００３５】
本明細書において使用される場合、「多糖」という用語は、複数の（すなわち、２つ以上）の共有結合された糖残基を含むポリマーを指す。結合は天然または非天然であり得る。天然結合として、例えば、グリコシド結合が挙げられるが、非天然結合として、例えば、エステル、アミド、またはオキシム結合部分が挙げられ得る。多糖は、広範囲の平均分子量（ＭＷ）値のいずれかを有するが、一般に少なくとも約１００ダルトンである。例えば、多糖は、少なくとも約５００、１０００、２０００、４０００、６０００、８０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００ダルトン以上の分子量を有することができる。多糖は、直鎖または分枝構造を有し得る。多糖は、より大きな多糖の分解（例えば、加水分解）により生成される多糖の断片を含み得る。分解は、多糖を酸、塩基、熱、または酵素で処理すること含む、当業者に既知の多様な手段のうちのいずれかによって達成され、分解された多糖を産生することができる。多糖は、化学的に改変されてよく、硫酸化、多硫酸化、スルホン酸化、多スルホン酸化、エステル化、およびアルキル化、例えば、メチル化を含むが、これらに限定されない修飾を有し得る。
【００３６】
「に由来する」という用語は、本明細書において、分子の起源を特定するように使用されるが、例えば、化学合成または組み換え手段によって分子が形成される方法に限定することを意味しない。
【００３７】
「分子量」は、本明細書において論じられる場合、数平均分子量または重量平均分子量のいずれかとして表され得る。別段の指示がない限り、本明細書において分子量に対する全ての言及は、重量平均分子量を指す。数平均および重量平均双方の分子量決定は、例えば、ゲル透過クロマトグラフィーまたは他の液体クロマトグラフィー技法を使用して測定され得る。
【００３８】
「薬学的に許容される」は、一般に安全、非毒性、かつ生物学的にもそれ以外にも望ましくないことはない薬学的組成物を調製する際に有用であることを意味し、動物用途ならびにヒト薬学的用途に許容されることを含む。
【００３９】
本明細書において使用される場合、「治療上有効な量」という表現は、適当な利益／リスク比で望ましい治療作用を生じるために有効な本発明のＮＡＳＰを含む化合物、材料、または組成物の量、例えば、技術標準薬学を使用する出血障害の治療に一般に適用可能なものを意味する。「治療上有効な用量または量」のＮＡＳＰ、血液因子、または他の治療薬は、本明細書に記載のとおり投与されるとき、出血の低減または凝固時間の短縮等の正の治療応答をもたらすこの物質の量を指す。
【００４０】
「薬学的に許容される塩」という用語は、本明細書に記載される化合物に関して見出される特定の置換基に応じて、比較的非毒性の酸または塩基を用いて調製される活性化合物の塩を含む。本発明の化合物が比較的酸性の官能性を含有するとき、塩基付加塩は、そのような化合物の中性形態を十分な量の所望の塩基と、純正または適切な不活性溶媒中のいずれかで接触させることにより得ることができる。薬学的に許容される塩基付加塩の例として、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノ、もしくはマグネシウム塩、または同様の塩が挙げられる。本発明の化合物が比較的塩基性の官能性を含有するとき、酸付加塩は、そのような化合物の中性形態を十分な量の所望の酸と、純正または適切な不活性溶媒中のいずれかで接触させることにより得ることができる。薬学的に許容される酸付加塩の例として、塩化水素酸、臭化水素酸、硝酸、カルボン酸、一水素炭酸、リン酸、一水素リン酸、二水素リン酸、硫酸、一水素硫酸、ヨウ化水素酸、または亜リン酸等の無機酸に由来するもの、ならびに酢酸、プロピオン酸、イソブチル酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸等の比較的非毒性の有機酸に由来する塩が挙げられる。アルギニン酸塩等のアミノ酸の塩、およびグルクロン酸またはガラクツノール酸等の有機酸の塩も挙げられる（例えば、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６：１−１９（１９７７）参照）。本発明のある特定の化合物は、塩基性および酸性官能性の双方を含有し、化合物が塩基付加塩または酸付加塩のいずれかに変換されるのを許す。
【００４１】
残渣が「ＳＯ３−」として定義されるとき、この式は、任意選択により有機または無機陽イオン性対イオンを含むことを意味する。好ましくは、この化合物の得られる塩形態は、薬学的に許容される。この構造は、プロトン化種「ＳＯ３Ｈ」も包含する。
【００４２】
化合物の中性形態は、塩を塩基または酸と接触させること、および好ましくは、従来の方法で親化合物を単離することにより再生成される。化合物の親形態形は、極性溶媒における可溶性等のある物理特性において様々な塩形態とは異なるが、塩は、本発明の目的で、化合物の親形態に相当する。
【００４３】
本明細書において使用される場合、「出血障害」という用語は、先天性凝固障害、後天性凝固障害、または外傷誘発性出血状態等の過剰な出血と関連付けられる任意の障害を指す。そのような出血障害として、血友病（Ｈｅｍ）Ａ、Ｈｅｍ  Ｂ、フォンヴィレブランド疾患、特発性血小板減少症、１つ以上の凝固因子（例えば、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、プレカリクレイン、およびＨＭＷＫ）の欠乏症、臨床的に有意な出血を伴う１つ以上の因子（例えば、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＩ因子（低プロトロンビン血症）、およびフォンヴィレブランド因子）欠乏症、ビタミンＫ欠乏症、フィブリノゲンの障害（無フィブリノゲン血症、低フィブリノゲン血症、および異常フィブリノゲン血症を含む）、α２−抗プラスミン欠乏症、および肝疾患、腎疾患、血小板減少症、血小板機能異常症、血腫、内出血、関節血症、手術、外傷、低体温、月経、および妊娠等に起因する過剰出血が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
「イコデックス」は、本明細書において使用される場合、硫酸化６−カルボキシ−イコデキストリンを指す。
【００４５】
「対象」とは、制限なく、ヒトおよび他の霊長類（チンパンジーおよび他の類人猿およびサル種等の非ヒト霊長類を含む）；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびウマ等の農場動物；イヌおよびネコ等の家畜哺乳類；マウス、ラット、およびモルモット等の齧歯類を含む研究室動物；鳥類（ニワトリ、七面鳥、および他のキジ鳥、アヒル、ガチョウ等の家禽、野生、および猟鳥）を含む、脊索動物亜門の任意の構成員を意味する。この用語は、特定の年齢を示さない。したがって、成体および新生個体の双方が関心対象である。
【００４６】
「患者」という用語は、その従来の意味において、本発明のＮＡＳＰの投与により予防または治療され得る状態に苦しむか、またはそれになり易い生きた有機体を指すように使用され、ヒトおよび非ヒト種の双方を含む。
【００４７】
「ＴＦＰＩ」および「ｆｌＴＦＰＩ」は、本明細書において使用される場合、それぞれ組織因子経路阻害剤および全長組織因子経路阻害剤を指す。
【００４８】
「ＴＦＰＩ１６０」は、ＴＦＰＩのＫＤ１およびＫＤ２ドメインを含む、アミノ酸１〜１６０を含むポリペプチドを指す。全長ＴＦＰＩのＫＤ３およびＣ末端は不在である。
実施形態
【００４９】
本発明の態様は、対象における血液凝固を亢進するための組成物、これらの組成物を含有する製剤、および方法を含む。ある実施形態による実践方法では、一定量の非抗凝固性の硫酸化またはスルホン酸化多糖（ＮＡＳＰ）が、対象における血液凝固を亢進するのに十分な様式で対象に投与される。本発明の方法を実践するためのキットも提供される。
【００５０】
本発明をさらに説明する前に、本発明が、本明細書に記載される特定の実施形態に限定されず、したがって、そのような実施形態は変化し得ることを理解されたい。本明細書に使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のみであり、制限するように意図するものではないことも理解されたい。本発明の範囲は、添付の請求項によってのみ制限される。別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者が一般に理解する意味と同一の意味を有する。値の範囲が提供される場合、その範囲の上限値および下限値の間の各介在値（文脈が別途明確に指示しない限り、下限値の単位の１０分の１まで）、ならびにその表示範囲の任意の他の表示値または介在値が本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限値および下限値は、より小さい範囲内に独立して含まれてもよく、表示範囲内の任意の具体的に除外された値に従って本発明内にも包含される。表示範囲がそれらの上限値および下限値のうちの１つまたは両方を含む場合、それらの包含される上限値および下限値のいずれかまたは両方を除外する範囲も本発明に包含される。ある範囲は、本明細書では「約」という用語によって先行される数値で提示される。「約」という用語は、本明細書においてそれが先行する正確な数とともに、その用語が先行する数の付近にあるか、または近似する数に対して文字通りの指示を提供する。数が具体的に列挙される数の付近にあるか、または近似するかを決定する際に、その付近にあるか、または近似する列挙されていない数は、それが提示される文脈において、具体的に列挙される数の実質的な等価を提供する数であり得る。本明細書に引用される全ての出版物、特許および特許出願は、各個別の出版物、特許、または特許出願が、明確かつ個別に参照により組み込まれることが示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。さらに、引用される各出版物、特許、または特許出願は、それらの出版物が引用される関連の主題を開示および説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。任意の出版物の引用は、出願日前にそれを開示するためであり、本明細書に記載される本発明が先行発明によりそのような出版物に先行する資格がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供される出版物の日付は、実際の出版日とは異なる場合があり、別々に確認する必要があり得る。
【００５１】
特許請求の範囲が任意の要素を除外するように作成されてもよいことに留意する。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連した「単に」、「のみ」等の排他的な専門用語の使用のため、または「否定的な」制限の使用のための先行記述となるよう意図される。この開示を読めば当業者には明らかとなるように、本明細書に記載および図示される個別の実施形態のそれぞれは、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態の特徴から容易に分離され得るか、またはそれらと結合され得る別個の構成要素および特徴を有する。任意の列挙される方法は、列挙される事象の順序で、または論理的に可能な任意の他の順序で実行されてもよい。本明細書に記載の方法および物質と同様もしくは同等の任意の方法および物質を本発明の実践または試験において使用することもできるが、代表的な例示の方法および物質は、これから説明される。
Ａ．ＮＡＳＰ
【００５２】
一態様では、本発明は、生体内または生体外で哺乳類血液の凝固を亢進する能力を持つ硫酸化またはスルホン酸化多糖を提供する。様々な実施形態では、この硫酸化またはスルホン酸化多糖は、凝固促進活性を有する。例示の実施形態では、硫酸化またはスルホン酸化多糖の凝固促進活性は、標準の全止血性アッセイ、例えば、トロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）を使用して測定可能であるのに十分な程度である。
【００５３】
本発明の例示のＮＡＳＰは、これらの多糖のうちの１つを投与された対象に、治療上有効な凝固促進作用を提供することを特徴とする。本発明の例示のＮＡＳＰは、対象への投与時に抗凝固作用も及ぼし、様々な実施形態では、本発明のＮＡＳＰは、そのＮＡＳＰの治療上有効な凝固促進作用を全体的に相殺するのに十分な程度の抗凝固作用を誘発しない。本発明の例示のＮＡＳＰは約０．０１μｇ／ｍＬ〜約７００μｇ／ｍＬの血漿（例えば、ヒト血漿）、例えば、約１０μｇ／ｍＬ〜約６００μｇ／ｍＬ血漿、例えば、約２０μｇ／ｍＬ〜約５００μｇ／ｍＬ血漿、例えば、約３０μｇ／ｍＬ〜約４００μｇ／ｍＬ、例えば、約４０μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬ血漿、例えば、約５０μｇ／ｍＬ〜約２００μｇ／ｍＬ血漿、例えば、約６０μｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬ血漿の濃度で凝固促進性である。様々な実施形態では、本発明のＮＡＳＰは、約１μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬ、例えば、約５μｇ／ｍＬ〜約２５０μｇ／ｍＬ、例えば、約１０μｇ／ｍＬ〜約２００μｇ／ｍＬ、例えば、約１５μｇ／ｍＬ〜約１５０μｇ／ｍＬ、例えば、約２０μｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬ、例えば、約２５μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬの濃度で凝固促進作用を有する。様々な実施形態では、本発明の化合物は、約４００μｇ以下、例えば、約３５０μｇ以下、例えば、約３００μｇ／ｍＬ以下、例えば、約２５０μｇ／ｍＬ以下、例えば、約２００μｇ／ｍＬ以下、例えば、約１５０μｇ／ｍＬ以下、例えば、約１００μｇ／ｍＬ以下、例えば、約５０μｇ／ｍＬ以下の濃度で凝固促進作用を有する。
【００５４】
本発明の例示のＮＡＳＰは、トロンビン生成が、校正自動トロンボグラム（ＣＡＴ）等の標準アッセイにおいて測定される血友病血漿レベルを超えるため、前述の濃度で実質的に非抗凝固性であり、標準アッセイの例は本明細書に記載される。例えば、実施例２および図３を参照されたい。凝固促進作用およびピークトロンビンの双方は、ＣＡＴによって測定され得る。
【００５５】
本発明の例示のＮＡＳＰは、凝固促進活性および抗凝固活性を持つ硫酸化またはスルホン酸化多糖である。潜在的ＮＡＳＰの抗凝固特性は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）凝固アッセイを使用して決定される。非抗凝固性硫酸化またはスルホン酸化多糖は、非分別ヘパリンの３分の１以下、および好ましくは１０分の１未満の抗凝固活性（凝固時間の統計的に有意な増加によって測定される）を呈する。
【００５６】
凝固を促進し、出血を低減するＮＡＳＰの能力は、様々な生体外凝固および全止血性アッセイ（例えば、ｄＰＴ、ａＰＴＴ、ＣＡＴ、およびＲＯＴＥＭアッセイ）および生体内出血モデル（例えば、血友病マウスまたはイヌにおける尾部の切り取りおよび／もしくは切断、または表皮出血時間の決定）を使用して容易に決定される。例えば、ＰＤＲ  Ｓｔａｆｆ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ′Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，２００４，Ｎｏｒｄｆａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．，６６：４６４−４６７；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９７６）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．，９：５７５−５８０；Ｗｅｌｓｃｈ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６４：２１３−２２２；Ｂｒｏｚｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ，８５：７４７−７４８；Ｓｃａｌｌａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ，１０２：２０３１−２０３７；Ｐｉｊｎａｐｐｅｌｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，５５：７０−７３；およびＧｉｌｅｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｂｌｏｏｄ，６０：７２７−７３０を参照されたい。凝固アッセイは、１つ以上のＮＡＳＰおよび１つ以上の血液因子、凝固促進剤、または他の治療薬の存在下で行われ得る。例えば、１つ以上の因子は、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、プレカリクレイン、ＨＭＷＫ、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＩ因子、およびフォンヴィレブランド因子、組織因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖａ因子、および第Ｘａ因子、第ＩＸａ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、および第ＶＩＩＩａ因子を含むが、これらに限定されない１つ以上のＮＡＳＰ、および／またはＡＰＴＴ試薬、トロンボプラスチン、フィブリン、ＴＦＰＩ、ラッセルマムシ毒、微粉化シリカ粒子、エラグ酸、スルファチド、およびカオリンを含むが、これらに限定されない１つ以上の治療薬と組み合わせて投与され得る。
【００５７】
実施例およびここに添付されている図面は、本明細書においてＮＡＳＰと称される作用物質が、真に「非抗凝固性」であること、すなわち、それらが選択された濃度範囲内で凝固時間を著しく増加させないことを確認する。そのような化合物は、それらが提示し得る任意の抗凝固活性が、それらが凝固促進活性を呈する濃度を著しく超える濃度においてのみ出現することを条件として、本発明の方法および組成物において使用され得る。問題になっているＮＡＳＰについて、望ましくない抗凝固特性が起こる濃度と所望の凝固促進活性が起こる濃度との比は、凝固促進指数と称される（例えば、治療指数）。本発明のＮＡＳＰの例示の治療指数は、約３、５、１０、３０、１００、３００、１０００以上である。例示の実施形態では、ａＰＴＴ：ＣＡＴ比は、標準方法を使用して決定され、「ａＰＴＴ」は、活性化部分トロンボプラスチン時間であり、「ＣＡＴ」は、校正自動トロンボグラフィーである。例えば、ＣＡＴアッセイの場合、ＥＣ５０はトロンビン生成（ＣＡＴ）曲線に由来する。ａＰＴＴアッセイの場合、凝固時間が正常な血漿対照より５０％増加する濃度が決定される。それら２つの値からａＰＴＴ／ＣＡＴ比を計算することができる。
【００５８】
様々な実施形態では、本発明は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、または少なくとも約２０％硫黄を含むＮＡＳＰを提供する。例示の実施形態では、この硫黄量は、ＮＡＳＰの元素分析によって決定される。
【００５９】
実施形態では、本発明のＮＡＳＰは、ＣＡＴアッセイにおいて測定されるように、約０．００１μｇ／ｍＬ〜約３０μｇ／ｍＬの血漿、例えば、約０．０１μｇ／ｍＬ〜約１０μｇ／ｍＬ、例えば、約０．０５μｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬのＥＣ５０を有する。様々な実施形態では、本発明のＮＡＳＰは、そのＥＣ５０で実質的に抗凝固性でない。本発明の例示のＮＡＳＰは、そのＥＣ５０の最大約１．１倍、１．３倍、１．６倍、１．９倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４．０倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍の濃度で実質的に抗凝固性でない。
【００６０】
様々な実施形態では、本発明は、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、キシロヘキサオース、ラフィノース、メレジトース、スタキオース、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、イコデキストリン、キシラン、および６−カルボキシイコデキストリンから選択される構成員である、上記の硫黄量を有したＮＡＳＰを提供する。６−カルボキシ−イコデキストリンのような酸化糖（上に列挙される糖の酸化類似体等）であるＮＡＳＰも提供される。
Ｂ．薬学的製剤
【００６１】
様々な実施形態では、本発明のＮＡＳＰは、薬学的製剤に組み込まれる。様々な実施形態では、ＮＡＳＰの所望の作用および効能に応じて、１つ以上のＮＡＳＰが一緒に製剤されてよい。例えば、２つ以上のＮＡＳＰ、例えば、３つ以上のＮＡＳＰおよび４つ以上のＮＡＳＰが一緒に製剤されてもよい。複数のＮＡＳＰが用いられる場合、組成物中の各ＮＡＳＰの質量パーセンテージは、組成物の総質量の１％以上から、例えば約２％以上、例えば約５％以上、例えば約１０％以上、例えば約２５％以上、および組成物の総質量の約５０％以上の範囲で変化し得る。
【００６２】
様々な実施形態では、本発明の薬学的製剤は、任意選択により１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含有する。例示の賦形剤として、制限なく、炭水化物、無機塩、抗菌剤、抗酸化剤、界面活性剤、緩衝剤、酸、塩基、およびそれらの組み合わせが挙げられる。液体賦形剤として、水、アルコール、ポリオール、グリセリン、植物油、リン脂質、および界面活性剤が挙げられる。糖等の炭水化物、誘導体化糖（例えば、アルジトール、アルドン酸、エステル化糖）、および／または糖ポリマーが賦形剤として存在し得る。特定の炭水化物賦形剤として、例えば、単糖（例えば、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボース等）；二糖（例えば、ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオース等）；多糖（例えば、ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、スターチ等）；およびアルジトール（例えば、マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール（グルシトール）、ピラノシルソルビトール、ミオイノシトール等）が挙げられる。賦形剤は、無機塩または緩衝剤（例えば、クエン酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硝酸カリウム、単塩基リン酸ナトリウム、二塩基リン酸ナトリウム、およびそれらの組み合わせを含むこともできる。
【００６３】
本発明の薬学的製剤は、微生物の成長を防止または阻止するための抗菌剤を含むこともできる。本発明に適した抗菌剤の非限定例として、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、フェノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル第二水銀、チメルソール、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００６４】
抗酸化剤も同様に製剤中に存在することができる。抗酸化剤を使用して酸化を防止し、それによって製剤のＮＡＳＰまたは他の成分の劣化を防止する。本発明の製剤において使用するために適した抗酸化剤として、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、重亜硫酸ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００６５】
界面活性剤が賦形剤として存在することができる。例示の界面活性剤として、ポリソルベート（例えば、「Ｔｗｅｅｎ  ２０」および「Ｔｗｅｅｎ  ８０」、およびプルロニック（例えば、Ｆ６８およびＦ８８（ＢＡＳＦ，Ｍｏｕｎｔ  Ｏｌｉｖｅ，Ｎ．Ｊ．）；ソルビタンエステル；脂質（例えば、レシチン等のリン脂質および他のホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン（好ましくはリポソーム形態でないが）、脂肪酸、および脂肪エステル）；コレステロール等のステロイド；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；ならびに亜鉛および他のそのような適した陽イオンが挙げられる。
【００６６】
酸または塩基が製剤中の賦形剤として存在することができる。使用することができる酸の非限定例として、塩酸、酢酸、リン酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、ギ酸、トリクロロ酢酸、硝酸、過塩素酸、リン酸、硫酸、フマル酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるそれらの酸が挙げられる。適切な塩基の例として、制限なく、水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、フマル酸カリウム、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される塩基が挙げられる。
【００６７】
製剤中のＮＡＳＰの量は、多数の因子に応じて変化するが、製剤が単位剤形（例えば、ピルもしくはカプセル）であるか、または容器（例えば、バイアルもしくはバッグ）中にあるとき、任意選択により治療上有効な用量である。治療上有効な用量は、臨床上望ましいエンドポイントを生じる量を決定するために、漸増量の製剤の投与を繰り返すことによって実験的に決定され得る。
【００６８】
製剤中の任意の個別の賦形剤の量は、賦形剤の性質および機能、および組成物の特定ニーズに応じて変化する。典型的には、任意の個別の賦形剤の最適な量は、ルーチン実験を通して、すなわち、可変量の賦形剤（低〜高の範囲）を含有する製剤を調製し、安定性および他のパラメータを審査した後、著しい副作用なしに最適な性能が得られる範囲を決定することによって決定される。しかしながら、一般的に賦形剤（複数可）は、約１重量％〜約９９重量％、好ましくは約５重量％〜約９８重量％、より好ましくは約１５〜約９５重量％の量の賦形剤を、最も好ましくは３０重量％未満の濃度で組成物中に存在する。これらの前述の薬学的賦形剤は、他の賦形剤に加えて、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ”，１９ｔｈ  ｅｄ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，（１９９５），ｔｈｅ  “Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ′ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ”，５２ｎｄ  ｅｄ．，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，Ｎ．Ｊ．（１９９８）、およびＫｉｂｂｅ，Ａ．Ｈ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，２０００に記載されている。
【００６９】
他の実施形態では、ＮＡＳＰは、以前に列挙した化合物の低分子量断片からなる群から選択される。ある実施形態では、この製剤は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含み得る。ある実施形態では、この製剤は、１つ以上の異なるＮＡＳＰ、および／または１つ以上の治療薬、および／または試薬をさらに含み得る。
【００７０】
この製剤は、全ての種類の製剤および特に経口投与または注入に適しているものを含む。追加の好適な組成物として、経口、眼内、または局所送達のためのものが挙げられる。
【００７１】
本明細書では、薬学的製剤は、意図される送達および使用形態に応じて、注入バッグ、シリンジ、埋め込みデバイス、またはその他に収容することもできる。好ましくは、本明細書に記載されるＮＡＳＰ組成物は、単位剤形であり、予め測定された形態または予め包装された形態で、単一投与に適した本発明の組成物の量を意味する。
【００７２】
製剤は、便宜上単位剤形で提示され、薬学の分野において周知の方法のうちのいずれかによって調製され得る。例示の方法は、化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒（「活性成分」）を１つ以上の副成分を構成する担体と関連付ける工程を含む。一般に、製剤は、本発明の化合物を液体担体または微粉化固体担体またはその両方と均一かつ密接に会合させ、次いで、必要に応じて、産物を所望の製剤に成形することによって調製される。経口製剤は、当業者に周知であり、それらを調製するための一般方法は、任意の標準的な薬学部教科書、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．（１９９５）において見出され、この開示全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【００７３】
様々な実施形態では、本発明は、本発明の１つ以上のＮＡＳＰを含む単位投与製剤を提供する。例示の実施形態では、単位投与製剤は、単一投与製剤が投与される対象の凝固状態における、好ましくは臨床上検出可能であり、かつ好ましくは臨床上有意義な変化を誘発するのに十分な治療上有効な投与量のＮＡＳＰを含む。例示の実施形態では、製剤中の本発明のＮＡＳＰの量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇのＮＡＳＰ投与量を提供するのに十分な量の範囲である。様々な実施形態では、本発明のＮＡＳＰの量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇの投与量を提供するのに十分である。単位投与製剤中の化合物の量は、特定のＮＡＳＰの効能および所望の凝固促進作用またはその程度、ならびに投与経路に依存する。
【００７４】
例示の単位投与製剤は、活性成分の有効用量、その適切な画分、またはその薬学的に許容される塩を含有するものである。予防的または治療的用量は、典型的には、治療される状態の性質および重症度、ならびに投与経路によって変化する。投与量、および場合によっては投与頻度も、個別の患者の年齢、体重、および応答性によって異なる。一般に、本発明の化合物について、本発明の単位投形態の総用量は、約１ｍｇ〜約７０００ｍｇ、例えば、約１ｍｇ〜約５００ｍｇ、例えば、約１０ｍｇ〜約２００ｍｇ、例えば、約２０ｍｇ〜約１００ｍｇ、例えば、約２０ｍｇ〜約８０ｍｇ、例えば、約２０ｍｇ〜約６０ｍｇの範囲である。いくつかの実施形態では、単位剤形の本発明のＮＡＳＰの量は、約５０ｍｇ〜約５００ｍｇ、例えば、約１００ｍｇ〜約５００ｍｇの範囲である。
【００７５】
本明細書のＮＡＳＰ組成物は、任意選択により、状態または疾患について対象を治療するために使用される、１つ以上の追加の作用物質、例えば、止血剤、血液因子、または他の薬品と組み合わせてもよい。様々な実施形態では、本発明は、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、プレカリクレイン、ＨＭＷＫ、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、およびフォンヴィレブランド因子等の１つ以上の血液因子を含む複合調製物を提供する。ＮＡＳＰ組成物は、第Ｘａ因子、第ＩＸａ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、および第ＶＩＩＩａ因子、プレカリクレイン、およびＨＭＷＫを含むが、これらに限定されない内因性凝固経路の活性剤等の凝固促進剤；または組織因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖａ因子、および第Ｘａ因子を含むが、これらに限定されない外因性凝固経路の活性剤等の他の凝固促進剤を含んでもよい。ＮＡＳＰ組成物は、天然に存在する、合成、または組み換え凝固因子もしくは断片、変異体、または生物活性を保持する（すなわち、凝固を促進する）その共役修飾された誘導体を含んでよい。あるいは、そのような作用物質は、ＮＡＳＰとは別個の組成物中に含有され、本発明のＮＡＳＰ組成物と同時、前、または後に共投与され得る。
【００７６】
あるＮＡＳＰ（それらの塩基多糖に基づく）と追加の作用物質と例示の組み合わせは、図６６Ａ〜Ｂに示される。その中での各組み合わせは、大文字（ＮＡＳＰの種類を指す）とそれに続く数（追加の作用物質を指す）によって特定される。例えば、「Ｃ５」は、セロペンタオース塩基多糖を有するＮＡＳＰと第Ｖ因子との組み合わせを指す。
【００７７】
そのような組み合わせの個別の成分は、単位剤形で同時または連続的のいずれかで投与され得る。単位剤形は、単一または複数単位剤形であり得る。例示の実施形態では、本発明は、組み合わせを単一単位剤形で提供する。単一単位剤形の例は、本発明の化合物および追加の治療薬の双方が同一カプセル内に含有されるカプセルである。例示の実施形態では、本発明は、組み合わせを２つの単位剤形で提供する。２つの単位剤形の例は、本発明の化合物を含有する第１のカプセル、および追加の治療薬を含有する第２のカプセルである。したがって、「単一単位」または「２つの単位」または「複数の単位」という用語は、物体の内部成分ではなく、患者が接種するその物体を指す。既知の治療薬の適量は、当業者により容易に理解される。
【００７８】
様々な実施形態では、本明細書におけるＮＡＳＰ組成物は、経口投与を意図されるとき、任意選択により１つ以上の透過亢進剤を含む。適切な透過亢進剤および本発明により提供されるもの等の凝固促進剤とのそれらの使用は、２０１１年７月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／５０９，５１４号、表題“Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ  ａｓ  Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ  ｔｏ  Ｉｍｐｒｏｖｅ  ｔｈｅ  Ｏｒａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｎ−Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ  Ｓｕｌｆａｔｅｄ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ”において開示される。いくつかの実施形態では、透過亢進剤は、消化管上皮壁透過亢進剤である。対象の生理機能に応じて、本明細書において使用される場合、「消化管上皮」という表現は、胃および腸管（例えば、十二指腸、空腸、回腸）等の消化管の上皮組織を指し、食道、直腸、および肛門の下位部分を含む身体の消化管機能に関与する他の構造をさらに含んでよい。様々な実施形態では、本発明の組成物は、消化管上皮壁透過亢進剤と組み合わせた凝固促進量のＮＡＳＰを含む。本発明において使用する透過促進剤の量は、上で参照される米国仮特許出願第６１／５０９，５１４号に記載されるものと概して同一である。同様に、例示の実施形態では、適切な量のＮＡＳＰは、上で参照される出願においてＮＡＳＰについて記載される量と同一である。様々な実施形態では、本発明の組成物は、凝固促進量のＮＡＳＰと、消化管上皮壁透過亢進剤および血液凝固因との組み合わせを含む。ＮＡＳＰおよび第２の作用物質、例えば、血液凝固因子の例示の量は、本明細書に記載される。消化管上皮壁透過亢進剤は、経口投与されるとき、消化管系によって吸収されるＮＡＳＰの量を増加させる化合物を含む。さらに、消化管透過亢進剤は、消化管上皮を通るＮＡＳＰ吸収の開始も加速させ得る（すなわち、吸収が開始するまでの時間量を低減する）とともに、対象の消化管上皮全体のＮＡＳＰの全体輸送速度を加速させ得る（すなわち、消化管系によるＮＡＳＰ吸収が完了するまでの時間量を低減する）。本発明の実施形態では、消化管上皮壁透過亢進剤は、特定の血液凝固障害に応じて、対象の生理機能および消化管系による吸収の所望の亢進に応じて変化し得る。いくつかの実施形態では、消化管上皮壁透過亢進剤は、密着結合調節物質である。「密着結合」という用語は、その便宜的な意味において、隣接した細胞の膜が一緒に結合される密接に関連した細胞面積を指すように用いられる。本発明の実施形態では、密着結合調節物質として、酵素、胆汁酸、多糖、脂肪酸およびその塩、ならびにそれらの任意の組み合わせが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００７９】
本発明の例示の実施形態では、本発明は、ａ）本発明の化合物、ｂ）追加の治療薬、およびｃ）薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的製剤を提供する。例示の実施形態では、この薬学的製剤は単位剤形である。例示の実施形態では、この薬学的製剤は単一の単位剤形である。例示の実施形態では、この薬学的製剤は２つの単位剤形である。例示の実施形態では、この薬学的製剤は、第１の単位剤形および第２の単位剤形を含む２つの単位剤形であり、第１の単位剤形は、ａ）本発明の化合物、ならびにｂ）第１の薬学的に許容される賦形剤を含み、第２の単位剤形は、ｃ）追加の治療薬およびｄ）第２の薬学的に許容される賦形剤を含む。
【００８０】
上述される特定の成分に加えて、本発明の製剤は、問題の製剤の種類に関する当該技術分野における他の作用物質を含むことができ、例えば、経口投与に適したものは、香味剤を含むことができることを理解されたい。
【００８１】
経口投与に適した本発明の製剤は、カプセル（例えば、軟ゲルカプセル）、それぞれ既定量の活性成分を含有するカシェットもしくは錠剤等の別個の単位として；粉末または顆粒として；水性液体もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液として；または水中油液体乳剤もしくは油中水液体乳剤として提示され得る。活性成分は、ボーラス、舐剤、またはペーストとして提示されることもできる。
【００８２】
錠剤は、任意選択により１つ以上の副成分を使用して、圧縮または成形により作製され得る。圧縮された錠剤は、任意選択により結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、潤滑表面活性剤、または分散剤と混合される粉末または顆粒等の自由流動形態の活性成分を適切な機械内で圧縮することにより調製され得る。成形された錠剤は、不活性希釈液で湿潤させた粉末化化合物の混合物を適切な機械内で成形することによって作製され得る。錠剤は、任意選択によりコーティングまたはスコアリングされ得、その中での活性成分の持続、遅延、または制御放出を提供するように製剤され得る。経口および非経口持続性放出薬物送達系は、当業者に周知であり、経口または非経口投与された薬物の持続放出を達成する一般方法は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，ｐａｇｅｓ  １６６０−１６７５（１９９５）において見出され、この開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００８３】
例示の実施形態では、本発明は、注入（例えば、点滴）による投与に適した形態で、本発明のＮＡＳＰの単位投与製剤を提供する。単位投与製剤は、使用直前に適切な薬学的に許容される希釈剤で希釈され得るか、または点滴のための希釈された単位投与として包装され得る。注入前の希釈に適した形態として、例えば、使用前の溶媒で再構成され得るとともに、使用前に媒体と合わせるための溶液または懸濁液、乾燥不溶性組成物、および投与前の希釈のための乳化剤および液体濃縮物を注入する準備ができている粉末または凍結乾燥材が挙げられる。注入前の固体組成物を再構成するために適した希釈剤の例として、注入のための静菌水、水中の５％デキストロース、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、生理食塩水、滅菌水、脱イオン化水、およびそれらの組み合わせが挙げられる。液体薬学的組成物に関して、溶液および懸濁液が想定される。一般に、経口単位剤形に適切であるとして上述される量は、注入可能な単位投与にも同様に適用可能である。
【００８４】
さらなる例示の実施形態では、本発明は、注入可能な単位投与製剤、および注入（例えば、点滴）により単位投与製剤の投与のためのデバイスを提供する。様々な実施形態では、デバイスは点滴バッグである。本実施形態の例では、本発明は、単位投与製剤が、希釈されるか、または希釈に適した形態で予め充填される点滴バッグ、または同様のデバイスを提供する。
【００８５】
潜在的なＮＡＳＰ活性（すなわち、凝固促進活性）を持つ硫酸化またはスルホン酸化多糖として、塩基多糖が、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、キシロヘキサオース、ラフィノース、メレジトース、スタキオース、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、イコデキストリン、および６−カルボキシイコデキストリンから選択される、硫酸化またはスルホン酸化多糖が挙げられるが、これらに限定されない。
Ｃ．凝固促進剤としてのＮＡＳＰ
【００８６】
例示の実施形態では、本発明は、ヘパリン様硫酸化またはスルホン酸化多糖等の硫酸化またはスルホン酸化多糖を逆説的に利用して凝固を促進する、止血を調節するための方法を提供する。本明細書に記載される選択された硫酸化またはスルホン酸化多糖は、本質的に抗凝固活性を欠くか、またはそれらが抗凝固活性を呈する濃度より低い濃度、好ましくは著しく低い濃度で凝固促進活性を呈するため、「非抗凝固性の硫酸化またはスルホン酸化多糖」と示される。
【００８７】
本発明の方法において使用するためのＮＡＳＰは、凝固促進活性を有する硫酸化またはスルホン酸化多糖である。潜在的ＮＡＳＰの特性は、ＴＦＰＩ希釈プロトロンビン時間（ｄＰＴ）または活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）凝固アッセイを使用して決定される。本発明のＮＡＳＰの凝固促進活性は、低いＴＦでトロンビン生成またはトロンボエロストグラフィーのような全止血アッセイによって決定され得る。非抗凝固性の硫酸化またはスルホン酸化多糖は、非分別ヘパリンの３分の１以下、および好ましくは１０分の１未満の抗凝固活性（凝固時間の増加により測定される）を呈する。
【００８８】
本明細書における例に示されるように、本発明のＮＡＳＰは、血漿および全血の凝固を促進する。本明細書に開示される実験では、ある候補ＮＡＳＰは、凝固アッセイにおいて、ヘパリンと比較して少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、または少なくとも約１０倍低い抗凝固活性を証明することが示される。これらの結果は、選択されたＮＡＳＰの全身投与が、出血障害において止血を調節するための固有の方法を表すことを示す。
【００８９】
したがって、例示の実施形態では、本発明は、先天性凝固障害、後天性凝固障害、および外傷誘発性出血状態を含む、出血障害のある対象において止血を制御するためのＮＡＳＰの使用に関する。
【００９０】
一態様では、本発明は、本発明の非抗凝固性の硫酸化またはスルホン酸化多糖（ＮＡＳＰ）を含む治療上有効な量の組成物を対象に投与することを含む、血液凝固の亢進を必要とする対象を治療するための方法を提供する。ある実施形態では、本発明は、本発明のＮＡＳＰを含む治療上有効な量の組成物を対象に投与することを含む、出血障害のある対象を治療するための方法を提供する。
【００９１】
例示の実施形態では、組成物は、血液凝固の亢進を必要とする対象を治療するための方法において使用される。この方法は、非抗凝固性の硫酸化またはスルホン酸化多糖を含む治療上有効な量の組成物を対象に投与することを含む。
【００９２】
例示の実施形態では、本発明は、ＮＡＳＰが、１つ以上の異なるＮＡＳＰとともに、かつ／または１つ以上の他の治療薬（複数可）と組み合わせて共投与される方法を提供する。
【００９３】
ある実施形態では、本発明のＮＡＳＰは、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォンヴィレブランド疾患、特発性血小板減少症、１つ以上の凝固因子（例えば、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、プレカリクレイン、およびＨＭＷＫ）の欠乏症、臨床的に有意な出血を伴う１つ以上の因子（例えば、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＩ因子（低プロトロンビン血症）、およびフォンヴィレブランド因子）欠乏症、ビタミンＫ欠乏症、フィブリノゲンの障害（例えば、無フィブリノゲン血症、低フィブリノゲン血症、および異常フィブリノゲン血症）、α２−抗プラスミン欠乏症、および肝疾患、腎疾患、血小板減少症、血小板機能異常症、血腫、内出血、関節血症、手術、外傷、低体温、月経、および妊娠等に起因する過剰出血からなる群から選択される出血障害を治療するために対象に投与される。
【００９４】
ある実施形態では、ＮＡＳＰは、先天性凝固障害、または血液因子欠乏症に起因する後天性凝固障害を治療するために対象に投与される。血液因子の欠乏は、１つ以上の因子（例えば、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、およびフォンヴィレブランド因子）の欠乏に起因し得る。
【００９５】
ある実施形態では、出血障害のある対象に、上記の別の治療薬と組み合わせて、ＮＡＳＰを含む治療上有効な量の組成物を投与する。
【００９６】
別の実施形態では、本発明は、対象における抗凝固作用を逆転させるための方法を提供する。この方法は、本発明の非抗凝固性の硫酸化またはスルホン酸化多糖（ＮＡＳＰ）を含む治療上有効な量の組成物を対象に投与することを含む。ある実施形態では、対象は、ヘパリン、クマリン誘導体（ワルファリンまたはジクマロール等）、組織ＴＦＰＩ、抗トロンビンＩＩＩ、ループス抗凝固剤、ネマトード抗凝固剤ペプチド（ＮＡＰｃ２）、活性部位遮断第ＶＩＩａ因子（第ＶＩＩａｉ因子）、第ＩＸａ因子阻害剤、第Ｘａ因子阻害剤（フォンダパリヌクス、イドラパリヌクス、ＤＸ−９０６５ａ、およびラザキサバン（ＤＰＣ９０６）を含む）、第ＶａおよびＶＩＩＩａ因子の阻害剤（活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）および可溶性トロンボモジュリン）、トロンビン阻害剤（ヒルジン、ビバリルジン、アルガトロバン、およびキシメラガトラン）を含むが、これらに限定されない抗凝固剤で治療されていてもよい。ある実施形態では、対象における抗凝固剤は、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＩ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、フォンヴィレブランド、プレカリクレイン、またはＨＭＷＫに結合する抗体を含むが、これに限定されない凝固因子に結合する抗体であり得る。
【００９７】
ある実施形態では、ＮＡＳＰは、１つ以上の異なるＮＡＳＰ（複数可）とともに、かつ／または対象における抗凝固剤の作用を逆転させるための１つ以上の他の治療薬と組み合わせて共投与され得る。例えば、対象には、本発明のＮＡＳＰを含む治療上有効な量の組成物、および上記のもの等の１つ以上の治療薬が投与され得る。対象における抗凝固剤の作用を逆転させるためにＮＡＳＰと併用される治療薬は、同一または異なる組成で、ＮＡＳＰの投与と同時に、投与前に、または投与後に投与され得る。
【００９８】
別の態様では、本発明は、血液凝固の改善が望ましい外科的または侵襲的手技を受ける対象を治療するための方法を提供する。この方法は、本発明の非抗凝固性の硫酸化またはスルホン酸化多糖（ＮＡＳＰ）を含む治療上有効な量の組成物を対象に投与することを含む。ある実施形態では、ＮＡＳＰは、１つ以上の異なるＮＡＳＰとともに、かつ／または１つ以上の前記した他の治療薬等と組み合わせて共投与され得る。外科的または侵襲的手技を受ける対象を治療するために使用される治療薬は、同一または異なる組成物中で、ＮＡＳＰの投与と同時、投与前、または投与後に投与され得る。
【００９９】
別の態様では、本発明は、対象におけるＴＦＰＩ活性を阻害する方法を提供し、この方法は、本発明のＮＡＳＰを含む治療上有効な量の組成物を対象に投与することを含む。
【０１００】
別の態様では、本発明は、生体試料中のＴＦＰＩ活性を阻害する方法を提供し、この方法は、生体試料（例えば、血液または血漿）を、ＴＦＰＩ活性を阻害するのに十分な量の本発明の非抗凝固性の硫酸化またはスルホン酸化多糖（ＮＡＳＰ）と合わせることを含む。
【０１０１】
別の態様では、本発明は、生体試料中の本発明のＮＡＳＰによる凝固の加速を測定する方法を提供し、この方法は、
ａ）生体試料をＮＡＳＰを含む組成物と合わせることと、
ｂ）生体試料の凝固時間を測定することと、
ｃ）生体試料の凝固時間を、ＮＡＳＰに曝露されていない対応する生体試料の凝固時間と比較することと、を含み、ＮＡＳＰに曝露された生体試料の凝固時間の減少は、観測された場合、凝固を加速させるＮＡＳＰを示す。
【０１０２】
ある実施形態では、凝固時間を測定するために、本発明の１つ以上の異なるＮＡＳＰおよび／または治療薬、ならびに／または試薬が生体試料に添加される。例えば、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、プレカリクレイン、ＨＭＷＫ、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＩ因子、およびフォンヴィレブランド因子、組織因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖａ因子、および第Ｘａ因子、第ＩＸａ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、および第ＶＩＩＩａ因子を含むが、これらに限定されない１つ以上の因子、および／またはＡＰＴＴ試薬、組織因子、トロンボプラスチン、フィブリン、ＴＦＰＩ、ラッセルマムシ毒、微粉化シリカ粒子、エラグ酸、スルファチド、およびカオリンを含むが、これらに限定されない１つ以上の試薬を添加することができる。
Ｄ．投与
【０１０３】
例示の実施形態では、本発明のＮＡＳＰを用いる少なくとも１つの治療上有効な治療サイクルが対象に投与される。「治療上有効な治療サイクル」は、投与されるとき、出血障害に対して個体において正の治療応答をもたらす治療サイクルを指す。止血を改善するＮＡＳＰによる治療サイクルは特定の関心事である。例えば、１つ以上の治療上有効な治療サイクルは、凝固および全止血アッセイ（例えば、以下に詳述されるＣＡＴ、ａＰＴＴ）によって決定されるように、約１％以上、例えば約５％以上、例えば約１０％以上、例えば約１５％以上、例えば約２０％以上、例えば約３０％以上、例えば４０％以上、例えば約５０％以上、例えば約７５％以上、例えば約９０％以上、例えば約９５％以上凝固（例えば、凝固速度）を増加させ得、血栓形成速度を約９９％以上増加させることを含む。他の例では、１つ以上の治療上有効な治療サイクルは、血栓形成速度を約１．５倍以上、例えば約２倍以上、例えば約５倍以上、例えば約１０倍以上、例えば約５０倍以上増加させ得、血栓形成速度を約１００倍以上増加させることを含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法により治療される対象は、正の治療応答を呈する。本明細書において使用される場合、「正の治療応答」は、本発明に従い治療を受ける個体が、血液凝固時間の短縮および出血の低減、および／または因子補充療法の必要性の低減等の改善を含む、出血障害の１つ以上の症状の改善を呈することを意味する。
【０１０４】
ある実施形態では、複数の治療上有効な用量の１つ以上のＮＡＳＰを含む組成物および／または止血剤、血液因子、または他の薬品等の他の治療薬が投与される。本発明の組成物は、典型的には、必須ではないが、経口、注入を介して（皮下、静脈内、または筋内）、点滴によって、または局所的に投与される。薬学的調製物は、投与直前に液体溶液または懸濁液の形態であり得るが、シロップ、クリーム、軟膏、錠剤、カプセル、粉末、ゲル、マトリクス、坐薬等の別の形態を取ってもよい。肺、直腸、経皮、経粘膜、髄腔内、心膜、動脈内、脳内、眼内、腹腔内等の追加の投与方法も企図される。ＮＡＳＰおよび他の作用物質を含む薬学的組成物は、当該技術分野において既知の任意の医学的に許容される方法に従い、同一または異なる投与経路を使用して投与され得る。
【０１０５】
例示の実施形態では、本発明の組成物は、例えば、病変、損傷、または手術の結果としての出血の治療のために、本発明のＮＡＳＰの局所送達に使用される。本発明による調製物は、局所治療にも適している。例えば、ＮＡＳＰは、出血部位での注入によるか、または固体、液体、または軟膏の形態、好ましくは接着テープまたは創傷カバーを介して投与され得る。坐薬、カプセル、特に耐胃液カプセル、ドロップ、またはスプレーが使用されてもよい。出血部位を標的するために特定の調製物および適切な投与方法が選択される。
【０１０６】
別の実施形態では、ＮＡＳＰおよび／または他の作用物質を含む薬学的組成物は、予防的に、例えば計画された手術前に投与される。一般に汎用性であるが、そのような予防的使用は、特に既知の既存の血液凝固障害のある対象に価値がある。
【０１０７】
本発明の別の実施形態では、ＮＡＳＰおよび／または他の作用物質を含む薬学的組成物は、徐放性製剤であるか、または徐放デバイスを使用して投与される製剤である。そのようなデバイスは、当該技術分野において周知であり、例えば、経皮パッチ、および非徐放性薬学的組成物を用いて徐放作用を達成するために、多様な用量で連続的な定常状態様式で経時的に薬物送達を提供することができる小型埋め込みポンプが挙げられる。
【０１０８】
予防的または治療的用量は、典型的には、治療される状態の性質および重症度、ならびに投与経路によって変化する。投与量、および場合によっては投与頻度も個別の患者の年齢、体重、および反応に従い変化する。一般に、総日用量（単一または分割用量で）は、約１ｍｇ／日〜約７０００ｍｇ／日、例えば、約１ｍｇ／日〜約５００ｍｇ／日、例えば、約１０ｍｇ／日〜約２００ｍｇ／日、例えば、約２０ｍｇ〜約１００ｍｇ、例えば、約２０ｍｇ〜約８０ｍｇ、例えば、約２０ｍｇ〜約６０ｍｇの範囲である。いくつかの実施形態では、総日用量は、約５０ｍｇ〜約５００／日、例えば、約１００ｍｇ〜約５００ｍｇ／日の範囲であり得る。小児、６５歳以上の患者、および腎臓または肝臓機能不全のある患者は、最初に低用量を受けること、およびその投与量は、個別の生理学的応答および／または薬物動態に基づいて滴定されることがさらに推奨される。当業者にとっては明らかであるように、場合によってはこれらの範囲外の投与量を使用する必要があり得る。さらに、臨床医または治療する医師は、個別の患者の応答と併せて、治療を中断、調整、または終了する方法および時期を把握していることに留意されたい。
【０１０９】
本発明は、本明細書に提供される本発明のＮＡＳＰを含む複合体を、その複合物または組成物に含有されるＮＡＳＰによる治療に応答性であるという状態に苦しむ患者に投与するための方法も提供する。この方法は、本明細書に記載される形態のうちのいずれかを介して、好ましくは薬学的組成物の一部として提供される、治療上有効な量の複合物または薬物送達系を投与することを含む。投与する方法は、ＮＡＳＰによる治療に応答性である任意の状態を治療するために使用され得る。より具体的には、本明細書における組成物は、Ｈｅｍ  Ａ、Ｈｅｍ  Ｂ、フォンヴィレブランド疾患、特発性血小板減少症、１つ以上の凝固因子（例えば、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、プレカリクレイン、およびＨＭＷＫ）の欠乏症、臨床的に有意な出血を伴う１つ以上の因子（例えば、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＩ因子（低プロトロンビン血症）、およびフォンヴィレブランド因子）欠乏症、ビタミンＫ欠乏症、フィブリノゲンの障害（無フィブリノゲン血症、低フィブリノゲン血症、および異常フィブリノゲン血症を含む）、α２−抗プラスミン欠乏症、および肝疾患、腎疾患、血小板減少症、血小板機能異常症、血腫、内出血、関節血症、手術、外傷、低体温、月経、および妊娠等に起因する過剰出血を含む、出血障害を治療する際に有効である。
【０１１０】
例示の実施形態では、本発明のＮＡＳＰは、経口、腹腔内（ｉ．ｐ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、またはそれらの投与方法の組み合わせを通じて投与される。
【０１１１】
当業者であれば、特定のＮＡＳＰが効果的に治療することができる状態を理解するであろう。投与される実際の用量は、対象の年齢、体重、および全身状態、ならびに治療される状態の重症度、医療専門家の判断、および投与される複合物に応じて変化する。治療上有効な量は、当業者によって決定され得、各特定症例の特定要件に対して調整される。
【０１１２】
予防的または治療的用量は、典型的には、治療される状態の性質および重症度、ならびに投与経路によって変化する。投与量、および場合によっては投与頻度も個別の患者の年齢、体重、および反応に従い変化する。一般に、本発明の化合物について、本発明の単位投形態の総用量は、約１ｍｇ〜約７０００ｍｇ、例えば、約１ｍｇ〜約５００ｍｇ、例えば、約１０ｍｇ〜約２００ｍｇ、例えば、約２０ｍｇ〜約１００ｍｇ、例えば、約２０ｍｇ〜約８０ｍｇ、例えば、約２０ｍｇ〜約６０ｍｇの範囲である。いくつかの実施形態では、単位剤形の本発明のＮＡＳＰの量は、約５０ｍｇ〜約５００ｍｇ、例えば、約１００ｍｇ〜約５００ｍｇの範囲である。
【０１１３】
一般的に、治療上有効な量は、１日約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇのＮＡＳＰ、より好ましくは、１日約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、さらにより好ましくは１日約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇの範囲である。例示の実施形態では、そのような用量は、約０．０１〜約５０ｍｇ／ｋｇ１日４回（ＱＩＤ）、約０．０１〜約１０ｍｇ／ｋｇ（ＱＩＤ）、約０．０１〜約２ｍｇ／ｋｇ（ＱＩＤ）、約０．０１〜約０．２ｍｇ／ｋｇ（ＱＩＤ）、約０．０１〜約５０ｍｇ／ｋｇ１日３回（ＴＩＤ）、約０．０１〜約１０ｍｇ／ｋｇ（ＴＩＤ）、約０．０１〜約２ｍｇ／ｋｇ（ＴＩＤ）、約０．０１〜約０．２ｍｇ／ｋｇ（ＴＩＤ）、約０．０１〜約２００ｍｇ／ｋｇ１日２回、約０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ１日２回（ＢＩＤ）、約０．０１〜約１０ｍｇ／ｋｇ（ＢＩＤ）、約０．０１〜約２ｍｇ／ｋｇ（ＢＩＤ）、または約０．０１〜約０．２ｍｇ／ｋｇ（ＢＩＤ）の範囲である。投与される化合物の量は、対象の状態の重症度、特定ＮＡＳＰの効能、および所望の凝固促進作用またはその程度、ならびに投与経路に依存する。
【０１１４】
本発明のＮＡＳＰ（例えば、薬学的調製物の一部として提供される）は、単独で、または他のＮＡＳＰもしくは治療薬、例えば、止血剤、血液因子、もしくは特定状態または疾患を治療するために使用される他の薬品と組み合わせて、医師の判断、患者のニーズ等に応じて多様な投与計画に従って投与され得る。特定の投与計画は、当業者に既知であるか、またはルーチン方法を使用して実験的に決定され得る。例示の投与計画として、制限なく、１日５回、１日４回、１日３回、１日２回、１日１回、週３回、週２回、週１回、月２回、月１回の投与、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられる。好ましい組成物は、わずか１日１回の投与を要するものである。
【０１１５】
本発明のＮＡＳＰは、他の作用物質の前、同時、または後に投与され得る。他の作用物質と同時に提供される場合、ＮＡＳＰは、同一または異なる組成物中で提供され得る。したがって、ＮＡＳＰおよび他の作用物質は、併用療法によって個体に提供され得る。「併用療法」とは、物質の組み合わせの治療効果が、治療を受ける対象において引き起こされるように意図された対象への投与である。例えば、併用療法は、ＮＡＳＰを含む一用量の薬学的組成物と、例えば、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、プレカリクレイン、ＨＭＷＫ、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、およびフォンヴィレブランド因子等の１つ以上の血液因子を含む、止血剤または凝固因子等の少なくとも１つの他の作用物質を含む一用量の薬学的組成物と、を投与することによって達成され得る。ＮＡＳＰ組成物は、第Ｘａ因子、第ＩＸａ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、および第ＶＩＩＩａ因子、プレカリクレイン、およびＨＭＷＫを含むが、これらに限定されない内因性凝固経路の活性剤等の凝固促進剤；または組織因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖａ因子、および第Ｘａ因子を含むが、これらに限定されない外因性凝固経路の活性剤等の他の凝固促進剤を含んでもよく、併せて特定の投与計画に従って、治療上有効な用量を含む。同様に、１つ以上のＮＡＳＰおよび治療薬は、少なくとも１つの治療用量で投与され得る。ＮＡＳＰおよび他の治療薬（複数可）が別個の薬学的組成物として投与されるとき、別個の薬学的組成物の投与は、これらの物質の組み合わせの治療効果が、治療を受ける対象において引き起こされる限り、同時または異なる時点で（すなわち、連続して、いずれかの順序で、同日に、または異なる日に）行うことができる。
Ｆ．適用
【０１１６】
一実施形態では、本発明のＮＡＳＰは、出血障害、特に凝固因子の欠乏と関連付けられるものを治療する際に止血を改善するため、または対象における抗凝固剤の作用を逆転させるために、本発明の方法において使用される。ＮＡＳＰは、先天性凝固障害、後天性凝固障害、または外傷によって誘発される出血状態を含む出血障害を治療するために対象に投与され得る。ＮＡＳＰにより治療され得る出血障害の例として、Ｈｅｍ  Ａ、Ｈｅｍ  Ｂ、フォンヴィレブランド疾患、特発性血小板減少症、１つ以上の凝固因子（例えば、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、プレカリクレイン、およびＨＭＷＫ）の欠乏症、臨床的に有意な出血を伴う１つ以上の因子（例えば、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＩ因子（低プロトロンビン血症）、およびフォンヴィレブランド因子）欠乏症、ビタミンＫ欠乏症、フィブリノゲンの障害（無フィブリノゲン血症、低フィブリノゲン血症、および異常フィブリノゲン血症を含む）、α２−抗プラスミン欠乏症、および肝疾患、腎疾患、血小板減少症、血小板機能異常症、血腫、内出血、関節血症、手術、外傷、低体温、月経、および妊娠等に起因する過剰出血が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態では、ＮＡＳＰは、血友病Ａ、血友病Ｂ、およびフォンヴィレブランド疾患を含む先天性凝固障害を治療するために使用される。他の実施形態では、ＮＡＳＰは、第ＶＩＩＩ因子、フォンヴィレブランド因子、第ＩＸ因子、第Ｖ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、および第ＸＩＩＩ因子の欠乏、特に血液凝固因子に対する阻害剤または自己免疫性に起因する障害、または凝固因子の合成の減少をもたらす疾患もしくは状態に起因する止血障害を含む、後天性凝固障害を治療するために使用される。
【０１１７】
患者のニーズは、治療される特定の出血障害に依存する。例えば、本発明のＮＡＳＰは、慢性状態（例えば、先天性または後天性凝固因子欠乏症）を治療するために、複数回投与で長期間に渡り投与され得る。あるいは、ＮＡＳＰは、急性状態（例えば、手術もしくは外傷により引き起こされる出血、または凝固補充療法を受けている対象における因子阻害剤／自己免疫エピソード）を治療するために、単回または複数回投与で比較的短期間、例えば１〜２週間投与され得る。さらに、ＮＡＳＰ療法は、前述のとおり、他の止血剤、血液因子、および薬品と併用されてもよい。さらに、血液製剤の注入は、過剰出血を経験している対象において喪失した血液に代わって必須であり得、損傷の場合、外科的修復が出血を止めるために適切であり得る。
【０１１８】
本発明は、対象における抗凝固作用を逆転させるための方法も提供する。この方法は、本発明のＮＡＳＰを含む治療上有効な量の組成物を対象に投与することを含む。ある実施形態では、対象は、ヘパリン、クマリン誘導体（ワルファリンまたはジクマロール等）、ＴＦＰＩ、ＡＴ  ＩＩＩ、ループス抗凝固剤、ネマトード抗凝固剤ペプチド（ＮＡＰｃ２）、活性部位遮断第ＶＩＩａ因子（第ＶＩＩａｉ因子）、第ＩＸａ因子阻害剤、第Ｘａ因子阻害剤（フォンダパリヌクス、イドラパリヌクス、ＤＸ−９０６５ａ、およびラザキサバン（ＤＰＣ９０６）を含む）、第ＶａおよびＶＩＩＩａ因子の阻害剤（活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）および可溶性トロンボモジュリンを含む）、トロンビン阻害剤（ヒルジン、ビバリルジン、アルガトロバン、およびキシメラガトランを含む）を含むが、これらに限定されない抗凝固剤で治療されていてもよい。ある実施形態では、対象における抗凝固剤は、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＩ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、フォンヴィレブランド、プレカリクレイン、またはＨＭＷＫに結合する抗体を含むが、これに限定されない凝固因子に結合する抗体であり得る。
【０１１９】
別の態様では、本発明は、外科的または侵襲的手技を受けている対象における凝固剤を改善するための方法を提供し、この方法は、本発明の非抗凝固性の硫酸化またはスルホン酸化多糖（ＮＡＳＰ）を含む治療上有効な量の組成物を対象に投与することを含む。ある実施形態では、ＮＡＳＰは、単独で、または１つ以上の異なるＮＡＳＰとともに、かつ／または前述の１つ以上の他の治療薬と組み合わせて、外科的もしくは侵襲的手技を受けている対象に共投与され得る。例えば、対象には、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、プレカリクレイン、ＨＭＷＫ、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、およびフォンヴィレブランド因子からなる群から選択される、治療上有効な量の１つ以上の因子が投与され得る。治療は、第Ｘａ因子、第ＩＸａ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、および第ＶＩＩＩａ因子、プレカリクレイン、およびＨＭＷＫを含む内因性凝固経路の活性剤等の凝固促進剤；または組織因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖａ因子、および第Ｘａ因子を含む外因性凝固経路の活性剤を投与することをさらに含み得る。
【０１２０】
上述の用途に加えて、本発明の化合物は、多様な他の治療方法における用途を見出す。例えば、一実施形態では、本発明の化合物は、間質性膀胱炎を治療するために使用される（例えば、Ｕｒｏｌｏｇｙ，（２０００，Ｄｅｃ．）１６４（６）：２１１９−２１２５；Ｕｒｏｌｏｇｙ，（１９９９，Ｊｕｎｅ）５３（６）：１１３３−１１３９；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  Ｓｅｒｉｅｓ，（２００１，Ｄｅｃ．）１２２３：２２７−２３７；Ｕｒｏｌｏｇｙ，（２００８，Ｊａｎ．）１７９（１）：１７７−１８５；Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｕｒｏｌｏｇｙ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ，（２００３，Ｓｅｐｔ．）２（４）：１４−１６；Ｕｒｏｌｏｇｙ，（２０１１，Ｓｅｐｔ．）７８（３）：Ｓ２１０−Ｓ２１１；Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｕｒｏｌｏｇｙ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ，（２０１１，Ｏｃｔ．）１０（６）４５１−４５９；Ｕｒｏｌｏｇｙ，（２０１１１，Ａｐｒｉｌ）１８５（４）：ｅ３８４参照）。
【０１２１】
様々な実施形態では、本発明の化合物は、抗炎症薬として、および神経変性障害の治療および予防における用途も見出す（例えば、Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，（２０１１，Ａｕｇ．）４９（８）：１７４５−１７５２；Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，（２０１１，Ｓｅｐｔ．）４９（９）：２０９０−２０９５；Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（ＢＢＡ）−Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ＆  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，（２００３，Ｓｅｐｔ．）１６５１（１−２）参照）。
【０１２２】
例示の実施形態では、本発明の化合物は、それらの抗癌活性に対する用途も見出す（例えば、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，（２０１２，Ｊａｎ．４）８７（１，４）：１８６−１９４；Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，（２０１０，Ｍａｙ  ２３）８１（１，２３）：４１−４８；Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，（２０１２，Ｊａｎ．４）８７（１，４）：１８６−１９４；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，（２０１１，Ｏｃｔ．１）４９（３，１）：３３１−３３６；Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，（２０１１）６４：３９１−４０２参照）。
【０１２３】
様々な実施形態では、本発明の化合物は、付着形成の予防のための作用物質としての用途も見出す（例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，（２０１１，Ｄｅｃ．）１７１（２）：４９５−５０３；Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ，（２００９，Ｓｅｐｔ．）９２（３）：Ｓ５８；Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｎｉｍａｌｌｙ  Ｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ，（２００９，Ｎｏｖ．−Ｄｅｃ．）１６（６）：Ｓ１２０参照）。
【０１２４】
例示の実施形態では、本発明の化合物は、抗ウイルス活性も有する（例えば、Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，（１９９９，Ｎｏｖ．）６（５）：３３５−３４０；Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，（１９９１，Ｆｅｂ．）１５（２）：１３９−１４８；Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（２０１０，Ｆｅｂ．）７１（２−３）：２３５−２４２；およびＡｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，（２０１１）６４：３９１−４０２参照）。
【０１２５】
様々な実施形態では、本発明の化合物は、補体系の阻害剤でもある（例えば、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｐａｒｔ  Ｃ：Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，（２０００，Ｊｕｌｙ）１２６（３）：２０９−２１５参照）。
【０１２６】
これらの異なる治療方法のそれぞれにおいて、そのような治療を必要とする対象の治療は、効果があるならば、治療上有効な量の本発明の作用物質を対象に投与することによる。様々な実施形態では、化合物は、状態を治療するために対象に投与され、この対象は、そうでなければ異なる状態に対して本発明の化合物による治療を必要としない。
【０１２７】
本発明の方法を実践する際、対象における血液凝固を亢進するためのプロトコルは、例えば、年齢、体重、血液凝固障害の重症度、対象の全身健康状態、ならびに投与される本発明のＮＡＳＰの特定組成および濃度によって変化し得る。本発明の実施形態では、経口投与および消化管系による吸収に続いて対象において達成されるＮＡＳＰの濃度は、場合によって約０．０１ｎＭ〜約５００ｎＭの範囲で変化し得る。関心の例示のＮＡＳＰは、それらの最適濃度で凝固促進性である。「最適濃度」とは、ＮＡＳＰが最大量の凝固促進活性を呈する濃度を意味する。例示のＮＡＳＰは、最適濃度よりはるかに高い濃度での抗凝固活性も証明したため、本発明の好ましいＮＡＳＰは、その最適濃度の範囲内で非抗凝固作用を示す。そのように、ＮＡＳＰの効能ならびに所望の作用に応じて、本発明の方法により提供される例示のＮＡＳＰの最適濃度は、０．０１μｇ／ｋｇ〜５００μｇ／ｋｇ、例えば０．１μｇ／ｋｇ〜２５０μｇ／ｋｇ、例えば０．１μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、例えば０．１μｇ／ｋｇ〜７５μｇ／ｋｇ、例えば、０．１μｇ／ｋｇ〜５０μｇ／ｋｇ、例えば、０．１μｇ／ｋｇ〜２５μｇ／ｋｇ、例えば、０．１μｇ／ｋｇ〜１０μｇ／ｋｇ、および０．１μｇ／ｋｇ〜１μｇ／ｋｇの範囲であり得る。関心のＮＡＳＰの校正自動トロンボグラフィー（ＣＡＴ）により決定される最適濃度および活性レベルは、２００５年５月２７日に出願された米国特許出願第１１／１４０，５０４号、現在の米国特許第７，７６７，６５４号、および２０１１年１月１３日に出願された米国特許出願第１３／００６，３９６号において詳細に記載され、これらの開示は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。同様に、本出願は、本発明のＮＡＳＰの最適濃度を決定する際の使用に関するＣＡＴアッセイの実施例を開示する。
【０１２８】
図６６Ａ〜Ｂにおいて特定される組み合わせ（ＮＡＳＰの種類（塩基多糖に基づく）と追加の作用物質）のそれぞれにおけるそれぞれのＮＡＳＰの例示の投与量は、図６７に示される。図６６Ａ〜Ｂの組み合わせの識別子に付随する下付き文字は、その組み合わせにおけるそれぞれのＮＡＳＰの投与量を指す。例えば、「Ｃ５ａ」は、セロペンタオース塩基多糖を有するＮＡＳＰと第Ｖ因子との組み合わせを指し、ＮＡＳＰの用量は約０．０１〜約１ｍｇ／ｋｇである。追加の作用物質の例示の投与量は、図６８に提供される。
【０１２９】
本発明の様々な実施形態では、本発明のＮＡＳＰを含有する組成物の投与量（例えば、経口投与）は、例示の実施形態では、１日当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、例えば１日当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約４００ｍｇ／ｋｇ、例えば１日当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、例えば１日当たり約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば１日当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、例えば１日当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ（１日当たり約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇを含む）の範囲で変化し得る。他の実施形態では、投与量（例えば、経口投与）は、１日４回約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ（ＱＩＤ）、例えば約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ（ＱＩＤ）、例えば約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ（ＱＩＤ）、例えば約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ（ＱＩＤ）、例えば約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．２ｍｇ／ｋｇ（ＱＩＤ）の範囲であり得る。他の実施形態では、投与量（例えば、経口投与）は、１日３回０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ（ＴＩＤ）、例えば０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ（ＴＩＤ）、例えば０．０１ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇ（ＴＩＤ）（０．０１ｍｇ／ｋｇ〜０．２ｍｇ／ｋｇ（ＴＩＤ）を含む）の範囲であり得る。さらに他の実施形態では、投与量（例えば、経口投与）は、１日２回０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ（ＢＩＤ）、例えば０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ（ＢＩＤ）、例えば０．０１ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇ（ＢＩＤ）（０．０１ｍｇ／ｋｇ〜０．２ｍｇ／ｋｇ（ＢＩＤ）を含む）の範囲であり得る。投与される化合物の量は、特定ＮＡＳＰの効能および濃度、所望の凝固促進作用またはその程度、およびＮＡＳＰの固有の吸収性および／または生物学的利用可能性に依存する。これらの因子のそれぞれは、本明細書に記載される方法または当該技術分野において認識される方法を使用して、当業者により容易に決定される。
【０１３０】
本明細書に記載の方法に関する様々な実施形態では、本明細書のＮＡＳＰは、１つ以上の透過亢進剤と組み合わせて経口投与される。適切な透過亢進剤および本発明により提供されるもの等のそれらの凝固促進剤との併用は、上記の米国仮特許出願第６１／５０９，５１４号に開示される。いくつかの実施形態では、透過亢進剤は、消化管上皮壁透過亢進剤である。様々な実施形態では、本発明は、凝固促進量のＮＡＳＰを含む組成物を、消化管上皮透過亢進剤と組み合わせて対象に経口投与することにより、血液凝固を亢進するための方法を提供する。様々な実施形態では、本発明は、凝固促進量のＮＡＳＰを含む組成物を、消化管上皮透過亢進剤および血液凝固因子と組み合わせて対象に経口投与することにより、血液凝固を亢進するための方法を提供する。
【０１３１】
別の態様では、本発明は、ＴＦＰＩ活性を阻害するのに十分な量の本発明のＮＡＳＰを用いてＴＦＰＩ活性を阻害する生体外方法を提供する。ある実施形態では、ＴＦＰＩ活性は、ＮＡＳＰを含む治療上有効な量の組成物を対象に投与することを含む方法によって対象において阻害される。ある実施形態では、本発明は、生体試料中のＴＦＰＩ活性を阻害する方法を提供し、この方法は、生体試料（例えば、血液または血漿）を、ＴＦＰＩ活性を阻害するのに十分な量のＮＡＳＰと合わせることを含む。
【０１３２】
本発明の方法において使用するための本発明の例示のＮＡＳＰは、凝固促進活性を有する硫酸化またはスルホン酸化多糖である。潜在的ＮＡＳＰの特性は、ＴＦＰＩ−ｄＰＴまたはａＰＴＴ凝固アッセイを使用して決定される。非抗凝固性の硫酸化またはスルホン酸化多糖は、非分別ヘパリンの３分の１以下、および好ましくは１０分の１未満の抗凝固活性（凝固時間の増加により測定される）を呈する。
【０１３３】
以下は、本発明を実行するための特定実施形態の実施例である。これらの実施例は、単なる例示目的で提供され、いかなる方法においても本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
【実施例】
【０１３４】
実施例１
硫酸化のために、異なる硫酸化試薬、ＳＯ３−ＮＭｅ３、ＳＯ３−ＮＥｔ３、およびＳＯ３−Ｐｙを使用した。これらの試薬をそれぞれ、マルトトリオース、α−シクロデキストリン、およびβ−シクロデキストリンに同一条件下で試し、最も有効な硫酸試薬を決定した。一般的な反応特徴は、全ての試薬において非常に類似しており、わずかな相違しかなかった。ＤＭＦ中のＳＯ３−ＮＥｔ３を、さらなる実験に使用するために選択した。オリゴ糖毎に異なる程度の硫酸化を達成するために、実験を室温および７０℃で行った。
【０１３５】
文献手順は、通常、糖成分の硫酸化試薬からの分離のためにセファデックスカラムを使用し、陽イオン交換のための別のセファデックスカラムまたは透析を使用する。所与のオリゴ糖のセファデックスクロマトグラフィーは失敗に終わったため、異なるプロトコルを確立した。新たなプロトコルは、単糖成分の沈殿およびクロロホルムによる硫酸化試薬の洗い出しを含む。トリエチルアンモニウムをナトリウムイオンに対して交換するために、混合液を水に再溶解して、Ｎａ＋形態の陽イオン交換樹脂（アンバーリスト１５）で処理した。
分析
【０１３６】
初期プロジェクトプランは、ＮＭＲおよび元素分析を使用する、得られた多糖混合液の特徴付けを想定した。これらの方法はいずれも本発明の例示の単糖に対して制限を有するため、異なる方法を確立した。ＨＩＬＩＣ（親水性相互作用液体クロマトグラフィー）と呼ばれるクロマトグラフィー法を使用して、異なる硫酸化程度の異なる生成物の特定、およびその相対量の定量化を含む、有意義な結果が得られた。
１）結果
【０１３７】
室温で、セロトリオース（１）は、７０％非硫酸化セロトリオース、３０％一硫酸化セロトリオース（４つの異性体）として産生され、７０℃で、セロトリオース（２）は、３０％非硫酸化セロトリオース、７０％一硫酸化セロトリオース（いくつかの異性体）として産生された。
【０１３８】
室温で、セロテトラオース（３）は、８０％非硫酸化セロテトラオース、２０％一硫酸化セロテトラオース（２つの異性体）として産生され、７０℃で、セロテトラオース（４）は、４０％非硫酸化セロテトラオース、３０％一硫酸化セロテトラオース（いくつかの異性体）、３０％分解生成物（Ｍ＝６９３）、微量の非硫酸化分解生成物として産生された。
【０１３９】
室温で、セロペンタオース（５）は、９０％非硫酸化セロペンタオース、１０％一硫酸化セロペンタオース（２つの異性体）として産生され、７０℃で、セロペンタオース（６）は、８０％非硫酸化セロペンタオース、１０％一硫酸化セロペンタオース（いくつかの異性体）、１０％分解生成物（Ｍ＝８５５）として産生された。
【０１４０】
室温で、マルトトリオース（７）は、５０％一硫酸化マルトトリオース、２５％二硫酸化マルトトリオース（２つの異性体）、２５％三硫酸化マルトトリオース（４つの異性体）として産生され、７０℃で、マルトトリオース（８）は、６０％一硫酸化マルトトリオース（いくつかの異性体）、４０％分解生成物（Ｍ＝６１１、断片化は硫酸化を示す）として産生された。
【０１４１】
室温で、マルトテトラオース（９）は、７０％非硫酸化マルトテトラオース、３０％一硫酸化マルトテトラオース（いくつかの異性体）として産生され、７０℃で、マルトテトラオース（１０）は、５０％非硫酸化マルトテトラオース、５０％一硫酸化マルトテトラオース（２つの異性体）として産生された。
【０１４２】
室温で、マルトペンタオース（１１）は、６０％非硫酸化マルトペンタオース、４０％一硫酸化マルトペンタオース（２つの異性体）として産生され、７０℃で、マルトペンタオース（１２）は、５０％非硫酸化マルトペンタオース、３０％一硫酸化マルトペンタオース（３つの異性体）、２０％分解生成物（Ｍ＝８５５）として産生された。
【０１４３】
室温で、ラフィノース（１３）は、７０％非硫酸化ラフィノース、３０％一硫酸化（いくつかの異性体）として産生され、７０℃で、ラフィノース（１４）は、２０％非硫酸化ラフィノース、３０％一硫酸化ラフィノース（４つの異性体）、微量の二硫酸化ラフィノース、５０％分解生成物（Ｍ＝１７１）として産生された。
【０１４４】
室温で、メレジトース（１５）は、４０％非硫酸化メレジトース、５０％一硫酸化メレジトース（４つの異性体）、１０％二硫酸化メレジトース（２つの異性体）として産生され、７０℃で、メレジトース（１６）は、２５％非硫酸化メレジトース、５０％一硫酸化メレジトース（４つの異性体）、２５％二硫酸化メレジトース（２つの異性体）、微量の三硫酸化メレジトースとして産生された。
【０１４５】
室温で、α−シクロデキストリン（１７）は、４５％非硫酸化α−シクロデキストリン、５０％一硫酸化α−シクロデキストリン、５％二硫酸化α−シクロデキストリン（２つの異性体）、微量の三硫酸化α−シクロデキストリンとして産生され、７０℃で、α−シクロデキストリン（１８）は、５０％非硫酸化α−シクロデキストリン、５０％一硫酸化α−シクロデキストリンとして産生された。
【０１４６】
室温で、β−シクロデキストリン（１９）は、７０％非硫酸化β−シクロデキストリン、３０％一硫酸化β−シクロデキストリン、微量の二硫酸化β−シクロデキストリン（２つの異性体）として産生され、７０℃で、β−シクロデキストリン（２０）は、６０％非硫酸化β−ＣＤ、４０％一硫酸化β−シクロデキストリンとして産生された。
【０１４７】
スタキオース（２０）は、約７３％硫酸化されたとして、約１０個の硫酸塩および１８．４％硫黄とともに産生された。
【０１４８】
キシロヘキサオース（２１）は、約５９％硫酸化多糖として、約８個の硫酸塩および１３．９％硫黄とともに産生された。
【０１４９】
γ−シクロデキストリン（２２）［１３〜１９％硫黄］。
実施例２
トロンビン生成アッセイ
【０１５０】
硫酸化多糖の凝固促進活性は、トロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）によって評価した。トロンビン生成に対する各硫酸化多糖の影響は、蛍光原基質Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣの低速分裂を測定し、続いてＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ（登録商標）リーダー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈｅｌｓｉｎｋｉ，Ｆｉｎｌａｎｄ；フィルター３９０ｎｍ励起および４６０ｎｍ放射）において、ＣＡＴを介して重複して測定した（Ｈｅｍｋｅｒ  ＨＣ．Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈａｅｍｏｓｔ  Ｔｈｒｏｍｂ（２００３）３３（４）：１５）。９６ウェルマイクロプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２ＨＢ、透明Ｕ底；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ）の各ウェルに、８０μＬの予熱した（３７℃）ヤギ抗ＦＶＩＩＩ抗体処理したヒト正常血漿プールを添加した。組織因子によるトロンビン生成を引き起こすために、ある量の組み換えヒト組織因子（ｒＴＦ）、ならびにホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、およびホスファチジルエタノールアミンからなるリン脂質小胞（最終濃度４μＭ）（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ  ＢＶ、Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を含む１０μＬのＰＰＰ試薬を添加した。硫酸化ポリマーの凝固促進活性を研究するために、１ｐＭの最終ＴＦ濃度を使用して、試験システムのＦＶＩＩＩおよびＴＦＰＩ感度を提供した。プレートを予熱した（３７℃）リーダーに置く直前に、１０μＬの試験または標準試料またはキャリブレータ化合物を添加した。トロンビン生成は、蛍光原基質およびＨｅｐｅｓ緩衝ＣａＣｌ２（１００ｍＭ）を含む２０μＬのＦｌｕＣａ試薬（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ  ＢＶ、Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を、各ウェルに分注することによって開始し、蛍光強度を３７℃で記録した。
【０１５１】
得られたトロンビン生成曲線のパラメータは、Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ  ＴＭソフトウェア（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ  ＢＶ、Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）およびトロンビンキャリブレータを使用して計算し、内部フィルターおよび基質消費作用について訂正した（Ｈｅｍｋｅｒ  ＨＣ，Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈａｅｍｏｓｔ  Ｔｈｒｏｍｂ（２００３）３３（４）：１５）。トロンビンキャリブレータを基準として用いて、試験ウェル中のトロンビンのモル濃度をソフトウェアによって計算した。各トロンビン生成曲線（ピークトロンビン、ｎＭ）のピークおよびピーク時間におけるトロンビン量は、硫酸化多糖濃度に対してプロットされ、これらの化合物の凝固促進プロファイルをもたらした。トロンビン生成アッセイ結果は、本明細書に添付される図面に示される。これらのプロットから、最大半量有効濃度（ＥＣ５０）値は、Ｓ字曲線の当てはめを使用して決定される。ＥＣ５０は、最大半量トロンビンピークに到達する濃度を表す。
【０１５２】
セロトリオースの結果は、図３Ａ、図３Ｂ、および図２１に示される。セロテトラオースの結果は、図４Ａ、図４Ｂ、および図２２に示される。セロペンタオースの結果は、図５Ａ、図５Ｂ、および図２３に示される。マルトトリオースの結果は、図６Ａ、図６Ｂ、および図１８に示される。マルトテトラオースの結果は、図７Ａ、図７Ｂ、および図１９に示される。マルトペンタオースの結果は、図８Ａ、図８Ｂ、図２０、図２５〜図２７、図３０、図３２、および図３４に示される。ラフィノースの結果は、図９Ａ、図９Ｂ、および図１７に示される。メレジトースの結果は、図１０Ａ、図１０Ｂ、図１５、および図２９に示される。α−シクロデキストリンの結果は、図１１Ａ、図１１Ｂ、図１３、図２８、および図２９に示される。β−シクロデキストリンの結果は、図１２Ａ、図１２Ｂ、図１４Ａ、図１４Ｂ、図２８、図２９、図３１、図３３、および図３５に示される。キシロヘキサオースの結果は、図２４に示される。スタキオースの結果は、図１６に示される。キシランの結果は、図４０、図４１、図５７、図５８、図５９、図６１、および図６２に示される。イコデキストリンおよび６−カルボキシイコデキストリンの結果は、図４２〜図４７、図５０、図６０、図６１、および図６３に示される。
【０１５３】
硫酸化多糖は、約０．０１μｇ／ｍＬで始まり、少なくとも２桁に渡る広範囲の濃度で凝結促進性であるが（例えば、硫酸化キシラン、硫酸化６−カルボキシイコデキストリン）、非硫酸化ポリマーは、本明細書に使用される条件下で本質的に不活性であり、負電荷硫酸基の重要性についての証拠を提供する。最適な凝結促進活性（１〜３０μｇ／ｍＬ）の濃度で、硫酸化多糖は、ヒト正常血漿プールのトロンビン生成を上回った。１００μｇ／ｍＬより高い濃度で、硫酸化多糖は、活性化部分トロンボプラスチン時間（図２９）を延長し、これはそれらの抗凝結活性を示す。
実施例３
ＴＦＰＩ−ｄＰＴおよびａＰＴＴ
ＴＦＰＩを用いる希釈プロトロンビン時間アッセイ
【０１５４】
添加されたＴＦＰＩ（ＴＦＰＩ−ｄＰＴ）を用いる希釈プロトロンビン時間アッセイを使用して、異なるＮＡＳＰのＴＦＰＩ阻害作用を評価した。プールされた正常ヒト血漿（Ｇｅｏｒｇｅ  Ｋｉｎｇ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｏｖｅｒｌａｎｄ  Ｐａｒｋ，ＫＳ）を、０．５μｇ／ｍＬ全長ＴＦＰＩ（ａａ１−２７６、ＳＫＨｅｐ１によって構成的に産生される）およびそれぞれのＮＡＳＰ（０〜５μｇ／ｍＬ）を用いて、１５分間室温でプレインキュベートした。０．５％ＢＳＡを含むＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水１：２００中に希釈されたＴＦ試薬ＴｒｉｎｉＣｌｏｔ  ＰＴ  Ｅｘｃｅｌ  Ｓ（Ｔｒｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｗｉｃｋｌｏｗ，Ｉｒｅｌａｎｄ）を、ＡＣＬ  Ｐｒｏ  Ｅｌｉｔｅ止血分析器（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）上の血漿試料に添加した。凝固は、２５ｍＭ  ＣａＣｌ２により開始させた。血漿：ＴＦ：ＣａＣｌ２の体積比は、１：１：１であった。
【０１５５】
データ分析のために、ＴＦＰＩ−ｄＰＴは、ログ濃度に対してプロットされる。最大半量有効濃度（ＥＣ５０）値は、Ｓ字曲線の当てはめを使用して決定される。
活性部分トロンボプラスチン時間アッセイ（ａＰＴＴ）
【０１５６】
ａＰＴＴアッセイを行って、ＮＡＳＰの抗凝固活性を研究した。つまり、５０μＬの解凍された正常ヒト血漿プール（Ｇｅｏｒｇｅ  Ｋｉｎｇ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｏｖｅｒｌａｎｄ  Ｐａｒｋ，ＫＳ）を、５μＬのＮＡＳＰ試料（０〜６０μｇ／ｍＬ最終血漿濃度）と混合した。ＮＡＳＰは、１％アルブミン（Ｂａｘｔｅｒ，Ａｕｓｔｒｉａ）を含む、イミダゾール緩衝液（３．４ｇ／Ｌイミダゾール；５．８５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中に希釈した。５０μＬのａＰＴＴ試薬（ＳＴＡ  ＡＰＴＴ，Ｒｏｃｈｅ）の添加後、試料を４分間３７℃でインキュベートした。凝固は、５０μＬの２５ｍＭ  ＣａＣｌ２溶液（Ｂａｘｔｅｒ，Ａｕｓｔｒｉａ）によって開始させ、最長５分間記録した。全てのピペット工程および凝固時間の測定は、ＡＣＬ  Ｐｒｏ  Ｅｌｉｔｅ（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）装置を用いて行った。試料は重複して流した。
【０１５７】
データ分析のために、凝固時間をＮＡＳＰ濃度に対してプロットする。凝固時間が正常な血漿対照よりも５０％増加する濃度は、線形曲線の当てはめを使用して決定される。
結果
【０１５８】
図３４は、正常なヒト血漿中のＴＦＰＩ−ｄＰＴ対ログ濃度の硫酸化マルトペンタオース（１５％  Ｓ）を示すプロットであり、硫酸化マルトペンタオースが血漿中のｒｅｃ．ＦＬ−ＴＦＰＩの作用を逆転させることを示す。この化合物のＥＣ５０は０．１５μｇ／ｍＬである。
【０１５９】
図３５は、正常なヒト血漿中のＴＦＰＩ−ｄＰＴ対ログ濃度の硫酸化βシクロデキストリン（２．９ｋＤａ、１８．９％  Ｓ）を示すプロットであり、硫酸化βシクロデキストリンが血漿中のｒｅｃ．ＦＬ−ＴＦＰＩの作用を逆転させることを示す。この化合物のＥＣ５０は０．０８μｇ／ｍＬである。
【０１６０】
本発明の代表的な化合物のＥＣ５０値は、表１および表２に記載される。表２は、これらの化合物のａＰＴＴアッセイから推定される５０％凝固時間についてのデータをさらに提供する。（図２９）ＥＣ５０値は、ＣＡＴアッセイによって決定された。
【表１−１】
2015509923.tif 000002
【表２−１】
2015509923.tif 000003
【０１６１】
本発明の例示のＮＡＳＰは、表３に示される供給元から取得した。
【表３−１】
2015509923.tif 000004
【０１６２】
硫酸化α−およびβ−シクロデキストリン、スタキオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、およびセロペンタオースは、実質的な凝固促進活性を示す。硫酸化マルトペンタオース、硫酸化β−シクロデキストリン、および他の硫酸化多糖は、それらの凝固促進ウィンドウ内で抗凝固性になる。それらのＥＣ５０は、Ｓｉｇｍａからの硫酸化マルトペンタオース（２．４μｇ／ｍＬ）および硫酸化β−シクロデキストリン（０．７μｇ／ｍＬ）に類似している。凝固促進活性は、シクロデキストリン、マルトトリオース／−テトラオース／−ペンタオース、およびセロトリオース／−テトラオース／−ペンタオースの化合物分子量とともに増加する。
実施例４
回転トロンボエラストメトリー（ＲＯＴＥＭ）−方法
【０１６３】
ＮＡＳＰ（０．４〜１１μｇ／ｍＬ）は、新鮮なクエン酸ヒト全血中で、全血血栓形成および硬度の連続粘弾性評価を可能にするアッセイである、回転トロンボエラストメトリー（ＲＯＴＥＭ）によって研究した。ヤギ（Ｂａｘｔｅｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｕｓｔｒｉａ）中で育てられた抗ヒトＦＶＩＩＩ血漿を用いて５０ＢＵ／ｍＬで血液をインキュベートし、血友病状態を刺激した。血栓は、４０μｇ／ｍＬ  ＣＴＩ（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｅｓｓｅｘ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ，ＶＴ，ＵＳＡ）の存在下、０．０４４ｐＭ組織因子（ＴＦ）（ＰＲＰ試薬、Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ  ＢＶ）を用いて引き起こした。次いで、３００μＬの予熱した（３７℃）ＦＶＩＩＩ阻害血液を、２０μＬの０．２Ｍ  ＣａＣｌ２溶液で再石灰化した。血栓形成は、３７℃でＲＯＴＥＭ装置（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ  Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して監視した。ｒＴＦの最終アッセイ濃度は４４ｆＭであった。ＲＯＴＥＭ記録を速やかに開始し、少なくとも１２０分間測定した。各血液試料を２つの独立した測定で分析した。
【０１６４】
凝固時間（ＣＴ）、血栓形成時間（ＣＦＴ）、および最大血栓硬度（ＭＣＦ）のトロンボエラストグラフィーパラメータを、製造者の指示に従って記録した。トロンボエラストグラムデータの第１の導関数をプロットして、時間（ｓ）に対する速度（ｍｍ／ｓ）のグラフを得る。このグラフから、最大速度（ｍａｘＶ）および最大速度に到達した時間（ｍａｘＶ−ｔ）も決定する。
結果
【０１６５】
図３０は、ヒト全血（０．０４４ｐＭ  ＴＦ）中の硫酸化マルトペントース（１５％  Ｓ）の回転トロンボエラストグラム（ＲＯＴＥＭ）であり、硫酸化マルトペントースが、ＦＶＩＩＩ阻害された血液中の凝固を正常に戻すことを示す。
【０１６６】
図３１は、ヒト全血（０．０４４ｐＭ  ＴＦ）中の硫酸化βシクロデキストリン（１８．９％  Ｓ）のＲＯＴＥＭであり、硫酸化βシクロデキストリンが、ＦＶＩＩＩ阻害された血液中の凝固を正常に戻すことを示す。
【０１６７】
硫酸化マルトペンタオースおよび硫酸化β−シクロデキストリンは、良好な凝固促進活性を示し、ＦＶＩＩＩ阻害された全血の凝固パラメータも回復する。硫酸化マルトペンタオースおよび硫酸化β−シクロデキストリンのいずれか、および大部分の他の多糖のいずれかによる接触経路の活性化はない。硫酸化多糖は、正常なヒト血漿中の外因性全長ＴＦＰＩの抗凝固作用を逆転させる。
実施例５
硫酸化および解重合キシランおよびイコデキストリンの調製（図３９）
５．１ａ  硫酸化キシランの合成
【０１６８】
キシランは、図６５に記載のとおり硫酸化した。硫酸化に続いて、異なる時間の長さの間、ポリマーを硫酸および過酸化水素で処理し、１，０００〜４，０００Ｄａの標的分子量範囲でポリマーを産生することを試みた。解重合工程後、溶液を３，０００  ＭＷＣＯ膜に通して透析した。残余分および濾液を回収し、ＮＭＲを行った。ＮＭＲ分析は、３Ｋ残余分のみが炭水化物に類似する材料を含むことを明らかにした。次に、３Ｋ残余分を１０Ｋ  ＭＷＣＯ膜に通して透析した。今回は、濾液のみを保持して特徴付けた（ＮＭＲおよびＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ）。濾液のＮＭＲは、硫酸化キシランと一致する。試料の分子量は、１１から３ｋＤＡに変動した。分子量は、解重合時間が増加するにつれて分子量が減少するという点で予想と一致した。
【０１６９】
硫酸化キシランは、国際公開第ＷＯ２００９／０８７５８１号に従い調製した。クロロスルホン酸（５０ｍＬ）を丸底フラスコに添加し、そこに４０℃で加熱して急速に攪拌しながらβ−ピコリン（２５０ｍＬ）を滴下添加した。ピコリンを完全に添加した後、激しく攪拌し、８５℃に加熱しながら２５ｇのキシランを混合液に添加した。反応液を８５℃で３．５時間保持し、その後反応液を室温に冷却し、次いで１２５ｍＬの水を添加した。次いで混合液をメタノール水酸化ナトリウム（５００ｍＬ  ＭｅＯＨ＋３４ｇ  ＮａＯＨ＋５８ｍＬ水）に注ぎ、その間に沈殿物が形成された。混合液を約２０分間攪拌した後、固体を濾過によって回収した。フィルターケーキをメタノールで数回洗浄した後、最終的にフィルター漏斗上で乾燥させた。半乾燥固体をタール乾燥パンに移し、高真空下４５℃で一晩乾燥させて１１１．２ｇを産生した。固体を２００ｍＬの水（測定ｐＨ４．７２）に溶解し、ｐＨを５Ｍ  ＮａＯＨで１２．３に調整した後、激しく攪拌しながら１Ｌのメタノールを添加した。混合液のｐＨを氷酢酸で６．８５に調整した後、追加で１０分間攪拌した。形成した固体を真空濾過によって回収し、タール乾燥皿に移し、高真空下で一晩５０℃で乾燥させて、１０３ｇの硫酸化キシランを産生した。この乾燥粉末は、接線限界濾過（ＰＡＬＬ，Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ，Ｏｍｅｇａ膜，１０００  ＭＷＣＯ）によってさらに精製した。透析した溶液を凍結乾燥させて、重量３９．９ｇの粉末を産生した。
解重合
【０１７０】
５ｇの硫酸化キシランを１５ｍＬの水に溶解し、９０℃に加熱した。平行して、１５０μＬの濃縮硫酸および３００μＬの３０％過酸化水素を、小バイアル中で一緒に混合し、８０℃に加熱した後、加熱した硫酸化キシランに添加して解重合工程を開始した。アリコート（３ｍＬ）を１５、３０、６０、および７５分で反応混合液から採取した。採取したアリコートを１０８０μＬの１Ｍ  ＮａＯＨに添加し、氷浴上で冷却した。このアリコートのｐＨを、１Ｍ  ＮａＯＨまたは１Ｍ  ＨＣｌの滴下添加によって７に調整した。次いで、アリコートを別個の限界濾過ユニットに移し（３０００分子量カットオフ、ＰＡＬＬ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｃｒｏｓｅｐ，ＯＭＥＧＡ膜）、５，０００ｒｐｍで３０分間５℃で遠心分離した。遠心分離に続いて、濾液を回収し、脱イオン化水を残余物に最大体積線まで添加した。次いで、上記で行ったように、試料を再度遠心分離した。このサイクルをさらに９回繰り返した。次いで、組み合わせた濾液および対応する残余物を凍結乾燥させた。得られた試料は、表１で以下に提示される。ＮＭＲは、表１に提示される試料のそれぞれに関して行った。結果を以下に記載する。次に、３Ｋ残余物試料を水に溶解し、１０Ｋ限界濾過デバイス（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ，Ｃａｔ  ＵＦＣ８０１００８）に載置し、３Ｋデバイスを用いて上記のとおり限界濾過した。次いで、回収した濾液を凍結乾燥させた。得られた試料を表２に記載する。残余物は凍結乾燥しなかった。
５．１ｂ  結果
【表１−２】
2015509923.tif 000005
分析
１Ｈ  ＮＭＲ
試料調製：
【０１７１】
約１００ｍｇの各試料を、約１ｍＬの酸化ジュウテリウムに溶解した。ＮＭＲは、４００ｍＨｚ装置を使用して室温で得た。
【０１７２】
プロトンＮＭＲを、３Ｋ濾液および残余物に関して行った。１Ｈ  ＮＭＲの３Ｋ残余物は、硫酸化キシランと一致した。スペクトルの変化は、解重合時間が増加するにつれて見られる。１Ｈ  ＮＭＲの３Ｋ濾液（図示せず）は、硫酸化キシランと一致せず、解重合条件が、３Ｋ  ＭＷＣＯ膜を通過することができる硫酸化キシランを産生するために十分でなかったことを示す。ＮＭＲスペクトルは、文献中に提示されるスペクトルと一致した（Ｃｈａｉｄｅｄｇｕｍｊｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．，３３７：９２５−９３３（２００２））。
ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ
【０１７３】
ＮＭＲ結果に基づいて、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳは、１０Ｋ濾液（Ｄ）に関してのみ行った。結果は、表２で以下に提示される。さらに、ペントサン多硫酸塩（ＰＰＳ、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手）を分析した。硫酸および過酸化水素で処理した試料（Ｄ）の分子量は、経時的に減少した（予想どおり）。
【表２−２】
2015509923.tif 000006
元素分析
【０１７４】
元素分析を、試料ＣおよびＤに関して行った（ＱＴＩ−Ｉｎｔｅｒｔｅｋ，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ，ＮＪ）。結果は、表３に提示される。ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳによって得られたＭＷに基づいて、２０モノマー糖単位（二十量体）および９モノマー糖単位（九量体）のオリゴマーが最も一致する。これに基づいて、元素結果（見出された）を、このようなオリゴマーについての予想元素結果と比較することができる。これらの結果は、表３に提示される。
【表３−２】
2015509923.tif 000007
【表４−１】
2015509923.tif 000008
【０１７５】
表４に提示される結果から、実験式を計算した。ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳによって得られた分子量（Ｍｗ）を使用して、実験式を計算した。試料ＣおよびＤの実験式は、表５に提示される。再度、二十量体（２０−ｍｅｒ）および九量体（９−ｍｅｒ）の理論的（予想された）実験式は、表６に提示される。
【表５】
2015509923.tif 000009
【表６】
2015509923.tif 000010
【０１７６】
硫酸含有量も導電率によって測定し、結果は、表７に提示される。
【表７】
2015509923.tif 000011
ａ  クロロスルホン酸／β−ピコリン法によって硫酸化
ｂ  クロロスルホン酸／β−ピコリン硫酸化法を硫酸化キシラン１．に関して繰り返した。
ｃ  クロロスルホン酸／β−ピコリン法によって硫酸化した後、ｗ／Ｈ２０２／Ｈ２ＳＯ４で解重合した。
ｄ  三酸化硫黄ピリジン錯体法によって硫酸化した。
トロンビン生成アッセイ
【０１７７】
本発明の代表的な硫酸化キシランのＣＡＴおよびトロンビン生成アッセイに由来するデータは、図４０、図４１、および図５６〜図６２、ならびに図６４に記載される。
５．２ａ  硫酸化６−カルボキシ−イコデキストリンの調製
【０１７８】
６−カルボキシ−イコデキストリンは、Ｍａｒｕｙａｍａの方法（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３０６（１９９８）３５−４３）をガイドとして使用し、硫酸化した（図５５）。強力陽イオン交換樹脂（５ｇ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＡＧ  ５０Ｗ−Ｘ８樹脂）での処理によって、６−カルボキシ−イコデキストリン（２．５７ｇ）を遊離酸に変換した。６−カルボキシ−イコデキストリン、遊離酸、水溶液（１００ｍＬ）を、ｐＨ８が得られるまでトリブチルアミン（ＴＢＡ）で処理した。次いで、この溶液を回転蒸発させて固体にした。残渣を約１００ｍＬの水に溶解した後、凍結乾燥させて３．６ｇの６−カルボキシ−イコデキストリン、ＴＢＡ塩を産生した。６−カルボキシ−イコデキストリン、ＴＢＡ塩は、以下のとおり硫酸化した。６−カルボキシ−イコデキストリン、ＴＢＡ塩（３．６ｇ）を１１２ｍＬのＤＭＦに溶解した。この溶液を４０℃油浴中に置き、その後２１．５ｇの三酸化硫黄ピリジン錯体を添加した。溶液を４０℃で１時間攪拌した。この時間中、ガム状の「ボール」が反応混合液中に形成された。このボールを反応混合液から除去し、１００ｍＬの水に溶解した。この溶液を、１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ９．９５に調整し、３ｘ５０ｍＬ分量のジクロロメタンで抽出した。水性層を分離し、回転蒸発させて約３０ｍＬの体積にした。濃縮物を強力陽イオン交換樹脂で処理した。得られた溶液はｐＨ１．７を測定し、１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ７に調整した。この溶液を透析カセット（３，５００  ＭＷＣＯ膜、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ）に移し、ＤＩ水に対して約１５時間室温で連続的に透析した。次いで、透析した材料を凍結乾燥させて、１．９ｇの硫酸化６−カルボキシ−イコデキストリンを産生した。
５．２ｂ  結果
【表１−３】
2015509923.tif 000012
ｅ  ６−カルボキシ−イコデキストリンを、トリブチルアミン塩に変換した後、
三酸化硫黄ピリジン錯体法によって硫酸化した。
【０１７９】
硫酸化６−カルボキシ−イコデキストリンを、それらが凝固を改変させる能力についてアッセイした。トロンビン生成アッセイからの結果は、図４２〜図４７に示される。
【表２−３】
2015509923.tif 000013
【表３−３】
2015509923.tif 000014
表４は、硫酸化６−カルボキシ−イコデキストリンのＲＯＴＥＭデータを提供する（実施例４、図４５）
【表４−２】
2015509923.tif 000015
【０１８０】
硫酸化キシランおよび硫酸化６−カルボキシ−イコデキストリンは、それぞれＥＣ５０の０．１μｇ／ｍＬおよび０．０７μｇ／ｍＬを有する非常に低濃度でのＣＡＴアッセイにおいて良好な凝固促進活性を示す。６−カルボキシ−イコデキストリンは、ＲＯＴＥＭ測定によって決定されるように、ＦＶＩＩＩ阻害された全血中の凝固も回復した。硫酸化６−カルボキシ−イコデキストリンは、非常に良好なａＰＴＴ／ＥＣ５０比を有する。Ｃ６−ＯＨの全体カルボキシル化は、分子のより高い安定性に起因し得る、良好な凝固促進活性をもたらす。低分子量の分画は、低減した活性を示す。しかしながら、分画９３Ａ（＜３Ｋ  ６−カルボキシ−イコデキストリン）は、依然として、０．４μｇ／ｍＬのＥＣ５０で約２倍の正常血漿レベルに達する。硫酸化６−カルボキシ−イコデキストリンによる接触経路のわずかな活性化は、３３μｇ／ｍＬを超える濃度で観測される。硫酸化６−カルボキシ−イコデキストリンは、正常なヒト血漿中の外因性全長ＴＦＰＩの抗凝固作用を逆転させる。
実施例６
Ｃａｃｏ−２細胞／インビボ研究
目的：
【０１８１】
ＮＡＳＰの経口での生物学的利用可能性を改善するための１つの戦略は、キトサン、ブロメライン、デオキシコリン（ＤＯＣ）、またはカプリン酸ナトリウム等の密着結合を調整する透過亢進剤の適用である。この研究の目標は、透過亢進剤の不在下および存在下でのＣａｃｏ−２−細胞モデルにおいて、選択されたＮＡＳＰの生体外吸収を決定することであった。
方法：
【０１８２】
半透過性フィルター上で培養されたヒト結腸腺癌（Ｃａｃｏ−２）細胞は、同時に分化して融合性単層を形成した。この細胞層は、構造的にも機能的にも小腸上皮に類似している。Ｃａｃｏ−２細胞は、１０％ウシ胎仔血清および１％Ｌ−グルタミンで補充したＰＥＴトランスウェル−２４プレート内のＲＰＭＩ細胞成長培地中で培養した。インキュベータ中３７℃、９５％空気、５％ＣＯ２雰囲気下で２１日後、融合性単層を得た。透過亢進剤の有無に関わらず、２００μＬ成長培地中に溶解した４つの選択したＮＡＳＰを、頂端区画内の細胞の上に１ｍｇ／ｍＬの濃度で添加し、３７℃でインキュベートした。この研究に使用したＮＡＳＰおよび透過亢進剤は、表１に列挙される。培地試料（１００μＬ）は、２、４、６、および８時間目に基底外側から回収し（８５０μＬ体積）、８時間以前に頂端側から回収した。各試料回収時に、除去したアリコートを新鮮な成長培地と置き換えた。細胞層が実験中に無傷のままであることを保証するために、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を監視して記録した。各実験では、三重ウェルを試験し、実験を１〜３回行った。
【０１８３】
頂端から基底外側区画に８時間の期間をかけて移されたＮＡＳＰの量は、全ての時点で半定量活性に基づくトロンビン生成アッセイ（ＣＡＴ）、および８時間の時点のみの基質特異的液体クロマトグラフィー質量分析によって決定した。
結果：
【０１８４】
４つの合成ＮＡＳＰの４または５種の亢進剤と組み合わせた吸収を、Ｃａｃｏ−２細胞モデルにおいて研究した。細胞の基底外側のＮＡＳＰの量は、時間とともに増加した（図６９、７０、７１、７２）。理論的に可能な最大濃度（μｇ／ｍＬ）は、試料採取によって引き起こされる希釈因子に起因して、各時点でわずかに異なっていた。８時間での可能な最大値は１４０μｇ／ｍＬ  ＮＡＳＰであった。８時間の時点での吸収は、吸収％でも表現された。透過亢進剤の不在下で、細胞を通る全てのＮＡＳＰの輸送が観測されなかったか、または脆弱な輸送が観測されたに過ぎないが、亢進剤の存在下では、吸収が著しく増加した。最高吸収は、ＤＯＣおよびキトサン＋ブロメラインの複合を用いて達成された。観測された作用は、６−カルボキシ−イコデキストリンの場合よりも低いＭＷ  ＮＡＳＰマルトペンタオースおよびβ−シクロデキストリンを用いる場合により優れていた。
実施例７
目的：
【０１８５】
体外全血ＴＥＧ  ＦＶＩＩＩ阻害されたモルモットモデルにおいて、凝固パラメータを改善することにおける非分画硫酸化６−カルボキシ−イコデキストリンの有効性を研究すること。
方法：
【０１８６】
雄のダンキンハートリーモルモットに、ヤギ抗ヒトＦＶＩＩＩ阻害剤血漿を４２  ＢＵ／ｋｇ（１．９ｍＬ／ｋｇ）の用量で試料採取の４５分前に静脈内注入した。４０分後、ＮＡＳＰをこれらの動物に、０．０５、０．１５、０．４５、または１．３５ｍｇ／ｋｇ（Ｎ＝５／群）で静脈内投与した。３００Ｕ／ｋｇ  ＦＥＩＢＡ（Ｂａｘｔｅｒ，ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，Ａｕｓｔｒｉａ）は正の対照として機能し、生理食塩水は媒体対照として機能した。注入直後に、大静脈を穿孔し、全血ＴＥＧ分析のためにクエン酸の存在下で（比率１：９）血液を採取した。測定は、トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ）止血分析器５０００（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ，ＵＳＡ）を使用し、３７℃で行った。全ての血液試料は、ＴＥＧキュベット中２０μＬの０．２Ｍ  ＣａＣｌ２溶液を３７℃で予熱し、３４０μＬの血液を添加し、混合した後速やかにＴＥＧ記録を開始することによって調製した。測定は少なくとも１２０分間継続した。凝固時間（Ｒ時間）、血栓促進の迅速性（角度）、および最大血栓硬度（ＭＡ）のＴＥＧパラメータを記録した。主要エンドポイントＲ時間をプロットし、異なる用量群の中央値を互いに比較した。
結果：
【０１８７】
硫酸化６−カルボキシ−イコデキストリンを用いるＣＡＴアッセイからの生体外結果に基づいて、０．０５、０．１５、０．４５、または１．３５ｍｇ／ｋｇ  ＮＡＳＰの静脈内投与後のＦＶＩＩＩ阻害されたモルモット（ｎ＝５）における凝固促進作用を研究するための投与パターンを設計した。動物は、処置なしに２時間後、凝固の兆候が見られなかったことと比較して、０．１５および０．４５ｍｇ／ｋｇ  ＮＡＳＰを投与したときに、わずかに低減した中央Ｒ時間（凝固時間）１１０分を示した（図７３）。
実施例８
目的：
【０１８８】
経口投与後のＣＤラットにおいて、異なる分子量の２つの硫酸化６−カルボキシ−イコデキストリンの薬物動態特性を研究すること。この研究は、Ｃａｃｏ−２−細胞実験に基づいて選択された２つの透過亢進剤が、生体内の経口での生物学的利用可能性を改善するかという問題にも対処する。
方法：
【０１８９】
一晩の絶食後、雄のＣＤラットに、硫酸化６−カルボキシ−イコデキストリン（Ｓ−６−Ｃｌ）の２つの液体調製物を、５０ｍｇ／ｋｇおよび５ｍＬ／ｋｇの用量で経口経管投与した。これらの調製物は、非分画であるか（平均ＭＷ２４ｋＤ）、またはフィルター法によって分画された（平均ＭＷ１４ｋＤ）。物質は、生理食塩水中で亢進剤なしに調製するか、または０．８重量％のＤＯＣもしくは３重量％のキトサン＋０．５ｍｇ／ｍＬブロメラインを用いて調製した。ＮＡＳＰを投与した各群は、６匹のラットからなる。各製剤について、３つの追加のラットを媒体対照とした。血液試料は、投与前および投与の１５、３０分、１、５、および７時間後に、クエン酸の存在下で（比率１：９）で回収した。乏血小板血漿は、３０００ｒｐｍで１０分間の２つの遠心分離工程によって調製した。
【０１９０】
血漿試料中のＮＡＳＰは、硫酸化多糖に特異的に結合する染料ＨｅｐａｒｉｎＲｅｄを使用する蛍光アッセイによって検出された。黒ハーフエリア９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ）中で実験を行った。Ｓ−６−Ｃl標準曲線（０．１８５〜２．５μｇ／ｍＬ）の場合、１０μＬのラット血漿を５μＬのＳ−６−Ｃｌでスパイクさせ、４０μＬのヒトプール血漿と混合して、個別の動物のマトリックス作用を最小限に抑えた。次いで、５μＬのＨｅｐａｒｉｎＲｅｄ染料を添加し、暗所において室温で５分間インキュベートした。投与した動物の血漿試料をそれに応じて処理したが、５μＬ  Ｓ−６−Ｃｌを緩衝液と置き換えた。蛍光信号は、Ｔｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅ２（商標）マイクロプレート蛍光リーダー（Ｅｘ／Ｅｍ  ５８０／６２０ｎｍ）を用いて検出され、Ｓ−６−Ｃｌは、Ｓ−６−Ｃｌ標準曲線に基づいて定量化した。このアッセイのラット血漿中のＳ−６−Ｃｌの検出限界は、０．１８５μｇ／ｍＬであった。
結果：
【０１９１】
生理食塩水中の５０ｍｇ／ｋｇの非分画Ｓ−６−Ｃｌを経口投与した６匹のラットのうち２匹は、０．２〜０．６μｇ／ｍＬの血漿レベルを示したが、６匹のラットのうち３匹は、分画Ｓ−６−Ｃｌを投与されたとき、最大３μｇ／ｍＬのＮＡＳＰの血漿レベルを有した。最高レベルは、投与後６０分で到達した。両方のＮＡＳＰの場合、ＤＯＣの存在下で吸収はさらに改善されず、両方のＮＡＳＰに対して同様の血漿レベルに到達した。キトサン＋ブロメラインの複合を亢進剤として使用したところ、Ｓ−６−Ｃｌの場合と同様の結果をもたらした。キトサン＋ブロメラインを用いた場合、全ての時点における血漿レベルは０．３μｇ／ｍＬ未満であり、これは生理食塩水群よりも低い。この低減した取り込みは、キトサン＋ブロメライン製剤の高い粘度に起因し得る。つまり、Ｓ−６−Ｃｌの経口での生物学的利用可能性は、個別のラット間で異なっていたが、それを経口投与されたラットの血漿中でＮＡＳＰを検出することは可能であった。
実施例９
目的：
【０１９２】
静脈内投与後のＣＤラットにおいて、異なるＭＷの３つの硫酸化６−カルボキシ−イコデキストリンの薬物動態特性を研究すること。
方法：
【０１９３】
雄のＣＤラットに、硫酸化６−カルボキシ−イコデキストリン（Ｓ−６−Ｃｌ）の３つの異なる調製物を、５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与した。これらの調製物は、非分画であるか（平均ＭＷ６３ｋＤ）、またはフィルター法によって分画された（それぞれ平均ＭＷ１２ｋＤおよび１４ｋＤのロットＡおよびＢ）。物質を生理食塩水中で調製し、５ｍＬ／ｋｇで注入した。各群は３匹の動物からなる。血液試料は、投与前および投与の５、３０分、１、３、６、および１０時間後に、クエン酸の存在下で（比率１：９）で回収した。乏血小板血漿は、３０００ｒｐｍで２つの遠心分離工程によって調製した。Ｓ−６−Ｃｌの血漿試料を液体クロマトグラフィー質量分析法、物質特異的方法によって分析した。
結果：
【０１９４】
５ｍｇ／ｋｇのＳ−６−Ｃｌの静脈内投与の５分後の生体内回復は、２８〜４４μｇ／ｍＬであり、これは予想された血漿濃度の半分未満であった（約１００μｇ／ｍＬ）。ロットＡ（１２ｋＤ）の場合、回復は最低であった。２つの分画Ｓ−６−Ｃｌの場合、血漿濃度は投与の６時間後に検出限界以下であった。早い時点の血漿濃度に基づいて、半減期は３０〜４５分であると推測される。
【０１９５】
本明細書で説明される実施例および実施形態は、例示のみを目的としており、これらを考慮して、種々の修正および変更が当業者に提案され、本明細書および添付の請求項の範囲の趣旨および範囲に含まれることが理解されよう。本明細書で引用される全ての出版物、特許、および特許出願は、あらゆる目的で参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３７】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図５０】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５６】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６３】
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【図６５】
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【図６７Ａ】
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【図６７Ｂ】
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【図６７Ｃ】
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【図６７Ｄ】
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【図６７Ｅ】
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【図６７Ｆ】
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【図６７Ｇ】
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【図６８】
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【図７３】
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【図３６】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５１】
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【図６４】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【国際調査報告】
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