(57)【要約】本発明者らは、天然の細胞標的の代わりに所望の細胞標的へ転向させるように改変された炭疸毒素のようなタンパク質毒素を用いた標的細胞治療の新規のシステムを記載した。本システムは、例えば、癌細胞または過度に活性の免疫系細胞のような、細胞集団内の望ましくない細胞を標的として死滅させるために使用され得る。2015509501.tif 000022
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞に特異的な非毒素関連受容体結合リガンドと融合した受容体破壊孔形成性AB毒素単位を含む融合タンパク質、および
標的細胞のサイトゾルへの治療用タンパク質の送達のための、孔形成性毒素単位と会合することができる相補的な毒素単位
を含む、標的細胞への活性分子の送達のための改変型バイナリー毒素システム。
【請求項２】
受容体破壊孔形成性単位が炭疽毒素防御抗原（PA）である、請求項1記載の改変型バイナリー毒素システム。
【請求項３】
PAがPAN682AD683Aである、請求項2記載の改変型バイナリー毒素システム。
【請求項４】
非毒素関連特異的標的受容体結合リガンドが、上皮増殖因子1または上皮増殖因子2である、請求項1〜3のいずれか一項記載の改変型バイナリー毒素システム。
【請求項５】
相補的な毒素単位が炭疽毒素致死因子（LF）である、請求項1〜4のいずれか一項記載の改変型バイナリー毒素システム。
【請求項６】
相補的な毒素単位が炭疽毒素致死因子のアミノ末端部分（LFN）である、請求項1〜5のいずれか一項記載の改変型バイナリー毒素システム。
【請求項７】
治療用タンパク質が、ジフテリア毒素の触媒ドメイン（DTA）、リシン、志賀毒素、またはシュードモナス外毒素Aである、請求項1〜6のいずれか一項記載の改変型バイナリー毒素システム。
【請求項８】
AB毒素が、ボツリヌス（botulinum）神経毒、炭疸毒素、ジフテリア毒素、リシン、志賀毒素、志賀様毒素、外毒素A、またはコレラ毒素である、請求項1〜7のいずれか一項記載の改変型バイナリー毒素システム。
【請求項９】
バイナリー毒素が、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）毒素α、β、ε、もしくはι；ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）C2毒素；またはクロストリジウム・スピロフォルム（Clostridium spiroforme）ι様毒素である、請求項8記載の改変型バイナリー毒素システム。
【請求項１０】
受容体結合リガンドが、上皮増殖因子受容体HERl、HER2、HER3、もしくはHER4；血管内皮増殖因子受容体VEGFR-1、VEGFR-2、もしくはVEGFR-3；インスリン様増殖因子1受容体；繊維芽細胞増殖因子受容体；トロンボスポンジン1受容体；エストロゲン受容体；ウロキナーゼ受容体；プロゲステロン受容体；テストステロン受容体；癌胎児性抗原；前立腺特異抗原；ファルネソイドX受容体；トランスフォーミング増殖因子受容体；トランスフェリン受容体；肝細胞増殖因子受容体；または血管作動性腸管ポリペプチド受容体1および2から選択される受容体と結合する、請求項1〜9のいずれか一項記載の改変型バイナリー毒素システム。
【請求項１１】
受容体結合リガンドが、抗体またはアフィボディから選択される、請求項1〜10のいずれか一項記載の改変型バイナリー毒素システム。
【請求項１２】
アフィボディがHER2アフィボディである、請求項11記載の改変型バイナリー毒素システム。
【請求項１３】
HER2アフィボディがZHER2である、請求項12記載の改変型バイナリー毒素システム。
【請求項１４】
治療用タンパク質が、志賀毒素の細胞毒性ドメイン、志賀様毒素1および2、リシン、リシン毒素A鎖、アブリン、ゲロニン、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリン、トリコサンチン、ペプシン（pepcin）、トウモロコシRIP、αサルシン、ウェルシュ菌ε毒素、ボツリヌス（Botulinum）神経毒、ブドウ球菌（Staphylococcus）エンテロトキシン、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）毒素、百日咳毒素、またはシュードモナス外毒素である、請求項1〜13のいずれか一項記載の改変型バイナリー毒素システム。
【請求項１５】
請求項1〜14のいずれか一項記載の改変型バイナリー毒素システムを含む、真核細胞へ生理活性分子を送達するためのキット。
【請求項１６】
請求項1〜14のいずれか一項記載の改変型バイナリー毒素システムを、癌を有すると診断された対象へ投与する工程を含む、癌を処置する方法。
【請求項１７】
改変型バイナリー毒素システムが、受容体転向型（receptor-redirected）炭疽防御抗原を含む、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
癌がHER2陽性癌であり、炭疽防御抗原がHER2結合リガンドと融合している、請求項16〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
HER2結合リガンドが、抗体またはアフィボディである、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
癌の処置のための、請求項1〜14のいずれか一項記載のバイナリー毒素システムの使用。
【請求項２１】
癌の処置のための受容体転向型炭疽防御抗原の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2012年2月23日に出願された米国仮出願第61/602,218号に基づく35U.S.C.§119（e）の下での恩典を主張するものであり、その内容は、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
政府の支援
本発明は、National Institutes of Healthによって授与されたAI022021の下で政府の支援を受けて作成された。政府は本発明において一定の権利を有している。
【０００３】
配列表
本願は、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる、EFS-Webを介してASCIIフォーマットで提出された配列表を含有している。2013年2月21日に作出された該ASCIIコピーは、002806-073301-PCT_SL.txtと命名されており、17,750バイトのサイズを有する。
【０００４】
分野
本発明は、分子遺伝学および分子生物学に関する。より具体的には、本態様は、標的とされた細胞受容体と結合し、孔を形成し、細胞毒のようなタンパク質分子を標的とされた細胞へ送達するよう、炭疸毒素のようなバイナリー細菌毒素を再構築するための組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００５】
背景
研究者および製薬会社の重要な目標は、新規の分子を、細胞のサイトゾルへ、具体的には、哺乳動物細胞へ導入するため、タンパク質送達媒体を使用する手法を同定することである。治療目的および生物工学的目的のための、生理活性ペプチドおよび生理活性タンパク質の哺乳動物細胞への送達のための方法は多数存在するが、単純な拡散過程によって細胞膜を通過することができない、タンパク質、酵素、または細胞毒のような比較的大きな分子を送達する方法が、未だ、特に必要とされている。
【０００６】
サイトゾルへの治療薬の到達を達成するために使用されている現在のテクノロジーは、大量の試料を必要とし、限定された選択性を有し、細胞内エンドソームから脱出しない傾向があるという点で、限定されている。従って、新規治療薬の効率的な送達は、薬物開発における障害となり続けている。
【発明の概要】
【０００７】
概要
本発明者らは、生理活性分子の細胞への細胞特異的な効率的な送達を提供する。より具体的には、本発明者らは、B成分が、標的細胞上の異種の特異的な細胞受容体に結合し、A成分が、B成分と相互作用して、生物活性分子を、細胞膜を通した転移を介して、標的細胞サイトゾルへ送達するような、バイナリー「AB」毒素を設計した。例えば、炭疸毒素のような活性毒素を、標的とされた癌細胞のサイトゾルへ送達するための手段として、炭疸毒素の輸送タンパク質PAの受容体特異性を改変することができる。細胞が、そのような細胞において有意に濃縮される特異的なマーカーを発現している限り、癌細胞のような任意の細胞を標的とすることができる。本発明のシステムは、選択された細胞集団の改変または根絶を求める研究目的および医学的適用の両方に有用である。例えば、記載されたシステムおよび組成物は、例えば、ヒト対象において、癌細胞の数を低下させるかもしくは癌細胞を根絶するか、または過剰反応性の免疫細胞の数を低下させるため、使用され得る。
【０００８】
本発明は、毒素の触媒部分（A単位またはA成分）を細胞へ能動的に転移させるトランスポータータンパク質（B単位もしくは結合単位またはB成分）を使用する、バイナリー毒素と呼ばれる細菌AB毒素の主要なサブクラスを利用する。A機能を有するタンパク質およびB機能を有するタンパク質は、別々ではあるが、細胞の中毒において相互作用する。バイナリー毒素の例には、炭疸毒素、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）ι毒素、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）C2毒素、およびクロストリジウム・スピロフォルム（Clostridium spiroforme）ι様毒素が含まれる。
【０００９】
本態様において、B単位のネイティブの受容体結合リガンドは、典型的には、破壊されるが、交換はされず、B単位は、標的細胞、例えば、癌細胞または免疫細胞の受容体に特異的に結合するリガンドと融合させられる。従って、B単位は、A単位の細胞質送達に必要とされる決定要因を保持しているが、特異的な細胞のターゲティングを選択することができる。ネイティブA成分は、触媒活性を含有しており、B成分を介して標的細胞サイトゾルへ転移する。
【００１０】
本態様において、A成分も、改変することができ、例えば、細胞毒と融合させることができる。本態様の送達システムを使用して利用され得る、細菌、植物、および動物によって産生される酵素タンパク質毒素のさらなる細胞毒性ドメインには、炭疽毒素、志賀毒素、志賀様毒素1および2、リシン、アブリン、ゲロニン、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリン、トリコサンチン、ペプシン（pepcin）、トウモロコシRIP、αサルシン、ウェルシュ菌ε毒素、ボツリヌス神経毒、ブドウ球菌（Staphylococcus）エンテロトキシン、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）毒素、百日咳毒素、またはシュードモナス外毒素が含まれる。
【００１１】
受容体が、リガンドを細胞内移行させ、転移した成分の適切な折り畳みを容易にする酸性細胞内区画へ運搬するものである限り、多様な特異的な細胞受容体を、本態様の組成物および方法を使用して標的とすることができる。本発明による操作されたバイナリー毒素によって標的とされ得る受容体には、例えば、HERl、HER2、HER3、およびHER4 EGF受容体；血管内皮増殖因子受容体VEGFR-1、VEGFR-2、およびVEGFR-3；インスリン様増殖因子1受容体；繊維芽細胞増殖因子受容体；トロンボスポンジン1受容体；エストロゲン受容体；ウロキナーゼ受容体；プロゲステロン受容体；テストステロン受容体；癌胎児性抗原；前立腺特異抗原；ファルネソイドX受容体；トランスフォーミング増殖因子受容体；トランスフェリン受容体；肝細胞増殖因子受容体；または血管作動性腸管ポリペプチド受容体1および2が含まれる。
【００１２】
改変型バイナリーまたはAB、孔形成性タンパク質毒素を含むさらなる送達システムは、例えば、ウェルシュ菌毒素（α、β、ε、ι）；ボツリヌス菌C2毒素；またはクロストリジウム・スピロフォルムι様毒素から選択され得る。
【００１３】
例えば、炭疸毒素は、A機能およびB機能が別々のタンパク質にあるクラス、いわゆるバイナリー毒素のメンバーである。炭疸毒素は、2種の代替的なAモエティ（moiety）、浮腫因子（EF）および致死因子（LF）の細胞質への送達のため、Bモエティ、防御抗原（PA）によって形成されるホモポリマー孔構造を使用する。本態様の受容体標的型PAバリアントは、毒性ネイティブAモエティ（EFおよびLF）を含む、非毒性および毒性の多様な治療用タンパク質を、選ばれた細胞のクラスに送達することができる。例えば、治療用タンパク質は、炭疸毒素の致死因子のN末端部分（LFN）に融合させられ、PAバリアントによる標的細胞サイトゾルへの転移の間にアンフォールドされる。本態様に従って使用するための、LFNと融合させられ得る例示的な毒素には、ジフテリア毒素の触媒ドメイン（DTA）、志賀毒素の触媒ドメイン、およびシュードモナス外毒素Aの触媒ドメインが含まれる。本態様に従って使用するための、LFNと融合させられ得るいくつかの非毒性タンパク質には、βラクタマーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）、および繊毛神経栄養因子が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】C末端にEGF（PDB＃1JL9）が連結されているPA63（PDB＃1TZO）によって形成された七量体プレポアの合成図を示す。PA63の単一サブユニット内のドメイン1、2、3、および4を含む軸方向像。破線は、EGFのN末端をPA63のC末端へ接続している8アミノ酸リンカー（SPGHKTQP）（SEQ ID NO:1）を表す。
【図２】精製されたmPA-EGFの特徴決定を示す。（2A）抗PA抗体および抗EGF抗体を用いたウエスタンブロット分析は、精製された融合タンパク質にPAタンパク質およびEGFタンパク質の両方が存在することを証明する。（2B）異なるpH値における、SDSによって解離可能なプレポア状態（黒矢印）からSDS抵抗性の孔状態（矢印）へのPA63オリゴマーの変換。ネイティブ型（83）およびタンパク質分解によって活性化された型（[63]7）のWT PA、mPA、およびmPA-EGFの試料（5μg）を、SDS-PAGEによって分離し、クーマシーブルー染色によって可視化した。
【図３】mPA-EGFの受容体特異的な細胞ターゲティングを証明する細胞毒性アッセイを反映する。（3A）A431細胞またはCHOK1細胞（3.5×104個）を、10nM PAまたはPAバリアント＋示された濃度のLFN-DTAと共にインキュベートした。4時間（A431細胞）または一晩（CHOK1）のインキュベーションの後、培地を、1ml当たり1μCiの3H-ロイシンを含有している培地と交換した。1時間のインキュベーションの後、取り込まれた3H-ロイシンをシンチレーション計数によって決定した。（3B、3C）パネル3Aについて記載されたのと同様にアッセイを実施したが、可溶性のEGF（500nM）またはANTRX2のPA結合VWAドメイン（ANTRX2；100nM）が、A431細胞との4時間のインキュベーション（パネルB）またはCHOK1細胞との一晩のインキュベーション（パネルC）の期間に存在した。曲線上の各点は、3回の実験の平均値を表す。
【図４】mPA-EGFが、受容体を保持する細胞へ、LFおよびEFを輸送することを証明する。（4A）A431細胞（1×106個）を、3時間、100nM LF＋10nM PAまたはPAバリアントによって処理した。細胞溶解物を調製し、SDS-PAGEによって分画し、PVDF膜に転写し、抗MEK1抗体を用いたウエスタンブロットによってMEK1切断を評価した。対照として、GAPDHを抗GAPDH抗体によってモニタリングした。（4B）A431細胞（3.5×104個）を、1時間、50nM EF＋10nM PAまたはPAバリアントに曝した。製造業者のプロトコル（Cell Signaling Technology）に従って、標準曲線に基づき、cAMPの細胞内濃度を検出するため、競合酵素連結イムノアッセイを実施した。「対照」と名付けられたカラムは、PAの非存在下でEFによって処理されたA431細胞に相当する。各バーは、四つ組で実施された実験の平均値を表す。
【図５】mPA-DTRの特徴決定を示す。図5Aは、精製されたmPA-DTR融合体にPAおよびDTRの両方が存在することを証明する、抗PA抗体および抗DTR抗体を用いたウエスタンブロット分析を示す。図5Bにおいては、CHOK1細胞（3.5×104個）を、過剰の可溶性DTRの存在下または非存在下で、WT PAまたはmPA-DTRの存在下で、ある範囲の濃度のLFN-DTAに一晩曝した。タンパク質合成を、3H-ロイシン取り込みによって決定した。曲線上の各点は、3回の実験の平均値に相当する。
【図６】mPA-ZHER2の受容体特異的なターゲティングを確認する細胞毒性アッセイのデータを提示する。HER2受容体陽性細胞株（SKBR-3、A431、およびMCF-7）ならびに陰性細胞株（CHOK1、HeLA、およびMDA-MB-468）（3.5×104細胞）を、ある範囲のLFN-DTA濃度＋一定濃度（20nM）のキメラmPA-ZHER2融合タンパク質に曝した。4時間のインキュベーションの後、培地を、1mL当たり1μCiの3H-ロイシンを含有している培地に交換した。1時間のインキュベーションの後、放射標識ロイシンの量をシンチレーション計数によって決定した。曲線上の各点は、4回の実験の平均値に相当する。
【図７】mPA-ZHER2＋LFN-DTAによる細胞株のHER2依存性の死滅を示す。図7Aにおいて、細胞を、4時間、一定濃度のmPA-ZHER2（20nM）＋様々な濃度のLFN-DTAと共にインキュベートし、次いで、1時間、[3H]-ロイシンを含有している培地と共にインキュベートした。タンパク質合成を、シンチレーション計数によって測定し、mPA-ZHER2単独によって処理された細胞に対して標準化した。図7Bにおいては、HER2受容体レベルを、FITC標識抗HER2アフィボディを用いたフローサイトメトリーによって決定した。平均蛍光強度を、FloJoソフトウェアパッケージを使用して計算し、[LFN-DTA]についてのlogEC50に対してプロットした。図7Cにおいては、細胞を図7Aと同一の条件に曝した。48時間後、細胞生存率を、XTT細胞毒性アッセイによって測定し、mPA-ZHER2単独によって処理された細胞に対して標準化した。図7Dにおいては、mPA-ZHER2単独（マイナス記号「-」；白バー）またはmPA-ZHER2＋10nM LFN-DTA（プラス記号「＋」；黒バー）のいずれかに細胞を24時間曝し、カスパーゼ3/7活性化を測定した後、アポトーシスを査定した。発光基質のカスパーゼ3/7による切断によって生成された、相対光単位（RLU）に相当する値を、用量応答曲線から抽出した。全てのパネルにおいて、HER2受容体のレベルが高い細胞株、中程度である細胞株、低い細胞株、検出不可能である細胞株が、それぞれ、黒四角、黒丸および白丸、黒三角、ならびに黒菱形および白菱形で示されている。グラフ上の各点は、4回の実験の平均値を表す。
【図８】mPA-ZHER2依存性死滅についての高親和性ZHER2アフィボディおよび低親和性ZHER2アフィボディによる競合を示す。細胞を、増加する量の高親和性HER2アフィボディ（ZHER2:342、図8A）またはより低い親和性のHER2アフィボディ（ZHER2:4、図8B）の存在下で、致死用量のmPA-ZHER2およびLFN-DTAに4時間曝し、図7に記載されるように、[3H]-ロイシン取り込みを測定しグラフ化した。HER2高発現細胞株、中発現細胞株、低発現細胞株が、それぞれ、四角、丸、および三角で示される。曲線上の各点は、4回の実験の平均値を表す。
【図９】mPA-ZHER2およびmPA-EGFによって差し向けられた、LFN-RTAによる細胞株の死滅を示す。細胞を、示された濃度のLFN-RTAと組み合わせられたmPA-ZHER2（図9A）またはmPA-EGF（図9B）に4時間曝し、タンパク質合成のレベルをシンチレーション計数によって測定した。高レベル、中レベル、低レベル、または検出不可能なレベルのHER2（表皮増殖因子2）またはEGFR（表皮増殖因子1もしくはHER1）を発現する細胞が、それぞれ、図9Aにおいて四角、丸、三角、および菱形で；図9Bにおいて、四角、丸、三角、および菱形で示される。
【図１０】mPA-ZHER2＋LFN-DTAまたはLFN-RTAによるHER2陽性トラスツズマブ抵抗性腫瘍細胞株の死滅を示す。図10Aにおいては、JIMT-1腫瘍細胞株を、増加する量のLFN-DTA（丸）またはLFN-RTA（四角）と組み合わせられたmPA-ZHER2と共に4時間インキュベートし、[3H]-ロイシン取り込みに対する効果を、図7に記載されたのと同様に測定した。図10Bにおいては、FITCとコンジュゲートしたHER2アフィボディを使用したFACS分析が、JIMT-1細胞の表面上のHER2の発現を確認する。未染色の細胞（ヒストグラムの左側の点線ピーク）と比較して、蛍光のシフト（ヒストグラムの右側の実線ピーク）を示す、ヒストグラム（右パネル）に提示された生データから、FlowJoソフトウェアパッケージを使用して、平均蛍光を計算し、GRAPHPAD PRISM（登録商標）ソフトウェアパッケージでプロットした（左パネル）。図10Cにおいては、JIMT-1細胞を図10Aと同一の条件に曝した。48時間後または72時間後に、細胞生存率をXTTアッセイによって測定し、mPA-ZHER2単独によって処理された対照細胞に対して標準化された細胞生存率（％）としてプロットした。図10Dにおいては、20nM mPA-ZHER2および示された濃度のLFN-DTAへの24時間および48時間の曝露の後、アポトーシスの指標であるカスパーゼ3/7活性化を測定した。プレ発光カスパーゼ3/7基質の切断によって、RLUが生成され、それをLFN-DTA濃度に対してプロットした。mPA-ZHER2単独によって処理された対照細胞をXで示す。
【図１１】mPA-ZHER2が不均一集団内のHER2陽性細胞の特異的な死滅を媒介することを示す。mPA-ZHER2およびLFN-DTA（A431CFPおよびSKBR3RFP）の作用に対して感受性であることが示された蛍光細胞を、抵抗性細胞（CHO-K1およびMDA-MB-468GFP）と等しく混合し、mPA-ZHER2＋LFN-DTAまたはmPA＋LFN-DTA（対照；実験が全て同時に実施されたため、対照FACSデータは、図7Cおよび8Aのものと同一である）と共にインキュベートした。24時間後、細胞をトリプシンによって剥離し、FACSによって定量化するか、またはPBSで洗浄し、蛍光顕微鏡によって画像化した（顕微鏡スライドFACSカラー写真は含まれない）。各バーは、三連で実施された実験の平均値を表す。対照が図11Aに示され、転向型（re-directed）融合毒素への曝露が図11Bに示される。
【図１２】不均一細胞集団におけるmPA-ZHER2によって媒介された死滅を示す。腫瘍細胞を、チャンバースライド（右パネル）の別々の区画に蒔き、37℃でインキュベートした。翌日、チャンバーを除去し、スライドをmPA-ZHER2＋LFN-DTAと共にインキュベートした。4時間後、細胞を[3H]-ロイシンが補足された培地と共に1時間インキュベートし、6M塩酸グアニジンに溶解させ、取り込まれた放射標識をシンチレーション計数によって定量化した。タンパク質合成（％）を、mPA＋LFN-DTAによって処理された細胞に対して標準化した。
【図１３】mPA-EGFが不均一集団内のEGF発現細胞を特異的に死滅させることを示す。図13Aにおいては、細胞を、20nM mPA-EGFおよび示された濃度のLFN-DTAに4時間曝し、上記実験と同様にして、タンパク質合成を測定した。タンパク質合成（％）を、mPA-EGF単独によって処理された細胞に対して標準化した。多量のEGFRを発現する細胞株は、MDA-MB-468、A431、およびMDA-MB-231であり；少量のEGFRを発現する細胞株は、BT-474であり；EGFRを実質的に発現しない細胞は、SKBR-3およびCHO-K1である。曲線上の各点は、4回の実験の平均値を表す。図13Bにおいては、蛍光細胞の集団を混合し、致死用量のmPA-EGFおよびLFN-DTAまたは対照としてのmPA＋LFN-DTAに曝した；実験が全て同時に実施されたため、対照FACSデータは、図11Aおよび14Aのものと同一である。24時間後、細胞をPBSで洗浄し、蛍光顕微鏡によって画像化するか、またはトリプシンによって剥離し、FACSによって定量化した（図13B）。各バーは、三連で実施された実験の平均値を表す。図13Cにおいては、癌細胞株のパネルを、チャンバースライドに一晩蒔いた。翌日、チャンバーを除去し、細胞を図Bに記載されたのと同一の処理に曝した。4時間の中毒の後、細胞を加工し、図13Aに記載されるようにして、タンパク質合成を定量化した。
【図１４】転向型mPAバリアントが、不均一な腫瘍細胞集団を排除するため、共に作用することを示す。図14A（対照）および14B（転向型融合毒素に曝された細胞）において、様々な蛍光細胞を等しい数で混合し、LFN-DTA＋mPA-ZHER2とmPA-EGFとの等モル混合物に曝した。LFN-DTA＋mPAを、対照として使用した（実験が全て同時に実施されたため、対照FACSデータは、図11Aおよび13Cのものと同一である）。24時間後、細胞集団をトリプシンによって剥離し、FACSによって定量化するか（図14Aおよび14B）、またはPBSで洗浄し、蛍光顕微鏡によって画像化した（示されないデータ）。各バーは、SKBR3細胞（赤）、A431細胞（シアン）、MDA-MB-468細胞（緑）、およびCHO-K1細胞（未標識）を使用して、三連で実施された実験の平均値を表す。図14Cにおいては、癌細胞株のより大きなパネルを、チャンバースライドの別々の区画に一晩蒔いた。翌日、仕切りを除去し、細胞を上記と同一の処理に曝した。4時間の中毒の後、細胞を[3H]-ロイシンが補足された培地と共に1時間インキュベートし、タンパク質合成をシンチレーション計数によって定量化した。タンパク質合成（％）を、mPAおよびLFN-DTAによって処理された細胞に対して標準化した。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
詳細な説明
本発明は、本明細書に記載された特定の方法論、プロトコル、および試薬等に限定されず、従って、変動し得ることが理解されるべきである。本明細書において使用される用語法は、特定の態様を記載するためのものに過ぎず、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定するものではない。
【００１６】
本明細書および特許請求の範囲において使用されるように、文脈がそうでないことを明白に示さない限り、単数形は、複数の指示対象を含み、逆もまた同様である。「または」という用語は、例えば「いずれか」によって修飾されない限り、包括的である。実施例、またはそうでないことが示された箇所を除き、本明細書において使用される成分の量または反応条件を表す数字は、全て、「約」という用語によって必ず修飾されるものとして理解されるべきである。
【００１７】
同定された全ての特許およびその他の刊行物は、例えば、本発明に関して使用され得る、そのような刊行物に記載された方法論を記載し開示する目的のため、参照によって明示的に本明細書に組み入れられる。これらの刊行物は、本願の出願日より前のそれらの開示のためにのみ提供される。この点に関して、先行発明のためまたはその他の理由のため、本発明者らがそのような開示に先行している資格を有しないことの承認として解釈されるべきものは存在しない。これらの文書の日付に関する陳述または内容に関する表現は、全て、本出願人らが入手可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確さに関しての承認を構成するものではない。
【００１８】
他に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語は、全て、本発明が関係する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同一の意味を有する。任意の公知の方法、装置、および材料が、本発明の実施または試行において使用され得るが、これに関する方法、装置、および材料が、本明細書に記載される。
【００１９】
多くの病原性細菌が、強力な酵素を哺乳動物細胞のサイトゾルへ効率的に送達するタンパク質機構を進化させてきた。いくつかの感染性細菌は、宿主細胞のサイトゾル区画に到達し、ホメオスタシスを崩壊させるタンパク質毒素を分泌する。AB毒素と呼ばれる細菌毒素の主要なクラスは、いくつかのバイナリー毒素の場合、毒素の触媒部分（A単位）を細胞内へ能動的に転移させることができる、受容体結合ドメイン（B単位または結合単位）を使用する。より具体的には、「A」成分は一般的に「活性」部分であり、「B」成分は一般的に毒素の「結合」部分である。従って、AモエティまたはA成分は、触媒活性を含有しており、BモエティまたはB成分は、Aモエティの標的細胞への細胞質送達に必要とされる決定要因を保有している。これらの送達決定要因には、受容体結合活性が含まれ、必ずではないが、しばしば、Aモエティを転移させる孔の形成のような膜浸透活性が含まれる。AB毒素の例には、炭疸毒素、ボツリヌス神経毒、ジフテリア毒素、志賀毒素、志賀様毒素、外毒素A、およびコレラ毒素が含まれる。これらおよび多様なその他の毒素のA成分およびB成分は周知である。例えば、PCT US2012/20731を参照のこと。これらの毒素をコードする核酸配列およびこれらの毒素のアミノ酸配列も公知である。
【００２０】
例えば、炭疸毒素は、A機能およびB機能が別々のタンパク質にあるクラス、いわゆるバイナリー毒素の一つのメンバーである。A機能を有するタンパク質およびB機能を有するタンパク質は、別々ではあるが、細胞の中毒において相互作用する。炭疸毒素は、2種の代替的なAモエティ、浮腫因子（EF；89kDa）および致死因子（LF；89kDa）の細胞質への送達のため、単一のBモエティ、防御抗原（PA；83kDa）を使用する。
【００２１】
細菌毒素B成分は、一般に、（そのようなことが活性に必要である場合）生理活性モエティが転移の間に正確にアンフォールドする限り、生理活性モエティが、細菌毒素のA成分または代理A成分に付着している時に、生理活性モエティを細胞のサイトゾルへ送達するために使用され得る。炭疽B成分PAに加えて、ウェルシュ菌毒素（α、β、ε、ι）、ボツリヌス菌C2毒素、およびC.スピロフォルムι様毒素のB成分が、本明細書に記載されるシステム、組成物、および方法において使用され得る。
【００２２】
生理活性ペプチドまたは細胞毒性ドメインを、LFの非毒性PA結合ドメイン（LFN）のようなバイナリーシステムのA成分に付着させることができ、このように形成された融合タンパク質は、孔を通って細胞のサイトゾルへ通過する。PCT US2012/20731を参照のこと。細胞毒性ドメインは、志賀毒素、志賀様毒素1および2、リシン、アブリン、ゲロニン、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリン、トリコサンチン、ペプシン（pepcin）、トウモロコシRIP、αサルシン、ウェルシュ菌ε毒素、ボツリヌス神経毒、ブドウ球菌エンテロトキシン、ディフィシル毒素、百日咳毒素、またはシュードモナス外毒素に由来し得る。
【００２３】
バイナリー毒素の作用は、1種または複数種の細胞表面受容体に結合する能力に依る。炭疸毒素は、毒素の防御抗原（PA）モエティが、2種の細胞表面タンパク質ANTXR1およびANTXR2のいずれかに結合し、タンパク質分解的に活性化された時に開始するイベントの連鎖によって作用する。活性化されたPAは、自己会合してオリゴマー孔前駆体を形成し、それが、次に、毒素の酵素モエティに結合し、それらをサイトゾルへ輸送する。より具体的には、PA63プレポアは、3個または4個ものLF分子に結合して複合体を形成し、次いで、それがエンドサイトーシスされる。エンドソームの酸性化によって、防御抗原プレポアは、コンフォメーションの再編成をして膜貫通イオン伝導孔を形成し、その孔が、エンドソームからサイトゾルへ致死因子を輸送する。致死因子のN末端ドメインLFNは、孔に対してナノモルの結合親和性を有し、このドメインは、単独で、化学モエティの転移のために使用され得る。さらに、LFNを模倣する小さな正の電荷を有するペプチドセグメントが、PA孔を通したこれらの分子の転移を補助するために使用されてもよい。これらの模倣体は、少なくとも1個の非天然アミノ酸を含んでいてもよい。PCT US2012/20731を参照のこと。改変された受容体特異性を有するPA融合タンパク質のような操作されたバイナリー毒素B成分は、生物学的研究において有用であり、インビボの選択された細胞集団の撹乱または破壊を含む、実用的な適用を有する。
【００２４】
本発明の態様は、ネイティブの受容体結合機能を破壊する二重変異をPAのドメイン4に保持しており、変異型タンパク質のC末端に上皮増殖因子（EGF）が融合している、遺伝学的に改変されたPAを提供する。得られた融合タンパク質は、EGF受容体を発現している細胞株（A431細胞）へ酵素エフェクタータンパク質を輸送したが、この受容体を欠く株（CHO-K1細胞）へは輸送しなかった。過剰の遊離EGFの添加は、融合タンパク質を介したA431細胞へのエフェクタータンパク質の輸送を阻止したが、ネイティブPAを介した輸送は阻止しなかった。さらに、変異型PAのC末端へのジフテリア毒素受容体結合ドメインの融合は、ジフテリア毒素受容体によるエフェクタータンパク質輸送をチャネリングした。
【００２５】
本発明者らの例に基づき、ネイティブの受容体結合ドメインを破壊し、所望の受容体結合ドメインと融合させるよう、AB毒素のいずれかの受容体結合ドメインを改変することができる。
【００２６】
従って、本発明者らは、標的細胞に特異的な非毒素関連受容体結合リガンドに融合した受容体破壊孔形成性バイナリー毒素単位を含む融合タンパク質と、標的細胞のサイトゾルへの治療用タンパク質の送達のための、孔形成性毒素単位と会合することができる相補的な毒素単位とを含む、標的細胞への活性分子の送達のための改変型バイナリー毒素システムを含むシステムまたは組成物を提供する。
【００２７】
標的とされ得、本発明に従って有用である付加的な細胞受容体には、HER1、HER2、HER3、およびHER4 EGF受容体；血管内皮増殖因子受容体VEGFR-1、VEGFR-2、およびVEGFR-3；インスリン様増殖因子1受容体；繊維芽細胞増殖因子受容体；トロンボスポンジン1受容体；エストロゲン受容体；ウロキナーゼ受容体；プロゲステロン受容体；テストステロン受容体；癌胎児性抗原；前立腺特異抗原；ファルネソイドX受容体；トランスフォーミング増殖因子受容体；トランスフェリン受容体；肝細胞増殖因子受容体；または血管作動性腸管ポリペプチド受容体1および2が含まれる。
【００２８】
ターゲティングモエティは、例えば、受容体のいずれかに特異的に結合するリガンド、抗体、またはアフィボディであり得る。そのようなリガンド、抗体、およびアフィボディは、周知であるか、または当業者に公知のルーチンの方法を使用して作成され得る。
【００２９】
哺乳動物細胞の特定のクラスへの毒性タンパク質のターゲティングは、しばしば、悪性疾患のための新しい処置の開発を目標として、広範囲に研究されている。ターゲティングのための一つのアプローチは、毒素の受容体結合ドメインを、特異的な細胞表面受容体に結合する増殖因子または抗体のような異種タンパク質に交換することを含む。
【００３０】
もう一つのアプローチは、ネイティブの受容体結合機能が崩壊した改変型の毒素に、異種タンパク質を連結させることである。本明細書においては、炭疸毒素の輸送モエティの受容体特異性を異種受容体へ転向させる（redirect）ため、バイナリー毒素に関して、後者のアプローチを使用した。
【００３１】
従って、本発明の全ての態様のいくつかの局面において、標的細胞に特異的な非炭疽毒素関連受容体結合リガンドに融合した受容体破壊孔形成性炭疽毒素単位と、標的細胞のサイトゾルへの治療用タンパク質の送達のための、孔形成性毒素単位と会合することができる相補的な毒素単位とを含む、標的細胞への活性分子の送達のための改変型バイナリー毒素システムを含む、システムまたは組成物。
【００３２】
炭疸毒素（ATx）は、3種の大きなタンパク質：防御抗原（PA、83kDa）、致死因子（LF、90kDa）、および浮腫因子（EF、89kDa）の集合体である。LFおよびEFは、細胞内エフェクタータンパク質（哺乳動物細胞のサイトゾル区画に存在する基質を修飾する酵素）である。LFは、MAPキナーゼファミリーの大部分のメンバーを切断するメタロプロテアーゼであり、EFは、細胞内のcAMPのレベルを上昇させる、カルモジュリンおよびCa2+に依存性のアデニリルシクラーゼである。Leppla,79 PNAS 3162(1982)；Duesbery et al.,280 Science 734(1998)；Vitale et al.,248 Biochem.Biophys.Res.Commn.706(1998)。集合体の第3の成分PAは、エンドソーム膜に孔を形成することができる受容体結合性トランスポーターである。Miller et al.,38 Biochem.10432(1999)；Young & Collier,76 Annu.Rev.Biochem.243(2007)。これらの孔は、EF、LF、またはEFもしくはLFのN末端PA結合ドメインを含有している様々な融合タンパク質の、エンドソーム膜を越えるサイトゾルへの転移を媒介する。Collier,30 Mol.Aspects Med.413(2009)。
【００３３】
細胞レベルにおけるATx作用は、PAが2種の受容体ANTXR1およびANTXR2のいずれかに結合し、フューリンクラスプロテアーゼによって活性化された時に開始される。Scobie,100 PNAS 5170(2003)；Bradley et al.,414 Nature 225(2001)；Klimpel et al.,89 PNAS 10277(1992)。切断は、周囲の媒体へ放出される20kDaの断片PA20と、受容体に結合したままである63kDaの断片PA63とを与える。受容体に結合したPA63は、自発的に自己会合して、nMの親和性でLFおよび／またはEFに結合することができる環状の七量体および八量体のオリゴマー（プレポア）を形成する。Kintzer et al.,392 J.Mol.Biol.614(2009)；Milne et al.,269 J.Biol.Chem.20607(1994)；Mogridge et al.,99 PNAS 7045(2002)；Cunningham et al.,99 PNAS 7049(2002)。得られたヘテロオリゴマー複合体は、エンドサイトーシスされ、エンドソーム区画へ送達され、そこで、酸性pHが、エンドソーム膜に孔を形成することを可能にする大きなコンフォメーション再編成をするようプレポアを誘導する。Young & Collier,2007。これらの孔は、結合したLF分子およびEF分子をアンフォールドし、エンドソーム膜を越えてそれらを輸送するタンパク質トランスロカーゼとして機能する。LF分子およびEF分子は、そこで、リフォールドし、それぞれの細胞内標的を修飾する。
【００３４】
2種の公知のPA受容体ANTXR1（TEM8とも呼ばれる）およびANTXR2（CMG2とも呼ばれる）は、フォン・ヴィルブランド／インテグリンA（VWA）MIDASドメインを含有している1型膜タンパク質である。PA内では、ドメイン4、いわゆる受容体結合ドメイン、および孔形成ドメインであるドメイン2の両方が、受容体のMIDASドメインとの結合に関与する。Lacy et al.,101 PNAS 13147(2004)。ANTXR1およびANTXR2は、PAに対する親和性の違いを有しているが（Scobie et al.,2005；Wigelsworth,279 J.Biol.Chem.23349(2004)）、これらの受容体は、両方とも、活性化されオリゴマー形成することを可能にする様式で、PAに結合する；両受容体は、プレポア:エフェクター複合体のエンドソーム区画への運搬、およびエンドソーム膜を越える転移を媒介する。
【００３５】
本発明の具体的な態様において、ドメイン4の2個の残基を変異させ、次いで、異種の受容体結合タンパク質：ヒト上皮増殖因子（EGF）（図1参照）、HER2アフィボディ（ZHER2）、またはジフテリア毒素の受容体結合ドメイン（DTR）と、変異型タンパク質のC末端を融合させることによって、PAの受容体結合活性を破壊した。得られた融合タンパク質は、エフェクター酵素の進入を媒介し、進入は、EGF、ZHER2、およびDTRのための細胞受容体に依存性であった。
【００３６】
一例において、ネイティブの受容体結合機能を破壊するため、PAのドメイン4内の2個の変異N682AおよびD683Aを、PAへ導入し（Rosovitz et al.,278 J.Biol.Chem.30936(2003)）、変異型タンパク質（mPA）を、大腸菌（E.coli）BL21(DE3)において発現させた。SEQ ID NO:10は、これらの変異体についてのアミノ酸参照配列を提供する。LFN-DTAの存在下でのタンパク質合成の阻害によって測定されるように、精製された産物は、試験された最も高い濃度（10nM）で、LFN-DTAのCHO-K1細胞への進入もA431細胞への進入も促進し得なかった。LFN-DTAは、LFのN末端PA63結合ドメインLFNと、ジフテリア毒素の触媒ドメインDTAとの間の融合物である。PCT US2012/20731を参照のこと。DTAモエティは、サイトゾル内で真核生物伸長因子2（eEF-2）のADPリボシル化を触媒して、タンパク質合成を阻止し、細胞死を引き起こす。Collier & Cole,164 Science 1179(1969)；Collier,25 J.Mol.Biol.83(1967)。PAのタンパク質分解的に活性化された型、mPA63は、孔に特徴的なSDS抵抗性の高分子量凝集物を形成することができたが、孔形成のpH依存性はいくらか改変された（図2B）。
【００３７】
次いで、受容体結合機能が事実上破壊されたPA N682A/D683A二重変異体（mPA）を、変異型タンパク質のC末端で、ヒトEGFと融合させた。精製されたモノマーmPA-EGFは、安定しており、より高い分子量と一致して、SDSポリアクリルアミドゲル上をネイティブPAよりわずかに遅く泳動した（図2A）。ウエスタンブロットは、産物が、抗PA抗体および抗EGF抗体の両方と反応することを示した。トリプシン処理によって得られたmPA63-EGF断片が、mPA63で見られたものに類似しているSDS-PAGE上の高分子量凝集物を形成することも示された（図2B）。PA63とは、SEQ ID NO:9のアミノ酸197〜764をさす。
【００３８】
完全な炭疽PAアミノ酸配列は、周知であるが、参考のため本明細書に提供される。配列は、太字およびイタリック体で示された29アミノ酸シグナルペプチドを含む：
2015509501.tif 000003
29aaシグナルペプチドを含む炭疽防御抗原；UniProtKB NO.P13423（PAG_BACAN）
【００３９】
下記は、29アミノ酸シグナルペプチドを含まない炭疽PAアミノ酸配列を示す。本明細書全体において変異体の番号付けに関する言及は、シグナルペプチドを含まない配列に関する。下記において、N682A/D683A変異体は太字で示される。
2015509501.tif 000004
【００４０】
高レベルのEGF受容体を発現するA431細胞（Lin et al.,224 Science 843(1984)；Ullrich et al.,309 Nature 418(1984)）は、mPA-EGFの存在下でLFN-DTAによって死滅したが（EC50およそ10pM）、EGF受容体を発現しないCHO-K1細胞は死滅しなかった（図3A）。野生型PAも、A431細胞におけるタンパク質合成の阻害を媒介したが、より高い濃度のLFN-DTA（EC50およそ100pM）が必要とされ、このことから、これらの細胞が低レベルのANTXR1、ANTXR2、または両方を発現していることが示唆された。転移欠損PA変異体PAF427H（Krantz,309 Science 777(2005)）は、A431細胞またはCHO-K1細胞のいずれにおいても死滅を媒介しなかった。
【００４１】
mPA-EGFによって媒介されるA431細胞へのLFN-DTAの進入が、EGF受容体との結合に依存するのであれば、遊離EGFの添加は、結合について競合し、毒性を阻止するであろう。図3Bに示されるように、50倍過剰のEGFは、LFN-DTAの細胞毒性効果から細胞を完全に防御したが、同濃度のANTXR2のPA結合VWAドメインには、効果がなかった。対照的に、A431細胞における野生型PAによって媒介される細胞毒性は、ANTXR2ドメインによって破壊されたが、EGFによっては有意な程度に阻害されなかった（図3C）。
【００４２】
炭疸毒素のネイティブエフェクターモエティLFおよびEFを、A431細胞へ転移させる、mPA-EGFの能力も、例示的なシステムにおいて証明された。LFは、N末端付近での切断によって、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（MEK）を不活化する（Duesbery et al.,1998；Vitale et al.,1998）。LF＋PAまたはそのバリアントと共に細胞をインキュベートした後、抗MEK1抗体を用いた細胞溶解物のウェスタンブロットによって、LF進入を特徴決定した。MEK1は、LFと、PAまたはmPA-EGFとの組み合わせによって完全に切断されたが、転移欠損変異体PA F427Hとの組み合わせによっては切断されなかった（図4A）。サイクリックAMP（cAMP）の細胞内レベルを決定するための酵素連結競合アッセイを使用して、EFの進入を測定したところ、mPA-EGFを転移媒体として用いた時、cAMPの400倍の上昇が観察された（図4B）。このレベルは、WT PAによるものよりおよそ100倍高く、mPAまたはPAF427Hによって観察されたレベルは、バックグラウンド程度であった。mPA-EGFによって観察された強力な上昇は、一部には、A431細胞上のEGFRの高いレベルによるものであった可能性が高い。
【００４３】
PAの以下の変異が、細胞結合を低下させることによって毒性を低下させることが公知であり、従って、PA受容体結合を破壊するため、単独でまたは組み合わせて使用され得る。
2015509501.tif 000005
【００４４】
LFNに加えて、ジフテリア毒素およびコレラ毒素のような細菌毒素の類似体を、治療用タンパク質を送達するために使用することができる。従って、一つの態様において、本発明は、インビボまたはエクスビボのいずれかで、対象の細胞を、治療用モエティに付着した成分Aまたは代理A成分を含む融合分子を含む組成物と接触させることによって、対象を処置する方法を提供する。PCT US2012/20731を参照のこと。
【００４５】
もう一つの例において、ジフテリア毒素の150残基の受容体結合ドメイン（DTR）を、mPAのC末端と融合させた。精製されたmPA-DTR融合物は、抗PA抗体および抗ジフテリア毒素抗体の両方と反応し（図5）、平面二重層系において、オリゴマー形成し、孔を形成し、積荷LFN-DTAに結合しそれを転移させる能力を保持していた。mPA-DTRバリアントは、CHOK1細胞へLFN-DTAを送達してタンパク質合成を阻害し、可溶性DTRは、この阻害を競合的に阻止した（図5）。
【００４６】
さらにもう一つの例において、HER2陽性細胞を特異的に標的とするため、高い親和性でHER2受容体と結合することが公知のアフィボディ（ZHER2；およそ58アミノ酸）を、受容体認識欠損変異型PAのC末端と融合させた。mPA-ZHER2を使用した細胞毒性アッセイは、LFN-DTAが、HER2受容体を発現している細胞のサイトゾルにおいてタンパク質合成を阻害するが、HER陰性細胞は影響されないことを証明した（図6）。初期乳癌患者の20％〜30％においてHER2遺伝子の増幅またはHER2の過剰発現が起こり、HER2受容体を過剰発現している患者は減少した全体生存率を有するため、HER2受容体陽性細胞のPAベースのターゲティングは、現在の戦略によって標的とされ得る癌細胞の重要な例である。
【００４７】
HER2は、EGFRと同一のファミリーに属する受容体チロシンキナーゼである。しかしながら、EGFRと異なり、HER2は公知の天然リガンドを有していない。本研究において、本発明者らは、HER2受容体に特異的な高親和性アフィボディ（ZHER2:342）（Orlova et al.2006）を受容体認識欠損PA（mPA）のC末端と融合させ、融合物mPA-ZHER2を作出することによって、転向型バイナリー毒素を開発した。アフィボディとは、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）プロテインAのZドメインに由来するターゲティングポリペプチドのクラスを表す。他の受容体ターゲティングリガンドより有利であるのは、アフィボディが、小さく（58アミノ酸；およそ6kDa）、pHおよび熱に対して安定であり、Cys残基を欠き、非依存的かつ可逆的に折り畳まれるという事実による（Nord et al.1997；Lofblom et al.2010）。さらに、ファージディスプレイテクノロジーによって、モノクローナル抗体で観察されるものに比較可能な親和性レベルへ、インビトロで急速にそれらを進化させることが可能である。
【００４８】
本発明者らの結果は、ZHER2:342アフィボディのようなHER2ターゲティングモエティが受容体破壊型B単位のC末端と融合している、mPAのような受容体認識破壊型B単位が、2種の殺細胞エフェクタータンパク質のいずれかの作用をHER2陽性腫瘍細胞へ指し向けることができることを示している。HER2陽性トラスツズマブ抵抗性腫瘍細胞株を含むこれらの細胞は、破壊され、培養物が、均一集団からなるか、またはHER2マーカーを欠く細胞と混合されているかに関わらず、特異的な死滅が観察された。実施例において使用されたZHER2:342アフィボディのアミノ酸配列は、以下の通りである：
2015509501.tif 000006
【００４９】
本発明者らは、概念証明を示すため、実施例に記載された具体的なアフィボディを使用したが、その結果を考慮すると、選択の細胞表面タンパク質に特異的に結合する任意のアフィボディまたは抗体を使用することが可能である。
【００５０】
本発明の全ての態様のいくつかの局面において、標的細胞に特異的な細胞非毒素関連受容体結合リガンドには、抗体および／または抗体の抗原結合部分もしくは抗原結合断片が含まれる。
【００５１】
HER2を標的とする例示的な抗体は、治療において使用されている組換えモノクローナル抗体であるトラスツズマブ（HERCEPTIN）である。HER2陽性細胞を標的とし、HER2およびHER3の二量体形成を防止するもう一つのモノクローナル抗体は、ペルツズマブ（2C4とも呼ばれる。商標PERJETA）である。これらの抗体のいずれかを、mPAのような受容体破壊型PA86サブユニットと融合させるために使用することができる。
【００５２】
「抗体」という用語は、免疫グロブリン（例えば、IgG、IgM、IgA、IgE、IgD等）をさす。
【００５３】
各抗体の基本的な機能ユニットは、（1個の免疫グロブリン（「Ig」）単位のみを含有している）免疫グロブリン（Ig）モノマーである。モノクローナル抗体、キメラ抗体、組換え抗体、およびヒト化抗体が、この定義に含まれる。
【００５４】
一つの態様において、本発明の抗体は、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体である。
【００５５】
具体的には、本発明は、抗体分子のイディオタイプを含有している抗体断片（「抗原結合断片」）を企図する。例えば、そのような断片には、Fab領域、F(ab')2断片、pFc'断片、およびFab'断片が含まれるが、これらに限定されない。
【００５６】
「Fab領域」および「抗原結合性断片領域」とは、抗原との結合において機能する免疫グロブリン「Y」の抗体腕部を交換可能にさす。Fab領域は、抗体の重鎖および軽鎖の各々に由来する1個の定常ドメインおよび1個の可変ドメインから構成される。所望の特異性を有するモノクローナルFab断片の迅速で容易な同定を可能にする、Fab発現ライブラリーの構築のための方法は、当技術分野において公知である（Huse et al.,Science,246:1275-1281(1989)）。もう一つの態様において、Fc断片およびFab断片は、2個のFab断片および1個のFc断片へ免疫グロブリンモノマーを切断するため、酵素パパインを使用することによって生成され得る。酵素ペプシン（pepsin）は、ヒンジ領域より下を切断し、従って、「F(ab')2断片」および「pFc'断片」が形成される。F(ab')2断片は、温和な還元によって2個の「Fab'断片」へ分割され得る。
【００５７】
本発明は、「単鎖抗体」断片、即ち、完全抗体の可変領域または相補性決定領域（CDR）のうちの少なくとも1個を有し、抗体の定常ドメインのいくらかまたは全部を欠くアミノ酸配列も企図する。これらの定常ドメインは、抗原結合には必要でないが、完全抗体の構造の主要な部分を構成する。単鎖抗体断片は、完全抗体より小さく、従って、完全抗体より大きな毛細管透過性を有し、そのため、単鎖抗体断片は、より効率的に標的抗原結合部位に集中し、結合することが可能である。また、抗体断片は、原核細胞において比較的大規模に作製され得、そのため、作製が容易である。さらに、単鎖抗体断片は、比較的小さいサイズのため、完全抗体より、レシピエントにおいて免疫応答を誘発する可能性が低い。単鎖抗体の作製のための技術は、公知である（米国特許第4,946,778号）。重鎖および軽鎖の可変領域を共に融合させて「単鎖可変断片」（「scFv断片」）を形成させることができ、それは、Fab断片のサイズの半分のみであるが、親免疫グロブリンの最初の特異性を保持する。
【００５８】
「Fc」および「結晶化可能断片」領域は、免疫細胞の活性をモジュレートする役割において機能する免疫グロブリン「Y」の基部を交換可能に指す。Fc領域は、抗体のクラスに依って、2個または3個の定常ドメインを与える2本の重鎖から構成される。Fc領域は、特異的なタンパク質に結合することによって、各抗体が所定の抗原に対する適切な免疫応答を生じることを確実にする。Fc領域は、Fc受容体のような様々な細胞受容体、および補体タンパク質のようなその他の免疫分子にも結合する。これをすることによって、それは、マスト細胞、好塩基球、および好酸球のオプソニン作用、細胞溶解、および脱顆粒を含む種々の生理学的効果を媒介する。実験的環境においては、Fc断片およびFab断片は、免疫グロブリンモノマーを酵素パパインによって2個のFab断片および1個のFc断片へ切断することによって、実験室において生成され得る。
【００５９】
本発明の全ての態様のいくつかの局面において、標的細胞に特異的な非毒素関連受容体結合リガンドには、アフィボディが含まれる。
【００６０】
「アフィニティボディ」、「Affibody（登録商標）」、および「アフィボディ」分子は、抗体と同様に、標的抗原に特異的に結合することができる抗体模倣タンパク質である（Nord,K.,et al.(1997)Nature Biotechnol.15:772-777）。アフィボディ分子は、アプタマーと同様に設計され使用され得る。一つの態様において、アフィボディ分子は、ブドウ球菌プロテインA（黄色ブドウ球菌によって産生されたプロテインA）のIgG結合ドメインに由来する骨格を含む。骨格は、Bドメインと名付けられたブドウ球菌プロテインAのIgG結合ドメインの3個のαヘリックスを含むIgG結合ドメインに由来し得る。Bドメインのアミノ酸配列は、Uhlen et al,J.Biol.Chem.259:1695-1702(1984)に記載されている。あるいは、骨格は、Nilsson et al.,Protein Eng.1:107-113(1987)に記載されている、Zドメインとして当技術分野において公知の合成IgG結合ドメインの3個のαヘリックスに由来し得る。アフィボディの骨格は、1個または複数個のアミノ酸位置にアミノ酸置換を含むIgG結合ドメインのアミノ酸配列を含む。アフィボディは、例えば、Zドメインの58アミノ酸配列を含む。
【００６１】
2015509501.tif 000007
9位、10位、11位、13位、14位、17位、18位、24位、25位、27位、28位、32位、および35位の各々におけるXは、任意のアミノ酸である（Capalaら、米国特許出願第US20100254899号）。
【００６２】
アフィボディ分子は、特異的な標的結合、およびいくつかの抗体によって示されるFc受容体結合のような無関係の相互作用の欠如のため、関心対象の分子（例えば、毒素、アイソトープ、治療用ペプチド）を、例えば、腫瘍細胞へ差し向けるために高度に適当な担体を構成する。
【００６３】
抗体と比べたAFFIBODY（登録商標）分子の共通の利点は、より高い可溶性、組織浸透、熱および酵素に対する安定性、ならびに比較的低い作製コストである。
【００６４】
抗ErbB2 AFFIBODY（登録商標）（抗HER2 AFFIBODY（登録商標）とも呼ばれる）、抗EGFR AFFIBODY（登録商標）、抗TNFαAFFIBODY（登録商標）、抗フィブリノーゲンAFFIBODY（登録商標）、抗トランスフェリンAFFIBODY（登録商標）、抗HSA AFFIBODY（登録商標）、抗インスリンAFFIBODY（登録商標）、抗IgG AFFIBODY（登録商標）、抗IgM AFFIBODY（登録商標）、抗IgA AFFIBODY（登録商標）、および抗IgE AFFIBODY（登録商標）（例えば、Abceam,Cambridge,MA）が、アフィボディの例であるが、これらに限定されない。
【００６５】
ナノモル未満までの親和性を有するアフィボディが、未感作ライブラリー選択から入手されており、ピコモルの親和性を有するアフィボディが、親和性成熟によって入手されている（Orlova et al.(2006)."Tumor imaging using a picomolar affinity HER2 binding affibody molecule".Cancer Res.66(8):4339-48.PMID 16618759）。弱い求電子剤とコンジュゲートしたアフィボディは、標的と共有結合する（Holm et al.,Electrophilic affibodies forming covalent bonds to protein targets,J Biol Chem.2009 Nov 20;284(47):32906-13.PMID 19759009）。
【００６６】
アフィボディ分子は、化学的にもしくは細菌において合成されてもよいし、または商業的供給元（例えば、Affibody AB,Bromma,Sweden；Abeam,Cambridge,MA）から購入されてもよい。
【００６７】
アフィボディ分子は、参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第5,831,012号に記載されるようなアフィボディのライブラリーを構築することによっても入手され得る。次いで、アフィボディライブラリーは、当技術分野において公知の方法によって、関心対象の標的抗原（例えば、HER-2、EGFR）に結合するアフィボディについてスクリーニングされ得る。
【００６８】
アフィボディ分子は、単独で、または他のタンパク質パートナーとの融合を介して、様々な宿主細胞において可溶性かつタンパク質分解的に安定な型で発現され得る、3ヘリックスバンドルドメインに基づく（Stahl et al.(1997)."The use of gene fusions to protein A and protein G in immunology and biotechnology".Pathol.Biol.(Paris)45:66-76.PMID 9097850）。
【００６９】
アフィボディは、改変を容認し、融合タンパク質へ組み入れられた時に独立に折り畳まれる。同一の特異性のアフィボディ分子のヘッドトゥーテール融合は、標的結合においてアビディティ効果を与えることが判明しており、異なる特異性のアフィボディ分子のヘッドトゥーテール融合は、二特異性または多特異性のアフィニティタンパク質を得ることを可能にする。他のタンパク質との融合物も作出され得る（Ronnmark et al.(2002)"Construction and characterization of affibody-Fc chimeras produced in Escherichia coli,"J.Immunol.Methods 261:199-211.PMID 11861078；Ronnmark et al.(2003)"Affibody-beta-galactosidase immunoconjugates produced as soluble fusion proteins in the Escherichia coli cytosol,"J.Immunol.Methods 281:149-160.PMID 14580889）。部位特異的コンジュゲーションのための部位は、所望の位置への単一のシステインの導入によって容易になる。
【００７０】
多数の異なるアフィボディ分子が、化学合成によって作製されている。システインまたはジスルフィド架橋を含有していないため、保護基が合成後に除去された時、それらは正確な三次元構造へ自発的に可逆的に折り畳まれる（Nord et al.(2001)"Recombinant human factor Vlll-specific affinity ligands selected from phage-displayed combinatorial libraries of protein A,"Eur.J.Biochem.268:1-10.PMID 11488921；Engfeldt et al.(2005)"Chemical synthesis of triple-labeled three-helix bundle binding proteins for specific fluorescent detection of unlabeled protein,"Chem.BioChem.6:1043-1050.PMID 15880677）。
【００７１】
本発明者らは、2種の構造的に異なる酵素LFおよびEFを細胞へ輸送するPAの能力は、それが異種タンパク質を送達し得ることを示唆すると仮定した。LFのPA63結合ドメインへの融合の後、数種のそのようなタンパク質およびペプチドの送達が証明された。Pentelute et al.,5 ACS Chem.Biol.359(2010)；Pentelute et al.,2011；Arora & Leppla,62 Infect.& Immun.4955(1994)；Arora et al.,267 J.Biol.Chem.15542(1992)；Hu & Leppla,4 PLoS ONE 4 e7946(2009a)；Milne et al.,15 Molec.Microbiol.661(1995)。適応性の第二のモードは、腫瘍を標的とする目的のため、PA内のフューリン活性化部位を、他のプロテアーゼに特異的な部位と交換した研究によって例示される。Liu et al.,60 Cancer Res.6061(2000)；Abi-Habib et al.,5 Molec.Cancer Therap.2556(2006)。本研究は、適応性の第三のモード、即ち、PAのタンパク質輸送活性が、異種細胞表面受容体を通して容易にチャネリングされ得ることを証明する。
【００７２】
毒素は極めて特異的な受容体を有するため、新しい標的受容体が、孔形成および細胞への複合体の輸送を可能にし得るか否かは、確かではなかった。しかしながら、本発明者らは、例示的なmPA-EGF融合構築物が、驚くべきことに、LF、EF、およびLFN-DTA融合タンパク質をサイトゾルへ輸送し得ることを示した。このことは、PAの必須のオリゴマー形成および輸送の機能が、代理受容体を通した進入のチャネリングによって妨害されないことを示唆した。調査された代理結合ドメインのうちの一方、DTRは、無関係な毒素において類似の機能を果たすが（Louie et al.,1 Molec.Cell 67(1997)）、他方のEGFは、細菌毒素作用との明白な関係を有していない。両タンパク質は、ANTXR1およびANTXR2と同様に、リガンドを細胞内移行させ、酸性細胞内区画にそれらを運搬する受容体に結合する。（a）酸性の小胞内pHが、PAプレポアの孔への変換を促進するために重大な役割を果たし（Miller et al.,38 Biochem.10432(1999);Collier,2009）；（b）エンドソーム膜を隔てたpH勾配が、タンパク質転移にとって必須であるため（Krantz et al.,2006）、酸性区画への進入は、PA融合タンパク質が適切に機能するために重要である可能性が高い。
【００７３】
上記のことを考慮すると、任意の新規の受容体ターゲティングドメインが、受容体破壊型PA83、例えば、本明細書に記載されるmPAに付加された時、同様に機能するはずであると結論を下すことが可能である。本発明の全ての態様のいくつかの局面において、受容体を標的とするドメインは、受容体破壊型PA83のC末端へ付加される。従って、いくつかの局面において、本発明は、標的細胞に特異的な非毒素関連受容体結合リガンドが受容体破壊型PAのC末端へ付加されている、標的細胞に特異的な非毒素関連受容体結合リガンドに融合したmPAのような、受容体破壊型孔形成性PAを含む融合タンパク質を含む組成物を提供する。組成物は、LFまたはLFのN末端PA結合部分（LFN）を含む融合タンパク質のような、標的細胞のサイトゾルへの治療用タンパク質の送達のための、孔形成性毒素単位と会合することができる相補的な毒素単位をさらに含み得る。
【００７４】
ドメイン4をこれらのリガンドに交換する代わりに、代理受容体リガンドをmPAのC末端へ融合させることに決定したのは、ドメイン4がプレポアを安定化することを示す結果に基づいていた。Katayama et al.,107 PNAS 3453(2010)。孔の膜貫通βバレルステムが形成され得るよう、孔形成性ループが構造の基部へ再配置されることを可能にするために、ドメイン4はドメイン2から離れて旋回しなければならない。PA63の残りの部分と共に脂質ナノディスクおよび脂質小胞へ挿入された炭疸毒素孔の三次元構造は、この旋回を阻害し、プレポアの孔への未成熟の変換を防止する（Katayama H,Wang J,Tama F,Chollet L,Gogol EP,Collier RJ,Fisher MT..Interactions of domain 4,Proc Natl Acad Sci U S A.2010 Feb 23;107(8):3453-7）。従って、変異型におけるドメイン4の保持は、プレポアから孔への変換の過程が妨害される可能性を最小限にしつつ、受容体特異性の改変を可能にした。とはいえ、mPAプレポアは、ネイティブのプレポアと異なり、pH8.5においてある程度の孔への変換をしたため、ドメイン4の受容体結合活性を破壊するために使用された二重変異は、mPA63プレポアの安定性を明らかにわずかに妨害した（図2A）。
【００７５】
標的細胞の受容体特異的なリガンドをB単位と融合させるか、または細胞毒性A単位融合物を作出するため、本明細書において利用された組換えテクノロジーに加えて、単離された成分を入手し、化学的ライゲーションまたはその他のコンジュゲーション技術を使用して、それらをコンジュゲートすることによって、これらの構築物を作製することもできる。例えば、Dawson et al.,Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation,266 Science 776(1994)；Muir et al.,Expressed Protein Ligation:A General Method for Protein Engineering,95 PNAS 6705(1998)；Nilsson et al.,Chemical Synthesis of Proteins,34 Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.91(2005)を参照のこと。
【００７６】
異種の細胞受容体を通したPA依存性タンパク質輸送の転向は、実験科学および医学の両方における適用を有する。Lepplaらは、タンパク質分解活性化部位を変化させることによって、腫瘍細胞へのPAのターゲティングを調査した。LFN-DTAに類似している細胞毒性融合タンパク質であるFP59を、ウロキナーゼまたはマトリックスメタロプロテアーゼが濃縮されている細胞のサイトゾルへ送達するため、PAの改変型が使用された。Abi-Habib et al.,5 Molec.Cancer Therap.2556(2006)；Liu et al.,2000。これらのプロテアーゼと同様に、EGFRも、数種の腫瘍において濃縮されている（Ciardiello & Tortora,358 N.Engl.J.Med.1160(2008)）。従って、mPA-EGFも、ターゲティングの代替手段として機能し得る。癌細胞またはウイルス感染細胞を含む標的細胞において受容体が濃縮されているその他のリガンドも、mPAまたはその他のAB毒素のB成分との融合のための候補となるであろう。
【００７７】
受容体結合モエティ、例えば、アゴニストを、AB毒素の孔形成性部分と融合させることによって、癌の処置のために標的とされ得るその他の受容体の例には、例えば、ある種の乳癌における、エストロゲン受容体、例えば、ある種の前立腺癌における、プロゲステロン受容体、インスリン様増殖因子が含まれる。
【００７８】
本発明者らの例に基づき、非毒性であってもよいし毒性であってもよい多様なタンパク質を、選ばれた細胞のクラスへ送達するための、受容体標的型PAバリアントの使用を想定することができる。しかしながら、LFNとの融合によって、必ずしも全てのタンパク質がPAによって輸送可能にはならない。DTAと同様に、志賀毒素およびシュードモナス外毒素Aの触媒ドメイン、ならびにβラクタマーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）、および繊毛神経栄養因子を含むいくつかの非毒性タンパク質は、LFNと融合した時にPAによって輸送されることが見出されたが（Arora & Leppla,1994；Arora et al.,1992；Hu & Leppla,2009b；Wesche et al.,37 Biochem.15737(1998)）；破傷風毒素軽鎖、ボツリヌス毒素E軽鎖、酸性繊維芽細胞増殖因子、塩基性繊維芽細胞増殖因子、およびHIV Tatタンパク質を含む他のLFN融合物は輸送されなかった。それぞれアデニンおよびメトトレキサートによるLFN-DTAおよびLFN-DHFRのリガンディング（liganding）と同様に、LFN-DTAのDTAモエティへの人工ジスルフィドの導入は、転移を阻止した。Wesche et al.,1998。これらの所見は、タンパク質がPA孔を通って転移するためにはアンフォールドする必要があることと一致しており、従って、酸性条件下でアンフォールドする傾向は、タンパク質が転移させられる能力の主要な決定要因である可能性がある。にも関わらず、ジフテリア毒素およびコレラ毒素のような細菌毒素の類似体は、他の化学エンティティまたはタンパク質治療薬を送達するために使用され得る。
【００７９】
従って、一つの態様において、本発明は、治療剤に付着した成分Aまたは代理A成分を含む融合体分子を含む、対象の標的とされた細胞へ送達されることが意図された治療薬を含む組成物と、インビボまたはエクスビボのいずれかで、対象の細胞を接触させることによって、対象を処置する方法を提供する。
【００８０】
全ての態様のいくつかの局面において、対象は癌を有する。全ての態様のいくつかの局面において、対象は、癌細胞がHER2を発現する癌を有しており、癌患者へ送達される毒素システムは、ターゲティングモエティを他のHER2特異的アフィボディまたはHER2特異的抗体に変化させ得ること以外は、実施例8において例示されるようなタンパク質の融合物を含む。
【００８１】
HER2遺伝子の増幅または過剰発現は、乳癌のおよそ30％において起こる。それは、疾患再発の増加および予後不良に強く関連している（Roy V,Perez EA(November 2009)."Beyond trastuzumab:small molecule tyrosine kinase inhibitors in HER-2-positive breast cancer".Oncologist 14(11):1061-9）。卵巣癌、胃癌、および子宮漿液性子宮内膜癌のような子宮癌の侵襲性の型においても、過剰発現が起こることが公知である（Tan M,Yu D(2007)."Molecular mechanisms of HER2-mediated breast cancer chemoresistance".Adv.Exp.Med.Biol.608:119-29）。従って、本明細書に記載されたシステムおよび方法は、少なくとも、HER2を過剰発現している乳癌、卵巣癌、胃癌、および子宮漿液性子宮内膜癌のような子宮癌の侵襲性の型の処置において有用である。従って、これらの癌の処置のための改変型バイナリー毒素システムの使用も、提供される。
【００８２】
本発明の組成物、システム、および使用は、薬学的に許容される担体で送達され得る。本明細書において使用されるように、「薬学的に許容される」という用語は、組成物、担体、希釈剤、および試薬をさし、交換可能に使用され、材料が、悪心、目眩、胃不調等のような望ましくない生理学的効果を生じることなく、哺乳動物へ投与され得ることを表す。薬学的に許容される担体は、それが望まれない限り、共に混合される薬剤に対する免疫応答の発生を促進しないであろう。溶解または分散した活性成分を含有している薬理学的組成物の調製は、当技術分野においてよく理解されており、製剤に基づき限定される必要はない。
【００８３】
典型的には、そのような組成物は、液状の溶液または懸濁物のいずれかとして注射可能物として調製されるが、使用前に液体に溶解させるかまたは懸濁させるのに適当な固体の形態が調製されてもよい。調製物は、乳化されていてもよいしまたはリポソーム組成物として提示されてもよい。活性成分は、本明細書に記載された治療法において使用するのに適当な量で、薬学的に許容され活性成分と適合性である賦形剤と混合され得る。適当な賦形剤には、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、およびそれらの組み合わせが含まれる。さらに、所望によって、組成物は、活性成分の有効性を増強する、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤等のような微量の補助物質を含有していてもよい。本発明の治療用組成物は、成分の薬学的に許容される塩を含んでいてもよい。薬学的に許容される塩には、例えば、塩酸もしくはリン酸のような無機酸、または酢酸、酒石酸、マンデル酸等のような有機酸によって形成された（ポリペプチドの遊離アミノ基によって形成された）酸付加塩が含まれる。例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等のような有機塩基から、遊離カルボキシル基によって形成された塩が得られてもよい。生理学的に容認される担体は、当技術分野において周知である。例示的な液状担体は、活性成分および水に加えて材料を含有していないか、またはリン酸緩衝生理食塩水のような、生理学的pH値のリン酸ナトリウム、生理食塩水、もしくは両方のような緩衝液を含有している無菌の水性溶液である。さらに、水性担体は、複数種の緩衝塩、ならびに塩化ナトリウムおよび塩化カリウムのような塩、デキストロース、ポリエチレングリコール、ならびにその他の溶質を含有していてもよい。液状組成物は、液相を、水に加えて含有していてもよいし、水を除外して含有していてもよい。そのような付加的な液相の例示的なものは、グリセリン、綿実油のような植物油、および水油乳濁液である。特定の障害または状態の処置において有効であろう、本明細書に記載された方法において使用される活性薬剤の量は、障害または状態の性質に依り、標準的な臨床的技術によって決定され得る。
【００８４】
「対象」という用語には、本明細書全体で使用されるように、ヒトおよび家畜のような哺乳動物、齧歯類モデル、イヌモデル、および霊長類モデルを含む実験動物モデルを含む、真核細胞を有する生物が含まれるものとする。
【００８５】
上記の態様のいずれかの特定の要素を、組み合わせるか、または他の態様における要素と置換することが可能である。さらに、本開示のある種の態様に関連した利点が、これらの態様に関して記載されているが、他の態様も、そのような利点を示すかもしれず、本開示の範囲内に含まれるために、全ての態様が必ずしもそのような利点を示す必要はない。
【００８６】
本発明のいくつかの態様は、以下の項目にリストされる:
１.  標的細胞に特異的な非毒素関連受容体結合リガンドと融合した受容体破壊孔形成性のバイナリー毒素またはAB毒素単位を含む融合タンパク質、および
標的細胞のサイトゾルへの治療用タンパク質の送達のための、孔形成性毒素単位と会合することができる相補的な毒素単位
を含む、標的細胞への活性分子の送達のための改変型バイナリー毒素システム。
２.  受容体破壊孔形成性単位が炭疽毒素防御抗原（PA）である、項目1に記載の改変型バイナリー毒素システム。
３.  PAがPAN682AD683Aである、項目2記載の改変型バイナリー毒素システム。
４.  非毒素関連特異的標的受容体結合リガンドが、上皮増殖因子1または上皮増殖因子2であるか、あるいは非毒素関連特異的受容体結合リガンドが、上皮増殖因子受容体1（EGFR）または上皮増殖因子受容体2（HER2）を標的とする、項目1〜3のいずれかに記載の改変型バイナリー毒素システム。
５.  相補的な毒素単位が炭疽毒素致死因子（LFまたはEF）である、項目1〜4のいずれかに記載の改変型バイナリー毒素システム。
６.  相補的な毒素単位が炭疽毒素致死因子のアミノ末端部分（LFNまたはEFN）である、項目1〜5のいずれかに記載の改変型バイナリー毒素システム。
７.  治療用タンパク質が、ジフテリア毒素の触媒ドメイン（DTA）、リシン、志賀毒素、またはシュードモナス外毒素Aである、項目1〜6のいずれかに記載の改変型バイナリー毒素システム。
８.  AB毒素が、ボツリヌス神経毒、炭疸毒素、ジフテリア毒素、リシン、志賀毒素、志賀様毒素、外毒素A、またはコレラ毒素である、項目1〜7のいずれかに記載の改変型バイナリー毒素システム。
９.  バイナリー毒素が、ウェルシュ菌毒素α、β、ε、もしくはι；ボツリヌス菌C2毒素；またはクロストリジウム・スピロフォルムι様毒素である、項目8に記載の改変型バイナリー毒素システム。
１０.  受容体結合リガンドが、上皮増殖因子受容体HERl、HER2、HER3、もしくはHER4；血管内皮増殖因子受容体VEGFR-1、VEGFR-2、もしくはVEGFR-3；インスリン様増殖因子1受容体；繊維芽細胞増殖因子受容体；トロンボスポンジン1受容体；エストロゲン受容体；ウロキナーゼ受容体；プロゲステロン受容体；テストステロン受容体；癌胎児性抗原；前立腺特異抗原；ファルネソイドX受容体；トランスフォーミング増殖因子受容体；トランスフェリン受容体；肝細胞増殖因子受容体；または血管作動性腸管ポリペプチド受容体1および2から選択される受容体と結合する、項目1〜9のいずれかに記載の改変型バイナリー毒素システム。
１１.  受容体結合リガンドが、抗体またはアフィボディから選択される、項目1〜10のいずれかに記載の改変型バイナリー毒素システム。
１２.  アフィボディがHER2アフィボディである、項目11に記載の改変型バイナリー毒素システム。
１３.  HER2アフィボディがZHER2である、項目12に記載の改変型バイナリー毒素システム。
１４.  治療用タンパク質が、志賀毒素の細胞毒性ドメイン、志賀様毒素1および2、リシン、リシン毒素A鎖、アブリン、ゲロニン、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリン、トリコサンチン、ペプシン（pepcin）、トウモロコシRIP、αサルシン、ウェルシュ菌ε毒素、ボツリヌス神経毒、ブドウ球菌エンテロトキシン、クロストリジウム・ディフィシル毒素、百日咳毒素、またはシュードモナス外毒素である、項目1〜13のいずれかに記載の改変型バイナリー毒素システム。
１５.  項目1〜14のいずれかに記載の改変型バイナリー毒素システムを含む、真核細胞へ生理活性分子を送達するためのキット。
１６.  項目1〜14のいずれかに記載の改変型バイナリー毒素システムを、癌を有すると診断された対象へ投与する工程を含む、癌を処置する方法。
１７.  改変型バイナリー毒素システムが、受容体転向型炭疽防御抗原を含む、項目16に記載の方法。
１８.  癌がHER2陽性癌であり、炭疽防御抗原がHER2結合リガンドと融合している、項目16〜17のいずれかに記載の方法。
１９.  HER2結合リガンドが、抗体またはアフィボディである、項目18記載の方法。
２０.  癌の処置のための、項目1〜14のいずれかに記載のバイナリー毒素システムの使用。
２１.  癌の処置のための受容体転向型炭疽防御抗原の使用。
２２.  項目1〜14のいずれかに記載の毒素システムと薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
【実施例】
【００８７】
以下は、受容体を発現する細胞へ、毒性または非毒性の治療薬を送達するための、非ネイティブの（即ち、毒素のための天然受容体ではない）受容体結合分子と融合したAB毒素の受容体破壊型孔形成性サブユニットの使用の概要を示す、全般的な本発明の概念実証を示すために実施された実施例を記載する。具体例は、当技術分野における知識および本明細書に提供された説明によって、毒素、破壊変異、受容体結合ドメイン等のクラスをより広く包含するよう拡張され得る。
【００８８】
実施例1. PA発現プラスミドの生成
ルーチンの方法によって、例えば、下記の例示的な発現プラスミドを作成するために使用された原理に従って、毒素についての公知の配列を用いて発現プラスミドを構築することができる。本実施例において、本発明者らは、この研究において使用される2種のPAキメラを作成した：以前に生成されたPAN682AD683A（mPA）遺伝子コード配列を使用して、オーバーラップエクステンションPCRによって、PAN682AD683A-EGF（mPA-EGF）およびPAN682AD683A-DTR（mPA-DTR）を作出した。いずれの場合にも、最初のPCR工程は、2種の反応（a）順方向プライマー
2015509501.tif 000008
＋それぞれEGFおよびDTRとオーバーラップする領域を含有している逆方向プライマーPARevEGF
2015509501.tif 000009
またはPARevDTR
2015509501.tif 000010
のいずれかを使用する反応；ならびに（b）EGFの配列を増幅するための順方向プライマーおよび逆方向プライマー
2015509501.tif 000011
ならびにDTRの配列を増幅するための順方向プライマーおよび逆方向プライマー
2015509501.tif 000012
を使用する反応からなっていた。次いで、2個の断片を共に縫合し増幅するため、PA-EGFについてはEGFRevプライマー、PA-DTRについてはDTRRevプライマーと組み合わせて、順方向プライマーPAForを使用する第二のPCR工程に、PCRによって生成されたDNA断片を供した。いずれの場合にも、全長PCR産物は、順方向プライマー内にEcoRI制限部位をコードし、逆方向プライマー内にXhoI制限部位をコードした。PCR産物を、標準的なプロトコルに従って、制限消化し、pet22b発現ベクターへクローニングした。各クローンは、ジフテリア毒素の膜貫通ドメインと受容体結合ドメインとの間の天然リンカーの一部である8残基リンカー（SPGHKTQP、SEQ ID NO:1）も、PAとEGFまたはDTRのいずれかとの間にコードしていた。
【００８９】
オリゴヌクレオチドは、Integrated DNA Technologies（Coralville,IA）から得られた。特記されない限り、全ての化学物質がSigma-Aldrich（St.Louis,MO）から供給された。大腸菌発現のために順応した合成ヒトEGF遺伝子は、Prof.E.Joop van Zoelen（Department of Cell Biology and Applied Biology,Heijendaalseweg,Nijmegen）から寛大にも寄贈された。可溶性EGFは、ProSpec-Tany Technogene Ltd（East Brunswick,NJ）から得られた。
【００９０】
実施例2. タンパク質の発現および精製
組換え野生型PA（WT PA）、PAF427H、mPA、mPA-EGF、およびmPA-DTRを、BL21(DE3)大腸菌株（Invitrogen,Carlsbad,CA）の周辺質において過剰発現させた。得られた細菌ペレットを、記載されたように（Miller et al.,1999）溶解し精製した。WT PAおよび様々なPAバリアントのオリゴマープレポアを、RTでの30分間の1:1000(wt:wt)の最終トリプシン:PA比での限定トリプシン消化によって作製した。ニックを入れられたタンパク質を、陰イオン交換クロマトグラフィに供して、PA63断片およびPA20断片を分離した。PA63は、自発的にオリゴマー形成してプレポアを形成した。
【００９１】
精製されたmPA-EGF融合物およびmPA-DTR融合物を、ウエスタンブロット分析によって特徴決定した。PA83バリアントを、WT PAと共に、SDS-PAGEに供し、フッ化ポリビニリデン膜（PVDF；Invitrogen,Carlsbad,CA）に転写した。膜を、2％BSAを含有しているトリス緩衝生理食塩水（pH7.4）でブロッキングし、マウス抗PA抗体（1:4000；カタログ番号MAB8082；Millipore,Billerica,MA）、ウサギ抗EGF抗体（1:50000；カタログ番号Ab9695；Abcam Cambridge,MA）、またはウサギ抗DT抗体（1:20000；カタログ番号Ab53828；Abcam）のいずれかをハイブリダイズさせた。増強化学発光（ECL）試薬（Pierce,Rockford,IL）を用いて、HRPにコンジュゲートしたヤギ抗ウサギIgG（1:20000；Santa Cruz Biotechnology,Inc,Santa Cruz,CA、カタログ番号sc-2004）またはウサギ抗マウスIgG（1:10000；Santa Cruz、カタログ番号sc-358914）のいずれかによって、一次抗体を検出した。
【００９２】
LF、EF、DTR、およびLFN-DTAを、Champion pet-SUMO発現系（Invitrogen）を使用して、4時間、1mMイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）による誘導の下で、BL21(DE3)大腸菌（Invitrogen）において発現させた。細胞ペレットを、溶解緩衝液（コンプリートRocheプロテアーゼインヒビター錠が補足された20mMトリスHCl pH8.0、150mM NaCl、10mMイミダゾール、10mgリゾチーム、2mg DNAase I）における超音波処理によって溶解した。超音波処理後、溶解物を、遠心分離によって清浄化し、3ml総容積のNi-NTAアガロース（Qiagen,Valencia,CA）に負荷した。樹脂を、15カラム容積の洗浄緩衝液（20mMトリスHCl pH8.0、150mM NaCl、20mMイミダゾール）で洗浄し、250mMイミダゾールが補足された同緩衝液によって溶出させた。得られた精製されたタンパク質を、20mMトリスHCl、pH8.0、150mM NaClへ交換し、4℃で一晩、SUMOプロテアーゼ（Invitrogen）によって切断した。未切断のHis-SUMO融合物およびSUMOプロテアーゼを、2回目のNi-NTAクロマトグラフィによって除去し、その際、フロースルーが、関心対象の切断された産物を含有していた。
【００９３】
実施例3. SDS抵抗性
酸性pHへの曝露は、SDS抵抗性オリゴマーの存在によって特徴付けられる、PAプレポアから孔への構造転換を引き起こす。WT PA、mPA、mPA-EGF、およびmPA-DTRのプレポア（5μg）を、室温で30分間、pH5.5緩衝液（100mM KCl、1mM EDTA、および各10mMシュウ酸ナトリウム、リン酸カリウム、およびMES、pH5.5）またはpH8.5緩衝液（20mMトリスpH8.5＋150nM NaCl）においてインキュベートした。次いで、各試料をSDS試料緩衝液に曝し、SDS-PAGE電気泳動によって分解した。タンパク質バンドをクーマシーブルー染色によって可視化した。
【００９４】
実施例4. 細胞培養
CHO-K1細胞株は、American Type Culture Collection（カタログ番号CCL-61、Manassas,VA）から得られた。この細胞は、10％ウシ胎仔血清（FBS）、500単位/mlのペニシリンG、および500単位/mlのストレプトマイシン硫酸塩が補足されたHam's F-12培地（Life Technologies,Inc.,Carlsbad,California）において維持された。やはりAmerican Type Culture Collection（カタログ番号CCL-1555）から得られたA431細胞株は、10％FBS、500単位/mlのペニシリンG、500単位/mlのストレプトマイシン硫酸塩、および1mMピルビン酸ナトリウムを含むダルベッコ変法イーグル培地（American Type Culture Collection）において培養された。
【００９５】
実施例5. 細胞毒性アッセイ
WT PAおよびその誘導体の、LFN-DTAをサイトゾルへ送達する能力を測定するため、タンパク質合成阻害を使用した。CHO-K1細胞およびA431細胞（1ウェル当たり3.5×104個）を、PA83バリアントのうちの1種（10nM）と組み合わせられた、（10nMから開始する）LFN-DTAの6種の10倍段階希釈物に曝した。37℃で、4時間（A431）または一晩（CHO-K1）、細胞をインキュベートした。毒素含有培地を除去し、1ml当たり1μCiの[3H]-ロイシン（Perkin Elmer,Billerica,Massachusetts）が補足されたロイシン欠損培地と共に、37℃で1時間、細胞をインキュベートした。プレートを冷PBSで2回洗浄し、シンチレーション計数によって決定される3H-ロイシンタンパク質の量によって、タンパク質合成を測定した。タンパク質合成（％）をLFN-DTAの対数濃度に対してプロットした。各バーは3回の実験の平均値を表す。
【００９６】
それぞれmPA-EGFおよびmPA-DTRと競合する50倍モル過剰の可溶性EGF（Prospec,East Brunswick,NJ）または10倍過剰のDTRを用いた以外は上記と同様に、競合実験を実施した。記載されたように（Scobie et al.,2005）組換え作製された10倍過剰のANTRX2のPA結合VWAドメイン（ANTHRX2）を用いて、対照実験も実施した。
【００９７】
実施例6. MEK切断
A431細胞のサイトゾルへのLFの転移を、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ1（MEK1）についての細胞溶解物に対するウエスタンブロットによってモニタリングした。A431細胞（1×106細胞）を、37℃で3時間、致死性の毒素（10nM PA83バリアントおよび100nM LF）に曝した。細胞を、100μlのトリス緩衝生理食塩水（20mMトリスHCl、150mM NaCl pH7.4）に採集し、SDS-PAGE試料緩衝液に懸濁させ、直ちに100℃で20分間インキュベートした。溶解物をSDS-PAGEによって分解し、PVDF膜（Invitrogen）に転写した。膜を、2％BSAを含有しているトリス緩衝生理食塩水（pH7.4）でブロッキングし、抗MEK1抗体（1:1000；Abcam、カタログ番号Ab32071）または抗GAPDH抗体（1:2500；Abcam、カタログ番号Ab9485）のいずれかをハイブリダイズさせた。HRPにコンジュゲートしたヤギ抗ウサギIgG（1:20000；Santa Cruz、カタログ番号sc-2004）およびECL試薬（Pierce）を用いて、一次抗体を検出した。
【００９８】
実施例7. 浮腫因子アデニル酸シクラーゼアッセイ
EFへの曝露によって、A431細胞において生成されるcAMPの量を決定するため、競合酵素連結イムノアッセイ（Cell Signaling Technology,Danvers,MA）を使用した。A431細胞（3.5×104個）を96穴組織培養プレートに蒔き、PAバリアント（10nMのWT PA、PAF427H、mPA、またはmPA-EGF）の存在下または非存在下で、EF（50nM）と共にインキュベートした。1時間後、培地を除去し、細胞を200μlの氷冷PBSで2回洗浄した。付着細胞を100μlの1×細胞溶解緩衝液によって溶解し、氷上で10分間インキュベートした。各細胞溶解上清（50μl）を、HRP連結cAMP溶液（50μl）と合わせ、cAMPアッセイプレートに添加し、室温で3時間インキュベートした。次いで、ウェルを200μlの1×洗浄緩衝液で4回洗浄し、TMB基質（100μl）を各々に添加し、10分間放置した。停止溶液（100μl）の添加後、各ウェルの吸光度を450nmで読み取り、標準曲線に基づきcAMPを推定するために使用した。EF+/-各PAバリアントによって産生された細胞内cAMPの量を、ヒストグラムとしてプロットした。各バーは4回の実験の平均値を表す。
【００９９】
実施例8：受容体転向型炭疽防御抗原によるHER2陽性癌細胞のターゲティング
本発明者らは、乳腺腫瘍および卵巣腫瘍の有意な割合の表面に発現されるマーカーHER2へ受容体特異性を転向するため、防御抗原（PA）と呼ばれる炭疸毒素の受容体結合性かつ孔形成性のモエティが改変された、標的型毒素を作出した。得られた融合タンパク質（mPA-ZHER2）は、トラスツズマブ抵抗性の株を含むHER2陽性腫瘍細胞へ特異的に殺細胞エフェクターを送達して、細胞死を引き起こした。HER2陰性細胞のオフターゲット死滅は、均一集団でも、HER2陽性細胞とHER2陰性細胞との混合物でも観察されなかった。異なる受容体を標的とするmPAバリアントの混合物は、これらの受容体を欠く細胞には影響することなく、いずれかの受容体を保持する細胞の死滅を媒介した。炭疸毒素は、HER2またはその他の腫瘍特異的な細胞表面マーカーを保持している細胞を破壊するための治療薬を開発するための有効なプラットフォームとして機能し得る。
【０１００】
mRNAレベルまたはタンパク質レベルでのHER2遺伝子の増幅および／または過剰発現が、乳癌、胃癌、および卵巣癌の20〜25％で起こる（Berchuck et al.1990；Gravalos & Jimeno 2008；Arteaga et al.2012；Slamon et al.1989）。特に、乳癌においては、全て患者生存率の減少に寄与する、腫瘍成長、再発、および治療に対する抵抗性の増加の徴候を示す、疾患の侵襲性の型に、HER2の発現の増加が関連している（Arteaga et al.2012）。FDAによって認可されたモノクローナル抗体であるトラスツズマブ（商標HERCEPTIN（登録商標））は、腫瘍成長を遅延させるのに有効であるが、腫瘍排除には無効なままである。従って、腫瘍細胞を積極的に死滅させる新しい治療薬は、癌関連研究の主要な目標であり続けている。この戦略の有望な例は、殺細胞性のタンパク質毒素の作用を、特異的な癌細胞へターゲティングすることである（Pastan et al.2007）。
【０１０１】
本発明者らは、炭疸毒素の受容体特異性を転向させるための簡便な手法を開発した（Mechaly et al.2012）。第一に、本発明者らは、炭疸毒素の受容体結合性／孔形成性成分である防御抗原（PA）のネイティブの受容体結合活性を破壊し、次いで、変異型タンパク質（mPA）のC末端へ異種の受容体結合リガンドを付加した。このアプローチを使用して、本発明者らは、2種の異なる受容体：ジフテリア毒素（DT）受容体（HB-EGF）および上皮増殖因子受容体（EGFR）（Mechaly et al.2012）へ特異的に毒素作用を差し向ける融合タンパク質を作出した。本研究において、本発明者らは、HER2受容体を保持している細胞へ毒素作用を転向させるため、このアプローチを使用した。
【０１０２】
炭疸毒素は、3種の非毒性のモノマータンパク質の集合体である（Young & Collier 2007）。それらのうちの2種、致死因子および浮腫因子（LFおよびEF）は、サイトゾル内で分子標的を共有結合的に修飾する酵素「エフェクタータンパク質」である。LFは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（MEK）ファミリーの大部分のメンバーを不活化するメタロプロテアーゼであり（Duesbery et al.1998；Vitale et al.1998）、EFは、サイクリックAMPの細胞内濃度を増加させる、カルモジュリンおよびCa2+に依存性のアデニル酸シクラーゼである（Leppla 1982）。第三のタンパク質PAは、特異的な細胞表面受容体にそれが結合することから開始し、結果的にエンドソーム膜に孔を形成する過程によって、細胞外環境からサイトゾルへLFおよびEFを輸送する（Collier 2009）。
【０１０３】
2種の公知の受容体ANTXR1（TEM8とも呼ばれる）およびANTXR2（CMG2とも呼ばれる）（Scobie 2003；Bradley et al.2001）のいずれかに結合した後、PAは、フューリンファミリープロテアーゼ（Klimpel et al.1992）によってタンパク質分解的に活性化される。活性化された型は、高い（nM）親和性でエフェクタータンパク質に結合する、七量体（Milne et al.1994）または八量体（Kintzer et al.2009）の環状オリゴマー（孔前駆体または「プレポア」）へ自己集合する（Cunningham et al.2002；Mogridge et al.2002）。得られた複合体は、エンドサイトーシスされ、エンドソーム区画へ送達され、そこで、酸性pHが、エンドソーム膜に孔を形成することを可能にする、プレポアのコンフォメーション変化を引き起こす（Miller et al.1999）。次に、孔が、結合したエフェクタータンパク質を能動的にアンフォールドし、膜を越えてサイトゾルへ輸送する（Young & Collier 2007）。そこで、それらは、活性酵素へリフォールドし、サイトゾル基質を修飾して、細胞過程の大きな撹乱、いくつかの場合には、細胞死を引き起こす。
【０１０４】
HER2は、EGFRと同一のファミリーに属する受容体チロシンキナーゼである。しかしながら、EGFRと異なり、HER2は公知の天然リガンドを有していない。本研究において、本発明者らは、HER2受容体に特異的な高親和性アフィボディ（ZHER2:342）（Orlova et al.2006）を受容体認識欠損PA（mPA）のC末端に融合させ、融合体mPA-ZHER2を作出することによって、転向型バイナリー毒素を開発した。アフィボディとは、黄色ブドウ球菌プロテインAのZドメインに由来するターゲティングポリペプチドのクラスを表す。他の受容体ターゲティングリガンドより有利であるのは、アフィボディが、小さく（58アミノ酸；およそ6kDa）、pHおよび熱に対して安定であり、Cys残基を欠き、非依存的かつ可逆的に折り畳まれるという事実による（Nord et al.1997；Lofblom et al.2010）。さらに、ファージディスプレイテクノロジーによって、モノクローナル抗体で観察されるものと比較可能な親和性レベルへ、インビトロで急速にそれらを進化させることが可能である。
【０１０５】
本発明者らの結果は、C末端にZHER2:342アフィボディが融合したmPAが、2種の殺細胞エフェクタータンパク質のいずれかの作用を、HER2陽性腫瘍細胞へ差し向けることができることを示している。HER2陽性トラスツズマブ抵抗性の腫瘍細胞株を含むこれらの細胞は、破壊され、培養物が、均一集団からなるか、HER2マーカーを欠く細胞と混合されているかに関わらず、特異的な死滅が観察された。
【０１０６】
材料および方法
試薬および化学物質
オリゴヌクレオチドおよびZHER2:342遺伝子は、Integrated DNA Technologies（Coralville,IA）によって合成された。ZHER2:4発現プラスミドおよびZHER2:342発現プラスミドは、Dr.Gregory Poon（Washington State University,Pullman,WA）によって親切にも提供された。特記されない限り、全ての化学物質がSigma-Aldrich（St.Louis,MO）から購入された。
【０１０７】
LFN-RTA発現プラスミドの生成
リシンのA鎖（RTA）を、オーバーラップエクステンションPCRによって、LFのN末端PA結合ドメイン（LFN）のC末端と融合させ、pet-SUMO発現ベクター（Invitrogen,Carlsbad,CA）へクローニングした。最初のPCR工程は、2種の反応（i）LFNのための順方向プライマー
2015509501.tif 000013
ならびにGSスペーサー（太字）およびRTAのためのオーバーラップ配列（下線）を含有しているLFNのための逆方向プライマー
2015509501.tif 000014
を使用する反応、ならびに（ii）GSスペーサー（太字）およびLFNとの5'オーバーラップ領域（下線）を含むRTAのための順方向プライマー
2015509501.tif 000015
ならびに二重終止コドン（太字）をコードするRTAのための逆方向プライマー
2015509501.tif 000016
を使用する反応からなっていた。2種のPCR産物を組み合わせるため、プライマーLFNFORおよびRTAREVを用いて、先の2種の鋳型を使用して、最終PCR反応を実施し、その後、それをpet-SUMO発現ベクター（Invitrogen）へライゲートした。
【０１０８】
タンパク質の発現および精製
記載されたように（Miller et al.1999；Mechaly et al.2012）、組換えのWT PA、mPA、mPA-ZHER2、およびmPA-EGFを発現させ精製した。組換えのLFN-DTAおよびLFN-RTAを、大腸菌のBL21(DE3)Star株（Invitrogen）において、1mMイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）の誘導の下で、30℃で4時間、ヘキサヒスチジン-SUMO融合物（SEQ ID NO:17として開示された「ヘキサヒスチジン」）として発現させた。細胞ペレットを、100mlの溶解緩衝液（50ml当たり1個のRocheコンプリートプロテアーゼインヒビター錠が補足された、20mMトリスHCl pH8.0、150mM NaCl、10mMイミダゾール、10mgリゾチーム、2mg DNAseI）に懸濁させ、超音波処理によって溶解した。細胞溶解物をNi2+-NTAアガロースカラムに負荷し、100mlの洗浄緩衝液（20mMトリスHCl pH8.0、150mM NaCl、および20mMイミダゾール）で洗浄し、250mMイミダゾールが補足された洗浄緩衝液で溶出させた。得られた精製されたタンパク質を、20mMトリスHCl pH 8.0および150mM NaClへ交換し、His6-SUMOタンパク質（SEQ ID NO:17として開示された「His6」）からLFN-DTA/RTAを分離するため、4℃で一晩、SUMOプロテアーゼによって切断した。次いで、His6-SUMO（SEQ ID NO:17として開示された「His6」）に結合し、関心対象のタンパク質（LFN-DTA/RTA）をフロースルー画分に残す、第二のNi2+-NTAカラムに、切断されたタンパク質を供した。
【０１０９】
アフィボディ（ZHER2:4およびZHER2:342）を、pet15b発現ベクター（EMD Millipore,Billerica,MA）から発現させ、切断工程の必要なしに、LFN-DTAと同様に精製した。
【０１１０】
細胞株および維持
A431細胞株（カタログ番号CCL-1555）およびCHO-K1細胞株（カタログ番号CCL-61）は、ATCC（Manassas,VA）から購入された。BT-474細胞株、MDA-MB-468細胞株、およびSKBR3細胞株は、Dr.Jean Zhao（Dana Farber Cancer Institute,Boston,MA）によって寛大にも提供された。MDA-MB-231細胞株は、Dr.Gregory Poon（Washington State University）によって提供された。JIMT-1細胞株は、AddexBio（カタログ番号C0006005；San Diego,CA）から購入された。
【０１１１】
A431細胞およびJIMT-1細胞は、10％FCS、500単位/mlのペニシリンG、および500単位/mlのストレプトマイシン硫酸塩（Invitrogen）が補足されたDMEMにおいて維持された。CHO-K1細胞株およびその他の全ての細胞株は、それぞれ、10％FCS、500単位/mlのペニシリンG、および500単位/mlのストレプトマイシン硫酸塩が補足されたHam's F12培地またはRPMI培地（Invitrogen）において培養された。
【０１１２】
蛍光タンパク質を発現する安定細胞株を、CFP、RFP、またはGFPをコードするピューロマイシンによって選択可能なレンチウイルス粒子（GenTarget,San Diego,CA）によって作製した。レンチウイルスを、A431細胞株（CFP）、SKBR3細胞株（RFP）、およびMDA-MB-468細胞株（GFP）へ形質導入した（MOI＝1）。形質導入後48時間目に、ピューロマイシン抵抗性である蛍光細胞を選択するため、培地を、1μg/mlピューロマイシンを含有している培地に交換した。均一な蛍光標識された細胞集団が選択されることを確実にするため、細胞を、1〜5μg/mlピューロマイシンを含有している培地においてさらに3回継代し、蛍光標示式細胞分取（FACS）によって分析した。
【０１１３】
表面のHER2およびEGF受容体のレベルの定量化
受容体切断の可能性を排除するため、非酵素試薬（Cellstripper（商標）、Cellgro,Herndon,VA）を使用して、細胞（1×105個/実験）を解離させた。細胞を、200μlのPBSまたは1μg/ml FITC標識抗EGFRアフィボディ（カタログ番号ab81872；Abcam,Cambridge,MA）もしくは2μg/ml FITC標識抗HER2アフィボディ（カタログ番号ab31891；Abcam）を含むPBSのいずれかに再懸濁させた。細胞を4℃で1時間インキュベートし、200μlのPBSで2回洗浄し、PBSに再懸濁させた。BD FACSCaliburフローサイトメーターを使用して、FACSを実施した。FACSヒストグラムを、FlowJoフローサイトメトリー分析ソフトウェア（Tree Star Inc.,Ashland,OR）を使用して分析し、GRAPHPAD PRISM（登録商標）ソフトウェアパッケージ（GraphPad software Inc.,La Jolla,CA）を使用して、平均蛍光強度（MFI）をプロットした。各プロットは、50,000イベント／条件が計数された3回の実験に相当する。
【０１１４】
細胞毒性アッセイおよび競合アッセイ
2.6.1  タンパク質合成阻害−96穴プレートに、2.5×104細胞/ウェル（BT-474）または3.5×104細胞/ウェル（その他の全ての細胞株）の密度で、適切な培地で、細胞を蒔き、37℃で一晩インキュベートした。翌日、20nM mPAバリアントが補足された培地によるLFN-DTAまたはLFN-RTAの（1μMの終濃度から開始する）10種の10倍段階希釈物に、細胞を曝した。4時間のインキュベーションの後、毒素含有培地を除去し、1ml当たり1μCiの[3H]-ロイシン（Perkin Elmer,Billerica,Massachusetts）が補足されたロイシン欠損培地に交換し、さらに1時間インキュベートした。プレートを、冷PBS（200μl）で2回洗浄した後、200μlのシンチレーション液を添加した。取り込まれた[3H]-ロイシンの量を、Wallac MicroBeta TriLux 1450 LSC（PerkinElmer,Waltham,MA）を使用したシンチレーション計数によって決定した。タンパク質合成（％）を、mPAバリアント単独によって処理された細胞に対して標準化し、GraphPad PrismでLFN-DTAまたはLFN-RTAの濃度に対してプロットした。曲線上の各点は、4回の実験の平均値に相当する。
【０１１５】
20nM mPA-ZHER2およびLFN-DTAを含有している培地に添加された、増加する濃度の遊離の（i）高親和性アフィボディ（ZHER2:342）または（ii）より低い親和性のアフィボディ（ZHER2:4）を用いて、上記のように、競合アッセイを実施した。低レベルのHER2を発現するMDA-MB-231細胞は、他の全ての細胞株（10nM）と比較して、より高い濃度のLFN-DTA（1μM）によってチャレンジされなければならなかった。タンパク質合成（％）を、mPA-ZHER2単独によって処理された細胞に対して標準化し、GRAPHPAD PRISMを使用してプロットした。曲線上の各点は、4回の実験の平均値に相当する。
【０１１６】
細胞生存率−製造業者のプロトコル（Biotium,Hayward,CA）に従って、XTTアッセイによって、細胞生存率を測定した。細胞（104個/ウェル）を、96穴オプティカルボトムプレートに適切な培地で蒔き、37℃で一晩インキュベートし、20nM mPA-ZHER2が補足された培地によるLFN-DTAの10種の10倍段階希釈物に曝した。48時間後または72時間後、25μlのXTT（ナトリウム2,3,-ビス(2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホフェニル)-5-[(フェニルアミノ)-カルボニル]-2H-テトラゾリウム分子内塩）試薬を各ウェルに添加し、還元型XTTの吸光度を、SpectraMax M2eマイクロプレートリーダー（Molecular Devices,Sunnyvale,CA）を使用して、475nmで測定した。細胞生存率（％）を、mPA-ZHER2単独で処理された細胞に対して標準化し、LFN-DTAの濃度に対して、GRAPHPAD PRISMでプロットした。各データ点は、四つ組で実施された測定の平均値に相当する。
【０１１７】
アポトーシスアッセイ
公知のアポトーシスマーカー、カスパーゼ3/7の活性化を測定する、細胞ベースのアポトーシスアッセイを、供給元のプロトコル（Caspase-Glo 3/7 Assay；Promega,Madison,WI）に従って実施した。細胞（104個/ウェル）を96穴オプティカルボトムプレートに播種し、20nM mPA-ZHER2が補足された培地によるLFN-DTAの8種の10倍段階希釈物に曝した。24時間後または48時間後、発光カスパーゼ3/7基質を各ウェルに添加した後、室温で30分間インキュベートした。カスパーゼ3/7による基質切断に起因する発光を、Wallac MicroBeta TriLux 1450 LSC（PerkinElmer）によって測定した。相対発光を、GRAPHPAD PRISMを使用して、LFN-DTAの濃度に対してプロットした。各データ点は、4回の独立の測定の平均値を表す。
【０１１８】
顕微鏡法
蛍光細胞を上記のように混合し（各2×104細胞）、37℃で一晩、組織培養物によって処理されたカバーガラスにおいて培養した。カバーガラスを、10nM LFN-DTA、ならびにmPA、mPA-ZHER2、mPA-EGF、またはmPA-ZHER2およびmPA-EGF（各20nM）に曝した。24時間後、細胞をPBSで2回洗浄し、4％ホルムアルデヒドで固定し、ガラススライドにマウントした。Nikon Eclipse TE2000-U蛍光倒立顕微鏡によって画像を取得し、MetaMorphソフトウェアパッケージ（Molecular Devices,Sunnyvale,CA）を使用して分析した。
【０１１９】
共培養細胞毒性アッセイ（タンパク質合成）
蛍光−蛍光細胞株（A431CFP、MDA-MB-468GFP、およびSKBR3RFP）を、未標識CHO-K1細胞と等しく（各105細胞）混合し、RPMI培地で6穴組織培養ディッシュへ播種し、37℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞を、10nM LFN-DTA、ならびにmPA、mPA-ZHER2、mPA-EGF、またはmPA-ZHER2およびmPA-EGF（各20nM）によって処理した。細胞をさらに24時間インキュベートし、PBSで2回洗浄し、トリプシンによって剥離した。細胞集団をPBSで再び洗浄し、BD FACSCaliburフローサイトメーター（BD Biosciences,San Jose,CA）を使用して、蛍光に基づき分取した。グラフ上の各バーは、少なくとも75,000イベントが計数された3回の実験に相当する。FACSデータをFlowJo分析ソフトウェアを使用して分析し、GRAPHPAD PRISM（登録商標）ソフトウェアパッケージを使用してプロットした。
【０１２０】
タンパク質合成−組織培養チャンバースライドの仕切られたセクションに癌細胞株のパネルおよびCHO-K1細胞を播種した（3.5×104細胞/ウェル）。一晩のインキュベーションの後、培地を除去し、仕切り要素を廃棄した。スライドを、PBSで2回洗浄し、20nMの（i）mPA、（ii）mPA-ZHER2、（iii）mPA-EGF、または（iv）両mPAバリアントの混合物と共に、10nM LFN-DTAを含有しているRPMIと共に4時間インキュベートした。スライドを、毒素含有培地から除去し、15mlのPBSで洗浄し、1ml当たり1μCiの[3H]-ロイシン（Perkin Elmer）が補足されたロイシン欠損培地においてさらに1時間インキュベートした。スライドを培地から除去し、30mlのPBSで洗浄し、乾燥させた。個々の細胞集団を、6M塩酸グアニジン（75μl）に溶解させ、シンチレーション液に添加した。取り込まれた[3H]-ロイシンの量を、シンチレーション計数によって決定した。タンパク質合成（％）を、mPAおよびLFN-DTAによって処理された細胞に対して標準化し、GRAPHPAD PRISMソフトウェアパッケージを使用してプロットした。
【０１２１】
結果
mPA-ZHER2はHER2陽性細胞の死滅を媒介する
本発明者らは、PAの変異型、受容体認識欠損型であるmPAのC末端に、高親和性の58残基のアフィボディZHER2:342を融合させた。得られた融合タンパク質（mPA-ZHER2）を、LFN-DTAエフェクタータンパク質と組み合わせて、様々なレベルのHER2受容体を示す癌細胞株を死滅させる能力について試験した。LFおよびEFは大部分の細胞に対して殺細胞性ではないため、本発明者らは、LFのN末端PA結合ドメイン（LFN）のジフテリア毒素の触媒ドメイン（DTA）との融合物であるLFN-DTAを、細胞内エフェクターとして使用した。DTAは、サイトゾルにおいて真核生物伸長因子2（eEF-2）をADPリボシル化して、タンパク質合成を阻止し、細胞死を引き起こす（Collier & Cole 1969；Collier 1967；Honjo et al.1968）。
【０１２２】
様々な細胞株を、一定濃度のmPA-ZHER2（20nM）＋様々な濃度のLFN-DTAと共に4時間インキュベートし、その後、1時間にわたるタンパク質合成を測定した。試験された細胞株の中で最も高いレベルのHER2を発現するBT-474細胞株が、最も感受性でもあった；即ち、タンパク質合成の50％の阻害のために最低濃度（EC50）のLFN-DTAを必要とした（図7A）。中レベルのHER2を発現する2種の細胞株（SKBR-3およびA431）は、中間レベルの感受性を示し；低レベルのHER2を有する株（MDA-MB-231）は、低い感受性（EC50およそ10nM）を示し；検出可能なHER2を有しない2種の株（CHO-K1、MDA-MB-468）は、試験されたLFN-DTAの最高濃度ですら影響されなかった。従って、EC50は、細胞表面上のHER2のレベルと逆の関係にあった（図7B）。様々な細胞株におけるHER2のレベルは、蛍光標識された抗HER2アフィボディとのインキュベーションの後、FACS分析によって決定された。
【０１２３】
細胞生存率は、LFN-DTAによるタンパク質合成の阻害が、細胞死を引き起こすことを確認した。癌細胞株を、mPA-ZHER2（20nM）および示された濃度のLFN-DTAに曝した。48時間後、生細胞において活性であるミトコンドリア酵素によるXTT試薬の還元を定量化する細胞毒性アッセイによって、細胞生存率を定量化した。タンパク質合成阻害および細胞死は、直接相関し（図7Aおよび7Cを比較すること）、細胞表面上に存在するHER2の量を反映する比較可能なEC50値を有していた（表1；図7B）。公知のアポトーシスマーカー、カスパーゼ3/7の活性化は、細胞死がアポトーシスに起因することを確認した（図7D）。カスパーゼ3/7活性化は、24時間後には増加しておらず（示されないデータ）、用量依存性であった；より多量のHER2受容体を発現する細胞は、より低いLFN-DTA濃度でカスパーゼ3/7活性化を示した。カスパーゼ3/7活性化のレベルは、様々な細胞型の間で異なり、SKBR3細胞株については確認され得なかった。
【０１２４】
遊離ZHER2:342アフィボディは、HER2陽性細胞のmPA-ZHER2依存性の死滅を競合的に阻害した（図8）。高レベルのHER2を発現するBT474細胞は、毒素阻止のため、低レベルまたは中レベルのHER2を発現する細胞株（EC50およそ20nM）と比べて、より高いレベルの遊離アフィボディを必要とした（EC50およそ400nM）（図8A）。より低い親和性のアフィボディ（ZHER2:4）（Wikman et al.2004）は、より高い親和性のZHER2:342アフィボディより毒素作用を阻止する効果が低かった（図8B）。
【０１２５】
バフィロマイシンA1は、mPA-ZHER2またはmPA-EGFのいずれかによって媒介されるLFN-DTA依存性の死滅からA431細胞を防御し、このことから、mPAバリアントによるエフェクターの転移が、野生型PAの場合と同様に、エンドソームpHに依存することが示された。
【０１２６】
mPA-ZHER2は複数の殺細胞エフェクターを送達することができる
本発明者らは、DTAがリシンの触媒ドメイン（RTA）に交換されたLFN-DTAの類似体を試験した。RTAは、DTAとは異なる生化学的機序によって、即ち、真核生物リボソームの28S rRNA内の重要なアデノシン残基を脱プリン化することによって、タンパク質合成を阻害する（Endo & Tsurugi 1987）。mPA-ZHER2（図3A）またはmPA-EGF（図9B）と組み合わせられたLFN-RTAは、それぞれHER2陽性細胞またはEGFR陽性細胞を死滅させた。一般に、LFN-RTAは、試験された細胞株を死滅させる効率がLFN-DTAより10〜100倍低かった。例外は、mPA-ZHER2と組み合わせられたLFN-RTAまたはLFN-DTAについてのEC50値がほぼ同一であったSKBR-3細胞株であった（図7Aおよび図9Aを比較すること）。SKBR-3は、検出可能なレベルのEGF受容体を欠くため、mPA-EGFによって媒介される死滅に対しては抵抗性であった。
【０１２７】
HER2標的型炭疸毒素はトラスツズマブ抵抗性の腫瘍細胞株を死滅させる
FDAによって認可されたモノクローナル抗体トラスツズマブは、HER2陽性患者の生存を延長するのに有効であったが、全ての患者が応答するわけではなく、大きな割合が、次第に治療抵抗性を発症する（Arteaga et al.2012）。HER2増幅を有しており、臨床的にトラスツズマブに対して抵抗性であった患者から最近単離されたJIMT-1細胞株（Tanner et al.2004）。本発明者らが試験した他のHER2陽性細胞株と同様に、JIMT-1細胞におけるタンパク質合成は、mPA-ZHER2およびLFN-DTAに応答して阻害され、アポトーシスによる細胞死がもたらされた（図10）。感受性のレベルは、HER2レベルと一致しており、LFN-RTAによって媒介される死滅は、LFN-DTAによるものより効率が低かった（図10A）。JIMT-1細胞は、他のHER2陽性細胞株と比較して、類似の細胞死滅およびカスパーゼ3/7活性化を達成するために、より長い毒素曝露期間（さらに24時間）を必要とした（図10Cおよび10D）。
【０１２８】
HER2陽性細胞とHER2陰性細胞との混合物においてバイスタンダー効果は見られなかった
可能性のあるバイスタンダー効果について試験するため、本発明者らは、HER2陽性細胞とHER2陰性細胞との混合物においてmPA-ZHER2の特異性を評価した。第一に、個々の細胞型を蛍光顕微鏡法またはFACSによって区別可能にするため、本発明者らは、区別可能な放出特性を有する蛍光タンパク質をコードする、ピューロマイシンによって選択可能なレンチウイルスによる形質導入によって、選択された細胞株を標識した。4種の細胞株（2種のHER2陽性株および2種のHER2陰性株）の各々からの等しい数の細胞を混合し、得られた混合物を、mPA-ZHER2＋LFN-DTAと共に24時間インキュベートした。フローサイトメトリーは、HER2陰性細胞であるCHO-K1（未標識）およびMDA-MB-468GFP（緑）が、ほぼ完全に集団を構成するようになり；HER2陽性のA431CFP細胞（シアン）およびSKBR3RFP細胞（赤）は、全体のおよそ50％から5％未満に低下したことを明らかにした（図11A）。付着細胞の蛍光顕微鏡法は比較可能な結果を与えた（図11B）。残存するSKBR-3細胞の小さな集団（およそ4％）は、顕微鏡法によって死んでいるように見えたため、フローサイトメトリーは、標識のために使用された蛍光タンパク質の本質的に長い半減期のため、この集団を過大評価した可能性があると、本発明者らは考える。従って、mPA-ZHER2/LFN-DTA組み合わせは、HER2陰性細胞に対する明白なバイスタンダー効果なしに、混合細胞集団内のHER2陽性細胞を死滅させることができた。
【０１２９】
本発明者らは、バイスタンダー効果について試験するためにもう一つのアプローチを使用した。複数の細胞株を、チャンバースライドの別々のウェルにおいて培養した（図12）。仕切り要素をスライドから除去し、次いで、全ての細胞株を含有しているスライドを、mPA-ZHER2およびLFN-DTAを含有している培地においてインキュベートした。4時間のインキュベーションの後、スライドを洗浄し、[3H]-ロイシンが補足された培地に移した。さらなる1時間のインキュベーションの後、細胞を洗浄し、個々の細胞集団を6M塩酸グアニジンによって溶解させ、取り込まれた放射性ロイシンを、シンチレーション計数によって定量化した。図6は、高レベルのHER2を発現する細胞および中レベルのHER2を発現する細胞は、死滅し、低いHER2発現を有するMDA-MB-231細胞は、限定された抵抗性を維持し、HER2を欠く細胞（CHO-K1およびMDA-MB-468）は、影響されなかったことを示す。
【０１３０】
mPA-ZHER2およびmPA-EGFの混合は不均一細胞集団内のHER2陽性細胞およびEGFR陽性細胞の両方の死滅を可能にした
mPA-HER2と同様に、LFN-DTAと組み合わせられたmPA-EGFは、均一な細胞集団（図13A）および不均一な細胞集団の両方において同族細胞株（この場合、EGFR陽性）を死滅させることができたが、EGF受容体を欠く細胞に対しては効果がなかった（図13）。mPA-EGFによる蛍光細胞の混合集団の死滅は、mPA-ZHER2について記載されたのと同一の警告を提示し、EGFR陽性細胞（MDA-MB-468、緑色）の小さな集団が残存した（図13Bおよび13C）。ここでも、放射性ロイシンの取り込みによってタンパク質合成を測定する、より高感度のアッセイは、EGFR陽性細胞が死滅し、極めて低いEGFR発現を有するかまたはEGFR発現を有しない細胞は生存したことを示した（図13D）。
【０１３１】
本発明者らは、mPA-ZHER2およびmPA-EGFの混合物の、癌細胞の混合集団において特異的な受容体を保持する細胞を標的とする能力も試験した。図14に示されるように、mPA-ZHER2およびmPA-EGFの組み合わせは、LFN-DTAの存在下で、HER2陽性細胞およびEGFR陽性細胞の両方を死滅させることができたが、いずれの受容体も発現しないCHO-K1細胞は、影響されないままであった。
【０１３２】
細胞株上のHER2およびEGFRのレベルの定量化
細胞（105個）を、FITCにコンジュゲートされた、HER2またはEGFRに特異的なアフィボディのいずれかと共にインキュベートし、FACSによって分析した（左パネル）。50,000イベントについての平均蛍光強度をFlowJoで計算し、GRAPHPAD PRISM（登録商標）ソフトウェアパッケージでプロットした。生データのヒストグラム（示されない）は、CHOK1細胞、A431細胞、BT474細胞、MDA-MB-231細胞、MDA-MB-468細胞、SKBR-3細胞において、EGF受容体およびHER2受容体について未染色の細胞と比較した蛍光のシフトを示した。
【０１３３】
LFN-DTAの送達はアポトーシスによる細胞死を引き起こす
様々な細胞株（MDA-MB-231、MDA-MB-468、およびCHOK1）を、mPA-ZHER2、および10-15M、10-13M、10-11M、10-9M、10-7Mの濃度のLFN-DTAに24時間曝した後、カスパーゼ3/7活性化によってアポトーシスを測定した。カスパーゼ3/7活性化および発光基質の切断によって生成された相対光単位（RLU）が、LFN-DTA濃度に対してプロットされる。各データ点は、4回の実験の平均値を表した。mPA-ZHER2単独に曝された対照細胞。示されないデータ。
【０１３４】
野生型PAおよび転向型mPAバリアントによって媒介されるエフェクターの進入はエンドソームのpHに依存する
A431細胞（3×105個）を、10-11M、10-10M、10-9M、10-8M、10-7Mの濃度のバフィロマイシンAの非存在下または存在下で、LFN-DTA（1nM）、およびmPA-ZHER2、mPA-EGF、またはWT PAのいずれか（20nM）に曝した。4時間後、細胞をPBSで洗浄し、[3H]-ロイシンを含有している培地と共にインキュベートした。1時間後、タンパク質合成のレベルを、シンチレーション計数によって測定した。タンパク質合成（％）を、mPAバリアント単独によって処理された細胞に対して標準化し、GRAPHPAD PRISMソフトウェアパッケージを使用してプロットした。曲線上の各点は、4回の実験の平均値を表した。示されないデータ。細胞表面のHER2、EGFR、およびANTRX1/2のレベルを、抗HER2アフィボディまたは抗EGFRアフィボディまたはFITC標識PAのいずれかを使用して、A431細胞上で定量化した。示されないデータ。
【０１３５】
考察
ある種の癌の侵襲性の型における細胞表面マーカーは、標的型抗癌治療を開発するための努力の重要な焦点となっている。顕著な例は、腫瘍成長の遅延および患者生存の延長において有効であるモノクローナル抗HER2抗体トラスツズマブである（Vogel et al.2002）。しかしながら、腫瘍を排除するのには無効であるため、大部分の患者が、次第に、この抗体に対する抵抗性を発症する（Arteaga et al.2012）。抗体治療は、そのような抵抗性を回避するため、従来の化学療法または放射線と組み合わせられており、連結された細胞毒性低分子化合物（「ペイロード」）の作用を通して細胞を死滅させる抗体薬物複合体（ADC）が、標的型治療の代替的なモードとして最近出現した（Carter & Senter 2008）。
【０１３６】
一部には、エフェクターモエティの触媒性の作用モードが、これらの毒素を極めて強力にするため、細胞内で作用する毒素を、その作用を腫瘍細胞へ指し向けるために改変することは、標的型治療のための魅力的なアプローチである。DTまたはシュードモナス外毒素A（ETA）のような毒素のネイティブの受容体結合ドメインの、異種の受容体結合タンパク質への交換は、これらの毒素の殺細胞作用をターゲティングするために有効に利用されている（Pastan et al.2007）。この研究の系統から、デニロイキンジフチトクス（商標ONTAK（登録商標））（Foss 2000；Williams et al.1987）と呼ばれる、皮膚T細胞リンパ腫のため認可された処置がもたらされ、その他の標的型タンパク質毒素は、現在調査中である（Madhumathi J & Verma 2012）。ONTAKは、DTの受容体結合ドメインをインターロイキン2（IL-2）に交換することによって作出された融合タンパク質である。IL-2モエティが、融合毒素を、腫瘍細胞上の高親和性IL-2受容体に結合させ、DTの触媒モエティ（DTA）が、サイトゾルへ輸送され、そこでタンパク質合成を阻止し、細胞死を引き起こす（Collier & Cole 1969；Collier 1967）。
【０１３７】
近年の炭疸毒素の構造および活性の解明によって、抗癌化学療法薬を開発するためのプラットフォームとしての可能性を調査するための実験が行われるようになった。ある研究においては、PAのフューリン部位が、タンパク質の活性化を防止するために変異させられ、改変型PAのネイティブの受容体結合活性が、血管内皮増殖因子または塩基性繊維芽細胞増殖因子によって誘導される血管形成を阻害するために活用された（Rogers et al.2007）。他の研究においては、ネイティブPAと組み合わせられた致死因子が、ヒト黒色腫細胞のアポトーシスを誘導することが見出され、そのことから、疾患進行が、一部、MAPKシグナリングの構成性の活性化による、この癌およびその他の癌への可能性のある適用が示唆された（Duesbery et al.2001；Koo et al.2002）。PAをターゲティングするための一つのアプローチは、フューリン切断部位を、癌細胞の表面上に過剰発現している、異なるプロテアーゼ、メタロプロテイナーゼまたはウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーターに選択的な部位に交換することであった（Abi-Habib et al.2006；Liu et al.2000）。
【０１３８】
本研究において、本発明者らは、HER2陽性細胞へ特異的に細胞毒性エフェクターを導入するための媒体としてそのタンパク質を使用するためのアプローチとして、PAの受容体認識特異性を変化させた。mPA-ZHER2は、HER2陽性細胞へのLFN-DTAおよびLFN-RTAの進入の高度に選択的なメディエーターであることが判明した。LFN-DTAのEC50は、試験された細胞株上のHER2のレベルと逆の関係を示した（図7）。LFN-RTAがLFN-DTAより10〜100倍低効力であった（図9）理由は不明であるが、サイトゾルにおけるエフェクターの安定性の差、標的分子の不活化の動力学、または多数のその他の要因のいずれかに関係している可能性がある。
【０１３９】
HER2受容体を保持している細胞に対するmPA-ZHER2の特異性は、競合アッセイ（図8）、ならびに混合細胞集団内のHER2陽性腫瘍細胞のみを標的とする能力（図12および11）によって示された。LFN-DTA＋mPA-ZHER2によって処理する前に、HER2陰性細胞をHER2陽性細胞と混合した時、オフターゲット効果は観察されなかった。HER2マーカーに対するモノマーZHER2アフィボディの親和性は、最も高性能の抗体のもの（およそ20pM）に匹敵し（Orlova et al.2006）、mPA-ZHER2の天然のオリゴマー形成特性は、細胞上のHER2受容体との複合体の相互作用のアビディティを増加させると推測される。オリゴマー形成が起こった後、受容体に対するアビディティは、毒性複合体の細胞からの解離が効果的には起こらないようなものになるであろう。
【０１４０】
野生型PAの場合と同様に、mPA-ZHER2またはmPA-EGFのいずれかによって媒介される殺細胞エフェクターの進入は、pH依存性であった。異なるPAバリアントについてのBFAの阻害濃度の差は、それぞれの受容体の存在量（EGFR＞ANTXR1/2＞HER2）による可能性が高い。あるいは、ANTXR1に結合したWT PAのpH閾値が、より高い親和性を有するANTXR2に結合した時より高い完全単位であるため、PA孔形成のpH閾値が、3種の受容体について変動するのかもしれない（Lacy et al.2004；Rainey et al.2005）。
【０１４１】
HER2陽性トラスツズマブ抵抗性腫瘍細胞株（JIMT-1）も、毒素作用に感受性であった（図10）。トラスツズマブに対して臨床的に抵抗性の患者から単離されたJIMT-1細胞株は、（遺伝子増幅にも関わらず）低いHER2の発現、他の細胞表面タンパク質による受容体マスキング（トラスツズマブ結合部位の80％もをマスクし得るイベント）、低いPTEN発現、PIK3CA遺伝子の活性化、およびニューレグリン1（NRG-1）の高発現を含む、HER2標的型抗体に対する抵抗性の発症に関連していると考えられる特性を示す（Tanner et al.2004；Nagy et al.2005；Koninki et al.2010）。HER2レベルに関するEC50は、トラスツズマブ感受性HER2陽性細胞株におけるデータと一致していた。LFN-RTAもJIMT-1細胞を死滅させるのに有効であったが、より高い濃度のLFN-DTAが必要であった（図4A）。XTT細胞毒性アッセイおよびカスパーゼ3/7活性化（図10Cおよび10D）によって査定されるように、LFN-DTAのJIMT-1細胞のサイトゾルへ送達は、アポトーシス細胞死をもたらした。転向型毒素は、48時間後に大部分の細胞（＞75％）を死滅させことができ、72時間後にはほぼ完全な排除（およそ95％）を達成した（図10C）。完全な細胞死滅を達成するために必要とされた、より多くの曝露は、カスパーゼ3/7活性化に到達するまでの時間を増加させる多数の違いのうちのいずれかに起因した可能性がある（48時間対24時間；図10D）。
【０１４２】
炭疸毒素によるトラスツズマブ抵抗性細胞株の排除は、現在の抗体治療と比べて可能性のある利点を表す。いくつかのADCが、（JIMT-1のような）トラスツズマブ抵抗性腫瘍細胞株を死滅させることが示されたが、LFN-DTA＋mPA-ZHER2より効果が有意に低く、中程度の死滅（およそ25％の細胞死）を達成するために高い用量を必要とする（μg/ml対pg/ml）（Lewis Phillips et al.2008；Koninki et al.2010）。この効力の差（およそ5000倍）は、mPA-ZHER2とHER2受容体との間の相互作用の強度を反映する、殺細胞性酵素のサイトゾルへの効率的な送達、およびサイトゾル基質の触媒的不活化に起因した可能性がある。20％利用可能であると推測された、抗体結合部位と比較された、JIMT-1細胞の表面上のmPA-ZHER2結合部位の到達可能性も、一つの要因であり得る（Nagy et al.2005）。
【０１４３】
腫瘍は、異なる受容体発現レベルを有する不均一な細胞集団から構成されているため、単一の抗癌治療が完全な腫瘍排除を達成し得る可能性は低い。低分子、抗体、および放射線の組み合わせが使用され、ある程度の成功をおさめている。炭疸毒素のバイナリー性、およびmPAのオリゴマー形成能は、不均一な細胞集団を排除するため、異なる過剰発現表面腫瘍マーカーを標的とするmPAのその他の型と、mPA-ZHER2を組み合わせることが可能であることも示唆する。この概念と一致して、LFN-DTAと組み合わせられた、mPA-ZHER2およびmPA-EGFは、異なるHER2およびEGF受容体の発現レベルを有する腫瘍細胞のパネルを完全に排除した（図14）。
【０１４４】
mPA-ZHER2の、異なる腫瘍マーカーを標的とする類似のmPAバリアントと協力的に作用する能力は、mPAによるターゲティングの適応性を強調する。mPAバリアントを組み合わせることに加えて、PA孔の、多様な細胞内エフェクター酵素のいずれかを転移させる能力は、異なる生化学的機序によって死滅させるエフェクターの組み合わせを使用することを可能にする。複数のエフェクターによる内部からの標的とされた細胞の酵素的崩壊は、化学療法における普遍的な問題である、抵抗性のエスケープ変異体が発生する可能性を最小にするはずである。
【０１４５】
本発明者らのインビトロのデータは、改変型受容体標的型炭疸毒素によるHER2受容体のターゲティングが、特異的かつ強力であり、HER2陰性細胞株に対してオフターゲット毒性を示さないことを示す。HER2陽性トラスツズマブ抵抗性腫瘍細胞株の毒素作用に対する感受性は、現在のFDAによって認可されている抗体治療と比べて、本発明者らのシステムが有意に有利である可能性を強調する。これらの理由および上記の利点のため、癌細胞の別個の集団のPAベースのターゲティングは、癌処置のための有望な治療戦略を表す。
【０１４６】
下記表1は、様々な癌細胞株に対するmPA-ZHER2およびLFN-DTAのインビトロ活性を示す。
【０１４７】
【表１】
2015509501.tif 000017
a.4時間の毒素曝露後に[3H]-ロイシン取り込みによって測定
b.48時間の毒素曝露後にXTT細胞生存アッセイによって測定
c.24時間の毒素曝露後にカスパーゼ3/7活性化によって測定
【０１４８】
本発明者らは、このシステムが、殺細胞エフェクタータンパク質、例えば、リシンの触媒ドメインと融合したLFNによって機能することも示し、記載されたシステムを使用したハーセプチン抵抗性細胞株JIMT-1の死滅も証明した。例えば、代替的な殺細胞性LFN融合物（リシンの触媒ドメインと融合したLFN；LFN-RTA）による死滅は、図9AおよびBに証明される。ハーセプチン抵抗性細胞株の死滅は、例えば、図10A〜Dに示される。
【０１４９】
参照
2015509501.tif 000018
2015509501.tif 000019
2015509501.tif 000020
2015509501.tif 000021
【図１】
2015509501.tif 000023
【図２】
2015509501.tif 000024
【図３】
2015509501.tif 000025
【図４】
2015509501.tif 000026
【図５】
2015509501.tif 000027
【図６】
2015509501.tif 000028
【図７Ａ】
2015509501.tif 000029
【図７Ｂ】
2015509501.tif 000030
【図７Ｃ】
2015509501.tif 000031
【図７Ｄ】
2015509501.tif 000032
【図８】
2015509501.tif 000033
【図９】
2015509501.tif 000034
【図１０Ａ】
2015509501.tif 000035
【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
2015509501.tif 000044
【図１４Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2015509501.tif 000047
2015509501.tif 000048
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