(57)【要約】  本開示は、日中条件下における光独立栄養種の組み換え細菌細胞の増殖に広く関する。特に、本開示は糖トランスポータータンパク質の発現によって日中条件下において増加した増殖を有する光独立栄養種の単離された細菌細胞およびその使用方法に関する。
2015530117.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光独立栄養種の単離された細菌細胞であって、
ガラクトーストランスポータータンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを含んでおり、前記ガラクトーストランスポータータンパク質の発現は、前記細菌細胞内へのグルコースの輸送を生じさせて、前記組み換えポリヌクレオチドを有していない対応する光独立栄養細菌細胞と比較して、暗条件下または日中条件下におけるグルコース上での前記細菌細胞の増殖を増加させる、光独立栄養種の単離された細菌細胞。
【請求項２】
前記組み換えポリヌクレオチドは、細菌のgalPトランスポータータンパク質、真核生物のgalPトランスポータータンパク質、真菌のgalPトランスポータータンパク質、哺乳類のgalPトランスポータータンパク質、細菌のメジャーファシリテイタースーパーファミリー（Major Facilitator Superfamily）（MFS）トランスポータータンパク質、真核生物のMFSトランスポータータンパク質、真菌のMFSトランスポータータンパク質、哺乳類のMFSトランスポータータンパク質、細菌のATPバインディングカセットスーパーファミリー（ATP Binding Cassette Superfamily）（ABC）トランスポータータンパク質、真核生物のABCトランスポータータンパク質、真菌のABCトランスポータータンパク質、哺乳類のABCトランスポータータンパク質、細菌のホスホトランスフェラーゼシステム（Phosphotransferase System）（PTS）トランスポータータンパク質、真核生物のPTSトランスポータータンパク質、哺乳類のPTSトランスポータータンパク質、およびこれらのホモログからなる群から選択されるガラクトーストランスポータータンパク質をコードしている、請求項１に記載の単離された細菌細胞。
【請求項３】
前記組み換えポリヌクレオチドは、E. coliのgalPトランスポータータンパク質をコードしている、請求項１に記載の単離された細菌細胞。
【請求項４】
光独立栄養種の単離された細菌細胞であって、
二糖の糖トランスポータータンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを含んでおり、前記二糖の糖トランスポータータンパク質の発現は、前記細菌細胞内への二糖の糖の輸送を生じさせて、前記組み換えポリヌクレオチドを有していない対応する光独立栄養細菌細胞と比較して、暗条件下または日中条件下における前記二糖の糖上での前記細菌細胞の増殖を増加させる、光独立栄養種の単離された細菌細胞。
【請求項５】
前記組み換えポリヌクレオチドは、スクローストランスポータータンパク質、ラクトーストランスポータータンパク質、ラクツローストランスポータータンパク質、マルトーストランスポータータンパク質、トレハローストランスポータータンパク質、セロビオーストランスポータータンパク質、およびこれらのホモログからなる群から選択される二糖の糖トランスポータータンパク質をコードしている、請求項４に記載の細菌細胞。
【請求項６】
前記組み換えポリヌクレオチドは、スクローストランスポータータンパク質をコードしている、請求項４に記載の細菌細胞。
【請求項７】
前記スクローストランスポータータンパク質は、E. coliのCscBスクローストランスポータータンパク質、B. subtilisのSacPトランスポータータンパク質、Brassica napusのSut1トランスポータータンパク質、Juglans regiaのSut1トランスポータータンパク質、Arabidopsis thalianaのSuc6トランスポータータンパク質、Arabidopsis thalianaのSUT4トランスポータータンパク質、Drosophila melanogasterのSlc45-1トランスポータータンパク質およびDickeya dadantiiのScrAトランスポータータンパク質からなる群から選択される、請求項６に記載の細菌細胞。
【請求項８】
前記スクローストランスポータータンパク質は、E. coliのCscBスクローストランスポータータンパク質である、請求項６に記載の細菌細胞。
【請求項９】
前記細菌細胞は、フルクトキナーゼタンパク質をコードする、少なくとも１つの追加の組み換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる、請求項４に記載の細菌細胞。
【請求項１０】
前記フルクトキナーゼタンパク質は、E. coliのCscKフルクトキナーゼタンパク質、Lycopersicon esculentumのFrk1フルクトキナーゼタンパク質、Lycopersicon esculentumのFrk2フルクトキナーゼタンパク質、H. sapiensのKHKフルクトキナーゼタンパク質、A. thalianaのFLN-1フルクトキナーゼタンパク質、A. thalianaのFLN-2フルクトキナーゼタンパク質、Yersinia pestis biovar Microtus str. 91001のNagC1フルクトキナーゼタンパク質、Yersinia pseudotuberculosisのYajFフルクトキナーゼタンパク質およびNatronomonas pharaonisのSukフルクトキナーゼタンパク質からなる群から選択される、請求項９に記載の細菌細胞。
【請求項１１】
前記フルクトキナーゼタンパク質は、E. coliのCscKフルクトキナーゼタンパク質である、請求項９に記載の細菌細胞。
【請求項１２】
光独立栄養種の単離された細菌細胞であって、
キシローストランスポータータンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを含んでおり、前記キシローストランスポータータンパク質の発現は、前記細菌細胞内へのキシロースの輸送を生じさせて、前記組み換えポリヌクレオチドを有していない対応する光独立栄養細菌細胞と比較して、暗条件下または日中条件下におけるキシロース上での前記細菌細胞の増殖を増加させる、光独立栄養種の単離された細菌細胞。
【請求項１３】
前記組み換えポリヌクレオチドは、E. coliのXylEキシローストランスポータータンパク質、E. coli xylF/xylG/xylHのABCキシローストランスポータータンパク質、Candida intermediaのGxf1トランスポータータンパク質、Pichia stipitisのSut1トランスポータータンパク質およびA. thalianaのAt5g59250トランスポータータンパク質からなる群から選択されるキシローストランスポータータンパク質をコードしている、請求項１２に記載の単離された細菌細胞。
【請求項１４】
前記組み換えポリヌクレオチドはE. coliのXylEキシローストランスポータータンパク質をコードしている、請求項１２に記載の単離された細菌細胞。
【請求項１５】
前記細菌細胞は、キシロースイソメラーゼをコードする、少なくとも１つの追加の組み換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる、請求項１２に記載の単離された細菌細胞。
【請求項１６】
前記細菌細胞は、キシルロキナーゼをコードする、少なくとも１つの追加の組み換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる、請求項１２に記載の単離された細菌細胞。
【請求項１７】
前記細菌細胞は、キシロースイソメラーゼをコードしている第２の組み換えポリヌクレオチド、およびキシルロキナーゼをコードしている第３の組み換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる、請求項１２に記載の単離された細菌細胞。
【請求項１８】
前記組み換えポリヌクレオチドは、キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼをさらにコードしている、請求項１２に記載の単離された細菌細胞。
【請求項１９】
前記キシロースイソメラーゼは、E. coliのXylAキシロースイソメラーゼ、A. thalianaのAT5G57655キシロースイソメラーゼ、Aspergillus nigerのXyrAキシロースイソメラーゼおよびHypocrea jecorinaのXyl1キシロースイソメラーゼからなる群から選択される、請求項１５に記載の単離された細菌細胞。
【請求項２０】
前記キシロースイソメラーゼは、E. coliのXylAキシロースイソメラーゼである、請求項１９に記載の単離された細菌細胞。
【請求項２１】
前記キシルロキナーゼは、E. coliのXylBキシルロキナーゼ、Arabidopsis thalianaのXK-1キシルロキナーゼ、Arabidopsis thalianaのXK-2キシルロキナーゼ、E. coliのLynKキシルロキナーゼ、Streptomyces coelicolorのSCO1170キシルロキナーゼ、Pseudomonas aeruginosaのMtlYキシルロキナーゼ、Yersinia pseudotuberculosisのSgbKキシルロキナーゼおよびE. coliのAtlKキシルロキナーゼからなる群から選択される、請求項１６に記載の単離された細菌細胞。
【請求項２２】
前記キシルロキナーゼは、E. coliのXylBキシルロキナーゼである、請求項２１に記載の単離された細菌細胞。
【請求項２３】
前記組み換えポリヌクレオチドおよび／または少なくとも１つの追加の組み換えポリヌクレオチドは、前記細菌細胞のゲノム中に安定的に組み込まれている、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の単離された細菌細胞。
【請求項２４】
前記細菌細胞は、糖トランスポータータンパク質をコードする少なくとも１つの追加の組み換えポリヌクレオチドさらに含んでおり、前記糖トランスポータータンパク質の発現は前記細菌細胞内への糖の輸送を生じさせる、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の単離された細菌細胞。
【請求項２５】
前記糖は、ヘキソース、ガラクトース、グルコース、フルクトース、マンノース、二糖、スクロース、ラクトース、ラクツロース、マルトース、トレハロース、セロビオース、ペントース、キシロース、アラビノース、リボース、リブロースおよびキシルロースからなる群から選択される、請求項２４に記載の単離された細菌細胞。
【請求項２６】
前記細菌細胞は、少なくとも１種類の汎用化学物質を生産するために前記細胞にとって必要なタンパク質をさらに含んでいる、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の単離された細菌細胞。
【請求項２７】
前記細菌細胞は、少なくとも１種類の汎用化学物質を生産する、請求項２６に記載の単離された細菌細胞。
【請求項２８】
前記細菌細胞は、日中条件下で、少なくとも１種類の汎用化学物質を持続的に生産する、請求項２７に記載の単離された細菌細胞。
【請求項２９】
前記汎用化学物質は、ポリマー、２，３−ブタンジオ−ル、１，３−プロパンジオ−ル、１，４−ブタンジオ−ル、ポリヒドロキシアルカノエ−ト、ポリヒドロキシブチレ−ト、イソプレン、ラクテート、スクシネート、グルタメート、シトレート、マレート、３−ヒドロキシプロピオネ−ト、アスコルベート、ソルビト−ル、アミノ酸、ヒドロキシブチレ−ト、カロテノイド、リコペン、β−カロテン、医薬品中間体、ポリケチド、スタチン、ω−３ 脂肪酸、イソプレノイド、ステロイド、抗生物質、エリスロマイシン、ソプレノイド、ステロイド、エリスロマイシンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２６に記載の単離された細菌細胞。
【請求項３０】
前記汎用化学物質はアルコ−ル、エタノ−ル、プロパノ−ル、イソプロパノ−ル、アセトン、ブタノ−ル、イソブタノ−ル、２−メチル−１−ブタノ−ル、３−メチル−１−ブタノ−ル、フェニルエタノ−ル、脂肪族アルコ−ル、イソペンテノ−ル、アルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、２−メチル−１−ブタナ−ル、３−メチル−１−ブタナ−ル、フェニルアセトアルデヒド、脂肪族アルデヒド、炭化水素、アルカン、アルケン、イソプレノイド、脂肪酸、ワックスエステル、エチルエステル、水素およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるバイオ燃料である、請求項２６に記載の単離された細菌細胞。
【請求項３１】
前記細菌細胞はシアノバクテリア、Acaryochloris、Anabaena、Arthrospira、Cyanothece、Gleobacter、Microcystis、Nostoc、Prochlorococcus、Synechococcus、Synechococcus elongatus、S. elongatus PCC7942、Synechocystis、Thermosynechococcus、Trichodesmium、紅色硫黄細菌、Chromatiaceae、Ectothiorhodospiraceae、紅色非硫黄細菌、Acetobacteraceae、Bradyrhizobiaceae、Comamonadaceae、Hyphomicrobiaceae、Rhodobacteraceae、Rhodobiaceae、Rhodocyclaceae、Rhodospirillaceae、緑色非硫黄細菌およびChloroflexaceaeからなる群から選択される、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の単離された細菌細胞。
【請求項３２】
細菌細胞の増殖を増加させる方法であって、
糖トランスポータータンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを含んでいる光独立栄養種の細菌細胞を準備すること；および
前記組み換えポリヌクレオチドが発現される条件下で、糖基質を用いて前記細菌細胞を培養することを包含しており、
前記組み換えポリヌクレオチドの発現は、前記細菌細胞内への前記糖基質の輸送を生じさせて、前記組み換えポリヌクレオチドを有していない対応する光独立栄養細菌細胞の細胞増殖と比較して、暗条件下または日中条件下における糖上での前記細菌細胞の増殖を増加させる、方法。
【請求項３３】
暗条件下または日中条件下で細菌細胞の密度を増加させる方法であって、
糖トランスポータータンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを含む、光独立栄養種の細菌細胞を準備すること；および
前記組み換えポリヌクレオチドが発現される条件下で、糖基質を用いて前記細菌細胞を培養することを包含しており、
前記組み換えポリヌクレオチドの発現は、前記細菌細胞内への前記糖基質の輸送を生じさせて、前記組み換えポリヌクレオチドを有していない対応する光独立栄養細菌細胞と比較して、暗条件下または日中条件下における細胞密度を増加させる、方法。
【請求項３４】
暗条件下または日中条件下で細菌のバイオマス生産を増加させる方法であって、
糖トランスポータータンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを含む、光独立栄養種の細菌細胞を準備すること；および
前記組み換えポリヌクレオチドが発現される条件下で、糖基質を用いて前記細菌細胞を培養することを包含しており
前記組み換えポリヌクレオチドの発現は、前記細菌細胞内への前記糖基質の輸送を生じさせて、前記組み換えポリヌクレオチドを有していない対応する光独立栄養細菌細胞と比較して、暗条件下または日中条件下におけるバイオマス生産を増加させる、方法。
【請求項３５】
少なくとも１種類の汎用化学物質を生産する方法であって、
糖トランスポータータンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを含む、光独立栄養種の細菌細胞を準備すること；
前記組み換えポリヌクレオチドが発現される条件下、および少なくとも１種類の汎用化学物質が生産される条件下で、糖基質を用いて前記細菌細胞を培養すること；および
少なくとも１種類の前記汎用化学物質を回収することを包含しており、
前記組み換えポリヌクレオチドの発現は前記細菌細胞内への前記糖基質の輸送を生じさせる、方法。
【請求項３６】
前記組み換えポリヌクレオチドは、ヘキソーストランスポータータンパク質、ガラクトーストランスポータータンパク質、グルコーストランスポータータンパク質、フルクトーストランスポータータンパク質、マンノーストランスポータータンパク質、メジャーファシリテイタースーパーファミリー（MFS）トランスポータータンパク質、ATPバインディングカセットスーパーファミリー（ABC）トランスポータータンパク質、ホスホトランスフェラーゼシステム（PTS）トランスポータータンパク質、二糖の糖トランスポータータンパク質、スクローストランスポータータンパク質、ラクトーストランスポータータンパク質、ラクツローストランスポータータンパク質、マルトーストランスポータータンパク質、トレハローストランスポータータンパク質、セロビオーストランスポータータンパク質、ペントーストランスポータータンパク質、キシローストランスポータータンパク質、アラビノーストランスポータータンパク質、リボーストランスポータータンパク質、リブローストランスポータータンパク質、およびキシルローストランスポータータンパク質からなる群から選択される糖トランスポータータンパク質をコードしている、請求項３２〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記細菌細胞は、ヘキソース、ガラクトース、グルコース、フルクトース、マンノース、二糖、スクロース、ラクトース、ラクツロース、マルトース、トレハロース、セロビオース、ペントース、キシロース、アラビノース、リボース、リブロースおよびキシルロースからなる群から選択される糖を用いて培養される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記組み換えポリヌクレオチドは、ガラクトーストランスポータータンパク質をコードしている、請求項３２〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ガラクトーストランスポータータンパク質は、細菌のgalPトランスポータータンパク質、真核生物のgalPトランスポータータンパク質、真菌のgalPトランスポータータンパク質、哺乳類のgalPトランスポータータンパク質、細菌のMFSトランスポータータンパク質、真核生物のMFSトランスポータータンパク質、真菌のMFSトランスポータータンパク質、哺乳類のMFSトランスポータータンパク質、細菌のPTSトランスポータータンパク質、真核生物のPTSトランスポータータンパク質、真菌のPTSトランスポータータンパク質および哺乳類のPTSトランスポータータンパク質からなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ガラクトーストランスポータータンパク質は、E. coliのgalPトランスポータータンパク質である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記ガラクトーストランスポータータンパク質は、前記細菌細胞内へグルコースを輸送する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記細菌細胞は、グルコースを用いて培養される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記組み換えポリヌクレオチドは、二糖の糖トランスポータータンパク質をコードしている、請求項３２〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記二糖の糖トランスポータータンパク質は、スクローストランスポータータンパク質、ラクトーストランスポータータンパク質、ラクツローストランスポータータンパク質、マルトーストランスポータータンパク質、トレハローストランスポータータンパク質、セロビオーストランスポータータンパク質およびこれらのホモログからなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記二糖の糖トランスポータータンパク質は、スクローストランスポータータンパク質である。請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記スクローストランスポータータンパク質は、E. coliのCscBスクローストランスポータータンパク質、B. subtilisのSacPトランスポータータンパク質、Brassica napusのSut1トランスポータータンパク質、Juglans regiaのSut1トランスポータータンパク質、Arabidopsis thalianaのSuc6トランスポータータンパク質、Arabidopsis thalianaのSUT4トランスポータータンパク質、Drosophila melanogasterのSlc45-1トランスポータータンパク質およびDickeya dadantiiのScrAトランスポータータンパク質からなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記スクローストランスポータータンパク質は、E. coliのCscBスクローストランスポータータンパク質である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記細菌細胞は、フルクトキナーゼタンパク質をコードしている、少なくとも１つの追加の組み換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４９】
前記フルクトキナーゼタンパク質は、E. coliのCscKフルクトキナーゼタンパク質、Lycopersicon esculentumのFrk1フルクトキナーゼタンパク質、Lycopersicon esculentum Frk2のフルクトキナーゼタンパク質、H. sapiensのKHKフルクトキナーゼタンパク質、A. thalianaのFLN-1フルクトキナーゼタンパク質、A. thalianaのFLN-2フルクトキナーゼタンパク質、Yersinia pestis biovar Microtus str. 91001のNagC1フルクトキナーゼタンパク質、Yersinia pseudotuberculosisのYajFフルクトキナーゼタンパク質およびNatronomonas pharaonisのSukフルクトキナーゼタンパク質からなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記フルクトキナーゼタンパク質は、E. coliのCscKフルクトキナーゼタンパク質である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記細菌細胞は、前記二糖を対応する単糖類に変換するタンパク質をさらに含んでいる、請求項４３に記載の方法。
【請求項５２】
前記細菌細胞は、二糖の糖、スクロース、ラクトース、ラクツロース、マルトース、トレハロースおよびセロビオースからなる群から選択される糖を用いて培養される、請求項４３に記載の方法。
【請求項５３】
前記組み換えポリヌクレオチドは、キシローストラスポータータンパク質をコードしている、請求項３２〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記組み換えポリヌクレオチドは、E. coliのXylEキシローストランスポータータンパク質、E. coliのxylF/xylG/xylHABCキシローストランスポータータンパク質、Candida intermediaのGxf1トランスポータータンパク質、Pichia stipitisのSut1トランスポータータンパク質およびA. thalianaのAt5g59250トランスポータータンパク質からなる群から選択されるキシローストランスポータータンパク質をコードしている、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記キシローストランスポータータンパク質はE. coliのXylEキシローストランスポータータンパク質である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記細菌細胞はキシロースイソメラーゼをコードする、少なくとも１つの追加の組み換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記細菌細胞は、キシルロキナーゼをコードする少なくとも１つの追加の組み換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる、請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
前記細菌細胞は、キシロースイソメラーゼをコードしている第２の組み換えポリヌクレオチドおよびキシルロキナーゼをコードしている第３の組み換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる、請求項５３に記載の方法。
【請求項５９】
前記組み換えポリヌクレオチドは、キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼをさらにコードしている、請求項５３に記載の方法。
【請求項６０】
前記キシロースイソメラーゼは、E. coliのXylAキシロースイソメラーゼ、A. thalianaのAT5G57655キシロースイソメラーゼ、Aspergillus nigerのXyrAキシロースイソメラーゼおよびHypocrea jecorinaのXyl1キシロースイソメラーゼからなる群から選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項６１】
前記キシロースイソメラーゼはE. coliのXylAキシロースイソメラーゼである、請求項５６に記載の方法。
【請求項６２】
前記キシルロキナーゼは、E. coliのXylBキシルロキナーゼ、Arabidopsis thalianaのXK-1キシルロキナーゼ、Arabidopsis thalianaのXK-2キシルロキナーゼ、E. coliのLynKキシルロキナーゼ、Streptomyces coelicolorのSCO1170キシルロキナーゼ、Pseudomonas aeruginosaのMtlYキシルロキナーゼ、Yersinia pseudotuberculosisのSgbKキシルロキナーゼおよびE. coliのAtlKキシルロキナーゼからなる群から選択される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６３】
前記キシルロキナーゼは、E.coliのXylBキシルロキナーゼである、請求項５７に記載の方法。
【請求項６４】
前記組み換えポリヌクレオチドおよび／または少なくとも１つの追加の組み換えポリヌクレオチドは、前記細菌細胞のゲノム中に安定的に組み込まれている、請求項３２〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記細菌細胞は、第２の糖トランスポータータンパク質をコードしている、少なくとも１つの追加の組み換えポリヌクレオチドをさらに含んでおり、前記第２の糖トランスポータータンパク質の発現は前記細菌細胞内への第２の糖基質の輸送を生じさせる、請求項３２〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記細菌細胞は、少なくとも１種類の汎用化学物質を持続的に生産する、請求項３２〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記少なくとも１種類の汎用化学物質は、１日に２４時間持続的に生産される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記汎用化学物質は、ポリマー、２，３−ブタンジオール、１，３−プロパンジオール、１，４−ブタンジオール、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリヒドロキシブチレート、イソプレン、ラクテート、スクシナート、グルタメート、シトレート、マレート、３−ヒドロキシプロピオネ−ト、アスコルベート、ソルビト−ル、アミノ酸、ヒドロキシブチレ−ト、カロテノイド、リコペン、β−カロテン、医薬品中間体、ポリケチド、スタチン、ω−３ 脂肪酸、イソプレノイド、ステロイド、抗生物質、エリスロマイシン、ソプレノイド、ステロイド、エリスロマイシン、ソプレノイド、ステロイド、エリスロマイシン、バイオ燃料およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記汎用化学物質は、アルコール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、アセトン、ブタノール、イソブタノール、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、フェニルエタノール、脂肪族アルコール、イソペンテノール、アルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、２−メチル−１−ブタナール、３−メチル−１−ブタナール、フェニルアセトアルデヒド、脂肪族アルデヒド、炭化水素、アルカン、アルケン、イソプレノイド、脂肪酸、ワックスエステル、エチルエステル、水素およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるバイオ燃料である、請求項６６に記載の方法。
【請求項７０】
前記細菌細胞は、シアノバクテリア、Acaryochloris、Anabaena、Arthrospira、Cyanothece、Gleobacter、Microcystis、Nostoc、Prochlorococcus、Synechococcus、Synechococcus elongatus、S. elongatus PCC7942、Synechocystis、Thermosynechococcus、Trichodesmium、紅色硫黄細菌、Chromatiaceae、Ectothiorhodospiraceae、紅色非硫黄細菌、Acetobacteraceae、Bradyrhizobiaceae、Comamonadaceae、Hyphomicrobiaceae、Rhodobacteraceae、Rhodobiaceae、Rhodocyclaceae、Rhodospirillaceae、緑色非硫黄細菌、およびChloroflexaceaeからなる群から選択される、請求項３２〜３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
〔関連出願への相互参照〕
本出願は、あらゆる目的のためにその全文が参照によって組み入まれている、２０１２年９月２８日に出願された米国特許仮出願第６１／７０７，８４８号の優先権を主張する  本開示は、日中条件下における、光独立栄養種の組み換え細菌細胞の増殖に広く関する。特に、本開示は、糖トランスポータータンパク質の発現によって日中条件下における向上した増殖を有する光独立栄養種の単離された細菌細胞およびその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アメリカ合衆国エネルギー情報局（ＥＩＡ、２００７）によると、２００４年の世界のエネルギー関連のＣＯ２排出は２６，９２２，０００，０００メートルトンであり、１９９０年から２６．７％上昇した。その結果として、大気中のＣＯ２レベルは過去１５０年間にわたって約２５％増加した。それゆえ、ＣＯ２排出を削減するための新しい技術を開発することがますます重要になっている。
【０００３】
また、世界は高価なガスおよび石油、およびこれらの貴重な資源の制限された供給に直面している。バイオ燃料は代替エネルギー源として認識されている。様々なバイオ燃料を生産する方法の改良のための努力がなされているが、さらなる開発が必要である。
【０００４】
上記の問題の１つの解決策は、バイオ燃料の生産のため植物のバイオマスを利用することである。しかしながら、植物の生産性は、ＣＯ２の拡散および隔離、生育する季節、および年間を通じての太陽エネルギーの収集が限定されることから、太陽エネルギーのバイオマスおよびバイオ燃料への変換の算出高が低い。より高いエネルギー変換は、微細藻類やシアノバクテリア等の光合成微生物によって達成される。シアノバクテリアS. elongatusは、グルコーストランスポーターを組み込むことによって、光エネルギーを用いて、外来性グルコース上で増殖するように改変可能であることが以前に報告されている。しかしながら、これらの形質転換された株は不安定であり、化学光合成の化学的阻害剤の添加を必要であった。このことはグルコースの利用および光合成は両立しかったことを意味する（Zhang et al., FEMS Microbiology Letters 161 (1998) 285-292）。S. elongatusシアノバクテリアの他の問題は、増殖およびバイオ燃料の生産が完全に光エネルギーに依存しており、このことにより光の非存在下では増殖することまたはバイオ燃料を生産することができないことである。したがって、S. elongatusの毎日のバイオマスおよびバイオ燃料の生産は、１日当たり９〜１６時間の範囲の日照時間に限られ、それゆえバイオ燃料の生産性の低下および生産コストの増大を招く。
【０００５】
したがって、糖基質を利用して日中条件下で増殖して１日に２４時間バイオ燃料を持続的に生産することができるシアノバクテリアなどの従来の光独立栄養種の細菌のニーズがある。
【発明の概要】
【０００６】
上記のニーズを満たすため、本開示は、日中条件下において糖基質上での増殖の増加した光独立栄養種の組み換え細菌細胞、日中条件下において、糖基質上での組み換え細菌細胞の増殖を増加させる方法、および汎用化学物質を生産するための組み換え細菌細胞の使用方法を提供する。加えて、本開示は、少なくとも一部分において、組み換え糖トランスポータータンパク質（例えばグルコーストランスポータータンパク質、スクローストランスポータータンパク質、またはキシローストランスポータータンパク質）を発現するように改変された光独立栄養種の細菌細胞は、日中条件下で、および特に日／夜の概日周期のうちの暗期または夜間において、外来性の糖基質により繁茂することができるという驚異的な発見に基づく。好都合なことに、前記組み換え糖トランスポータータンパク質の発現は、組み換え細菌細胞が、日中条件下においてバイオマスの生産のために外来性糖基質の利用することを可能にする。加えて、前記組み換え細菌細胞は糖基質の利用を開始するための調整期間を必要としない。好都合なことに、外来性の糖基質の利用は光合成と両立および相補するため、本開示の組み換え細菌細胞は光合成の化学阻害剤を必要としない。さらに、本開示の組み換え細菌細胞は、持続的な増殖のために２４時間の光周期（すなわち連続的な光の供給）を必要としないため、細菌細胞を増殖させるための生産コストは低減される。このようにして、本開示の組み換え細菌細胞はバイオ燃料等の汎用化学物質を1日に２４時間持続的に生産することができ、このことは、組み換え細菌細胞の生産性を向上させ、汎用化学物質の生産コストを低減する。
【０００７】
従って、本開示のある１つの観点は、ガラクトーストランスポータータンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを含んでおり、当該ガラクトーストランスポータータンパク質の発現は、細菌細胞内へのグルコースの輸送を生じさせて、当該組み換えポリヌクレオチドを有していない対応する光独立栄養細菌細胞と比較して、暗条件下または日中条件下におけるグルコース上での当該細菌細胞の増殖を増加させる、光独立栄養種の単離された細菌細胞に関する。特定の実施形態において、当該組み換えポリヌクレオチドは、細菌のgalPトランスポータータンパク質、真核生物のgalPトランスポータータンパク質、真菌のgalPトランスポータータンパク質、哺乳類のgalPトランスポータータンパク質、細菌のメジャーファシリテイタースーパーファミリー（Major Facilitator Superfamily）（Major Facilitator Superfamily)（MFS）トランスポータータンパク質、真核生物のMFSトランスポータータンパク質、真菌のMFSトランスポータータンパク質、哺乳類のMFSトランスポータータンパク質、細菌のATPバインディングカセットスーパーファミリー(ATP Binding Cassette Superfamily)（ABC）トランスポータータンパク質、真核生物のABCトランスポータータンパク質、真菌のABCトランスポータータンパク質、哺乳類のABCトランスポータータンパク質、細菌のホスホトランスフェラーゼシステム(Phosphotransferase System)（PTS）トランスポータータンパク質、真核生物のPTSトランスポータータンパク質、哺乳類のPTSトランスポータータンパク質、およびこれらのホモログから選択されるガラクトーストランスポータータンパク質をコードしている。特定の実施形態において、当該組み換えヌクレオチドは、E. coliのgalPトランスポータータンパク質をコードしている。
【０００８】
本開示の別の局面は、二糖の糖トランスポータータンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを含んでおり、当該二糖の糖トランスポータータンパク質の発現は、当該細菌細胞内への二糖の輸送を生じさせて、当該組み換えポリヌクレオチドを有していない対応する光独立栄養細菌細胞と比較して、暗条件下または日中条件下における当該二糖上での当該細菌細胞の増殖を増加させる、光独立栄養種の単離された細菌細胞に関する。特定の施形態において、組み換えポリヌクレオチドは、スクローストランスポータータンパク質、ラクトーストランスポータータンパク質、ラクツローストランスポータータンパク質、マルトーストランスポータータンパク質、トレハローストランスポータータンパク質、セロビオーストランスポータータンパク質およびこれらのホモログから選択される二糖の糖トランスポータータンパク質をコードしている。特定の実施形態において、組み換えポリヌクレオチドは、スクローストランスポータータンパク質をコードしている。特定の実施形態において、当該スクローストランスポータータンパク質は、E. coliのCscBスクローストランスポータータンパク質、B. subtilisのSacPトランスポータータンパク質、Brassica napusのSut1トランスポータータンパク質、Juglans regiaのSut1トランスポータータンパク質、Arabidopsis thalianaのSuc6トランスポータータンパク質、Arabidopsis thalianaのSUT4トランスポータータンパク質、Drosophila melanogasterのSlc45-1トランスポータータンパク質、およびDickeya dadantiiのScrAトランスポータータンパク質から選択される。特定の実施形態において、スクローストランスポータータンパク質は、E. coliのCscBスクローストランスポータータンパク質である。上述の任意の実施形態と組み合わせることが可能な特定の実施形態において、細菌細胞は、フルクトキナーゼタンパク質をコードする、少なくとも１つの追加の組み換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる。特定の実施形態において、当該フルクトキナーゼタンパク質は、E. coliのCscKフルクトキナーゼタンパク質、Lycopersicon esculentumのFrk1フルクトキナーゼタンパク質、Lycopersicon esculentumのFrk2フルクトキナーゼタンパク質、H. sapiensのKHKフルクトキナーゼタンパク質、A. thalianaのFLN-1フルクトキナーゼタンパク質、A. thalianaのFLN-2フルクトキナーゼタンパク質、Yersinia pestis biovar Microtus str. 91001のNagC1フルクトキナーゼタンパク質、Yersinia pseudotuberculosisのYajFフルクトキナーゼタンパク質およびNatronomonas pharaonisのSukフルクトキナーゼタンパク質から選択される。特定の実施形態において、当該フルクトキナーゼタンパク質は、E. coliのCscKフルクトキナーゼタンパク質である。
【０００９】
本開示の別の局面は、キシローストランスポータータンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを含んでおり、当該キシローストランスポータータンパク質の発現は、細菌細胞内へのキシロースの輸送を生じさせて、当該組み換えポリヌクレオチドを有していない対応する光独立栄養細菌細胞と比較して、暗条件下または日中条件下におけるキシロース上での当該細菌細胞の増殖を増加させる、光独立栄養種の単離された細菌細胞に関連する。特定の実施形態において、当該組み換えポリヌクレオチドは、E. coliのXylEキシローストランスポータータンパク質、E. coliのxylF/xylG/xylHABCキシローストランスポータータンパク質、Candida intermediaのGxf1トランスポータータンパク質、Pichia stipitisのSut1トランスポータータンパク質およびA. thalianaのAt5g59250トランスポータータンパク質から選択されるキシローストランスポータータンパク質をコードしている。特定の実施形態において、組み換えポリヌクレオチドはE. coliのXylEキシローストランスポータータンパク質をコードしている。上の任意の実施形態と組み合わせることが可能な特定の実施形態において、細菌細胞は、キシロースイソメラーゼをコードする、少なくとも１つの追加の組み換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる。上述の任意の実施形態と組み合わせることが可能な特定の実施形態において、細菌細胞は、キシルロキナーゼをコードする、少なくとも１つの追加の組み換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる。上述の任意の実施形態と組み合わせることが可能な特定の実施形態において、細菌細胞はさらに、キシロースイソメラーゼをコードしている第２の組み換えポリヌクレオチド、およびキシルロキナーゼをコードしている第３の組み換えポリヌクレオチドを含んでいる。上述の任意の実施形態と組み合わせることが可能な特定の実施形態において、組み換えポリヌクレオチドは、キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼをさらにコードしている。上述の任意の実施形態と組み合わせることが可能な特定の実施形態において、キシロースイソメラーゼは、E. coliのXylAキシロースイソメラーゼ、A. thalianaのAT5G57655キシロースイソメラーゼ、Aspergillus nigerのXyrAキシロースイソメラーゼおよびHypocrea jecorinaのXyl1キシロースイソメラーゼから選択される。上述の任意の実施形態と組み合わせることが可能なあ特定の実施形態において、当該キシロースイソメラーゼは、E. coliのXylAキシロースイソメラーゼである。上述の任意の実施形態と組み合わせることが可能なある実施形態において、キシルロキナーゼは、E. coliのXylBキシルロキナーゼ、Arabidopsis thalianaのXK-1キシルロキナーゼ、Arabidopsis thalianaのXK-2キシルロキナーゼ、E. coliのLynKキシルロキナーゼ、Streptomyces coelicolorのSCO1170キシルロキナーゼ、Pseudomonas aeruginosaのMtlYキシルロキナーゼ、Yersinia pseudotuberculosisのSgbKキシルロキナーゼおよびE. coliのAtlKキシルロキナーゼから選択される。上述の任意の実施形態と組み合わせることが可能な特定の実施形態において、キシルロキナーゼは、E. coliのXylBキシルロキナーゼである。
【００１０】
上述の任意の実施形態と組み合わせることが可能な特定の実施形態において、組み換えポリヌクレオチドおよび／または少なくとも１つの追加の組み換えポリヌクレオチドは、安定的に細菌細胞のゲノムに組み込まれる。上述の任意の実施形態と組み合わせることが可能な特定の実施形態において、当該細菌細胞は、糖トランスポータータンパク質をコードする少なくとも１つの追加の組み換えポリヌクレオチドさらに含んでおり、当該糖トランスポータータンパク質の発現は当該細菌細胞内への糖の輸送を生じさせる。上述の任意の実施形態と組み合わせることが可能な特定の実施形態において、当該糖は、ヘキソース、ガラクトース、グルコース、フルクトース、マンノース、二糖、スクロース、ラクトース、ラクツロース、マルトース、トレハロース、セロビオース、ペントース、キシロース、アラビノース、リボース、リブロース、およびキシルロースから選択される。上述の任意の実施形態と組み合わせることが可能な特定の実施。形態において、細菌細胞は、少なくとも１種類の汎用化学物質を生産するために細菌細胞にとって必要な当該タンパク質をさらに含んでいる。上述の任意の実施形態と組み合わせることが可能な特定の実施形態において、当該細菌細胞は、少なくとも１種類の汎用化学物質を生産する。上述の任意の実施形態と組み合わせることが可能な特定の実施形態において、細菌細胞は、少なくとも１種類の汎用化学物質を生産する。上述の任意の実施形態と組み合わせることが可能な特定の実施形態において、汎用化学物質は、ポリマー、２，３−ブタンジオ−ル、１，３−プロパンジオ−ル、１，４−ブタンジオ−ル、ポリヒドロキシアルカノエ−ト、ポリヒドロキシブチレ−ト、イソプレン、ラクテート、スクシネート、グルタメート、シトレート、マレート、３−ヒドロキシプロピオネ−ト、アスコルベート、ソルビト−ル、アミノ酸、ヒドロキシブチレ−ト、カロテノイド、リコペン、β−カロテン、医薬品中間体、ポリケチド、スタチン、ω−３ 脂肪酸、イソプレノイド、ステロイド、抗生物質、エリスロマイシン、ソプレノイド、ステロイド、エリスロマイシンおよびこれらの組み合わせから選択される。上述の任意の実施形態と組み合わせることが可能な特定の実施形態において、当該汎用化学物質はアルコ−ル、エタノ−ル、プロパノ−ル、イソプロパノ−ル、アセトン、ブタノ−ル、イソブタノ−ル、２−メチル−１−ブタノ−ル、３−メチル−１−ブタノ−ル、フェニルエタノ−ル、脂肪族アルコ−ル、イソペンテノ−ル、アルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、２−メチル−１−ブタナ−ル、３−メチル−１−ブタナ−ル、フェニルアセトアルデヒド、脂肪族アルデヒド、炭化水素、アルカン、アルケン、イソプレノイド、脂肪酸、ワックスエステル、エチルエステル、水素、およびこれらの組み合わせから選択されるバイオ燃料である。上述の任意の実施形態と組み合わせることが可能な特定の実施形態において、細菌細胞は、シアノバクテリア、Acaryochloris、Anabaena、Arthrospira、Cyanothece、Gleobacter、Microcystis、Nostoc、Prochlorococcus、Synechococcus、Synechococcus elongatus、S. elongatus PCC7942、Synechocystis、Thermosynechococcus、Trichodesmium、紅色硫黄細菌、Chromatiaceae、Ectothiorhodospiraceae、紅色非硫黄細菌、Acetobacteraceae、Bradyrhizobiaceae、Comamonadaceae、Hyphomicrobiaceae、Rhodobacteraceae、Rhodobiaceae、Rhodocyclaceae、Rhodospirillaceae、緑色非硫黄細菌、およびChloroflexaceaeから選択される。
【００１１】
本開示の別の局面としては、細菌細胞の増殖を増加させる方法であって、糖トランスポータータンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを含んでいる光独立栄養種の細菌細胞を準備すること；および当該組み換えポリヌクレオチドが発現される条件下で、糖基質を用いて当該細菌細胞を培養することであって、当該組み換えポリヌクレオチドの発現は、当該細菌細胞内への当該糖基質の輸送を生じさせて、当該組み換えポリヌクレオチドを有していない対応する光独立栄養細菌細胞の細胞増殖と比較して、暗条件下または日中条件下における当該糖基質上での細菌細胞の増殖を増加させることによる方法が挙げられる。
【００１２】
本開示の別の局面としては、暗条件下または日中条件下で細菌細胞の密度を増加させる方法であって、糖トランスポータータンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを含む、光独立栄養種の細菌細胞を準備すること；および当該組み換えポリヌクレオチドが発現される条件下で、糖基質を用いて当該細菌細胞を培養することであって、当該組み換えポリヌクレオチドの発現は、細菌細胞内への当該糖基質の輸送を生じさせて、当該組み換えポリヌクレオチドを有していない対応する光独立栄養細菌細胞と比較して、暗条件下または日中条件下における細胞密度を増加させることによる方法が挙げられる。
【００１３】
本開示の別の局面としては、暗条件下または日中条件下で細菌のバイオマス生産を増加させる方法であって、糖トランスポータータンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを含む、光独立栄養種の細菌細胞を準備すること；および当該組み換えポリヌクレオチドが発現される条件下で、糖基質を用いて当該細菌細胞を培養することであって当該組み換えポリヌクレオチドの発現は、細菌細胞内への当該糖基質の輸送を生じさせて、当該組み換えポリヌクレオチドを有していない対応する光独立栄養細菌細胞と比較して、暗条件下または日中条件下におけるバイオマス生産を増加させることによる方法が挙げられる。
【００１４】
本開示の別の局面としては、少なくとも１種類の汎用化学物質を生産する方法であって、糖トランスポータータンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを含む、光独立栄養種の細菌細胞を準備すること；当該組み換えポリヌクレオチドが発現される条件下、および少なくとも１種類の汎用化学物質が生産される条件下で、糖基質を用いて当該細菌細胞を培養すること；および少なくとも１種類の当該汎用化学物質を回収することであって、当該組み換えポリヌクレオチドの発現は当該細菌細胞内への当該糖基質の輸送を生じさせることによる方法が挙げられる。
【００１５】
上述の任意の実施形態と組み合わせることが可能な特定の実施形態において、当該組み換えポリヌクレオチドは、ヘキソースの糖トランスポータータンパク質、ガラクトーストランスポータータンパク質、グルコーストランスポータータンパク質、フルクトーストランスポータータンパク質、マンノーストランスポータータンパク質、メジャーファシリテイタースーパーファミリー（MFS）トランスポータータンパク質、ATPバインディングカセットスーパーファミリー（ABC）トランスポータータンパク質、ホスホトランスフェラーゼシステム（PTS）トランスポータータンパク質、二糖の糖トランスポータータンパク質、スクローストランスポータータンパク質、ラクトーストランスポータータンパク質、ラクツローストランスポータータンパク質、マルトーストランスポータータンパク質、トレハローストランスポータータンパク質、セロビオーストランスポータータンパク質、ペントーストランスポータータンパク質、キシローストランスポータータンパク質、アラビノーストランスポータータンパク質、リボーストランスポータータンパク質、リブローストランスポータータンパク質、およびキシルローストランスポータータンパク質から選択される糖トランスポータータンパク質をコードする。特定の実施形態において、細菌細胞は、ヘキソース、ガラクトース、グルコース、フルクトース、マンノース、二糖、スクロース、ラクトース、ラクツロース、マルトース、トレハロース、セロビオース、ペントース、キシロース、アラビノース、リボース、リブロース、およびキシルロースから選択される糖を用いて培養される。上述の任意の実施形態と組み合わせることが可能な特定の実施形態において、組み換えポリヌクレオチドは、ガラクトーストランスポータータンパク質をコードしている。特定の実施形態において、ガラクトーストランスポータータンパク質は、細菌のgalPトランスポータータンパク質、真核生物のgalPトランスポータータンパク質、真菌のgalPトランスポータータンパク質、哺乳類のgalPトランスポータータンパク質、細菌のMFSトランスポータータンパク質、真核生物のMFSトランスポータータンパク質、真菌のMFSトランスポータータンパク質、哺乳類のMFSトランスポータータンパク質、細菌のPTSトランスポータータンパク質、真核生物のPTSトランスポータータンパク質、真菌のPTSトランスポータータンパク質、および哺乳類のPTSトランスポータータンパク質から選択される。特定の実施形態において、当該ガラクトーストランスポータータンパク質は、E. coliのgalPトランスポータータンパク質である。上述の任意の実施形態と組み合わせることが可能な特定の実施形態において、ガラクトーストランスポータータンパク質は、当該細菌細胞内へグルコースを輸送する。上述の任意の実施形態と組み合わせることが可能な特定の実施形態において、細菌細胞は、グルコースを用いて培養される。上述の任意の実施形態と組み合わせることが可能な特定の実施形態において、当該組み換えポリヌクレオチドは、二糖の糖トランスポータータンパク質をコードしている。特定の実施形態において、当該二糖の糖トランスポータータンパク質は、スクローストランスポータータンパク質、ラクトーストランスポータータンパク質、ラクツローストランスポータータンパク質、マルトーストランスポータータンパク質、トレハローストランスポータータンパク質、セロビオーストランスポータータンパク質およびこれらのホモログから選択される。特定の実施形態において、当該二糖の糖トランスポータータンパク質は、スクローストランスポータータンパク質である。特定の実施形態において、当該スクローストランスポータータンパク質は、E. coliのCscBスクローストランスポータータンパク質、B. subtilisのSacPトランスポータータンパク質、Brassica napusのSut1トランスポータータンパク質、Juglans regiaのSut1トランスポータータンパク質、Arabidopsis thalianaのSuc6トランスポータータンパク質、Arabidopsis thalianaのSUT4トランスポータータンパク質、Drosophila melanogasterのSlc45-1トランスポータータンパク質およびDickeya dadantiiのScrAトランスポータータンパク質から選択される。特定の実施形態において、スクローストランスポータータンパク質は、E. coliのCscBスクローストランスポータータンパク質である。上述の任意の実施形態と組み合わせることが可能な特定の実施形態において、当該細菌細胞は、フルクトキナーゼタンパク質をコードしている、少なくとも１つの追加の組み換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる。特定の実施形態において、当該フルクトキナーゼタンパク質は、E. coliのCscKフルクトキナーゼタンパク質、Lycopersicon esculentumのFrk1フルクトキナーゼタンパク質、Lycopersicon esculentum Frk2のフルクトキナーゼタンパク質、H. sapiensのKHKフルクトキナーゼタンパク質、A. thalianaのFLN-1フルクトキナーゼタンパク質、A. thalianaのFLN-2フルクトキナーゼタンパク質、Yersinia pestis biovar Microtus str. 91001のNagC1フルクトキナーゼタンパク質、Yersinia pseudotuberculosisのYajFフルクトキナーゼタンパク質、およびNatronomonas pharaonisのSukフルクトキナーゼタンパク質から選択される。特定の実施形態において、当該フルクトキナーゼタンパク質は、E. coliのCscKフルクトキナーゼタンパク質である。上述の任意の実施形態と組み合わせることが可能な特定の実施形態において、当該細菌細胞は当該二糖を対応する単糖類に変換するタンパク質をさらに含んでいる。上述の任意の実施形態と組み合わせることが可能な特定の実施形態において、当該細菌細胞は、二糖の糖、スクロース、ラクトース、ラクツロース、マルトース、トレハロースおよびセロビオースから選択される糖を用いて培養される。上述の任意の実施形態と組み合わせることが可能な特定の実施形態において、当該組み換えポリヌクレオチドは、キシローストラスポータータンパク質をコードしている。特定の実施形態において、当該キシローストランスポータータンパク質は、E. coliのXylEキシローストランスポータータンパク質、E. coli xylF/xylG/xylHのABCキシローストランスポータータンパク質、Candida intermediaのGxf1トランスポータータンパク質、Pichia stipitisのSut1トランスポータータンパク質およびA. thalianaのAt5g59250トランスポータータンパク質から選択される。特定の実施形態において、当該キシローストランスポータータンパク質は、E. coliのXylEキシローストランスポータータンパク質である。上述の任意の実施形態と組み合わせることが可能な特定の実施形態において、細菌細胞はキシロースイソメラーゼをコードす���、少なくとも１つの追加の組み換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる。上述の任意の実施形態と組み合わせることが可能な特定の実施形態において、当該細菌細胞は、キシルロキナーゼをコードする、少なくとも１つの追加の組み換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる。上述の任意の実施形態と組み合わせることが可能な特定の実施形態において、当該細菌細胞はキシロースイソメラーゼをコードしている第２の組み換えポリヌクレオチド、およびキシルロキナーゼをコードしている第３の組み換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる。上述の任意の実施形態と組み合わせることが可能な特定の実施形態において、組み換えポリヌクレオチドは、キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼをさらにコードしている。上述の任意の実施形態と組み合わせることが可能な特定の実施形態において、当キシロースイソメラーゼは、E. coliのXylAキシロースイソメラーゼ、A. thalianaのAT5G57655キシロースイソメラーゼ、Aspergillus nigerのXyrAキシロースイソメラーゼおよびHypocrea jecorinaのXyl1キシロースイソメラーゼから選択される。上述の任意の実施形態と組み合わせることが可能な特定の実施形態において、キシロースイソメラーゼはE. coliのXylAキシロースイソメラーゼである。上述の任意の実施形態と組み合わせることが可能な特定の実施形態において、キシルロキナーゼは、E. coliのXylBキシルロキナーゼ、Arabidopsis thalianaのXK-1キシルロキナーゼ、Arabidopsis thalianaのXK-2キシルロキナーゼ、E. coliのLynKキシルロキナーゼ、Streptomyces coelicolorのSCO1170キシルロキナーゼ、Pseudomonas aeruginosaのMtlYキシルロキナーゼ、Yersinia pseudotuberculosisのSgbKキシルロキナーゼ、およびE. coliのAtlKキシルロキナーゼから選択される。上述の任意の実施形態と組み合わせることが可能な特定の実施形態において、当該キシルロキナーゼは、E.coliのXylBキシルロキナーゼである。上述の任意の実施形態と組み合わせることが可能な特定の実施形態において、当該組み換えポリヌクレオチドおよび／または少なくとも１つの追加の組み換えポリヌクレオチドは、安定的に細菌細胞のゲノムに組み込まれる。上述の任意の実施形態と組み合わせることが可能な特定の実施形態において、細菌細胞は第２の糖トランスポータータンパク質をコードしている、少なくとも１つの追加の組み換えポリヌクレオチドをさらに含んでおり、当該第２の糖トランスポータータンパク質の発現は当該細菌細胞内への第２の糖基質の輸送を生じさせる。上述の任意の実施形態と組み合わせることが可能な特定の実施形態において、細菌細胞は少なくとも１種類の汎用化学物質を持続的に生産する。特定の実施形態において、少なくとも１種類の汎用化学物質は、１日に２４時間持続的に生産される。上述の任意の実施形態と組み合わせることが可能な特定の実施形態において、当該汎用化学物質は、ポリマー、２，３−ブタンジオール、１，３−プロパンジオール、１，４−ブタンジオール、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリヒドロキシブチレート、イソプレン、ラクテート、スクシネート、グルタメート、シトレート、マレート、３−ヒドロキシプロピオネ−ト、アスコルベート、ソルビト−ル、アミノ酸、ヒドロキシブチレ−ト、カロテノイド、リコペン、β−カロテン、医薬品中���体、ポリケチド、スタチン、ω−３ 脂肪酸、イソプレノイド、ステロイド、抗生物質、エリスロマイシン、ソプレノイド、ステロイド、エリスロマイシン、ソプレノイド、ステロイド、エリスロマイシン、バイオ燃料およびこれらの組み合わせから選択される。上述の任意の実施形態と組み合わせることが可能な特定の実施形態において、汎用化学物質は、アルコール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、アセトン、ブタノール、イソブタノール、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、フェニルエタノール、脂肪族アルコール、イソペンテノール、アルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、２−メチル−１−ブタナール、３−メチル−１−ブタナール、フェニルアセトアルデヒド、脂肪族アルデヒド、炭化水素、アルカン、アルケン、イソプレノイド、脂肪酸、ワックスエステル、エチルエステル、水素およびこれらの組み合わせから選択されるバイオ燃料である。上述の任意の実施形態と組み合わせることが可能な特定の実施形態において、当該細菌細胞は、シアノバクテリア、Acaryochloris、Anabaena、Arthrospira、Cyanothece、Gleobacter、Microcystis、Nostoc、Prochlorococcus、Synechococcus、Synechococcus elongatus、S. elongatus PCC7942、Synechocystis、Thermosynechococcus、Trichodesmium、紅色硫黄細菌、Chromatiaceae、Ectothiorhodospiraceae、紅色非硫黄細菌、Acetobacteraceae、Bradyrhizobiaceae、Comamonadaceae、Hyphomicrobiaceae、Rhodobacteraceae、Rhodobiaceae、Rhodocyclaceae、Rhodospirillaceae、緑色非硫黄細菌、およびChloroflexaceaeから選択される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１Ａは、S. elongatusのゲノムへのグルコーストランスポーター遺伝子の組み込みの概略図を示している。図１Ｂは、５ｇ／Ｌグルコースありおよびなしで培養したS. elongatesのgalP株（丸）および野生型株（四角）の増殖曲線を示す。図１Ｃは、グルコースありおよびなしで培養したS. elongatesのGlut 1株（三角）、およびglcP株（ひし形）および野生型株（四角）の増殖曲線を示す。図１Ｂおよび１Ｃについて、白抜きの図形は５ｇ／Ｌグルコースなしでの増殖を示し、塗りつぶした図形は５ｇ／Ｌグルコースありでの増殖を示す。図１Ｄは、glg遺伝子の欠失ありおよびなしでのS. elongatesのgalP株（丸）および野生型株（四角）の増殖曲線を示す。図１Ｄについては、サンプルを５ｇ／Ｌグルコースを用いて培養した。塗りつぶした図形はglgC遺伝子を含んでいる株を示し、“ｘ”の図形はglgCの欠失を有する株を示している。図１Ｂ〜１Ｄについては、白色の領域は光周期を示し、影付きの領域は暗周期を示している。エラーバーは３連における標準偏差を示す。
【図２】図２Ａは、ｐＡＬ８２プラスミドを用いたglgC遺伝子を欠失させて、S. elongates glc欠失株を作製するための組み換えの事象の概略図を示している。バーは組み換えのための相同性領域を示している。矢印は、組み換えの実証のために用いられたプライマーを示している。図２Ｂは、正しい組み換えのＰＣＲによる確認を示している。ＰＣＲを、S. elongatusの野生型株（レーン１および４）、AL535株（レーン２および５）およびAL536株（レーン３および６）のゲノムＤＮＡを鋳型として用いて、プライマーGR050およびIM581（レーン１〜３、生成物のサイズ：１．７ｋｂ）；およびプライマーIM573およびGR015（レーン４〜６、生成物のサイズ:２．２ｋｂ）によって行った。
【図３】図３Ａ〜Ｅは、S. elongates galP株の性質決定を示している。すべてのサンプルを、連続光下で５ｇ／Ｌグルコースを含むＢＧ−１１培地において増殖させた。図３Ａは、S. elongatesの野生型株の共焦点顕微鏡のイメージ（左）および透過光顕微鏡のイメージ（右）を示している。図３Ｂは、S. elongatesのgfp株（左）およびS. elongatesのgalP-gfp株（右）の共焦点顕微鏡のイメージを示している。図３Ｃは、様々な量のＩＰＴＧの存在下で培養したS. elongates galP-gfp株の増殖曲線を示している。丸は、ＩＰＴＧなしを示し、四角は０．０１ｍＭのＩＰＴＧを示し、三角は０．１ｍＭのＩＰＴＧを示し、ひし形は１．０ｍＭのＩＰＴＧを示している。図３Ｄは、図３Ｃに示されている増殖曲線解析の工程の間のS. elongates galP-gfp株の蛍光分析を示している。Ｙ軸はＯＤ７３０で除算したＧＦＰ蛍光強度を示している。図３Ｅは、様々な濃度の重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）の存在下において培養したＳ. elongatesのgalP株（gfpなし；塗りつぶした図形）および野生型株（白抜きの図形）の増殖曲線を示している。四角は重炭酸塩なしを示し；丸は５ｍＭの重炭酸塩を示し；三角は１０ｍＭの重炭酸塩を示し；逆三角は２０ｍＭの重炭酸塩を示す。エラーバーは３連における標準偏差を示す。
【図４】図４Ａは、S. elongatusのゲノム中へのスクロース分解経路の組み込みの概略図を示す。図４Ｂは、S. elongatusにおける合成的なスクロース分解経路を示す。灰色の矢印は、異種の酵素によって触媒される段階を示している。“PPP”は、ペントースリン酸経路に対応する。図４ＣはS. elongatusのcscB-cscK株（丸)および野生型株（四角）の増殖曲線を示している。白抜きの図形は、５ｇ／Ｌスクロースなしで培養した細胞を示し、塗りつぶした図形は、５ｇ／Ｌスクロースありで培養した細胞を示す。白色の領域は光周期を示し、影付きの領域は暗周期を示している。エラーバーは３連における標準偏差を示す。
【図５】図５Ａは、S. elongatusのゲノム中へのキシロース分解経路の組み込みの概略図を示す。図５Ｂは、S. elongatusにおける合成的なキシロース分解経路を示す。灰色の矢印は、異種の酵素によって触媒される段階を示している。図５Ｃは、S. elongatusのxylEAB株（丸）、xylE株（四角）および野生型の株（三角）の増殖曲線を示す。白抜きの図形は５ｇ／Ｌキシロースなしで培養した細胞を示し、塗りつぶした図形は５ｇ／Ｌキシロースありで培養した細胞を示す。白色の領域は光周期を示し、影付きの領域は暗周期を示している。エラーバーは３連における標準偏差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本開示は、グルコーストランスポータータンパク質、スクローストランスポータータンパク質またはキシローストランスポータータンパク質、などの糖タンパク質の組み換え発現が、光独立栄養種の単離された細菌細胞に光の非存在下で増殖することを可能にし、これにより一日に２４時間、バイオ燃料等の汎用化学物質を持続的に生産することを可能にするという驚くべき発見に、少なくとも部分的に基づいている。都合の良いことに、本開示の組み換え細菌細胞は、光合成の化学阻害剤を必要とせず、増殖のための光の供給も必要としないために、生産コストを低減させる。
【００１８】
本開示の特定の局面は、ガラクトーストランスポータータンパク質をコードしている組み換えポリヌクレオチドを含んでおり、当該ガラクトーストランスポータータンパク質の発現は、細菌細胞内へのグルコースの輸送を生じさせて、当該組み換えポリヌクレオチドを有していない対応する同一種の光独立栄養細菌細胞と比較して、暗条件下または日中条件下におけるグルコース上での当該細菌細胞の増殖を増加させる光独立栄養種の単離された細菌細胞を提供する。本開示の他の局面は、二糖の糖トランスポータータンパク質をコードしている組み換えポリヌクレオチドを含んでおり、当該二糖の糖トランスポータータンパク質の発現は、細菌細胞内への二糖の糖の輸送を生じさせて、当該組み換えポリヌクレオチドを有していない対応する同一種の光独立栄養細菌細胞と比較して、暗条件下または日中条件下における当該二糖の糖上での当該細菌細胞の増殖を増加させる光独立栄養種の単離された細菌細胞を提供する。本開示の他の局面は、キシローストランスポータータンパク質をコードしている組み換えポリヌクレオチドを含んでおり、当該ガラクトーストランスポータータンパク質の発現は、細菌細胞内へのキシロースの輸送を生じさせて、当該組み換えポリヌクレオチドを有していない対応する同一種の光独立栄養細菌細胞と比較して、暗条件下または日中条件下におけるキシロース上での当該細菌細胞の増殖を増加させる光独立栄養種の単離された細菌細胞を提供する。特定の実施形態において、単離された細菌細胞は汎用化学物質を生産する。
【００１９】
本開示の他の局面は、糖トランスポータータンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを含んでいる光独立栄養種の細菌細胞を準備すること；および組み換えポリヌクレオチドが発現する条件下で、糖基質を用いて細菌細胞を培養することであって、当該ガラクトーストランスポータータンパク質の発現は、当該細菌細胞内への糖基質の輸送を生じさせて、当該組み換えポリヌクレオチドを有していない対応する同一種の光独立栄養細菌の細胞増殖と比較して、暗条件下または日中条件下における糖上での細胞増殖を増加させることによる、細菌増殖の増加方法を提供する。本開示の他の局面は、糖トランスポータータンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを含んでいる光独立栄養種の細菌細胞を準備すること；および当該組み換えポリヌクレオチドが発現する条件下で、糖基質を用いて細菌細胞を培養することであって、当該糖トランスポータータンパク質の発現は、当該細菌細胞内への糖基質の輸送を生じさせて、当該組み換えポリヌクレオチドを有していない対応する同一種の光独立栄養細菌細胞と比較して、暗条件下または日中条件下における細菌細胞密度またはバイオマス生産を増加させることによる、暗条件下または日中条件下における細菌細胞密度またはバイオマス生産の増加方法を提供する。
【００２０】
本開示の他の局面は、糖トランスポータータンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを含んでいる光独立栄養種の細菌細胞を準備すること；当該組み換えポリヌクレオチドが発現される条件下および少なくとも一つの汎用化学物質が生産される条件下で、糖基質を用いて細菌細胞を培養すること；および少なくとも一つの当該汎用化学物質を回収することであって、当該組み換えポリヌクレオチドの発現は、当該細菌細胞への当該糖基質の輸送を生じさせることによる、少なくとも一つの汎用化学物質の生産方法を提供する。特定の実施形態において、細菌細胞は細菌細胞にとって、少なくとも一つの汎用化学物質を生産するために必要なタンパク質を含んでいる。
【００２１】
（単離された細菌細胞）
本開示の特定の局面はラクトース、スクロースまたはキシロースなどの糖類上で増殖可能な光独立栄養種の組み換え細菌細胞に関する。
【００２２】
本明細書に用いられるとき、“光独立栄養細菌”、“光独立栄養細菌細胞”、“光独立栄養生物”または“光独立栄養種の細胞”という用語は、エネルギーを獲得するために光合成を実行し、唯一の炭素源として二酸化炭素を利用することができる細菌細胞を指す。光独立栄養細菌は、二酸化炭素および水を、生合成および呼吸などの細胞の機能において用いられるための有機物質に変換するために太陽光から得たエネルギーを用いる。光独立栄養細菌は、典型的には、光合成のプロセスを通じて太陽光からそれらのエネルギーを得るグラム陰性桿菌である。このプロセスにおいて、太陽光エネルギーは、炭化水素の合成において用いられ、当該炭化水素は、組み換え光独立栄養生物においてバイオ燃料の合成における中間生成物としてさらに用いられる。嫌気性条件下でのみ増殖する嫌気性光独立栄養生物と呼ばれる特定の光独立栄養生物は、水素源として水を用いることも、光合成から酸素を生産することもない。他の光独立栄養細菌としては酸素産生型光独立栄養生物が挙げられる。これらの細菌は典型的にはシアノバクテリアである。酸素産生型光独立栄養生物は、藻類および複合植物中のものと類似しているクロロフィル色素および光合成プロセスにおける光合成を用いる。当該プロセスの間、それらは、水素源として水を用い、光合成の産物として酸素を生産する。
【００２３】
本開示に好適な単離された細菌細胞としては、限定されないが、好塩性細菌、ヘリオバクテリア、紅色硫黄細菌、紅色非硫黄細菌、緑色硫黄細菌、緑色非硫黄細菌およびシアノバクテリアが挙げられる。シアノバクテリアには、典型的に、桿菌および球菌ならびに特定の糸状形状の種類が挙げられる。好適なシアノバクテリアの例としては、これらに限定されないが、Prochlorococcus、SynechococcusおよびNostocvariousが挙げられる。細胞は、細胞質の、クロロフィルを包含している皿状の膜である、チラコイドを含んでいてもよい。生物は窒素化合物の固定において機能すると考えられている分化した細胞である、異質細胞を産生する。
【００２４】
したがって、特定の実施形態において、本開示の単離された細胞は、シアノバクテリア、Acaryochloris、Anabaena、Arthrospira、Cyanothece、Gleobacter、Microcystis、Nostoc、Prochlorococcus、Synechococcus、Synechococcus elongatus、S. elongatus PCC7942、Synechocystis、Thermosynechococcus、Trichodesmium、紅色硫黄細菌、Chromatiaceae、Ectothiorhodospiraceae、紅色非硫黄細菌、Acetobacteraceae、Bradyrhizobiaceae、Comamonadaceae、Hyphomicrobiaceae、Rhodobacteraceae、Rhodobiaceae、Rhodocyclaceae、Rhodospirillaceae、緑色非硫黄細菌、およびChloroflexaceaeから選択される。さらなる他の実施形態において、光独立栄養細菌細胞はシアノバクテリアである。さらに他の実施形態において、単離された細菌細胞はSynechococcusである。好ましくは単離された細菌細胞はSynechococcus elongatusである。より好ましくは、単離された細菌細胞はS. elongatus PCC7942である。
【００２５】
本開示の光独立栄養種の細菌細胞は組み替えポリヌクレオチドが細菌細胞に導入され、遺伝的に改変された細菌細胞が天然に生じないように、遺伝学的に改変されている。好適な単離された細菌細胞は、所望の糖を輸送することが可能な一つ以上のタンパク質をコードしている一つ以上のポリヌクレオチドの構築物を発現可能なものである。好ましい実施形態において、一つ以上のタンパク質としては、メジャーファシリテイタースーパーファミリー（MFS）トランスポーター、ホスホトランスフェラーゼシステム（PTS）トランスポーター、ATPバインディングカセットスーパーファミリー（ABC）トランスポーター、ヘキソースの糖トランスポーター、ガラクトーストランスポーター、グルコーストランスポーター、フルクトーストランスポーター、マンノーストランスポーター、ペントーストランスポーター、キシローストランスポーター、アラビノーストランスポーター、リボーストランスポーター、リブローストランスポーター、キシルローストランスポーター、スクロース、ラクトーストランスポーター、ラクツローストランスポーター、マルトーストランスポーター、トレハローストランスポーターおよびセロビオーストランスポーターが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、日中条件下で、増加した増殖、増加したバイオマス生産および増加した汎用化学物質を導く、糖を輸送可能な一つ以上のタンパク質である。
【００２６】
本明細書で用いられるとき、“日中条件”または“概日周期”は、毎日２４時間周期中に生じ、明期または昼期および暗期または夜期を含む増殖条件を指す。
【００２７】
本明細書に用いられるとき、“組み換えポリヌクレオチド”または“組み換え核酸”は、以下のうちの少なくとも一つが事実である核酸の重合体を指す：（ａ）核酸の配列が所定の宿主生物にとって外来である（すなわち天然に見出されない）核酸配列；（ｂ）当該配列は、宿主生物において天然に見出されるが、非天然な（例えば予測されるよりも多い）量において存在している；または（ｃ）核酸の配列が天然において互いに同一の関係性において見出されない二つ以上の部分配列を含んでいる。例えば、例（ｃ）に関して、組み換え核酸配列は新規の機能的な核酸を作製するために配置された、無関係な遺伝子由来の二つ以上の配列を有するだろう。詳細には、本開示は、単離された細菌細胞への発現ベクターの導入を記載しており、通常細胞中に見出されない酵素、または通常細胞中に見出されるが、異なる制御配列下にある酵素をコードしている核酸配列を含んでいる。単離された細菌細胞のゲノムに関しては、すれば、タンパク質をコードしている核酸配列は組み替えである。
【００２８】
“遺伝学的に操作された”または“遺伝学的に改変された”は、任意の組み換えＤＮＡ技術または組み換えＲＮＡ技術によって改変された光独立栄養種の単離された任意の細菌細胞を指す。言い換えると、単離された細菌細胞は、形質移入され、形質転換され、または形質導入され、それにより所望のタンパク質の発現を細胞に生じさせるように変化した。単離された細菌細胞を遺伝学的に操作するための方法およびベクターは、当技術分野において公知である；例えば、種々の技術はCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. (Wiley & Sons, New York, 1988, and quarterly updates)に例示されている。遺伝子操作技術としては発現ベクター、標的化した相同組み換えおよび遺伝子活性化（例えば、米国特許第５，２７２，０７１号を参照のこと）および遺伝子操作した転写因子によるトランス活性化（例えば、Segal et al., 1999, Proc Natl Acad Sci USA 96(6):2758-63を参照のこと）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２９】
遺伝子発現または機能における向上をもたらす遺伝子改変は、遺伝子の、増幅、過剰産生、過剰発現、活性化、促進、付加または上方制御として言及され得る。より詳細には、本明細書において記載されているタンパク質または酵素の増加した作用（または活性）はタンパク質または酵素の向上した発現および／または機能性（生物学的活性）をもたらすという問題において、および当該酵素のより高い活性（例えば特異的な活性またはインビボの酵素活性）をもたらすという問題において、光独立栄養細菌細胞における任意の遺伝学的改変を指し、酵素のより高い活性（例えば特異的活性またはインビボの酵素活性）、酵素の低減された阻害または分解および酵素の過剰発現を包含している。例えば、生得のプロモーターのものよりも高い発現レベルをもたらすプロモーターの使用によって、遺伝子のコピー数が増加し、遺伝子発現レベルが上昇し得るか、または酵素の生物学的活性を上昇させるために遺伝子操作もしくは従来の突然変異誘発によって遺伝子が変化する。これらの改変のいくつかの組み合わせもまた可能である。
【００３０】
一般的に、本開示によると、変異体または改変されたタンパク質の所定の性質（例えば、タンパク質の機能）における向上または低下は、同一の生物由来の（すなわち、同一資源または親配列由来の）野生型の同一の特性を参照して作り出され、同一のまたは同等の条件下で測定または確立される。同様に、遺伝学的に改変された、単離された細菌細胞の性質（例えば、タンパク質の発現および／またはタンパク質の生物学的活性、または生成物の産生）における向上または低下は、同一または同等の条件下での同一種の、好ましくは同一の株の野生型の細菌細胞の同一の性質を参照して作り出される。当該条件としては、タンパク質の活性（例えば発現または生物学的な活性）または単離された細菌細胞の他の特性が測定されるアッセイ条件または培養条件（例えば培地成分、温度、ｐＨなど）、ならびに用いられるアッセイの種類、調査される宿主細菌細胞などが挙げられる。上記されているように、同等の条件は、類似の、しかし必ずしも同一ではない（例えば、条件におけるいくつかの保存的な変化は許容され得る）条件（例えば培養条件）であり、同一の条件でなされる比較物と比較して微生物の増殖または酵素の発現または生物学的な活性における影響を実質的に変化させない条件である。
【００３１】
好ましくは、所定のタンパク質の機能を向上または低下させる遺伝学的な改変を有している光独立栄養種の遺伝学的に改変された単離された細菌細胞は、光独立栄養種の単離された細菌細胞はタンパク質を有していない同一種の対応する野生型の細菌細胞における野生型タンパク質の活性と比較して、少なくとも約２倍、およびより好ましくは少なくとも約５倍、およびより好ましくは少なくとも約１０倍、およびより好ましくは約２０倍、およびより好ましくは少なくとも約３０倍、およびより好ましくは少なくとも約４０倍、およびより好ましくは少なくとも約５０倍、およびより好ましくは少なくとも約７５倍、およびより好ましくは少なくとも約１００倍、およびより好ましくは少なくとも約１２５倍、およびより好ましくは少なくとも約１５０倍または少なくとも約２倍（例えば３倍、４倍、５倍、６倍など）から開始する任意の全ての整数の増加量のタンパク質の活性（例えば発現、産生および／または生物学的活性）において、それぞれ増加または減少を有している。
【００３２】
（糖トランスポータータンパク質）
本開示の別の局面は、ガラクトーストランスポータータンパク質、スクローストランスポーターまたはキシローストランスポーターなどの糖トランスポータータンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを含んでいる光独立栄養種の単離された細菌細胞に関する。
【００３３】
本開示の糖トランスポータータンパク質としては、限定されないが、毒性とならずに本願の光独立栄養細菌細胞によって利用されるのに十分な量の糖基質を輸送可能な任意の糖タンパク質が挙げられる。さらに、当基質の利用は、暗条件下および／または日中条件下における光独立栄養細菌細胞の増殖、細胞密度および／またはバイオマス生産を増加させる。
【００３４】
好適な糖トランスポータータンパク質としては、限定されないが、メジャーファシリテイタースーパーファミリー（MFS）トランスポータータンパク質、ホスホトランスフェラーゼシステム（Phosphotransferase System）（PTS）トランスポータータンパク質、ATPバインディングカセットスーパーファミリー（ATP Binding Cassette Superfamily）（ABC）トランスポータータンパク質、ヘキソースの糖トランスポータータンパク質、二糖の糖トランスポータータンパク質およびペントーストランスポータータンパク質が挙げられる。
【００３５】
好適なヘキソースの糖トランスポータータンパク質としては、限定されないが、ガラクトーストランスポータータンパク質（Escherichia coliのgalPトランスポータータンパク質、MFSトランスポータータンパク質、PTSトランスポータータンパク質およびSyjfF/ytfR/ytfT/ytfQ ABCシステムなど）；グルコーストランスポータータンパク質（Escherichia coliのptsI/ptsH/ptsG/crr PTSシステム、Homo sapiensのGLUT1およびGLUT3 MFSトランスポーターおよびSynechocystis sp PCC6803のglcP MFSトランスポーターなど）；フルクトーストランスポータータンパク質（Homo sapiensのGLUT5 MFS トランスポーターなど）； マンノーストランスポータータンパク質（Escherichia coliのmanX/manY/manZ PTSシステムおよびマンノースを輸送するグルコース特異的トランスポーターなど）が挙げられる。
【００３６】
好適な二糖の糖トランスポーターの例としては限定されないが、スクローストランスポータータンパク質（Bacillus subtilisのsacP PTSシステムおよびEscherichia coli EC3132のcscB MFSトランスポーターなど）；ラクトーストランスポータータンパク質（Escherichia coli由来のlacY MFSトランスポーターなど）；ラクツローストランスポータータンパク質（Streptococcus pneumoniae由来のLacE2 MFS トランスポーターなど）；マルトーストランスポータータンパク質（Escherichia coliのmalE/malF/malG/malK ABCシステムなど）；トレハローストランスポータータンパク質（Escherichia coli由来のTreB PTSタンパク質など）；およびセロビオーストランスポータータンパク質（Strptococcus pneumoniaにおけるCelD PTSシステムなど）が挙げられる。
【００３７】
好適なペントーストランスポーターの例としては、限定されないが、キシローストランスポータータンパク質（E. coliのxylE MFSトランスポータータンパク質およびEscherichia coliのxylF/xylG/xylH ABC システムなど）；アラビノーストランスポータータンパク質（Escherichia coliのaraJ MFS トランスポーターなど）；リブローストランスポータータンパク質（Escherichia coliのRbs ABCトランスポーターシステムなど）；リブローストランスポータータンパク質；およびキシルローストランスポータータンパク質（Leuconostoc kimchiiのMFSトランスポーター(LKI_09995)など）が挙げられる。
【００３８】
好適な糖トランスポータータンパク質としてはまた、限定されないが、毒性とならずに本願の光独立栄養細菌細胞によって利用されるのに十分な量の糖基質を輸送可能にそれらの内在性の形態から改変させたまたは変化させたトランスポータータンパク質が挙げられる。
【００３９】
さらに、本明細書に記載されている糖タンパク質はそれらのホモログタンパク質を用いて容易に置き換えられ得る。本明細書に用いられるとき、“ホモログタンパク質”は、本願明細書または引用された参照に記載されている任意のタンパク質と、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるポリペプチドの配列を有するタンパク質を指している。ホモログタンパク質は、当該タンパク質に保存されていると認識されているアミノ酸残基を維持している。ホモログタンパク質は、当該ホモログタンパク質の機能または活性に影響しない、またはわずかな影響しか及ぼさない限り、置換された、または異なるアミノ酸残基であることが見出された非保存性のアミノ酸残基、または挿入もしくは欠失された（複数の）アミノ酸を有し得る。
【００４０】
＜ガラクトーストランスポータータンパク質＞
特定の実施形態において、本開示の単離された細菌細胞は、細菌細胞へグルコースを輸送することが可能なガラクトーストランスポータータンパク質をコードしている組み換えポリヌクレオチドを含んでいる。ガラクトーストランスポーターは、一般的に、細胞内へガラクトースを輸送する。しかし、E. coliのガラクトーストランスポーターであるgalPおよびメジャーファシリテイタースーパーファミリー（MFS）などの特定のガラクトーストランスポーターは細胞内へグルコースを輸送することも可能であることが示されている（Flores N et al Nat Biotech 14(5): 620-623. 1996）。そのようなガラクトーストランスポーターは、グルコーストランスポーターによって細胞内へ輸送されるグルコースの量と比較して、Synechococcus elongatusなどの光独立栄養細菌細胞内へ低レベルのグルコースを輸送することが示されている。理論によって拘束されることを望むものではないが、E. coliなどの最も化学合成従属栄養性の微生物は、エネルギー消費に対して高いパーセンテージのそれらのグルコースの取り込みを使用すると考えられている（例えば、ＣＯ２への燃焼−生産されるバイオマスによって測定される、対、消費される糖）。一方、S. elongatusなどの光独立栄養細胞は、一般的に、光合成からそれらのエネルギーの大部分を産出し、それゆえ、生合成のための炭素主鎖の資源として、グルコース取り込みのみを用いる。理論によって拘束されることを望むものではないが、細胞内への高レベルのグルコースの輸送は、シアノバクテリアであるS. elongatusなどの特定の光独立栄養性の細菌細胞にとって有毒であり得る。しかし、理論によって拘束されることを望むものではないが、低レベルのグルコースの輸送は、有毒ではなく、概日周期の暗期の間の増殖のために、光独立栄養性の細菌細胞（シアノバクテリアS. elongatusなど）によって利用され得るとさらに考えられている。
【００４１】
ガラクトーストランスポーターは、細胞内へ糖を輸送するためにエネルギーを必要とする能動トランスポーターであり得る。エネルギーはＡＴＰによって、または電気化学的な勾配を低下させるイオンの共輸送によって、供給され得る。例えば、ATPバインディングカセット（ABC)トランスポーターは、ATPを利用して光独立性細菌細胞内へ糖を輸送する。あるいは、ガラクトーストランスポーターは促進された拡散輸送を利用して細胞内へ糖を輸送する受動トランスポーターであり得る。特定の実施形態において、ガラクトーストランスポーターは、galPトランスポーターである。galPトランスポーターは、メジャーファイシリテイタースーパーファミリーのトランスポーターのメンバーである。MTSトランスポーターは電気化学的なＨ＋勾配を用いて、細胞内への第二次能動輸送によって、濃度勾配に逆らって細菌細胞のサイトゾル内へ糖を取り込む、糖−プロトン（Ｈ＋）共輸送体である。
【００４２】
好適なガラクトース輸送システムの他の例は、ホスホトランスフェラーゼシステムである。ホスホトランスフェラーゼシステム（PTS）はまた、PEP群の移行としても知られており、エネルギー源がホスホエノールピルビン酸（PEP）由来である糖の取り込みのために細菌細胞によって用いられる能動輸送の異なる方法である。PTSシステムは細胞膜の酵素および細胞質の酵素が関与する多成分のシステムとして知られている。この輸送の例は、E. coli.において見出される。PTSシステムは、細胞内への多くの糖（ガラクトース、マンノース、フルクトースおよびセロビオースが挙げられる）の輸送に関与する。
【００４３】
したがって、特定の実施形態において、ガラクトーストランスポータータンパク質は、細菌のgalPトランスポータータンパク質、真核生物のgalPトランスポータータンパク質、真菌のgalPトランスポータータンパク質、哺乳類のgalPトランスポータータンパク質、細菌のメジャーファシリテイタースーパーファミリー（MFS）トランスポータータンパク質、真核生物のMFSトランスポータータンパク質、真菌のMFSトランスポータータンパク質、哺乳類のMFSトランスポータータンパク質、細菌のＡＴＰバインディングカセットスーパーファミリー（ATP Binding Cassette Superfamily）（ABC）トランスポータータンパク質、真核生物のABCトランスポータータンパク質、真菌のABCトランスポータータンパク質、哺乳類のABCトランスポータータンパク質、細菌のホスホトランスフェラーゼシステム（PTS）トランスポータータンパク質、真核生物のPTSトランスポータータンパク質、哺乳類のPTSトランスポータータンパク質、およびこれらのホモログから選択される。特定の好ましい実施形態において、ガラクトーストランスポータータンパク質は、E. coliのgalPトランスポータータンパク質またはそのホモログである。他の好ましい実施形態において、ガラクトーストランスポータータンパク質は、配列番号２と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一または１００％同一であるアミノ酸配列を有するE. coliのgalPトランスポータータンパク質である。
【００４４】
他の実施形態において、ガラクトーストランスポータータンパク質をコードしている組み換えポリヌクレオチドは、単離された細菌細胞のゲノム中に安定的に組み込まれる。細菌細胞のゲノム中へ組み換えポリヌクレオチドを安定的に組み込む方法は、当技術分野において公知であり、限定されないが、相同組み換えが挙げられる。
【００４５】
ガラクトーストランスポーターに加えて、本開示の単離された細菌細胞は、糖輸送タンパク質をコードしている、少なくとも一種類の追加の組み換えポリヌクレオチドを含んでおり、当該糖輸送タンパク質の発現は、光独立栄養性の細菌細胞への糖の輸送を生じさせる。糖トランスポータータンパク質は、当技術分野において公知であり、限定されないが、
ヘキソースの糖（ガラクトース、グルコース、フルクトースなど）を輸送するタンパク質；二糖の糖（スクロース、ラクトース、ラクツロース、マルトース、トレハロース、セロビオースなど）を輸送するタンパク質；およびペントースの糖（キシロース、アラビノース、リボース、リブロース、およびキシルロースなど）を輸送するタンパク質が挙げられる。
【００４６】
本開示の他の局面は、本開示のガラクトーストランスポータータンパク質をコードしている組み換えポリヌクレオチドの発現から生じる、向上した特性に関する。これらの向上した特性としては、限定されないが、暗条件下または日中条件下におけるグルコース上での増加した細胞増殖が挙げられる。これらの特性は、ガラクトーストランスポータータンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを含んでいない（すなわち有していない）対応する光独立栄養細菌細胞と比較した場合に向上している。したがって、特定の実施形態において、本開示の単離された細菌細胞は、本開示のガラクトーストランスポータータンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを有していない対応する光独立栄養細菌細胞と比較して、暗条件下または日中条件下において増加した増殖、細胞密度および／またはバイオマス生産を有している。他の実施形態において、暗条件下または日中条件下におけるグルコース上での増加した細胞増殖、細胞密度および／またはバイオマス生産は、本開示のガラクトーストランスポータータンパク質をコードしている組み換えポリヌクレオチドを有していない対応する光独立栄養細菌細胞と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１２５％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、少なくとも１７５％、少なくとも２００％、少なくとも２２５％、少なくとも２５０％、少なくとも２７５％、少なくとも３００％、少なくとも３５０％、少なくとも４００％、少なくとも４５０％、少なくとも５００％、任意のパーセンテージ、５％〜５００％の全整数（例えば６％、７％、８％など）において、またはそれより大きく、増加している。
【００４７】
＜二糖トランスポータータンパク質＞
他の実施形態において、本開示の光独立栄養種の単離された細菌細胞は、スクローストランスポータータンパク質などの二糖のトランスポータータンパク質をコードしている組み換えポリヌクレオチドを含んでおり、当該二糖の糖トランスポータータンパク質の発現は、細菌細胞内への二糖の輸送を生じさせて、当該組み換えポリヌクレオチドを有していない対応する光独立栄養細菌細胞と比較して、暗条件下または日中条件下における当該二糖上での細菌細胞の増殖を増加させる。いくつかの実施形態において、細菌細胞は、二糖の糖をその対応する単糖類に変換するのに必要なタンパク質を含んでいる。二糖の糖（スクロースなど）をその対対応する単糖類に変換するのに必要なタンパク質は、当技術分野において公知である。
【００４８】
二糖のトランスポータータンパク質としては、スクローストランスポータータンパク質、ラクトーストランスポータータンパク質、ラクツローストランスポータータンパク質、マルトーストランスポータータンパク質、トレハローストランスポータータンパク質およびセロビオーストランスポータータンパク質であり得る。
【００４９】
スクロースは、S. elongatusなどのシアノバクテリアの天然の代謝物であり、浸透圧に応答して合成される（Ducat DC et al., (2012) Appl Environ Microbiol 78(8):2660-2668; and Suzuki E et al, (2010) Appl Environ Microbiol 76(10):3153-3159）。したがって、特定の実施形態において、二糖のトランスポータータンパク質はスクローストランスポータータンパク質である。スクローストランスポータータンパク質は、E. coliのCscBスクローストランスポータータンパク質、B. subtilisのSacPトランスポータータンパク質、Brassica napusのSut1トランスポータータンパク質、Juglans regiaのSut1トランスポータータンパク質、Arabidopsis thalianaのSuc6トランスポータータンパク質、Arabidopsis thalianaのSUT4トランスポータータンパク質、Drosophila melanogasterのSlc45-1トランスポータータンパク質、Dickeya dadantiiのScrAトランスポータータンパク質およびこれらのホモログであり得る。特定の好ましい実施形態において、スクローストランスポータータンパク質は、E. coliのCscBスクローストランスポータータンパク質またはそのホモログである。他の好ましい実施形態において、スクローストランスポータータンパク質は、配列番号１４と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一または１００％同一であるアミノ酸配列を有するE. coliのg CscBスクローストランスポータータンパク質である。
【００５０】
他の実施形態において、二糖トランスポータータンパク質をコードしている組み換えポリヌクレオチドは、単離された細菌細胞のゲノム中に安定的に組み込まれる。細菌細胞のゲノム中へ組み換えポリヌクレオチドを安定的に組み込む方法は、当技術分野において公知であり、限定されないが、相同組み換えが挙げられる。
【００５１】
二糖トランスポータータンパク質に加えて、本開示の単離された細菌細胞は、糖輸送タンパク質をコードしている、少なくとも一つの追加の組み換えポリヌクレオチドを含んでおり、当該糖輸送タンパク質の発現は、光独立栄養性の細菌細胞への糖の輸送を生じさせる。糖トランスポータータンパク質は、当技術分野において公知であり、限定されないが、ヘキソースの糖（ガラクトース、フルクトース、マンノースなど）を輸送するタンパク質；二糖の糖（スクロース、ラクトース、ラクツロース、マルトース、トレハロース、セロビオースなど）を輸送するタンパク質；およびペントースの糖（キシロース、アラビノース、リボース、リブロース、およびキシルロースなど）を輸送するタンパク質が挙げられる。
【００５２】
本開示の他の局面は、本開示の二糖の糖トランスポータータンパク質をコードしている組み換えポリヌクレオチドの発現から生じる、向上した特性に関する。これらの向上した特性としては、限定されないが、暗条件下または日中条件下におけるスクロースなどの二糖上での増加した細胞増殖が挙げられる。これらの特性は、二糖トランスポータータンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを含んでいない（すなわち有していない）対応する同一種の光独立栄養細菌細胞と比較した場合に向上している。したがって、特定の実施形態において、本開示の単離された細菌細胞は、二糖トランスポータータンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを有していない対応する光独立栄養細菌細胞と比較して、暗条件下または日中条件下においてスクロースなどの二糖上での増加した増殖、細胞密度および／またはバイオマス生産を有している。他の実施形態において、暗条件下または日中条件下におけるスクロースなどの二糖上での単離された細菌細胞の増加した細胞増殖、細胞密度および／またはバイオマス生産は、本開示の二糖トランスポータータンパク質をコードしている組み換えポリヌクレオチドを有していない対応する光独立栄養細菌細胞と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１２５％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、少なくとも１７５％、少なくとも２００％、少なくとも２２５％、少なくとも２５０％、少なくとも２７５％、少なくとも３００％、少なくとも３５０％、少なくとも４００％、少なくとも４５０％、少なくとも５００％、任意のパーセンテージ、５％〜５００％の全整数（例えば６％、７％、８％など）において、またはそれより大きく、増加している。
【００５３】
＜キシローストランスポータータンパク質＞
キシロースは、豊富に利用可能なヘミセルロースバイオマスの主要部分であり、バイオ燃料などの汎用化学物質の微生物の生産にとって安価で再生可能な原料を供給し得る（Steen EJ et al., (2010) Nature 463(7280):559-562）。しかし、キシロースは、シアノバクテリアS. elongatusなどの光独立栄養性細菌細胞の公知の代謝物ではない。
【００５４】
したがって、さらなる実施形態において、本開示の光独立栄養種の単離された細菌細胞は、キシローストランスポータータンパク質をコードしている組み換えポリヌクレオチドを含んでおり、当該キシローストランスポータータンパク質の発現は、当該細菌細胞内へのキシロースの輸送を生じさせて、当該組み換えポリヌクレオチドを有していない対応する光独立栄養細菌細胞と比較して、暗条件下または日中条件下におけるキシロースでの当該細菌細胞の増殖を増加させる。
【００５５】
キシローストランスポータータンパク質は、E. coliのXylEキシローストランスポータータンパク質、E. coliのxylF/xylG/xylHABCキシローストランスポータータンパク質、Candida intermediaのGxf1トランスポータータンパク質、Pichia stipitisのSut1トランスポータータンパク質、A. thalianaのAt5g59250トランスポータータンパク質およびこれらのホモログであり得る。特定の好ましい実施形態において、キシローストランスポータータンパク質は、E. coliのXylEキシローストランスポータータンパク質またはそのホモログである。他の好ましい実施形態において、キシローストランスポータータンパク質は、配列番号８と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一または１００％同一であるアミノ酸配列を有するE. coliのXylEキシローストランスポータータンパク質である。
【００５６】
他の実施形態において、キシローストランスポータータンパク質をコードしている組み換えポリヌクレオチドは、単離された細菌細胞のゲノム中に安定的に組み込まれる。細菌細胞のゲノム中へ組み換えポリヌクレオチドを安定的に組み込む方法は、当技術分野において公知であり、限定されないが、相同組み換えが挙げられる。  キシローストランスポータータンパク質に加えて、本開示の単離された細菌細胞は、糖輸送タンパク質をコードしている、少なくとも一つの追加の組み換えポリヌクレオチドを含んでおり、当該糖輸送タンパク質の発現は、光独立栄養性の細菌細胞への糖の輸送を生じさせる。糖トランスポータータンパク質は、当技術分野において公知であり、限定されないが、ヘキソースの糖（ガラクトース、フルクトース、マンノースなど）を輸送するタンパク質；二糖の糖（スクロース、ラクトース、ラクツロース、マルトース、トレハロース、セロビオースなど）を輸送するタンパク質；およびペントースの糖（キシロース、アラビノース、リボース、リブロース、およびキシルロースなど）を輸送するタンパク質が挙げられる。
【００５７】
本開示の他の局面は、本開示のキシローストランスポータータンパク質をコードしている組み換えポリヌクレオチドの発現から生じる、向上した特性に関する。これらの向上した特性としては、限定されないが、暗条件下または日中条件下におけるキシロース上での増加した細胞増殖が挙げられる。これらの特性は、キシローストランスポータータンパク質をコードしている組み換えポリヌクレオチドを含んでいない（すなわち有していない）対応する同一種の光独立栄養細菌細胞と比較した場合に向上している。したがって、特定の実施形態において、本開示の単離された細菌細胞は本開示のキシローストランスポータータンパク質をコードしている組み換えポリヌクレオチドを有していない対応する光独立栄養細菌細胞と比較して、暗条件下または日中条件下においてキシロース上での増加した増殖、細胞密度および／またはバイオマス生産を有している。他の実施形態において、暗条件下または日中条件下におけるキシロース上での単離された細菌細胞の増殖、細胞密度および／またはバイオマス生産は、本開示の二糖トランスポータータンパク質をコードしている組み換えポリヌクレオチドを有していない対応する光独立栄養細菌細胞と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１２５％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、少なくとも１７５％、少なくとも２００％、少なくとも２２５％、少なくとも２５０％、少なくとも２７５％、少なくとも３００％、少なくとも３５０％、少なくとも４００％、少なくとも４５０％、少なくとも５００％、任意のパーセンテージ、５％〜５００％の全整数（例えば６％、７％、８％など）において、またはそれより大きく、増加している。
【００５８】
＜追加のタンパク質成分＞
さらなる実施形態において、糖トランスポータータンパク質をコードしている組み換えポリヌクレオチドを含んでいる本開示の光独立栄養種の単離された細菌細胞は、当該単離された細菌細胞の中心的な代謝へ開示された糖の組み入れを促進する、少なくとも一つの下流の代謝酵素をコードしている、少なくとも１つの追加の組み換えポリヌクレオチドをさらに含み得る。少なくとも一つの下流の代謝酵素をコードしている、少なくとも１つの追加の組み換えポリヌクレオチドは、単離された細菌細胞のゲノム中に安定的に組み込まれる。細菌細胞のゲノム中へ組み換えポリヌクレオチドを安定的に組み込む方法は、当技術分野において公知であり、限定されないが、相同組み換えが挙げられる。
【００５９】
特定の実施形態において、少なくとも一つの下流の代謝酵素は、ヘキソースの糖トランスポータータンパク質をコードしている組み換えポリヌクレオチドを含んでいる本開示の単離された細菌細胞の中心的な代謝へ本開示のヘキソースの糖の組み入れを促進する。好適な下流の代謝性のガラクトース酵素としては、限定されないが、ガラクトース−１−エピメラーゼ、ガラクトキナーゼ、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼおよびＵＤＰ−グルコース−４−エピメラーゼが挙げられる。好適な下流の代謝性のグルコース酵素としては、限定されないが、グルコキナーゼが挙げられる。好適な下流の代謝性のグルコース酵素としては、限定されないが、グルコキナーゼが挙げられる。好適な下流の代謝性のフルクトース酵素としては、限定されないが、マンノ（フルクト）キナーゼおよびフルクトキナーゼが挙げられる。好適な下流の代謝性のマンノース酵素としては、限定されないが、マンノ（フルクト）キナーゼおよびマンノース−６−リン酸イソメラーゼが挙げられる。
【００６０】
特定の実施形態において、少なくとも一つの下流の代謝酵素は、二糖トランスポータータンパク質をコードしている組み換えポリヌクレオチドを含んでいる本開示の単離された細菌細胞の中心的な代謝へ本開示の二糖の糖の組み入れを促進する。好適な下流の代謝性のラクトース酵素の例としては、限定されないが、β−ガラクトシダーゼが挙げられる。好適な下流の代謝性のマルトース酵素の例としては、限定されないが、マルトースホスホリラーゼおよびβ−ホスホグルコムターゼが挙げられる。好適な下流の代謝性のトレハロース酵素の例としては、限定されないが、B. subtilis由来のtreAおよびL. lactis由来のtrePおよびpgmBが挙げられる。好適な下流の代謝性のセロビオース酵素の例としては、限定されないが、Hypocrea jecorina由来のCel1a、Cel3a BGLIまたはBGLIIが挙げられる。
【００６１】
特定の好ましい実施形態において、少なくとも一つの下流の代謝酵素は、スクローストランスポータータンパク質をコードしている組み換えポリヌクレオチドを含んでいる本開示の単離された細菌細胞の中心的な代謝への本開示のスクロースの組み入れを促進する。好適な下流の代謝性のスクロース酵素としては、限定されないが、フルクトキナーゼ、スクラーゼ−６−リン酸ヒドロラーゼおよびインベルターゼが挙げられる。好適なフルクトキナーゼとしては、限定されないが、E. coliのCscKフルクトキナーゼタンパク質、Lycopersicon esculentumのFrk1フルクトキナーゼタンパク質、Lycopersicon esculentumのFrk2フルクトキナーゼタンパク質、H. sapiensのKHKフルクトキナーゼタンパク質、A. thalianaのFLN-1フルクトキナーゼタンパク質、A. thalianaのFLN-2フルクトキナーゼタンパク質、Yersinia pestis biovar Microtus str. 91001のNagC1フルクトキナーゼタンパク質、Yersinia pseudotuberculosisのYajFフルクトキナーゼタンパク質、およびNatronomonas pharaonisのSukフルクトキナーゼタンパク質およびこれらのホモログが挙げられる。特定の好ましい実施形態において、フルクトキナーゼはE. coliのCscKフルクトキナーゼタンパク質またはそのホモログである。他の好ましい実施形態において、フルクトキナーゼは、配列番号１６と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一または１００％同一であるアミノ酸配列を有するCscKタンパク質である。
【００６２】
特定の実施形態において、少なくとも一つの下流の代謝酵素は、単離された細菌細胞の中心的な代謝へ本開示のペントースの糖の組み入れを促進する。好適な下流の代謝性のアラビノース酵素としては、限定されないが、Ｌ−アラビノース イソメラーゼ、Ｌ−リブロキナーゼおよびＬ−リブロース−５−リン酸−4−エピメラーゼが挙げられる。好適な下流の代謝性のリボース酵素としては、限定されないが、E. coli由来のRbsKが挙げられる。
【００６３】
特定の好ましい実施形態において、少なくとも一つの下流の代謝酵素は、キシローストランスポータータンパク質をコードしている組み換えポリヌクレオチドを含んでいる本開示の単離された細菌細胞の中心的な代謝へキシロースの組み入れを促進する。好適な下流の代謝性のキシロース酵素としては、限定されないが、キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼが挙げられる。キシローストランスポータータンパク質をコードしている組み換えポリヌクレオチドを含んでいる本開示の単離された細菌細胞は、キシロースイソメラーゼをコードしている追加の組み換えポリヌクレオチドおよび／またはキシルロキナーゼをコードしている追加の組み換えポリヌクレオチドをさらに含み得る。あるいは、キシローストランスポータータンパク質をコードしている組み換えポリヌクレオチドを含んでいる本開示の単離された細菌細胞は、キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼの両方をコードしている追加の組み換えポリヌクレオチドをさらに含み得る。好ましくは、キシロース上で増殖し得る本開示の単離された細菌細胞は、キシローストランスポータータンパク質、キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼをコードしている組み換えポリヌクレオチドを含んでいる。特定の実施形態において、キシロースイソメラーゼは、E. coliのxylA遺伝子によってコードされるXylAタンパク質、A. thalianaのAT5G57655キシロースイソメラーゼ、Aspergillus nigerのXyrAキシロースイソメラーゼ、Hypocrea jecorinaのXyl1キシロースイソメラーゼおよびこれらのホモログである。特定の好ましい実施形態において、キシロースイソメラーゼはE. coliのxylA遺伝子由来のXylAタンパク質またはそのホモログである。他の好ましい実施形態において、キシロースイソメラーゼは、配列番号１０と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一または１００％同一であるアミノ酸配列を有するE. coliのXylAタンパク質である。
【００６４】
他の実施形態においてキシルロキナーゼは、E. coliのxylB遺伝子によってコードされるXylBタンパク質、Arabidopsis thalianaのXK-1キシルロキナーゼ、Arabidopsis thalianaのXK-2キシルロキナーゼ、E. coliのLynKキシルロキナーゼ、Streptomyces coelicolorのSCO1170キシルロキナーゼ、Pseudomonas aeruginosaのMtlYキシルロキナーゼ、Yersinia pseudotuberculosisのSgbKキシルロキナーゼ、およびE. coliのAtlKキシルロキナーゼおよびこれらのホモログである。特定の好ましい実施形態において、キシルロキナーゼはE. coliのylB遺伝子によってコードされるXylBタンパク質またはそのホモログである。他の好ましい実施形態において、キシルロキナーゼは、配列番号１２と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一または１００％同一であるアミノ酸配列を有するE. coliのXylBタンパク質である。
【００６５】
さらに、本開示の単離された細菌細胞は、開示された糖トランスポータータンパク質および下流の代謝酵素の組み合わせを発現するように改変され得る。そのような組み合わせの非限定的な例としては、代謝酵素を伴うグルコースおよびフルクトースの輸送；代謝酵素を伴うグルコースおよびキシロースの輸送；代謝酵素を伴うグルコース、キシロースおよびアラビノースの輸送；代謝酵素を伴うグルコース、フルクトース、キシロースおよびアラビノースの輸送；代謝酵素を伴うグルコース、フルクトース、マンノース、キシロースおよびアラビノースの輸送；および代謝酵素を伴うスクロースおよびラクトースの輸送が挙げられる。
【００６６】
（糖トランスポータータンパク質をコードするポリヌクレオチド構築物）
本開示の他の局面は、一つ以上の糖トランスポータータンパク質および／または一つ以上の下流の代謝酵素をコードしているポリヌクレオチド配列を含んでいるポリヌクレオチド構築物に関する。本開示のポリヌクレオチドは、好適な条件下で培養された本開示の単離された細菌細胞において対象のタンパク質が発現されるように、プロモーターおよび任意の制御配列に作動可能に連結され得る。プロモーター及び制御配列は、本開示の光独立栄養種の単離された各細菌細胞に特異的であり得る。いくつかの実施形態において、発現ベクターはポリヌクレオチド構築物を含んでいる。ポリヌクレオチド構築物および発現ベクターを設計し、作製する方法は、当技術分野において公知である。
【００６７】
本明細書に用いられるとき、“ポリヌクレオチド配列” “ポリヌクレオチドの配列”という用語およびそれらの変形は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを包含する）として、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを包含する）として、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドである任意の種類のポリヌクレオチドとして、およびポリマーが、ＤＮＡおよびＲＮＡに見出されるような、ベースペアリングおよびベーススタッキングを可能にする構成においてヌクレオベースを含むという場合は、非ヌクレオチドの主鎖を含んでいる他のポリマーとして、一般的であるものとする。したがって、これらの用語は、公知の種類のポリヌクレオチド配列の修飾（例えば、天然に生じている一つ以上のヌクレオチドのアナログへの置換；ヌクレオチド間の修飾（例えば、荷電していない連結を有するもの（例えばメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメートなど）、負に荷電した連結を有するもの（例えばホスホチオエート、ホスホロジチオエートなど）、および正に荷電した連結を有するもの（例えばアミノアルキルホスホロアミデート、アミノアルキルホスホトリエステルなど）など）；ペンダント部分を含んでいるもの（例えばタンパク質（ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリーＬ−リジンなどが挙げられる））；挿入剤を有するもの（アクリジン、ソラレンなど）；およびキレート剤を含むもの（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）など）を包含している。本明細書で用いられるとき、ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドに対する記号は、IUPAC-IUBの生化学用語委員会によって推奨されているものである（Biochem. 9:4022, 1970）。
【００６８】
対象のタンパク質をコードしているポリヌクレオチドの配列は、当業者に知られている任意の好適な方法（例えば、直接化学合成またはクローニングが挙げられる）によって準備される。直接化学合成に対し、ポリヌクレオチドのポリマーの形成は、典型的には、３’−ブロックしたヌクレオチドモノマーおよび５’−ブロックしたヌクレオチドモノマーの、伸長しているヌクレオチド鎖の末端の５’−水酸基への連続的な付加であって、それぞれの付加は、リン誘導体（ホスホトリエステル、ホスホロアミダイトまたは類似物）など）である付加されたモノマーの３’位における成長鎖の末端の５’−水酸基への求核攻撃によって影響される付加に関与する。このような方法論は当業者に知られており、適切なテキストおよび文献に記載されている（例えば、Matteuci et al. (1980) Tet. Lett. 521:719; U.S. Pat. Nos. 4,500,707; 5,436,327; and 5,700,637）。さらに、所望の配列は、当業者に公知の技術を介して（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；例えば米国特許第4,683,195号)の利用など）、適切な制限酵素を用いてＤＮＡを切断し、ゲル電気泳動を用いて断片を分離し、その後、ゲルから所望のポリヌクレオチド配列を回収することによって天然資源から単離され得る。
【００６９】
所望の対象のタンパク質をコードしている各ポリヌクレオチド配列は発現ベクターに組み込まれ得る。“発現ベクター”または“ベクター”は、本開示の単離された細菌細胞を、形質導入、形質転換または感染させ、それにより細胞に、当該細胞にとって内在性のもの以外を、または当該細胞において天然には生じない方法において、ポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質を発現させる化合物および／または組成物を指す。発現ベクターは単離された細菌細胞によって発現される、ポリヌクレオチド配列（通常ＲＮＡまたはＤＮＡ）を含んでいる。また、選択的に、発現ベクターは、単離された細菌細胞へのポリヌクレオチドの挿入を達成する目的のための物質（ウイルス、リポソーム、タンパク質被膜または類似物など）を含んでいる。本開示における使用を意図している発現ベクターは、その中へ任意の好ましいまたは必要とされる作動可能な要素とともに、ポリヌクレオチドが挿入され得るものが挙げられる。さらに、発現ベクターは単離された細菌細胞へ移行され、その中で複製され得る。いったん好適な細菌細胞内へ移行されるか、形質転換されると、当該ベクターは、複製され、宿主ゲノムとは独立して機能し得るか、いくつかの例では、ゲノム自体に組み込まれる。発現ベクターの例としては、限定されないが、プラスミド、ファージ粒子または単に潜在的なゲノム挿入物が挙げられる。好ましい発現ベクターはプラスミドであり、特に、文書により裏付けがあり、特にポリヌクレオチド配列の転写に好ましいまたは必要な作動可能な要素を含む制限酵素部位を有するものである。そのようなプラスミドならびに他の発現ベクターは、当業者に公知である。
【００７０】
個々のポリヌクレオチド配列の組み込みは、例えば、発現ベクター（例えば、プラスミド）における特異的な部位を切断する制限酵素（ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｈｈａｌ、Ｘｈｏｌ、Ｘｍａｌなど）の使用を含む既知の方法を通じて行われる。制限酵素は、切断された発現ベクターの末端への配列相補性を有する末端を有するか、または有するように合成されたポリヌクレオチド配列にアニールし得る一本鎖末端を生成する。アニーリングは、好適な酵素（例えば、ＤＮＡリガーゼ）を使用して実施される。当業者によって理解される通り、多くの場合、発現ベクターおよび所望のポリヌクレオチド配列の両方を、同一の制限酵素で切断し、それによって、発現ベクターの末端およびポリヌクレオチド配列の末端が、互いに相補的であることを確実にする。加えて、発現ベクターへのポリヌクレオチド配列の連結を容易にするために、ＤＮＡリンカーを用いてもよい。
【００７１】
また、一連の個々のポリヌクレオチド配列は、当業者に知られている方法（例えば、米国特許Ｎｏ．４，６８３，１９５）を利用することによって組み合わせられ得る。例えば、所望のポリヌクレオチド配列の各々は、最初に、別個のＰＣＲにおいて生成され得る。その後に、特異的なプライマーは、ＰＣＲ産物の末端が相補配列を含むように設計される。ＰＣＲ生成物が混合され、変性され、かつ、再度アニールされるときに、当該ストランドは、これらの３’末端の重複部分においてマッチングする配列を有してもいてもよく、互いに対して、プライマーとして作用し得る。ＤＮＡポリメラーゼによるこの重複部分の伸長は、元の配列が共に“スプライスされる（spliced）”分子を生成する。このように、一連の個々のポリヌクレオチド配列は、共にスプライスされ、その後に、単離された細菌細胞に、同時に形質導入されてもよい。このように、複数のポリヌクレオチド配列の各々の発現は影響を受ける。
【００７２】
次に、個々のポリヌクレオチド配列、または“スプライスされた”ポリヌクレオチド配列は、発現ベクターに組み込まれる。本開示は、発現ベクターにポリヌクレオチド配列を組み込む工程に関することに限定されない。当業者は、発現ベクターにポリヌクレオチド配列を組み込むために必要な手段を熟知している。典型的な発現ベクターは、リボソーム結合部位（例えば、３〜９つのヌクレオチドの長さであり、E. coliにおける開始コドンから３〜１１のヌクレオチド上流に位置するヌクレオチド配列）に加えて１つ以上の制御領域が上流に位置する所望のポリヌクレオチド配列を含んでいる（Shine et al. (1975), Nature 254:34 and Steitz, Biological RegulationおよびDevelopment: Gene Expression (ed. R.F. Goldberger), vol. 1, p. 349, 1979, Plenum Publishing, NYを参照すること）。
【００７３】
制御領域としては、例えば、プロモーターおよびオペレーターを含有するそれらの領域が挙げられる。プロモーターは、所望のポリヌクレオチド配列に作動可能に連結され、それにより、ＲＮＡポリメラーゼ酵素を介して、ポリヌクレオチド配列の転写が開始される。オペレーターは、プロモーターに隣接したポリヌクレオチドの配列であり、当該オペレーターは、リプレッサータンパク質が結合し得るタンパク質結合ドメインを含有する。リプレッサータンパク質が存在しない場合は、転写はプロモーターを介して開始する。リプレッサータンパク質が存在する場合、オペレーターのタンパク質結合ドメインに特異的なリプレッサータンパク質は、オペレーターに結合して、それにより転写を阻害する。このように、転写の制御は、用いられる特定の制御領域と、対応するリプレッサータンパク質の存在または不在とに基づいて、達成される。例としては、ラクトースプロモーター（Ｌａｄリプレッサータンパク質は、ラクトースと接触した場合、構造変化して、それにより、当該Ｌａｄリプレッサータンパク質がオペレーターに結合することを妨げる。）およびトリプトファンプロモーター（ＴｒｐＲリプレッサータンパク質は、トリプトファンと複合体化した場合、オペレーターを結合する立体配座を有し、トリプトファンが存在しない場合、ＴｒｐＲリプレッサータンパク質は、オペレーターに結合しない立体配座を有する。）が挙げられる。別の例としては、ｔａｃプロモーターである（deBoer et al. (1983) Proc Natl Acad Sci USA, 80:21-25を参照すること）。当業者によって認識されるように、これらの発現ベクターおよび他の発現ベクターが、本開示において用いられてもよく、本開示は、この点に関して限定されない。特定の実施形態において、プロモーターは、ラクトース（lac）によって制御可能なＰｔｒｃプロモーターである。
【００７４】
任意の好適な発現ベクターを、所望の配列を組み込むために用いてよいが、容易に利用可能な発現ベクターとしては、プラスミド（ｐＡＭ２９９１、ｐＳＣｌＯｌ、ｐＢＲ３２２、ｐＢＢＲｌＭＣＳ−３、ｐＵＲ、ｐＥＸ、ｐＭＲｌＯＯ、ｐＣＲ４、ｐＢＡＤ２４、ｐＵＣ１９など）およびバクテリオファージ（Ｍｌ３ファージおよびλファージなど）が挙げられる。もちろん、上記発現ベクターは、光合成独立栄養種の特定の細菌細胞のみに好適であればよい。しかし、当業者は、任意の、特定の発現ベクターが、任意の所定の単離されたバクテリア細胞に適合するか否かを、通常の実験を通じて容易に決定し得る。例えば、発現ベクターは、単離された細菌細胞に導入され、次に、当該ベクターに含まれた配列の増殖性および発現についてモニターされる。さらに、発現ベクター、および、任意の、特定の単離されたバクテリア細胞へのこれらの適合性が記載された関連する文書および文献を参照してもよい。
【００７５】
（単離された細菌細胞を作製する方法および培養する方法）
本開示の発現ベクターは、本開示の光合成独立栄養種の単離された細菌細胞に導入されるか、または移入される。単離された細菌細胞に発現ベクターを移入するための上記方法は、当業者によく知られている。例えば、細菌細胞を発現ベクターによって形質転換するための方法の１つは、発現ベクターを、カルシウム沈殿物を介して導入する塩化カルシウム処理を伴う。また、他の塩（例えば、リン酸カルシウム）は、同様の手順に従って使用され得る。さらに、電気穿孔（すなわち、ポリヌクレオチド配列に対する細胞の透過性を向上する電流の印加）が単離された細菌細胞を形質移入するために用いられ得る。また、ポリヌクレオチド配列のマイクロインジェクションによって、単離された細菌細胞を形質移入することが可能となる。また、脂質複合体、リポソームおよびデンドリマーなどの他の手段を用いてもよい。当業者は、これらの方法、または他の方法を用いて、所望の配列によって単離された細菌細胞を形質移入させ得る。
【００７６】
形質転換された細菌細胞を同定するために、種々の方法が利用可能である。例えば、形質転換された可能性のある細菌細胞の培養物は、好適な希釈を用いられ、個々の細胞に分離され、その後、個々に増殖されて、所望のポリヌクレオチド配列の発現について試験され得る。さらに、プラスミドが用いられる場合、よく使用される技術は、発現ベクター内に意図的に含有させた遺伝子（ａｍｐ遺伝子、ｋａｎ遺伝子、ｇｐｔ遺伝子、ｎｅｏ遺伝子、およびｈｙｇ遺伝子など）によって付与された抗菌薬耐性に基づいた細胞の選別を伴う。
【００７７】
いったん単離された細菌細胞を、発現ベクターで形質転換させたら、単離された細菌細胞を増殖させる。本開示の方法は、細胞中の組み換えポリヌクレオチドが発現されるように、単離された細菌細胞を培養することを包含する。光合成独立栄養種の細菌細胞に対し、この工程は、好適な培地で細胞を培養することを必要とする。一般的に、細胞は、適切な培地において、約２５℃〜約３５℃の温度で増殖し得る。本開示の好ましい増殖培地は、ＢＧ−１１培地などの、市販用に調製されている通常の培地である。また、他の特定増殖培地または合成増殖培地が使用されてもよく、光合成独立栄養種の特定の細菌細胞の増殖のための適切な培地が、微生物学または細菌学の技術分野における当業者によって知られているであろう。
【００７８】
本開示のいくつかの局面によると、培養培地は、単離された細菌細胞のための炭素源を含んでいてもよい。当該“炭素源”は、概して、細菌細胞の増殖のための炭素の供給源として利用されるのに適した物質または化合物を指す。炭素源は、種々の形態であり得、ポリマー、炭水化物、酸、アルコール、アルデヒド、ケトン、アミノ酸、ペプチド等が挙げられるが、これらに限定されない。これらとしては、例えば、グルコース、ガラクトース、キシロースおよびアラビノース等の種々の単糖；スクロースおよびラクトース等の二糖；オリゴ糖；多糖；セルロースおよびヘミセルロース等のバイオマスポリマー；飽和または不飽和の脂肪酸；スクシナート；ラクテート；アセテート；エタノール；等；またはこれらの混合物が挙げられる。複数のバイオマスポリマーが、植物バイオマスをイオン性液体で処理することによって生成され得る。次いで、この処理されたバイオマスは培養に添加され得、培養は２つ以上のバイオマスポリマーを含むことになる。本開示の好ましい実施形態において、炭素源は単糖または二糖等の糖基質である。
【００７９】
適切な炭素源に加えて、バイオ燃料を生産するための発酵培地は、培養物の増殖および脂肪酸誘導分子の生産に必要な酵素経路の助長に適した、当業者に公知の適切なミネラル、塩、コファクター、バッファーおよび他の成分を含んでいてもよい。反応は、微生物の要求に基づいて好気条件、無酸素条件または嫌気条件が好ましい、好気条件または嫌気条件下で行われてもよい。単離された細菌細胞が増殖および／または繁殖するにつれて、バイオ燃料等の汎用化学物質を生産するのに必要なタンパク質が発現する。
【００８０】
（細菌細胞の増殖、細胞密度およびバイオマス生産に関する実施形態）
本書に開示されるとおり、糖トランスポータータンパク質の発現は、同一種の野生型または形質転換されていない光独立栄養細菌細胞と比較して、暗条件下または日中条件下における光独立栄養種の細菌細胞の糖基質上での増殖の増加、細胞密度の増加、およびバイオマス生産の増加を生じさせる。
【００８１】
したがって、本開示のある実施形態は、糖トランスポータータンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを含んでいる光独立栄養種の細菌細胞を準備すること；および当該組み換えポリヌクレオチドが発現される条件下で、糖基質を用いて当該細菌細胞を培養することによって、細菌細胞の増殖を増加させる方法であって、当該組み換えポリヌクレオチドの発現は、当該細菌細胞内への当該糖基質の輸送を生じさせて、当該糖トランスポータータンパク質をコードする当該組み換えポリヌクレオチドを有していない対応する同一種の光独立栄養細菌細胞の細胞増殖と比較して、暗条件下または日中条件下における糖上での細胞増殖を増加させる、方法に関する。他の実施形態において、暗条件下または日中条件下における、糖トラスポーターを発現している細菌細胞の糖基質上での増殖は、糖トランスポータータンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを有していない対応する同一種の光独立栄養細菌細胞と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１２５％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、少なくとも１７５％、少なくとも２００％、少なくとも２２５％、少なくとも２５０％、少なくとも２７５％、少なくとも３００％、少なくとも３５０％、少なくとも４００％、少なくとも４５０％、少なくとも５００％、任意のパーセンテージ、５％と５００％との間の整数全て（例えば、６％、７％、８％等）において、またはそれより大きく、増加する。
【００８２】
他の実施形態は、糖トランスポータータンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを含む、光独立栄養種の細菌細胞を準備すること；および当該組み換えポリヌクレオチドが発現される条件下で、糖基質を用いて当該細菌細胞を培養することによって、暗条件下または日中条件下で細菌細胞の密度を増加させる方法であって、当該組み換えポリヌクレオチドの発現は、当該細菌細胞内への当該糖基質の輸送を生じさせて、当該糖トランスポータータンパク質をコードする当該組み換えポリヌクレオチドを有していない対応する同一種の光独立栄養細菌細胞と比較して、暗条件下または日中条件下における細胞密度を増加させる、方法に関する。他の実施形態において、暗条件下または日中条件下における、糖トラスポーターを発現している細菌細胞の糖基質上での細胞密度は、糖トランスポータータンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを有していない対応する同一種の光独立栄養細菌細胞と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１２５％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、少なくとも１７５％、少なくとも２００％、少なくとも２２５％、少なくとも２５０％、少なくとも２７５％、少なくとも３００％、少なくとも３５０％、少なくとも４００％、少なくとも４５０％、少なくとも５００％、任意のパーセンテージ、５％と５００％との間の整数全て（例えば、６％、７％、８％等）において、またはそれより大きく、増加する。
【００８３】
さらなる実施形態は、糖トランスポータータンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを含む、光独立栄養種の細菌細胞を準備すること；および組み換えポリヌクレオチドが発現される条件下で、糖基質を用いて当該光独立栄養細菌細胞を培養することによって、暗条件下または日中条件下で細菌のバイオマス生産を増加させる方法であって、当該組み換えポリヌクレオチドの発現は、当該細菌細胞内への当該糖基質の輸送を生じさせて、当該糖トランスポータータンパク質をコードする当該組み換えポリヌクレオチドを有していない対応する同一種の光独立栄養細菌細胞と比較して、暗条件下または日中条件下におけるバイオマス生産を増加させる、方法に関する。他の実施形態において、暗条件下または日中条件下における、糖トラスポーターを発現している細菌細胞の糖基質上でのバイオマス生産は、糖トランスポータータンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを有していない対応する同一種の光独立栄養細菌細胞と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１２５％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、少なくとも１７５％、少なくとも２００％、少なくとも２２５％、少なくとも２５０％、少なくとも２７５％、少なくとも３００％、少なくとも３５０％、少なくとも４００％、少なくとも４５０％、少なくとも５００％、任意のパーセンテージ、５％と５００％との間の整数全て（例えば、６％、７％、８％等）において、またはそれより大きく、増加する。
【００８４】
他の実施形態において、組み換えポリヌクレオチドは、ヘキソース糖トラスポーター、ガラクトーストラスポーター、グルコーストラスポーター、フルクトーストラスポーター、マンノーストラスポーター、メジャーファシリテイタースーパーファミリー（MFS）トラスポーター、ホスホトランスフェラーゼシステム（PTS）トラスポーター、ペントーストラスポーター、キシローストラスポーター、アラビノーストラスポーター、リボーストラスポーター、リブローストラスポーター、キシルローストラスポーター、およびこれらのホモログから選択される糖トランスポータータンパク質をコードしている。他の実施形態において、組み換えポリヌクレオチドは、スクローストラスポーター、ラクトーストラスポーター、ラクツローストラスポーター、マルトーストラスポーター、トレハローストラスポーター、セロビオーストラスポーター、およびこれらのホモログから選択される糖トランスポータータンパク質をコードしている。細菌細胞が二糖の糖トランスポータータンパク質を含む実施形態において、細菌細胞は、二糖をその対応する単糖に転換するために必要なタンパク質をさらに含んでいてもよい。
【００８５】
ある実施形態において、組み換えポリヌクレオチドは、ガラクトーストランスポータータンパク質をコードしている。さらに他の実施形態において、ガラクトーストランスポータータンパク質は、細菌のgalPトランスポーター、E. coliのgalPトランスポーター、真核生物のgalPトランスポーター、真菌のgalPトランスポーター、哺乳類のgalPトランスポーター、細菌のMFSトランスポーター、真核生物のMFS、真菌のMFS、哺乳類のMFS、細菌のPTSトランスポーター、真核生物のPTS、真菌のPTS、哺乳類のPTS、およびこれらのホモログから選択される。好ましくは、ガラクトーストランスポータータンパク質は、細菌細胞内へグルコースを輸送する。
【００８６】
他の実施形態において、組み換えポリヌクレオチドは、二糖トランスポータータンパク質をコードしている。ある実施形態において、二糖トランスポータータンパク質は、スクローストランスポータータンパク質、フルクトーストランスポータータンパク質、ラクトーストランスポータータンパク質、ラクツローストランスポータータンパク質、マルトーストランスポータータンパク質、トレハローストランスポータータンパク質、セロビオーストランスポータータンパク質、およびこれらのホモログから選択される。好ましくは、二糖トランスポータータンパク質は、スクローストランスポータータンパク質である。より好ましくは、スクローストランスポータータンパク質は、E. coliのCscBスクローストランスポータータンパク質である。さらなる実施形態において、スクローストランスポータータンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを含む本開示の細菌細胞は、本開示のフルクトキナーゼタンパク質をコードする少なくとも１つの追加の組み換えポリヌクレオチドをさらに含む。
【００８７】
他の実施形態において、組み換えポリヌクレオチドは、キシローストランスポータータンパク質をコードしている。ある好ましい実施形態において、キシローストランスポータータンパク質は、E. coliのXylEキシローストランスポータータンパク質である。さらなる実施形態において、キシローストランスポータータンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを含む本開示の細菌細胞は、本開示のキシロースイソメラーゼおよび／またはキシルロキナーゼタンパク質をコードする少なくとも１つの追加の組み換えポリヌクレオチドをさらに含む。ある実施形態において、キシローストランスポータータンパク質、キシロースイソメラーゼおよび／またはキシルロキナーゼタンパク質は、単一の組み換えポリヌクレオチドによってコードされている。好ましくは、キシロースイソメラーゼはE. coliのXylAキシロースイソメラーゼであり、キシルロキナーゼはE. coliのXylBキシルロキナーゼである。
【００８８】
さらなる実施形態において、組み換えポリヌクレオチドは、安定的に細菌細胞のゲノムに組み込まれている。組み換えポリヌクレオチドを安定的に細菌細胞のゲノムに組み込む方法は、当該技術分野において広く知られており、相同組み換えが挙げられるが、これに限定されない。
【００８９】
糖トランスポータータンパク質に加え、本開示の細菌細胞は、第２の糖トランスポータータンパク質、第３の糖トランスポータータンパク質、第４の糖トランスポータータンパク質、第５の糖トランスポータータンパク質、またはそれ以上の糖トランスポータータンパク質をコードしている、少なくとも１つの追加の組み換えポリヌクレオチドも含んでおり、各糖トランスポータータンパク質の発現は細菌細胞内への第２、第３、第４、第５、またはそれ以上の糖の輸送を生じさせてもよい。第２、第３、第４、第５、またはそれ以上の糖トランスポータータンパク質は、第１の糖トランスポーターと同じ種類の糖を輸送してもよいし、第１の糖トランスポーターによって輸送されたものとは異なる糖を輸送してもよい。第２、第３、第４、第５、またはそれ以上の糖トランスポータータンパク質は、開示された糖トランスポーターの何れかであってもよい。
【００９０】
本開示の方法は、糖トランスポータータンパク質を発現している光独立栄養種の細菌細胞を利用する。これらの細菌細胞は、概日周期の暗期の間に増殖するために、炭素源として外因性の糖基質を利用することができる。さらに、糖トランスポータータンパク質を発現している細菌細胞による外因性の糖基質の利用は、細菌細胞によって行われる光合成と両立し、相補的である。この方法で、細菌細胞は１日に２４時間持続的に増殖することができる。外因性の糖基質は、細菌細胞を培養する工程の一部として提供され、また、培養培地において提供されてもよい。
【００９１】
光独立栄養種の細菌細胞を培養する間に添加される適切な糖基質としては、細菌細胞によって発現される糖トランスポータータンパク質によって輸送され得る糖が挙げられる。適切な糖の例としては、ガラクトース、グルコース、フルクトースおよびマンノース等のヘキソース；ならびにキシロース、アラビノース、リボース、リブロースおよびキシルロース等のペントースが挙げられるが、これらに限定されない。適切な糖のさらなる例としては、スクロース、ラクトース、ラクツロース、マルトース、トレハロースおよびセロビオース等の二糖が挙げられる。
【００９２】
さらに、糖基質としては、植物バイオマス、リグノセルロース性バイオマス、バイオマスポリマー、リグノセルロース、セルロース、ヘミセルロース、多糖またはこれらの混合物も挙げられるが、これらに限定されない。そのような組成物の供給源としては、草（例えば、スイッチグラス、茅（Miscanthus））、もみ殻、バガス、綿、ツナソ、ユーカリ、アサ、アマ、タケ、サイザルアサ、マニラアサ、藁、葉、刈り取った草、トウモロコシの茎葉、トウモロコシの穂軸、蒸留穀物、マメ科植物、モロコシ、サトウキビ、糖ビートパルプ、木くず、おがくず、およびバイオマス作物（例えば、Crambe）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、そのような基質の供給源は、精製されていない植物供給原料（例えば、イオン性液体で処理した植物バイオマス）または精製されたバイオマスポリマー（例えば、ブナのキシランまたはリン酸膨張セルロース）であってもよい。
【００９３】
したがって、ある実施形態において、光独立栄養種の細菌細胞は、ヘキソース、ガラクトース、グルコース、フルクトース、マンノース、ペントース、キシロース、アラビノース、リボース、リブロースおよびキシルロースから選択される糖を用いて培養される。他の実施形態において、細菌細胞は、二糖、スクロース、ラクトース、ラクツロース、マルトース、トレハロースおよびセロビオースから選択される糖を用いて培養される。ある好ましい実施形態において、細菌細胞は、グルコースを用いて培養される。
【００９４】
したがって、本開示の光独立栄養種の細菌細胞は、長時間完全な光の非存在下において唯一の炭素源として糖基質を利用することができる細菌の変異体についてスクリーニングすることができる変異体のライブラリーを生成するために、ランダム突然変異誘発によって変異されられていてもよい。ランダム突然変異誘発およびスクリーニングの方法は、当該技術分野において広く知られている。突然ランダム変異誘発の方法の例としては、化学的突然変異誘発および放射線突然変異誘発が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９５】
（汎用化学物質を生産する方法）
本開示のある局面は、汎用化学物質を生産する単離された光独立栄養種の細菌細胞、および、汎用化学物質を生産する方法に関する。汎用化学物質としては、開示の単離された細菌細胞から直接または副産物として生産され得る、販売に適したまたは市場性のある任意の化学製品が挙げられるが、これに限定されない。汎用化学物質の例としては、バイオ燃料、ポリマー、特殊化学製品および医薬品中間体が挙げられるが、これらに限定されない。バイオ燃料としては、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、アセトン、ブタノール、イソブタノール、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、フェニルエタノール、脂肪族アルコールおよびイソペンテノール等のアルコール；アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、２−メチル−１−ブタナール、３−メチル−１−ブタナール、フェニルアセトアルデヒドおよび脂肪族アルデヒド等のアルデヒド；アルカン、アルケン、イソプレノイド、脂肪酸、ワックスエステルおよびエチルエステル等の炭化水素；ならびに水素等の無機燃料が挙げられるが、これらに限定されない。ポリマーとしては、２，３−ブタンジオール、１，３−プロパンジオール、１，４−ブタンジオール、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリヒドロキシブチレートおよびイソプレンが挙げられるが、これらに限定されない。特殊化学製品としては、リコペン、β−カロテン等のカロテノイドが挙げられるが、これらに限定されない。医薬品中間体としては、ポリケチド、スタチン、ω−３ 脂肪酸、イソプレノイド、ステロイドおよびエリスロマイシン（抗生物質）が挙げられるが、これらに限定されない。汎用化学物質のさらなる例としては、ラクテート、スクシネート、グルタメート、シトレート、マレート、３−ヒドロキシプロピオネ−ト、アスコルベート、ソルビト−ル、アミノ酸（ロイシン、バリン、イソロイシン等）およびヒドロキシブチレ−トが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９６】
いくつかの実施形態において、本開示の単離された細菌細胞は、所望の汎用化学物質の生産のための任意の前駆体を天然に生産する。所望の酵素をコードするこれらの遺伝子は、単離された細菌細胞と異種起源であってもよいし、これらの遺伝子は、単離された細菌細胞に内因性であるが、細菌細胞において遺伝子の発現を高める異種起源のプロモーターおよび／または制御領域に作用可能に連結されていてもよい。例えば、ある実施形態において、本開示の単離された細菌細胞は、糖の消化に関わる代謝遺伝子（解糖回路の遺伝子、ペントースリン酸回路の遺伝子、およびトリカルボン酸回路の遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない）を過剰発現するためにさらに改変されていてもよい。
【００９７】
他の実施形態において、本開示の単離された細菌細胞は、所望の汎用化学物質を天然には生産せず、それゆえ所望の汎用化学物質を生産するために必要な１つ以上の遺伝子を発現することができる異種起源のポリヌクレオチド構成物を含む。細菌細胞に汎用化学物質を生産させるそのような異種起源の遺伝子の例は、ＰＣＴ公報ＷＯ２０１０／０７１５８１号、ならびに米国特許出願公開第２０１０／００６８７７６号および第２０１１／００５３２１６号において開示されている。
【００９８】
さらに、本開示の単離された細菌細胞は、例えば、Zymomonas mobilis由来のピルビン酸デカルボキシラーゼ（pdc）およびアルコールデヒドロゲナーゼ（adhB）（またはそれらのホモログ）を発現することによってエタノールを生産するよう改変されていてもよい。本開示の単離された細菌細胞はまた、例えば、Bacillus subtilis由来の２−アセトラクテートシンターゼ（alsS）、Escherichia coli由来のアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（ilvC）およびジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ilvD）、ならびにLactococcus lactis由来の２−ケトイソバレリン酸デカルボキシラーゼ（kivd）を発現することによってイソブチルアルデヒドを生産するよう改変されていてもよい。本開示の単離された細菌細胞はさらに、例えば、Escherichia coli由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（yqhD）と共にイソブチルアルデヒドの生産に寄与する全ての遺伝子を発現することによってイソブタノールを生産するよう改変されていてもよい。さらに、本開示の単離された細菌細胞は、例えば、Lactococcus lactis由来の２−ケトイソバレリン酸デカルボキシラーゼ（kivd）およびEscherichia coli由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（yqhD）を発現することによって他の高次鎖アルコール（１−プロパノール、１−ブタノール、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノールおよび２−フェニルエタノール等）を生産するよう改変されていてもよい。
【００９９】
本開示はまた、本開示の方法から生産された汎用化学物質を単離するために提供される。汎用化学物質を単離することは、単離された汎用化学物質から、汎用化学物質が生産された、単離された細菌細胞の少なくとも一部または全部、およびその一部を分離することを含む。単離された汎用化学物質は、細菌細胞の少なくとも一部または全部、およびその一部から形成された不純物を含まないか、または基本的に含まないものであり得る。残存している不純物の量および特性が単離された汎用化学物質の使用に干渉しない場合、当該単離された汎用化学物質はこれらの不純物を基本的に含まない。
【０１００】
したがって、ある実施形態において、本開示の糖トランスポータータンパク質を含む単離された光独立栄養種の細菌細胞は、当該細菌細胞が少なくとも１種類の汎用化学物質を生産するために必要なタンパク質をさらに含んでいる。ある実施形態において、単離された細菌細胞は、少なくとも１種類の汎用化学物質を生産する。
【０１０１】
本開示の他の局面は、糖トランスポータータンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを含む光独立栄養種の細菌細胞を準備すること；組み換えポリヌクレオチドが発現される条件下、および少なくとも１種類の汎用化学物質が生産される条件下で、糖基質を用いて当該細菌細胞を培養すること；および少なくとも１種類の汎用化学物質を回収することによって、少なくとも１種類の汎用化学物質を生産する方法であって、当該組み換えポリヌクレオチドの発現は当該細菌細胞内への糖基質の輸送を生じさせる、方法に関する。ある実施形態において、細菌細胞は、当該細菌細胞が少なくとも１種類の汎用化学物質を生産するために必要なタンパク質を含んでいる。例示的な糖トランスポータータンパク質および糖基質は、前のセクションに記載されているとおりである。細菌細胞が二糖の糖トランスポーターを発現する実施形態において、細菌細胞は、二糖をその対応する単糖に転換するために必要なタンパク質をさらに含んでいてもよい。他の実施形態において、組み換えポリヌクレオチドは、細菌細胞のゲノム中に安定的に組み込まれている。さらに他の実施形態において、細菌細胞は、第２の糖トランスポータータンパク質、第３の糖トランスポータータンパク質、第４の糖トランスポータータンパク質、第５の糖トランスポータータンパク質、またはそれ以上の糖トランスポータータンパク質をコードする少なくとも１つの追加の組み換えポリヌクレオチドをさらに含んでおり、各糖トランスポータータンパク質の発現は細菌細胞内への第２、第３、第４、第５、またはそれ以上の糖の輸送を生じさせる。第２、第３、第４、第５、またはそれ以上の糖トランスポータータンパク質は、第１の糖トランスポーターと同じ種類の糖基質を輸送してもよいし、第１の糖トランスポーターによって輸送されたものとは異なる糖基質を輸送してもよい。第２、第３、第４、第５、またはそれ以上の糖トランスポータータンパク質は、開示された糖トランスポーターの何れかであってもよい。
【０１０２】
本書に開示されているとおり、糖トランスポータータンパク質（ガラクトーストランスポータータンパク質、二糖トランスポータータンパク質、またはキシローストランスポータータンパク質等）の発現によって、細菌細胞は暗条件下で汎用化学物質を持続的に生産する。すなわち、細菌細胞は、日中は光合成を利用し、夜の間（すなわち、暗いところにおいて）は外因的に供給された糖基質を炭素源として利用することによって、汎用化学物質を生産する。そして今度は、これにより、細菌細胞は、少なくとも１種類の汎用化学物質を１日に２４時間持続的に生産する。このように、ある実施形態において、細菌細胞は暗条件下で少なくとも１種類の汎用化学物質を持続的に生産する。好ましくは、少なくとも１種類の汎用化学物質は、１日に２４時間持続的生産される。
【０１０３】
他の実施形態において、少なくとも１種類の生産された汎用化学物質は、ポリマー、２，３−ブタンジオール、１，３−プロパンジオール、１，４−ブタンジオール、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリヒドロキシブチレート、イソプレン、ラクテート、スクシネート、グルタメート、シトレート、マレート、３−ヒドロキシプロピオネ−ト、アスコルベート、ソルビト−ル、アミノ酸、ヒドロキシブチレ−ト、カロテノイド、リコペン、β−カロテン、医薬品中間体、ポリケチド、スタチン、ω−３ 脂肪酸、イソプレノイド、ステロイド、抗生物質、エリスロマイシン、ソプレノイド、ステロイド、エリスロマイシン、バイオ燃料、およびこれらの組み合わせから選択される。さらなる実施形態において、生産された汎用化学物質は、アルコール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、アセトン、ブタノール、イソブタノール、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、フェニルエタノール、脂肪族アルコール、イソペンテノール、アルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、２−メチル−１−ブタナール、３−メチル−１−ブタナール、フェニルアセトアルデヒド、脂肪族アルデヒド、炭化水素、アルカン、アルケン、イソプレノイド、脂肪酸、ワックスエステル、エチルエステル、水素、およびこれらの組み合わせから選択されるバイオ燃料である。
【０１０４】
（補足的な情報）
本開示の実施は、特に断りがない限り、当該分野の技術の範囲内にある分子生物学（組み換え手法が挙げられる）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の手法を利用する。当該手法は、文献（例えば、分子クローニング：A Laboratory Manual, second edition（Sambrook et al., 1989）；オリゴヌクレオチド合成（Gait, ed., 1984）；動物細胞培養（Freshney, ed., 1987)）；実験免疫学のハンドブック（Weir & Blackwell, eds.）；哺乳類細胞用の遺伝子導入ベクター（Miller & Calos, eds., 1987）；分子生物学における現行のプロトコル（Ausubel et al., eds., 1987）；ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応（Mullis et al., eds., 1994）；免疫学における現行のプロトコル（Coligan et al., eds., 1991）；免疫アッセイハンドブック（Wild ed., Stockton Press NY, 1994；生物複合物技術（Hermanson, ed., Academic Press, 1996）；および;免疫学的アッセイの方法（Masseyeff, Albert, and Staines, eds., Weinheim: VCH Verlags gesellschaft mbH, 1993）において十分に説明されている。
【０１０５】
タンパク質をコードしている核酸配列が他のタンパク質をコードしている核酸配列に対して類似の配列を有している場合に、当該タンパク質は、当該他のタンパク質に対して、「相同性」を有しているか、または「相同」である。代替的に、２つのタンパク質が類似のアミノ酸配列を有している場合に、タンパク質は、他のタンパク質に対して相同性を有している。したがって、「ホモログタンパク質」という用語は、２つのタンパク質が類似のアミノ酸配列を有していることを意味すると定義づけられる。
【０１０６】
本明細書に使用されるとき、２つのタンパク質（すなわちタンパク質の領域）は、アミノ酸配列が少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有している場合に、実質的に相同である。同様に、２つのポリヌクレオチド（すなわちポリヌクレオチドの領域）は、核酸配列が少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有している場合に、実質的に相同である。２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するために、配列は、最適な比較目的のために整列化される（例えば、ギャップが、最適な整列化のために、第１および第２のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方に導入され得、非相同性の配列が、比較目的のために無視され得る）。対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドが、それから比較される。第１の配列における位置が、第２の配列の対応する位置において同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められているそのとき、複数の分子は、その位置において同一である（本明細書に使用されるとき、アミノ酸「同一性」または核酸「同一性」は、アミノ酸「相同性」または核酸「相同性」に等しい）。２つの配列の間におけるパーセント同一性は、当該２つの配列の最適な整列化のために導入される必要のあるギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、当該配列によって共有されている同一の位置の数の相関関係である。
【０１０７】
２つの配列の間におけるパーセント同一性は、２つの配列の最適な整列化のために導入される必要のあるギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、当該配列によって共有されている同一の位置の数の相関関係である。配列比較のために、１つの配列は、試験配列が比較される基準配列としての役割を典型的に果たす。配列比較アルゴリズム用いる場合、試験配列および基準配列がコンピュータに入力され、必要に応じて部分列調整が指定され、配列アルゴリズムプログラムが指定される。初期設定のプログラムパラメータが使用され得るか、または代替のパラメータが指定され得る。それから、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、基準配列に対する試験配列についてのパーセント配列同一性を算出する。２つの配列を同一性について比較する場合、当該配列は、連続的である必要はないが、いずれのギャップも全体のパーセント同一性を低下させるペナルティをもたらす。blastnについて、初期設定のパラメータは、ギャップ開始ペナルティ＝５、およびギャップ伸長ペナルティ＝２である。blastpについて、初期設定のパラメータは、ギャップ開始ペナルティ＝１１、およびギャップ伸長ペナルティ＝１である。
【０１０８】
本明細書に使用されるとき、「比較領域」は、２つの配列が最適に整列化された後に同じ数の連続する位置の基準配列と配列が比較され得る２０〜６００、通常には約５０〜約２００、より通常には約１００〜約１５０からなる群から選択される連続する位置の数のいずれか１つの部分に対する参照を包含している。比較のための配列の整列化の方法は、当該分野においてよく知られている。比較のための配列の最適な整列化は、知られているアルゴリズムを用いて（例えば、Smith and Waterman, Adv Appl Math, 2:482, 1981の部分的な相同性アルゴリズム；Needleman and Wunsch, J Mol Biol, 48:443, 1970の相同性整列化アルゴリズム；Pearson and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA, 85:2444, 1988の類似性方法のための検索；これらのアルゴリズム（Wisconsin Genetics Software Package（Genetics Computer Group, Madison, WI）におけるFASTDB（Intelligenetics）、BLAST（National Center for Biomedical Information）、GAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA）のコンピュータ化された実行、または手動の整列化および目視検査によって）導入され得る。
【０１０９】
パーセント配列同一性およびパーセント配列類似性を決定するために好適なアルゴリズムの好ましい例は、FASTAアルゴリズム（Pearson and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA, 85:2444, 1988; and Pearson, Methods Enzymol, 266:227-258, 1996）である。パーセント同一性を算出するために、ＤＮＡ配列のFASTA整列化に使用される好ましいパラメータは、BL50 Matrix 15：−２、ｋ−タプル（tuple）＝２；連結ペナルティ＝４０、最適化＝２８；ギャップペナルティ−１２、ギャップ長ペナルティ＝２；および幅＝１６に最適化されている。
【０１１０】
パーセント配列同一性およびパーセント配列類似性を決定するためのアルゴリズムの好ましい他の例は、BLASTアルゴリズムおよびBLAST 2.0アルゴリズム（それぞれ、Altschul et al., Nuc Acids Res, 25:3389-3402, 1977; and Altschul et al., J Mol Biol, 215:403-410, 1990）である。BLASTおよびBLAST 2.0は、本開示の核酸およびタンパク質についてのパーセント配列同一性を決定するために、本明細書に記載のパラメータを用いて使用される。BLAST解析を実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationのウェブサイトを介して一般に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列における同じ長さのワードを用いて整列化されたときに正に評価される閾値スコアＴの一部と一致するか、または当該一部を満たす、クエリ配列における長さＷの短いワードを同定することによって、高得点の配列対（ＨＳＰ）を同定することにまず関する。Ｔは、近傍ワードスコア閾値と呼ばれる。これらの初期の近傍ワードヒットは、それらを含んでいるより長いＨＳＰを見出すための検索を開始させるシードとしての役割を果たす。ワードヒットは、累積整合スコアが上昇する限り、各配列の両方向に沿って伸長される。累積スコアは、パラメータＭ（一致する残基の対についての報酬スコア；常に０を超える）およびＮ（不一致の残基についてのペナルティスコア；常に０未満）を用いて、ヌクレオチド配列について算出される。アミノ酸配列について、採点マトリクスは、累積スコアを算出するために使用される。各方向におけるワードヒットの伸長は、累積整合スコアが、その最大の獲得値から数Ｘまで低下するか；１つ以上の負に採点される残基の整列化の蓄積によって、累積スコアが０以下になるか；またはいずれかの配列の末端に達すると、中止される。BLASTアルゴリズムのパラメータＷ、ＴおよびＸは、整列化の感度および速度を決定する。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列用）は、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を初期値として使用する。アミノ酸配列について、BLASTPプログラムは、３のワード長、１０の期待値（Ｅ）、５０のBLOSUM62採点マトリクス（Henikoff and Henikoff, Proc Natl Acad Sci USA, 89:10915, 1989）整列化（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両方の鎖の比較を初期値として使用する。
【０１１１】
また、BLASTアルゴリズムは、２つの配列の間における類似性の統計分析を実施する（例えば、Karlin and Altschul, Proc Natl Acad Sci USA, 90:5873-5787, 1993を参照）。BLASTアルゴリズムによって与えられる類似性の１つの基準は、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間における一致が偶然に生じる確率の指標を規定する最小和確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、核酸は、基準核酸に対する試験核酸の比較における最小和確率が約０．２未満、より好ましくは０．０１、最も好ましくは０００．１である場合に、基準配列と類似するとみなされる。
【０１１２】
有用なアルゴリズムの他の例はPILEUPである。PILEUPは、関連性およびパーセント配列同一性を示すために、対をなす連続的なアラインメントを用いて、関連する配列の一群から複数の配列アラインメントを生成する。また、PILEUPは、アラインメントを生成するために使用された集団化の関連性を示す樹形図または系統樹をプロットする。PILEUPは、公開済の方法と類似する方法（Feng and Doolittle, J Mol Evol, 35:351-360, 1987）を採用している、連続的な整列化方法（Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-153, 1989）の簡易化を利用する。プログラムは、それぞれ５０００の最大長のヌクレオチドまたはアミノ酸の３００配列まで整列化し得る。多重の配列化手順は、２つの整列化された配列の集団を生成する、最も類似する２つの配列の、対をなす配列化によって始まる。この集団は、それから、次に最も関連する配列または整列化された配列の集団に対して、整列化される。配列の２つの集団は、個々の２つの配列の、対をなすアラインメントの単純な伸長によって整列化される。最終的な整列化は、対をなす連続的な一連のアラインメントによって実現される。プログラムは、特定の配列、および配列比較の領域についてのそれらのアミノ酸もしくはヌクレオチドの座標を指定すること、ならびにプログラムのパラメータを指定することによって実行される。PILEUPを用いれば、基準配列は、以下のパラメータ：初期設定のギャップ加重（３．００）、初期設定のギャップ長加重（０．１０）、および加重された末端ギャップを用いて、パーセント配列同一性を決定するために他の試験配列と比較される。PILEUPは、GCG配列分析ソフトウェアパッケージ（例えば、バージョン７．０（Devereaux et al., Nuc Acids Res, 12:387-395, 1984））から入手され得る。
【０１１３】
複数のＤＮＡ配列アラインメントおよびアミノ酸配列アラインメントにとって好適なアルゴリズムの好ましい他の例は、CLUSTALWプログラム（Thompson et al., Nucl Acids. Res, 22:4673-4680, 1994）である。ClustalWは、配列の複数の群の間における、対をなす比較を実施し、相同性に基づいて複数のアラインメントにそれらを集合させる。ギャップ開始ペナルティおよびギャップ伸長ペナルティは、それぞれ１０および０．０５であった。アミノ酸配列の整列化のために、アルゴリズムが、タンパク質加重マトリクス（Henikoff and Henikoff, Proc Natl Acad Sci USA, 89:10915-10919, 1992）として使用され得る。
【０１１４】
本開示のポリヌクレオチドは、表４の遺伝子ならびに配列番号１〜１６の核酸配列およびアミノ酸配列によってコードされているポリペプチドの保存的に変更されたバリアントをコードしているポリヌクレオチドをさらに包含している。本明細書に使用されるとき、「保存的に変更されたバリアント」は、化学的に類似のアミノ酸との、アミノ酸の置換を生じる個々の変異を含んでいる。機能的に類似のアミノ酸を示す保存的置換の表は、当該分野においてよく知られている。そのような保存的に変更されたバリアントは、さらに、本開示の多形バリアント、種間相同物および対立遺伝子を除外しない。以下の８つの群は、互いにとって保存的な置換であるアミノ酸を含んでいる。１．アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２．アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３．アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４．アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５．イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６．フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７．セリン（Ａ）、スレオニン（Ｔ）；および８．システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）。
【０１１５】
核酸またはタンパク質に対する言及に使用されるとき、「由来する」または「の」という用語は、その配列が所定の生物の核酸またはタンパク質と同一であるか、または実質的に同一であることを示す。
【０１１６】
細菌に対する言及に使用されるとき、「対応する」という用語は、所定の細菌と同じ属および種の細菌を指す。例えば、ガラクトーストランスポータータンパク質をコードしている組み換えポリヌクレオチドを含んでいるS. elongates細胞について、「対応する細菌」は、当該組み換えポリヌクレオチドを欠いている（例えば、またはそうでなければガラクトーストランスポータータンパク質を発現しない）S. elongates細胞（野生体、親、または類似物）である。
【０１１７】
生物学的な機能（例えば、酵素活性、化合物の生成、タンパク質発現など）に対する言及に使用されるとき、「減少（する）（decrease）」、「低減する（reduce）」または「低減（reduction）」という用語は、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも５０％、より一層好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９０％までの測定可能な減少を指す。低減は、機能に応じて１０％〜１００％であり得る。「実質的な低減」などという用語は、少なくとも５０％、７５％、９０％、９５％または１００％の低減を指す。
【０１１８】
「増加（する）（increase）」、「向上させる（elevate）」または「向上（elevation）」という用語は、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも５０％、より一層好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９０％までの測定可能な増大を指す。向上は、機能に応じて１０％〜１００％；または少なくとも１０倍、１００倍、１００倍〜１０００倍、または１０００倍〜１００００倍以上であり得る。「実質的な向上」などという用語は、少なくとも５０％、７５％、９０％、９５％または１００％の向上を指す。
【０１１９】
本明細書に使用されるとき、「単離された」および「精製された」という用語は、天然に関連している少なくとも１つの成分から移動させられている（例えば、本来の環境から取り出されている）材料を指す。生合成によって生成された化学物質に言及されるとき、「単離された」という用語は、化学物質を産生した細菌の培養培地から取り出されている化学物質を指す。したがって、単離された化学物質は、異質な化合物または所望されない化合物（例えば、基材分子、細菌構成要素など）を含んでいない。
【０１２０】
本明細書に使用されるとき、単数形「a」、「an」および「the」は、特に断りがない限り、複数への言及を包含している。例えば、「a」ガラクトーストランスポータータンパク質は、１つ以上のガラクトーストランスポータータンパク質を包含している。
【０１２１】
本明細書に使用されるとき、「含んでいる」という表現は、制限を設けられておらず、そのような実施形態はさらなる要素を含み得る。一方、「からなる」という表現は、閉じられており、そのような実施形態は、さらなる要素（微量の不純物を除く）を含み得ない。「から実質的になる」とう表現は、部分的に閉じられており、そのような実施形態は、当該実施形態の基本的な特性を実質的に変更しない要素をさらに含み得る。「含んでいる」と本明細書に記載されている複数の局面および実施形態は、複数の局面および実施形態「からなる」および／または「から実質的になる」を包含していると理解される。
【０１２２】
本明細書に開示されている組成物および方法は、それらの好ましい実施形態と関連して説明されており、以上の記載は、例示を目的としており、添付の特許請求の範囲に規定されている通りのその範囲を、限定しないと理解される。添付の特許請求の範囲に規定されている通りのその範囲内における他の局面、利点および変更は、本開示に属する分野の当業者にとって明らかである。
【０１２３】
以下の実施例は、単なる例示であり、本開示の任意の局面を限定することを決して意図されていない。
【実施例】
【０１２４】
〔実施例１：Synechococcus elongatus PCC7942におけるグルコーストランスポータータンパク質の発現〕
シアノバクテリア等の光独立栄養性の細菌細胞は、汎用化学物質（バイオ燃料が挙げられる）への再生可能な太陽エネルギーの変換のためのプラットフォームとして改良され得る。この変換を行うために、モデルのシアノバクテリアである、Synechococcus elongatus PCC7942は、ソブチルアルデヒドおよびイソブタノールを生成させるために以前に改変された（国際公開第２０１０／０７１８５１号参照）。しかし、S. elongatusは絶対光栄養生物であり、増殖に対しては、光合成的に得られるエネルギーの生成に厳密に依存しており、そのために光エネルギーの非存在下ではバイオマスまたは生成物の形成が不可能である。シアノバクテリアの任意の燃料変換に対し経済的に競合できるようになるには、光エネルギーが太陽から供給されなければならないため、光エネルギーは１日当たり約９時間から１６時間の間しか利用できない。このシナリオを改善するために、３つのS. elongatus株を、夜間（すなわち概日周期の暗期）、グルコース、スクロース、およびキシロースのそれぞれにおいて増殖するように改良した。グルコース、スクロース、およびキシロースを夜間に利用するために、グルコース、スクロース、およびキシロース特異的な糖トランスポータータンパク質をそれぞれS.elongatus PCC7942に導入した。
【０１２５】
（材料および方法）
試薬。シグマアルドリッチ（セントルイス、ＭＯ）から糖類である、グルコース、フルクトース、スクロース、およびキシロースを入手した。フィッシャー・サイエンティフィック（ハノバーパーク、ＩＬ）からＩＰＴＧを入手した。ＮＥＢ（イプスウィッチ、ＭＡ）からＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼを入手した。EMD4Biosciences（サンディエゴ、ＣＡ）からＫＯＤポリメラーゼを入手した。ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ（サンタナ、ＣＡ）から、スペクチノマイシンを入手した。Integrated DNA Technologies, Inc（サンディエゴ、ＣＡ）で、オリゴヌクレオチドを合成した。
【０１２６】
培養条件。全てのシアノバクテリア株を、３０℃でＢＧ−１１培地（Rippka R, et al., （1979） Journal of General Microbiology 111（1）:1-61）において増殖させた。培養物を、５６ｃｍｘ３６ｃｍｘ７６ｃｍの寸法のカスタムキャビネット内で維持した。このキャビネットに、Veriluxの、２６ワットの定格値の２つのCFLnatural spectrum bulbを設置した。光の蛍光比率は２５μＥｓ−１ｍ−２であった。振盪機を、１００ｒｐｍの設定で振盪を維持させた。日中の実験のための前培養物を、適切な概日リズムを確実にするするために、日中の光条件において、少なくとも７２時間維持した。増殖アッセイには、３０ｍＬ試験管中で総容積１０ｍＬの培養物を使用した。細胞増殖をＯＤ７３０を測定することによって監視した。
【０１２７】
Synechococcus elongatus（S. elongates）株を用いた増殖アッセイのために、対数期における細胞を、２０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシンおよび０．１ｍＭのＩＰＴＧを含んでいる１０ｍＬのＢＧ−１１の培地中で、ＯＤ７３００．２まで希釈した。野生型のアッセイでは、スペクチノマイシンを抜いた。
【０１２８】
コンタミネーションのための試験アッセイに対しては、明視野顕微鏡を利用した。初めから終わりまでの一定の体積を確実にするために、ペトロフハウザー・カウンティングチャンバのスライド中で細胞を計数した。カウンティングチャンバーを無作為に選択し、緑色の細胞対無色の細胞を計数した。全ての報告した結果について、緑色細胞はｎ≧５００である培養物の９９％を超えていた。
【０１２９】
プラスミド構築。実施例１で使用した全てのS. elongatus株およびプラスミドを、表１に記載している。使用した全てのプライマーを、表２に記載している。
【０１３０】
【表１】
2015530117.tif 000003
【０１３１】
【表２】
2015530117.tif 000004
【０１３２】
galP、xylE、xylA、およびxylB遺伝子をE.coliのゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）から単離した。glcP遺伝子をSynechocystis sp.PCC6803のｇＤＮＡ（ＡＴＣＣ）から単離した。cscB遺伝子およびcscK遺伝子をE.coliのATCC700927（ＡＴＣＣ）のｇＤＮＡから単離した。glut1遺伝子をヒト赤血球から単離した。各遺伝子のＧｅｎｅＩＤ登録番号およびヌクレオチド配列を表３に記載している。
【０１３３】
【表３】
2015530117.tif 000005
【０１３４】
galP遺伝子を、ＭＣ１２７およびＭＣ１２８プライマーを用いて増幅し、ＭｆｅＩおよびＢｇＩＩＩによって消化し、そしてＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩによって消化したｐＡＭ  ２９９１とライゲートして、ｐＡＬ４０を作製した。xylE遺伝子を、ＪＭ０５およびＪＭ０６から増幅し、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩによって消化し、同様の酵素によって消化されたｐＡＭ２９９１とライゲートして、ｐＡＬ６５を作製した。xylAB遺伝子を、ＪＭ０７およびＪＭ０８を用いて増幅し、ＡｖｒＩＩおよびＢａｍＨＩによって消化し、そして同様に消化されたｐＡＬ６５とライゲートして、ｐＡＬ７０を作製した。glcP遺伝子を、ＭＣ１７０およびＭＣ１７１を用いて増幅し、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩによって消化し、同様に消化されたｐＡＭ２９９１とライゲートして、ｐＡＬ４６を作製した。cscBおよびcscK遺伝子を、ＪＭ５５およびＪＭ５６によって増幅し、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩによって消化し、同様に消化されたｐＡＭ２９９１とライゲートして、ｐＡＬ２８９を作製した。
【０１３５】
S. elongatus染色体からglgC遺伝子を欠失させるために、ｐＡＬ８２プラスミドを構築した（図３）。相同組み換えのための領域（５９０，４５９〜５９３、７５１）を、プライマーＧＲ００５およびＧＲ００６を用いてS. elongatusのｇＤＮＡから増幅した。生成物を、ＸｈｏＩおよびＭｌｕＩによって消化し、同様の酵素によって消化されたｐＳＡ６９（Atsumi S et al., (2008) Nature 451(7174):86-89）とライゲートした。プライマーＩＭ５７３およびＩＭ５７４とともに、ＰＣＲテンプレートとしてｐＢＢＲ１ＭＣＳ−５（Kovach Me et al., (1994) Biotechniques 16(5):800-802）を使用し、ゲンタマイシン耐性遺伝子をクローニングした。ＰＣＲ産物をＳａｌＩおよびＮｈｅＩによって消化し、同様の酵素で切断されたｐＧＲ０１とライゲーシトして、ｐＡＬ８２を作製した。
【０１３６】
S. elongatesの形質転換。S. elongatesの形質転換を、以前に記載されているように行った（Golden S et al., (1987) Methods Enzymol 153:215-246）。新しい選択プレートへコロニーを移すことによって株を数回分離させた。ＮＳＩにおける染色体への標的遺伝子の組み込みを実証するために、正しい組み換えをＰＣＲによって確認した。使用した株および作成した株を表１に記載している。
【０１３７】
共焦点顕微鏡。すべての共焦点顕微鏡のイメージを、Olympus America FV1000 systemを用いて撮影した。４８８ｎｍのレーザーをすべての変異体の励起に使用した。発光フィルタを５００ｎｍ〜６００ｎｍに設定した。ピンホールの開口を１００μｍに設定した。レーザー％を、１１．５％に設定した。細胞をイメージングのためのガラス底培養皿に配置した。
【０１３８】
プレートリーダーＧＦＰアッセイ。すべてのＧＦＰアッセイを、Microtek Synergy H1 plate reader（BioTek）を用いて行った。ＢＧ−１１培地のみをブランクとして使用し、励起波長および発光波長をそれぞれ４８５ｎｍおよび５２８ｎｍに設定した。
【０１３９】
グルコースおよびキシロースの消費アッセイ。培養培地中のグルコースおよびキシロースの濃度を、Aminex HPX-87 column（Bio-Rad）および屈折率検出器を備えた高速液体クロマトグラフィー（島津）によって測定した。試料を、FiltrEX filter 96 plates （Corning）を用いて遠心分離し、濾過した。
【０１４０】
（結果）
グルコース上での増殖。 Synechococcus elongatus（S. elongates）の細胞における、糖の効率的な取り込みを誘導することによる、暗条件下でのS. elongatesの増殖能を測定した。グルコースは、グリコーゲンの形態においてS. elongatusにおける一般的なエネルギー貯蔵分子である（Smith AJ （1983） Ann Microbiol （Paris） 134B（1）:93-113）。グリコーゲンは、代謝の明期の間中に細胞内に蓄積され、続いて、暗期の間中、重要な化学プロセスを維持するためのエネルギー源として使用される（Smith AJ (1983) Ann Microbiol (Paris) 134B(1):93-113）。そのため、内在性のグルコースの分解のために必要とされるすべての遺伝子は、S. elongatusに存在するはずである。
【０１４１】
S. elongatusにおいて従属栄養形式に作り変えるために、S. elongatusに従属栄養形式を付与する試みにおいて糖トランスポータータンパク質をコードしている、ホモログ遺伝子を利用した。S. elongatus細胞の染色体内で、個々の様々な生物からの３つのグルコーストランスポータータンパク質を組み込んだ（図１）。３つのトランスポータータンパク質は、Synechocystis sp.ＰＣＣ６８０３由来のＧｌｃＰトランスポータータンパク質（Zhang CC et al., (1989) Mol Microbiol 3（9）:1221-1229）、Escherichia coli由来のＧａｌＰトランスポータータンパク質（Hernandez-Montalvo V et al., (2003) Biotechnol Bioeng 83(6):687-694）、およびヒト赤血球由来のＧａｌＰトランスポータータンパク質（Mueckler M et al., (1985) Science 229(4717):941-945）であった。S. elongatusの染色体のニュートラルサイトＩ（ＮＳＩ）において、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性プロモーターＰｔｒｃの制御下に各遺伝子を組み込んだ（図１Ａ）。結果とした得られた３つの株の増殖および野生型コントロールを、グルコースの存在下および非存在下で培養し、日中の照明条件下で測定した（図１Ｂおよび１Ｃ）。
【０１４２】
galP株。細胞外のグルコース上で増殖可能な株と増殖不可能な株との間の増殖差を拡大するために、ＣＯ２の量および光強度を制限するように条件を設定した（２５μＥ／ｍ２／ｓ）。ＯＤ７３０に基づく野生型S. elongatusの増殖率の基底値は、光サイクル間（４８〜６９ｈ）で０．１６１日−１であり、暗サイクル間では増殖しなかった（図１Ｂおよび表４）。野生型コントロールは、光の存在下でグルコースを用いて培養した場合、より高い割合（０．２０４日−１）で増殖したが、暗サイクル間では増殖を示さなかった（図１Ｂ）。すべての期間における増殖率を表４に記載している。顕微鏡解析（１０００ｘ）において、グルコースの存在または非存在下において、増殖した細胞のサイズおよび形状等の細胞形態の変化は検出されなかった。
【０１４３】
表４において、日中条件の間のＯＤ７３０から増殖率を算出した。すべての増殖率は日−１で記した。表で、“±”は標準偏差を示す。０．０５０日−１未満に算出される任意の増殖率は有意でないと見做し、未検出（ｎｄ）として表中に示した。表中で、“Ｌ”は光条件、“Ｄ”は暗条件、“ＯＥ”は過剰発現、“ＫＯ”は欠失、“Ｘｙｌ”はキシロース、“Ｇｌｃ”はグルコース、“Ｓｕｃ”はスクロースおよび“ｎ／ａ”は未解析に対応している。
【０１４４】
【表４】
2015530117.tif 000006
【０１４５】
グルコースの存在下で培養した場合、増殖の一定した増加を示した唯一の組み換えS. elongatus株は、GalPトランスポータータンパク質を発現している株であった（図１Ｂ）。
【０１４６】
野生型コントロールと比較して増加した増殖に加え、GalPトランスポータータンパク質（galＰ株）を発現している株は、野生型コントロールが増殖を示していない（ＯＤ７３００．４未満）暗サイクル間であっても増殖を示した（ＯＤ７３０約１）（図１Ｂおよび１Ｃ）。光条件下でグルコースとともに培養した場合、galP株の増殖率は０．５４０日−１であり、暗条件下でグルコースとともに培養した場合の増殖率は０．１９９日−１であった。galP株の増殖率は、グルコースの存在下における光条件下で、同様の条件下で増殖した野生型コントロール（０．２０４日−１）よりも１６４％高かった。しかし、９６時間後のgalP株のグルコース消費は、ＨＰＬＣ分析によって検出が不可能であった。実験の間、バイオマスの乾燥重量は０．１ｇ／Ｌのみ増加した。
【０１４７】
glcPおよびglut1株。GlcPトランスポータータンパク質を含んでいる株は、初めの光サイクルの間は良好な増殖を示したが、続くサイクルでは増殖が停止した（図１Ｃ）。この結果は従来の結果と一致している（Zhang C-C et al., (1998) FEMS Microbiol Lett 161(2):285-292; and Stebegg R et al., (2012) J Bacteriol 194（17）:4601-4607）。さらに、Ｇｌｕｔ１トランスポータータンパク質を含んでいる株は増殖不全を示した（図１Ｃ）。すべての増殖アッセイは、コンタミネーションがないことを顕微鏡解析によって確認した。上記の結果は、S. elongatusは、いったんグルコースが細胞内へ輸送されると、増殖のためにグルコースを代謝し得ることを証明している。
【０１４８】
galP−△glgC株。S. elongatusは本来グリコーゲンの形態で固定された炭素を天然に蓄積するため（Stanier R （1975）Biochem Soc Trans 3（3）:352-359）、輸送されたグルコースのある部分は細胞増殖に貢献する代わりに補足され、貯蔵されると仮定した。この可能性を試験するために、galP株（galP−△glgC株）および野生型コントロールの両方から、グリコーゲン、glgCの形成のために必要な遺伝子を欠失させた（図２）。増殖挙動における任意の変化のための試験を行うために、これらの株をアッセイした。galP−△glgC株およびglgCの欠失を含んでいる野生型コントロールの両方は、グルコースの存在下で有意に増殖することができなかった（図１Ｄ）。
【０１４９】
galP発現の性質決定。galP株内でgalPの発現を性質決定するために、gfPをgalPの３’末端に融合させた（galP-gfpとして表示）。galP-gfpまたはgfp単独を発現している株を、共焦点蛍光顕微鏡を用いて調べた（図３Ａおよび３Ｂ）。galP-gfpを発現している株は細胞膜中のみに蛍光シグナルを示し（図３Ｂ）、gfp発現のコントロール株は細胞膜全体に渡って蛍光シグナルを示し（図３Ａ）、野生型コントロール株は蛍光シグナルを示さなかった（図３Ａ）。これらの結果は、GalPトランスポータータンパク質がS. elongatesの膜に正常に局在し、このことにより細胞内へのグルコースの効率的な輸送を可能にすることを示している。
【０１５０】
また、galPおよびgalP-gfp株を様々な濃度のＩＰＴＧとともに培養し、それらの増殖を連続的な光条件下で測定した（図３Ｃ）。ＩＰＴＧ濃度における変化は、培養物の増殖における変化を誘導した。このことはgalP株にも同様に当てはまる。しかし、野生型コントロールの増殖は、１ｍＭまでの任意の量のＩＰＴＧ添加によって変化しなかった。至適増殖は０．１ｍＭのＩＰＴＧを用いた誘導から生じ、１ｍＭを用いた誘導はわずかに低下した細胞増殖を導いた（図３Ｃ）。
【０１５１】
galP-gfp株の培養物の蛍光強度を、同様に増殖アッセイを通じて測定した（図３Ｄ）。galP-gfp株のＧＦＰ蛍光強度およびＯＤ７３０のタイムコースを、様々な濃度のＩＰＴＧとともに培養した細胞を用いて測定した（図３Ｄ）。１ｍＭのＩＰＴＧおよび０．１ｍＭのＩＰＴＧとともに培養することによって、ＧａｌＰ−ＧＦＰ融合タンパク質と同様のレベルの発現が生じ、Ｐｔｒｃプロモーターからの発現は、このコンストラクトにおいて０．１ｍＭのＩＰＴＧで飽和することが、標準化した蛍光強度（ＲＦＵ／ＯＤ７３０）によって示された。
【０１５２】
また、従属栄養増殖における重炭酸塩の影響を性質決定した（図３Ｅ）。この実験を用いて、galP株の従属栄養増殖がアッセイ条件によって導入された炭素の制限によることのみで測定可能かどうかを判断した。重炭酸塩の非存在下で、または連続的な光条件下の様々な濃度の重炭酸塩の存在下で培養した場合、galP株は類似した増殖を示した（図３Ｅ）。しかし、高濃度の重酸塩は野生型コントロールの増殖をわずかに向上させた（図３Ｅ）。野生型コントロールの増殖速度は、重炭酸塩なしで培養した場合、２０ｍＭの重炭酸塩によって、０．２５９日−1から０．３９８日−1まで増加したが、galP株の増殖速度は重炭酸塩の存在下で変化しなかった（〜０．６３６日−1）。これらの結果は５ｇ／Ｌグルコースの存在下において、炭素固定はgalP株の増殖にとって律速段階ではないことを示唆している。しかし炭素固定は、５ｇ／Ｌグルコースの存在下において野生型コントロールにとって増殖の律速として現れることを示唆している。
【０１５３】
スクロース上での増殖。スクロースはS. elongatusにおける天然代謝物であり、浸透圧に応答して合成されることが示されている（Ducat DC et al., (2012) Appl Environ Microbiol 78(8):2660-2668; and Suzuki E et al, （2010） Appl Environ Microbiol 76(10):3153-3159）。
【０１５４】
野生型S. elongatusは、光条件下においてスクロースなしで培養した場合の増殖率（０．１６１日−1）および暗条件下において増殖なしと比較して、スクロースの存在下で培養した場合、光条件下において０．３１０日−1、および暗条件下において０．０８７日−1の、増加した増殖率を有していた（図４Ｃ）。この結果は、S. elongatusはスクロースに対してわずかに透過性であり、スクロースを炭素源として利用し得ることを明示している。
【０１５５】
スクロースによるS. elongatusの増殖率を向上させるために、E. coliのATCC700927スクローストランスポーター遺伝子cscBおよびE. coliのATCC700927フルクトキナーゼ遺伝子cscKを、S. elongatusのゲノムに組み込んだ（図４Ａ）。この遺伝子は、S. elongatusの細胞内で適切に発現されることが示されている。この株は、ＣｓｃＢトランスポーターを通じてより十分にスクロースを細胞内へ透過させるため、および内在性スクロースインベルターゼ（SYNPCC7942_0397によってコードされた）によってグルコースおよびスクロースに加水分解させるために構築した。フルクトキナーゼ遺伝子ｃｓｃＫを、酸化的ペントースリン酸経路の中心的代謝物であるフルクトース−６−リン酸への炭素フラックスを最大化させるために過剰発現させた（図４Ｂ）。
【０１５６】
cscK-cscB株は、５ｇ／Ｌスクロースの存在下で培養した場合、光条件下で０．３７６日−1の上昇した増殖率を有することが結果によって示された（図４Ｃ）。このことは野生型コントロールの増殖率（０．３１０日−1）と比較して、およそ２１．３％の増加を示している。また、当該結果によってcscK-cscB株は５ｇ／Ｌスクロースの存在下で培養した場合、暗条件下で０．１２８日−1の上昇した増殖率を有することが示された（図４Ｃ）。これは野生型コントロールの増殖率（０．０８７日−1）と比較して、約４７．１％の増加を示している。スクロースは野生型コントロールの増殖を向上させたが、増殖におけるスクロースの効果は、野生型コントロールにおけるものよりもcscB-cscK株におけるものの方が大きかった。
【０１５７】
キシロース上での増殖。キシロースは、豊富に入手可能なヘミセルロースのバイオマスの主要な部分であり、バイオ燃料および化学製品の微生物の生産のための有望で安価な、再生可能な原料になり得る（Steen EJ et al., (2010) Nature 463(7280):559-562）。しかしキシロースは、S. elongatus等のシアノバクテリアの既知の代謝物ではない（図５）。
【０１５８】
キシロースの利用のためにS. elongatusを改変させるために、キシローストランスポーターをコードするE. coliのxylE遺伝子をS. elongatusに組み込んだ（図５Ａ）。しかし、キシローストランスポーターの発現は、日中条件下、キシロースの存在下において培養した場合、株の増殖を増加させなかった（図５Ｃ）。
【０１５９】
これらの結果に基づいて、中心代謝物へのキシロースの変換を可能にする下流キシロース代謝酵素が、S. elongatusには欠けていると仮定した。S. elongatusのゲノム配列解析に基づき、S. elongatusのゲノムは、キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼをコードする遺伝子を含んでいないことを明らかにした。キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼは、キシロース分解の初めの２段階の原因となる（図５Ｂ）。
【０１６０】
したがって、キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼ（それぞれxylAおよびxylB）をコードするE. coli遺伝子を発現させるために、S. elongatusを改変させた。S. elongatusにキシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼを導入するために、E. coli xylE遺伝子、xylA遺伝子およびxylB遺伝子を含んでいるオペロンをS. elongatusゲノムに組み込んでxylEAB株を作製した（図５Ａ）。
【０１６１】
このxylEAB株は、日中条件下で従属栄養的に増殖することを示した（図５Ｂ）。xylE-xylA-xylBオペロンは、株をキシロースを用いて培養した場合、暗条件下で同様に従属栄養増殖を可能にしたが、野生型コントロールは、暗条件下でキシロースを用いて培養した場合増殖を示さなかった（図５Ｂ）。xylEAB株は、キシロースの存在下で培養した場合、明条件下で０．４７１日−1の増殖率、および暗条件下で０．２９１日−1の増殖率を有していた。これは同一のそれぞれの条件下で、０．３５０日−1および０．０６２日−1の増殖率を有していた野生型コントロールとは対照的であった。したがって、xylEAB株は、同様の条件下で増殖した野生型コントロールの増殖率よりも、およそ３４．６％大きい、光条件下での増殖率を有していた。さらに、xylEAB株は、同様の条件下で増殖した野生型コントロールの増殖率よりも、およそ３６９％大きい、暗条件下での増殖率を有していた。ＨＰＬＣによって測定されたキシロース消費率は、９６ｈの増殖期間にわたって、平均して約１０ｍｇｈ−１であった。
【０１６２】
興味深いことに、galP株の増殖は、それぞれの糖の存在下で培養した場合、光条件下でxylEAB株のものより速かった（図１Ｂおよび５Ｃ）。しかし、xylEAB株の増殖は、それぞれの糖の存在下で培養した場合、暗条件下でgalP株のものより速かった（図１Ｂおよび５Ｃ）。
【０１６３】
〔実施例２：Synechococcus elongatus PCC7942における糖トランスポータータンパク質の発現〕
実施例１に記載されているように、ＰＴＲＣプロモーターの制御下でSynechococcus elongatus ＰＣＣ７９４２のニュートラルサイトI（ＮＳＩ）に、選択的な単糖および二糖の糖トランスポーターをクローニングする。クローニングする糖トランスポーターとしては以下が挙げられるが、これらに限定されない：
グルコーストランスポーター−Homo sapiensのGLUT3 MFSトランスポーターの他に、Escherichia coliのptsI/ptsH/ptsG/crr PTSシステム。
フルクトーストランスポーター−Homo sapiensのGLUT3 MFSトランスポーター。
マンノーストランスポーター−Escherichia coliのmanX/manY/manZ PTSシステム。グルコース特異的なトランスポーターをマンノースの取り込みについても試験する。
ガラクトーストランスポーター−Escherichia coliのyjfF/ytfR/ytfT/ytfQ ABCシステム。
キシローストランスポーター−Escherichia coliのxylF/xylG/xylH ABCシステム。
アラビノース−Escherichia coliのaraJ MFSトランスポーター。
スクロース−Bacillus subtilisのsacP PTSシステム。
ラクトース−Escherichia coliのlacY MFSトランスポーター。
マルトース−Escherichia coliのmalE/malF/malG/malK ABCシステム。
【０１６４】
〔実施例３：Synechococcus elongatus PCC7942への代謝遺伝子の組み込み〕
主要な代謝への糖の組み入れを促進するために、実施例２の糖トランスポーターを用いて形質転換されたSynechococcus elongatus PCC7942へ下流の代謝遺伝子を組み込む。単一遺伝子または糖トランスポーターに対応している上流の遺伝子の完全なリストを含んでいる、様々な組み合わせにおいて、それぞれ糖特有代謝遺伝子をクローニングすることによって組み込みを行う。実施例１に記載されているように、ＰＴＲＣプロモーターの制御下でSynechococcus elongatus PCC7942のＮＳＩへそれらを組み込んでいる
以下は糖の非制限的なリスト、およびそれらの対応する代謝遺伝子である。
【０１６５】
グルコース−グルコース−６−リン酸へのグルコースのリン酸化のためのEscherichia coliのグルコキナーゼ（ｇｌｋ）。
【０１６６】
フルクトース−フルクトース−６−リン酸へのフルクトースのリン酸化のためのEscherichia coliのマンノ（フルクト）キナーゼ（ｍａｋ）およびEscherichia coli EC3132のフルクトキナーゼ（ｃｓｃＫ）。
【０１６７】
マンノース−マンノース−６−リン酸へのマンノースのリン酸化のためのEscherichia coliのマンノ（フルクト）キナーゼ（ｍａｋ）およびすべてのシステムのためのフルクトース−６−リン酸へのマンノース−６−リン酸の異性化のためのEscherichia coliのマンノース−６−リン酸イソメラーゼ（ｍａｎＡ）。
【０１６８】
ガラクトース−α−Ｄ−ガラクトースへのβ−Ｄ−ガラクトースのエピマー化のためのEscherichia coliのガラクトース−1−エピメラーゼ（ｇａｌＭ）、α−Ｄ−ガラクトース−1−リン酸へのα−Ｄ−ガラクトースのリン酸化のためのEscherichia coliのガラクトキナーゼ（ｇａｌＫ）、ウリジン二リン酸（uridyl diphosphate）（ＵＤＰ）−Ｄ−ガラクトースへのα−Ｄ−ガラクトース−1−リン酸の変換のためのEscherichia coliのガラクトース−1−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ（ｇａｌＴ）、およびＵＤＰ−Ｄ−グルコースへのＵＤＰ−Ｄ−ガラクトースのエピマー化のためのEscherichia coliのＵＤＰ−グルコース−４−エピメラーゼ（ｇａｌＥ）。
【０１６９】
アラビノース−  Ｌ−リブロースへのＬ−アラビノースの異性化のためのEscherichia coliのＬ−アラビノースイソメラーゼ（ａｒａＡ）、Ｌ−リブロース−５−リン酸へのＬ−リブロースのリン酸化のためのEscherichia coliのＬ−リブロキナーゼ（ａｒａＢ）、およびキシルロース−５−リン酸へのＬ−リブロース−５−リン酸のエピマー化のためのＬ−リブロース−５−リン酸−４−エピメラーゼ。
【０１７０】
スクロース−  ＰＴＳ輸送システムとの協同における、前述したフルクトース分解酵素と協同した、β−Ｄ−グルコース−６−リン酸およびβ−Ｄ−フルクトースへのスクロース−６−リン酸の水和のためのBacillus subtilis由来のスクロース−６−リン酸ヒドロラーゼ（sacA）。ＭＦＳ輸送システムと同時の使用のための、前述したフルクトース分解酵素に協同した、β−Ｄ−グルコースおよびβ−Ｄ−フルクトースへのスクロースの水和のためのEscherichia coliEC3132由来のインベルターゼ（cscA）。
【０１７１】
マルトース−  β−Ｄ−グルコースおよびβ−Ｄ−グルコース−１−リン酸へのマルトースのリン酸化のためのLactococcus lactis由来のマルトースホスホリラーゼ（malP）、およびβ−Ｄ−グルコース−６−リン酸へのβ−Ｄ−グルコース−１−リン酸の変換のためのLactococcus lactis由来のβ−ホスホグルコムターゼ（pgm）。
【０１７２】
ラクトース−  前述したガラクトース分解酵素に協同した、β−Ｄ−ガラクトースおよびβ−Ｄ−グルコースへのラクトースの水和のためのEscherichia coli由来のβ−ガラクトシダーゼ（lacZ）。
【０１７３】
〔実施例４：Synechococcus elongatus PCC7942における糖異化経路の組み合わせ〕
実施例３に記載されたそれぞれの糖異化経路をクローニングし性質決定した後、個々の株の基質利用をさらに拡張するために、Synechococcus elongatus PCC7942中に異化経路の異なる組み合わせを構築する。
【０１７４】
以下は経路の組み合わせの非制限なリストである：
グルコースおよびフルクトースの輸送／代謝
グルコースおよびキシロースの輸送／代謝
グルコース、キシロースおよびアラビノースの輸送／代謝
グルコース、フルクトース、キシロースおよびアラビノースの輸送／代謝
グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、キシロースおよびアラビノースの輸送/代謝
スクロースおよびラクトースの輸送/代謝。
【０１７５】
〔実施例５：他の光独立栄養性または光従属栄養性シアノバクテリアにおける糖異化経路の構築〕
実施例４に記載されている糖異化経路を、シアノバクテリアの他の光独立栄養または光従属栄養株（これらに限定されないが、耐熱性シアノバクテリアThermosynechococcus elongatus BP-1、海洋シアノバクテリアSynechococcus ｓｐ.WH8102、Synechococcus elongatus PCC7002、およびSynechocystis sp PCC6803が挙げられる）に構築する。基準として、海洋光独立栄養Synechococcus elongatus PCC7002および好熱性の淡水光独立栄養Thermosynechococcus elongatus BP‐1にグルコース経路を構築する。Synechocystis sp PCC6803の糖利用能を、すべての単糖および二糖経路としての経路を組み入れることによって、グルコース以外にも拡張する。
【０１７６】
〔実施例６：Synechococcus elongatus PCC7942における汎用化学物質の生産〕
汎用化学物質（これらに限定されないが、バイオ燃料、ポリマー、特殊化学品および医薬中間体が挙げられる）の生産は、実施例１〜４において記載されている、様々な糖トランスポーターおよび糖異化経路を含んでいるSynechococcus elongatus PCC7942株において増加している。バイオ燃料としては、限定されないが、アルコール（エタノール、プロパノール、イソプロパノール、アセトン、ブタノール、イソブタノール、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、フェニルエタノール、脂肪族アルコールおよびイソペンテノールなど）；アルデヒド（アセチルアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、２−メチル−１−ブタナール、３−メチル−１−ブタナール、フェニルアセトアルデヒドおよび脂肪族アルデヒドなど）；炭化水素（アルカン、アルケン、イソプレノイド、脂肪酸、ワックスエステルおよびエチルエステルなど）；および無機燃料（水素など）が挙げられる。ポリマーとしては、限定されないが、２、３−ブタンジオール、１、３−プロパンジオール、１、４−ブタンジオール、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリヒドロキシブチレート、およびイソプレンが挙げられる。特殊化学品としては、限定されないが、カロテノイド（リコピン、β−カロチンなど）が挙げられる。医薬品中間体としては、限定されないが、ポリケチド、スタチン、ω−３ 脂肪酸、イソプレノイド、ステロイドおよびエリスロマイシン（抗生物質）が挙げられる。汎用化学品のさらなる例としては、限定されないが、ラクテート、スクシネート、グルタメート、シトレート、マレート、３−ヒドロキシプロピオネート、アスコルベート、ソルビトール、アミノ酸（ロイシン、バリン、イソロイシン等）、およびヒドロキシブチレートが挙げられる。
【０１７７】
１つ以上の単糖または二糖の糖の代謝が可能なSynechococcuselongatus PCC7942の株をいくつかのバイオ燃料を生産させるために改変する。
【０１７８】
生産されるバイオ燃料としては：
エタノール：Zymomonasmobilis（またはそれらのホモログ）由来のピルビン酸デカルボキシラーゼ（pdc）およびアルコールデヒドロゲナーゼ（adhB）の組み込み。
【０１７９】
イソブチルアルデヒド：Bacillussubtilis由来の２‐アセトラクテートシンターゼ（alsS）およびEscherichiacoli由来のアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（ilvC）およびジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ilvD）、およびLactococcuslactis由来の２‐ケトイソバレレートデカルボキシラーゼ（kivd）の組み込み。
【０１８０】
イソブタノール：Escherichiacoli由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（yqhD）と協同した、イソブチルアルデヒド生産原因遺伝子すべての組み込み。
【０１８１】
他の長鎖アルコール：１−プロパノール、１−ブタノール、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノールおよび２−フェニルエタノールを最低限必要とするEscherichiacoli由来のケトイソバレレートデカルボキシラーゼ（kivd）およびアルコールデヒドロゲナーゼ（yqhD）。
【０１８２】
２、３−ブタンジオール：Bacillussubtilis由来の２−アセトラクテートシンターゼ（alsS）の組み込み、Aeromonashydrophila由来の２−アセトラクテートデカルボキシラーゼ（alsD）、Clostridiumbeijerinckii由来の第二級アルコールデヒドロゲナーゼ（adh）
が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８３】
〔実施例７：光非存在下における無制限の増殖のためのSynechococcus elongatus PCC7942株の改変〕
Synechococcus elongatus PCC7942株を、ランダム変異導入によって、光非存在下で糖基質上での無制限の増殖が可能となるように改変する。簡潔には、化学的突然変異源（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）またはエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）等）を、機能的なグルコース輸送経路を担っているS. elongatus PCC7942のゲノム全体にランダムな点変異を誘発するために使用する。突然変異誘発後、培養物を光独立栄養条件下で短期間（１〜２週間）濃縮し、光合成能の維持を確実にする。この後、細胞を１０ｇ／Ｌのグルコースを含んでいるＢＧ−１１プレートに播種し、暗所において３０℃でインキュベートし、光非存在下でグルコース上で増殖可能な株を選択する。増殖可能な株を、S. elongatus PCC7942派生体であることを確かめるためにＰＣＲによって検証し、その後全ゲノムを配列決定し、さらに分析する。
【０１８４】
【表５】
2015530117.tif 000007
【０１８５】
【表６】
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【０１８６】
【表７】
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【０１８７】
【表８】
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【０１８８】
【表９】
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【０１８９】
【表１０】
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【０１９０】
【表１１】
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【０１９１】
【表１２】
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【０１９２】
【表１３】
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【０１９３】
【表１４】
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【０１９４】
【表１５】
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【０１９５】
【表１６】
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【０１９６】
【表１７】
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【０１９７】
【表１８】
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【０１９８】
【表１９】
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【０１９９】
【表２０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年6月2日(2015.6.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光独立栄養種の単離された細菌細胞であって、
糖トランスポータータンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを含んでおり、前記糖トランスポータータンパク質の発現は、前記細菌細胞内への糖の輸送を生じさせて、前記組み換えポリヌクレオチドを有していない対応する光独立栄養細菌細胞と比較して、暗条件下または日中条件下における前記糖上での前記細菌細胞の増殖を増加させる、光独立栄養種の単離された細菌細胞。
【請求項２】
前記糖はグルコースであり、前記糖トランスポータータンパク質は、E. coliのgalPトランスポータータンパク質である、請求項１に記載の細菌細胞。
【請求項３】
前記糖はスクロースであり、前記糖トランスポータータンパク質は、E. ｃoliのCscBスクローストランスポータータンパク質、B. subtilisのSacPトランスポータータンパク質、Brassica napusのSut1トランスポータータンパク質、Juglans regiaのSut1トランスポータータンパク質、Arabidopsis thalianaのSuc6トランスポータータンパク質、Arabidopsis thalianaのSUT4トランスポータータンパク質、Drosophila melanogasterのSlc45-1トランスポータータンパク質およびDickeya dadantiiのScrAトランスポータータンパク質からなる群から選択されるスクローストランスポータータンパク質である、請求項１に記載の細菌細胞。
【請求項４】
前記細菌細胞は、フルクトキナーゼタンパク質をコードする、少なくとも１つの追加の組み換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる、請求項１に記載の細菌細胞。
【請求項５】
前記フルクトキナーゼタンパク質は、E. coliのCscKフルクトキナーゼタンパク質、Lycopersicon esculentumのFrk1フルクトキナーゼタンパク質、Lycopersicon esculentumのFrk2フルクトキナーゼタンパク質、H. sapiensのKHKフルクトキナーゼタンパク質、A. thalianaのFLN-1フルクトキナーゼタンパク質、A. thalianaのFLN-2フルクトキナーゼタンパク質、Yersinia pestis biovar Microtus str. 91001のNagC1フルクトキナーゼタンパク質、Yersinia pseudotuberculosisのYajFフルクトキナーゼタンパク質、およびNatronomonas pharaonisのSukフルクトキナーゼタンパク質からなる群から選択される、請求項４に記載の細菌細胞。
【請求項６】
前記糖はキシロースであり、前記糖トランスポータータンパク質は、E. coliのXylEキシローストランスポータータンパク質、E. coli xylF/xylG/xylHのABCキシローストランスポータータンパク質、Candida intermediaのGxf1トランスポータータンパク質、Pichia stipitisのSut1トランスポータータンパク質、およびA. thalianaのAt5g59250トランスポータータンパク質からなる群から選択されるキシローストランスポータータンパク質である、請求項１に記載の細菌細胞。
【請求項７】
前記細菌細胞は、キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼのうちの１つまたは両方をコードする、少なくとも１つの追加の組み換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる、請求項６に記載の細菌細胞。
【請求項８】
前記キシロースイソメラーゼは、E. coliのXylAキシロースイソメラーゼ、A. thalianaのAT5G57655キシロースイソメラーゼ、Aspergillus nigerのXyrAキシロースイソメラーゼ、およびHypocrea jecorinaのXyl1キシロースイソメラーゼからなる群から選択される、請求項７に記載の細菌細胞。
【請求項９】
前記キシルロキナーゼは、E. coliのXylBキシルロキナーゼ、Arabidopsis thalianaのXK-1キシルロキナーゼ、Arabidopsis thalianaのXK-2キシルロキナーゼ、E. coliのLynKキシルロキナーゼ、Streptomyces coelicolorのSCO1170キシルロキナーゼ、Pseudomonas aeruginosaのMtlYキシルロキナーゼ、Yersinia pseudotuberculosisのSgbKキシルロキナーゼおよびE. coliのAtlKキシルロキナーゼからなる群から選択される、請求項７に記載の細菌細胞。
【請求項１０】
前記組み換えポリヌクレオチドおよび／または少なくとも１つの追加の組み換えポリヌクレオチドは、前記細菌細胞のゲノム中に安定的に組み込まれている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の細菌細胞。
【請求項１１】
前記細菌細胞はシアノバクテリア、Acaryochloris、Anabaena、Arthrospira、Cyanothece、Gleobacter、Microcystis、Nostoc、Prochlorococcus、Synechococcus、Synechococcus elongatus、S. elongatus PCC7942、Synechocystis、Thermosynechococcus、Trichodesmium、紅色硫黄細菌、Chromatiaceae、Ectothiorhodospiraceae、紅色非硫黄細菌、Acetobacteraceae、Bradyrhizobiaceae、Comamonadaceae、Hyphomicrobiaceae、Rhodobacteraceae、Rhodobiaceae、Rhodocyclaceae、Rhodospirillaceae、緑色非硫黄細菌、およびChloroflexaceaeからなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の細菌細胞。
【請求項１２】
暗条件下または日中条件下で細菌細胞の増殖を増加させる方法であって、
請求項１〜９のいずれか１項に記載の細菌細胞を準備すること；および
前記組み換えポリヌクレオチドが発現される条件下で、糖基質を用いて前記細菌細胞を培養することを包含しており、
前記組み換えポリヌクレオチドの発現は、前記細菌細胞内への前記糖基質の輸送を生じさせて、前記組み換えポリヌクレオチドを有していない対応する光独立栄養細菌の細胞増殖と比較して、暗条件下または日中条件下における細菌細胞の増殖を増加させる、方法。
【請求項１３】
少なくとも１種類の汎用化学物質を生産する方法であって、
請求項１〜９のいずれか１項に記載の細菌細胞を準備すること；
前記組み換えポリヌクレオチドが発現される条件下、および少なくとも１種類の汎用化学物質が生産される条件下で、糖基質を用いて前記細菌細胞を培養すること；および
少なくとも１種類の前記汎用化学物質を回収することを包含しており、
前記組み換えポリヌクレオチドの発現は前記細菌細胞内へ前記糖基質の輸送を生じさせる、方法。
【請求項１４】
前記細菌細胞は少なくとも１種類の汎用化学物質を１日２４時間持続的に生産する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記汎用化学物質は、ポリマー、２，３−ブタンジオール、１，３−プロパンジオール、１，４−ブタンジオール、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリヒドロキシブチレート、イソプレン、ラクテート、スクシナート、グルタメート、シトレート、マレート、３−ヒドロキシプロピオネ−ト、アスコルベート、ソルビト−ル、アミノ酸、ヒドロキシブチレ−ト、カロテノイド、リコペン、β−カロテン、医薬品中間体、ポリケチド、スタチン、ω−３ 脂肪酸、イソプレノイド、ステロイド、抗生物質、エリスロマイシン、ソプレノイド、ステロイド、エリスロマイシン、ソプレノイド、ステロイド、エリスロマイシン、バイオ燃料およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記汎用化学物質は、アルコール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、アセトン、ブタノール、イソブタノール、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、フェニルエタノール、脂肪族アルコール、イソペンテノール、アルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、２−メチル−１−ブタナール、３−メチル−１−ブタナール、フェニルアセトアルデヒド、脂肪族アルデヒド、炭化水素、アルカン、アルケン、イソプレノイド、脂肪酸、ワックスエステル、エチルエステル、水素およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるバイオ燃料である、請求項１４に記載の方法。
【国際調査報告】
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