(57)【要約】本明細書には、チオリダジンのようなドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬と化学療法剤を含む、癌を処置するための方法、使用方法、組み合わせおよび組成物が記載されている。選択肢として、化学療法剤はシタラビンのようなデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）合成阻害薬、またはパクリタキセルまたはドセタキセルのような微小管阻害薬である。本発明の方法、使用方法、組み合わせおよび組成物は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）のような癌の処置に有用である。【選択図】図１９
2015516378.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者における急性骨髄性白血病を処置するためのチオリダジンとシタラビンの使用。  
【請求項２】
前記チオリダジンと前記シタラビンは同時に使用される、ことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記チオリダジンと前記シタラビンは異なる時間に使用される、ことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記チオリダジンは前記シタラビンの使用の前に使用される、ことを特徴とする請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記シタラビンは前記チオリダジンの使用の前に使用される、ことを特徴とする請求項３に記載の使用。
【請求項６】
使用時に前記シタラビンの前記被験者における血漿濃度は１ｎＭと１００ｎＭの間である、ことを特徴とする請求項１−５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
使用時に前記シタラビンの前記被験者における血漿濃度は５ｎＭ未満である、ことを特徴とする請求項６に記載の使用。
【請求項８】
使用時に前記チオリダジンの前記被験者における血漿濃度は５μＭと１５μＭの間である、ことを特徴とする請求項１−７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
使用時に前記チオリダジンの前記被験者における血漿濃度は約１０μＭである、ことを特徴とする請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
使用時に前記シタラビンの前記被験者における血漿濃度は１ｎＭと１００ｎＭの間であり、前記チオリダジンの前記被験者における血漿濃度は５μＭと１５μＭの間である、ことを特徴とする請求項１−５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
前記被験者は寛解にある、ことを特徴とする請求項１−１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
前記被験者はヒトである、ことを特徴とする請求項１−１１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
被験者における急性骨髄性白血病を処置するためのチオリダジンとシタラビンの組み合わせ。
【請求項１４】
前記チオリダジンと前記シタラビンは同時に使用される、ことを特徴とする請求項１３に記載の組み合わせ。
【請求項１５】
前記チオリダジンと前記シタラビンは異なる時間に使用される、ことを特徴とする請求項１３に記載の組み合わせ。
【請求項１６】
前記チオリダジンは前記シタラビンの使用の前に使用される、ことを特徴とする請求項１５に記載の組み合わせ。
【請求項１７】
前記シタラビンは前記チオリダジンの使用の前に使用される、ことを特徴とする請求項１５に記載の組み合わせ。
【請求項１８】
前記シタラビンは、使用時に前記シタラビンの前記被験者における血漿濃度が１ｎＭと１００ｎＭの間であるように調製される、ことを特徴とする請求項１３−１７のいずれかに記載の組み合わせ。
【請求項１９】
前記シタラビンは、使用時に前記シタラビンの前記被験者における血漿濃度が５ｎＭ未満であるように調製される、ことを特徴とする請求項１８に記載の組み合わせ。
【請求項２０】
前記チオリダジンは、使用時に前記チオリダジンの前記被験者における血漿濃度が５μＭと１５μＭの間であるように調製される、ことを特徴とする請求項１３−１９のいずれか１項に記載の組み合わせ。
【請求項２１】
前記チオリダジンは、使用時に前記チオリダジンの前記被験者における血漿濃度が約１０μＭであるように調製される、ことを特徴とする請求項２０に記載の組み合わせ。
【請求項２２】
前記シタラビンは使用時に前記シタラビンの前記被験者における血漿濃度が１ｎＭと１００ｎＭの間であるように調製され、そして前記チオリダジンは前記チオリダジンの前記被験者における血漿濃度が５μＭと１５μＭの間であるように調製される、ことを特徴とする請求項１３−１７のいずれか１項に記載の組み合わせ。
【請求項２３】
前記被験者は寛解にある、ことを特徴とする請求項１３−２２のいずれか１項に記載の組み合わせ。
【請求項２４】
前記被験者はヒトである、ことを特徴とする請求項１３−２３のいずれか１項に記載の組み合わせ。
【請求項２５】
チオリダジンとシタラビンを含む組成物。
【請求項２６】
さらに医薬的に許容可能な担体を含む、ことを特徴とする請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
急性骨髄性白血病を処置するための請求項２５または２６に記載の組成物。
【請求項２８】
急性骨髄性白血病を処置するためのチオリダジンとシタラビンを含むキット。
【請求項２９】
チオリダジンとシタラビンが異なる容器に入っており、選択肢として医薬的に許容可能な担体と共にある、ことを特徴とする請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
チオリダジンとシタラビンが単一の容器、選択肢として医薬的に許容可能な担体、に入っていることを特徴とする請求項２８に記載のキット。
【請求項３１】
キットの使用説明書をさらに含む、ことを特徴とする請求項２８−３０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３２】
チオリダジンとシタラビンを投与するステップを有する、ことを特徴とする被験者の急性骨髄性白血病を処置する方法。
【請求項３３】
前記チオリダジンと前記シタラビンは前記被験者に同時に投与される、ことを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記チオリダジンと前記シタラビンは前記被験者に異なる時間に投与される、ことを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記チオリダジンは前記シタラビンの前に被験者に投与される、ことを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記シタラビンは前記チオリダジンの前に被験者に投与される、ことを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記シタラビンは前記シタラビンの前記被験者における血漿濃度が１ｎＭと１００ｎＭの間であるように被験者に投与される、ことを特徴とする請求項３２−３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記シタラビンは前記シタラビンの前記被験者における血漿濃度が５ｎＭ未満であるように被験者に投与される、ことを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記チオリダジンは前記チオリダジンの前記被験者における血漿濃度が５μＭと１５μＭの間であるように被験者に投与される、ことを特徴とする請求項３２−３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記チオリダジンは前記チオリダジンの前記被験者における血漿濃度が約１０μＭであるように被験者に投与される、ことを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記シタラビンは前記シタラビンの前記被験者における血漿濃度が１ｎＭと１００ｎＭの間であるように被験者に投与され、そして前記チオリダジンは前記チオリダジンの前記被験者における血漿濃度が５μＭと１５μＭの間であるように被験者に投与される、ことを特徴とする請求項３２−３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記被験者は寛解にある、ことを特徴とする請求項３２−４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
細胞にチオリダジンとシタラビンを接触させるステップを有することを特徴とする、１つまたはそれ以上の白血病細胞の増殖を減少させる方法。
【請求項４４】
前記白血病細胞が急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞である、ことを特徴とする請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記白血病細胞が癌幹細胞である、ことを特徴とする請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞が生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）にある、ことを特徴とする請求項４３−４５のいずれか１項記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞が試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）にある、ことを特徴とする請求項４３−４５のいずれか１項記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞は１ｎＭと１００ｎＭの間の濃度のシタラビンと接触させられる、ことを特徴とする請求項４３−４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞は５ｎＭ未満の濃度のシタラビンと接触させられる、ことを特徴とする請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞は５μＭと１５μＭの間の濃度のチオリダジンと接触させられる、ことを特徴とする請求項４３−４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞は約１０μＭの濃度のチオリダジンと接触させられる、ことを特徴とする請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記細胞は１ｎＭと１００ｎＭの間の濃度のシタラビンと接触させられ、そして前記細胞は５μＭと１５μＭの間の濃度のチオリダジンと接触させられる、ことを特徴とする請求項４３−４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記細胞は約１０μＭの濃度のチオリダジンと接触させられる、ことを特徴とする請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
ドーパミン受容体遮断薬と化学療法剤を使用することを特徴とする、被験者における癌を処置するための方法。
【請求項５５】
前記化学療法剤はＤＮＡ合成阻害薬または微小管阻害薬である、ことを特徴とする請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＤＮＡ合成阻害薬はシタラビンである、ことを特徴とする請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ドーパミン受容体遮断薬はＤ２ファミリードーパミン受容体遮断薬である、ことを特徴とする請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記ドーパミン受容体遮断薬はフェノチアジン誘導体である、ことを特徴とする請求項５４―５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記フェノチアジン誘導体はチオリダジンである、ことを特徴とする請求項５４―５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記ドーパミン受容体遮断薬は表１から選択される、ことを特徴とする請求項５４―５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記癌または前癌性の疾病は白血病またはリンパ腫である、ことを特徴とする請求項５４―６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記白血病は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、ことを特徴とする請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記被験者は寛解にある、ことを特徴とする請求項５４―６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記被験者はヒトである、ことを特徴とする請求項５４―６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
細胞にドーパミン受容体遮断薬と化学療法剤を接触させるステップを有することを特徴とする、癌細胞の増殖を減少させる方法。
【請求項６６】
前記化学療法剤はＤＮＡ合成阻害薬または微小管阻害薬である、ことを特徴とする請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記ＤＮＡ合成阻害薬はシタラビンである、ことを特徴とする請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記ドーパミン受容体遮断薬はＤ２ファミリードーパミン受容体遮断薬である、ことを特徴とする請求項６５―６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記ドーパミン受容体遮断薬はフェノチアジン誘導体である、ことを特徴とする請求項６５―６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
前記フェノチアジン誘導体はチオリダジンである、ことを特徴とする請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記ドーパミン受容体遮断薬は表１から選択される、ことを特徴とする請求項６５―６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
前記癌細胞は白血病癌細胞である、ことを特徴とする請求項６５―７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記白血病癌細胞は白血病癌幹細胞である、ことを特徴とする請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記白血病は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、ことを特徴とする請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記細胞が生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）にある、ことを特徴とする請求項６５−７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記細胞が試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）にある、ことを特徴とする請求項６５−７４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の処置のための方法および組成物に関し、特にドーパミン受容体遮断薬および化学療法剤による癌の処置のための方法および組成物に関するものである。
【０００２】
（関連出願）
本出願は２０１３年３月１５日出願の米国特許出願１３／８３７，１１５（特許文献１）および２０１２年３月２８日出願の米国暫定特許出願６１／６１６，６５８（特許文献２）に対し優先権を主張し、それらはここに参照としてそれらの全てが採り入れられる。
【背景技術】
【０００３】
多くの証拠が癌／腫瘍の発現が癌幹細胞（ＣＳＣ）と呼ばれ（Ｄｉｃｋ，２００９；Ｊｏｒｄａｎ，２００９；Ｒｅｙａ他、２００１）独自に疾病を開始し維持することができる稀な細胞集団に起因することを示唆した。さらに実験の結果が、癌細胞系の増殖を抑制し（Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ，２００６）またはマウスモデルにおいて腫瘍量を減少させる（Ｆｒｅｓｅ及びＴｕｖｅｓｏｎ，２００７）能力を特徴とする従来型の化学療法薬剤がヒト癌幹細胞（ＣＳＣ）に対して有効でないことを示した（Ｇｕａｎ他，２００３；Ｌｉ他，２００８）。この化学療法剤に対する抵抗性は、しばしば健康な幹細胞および前駆細胞に影響を与える無差別な細胞毒性と組合わされて、投与量制限につながり、そして保護処置を必要とさせる（Ｓｍｉｔｈ他、２００６）。この方向に沿った最近の事例には、細胞死の選択的誘導（Ｇｕｐｔａ他，２００９；Ｒａｊ他，２０１１）があるが、それはまだ正常幹細胞及びヒトシステムでのテストが残されている。したがって前臨床検査用の真に選択的な抗ガン剤を提供するために、癌幹細胞のみを標的とする薬剤の識別が喫緊の課題である。
【０００４】
正常幹細胞及び腫瘍性幹細胞は自己再生と分化ポテンシャルとの間のしっかりと制御された平衡状態により機能的に定義される。癌幹細胞の場合この平衡状態は増大した自己再生とサバイバルの側にかたより、その結果限定された分化能力をもたらし、それは最終的に腫瘍の成長を可能にする。正常な幹細胞にも等しく影響する直接的毒性効果とは対照的に、癌幹細胞を根絶する他の手段は、癌幹細胞集団を消耗させる努力の中で、この平衡状態を分化の側に変更することによる。したがって、選択的に体細胞性癌幹細胞を標的にし、一方で健常な幹細胞能力を助命する分子を識別することは、革新的な診断及び処置の開発にとって選択的にヒト癌幹細胞を標的にするために有用である。
【０００５】
血液系腫瘍は血液、骨髄およびリンパ節に影響を及ぼす癌のタイプである。血液系腫瘍は２つの主要血液細胞分化系列のいずれかに由来する：骨髄性またはリンパ性細胞系。血液系腫瘍の例は、急性骨髄性白血病および慢性骨髄性白血病を含む。
【０００６】
血液系腫瘍は全て一般的に骨髄内の骨髄性分化系列の前駆体から発生すると考えられているが、それらは症状、病理および処置において高度に多岐にわたっている。例えば２００８年ＷＨＯ骨髄増殖性腫瘍分類（Ｔｅｆｆｅｒｉ他、Ｃａｎｃｅｒ９月１日号、３８４２−３８４７頁（２００９年）および；Ｖａｎｎｕｃｃｈｉ他  骨髄増殖性腫瘍の理解と管理の進展  ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．２００９年；５９：１７１−１９１参照。両文献はここに参照され採り入れられる。）は骨髄性腫瘍の５つの異なる分類スキームを提示し、そして急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）及び他の骨髄増殖性腫瘍とは異なるカテゴリーに分類している。さらに慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）はしばしばＢＣＲ−Ａｂｌ転座を含むことが特徴としてあげられるが、これは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）には存在しない。骨髄腫瘍のような白血病の好適な処置は、造血性幹細胞集団に不当に影響を与えることなく白血病細胞を標的とするであろう。
【０００７】
チオリダジンはフェノチアジン薬グループに属するドーパミン受容体遮断薬であり、そして抗精神病薬として使用されている。それは１９５９以来、病院で使用されてきたが、高投与量での心毒性および網膜症にたいする懸念から、この薬は一般的には処方されず、より普遍的に使用される抗精神病薬に対し、応答に失敗した又は禁忌である患者に対しとっておかれている。統合失調症に有効であると見做される量の投与量でドーパミン受容体遮断薬による処置を受けている統合失調症患者は、一般集団に比べて直腸、結腸及び前立腺癌の発現率が低いことが報告されている。
【０００８】
シタラビン（シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ））はＤＮＡ合成阻害薬であり、そして成人ヒト急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の導入療法および強化化学療法の両方に使用される至適基準の化学療法剤である。しかしこの処置は高用量において有意の罹患リスクおよび死亡リスクの問題を提起する（ＥｓｔｅｙとＤｏｈｎｅｒ，２００６）。
【０００９】
癌の処置のための新規の方法および組成物、とくに急性骨髄性白血病の処置と予後のための方法に対するニーズが存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許出願１３／８３７，１１５
【特許文献２】米国暫定特許出願６１／６１６，６５８
【発明の概要】
【００１１】
ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬とＤＮＡ合成阻害薬のような化学療法剤との組み合わせは、癌細胞の殺傷に驚くほど効果的であると判断された。本明細書に記載の通り、チオリダジン、クロルプロマジン、フルフェナジンまたはプロクロルペラジンのようなドーパミン受容体遮断薬は、癌細胞とくに急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に対し細胞毒性である。ドーパミン受容体遮断薬は癌細胞に毒性な濃度において造血性幹細胞のような正常幹細胞に対し比較的限定的な効果を及ぼすことが分かっている。さらに事例１３と１５で示されるように、ドーパミン受容体遮断薬チオリダジンと化学療法剤シタラビンの組み合わせはシナジー的効果を示し、そしてＡＭＬ癌細胞数の有意の減少をもたらした。チオリダジンとシタラビンの組み合わせはまた、ＡＭＬ癌細胞を根絶し、一方で正常造血幹細胞機能を維持することが示された。従ってドーパミン受容体遮断薬とシタラビンのような化学療法剤の組み合わせは、低レベルで投与されるべき化学療法剤の治療的に効果のある用量を可能にし、それにより化学療法剤の高用量に通常付帯する望ましくない副作用を防止する。
【００１２】
従って本発明の１側面は、ドーパミン受容体遮断薬および化学療法剤を被験者に投与するステップを有する、被験者の癌または前癌性の疾病を処置する方法を含む。他の側面は、癌または前癌性の疾病の処置に対しドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬および化学療法剤を使用する方法を含む。本発明のもう１つの側面は、癌または前癌性の疾病の処置に使用されるドーパミン受容体遮断薬および化学療法剤の組み合わせを含む。ある実施形態では化学療法剤はシタラビンのようなＤＮＡ合成阻害薬である。ある実施形態では化学療法剤はタキサンのような微小管阻害薬である。ある実施形態ではドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬はチオリダジンのようなフェノチアジン誘導体または表１から選択されるドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬である。ある実施形態ではドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬は１つまたはそれ以上のドーパミン受容体（ＤＲ）に選択的な抗体である。ある実施形態では癌または前癌性の疾病は白血病またはリンパ腫であり、選択肢として急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。ある実施形態では、シタラビンの使用または投与は、被験者におけるシタラビンの濃度を１ｎＭと１００ｎＭの間、場合によって５ｎＭ未満にする。ある実施形態では、チオリダジンの使用または投与は、被験者におけるチオリダジンの濃度を５μＭと１５μＭの間、場合によって約１０μＭにする。
【００１３】
本発明の他の側面は、癌細胞にドーパミン受容体遮断薬および化学療法剤を接触させるステップを含む癌細胞の細胞死を誘導する方法を含む。本発明の類似の側面は、癌細胞にドーパミン受容体遮断薬および化学療法剤を接触させるステップを含む癌細胞の増殖を減少させる方法を含む。他の実施形態では細胞は生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）である。ある実施形態では、化学療法剤はシタラビンのようなＤＮＡ合成阻害薬である。ある実施形態ではドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬はチオリダジンのようなフェノチアジン誘導体または表１から選択される化合物である。ある実施形態ではドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬は１つまたはそれ以上のドーパミン受容体（ＤＲ）に選択的な抗体である。ある実施形態では化学療法剤はタキサンのような微小管阻害薬である。ある実施形態では癌は白血病であり、選択肢として急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。ある実施形態では癌細胞は癌幹細胞であり、選択肢として白血病癌幹細胞である。
【００１４】
本発明のさらなる側面は、ドーパミン受容体遮断薬および化学療法剤からなる組成物を含む。ある実施形態ではドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬はチオリダジンのようなフェノチアジン誘導体または表１から選択される化合物である。ある実施形態では、化学療法剤はシタラビンのようなＤＮＡ合成阻害薬である。また、ドーパミン受容体遮断薬および化学療法剤からなる組成物の癌の処置における使用法が提供される。選択肢として、組成物は化学療法剤に接合したドーパミン受容体遮断薬を含む。例えば、ある実施形態ではシタラビンのようなＤＮＡ合成阻害薬に接合したドーパミン受容体遮断薬からなる化合物が提供される。ある実施形態では、タキソールのような微小管阻害薬に接合したドーパミン受容体遮断薬が提供される。ある実施形態では、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬はチオリダジンのようなフェノチアジン誘導体または表１から選択される化合物である。ある実施形態ではドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬は１つまたはそれ以上のドーパミン受容体（ＤＲ）に選択的な抗体である。ある実施形態では、組成物はさらに医薬的に許容可能な担体を含む。
【００１５】
本発明のある側面では、ドーパミン受容体遮断薬および化学療法剤からなるキットが提供される。ある実施形態では、そのキットは白血病の処置に使用されるような、癌の処置に使用される。ある実施形態では、キットは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の処置に使用される。ある実施形態では、ドーパミン受容体遮断薬および化学療法剤は別々の容器、選択肢として１つまたはそれ以上の医薬的に許容可能な担体に入れられる。ある実施形態では、ドーパミン受容体遮断薬および化学療法剤は別々の容器に入れられるが、キット内に一緒に梱包される。ある実施形態では、キットは単一の容器、選択肢として１つの医薬的に許容可能な担体の中に、ドーパミン受容体遮断薬および化学療法剤を含む。ある実施形態では、キットは、癌の処置におけるドーパミン受容体遮断薬および化学療法剤の使用説明書のような、キットの使用説明書を含む。ある実施形態では、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬はチオリダジンである。ある実施形態では、化学療法剤はシタラビンである。
【００１６】
本発明の１側面では、ドーパミン受容体遮断薬および放射線治療を被験者に投与するステップを有する、被験者の癌または前癌性の疾病を処置する方法が提供される。選択肢として、方法は被験者に本明細書に記載される化学療法剤を投与するステップも含む。
【００１７】
本開示の他の特徴および優位性は以下の詳細説明から明らかになるであろう。しかし詳細説明および特定の事例は、本開示の好適な実施形態を示すが、説明のためにだけ与えられ、開示の精神と範囲内で多くの変更と修飾がこの記述を読んだ当業者には自明である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
本発明の１つ以上の実施形態が図に関連して記載される；
【図１】１０μＭのチオリダジンはＨＬ−６０、ＭＶ４−１１およびＯＣＩ３の白血病細胞系に対し細胞毒性があることを示す図である。
【図２】１０μＭのチオリダジンは正常造血幹細胞（ＨＳＣ）のコロニー形成ポテンシャルには限られた影響しか及ぼさないが（図２Ａ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の芽細胞形成ポテンシャルを有意に減少させることを示す図である。
【図３−４】（図３）は、チオリダジンで処置された正常造血幹細胞（ＨＳＣ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）から形成されたＣＦＵコロニーの細胞ペレットを示す図である。（図４）は、１０μＭのクロルプロマジンと１０μＭのチオリダジンは共にＨＬ−６０、ＭＶ４−１１およびＯＣＩ３の白血病細胞系に対し細胞毒性があることを示す図である。
【図５】ドーパミン受容体ＤＲ１、ＤＲ２、ＤＲ３、ＤＲ４およびＤＲ５の発現を示す図である。ドーパミン受容体（ＤＲ）発現は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞系、幾つかの原発性ＡＭＬおよび単核細胞（ＭＮＣ）には見られるが、造血幹細胞（ＨＳＣ）を豊富に含んだ細胞（系統枯渇へその緒臍帯血ＣＢｌｉｎ（−））では見られなかった。
【図６】多重ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞系に対し細胞毒性があることを示す図である。ＳＫＦ＝（Ｒ）−（＋）−ＳＫＦ−３８３９３塩酸塩；７ＯＨ＝Ｒ（＋）−７−ヒドロキシ−ＤＰＡＴ臭化水素酸塩；ＧＲ＝ＧＲ  １０３６９１；ＳＣＨ＝Ｒ（＋）−ＳＣＨ−２３３９０塩酸塩；ＣＬＯＺ＝クロザピン；ＣＨＬ＝クロルプロマジン塩酸塩；ＴＨＩＯ＝チオリダジン。
【図７−８】（図７）は、原発性ＡＭＬにおいてドーパミン受容体がＣＤ１４＋細胞集団の中に発現することを示す蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）データの図である。（図８）は、原発性ＡＭＬにおいてチオリダジンがＣＤ１４＋細胞を選択的に標的とし、そしてその正規化出現度数を減少させることを示す図である。
【図９Ａ−Ｃ】腫瘍性のヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を分化する化合物のための化学スクリーニングを使用した、メフロキンとチオリダジンの識別を示す図である。（図９Ａ）はスクリーニング手順の概略を示す。（図９Ｂ）は５９０種類の化合物スクリーンの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびヘキスト信号の％残存活性（％ＲＡ）のＸＹ分散プロットである。囲まれた領域は減少したＧＦＰと減少したヘキストで定義される多能性の喪失（ＬＯＰ）を示す。各点はｎ＝３、平均＋／−標準誤差。（図９Ｃ）は５９０種類の化合物の反応の要約を示す。
【図９Ｄ−Ｇ】（図９Ｄ）は候補化合物；チオリダジン、アザチオプリンおよびメフロキンの化学構造式を示す。（図９Ｅ）は候補化合物１０μＭで処置したｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ細胞のＧＦＰ、ヘキストおよびそれらを合体させた代表的顕微鏡画像である。（図９Ｆ）はこれら画像のＧＦＰ強度のヒストグラムである。（図９Ｇ）はｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰの投与量反応曲線と５０％有効濃度（ＥＣ５０）の計算値である。各点はｎ＝３、平均＋／−標準誤差。
【図１０Ａ−Ｃ】サリノマイシン、メフロキンおよびチオリダジンの正常および腫瘍性集団に対する影響を示す図である。（図１０Ａ−Ｂ）１０−７−１０−６Ｍのサリノマイシン（ＳＡＬ）、メフロキン（ＭＱ）およびチオリダジン（ＴＨＩＯ）で処置されたＨ９（図１０Ａ）およびｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ（図１０Ｂ）内のＯｃｔ４＋細胞の出現頻度のフローサイトメトリ分析である。各バーはｎ＝３、平均＋／−標準誤差。数値はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で処置された対照試料に対し正規化されている；（−）ＤＭＳＯ平均、（−−）平均マイナス１標準誤差、（−）ＢＭＰ４処置試料における％Ｏｃｔ４＋レベル。（図１０Ｃ）同一化合物の同一濃度での、ｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ内のＯｃｔ４＋細胞の正規化出現頻度％に対するＨ９内のＯｃｔ４＋細胞の正規化出現頻度％の比率である。
【図１０Ｄ−Ｈ】（図１０Ｄ、Ｅ）は１０μＭのエトポシド、チオリダジン（ＴＨＩＯ）、ＢＭＰ４で２４時間処置後、およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）処置（対照、ＣＴＲＬ）において、ｐ５３（図１０Ｄ）およびｐ２１（図１０Ｅ）に対しポジティブに染色する腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）のパーセントを示す。各バーはｎ＝３、平均＋／−標準誤差。エトポシド、チオリダジン処置後の代表的画像が含まれる。矢印はエトポシド処置細胞とチオリダジン処置細胞におけるｐ５３＋とｐ２１＋を示す。（図１０Ｆ）は腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）のチオリダジン処置後、２倍超増加した分化に伴う遺伝子を示す図である。遺伝子はそれぞれの行に分けられている、内胚葉（ＥＮＤＯ）、中胚葉（ＭＥＳＯ）、胚細胞（ＧＥＲＭ）、神経細胞（ＮＥＵＲＯ）および栄養芽細胞（ＴＲＯＰＨ）。各バーは２つの別個の実験の平均値である。（図１０Ｇ−Ｋ）はメチルセルロース検定法を使用して検知された、化合物処置に反応した造血性多重分化系列及びクローン原性ポテンシャルを示す。（図１０Ｇ）は化合物処置後の造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）からの代表的コロニー形成単位（ＣＦＵ）ペレットを示す。（図１０Ｈ）は化合物処置後のＡＭＬからの代表的芽細胞ＣＦＵペレットを示す。
【図１０Ｉ−Ｌ】（図１０Ｉ−Ｊ）は、化合物処置後のＨＳＰＣ（図１０Ｉ）およびＡＭＬ芽細胞（図１０Ｊ）から生成されたそれぞれＣＦＵと芽細胞ＣＦＵの定量化結果を示す。数値はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で処置された対照試料に対し正規化されている；（−）ＤＭＳＯ平均、（−−）平均マイナス１標準誤差。各ＨＳＰＣバーはｎ＝７個別サンプル、平均＋／−標準誤差。各ＡＭＬバーは少なくともｎ＝５個別患者サンプル、平均＋／−標準誤差。（図１０Ｋ）は同一化合物の同一濃度における正規化されたＡＭＬ芽細胞のＣＦＵに対するＨＳＰＣのＣＦＵの比率。（図１０Ｌ）チオリダジン１０μＭ（ＴＨＩＯ  １０μＭ）またはＤＭＳＯ溶媒（ＣＴＲＬ）で９６時間まで処置後の培養された患者ＡＭＬ細胞内のＣＤ１１ｂ顆粒球細胞の正規化出現頻度を示す。各バーはｎ＝３、平均＋／−標準誤差。（＊）ｐ＜０．０５（＊＊）ｐ＜０．０１（＊＊＊）ｐ＜０．００１（＊＊＊＊）ｐ＜０．０００１。
【図１１Ａ−Ｂ】サリノマイシン、メフロキンおよびチオリダジンの線維芽細胞由来人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）に対する効果を示す図である。（図１１Ａ）１０−７−１０−６Ｍのサリノマイシン（ＳＡＬ）、メフロキン（ＭＱ）およびチオリダジン（ＴＨＩＯ）で処置した線維芽細胞由来ｉＰＳＣ（Ｆｉｂ−ｉＰＳ）におけるＯｃｔ４＋細胞の出現頻度のフローサイトメトリ分析である。各バーはｎ＝３；平均＋／−標準誤差。数値はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で処置された対照試料に対し正規化されている；（−）ＤＭＳＯ平均、（−−）平均マイナス１標準誤差、（−）ＢＭＰ４処置試料の％Ｏｃｔ４＋レベル。（図１１Ｂ）化合物の腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）に対する拡大投与量応答である。各点は平均＋／−標準誤差。
【図１１Ｃ−Ｄ】（図１１Ｃ）はチオリダジンで処置された系統枯渇へその緒臍帯血（ＣＢｌｉｎ−）の造血性分化系列ポテンシャルを示す。メチルセルロース検定法において生成された赤芽球（ＣＦＵ−Ｅ）、マクロファージ（ＣＦＵ−Ｍ）および顆粒球（ＣＦＵ−Ｇ）コロニーのコロニー形成単位（ＣＦＵ）を示す。（図１１Ｄ）はサリノマイシン、メフロキンおよびチオリダジンで処置された系統枯渇へその緒臍帯血（ＣＢｌｉｎ−）から生成されたＣＦＵの構成を示す図である。０．１μＭ、１μＭ、１０μＭのサリノマイシン（ＳＡＬ）、メフロキン（ＭＱ）およびチオリダジン（ＴＨＩＯ）処置で生成されたＣＦＵの％構成を示す。（＊）ｐ＜０．０５（＊＊）ｐ＜０．０１。
【図１２Ａ−Ｂ】造血性幹細胞（ＨＳＣ）および白血病幹細胞（ＬＳＣ）生着に対するチオリダジンの影響を示す図である。（図１２Ａ）チオリダジン１０μＭ（ＴＨＩＯ  １０μＭ）またはメフロキン１０μＭ（ＭＱ  １０μＭ）で造血性幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）を処置後の骨髄におけるヒトＣＤ４５＋細胞の出現頻度である。数値はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で処置された対照試料（ＣＴＲＬ）に対し正規化されている。計２つのＨＳＰＣ試料が評価された。平均＋／−標準誤差。（図１２Ｂ）ｈＣＤ４５＋集団内の側方散乱（ＳＳＣ）に対する骨髄性マーカー（ＣＤ３３）またはリンパ系マーカー（ＣＤ１９）の代表的フローサイトメトリプロットである。
【図１２Ｃ−Ｅ】（図１２Ｃ）チオリダジン１０μＭ（ＴＨＩＯ  １０μＭ）またはメフロキン１０μＭ（ＭＱ  １０μＭ）で急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）処置後の骨髄（ＢＭ）内のＣＤ４５＋ＣＤ３３＋ＡＭＬ芽細胞の発現頻度である。数値はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で処置された対照試料（ＣＴＲＬ）に対し正規化されている。計２つのＡＭＬ試料が評価された。（図１２Ｄ）ＤＭＳＯ処置された対照（ＣＴＲＬ）集団とチオリダジン処置（ＴＨＩＯ  １０μＭ）におけるＣＤ３３に対するＣＤ４５の代表的フロープロットである。（図１２Ｅ）ｈＣＤ４５造血性幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）生着の正規化％に対するｈＣＤ４５  ＣＤ３３ＡＭＬ芽細胞生着の正規化％の比率である。（＊）ｐ＜０．０５。
【図１３Ａ−Ｃ】薬剤処置に対する生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）応答を示す図である。（図１３Ａ）は１μＭのサリノマイシン（ＳＡＬ  １μＭ）で造血性幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）を処置後の骨髄内のヒトＣＤ４５＋細胞の正規化出現頻度をＤＭＳＯ処置された対照（ＣＴＲＬ）との比較で示す。計２つのＨＳＰＣ試料が評価された。平均＋／−標準誤差。（＊＊＊＊）ｐ＜０．０００１。（図１３Ｂ）は造血幹細胞（ＨＳＣ）および白血病幹細胞（ＬＳＣ）の脾臓生着に対するチオリダジンの効果を示す図である。（図１３Ｂ上段）はチオリダジン１０μＭ（ＴＨＩＯ  １０μＭ）で造血性幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）を処置後の脾臓内のヒトＣＤ４５＋細胞の出現頻度を示す。数値はＤＭＳＯで処置されたＨＳＰＣ対照試料（ＣＴＲＬ）に対し正規化されている。計２つのＨＳＰＣ試料が評価された。平均＋／−標準誤差。（図１３Ｂ下段）はチオリダジン１０μＭ（ＴＨＩＯ  １０μＭ）でＡＭＬを処置後の脾臓内のＣＤ４５＋ＣＤ３３＋芽細胞の出現頻度を示す。数値はＤＭＳＯで処置されたＡＭＬ対照試料（ＣＴＲＬ）に対し正規化されている。計２つのＡＭＬ患者試料が評価された。（図１３Ｃ）チオリダジンの赤血球および巨核球の再生に対する効果を示す図である。チオリダジン１０μＭ（ＴＨＩＯ  １０μＭ）処置またはＤＭＳＯ処置された（ＣＴＲＬ）ＨＳＰＣを注入された異種移植骨髄内で検知されるヒト血液細胞の構成。赤血球（ＲＢＣ）はグリコホリンＡポジティブ性により、そして血小板はＣＤ４１ａにより規定される。
【図１３Ｄ−Ｆ】（図１３Ｄ）はＡＭＬとの異種移植の骨髄性白血病生着の確認を示す。側方散乱対リンパ系細胞のマーカーであるＣＤ１９のフローサイトメトリ。囲み内の数値は平均＋／−標準誤差。（図１３Ｅ−Ｆ）は造血幹細胞（ＨＳＣ）および白血病幹細胞（ＬＳＣ）の生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）自己再生に関するチオリダジンの効果を示す図である。チオリダジン１０μＭ（ＴＨＩＯ  １０μＭ）処置またはＤＭＳＯ処置された（ＣＴＲＬ）原発性系統枯渇へその緒臍帯血（ＣＢｌｉｎ−）  （図１３Ｅ）または原発性ＡＭＬ（図１３Ｆ）生着片から外植された同数のｈＣＤ４５細胞を受け取る、２次異種移植の骨髄における、ｈＣＤ４５＋細胞（図１３Ｅ）またはｈＣＤ４５＋ＣＤ３３＋（図１３Ｆ）の生着レベルを示す。各バーはｎ＝３マウス、平均＋／−標準誤差。
【図１４Ａ−Ｂ】腫瘍性幹細胞に発現したドーパミン受容体を示す図である。ＳＳＥＡ３および全ての５つのドーパミン受容体（ＤＲ）サブタイプで染色された正常Ｈ９（図１４Ａ）および腫瘍性ｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ細胞（図１４Ｂ）のフローサイトメトリである。ＳＳＥＡ３＋断片内のドーパミン受容体（ＤＲ）発現が示される。
【図１４Ｃ−Ｄ】（図１４Ｃ）はＣＤ３４，ＣＤ３８および全ての５つのドーパミン受容体（ＤＲ）サブタイプで染色された分化系列が枯渇した臍帯血（造血性幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ））のフローサイトメトリ。ドーパミン受容体（ＤＲ）発現はゲートで囲まれた集団で示される。（図１４Ｄ）は全ての５つのドーパミン受容体（ＤＲ）サブタイプで染色された、ＦＡＢ分類を持つ１３人のＡＭＬ患者試料のフローサイトメトリ。
【図１４Ｅ−Ｆ】ＤＲＤ３（図１４Ｅ）およびＤＲＤ５（図１４Ｆ）にもポジティブである、患者試料からのＡＭＬ芽細胞（ＣＤ３３＋ＣＤ４５＋）の出現頻度。計８人の患者試料が異種移植のレシピエントにおける白血病発症ポテンシャルについて評価された。白血病発症はマウス骨髄においてヒト生着＞ＣＤ３３＋ｈＣＤ４５＋の０．１％で定義された。２２匹のマウスの内４匹の白血病発症ＡＭＬ試料が検定され、一方１７匹のマウスの内４匹の白血病非発症ＡＭＬ試料が検定された。計ｎ＝８ＡＭＬ試料、平均＋／−標準誤差。
【図１５Ａ−Ｃ】（図１５Ａ−Ｂ）は全ての５種類のドーパミン受容体で染色された線維芽細胞由来ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）（図１５Ａ）およびへその緒臍帯血由来ｈｉＰＳＣ（図１５Ｂ）内のＳＳＥＡ３＋断片のフローサイトメトリ。（図１５Ｃ）はヒト血液集団のドーパミン受容体発現を示す。へその緒臍帯血単核細胞のフローサイトメトリであり、赤血球系（グリコホリンＡ）、巨核球（ＣＤ４１ａ）で染色されている。
【図１５Ｄ−Ｅ】（図１５Ｄ）はへその緒臍帯血単核細胞のフローサイトメトリでありＴ−細胞（ＣＤ３）、Ｂ−細胞（ＣＤ１９）で染色されている。（図１５Ｅ）はへその緒臍帯血単核細胞のフローサイトメトリであり単球（ＣＤ１４）、顆粒球（ＣＤ１５）で染色されている。ゲートで囲まれた集団内の全ての５つのドーパミン受容体による染色はヒストグラムで示される。
【図１５Ｆ−Ｇ】（図１５Ｆ）血液集団内でのドーパミン受容体の局在性の要約。（図１５Ｇ）はＡＭＬ患者のフローサイトメトリであり、ゲートで囲まれた集団にドーパミン受容体を示す。
【図１６Ａ−Ｂ】図１６はＡＭＬにおいてチオリダジンがドーパミン受容体シグナル伝達を抑制し、シタラビンとの組み合わせ処置が癌細胞に対しシナジー効果を持つことを示す図である。（図１６Ａ）はＡＭＬ−ＯＣＩ２およびＡＭＬ−ＯＣＩ３細胞系のドーパミン受容体発現を示す。（図１６Ｂ）は３種類のドーパミン受容体遮断薬で処置されたＡＭＬ−ＯＣＩ２およびＡＭＬ−ＯＣＩ３細胞の細胞数。数値はＤＭＳＯで処置された対照試料に対し正規化されている。各バーはｎ＝３；平均＋／−標準誤差。
【図１６Ｃ−Ｄ】無血清条件下でドーパミン受容体Ｄ２ファミリー刺激薬の７０Ｈ−ＤＰＡＴ（図１６Ｃ）またはドーパミン受容体Ｄ１ファミリー刺激薬のＳＫＦ３８３９３（図１６Ｄ）で処置された、同一の細胞系の生存可能細胞数（７ＡＡＤ−、ヘキスト＋）を示す図である。数値はＤＭＳＯで処置された対照試料に対し正規化されている。各バーはｎ＝３；平均＋／−標準誤差。
【図１６Ｅ−Ｆ】ＡＭＬと造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）の薬剤による単独処置と組み合わせ処置の対比を示す図である。  （図１６Ｅ）被験者ＡＭＬおよびＨＳＰＣのチオリダジン（Ｔｈｉｏ  １０μＭ）またはシタラビン（ＡｒａＣ）による単独薬剤処置の後、コロニー形成単位（ＣＦＵ）を生成し、検数した。  （図１６Ｆ）同一の被験者試料に対しチオリダジンおよびシタラビンの組み合わせ処置の後、コロニー形成単位（ＣＦＵ）を生成し、検数した。  それぞれの濃度に対しＨＳＰＣ：ＡＭＬ  ＣＦＵの正規化比率が計算され、該当する棒グラフペアの上に表示されている。ＡｒａＣ処置に対する有効半減濃度（ＥＣＡｒａＣ）はチオリダジンとの組み合わせにより（ＥＣＡｒａＣ＋Ｔｈｉｏ）１００ｎＭから１ｎＭに減少した。あるいは、チオリダジンと組み合わせた１００ｎＭ  ＡｒａＣは芽細胞性ＣＦＵをほぼ完全に消滅させたが、一方でＨＳＰＣ機能を維持した。ＨＳＰＣの棒グラフはｎ＝４、２つの分化系列枯渇臍帯血  （ＣＢｌｉｎ−）；ＡＭＬ棒グラフはｎ＝４、ＡＭＬ被験者試料、平均±標準誤差、（＊）ｐ＜０．０５、（＊＊）ｐ＜０．０１、（＊＊＊）ｐ＜０．００１、（＊＊＊＊）ｐ＜０．０００１。
【図１７】チオリダジンとＤＮＡ合成阻害薬との組み合わせ治療の有用性を示す図である。  （図１７Ａ−Ｂ）蛍光活性化細胞の芽細胞ＣＦＵ生成が被験者ＡＭＬ細胞をＤＭＳＯ溶媒またはチオリダジン１０μＭ（ＴＨＩＯ）で処置されたＤＲ＋（図１７Ａ）とＤＲ−（図１７Ｂ）の分画にソートした。  （図１７Ｃ）統合失調症被験者に対しチオリダジンが投与される臨床的範囲を示す図解である。抗白血病幹細胞（ＬＳＣ）効果を誘導することが示されたチオリダジン濃度が被験者応答に沿ってプロットされている。  （図１７Ｄ）ＡＭＬ被験者に対しＡｒａＣが投与される臨床的範囲を示す図解である。単独処置としてのＡｒａＣの示差的用量（ＡｒａＣ示差的ＣＦＵ）がチオリダジンと組み合わされた場合、同じ標的応答を得るためにＡｒａｃ濃度（Ａｒａｃ＋チオリダジン１０μＭ示差的ＣＦＵ）の１００倍の減少に沿ってプロットされている。ヒト血漿レベルは公開データから適応された（Ｒｅｇｅｎｔｈａｌら、１９９９）。
【図１８Ａ】図１８はチオリダジン様薬剤を同定するための拡張スクリーンの図である。（図１８Ａ）は２４４６個の化合物からなる拡張スクリーンのＧＦＰ平均輝度と細胞数のＸＹ散布図である。輪郭を付けられた領域は、減少した平均ＧＦＰ輝度で定義される多能性の喪失（ＬＯＰ）と細胞数の点を示す。チオリダジンのデータポイントは他の選択された点と共に輪郭を付けられている。それぞれの点はｎ＝３の平均値。
【図１８Ｂ−Ｅ】（図１８Ｂ）他のフェノチアジン化合物；フルフェナジンおよびプロクロルペラジンの化学構造式を示す。（図１８Ｃ）は選択された的中化合物の１０μＭ濃度で処置したｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ細胞のＧＦＰ、ヘキストおよびそれらを合体させた代表的顕微鏡画像である。（図１８Ｄ）はこれら画像のＧＦＰ輝度のヒストグラムである。（図１８Ｅ）は候補化合物で処置されたｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰの投与量反応曲線と５０％有効濃度（ＥＣ５０）の計算値である。各点はｎ＝３、平均±標準誤差。
【図１８Ｆ】ｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰの蛍光顕微鏡図である。ＢＭＰ４で処置され、または処置されず、そしてヘキストで染色されたｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ細胞のＧＦＰ，ヘキストおよびそれらの合体蛍光図。対応するＧＦＰログ輝度ヒストグラムも示される。
【図１９】単一処置としての種々の濃度のシタラビン（ＡｒａＣ）で処置され（単一薬剤：ＡｒａＣ）、またはチオリダジン１０μＭ濃度と組み合わせて処置され（組み合わせ：ＡｒａＣ＋チオリダジン１０μＭ）、ＤＭＳＯ対照（Ｙ軸の１００に交差する実線で示され、破線は対照の標準偏差を示す）に対して正規化された、ＯＣＩ−ＡＭＬ２（図１９Ａ）およびＯＣＩ−ＡＭＬ３（図１９Ｂ）細胞系における生細胞数の用量反応曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
（Ｉ．定義）
ここでは「癌」は、隣接組織または体の他の部位に拡大する制御されない異常な細胞増殖により引き起こされる一群の疾病の１つを言う。癌細胞は癌細胞が一塊になる固形腫瘍を形成可能であり、または白血病のように分散した細胞として存在する。
【００２０】
「癌細胞」とは、制御されない異常な増殖と他の組織に侵入する能力を特徴とする細胞、あるいはそのような細胞から由来する細胞を言う。癌細胞は例えば、癌患者から獲得された原発性癌細胞、またはそのような細胞から由来する細胞系を含む。同様に「血液系癌細胞」とは、血液細胞または骨髄細胞由来の癌細胞をいう。癌細胞の事例としては、限定されないが、癌幹細胞、乳癌細胞、直腸癌細胞、結腸癌細胞、前立腺癌細胞、および骨髄腫，白血病細胞またはリンパ腫細胞などの血液系癌細胞を含む。
【００２１】
「癌幹細胞」とは、自己再生能力および、腫瘍または血液系腫瘍からなる癌細胞の分化系列に分化する能力のある細胞を言う。癌幹細胞はその疾病を独自に開始しそして維持することができる。
【００２２】
「前癌障害」とは癌に発展する可能性のある一群の高増殖性障害の１つであり、例えば骨髄増殖性疾病のような前癌血液障害または骨髄異形成症候群を含み、それは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に関連し、および／またはそれに発展する可能性のある前悪性の症状である。
【００２３】
「前癌細胞」とは、制御されない異常な増殖を特徴とする細胞またはそのような細胞に由来する細胞を言う。「前癌細胞」には、例えば前癌障害の患者から獲得された原発性前癌細胞、またはそのような細胞または癌幹細胞由来の細胞系を含む。同様に、「血液系前癌細胞」とは、血液細胞または骨髄細胞由来の前癌細胞を言う。ある実施形態では、血液系前癌細胞は骨髄増殖性細胞である。
【００２４】
「白血病」とは、造血性組織、他の器官および通常血液内において、増加した数で発見される異常白血球の進行的増殖を含む任意の疾病を言う。「白血病細胞」とは、増大する細胞異常増殖を特徴とする白血球細胞を言う。白血病細胞は白血病と診断された被験者から獲得されてもよい。
【００２５】
「急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）」とは、血液細胞の骨髄系の癌を言い、骨髄に蓄積しそして正常な血液細胞の生成を妨害する異常白血球の速い成長を特徴とする。骨髄異形成性または骨髄増殖性症候群のような前白血病症状もまたＡＭＬに進展する可能性が有る。
【００２６】
「単球性白血病」とは、ＣＤ１４を発現することを特徴とする白血病のサブタイプを言い、そして急性骨髄性白血病のサブタイプである急性単球性白血病を含む。ある実施形態では、被験者は、骨髄に２０％超の芽細胞を持ち、かつその内８０％超が単球系である場合、急性単球性白血病であると識別される。
【００２７】
「ドーパミン受容体遮断薬」とは、１つ以上のドーパミン受容体の機能または活性において任意の検知可能なまたは測定可能な減少を生成する化合物を言う。たとえば、ある実施形態では、ドーパミン受容体遮断薬は１つまたはそれ以上のドーパミン受容体に選択的な抗体である。ある実施形態では、ドーパミン受容体（ＤＲ）はＤＲ１，ＤＲ２，ＤＲ３，ＤＲ４およびＤＲ５から選択される。ドーパミン受容体遮断薬は１つのドーパミン受容体に選択的または多重のドーパミン受容体に選択的（即ち「多重受容体遮断薬」）であってよい。多重受容体遮断薬の事例には、チオリダジンおよびクロルプロマジンを含む。ドーパミン受容体は一般的にＤ１ファミリードーパミン受容体（ＤＲ１およびＤＲ５）とＤ２ファミリードーパミン受容体（ＤＲ２、ＤＲ３およびＤＲ４）にグループ分けされる。ある実施形態では、ドーパミン受容体遮断薬は表１に記載される化合物から選択される１つの化合物である。
【００２８】
【表１】
2015516378.tif 000003
2015516378.tif 000004
2015516378.tif 000005
【００２９】
「フェノチアジン」または「フェノチアジン誘導体」とは、フェノチアジン分子または骨格に由来し、または含む化合物を言う。フェノチアジンの一般式はＳ（Ｃ６Ｎ４）２ＮＨであり、フェノチアジン誘導体はフェノチアジンに対し１つ以上の置換または追加を有する。例えば、幾つかのフェノチアジン誘導体は３環構造を持ち、そこでは２つのベンゼン環が窒素および硫黄により連結されている。フェノチアジン誘導体の事例には、限定されないが、チオリダジン、クロルプロマジン、レボメプロマジン、メソリダジン、フルフェナジン、ペルフェナジン、プロクロルペラジン、およびトリフルオペラジンを含む。本発明の方法で使用されるフェノチアジン誘導体の追加の事例は、表１に示される。ある実施形態では、チオリダジンはＩＵＰＡＣ名１０−｛２−［（ＲＳ）−１−メチルピペリジンー２−イル］エチル｝−２−メチルサルファニルフェノチアジンを持つ。
選択肢として、チオリダジンのような１種類以上のフェノチアジン誘導体のラセミ体がここに記載される方法で使用される。
【００３０】
「化学療法剤」とは、癌の処置に有用な化学物質を言う。化学療法剤の事例には、細胞分裂および／またはＤＮＡ合成を阻害する抗増殖薬剤または抗腫瘍薬剤を含む。本明細書に記載される方法および組成物での使用に適合する化学療法剤のさらなる事例には、スティーブングラント（Ｓｔｅｖｅｎ  Ｇｒａｎｔ）著「ＡＭＬおよびＭＤＳ用の新薬」Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ＆  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ２２（２００９）５０１−５０７に記載の化学療法剤を含む。本明細書に記載される方法および組成物での使用に適合する化学療法剤のまたさらなる事例には、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｏｒｇ／Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ／ＴｒｅａｔｍｅｎｔｓａｎｄＳｉｄｅＥｆｆｅｃｔｓ／ＴｒｅａｔｍｅｎｔＴｙｐｅｓ／Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ／ＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓＡｎＩｎｄｅｐｔｈＤｉｓｃｕｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓａｎｄｉｔｓＲｏｌｅｉｎＴｒｅａｔｍｅｎｔ／ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ−ｔｙｐｅｓ−ｏｆ−ｃｈｅｍｏ−ｄｒｕｇｓに記載される化学療法剤を含む。本明細書に記載される方法および組成物での使用に適合する化学療法剤の他の事例には、ミトキサントロン（ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害薬）およびダウノルビシン（ＤＮＡ干渉物質）などのＡＭＬ処置に適した薬剤を含む。ある実施形態では、化学療法剤はシタラビンである。
【００３１】
「ＤＮＡ合成阻害薬」とは、癌細胞によるＤＮＡの合成を阻害または防止する化学療法剤を言う。ＤＮＡ合成阻害薬の事例には、限定されないが、シタラビン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、５−フルオロウラシル、カペシタビン、フロクスウリジン、ゲムシタビン、デシタビン、ビダーザ、フルダラビン、ネララビン、クラドリビン、クロファラビン、ペントスタチン、チアラビン、トロキサシタビン、サパシタビン（ｓａｐａｃｉｔａｂｉｎｅ）またはフォロデシン、およびＷｉｌｌｉａｍ  Ｂ  Ｐａｒｋｅｒ著「癌治療に使用されるプリンおよびピリミジン抗代謝薬の酵素学」Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ．２００９  Ｊｕｌｙ；１０９（７）：２８８０−２８９３に記載されるプリンおよびピリミジン抗代謝薬を含む。ある実施形態では、ＤＮＡ合成阻害薬はシタラビンまたは本明細書に記載される他のデオキシシチジン類似体である。ある実施形態では、ＤＮＡ合成阻害薬はフルダラビン、ネララビン、クラドリビンまたはクロファラビンのようなＤＮＡ伸長ターミネータであり、そしてシタラビンと同様に機能する。
【００３２】
「シタラビン」とは、シトシン塩基とアラビノース糖からなる化合物で、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でアラビノフラノシルシトシン三リン酸に変換されるものを言う。シタラビンはまたシトシンアラビノシドまたはＡｒａ−Ｃ（アラビノフラノシルシトシン）とも呼ばれる。
【００３３】
「微小管阻害薬」とは有糸分裂の間の微小管の正常な機能またはプロセスに干渉する化学療法剤を言う。微小管阻害薬の事例には、限定されないが、パクリタキセルまたはドセタキセルのようなタキサン、およびビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビンのようなビンカアルカロイドを含む。
【００３４】
「癌細胞の増殖を減少させる」とは、細胞成長または細胞分裂の結果として癌細胞から発生する細胞数の減少を意味し、細胞死または癌幹細胞の分化を含む。「細胞死」とは、ネクローシスおよびアポトーシスを含む全ての形態の細胞死を含む。「癌幹細胞の分化」とは、それにより癌幹細胞が自己再生の能力を失い、腫瘍または血液系腫瘍を含む癌細胞の系列分化を引き起こすプロセスを言う。
【００３５】
「効果的な数量」または「治療的に効果的な数量」とは、投与において、そして所望の結果を得るために必要な期間において効果的な数量を言う。例えば、ＡＭＬのような癌のコンテキストまたは治療において効果的な数量とは、たとえば寛解を誘発し、腫瘍量を減少させ、および／またはその化合物の投与無く得られた応答に比べて腫瘍の拡散または白血病細胞の成長を防止する数量をいう。効果的な数量は病期、動物の年齢、性別、および体重のような因子により変化する。このような数値に対応する所定の化合物の数量は所定の薬剤または化合物、製剤処方、投与経路、疾病または障害のタイプ、治療される被験者またはホストの独自性、など多くの因子により変化するが、それでも当業者により日常的に決定可能である。例えば図１７Ｃおよび図１７ＤはチオリダジンおよびＡｒａＣそれぞれに対する代表的な用量と被験者反応を示す。
【００３６】
「血漿濃度」とは、ある特定の化合物の総血漿濃度を言う。例えば、ある実施形態において、チオリダジンの１つの血漿濃度約１０μＭは結合型および非結合型を含むチオリダジンの総血漿濃度約１０μＭを言う。
【００３７】
「医薬的に許容可能」とは、動物、特にヒトの治療に適合するという意味である。
【００３８】
「被験者」とは、哺乳類を含む動物界の全ての構成要員を含み、好適にはヒトを示す。選択肢として、「被験者」は癌であると診断され、または寛解にある哺乳類を含む。
【００３９】
「処置する」または「処置」とは、当業者に周知のとおり、臨床転帰を含む有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを意味する。有益なまたは所望の結果には、限定されないが、検知可能であれ不可能であれ、１つ以上の徴候または症状の軽減または回復、疾病の程度の減弱、安定した（即ち、悪化しない）病状（例えば患者を寛解に保つ）、疾病の拡散の防止、疾病の進行の遅延または進行速度の低下、病状の回復または緩和、疾病の再発の減弱、そして寛解（部分寛解または完全寛解）を含んでよい。「処置する」または「処置」は処置を受けなかった場合の期待生存に対し延長された生存を意味してもよい。「処置する」または「処置」とは、また、予防的処置を含む。ある実施形態では、処置用法は、ここに記載されるような被験者に処置的に有効な量のドーパミン受容体遮断薬を投与するステップと、そして選択肢として、単一の投与、あるいは連続的な投与のステップを含む。
【００４０】
「シナジー」または「シナジー的」とは、ＤＲ遮断薬と化学療法剤の組み合わせ効果がＤＲ遮断薬または化学療法剤の個別の効果と比較して大きいことを意味する。この文脈における用語「効果」は限定されないが、癌細胞の増殖、腫瘍細胞生存、細胞の生存率または増殖を減少させることを含む。例えば、実施例１３と図１６および実施例１５と図１９に示されるように、白血病細胞に対するチオリダジンおよびシタラビンの組み合わせ処置はシタラビンだけで処理するよりも白血病生細胞の数を大きく減少させる結果をもたらす。
ＩＩ  方法および使用方法  
【００４１】
別の化学療法剤と組み合わせたドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬は、癌細胞の増殖を減少させおよび／または癌細胞の細胞死を誘導するのに驚くほど効果的であることが見出された。実施例１３に示されているように、ＤＲ遮断薬チオリダジンとＤＮＡ合成阻害剤のシタラビンとの組合せは、造血多能性幹細胞（ＨＳＰＣ）の機能を保持しながら、ＡＭＬ−芽球ＦＣＵを減少させるのに必要なシタラビンの有効濃度の有意な減少をもたらした。さらに、実施例１５と図１９に示すように、シタラビンと組み合わせたチオリダジンの使用は、ＡＭＬ患者由来の細胞系からの白血病細胞の生存率を有意に低下させた。
【００４２】
従って、ある実施形態では、それを必要とする被験者にドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬および化学療法剤を投与するステップを有する、被験者の癌または前癌障害を処置する方法が提供される。また、癌または前癌障害を処置するためのドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬および化学療法剤の使用法、および癌または前癌障害を処置するためのドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬および化学療法剤の組み合わせが提供される。ある実施形態では、化学療法剤はシタラビンのようなＤＮＡ合成阻害薬である。ある実施形態では、ここに記載される方法または使用法は骨髄増殖性疾病などの前癌障害を処置するのに有用である。ある実施形態では、癌はＡＭＬ、または単球性白血病などの白血病である。ここに記載される方法または使用法は特にドーパミン受容体を発現する癌細胞に有用である。ある実施形態では、ここに記載される方法または使用法は単球マーカーＣＤ１４を発現する癌細胞の処置に有用である。ある実施形態では、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬は造血性幹細胞または正常幹細胞に比べて、優先的に被験者の癌幹細胞の分化を誘発する。ある実施形態では、癌幹細胞は白血病癌幹細胞である。ある実施形態では、被験者はＡＭＬを罹患し、癌幹細胞はＡＭＬ癌幹細胞である。
【００４３】
ある実施形態では、ＤＲ遮断薬および化学療法剤の治療上有効な用量が使用され、使用のために処方され、および／または被験者に投与される。ある実施形態では、ＤＲ遮断薬および化学療法剤が使用され、使用のために処方されおよび／または被験者に同時に投与され、選択肢としてＤＲ遮断薬および化学療法剤を含む１つの組成物として同時に投与され、または２つの別々の用量として投与される。例えば、ある実施形態では、ＤＲ遮断薬と化学療法剤はリンカーと共にまたはリンカーなしに、接合される。ある実施形態では、ＤＲ遮断薬および化学療法剤が使用され、使用のために処方され、および／または異なる時点で被験者に投与される。例えば、ある実施形態では、ＤＲ遮断薬は化学療法剤の前または後に使用、または投与される。ある実施形態では、ＤＲ遮断薬は、１分、２分、５分、１０分、３０分、４５分、１時間、１．５時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１６時間、または２４時間で区切られた時間だけ化学療法剤の前または後に使用または投与される。選択肢として、いくつかの実施形態ではＤＲ遮断薬および化学療法剤は、使用され、使用のために処方され、および／または２４時間、３６時間、４８時間、３日、４日、５日、６日、または一週間以上の間隔を開けて被験者に投与される。
【００４４】
ある実施形態では、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬はＤＲ１，ＤＲ２，ＤＲ３，ＤＲ４およびＤＲ５などの１種類以上のドーパミン受容体（ＤＲ）に対する遮断薬である。選択肢としてドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬は多重受容体遮断薬であり、または単一のドーパミン受容体（ＤＲ）サブタイプに特異である。ある実施形態では、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬はチオリダジン、クロルプロマジン、フルフェナジンまたはプロクロルペラジンなどのフェノチアジン誘導体である。ある実施形態では、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬は表１に記載される化合物から選択される。ある実施形態では、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬は１つまたはそれ以上のドーパミン受容体に選択的な抗体である。当業者は容易にここに記載されるような癌の処置に有用な、追加のドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬を識別できるであろう。
【００４５】
ある実施形態では、ここに記載される方法、組み合わせ、組成物または使用法は、チオリダジン、クロルプロマジン、フルフェナジンまたはプロクロルペラジンなどのフェノチアジン誘導体を含む。当業者は容易にここに記載されるような癌の処置に有用な、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬である追加のフェノチアジン誘導体を識別できるであろう。ある実施形態では、フェノチアジン誘導体は、正常幹細胞または造血性幹細胞に比べて白血病細胞のような癌細胞に対し差別的に毒性を有する。
【００４６】
ある実施形態では、本明細書に記載の方法、組み合わせ、組成物または使用法は、ＤＮＡ合成阻害剤としての化学療法剤を含む。例えば、ある実施形態では、ＤＮＡ合成阻害剤はシタラビンである。ある実施形態では、ＤＮＡ合成阻害剤は、シタラビンと類似の構造または機能を有している。例えば、ある実施形態ではＤＮＡ合成阻害剤は、ゲムシタビン、デシタビン、ビダーザ、トロキサシタビン、チアラビンまたはサパシタビン（ｓａｐａｃｉｔａｂｉｎｅ）などのデオキシシチジン類似体である。ある実施形態では、ＤＮＡ合成阻害剤は、シタラビン、６−チオグアニン、フルダラビン、クラドリビンまたはクロファラビンのようなＡＭＬの治療に有用であることが公知の化合物である。ある実施形態では、ＤＮＡ合成阻害剤は、シタラビン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、５−フルオロウラシル、カペシタビン、フロクスウリジン、ゲムシタビン、デシタビン、ビダーザ、フルダラビン、ネララビン、クラドリビン、クロファラビン、ペントスタチン、チアラビン、トロキサシタビン、サパシタビン（ｓａｐａｃｉｔａｂｉｎｅ）およびフォロデシンから選択される。ある実施形態では、化学療法剤は、ミトキサントロン（ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤）またはダウノルビシン（ＤＮＡ干渉物質）のようなＡＭＬ治療に適した薬剤である。
【００４７】
ある実施形態では、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬および／または化学療法剤は、使用のために処方され、および／またはそれを必要とする被験者への投与のため、既存技術において既知のように調製される。適合する調剤の選択と調製のための従来技術の手順および原材料は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （２００３年、２０版）および１９９９年発行のＴｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ（ＵＳＰ  ２４  ＮＦ１９）に記載されている。
【００４８】
ある実施形態では、本明細書に記載される方法、組み合わせ、組成物、および使用方法は、使用、使用のための処方および／または必要とする被験者への投与に適したＤＲ遮断薬および化学療法薬の特定のレベルを提供する。例えば、ある実施形態では、ＤＲ遮断薬および化学療法剤の組み合わせは、使用され、使用のために処方され、および／または被験者に投与されるべき化学療法剤の用量が、化学療法剤が単独で使用され、使用のために処方され、および／または被験者に投与される場合に、有益なまたは所望の結果を達成するために必要とされる化学療法剤の用量と比べて、少ない用量を可能にする（例えば図１７Ｄ参照）。ある実施形態では、化学療法剤はシタラビンであり、そして使用され、使用のために処方され、および／または被験者に投与されるシタラビンの用量は結果的に０．１ｎＭと１００ｎＭの間のシタラビンの血漿濃度となり、選択肢として１ｎＭと１００ｎＭの間である。ある実施形態では、使用され、使用のために処方され、および／または被験者に投与されるシタラビンの用量は結果的に５ｎＭ未満、０．１ｎＭと５ｎＭの間、または０．５ｎＭと２．５ｎＭの間の血漿濃度となる。ある実施形態では、使用され、使用のために処方され、および／または被験者に投与されるシタラビンの用量は結果的に０．０００１μΜと２μΜの間、または選択肢として０．００１μΜと２μΜの間の血漿濃度となる。ある実施形態では、ドーパミン受容体遮断薬は、チオリダジンであり、そして使用され、使用のために処方され、および／または被験者に投与されるチオリダジンの用量は結果的に０．１μΜと２０μΜの間の血漿濃度となる。ある実施形態では、使用され、使用のために処方され、および／または被験者に投与されるチオリダジンの用量は結果的に５μΜと１５μΜの間の血漿濃度となる。ある実施形態では、使用され、使用のために処方され、および／または被験者に投与されるチオリダジンの用量は結果的に約１０μΜの血漿濃度となる。ある実施形態では、シタラビンが使用され、使用のために処方され、および／または被験者に投与され、被験者におけるシタラビンの血漿濃度は、１ｎＭおよび１００ｎＭの間であり、そしてチオリダジンが使用され、使用のために処方され、および／または被験者に投与され、被験者におけるチオリダジンの血漿濃度は、５μΜと１５μΜの間であり、そして選択肢として約１０μΜである。
【００４９】
ある実施形態では、その細胞にドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬および化学療法剤を接触させるステップを有する、癌細胞の増殖を減少させる方法もまた提供される。同様の実施形態では、癌細胞の増殖を減少させるためのドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬および化学療法剤の使用法が提供される。ある実施形態では、細胞をドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬と化学療法剤に接触させるステップを有する、癌細胞の細胞死を誘導する方法が提供される。同様の実施形態では、癌細胞の細胞死を誘導させるためのドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬および化学療法剤の使用法が提供される。ある実施形態では、化学療法剤はシタラビンのようなＤＮＡ合成阻害薬である。ある実施形態では、ドーパミン受容体遮断薬は１つまたはそれ以上のドーパミン受容体に選択的な抗体である。ある実施形態では、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬はチオリダジンのようなフェノチアジン誘導体である。ある実施形態では、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬は癌幹細胞の分化または細胞死を誘発する。ある実施形態では、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬は癌細胞の細胞死を誘発する。選択肢として癌細胞は生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）または生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）である。癌細胞は骨髄異形成性細胞または骨髄増殖性細胞などの前癌細胞であってもよい。ある実施形態では、癌細胞はＡＭＬ患者からの細胞などの白血病細胞である。ある実施形態では、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬はチオリダジン、クロルプロマジン、フルフェナジン、またはプロクロルペラジンなどのフェノチアジン誘導体である。ある実施形態では、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬は表１に記載される化合物から選択される。ある実施形態では、化学療法剤はパクリタキセルまたはドセタキセルのような微小管阻害薬である。選択肢として化学療法剤とドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬はリンカーでまたはリンカー無しで接合されている。
【００５０】
本開示の一側面では、１つまたはそれ以上の白血病細胞のような１つまたはそれ以上の癌細胞の増殖を低減するための方法が提供される。ある実施形態では、本方法は、１つまたはそれ以上の細胞をチオリダジンおよびシタラビンに接触させるステップを含む。ある実施形態では、白血病細胞は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞である。選択肢として、白血病細胞は、白血病癌幹細胞である。ある実施形態では、細胞は、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）又は試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）である。ある実施形態では、細胞は、約０．１から１００ｎＭまで、選択肢として約１ｎＭから１００ｎＭまでの濃度のシタラビンと接触される。ある実施形態では、細胞は５ｎＭ未満、０．１ｎＭおよび５ｎＭの間もしくは０．５ｎＭと２．５ｎＭの間、の濃度のシタラビンと接触される。ある実施形態では、細胞は０．０００１μΜと２μΜの間で、または選択肢として０．００１μΜと２μΜの間の濃度のシタラビンと接触される。ある実施形態では、細胞は０．１μΜと２０μΜの間の濃度でチオリダジンと接触される。ある実施形態では、細胞は５μΜと１５μΜの間の濃度でチオリダジンと接触される。ある実施形態では、細胞は約１０μΜの濃度でチオリダジンと接触される。ある実施形態では、細胞は１ｎＭおよび１００ｎＭの濃度のシタラビンと接触され、そして細胞は５μΜと１５μΜの間、選択肢として約１０μＭの濃度のチオリダジンと接触される。
【００５１】
本発明の一側面では、ＤＲ遮断薬および化学療法剤を含む組成物が提供される。選択肢として、ＤＲの遮断薬および化学療法剤は、接合されないか、または、リンカーでまたはリンカー無しのいずれかで接合されてもよい。ある実施形態では、化学療法剤は、ＤＮＡ合成阻害剤、または微小管阻害剤である。ある実施形態では、ＤＮＡ合成阻害剤は、シタラビンまたは本明細書に記載のような別のデオキシシチジン類似体である。ある実施形態では、ＤＮＡ合成阻害剤は、フルダラビン、ネララビン、クラドリビン、またはクロファラビンのようなＤＮＡ伸長ターミネータであり、シタラビンに対して類似の機能を果たす。ある実施形態では、ドーパミン受容体遮断薬は、Ｄ２ファミリードーパミン受容体遮断薬である。ある実施形態では、組成物は表１から選択されるドーパミン受容体遮断薬である。ある実施形態では、ドーパミン受容体遮断薬は、チオリダジンのようなフェノチアジン誘導体である。ある実施形態では、ドーパミン受容体遮断薬は、１つまたはそれ以上のドーパミン受容体に対して選択的な抗体である。選択肢として、本明細書に記載の組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （２００３年、２０版）および１９９９年発行のＴｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ（ＵＳＰ  ２４  ＮＦ１９）に記載の担体のような、医薬的に許容可能な担体を含む。ある実施形態では、チオリダジン、シタラビンおよび医薬的に許容可能な担体を含む組成物が提供される。
【００５２】
ある実施形態では、化学療法剤とＤＲ遮断薬は、化学療法剤の一部である１つの原子とＤＲ拮抗薬の一部である１つの原子間の共有結合を介してなどのように、直接接合されている。あるいは、化学療法剤およびＤＲ遮断薬は、リンカーを介して接合される。ある実施形態では、化学療法剤およびＤＲ遮断薬は、リンカーを介して接合される。本明細書で用いる場合、用語「リンカー」は、１つまたはそれ以上の原子の部分であって化学療法剤とＤＲ遮断薬を結合またはカップリングさせる機能を果たすものを言う。リンカーの例としては、限定されないが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコールおよび／またはポリビニルピロリドンなどのポリマーを含む。  
【００５３】
別の側面では、本明細書に記載されるＤＲ遮断薬および化学療法剤を含むキットが提供される。ある実施形態では、キットは癌の処置に使用するためのものである。ある実施形態では、キットは急性骨髄性白血病の処置に使用するためのものである。
【００５４】
ある実施形態では、ここに記載されるキットは、癌の処置のためのような臨床現場での使用に適した便利な形態でパッケージされたＤＲ遮断薬および化学療法剤を提供する。ある実施形態では、ＤＲ遮断薬および化学療法剤は、選択肢として薬学的に許容される担体で別個の容器内にある。別の実施形態では、ＤＲ遮断薬および化学療法剤は、選択肢として薬学的に許容される担体で、単一の容器内にある。いくつかの実施形態では、キットは、癌の治療における使用説明書のような、ＤＲ遮断薬および化学療法剤の使用指示書を含む。ある実施形態では、化学療法剤は、シタラビンのようなＤＮＡ合成阻害剤である。ある実施形態では、化学療法剤は、タキサンのような微小管阻害剤である。ある実施形態では、ＤＲ遮断薬は、チオリダジンのようなフェノチアジン誘導体、または表１から選択されるＤＲ遮断薬である。本明細書に記載されるキットのある実施形態では、ＤＲ遮断薬はチオリダジンであり、化学療法剤はシタラビンである。あるいはキットは１つの化学療法剤の複数の用量及び１つのドーパミン受容体遮断薬の複数の用量を含む。ある実施形態ではキットは、化学療法剤およびドーパミン受容体遮断薬からなる組成物の複数の用量を含む。
【００５５】
本発明のさらなる側面は、癌または前癌障害の処置に対するドーパミン受容体遮断薬および化学療法剤の使用法、または癌または前癌障害の処置に対するドーパミン受容体遮断薬および化学療法剤からなる組成物の使用法を含む。ある実施形態では、癌は白血病である。ある実施形態では、白血病は急性骨髄性白血病または単球性白血病である。ある実施形態では、ドーパミン受容体遮断薬はチオリダジン、クロルプロマジン、フルフェナジン、またはプロクロルペラジンなどのフェノチアジン誘導体である。ある実施形態では、ドーパミン受容体遮断薬は表１にリストアップされる化合物から選択される。ある実施形態では、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬は１つまたはそれ以上のドーパミン受容体に選択的な抗体である。ある実施形態では、化学療法剤はシタラビンのようなＤＮＡ合成阻害剤、またはパクリタキセルまたはドセタキセルのような微小管阻害薬である。
【００５６】
以下の、非限定的事例は本発明の開示を示す。
【００５７】
（事例）
（事例１：チオリダジンは白血病細胞系に対し細胞毒性を有する）
正規化された細胞数に対するチオリダジンの効果が３つの白血病細胞系：ＨＬ−６０、ＭＶ４−１１及びＯＣＩ−ＡＭＬ３で評価された。３つの細胞系は全て白血病細胞系である。ＨＬ−６０は前骨髄球性ＡＭＬ由来であり、一方ＭＶ４−１１及びＯＣＩ−ＡＭＬ３はＡＭＬの代表である。それぞれの化合物は細胞と共に７２時間インキュベートされる。対照はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（即ち化合物に使用される溶媒）に７２時間。それぞれの条件は３度繰り返された。
【００５８】
図１にしめすように、０．１μＭと１μＭのチオリダジン投与は正規化細胞数にほとんど影響を与えなかったが、一方１０μＭでは正規化細胞数は殆どゼロに減少した。
【００５９】
（事例２：  ＡＭＬの芽細胞形成ポテンシャルと正常幹細胞のコロニー形成ポテンシャルに対するチオリダジンの異なる活性）
ＡＭＬ細胞系における芽細胞形成に対するチオリダジンの効果が正常ヒト幹細胞におけるコロニー形成に対するチオリダジンの効果と比較された。
【００６０】
正常ヒト幹細胞（ＨＳＣ）および前駆細胞は健常な患者の前駆細胞が増大させられた末梢血またはへその緒臍帯血のいずれかに由来した。原発性ＡＭＬ細胞はＡＭＬと診断された患者から採取された。正常ＨＳＣおよび原発性ＡＭＬ細胞は共に標準生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）メトセルロース検定条件（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｔｅｍｃｅｌｌ．ｃｏｍ／ｅｎ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／Ａｌｌ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ−Ｈ４４３４−Ｃｌａｓｓｉｃ．ａｓｐｘおよびＣｌｉｎｔｏｎ  Ｃａｍｐｂｅｌｌ他「ヒト幹細胞序列は自己再生ポテンシャルに関するＭｃｌ−１ｈへの機能的依存性により定義される」Ｂｌｏｏｄ  １１６（９）１４３３−１４４２（２０１０年６月４日）参照、これらはここに参照され採り入れられる）のもとで少なくとも１４日間培養され、その後コロニーの数が記録された。図２に示すように、１０μＭチオリダジンは正常ＨＳＣとＡＭＬ細胞とでは異なる効果を見せた。１０μＭチオリダジンは正常ＨＳＣのコロニー形成ポテンシャルを約１００（対照、ＤＭＳＯ処置）から総コロニー数６６まで減少させた。（図２Ａ）。しかしＡＭＬ細胞に対してはＣＦＵコロニーの数を約２２芽細胞コロニーから１．６芽細胞コロニーに大幅に減少させた（図２Ｂ）。
【００６１】
図３はチオリダジンで処置された正常ヒト幹細胞（ＨＳＣ）とＡＭＬから形成されたＣＦＵコロニーの細胞ペレットを示す。１０μＭの投与量では、ペレット化した細胞はＨＳＣでは視認できるが、ＡＭＬ細胞では見えない。したがってチオリダジンはＡＭＬ細胞の芽細胞―ＣＦＵポテンシャルを選択的に標的とする。
【００６２】
（事例３：クロルプロマジンはＡＭＬ細胞系に対して毒性を有する）
ドーパミン受容体遮断薬でありそしてフェノチアジン関連化合物であるクロルプロマジンもＡＭＬ細胞系ＨＬ−６０，ＭＶ４−１１およびＯＣＩ−ＡＭＬ３に対する効果について調査された。試験は事例１に示されるように実施された。図４に示すように、１０μＭクロルプロマジンはＡＭＬ細胞系に対して毒性を有する。
【００６３】
（事例４：正常血液ｖｓ白血病におけるドーパミン受容体の発現）
ドーパミン受容体ＤＲ１，ＤＲ２，ＤＲ３，ＤＲ４およびＤＲ５の発現が、ＡＭＬ細胞系（ＨＬ−６０，ＭＶ４−１１，ＡＭＬ−ＯＣＩ２およびＡＭＬ−ＯＣＩ３）、ＡＭＬ患者から単離された原発性ＡＭＬ細胞（ＡＭＬ２２１０１、ＡＭＬ２９４２８、ＡＭＬ２２１７４、ＡＭＬ２９５６０）、正常血液単核細胞（ＭＮＣ）（ＭＰＢ２１４７１およびＭＰＢ２８１３７；健常患者血液）およびＳｔｅｍＳｅｐ（登録商標）ヒト造血性前駆体細胞エンリッチメントキット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｔｅｍｃｅｌｌ．ｃｏｍ／ｅｎ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／Ａｌｌ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ＳｔｅｍＳｅｐ−Ｈｕｍａｎ−Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ−Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ−Ｃｅｌｌ−Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ−Ｋｉｔ．ａｓｐｘ）を使用し、ＨＳＣ／ヒト前駆体細胞のエンリッチメントレベルがフローサイトメトリで確認された、正常ヒト幹細胞または前駆体を豊富に含んだへその緒臍帯血原発性細胞（ＣＢ１０７、ＣＢ１０８およびＣＢ１０９）に対して分析された。アイソタイプ発現が背景として計測された。アイソタイプピークの右側のピークはドーパミン受容体（ＤＲ）マーカーのポジティブ発現を意味する。
【００６４】
図５に示されるように、ドーパミン受容体は原発性ＡＭＬ、ＡＭＬ細胞系および正常単核血液細胞（ＭＮＣ）において発現するが、正常ヒト幹細胞（ＨＳＣ）（系統枯渇へその緒臍帯血（ＣＢｌｉｎ−））を豊富に含んだ血液では発現しない。データは試料がドーパミン受容体（ＤＲ）発現にポジティブな場合、全ての５つのＤＲサブタイプが通常存在することを示す。
【００６５】
全ての原発性ＡＭＬがドーパミン受容体を発現するとは限らなかった。従って、ドーパミン受容体遮断薬によるＡＭＬ処置に適した被験者を識別するため、被験者はドーパミン受容体発現について事前にスクリーニングされてよい。選択肢として、被験者の事前スクリーニングは全ての５つのＤＲサブタイプ、または特定のサブタイプ、またはサブタイプの組合せに及んでもよい。
【００６６】
（事例５：多重ＤＲ遮断薬はＡＭＬ細胞系に対し細胞毒性を有する）
一連のドーパミン受容体刺激薬、Ｄ３−遮断薬、ＤＲ１＆５−遮断薬および多重受容体遮断薬が３つのＡＭＬ細胞系ＨＬ−６０、ＯＣＩ−ＡＭＬ２、ＯＣＩ−ＡＭＬ３に対する細胞毒性に関して試験された。試験は事例１の設定に従って実行された。
【００６７】
図６に示すように、高い濃度のクロザピン（ＣＬＯＺ）、およびクロルプロマジン塩酸塩（ＣＨＬ）、チオリダジン（ＴＨＩＯ）はＡＭＬ細胞系に対し有意の細胞毒性を有する。理論に制限されることなく、細胞毒性効果は多重ドーパミン受容体の阻害を必要とするかもしれない。多重受容体遮断薬であるＣＬＯＺ、ＣＨＬ、ＴＨＩＯはＡＭＬ細胞系を根絶するように作用するが、一方特異遮断薬であるＤ３−、ＤＲ１＆５−は細胞数を６０％にまで減少させるだけである。
【００６８】
（事例６：ドーパミン受容体は原発性ＡＭＬのＣＤ１４＋細胞集団において発現する）
原発性ＡＭＬ細胞においてドーパミン受容体サブタイプの発現が分析された。ＡＭＬ患者から得られた原発性ＡＭＬ細胞はＤＲサブタイプおよびＣＤ１４に特異な抗体を、フローサイトメトリを使用した分析の前に含んだ。大多数のＤＲ＋細胞はＣＤ１４ポジティブであることが判った。
【００６９】
図７に示すように、ＣＤ１４単球マーカーの発現はそれぞれのＤＲサブタイプの発現と相関関係が有る。
【００７０】
チオリダジンの効果も原発性ＡＭＬ内のＣＤ１４＋細胞サブ集団で試験された。原発性ＡＭＬ細胞は対照（ＤＭＳＯ溶媒）または１０μＭチオリダジンのもとで７２時間培養され、そしてＣＤ１４に特異な抗体により染色された。対照とチオリダジン処置試料の両方のＣＤ１４＋細胞の数はフローサイトメトリを使用して測定され、そしてＣＤ１４＋細胞の出現頻度はチオリダジン処置試料の方が低く、このことはこの化合物が選択的にＡＭＬ細胞の中のＣＤ１４＋サブ集団を標的とすることを示唆した。
【００７１】
図８に示すように、１０μＭチオリダジンも原発性ＡＭＬ細胞内のＣＤ１４＋細胞の正規化出現頻度を減少させ、このことはチオリダジンが選択的にＣＤ１４＋細胞を標的とすることを示した。ＡＭＬ対照グループはＣＤ１４＋細胞を一部分含んだ。この一部分はチオリダジン処置により減少し、そして対照（１００％）対処置済（２０％）の正規化出現頻度の減少として示されている。
【００７２】
（事例７：ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の分化を誘発する薬剤の識別と特徴付け）
正常な幹細胞（ＳＣ）に影響することなく癌幹細胞（ＣＳＣ）を標的にする薬剤の識別は、将来の癌治療にとって理想的であるが、しかし膨大な生物学的スクリーンを受容できるヒトの癌幹細胞（ＣＳＣ）及び正常な幹細胞の両方の検定法がないため、制限されている。以下の事例で述べるように、腫瘍性ｖｓ正常ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）分化プラットフォームを使用して、非毒性であり、癌幹細胞（ＣＳＣ）の腫瘍性自己再生に打ち勝つための分化を誘発する、化合物が識別される。識別された抗癌幹細胞（ＣＳＣ）薬剤の幾つかの候補の内、承認された抗精神病薬であるチオリダジンは、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で白血病を開始する能力のあるヒト体細胞系癌幹細胞（ＣＳＣ）を選択的に標的とすることができ、一方で正常血液幹細胞（ＳＣ）の能力には影響を与えなかった。チオリダジンによるドーパミン受容体（ＤＲ）シグナリングの遮断は癌幹細胞（ＣＳＣ）の選択的標的化の基礎をなし、そしてドーパミン受容体（ＤＲ）が造血性腫瘍および乳癌由来の癌幹細胞（ＣＳＣ）のバイオマーカーであることを明らかにした。
【００７３】
（実験手順）
（腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）ＥＯＳ−ＧＦＰ系の生成）
腫瘍性ｖ１Ｈ９またはｖ２Ｈ９ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）（Ｗｅｒｂｏｗｅｔｓｋｉ−Ｏｇｉｌｖｉｅ他、２００９）がＤｒ  Ｊａｍｅｓ  Ｅｌｌｉｓにより提供されたＥＯＳ−Ｃ３＋ＥＯＳ−Ｓ４＋ベクタ−を運ぶレンチウィルスを形質導入された（Ｈｏｔｔａ他、２００９）。レンチウィルス形質導入の後、細胞はピューロマイシンを使用して選択され、そしてその後ＦＡＳＣＡｒｉａ  ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現に基づき、単一細胞として９６ウェルプレートにソートされた。単一細胞クローンから形成されたコロニーは、ｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ（ＥＯＳ−Ｃ３＋），ｖ２Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ（ＥＯＳ−Ｃ３＋）およびｖ１Ｈ９−Ｓｏｘ２−ＧＦＰ（ＥＯＳ−Ｓ４＋）系を確立するのに使用された。
【００７４】
（細胞培養液）
Ｈ９ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ），ｖ１Ｈ９，ｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ，ｖ２Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ，ｖ１Ｈ９−Ｓｏｘ２−ＧＦＰおよび線維芽細胞由来人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は前述のように培養された（Ｃｈａｄｗｉｃｋ他２００３；Ｗｅｒｂｏｗｅｔｓｋｉ−Ｏｇｉｌｖｉｅ他、２００９）。
【００７５】
（原発性ヒト試料）
ＡＭＬ標本のため、末梢血および／または骨髄が臨床的プレゼンテーション時に収集された。健康な造血性細胞がへその緒の臍帯血試料から得られた。全ての試料は研究倫理委員会（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｂｏａｒｄ）承認済みプロトコルに従うインフォームドコンセントに従い、マックマスター大学（ＭｃＭａｓｔｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）およびロンドン健康科学センターで採取された。
【００７６】
（正常および腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）用、試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）培養プラットフォーム）
化学スクリーンは，ウェル当り５，０００細胞で８ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を追加されたマウス胚性線維芽細胞条件培地（ＭＥＦＣＭ）内に植えつけられたｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ細胞を含んだ。２４時間後、培地は化合物１０μＭおよび０．１％ＤＭＳＯ，０．１％ＤＭＳＯ（−ＢＭＰ４）またはＢＭＰ４１００ｎｇ／ｍｌおよび０．１％ＤＭＳＯ（＋ＢＭＰ４）を含むＭＥＦＣＭと４８時間に亘って交換され、その後化合物を含む新鮮な培地に２４時間に亘って交換された（合計化合物処置７２時間）。その後固定され自動画像化及びプレート読み取り機分析のために調製された。コンフルエントなＨ９及び線維芽細胞由来人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が１０，０００細胞／ウェルで８ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を追加されたＭＥＦＣＭ内に植えつけられた。２４時間後細胞は化合物１０μＭおよび０．１％ＤＭＳＯ，０．１％ＤＭＳＯ（−ＢＭＰ４）またはＢＭＰ４１００ｎｇ／ｍｌおよび０．１％ＤＭＳＯ（＋ＢＭＰ４）で処置された。化合物を加えられた新鮮なＭＥＦＣＭが毎日５日間にわたって交換された。５日目にヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は固定され、自動画像化及びプレート読み取り機分析のために調製された。更なる詳細は補足的実験手順参照。
【００７７】
（奇形腫検定法）
４００，０００のＨ９ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）またはｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰがオス非肥満糖尿病（ＮＯＤ）／重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスの精巣内に注入され、そして奇形腫がＯｃｔ４について前述のように（Ｗｅｒｂｏｗｅｔｓｋｉ−Ｏｇｉｌｖｉｅ他、２００９）分析された。
【００７８】
（異種移植検定法）      
ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃＳｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１ｗｊｌ／ＳｚＪ成体マウス（ＮＳＧマウス）が移植２４時間前に３１５ラドで亜致死性に放射線照射された。化合物またはＤＭＳＯ溶媒で２４時間処置された０．８−１．０ｘ１０７ＡＭＬ単球細胞（ＭＮＣ）または１．５−１．８ｘ１０５系統枯渇へその緒臍帯血（ＣＢ  ｌｉｎ−）造血性細胞が尾静脈経由で注入された（静脈内注射（ＩＶ））。６−１０週間後、動物は殺傷され、そして骨髄と脾臓がヒト細胞の存在についてフローサイトメトリで分析され（ＬＳＲＩＩ、ＢＤ）そしてデータはＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ）  を使用して分析された。２次的ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）移植に対しては、系統枯渇へその緒臍帯血（ＣＢ  ｌｉｎ−）生着からの同一数の移植ヒト細胞が、前述のように成体放射線照射ＮＳＧマウスに静脈内注射（ＩＶ）で注入された。
【００７９】
（統計的分析）
データは平均値±平均値の標準誤差または平均値±標準偏差で表わされる。グループ間の有意の差異は独立２方向または１方向ｔ検定を使用して決定された。
【００８０】
（多能性幹細胞培養）
Ｈ９ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ），ｖ１Ｈ９，ｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ，ｖ２Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ，ｖ１Ｈ９−Ｓｏｘ２−ＧＦＰおよび線維芽細胞由来人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は８ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（ＧＩＢＣＯ  １３２５６−０２）を追加されたマウス胚性線維芽細胞条件培地（ＭＥＦＣＭ）を有するＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）コートされた（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ３５３２３４）プレート上で培養された。ＭＥＦＣＭはＫＯ−ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ１０８２９−０１８），２０％ＫＯ−血清代替（ＧＩＢＣＯ１０８２８−０２８），１％非必須アミノ酸（ＧＩＢＣＯ１１１４０−０５０）、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１１ｍＭ  βメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｍ７５２２）から構成される。細胞系は１００ユニット／ｍＬのＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ＩＶ（ＧＩＢＣＯ１７１０４−０１９）を２−３分間使用して７日ごとに継代された。細胞蒔き密度、検定法継続期間、および９６ウェル内のＤＭＳＯ溶媒濃度は、ｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ細胞および正常Ｈ９ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）に対して最適化された。ｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰに対しては、最適初期細胞蒔き密度は７２時間処置に対し５，０００細胞／ウェルがＧＦＰ最大レベルと±ＢＭＰ４対照間のｚ’識別に基づいて選択された。正常ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）に対しては、最適細胞蒔き密度１０，０００細胞／ウェルが最大ｚ’―プライム識別に基づいて選択された。
【００８１】
（原発性ヒト試料）
単核細胞がＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅプレミアム（ＧＥヘルスケア）を使用して調製された。造血性細胞に対しては、ＥａｓｙＳｅｐ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  テクノロジーズ）を使用して系統枯渇化がメーカーの推奨に従って実施された。  
【００８２】
（ＡＭＬ／ＨＰＳＣ細胞培養）
ＡＭＬ細胞系、即ち、ＯＣＩ−ＡＭＬ２（Ｍ４），ＯＣＩ−ＡＭＬ３（Ｍ４），ＨＬ−６０（Ｍ２）およびＭＶ−４−１１（Ｍ５）は５％過熱―非活性ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＨｙＣｌｏｎｅ）を加えたロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）（Ｇｉｂｃｏ）内で培養された。Ｒ（＋）−７−ヒドロキシ−ＤＰＡＴハイドロブロマイド（Ｓｉｇｍａ）でのドーパミン受容体（ＤＲ）刺激薬研究に対しては、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）内のドーパミンの蔓延のため（Ｌｉｔｔｌｅ他，２００２）、無血清条件が適用された。ＡＭＬ患者芽細胞が５％過熱非活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＨｙＣｌｏｎｅ）、５ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ３（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ），５ｘ１０−５Ｍ  βメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）およびＢＩＴ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  タクノロジーズ）を加えたイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）内で培養された。ヒト幹細胞（ＨＳＣ）培地は１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ）、１００ｎｇ／ｍＬ  Ｆｌｔ−３Ｌ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）  ２０ｎｇ／ｍＬ  トロンボポエチン（ＴＰＯ）（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を加えたイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）を含んだ。患者のヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）試料は化合物またはＤＭＳＯ溶媒（０．１％）で２４時間処置され、その後コロニー形成単位（ＣＦＵ）プレーティングや異種移植研究が実施された。
【００８３】
（抗体）
免疫細胞化学に使用された抗体は以下の通り：Ｏｃｔ３／４（ＢＤ  Ｔｒｕｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ｃａｔ＃６１１２０３），Ｓｏｘ２（Ｒ＆Ｄ，  ｃａｔ＃ＡＦ２０１８）。ヒト造血性細胞を検知するため、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ−，フィコエリトリン（ＰＥ）−，アロフィコシアニン（ＡＰＣ）−またはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）ラベル付きの抗ヒトＣＤ４５が使用された（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。ＦＩＴＣ抗ＣＤ３３、ＰＥ抗ＣＤ１３、ＦＩＴＣ抗ＣＤ４１ａ，ＦＩＴＣ抗ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ドーパミン受容体（ＤＲ），ＰＥ抗ＣＤ１９抗体はＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎより入手した。ＰＥ抗ＣＤ１４，ＰＥ抗ＣＤ１５およびＰＥ抗ＧｌｙＡはＩｍｍｕｎｏｔｅｃｈ  Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒより入手した。多能性を測定するため、ＰＥ抗ＳＳＥＡ２（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＰＥ−またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８抗Ｏｃｔ４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）が使用された。ウサギ抗ヒトドーパミン受容体抗体ＤＲＤ１（Ｃａｔ＃３２４３９０），ＤＲＤ２（Ｃａｔ＃３２４３９３），ＤＲＤ３（Ｃａｔ＃３２４４０２），ＤＲＤ４（Ｃａｔ＃３２４４０５），ＤＲＤ５（Ｃａｔ＃３２４４０８），はＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌより入手した。抗ウサギＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ−４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）は２次抗体として使用された。Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙより入手した原発性抗ｐ５３（Ｃａｔ＃２５２７）および抗ｐ２１（Ｃａｔ＃２９４７）ウサギ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は固定され透過処理された細胞を染色するのに使用された。抗ウサギＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ−５４６（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）は２次抗体として使用された。
【００８４】
（自動画像化および分析）
（腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の画像化）
細胞は２％パラホルムアルデヒドで固定され、そして１０μｇ／ｍＬヘキスト３３３４２（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）でＣｏｍｂｉ  Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ  Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して染色された。Ｏｃｔ４免疫細胞学に関する実験のためには、Ｏｃｔ４用モノクローナル抗体（ＢＤ）がＡｌｅｘｓ−Ｆｌｕｏｒ−６４７２次抗体（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）と共に使用された。免疫細胞学的染色はＪａｎｕｓ自動液体ハンドラー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用した。画像は１０ｘＮ．ＡでＡｒｒａｙｓｃａｎ  ＨＣＳ  ＶＴＩリーダー（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ）を使用して、落射蛍光照明および標準フィルターセットの手段により獲得された。
【００８５】
（正常ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の画像化）
細胞は２％パラホルムアルデヒドで固定され、そして１０μｇ／ｍＬヘキスト３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色された。標準的蛍光発光免疫細胞化学技術が、細胞をＯｃｔ４用モノクローナル抗体（ＢＤ）およびＡｌｅｘｓ−Ｆｌｕｏｒ−６４７  ２次抗体（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）で染色するのに使用された。全ての工程はＪａｎｕｓ  自動液体ハンドラー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して実施された。画像は５ｘでＡｒｒａｙｓｃａｎ  ＨＣＳ  ＶＴＩリーダー（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ）を使用して、落射蛍光照明および標準フィルターセットの手段により獲得された。
【００８６】
（画像分析）
画像分析はＡｃａｐｅｌｌａソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）のカスタムスクリプトを使用して実施された。細胞核物質はヘキスト信号から区分された。腫瘍性細胞系に関しては物体輝度分析が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ポジティブ細胞に対してのみ実施された。正常細胞系に関しては、Ａｌｅｘｓ−Ｆｌｕｏｒ−６４７ポジティブ細胞が定量された。画像およびウェルレベルのデータはＣｏｌｕｍｂｕｓデータベース（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で保存されそして分析され、さらにＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅ（ＩＤＢＳ）でデータ分析、化合物登録、およびヒット識別が実施された。
【００８７】
（遺伝子発現分析）
特定の条件下の細胞が集められそしてＲＮＡがＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出され，相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）がＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（登録商標）ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して生成され、事前増幅およびＴａｑＭａｎ（登録商標）アレイ反応（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）がメーカー指示通りに実施された。それぞれの処置済み細胞集団の遺伝子発現プロファイルはＴａｑＭａｎ（登録商標）幹細胞多能性アレイカードを使用して、ＶｉｉＡ  ７  リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で分析された。各反応試料はアレイカード上のウェルに搭載され、そして３３６Ｘｇで各１分間２度遠心分離され、密封され、サーマルサイクラーに置かれた。以下のサイクル条件が全てのアレイカードの使用に適用された：４５℃で１０分間、８４℃で１０分間、そして（９４℃で３０秒その後６０℃で１分間）のサイクルを４０回。アレイデータは１８Ｓ  ＲＮＡ及びグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）に対して正規化され、そしてデータ分析２．０ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して比較された。
【００８８】
（メチルセルロースコロニ−形成検定法）
ＡＭＬ患者および系統枯渇へその緒臍帯血（ＣＢｌｉｎ−）細胞が化合物存在下またはＤＭＳＯ溶媒（０．１％）対照で２４時間培養された。ＡＭＬ細胞は５０，０００細胞／ｍＬでＭｅｔｈｏｃｕｌｔ  ＧＦ  Ｈ４４３４（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内にプレートされた。系統枯渇へその緒臍帯血（ＣＢｌｉｎ−）細胞は１，０００細胞／ｍＬでＭｅｔｈｏｃｕｌｔ  ＧＦ  Ｈ４４３４（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内にプレートされた。コロニーは１４日間の培養後、標準形態基準を使用してスコア付けされた。
【００８９】
（体積測定的細胞カウント）
ドーパミン受容体遮断薬（図１６Ｂ）とドーパミン受容体刺激薬（図１６Ｃ，Ｄ）による７２時間処置後のＡＭＬ−ＯＣＩ２とＡＭＬ−ＯＣＩ３細胞の存在数は、前方散乱および側方散乱クラスタリングにより定義される格子ストラタジーに従って固定容積内のイベントの数を測定することによりカウントされる、７ＡＡＤ−およびヘキスト＋。
【００９０】
（事例８：腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の分化を誘発する化合物の高生産性スクリーニング識別）  
発明者らは以前に、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）および生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）において、末端分化能力の迷走的遮断と共に自己再生および生存の増大を含む腫瘍性の特徴を示す、変異形ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）系について述べた（Ｗｅｒｂｏｗｅｔｓｋｉ−Ｏｇｉｌｖｉｅ他、２００９）。体細胞系癌幹細胞（ＣＳＣ）との機能的特徴の類似性に基づき、腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）が生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で高含有量高生産性のスクリーニングを許容する、体細胞系癌幹細胞（ＣＳＣ）の代理物として試験された。スクリーニングプラットフォームは選択的に腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を標的とし、一方正常ｈＰＳＣには殆ど影響しない小分子を識別するように開発された。この分化スクリーニングプラットフォームは、体細胞系癌幹細胞（ＣＳＣ）を選択的に標的とし、一方正常幹細胞（ＳＣ）の能力を残す、強力な候補医薬を識別することができる。
【００９１】
Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２は正常および腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の自己再生性多能性状態の喪失と分化の誘発に対する信頼度の高い指標を提供する。腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の誘発された分化の間のＯｃｔ４およびＳｏｘ２の喪失を検知する、より直接的な方法を提供するため、ＧＦＰレポーター系が、ＥＯＳ−ＧＦＰレポーター（それぞれｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰおよびｖ１Ｈ９−Ｓｏｘ２−ＧＦＰ）を腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）に形質導入することにより形成された（Ｈｏｔｔａ他、２００９）。ＧＦＰ輝度は自己再生の安定性に有利に働く処置およびＢＭＰ４の追加による分化を誘発する条件において、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２発現と相関しているように観察された。この応答は、Ｓｏｘ２レポーター系（ｖ１Ｈ９−Ｓｏｘ２−ＧＦＰ）のみならず、同じＥＯＳレンチウィルスＧＦＰレポーター（ｖ２Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ）を形質導入された追加の腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）系、ｖ２Ｈ９（Ｗｅｒｂｏｗｅｔｓｋｉ−Ｏｇｉｌｖｉｅ他、２００９）を使用して一貫して見られた。
【００９２】
生成された全てのヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）系における分化に対する均一な応答と多能性の維持はまた、ＥＯＳレポーター形成挿入によるウィルス統合またはクローンの選択は応答性に無関係であることを明らかにした。この結果は、分化を誘発する化合物は腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）系におけるＧＦＰ輝度の減少に基づいて識別可能であり、そして化学スクリーニングに利用可能であることを示唆した。そのため、自動高含有量顕微鏡法および蛍光定量ベースの高生産性スクリーニングのための条件が、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の多能性マーカー発現の減少を検知するのに使用された。正常ｈＰＳＣの顕微鏡分析では、ＢＭＰ４処置の後、明確なＯｃｔ４＋細胞が消失したことを示した。同様に、腫瘍性Ｏｃｔ４−ＧＦＰ  ｈＰＳＣのＢＭＰ４処置によるＯｃｔ４とＧＦＰの両方の減少は、高含有量顕微鏡法およびプレート読み取り機ベースの蛍光定量法により計量された。癌幹細胞（ＣＳＣ）を標的とする理想的な候補を識別するため、化合物処置に応答した正常および腫瘍性ｈＰＳＣの両方の分化が並行して評価された。
【００９３】
スクリーニングプラットフォームの有効性を前提として、ＮＩＨクリニカルコレクションおよびカナダ化合物コレクションからの５９０の確立された注釈つきの化合物からなる化学ライブラリーがスクリーニングされた。これらのコレクションは以前に他の多くの哺乳類細胞系において綿密に調査された（Ｄｉａｌｌｏ他，２０１０；Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ，２００６）。蛍光定量的な高生産性スクリーニング（ＨＴＣ）および高含有量スクリーニング（ＨＣＳ）プラットフォームは、５１の定義された化合物の多能性の喪失（それぞれＧＦＰ  ＲＦＵおよび細胞当り平均ＧＦＰ輝度）および細胞カウント（それぞれヘキストＲＦＵおよび細胞カウント）に対し等価の測定値を与えるという証明に従って、高生産性スクリーニング（ＨＴＣ）がより高速に化合物ライブラリーをスクリーニングするための好適なプラットフォームとして選択された（図９Ａ）。スクリーニングされた５９０の化合物の中で（従前の研究に基づき１０μＭで（Ｉｎｇｌｅｓｅ他、２００７））、１１の化合物が、ＧＦＰ％残存活性（％ＲＡ）とヘキスト％ＲＡの両方での減少により示されるように、分化を誘発するとして識別された（図９Ｂ−Ｃ）。計４つのこれら化合物、インダトラリン、チオリダジン、アザチオプリン、およびメフロキンが、クラスタリングおよびヘキスト％ＲＡが３０％超であることに基づいて（図９Ｂ）候補化合物として識別された。
【００９４】
２次的高含有量分析はインダトラリンが疑問のある候補であることを明らかにし、それは除外された。しかし高含有量分析および高生産性スクリーニング（ＨＴＣ）は共にチオリダジン、アザチオプリン、およびメフロキンが候補化合物であることを確認し（図９Ｄ）、そしてそれら化合物は更なる試験向けに選択された（図９Ｅ−Ｇ）。対照処置ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）に比較して、それぞれの化合物は明確な形態的変化を腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）に誘発した（図９Ｅ）。ＧＦＰ輝度の減少は、画像分析（図９Ｆ）を使用して確認され、そしてさらにそれぞれの化合物の最大半量有効濃度（ＥＣ５０）を計算するため、広範囲の投与量に亘って評価された（図９Ｇ）。チオリダジンとメフロキンのみが１０μＭの目標閾値より低いＥＣ５０値を有し（図９Ｇ）、それにより、それら化合物は患者からの腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）および体細胞系癌幹細胞（ＣＳＣ）を使用する更なる詳細な評価向けの候補として定義された。
【００９５】
チオリダジン様作用化合物を同定するための我々のスクリーニングアプローチと特異性を再確認するために、腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）応答のスクリーニングに使用される化学物質を２４４６の化合物を含む範囲に拡大した（図１８Ａ）。チオリダジンは、他の二つのフェノチアジン化合物；フルフェナジンおよびプロクロルペラジン；と共に、同定された２６化合物のリストの中で的中として同定された（図１８Ａ−Ｂ）。高含量の分析を使用したフルフェナジンおよびプロクロルペラジンの更なる評価は、対照−処理細胞（図１８Ｆ）と比較した腫瘍性ｈＰＳＣｓの明確な形態学的変化（図１８Ｃ）を明らかにした。ＧＦＰ輝度の低下は、画像解析｛図１８Ｄ）を用いて確認され、広範囲の用量にわたってさらに評価され、各化合物のＥＣ５０が計算された（図１８Ｅ）。スクリーンで同定された３つのフェノチアジンの中で、チオリダジンが腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣｓ）において最低のＥＣ５０値を示し（図９Ｇｖｓ図１８Ｅ）、それによりＡＭＬの癌幹細胞（ＣＳＣ）の標的化のためにテストされたフェノチアジン中でチオリダジンを最良の候補フェノチアジンとした。
【００９６】
（事例９：チオリダジンは正常造血性幹／前駆細胞に影響を与えずに、選択的に腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の分化を誘発し、そしてヒトＡＭＬ芽細胞を減少させる。）
Ｏｃｔ４の喪失を検知しそして分化の程度を明らかにするため、チオリダジンとメフロキンに対する応答が、正常（図１０Ａ）および腫瘍性（図１０Ｂ）のヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の両方で、３つの濃度で定量的フローサイトメトリを使用して評価された。乳癌幹細胞の既報告の選択的抑制薬（Ｇｕｐｔａ他，２００９）のサリノマイシンが比較のため含まれた。１０μＭでは、全ての化合物が細胞数を減少させた。しかし、残存正常ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）内のＯｃｔ４レベルはＢＭＰ４処置で観察されたレベルを下回らなかった（図１０Ａ）。これと同一の応答が、明確な成体由来の追加の正常ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）系を代表する線維芽細胞由来ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）で再現され（図１１Ａ）、このことは、効果が胚性起源に特異ではないことを示唆した。同じ化合物が腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の処置に使用された場合、チオリダジンとメフロキン処置は腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）内の細胞数とＯｃｔ１４のレベルの減少をもたらした。チオリダジンだけがＯｃｔ４のレベルをＢＭＰ４分化対照以下に減少させることができ（図１０Ｂ）、これはチオリダジンが腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の分化阻害に打ち勝つ能力が有ることを示唆した。この応答を確認するため、全ての化合物の腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）に対する網羅的な投与量反応が実施された（図１１Ｂ）。
【００９７】
選択的に腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を分化させる化合物を定量的に識別するために、これらの化合物に応答したＯｃｔ４＋細胞の正規化％の正常ｈＰＳＣと腫瘍性ｈＰＳＣの間の比率が測定された。例えば、比率１は分化が同等であることを意味し、一方比率＞１は、正常ｈＰＳＣに対して腫瘍性ｈＰＳＣの方が、分化が相対的に多いことを意味する。チオリダジンだけが、１μＭと１０μＭの両方で正常ｈＰＳＣに対する腫瘍性ｈＰＳＣの分化に有意のインパクトを与えた（図１０Ｃ）。細胞ストレスマーカーｐ５３（図１０Ｄ）およびその転写ターゲットｐ２１（図１０Ｅ）の速い蓄積が、さらに分化誘発を細胞毒性から区別するのに使用された。腫瘍性ｈＰＳＣに対する毒性化学治療薬エトポシドによる処置は、２４時間後に高レベルのｐ５３とｐ２１をもたらした。しかし１０μＭのチオリダジンまたはＢＭＰ４の処置は、毒性だけを誘発する薬剤と異なり、ｐ５３またはｐ２１の蓄積を生じなかった。このことはストレス応答プログラムよりはむしろ誘発された分化と一貫性があった。さらにチオリダジン処置は腫瘍性ｈＰＳＣ内に分化遺伝子の発現をもたらし、それはＴａｑＭａｎ  Ｌｏｗ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ａｒｒａｙ−ｑＰＣＲにより定量化された。処置された腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）内で、分化関連遺伝子５０種類の内２１種類において増加が観察され（図１０Ｆ）、それはチオリダジンの分化誘発効果と一貫性があった。
【００９８】
化学的応答における腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の体細胞性癌幹細胞（ＣＳＣ）に対する潜在的類似性を検証するため、ヒト造血性システムの正常および腫瘍性集団が評価された。実験的に、ヒト造血性幹―前駆細胞（ＨＳＰＣ）および白血病幹細胞（ＬＳＣ）の両方の自己再生および分化は、造血性システムにユニークに使用可能な、強力で確立された生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）および生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）検定法により調査可能である。それにより、それを、正常および腫瘍性ｈＰＳＣを抗癌幹細胞（ＣＳＣ）化合物の１次スクリーニングツールとして使用するという潜在的代理性を評価するための理想的な組織にしている。系統枯渇へその緒臍帯血（ＣＢｌｉｎ−）は造血性幹―前駆細胞（ＨＳＰＣ）を高度に豊富に含み、そして、自己再生と全ての血液系統への多系統分化ができる正常体細胞性幹細胞（ＳＣ）の信頼度の高い供給源である。急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、自己再生する白血病幹細胞（ＬＳＣ）により維持される成熟骨髄の分化阻害を特徴とする血液性腫瘍である（ＢｏｎｎｅｔおよびＤｉｃｋ，１９９７；Ｌａｐｉｄｏｔ他，１９９４）。
【００９９】
このように、メチルセルロース内の前駆体検定法が造血性幹―前駆細胞（ＨＳＰＣ）と５つの急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者試料で実施された；各試料は各化合物の生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）のクローン原性および多重系統造血性分化に対するインパクトを評価するため、チオリダジン、メフロキンまたはサリノマイシンで処置された。全コロニー形成単位（ＣＦＵ）のＨＳＰＣ（図１０Ｇ）およびＡＭＬ（図１０Ｈ）から生成され、それぞれの化合物で処置された代表的細胞ペレットが示される。チオリダジン処置はＡＭＬの増殖／クローン原性能力を低減させ、一方でＨＳＰＣの多重系統分化を維持した（図１１Ｃ）。多重系統分化における変化は、これら化合物でＨＳＰＣ試料（図１０Ｉ）およびＡＭＬ患者試料（図１０Ｊ）を処置した後に形成されたコロニー形成単位（ＣＦＵ）の列挙に基づいて定量化された。１μＭと１０μＭの両方でサリノマイシンはＡＭＬ−芽細胞ＣＦＵポテンシャルを減少させたが（図１０Ｊ）、しかし同時に、全ての試験投与濃度でＨＳＰＣのＣＦＵポテンシャルを減少させ（図１０Ｉ）、このことは、造血性システムにおける非特異的毒性を示唆した。対照的に、チオリダジンおよびメフロキンはＡＭＬ−芽細胞ＣＦＵ形成を減少させたが（図１０Ｊ）、一方でＨＳＰＣのＣＦＵポテンシャル（図１０Ｉ）および多重系統構成（図１１Ｄ）に殆ど影響せず、このことは、チオリダジンおよびメフロキンは正常な造血を変化させないことを示唆した。
【０１００】
識別された化合物の臨床用に最も望まれる結果は、ＡＭＬ−芽細胞ＣＦＵ形成の優先的消滅と、一方で正常造血性幹―前駆細胞（ＨＳＰＣ）の前駆体能力を維持することである。ＡＭＬを標的とするための最高の選択性を明らかにするため、ＨＳＰＣから生成された全ＣＦＵに対するＡＭＬ−芽細胞の比率が計算された（図１０Ｋ）。比率１は正常前駆体と腫瘍性前駆体のポテンシャルが等しいことを意味する。比率＞１は選択的にＡＭＬ−芽細胞ＣＦＵポテンシャルを減少させる化合物を定義する。サリノマイシン（１μＭ）、メフロキン（１０μＭ）およびチオリダジン（１０μＭ）投与はそれぞれの化合物に対する最高の比率値を示し（図１０Ｋ）、そして生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）評価向けに選択された。チオリダジン１０μＭは、特に、全ての化合物のなかで最高比率を示したが、しかし最も重要なのは、正常ＨＳＰＣのＣＦＵポテンシャルに比較して有意に低いＡＭＬ−芽細胞ＣＦＵポテンシャルを示した唯一の化合物である点である（図１０Ｋ）。
【０１０１】
ＡＭＬ−芽細胞ＣＦＵのクローン原性ポテンシャルを減少させるチオリダジンの特殊性が分化の誘発に起因するものかを議論するため、チオリダジン処置に応答した、患者ＡＭＬ細胞内の顆粒球性成熟マーカーＣＤ１１ｂの出現頻度が検定された（図１０Ｌ）。顆粒球性ＡＭＬ−芽細胞の発現頻度の顕著な増加は、処置の期間観察され（図１０Ｌ）、それはチオリダジンがそのＡＭＬ細胞の特異的標的化を分化の誘発を介して表わすことを示唆している。この発見は、腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）においてみられた分化誘発に類似しており、そしてこのスクリーニングプラットフォームの、腫瘍性細胞を分化させることができる薬剤を識別することに対する強力な読み出しを確認する。この結果はまた、チオリダジンがＡＭＬ癌幹細胞（ＣＳＣ）の特異的標的化に対する最良の候補であり、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）ヒトーマウス異種移植検定法を使用した試験が必要であることを示唆する。
【０１０２】
（事例１０：チオリダジンは白血病幹細胞（ＬＳＣ）機能を減少させ、一方で正常造血性幹―前駆細胞（ＨＳＰＣ）を残す）
生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で検知されたＡＭＬ−芽細胞の抑制が、腫瘍性幹細胞区画に影響する化合物に起因するかを描写するため、機能的に白血病幹細胞（ＬＳＣ）および造血性幹細胞（ＨＳＣ）を定義する異種移植研究（Ｄｉｃｋ，２００８）が実施された（図１２）。造血性幹―前駆細胞（ＨＳＰＣ）のサリノマイシン（１μＭ）による処置は造血性生着をほぼ検知不能レベルにまで減少させ（図１３Ａ）、そのことはこの化合物がＨＳＰＣからの正常造血に干渉することを明示し、そしてこの化合物は所望の抗癌幹細胞（ＣＳＣ）の選択的標的化を提供する可能性が低いため、さらなる評価から除外された。対照的に、メフロキン（１０μＭ）処置は、僅かな、しかし有意とは言えない、造血性幹細胞（ＨＳＣ）能力の減少を対照に比較して示した（図１２Ａ）。しかしメフロキンはＡＭＬ白血病幹細胞（ＬＳＣ）能力の減少には効果が無いことが判り、従って選択的効果が欠如しているため、さらなる評価を中断された（図１２Ｃ）。
【０１０３】
サリノマイシンとメフロキンの両方と対照的に、ＨＳＰＣのチオリダジン（１０μＭ）での処置は対照溶媒処置細胞と同じ骨髄生着（図１２Ａ）と脾臓生着（図１３Ｂ）のレベルを示した。多重系統再構成能力は対照とチオリダジン処置ヒト造血性幹細胞（ＨＳＣ）で同一であり、骨髄性（図１２Ｂ）、リンパ系（図１２Ｂ）、赤血球系（図１３Ｄ）、および巨核球性発現（図１３Ｄ）は全く影響されなかった。一連の２次的生着で測定されたように、チオリダジン処置は対照処置試料にくらべて造血性幹細胞（ＨＳＣ）自己再生に影響を与えなかった（図１３Ｆ）。しかしサリノマイシンとメフロキンと全く対照的に、チオリダジン処置は白血病疾病開始ＡＭＬ白血病幹細胞（ＬＳＣ）を有意に減少させた（図１２Ｃ−Ｄ；図１３Ｃ；図１３Ｅ）。
【０１０４】
ＨＳＰＣ正常造血性再生（％ｈＣＤ４５＋）対ＡＭＬ白血病誘発（％ＣＤ３３＋ｈＣＤ４５＋芽細胞）比率の計算は、チオリダジンが白血病幹細胞（ＬＳＣ）機能を有意に減少させ、一方で正常造血性幹細胞（ＨＳＣ）能力を保持することを明らかにした（図１２Ｅ）。チオリダジンが無い場合、２次移植レシピエントの白血病生着レベルに差が無いことが観察された（図１３Ｆ）。このことは、２次レシピエントにとってこの化合物への連続的暴露が白血病誘発を抑制するのに必要であることを示唆した。これらのデータは，生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でチオリダジンが体細胞性癌幹細胞（ＣＳＣ）を選択的に標的とし、一方で正常幹細胞機能には影響を与えないことを示した。チオリダジンが正常および腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を使用する新規の分化スクリーニングプラットフォームの生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での使用を介して識別されたため、チオリダジンの機能的効果は、体細胞性癌幹細胞（ＣＳＣ）を理解するのにヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を使用することの予測的価値の事例を提供する。
【０１０５】
（事例１１：ドーパミン受容体はヒト癌幹細胞（ＣＳＣ）を明確に分離する）
チオリダジンはドーパミン受容体（ＤＲ１−５）を介して作用することが知られている（ＢｅａｕｌｉｅｕおよびＧａｉｎｅｔｄｉｎｏｖ，２０１１；ＳｅｅｍａｎおよびＬｅｅ，１９７５）。正常幹細胞に比較してヒト癌幹細胞（ＣＳＣ）に選択的に干渉するチオリダジン作用のメカニズムがドーパミン受容体遮断性を介したものなのかを評価するため、ドーパミン受容体（ＤＲ）の細胞表面発現が分析された。現在までに、５つのドーパミン受容体（ＤＲ）が識別され、そしてＤ１ファミリー受容体（Ｄ１とＤ５）とＤ２ファミリー受容体（Ｄ２，Ｄ３およびＤ４）に分けられた（ＳｉｂｌｅｙおよびＭｏｎｓｍａ，１９９２）。多能性マーカーＳＳＥＡ３を発現する正常ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）はドーパミン受容体（ＤＲ）発現を欠く（図１４Ａおよび図１５Ａ−Ｂ）。対照的に腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は５種類全てのドーパミン受容体（ＤＲ）を発現した（図１４Ｂ）。観察された腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）に対するドーパミン受容体（ＤＲ）の差別的な発現とチオリダジンの選択的抑制は、ドーパミン受容体（ＤＲ）シグナリングの抑制が、正常幹細胞（ＳＣ）と比較したヒト癌幹細胞（ＣＳＣ）に対する選択的標的化に役割を果たしている可能性を示唆する。
【０１０６】
チオリダジン処置の機能的役割に基づいた、癌幹細胞（ＣＳＣ）におけるドーパミン受容体（ＤＲ）の潜在的役割を拡大するため、我々はドーパミン受容体（ＤＲ）遮断がチオリダジン処置後の白血病幹細胞（ＬＳＣ）の機能喪失を説明できるかを検討した。造血性幹―前駆細胞（ＨＳＰＣ）そして正常臍帯血（ＣＢ）からのヒト造血性単核細胞（図１５Ｃ−Ｆ）及びＡＭＬ患者試料（図１４Ｄおよび図１５Ｇ）におけるＤＲ１−５の発現が分析され（図１４Ｃ）た。ドーパミン受容体（ＤＲ）は、臍帯血の原始造血性幹細胞（ＨＳＣ）または前駆体集団（それぞれＣＤ３４＋３８−またはＣＤ３４＋３８＋として識別される（Ｂｈａｔｉａ他，１９９７））では観察されなかった（図１４Ｃ）。これは造血性幹細胞（ＨＳＣ）および前駆体はチオリダジンの標的を発現しないことを示唆した。
【０１０７】
同様に、ドーパミン受容体（ＤＲ）は、赤血球系（図１５Ｃ）、巨核球性（図１５Ｃ）およびリンパ系細胞（図１５Ｄ）では検知不能であった。ＣＤ１４＋として定義される単球およびＣＤ１５＋として定義される顆粒球集団の半分のみがドーパミン受容体（ＤＲ）を発現した（図１５Ｅ−Ｆ）。分析された全ての１３のＡＭＬ患者試料が５種類全ての受容体の異なるレベルを有するＤＲ＋芽細胞の集団を含み、そしてそれらはＣＤ３４＋／ＣＤ１４＋細胞において優勢に検知された（図１５Ｇ）。しかし、正常造血性幹細胞（ＨＳＣ）と異なり、ＣＤ３４＋細胞はヒトＡＭＬにおける白血病幹細胞（ＬＳＣ）能力と相関せず（Ｔａｕｓｓｉｇ他，２００８）、そして近年ＣＤ３４またはＣＤ３８を欠く多くの細画分で識別された（Ｅｐｐｅｒｔ他、２０１１）。正常およびＡＭＬヒト造血性試料におけるドーパミン受容体（ＤＲ）の差別的発現は、ヒトＡＭＬ白血病幹細胞（ＬＳＣ）が不均一であり、薬剤標的化は代替表現型の叙述ではなく分子経路に基づくべきであることを強く示唆した。
【０１０８】
ＡＭＬ芽細胞におけるドーパミン受容体（ＤＲ）発現がＡＭＬ患者における白血病幹細胞（ＬＳＣ）出現率に相関するか否かが調査された。ＤＲＤ３＋芽細胞（図１４Ｅ）よびＤＲＤ５＋芽細胞（図１４Ｆ）の大きな分画を持つＡＭＬ試料は、白血病幹細胞（ＬＳＣ）が異種移植レシピエントにおいて白血病を開始することができるため白血病幹細胞（ＬＳＣ）を有し、それは白血病幹細胞（ＬＳＣ）を含まない有意に低いレベルのドーパミン受容体（ＤＲ）を含むＡＭＬ患者試料と異なる。白血病幹細胞（ＬＳＣ）を含むＡＭＬ患者試料は予後不良と相関し、一方ＬＳＣを含まない試料は良好な予後を示した（Ｅｐｐｅｒｔ他，２０１１）。高レベルのドーパミン受容体（ＤＲ）出現は予後不良と相関し、一方低レベルのＤＲ出現は良好な予後を示した（図１４Ｅ−Ｆ）。これはドーパミン受容体（ＤＲ）評価が予後バイオマーカーとしての用途を持ち、そしてそれぞれのＡＭＬ患者に対する分子署名または白血病幹細胞（ＬＳＣ）の検数より単純であることを示唆する。
【０１０９】
（事例１２：チオリダジンのドーパミン受容体（ＤＲ）遮断はヒトＡＭＬを抑制する）
ヒトＡＭＬ内のドーパミン受容体（ＤＲ）の機能的役割をよりよく理解するため、患者由来の２種類のＡＭＬ細胞系；ＡＭＬ−ＯＣＩ２とＡＭＬ−ＯＣＩ３が使用された（Ｋｏｉｓｔｉｎｅｎ他，２００１）。
【０１１０】
原発性試料のように、これら２種類の細胞系は各ＤＲ１−５（図１６Ａ）に対し患者試料よりはるかに高いレベルの発現を示した。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）内のドーパミンの生物学的利用能に起因して（Ｌｉｔｔｌｅ他，２００２）、ＡＭＬ内のドーパミン受容体（ＤＲ）の役割を評価するのに無血清条件が採用された。両方のＡＭＬ系はチオリダジン処置され、そして他の既知のドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬クロザピンおよびクロルプロマジンと比較された（ＳｅｅｍａｎおよびＬｅｅ，１９７５）。３つの全てのＤＲ遮断薬は処置後ＡＭＬ細胞数を減少させた（図１６Ｂ）。ドーパミン受容体（ＤＲ）のヒトＡＭＬ細胞を標的化する特異性を評価するため、患者ＡＭＬ試料はＤＲ＋とＤＲ−細画分に蛍光活性化細胞振り分けにより分割され、その後ＤＭＳＯ溶媒またはチオリダジンで２４時間処置され、その後、芽細胞コロニー形成単位（ＣＦＵ）の内容について検定された。
【０１１１】
芽細胞コロニー形成単位（ＣＦＵ）形成の減少はチオリダジン処置ＤＲ＋細画分にのみ見られた（図１７Ａ）、一方チオリダジン処置ＤＲ−細画分では見られなかった（図１７Ｂ）。逆に、ドーパミン受容体（ＤＲ）Ｄ２ファミリー刺激薬７ＯＨ−ＤＰＡＴの追加は、ＡＭＬ細胞を増加させた（図１６Ｃ）。ドーパミン受容体（ＤＲ）Ｄ２ファミリーおよびＤ１ファミリーは、反対の作用を細胞間シグナリングに加え、その結果異なる生物学的効果をもたらす（Ｓｅｌｆ他，１９９６）。ドーパミン受容体（ＤＲ）Ｄ１ファミリー刺激薬ＳＫＦ３８３９３による処置はＡＭＬ細胞を有意に減少させ、それはＤ２ファミリーシグナリングがＡＭＬ細胞の生存に必要であることを確認した（図１６Ｄ）。これらの結果を組み合わせて、チオリダジンの作用のメカニズムはＤ２ファミリードーパミン受容体（ＤＲ）の遮断によるものであり、標的を外したためではないことを示唆し、そしてドーパミン受容体（ＤＲ）シグナリングを介した癌幹細胞（ＣＳＣ）標的化の新規の道を識別したことを示唆する。
【０１１２】
（事例１３：ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬とＤＮＡ合成阻害薬を使用した組み合わせ治療）
臨床的に許容できる用量でチオリダジンの抗ＬＳＣ作用を確証する（図１７Ｃ）際に、ＤＮＡ合成阻害剤シタラビン（ＡｒａＣ）を使用して、この薬剤が従来のＡＭＬ化学療法と組み合わせることができるか否かを調べた。ＡｒａＣは成人のＡＭＬの誘導療法と統合療法の両方で至適基準的な化学療法であるが、この治療は、高用量で有意な罹患率および死亡率のリスクをもたらす（ＥｓｔｅｙとＤｏｈｎｅｒ、２００６）。正常造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）対ＡＭＬ芽細胞検出を使用して、濃度＞１μＭでは、ＡｒａＣはＡＭＬ芽細胞ＣＦＵに対し完全な毒性を誘発したが、しかし、通常のＨＳＰＣｓを枯渇させるのにも十分であった（図１６Ｅ）。さまざまな用量を使用して、私たちは、ＨＳＰＣ機能を保持しながらＡＭＬ芽細胞ＣＦＵを減少させる濃度として定義されるＡｒａＣの有効濃度（ＥＣＡｒａｃ）を１００ｎＭと同定した（図１６Ｅ）。しかし、濃度１０μΜのチオリダジンとＡｒａＣの組み合わせは、有効濃度（ＥＣＡｒａＣ−Ｔｈｉｏ）を１ｎＭに減少させた。これは必要なＡｒａＣ用量の１００倍の減少を表す（図１６Ｆ）。チオリダジンのこの組合せ効果は、図１７Ｄに示すように、高用量のＡｒａＣ療法に伴う重度の細胞毒性効果を減少させることができるため、ＡＭＬ患者に対し有意な利益を有する可能性がある。
【０１１３】
あるいは、１０μΜのチオリダジンと１００ｎＭのＡｒａＣの組み合わせは、ＨＳＰＣ機能を保持しながらＡＭＬ芽細胞ＣＦＵを完全に消滅させ（図１６Ｆ）、このことはこれらの特定の濃度が患者の寛解を誘導し、ＡＭＬの再発を防止できることを示唆した。まとめると、これらのデータは、抗ＬＳＣ剤（チオリダジン）とヒトＡＭＬのための単一の一次治療として現在使用されている抗増殖剤（ＡｒａＣ）を組み合わせることが、白血病誘発階層における他の細胞に加えてＣＳＣの標的化に向けたシナジー的利益をもつことを示す。
【０１１４】
（実施例１４：ＤＲ抗体を使用した組み合わせ療法）  
ＡＭＬ細胞はＤＲ（ＤＲ１、ＤＲ２、ＤＲ３、ＤＲ４およびＤＲ５）の一つに結合する一次抗体で処置され、そしてその後細胞毒性剤に接合された二次抗体（特異的に一次抗体を認識し結合する）で処置される。一次および二次抗体の順次結合は、ＤＲを発現する細胞の特異的標的化および細胞毒性ペイロードの送達を可能にする。多数の細胞毒性薬剤が二次抗体に化学的に合体させることができる。
【０１１５】
リボソーム不活性化タンパク質、サポリンは二次抗体に結合され、そして受容体の内在化の際に細胞に侵入することができ、それによって細胞のリボソームを剥離させ不活性化し、それはタンパク質の阻害をもたらし、最終的には細胞死につながる。これらの順次投与された抗体は、チオリダジンおよびＡｒａＣの組み合わせ療法に類似しており、一次抗体はＤＲに結合し（チオリダジン様応答）、一方で二次抗体はサポリン細胞毒性効果（ＡｒａＣ様応答）を送達する。選択肢としてこの抗体システムは、細胞毒性剤に接合した単一のＤＲ抗体に設計することができる。  
【０１１６】
ＡＭＬ細胞を定義された期間（２４時間）、この一次および二次抗体の組み合わせで処理した後、ＡＭＬ細胞はメチルセルロース条件で播種され、芽細胞ＣＦＵを生成し、そして二次抗体のみ（即ち、一次ＤＲ抗体無しで）で処理されたＡＭＬ細胞と比較して採点された。一次ＤＲ抗体および二次サポリン結合抗体で処置された細胞は、二次抗体で処理した対照細胞に比較してＡＭＬ芽細胞ＣＦＵ生成を有意に減少させることが観察される。
【０１１７】
（実施例１５：シタラビンおよびチオリダジンによる白血病細胞系の組み合わせ療法）  
ＯＣＩ−ＡＭＬ２およびＯＣＩ−ＡＭＬ３はＡＭＬ患者由来の細胞系であり、培地１００μＬにウェル当たり２５，０００細胞で９６平底ウェルプレートに播種された。細胞は標準的な培養培地中で、単一処置として、または１０μΜのチオリダジンと組み合わせて、０．０１−１μΜの範囲のシタラビン（ＡｒａＣ）のさまざまな濃度で２４時間処理された。細胞は、次いで、蛍光生存能力染色７−アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）で染色され、そして体積計測細胞数計数モードで動作するハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）アダプタ付きのフローサイトメーターを用いて測定された。生細胞は７ＡＡＤ染色に対して陰性であることに加えて、前方および側方散乱プロファイルを確立するゲート内イベントによって定義された。
【０１１８】
図１９に示すように、シタラビンおよびチオリダジンの組み合わせでの処置は、白血病細胞系の生存率または増殖を低下させるのに非常に効果的である。試験されたＡｒａＣのすべての用量において、チオリダジンとの組み合わせは、ＡｒａＣ単独の処置と比較して有意に白血病細胞の数を減少させ、ＡｒａＣ＋チオリダジン１０ｕＭの組み合わせは、ＡｒａＣ自体よりも効果的に白血病細胞の生存率を減少させることを示した。さらに、試験されたＡｒａＣの各用量において、同一の白血病細胞レベルの減少が、チオリダジンとの組み合わせでは約１０倍少ないＡｒａＣの使用により達成できた。ＡｒａＣの有効性におけるこの１０倍の増加は、ＡｒａＣの化学療法を受けている患者への臨床的有益性を表し、そして例えば、チオリダジンと組み合わせて使用される場合、治療計画がより低用量のＡｒａＣの使用により、延長可能であることを示唆している。
【０１１９】
本発明は現在好適であると見做される事例を参照して記述されてきたが、本発明は開示された事例に制限されないことを理解するべきである。逆に、本発明は請求項の精神と範囲に含まれる種々の変化形および等価のアレンジメントに及ぶことを意図している。
【０１２０】
全ての刊行物、特許および特許申請は、あたかもそれぞれの刊行物、特許および特許申請が特異的にかつ個別にその全体が参照により採り入れられるように、その全てがここに参照により採り入れられる。
【０１２１】
（参照）
2015516378.tif 000006
2015516378.tif 000007
2015516378.tif 000008
2015516378.tif 000009
2015516378.tif 000010
2015516378.tif 000011
【図１】
2015516378.tif 000012
【図２】
2015516378.tif 000013
【図３−４】
2015516378.tif 000014
【図５】
2015516378.tif 000015
【図６】
2015516378.tif 000016
【図７−８】
2015516378.tif 000017
【図９Ａ−Ｃ】
2015516378.tif 000018
【図９Ｄ−Ｇ】
2015516378.tif 000019
【図１０Ａ−Ｃ】
2015516378.tif 000020
【図１０Ｄ−Ｈ】
2015516378.tif 000021
【図１０Ｉ−Ｌ】
2015516378.tif 000022
【図１１Ａ−Ｂ】
2015516378.tif 000023
【図１１Ｃ−Ｄ】
2015516378.tif 000024
【図１２Ａ−Ｂ】
2015516378.tif 000025
【図１２Ｃ−Ｅ】
2015516378.tif 000026
【図１３Ａ−Ｃ】
2015516378.tif 000027
【図１３Ｄ−Ｆ】
2015516378.tif 000028
【図１４Ａ−Ｂ】
2015516378.tif 000029
【図１４Ｃ−Ｄ】
2015516378.tif 000030
【図１４Ｅ−Ｆ】
2015516378.tif 000031
【図１５Ａ−Ｃ】
2015516378.tif 000032
【図１５Ｄ−Ｅ】
2015516378.tif 000033
【図１５Ｆ−Ｇ】
2015516378.tif 000034
【図１６Ａ−Ｂ】
2015516378.tif 000035
【図１６Ｃ−Ｄ】
2015516378.tif 000036
【図１６Ｅ−Ｆ】
2015516378.tif 000037
【図１７】
2015516378.tif 000038
【図１８Ａ】
2015516378.tif 000039
【図１８Ｂ−Ｅ】
2015516378.tif 000040
【図１８Ｆ】
2015516378.tif 000041
【図１９】
2015516378.tif 000042
【国際調査報告】
2015516378.tif 000043
2015516378.tif 000044
2015516378.tif 000045
2015516378.tif 000046
2015516378.tif 000047