(57)【要約】本発明は、グリコーゲンベースのカチオン性ポリマー、前記カチオン性ポリマーのアニオン性化合物との複合体、前記複合体を含む医薬組成物、および前記アニオン性化合物を特定の薬理学的標的、例えば臓器、組織または細胞に送達またはトランスフェクトするための前記複合体の使用に関する。
2015510020.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）：
【化１】
2015510020.tif 000048
（ａ）
であって、式中、Ｒ基は、同じでも異なってもよく、水素原子、任意で医薬的に許容可能な有機もしくは無機塩基を有する塩形態の、カルボキシメチル基、またはＮＨ２−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ＮＨ２−｛［（Ｃ１−Ｃ６）アルキル］−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアンモニオ｝−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、｛［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアンモニオ｝−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ＮＨ２−［（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、｛［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ｝−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、［トリ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアンモニオ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アゾシクリル−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択される窒素を含有する基であり、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル鎖は、同じでも異なってもよく、任意で１つ以上のヒドロキシル基で置換され、
ｎは１以上の整数である、（ａ）；ならびに
（ｂ）：
【化２】
2015510020.tif 000049
（ｂ）
であって、式中、Ｒ１は水素原子、任意で医薬的に許容可能な有機もしくは無機塩基を有する塩形態の、カルボキシメチル基、またはＮＨ２−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ＮＨ２−｛［（Ｃ１−Ｃ６）アルキル］−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアンモニオ｝−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、｛［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアンモニオ｝−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ＮＨ２−［（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、｛［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ｝−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、［トリ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアンモニオ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択される窒素を含有する基から選択され、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル鎖は、同じでも異なってもよく、任意で１つ以上のヒドロキシル基で置換され、
Ｘ１およびＸ２は、同じでも異なってもよく、−ＯＨ基または窒素を含有する−ＮＨＲ２基であり、Ｒ２は水素原子、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、Ｈ−［ＮＨ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル］ｐ−から選択され、ｐは１以上の整数であり、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基は同じでも異なってもよく、
ｍは１以上の整数である、（ｂ）
からなる群から選択される少なくとも１つの繰り返し単位を含むグリコーゲンベースのカチオン性ポリマーであるが、
ただしＲ、Ｒ１、Ｘ１およびＸ２からの少なくとも１つは、それぞれＲ、Ｒ１、Ｘ１およびＸ２について定義された、窒素を含有する基であり、
前記グリコーゲンベースのカチオン性ポリマーはグリコーゲンのＮ−（３−クロロ−２−ヒドロキシプロピル）−トリメチルアンモニウム塩化物との反応により得られる生成物とは異なるることを条件とする、グリコーゲンベースのカチオン性ポリマー。
【請求項２】
前記Ｒ基は、同じでも異なってもよく、水素原子、任意で医薬的に許容可能な有機もしくは無機塩基を有する塩形態の、カルボキシメチル基または［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、｛［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ３）アルキル−ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアンモニオ｝−（Ｃ１−Ｃ３）−アルキル、｛［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ｝−（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、［トリ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアンモニオ］−（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、アゾシクリル−（Ｃ１−Ｃ３）アルキルから選択される窒素を含有する基であり、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル鎖は、同じでも異なってもよく、任意で１つのヒドロキシル基で置換される、請求項１に記載のグリコーゲンベースのカチオン性ポリマー。
【請求項３】
前記Ｒ基は、同じでも異なってもよく、水素原子、任意で医薬的に許容可能な有機もしくは無機塩基を有する塩形態の、カルボキシメチル基またはＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチル、［（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）ジメチルアンモニオ］エチル、［（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）ジメチルアンモニオ］プロピル、［（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチル）ジエチルアンモニオ］エチル、（トリメチルアンモニオ）−２−ヒドロキシプロピル、ピペリジル−Ｎ−エチルもしくはモルホリニル−Ｎ−エチルから選択される窒素を含有する基である、請求項２に記載のグリコーゲンベースのカチオン性ポリマー。
【請求項４】
Ｒ１は水素原子、任意で医薬的に許容可能な有機もしくは無機塩基を有する塩形態の、カルボキシメチル基、または［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、｛［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ３）アルキル−ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアンモニオ｝−（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、｛［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ｝−（Ｃ１−Ｃ３）アルキルもしくは［トリ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアンモニオ］−（Ｃ１−Ｃ３）アルキルから選択される窒素を含有する基であり、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル鎖は、同じでも異なってもよく、任意で１つのヒドロキシル基で置換される、前請求項のいずれか１項に記載のグリコーゲンベースのカチオン性ポリマー。
【請求項５】
Ｒ１は水素原子またはカルボキシメチル基である、請求項４に記載のグリコーゲンベースのカチオン性ポリマー。
【請求項６】
Ｘ１およびＸ２は、同じでも異なってもよく、窒素を含有する−ＮＨＲ２基であり、Ｒ２は水素原子またはＨ−［ＮＨ−（Ｃ１−Ｃ４）アルキル］ｐ−であり、ｐは１以上の整数であり、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基は同じでも異なってもよい、前請求項のいずれか１項に記載のグリコーゲンベースのカチオン性ポリマー。
【請求項７】
前記Ｈ−［ＮＨ−（Ｃ１−Ｃ４）アルキル］ｐ−基は、５０〜３，０００ダルトンの分子量を有する、ポリエチレンイミン、スペルミン（Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨ２）、またはスペルミジン（Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ２）である、請求項６に記載のグリコーゲンベースのカチオン性ポリマー。
【請求項８】
前記繰り返し単位（ａ）および（ｂ）は：
−ＮＨ２−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ＮＨ２−［（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、｛［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ｝−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルおよびアゾシクリル−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルからなる群から選択される、生理学的ｐＨでイオン化可能である少なくとも１つの窒素を含有する基；ならびに
−ＮＨ２−｛［（Ｃ１−Ｃ３）アルキル］−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアンモニオ｝−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルおよび｛［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ３）アルキル−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアンモニオ｝−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルからなる群から選択される、生理学的ｐＨより低いｐＨでイオン化可能である少なくとも１つの窒素を含有する基
を含む、前請求項のいずれか１項に記載のグリコーゲンベースのカチオン性ポリマー。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のグリコーゲンベースのカチオン性ポリマーとアニオン性化合物との間の複合体。
【請求項１０】
前記複合体は前記グリコーゲンベースのカチオン性ポリマーの重量に対して５重量％〜６０重量％の量の前記アニオン性化合物を含む、請求項９に記載の複合体。
【請求項１１】
前記複合体は前記グリコーゲンベースのカチオン性ポリマーの重量に対して１０重量％〜５０重量％の量の前記アニオン性化合物を含む、請求項１０に記載の複合体。
【請求項１２】
（Ａ）（１）（ａ）：
【化３】
2015510020.tif 000050
（ａ）
であって、式中、Ｒ基は、同じでも異なってもよく、水素原子、任意で医薬的に許容可能な有機もしくは無機塩基を有する塩形態の、カルボキシメチル基、またはＮＨ２−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ＮＨ２−｛［（Ｃ１−Ｃ６）アルキル］−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアンモニオ｝−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、｛［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアンモニオ｝−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ＮＨ２−［（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、｛［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ｝−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、［トリ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアンモニオ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アゾシクリル−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択される窒素を含有する基であり、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル鎖は、同じでも異なってもよく、任意で１つ以上のヒドロキシル基で置換され、
ｎは１以上の整数である、（ａ）；ならびに
（ｂ）：
【化４】
2015510020.tif 000051
（ｂ）
であって、式中、Ｒ１は水素原子、任意で医薬的に許容可能な有機もしくは無機塩基を有する塩形態の、カルボキシメチル基、またはＮＨ２−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ＮＨ２−｛［（Ｃ１−Ｃ６）アルキル］−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアンモニオ｝−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、｛［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアンモニオ｝−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ＮＨ２−［（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、｛［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ｝−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、［トリ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアンモニオ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択される窒素を含有する基から選択され、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル鎖は、同じでも異なってもよく、任意で１つ以上のヒドロキシル基で置換され、
Ｘ１およびＸ２は、同じでも異なってもよく、−ＯＨ基または窒素を含有する−ＮＨＲ２基であり、Ｒ２は水素原子、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、Ｈ−［ＮＨ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル］ｐ−から選択され、ｐは１以上の整数であり、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基は同じでも異なってもよく、
ｍは１以上の整数である、（ｂ）
からなる群から選択される少なくとも１つの繰り返し単位を含むグリコーゲンベースのカチオン性ポリマーであるが、
ただしＲ、Ｒ１、Ｘ１およびＸ２からの少なくとも１つは、それぞれＲ、Ｒ１、Ｘ１およびＸ２について定義された、窒素を含有する基である、グリコーゲンベースのカチオン性ポリマーと
（２）アニオン性化合物と
の間の複合体；ならびに
（Ｂ）少なくとも１つの医薬的に許容可能な賦形剤
を含む医薬組成物。
【請求項１３】
前記アニオン性化合物は核酸である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
注射用の、前請求項１２および１３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１５】
（１）（ａ）：
【化５】
2015510020.tif 000052
（ａ）
であって、式中、Ｒ基は、同じでも異なってもよく、水素原子、任意で医薬的に許容可能な有機もしくは無機塩基を有する塩形態の、カルボキシメチル基、またはＮＨ２−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ＮＨ２−｛［（Ｃ１−Ｃ６）アルキル］−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアンモニオ｝−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、｛［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアンモニオ｝−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ＮＨ２−［（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、｛［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ｝−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、［トリ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアンモニオ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アゾシクリル−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択される窒素を含有する基であり、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル鎖は、同じでも異なってもよく、任意で１つ以上のヒドロキシル基で置換され、
ｎは１以上の整数である、（ａ）；ならびに
（ｂ）：
【化６】
2015510020.tif 000053
（ｂ）
であって、式中、Ｒ１は水素原子、任意で医薬的に許容可能な有機もしくは無機塩基を有する塩形態の、カルボキシメチル基、またはＮＨ２−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ＮＨ２−｛［（Ｃ１−Ｃ６）アルキル］−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアンモニオ｝−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、｛［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアンモニオ｝−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ＮＨ２−［（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、｛［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ｝−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、［トリ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアンモニオ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択される窒素を含有する基から選択され、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル鎖は、同じでも異なってもよく、任意で１つ以上のヒドロキシル基で置換され、
Ｘ１およびＸ２は、同じでも異なってもよく、−ＯＨ基または窒素を含有する−ＮＨＲ２基であり、Ｒ２は水素原子、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、Ｈ−［ＮＨ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル］ｐ−から選択され、ｐは１以上の整数であり、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基は同じでも異なってもよく、
ｍは１以上の整数である、（ｂ）
からなる群から選択される少なくとも１つの繰り返し単位を含むグリコーゲンベースのカチオン性ポリマーであるが、
ただしＲ、Ｒ１、Ｘ１およびＸ２からの少なくとも１つは、それぞれＲ、Ｒ１、Ｘ１およびＸ２について定義された、窒素を含有する基である、グリコーゲンベースのカチオン性ポリマーと
（２）アニオン性化合物と
の間の複合体の、前記アニオン性化合物を特定の薬理学的標的内に送達またはトランスフェクトするための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はグリコーゲンベースのカチオン性ポリマー、前記ポリマーおよび少なくとも１つのアニオン性化合物を含む複合体、ならびにアニオン性化合物を送達するための前記複合体の使用に関する。
【０００２】
とくに、グリコーゲンベースのカチオン性ポリマーは、核酸のトランスフェクションのための、非ウイルスベクターとして有用である。
【背景技術】
【０００３】
有効成分の副作用を低減するため、およびそれらの治療効果を最大化するため、医薬剤形により有効成分の放出フェーズを制御する制御放出システム、また有効成分を特定の薬理学的標的に送達および配向することができるシステムが開発された。
【０００４】
とくに、送達および配向システムは有効成分と、得られる複合体が保存および投与中は安定であるが、有効成分を正しい薬理学的標的に放出するように相互作用しなければならない。
【０００５】
一般的には、送達システムと有効成分との間の相互作用は非共有結合性であり、例えば、静電、イオンまたはファンデルワールス相互作用、水素結合等である。
【０００６】
送達および配向システムを開発する際の問題は、１つは低分子量の有効成分について、もう１つは高分子量のポリマーおよび分子、例えば核酸について提起された。
【０００７】
とくに、遺伝子欠損を補正する、遺伝子を過剰発現する、遺伝子の発現を抑制する、または細胞内に新たな機能を導入することを目的とする、核酸配列および／または遺伝子構築物の標的細胞への挿入の任意のプロセスは、遺伝子治療の分野では「トランスフェクション」の語で表される。
【０００８】
このプロセスは、遺伝子疾患の治療、ならびに慢性疾患の治療および予防戦略の開発の両方において有望であると考えられる。
【０００９】
しかしながら、天然型でインビボ投与される場合、核酸は、他のポリアニオン性物質と同様に、カチオン性酵素（例えばヌクレアーゼおよびプロテアーゼ）により急速に分解され、細胞にわずかしか吸収されない。
【００１０】
これまで研究され、開発された遺伝子ベクターとしては、ウイルス系（レトロウイルス、アデノウイルス、等）および非ウイルス系（リポソーム、ポリマー、ペプチド、等）がある。
【００１１】
ウイルスベクターは非ウイルス系より高いトランスフェクション効率を有することが知られている。しかしながら、ウイルスベクターのインビボ使用は、多数の欠点、例えば複製のリスク、免疫反応を誘発する可能性、細分化された細胞のみが標的として利用可能であること、サイズの大きな遺伝子の低い充填量、またはＤＮＡフラグメントのランダム挿入により制限される。
【００１２】
非ウイルスベクターに基づく遺伝子治療の使用は、比較的安全であり、調製コストが低いなどの多数の利点を有することが当技術分野において知られている。
【００１３】
非ウイルスベクター、例えばカチオン性ポリマー、リポソームおよび合成ベクターは、ウイルスベクターの使用の代替として幅広く研究されている。
【００１４】
Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチル−デキストラン（ＤＥＡＥ−デキストラン）は、有効成分の制御放出（例えば、例えば国際公開第ＷＯ９０／０９７８０号に記載される、粘膜内への制御放出）に、およびその後トランスフェクション剤（例えば、欧州特許第ＥＰ１，７３８，７６９号に記載）として用いる天然ポリマーの最初の化学誘導体の１つであった。
【００１５】
ＤＥＡＥ−デキストランはＮ，Ｎ−ジエチルアミノエチル塩化物およびデキストランを反応させることにより得られるポリカチオン性ポリマーであり、グルコース単位がほとんど分岐せずにα−１，６結合によって結合し、グルコースモノマーがα−１，４結合によって結合した線状ポリマーである（番号は以下の式に示す）。
【００１６】
下記の構造式により表されるＤＥＡＥ−デキストランは、窒素原子が互いに異なる物理化学的特性を有する、窒素残基を含む２つの置換基を有する。
【化１】
2015510020.tif 000003
【００１７】
第１置換基は、生理学的ｐＨでイオン化形態である、約９．５のｐＫａを有する第３級アミン官能基（Ｎ’で示す）を含む。「タンデム」として知られる第２置換基は、永久正電荷を有し、約５．７のｐＫａを有する、生理学的ｐＨで非イオン化形態である第２の第３級アミン官能基（Ｎ”で示す）の酸性度に影響を及ぼす、第４級アンモニウム基（Ｎ＋）を含む（Ｆ．Ｇｕｂｅｎｓｅｋ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ：Ｐａｒｔ  Ａ−Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−２（５）１９６８，１０４５−１０５４）。
【００１８】
しかしながら、ＤＥＡＥ−デキストランの正電荷は核酸以外のアニオン性生物学的構造とインビボ相互作用し、毒性現象をもたらすことが知られている。
【００１９】
一般的には、カチオン性ポリマーと核酸との間の複合体の形成およびその後の送達のメカニズムは、下記のように要約することができる。
【００２０】
遺伝子材料はカチオン性ポリマーと弱い相互作用、例えば静電相互作用によって複合する。この複合体の形成は核酸をヌクレアーゼ分解から保護し、複合体の表面上に存在する正電荷が細胞膜と相互作用し、エンドソームの形成によって、複合体のエンドサイトーシスを刺激するため、核酸を細胞内に送達することを可能にする。
【００２１】
エンドソームの内部は約４．５〜５のｐＨを有し、これは約７．３である細胞質媒体のｐＨよりかなり酸性である。このｐＨの違いは、エンドソーム膜上に存在する、Ｈ＋イオンをサイトゾルからエンドソーム内に押し出すＡＴＰ依存性プロトンポンプにより維持される。酸性ｐＨは、ヌクレオチドサブユニット間のホスホジエステル結合の加水分解により核酸を分解する酵素であるリソソームヌクレアーゼの活性を促進する。
【００２２】
緩衝能を有するポリマーはリソソームヌクレアーゼの活性を阻害し、同時にエンドソームのオスモル濃度を変化させる。
【００２３】
実際、ポリマーはＨ＋イオンを捕捉するが、サイトゾルはエンドソームの電気的中性を維持するためＣｌ−イオンと同時に他のＨ＋イオンを必要とする。しかしながら、Ｈ＋およびＣｌ−イオンの需要はエンドソーム内のイオン濃度の増加、結果としてサイトゾルに対するエンドソームのオスモル濃度の増加をもたらす。オスモル濃度の増加はサイトゾルからの水分を必要とする。結果として、エンドソームは破裂するまで膨潤し、ポリマー−核酸複合体を細胞質内に放出する。
【００２４】
「プロトンスポンジメカニズム」として知られるこのメカニズムは、とくに、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ポリマーに関してＪ−Ｐ．Ｂｅｈｒにより“Ｔｈｅ  ｐｒｏｔｏｎ  ｓｐｏｎｇｅ：ａ  ｔｒｉｃｋ  ｔｏ  ｅｎｔｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｄｉｄ  ｎｏｔ  ｅｘｐｌｏｉｔ”（Ｃｈｉｍｉａ，１９９７，５１，３４−３６）において、より一般的には、Ｈ．Ｅｌｉｙａｈｕ  ｅｔ  ａｌ．により“Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ”（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００５，１０，３４−６４）において記載された。
【００２５】
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、例えば、Ｏ．Ｂｏｕｓｓｉｆ  ｅｔ  ａｌ．により  “Ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ：Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ”（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９５，Ｖｏｌ．９２，７２９７−７３０１）において、および国際特許出願第ＷＯ０２／１００４３５号において記載されるような、オリゴヌクレオチドおよびプラスミドの細胞内へのインビトロでの高度に効率的な放出を特徴とする、線状または分岐カチオン性ポリマーである。ＰＥＩはヌクレアーゼによる分解に対して核酸を保護する高い電荷密度を有するポリマーとして記載されている。ＰＥＩの高い緩衝能は、エンドソームの浸透膨潤（「プロトンスポンジ」メカニズム）を誘発し、ベクター−核酸複合体を細胞質内へ放出させることにより、細胞取り込み段階中のエンドソームにおける分解に対して核酸を保護すると考えられる。
【００２６】
トランスフェクション剤として幅広く研究されてきた別のポリマーは、例えば、国際特許出願第ＷＯ０３／０６３８２７号に記載された、負電荷を帯びた核酸のホスフェート基と相互作用する、生理学的ｐＨでイオン化した第１級アミン基を特徴とする、ポリ（Ｌ−リシン）（ＰＬＬ）である。しかしながら、ＰＬＬの毒性およびトランスフェクション効率はそれらの分子量に直接比例する：ポリマーの分子量が増加すると、一方でトランスフェクション効率の増加、および他方で細胞毒性の増加が見られる。加えて、ＰＬＬの主鎖は生理学的条件下ではほとんど分解されず、その蓄積は長期的には結果として毒性をもたらし得る。
【００２７】
ほとんどのカチオン性ポリマーについて、ＰＬＬの核酸との複合体も物理化学的欠点を有する。例えば、調製プロセスはサイズをほとんど制御できず、これは限られた拡散能力および／または製剤もしくは投与段階中の沈殿の可能性を有する大きな粒子の存在をもたらし得る。加えて、ＰＬＬの酸塩基特性は、おそらく核酸を細胞質媒体内へ放出する能力が制限されるため、高いトランスフェクション効率を得ることを可能にしないと考えられる。
【００２８】
他のカチオン性ポリマーは、天然および合成の両方とも、従来技術において核酸のトランスフェクション剤として記載された。
【００２９】
例えば、国際特許出願第ＷＯ０３／０７８５７６号は、核酸のトランスフェクション剤としてのキトサンについて記載する。
【００３０】
キトサンは、β−１，４結合によって結合した、ポリマー中にランダムに分布したＤ−グルコサミンおよびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位からなり、約６．５のｐＫａを有するアミン基を含む天然線状ポリマーである。
【００３１】
核酸のトランスフェクション剤として、例えばポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）構造を有する、陽イオン性基を含むデンドリマー、線状構造を有する高分子；メタクリルポリマー（例えばＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、ＤＭＡＥＭＡ）、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、および可溶化、官能または配向基を有するこれらのポリマーの誘導体、例えばポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を含有するポリマー構造についても広範な研究が行われた。
【００３２】
例えば、国際特許出願第ＷＯ９７／２５０６７号に記載される、線状ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）は、可溶性および／または分散性複合体の形成を可能にする水溶性ポリマーである。低ｐＫａ値は核酸の充填量を低減することが知られているので、好適には、これらのポリマーのカチオン性基のｐＫａ値は７〜８の間で維持されるべきである。また、エンドソームによるＰＡＭＡＭおよび核酸をベースとするデンドリマーから形成された複合体の放出は「プロトンスポンジ」効果に関する。具体的には、Ｃ．Ｌ．Ｗａｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．は“Ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＡＭＡＭ  ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ”（ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，９：３８）において、第１級アミン残基の部分アセチル化がＰＡＭＡＭベースのデンドリマーの緩衝能およびｓｉＲＮＡの放出の両方を低減することについて記載している。
【００３３】
カチオン性ポリマーは核酸のトランスフェクション剤以外の用途についても開発された。
【００３４】
例えば、Ｐａｌ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．の論文（Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  Ａ：Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ａｓｐｅｃｔｓ  ２８９，２００６，ｐａｇｅｓ  １９３−１９９）の第２．２節では、カチオン性モノマーＮ−（３−クロロ−２−ヒドロキシプロピル）−トリメチルアンモニウム塩化物を多糖グリコーゲンの骨格上に組み入れることにより、どのようにグリコーゲンがカチオン化したかについて開示されている。前記カチオン性ポリマーは鉄鉱懸濁液の凝集剤として効果的であることが見出された。
【００３５】
理想的なトランスフェクション剤は、生理学的標的を操作する必要性なしに、高いトランスフェクション能を確保すべきであり；いずれの長期的な副作用も回避するため、効果的な用量で毒性ではなく、生分解性であるべきであることが知られている。
【００３６】
加えて、サイズは細胞外媒体中の複合体の拡散能力および細胞中のエンドサイトーシス／ファゴサイトーシス効率の両方を制限し得ることが知られているため、トランスフェクション剤がポリマーである場合、マイクロメートルより小さな（すなわち１０−６ｍ未満の）粒子を形成すべきであり、好適にはナノ粒子を形成すべきである。
【００３７】
最後に、ポリマー構造はさまざまなｐＫａ値を特徴とするアミン基および／または窒素原子を含むべきである。実際、生理学的ｐＨ値より高いｐＫａ値を有するアミン基は生理学的ｐＨで核酸の複合を促進し；およそエンドソームｐＨ値のｐＫａ値を有するアミン基は「プロトンスポンジ」メカニズムを活性化し、ポリマー−核酸複合体の細胞質内へ放出を確保し；最後に、第４級アンモニウム基は、ｐＨ値に関係なく、複合およびエンドソームからの放出を確保する。
【発明の概要】
【００３８】
出願人は、低分子量有効成分の送達におよび核酸の非ウイルスベクターとしての両方に用いることができ、従来技術において知られる材料の欠点を克服することができる新規ポリマーを開発するという課題を提起した。
【００３９】
驚くべきことに、出願人はここでグリコーゲンを修飾して新規カチオン性誘導体を得ることができることを見出した。
【００４０】
有利には、前記グリコーゲンの新規カチオン性誘導体は低い細胞毒性を特徴とする。
【００４１】
出願人はこれは主に２つの理由によると考える。第１に、グリコーゲンは生体適合性ポリマーであり、これはすべての動物の体における糖の代謝および貯蔵の生成物であり、そこではこれは連続的に生成および分解される。加えて、出願人は、グリコーゲン中の多数の分岐は構造に、カチオン電荷へのアクセスを選択的に低減することができる：可溶性分子がポリマー構造内で拡散し、カチオン部位で複合することができる安定な球状コンホメーションをもたらすが、対照的に、より多くの複合体構造との相互作用は立体的な理由で不可能となると考える。この球状コンホメーションは、一般的には細胞膜を損傷する、カチオン電荷の毒性を低減することを可能にする。
【００４２】
出願人は、グリコーゲンの新規カチオン性誘導体はそれらが由来する天然ポリマーの生体適合性特性を保存することを見出した。
【００４３】
出願人は、これらのグリコーゲンの新規カチオン性誘導体は幅広い範囲内のサイズおよび分子量を有するアニオン性化合物と複合体を形成することができることも見出した。
【００４４】
有利には、前記複合体はナノメートルサイズを有し、それらが溶液中にある場合、高濃度であっても、いずれの凝集も示さない。
【００４５】
出願人は、グリコーゲンの新規カチオン性誘導体はアニオン性化合物を特定の生理学的標的（例えば臓器、組織および細胞）に送達することができることを見出した。
【００４６】
出願人は、本発明によるグリコーゲンのカチオン性誘導体は細胞内に浸透することができることも見出した。
【００４７】
結果として、前記グリコーゲンの新規カチオン性誘導体はアニオン性化合物を細胞内に送達するのに用いることができる。
【００４８】
最後に、出願人は、本発明によるグリコーゲンのカチオン性誘導体はタンパク質および酵素の保存において安定化剤として、ならびにワクチンの製造において補助剤として用いることができることを見出した。
【００４９】
有利には、グリコーゲンの新規カチオン性誘導体は、アニオン性化合物の複合およびポリマー−アニオン性化合物複合体のエンドソームから細胞質への放出の両方を促進するため、互いに異なるｐＫａ値を特徴とするアミン基を有する置換基を含む。
【００５０】
有利には、本発明によるグリコーゲンの新規カチオン性誘導体は低粘度を有し、結果として注射用の医薬組成物に製剤することができる。
【００５１】
第１態様では、本発明はよって修飾グリコーゲンをベースとする新規カチオン性ポリマーに関し、とくに本発明は、
（ａ）：
【化２】
2015510020.tif 000004
（ａ）
であって、式中、Ｒ基は、同じでも異なってもよく、水素原子；任意で医薬的に許容可能な有機もしくは無機塩基を有する塩形態の、カルボキシメチル基；またはＮＨ２−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ＮＨ２−｛［（Ｃ１−Ｃ６）アルキル］−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアンモニオ｝−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、｛［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアンモニオ｝−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ＮＨ２−［（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、｛［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ｝−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、［トリ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアンモニオ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アゾシクリル−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択される窒素を含有する基であり、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル鎖は、同じでも異なってもよく、任意で１つ以上のヒドロキシル基で置換され；
ｎは１以上の整数である、（ａ）；ならびに
（ｂ）：
【化３】
2015510020.tif 000005
（ｂ）
であって、式中、Ｒ１は水素原子；任意で医薬的に許容可能な有機もしくは無機塩基を有する塩形態の、カルボキシメチル基；またはＮＨ２−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ＮＨ２−｛［（Ｃ１−Ｃ６）アルキル］−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアンモニオ｝−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、｛［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアンモニオ｝−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ＮＨ２−［（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、｛［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ｝−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、［トリ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアンモニオ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択される窒素を含有する基から選択され、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル鎖は、同じでも異なってもよく、任意で１つ以上のヒドロキシル基で置換され；
Ｘ１およびＸ２は、同じでも異なってもよく、−ＯＨ基または窒素を含有する−ＮＨＲ２基であり、Ｒ２は水素原子、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、およびＨ−［ＮＨ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル］ｐ−から選択され、ｐは１以上の整数であり、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基は同じでも異なってもよく；
ｍは１以上の整数である、（ｂ）
からなる群から選択される少なくとも１つの繰り返し単位を含む、グリコーゲンをベースとするカチオン性ポリマーであるが、
ただしＲ、Ｒ１、Ｘ１およびＸ２からの少なくとも１つは、それぞれＲ、Ｒ１、Ｘ１およびＸ２について定義された、窒素を含有する基であり、
前記グリコーゲンベースのカチオン性ポリマーはグリコーゲンのＮ−（３−クロロ−２−ヒドロキシプロピル）−トリメチルアンモニウム塩化物との反応により得られる生成物とは異なるることを条件とする、グリコーゲンベースのカチオン性ポリマーに関する。
【００５２】
上記表現「ただしＲ、Ｒ１、Ｘ１およびＸ２からの少なくとも１つは、それぞれＲ、Ｒ１、Ｘ１およびＸ２について定義された、窒素を含有する基である」とは、Ｒが窒素を含有する基である場合、この基はＲにおいて定義されたものであり、Ｒ１が窒素を含有する基である場合、この基はＲ１において定義されたものであり、Ｘ１が窒素を含有する基である場合、この基はＸ１において定義されたものであり、Ｘ２が窒素を含有する基である場合、この基はＸ２において定義されたものであることを意味する。
【００５３】
第２態様では、本発明は、グリコーゲンベースのカチオン性ポリマーとアニオン性化合物との間の複合体に関する。
【００５４】
好適な実施形態によると、前記アニオン性化合物は有効成分である。有利には、前記アニオン性化合物は核酸である。
【００５５】
第３態様では、本発明は、グリコーゲンベースのカチオン性ポリマーとアニオン性化合物との間の複合体、および少なくとも１つの医薬的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【００５６】
第４態様では、本発明は、グリコーゲンベースのカチオン性ポリマーとアニオン性化合物との間の複合体の、前記アニオン性化合物を特定の薬理学的標的、例えば臓器、組織または細胞内に送達またはトランスフェクトするための使用に関する。
【００５７】
１つの好適な実施形態によると、前記アニオン性化合物は有効成分である。有利には、前記アニオン性化合物は核酸である。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
図１〜８は、実施例５に記載する、ゲル電気泳動後に得られた８つのアガロースゲルを示す。図１〜８のすべてにおいて、ｓｉＲＮＡ（＊）およびＤＮＡ（＊）マーカーを入れ、比較目的で用いられる対応するバンドを得、電気泳動法が機能していることを確認した。
【図１】本発明によるポリマー３とさまざまな濃度（０．５重量％〜８重量％）のｓｉＲＮＡとの間で得られた複合体を入れたアガロースゲルを示す。核酸を含まない（０％）ポリマー３を比較例として用い、本発明によるカチオン性ポリマーがｓｉＲＮＡに対するスポットの検出に干渉しないことを確認した。
【図２】下記を入れたアガロースゲルを示す：−本発明によるポリマー３と１０重量％〜２０重量％の濃度のｓｉＲＮＡとの間で得られた複合体；−本発明によるカチオン性ポリマーがｓｉＲＮＡに対するスポットの検出に干渉しないことを確認するための比較例として核酸を含まない（０％）ポリマー３；および−本発明に従って修飾していないグリコーゲンが核酸と複合することができないことを確認するための比較例としてのポリマー５０（未修飾Ｐｏｌｇｌｕｍｙｔ（商標）グリコーゲン）。
【図３】本発明によるポリマー３とさまざまな濃度（３０重量％〜８００重量％）のｓｉＲＮＡとの間で得られた複合体を入れたアガロースゲルを示す。
【図４】本発明によるポリマー１、２および６と各ポリマーの総重量に対して５重量％〜２０重量％の濃度のｓｉＲＮＡとの間で得られた複合体を入れたアガロースゲルを示す。
【図５】本発明によるポリマー１０、１４および１５と各ポリマーの総重量に対して５重量％〜２０重量％の濃度のｓｉＲＮＡとの間で得られた複合体を入れたアガロースゲルを示す。
【図６】本発明によるポリマー８、１２および１６と各ポリマーの総重量に対して５重量％〜２０重量％の濃度のｓｉＲＮＡとの間で得られた複合体を入れたアガロースゲルを示す。
【図７】本発明によるポリマー２１、２４および２５と各ポリマーの総重量に対して５重量％〜２０重量％の濃度のｓｉＲＮＡとの間で得られた複合体を入れたアガロースゲルを示す。
【図８】本発明によるポリマー２０、２３および２８と各ポリマーの総重量に対して５重量％〜２０重量％の濃度のｓｉＲＮＡとの間で得られた複合体を入れたアガロースゲルを示す。
【図９】実施例８に記載するように得られた、本発明によるポリマー２、３および４の滴定曲線を示す。
【図１０】実施例８に記載するように得られたポリマー４（本発明）および１８（比較例）の滴定曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
本明細書および下記の特許請求の範囲において、「カチオン性ポリマー」の語は、生理学的ｐＨで、全体的に正電荷を有するポリマーを示す。
【００６０】
本明細書および下記の特許請求の範囲において、「グリコーゲン」の語は、一般的には、下記の式：
【化４】
2015510020.tif 000006
に示すように、グルコースモノマーが線状鎖においてα−（１，４）結合により結合し、分岐がα−（１，６）結合により、一般的には、限定なしに、７〜１１個のグルコースモノマー毎にグラフトした、高い分岐度を特徴とするグルコースホモポリマーを示す。
【００６１】
本明細書および下記の特許請求の範囲の目的のため、「グリコーゲンベース」の語は、ポリマーが、本発明によるカチオン性ポリマーを得るように部分的に修飾される、上述のグリコーゲン構造を含むことを示すように用いられる。
【００６２】
本明細書および下記の特許請求の範囲の目的のため、「繰り返し単位」の語は、本発明によるカチオン性ポリマーにおいて少なくとも一度は存在するモノマーを示す。
【００６３】
本明細書および下記の特許請求の範囲の目的のため、「（Ｃ１−Ｃ６）アルキル」の語は、１〜６つの炭素原子を含有する線状または分岐アルキル基、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｓｅｃ−ペンチル、３−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、ｓｅｃ−ヘキシルまたはネオヘキシルを示す。
【００６４】
本明細書および下記の特許請求の範囲の目的のため、「アゾシクリル」の語は、少なくとも１つのＮ原子を含有する、３員〜７員芳香族または脂肪族ヘテロ環状環、例えば、アジリジン、ピロール、ピロリン、ピロリジン、ピリジンまたはピペリジンを示す。任意で、上記ヘテロ環状環は、Ｎ、ＯおよびＳから選択される少なくとも１つの第２ヘテロ原子、例えば、チアゾール、オキサジンまたはチアジンを含むことができる。
【００６５】
本明細書および下記の特許請求の範囲の目的のため、「複合体」の語は、非共有結合性相互作用（例えば静電、イオンまたはファンデルワールス相互作用、水素結合等）による、本発明によるグリコーゲンベースのカチオン性ポリマーの少なくとも１つのアニオン性化合物との相互作用により得られる生成物を示す。
【００６６】
本明細書および下記の特許請求の範囲の目的のため、「有効成分」の語は、投与後、細胞または生物の生物学的機能と相互作用し、あるいは前記生物学的機能を修飾することができる天然、半合成または合成分子を含む。本発明による有用な有効成分はよって、病態の治療、予防または診断に用いることができる、全体的に負電荷を有する分子、すなわちアニオン性分子である。前記アニオン性分子は有機または無機であってもよい。例えば、それらは有機アニオン性分子であってもよく、低分子量（例えばアミノ酸、スルファミドまたはビタミン）または高分子量（例えばワクチン、またはヘパリンのようなグルコサミノグリカン）を有していてもよい。
【００６７】
本明細書および下記の特許請求の範囲の目的のため、「核酸」の語は、二本鎖または一本鎖であり、全体的に負電荷を有する、天然または合成由来のヌクレオチド高分子を示す。とくに、この語はオリゴヌクレオチド、ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）、ＤＮＡ（ｃＤＮＡ、ｍｔＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ）を含む。
【００６８】
本明細書および下記の特許請求の範囲の目的のため、「有効成分の送達」および「有効成分を送達する」の語は、本発明によるカチオン性ポリマーと複合させた有効成分の特定の生理学的標的、例えば組織または臓器への輸送を示す。
【００６９】
本明細書および下記の特許請求の範囲の目的のため、「トランスフェクション」および「トランスフェクトする」の語は、核酸配列の細胞内、とくに細胞質および／または核内への導入を示す。
【００７０】
とくに、本発明は、
（ａ）：
【化５】
2015510020.tif 000007
（ａ）
であって、式中、Ｒ基は、同じでも異なってもよく、水素原子；任意で医薬的に許容可能な有機もしくは無機塩基を有する塩形態の、カルボキシメチル基；またはＮＨ２−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ＮＨ２−［（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアンモニオ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、｛［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアンモニオ｝−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ＮＨ２−［（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、｛［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ｝−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、［トリ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアンモニオ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アゾシクリル−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択される窒素を含有する基であり、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル鎖は、同じでも異なってもよく、任意で１つ以上のヒドロキシル基で置換され；
ｎは１以上の整数である、（ａ）；ならびに
（ｂ）：
【化６】
2015510020.tif 000008
（ｂ）
であって、式中、Ｒ１は水素原子；任意で医薬的に許容可能な有機もしくは無機塩基を有する塩形態の、カルボキシメチル基；またはＮＨ２−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ＮＨ２−［（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアンモニオ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、｛［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアンモニオ｝−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ＮＨ２−［（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、｛［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ｝−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、［トリ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアンモニオ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択される窒素を含有する基から選択され、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル鎖は、同じでも異なってもよく、任意で１つ以上のヒドロキシル基で置換され；
Ｘ１およびＸ２は、同じでも異なってもよく、−ＯＨ基または窒素を含有する−ＮＨＲ２基であり、Ｒ２は水素原子、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、およびＨ−［ＮＨ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル］ｐ−から選択され、ｐは１以上の整数であり、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基は同じでも異なってもよく；
ｍは１以上の整数である、（ｂ）
からなる群から選択される少なくとも１つの繰り返し単位を含むグリコーゲンベースのカチオン性ポリマーであるが、
ただしＲ、Ｒ１、Ｘ１およびＸ２からの少なくとも１つは、それぞれＲ、Ｒ１、Ｘ１およびＸ２について定義された、窒素を含有する基であり、
前記グリコーゲンベースのカチオン性ポリマーは、とくに、Ｐａｌ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．の論文（Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  Ａ：Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍ．  Ｅｎｇ．Ａｓｐｅｃｔｓ  ２８９，２００６，ｐａｇｅｓ  １９３−１９９）の第２．２節において開示されるような、グリコーゲンのＮ−（３−クロロ−２−ヒドロキシプロピル）−トリメチルアンモニウム塩化物との反応により得られる生成物とは異なることを条件とする、グリコーゲンベースのカチオン性ポリマーに関する。
【００７１】
好適には、Ｒ基は、同じでも異なってもよく、水素原子；任意で医薬的に許容可能な有機もしくは無機塩基を有する塩形態の、カルボキシメチル基；または［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、｛［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ３）アルキル−ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアンモニオ｝−（Ｃ１−Ｃ３）−アルキル、｛［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ｝−（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、［トリ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアンモニオ］−（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、アゾシクリル−（Ｃ１−Ｃ３）アルキルから選択される窒素を含有する基であり、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル鎖は、同じでも異なってもよく、任意で１つのヒドロキシル基で置換される。
【００７２】
好適には、「アゾシクリル」の語で表される少なくとも１つのＮ原子を含有するヘテロ環状環は５員または６員芳香族または脂肪族ヘテロ環状環、例えば、ピロール、ピロリン、ピロリジン、ピリジンまたはピペリジンである。有利には、前記５員または６員ヘテロ環状環はＮ、ＯおよびＳから選択される少なくとも１つの第２ヘテロ原子を含み、例えば、ジアゾール、オキサジンおよびチアジンがある。好適には、前記ヘテロ環状環は脂肪族である。さらにより好適には、前記ヘテロ環状環はモルホリンまたはピペリジンである。
【００７３】
より好適には、Ｒ基は、同じでも異なってもよく、水素原子；任意で医薬的に許容可能な有機もしくは無機塩基を有する塩形態の、カルボキシメチル基；またはＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチル、［（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）ジメチルアンモニオ］エチル、［（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）ジメチルアンモニオ］プロピル、［（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチル）ジエチルアンモニオ］エチル、（トリメチルアンモニオ）−２−ヒドロキシプロピル、ピペリジル−Ｎ−エチルもしくはモルホリニル−Ｎ−エチルから選択される窒素を含有する基である。
【００７４】
好適には、Ｒ１は、水素原子；任意で医薬的に許容可能な有機もしくは無機塩基を有する塩形態の、カルボキシメチル基；または［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、｛［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ３）アルキル−ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアンモニオ｝−（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、｛［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ｝−（Ｃ１−Ｃ３）アルキルもしくは［トリ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアンモニオ］−（Ｃ１−Ｃ３）アルキルから選択される窒素を含有する基であり、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル鎖は、同じでも異なってもよく、任意で１つのヒドロキシル基で置換される。
【００７５】
より好適には、Ｒ１は水素原子またはカルボキシメチル基である。
【００７６】
好適には、Ｘ１およびＸ２は、同じでも異なってもよく、−ＮＨＲ２基であり、Ｒ２は水素原子またはＨ−［ＮＨ−（Ｃ１−Ｃ４）アルキル］ｐ−であり、ｐは１以上の整数であり、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基は同じでも異なってもよい。
【００７７】
好適には、前記Ｈ−［ＮＨ−（Ｃ１−Ｃ４）アルキル］ｐ−基は、５０〜３，０００ダルトンの分子量、より好適には１，０００〜２，３００ダルトンの分子量を有する、ポリエチレンイミン、スペルミン（Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨ２）、またはスペルミジン（Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ２）である。
【００７８】
医薬的に許容可能な有機塩基の例としては、トロメタミン、リジン、アルギニン、グリシン、アラニン、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、プロピルアミン、ジプロピルアミン、トリプロピルアミン、エチレンジアミン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、グアニジン、モルホリン、ピペリジン、ピロリジン、ピペラジン、１−ブチルピペリジン、１−エチル−２−メチルピペリジン、Ｎ−メチルピペラジン、１，４−ジ−メチルピペラジン、Ｎ−ベンジルフェネチルアミン、Ｎ−メチルグルコサミンおよびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンがある。
【００７９】
医薬的に許容可能な無機塩基の例としては、アルカリ金属またはアルカリ土類金属水酸化物または炭酸塩、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムおよび炭酸カルシウムがある。
【００８０】
有利には、前記繰り返し単位（ａ）および（ｂ）はグリコーゲン鎖においてランダムに配置される。
【００８１】
繰り返し単位（ａ）および（ｂ）の例はそれぞれ以下の表ＡおよびＢに示す。
【００８２】
【表Ａ−１】
2015510020.tif 000009
【表Ａ−２】
2015510020.tif 000010
【表Ａ−３】
2015510020.tif 000011
【表Ａ−４】
2015510020.tif 000012
【表Ａ−５】
2015510020.tif 000013
【表Ａ−６】
2015510020.tif 000014
【表Ａ−７】
2015510020.tif 000015
【表Ｂ−１】
2015510020.tif 000016
【表Ｂ−２】
2015510020.tif 000017
【表Ｂ−３】
2015510020.tif 000018
【００８３】
好適な実施形態によると、前記繰り返し単位（ａ）および（ｂ）は、生理学的ｐＨでイオン化可能であり、前記アニオン性化合物の複合を促進する窒素を含有する少なくとも１つの基、および生理学的ｐＨより低いｐＨでイオン化可能であり、エンドソームからの複合体の放出を促進する窒素を含有する少なくとも１つの基を含む。
【００８４】
好適には、生理学的ｐＨでイオン化可能である前記窒素を含有する基は、本発明によるカチオン性ポリマーを調製するのに用いられるグリコーゲン中にヒドロキシル基の総数に対して１％〜３０％の数値割合で存在する。
【００８５】
好適には、生理学的ｐＨより低いｐＨでイオン化可能である前記窒素を含有する基は、本発明によるカチオン性ポリマーを調製するのに用いられるグリコーゲン中にヒドロキシル基の総数に対して０．１％〜１０％の数値割合で存在する。
【００８６】
本発明の目的のため、生理学的ｐＨでイオン化可能である前記窒素を含有する基は、ＮＨ２−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ＮＨ２−［（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、｛［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ｝−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルおよびアゾシクリル−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルである。
【００８７】
有利には、生理学的ｐＨより低いｐＨでイオン化可能である前記窒素を含有する基はＮＨ２−｛［（Ｃ１−Ｃ３）アルキル］−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアンモニオ｝−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルおよび｛［Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ］−（Ｃ１−Ｃ３）アルキル−ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアンモニオ｝−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルである。
【００８８】
有利には、本発明によるグリコーゲンの新規カチオン性誘導体は低粘度を有し、結果として注射用の医薬組成物に製剤することができる。とくに、本発明によるグリコーゲンの新規カチオン性誘導体は、ＰＢＳ中１％の濃度で回転型レオメーターで測定される、１０ｍＰａ・ｓ未満、好適には５ｍＰａ・ｓ未満の粘度を有する。
【００８９】
本発明によるカチオン性ポリマーを調製するのに用いられるグリコーゲンは、当技術分野において知られる方法の１つに従って得ることができる。
【００９０】
好適には、グリコーゲンは、国際特許出願第ＷＯ９４／０３５０２号に記載されるように調製される。
【００９１】
好適には、前記グリコーゲンは、ヨーロッパイガイ（Ｍｙｔｉｌｕｓ  ｅｄｕｌｉｓ）およびムラサキイガイ（Ｍｙｔｉｌｕｓ  ｇａｌｌｏｐｒｏｖｉｎｃｉａｌｉｓ）種から得られる。
【００９２】
本発明の目的に用いることができるグリコーゲンの他の供給源としては、カキおよびネコゼフネガイ（Ｃｒｅｐｉｄｕｌａ  ｆｏｒｎｉｃａｔａ）のような貝類、ならびに肝臓および筋肉のような脊椎動物のグリコーゲンに富む臓器が挙げられる。
【００９３】
好適には、前記グリコーゲンは窒素を含有する化合物および還元糖を実質的に含まない。本明細書および下記の特許請求の範囲に用いられる場合、「窒素を含有する化合物および還元糖を実質的に含まない」という表現は、ケルダール法により測定される窒素含有量が６０ｐｐｍ未満であり、Ｆ．Ｄ．Ｓｎｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｎｅｌｌ（“Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｓｉｓ”，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９５４，ｖｏｌ．ＩＩＩ，ｐ．２０４）の方法により測定される還元糖の含有量が０．２５％未満であることを示す。
【００９４】
好適には、本発明に従って用いられるグリコーゲンは、約４４％〜約４５％の炭素含有量、約（２．５±０．１）×１０６ダルトンの分子量および１９７±２．０の旋光度（α）Ｄ２０（ｃ＝１、水中）も特徴とする。
【００９５】
より好適には、本発明に従って用いられるグリコーゲンは、Ａｚｉｅｎｄｅ  Ｃｈｉｍｉｃｈｅ  Ｒｉｕｎｉｔｅ  Ａｎｇｅｌｉｎｉ  Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ  Ａ．Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｆ．Ｓ．ｐ．Ａ．により製造されるＰｏｌｇｌｕｍｙｔ（商標）グリコーゲンである。
【００９６】
当業者であれば、本発明が治療効果自体を有する新規クラスの化合物を対象としないことを容易に理解するだろう。むしろ、本発明は、前述したグリコーゲンベースのカチオン性ポリマーの、少なくとも１つのアニオン性化合物と複合体を形成するための使用に関する。
【００９７】
第２態様では、本発明はグリコーゲンベースのカチオン性ポリマーとアニオン性化合物との間の複合体に関し、前記グリコーゲンベースのカチオン性ポリマーは前述した（ａ）および（ｂ）からなる群から選択される少なくとも１つの繰り返し単位を含む。
【００９８】
好適には、前記アニオン性化合物は有機または無機であり、低分子量または高分子量を有する。
【００９９】
より好適には、前記アニオン性化合物は、例えば、下記のクラス：抗感染薬、例えば抗生物質および抗ウイルス薬；鎮痛薬；食欲抑制薬；駆虫薬；抗喘息薬；抗痙攣薬；抗うつ薬；抗糖尿病薬；抗下痢薬；抗ヒスタミン薬；抗炎症薬；抗片頭痛薬；抗悪心薬；抗悪性腫瘍薬；抗パーキンソン薬；鎮痒薬；抗精神病薬；解熱薬；鎮痙薬；抗コリン薬；交感神経興奮薬；キサンチン誘導体；心血管系の薬、例えばカリウム、カルシウムチャネル遮断薬、ベータ遮断薬、アルファ遮断薬および抗不整脈薬；抗高血圧薬；利尿薬および抗利尿薬；中枢および末梢血管拡張薬；中枢神経系刺激薬；血管収縮薬；鎮咳薬；うっ血除去薬；ホルモン；催眠薬；免疫抑制薬；筋弛緩薬；副交感神経遮断薬；精神刺激薬；鎮静薬；トランキライザーの１つに属する有効成分である。
【０１００】
好適な実施形態によると、前記アニオン性化合物は核酸である。
【０１０１】
好適には、前記核酸は、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）およびＤＮＡ（ｃＤＮＡ、ｍｔＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ）から選択される。
【０１０２】
出願人は、前記複合体は、１〜２００ｎｍ、好適には２０〜１００ｎｍ、より好適には３０〜５０ｎｍの平均直径（Ｚ）を有するナノ粒子を形成することができることを見出した。
【０１０３】
好適な実施形態によると、前記複合体は、前記グリコーゲンベースのカチオン性ポリマーの重量に対して５重量％〜６０重量％の量の前記アニオン性化合物を含む。
【０１０４】
好適には、前記複合体は、前記グリコーゲンベースのカチオン性ポリマーの重量に対して１０重量％〜５０重量％の量の前記アニオン性化合物を含む。
【０１０５】
より好適には、前記複合体は、前記グリコーゲンベースのカチオン性ポリマーの重量に対して１０重量％〜３０重量％の量の前記アニオン性化合物を含む。
【０１０６】
グリコーゲンベースのカチオン性ポリマーとアニオン性化合物との間の複合体は有利には医薬組成物として調製することができる。
【０１０７】
第３態様では、本発明は、グリコーゲンベースのカチオン性ポリマーとアニオン性化合物との間の複合体、および少なくとも１つの医薬的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物において、前記グリコーゲンベースのカチオン性ポリマーが前述した（ａ）および（ｂ）からなる群から選択される少なくとも１つの繰り返し単位を含む、医薬組成物に関する。
【０１０８】
１つの好適な実施形態では、前記アニオン性化合物は核酸である。
【０１０９】
「賦形剤」の語は、医薬剤形を調製するのに適した当技術分野において知られるいずれかの作用剤を意味する。
【０１１０】
本発明による適した賦形剤の例としては、防腐剤、安定化剤、界面活性剤、浸透圧調節塩、乳化剤、甘味料、香味料、染料等がある。
【０１１１】
前記医薬組成物は、当技術分野において知られる方法に従って単位投与剤形に調製することができる。
【０１１２】
好適には、前記医薬組成物は注射用、例えば水溶液、懸濁液もしくは乳濁液であり、または粉末の形態であって、静脈内、筋肉内、皮下、経皮もしくは腹腔内投与用の水溶液、懸濁液もしくは乳濁液の調製のために元に戻してもよい。
【０１１３】
あるいは、前記医薬組成物は、例えば、即時および持続放出のための、経口投与用の錠剤、カプセル剤、コーティング錠剤、顆粒剤、液剤およびシロップ剤；経皮投与用の薬用プラスター、溶液、ペースト、クリームまたは軟膏；直腸投与用の坐薬；エアロゾル投与用の無菌液の形態であってもよい。
【０１１４】
第４態様では、本発明は、グリコーゲンベースのカチオン性ポリマーとアニオン性化合物との間の複合体の、前記アニオン性化合物を特定の薬理学的標的、例えば臓器、組織または細胞に送達または輸送するための使用において、前記グリコーゲンベースのカチオン性ポリマーが前述した（ａ）および（ｂ）からなる群から選択される少なくとも１つの繰り返し単位を含む、使用に関する。
【０１１５】
好適な実施形態によると、前記アニオン性化合物は有効成分である。有利には、前記アニオン性化合物は核酸である。有利には、前記薬理学的標的は細胞である。
【０１１６】
好適な実施形態では、本発明によるグリコーゲンベースのカチオン性ポリマーは、直接またはスペーサーによって、細胞表面上に存在する標的を高度に特異的に結合することができ、特定の細胞（例えば腫瘍細胞、肝細胞、造血細胞、等）内への複合体の吸収を促進することができる配向基に結合することができる。
【０１１７】
配向基はカチオン性ポリマーを細胞コンパートメント（例えば核、ミトコンドリア等）に配向するのに用いることもできる。
【０１１８】
配向基は、例えば、葉酸、単糖、オリゴ糖、ペプチド、タンパク質およびヒアルロン酸オリゴマーから選択することができる。
【０１１９】
下記の実施例は本発明を、いずれにも限定することなく、例示すること意図する。
【実施例】
【０１２０】
（実施例１）単位（ａ）を含むグリコーゲンベースのカチオン性ポリマーの調製
（ｉ）窒素を含有する基を含むグリコーゲンベースのカチオン性ポリマーの合成
磁気撹拌器および還流冷却器を備えた２つ口丸底フラスコにおいて、１０ｇのＰｏｌｇｌｕｍｙｔ（商標）グリコーゲン（６１．７３ｍｍｏｌのグルコース）を１２４ｍＬの１ＮのＮａＯＨ（生成物１〜７、９〜１１および１３〜１５の合成のため）または２ＮのＮａＯＨ（生成物８、１２および１６の合成のため）に溶解した。溶解が完了した後、混合物を７０℃まで加熱し、２時間撹拌した。
【０１２１】
所望の生成物に応じて、下記の試薬（Ｉ）〜（ＶＩ）の１つを、表１に報告する（試薬のｍｍｏｌで表す）量で添加した：
（Ｉ）２−クロロ−Ｎ，Ｎ−ジエチルエチルアミン塩酸塩；
（ＩＩ）３−クロロ−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピルアミン塩酸塩；
（ＩＩＩ）２−クロロ−Ｎ，Ｎ−ジメチルエチルアミン塩酸塩；
（ＩＶ）Ｈ２Ｏ中の６０重量％の３−クロロ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウム塩化物の溶液；
（Ｖ）１−（２−クロロエチル）ピペリジン；および
（ＶＩ）４−（２−クロロエチル）モルホリン。
【０１２２】
混合物を７０℃で一晩撹拌した。
【０１２３】
翌日、加熱を停止し、混合物を室温まで冷却させた。粗反応生成物を次に４００ｍＬのアセトンにゆっくり注いだ。添加が完了した後、得られた懸濁液を約３０分間撹拌した。撹拌を停止した後、混合物を放置して上澄みの分離まで沈殿させ、沈殿物を得た。
【０１２４】
上澄みを捨て、得られた沈殿物をアセトン（２００ｍＬ）で２回洗浄した。こうして得られた固体を濾過し、２００ｍＬの蒸留水に溶解し、１ＮのＨＣｌ溶液でｐＨを中性にし、最後に導電率が一定（約２〜３μＳ）になるまで再生セルロースチューブ（カットオフ１５，０００）中での蒸留水に対する透析を行った。得られた溶液を０．４５μｍフィルターを通して濾過し、真空下で濃縮し、最後に凍結乾燥させた。
【０１２５】
合成収率は以下の表１に示す。
【表１】
2015510020.tif 000019
【０１２６】
記載した方法によって、以下の表２に示す構造を有するカチオン性ポリマー１〜１６および４０〜４１を調製した。
【０１２７】
示される構造中、略語「Ｇｌｕ」は、ポリマー鎖が未修飾グルコースの繰り返し単位または本発明による繰り返し単位で続き得ることを示す。加えて、可視化を促進するため、分岐は示さず、置換基は位置６および異なる繰り返し単位においてのみ示す。
【０１２８】
当業者であれば、同じ繰り返し単位は、同じでも異なってもよい、１〜３つの置換基を含むことができること、ならびにこれらの置換基が独立して位置２、３および／または６上に存在することができることを容易に理解するだろう。
【０１２９】
【表２−１】
2015510020.tif 000020
【表２−２】
2015510020.tif 000021
【表２−３】
2015510020.tif 000022
【０１３０】
（ｉｉ）窒素を含有する基およびカルボキシメチル基を含むグリコーゲンベースのカチオン性ポリマーの合成
少なくとも１つのカルボキシメチル基を含有するＰｏｌｇｌｕｍｙｔ（商標）グリコーゲン（グリコーゲン−ＣＭ）を後述するように合成した。
【０１３１】
予め真空下の６０℃のオーブンで一定重量まで乾燥させた９．５７ｇ（５９．０７ｍｍｏｌのグルコース）の無水Ｐｏｌｇｌｕｍｙｔ（商標）グリコーゲンを、磁気撹拌器を備えた窒素流下の２つ口丸底フラスコに入れ、２００ｍＬの無水ジメチルスルホキシドに溶解した。溶解が完了した後、水素化ナトリウムを表３に報告する量で添加し、混合物を室温で１時間撹拌した。次に、クロロ酢酸ナトリウムを表３に報告する量で添加し、混合物を室温で一晩撹拌した。
【０１３２】
翌日、混合物をアセトン（８００ｍＬ）にゆっくり注ぎ、得られた懸濁液を約３０分間撹拌した。得られた固体を濾過し、アセトン（４００ｍＬ）で２回洗浄し、再度濾過し、蒸留水（２００ｍＬ）に溶解した。得られた溶液に、導電率が一定（約２〜３μＳ）になるまで再生セルロースチューブ（カットオフ１５，０００）中での蒸留水に対する透析を行った。得られた溶液を０．４５μｍフィルターを通して濾過し、真空下で濃縮し、最後に凍結乾燥させた。
【０１３３】
グルコースモノマー１００個当たりのカルボキシメチル基で誘導体化したグルコース分子の数であると理解される誘導体化の程度（ＤＤ）を、ＩＲ分光法により、既知の滴定量のＰｏｌｇｌｕｍｙｔ（商標）グリコーゲンおよび酢酸ナトリウムを含有する混合物で較正曲線を作成することにより決定した。
【表３】
2015510020.tif 000023
【０１３４】
こうして得られたグリコーゲン−ＣＭを下記の合成に用い、窒素基を含むカチオン性ポリマーを得た。
【０１３５】
ジエチルアミノエチル基を含むグリコーゲン−ＣＭ（ＤＥＡＥ−グリコーゲン−ＣＭ）および２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウム基を含むグリコーゲン−ＣＭ（２−ＯＨ−ＰＴＭＡ−グリコーゲン−ＣＭ）をとくに合成した。
【０１３６】
ＤＥＡＥ−グリコーゲン−ＣＭ
磁気撹拌器および還流冷却器を備えた２つ口丸底フラスコにおいて、１ｇの生成物１０３を１０．８ｍＬの１ＮのＮａＯＨに溶解し、７０℃で２時間加熱した。
【０１３７】
０．９２９ｇの２−クロロ−Ｎ，Ｎ−ジエチルエチルアミン塩酸塩（５．４ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を７０℃で一晩撹拌した。
【０１３８】
翌日、加熱を停止し、混合物を室温まで冷却させた。粗反応生成物を次に１００ｍＬのアセトンにゆっくり注いだ。添加の終わりに、得られた懸濁液を３０分間撹拌した。
【０１３９】
得られた固体を濾過し、アセトン（１００ｍＬ）で２回洗浄し、５０ｍＬの蒸留水に溶解し、１Ｎの塩酸でｐＨを６．５〜７にし、最後に導電率が一定（約２〜３μＳ）になるまで再生セルロースチューブ（カットオフ１５，０００）中での蒸留水に対する透析を行った。得られた溶液を０．４５μｍフィルターを通して濾過し、真空下で濃縮し、最後に凍結乾燥させた。
【０１４０】
２−ＯＨ−ＰＴＭＡ−グリコーゲン−ＣＭ
磁気撹拌器および還流冷却器を備えた２つ口丸底フラスコにおいて、２．５ｇの生成物１０３を２７ｍＬの１ＮのＮａＯＨに溶解し、７０℃で２時間加熱した。
【０１４１】
次に、３−クロロ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウム塩化物の溶液（Ｈ２Ｏ中６０重量％、＝８．１ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を７０℃で一晩撹拌した。
【０１４２】
翌日、加熱を停止し、混合物を室温まで冷却させた。粗反応生成物を次に８０ｍＬのアセトンにゆっくり注いだ。
【０１４３】
得られた固体を濾過し、アセトン（８０ｍＬ）で２回洗浄し、５０ｍＬの蒸留水に溶解し、導電率が一定（約２〜３μＳ）になるまで再生セルロースチューブ（カットオフ１５，０００）中での蒸留水に対する透析を行った。得られた溶液を０．４５μｍフィルターを通して濾過し、真空下で濃縮し、最後に凍結乾燥させた。
【０１４４】
記載した方法によって得られたカチオン性ポリマー１７および１９は以下の表４に示す。
【０１４５】
可視化を促進するため、分岐は示さず、置換基は位置６および異なる繰り返し単位においてのみ示す。示される構造中、略語「Ｇｌｕ」は、ポリマー鎖が未修飾グルコースの繰り返し単位または本発明による繰り返し単位で続き得ることを示す。
【０１４６】
当業者であれば、同じ繰り返し単位は、同じでも異なってもよい、１〜３つの置換基を含むことができること、ならびにこれらの置換基が独立して同じ繰り返し単位の位置２、３および／または６上に存在することができることを容易に理解するだろう。
【０１４７】
【表４】
2015510020.tif 000024
【０１４８】
（実施例２）単位（ｂ）を含むグリコーゲンベースのカチオン性ポリマーの調製
Ｐｏｌｇｌｕｍｙｔ（商標）グリコーゲンを下記の方法に従って過ヨウ素酸カリウムで酸化した。
【０１４９】
暗色ガラス瓶において、２０ｇのＰｏｌｇｌｕｍｙｔ（商標）グリコーゲン（１２３．４６ｍｍｏｌのグルコース）を４００ｍＬの蒸留水に溶解した。過ヨウ素酸カリウムを表５に示す（試薬のｍｍｏｌで表す）量で添加し、混合物を室温で３０分間撹拌した。
【０１５０】
過剰なエチレングリコール（２６ｍＬ）を添加することにより反応を停止し、撹拌を室温で２時間継続した。
【０１５１】
混合物に、導電率が一定（約２〜３μＳ）になるまで再生セルロースチューブ（カットオフ１５，０００）中での蒸留水に対する透析を行った。混合物を次に０．４５μｍフィルターを通して濾過し、凍結乾燥させた。
【０１５２】
次に、酸化度（酸化グルコースモノマーの％）を、塩酸ヒドロキシルアミンとさまざまな炭水化物上に存在する遊離アルデヒド基との間の反応により放出される塩酸の０．１ＮのＮａＯＨでの滴定により決定した。反応は以下に示す：
グリコーゲン−（ＣＨ＝Ｏ）ｚ＋ｚ・Ｈ２Ｎ−ＯＨ＊ＨＣｌ＝グリコーゲン−（ＣＨ＝Ｎ−ＯＨ）ｚ＋ｚ・Ｈ２Ｏ＋ｚ・ＨＣｌ
【０１５３】
酸化モノマーの割合は下記の式：
【数１】
2015510020.tif 000025
式中、
Ｖ＝ＮａＯＨのｍＬ
Ｎ＝ＮａＯＨの規定度
Ｗ＝無水試料のｍｇ
１６２＝グルコース繰り返し単位の分子量
によって決定した。
【０１５４】
【表５】
2015510020.tif 000026
【０１５５】
こうして得られた酸化Ｐｏｌｇｌｕｍｙｔ（商標）グリコーゲンを以下の試薬（ＶＩＩ）〜（Ｘ）の１つと、表６に示す（試薬のｍｍｏｌで表す）量で反応させた：
（ＶＩＩ）スペルミン（Ｆｌｕｋａ、製品番号８５５９０）；
（ＶＩＩＩ）テトラエチレンペンタミン（Ｆｌｕｋａ、製品番号１５６５２８４３）；
（ＩＸ）水中５０重量％のポリエチレンイミンＭＷ１３００の溶液（Ａｌｄｒｉｃｈ、製品番号４８２５９５）；
（Ｘ）水中５０重量％のポリエチレンイミンＭＷ２０００の溶液（Ａｌｄｒｉｃｈ、４０８７００）。
【０１５６】
誘導体を下記の一般的な方法に従って合成した。
【０１５７】
機械撹拌器（ＩＫＡ  Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋモデル）を備えた３つ口丸底フラスコにおいて、２ｇの酸化Ｐｏｌｇｌｕｍｙｔ（商標）グリコーゲンを２００ｍＬのｐＨ８．５のホウ酸塩緩衝液に溶解した。アミンを４０ｍＬのホウ酸塩緩衝液に溶解し、反応フラスコにゆっくり添加し、混合物を室温で機械的に撹拌した。
【０１５８】
４時間後、水素化ホウ素ナトリウム（４７３ｍｇ；１２．５ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で一晩機械的に撹拌した。
【０１５９】
翌日、粗反応生成物を４００ｍＬのアセトンにゆっくり注ぎ、得られた懸濁液を３０分間撹拌した。得られた固体を濾過し、アセトン（４００ｍＬ）で２回洗浄し、再度濾過し、蒸留水（１００ｍＬ）に溶解した。溶液を１ＮのＨＣｌで中和し、導電率が一定（約２〜３μＳ）になるまで再生セルロースチューブ（カットオフ１５，０００）中での蒸留水に対する透析を行った。得られた溶液を０．４５μｍフィルターを通して濾過し、最後に凍結乾燥させた。
【０１６０】
【表６】
2015510020.tif 000027
【０１６１】
記載した方法によって得られたカチオン性ポリマー２０〜３０は以下の表７に示す。  示される構造中、略語「Ｇｌｕ」は、ポリマー鎖が未修飾グルコースの繰り返し単位または本発明による繰り返し単位で続き得ることを示す。可視化を促進するため、分岐は示さず、置換基は異なる繰り返し単位上に示す。
【０１６２】
【表７−１】
2015510020.tif 000028
【表７−２】
2015510020.tif 000029
【０１６３】
（実施例３）タイプ（ａ）の繰り返し単位を含有するカチオン性ポリマーの誘導体化の程度（ＤＤ）の決定
繰り返し単位（ａ）を含有するポリマー中に存在する窒素を含有する基の数に対する、誘導体化の程度を、アミン基の対応する塩酸塩への変換により、およびアミン基上または第４級アンモニウム基上に存在するハロゲンイオンの量を決定することにより計算した。
【０１６４】
同じ手順を、比較生成物として用いられる、ＤＥＡＥ−デキストラン塩酸塩（市販製品ＤＥＡＥ−デキストラン塩酸塩、Ｓｉｇｍａ、製品番号Ｄ９８８５）に適用した。
【０１６５】
ハロゲンイオンの量を、カールフィッシャー法により決定された含水量を引くことにより得られた、ポリマーの乾燥重量について決定した。
【０１６６】
１ｇのアミン誘導体を１０ｍＬの蒸留水に溶解した。溶解が完了した後、１０ｍＬの１Ｎの塩酸を添加し、混合物を３０分間撹拌した。撹拌が完了した後、混合物をアセトン（１００ｍＬ）にゆっくり注いだ。得られた固体を濾過し、アセトン（１００ｍＬ）で２回洗浄し、真空下の６０℃のオーブンで乾燥させた。
【０１６７】
ハロゲンイオンの量は重量パーセント、すなわち、カチオン性ポリマー１００ｇ当たりのハロゲンイオンの重量として表す。
【０１６８】
決定を目的として、各窒素原子は独立して置換されているとみなした。
【０１６９】
誘導体化の程度を以下に示す式に従って計算した。
【数２】
2015510020.tif 000030
ＤＤ＝誘導体化の程度
Ｈ．Ｉ．＝水和試料１００ｇ当たりのハロゲンイオンのグラム数
ＭＷ＝単一のアルキルアミン塩酸塩基で置換されたモノマーの分子量
３５．４５＝塩素の分子量
【０１７０】
得られた結果は以下の表８に示す。
【表８】
2015510020.tif 000031
【０１７１】
誘導体化の程度および官能基の影響を２つの操作パラメーター、（ｉ）最小化しなければならない、凝集傾向；および（ｉｉ）最大化しなければならない、充填量の関数として研究した。
【０１７２】
（実施例４）動的光散乱（ＤＬＳ）測定
動的光散乱実験を用い、カチオン性ポリマーの凝集傾向を研究した。
【０１７３】
動的光散乱実験を、実施例１に記載したように調製されたＰｏｌｇｌｕｍｙｔ（商標）グリコーゲンをベースとするカチオン性ポリマーについて、およびさまざまなｓｉＲＮＡ／ポリマー重量パーセント比で調製されたｓｉＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、製品番号１２９９００１）との各複合体について、以下に報告するように行った。
【０１７４】
光散乱実験のため、下記の溶液を調製した：
−溶液１：ＲＮアーゼフリーＰＢＳ中、ｓｉＲＮＡ０．１ｍｇ／ｍＬのストック溶液；
−溶液２：無菌０．２２μｍフィルターを通して濾過した、ＲＮアーゼフリーＰＢＳ中、０．２ｍｇ／ｍＬの濃度のさまざまなカチオン性ポリマーのストック溶液
−溶液３：無菌０．２２μｍフィルターを通して濾過した、ＲＮアーゼフリーＰＢＳの溶液。
【０１７５】
略語ＰＢＳ（リン酸塩緩衝生理食塩水）とは、塩化ナトリウム８ｇ／ｌ、リン酸ナトリウム１．７８ｇ／ｌ、塩化カリウム０．２ｇ／ｌおよびリン酸カリウム０．２７ｇ／ｌの生理食塩水溶液を含むｐＨ７．４の標準的なリン酸塩緩衝生理食塩水を表す。
【０１７６】
分析した試料は、溶液１、２および３を表９に示す比に従って混合することにより得た。試料は次に２回、３０秒間撹拌処理し、３０分間放置した。その後の３０秒間の撹拌処理および１時間の放置後、分析前に溶液を５分間撹拌処理し、試料をＤＬＳ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｍａｌｖｅｒｎで分析した。
【０１７７】
測定値は２５℃および１７３°の散乱角でヘリウムネオンレーザー（λ＝６３２．８ｎｍ）を用いて得た。結果はＺｅｔａｓｉｚｅｒソフトウェアを用いて処理した。
【０１７８】
【表９】
2015510020.tif 000032
【０１７９】
実験は下記のパラメーターを決定することを可能にする：
１．ｓｉＲＮＡを含まないＰｏｌｇｌｕｍｙｔ（商標）グリコーゲンのカチオン性誘導体の平均直径（Ｚ）（結果は表１０に示す）；
２．ナノ粒子のアスペクト比（結果は表１０に示す）；および
３．凝集現象が見られないポリマーの重量に対するｓｉＲＮＡの最大重量パーセント比（結果は表１０に示す）。
【０１８０】
【表１０】
2015510020.tif 000033
【０１８１】
（１）平均直径（Ｚ）
表１０からわかるように、すべての誘導体は１００ｎｍ未満の平均直径（Ｚ）を有する。
【０１８２】
有利には、かつＤＥＡＥ−デキストランとは対照的に、本発明によるカチオン性誘導体は７０ｎｍ未満の平均直径（Ｚ）を有するナノ粒子を形成する。
【０１８３】
（２）アスペクト比
アスペクト比は、平均直径により正規化された粒子サイズの分布ピークの中間高さの幅であり、よってサイズ分布ピークの形状を表す。
【０１８４】
わかるように、すべての本発明によるカチオン性ポリマーは、４．５に等しいアスペクト比でのサイズ分布を示したＤＥＡＥ−デキストランとは対照的に、０．８〜１．１のアスペクト比でのサイズ分布を有した。
【０１８５】
これは、同じ合成方法を用いることにより、本発明によるグリコーゲンベースのカチオン性ポリマーが平均値に近いサイズ範囲内の制御サイズを有するナノ粒子を得ることを可能にすることを示した。
【０１８６】
（３）凝集が見られないｓｉＲＮＡ／ポリマーの最大重量パーセント比
結果は、誘導体化の程度の関数として、本発明によるすべての置換基を含むカチオン性ポリマーが５０重量％までのｓｉＲＮＡと凝集のない複合体を形成したことを示した。
【０１８７】
ポリマー１８（ＤＥＡＥ−デキストラン）は２０重量％までのｓｉＲＮＡとのみ凝集のない複合体を形成した。
【０１８８】
（実施例５）充填量の決定
充填量を繰り返し単位（ａ）および（ｂ）を含有する一連の誘導体についてゲル電気泳動によって決定した。
【０１８９】
複合体を下記の方法に従って調製した。
【０１９０】
ｓｉＲＮＡとさまざまなポリマー誘導体との間の複合体をさまざまなｓｉＲＮＡ／ポリマー比（重量％）を用いて調製した。
【０１９１】
表１１および１２に記載するさまざまな濃度のポリマー溶液を０．２μｍフィルターを通して濾過したＲＮアーゼフリーＰＢＳ中で、ＲＮアーゼフリー水中０．３４０ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、製品番号１２９９００１）の溶液と混合した。次に、混合物を約３０秒間撹拌処理し、室温で１５分間放置し、再度３０秒間撹拌処理し、約３０分間放置した後、ゲル電気泳動を行った。
【０１９２】
ゲルは、１０μｌの各複合体の溶液を、ＭＯＰＳ−ＥＤＴＡ−酢酸ナトリウム緩衝液中で調製された１：２００，０００比のＧｒｅｅｎ  Ｇｅｌ  Ｐｌｕｓ（商標）核酸染料２００００Ｘを含有する４％アガロースゲル上に充填することにより展開した。
【０１９３】
アガロースゲルを８０Ｖの一定圧力で１時間展開した。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＬＡＳ４０００システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により画像を得た。
【０１９４】
得られたゲルは図１〜８に示す。
【０１９５】
ポリマー３（ＤＥＡＥ−グリコーゲン）とｓｉＲＮＡとの間の複合体を、ポリマー溶液およびｓｉＲＮＡを以下の表１１に示す量で用いて調製した。ポリマー３に０．５重量％〜８００重量％のｓｉＲＮＡを充填した。
【０１９６】
ポリマー３とｓｉＲＮＡとの間の複合体を入れ、その後電気泳動により展開したゲルは、表１１に挙げる図に示す。
【０１９７】
【表１１−１】
2015510020.tif 000034
【表１１−２】
2015510020.tif 000035
【０１９８】
図１において、０．５重量％〜８重量％の割合のｓｉＲＮＡと複合させたポリマー３のカラムには単独のｓｉＲＮＡに対応する白いバンドが存在しなかったことがわかる。バンドが存在しないことは、ポリマー３がポリマーの重量に対して０．５重量％〜８重量％のｓｉＲＮＡと完全に複合することができたことを示した。
【０１９９】
図２において、ｓｉＲＮＡと複合させたポリマー３のカラムにｓｉＲＮＡに対応するバンドが存在しないことは、ポリマー３がポリマーの重量に対して１０重量％〜２０重量％の割合のｓｉＲＮＡと完全に複合することができたことを示した。ポリマー５０（未修飾Ｐｏｌｇｌｕｍｙｔ（商標）グリコーゲン）のカラムにｓｉＲＮＡに対応するバンドが存在することは、未修飾Ｐｏｌｇｌｕｍｙｔ（商標）グリコーゲンがポリマーの重量に対して１０重量％に等しい割合のｓｉＲＮＡとも複合することができなかったことを示した。
【０２００】
図３において、３０％のｓｉＲＮＡと複合させたポリマー３のカラムにｓｉＲＮＡに対応するバンドが存在しないことは、ポリマー３がポリマーの総重量に対して３０重量％のｓｉＲＮＡと完全に複合することができたことを示した。対照的に、５０％〜８００％の割合のｓｉＲＮＡに対応するバンドの存在は、ポリマー３がポリマーの総重量に対して５０重量％のｓｉＲＮＡと複合することができなかったことを示した。
【０２０１】
これらの実験はこうして、ポリマー３の最大充填量が３０重量％のｓｉＲＮＡであったことを示した。対照的に、未修飾Ｐｏｌｇｌｕｍｙｔ（商標）グリコーゲン（ポリマー５０）はｓｉＲＮＡと複合することができなかった。
【０２０２】
加えて、ポリマー−ｓｉＲＮＡ複合体を下記のポリマーを用いて調製した：
−繰り返し単位（ａ）を含む、Ｎｏ．１、２、６、８、１０、１２、１４、１６；
−繰り返し単位（ｂ）を含む、Ｎｏ．２０、２１、２３、２４、２５、２８。
【０２０３】
２つのｓｉＲＮＡ充填割合：ポリマーの重量に対して５％および２０％を用いた。用いられた溶液は以下の表１２に示す。
【０２０４】
【表１２】
2015510020.tif 000036
【０２０５】
図４において、それぞれ５重量％および２０重量％のｓｉＲＮＡと複合させたポリマー１のカラムにｓｉＲＮＡに対応するバンドが存在することは、ポリマー１（低い誘導体化の程度を有するＤＥＡＥ−Ｐｏｌｇｌｕｍｙｔ）がｓｉＲＮＡと複合することができなかったことを示した。ポリマー２はポリマーの総重量に対して５重量％の割合のｓｉＲＮＡと複合することができ、ポリマー６はポリマーの総重量に対して２０重量％のｓｉＲＮＡとも複合することができた。
【０２０６】
図５において、２０重量％のｓｉＲＮＡと複合させたポリマー１０および１４のカラムにｓｉＲＮＡに対応するバンドが存在することは、これらのポリマーが５重量％のｓｉＲＮＡと複合することができたことを示した。対照的に、ポリマー１５は２０重量％のｓｉＲＮＡと複合することができた。
【０２０７】
図６において、ｓｉＲＮＡに対応するバンドが存在しないことは、ポリマー８、１２および１６が２０重量％のｓｉＲＮＡと複合することができたことを示した。
【０２０８】
図７において、ポリマー２４および２５のカラムにｓｉＲＮＡに対応するバンドが存在することは、これらのポリマーが５％のｓｉＲＮＡと複合することができなかったことを示した。対照的に、ポリマー２１は２０％のｓｉＲＮＡとも複合した。
【０２０９】
図８において、２０％のｓｉＲＮＡと複合させたポリマー２３および２０のカラムにｓｉＲＮＡに対応するバンドが存在することは、これらのポリマーが５％のｓｉＲＮＡと複合したことを示した。対照的に、ポリマー２８は２０％のｓｉＲＮＡと複合した。
【０２１０】
一般的には、よって、実験はポリマー１（もっとも低い誘導体化の程度を有するＤＥＡＥ−グリコーゲン）、２４および２５のみが５重量％未満のｓｉＲＮＡと複合することができたことを示すことができた。
【０２１１】
他のすべての誘導体は、比較ポリマー１８（ＤＥＡＥ−デキストラン）と同様に、２０％のｓｉＲＮＡと複合することができた。対照的に、ポリマー５０（未修飾Ｐｏｌｇｌｕｍｙｔ（商標）グリコーゲン）はｓｉＲＮＡと複合体を形成することができなかった。
【０２１２】
（実施例６）Ｐｏｌｇｌｕｍｙｔ（商標）グリコーゲンのカチオン性誘導体での細胞毒性実験
細胞毒性実験を、（ＤＥＡＥ）−グリコーゲン（ポリマー１〜４）、（ＤＭＡＰ）−グリコーゲン（ポリマー５〜８）、（ＤＭＡＥ）−グリコーゲン（ポリマー９〜１２）、（２−ＯＨ−ＰＴＭＡ）−グリコーゲン（ポリマー１３〜１６）、未修飾Ｐｏｌｇｌｕｍｙｔ（商標）グリコーゲン（ポリマー５０）、ＤＥＡＥ−デキストラン塩酸塩（ポリマー１８）、および核酸の送達について幅広く研究されている別の対照ポリマー、分岐ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ａｌｄｒｉｃｈ、製品番号４０８７２−７）（ポリマー６０）について行った。
【０２１３】
（ａ）本発明によるカチオン性ポリマーについての実験
・カチオン性ポリマーの調製
カチオン性ポリマーを水に溶解し、細胞培養液に適切に希釈して１０〜１０−５ｍｇ／ｍｌの最終濃度を得、これを用いて２４、４８および７２時間後に細胞毒性を２つの細胞株：ＭｏｎｏＭａｃ−６およびＨＴ２９について評価した。
【０２１４】
・ＭｏｎｏＭａｃ−６細胞株
ヒト単球／マクロファージ細胞株ＭｏｎｏＭａｃ−６はＰｒｏｆ．Ｍａｎｔｏｖａｎｉ（Ｈｕｍａｎｉｔａｓ、イタリア）により親切に提供された。
【０２１５】
細胞を、５％のＣＯ２を有する３７℃のインキュベーターにおいて、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２％のＬ−グルタミン、１％のペニシリン／ストレプトマイシン溶液、１％の非必須アミノ酸、１％の１００ｍＭのピルビン酸ナトリウムおよび１％のオキサロ酢酸を補充したＲＰＭＩ１６４０培地に保持した。
【０２１６】
懸濁液中で成長する細胞を、新しい新鮮な完全培地中の細胞培養物の１：４希釈によって、１週間毎に行われる継代により培養物中に維持した。
【０２１７】
・ＨＴ−２９細胞株
米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ、米国メリーランド州）から入手したヒト結腸癌細胞ＨＴ−２９を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２％のＬ−グルタミン、１％のペニシリン／ストレプトマイシン溶液、１％の非必須アミノ酸、１％の１００ｍＭのピルビン酸ナトリウムおよび２％の１ＭのＨＥＰＥＳ溶液を補充したダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ高グルコースｐＨ７．４）に維持した。
【０２１８】
接着により成長する細胞を、１週間毎に継代を行い、フラスコ当たり３００，０００細胞を播種した後、トリプシン／ＥＤＴＡで処理し、細胞を単一層から分離することにより、培養物中に維持した。
【０２１９】
・細胞毒性アッセイ
実験の２４時間前に９６ウェルプレートに播種したＭｏｎｏＭａｃ−６およびＨＴ−２９細胞（１０，０００細胞／ウェル）を、さまざまな濃度のカチオン性誘導体と２４、４８および７２時間インキュベートした。
【０２２０】
試験化合物での処理の終わりに、細胞生存率をアデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）生成の関数としてＡＴＰｌｉｔｅキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて決定した。
【０２２１】
ＡＴＰｌｉｔｅアッセイは、細胞中に存在するＡＴＰの、読み取り前にウェルに添加されるルシフェラーゼおよびｄ−ルシフェリンとの反応後に生成される発光の生成に基づく。生成された発光の強度は試料中に存在するＡＴＰの濃度に直接比例し、ルミノメーター（ＶＩＣＴＯＲ−３  Ｗａｌｌａｃ）を用いて測定される。
【０２２２】
ルミノメーター測定を行う前に、１００μｌの培養液中の５０μｌの溶解液（０．２ＮのＮａＯＨ中０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を各ウェルに添加する。室温で７００ｒｐｍで撹拌しながらの５分のインキュベーション後、５０μｌのＡＴＰｌｉｔｅキットを各ウェルに添加し、５分間の撹拌後、プレートをさらに１０分間暗室でインキュベートし、発光測定を行う。
【０２２３】
各誘導体について、実験を２通り行った。
【０２２４】
細胞生存率の割合を、処理した細胞および未処理の対照細胞の発光値の平均を考慮することにより決定した。
【０２２５】
各誘導体の細胞生存率の割合（ＣＶ％）を、下記の式：
【数３】
2015510020.tif 000037
に従って、対照に対する平均割合として表した。
【０２２６】
化合物は、生存率パーセントが５０％未満である場合、細胞毒性であるとみなす。
【０２２７】
【表１３】
2015510020.tif 000038
【０２２８】
表１３の結果は、本発明によるカチオン性ポリマーが０．０１ｍｇ／ｍＬの濃度では細胞毒性でないことを示すことができた。
【０２２９】
【表１４】
2015510020.tif 000039
【０２３０】
表１４の結果は、本発明によるカチオン性ポリマーが、ＤＥＡＥ−デキストランおよびＰＥＩとは異なり、０．１ｍｇ／ｍＬの濃度では細胞毒性でないことを示すことができた。
【０２３１】
【表１５】
2015510020.tif 000040
【０２３２】
表１５の結果は、本発明によるカチオン性ポリマーが、ポリマー７は例外として、ＤＥＡＥ−デキストランおよびＰＥＩとは異なり、１ｍｇ／ｍＬの濃度では細胞毒性でないことを示すことができた。誘導体７は懸濁液中の細胞培養物に対してのみ細胞毒性であることが示された。
【０２３３】
【表１６】
2015510020.tif 000041
【０２３４】
表１６の結果は、本発明によるカチオン性ポリマーが、ＤＥＡＥ−デキストランおよびＰＥＩとは異なり、１０ｍｇ／ｍＬの濃度では細胞毒性でないことを示すことができた。
【０２３５】
（ｂ）本発明によるカチオン性ポリマーの蛍光誘導体についての実験
細胞毒性実験は、細胞取り込み実験を行うもっとも高い非細胞毒性濃度を決定するのを目的として、本発明によるカチオン性ポリマーの蛍光誘導体を用いて行った。
【０２３６】
本発明によるカチオン性ポリマーの蛍光誘導体は下記のように合成した。
【０２３７】
磁気撹拌器を備えた２つ口丸底フラスコにおいて、５００ｍｇの本発明によるカチオン性ポリマーの１つを、光の非存在下で、１０ｍＬの蒸留水に溶解した。２ｍＬの１ＮのＮａＯＨを添加し、混合物を室温で１．５時間撹拌した。次に、約０．３ｍＬのＤＭＳＯに溶解した３６ｍｇのフルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を添加した。混合物を室温で一晩撹拌した。
【０２３８】
翌日、２０ｍＬのアセトンを反応フラスコに注ぎ、約３０分間撹拌した後、ポリマーを沈殿させた。上澄みを捨て、沈殿物を約２０ｍＬのアセトンで２回洗浄した。
【０２３９】
沈殿物を次に約１０ｍＬの蒸留水に溶解し、溶液に、光の非存在下で、再生セルロースチューブ（カットオフ１５，０００）中での蒸留水に対する透析を行った。透析が完了した後、溶液を０．４５μｍフィルターを通して濾過し、凍結乾燥させた。
【０２４０】
これらの実験を前述したように調製されたＨＴ２９接着細胞について行った。
【０２４１】
結果は以下の表１７に示すが、表中、本発明によるカチオン性ポリマーの蛍光誘導体は表２と同じ番号に「ｆ」を付けて表した。
【０２４２】
【表１７】
2015510020.tif 000042
【０２４３】
得られた結果から、２４時間にわたり本発明によるカチオン性ポリマーの蛍光誘導体のすべてが非細胞毒性であるもっとも高い濃度は１ｍｇ／ｍｌであることがわかった。対照的に、ＤＥＡＥ−デキストランの蛍光誘導体は分析したすべての濃度で高度に細胞毒性だった。
【０２４４】
（実施例７）細胞取り込み実験
細胞取り込み実験は２、６および２４時間で、本発明のカチオン性ポリマーの蛍光誘導体（１ｆ〜１６ｆ）およびＤＥＡＥ−デキストラン塩酸塩を、１ｍｇ／ｍＬの濃度、すなわち、蛍光誘導体１ｆ〜１６ｆが２４時間にわたり非細胞毒性であることが示された、細胞毒性実験において分析したもっとも高い濃度で用いて行った。
【０２４５】
実験は下記の手順に従って処理したＨＴ２９接着細胞を用いて行った。
【０２４６】
実験の前日に２０，０００細胞／ウェルの密度で播種したＨＴ−２９細胞を、１ｍｇ／ｍｌの濃度の各蛍光誘導体と２、６および２４時間インキュベートした。各インキュベーション期間の終わりに、培地をウェルから取り出し、細胞を標準的なｐＨ７．４リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。
【０２４７】
次に、細胞を２００μｌの溶解液（０．２ＮのＮａＯＨ中０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で処理し、蛍光を蛍光分析（λｅｘｃ．４８５ｎｍ；λｅｍ．５３５ｎｍ）により測定した。
【０２４８】
各化合物および各時間について２回の平均蛍光を計算し、その値を表１８に示す。
【０２４９】
【表１８】
2015510020.tif 000043
【０２５０】
蛍光誘導体の細胞取り込みの効果的な量を、細胞溶解媒（０．２ＮのＮａＯＨ中０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中の各蛍光誘導体について較正曲線を構築することにより計算した。
【０２５１】
較正曲線から、および観測された蛍光強度から、細胞取り込み量ｍｇ／ｍＬを計算し、表１９に記載した。
【０２５２】
【表１９】
2015510020.tif 000044
【０２５３】
得られた結果は、ＤＥＡＥ−デキストランに対する本発明によるカチオン性ポリマーの細胞取り込みの程度を示した。
【０２５４】
また、誘導体化の程度は細胞取り込みに対して直接比例する影響を有したことがわかった。
【０２５５】
（実施例８）緩衝能の評価
緩衝能を評価し、本発明によるカチオン性ポリマーが、細胞吸収後エンドソームからのポリマー−核酸複合体の放出を可能にするのに必要であると考えられる「プロトンスポンジ」効果も誘発するような特性を有することを確認した。
【０２５６】
本発明によるカチオン性ポリマー（ＤＥＡＥ−グリコーゲン）およびＤＥＡＥ−デキストランを、塩酸塩への変換（実施例２に記載）後、ＮａＯＨで滴定し、滴定をｐＨ変化により観察した。
【０２５７】
１００ｍｇのポリマー塩酸塩を１００ｍＬの蒸留水に溶解し、溶液を室温で一晩撹拌した。翌日、溶液を０．０１ＮのＮａＯＨで滴定し、滴定液の添加を線量計で行い、滴定をｐＨ計で観察した。
【０２５８】
本発明によるカチオン性誘導体について行った滴定実験は、本発明のカチオン性ポリマーに高い緩衝能をもたらす、約４．５〜８の範囲内のおよそ生理学的ｐＨ以下のｐＫａ分布を示すことができた。
【０２５９】
およそ生理学的ｐＨのｐＫａ値は、本発明のカチオン性ポリマーに核酸との複合に必要な正電荷をもたらすのに有用だった。
【０２６０】
生理学的ｐＨより低いｐＫａ値は、（「プロトンスポンジ」効果によって）エンドソームから細胞質内への複合体の放出を確保するのに有用だった。
【０２６１】
図９は比較を目的としてカチオン性ポリマー２、３および４（本発明によるＤＥＡＥ−グリコーゲン）の滴定曲線を示す。同じクラスの誘導体間で、誘導体化の程度が増加すると緩衝能が増加したことがわかる。
【０２６２】
加えて、図１０に示すように、ポリマー４（ＤＥＡＥ−グリコーゲン）および生成物１８（ＤＥＡＥ−デキストラン）は同様の誘導体化の程度および緩衝能を有したことがわかった。
【０２６３】
（実施例９）レオロジー測定
レオロジー実験を、本発明によるカチオン性誘導体１〜１６（ＤＥＡＥ−、ＤＭＡＰ−、ＤＭＡＥ−、２−ＯＨ−ＰＴＭＡ−グリコーゲン）およびＤＥＡＥ−デキストラン塩酸塩について、ＰＢＳ中１％の濃度で行った。
【０２６４】
測定は、Ｂｏｈｌｉｎ  Ｒ６  ４０．５．３２ソフトウェアにより操作され、コーンプレートジオメトリー２°／５５ｍｍを備え、Ｐｅｌｔｉｅｒ  Ｂｏｈｌｉｎ装置で２５℃に恒温維持され、１〜５Ｐａのせん断応力範囲内の「制御応力」モードで行われるＢｏｈｌｉｎ  Ｇｅｍｉｎｉ  １５０回転型レオメーターを用いて行った。
【０２６５】
分析したすべての試料は、ｍＰａ・ｓ単位の、非常に低い粘度値を示した。この特性は本発明によるカチオン性誘導体を注射で用いることも可能にした。
【０２６６】
例として、表２０は単一の応力値（２．５Ｐａ）でのさまざまな誘導体の粘度値を報告する。
【０２６７】
【表２０】
2015510020.tif 000045
【０２６８】
（実施例１０）アニオン性分子と複合させたグリコーゲンのカチオン性誘導体での細胞毒性実験
ＨＴ−２９細胞を実験の前日に１０，０００細胞／ウェルの密度で１０％の血清を含有する１００μｌの体積のＤＭＥＭ培地に播種した。
【０２６９】
実験の当日、培地をウェルから取り出し、２．５％の血清を含有する１５０μｌのＤＭＥＭ培地を添加した。本発明によるカチオン性ポリマーおよび蛍光ｓｉＲＮＡから形成された５０μｌの複合体を次に添加した。本発明によるカチオン性ポリマーおよび蛍光ｓｉＲＮＡから形成された複合体を下記の手順に従って調製した。
【０２７０】
それぞれ４０ｍｌのＲＮアーゼフリーＰＢＳ中の６．２８３ｍｇのカチオン性ポリマー３、７、１１および１５を含有する４つの溶液を調製した。１４２．８６μＬのそれぞれの溶液に６．６μＬのＲＮアーゼフリーＰＢＳ中のｓｉＲＮＡの溶液（濃度２０μＭ）を添加し、数分後、それぞれを３５０．５４μＬのＲＮアーゼフリーＰＢＳで希釈した。溶液中のｓｉＲＮＡの最終濃度は、ポリマーの重量に対して１０重量％のｓｉＲＮＡに等しい、２６４ｎＭであった。
【０２７１】
こうして得られた溶液を約３０秒間撹拌し、室温で１０分間インキュベートし、再度３０秒間撹拌し、５分間放置した。実験を行う前、溶液を再度３０秒間撹拌した。
【０２７２】
ｓｉＲＮＡを添加しなかった４０ｍｌのＲＮアーゼフリーＰＢＳ中のカチオン性ポリマー３、７、１１および１５の溶液（５０μｌ）を第１比較例として用いた。
【０２７３】
製造業者Ｌｉｆｅ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）によりｓｉＲＮＡのトランスフェクションについて記載された手順に従って調製され、ポリマーとの複合体に用いたのと同じ量のｓｉＲＮＡを含有する、ｓｉＲＮＡとトランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００との間の複合体を第２比較例として用いた。
【０２７４】
ｓｉＲＮＡを添加しなかったトランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００を第３比較例として用いた。
【０２７５】
上述したように調製された複合体およびすべての比較材料を細胞と接触させた。
【０２７６】
細胞を３７℃で４および２４時間インキュベートし、その後上澄みを除去し、２．５％の血清を含有する１００μｌの培地を添加した。
【０２７７】
試験化合物での処理の終わりに、上記実施例６に記載したように、細胞生存率をアデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）生成の関数として、ＡＴＰｌｉｔｅキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて決定した。
【０２７８】
実施例６に記載したように決定された結果は、以下の表２１に生細胞の割合として示す。
【０２７９】
【表２１】
2015510020.tif 000046
【０２８０】
得られた結果は、本発明によるカチオン性ポリマーとｓｉＲＮＡとの間で得られた複合体は細胞毒性でないことを示した。
【０２８１】
結果として、カチオン性ポリマー３、７、１１および１５を下記の細胞取り込み実験に用いた。
【０２８２】
（実施例１１）蛍光アニオン性分子と複合させたグリコーゲンのカチオン性誘導体での細胞取り込み実験
実験は、上記実施例７に記載したものと同様の方法で、ＨＴ２９接着細胞を用いて行った。
【０２８３】
ＨＴ−２９細胞を実験の前日に２０，０００細胞／ウェルの密度で１０％の血清を含有する１００μｌの体積のＤＭＥＭ培地に播種した。
【０２８４】
実験の当日、培地をウェルから取り出し、２．５％の血清を含有する１５０μｌのＤＭＥＭ培地を添加した。本発明によるカチオン性ポリマーおよび蛍光ｓｉＲＮＡから形成された５０μｌの複合体を次に添加した。
【０２８５】
本発明によるカチオン性ポリマーおよび蛍光ｓｉＲＮＡから形成された複合体を下記の手順に従って調製した。
【０２８６】
それぞれ４０ｍｌのＲＮアーゼフリーＰＢＳ中の６．２８３２ｍｇのカチオン性ポリマー３、７、１１および１５を含有する４つの溶液を調製した。１４２．８６μＬのこれらの溶液のそれぞれに６．６μＬのＲＮアーゼフリーＰＢＳ中のｓｉＲＮＡの溶液（濃度２０μＭ）を添加し、数分後、それぞれを３５０．５４μＬのＲＮアーゼフリーＰＢＳで希釈した。ｓｉＲＮＡを蛍光化合物Ａｌｅｘａ−４８８で標識した。ｓｉＲＮＡの最終濃度は、ポリマーの重量に対して１０重量％のｓｉＲＮＡに等しい、２６４ｎＭであった。
【０２８７】
こうして得られた溶液を約３０秒間撹拌し、室温で１０分間インキュベートし、さらに３０秒間撹拌し、５分間放置した。実験を行う前、溶液を再度さらに３０秒間撹拌した。
【０２８８】
製造業者Ｌｉｆｅ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）によりｓｉＲＮＡのトランスフェクションについて記載された手順に従って調製され、ポリマーとの複合体に用いたのと同じ量のｓｉＲＮＡを含有する、ｓｉＲＮＡとトランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００との間の複合体を第１比較例として用いた。
【０２８９】
単独のｓｉＲＮＡの蛍光を次の比較例として測定した。
【０２９０】
上述したように調製された複合体およびすべての比較材料を細胞と接触させた。
【０２９１】
細胞を３７℃で４時間インキュベートし、上澄みを捨てた後、細胞を２００μｌのＰＢＳで２回洗浄した。
【０２９２】
次に、細胞を２００μｌの溶解液（０．２ＮのＮａＯＨ中０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で、室温で撹拌しながら５分間処理した。
【０２９３】
Ａｌｅｘａ−４８８で標識したｓｉＲＮＡにより放出された蛍光を、ポリマーとｓｉＲＮＡとの間の複合体の細胞との接触を４時間維持した後、蛍光光度計（λｅｘｃ．４８５ｎｍ；λｅｍ．５３５ｎｍ）により測定した。
【０２９４】
各ポリマーについて、実験を３通り行い、平均蛍光強度を次に計算した。この値から、１３６６に等しい単独の培養液について計算された蛍光強度の平均値を引き、最終蛍光強度を求めた。
【０２９５】
単独の培養液の平均蛍光強度値が１３２８に等しい第１比較例（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２００＋ｓｉＲＮＡ）について同じ手順に従った。
【０２９６】
結果を表２２に示す。
【０２９７】
【表２２】
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【０２９８】
得られた結果は、本発明によるカチオン性ポリマーがｓｉＲＮＡの細胞膜内への取り込みを誘発することができることを示した。加えて、本発明によるカチオン性ポリマーは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００を含む比較例として用いた複合体より多量のｓｉＲＮＡを取り込むことを可能にした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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