(57)【要約】  本出願は、２つ以上の細胞株を使用し、酵素混合物を産生する方法、酵素混合物を産生するための細胞株の特定又は作製方法、並びに酵素混合物を産生するための細胞バンクを準備する方法、を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
変換工程を触媒する酵素混合物を製造する方法であって：
第１及び第２の細胞株を液体培地中で組み合わせる工程であって；前記第１の細胞株は、第１組の１つ以上の酵素をコードしており、かつ発現するように準備されており；前記第２の細胞株は、第２組の１つ以上の酵素をコードしており、かつ発現するように準備されており；前記第１組及び前記第２組の酵素は、前記変換工程を増強する触媒活性を有し；前記第１組の酵素のうち１つ以上の酵素は、前記第１の細胞株にとって外来性のものであり；かつ前記第２組の酵素のうち１つ以上の酵素は、前記第２の細胞株にとって外来性のものであるか、又は前記第１の細胞株によりコードされていないか、若しくは前記第１の細胞株においてより低レベルで発現される、工程と、
前記組み合わせられた細胞株を培養する工程であって；前記細胞株が前記酵素を前記培地中に分泌すること、又は前記細胞株が溶解し前記酵素を放出することにより、前記変換工程を増強するのに有効な比率で酵素混合物を供給する、工程
を含む方法。
【請求項２】
前記第２組の酵素のうち１つ以上の酵素が、前記第２の細胞株に対して外来性のものであるか、又は前記第１の細胞株によりコードされていない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第２組の酵素のうち１つ以上の酵素が、前記第１の細胞株においてより低レベルで発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記変換工程を触媒する複数の酵素を同定すること；及び
第１組の１つ以上の前記同定された酵素をコードしており、かつ発現するように準備されている第１の細胞株、及び第２組の前記１つ以上の酵素をコードしており、かつ発現するように準備されている第２の細胞株を同定又は作製して、前記第１及び前記第２の細胞株を提供すること、
を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
異なる組の変換工程を触媒する酵素をコードしており、かつ発現するように準備されている細胞株を同定又は作製し、前記細胞株に前記酵素を発現する準備を保持させ、細胞株バンクを作製するために、選択圧下又は栄養要求性の生育を可能にする条件下で前記細胞株を生育させ；
ここで、前記複数の細胞株は、
第１組の１つ以上の酵素をコードしており、かつ発現するように準備されている前記第１の細胞株と、
第２組の１つ以上の酵素をコードしており、かつ発現するように準備されている前記第２の細胞株を含み；
前記バンクから前記第１及び前記第２の細胞株を選択すること、
を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞株を、前記同定する工程において異なる選択圧下で生育させ、かつ前記培養する工程において選択圧は用いずに生育させる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
細胞バンクを調製する方法であって、
変換工程を触媒する複数の酵素を同定し；
異なる組の前記複数の酵素をコードしており、かつ発現するように準備されている複数の細胞株を同定又は作製し；
前記細胞株に、細胞株がコードしている前記組の酵素を発現する準備を保持させ、細胞株バンクを提供するために、異なる選択圧下又は栄養要求性の生育を可能にする条件下で前記細胞株を増殖させ；及び
異なる組み合わせの前記細胞株を組み合わせ、該組み合わせた細胞株を液体培地中で培養し、ここで、前記酵素が分泌されるか、あるいは前記細胞が溶解しかつ前記酵素が前記培地中に放出されることで、異なる酵素混合物が提供され、かつ前記酵素の前記変換工程を増強する能力を比較する、
ことを含む方法。
【請求項８】
前記第１及び前記第２の細胞株が、それぞれ、前記第１組及び前記第２組の１つ以上の酵素をコードするよう遺伝子操作された同一の細胞株である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第２組の１つ以上の酵素が、前記第２の細胞株により内在的に発現される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１組の１つ以上の酵素のうち少なくとも１つは前記第２の細胞株によりコードされず、かつ前記第２組の１つ以上の酵素のうち少なくとも１つは前記第１の細胞株によりコードされない、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第２組の少なくとも１つの酵素が、前記第１の細胞株によりコードされ、かつ発現されるように準備されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記組み合わせる工程が、第１、第２及び第３の細胞株を組み合わせることを含み、前記第３の細胞株が、第３組の１つ以上酵素をコードし、かつ発現するように準備されている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１組の酵素が、２つ以上の異なる酵素を含み、各々が、前記変換工程を増強する活性を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記培養物中の細胞由来の前記酵素混合物を分離することを更に含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記酵素混合物を基質と組み合わせることを更に含み、前記酵素混合物が、前記基質の生成物への変換を増強する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記基質がセルロース及び／又はヘミセルロースであり、かつ前記生成物がグルコースである、又は
前記基質がデンプンであり、かつ前記生成物が糖である、
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記混合物中の前記酵素の割合を求めることを更に含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記混合物において、前記第１組の酵素に含まれる酵素と前記第２組の酵素に含まれる酵素とのモル比が、前記第１又は前記第２の細胞株のいずれか単独により発現される前記酵素のモル比と比較して少なくとも２倍異なる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２組の酵素の前記酵素が、前記第２の細胞株にとって外来性のものである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
分泌された前記第１組の酵素と分泌された前記第２組の酵素酵素とのモル比が、前記第１又は前記第２の細胞株のいずれか単独により発現される前記酵素のモル比と比較して少なくとも２倍異なる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１の細胞株にとって外来性の前記第１組の酵素と前記第２の細胞株にとって外来性の前記第２組の酵素とのモル比が、前記第１又は前記第２の細胞株のいずれか単独により発現される前記酵素のモル比と比較して少なくとも２倍異なる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記混合物において、前記第１組の酵素のうち最も高発現される酵素と前記第２組の酵素のうち最も高発現される酵素とのモル比が、前記第１又は前記第２の細胞株のいずれか単独により発現される前記酵素のモル比と比較して少なくとも２倍異なる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記モル比が少なくとも５倍異なる、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記モル比の範囲が１：２０〜２０：１である、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記モル比の範囲が１：５〜５：１である、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記モル比の範囲が１：２〜２：１である、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１及び前記第２の細胞株が同じ株である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１及び前記第２の細胞株が、異なる組の１つ以上の外来性酵素を発現するよう改変された同じ株である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１及び前記第２の細胞株が微生物細胞株である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１及び前記第２の細胞株が真菌細胞株の細胞株である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１及び前記第２の細胞株が糸状菌細胞株又は細菌細胞株である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記第１及び前記第２の細胞株が同属の真菌細胞株に由来する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１及び前記第２の細胞株が異属の真菌細胞株である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記第１及び前記第２の細胞株が同属の異種の真菌細胞株である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記第１及び前記第２の細胞株が同種の異なった株の真菌細胞株である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記第１及び前記第２の細胞株が同属の異種の真菌細胞株である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記第１の細胞株が真菌細胞株であり、かつ前記第２の細胞株が細菌細胞株である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記第１及び／又は前記第２の細胞株が真菌細胞株である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記第１及び／又は前記第２の細胞株がトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）細胞株である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記第１及び／又は前記第２の細胞株が細菌細胞株である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記第１及び／又は前記第２の細胞株がバチルス（Bacillus）細胞株である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記組み合わせる工程の前に、前記細胞株の生育特性を決定することを更に含む、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記生育特性に基づき、前記細胞株を混合する際の比を決定することを更に含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞株の生育特性が異なる液体培地において決定される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記異なる液体培地における前記細胞株の前記生育特性に基づき、前記組み合わせた細胞株を培養するための前記液体培地を選択することを更に含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞株の前記生育特性が同じ液体培地において決定される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
前記同じ液体培地における前記細胞株の前記生育特性に基づき、前記組み合わせた細胞株を培養するための前記液体培地を選択することを更に含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞株の生育速度が、前記選択された液体培地において、互いに対し２倍以内である、請求項４６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（優先権）
本出願は２０１１年１２月１３日出願の米国特許仮出願第６１／５７０，２４３号に対する優先権を主張し、その全体が参照により本出願に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
酵素カクテルは多くの工業工程において使用されている。酵素カクテルは、各酵素を別個の細胞株において産生させた後、混合することにより調製することができる。別個に産生及び混合すると、多くの場合、相当な費用が生じることになる。酵素カクテルは、特定のカクテルに所望されるすべての酵素を、遺伝子操作により単一の産生細胞株に導入することによっても製造することができる。この場合、特定の細胞株により発現される酵素は、常に同じ又はほぼ同じ割合で産生されることから、この方法は柔軟性に欠く。このような柔軟性に関する制限は、特に、バイオマスの加水分解及び穀類の加工などの用途のため、この方法により酵素カクテルを製造する際に欠点となる。これらの用途においては、酵素カクテルの選択及び性能は、多くの場合、基質及び／又は前処理法に依存する。異なる基質又は前処理には、異なるブレンドが必要とされる。新しい又は更にはわずかに改変されたブレンドが所望される都度、新しく産生宿主を作製する必要も生じ得る。
【０００３】
異なる細胞株を生育させる際には異なる条件が必要とされることから、細菌細胞株の共培養法の開発には非常に時間がかかると報告されている（Ｄａｓｈｔｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．，５：５７８〜５９５，２００９）。安定的な共培養を同時に樹立するには、培地、並びに例えば、温度、雰囲気、及び炭素源など生育に必要とされる条件が関係すると報告されている（Ｍａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，５：５００〜５１６，２００９）。共培養は、代謝の相互作用（すなわち、栄養共生関係又は基質に対する競合関係）並びにその他の相互作用（すなわち、生育促進又は抗生物質等による生育阻害）によって影響を受けることも報告されている（例えば、Ｍａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，５：５００〜５１６，２００９を参照されたい）。
【０００４】
これまでに、固相（例えば、発酵トレイを用いる）での２種類の真菌株の共発酵が報告されている（例えば、Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：１〜１３，２００８；Ｐａｎｄｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｓｃｉ．，７７：１４９〜１６２，１９９９；Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎ  ＆  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ６５：２４８〜２５２，２０１１；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７３：５３３〜５４０，２００６を参照されたい）。しかしながら、固相での共発酵は難しく、かつ産業規模で酵素の組換え体を産生するにあたり、必ずしも好適なものではない。多くの場合、液内発酵は、より柔軟性があり、例えば、酵素混合物を産生する際に、ペニシリウム種（Penicillium sp.）ＣＨ−ＴＥ−００１及びアスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）ＣＨ−ＴＥ−０１３に対し使用する場合に、より望ましいものであると見なされている（Ｇａｒｃｉａ−Ｋｉｒｃｈｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ＆  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９８：１１０５〜１１１４，２００２）。加えて、従来の、微生物の混合培養法は、異なる条件下で発酵を実施した後、特定の特徴に関し濃縮した培養微生物を得て、次に混合することにより、複雑な培養物を処方するというものであった（例えば、欧州特許第２２９２７３１号を参照されたい）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、変換工程を触媒する酵素混合物を産生する方法を供給する。このような方法は、液体培地中で、第１及び第２の細胞株を組み合わせること、並びに組み合わせた細胞株を培養すること、を包含する。細胞株が酵素を培地中に分泌すること、あるいは溶解して酵素を放出することにより、変換工程を増強するのに有効な比率で酵素混合物が産生される。第１の細胞株は、第１組の１つ以上の酵素をコードしており、かつ発現するように準備されている。第２の細胞株は、第２組の１つ以上の酵素をコードしており、かつ発現するように準備されている。第１及び第２組の酵素は、変換工程を増強する触媒活性を有する。第１組の酵素のうちの１つ以上は、第１の細胞株に対し外来性のものである。第２組の酵素のうち１つ以上は、第２の細胞株に対し外来性のものであるか、又は第１の細胞株によりコードされていないか、若しくは第１の細胞株により、より低レベルで発現されている。一部の方法では、第２組の酵素のうち１つ以上は、第２の細胞株に対し外来性のものであり、あるいは第１の細胞株によりコードされていない。一部の方法では、第２組の酵素のうち１つ以上は、第１の細胞株により、より低レベルで発現される。ある種の方法は、第３、第４、又は更には第５若しくは第６の細胞株も含有し、これらの各細胞株は培地中に酵素を分泌することができ、あるいは溶解して酵素を放出し、それぞれ第３、第４、第５、又は第６組の１つ以上の酵素を発現するように準備されている。これらの追加の酵素組も変換工程を増強する触媒活性を有し、ここで、これらの酵素のうちの１つ以上は各細胞株に対し外来性である。これらの酵素の追加組のうち、１つ以上の酵素は、該酵素を発現している細胞以外の１つ以上の細胞株に対し外来性のものであってよい。
【０００６】
一部の方法は、変換工程を触媒する複数の酵素を同定し、並びに（１）同定された第１組の１つ以上の酵素をコードしており、かつ発現するように準備されている第１の細胞株、及び（２）第２組の１つ以上の酵素をコードしており、かつ該第２組の１つ以上の酵素を発現するように準備されている細胞株を、同定又は作製して、第１及び第２の細胞株を供給すること、を更に包含する。細胞株は、選択圧下又は栄養要求性の生育を可能にする条件下で生育し、その準備を保有し、細胞株バンクを形成する。一部の方法は、変換工程を触媒する異なる組の酵素をコードしており、かつ発現するように準備されており、細胞株を同定又は作製すること、並びに第１及び第２の細胞株を細胞株バンクから選択すること、を更に包含する。本発明の一部の方法には、第３、第４、第５又は更には第６の細胞株を更に包含させることができる。複数の細胞株は、第１組の１つ以上の酵素をコードしており、かつ発現するように準備されている第１の細胞株、及び第２組の１つ以上の酵素をコードしており、かつ発現するように準備されている第２の細胞株を含む。２つを超える細胞株が想到される場合、第３、第４、第５又は第６の細胞株は、第３、第４、第５又は第６組の１つ以上の酵素のうち１つ以上の酵素をコードしており、かつ発現するように準備されている。各複数の細胞株の表現型は、栄養要求性の生育を可能にする選択圧下又は条件下で生育させることにより維持することができる。一部の方法では、細胞株は、同定する工程においては異なる選択圧下で生育させ、かつ培養する工程においては選択圧は用いずに生育させる。
【０００７】
本発明は、細胞バンクを調製する工程を更に供給する。このような方法は、（１）変換工程を触媒する複数の酵素を同定し、（２）異なる複数の酵素組をコードしており、かつ発現するように準備されている複数の細胞株を同定又は作製すること、（３）異なる選択圧下、又は栄養要求性の生育を可能にする選択条件下で細胞株を生育させ、細胞株に、コードしている酵素組を発現する準備を保持させて、細胞バンクを調製すること、並びに（４）異なる組み合わせの細胞株を組み合わせて、組み合わせた細胞株を液体培地中で培養し、酵素が示す、変換工程を増強する能力を比較すること、を含む。酵素が分泌されるか、あるいは細胞が溶解しかつ酵素が培地中に放出されることで、異なる酵素混合物が供給される。
【０００８】
一部の方法では、第１及び第２の細胞株、又はその他の１つ以上の細胞株は、それぞれ、第１及び第２組の酵素、又はこれら以外の１つ以上の組の１つ以上の酵素、をコードするよう遺伝子操作された、同一の細胞株である。一部の方法では、第２組の酵素のうち１つ以上の酵素は、第２の細胞株により内在的に発現される。第３、第４、第５、又は第６の組の酵素のうち１つ以上の酵素は、各細胞株により内在的に発現される。一部の方法では、第１組の酵素の１つ以上の酵素のうち少なくとも１つは第２の細胞株によりコードされておらず、かつ第２組の酵素の１つ以上の酵素のうち少なくとも１つは第１の細胞株によりコードされない。一部の方法では、任意の組の１つ以上の酵素のうち少なくとも１つは、該酵素をコードしている細胞株以外の細胞株のうち少なくとも１つにはコードされない。一部の方法では、第２組の酵素のうち少なくとも１つは、第１の細胞株によりコードされており、かつ発現されるように準備されている。一部の方法では、混合する工程は、第１、第２、及び第３の細胞株を混合することを含み、第３の細胞株は、第３組の酵素のうち１つ以上の酵素をコードしており、かつ発現するように準備されている。一部の方法では、混合する工程は、第１、第２、第３、第４、第５又は第６の細胞株を混合することを含み、ここで、後半の細胞株（すなわち、第１及び第２の細胞株以降の細胞株）は、第３、第４、第５及び第６組の酵素のうち１つ以上の酵素をコードしており、かつ発現するように準備されている。一部の方法では、第１組の酵素は、２つ以上の異なる酵素を含み、各酵素は、変換工程を増強する活性を有する。一部の方法では、各組の酵素は、２つ以上の異なる酵素を含み、各酵素は、変換工程を増強する活性を有する。
【０００９】
一部の方法は、培養物中の細胞から、酵素混合物を分離することを更に含む。一部の方法は、酵素混合物を基質と組み合わせることを更に含み、該酵素混合物は、基質の生成物への変換工程を増強する。一部の方法では、基質はセルロース及び／又はヘミセルロースであり、かつ生成物はグルコースである。一部の方法では、基質はデンプンであり、かつ生成物は糖である。
【００１０】
一部の方法は、混合物中の酵素の比率を測定することを含む。一部の方法では、混合物において、第１組の酵素に含まれる酵素と、第２組の酵素に含まれる酵素とのモル比は、第１又は第２の細胞株のいずれか単独により発現される酵素のモル比と比較して少なくとも２倍異なる。一部の方法では、第２組の酵素に含まれる酵素は、第２の細胞株にとって外来性のものである。一部の方法では、分泌された第１組の酵素と、分泌された第２組の酵素に含まれる酵素とのモル比は、第１又は第２の細胞株のいずれか単独により発現される酵素のモル比と比較して少なくとも２倍異なる。一部の方法では、第１の細胞株にとって外来性の第１組の酵素と、第２の細胞株にとって外来性の第２組の酵素とのモル比は、第１又は第２の細胞株のいずれか単独により発現される酵素のモル比と比較して少なくとも２倍異なる。一部の方法では、混合物において、第１組の酵素のうち最も高発現される酵素と、第２組の酵素のうち最も高発現される酵素とのモル比は、第１又は第２の細胞株のいずれか単独により発現される酵素のモル比と比較して少なくとも２倍異なる。一部の方法では、モル比は少なくとも５倍異なる。一部の方法では、モル比は１：２０〜２０：１の範囲である。一部の方法では、モル比は１：５〜５：１の範囲である。一部の方法では、モル比は１：２〜２：１の範囲である。一部の実施形態では、各酵素組の酵素のモル比は、各細胞株を培養し、酵素組を混合して各酵素に関し望ましい比率を有する混合物を調製することにより求めることができる。
【００１１】
一部の方法では、第１及び第２の細胞株は同じ株である。一部の方法では、複数の細胞株のうち２つ以上の細胞株は同じ株であってよい。一部の方法では、第１及び第２の細胞株は、１つ以上の外来性酵素の異なる組を発現するよう改変された同じ株である。一部の方法では、複数の細胞株のうち、同じ株である２つ以上の細胞株は、１つ以上の外来性酵素の異なる組を発現するよう改変することができる。一部の方法では、第１及び第２の細胞株は、微生物細胞株である。一部の方法では、複数の細胞株のうち１つ以上の細胞株は、微生物細胞株である。一部の方法では、第１及び第２の細胞株は、真菌細胞株である。一部の方法では、複数の細胞株のうち１つ以上の細胞株は、真菌細胞株である。一部の方法では、第１及び第２の細胞株は、糸状菌細胞株であるか、又は微生物細胞株である。一部の方法では、複数の細胞株のうち１つ以上の、又は２つ以上の細胞株は糸状菌細胞株であるか、又は微生物細胞株である。一部の方法では、第１及び第２の細胞株は、同属の真菌細胞株に由来する。一部の方法では、複数の細胞株のうち２つ以上の細胞株は、同属の真菌細胞株である。一部の方法では、第１及び第２の細胞株は、異属の真菌細胞株に由来する。一部の方法では、複数の細胞株のうち２つ以上の細胞株は、異属の真菌細胞株である。一部の方法では、第１及び第２の細胞株は、同属異種の真菌細胞株である。一部の方法では、複数の細胞株のうち２つ以上の細胞株は、同属異種の真菌細胞株である。一部の方法では、第１及び第２の細胞株は、同種の異なった株の真菌細胞株である。一部の方法では、複数の細胞株のうち２つ以上の細胞株は、同種の異なった株の真菌細胞株である。一部の方法では、第１及び第２の細胞株は、同属異種の真菌細胞株である。一部の方法では、複数の細胞株のうち２つ以上の細胞株は、同属異種の真菌細胞株である。一部の方法では、第１株は真菌細胞株であり、かつ第２細胞株は微生物細胞株である。一部の方法では、複数の細胞株のうち少なくとも１つの細胞株は真菌細胞株であり、かつ複数の細胞株のうち少なくとも１つの細胞株は微生物細胞株である。一部の方法では、第１及び／又は第２の細胞株は真菌細胞株である。一部の方法では、複数の細胞株のうち１つ以上の細胞株は、真菌細胞の細胞株である。一部の方法では、第１及び／又は第２の細胞株は、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）の細胞株である。一部の方法では、複数の細胞株のうち１つ以上の細胞株は、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）細胞株である。一部の方法では、第１及び／又は第２の細胞株は細菌細胞株である。一部の方法では、複数の細胞株のうち１つ以上の細胞株は、細菌細胞株である。一部の方法では、第１及び／又は第２の細胞株はバチルス（Bacillus）細胞株である。一部の方法では、複数の細胞株のうち１つ以上の細胞株は、バチルス（Bacillus）細胞株である。
【００１２】
一部の方法は、混合する工程の前に、細胞株の生育特性を決定すること、例えば、生育特性に基き細胞株を混合する際の比を決定することを更に含む。一部の方法では、細胞株の生育特性は異なる液体培地において決定される。一部の方法は、異なる液体培地中における細胞株の生育特性に基づき、組み合わせた細胞株を培養するための、液体培地を選択することを更に含む。一部の方法では、細胞株の生育特性は同一の液体培地において測定される。一部の方法は、同一の液体培地中における細胞株の生育特性に基づき、組み合わせた細胞株を培養する際の液体培地を選択することを更に含む。一部の方法では、細胞株の生育速度は、選択された液体培地において、互いに対し２倍以内である。
【００１３】
用語の定義
本方法に使用した細胞は、任意の種類の生物、例えば、真核生物、原核生物、及び古細菌に由来し得る。好ましくは、細胞は微生物（すなわち、微生物細胞株）に由来し、すなわち細胞は、原核細胞、古細菌、又は単細胞性の生育をすることのできる真菌（例えば、糸状菌又は酵母）などの真核生物、及び藻類である。生物は異なるドメインに分類され得る（例えば、真核生物及び原核生物）。ドメインは、更に、界、例えば、細菌（例えば、真性細菌）；古細菌；原生生物；真菌；植物界；及び動物界に細分される。界は、門、綱、亜綱、目、科、及び属に更に分割される。例えば、真菌由来の属としては、トリコデルマ（Trichoderma）、アスペルギルス（Aspergillus）、皮膚糸状菌（Dermatophytes）、フザリウム（Fusarium）、アオカビ（Penicillum）、及びサッカロミセス（Saccharomyces）が挙げられる。属は更に種に分割される。例えば、トリコデルマ（Trichoderma）由来の種としては、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）、トリコデルマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum）、及びトリコデルマ・コニンギ（Trichoderma koningii）が挙げられる。種は株に分割される。
【００１４】
異なった株は、同種の別個の単離菌である。異なった株は、異なる遺伝子型及び／又は表現型を有する。
【００１５】
「細胞株」は、ＤＮＡ複製に固有であり偶然に生じるランダム変異以外の変化を生じさせずに、インビトロにおいて連続的に（好ましくは不定）生育させかつ分裂させることのできる、ほぼ同一遺伝子性の細胞集団を指すにあたって一般的な感覚で使用される。細胞株は、典型的には単一のコロニーから生育させる。
【００１６】
液内発酵は、少なくとも大部分の細胞を液体培地の液面下で生育させる工程である。
【００１７】
固相発酵は、細胞を固体培地上及び固体培地内で生育させる工程である。
【００１８】
「外来性酵素」は、通常であれば細胞により発現されない酵素（例えば、別の株、種、属又は界由来の異種酵素）、あるいは通常でも細胞により発現されるものの、通常であれば細胞に存在していない遺伝子材料による制御下に置くことで高発現するようになる酵素を意味する。このような発現は、このような酵素をコードしている遺伝子を、通常であれば存在しない位置に導入することにより、あるいは酵素の発現が増加するよう細胞を遺伝子操作することにより、得ることができる。このような遺伝子操作により、酵素の発現を調節する調節エレメントに変更を加えることができ、あるいは酵素の発現を増加させるようトランス作用するタンパク質をコードしている遺伝子材料を導入することができる。
【００１９】
異種核酸（例えば、ＤＮＡ）は、通常であれば細胞中に存在しない（すなわち遺伝子操作により導入された）核酸を意味する。異種核酸は、異なる株、種、属又は界（すなわち、異種）に由来する核酸であってよく、あるいは通常でも細胞中に存在するものの、通常存在しているのと異なる位置に導入された核酸であってもよい。
【００２０】
酵素が通常でも細胞により発現され、かつ酵素をコードしている核酸又は酵素の発現を制御する任意のその他の核酸のいずれも細胞に導入されていない場合、酵素は細胞にとって内在性のものである。内在性遺伝子は、細胞において、通常であれば、ゲノム上の通常の位置に存在する遺伝子を意味する。酵素又は酵素をコードしている核酸が、通常であれば細胞によりコードされておらずかつ遺伝子操作により細胞に導入されたものである場合、細胞にとって異種性のものである。
【００２１】
用語「糸状菌」は、真菌亜門のうち糸状形態をとるものすべてを指す（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．Ｊ．（１９６２），Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい）。これらの真菌は、キチン、セルロース、及びその他の複合多糖からなる細胞壁を有する栄養菌糸を示すことを特徴とする。糸状菌は、酵母とは形態学的に、生理学的に、及び遺伝学的に異なる。糸状菌の栄養生長は菌糸の伸展によるものであり、炭素の異化は絶対好気性である。
【００２２】
細胞は、細胞が、ＤＮＡの発現を可能にする１つ以上の調節エレメントと操作可能に連結された酵素をコードしているＤＮＡを含む場合、酵素を発現するように準備されている。酵素は外来性又は内在性のものであってよい。発現は常時発現型又は誘導型の発現であり得る。酵素をコードしているＤＮＡは、細胞のゲノム又は遺伝子副体上に位置する。異なる細胞株により、２種類の酵素が異なる程度に発現するとされる場合、タンパク質としての各発現レベルに関し、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表される範囲は重複しない。発現レベルは、それぞれ、同密度かつ各細胞株の培養生育段階が同段階である培養物間で比較される。発現レベルは、好ましくは、培養培地に分泌されたタンパク質濃度から求められる。発現レベルは、モル単位、活性ユニット、ＯＤ又はその他の単位で求めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】Ｆｖ３Ｃ翻訳領域を有するｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター。
【図２】ｐＴＴＴ−ｐｙｒ１３−Ｆｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３融合体の発現プラスミドマップ。
【図３】ｐＥＮＴＲ−ＴＯＰＯ−Ｂｇｌ１（９４３／９４２）のプラスミドマップ。
【図４】ＴＯＰＯ  Ｂｌｕｎｔ／Ｐｅｇｌ１−Ｆｖ４３Ｄのプラスミドマップ。
【図５】ＳＤＳゲル電気泳動によるＦｖ４３Ｄ及び（Ｆｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ／Ｂｇｌ３キメラ）の発現の解析。
【図６】２種類のトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）株の共発酵により産生されたＦｖ４３Ｄ及び（Ｆｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ／Ｂｇｌ３キメラ）のＨＰＬＣクロマトグラム。
【図７】トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）ＲＬ−Ｐ３７によるセルラーゼ発現及びＴ．リーゼイ（T. reesei）ＲＬ−Ｐ３７−ｄ／Ｔｒ３Ａによるβ−グルコシダーゼ１（Ｂｇｌ１、又はＴｒ３Ａ）発現のＳＤＳゲル電気泳動解析。
【図８】トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）ＲＬ−Ｐ３７及びＴ．リーゼイ（T. reesei）ＲＬ−Ｐ３７−ｄ／Ｔｒ３Ａの共発酵により産生されたＢｇｌ１（Ｔｒ３Ａ）及びセルラーゼのＨＰＬＣクロマトグラム。
【図９】２種類のＢ．リケニフォルミス（B. licheniformis）株を共発酵することにより産生されたアミラーゼ変異体１及び２のＨＰＬＣクロマトグラム。
【図１０】２種類のＢ．リケニフォルミス（B. licheniformis）株を共発酵することにより産生されたアミラーゼ変異体１及び２のＨＰＬＣクロマトグラム。
【図１１】３種類のトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）株を共発酵することにより産生された（Ｆｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ／Ｂｇｌ３キメラ）、Ｂｇｌ１（Ｔｒ３Ａ）、及びグルコアミラーゼのＨＰＬＣクロマトグラム。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
Ｉ．序論
本発明は、同一の変換工程を触媒する異なる酵素組を発現する異なる細胞株を共培養することによる、酵素カクテルの製造方法を供給する。共培養法は、従来法と比較してより柔軟であり、かつ費用が抑えられる。個々の基質及び前処理法に備え新しく産生株を作製せずとも、必要とされるとおりに各種混合物を製造することができる。所望の酵素混合物を一バッチで作製することにより、複数種の別個の発酵物を混合する必要もなくなる。本方法に従う酵素混合物の調製では、各発酵物をすべて回収する工程は必要とせず、及び／又は各酵素成分を別個に保存する必要もない。更に、各産生株を別個に維持することにより、（単一の産生細胞株に組み込まれた）全カクテルが一度に損なわれることを予防することができる。
【００２５】
ＩＩ．変換工程
変換工程は、基質を、少なくとも２つの酵素により触媒作用させることのできる生成物に変換する工程である。基質は、複数種の分子を含有している植物材料などの複合基質であってよい。生成物は、単一又は複数の生成物であってよい。変換工程は、単工程であってよく、あるいは複数の工程を包含してもよい。工程には、複数の連続的な及び／又は並行した工程を包含させることができる。連続工程、並行工程、又は同じ工程を組み合わせた工程において、異なる酵素を作用させることができる。変換工程例としては、セルロース系バイオマス、グリコーゲン、デンプン及びこれらの各種形態の、糖類（例えば、グルコース、キシロース、マルトース）及び／又はアルコール（例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール）への変換が挙げられる。
【００２６】
一部の変換工程では、デンプン、例えば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、又は大麦デンプン、トウモロコシ固形分、小麦固形分、及び穀類及び塊茎由来のデンプン（例えば、サツマイモ、ジャガイモ、コメ、及びキャッサバデンプン）を、エタノール、あるいは発酵に有用な糖類、特にマルトトリオース、グルコース、及び／又はマルトースを豊富に含むシロップに変換し、あるいは単に、それ自体が生成物として有用である、１つ以上の糖類に変換する。
【００２７】
一部の変換工程は、セルロース並びに／又はヘミセルロース、及びしばしばリグニン、デンプン、オリゴ糖、及び／又は単糖類を含む材料などといった、セルロース又はリグノセルロース系材料に作用する。セルロース又はリグノセルロース系材料は、場合により、更にタンパク質及び／又は脂質などの追加成分を含む。セルロース又はリグノセルロース系材料としては、バイオエネルギー作物、農業廃棄物、都市固形廃棄物、産業固形廃棄物、製紙スラッジ、庭ごみ、木質系廃棄物及び林業廃棄物、例えば、トウモロコシ穂軸、作物残渣、例えば、トウモロコシ皮、トウモロコシ茎葉、イネ科草本、小麦、麦わら、大麦わら、まぐさ、稲わら、スイッチグラス、古紙、サトウキビバガス、ソルガム、暖竹、力芝、ススキ、杉、穀物の製粉から得られる成分、樹木（tress）、枝、根、葉、木片、おがくず、灌木及び低木、野菜、果実、花及び動物の糞尿が挙げられる。セルロース又はリグノセルロース系材料は、単一の資源から由来するものであり得、あるいは１つ以上の資源に由来する混合物を含み得る。例えば、セルロース又はリグノセルロース系材料は、トウモロコシ穂軸及びトウモロコシ茎葉の混合物、又は草本類及び葉の混合物を含み得る。セルロース又はリグノセルロース系基質材料の酵素変換による生成物例は、グルコース及びエタノールである。
【００２８】
他の変換工程では、基質はグルコース、フルクトース、デキストロース、及びスクロース、並びに／又は例えばキシロース及びアラビノースなどの五炭糖類、及びこれらの混合物である。スクロースは、サトウキビ、サトウダイコン、キャッサバ、サトウモロコシ、及びこれらの混合物に由来し得る。グルコース及びデキストロースは、トウモロコシ、小麦、ライ麦、大麦、オーツ麦、及びこれらの混合物などの穀類を含む、デンプン系原料の糖化を介し、再生可能な穀類資源から誘導することができる。発酵性糖は、前処理及び糖化工程を介し、セルロース又はリグノセルロース系バイオマスから誘導することもできる。このような変換工程の生成物は、エタノール又はブタノールなどのアルコールであり得る。
【００２９】
一部の変換工程では、基質は前処理される。前処理は、機械的、化学的、又は生化学的加工又はこれらの加工の組み合わせであり得る。前処理は、自己加水分解、蒸気爆砕、磨砕、細断、ボールミル粉砕、加圧粉砕、照射（radiation）、熱水流通過処理、希酸処理、濃酸処理、過酢酸処理、超臨界二酸化炭素処理、アルカリ処理、有機溶媒処理、及び微生物、例えば、真菌又は細菌などによる処理といった技術を１つ以上含み得る。アルカリ処理は、水酸化ナトリウム処理、石灰処理、湿式酸化、アンモニア処理、及び酸化アルカリ処理を包含し得る。前処理は、リグニンの除去又は変質、ヘミセルロースの除去、セルロースの脱結晶化、ヘミセルロースからのアセチル基の除去、セルロースの重合度の低減、リグノセルロース系バイオマスの細孔体積の増大、リグノセルロースの表面積の増大、又はこれらの任意の組み合わせを包含し得る。
【００３０】
ＩＩＩ．酵素
限定するものではないが、主に６種、すなわちヒドロラーゼ、オキシドレダクターゼ、転移酵素、分解酵素、イソメラーゼ又は合成酵素に分類される酵素を包含する、酵素類から選択される任意の酵素の組み合わせからなるカクテルを製造することができる（国際生化学分子生物学連合命名委員会（ＮＣ−ＩＵＢＭＢ），Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，１９９２）。好適な酵素の例としては、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、フィターゼ、クチナーゼ、フィターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、イソメラーゼ、グルコースイソメラーゼ、エステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マルターゼ、マンナナーゼ、グルクロニダーゼ、ガラクタナーゼ、β−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、ラクターゼ、ポリガラクツロナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、及びコンドロイチナーゼ、又は密接に関係しかつ安定性に劣る任意の既存の相同体が挙げられる。
【００３１】
酵素は、例えば細菌又は真菌など任意の起源に由来し得る。酵素は複合型酵素であってよく、すなわち、機能性酵素である融合タンパク質であってよく、少なくとも１つの部分又は１つの部位は、第１の種に由来し、かつ別の部分又は部位は第２の種に由来する。酵素は、天然の酵素の変異型、切断型、又は混合型であってよい。本方法に好適な酵素は、分泌タンパク質、細胞質タンパク質、核タンパク質、又は膜タンパク質であってよい。細胞外酵素、例えば、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、プロテアーゼ、あるいはアミラーゼなどのデンプン分解酵素は、通常、コード配列のＮ末端部に連結したシグナル配列を有する。
【００３２】
酵素基質の例としては、リグノセルロース系材料、セルロース、ヘミセルロース、デンプン、又はこれらの組み合わせが挙げられる。リグノセルロース系材料の変換を触媒する酵素群の例としては、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、又はセロビオヒドロラーゼ、及びβ−グルコシダーゼが挙げられる。ヘミセルロースの変換を触媒する酵素群の例としては、少なくとも、キシラナーゼ、マンナナーゼ、キシロシダーゼ、マンノシダーゼ、グルコシダーゼ、アラビノシダーゼ、グルクロニダーゼ、及びガラクトシダーゼが挙げられる。デンプンの加水分解を触媒する酵素群の例としては、少なくとも、α−アミラーゼ、糖化α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、及びプルラナーゼが挙げられる。原材料及び前処理法に応じて、追加の酵素、例えば、プロテアーゼ及びフィターゼを選択することができる。
【００３３】
セルラーゼは、セルロース中のβ−Ｄ−グルコシダーゼ結合を加水分解する酵素である。セルロース分解酵素は、従来、主に３種、すなわちエンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ又はセロビオヒドロラーゼ、及びβ−グルコシダーゼに分類される（Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ  ５：２５５〜２６１（１９８７））。セルラーゼ酵素としては、ＥＧ４、スオレニン（swollenin）、エクスパンシン、及びＣＩＰ１といったＧＨ６１メンバーなどのアクセサリー酵素が挙げられる。これまでに数多くのセルラーゼが科学文献において報告されており、例えば、トリコデルマ・リーゼイ由来のもの（Trichoderma reesei）：Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１：６９１〜６９６，１９８３（ＣＢＨＩにより発表）；Ｔｅｅｒｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，５１：４３〜５２，１９８７（ＣＢＨＩＩにより発表）；Ｐｅｎｔｔｉｌａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，４５：２５３〜２６３，１９８６（ＥＧＩにより発表）；Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，６３：１１〜２２，１９８８（ＥＧＩＩにより発表）；Ｏｋａｄａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６４：５５５〜５６３，１９８８（ＥＧＩＩＩにより発表）；Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２４９：５８４〜５９１，１９９７，（ＥＧＩＶにより発表）；並びにＳａｌｏｈｅｉｍｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３：２１９〜２２８，１９９４（トリコデルマ（Trichoderma）以外の種由来のＥＧＶエキソセロビオヒドロラーゼ及びエンドグルカナーゼ）も報告されており、例えば、Ｏｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０はアスペルギルス・アクレアタス（Aspergillus aculeatus）により産生されるエンドグルカナーゼＦ１−ＣＭＣをコードしているｃＤＮＡ配列を報告する；Ｋａｗａｇｕｃｈｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６は、アスペルギルス・アクレアタス（Aspergillus aculeatus）由来のβ−グルコシダーゼ１をコードしているｃＤＮＡのクローニング及び配列決定を報告する；Ｓａｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５は、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）ＩＦＯ  ４３０８由来のエンドグルカナーゼＣＭＣａｓｅ−１をコードしているｃＤＮＡ配列を報告する；並びにＳａａｒｉｌａｈｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０は、エルワイナ・カロトバラ（Erwinia carotovara）由来のエンドグルカナーゼを報告する。
【００３４】
ヘミセルラーゼは、キシラナーゼ、マンナナーゼ、キシロシダーゼ、マンノシダーゼ、グルコシダーゼ、アラビノシダーゼ、グルクロニダーゼ、及びガラクトシダーゼなどのヘミセルロースの分解及び／又は修飾を触媒する酵素である。例えば、ヘミセルラーゼはキシラナーゼであってよく、すなわち、天然又は組み換えにより産生された任意のキシラン分解酵素であってよい。一般的に、キシラン分解酵素は、エンド及びエキソ式にキシランを加水分解するエンド及びエキソキシラナーゼである。キシラン分解酵素の例としては、エンド−１，３−β−キシロシダーゼ、エンド−β１，４−キシラナーゼ（１，４−β−キシランキシラノヒドロラーゼ；ＥＣ  ３．２．１．８）、１，３−β−Ｄ−キシランキシロヒドロラーゼ及びβ−１−４−キシロシダーゼ（１，４−β−キシランキシロヒドロラーゼ；ＥＣ  ３．２．１．３７）（ＥＣ  Ｎｏｓ．３．２．１．３２、３．２．１．７２、３．２．１．８、３．２．１．３７）が挙げられる。糸状菌（例えば、アスペルギルス（Aspergillus）、ジスポートリカム（Disportrichum）、ペニシリウム（Penicillium）、ヒュミコラ（Humicola）、ニューロスポラ（Neurospora）、フザリウム（Fusarium）、トリコデルマ（Trichoderma）及びグリオクラジウム（Gliocladium）属の真菌）又は細菌種（例えば、バチルス（Bacillus）、サーモトガ（thermotoga）、ストレプトミセス（Streptomyces）、ミクロテトラスポーラ（Microtetraspora）、アクチノマヅラ（Actinmadura）、サーモモノスポラ（Thermomonospora）、放線菌（Actinomyctes）及びセファロスポチウム（Cepholosporum））に由来するキシラナーゼが好ましい。
【００３５】
アミラーゼは、デンプン分解酵素であり、デンプン中のα−Ｄ−（１→４）Ｏ−グルコシド結合を切断するヒドロラーゼとして分類される。一般的に、α−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１，α−Ｄ−（１→４）−グルカングルカノヒドロラーゼ）は、デンプン分子内のα−Ｄ−（ｌ→４）Ｏ−グルコシド結合をランダムに切断するエンド作用型酵素として定義される。例えば、β−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２，α−Ｄ−（ｌ→４）−グルカンマルトヒドロラーゼ）などのエキソ作用型アミロース分解酵素、並びにマルトース生成型α−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１３３）などの一部の生成物特異的アミラーゼは、基質の非還元末端からデンプン分子を切断する。β−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２０、α−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ）、グルコアミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．３、α−Ｄ−（ｌ→４）−グルカングルコヒドロラーゼ）、及び生成物特異的アミラーゼは、デンプンから、特定の長さのマルト−オリゴ糖類を生成し得る。
【００３６】
好ましくは、α−アミラーゼは、バチルス種（Bacillus sp.）に由来し、特に、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）又はバチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、並びにゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）に由来し、並びにアスペルギルス（Aspergillus）（すなわち、アスペルギルス・オリゼ（A. oryzae）、及びアスペルギルス・ニガー（A. niger））に由来する真菌α−アミラーゼである。所望により、α−アミラーゼは、α−アミラーゼ前駆体から誘導することができる。α−アミラーゼ前駆体は、α−アミラーゼを産生することのできる任意の資源により産生される。α−アミラーゼの好適な資源は、真菌、細菌、植物又は動物などの原核生物又は真核生物である。好ましくは、α−アミラーゼ前駆体は、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）、又はバチルス（Bacillus）により産生され；より好ましくは、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）又はバチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）により産生され；最も好ましくは、α−アミラーゼはバチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）により産生される。α−アミラーゼはバチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）に由来するものであってもよい。
【００３７】
グルコアミラーゼは、アミログルコシダーゼに分類される酵素である（Ｅ．Ｃ．３．２．１．３、グルコアミラーゼ、１，４−α−Ｄ−グルカングルコヒドロラーゼ）。これらの酵素は、アミロース及びアミロペクチン分子の非還元末端からグルコシル残基を放出する。
【００３８】
プルラナーゼはデンプン脱分岐酵素である。プルラナーゼはＥＣ  ３．２．１．４１に分類される酵素であり、この酵素は、例えば、アミロペクチン及びプルラン中の、α−１，６−グリコシド結合を加水分解する能力により特徴づけられる。
【００３９】
他の酵素としては、例えば、セリン、メタロ、チオール、又は酸プロテアーゼなどのプロテアーゼが挙げられる。セリンプロテアーゼ（例えば、スブチリシン）は、例えば、Ｈｏｎｎｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ  Ｚ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ３６４：１５３７〜１５４０，１９８３；Ｄｒｅｎｔｈ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６：１７７〜１８１，１９７２；米国特許第４，７６０，０２５号（ＲＥ  ３４，６０６）、同第５，１８２，２０４号及び同第６，３１２，９３６号並びに欧州特許第０  ３２３，２９９号に記載される。タンパク質分解活性は、Ｋ．Ｍ．Ｋａｌｉｓｚ，「Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ」Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａ．Ｆｉｅｃｈｔ  Ｅｄ．１９８８に記載されるとおりに測定することができる。
【００４０】
フィターゼは、フィターゼの（１）ミオイノシトール及び／又は（２）これらの一、二、三、四、及び／又は五リン酸、並びに（３）無機リン酸への加水分解を触媒する酵素である。例えば、フィターゼをとしては、ＥＣ番号３．１．３．８、又はＥＣ番号３．１．３．２６により定義される酵素が挙げられる。
【００４１】
ＩＶ．細胞株
既刊文献から、及び／又は変換工程を増強するものと見込まれる酵素のうち１つ以上の酵素の組み合わせを試験することにより、異なる組の酵素を発現する細胞株を同定し、又はこのような異なる組の酵素を発現するように細胞株を作製する。ある種の細胞株により内在的に発現される酵素は公知である。例えば、トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）は、複数種のセルロースプロセシング酵素の資源となり、及びバチルス（Bacillus）は、数多くのアミラーゼの資源となる。このような細胞株は、しばしば改変させずに使用される。しかしながら、多くの場合、酵素による変換工程を増強するのに望ましい１つ以上の酵素は、既存の細胞株では、内因的には十分に発現されない。この場合、既存の細胞株を遺伝子操作して酵素を外因的に発現させることができる。既存の細胞株では、変換工程を増強するのに望ましい複数種の酵素が十分に発現されない場合には、既存の細胞株を遺伝子組換えして、各酵素を外因的に発現させることができる。モジュール性を最大にするため、このような各酵素を細胞株それ自体に外因的に発現させることができる。好ましくは、異なる酵素を導入した細胞株は、遺伝子操作により、同じ親細胞株からの改変を示す。
【００４２】
内在性の発現、外来性の発現、あるいは両方の結果として、共培養される細胞株は異なる酵素組又は一連の酵素を発現することができ、これらの酵素のすべては酵素による変換を増大させるよう寄与する。変換工程を増強する任意の内在的に酵素を発現せず、かつ１種以上の外来性酵素を発現するよう遺伝子操作をなされた細胞株に関しては、細胞株により産生される酵素組又は一連の酵素は「外来性酵素を含む」とされる。変換工程を増強する任意の内在的に酵素を発現し、かつ１種以上の外来性酵素を発現するよう遺伝子操作をなされた細胞株に関しては、細胞株により産生される酵素組又は一連の酵素は「内在性酵素及び外来性酵素を含む」とされる。外来性酵素を発現するよう遺伝子操作をなされていない細胞株では、細胞株により産生される酵素組又は一連の酵素は「内在性酵素のみを含む」とされる。一連の外来性酵素は容易に知られかつ認識されるものの、これは内在的に酵素が微量に発現している場合には必須ではない。この理由から、酵素組又は一連の酵素は、実施例において使用される条件及び／又はプロトコールに従ってＨＰＬＣにより測定されるものとして検出可能な程度に発現した酵素のみを含むものとして定義される。好ましくは、組中の各酵素は、この組において最も高発現した酵素の少なくとも１／１００又は１／１０程度に発現され、及び／又は分泌される。本方法の実施に際し、組内に含まれるすべての酵素の同一性を把握する必要はない。むしろ、所定の細胞株により産生される組内の少なくとも１つの酵素の同一性を把握すれば十分である。
【００４３】
ある種の細胞株によりコードされる酵素組は、第２の細胞株によりコードされる酵素組と全く重ならず、又は一部若しくは完全に重なり得る。第１の細胞株の第１組中に存在する酵素及び第２の細胞株の第２組中に存在する酵素は、異なる程度に発現されてもよい。組み中の酵素の同一性が完全に重なり合う場合、少なくとも１つの酵素は組間で異なる程度に発現される（すなわち、平均標準誤差（ＳＥＭ）は重なり合わない）。好ましくは、各酵素組には、共培養時に包含される他の細胞株由来の他の酵素組において発現されていない又はより低レベルで発現される少なくとも１つの酵素を含む。好ましくは、変換工程を触媒する１組の酵素（例えば、第１組）中の少なくとも１つの酵素は、同じ酵素組を発現する細胞株（例えば、第１細胞株）にとって外来性のものである。好ましくは、共培養に含有させる任意の細胞株のうち、外来性酵素を発現しないものは内在的に酵素を発現し、この内在性酵素は、共培養に含有させる他の細胞株では発現されず、あるいは非常にわずかに発現する。１組の酵素が外来性酵素を含有し、かつそれ以外のすべての組の酵素が内在性酵素である場合、他の組を発現している細胞株は、第１の細胞株とは異なる株、種、又は属であり得る。あるいは、１つの細胞株は外来性酵素を発現するよう改変された親株あるいは細胞株となり、かつ別の細胞株は改変をなされていない親株又は細胞株となり得る。改変させた細胞株と親細胞株を同時発現させた場合、望ましくないことに、親細胞株により産生される内在性酵素に対する外来性酵素の相対濃度が希釈される恐れもあるものの、実際の所、改変を行うことにより、内在性酵素の発現を著しく抑制し、変換工程を増強することもできる。この状況では、改変した細胞株と親株又は細胞株との共培養により、いずれかの細胞株を単独で培養した場合よりも効果的な割合で外来性及び内在性酵素の混合物を得ることができる。
【００４４】
２つ以上の細胞株を共培養することにより、酵素の異なる組を同時に発現させて、各細胞株単独の場合と異なる酵素比又は酵素活性を得ることができる。好ましくは比はモル数によるものであるが、活性単位、質量又は他の単位を使用することもできる。
【００４５】
任意の酵素比は、１）共培養により得られた酵素混合物中の、第１組の酵素及び第２組の酵素間の差異、並びに２）１つの又は両方の個々の細胞株を決定することにより比較することができる。このような比較は、第１組において最も高発現されている酵素と、第２組において最も高発現されている酵素との対比較に基き、最も容易に実証される（発現は、タンパク質、又は分泌タンパク質の発現程度として測定される）。いずれかの別個の細胞株では、このような酵素の割合は、酵素混合物のものと比較して好ましくは少なくとも２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０倍異なる。例えば、第１組において最も高発現している酵素と、第２組において最も高発現している酵素を、共培養により得られる混合物中でモル比１：１で発現させ、及び第１細胞株においては１０：１比、かつ第２細胞株においては１：１０比で発現させる。したがって、混合物中のモル比は、互いの細胞株と比較して１０倍異なる。対比較又は群比較は、第１組又は第２組中の任意の他の酵素間になすことができる。比較に使用する分類は、例えば、各組中の分泌された酵素、各組中の細胞内酵素、各組中の外来性酵素、又は各組中の組換えタグを有する酵素として定義することができる。
【００４６】
同様に、第１の組中の既知の酵素のモル量と、第２の組中の酵素のモル量を要約し（あるいは少なくともこれらのモル濃度は既知）、算出する、ことにより、第１及び第２の組間の酵素比を比較することができる。このような比は、好ましくは、１：５０〜５０：１、１：４５〜４５：１、１：４０〜４０：１、１：３５〜３５：１、１：３０〜３０：１、１：２５〜２５：１、１：２０〜２０：１、１：１０〜１０：１、１：５〜５：１、又は１：２〜２：１である。
【００４７】
１つ以上の外来性酵素を発現するよう、従来法により細胞株を遺伝子操作する。このような方法のうち一部のものでは、確実に発現させるために制御配列に操作可能に連結した酵素をコードしている核酸により、細胞株を形質転換させる。所望により、酵素を組み換えタグ（例えば、Ｈｉｓ−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、ＧＳＴ、ＨＡ−タグ、ＭＢＰ、Ｍｙｃ−タグ）と融合させて、共培養物又は共培養により得られる酵素混合物からの検出又は定量を容易にすることもできる。また、好ましくは酵素をコードしている核酸をシグナルペプチドと融合して、分泌させることもできる。宿主生物において発現及び分泌させる酵素に応じて、任意の好適なシグナルペプチドを使用することができる。シグナル配列の例としては、ストレプトミセス（Streptomyces）セルラーゼ遺伝子由来のシグナル配列が挙げられる。好ましいシグナル配列は、ストレプトミセス・リビダンス（S. lividans）セルラーゼ、ｃｅｌＡである（Ｂｅｎｔｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１７：１４１〜１４７，２００２）。次に、核酸は、エピソームに対する形質転換の結果として、あるいは染色体への組み込みを介して、好ましい安定性を維持する。あるいは、染色体において酵素をコードしているＤＮＡの、シス配列又はトランス因子を活性化することにより、酵素の発現を誘導することもできる。
【００４８】
細胞株を遺伝子操作して外来性遺伝子を発現させることに加えて、細胞株を遺伝子操作して、変換工程を阻害する生成物をコードしている内在的に遺伝子の発現を阻害又はノックアウトすることが望ましい場合もある。阻害又はノックアウトストラテジを使用して、不必要な遺伝子を除去すること、あるいは内在性遺伝子を置き換えることもでき、並びに不必要な遺伝子を、改良型の遺伝子、遺伝子変異体及び／又は異種型遺伝子により置き換えることもできる。このような阻害又はノックアウトは、ｓｉＲＮＡ、Ｚｎフィンガータンパク質、特定の内在的に遺伝子の発現をノックアウト又は減少させる、その他の既知の分子生物学的手法、又は同様物により実施することができる。
【００４９】
共培養のために組み合わせた細胞株は、異なる又は同一のドメイン、界、門、綱、亜綱、目、科、属、又は種に由来し得る。これらの細胞株は、異なる種の異なる株、同じ種の異なる株、又は同じ株にも由来し得る。
【００５０】
組み合わせの例としては、同じ種の異なる株に由来する細胞株が挙げられる（例えば、トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）ＲＬ−Ｐ３７（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ  ａｎｄ  Ｍｏｎｔｅｎｅｃｏｕｒｔ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４６〜５３，１９８４）及びＴ．リーゼイ（T. reesei）ＱＭ−９４１４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２６９２１；Ｕ．Ｓ．Ａｒｍｙ  Ｎａｔｉｃｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにより単離）。同じ界（例えば、真菌）の異なる種の異なる株に由来する細胞株を使用することができる（例えば、トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）ＲＬ−Ｐ３７及びアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger））。異なる界／ドメインの異なる種の異なる株に由来する細胞株を使用することもできる（例えば、細菌、酵母、菌類、藻類、及び高等真核細胞（植物又は動物細胞））。組み合わせの例としては、更に、細菌（例えば、バチルス・スブチリス（B. subtilis）又は大腸菌（E. coli））及び真菌（例えば、トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）又はアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger））；細菌及び酵母（例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）又はピキア（Pichia））；酵母及び真菌；細菌及び藻類、酵母及び藻類、並びに真菌及び藻類が挙げられる。
【００５１】
同一の親株由来の２つ以上の細胞株を遺伝子操作する場合（例えば、トリコデルマ・リーゼイT. reesei）、ＲＬ−Ｐ３７又はバチルス・スブチリス（B. subtilis））、各細胞株には１つ以上の外因酵素をコードさせてよい。所望により、同一の細胞株を遺伝子操作して、親株において遺伝子を抑制又は阻害、例えば、通常の発現レベルの少なくとも５０％、７５％、又は９０％だけ抑制又は阻害することもできる。
【００５２】
本方法に好適な細胞株としては、細菌、酵母、真菌、及び高等真核細胞の細胞株、例えば、植物又は動物細胞の細胞株などが挙げられる。微生物細胞株が好ましい。
【００５３】
細胞株は酵母細胞株であってよい。酵母細胞の例としては、サッカロミセス（Saccharomyces sp.）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces sp.）、ピキア（Pichia sp.）、ハンゼヌラ（Hansenula sp.）、クリベロミセス（Kluyveromyces sp.）、プルタフィア（Prtaffia sp.）、又はカンジダ（Candida sp.）、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、ハンゼヌラ（Hansenula polymorpha）ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ピキア・カナデンシス（P. canadensis）、クリベロミセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）、及びファフィア・ロドザイマ（Phaffia rhodozyma）を挙げることができる。
【００５４】
細胞株は真菌細胞株であってよい。真菌の例としては、アスペルギルス・オリゼ（A. oryzae）及びアスペルギルス・ニガー（A. niger）などアスペルギルス（Aspergillus）属の種、サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）などサッカロミセス（Saccharomyces）属の種、シゾサッカロミセス・ポンベ（S. pombe）などシゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属の種、並びにトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）などトリコデルマ属（Trichoderma）の種である。
【００５５】
真菌の好ましい例としては、糸状菌細胞が挙げられる。親細胞が糸状菌である場合、細胞は、限定するものではないが、トリコデルマ属（例えば、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、これまでＴ．ロンギブラキアタム（T. longibrachiatum）として分類されていたヒポクレア・ジェコリナ（Hypocrea jecorina）の無性形態、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）、トリコデルマ・コニンギ（Trichoderma koningii）、トリコデルマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum））（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０：４６〜５３，１９８４；ＡＴＣＣ番号５６７６５及びＡＴＣＣ番号２６９２１）、ペニシリウム（Penicillium sp.）、ヒュミコラ（Humicola sp.）（例えば、ヒュミコラ・インソレンス（H. insolens）、ヒュミコラ・ラヌギノス（H. lanuginose）、又はヒュミコラ・グリセア（H. grisea）、クリソスポリウム（Chrysosporium sp.）（例えば、クリソスポリウム・ラックノウエンス（C. lucknowense））、グリオクラジウム（Gliocladium sp.）、アスペルギルス（Aspergillus sp.）（例えば、アスペルギルス・オリゼ（A. oryzae）、アスペルギルス・ニガー（A. niger）、ショウユコウジカビ（Aspergillus sojae）、ショウユコウジカビ（A. japonicus）、アスペルギルス・ニデュランス（A. nidulans）、又はアワモリコウジカビ（A. awamori））（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９：７３８０７４３，１９９３  ａｎｄ  Ｇｏｅｄｅｇｅｂｕｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ  ４１：８９〜９８，２００２）、フザリウム（Fusarium sp.）（例えば、フザリウム・ロゼウム（F. roseum）、フザリウム・グラミニウム（F. graminum）、フザリウム・セレアリス（F. cerealis）、フザリウム・オキシスポラム（F. oxysporuim）、又はフザリウム・ベネナタム（F. venenatum））、ニューロスポラ（Neurospora sp.）（例えば、ニューロスポラ・クラッサ（N. crassa））、ヒポクレア（Hypocrea sp.）、ムコール（Mucor sp.）（例えば、ムコール・ミエヘイ（M. miehei））、リゾプス（Rhizopus sp.）及びエメリセラ（Emericella sp.）（同様に、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＳｃＬ．２２８：２１〜２６，１９８５を参照されたい）に属する。用語「トリコデルマ（Trichoderma）」又は「トリコデルマ（Trichoderma sp.）」又は「トリコデルマ（Trichoderma spp）」は、これまでに又は現在トリコデルマ（Trichoderma）として分類されている任意の真菌属を指す。真菌は、アスペルギルス・ニデュランス（A. nidulans）、アワモリコウジカビ（A. awamori）、アスペルギルス・オリゼ（A. oryzae）、アスペルギルス・アクレアタス（A. aculeatus）、アスペルギルス・ニガー（A. niger）、ショウユコウジカビ（A. japonicus）、トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）、トリコデルマ・ビリデ（T.viride）、フザリウム・オキシスポラム（F. oxysporum）、又はフザリウム・ソラニー（F. solani）である。アスペルギルス株は、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９：７３８〜７４３，１９９３、及びＧｏｅｄｅｇｅｂｕｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  ４１：８９〜９８，２００２に公開されている。これらの文献に記載される内容を、特に真菌に関し、それぞれ参照により、本開示に明示的に援用する。好ましくは���真菌は、トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）株などのトリコデルマ（Trichoderma）株である。トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）株は既知であり、非限定的な例としては、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１３６３１、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２６９２１、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．５６７６４、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．５６７６５、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．５６７６７、及びＮＲＲＬ１５７０９が挙げられる。これらの文献に記載される内容を、特にＴ．リーゼイ株に関し、それぞれ参照により、本開示に明示的に援用する。宿主株は、ＲＬ−Ｐ３７に由来し得る（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：４６〜５３，１９８４）。
【００５６】
細胞株は細菌細胞株であってよい。本方法に好適な細菌細胞の例としては、グラム陽性菌（例えば、ストレプトミセス（Streptomyces）及びバチルス（Bacillus））並びにグラム陰性菌（例えば、大腸菌（Escherichia coli）及びシュードモナス（Pseudomonas sp.））が挙げられる。好ましい例としては、例えば、バチルス・リケニホルミス（B. lichenformis）又はバチルス・スブチリス（B. subtilis）などのバチルス（Bacillus）株、ラクトバチルス（Lactobacillus）株、ストレプトコッカス（Streptococcus）株、例えば、パントエア・シトレア（P. citrea）などのパントエア（Pantoea）株、例えば、シュードモナス・アルカリゲネス（P. alcaligenes）などのシュードモナス（Pseudomonas）株、ストレプトミセス・アルバス（S. albus）、ストレプトミセス・リビダンス（S. lividans）、ストレプトミセス・ムリナス（S. murinus）、ストレプトミセス・ルビギノサス（S. rubiginosus）、Ｓ．セリカラー（S. coelicolor）、又はＳ．グリセウス（S. griseus）などのストレプトミセス（Streptomyces）株、あるいは、例えば、大腸菌（E. coli）などのエシェリキア（Escherichia）株が挙げられる。「バチルス（Bacillus）」属には、当業者に既知である通り、「バチルス（Bacillus）」のすべての種が包含され、例えば、限定するものではないが、バチルス・スブチリス（B. subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（B. licheniformis）、バチルス・レンタス（B. lentus）、バチルス・ブレビス（B. brevis）、バチルス・ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィルス（B. alkalophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、バチルス・クラウシィ（B. clausii）、バチルス・ハロドュランス（B. halodurans）、バチルス・メガテリウム（B. megaterium）、バチルス・コアギュランス（B. coagulans）、バチルス・サーキュランス（B. circulans）、バチルス・ロータス（B. lautus）、及び、バチルス・チューリンゲンシス（B. thuringiensis）が包含される。バチルス属は分類上の再編成を受け続けるものと認識される。したがって、この属が、例えば、現在では「ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス（Geobacillus stearothermophilus）」という名称であるバチルス・ステアロサーモフィラス（B. stearothermophilus）などの生物が挙げられるがこれに限定されない、再分類された種を含むことが意図される。酸素存在下での、耐久性の高い内生胞子の形成は、バチルス属を定義する特性であると考慮されるものの、この特性は、現在、アリシクロバチルス（Alicyclobacillus）、アムピバチルス（Amphibacillus）、アネウリニバチルス（Aneurinibacillus）、アノキシバチルス（Anoxybacillus）、ブレビバチルス（Brevibacillus）、フィロバチルス（Filobacillus）、グラシリバチルス（Gracilibacillus）、ハロバチルス（Halobacillus）、パエニバチルス（Paenibacillus）、サリバチルス（Salibacillus）、サーモバチルス（Thermobacillus）、ウレイバチルス（Ureibacillus）、及びバルジバチルス（Virgibacillus）と命名されている属にも当てはまる。
【００５７】
細胞株は植物細胞株であってもよい。植物細胞の例としては、マメ亜科などのマメ科由来の植物細胞が挙げられる。本方法に好適な植物細胞の例としては、クズ（kudzu）、ポプラ（poplar）（例えば、ギンドロ（Populus alba）ｘトレムラ（tremula）ＣＡＣ３５６９６又はギンドロ（Populus alba））（Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５７９（１１）：２５１４〜２５１８，２００５）、ａｓｐｅｎ（例えば、ヤマナラシ（Populus tremuloides）など）、又はヨーロッパナラ（Quercus robur）由来の植物細胞が挙げられる。
【００５８】
細胞株は、藻類細胞、例えば、緑藻類、紅藻類、灰色藻類、クロララクニオン藻類、ミドリムシ類、クロミスタ類又は渦鞭毛藻類であってもよい。
【００５９】
細胞株は、形態に基づきシアノバクテリアの次の群：クロオコッカス（Chroococcales）、プレウロカプサ（Pleurocapsales）、ユレモ（Oscillatoriales）、ネンジュモ（Nostocales）、又はスティゴネマ（Stigonematales）のいずれかに分類される、シアノバクテリア細胞である。
【００６０】
細胞株は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、ＣＯＳ細胞、あるいはその他の不死化細胞株、例えば、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関から入手可能な細胞株などの、哺乳類細胞であってもよい。
【００６１】
一部の方法では、第１の細胞株は、外来性β−キシロシダーゼをコードしているトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）株であり、かつ第２の細胞株は、外来性β−グルコシダーゼをコードしているトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）株である。
【００６２】
一部の方法では、第１の細胞株はバチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）アミラーゼをコードしているバチルス・リケニフォルミス（B.licheniformis）株であり、かつ第２の細胞株は、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）アミラーゼをコードしているバチルス・リケニフォルミス（B.licheniformis）株である。
【００６３】
例えば、一部の方法では、第１の細胞株は、外来性ＧＨ６１酵素をコードしているトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）株であり、かつ第２の細胞株は、外来性又は内在性セルラーゼを発現しているトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）株である。
【００６４】
Ｖ．共培養法
一部の実施形態では、共培養する細胞株を、最初に別個に培養して、種培養液を得ることができる（好ましくは、種培養液の吸光度は、波長６００ｎｍ及び光路長１ｃｍにおいて、少なくとも約０．１、０．２、０．４、０．８、１．０、又は１．５）。次に、この種培養液を、当量の又はその他の望ましい割合の（以降に詳細に記載する）新しい培地と混合し、種共培養液を得る。所望により、単離細胞を、タンパク質産生用の培養培地に直接（例えば、種培養は行わずに）播種することもできる。
【００６５】
１つの細胞株から別の細胞株を生育させる際の潜在的な課題は、細胞株を選択することにより、例えば、固有の生育特性が類似している密接に関係する細胞株を選択し、少なくとも１つの細胞株にとっては最適なものではないものの、別個の培養培地で各細胞株を生育させた場合に生育の差異が軽減される培養培地を選択することにより、並びに／あるいは体積比を、更に正確に言えばＯＤ又は細胞数を調整し、生育特性の差異が補償されるよう培地を組み合わせることにより、軽減させることができる。
【００６６】
密接に関係する細胞株のうちの１つの資源は、同種（例えば、トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei））又は同じ株由来の細胞株であり、あるいはより好ましくは、異なる外来性酵素を発現するよう別の手法により改変された同一の親株又は細胞株由来のものである。例えば、第１の細胞株は、酵素Ａを発現するよう遺伝子操作された親細胞株であり、かつ第２の細胞株は、酵素Ｂを発現するよう遺伝子操作された親株である。
【００６７】
細胞共培養の際に細胞株を組み合わせる前に、各細胞株の生育特性を求めることができる。次に、規定の生育特性に基づき、第１の酵素組及び第２の酵素組（又は第３組以上の酵素組）の共発現を最適化する際の細胞株の混合比又は混合比の範囲を求めて、生育特性の少なくとも一部を補償することができる。
【００６８】
任意の細胞培養系では、播種後に、誘導期、生育促進期（accelerated growth phase）、対数生育期又は「ｌｏｇ」期、生育減退期（negative growth acceleration phase）、定常期又は静止期、などの特徴的な生育パターンが示される。対数生育期及び定常期により、細胞株、対数生育中の集団倍加時間、生育速度、及び定常期に得られる最大細胞密度についての情報が得られる。例えば、持続的な生育を示す対数生育期では、細胞は最高速度で細胞分裂を行い、細胞数は時間に対し対数関数的に増加する。特定の時間に一度計数を行い、ｌｏｇ間中で間隔を開けた後で２度目の計数を行い、経過時間を把握することにより、細胞分裂又は倍加の総回数、生育速度及び世代時間を算出することができる。
【００６９】
集団倍加時間を測定して、連続継代時の培養物をモニターし、細胞収率並びに継代培養時に必要とされる希釈係数を算出することもできる。集団倍加時間は、平均的な数値であり、かつ培養時の広範な細胞分裂速度をもとに最終的に得られる。細胞の種類、培養容器及び条件を変更することで、倍加時間にも違いが出てくる。規定の生育特性を利用して、共培養に使用した各細胞株の集団倍加時間を求めることができる。好ましくは、共培養される細胞株の指数的増加時の集団倍加時間は、互いに対し２又は５倍以内である。例えば、共培養に選択される細胞株の指数的増加時の集団倍加時間は、互いに対し２、３、４、又は５倍以内である。生育速度がより大幅に異なる場合には、好ましくは培養培地に変更を加え、集団倍加時間がより類似する、好ましくは互いに対し２又は５倍以内である培養培地を特定する。例えば、培養培地により供給される成分及び条件を調整し、かつ利用し、細胞株の対数生育時の集団倍加時間における差異が互いに対し２又は５倍以内になるよう、差異を軽減させることができる。更に、最初に、一般的な培養培地を利用して、生育特性における差異がわずかになるよう細胞株を選択した後、生育特性の差異が更にわずかになるよう、培養培地／条件を調整することができる。
【００７０】
第１の細胞株によりコードされる酵素組対第２の細胞株によりコードされる酵素組の最適比は、必ずしも事前に判明するものではない。異なる体積比、ＯＤ又は細胞数で細胞株を組み合わせて、小規模実験により異なる比を比較して、このような解析により求められた最適比を以降の大規模培養に使用することができる。
【００７１】
許容できないほどに１つ以上のその他の細胞株を打ち負かす（例えば、他の細胞株よりも急速に生育することにより、及び他の細胞株の生育を抑制することにより、他の細胞株を打ち負かす）細胞株を存在させないよう、細胞株は、ほぼ同時に生育曲線中の所定のポイントに達するような比にすることができる。例えば、各細胞株がほぼ同時に対数生育期中期に達するよう割合を調整することができる。あるいは、各細胞株はほぼ同時に定常期（定常期中期）に達する。好ましくは、各細胞株は、対数生育期中期及び定常期のいずれもでほぼ同時に達する。場合により、各細胞株は、ほぼ同時に静止期に達する。
【００７２】
生育特性を利用して、２つ／３つ以上の細胞株間で、特定の割合での回収時細胞密度を得るのに必要とされる回収時間及び／又は播種密度を求めることもできる。例えば、ある種の基質／前処理法に関しては、等モル比の異なる酵素組が望ましい場合がある。他の種類の基質／前処理法に関し、所望される酵素の割合が異なる場合、１つ以上の細胞株の播種密度並びに回収時間を変更して、これを達成することができる。
【００７３】
各細胞株は、特に、異なる生物（例えば、異なるドメイン、界、属、又は種）、又は異なる株に由来する細胞株に関しては、培養培地中で最適生育に必要とするものが異なる可能性がある。しかしながら、任意の単一の細胞株に関しては最適ではないものの、この培地ではすべての細胞株が類似する生育特性を示す場合、この培地はすべての細胞株の共発酵に最適なものであり得る。適宜、複数の培養培地において、各細胞株の生育特性を求めることができる。次に、これらの生育特性を比較して、細胞株の生育特性が最も類似する培養培地を特定する。例えば、このような培地において、各細胞株は、同時に定常期（定常期中期）生育期中期及び／又は静止期に達する。選択された培養培地を次に共培養に使用する。
【００７４】
細胞密度に基づき生育特性を決定する代わりに、あるいはこれに組み合わせて、酵素量及び／又は発現した酵素の活性を生育曲線に沿って測定することができる。生育曲線に従いこれらが変動することにより、酵素の最適な同時発現に際し細胞株を混合する割合を決定する際の指針がもたらされる。例えば、一部の酵素の発現レベルは、その他の酵素のものよりも低い場合がある。これらの酵素に関しては、これらの低発現型の酵素を所望の量で得るために、この酵素を発現する細胞株をより高密度に播種することが好ましい。
【００７５】
同じ株由来の細胞株は、通常、類似する生育特性を有し、かつ類似する培養培地を必要とする。それに対し、異なる株又は異なる生物由来の細胞株は、多くの場合異なる生育特性を有し、かつ異なる培養培地を必要とする。上述のように、異なる細胞株の生育特性を決定して、各細胞株の播種密度を決定することができる。場合により、各細胞株の、各種培養培地における生育特性を決定して、共培養に好適な培地を決定する。
【００７６】
酵素は直接培養培地に放出され得る。あるいは、細胞の溶解により細胞内酵素が放出され得る。更に、所定の細胞株により発現される一部の酵素は直接放出されるのに対し、他の酵素は細胞の溶解により放出される場合がある。放出された酵素は、分泌又は溶解のいずれで得られた場合にも培養培地から回収することができ、あるいは全ブロスとして更に何らかの加工を行う場合には、培養培地をそのまま最小量使用することができる。細胞片（例えば、宿主細胞、溶解断片）は、所望により、例えば、必要に応じて遠心分離又は限外濾過により除去することができる。所望により酵素混合物は、例えば、市販のタンパク質濃縮フィルタにより濃縮することができる。酵素混合物は、１つ以上の精製工程、例えば、イムノアフィニティクロマトグラフィー、イオン交換カラムによる分取（例えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）又はカルボキシメチルもしくはスルホプロピル基を含有する担体）、Ｂｌｕｅ−セファロース、ＣＭ  Ｂｌｕｅ−セファロース、ＭＯＮＯ−Ｑ、ＭＯＮＯ−Ｓ、レンチルレクチンセファロース、ＷＧＡ−セファロース、Ｃｏｎ  Ａ−セファロース、Ｅｔｈｅｒ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、Ｂｕｔｙｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、又はプロテインＡセファロースでのクロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィー、シリカクロマトグラフィー、等電点電気泳動法、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、ゲルろ過、例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘモレキュラーシーブ又は分子ふるいクロマトグラフィーを使用したゲルろ過、選択的にペプチドを結合したカラムでのクロマトグラフィー、及びエタノール、ｐＨ又は硫安沈殿、膜濾過並び各種手法により、他の不純物から更に分離することができる。一部の方法では、更に何らかの加工を行う場合、最小量を用いて酵素混合物が下流の用途において使用される。
【００７７】
細胞から又は最終生成物中に分泌又は溶解される酵素量は、従来技術を用いて、例えば、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、又はドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定することができる。同様に、酵素活性は、当該技術分野で公知の方法を用い測定することができる。
【００７８】
ＶＩ．細胞バンクの作製
異なる酵素組を発現している細胞株を細胞バンクで保管し、異なる組み合わせで共培養することができる。特定の変換工程を有する、あるいは変換を考慮して特定の組を有する、細胞バンクを構築することができる。変換工程を増強する酵素は、既知の若しくは報告されている資源から、又は実験により、あるいはこれらの両方から特定することができる。次に、酵素組をコードしており、かつ異なる酵素組を発現するように準備されている細胞株を特定又は作製する。内在性又は外来性の１つ以上の酵素を発現している細胞株は既に既知である場合がある。特定の酵素又は特定の酵素の組み合わせ又は一連の酵素を十分な程度に発現している細胞株が存在しない場合、１つ以上の酵素を外因的に発現している細胞株を特に作製することもできる。
【００７９】
バンクにおいて、細胞株は、固相培地又は液体培地で冷凍又は凍結させて保管することができる。使用前に、細胞のバイアルを典型的には別個に増殖させて種培養を生成する。これも同様に液体又は固相培地で実施することができる。異なる選択圧下で細胞株を増殖及び保管することにより、各酵素組の発現を得てかつ潜在的な相互汚染を回避することができる。あるいは、栄養要求株の生育を可能にする条件下で細胞株を増殖及び保管することにより、遺伝型を維持することができる。
【００８０】
細胞株を共培養し、使用することにより、上記の方法を用い酵素混合物を製造することができる。組み合わせた後、組み合わせた細胞株を入れた培地中で細胞株を増殖させることで、共培養工程において必ずしも、選択条件、又は細胞株を別個に生育させかつ保管するために使用することのできる栄養要求性の生育を可能にする条件を使用する必要はなくなる。
【００８１】
細胞バンクにより、変換工程を増強する酵素を異なる組み合わせで又は相対的な発現レベルで供給する細胞株を、異なる順列で選択することが可能になる。異なる組み合わせを比較して、所定の酵素混合物が、変換効率を増大させるに当たって最良の活性を有するか決定することができる。このような比較により、必ずしも、どの酵素があるいは酵素のどのような割合が最適なのかを予め正確に把握していなくとも、バンク内の細胞株の最良の組み合わせを示すことができる。これらの観点から、共培養により発現させる一連の酵素をテーラーメードして、特定の変換工程に必要とされる特定の要求を満たすことができる。
【００８２】
異なる工程に際し、細胞バンク由来の細胞株の種培養を組み合わせる比を変化させて、基質又は基質の前処理におけるばらつきに対応することができる。例えば、セルロースの調製においてヘミセルロースの量を変更することができる。多量のヘミセルロースを処理する際の酵素カクテルは、高濃度キシラナーゼ活性を含む。一部のデンプン製剤は、アミラーゼ活性を阻害することが既知である物質（例えば、原材料又は代謝産物）を含有する場合があり、このような場合、アミラーゼ量がより多量であることが望ましい。前処理する基質の組成（例えば、グルカン／キシラン特性の違い）に応じ、酵素生成株の種培養を異なる割合で混合することにより、異なる酵素カクテルを製造し、これにより異なる相対量の酵素を有する酵素カクテルを製造することができる。
【００８３】
また、細胞バンクの作成は、変換工程とは関係なく有用なものであり得る。共通して使用される各種産業酵素をコードしている異なる細胞株をバンク化することにより、共培養の際に、細胞株を、直近の変換工程に応じて共培養用のバンクから異なる組み合わせで組み合わせることができる。したがって、本明細書で供給される共発酵法は、得られる組成物について柔軟性を供給するだけでなく、例えば、各望ましい酵素成分に関し別個に発酵を実施した後に混合する場合と比較して費用を削減するなどの各種その他の利益も供給し、すなわち、共発酵法では、所望の割合で酵素を有する組成物が得られることから、酵素の保管に伴う費用が削減さるのに対し、混合するという方略では、発酵又は調製にあたって各個別の酵素を保管する必要がある。
【００８４】
ＶＩＩ．用途
本方法により製造された酵素混合物は、変換工程が利用される、多様な農芸的、産業的、医薬的、及び栄養学的用途を有する。このような変換工程の基質は、例えば、リグノセルロース系材料、セルロース、ヘミセルロース、デンプンであってよい。
【００８５】
例えば、セルロース系材料の加水分解に、例えば、バイオマスのバイオ燃料への発酵時に、セルラーゼ酵素及び／又はセルラーゼのアクセサリー酵素の混合物を使用することができる。混合物は、穀類からグルコースを生成する際に有用であり、あるいは動物用飼料に含まれる、試料の消化性を向上させ、糞便の排泄を減少させる栄養補助剤としても有用である。セルラーゼ酵素を使用して、リグノセルロース系バイオマスを発酵性糖質に変換することにより、アルコール発酵（例えば、ビール醸造）の効率を上昇させることもできる。セルラーゼ混合物は、コーヒーの商業的な食品加工の際に、すなわち、マメの乾燥時のセルロースの加水分解に、使用することができる。また、これらはパルプ及び製紙工業において各種用途に使用されてきた。製薬用途では、セルラーゼは、ヒトの胃において見られるセルロース胃石セルラーゼは植物胃石の治療薬として有用である。
【００８６】
セルラーゼ酵素、セルラーゼアクセサリー酵素、及び／又はヘミセルラーゼ酵素の混合物は、繊維工業及び洗濯洗剤に広範に使用される。セルロース系又はリグノセルロース系材料の発酵性糖質への加水分解には、セルラーゼを使用することもできる。
【００８７】
アミラーゼの混合物、すなわちα−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、及び／又はプルラナーゼの混合物は、食品産業において多様な用途を有する。例えば、アミラーゼ酵素の混合物は、シロップの製造、デキストロースの製造、製パン、発酵麦芽汁の糖化、食用デキストリン、及び糖製品の製造、ドライ・ブレックファスト用の食品の製造、チョコレートシロップの製造、及び果汁からのデンプンの除去に有用である。エタノールを産生する際に、穀類製品からグルコースを生成するのにあたってアミラーゼを使用することもできる。
【００８８】
穀類の湿式ミリング及び製品の洗浄に、フィターゼを含有する酵素混合物を使用することができる。これらはまた、パーソナルケア製品、医薬品及び食品及び栄養製品並びに、各種工業用途、特にクリーニング、織物、平版印刷及び化学技術分野においても、その他の多くの使用法が見出される。
【実施例】
【００８９】
実施例１：β−キシロシダーゼ及びβ−グルコシダーゼ混合物を産生するための２種のトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）株の同時発酵
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質発現の解析：
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析に、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ  ４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル及びＭＯＰＳ（インビトロジェン）緩衝液と、ＳｅｅＢｌｕｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ２分子量マーカーを使用した。培養上清ベースで当量のサンプルを加えた。
【００９０】
ＨＰＬＣによるタンパク質発現の解析：
液体クロマトグラフィー（ＬＣ）及びマススペクトロスコピー（ＭＳ）を実施して、発酵ブロスに含まれている酵素を分離し、定量した。一部の場合では、ＨＰＬＣによる解析の前に、酵素試料は、遺伝子操作により発現させたＳ．プリカタス（S. plicatus）由来のｅｎｄｏＨグリコシダーゼ（例えば、ＮＥＢ  Ｐ０７０２Ｌ）により処理した。ｅｎｄｏＨは、サンプル中の総タンパク質１μｇ当たり０．０１〜０．０３μｇ量になるよう使用した。ＨＰＬＣ解析に先立ち、混合物を、３７℃、ｐＨ  ４．５〜６．０で３時間インキュベートし、Ｎ−結合糖鎖を酵素により除去させた。次に、ＨＩＣ−フェニルカラム、及び高濃度−低濃度という塩濃度勾配を用い、約５０μｇのタンパク質に対し３５分間かけて疎水性相互作用クロマトグラフィー（Ａｇｉｌｅｎｔ１１００  ＨＰＬＣ）を行った。高塩濃度の緩衝液Ａ：４Ｍの硫酸アンモニウム／２０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ  ６．７５）と、低塩濃度の緩衝液Ｂ：２０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ  ６．７５）とを用い、勾配を作成した。ＵＶ  ２２２ｎｍでピークを検出した。画分を回収し、マススペクトロスコピーにより解析して各ピークにおけるタンパク質を同定した。サンプルの総積分面積に対する各ピーク面積の割合（％）としてタンパク質比を記載する。
【００９１】
Ｆｖ３Ｃのクローニング及び発現：
ブロード研究所（Broad Institute）のデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／）において、フザリウム・バーティシリオイド（Fusarium verticillioides）からＦｖ３Ｃ配列（配列番号１及び２）を得た。テンプレートとしてフザリウム・バーティシリオイド（Fusarium verticillioides）由来の精製ゲノムＤＮＡを用い、ＰＣＲによりＦｖ３Ｃ翻訳領域を増幅させた。ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  Ｔｅｔｒａｄ  ２  Ｐｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をＰＣＲサーモサイクラーとして使用した。ＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をＤＮＡポリメラーゼとして使用した。翻訳領域を増幅する際に使用したプライマーは次の通りのものである：
順方向プライマーＭＨ２３４（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣＴＧＡＡＴＴＧＧＧＴＣＧＣ−３’）（配列番号１５）
逆方向プライマーＭＨ２３５（５’−ＴＴＡＣＴＣＣＡＡＣＴＴＧＧＣＧＣＴＧ−３’）（配列番号１６）
【００９２】
順方向プライマーには、４つの追加のヌクレオチド（配列−ＣＡＣＣ）を５’末端に含有させて、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）への定方向クローニングを促進させた。翻訳領域を増幅させる際のＰＣＲ条件は次のとおりであった：工程１：９４℃で２分。工程２：９４℃で３０秒。工程３：５７℃で３０秒。工程４：７２℃で６０秒。工程２、３及び４を更に２９サイクル繰り返した。工程５：７２℃で２分。Ｆｖ３Ｃ翻訳領域のＰＣＲ産物を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。生成したＰＣＲ産物を、最初にｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターにクローニングし、ＴＯＰ１０ケミカルコンピテント大腸菌（E. coli）細胞（インビトロジェン）を形質転換させ、５０ｐｐｍのカナマイシンを含有させたＬＡプレートに播種した。ＱＩＡｓｐｉｎプラスミド調製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、大腸菌（E. coli）形質転換体からプラスミドＤＮＡを得た。ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターに挿入されたＤＮＡの配列を、Ｍ１３順方向及び逆方向プライマーと、次のその他の配列プライマーとを用い確認した：
ＭＨ２５５（５’−ＡＡＧＣＣＡＡＧＡＧＣＴＴＴＧＴＧＴＣＣ−３’）（配列番号１７）
ＭＨ２５６（５’−ＴＡＴＧＣＡＣＧＡＧＣＴＣＴＡＣＧＣＣＴ−３’）（配列番号１８）
ＭＨ２５７（５’−ＡＴＧＧＴＡＣＣＣＴＧＧＣＴＡＴＧＧＣＴ−３’）（配列番号１９）
ＭＨ２５８（５’−ＣＧＧＴＣＡＣＧＧＴＣＴＡＴＣＴＴＧＧＴ−３’）（配列番号２０）
Ｆｖ３Ｃ翻訳領域のＤＮＡ配列を有するｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターを図１に示す。
【００９３】
キメラβ−グルコシダーゼ：野生型フザリウム・バーティシリオイド（Fusarium verticillioides）Ｆｖ３Ｃ（配列番号１及び２）のＣ末端遺伝子配列の一部を、トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）β−グルコシダーゼ、Ｂｇｌ３（又はＴｒ３Ｂ）（配列番号７及び８）由来のＣ末端配列により置き換えた。詳細には、Ｆｖ３Ｃの連続的に延びる残基１〜６９１を、Ｂｇｌ３の連続的に延びる残基６６８〜８７４と融合させた（配列番号９及び１０）。融合ＰＣＲによりキメラ／融合分子を構築した。Ｆｖ３Ｃ（図１）及びＢｇｌ３をコードしているゲノム配列のｐＥＮＴＲクローンを、ＰＣＲテンプレートとして用いた。いずれのエントリークローンもｐＤＯＮＲ（商標）２２１ベクター（インビトロジェン）に構築した。２段階で融合産物を組み立てた。第一段階では、ｐＥＮＴＲ＿Ｆｖ３Ｃ  ＤＮＡをテンプレートとして用い、かつ次のオリゴヌクレオチドプライマー：
ｐＤｏｎｏｒ順方向：５’−ＧＣＴＡＧＣＡＴＧＧＡＴＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣ−３’（配列番号２１）
Ｆｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３逆方向：５’−ＧＧＡＧＧＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＴＧＡＡＣＧＴＣＧＡＣＣＡＡＧＡＴＡＧＡＣＣＧＴＧＡ  ＣＣＧＡＡＣ  ＴＣＧＴＡＧ３’（配列番号２２）、を用い、ＰＣＲ反応によりＦｖ３Ｃキメラ部を増幅させた。
【００９４】
次のオリゴヌクレオチドプライマー：
ｐＤｏｎｏｒ逆方向：５’−ＴＧＣＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ−３’（配列番号２３）
Ｆｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３順方向：５’−ＣＴＡＣＧＡＧＴＴＣＧＧＴＣＡＣＧＧＴＣＴＡＴＣＴＴＧＧＴＣＧＡＣＧＴＴＣＡＡＧＴＴＣ  ＴＣＣＡＡＣＣＴＣＣ−３’（配列番号２４）、を用い、ｐＥＮＴＲ＿Ｂｇｌ３ベクターからＢｇｌ３キメラ部を増幅させた。
【００９５】
第二段階では、融合ＰＣＲ反応を行い、次のネスト化プライマー組：
Ａｔｔ  Ｌ１順方向：５’ＴＡＡＧＣＴＣＧＧＧＣＣＣＣＡＡＡＴＡＡＴＧＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＧＡＣＴＧＡＴＡＧＴ  ３’（配列番号２５）
ＡｔｔＬ２逆方向：５’ＧＧＧＡＴＡＴＣＡＧＣＴＧＧＡＴＧＧＣＡＡＡＴＡＡＴＧＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＧＡＣＴＧＡＴＡ−３’（配列番号２６）、を使用する、続く融合ＰＣＲ反応のため、各ＰＣＲ産物（第１のＰＣＲ反応液をそれぞれ約１μＬ及び０．２μＬ）をテンプレートとして当量加えた。
【００９６】
高性能Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ  ＯＹ）を用い、ＰＣＲ反応を実施した。得られる融合ＰＣＲ産物は、インタクトなＧａｔｅｗａｙ特異的ａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２組み換え部位を末端に含有しており、Ｇａｔｅｗａｙ  ＬＲ組み換え反応（インビトロジェン）により最終的なデスティネーションベクターに直接クローニングすることができた。
【００９７】
０．８％アガロースゲルでＤＮＡ断片を分離した後、断片をＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ（登録商標）Ｅｘｔｒａｃｔ  ＰＣＲクリーンアップキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．ＫＧ）で精製し、ｐＴＴＴ−ｐｙｒＧ１３デスティネーションベクター及びＬＲクロナーゼ（商標）ＩＩ酵素ミックス（インビトロジェン）を用い、各１００ｎｇの断片を組み換えた。得られた組み換え産物により、大腸菌Ｍａｘ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ＤＨ５α（インビトロジェン）を形質転換させ、キメラβ−グルコシダーゼを収容している発現コンストラクトｐＴＴＴ−ｐｙｒＧ１３−Ｆｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３融合体（図２）を含有しているクローンを、２ｘＹＴ寒天プレートで選択した。２ｘＹＴ寒天プレートは、１６ｇ／Ｌのバクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ）、１０ｇ／Ｌのバクト酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）、５ｇ／ＬのＮａＣｌ、１６ｇ／Ｌのバクトアガー（Ｄｉｆｃｏ）、及び１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを用い調製した。１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有させた２ｘ  ＹＴ培地でバクテリアを生育させた。その後、プラスミドを単離し、ＢｇｌＩ又はＥｃｏＲＶのいずれかの制限酵素により消化した。得られたＦｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３領域の配列をＡＢＩ３１００シークエンスアナライザ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により確認した。
【００９８】
更に、Ｆｖ３Ｃ（配列番号１及び２）、タラロミセス・エマーソニィ（Talaromyces emersonii）Ｔｅ３Ａ由来のβ−グルコシダーゼ配列由来のループ領域（配列番号５及び６）、及びトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３（Ｔｒ３Ｂ）に由来するＣ末端配列の一部（配列番号７及び８）、を含んでなるキメラβ−グルコシダーゼを構築した。この構築は、Ｆｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３キメラ体のループ領域を置き換えて実施した。Ｆｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３キメラ（ＲＲＳＰＳＴＤＧＫＳＳＰＮＮ  ＴＡＡＰＬ（配列番号２７）の配列を有する）のＦｖ３Ｃ残基６６５〜６８３を、Ｔｅ３Ａ残基６３４〜６４０（ＫＹＮＩＴＰＩ（配列番号２８））で特異的に置換した。この複合分子を、融合ＰＣＲ法により構築した。
【００９９】
２つのＮ−グリコシル化部位、すなわちＳ７２５Ｎ及びＳ７５１ＮをＦｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３骨格に組み込んだ。テンプレートとしてｐＴＴＴ−ｐｙｒＧ１３−Ｆｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３融合プラスミド（図２）を選択し、上記の通りにＰＣＲによる融合増幅法を用い、これらのグリコシル化変異（mutations）をＦｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３骨格に組み込み、一次ＰＣＲ産物を生成した。各ＰＣＲ反応時には次のプライマー対を加えた：
Ｐｒ  ＣｂｈＩ順方向：５’ＣＧＧＡＡＴＧＡＧＣＴＡＧＴＡＧＧＣＡＡＡＧＴＣＡＧＣ  ３’（配列番号２９）及び
７２５／７５１逆方向：５’−ＣＴＣＣＴＴＧＡＴＧＣＧＧＣＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＧＧＧＧＡＡＧＣＣＡＴＡＧＴＣＣＴＴＡＡ  ＧＧＴＴＣＴＴＧＣＴＧＡＡＧＴＴＧＣＣＣＡＧＡＧＡＧ  ３’（配列番号３０）
７２５／７５１順方向：５’−ＧＧＣＴＴＣＣＣＣＡＡＧＡＡＣＧＴＴＣＧＣＣＧＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＴＴＴＡＴＣＴＡＣＣ  ＣＣＴＡＣＣＴＧＡＡＣＡＣＣＡＣＴＡＣＣＴＣ  ３’（配列番号３１）、及び
Ｔｅｒ  ＣｂｈＩ逆方向：５’ＧＡＴＡＣＡＣＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＧＡＴＴＣＴＡＣＧＧ  ３’（配列番号３２）。
【０１００】
次に、Ｐｒ  ＣｂｈＩ順方向及びＴｅｒ  ＣｂｈＩプライマーを用い、ＰＣＲ産物を融合させた。得られた融合産物は、２つの所望のグリコシル化部位だけでなく、インタクトなａｔｔＢ１及びａｔｔＢ２領域も含有していたことから、Ｇａｔｅｗａｙ  ＢＰ組み換え反応（インビトロジェン）によりｐＤＯＮＲ２２１ベクターに組み込むことができた。これにより、次にｐＥＮＴＲ−Ｆｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３／Ｓ７２５Ｎ  Ｓ７５１Ｎクローンを骨格として使用し、３重ハイブリッド分子Ｆｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ／Ｂｇｌ３を構築した。
【０１０１】
Ｆｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３複合体の残基６６５〜６８３を、Ｔｅ３Ａ（配列番号５及び６）由来のループ配列で置き換えるために、次のプライマーセット：
セット１：ｐＤｏｎｏｒ順方向：５’−ＧＣＴＡＧＣＡＴＧＧＡＴＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡ  ＡＣＧＡＣＧＧＣ  ３’（配列番号２１）及び
Ｔｅ３Ａ逆方向：５’−ＧＡＴＡＧＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＡＡＣＴＣＧＴＡＧＡＴＡＧＧＣＧＴＧＡＴＧＴＴ  ＧＴＡＣＴＴＧＴＣＧＡＡＧＴＧＡＣＧＧＴＡＧＴＣＧＡＴＧＡＡＧＡＣ  ３’（配列番号３３）；
セット２：Ｔｅ３Ａ２順方向：５’−ＧＴＣＴＴＣＡＴＣＧＡＣＴＡＣＣＧＴＣＡＣＴＴＣＧＡＣＡＡＧＴＡＣＡＡＣＡＴＣＡＣ  ＧＣＣＴＡＴＣＴＡＣＧＡＧＴＴＣＧＧＴＣＡＣＧＧＴＣＴＡＴＣ−３’（配列番号３４）；及び
ｐＤｏｎｏｒ逆方向：５’ＴＧＣＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ  ３’（配列番号２３）、を用い、一次ＰＣＲ反応を実施した。
【０１０２】
一次ＰＣＲ反応により得られた断片を、次に次のプライマー：
Ａｔｔ  Ｌ１順方向：５’  ＴＡＡＧＣＴＣＧＧＧＣＣＣＣＡＡＡＴＡＡＴＧＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＧＡＣＴＧＡＴＡＧＴ  ３’（配列番号２５）及び
ＡｔｔＬ２逆方向：５’ＧＧＧＡＴＡＴＣＡＧＣＴＧＧＡＴＧＧＣＡＡＡＴＡＡＴＧＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＧＡＣＴＧＡＴＡ  ３’（配列番号２６）を使用して融合させた。
【０１０３】
得られる融合ＰＣＲ産物は、インタクトなＧａｔｅｗａｙ特異的ａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２組み換え部位を末端に含有しており、Ｇａｔｅｗａｙ  ＬＲ組み換え反応（インビトロジェン）により最終的なデスティネーションベクターに直接クローニングすることができた。
【０１０４】
Ｆｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ／Ｂｇｌ３をコードしている遺伝子のＤＮＡ配列を配列番号１１として掲載する。Ｆｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ／Ｂｇｌ３（ＦＡＢ）複合体のアミノ酸配列は配列番号１２として掲載する。Ｆｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ／Ｂｇｌ３キメラ体をコードしている遺伝子配列をｐＴＴＴ−ｐｙｒＧ１３ベクターにクローニングし、以降に記載の通りに、トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）レシピエント株で発現させた。
【０１０５】
特に、この断片を０．５〜１μｇ用い、下記の通り若干の変更を加えたプロトプラスト−ＰＥＧ法により、トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）６遺伝子欠失株ｍａｄ６（遺伝子ｃｅｌ７Ｂ、ｃｅｌ５Ａ、ｃｅｌ６Ａ、ｃｅｌ７Ａ、ｃｅｌ３Ａ、ｃｅｌ１２Ａを欠失。国際公開第２０１０／１４１７７９号）を特異的に形質転換させた。プロトプラストの調製に際し、１５０ｒｐｍで振とうさせながらトリコデルマ（Trichoderma）最少培地ＭＭ（組成：２０ｇ／Ｌのグルコース、１５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ  ４．５）、５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．６ｇ／ＬのＭｇＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ、０．６ｇ／ＬのＣａＣｌ２ｘ２Ｈ２Ｏ、１ｍＬの１０００ｘトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）微量元素溶液（組成：５ｇ／ＬのＦｅＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ、１．４ｇ／ＬのＺｎＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ、１．６ｇ／ＬのＭｎＳＯ４ｘＨ２Ｏ、３．７ｇ／ＬのＣｏＣｌ２ｘ６Ｈ２Ｏ）により、２４℃で１６〜２４時間芽胞を生育させた。出芽した芽胞を遠心分離により回収し、５０ｍｇ／ｍＬのＧｌｕｃａｎｅｘ  Ｇ２００（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  ＡＧ）溶液により処理し、真菌細胞壁を溶解させた。更に、Ｐｅｎｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅ  ６１（１９８７）１５５〜１６４に記載の方法に従って、プロトプラストを調製した。形質転換混合物（総量２００μＬ中に約１μｇのＤＮＡ及び１〜５ｘ  １０７プロトプラストを含有）を、各々２５％  ＰＥＧ溶液２ｍＬで処理し、２倍量の１．２Ｍのソルビトール／１０ｍＭのトリス（ｐＨ  ７．５）、１０ｍＭのＣａＣｌ２で希釈し、３％  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｔｏｐアガロースＭＭ（５ｍＭのウリジン及び２０ｍＭのアセトアミド含有）と混合した。得られた混合物を、ウリジン及びアセトアミドを含有させた２％  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅアガロースプレートに接種した。プレートを２８℃で更に７〜１０日間インキュベートした後、１つの形質転換体を、ウリジン及びアセトアミドを含有させた新しいＭＭプレートに再度接種した。別個のクローン由来の芽胞を９６ウェルマイクロタイタープレート又は振とうフラスコのいずれかの発酵培地に接種した。
【０１０６】
β−グルコシダーゼ発現ベクターの構築：
ネイティブなトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）β−グルコシダーゼ遺伝子ｂｇｌ１のＮ末端領域のコドンを最適化させた（ＤＮＡ  ２．０，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）。この合成領域は、この酵素をコードしている最初の４４７塩基からなる。次に、プライマーＳＫ９４３及びＳＫ９４１を用い、この断片をＰＣＲ法により増幅させた。プライマーＳＫ９４０及びＳＫ９４２を用い、トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）株ＲＬ−Ｐ３７（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ，Ｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９８４，２０：４６〜５３）から抽出したゲノムＤＮＡサンプルから、ネイティブなｂｇｌ１遺伝子の残りの領域をＰＣＲ法により増幅させた。プライマーＳＫ９４３及びＳＫ９４２を用い、ｂｇｌ１遺伝子のこれらの２つのＰＣＲ産物を、融合ＰＣＲ反応により融合させた。
順方向プライマーＳＫ９４３：（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＡＧＡＴＡＴＡＧＡＡＣＡＧＣＴＧＣＣＧＣＴ−３’）（配列番号３５）
逆方向プライマーＳＫ９４１：（５’−ＣＧＡＣＣＧＣＣＣＴＧＣＧＧＡＧＴＣＴＴＧＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＧ−３’）（配列番号３６）
順方向プライマー（ＳＫ９４０）：（５’−ＣＴＧＴＣＧＣＧＧＧＡＣＣＡＣＴＧＧＧＣＡＡＧＡＣＴＣＣＧＣＡＧＧＧＣＧＧＴＣＧ−３’）（配列番号３７）
逆方向プライマー（ＳＫ９４２）：（５’−ＣＣＴＡＣＧＣＴＡＣＣＧＡＣＡＧＡＧＴＧ−３’）（配列番号３８）
【０１０７】
得られた融合ＰＣＲフラグメントをＧａｔｅｗａｙ（登録商標）ＥｎｔｒｙベクターｐＥＮＴＲ（商標）／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）にクローニングし、大腸菌Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０化学コンピテント細胞（インビトロジェン）に形質転換することにより、中間体ベクターｐＥＮＴＲ−ＴＯＰＯ−Ｂｇｌ１（９４３／９４２）を得た（図３）。挿入したＤＮＡのヌクレオチド配列を確認した。正しいｂｇｌ１配列を有するｐＥＮＴＲ−９４３／９４２ベクターを、ＬＲクロナーゼ（登録商標）反応により、ｐＴｒｅｘ３ｇで組み替えた（インビトロジェンによるプロトコル概要を参照されたい）。ＬＲクロナーゼ反応混合物により大腸菌（E. coli）Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０ケミカルコンピテントセル（インビトロジェン）を形質転換させ、発現ベクターｐＴｒｅｘ３ｇ  ９４３／９４２を得た。ベクターには、形質転換したトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）の選択マーカーとして、アセトアミダーゼをコードしているアスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）のａｍｄＳ遺伝子も含有させた。プライマーＳＫ７４５及びＳＫ７７１（下記）を用い、発現カセットをＰＣＲにより増幅させて、トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）６遺伝子欠失株ｍａｄ６の形質転換体用の産物を生成した。
順方向プライマーＳＫ７７１：（５’−ＧＴＣＴＡＧＡＣＴＧＧＡＡＡＣＧＣＡＡＣ−３’）（配列番号３９）
逆方向プライマーＳＫ７４５：（５’−ＧＡＧＴＴＧＴＧＡＡＧＴＣＧＧＴＡＡＴＣＣ−３’）（配列番号４０）
【０１０８】
β−キシロシダーゼＦｖ４３Ｄ発現カセットの構築：
β−キシロシダーゼＦｖ４３Ｄ（配列番号１３）発現カセットを構築するため、プライマーＳＫ１３２２及びＳＫ１２９７（下記）を用い、Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）ゲノムＤＮＡサンプルからｆｖ４３Ｄ遺伝子産物（配列番号１４）を増幅させた。ＲＬ−Ｐ３７株から抽出したトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）ゲノムＤＮＡサンプルのエンドグルカナーゼ遺伝子ｅｇｌ１のプロモーター領域を、プライマーＳＫ１２３６及びＳＫ１３２１（下記）を用いＰＣＲ増幅させた。続いて、これらのＰＣＲ増幅させたＤＮＡ断片を、プライマーＳＫ１２３６及びＳＫ１２９７（下記）を用い融合ＰＣＲ反応により融合させた。得られる融合ＰＣＲ産物をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン）にクローニングし、プラスミドＴＯＰＯ  Ｂｌｕｎｔ／Ｐｅｇｌ１−Ｆｖ４３Ｄを作製した（図４を参照されたい）。次に、このプラスミドを用い、大腸菌（E. coli）Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０ケミカルコンピテントセル（インビトロジェン）を形質転換させた。いくつかの大腸菌（E.  coli）クローンからプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素による消化によりそれらの配列を確認した。プライマーＳＫ１２３６及びＳＫ１２９７を用い、ＰＣＲによりＴＯＰＯ  Ｂｌｕｎｔ／Ｐｅｇｌ１−Ｆｖ４３Ｄから発現カセットを増幅させて、形質転換用の配列を生成した。
順方向プライマーＳＫ１３２２：（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＴＴＣＴＧＴＣ−３’）（配列番号４１）
逆方向プライマーＳＫ１２９７：（５’−ＧＧＴＴＡＣＴＡＧＴＣＡＡＣＴＧＣＣＣＧＴＴＣＴＧＴＡＧＣＧＡＧ−３’）（配列番号４２）
順方向プライマーＳＫ１２３６：（５’−ＣＡＴＧＣＧＡＴＣＧＣＧＡＣＧＴＴＴＴＧＧＴＣＡＧＧＴＣＧ−３’）（配列番号４３）
逆方向プライマーＳＫ１３２１：（５’−ＧＡＣＡＧＡＡＡＣＴＴＧＡＧＣＴＧＣＡＴＧＧＴＧＴＧＧＧＡＣＡＡＣＡＡＧＡＡＧＧ−３’）（配列番号４４）
【０１０９】
混合した株を発酵させてβ−キシロシダーゼ及びβ−グルコシダーゼタンパク質生成物を産生する：
ｆｖ４３Ｄ又はｆｖ３Ｃ／ｔｅ３Ａ／ｂｇｌ３のいずれかを発現している６遺伝子欠失型トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）株２種を、それぞれ、３０ｍＬのＹＥＧブロス（５ｇ／Ｌの酵母エキス、２０ｇ／Ｌのグルコース）を入れた２５０ｍＬのガラス製４枚羽フラスコに接種した。続いて振盪させながら２８℃にて２日間生育させ、培養物を２組ずつタンパク質産生培地に移した。グルコース／ソホロース及び２ｇ／Ｌのウリジンを含有させた３６ｍＬの合成培地、例えば、滅菌後に約２％のグルコース／ソホロース混合物を炭素源として添加した、グリシンミネラル培地（６．０ｇ／Ｌのグリシン；４．７ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４；５．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４；１．０ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；３３．０ｇ／ＬのＰＩＰＰＳ；ｐＨ５．５）、１０ｍＬ／Ｌの１００ｇ／ＬのＣａＣｌ２、２．５ｍＬ／Ｌのトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）微量成分（４００Ｘ））：１７５ｇ／Ｌの無水クエン酸；２００ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；１６ｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；３．２ｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ；１．４ｇ／ＬのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ；０．８ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３を２５０ｍＬのＴｈｏｍｓｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｆｌａｓｋに入れ、これを産生培地とした。移した体積は次のとおりであった：
対照、（Ｆｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ／Ｂｇｌ３）＝４ｍＬ；Ｆｖ４３Ｄ＝４ｍＬ
試験フラスコ，Ｆｖ４３Ｄ／（Ｆｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ／Ｂｇｌ３）＝２ｍＬ／４ｍＬ
【０１１０】
すべてのフラスコは３０℃、１６０ｒｐｍで４日間インキュベートした。４日間のインキュベート後、遠心分離により細胞を沈降させ、上清を以降の解析まで４℃で保管した。
【０１１１】
振盪フラスコの上清中のタンパク質の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図５）及びＨＰＬＣ（図６）により解析した。
【０１１２】
表１．単独培養ブロス又は共培養ブロス中の各タンパク質量（ＨＰＬＣによる合計
積分面積の割合として表す）
2015500041.tif 000003
【０１１３】
混合した株発酵による、β−グルコシダーゼ含量の増大したトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）タンパク質生成物の産生
ＲＬ−Ｐ３７（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９８４，２０：４６〜５３）に由来し、セルラーゼ高産生性について選択したトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）変異株（ＲＬ−Ｐ３７−ｄ）を、３０ｍＬのＹＥＧブロス（５ｇ／Ｌの酵母エキス、２０ｇ／Ｌのグルコース）を入れた１つの２５０ｍＬガラス製４枚羽フラスコに接種した。トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）ｂｇｌ１（ｔｒ３Ａ）を発現している６遺伝子欠失型トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）株（株の作製については、上記「β−グルコシダーゼ発現ベクターの構築」において記載）を、３０ｍＬのＹＥＧブロスを入れた別個の２５０ｍＬガラス製４枚羽フラスコに接種した。続いて振盪させながら２８℃にて２日間生育させ、培養物をタンパク質産生培地に移した。
【０１１４】
グルコース／ソホロース及びウリジンを含有させた３６ｍＬの合成培地、例えば、グリシンミネラル培地（６．０ｇ／Ｌのグリシン；４．７ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４；５．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４；１．０ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；滅菌後に約２％のグルコース／ソホロース混合物を炭素源として添加した３３．０ｇ／ＬのＰＩＰＰＳ；ｐＨ  ５．５）、１０ｍＬ／Ｌの１００ｇ／ＬのＣａＣｌ２、２．５ｍＬ／Ｌのトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）微量成分（４００Ｘ））：１７５ｇ／Ｌの無水クエン酸；２００ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；１６ｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；３．２ｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ；１．４ｇ／ＬのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ；０．８ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３を２５０ｍＬのＴｈｏｍｓｏｎ  Ｕｌｔｒａフラスコに入れ、これを産生培地とした。移した体積は次のとおりであった：
対照、ＲＬ−Ｐ３７−ｄ＝４ｍＬ
試験フラスコ，ＲＬ−Ｐ３７−ｄ／Ｔｒ３Ａ＝４ｍＬ／２ｍＬ
【０１１５】
すべてのフラスコは３０℃、１６０ｒｐｍで４日間インキュベートした。４日間のインキュベート後、遠心分離により細胞を沈降させ、上清を以降の解析まで４℃で保管した。
【０１１６】
振盪フラスコの上清中のタンパク質の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図７）及びＨＰＬＣ（図８）により解析した。
【０１１７】
表２．単独培養ブロス又は共培養ブロス中の各タンパク質量（ＨＰＬＣによる合計
積分面積の割合として表す）
2015500041.tif 000004
【０１１８】
実施例２：アミラーゼ変異体の混合物を産生するための２種類のバチルス（Bacillus）株の同時発酵
材料及び方法：本実施例に使用したいずれの株も産生株である。アミラーゼ変異体１（アミラーゼ−１）、すなわち４つの置換を有するバチルス・リケニフォルミス（Bacilllus licheniformis）アミラーゼを、米国特許第５，９５８，７３９号に従って発現させる。アミラーゼ変異体２（アミラーゼ−２）、すなわち置換を有するゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）を、米国特許公開第２００９０３１４２８６Ａ１号に従って発現させる。２５０ｍＬのＴｈｏｍｓｏｎ  Ｕｌｔｒａ振盪フラスコにおいて実験を実施した。酵母エキス、リン酸塩、硫酸塩、及びその他の栄養成分、並びに適切な消泡剤を含有させた種培地において種培養を生育させた。対照及び試験フラスコには、ラクトース、酵母エキス、スルホン酸塩、及びリン酸塩、その他の塩類、並びにＭａｌｔｒｉｎ（登録商標）Ｍ−１０００及び適切な消泡剤を含有している培地を使用した。このような培地の組成は次のとおりである：
【０１１９】
混合株発酵によるアミラーゼブレンドの作製：２種類の種培養を開始した。アミラーゼ−１及びアミラーゼ−２の凍結バイアルを使用して、２５０ｍＬの羽根つきガラス製フラスコにいれた３５ｍＬの種培地において種培養を開始した。種フラスコを３８℃、１６０ｒｐｍで３時間インキュベートした。３時間後、種培養物を使用して、各酵素の対照フラスコ及び２つ組の試験フラスコにおいて培養を開始した。これらの各フラスコには培地２７ｍＬを入れた。対照フラスコには各種培養物を３．０ｍＬ接種した。試験フラスコには、各種培養物を１．５ｍＬ接種した。次に、すべてのフラスコを４０℃かつ１６０ｒｐｍにて４８時間インキュベートした。４８時間のインキュベートが終了した時点でｐＨを確認して、発酵がエンドポイントに達しているか決定した。すべてのフラスコはｐＨ  ７〜８であったことから、エンドポイントに達していることが示された。対照及び試験培養物上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルにより、すべてのフラスコにおいて酵素が発現していたことが示された。２つ組み試験培養物をＨＰＬＣにより解析して、これらの培養物が、アミラーゼ−１及びアミラーゼ−２をそれぞれ含有していたことを確認した。ＨＰＬＣにより、酵素が共発現されていたことが確認された。
【０１２０】
実施例３：活性比１：３でアミラーゼ変異体の混合物を産生するための２種類のバチルス（Bacillus）株の同時発酵
１４Ｌアミラーゼ−１／アミラーゼ−２の実験：上記のフラスコでの実験と同一の２種類の酵素を使用し、１４Ｌの発酵を実施して、同時発酵により良好に制御された様式で、特定の比で２種の酵素が製造され得るかを試験した。活性比１：３のアミラーゼ−１：アミラーゼ−２を有する生成物を作製することに決めた。
【０１２１】
１４Ｌ規模での２種類の酵素の産生速度に基づき、種フラスコ（３０ｍＬの種培地（酵母エキス、リン酸塩、硫酸塩、及びその他の栄養成分、並びに適切な消泡剤を含む）を入れた２５０ｍＬの羽根つきガラス製フラスコ）に、０．２ｍＬのアミラーゼ−１及び０．８ｍＬのアミラーゼ−２を接種した。種フラスコを３７℃、１６０ｒｐｍで３時間インキュベートした。３時間経過後、フラスコに含まれるすべての中身を、産生培地を入れた１４Ｌの種培養発酵器に移し、培養を実施した。
【０１２２】
播種槽の呼吸速度（ＯＵＲ）が６０ｍＭ／Ｋｇ／Ｈｒに達したならば、０．６Ｋｇを使用して産生発酵器に接種し、一般的な流加式条件下で１００時間の発酵を行いアミラーゼの産生を実施した。
【０１２３】
産生発酵中には、時間の経過に伴いサンプルを回収してアミラーゼ活性について解析した。生育及び酵素産生曲線は、１４Ｌ規模でのアミラーゼ発酵に典型的なものであった。１００時間の時点で、最終的な試料をＨＰＬＣにより解析して、２種の酵素の比を求めた。ピーク面積に基づくと、タンパク質比は１：２．９（アミラーゼ−１：アミラーゼ−２）であった。このＨＰＬＣ法では、アミラーゼ−２産生株を作製する際に使用したタンパク質骨格由来の酵素により、ピークが２つ示された。両方のピーク面積を合わせて、アミラーゼ−２面積の合計を決定する。
【０１２４】
実施例４：グルコアミラーゼ及び２種類のβ−グルコシダーゼタンパク質産物を産生するための混合株の発酵
ｆｖ３Ｃ／ｔｅ３Ａ／ｂｇｌ３を発現している第１の６遺伝子欠失型トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）株、トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）β−グルコシダーゼ１（ｂｇｌ１）を発現している第２の６遺伝子欠失型トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）株；並びにグルコアミラーゼを発現している四遺伝子欠失型トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）株（国際公開第２００５／００１０３６号）を、３０ｍＬのＹＥＧブロス（５ｇ／Ｌの酵母エキス、２０ｇ／Ｌのグルコース）及び２ｇ／Ｌのウリジンを含有させた２５０ｍＬのガラス製の枚羽フラスコにそれぞれ接種した。ウリジンを添加したＰＤＡ（ジャガイモデキストロース寒天培地）で生育し、胞子形成した培養物から、接種菌を採取した。続いて振盪させながら２８℃にて２日間生育させ、培養物を２組ずつタンパク質産生培地に移した。グルコース／ソホロース及び２ｇ／Ｌのウリジンを含有させた３６ｍＬの合成培地、例えば、滅菌後に約２％のグルコース／ソホロース混合物を炭素源として添加した、グリシンミネラル培地（６．０ｇ／Ｌのグリシン；４．７ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４；５．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４；１．０ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；３３．０ｇ／ＬのＰＩＰＰＳ；ｐＨ  ５．５）、１０ｍＬ／Ｌの１００ｇ／ＬのＣａＣｌ２、２．５ｍＬ／Ｌのトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）微量成分（４００Ｘ））：１７５ｇ／Ｌの無水クエン酸；２００ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；１６ｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；３．２ｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ；１．４ｇ／ＬのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ；０．８ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３を２５０ｍＬのガラス製４枚羽振盪フラスコに入れ、これを各産生培地とした。移した体積は次のとおりであった：
対照、（Ｆｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ／Ｂｇｌ３）＝３ｍＬ；Ｔｒ３Ａ＝３ｍＬ；グルコアミラーゼ＝３ｍＬ
試験フラスコ，１ｍＬの各（Ｆｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ／Ｂｇｌ３），Ｔｒ３Ａ，グルコアミラーゼ。
【０１２５】
すべてのフラスコは２８℃、２００ｒｐｍ（Ｉｎｎｏｖａ  ４９００）で４日間インキュベートした。４日間のインキュベート後、遠心分離により細胞を除去し、上清を以降の解析まで４℃で保管した。
【０１２６】
振盪フラスコの上清中のタンパク質の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣ（図１１）により解析した。
【０１２７】
表３．単独培養ブロス又は共培養ブロス中の各タンパク質量（ＨＰＬＣによる合計
積分面積の割合として表す）
2015500041.tif 000005
【０１２８】
実施例５：直接摂取することによりβ−グルコシダーゼ含量が増大したトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）タンパク質産物を製造するための混合株の発酵
ＲＬ−Ｐ３７（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９８４，２０：４６〜５３）に由来し、かつ高セルロース産生性について選択したトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）変異株（ＲＬ−Ｐ３７−ｄ）を、ｆｖ３Ｃ／ｔｅ３Ａ／ｂｇｌ３を発現している６遺伝子欠失株とともに接種した。グルコース／ソホロース及びウリジンを含有させた３０ｍＬの産生培地、例えば、滅菌後に約２％のグルコース／ソホロース混合物を炭素源として添加した、グリシンミネラル培地（６．０ｇ／Ｌのグリシン；４．７ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４；５．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４；１．０ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；３３．０ｇ／ＬのＰＩＰＰＳ；ｐＨ  ５．５）、１０ｍＬ／Ｌの１００ｇ／ＬのＣａＣｌ２、２．５ｍＬ／Ｌのトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）微量成分（４００Ｘ））：１７５ｇ／Ｌの無水クエン酸；２００ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；１６ｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；３．２ｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ；１．４ｇ／ＬのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ；０．８ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３、を２５０ｍＬのガラス製４枚羽振盪フラスコに入れ、ウリジンを添加した、成熟した胞子を形成したＰＤＡプレートから各株を接種した。振盪しながら２８℃で４日間生育させた後、培養物を回収した。遠心分離により細胞を除去し、上清を以降のＨＰＬＣによる解析まで４℃で保管した。混合培養ブロス、すなわち（Ｆｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ／Ｂｇｌ３）では総タンパク質が５６％であると示されたのに対し、Ｆｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ／Ｂｇｌ３株を単一培養物として別個に生育させた場合には合計タンパク質は７０％であるものと示された。
【０１２９】
実施例６：２種のβ−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、及びβ−キシロシダーゼ成分を直接接種することによりトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）タンパク質産物を産生するための混合株発酵
グルコース／ソホロース及びウリジンを含有させた３０ｍＬの産生培地、例えば、滅菌後に約２％のグルコース／ソホロース混合物を炭素源として添加した、グリシンミネラル培地（６．０ｇ／Ｌのグリシン；４．７ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４；５．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４；１．０ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；３３．０ｇ／ＬのＰＩＰＰＳ；ｐＨ  ５．５）、１０ｍＬ／Ｌの１００ｇ／ＬのＣａＣｌ２、２．５ｍＬ／Ｌのトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）微量原子（４００Ｘ））：１７５ｇ／Ｌの無水クエン酸；２００ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；１６ｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；３．２ｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ；１．４ｇ／ＬのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ；０．８ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３，を入れた各々別個の、２５０ｍＬのガラス製４枚羽フラスコに、成熟した胞子を形成したウリジン添加ＰＤＡプレートからｆｖ３Ｃ／ｔｅ３Ａ／ｂｇｌ３を発現している第１の６遺伝子欠失型トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）株、ｂｇｌ１（ｔｒ３Ａ）を発現している第２の６遺伝子欠失型トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）株、ｆｖ４３Ｄを発現している第３の６遺伝子欠失株、及びトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）グルコアミラーゼを発現している四遺伝子欠失型トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）株（国際公開第２００５／００１０３６号）を接種した。振盪しながら２８℃で４日間生育させた後、培養物を回収した。遠心分離により細胞を除去し、上清を以降のＨＰＬＣによる解析まで４℃で保管した。
【０１３０】
表４．単独培養ブロス又は共培養ブロス中の各タンパク質量（ＨＰＬＣによる合計積分面積の割合として表す）＊
2015500041.tif 000006
＊  単独培養は、すべて、種培養を加える工程を用い培養したのに対し、混合培養（最終列）は、種培養工程を用いずに寒天プラグから直接播種した。
【０１３１】
本明細書で参照される特許及び刊行物内に開示されているすべての配列を含むすべての特許及び刊行物は、すべての目的に際しその全体が参照により明示的に組み込まれるものとする。好ましい手法及び材料を記載したが、本明細書に記載のものと同じ、又は本明細書に記載のものに相当する任意の方法及び材料を、本開示を実施又は試験するために使用できる。文脈により明白なものである限りは、任意の実施形態、態様、工程、特徴、要素又は制限を任意に互いに組み合わせて使用することができる。
【０１３２】
配列表
配列番号１  フザリウム・バーティシリオイド（Fusarium verticillioides）由来のＧＨ３ファミリーのβ−グルコシダーゼＦｖ３Ｃのヌクレオチド配列
2015500041.tif 000007
【０１３３】
（上配列表の続き）
2015500041.tif 000008
【０１３４】
配列番号２  フザリウム・バーティシリオイド（Fusarium verticillioides）のＧＨ３ファミリーのβ−グルコシダーゼＦｖ３Ｃのタンパク質配列
2015500041.tif 000009
【０１３５】
配列番号３  トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）のＧＨ３ファミリーのβ−グルコシダーゼＢｇｌ１（又はＴｒ３Ａ）のヌクレオチド配列
2015500041.tif 000010
【０１３６】
配列番号４  トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）β−グルコシダーゼ１（Ｂｇｌ１）、すなわちトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）由来のＧＨ３ファミリーβ−グルコシダーゼのタンパク質配列
2015500041.tif 000011
【０１３７】
配列番号５  トリコデルマ・リーゼイ（T.reesei）において発現させるためコドン最適化した、タラロミセス・エマソニィ（Talaromyces emersonii）由来のＧＨ３ファミリーβ−グルコシダーゼＴｅ３Ａのヌクレオチド配列
2015500041.tif 000012
【０１３８】
配列番号６  タラロミセス・エマーソニィ（Talaromyces emersonii）由来のＧＨ３ファミリーβ−グルコシダーゼＴｅ３Ａのタンパク質配列
2015500041.tif 000013
【０１３９】
配列番号７  トリコデルマ・リーゼイ（T.reesei）由来のＧＨ３ファミリーβ−グルコシダーゼＢｇｌ３（又はＴｒ３Ｂ）のヌクレオチド配列
2015500041.tif 000014
【０１４０】
配列番号８  トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）由来のＧＨ３ファミリーβ−グルコシダーゼＢｇｌ３（又はＴｒ３Ｂ）のタンパク質配列
2015500041.tif 000015
【０１４１】
配列番号９  Ｆｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３をコードしているヌクレオチド配列
2015500041.tif 000016
【０１４２】
（上配列表の続き）
2015500041.tif 000017
【０１４３】
（上配列表の続き）
2015500041.tif 000018
【０１４４】
配列番号１０  Ｆｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３キメラポリペプチド配列（Ｂｇｌ３キメラ部位をボールド体の大文字で示す）
2015500041.tif 000019
【０１４５】
配列番号１１：Ｆｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ／Ｂｇｌ３キメラをコードしている核酸配列
2015500041.tif 000020
【０１４６】
（上配列表の続き）
2015500041.tif 000021
【０１４７】
配列番号１２：Ｆｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ／Ｂｇｌ３キメラのアミノ酸配列
2015500041.tif 000022
【０１４８】
配列番号１３：フザリウム・バーティシロイド（Fusarium verticilloides）由来のＧＨ４３Ｄファミリー酵素Ｆｖ４３Ｄのヌクレオチド配列
2015500041.tif 000023
【０１４９】
配列番号１４  Ｆｖ４３Ｄのタンパク質配列
2015500041.tif 000024
【０１５０】
配列番号１５  順方向プライマーＭＨ２３４
５’−ＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣＴＧＡＡＴＴＧＧＧＴＣＧＣ−３’
【０１５１】
配列番号１６  逆方向プライマーＭＨ２３５
５’−ＴＴＡＣＴＣＣＡＡＣＴＴＧＧＣＧＣＴＧ−３’
【０１５２】
配列番号１７  ＭＨ２５５
５’−ＡＡＧＣＣＡＡＧＡＧＣＴＴＴＧＴＧＴＣＣ−３’
【０１５３】
配列番号１８  ＭＨ２５６
５’−ＴＡＴＧＣＡＣＧＡＧＣＴＣＴＡＣＧＣＣＴ−３’
【０１５４】
配列番号１９  ＭＨ２５７
５’−ＡＴＧＧＴＡＣＣＣＴＧＧＣＴＡＴＧＧＣＴ−３’
【０１５５】
配列番号２０  ＭＨ２５８
５’−ＣＧＧＴＣＡＣＧＧＴＣＴＡＴＣＴＴＧＧＴ−３’
【０１５６】
配列番号２１  ｐＤｏｎｏｒ順方向
５’−ＧＣＴＡＧＣＡＴＧＧＡＴＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣ−３’
【０１５７】
配列番号２２  Ｆｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３逆方向
５’−ＧＧＡＧＧＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＴＧＡＡＣＧＴＣＧＡＣＣＡＡＧＡＴＡＧＡＣＣＧＴＧＡ  ＣＣＧＡＡＣ  ＴＣＧＴＡＧ  ３’
【０１５８】
配列番号２３  ｐＤｏｎｏｒ逆方向
５’−ＴＧＣＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ−３’
【０１５９】
配列番号２４  Ｆｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３順方向
５’−  ＣＴＡＣＧＡＧＴＴＣＧＧＴＣＡＣＧＧＴＣＴＡＴＣＴＴＧＧＴＣＧＡＣＧＴＴＣＡＡＧＴＴＣ  ＴＣＣＡＡＣＣＴＣＣ−３’
【０１６０】
配列番号２５  Ａｔｔ  Ｌ１順方向
５’  ＴＡＡＧＣＴＣＧＧＧＣＣＣＣＡＡＡＴＡＡＴＧＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＧＡＣＴＧＡＴＡＧＴ  ３’
【０１６１】
配列番号２６  ＡｔｔＬ２逆方向
５’ＧＧＧＡＴＡＴＣＡＧＣＴＧＧＡＴＧＧＣＡＡＡＴＡＡＴＧＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＧＡＣＴＧＡＴＡ  ３’
【０１６２】
配列番号２７  Ｆｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３キメラのＦｖ３Ｃ残基６６５〜６８３
ＲＲＳＰＳＴＤＧＫＳＳＰＮＮ  ＴＡＡＰＬ
【０１６３】
配列番号２８  Ｔｅ３Ａ残基６３４〜６４０
ＫＹＮＩＴＰＩ
【０１６４】
配列番号２９  Ｐｒ  ＣｂｈＩ順方向
５’  ＣＧＧＡＡＴＧＡＧＣＴＡＧＴＡＧＧＣＡＡＡＧＴＣＡＧＣ  ３’
【０１６５】
配列番号３０  ７２５／７５１逆方向
５’−ＣＴＣＣＴＴＧＡＴＧＣＧＧＣＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＧＧＧＧＡＡＧＣＣＡＴＡＧＴＣＣＴＴＡＡ  ＧＧＴＴＣＴＴＧＣＴＧＡＡＧＴＴＧＣＣＣＡＧＡＧＡＧ  ３’
【０１６６】
配列番号３１  ７２５／７５１順方向
５’−ＧＧＣＴＴＣＣＣＣＡＡＧＡＡＣＧＴＴＣＧＣＣＧＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＴＴＴＡＴＣＴＡＣＣ  ＣＣＴＡＣＣＴＧＡＡＣＡＣＣＡＣＴＡＣＣＴＣ  ３’
【０１６７】
配列番号３２  Ｔｅｒ  ＣｂｈＩ逆方向
５’ＧＡＴＡＣＡＣＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＧＡＴＴＣＴＡＣＧＧ  ３’
【０１６８】
配列番号３３  Ｔｅ３Ａ逆方向
５’−ＧＡＴＡＧＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＡＡＣＴＣＧＴＡＧＡＴＡＧＧＣＧＴＧＡＴＧＴＴ  ＧＴＡＣＴＴＧＴＣＧＡＡＧＴＧＡＣＧＧＴＡＧＴＣＧＡＴＧＡＡＧＡＣ  ３’
【０１６９】
配列番号３４  Ｔｅ３Ａ２順方向
５’−ＧＴＣＴＴＣＡＴＣＧＡＣＴＡＣＣＧＴＣＡＣＴＴＣＧＡＣＡＡＧＴＡＣＡＡＣＡＴＣＡＣ  ＧＣＣＴＡＴＣＴＡＣＧＡＧＴＴＣＧＧＴＣＡＣＧＧＴＣＴＡＴＣ−３’
【０１７０】
配列番号３５  順方向プライマーＳＫ９４３
５’−ＣＡＣＣＡＴＧＡＧＡＴＡＴＡＧＡＡＣＡＧＣＴＧＣＣＧＣＴ−３’
【０１７１】
配列番号３６  逆方向プライマーＳＫ９４１
５’−ＣＧＡＣＣＧＣＣＣＴＧＣＧＧＡＧＴＣＴＴＧＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＧ−３’
【０１７２】
配列番号３７  順方向プライマー（ＳＫ９４０）
５’−ＣＴＧＴＣＧＣＧＧＧＡＣＣＡＣＴＧＧＧＣＡＡＧＡＣＴＣＣＧＣＡＧＧＧＣＧＧＴＣＧ−３’
【０１７３】
配列番号３８  逆方向プライマー（ＳＫ９４２）
５’−ＣＣＴＡＣＧＣＴＡＣＣＧＡＣＡＧＡＧＴＧ−３’
【０１７４】
配列番号３９  順方向プライマーＳＫ７７１
５’−ＧＴＣＴＡＧＡＣＴＧＧＡＡＡＣＧＣＡＡＣ−３’
【０１７５】
配列番号４０  逆方向プライマーＳＫ７４５
５’−ＧＡＧＴＴＧＴＧＡＡＧＴＣＧＧＴＡＡＴＣＣ−３’
【０１７６】
配列番号４１  順方向プライマーＳＫ１３２２
５’−ＣＡＣＣＡＴＧＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＴＴＣＴＧＴＣ−３’
【０１７７】
配列番号４２  逆方向プライマーＳＫ１２９７
５’−ＧＧＴＴＡＣＴＡＧＴＣＡＡＣＴＧＣＣＣＧＴＴＣＴＧＴＡＧＣＧＡＧ−３’
【０１７８】
配列番号４３  順方向プライマーＳＫ１２３６
５’−ＣＡＴＧＣＧＡＴＣＧＣＧＡＣＧＴＴＴＴＧＧＴＣＡＧＧＴＣＧ−３’
【０１７９】
配列番号４４  逆方向プライマーＳＫ１３２１
５’−ＧＡＣＡＧＡＡＡＣＴＴＧＡＧＣＴＧＣＡＴＧＧＴＧＴＧＧＧＡＣＡＡＣＡＡＧＡＡＧＧ−３’
【図１】
2015500041.tif 000025
【図２】
2015500041.tif 000026
【図３】
2015500041.tif 000027
【図４】
2015500041.tif 000028
【図５】
2015500041.tif 000029
【図６】
2015500041.tif 000030
【図７】
2015500041.tif 000031
【図８】
2015500041.tif 000032
【図９】
2015500041.tif 000033
【図１０】
2015500041.tif 000034
【図１１】
2015500041.tif 000035
【配列表】
2015500041000001.app
【国際調査報告】
2015500041.tif 000036
2015500041.tif 000037
2015500041.tif 000038
2015500041.tif 000039