(57)【要約】  本発明は、ＬＲＰ６受容体に結合するＬＲＰ６構築物に関する。ＬＲＰ６構築物がＷｎｔシグナルの増強なしでＷｎｔシグナル伝達経路を阻害するように、ＬＲＰ６構築物は少なくとも１つのＬＲＰ６結合部分および半減期延長分子を含む。ＬＲＰ６構築物はまた、増加した半減期を有し、治療的利益に対する時間を多く提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＲＰ６に結合する第１および第２のＬＲＰ６一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）およびヒト血清アルブミンを含む単離された低比重(low density)リポタンパク質関連タンパク質６（ＬＲＰ６）構築物であって、第１および第２のｓｃＦｖ分子はヒト血清アルブミンのＮ−およびＣ−末端に連結されており、ＬＲＰ６構築物は古典的(canonical)Ｗｎｔシグナル伝達経路を阻害し、ＬＲＰ６構築物はＬＲＰ６結合タンパク質の存在下でＷｎｔシグナルの有意な増強を示さない、単離された構築物。
【請求項２】
第１のＬＲＰ６  ｓｃＦｖがヒト血清アルブミンのＮ−末端に連結されており、ＬＲＰ６のプロペラ１領域に結合し、第２のＬＲＰ６  ｓｃＦｖがヒト血清アルブミンのＣ−末端に連結されており、ＬＲＰ６のプロペラ３領域に結合する、請求項１に記載の単離された構築物。
【請求項３】
第１のＬＲＰ６  ｓｃＦｖがヒト血清アルブミンのＣ−末端に連結されており、ＬＲＰ６のプロペラ１領域に結合し、第２のＬＲＰ６  ｓｃＦｖがヒト血清アルブミンのＮ−末端に連結されており、ＬＲＰ６のプロペラ３領域に結合する、請求項１に記載の単離された構築物。
【請求項４】
ＬＲＰ６結合タンパク質が、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３およびＷｎｔ３ａからなる群から選択されるＷｎｔ結合タンパク質である、請求項１に記載の単離された構築物。
【請求項５】
第１および第２のＬＲＰ６  ｓｃＦｖが、Ｆｃリンカー、ヒンジリンカー、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー、Ａｌａリンカー、およびＫＴＨＴリンカーからなる群から選択される連結リンカーを介して、ヒト血清アルブミンのＮ−およびＣ−末端に間接的に連結されている、請求項１に記載の単離された構築物。
【請求項６】
第１および第２のＬＲＰ６  ｓｃＦｖが、ヒト血清アルブミンへの直接融合により、ヒト血清アルブミンのＮ−およびＣ−末端に直接的に連結されている、請求項１に記載の単離された構築物。
【請求項７】
ヒト血清アルブミンが、変異体ヒト血清アルブミンまたはヒト血清アルブミンの断片からなる群から選択される、請求項１に記載の単離された構築物。
【請求項８】
変異体ヒト血清アルブミンが変異Ｃ３４ＳおよびＮ５０３Ｑを含む、請求項７に記載の単離された構築物。
【請求項９】
ヒト血清アルブミンの断片が、ＤＩ、ＤＩＩ、ＤＩＩＩおよびＤＩＶからなる群から選択されるヒト血清アルブミンの少なくとも１つのドメインを含む、請求項７に記載の単離された構築物。
【請求項１０】
ｓｃＦｖ断片が未変異(unmutated)のｓｃＦｖ断片と比較してｓｃＦｖの安定性を改善する少なくとも１つのアミノ酸変異を含み、該アミノ酸変異が図３２−３５から選択される、請求項１に記載の単離された構築物。
【請求項１１】
ｓｃＦｖ断片がＬＲＰ６のプロペラ１領域に結合し、未変異のｓｃＦｖ断片と比較してｓｃＦｖの安定性を改善する少なくとも１つのアミノ酸変異を含み、該アミノ酸変異がＳ３４ＭおよびＳ４９Ａからなる群から選択される、請求項１０に記載の単離された構築物。
【請求項１２】
ｓｃＦｖ断片がＬＲＰ６のプロペラ３領域に結合し、未変異のｓｃＦｖ断片と比較してｓｃＦｖの安定性を改善する少なくとも１つのアミノ酸変異を含み、該アミノ酸変異がＭ９５Ｆである、請求項１０に記載の単離された構築物。
【請求項１３】
ｓｃＦｖ断片がＬＲＰ６のプロペラ１領域に結合し、未変異のｓｃＦｖ断片と比較してｓｃＦｖの安定性を改善する少なくとも１つのアミノ酸変異を含み、該アミノ酸変異がＳ３４ＭおよびＳ４９Ａからなる群から選択され；ｓｃＦｖ断片がＬＲＰ６のプロペラ３領域に結合し、未変異のｓｃＦｖ断片と比較してｓｃＦｖの安定性を改善する少なくとも１つのアミノ酸変異を含み、該アミノ酸変異がＭ９５Ｆである、請求項１０に記載の単離された構築物。
【請求項１４】
Ｗｎｔリガンド誘導リン酸化アッセイにより評価されるとき、ＬＲＰ６のリン酸化を阻害する、請求項１に記載の単離された構築物。
【請求項１５】
細胞集団を枯渇させる、細胞集団の増殖を阻害するか、または減少させる、細胞集団からの炎症性メディエーターの分泌を阻害するか、または減少させる、細胞集団からの細胞質顆粒の分泌を阻害するか、または減少させる機能活性を有し、該細胞集団が  からなる群から選択されるアッセイにより決定されるとき、腫瘍細胞およびＷｎｔ依存性細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の単離された構築物。
【請求項１６】
半減期延長分子(extender)を有しないＬＲＰ６結合部分と比較して約５時間の半減期の増加を示す、請求項１に記載の単離された構築物。
【請求項１７】
配列番号：２９３または配列番号：２９３と少なくとも９５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む、単離された低比重リポタンパク質関連タンパク質６（ＬＲＰ６）構築物。
【請求項１８】
配列番号：２９５または配列番号：２９５と少なくとも９５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む、単離された低比重リポタンパク質関連タンパク質６（ＬＲＰ６）構築物。
【請求項１９】
請求項１に記載の低比重リポタンパク質関連タンパク質６（ＬＲＰ６）構築物をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項２０】
配列番号：２９３を含む低比重リポタンパク質関連タンパク質６（ＬＲＰ６）構築物をコードするヌクレオチド配列、または、配列番号：２９３と少なくとも９８％の配列同一性を含むヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項２１】
配列番号：２９５を含む低比重リポタンパク質関連タンパク質６（ＬＲＰ６）構築物をコードするヌクレオチド配列、または、配列番号：２９５と少なくとも９８％の配列同一性を含むヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項２２】
請求項１９−２１のいずれかに記載の核酸を含むベクター。
【請求項２３】
請求項１−１８のいずれかに記載の低比重リポタンパク質関連タンパク質６（ＬＲＰ６）構築物および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２４】
（ａ）ＬＲＰ６標的受容体の第１の結合部位に結合する第１の一本鎖Ｆｖ分子を提供すること；（ｂ）ＬＲＰ６標的受容体の第２の結合部位に結合する第２の一本鎖Ｆｖ分子を提供すること；および（ｃ）第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖを半減期延長分子に直接的または間接的に連結すること、を含む請求項１に記載の低比重リポタンパク質関連タンパク質６（ＬＲＰ６）構築物を製造する方法であって、該ＬＲＰ６構築物は古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路を阻害し、該ＬＲＰ６構築物はＬＲＰ６結合タンパク質の存在下でＷｎｔシグナルの有意な増強を示さない、方法。
【請求項２５】
請求項１−１８のいずれかに記載の低比重リポタンパク質関連タンパク質６（ＬＲＰ６）構築物を使用する、古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路によって介在される疾患を処置する方法。
【請求項２６】
請求項１−１８のいずれかに記載の低比重リポタンパク質関連タンパク質６（ＬＲＰ６）構築物を含む有効量の組成物を必要とする対象に投与することにより、ＬＲＰ６を発現する癌を有する対象を選択することを含む、癌を処置する方法。
【請求項２７】
対象がヒトである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＬＲＰ６を発現する癌を有する対象を選択すること、請求項１−１８のいずれかに記載の低比重リポタンパク質関連タンパク質６（ＬＲＰ６）構築物を含む有効量の組成物を必要とする対象に投与することを含む癌を処置する方法であって、該癌は乳癌、肺癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、肝臓癌、肝臓癌、胃癌、前立腺癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨肉腫、扁平上皮癌および黒色腫からなる群から選択される、方法。
【請求項２９】
乳癌、肺癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、肝臓癌、肝臓癌、胃癌、前立腺癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨肉腫、扁平上皮癌および黒色腫からなる群から選択される癌の処置のための医薬の製造のための、請求項１−１８のいずれかに記載の低比重リポタンパク質関連タンパク質６（ＬＲＰ６）構築物の使用。
【請求項３０】
医薬としての使用のための、請求項１−１８のいずれかに記載の低比重リポタンパク質関連タンパク質６（ＬＲＰ６）構築物。
【請求項３１】
古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路によって介在される癌を処置することにおいて使用するための、配列番号：２９３を有する低比重リポタンパク質関連タンパク質６（ＬＲＰ６）構築物。
【請求項３２】
古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路によって介在される癌を処置することにおいて使用するための、配列番号：２９５を有する低比重リポタンパク質関連タンパク質６（ＬＲＰ６）構築物。
【請求項３３】
薬物としての使用のための、配列番号：２９３を有する低比重リポタンパク質関連タンパク質６（ＬＲＰ６）構築物。
【請求項３４】
薬物としての使用のための、配列番号：２９５を有する低比重リポタンパク質関連タンパク質６（ＬＲＰ６）構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１１年１１月４日出願の米国仮出願第６１／５５５，８４８号に基づく優先権を主張するものであり、出典明示によりその内容をその全体において本明細書に包含させる。
【０００２】
分野
本発明は、ＬＲＰ６受容体に結合するＬＲＰ６構築物に関する。ＬＲＰ６構築物がＷｎｔシグナルの増強なしでＷｎｔシグナル伝達経路を阻害するように、ＬＲＰ６構築物は少なくとも１つのＬＲＰ６結合部分および半減期延長分子を含む。ＬＲＰ６構築物はまた、増加した半減期を有し、治療的利益に対する時間を多く提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
Ｗｎｔ／β−カテニン経路は、β−カテニンのタンパク質安定性の調節を通して、発生中における種々の生物学的プロセスおよび組織ホメオスタシスを制御する。該経路はまた、多数のヒトの癌に関与している（Cleversら (2006) Cell 127:469-480;およびLoganら (2004) Annu. Rev Cell Dev. Biol 20:781-810参照）。
【０００４】
Ｗｎｔシグナルは、２つの別個の受容体型、セルペンチン受容体のＦｒｉｚｚｌｅｄおよび一回膜貫通タンパク質であるＬＲＰ５またはＬＲＰ６を介して、細胞膜を横切って伝達される。Ｗｎｔタンパク質は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ＬＲＰ５／６シグナル伝達複合体の集合を促進し、ＧＳＫ３およびカゼインキナーゼＩによるＬＲＰ５／６の細胞質ＰＰＰＳＰｘＳモチーフのリン酸化を誘導する。リン酸化されたＬＲＰ５／６はアキシンと結合し、β−カテニン分解複合体を不活化する。安定化されたβ−カテニンは核に入り、ＴＣＦファミリー転写因子と結合して、転写をオンにする。
【０００５】
ＬＲＰ５／６の大きな細胞外ドメインは、それぞれの後にＥＧＦ−様ドメインが続く４つのＹＷＴＤ型β−プロペラ領域、およびＬＤＬＲドメインを含む。各々のプロペラ領域は、６枚羽根の(six-bladed)β−プロペラ構造を形成する６つのＹＷＴＤモチーフを含む。生化学的研究により、Ｗｎｔタンパク質はＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＬＲＰ６の両方と物理的に相互作用し、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ＬＲＰ６シグナル伝達複合体の形成を誘導することが示唆されている（Semenovら (2001) Curr. Biol 11, 951-961; Tamaiら (2000) Nature 407, 530-535）。Ｗｎｔタンパク質の他に、ＬＲＰ５／６の大きな細胞外ドメインは、Ｗｎｔアンタゴニスト、ＤＫＫ１およびスクレロスチン（ＳＯＳＴ）、ならびにＷｎｔアゴニストであるＲ−スポンジン(R-Spondin) を含む複数の分泌型Ｗｎｔモジュレーターと結合する。
【０００６】
ＬＲＰ６に対する抗体が同定されているが、ＩｇＧフォーマット化分子の治療特性は、大型サイズによる限定された組織浸透および標的組織、例えば、腫瘍の乏しい血管新生(vascularization)を含むいくつかの因子により限定され得る（Schmidt & Wittrup, (2009) Mol. Cancer Ther. 8, 2861-71）。加えて、腫瘍学的使用のために、免疫抑制性腫瘍微小環境がＦｃ介在エフェクター機能を抑制することができる（Dougan & Dranoff, 2009, Curr Protocol Immunol Chapter 20: Unit 20.11）。したがって、新規なタンパク質治療フォーマットの必要性が存在する。しかしながら、５０−６０ｋＤａより小さい組換えタンパク質の治療効果は、例えば、腎臓クリアランスおよび内皮細胞によるエンドサイトーシスによって、短い血清半減期により限定され得る。
【０００７】
したがって、有効な治療を可能にするために、これらの抗体フォーマットの血清半減期を延長する新規なＬＲＰ６抗体フォーマットおよび方法の必要性が存在する。特に、とりわけヒトの癌を処置するために、Ｗｎｔシグナル伝達経路を阻害する、新規なＬＲＰ６抗体フォーマットの必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、Ｗｎｔシグナルの増強なしでＷｎｔシグナル伝達を阻害し、増加した半減期を示す新規のＬＲＰ６構築物を提供する。具体的には、本発明は、ＬＲＰ６構築物がＬＲＰ６に結合し、Ｗｎｔシグナルの有意な増強なしでＷｎｔシグナル伝達を阻害し、増加した半減期（例えば、少なくとも約５時間、少なくとも１０時間、少なくとも１５時間、少なくとも２０時間、少なくとも２５時間、少なくとも３０時間、少なくとも３５時間、少なくとも４０時間、またはそれ以上）を有するように、少なくとも１つのＬＲＰ６結合部分および少なくとも１つの半減期延長分子(extender)を含むＬＲＰ６複合体を提供する。
【０００９】
したがって、１つの局面において、本発明は、ＬＲＰ６に結合する第１および第２のＬＲＰ６結合部分および半減期延長分子を含む単離された低比重リポタンパク質関連タンパク質６（ＬＲＰ６）構築物であって、半減期延長分子はＰＥＧ、ＦｃおよびＨＳＡからなる群から選択され、第１および第２のＬＲＰ６結合部分は半減期延長分子のＮ−およびＣ−末端に連結されており、ＬＲＰ６構築物は古典的(canonical)Ｗｎｔシグナル伝達経路を阻害し；ＬＲＰ６構築物は非ブロック化(unblocked)ＬＲＰ６結合タンパク質の存在下で、Ｗｎｔシグナルの有意な増強を示さない、単離された構築物に関する。１つの態様において、ＬＲＰ６結合部分は、抗体、二重特異性一本鎖Ｆｖ（（ｓｃＦｖ’）２）分子、単一ドメイン抗体、ダイアボディ(diabody)、トリアボディ(triabody)、ホルモン、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２分子、ｓｃＦａｂ断片およびタンデム(tandem)ｓｃＦｖ（ｔａＦｖ）断片からなる群から選択される。１つの態様において、ＬＲＰ６結合部分は一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）である。１つの態様において、ＬＲＰ６構築物はＬＲＰ６の２つ以上のプロペラ領域に結合し、プロペラ領域はプロペラ１およびプロペラ３からなる群から選択される。１つの態様において、第１のＬＲＰ６結合部分は半減期延長分子のＮ−末端に連結されており、ＬＲＰ６のプロペラ１領域に結合し、第２のＬＲＰ６結合部分は半減期延長分子のＣ−末端に連結されており、ＬＲＰ６のプロペラ３領域に結合する。他の態様において、第１のＬＲＰ６結合部分は半減期延長分子のＣ−末端に連結されており、ＬＲＰ６のプロペラ１領域に結合し、第２のＬＲＰ６結合部分は半減期延長分子のＮ−末端に連結されており、ＬＲＰ６のプロペラ３領域に結合する。１つの態様において、ＬＲＰ６結合タンパク質は、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３およびＷｎｔ３ａからなる群から選択されるＷｎｔ結合タンパク質である。１つの態様において、ＬＲＰ６結合部分は、Ｆｃリンカー、ヒンジリンカー、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー、ＡｌａリンカーおよびＫＴＨＴリンカーからなる群から選択されるリンカーを介して、半減期延長分子のＮ−およびＣ−末端に連結されている。他の態様において、ＬＲＰ６結合部分は、半減期延長分子への直接融合により、半減期延長分子のＮ−およびＣ−末端に連結されている。１つの態様において、ＬＲＰ６構築物は、Ｗｎｔリガンド誘導リン酸化アッセイにより評価されるとき、ＬＲＰ６のリン酸化を阻害する。１つの態様において、ＬＲＰ６構築物は、細胞集団を枯渇させる、細胞集団の増殖を阻害するか、または減少させる、細胞集団からの炎症性メディエーターの分泌を阻害するか、または減少させる、細胞集団からの細胞質顆粒の分泌を阻害するか、または減少させる機能活性を有し、細胞集団は腫瘍細胞およびＷｎｔ依存性細胞からなる群から選択される。１つの態様において、ＬＲＰ６構築物は、半減期延長分子なしのＬＲＰ６結合部分と比較して約５時間の半減期の増加を示す。
【００１０】
他の局面において、本発明は、ＬＲＰ６に結合する第１および第２のＬＲＰ６一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）およびヒト血清アルブミンを含む単離された低比重リポタンパク質関連タンパク質６（ＬＲＰ６）構築物であって、第１および第２のｓｃＦｖ分子はヒト血清アルブミンのＮ−およびＣ−末端に連結されており、ＬＲＰ６構築物は古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路を阻害し、ＬＲＰ６構築物はＬＲＰ６結合タンパク質の存在下でＷｎｔシグナルの有意な増強を示さない、単離された構築物に関する。１つの態様において、第１のＬＲＰ６  ｓｃＦｖはヒト血清アルブミンのＮ−末端に連結されており、ＬＲＰ６のプロペラ１領域に結合し、第２のＬＲＰ６  ｓｃＦｖはヒト血清アルブミンのＣ−末端に連結されており、ＬＲＰ６のプロペラ３領域に結合する。他の態様において、第１のＬＲＰ６  ｓｃＦｖはヒト血清アルブミンのＣ−末端に連結されており、ＬＲＰ６のプロペラ１領域に結合し、第２のＬＲＰ６  ｓｃＦｖはヒト血清アルブミンのＮ−末端に連結されており、ＬＲＰ６のプロペラ３領域に結合する。１つの態様において、ＬＲＰ６結合タンパク質は、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３およびＷｎｔ３ａからなる群から選択されるＷｎｔ結合タンパク質である。１つの態様において、第１および第２のＬＲＰ６  ｓｃＦｖは、Ｆｃリンカー、ヒンジリンカー、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー、Ａｌａリンカー、およびＫＴＨＴリンカーからなる群から選択される連結リンカーを介して、ヒト血清アルブミンのＮ−およびＣ−末端に間接的に連結されている。他の態様において、第１および第２のＬＲＰ６  ｓｃＦｖは、ヒト血清アルブミンへの直接融合により、ヒト血清アルブミンのＮ−およびＣ−末端に直接的に連結されている。１つの態様において、ヒト血清アルブミンは、変異体ヒト血清アルブミンまたはヒト血清アルブミンの断片からなる群から選択される。１つの態様において、変異体ヒト血清アルブミンは変異Ｃ３４ＳおよびＮ５０３Ｑを含む。１つの態様において、ヒト血清アルブミンの断片は、ＤＩ、ＤＩＩ、ＤＩＩＩおよびＤＩＶからなる群から選択されるヒト血清アルブミンの少なくとも１つのドメインを含む。１つの態様において、ｓｃＦｖ断片は未変異(unmutated)のｓｃＦｖ断片と比較してｓｃＦｖの安定性を改善する少なくとも１つのアミノ酸変異を含み、アミノ酸変異は図３２−３５から選択される。１つの態様において、ｓｃＦｖ断片はＬＲＰ６のプロペラ１領域に結合し、未変異のｓｃＦｖ断片と比較してｓｃＦｖの安定性を改善する少なくとも１つのアミノ酸変異を含み、アミノ酸変異はＩ３４ＭおよびＳ４９Ａからなる群から選択される。他の態様において、ｓｃＦｖ断片はＬＲＰ６のプロペラ３領域に結合し、未変異のｓｃＦｖ断片と比較してｓｃＦｖの安定性を改善する少なくとも１つのアミノ酸変異を含み、アミノ酸変異はＭ１００Ｆである。さらに他の態様において、ｓｃＦｖ断片はＬＲＰ６のプロペラ１領域に結合し、未変異のｓｃＦｖ断片と比較してｓｃＦｖの安定性を改善する少なくとも１つのアミノ酸変異を含み、アミノ酸変異はＩ３４ＭおよびＳ４９Ａからなる群から選択され；ｓｃＦｖ断片はＬＲＰ６のプロペラ３領域に結合し、未変異のｓｃＦｖ断片と比較してｓｃＦｖの安定���を改善する少なくとも１つのアミノ酸変異を含み、アミノ酸変異はＭ１００Ｆである。１つの態様において、ＬＲＰ６構築物は、Ｗｎｔリガンド誘導リン酸化アッセイにより評価されるとき、ＬＲＰ６のリン酸化を阻害する。他の態様において、ＬＲＰ６構築物は、細胞集団を枯渇させる、細胞集団の増殖を阻害するか、または減少させる、細胞集団からの炎症性メディエーターの分泌を阻害するか、または減少させる、細胞集団からの細胞質顆粒の分泌を阻害するか、または減少させる機能活性を有し、細胞集団は腫瘍細胞およびＷｎｔ依存性細胞からなる群から選択される。１つの態様において、ＬＲＰ６構築物は半減期延長分子なしのＬＲＰ６結合部分と比較して約５時間の半減期の増加を示す。
【００１１】
他の局面において、本発明は、配列番号：２９３；または配列番号：２９３と少なくとも９５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む、単離された低比重リポタンパク質関連タンパク質６（ＬＲＰ６）構築物に関する。
【００１２】
他の局面において、本発明は、配列番号：２９５；または配列番号：２９５と少なくとも９５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む、単離された低比重リポタンパク質関連タンパク質６（ＬＲＰ６）構築物に関する。
【００１３】
他の局面において、本発明は、低比重リポタンパク質関連タンパク質６（ＬＲＰ６）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に関する。
【００１４】
他の局面において、本発明は、配列番号：２９３を含む低比重リポタンパク質関連タンパク質６（ＬＲＰ６）構築物をコードするヌクレオチド配列；または、配列番号：２９３と少なくとも９８％の配列同一性を含むヌクレオチド配列を含む核酸に関する。
【００１５】
他の局面において、本発明は、配列番号：２９５を含む低比重リポタンパク質関連タンパク質６（ＬＲＰ６）構築物をコードするヌクレオチド配列；または、配列番号：２９５と少なくとも９８％の配列同一性を含むヌクレオチド配列を含む核酸に関する。
【００１６】
他の局面において、本発明は、ＬＲＰ６構築物をコードする核酸を含むベクターに関する。
【００１７】
他の局面において、本発明は、低比重リポタンパク質関連タンパク質６（ＬＲＰ６）構築物および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。
【００１８】
他の局面において、本発明は、（ａ）ＬＲＰ６標的受容体の第１の結合部位に結合する第１の一本鎖Ｆｖ分子を提供すること；（ｂ）ＬＲＰ６標的受容体の第２の結合部位に結合する第２の一本鎖Ｆｖ分子を提供すること；および（ｃ）第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖを半減期延長分子に直接的または間接的に連結すること、を含む請求項１に記載の低比重リポタンパク質関連タンパク質６（ＬＲＰ６）構築物を製造する方法であって、ＬＲＰ６構築物は古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路を阻害し、ＬＲＰ６構築物はＬＲＰ６結合タンパク質の存在下でＷｎｔシグナルの有意な増強を示さない、方法に関する。
【００１９】
他の局面において、本発明は、低比重リポタンパク質関連タンパク質６（ＬＲＰ６）構築物を使用する、古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路によって介在される疾患を処置する方法に関する。
【００２０】
他の局面において、本発明は、低比重リポタンパク質関連タンパク質６（ＬＲＰ６）構築物を含む有効量の組成物を必要とする対象に投与することにより、ＬＲＰ６を発現する癌を有する対象を選択することを含む、癌を処置する方法に関する。１つの態様において、対象はヒトである。
【００２１】
他の局面において、本発明は、ＬＲＰ６を発現する癌を有する対象を選択すること、前記請求項のいずれかに記載の低比重リポタンパク質関連タンパク質６（ＬＲＰ６）構築物を含む有効量の組成物を必要とする対象に投与することを含む癌を処置する方法であって、癌は乳癌、肺癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、肝臓癌、肝臓癌、胃癌、前立腺癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨肉腫、扁平上皮癌および黒色腫からなる群から選択される、方法に関する。
【００２２】
他の局面において、本発明は、乳癌、肺癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、肝臓癌、肝臓癌、胃癌、前立腺癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨肉腫、扁平上皮癌および黒色腫からなる群から選択される癌の処置のための医薬の製造のための、前記請求項のいずれかに記載の低比重リポタンパク質関連タンパク質６（ＬＲＰ６）構築物の使用に関する。
【００２３】
他の局面において、本発明は、医薬としての使用のための、低比重リポタンパク質関連タンパク質６（ＬＲＰ６）構築物に関する。他の局面において、本発明は、古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路によって介在される癌を処置することにおいて使用するための、配列番号：２９３を有する低比重リポタンパク質関連タンパク質６（ＬＲＰ６）構築物に関する。他の局面において、本発明は、古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路によって介在される癌を処置することにおいて使用するための、配列番号：２９５を有する低比重リポタンパク質関連タンパク質６（ＬＲＰ６）構築物に関する。他の局面において、本発明は、薬物としての使用のための、配列番号：２９３を有する低比重リポタンパク質関連タンパク質６（ＬＲＰ６）構築物に関する。他の局面において、本発明は、薬物としての使用のための、配列番号：２９５を有する低比重リポタンパク質関連タンパク質６（ＬＲＰ６）構築物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１Ａ−Ｅは、Ｗｎｔ１またはＷｎｔ３ａリガンドを一過性に発現するＨＥＫ２９３  ＳＴＦ  細胞における抗−ＬＲＰ６  マウス血清アルブミン融合分子の活性を示すグラフである（遺伝子レポーターアッセイ）。データは、抗−ＬＲＰ６  ＭＳＡ融合分子がＷｎｔ１またはＷｎｔ３ａシグナル伝達のいずれかを遮断することを示す。
【図２】図２は、ＳＴＦレポーター遺伝子アッセイにおける、Ｗｎｔ１およびＷｎｔ３ａ誘導シグナル伝達を阻害する抗−ＬＲＰ６二重特異性血清アルブミン融合物および二重特異性ＬＲＰ６抗体半分子の効力を示す。
【図３】図３は、腫瘍を有さないｎｕｄｅマウスにおける、β−プロペラ１領域に結合するＬＲＰ６マウス血清アルブミン融合分子の５ｍｇ／ｋｇでの単回ＩＶ投与を示すグラフである。
【図４】図４は、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１腫瘍を有するマウスにおける、β−プロペラ１領域に結合するＬＲＰ６マウス血清アルブミン融合分子の５ｍｇ／ｋｇでの、血清濃度およびＡｘｉｎ２  ｍＲＮＡに対する効果を示すグラフである。
【図５】図５は、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１腫瘍を有するマウスにおける、β−プロペラ１領域に結合するＬＲＰ６マウス血清アルブミン融合分子の５ｍｇ／ｋｇでの、血清濃度およびＡｘｉｎ２  ｍＲＮＡに対する効果を示すグラフである。
【００２５】
【図６】図６は、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１モデルにおいて、プロペラ１  抗−ＬＲＰ６  Ｆａｂ  ＭＳＡ融合タンパク質がインビボで腫瘍退縮を引き起こすことを示すグラフである。
【図７】図７は、Ｗｎｔ１またはＷｎｔ３ａリガンドを一過性に発現するＨＥＫ２９３  ＳＴＦ  細胞における抗−ＬＲＰ６  Ｆａｂ、マウス血清アルブミン結合化およびＰＥＧ化抗−ＬＲＰ分子の活性を示すグラフである（遺伝子レポーターアッセイ）。
【図８】図８は、抗−ＬＲＰ６  ｓｃＦｖおよびＨＳＡ融合分子の略図である。
【図９】図９は、いくつかの抗−ＬＲＰ６融合分子を示す。
【図１０】図１０Ａ−Ｃは、精製された二重特異性ＨＳＡ融合分子を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。
【００２６】
【図１１】図１１は、ＨＳＡ融合ベースの二パラトープ(biparatopic)分子の熱安定性測定を示す。
【図１２】図１２ＡおよびＢは、それぞれの分子のＴｍを示すＤＳＦ実験からのグラフである。Ｔｍはピークの中間点により示される。非変異分子の曲線は強調されている。
【図１３】図１３ＡおよびＢは、それぞれの分子のＴｍを示すＤＳＦ実験からのグラフである。
【図１４】図１４は、ＤＳＦにより測定されるとき、ＨＳＡ融合ベースの二パラトープ分子の熱安定性を示す。
【図１５】図１５Ａ−Ｂは、分析ＳＥＣからの８０１Ｔおよび８０２Ｔの溶出プロフィールを示すグラフである。
【００２７】
【図１６】図１６は、マルチプル(multiple)凍結融解（ＦＴ）後の分析ＳＥＣによる抗−ＬＲＰ６  ＨＳＡ融合ベースの二パラトープ分子の凝集を示す。
【図１７】図１７Ａ−Ｅは、ＥＬＩＳＡにより測定されるとき、抗−ＬＲＰ６  ｓｃＦｖ  融合分子のＬＲＰ６への結合を示すグラフである。
【図１８】図１８Ａ−Ｂは、競合ＥＬＩＳＡによりプレート結合ＬＲＰタンパク質への結合に対して可溶性ＬＲＰ６タンパク質と競合する抗−ＬＲＰ６  ｓｃＦｖ融合分子の能力を示すグラフである。
【図１９】図１９（Ａ、Ｃ−Ｅ）は、Ｗｎｔ１およびＷｎｔ３ａ誘導ＨＥＫ２９３  Ｗｎｔレポーター遺伝子アッセイにおいて抗−ＬＲＰ６融合分子の活性を示すグラフである。（Ｂ）は、抗−ＬＲＰ６融合分子の効力を要約する表である。
【図２０】図２０は、Ｗｎｔ１およびＷｎｔ３ａ誘導ＭＤＡ−ＭＢ４３５  Ｗｎｔレポーター遺伝子アッセイにおいて抗−ＬＲＰ６融合分子の活性を示すグラフである。
【００２８】
【図２１】図２１（Ａ）は、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１−腫瘍を有するマウスにおける、β−プロペラ１領域に結合する抗−ＬＲＰ６  ヒト血清アルブミン融合分子の５ｍｇ／ｋｇでの単回ＩＶ投与を示すグラフである。（Ｂ）は、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１腫瘍を有するマウスにおける、β−プロペラ１領域に結合する抗−ＬＲＰ６  ヒト血清アルブミン融合分子の５ｍｇ／ｋｇでの、Ａｘｉｎ２  ｍＲＮＡに対する効果を示すグラフである。
【図２２】図２２は、ナイーブな(naive)ラットにおける、β−プロペラ１領域に結合する抗−ＬＲＰ６  ヒト血清アルブミン融合分子の５ｍｇ／ｋｇでの単回ＩＶ投与を示すグラフである。
【図２３】図２３（Ａ）は、腫瘍ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１モデルにおいて、プロペラ１  抗−ＬＲＰ６  Ｆａｂ  ヒト血清アルブミン融合タンパク質がインビボで抗腫瘍効果を引き起こすことを示すグラフである。（Ｂ）は、試験の最後での種々の処置後のＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１  腫瘍  Ａｘｉｎ２  ｍＲＮＡ発現に対する効果を示す棒グラフである。
【図２４】図２４（Ａ）は、腫瘍ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１モデルにおいて、プロペラ１  抗−ＬＲＰ６  Ｆａｂ  ヒト血清アルブミン融合タンパク質がインビボで退縮を引き起こすことを示すグラフである。（Ｂ）は、試験の最後での種々の処置後のＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１  腫瘍  Ａｘｉｎ２  ｍＲＮＡ発現に対する効果を示す棒グラフである。（Ｃ）８０２ＴＦが腫瘍ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１モデルにおいて、インビボで用量依存的抗腫瘍活性を引き起こすことを示すグラフである。
【図２５】図２５は、いくつかの抗−ＬＲＰ６  Ｆｃ融合分子を示す。
【００２９】
【図２６】図２６は、抗−ＬＲＰ６  Ｆｃ−融合分子の略図である。
【図２７】図２７は、精製された抗−ＬＲＰ６二重特異性Ｆｃ融合分子を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。
【図２８】図２８は、分析ＳＥＣからの９１１Ｔの溶出プロフィールを示すグラフである。
【図２９】図２９は、分析ＳＥＣからの９１２Ｔの溶出プロフィールを示すグラフである。
【図３０】図３０は、ＥＬＩＳＡにより測定されるとき、抗−ＬＲＰ６  ｓｃＦｖ  融合分子のＬＲＰ６への結合を示すグラフである。
【００３０】
【図３１】図３１は、Ｗｎｔ１およびＷｎｔ３ａ誘導ＨＥＫ２９３  Ｗｎｔレポーター遺伝子アッセイにおいて抗−ＬＲＰ６融合分子の活性を示すグラフである。
【図３２】図３２は、ＭＯＲ０６４７５  ｓｃＦｖにおける単一の変異の、Ｔｍに対する影響を示す表である。
【図３３】図３３は、ＭＯＲ０８１６８  ｓｃｆｖにおける単一の変異の、Ｔｍに対する影響を示す表である。
【図３４】図３４は、細菌および哺乳動物の両方の系において発現された物質における、ＭＯＲ０８１６８  ｓｃＦｖの二重変異のＴｍに対する影響を示す表である。
【図３５】図３５は、ＥＬＩＳＡ、Ｐｒｏｔｅｏｎ親和性およびＳＴＦレポーター遺伝子アッセイにおける、野生型ならびにＭＯＲ０６４７５およびＭＯＲ０８１６８  ｓｃＦｖの単一／二重の変異を有するバージョンの結合および機能活性を要約する表である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
詳細な説明
定義
本発明がより容易に理解されるよう、特定の用語を最初に定義する。さらなる定義は、詳細な説明全体を通して示される。
【００３２】
「ＬＲＰ６」なる用語は、受入番号ＮＰ００２３２７において定義されるヒト低比重リポタンパク質関連タンパク質６を示す。
【００３３】
本明細書において使用される「ＬＲＰ６構築物」なる語句は、少なくとも１つのＬＲＰ６結合部分および少なくとも１つの半減期延長分子を含む分子を示す。ＬＲＰ６結合部分は、ＬＲＰ６の少なくとも１つの領域、例えば、ＬＲＰ６のプロペラ領域に結合するあらゆる分子であり得る。ＬＲＰ６構築物はＬＲＰ６に結合し、Ｗｎｔシグナルの増強なしでＷｎｔシグナル伝達経路を阻害する。加えて、ＬＲＰ６構築物は、ＬＲＰ６結合部分単独と比較してインビトロおよびインビボで（例えば、少なくとも５時間、少なくとも１０時間、少なくとも１５時間、少なくとも２０時間、少なくとも２５時間、少なくとも３０時間、少なくとも３５時間、少なくとも４０時間、またはそれ以上）増加した半減期を示す。
【００３４】
「ＬＲＰ６結合部分」なる用語は、ＬＲＰ６標的エピトープ、抗原、リガンドまたは受容体に特異的に結合するあらゆる分子を示す。ＬＲＰ６結合部分は、限定はしないが、抗体（例えば、モノクローナル、ポリクローナル、組換え、ヒト化およびキメラ抗体）、抗体断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’２、ｓｃＦｖ抗体、ＳＭＩＰ、ドメイン抗体、ダイアボディ、ミニボディ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、アフィボディ(affibodies)、ナノボディおよびドメイン抗体）、受容体、リガンド、アプタマー、および既知の結合パートナーを有する他の分子を含む。
【００３５】
本明細書において使用される「抗体」なる用語は、（例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布によって）ＬＲＰ６エピトープと相互作用し、シグナル伝達を阻害する全抗体(whole antiboy)を示す。天然の「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各々の重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略す）および重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３で構成される。各々の軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略す）および軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬで構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と称される領域と共に散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分することができる。各々のＶＨおよびＶＬは、アミノ−末端からカルボキシ−末端へ以下の順番で並んだ３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第一成分（Ｃｌｑ）を含む宿主の組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
【００３６】
例えば、抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、または抗体様特性を有するタンパク質スカフォールド、例えば、フィブロネクチンまたはアンキリン反復であり得る。抗体は、任意の以下のアイソタイプ：ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡｌ、ＩｇＡ２およびＩｇＡｓｅｃ）、ＩｇＤまたはＩｇＥを有することができる。
【００３７】
軽鎖および重鎖は共に、構造上および機能上の相同性の領域に分けられる。「定常」および「可変」なる用語は、機能的に使用される。この点に関し、軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）部分の両方の可変ドメインが抗原認識および特異性を決定することが理解される。逆に、軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）の定常ドメインは、重要な生物学的特性、例えば分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合などを与える。慣例により、定常領域ドメインの番号付けは、抗体の抗原結合部位またはアミノ末端からより遠く離れるにつれて大きくなる。Ｎ−末端は可変領域であり、Ｃ−末端は定常領域である；ＣＨ３およびＣＬドメインは、それぞれ重鎖および軽鎖のカルボキシ−末端を実際に含む。
【００３８】
本明細書において使用される「抗体断片」なる用語は、（例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布によって）ＬＲＰ６エピトープと特異的に相互作用し、シグナル伝達を阻害する能力を保持している、抗体の１以上の断片を示す。抗体のエピトープ結合機能は、完全長抗体の断片により行うことができる。抗体の「抗原−結合部分」なる用語内に包含される結合断片の例は、これらに限定されないが、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結した２つのＦａｂ断片を含む二価の断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなるｓｃＦａｂ、（ｖ）ＶＨおよびＶＬドメインを含むｄＡｂ；（ｖｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Wardら, Nature 341 :544-546 (1989)）；（ｖｉｉ）ＶＬドメインからなるｄＡｂ；（ｖｉｉｉ）および単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；および（ｉｘ）所望により合成リンカーによって結合され得る２つ以上の単離されたＣＤＲの組合せを含む。これらの抗体断片は、当業者により知られている慣用の技術を使用して得られ、該断片は、無傷な抗体と同じ手法において有用性についてスクリーニングされる。抗体断片は、組換えＤＮＡ技術により、または無傷な免疫グロブリンの酵素的または化学的開裂により作製することができる。
【００３９】
本明細書において使用される「ｓｃＦｖ」なる用語は、組換え方法を使用して、またはＶＬおよびＶＨ領域が対になって一価の分子を形成する単一のタンパク質鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Birdら Science 242:423-426 (1988)およびHustonら Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5879-5883 (1988)参照）として作成されることを可能にする合成リンカーによって連結することができる合成リンカーによって、結合されたＶＬおよびＶＨを示す。
【００４０】
「半減期延長分子」なる用語は、結合されている分子にさらなる機能性を与える生物学的または化学的物質(entity)を示す。特定の態様において、半減期延長分子は、ポリペプチド、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、または化学的物質、例えば、ＬＲＰ６結合部分の半減期を増加させるポリエチレングリコール(gycol)（ＰＥＧ）である。半減期延長分子は、本明細書に記載されているアッセイ（例えば、Ａｘｉｎ２のｍＲＮＡ発現レベル）により決定されるとき、ＬＲＰ６結合部分の半減期を少なくとも約５時間、少なくとも１０時間、少なくとも１５時間、少なくとも２０時間、少なくとも２５時間、少なくとも３０時間、少なくとも３５時間、少なくとも４０時間、またはそれ以上増加させることができる。
【００４１】
本明細書において使用される「Ｗｎｔシグナル伝達経路」なる語句は、分泌型タンパク質リガンドのＷｎｔファミリーのメンバーがＬＲＰおよびＦｒｉｚｚｌｅｄ（ＦＺＤ）の受容体複合体に結合し、それによりβ−カテニンが核内に移動し、ＬＥＦ／ＴＣＦ転写因子と相互作用し、標的遺伝子の発現を活性化することができる、古典的Ｗｎｔ経路を示す。Ｗｎｔシグナル伝達経路は、Ｗｎｔレポーター遺伝子アッセイまたは本明細書に記載されているＷｎｔ指向シグナル伝達の他の手段（例えば、ＬＲＰ６のリン酸化、β−カテニンの安定化および核移行、細胞増殖／生存）を使用して測定することができる。
【００４２】
「Ｗｎｔ１シグナル伝達経路」なる語句は、Ｗｎｔ１リガンドおよびＷｎｔ１結合リガンドのクラス、例えば、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ１０ａまたはＷｎｔ１０ｂと相互作用するＬＲＰ６によって活性化される古典的Ｗｎｔ経路を示す。
【００４３】
「Ｗｎｔ３シグナル伝達経路」なる語句は、Ｗｎｔ３またはＷｎｔ３ａリガンドと相互作用するＬＲＰ６によって活性化される古典的Ｗｎｔ経路を示す。
【００４４】
本明細書において使用される「単離されたＬＲＰ６構築物」なる語句は、異なる抗原特異性を有する他のＬＲＰ６構築物を実質的に含まないＬＲＰ６構築物を示す（例えば、ＬＲＰ６に特異的に結合する単離されたＬＲＰ６構築物は、ＬＲＰ６以外の抗原に特異的に結合する構築物を実質的に含まないものである）。さらに、単離されたＬＲＰ６構築物は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まないものであってもよい。しかしながら、ＬＲＰ６に特異的に結合する単離されたＬＲＰ６構築物は、他の抗原、例えば他の種のＬＲＰ６分子に対する交差反応性を有するものであってもよい。本明細書において使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」なる語句は、実質的に同一のアミノ酸配列を有するか又は同じ遺伝源(genetic source)に由来する、抗体、抗体断片、二特異性抗体等を含むポリペプチドを示す。この用語はまた、単一の分子組成の抗体分子の調製物も含む。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。
【００４５】
本明細書において使用される「ヒト抗体」なる語句は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方がヒト起源の配列に由来するものである可変領域を有する抗体を含む。さらに、該抗体が定常領域を含む場合、該定常領域もかかるヒト配列、例えば、ヒト生殖細胞系列配列に由来するものであるか、またはヒト生殖細胞系列配列の変異したバージョンであるか、あるいは、該抗体は、例えば、Knappikら. (2000. J Mol Biol 296, 57-86) に記載されているヒトフレームワーク配列の解析から得られるコンセンサスフレームワーク配列を含むものである。免疫グロブリン可変ドメイン、例えば、ＣＤＲの構造および位置は、周知の番号付け体系、例えば、Ｋａｂａｔ番号付け体系、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け体系、またはＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの組合せを使用して定義することができる（例えば、Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services (1991), eds. Kabatら; Al Lazikaniら (1997) J. Mol. Bio. 273:927 948); Kabatら (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edit., NIH Publication no. 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services; Chothiaら (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothiaら (1989) Nature 342:877-883;およびAl-Lazikaniら (1997) J. Mol. Biol. 273:927-948参照）。
【００４６】
ヒト抗体およびヒト抗体断片は、ヒト配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロのランダムなもしくは部位特異的変異誘発によって又はインビボの体細胞変異によって導入される変異、または安定性もしくは製造を促進するための保存的置換）を含んでもよい。しかしながら、本明細書において使用される「ヒト抗体」および「ヒト抗体断片」なる用語は、別の哺乳動物種、例えばマウスの生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトのフレームワーク配列上に移植された抗体を含むことを意図していない。
【００４７】
本明細書において使用される「組換えヒト抗体」なる語句は、組換えの手段によって調製、発現、作成または単離される全てのヒト抗体、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニックまたは染色体導入である動物（例えば、マウス）または該動物から調製されたハイブリドーマから単離される抗体、ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマ(transfectoma)から単離される抗体、組換えのコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体、および、ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の全てまたは一部を他のＤＮＡ配列へスプライシングすることを含む他のいずれかの手段によって調製、発現、作成または単離される抗体を含む。かかる組換えヒト抗体は、フレームワークおよびＣＤＲ領域がヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来するものである可変領域を有する。１つの態様において、しかしながら、かかる組換えヒト抗体は、インビトロの変異誘発（または、ヒトＩｇ配列に関してトランスジェニックである動物を使用するとき、インビボの体細胞変異誘発）に供することができ、それにより、該組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列のＶＨおよびＶＬ配列に由来し且つ関連するが、インビボのヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内には天然には存在しない可能性がある配列である。
【００４８】
本明細書において使用される「連結リンカー」なる用語は、少なくとも１つのＬＲＰ６結合部分（例えば、ｓｃＦｖ）と半減期延長分子を連結するために、単独または組合せにおいて使用されるアミノ酸、例えば、アラニン、グリシンおよびセリン残基からなるペプチドリンカーを示す。１つの態様において、該リンカーはＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーであり、アミノ酸配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）２、すなわち、（Ｇｌｙ２Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎは１以上の正の整数である）を含む。例えば、ｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３、ｎ＝４、ｎ＝５およびｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９およびｎ＝１０。１つの態様において、該リンカーは、限定はしないが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含む。他の態様において、該リンカーは、ＧｌｕおよびＬｙｓ残基がより良い溶解度のためにＧｌｙ−Ｓｅｒリンカー内に散在したものである。他の態様において、該リンカーは、複数の（Ｇｌｙ２Ｓｅｒ）、（ＧｌｙＳｅｒ）または（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）の繰り返しを含む。他の態様において、該リンカーは、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）＋（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）＋（ＧｌｙＳｅｒ）の組み合わせおよび重複を含む。他の態様において、ＳｅｒはＡｌａで置換することができ、例えば、（Ｇｌｙ４Ａｌａ）または（Ｇｌｙ３Ａｌａ）である。他の態様において、該リンカーは、Ｇｌｙ、ＳｅｒおよびＰｒｏの任意の組合せを含む。さらに他の態様において、該リンカーは、モチーフ（ＧｌｕＡｌａＡｌａＡｌａＬｙｓ）ｎ（式中、ｎは１以上の正の整数である）を含む。他の態様において、該リンカーは、アミノ酸配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ｘｎ（式中、Ｘは任意のアミノ酸（例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＧｌｕまたはＶａｌ）であり得、ｎは１−２０の整数である）を含むＡｌａリンカーである。他の態様において、連結リンカーは、少なくとも１つのＬＲＰ６結合部分（例えば、ｓｃＦｖ）と半減期延長分子を連結するために使用されない。
【００４９】
本明細書において使用される「ドメイン間(interdomain)リンカー」なる用語は、複数のＬＲＰ６結合部分を互いに連結するために、単独または組合せにおいて使用されるアミノ酸、例えば、アラニン、グリシンおよびセリン残基からなるペプチドリンカーを示す。１つの態様において、該リンカーはＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーであり、アミノ酸配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）２、すなわち、（Ｇｌｙ２Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎは１以上の正の整数である）を含む。例えば、ｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３、ｎ＝４、ｎ＝５およびｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９およびｎ＝１０。１つの態様において、該リンカーは、限定はしないが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含む。他の態様において、該リンカーは、ＧｌｕおよびＬｙｓ残基がより良い溶解度のためにＧｌｙ−Ｓｅｒリンカー内に散在したものである。他の態様において、該リンカーは、複数の（Ｇｌｙ２Ｓｅｒ）、（ＧｌｙＳｅｒ）または（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）の繰り返しを含む。他の態様において、該リンカーは、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）＋（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）＋（ＧｌｙＳｅｒ）の組み合わせおよび重複を含む。他の態様において、ＳｅｒはＡｌａで置換することができ、例えば、（Ｇｌｙ４Ａｌａ）または（Ｇｌｙ３Ａｌａ）である。他の態様において、該リンカーは、Ｇｌｙ、ＳｅｒおよびＰｒｏの任意の組合せを含む。さらに他の態様において、該リンカーは、モチーフ（ＧｌｕＡｌａＡｌａＡｌａＬｙｓ）ｎ（式中、ｎは１以上の正の整数である）を含む。他の態様において、該リンカーは、アミノ酸配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ｘｎ（式中、Ｘは任意のアミノ酸（例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＧｌｕまたはＶａｌ）であり得、ｎは１−２０の整数である）を含むＡｌａリンカーである。
【００５０】
本明細書において使用される「結合部位」なる用語は、ＬＲＰ６結合部分が選択的に結合するＬＲＰ６標的受容体上の領域を含む。例えば、ＬＲＰ６上の結合部位は、β−プロペラ１結合ドメイン、β−プロペラ２結合ドメイン、β−プロペラ３結合ドメイン、およびβ−プロペラ４結合ドメインを含む。
【００５１】
本明細書において使用される「エピトープ」なる用語は、高い親和性で免疫グロブリンと結合することができるあらゆる決定因子(determinant)を示す。エピトープは、ＬＲＰ６結合部分（例えば、ｓｃＦｖ）により結合されるＬＲＰ６受容体の領域である。エピトープを含む所与のポリペプチド（例えば、ＬＲＰ６）の領域は、当該技術分野において周知の任意のエピトープマッピング手法を使用して同定することができる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E.Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey参照。例えば、直線状エピトープは、例えば、タンパク質分子の部分に相当する多数のペプチドを固体支持体上で同時に合成し、該ペプチドが支持体に付着している間に該ペプチドを抗体と反応させることによって、決定し得る。かかる手法は当該技術分野において公知であり、例えば、米国特許第４，７０８，８７１号；Geysenら, (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:3998-4002; Geysenら, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:78-182; Geysenら, (1986) Mol. Immunol. 23:709-715に記載されている。同様に、立体構造的エピトープは、例えば、Ｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴によってアミノ酸の空間的高次構造を決定することにより、容易に同定される。例えば、上記Epitope Mapping Protocols参照。タンパク質の抗原性領域も、標準的な抗原性および疎水性(hydropathy)プロット、例えば、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐから入手可能なＯｍｉｇａ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．０ソフトウェアプログラムを使用して、例えば、計算されるプロットを用いて同定することができる。このコンピュータープログラムは、抗原性プロファイルの決定のためにHopp/Woods method, Hoppら, (1981) Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:3824-3828を採用し、疎水性プロットのためにＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ法、Kyteら, (1982) J.MoI. Biol. 157:105-132を採用している。
【００５２】
２つの実体間の「特異的結合」なる用語は、少なくとも１０２Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０２Ｍ−１、少なくとも１０３Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０３Ｍ−１、少なくとも１０４Ｍ−１少なくとも５ｘ１０４Ｍ−１、少なくとも１０５Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０５Ｍ−１、少なくとも１０６Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０６Ｍ−１、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０１２Ｍ−１、少なくとも１０１３Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０１３Ｍ−１、少なくとも１０１４Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０１４Ｍ−１、少なくとも１０１５Ｍ−１、または少なくとも５ｘ１０１５Ｍ−１の平衡定数（ＫＡ）（ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）での結合を意味する。
【００５３】
「特異的に（または選択的に）結合する」なる語句は、タンパク質および他の生物学的物質(biologics)の異種性集団中における同種抗原の存在を決定するＬＲＰ６結合部分とその同種抗原（例えば、ヒトＬＲＰ６）との間の結合反応を示す。上記平衡定数（ＫＡ）に加えて、ＬＲＰ６結合部分はまた、通常、５ｘ１０−２Ｍ未満、１０−２Ｍ未満、５ｘ１０−３Ｍ未満、１０−３Ｍ未満、５ｘ１０−４Ｍ未満、１０−４Ｍ未満、５ｘ１０−５Ｍ未満、１０−５Ｍ未満、５ｘ１０−６Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、５ｘ１０−７Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５ｘ１０−８Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５ｘ１０−９Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５ｘ１０−１０Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５ｘ１０−１１Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５ｘ１０−１２Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５ｘ１０−１３Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５ｘ１０−１４Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５ｘ１０−１５Ｍ未満、または１０−１５Ｍ未満またはそれより小さい解離速度定数（ＫＤ）（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を有し、非特異的抗原への結合に対するその結合親和性よりも少なくとも２倍大きい親和性でＬＲＰ６と結合する。１つの態様において、ＬＲＰ６結合部分は、本明細書に記載されている方法または当業者に知られている方法（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、ＳＥＴ）（Biacore International AB, Uppsala, Sweden）を使用して評価されるとき、３０００ｐＭ未満、２５００ｐＭ未満、２０００ｐＭ未満、１５００ｐＭ未満、１０００ｐＭ未満、７５０ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、２５０ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１５０ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、７５ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、１ｐＭの解離定数（Ｋｄ）を有する。
【００５４】
本明細書において使用される「Ｋａｓｓｏｃ」または「Ｋａ」なる用語は、特定のＬＲＰ６結合部分−抗原相互作用の会合速度を示し、他方、本明細書において使用される「Ｋｄｉｓ」または「Ｋｄ」なる用語は、特定のＬＲＰ６結合部分−抗原相互作用の解離速度を示す。本明細書において使用される「ＫＤ」なる用語は、Ｋａに対するＫｄの比（すなわちＫｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される解離定数を示す。ＬＲＰ６結合部分、例えば、ＬＲＰ６抗体またはその断片に対するＫＤ値は、当該分野において十分に確立された方法を使用して決定することができる。抗体のＫＤを決定するための方法は、表面プラズモン共鳴を使用すること、またはバイオセンサー系、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ(登録商標)システムを使用することである。
【００５５】
本明細書において使用される「親和性」なる用語は、単一の抗原性部位におけるＬＲＰ６結合部分と抗原との間の相互作用の強さを示す。各々の抗原部位内において、抗体「アーム」の可変領域は、多数の部位において弱い非共有結合的力を介して抗原と相互作用する；相互作用が大きければ大きいほど、親和性は強くなる。
【００５６】
本明細書において使用される「アビディティー」なる用語は、ＬＲＰ６結合部分−ＬＲＰ６抗原複合体の全体的安定性または強度の有益な尺度を示す。それは３つの主な要因：抗体エピトープ親和性；抗原および抗体両方の価数；および相互作用する部分の構造的配置によって制御される。最後に、これらの要因は、抗体の特異性、すなわち、特定の抗体が正確な(precise)抗原エピトープに結合している可能性を規定する。
【００５７】
本明細書において使用される「阻害」なる語句は、ＬＲＰ６に結合し、古典的Ｗｎｔシグナル伝達の生物学的活性を阻害、減少する、例えば、Ｗｎｔレポーター遺伝子アッセイまたはホスホＬＲＰ６アッセイにおいてＬＲＰ６誘導シグナル伝達活性を低下、減少するＬＲＰ６構築物を示す。アッセイの例は、以下の実施例においてより詳細に記載されている。いくつかの態様において、ＬＲＰ６構築物は、Ｗｎｔレポーター遺伝子アッセイにおいて１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下または１００ｐＭ以下、１０ｐＭ、１ｐＭ、０．５ｐＭ、０．１ｐＭのＩＣ５０にて測定されるとき、ＬＲＰ６誘導活性を低下、減少または阻害する。いくつかの態様において、ＬＲＰ６構築物の活性は、ＳＥＴ、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、Ｓｃａｔｃｈａｒｄを使用して、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．５ｐＭまたは１００ｐＭ以下のＩＣ５０にてＬＲＰ６への結合により測定することができる。
【００５８】
本明細書において使用される「Ｗｎｔ１」なる用語は、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ１０ａまたはＷｎｔ１０ｂを示す。
【００５９】
本明細書において使用される「Ｗｎｔ３ａ」なる用語は、Ｗｎｔ３ａおよびＷｎｔ３を示す。
【００６０】
本明細書において使用される「増強」なる用語は、Ｗｎｔシグナルが、Ｗｎｔリガンドの存在下において、抗体の断片の全長ＩｇＧ  ＬＲＰ６抗体への変換によって活性化および増強されるプロセスを示す。例えば、Ｗｎｔ１  Ｆａｂは、ＬＲＰ６受容体のプロペラ１領域に結合し、Ｗｎｔリガンド、例えば、Ｗｎｔ３の非存在下においてＷｎｔ１経路を遮断する。Ｗｎｔリガンド、例えば、Ｗｎｔ３の存在下において、Ｗｎｔ１  Ｆａｂは、Ｗｎｔ１経路を介するシグナル伝達を遮断するが、Ｗｎｔ３経路を介してシグナル活性化が生じ得、それによりシグナルが産生される。Ｗｎｔ１  Ｆａｂが全長Ｗｎｔ１  ＩｇＧに変換されると、該Ｗｎｔ１  ＩｇＧは２つのＬＲＰ６受容体のプロペラ１領域に結合し、Ｗｎｔリガンド、例えば、Ｗｎｔ３の存在下においてＷｎｔ１経路を遮断するが；シグナル活性化がＷｎｔ３経路を介して生じ、それが増強される。作用の理論を提供する必要はないが、１つの可能性のあるメカニズムは、ＩｇＧクラスターが各ＬＲＰ６受容体のプロペラ１領域に結合することによって２以上のＬＲＰ６受容体を一緒にし、それがＷｎｔ３リガンドの存在下においてＷｎｔ３経路を介するより強いシグナルをもたらすというものである。ＬＲＰ６受容体の二量体化は、おそらくは、ＬＲＰ６を含む様々な相互作用のアビディティーの増大を通じて、Ｗｎｔシグナル伝達を促進する。
【００６１】
ＬＲＰ６受容体のプロペラ３領域に結合し、Ｗｎｔ３経路を遮断するＷｎｔ３  Ｆａｂを使用して、逆の結果が得られる。Ｗｎｔ１リガンドの存在下において、Ｗｎｔ３  ＦａｂはＷｎｔ３経路を遮断するが、Ｗｎｔ１経路を活性化してシグナルを生成する。Ｗｎｔ３  Ｆａｂが全長Ｗｎｔ３  ＩｇＧに変換されると、該Ｗｎｔ３  ＩｇＧは２つのＬＲＰ６受容体のプロペラ３領域に結合し、Ｗｎｔ１リガンドの存在下において、Ｗｎｔ１経路を介するシグナル伝達を阻害する。
【００６２】
「有意な増強が無い」または「増強を回避する」なる用語は、同じエピトープに結合する対照抗体またはそれらの断片と比較して活性化または増強されないＷｎｔシグナルを示す。有意な増強が無いは、対照抗体またはそれらの断片よりも、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％低いものであり得る。
【００６３】
本明細書において使用される「クラスター」なる用語は、ＬＲＰ６受容体と共に集合し又は集団となり、Ｗｎｔシグナル伝達を増強するあらゆるタンパク質を示す。かかるタンパク質の例は、これらに限定されないが、Ｗｎｔ１リガンド、Ｗｎｔ３ａリガンドおよびＷｎｔ３リガンドを含む。これらのタンパク質は、多量体化、例えば、２つの内在性ＬＲＰ６受容体の二量体化を引き起こし得る。かかる二量体化は、ＬＲＰ６の増大した相互作用に起因する増大したアビディティーをもたらし得、Ｗｎｔリガンドの存在下においてＷｎｔシグナルを増強することができる。
【００６４】
「保存的に修飾されたバリアント(variant)」なる語句は、アミノ酸および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に対して、保存的に修飾されたバリアントは、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を示すか、または、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には本質的に同一の配列を示す。遺伝子コードの縮重のため、多数の機能的に同一の核酸が所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはすべてアミノ酸アラニンをコードする。したがって、あるコドンによってアラニンが特定されるあらゆる位置において、該コドンは、コードされるポリペプチドを変化させることなく、記載した対応するコドンのいずれかに変更することができる。かかる核酸変異は「サイレント変異」であり、保存的に修飾された変異の一種である。本明細書におけるポリペプチドをコードするすべての核酸配列はまた、核酸のあらゆる可能なサイレント変異も表す。当業者は、核酸中の各々のコドン（通常メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、およびトリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を修飾して機能的に同一の分子を生み出し得ることを認識するであろう。したがって、したがって、ポリペプチドをコードする核酸のそれぞれのサイレント変異が記載されたそれぞれの配列中に潜在している。
【００６５】
ポリペプチド配列について、「保存的に修飾されたバリアント」は、アミノ酸の、化学的に類似するアミノ酸での置換をもたらす、ポリペプチド配列に対する個々の置換、欠失または付加を含む。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は当該技術分野において周知である。かかる保存的に修飾されたバリアントは、多型バリアント、種間ホモログおよび対立遺伝子に対して追加的なものであり、これらを除外しない。以下の８つのグループは、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins (1984)参照）。いくつかの態様において、「保存的配列修飾」なる用語は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に有意な影響を与えず、または有意に変化をさせないアミノ酸修飾を示すために使用される。
【００６６】
「交差遮断する」、「交差遮断される」および「交差遮断」なる用語は、標準的な競合結合アッセイにおいて他の抗体とＬＲＰ６との結合に干渉するＬＲＰ６結合部分、例えば、抗体または断片の能力を意味するために本明細書において互換的に使用される。ＬＲＰ６結合部分が別の結合部分とＬＲＰ６との結合に干渉することができる能力または程度、およびそれをそれを交差遮断と言えるか否かは、標準的な競合結合アッセイを使用して決定することができる。１つの適切なアッセイは、表面プラズモン共鳴の技術を使用する相互作用の程度を測定することができるＢｉａｃｏｒｅ技術（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００装置(Biacore, Uppsala, Sweden)を使用することによる）の使用を含む。交差遮断を測定するための別のアッセイは、ＥＬＩＳＡに基づくアプローチを使用する。
【００６７】
本明細書において使用される「最適化」なる用語は、産生細胞または生物、一般的には真核細胞、例えばピチア(Pichia)の細胞、トリコデルマ(Trichoderma)の細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはヒト細胞において好適なコドンを使用するアミノ酸配列をコードするよう変更されたヌクレオチド配列を示す。最適化されたヌクレオチド配列は、「親」配列としても知られている出発ヌクレオチド配列によって元々コードされるアミノ酸配列を完全に又は可能な限り多く保持するよう、操作される。
【００６８】
様々な種の抗原に対する抗体の結合能力を評価するための標準的なアッセイは、当該技術分野において公知であり、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットおよびＲＩＡを含む。これらの標準アッセイはまた、ＬＲＰ６構築物に対して適当であり、実施例において詳細に記載されている。ＬＲＰ６構築物の結合速度（例えば、結合親和性）はまた、当該技術分野において公知の標準的なアッセイ、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ分析またはＦＡＣＳ相対的親和性（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）によって評価することができる。ＬＲＰ６の機能的特性に対するＬＲＰ６構築物の効果を評価するためのアッセイ（例えば、Ｗｎｔ経路を調節する受容体結合アッセイ）は、実施例においてさらに詳細に記載されている。
【００６９】
したがって、当該技術分野において公知の方法および本願明細書に記載される方法によって決定される、これらのＬＲＰ６機能特性（例えば、生化学的、免疫化学的、細胞性、生理学的または他の生物学的活性など）の１以上を「阻害する」ＬＲＰ６構築物は、ＬＲＰ６構築物の非存在下において見られる活性と比較して特定の活性の統計的に有意な減少に関連すると理解される。ＬＲＰ６活性を阻害するＬＲＰ６構築物は、測定されるパラメーターの少なくとも１０％、少なくとも５０％、８０％または９０％統計的に有意な減少を引き起こし、１つの態様において、ＬＲＰ６構築物は、ＬＲＰ６機能活性の９５％、９８％または９９％以上を阻害し得る。
【００７０】
２以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、「同一パーセント」または「同一性パーセント」なる語句は、同一である２以上の配列または部分配列(subsequence)を示す。以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用して、または手動アラインメントおよび目視検査によって測定されるとき、比較ウインドウまたは指定した領域にわたって、最大の対応(maximum correspondence)に対して比較およびアラインされたとき、２つの配列が、同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定されたパーセント（すなわち、特定された領域にわたって、または、特定されていない場合、全配列にわたって、６０％同一性、所望により６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性）を有するとき、「実質的に同一」である。所望により、同一性は、長さにおいて少なくとも約５０ヌクレオチド（または１０アミノ酸）である領域にわたって、またはさらに好ましくは、長さにおいて１００から５００または１０００またはそれ以上のヌクレオチド（または２０、５０、２００またはそれ以上のアミノ酸）である領域にわたって存在する。
【００７１】
配列比較について、通常は１つの配列が参照配列としての役割を果たし、試験配列は該参照配列と比較される。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要であれば部分配列の座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。デフォルトのプログラムパラメーターを使用することができるか、または代替のパラメーターを指定することができる。次に、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメーターに基づいて、参照配列と比較して試験配列の配列同一性パーセントを算出する。
【００７２】
本明細書において使用される「比較ウインドウ」は、２つの配列が最適にアラインされた後、配列を同じ数の連続する位置の参照配列と比較し得る、２０から６００、通常約５０から約２００、より通常約１００から約１５０からなる群から選択される連続する位置の数のいずれかのセグメントへの言及を含む。比較のための配列のアラインメントの方法は、当該技術分野において周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482cの局所的相同性アルゴリズムによって、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Pearson and Lipman, (1988) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）によって、または、手動アラインメントおよび目視検査（例えば、Brentら, (2003) Current Protocols in Molecular Biology参照）によって、行うことができる。
【００７３】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適当なアルゴリズムの２つの例は、それぞれAltschulら, (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402；およびAltschulら, (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410に記載されている、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を行うためソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センターを通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインしたときに一致するかまたはいくつかの正の値の閾値スコアＴを満たすクエリー配列中の長さＷの短いワードを同定することにより、最初に高スコア配列ペア（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値(前記Altschulら)と称される。これらの初期隣接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見出す検索を開始するための種としての役割を果たす。ワードヒットは、累積アラインメントスコアを増大させ得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメータＭ（一致する残基のペアに対する報酬スコア(reward score)；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基に対するペナルティスコア；常に＜０）を使用して算出される。アミノ酸配列について、累積スコアを算出するためにスコアリングマトリックスが使用される。各方向におけるワードヒットの伸長は、以下の場合に停止される：累積アラインメントスコアがその最大達成値から数(quantity)Ｘ減少するとき；１以上の負のスコアを与える残基アラインメントの蓄積のため、累積スコアがゼロ以下となるとき；または、いずれかの配列の末端に到達するとき。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３のワード長、および１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff and Henikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915参照）、５０のアラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖比較をデフォルトとして使用する。
【００７４】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析を実行する（例えば、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の一つの尺度は、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる可能性の指標を提供する最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸と参照核酸との比較における最小合計確率が約０．２未満、さらに好ましくは約０．０１未満、およびより好ましくは約０．００１未満であるとき、核酸は参照配列と類似すると考えられる。
【００７５】
２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントはまた、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているE. MeyersおよびW. Miller(Comput. Appl. Biosci. 4:11-17 (1988))のアルゴリズムを使用し、ＰＡＭ１２０重み付き残基表(weight residue table)、１２のギャップ長ペナルティおよび４のギャップペナルティを使用して決定することができる。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（www.gcg.comにおいて入手可能）中のＧＡＰプログラムに組み込まれているNeedlemanおよびWunsch(J. Mol, Biol. 48:444-453 (1970))アルゴリズムを使用し、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、および１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップ重みおよび１、２、３、４、５または６の長さ重みを使用して決定することができる。
【００７６】
上記配列同一性のパーセント以外の、２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることの別の指標は、以下に記載されるとおり、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、第２の核酸によってコードされるポリペプチドに対して抗体と免疫学的に交差反応性であることである。したがって、例えば２つのペプチドが保存的置換のみによって異なるとき、ポリペプチドは通常、第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、以下に記載されるとおり、２つの分子またはそれらの相補体がストリンジェント条件下で互いにハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であることのさらなる別の指標は、同じプライマーを使用して該配列を増幅することができることである。
【００７７】
「核酸」なる語句は、本明細書において「ポリヌクレオチド」なる語句と互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよび一本鎖または二本鎖のいずれかの形態におけるそのポリマーを示す。他に記載のない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に修飾されたバリアント（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列、ならびに明白に明示される配列をも黙示的に包含する。具体的には、以下において詳細に記載する通り、縮重コドン置換は、１以上の選択された（または全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基によって置換されている配列を生成することによってなし遂げられ得る（Batzerら (1991) Nucleic Acid Res. 19:5081; Ohtsukaら (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608;およびRossoliniら(1994) Mol. Cell. Probes 8:91-98）。
【００７８】
「作動可能に連結」なる語句は、２以上のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）のセグメント間の機能的関係を示す。一般的に、それは、転写調節配列と転写される配列との機能的関係を示す。例えば、プロモーターまたはエンハンサー配列は、それが適切な宿主細胞または他の発現系においてコード配列の転写を刺激または調節するとき、コード配列に作動可能に連結している。一般的に、転写される配列に作動可能に連結しているプロモーター転写調節配列は、該転写される配列と物理的に連続しており、すなわち、それらはシス作用性である。しかしながら、いくつかの転写調節配列、例えばエンハンサーは、それが転写を増強するコード配列と物理的に連続しているかまたは極めて近接して位置している必要がない。
【００７９】
本明細書において互換的に使用される「ポリペプチド」および「タンパク質」なる用語は、アミノ酸残基のポリマーを示す。該用語は、１以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的化学的模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーおよび非天然アミノ酸ポリマーに適用される。他に記載のない限り、特定のポリペプチド配列はまた、その保存的に修飾されたバリアントも黙示的に包含する。
【００８０】
「対象」なる用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含む。非ヒト動物は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、鳥類、両生動物およびは虫類を含む。特記した場合を除き、「患者」または「対象」なる用語は、本明細書において互換的に使用される。
【００８１】
「抗癌剤」なる用語は、細胞増殖性疾患、例えば癌を処置するために使用することができるあらゆる薬剤を意味し、細胞毒性剤、化学療法剤、放射線治療および放射線治療剤、標的化された抗癌剤および免疫療法剤を含む。
【００８２】
「腫瘍」なる用語は、悪性であるか良性であるかに関わらず、腫瘍性の細胞成長および増殖、ならびに全ての前癌性および癌性の細胞および組織を示す。
【００８３】
「抗腫瘍活性」なる用語は、腫瘍細胞の増殖速度、生存能力または転移活性の低下を意味する。抗腫瘍活性を示す一つの可能な方法は、治療の間に生じる異常細胞の増殖速度の低下、または腫瘍サイズ安定性または減少を示すことである。かかる活性は、これらに限定されないが、異種移植モデル、同種移植モデル、ＭＭＴＶモデル、および抗腫瘍活性を研究するために当分野で知られている他の既知のモデルを含む受け入れられたインビトロまたはインビボの腫瘍モデルを使用して評価することができる。
【００８４】
「悪性腫瘍」なる用語は、非良性腫瘍または癌を示す。本明細書において使用される「癌」なる用語は、調節解除された又は制御されない細胞増殖に特徴付けられる悪性腫瘍を含む。例示的な癌としては、以下が挙げられる：癌腫、肉腫、白血病およびリンパ腫。「癌」なる用語は、原発性悪性腫瘍（例えば、その細胞が対象の体における元の腫瘍の部位以外の部位へ移動していないもの）および二次悪性腫瘍（例えば、転移、即ち元の腫瘍の部位とは異なる二次的部位への腫瘍細胞の移動から生じるもの）を含む。
【００８５】
様々な側面を、以下のセクションおよびサブセクションにおいてさらに詳細に説明する。
【００８６】
ＬＲＰ６およびＷｎｔ−シグナル伝達経路
本発明は、ＬＲＰ６構築物およびその使用に関する。ＬＲＰ６構築物は、少なくとも１つのＬＲＰ６結合部分および少なくとも１つの半減期延長分子を含む。これらのＬＲＰ６構築物は、ＬＲＰ６受容体上の少なくとも１つの結合部位に結合し、Ｗｎｔシグナルの増強なしでＷｎｔシグナル伝達を阻害し、古典的Ｗｎｔシグナル伝達と関連する疾患、例えば、癌に役立つ。
【００８７】
Ｗｎｔシグナル伝達経路は、胚発生および出生後の組織維持において重要である。これは、細胞の増殖、運動および細胞生存の時間的および空間的調節を制御する特定の遺伝子セットを指揮することによって達成される（Barker and Clevers (2006) Nature Rev. 5:997において概説されている）。この経路の適切な調節は、組織ホメオスタシスを維持するために重要である。この経路の慢性的活性化は、制御されない細胞増殖および生存を促進し、その結果、細胞増殖性疾患、例えば癌の発生を駆動し得る。あるいは、この経路の異常な阻害は、多くの疾患状態、例えば骨量の減少および他の骨疾患をもたらし得る。Ｗｎｔタンパク質は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体および、低比重リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）関連タンパク質（ＬＲＰ）のメンバーである２つの細胞表面受容体：ＬＲＰ５およびＬＲＰ６うち一方と相互作用することによって、下流のシグナル伝達を開始する（Heら(2004) Development 31:1663-1677において概説されている）。
【００８８】
ＬＲＰ６の細胞外ドメインは、３つの基本的ドメインを含む：１）ＹＷＴＤ（チロシン、トリプトファン、スレオニン、アスパラギン酸）−型β−プロペラ領域、２）ＥＧＦ（上皮細胞増殖因子）様ドメイン、および３）ＬＤＬＲタイプＡ（ＬＡ）ドメイン。
【００８９】
ＬＲＰ６のＹＷＴＤ型β−プロペラ領域は、各々４３−５０アミノ酸残基の６つのＹＷＴＤリピートを含み、６枚羽根のβ−プロペラ構造を形成する。ＬＲＰ６の中には、各々の後に保存されたシステイン残基を有する約４０アミノ酸残基を含むＥＧＦ様ドメインが続き、次に３つのＬＡドメインが続く、４つのＹＷＴＤ型β−プロペラ領域が存在する。（Springerら (1998) J. MoI. Biol. 283:837-862; Jeonら (2001) Nat. Struct. Biol. 8:499-504）。β−プロペラ−ＥＧＦ−様ドメインは、細胞外リガンドと結合し得る。ＬＲＰ６の細胞外ドメインは、アミノ酸残基１９から１２４６によって規定され、それぞれβ−プロペラ領域１、２、３および４に対応する、アミノ酸残基４３−３２４、３５２−６２７、６５４−９２９および９５７−１２５０における４つのβ−プロペラドメインを含む。プロペラドメイン１−２は、アミノ酸１９−６２９を含み、プロペラドメイン３−４は、アミノ酸６３１−１２４６を含む。
【００９０】
ファージに基づくパニングを使用して、実施例に示されるとおり、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害または増強するＬＲＰ６抗体が同定されている。２つのクラスのＬＲＰ６アンタゴニスト性抗体が同定されている。１つのクラスの抗体はＷｎｔ１によって表されるＷｎｔタンパク質を特異的に阻害し、他方、第２のクラスはＷｎｔ３ａによって表されるＷｎｔタンパク質を特異的に阻害する。エピトープマッピング実験により、Ｗｎｔ１特異的ＬＲＰ６抗体およびＷｎｔ３ａ特異的ＬＲＰ６抗体がそれぞれＬＲＰ６の１番目のプロペラおよび３番目のプロペラに結合することが示され、Ｗｎｔ１およびＷｎｔ３ａタンパク質はＬＲＰ６の異なるプロペラに結合することが示唆される（２００８年１０月３１日出願の国際出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６４８２１；２０１１年５月６日出願のＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５７２００；および２０１１年５月６日出願のＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５７２０２（これらの内容を全体において出典明示により本明細書に包含させる）参照）。ＬＲＰ６のプロペラ３ドメインのさらなる特性化により、抗体との相互作用に関与するかかるドメイン中の残基が同定された。水素−重水素交換（ＨＤｘ）質量分析（ＭＳ）を使用してプロペラ３のＹＷＴＤ−ＥＧＦ領域内の抗体結合部位が同定され、該部位はプロペラ３ドメインのブレード(blade)１および６間の凹面に相当するものであった。
【００９１】
上記特定されたＬＲＰ６抗体またはその断片は、本発明のＬＲＰ６構築物を作製するために使用された。
【００９２】
ＬＲＰ６結合部分
２つのクラスの抗−ＬＲＰ６抗体は、以前に記載されている（２０１１年５月６日出願のＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５７２００および２０１１年５月６日出願のＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５７２０２（これらの内容を全体において出典明示により本明細書に包含させる））：１つのクラスは第１のプロペラ領域に結合し、Ｗｎｔ１クラス特異的シグナル伝達を阻害し、第２のクラスは第３のプロペラ領域に結合し、Ｗｎｔ３クラス特異的シグナル伝達を阻害する。
【００９３】
１．抗体
１つの態様において、ＬＲＰ６構築物がＬＲＰ６に結合し、Ｗｎｔシグナルの増強なしでＷｎｔシグナル伝達を阻害し、インビトロおよびインビボで増加した半減期を示すように、ＬＲＰ６構築物は、半減期延長分子に連結した少なくとも１つの抗体を使用することにより生産される。
【００９４】
抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥアイソタイプを含む。本明細書において使用される抗体またはそれらの抗体断片は、標的タンパク質、糖タンパク質または標的細胞の外部または内部に存在するエピトープに結合する１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）または結合ペプチドを含む。
【００９５】
表１：本発明のＬＲＰ６抗体の例
【表１−１】
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【００９６】
【表１−２】
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【００９７】
【表１−３】
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【００９８】
【表１−４】
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【００９９】
【表１−５】
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【０１００】
【表１−６】
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【０１０１】
【表１−７】
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【０１０２】
【表１−８】
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【０１０３】
【表１−９】
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【０１０４】
【表１−１０】
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【０１０５】
【表１−１１】
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【０１０６】
【表１−１２】
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【０１０７】
【表１−１３】
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【０１０８】
【表１−１４】
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【０１０９】
【表１−１５】
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【０１１０】
【表１−１６】
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【０１１１】
【表１−１７】
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【０１１２】
【表１−１８】
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【０１１３】
【表１−１９】
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【０１１４】
【表１−２０】
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【０１１５】
【表１−２１】
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【０１１６】
【表１−２２】
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【０１１７】
【表１−２３】
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【０１１８】
【表１−２４】
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【０１１９】
【表１−２５】
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【０１２０】
【表１−２６】
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【０１２１】
【表１−２７】
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【０１２２】
【表１−２８】
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【０１２３】
【表１−２９】
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【０１２４】
【表１−３０】
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【０１２５】
ＬＲＰ６タンパク質（例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＬＲＰ６）に特異的に結合する抗体は、上記表１に示され、配列番号：１４、３４、３６、４４、６０および６２のアミノ酸配列を有するＶＨドメイン；ならびに配列番号：１３、３３、３５、４３、５９および６１のアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む。ＬＲＰ６タンパク質（例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＬＲＰ６）に特異的に結合するさらなる抗体は、配列番号：８２、８９、１０６、１０８、１２８、１３０および１３８のアミノ酸配列を有するＶＨドメイン；ならびに配列番号：８１、９０、１０５、１０７、１２７および１２９のアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む。
【０１２６】
他の抗体は、変異しているが、ＣＤＲ領域において、表１に記載されている配列中に示されるＣＤＲ領域と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％同一性を有するアミノ酸を含む。いくつかの態様において、それは、表１に記載されている配列中に示されるＣＤＲ領域と比較した場合に、ＣＤＲ領域において、わずか１、２、３、４または５個のアミノ酸が変異しているが、元の抗体のエピトープに対するその特異性を依然として維持している変異体アミノ酸配列を含む。
【０１２７】
本発明はまた、ＬＲＰ６タンパク質（例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＬＲＰ６）に特異的に結合する抗体のＶＨ、ＶＬ、全長重鎖および全長軽鎖をコードする核酸配列を提供する。かかる核酸配列は、哺乳動物細胞における発現のために最適化することができる（例えば、β−プロペラ１抗体についてのＭＯＲ０８１６８、ＭＯＲ０８５４５およびＭＯＲ０６７０６ならびにβ−プロペラ３抗体についてのＭＯＲ０６４７５、ＭＯＲ０８１９３およびＭＯＲ０８４７３に関する表１）。かかる核酸配列は、さらに、ＬＲＰ６構築物を製造するために使用することができる。
【０１２８】
ＬＲＰ６抗体は、別個のＬＲＰ６  β−プロペラ領域に結合する。プロペラ１抗体は、β−プロペラ１ドメインに結合し、プロペラ１依存性のＷｎｔｓ、例えば、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７Ａ、Ｗｎｔ７Ｂ、Ｗｎｔ９、Ｗｎｔ１０Ａ、Ｗｎｔ１０Ｂを遮断する。プロペラ３抗体は、β−プロペラ３ドメインに結合し、プロペラ３依存性のＷｎｔｓ、例えば、Ｗｎｔ３ａおよびＷｎｔ３を遮断する。
【０１２９】
他の抗体は、アミノ酸またはアミノ酸をコードする核酸が変異されているが、表１に記載の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の同一性を有するものを含む。いくつかの実施形態では、表１に記載の配列に示されている可変領域と比較した場合、可変領域において１、２、３、４または５以下のアミノ酸が変異されているが、実質的に同一の治療活性を保持している変異アミノ酸配列を含む。
【０１３０】
これらの抗体の各々はＬＲＰ６に結合でき、ＶＨ、ＶＬ、全長軽鎖および全長重鎖配列（アミノ酸配列およびアミノ酸配列をコードする配列）を「組み合わせて適合させ」て、他のＬＲＰ６抗体を作成できる。かかる「組み合わせて適合させ」たＬＲＰ６抗体は、当該技術分野で知られている結合アッセイ（例えばＥＬＩＳＡ、および実施例の節に記載の他のアッセイ）を用いて試験してもよい。これらの組み合わせて適合させた抗体で、特定のＶＨ／ＶＬ対の対由来のＶＨ配列は、構造的に類似したＶＨ配列で置換されるべきである。同様に、特定の全長重鎖／全長軽鎖の対由来の全長重鎖配列は、構造的に類似した全長重鎖配列で置換されるべきである。同様に、特定のＶＨ／ＶＬの対由来のＶＬ配列は、構造的に類似したＶＬで置換されるべきである。同様に、特定の全長重鎖／全長軽鎖の対由来の全長軽鎖配列は、構造的に類似した全長軽鎖配列で置換されるべきである。したがって、一態様では、本発明は：配列番号１４、３４、３６、４４、６０および６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号１３、３３、３５、４３、５９および６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；配列番号８２、１０６、１０８、１２８、１３０および１３８からなる群から選択される重鎖；ならびに配列番号８１、９０、１０５、１０７、１２７、１２９および１３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有し；ＬＲＰ６（例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＬＲＰ６）に特異的に結合するものである、単離されたモノクローナル抗体またはそれらの断片を提供する。
【０１３１】
ＬＲＰ６のβプロペラ１ドメインに結合し、重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（またはそれらの組合せ）を含むＬＲＰ６抗体は、表１に記載されている。該抗体のＶＨ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号１、２１および４７に示される。該抗体のＶＨ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号２、２２および４８に示される。該抗体のＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号３、２３および４９に示される。該抗体のＶＬ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号４、２４および５０に示される。該抗体のＶＬ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号５、２５および５１に示される。該抗体のＶＬ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号６、２６および５２に示される。ＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔ系を用いて描写される（Kabatら (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242;Chothiaら (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917;Chothiaら (1989) Nature 342:877-883;およびAl-Lazikaniら (1997) J. Mol. Biol. 273, 927-948）。
【０１３２】
ＬＲＰ６のβプロペラ３ドメインに結合し、重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（またはそれらの組合せ）を含むＬＲＰ６抗体は、表１に記載されている。該抗体のＶＨ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号６９、９３および１１５に示される。該抗体のＶＨ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号７０、９４および１１６に示される。該抗体のＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号７１、９５および１１７に示される。該抗体のＶＬ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号７２、９６および１１８に示される。該抗体のＶＬ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号７３、９７および１１９に示される。該抗体のＶＬ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号７４、９８および１２０に示される。これらの各抗体がＬＲＰ６に結合でき、抗原結合特異性がＣＤＲ１、２および３領域により主として与えられることに鑑みると、ＶＨ  ＣＤＲ１、２および３配列ならびにＶＬ  ＣＤＲ１、２および３配列を「組み合わせて適合させ」てよい（すなわち、異なる抗体由来のＣＤＲを組み合わせて適合させることができる）が、各抗体は、他のＬＲＰ６結合分子を作成するために、ＶＨ  ＣＤＲ１、２および３ならびにＶＬ  ＣＤＲ１、２および３を含有しなければならない。かかる「組み合わせて適合させ」たＬＲＰ６抗体は、当該技術分野で知られている結合アッセイおよび実施例に記載のもの（例えばＥＬＩＳＡ）を用いて試験してもよい。ＶＨ  ＣＤＲ配列が組み合わせて適合されている場合、特定のＶＨ配列由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は、構造的に類似したＣＤＲ配列で置換されるべきである。同様に、ＶＬ  ＣＤＲ配列が組み合わせて適合されている場合、特定のＶＬ配列由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は、構造的に類似したＣＤＲ配列で置換されるべきである。一以上のＶＨおよび／またはＶＬ  ＣＤＲ領域配列を、本発明のモノクローナル抗体について本明細書に示されるＣＤＲ配列由来の構造的に類似した配列で置換することにより、新たなＶＨおよびＶＬ配列が構築できることを、当業者は容易に理解する。
【０１３３】
したがって、本発明は、配列番号１、２１および４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２、２２および４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３、２３および４９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号４、２４および５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号５、２５および５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；ならびに、配列番号６、２６および５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含み、ＬＲＰ６に結合する、単離されたＬＲＰ６  β−プロペラ１モノクローナル抗体またはそれらの断片を提供する。
【０１３４】
したがって、本発明は、配列番号６９、９３および１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号７０、９４および１１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号７１、９５および１１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号７２、９６および１１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号７３、９７および１１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；ならびに、配列番号７４、９８および１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含み；ＬＲＰ６に結合する、単離されたＬＲＰ６  β−プロペラ３モノクローナル抗体またはそれらの断片を提供する。
【０１３５】
特定の態様において、ＬＲＰ６に結合する抗体は、配列番号１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号５の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号６の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【０１３６】
特定の態様において、ＬＲＰ６に結合する抗体は、配列番号２１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号２３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号２４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２５の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号２６の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【０１３７】
特定の態様において、ＬＲＰ６に結合する抗体は、配列番号４７の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号４８の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号４９の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号５０の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号５１の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号５２の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【０１３８】
特定の態様において、ＬＲＰ６に結合する抗体は、配列番号６９の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号７０の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号７１の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号７２の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号７３の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号７４の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【０１３９】
特定の態様において、ＬＲＰ６に結合する抗体は、配列番号９３の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号９４の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号９５の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号９６の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号９７の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号９８の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【０１４０】
特定の態様において、ＬＲＰ６に結合する抗体は、配列番号１１５の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１１６の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１１７の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１１８の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１１９の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号１２０の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【０１４１】
特定の態様において、ＬＲＰ６に結合する抗体は、配列番号１４のＶＨおよび配列番号１３のＶＬを含む。特定の態様において、ＬＲＰ６に結合する抗体は、配列番号３４のＶＨおよび配列番号３３のＶＬを含む。特定の態様において、ＬＲＰ６に結合する抗体は、配列番号３５のＶＨおよび配列番号３６のＶＬを含む。特定の態様において、ＬＲＰ６に結合する抗体は、配列番号４３のＶＨおよび配列番号４４のＶＬを含む。特定の態様において、ＬＲＰ６に結合する抗体は、配列番号６０のＶＨおよび配列番号５９のＶＬを含む。特定の態様において、ＬＲＰ６に結合する抗体は、配列番号６２のＶＨおよび配列番号６１のＶＬを含む。特定の態様において、ＬＲＰ６に結合する抗体は、配列番号８２のＶＨおよび配列番号８１のＶＬを含む。特定の態様において、ＬＲＰ６に結合する抗体は、配列番号９０のＶＨおよび配列番号８９のＶＬを含む。特定の態様において、ＬＲＰ６に結合する抗体は、配列番号１０６のＶＨおよび配列番号１０５のＶＬを含む。特定の態様において、ＬＲＰ６に結合する抗体は、配列番号１０８のＶＨおよび配列番号１０７のＶＬを含む。特定の態様において、ＬＲＰ６に結合する抗体は、ＬＲＰ６に結合する抗体は、配列番号１２８のＶＨおよび配列番号１２７のＶＬを含む。特定の態様において、ＬＲＰ６に結合する抗体は、配列番号１３０のＶＨおよび配列番号１２９のＶＬを含む。特定の態様において、ＬＲＰ６に結合する抗体は、配列番号１３８のＶＨおよび配列番号１３７のＶＬを含む。
【０１４２】
１つの態様において、ＬＲＰ６抗体はアンタゴニスト抗体である。１つの態様において、ＬＲＰ６抗体はアゴニスト抗体である。１つの態様において、ＬＲＰ６に結合する抗体は表１に記載の抗体である。
【０１４３】
本明細書において使用されるとき、抗体の可変領域または全長鎖がヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子を用いる系から獲得されるとき、ヒト抗体は、特定の生殖細胞系列配列「の産物」であるかまたはそれ「に由来する」、重鎖もしくは軽鎖可変領域または全長重鎖もしくは軽鎖を含む。かかる系は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を担持するトランスジェニックマウスを、興味ある抗原で免疫するか、あるいは興味ある抗原でファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることを含む。ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列「の産物」であるかまたはそれ「に由来する」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖細胞系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較して、ヒト抗体配列と配列において最も近い（すなわち、最大の同一性％）ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列を選択することにより、それ自体同定できる。特定のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列「の産物」であるかまたはそれ「に由来する」ヒト抗体は、例えば、天然体細胞変異あるいは部位特異的変異の意図的導入のために、生殖細胞系列配列と比較した場合、アミノ酸の相違を含有してもよい。しかしながら、ＶＨまたはＶＬフレームワーク領域において、選択されたヒト抗体は、一般的に、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と、アミノ酸配列において少なくとも９０％同一であり、他の種の生殖細胞系列免疫グロブリンアミノ酸配列（例えば、マウス生殖細胞系列配列）と比較したとき、ヒトであるとヒト抗体を同定するアミノ酸残基を含有する。ある場合において、ヒト抗体は、生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と、アミノ酸配列において少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは少なくとも９５％、またはさらに少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であり得る。一般的に、組換えヒト抗体は、ＶＨまたはＶＬフレームワーク領域においてヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と、１０以下のアミノ酸の相違を示す。ある場合において、ヒト抗体は、生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と、５以下、または４、３、２あるいは１以下のアミノ酸の相違を示し得る。
【０１４４】
相同抗体(homologous antibody)
本発明の範囲内に含まれるものは、表１に記載の配列と相同なアミノ酸配列であって、ＬＲＰ６タンパク質（例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＬＲＰ６）に結合し、表１に記載の抗体の所望の機能的特性を保持している抗体またはそれらの断片である。
【０１４５】
例えば、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体（またはその断片）であって、該重鎖可変領域は配列番号１４、３４、３６、４４、６０および６２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含み；該軽鎖可変領域は配列番号１３、３３、３７、４３、５９および６１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含み；該抗体は、ＬＲＰ６（例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＬＲＰ６）のβ−プロペラ１に結合し、β−プロペラ１依存性Ｗｎｔタンパク質のシグナル伝達活性を阻害する抗体。該シグナル伝達活性は、Ｗｎｔレポーター遺伝子アッセイまたは本明細書に記載のＷｎｔ指向性(directed)シグナル伝達（ＬＲＰ６のリン酸化反応、β−カテニンの安定化および核移行ならびに細胞増殖／生存）の他の測定において測定することができる。具体的な例では、かかる抗体は、馴化培地を用いるまたはトランスフェクトされた細胞を用いる場合、Ｗｎｔ１アッセイにおいて１０ｎＭ未満のＥＣ５０値を有する。
【０１４６】
別の例は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体（またはその断片）であって、該重鎖可変領域は配列番号８２、８９、１０６、１０８、１２８、１３０および１３８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含み；該軽鎖可変領域は配列番号８１、９０、１０５、１０７、１２７、１２９および１３７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含み；ＬＲＰ６（例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＬＲＰ６）のβ−プロペラ３に結合し、β−プロペラ３依存性Ｗｎｔタンパク質のシグナル伝達活性を阻害する抗体である。該シグナル伝達活性は、Ｗｎｔレポーター遺伝子アッセイまたは本明細書に記載のＷｎｔ指向性シグナル伝達（ＬＲＰ６のリン酸化反応、β−カテニンの安定化および核移行ならびに細胞増殖／生存）の他の測定において測定することができる。具体的な例では、かかる抗体は、馴化培地を用いるまたはトランスフェクトされた細胞を用いる場合、Ｗｎｔ３ａアッセイにおいて１０ｎＭ未満のＥＣ５０値を有する。
【０１４７】
他の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬアミノ酸配列は、表１に記載の配列と５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一でありうる。他の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬアミノ酸配列は、１、２、３、４または５以下のアミノ酸位置でのアミノ酸置換を除き同一でありうる。表１に記載のプロペラ１抗体のＶＨおよびＶＬ領域と高い（すなわち、８０％以上の）同一性を有するＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体は、それぞれ配列番号１４、３４、６０、１３、３３および５９をコードする核酸分子の変異誘発（例えば部位特異的またはＰＣＲ介在変異誘発）により得ることができ、次いで本明細書に記載の機能的アッセイを用いて保持される機能について、コードされる変化された抗体を試験できる。
【０１４８】
表１に記載のプロペラ３抗体のＶＨおよびＶＬ領域と高い（すなわち、８０％以上の）同一性を有するＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体は、それぞれ配列番号８２、１０６、１２８、８１、１０５および１２７をコードする核酸分子の変異誘発（例えば部位特異的またはＰＣＲ介在変異誘発）により得ることができ、次いで本明細書に記載の機能的アッセイを用いて保持される機能について、コードされる変化された抗体を試験できる。
【０１４９】
他の実施形態では、重鎖および／または軽鎖ヌクレオチド配列の可変領域は、上記の配列と６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一でありうる。これらの相同抗体またはその断片は、ＬＲＰ６構築物を作製するために使用することができる。
【０１５０】
保存的修飾を有する抗体
保存的修飾を有する抗体も範囲内に含まれる。該抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を有し、これらのＣＤＲ配列の一以上は、特定されるアミノ酸配列またはその保存的修飾を有し、該保存的修飾を有する抗体またはその断片は、ＬＲＰ６に特異的に結合し、Ｗｎｔレポーター遺伝子アッセイまたは本明細書に記載のＷｎｔ指向性シグナル伝達（例えば、ＬＲＰ６のリン酸化反応、β−カテニンの安定化および核移行、細胞増殖／生存）の他の測定において測定できる、Ｗｎｔシグナル伝達経路を阻害することによりＬＲＰ６活性を阻害する。保存的修飾を有するこれらの抗体またはそれらの断片は、本発明のＬＲＰ６構築物を作製するために使用することができる。
【０１５１】
同じエピトープに結合する抗体
表１に記載のＬＲＰ６抗体と同じエピトープに結合する抗体も範囲内に含まれる。さらなる抗体はそれゆえ、本明細書に記載されているＬＲＰ結合アッセイにおいて他の抗体と交差競合する（例えば、統計的に有意に競合的に結合を阻害する）能力に基づいて同定できる。ＬＲＰ６タンパク質（例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＬＲＰ６）と本発明の抗体の結合を阻害する試験抗体の能力は、試験抗体がＬＲＰ６への結合について当該抗体と競合できることを示し；かかる抗体は、理論に縛られないが、それが競合する抗体とＬＲＰ６タンパク質上の同じまたは関連する（例えば、構造的に類似する、または空間的に近接した）エピトープに結合しうる。ある実施形態では、本発明の抗体とＬＲＰ６上の同じエピトープに結合する抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。かかるヒトモノクローナル抗体は、本明細書に記載の通りに調製し、単離できる。同じエピトープに結合するこれらの抗体またはそれらの断片は、本発明のＬＲＰ６構築物を作製するために使用することができる。
【０１５２】
２．抗体断片
１つの態様において、ＬＲＰ６構築物がＬＲＰ６に結合し、Ｗｎｔシグナルの増強なしでＷｎｔシグナル伝達を阻害し、インビトロおよびインビボで増加した半減期を示すように、ＬＲＰ６構築物は、半減期延長分子に連結した少なくとも１つの抗体を使用することにより生産される。抗体の抗体断片は、標的抗原に特異的に結合する能力を保持するべきである。抗体断片は、別々の可変重鎖、可変軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂｃおよびｓｃＦａｂを含む。断片は、無傷な免疫グロブリンの酵素的または化学的開裂により作製することができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片は、標準方法、例えば、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Pubs., N.Y. (1988)に記載されているものを使用して、ｐＨ３．０−３．５でペプシンでのタンパク質分解消化により、ＩｇＧ分子から得ることができる。Ｆａｂ断片は、限定切断(limited 還元)によりＦ（ａｂ’）２断片から、または還元剤の存在下でパパインでの消化により全抗体から得ることができる。断片はまた、組換えＤＮＡ技術により製造することができる。選択された断片をコードする核酸のセグメントは、制限酵素での完全長コード配列の消化により、またはデノボ合成により製造される。しばしば、断片は、ファージコート融合タンパク質の形態において発現される。この発現方法は、抗体のアフィニティー鋭敏化(sharpening)のために有利である。
【０１５３】
ｓｃＦｖ
「一本鎖抗体」（ｓｃＦｖ）は、ＶＬドメインおよびＶＨドメインが対合して一価分子を形成する、ＶＨドメインに連結したＶＬドメインを含む、単一のポリペプチド鎖からなる抗体断片である。一本鎖抗体は、当該技術分野で知られている方法により調製できる（例えば、Birdら (1988) Science 242:423-426およびHustonら (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883参照）。１つの態様において、ＬＲＰ６構築物は、少なくとも１つの半減期延長分子と連結することにより、ＬＲＰ６結合部分としてｓｃＦｖを使用して製造される。ｓｃＦｖを作製するために使用されるＶＨおよびＶＬドメインは、同じ抗体または異なる抗体由来であってよく、互いに連結され得る。ｓｃＦｖは、少なくとも１、２、３、４、５または６つのＣＤＲを含む。
【０１５４】
ｓｃＦｖおよび変異体ｓｃＦｖを作製するための方法は、２０１１年５月６日出願のＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５７２００；および２０１１年５月６日出願のＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５７２０２（これらの内容を出典明示によりそれら全体において本明細書に包含させる）に示される。ｓｃＦｖの熱安定性についての結果は、図３２−３５に記載されている。
【０１５５】
ｓｃＦｖは、多くの異なる方向において半減期延長分子に連結され得る。１つの態様において、少なくとも１つのｓｃＦｖは、半減期延長分子のＣ−末端に連結される。他の態様において、少なくとも１つのｓｃＦｖは、半減期延長分子のＮ−末端に連結される。他の態様において、少なくとも１つのｓｃＦｖは、半減期延長分子のＮ−末端およびＣ−末端の両方に連結される。
【０１５６】
リンカー
ＳｃＦｖ分子は、リンカーを使用してＶＨおよびＶＬ領域を互いに連結することにより生産することができる。ｓｃＦｖ分子は、最適化された長さおよび／またはアミノ酸組成でのｓｃＦｖリンカー（例えば、Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカー）を含む。リンカーの長さが、ｓｃＦｖの可変領域がどのようにして折りたたまれ、相互作用するかということに、大きな影響を及ぼすことが知られている。実際、短いリンカーが使用されるとき（例えば、５−１０アミノ酸；５−２０アミノ酸）、鎖内の折りたたみは妨げられ、鎖間の折りたたみは、機能的エピトープ結合部位を形成するために２つの可変領域を集めることを必要とする。リンカーの配向および大きさの例、例えば、Hollingerら 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448、米国特許出願公開第２００５／０１００５４３、２００５／０１７５６０６、２００７／００１４７９４号、およびＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０２０２５８およびＷＯ２００７／０２４７１５（出典明示により本明細書に包含させる）参照。
【０１５７】
ｓｃＦｖは、そのＶＬおよびＶＨ領域間のに、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５以上のアミノ酸残基のリンカー配列を含むことができる。リンカー配列は任意の天然に存在するアミノ酸から構成されてもよい。いくつかの実施形態では、アミノ酸グリシンおよびセリンはリンカー配列内のアミノ酸を含む。別の実施形態では、リンカー領域の配向はグリシンリピート（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎのセットを含み、ここにｎは１以上の正の整数である。
【０１５８】
一実施形態では、リンカーには（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３が挙げられるが、これらに限定されるものではない。別の実施形態では、より良好な溶解度のため、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー内にＧｌｕおよびＬｙｓ残基を散在させることができる。別の実施形態では、リンカーには（Ｇｌｙ２Ｓｅｒ）、（ＧｌｙＳｅｒ）または（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）の多重の繰り返しが挙げられる。別の実施形態では、リンカーには（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）＋（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）＋（ＧｌｙＳｅｒ）の組み合わせおよび倍数が挙げられる。別の実施形態では、ＳｅｒがＡｌａで交換され得る、例えば（Ｇｌｙ４Ａｌａ）または（Ｇｌｙ３Ａｌａ）。また別の実施形態では、リンカーはモチーフ（ＧｌｕＡｌａＡｌａＡｌａＬｙｓ）ｎを含み、ここにｎは１以上の正の整数である。
【０１５９】
ｓｃＦｖリンカーは、長さを変化させることができる。１つの態様において、ｓｃＦｖリンカーは、長さにおいて約５から約５０アミノ酸である。他の態様において、ｓｃＦｖリンカーは、長さにおいて約１０から約４０アミノ酸である。他の態様において、ｓｃＦｖリンカーは、長さにおいて約１５から約３０アミノ酸である。他の態様において、ｓｃＦｖリンカーは、長さにおいて約１５から約２０アミノ酸である。リンカー長におけるバリエーションは活性を維持または増強することができ、活性試験において優れた有効性を生じさせる。ｓｃＦｖリンカーは、当該技術分野で知られている技術を用いてポリペプチド配列内に導入することができる。例えば、ＰＣＲ変異誘発を使用することができる。修飾はＤＮＡ配列解析により確認できる。プラスミドＤＮＡを用いて、産生されるポリペプチドの安定な産生のために宿主細胞を形質転換させることができる。
【０１６０】
一実施形態では、ｓｃＦｖ分子は、ＶＨドメインとＶＬドメインの間に挿入された（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４のアミノ酸配列を有し、該ＶＨおよび該ＶＬドメインはジスルフィド結合により連結されるものである、ｓｃＦｖリンカーを含む。
【０１６１】
ｓｃＦｖ分子はさらに、ＶＬドメインにおけるアミノ酸をＶＨドメインにおけるアミノ酸と連結する、少なくとも１つのジスルフィド結合を含むことができる。ジスルフィド結合を提供するために、システイン残基が必要である。ジスルフィド結合は、ｓｃＦｖ分子に含まれ得る。ＶＨおよびＶＬドメインをコードする遺伝子の修飾は、当該技術分野で知られている技術、例えば、部位特異的変異誘発を用いて実施されうる。
【０１６２】
安定性および変異
ｓｃＦｖ分子の安定性は、従来の対照のｓｃＦｖ分子または全長抗体の生物物理学的特性（例えば、熱安定性）を参照して評価されうる。一実施形態では、ＬＲＰ６構築物は、記載されているアッセイにおいて、対照の結合分子（例えば、従来のｓｃＦｖ分子）よりも、セ氏約０．１、約０．２５、約０．５、約０．７５、約１、約１．２５、約１．５、約１．７５、約２、約２．５、約３、約３．５、約４、約４．５、約５、約５．５、約６、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、約９、約９．５、約１０度、約１１度、約１２度、約１３度、約１４度、または約１５度大きい熱安定性を有する。
【０１６３】
ｓｃＦｖの改善された熱安定性は、後に、ＬＲＰ６構築物全体に与える。従来の抗体に比べて少なくとも約２℃または３℃、ｓｃＦｖの熱安定性を改善することができる。一実施形態では、ｓｃＦｖは、従来の抗体に比べて１℃改善された熱安定性を有する。別の実施形態では、ｓｃＦｖは、従来の抗体に比べて２℃改善された熱安定性を有する。他の態様において、ｓｃＦｖは、従来の抗体に比べて４、５、６、７、８、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５℃改善された熱安定性を有する。例えば、本明細書に記載されているｓｃＦｖ分子とｓｃＦｖ分子の間、あるいは、ｓｃＦｖ分子とｓｃＦｖ  ＶＨおよびＶＬが由来した抗体のＦａｂ断片の間で、比較がなされ得る。熱安定性は当該技術分野で知られている方法を用いて測定できる。例えば、一実施形態では、Ｔｍが測定されうる。Ｔｍを測定するための方法およびタンパク質安定性を決定する他の方法は、以下に詳細に記載される。
【０１６４】
ｓｃＦｖにおける変異はｓｃＦｖの安定性を変化させ、ｓｃＦｖにおいて変異の無いＬＲＰ６構築物と比べて、ｓｃＦｖおよび変異ｓｃＦｖを含むＬＲＰ６構築物の全体の安定性を改善する。ｓｃＦｖへの変異は、実施例で示されるように生成できる。変異ｓｃＦｖの安定性は、実施例で示される通り、Ｔｍ、変性(denaturation)温度、凝集温度などの測定を用いて、変異無しのｓｃＦｖに対して比較される。変異ｓｃＦｖの結合能力はＥＬＩＳＡなどのアッセイを用いて決定できる。
【０１６５】
１つの態様において、ｓｃＦｖは、変異ｓｃＦｖがＬＲＰ６構築物に改善された安定性を与えるように、少なくとも１つの変異を含む。他の態様において、ｓｃＦｖは、変異ｓｃＦｖがＬＲＰ６構築物に安定性改善された安定性を与えるように、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の変異を含む。他の態様において、ｓｃＦｖは、変異ｓｃＦｖがＬＲＰ６構築物に安定性改善された安定性を与えるように、変異の組み合わせを含む。
【０１６６】
タンパク質安定性を評価するための方法
ＬＲＰ６構築物の安定性を評価するために、マルチドメインタンパク質の最小ドメインならびに全体のマルチドメインタンパク質の安定性を、以下に記載の方法および以下に記載のものを用いて予測した。かかる方法は、最も安定性の悪いドメインが最初に変性(unfold)するか、協調的に変性するマルチドメインユニット（すなわち、単一の変性転移を示すマルチドメインタンパク質）の全体の安定性閾値を制限する場合の、多重の熱変性転移の決定を可能にさせる。最も安定性の悪いドメインは多くのさらなる方法で同定されうる。変異誘発を実行して、どのドメインが全体の安定性を制限するのか精査(probe)できる。さらに、マルチドメインタンパク質のプロテアーゼ耐性を、最も安定性の悪いドメインが、ＤＳＣまたは他の分光法を介して、本来変性されるだろうと知られている条件下で実行することができる（Fontanaら., (1997)Fold. Des., 2:R17-26;Dimasiら.(2009)J. Mol. Biol. 393:672-692）。一旦、最も安定性の悪いドメインが同定されれば、このドメイン（またはその部分）をコードする配列を、方法での試験配列として用いることができる。
【０１６７】
ａ）熱安定性
組成物の熱安定性は、当該技術分野で知られている多数の非限定的な生物物理学的または生化学的技術を用いて解析できる。特定の実施形態では、熱安定性は分析分光測定により評価される。
【０１６８】
例示的な分析分光測定方法は示差操走査型熱量測定（ＤＳＣ）である。ＤＳＣは、ほとんどのタンパク質またはタンパク質ドメインの変性に伴って起こる熱吸収(heat absorbance)に感受性である熱量計を用いる（例えばSanchez-RuizらBiochemistry, 27:1648-52, 1988を参照）。タンパク質の熱安定性を決定するために、タンパク質のサンプルを熱量計に挿入し、ＦａｂまたはＦｖが変性するまで温度を上昇させる。該タンパク質が変性する温度がタンパク質全体の安定性を示す。
【０１６９】
別の例示的な分析分光測定方法は円二色性（ＣＤ）分光測定である。ＣＤ分光測定は、組成物の光学活性を、温度上昇の関数として測定する。円二色性（ＣＤ）分光測定は、構造的非対称により上昇する左旋偏光−対−右旋偏光の吸収の差を測定する。無秩序なまたは変性された構造が、秩序立ったまたは折りたたまれた構造のものとは非常に異なるＣＤスペクトルを生じる。ＣＤスペクトルは温度上昇の変性(denaturing)効果に対するタンパク質の感度を反映し、それゆえ、タンパク質の熱安定性を示す（van Mierlo and Steemsma, J. Biotechnol., 79(3):281-98, 2000を参照）。
【０１７０】
熱安定性を測定するための別の例示的な分析分光測定方法は蛍光発光分光測定である（上記van Mierlo and Steemsmaを参照）。熱安定性を測定するためのさらに別の例示的な分析分光測定方法は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光測定（例えば上記van Mierlo and Steemsmaを参照）。
【０１７１】
組成物の熱安定性は生化学的に測定できる。熱安定性を評価するための例示的な生化学的方法は、熱挑戦アッセイ(thermal challenge assay)である。「熱挑戦アッセイ」において、組成物は一定期間、様々な温度上昇に供される。例えば、一実施形態では、試験ｓｃＦｖ分子またはｓｃＦｖ分子を含む分子は、例えば１−１．５時間、様々な温度上昇に供される。次いで、タンパク質の活性が関連する生化学的アッセイにより評価される。例えば、もしタンパク質が結合タンパク質（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ含有ポリペプチド）であれば、該結合タンパク質の結合活性が、機能的あるいは定量的ＥＬＩＳＡにより決定されうる。
【０１７２】
かかるアッセイは、ハイ−スループット形式、ならびに大腸菌およびハイ−スループットスクリーニングを用いる、実施例で開示されるものにおいて実行されうる。ｓｃＦｖバリアントのライブラリーは当該技術分野で知られている方法を用いて構築されうる。ｓｃＦｖ発現は誘導することができ、ｓｃＦｖは熱挑戦に付すことができる。挑戦された試験サンプルは、結合に関してアッセイすることができ、安定であるｓｃＦｖはスケールアップし、さらに特徴付けすることができる。
【０１７３】
熱安定性は、上記技術のいずれか（例えば分光分析技術）を用いて、組成物の融解温度（Ｔｍ）を測定することにより評価される。融解温度は、組成物の分子の５０％が折りたたまれた状態にある、熱転移曲線の中点における温度である（例えば、Dimasiら (2009)J. Mol Biol. 393:672-692を参照）。一実施形態では、ｓｃＦｖのためのＴｍ値は、約４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、９９℃、１００℃である。一実施形態では、ＩｇＧのためのＴｍ値は、約４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、９９℃、１００℃である。一実施形態では、多価抗体のためのＴｍ値は、約４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、９９℃、１００℃である。
【０１７４】
熱安定性はまた、分析熱量測定技術（例えば、ＤＳＣ）を用いて、組成物の比熱または熱容量（Ｃｐ）を測定することにより評価される。組成物の比熱は、１ｍｏｌの水の温度を１℃上昇させるために必要な（例えば、ｋｃａｌ／ｍｏｌで表した）エネルギーである。大きなＣｐは変性したまたは不活性なタンパク質組成物の顕著な特徴である。組成物の熱容量における変化（ΔＣｐ）は、その熱転移の前および後に組成物の比熱を決定することにより測定される。熱安定性はまた、変性のギブス自由エネルギー（ΔＧ）、変性のエンタルピー（ΔＨ）、または変性のエントロピー（ΔＳ）を含めた熱力学安定性の他のパラメーターを測定または決定することにより評価することができる。前記生化学的アッセイ（例えば熱挑戦アッセイ）の一以上を用いて、組成物の５０％がその活性（例えば結合活性）を保持する温度（すなわちＴｃ値）を決定する。
【０１７５】
さらに、ｓｃＦｖへの変異は、未変異のｓｃＦｖに比べてｓｃＦｖの熱安定性を変化させる。変異ｓｃＦｖがＬＲＰ６構築物に組み込まれる場合、該変異ｓｃＦｖはＬＲＰ６構築物全体に熱安定性を授ける。一実施形態では、ｓｃＦｖは、該ｓｃＦｖに熱安定性を授ける単一変異(single mutation)を含む。別の実施形態では、ｓｃＦｖは、該ｓｃＦｖに熱安定性を授ける多重変異(multiple mutations)を含む。一実施形態では、ｓｃＦｖにける多重変異は該ｓｃＦｖの熱安定性に相加効果がある。
【０１７６】
ｂ）％凝集
組成物の安定性は、その凝集傾向を測定することによって決定される。凝集は、非限定的な生化学的あるいは生物物理学的技術により測定できる。例えば、組成物の凝集は、クロマトグラフィー、例えばサイズ−排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて評価することができる。ＳＥＣはサイズに基づいて分子を分離する。カラムには、イオンおよび小さな分子をその内部に受け入れるが、大きなものは受け入れないポリマーゲルの半個体ビーズが充填される。タンパク質組成物がカラムの頂部にアプライされると、コンパクトな折りたたまれたタンパク質（すなわち非凝集タンパク質）は、大きなタンパク質凝集体が利用できるよりも大きな容量の溶媒を通って分布する。その結果、大きな凝集体はカラムを通ってより迅速に移動し、このようにして、混合物はその成分に分離でき、または分画することができる。各画分はそれがゲルから溶出されるにつれ、（例えば、光散乱によって）別々に定量することができる。したがって、組成物の％凝集は、画分の濃度を、ゲルにアプライされたタンパク質の全濃度と比較することにより、決定することができる。安定な組成物は実質的に単一の画分としてカラムから溶出され、溶出プロフィールまたはクロマトグラムにおいては実質的に単一のピークとして出現する。
【０１７７】
ｃ）結合親和性
組成物の安定性は、その標的結合親和性を決定することにより評価することができる。結合親和性を決定するための種々の方法が当該技術分野で知られている。結合親和性を決定するための例示的な方法は、表面プラズモン共鳴を使用する。表面プラズモン共鳴は、例えばＢＩＡｃｏｒｅシステム(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden and Piscataway,N.J.)を用いる、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出による、リアルタイムの生物特異的相互作用の解析を可能とする、光学的現象である。さらなる説明に関しては、Jonsson,Uら (1993)Ann. Biol. Clin. 51:19-26;Jonsson,U., i(1991)Biotechniques 11:620-627;Johnsson,Bら (1995)J. Mol. Recognit. 8:125-131;およびJohnnson,Bら (1991)Anal. Biochem. 198:268-277を参照のこと。
【０１７８】
他の抗体断片
他の抗体断片、例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂもまた、ＬＲＰ６構築物を産生するために使用することができる。一本鎖抗体はまた、ＬＲＰ６構築物、例えば２つの鎖からなる「ｄｉｓｂｕｄ」において使用することができ、それぞれの鎖は、短いペプチドリンカーにより結合される同一ポリペプチド鎖上で軽鎖可変領域に結合された重鎖可変領域を含み、同一鎖上の２つの領域はお互いに対合しないが、他方の鎖の相補ドメインと二重特異性分子を形成する。ダイアボディの調製方法は、当該技術分野で知られている（例えば、Holligerら (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448、およびPoljakら (1994) Structure 2:1121-1123参照）。
【０１７９】
ドメイン抗体（ｄＡｂ）は、ＬＲＰ６構築物において使用することができ、抗体の重鎖あるいは軽鎖のいずれかの可変領域に対応する、抗体の小さい機能的結合断片である。ドメイン抗体は、細菌、酵母および哺乳動物細胞系において良好に発現する。ドメイン抗体およびそれらの産生方法のさらなる詳細は、当該技術分野で知られている（例えば、米国特許第６，２９１，１５８；６，５８２，９１５；６，５９３，０８１；６，１７２，１９７；６，６９６，２４５号；欧州特許０３６８６８４＆０６１６６４０；ＷＯ０５／０３５５７２、ＷＯ０４／１０１７９０、ＷＯ０４／０８１０２６、ＷＯ０４／０５８８２１、ＷＯ０４／００３０１９およびＷＯ０３／００２６０９参照）。ナノボディは抗体の重鎖に由来する。
【０１８０】
ナノボディは、一般的に、単一の可変ドメインおよび２つの定常ドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）を含み、元の抗体の抗原結合能を保持する。ナノボディは当該技術分野で知られている方法により調製できる（例えば、米国特許第６，７６５，０８７号、米国特許第６，８３８，２５４号、ＷＯ０６／０７９３７２参照）。ユニボディは、ＩｇＧ４抗体の１つの軽鎖および１つの重鎖からなる。ユニボディはＩｇＧ４抗体のヒンジ領域の除去により作製され得る。ユニボディおよびそれらの調製方法のさらなる詳細は、ＷＯ２００７／０５９７８２において見いだすことができる。
【０１８１】
半減期延長分子
本発明は、ＬＲＰ６構築物がＬＲＰ６に結合し、Ｗｎｔシグナルの増強なしでＷｎｔシグナル伝達を阻害し、インビトロおよびインビボで増加した半減期を示すように、少なくとも１つのＬＲＰ６結合部分および少なくとも１つの半減期延長分子を含むＬＲＰ６複合体を提供する。半減期延長分子は、Ｗｎｔシグナル経路を阻害することにおいてＬＲＰ６構築物の治療効果を延長する。それ自体、ＬＲＰ６構築物は、望ましい特性、例えば、少なくとも５時間、少なくとも１０時間、少なくとも１５時間、少なくとも２０時間、少なくとも２５時間、少なくとも３０時間、少なくとも３５時間、少なくとも４０時間またはそれ以上のインビボ半減期の増加を有する。組換えタンパク質の血清半減期を改善するために、いくつかのアプローチを取ることができる。例えば、ペグ化、グリコシル化(glysosylation)、抗体Ｆｃドメイン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミン結合リガンドおよび糖質障壁との融合；ＩｇＧ、ＦｃＲｎ、Ｆｃおよびトランスフェリンなどの血清タンパク質（例えば、ＨＳＡ）と結合するタンパク質との遺伝的融合；ナノボディ、Ｆａｂ、ＤＡＲＰｉｎ、アビマー、アフィボディおよびアンチカリンなどの血清タンパク質に結合する他のＬＲＰ６結合部分とのカップリング（遺伝的または化学的）；またはナノ担体、持続放出製剤または医薬デバイスへの導入による。
【０１８２】
（ｉ）ヒト血清アルブミン
１つの態様において、本発明は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に連結した少なくとも２つのＬＲＰ６結合部分を含むＬＲＰ６構築物を提供する。成熟形態において５８５個のアミノ酸のタンパク質であるＨＳＡは、血清の浸透圧の有意な割合の原因であり、内因性および外因性リガンドの担体としても機能する。担体分子としてのアルブミンの役割およびその不活性性質は、インビボでポリペプチドの担体およびトランスポーターとしての使用のために望ましい特性である。種々のタンパク質のための担体としてのアルブミン融合タンパク質の成分としてのアルブミンの使用は、ＷＯ９３／１５１９９、ＷＯ９３／１５２００およびＥＰ  ４１３  ６２２に提案されている。ポリペプチドへの融合のためのＨＳＡのＮ−末端断片の使用もまた、提案されている（ＥＰ  ３９９  ６６６）。したがって、遺伝的または化学的融合または複合体化により、アルブミンに対する抗体またはそれらの断片は、安定化する、または保存可能期間を延長する、および／または溶液中で、インビトロでおよび／またはインビボで長期間、分子の活性を保持することができる。
【０１８３】
別のタンパク質へのアルブミンの融合は、ＨＳＡをコードするＤＮＡまたはそれらの断片がタンパク質をコードするＤＮＡに連結されるように、遺伝子操作により成し遂げられ得る。次に、適当な宿主は、融合ポリペプチドを発現するように適当なプラスミド上に配列されるように、融合ヌクレオチド配列で形質転換またはでトランスフェクトされる。発現は、例えば、原核生物または真核細胞からインビトロ、または、例えば、トランスジェニック生物からインビボでもたらされ得る。例えば、出典明示により本明細書に包含させるＷＯ２００１０７７１３７およびＷＯ２００３０６００７において見出すことができる。特定の態様において、融合タンパク質の発現は、哺乳動物細胞系、例えば、ＣＨＯ細胞系において行われる。
【０１８４】
１つの態様において、ＨＳＡは、配列番号：２０９を有する野生型ＨＳＡである。
ｄａｈｋｓｅｖａｈｒｆｋｄｌｇｅｅｎｆｋａｌｖｌｉａｆａｑｙｌｑｑｃｐｆｅｄｈｖｋｌｖｎｅｖｔｅｆａｋｔｃｖａｄｅｓａｅｎｃｄｋｓｌｈｔｌｆｇｄｋｌｃｔｖａｔｌｒｅｔｙｇｅｍａｄｃｃａｋｑｅｐｅｒｎｅｃｆｌｑｈｋｄｄｎｐｎｌｐｒｌｖｒｐｅｖｄｖｍｃｔａｆｈｄｎｅｅｔｆｌｋｋｙｌｙｅｉａｒｒｈｐｙｆｙａｐｅｌｌｆｆａｋｒｙｋａａｆｔｅｃｃｑａａｄｋａａｃｌｌｐｋｌｄｅｌｒｄｅｇｋａｓｓａｋｑｒｌｋｃａｓｌｑｋｆｇｅｒａｆｋａｗａｖａｒｌｓｑｒｆｐｋａｅｆａｅｖｓｋｌｖｔｄｌｔｋｖｈｔｅｃｃｈｇｄｌｌｅｃａｄｄｒａｄｌａｋｙｉｃｅｎｑｄｓｉｓｓｋｌｋｅｃｃｅｋｐｌｌｅｋｓｈｃｉａｅｖｅｎｄｅｍｐａｄｌｐｓｌａａｄｆｖｅｓｋｄｖｃｋｎｙａｅａｋｄｖｆｌｇｍｆｌｙｅｙａｒｒｈｐｄｙｓｖｖｌｌｌｒｌａｋｔｙｅｔｔｌｅｋｃｃａａａｄｐｈｅｃｙａｋｖｆｄｅｆｋｐｌｖｅｅｐｑｎｌｉｋｑｎｃｅｌｆｅｑｌｇｅｙｋｆｑｎａｌｌｖｒｙｔｋｋｖｐｑｖｓｔｐｔｌｖｅｖｓｒｎｌｇｋｖｇｓｋｃｃｋｈｐｅａｋｒｍｐｃａｅｄｙｌｓｖｖｌｎｑｌｃｖｌｈｅｋｔｐｖｓｄｒｖｔｋｃｃｔｅｓｌｖｎｒｒｐｃｆｓａｌｅｖｄｅｔｙｖｐｋｅｆｎａｅｔｆｔｆｈａｄｉｃｔｌｓｅｋｅｒｑｉｋｋｑｔａｌｖｅｌｖｋｈｋｐｋａｔｋｅｑｌｋａｖｍｄｄｆａａｆｖｅｋｃｃｋａｄｄｋｅｔｃｆａｅｅｇｋｋｌｖａａｓｑａａｌｇｌ（配列番号：２０９）。
【０１８５】
他の態様において、ＨＳＡは、配列番号：２１０を有する変異体ＨＳＡである。
Ｄａｈｋｓｅｖａｈｒｆｋｄｌｇｅｅｎｆｋａｌｖｌｉａｆａｑｙｌｑｑｓｐｆｅｄｈｖｋｌｖｎｅｖｔｅｆａｋｔｃｖａｄｅｓａｅｎｃｄｋｓｌｈｔｌｆｇｄｋｌｃｔｖａｔｌｒｅｔｙｇｅｍａｄｃｃａｋｑｅｐｅｒｎｅｃｆｌｑｈｋｄｄｎｐｎｌｐｒｌｖｒｐｅｖｄｖｍｃｔａｆｈｄｎｅｅｔｆｌｋｋｙｌｙｅｉａｒｒｈｐｙｆｙａｐｅｌｌｆｆａｋｒｙｋａａｆｔｅｃｃｑａａｄｋａａｃｌｌｐｋｌｄｅｌｒｄｅｇｋａｓｓａｋｑｒｌｋｃａｓｌｑｋｆｇｅｒａｆｋａｗａｖａｒｌｓｑｒｆｐｋａｅｆａｅｖｓｋｌｖｔｄｌｔｋｖｈｔｅｃｃｈｇｄｌｌｅｃａｄｄｒａｄｌａｋｙｉｃｅｎｑｄｓｉｓｓｋｌｋｅｃｃｅｋｐｌｌｅｋｓｈｃｉａｅｖｅｎｄｅｍｐａｄｌｐｓｌａａｄｆｖｅｓｋｄｖｃｋｎｙａｅａｋｄｖｆｌｇｍｆｌｙｅｙａｒｒｈｐｄｙｓｖｖｌｌｌｒｌａｋｔｙｅｔｔｌｅｋｃｃａａａｄｐｈｅｃｙａｋｖｆｄｅｆｋｐｌｖｅｅｐｑｎｌｉｋｑｎｃｅｌｆｅｑｌｇｅｙｋｆｑｎａｌｌｖｒｙｔｋｋｖｐｑｖｓｔｐｔｌｖｅｖｓｒｎｌｇｋｖｇｓｋｃｃｋｈｐｅａｋｒｍｐｃａｅｄｙｌｓｖｖｌｎｑｌｃｖｌｈｅｋｔｐｖｓｄｒｖｔｋｃｃｔｅｓｌｖｎｒｒｐｃｆｓａｌｅｖｄｅｔｙｖｐｋｅｆｑａｅｔｆｔｆｈａｄｉｃｔｌｓｅｋｅｒｑｉｋｋｑｔａｌｖｅｌｖｋｈｋｐｋａｔｋｅｑｌｋａｖｍｄｄｆａａｆｖｅｋｃｃｋａｄｄｋｅｔｃｆａｅｅｇｋｋｌｖａａｓｑａａｌｇｌ（配列番号：２１０）。
【０１８６】
変異ＨＳＡは、野生型ＨＳＡと比較して、２つのアミノ酸置換（すなわち、配列番号：２１０に記載されている「Ｃ３４Ｓ」および「Ｎ５０３Ｑ」置換）を有する。該変異ＨＳＡは、２つのアミノ酸置換（すなわち、アミノ酸残基３４でのシステインに対してセリン（「Ｃ３４Ｓ」）およびアミノ酸残基５０３でのアスパラギンに対してグルタミン（「Ｎ５０３Ｑ」））を含む。位置３４のシステイン残基（すなわち、Ｃ３４）は、システイン以外の任意のアミノ酸残基（例えば、セリン、スレオニンまたはアラニン）に変異させることができる。同様に、位置５０３のアスパラギン残基（すなわち、Ｎ５０３）は、アスパラギン以外の任意のアミノ酸残基（例えば、グルタミン、セリン、ヒスチジンまたはアラニン）に変異させることができる。具体的には、アミノ酸残基３４でのシステインに対するセリンの置換は、ＨＳＡの酸化およびタンパク質不均一性の減少をもたらす。野生型ＨＳＡにおいて、アミノ酸残基５０３のアスパラギンは、脱アミノ化に感受性であり、恐らく、薬理学半減期の減少をもたらす。アミノ酸残基５０３でのアスパラギンに対するグルタミンの置換は、哺乳動物（例えば、ヒト）またはそれらの細胞、組織または臓器に投与されるとき、ＨＳＡ、および対応して、ＨＳＡを含むＬＲＰ６構築物の薬理学半減期の増加をもたらすことができる。
【０１８７】
本発明は、切断された野生型ＨＳＡポリペプチドを使用して形成され、連結リンカー有りまたは無しでＬＲＰ６結合部分に連結されるＬＲＰ６複合体をさらに提供する。完全長の野生型ＨＳＡアミノ酸配列（すなわち、配列番号：２０９）の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、５０、１００、２００以上のアミノ酸を欠いている野生型ＨＳＡポリペプチドは、本明細書に記載されている任意のＬＲＰ６結合部分に連結させることができる。切断は、ＨＳＡの１または両方の末端で起こり得、または、内部残基の欠失を含み得る。２つ以上のアミノ酸残基の切断は、直線（すなわち、連続）である必要はない。野生型ＨＳＡの例は、１以上の連結リンカーまたはＬＲＰ６結合部分と共に、１以上のＨＳＡのドメインＩ（「ＤＩ」、配列番号：２０９の残基１−１９７）、ＨＳＡのドメインＩＩ（「ＤＩＩ」、配列番号：２０９の残基１８９−３８５）、またはＨＳＡのドメインＩＩＩ（「ＤＩＩＩ」残基、配列番号：２０９の３８１−５８５）、またはそれらの組合せ、例えば、ＨＳＡのドメインＩおよびＩＩ、ＩおよびＩＩＩならびにＩＩおよびＩＩＩを有するものを含む。ＬＲＰ６複合体の血清クリアランス速度は、切断された野生型ＨＳＡを含む複合体を試験することにより最適化することができる。
【０１８８】
半減期延長分子（例えば、ＨＳＡ）は、ＨＳＡにおけるアミノ酸残基の部位特異的化学修飾により必ずしも修飾されない。ＨＳＡの正しく折り畳まれた三次構造は、タンパク質の外部面上に特定のアミノ酸残基を提示する。化学的反応性のアミノ酸残基（例えば、システイン）は、他の薬剤の部位特異的結合を可能にするように、これらの表面露出残基に対して置換することができる。
【０１８９】
あるいは、または加えて、半減期延長分子（例えば、ＨＳＡ）は、所望により、これらのアミノ酸残基のグリコシル化を変化するために、ＨＳＡ配列からのアスパラギン、セリンまたはスレオニン残基の付加または除去により修飾され得る。ＨＳＡに加えられるグリコシル化部位は、表面露出され得る。ＨＳＡに導入されるグリコシルまたは他の炭水化物部分は、診断、治療または細胞毒性剤と直接結合することができる。
【０１９０】
半減期延長分子（例えば、ＨＳＡ）の表面露出されたアミノ酸残基は、診断、治療または細胞毒性剤の化学的結合を可能にするように、システイン残基で置換され得る。ＨＳＡの表面上に露出されたシステイン残基は（天然三次構造へ折り畳まれるとき）、チオール反応基、例えば、マレイミドまたはハロアセチルへの診断、治療または細胞毒性剤の特異的結合を可能にする。マレイミド基に対するシステイン残基のチオール機能性の求核反応性は、タンパク質における他の何らかのアミノ酸機能性、例えば、リジン残基のアミノ基またはＮ−末端アミノ基と比較して約１０００倍高い。ヨードアセチルおよびマレイミド試薬におけるチオール特異的機能性は、アミン基と反応し得るが、より高いｐＨ（＞９．０）およびより長い反応時間を必要とする（Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London）。タンパク質における遊離チオールの量は、標準Ｅｌｌｍａｎアッセイを使用して概算され得る。場合によっては、試薬、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはセレノールでのジスルフィド結合の還元は（Singhら Anal. Biochem. 304:147-156 (2002)）、反応性遊離チオールを産生するために必要である。
【０１９１】
システイン置換のための部位は、ＨＳＡの表面接近性の分析により同定することができる。表面接近性は、溶媒分子、例えば、水により接触することができる表面積（例えば、オングストローム平方）として表すことができる。水の占有空間は、１．４オングストローム半径を有する球形に近い。タンパク質のそれぞれのアミノ酸の表面接近性を計算するためにソフトウェアは、自由に利用できるか、またはライセンスされる。例えば、座標を得られる既知のＸ線結晶学でのタンパク質のそれぞれのアミノ酸の表面接近性を計算するためにアルゴリズムを使用する結晶学プログラムのＣＣＰ４  Ｓｕｉｔｅ（「The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography」 Acta. Cryst. D50:760-763 (1994); www.ccp4.ac.uk/dist/html/INDEX.html）。溶媒接近性はまた、Swiss Institute of BioinformaticsからダウンロードされるフリーのソフトウェアDeepView Swiss PDB Viewerを使用して評価され得る。表面露出された部位でのシステインの置換は、診断または治療剤に連結したチオール反応基への反応性システインの連結を可能にする。グリコシル化
【０１９２】
加えて、変化した血清クリアランス速度は、半減期延長分子（例えば、ＨＳＡ）へグリコシル化部位を操作することによりなし遂げることができる。１つの態様において、ＨＳＡをグリコシル化することができる。ポリペプチドのグリコシル化は、一般的に、Ｎ−連結またはＯ−連結のいずれかである。Ｎ−連結は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を示す。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（式中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸を示す）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のために認識配列である。したがって、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、可能性のあるグリコシル化部位を与える。Ｏ−連結グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンへの糖、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースの１つの結合を示すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンもまた使用され得る。
【０１９３】
ＨＳＡへのグリコシル化部位の付加または欠失は、好都合には、（Ｎ−連結グリコシル化部位について）上記トリペプチド配列の１つ以上を作るように、アミノ酸配列を改変することにより達成される。該改変はまた、（Ｏ−連結グリコシル化部位について）ＨＳＡの配列に対する１つ以上のセリンまたはスレオニン残基の付加、欠失または置換により作られ得る。ＨＳＡにおける得られる炭水化物構造はまた、細胞毒性、免疫調節または細胞増殖抑制剤の部位特異的結合のために使用することができる。
【０１９４】
半減期延長分子、例えば、ＨＳＡは、ＬＲＰ６結合部分、例えば、ｓｃＦｖと直接的または間接的に連結することにより、ＬＲＰ６複合体に組み込むことができる。「直接」的連結なる用語は、ＬＲＰ６結合部分と半減期延長分子との間にギャップがないように、半減期延長分子に即座に結合されているＬＲＰ６結合部分を示す。「間接」的連結なる用語は、半減期延長分子に即座に連結されず、むしろＬＲＰ６結合部分と半減期延長分子との間にアミノ酸「連結リンカー」を介して結合されているＬＲＰ６結合部分を示す。アミノ連結リンカーの例は、限定はしないが、グリシン、アラニン、セリン、グルタミン、ロイシンまたはバリン残基リンカーからなる、またはこれらの残基の任意の組合せを含むリンカーを含む。これらのアミノ酸連結リンカーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のアミノ酸長であってよく、ＬＲＰ６結合部分と半減期延長分子との間にフレキシブルな(flexible)つなぐ鎖(tether)を提供する。アミノ酸連結リンカーは、半減期延長分子、例えば、ＨＳＡまたは変異ＨＳＡのＣ−またはＮ−末端に、結合（例えば、共有的に（例えば、ペプチド結合）、イオン的に、または疎水的に結合、または、高アフィニティータンパク質−タンパク質結合相互作用（例えば、ビオチンおよびアビジン）を介して）することができる。
【０１９５】
（ｉｉ）Ｆｃ融合物
本発明は、少なくとも１つのＬＲＰ６結合部分およびＦｃ分子である少なくとも１つの半減期延長分子を含むＬＲＰ６構築物を提供する。天然抗体分子は、２つの同一の重鎖および２つの同一の軽鎖からなる。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。抗体のパパイン消化は、２つの断片、ＦａｂおよびＦｃを生産する。Ｆｃ断片は、ＣＨ２、ＣＨ３およびヒンジ領域の部分からなる。Ｆｃ領域は、クラスＩｇＧの抗体の血清半減期を維持するために重要であることが認識されている（Ward and Ghetie, Ther. Immunol. 2:77-94 (1995)）。試験によって、ＩｇＧ抗体の血清半減期が、新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）へのＦｃの結合によって介在されることが見出されている。ＦｃＲｎは、膜貫通α鎖および可溶性β鎖（β２−マイクログロブリン）からなるヘテロダイマーである。分子生物学技術の進歩が、複数の機能性ドメインを有する新規キメラポリペプチドの調製を可能にした。最も一般的なこのようなキメラポリペプチドは、免疫グロブリン（Ｉｇ）融合タンパク質である。これらのタンパク質は、非関連タンパク質またはタンパク質断片に融合した抗体、一般的にマウスまたはヒト抗体のＦｃ領域からなる。
【０１９６】
本明細書において使用される「Ｆｃ」なる用語は、抗体のＣＨ３、ＣＨ２および定常ドメインのヒンジ領域の少なくとも一部を含むポリペプチドを示す。所望により、Ｆｃ領域は、いくつかの抗体クラスに存在するＣＨ４ドメインを含んでもよい。Ｆｃは、抗体の定常ドメインのヒンジ領域全体を含むものであってもよい。１つの態様において、本発明は、抗体のＦｃおよびＣＨ１領域を含む。１つの態様において、本発明は、抗体のＦｃおよびＣＨ３領域を含む。他の態様において、本発明は、抗体の定常ドメインのＦｃ、ＣＨ１領域およびＣカッパ／ラムダ領域を含む。典型的な修飾は、１以上のドメインにおける１つ以上のアミノ酸の付加、欠失または置換を含む。かかる変更は、エフェクター機能、半減期等を最適化するために含めることができる。
【０１９７】
半減期延長分子としてＦｃを含むＬＲＰ６複合体は、標準組換えＤＮＡ技術により、またはタンパク質合成技術により、例えば、ペプチドシンセサイザーの使用により生産され得る。例えば、Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸分子は、自動ＤＮＡシンセサイザーを含む慣用の技術により合成することができる。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、２つの連続遺伝子断片間に相補的オーバーハングを引き起こすアンカープライマーを使用して行い、次に、キメラ遺伝子配列を産生するようにアニールおよび増幅される（例えば、“Current Protocols in Molecular Biology”, Ausubelら eds., John Wiley & Sons, (1992)参照）。さらに、生物活性分子をコードする核酸は、生物活性分子が定常ドメインまたはその断片にインフレームで連結されるように、Ｆｃドメインまたはその断片を含む発現ベクターにクローニングすることができる。
【０１９８】
抗体の定常領域へのポリペプチドを融合または結合するために方法は、実施例の部に示されており、当分野で知られている。例えば、米国特許第５，３３６，６０３、５，６２２，９２９、５，３５９，０４６、５，３４９，０５３、５，４４７，８５１、５，７２３，１２５、５，７８３，１８１、５，９０８，６２６、５，８４４，０９５および５，１１２，９４６号；欧州特許公報、ＥＰ  ０  ３０７  ４３４；ＥＰ  ０  ３６７  １６６；ＥＰ  ０  ３９４  ８２７；ＰＣＴ公開ＷＯ  ９１／０６５７０、ＷＯ  ９６／０４３８８、ＷＯ  ９６／２２０２４、ＷＯ  ９７／３４６３１およびＷＯ  ９９／０４８１３；Ashkenaziら Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539 (1991); Trauneckerら Nature 331:84-86 (1988); Zhengら J. Immunol. 154:5590-5600 (1995);およびVilら Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341 (1992)、ＷＯ  ９８／２３２８９；ＷＯ  ９７／３４６３１；米国特許第６，２７７，３７５号；ＷＯ  ９３／１５１９９、ＷＯ  ９３／１５２００；ＷＯ  ０１／７７１３７；およびＥＰ  ４１３，６２２（これらそれぞれをそれら全体において出典明示により本明細書に包含させる）参照。半減期延長分子として修飾されたＦｃを含むＬＲＰ６構築物もまた、本発明の範囲内である
【０１９９】
（ｉｉｉ）ペグ化
他の態様において、ＬＲＰ６構築物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である少なくとも１つの半減期延長分子を含む。インビボでのＬＲＰ６複合体の血清循環を延長するため、連結リンカー有りまたは無しで、高分子量ＰＥＧなどの不活性ポリマー分子をＬＲＰ６結合部分に、ＬＲＰ６結合部分のＮもしくはＣ末端またはリジン残基のエプシロン−アミノ基とＰＥＧの部位特異的コンジュゲーションにより結合することができる。ペグ化するため、ＬＲＰ６結合部分は、一般的に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えば、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体と、１以上のＰＥＧ基がＬＲＰ６結合部分に結合するような条件下で反応させる。ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（または同様の反応性水溶性ポリマー）を用いたアシル化反応またはアルキル化反応により実施できる。本明細書において使用される「ポリエチレングリコール」なる用語は、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−もしくはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドなどの、他のタンパク質を誘導体化するために用いられているあらゆる形態のＰＥＧを含むことを意図する。生物学的活性の最小限の損失をもたらす直鎖または分枝鎖ポリマー誘導体化を、使用することができる。コンジュゲーションの程度は、ＬＲＰ６複合体をもたらすＰＥＧ分子とＬＲＰ６結合部分の適切なコンジュゲーションを確保するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析によりしっかりとモニタリングすることができる。未反応のＰＥＧは、サイズ排除またはイオン交換クロマトグラフィーによりＬＲＰ６複合体から分離することができる。ＬＲＰ６複合体は、当業者によく知られている方法を使用して、例えば、本明細書に記載されている免疫測定法により、結合活性およびインビボでの有効性を試験することができる。タンパク質をペグ化する方法は、当該技術分野において知られている（例えば、ＮｉｓｈｉｍｕｒａらによるＥＰ  ０  １５４  ３１６およびＩｓｈｉｋａｗａらによるＥＰ  ０  ４０１  ３８４参照）。
【０２００】
他の修飾されたペグ化技術は、ｔＲＮＡシンテターゼおよびｔＲＮＡを含む再構成系を介して生合成タンパク質に化学的に特定された側鎖を導入する、再構成化学的直交操作技術（ＲｅＣＯＤＥ  ＰＥＧ）を含む。この技術は、大腸菌、酵母および哺乳動物細胞において３０個を超える新しいアミノ酸の生合成タンパク質への取り込みを可能とする。ｔＲＮＡは非天然アミノ酸をアンバーコドンが位置する任意の位置で取り込み、アンバーを終止コドンから化学的に特定したアミノ酸の取り込みを伝達するものに変換する。
【０２０１】
組換えペグ化技術（ｒＰＥＧ）も血清半減期延長のために用いることができる。この技術は、ＬＲＰ６結合部分の末尾に３００〜６００アミノ酸の構造不定の(unstructured)タンパク質を遺伝的に融合することを含む。かかる構造不定のタンパク質鎖の見かけの分子量は、その実際の分子量よりも約１５倍大きいため、ＬＲＰ６結合部分の血清半減期は大きく延長される。化学的コンジュゲーションおよび再精製を必要とする従来のＰＥＧ化と対照的に、製造工程がかなり単純化され、産物が均一である。
【０２０２】
（ｉｖ）ＰＳＡ
他の態様において、ＬＲＰ６構築物は、ポリシアル酸（ＰＳＡ）である少なくとも１つの半減期延長分子を含む。ポリシアル化がもう一つの技術であり、これは天然ポリマーＰＳＡを用いて活性時間を延長し、治療ペプチドおよびタンパク質の安定性を改善する。ＰＳＡはシアル酸（糖）のポリマーである。タンパク質および治療ペプチド薬物送達に用いられる場合、ポリシアル酸は、コンジュゲーションにより保護的な微小環境を提供する。これは循環中のＬＲＰ６複合体の活性時間を延長し、免疫系により認識されるのを防ぐ。ＰＳＡポリマーは人体において天然に見出される。これはある種の細菌によって採用されており、それらの細胞壁を覆うために数百万年にわたって進化させてきた。これらの天然ポリシアル化細菌は、分子擬態のおかげで、体の防御システムの追跡を免れることができる。天然の究極のステルス技術であるＰＳＡは、かかる細菌から大量に、あらかじめ定められた物理的特徴で容易に産生できる。細菌のＰＳＡは、人体におけるＰＳＡと化学的に同一であるため、タンパク質と結合させても、完全に非免疫原性である。
【０２０３】
（ｖ）ＨＥＳ化
他の態様において、ＬＲＰ６構築物は、ヒドロキシエチルデンプン（「ＨＥＳ」）である少なくとも１つの半減期延長分子を含む。ＬＲＰ６結合部分に連結したＨＥＳ誘導体の使用は、延長された半減期を有するＬＲＰ６複合体をもたらすことができる。ＨＥＳは、ロウトウモロコシ(waxy maize)デンプン由来の修飾された天然ポリマーであり、体の酵素により代謝できる。ＨＥＳ溶液は通常、不充分な血液量を代替し、血液のレオロジー特性を改善するために投与される。ＬＲＰ６結合部分のＨｅｓ化は、分子の安定性の上昇により、ならびに腎クリアランスの低下によって循環半減期の延長を可能とし、増加した生物学的活性をもたらす。ＨＥＳの分子量などの様々なパラメーターを変化させることにより、広範なＨＥＳ  ＬＲＰ６複合体を設計できる。
【０２０４】
ＬＲＰ６構築物
本発明は、ＬＲＰ６構築物がＬＲＰ６に結合し、Ｗｎｔシグナルの増強なしでＷｎｔシグナル伝達を阻害し、インビトロおよびインビボで増加した半減期を示すように、少なくとも１つのＬＲＰ６結合部分および少なくとも１つの半減期延長分子を含むＬＲＰ６複合体を提供する。半減期延長分子は、Ｗｎｔシグナル経路を阻害することにおいてＬＲＰ６構築物の治療効果を延長する。それ自体、ＬＲＰ６構築物は、望ましい特性、例えば、少なくとも５時間のインビボ半減期の増加を有する。本発明は、ＬＲＰ６構築物がプロペラ１（例えばＷｎｔ１）およびプロペラ３（例えばＷｎｔ３）の両方のリガンド−介在シグナル伝達を阻害し、Ｗｎｔシグナルの増強を回避する能力を有するということを見出したことに基づく。ＬＲＰ６構築物のＬＲＰ６結合部分は、別個のＬＲＰ６  β−プロペラ領域に結合するように設計される。ＬＲＰ６構築物の少なくとも１つのＬＲＰ６結合部分は、β−プロペラ１ドメインに結合し、プロペラ１依存性のＷｎｔｓ、例えば、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７Ａ、Ｗｎｔ７Ｂ、Ｗｎｔ９、Ｗｎｔ１０Ａ、Ｗｎｔ１０Ｂを遮断し、Ｗｎｔ１シグナル伝達経路を阻害するプロペラ１抗体またはそれらの断片を含み；ＬＲＰ６構築物の少なくとも１つのＬＲＰ６結合部分は、β−プロペラ３ドメインに結合し、プロペラ３依存性のＷｎｔｓ、例えば、Ｗｎｔ３ａおよびＷｎｔ３を遮断し、Ｗｎｔ３シグナル伝達経路を阻害するプロペラ３抗体またはそれらの断片を含む。ＬＲＰ６構築物の多重結合効果に加えて、ＬＲＰ６構築物の半減期はまた、半減期延長分子によって増加される。半減期は、少なくとも約５時間、少なくとも１０時間、少なくとも１５時間、少なくとも２０時間、少なくとも２５時間、少なくとも３０時間、少なくとも３５時間、少なくとも４０時間またはそれ以上、少なくとも１０時間、少なくとも１５時間、少なくとも２０時間、少なくとも２５時間、少なくとも３０時間、少なくとも３５時間、少なくとも４０時間またはそれ以上増加される。
【０２０５】
ＬＲＰ６結合部分は、限定はしないが、抗体（例えば、モノクローナル、ポリクローナル、組み換え、ヒト化およびキメラ抗体）、抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’２、ＳＭＩＰ、ドメイン抗体、ダイアボディ、ミニボディ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、アフィボディ、ナノボディおよびドメイン抗体）、受容体、リガンド、アプタマーならびに既知の結合パートナーを有する他の分子を含む。１つの態様において、ＬＲＰ６構築物は、ＬＲＰ６結合部分として少なくとも２つのｓｃＦｖを使用して作製される。１つの態様において、ＬＲＰ６構築物は、ＬＲＰ６結合部分として少なくとも１つのＦａｂを使用して作製される。１つの態様において、ＬＲＰ６構築物は、ＬＲＰ６結合部分として少なくとも１つのｓｃＦａｂを使用して作製される。１つの態様において、ＬＲＰ６構築物は、ＬＲＰ６結合部分の任意の組合せを使用して作製される。ＬＲＰ６構築物の典型的な例は、表２に示される。
【０２０６】
表２：ＬＲＰ６構築物の例
【表２−１】
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【０２０７】
【表２−２】
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【０２０８】
【表２−３】
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【０２０９】
【表２−４】
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【０２１０】
【表２−５】
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【０２１１】
【表２−６】
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【０２１２】
【表２−７】
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【０２１３】
【表２−８】
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【０２１４】
【表２−９】
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【０２１５】
【表２−１０】
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【０２１６】
【表２−１１】
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【０２１７】
【表２−１２】
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【０２１８】
【表２−１３】
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【０２１９】
【表２−１４】
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【０２２０】
【表２−１５】
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【０２２１】
【表２−１６】
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【０２２２】
【表２−１７】
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【０２２３】
【表２−１８】
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【０２２４】
【表２−１９】
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【０２２５】
【表２−２０】
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【０２２６】
【表２−２１】
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【０２２７】
【表２−２２】
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【０２２８】
【表２−２３】
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【０２２９】
【表２−２４】
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【０２３０】
【表２−２５】
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【０２３１】
【表２−２６】
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【０２３２】
【表２−２７】
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【０２３３】
【表２−２８】
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【０２３４】
【表２−２９】
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【０２３５】
【表２−３０】
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【０２３６】
【表２−３１】
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【０２３７】
【表２−３２】
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【０２３８】
【表２−３３】
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【０２３９】
【表２−３４】
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【０２４０】
【表２−３５】
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【０２４１】
【表２−３６】
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【０２４２】
【表２−３７】
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【０２４３】
【表２−３８】
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【０２４４】
【表２−３９】
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【０２４５】
【表２−４０】
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【０２４６】
【表２−４１】
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【０２４７】
【表２−４２】
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【０２４８】
【表２−４３】
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【０２４９】
【表２−４４】
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【０２５０】
【表２−４５】
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【０２５１】
【表２−４６】
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【０２５２】
【表２−４７】
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【０２５３】
【表２−４８】
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【０２５４】
【表２−４９】
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【０２５５】
【表２−５０】
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【０２５６】
【表２−５１】
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【０２５７】
【表２−５２】
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【０２５８】
【表２−５３】
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【０２５９】
【表２−５４】
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【０２６０】
【表２−５５】
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【０２６１】
【表２−５６】
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【０２６２】
【表２−５７】
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【０２６３】
【表２−５８】
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【０２６４】
【表２−５９】
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【０２６５】
ＬＲＰ６構築物は、例えば、標的のレパートリーを拡大する、新規結合特異性、増強した効力およびシグナル増強なしを有する従来の抗体を超える利点を提供する。単一のＬＲＰ６構築物は、同じ細胞上の単一のＬＲＰ６標的受容体における複数のプロペラ領域に結合し、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害することができる。１つの態様において、ＬＲＰ６構築物は、プロペラ１（Ｐ１）、プロペラ２（Ｐ２）、プロペラ３（Ｐ３）およびプロペラ４（Ｐ４）からなる群から選択されるβ−プロペラ領域の任意の組合せに結合する。１つの態様において、ＬＲＰ６構築物は、ＬＲＰ６のプロペラ１およびプロペラ３ドメインに結合する。したがって、単一のＬＲＰ６構築物は、複数のβ−プロペラ領域に結合し、それぞれのドメインによって介在されるＷｎｔシグナル伝達を阻害することにより増加した作用効力を有する。例えば、単一のＬＲＰ６構築物は、プロペラ１およびプロペラ３ドメインの両方に結合するが、Ｗｎｔシグナルの増強を回避することによって、プロペラ１およびプロペラ３の両方が介在するＷｎｔシグナル伝達を阻害する。
【０２６６】
ＬＲＰ６構築物は、ＬＲＰ６受容体の多重の結合部位に同時に結合することができる。ＬＲＰ６構築物のＬＲＰ６結合部分は、ＬＲＰ６受容体の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８以上の結合部位に結合し得る。ＬＲＰ６構築物は、同一のＬＲＰ６受容体上の異なるエピトープ、例えば、ＬＲＰ６受容体のβ−プロペラ１ドメインまたはβ−プロペラ３ドメインに対して特異的である、１以上のＬＲＰ６結合部分を含むことができる。あるいは、ＬＲＰ６構築物は、異なる標的受容体、例えば、ＬＲＰ６ならびにＥｒｂ、ｃｍｅｔ、ＩＧＦＲ１、ＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄおよびＮｏｔｃｈ受容体などのＬＲＰ６ではない受容体上のエピトープに対して特異的である、１以上のＬＲＰ６結合部分を含むことができる。
【０２６７】
１つの態様において、２以上の同一のＬＲＰ６結合部分（すなわち、同じ構造および結合親和性を有する部分）は、半減期延長分子、例えば、標的抗原に対する結合部分の改善したアビディティーを提供するＨＳＡのアミノおよびカルボキシ末端で、それぞれ半減期延長分子、１以上の（例えば、タンデムにおいて）に連結される（例えば、ｓｃＦｖ（Ｐ１）−ｓｃＦｖ（Ｐ１）−ＨＳＡ；ｓｃＦｖ（Ｐ３）−ｓｃＦｖ（Ｐ３）−ＨＳＡ；ＨＳＡ−ｓｃＦｖ（Ｐ１）−ｓｃＦｖ（Ｐ３））。あるいは、２以上の異なるＬＲＰ６結合部分（例えば、２以上の同じか、または異なっている標的分子に対する結合親和性を有するＦａｂ、ｓｃＦｖ（例えば、ｓｃＦｖ（Ｐ１）−ＨＳＡ−Ｆａｂ（Ｐ３）；ｓｃＦｖ（Ｐ３）−ＨＳＡ−Ｆａｂ（Ｐ１）；Ｆａｂ（Ｐ１）−ＨＳＡ−ｓｃＦｖ（Ｐ３）；Ｆａｂ（Ｐ３）−ＨＳＡ−ｓｃＦｖ（Ｐ１）））、または、同一の標的分子上の２以上の異なるエピトープに対する結合親和性を有するＦａｂまたはｓｃＦｖは、複数の標的抗原またはエピトープがＬＲＰ６複合体に連結されるように、半減期延長分子に連結することができる（例えば、ｓｃＦｖ（Ｐ３）−ＨＳＡ−ｓｃＦｖ（Ｐ１）；ｓｃＦｖ（Ｐ１）−ＨＳＡ−ｓｃＦｖ（Ｐ３）、Ｆａｂ（Ｐ１）−ＨＳＡ−Ｆａｂ（Ｐ３）、Ｆａｂ（Ｐ３）−ＨＳＡ−Ｆａｂ（Ｐ１）、ｓｃＦｖ（Ｐ１）−ｓｃＦｖ（Ｐ３）−ＨＳＡ、ｓｃＦｖ（Ｐ３）−ｓｃＦｖ（Ｐ１）−ＨＳＡ）Ｆａｂ（Ｐ１）−Ｆａｂ（Ｐ３）−ＨＳＡ、Ｆａｂ（Ｐ３）−Ｆａｂ（Ｐ１）−ＨＳＡ）。他の態様において、異なる種のＬＲＰ６結合部分もまた、例えば、ＬＲＰ６に対する２以上の異なる結合特異性またはアゴニスト性／アンタゴニスト性の生物学的特性を与えるように、ＬＲＰ６複合体に連結することができる。
【０２６８】
１つの態様において、ＬＲＰ６構築物は、ＬＲＰ６受容体のプロペラ１領域に結合するｓｃＦｖ、半減期延長分子（例えば、ＨＳＡ）およびＬＲＰ６受容体のプロペラ３領域に結合するｓｃＦｖを含む。該構築物は、「８０１」と称され、ｓｃＦｖ（Ｐ１）−ＨＳＡ−ｓｃＦｖ（Ｐ３）の構築物配列を有する。
【０２６９】
１つの態様において、ＬＲＰ６構築物は、ＬＲＰ６受容体のプロペラ３領域に結合するｓｃＦｖ、半減期延長分子（例えば、ＨＳＡ）およびＬＲＰ６受容体のプロペラ１領域に結合するｓｃＦｖを含む。該構築物は、「８０２」と称され、ｓｃＦｖ（Ｐ３）−ＨＳＡ−ｓｃＦｖ（Ｐ１）の構築物配列を有する。
【０２７０】
他の態様において、ＬＲＰ６構築物は、ＬＲＰ６受容体のプロペラ１領域に結合するＦａｂ、半減期延長分子（例えば、ＨＳＡ）およびＬＲＰ６受容体のプロペラ３領域に結合するＦａｂを含む。該構築物は、Ｆａｂ（Ｐ１）−ＨＳＡ−Ｆａｂ（Ｐ３）と称される。
【０２７１】
他の態様において、ＬＲＰ６構築物は、ＬＲＰ６受容体のプロペラ１領域に結合するｓｃＦｖ、半減期延長分子（例えば、ＨＳＡ）およびＬＲＰ６受容体のプロペラ３領域に結合するＦａｂを含む。該構築物は、ｓｃＦｖ（Ｐ１）−ＨＳＡ−Ｆａｂ（Ｐ３）と称される。
【０２７２】
他の態様において、ＬＲＰ６構築物は、ＬＲＰ６受容体のプロペラ１領域に結合するＦａｂ、半減期延長分子（例えば、ＰＥＧ）およびＬＲＰ６受容体のプロペラ３領域に結合するＦａｂを含む。該構築物は、Ｆａｂ（Ｐ１）−ＰＥＧ−Ｆａｂ（Ｐ３）と称される。
【０２７３】
他の態様において、ＬＲＰ６構築物は、ＬＲＰ６受容体のプロペラ１領域に結合するｓｃＦｖ、半減期延長分子（例えば、Ｆｃ）およびＬＲＰ６受容体のプロペラ３領域に結合するｓｃＦｖを含む。該構築物は、ｓｃＦｖ（Ｐ１）−Ｆｃ−ｓｃＦｖ（Ｐ３）と称される。
【０２７４】
ＬＲＰ６構築物配向
ＬＲＰ６構築物は、得られるＬＲＰ６構築物が機能的活性および長期半減期を保持する（例えば、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する）限り、少なくとも１つのＬＲＰ６結合部分（例えば、ｓｃＦｖおよびＦａｂ）を使用して、任意の配向で作製される。任意の数のＬＲＰ６結合部分が、得られるＬＲＰ６構築物が機能的活性を保持する（例えば、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する）限り、半減期延長分子のＣ−末端および／またはＮ−末端に付加され得ることが理解されるべきである。１つの態様において、１、２、３以上のＬＲＰ６結合部分が半減期延長分子のＣ−末端に連結される。他の態様において、１、２、３以上のＬＲＰ６結合部分が半減期延長分子のＮ−末端に連結される。他の態様において、１、２、３以上のＬＲＰ６結合部分が半減期延長分子のＮ−末端およびＣ−末端の両方に連結される。例えば、ＬＲＰ６構築物は、半減期延長分子のＣ−末端および／またはＮ−末端に連結される同じ種類の２つ以上のＬＲＰ６結合部分、例えば、ｓｃＦｖ−半減期延長分子−ｓｃＦｖを含むことができる。あるいは、ＬＲＰ６構築物は、半減期延長分子のＣ−末端および／またはＮ−末端に連結される異なる種類の２つ以上のＬＲＰ６結合部分、例えば、ｓｃＦｖ−半減期延長分子−Ｆａｂを含むことができる。
【０２７５】
ＬＲＰ６結合部分および半減期延長分子の任意の数の置換(permutation)を有するＬＲＰ６構築物が作製される。１つの態様において、半減期延長分子はＨＳＡである。他の態様において、半減期延長分子はＦｃである。他の態様において、半減期延長分子はＰＥＧである。これらのＬＲＰ６構築物は、本願明細書に記載される方法およびアッセイを使用して、機能性について試験することができる。
【０２７６】
ＬＲＰ６複合体は、種々の機能的アッセイによって特徴付けることができる。例えば、それらは、本明細書に記載されるＷｎｔ遺伝子アッセイにおける古典的Ｗｎｔシグナル伝達の阻害による生物学的活性を阻害する能力、ＬＲＰ６タンパク質（例えばヒトおよび／またはカニクイザルＬＲＰ６）とのアフィニティー、エピトープ結合、タンパク質分解に対する耐性、およびＷｎｔ経路を阻止する能力によって、特徴付けることができる。加えて、ＬＲＰ６複合体は、Ｗｎｔリガンドの存在下でＷｎｔシグナルを増強する能力によって特徴付けられる。種々の方法を用いて、ＬＲＰ６−介在Ｗｎｔシグナル伝達を測定することができる。例えば、Ｗｎｔシグナル伝達経路は、（ｉ）β−カテニンの存在量および局在の測定；および（ｉｉ）ＬＲＰ６または他の下流Ｗｎｔシグナル伝達タンパク質（例えばＤＶＬ）のリン酸化反応の測定、およびｉｉｉ）特異的な遺伝子の特徴または遺伝子標的（例えば、ｃ−ｍｙｃ、Ｃｙｃｌｉｎ−Ｄ、Ａｘｉｎ２）の測定によってモニタリングすることができる。
【０２７７】
ＬＲＰ６複合体
ＬＲＰ６複合体は、ＬＲＰ６複合体を産生するために、診断または検出可能な剤と結合(conjugate)することができる。このようなＬＲＰ６複合体は、特定の治療の有効度を測定するといった、臨床試験手順の一部として、発現、成長、発育および／または疾患または障害の重症度を監視または予見するために有用となり得る。このような診断および検出は、ＬＲＰ６複合体に、限定はしないが、以下のものを含む検出可能な物質を結合させることにより成し遂げられ得る。種々の酵素、限定はしないが、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼ；補欠分子族、限定はしないが、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチン；蛍光物質、限定はしないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセイン  イソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン  フルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリン；発光物質、限定はしないが、ルミノール；生物発光体、限定はしないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリン；放射性物質、限定はしないが、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉおよび１２１Ｉ，）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎおよび１１１Ｉｎ，）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎおよび１１７Ｔｉｎ；種々の陽電子放射断層撮影に使用する陽電子放出金属、および放射性でない常磁性金属イオン。
【０２７８】
本発明はさらに、細胞毒素、例えば、細胞増殖抑制剤または細胞破壊剤、治療剤、または放射性金属イオン、例えば、アルファ−エミッターなどの治療的部分(therapeutic moiety)と結合(conjugate)したＬＲＰ６複合体の使用を包含する。細胞毒素または細胞毒性剤は細胞に有害であるあらゆる薬剤を含む。
【０２７９】
ＬＲＰ６複合体は、放射性同位体と結合して、放射性免疫複合体とも呼ばれる、細胞毒性放射性医薬品を生成することができる。診断または治療の用途のために抗体と結合(conjugate)できる放射性同位体の例は、ヨウ素ｌ３１、インジウム１１１、イットリウム９０およびルテチウム１７７を含むが、これらに限定されるものではない。放射性免疫複合体を調製する方法は当分野にて確立されている。放射性免疫複合体の例は商業的に利用可能であり、ＺｅｖａｌｉｎＴＭ（ＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）およびＢｅｘｘａｒＴＭ（Ｃｏｒｉｘａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を含み、類似の方法も放射性免疫複合体の調製のために使用できる。１つの態様において、大環状キレート剤は、リンカー分子を介してＬＲＰ６複合体と付着できる１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）である。そのようなリンカー分子は当分野において周知であり、Denardoら (1998) Clin Cancer Res. 4(10):2483-90; Petersonら (1999) Bioconjug. Chem. 10(4):553-7;およびZimmermanら (1999) Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50（それぞれ出典明示によりそれら全体を包含させる）に記載される。
【０２８０】
ＬＲＰ６複合体調製
ＬＲＰ６構築物は、組換え的に製造することができる。例えば、ＬＲＰ６結合部分および半減期延長分子をコードするヌクレオチド配列は、細菌（例えば、大腸菌）、昆虫、酵母または哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）または哺乳動物組織、臓器もしくは生物体（例えば、トランスジェニック齧歯動物、有蹄動物（例えば、ヤギ）または非ヒト霊長類）において、（例えば、プラスミド、ウイルスベクター、またはトランスジェニック的において）発現され得る。宿主細胞、組織または臓器においてＬＲＰ６構築物の発現後、当業者は、標準タンパク質精製方法（例えば、ＦＰＬＣまたはアフィニティークロマトグラフィー）を使用して、ＬＲＰ６構築物を単離および精製し得る。
【０２８１】
あるいは、ＬＲＰ６構築物は、合成的に製造することができる。例えば、ＬＲＰ６構築物は、ペプチド合成の分野において一般的に確立されている技術、例えば固相アプローチにより製造することができる。固相合成は、不溶性支持体またはマトリックス、例えば、ポリスチレンに連結される成長ペプチド鎖へのアミノ酸残基の段階的付加を含む。ペプチドのＣ−末端残基は、最初に、Ｎ−保護剤、例えば、ｔ−ブチルオキシカルボニル基（ｔＢｏｃ）またはフルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）基で保護されたアミノ基で、市販されている支持体に固定される。アミノ−保護基を適当な脱保護剤で除去し、例えば、ｔＢＯＣの場合ＴＦＡまたはＦＭＯＣに対してピペリジン、次のアミノ酸残基（Ｎ−保護形態において）をカップリング剤、例えば、ジシクロカルボジイミド（ＤＣＣ）で付加する。ペプチド結合の形成時に、試薬は支持体から洗浄される。最後の残基の付加後、薬剤を適当な試薬、例えば、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）またはフッ化水素（ＨＦ）で支持体から解離する。所望により、ＬＲＰ６構築物は、１、２、３以上のセグメントにおいて製造することができ、これは、次にＬＲＰ６構築物全体を形成するために連結することができる。
【０２８２】
予防的および治療的使用
本発明は、有効量のＬＲＰ６複合体を必要とする対象に投与することにより、ＬＲＰ６  Ｗｎｔシグナル伝達経路と関連する疾患または障害を処置する方法を提供する。特定の態様において、本発明は、有効量のＬＲＰ６複合体を必要とする対象に投与することにより、癌（例えば、乳癌、肺癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、胃癌、前立腺癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨肉腫、扁平上皮癌および黒色腫）を処置または予防する方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、有効量のＬＲＰ６複合体を必要とする対象に投与することにより、Ｗｎｔシグナル伝達経路と関連する癌を処置または予防する方法を提供する。
【０２８３】
１つの実施形態において、本発明は、乳癌、肺癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、膀胱癌、肝癌、胃癌、前立腺癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨肉腫、扁平上皮癌、黒色腫を含むがこれらに限定されない、Ｗｎｔシグナル伝達経路に関連する癌の処置の方法を提供する。
【０２８４】
ＬＲＰ６複合体はまた、骨粗鬆症、骨関節炎、腎多嚢胞病、糖尿病、統合失調症、血管系の病気、心臓病、非発癌の増殖性病、繊維症、およびアルツハイマー病などの神経変性疾患を含むがこれらに限定されない、Ｗｎｔシグナル伝達の以上または血管に関連する他の障害の治療または予防に使用できる。Ｗｎｔシグナル伝達経路は組織修復と再生における重要な役割を果たす。Ｗｎｔシグナル伝達に細胞を感作させる剤は、骨疾患、粘膜炎、急性および慢性の腎疾患および他のものなどの多くの症状の組織再生を促進するために使用できる。
【０２８５】
ＬＲＰ６複合体との併用療法に好適な剤は、古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性を調節できる、当分野で既知の標準治療剤（例えば、ＰＩ３キナーゼ剤）を含む。
【０２８６】
医薬組成物
ＬＲＰ６複合体は、放射線治療または手術の前、同時または後に投与され得る。例えば、増殖性疾患（例えば、乳癌）に罹患している患者は、癌性組織部位で標的化された放射線治療または外科的介入（例えば、腫瘍摘出手術または乳腺切除術）と同時に、ＬＲＰ６複合体を単独で、または本明細書に記載されている他の治療剤、細胞毒性剤または細胞毒性剤と組み合わせて与えられ得る。ＬＲＰ６複合体と組み合わせての使用のための適当な放射線治療は、小線源療法および標的化術中放射線治療(brachy therapy and targeted intraperative radiotherapy)（ＴＡＲＧＩＴ）を含む。
【０２８７】
本明細書において提供される医薬組成物は、１以上のＬＲＰ６結合部分（例えば、抗体または抗体断片）を含む治療または診断有効量のＬＲＰ６複合体を含む。１以上のＬＲＰ６結合部分で製造されるＬＲＰ６複合体である活性成分を、種々の薬物送達系における使用のために製剤化することができる。１以上の生理学的に許容される賦形剤または担体もまた、適切な製剤のために組成物に包含され得る。本発明における使用のための適当な製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985)において見られる。薬物送達のための方法の簡潔なレビュー、Langer Science 249:1527-1533 (1990)参照。
【０２８８】
医薬組成物は、予防および／または治療処置のための、非経口、鼻腔内、局部、経口または局所投与、例えば、経皮手段のためと意図される。一般的に、医薬組成物は、非経腸的に（例えば、静脈内、筋肉内または皮下注射により）、または経口吸入により、または局所適用により投与される。したがって、非経口投与用組成物は、許容される担体、好ましくは水性担体、例えば、水、緩衝用水、塩水、ＰＢＳなど中に溶解または懸濁されたＬＲＰ６複合体を含み得る。組成物は、生理学的条件に近づけるために必要とされるとき、薬学的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、緊張力(tonicity)調整剤、湿潤剤、洗剤などを含み得る。本発明はまた、錠剤、カプセルなどの製剤のために、不活性成分、例えば、結合剤または増量剤を含み得る経口送達用組成物を提供する。さらに、本発明は、クリーム、軟膏などの製剤のために、不活性成分、例えば、溶媒または乳化剤を含み得る局所投与用組成物を提供する。
【０２８９】
これらの組成物は、慣用の滅菌技術により滅菌され得、または滅菌濾過され得る。得られる水溶液は、水溶液または凍結乾燥されたものとして使用のためにパッケージされてよく、凍結乾燥調製物は投与の前に滅菌水性担体と混合される。調製物のｐＨは、一般的に、３から１１、さらに好ましくは５から９または６から８、より好ましくは７から８、例えば、７から７．５である。固体形態における得られる組成物は、例えば、錠剤またはカプセルの密閉パッケージ中に、固定量のＬＲＰ６複合体をそれぞれ含む複数の単回投与単位にパッケージされ得る。固体形態における組成物はまた、フレキシブルな量のための容器、例えば、局所的に適用できるクリームまたは軟膏のために設計されたスクイーズできる(squeezable)チューブ中にパッケージすることができる。
【０２９０】
有効量のＬＲＰ６複合体を含む組成物は、予防および／または治療処置のために哺乳動物（例えば、ヒト）に投与することができる。予防適用において、ＬＲＰ６複合体を含む組成物は、疾患または状態（例えば、癌）に罹患しやすい、または発症する危険性がある患者に投与される。かかる量は、「予防有効用量」であると定義される。該使用において、正確な量は、再び、患者の健康状態に依存するが、一般的に、投与毎に約０．５ｍｇから約４００ｍｇのＬＲＰ６複合体（例えば、投与毎に１０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇまたは４００ｍｇ以上）および投与毎に約０．１μｇから約３００ｍｇの１以上の免疫調節剤（例えば、投与毎に１０μｇ、３０μｇ、５０μｇ、０．１ｍｇ、１０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇまたは２００ｍｇ）の範囲である。ＬＲＰ６複合体の投与は、時間、日、週、月または年毎に１回以上（例えば、時間、日、週、月または年毎に２、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２回）で患者に予防的に投与することができる。さらに一般的には、ＬＲＰ６複合体を週毎に単回投与で投与する。
【０２９１】
治療的適応において、ＬＲＰ６複合体の投与は、疾患または状態およびその合併症の１つ以上の症状を、治療または少なくとも部分的に阻止または緩和するのに十分な量において、疾患または状態（例えば、癌、自己免疫疾患、心臓血管疾患、骨疾患、眼科疾患）にすでに罹患している哺乳動物（例えば、ヒト）に投与される。この目的を成し遂げるために十分な量は、「治療有効用量」として定義される。該使用に対して有効な量は、疾患または状態の重症度および患者の全身状態に依存してよいが、一般的に、投与毎に約０．５ｍｇから約４００ｍｇのＬＲＰ６複合体（例えば、投与毎に１０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇまたは４００ｍｇ以上）の範囲である。ＬＲＰ６複合体の投与は、時間、日、週、月または年毎に１回以上（例えば、時間、日、週、月または年毎に２、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２回）で患者に治療的に投与することができる。さらに一般的には、ＬＲＰ６複合体を週毎に単回投与で投与する。
【０２９２】
いくつかの態様において、患者に、週毎に１回以上（例えば、週毎に２、３、４、５、６または７以上）で投与毎に約０．５から約４００ｍｇ、好ましくは週毎に１回以上で投与毎に約５ｍｇから約３００ｍｇ、よりさらに好ましくは週毎に１回以上で投与毎に約５ｍｇから約２００ｍｇの範囲おいて、ＬＲＰ６複合体を与え得る。患者にまた、約５０ｍｇから約８００ｍｇの範囲において週２回投与でＬＲＰ６複合体または約５０ｍｇから約１，２００ｍｇの範囲において月１回投与でＬＲＰ６複合体を与え得る。
【０２９３】
他の態様において、ＬＲＰ６複合体は、週毎に約０．５ｍｇから週毎に約２０００ｍｇ、週毎に約１．０ｍｇから週毎に約１０００ｍｇ、週毎に約５ｍｇから週毎に約５００ｍｇ、週毎に約１０ｍｇから週毎に約１００ｍｇ、週毎に約２０ｍｇから週毎に約８０ｍｇ、週毎に約１００ｍｇから週毎に約３００ｍｇ、または週毎に約１００ｍｇから週毎に約２００ｍｇの典型的な用量範囲において患者に投与され得る。他の局面において、７０ｋｇ患者への投与用量は、本明細書において提供されるＨＳＡリンカー複合体の、例えば、約１μｇから約５０００ｍｇ、約２μｇから約４５００ｍｇ、約３μｇから約４０００ｍｇ、約４μｇから約３，５００ｍｇ、約５μｇから約３０００ｍｇ、約６μｇから約２５００ｍｇ、約７μｇから約２０００ｍｇ、約μｇから約１９００ｍｇ、約９μｇから約１，８００ｍｇ、約１０μｇから約１，７００ｍｇ、約１５μｇから約１，６００ｍｇ、約２０μｇから約１，５７５ｍｇ、約３０μｇから約１，５５０ｍｇ、約４０μｇから約１，５００ｍｇ、約５０μｇから約１，４７５ｍｇ、約１００μｇから約１，４５０ｍｇ、約２００μｇから約１，４２５ｍｇ、約３００μｇから約１，０００ｍｇ、約４００μｇから約９７５ｍｇ、約５００μｇから約６５０ｍｇ、約０．５ｍｇから約６２５ｍｇ、約１ｍｇから約６００ｍｇ、約１．２５ｍｇから約５７５ｍｇ、約１．５ｍｇから約５５０ｍｇ、約２．０ｍｇから約５２５ｍｇ、約２．５ｍｇから約５００ｍｇ、約３．０ｍｇから約４７５ｍｇ、約３．５ｍｇから約４５０ｍｇ、約４．０ｍｇから約４２５ｍｇ、約４．５ｍｇから約４００ｍｇ、約５ｍｇから約３７５ｍｇ、約１０ｍｇから約３５０ｍｇ、約２０ｍｇから約３２５ｍｇ、約３０ｍｇから約３００ｍｇ、約４０ｍｇから約２７５ｍｇ、約５０ｍｇから約２５０ｍｇ、約１００ｍｇから約２２５ｍｇ、約９０ｍｇから約２００ｍｇ、約８０ｍｇから約１７５ｍｇ、約７０ｍｇから約１５０ｍｇ、または約６０ｍｇから約１２５ｍｇの範囲であり得る。投与レジメンは、最適な治療応答を提供するように調整され得る。他の局面において、ＬＲＰ６複合体は、一日おきに約０．５ｍｇから一日おきに約５００ｍｇ、好ましくは一日おきに約５ｍｇから一日おきに約７５ｍｇ、さらに好ましくは一日おきに約１０ｍｇから一日おきに約５０ｍｇ、よりさらに好ましくは一日おきに２０ｍｇから一日おきに約４０ｍｇの範囲において投与され得る。ＬＲＰ６複合体はまた、週毎に３回約０．５ｍｇから週毎に３回約１００ｍｇ、好ましくは週毎に３回約５ｍｇから週毎に３回約７５ｍｇ、さらに好ましくは週毎に３回約１０ｍｇから週毎に３回約５０ｍｇ、よりさらに好ましくは週毎に３回約２０ｍｇから週毎に３回約４０ｍｇの範囲において投与され得る。
【０２９４】
本発明の方法の非限定的な態様において、ＬＲＰ６複合体は、１、２、３または４時間連続的に；１日に１、２、３または４回；一日おきにまたは３日毎、４日毎、５日毎または６日毎；週に１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０回；週２回；月に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０回；一月おき；６月毎に１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０回；年に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０回；または一年おきで、哺乳動物（例えば、ヒト）に投与される。ＬＲＰ６複合体は、治療レジメン中、異なる頻度で投与され得る。さらなる態様において、ＬＲＰ６複合体は、同じ頻度または異なる頻度で患者に投与され得る。
【０２９５】
所望の治療効果をなし遂げるために必要とされる１以上の診断剤または治療剤およびＬＲＰ６複合体の量は、多くの因子、例えば、選択される特定の診断剤または治療剤、投与様式およびレシピエントの臨床状態に依存する。当業者は、所望の結果をなし遂げるための１以上の診断剤または治療剤およびＬＲＰ６複合体の適当な用量を決定することができる。
【０２９６】
有効量のＬＲＰ６複合体を含む組成物の単回または複数回投与は、処置する医師により選択される投与レベルおよびパターンで行うことができる。投与(dose)および投与(administration)スケジュールは、哺乳動物（例えば、ヒト）における疾患または状態の重症度に基づいて決定および調整することができ、臨床医により一般的に実施されている方法または本明細書に記載されているものにしたがって、処置経過中にモニタリングしてもよい。
【０２９７】
ＬＲＰ６複合体は、直接または当分野で知られている任意の薬学的に許容される担体または塩と組み合わせて、哺乳動物対象、例えば、ヒトに投与することができる。薬学的に許容される塩は、医薬産業において一般的に使用される非毒性酸付加塩または金属錯体を含み得る。酸付加塩の例は、有機酸、例えば、酢酸、乳酸、パモ酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、パルミチン酸、スベリン酸、サリチル酸、酒石酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸またはトリフルオロ酢酸など；ポリマー酸、例えば、タンニン酸、カルボキシメチルセルロースなど；および無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などを含む。金属錯体は、亜鉛、鉄などを含む。１つの典型的な薬学的に許容される担体は生理食塩水である。他の生理学的に許容される担体およびそれらの製剤は当業者に知られており、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, (18 th edition), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton, PA. Diagnostic and Therapeutic Applicationsにおいて記載されている。
【０２９８】
ＬＲＰ６複合体は、例えば、増殖性疾患（例えば、癌、例えば、黒色腫、明細胞肉腫および腎臓癌）および自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、リウマチ性関節炎およびブドウ膜炎）の診断または処置を含む、ヒトにおける診断および治療的適応のために使用することができる。ヒト増殖性および自己免疫疾患の以下の議論は、どのＬＲＰ６複合体が診断および治療的適応において適用することができるを、開業医に一般的な意味解釈を提供することを意味するが、本発明の範囲を限定することを意味しない。
【０２９９】
本発明は完全に記載されており、以下の実施例および特許請求の範囲によりさらに説明されるが、これらは説明のためであり、さらなる限定を意図しない。
【実施例】
【０３００】
実施例１：抗−ＬＲＰ６モノおよび二パラトープ血清アルブミン融合物の作製
この実施例は、モノ特異的フォーマットについて血清アルブミンへの抗−ＬＲＰ６  Ｆａｂの融合ならびに二パラトープフォーマットについて血清アルブミンへの抗−ＬＲＰ６  Ｆａｂおよび抗−ＬＲＰ６  ｓｃＦｖまたはｓｃＦａｂの融合として設計された、モノ特異的および二パラトープ抗−ＬＲＰ６抗体の生産および特性化を記載する。野生型マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）との融合に加えて、ＭＳＡまたはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）における遊離システインが、セリン（ＭＳＡ（Ｃ：Ｓ）またはＨＳＡ（Ｃ：Ｓ））に変異されている融合物もまた調製した。モノ特異的バリアントは、抗−ＬＲＰ６  ＦａｂへのＭＳＡ、ＭＳＡ（Ｃ：Ｓ）またはＨＳＡ（Ｃ：Ｓ）のＣ−末端付加により設計された。二パラトープバリアントは、抗−ＬＲＰ６  Ｆａｂ  ＭＳＡまたは抗−ＬＲＰ６  Ｆａｂ  ＭＳＡ（Ｃ：Ｓ）／ＨＳＡ（Ｃ：Ｓ）骨格への、抗−ＬＲＰ６  ｓｃＦｖまたは抗−ＬＲＰ６  ｓｃＦａｂ（ＣＬおよびＶＨ間に６ｘ  Ｇｌｙ４Ｓｅｒ−リンカーを有するＦａｂ）のいずれかのＣ−末端付加により設計された。
【０３０１】
（ａ）材料および方法
（ｉ）血清アルブミンに融合されたモノ特異的抗−ＬＲＰ６  Ｆａｂの作製
抗−ＬＲＰ６＿ＭＯＲ０８１６８  Ｆａｂ−ＭＳＡ
ＭＯＲ０８１６８−ＶＨをベクターｐＭＯＲＰＨｘ９−ＦＨ−ＭＯＲ０８１６８から増幅し、ＰＣＲ産物をＮｒｕＩ／ＢｌｐＩを介してベクターｐＲＳ５ａ−ＭＯＲ０６７０６−ＭＳＡにクローニングした（プライマー１：ｇｃｔａｃｇｔｃｇｃｇａｔｔｃｔｇｇａａｇｇｃｇｔｇｃａｃｔｇｔｃａｇｇｔｇｃａａｔｔｇｇｔｇｇａａａｇｃ（配列番号：３０１）、プライマー２：ｇｃｔａｃｇｇｃｔａｇｃｔｇａｇｃｔａａｃｃｇｔｃａｃｃａｇ（配列番号：３０２）。得られたベクターをｐＲＳ５ａ−ＭＯＲ０８１６８−ＭＳＡと称した。
【０３０２】
ＭＯＲ０８１６８−ＶＬをベクターｐＭＯＲＰＨｘ９−ＦＨ−ＭＯＲ０８１６８から増幅し、ＰＣＲ産物をＡｇｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを介してベクターｐＲＳ５ａ−ｈラムダ−ＭＯＲ０６７０６にクローニングした（プライマー３：ｇｃｔａｃｇａｃｃｇｇｔｇａｔａｔｃｇａａｃｔｇａｃｃｃａｇｃｃｇ（配列番号：３０３）、プライマー４：ｇｃｔａｃｇａａｇｃｔｔｃｇｔｇｃｃｇｃｃｇｃｃａａａｃ（配列番号：３０４）。得られたベクターをｐＲＳ５ａ−ｈラムダ−ＭＯＲ０８１６８と称した。
【０３０３】
抗−ＬＲＰ６＿ＭＯＲ０８１６８  Ｆａｂ−ＭＳＡ（Ｃ：Ｓ）
ＭＳＡ遺伝子内に置換Ｃ５８Ｓを、ベクターｐＲＳ５ａ−ＭＳＡ−ＭＯＲ０８１６８においてQuickChange Site-Directed Mutagenesis (Agilent)により導入した（プライマー５：ｃａｇｔａｃｃｔｇｃａｇａａｇｔｃｃａｇｃｔａｃｇａｃｇａｇｃａｃ（配列番号：３０５）、プライマー６：ｇｔｇｃｔｃｇｔｃｇｔａｇｃｔｇｇａｃｔｔｃｔｇｃａｇｇｔａｃｔｇ（配列番号：３０６）。
【０３０４】
ＭＳＡ遺伝子内に置換Ｃ６０３Ｓを、ＰＣＲ、次に、ベクターｐＲＳ５ａ−ＭＳＡ−ＭＯＲ０１６８＿Ｃ５８ＳにＡｇｅＩ／ＡｓｃＩを介してＰＣＲ産物のクローニングにより導入した（プライマー７：ｇｇｃｃｃａｃａａｇａｇｃｇａｇａｔｃｇｃｃｃ（配列番号：３０７）、プライマー８：ｇｃｇｇｃｃｇｃｃｃｇｇｃｇｃｇｃｃｔｃａｔｃａｇｔｇａｔｇｇｔｇａｔｇａｔｇｇｔｇｇｇｃｃａｇｇｇｃｇｔｃｃｔｔｇｇａｃｃｇｇｇｔｃａｃｃａｇｇｔｔｇｇｇ（配列番号：３０８）。最後に、遺伝子最適化ＭＯＲ０８１６８−ＶＨをＧｅｎｅａｒｔベクター０９２４６９０＿８１６８ｓｃ−ｆｖＣＨ１ｍｕｔ＿ｃｙｓから増幅し、ベクターｐＲＳ５ａ−ＭＳＡ−ＭＯＲ０８１６８＿Ｃ５８Ｓ＿Ｃ６０３ＳにＭｆｅＩ／ＢｌｐＩを介してクローニングし、得られたベクターをｐＲＳ５ａ−ＭＳＡ−ＭＯＲＯ８１６８ｏｐｔ＿Ｃ５８Ｓ＿Ｃ６０３Ｓと称した（プライマー９：ｔｇｔｃａｇｇｔｇｃａａｔｔｇｇｔｃｇａｇｔｃｔｇｇｃｇｇａｇｇａｃｔｇ（配列番号：３０９）、プライマー１０：ｃｃｔｔｇｇｔｇｃｔｇｇｃｔｇａｇｃｔｇ（配列番号：３１０）。遺伝子最適化ＭＯＲ０８１６８−ＶＬをＧｅｎｅａｒｔベクター０９２４６９０＿８１６８ｓｃ−ｆｖＣＨ１ｍｕｔ＿ｃｙｓから増幅し、ベクターｐＲＳ５ａ−ｈラムダにＡｇｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを介してクローニングした。得られたベクターをｐＲＳ５ａ−ｈラムダ−ＭＯＲ０８１６８ｏｐｔと称した（プライマー１１：ｇｃｔｔｃｃｇｇａｃａｃｃａｃｃｇｇｔｇａｃａｔｃｇａｇｃｔｇａｃｃｃａｇｃｃ（配列番号：３１１）、プライマー１２：ｃａｇｃａｃｇｇｔａａｇｃｔｔｇｇｔｇｃｃｔｃｃｇｃｃｇａａｃａｃｃａｇ（配列番号：３１２）。
【０３０５】
抗−ＬＲＰ６＿ＭＯＲ０８１６８  Ｆａｂ−ＨＳＡ（Ｃ：Ｓ）
ＨＳＡ−Ｃ：ＳをコードするＤＮＡ断片をベクターｐＲＳ５ａＨＳＡｃｙｓから単離し、ｐＲＳ５ａ−ＭＳＡ−ＭＯＲ０８１６８ｏｐｔ＿Ｃ５８Ｓ＿Ｃ６０３ＳにＮｈｅＩ／ＡｓｃＩを介してクローニングした。得られたベクターをｐＲＳ５ａ−ＭＯＲ０８１６８ｏｐｔ＿ＨＳＡ＿ＣｔｏＳと称した。ＭＯＲ０８１６８−ＬＣ（ｐＲＳ５ａ−ｈラムダ−ＭＯＲ０８１６８ｏｐｔ）は、抗−ＬＲＰ６＿ＭＯＲ０８１６８  Ｆａｂ−ＭＳＡ（Ｃ：Ｓ）に対して記載されているとおりに作製した。
【０３０６】
抗−ＬＲＰ６＿ＭＯＲ０８５４５  Ｆａｂ−ＭＳＡ
ＭＯＲ０８５４５−ＶＨをコードする遺伝子最適化ＤＮＡ断片は、ＮｒｕＩ／ＮｈｅＩを介してＧｅｎｅａｒｔベクター０８１４７４６＿ＭＯＲ０８５４５＿重−ｍａｍｍａから単離し、ベクターｐＲＳ５ａ−ｈ−ＩｇＧ１（ＭＶ）−ＭＳＡにクローニングし、得られたベクターをｐＲＳ５ａ−ＭＳＡ−ＭＯＲ０８５４５と称した。ＭＯＲ０８５４５−ＶＬをコードする遺伝子最適化ＤＮＡ断片は、ＡｇｅＩ／ＮａｒＩを介してＧｅｎｅａｒｔベクター０８１４７４７＿ＭＯＲ０８５４５＿軽＿ｍａｍｍａから単離し、ベクターｐＲＳ５ａ−ｈ−ラムダにクローニングし、得られたベクターをｐＲＳ５ａ−ｈ−ラムダ−ＭＯＲ０８５４５と称した。
【０３０７】
抗−ＬＲＰ６＿ＭＯＲ０６７０７  Ｆａｂ−ＭＳＡ
ＭＯＲ０６７０７−ＶＨをコードする遺伝子最適化ＤＮＡ断片は、ＮｒｕＩ／ＮｈｅＩを介してＧｅｎｅａｒｔベクター０８１４７４８＿ＭＯＲ０６７０７＿重＿ｍａｍｍａから単離し、ｐＲＳ５ａ−ＭＳＡ−ＭＯＲ０８５４５にクローニングし、得られたベクターをｐＲＳ５ａ−ＭＳＡ−ＭＯＲ０６７０７と称した。ＭＯＲ０６７０７−ＶＬをコードする遺伝子最適化ＤＮＡ断片は、ＡｇｅＩ／ＮａｒＩを介してＧｅｎｅａｒｔベクター０８１４７４９＿ＭＯＲ０６７０７＿軽＿ｍａｍｍａから単離し、ベクターｐＲＳ５ａ−ｈ−ラムダにクローニングし、得られたベクターをｐＲＳ５ａ−ｈ−ラムダ−ＭＯＲ０６７０７と称した。
【０３０８】
抗−ＬＲＰ６＿ＭＯＲ０６７０６  Ｆａｂ−ＭＳＡ
ＭＯＲＯ６７０６−ＶＨをベクターｐＭＯＲＰＨｘ９−ＦＨ−ＭＯＲ０６７０６から増幅し、ＰＣＲ産物をベクターｐＲＳ５ａ（ＭＶ）−ｈＩｇＧ１−ＭＳＡ−６７０７−ＳａｌＩにＮｒｕＩ／ＮｈｅＩを介してクローニングした（プライマー２７：ｇｃｔａｃｇｔｃｇｃｇａｔｔｃｔｇｇａａｇｇｃｇｔｇｃａｃｔｇｔｃａｇｇｔｇｃａａｔｔｇｇｔｇｇａａａｇｃ（配列番号：３１３）、プライマー２８：ｇｃｔａｃｇｇｃｔａｇｃｔｇａｇｃｔａａｃｃｇｔｃａｃｃａｇ（配列番号：３１４）。得られたベクターをｐＲＳ５ａ−ｈＩｇＧ１−ＭＯＲ０６７０６−ＳａｌＩ−ＭＳＡと称した。ベクターｐＲＳ５ａ−ｈラムダ−ＭＯＲ０６７０７における開始コドンの上流のＨｉｎｄＩＩＩ部位をQuickChange Site-Directed Mutagenesis (Agilent)により除去した（プライマー２９：ｇｇｔｃｃａａｃｔｇｃａｃｇｇｔａｇｃｔｔｔｃｔａｇａｇｃｃｇ（配列番号：３１５）、プライマー３０：ｃｇｇｃｔｃｔａｇａａａｇｃｔａｃｃｇｔｇｃａｇｔｔｇｇａｃｃ（配列番号：３１６）。第２の変異誘発工程において、ＨｉｎｄＩＩＩ部位をベクターｐＲＳ５ａ−ｈラムダ−ＭＯＲ０６７０７−ｗ／ｏ−ＨｉｎｄＩＩＩにおけるＶＬおよびＣＬをコードする配列領域間に組み込んだ（プライマー３１：ｇｃｇｇａａｃａａａｇｃｔｔａｃｃｇｔｇｃｔｇｇｇｃｃ（配列番号：３１７）、プライマー３２：ｇｇｃｃｃａｇｃａｃｇｇｔａａｇｃｔｔｔｇｔｔｃｃｇｃ（配列番号：３１８）。ＭＯＲ０６７０６−ＶＬをベクターｐＭＯＲＰＨｘ９−ＦＨ−ＭＯＲ０６７０６から増幅し、ＰＣＲ産物を変異ベクターｐＲＳ５ａ−ｈラムダ−ＭＯＲ０６７０７にＡｇｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを介してクローニングした（プライマー３３：ｇｃｔａｃｇａｃｃｇｇｔｇａｔａｔｃｇａａｃｔｇａｃｃｃａｇｃｃｇ（配列番号：３１９）、プライマー３４：ｇｃｔａｃｇａａｇｃｔｔｃｇｔｇｃｃｇｃｃｇｃｃａａａｃ（配列番号：３２０）。得られたベクターをｐＲＳ５ａ−ｈラムダ−ＭＯＲ０６７０６と称した。
【０３０９】
抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０６４７５  Ｆａｂ−ＭＳＡ
ＭＯＲ０６４７５  Ｆａｂを、ＶＨリーダー配列を有するベクターｐＲＳ５ａを使用して、ＭＳＡのＮ−末端に融合した。ＭＯＲ０６４７５およびＭＳＡ間にヒンジリンカーが存在した。ヒンジリンカー配列はＤＫＴＨＴであった。得られたベクターをｐＲＳ５ａ−ＭＳＡ−ＭＯＲ６４７５  ５０１と称した。該タンパク質を２９３Ｔ懸濁細胞において発現させ、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔにより精製した。
【０３１０】
抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０６４７５  ｓｃＦｖ−ＭＳＡ
ＬＨ方向におけるＭＯＲ０６４７５  ｓｃＦｖを、ＶＨリーダー配列を有するベクターｐＲＳ５ａを使用して、ＭＳＡのＮ−末端に融合した。ＭＯＲ０６４７５  ｓｃＦｖおよびＭＳＡ間に（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２リンカーが存在した。精製目的のためにＭＳＡのＣ−末端にＨｉｓタグが存在した。得られたベクターをｐＲＳ５ａ−ｓｃＦｖ６４７５−ＭＳＡ  ５０７と称した。該タンパク質を２９３Ｔ懸濁細胞において発現させ、ＱｉａｇｅｎからのＮＴｉ樹脂により精製した。
【０３１１】
（ｉｉ）血清アルブミンへの融合に基づく二パラトープ抗−ＬＲＰ６構築物の作製
抗−ＬＲＰ６＿ＭＯＲ０８１６８  Ｆａｂ−ＭＳＡ（Ｃ：Ｓ）ＭＯＲ０６４７５  ｓｃＦｖ
ＢｓｔＥＩＩ制限酵素認識部位を、QuickChange Site-Directed Mutagenesis (Agilent)によりベクターｐＲＳ５ａ−ＭＯＲ０８１６８ｏｐｔ−ＨＳＡ−Ｃ  ｔｏ  Ｓに導入した、プライマー１３：ｇｇｃｃａｇｇｇｃａｃａｃｔｔｇｔｇａｃｃｇｔｃａｇｃｔｃ（配列番号：３２１）、プライマー１４：ｇａｇｃｔｇａｃｇｇｔｃａｃａａｇｔｇｔｇｃｃｃｔｇｇｃｃ（配列番号：３２２）。得られたベクターをｐＲＳ５ａ−ＭＯＲ０８１６８ｏｐｔ−ＭＳＡ−Ｃ５８Ｓ−Ｃ６０３Ｓ＿１ＢｓｔｅＩＩ＿ｓｉｔｅと称した。ＭＯＲ０６４７５  ｓｃＦｖをベクターｐＲＳ５ａ−ＭＯＲ０６４７５−ｓｃＦｖから増幅し、ＰＣＲ産物をＢｓｔＥＩＩ／ＸｂａＩを介してベクターｐＲＳ５ａ−ＭＯＲ０８１６８ｏｐｔ−ＭＳＡ−Ｃ５８Ｓ−Ｃ６０３Ｓ＿１ＢｓｔｅＩＩ＿ｓｉｔｅにクローニングした（プライマー１５：ｇｇｃｃｃｃａａｃｃｔｇｇｔｇａｃｃｃｇｇｔｃｃａａｇｇａｃｇｃｃｃｔｇｇｃｃｇｇｃｇｇｃｔｃｃｇｇｃｇｇａａｇｃｇａｔａｔｃｇｔｇｃｔｇａｃａｃａｇａｇｃｃｃ（配列番号：３２３）、プライマー１６：ｇｔｔｔａａａｃｇｇｇｃｃｃｔｃｔａｇａｇｃｇｇｃｃｇｃｃｃｇｇｃｇｃｇｃｃｔｃａｇｃｔｇｇａｃａｃｔｇｔｃａｃｃａｇｇｇｔｔｃ（配列番号：３２４）。得られたベクターをｐＲＳ５ａ−ＭＯＲ０８１６８ｏｐｔ−ＭＳＡ−ＣｔｏＳ−６４７５ｓｃＦｖと称した。ＭＯＲ０８１６８−ＬＣ（ｐＲＳ５ａ−ｈラムダ−ＭＯＲ０８１６８ｏｐｔ）は、抗−ＬＲＰ６＿ＭＯＲ０８１６８  Ｆａｂ−ＭＳＡ（Ｃ：Ｓ）に対して記載されているとおりに作製した。
【０３１２】
抗−ＬＲＰ６＿ＭＯＲ０８１６８  Ｆａｂ−ＨＳＡ（Ｃ：Ｓ）ＭＯＲ０６４７５  ｓｃＦｖ
ＡｆｅＩ制限酵素認識部位を、QuickChange Site-Directed Mutagenesis (Agilent)によりベクターｐＲＳ５ａ−ＭＯＲ０８１６８ｏｐｔ−ＨＳＡ−  Ｃ５８Ｓ＿Ｃ６０３Ｓに導入した、プライマー１７：ｇｃｇｇｃｃａｇｔｃａｇｇｃａｇｃｇｃｔｔｇｇｔｔｔｇｔｇａｔｇ（配列番号：３２５）、プライマー１８：ｃａｔｃａｃａａａｃｃａａｇｃｇｃｔｇｃｃｔｇａｃｔｇｇｃｃｇｃ（配列番号：３２６）。得られたベクターをｐＲＳ５ａ−ＭＯＲ０８１６８ｏｐｔ−ＨＳＡ−ＣｔｏＳ＿ＡｆｅＩと称した。ＭＯＲ０６４７５−ｓｃＦｖをベクターｐＲＳ５ａ−ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ−ＭＯＲ０８１６８ｏｐｔ−６４７５ｓｃＦｖから増幅し、ＰＣＲ産物をＡｆｅＩ／ＸｂａＩを介してベクターｐＲＳ５ａ−ＭＯＲ０８１６８ｏｐｔ−ＨＳＡ−ＣｔｏＳ＿ＡｆｅＩにクローニングした（プライマー１９：ｃａｇｇｃａｇｃｇｃｔｔｇｇｔｔｔｇｇｇｃｇｇｃｔｃｃｇｇｃｇｇａａｇｃｇａｔａｔｃｇ（配列番号：３２７）、プライマー２０：ｇｇｇｔｔｔａａａｃｇｇｇｃｃｃｔｃｔａｇａｇｃ（配列番号：３２８）。得られたベクターをｐＲＳ５ａ−ＭＯＲ０８１６８ｏｐｔ−ＨＳＡ−ＣｔｏＳ−６４７５−ｓｃＦｖと称した。ＭＯＲ０８１６８−ＬＣ（ｐＲＳ５ａ−ｈラムダ−ＭＯＲ０８１６８ｏｐｔ）は、抗−ＬＲＰ６＿ＭＯＲ０８１６８  Ｆａｂ−ＭＳＡ（Ｃ：Ｓ）に対して記載されているとおりに作製した。
【０３１３】
抗−ＬＲＰ６＿ＭＯＲ０８１６８  Ｆａｂ−ＨＳＡ（Ｃ：Ｓ）ＭＯＲ０６４７５  ｓｃＦａｂ
ＭＯＲ０６４７５  ｓｃＦａｂを、（ＣＬおよびＶＨ間に６ｘＧｌｙ４Ｓｅｒ−リンカーを有する完全ＩｇＧ１ＬＡＬＡをコードする）ベクターｐＲＳ５ａ−ｈカッパ−リンカー−ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ−ＭＯＲ０６４７５から増幅し、ＰＣＲ産物をＡｆｅＩ／ＸｂａＩを介してベクターｐＲＳ５ａ−ＭＯＲ０８１６８ｏｐｔ−ＨＳＡ−ＣｔｏＳ＿ＡｆｅＩにクローニングした（プライマー２１：ｃａｇｇｃａｇｃｇｃｔｔｇｇｔｔｔｇｇｇｃｇｇｃｔｃｃｇｇｃｇｇａａｇｃｇａｔａｔｃｇｔｇｃｔｇａｃｃｃａｇａｇｃｃ（配列番号：３２９）、プライマー２２：ｇｃｃｃｔｃｔａｇａｇｃｇｇｃｃｇｃｃｃｇｇｃｇｃｇｃｃｔｃａｔｃａｇｃａｇｃｔｃｔｔｇｇｇｃｔｃｃａｃｔｃｔｃｔｔｇ（配列番号：３３０）。得られたベクターをｐＲＳ５ａ−ＭＯＲ０８１６８ｏｐｔ−ＨＳＡ−ＣｔｏＳ−６４７５−ｓｃＦａｂと称した。ＭＯＲ０８１６８−ＬＣ（ｐＲＳ５ａ−ｈラムダ−ＭＯＲ０８１６８ｏｐｔ）は、抗−ＬＲＰ６＿ＭＯＲ０８１６８  Ｆａｂ−ＭＳＡ（Ｃ：Ｓ）に対して記載されているとおりに作製した。
【０３１４】
（ｉｉｉ）モノ特異的および二パラトープ抗−ＬＲＰ６  Ｆａｂ  ＭＳＡ／ＭＳＡ（Ｃ：Ｓ）／ＨＳＡ（Ｃ：Ｓ）融合物の一時的発現
３−４Ｌ  ＨＥＫ２９３細胞を、Ｒｏｃｋｓ  １０ｒｐｍ、Ａｎｇｌｅ  ７°、Ａｅｒａｔｉｏｎ  ２５Ｌ／時、２５％  Ｏ２、６％  ＣＯ２で、ＢｉｏＷａｖｅ２０において、Ｖ３  Ｍｅｄｉａ：  Ｌｏｔ＃  Ｄ０７６６８Ｂにおいて、２Ｅ６生存細胞／ｍＬの密度にまで培養した。該細胞を、Ｖ３培地において１−２Ｌ  ＤＮＡ：ＰＥＩ−ＭＩＸ（プラスミド：５ｍｇ  ＨＣ＋５ｍｇ  ＬＣ＋２０ｍｇ  ＰＥＩ）で一時的にトランスフェクトした。トランスフェクションの６時間後、５Ｌ  Ｆｅｅｄｉｎｇ培地（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）：  Ｌｏｔ＃  ０９−０２１を培養物に加えた。次に、細胞をＲｏｃｋｓ  ２４ｒｐｍ、Ａｎｇｌｅ：  ７°、Ａｅｒａｔｉｏｎ  ２５Ｌ／時、２５％  Ｏ２、０−６％  ＣＯ２で、さらに培養した。トランスフェクション後の７から１０日間、細胞をＦｒｅｓｅｎｉｕｓフィルター０．２μｍを使用するクロスフロー濾過により取り出した。後に、細胞フリーな物質を、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓからの１０ｋＤａカットオフフィルターを使用する交差流濾過で１．７５Ｌに濃縮した。濃縮物をｓｔｅｒｉｃｕｐフィルター（０．２２μｍ）を介して滅菌濾過した。滅菌上清を４℃で貯蔵した。
【０３１５】
全ての記載されている抗−ＬＲＰ６  Ｆａｂ融合バリアントを、上記されているものと同様の方法において発現させた。
【０３１６】
（ｉｖ）モノ特異的および二パラトープ抗−ＬＲＰ６  Ｆａｂ  ＭＳＡ／ＭＳＡ（Ｃ：Ｓ）／ＨＳＡ（Ｃ：Ｓ）融合物の精製
１０ｍｌのＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  Ｆａｂ  ラムダ  アフィニティーマトリックス（ＢＡＣ  ＃０８４９．１０）を備えた新たに衛生的な(sanitized)（０．５Ｍ  ＮａＯＨ／３０％イソプロパノール）ＸＫ１６／２０カラムを使用して、クーリングキャビネットにおいて４℃でＡＫＴＡ  １００  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  Ａｉｒ  クロマトグラフィーシステムにおいて精製を行った。１ｍｌ／分のローディングを除いて、全ての流速は２ｍｌ／分であった。カラムを１０ＣＶのＰＢＳ（１０ｘから作製、Ｇｉｂｃｏ）で平衡にし、次に、濃縮され滅菌濾過された発酵上清（約１ｌ）を１．０ｍｌ／分でローディングした。カラムを１０ＣＶのＰＢＳで洗浄した。次に、Ｆａｂ融合物を、５ＣＶの１００ｍＭ  グリシン／ＨＣｌ−Ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ３．０で溶出した。溶出液を、０．３ｍｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ９．０を含むチューブに３ｍｌ画分において回収した。該回収物を滅菌濾過し(Millipore Steriflip, 0.22μm)、ＯＤ２８０ｎｍをラムダ３５Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ(Perkin Elmer)において測定し、タンパク質濃度を配列データに基づいて計算した。該回収物を凝集（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）および純度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＬＡＬおよびＭＳ）について別々に試験し、結果に基づいて、主要な回収物のみをさらに使用した。第２の精製工程のために、第１の精製からの回収物を、新たに衛生的な（０．５Ｍ  ＮａＯＨ／３０％イソプロパノール）ＨｉＬｏａｄ  ２６／６０−Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  カラム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にローディングし、１ｍｌ／分でＰＢＳで流し、溶出液を４ｍｌ画分において回収し、第１の精製工程に記載されているとおりに分析した。
【０３１７】
全ての記載されている二パラトープ抗−ＬＲＰ６  Ｆａｂ融合バリアントを、上記されているものと同様の方法において精製した。
【０３１８】
（ｖ）サイズ排除クロマトグラフィー  多角度光散乱検出器（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）
ＳＥＣ−ＭＡＬＳ測定を、三角度光散乱検出器(miniDAWN Treos, Wyatt Technology, Santa Barbara, CA, USA)に連結したＡｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣシステム (Agilent Technologies)において行った。０．１８６ｍｌ／ｇの特定の屈折率増加（ｄｎ／ｄｃ）を使用する示差屈折計(Optilab rEX, Wyatt Technology)でサンプルの濃度をオンラインで追跡した(Wenら 1996 Anal Biochem. 240:155-66)。５０μｌのサンプル容量をＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬ  カラム(GE Healthcare)上に注入した。データを記録し、ＡＳＴＲＡ  Ｖ  ソフトウェア(Wyatt Technology)を使用して処理した。ＭＡＬＳ検出器に対する検出器ディレイ(delay)ボリューム(volume)および規格化係数を決定するために、ＢＳＡサンプル(Sigma, Catalog # A8531)を参照として使用した。デスパイキング(despiking)もバンド拡がり(band broadening)補正も適用しなかった。
【０３１９】
実施例２：二パラトープＬＲＰ６抗体半分子の作製
この実施例は、二パラトープ抗−ＬＲＰ６  ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ抗体半分子の生産および特性化を記載する。ジスルフィド結合形成を防止するためにヒンジ変異（システインからグリシンまたはセリン）および非共有結合を崩壊させるためにＣＨ３変異（Ｆ４０５ＴおよびＹ４０７Ｄ）の組合せを使用して、抗体半分子を設計した。二パラトープバリアントは、抗−ＬＲＰ６抗体半分子への、抗−ＬＲＰ６  ｓｃＦｖのＣ−末端融合により設計された。さらなるＣＨ２およびＣＨ３（Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ｄ）ドメインを有するバリアントも製造した。
【０３２０】
（ａ）材料および方法
（ｉ）二パラトープＬＲＰ６抗体半分子の作製
抗−ＬＲＰ６＿ＭＯＲ０８１６８  ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ（ｍｕｔ  ヒンジ  Ｆ：Ｔ；  Ｙ：Ｄ）ＭＯＲ０６４７５  ｓｃＦｖ
ＭＯＲ０８１６８ｏｐｔ−ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡのヒンジ領域内の両方のシステインを、ベクターｐＲＳ５ａ−ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ−ＭＯＲＯ８１６８ｏｐｔ−６４７５ｓｃＦｖにおいて、QuickChange Site-Directed Mutagenesis (Agilent)により、グリシンに置換した（プライマー２３：ｃａａｇａｃｃｃａｃａｃｃｇｇｃｃｃｃｃｃｃｇｇｃｃｃａｇｃｃｃｃａｇａｇｇｃ（配列番号：３３１）、プライマー２４：ｇｃｃｔｃｔｇｇｇｇｃｔｇｇｇｃｃｇｇｇｇｇｇｇｃｃｇｇｔｇｔｇｇｇｔｃｔｔｇ（配列番号：３３２）。さらに、置換ＦｔｏＴおよびＹｔｏＤを、QuickChange Site-Directed Mutagenesis (Agilent)により、ベクターｐＲＳ５ａ−ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ−ＭＯＲ０８１６８ｏｐｔ−６４７５ｓｃＦｖ＿ｍｕｔ＿ヒンジのＣＨ３ドメインに導入した、プライマー２５：ｇｃｇａｃｇｇｃａｇｃｔｔｃａｃｃｃｔｇｇａｃａｇｃａａｇｃｔｇａｃｃ（配列番号：３３３）、プライマー２６：ｇｇｔｃａｇｃｔｔｇｃｔｇｔｃｃａｇｇｇｔｇａａｇｃｔｇｃｃｇｔｃｇｃ（配列番号：３３４）。得られたベクターをｐＲＳ５ａ−ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ−ＭＯＲ０８１６８ｏｐｔ−６４７５ｓｃＦｖ＿ｍｕｔ−ヒンジ＿ＦｔｏＴ＿ＹｔｏＤと称した。ＭＯＲ０８１６８−ＬＣ（ｐＲＳ５ａ−ｈラムダ−ＭＯＲ０８１６８ｏｐｔ）は、以前の実施例における抗−ＬＲＰ６＿ＭＯＲ０８１６８  Ｆａｂ−ＭＳＡ（Ｃ：Ｓ）に対して記載されているとおりに作製した。
【０３２１】
抗−ＬＲＰ６＿ＭＯＲ０８１６８  ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ２（ＣＨ２＿ＣＨ３）（ｍｕｔ  ヒンジ  Ｆ：Ｔ；  Ｙ：Ｄ）ＭＯＲ０６４７５  ｓｃＦｖ
ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ（ｍｕｔ  ヒンジ  Ｆ：Ｔ；  Ｙ：Ｄ）の完全ＣＨ２／３−ドメインをコードする遺伝子最適化ＤＮＡ断片を、ＤＮＡ２．０  ベクター  ４９６９２＿ＣＬＯＮＥＤから単離し、ＡｆｅＩ／ＢａｍＨＩを介してベクターｐＲＳ５ａ−ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ−ＭＯＲ０８１６８ｏｐｔ−６４７５ｓｃＦｖ＿ｍｕｔ−Ｈｉｎｇｅ＿ＦｔｏＴ＿ＹｔｏＤにクローニングした。得られたベクターをｐＲＳ５ａ−ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ−ＭＯＲ０８１６８ｏｐｔ−２ｘＣＨ２／３−６４７５ｓｃＦｖ＿ｍｕｔ−Ｈｉｎｇｅ＿ＦｔｏＴ＿ＹｔｏＤと称した。ＭＯＲ０８１６８−ＬＣ（ｐＲＳ５ａ−ｈラムダ−ＭＯＲ０８１６８ｏｐｔ）は、以前の実施例における抗−ＬＲＰ６＿ＭＯＲ０８１６８  Ｆａｂ−ＭＳＡ（Ｃ：Ｓ）に対して記載されているとおりに作製した。
【０３２２】
（ｉｉ）二パラトープ抗−ＬＲＰ６抗体半分子の一時的発現
一時的発現を上記実施例１に記載されているとおりに行った。
【０３２３】
（ｉｉｉ）二パラトープ抗−ＬＲＰ６抗体半分子の精製
抗−ＬＲＰ６＿ＭＯＲ０８１６８  ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ（ｍｕｔ  ヒンジ  Ｆ：Ｔ；  Ｙ：Ｄ）ＭＯＲ０６４７５  ｓｃＦｖ
５ｍｌ  ＨｉＴｒａｐ  プロテイン  Ｇ  カラム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、クーリングキャビネットにおいて４℃でＡＫＴＡ  １００  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  Ａｉｒ  クロマトグラフィーシステムにおいて二パラトープ抗体半分子の精製を行った。１ｍｌ／分のローディングを除いて、全ての流速は３ｍｌ／分であった。カラムを１０ＣＶのＰＢＳ（１０ｘから作製、Ｇｉｂｃｏ）で平衡にし、次に、濃縮され滅菌濾過された発酵上清（約１Ｌ）を１．０ｍｌ／分でローディングした。カラムを１０ＣＶのＰＢＳで洗浄した。次に、抗体半分子を、１００ｍＭ  グリシン／ＨＣｌ−Ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ４．５から１００ｍＭ  グリシン／ＨＣｌ−Ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ２．５（１２ＣＶ）の勾配、次に６ＣＶの１００ｍＭ  グリシン／ＨＣｌ−Ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ２．０で溶出した。検出ピークに対応する画分（１ｍｌ）をプールし、１０％  ｖｏｌ．の１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ９．０の添加により中和した。該回収物を滅菌濾過し(Millipore Steriflip, 0.22μm)、ＯＤ２８０ｎｍをラムダ３５Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ(Perkin Elmer)において測定し、タンパク質濃度を配列データに基づいて計算した。該回収物を凝集（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）および純度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＬＡＬおよびＭＳ）について別々に試験し、結果に基づいて、主要な回収物のみをさらに使用した。
【０３２４】
抗−ＬＲＰ６＿ＭＯＲ０８１６８  ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ２（ＣＨ２＿ＣＨ３）（ｍｕｔ  ヒンジ  Ｆ：Ｔ；  Ｙ：Ｄ）ＭＯＲ０６４７５  ｓｃＦｖ
５ｍｌ  ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ  カラム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、クーリングキャビネットにおいて４℃でＡＫＴＡ  １００  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  Ａｉｒ  クロマトグラフィーシステムにおいて二パラトープ抗体半分子の精製を行った。全ての流速は５ｍｌ／分であった。カラムを５ＣＶのＰＢＳ（１０ｘから作製、Ｇｉｂｃｏ）で平衡にし、次に、濃縮され滅菌濾過された発酵上清（約１ｌ）を５．０ｍｌ／分でローディングした。カラムを５ＣＶのＰＢＳ、次に５ＣＶの５０ｍＭ  Ｃｉｔｒａｔｅ、９０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ５．５で洗浄した。次に、抗体半分子を、４ｍｌ画分において５ＣＶの５０ｍＭ  Ｃｉｔｒａｔｅ、９０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ３．０で溶出した。検出ピークに対応する画分をプールし、１Ｍ  ＮａＯＨの添加によりｐＨ６−７に中和した。該回収物を滅菌濾過し(Millipore Steriflip, 0.22μm)、ＯＤ２８０ｎｍをラムダ３５Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ(Perkin Elmer)において測定し、タンパク質濃度を配列データに基づいて計算した。該回収物を凝集（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）および純度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＬＡＬおよびＭＳ）について別々に試験し、結果に基づいて、主要な回収物のみをさらに使用した。
【０３２５】
（ｉｖ）サイズ排除クロマトグラフィー  多角度光散乱検出器（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）
ＳＥＣ−ＭＡＬＳを本願の実施例１のとおりに行った。
【０３２６】
実施例３：抗−ＬＲＰ６モノおよび二パラトープ血清アルブミン融合物および二パラトープＬＲＰ６抗体半分子の発現、精製および特性化
全ての血清アルブミン融合構築物が成功裏に発現され、精製された。精製された産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認し、予期されるサイズに対応するバンドを示した。質量分析（ＭＳ）によるさらなる検証は、抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８  Ｆａｂ−ＨＳＡ（Ｃ：Ｓ）ＭＯＲ０６４７５−ｓｃＦｖ、抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８  Ｆａｂ−ＭＳＡ（Ｃ：Ｓ）ＭＯＲ０６４７５−ｓｃＦｖ、抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８  Ｆａｂ−ＭＳＡ、抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８  Ｆａｂ−ＨＳＡ（Ｃ：Ｓ）および抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０６７０６−ＭＳＡが、Ｎ−末端にピログルタミン酸を有して、予期される質量（それぞれ１４０２０７、１３９６１１、１１３８５１、１１３５９４および１１３９３１Ｄａ）に対応することを証明した。抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８  Ｆａｂ−ＨＳＡ（Ｃ：Ｓ）ＭＯＲ０６４７５−ｓｃＦａｂからの軽鎖もまた、予期される質量（２２８３７Ｄａ）に対応し、重鎖はトリプシンペプチド質量指紋(fingerprint)（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ）により確認された。凝集は、ＳＥＣ  ＭＡＬＳにより決定されるとき、全ての抗−ＬＲＰ６モノおよび二パラトープ血清アルブミン融合物に対して６％未満であった。
【０３２７】
二パラトープ抗−ＬＲＰ６  ＩｇＧ１抗体半分子もまた、単量体形態において良く発現された。予期されるサイズに対応するバンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出された。ＭＳによるさらなる検証は、ＭＯＲ０８１６８−ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ（ｍｕｔ  ヒンジ  Ｆ：Ｔ；  Ｙ：Ｄ）ＭＯＲ０６４７５−ｓｃＦｖおよびＭＯＲ０８１６８−ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ２（ＣＨ２＿ＣＨ３）（ｍｕｔ  ヒンジ  Ｆ：Ｔ；  Ｙ：Ｄ）ＭＯＲ０６４７５−ｓｃＦｖが、Ｎ−末端にピログルタミン酸およびグリコシル化を有して、予期される質量（それぞれ９８５３６および１２３３０１Ｄａ）に対応することを証明した。凝集は、ＳＥＣ  ＭＡＬＳにより決定されるとき、両方のバリアントに対して６％未満であった。
【０３２８】
質量分析：
この試験のために作製された全ての分子を、それらの完全性および純度を確認するために、質量分析により分析した。無傷な分子のＬＣ−ＭＳ分析からなる、および、サンプルの、（ｉ）脱グリコシル化、（ｉｉ）還元、（ｉｉｉ）還元および脱グリコシル化、（ｉｖ）還元およびカルボキシアミドメチル化(carboxyamidomethylation)の処理後に、少なくとも１つのＬＣ−ＭＳ分析による標準ＱＣ方法を適用した。
【０３２９】
抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８  Ｆａｂ−ＨＳＡ（Ｃ：Ｓ）ＭＯＲ０６４７５−ｓｃＦａｂの場合、重鎖の同一性をトリプシンペプチドマッピングにより確認された。
【０３３０】
ＬＣ−ＭＳ器具：
液体クロマトグラフィー（ＬＣ）を、質量分析計に直接連結されたＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣシステムにて行った。溶媒Ａ：２％  ＣＨ３ＣＮ  ｉｎ  Ｈ２Ｏ  ０．１％  ギ酸、および溶媒Ｂ：ＣＨ３ＣＮ  ０．１％  ギ酸。無傷なサンプル（４μｇ）を以下の勾配を有するＭａｓｓＰｒｅｐ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（０．４ｍＬ／分、Ｗａｔｅｒｓ）にて分離した：５分、０％Ｂから９０％Ｂ。処理されたサンプル（４μｇ）を、以下の勾配を有する０．１μＬ／分の流速で、ＰＯＲＯＳ  １０  Ｒ１  カラム（１５０ｘ１ｍｍ、Ｍｏｒｅｙ）にて分離した：０．５分、０％Ｂから２２％Ｂまで、次に１０分、４４％Ｂまで、次に１分、９０％Ｂまで、２分間９０％Ｂで維持、次に０％Ｂに戻す。
【０３３１】
エレクトロスプレーオン化飛行時間（ＥＳＩ＿ＴＯＦ）質量分析計(Waters Q_TOF Premier Spectrometer)を、１２０℃の供給源温度、２５０℃の脱溶媒和温度、４０Ｖにセットされたサンプルコーン(sample cone)下で、ポジティブＶ−モードにおいて作動させ、０．０５ｓ  走査間遅延(interscan delay)での０．９５Ｈｚスキャン速度を使用して、全体分析にわたるデータを獲得した。無傷な、および処理されたサンプルの測定のために、キャピラリー(capillary)電圧を１．５ｋＶおよび２．８ｋＶに設定し、質量スペクトルを１０００から６０００および６００から２０００のｍ／ｚ範囲においてそれぞれ得た。ＥＳＩ−ＴＯＦスペクトルの解析後に、評価を行った。
【０３３２】
サンプル処理：
（ｉ）脱グリコシル化：
２５μｇの凍結乾燥されたヒトＩｇＧを５μＬの０．４Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３を含む８Ｍ  ウレアに溶解させる。次に、３７μＬの５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ８．３）、次に、５μＬの反応バッファーＧ７、次に、１．６μＬのＰＮＧａｓｅＦ(New England Biolabs, Ipswich, MA)を加え、混合物を７０分間３７℃でインキュベートする。
【０３３３】
（ｉｉ）還元：
２５μｇの凍結乾燥されたヒトＩｇＧを、５μＬの８Ｍ  ウレア／０．４Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ８．３）での溶解、次に、５μＬの５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ８．３）の添加後に、１．２μＬ  １Ｍ  ＤＴＴで（窒素下で５０℃で３０分間）還元させる。
【０３３４】
（ｉｉｉ）還元／脱グリコシル化
２５μｇの凍結乾燥されたヒトＩｇＧを、５μＬの８Ｍ  ウレア／０．４Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３および５μＬの５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ８．３）での溶解後に、１．２μＬ  １Ｍ  ＤＴＴで還元させる。５０℃での３０分インキュベーション後、５μＬの反応バッファーＧ７および３２μＬの５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ８．３）、次に、１．６μＬのＰＮＧａｓｅＦ（New England Biolabs, Ipswich,MA）を加え、混合物を３７℃で７０分間インキュベートする。
【０３３５】
（ｉｉｉ）還元／カルボキシアミドメチル化
１００μｇの凍結乾燥されたヒトＩｇＧを、８０μＬの８Ｍ  ウレア／ｇ  ０．４Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ８．３）に溶解させ、次に２．３μＬ  １Ｍ  ＤＴＴの添加後、混合物を窒素下に置き、５０℃で３０分インキュベートする。次に、該溶液を室温に冷却し、６．５μＬの１Ｍ  ヨードアセトアミドを加え、混合物を暗い場所で室温で３０分インキュベートする。反応を、ｐＨ３−４に達するように１０％ギ酸の添加により停止させる。
【０３３６】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳＭＳ分析：
カルボキシアミドメチル化サンプル（ｉｖ）を、それぞれの鎖の脱塩および回収のためにＨＰＬＣに注入した。約４．４μｇのＨＣを回収し、ＳｐｅｅｄＶａｃで乾燥させた。カルボキシアミドメチル化ＨＣ（５μｌ  ８Ｍ  ウレア  ０．４Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３＋４０μｌ  ０．４Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３＋１μｌ  １Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ１０）の溶解後、１μＬのトリプシン（１μｇ／μｌ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、３７℃で一晩インキュベーションした。反応を、ｐＨ３−４に達するように１０％ギ酸の添加により停止させた。
【０３３７】
得られた消化物のアリコート（２μＬ）を、ＺｉｐＴｉｐＣ１８（Ｗａｔｅｒｓ）により精製し、アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ  Ｈ２Ｏ（５０／５０）中の２μｌ  マトリックス  ＨＣＣＡにてＭＡＬＤＩ標的上に直接溶出した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳおよびＭＳＭＳ（Ａｕｔｏｆｌｅｘ  ＩＩＩ、Ｂｒｕｋｅｒ）スペクトルを、ポジティブレフレクション(positive reflectron)およびＬＩＦＴモードのそれぞれにおいて得た。データ評価を、社内配列データベースに対するＭＡＳＣＯＴサーチにより行った。
【０３３８】
実施例４：Ｗｎｔレポーター遺伝子アッセイにおける抗−ＬＲＰ６モノおよび二パラトープ血清アルブミン融合物および二パラトープＬＲＰ６抗体半分子のインビトロ活性の評価
抗−ＬＲＰ６モノおよび二パラトープ血清アルブミン融合物および二パラトープＬＲＰ６抗体半分子がＷｎｔシグナル伝達を阻害する能力を、Ｗｎｔ１およびＷｎｔ３ａ応答性ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにおいて試験した。以下に記載されるとおり、Ｗｎｔ１またはＷｎｔ３ａ発現プラスミドの共トランスフェクションにより、またはＷｎｔ１またはＷｎｔ３ａを過剰発現する細胞との共培養により、Ｗｎｔ３ａ馴化培地にて細胞を刺激した。
【０３３９】
（ｉ）馴化培地でのＷｎｔ３ａレポーター遺伝子アッセイ
３ｘ１０４個のＨＥＫ２９３−ＳＴＦ細胞／ウェルを９６ウェル組織培養プレートに播種し、細胞を１００μＬ培地中で３７℃／５％  ＣＯ２で一晩インキュベートした。
【０３４０】
次の日、種々の抗−ＬＲＰ６構築物希釈物を２０Ｘ溶液としてＰＢＳにおいて作製した。２０μＬ／ウェルの上清を９６ウェル組織培養プレートから取り出し、５μＬ／ウェルの抗−ＬＲＰ６構築物希釈物および１５μＬの馴化培地に置き換えた。
【０３４１】
３７℃／５％  ＣＯ２での１６から２４時間インキュベーション後、１００μＬ  ＢｒｉｇｈｔＧｌｏ  ルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、プレートを１０分間インキュベートした。発光を、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＥｎｖｉｓｉｏｎまたはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ３／Ｍ５  プレートリーダーのいずれかを使用して決定した。
【０３４２】
（ｉｉ）一時的にトランスフェクトされた細胞でのＷｎｔ１／Ｗｎｔ３ａレポーター遺伝子アッセイ
３ｘ１０４個のＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞／ウェルを９６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ  ＃３９０３）に播種し、細胞を１００μＬ培地中で３７℃／５％  ＣＯ２でインキュベートした。１２から１６時間後、細胞を、Ｗｎｔ発現プラスミド、１ｎｇ／ウェル；ｐＴＡ−Ｌｕｃ−１０ｘＳＴＦ（Ｆｉｒｅｆｌｙ  ルシフェラーゼ構築物）５０ｎｇ／ウェル；およびｐｈＲＬ−ＳＶ４０（Ｒｅｎｉｌｌａ  ルシフェラーゼ構築物）０．５ｎｇ／ウェルでトランスフェクトした。
【０３４３】
上記プラスミドおよび０．２μＬ  ＦｕＧｅｎｅ６／ウェル（Ｒｏｃｈｅ）を含むトランスフェクションプレミックス（１０μＬ／ウェル）を調製した。トランスフェクションプレミックスをＲＴで１５分インキュベートし、次に、ウェルに分配した。プレートをＲＴで２分間４００ｒｐｍで揺れ動かし、次に、３７℃／５％  ＣＯ２で４時間インキュベートした。トランスフェクション、インキュベーションの４時間後、抗体を培地において２０Ｘ溶液に希釈し、トランスフェクト細胞に加えた（５μＬ／ウェル）。
【０３４４】
２４時間後、７５μＬ／ウェル  ＤｕａｌＧｌｏ  ルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、上記のとおりＦｉｒｅｆｌｙ  ルシフェラーゼ活性の読出し前に、細胞溶解のために１０分間プレートを揺れ動かした。発光読出し後、７５μＬ／ウェル  ＤｕａｌＧｌｏ  Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏｗ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、Ｒｅｎｉｌｌａ  ルシフェラーゼ活性を決定するために、発光を再び測定した。分析のために、Ｆｉｒｅｆｌｙ  ルシフェラーゼ活性およびＲｅｎｉｌｌａ  ルシフェラーゼ活性間の比率を計算した。抗−ＬＲＰ６構築物のＩＣ５０−決定のために、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して相対ルシフェラーゼ値を分析した。
【０３４５】
（ｉｉｉ）Ｗｎｔ１／Ｗｎｔ３ａ共培養レポーター遺伝子アッセイ
Ｗｎｔ１または他のＷｎｔリガンドを過剰発現する細胞（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１またはＬ−細胞）と安定なＳＴＦレポーター細胞系（ＨＥＫ２９３、ＮＩＨ／３Ｔ３、ＴＭ３、ＰＡ１、ＭＤＡ−ＭＢ４３５、ＭＤＡ−ＭＢ２３１）との共培養を使用して、同様のアッセイもまた行うことができる。簡潔には、４ｘ１０４個のＳＴＦレポーター細胞を、９６ウェルＴＣプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ＃３９０３）のウェルあたり３０μｌにて置く。２ｘ１０４個の安定なＷｎｔリガンドを発現する細胞をウェルあたり３０μｌで加える。最後に、３０μＬの３Ｘ抗体希釈物をウェル毎に加える。プレートを３７℃／５％ＣＯ２で４０−４８時間インキュベートし、ルシフェラーゼシグナルを、ウェルあたり９０μｌ  ＢｒｉｇｈｔＧｌｏルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）の添加、１０分間穏やかな震盪しながら室温でインキュベーション、および適当なプレートリーダー（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳｐｅｃｔｒａｍａｘＭ３またはＭ５）での発光シグナルの測定により決定する。活性パーセントを、抗体コントロール無しに対する比率として測定される（１００％Ｗｎｔ誘導）。
【０３４６】
結果
一価の血清アルブミン融合分子、抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８  Ｆａｂ−ＭＳＡ、抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８  Ｆａｂ−ＨＳＡ（Ｃ：Ｓ）、抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８５４５  Ｆａｂ−ＭＳＡ、抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０６７０６  Ｆａｂ−ＭＳＡ、抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０６４７５  Ｆａｂ−ＭＳＡおよび抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０６４７５  ｓｃＦｖ−ＭＳＡの活性を、図１に示す。ＭＯＲ０８１６８、ＭＯＲ０８５４５およびＭＯＲ０６７０６誘導分子は、Ｗｎｔ３ａ誘導レポーター遺伝子活性ではなく、Ｗｎｔ１の強力なインヒビターであったが、ＭＯＲ０６４７５誘導ＭＳＡ−融合構築物は、Ｗｎｔ１−駆動シグナル伝達ではなくＷｎｔ３ａの強力なインヒビターであった。
【０３４７】
抗−ＬＲＰ６二パラトープ血清アルブミン融合物および二パラトープＬＲＰ６抗体半分子の活性は図２に要約される。該データは、該構築物が、Ｗｎｔ１およびＷｎｔ３ａ駆動シグナル伝達の両方を阻害することができたことを示す。
【０３４８】
実施例５：インビボでの抗−ＬＲＰ６血清アルブミン構築物の薬物動態学および薬物動力学特性の評価
いくつかの抗−ＬＲＰ６  Ｆａｂおよび血清アルブミン構築物の薬物動態学（ＰＫ）および薬物動力学（ＰＤ）特性を、腫瘍を有さないマウスおよび当分野においてＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１として知られている認識された遺伝的に操作されたマウスモデルにおいてインビボにてさらに特徴付けした。ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１トランスジェニックマウスから生じた乳房腫瘍はＷｎｔ１依存である：例えば、テトラサイクリン調節システムを使用するＷｎｔ１発現の停止(turning off)（Guntherら (2003), Genes Dev. 17, 488-501）またはＦｚ８ＣＲＤＦｃを使用するＷｎｔ活性のブロック（DeAlmeidaら (2007) Cancer Research 67, 5371-5379）が、インビボにて腫瘍増殖を阻害する。
【０３４９】
腫瘍を有さないマウスにおいて抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８  Ｆａｂ−ＭＳＡのＰＫ特性を決定するために、ヌードマウスに、５ｍｇ／ｋｇの抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８  Ｆａｂ−ＭＳＡの単回投与でＩＶ投与した。ＭＳＡ構築物の血清濃度を、注入の完了後、複数の時点で質量分析により決定し（それぞれ２、８、２４、７２、１２０、１６８、２４０および３３６時）、結果は図３に示される。抗体および抗体様バリアントの血清濃度を決定するための質量分析の使用は、ＵＳ２００７／０８８２５８（出典明示により本明細書に包含させる）に記載されている詳細に基づく。サンプルを、６７ｍＭの最終濃度に塩酸を加えることによりｐＨを３．５±０．２５に調整した。次に、ペプシンを２μｇペプシン／μＬ血清の最終濃度に加え、プレートに蓋をし、簡潔に遠心し、ボルテックスした。消化を、オーブンにおいて３７℃で２時間続けた。
【０３５０】
ペプシン消化完了したとき、サンプルを、２Ｍ  ウレア／１％  デオキシコール酸（ＤＯＣ）ナトリウム／１０ｍＭ  ＤＴＴ／５０ｍＭ  重炭酸アンモニウム（ｐＨ７．８）で５Ｘに希釈し、プレートをボルテックスした。ＤＴＴによるジスルフィド結合還元を容易にするために、プレートをオーブンにおいて５８℃で２時間インキュベートした。ＩＡＡを２０ｍＭの最終濃度に加え、遊離システイン残基をカルボキサミドメチル化するために１時間暗い場所で環境温度でプレートをインキュベートした。０．７５μｇブタ／μＬ血清を加えた。プレートに蓋をし、簡潔に遠心し、ボルテックスした。サンプルをオーブンにおいて３７℃で一晩消化した。次の日に、ギ酸を１％（ｖ／ｖ）の最終濃度に加え、消化を終えた。
【０３５１】
真空マニホールドにおいてＯａｓｉｓ  ＭＣＸ  ９６−ウェル  ３０μｍ、３０ｍｇプレート（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．）を使用する固相抽出（ＳＰＥ）により消化物を精製した(cleaned-up)。製造業者の推奨プロトコールによって、小さな修飾が行われた。簡潔には、Ｏａｓｉｓ  ＭＣＸウェルを、１．０ｍＬ  メタノール、次に１．０ｍＬ  ＨＰＬＣグレード水で前洗浄した。サンプルを負荷し、次に、２ｘ１ｍｌ  １％酢酸、次に２ｘ１ｍｌ  メタノールで洗浄した。次に、１ｍＬ  ５０％メタノール、４５％エタノール中５％水酸化アンモニウムを使用して、９６−ウェル  ２ｍＬ回収プレートに溶出した。乾燥するまでサンプルを蒸発させ、≦−５０℃で貯蔵した。ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の前に、消化物を１％トリフルオロ酢酸において新たに再構成させた。
【０３５２】
２．５μＬ  血清当量(equivalent)をＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  キャピラリー  ＨＰＬＣ上に注入した。ＭＳ／ＭＳ分析を、ＳＲＭモードにおいて操作するＱｕａｎｔｕｍ  Ｖａｎｔａｇｅ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）において行った。濃度値を、抗−ＬＲＰ６分子を対応するマトリックスに連続希釈することにより作製された標準曲線に対して、内部標準ペプチドに標準化された抗−ＬＲＰ６分子の典型的な単一のペプチドのピーク面積比率を比較することにより決定した。
【０３５３】
ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１腫瘍におけるＷｎｔ−シグナル伝達に対する抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８  Ｆａｂ−ＭＳＡの効果もまた評価した。これらの試験において、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１腫瘍に、５ｍｇ／ｋｇの抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８  Ｆａｂ−ＭＳＡおよび血清濃度の抗体の単回投与で静脈内に（ＩＶ）投与し、β−カテニン標的遺伝子Ａｘｉｎ２のｍＲＮＡ発現を１４日間にわたって分析した。結果は図４に示される。抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８  Ｆａｂ−ＭＳＡの終末相半減期は約１７時間であった。加えて、血清中の抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８  Ｆａｂ−ＭＳＡのレベルが減少するとき回復される、Ａｘｉｎ２  ｍＲＮＡ発現における有意な減少が、腫瘍において観察された。同様の試験を抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０６７０６−ＭＳＡおよび抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０６７０６  Ｆａｂで行った。抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８  ＦａｂおよびＭＳＡ−融合物で得られたデータと一致して、ＭＯＲ０６７０６  Ｆａｂの終末相半減期は約２．７時間であった。対照的に、片方の(companion)ＭＳＡ−融合物の半減期は、約１７時間であった。加えて、抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８  Ｆａｂ−ＭＳＡと同様に、Ａｘｉｎ２  ｍＲＮＡにおける時間および濃度依存変化が、抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０６７０６  Ｆａｂ−ＭＳＡの投与後に観察された（図５）。
【０３５４】
総合すれば、これらの結果は、ＭＳＡへの融合物が、抗−ＬＲＰ６  Ｆａｂ分子の血清半減期を増加させることができることを示唆する。データは、Ｗｎｔ１−クラス特異的血清アルブミン構築物がＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１異種移植片においてＷｎｔシグナル伝達を抑制することができること、および該抑制が血清濃度と相関していることをさらに証明する。
【０３５５】
実施例６：ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１同種移植モデルにおける抗−ＬＲＰ６血清アルブミン構築物のインビボ抗腫瘍有効性の評価
ＰＫ−ＰＤ試験に加えて、抗−ＬＲＰ６血清アルブミン構築物の有効性もまた、上記実施例５に記載されているＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１モデルにおいて決定した。これらの試験において、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１腫瘍断片をメスヌードマウスに皮下に（ＳＣ）移植した。移植１９日後、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１腫瘍を有するマウス（ｎ＝８、平均１７９ｍｍ３；範囲：９２−３８０ｍｍ３）をビヒクルＩｇＧ（４ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ、１週（ｑｗ）またはＬＲＰ６−プロペラ１  ８１６８−Ｆａｂ−ＭＳＡ（６ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ、週に３回（３ｑｗ）で処理し、腫瘍を週に２回カリパスで測った。ＬＲＰ６−プロペラ１  ８１６８−Ｆａｂ−ＭＳＡが抗腫瘍活性（９０％退行、ｐ＜０．０５）を証明し、結果は図６に示される。
【０３５６】
実施例７：８５４５のペグ化方法およびインビトロでの特性化
（ｉ）抗−ＬＲＰ６＿ＭＯＲ０８５４５  Ｆａｂ  構築物の作製
ｐＭＯＲＰＨｘ９−ＦＨ−ＭＯＲ０８５４５に対してプライマー対（プライマー３５：ｃｃｇｔｔｇｃｇｃｃｇａｃｔｇａｇｇｃｃｔｇｃｔｇａｔａａｇｃａｔｇｃｇｔａｇｇ（配列番号：３３５）、プライマー３６：ｃｃｔａｃｇｃａｔｇｃｔｔａｔｃａｇｃａｇｇｃｃｔｃａｇｔｃｇｇｃｇｃａａｃｇｇ（配列番号：３３６）にて変異誘発を行い、ｐＭＯＲＰＨｘ９−ＦＨ−ＭＯＲ０８５４５−２ｃｙｓを調製した。次に、ＭＯＲ０８５４５−ＶＨおよびＶＬを、プライマー対（プライマー３８：ｃａｃｔｇｇｃｔｇｇｔｔｔｃｇｃｔａｃｃｇ（配列番号：３３７）；プライマー３９：ｃｇｇｇｔｇｇｃｔｃｃａａｔｇｇｔｇａｔｇｇｔｇａｔｇｇｔｇｇａａｔｔｃｔｔａｔｃａｇｃａｇｃｔｔｔｔｃｇｇｔｔｃｃａｃｔｔｔｔｔｔａｔｃ（配列番号：３３８）でベクターｐＭＯＲＰＨｘ９−ＦＨ−ＭＯＲ０８５４５−２ｃｙｓから増幅し、ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ制限酵素で消化し、同じ酵素で消化されたベクターｐＦＡＢ−ＥｘｐＣｏｌにライゲートした。得られた構築物をｐＦＡＢ−ＥｘｐＣｏｌ／ＭＯＲ０８５４５−２Ｃｙｓと称した。
【０３５７】
（ｉｉ）抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８５４５  Ｆａｂの微生物発現
プラスミドｐＦＡＢ−ＥｘｐＣｏｌ／ＭＯＲ０８５４５−２Ｃｙｓを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換した。形質転換した大腸菌細胞を、２２０ｒｐｍ、３０℃、ｐＨ７．０±０．１で２ｘＹＴ培地＋０．１％  グルコースで満たした１００Ｌバイオリアクターにおいて培養した。０．８のＯＤ５５０時に、細胞をＩＰＴＧで誘導し、さらに８時間培養後に遠心分離により回収した。１００ｇ湿式細胞ペレット部分を８００ｍｌのＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）に再懸濁し、５５℃、４００ｒｐｍで１６時間で溶解させた。６００Ｕ  Ｂｅｎｚｏｎａｓｅおよび５ｍＬ  ＭｇＣｌ２ｘ６Ｈ２Ｏ（１Ｍ）の添加ならびに室温でさらに１時間撹拌後、ペリプラズム抽出物を遠心分離（１時間、１１０００ｇ、４℃）により回収し、プールされ精製された抽出物を、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓからの１０ｋＤａカットオフフィルターを使用するクロスフロー濾過により、２Ｌに濃縮した。
【０３５８】
（ｉｉｉ）抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８５４５  Ｆａｂの精製
新たに衛生的なＸＫ２６／２０  プロテインＡ  セファロース  ＦＦカラムを使用する、クーリングキャビネットにおいて４℃でのＡＫＴＡ−３Ｄ  クロマトグラフィーにて精製を行った。１ｍｌ／分のローディングを除いて、全ての流速は２ｍｌ／分であった。カラムを１０ＣＶのＰＢＳで平衡にし、濃縮され滅菌濾過されたペリプラズム抽出物（約２Ｌ）を１．０ｍｌ／分でローディングした。カラムを、０．５Ｍ  アルギニンを含む１０ＣＶのＰＢＳで１回および１０ＣＶのＰＢＳのみで１回の２回洗浄した。
【０３５９】
次に、Ｆａｂを、５ＣＶの５０ｍＭ  Ｃｉｔｒａｔｅ  ｐＨ３．０、１４０ｍＭ  ＮａＣｌで溶出した。溶出液を回収し、１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ９．０−１０でｐＨ７．０に即座に中和した。該回収物を滅菌濾過し(Millipore Steriflip, 0.22μm)、ＯＤ２８０ｎｍをＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計において測定し、タンパク質濃度を配列データに基づいて計算した。該回収物を凝集（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）、純度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＭＳ）および低エンドトキシン（ＬＡＬ−ｔｅｓｔ）について試験した。これらの結果に基づいて、主要な回収物のみをさらに使用した。
【０３６０】
（ｉｖ）抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８５４５  Ｆａｂのペグ化
１００ｍＭ  Ｋ−ホスフェート、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５へのバッファー交換を、Ｚｅｂａカラムで行った。鎖間ジスルフィドの還元のために、Ｆａｂを４０ｍＭ  ＴＣＥＰで処理し、次に室温で３０分間穏やかな震盪をした。ＴＣＥＰ除去を、Ｚｅｂａ  カラムおよび上記と同じ条件を使用して繰り返した。ペグ化のために、２０倍モル過剰のＳＵＮＢＲＩＧＨＴ−ＭＥ−２００ＭＡ（ＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｊａｐａｎ）を還元されたＦａｂに加え、次に一晩室温で震盪した。サンプルを、１：４の比率で４０ｍＭ  ＣＨ３ＣＯＯＨと混合した。ペグ化付加物を、バッファーＡ（２５ｍＭ  ＣＨ３ＣＯＯＨ、ｐＨ４．５）およびバッファーＢ（７５ｍＭ  ＣＨ３ＣＯＯＨ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）の段階勾配を使用するＴＳＫ−ｇｅｌ  ＳＰ−５ＰＷ  陽イオン交換にて分離し、鎖間システインに結合された２つの２０ｋｄ  ＰＥＧを有するＦａｂ画分をさらに試験した。
【０３６１】
（ｖ）抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８５４５  Ｆａｂ−２ｘＰＥＧ２０の活性
抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８５４５  ２ｃ−Ｆａｂ−２ｘＰＥＧ２０のインビトロ活性を、実施例４に記載されているＷｎｔ１およびＷｎｔ３ａ誘導レポーター遺伝子アッセイを使用して評価した。親のＭＯＲ０８５４５  Ｆａｂ、ＭＯＲ０８５４５  Ｆａｂ−ＭＳＡ（実施例４、図１参照）およびＭＯＲ０８５４５−２ｃ−Ｆａｂを比較したとき、抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８５４５  ２ｃ−Ｆａｂ−２ｘＰＥＧ２０は、Ｗｎｔ１およびＷｎｔ３ａ誘導アッセイの両方において同様の効力であり（図７）、ＰＥＧ部分の付加がＭＯＲ０８５４５がＷｎｔシグナル伝達を阻害する能力を有意に変化させないを示唆した。
【０３６２】
抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８５４５  ２ｃ−Ｆａｂ−２ｘＰＥＧ２０のインビトロ活性を、実施例４に記載されているＷｎｔ１およびＷｎｔ３ａ誘導レポーター遺伝子アッセイを使用して評価した。親のＭＯＲ０８５４５  Ｆａｂ、ＭＯＲ０８５４５  Ｆａｂ−ＭＳＡ（実施例４、図１参照）およびＭＯＲ０８５４５−２ｃ−Ｆａｂを比較したとき、抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８５４５  ２ｃ−Ｆａｂ−２ｘＰＥＧ２０は、Ｗｎｔ１およびＷｎｔ３ａ誘導アッセイの両方において同様の効力であり（図７）、ＰＥＧ部分の付加がＭＯＲ０８５４５がＷｎｔシグナル伝達を阻害する能力を有意に変化させないを示唆した。
【０３６３】
実施例８：二重特異性ＨＳＡ融合タンパク質の作製
材料および方法
構築物
ｓｃＦｖ６４７５  ＶＨおよびＶＬ配列は、抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８  ＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ＭＯＲ０６４７５  ｓｃＦｖ由来であった（配列番号：１６６）。発現時に効果を試験することができるように、ＶＬ−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４−ＶＨ方向におけるｓｃＦｖ６４７５を、種々のリーダー配列を有するｐＮＡＴ４３ベクターにクローニングした。同様に、ｓｃＦｖ８１６８  ＶＨおよびＶＬ配列は、抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ６４７５  ｓｃＦｖ由来であった。ＶＨ−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４−ＶＬ方向におけるｓｃＦｖ８１６８を、ｐｅｌＢリーダー配列を有するｐＮＡＴ４３ベクターにクローニングした。ＴＥＶ切断部位およびＨｉｓタグを精製のためにＣ−末端に加えた。
【０３６４】
ＨＳＡ融合二パラトープ構築物のために、図８に示されるとおり、ｓｃＦｖ８１６８をヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；配列番号：２１０）のＮ−末端に融合し、ｓｃＦｖ６４７５をＨＳＡのＣ−末端に融合し、融合構築物８０１（配列番号：２６５）を調製した。ｓｃＦｖ８１６８とＨＳＡ間のリンカーはＡＡＳであり、ＨＳＡと６４７５間のリンカーはＡＡＡＬである。酸化および脱アミノ化それぞれの危険性を最小限にするために、２つの点変異Ｃ３４ＳおよびＮ５０３ＱをＨＳＡに導入した。加えて、図８および９に示されるとおり、ｓｃＦｖ８１６８およびｓｃＦｖ６４７５を逆方向においてＨＳＡに融合し、８０２（配列番号：２６９）を調製した。ｓｃＦｖ８１６８に対して２つの有益な変異（ＶＨ：Ｓ３４ＭおよびＳ４９Ａ）およびｓｃＦｖ６４７５に対して１つの変異（ＶＨ：Ｍ１００Ｆ）を導入し、安定なバージョン８０１Ｔ（３つの変異に関してＴ）および８０２Ｔ（３つの変異に関してＴ）を作製した。これらの変異は、以前に、２０１１年５月６日出願の国際出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５７２００；および２０１１年５月６日出願のＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５７２０２（これらの内容を出典明示によりそれら全体において本明細書に包含させる）に記載された。
【０３６５】
他のＨＳＡ融合二パラトープ構築物を、対応するリンカーおよびタグを有するか、またはそれらの欠失で、図９にしたがって構築した。最適なフォーマットを決定するために、複数のリンカーを試験した：ＧＳリンカー（８０３Ｔ（配列番号：２７３）および８０４Ｔ（配列番号：２７５））、ヒトＩｇＧ１のヒンジ上部からＫＴＨＴ（８０８Ｔ、配列番号：２８３）、リンカーなし（８０２Ｔ（配列番号：２８１）、８０１ＴＦ（配列番号：２９３）および８０２ＴＦ（配列番号：２９５））。加えて、最適化されたｓｃＦｖ８１６８およびｓｃＦｖ６４７５がタンデムにおいて連結されている（８１２Ｔ、配列番号：２８５）、ならびに、ＨＳＡがＣ−末端に位置されている（８１２Ｔ−ＨＳＡ；配列番号：２８７）分子を、構築し、評価した。単一のモジュール変異体８１６８ｓｃＦｖ−ＨＳＡ（８０９Ｔ；配列番号：２８９）および変異体６４７５ｓｃＦｖ−ＨＳＡ（８１０Ｔ；配列番号：２９１）分子もまた作製した。
【０３６６】
哺乳動物細胞におけるタンパク質生産およびＮｉ−ＮＴＡでの精製
構築物を、５０ｍｌの２９３Ｔ懸濁細胞において一時的に発現させた。簡潔には、最適なトランスフェクション効率のために、ＰＥＩをＤＮＡ５０μｇと１：３で混合した。１ｍｌあたり１．４ｅ６での細胞を、トランスフェクションのために使用した。トランスフェクト細胞を、２５０ｍｌのろ紙フラスコ(filter paper flask)において震盪しながらＣＯ２チャンバー  ８０ｒｐｍにおける６日間インキュベーションし、回収した。上清を、最適なタンパク質回収のために、約１ｍｌに濃縮した。製造業者からの指示にしたがって、ＭａｇｎｅＨｉｓキットにより、タンパク質を手動で精製した。精製されたタンパク質を、バッファー交換しながら一晩ＰＢＳで透析した。透析の前または後に、タンパク質サンプルをＤＳＦ分析のために使用した。
【０３６７】
非タグ化ＨＳＡ融合分子の精製
上記のとおりトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞を、１５００ｇで３０分間遠沈した。上清を０．８／０．２μｍ  Ｐａｌｌフィルタートップユニット(top unit)を通して(though)濾過し、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．５）で１：４希釈した。使用の前に、ＧＥ  Ｑ  セファロース高速流ビーズを、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー、ＨＥＰＥＳ／１Ｍ  ＮａＣｌバッファー、次にＨＥＰＥＳバッファーで洗浄した。１０ｍｌのビーズを希釈された上清に加えた。混合物を回転しながら４℃で２時間インキュベートした。結合溶液をエクステンダー(extender)を備えたＢｉｏ−Ｒａｄ  ２．５ｘ１０ｃｍ  ガラスカラムに移し、２５ｍｌの５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファーで洗浄した。タンパク質を溶出バッファー（１Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）を使用して１０ｍｌ画分に溶出した。溶出画分をＧＥ  Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ２０  ＰＥＳ  ５  ｋＤａ  ＭＷＣＯカラムを使用して２５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、次に、１０ｍｌ注射ループを使用して、ＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ２６／６０  ＳＥＣ  カラム上に負荷した。カラムを、移動相としてＧｉｂｃｏダルベッコリン酸緩衝生理食塩水にて４℃で４ｍｌ／分で流した。５ｍｌ画分を回収し、純度に基づいてプールした。
【０３６８】
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）による構築物の評価
上記のとおり哺乳動物２９３Ｔ細胞における発現および精製後に、４００μｌの以下のサンプルを、それらの熱安定性の特性化のためにＭｉｃｒｏＣａｌ  ＶＰ−Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ＤＳＣシステムに注入した：１３．８８μＭで８０１、９．３４μＭで８０１Ｔ、１５．０４μＭで８０２、および９．７５μＭで８０２Ｔ。次に、ＤＳＣプロフィールをＭｉｃｒｏＣａｌにより提供されるＤＳＣ分析プログラムを備えたＯｒｉｇｉｎにおいて分析した。
【０３６９】
結果および議論
ＨＳＡ融合分子の構築および最適化
安定性を改善されたｓｃＦｖ８１６８およびｓｃＦｃ６４７５を使用して、多くのＨＳＡ融合構築物を結合活性ならびに安定性の最適化のために設計および構築した。ｓｃＦｖ８１６８において２つの変異（ＶＨ：Ｓ３４ＭおよびＳ４９Ａ）およびｓｃＦｖ６４７５において１つの変異（ＶＨ：Ｍ１００Ｆ）が存在し、したがって、これらの融合分子は、３個の変異に関してＴと称した。図１０に示されるとおり、構築物中に３つのモジュールが存在した。８０１Ｔおよび８０３Ｔにおいて、モジュール１としてのｓｃＦｖ８１６８（ＶＨ：Ｓ３４ＭおよびＳ４９Ａ）はＨＳＡ（モジュール２）のＮ−末端に位置するが、モジュール３としてのｓｃＦｖ６４７５（ＶＨ：Ｍ１００Ｆ）はＨＳＡのＣ−末端に位置した。８０２Ｔおよび８０８Ｔにおいて、ｓｃＦｖ６４７５（ＶＨ：Ｍ１００Ｆ）はＨＳＡのＮ−末端に位置するが、ｓｃＦｖ８１６８（ＶＨ：Ｓ３４ＭおよびＳ４９Ａ）はＨＳＡのＣ−末端に位置した。ｓｃＦｖ６４７５（ＶＨ：Ｍ１００Ｆ）およびｓｃＦｖ８１６８（ＶＨ：Ｓ３４ＭおよびＳ４９Ａ）は、８１２Ｔにおいてタンデムにて、または次に８１２Ｔ−ＨＳＡにおいてＨＳＡにて融合された。
【０３７０】
モジュール１とモジュール２間のリンカーはリンカー１と称され、リンカー２はモジュール２とモジュール３間のリンカーを称する。８０１Ｔおよび８０２Ｔにおいて、リンカー１はＡＡＳであり、リンカー２はＡＡＡＬである。８０３Ｔおよび８０４Ｔにおいて、リンカー１はＧｌｙ４ＳｅｒＧｌｙＳｅｒであり、リンカー２は３ＸＧｌｙ４Ｓｅｒである。８０８Ｔにおいて、ヒンジリンカーＫＴＨＴは両方のリンカーに対して使用された。８０１ＴＦおよび８０２ＴＦおよび８０２Ｔリンカーなしにおいてリンカーは存在しなかった。８０９は４ＸＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーを介して連結されたｓｃＦｖ８１６８およびＨＳＡを含んだ。同様に、８１０は４ＸＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーを介して連結されたｓｃＦｖ６４７５およびＨＳＡを含んだ。
【０３７１】
ＨＳＡ融合分子の発現および非タグ精製
Ｈｉｓタグ化ＨＳＡ融合物ならびに非タグ化融合分子の両方の発現は、１００−２００ｍｇ／Ｌの範囲であった。異なるリンカー修飾は、哺乳動物細胞における発現に影響しないようであった（データは示していない）。図１０に示されるとおり、非タグ化ＨＳＡ融合分子の精製はしっかりと(robust)、１リットルあたり約７０−８０ｍｇの精製されたタンパク質を生じた。分子量をＬＣ−ＭＳにより確認し、分子量は予測されたものと一致した（データは示していない）。
【０３７２】
ＨＳＡ分子の熱安定性および凝集プロフィール
ＤＳＦおよびＤＳＣプロファイリングについて８０１、８０２およびそれらの変異体対応物を比較すると、ＤＳＦにおける６９℃またはＤＳＣにおける７１−７２℃でのピークは、ＨＳＡからのピークに起因した。これは、ＨＳＡのＴｍの本発明者らの社内データ（示されていない）および文献測定（Michnikら2006, J Thermal Analysis Calorimetry, 84(1) 113-117）と一致した。ＤＳＣおよびＤＳＦデータは非常に同等であり、異なる方法による測定の一貫性を示唆した（図１１）。３個の変異体８０１Ｔおよび８０２Ｔは、温度ランピング(ramping)中第１の融点について、８０１Ｔにおいて８０１に対して７−９℃増加および８０２Ｔにおいて８０２に対して１２−１３℃増加で、野生型対応物に対して有意なＴｍ改良を証明した。図１２および図１３に示されるとおり、３個の変異で、全融合分子のＴｍは、より狭くなり、融合分子の３つの異なる成分中でより統一されたＴｍを示した。
【０３７３】
８１２Ｔを除いて、種々のＨＳＡ融合分子のＴｍは６２−６６℃の範囲であった（図１４）。一般的に、Ｔｍは、６６℃、６５．５℃および６６℃のＴｍがそれぞれ観察される８０２Ｔ、８０４Ｔ、８０８Ｔにおいて示されるとおり、ＨＳＡのＮ−末端でのｓｃＦｖ６４７５およびＨＳＡのＣ−末端でのｓｃＦｖ８１６８の方向で高くなる傾向であった。反対方向において、８０１Ｔおよび８０３Ｔにより例示されるとおり、記録されるＴｍはそれぞれ６２℃および６３℃であった。
【０３７４】
凝集傾向を分析的ＳＥＣにより評価した。図１５Ａに示されるとおり、４℃で２週間貯蔵されたとき、８０２Ｔの単量体画分は９８％であったが、８０１Ｔは９３％であった。１回凍結および解凍すると、８０２Ｔのみの単量体画分は９７％にわずかに減少するが、８０１Ｔの単量体画分は９１％に減少した（図１５Ｂ）。複数回の凍結−解凍後（最大４回）、８０２Ｔの単量体画分は、９９％残った（ｎ＝１）。一般的に、凝集の最小変化は、複数回の凍結−解凍サイクル後に、いくつかのＨＳＡ−融合分子において観察され（図１６参照）、一般的に、これらの分子が凝集傾向に関して安定なタンパク質であることを示した。上記Ｔｍにおける傾向と一致して、８０２Ｔおよび８０４Ｔの両方がそれらの姉妹(sibling)分子、８０１Ｔおよび８０３Ｔよりも低い凝集を示したことがまた興味深かった。
【０３７５】
約２ｍｇ／ｍｌの濃度で、８０２ＴＦの単量体画分は９７．７％と記録され、８０１ＴＦは９６．６％と記録された。約５ｍｇ／ｍｌに濃縮したとき、８０２ＴＦは９５．６％と記録され、８０１ＴＦは９０．８％と記録された。結果は、濃度によって引き起こされる凝集の一般的な傾向と一致した。
【０３７６】
実施例９：ＥＬＩＳＡによるＨＳＡ−融合分子の結合活性の評価
材料および方法
ＬＲＰ６タンパク質に対する種々の融合タンパク質（図９参照）の結合ＥＣ５０を、ＥＬＩＳＡにより測定した。一般的に、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを、４℃で一晩、２．５μｇ／ｍｌ  ＬＲＰ６抗原（詳細について以下参照）でコーティングした。プレートを１時間５０μｌの２％  ＢＳＡでブロックし、洗浄溶液（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を有するＰＢＳ）で５回洗浄した。それに応じて、サンプルを１％ＢＳＡで希釈した。プレートを室温で１時間インキュベートし、３回洗浄した。検出を、１％  ＢＳＡにて１：２０００希釈で５０μｌ  ｐｅｎｔａＨｉｓ−ＨＲＰ（Qiagen Mat. No. 1014992）を加えることにより行い、室温で１時間インキュベートし、３回洗浄した。５０μｌの基質試薬ＡプラスＢ（R&D Systems）を加え、次に、色に依存して５−２０分間インキュベートした。反応を２５μｌの停止溶液を加えることにより停止させ、次にＢｉｏｔｅｋ  ＥＬ８０８プレートリーダーを使用して４５０ｎｍで吸光度を読んだ。
【０３７７】
一様な(uniform)方法において融合分子の結合を測定するために、全ての分子をストレプトアビジン−ＨＲＰにより検出されるようにビオチン化した。モノ特異的ＨＳＡ融合分子（ｓｃＦｖ８１６８−ＨＳＡ（８０９）およびｓｃＦｖ６４７５−ＨＳＡ（８１０））をコントロールとして使用した。全体として、３つの抗原を使用した：ＬＲＰ６プロペラドメイン１−２（ＰＤ１／２、受入番号ＮＰ００２３２７のアミノ酸残基１９−６２９）、ＬＲＰ６プロペラドメイン３−４（ＰＤ３／４、受入番号ＮＰ００２３２７のアミノ酸残基６３１−１２４６）およびＬＲＰ６プロペラドメイン１−４−Ｆｃ（ＰＤ１−４、ＬＲＰ６−Ｆｃ；R&D Systems, catalog No: 1505-LR）。
【０３７８】
競合ＥＬＩＳＡ
二パラトープ構築物がＬＲＰ６の複数のドメインに結合する能力を決定するために、競合ＥＬＩＳＡを行った。例えば、ＬＲＰ６プロペラドメイン１−２（ＰＤ１／２）への結合が他のＬＲＰ６プロペラドメインへの結合を妨げたと決定するために、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを４℃で一晩５μｇ／ｍｌでのＰＤ１／２でコーティングした。プレートを５０μｌの２％  ＢＳＡで１時間でブロックし、洗浄溶液（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を有するＰＢＳ）で５回洗浄した。１％  ＢＳＡにおいて２ｎＭにてビオチン化ＨＳＡ融合分子８０２Ｔを、バッファーまたは溶液において１００ｎＭで異なる抗原（ＰＤ１／２、ＰＤ３／４またはＬＲＰ６−Ｆｃ）と混合した。アッセイプレートに加える前に、混合物を室温で３０分間インキュベートした。プレートを室温で１時間さらにインキュベートし、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。検出を以下のとおりに行った：１％  ＢＳＡにおいて１：２００希釈での５０μｌのストレプトアビジン−ＨＲＰ（R&D Systems, Cat #890803）を加え、プレートを室温で１時間インキュベートし、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。５０μｌの基質試薬ＡプラスＢ（R&D Systems, Cat #DY999)を加え、次に、色に依存して５−２０分間インキュベートした。反応を２５μｌの停止溶液(R&D systems, cat #DY994)を加えることにより停止させ、次にＢｉｏｔｅｋ  ＥＬ８０８プレートリーダーを使用して４５０ｎｍで吸光度を読んだ。
【０３７９】
ｓｃＦｖ８１６８またはｓｃＦｖ６４７５の両方をコントロールとして使用した。競合ＥＬＩＳＡを、ＬＲＰ６  ＰＤ３／４およびＬＲＰ６プロペラドメイン１−４−Ｆｃ（ＰＤ１−４、ＬＲＰ６−Ｆｃ；R&D Systems, catalog No: 1505-LR）でコーティングしたアッセイプレートを使用して行った。
【０３８０】
結果および議論
ＥＬＩＳＡによる結合評価
いくつかのＨＳＡ融合分子（詳細について図９参照）のＥＬＩＳＡ結合を評価した。データを図１７に示す。図１７Ａおよび１７Ｂに示されるとおり、８１６８−ＨＳＡ（８０９）は０．５４ｎＭのＥＣ５０でＰＤ１／２に結合するが、ＰＤ３／４への結合は非常に弱い（ＥＣ５０：＞７５ｎＭ）。対照的に、ｓｃＦｖ  ６４７５−ＨＳＡ（８１０）は、０．４６ｎＭのＥＣ５０でＰＤ３／４に、および＞１５８ｎＭのＥＣ５０でＰＤ１／２に結合する。これは、ｓｃＦｖ８１６８およびｓｃＦｖ６４７５がそれぞれＬＲＰ６  ＰＤ１／２およびＰＤ３／４に特異的に結合することを示す。ＬＲＰ６−Ｆｃへの種々の融合分子の結合をまた比較した。結果は図１７Ｃに示される。加えて、８１２Ｔ−ＨＳＡをＥＬＩＳＡ結合について試験した。図１７Ｄに示されるとおり、結合ＥＣ５０は８０２Ｔと同様であると概算される。さらに、ヒトＬＲＰ６への８０２ＴＦの結合もまた評価した。結果は図１７Ｅにおいて示される。ＥＬＩＳＡにより評価されるとき、８０２ＴＦもまた、マウスおよびカニクイザルＬＲＰ６へと同様の結合を示した。
【０３８１】
競合ＥＬＩＳＡ
二パラトープ分子が標的に結合し、ＬＲＰ６完全分子における２つの異なるパラトープを占有するか否かを決定するために、競合ＥＬＩＳＡアッセイを行った。第１に、結合および競合を、抗原ＰＤ１／２または抗原ＰＤ３／４のいずれかについて評価した。図１８Ａに示されるとおり、ＰＤ１／２またはＰＤ３／４のいずれかをプレート表面上に被覆した。次に、２ｎＭでの８０２Ｔを、１００ｎＭでのＰＤ１／２、ＰＤ３／４またはＬＲＰ６−Ｆｃを有する溶液にて混合し、次にウェルに適用した。結果は、溶液におけるＰＤ１／２は、表面上に被覆されたＰＤ１／２への８０２Ｔの結合と競合することができるが、ＰＤ３／４は該結合と競合することができないことを示す。対照的に、可溶性ＰＤ３／４は、ＰＤ１／２結合プレートではなくＰＤ３／４結合プレートに対して結合について８０２Ｔと競合することができる。予期されるとおり、溶液におけるＬＲＰ６  ＰＤ１−４（図１８ＡにおけるＬＲＰ６）は、表面上に被覆されたＰＤ１／２およびＰＤ３／４抗原の両方への結合に対して８０２Ｔと競合することができる。
【０３８２】
ＬＲＰ６−Ｆｃ（R&D Systems, catalog No: 1505-LR）のＬＲＰ６  ＰＤ１−４がＥＬＩＳＡプレート上に固定されているさらなる実験を行った（図１８Ｂ）。これらの試験において、溶液において１００ｎＭにてＰＤ１／２もＰＤ３／４も無しで、固定されたＬＲＰ６への結合に対して８０２Ｔと完全に競合することができた。しかしながら、溶液におけるＬＲＰ６は該結合と競合することができた。これらの結果は、ＬＲＰ６上への８０２Ｔの結合が恐らく２つのパラトープを同時に占有することを示唆する。
【０３８３】
実施例１０：Ｗｎｔリガンド駆動レポーター遺伝子アッセイにおけるＨＳＡ−融合分子のインビトロ機能活性の評価
上記実施例４に記載されているのと同じ方法を使用して、図９に記載されているＨＳＡ融合分子を、Ｗｎｔ１およびＷｎｔ３ａ誘導レポーター遺伝子活性の両方を阻害する能力について評価した。
【０３８４】
８０１、８０１Ｔ、８０２および８０２Ｔを、一時的にトランスフェクトされた細胞フォーマットを使用して試験し、全てがＷｎｔ１およびＷｎｔ３ａ−介在シグナル伝達の両方の強力なインヒビターであることを見出された（図１９Ａ）。さらなる分子もまた、このアッセイフォーマットを使用して評価し（図１９Ｂおよび図１９Ｃ）、作成されたデータは、リンカーの変化およびＨｉｓタグの存在／非存在が抗−ＬＲＰ６  ＨＳＡ−融合分子の効力に影響しないことを証明している。種々の抗−ＬＲＰ６  ＨＳＡ−融合分子が共培養フォーマットを使用して試験されたとき、同様のデータが得られた（示されていない）。２つのｓｃＦｖ部分がタンデムにおいて融合される８１２Ｔ、および２つのｓｃＦｖ部分がタンデムにおいて融合され、次にＨＳＡへ融合されている８１２Ｔ−ＨＳＡの効力が、８０２Ｔと同様であることを見出した（図１９Ｄ）。これらの結果は、実施例９において報告されている結合ＥＬＩＳＡデータと一致しており、抗−ＬＲＰ６  ｓｃＦｖ’ｓが、いくつかの方向において、および異なる位置でのＨＳＡ融合にて効力を保持することができることを示唆する。Ｈｉｓタグおよびリンカーの両方を欠いている８０１Ｔおよび８０２Ｔの型もまた作製し、レポーター遺伝子アッセイにおいて試験されたとき、効力が８０１ＴＦに対して８０２Ｔと同様に見られ、効力の増加が８０２ＴＦに対して観察された（図１９Ｅ）。
【０３８５】
ＨＥＫ２９３細胞に加えて、ＭＤＡ−ＭＢ４３５黒色腫細胞においてＷｎｔ１およびＷｎｔ３ａ誘導Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する８０１Ｔおよび８０２Ｔの活性を決定した。これらの試験において、ＳＴＦレポーターにて安定に感染したＭＤＡ−ＭＢ４３５細胞を、共培養フォーマットにおいてＷｎｔ１およびＷｎｔ３ａで刺激した。ＳＴＦレポーターのレンチウイルスをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にパッケージングし、ＭＤＡ−ＭＢ４３５細胞を感染するためにウイルス上清を使用した。様々な安定に選択されたクローンを、上記実施例４に記載されているレポーター遺伝子共培養アッセイのために使用した。ＨＥＫ２９３細胞に加えて、８０１Ｔおよび８０２Ｔの両方は、ＭＤＡ−ＭＢ４３５細胞において、Ｗｎｔシグナル伝達の強力なインヒビターであった（図２０）。このデータはさらに、抗−ＬＲＰ６  ＨＳＡ融合分子がＷｎｔシグナル伝達を阻害する能力がＨＥＫ２９３細胞に限定されないこと、およびこれらの分子が広範囲の設定においてＷｎｔシグナル伝達を阻害する可能性を有することを示唆する。
【０３８６】
実施例１１：インビボでの抗−ＬＲＰ６血清アルブミン構築物の薬物動態学および薬物動力学特性の評価
いくつかの抗−ＬＲＰ６  ＨＳＡ構築物の薬物動態学（ＰＫ）および薬物動力学（ＰＤ）特性を、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１腫瘍を有するマウスおよび腫瘍を有さないラットにおいて評価した。（DeAlmeidaら (2007) Cancer Res. 67, 5371-5379); Ettenbergら (2010) Proc. Nat. Acad. Sci. 107, 15473-15478；２００８年１０月３１日出願の国際出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６４８２１；２０１１年５月６日出願のＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５７２００；および２０１１年５月６日出願のＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５７２０２（これらの内容をそれら全体において出典明示により本明細書に包含させる）。
【０３８７】
８０２Ｔ、８０２Ｔリンカーなしおよび８０２Ｔ  ｈｉｓ  ｔａｇなしのＰＫ特性を決定するために、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１腫瘍を有するヌードマウスを５ｍｇ／ｋｇの上記分子の単回投与でｉ．ｖ．投与した。ＨＳＡ構築物の血清濃度を、注入の完了後に複数の時点（それぞれ０．５、２、８、２４および４８時）で実施例５に記載されている方法を使用して質量分析により決定した。結果は図２１Ａに示される。全ての分子のＰＫ特性は、約１４時間の半減期と類似であった。加えて、サンプルを、７、２４および４８時の時点でのＷｎｔシグナル伝達阻害の分析のために取った。これらのサンプルにおいて、β−カテニン標的遺伝子Ａｘｉｎ２のｍＲＮＡ発現のレベルを分析した。結果は図２１Ｂに示される。上記実施例５に記載されている抗−ＬＲＰ６  Ｆａｂ  ＭＳＡ構築物および他の抗ＬＲＰ６標的化薬剤で得られたデータと一致して、Ａｘｉｎ２  ｍＲＮＡ発現の減少を観察し、この大きさは抗−ＬＲＰ６  ＨＳＡ分子の血清濃度に依存した、Ettenbergら (2010) Proc. Nat. Acad. Sci. 107, 15473-15478；２００８年１０月３１日出願の国際出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６４８２１；２０１１年５月６日出願のＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５７２００；および２０１１年５月６日出願のＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５７２０２（これらの内容をそれら全体において出典明示により本明細書に包含させる）。ＰＫデータと一致して、全ての３分子（８０２Ｔ、８０２Ｔリンカーなしおよび８０２Ｔ  ｈｉｓ  ｔａｇなし）は、Ａｘｉｎ２  ｍＲＮＡレベルにおいて同様の変化を示した（図２１Ｂ）。
【０３８８】
８０１Ｔ、８０２Ｔおよび８０２Ｔ  ｈｉｓ  ｔａｇなしのＰＫ特性を評価するために、ナイーブ  Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを５ｍｇ／ｋｇの上記分子の単回投与でＩＶ投与した。ＨＳＡ構築物の血清濃度を、注入の完了後に複数の時点（それぞれ１、６、２４、４８、７２、９６および１９２時）で実施例５に記載されている質量分析により決定した。８０２Ｔに対する結果は図２２に示される。アッセイの検出限界以下であったため、９６および１９２時の時点に対して値は報告されていないことに注意すること。
【０３８９】
ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１−腫瘍を有するヌードマウスにおける８０２ＴＦのＰＫ特性もまた評価した。これらの試験において、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１腫瘍を有するヌードマウスを６または２４ｍｇ／ｋｇの８０２ＴＦの単回投与でｉ．ｖ．投与し、血清濃度を、注入の完了後に複数の時点（それぞれ１、２、８、２４、４８および７２時）で実施例５に記載されている方法を使用して質量分析により決定した。終末相半減期は、６ｍｇ／ｋｇ投与後１８時間から２４ｍｇ／ｋｇ投与後２４時間の範囲で見られた。
【０３９０】
実施例１２：ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１同種移植モデルにおける抗−ＬＲＰ６血清アルブミン構築物のインビボでの抗腫瘍有効性の評価
抗−ＬＲＰ６  プロペラ１＋３  ｓｃＦｖ６４７５（ＶＨ：Ｍ９５Ｆ）−ＨＳＡ−ｓｃＦｖ８１６８（ＶＨ：Ｓ３４ＭおよびＳ４９Ａ）８０２Ｔの抗腫瘍活性を、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１同種移植モデルにおいて評価した。ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１腫瘍断片をメスヌードマウスに皮下に（ＳＣ）移植した。移植２３日後、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１腫瘍（ｎ＝５、平均１８５ｍｍ３；範囲：１１５−２６５ｍｍ３）を有するマウスを、ビヒクル（ＰＢＳ、静脈内に（ＩＶ）、週１回（ｑｗ）、またはＬＲＰ６−プロペラ１＋３  ８０２Ｔ（２、４、６および８ｍｇ／ｋｇ、ｉｖ、週に３回（３ｑｗ）で処理し、腫瘍を週に２回カリパスで測った（図２３Ａ）。８０２Ｔは、８ｍｇ／ｋｇ  ３ｑｗで１０％のＴ／Ｃに達する用量依存抗腫瘍活性を証明した（ｐ＜０．０５  対  ビヒクル）。加えて、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１腫瘍におけるＷｎｔ−シグナル伝達に対する種々の用量の８０２Ｔの効果は、試験の最後に評価した。腫瘍を最後の投与の７時間後に回収し、β−カテニン標的遺伝子  Ａｘｉｎ２のｍＲＮＡ発現を評価した。図２３Ｂに示されるとおり、抗腫瘍効果と一致して、Ａｘｉｎ２  ｍＲＮＡ発現の減少を観察した。
【０３９１】
さらなる試験において、８０２Ｔの抗腫瘍活性を、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１同種移植モデルにおいて、抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８−Ｆａｂ−ＭＳＡと比較して評価した。ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１腫瘍断片をメスヌードマウスに皮下に（ＳＣ）移植した。移植２３日後、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１腫瘍（ｎ＝６、平均２３６ｍｍ３；範囲：１２４−４０２ｍｍ３）を有するマウスを、ビヒクル（ＰＢＳ、静脈内に（ＩＶ）、週１回（ｑｗ）、８０２Ｔ（６、１２および２４ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ、週に３回（３ｑｗ）、およびＬＲＰ６  プロペラ１  ８１６８−Ｆａｂ−ＭＳＡ（６ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ、３ｑｗ）で処理し、腫瘍を週に２回カリパスで測った（図２４Ａ）。８０２Ｔは、６ｍｇ／ｋｇ  ３ｑｗで投与されたとき８％のＴ／Ｃ、ならびに、それぞれ１２ｍｇ／ｋｇおよび２４ｍｇ／ｋｇ  ３ｑｗで投与されたとき４４％および９８％退行に達する用量依存抗腫瘍活性を証明した（両方ともｐ＜０．０５  対  ビヒクル）。６ｍｇ／ｋｇ  ３ｑｗで投与されたＬＲＰ６−プロペラ１  ８１６８−Ｆａｂ−ＭＳＡは９４％退行を引き起こした（ｐ＜０．０５  対  ビヒクル）。上記のとおり、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１  腫瘍におけるＷｎｔ−シグナル伝達に対する種々の用量の８０２Ｔおよび抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８  Ｆａｂ−ＭＳＡの効果は、試験の最後に評価した。腫瘍を最後の投与の７時間後に回収し、β−カテニン標的遺伝子  Ａｘｉｎ２のｍＲＮＡ発現を評価した。図２４Ｂに示されるとおり、該分子の抗腫瘍効果と一致して、Ａｘｉｎ２  ｍＲＮＡ発現の減少を観察した。
【０３９２】
８０２ＴＦの抗腫瘍活性を、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１同種移植モデルにおいて評価した。ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１腫瘍断片をメスヌードマウスに皮下に（ＳＣ）移植した。移植２６日後、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１腫瘍（ｎ＝６、平均２０４ｍｍ３；範囲：１２７−３８４ｍｍ３）を有するマウスを、ビヒクル（ＰＢＳ、静脈内に（ＩＶ）、週１回（ｑｗ）、８０２ＴＦ（６、１２および２４ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ、週に３回（３ｑｗ）、および抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８−Ｆａｂ−ＭＳＡ（６ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ、３ｑｗ）で処理し、腫瘍を週に２回カリパスで測った（図２４Ｃ）。８０２ＴＦは、１２または２４ｍｇ／ｋｇ  ３ｑｗで投与されたとき、３５日目に〜４５％退行に達する用量依存抗腫瘍活性を証明した（ｐ＜０．０５  対  ビヒクル）。上記のとおり、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１腫瘍におけるＷｎｔ−シグナル伝達に対する種々の用量の８０２ＴＦおよび抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８  Ｆａｂ−ＭＳＡの効果は、試験の最後に評価した。腫瘍を最後の投与の３および７時間後に回収し、β−カテニン標的遺伝子  Ａｘｉｎ２のｍＲＮＡ発現を評価した。
【０３９３】
実施例１３：抗−ＬＲＰ６二パラトープＦｃベースの融合分子の作製および結合特性
ＨＳＡ−融合に加えて、Ｆｃベースの二パラトープ分子もまた作製した。これらの分子において、ｓｃＦｖ８１６８またはｓｃＦｖ６４７５の熱安定性を増強された変異体を、ＣＨ２のＮ−末端またはＣＨ３のＣ−末端に融合し、図２５および図２６に示されるとおりｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ融合物を作製し、それぞれ９１１Ｔ（配列番号：２９７）および９１２Ｔ（配列番号：２９９）を作製した。
【０３９４】
本願の実施例８に以前に記載されている方法を使用して、該分子を生産し、精製し、特徴付けした。それらは良く発現した。ゲル純度は図２７に示される。加えて、９１１Ｔおよび９１２Ｔの両方は分析ＳＥＣにより評価された。データは、それぞれ図２８および図２９に示される。ＤＳＦによって、９１１ＴのＴｍは５３．５℃、６０℃であり、９１２ＴのＴｍは５２．５℃および６２℃である。
【０３９５】
９１１Ｔおよび９１２Ｔの両方の結合ＥＣ５０は、本願の実施例１０に記載されているのと同じ方法を使用して、ＥＬＩＳＡにより測定した。結果は図３０に示されている。ＬＲＰ６−Ｆｃ（R&D Systems, catalog No: 1505-LR)への９１１Ｔに対する結合ＥＣ５０は０．０８４ｎＭであり、９１２ＴのＥＣ５０は０．１１３ｎＭであった。これらは、全て、０．２７６ｎＭでの８０２ＴのＥＣ５０より低く、恐らく４価のＦｃ−融合分子を示す。
【０３９６】
実施例１４：抗−ＬＲＰ６二パラトープＦｃベースの融合分子のインビトロでの機能活性の評価
図２５に記載されている抗−ＬＲＰ６二パラトープＦｃベースの融合分子を、上記実施例４に記載されているのと同じ方法を使用して、Ｗｎｔ１およびＷｎｔ３ａ誘導レポーター遺伝子活性の両方を阻害する能力について評価した。
【０３９７】
９１１Ｔおよび９１２Ｔを一時的にトランスフェクトされた細胞フォーマットを使用して試験し、全てがＷｎｔ１およびＷｎｔ３ａ−介在シグナル伝達の両方の強力なインヒビターであることを見出した（図３１）。加えて、全ての分子が少なくとも８０２Ｔと同じ程度に強力であり、複数の半減期を延長するタンパク質と融合されたとき、抗−ＬＲＰ６  ｓｃＦｖ部分がそれらの効力を保持することができることを示唆した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ−１】
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【図１５Ａ−２】
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【図１５Ｂ−１】
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【図１５Ｂ−２】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４−１】
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【図３４−２】
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【図３５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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