(57)【要約】本発明は、骨欠損の処置にとって有用である繊維強化骨修復パテおよび柔軟な繊維強化凍結乾燥インプラントを特色とする。パテおよび凍結乾燥インプラントは、セラミック粒子を含む。本発明の配合物は、セラミック粒子の移動の減少を示すことができ、力学的に強化されていることから、医師が移植技法の際に、材料を引裂くかまたは穿刺することなく激しく操作することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）100μmから1000μmの平均粒子サイズを有する25重量％から65重量％の微粒子骨補填材(bone graft substitute)または微粒子脱灰骨基質；
（ii）前記微粒子骨補填材を懸濁するための30重量％から75重量％のハイドロゲル担体；および
（iii）0.5から15 mmの平均長を有する、0.2重量％から2重量％の繊維
を含む骨修復パテであって、
非硬化性で展性であり、パテからのセラミック粒子の移動が減少している、骨修復パテ。
【請求項２】
前記ハイドロゲル担体が、グリセリン、ポリエチレングリコール、N-メチルピロリドン、およびトリアセチンから選択される分散剤；カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、およびヒアルロン酸から選択されるポリマー；ならびに水を含む、請求項1記載の骨修復パテ。
【請求項３】
（i）グリセリン、ポリエチレングリコール、N-メチルピロリドン、およびトリアセチンから選択される、3重量％から10重量％の分散剤；
（ii）カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、およびヒアルロン酸から選択される、0.5重量％から2.0重量％のポリマー；
（iii）40重量％から60重量％の微粒子リン酸カルシウム；
（iv）25重量％から55重量％の水；ならびに
（v）0.5から15 mmの平均長を有する、0.2重量％から2重量％の繊維
を含む、請求項2記載の骨修復パテ。
【請求項４】
前記微粒子骨補填材が、ヒドロキシアパタイト粒子、ダーライト粒子、リン酸四カルシウム粒子、ピロリン酸カルシウム粒子、リン酸三カルシウム粒子、リン酸水素カルシウム粒子、リン酸八カルシウム粒子、フルオロアパタイトカルシウム粒子、およびその混合物から選択される、請求項3記載の骨修復パテ。
【請求項５】
前記微粒子骨補填材が、直径250ミクロンから425ミクロンを有するヒドロキシアパタイト粒子である、請求項4記載の骨修復パテ。
【請求項６】
前記微粒子骨補填材が、P-15ペプチドによってコーティングされた無機骨ミネラルである、請求項5記載の骨修復パテ。
【請求項７】
前記ポリマーが、カルボキシメチルセルロースナトリウムであり、かつ前記分散剤がグリセリンである、請求項3記載の骨修復パテ。
【請求項８】
（i）4.5重量％から7.5重量％のグリセリン；
（ii）1.0重量％から2.0重量％のカルボキシメチルセルロースナトリウム；
（iii）45重量％から65重量％の無機骨ミネラル；および
（iv）0.5から15 mmの平均長を有する0.2重量％から2重量％の繊維；ならびに
（v）35重量％から45重量％の水、
を含む、請求項3記載の骨修復パテ。
【請求項９】
前記繊維が、シルク繊維、セルロース繊維、ナイロン繊維、コラーゲン繊維、エラスチン繊維、ゼラチン繊維、ケラチン繊維、ヒアルロナン繊維、アルジネート繊維、グリコ-ラクチド繊維、キトサン繊維、ポリエチレン繊維、ポリウレタン繊維、ポリグリコリド繊維、ポリ-l-ラクチド繊維、ポリ-β-ヒドロキシ酪酸繊維、ポリジオキサノン繊維、ポリエステル繊維、ポリカーボネート繊維、ダクロン繊維、生物活性ガラス繊維、金繊維、炭素繊維、ニチノール繊維、およびステンレススチール繊維から選択される、請求項1〜8のいずれか1項記載の骨修復パテ。
【請求項１０】
7から12 mmの平均長を有する、0.75重量％から1.25重量％のシルク繊維を含む、請求項8記載の骨修復パテ。
【請求項１１】
前記繊維が5μmから60μmの直径を有する、請求項9または10記載の骨修復パテ。
【請求項１２】
前記微粒子が、粒子を含み、かつ前記パテにおける粒子数対繊維数の比率が0.1から10である、請求項9または10記載の骨修復パテ。
【請求項１３】
押し出し加工される、請求項1〜12のいずれか1項記載の骨修復パテ。
【請求項１４】
インビボで移動の減少を示す、インビボで移動を示さない、またはインビトロで移動時間の減少を示す、請求項1〜13のいずれか1項記載の骨修復パテ。
【請求項１５】
請求項1〜14のいずれか1項記載の骨修復パテを凍結乾燥することによって形成された、骨欠損を直すための柔軟な移植可能組成物。
【請求項１６】
1.5から15のLAF乾燥対LAF湿潤比を有する、請求項15記載の柔軟な移植可能組成物。
【請求項１７】
LAFFR対LAF無繊維比が3から100である、請求項15記載の柔軟な移植可能組成物。
【請求項１８】
YSFR対YS無繊維比が3から15である、請求項15記載の柔軟な移植可能組成物。
【請求項１９】
MFR対M無繊維比が5から40である、請求項15記載の柔軟な移植可能組成物。
【請求項２０】
（i）グリセリン、ポリエチレングリコール、N-メチルピロリドン、およびトリアセチンから選択される、5重量％から20重量％の分散剤；
（ii）カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、およびヒアルロン酸から選択される、1.0重量％から6.0重量％のポリマー；
（iii）100μmから1000μmの平均粒子サイズを有する、65重量％から90重量％の微粒子骨補填材または微粒子脱灰骨基質；ならびに
（iv）0.5から15 mmの平均長を有する、0.2重量％から3.5重量％の繊維を含む、
骨欠損を直すための柔軟な移植可能組成物であって、
5から35％の多孔性を有し、かつ1.5重量％から20重量％の水を含む、柔軟な移植可能組成物。
【請求項２１】
前記微粒子骨補填材が、ヒドロキシアパタイト粒子、ダーライト粒子、リン酸四カルシウム粒子、ピロリン酸カルシウム粒子、リン酸三カルシウム粒子、リン酸水素カルシウム粒子、リン酸八カルシウム粒子、フルオロアパタイトカルシウム粒子、およびその混合物から選択される、請求項20記載の柔軟な移植可能組成物。
【請求項２２】
前記微粒子骨補填材が、250ミクロンから425ミクロンの直径を有するヒドロキシアパタイト粒子である、請求項20記載の柔軟な移植可能組成物。
【請求項２３】
前記微粒子骨補填材がP-15ペプチドによってコーティングされた無機骨ミネラルである、請求項20記載の柔軟な移植可能組成物。
【請求項２４】
前記ポリマーがカルボキシメチルセルロースナトリウムであり、かつ前記分散剤がグリセリンである、請求項20記載の柔軟な移植可能組成物。
【請求項２５】
（i）8重量％から15重量％のグリセリン；
（ii）1.5重量％から3.0重量％のカルボキシメチルセルロースナトリウム；
（iii）75重量％から90重量％の無機骨ミネラル；および
（iv）0.5から15 mmの平均長を有する、0.2重量％から3.5重量％の繊維；ならびに
（v）1.5重量％から6重量％の水
を含む、請求項20記載の柔軟な移植可能組成物。
【請求項２６】
前記繊維が、シルク繊維、セルロース繊維、ナイロン繊維、コラーゲン繊維、エラスチン繊維、ゼラチン繊維、ケラチン繊維、ヒアルロナン繊維、アルジネート繊維、グリコ-ラクチド繊維、キトサン繊維、ポリエチレン繊維、ポリウレタン繊維、ポリグリコリド繊維、ポリ-l-ラクチド繊維、ポリβ-ヒドロキシ酪酸繊維、ポリジオキサノン繊維、ポリエステル繊維、ポリカーボネート繊維、ダクロン繊維、生物活性ガラス繊維、金繊維、炭素繊維、ニチノール繊維、およびステンレススチール繊維から選択される、請求項20〜25のいずれか1項記載の柔軟な移植可能組成物。
【請求項２７】
7から12 mmの平均長を有する、1.2重量％から1.8重量％のシルク繊維を含む、請求項26記載の柔軟な移植可能組成物。
【請求項２８】
前記繊維が5μmから60μmの直径を有する、請求項26または27記載の柔軟な移植可能組成物。
【請求項２９】
前記微粒子が粒子を含み、かつ柔軟な移植可能組成物における粒子数対繊維数の比率が0.1から10である、請求項20〜28のいずれか1項記載の柔軟な移植可能組成物。
【請求項３０】
請求項1〜19のいずれか1項記載の押し出し加工骨修復パテから形成される、請求項20〜29のいずれか1項記載の柔軟な移植可能組成物。
【請求項３１】
1.5から15のLAF乾燥対LAF湿潤比を有する、請求項20〜30のいずれか1項記載の柔軟な移植可能組成物。
【請求項３２】
湿潤状態LAFFR対湿潤状態LAF無繊維比が3から100である、請求項20〜30のいずれか1項記載の柔軟な移植可能組成物。
【請求項３３】
YSFR対YS無繊維比が3から15である、請求項20〜30のいずれか1項記載の柔軟な移植可能組成物。
【請求項３４】
MFR対M無繊維比が5から40である、請求項20〜30のいずれか1項記載の柔軟な移植可能組成物。
【請求項３５】
インビボで移動の減少を示す、インビボで移動を示さない、またはインビトロで移動時間の減少を示す、請求項20〜30のいずれか1項記載の組成物。
【請求項３６】
前記繊維が細胞接着ペプチドを含む、請求項1〜35のいずれか1項記載の組成物。
【請求項３７】
前記細胞接着ペプチドが、アルギニン-グリシン-アスパラギン酸（RGD）およびチロシン-イソロイシン-グリシン-セリン-アルギニン（YIGSR）から選択されるアミノ酸配列を含むか、または細胞接着ペプチドがコラーゲン模倣ペプチドである、請求項36記載の組成物。
【請求項３８】
前記細胞接着ペプチドが、DGEA、GFOGER、GLOGER、GMOGER、GLSGER、GASGER、GAOGER、およびGTPGPQGIAGQRGVV（P15）から選択されるアミノ酸配列またはその生物活性断片を含むコラーゲン模倣ペプチドである。請求項37記載の組成物。
【請求項３９】
前記繊維が、P-15ペプチドを含むシルク繊維である、請求項36記載の組成物。
【請求項４０】
P-15ペプチドによってコーティングされた無機骨ミネラルである微粒子骨補填材を含む、請求項39記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨空隙充填剤の分野、および整形外科に関わる状態を処置するためのその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
医師は時に、脊椎固定技法などの際に、疾患、外傷、骨手術もしくは他の原因によって損傷を受けている骨を修復すること、または術前に骨がなかった場所で骨材料を生長させることが求められる。その技法の転帰として、2つまたはそれより多くの椎体が特異的方向で維持されることが望ましい。これは、椎体間に強固な骨柱または骨橋を生長させることによって行うことができる。これによって、椎体は互いに対して固定された位置で維持される。長骨骨折の修復はしばしば、単に、破壊された骨成分を本来の近位に再配置して、それらが互いに癒合することができるまでそれらをその場で固定することによって行うことができる。これは、たとえば通常の脚の骨折を修復するためにとられるアプローチである。骨折した骨を接合して、骨折した成分が治癒するあいだ、強固なまたは半強固なギプスまたは副木において数週間固定する。
【０００３】
しかし時に、患者が骨の一部を失っている場合にはこのアプローチは不十分である。これは、骨がひどく粉砕されて、破片をつなぎ合わせることが不可能なある種の外傷において起こりうる。よりしばしば、これは、多量の骨を破壊する疾患の結果として、または多量の骨の破壊が不可避である骨手術の結果として起こる。これらの場合、治癒のために適切な位置で接合させる患者の骨はない。それどころか、何とかして充填しなければならない空隙もしくは欠損、または新しい骨によって充填される必要がある2つの骨構造間の間隙が存在する。この欠損または空隙を充填するには、生物学的適合性であるのみならず、好ましくは部位が治癒するにつれて天然の骨の内部生長を容認または促進さえする材料が必要である。そのような場合、新たな内部生長する天然の骨が骨格構造の一部としてその場所を占めるにつれて、材料が最終的に吸収されるようになることが理想的である。材料が完全に吸収されれば、異物材料が骨格に残っている場合に起こりえて、おそらく将来的に骨折を生じうる応力集中の可能性がなくなる。
【０００４】
多数の骨置換材料が医師によって用いられているが、その成否の程度は様々である。1つのアプローチは、患者自身から回収した骨材料、またはいわゆる自家骨を用いることである。このアプローチは、生物学的適合性および生物学的拒絶の問題を回避するという点において有利である。しかし、そのようなアプローチは必然的に、当初の損傷に関して1つと骨材料を供与する部位に関して1つの、2つの手術技法、2つの手術部位、および2つの治癒プロセスを伴う。このことは、費用がより高くなること、ならびに既に重度に状態が悪いかまたは損傷を受けている患者の感染症および病的状態のリスクが増加することを意味する。同様に、このアプローチでは、外科医が、供与部位から供与材料を採取して、その当初の部位に合うように適合させ、そして両方の部位を修復することから、膨大な時間および外科的熟練を必要としうる。決定的であるのは、ドナー材料として供するために利用可能な患者の体の骨量には明白な限界がある点である。
【０００５】
または、骨欠損を充填するために、微粒子骨補填材(bone graft substitute)を用いることができる。微粒子骨補填材の選択は、処置におけるその意図される役割、ヒトの体とのその生物学的適合性およびその利用能に依存する。重要な制限は、処置がうまくゆくために、材料が体の自然の作用によって吸収される必要があるのか、または永続的な支持構造としてその場に留まる必要があるのかという点である。有用なセラミック微粒子の中で、同種異系材料は容易に入手可能であり、または異種起源の骨も同様に利用される。合成材料、主にヒドロキシアパタイトもまた利用可能である。非配合セラミック微粒子が乾燥顆粒として入手可能であるが、概して、骨欠損を充填するために十分な粘着性および接着性を欠如する。それゆえ、それらはしばしば適切な担体と混合される。
【０００６】
一般的に、骨処置材料の配合者は、欠損部位に骨修復材料を送達するために適切な担体を選択することを通して取扱適性を改善することに多大な努力を傾けてきた。骨修復材料は容易に留置されて欠損部から移動しないことが望ましい。さらにおよび主に、骨の形成は、担体によって阻害されてはならない。すなわち、骨修復材料の担体材料は、生物学的適合性でなければならず、修復材料微粒子間に細胞および血管を浸潤させるための適度な空間を提供しながら、それが媒介する骨形成を妨害してはならない。担体材料は生体分解して再吸収されるべきである。しかし、分解速度が速すぎることは、細胞および血管が浸潤できないことから好ましくない。しかし、吸収速度が遅すぎる場合も、細胞遊走、血管貫通および骨形成を妨害する。
【０００７】
欠損部位に適用した場合に、移植部位からのセラミック微粒子の移動が最小限である担体中に、高濃度の吸収可能なセラミック微粒子を含む骨修復処置配合物がなおも必要である。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、骨欠損の処置にとって有用である繊維強化骨修復パテおよび柔軟な繊維強化凍結乾燥インプラントを特色とする。パテおよび凍結乾燥インプラントは、セラミック粒子を含む。本発明の配合物は、セラミック粒子の移動の減少を示すことができ、力学的に強化されており、そのため、医師は、移植技法の際に材料を引裂くかまたは穿刺することなく激しく操作することができる。
【０００９】
第一の局面において、本発明は、（i）100μmから1000μm（たとえば、150±50、250±50、350±50、450±50、550±50μm、600±50μm、または750±250μm）の平均粒子サイズを有する25重量％から65重量％（たとえば、25重量％から35重量％、35重量％から45重量％、45重量％から55重量％、または55重量％から65重量％）の微粒子骨補填材または微粒子脱灰骨基質；（ii）微粒子骨補填材を懸濁させるための30重量％から75重量％（たとえば、30重量％から40重量％、40重量％から50重量％、50重量％から60重量％、60重量％から70重量％、または65重量％から75重量％）のハイドロゲル担体；および（iii）0.5から15 mm（たとえば、0.5から1.5 mm、1.0から3.0 mm、2.5から15 mm、4.5から9 mm、7.0から15 mm、または10から15 mm）の平均長を有する、0.2重量％から2重量％（たとえば、0.2重量％から0.6重量％、0.5重量％から0.9重量％、0.8重量％から1.2重量％、または1.1から2.0重量％）の繊維を含む骨修復パテであって、非硬化性で展性であり、パテからのセラミック粒子の移動が減少している骨修復パテを特色とする。本発明の繊維強化パテは、インビボで移動の減少を示しうるかまたは移動を示さず、およびインビトロで移動時間の減少を示しうる。特定の態様において、ハイドロゲル担体は、グリセリン、ポリエチレングリコール、N-メチルピロリドン、およびトリアセチンから選択される分散剤；カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、およびヒアルロン酸から選択されるポリマー；ならびに水を含む。たとえば、骨修復パテは、（i）グリセリン、ポリエチレングリコール、N-メチルピロリドン、およびトリアセチンから選択される、3重量％から10重量％（たとえば、3重量％から5重量％、4.5重量％から7重量％、6重量％から8重量％、または7重量％から10重量％） の分散剤；（ii）カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、およびヒアルロン酸から選択される、0.5重量％から8.0重量％（たとえば、0.5重量％から1.5重量％、1.0重量％から3.0重量％、2.0重量％から5.0重量％、または4.0重量％から8.0重量％）のポリマー；（iii）40重量％から60重量％（たとえば、40重量％から45重量％、40重量％から50重量％、45重量％から55重量％、50重量％から60重量％、または55重量％から60重量％）の微粒子リン酸カルシウム；（iv）25重量％から55重量％（たとえば、25重量％から35重量％、30重量％から40重量％、35重量％から45重量％、40重量％から55重量％、または45重量％から55重量％）の水；ならびに（v）0.5から15 mm（たとえば、0.5から1.5 mm、1.0から3.0 mm、2.5から15 mm、4.5から9 mm、7.0から15 mm、または10から15 mm）の平均長を有する、0.2重量％から2重量％（たとえば、0.2重量％から0.6重量％、0.5重量％から0.9重量％、0.8重量％から1.2重量％、または1.1重量％から2.0重量％）の繊維を含みうる。微粒子骨補填材は、任意の合成または天然のカルシウム含有ミネラルでありうる。微粒子骨補填材は、ヒドロキシアパタイト粒子、ダーライト粒子、リン酸四カルシウム粒子、ピロリン酸カルシウム粒子、リン酸三カルシウム粒子、リン酸水素カルシウム粒子、リン酸八カルシウム粒子、フルオロアパタイトカルシウム粒子、およびその混合物から選択されうる。たとえば、微粒子骨補填材は、P-15ペプチドをコーティングした無機骨ミネラルなどの、250ミクロンから425ミクロンの直径を有するヒドロキシアパタイト粒子でありうる。特定の態様において、骨修復パテは、ポリマーであるカルボキシメチルセルロースナトリウムおよび分散剤であるグリセリンを含む。骨修復パテは、（i）4.5重量％から7.5重量％のグリセリン；（ii）1.0重量％から2.0重量％のカルボキシメチルセルロースナトリウム；（iii）45重量％から65重量％の無機骨ミネラル；および（iv）0.5から15 mm（たとえば、0.5から1.5 mm、1.0から3.0 mm、2.5から15 mm、4.5から9 mm、7.0から15 mm、または10から15 mm）の平均長を有する、0.2重量％から2重量％（たとえば、0.2重量％から0.6重量％、0.5重量％から0.9重量％、0.8重量％から1.2重量％、または1.1重量％から2.0重量％）の繊維；ならびに（v）35重量％から45重量％の水を含みうる。繊維は、シルク繊維（たとえば、織物用シルクまたは手術用シルク）、セルロース繊維、ナイロン繊維、コラーゲン繊維、エラスチン繊維、ゼラチン繊維、ケラチン繊維、ヒアルロナン繊維、アルジネート繊維、グリコ-ラクチド繊維、キトサン繊維、ポリエチレン繊維、ポリウレタン繊維、ポリグリコリド繊維、ポリ-l-ラクチド繊維、ポリ-β-ヒドロキシ酪酸繊維、ポリジオキサノン繊維、ポリエステル繊維（たとえば、PLLA、PGA、PLG、PCL、PMA、PET、およびPLA）、ポリカーボネート繊維、ダクロン繊維、生物活性ガラス繊維、金繊維、炭素繊維、ニチノール繊維、およびステンレススチール繊維から選択されうるがこれらに限定されるわけではない。たとえば、パテは、7から12 mm（たとえば、7±2、8±2、9±2、10±2、11±2、または12±2 mm）の平均長を有する、0.75重量％から1.25重量％（たとえば、0.75重量％から0.90重量％、0.85重量％から0.95重量％、0.90重量％から1.05重量％、または1.0重量％から1.25重量％）のシルク繊維を含みうる。特定の態様において、繊維は、5μmから60μm（たとえば、5μmから20μm、15μmから30μm、20μmから40μm、または35μmから60μm）の平均直径を有する。本発明の骨修復パテのある態様において、微粒子は粒子を含み、パテにおける粒子数対繊維数の比率は、0.1から10（たとえば、0.25から4、0.5から2、0.75から1.25、または0.9から1.1）である。
【００１０】
関連する局面において、本発明は、本発明の骨修復パテを凍結乾燥することによって形成された骨欠損を直すための柔軟な移植可能組成物を特色とする。特定の態様において、柔軟な移植可能組成物は、破壊荷重（LAF）に関して1.5から15（たとえば、1.5から3、2.5から6、5から9、または8から15）のLAF乾燥対LAF湿潤比を有する。なお他の態様において、LAFFR対LAF無繊維比は、3から100（たとえば、3から12、10から15、15から22、または22から35、または35から100）である。なお他の態様において、柔軟な移植可能組成物は、降伏応力（YS）に関して、3から15（たとえば、5±2、7±2、9±2、11±2、13±2、または15±2）のYSFR対YSfiberlss比を有する。柔軟な移植可能組成物は、モジュラス（M）比に関して、5から40（たとえば、8±3、15±5、20±5、25±5、30±5、35±5、または40±5）のMFR対M無繊維比を有しうる。本発明の柔軟な繊維強化移植可能組成物は、インビボで移動の減少を示しうるかまたは移動を示さず、およびインビトロで移動時間の減少を示しうる。
【００１１】
本発明はさらに、（i）グリセリン、ポリエチレングリコール、N-メチルピロリドン、およびトリアセチンから選択される、5重量％から20重量％（たとえば、5重量％から10重量％、10重量％から15重量％、または15重量％から20重量％）の分散剤；（ii）カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、およびヒアルロン酸から選択される、1.0重量％から6.0重量％（たとえば、1.0重量％から1.5重量％、1.5重量％から2.5重量％、2.5重量％から4.5重量％、または3.5重量％から6.0重量％）のポリマー；（iii）100μmから1000μm（たとえば、150±50、250±50、350±50、450±50、550±50μm、600±50μm、または750±250μm）の平均粒子サイズを有する、65重量％から90重量％（たとえば、65重量％から75重量％、75重量％から85重量％、80重量％から90重量％、または85重量％から90重量％）の微粒子骨補填材または微粒子脱灰骨基質；ならびに（iv）0.5から15 mm（たとえば、0.5から1.5 mm、1.0から3.0 mm、2.5から15 mm、4.5から9 mm、7.0から15 mm、または10から15 mm）の平均長を有する、0.2重量％から3.5重量％（たとえば、0.2重量％から0.6重量％、0.5重量％から0.9重量％、0.8重量％から1.2重量％、1.1重量％から2.0重量％、1.5重量％から2.2重量％、1.9重量％から2.7重量％、または2.4重量％から3.5重量％）の繊維を含む、骨欠損を直すための柔軟な移植可能組成物であって、5から35％の多孔性を有し、1.5重量％から20重量％（たとえば、1.5重量％から6重量％、5重量％から9重量％、8重量％から12重量％、または11重量％から20重量％）の水を含む、柔軟な移植可能組成物を特色とする。特定の態様において、柔軟な移植可能組成物における平均孔サイズは、約25μmから約200μmである。微粒子骨補填材は、ヒドロキシアパタイト粒子、ダーライト粒子、リン酸四カルシウム粒子、ピロリン酸カルシウム粒子、リン酸三カルシウム粒子、リン酸水素カルシウム粒子、リン酸八カルシウム粒子、フルオロアパタイトカルシウム粒子、およびその混合物から選択されうる。たとえば、微粒子骨補填材は、直径250ミクロンから425ミクロンのヒドロキシアパタイト粒子でありうる。1つの特定の態様において、微粒子骨補填材は、P-15ペプチドによってコーティングされた無機骨ミネラルである。ある態様において、ポリマーは、カルボキシメチルセルロースナトリウムであり、分散剤はグリセリンである。たとえば、組成物は、（i）8重量％から15重量％（たとえば、8.0重量％から9.5重量％、9.5重量％から12.5重量％、または12.5重量％から15重量％）のグリセリン；（ii）1.5重量％から3.0重量％（たとえば、1.5重量％から1.75重量％、1.75重量％から2.25重量％、2.25重量％から2.75重量％、または2.75重量％から3.0重量％）のカルボキシメチルセルロースナトリウム；（iii）75重量％から90重量％（たとえば、75重量％から80重量％、80重量％から85重量％、または85重量％から90重量％）の無機骨ミネラル；および（iv）0.5から15 mm（たとえば、0.5から1.5 mm、1.0から3.0 mm、2.5から15 mm、4.5から9 mm、7.0から15 mm、または10から15 mm）の平均長を有する、0.2重量％から3.5重量％（たとえば、0.2重量％から0.6重量％、0.5重量％から0.9重量％、0.8重量％から1.2重量％、1.1重量％から2.0重量％、1.5重量％から2.2重量％、1.9重量％から2.7重量％、または2.4重量％から3.5重量％）の繊維；および（v）1.5重量％から6重量％（たとえば、1.5重量％から2.5重量％、2.25重量％から3.25重量％、3.25重量％から4.75重量％、または4.75重量％から6.0重量％）の水を含みうる。繊維は、シルク繊維（たとえば、織物用シルクまたは外科用シルク）、セルロース繊維、ナイロン繊維、およびポリエステル繊維（たとえば、PLLAまたはPGA）から選択されうるが、これらに限定されるわけではない。たとえば、柔軟な移植可能組成物は、7から12 mm（たとえば、7±2、8±2、9±2、10±2、11±2、または12±2 mm）の平均長を有する、1.2重量％から1.8重量％（たとえば、1.2重量％から1.5重量％または1.4重量％から1.7重量％）のシルク繊維を含みうる。特定の態様において、繊維は、5μmから60μm（たとえば、5μmから20μm、15μmから30μm、20μmから40μm、または35μmから60μm）の平均直径を有する。本発明の柔軟な移植可能組成物のある態様において、微粒子は粒子を含み、パテにおける粒子数対繊維数の比率は、0.1から10（たとえば、0.25から4、0.5から2、0.75から1.25、または0.9から1.1）である。特定の態様において、柔軟な移植可能組成物は、1.5から15（たとえば、1.5から3、2.5から6、5から9、または8から15）のLAF乾燥対LAF湿潤比を有する。なお他の態様において、LAFFR対LAF無繊維比は、3から100（たとえば、3から12、10から15、15から22、または22から35、または35から100）である。なお他の態様において、柔軟な移植可能組成物は、降伏応力（YS）に関して、3から15（たとえば、7±2、9±2、11±2、13±2、または15±2）のYSFR対YS無繊維比を有する。柔軟な移植可能組成物は、モジュラス（M）比に関して、5から40（たとえば、20±5、25±5、30±5、35±5、または40±5）のMFR対M無繊維比を有しうる。本発明の柔軟な繊維強化移植可能組成物は、インビボでの移動の減少を示しうるか、または移動を示さず、およびインビトロで移動時間の減少を示しうる。
【００１２】
上記の組成物のいずれかのある態様において、組成物は、合成または天然に存在するカルシウム含有ミネラルである微粒子骨補填材、および微粒子脱灰骨基質の両方を含む。
【００１３】
上記の組成物のいずれかの1つの特定の態様において、微粒子骨補填材は、細胞外マトリクス（たとえば、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、エラスチン、フィブリノーゲン、I型コラーゲン、II型コラーゲン、またはV型コラーゲン）の細胞接着タンパク質の結合ドメインに由来する細胞接着ペプチドによってコーティングされる。たとえば、細胞接着ペプチドは、アルギニン-グリシン-アスパラギン酸（RGD）、およびチロシン-イソロイシン-グリシン-セリン-アルギニン（YIGSR）から選択されるアミノ酸配列を含みうる。特定の態様において、細胞接着ペプチドは、α2β1またはα1β1結合コラーゲン模倣ペプチドである。例示的なコラーゲン模倣ペプチドには、
2015510406.tif 000002
から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドまたはその生物活性断片が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。または、細胞接着ペプチドは、本発明の配合物中の繊維に共有結合または非共有結合（すなわち、複合体形成）されうる。
【００１４】
上記の組成物のいずれかのもう1つの特定の態様において、繊維は、細胞外マトリクス（たとえば、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、エラスチン、フィブリノーゲン、I型コラーゲン、II型コラーゲン、またはV型コラーゲン）の細胞接着タンパク質の結合ドメインに由来する細胞接着ペプチドを含む。たとえば、細胞接着ペプチドは、アルギニン-グリシン-アスパラギン酸（RGD）、およびチロシン-イソロイシン-グリシン-セリン-アルギニン（YIGSR）から選択されるアミノ酸配列を含みうる。特定の態様において、細胞接着ペプチドは、α2β1またはα1β1結合コラーゲン模倣ペプチドである。例示的なαコラーゲン模倣ペプチドには、
2015510406.tif 000003
から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドまたはその生物活性断片が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。細胞接着ペプチドは、本発明の配合物中の繊維に共有結合されうる、または非共有結合（すなわち、複合体形成）されうる。
【００１５】
上記の組成物のいずれかのある態様において、組成物は、P-15ペプチドを含むシルク繊維を含む。組成物はさらに、P-15ペプチドによってコーティングされた無機骨ミネラルなどの微粒子骨補填材を含みうる。
【００１６】
上記の骨修復パテのいずれかの特定の態様において、骨修復パテは、押し出し加工される。
【００１７】
上記の柔軟な移植可能組成物のいずれかの特定の態様において、柔軟な移植可能組成物は、押し出し加工された骨修復パテから形成される。
【００１８】
本発明はさらに、本発明の移植可能組成物を対象の骨欠損部位に移植することによって、対象における骨欠損を直す方法を特色とする。骨欠損は、本明細書において記述される任意のタイプの骨欠損でありうる。
【００１９】
「コラーゲン模倣ペプチド」は、α2β1インテグリンに対して親和性を有するアミノ酸残基3から50個の合成ペプチドを意味する。α2β1コラーゲン模倣ペプチドは、SEQ ID NO:1〜20のいずれかのペプチド配列：
2015510406.tif 000004
を含むペプチド、および参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第7,199,103号に記載される任意の他のα2β1コラーゲン模倣ペプチドを含むがこれらに限定されるわけではない。
【００２０】
本明細書において用いられる「細胞接着ペプチド」という用語は、足場依存性細胞の表面に表示されるインテグリンなどの細胞表面分子を介して足場依存性細胞に結合することができる、長さがアミノ酸残基3から100個（たとえば、長さがアミノ酸残基3から80個、3から60個、3から50個、または3から40個）のペプチドを意味する。
【００２１】
本明細書において用いられる「押し出し加工される」という用語は、細長いもの（たとえば、その最大寸法が約2±1 mm、4±1 mm、6±2 mm、10±2 mm、または12±3 mmの開口部を用いて押し出されたひもまたはロープまたはリボン）、またはシート（たとえば、4±2 mm×25±8 mmである開口部を用いて）を形成するようにサイズを合わせた開口部の中に、本発明の繊維強化骨修復パテを通過させる方法を意味する。細長いものを並べて置いて、移植前に任意の所望の既定の形状に押してもよい。任意で、細長い材料を凍結乾燥して、柔軟な移植可能組成物を形成する。
【００２２】
本明細書において用いられる、「微粒子脱灰骨基質」という用語は、その当初のミネラル含有量の一部が脱灰プロセスによって除去される骨粒子を意味する。脱灰は、酸溶液を用いることによって骨の無機ミネラル成分を除去する（Reddi et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 69:1601 (1972)を参照されたい）。酸溶液の強度、骨粒子の形状、および脱灰処置の期間は、脱灰の程度を左右しうる（Lewandrowski et al, J Biomed Materials Res. 31 :365(1996)を参照されたい）。
【００２３】
本明細書において用いられる「LAFFR対LAF無繊維比」という用語は、81〜84重量％のABM/P-15、2.3〜2.5重量％のカルボキシメチルセルロースナトリウム、11.0〜11.3重量％のグリセロール、および3〜5重量％の水を含む無繊維凍結乾燥配合物の破壊荷重に対する本発明の繊維強化配合物の破壊荷重（LAFFR）の比率を意味する。
【００２４】
本明細書において用いられる「YSFR対YS無繊維比」という用語は、81〜84重量％のABM/P-15、2.3〜2.5重量％のカルボキシメチルセルロースナトリウム、11.0〜11.3重量％のグリセロール、および3〜5重量％の水を含む無繊維凍結乾燥配合物の降伏応力に対する本発明の繊維強化配合物の降伏応力（YSFR）の比率を意味する。
【００２５】
本明細書において用いられる「MFR対M無繊維比」という用語は、81〜84重量％のABM/P-15、2.3〜2.5重量％のカルボキシメチルセルロースナトリウム、11.0〜11.3重量％のグリセロール、および3〜5重量％の水を含む無繊維凍結乾燥配合物のモジュラスに対する本発明の繊維強化配合物のモジュラス（YSFR）の比率を意味する。
【００２６】
本明細書において用いられる「LAF乾燥対LAF湿潤比」という用語は、実施例2に記述される方法を用いて湿らせた場合の同じ配合物の破壊荷重に対する本発明の乾燥状態繊維強化配合物の破壊荷重（LAF乾燥）の比率を意味する。
【００２７】
本明細書において用いられる「移動の減少」という用語は、実施例10に記載されるPLIF技法において、繊維が除去されたこと以外は同じ配合物の成績と比較した、本発明の繊維強化配合物に関して観察されるセラミック粒子のインビボ移動の減少を意味する。「移動しない」とは、実施例10のPLIF試験においてセラミック粒子のインビボ移動が観察されないことを意味する。
【００２８】
本明細書において用いられる「押し出し時間の減少」という用語は、実施例6において記述されたインビトロ法において、繊維が除去されたこと以外は同じ配合物の成績と比較した本発明の繊維強化パテのインビトロ押し出し速度の減少を意味する。たとえば、本発明の繊維強化パテの押し出し時間は、3±0.5分、4±0.5分、5±0.5分、6±0.6分、7±0.5分、または8±0.5分でありうる。
【００２９】
本発明の他の特色および利点は、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】実施例2に記述されるボールパンチ変形（BPD）試験を行うために用いられる装置の写真である。
【図２】実施例2に記述されるBPD試験を用いて乾燥状態（左）および湿潤状態（右）で試験した凍結乾燥試料に関する圧縮荷重（N）対伸び（mm）をプロットするグラフである。
【図３】本発明の配合物におけるセラミック粒子と繊維との相互作用を示す図である。このタイプの相互作用（ならびに担体基質との相互作用）は、配合物の強度を増強させて粒子の移動を減少させると考えられる。
【図４】図4A〜4Dは、実施例6に記載されるインビトロ粒子押し出し試験装置の写真である。図4Bは、無繊維パテの成績を示す写真である。図4Cは、0.5重量％シルク繊維強化（SFR）パテの成績を示す写真である。図4Dは、1.0重量％SFRパテの成績を示す写真である。これらの写真は、押し出しが起こった後に、各々の写真に関して異なる時点で撮影した。
【図５】BPD試験における試料の破壊荷重（LAF）を示す図である（実施例9を参照されたい）。湿潤状態の無繊維Flex配合物では、LAFが一貫して非常に低かった（すなわち、0.5 N）ことから、試験を行わなかった。上および下のエラーバーはそれぞれ、乾燥試料および湿潤試料に関するものであり、95％信頼区間を表す。
【図６】図6Aおよび6Bは、シルク繊維強化Flex配合物の走査型電子顕微鏡画像である。シルク強化Flexの2つの試料に関して3つの個別の視野で平均孔径を測定した。第一の試料において、平均孔径は96±69ミクロンであった。第二の試料において、平均孔径は、59±31ミクロンであった（実施例11を参照されたい）。SEM画像は、本発明の配合物における凍結乾燥ハイドロゲルマトリクスと繊維との相互作用を示す。このタイプの相互作用は、配合物の強度を増強して、粒子の移動を減少させると考えられる。
【図７】湿潤および乾燥状態1.0％シルク繊維強化Flex配合物における圧縮応力対ひずみのプロットである（実施例12を参照されたい）。乾燥および湿潤試料の両方に関する推定降伏強度（0.2％オフセットひずみ）はそれぞれ、1.5 MPaおよび0.55 MPaであることが見いだされた（n＝1、2）。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
詳細な説明
本発明は、骨欠損の処置において有用である繊維強化骨修復パテおよび柔軟な繊維強化凍結乾燥インプラントを特色とする。パテおよび凍結乾燥インプラントは、ハイドロゲル担体中に懸濁させたセラミック粒子を含み、ある量の繊維を含む。本発明の繊維強化配合物は、セラミック粒子の移動の減少を示すことができ、力学的に強化されていることから、医師は、移植技法の際に材料を引裂くかまたは穿刺することなく激しく操作することができる。
【００３２】
繊維
本発明の配合物は、長さが約0.5 mmから約15 mmの繊維を含む。繊維は、シルク繊維（たとえば、織物用シルクまたは外科用シルク）、セルロース繊維、ナイロン繊維、コラーゲン繊維、エラスチン繊維、ゼラチン繊維、ケラチン繊維、ヒアルロナン繊維、アルジネート繊維、グリコ-ラクチド繊維、キトサン繊維、ポリエチレン繊維、ポリウレタン繊維、ポリグリコリド繊維、ポリ-l-ラクチド繊維、ポリ-β-ヒドロキシ酪酸繊維、ポリジオキサノン繊維、ポリエステル繊維（たとえば、PLLA、PGA、PLG、PCL、PMA、PET、およびPLA）、ポリカーボネート繊維、ダクロン繊維、生物活性ガラス繊維、金繊維、炭素繊維、ニチノール繊維、およびステンレススチール繊維から選択されうるがこれらに限定されるわけではない。
【００３３】
たとえば、本発明の配合物において用いることができる繊維は、L-ラクチド、L-乳酸、D-ラクチド、D-乳酸、D,L-ラクチド、グリコリド、α-ヒドロキシ酪酸、α-ヒドロキシ吉草酸、α-ヒドロキシ酢酸、α-ヒドロキシカプロン酸、α-ヒドロキシヘプタン酸、α-ヒドロキシデカン酸、α-ヒドロキシミリスチン酸、α-ヒドロキシオクタン酸、α-ヒドロキシステアリン酸、ヒドロキシ酪酸、ヒドロキシ吉草酸、β-プロピオラクチド、α-プロピオ乳酸、γ-カプロラクトン、β-カプロラクトン、γ-ブチロラクトン、ピバロラクトン、テトラメチルグリコリド、テトラメチルグリコール酸、ジメチルグリコール酸、トリメチレンカーボネート、およびジオキサノンからなる群より選択されるモノマーのホモポリマーまたはコポリマー；シルク、コラーゲン、およびケラチンなどのペプチド繊維；セルロース、キチン、およびキトサンなどの多糖類繊維；ならびにこれらの混合物などの吸収性繊維を含むがこれらに限定されるわけではない。または、本発明の配合物において用いられる繊維は、生物活性ガラス繊維、金繊維、炭素繊維、ニチノール繊維、およびステンレススチール繊維などの無機繊維でありうる。
【００３４】
本発明の配合物において用いられる繊維は、0.5から15 mm（たとえば、0.5から1.5 mm、1.0から3.0 mm、2.5から15 mm、4.5から9 mm、7.0から15 mm、または10から15 mm）の平均長、および5μmから60μｍ（たとえば、5μmから20μm、15μmから30μm、20μmから40μm、または35μmから60μm）の平均直径を有しうる。
【００３５】
細胞接着ペプチドを含む繊維
本発明の配合物における繊維は任意で、1つまたは複数の細胞接着ペプチドを含む。細胞接着ペプチドは、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、エラスチン、フィブリノーゲン、I型、II型、およびV型コラーゲンなどのコラーゲンを含む、細胞接着において役割を果たすことが知られている細胞外マトリクスの任意のタンパク質、ならびにその生物活性断片を含みうる。さらに、細胞接着ペプチドは、上記の分子の結合ドメインを含む誘導体または断片を含む、前述の任意のタンパク質に由来する任意のペプチドでありうる。例示的なペプチドには、RGD（アルギニン-グリシン-アスパラギン酸）モチーフ、YIGSR（チロシン-イソロイシン-グリシン-セリン-アルギニン）モチーフなどのインテグリン結合モチーフを有するペプチド、および機能的同等物である関連ペプチドが挙げられる。たとえば、RGD配列を含むペプチド（たとえば、GRGDS）およびWQPPRARI配列は、内皮細胞の伸展および遊走特性を支配することが知られている（V. Gauvreau et al., Bioconjug Chem. 16:1088 (2005)を参照されたい）。REDVテトラペプチドは、内皮細胞接着を支持するが、平滑筋細胞、繊維芽細胞、または血小板の接着は支持しないことが示されており、およびYIGSRペンタペプチドは、上皮細胞の接着を促進するが、血小板の接着は促進しないことが示されている（Boateng et al., Am. J. Physiol. Cell Physiol. 288:30 (2005)を参照されたい）。細胞接着配列の他の例は、内皮細胞のCD13に結合するNGRトリペプチド（L. Holle et al., Oncol. Rep. 11:613 (2004)を参照されたい）およびI型コラーゲンに結合するDGEA（Hennessy et.al. Biomaterials, 30:1898 (2009)を参照されたい）である。
【００３６】
本発明の移植可能組成物において用いることができる細胞接着ペプチドは、前述のペプチド、ならびにその各々が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,156,572号、米国特許出願公開第2003/0087111号、および米国特許出願公開第2006/0067909号に開示されるペプチドを含むがこれらに限定されるわけではない。
【００３７】
ある態様において、細胞接着ペプチドは、コラーゲン模倣ペプチドである。インテグリンα2β1は、各々が1回膜貫通ドメインを有するインテグリンファミリーメンバーである同一でない2つのサブユニット、α2およびβ1からなり、α2β1は、α2サブユニットの専用の領域を介してコラーゲンに結合することが知られている。コラーゲンには、いくつかの公知のα2β1認識部位が存在する。このことは、特異的で再現可能なペプチドに切断される精製α鎖に由来するコラーゲン断片を用いることにより理解される。本発明の移植可能組成物において用いることができるコラーゲン模倣ペプチドは、その各々が参照により本明細書に組み入れられる、PCT国際公開番号WO/1999/050281；WO/2007/017671；およびWO/2007/052067において記述されるペプチドを含むがこれらに限定されるわけではない。コラーゲン模倣ペプチドは、SEQ ID NO:1〜20のいずれかのペプチド配列を含むペプチド：
2015510406.tif 000005
および参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第7,199,103号に記述される他の任意のコラーゲン模倣ペプチドを含むがこれらに限定されるわけではない。
【００３８】
たとえば、細胞接着ペプチドを繊維に結合させることができる。たとえば、シルク繊維を、Chen et al., J Biomed Mater Res A. 67:559 (2003)によって既に記述された方法を用いて、細胞接着ペプチドに共有結合させることによって修飾することができる。簡単に説明すると、シルク繊維におけるアスパラギン酸およびグルタミン酸アミノ酸のカルボキシル基を、PBS中で活性化（すなわち、1-エチル-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（EDC）およびN-ヒドロキシスクシニミド（NHS）との反応によって）させた後、細胞接着ペプチドのN-末端と反応させて、細胞接着ペプチドを含む繊維を産生することができる。
【００３９】
微粒子骨補填材
本発明の配合物は、微粒子骨補填材を含む。骨補填材は、たとえば石灰化骨基質、有機物除去骨基質、無機骨ミネラル、またはその混合物などのリン酸カルシウム材料から選択される微粒子セラミックでありうる。リン酸カルシウムは、当技術分野において公知の任意の生物適合性のリン酸カルシウム材料でありうる。リン酸カルシウム材料は、多様な方法の任意の1つによって、および任意の適した開始成分を用いて産生されうる。たとえば、リン酸カルシウム材料は、非晶質のアパタイトリン酸カルシウムを含みうる。リン酸カルシウム材料は、結晶リン酸カルシウム反応物質の固相状態酸塩基反応によって、結晶ヒドロキシアパタイト固体を形成することによって産生されうる。他のリン酸カルシウム材料の作製法が、当技術分野において公知であり、そのいくつかを以下に記述する。または、リン酸カルシウム材料は結晶ヒドロキシアパタイト（HA）でありうる。結晶HAは、たとえば米国再発行特許第33,221号および第33,161号において記述される。これらの特許は、リン酸カルシウム再石灰化組成物の調製、および同じリン酸カルシウム組成物に基づく微晶質で非セラミックの徐々に吸収可能なヒドロキシアパタイト担体材料の調製について教示している。リン酸四カルシウム（TTCP）、およびリン酸一カルシウム（MCP）またはその一水和物型（MCPM）からなる類似のリン酸カルシウム系が、米国特許第5,053,212号および第5,129,905号に記述されている。このリン酸カルシウム材料は、結晶リン酸カルシウム反応物質の固相状態酸塩基反応によって、結晶ヒドロキシアパタイト固体を形成することによって産生される。炭酸塩置換結晶HA材料（一般的にダーライトと呼ばれる）を調製してもよい（米国特許第5,962,028号を参照されたい）。これらのHA材料（一般的に炭酸ヒドロキシアパタイトと呼ばれる）は、反応物質を水性液体と混合して実質的に均一な混合物を提供する段階、混合物を適切に成型する段階、および水の存在下で混合物を硬化させる段階によって形成されうる。硬化の際に、混合物は、固体で本質的にモノリシックなアパタイト構造へと結晶化する。反応物質は、一般的にリン酸源、たとえばリン酸またはリン酸塩、アルカリ土類金属、詳しくはカルシウム、任意で結晶核、詳しくはヒドロキシアパタイトまたはリン酸カルシウム結晶、炭酸カルシウム、および生理的に許容される潤滑剤を含む。乾燥成分を混合物として予め調製して、次に、実質的に均一な混合が起こる条件で水性液体成分と混合してもよい。
【００４０】
細胞接着ペプチド
本発明の配合物におけるセラミック粒子は、任意で1つまたは複数の細胞接着ペプチドによってコーティングされる。細胞接着ペプチドは、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、エラスチン、フィブリノーゲン、ならびにI型、II型、およびV型コラーゲンなどのコラーゲンを含む、細胞接着において役割を果たすことが知られている細胞外マトリクスの任意のタンパク質、ならびにその生物活性断片を含みうる。さらに、細胞接着ペプチドは、上記の分子の結合ドメインを含む誘導体または断片を含む、前述の任意のタンパク質に由来する任意のペプチドでありうる。例示的なペプチドには、RGD（アルギニン-グリシン-アスパラギン酸）モチーフ、YIGSR（チロシン-イソロイシン-グリシン-セリン-アルギニン）モチーフなどのインテグリン結合モチーフを有するペプチド、および機能的同等物である関連ペプチドが挙げられる。たとえば、RGD配列を含むペプチド（たとえば、GRGDS）およびWQPPRARI配列は、内皮細胞の伸張および遊走特性を支配することが知られている（V. Gauvreau et al., Bioconjug Chem. 16:1088 (2005)を参照されたい）。REDVテトラペプチドは、内皮細胞接着を支持するが、平滑筋細胞、繊維芽細胞、または血小板の接着は支持しないことが示されており、およびYIGSRペンタペプチドは、上皮細胞接着を促進するが、血小板の接着は促進しないことが示されている（Boateng et al, Am. J. Physiol. Cell Physiol. 288:30 (2005)を参照されたい）。細胞接着配列の他の例は、内皮細胞のCD13に結合するNGRトリペプチド（L. Holle et al., Oncol. Rep. 11:613 (2004)を参照されたい）、およびI型コラーゲンに結合するDGEA（Hennessy et.al. Biomaterials, 30: 1898 (2009)を参照されたい）である。
【００４１】
本発明の移植可能組成物において用いることができる細胞接着ペプチドは、前述のペプチド、ならびにその各々が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,156,572号；米国特許出願公開第2003/0087111号；および米国特許出願公開第2006/0067909号において開示されるペプチドを含むがこれらに限定されるわけではない。
【００４２】
または、細胞接着ペプチドは、特異的細胞タイプ（たとえば、内皮細胞）に対する接着および選択性に関してペプチドライブラリをスクリーニングすることによって得ることができ、またはファージディスプレイ技術を介して経験的に開発することができる。
【００４３】
ある態様において、細胞接着ペプチドは、コラーゲン模倣ペプチドである。インテグリンα2β1は、各々が1回膜貫通ドメインを有するインテグリンファミリーメンバーである、同一でない2つのサブユニット、α2およびβ1からなり、α2β1は、α2サブユニットの専用の領域を介してコラーゲンに結合することが知られている。コラーゲンには、いくつかの公知のα2β1認識部位が存在する。このことは、特異的で再現可能なペプチドに切断される精製α鎖に由来するコラーゲン断片を用いることにより理解される。本発明の移植可能組成物において用いることができるコラーゲン模倣ペプチドは、その各々が参照により本明細書に組み入れられる、PCT国際公開番号WO/1999/050281；WO/2007/017671；およびWO/2007/052067において記述されるペプチドを含むがこれらに限定されるわけではない。コラーゲン模倣ペプチドは、SEQ ID NO:1〜20のいずれかのペプチド配列を含むペプチド：
2015510406.tif 000006
および参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第7,199,103号に記述される他の任意のコラーゲン模倣ペプチドを含むがこれらに限定されるわけではない。
【００４４】
たとえば、平均粒子径300ミクロンを有し、ほぼ全てが200ミクロンから425ミクロンの範囲内に入るABM微粒子に、細胞接着ペプチドをコーティングすることができる。しかし、50ミクロンから2000ミクロンの粒子サイズ範囲も同様に用いられうる。
【００４５】
無機骨ミネラル（ABM）はまた、合成アロプラスト基質でありうるか、または「無機」という定義に当てはまらない他のいくつかのタイプの異種移植もしくは同種異系移植石灰化基質でありうる。アロプラストは、リン酸カルシウム材料でありうるか、または、骨補填材配合物において既に用いられているいくつかの他の無機材料、たとえば、リン酸カルシウムを含む混合物において用いられ、生物適合性の骨伝導性基質として機能しうる、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、ケイ酸カルシウムの1つでありうる。無機骨ミネラル、合成アロプラスト基質、および異種移植または同種異系移植石灰化基質は、微粒子骨補填材でありえて、細胞接着ペプチドをその表面に結合させるために用いることができる。
【００４６】
ハイドロゲル
本発明の繊維強化パテを調製するために、微粒子骨補填材を、短い繊維と共に生物適合性の多糖類ゲルの中に懸濁することができる。利用されうる多糖類は、たとえば以下のクラスの多糖類の中の任意の適した多糖類を含む：セルロース／デンプン、キチンおよびキトサン、ヒアルロン酸、アルジネート、カラゲニン、寒天、およびアガロース。用いることができるある種の特異的多糖類は、寒天、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、結晶セルロース、酸化セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、およびキサンタンゴムを含む。
【００４７】
ハイドロゲルは典型的に、材料の粘度を制御するための溶媒を含む。溶媒は、たとえばグリセロール、トリアセチン、イソプロピルアルコール、エタノール、およびエチレングリコールを含むアルコールもしくはアルコールエステル、またはこれらの混合物でありうる。パスタまたはゲルは、界面活性剤、安定化剤、pH緩衝剤、および他の添加剤（たとえば、増殖因子、抗生物質、鎮痛剤等）などの他の成分を含みうる。たとえば、適したゲルまたはパスタを、水、グリセリン、およびカルボキシメチルセルロースナトリウムを用いて調製することができる。
【００４８】
柔軟な凍結乾燥繊維強化インプラント（すなわち、Flex材料）は、繊維強化パテを凍結乾燥することによって、実施例1に記述されるように調製される。
【００４９】
治療
本発明の組成物は、対象に移植される骨補填材として用いることができる。本発明の組成物は、インプラントの急速な石灰化を促進するために細胞接着ペプチドを含みうる。
【００５０】
本発明の組成物は、整形外科に関わる多様な状態を修復するために有用でありうる。たとえば、組成物は、脊椎骨折の予防もしくは処置のために椎体に注射されうる、骨折の修復を増強するもしくは骨折した断片を安定化するために長骨もしくは扁平骨の骨折部に直接注射されうる、または骨の強度を改善するためにインタクトの骨粗鬆症骨に注射されうる。組成物は、骨ねじまたは骨-インプラント界面を増強するために有用でありうる。さらに、組成物は、骨が欠損している可能性がある骨格領域において骨充填剤として有用でありうる。そのような欠損が存在しうる状況の例には、分節骨の喪失を伴う外傷後、骨が切除されている骨腫瘍手術後、および関節全置換術後（たとえば、インパクショングラフティング(impaction grafting)およびその他）が挙げられる。組成物は、関節形成術を受ける患者において、人工関節成分を保持および固定するために移植前にパスタ剤として、切除手術後の脊髄前柱を安定化するための支柱として、分節骨の構造支持体として（たとえば、骨分節を集合させて、ねじ、外部プレートおよび関連する内部固定ハードウェアを支持する）、および脊椎固定における骨補填材として配合されうる。
【００５１】
本発明の組成物は、人工骨インプラントをコーティングするために用いることができる。たとえば、人工骨インプラントが多孔性の表面を有する場合、その中での骨生長（骨の内部生長）を促進するために組成物を表面に適用してもよい。組成物はまた、骨内部の固定を増強するために人工骨インプラントに適用されうる。
【００５２】
本発明の組成物は、股関節再置換、たとえば外傷による骨喪失の置換、顎顔面手術のリモデリング、または歯周欠損部の充填ならびに歯槽堤増大およびサイナスリフトを含む抜歯後歯槽の充填を含む、たとえば整形外科手術におけるリモデリングインプラントまたは人工骨置換材料として用いることができる。このように、本発明の組成物は、骨修復部位で、いかなる数の骨欠損も直すために用いられうる。
【００５３】
以下の実施例は、本明細書において請求される方法および化合物がどのように行われ、作製され、および評価されるかに関する完全な開示および説明を当業者に提供するために示され、本発明の純粋な例であると意図され、本発明者らが本発明として見なす範囲を制限しないと意図される。
【００５４】
以下の実施例は、本明細書において請求される方法および化合物がどのように行われ、作製され、および評価されるかに関する完全な開示および説明を当業者に提供するために示され、本発明の純粋な例であると意図され、本発明者らが本発明として見なす範囲を制限しないと意図される。
【実施例】
【００５５】
実施例1．繊維強化移植可能材料の調製
繊維強化パテおよび繊維強化Flex（凍結乾燥パテ）は、PCT国際公開番号WO2007070681に記述される方法と類似の方法を用いて調製した。
【００５６】
パテの調製
約51.9重量％無機骨ミネラル粒子（ABM、OsteoGraf（登録商標）-N300としても知られる天然の微孔性外因性骨材料）、約1.5重量％カルボキシメチルセルロースナトリウム、約6.98重量％グリセロール、および約39.57重量％水を含むパテ材料を、水、グリセロール、およびカルボキシメチルセルロースナトリウムを混合して、ハイドロゲルを形成する段階、ならびにABM粒子をハイドロゲルと混合してパテを形成する段階によって調製した。ハイドロゲル／パテは、混合の際に形成されるいかなる気泡も除去するために、任意で真空に供される。ABM粒子は任意で、その表面に結合したP-15ペプチド（米国特許第5,635,482号を参照されたい）を含む（Dentsply Tulsa Dental SpecialtiesからPEPGEN P-15（登録商標）として販売）。
【００５７】
繊維強化パテの調製
上記のパテに、既定量の繊維を混合しながら少しずつ増量して加えた。Ross高粘度（HV）ブレードなどのブレードを備えたRossダブルプラネタリーミキサーなどの混合装置を用いることによって、均一なバッチを得た。
【００５８】
繊維強化Flexの調製
繊維強化パテを成型して（すなわち、型に入れて）、低温フリーザー（-65℃）に1時間以上入れて、少なくとも5時間凍結乾燥した。得られた繊維強化Flex材料の水分含有量を、周囲の空気に曝露後に評価することができる。水分含有量を、必要に応じて、水分に対する曝露または乾燥条件によって調節してもよい。
【００５９】
実施例において記述される繊維強化Flex配合物は、Flex配合物を形成するために凍結乾燥されるパテに含まれる繊維の重量百分率によって識別される。得られたFlex配合物における繊維のおおよその重量百分率は、パテから水分を除去した後では高い。Flex配合物のおおよその繊維含有量を以下の表1に提供する。
【００６０】
（表１）
2015510406.tif 000007
1. Flex配合物中の水分含有量を1％から7％と仮定して計算した濃度
【００６１】
実施例2．改変ボールパンチ変形試験
繊維強化Flexは、無繊維配合物と比較して、外科医による取り扱いおよび移植の容易さを改善することができる。繊維強化材料はまた、移植後の粒子の移動も減少させることができる。
【００６２】
本発明のFlex製品に関する標準的な力学試験である引っ張り試験は、製品が引き裂かれることがほとんどないことから、材料を現実のシナリオで適切に試験することができない。実際には、凍結乾燥配合物の移植の際に、引っ張るのではなくて穿刺動作で手の圧力がFlex条片に加えられる。現実の外科の状況での製品の性能を確認するためには、乾燥および湿潤状態Flex試料（様々な技術および流体を用いて）の両方について試験を行うのが理想的であろう。
【００６３】
繊維強化Flexが手による穿刺動作にうまく耐えることができるか否かを評価するために、新しい試験法である改変ボールパンチ変形試験（BPD試験）が開発された。BPD試験は、Flexおよび繊維強化Flex製品の実際の取扱適性を模倣する。さらに、この試験は、ASTM E643の改変型である。
【００６４】
Flex材料の試料を、BPD試験装置の試料ホルダーに入れる（図1Bを参照されたい）。装置は、3/4インチのダイス型と共に1/2インチボールを含む（図1Aを参照されたい）。試料を底のダイス型の穴の上に並べて、上のダイス型を試料の上に並べ、試料が動かないようにラッチを固定する。斜交平行線模様をつけた底部の部品によっても、試料の引き込み（側面から中に入ること）は最小限となる。ボールを、ホルダーの3/4インチの穴の上に置き、試験される試料の真上に配置する。ボールが0.5 mm/秒で移動すると試験が始まり、最初の接点からの最大の伸びは15 mmである。ボールが試料に向かって進行する際の圧縮荷重（すなわち、ニュートンで測定される圧縮の際に適用される力）を記録する。BPD試験は、（i）破壊荷重（LAF、試料が破断する前に達する最大荷重）、（ii）破断時の伸び（EAF、最大荷重での圧縮による伸び）、および（iii）試料のモジュラス（すなわち、剛性）（圧縮荷重対圧縮による伸びをプロットするBPD試験曲線の直線領域の勾配）を測定する。
【００６５】
湿潤状態Flex製品を試験するために、試料ホルダーに入れた乾燥Flex試料のアセンブリ全体をリン酸緩衝生理食塩液（PBS）中に5分間沈めることによってFlexを湿らせる。過剰量の液体を除去して、試料を試験する。
【００６６】
例示的なデータを図2に示す。BPD試験結果を無繊維Flexに関して示す。試験結果は、乾燥材料に関して、LAF平均値8.5 NおよびEAF平均値約9 mmで良好な再現性を示す（図2右を参照されたい）。これに対し、湿潤状態無繊維Flexは、LAFの相当な減少（平均値約0.15 N）およびEAFの相当な減少（平均約3.7 mm）を示す（図2左を参照されたい）。
【００６７】
実施例3．繊維強化Flexの力学的特性に及ぼすシルク繊維の長さおよび濃度の効果
以下の試験の目的は、シルク繊維強化Flex（SFR Flex）試料の力学的特性に及ぼすシルク繊維の長さおよび濃度の効果を理解することであった。
【００６８】
SFR Flex試料を、実施例1に記載される方法を用いて調製した。本試験に用いた繊維は、1/2インチ、3/8インチ、および1/4インチの長さに切断した粗紡シルク繊維（織物等級）であった。試料を、実施例2に記述されるBPD試験に供した。結果を以下の表2に示す。
【００６９】
（表２）
2015510406.tif 000008
【００７０】
結果および考察
繊維の含有量が減少すると、LAFの着実な減少を観察することができ、LAFの最小値は、概して無繊維Flex試料において観察される。乾燥状態1.0％SFR Flex試料は、乾燥状態無繊維Flexより5倍高いLAF値を示す。乾燥状態0.5％SFR Flex試料は全て、乾燥状態無繊維Flexより強く、2倍を超える値からほぼ4倍高いLAF値を有する。乾燥状態0.25％SFR Flex試料は、乾燥状態無繊維Flexよりおよそ2倍強い。
【００７１】
乾燥状態1％SFR Flex試料のモジュラスは類似であることが観察されたが、乾燥状態0.5％SFR Flexおよび乾燥状態0.25％SFR Flex試料では、モジュラスは、減少し始め、このことはそれらの試料の剛性がより低いことを示している。このことは、試料間で定性的に感じられうる。平均値では、1.0％SFR Flex試料は、他の全ての試料と比較して剛性であった。それらはねじり柔軟性を維持したが、引っ張るとかなり剛性であった。これは、繊維とABM粒子のあいだの内部摩擦力の増加による可能性が最も高い。1.0％SFR Flex試料は、湿潤状態でなおも非常に粘着性で、手で引き裂くためには大きい力を必要とした。0.5％SFR Flexおよび0.25％SFR Flex試料はより柔軟で、無繊維Flexと非常に類似の挙動を示した。それらは、かなり強く、破壊するために無繊維Flexより多くの力を必要とした。湿潤状態では、それらの試料は、無繊維Flexよりなおも強かったが、かなり容易に破壊された。
【００７２】
1/2インチおよび3/8インチ試料で観察された強度の差は、所定の試料において認められる繊維の数による可能性がある。長さが12 mmおよび6 mmの2つの等しい重量の繊維の山が存在する場合、6 mmの山には12 mmより2倍多くの繊維が存在する。このように、6 mm繊維を有する1.0％SFR Flex試料は、12 mm繊維を有するFlex試料の2倍多くの繊維を有する。
【００７３】
理論的繊維数を決定するために、小さい塊の繊維をとって、それらの重量を測定することによってシルク重量を集めた。次に、塊を顕微鏡用スライドガラス上に置いて、ほつれさせて個々の全ての繊維をばらばらにして、テープで縛り、計数した。重量を繊維数で除して、次に、シルクの長さあたりの総重量を得るために、繊維の長さで除した。たとえば、9 mm繊維の塊の重量が0.0018 gで、繊維100本を含むことが認められる場合、繊維1 mmあたりの重量は、0.0018 g/（繊維100本×9 mm）＝0.000002 g/mm繊維である。
【００７４】
本発明者らは、3/8インチ繊維試料に関して、（i）1.0％SFR Flex試料では0.25％SFR Flex試料よりおよそ11,300本多くの繊維が存在する；（ii）3/8インチ1.0％SFR Flex試料では、1/2インチ1.0％SFR Flex試料よりおよそ2,800本多くの繊維が存在する；および（iii）3/8インチ1.0％SFR Flex試料では、これらの材料において観察されたより高いLAFに寄与しうるおよそ33％多くの繊維が存在すると計算する。
【００７５】
シルク繊維が試料を強化する機序は、繊維とABM粒子のあいだの摩耗作用により生じうる。シルク繊維は、ハイドロゲル担体よりむしろ、ABM粒子に密接に会合しうる。BPD試験の際に、試料が変形し始めると、シルク繊維はABM微粒子から出てゆき、最終的に繊維が外れて試料は崩壊する。この強化機序の証拠を図5に見ることができる。1/2インチおよび1/4インチSFR Flex試料のモジュラスはいずれも、繊維が最後のABM粒子のあいだから最終的に放出される際に起こる破壊点まで非常に類似である（同じではないが）。1/4インチ試料は、平均で1/2インチ試料より1 mm前で壊れる。ABM粒子の平均直径300μm（0.3 mm）を用いると、1/2インチおよび1/4インチシルク繊維と相互作用する可能性がある粒子はそれぞれ、およそ40個（12 mm/0.3 mm＝40）および20個存在する。多数の繊維が同様に、1つのABM粒子と相互作用している可能性がある。
【００７６】
本発明者らは、長さ9 mmのシルク繊維を含む1.0％SFRパテおよびFlex配合物に関して、配合物におけるABM粒子数対繊維数の比率は、およそ1：1であると計算した。この比率、および粒子サイズに対する繊維の長さは、本発明の配合物に関する取扱適性および移植後の移動に対する抵抗性を決定する上で重要でありうる。
【００７７】
実施例4．インビトロシミュレーションPLF手術
脊柱モデルおよびスポンジを用いる後外側固定（PLF）シミュレーションを用いて、シルク繊維強化（SFR）Flex試料に関して、定性的取扱適性データを定量的力学試験データと相関させた。
【００７８】
SFR Flex試料を、実施例1に記述される方法を用いて調製した。本試験に用いた繊維は、3/8インチの長さに切断された粗紡糸シルク繊維（織物等級）であった。1％SFR Flex、0.5％SFR Flex、0.25％SFR Flex、および無繊維Flex試料を本試験において用いた。
【００７９】
スポンジ／脊柱モデルシミュレーション
大きいスポンジをロールパンのように半分に切断して、一部を片側で接着させたたままにする。次いでジップタイ(zip tie)をスポンジの中のバン(bun)の中心に通した。腰椎モデルの横突起のモデルをスポンジの内部に入れた。試料を、スポンジモデルの中で横突起間領域を横切るように配置した。各試料に最悪のシナリオの圧（すなわち、通常の手術に一致する様式よりかなり大きい圧を用いた）を手で加えた。試料を取り出して伸ばし、何度も再配置した。最初の取り扱いを観察した後、試料をパテ様の形状に成型して脊柱に再度配置した。
【００８０】
取り扱いに関する知見
無繊維Flex試料は、ねじれおよび引っ張りに対して非常に伸張性があり、柔軟であった。無繊維Flex試料を横突起間領域に最初に配置すると、試料は引裂かれ、手による軽微な圧によってさらなる引き裂きが起こった。無繊維Flex試料は、水和後まもなくばらばらに壊れ始めたが、同様にパテへと戻り始めた。SFR Flex試料と比較して、無繊維Flex試料から、より多くのABM/P-15粒子が剥がれ落ちる（微粒子化と呼ばれる）ことが観察された。
【００８１】
0.25％SFR Flex試料は、乾燥型で柔軟で伸張性であった（この配合物は、無繊維Flexに似た感触を有する）。配合物を水和させると、より粘液性となり、これも無繊維Flexと同様に微粒子化した。手で強く圧を与えた後に小さい裂傷が形成され、一度裂傷が形成されると、試料はかなり容易にばらばらになり始めた。水和させると、この配合物はSFRパテを形成した。
【００８２】
0.5％SFR Flexは容認可能に柔軟性であったが、無繊維Flexおよび0.25％SFR Flex試料ほど柔軟ではなかった。0.5％SFR Flex試料は、最初に適用された圧によって最初は裂けたが、これによって条片が弱くなるようには全く思われなかった。その後の成型操作によって、これ以上の破断を生じなかった。0.5％SFR Flex試料は、一度水和すると、SFRパテへと戻り、これを再形成して、再移植することができる。
【００８３】
1.0％SFR Flex試料は、引っ張りに対してかなり剛性であったが、なおもそのねじり柔軟性を維持した。この配合物は、当初、乾燥状態で空隙に適合しなかった。しかし、配合物を湿らせると、条片は、かなりより柔軟となり、条片はうまく適合した。1.0％SFR Flex試料は、湿らせた後に手で大きい引っ張り力を与えると最後には破断した。
【００８４】
この試験は、強化Flex材料の2つの重要な力学的特性、すなわち形成性と強度に向けて行われる。強度は、移植可能な材料が手術の際に手による圧力にどれほど耐えるかを理解するために必須の特徴である。形成性もまた非常に重要である。たとえば、1.0％SFR Flex試料は非常に剛性で、当初、空隙にうまく適合しなかった。湿らせると、試料はより柔軟で成型可能となった。これは0.5％SFR Flex試料より50％大きい強度を有するが、0.5％SFR Flex試料は初回形成性を有し、手による圧（これは移植の際に通常適用される圧より過度の圧であった）に対処するために十分な強度を有した。
【００８５】
さらに、繊維含有量を減少させることによって、より容易に押し出され、製造の際に混合技法が単純となる製品を得ることができる。本発明者らは、0.5％SFR Flexにおいて認められる繊維含有量付近では、パテがより粘着性になり始め、それによって混合が難しくなり、および成型操作のためにより容易に押し出されなくなることを観察している。3/8インチ繊維を含む0.5％SFR Flexは、乾燥状態または湿潤状態であるかによらず、取り扱いが容易で、良好に混合し、乾燥状態無繊維Flexと類似の特性を示す。
【００８６】
実施例5．力学的特性に及ぼす繊維タイプおよび繊維直径の効果
本試験の目的は、繊維強化（FR）Flexの力学的特性に及ぼす繊維タイプの効果を理解することであった。
【００８７】
FR Flex試料を、実施例1に記述される方法を用いて調製した。本試験のために用いた繊維は、6 mmおよび12 mmの繊維長を有するPLLA、PGA、およびシルク（織物および医用）の繊維であった。糸巻きに捲かれたシルクを巻き戻して測定して、手動で12 mmの長さに切断した。繊維の直径の測定も同様に行った。乾燥試料を、実施例2に記述されるBPD試験に供した。結果を以下の表3に示す。
【００８８】
（表３）乾燥試料の力学的性能
2015510406.tif 000009
【００８９】
結果および考察
0.5％FR Flexの医用シルク、PGA、およびPLLA試料はそれぞれ、19.2、24.0および20.9 Nという類似のLAF値を示し、12 mm織物シルクより6 mm織物シルクと類似の性能を示す。これらの試料は全て、無繊維Flexより1.5倍以上強い。
【００９０】
本発明者らは、最高のLAFを有する試料である0.5％SFR Flex試料中の織物シルクにおいて、他の任意の試料より3倍またはそれより多くの繊維が存在することを観察した。意外にも、この0.5％SFR Flex試料（医用シルクを含む）は、PLLAおよびPGAを用いて作製された0.5％SFR Flexと同等の強度を有するが、これらの試料はそれぞれ、5倍および7.7倍の繊維数を含む。
【００９１】
繊維の顕微鏡写真を撮影して、その直径を測定した。本発明者らは、PLLAおよびPGA繊維が、医用シルクまたは織物シルクよりかなりなめらかであることを認めた。本発明者らはまた、医用等級のシルクが、織物用シルクを含む他の全ての繊維よりかなり大きい直径を有することを認めた。
【００９２】
PLLAおよびPGAに関して観察されたこのよりなめらかな繊維は、ABM粒子と繊維とのあいだの摩擦を減少させうる。その上、PLLAおよびPGAはいずれも、シルクより親水性である。それゆえ、ハイドロゲルは、PLLAおよびPGA繊維の周囲に潤滑層を形成することができ、繊維に沿って滑るABM粒子とのあいだの摩擦を減少させて、これらの配合物に関して観察されるLAFを減少させるという仮説が立てられる。
【００９３】
直径がより大きい医用等級シルクは、摩擦相互作用する繊維がそのように少ないことから、同じ重量百分率の織物シルクほど強くない可能性がある。より大きい直径はまたより堅固であり、直径がはるかにより小さい織物シルクのように周囲に空隙を形成しない。それゆえ、医用シルクは単純に、さらに追加の強度を与えることなく、ABM粒子を単に通り過ぎる。医用等級のシルクは、多数のシルク繊維とある種の「糊」、おそらくセリシンまたはロウとの複合体であるように思われる。
【００９４】
実施例6．移動特性に及ぼす繊維の効果
本試験の目的は、移植後の微粒子の移動に及ぼすシルク繊維強化（SFR）パテの効果を理解することであった。インビボで水和させると、Flex材料はパテを形成する。インプラントが骨欠損部位でABM粒子を保持することは重要である。
【００９５】
繊維強化パテ試料を、実施例1に記述される方法を用いて調製した。
【００９６】
脊椎インプラントケージの腔およびケージの挿入穴を模倣するインビトロモデルを開発した（図4Aを参照されたい）。中央のプレートを底部プレートの上に置いて、パテを中心腔の中にしっかりと充填する。4つのねじを用いて上のプレートを固定して、内部ケージ腔を密封する。小さい針を用いて、流体入口の穴を流体で充填して、気泡を消失させる。2つのシリンジにリン酸緩衝生理食塩液（PBS）を満たして、100μl/分（両方で全体で200μl/分）の速度に設定したデュアルシリンジポンプに取り付けた。流体入口を介してシリンジと脊椎ケージモデルとをチューブでつなぐ。ストップウォッチを用いて、ポンプの開始から肉眼で見てABM顆粒が上部プレートの上に達するまで移動する時間を測定し、および他の全ての関連する時点を測定した。結果を表4に提供する。
【００９７】
（表４）
2015510406.tif 000010
a.ABM/P-15微粒子が「挿入穴」の上部に達するまでに要する時間
【００９８】
結果および考察
無繊維パテは、モデルの内部ケージ腔からの排出が最も速く、2.5分であった（図4Bを参照されたい）。大きい「ヘビ状の」パテが穴から押し出されて、PBSが流出し始めたことから、9分でポンプを停止した。パテおよそ0.4 ccがこの実験の際に押し出された。
【００９９】
0.5％SFRパテは、5.5分でモデルの内部ケージ腔から押し出され始めた（図4Cを参照されたい）。試験終了時（12分）、0.5％SFRパテのおよそ0.05 ccが押し出された。押し出された材料の大部分（およそ60％）はハイドロゲル担体であり、ABM粒子ではなかった。
【０１００】
1.0％SFRパテは、7.5分でモデルの内部ケージ腔から押し出され始めた（図4Dを参照されたい）。試験終了時（16分）、1.0％SFRパテのおよそ0.05 ccが押し出された。押し出された材料の大部分（およそ80％）はハイドロゲル担体であり、ABM粒子ではなかった。
【０１０１】
FRパテ材料は、無繊維配合物と比較して移植部位からの押し出し能の劇的な減少を示すことが認められた。
【０１０２】
実施例7．パテ配合物の引っ張り強度に及ぼす繊維の効果
本試験の目的は、パテ配合物の引っ張り強度に及ぼすシルク繊維の効果を理解することであった。
【０１０３】
無繊維およびシルク繊維強化（1％繊維）パテ試料の両方を、実施例1に記載される方法を用いて調製した。Instron（商標）力学的試験機器を用いて、パテ配合物を破断するまで伸張させた。パテ配合物をこの機器によって引っ張る際に、機器が試料に及ぼした力を測定して、降伏応力を計算した。
【０１０４】
降伏応力（力学的試験の際に試料に適用された単位面積あたりの力）を、無繊維配合物と1％SFR配合物の両方に関して測定した。無繊維パテは、平均降伏応力5±1 kPaを示したが、SFR配合物は、21±2 kPaの平均降伏応力を示した。結果は、パテの降伏応力が、平均値で、シルク繊維を加えることによって4倍増加したことを示している。
【０１０５】
実施例8．Flex配合物の引っ張り強度に及ぼす繊維の効果
本試験の目的は、Flex配合物の引っ張り強度に及ぼすシルク繊維の効果を理解することであった。
【０１０６】
無繊維Flexおよび1.0％SFR Flex試料を、実施例1に記述される方法を用いて調製した。Instron（商標）力学的試験機器を用いて、Flex配合物を破断するまで伸張させた。Flex配合物を機器によって引っ張る際に、機器が試料に及ぼした力を測定して、モジュラスおよび降伏応力を計算した。
【０１０７】
降伏応力およびモジュラスを、無繊維Flex配合物および1％SFR Flex配合物の両方について測定した。結果を表5に提供する。
【０１０８】
（表５）
2015510406.tif 000011
a. 材料の弾性変形に対する抵抗性。これは引っ張り試験の弾性領域における応力対ひずみの比率である。ひずみは、力学的試験の際に材料の当初の長さによって除した材料の長さの変化である。
【０１０９】
無繊維Flexは、41±3 kPaの平均降伏応力を示したが、SFR Flex配合物は、384±84 kPaの平均降伏応力を示した。無繊維Flexは、89±16 kPaの平均モジュラスを示したが、SFR配合物Flexは、2,403±458 kPaの平均モジュラスを示した。結果は、シルク繊維を加えることによって、平均値でFlexの降伏応力が9倍、およびモジュラスが27倍増加することを示している。
【０１１０】
実施例9．Flex配合物のLAFおよびEAFに及ぼす繊維の効果
無繊維Flexおよび1.0％SFR Flex試料の両方を、実施例1に記述される方法を用いて調製した。実施例2に記述されるBPD試験を用いて、厚さおよそ4 mmの試料を分析した。破壊荷重（LAF）および破断時の伸び（EAF）の結果を表6に提供する。
【０１１１】
（表６）
2015510406.tif 000012
【０１１２】
無繊維Flexは、7.8±0.4 Nの平均LAFおよび10.2±0.2 mmの平均EAFを示した。これに対し、1％SFR Flex配合物は、66.9±8.2 NのLAFおよび7.8±0.5 mmのEAFを示した。無繊維Flexに関して何らかの引き込みが観察され（すなわち、試験の際に、試料がホルダーの側面から引っ込んで、伸張のデータを歪める）、このことは、SFR Flex配合物に関して観察されたEAF値と比較してそのEAF値がより大きいことにわずかに関与する。
【０１１３】
実施例10．動物モデルにおけるFlex配合物の移動特徴
ヒツジにおけるこの3週間の腰椎パイロット試験の目的は、繊維強化Flex配合物の製品移動特徴を無繊維Flex配合物と比較することであった。後方腰椎椎体間固定（PLIF）技法に及ぼすFlex配合物の移動効果を評価するために、十分に確立されたヒツジPLIFモデルを利用した。このモデルは、研究者、医師、および規制当局によって、ヒトにおける脊椎固定関連技法の予測モデルとして容認されている。本試験は、構築物を移植するのみならず、生きた動物における術後の構築物の移動をさらに評価することをねらいとした。これらの脊柱固定手術は、術後かつ屠殺前に脊椎の最大限の可動性を確保するために器具を用いない（un-instrumented）で行われた。これは、試料の各々に関して最悪の試験シナリオを提供することを意図した。
【０１１４】
試験したFlex試料
以下のFlex試料を実施例1に記述される方法を用いて調製した：
（1）無繊維Flex；
（2）長さ12 mmの0.5重量％PLLA繊維を含むパテから形成された繊維強化Flex；
（3）Na2CO3によって洗浄してシルク繊維の表面上のセリシンの98％を除去した、長さ9 mmの0.5重量％シルク繊維を含むパテから形成された繊維強化Flex；および
（4）Na2CO3によって洗浄してシルク繊維の表面上の98％のセリシンを除去した、長さ9 mmの1.0重量％シルク繊維を含むパテから形成された繊維強化Flex。
【０１１５】
各配合物の3つの試料を、水分含有量（Karl Fischer）、およびパーセント固体含有量に関して試験した。無繊維FlexおよびFR Flex試料の平均水分含有量はそれぞれ、3.7％および3.4％であった。平均無水パーセント固体含有量は、無繊維FlexおよびFR Flex試料に関してそれぞれ、86％および86.4％であった。
【０１１６】
厚さがおよそ3.5から4.0 mmの試料を、実施例2に記述されるBPD試験を用いて分析した。湿潤状態では、1.0％SFR Flex、0.5％SFR Flex、PLLA繊維を含む0.5％FR Flex、および無繊維Flexはそれぞれ、その乾燥状態の強度のおよそ59％、63％、76％、および94％を失った（図5を参照されたい）。同じ重量％で添加したシルクおよびPLLAは、類似の乾燥状態LAF値を有するが、その湿潤状態LAF値は、有意に異なる。この喪失は、条片の相対的粘着性の差を示している：シルクFR Flex配合物は、PLLA FR Flex配合物より高い粘着性を有するように思われる。
【０１１７】
移植
簡単に説明すると、骨格的に成熟した雌性ヒツジ6匹の各々に、器具を用いないシングルレベルPLIF技法を行った。後方アプローチを用いて、正中線でL4からL5レベルで棘突起に沿っておよび横突起を超えて横突起先端まで切開を行って、椎弓板および横突起（TP）を露出した。小関節面を骨鉗子によって除去して、横突起および椎体を、バーを用いて注意深く剥皮した。実験材料を、腰椎椎体L4およびL5の横突起の隣で横突起を横切る脊柱の溝に留置する。
【０１１８】
インプラントの移動を試験するために、創傷治癒の正常な段階に基づいて3週間というエンドポイントを選択した。術後3週間で、インプラントの位置は、その永続的な位置であると予想され、このようにインプラントの移動を正確に決定することが可能となった。
【０１１９】
4つ全てのFlex配合物を、ヒツジの腰椎に移植した（ヒツジ6匹に各々3つの試料を移植した）。全てのヒツジの手術部位は非常に良好に作製され、可能な限り、乾燥状態で維持した。移植時、試料を全てその場に置いて、適合するように引き裂いた（およそ30 mmの引裂き）。ヒツジの剖検および腰椎切除は生存中に3週間後に行った。
【０１２０】
取扱適性
FR Flex試料は全て、無繊維Flexほど柔軟ではなく、1.0％SFR Flex配合物は、全ての中で最も柔軟性が低かった（引っ張り伸びは非常に低かったが、ひずみおよび曲げに対してはなおも非常に柔軟性であった）。
【０１２１】
試料は全て、引裂き部位で何らかの微粒子化を示し、無繊維Flexは、この領域で砕けていた。繊維強化試料は全て、無繊維Flexより引裂くことが難しく、1.0％SFR Flexは、最も難しかった。
【０１２２】
PLLA繊維を有する0.5％FR Flexおよび1.0％SFR Flex配合物は、当初、無繊維Flexほど移植部位に粘着性ではなく、跳ね返った。ある程度水和させると、それらは骨に粘着し始め、より適合性となった。
【０１２３】
剖検後X線、CT、および解剖
剖検後X線は、一瞥しただけで良好な解像度で低粘稠化および移動に関する情報を提供した。移植した3つの試料に関して、低粘稠化または移動したことが観察された試料の数を表7に提供する。
【０１２４】
（表７）
2015510406.tif 000013
a.同じ試料が低粘稠化および移動を示した。
【０１２５】
結論
初回の試験の際に、0.5％SFR Flex試料は最も良好な取扱適性を有した。移植の際に、0.5％SFR Flex試料は、取り扱いが容易で、それらは移植部位に非常に良好に適合した。それらはまた、サイズを合わせるために引裂くのが容易であった。しかし、これらの試料は、ヒツジ試験の3週間エンドポイントでの成績に関しては不適切であった。3つの0.5％SFR Flexインプラントのうち2つが移動または分離した。移動しなかった1つの試料は、内部横突起（TP）領域で低粘稠化を示した。
【０１２６】
0.5％FR Flex（PLLA）試料は、移植の際に良好な成績を示した。これらのプロトタイプは、他より厚いことが観察され、密度が高いように感じられた。それらは当初かなり硬かったが、サイズを合わせるために引裂くのは容易であった。3週間の期間後、1つの試料にTP間空隙に低粘稠化のみが存在し、別のものでは軽微な移動が観察された。
【０１２７】
1.0％SFR Flex試料は、全体の中で最も強く、このことは、外科医がサイズを合わせるために条片を裂いている移植の際に認められた（処理可能どころではなく、引裂くのは最も難しい）。条片はまた、他の条片ほど当初適合性ではなかった。このことは、試料を移植部位に押しつけた後、骨および組織から跳ね返ったことから認められた。3週間の時点で、1.0％SFR Flex試料は、低粘稠化がほとんどまたは全くなく、移動が全くなく、最も良好な成績を示した。それらはまた、良好な血管形成および良好な基質層（すなわち、骨芽細胞によって分泌されるコラーゲン様マトリクスおよび石灰化材料）を有した。
【０１２８】
無繊維Flexは、移植の際に非常に良好な成績を示した。条片はかなり柔軟性で、天然の骨および組織にうまく適合した。インビボで3週間後、条片はかなり低粘稠化して、その当初の長さからおよそ10 mm伸長した。血管形成および基質形成もまた観察された。
【０１２９】
これらの結果から、本発明者らは、1.0％SFR Flex配合物がインビボでのその性能に基づいて優れているという結論に達する。純粋に取り扱いに基づくと、この配合物は、その乾燥状態で最も理想的というわけではない。これは、引っ張り時の伸びおよび初回適合性が最も低い。しかし、水和後、条片の取扱適性はかなり理想的となり、成績は他を上回る；条片は、部位に適合して、操作時にばらばらにならない。典型的なヒトの手術部位は、本試験で用いた部位よりかなり湿っており、このため、この配合物に関するいかなる取り扱いの問題も最小限となりうる。
【０１３０】
実施例11．SEMイメージング
走査型電子顕微鏡（SEM）測定を、シルク繊維強化Flex配合物に関して行い、ミクロンバーを各画像に組み入れた（図6Aおよび6Bを参照されたい）。孔サイズを、異なるSEM画像の個別の視野および較正したカリパスを用いて評価した。測定した孔サイズを、次に、各々の写真画像に関連するサイズバーに対して標準化した。孔の平均直径を、2つのシルク繊維強化Flexの試料に関して、3つの個別の視野で測定した。第一の試料において、孔の平均直径は、96±69ミクロンであった。第二の試料において、孔の平均直径は59±31ミクロンであった。
【０１３１】
配合物の多孔性は、対象への移植後に細胞および血管の浸潤を促進するために重要でありうる。これらの材料に存在する観察された孔のサイズは、浸潤および骨形成を促進するために十分である。
【０１３２】
実施例12．圧縮試験
本試験の目的は、本発明の1.0％シルク繊維強化Flex配合物の圧縮強度の予備的な評価を行うことであった。この試験は、その乾燥および湿潤状態での繊維強化Flexの圧縮強度の理解を得るために、実施例2の方法と類似の方法を用いて行われた。クロスヘッド速度は0.1インチ/分であった。
【０１３３】
繊維強化パテを型に詰めてパテを凍結乾燥することによって、直径12 mmおよび高さ12 mmの円筒状の4つの繊維強化Flexを作製した。試料を、乾燥および湿潤状態で試験した。結果を図7に示す。
【０１３４】
応力対ひずみのプロット（図7を参照されたい）から、ゲルマトリクスが、加えられた応力に対してその自身の初回反応を有することは明らかである（ひずみ0からおよそ0.08までの領域を参照されたい）。粒子および繊維は、急勾配の増加によって証明されるように加えられた荷重を受け始め、乾燥配合物に関しておよそ1.5 MPaで降伏が起こる。0.2％オフセットひずみを用いて、降伏強度を計算した。観察されたモジュラス（勾配から計算）は、14.66 MPaであると観察された。
【０１３５】
応力対ひずみのプロット（図7を参照されたい）から、2つの湿潤状態試料が、異なる4つの領域で非常に興味深いプロファイルを示したことは明白である。最初に0から0.12のひずみのあいだはゲル反応が最も起こりやすい。第二に0.12から0.27のひずみでは、外側の湿った材料が破壊された。第三の0.27から0.45のひずみでは、内部の乾燥材料が荷重を受けて破断し始めた。最後に勾配の最後の急な増加は、直接接触したABM顆粒であった。試料はおよそ0.55 MPaの湿潤状態降伏強度および3.47 MPaのモジュラスを有した。
【０１３６】
実施例13．圧延対押し出し加工によって調製した試料
本試験の目的は、（i）パテをシートへと圧延することによって、または（ii）パテを押し出すことによって試料を調製した、1.0％シルク繊維強化Flex（湿潤状態および乾燥状態）および1.0％シルク繊維強化パテに関して観察されたボールパンチ変形強度の荷重値と引っ張り試験の応力値を比較することであった。
【０１３７】
圧延加工条片は、1.0％シルク繊維強化パテを作製する段階、およびパテを圧延して所望の形状を形成する段階によって調製した。次に条片を凍結乾燥して1.0％シルク繊維強化Flex条片を形成した（厚さおよそ4 mm）。
【０１３８】
押し出し加工条片は、1.0％シルク繊維強化パテを作製する段階、およびパテを直径12 mmの開口部から長さ200 mmの「ロープ」に押し出す段階によって調製した。「ロープ」を型に入れて圧縮して凍結乾燥させて、1.0％シルク繊維強化Flex条片（厚さおよそ4 mm）を形成した。または、本発明のパテを25 mm×4 mmの開口部から押し出して、凍結乾燥用シートを形成することができる。
【０１３９】
引っ張り強度およびモジュラスを、1.0％シルク繊維強化パテの圧延加工および押し出し加工条片に関して評価した。結果を表8に提供する。
【０１４０】
（表８）
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【０１４１】
LAF、EAF、および応力を、乾燥状態1.0%シルク繊維強化Flexの圧延加工および押し出し加工条片に関して評価した。結果を表9に提供する。
【０１４２】
（表９）
2015510406.tif 000015
【０１４３】
LAF、EAF、および応力を、湿潤状態1.0％シルク繊維強化Flexの圧延加工および押し出し加工条片に関して評価した。結果を表10に提供する
【０１４４】
（表１０）
2015510406.tif 000016
【０１４５】
結論
1％SFRパテの圧延加工条片は、401.44±56.19 kPaの引っ張り強度および2011.44±310.89 kPaのモジュラスを有することが観察された。これに対し、1％SFRパテの押し出し加工条片の引っ張り強度およびモジュラスはそれぞれ、645.29±46.61 kPaおよび4404.29±241.39 kPaであることが観察された。結果は、押し出し加工によって調製された繊維強化パテの降伏応力（YS）およびモジュラスの統計学的に有意な増加を示している。データは、押し出し加工繊維強化パテが圧延加工繊維強化パテより50％強いことを示唆している。
【０１４６】
乾燥状態の1％SFR Flexの圧延加工および押し出し加工条片は、（i）53.29±3.57 Nおよび53.92±3.19 NのLAFをそれぞれ有することが観察され；（ii）7.51±0.22 mmおよび6.43±0.33 mmのEAFをそれぞれ有することが観察され；ならびに164.99±14.43 kPaおよび184.73±10.35 kPaの応力値をそれぞれ有することが観察された。乾燥状態1％SFR Flexにおいて、押し出し加工は、試料の強度または取扱特性にほとんどまたは全く変化を生じなかった。
【０１４７】
浸潤状態の1％SFR Flexの圧延加工および押し出し加工条片は、（i）9.50±1.07 Nおよび21.91±2.28 NのLAFをそれぞれ有することが観察され、（ii）7.81±0.59 mmおよび7.12±0.84 mmのEAFをそれぞれ有することが観察され；ならびに29.91±3.68 kPaおよび68.81±5.00 kPaの応力値をそれぞれ有することが観察された。湿潤状態の圧延加工試料は、乾燥状態の圧延加工試料の強さのおよそ18％であることが観察された。これに対し、湿潤状態の押し出し加工試料は、乾燥状態の押し出し加工試料の強さのおよそ37％であることが観察された。このように、押し出し加工によって、湿潤状態でより強いままである繊維強化Flex製品が得られる。押し出し加工試料は、圧延加工試料と比較して有意により高いLAFおよび応力を示すことが観察された。応力の計算は、変形試験の際に試料において観察される応力を推定する方法を提供して、試料を「穿刺する」ために必要な応力の測定を提供する。このように、押し出し加工によって、移植の際の穿刺に対してより抵抗性である繊維強化Flex製品が得られる。
【０１４８】
この試験から、押し出し加工試料は一般的に、押し出し方向と平行に引っ張る場合、張力下でより強くより剛性であることは明白である。
【０１４９】
他の態様
本明細書において言及した全ての刊行物、特許、および特許出願は、各々の独立した刊行物または特許出願が参照により具体的におよび個々に本明細書に組み入れられることを示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１５０】
本発明は、その特異的態様に関連して記述してきたが、さらなる改変を行うことができ、本出願は、一般的に本発明の原理に従う本発明の任意の変化形、使用、または適応を含むと意図され、本出願は、本発明が属する技術分野における公知のまたは慣例的な実践に含まれ、本明細書においてこれまで記述した本質的な特色に適用されうる本開示からのそのような逸脱を含み、および本出願は、特許請求の範囲に従うと理解されるであろう
【０１５１】
本出願は、参照により本明細書に組み入れられる、2011年12月23日に提出された米国特許仮出願第61/579,806号からの恩典を主張する。
【０１５２】
他の態様は特許請求の範囲の範囲内である。
【図１】
2015510406.tif 000017
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2015510406.tif 000023
【国際調査報告】
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2015510406.tif 000025