(57)【要約】免疫原性組成物に安定化添加物を添加することは、抗原安定性を増強する際に有効である。適切な安定化添加物は、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、スクロース、アルギニン、プロテアーゼ阻害剤、グリセロールおよび／またはシトラートを含む。本発明者らは、ワクチン製剤に安定化添加物を添加すると抗原安定性を増強するのに有効であることを見いだした。１つの適した安定化添加物は、これが特に抗原を安定化するのに有効なことが示されたので、ＥＤＴＡである。本発明者らは、ＥＤＴＡが抗原の分解の機構に関与するキレート金属イオンによって、またはメタロプロテアーゼが抗原を分解することを阻害することによって、特にレドックス反応を阻害する際に役割を果たすかもしれないと考える。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥｓｘＡ抗原、ＥｓｘＢ抗原および安定化添加物を含む免疫原性組成物であって、前記組成物のｐＨは、５−６．５である、組成物。
【請求項２】
Ｓｔａ００６抗原、Ｓｔａ０１１抗原および／またはＨｌａ抗原をさらに含む、請求項１の免疫原性組成物。
【請求項３】
前記ＥｓｘＡ抗原および前記ＥｓｘＢ抗原は、ハイブリッドポリペプチドを形成するように連結される、請求項１または請求項２の免疫原性組成物。
【請求項４】
（ｉ）ＥｓｘＡ抗原およびＥｓｘＢ抗原を含む融合タンパク質、並びに（ｉｉ）安定化添加物を含む免疫原性組成物。
【請求項５】
前記安定化添加物は、ＥＤＴＡである、前述の請求項のいずれか１項の免疫原性組成物。
【請求項６】
アジュバント（たとえば、水酸化アルミニウムアジュバント）および／またはサッカライド（たとえば、スクロース）をさらに含む、前述の請求項のいずれか１項の免疫原性組成物。
【請求項７】
凍結乾燥形態の、前述の請求項のいずれか１項の免疫原性組成物。
【請求項８】
水溶液形態の、請求項１−６いずれか１項の免疫原性組成物。
【請求項９】
請求項７の組成物を水性材料で再構成することによって請求項８の組成物を調製するための方法。
【請求項１０】
ＥＤＴＡおよび１つまたは複数のポリペプチドを含む凍結乾燥物。
【請求項１１】
ホモ二量体形態のＳｔａ００６ポリペプチド。
【請求項１２】
ヘテロ二量体形態のＳｔａ００６およびＳｔａ０１１ポリペプチド。
【請求項１３】
ホモ二量体形態のＥｓｘＡＢハイブリッドポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１１−１３いずれか１項の二量体を含む免疫原性組成物。
【請求項１５】
哺乳動物にいずれかの前述の請求項のポリペプチドまたは組成物の有効量を投与する工程を含む、哺乳動物における免疫応答を高めるための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１１年１２月２３日に出願された米国仮出願６１／５８０．１９１の利益を主張し、その全ての完全な内容が、全ての目的のためにここで参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）に由来する抗原を含む免疫原性組成物に、および免疫化におけるこれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は、グラム陽性球状細菌であり、血流、下気道、皮膚および軟組織感染症の主要な原因である。これは、軽微な皮膚感染症から致命的な疾患までの範囲の疾病を引き起こし、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）と関連する年間の米国死亡率は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳを含む任意のその他の感染性の疾患のものを上回る。
【０００４】
現在、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する承認されたワクチンはない。細菌型５および８からの表面多糖の混合物に基づいたワクチン、ＳｔａｐｈＶＡＸ（商標）は、２００５年に第三相臨床試験で偽薬基と比較したときに感染症を減少させることができなかった。参照文献１は、単一の抗原、ＩｓｄＢ、保存された鉄隔絶細胞−表面タンパク質に基づいたＭｅｒｃｋおよびＩｎｔｅｒｃｅｌｌからの「Ｖ７１０」ワクチンでのデータを報告する 。
【０００５】
参照文献４は、「コンボ−１」（ＥｓｘＡ、ＥｓｘＢ、突然変異体Ｈｌａ、Ｓｔａ００６およびＳｔａ０１１の混合物）および「コンボ−２」（ＥｓｘＡ、ＥｓｘＢ、ＩｓｄＡ、Ｓｔａ００６およびＳｔａ０１１の混合物）を含む、種々の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗原およびこれらの組み合わせを開示する。これらの抗原でのさらなる研究において、本発明者らは、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ポリペプチド抗原が単一緩衝液溶液において不安定であり得ることを観察した。抗原の不安定性は、（１）ワクチンを投与前に長期間の間貯蔵することができない（２）投与されるときに、分解生成物が有害で（たとえば、阻害性で）あり得る、および（３）バッチ間のワクチンのばらつきは、品質および規制承認要件を満たさないため、望ましくない。したがって、免疫原性組成物において黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ポリペプチド抗原を安定化することが本発明の目的である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ワクチン製剤に安定化添加物を添加すると抗原安定性を増強するのに有効であることを見いだした。１つの適した安定化添加物は、これが特に抗原を安定化するのに有効なことが示されたので、ＥＤＴＡである。本発明者らは、ＥＤＴＡが抗原の分解の機構に関与するキレート金属イオンによって、またはメタロプロテアーゼが抗原を分解することを阻害することによって、特にレドックス反応を阻害する際に役割を果たすかもしれないと考える。また、本発明者らは、ワクチン製剤における低濃度（たとえば、１００ｍＭ以下）のＥＤＴＡの存在は、ワクチンの熱特徴に対して有意な影響を有さず、および任意の望ましくない可塑化効果を引き起こさないことを示し、したがって、ＥＤＴＡ含有組成物は、さらに貯蔵安定性を増強するために凍結乾燥することができることを意味する。
【０００７】
したがって、本発明は、ＥｓｘＡ抗原、ＥｓｘＢ抗原および安定化添加物を含む免疫原性組成物を提供する。組成物は、水溶液形態であることができる、この場合、これは、理想的には５−６．５の間のｐＨを有する。また、組成物は、アジュバント、たとえばアルミニウム塩を含んでいてもよい。
【０００８】
ＥＤＴＡおよび５−６．５の間のｐＨを使用する組み合わせは、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ワクチンの抗原を安定化する際に相乗効果をもたらす。好ましくは、ｐＨは、約６である。
【０００９】
ＥｓｘＡおよびＥｓｘＢ抗原は、後述するように、ハイブリッドポリペプチド、たとえばＥｓｘＡ抗原の下流にＥｓｘＢ抗原を持つＥｓｘＡＢハイブリッドとして結合することができる。ＥｓｘＡＢハイブリッドポリペプチドは、単一遺伝子の、またはオリゴマーの形態で存在することができる。オリゴマーは、二量体、三量体またはそれ以上であることができる。
【００１０】
また、本発明は、二量体形態のＥｓｘＡＢハイブリッドポリペプチドを提供する。いくつかの状態下で、ＥｓｘＡＢの単量体および二量体形態は、溶液中で平衡状態にある。二量体形態は、各ＥｓｘＡＢ単量体の特有のシステイン残基のスルフィド基を介して２つの単量体分子の二量体化によって形成される。単量体形態は、これが二量体形態よりも安定であり、二量体形態の生成（たとえば、酸化反応による）は、ばらついており、このため純度の変動を引き起こすので、免疫原性組成物において好ましい。本発明者らは、ＥＤＴＡがＥｓｘＡＢ単量体形態を安定化し、および高い製剤の全体の選択性（すなわち、総ＥｓｘＡＢに相対的な単量体ＥｓｘＡＢの高い比率）を保持することを観察した。
【００１１】
本発明の免疫原性組成物は、さらなる黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗原、特にＳｔａ００６、Ｓｔａ０１１およびＨｌａをさらに含んでいてもよい。これらの抗原は、参照文献４において詳細に考察してある。本発明の特に有用な組成物は、これらの抗原の５つ全て（すなわち、ＥｓｘＡ、ＥｓｘＢ、Ｓｔａ００６、Ｓｔａ０１１およびＨｌａ、好ましくはＨｌａの無毒の突然変異体形態で）を含む。ＥｓｘＡＢｉｓとＳｔａ００６、Ｓｔａ０１１およびＨｌａの単純な組み合わせは、安定化添加物の非存在下において水溶液状態で完全には安定でない。本発明者らは、ＥｓｘＡＢがＳｔａ００６およびＳｔａ０１１と共に緩衝液溶液においてレドックス反応を行うと考える。ＥＤＴＡの添加および組成物のｐＨをｐＨ  ６周辺に合わせると、ＥｓｘＡＢをその単量体形態に維持して、その他の成分との干渉が最小限になる。
【００１２】
本発明のいくつかの態様において、さらなる抗原は、ポリペプチドまたはサッカライドであることができる。たとえば、これらは、また、たとえば抗原型５および／または抗原型８系統に対する１つまたは複数の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜サッカライド抱合体（類）を有効に含むことができる。その他の態様において、組成物は、さらなるブドウ球菌ポリペプチド抗原を含まない。その他の態様において、組成物は、さらなるブドウ球菌抗原を含まない。さらにもう一つの態様において、組成物は、さらなる抗原を含まない。
【００１３】
また、本発明は、本発明の免疫原性組成物の凍結乾燥物を提供する。この凍結乾燥物は、本発明の水溶液免疫原性組成物を提供するために、水溶液材料で再構成することができる。したがって、投与のために、凍結乾燥物を適した液体希釈剤（たとえば、緩衝液、生理食塩水溶液、ｗｆｉ）で再構成させる。液体希釈剤は、アジュバント（たとえば、アルミニウム塩または水中油乳濁液アジュバント）を含むことができる。
【００１４】
また、本発明は、ＥＤＴＡおよび少なくとも１つの抗原を含む凍結乾燥物をする。好ましくは、抗原は、ポリペプチド（類）である。
【００１５】
また、本発明は、Ｓｔａ００６抗原のオリゴマーおよびまたこのようなオリゴマーを含む免疫原性組成物を提供する。オリゴマーは、二量体、三量体、四量体またはそれ以上であることができる。オリゴマーは、Ｃａ＋＋イオンを含んでいてもよく、Ｓｔａ００６オリゴマーを含む組成物は、５−５００のｍＭＣａ＋＋イオンを含んでいてもよい。
【００１６】
また、本発明は、Ｓｔａ００６抗原およびＳｔａ０１１抗原のヘテロ二量体を提供する。この二量体は、Ｃａ＋＋イオンを含んでいてもよく、このような二量体を含む組成物は、５−５００のｍＭ  Ｃａ＋＋イオンを含んでいてもよい。
【００１７】
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗原
ＥｓｘＡ
「ＥｓｘＡ」抗原は、「タンパク質」と注釈がついている。ＮＣＴＣ８３２５株において、ＥｓｘＡは、ＳＡＯＵＨＳＣ＿００２５７であり、アミノ酸配列配列番号：１０（ＧＩ：８８１９４０６３）を有する。
【００１８】
本発明のＥｓｘＡ抗原は、配列番号：１０を認識する抗体を（たとえば、ヒトに投与されるときに）誘発することができ、および／または：（ａ）配列番号：１０に５０％またはそれ以上（たとえば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）の同一性を有する；および／または（ｂ）配列番号：１０の少なくとも「ｎ」個であって、「ｎ」は７またはそれ以上（たとえば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０またはそれ以上）である連続したアミノ酸の断片を含む、アミノ酸配列を含んでいてもよい。これらのＥｓｘＡタンパク質は、配列番号：１０の変異体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号：１０からのエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号：１０のＣ末端から１つまたは複数のアミノ酸（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれ以上）および／またはＮ末端基から１つまたは複数のアミノ酸（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれ以上）を欠いており、一方で少なくとも１つの配列番号：１０のエピトープを保持する。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省く。
【００１９】
ＥｓｘＢ
「ＥｓｘＢ」抗原は、「ＥｓｘＢ」と注釈がついている。ＮＣＴＣ８３２５株において、ＥｓｘＢは、ＳＡＯＵＨＳＣ＿００２６５であり、アミノ酸配列配列番号：１１（ＧＩ：８８１９４０７０）を有する。本発明のＥｓｘＢ抗原は、配列番号：１１を認識する抗体を（たとえば、ヒトに投与されるときに）誘発することができ、および／または：（ａ）配列番号：１１に５０％またはそれ以上（たとえば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）の同一性を有する；および／または（ｂ）配列番号：１１の少なくとも「ｎ」個であって、「ｎ」は７またはそれ以上（たとえば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれ以上）である連続したアミノ酸の断片を含む、アミノ酸配列を含んでいてもよい。これらのＥｓｘＢタンパク質は、配列番号：１１の変異体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号：１１からエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号の：１１のＣ末端から１つまたは複数のアミノ酸（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれ以上）および／またはＮ末端基から１つまたは複数のアミノ酸（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれ以上）を欠いており、一方で少なくとも１つの配列番号：１１のエピトープを保持する。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省く。
【００２０】
ＥｓｘＡＢ
組成物がＥｓｘＡおよびＥｓｘＢ抗原を含む場合、これらは単一のポリペプチド（すなわち、融合ポリペプチドとして）として存在してもよい。したがって、単一のポリペプチドは、配列番号：１０および配列番号：１１の両方を認識する抗体を（たとえば、ヒトに投与されるときに）誘発することができる。単一のポリペプチドは、以下を含むことができる：（ｉ）配列番号：１０に５０％またはそれ以上（たとえば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）の同一性を有する、および／またはＥｓｘＡについて上記記載の通り、配列番号：１０の少なくとも「ｎ」個の連続したアミノ酸の断片を含む第１のポリペプチド配列；並びに（ｉｉ）配列番号：１１に５０％またはそれ以上（たとえば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）の同一性を有する、および／またはＥｓｘＢについて上記記載の通り、配列番号：１１の少なくとも「ｎ」個の連続したアミノ酸の断片を含む第２のポリペプチド配列。第１および第２のポリペプチド配列は、いずれの順序でＮ−からＣ−末端であることもできる。配列番号：１５１（「ＥｓｘＡＢ」）および１５２（「ＥｓｘＢＡ」）は、このようなポリペプチドの例であり、両方ともヘキサペプチドリンカーＡＳＧＧＧＳ（配列番号：１７３）を有する。もう一つの「ＥｓｘＡＢ」ハイブリッドは、配列番号：２４１を含み、これは、Ｎ末端基メチオニンと共に提供され得る（たとえば配列番号：２５０）。
【００２１】
したがって、有用なポリペプチドは、（ａ）配列番号：２４１に８０％またはそれ以上（たとえば８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）の同一性を有する；および／または（ｂ）配列番号：２４１のアミノ酸１−９６からの少なくとも「ｎ」個の断片および配列番号：２４１のアミノ酸１０３−２０５からの少なくとも「ｎ」個の連続したアミノ酸の断片の両方であって、「ｎ」は、７またはそれ以上（たとえば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である連続したアミノ酸を含むアミノ酸配列を含む。これらのポリペプチド（たとえば、配列番号：２５０）は、配列番号：１０を含む野生型ブドウ球菌性タンパク質および配列番号：１１を含む野生型ブドウ球菌性タンパク質の両方を認識する抗体を（たとえば、ヒトに投与されるときに）誘発することができる。したがって、免疫応答は、抗原ＥｓｘＡおよびＥｓｘＢの両方を認識するだろう。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号：１０からのエピトープおよび配列番号：１１からのエピトープを提供する。
【００２２】
Ｓｔａ００６
「Ｓｔａ００６」抗原は、「フェリクロム−結合タンパク質」と注釈がついており、また文献［５］において「ＦｈｕＤ２」ともいわれる。ＮＣＴＣ８３２５株において、Ｓｔａ００６は、ＳＡＯＵＨＳＣ＿０２５５４であり、アミノ酸配列配列番号：４２（ＧＩ：８８１９６１９９）を有する。Ｎｅｗｍａｎ株において、これは、ｎｗｍｎ＿２１８５（ＧＩ：１５１２２２３９７）である。本発明で使用されるＳｔａ００６は、配列番号：４２を認識する抗体を（たとえば、ヒトに投与されるときに）誘発することができる、および／または：（ａ）配列番号：４２に５０％またはそれ以上（たとえば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）の同一性を有する；および／または（ｂ）配列番号：４２の少なくとも「ｎ」個であって、「ｎ」は７またはそれ以上（たとえば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である連続したアミノ酸の断片を含むアミノ酸配列を含んでいてもよい。これらのＳｔａ００６タンパク質は、配列番号：４２の変異体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号：４２からエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号：４２のＣ末端から１つまたは複数のアミノ酸（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれ以上）および／またはＮ末端基から１つまたは複数のアミノ酸（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれ以上）を欠いており、一方で少なくとも１つの配列番号：４２のエピトープを保持する。配列番号：４２の最初の１７個のＮ末端アミノ酸は、有用に省略することができる（配列番号：２４６を提供する）。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省略する。Ｓｔａ００６の突然変異体形態は、参照文献６において報告されている。Ｓｔａ００６抗原は、たとえばアシル化されたＮ末端基システインでラピデートされて（ｌａｐｉｄａｔｅｄ）もよい。１つの有用なＳｔａ００６配列は、配列番号：２４８であり、これは、Ｎ末端基にてＭｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−配列を有する。Ｓｔａ００６ｃａｎは、単量体またはオリゴマー（たとえば、二量体）として存在し、Ｃａ＋＋イオンがオリゴマー形成し易くする。
【００２３】
本発明は、Ｓｔａ００６の単量体および／またはオリゴマーを使用することができる。Ｓｔａ００６は、ホモ二量体またはＳｔａ０１１とのヘテロ二量体であることができる。
【００２４】
Ｓｔａ０１１
「Ｓｔａ０１１」抗原は、「リポプロテイン」と注釈がついている。ＮＣＴＣ８３２５株において、Ｓｔａ０１１は、ＳＡＯＵＨＳＣ＿０００５２であり、アミノ酸配列配列番号：４７（ＧＩ：８８１９３８７２）を有する。本発明で使用されるＳｔａ０１１ 抗原は、配列番号：４７を認識する抗体を（たとえば、ヒトに投与されるときに）誘発することができ、および／または：（ａ）配列番号：４７に５０％またはそれ以上（たとえば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）の同一性を有する；および／または（ｂ）配列番号：４７の少なくとも「ｎ」個であって、「ｎ」は７またはそれ以上（たとえば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である連続したアミノ酸の断片を含む、アミノ酸配列を含んでいてもよい。これらのＳｔａ０１１タンパク質は、配列番号：４７の変異体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号：４７からエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号：４７のＣ末端から１つまたは複数のアミノ酸（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれ以上）および／またはＮ末端基から１つまたは複数のアミノ酸（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれ以上）を欠いており、一方で少なくとも１つの配列番号：４７のエピトープを保持する。配列番号：４７の最初の２３個のＮ末端アミノ酸は、有用に省略することができる（配列番号：２４７を提供する）。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省略する。Ｓｔａ０１１抗原は、アシル化されたＮ末端基システインでラピデートされてもよい１つの有用なＳｔａ０１１配列は、配列番号：２４９であり、これは、Ｎ末端基メチオニンを有する。配列番号：４７の変異体形態は、Ｓｔａ０１１抗原として、またはこれを調製するために使用されてもよく、種々のＩｌｅ／Ｖａｌ／Ｌｅｕ置換を伴う配列番号：２１３、２１４および２１５を含むが、限定されない。Ｓｔａ０１１は、単量体またはオリゴマーとして存在することができ、Ｃａ＋＋イオンがオリゴマー形成し易くする。本発明は、Ｓｔａ０１１の単量体および／またはオリゴマーを使用することができる。
【００２５】
Ｈｌａ
「Ｈｌａ」抗原は、「α−ヘモリシン前駆体」であり、「α毒素」または単に「ヘモリシン」としても知られる。ＮＣＴＣ８３２５株において、Ｈｌａは、ＳＡＯＵＨＳＣ＿０１１２１であり、アミノ酸配列配列番号：１４（ＧＩ：８８１９４８６５）を有する。Ｈｌａは、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の大部分の株によって産生される重要な病原性決定因子であり、孔形成および溶血性活性を有する。抗Ｈｌａ抗体は、動物モデルにおいて毒素の有害な効果を中和することができ、Ｈｌａは、肺炎から守るために特に有用である。本発明で使用されるＨｌａ抗原は、配列番号：１４を認識する抗体を（たとえば、ヒトに投与されるときに）誘発することができ、および／または：（ａ）配列番号：１４に５０％またはそれ 以上（たとえば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）の同一性を有する；および／または（ｂ）配列番号：１４の少なくとも「ｎ」個であって、「ｎ」は７またはそれ以上（たとえば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である連続したアミノ酸の断片を含む、アミノ酸配列を含んでいてもよい。これらのＨｌａタンパク質は、配列番号：１４の変異体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号：１４からのエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号：１４のＣ末端から１つまたは複数のアミノ酸（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれ以上）および／またはＮ末端基から１つまたは複数のアミノ酸（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれ以上）を欠いており、一方で少なくとも１つの配列番号：１４のエピトープを保持する。配列番号：１４の最初の２６個のＮ末端アミノ酸は、有用に省略することができる（たとえば、配列番号：２３１を与える）。また、Ｃ末端における切断を使用して、たとえば５０個のアミノ酸だけを残すことができる（配列番号：１４の残基２７−７６）［７］。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省略する。
【００２６】
Ｈｌａの毒性は、化学的不活性化（たとえば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドまたはその他の架橋試薬を使用する）によって、本発明の組成物において回避することができる。しかし、その代わりに、その免疫原性を保持し、一方で毒性活性を取り除いてあるＨｌａの突然変異体形態を使用することが好ましい。このような解毒化された突然変異体は、すでに当該技術分野において公知である。１つの有用なＨｌａ抗原は、成熟した抗原の残基３５（すなわち、最初の２６個のＮ末端基アミノ酸を省いた後＝配列番号：２３１の残基３５）である配列番号：１４の残基６１に突然変異を有する。したがって、残基６１は、ヒスチジンでなくてもよく、その代わりにたとえばＩｌｅ、Ｖａｌまたは好ましくはＬｅｕでもよい。また、この位置にてＨｉｓ−Ａｒｇ突然変異を使用することができる。たとえば、配列番号：１５０は、成熟した突然変異体Ｈｌａ−Ｈ３５Ｌ配列であり（すなわち、Ｈ３５Ｌ突然変異をもつ配列番号：２３１）、および有用なＨｌａ抗原は、配列番号：１５０を含む。もう一つの有用な突然変異は、短配列で長いループを置換して、たとえば配列番号：１８９（Ｈ３５Ｌ突然変異をまた含む）および配列番号：２１６（Ｈ３５Ｌ突然変異を含まない）におけるように、配列番号：１４の残基１３６−１７４にて３９ｍｅｒをＰＳＧＳ（配列番号：２２５）などの四量体と置換する。もう一つの有用な突然変異は、残基Ｙ１０１を、たとえばロイシンで置換する（配列番号：２４２）。もう一つの有用な突然変異は、残基Ｄ１５２を、たとえばロイシンで置換する（配列番号：２４３）。もう一つの有用な突然変異体は、残基Ｈ３５およびＹ１０１を、たとえばロイシンで置換する（配列番号：２４４）。もう一つの有用な突然変異体は、残基Ｈ３５およびＤ１５２を、たとえばロイシンで置換する（配列番号：２４５）。
【００２７】
さらなる有用なＨｌａ抗原は、参照文献８および９に開示されている。
【００２８】
配列番号：１６０、１６１および１９４は、配列番号：１４の３つの有用な断片である（それぞれ「Ｈｌａ２７−７６’、Ｈｌａ２７−８９’およびＨｌａ２７−７９’」）。配列番号：１５８、１５９および１９５は、配列番号：１５０からの対応する断片である。
【００２９】
１つの有用なＨｌａ配列は、配列番号：２３２であり、これを実施例において使用した。これは、Ｎ末端Ｍｅｔ、次いで発現ベクターからのＡｌａ−Ｓｅｒジペプチド、次いで配列番号：１５０（ＮＣＴＣ８３２５株から）を有する。これは、配列番号：２３３によってコードされる。
【００３０】
ハイブリッドポリペプチド
本発明に使用される抗原は、個々の別々のポリペプチドとして組成物に存在してもよい。しかし、複数の抗原が使われる場合、これらは、別々のポリペプチドとして存在する必要はない。その代わりに、少なくとも２つ（たとえば、２、３、４、５またはそれ以上）の抗原を単一のポリペプチド鎖（「ハイブリッド」ポリペプチド）として発現することができる。ハイブリッドポリペプチドは、２つの主な利点を提供する：第１に、それ自体上で不安定または十分に発現され得ないポリペプチドを、問題を解決する適切なハイブリッドパートナーを付加することによって補助することができる；第２に、市販の製造では、両方が抗原的に有用である２つのポリペプチド産生するために、１回の発現および精製の必要性のみを使用するように単純化しなければならない。
【００３１】
ハイブリッドポリペプチドは、第１の抗原基からの２つまたはそれ以上のポリペプチド配列を含んでいてもよい。ハイブリッドポリペプチドは、第１の抗原基からの１つまたは複数のポリペプチド配列および第２の抗原基からの１つまたは複数のポリペプチド配列を含んでいてもよい。その上、ハイブリッドポリペプチドは、上に収載した抗原のそれぞれからの２つ以上のポリペプチド配列または配列が株全体で部分的な可変性を有する場合には、同じ抗原の２つ以上の変異形を含んでいてもよい。
【００３２】
２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０の抗原からのアミノ酸配列からなるハイブリッドは、有用である。特に、２つまたは３つの抗原などの、２つ、３つ、４つまたは５つの抗原からのアミノ酸配列からなるハイブリッドが好ましい。
【００３３】
異なるハイブリッドポリペプチドを単一の製剤において共に混合してもよい。また、ハイブリッドポリペプチドは、上記の通りに抱合体または非黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗原と結合することができる。
【００３４】
ハイブリッドポリペプチドは、式ＮＨ２−Ａ−｛−Ｘ−Ｌ−｝ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨよって表することができ、式中：Ｘは、上記したように、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗原のアミノ酸配列であり、Ｌは、随意のリンカーアミノ酸配列であり；Ａは、随意のＮ末端アミノ酸配列であり；Ｂは、随意のＣ末端アミノ酸配列であり；ｎは、２またはそれ以上の整数（たとえば、２、３、４、５、６、その他）である。通常、ｎは、２または３である。
【００３５】
−Ｘ−部分がその野生型形態においてリーダーペプチド配列を有する場合、これは、ハイブリッドタンパク質に含まれても、または省略されてもよい。いくつかの態様において、リーダーペプチドは、ハイブリッドタンパク質のＮ末端基に位置する−Ｘ−部分のものを除いて欠失される、すなわち、Ｘ１のリーダーペプチドは保持されるが、Ｘ２…Ｘｎのリーダーペプチドが省略される。これは、全てのリーダーペプチドを欠失させること、および部分−Ａ−としてＸ１のリーダーペプチドを使用することに等しい。
【００３６】
それぞれの｛−Ｘ−Ｌ−｝のｎ個の例について、リンカーアミノ酸配列−Ｌ−は、存在しても、または存在しなくてもよい。たとえば、−ｎ＝２のとき、ハイブリッドは、ＮＨ２−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−Ｌ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｌ２−ＣＯＯＨ、その他であってもよい。リンカーアミノ酸配列−Ｌ−は、典型的には短いだろう（たとえば、２０またはより短いアミノ酸、すなわち２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）。例には、クローニングを容易にする短いペプチド配列、ポリ−グリシンリンカー（すなわち、Ｇｌｙｎ含み、式中ｎ  ＝  ２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上である）およびヒスチジンタグ（すなわち、Ｈｉｓｎ、式中ｎ  ＝  ３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上である）を含む。その他の適切なリンカーアミノ酸配列は、当業者にとって明らかだろう。有用なリンカーは、ＧＳＧＧＧＧ（配列番号：１７１）またはＧＳＧＳＧＧＧＧ（配列番号：１７２）であり、Ｇｌｙ−Ｓｅｒジペプチドは、ＢａｍＨＩ制限部位から形成され（またはこれらの２つ、配列番号：２３０のテトラペプチドを形成するために）、したがって、クローニングおよび操作を補助し、並びに（Ｇｌｙ）４テトラペプチド（配列番号：２２７）は、典型的なポリ−グリシンリンカーである。その他の適切なリンカーは、特に最終的なＬｎ−として使用するためには、ＡＳＧＧＧＳ（配列番号：１７３、たとえば、は配列番号：１７４によってコードされる）またはＬｅｕ−Ｇｌｕジペプチドである。
【００３７】
−Ａ−は、随意のＮ末端アミノ酸配列である。これは、典型的には短い（たとえば、４０またはより短いアミノ酸、すなわち４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）だろう。例には、タンパク質輸送を指揮するためのリーダー配列またはクローニングまたは精製を容易にする短いペプチド配列（たとえば、ヒスチジンタグ、すなわちＨｉｓｎ、式中ｎ  ＝  ３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）。その他の適切なＮ末端アミノ酸配列は、当業者にとって明らかだろう。Ｘ１がそれ自体のＮ末端基メチオニンを欠いている場合、−Ａ−は、好ましくは、Ｎ末端基メチオニン（たとえば、Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒまたは単一のＭｅｔ残基）を提供するオリゴペプチド（たとえば、１、２、３、４、５、６、７または８個のアミノ酸をもつ）である。
【００３８】
−Ｂ−は、随意のＣ末端アミノ酸配列である。これは、典型的には短い（たとえば、４０またはより短いアミノ酸（すなわち、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）だろう。例には、タンパク質輸送を指揮するための配列、クローニングまたは精製を容易にする短いペプチド配列（たとえば、ヒスチジンタグ、すなわち、配列番号：２２６などのＨｉｓｎ、式中ｎ  ＝  ３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上を含む）またはタンパク質安定性を増強する配列を含む。その他の適切なＣ末端アミノ酸配列は、当業者にとって明らかだろう。
【００３９】
本発明の１つのハイブリッドポリペプチドは、ＥｓｘＡおよびＥｓｘＢ抗原を含んでいてもよい。これらは、いずれの順序でＮ−からＣ−末端であってもよい。配列番号：１５１（「ＥｓｘＡＢ」；配列番号：１６９によってコードされる）および１５２（「ＥｓｘＢＡ」）は、このようなハイブリッドの例であり、両方とも、ヘキサペプチドリンカーＡＳＧＧＧＳ（配列番号：１７３）を有する。もう一つの「ＥｓｘＡＢ」ハイブリッドは、配列番号：２４１を含み、これは、Ｎ末端基メチオニンと共に提供してもよい（たとえば、配列番号：２５０）。
【００４０】
本発明のもう一つのハイブリッドポリペプチドは、ＨｌａおよびＳｔａ００６抗原を含んでいてもよい。これらは、いずれの順序でＮ−からＣ−末端であってもよい。配列番号：２２２（「ＨｌａＨ３５Ｌ−Ｓｔａ００６」）は、このようなハイブリッドの例であり、式中ＨｌａのＨ３５Ｌ突然変異体は、ヘキサペプチドリンカーＡＳＧＧＧＳを介してＳｔａ００６に連結される（配列番号：１７３）。
【００４１】
本発明のもう一つのハイブリッドポリペプチドは、ＨｌａおよびＥｓｘＡおよびＥｓｘＢ抗原を含んでいてもよい。これらは、いずれの順序でＮ−からＣ−末端であってもよい。配列番号：２２０（「ＨｌａＨ３５Ｌ−ＥｓｘＡＢ」）は、このようなトリプルハイブリッドの例であり、ＨｌａのＨ３５Ｌ突然変異体がリンカーＡＳＧＧＧＳを介してＥｓｘＡＢに連結される（配列番号：１７３）。ＥｓｘＡＢは、すでに同じリンカーを含み、そして配列番号：２２０は、これらのリンカーの２つを含む。ＨｌａおよびＥｓｘＡおよびＥｓｘＢ抗原を含むハイブリッドポリペプチドのもう一つの例は、配列番号：２３７（実施例において使用したとおりの「ＨｌａＨ３５Ｌ−ＥｓｘＡＢ」）であり、ＨｌａのＨ３５Ｌ突然変異体がそのＮ末端基を置換するためにリンカーＡＰＴＡＲＧ（配列番号：２３９）を介してＥｓｘＡに、次いでそのＮ末端基を置換するためにリンカーＡＳＧＧＧＳ（配列番号：１７３）を介してＥｓｘＢに連結される。このハイブリッドは、配列番号：２４０などの適切なＮ末端配列と共に提供することができる。
【００４２】
本発明のもう一つのハイブリッドポリペプチドは、Ｓｔａ００６およびＥｓｘＡおよびＥｓｘＢ抗原を含んでいてもよい。これらは、任意の順序でＮ−からＣ−末端であってもよい。配列番号：２２３（「Ｓｔａ００６−ＥｓｘＡＢ」）は、このようなトリプルハイブリッドの例であり、Ｓｔａ００６がリンカーＡＳＧＧＧＳを介してＥｓｘＡＢに連結される（配列番号：１７３）。ＥｓｘＡＢは、同じリンカー、それで、配列番号をすでに含む：２２３は、これらのリンカーの２つを含む。Ｓｔａ００６およびＥｓｘＡおよびＥｓｘＢ抗原を含むハイブリッドポリペプチドのもう一つの例は、配列番号：２３８（実施例において使用したとおりの「Ｓｔａ００６−ＥｓｘＡＢ」）であり、Ｓｔａ００６がそのＮ末端基を置換するためにリンカーＡＰＴＡＲＧ（配列番号：２３９）を介してＥｓｘＡに、次いでそのＮ末端基を置換するためにリンカーＡＳＧＧＧＳ（配列番号：１７３）を介してＥｓｘＢに連結される。このハイブリッドは、配列番号：２４０などの適切なＮ末端配列と共に提供することができる。
【００４３】
有用には、これらのハイブリッドポリペプチドは、ハイブリッドで提示された野生型ブドウ球菌性タンパク質（たとえば、配列表に示したとおり）のそれぞれを認識する、たとえば野生型ＥｓｘＡおよび野生型ＥｓｘＢの両方を認識するか、または野生型Ｈｌａおよび野生型Ｓｔａ００６の両方を認識するか、または野生型Ｈｌａおよび野生型ＥｓｘＡおよび野生型ＥｓｘＢを認識するか、または野生型Ｓｔａ００６および野生型ＥｓｘＡおよび野生型ＥｓｘＢを認識する抗体を（たとえば、ヒトに投与されるときに）誘発することができる。
【００４４】
本発明で使用されるポリペプチド
本発明で使用されるポリペプチドは、種々の形態（たとえば、天然の、融合された、グリコシル化された、グリコシル化されていない、脂質付加された、脂質付加されていない、リン酸化された、リン酸化されていない、ミリストイル化された、非ミリストイル化されてない、単量体の、多量体の、粒子の、変性された、その他）を採ることができる。
【００４５】
本発明で使用されるポリペプチドは、種々の手段（たとえば、組換え発現、細胞培養からの精製、化学的合成、その他）によって調製することができる。特にハイブリッドポリペプチドのためには、組換えで発現されたタンパク質が好ましい。
【００４６】
本発明で使用されるポリペプチドは、好ましくは精製された、または実質的に精製された形態で提供され、すなわちその他のポリペプチド（たとえば、天然に存在するポリペプチドがない）、特にその他のブドウ球菌性、または宿主細胞ポリペプチドが実質的になく、一般に少なくとも約５０％純粋（重量の）、および通常少なくとも約９０％純粋であり、すなわち組成物の約５０％未満およびより好ましくは約１０％未満（たとえば、５％）がその他の発現されたポリペプチドで構成される。したがって、組成物における抗原は、分子が発現される全生物から分離される。
【００４７】
本発明で使用されるポリペプチドは、好ましくはブドウ球菌性ポリペプチドである。「ポリペプチド」という用語は、任意の長さのアミノカルボン酸重合体をいう。重合体は、直鎖状でも、または分枝でもよく、これは、修飾されたアミノ酸を含んでいてもよく、およびこれは、非アミノ酸によって中断されていてもよい。また、本用語は、天然に、または介入；たとえば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または標識化成分との抱合などの任意のその他の操作もしくは修飾によって修飾されたアミノカルボン酸重合体を包含する。また、たとえば、１つまたは複数のアミノ酸の類似体を含むポリペプチド（たとえば、非天然のアミノ酸、その他を含む）、並びに当該技術分野に公知のその他の修飾を含む。ポリペプチドは、単一鎖または会合した鎖として存在することができる。
【００４８】
本発明は、配列−Ｐ−Ｑ−または−Ｑ−Ｐ−を含むポリペプチドを提供し、式中：−ｐ−は、上で定義したとおりのアミノ酸配列であり、および−Ｑ−は、上で定義したとおりのアミノ酸配列ではなく、すなわち本発明は、融合タンパク質を提供する。−Ｐ−のＮ末端基コドンがＡＴＧでないが、このコドンがポリペプチドのＮ末端基にて存在しない場合、これは、Ｍｅｔとしてよりもむしろそのコドンのための標準アミノ酸と翻訳されるだろう。しかし、このコドンがポリペプチドのＮ末端基にある場合、これは、Ｍｅｔとして翻訳されるだろう。−Ｑ−部分の例は、ヒスチジンタグ（すなわち、Ｈｉｓｎ、式中ｎ  ＝  ３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上である）、マルトース−結合タンパク質またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を含むが、限定されない。
【００４９】
本発明のポリペプチドの発現は、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）において生じてもよいが、本発明は、通常発現（組換え発現）のために異種宿主を使用する。異種宿主は、原核生物（たとえば、細菌）でも、または真核生物でもよい。これは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でもよいが、その他の適切な宿主は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）ｌａｃｔａｍｉｃａ、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ）、マイコバクテリア（たとえば、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ））、酵母などを含む。本発明のポリペプチドをコードする野生型黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）遺伝子と比較して、コードされるアミノ酸に影響を及ぼすことなくこのような宿主における発現効率を最適化するために、コドンを変化することが役だつ。
【００５０】
株および変異体
本明細書に記述した抗原のための例示的なアミノ酸およびヌクレオチド配列は、ＮＣＴＣ  ８３２５および／またはＮｅｗｍａｎ黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株から、これらのＧＩ数を使用して公共の配列データベースにおいて容易に見いだすことができるが、たとえば、本発明はＮＣＴＣ  ８３２５およびＮｅｗｍａｎ株からの配列に限定されない。ＭＲＳＡ株Ｎ３１５およびＭｕ５０［１０］、ＭＷ２、Ｎ３１５、ＣＯＬ、ＭＲＳＡ２５２、ＭＳＳＡ４７６、ＲＦ１２２、ＵＳＡ３００（非常に病原性）、ＪＨ１およびＪＨ９のものを含む黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のいくつかのその他の株のゲノム配列を利用できる。標準的な検索および配列比較技術を使用して、ＮｅｗｍａｎまたはＮＣＴＣ  ８３２５株から、これらの（またはその他の）さらなるゲノム配列のいずれかにおいて、任意の特定の配列の相同体を同定することができる。その上、ＮｅｗｍａｎおよびＮＣＴＣ８３２５株から利用できる配列は、その他の株から相同的配列を増幅するためのプライマーをデザインするために使用することができる。したがって、本発明は、これらの２つの株に限定されないが、むしろ黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のその他の株、並びに非天然の変異体からのこのような変異体および相同体を包含する。一般に、特定の配列番号の適切な変異体は、その対立遺伝子変異体、その多形形態、その相同体、その相同分子種、そのパラログ、その突然変異体などを含む。
【００５１】
したがって、たとえば、本発明で使用されるポリペプチドは、本明細書における配列番号と比較して、１つまたは複数（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、その他）の保存的置換などのアミノ酸置換（すなわち、１つのアミノ酸の、関連した側鎖を有する別のものでの置換）を含んでいてもよい。遺伝的にコードされたアミノ酸は、４つのファミリーに一般に分けられる：（１）酸性、すなわちアスパルテート、グルタマート；（２）塩基性、すなわちリジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性、すなわちアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電の極性、すなわちグリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、時に一緒に芳香族アミノ酸と分類される。一般に、これらのファミリー内の単一のアミノ酸の置換は、生物学的活性に対して重要な効果を有さない。また、ポリペプチドは、配列番号の配列に相対的に１つまたは複数（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、その他）の単一のアミノ酸欠失を含んでいてもよい。また、ポリペプチドは、配列番号の配列に相対的に１つまたは複数（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、その他）の挿入（たとえば、１、２、３、４または５アミノ酸のそれぞれ）を含んでいてもよい。
【００５２】
同様に、本発明で使用されるポリペプチドは、以下であるアミノ酸配列を含んでいてもよい：
・配列表に開示された配列と同一である（すなわち、１００％同一）；
・配列表に記載した配列と配列同一性を共有する（たとえば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）；
・（ａ）または（ｂ）の配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０（またはそれ以上の）単一のアミノ酸変異（欠失、挿入、置換）を有し、これは、別々の位置にあってもよく、または隣接してもよい；および、
・対整列アルゴリズムを使用して配列表からの特定の配列と共に整列させたときに、Ｎ末端基からＣ末端までのｘアミノ酸のそれぞれの移動ウインドウは（ｐアミノ酸、式中ｐ＞ｘまで拡張する整列について、ｐ−ｘ＋１個のこのようなウインドウがあるように）、少なくともｘ・ｙ個の同一の整列させたアミノ酸を有し、式中：ｘは、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００から選択され；ｙは、０．５０、０．６０、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９から選択され；およびｘ・ｙが整数でない場合、最も近い整数まで切り上げられる。好ましい対整列アルゴリズムは、デフォルトパラメーター（たとえば、Ｇａｐオープニングペナルティー＝  １０．０で、かつＧａｐエクステンションペナルティー＝  ０．５で、ＥＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスを使用する）を使用するＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバル整列アルゴリズム［１１］である。このアルゴリズムは、ＥＭＢＯＳＳパッケージにおいてニードルツールで都合よく実行される［１２］。
【００５３】
ハイブリッドポリペプチドが使用される場合、ハイブリッド内の個々の抗原（すなわち、個々の−Ｘ−部分）は、１つまたは複数の株由来であってもよい。ｎ＝２の場合、たとえばＸ２は、Ｘ１と同じ株由来または異なる株由来であってもよい。ｎ＝３の場合、株は、（ｉ）Ｘ１＝Ｘ２＝Ｘ３（ｉｉ）Ｘ１＝Ｘ２／Ｘ３（ｉｉｉ）Ｘ１／Ｘ２＝Ｘ３（ｉｖ）Ｘ１／Ｘ２／Ｘ３または（ｖ）Ｘ１＝Ｘ３／Ｘ２、その他であってもよい。
【００５４】
群（ｃ）内において、欠失または置換は、Ｎ末端基および／またはＣ末端にあってもよく、または２つの末端の間にあってもよい。したがって、トランケーションは、欠失の例である。トランケーションは、Ｎ末端基および／またはＣ末端における４０までの（またはそれ以上の）アミノ酸の欠失を含んでいてもよい。たとえば、Ｎ末端基トランケーションにより、異種宿主における組換え発現を容易にするためにリーダーペプチドを除去することができる。Ｃ末端トランケーションにより、たとえば、異種宿主における組換え発現を容易にするために、アンカー配列を除去することができる。
【００５５】
一般に、抗原が配列表からの完全な黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）配列と同一でない配列を含むとき（たとえば、それが、これに対して＜１００％の配列同一性で配列表を含むときに、またはそれがこれらの断片を含むとき）、それぞれの個々の例において、抗原は完全な黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）配列を認識する抗体を誘発することができることが好ましい。
【００５６】
サッカライドとの組み合わせ
本発明の免疫原性組成物は、サッカライド抗原（たとえば、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＰＮＡＧ）である、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のエキソポリサッカライド、およびを含む公知のサッカライド抗原であり、およびたとえばタイプ５、タイプ８またはタイプ３３６由来であることができる黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の莢膜サッカライドである）をさらに含んでいてもよい。いくつかの態様において、組成物は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）サッカライド抗原を含まない。
【００５７】
非ブドウ球菌性抗原との組み合わせ
本発明の免疫原性組成物は、非ブドウ球菌性抗原を、および特に院内感染に関連した細菌由来の抗原と共に、さらに含んでいてもよい。たとえば、免疫原性組成物は、以下からなる群より選択される１つまたは複数の抗原をさらに含んでいてもよい：クロストリジウム・ディフィシール（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）；緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）；鵞口瘡カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）；および腸管外病原性の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）。本発明のブドウ球菌性抗原と組み合わせて使用するためのさらなる適切な抗原は、参照文献１３の３３−４６ページに収載されている。
【００５８】
好ましい組成物
本発明の好ましい組成物は、以下の全４つを含む：（ｉ）単一のポリペプチドは、たとえば配列番号：２５０を含むＥｓｘＡ抗原およびＥｓｘＢ抗原の両方を含む；（ｉｉ）Ｓｔａ００６抗原は、たとえば、配列番号：２４８を含む；（ｉｉｉ）Ｓｔａ０１１抗原は、たとえば、配列番号：２４９を含む；および（ｉｖ）ＨｌａのＨ３５Ｌ突然変異体形態は、たとえば、配列番号：２３２を含む。この組成物は、式（Ｋ）のＴＬＲ７アゴニストを使用するときに、特に有用である。
【００５９】
配列番号：２５０、２４８、２４９および２３２は、組み合わせて有用なアミノ酸配列であるが、本発明は、これらの正確な配列に限定されない。したがって、これらの配列の１つ、２つ、３つまたは全４つは、独立して５つまでの単一のアミノ変化（すなわち、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの単一のアミノ酸置換、欠失および／または挿入）によって修飾することができ、ただし、修飾された配列は、なおも修飾されていない配列からなるポリペプチドに結合する抗体を誘発することができる。
【００６０】
本発明の１つの有用な組成物は、以下の全４つを含む：（ｉ）第１のポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号：２５０を有する；（ｉｉ）第２のポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号：２４８を有する；（ｉｉｉ）第３のポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号：２４９を有する；および（ｉｖ）第４のポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号：２３２を有する。いくつかの態様において、組成物は、１つまたは複数のさらなるポリペプチドを含んでいてもよく；その他の態様において、組成物における唯一のポリペプチドが、これらの４つの特定されたポリペプチドである。配列番号：２５０、２４８、２４９および２３２は、組み合わせて有用なアミノ酸配列であるが、しかし、本発明はこれらの正確な配列に限定されない。したがって、これらの４つの配列の１つ、２つ、３つまたは全４つは、独立して１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの単一のアミノ変化（すなわち、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの単一のアミノ酸置換、欠失および／または挿入）によって修飾することができ、ただし、修飾された配列は、なおも修飾されていない配列からなるポリペプチドに結合する抗体を誘発することができる。好ましい態様において、したがって、組成物は、配列番号：２５０、２４８、２４９および２３２の１つ、２つ、３つまたは全４つが１つの単一のアミノ酸置換、欠失および／または挿入によって独立して修飾された、これらの４つの特定されたポリペプチドを含む。
【００６１】
４つのポリペプチドは、実質的に同等の質量にて存在してもよく、すなわちこれらのそれぞれの質量は、全てのポリペプチドの平均質量の＋５％以内にある。したがって、これらは、ａ：ｂ：ｃ：ｄ質量比で存在してもよく、式中ａ−ｄのそれぞれは、０．９５−１．０５である。
【００６２】
安定化添加物
本発明のいくつかの態様において、免疫原性組成物は、安定化添加物を含む。このような添加剤は、二価の金属カチオンのキレート剤（たとえば、ＥＤＴＡ、エチレンジアミン四酢酸）、糖（たとえば、スクロースまたはトレハロースなどの二糖）、糖アルコール（たとえば、マンニトール）、遊離アミノ酸（たとえば、アルギニン）、緩衝液塩（たとえば、ホスフェート、シトラート）、ポリオール（たとえば、グリセロール、マンニトール）またはプロテアーゼ阻害剤を含むが、限定されない。
【００６３】
ＥＤＴＡは、好ましい添加物である。本発明の免疫原性組成物におけるＥＤＴＡの終濃度は、約１−５０ｍＭ、約１−１０または約１ｍＭ−５ｍＭ、好ましくは約２．５ｍＭおよびより好ましくは、約５．０ｍＭであることができる。
【００６４】
組成物のｐＨを制御するために、緩衝液は、もう一つの有用な添加物である。これは、特に凍結乾燥された材料の再構成の後に重要であり得る。本発明の組成物は、１つまたは複数の緩衝液（類）を含んでいてもよい。典型的な緩衝液は、ホスフェート緩衝液；トリス緩衝液；ホウ酸塩緩衝液；スクシナート緩衝液；ヒスチジン緩衝液；またはシトラート緩衝液を含む。ホスフェート緩衝液が好ましい。緩衝液は、５−２０ｍＭ範囲で典型的には含まれるだろう。本発明の水溶液組成物は、５−６．５の間、たとえば５．８−６．２もしくは５．９−６．１の間のｐＨまたは６のｐＨを好ましくは有する。
【００６５】
サッカライドまたは糖アルコール（またはその混合物、たとえばマンニトール／スクロース混合物）は、特に凍結乾燥を使用するときに、また有用である。適切な材料は、マンニトール、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストロースなどを含むが、限定されないスクロースの使用が特に好ましい。このような材料は、１容積につき約１重量％または１容積につき約３重量％−約６重量％または１容積につき約１０％または約１２．５重量％まで、好ましくは１容積につき約５重量％の濃度にで存在することができる。
【００６６】
凍結乾燥
本発明の格納免疫原性組成物の１つの方法は、凍結乾燥形のものである。この手順は、金属キレータ（たとえば、ＥＤＴＡ）の添加の有無にかかわらず使用することができる。また、本発明者は、ＥＤＴＡがワクチンの熱特徴に対して有意な影響を有さず、および任意の望ましくない可塑化する効果を導入しないことを示し、したがって、ＥＤＴＡを含む組成物をさらに貯蔵安定性を増強するために凍結乾燥することができることを意味する。
【００６７】
したがって、一般に、本発明は、また、二価の金属カチオンキレート剤（たとえば、ＥＤＴＡ）、および少なくとも１つの抗原（たとえば、少なくとも１つのポリペプチド抗原）を含む凍結乾燥物を提供する。
【００６８】
また、本発明は、本発明の水溶液免疫原性組成物の凍結乾燥物を提供する。これは、本発明の水溶液組成物を凍結乾燥することによって調製される。次いで、これを水溶液材料で再構成して本発明の水溶液免疫原性組成物を提供することができる。凍結乾燥された材料に存在する材料は、凍結乾燥物において残るだろうし、したがって、再構成の後にも、たとえば緩衝液塩、リオ保護剤（たとえば、スクロースまたはマンニトール）、キレート剤、その他が存在するだろう。材料が凍結乾燥の前よりも小容積の材料で再構成される場合、これらの材料は、より濃縮された形態で存在するだろう。再構成された凍結乾燥物は、１容積につき約２．５重量％まで、好ましくは１容積につき約１％−約２重量％の濃度にてリオ保護剤（たとえば、スクロースまたはマンニトール）を好ましくは含む。凍結乾燥の後および再構成の前に組成物に存在するＥＤＴＡの量は、理想的には、少なくとも０．７５ｍＭおよび好ましくは少なくとも２．５ｍＭである。５０ｍＭの最大が想定される。
【００６９】
凍結乾燥物を再構成するために有用な液体の材料は、以下を含むが、これらに限定されない：塩溶液、生理食塩水など；緩衝液、ＰＢＳなど；水、ｗｆｉなど。これらは、有用には４．５と７．５の間、たとえば６．８と７．２の間のｐＨを有する。再構成された凍結乾燥物は、５−６．５の間、たとえば５．８−６．２もしくは５．９−６．１の間のｐＨまたは６のｐＨを好ましくは有する。再構成のための液体材料は、アジュバント、たとえばアルミニウム塩アジュバントを含むことができる。アジュバントの水溶液懸濁液（任意にヒスチジン緩衝液などの緩衝液を含む）は、凍結乾燥されたポリペプチドを同時に再構成し、および吸着するために有用である。その他の態様において、液体の材料は、アジュバントがない。典型的には、凍結乾燥物は、不溶性金属塩アジュバントを含まない。
【００７０】
また、本発明は、ＥＤＴＡおよび少なくとも１つの抗原を含む凍結乾燥物を提供する。
【００７１】
免疫原性組成物および医薬
本発明の免疫原性組成物は、ワクチンとして有用であり得る。本発明に従ったワクチンは、予防的（すなわち、感染を予防するために）または治療的（すなわち、感染を治療するために）のいずれでもよく、典型的には予防的であるだろう。
【００７２】
したがって、組成物は、薬学的に許容され得る。これらは、通常抗原に加えて成分を含み、たとえばこれらは、典型的には１つまたは複数の薬学的担体（類）および／または賦形剤（類）を含むだろう。このような成分の完全な考察は、参照文献３９において利用できる。
【００７３】
組成物は、一般に水溶液形態で哺乳動物に投与されるだろう。しかし、投与の前に、組成物は、非水溶液形態であってもよかった。たとえば、いくつかの免疫原性組成物は、水溶液形態で製造し、次いで水溶液形態に満たし、および分散させ、およびまた投与されるが、その他の免疫原性組成物は、製造の間に凍結乾燥し、および使用時に水溶液形態に再構成される。したがって、本発明の組成物は、凍結乾燥された製剤など、乾燥されていてもよい。
【００７４】
本発明の組成物が複数のポリペプチドを含む場合、それぞれ異なるポリペプチドの質量は、同じ、または異なることができる。理想的には、これらは、実質的に同等の質量にて存在してもよく、すなわちこれらのそれぞれの質量は、全てのポリペプチドの平均質量の±５％以内にある。２つの抗原がハイブリッドポリペプチドとして存在する態様において、ハイブリッドは、この目的について、単一のポリペプチドと考えられる。多価製剤に含まれるポリペプチドの量に影響を与え得る因子は、免疫応答を誘発するために十分なポリペプチドの量および（それ自体と、またはその他のポリペプチドと）凝集を生じさせ、またはその他のポリペプチドの安定性に影響を及ぼすだろう量を含む。免疫原性組成物におけるポリペプチドの典型的な質量は、１−１００μｇの間である。
【００７５】
組成物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールなどの保存剤を含んでいてもよい。しかし、免疫原性組成物は、水銀材料が実質的にない、たとえばチオメルサールがない（すなわち、５μｇ／ｍｌ未満）べきであることが好ましい。水銀を含んでいない組成物が、より好ましい。保存剤がない組成物が、特に好ましい。
【００７６】
熱的安定度を改善するために、組成物は、温度保護剤を含んでいてもよい。このような薬剤のさらなる詳細を下に提供してある。浸透圧を制御するために、ナトリウム塩などの生理的塩を含むことが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）は、好ましく、これは１−２０ｍｇ／ｍｌの間、たとえば約１０±２ｍｇ／ｍｌ  ＮａＣｌで存在してもよい。存在してもよいその他の塩は、塩化カリウム、リン酸カリウム、無水リン酸二ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、その他を含む。
【００７７】
組成物は、好ましくは２４０−３６０  ｍＯｓｍ／ｋｇの間、２００  ｍＯｓｍ／ｋｇ−４００  ｍＯｓｍ／ｋｇ間の重量モル浸透圧濃度を一般に有するだろうし、より好ましくは、２９０−３１０  ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲に入るだろう。
【００７８】
組成物は、１つまたは複数の緩衝液を含んでいてもよい。典型的な緩衝液は、ホスフェート緩衝液；トリス緩衝液；ホウ酸塩緩衝液；スクシナート緩衝液；ヒスチジン緩衝液（特に、水酸化アルミニウムアジュバントと共に）；またはシトラート緩衝液を含む。緩衝液は、典型的には５−２０ｍＭ範囲で含まれるだろう。緩衝液は、好ましくは１０ｍＭリン酸カリウムである。
【００７９】
組成物のｐＨは、好ましくは約５−約６．５の間およびより好ましくは約５．５−６の間および最も好ましくは約６である。
【００８０】
組成物は、好ましくは無菌である。組成物は、好ましくは非発熱性であり、たとえば用量当たり＜１  ＥＵ（エンドトキシン単位、標準的基準）および用量当たり好ましくは＜０．１  ＥＵである。組成物は、好ましくはグルテンなしである。
【００８１】
組成物は、単一の免疫化のための材料を含んでいてもよく、または複数の免疫化のための材料（すなわち、「多用量」キット）を含んでいてもよい。保存剤の包含が、多用量配置において好ましい。多用量組成物において保存剤を含むことの代わりに（または加えて）、組成物は、材料の除去のための無菌の補助具を有する容器に含まれてもよい。
【００８２】
ヒトワクチンは、典型的には約０．５ｍｌの投薬量容積で投与されるが、半分用量（すなわち、約０．２５ｍｌ）を子供に投与してもよい。
【００８３】
また、本発明の免疫原性組成物は、１つまたは複数の免疫調節性薬剤を含んでいてもよい。好ましくは、免疫調節性薬剤の１つまたは複数は、１つまたは複数のアジュバントを含む。アジュバントは、ＴＨ１アジュバントおよび／またはＴＨ２アジュバントを含んでいてもよく、さらに後述してある。したがって、免疫原性組成物は、アルミニウム塩アジュバントなどのアジュバントをさらに含んでいてもよく、たとえば１つまたは複数の抗原がアルミニウム塩に吸着されていてもよい。さらに一般的にいえば、本発明の組成物に使用されてもよいアジュバントは、参照文献４においてすでに収載したものを含むが、限定されない。これらは、ミネラルを含むアジュバントおよび油−水乳濁液を含む。
【００８４】
ミネラルを含有するアジュバント
ミネラルを含有するアジュバントは、アルミニウム塩およびカルシウム塩などのミネラル塩（またはこれらの混合物）を含む。好ましくは、組成物は、アルミニウム塩アジュバントを含む。アルミニウム塩は、水酸化物、ホスフェート、その他を含み、塩は任意の適切な形態（たとえば、ゲル、結晶性、非晶質、その他）を採る。カルシウム塩は、リン酸カルシウムを含む（たとえば、参照文献１４に開示された「ＣＡＰ」粒子）。これらの塩に対する吸着が好ましく（たとえば、全ての抗原を吸着してもよい）。また、ミネラルを含有する組成物は、金属塩の粒子として製剤化してもよい［１５］。
【００８５】
アルミニウムヒドロキシドおよびアルミニウムホスフェートとして公知のアジュバントを使用してもよい。これらの名前は、従来のものであるが、いずれも存在する実際の化学化合物の正確な記述ではないため、便宜のためにだけに使用される（たとえば、参照文献１６の第９章を参照））。本発明は、アジュバントとして一般的に使用される「ヒドロキシド」または「ホスフェート」アジュバントのいずれかであることができる。「アルミニウムヒドロキシド」として公知のアジュバントは、典型的にはアルミニウムオキシヒドロキシド塩であり、これは、通常少なくとも部分的に結晶性である。「アルミニウムホスフェート」として公知のアジュバントは、典型的にはアルミニウムヒドロキシホスフェートであり、たいてい小量のサルフェート（すなわち、アルミニウムヒドロキシホスフェートサルフェート）を含む。これらは、沈澱によって得てもよく、および沈澱の間の反応状態および濃度は、塩におけるヒドロキシルに対するホスフェートの置換度に影響を及ぼす。
【００８６】
アルミニウムヒドロキシドアジュバントについては、繊維形態が（たとえば、透過型電子顕微鏡写真において見られるように）典型的である。アルミニウムヒドロキシドアジュバントのｐＩは、すなわち典型的には約１１であり、アジュバントそれ自体が、生理的ｐＨにて生の表面電荷を有する。アルミニウムヒドロキシドアジュバントについて、ｐＨ  ７．４にてｍｇ  Ａｌ−＋＋＋当たり１．８−２．６ｍｇの間のタンパク質の吸着能が報告されている。
【００８７】
アルミニウムホスフェートアジュバントは、０．３−１．２の間、好ましくは０．８−１．２の間、より好ましくは０．９５＋０．１のＰＯ４／Ａｌモル比を一般に有する。特にヒドロキシホスフェート塩については、アルミニウムホスフェートは、一般に非晶質だろう。典型的なアジュバントは、０．８４−０．９２間のＰＯ４／Ａｌモル比をもつ非晶質アルミニウムヒドロキシホスフェートであり、０．６ｍｇ  Ａｌ３＋／ｍｌにて含まれる。アルミニウムホスフェートは、一般に粒子（たとえば、透過型電子顕微鏡写真において見られるような板状形態）だろう。粒子の典型的な直径は、任意の抗原吸着の後に範囲０．１−１０μｍ（たとえば、約０．１−５μｍ）である。アルミニウムホスフェートアジュバントについて、ｐＨ  ７．４にてｍｇ  Ａｌ＋＋＋当たり０．７−１．５ｍｇタンパク質の間の吸着能が報告されている。
【００８８】
アルミニウムホスフェートのゼロ電荷点（ＰＺＣ）は、ヒドロキシルの代わりにホスフェートへの置換度に逆相関があり、この置換度は、沈澱によって塩を調製するために使用される反応物の反応状態および濃度に応じて変化することができる。また、ＰＺＣは、溶液における遊離リン酸イオンの濃度を変えることによって（より多いホスフェート＝より多い酸性ＰＺＣ）またはヒスチジン緩衝液などの緩衝液を添加する（ＰＺＣをより塩基性にする）ことによって変化される。本発明に従って使用されるアルミニウムホスフェートは、４．０−７．０の間、より好ましくは５−６．５の間、たとえば約５．７のＰＺＣを一般に有するだろう。
【００８９】
本発明の組成物を調製するために使用されるアルミニウム塩の懸濁液は、緩衝液（たとえば、ホスフェートまたはヒスチジンまたはトリス緩衝液）を含んでいてもよいが、これは必ずしも必要でない。懸濁液は、好ましくは無菌で、および発熱物質がない。懸濁液は、遊離ホスフェートイオン水溶液を含んでいてもよく、たとえば１．０−２０ｍＭの間、好ましくは５−１５ｍＭの間およびより好ましくは約１０ｍＭの濃度にて存在する。また、懸濁液は、塩化ナトリウムを含んでいてもよい。
【００９０】
好ましいアルミニウム塩アジュバントは、水酸化アルミニウムアジュバントである。
【００９１】
本発明は、アルミニウムヒドロキシドおよびアルミニウムホスフェートの両方の混合物を氏硫黄することができる。この場合、ヒドロキシドよりも多くのアルミニウムホスフェート、たとえば少なくとも２：１、たとえば≧５：１、≧６：１、≧７：１、≧８：１、≧９：１、その他の重量比があってもよい。
【００９２】
患者に対する投与のための組成物におけるＡｌ＋＋＋の濃度は、１０ｍｇ／ｍｌ未満、たとえば≦５ｍｇ／ｍｌ、≦４ｍｇ／ｍｌ、≦３ｍｇ／ｍｌ、≦２ｍｇ／ｍｌ、≦１ｍｇ／ｍｌその他が好ましい。好ましい範囲は、０．３−１ｍｇ／ｍｌの間である。０．８５ｍｇ／用量の最大が好ましい。
【００９３】
ミネラル塩は、それに吸着された、ＴＬＲ７アゴニストなどのＴＬＲアゴニストを有用に有することができる（たとえば、参照文献１７を参照されたい）。
【００９４】
油＆水乳濁液
本発明におけるアジュバントとしての用途に適する油水乳濁液組成物は、ＭＦ５９（参照文献１６の第１０章；参照文献１８も参照されたい）およびＡＳ０３などの油−水乳濁液を含む。また、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を使用してもよい。
【００９５】
種々の油−水乳濁液アジュバントが公知であり、これらは、典型的には少なくとも１つの油および少なくとも１つの表面活性物質を含み、油および表面活性物質は、生物分解可能（代謝可能）および生物学的適合性である。乳濁液中の油滴は、一般に５μｍ未満の直径であり、および理想的にはサブミクロンの直径を有し、これらの小さなサイズは、マイクロ流動化装置で達成されて安定な乳濁液を提供する。２２０ｎｍ未満のサイズである液滴は、これらが滅菌を濾過するために供することができるので、好ましい。
【００９６】
乳濁液は、動物（魚など）または植物供給源からのものなどの油を含むことができる。植物性油脂のための供与源は、木の実、種および穀物を含む。ラッカセイ油、ダイズ油、ヤシ油およびオリーブ油は、最も一般に利用できる、木の実油の例である。ホホバ油を使用することができ、たとえばホホバマメから得られる。種子油は、サフラワー油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマの種子油および同様のものを含む。穀物群において、トウモロコシ油は、最も容易に利用できるが、コムギ、カラスムギ、ライ麦、米、テフ、ライ小麦および同様のものなどのその他の穀物の油も使用してもよい。種子油に天然に存在しないが、グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６−１０炭素脂肪酸エステルは、木の実および種子油から開始して適切な材料の加水分解、分離およびエステル化によって調製してもよい。哺乳動物の乳由来の脂肪および油は代謝性であり、したがって、本発明の実施の際に使用してもよい。動物供与源から純粋な油を得るために必要な分離、精製、鹸化およびその他の手段のための手順は、当該技術分野において周知である。大部分の魚は、容易に回収して得る代謝性油を含む。たとえば、タラ肝油、サメ肝油および鯨ろうなどの鯨油は、本明細書において使用し得る魚油のいくつかの例である。いくつかの分枝鎖油は、５−炭素イソプレン単位で生化学的に合成され、およびテルペノイドと一般に呼ばれる。サメ肝油は、スクアレン、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエンとして公知の分枝の不飽和テルペノイドを含み、これは、特に本明細書において好ましい。また、スクアラン、スクアレンに対する飽和類似体は、好ましい油である。
【００９７】
スクアレンおよびスクアランを含む魚油は、市販の供与源から容易に入手でき、または当該技術分野において公知の方法によって得てもよい。その他の好ましい油は、トコフェロールである（下記を参照されたい）。油の混合物を使用するとができる。
【００９８】
表面活性物質は、それらの「ＨＬＢ」（親水溶液／親油性バランス）によって分類することができる。本発明の好ましい表面活性物質は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５およびより好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する。
【００９９】
本発明は、以下を含むが、限定されない表面活性物質と共に使用することができる：ポリオキシエチレンソルビタンエステル表面活性物質（一般にツイーンと呼ばれる）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０；直鎖状ＥＯ／ＰＯブロック共重合体などのＤＯＷＦＡＸ（商標）商品名のもとで販売されるエチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）の共重合体；オクトキシノール、これは、繰り返されるエトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数を変更することができ、オクトキシノール−９（トライトンＸ−１００またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が、特に関心対象である；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ホスファチジルコリン（レシチン）などのリン脂質；テルギトール（商標）ＮＰシリーズなどのノニルフェノールエトキシレート；トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ  ３０）などのラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコールに由来するポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ表面活性物質として公知）；並びにソルビタントリオレアート（スパン８５）およびソルビタンモノラウラートなどのソルビタンエステル（一般にスパン類として公知）。非イオン性界面活性物質が好ましい。乳濁液に含むために好ましい表面活性物質は、ツイーン８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）、スパン８５（ソルビタントリオレアート）、レシチンおよびトライトンＸ−１００である。
【０１００】
表面活性物質の混合物、たとえばツイーン８０／スパン８５混合物を使用することができる。ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（ツイーン８０）などのポリオキシエチレンソルビタンエステルおよびｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（トライトンＸ−１００）などのオクトキシノールの組み合わせも適する。もう一つの有用な組み合わせは、ラウレス（ｌａｕｒｅｔｈ）９プラスポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを含む。
【０１０１】
表面活性物質の好ましい量（重量％）は、以下の通りである：ポリオキシエチレンソルビタンエステル（ツイーン８０などの）０．０１−１％、特に約０．１％；オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（トライトンＸ−１００またはトライトンシリーズのその他の洗浄剤など）０．００１−０．１％、特に０．００５−０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（ラウレス９など）０．１−２０％、好ましくは０．１−１０％および特に０．１−１％または約０．５％。
【０１０２】
好ましい乳濁液アジュバントは、＜１μｍ、たとえば≦７５０ｎｍ、≦５００ｎｍ、≦４００ｎｍ、≦３００ｎｍ、≦２５０ｎｍ、≦２２０ｎｍ、≦２００ｎｍまたはより小さい平均液滴サイズを有する。これらの液滴サイズは、微小流動化などの技術によって都合よく達成することができる。
【０１０３】
本発明で有用な具体的な油−水乳濁液アジュバントは、以下を含むが、限定されない：
・スクアレン、ポリソルベート８０およびソルビタントリソルベートのサブミクロン乳濁液。これらの３つの成分は、１０：１：１の体積比または３９：４７：４７の重量比率にて存在することができる。容積による乳濁液の組成は、約５％のスクアレン、約０．５％のポリソルベート８０および約０．５％のソルビタントリソルベートであることができる。重量条件では、これらの比は、４．３％のスクアレン、０．５％のポリソルベート８０および０．４８％のソルビタントリソルベートになる。このアジュバントは、参照文献２２の第１０章および参照文献２３の第１２章においてより詳細に記載したとおりに「ＭＦ５９」として公知である［１９−２１］。ＭＦ５９乳濁液は、クエン酸イオン、たとえば１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液を都合よく含む。
【０１０４】
・スクアレン、トコフェロールおよびポリソルベート８０の乳濁液。乳濁液は、リン酸緩衝食塩水を含んでいてもよい。これは、またスパン８５（たとえば、１％にて）および／またはレシチンを含んでいてもよい。これらの乳濁液は、２から１０％までのスクアレン、２から１０％までのトコフェロールおよび０．３から３％までのポリソルベート８０を有してもよく、スクアレン：トコフェロールの重量比は、これがより安定な乳濁液を提供するので、好ましくは≦１である。スクアレンおよびポリソルベート８０は、約５：２の体積比または約１１：５の重量比で存在してもよい。したがって、３つの成分（スクアレン、トコフェロール、ポリソルベート８０）は、１０６８：１１８６：４８５または約５５：６１：２５の重量比で存在してもよい。１つのこのような乳濁液（「ＡＳ０３」）は、ＰＢＳにツイーン８０を溶解して２％の溶液を得て、次いで（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍｌのスクアレン）の混合物と９０ｍｌのこの溶液を混合して、次いで混合物を微少溶液にする（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｉｎｇ）ことによって作製することができる。生じる乳濁液は、たとえば１００−２５０ｎｍの間、好ましくは約１８０ｎｍの平均直径で、サブミクロンの油滴を有してもよい。乳濁液は、また３−ｄｅ−Ｏ−アシル化されたモノホスホリルリピドＡ（３ｄ−ＭＰＬ）を含んでいてもよい。このタイプのもう一つの有用な乳濁液は、たとえば上で考察した比で、ヒト用量当たり、０．５−１０ｍｇスクアレン、０．５−１１ｍｇトコフェロールおよび０．１−４ｍｇポリソルベート８０［２４］を含んでいてもよい。
【０１０５】
・スクアレン、トコフェロールおよびトライトン洗浄剤（たとえば、トライトンＸ−１００）の乳濁液。乳濁液は、また３ｄ−ＭＰＬを含んでいてもよい（下記参照されたい）。乳濁液は、リン酸緩衝液を含んでいてもよい。
【０１０６】
・ポリソルベート（たとえば、ポリソルベート８０）、トライトン洗浄剤（たとえば、トライトンＸ−１００）およびトコフェロール（たとえば、α−トコフェロールスクシナート）を含む乳濁液。乳濁液は、約７５：１１：１０（たとえば、７５０μｇ／ｍｌポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌ  トライトンＸ−１００および１００μｇ／ｍｌα−トコフェロールスクシナート）の質量比にてこれらの３つの成分を含んでいてもよく、これらの濃度は、抗原からこれらの成分の任意の寄与を含むべきである。また、乳濁液は、スクアレンを含んでいてもよい。また、乳濁液は、３ｄ−ＭＰＬを含んでいてもよい（下記参照されたい）。水相は、リン酸緩衝液を含んでいてもよい。
【０１０７】
・スクアレン、ポリソルベート８０およびポロキサマー４０１（「プルロニック（商標）Ｌ１２１」）の乳濁液。乳濁液は、リン酸緩衝食塩水（ｐＨ  ７．４）中に製剤化することができる。この乳濁液は、ムラミルジペプチドのための有用な送達媒体であり、「ＳＡＦ−１」アジュバント［２５］（０．０５−１％のＴｈｒ−ＭＤＰ、５％のスクアラン、２．５％のプルロニックＬ１２１および０．２％のポリソルベート８０）中でスレオニル−ＭＤＰと共に使用されてきた。また、これは、「ＡＦ」アジュバント［２６］（５％のスクアラン、１．２５％のプルロニックＬ１２１および０．２％のポリソルベート８０）中のように、Ｔｈｒ−ＭＤＰなしで使用することができる。微少溶液化（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓａｔｉｏｎ）が好ましい。
【０１０８】
・スクアレン、水溶性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤（たとえば、ポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）および疎水性非イオン性界面活性剤（たとえば、ソルビタンモノオレアート（ｍｏｎｏｌｅａｔｅ）または「スパン８０」）などの、アソルビタンエステルまたはマンイドエステル）を含む乳濁液。乳濁液は、好ましくは熱可逆的であり、および／または少なくとも９０％の２００ｎｍ未満のサイズである油滴（容積による）を有する［２７］。また、乳濁液は、以下の１つまたは複数を含んでいてもよい：アルジトール；低温保護剤（たとえば、ドデシルマルトシドおよび／またはスクロースなどの糖）；および／またはアルキルポリグリコシド。乳濁液は、ＴＬＲ４アゴニストを含んでいてもよい［２８］。このような乳濁液は、凍結乾燥してもよい。
【０１０９】
・スクアレン、ポロキサマー１０５およびＡｂｉｌ−Ｃａｒｅの乳濁液［２９］。アジュバントワクチンにおけるこれらの成分の終濃度（重量）は、５％のスクアレン、４％のポロキサマー１０５（プルロニックポリオール）および２％のＡｂｉｌ−Ｃａｒｅ  ８５（ビス−ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６  ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６ジメチコン；カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド）である。
【０１１０】
・０．５−５０％の油、０．１−１０％のリン脂質および０．０５−５％の非イオン性界面活性物質のを有する乳濁液。参照文献３０に記載されているように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカルジオリピンである。サブミクロンの液滴サイズが有利である。
【０１１１】
・代謝可能でない油（軽鉱油など）および少なくとも１つの表面活性物質（レシチン、ツイーン８０またはスパン８０など）のサブミクロンの油−水乳濁液。キルアサポニン（ＱｕｉｌＡｓａｐｏｎｉｎ）、コレステロール、サポニン親油性接合体（グルクロン酸のカルボキシル基を介した非アシルサポニンに対する脂肪族アミンの付加によって生成される参照文献３１に記述されたＧＰＩ−０１００など）、ジメチジオクタデシルアンモニウムブロミド（ｄｉｍｅｔｈｙｉｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）および／またはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンなどの添加剤が含まれてもよい。
【０１１２】
・サポニン（たとえば、ＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）およびステロール（たとえば、コレステロール）がらせん形ミセルとして会合された乳濁液［３２］。
【０１１３】
・鉱油、非イオン性親油性エトキシル化脂肪族アルコールおよび非イオン性親水性表面活性物質（たとえば、エトキシル化脂肪族アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロック共重合体）を含む乳濁液［３３］。
【０１１４】
・鉱油、非イオン性親水性エトキシル化脂肪族アルコール、および非イオン性親油性表面活性物質（たとえば、エトキシル化脂肪族アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロック共重合体）を含む乳濁液［３３］。
【０１１５】
いくつかの態様において、乳濁液は、送達時にその場で抗原と混合してもよく、したがって、アジュバントおよび抗原は、使用時に最終的な製剤の準備ができたパッケージされ、または分配された組成物において別々に保持させてもよい。その他の態様において、乳濁液を製造の間に抗原と混合させて、したがって、組成物を液体のアジュバントの形態にパッケージさせる。抗原は、一般に水溶液形態であるだろうし、その結果、組成物は、最終的に二液体を混合することによって調製される。混合するための二液体の体積比は、変更することができるが（たとえば、５：１〜１：５の間）、一般に約１：１である。成分の濃度が具体的な乳濁液の上記の記述において示されている場合、これらの濃度は、典型的には薄めていない組成物についてのものであり、したがって、抗原溶液と混合後の濃度は、減少するだろう。
【０１１６】
組成物がトコフェロールを含む場合、（α、β、γ、δ、εまたはζトコフェロールのいずれかを使用することができるが、α−トコフェロールが好ましい。トコフェロールは、いくつかの形態、たとえば異なる塩および／または異性体を採ることができる。塩は、スクシナート、アセテート、ニコチナート、その他などの有機塩を含む。Ｄ−α−トコフェロールおよびＤＬ−α−トコフェロールの両方を使用することができる。ビタミンＥは、高齢患者（たとえば、６０歳以上）において免疫応答似た死してポジティブな効果を有することが報告されていたので［３４］、トコフェロールは、この患者の群における使用のための組成物に都合よく含まれる。また、これらは、乳濁液を安定化するのを補助し得る抗酸化剤特性を有する［３５］。好ましいα−トコフェロールは、ＤＬ−α−トコフェロールであり、このトコフェロールの好ましい塩は、スクシナートである。
【０１１７】
水酸化アルミニウムおよび／またはアルミニウムホスフェートアジュバントの使用は、特に好ましく、抗原は、これらの塩に一般に吸着される。
【０１１８】
本発明の組成物は、細胞を媒介された免疫応答、並びに体液性免疫応答を誘発し得る。この免疫応答は、持続性の（たとえば、中和する）抗体および黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する曝露に迅速に応答することができる細胞性免疫を好ましくは誘導するだろう。
【０１１９】
免疫応答は、ＴＨ１免疫応答およびＴＨ２応答の一方または両方であってもよい。好ましくは、免疫応答は、ＴＨ１応答の増強およびＴＨ２応答の増強の一方または両方を提供する。
【０１２０】
免疫応答の増強は、全身性および粘膜性免疫応答の一方または両方であってもよい。好ましくは、免疫応答は、増強された全身性および増強された粘膜性の免疫応答の一方または両方を提供する。好ましくは、粘膜免疫応答は、ＴＨ２免疫応答である。好ましくは、粘膜免疫応答は、ＩｇＡの産生の増大を含む。
【０１２１】
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染は、体の種々の領域に影響を及ぼしうるし、このため、本発明の組成物は、種々の形態に調製してもよい。たとえば、組成物は、注射剤として、液体溶液または懸濁液のいずれかとして調製してもよい。また、注射前に液体媒体中の溶液、または中の懸濁液に適した固体形態を調製することができる（たとえば、凍結乾燥した組成物またはスプレー−凍結した乾燥組成物）。組成物は、局所的投与のために、たとえば軟膏、クリームまたは粉末として調製してもよい。組成物は、経口投与のために、たとえば錠剤またはカプセルとして、スプレーとして、またはシロップ（任意に風味をつけた）として調製してもよい。組成物は、肺投与のために、たとえば吸入器として、細粉またはスプレーを使用して調製してもよい。組成物は、坐薬または膣座薬として調製してもよい。組成物は、経鼻、経耳または経眼投与のために、たとえばドロップとして調製してもよい。組成物は、キット形態であってもよく、組み合わせられる組成物が患者への投与前にちょうど再構成されるようにデザインされる。このようなキットは、液体形態の１つまたは複数の抗原および１つまたは複数の凍結乾燥された抗原を含んでいてもよい。
【０１２２】
組成物が使用前にその場で調製されるべき場合（たとえば、成分が凍結乾燥形で存在する場合）、キットとして提示される場合、キットは、２つのバイアルを含んでいてもよく、またはこれは、１つのあらかじめ満たされた注射器および１つのバイアルを含んでいてもよく、注射器の内容物は、注射前にバイアルの内容物を再活性化するために使用される。
【０１２３】
ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、抗原の免疫学的に有効な量、並びに必要に応じて任意のその他の成分を含む。「免疫学的に有効な量」とは、個体に対するその量の投与が、単一用量において、または一連の一部として、治療または予防のために有効であることを意味する。この量は、治療される個体の健康および物理的条件、年齢、治療される個体の分類群（たとえば、非ヒト霊長類、霊長類、その他）、個体の免疫系が抗体を合成する能力、望まれる防護度、ワクチンの処方、医学的状況の治療医師の評価およびその他の関連した要因に応じて変化する。量は、比較的広範囲に入り、ルーチンの試行を介して決定することができるであろうことが予想される。複数の抗原が組成物に含まれる場合、２つの抗原は、互いに同じ用量にて、または異なる用量にて存在してもよい。
【０１２４】
上で述べたように、組成物は、温度保護剤を含んでいてもよく、この成分は、アジュバントを用いた組成物（特に、アルミニウム塩などのミネラルアジュバントを含むもの）において特に有用であり得る。参照文献３６に記載されているように、液体温度保護剤を水溶液ワクチン組成物に添加してその凍結点を低下させ、たとえば凍結点を０℃以下に減少させてもよい。したがって、組成物は、熱破壊を阻害するために、０℃以下で、しかしその凍結点より上で貯蔵させることができる。また、温度保護剤は、組成物を凍結し、一方で凍結および解凍の後の凝集または沈降からミネラル塩アジュバントを保護することを可能にし、また高温、たとえば４０℃を上回るにて組成物を保護し得る。水溶液ワクチンおよび液体温度保護剤から開始して、液体温度保護剤が最終混合の１−８０容量％を形成するように、混合してもよい。適切な温度保護剤は、ヒト投与のために安全で、水に容易に混和性／可溶性であるべきで、および組成物におけるその他の成分（たとえば、抗原およびアジュバント）に損傷を与えるべきでない。例には、グリセリン、プロピレングリコールおよび／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。適切なＰＥＧ類は、２００−２０，０００Ｄａの範囲である平均分子量を有してもよい。好ましい態様において、ポリエチレングリコールは、約３００Ｄａ（「ＰＥＧ−３００」）の平均分子量を有することができる。
【０１２５】
治療の方法およびワクチンの投与
また、本発明は、哺乳動物における免疫応答を高める方法であって、哺乳動物に本発明の組成物を投与する工程を含む方法を提供する。免疫応答は、好ましくは保護的であり、および好ましくは抗体および／または細胞媒介免疫を含む。本方法は、既往性反応を高め得る。
【０１２６】
また、本発明は、哺乳動物における免疫応答を高めるための医薬の製造におけるＥｓｘＡ抗原、ＥｓｘＢ抗原および安定化添加物の使用を提供する。また、使用は、Ｓｔａ００６抗原、Ｓｔａ０１１抗原および／またはＨｌａ抗原を含んでいてもよい。また、これは、アジュバントの使用を含んでいてもよい。
【０１２７】
また、本発明は、哺乳動物における免疫応答を高めるための医薬の製造におけるＥｓｘＡＢ抗原および安定化添加物の使用を提供する。また、使用は、Ｓｔａ００６抗原、Ｓｔａ０１１抗原および／またはＨｌａ抗原を含んでいてもよい。また、これは、アジュバントの使用を含んでいてもよい。
【０１２８】
また、本発明は、再構成の後に哺乳動物における免疫応答を高めるための、凍結乾燥された医薬の製造におけるＥＤＴＡおよび抗原の使用を提供する。
【０１２９】
これらの使用および方法によって哺乳動物における免疫応答を高めることによって、哺乳動物は、院内感染を含む黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染から保護することができる。より詳細には、哺乳動物は、皮膚感染、肺炎、髄膜炎、骨髄炎心内膜炎、毒素ショック症候群および／または敗血症から保護され得る。
【０１３０】
また、本発明は、第１の成分および第２の成分を含むキットであって、第１の成分も第２の成分も記の通りの本発明の組成物でないが、第１の成分および第２の成分は、上記の通りに本発明の組成物を提供するために組み合わせることができるキットを提供する。キットは、以下の１つのまたは複数を含む第３の成分をさらに含んでいてもよい：説明書、注射器もしくはその他の送達装置、アジュバントまたは薬学的に許容される製剤化溶液。
【０１３１】
また、本発明は、本発明の免疫原性組成物が事前に充填された送達装置を提供する。
【０１３２】
哺乳動物は、好ましくはヒトである。ワクチンが予防的使用のためのものである場合、ヒトは、好ましくは小児（たとえば、幼児または乳児）または１０代であり；ワクチンが治療上の使用のためのものである場合、ヒトは、好ましくは１０代または成人である。また、子供のために意図されるワクチンは、成人に投与して、たとえば安全性、投薬量、免疫原性などを評価してもよい。本発明に従って有用に予防接種をすることができるその他の哺乳類は、ウシ、イヌ、ウマおよびブタである。
【０１３３】
治療的処置の有効性を調べる１つの方法は、本発明の組成物の投与後に黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染をモニターすることを含む。予防的処置の有効性を調べる１つの方法は、組成物の投与の後に本発明の組成物における抗原に対する免疫応答、全身性（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ産生のレベルをモニターすることなど）および／または粘膜性（ＩｇＡ産生のレベルをモニターすることなど）をモニターすることを含む。典型的には、抗原特異的粘膜抗体反応は、免疫化後、しかし暴露前に決定されるのに対し、抗原特異的血清抗体反応は、免疫化後および暴露後に決定される。
【０１３４】
本発明の組成物の免疫原性を評価するもう一つの方法は、免疫ブロットおよび／またはマイクロアレイによって患者の血清または粘膜分泌物をスクリーニングするために組換えでタンパク質を発現することである。タンパク質と患者の試料との間の陽性反応は、患者が問題のタンパク質に対する免疫応答を開始していることを示す。また、この方法は、抗原内の免疫優性抗原および／またはエピトープを同定するために使用してもよい。
【０１３５】
免疫原性組成物の有効性は、また、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染、たとえばモルモットまたはマウスの動物モデルを免疫原性組成物に曝露することによってインビボで決定することができる。特に、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染症の研究のために、３つの有用な動物モデルがあり、すなわち：（ｉ）マウス膿瘍モデル［３７］、（ｉｉ）マウス致死感染モデル［３７］および（ｉｉｉ）マウス肺炎モデル［３８］。膿瘍モデルは、静脈内暴露後のマウス腎臓における膿瘍に注目する。致死感染モデルは、静脈内または腹腔内経路によって黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の通常の致死用量によって感染させた後に生存するマウスの数に注目する。また、肺炎モデルは、生存割合に注目するが、鼻腔内感染を使用する。有用な免疫原性組成物は、これらのモデルの１つまたは複数に有効でり得る。たとえば、いくつかの臨床的状況については、血液伝播を予防すること、または食菌作用を促進することを必要とせずに、肺炎から守ることが望ましいであろうし；その他の状況において、主な要求は、血液伝播を予防することであってもよい。異なる抗原および異なる抗原の組み合わせは、有効な免疫原性組成物の異なる側面に寄与し得る。
【０１３６】
本発明の組成物は、一般に患者に直接投与されるだろう。直接の送達は、非経口注射（たとえば、皮下に、腹膜内に、静脈内に、筋肉内に、または組織の間隙に）によって、または粘膜に、直腸、経口（たとえば、錠剤、スプレー）、膣、局所的、経皮もしくは経皮性、鼻腔内、経眼、経耳、経肺またはその他の粘膜投与などによって達成してもよい。
【０１３７】
本発明は、全身性および／または粘膜性の免疫を誘発するために、好ましくは増強された全身性および／または粘膜性の免疫を誘発するために使用してもよい。
【０１３８】
好ましくは増強された全身性および／または粘膜性の免疫は、増強されたＴＨ１および／またはＴＨ２免疫応答において反映される。好ましくは、増強された免疫応答は、ＩｇＧ１および／またはＩｇＧ２ａおよび／またはＩｇＡの産生の増大を含む。
【０１３９】
投薬量は、単一用量スケジュールまたは複数用量スケジュールによるものであることができる。複数用量は、一次免疫化スケジュールにおいて、および／またはブースター免疫化スケジュールにおいて使用されてもよい。複数用量スケジュールにおいて、種々の用量を同じまたは異なる経路、たとえば非経口の一次および粘膜のブースター、粘膜の一次および非経口のブースター、その他によって与えてもよい。複数用量は、典型的には少なくとも１週間隔（たとえば、約２週、約３週、約４週、約６週、約８週、約１０週、約１２週、約１６週、その他）にて投与されるだろう。
【０１４０】
本発明に従って調製されるワクチンは、子供および成人を治療するために使用してもよい。したがって、ヒト患者は、１歳未満、１−５歳、５−１５歳、１５−５５歳または少なくとも５５歳であってもよい。ワクチンを受けるために好ましい患者は、高齢者（たとえば、５０歳≧、６０歳≧および好ましくは≧６５歳）、若者（たとえば、５歳≦）、入院患者、医療従事者、軍部および軍人、妊婦、慢性疾患であるものまたは免疫不全患者である。しかし、ワクチンは、単にこれらの郡に対してのみ適するのではなく、さらに一般的にいえば全集団に使用されてもよい。
【０１４１】
本発明によって産生されるワクチンは、その他のワクチンと実質的に同時に（たとえば、同じ医療診断またはヘルスケア専門家またはワクチン接種センターへの来診の間に）、たとえば、インフルエンザワクチン、麻疹ワクチン、おたふくかぜワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、抱合インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タイプｂワクチン、不活性化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌抱合ワクチン（四価のＡ−Ｃ−Ｗ１３５−Ｙワクチンなど）、呼吸器合胞体ウイルスワクチン、その他実質的に同時に患者に投与してもよい。同時投与に適したさらなる非ブドウ球菌ワクチンは、参照文献１３の３３−４６ページに収載された１つまたは複数の抗原を含んでいてもよい。
【０１４２】
一般
本発明の実施は、特に明記しない限り、当該技術分野の技術の中で、化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬学の従来法を使用するだろう。このような技術は、文献において完全に説明されている。たとえば、参照文献３９−４６、その他を参照されたい。
【０１４３】
「ＧＩ」番号付けを上で使用してある。ＧＩ番号または「ＧｅｎＩｎｆｏ識別子」は、配列がそのデータベースに付加されるときに、ＮＣＢＩによって処理されるそれぞれの配列記録に連続的に割り当てられる一連の数字である。ＧＩ番号は、配列記録のアクセッション番号との類似点を有さない。配列が更新されるとき、（たとえば、修正のため、またはそれ以上の注釈または情報を添加するため）、これは、新たなＧＩ番号を受ける。したがって、与えられたＧＩ番号と関連する配列は、決して変えられない。
【０１４４】
本発明が「エピトープ」に関する場合、このエピトープは、骨髄性リンパ細胞エピトープおよび／またはＴ細胞エピトープであってもよい。このようなエピトープは、経験的に同定することができ（たとえば、ＰＥＰＳＣＡＮ［４７、４８］または類似の方法を使用する）、またはこれらは、予測することができる（たとえば、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性インデックス［４９］、マトリックスに基づいたアプローチ［５０］、ＭＡＰＩＴＯＰＥ［５１］、ＴＥＰＩＴＯＰＥ［５２、５３］、ニューラルネットワーク［５４］、ＯｐｔｉＭｅｒ＆ＥｐｉＭｅｒ［５５、５６］、ＡＤＥＰＴ［５７］、Ｔｓｉｔｅｓ［５８］、親水性［５９］、抗原性インデックス［６０］または参照文献６１−６５、その他において開示された方法を使用する）。
【０１４５】
エピトープは、抗体の抗原結合部位またはＴ細胞受容体によって認識される、およびこれに結合する抗原の部分であり、これらは「抗原決定基」ともをいわれ得る。
【０１４６】
抗原「ドメイン」が省略される場合、これは、シグナルペプチドの、細胞外ドメインの、細胞質ドメインの、膜貫通ドメインの、その他の省略を含んでいてもよい。
【０１４７】
「を含む」という用語は、「を含むこと」、並びに「からなること」を包含し、たとえば、Ｘ「を含む」組成物は、Ｘだけからなってもよく、または何かさらなる、たとえばＸ  ＋  Ｙを含んでいてもよい。
【０１４８】
数値ｘに関連して「約」という用語は、任意であり、たとえば、ｘ＋１０％を意味する。
【０１４９】
２つの配列アミノ酸の間の配列同一性に関し、整列したときに、２つの配列を比較する際にアミノ酸のパーセンテージが同じであることを意味する。この整列およびパーセント相同性または配列同一性は、当該技術分野において公知のソフトウェアプログラム（たとえば、参照文献６６の７．７．１８に記述されたもの）を使用して決定することができる。好ましい整列は、１２のギャップオープンペナルティおよび２のギャップエクステンションペナルティ、６２のＢＬＯＳＵＭマトリックスでアフィンギャップ検索を使用するＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、参照文献６７に開示されている。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】７２時間まで２５℃にてインキュベートしたＥＤＴＡの非存在下におけるｐＨ６での一価の（ＥｓｘＡＢ）（Ａ）、（Ｂ）三価（Ｓｔａ００６、Ｓｔａ０１１およびＨｌａＨ３５Ｌ）、および（Ｃ）四価（ＥｓｘＡＢ、Ｓｔａ００６、Ｓｔａ０１１およびＨｌａＨ３５Ｌ）の予め凍結乾燥させた製剤のキャピラリー電機泳動プロフィールを示す。ピーク：ＥｓｘＡＢ単量体（１５分）、Ｓｔａ０１１単量体（１７分）、ＨｌａＨ３５Ｌ（１８分）、ＥｓｘＡＢ二量体（１９分）、Ｓｔａ０１１二量体（２１分）、Ｓｔａ００６二量体（２１．５分）。
【図２】０．７５ｍＭ  ＥＤＴＡにおける予め凍結乾燥させた製剤の示差走査熱量測定プロフィールを示す（−３３．３９℃にてガラス遷移温度（Ｔｇ））。
【図３】５ｍＭ  ＥＤＴＡにおける予め凍結乾燥させた製剤の示差走査熱量測定プロフィールを示す（−３２．８６℃にてガラス遷移温度（Ｔｇ））。
【図４】７２時間まで２−８℃にてインキュベートした０．７５ｍＭ  ＥＤＴＡにおける四価（ＥｓｘＡＢ、Ｓｔａ００６、Ｓｔａ０１１およびＨｌａＨ３５Ｌ）の予め凍結乾燥させた製剤のサイズ排除クロマトグラフィプロフィールを示す。ピーク：Ｓｔａ００６＋Ｓｔａ０１１＋ＥｓｘＡＢ（１１分）、ＨｌａＨ３５Ｌ（１２．５分）、ＥＤＴＡ（１４分）。
【図５】７２時間まで２５℃にてインキュベートした０．７５ｍＭ  ＥＤＴＡにおける四価（ＥｓｘＡＢ、Ｓｔａ００６、Ｓｔａ０１１およびＨｌａＨ３５Ｌ）の予め凍結乾燥させた製剤のサイズ排除クロマトグラフィプロフィールを示す。ピーク：Ｓｔａ００６＋Ｓｔａ０１１＋ＥｓｘＡＢ（１１分）、ＨｌａＨ３５Ｌ（１２．５分）、ＥＤＴＡ（１４の分）。
【図６】７２時間まで２−８℃にてインキュベートした５ｍＭ  ＥＤＴＡにおける四価（ＥｓｘＡＢ、Ｓｔａ００６、Ｓｔａ０１１およびＨｌａＨ３５Ｌ）の予め凍結乾燥させた製剤のサイズ排除クロマトグラフィプロフィールを示す。ピーク：Ｓｔａ００６＋Ｓｔａ０１１＋ＥｓｘＡＢ（１１分）、ＨｌａＨ３５Ｌ（１２．５分）、ＥＤＴＡ（１４分）。
【図７】７２時間まで２５℃にてインキュベートした５ｍＭ  ＥＤＴＡにおける四価（ＥｓｘＡＢ、Ｓｔａ００６、Ｓｔａ０１１およびＨｌａＨ３５Ｌ）の予め凍結乾燥させた製剤のサイズ排除クロマトグラフィプロフィールを示す。ピーク：Ｓｔａ００６＋Ｓｔａ０１１＋ＥｓｘＡＢ（１１分）、ＨｌａＨ３５Ｌ（１２．５分）、ＥＤＴＡ（１４分）。
【図８】ｔ＝０（Ａ）、２４時間後（Ｂ）、４８時間後（Ｃ）および７２時間後（Ｄ）の２−８℃にて、および２５℃にてインキュベートした５  ｍＭ  ＥＤＴＡにおける一価および四価の予め凍結乾燥させた製剤の天然のタンパク質ゲルを示す。レーン１：Ｓｔａ００６；レーン２：Ｓｔａ０１１；レーン３：ＨｌａＨ３５；レーン４：ＥｓｘＡＢ；レーン５：ＥｓｘＡＢ、Ｓｔａ００６、Ｓｔａ０１１およびＨｌａＨ３５Ｌ．ＭＷ：ＥｓｘＡＢ単量体（２２．８ｋＤａ）、Ｓｔａ０１１単量体（２７ｋＤａ）、Ｓｔａ００６単量体（３２ｋＤａ）、ＨｌａＨ３５Ｌ（３３ｋＤａ）、ＥｓｘＡＢ二量体（４５．６ｋＤａ）、Ｓｔａ０１１二量体（５４ｋＤａ）、Ｓｔａ００６二量体（６４ｋＤａ）、ＥｓｘＡＢ二量体（９１．２ｋＤａ）。ＭＷマーカー。
【図９】７２時間まで室温にてインキュベートした（Ａ）ｐＨ７．２および（Ｂ）ｐＨ  ６での四価（ＥｓｘＡＢ、Ｓｔａ００６、Ｓｔａ０１１およびＨｌａＨ３５Ｌ）の予め凍結乾燥させた製剤のキャピラリー電機泳動プロフィールを示す。ピーク：ＥｓｘＡＢ単量体（１５分）、Ｓｔａ０１１単量体（１７分）、ＨｌａＨ３５Ｌ（１８分）、ＥｓｘＡＢ二量体（１９分）、Ｓｔａ０１１二量体（２１分）、Ｓｔａ００６二量体（２１．５分）。
【図１０】逆相クロマトフラフィーによって記録した、Ｓｔａ００６、Ｓｔａ０１１およびＥｓｘＡＢについてのｐＨの関数として二量体に対する単量体のタンパク質選択性を示す。Ｓｔａ００６（◆）、Ｓｔａ０１１（■）、ＥｓｘＡＢ（▲）。
【図１１】（Ａ）２４時間室温にてインキュベートしたｐＨ６での５ｍＭ  ＥＤＴＡにおける四価（ＥｓｘＡＢ、Ｓｔａ００６、Ｓｔａ０１１およびＨｌａＨ３５Ｌ）の予め凍結乾燥させた製剤製剤および（Ｂ）水溶液中に再構成させた凍結乾燥させた製剤のサイズ排除クロマトグラフィプロフィールを示す。
【図１２】ｐＨ  ６．０またはｐＨ  ７．２にて予め凍結乾燥させた製剤において調製された再構成された凍結乾燥させたアジュバントの四価のワクチンで免疫化後のマウスにおけるＨｌａＨ３５Ｌ抗原に対する抗体価を示す。対照は、生理食塩水プラスアジュバントの同一のクールを受けた。
【図１３】ｐＨ  ６．０またはｐＨ  ７．２にて予め凍結乾燥させた製剤において調製された再構成された凍結乾燥させたアジュバントの四価のワクチンで免疫化後のマウスにおけるＳｔａ００６抗原に対する抗体価を示す。対照は、生理食塩水プラスアジュバントの同一のクールを受けた。
【図１４】ｐＨ  ６．０またはｐＨ  ７．２にて予め凍結乾燥させた製剤において調製された再構成された凍結乾燥させたアジュバントの四価のワクチンで免疫化後のマウスにおけるＳｔａ０１１抗原に対する抗体価を示す。対照は、生理食塩水プラスアジュバントの同一のクールを受けた。
【図１５】ｐＨ  ６．０またはｐＨ  ７．２にて予め凍結乾燥させた製剤において調製された再構成された凍結乾燥させたアジュバントの四価のワクチンで免疫化後のマウスにおけるＥｓｘＡＢ抗原に対する抗体価を示す。対照は、生理食塩水プラスアジュバントの同一のクールを受けた。
【図１６】黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）暴露後の免疫されたマウスの生存割合示す。
【発明を実施するための形態】
【０１５１】
材料および方法
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）解析は、ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｑ２０００で行った。１０μＬの試験溶液を気密性のＴ０アルミニウムパンに充填して、−８０℃にて平衡化し、次いで異なる走査割合（１０から２０℃／分まで）にて０℃まで加熱した。
【０１５２】
サイズ排除高圧液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）解析は、１００μＬの予め凍結乾燥させた製剤を注射することによって、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９５機器で行った。分離は、０．８ｍＬ／分アイソクラチック条件（０．１Ｍのリン酸ナトリウム＋  ０．１Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ  ７）においてカラムＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｂｉｏｓｅｐ  ＳＥＣ−Ｓ−３０００で行った。スペクトルは、２１４ｎｍにて記録した。
【０１５３】
逆相クロマトフラフィー（ＲＰ）解析は、５０μＬの予め凍結乾燥させた製剤を注射することによってＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９５機器で行った。分離は、カラムＡＣＥ  ３  Ｃ４−３００で行った。流速：１  ｍＬ／分（ＴＦＡ／アセトニトリル勾配中）。
【０１５４】
キャピラリー電気泳動解析は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＰＡ８００機器、ＳＤＳ−ＭＷ適用で行った。試料は、１０μＬのＴＲＩＳ−ＳＤＳ緩衝液と９０μＬの予め凍結乾燥させた製剤を混合することによって調製した。
【０１５５】
凍結乾燥の実行は、５枚の棚によって構成したＶｉｒｔｉｓ  Ｇｅｎｅｓｉｓ  ＥＬ  ２５において行った。０．３ｍＬの溶液を、２ｃｃのタイプＩ  ガラスバイアルおよびシリコンブチルのストッパーに充填した。
【０１５６】
抗原純度：ＥｓｘＡＢ純度＝（単両体＋二量体）／総量タンパク質。
【０１５７】
抗原選択性：ＥｓｘＡＢ  選択性％  ＝％の単量体／％（単両体＋二量体）。
【０１５８】
ＥｓｘＡＢ安定性
ＥｓｘＡＢハイブリッドポリペプチド（配列番号：２５０）の単量体および二量体形態の安定性を調査するために、スクロース５／１０％ｗ／Ｖ、アルギニン５０／１５０ｍＭ、ＥＤＴＡ  ２０ｍＭ、プロテアーゼ阻害剤混合物、グリセロール１０％およびシトラート５０ｍＭを含む種々の安定化する添加剤をスクリーニングした。これらの全ては、ｐＨ６．０にて１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液において解析した。また、緩衝ｐＨは、ｐＨ  ５．８および５．５にて試験した試験した貯蔵条件は、室温（ＲＴ）、２−８℃および凍結／解凍サイクルであった。
【０１５９】
全ての実験において、部分的二量体化およびそれに伴う純度の喪失を観察した。
【０１６０】
２０ｍＭ  ＥＤＴＡだけが、単量体形態の安定化し、結果として、合計純度８０％を維持した。表１は、室温にて、および２−８℃にて実施したｐＨ  ６．０にて緩衝液および０または２０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む実験のＲＰ−ＨＰＬＣ解析から得たデータを示す。
【０１６１】
【表１】
2015500864.tif 000002
【０１６２】
製品安定を保持するために必要な最終的なプレバルク緩衝液におけるＥＤＴＡの最小濃度を確認するために、単量体ＥｓｘＡＢ（ｐＨ６にて１０ｍＭリン酸カリウムにおいて貯蔵してある）の安定性を０−２０ｍＭ  ＥＤＴＡの濃度範囲にわたって研究した。ＲＰ−ＨＰＬＣから得られたデータを表２に報告してある。
【０１６３】
【表２】
2015500864.tif 000003
【０１６４】
得られたデータに基づいて、ＥｓｘＡＢ単量体は、最終的な緩衝液がＥＤＴＡ濃度≧２ｍＭを有するとき、６日までの間ＲＴでのＲＰ−ＨＰＬＣ純度および選択性に関し、安定とみなすことができる。
【０１６５】
５ｍＭ  ＥＤＴＡの有無におけるＥｓｘＡＢ単量体の安定性についてのさらなる研究を実施した。ＥＤＴＡの存在下において、ＥｓｘＡＢ単量体は、２８日までの間２−８℃にて安定であった；一方、ＥＤＴＡの非存在下において、ＲＰ−ＨＰＬＣ選択性および純度の有意な喪失が７日後にあった。また、ＥｓｘＡＢ単量体は、５回までの凍結／融解サイクル後に安定であった；一方、ＥＤＴＡの非存在では、３回の凍結／融解サイクル後にＲＰ−ＨＰＬＣ選択性のわずかな喪失を引き起こした。
【０１６６】
したがって、ＥｓｘＡＢ単量体が濃縮されたバルクをｐＨ６にて１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液において、および５ｍＭ  ＥＤＴＡにおいて保存した。
【０１６７】
抗原安定性
この実験において使用した組成物の抗原を下の表３に要約してある。全ての４抗原は、組換えタンパク質であり−これらは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に発現させて、総細胞抽出物の可溶性画分から精製した。
【０１６８】
【表３】
2015500864.tif 000004
【０１６９】
ｐＨ  ６にて１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液における四価（ＥｓｘＡＢ、Ｓｔａ００６、Ｓｔａ０１１およびＨｌａＨ３５Ｌ）、三価（Ｓｔａ００６、Ｓｔａ０１１およびＨｌａＨ３５Ｌ）および一価（ＥｓｘＡＢ）の予め凍結乾燥させた製剤のタンパク質安定性を解析した。図１は、キャピラリー電気泳動法解析の結果を報告する。興味深いことに、一価および三価の製剤は、７２時間まで２５℃にて安定であったが、四価の製剤において、ＥｓｘＡＢが時間とともにＳｔａ単量体（グラフにおける＊で顕著な）出現を伴ってＥｓｘＡＢの二量体およびヘテロ二量体を発生する傾向があった。本発明者らは、単量体ＥｓｘＡＢが、Ｓｔａ００６およびＳｔａ０１１と共に、安定化添加物の非存在下においてレドックス反応を行うと考える。
【０１７０】
製剤に対するＥＤＴＡの影響
その単量体形態においてＥｓｘＡＢを維持するために、およびその他の成分（すなわちＳｔａ００６、Ｓｔａ０１１およびＨｌａＨ３５Ｌ）とのあらゆる干渉を回避するために、両方に最適な必要とされるＥＤＴＡの濃度を調査した。
製剤の熱特性に対するＥＤＴＡの影響を、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）の手段によって評価した。有用な抗原ストック供給を残すために、実験は偽薬製剤を使用することによって実施した。偽薬製剤は、ｐＨ  ７．２にて１０ｍＭリン酸カリウム、５％のスクロースおよび０、０．７５ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、５０ｍＭまたは１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、およびｐＨ  ６．０にて１０  ｍＭリン酸カリウム、５％のスクロースおよび５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む。
図２および３は、それぞれ、０．７５ｍＭおよび５ｍＭ  ＥＤＴＡ偽薬製剤（ｐＨ  ７．２にて）の加熱相から得られるデータを報告する。開始温度値は、凍結した溶液のガラス遷移温度（Ｔｇ）を表す。０．７５ｍＭ（−３３．３９℃）および５ｍＭ（−３２．８６℃）ＥＤＴＡ偽薬製剤についてのＴｇ値は、ＥＤＴＡ（−３３．８８℃）を伴わない偽薬についてのＴｇ値に類似する。
結果は、溶液の熱挙動に対して、試験したＥＤＴＡ濃度（ｐＨ  ６．０およびｐＨ  ７．２にて）のいずれについても有意な影響を示さなかったし、望ましくない可塑化する効果がなかった。また、製剤のスクロースに基づいた凍結乾燥サイクルは、ＥＤＴＡの存在による影響を受けなかった。
この結論は、５ｍＭ  ＥＤＴＡ偽薬製剤（ｐＨ  ７．２にて）での凍結乾燥顕微鏡観察（ＦＤＭ）研究によってさらに確認された。
次に、四価の予め凍結乾燥させた製剤の安定性に対するＥＤＴＡの効果を解析した。試験した製剤の組成物を下の表４に収載してある。
【０１７１】
【表４】
2015500864.tif 000005
【０１７２】
１）サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）−ＨＰＬＣ解析
これらの解析は、ｔ＝０（図４−７）にて、四価の組成物のプロフィールがＥＤＴＡによってわずかに影響を受けることを示した：第１のピークの領域の増加（Ｓｔａ００６およびＳｔａ０１１二量体および部分的にＥｓｘＡＢ単量体によるシグナルのオーバーラップ）、並びに第２のピークの領域の減少（ＨｌａＨ３５Ｌおよび部分的にＥｓｘＡＢ単量体）が観察された。
【０１７３】
２−８℃およびＲＴにて、２４時間、４８時間および７２時間（図４−７）の後、ピークプロフィールのさらなる修飾が明らかになり、おそらくＳｔａ００６およびＳｔａ０１１の単量体形態の形成と関連する、２つのピークの間の滞留時間の中間における新たな有意な肩の存在を示した（グラフにおいて＊でマークした）。低滞留時間にて凝集ピーク（グラフにおいて＊＊でマークした）も明らかである。
【０１７４】
タンパク質は、より低い温度およびより高いＥＤＴＡ濃度にてより安定である。実際に、０．７５ｍＭの予め凍結乾燥させた製剤は、任意の温度にて調査した時間幅において安定でなかったが、５ｍＭ製剤は、２−８℃においてのみ優れた安定性を示した。加えて、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ製剤を解析したが、タンパク質安定性の適度な増加は、注射当たりのＥＤＴＡ投薬量における増大を正当化するには不十分であると考えられた。
【０１７５】
２）天然ゲル解析
予め凍結乾燥させた製剤（５ｍＭ  ＥＤＴＡ）の天然ゲル（ＳＤＳなし、および還元剤なし）により、以前のデータを確認し、タンパク質Ｓｔａ００６、Ｓｔａ０１１およびＥｓｘＡＢの単量体−二量体バンドの強度の変化、並びに少なくとも２つの新たなバンド（図８において矢印を参照されたい）の出現を示した。
【０１７６】
ｐＨ最適化
【０１７７】
７．２から６にｐＨを変えることにより、図９において強調されるように、製剤安定性のさらなる増加が観察され、ｐＨ  ７．２およびｐＨ  ６の両方にて、７２時間までＲＴにて維持した予め凍結乾燥させた製剤のキャピラリー電機泳動で記録したプロフィールを比較する。特にｐＨ  ６．０にて、ＥｓｘＡＢ二量体のピークの、およびＳｔａ０１１単量体の増加は、時間とともにｐＨ７．２におけるよりも著しく低い。
【０１７８】
異なるｐＨ状態におけるＥｓｘＡＢの安定性を、安定性のパラメーターであるタンパク質選択性を測定することによって調査した。
【０１７９】
図１０は、逆相クロマトグラフィーによって記録した、３つのタンパク質についてのΔ選択性（ｔ２４ｈ−ｔ０）を報告する：ＥｓｘＡＢ、Ｓｔａ００６およびＳｔａ０１１（ＨｌａＨ３５Ｌは、選択性に関して記述することができない）。ｐＨ  ７から６へのΔ選択制の減少は、明らかであるが（全てのタンパク質についてｐ−値＝０によって確認される）ｐＨ  ５におけるさらなる減少は、２つのタンパク質について統計的関連の限界である（Ｓｔａ００６：ｐ−値＝０．０４０、Ｓｔａ０１１：ｐ−値＝０、ＥｓｘＡＢ：ｐ−値＝０．０５３）。
【０１８０】
ｐＨ最適化を考慮し、およびｐＨ  ５にてＥＤＴＡ−ホスフェート溶液が緩衝能力を有さないので、ｐＨ６を最終製剤について選択した。その上、この製剤の熱特性に対するｐＨの影響をＤＳＣによって評価した。望ましくない可塑化効果はなかったし、スクロースに基づいた凍結乾燥サイクルは、影響を受けなかった。
【０１８１】
要約すると、ｐＨ  ６にて製剤は、抗原相互作用を最小限にし、およびＲＴにて７２時間まで選択した予め凍結乾燥させた製剤の許容される安定性を保証する。選択した予め凍結乾燥させた製剤の組成物を表５に要約してある。
【０１８２】
【表５】
2015500864.tif 000006
【０１８３】
【表６】
2015500864.tif 000007
【０１８４】
予め凍結乾燥させた製剤を表６の凍結乾燥サイクルに従って凍結乾燥して、ケーキ様の外見をもつ乾燥製品を得た。
【０１８５】
最後に、凍結乾燥によるタンパク質安定性を、予め凍結乾燥させた製剤（系が平衡に達することができるように、２４時間ＲＴにて貯蔵した）の、および０．３ｍＬの水で再構成した凍結乾燥させた製品のＳＥＣプロフィールを比較することによって検証した。図１３は、製剤凍結乾燥前（Ａ）および凍結乾燥後（Ｂ）のクロマトグラムが互いに反映することを示す。
【０１８６】
中毒学的／臨床的研究
バイアル当たりの各成分の量（中毒学的／臨床的研究のために使用される最終投薬量に従って）を表７に収載してある。
【０１８７】
【表７】
2015500864.tif 000008
【０１８８】
凍結乾燥物を、中毒学的／臨床的研究などのさらなる研究のために適切な希釈剤（たとえば、水酸化アルミニウムおよび／または生理食塩水溶液）で再構成させる。表８は、１２月までの２−８℃において貯蔵した上記の代表的な黄色ブドウ状球菌凍結乾燥ワクチンロットの主な製品品質属性についての安定性データを報告する。表９および１０は、６月までの促進条件（２３／２７℃６０±５％の相対湿度）および４週までの圧力条件（３８／４２℃）下でのデータを報告する 。
【０１８９】
【表８】
2015500864.tif 000009
【０１９０】
【表９】
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【０１９１】
【表１０】
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【０１９２】
ｐＨモニタリングにより、全ての貯蔵状態下において時間とともに製品の化学的物理安定度およびホスフェートの緩衝能力が維持されたことを確認する。
【０１９３】
残留する水分は、１２月の安定時間の後に２／８℃にて１，４  ％までの増大を示す。増大は、促進条件および圧力条件下でより有意である。しかし、全ての残留する水分値は、なおも米国食品医薬品局および世界保健機関によって承認された３％以下の値である。したがって、選択した凍結乾燥させた製剤の適合性が確立される。
【０１９４】
最後に、逆相クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により、タンパク質Ｓｔａ００６、Ｓｔａ０１１、ＥｓｘＡＢに対する選択性を決定することができる。上記の結果は、選択性が調査した期間以内の全ての貯蔵条件下で安定であることを示す。これは、製剤全体の安定性をモニターするときに、重要なパラメーターである。選択性は、特に３７℃にて、時間とともにわずかに減少することが予想される。各タンパク質について許容されるΔ選択値は、時刻ゼロに関して、±２０％である。表８、９、１０のデータは、ＥＤＴＡ、ｐＨ  ６の存在において、および液体製品に関するスクロースに基づいた凍結乾燥させた製剤との組み合わせにおいて、黄色ブドウ球菌（ｓｔａｐｈ  ａｕｒｅｕｓ）抗原の安定性の改善を示した。加えて、データは、上位３％の許容規準に近い残留する水分値でさえ、凍結乾燥および貯蔵による、製剤適合性およびそのリオプロテクター（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔｏｒ）活性を確認する。
【０１９５】
再構成後の凍結乾燥させたワクチンの短時間安定性研究
表７のワクチンの凍結乾燥物を（１）７ｍｇ／ｍｌのＮａＣｌ中の２ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムまたは（２）生理食塩水（９ｍｇ／ｍｌのＮａＣｌ）の溶液中に再構成して、３６μｇ／用量、１２μｇ／用量および４μｇ／用量の投薬量を得た。再構成したワクチンの特徴は、２つの異なる温度２−８℃および３６−３８℃にて、０、３、８および２４時間の貯蔵にて評価した。評価した特徴は、ｐＨ、重量モル浸透圧濃度および外見であった。また、水酸化アルミニウムで再構成したワクチンについては、吸着の割合および粒径分布も評価した。また、生理食塩水で再構成したワクチンについては、タンパク質選択性（逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣ解析を行うことによる）および凝集体形成（サイズ−除外（ＳＥＣ）−ＨＰＬＣ解析を行うことによる）を評価した。
【０１９６】
ｐＨ
時間にわたるｐＨ傾向は、タンパク質の安定性の指標を提供する。再構成したワクチンのｐＨ値は、内標準手順および欧州薬局方定義に従って決定した。ワクチンについて許容されるｐＨ値は、５．５０  ≦  ｐＨ  ≦  ６．５０の範囲である。
【０１９７】
重量モル浸透圧濃度
ｔ＝０にて再構成したワクチンの重量モル浸透圧濃度値は、内標準手順および欧州薬局方定義に従って決定した。
【０１９８】
外見
本方法は、再構成したワクチンの視覚的点検に基づいている。少なくとも３つの容器を調べた。これらの色および透明度を評価した。内容物を、バイアルの透明な無色の壁を介して、透明度を評価するために黒い背景に対して、および拡散した日光を用いて呈色を明らかにするために白い背景に対して調べた。再構成したワクチンは、それが乳白色の液体に対応し、白い懸濁液で目に見える異物粒子がなかったときに、「適合」と定義した。
【０１９９】
水酸化アルミニウムに対する吸着の割合
この半定量方法は、水酸化アルミニウムに吸着されるタンパク質の割合に対する時間および温度の効果をモニタリングすることができる。解析は、ＳＤＳ−Ｐａｇｅ法を使用して行った。ＨｌａＨ３５Ｌは、完全に吸着されず、およびおよそ１０−２０％の割合にて上清に残ることが以前に示されている。
【０２００】
粒径分布
時間わたる粒径の変化は、不安定性の指標である。粒径分布は、ＡｃｃｕＳｉｚｅｒ  ＡＰＳ機器を使用して評価した。各解析を行う前に、再構成したワクチンの懸濁液を室温（ＲＴ）にて１０分間穏やかに振盪した。
【０２０１】
ＲＰ−ＨＰＬＣによる選択性
逆相クロマトグラフィーにより、タンパク質Ｓｔａ００６、Ｓｔａ０１１、ＥｓｘＡＢに対する選択性の決定することができる。これは、製剤全体の安定性をモニターするときに、重要なパラメーターである。選択性は、特に３７℃にて時間とともにわずかに減少することが予想される。各タンパク質について許容されるΔ選択性値は、時刻ゼロに関して±２０％である。
【０２０２】
選択性パラメーターは、各タンパク質の二量体および単量体形態のピーク面積割合（領域％）を使用することによって決定される。ＨｌａＨ３５Ｌ抗原は、単量体形態においてのみ存在し、およびしたがって、ＨｌａＨ３５Ｌについては決定しなかった。
【０２０３】
選択性％（Ｓｔａ００６およびＳｔａ０１１）＝％領域二量体／（％領域二量体＋  ％領域単量体）×１００
【０２０４】
選択制  ％（ＥｓｘＡＢ）＝％領域単量体／（％領域二量体＋  ％領域単量体）×１００。
【０２０５】
サイズ排除クロマトグラフィー
貯蔵の間の凝集体の形成は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ解析によってモニターした。全ての試料からのクロマトグラムは、両温度（２−８および３６−３８℃）にて３時間まででは重ねることができたが、３６−３８℃にて８時間の貯蔵の後に抗原プロフィールのわずかな変化が観察された。
【０２０６】
結果
１）水酸化アルミニウムでの再構成
ｐＨ−全ての再構成した試料において、両温度（２−８℃および３６−３８℃）および全ての時点（再構成の０、３、８および２４時間後）にて、ｐＨ値は、許容限界（ｐＨ  ５．５０−６．５０）内であった。しかし、特に３６−３８℃にて、時間とともにｐＨを増加させる傾向があった。
【０２０７】
重量モル浸透圧濃度−時間ゼロにて測定した全てのサンプルにおける重量モル浸透圧濃度は、約０．２−０．３ｏｓｍ／ｋｇであった。
【０２０８】
外見−全ての試験試料は、適合した外見を示した。
【０２０９】
吸着−類似の傾向が、時間とともに各温度について観察された。２−８℃にて、非吸着ＨｌａＨ３５Ｌの量は、時間とともに安定なままであり；３６−３８℃にて、２．５倍の非吸着タンパク質の増加が時刻ゼロに関して２４時間にて観察される傾向。しかし、吸着される抗原の量は、７０％よりも高いままである。Ｓｔａ００６、Ｓｔａ０１１およびＥｓｘＡＢ抗原のアジュバントに対する吸着は、常に９０％より高かった（すなわち、９９−１００％）。
【０２１０】
粒径分布−粒径解析では、平均直径が、各投薬量について、調査した時間間隔にわたって（再構成後２４時間まで）安定であることを示した。
【０２１１】
上記した結果に基づいて、水酸化アルミニウムで再構成した黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）凍結乾燥させたワクチンが、試験した両温度（２−８℃および３６−３８℃）にて２４時間まで臨床的使用に適したままであると、本発明者らは、結論した。
【０２１２】
２）生理食塩水での再構成
ｐＨ−生理食塩水溶液で再構成した全ての試料において、ｐＨ値は、２−８および３６−３８℃の両方の貯蔵により、調査した時間間隔にわたって（再構成後２４時間まで）一定かつ設定限界（ｐＨ  ５．２０−６．２０）の範囲内のままだったで。
【０２１３】
重量モル浸透圧濃度−全ての試料において、時刻ゼロにて測定した重量モル浸透圧濃度は、約０．２−０．３ｏｓｍ／ｋｇであった。
【０２１４】
外見−全ての試料は、適合した外見を有した。
【０２１５】
ＲＰ−ＨＰＬＣ−逆相プロフィールは、２−８℃にて選択性が調査した時間間隔において一定であったが、３６−３８℃にて、Ｓｔａ００６およびＥｓｘＡＢについてわずかな減少が観察され、これが２４時間にてより明らかになったことを示した。この減少は、調査した時間間隔にわたって１０％未満のままであった。
【０２１６】
ＳＥＣ−ＨＰＬＣ−全ての試料からのクロマトグラムは、両温度（２−８および３６−３８℃）にて３時間まで重ねることができたが、３６−３８℃にて８時間の貯蔵後は、抗原プロフィールのわずかな変化が観察された。
【０２１７】
これらの結果に基づいて、生理食塩水溶液で再構成した黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）凍結乾燥させたワクチンが、試験した両温度（２−８℃および３６−３８℃）にて２４時間までヒト使用に適したままであると、本発明者らは、結論した。
【０２１８】
マウスにおける免疫原性研究
免疫原性およびｐＨ  ６およびｐＨ  ７．２にて凍結乾燥前の製剤での四価のワクチンの予防効果を調査した。両ワクチン製剤は、７ｍｇ／ｍｌのＮａＣｌ中の２ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムの溶液中で凍結乾燥して、再構成した。ｐＨ  ６．０での凍結乾燥前製剤は、１０ｍＭ  ｐＨ  ６．０リン酸カリウム緩衝液、１０ｍＭ  ｐＨ  ６．０リン酸カリウム緩衝液中に調製した１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ｐＨ  ６．０リン 酸カリウム緩衝液中に調製した３５％のスクロースおよび５０μｇタンパク質／ｍｌの各抗原（ＨｌａＨ３５Ｌ、ＥｓｘＡＢ、Ｓｔａ００６およびＳｔａ０１１）を混合することによって調製した。ｐＨ  ７．２での凍結乾燥前製剤は、１０ｍＭ  ｐＨ  ７．２リン酸カリウム緩衝液を使用したことを除き、上記と同じ方法で調製した。
【０２１９】
ＣＤ１マウスを２週間隔で腹腔内投与を介して２回免疫して、各マウスは２００μｌの製剤を受けた。対照は、生理食塩水プラスアジュバント（２ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウム）の同一のクールを受けた。２回目の免疫化後、抗体価を、９日に抜き取ったマウスの血清におけるルミネックスアッセイによって決定した。統計解析は、マンホイットニーのＵ検定によって行った。
【０２２０】
免疫した動物には、黄色ブドウ球菌（Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ）の細菌懸濁液の腹注によって２４日目に曝露した。黄色ブドウ球菌（Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ）の培養を遠心分離して、２回洗浄して、暴露前にＰＢＳに希釈した。マウスには、およそ２−５＊１０８  ＣＦＵの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を感染させた。生存割合をフィッシャー直接確率法によって解析した。マウスは、ノバルティス動物福祉方針に一致して、毎日モニターして、人道的な指標に従って安楽死させた。
【０２２１】
図１２−１５は、免疫化後のマウスの抗体価を報告する。各抗原についての抗体価は、ｐＨ  ６．０およびｐＨ  ７．２での凍結乾燥前製剤において調製した２つのワクチン間で有意に相違しなかった。
【０２２２】
図１６は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ）曝露後の免疫されたマウスの生存割合を報告する。予防効果は、ｐＨ  ６．０およびｐＨ  ７．２での凍結乾燥前形成において調製したワクチン間で著しく相違しなかった。
【０２２３】
したがって、凍結乾燥前緩衝液をｐＨ  ７．２−ｐＨ  ６．０に変えることは、免疫化組成物の予防効果を有意に変化させなかった。
【０２２４】
本発明は、例のみによって上記してあり、本発明の範囲および趣旨範囲内のままで変更を行ってもよいことが理解されるであろう。
【０２２５】
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［３９］  Ｇｅｎｎａｒｏ  （２０００）  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ．  ２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ＩＳＢＮ：  ０６８３３０６４７２。
［４０］  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  （Ｓ．  Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｎ．  Ｋａｐｌａｎ，  ｅｄｓ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）
［４１］  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｓ．  Ｉ−ＩＶ  （Ｄ．Ｍ．  Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，  ｅｄｓ，  １９８６，  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）
［４２］  Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（２００１）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）。
［４３］  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （Ｂｉｒｄｉ，  Ｋ．Ｓ．  ｅｄ．，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９７）
［４４］  Ａｕｓｕｂｅｌら、（ｅｄｓ）  （２００２）  Ｓｈｏｒｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）。
［４５］  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：  Ａｎ  Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ，  （Ｒｅａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  １９９８，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）
［４６］  ＰＣＲ  （Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｓｅｒｉｅｓ），  ２ｎｄ  ｅｄ．  （Ｎｅｗｔｏｎ  ＆  Ｇｒａｈａｍ  ｅｄｓ．，  １９９７，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ）
［４７］  Ｇｅｙｓｅｎら、（１９８４）  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８１：３９９８−４００２。
［４８］  Ｃａｒｔｅｒ  （１９９４）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ３６：２０７−２３。
［４９］  Ｊａｍｅｓｏｎ，  ＢＡら、１９８８，  ＣＡＢＩＯＳ  ４（１）：１８１−１８６。
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［５１］  Ｂｕｂｌｉｌら、（２００７）  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ６８（１）：２９４−３０４。
［５２］  Ｄｅ  Ｌａｌｌａら、（１９９９）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６３：１７２５−２９。
［５３］  Ｋｗｏｋら、（２００１）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ２２：５８３−８８。
［５４］  Ｂｒｕｓｉｃら、（１９９８）  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ１４（２）：１２１−３０
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［５６］  Ｒｏｂｅｒｔｓら、（１９９６）  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ１２（７）：５９３−６１０。
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［５８］  Ｆｅｌｌｅｒ＆  ｄｅ  ｌａ  Ｃｒｕｚ  （１９９１）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４９（６３１１）：７２０−１。
［５９］  Ｈｏｐｐ  （１９９３）  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：１８３−１９０。
［６０］  Ｗｅｌｌｉｎｇら、（１９８５）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  １８８：２１５−２１８。
［６１］  Ｄａｖｅｎｐｏｒｔら、（１９９５）  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４２：３９２−２９７。
［６２］  Ｔｓｕｒｕｉ  ＆  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  （２００７）  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ．  １０５（４）：２９９−３１６。
［６３］  Ｔｏｎｇら、（２００７）  Ｂｒｉｅｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．  ８（２）：９６−１０８。
［６４］  Ｓｃｈｉｒｌｅら、（２００１）  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２５７（１−２）：１−１６。
［６５］  Ｃｈｅｎら、（２００７）  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ３３（３）：４２３−８。
［６６］  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｆ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌら編ｅ、１９８７）  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３０
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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