(57)【要約】  本発明は、神経膠芽腫または退形成性星状細胞腫などの上皮成長因子欠失変異体ｖＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）関連障害を、薬物と複合体化されたＥＧＦＲｖＩＩＩに対する抗体を含む抗原結合タンパク質を使用して治療する方法に関する。そのような抗体およびそれらの薬物複合体の診断用製剤および治療用製剤も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍を有する哺乳類動物を治療する方法であって、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体を、それを必要とする前記哺乳類動物へ約０．１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与することを含む方法。
【請求項２】
前記抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体を少なくとも０．１、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５．４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０８．５、９．０、または９．５ｍｇ／ｋｇから１１．０ｍｇ／ｋｇ以下の用量でそれを必要とする前記哺乳類動物へ投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体を少なくとも０．５〜１ｍｇ／ｋｇ、０．１〜２ｍｇ／ｋｇ、２〜３ｍｇ／ｋｇ、３〜４ｍｇ／ｋｇ、４〜５ｍｇ／ｋｇ、５〜６ｍｇ／ｋｇ、６〜７ｍｇ／ｋｇ、７〜８ｍｇ／ｋｇ、８〜９ｍｇ／ｋｇ、９〜１０ｍｇ／ｋｇ、１．５〜２．５ｍｇ／ｋｇ、２．５〜３．５ｍｇ／ｋｇ、３．５〜４．５ｍｇ／ｋｇ、４．５〜５．５ｍｇ／ｋｇまたは５．５〜６．５ｍｇ／ｋｇの用量でそれを必要とする前記哺乳類動物へ投与する、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
本発明の前記の投与ステップが前記抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体を前記哺乳類動物へ静脈内投与すること、ボーラス注射により投与すること、脳内投与すること、または持続性放出により投与することを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体を少なくとも週に２回、少なくとも週に１回、少なくとも２週に１回、少なくとも３週に１回、または少なくとも４週に１回投与する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記哺乳類動物における前記腫瘍がＥＧＦＲｖＩＩＩ．Ｉを発現する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記哺乳類動物における前記腫瘍が肺癌、乳癌、結腸癌、胃癌、腎臓癌、頭頸部癌、前立腺癌、卵巣癌、神経膠芽腫、退形成星状細胞腫、星状細胞腫またはグリア細胞成分を含む腫瘍、特に神経膠芽腫、退形成星状細胞腫、星状細胞腫またはグリア細胞成分を含む腫瘍である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記哺乳類動物における前記腫瘍が神経膠芽腫または退形成星状細胞腫である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記哺乳類動物における前記腫瘍が再発神経膠芽腫または再発退形成星状細胞腫である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記哺乳類動物における前記腫瘍が乏突起神経膠腫（ｏｌｉｇｏｄｅｎｒｏｇｌｉｏｍａ）、乏突起星状細胞腫、神経膠肉腫、混合膠腫、毛様細胞性星状細胞腫、多形性黄色星状細胞腫、上衣下巨細胞性星状細胞腫、星状芽細胞腫、海綿芽細胞腫、大脳神経膠腫症、または神経節膠腫（ｇａｎｇｌｉｇｌｉｏｍａ）もしくは退形成神経節膠腫を含む神経膠性腫瘍である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記哺乳類動物が前記抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体の最初の投与から３か月よりも長く、４か月よりも長く、５か月よりも長く、または６か月よりも長く生存する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記哺乳類動物における前記腫瘍前記抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体の最初の投与から３か月後、４か月後、５か月後、または６か月後に進行していなかった、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記哺乳類動物が、前記抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体の最初の投与前の前記哺乳類動物における循環腫瘍細胞のレベルと比べて減少している循環腫瘍細胞のレベルを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記哺乳類動物が、前記抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体の最初の投与前の前記哺乳類動物における腫瘍に特有のエキソソームのレベルと比べて低下している腫瘍に特有のエキソソームのレベルを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記哺乳類動物における腫瘍のサイズが、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体の最初の投与前の腫瘍のサイズと比べて抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体の投与後に減少する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記哺乳類動物における腫瘍のサイズが、前記抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体の最初の投与前の前記哺乳類動物における腫瘍のサイズと比べて少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％減少する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記哺乳類動物が完全奏功または部分奏功を示す、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記哺乳類動物が、前記抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体の最初の投与から６か月間の無憎悪生存期間を示す、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
マクドナルド診断基準またはＲＡＮＯ診断基準によって評価される、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体の抗体が抗体１３１である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体の抗体が、配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体に複合体化された薬物が放射性同位体、化学療法薬、毒素またはそれらの断片もしくは異型体である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体が少なくとも１〜１０個、少なくとも１〜５個、少なくとも３〜４個または少なくとも３〜５個のマイタンシノイドＤＭ１分子に複合体化されている、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記薬物が切断不可能リンカー基を介して前記抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体に複合体化されている、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記薬物がスクシンイミジル‐４‐（Ｎ‐マレイミドメチル）シクロヘキサン‐１‐カルボキシレート（ＳＭＣＣ）を介して前記抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体に複合体化されている、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体が図８Ａ、８Ｂおよび８Ｄに示されているＡｂ１３１‐ＤＭ１であり、図８Ｂに示されている完全長重鎖および図８Ｄに示されている完全長軽鎖を含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体が配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、前記抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体がＭＣＣリンカーによって３〜５個のマイタンシノイドに複合体化されている、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記の投与ステップを、前記哺乳類動物への外科手術の実施、放射線治療の実施、原発性状況における全脳放射線治療の実施、再発性状況における局所的放射線治療の実施、原発性状況および再発性状況におけるテモゾロミドの投与、ベバシズマブの投与、イリノテカンの投与、ＰＣＶ、プロカバジン（ｐｒｏｃａｂａｚｉｎｅ）、ロムスチン［ＣＣＮＵ］、ビンクリスチンの投与、グリアデル・ウェファー（ＢＣＮＵをしみ込ませたポリフェプロザン）の移植、チロシンキナーゼ阻害剤の投与、放射線増感剤の投与、ワクチン系治療法の実施、原発性状況または再発性状況における抗体薬物複合体の投与または二特異的Ｔ細胞増強剤の投与、または標的化薬物の投与による前記哺乳類動物の治療の前に、前記哺乳類動物の治療と組み合わせて、または前記哺乳類動物の治療の後に実施する、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記哺乳類動物がヒトである、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１２年１１月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／７２７，０２９号および２０１１年１１月１６日に出願された米国仮特許出願第６１／５６０，７３１号の利益を主張するものである。それらの特許仮出願は本明細書において参照により組み込まれる。
【０００２】
配列表の参照
本願は電子形式の配列表と共に提出されている。その配列表は２０１１年１１月１６日に作成されたＡ‐１６８０‐ＵＳ‐ＰＳＰ＿ＳＥＱ．ｔｘｔという表題の８９ＫＢのサイズのファイルとして提供される。その電子形式の配列表の中の情報はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本発明の分野
本発明は、神経膠芽腫または退形成性星状細胞腫などの上皮成長因子欠失変異体ｖＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）関連障害を、薬物と複合体化されたＥＧＦＲｖＩＩＩに対する抗体を含む抗原結合タンパク質を使用して治療する方法に関する。そのような抗体およびそれらの薬物複合体の診断用製剤および治療用製剤も提供される。
【背景技術】
【０００４】
ヒトと動物の癌のより良い診断と治療に役立つ腫瘍特異的分子が前世紀より捜し求められている。分子構造データに基づく腫瘍特異的物質の確固たる証拠は、ウイルス誘導性癌に基づく物質およびウイルスゲノムにより特定される分子構造を含む物質を例外として、ヒトの大半の種類の癌において提供することが難しかった。新規の分子構造に基づく腫瘍特異的分子の例は極めて少ない。悪性ヒト神経膠腫、ならびに乳癌および他のヒト癌腫のような上皮成長因子受容体分子の増幅または変化に関連する可能性がある他の腫瘍の場合では、独特の配列を有する構造的に変化した分子の明白な表示はこれまで無い。
【０００５】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は癌原遺伝子ｃ‐ｅｒｂＢの１７０キロダルトンの膜糖タンパク質産物である。ＥＧＦＲ遺伝子の配列は知られている（Ｕｌｌｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）．Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ａｂｅｒｒａｎｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ａ４３１  Ｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ３０９：４１８−４２５）。ＥＧＦＲ遺伝子は、もともとニワトリ赤芽球症ウイルスにおいて特定されたｅｒｂＢ癌遺伝子の細胞性ホモログである（Ｄｏｗｎｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）．Ｃｌｏｓｅ  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ｖ−ｅｒｂ  Ｂ  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ３０７：５２１−５２７，Ｕｌｌｒｉｃｈ，  ｅｔ  ａｌ．（１９８４））。この癌遺伝子の遺伝子増幅による活性化が様々なヒト腫瘍において観察されており（Ｈａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７Ａ）．Ｔｈｅ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｇｅｎｅ  ｉｎ：  Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ，Ｇｅｎｅｓ，ａｎｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｇｕｒｏｆｆ，  Ｇ．  １２ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｈａｐｔｅｒ  ２．ｐｐ．４０−７６．Ｗｉｌｅｙ，Ｎ．Ｙ．）、特にグリア細胞起源の腫瘍において観察されている（Ｌｉｂｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）．Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｏｓｓｉｂｌｅ  Ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＥＧＦ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｕｍｏｕｒｓ  ｏｆ  Ｇｌｉａｌ  Ｏｒｉｇｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：１４４−１４７、Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｇｌｉｏｍａｓ  ｉｓ  Ｉｎｖａｒｉａｂｌｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：６８９９−６９０３、Ｙａｍａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）．Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｇｅｎｅ（ｃ−ｅｒｂＢ）ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｕｍｏｒｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８：１８１６−１８２０、Ｍａｌｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  Ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  Ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４：２７１１−２７１４）。
【０００６】
ＥＧＦ‐ｒは多くの種類のヒト固形腫瘍で過剰発現されていることが示されている。Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  ７：３５９（１９８９），Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １：３３９−３４４（１９９０）、Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ  ａｎｄ  Ｄｅａｎ  Ｉｎｔ’ｌ  Ｊ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ４：２７７−２９６（１９９４）。例えば、ＥＧＦＲの過剰発現がある特定の肺癌、乳癌、結腸癌、胃癌、脳癌、膀胱癌、頭頚部癌、卵巣癌、腎臓癌および前立腺癌において観察されている。Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ  ａｎｄ  Ｄｅａｎ  Ｉｎｔ’ｌ  Ｊ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ４：２７７−２９６（１９９４）。上皮成長因子（ＥＧＦ）とトランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ‐α）の両方がＥＧＦ‐ｒに結合し、細胞増殖と腫瘍成長を導くことが示されている。
【０００７】
ｖ‐ｅｒｂＢ癌遺伝子と通常のＥＧＦＲ遺伝子の間の一つの主要な違いは、ウイルス性癌遺伝子は通常の受容体のアミノ末端短縮型であること、ウイルス性癌遺伝子は細胞質外ドメインの大半を欠失しているが、経膜ドメインおよびチロシンキナーゼドメインを保持すること  （Ｆｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｃ‐ｅｒｂ  Ｂ  ｂｙ  ＬＴＲ  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  ｂｙ  Ａｖｉａｎ  Ｌｅｕｋｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ．Ｃｅｌｌ  ３３：３５７−３６８、Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ａ  Ｎｅｗ  Ａｖａｉｎ  Ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ，ＡＥＶ−Ｈ  Ｃａｒｒｉｅｓ  ｅｒｂＢ  Ｇｅｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｔｈ  Ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｓａｒｃｏｍａ．Ｃｅｌｌ  ３４：２２５−２３２、Ｎｉｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）．ｃ−ｅｒｂＢ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＡＬＶ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ：Ｎｏｖｅｌ  ＲＮＡ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ａｍｉｎｏ−Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ＥＧＦ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｃｅｌｌ  ４１：７１９−７２６、Ｇａｍｍｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｃａｒｂｏｘｙ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｅ  ｗｉｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒａｌ  ｅｒｂＢ  Ｇｅｎｅｓ．    Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：６０５３−６０５７）である。これにより、上皮成長因子（ＥＧＦ）に結合することができないが、まだ他の基質をリン酸化することができるタンパク質が生じ（Ｇｉｌｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｌｙｔｉｏｎ  ａｔ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｉｓ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｖ−ｅｒｂ  Ｂ  Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  ｉｎ  Ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ．Ｃｅｌｌ  ４０：６０９−６１８、Ｋｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  ａ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｓ  ａ  Ｐｒｏｂｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｋｉｎａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｖｉａｎ  ＥＧＦ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ｖ−ｅｒＢ  Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｃｅｌｌ  ４０：６１９−６２５）、そして、そのキナーゼドメインが制御されておらず、常に活性であるのでｖ‐ｅｒｂＢタンパク質は発癌性である（Ｄｏｗｎｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）という推測が導かれた。
【０００８】
ウイルス性ｅｒｂＢ癌遺伝子において様々な遺伝的変化が、例えば、その遺伝子のアミノ酸置換やその遺伝子のカルボキシ末端の欠失が起こり得る。しかしながら、入手可能な証拠は、アミノ末端短縮が発癌にとって重要であることを示している。アミノ末端短縮は、プロモーターの挿入またはレトロウイルスの導入により生じるものを含み、全てのｖ‐ｅｒｂＢ癌遺伝子の特徴である（Ｎｉｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）．ｃ−ｅｒｂＢ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＡＬＶ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ：  Ｎｏｖｅｌ  ＲＮＡ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ａｍｉｎｏ−Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ＥＧＦ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｃｅｌｌ  ４１：７１９−７２６、Ｇａｍｍｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｃａｒｂｏｘｙ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｅ  ｗｉｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒａｌ  ｅｒｂＢ  Ｇｅｎｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：６０５３−６０５７）。
【０００９】
対照的に、カルボキシ末端の欠失はレトロウイルス導入により生じる腫瘍とのみ関係が有るようであり、宿主範囲と腫瘍の種類の特異度を決定するようである（Ｇａｍｍｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６；Ｒａｉｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）．ｃ−ｅｒｂＢ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｖｉａｎ  Ｌｅｕｋｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ：Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  Ｓｉｔｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｒｏｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃ−ｅｒｂＢ  Ａｌｌｅｌｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：２２８７−２２９１）。アミノ末端短縮ニワトリｃ‐ｅｒｂＢ遺伝子またはキメラウイルス性癌遺伝子‐ヒトＥＧＦ受容体を用いる形質移入実験は、この欠失が、それだけで形質転換性タンパク質を作製することに充分であることを示す（Ｐｅｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）．Ｐｒｏｖｉｒａｌ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃ−ｅｒｂＢ  ｉｓ  Ｌｅｕｋｅｍｏｇｅｎｉｃ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  Ｓａｒｃｏｍａｇｅｎｉｃ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃ−ｅｒｂＢ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６２：１８４０−１８４４、Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）．Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｖ−ｅｒｂＢ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：７５９７−７６０１）  。
【００１０】
ＥＧＦＲ遺伝子の増幅は悪性ヒト神経膠腫の約４０％で生じ（Ｌｉｂｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｏｓｓｉｂｌｅ  Ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＥＧＦ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｕｍｏｕｒｓ  ｏｆ  Ｇｌｉａｌ  Ｏｒｉｇｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：１４４−１４７、Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｇｌｉｏｍａｓ  ｉｓ  Ｉｎｖａｒｉａｂｌｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：６８９９−６９０３）  、その受容体遺伝子の再構成は遺伝子増幅を有する腫瘍の多くで明らかである。それらの構造の変化はその遺伝子のアミノ末端側半分に優先的に影響するようであるが（Ｙａｍａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）．Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｏｓｓｉｂｌｅ  Ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＥＧＦ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｕｍｏｕｒｓ  ｏｆ  Ｇｌｉａｌ  Ｏｒｉｇｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：１４４−１４７、Ｍａｌｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  Ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  Ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４：２７１１−２７１４）、その再構成の性質はその時点ではどの腫瘍においても正確に特徴解析されていなかった。
【００１１】
サイズ変異型ＥＧＦＲ遺伝子と増幅がいくつかのヒトの癌において報告されている  （Ｈｕｍｐｈｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）．Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｌｉｏｍａ  Ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４８：２２３１−２２３８、Ｂｉｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，４７：１９１−２０５、Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｇｌｉｏｍａｓ  ｉｓ  Ｉｎｖａｒｉａｂｌｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：６８９９−６９０３、および  Ｈｕｍｐｈｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｉｏｍａ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８（８）：２２３１−８（１９８８））。しかしながら、それらの変化したＥＧＦＲ分子の細胞における分子的基盤は決定されていなかった。
【００１２】
１９８９年にビグナー博士とフォーゲルスタイン博士の研究がＩＩＩ型変異体（デルタ‐ＥＧＦｒまたはＥＧＦＲｖＩＩＩとも呼ばれる）として知られるようになったＥＧＦ受容体変異体の配列を解明した。この研究は米国特許第６，４５５，４９８号、第６，１２７，１２６号、第５，９８１，７２５号、第５，８１４，３１７号、第５，７１０，０１０号、第５，４０１，８２８号、および第５，２１２，２９０号に記載されており、それらの特許の開示は参照によりここに組み込まれる。
【００１３】
ＥＧＦＲ変異体は、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅を伴う遺伝子再構成によって生じる。公知の８つの主要なＥＧＦＲの変異体が存在する：（ｉ）ＥＧＦＲｖＩはＥＧＦＲの細胞外ドメインの大半を欠失する、（ｉｉ）ＥＧＦＲｖＩＩはＥＧＦＲの細胞外ドメイン中の８３アミノ酸のインフレーム欠失からなる、（ｉｉｉ）ＥＧＦＲｖＩＩＩはＥＧＦＲの細胞外ドメイン中の２６７アミノ酸のインフレーム欠失からなる、（ｉｖ）ＥＧＦＲｖＩＶはＥＧＦＲの細胞質ドメイン中に欠失を含む、（ｖ）ＥＧＦＲｖＶはＥＧＦＲの細胞質ドメイン中に欠失を含む、（ｖｉ）ＥＧＦＲ．ＴＤＭ／２‐７はＥＧＦＲの細胞外ドメイン中にエクソン２〜７の重複を含む、（ｖｉｉ）ＥＧＦＲ．ＴＤＭ／１８‐２５はＥＧＦＲのチロシンキナーゼドメイン中にエクソン１８〜２６の重複を含む、および（ｖｉｉｉ）ＥＧＦＲ．ＴＤＭ／１８‐２６はＥＧＦＲのチロシンキナーゼドメイン中にエクソン１８〜２６の重複を含む（Ｋｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．ＥＧＦ  ｍｕｔａｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｖＩＩＩ  ａｓ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔａｒｇｅｔ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｌａｔ  Ｃａｎｃｅｒ．８（２）：８３−９６（２００１））。加えて、エクソン１１と１４の接合部に新規のヒスチジン残基を導入する２つ目の欠失を有する２つ目のよりまれなＥＧＦＲｖＩＩＩ変異体（ＥＧＦＲｖＩＩＩ／D１２‐１３）が存在する（Ｋｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．ＥＧＦ  ｍｕｔａｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｖＩＩＩ  ａｓ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔａｒｇｅｔ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｌａｔ  Ｃａｎｃｅｒ．８（２）：８３−９６  （２００１））。
【００１４】
ＥＧＦＲｖＩＩＩはヒトの癌において最も生じることが多い上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体の変異体である  （Ｋｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．ＥＧＦ  ｍｕｔａｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｖＩＩＩ  ａｓ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔａｒｇｅｔ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｌａｔ  Ｃａｎｃｅｒ．８（２）：８３−９６（２００１））。遺伝子増幅の過程で２６７アミノ酸の欠失が細胞外ドメインに生じ、腫瘍特異的モノクローナル抗体が標的とすることができる新規の接合部を作製する。このＥＧＦ受容体の変異体はリガンドに無関係な様式での構成的なシグナル伝達を介して腫瘍進行に寄与する。ＥＧＦＲｖＩＩＩはどの正常組織でも発現することが分かっていない（Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ，ＣＪ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ａｒｅ  ｔｕｍｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｒｅａｃｔ  ｗｉｔｈ  ｂｒｅａｓｔ  ａｎｄ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｇｌｉｏｍａｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５５（１４）：３１４０−３１４８（１９９５）、Ｏｌａｐａｄｅ−Ｏｌａｏｐａ，ＥＯ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｖａｒｉａｎｔ  ＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．８２（１）：１８６−９４（２０００））。グリシン置換を有する２６７アミノ酸の欠失により、抗体の標的化を可能とし得る独特の接合部が作製される。さらに、ＥＧＦＲｖＩＩＩのある特定の腫瘍における発現と正常組織におけるその発現の欠如を考えると、ＥＧＦＲｖＩＩＩは腫瘍治療における薬物標的化の理想的な標的であり得る。特に、ＥＧＦＲｖＩＩＩは腫瘍の免疫複合体（例えば、抗新生物剤または毒素に複合体化された抗体）治療の理想的な候補であるように見える。ＥＧＦＲｖＩＩＩを過剰発現する癌の別の治療法には、その変異体受容体を特異的に標的とし、通常のＥＧＦＲを切断しない腫瘍特異的リボザイムの使用が含まれた。そのリボザイムは胸腺欠損ヌードマウスにおいて乳癌の成長を著しく阻害することが分かった（Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．１０４（６）：７１６−２１（２００３））。
【００１５】
ＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質全長に対する一般的な抗体が説明されている。国際特許出願第０１／６２９３１号、およびＫｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．ＥＧＦ  ｍｕｔａｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｖＩＩＩ  ａｓ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔａｒｇｅｔ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｌａｔ  Ｃａｎｃｅｒ．８（２）：８３−９６（２００１）、Ｋｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ａｓ  ａ  ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂａｓｅｄ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｔｈｅｒａｐｈｙ．  Ｂｒａｉｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｐａｔｈｏｌ．１７（２）：７１−７８（２０００）、Ｋｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｇｌｉｏｍａ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ  ｂｙ  ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｃＦｖ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ．８８（６）：９６２−９６９（２０００）、Ｌａｎｄｒｙ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｉｎ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｇｅｎ：Ｆｖ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｕｔａｎｔ  ＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＥＧＦＲｖＩＩＩ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．３０８（５）：８８３−８９３（２００１）、Ｒｅｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．Ａｓｔａｔｉｎｅ−２１１  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｕｓｉｎｇ  Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ５−［２１１Ａｔ］ａｓｔａｔｏ−３−ｐｙｒｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ．Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．２６（４）：４０５−４１１（１９９９）、Ｒｅｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｏｆ  ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｔｓ  ｍｕｒｉｎｅ  ｐａｒｅｎｔ．Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．２４（７）：６３９−６４７（１９９７）、Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ  ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．５０（１２）：６３９−６５２（２００２）、Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ａｒｅ  ｔｕｍｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｒｅａｃｔ  ｗｉｔｈ  ｂｒｅａｓｔ  ａｎｄ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｇｌｉｏｍａｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．５５（１４）：３１４０−３１４８（１９９５）、Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｃｌａｓｓ  ＩＩＩ  ｖａｒｉａｎｔ  ｏｆ  ���ｈｅ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲＶＩＩＩ）：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｓ  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ．４（２）：１４８−１５８（１９９８）、Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｃｌａｓｓ  ＩＩＩ  ｖａｒｉａｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  （ＥＧＦＲｖＩＩＩ）：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｓ  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ．４（２）：１４８−１５８（１９９８）、Ｊｕｎｇｂｌｕｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ／ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１００（２）：６３９−４４（２００３）、Ｍａｍｏｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）−ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  Ｍｅｄｉａｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ＥＧＦＲ−ａｎｄ  ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６３：３１５４−３１６１（２００３））を参照のこと。しかしながら、これらの上述した抗体のそれぞれは可変領域および／または定常領域のどちらかにおいてマウス配列を有する、または含む。そのようなマウス由来タンパク質の存在がその抗体の急速な排出につながり得る、または患者におけるその抗体に対する免疫応答の生起につながり得る。加えて、そのような抗体は親和性が比較的に低く、親和性成熟の後でさえ約２．２×１０−８から１．５×１０−９である（Ｋｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．ＥＧＦ  ｍｕｔａｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｖＩＩＩ  ａｓ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔａｒｇｅｔ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｌａｔ  Ｃａｎｃｅｒ．８（２）：８３−９６（２００１））。
【００１６】
マウスまたはラットに由来する抗体の利用を避けるため、研究者らは、げっ歯類動物が完全ヒト抗体を作製することができるようにそのげっ歯類動物にヒト抗体機能を導入した。例えば、Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｏｆ  ｍｅｇａｂａｓｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｌｏｃｉ  ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅｓ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．１５（２）：１４６−５６（１９９７）を参照のこと。このアプローチは野生型ＥＧＦＲに対する良好な抗体の作製との関連で使用されてきた。例えば、Ｙａｎｇ  Ｘ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ＡＢＸ−ＥＧＦ，ａ  ｆｕｌｌｙ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉ−ＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｏｎｃｏｌ  Ｈｅｍａｔｏ  ３８（１）：１７−２３（２００１）、Ｙａｎｇ  Ｘ−Ｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  Ｔｕｍｏｒｓ  ｂｙ  ａ  Ｆｕｌｌｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５９（６）：１２３６−１２４３（１９９９）、および米国特許第６，２３５，８８３号を参照のこと。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】米国特許第６，４５５，４９８号明細書
【特許文献２】米国特許第６，１２７，１２６号明細書
【特許文献３】米国特許第５，９８１，７２５号明細書
【特許文献４】米国特許第５，８１４，３１７号明細書
【特許文献５】米国特許第５，７１０，０１０号明細書
【特許文献６】米国特許第５，４０１，８２８号明細書
【特許文献７】米国特許第５，２１２，２９０号明細書
【特許文献８】国際公開第２００１／６２９３１号
【特許文献９】米国特許第６，２３５，８８３号明細書
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｕｌｌｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）．Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ａｂｅｒｒａｎｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ａ４３１  Ｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ３０９：４１８−４２５）
【非特許文献２】Ｄｏｗｎｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）．Ｃｌｏｓｅ  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ｖ−ｅｒｂ  Ｂ  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ３０７：５２１−５２７，Ｕｌｌｒｉｃｈ，  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）
【非特許文献３】Ｈａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７Ａ）．Ｔｈｅ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｇｅｎｅ  ｉｎ：Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ，Ｇｅｎｅｓ，ａｎｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｇｕｒｏｆｆ，Ｇ．１２ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｈａｐｔｅｒ  ２．ｐｐ．４０−７６．Ｗｉｌｅｙ，Ｎ．Ｙ．
【非特許文献４】Ｌｉｂｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）．Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｏｓｓｉｂｌｅ  Ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＥＧＦ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｕｍｏｕｒｓ  ｏｆ  Ｇｌｉａｌ  Ｏｒｉｇｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：１４４−１４７
【非特許文献５】Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｇｌｉｏｍａｓ  ｉｓ  Ｉｎｖａｒｉａｂｌｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：６８９９−６９０３
【非特許文献６】Ｙａｍａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）．Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｇｅｎｅ（ｃ−ｅｒｂＢ）  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｕｍｏｒｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８：１８１６−１８２０
【非特許文献７】Ｍａｌｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  Ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  Ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４：２７１１−２７１４
【非特許文献８】Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  ７：３５９（１９８９）
【非特許文献９】Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １：３３９−３４４（１９９０）
【非特許文献１０】Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ  ａｎｄ  Ｄｅａｎ  Ｉｎｔ’ｌ  Ｊ．  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ４：２７７−２９６  （１９９４）
【非特許文献１１】Ｆｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｃ‐ｅｒｂ  Ｂ  ｂｙ  ＬＴＲ  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  ｂｙ  Ａｖｉａｎ  Ｌｅｕｋｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ．Ｃｅｌｌ  ３３：３５７−３６８
【非特許文献１２】Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ａ  Ｎｅｗ  Ａｖａｉｎ  Ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ，  ＡＥＶ−Ｈ  Ｃａｒｒｉｅｓ  ｅｒｂＢ  Ｇｅｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｔｈ  Ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｓａｒｃｏｍａ．Ｃｅｌｌ  ３４：２２５−２３２
【非特許文献１３】Ｎｉｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）．ｃ−ｅｒｂＢ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＡＬＶ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ：Ｎｏｖｅｌ  ＲＮＡ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ａｍｉｎｏ−Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ＥＧＦ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｃｅｌｌ  ４１：７１９−７２６
【非特許文献１４】Ｇａｍｍｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｃａｒｂｏｘｙ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｅ  ｗｉｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒａｌ  ｅｒｂＢ  Ｇｅｎｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：６０５３−６０５７
【非特許文献１５】Ｇｉｌｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｌｙｔｉｏｎ  ａｔ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｉｓ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｖ−ｅｒｂ  Ｂ  Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  ｉｎ  Ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ．Ｃｅｌｌ  ４０：６０９−６１８
【非特許文献１６】Ｋｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  ａ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｓ  ａ  Ｐｒｏｂｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｋｉｎａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｖｉａｎ  ＥＧＦ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ｖ−ｅｒＢ  Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｃｅｌｌ  ４０：６１９−６２５
【非特許文献１７】Ｇａｍｍｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６；Ｒａｉｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）．ｃ−ｅｒｂＢ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｖｉａｎ  Ｌｅｕｋｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ：Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  Ｓｉｔｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｒｏｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃ−ｅｒｂＢ  Ａｌｌｅｌｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：２２８７−２２９１
【非特許文献１８】Ｐｅｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）．Ｐｒｏｖｉｒａｌ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃ−ｅｒｂＢ  ｉｓ  Ｌｅｕｋｅｍｏｇｅｎｉｃ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  Ｓａｒｃｏｍａｇｅｎｉｃ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃ−ｅｒｂＢ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６２：１８４０−１８４４
【非特許文献１９】Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）．Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｖ−ｅｒｂＢ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：７５９７−７６０１
【非特許文献２０】Ｙａｍａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）．Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｏｓｓｉｂｌｅ  Ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＥＧＦ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｕｍｏｕｒｓ  ｏｆ  Ｇｌｉａｌ  Ｏｒｉｇｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：１４４−１４７
【非特許文献２１】Ｈｕｍｐｈｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）．Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｌｉｏｍａ  Ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４８：２２３１−２２３８
【非特許文献２２】Ｂｉｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，４７：１９１−２０５
【非特許文献２３】Ｋｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．ＥＧＦ  ｍｕｔａｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｖＩＩＩ  ａｓ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔａｒｇｅｔ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｌａｔ  Ｃａｎｃｅｒ．８（２）：８３−９６（２００１）
【非特許文献２４】Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ，ＣＪ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ａｒｅ  ｔｕｍｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｒｅａｃｔ  ｗｉｔｈ  ｂｒｅａｓｔ  ａｎｄ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｇｌｉｏｍａｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５５（１４）：３１４０−３１４８（１９９５）
【非特許文献２５】Ｏｌａｐａｄｅ−Ｏｌａｏｐａ，ＥＯ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｖａｒｉａｎｔ  ＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．８２（１）：１８６−９４（２０００）
【非特許文献２６】Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．１０４（６）：７１６−２１（２００３）
【非特許文献２７】Ｋｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ａｓ  ａ  ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂａｓｅｄ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｔｈｅｒａｐｈｙ．Ｂｒａｉｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｐａｔｈｏｌ．１７（２）：７１−７８（２０００）
【非特許文献２８】Ｋｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｇｌｉｏｍａ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ  ｂｙ  ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｃＦｖ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ．８８（６）：９６２−９６９（２０００）
【非特許文献２９】Ｌａｎｄｒｙ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｉｎ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｇｅｎ：Ｆｖ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｕｔａｎｔ  ＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＥＧＦＲｖＩＩＩ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．３０８（５）：８８３−８９３（２００１）
【非特許文献３０】Ｒｅｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．Ａｓｔａｔｉｎｅ−２１１  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｕｓｉｎｇ  Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ５−［２１１Ａｔ］ａｓｔａｔｏ−３−ｐｙｒｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ．Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．２６（４）：４０５−４１１（１９９９）
【非特許文献３１】Ｒｅｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｏｆ  ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｔｓ  ｍｕｒｉｎｅ  ｐａｒｅｎｔ．Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．２４（７）：６３９−６４７（１９９７）
【非特許文献３２】Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ  ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．５０（１２）：６３９−６５２（２００２）
【非特許文献３３】Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ａｒｅ  ｔｕｍｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｒｅａｃｔ  ｗｉｔｈ  ｂｒｅａｓｔ  ａｎｄ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｇｌｉｏｍａｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．５５（１４）：３１４０−３１４８（１９９５）
【非特許文献３４】Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｃｌａｓｓ  ＩＩＩ  ｖａｒｉａｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲＶＩＩＩ）：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｓ  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ．４（２）：１４８−１５８（１９９８）
【非特許文献３５】Ｊｕｎｇｂｌｕｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ／ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１００（２）：６３９−４４（２００３）
【非特許文献３６】Ｍａｍｏｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  （ＥＧＦＲ）−ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  Ｍｅｄｉａｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ＥＧＦＲ−  ａｎｄ  ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６３：３１５４−３１６１  （２００３）
【非特許文献３７】Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｏｆ  ｍｅｇａｂａｓｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｌｏｃｉ  ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅｓ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．１５（２）：１４６−５６（１９９７）
【非特許文献３８】Ｙａｎｇ  Ｘ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ＡＢＸ−ＥＧＦ，ａ  ｆｕｌｌｙ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉ−ＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｏｎｃｏｌ  Ｈｅｍａｔｏ  ３８（１）：１７−２３（２００１）
【非特許文献３９】Ｙａｎｇ  Ｘ−Ｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  Ｔｕｍｏｒｓ  ｂｙ  ａ  Ｆｕｌｌｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５９（６）：１２３６−１２４３（１９９９）
【発明の概要】
【００１９】
１つの実施形態では、本発明は、ＥＧＦＲｖＩＩＩおよび配列ＬＥＥＫＫＧＮＹＶＶＴＤＨＣ（配列番号５６）を含むペプチドに特異的に結合する、毒素、特にＤＭ１に複合体化されている単離ヒトモノクローナル抗体を含む。別の実施形態では、本発明は、ＬＥＥＫＫＧＮＹＶＶＴＤＨＣ（配列番号５６）を含む配列内に含まれるエピトープに特異的に結合する単離ヒトモノクローナル抗体であって、毒素、特にＤＭ１に複合体化されている単離ヒトモノクローナル抗体を含み、ここで、ＳＰＯＴアレイにおけるアラニンスキャニングにより決定される結合に必要とされる残基が、ＥＥＫ、ＫＫＮＹＶ、ＬＥＫ、ＥＫＮＹおよびＥＥＫＧＮからなる群より選択される。
【００２０】
さらなる実施形態は、ＶＨ３‐３３遺伝子によってコードされている重鎖可変領域アミノ配列を含む、毒素、特にＤＭ１に複合体化されている単離ヒトモノクローナル抗体を含む。その重鎖可変領域アミノ配列は、ＪＨ４ｂ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列、またはＤ６‐１３およびＤ３‐９からなる群より選択されるＤ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含むことができる。
【００２１】
他の実施形態は、Ａ２３（ＶＫ２）遺伝子によってコードされる軽鎖可変領域アミノ配列を含む、毒素、特にＤＭ１に複合体化されている単離ヒトモノクローナル抗体を含む。その軽鎖可変領域アミノ配列はＪＫ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含むことができる。
【００２２】
他の実施形態は、ＥＧＦＲｖＩＩＩに結合し、毒素、特にＤＭ１に複合体化されており、そして、（配列番号１３８、２、４、５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、および１７）において特定される抗体１３．１．２、１３１、１７０、１５０、０９５、２５０、１３９、２１１、１２４、３１８、３４２および３３３の重鎖アミノ酸配列からなる群より選択される重鎖アミノ酸配列を含む単離抗体またはその断片を含む。その抗体はモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であり得る。
【００２３】
その毒素はリンカーを介してその抗体と結合し得る。その毒素は二次抗体を介してその抗体と結合し得る。さらなる実施形態はその抗体を産生するハイブリドーマ細胞株、およびその抗体をコードする遺伝子を含む形質転換細胞を含む。その細胞は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞であり得る。
【００２４】
さらなる実施形態は、ＥＧＦＲｖＩＩＩの発現と関連する細胞増殖を阻害する方法であって、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する細胞を有効量のその抗体または断片で処理することを含む方法を含む。１つの実施形態では、その抗体は毒素、特にＤＭ１に複合体化されており、そして、抗体１３．１．２（配列番号１３８）、１３１（配列番号２）、１７０（配列番号４）、１５０（配列番号５）、０９５（配列番号７）、２５０（配列番号９）、１３９（配列番号１０）、２１１（配列番号１２）、１２４（配列番号１３）、３１８（配列番号１５）、３４２（配列番号１６）、および３３３（配列番号１７）の重鎖アミノ酸配列からなる群より選択される重鎖アミノ酸配列を含む。その方法はインビボで実施され得、そして、肺癌、結腸癌、胃癌、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、頭頚部癌または卵巣癌または神経膠芽腫などの上皮細胞の増殖を伴う癌を患う哺乳類動物、例えばヒトに対して実施され得る。
【００２５】
さらなる実施形態は標的細胞を殺滅する方法を含む。これは、その標的細胞を毒素と結合した抗体と接触させることによって達成される。その抗体はペプチドＬＥＥＫＫＧＮＹ（配列番号１３３）に結合する。１つの実施形態では、その抗体はペプチドに対して１．３×１０−９Ｍよりも高い結合親和性を有する。１つの実施形態では、その毒素はＤＭ１である。１つの実施形態では、その抗体毒素化合物は、そのペプチドを有しない細胞に対するよりも標的細胞に対して１０倍毒性が高い。１つの実施形態では、その抗体は、抗体１３．１．２（配列番号１３８）、１３１（配列番号２）、１７０（配列番号４）、１５０（配列番号５）、０９５（配列番号７）、２５０（配列番号９）、１３９（配列番号１０）、２１１（配列番号１２）、１２４（配列番号１３）、３１８（配列番号１５）、３４２（配列番号１６）、および３３３（配列番号１７）の重鎖アミノ酸配列からなる群より選択される重鎖アミノ酸配列を含む。別の実施形態では、その抗体は切断不可能リンカーを介して毒素と結合している。
【００２６】
本発明のさらなる実施形態は、ＥＧＦＲｖＩＩＩに結合し、次の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖アミノ酸配列を含む、毒素、特にＤＭ１に複合体化されている単離抗体を含む：
（ａ）配列番号１３８、２、４、５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、および１７において特定される抗体１３．１．２、１３１、１７０、１５０、０９５、２５０、１３９、２１１、１２４、３１８、３４２および３３３のＣＤＲ１領域のアミノ酸配列からなる群より選択される配列からなるＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１３８、２、４、５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、および１７において特定される抗体１３．１．２、１３１、１７０、１５０、０９５、２５０、１３９、２１１、１２４、３１８、３４２および３３３のＣＤＲ２領域のアミノ酸配列からなる群より選択される配列からなるＣＤＲ２；および
（ｃ）配列番号１３８、２、４、５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、および１７において特定される抗体１３．１．２、１３１、１７０、１５０、０９５、２５０、１３９、２１１、１２４、３１８、３４２および３３３のＣＤＲ３領域のアミノ酸配列からなる群より選択される配列からなるＣＤＲ３。１つの実施形態では、その複合体化抗体はモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト、またはヒト化抗体である。１つの実施形態では、その複合体化抗体は薬学的に許容可能な担体、希釈剤、および／または治療薬と結合している。
【００２７】
ＥＧＦＲｖＩＩＩに結合し、配列番号１４０、１９、２０、２１、２９、２３、２５、２６、２８、３３、３１および３２において特定される抗体１３．１．２、１３１、１７０、１５０、１２３、０９５、１３９、２５０、２１１、３１８、３４２、および３３３の軽鎖アミノ酸配列からなる群より選択される軽鎖アミノ酸配列を含む、毒素、特にＤＭ１に複合体化されている単離抗体またはその断片も含まれる。その複合体化抗体はモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体であり得る。その複合体化抗体は薬学的に許容可能な担体または希釈剤と結合し得る。
【００２８】
１つの実施形態では、配列番号１４０、１９、２０、２１、２９、２３、２５、２６、２８、３３、３１および３２において特定される抗体１３．１．２、１３１、１７０、１５０、１２３、０９５、１３９、２５０、２１１、３１８、３４２、および３３３の軽鎖アミノ酸配列からなる群より選択される軽鎖アミノ酸配列を含む抗体を産生するハイブリドーマ細胞株または形質転換細胞が企図される。
【００２９】
さらに別の実施形態は、ＥＧＦＲｖＩＩＩの発現と関連する細胞増殖を阻害する方法であって、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する細胞を有効量の上記の複合体抗体または断片で処理することを含む方法を含む。その方法はインビボで、そして、肺癌、結腸癌、胃癌、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、頭頚部癌、卵巣癌または神経膠芽腫などの上皮細胞の増殖を伴う癌を患う哺乳類動物、例えばヒトにおいて実施され得る。
【００３０】
さらに別の実施形態は、ＥＧＦＲｖＩＩＩに結合し、次の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む軽鎖アミノ酸配列を含む、毒素、特にＤＭ１に複合体化されている単離抗体を含む：
（ａ）配列番号１４０、１９、２０、２１、２９、２３、２５、２６、２８、３３、３１および３２において特定される抗体１３．１．２、１３１、１７０、１５０、１２３、０９５、１３９、２５０、２１１、３１８、３４２、および３３３のＣＤＲ１領域のアミノ酸配列からなる群より選択される配列からなるＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１４０、１９、２０、２１、２９、２３、２５、２６、２８、３３、３１および３２において特定される抗体１３．１．２、１３１、１７０、１５０、１２３、０９５、１３９、２５０、２１１、３１８、３４２、および３３３のＣＤＲ１領域のアミノ酸配列からなる群より選択される配列からなるＣＤＲ２；および
（ｃ）配列番号１４０、１９、２０、２１、２９、２３、２５、２６、２８、３３、３１および３２において特定される抗体１３．１．２、１３１、１７０、１５０、１２３、０９５、１３９、２５０、２１１、３１８、３４２、および３３３のＣＤＲ１領域のアミノ酸配列からなる群より選択される配列からなるＣＤＲ３。
【００３１】
前段落で特定された複合体化抗体は次の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖アミノ酸配列をさらに含むことができる：
（ａ）配列番号１３８、２、４、５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、および１７において特定される抗体１３．１．２、１３１、１７０、１５０、０９５、２５０、１３９、２１１、１２４、３１８、３４２および３３３のＣＤＲ１領域のアミノ酸配列からなる群より選択される配列からなるＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１３８、２、４、５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、および１７において特定される抗体１３．１．２、１３１、１７０、１５０、０９５、２５０、１３９、２１１、１２４、３１８、３４２および３３３のＣＤＲ２領域のアミノ酸配列からなる群より選択される配列からなるＣＤＲ２；および
（ｃ）配列番号１３８、２、４、５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、および１７において特定される抗体１３．１．２、１３１、１７０、１５０、０９５、２５０、１３９、２１１、１２４、３１８、３４２および３３３のＣＤＲ３領域のアミノ酸配列からなる群より選択される配列からなるＣＤＲ３。
【００３２】
さらなる実施形態は、ＥＧＦＲｖＩＩＩの発現と関連する細胞増殖を阻害する方法であって、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する細胞を有効量の上記の複合体化抗体または断片で処理することを含む方法を含む。その方法はインビボで、肺癌、乳癌、頭頚部癌、卵巣癌、結腸癌、胃癌、腎臓癌、または前立腺癌、または神経膠芽腫などの上皮細胞の増殖を伴う癌を患う哺乳類動物、例えばヒトに対して実施され得る。
【００３３】
他の実施形態は、配列番号１３８、２、４、５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、および１７において特定される抗体１３．１．２、１３１、１７０、１５０、０９５、２５０、１３９、２１１、１２４、３１８、３４２、および３３３の重鎖アミノ酸配列からなる群より選択される重鎖アミノ酸配列またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド分子を含み、または配列番号１４０、１９、２０、２１、２９、２３、２５、２６、２８、３３、３１および３２において特定される抗体１３．１．２、１３１、１７０、１５０、１２３、０９５、１３９、２５０、２１１、３１８、３４２、および３３３の軽鎖アミノ酸配列からなる群より選択される軽鎖アミノ酸配列またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド分子を含む。
【００３４】
さらなる実施形態は、容器、その容器の中に含まれる組成物、ＥＧＦＲｖＩＩＩの発現を特徴とする癌を治療するためにその組成物を使用することができることを表示する添付文書またはラベルを含む製品を含み、ここでその組成物は上記の複合体化抗体を含む。そのような癌には肺癌、乳癌、頭頚部癌、前立腺癌、結腸癌、胃癌、腎臓癌、または卵巣癌、または神経膠芽腫が含まれる。肺癌、乳癌、結腸癌、胃癌、腎臓癌、頭頚部癌、前立腺癌、または卵巣癌、または神経膠芽腫をスクリーニングするため、上皮癌によって発現される抗原であるＥＧＦＲｖＩＩＩを哺乳類組織または細胞において検出するためのアッセイキットであって、その抗原タンパク質に結合する抗体、および抗原が存在する場合はその抗体の抗原との反応を提示するための手段を含むキットも含まれる。その抗体は標識化モノクローナル抗体であり得、またはその抗体は非標識第１抗体であり得、そして、その反応を提示する手段は抗免疫グロブリンである標識化第２抗体を含む。その抗原に結合するその抗体は、フルオロクローム、酵素、放射性核種、および放射線不透過性物質からなる群より選択されるマーカーで標識され得る。その抗原に結合するその抗体は第２標識化抗体によって検出され得る。その抗原に結合するその抗体は過剰発現された野生型ＥＧＦＲにも結合することができる。そのキットを患者の選別のために臨床的に用いることができる。
【００３５】
さらなる実施形態は、毒素、特にＤＭ１に複合体化されている抗体であって、新規のＧｌｙ残基を含むＥＧＦＲｖＩＩＩのエピトープを特異的に認識する抗体を含む。
【００３６】
別の実施形態は、毒素、特にＤＭ１に複合体化されている抗体、またはその変異形であって、認識配列ＥＥＫＫＧＮＹＶＶＴ（配列番号５７）に結合する抗体、またはその変異形を含む。
【００３７】
別の実施形態では、腫瘍を有する哺乳類動物を治療する方法であって、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体を、それを必要とするその哺乳類動物へ少なくとも０．１、０．５、１．０、１、５、２．０、２．５、３．０、３．５．４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０８．５、９．０、または９．５ｍｇ／ｋｇから１１．０ｍｇ／ｋｇ以下の用量で投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、その方法は抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体を、それを必要とするその哺乳類動物へ少なくとも０．５〜１ｍｇ／ｋｇ、０．１〜２ｍｇ／ｋｇ、２〜３ｍｇ／ｋｇ、３〜４ｍｇ／ｋｇ、４〜５ｍｇ／ｋｇ、５〜６ｍｇ／ｋｇ、６〜７ｍｇ／ｋｇ、７〜８ｍｇ／ｋｇ、８〜９ｍｇ／ｋｇ、９〜１０ｍｇ／ｋｇ、１．５〜２．５ｍｇ／ｋｇ、２．５〜３．５ｍｇ／ｋｇ、３．５〜４．５ｍｇ／ｋｇ、４．５〜５．５ｍｇ／ｋｇまたは５．５〜６．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与することを提供する。
【００３８】
本発明のこの方法では、本発明の投与ステップは抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体をその哺乳類動物へ静脈内投与すること、ボーラス注射により投与すること、脳内投与すること、または持続性放出により投与することを含む。
【００３９】
本発明のこの方法では、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体を少なくとも週に２回、少なくとも週に１回、少なくとも２週に１回、少なくとも３週に１回、または少なくとも４週に１回投与する。
【００４０】
本発明のこの方法では、哺乳類動物、特にヒトにおけるその腫瘍はＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する。本発明のこの態様の特定の実施形態では、その腫瘍は肺癌、乳癌、結腸癌、胃癌、腎臓癌、頭頸部癌、前立腺癌、卵巣癌、神経膠芽腫、退形成星状細胞腫、星状細胞腫またはグリア細胞成分を含む腫瘍、具体的には神経膠芽腫、退形成星状細胞腫、星状細胞腫またはグリア細胞成分を含む腫瘍、より具体的には神経膠芽腫または退形成星状細胞腫、より具体的には再発神経膠芽腫または再発退形成星状細胞腫である。
【００４１】
この方法の１つの実施形態では、その哺乳類動物における腫瘍は乏突起神経膠腫（ｏｌｉｇｏｄｅｎｒｏｇｌｉｏｍａ）、乏突起星状細胞腫、神経膠肉腫、混合膠腫、毛様細胞性星状細胞腫、多形性黄色星状細胞腫、上衣下巨細胞性星状細胞腫、星状芽細胞腫、海綿芽細胞腫、大脳神経膠腫症、または神経節膠腫（ｇａｎｇｌｉｇｌｉｏｍａ）および退形成神経節膠腫を含む神経膠性腫瘍である。
【００４２】
本発明のこの方法では、その哺乳類動物は初回用量の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体の投与後に３か月よりも長く、４か月よりも長く、５か月よりも長く、または６か月よりも長く生存する。
【００４３】
本発明のこの方法では、その哺乳類動物における腫瘍が初回用量の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体の投与から３か月後、４か月後、５か月後、または６か月後に進行しない。
【００４４】
本発明のこの方法では、その哺乳類動物が、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体の最初の投与前のその哺乳類動物における循環腫瘍細胞のレベルと比べて減少している循環腫瘍細胞のレベルを含む。
【００４５】
本発明のこの方法では、その哺乳類動物は、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体の最初の投与前のその哺乳類動物における腫瘍に特有のエキソソームのレベルと比べて低下している腫瘍に特有のエキソソームのレベルを含む。本発明のこの方法では、その哺乳類動物における腫瘍のサイズは、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体の初回用量の投与前の腫瘍のサイズと比べて抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体の投与後に減少する。
【００４６】
本発明のこの方法では、哺乳類動物における腫瘍のサイズは、マクドナルド診断基準またはＲＡＮＯ診断基準によって評価すると、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体の最初の投与前のその哺乳類動物における腫瘍のサイズと比べて少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％減少する。
【００４７】
本発明のこの方法では、その哺乳類動物は、マクドナルド診断基準で評価すると、完全奏功または部分奏功を示す。本発明のこの方法では、その哺乳類動物は、マクドナルド診断基準またはＲＡＮＯ診断基準で評価すると、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体の最初の投与から６か月間の無憎悪生存期間を示す。
【００４８】
本発明のこの態様では、上記の方法によって、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体の最初の投与前の哺乳類動物における拡散強調ＭＲＩ（ＤＷＩ）に由来する見かけの拡散係数と比べて上昇したその哺乳類動物の拡散係数が生じる。
【００４９】
本発明のこの方法では、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体の抗体は抗体１３１または抗体１３．１．２、特に抗体１３１である。本発明のこの方法の１つの実施形態では、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体の抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００５０】
この方法のいくつかの実施形態では、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体は図８Ａ、８Ｂおよび８Ｄに示されるＡｂ１３１‐ＤＭ１であり、図８Ｂに示される重鎖可変ドメインおよび図８Ｄに示される軽鎖可変ドメインを含む。
【００５１】
この方法のいくつかの実施形態では、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体は図８Ａ、８Ｂおよび８Ｄに示されるＡｂ１３１‐ＤＭ１であり、図８Ｂに示される完全長重鎖および図８Ｄに示される完全長軽鎖を含む。
【００５２】
本発明のこの方法では、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体が複合体化されている薬物は放射性同位体、化学療法薬、毒素、またはそれらの断片もしくは異型体、特に少なくとも１〜１０個、少なくとも１〜５個、または少なくとも３〜５個のマイタンシノイドＤＭ１である。
【００５３】
本発明のこの方法では、薬物は切断不可能リンカー基、具体的にはチオエーテルリンカー基、より具体的にはスクシンイミジル‐４‐（Ｎ‐マレイミドメチル）シクロヘキサン‐１‐カルボキシレート（ＳＭＣＣ）を介して抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体に複合体化されている。その複合体化形態では、切断不可能リンカーはＭＣＣである。
【００５４】
この方法の特定の実施形態では、配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体であって、ＭＣＣリンカーによって３〜５個のマイタンシノイドに複合体化されている抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体が、上記の腫瘍を有する哺乳類動物を治療するために使用される。
【００５５】
本発明のこの方法では、投与ステップを、腫瘍を有する哺乳類動物への外科手術の実施、放射線治療の実施、原発性状況における全脳放射線治療の実施、再発性状況における局所的放射線治療の実施、原発性状況および再発性状況におけるテモゾロミドの投与、ベバシズマブなどの抗血管新生（ａｎｔｉ−ａｎｇｉｇｅｎｉｃ）化合物の投与、イリノテカンの投与、ＰＣＶ、プロカバジン（ｐｒｏｃａｂａｚｉｎｅ）、ロムスチン［ＣＣＮＵ］、ビンクリスチンの投与、グリアデル・ウェファー（ＢＣＮＵをしみ込ませたポリフェプロザン）の移植、チロシンキナーゼ阻害剤の投与、放射線増感剤の投与、ワクチン系治療法の実施、抗体薬物複合体の投与、原発性状況または再発性状況における二特異的Ｔ細胞結合剤（ｅｎｇａｇｅｒ）の投与または標的化薬物の投与によるその哺乳類動物の治療の前に、その哺乳類動物の治療と組み合わせて、またはその哺乳類動物の治療の後に実施する。
【００５６】
本発明のこの方法の代替的な実施形態では、その哺乳類動物はベバシズマブを含む抗血管新生化合物で以前治療されたことがない。この代替的な実施形態では、本発明の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体での治療前に抗血管新生化合物で治療されたことがない哺乳類動物は、そのような抗血管新生化合物で以前治療されたことがある哺乳類動物よりも肯定的な応答を有する。いくつかの実施形態では、Ａｂ１３１‐ＤＭ１などの本発明の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ薬物複合体と組み合わせて哺乳類動物に投与される治療用分子は、リンドペピムート（Ｒｉｎｄｏｐｅｐｉｍｕｔ）のような抗ＥＧＦＲｖＩＩＩワクチン、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体、別の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体、または抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ二特異的Ｔ細胞結合剤などの別の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ治療用分子である。
【００５７】
本発明のこの方法のいくつかの実施形態では、Ａｂ１３１‐ＤＭ１などの本発明の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ薬物複合体と組み合わせて哺乳類動物に投与される治療用分子はパニツムマブ、セツキシマブ、他の抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＥＧＦＲワクチン、抗ＥＧＦＲ抗体薬物複合体または抗ＥＧＦＲ二特異的Ｔ細胞結合剤のような抗ＥＧＦＲ治療用分子である。
【００５８】
本発明のこの方法のいくつかの実施形態では、Ａｂ１３１‐ＤＭ１などの本発明の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ薬物複合体と組み合わせて哺乳類動物に投与される治療用分子はシルツキシマブ（ｓｉｌｔｕｘｉｍａｂ）のような抗インターロイキン‐６抗体、トシリズマブのような抗インターロイキン‐６受容体抗体、抗インターロイキン‐６抗体薬物複合体もしくは抗インターロイキン‐６受容体抗体薬物複合体、または抗インターロイキン‐６二特異的Ｔ細胞結合剤もしくは抗インターロイキン‐６受容体二特異的Ｔ細胞結合剤などの抗インターロイキン‐６治療用分子である。
【００５９】
本発明のこの方法のいくつかの実施形態では、Ａｂ１３１‐ＤＭ１などの本発明の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ薬物複合体と組み合わせて哺乳類動物に投与される治療用分子は抗インターロイキン‐８抗体、などの抗インターロイキン‐８受容体抗体、抗インターロイキン‐８抗体薬物複合体もしくは抗インターロイキン‐８受容体抗体薬物複合体、または抗インターロイキン‐８二特異的Ｔ細胞結合剤もしくは抗インターロイキン‐８受容体二特異的Ｔ細胞結合剤などの抗インターロイキン‐８治療用分子である。
【００６０】
本発明のこの方法のいくつかの実施形態では、本発明の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体、例えばＡｂ１３１‐ＤＭ１は、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ、抗ＥＧＦＲ、抗インターロイキン‐６、抗インターロイキン６受容体、抗インターロイキン‐８または抗インターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｎ）‐８受容体治療用分子が哺乳類動物に投与される前に、その投与と組み合わせて、またはその投与の後に、またはそれ以外に投与される。
【００６１】
本発明のこの方法のいくつかの実施形態では、その哺乳類動物はヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１Ａ】２６７アミノ酸の欠失とＧ置換を示す野生型ＥＧＦＲとＥＧＦＲｖＩＩＩの間のアラインメントを示す。
【図１Ｂ】２６７アミノ酸の欠失とＧ置換を示す野生型ＥＧＦＲとＥＧＦＲｖＩＩＩの間のアラインメントを示す。
【図１Ｃ】２６７アミノ酸の欠失とＧ置換を示す野生型ＥＧＦＲとＥＧＦＲｖＩＩＩの間のアラインメントを示す。
【図１Ｄ】２６７アミノ酸の欠失とＧ置換を示す野生型ＥＧＦＲとＥＧＦＲｖＩＩＩの間のアラインメントを示す。
【図１Ｅ】２６７アミノ酸の欠失とＧ置換を示す野生型ＥＧＦＲとＥＧＦＲｖＩＩＩの間のアラインメントを示す。
【図２】ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＰＥＰ３  １４マーペプチドの設計を示す図である。図２Ａでは、ＥＧＦＲのＮ末端配列と同一であるアミノ酸ＬＥＥＫＫ（配列番号５８）（１〜５）を有するＥＧＦＲｖＩＩＩのＮ末端配列に、特有のＧリシン残基が続き、ＥＧＦＲ中の残基２７３から２８０と同一であるアミノ酸が続く。図２Ｂは、ＥＧＦＲｖＩＩＩにおいて欠失されているＥＧＦＲのアミノ酸（６〜２７２）を表す。
【図３Ａ】本発明の抗体の配列を提供する。提供される各抗体について、ヌクレオチド配列とアミノ酸配列が重鎖可変領域と軽鎖可変領域の両方について提供される。したがって、４つの配列が記載されている全ての抗体について提供される。
【図３Ｂ】本発明の抗体の配列を提供する。提供される各抗体について、ヌクレオチド配列とアミノ酸配列が重鎖可変領域と軽鎖可変領域の両方について提供される。したがって、４つの配列が記載されている全ての抗体について提供される。
【図３Ｃ】本発明の抗体の配列を提供する。提供される各抗体について、ヌクレオチド配列とアミノ酸配列が重鎖可変領域と軽鎖可変領域の両方について提供される。したがって、４つの配列が記載されている全ての抗体について提供される。
【図３Ｄ】本発明の抗体の配列を提供する。提供される各抗体について、ヌクレオチド配列とアミノ酸配列が重鎖可変領域と軽鎖可変領域の両方について提供される。したがって、４つの配列が記載されている全ての抗体について提供される。
【図３Ｅ】本発明の抗体の配列を提供する。提供される各抗体について、ヌクレオチド配列とアミノ酸配列が重鎖可変領域と軽鎖可変領域の両方について提供される。したがって、４つの配列が記載されている全ての抗体について提供される。
【図３Ｆ】本発明の抗体の配列を提供する。提供される各抗体について、ヌクレオチド配列とアミノ酸配列が重鎖可変領域と軽鎖可変領域の両方について提供される。したがって、４つの配列が記載されている全ての抗体について提供される。
【図３Ｇ】本発明の抗体の配列を提供する。提供される各抗体について、ヌクレオチド配列とアミノ酸配列が重鎖可変領域と軽鎖可変領域の両方について提供される。したがって、４つの配列が記載されている全ての抗体について提供される。
【図３Ｈ】本発明の抗体の配列を提供する。提供される各抗体について、ヌクレオチド配列とアミノ酸配列が重鎖可変領域と軽鎖可変領域の両方について提供される。したがって、４つの配列が記載されている全ての抗体について提供される。
【図３Ｉ】本発明の抗体の配列を提供する。提供される各抗体について、ヌクレオチド配列とアミノ酸配列が重鎖可変領域と軽鎖可変領域の両方について提供される。したがって、４つの配列が記載されている全ての抗体について提供される。
【図３Ｊ】本発明の抗体の配列を提供する。提供される各抗体について、ヌクレオチド配列とアミノ酸配列が重鎖可変領域と軽鎖可変領域の両方について提供される。したがって、４つの配列が記載されている全ての抗体について提供される。
【図３Ｋ】本発明の抗体の配列を提供する。提供される各抗体について、ヌクレオチド配列とアミノ酸配列が重鎖可変領域と軽鎖可変領域の両方について提供される。したがって、４つの配列が記載されている全ての抗体について提供される。
【図３Ｌ】本発明の抗体の配列を提供する。提供される各抗体について、ヌクレオチド配列とアミノ酸配列が重鎖可変領域と軽鎖可変領域の両方について提供される。したがって、４つの配列が記載されている全ての抗体について提供される。
【図４】１３．１．２抗体重鎖領域を特定の生殖系列重鎖領域に対して比較する表である。「−」は、そのハイブリドーマ重鎖領域のアミノ酸残基がその特定の位置について生殖系列と同じであることを表す。生殖系列からの逸脱は適切なアミノ酸残基によって示されている。
【図５】１３．１．２抗体軽鎖領域を特定の生殖系列軽鎖領域に対して比較する表である。「−」は、そのハイブリドーマ軽鎖領域のアミノ酸残基がその特定の位置について生殖系列と同じであることを表す。生殖系列からの逸脱は適切なアミノ酸残基によって示されている。
【図６Ａ−１】様々なハイブリドーマ由来抗体重鎖領域を特定の生殖系列重鎖領域に対して比較する表である。「−」は、そのハイブリドーマ重鎖領域のアミノ酸残基がその特定の位置について生殖系列と同じであることを表す。生殖系列からの逸脱は適切なアミノ酸残基によって示されている。
【図６Ａ−２】様々なハイブリドーマ由来抗体重鎖領域を特定の生殖系列重鎖領域に対して比較する表である。「−」は、そのハイブリドーマ重鎖領域のアミノ酸残基がその特定の位置について生殖系列と同じであることを表す。生殖系列からの逸脱は適切なアミノ酸残基によって示されている。
【図６Ａ−３】様々なハイブリドーマ由来抗体重鎖領域を特定の生殖系列重鎖領域に対して比較する表である。「−」は、そのハイブリドーマ重鎖領域のアミノ酸残基がその特定の位置について生殖系列と同じであることを表す。生殖系列からの逸脱は適切なアミノ酸残基によって示されている。
【図６Ａ−４】様々なハイブリドーマ由来抗体重鎖領域を特定の生殖系列重鎖領域に対して比較する表である。「−」は、そのハイブリドーマ重鎖領域のアミノ酸残基がその特定の位置について生殖系列と同じであることを表す。生殖系列からの逸脱は適切なアミノ酸残基によって示されている。
【図７Ａ−１】様々なハイブリドーマ由来抗体軽鎖領域を特定の生殖系列軽鎖領域に対して比較する表である。「−」は、そのハイブリドーマ軽鎖領域のアミノ酸残基がその特定の位置について生殖系列と同じであることを表す。生殖系列からの逸脱は適切なアミノ酸残基によって示されている。
【図７Ａ−２】様々なハイブリドーマ由来抗体軽鎖領域を特定の生殖系列軽鎖領域に対して比較する表である。「−」は、そのハイブリドーマ軽鎖領域のアミノ酸残基がその特定の位置について生殖系列と同じであることを表す。生殖系列からの逸脱は適切なアミノ酸残基によって示されている。
【図７Ａ−３】様々なハイブリドーマ由来抗体軽鎖領域を特定の生殖系列軽鎖領域に対して比較する表である。「−」は、そのハイブリドーマ軽鎖領域のアミノ酸残基がその特定の位置について生殖系列と同じであることを表す。生殖系列からの逸脱は適切なアミノ酸残基によって示されている。
【図７Ａ−４】様々なハイブリドーマ由来抗体軽鎖領域を特定の生殖系列軽鎖領域に対して比較する表である。「−」は、そのハイブリドーマ軽鎖領域のアミノ酸残基がその特定の位置について生殖系列と同じであることを表す。生殖系列からの逸脱は適切なアミノ酸残基によって示されている。
【図８Ａ】Ａｂ１３１‐ＤＭ１複合体の構造を示す概略図である。
【図８Ｂ】図８ＢはＡｂ１３１‐ＤＭ１複合体の抗体重鎖のアミノ酸配列を提供し、可変ドメインは陰を付けられており、そして、最初のアミノ酸からアミノ酸１２３まで続く。
【図８Ｃ】その抗体重鎖をコードする核酸配列を提供する。
【図８Ｄ】Ａｂ１３１‐ＤＭ１複合体の抗体軽鎖のアミノ酸配列を提供し、可変ドメインは陰を付けられており、そして、最初のアミノ酸からアミノ酸１１３まで続く。
【図８Ｅ】その抗体軽鎖をコードする核酸配列を提供する。
【図９】抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体１３１（黒色の破線）、Ａｂ１３１‐ＤＭ１複合体（黒色の実線）、抗ＥＧＦＲ抗体（灰色の一点鎖線）の結合特異性を示すグラフである。
【図１０】毒素（ＤＭ１）同等物（左のパネル）またはＡｂ１３１‐ＤＭ１複合体同等物（右のパネル）の関数としてＵ２５１ｖＩＩＩ細胞増殖阻害を示す２つのグラフである。
【図１１】ビヒクルを、５．３ｍｇ／ｋｇでＡＢ１３１‐ＤＭ１複合体を、１７．８ｍｇ／ｋｇでＡＢ１３１‐ＤＭ１複合体を、または対照複合体を用いる治療の関数としてＤ３１７皮下異種移植片において検出されたリン酸化ヒストンＨ３（＋）細胞の数（縦軸）を示すグラフである。
【図１２】対照複合体または１．７ｍｇ／ｋｇ、５．６ｍｇ／ｋ８もしくは１７ｍｇ／ｋｇでのＡｂ１３１‐ＤＭ１複合体の単一用量を用いて処置されたＵ２５１ｖＩＩＩ異種移植片における時間の関数としての腫瘍体積（縦軸）を示すグラフである。
【図１３】ビヒクル、対照複合体、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体１３１またはＡｂ１３１‐ＤＭ１複合体を用いて処置されたＤ３１７皮下異種移植片における時間の関数としての腫瘍体積（縦軸）を示すグラフである。
【図１４】ビヒクル、対照複合体または７．３ｍｇ／ｋｇ、１４．６ｍｇ／ｋｇもしくは２２ｍｇ／ｋｇでのＡｂ１３１‐ＤＭ１複合体の単一用量を用いて処置されたＤ３１７皮下異種移植片における腫瘍体積（縦軸）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
上で考察したように、ＥＧＦＲｖＩＩＩは、ＥＧＦｒの細胞外ドメイン中の２６７アミノ酸が接合部でのグリシンの単一アミノ酸置換によって欠失されているＥＧＦＲの欠失変異体である。これらの特徴は、図１中の野生型ＥＧＦＲとＥＧＦＲｖＩＩＩの間の配列アラインメントにおいて示されている。その欠失の接合部におけるグリシンのアミノ酸置換を考えると、野生型ＥＧＦＲには存在しない、ＥＧＦＲｖＩＩＩに存在する新規のエピトープに対する抗体を作製することが理論的に可能となる。したがって、図２に示される免疫とスクリーニングのためのペプチドが設計され、ＰＥＰ３と名付けられた（Ｋｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．  ＥＧＦ  ｍｕｔａｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｖＩＩＩ  ａｓ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔａｒｇｅｔ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｌａｔ  Ｃａｎｃｅｒ．８（２）：８３−９６（２００１））。そのような１４マーペプチドはＥＧＦＲｖＩＩＩと野生型ＥＧＦＲに共通の５Ｎ末端アミノ酸、特有のグリシン接合部位、および野生型ＥＧＦＲ（残基２７３〜２８０に対応する）とＥＧＦＲｖＩＩＩ（残基７〜１４に対応する）の間の保存配列に含まれる８アミノ酸残基を有する。加えて、神経膠芽腫細胞およびＥＧＦＲｖＩＩＩをコードする遺伝子で形質移入された細胞（Ｂ３００．１９細胞）も免疫とスクリーニングのために活用した（時折、本明細書においてＢ３００．１９／ＥＧＦＲｖＩＩＩ形質移入体と称される）。
【００６４】
ＥＧＦＲｖＩＩＩに対するヒト抗体を作製するため、遺伝子導入ゼノマウス（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ）（登録商標）マウスを、神経膠芽腫細胞／ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｂ３００．１９／ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞、および野生型ＥＧＦＲと比べてＥＧＦＲｖＩＩＩにおいて表される新規細胞外ドメイン中の接合部領域を対象とするペプチド（ＰＥＰ３）の組合せを用いて免疫した。免疫されたマウスに由来するＢ細胞を単離し、ハイブリドーマを作製するためにそれらのＢ細胞を使用し、続いてＥＧＦＲｖＩＩＩへの結合についてスクリーニングするか、ゼノマックス（ＸｅｎｏＭａｘ）（商標）／スラム（ＳＬＡＭ）（商標）技術  （Ｂａｂｃｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ，ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｏｆ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９３（１５）：７８４３−８（１９９６）、および米国特許第５，６２７，０５２号）を用いるＥＧＦＲｖＩＩＩへの結合についてのスクリーニングにおいてそれらのＢ細胞を直接的に使用した。ＥＧＦＲｖＩＩＩに結合すると特定された抗体は、ＥＧＦＲｖＩＩＩの特異的な認識を確認するために一連のアッセイにおいてスクリーニングされた。この過程を通してＥＧＦＲｖＩＩＩに結合し、そして、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的である一団のヒトモノクローナル抗体が作製、単離、および特徴解析された。その後のエピトープマッピングにより特有であるが重複する特異性が示された。全ての抗体を、細胞傷害性薬物を細胞へ送達することを目的として細胞によって取り込まれるそれらの抗体の能力についてインビトロでさらに評価した。効率的な薬物送達を示す抗体が細胞傷害性薬物と直接に複合体化され、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する腫瘍細胞をインビトロおよびインビボで殺滅するそれらの能力について検討した。これらの研究によって、特定の遺伝子損傷を有する腫瘍を持つ患者において癌を治療するための次世代の抗体薬物複合体の基礎が提供される。
【００６５】
上記の過程を通して一団の完全ヒト抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体が作製された。そのハイブリドーマアプローチを用いて、ＰＥＰ３との結合についてＥＬＩＳＡで陽性である、抗体１３．１、１３．２、１３．３、および１３．４を含むいくつかの抗体が、野生型ＥＧＦＲとの限定的な交差反応性と共に作製された。これらのうち、抗体１３．１（および、特に、そのサブクローン１３．１．２）をさらなる研究開発のために選択した。ゼノマックスアプローチを用いて、ｐｅｐ３オリゴヌクレオチドとの結合について非常に特異的であり、野生型ＥＧＦＲとの限定的な交差反応性を有する抗体１３１、１３９、２５０、および０９５を含む一団の抗体が作製された。これらのうち、１３１抗体は非常に興味深い特質を有する。それらの抗体のそれぞれの配列が図４〜７に示されている（配列番号１〜３３および１４１〜１４４）。それらの配列と様々な抗体の結合能の比較を実施し、結果が図４〜１０に示されている。図９Ａ〜９Ｌおよび図１０Ａ〜１０Ｄに見ることができるように、抗体１３１、１３９、および１３．１．２は全てＡＢＸ‐ＥＧＦと比べてＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞（Ｈ１４７７）に対する優れた選択性を示した。それらの結果のうちのいくつかはグラフの形式で図９Ｍ〜９Ｐに示されており、それは抗体１３．１．２および１３１の少なくとも２つが単にＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞と比べてＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞に対する優れた特異性を示したことを示す。さらに、本実施形態の抗体のいくつかのありうる有用性を検討した。その結果が図１１〜１６に示されている。最後に、変化した結合特性を有する抗体を得るために、予想された構造モデルに基づいてそれらの抗体の変異形を作製した。
【００６６】
さらに、本発明の抗体は、同一または類似のエピトープに結合する他の抗体のスクリーニングに非常に有用である。本発明の抗体は、形成される抗原抗体複合体の特徴に関して同一または向上した効果を有することが期待される他の抗体の解明のための交差競合試験において活用され得る。
【００６７】
１３１抗体および１３．１．２のそれぞれがＥＧＦＲｖＩＩＩへの非常に高い親和性を有し、細胞によってよく取りこまれ、そして、毒素に複合体化すると、細胞殺滅に非常に有効であるようであった。興味深いことに、それらの両方の抗体は、ゼノマウス・マウスの異なる免疫で作製され、そして、異なる技術を利用しているにもかかわらず、非常に類似した生殖系列遺伝子に由来した。しかしながら、エピトープマッピング実験によると、それらの抗体のそれぞれがＥＧＦＲｖＩＩＩ分子上のわずかに異なるエピトープに結合し、そして、結合に必須であるＥＧＦＲｖＩＩＩ上のわずかに異なる残基を有するようである。これらの結果は、生殖系列遺伝子の利用がＥＧＦＲｖＩＩＩを標的とする抗体治療薬の作製にとって重要であり、そして、これらの構造上の知見に基づいて抗体と他の治療薬のさらなる設計を可能とするような形で小さな変化が抗体の結合と効果を改変することができることを示す。
【００６８】
１３．１．２抗体および１３１抗体と同じエピトープ、またはそれらの抗体との結合に競合するエピトープに結合する抗体が非常に望ましい。下でより詳細に考察するように、ＳＰＯＴアレイでのアラニンスキャニングを通してある特定の抗体の結合にとって重要な残基が解明されている。したがって、重要な結合残基を共有する抗体も非常に望ましい。
【００６９】
定義
別途定義されない限り、本明細書において使用される科学用語および技術用語は、当業者が一般に理解する意味を有するものとする。さらに、別途文脈により要求されない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。全般的に、本明細書に記載される細胞および組織培養、分子生物学、およびタンパク質化学およびオリゴまたはポリヌクレオチド化学、およびハイブリダイゼーションとの関連で利用される命名法、およびそれらの技術は、当技術分野においてよく知られており、一般的に用いられるものである。標準的な技術が組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、および組織培養および形質転換（例えば、電気穿孔、リポフェクション）について用いられる。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様書に従って、または当技術分野において一般的に達成されているように、または本明細書に記載されるように実施される。全般的に、前述の技術と技法は、当技術分野において周知の従来法に従って、および本明細書を通して引用され、考察されている様々な一般的およびより具体的な参照文献に記載されているように実施される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）を参照のこと。その文献は参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、および医薬品化学との関連で利用される命名法、ならびにそれらの実験技法および技術は、当技術分野においてよく知られており、一般的に用いられるものである。標準的な技術が化学合成、化学分析、医薬調製、製剤、および送達、および患者の治療について用いられる。
【００７０】
「マクドナルド診断基準」という用語は、Ｍａｃｄｏｎａｌｄ  ＤＲ，Ｃａｓｃｉｎｏ  ＴＬ，Ｓｃｈｏｌｄ  ＳＣ  Ｊｒ，Ｃａｉｒｎｃｒｏｓｓ  ＪＧ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  ｐｈａｓｅ  ＩＩｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｓｕｐｒａｔｅｎｔｏｒｉａｌ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｇｌｉｏｍａ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．１９９０；８：１２７７−１２８０に提示されている診断基準を意味するものとする。
【００７１】
「ＲＡＮＯ診断基準」という用語は、Ｗｅｎ  ＰＹ，Ｍａｃｄｏｎａｌｄ  ＤＲ，Ｒｅａｒｄｏｎ  ＤＡ，ａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｕｐｄａｔｅｄ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  Ｈｉｇｈ−Ｇｒａｄｅ  Ｇｌｉｏｍａｓ：Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ．Ｊ  ＣｌｉｎＯｎｃｏｌ．２０１０；２８：１９６３−１９７２に提示されている診断基準を意味するものとする。
【００７２】
「完全奏功（ＣＲ）」という用語は、脱ステロイドおよび神経学的に安定または改善した状態で、少なくとも４週間間隔の連続ＭＲＩ画像スキャンでの全ての増大腫瘍の消失を意味するものとする。
【００７３】
「増大病変」という用語は、サイズ（最大の断面積を有する病変）と正確な反復測定への適性に基づいて選択される病変を意味するものとする。
【００７４】
「部分奏功（ＰＲ）」という用語は、ステロイド安定または減少および神経学的に安定または改善した状態で、少なくとも４週間間隔の連続ＭＲＩ画像スキャンでの全ての増大腫瘍の５０％以上のサイズ減少を意味するものとする。
【００７５】
「無憎悪生存期間（ＰＦＳ）」という用語は、最初のＡｂ１３１‐ＤＭ１の投与の日付から疾患進行を放射線学的に証拠づけた日付（ＭＲＩスキャンの日付）、または原因とは無関係に死亡の日付までの日数として定義される。
【００７６】
「肯定的な応答」という用語は、腫瘍サイズの減少、見かけの拡散係数の上昇、循環腫瘍細胞の減少、腫瘍に関連する循環エクソームの減少であって、最初の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体複合体の投与の前の哺乳類動物におけるこれらのパラメータと比べた腫瘍サイズの減少、見かけの拡散係数の上昇、循環腫瘍細胞の減少、腫瘍に関連する循環エクソームの減少を意味するものとする。肯定的な応答は、マクドナルド診断基準またはＲａｎｏ診断基準により判断される無憎悪生存期間、完全奏功、および部分奏功も意味する。肯定的な応答は、生存期間の増加も意味する。
【００７７】
ＢｉＴＥまたは二特異的Ｔ細胞結合剤という用語は、異なる抗体の２つの単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であって、一方のｓｃＦｖはＣＤ３受容体を介してＴ細胞に結合し、他方のｓｃＦｖは腫瘍細胞上に発現する分子に結合する、単鎖可変断片を含む融合タンパク質を意味するもの指すものとする。二特異的Ｔ細胞阻害剤は米国特許出願第７３５，２６４１号、第７，８２０，１６６号、第８，０７６，４５０号、第８１０１，７２２号、および第８，２３６，３０８号に記載されている。
【００７８】
「見かけの拡散係数」という用語は、Ｃｈｅｎｅｖｅｒｔ，Ｔ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｆｆｕｄｉｏｎ  Ｍａｇｎｅｔ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ：ａｎ  Ｅａｒｌｙ  Ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  Ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｉｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｕｍｏｒｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｖｏｌ．９２，Ｎｏ．２４，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０，２０００に提示されている意味を有するものとする。
【００７９】
「単離ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において使用される場合、ゲノム起源、ｃＤＮＡ起源、または合成起源、またはそれらのある組合せのポリヌクレオチドであって、その起源によって「単離ポリヌクレオチド」が、（１）その「単離ポリヌクレオチド」が自然界で見出されるポリヌクレオチドの全体または部分と結合しておらず、（２）自然界では結合していないポリヌクレオチドに機能するように結合しており、または（３）より大きい配列の一部として自然界では生じることがないポリヌクレオチドを意味するものとする。
【００８０】
「単離タンパク質」という用語は、本明細書において、ｃＤＮＡ起源、組換えＲＮＡ起源、または合成起源、またはそれらのある組合せのタンパク質であって、その起源または由来源によって「単離タンパク質」が、（１）自然界で見出されるタンパク質と結合しておらず、（２）同じ起源の他のタンパク質が含まれておらず、例えば、マウスタンパク質が含まれておらず、（３）異なる種の細胞により発現され、または（４）自然界では生じないタンパク質を意味する。
【００８１】
「ポリペプチド」という用語は、本明細書において、未変性のタンパク質、断片、またはポリペプチド配列の類似体を指す総称用語として使用される。したがって、未変性のタンパク質、断片、および類似体はそのポリペプチド類の種類である。本発明による好ましいポリペプチドは、ヒト重鎖免疫グロブリン分子およびヒトκ軽鎖免疫グロブリン分子、ならびに重鎖免疫グロブリン分子を軽鎖免疫グロブリン分子、例えばκ軽鎖免疫グロブリン分子またはλ軽鎖免疫グロブリン分子と含む組合せ、およびその逆の組合せにより形成される抗体分子、ならびにそれらの断片および類似体を含む。
【００８２】
対象物に対して適用される「天然の」という用語は、本明細書において使用される場合、ある対象物が自然界で見出され得るという事実を指す。例えば、自然界の起源から単離することができる（ウイルスを含む）生物に存在し、実験室その他で人間によって意図的に改変されていないポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は天然である。
【００８３】
「機能するように結合した」という用語は、本明細書において使用される場合、そのように記載された成分の位置が、それらが意図された様に機能することを可能とする位置関係にあることを指す。コード配列に「機能するように結合した」制御配列は、そのコード配列の発現がその制御配列と適合する条件下で達成されるように結合されている。
【００８４】
「制御配列」という用語は、本明細書において使用される場合、コード配列の発現とプロセシングを達成するのに必要な、それらに結合しているポリヌクレオチド配列を指す。そのような制御配列の性質は宿主生物に応じて異なる。原核生物では、そのような制御配列は概してプロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含む。真核生物では、そのような制御配列はプロモーターおよび転写終結配列を含む。「制御配列」という用語は、存在が発現とプロセシングにとって必須である全ての成分を少なくとも含むものとし、そして、存在が有利である追加的成分、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列を含むこともできる。
【００８５】
本明細書において言及される「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチドかデオキリヌクレオチドかどちらかの種類のヌクレオチドの修飾型のいずれかの、少なくとも１０塩基長の重合体形状のヌクレオチドを意味する。その用語は一本鎖形状または二本鎖形状のＤＮＡを含む。
【００８６】
本明細書において言及される「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然オリゴヌクレオチド結合および非天然オリゴヌクレオチド結合によって繋げられている天然ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、概して２００塩基以下の長さを含むポリヌクレオチド亜集団である。好ましくは、オリゴヌクレオチドは１０〜６０塩基長であり、最も好ましくは１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０から４０塩基長である。オリゴヌクレオチドは通常、例えば、プローブ用に一本鎖であるが、オリゴヌクレオチドは、例えば、遺伝子変異体の構築において使用するために、二本鎖でもよい。本発明のオリゴヌクレオチドはセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのどちらかであり得る。
【００８７】
本明細書において言及される「天然ヌクレオチド」という用語はデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。本明細書において言及される「修飾ヌクレオチド」という用語は、修飾糖基または置換糖基などを有するヌクレオチドを含む。本明細書において言及される「オリゴヌクレオチド結合」という用語は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニラデート、ホスホロアミデートなどのようなオリゴヌクレオチド結合を含む。例えば、ＬａＰｌａｎｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：９０８１（１９８６）、Ｓｔｅｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０６：６０７７（１９８４）；Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３２０９（１９８８）、Ｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ６：５３９（１９９１）、Ｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｐｐ．８７−１０８（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  Ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９１））、Ｓｔｅｃらの米国特許第５，１５１，５１０号、Ｕｈｌｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｅｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９０：５４３（１９９０）を参照のこと。それらの文献の開示が参照によりここに組み込まれる。オリゴヌクレオチドは、所望により、検出用の標識を含み得る。
【００８８】
「変異形」という用語は、本明細書において使用される場合、列挙されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドと異なるが、タンパク質の活性を悪く変えないようにわずかに異なるポリペプチド、ポリヌクレオチド、または分子である。エピトープの変異形が存在し得る。抗体の変異形が存在し得る。好ましい実施形態では、タンパク質変異形のエピトープに結合する能力は悪く変えられていない。１つの実施形態では、そのタンパク質変異形は野生型モノクローナル抗体の１０〜５００％の能力で結合し得る。例えば、そのタンパク質変異形は野生型モノクローナル抗体の能力の１０％、５０％、１１０％、５００％、または５００％よりも高い能力で結合し得る。１つの実施形態では、１０〜５００％の間の結合能の範囲が含まれる。結合能は、その変異形のエピトープに対するｋａ、ｋｄ、またはＫＤを含むが、これらに限定されない多くの方式で表され得る。１つの好ましい実施形態では、エピトープは本明細書において説明されるものである。
【００８９】
１つの実施形態では、変異形抗体は５個以下のアミノ酸の置換、欠失または付加によって野生型配列と異なり得る。そのような変異形は概して、開示されるポリペプチド配列のうちの１つを修飾し、そして、例えば、本明細書に記載される代表的な技法を用いてその修飾されたポリペプチドの結合特性を評価することによって、特定され得る。別の実施形態では、ポリペプチド変異形は好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約９０％、および最も好ましくは少なくとも約９５％の同一性をその特定化ポリペプチドに対して示す。好ましくは、その変異形はわずかに保存的置換および／または修飾で異なる。変異形タンパク質は、構造的に類似しているタンパク質、および本明細書に記載されているタンパク質構造に対して機能的に等しいタンパク質を含む。別の実施形態では、そのタンパク質は、本明細書に記載されるタンパク質に対して機能的に等しい場合、変異形のパラトープが本明細書に記載されるパラトープと類似している限り、変異形である。１つの実施形態では、図１７に記載されているパラトープに類似の形状を有するどのような物質も変異形である。１つの実施形態では、図１８に記載されているパラトープに類似の形状を有するどのような物質も変異形である。１つの実施形態では、図１９Ａおよび１９Ｂに記載されている相互作用面に類似の形状を有するどのような物質も変異形である。
【００９０】
１つの実施形態では、核酸配列がストリンジェントな条件下で野生型配列に選択的にハイブリダイズすることができる場合、その抗体は変異形である。１つの実施形態では、適切な中程度にストリンジェントな条件は、５×ＳＳＣ；０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８：０）の溶液中での前洗浄、５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣにおいて一晩のハイブリダイゼーション、または、異種間相同性の場合では、４５℃で０．５×ＳＳＣを用いるハイブリダイゼーションとそれに続く６５℃で２０分間の、０．１％ＳＤＳを含有する２×、０．５×および０．２×ＳＳＣを用いるそれぞれ２回の洗浄を含む。遺伝コードの縮重により一つのハイブリダイズ性ＤＮＡ配列によってコードされる抗体ポリペプチドをコードする（複数の）ヌクレオチド配列であるので、そのような（複数の）ハイブリダイズ性ＤＮＡ配列も本発明の範囲内にある。本明細書において言及される「選択的にハイブリダイズする」という用語は、検出可能に、および特異的に結合することを意味する。本発明に従うポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびそれらの断片は、非特異的な核酸へのかなりの量の検出可能な結合を最小にするハイブリダイゼーションと洗浄の条件下で核酸ストランドに選択的にハイブリダイズする。高ストリンジェンシー条件を用いて、当技術分野において知られており、そして、本明細書において考察されるような選択的ハイブリダイゼーション条件を達成することができる。概して、本発明のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、および断片と目的の核酸配列の間の核酸配列相同性は少なくとも８０％であり、より典型的には少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、および１００％という好ましくも上昇する相同性を有する。２つのアミノ酸配列の間に部分的または完全な同一性が存在する場合、それらの配列は相同である。例えば、８５％相同性は、２つの配列が最大マッチングのために整列させられるとき、アミノ酸の８５％が同一であることを意味する。最大マッチングでは（マッチさせられている２つの配列のうちのどちらかにおける）ギャップが許される。５以下のギャップ長が好ましく、２以下がより好ましい。代わりに、および、好ましくは、２つのタンパク質配列（またはそれらに由来する少なくとも３０アミノ酸長のポリペプチド配列）が変異データマトリックスを有するＡＬＩＧＮプログラムと６以上のギャップペナルティーを用いて（標準偏差単位で）５より大きいアラインメントスコアを有する場合、それらの配列は相同（この用語が本明細書において使用されるように）である。Ｄａｙｈｏｆｆ，  Ｍ．Ｏ．，  ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｐｐ．１０１−１１０（Ｖｏｌｕｍｅ  ５，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（１９７２））およびこの巻の補遺２号、１〜１０頁を参照のこと。それらの２つの配列またはそれらの部分は、それらのアミノ酸がＡＬＩＧＮプログラムを用いて最適に整列されて、５０％以上同一である場合、より好ましく相同である。「に対応する」という用語は、ポリヌクレオチド配列が基準ポリヌクレオチド配列の全体または一部に対して相同���ある（すなわち、同一である。厳密に進化的に関連してはいない）こと、またはポリペプチド配列が基準ポリペプチド配列に対して同一であることを意味するために本明細書において使用される。反対に、「に相補である」という用語は、相補配列が基準ポリヌクレオチド配列の全体または一部に対して相同であることを意味するために本明細書において使用される。例えば、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は基準配列「ＴＡＴＡＣ」に対応しており、基準配列「ＧＴＡＴＡ」に対して相補である。
【００９１】
次の用語は、２つ以上のポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の配列関係を説明するために使用される：「基準配列」、「比較ウインドウ」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」、および「実質的な同一性」。「基準配列」は配列比較の基準として用いられる定義済みの配列である。基準配列は、例えば、配列表に提示される完全長ｃＤＮＡまたは遺伝子配列の一部として、より大きい配列の一部であり得、または完全長ｃＤＮＡまたは遺伝子配列を含み得る。概して、基準配列は少なくとも１８ヌクレオチド長または６アミノ酸長であり、しばしば、少なくとも２４ヌクレオチド長または８アミノ酸長であり、多くの場合、少なくとも４８ヌクレオチド長または１６アミノ酸長である。２つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列はそれぞれ（１）それらの２つの分子の間で類似の配列（すなわち、完全長ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の一部）を含み得る、および（２）それらの２つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間で相違する配列をさらに含み得るので、２つ（またはより多くの）分子の間の配列比較は、それらの２つの分子の配列を「比較ウインドウ」に対して比較して配列類似性を有する局所的領域を特定および比較することによって実施されるのが典型的である。「比較ウインドウ」は、本明細書において使用される場合、少なくとも１８連続ヌクレオチド位置または６アミノ酸からなる概念上の断片であって、ポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が少なくとも１８連続ヌクレオチドまたは６アミノ酸配列からなる基準配列と比較され得、そして、比較ウインドウ内のポリヌクレオチド配列の部分が、２つの配列の最適アラインメントのために（付加または欠失を含まない）基準配列と比較されると、２０パーセント以下の付加、欠失、置換など（すなわち、ギャップ）を含み得る、その概念上の断片を指す。比較ウインドウを整列させるための配列の最適アラインメントはＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法により、これらのアルゴリズムのコンピューター化実装（ウィスコンシン・ジェネティクス・ソフトウェア・パッケージ・リリース７．０中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ（ジェネティクス・コンピューター・グループ、５７５サイエンスドライブ、ウィスコンシン州、マディソン）、Ｇｅｎｅｗｏｒｋｓ、またはＭａｃＶｅｃｔｏｒソフトウェア・パッケージ）により、またはインスペクションにより実施され得、そして、それらの様々な方法によって生じた最良のアラインメント（すなわち、比較ウインドウに対して最大パーセンテージの相同性を生じるアラインメント）が選択される。
【００９２】
「配列同一性」という用語は、２つのポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が比較ウインドウに対して同一である（すなわち、ヌクレオチド間基準または残基間基準で）ことを意味する。「配列同一性のパーセンテージ」という用語は、２つの最適に整列された配列を比較ウインドウに対して比較し、マッチした位置の数を得るために同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）または残基が両方の配列に存在する位置の数を決定し、そのマッチした位置の数を比較ウインドウ内の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算し、そして、その結果を１００で乗算して配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。「実質的な同一性」という用語は、本明細書において使用される場合、基準配列と比べて少なくとも１８ヌクレオチド（６アミノ酸）位置からなる比較ウインドウに対して、しばしば、少なくとも２４〜４８ヌクレオチド（８〜１６アミノ酸）位置のウインドウに対して少なくとも８５パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも９０〜９５パーセントの配列同一性、より一般的には少なくとも９９パーセント配列同一性を有する配列を含むポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列という特徴を示し、ここでその同一性のパーセンテージは、総計で比較ウインドウに対して基準配列の２０パーセント以下になる欠失または付加を含み得る配列に対して基準配列を比較することによって計算される。その基準配列はより大きい配列の一部であり得る。野生型タンパク質または核酸に対して実質的な同一性を有するアミノ酸または核酸はその野生型タンパク質または核酸の変異形の例である。
【００９３】
本明細書において使用される場合、２０種の通常のアミノ酸とそれらの省略形は従来の使用法に従う。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  −  Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｎ，Ｅｄｓ．、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．（１９９１））を参照のこと。その文献は参照により本明細書に組み込まれる。それらの２０種の通常のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ‐アミノ酸）、α，α‐二置換アミノ酸などの非天然アミノ酸、Ｎ‐アルキルアミノ酸、乳酸、および他の非従来型のアミノ酸も本発明のポリペプチドの適切な成分であり得る。非従来型のアミノ酸の例には４‐ヒドロキシプロリン、g‐カルボキシグルタミン酸、ε‐Ｎ、Ｎ、Ｎ‐トリメチルリシン、ε‐Ｎ‐アセチルリシン、Ｏ‐ホスフォセリン、Ｎ‐アセチルセリン、Ｎ‐ホルミルメチオニン、３‐メチルヒスチジン、５‐ヒドロキシリシン、σ‐Ｎ‐メチルアルギニン、および他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、４‐ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書において用いられるポリペプチドの表記法では、標準的な使用法と慣例に従い、左側方向がアミノ末端方向であり、右側方向がカルボキシ末端方向である。
【００９４】
同様に、別段の定めがない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は５’方向と呼ばれる。新生ＲＮＡ転写物の５’から３’付加の方向は転写方向と呼ばれる。ＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖上にあり、ＲＮＡ転写物の５’末端の５’側にある配列領域は「上流配列」と呼ばれ、ＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖上にあり、ＲＮＡ転写物の３’末端の３’側にある配列領域は「下流配列」と呼ばれる。
【００９５】
ポリペプチドに適用される場合、「実質的な同一性」という用語は、２つのペプチド配列が、例えば、初期ギャップウェイトを用いるＧＡＰプログラムまたはＢＥＳＴＦＩＴプログラムによって最適に整列されると、それらの配列が少なくとも８０パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも９０パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも９５パーセントの配列同一性、および最も好ましくは少なくとも９９パーセントの配列同一性を共有することを意味する。同一ではない残基位置が保存的アミノ酸置換によって異なることが好ましい。保存的アミノ酸置換は、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有する一群のアミノ酸はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり、脂肪族‐ヒドロキシル側鎖を有する一群のアミノ酸はセリンとトレオニンであり、アミド含有側鎖を有する一群のアミノ酸はアスパラギンとグルタミンであり、芳香族側鎖を有する一群のアミノ酸はフェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有する一群のアミノ酸はリシン、アルギニン、およびヒスチジンであり、含硫側鎖を有する一群のアミノ酸はシステインとメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群はバリン‐ロイシン‐イソロイシン、フェニルアラニン‐チロシン、リシン‐アルギニン、アラニン‐バリン、グルタミン酸‐アスパラギン酸、およびアスパラギン‐グルタミンである。実質的な同一性を有するポリペプチドは変異形であり得る。
【００９６】
変異形タンパク質にはわずかな差異を有するタンパク質も含まれる。本明細書において考察されるように、抗体または免疫グロブリン分子のアミノ酸配列におけるわずかな差異は、そのアミノ酸配列中の差異が少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、および最も好ましくは９９％を維持することを条件に、本発明によって包含されると企図される。特に、保存的アミノ酸置換物が企図される。
【００９７】
保存的置換物は、側鎖について関連があるアミノ酸からなるファミリーの中で生じるものである。遺伝的にコードされるアミノ酸は一般的に次のファミリーに分類される：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。より好ましいファミリーは次の通りである：セリンとトレオニンは脂肪族‐ヒドロキシファミリーであり、アスパラギンとグルタミンはアミド含有ファミリーであり、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンは脂肪族ファミリーであり、そして、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは芳香族ファミリーである。例えば、イソロイシンまたはバリンによるロイシンの単離された置換体、グルタミン酸によるアスパラギン酸の単離された置換体、セリンによるトレオニンの単離された置換体、または構造的に関連したアミノ酸によるあるアミノ酸の類似の置換体は、特にその置換がフレームワーク部位内のアミノ酸に関係しない場合、その結果生じる分子の結合または特性に大きな効果を持たないことを予想することは妥当である。アミノ酸の変更が機能性のペプチドを生じるかどうかは、そのポリペプチド派生物の特定の活性を分析することによって容易に決定され得る。分析法は本明細書において詳細に説明される。抗体または免疫グロブリン分子の断片または類似体は当業者によって容易に調製され得る。断片または類似体の好ましいアミノ末端およびカルボキシ末端は機能ドメインの境界付近に存在する。構造ドメインおよび機能ドメインは、ヌクレオチド配列データおよび／またはアミノ酸配列データの公的配列データベースまたは所有権で保護された配列データベースに対する比較によって特定され得る。公知の構造および／または機能を有する他のタンパク質に存在する配列モチーフまたは予想タンパク質立体構造ドメインを特定するためにコンピューター化比較方法を用いることが好ましい。公知の三次元構造に折り畳まるタンパク質配列を特定する方法は公知である。Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１６４（１９９１）．したがって、前述の例は、当業者が本明細書に記載される抗体に従う構造ドメインおよび機能ドメインを定義するために用いられ得る配列モチーフと立体構造を認識することができることを示している。
【００９８】
好ましいアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させる、（２）酸化に対する感受性を低下させる、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変化させる、（４）結合親和性を変化させる、および（４）そのような類似体の他の生理化学的または機能的特性を付与または修飾するアミノ酸置換である。類似体には天然ペプチド配列以外の配列の様々な突然変異タンパク質が含まれ得る。例えば、単一または複数のアミノ酸置換（好ましくは保存的アミノ酸置換）が天然配列に（好ましくは分子間接触を形成するドメイン（複数可）の外側のポリペプチド部分に）形成され得る。保存的アミノ酸置換は親配列の構造的特性を実質的に変化させることはないはずである（例えば、置換アミノ酸は親配列中に存在するヘリックスを乱す、または親配列に特徴的な他の種類の二次構造を壊す傾向が無いはずである）。当技術分野において認識されているポリペプチドの二次構造と三次構造の例はＰｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４））、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｔｏｏｚｅ，ｅｄｓ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１））、およびＴｈｏｒｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｔ．Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：１０５（１９９１）に記載されており、それらの文献はそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
【００９９】
「ポリペプチド断片」という用語は、本明細書において使用される場合、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有するが、残りのアミノ酸配列が、例えば、完全長ｃＤＮＡ配列から推定される天然配列における対応する位置と同一であるポリペプチドを指す。典型的には、断片は少なくとも５、６、８または１０アミノ酸長であり、好ましくは少なくとも１４アミノ酸長であり、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸長であり、通常、少なくとも５０アミノ酸長であり、そして、さらにより好ましくは少なくとも７０アミノ酸長である。「類似体」という用語は、本明細書において使用される場合、推定されたアミノ酸配列の一部に対して実質的な同一性を有する少なくとも２５アミノ酸の断片から構成されるポリペプチドを指す。典型的には、類似体は少なくとも２０アミノ酸長であり、好ましくは少なくとも５０アミノ酸長であるか、それより長く、そして、多くの場合、完全長天然ポリペプチドと同じ長さであり得る。断片と類似体の両方が変異形の形態である。
【０１００】
ペプチド類似体は製薬産業において鋳型ペプチドの特質と類似の特質を有する非ペプチド薬物として一般的に使用される。これらの種類の非ペプチド化合物は「ペプチド模倣物」または「ペプチドミメティクス」と呼ばれる。Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５：２９（１９８６）；Ｖｅｂｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ  ＴＩＮＳ  ｐ．３９２（１９８５）、およびＥｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９（１９８７）。それらの文献は参照により本明細書に組み込まれる。そのような化合物は、多くの場合、コンピューター化分子モデリングの支援を得て開発される。治療上有用なペプチドと構造的に類似のペプチド模倣物は、同等の治療効果または予防効果をもたらすために使用され得る。一般に、ペプチドミメティクスは模範ポリペプチド（すなわち、生化学的特性または薬理学的活性を有するポリペプチド）、例えばヒト抗体と構造的に類似しているが、所望により、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＳＯ−からなる群より選択される結合によって当技術分野において周知の方法により置換された１つ以上のペプチド結合を有する。コンセンサス配列の１つ以上のアミノ酸の同じ種類のＤ‐アミノ酸による規則的な置換（例えば、Ｌ‐リシンの代わりにＤ‐リシン）を用いてより安定なペプチドを作製することができる。加えて、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列変化を含む拘束ペプチドを当技術分野において公知の方法によって（Ｒｉｚｏ  ａｎｄ  Ｇｉｅｒａｓｃｈ  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７（１９９２），  参照により本明細書に組み込まれる）、例えば、ペプチドを環状化する分子内ジスルフィド架橋を形成することができる内部システイン残基を付加することによって作製することができる。ペプチド模倣物とペプチドミメティクスは両方とも変異形の形態である。
【０１０１】
「抗体」または「抗体ペプチド（複数可）」は完全抗体、または特異的結合についてその完全抗体と競合するその結合断片を指す。結合断片は組換えＤＮＡ技術によって、または完全抗体の酵素的切断もしくは化学的切断によって作製される。結合断片にはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、および単鎖抗体が含まれる。「二特異的」または「二機能性」抗体以外の抗体は、同一であるその結合部位の各々を有すると理解される。抗体は、過剰な抗体が対抗受容体に結合した受容体の量を（インビトロ競合結合アッセイにおいて測定される場合）少なくとも約２０％、４０％、６０％または８０％、およびより一般的には約８５％よりも多く減少させるとき、受容体の対抗受容体への接着を実質的に阻害する。
【０１０２】
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合できる、またはそれ以外の場合では分子と相互作用できるあらゆるタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は一般に、アミノ酸または炭水化物もしくは糖側鎖などの分子の化学的活性表面集団からなり、一般に特定の三次元構造特性ならびに特定の荷電特性を有する。エピトープは「直鎖状」または「立体構造的」であり得る。直鎖状エピトープでは、そのタンパク質と相互作用分子（例えば、抗体）の間の相互作用点の全てがそのタンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直鎖状に存在する。立体構造エピトープでは、相互作用点は、互いに分け隔てられているそのタンパク質上のアミノ酸残基にわたって存在する。抗体は、解離定数が１μＭ以下、好ましくは１００ｎＭ以下、およびより好ましくは１０ｎＭ以下、およびさらにより好ましくは１ｎＭ以下であるとき、抗原に特異的に結合すると言われる。抗原上の所望のエピトープが一度決定されると、例えば、本発明において記載される技術を用いてそのエピトープに対する抗体を作製することができる。あるいは、発見過程の間に抗体の作製と特徴解析により望ましいエピトープについての情報が解明され得る。次に、この情報より、同じエピトープへの結合について競合的に抗体をスクリーニングすることができる。これを達成するためのアプローチは、互いに競合的に結合する抗体（例えば、それらの抗体は抗原との結合について競合する）を見つけるための交差競合試験を実施することである。交差競合に基づく「ビニング（ｂｉｎｎｉｎｇ）」抗体用ハイスループットプロセスは国際特許出願第０３／４８７３１に記載されている。当業者によって理解されるように、抗体が特異的に結合することができる事実上どのようなものでもエピトープであり得る。エピトープは抗体が結合する残基を含み得る。１つの実施形態では、そのエピトープはＥＧＦＲｖＩＩＩエピトープである。１つの実施形態では、そのエピトープは配列ＬＥＥＫＫＧＮＹＶＶＴＤ（配列番号５９）を含む。１つの実施形態では、そのエピトープは配列ＥＥＫＫＧＮＹＶＶＴ（配列番号５７）を含む。１つの実施形態では、そのエピトープは配列ＥＫＮＹ（配列番号６０）を含む。１つの実施形態では、そのエピトープは配列ＥＥＫＧＮ（配列番号６１）を含む。当業者は、これらは実際には一つのペプチド上でこの順序で集められている必要は無く、むしろ、これらは、パラトープと相互作用するエピトープを形成する残基であることを理解するであろう。当業者によって理解されるように、分子の形状を作り出す残基または側鎖によって占められる空間が、エピトープが何であるのか決定するのに役立つ。同様に、エピトープと関連するあらゆる官能基、ファンデルワールス相互作用、側鎖の移動度などが全て、実際にエピトープが何であるのか決定することができる。したがって、エピトープはエネルギー相互作用を含むこともできる。
【０１０３】
「パラトープ」という用語は、エピトープへの結合を決定する結合領域の一般的な構造を説明するものとされる。この構造は、結合領域がエピトープに結合することができるか否か、そしてどのように結合することができるのかに影響する。パラトープは、抗体またはその断片にとって重要である、抗原決定基に結合するための抗体の抗原性部位を指すことができる。パラトープは抗体のイディオトープ、およびエピトープに結合する相補性決定領域（ＣＤＲ）領域も指す。１つの実施形態では、パラトープは図１７のＬ１  １０、Ｌ２  ３０、Ｌ３  ５０、Ｈ１  ２０、Ｈ２  ４０、およびＨ３  ６０である抗体の領域である。１つの実施形態では、パラトープは、実施例１６中のＣＤＲ配列をＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３のために含む抗体の領域である。１つの実施形態では、パラトープは図１８中のＬ１  １１０、Ｌ２  １３０、Ｌ３  １５０、Ｈ１  １２０、Ｈ２  １４０、およびＨ３  １６０である抗体の領域である。１つの実施形態では、パラトープは、実施例１８中のＣＤＲ配列をＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３のために含む抗体の領域である。１つの実施形態では、パラトープは実施例１８に記載される配列を含む。１つの実施形態では、パラトープは、図１９Ａおよび図１９Ｂに示されるように、エピトープと相互作用する残基を含む。実線で書かれた黒色の構造はペプチド構造である。１つの実施形態では、パラトープは１３．１．２ｍＡｂの残基Ｔｙｒ１７２Ａｒｇを含む。１つの実施形態では、１３．１．２ｍＡｂのパラトープは、Ｔｙｒ１７２Ａｒｇ、Ａｒｇ１０１Ｇｌｕ、Ｌｅｕ９９Ａｓｎ、Ｌｅｕ９９Ｈｉｓ、Ａｒｇ１０１Ａｓｐ、Ｌｅｕ２１７Ｇｌｎ、Ｌｅｕ９９Ｔｈｒ、Ｌｅｕ２１７Ａｓｎ、Ａｒｇ１０１Ｇｌｎ、およびＡｓｎ３５Ｇｌｙからなる群より選択される少なくとも１つの残基を含む。当業者によって理解されるように、どのような抗体またはその変異形のパラトープも本願によって記載される方法で決定され得る。残基が結合エネルギーの１０％分寄与すると予想される場合、それらは「重要である」と考えられる。１つの実施形態では、残基が結合エネルギーの２％分寄与すると予想される場合、それらは「重要である」と考えられる。１つの実施形態では、残基が結合エネルギーの５０％分寄与すると予想される場合、それらは「重要である」と考えられる。１つの実施形態では、残基がエピトープの表面、またはパラトープの表面と相互作用すると予想される場合、それらは「重要である」と考えられる。１つの実施形態では、残基の変更が結合の喪失という結果になる場合、それらの残基は「重要である」と考えられる。
【０１０４】
「特異的に」または「優先的に」結合するという用語、または類似の語句は、抗体が専らそのエピトープに結合することを表すことを意味しない。むしろ、その意味するところは、抗体またはその変異形が、その抗体が曝露されている少なくとも１つの他の物質にその抗体が結合する程度よりも高い程度でそのエピトープに結合することができるということである。１つの実施形態では、特異的に結合する抗体はＥＧＦＲタンパク質に結合するよりも高い親和性で（よりしっかりと、またはより低いＫＤで）ＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質に結合する。例えば、特異的に結合する抗体は少なくともわずかな増加から１、１〜２、２〜５、５〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜５０、５０〜７０、７０〜９０、９０〜１２０、１２０〜１５０、１５０〜２００、２００〜３００、３００〜５００、５００〜１０００パーセント、またはそれより大きいパーセントだけよりしっかりと結合する。
【０１０５】
アミノ酸、数、アミノ酸からなる略記法、例えば、Ｌｅｕ２１７Ｇｌｎはその番号を付けられたアミノ酸における１番目のアミノ酸から２番目のアミノ酸への変異を表す。したがって、Ｔｙｒ１７２Ａｒｇであれば、野生型タンパク質は位置１７２にチロシンを有するが、その変異体は位置１７２にアルギニンを有することを意味する。
【０１０６】
「薬剤」という用語は、化学化合物、化学化合物の混合物、生物学的巨大分子、または生物学的物質より作製された抽出物を表すために本明細書において使用される。
【０１０７】
本明細書において使用されるとき、「哺乳類動物」は、哺乳類動物であると考えられているあらゆる動物を指すために使用される。好ましくは、その哺乳類動物はヒトである。
【０１０８】
抗体の酵素パパインによる消化により、「Ｆａｂ」断片としても知られる２つの同一の抗原結合断片、および抗原結合活性を有しないが結晶化能を有する「Ｆｃ」断片が生じる。抗体の酵素ペプシンによる消化により、その抗体分子の２つの腕が結合されたままであり、２つの抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）２断片が生じる。Ｆ（ａｂ’）２断片は抗原を架橋する能力を有する。
【０１０９】
本明細書において使用されるとき、「Ｆｖ」は抗原認識部位と抗原結合部位の両方を保持する抗体の最小断片を指す。これらの断片も抗体の変異形と考えることができる。
【０１１０】
本明細書において使用されるとき、「Ｆａｂ」は軽鎖の定常ドメインと重鎖のＣＨ１ドメインを含む抗体断片を指す。
【０１１１】
「ｍＡｂ」という用語はモノクローナル抗体を指す。
【０１１２】
ゼノマックス方法で作製された抗体配列の記述は次のように符号化される：「ＡＢ」は抗体を指し、「ＥＧＦＲｖＩＩＩ」は抗体の結合特異性を指し、「Ｘ」は由来するゼノマウス・マウスを指し、「Ｇ１」はＩｇＧ１アイソタイプを指し、または「Ｇ２」はＩｇＧ２アイソタイプを指し、最後の三桁の数字はその抗体が得られた単一の細胞の番号を指し、例えば、ＡＢ‐ＥＧＦＲｖＩＩＩ‐ＸＧ１‐０９５であれば、ＩｇＧ１アイソタイプで細胞番号９５番のゼノマウス・マウスに由来する、ＥＧＦＲｖＩＩＩに対する結合特異性を有する抗体である。
【０１１３】
「ＳＣ」という用語は単一の細胞を指し、そして、特定のゼノマックスで得られた抗体は、ＳＣとそれに続く三桁の数字、または三桁の数字だけで呼ばれることもあり得、これは本明細書においてその抗体が得られた単一の細胞の番号を指す。
【０１１４】
ハイブリドーマ由来の抗体配列の記述は次のように符号化される：「ＡＢ」は抗体を指し、「ＥＧＦＲｖＩＩＩ」は抗体の結合特異性を指し、「Ｘ」は由来するゼノマウス・マウスを指し、「Ｇ１」はＩｇＧ１アイソタイプを指し、または「Ｇ２」はＩｇＧ２アイソタイプを指し、「Ｋ」はκを指し、「Ｌ」はλを指す。例えば、ＡＢ‐ＥＧＦＲｖＩＩＩ‐ＸＧ１Ｋ‐１３．１．２の最後の三桁の数字はその抗体が得られたクローンを指す。
【０１１５】
「標識」または「標識された」は、本明細書において使用される場合、検出可能部分、例えば、放射性標識、蛍光性標識、酵素性表域、化学発光性標識またはビオチニル基のポリペプチドへの付加を指す。放射性同位体または放射性核種は３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉを含むことができ、蛍光性標識はローダミン、ランタニドリン、またはＦＩＴＣを含むことができ、そして、酵素性標識はホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、β‐ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼを含むことができる。
【０１１６】
「医薬品または薬物」という用語は、本明細書において使用される場合、適切に患者に投与されると所望の治療効果を誘導することができる化学化合物または組成物を指す。他の化学用語は、Ｔｈｅ  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ（Ｐａｒｋｅｒ，Ｓ．，  Ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８５））（参照により本明細書に組み込まれる）によって例示されるように、当技術分野の従来の使用法に従って本明細書において使用される。
【０１１７】
本明細書において使用される場合、「実質的に純粋な」は、目的の種が存在する主要な種であり（すなわち、モル基準でその組成物中の他のどのような個々の種よりも豊富であり）、好ましくは相当に精製された画分が、その目的の種が存在する全ての巨大分子種のうちの（モル基準で）少なくとも約５０パーセントを含む組成であることを意味する。一般に、実質的に純粋な組成物は組成物中に存在する全ての巨大分子種のうちの約８０パーセントよりも多くを含み、より好ましくは約８５％、９０％、９５％、９９％、および９９．９％よりも多くを含む。その目的の種が絶対的な均一性にまで精製され（従来の検出方法では組成物中に汚染混入種を検出することができない）、その組成物が基本的に単一の巨大分子種からなることが最も好ましい。
【０１１８】
「患者」という用語はヒトおよび獣医学上の対象を含む。
【０１１９】
「スラム（登録商標）技術」という用語は、「選択リンパ球抗体法」（Ｂａｂｃｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ｉ９３：７８４３−７８４８（１９９６）、およびＳｃｈｒａｄｅｒの米国特許第５，６２７，０５２号。それらの両方が参照により全体が組み込まれる）を指す。
【０１２０】
「ゼノマックス（商標）」という用語は、（下に記載される）ゼノマウス（登録商標）マウスを用いるスラム技術の使用を指す。
【０１２１】
抗体構造
基本的な抗体の構造単位は四量体を含むことが知られている。各四量体は同一の二対のポリペプチド鎖から構成され、各対が１本の「軽」鎖（約２５ｋＤａ）と１本の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識に主に貢献する約１００〜１１０個以上のアミノ酸からなる可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能に主に貢献する定常領域を定義する。ヒト軽鎖はκ軽鎖およびλ軽鎖として分類される。重鎖はμ、δ、γ、α、またはεとして分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥと定義する。軽鎖および重鎖内で、可変領域と定常領域が約１２個以上のアミノ酸からなる「Ｊ」領域によって連結され、重鎖は約１０個多くのアミノ酸からなる「Ｄ」領域も含む。Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））（あらゆる目的のため、その全体が参照により組み込まれる）を全般的に参照のこと。各軽鎖／重鎖対の可変領域は抗体結合部位を形成する。
【０１２２】
したがって、完全抗体は２か所の結合部位を有する。二機能性抗体または二特異的抗体の場合を除き、それらの２つの結合部位は同一である。
【０１２３】
それらの鎖は全て、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域により連結された、比較的に保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）からなる同じ一般構造を示す。各対の２本の鎖に由来するＣＤＲはフレームワーク領域によって整列させられ、特定のエピトープへの結合を可能にする。Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖と重鎖の両方がＦＲ１ドメイン、ＣＤＲ１ドメイン、ＦＲ２ドメイン、ＣＤＲ２ドメイン、ＦＲ３ドメイン、ＣＤＲ３ドメインおよびＦＲ４ドメインを含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  （Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７  ａｎｄ  １９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３（１９８９）の定義に従う。
【０１２４】
二特異的抗体または二機能性抗体は２つの異なる重鎖／軽鎖対と２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二特異的抗体は、ハイブリドーマの融合、またはＦａｂ’断片の結合を含む様々な方法によって作製され得る。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ＆  Ｌａｃｈｍａｎｎ  Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１（１９９０）、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと。二特異的抗体の作製は従来の抗体の作製と比べて比較的労働集約的な過程であり得、そして、収量と精製度は二特異的抗体については一般により低い。二特異的抗体は、単一の結合部位を有する断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦｖ）の形状では存在しない。
【０１２５】
抗体の一般的な構造上の態様に加えて、パラトープとエピトープの間のより特異的な相互作用が構造的アプローチにより検討され得る。１つの実施形態では、ＣＤＲの構造がパラトープを形成し、それによって抗体がエピトープに結合することができる。そのようなパラトープの構造は多数の方法によって決定され得る。伝統的な構造調査アプローチ、例えば、ＮＭＲまたはＸ線結晶学を用いることができる。これらのアプローチはパラトープだけの構造、またはパラトープがエピトープに結合している間のその構造を調査することができる。あるいは、コンピューター上で分子モデルを作製することができる。構造は、市販のパッケージ、例えばＡｃｃｅｌｒｙｓ社（カリフォルニア州、サンディエゴ）のＩｎｓｉｇｈｔＩＩモデリングパッケージの支援を受けて、相同性モデリングにより作製され得る。簡単に説明すると、調査する抗体の配列を用いて公知の構造を有するタンパク質のデータベース、例えばプロテイン・データバンクに対して検索を行うことができる。公知の構造を有する相同タンパク質を特定した後に、これらの相同タンパク質をモデリングテンプレートとして用いる。可能性があるテンプレートのそれぞれを整列し、そうしてそれらのテンプレートの間で構造に基づく配列アラインメントを作製することができる。次に、未知の構造を有するその抗体の配列をこれらのテンプレートと整列して未知の構造を有するその抗体の分子モデルを作製することができる。当業者によって理解されるように、コンピューター上でそのような構造を作製するための多数の代替的な方法が存在し、それらのいずれも用いることができる。例えば、ＱＵＡＮＴＡ（Ｐｏｌｙｇｅｎ社、マサチューセッツ州、ウォルサム）を用いるＨａｒｄｍａｎらの米国特許第５，９５８，７０８号に記載されている方法およびＣＨＡＲＭ（Ｂｒｏｏｋｓ，Ｂ．Ｒ．，Ｂｒｕｃｃｏｌｅｒｉ，Ｒ．Ｅ．，Ｏｌａｆｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．，Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．，Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ，Ｓ．ａｎｄ  Ｋａｒｐｌｕｓ，Ｍ．，１９８３，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ，．４：１８７）に類似の方法を用いることができる（その全体が参照によりここに組み込まれる）。
【０１２６】
パラトープの形状は、可能性があるパラトープがエピトープに結合するかどうか、およびどの位よく結合するか決定する上で重要であるだけではなく、そのエピトープとそのパラトープの間の相互作用自体が変異形抗体の設計における重要な情報原である。当業者によって理解されるように、この相互作用を研究することができる様々な方法が存在する。一つの方法は、おそらく上記のように作製された、作製された構造モデルを使用し、次にＩｎｓｉｇｈｔＩＩ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社、カリフォルニア州、サンディエゴ）のような、ドッキングモジュールを有し、特に、パラトープとそのエピトープの間の立体配座空間と配向性空間についてモンテカルロ検索を実行することができるプログラムを使用することである。その結果、どこで、およびどのようにエピトープがパラトープと相互作用するか推定することができる。１つの実施形態では、エピトープの断片だけ、またはエピトープの変異形を使用して適切な相互作用の決定を支援する。１つの実施形態では、エピトープ全体をパラトープとエピトープの間の相互作用のモデリングに使用する。当業者によって理解されるように、これらの２つの異なるアプローチは異なる利点と欠点を有する。例えば、エピトープの断片のみを用いることは、長時間をかけることなく、各側鎖の可能性がある変化についてのより詳細な調査を可能とする。他方、タンパク質全体の代わりにエピトープの断片のみ、または単にそのエピトープを用いることで、そのエピトープ断片の特徴がそのエピトープ全体の特徴と同じではないことがあり得る可能性があり、したがって、コンピューターモデリングの間に判断を誤るリスクが上昇する可能性がある。１つの実施形態では、両方のアプローチが結果を照合するために限定的に使用される。好ましい実施形態では、エピトープの変異形が使用される場合、そのエピトープの変異形がそのエピトープの最も重要な残基を含むようにその変異形が最適化される。それらの最も重要な残基の正体は、例えば、本明細書の実施例４および１４に記載されるように、あらゆる数の方法で決定され得る。
【０１２７】
これらの作製された構造の使用を通して、どの残基がエピトープとパラトープの間の相互作用において最も重要であるか決定することができる。したがって、１つの実施形態では、抗体の結合特性を変えるためにどの残基を変えるべきか容易に選択することができる。例えば、パラトープ内のある特定の残基の側鎖がエピトープの結合を立体的に妨げる可能性が有り、したがって、これらの残基をより小さい側鎖を有する残基に変更することが有益であり得ることは、ドッキングモデルから明らかであり得る。このことは多数の方法で決定され得る。例えば、単にそれらの２つのモデルを見て、官能基と近接性に基づいて相互作用を推定することができる。あるいは、より好適なエネルギー相互作用を得るため、上記のようにエピトープとパラトープの対合を繰り返し行ってもよい。抗体の様々な変異形についてこれらの相互作用を決定して、抗体がエピトープに結合し得る代替的な様式を決定することもできる。様々なモデルを組み合わせて、望ましい特定の特徴を有する抗体を得るために、どのように抗体の構造を変えればよいか決定することもできる。
【０１２８】
上で決定されたモデルは様々な技法により試験され得る。例えば、変異形のうちのどれをさらに調査するか決定するために相互作用エネルギーを上で考察されたプログラムを用いて決定することができる。また、クーロン力相互作用およびファンデルワールス相互作用が、エピトープと変異形パラトープの相互作用エネルギーを決定するために用いられる。また、部位特異的突然変異形成が、抗体構造における予想された変化が実際に結合特性における所望の変化を引き起こすのか見るために用いられる。あるいは、それらのモデルが正確であることを検証するために、またはパラトープとエピトープの間で生じている可能性がある一般的に結合していることを決定するためにエピトープに対する変更を行うことができる。
【０１２９】
構造をモデル化するための上記の方法を用いて、タンパク質構造におけるどのような変化が抗体の特定の所望の特徴を生じさせるのか決定することができる。これらの方法を用いてタンパク質構造におけるどのような変化が所望の特徴を生じさせないのか決定することができる。
【０１３０】
当業者によって理解されるように、これらのモデルは、本実施形態の抗体およびそれらの変異形の作製に必要な指針を提供するが、コンピューター上のモデルの、おそらくインビトロ試験を介した日常的な試験を実施することがまだ望ましくあり得る。加えて、当業者に明らかであるように、どのような修飾も抗体の活性に対して追加的な副作用を有することもあり得る。例えば、より強い結合を引き起こすことが予想されるどのような改変もより強い結合を誘導しうるが、抗体の活性を低下または変化させ得る他の構造的変化を引き起こすこともあり得る。その状況であるか否かの決定は当技術分野において日常的であり、多数の方法で達成され得る。例えば、その活性は、実施例２１におけるように、ＥＬＩＳＡ試験により試験され得る。あるいは、それらの試料は表面プラズモン共鳴装置の使用を介して試験され得る。
【０１３１】
抗体の結合、およびより強い結合のための変異形抗体
１つの実施形態では、上記のモデルは、抗体のそのエピトープへの結合能を高めるために使用される。その抗体はより容易にエピトープに結合することができ、したがって、より高い結合定数（ｋａ）を有する。あるいは、その抗体はよりゆっくりとエピトープから解離することができ、したがって、より低い解離定数（ｋｄ）を有し、またはそのエピトープ‐パラトープ相互作用のＫＤはより小さい値であり得、したがって、エピトープとパラトープの間の結合の程度をより高くする。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、変異形抗体は反対の特徴をもって結合するように設計される。すなわち、それらの抗体はしっかりと、またはおそらく短時間で結合しない。
【０１３３】
他の実施形態では、変異形抗体は野生型抗体とそれらのＫＤでは異ならないが、それらの変異形抗体は特定のエピトープに対してより特異的である。このことは、それらの設計された抗体のパラトープが他のエピトープへ結合するリスクが低いことを意味し得る。それらの抗体は改変された他の特徴を有することができる。例えば、変異形は非特異的抗体結合からより影響を受けずにいることができる、または抗体が高濃度で存在するときでさえ、溶液中で溶媒和されたままでいることができる。そのような変異形は考察された抗体の中に存在し得る。例えば、下で検討されるいくつかの変異形抗体の濃度が高くなるほど、Ｂｉａｃｏｒｅ実験においてゆっくりと結合する成分、例えば１３．１．２ｍＡｂが生じた一方、ある特定の変異形、例えば、Ｌ２１７Ｎ‐２．１は同じ濃度であってもこのよりゆっくりとした成分を示さなかった。
【０１３４】
上で決定されたモデルにより予想された変異形が作製され、次に、それらの変異形が所望の特徴をもって実際に結合するか決定するために試験されることができる。エピトープとのより大きい総合相互作用エネルギーを有する変異体がさらなる試験のために選択され得る。その相互作用エネルギーは多数の方法で決定され得、それらのうちの１つが上に記載されている。
【０１３５】
これらの変異形は多数の方法で決定され得る。例となる選択肢にはＫｉｎＥｘＡ法（例えば、Ｌａｃｋｉｅの１９９４年１２月１３日登録の特許第５，３７２，７８３号。その全体が参照により本明細書に組み込まれる）（Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、アイダホ州、ボイ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）、Ｂｉａｃｏｒｅ社、ニュージャージー州、ピスカタウェイ）、ストップト・フロー蛍光法、共振ミラー法、および蛍光偏光法が含まれるが、これらに限定されない。これらの選択肢のうちの多くがデータを記録するだけではなく、そのデータを様々な理論曲線にフィットするためのすぐに利用できる方法も提供し、そうしてｋａ、ｋｄ、およびＫＤ、ならびに他の特性を決定することができる。これらの曲線の得られたデータへのフィッティングはいくらかの変動の可能性が無いわけではないことに留意することが重要である。このため、適切な結合定数、解離定数、および平衡定数を、これらの曲線フィッティング機構を介するだけではなく、互いに直接的に比較して、そして、当業者の知識に照らして見ることができる。
【０１３６】
ヒト抗体および抗体のヒト化
ヒト抗体は、マウスまたはラットの可変領域および／または定常領域を有する抗体に関連する問題のうちのいくつかを回避する。そのようなマウスまたはラット由来のタンパク質の存在がそれらの抗体の急速な排出につながり得る、または患者によるその抗体に対する免疫応答の発生につながり得る。マウスまたはラット由来の抗体の利用を避けるため、げっ歯類動物が完全ヒト抗体を作製するようにヒト抗体機能をそのげっ歯類動物へ導入することにより完全ヒト抗体を作製することができる。
【０１３７】
メガベースサイズのヒト遺伝子座をＹＡＣにクローン化および再構成し、そして、それらをマウス生殖系列へ導入する能力によって、非常に大きい遺伝子座または大まかにマップされた遺伝子座の機能性要素の解明、ならびにヒトの疾患の有用なモデルの作製への強力なアプローチが提供される。さらに、マウス遺伝子座をそれらのヒト同等物で置換するためにそのような技術を利用すれば、それらのヒト遺伝子産物の発生時における発現と制御、それらの他の系との連絡、および疾患の誘発と進行におけるそれらの関与に対する特有の見識が提供され得るだろう。
【０１３８】
そのような戦略の重要な実際の適用はマウス液性免疫系の「ヒト化」である。内在性Ｉｇ遺伝子が不活化されたマウスへのヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座の導入は、抗体のプログラムされた発現と組み立ての基礎にある機構、ならびにＢ細胞発生におけるそれらの役割を研究する機会を提供する。さらに、そのような戦略は、完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を産生するための理想的な起源（ヒトの疾患における抗体療法の可能性の実現に向けた重要なマイルストーンである）を提供することができるだろう。完全ヒト抗体は、マウスｍＡｂまたはマウス誘導体化ｍＡｂに本来備わる免疫原性応答およびアレルギー応答を最小化し、投与される抗体の効力と安全性を上昇させることが予期される。完全ヒト抗体の使用は、慢性ヒト疾患および再発性ヒト疾患、例えば繰返し抗体を投与することが必要な炎症、自己免疫、および癌の治療においてかなりの利点を提供することが予期され得る。
【０１３９】
この目標へ向けた一つのアプローチは、マウス抗体産生に欠け、ヒトＩｇ遺伝子座の大きな断片を有するマウス株であれば、マウス抗体が存在しない状態で広範囲のヒト抗体を産生するだろうと期待してそのようなマウス株を設計することであった。大きいヒトＩｇ断片であれば大きく変化し得る遺伝子多様性ならびに抗体産生と発現の適切な制御を保持するだろう。抗体の多様化と選択のためのマウスの機構、およびヒトタンパク質に対する免疫寛容の欠如を利用することにより、これらのマウス株における再現されたヒト抗体レパートリーが、ヒト抗原を含む、目的のあらゆる抗原に対する高親和性抗体をもたらすはずである。ハイブリドーマ技術を用いれば、所望の特異性を有する抗原特異的ヒトｍＡｂが容易に作製され、選択されることができるだろう。この一般的な戦略は、１９９４年に公開されたような、我々の最初のゼノマウス・マウス株の作製との関連で示されている（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３−２１（１９９４）を参照のこと）。それらのゼノマウス株は、ヒト重鎖遺伝子座とκ軽鎖遺伝子座の、それぞれ、２４５ｋｂと１９０ｋｂのサイズの生殖系列配置断片であって、コア可変配列と定常領域配列を含有する断片を含有する酵母人工染色体（ＹＡＣ）で操作された。同上文献。それらのヒトＩｇ含有ＹＡＣは抗体の再構成と発現の両方についてマウスの系と適合することが判明し、そして、不活化されたマウスＩｇ遺伝子の代わりになることができた。このことは、Ｂ細胞の発生を誘導し、完全ヒト抗体の成人様ヒトレパートリーを産生し、そして、抗原特異的ヒトｍＡｂを生成するそれらの能力によって示された。これらの結果は、より大きな数のＶ遺伝子、追加的な調節性要素、およびヒトＩｇ定常領域を含有するより大きな部分のヒトＩｇ遺伝子座の導入によって、感染と免疫に対するヒト液性応答に特徴的である完全レパートリーが実質的に再現され得ることも示唆した。近年、Ｇｒｅｅｎらの研究は、それぞれヒト重鎖遺伝子座とκ軽鎖遺伝子座のメガベースサイズの生殖系列配置ＹＡＣ断片の導入による、ヒト抗体レパートリーの約８０％超の導入へと伸展した。Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６（１９９７）、および１９９６年１２月３日に出願された米国特許出願第０８／７５９，６２０号を参照のこと。それらの文献は参照によりここに組み込まれる。
【０１４０】
ゼノマウス・マウスの作製は、１９９０年１月１２日に出願された米国特許出願第０７／４６６，００８号、１９９０年１１月８日に出願された第０７／６１０，５１５号、１９９２年７月２４日に出願された第０７／９１９，２９７号、１９９２年７月３０に出願された第０７／９２２，６４９号、１９９３年３月１５日に出願された第０８／０３１，８０１号、１９９３年８月２７日に出願された第０８／１１２，８４８号、１９９４年４月２８日に出願された第０８／２３４，１４５号、１９９５年１月２０日に出願された第０８／３７６，２７９号、１９９５年４月２７日に出願された第０８／４３０，９３８号、１９９５年６月５日に出願された第０８／４６４，５８４号、１９９５年６月５日に出願された第０８／４６４，５８２号、１９９５年６月５日に出願された第０８／４６３，１９１号、１９９５年６月５日に出願された第０８／４６２，８３７号、１９９５年６月５日に出願された第０８／４８６，８５３号、１９９５年６月５日に出願された第０８／４８６，８５７号、１９９５年６月５日に出願された第０８／４８６，８５９号、１９９５年６月５日に出願された第０８／４６２，５１３号、１９９６年１０月２日に出願された第０８／７２４，７５２号、および１９９６年１２月３日に出願された第０８／７５９，６２０号、および米国特許第６，１６２，９６３号、第６，１５０，５８４号、第６，１１４，５９８号、第６，０７５，１８１号、および第５，９３９，５９８号、および日本国特許第３  ０６８  １８０  Ｂ２号、第３  ０６８  ５０６  Ｂ２号、および第３  ０６８  ５０７  Ｂ２号においてさらに考察および詳しく説明されている。Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６（１９９７）およびＧｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３−４９５（１９９８）も参照のこと。１９９６年６月１２日に付与公開された欧州特許第０  ４６３  １５１  Ｂ１号、１９９４年２月３日に公開された国際特許出願第９４／０２６０２号、１９９６年１０月３１日に公開された国際特許出願第９６／３４０９６号、１９９８年６月１１日に公開された国際公開第９８／２４８９３号、２０００年１２月２１日に公開された国際公開第００／７６３１０号、国際公開０３／４７３３６号も参照のこと。上で引用した特許、特許出願、および引用文献のそれぞれの開示はそれらの全体が参照によりここに組み込まれる。
【０１４１】
代替的なアプローチでは、ＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社を含む他のものは、「ミニ遺伝子座」アプローチを利用した。そのミニ遺伝子座アプローチでは、Ｉｇ遺伝子座に由来する部分（個々の遺伝子）を包含することによって外来性のＩｇ遺伝子座を模倣する。したがって、１つ以上のＶＨ遺伝子、１つ以上のＤＨ遺伝子、１つ以上のＪＨ遺伝子、μ定常領域、および２つ目の定常領域（好ましくはγ定常領域）が、動物に挿入するためのコンストラクトに形成される。このアプローチは、Ｓｕｒａｎｉらの米国特許第５，５４５，８０７号、およびそれぞれＬｏｎｂｅｒｇとＫａｙの米国特許第５，５４５，８０６号、第５，６２５，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，６６１，０１６号、第５，７７０，４２９号、第５，７８９，６５０号、第５，８１４，３１８号、第５，８７７，３９７号、第５，８７４，２９９号、および第６，２５５，４５８号、ＫｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔとＢｅｒｎｓの米国特許第５，５９１，６６９号および第６，０２３．０１０号、Ｂｅｒｎｓらの米国特許第５，６１２，２０５号、第５，７２１，３６７号、および第５，７８９，２１５号、およびＣｈｏｉとＤｕｎｎの米国特許第５，６４３，７６３号、およびＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社の１９９０年８月２９日に出願された米国特許出願第０７／５７４，７４８号、１９９０年８月３１日に出願された第０７／５７５，９６２号、１９９１年１２月１７日に出願された第０７／８１０，２７９号、１９９２年３月１８日に出願された第０７／８５３，４０８号、１９９２年６月２３日に出願された第０７／９０４，０６８号、１９９２年１２月１６日に出願された第０７／９９０，８６０号、１９９３年４月２６日に出願された第０８／０５３，１３１号、１９９３年７月２２日に出願された第０８／０９６，７６２号、１９９３年１１月１８日に出願された第０８／１５５，３０１号、１９９３年１２月３日に出願された第０８／１６１，７３９号、１９９３年１２月１０日に出願された第０８／１６５，６９９号、１９９４年３月９日に出願された第０８／２０９，７４１号に記載されており、それらの開示は参照によりここに組み込まれる。欧州特許第０  ５４６  ０７３  Ｂ１号、国際特許出願第９２／０３９１８号、第９２／２２６４５号、第９２／２２６４７号、第９２／２２６７０号、第９３／１２２２７号、第９４／００５６９号、第９４／２５５８５号、第９６／１４４３６号、第９７／１３８５２号、および第９８／２４８８４号、および米国特許第５，９８１，１７５号も参照のこと。それらの開示はそれらの全体が参照によりここに組み込まれる。Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３、Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）、およびＴｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）をさらに参照のこと。それらの文献の開示はそれらの全体が参照によりここに組み込まれる。
【０１４２】
Ｋｉｒｉｎは、ミクロ細胞融合を介して染色体の大きな部分、または染色体全体が導入されたマウス由来のヒト抗体の作製も実証している。欧州特許出願第７７３  ２８８号および第８４３  ９６１号を参照のこと。それらの開示は参照によりここに組み込まれる。Ｘｅｎｅｒｅｘ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社はヒト抗体の将来的な作製技術を開発している。この技術では、ＳＣＩＤマウスを、ヒトリンパ細胞、例えばＢ細胞および／またはＴ細胞を用いて再構成する。次に、マウスを抗原で免疫し、そして、そのマウスはその抗原に対する免疫応答を生起させることができる。米国特許第５，４７６，９９６号、第５，６９８，７６７号、および第５，９５８，７６５号を参照のこと。ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答によって、産業界はキメラ抗体、それ以外ではヒト化抗体を調製するようになった。キメラ抗体はヒト定常領域とマウス可変領域を有するが、ある特定のヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）応答が、特にその抗体の長期にわたる利用または複数回の利用において観察されると予期される。したがって、ＨＡＭＡまたはＨＡＣＡ応答の懸案事項および／または効果を低下させるためには、ＥＧＦＲｖＩＩＩに対する完全ヒト抗体を提供することが望ましいだろう。
【０１４３】
複合体化抗体治療薬
本明細書において考察されるように、ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の機能はその作動形態の少なくとも一部にとって重要であるように見える。機能という言葉によって、例として、ＥＧＦＲｖＩＩＩに効力を有するＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の活性を意味する。したがって、ある点においては、ＥＧＦＲｖＩＩＩに対する治療薬候補としての抗体の作製との関連で、それらの抗体が補体と結合することができ、細胞傷害性リンパ球を動員することができ、したがって、ＣＤＣおよびＡＤＣＣに参加することができることが望ましくあり得る。これらと同じことができる、多数の抗体のアイソタイプが存在し、これには、以下を含むが、これらに限定されない：マウスＩｇＭ、マウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇＧ２ｂ、マウスＩｇＧ３、ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ３、およびヒトＩｇＡ。また、それらの抗体が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などのエフェクター細胞上のＦｃ受容体の結合を介して抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を活性化することができることは、ＥＧＦＲｖＩＩＩに対する治療薬候補としての抗体の作製との関連で望ましくあり得る。ＡＤＣＣができる多数のアイソタイプの抗体が存在し、これには、以下を含むが、これらに限定されない：マウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇＧ２ｂ、マウスＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ１、およびヒトＩｇＧ３。作製される抗体は、最初は必ずしもそのようなアイソタイプを有するわけではなく、むしろ、作製される抗体はどのアイソタイプでも有することができ、そして、後でその抗体が、当技術分野において周知の従来法を用いてアイソタイプスイッチされ得ることが理解される。そのような技法は、特に、直接組換え法（例えば米国特許第４，８１６，３９７号を参照のこと）および細胞間融合法（例えば米国特許第５，９１６，７７１号および第６，２０７，４１８号を参照のこと）の使用を含む。
【０１４４】
細胞間融合技法ではどれでも所望のアイソタイプを有する重鎖を所有する骨髄腫細胞株または他の細胞株を調製し、軽鎖を所有する別の骨髄腫細胞株または他の細胞株を調製する。その後、そのような細胞を融合することができ、そして、完全抗体を発現する細胞株を単離することができる。
【０１４５】
例として、本明細書において考察されるある特定の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体はヒト抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＩｇＧ１抗体である。そのような抗体がＥＧＦＲｖＩＩＩ分子への所望の結合を有する場合は、その抗体は、ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧＡを作製するために容易にアイソタイプスイッチされ得るが、それでも同じ（その抗体の特異性とその親和性のいくらかを定義する）可変領域を有する。次に、ＩｇＧ１を含むそのような分子は補体と結合し、ＣＤＣに参加することができるだろう。ＩｇＧ１定常領域またはＩｇＧ３定常領域を含む場合では、そのような分子は細胞傷害性リンパ球の動員を介した抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）に参加することもできるだろう。
【０１４６】
したがって、上で考察したような所望の「構造」特性を満たす抗体候補が作製されるとき、それらの抗体候補は一般に、アイソタイプスイッチングを介して所望の「機能」特性のうちの少なくともある特定のものを有して提供され得る。
【０１４７】
他の治療薬の設計と作製
ＥＧＦＲｖＩＩＩに関して本明細書において作製され、特徴解析される抗体の活性に基づき、抗体部分を越えた他の治療法の設計が促進される。そのような療法には、先進抗体治療薬、例えば二特異的抗体、免疫毒素、および放射性標識治療薬、ペプチド治療薬の作製、遺伝子治療、特にイントラボディ、アンチセンス治療薬、および小分子が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４８】
補体の結合と細胞傷害性リンパ球の動員が望ましい特性である、先進抗体治療薬の作製に関しては、例えば、二特異的抗体、免疫毒素、または放射性標識治療薬の使用を介して細胞殺滅を強化することが可能である。
【０１４９】
例えば、二特異的抗体に関しては、（ｉ）一方がＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的であり、他方が一緒に複合体化されている２つ目の分子に特異的である、２つの抗体、（ｉｉ）ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的である１本の鎖と２つ目の分子に特異的である２本目の鎖を有する単一の抗体、または（ｉｉｉ）ＥＧＦＲｖＩＩＩともう一方の分子に対する特異性を有する単鎖抗体を含む二特異的抗体が作製され得る。そのような二特異的抗体は、周知の技法を用いて作製され得、例えば、（ｉ）と（ｉｉ）に関しては、例えばＦａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４：７２−８１  （１９９４）およびＷｒｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ、上掲、を参照し、（ｉｉｉ）に関しては、例えばＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（Ｓｕｐｐｌ．）７：５１−５２（１９９２）を参照のこと。いずれの場合も、その２つ目の特異性は、ＣＤ１６またはＣＤ６４（例えばＤｅｏ  ｅｔ  ａｌ．１８：１２７（１９９７）を参照のこと）、ＣＤ３（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ社のＢｉＴＥ技術）またはＣＤ８９（例えばＶａｌｅｒｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ９０：４４８５−４４９２（１９９７）を参照のこと）を含むが、これらに限定されないＦｃ鎖活性化受容体に対してなされ得る。前述のことに従って調製された二特異的抗体であれば、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する細胞、特に本発明のＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体が有効である細胞を殺滅する可能性があるだろう。
【０１５０】
免疫毒素に関しては、当技術分野において周知の技法を利用して、抗体を免疫毒素として作用するように改変することができる。例えば、Ｖｉｔｅｔｔａ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １４：２５２（１９９３）を参照のこと。米国特許第５，１９４，５９４号も参照のこと。放射性標識抗体の調製に関しては、そのような改変抗体は、当技術分野において周知の技法を利用して容易に調製されることもできる。例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ６５５−６８６（２ｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｈａｆｎｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇｏ，ｅｄｓ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｒａｖｅｎ（１９９６））を参照のこと。米国特許第４，６８１，５８１号、第４，７３５，２１０号、第５，１０１，８２７号、第５，１０２，９９０号（米国再発行特許番号第３５，５００号）、第５，６４８，４７１号、および第５，６９７，９０２号も参照のこと。免疫毒素と放射性標識分子のそれぞれは、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する細胞、特に本明細書に記載される抗体が有効である細胞を殺滅する可能性があるだろう。
【０１５１】
それらの抗体はより短時間で結合する、またはエピトープからよりゆっくりと解離するように設計され得るので、それらの抗体自体が設計された治療薬であり得る。それらの抗体の変化した特徴を、例えば、患者への治療薬の投与において利用することができる。
【０１５２】
治療用免疫複合体
理解されるように、薬物に複合体化した抗体、毒素に複合体化した抗体、または他の分子に複合体化した抗体（本明細書において、免疫複合体、免疫毒素または抗体薬物複合体（「ＡＤＣ」）と互換的に呼称される）は、特異的結合分子、例えば抗体によって特異的に結合され得る分子を発現する細胞の標的殺滅に非常に有用である。上で考察したように、ＥＧＦＲｖＩＩＩは、どの正常組織でも発現することが分かっていない。さらに、ＥＧＦＲｖＩＩＩは多数のヒト腫瘍においてかなりの発現を示す。したがって、ＥＧＦＲｖＩＩＩは免疫毒素を用いる標的化にとって非常に魅力的な分子である。
【０１５３】
多くの報告が、モノクローナル抗体薬物複合体を用いる腫瘍細胞の特異的標的化の試みについて現れている（Ｓｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  １８９−２１６（Ｃ．Ｖｏｇｅｌ，ｅｄ．１９８７）；Ｇｈｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ，ｉｎ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｒｕｇｓ  １−２２（Ｅ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，ｅｄ．１９８３）；Ｄｉｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １−２３（Ｊ．Ｒｏｄｗｅｌｌ，ｅｄ．１９８８）；Ｐｉｅｔｅｒｓｚ  ｅｔ  ａｌ，ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ２５−５３（Ｊ．Ｒｏｄｗｅｌｌ，ｅｄ．１９８８）；Ｂｕｍｏｌ  ｅｔ  ａｌ，ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ５５−７９（Ｊ．Ｒｏｄｗｅｌｌ，ｅｄ．１９８８））。メトトレキサート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルファラン、マイトマイシンＣ、およびクロラムブチルなどの細胞傷害性薬物が様々なマウスモノクローナル抗体に対して複合体化されている。いくつかの事例では、それらの薬物分子は、血清アルブミン（Ｇａｒｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４６：２４０７−２４１２（１９８６）、Ｏｈｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２３：８１−８６（１９８６）、Ｅｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：１０７６−１０８０（１９８０））、デキストラン（Ｈｕｒｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２：２５−３５（１９８０）、Ｍａｎａｂｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３４：２８９−２９１（１９８５）、Ｄｉｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４６：４８８６−４８９１（１９８６）、Ｓｈｏｖａｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８２７６−８２８０（１９８８））、またはポリグルタミン酸（Ｔｓｕｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．７３：７２１−７２９（１９８４）、Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２７：１６０２−１６０７（１９８４）、Ｔｓｕｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５２：１１１−１１６（１９８５））などの仲介性担体分子を介して抗体分子に結合された。
【０１５４】
多岐にわたるリンカー技術がそのような免疫複合体の調製のために用いられており、そして、切断可能リンカーと切断不可能リンカーの両方が研究されてきた。しかしながら、大半の事例では、薬物分子が標的部位において非修飾型の形状で複合体から放出され得た場合では、それらの薬物の完全な細胞傷害性能力が観察され得ただけであった。
【０１５５】
抗体薬物複合体の調製に用いられてきた切断可能リンカーのうちの１つは、受容体介在性エンドサイトーシスの際に遭遇するエンドソーム、およびリソソームなどの様々な細胞内区画の酸性環境を利用する、ｃｉｓ‐アコニット酸系の酸不安定性リンカーである。ＳｈｅｎとＲｙｓｅｒは、ダウノルビシンの巨大分子担体との複合体の調製のためにこの方法を導入した（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０２：１０４８−１０５４（１９８１））。ＹａｎｇとＲｅｉｓｆｅｌｄは、ダウノルビシンを抗黒色腫抗体に複合体化するために同じ技法を用いた（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．８０：１１５４−１１５９（１９８８））。近年、Ｄｉｌｌｍａｎらも、ダウノルビシンの抗Ｔ細胞抗体との複合体を調製するために同様に酸不安定性リンカーを使用した（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：６０９７−６１０２（１９８８））。
【０１５６】
Ｔｒｏｕｅｔらによって探求された代替的なアプローチはペプチドスペーサー腕を介して抗体にダウノルビシンを結合することを伴う（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７９：６２６−６２９（１９８２））。これは、リソソーム性ペプチダーゼの作用によって遊離薬物がそのような複合体から放出され得るという前提の下で作られた。
【０１５７】
しかしながら、インビトロ細胞傷害性試験により、抗体薬物複合体が遊離非複合体化薬物と同じ細胞傷害性力価に達することはまれであることが明らかにされている。このことが、薬物分子が抗体から放出される機構は非常に非効率的であることを示唆した。免疫毒素の分野では、モノクローナル抗体と触媒として活性が有るタンパク質毒素の間のジスルフィド架橋を介して形成された複合体は、他のリンカーを含有する複合体よりも細胞傷害性であることが示された。Ｌａｍｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１２０３５−１２０４１（１９８５）、Ｌａｍｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ  １７５−２０９（Ａ．Ｆｒａｎｋｅｌ，ｅｄ．１９８８）、Ｇｈｅｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：２６１０−２６１７（１９８８）を参照のこと。これは、高細胞内濃度のグルタチオンが、抗体分子と毒素の間のジスルフィド結合の効率的な切断に寄与していることに起因した。これにもかかわらず、薬物と巨大分子の間の複合体の調製へのジスルフィド架橋の使用についてはわずかに少数の例が報告されているだけである。Ｓｈｅｎらは、メトトレキサートのメルカプトエチルアミド誘導体への変換と、それに続くジスルフィド結合を介したポリ‐Ｄ‐リシンとの複合体化について記述した（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１０９０５−１０９０８（１９８５））。加えて、ある報告書が、トリスルフィド含有有毒薬物カリチアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｙｃｉｎ）の抗体との複合体の調製について記述した（Ｍｅｎｅｎｄｅｚら、第４回国際対癌モノクローナル抗体免疫複合体会議、サンディエゴ、要約集８１（１９８９年））。別の報告書は、トリスルフィド含有有毒薬物カリチアマイシンの抗体との複合体の調製について記述した（Ｈｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，５３  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３３３６−３３４２（１９９３））．
【０１５８】
ジスルフィド結合抗体薬物複合体が無い一つの理由は、ジスルフィド架橋を介して薬物を抗体に結合させるために容易に使用され得るイオウ原子含有部分を担持する細胞傷害性薬物が入手できないことである。さらに、既存の薬物の化学修飾は、それらの細胞傷害性能力を減少させることなくしては、困難である。
【０１５９】
既存の抗体薬物複合体に関する別の主要な欠点は、限られた数の標的化抗原が原因で、それらが充分な濃度の薬物を標的部位に送達することができないこと、ならびにメトトレキサート、ダウノルビシンおよびビンクリスチンの制癌薬物の比較的に穏やかな細胞傷害性である。有意な細胞傷害性を達成するため、多数の薬物分子の抗体への直接的な結合か、高分子担体分子を介した結合のどちらかが必要となる。しかしながら、そのようなかなり修飾された抗体は、多くの場合、標的抗原への結合の低下と血流からの急速なインビボ排出を示す。
【０１６０】
マイタンシノイド類は細胞傷害性の高い薬物である。マイタンシンは、東アフリカの灌木であるマイテヌス・セラータ（Ｍａｙｔｅｎｕｓ  ｓｅｒｒａｔａ）からＫｕｐｃｈａｎらにより最初に単離され、メトトレキサート、ダウノルビシン、およびビンクリスチンのような従来の癌化学療法剤よりも細胞傷害性が１００〜１０００倍高いことが示された（米国特許第３，８９６，１１１号）。その後、マイタンシノイド類、例えばマイタンシノールおよびマイタンシノールのＣ−３エステルを産生する微生物もいることが発見された（米国特許第４，１５１，０４２号）。マイタンシノールの合成Ｃ−３エステルとマイタンシノールの類似体も報告されている（Ｋｕｐｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２１：３１−３７（１９７８）、Ｈｉｇａｓｈｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２７０：７２１−７２２（１９７７）、Ｋａｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３２：３４４１−３４５１（１９８４））。Ｃ‐３エステルが調製されていたマイタンシノールの類似体の例には、芳香環上（例えば、デクロロ）またはＣ‐９位、Ｃ‐１４位（例えば、ヒドロキシル化メチル基）、Ｃ‐１５位、Ｃ‐１８位、Ｃ‐２０位およびＣ‐４、５位における修飾を有するマイタンシノールが挙げられる。
【０１６１】
天然Ｃ‐３エステルおよび合成Ｃ‐３エステルは２つのグループに分類され得る：
（ａ）単純なカルボン酸とのＣ‐３エステル（米国特許第４，２４８，８７０号、第４，２６５，８１４号、第４，３０８，２６８号、第４，３０８，２６９号、第４，３０９，４２８号、第４，３１７，８２１号、第４，３２２，３４８号、および第４，３３１，５９８号）、および
（ｂ）Ｎ‐メチル‐Ｌ‐アラニンの誘導体とのＣ‐３エステル（米国特許第４，１３７，２３０号、第４，２６０，６０８号、第５，２０８，０２０号、およびＣｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１２：３４４１（１９８４））。
【０１６２】
グループ（ｂ）のエステルはグループ（ａ）のエステルよりも細胞傷害性がかなり高いことが分かった。
【０１６３】
マイタンシンは有糸分裂阻害剤である。マイタンシンでのＬ１２１０細胞のインビボ処理により、それらの細胞の６７％が有糸分裂期に蓄積されることが報告されている。非処理対照細胞は３．２〜５．８％の間の範囲の分裂指数を示すことが報告された（Ｓｉｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．４３  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９７５，Ｂｉｂｌ．Ｈａｅｍａｔ．４９５−５００（１９７６））。ウニの卵およびハマグリの卵を用いる実験により、マイタンシンは微小管タンパク質であるチューブリンの重合を阻害することにより微小管の形成を妨害して有糸分裂を阻害することが示唆されている（Ｒｅｍｉｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １８９：１００２−１００５（１９７５））。
【０１６４】
インビトロでは、Ｐ３８８、Ｌ１２１０、およびＬＹ５１７８マウス白血病細胞懸濁液は、１０−３〜１０−１．ｍｕ．ｇ／ｍｕ．ｌの用量のマイタンシンによって阻害され、Ｐ３８８系列が最も感受性が高いことが判明されている。マイタンシンはヒト鼻咽喉癌細胞のインビトロ増殖の活性阻害剤であることも示されており、ヒト急性リンパ芽球性白血病系列ＣＥＭは１０−７ｍｇ／ｍｌ程度の低濃度で阻害されることが報告された（Ｗｏｌｐｅｒｔ−ＤｅＦｉｌｌｉｐｐｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２４：１７３５−１７３８（１９７５））。
【０１６５】
インビボでもマイタンシンは活性であることが示されている。Ｐ３８８リンパ球性白血病系における腫瘍増殖は５０〜１００倍の用量範囲にわたって阻害されることが示され、それは高い治療指数であることを示唆した。また、かなりの阻害性活性がＬ１２１０マウス白血病系、ヒトルイス肺癌系、およびヒトＢ‐１６黒色癌系について示され得た（Ｋｕｐｃｈａｎ，Ｐｅｄ．Ｐｒｏｃ．３３：２２８８−２２９５（１９７４））。
【０１６６】
マイタンシノイド類の細胞結合性薬剤（例えば、抗体）との複合体化についての現行の方法は２つの反応ステップを含む。細胞結合性薬剤、例えば抗体をまずＮ‐スクシンイミジルピリジルジチオプロピオネート（ＳＰＤＰ）などの架橋試薬で修飾してジチオピリジル基を抗体に導入する（Ｃａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７３：７２３−７３７（１９７８）、米国特許第５，２０８，０２０号）。第２ステップにおいて、チオール基を有する反応性マイタンシノイド、例えばＤＭ１（以前は、Ｎ２’‐デアセチル‐Ｎ２’‐（３メルカプト‐１‐オキソプロピル）‐マイタンシンと呼ばれる）が開始試薬として修飾化抗体に添加され、それらの修飾化抗体中のチオピリジル基を置換することとなり、そして、ジスルフィド結合細胞傷害性マイタンシノイド／抗体複合体が作製される（米国特許第５，２０８，０２０号）。スクシンイミジル‐４‐（Ｎ‐マレイミドメチル）シクロヘキサン‐１‐カルボキシレート（ＳＭＣＣ）リンカーを使用する別の方法は米国特許出願番号第１１／９２７，２１７号の特許出願（米国特許出願公開第２００８／０１１４１５３号）に記載されている。マイタンシノイド類の複合体化のための１ステップ方法は米国特許第６，４４１，１６３号に記載されている。マイタンシノイド系免疫毒素技術はＩｍｍｕｎｏｇｅｎ社（マサチューセッツ州、ケンブリッジ）より入手可能である。
【０１６７】
別の重要な毒素技術はオーリスタチン毒素に基づく。オーリスタチンは、インド洋ウミウシのドラベラ（Ｄｏｌａｂｅｌｌａ）から強力な細胞増殖阻害性物質として得られたドラスタチン１０に由来する。米国特許第４，８１６，４４４号および第４，９７８，７４４号を参照のこと。他のドラスタチン類については、米国特許第４，４１４，２０５号（ドラスタチン‐１、２、および３）、第５，０７６，９７３号（ドラスタチン‐３）、第４，４８６，４１４号（ドラスタチン‐ＡおよびＢ）、；第４，９８６，９８８号（ドラスタチン‐１３）、第５，１３８，０３６号（ドラスタチン‐１４）、および第４，８７９，２７８号（ドラスタチン‐１５）も参照のこと。アリゾナ大学のＰｅｔｔｉｔ博士と同僚により単離および合成され、様々なオーリスタチン誘導体が試験され、そして、細胞にとって非常に有毒であることが示されている。Ｐｅｔｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ  ３３７．  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ  １０  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．  １０（７）：５２９−４４（１９９５）、Ｗｏｙｋｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｐｏｓｔａｎｔｉｆｕｎｇａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｔ  ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ  １０  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ  ＰＨＥ．  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．  ４５：３５８０−３５８４（２００１）、Ｐｅｔｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ  １０  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．  ４２：２９６１−２９６５  （１９９８）、ＷｏｙｋｅＴｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ  ＰＨＥ  ｏｎ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙに投稿中、を参照のこと。
【０１６８】
近年、抗体上の積載物として送達されるときわめて有効であると思われるさらなるオーリスタチン誘導体が開発された。例えば、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）は、腫瘍特異的抗体に複合体化されると腫瘍細胞に対して強力な毒素であると示されている。Ｄｏｒｏｎｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．（２００３）（オンラインで入手可能）、Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．ｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥ，ａｎ  ａｎｔｉ−ＣＤ３０−ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ  Ｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｗｉｔｈ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｂｌｏｏｄ．（２００３）  Ｍａｙ  ８［印刷前の電子出版］．電子出版  ２００３年４月２４日  （オンラインで入手可能）。オーリスタチン分子の毒性に加えて、研究により、ペプチド結合複合体は緩衝液中および血漿中において他のリンカー技術よりも安定であり、したがって、特異的であり、正常組織に対して毒性が低いことが示されている。  Ｄｏｒｏｎｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．（２００３）（オンラインで入手可能）、Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．ｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥ，ａｎ  ａｎｔｉ−ＣＤ３０−ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ  Ｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｗｉｔｈ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｂｌｏｏｄ．（２００３）Ｍａｙ  ８［印刷前の電子出版］．電子出版  ２００３年４月２４日  （オンラインで入手可能）。そのようなリンカーは分岐ペプチド設計に基づき、それらには、例えば、ｍＡｂ‐バリン‐シトルリン‐ＭＭＡＥ複合体およびｍＡｂ‐フェニルアラニン‐リシン‐ＭＭＡＥ複合体が含まれる。  Ｄｏｒｏｎｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．（２００３）（オンラインで入手可能）、Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．ｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥ，ａｎ  ａｎｔｉ−ＣＤ３０−ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ  Ｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｗｉｔｈ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｂｌｏｏｄ．（２００３）Ｍａｙ  ８［印刷前の電子出版］．電子出版  ２００３年４月２４日（オンラインで入手可能）。そのような設計と複合体化技法は、例えば、Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｏｆ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｐｒｅｐａｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｎｋｅｒｓ：ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｇｇｒｅｇａｔｉ��ｎ  ｂｙ  ｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ  ｃｈａｉｎｓ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．４５（１９）：４３３６−４３（２００２）およびＤｕｂｏｗｃｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｂ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ  ｐｒｏｄｒｕｇｓ．２．Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇ  ｓ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ（Ｔａｘｏｌ），ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ  ａｎｄ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ．Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．８（２３）：３３４７−５２（１９９８）によって説明される。前述の内容に基づくオーリスタチンＥ系免疫毒素技術はＳｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社（ワシントン州、シアトル）から入手可能である。
【０１６９】
免疫複合体を作製するための毒素としての可能性を有するように見える自然起源抽出物から得られた多数の新規微小管作用性化合物、および半合成類似体および合成類似体が存在する（ｎｅｗｍｅｄｉｎｃ「ドット」ｃｏｍのウェッブサイトを参照のこと）。そのような分子、およびそれらを利用する医薬製品の例には次のものが挙げられる：コルヒチン部位結合剤（クラシン）、コンブレスタチン類（ＡＶＥ８０６、コンブレスタチンＡ‐４プロドラッグ（ＣＡ４Ｐ）、オキシ‐４５０３）、クリプトフィシン類（ＬＹ３５５７０３）、ディスコデルモリド、ドラスタチンおよび類似体（オーリスタチンＰＨＥ、ドラスタチン１０、ＩＬＸ‐６５１、シンプロスタチン１、ＴＺＴ‐１０２７）、エポチロン類（ＢＭＳ‐２４７５５０、ＢＭＳ‐３１０７０５、ＥＰＯ９０６、ＫＯＳ‐８６２、ＺＫ‐ＥＰＯ）、エリュテロビン、ＦＲ１８２８７７、ハリコンドリンＢ（Ｅ７３８９）、ハリミド（Ｈａｌｉｍｉｄｅ）（ＮＰＩ‐２３５２およびＮＰＩ‐２３５８）、ヘミアステリン類（ＨＴＩ‐２８６）、ラウリマリド、マイタンシノイド類（「ＤＭ１」）（ビバツズマブ（Ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ）・メルタンシン、カンツズマブ・メルタンシン、ｈｕＮ９０１‐ＤＭ１／ＢＢ‐１０９０１ＴＡＰ、ＭＬＮ５９１ＤＭ１、Ｍｙ９‐６‐ＤＭ１、トラスツズマブ‐ＤＭ１）、ＰＣ‐ＳＰＥＳ、ペロルシドＡ、レスベラトロール、Ｓ‐アリルメルカプトシステイン（ＳＡＭＣ）、スポンジスタチン類、ビチレヴアミド（Ｖｉｔｉｌｅｖｕａｍｉｄｅ）、分子モーターキネシン類（ＳＢ‐７１５９９２）、設計コルヒチン部位結合剤（Ａ‐２８９０９９、Ａ‐２９３６２０／Ａ‐３１８３１５、ＡＢＴ‐７５１／Ｅ７０１０、Ｄ‐２４８５１／Ｄ‐６４１３１、ＺＤ６１２６）、他の新規紡錘体毒素（２‐メトキシエストラジオール  （２−ＭＥ２）、ベンゾイミダゾールカルバメート類（Ｂｅｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ  Ｃａｒｂａｍａｔｅｓ）（ＡＮＧ６００シリーズ、メベンダゾール）、ＣＰ２４８／ＣＰ４６１、ＨＭＮ‐２１４、Ｒ４４０、ＳＤＸ‐１０３、Ｔ６７／Ｔ６０７）。さらに、さらなる海産生物由来毒素はＭａｙｅｒ，Ａ．Ｍ．Ｓ．Ｍａｒｉｎｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｉｎ  １９９８：Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｓｔ．４１（４）：１５９−１６４（１９９９）に概説されている。
【０１７０】
治療投与および製剤
長期作用性によって、静脈内注射、皮下注射または筋肉内注射などの代わりの非経口経路による投与のより頻度が低く、より便利なスケジュールが可能になる。
【０１７１】
インビボ投与用に使用される場合、本明細書に記載される複合体化抗体製剤、特にＡｂ１３１‐ＤＭ１複合体は無菌であるべきである。これは、例えば、凍結乾燥と再構成の前、またはその後に無菌濾過膜を通す濾過により容易に達成される。複合体化抗体は通常、凍結乾燥形状で、または溶液状で貯蔵される。治療用抗体組成物は一般に、無菌のアクセスポートを有する容器、例えば、製剤を取り出すことを可能にするアダプター、例えば皮下注射針により穴をあけることができるストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルに入れられる。
【０１７２】
抗体投与経路は公知の方法、例えば、静脈内経路、腹腔内経路、脳内経路、筋肉内経路、眼内経路、動脈内経路、髄腔内経路、吸入経路または病巣内経路による注射または点滴、または下に記されるような持続放出系による注射または点滴に合う。抗体が点滴またはボーラス注射により連続的に投与されることが好ましい。１つの実施形態では、Ａｂ１３１‐ＤＭ１複合体は静脈内に投与される。別の実施形態では、Ａｂ１３１‐ＤＭ１複合体は注射により腫瘍へ投与される。別の実施形態では、Ａｂ１３１‐ＤＭ１複合体は貯留槽、デポー製剤、または移植された装置から直接腫瘍に連続的に投与される。
【０１７３】
本発明のいくつかの実施形態では、複合体化抗体、例えばＡｂ１３１‐ＤＭ１複合体のための特定の投与計画が提供される。所与の患者への抗体製剤の投与量は、疾患の重症度と種類、体重、性別、食事、投与時間と経路、他の薬物治療、および他の関連する臨床因子を含む、薬物の作用を修飾することが知られている様々な要因を考慮して、主治医によって決定される。
【０１７４】
典型的には、医師は、投与量が所望の効果を達成する量に達するまで抗体を投与する。この治療法の進行は、ＭＲＩなどの放射線画像撮影を含む従来の測定法および本明細書に記載される測定法によって容易にモニターされる。
【０１７５】
本明細書に記載されるような複合体化抗体、例えばＡｂ１３１‐ＤＭ１複合体は薬学的に許容可能な担体との混合物の状態で調製され得る。治療用組成物は静脈内に、または鼻もしくは肺を通して、好ましくは液体または（凍結乾燥された）粉末エアロゾルとして投与され得る。組成物は所望により非経口的に、または皮下に投与されてもよい。全身投与されるとき、治療用組成物は無菌であり、発熱性物質が含まれていない、ならびにｐＨ、例えば４〜約６のｐＨ、等張性、および安定性に注意を払った非経口的に許容可能な溶液の状態であるべきである。これらの条件は当業者に知られている。
【０１７６】
簡単に説明すると、化合物の投与製剤は、所望の精製度を有する複合体化抗体、例えばＡｂ１３１‐ＤＭ１複合体を生理的に許容可能な担体、賦形剤、または安定化剤と混合することによって、貯蔵または投与用に調製される。そのような物質は、使用される投与量と濃度において受容者にとって無毒であり、そして、ホウ酸塩、コハク酸塩  重炭酸塩、リン酸ナトリウム（「ＮａＯＡＣ」）、トリス塩酸、トリス緩衝液、クエン酸、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（すなわち、ＰＢＳ緩衝液）、酢酸塩、および他の有機酸の塩などの緩衝剤；アスコルビン酸などの抗酸化剤；ポリアルギニンなどの低分子量（約１０残基未満）ペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリジノン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏｎｅ）などの親水性重合体；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、およびセルロースまたはその誘導体、グルコース、ショ糖、マンノース、またはデキストリン類を含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの対イオンおよび／またはポリソルベート２０もしくは８０を含むツイーン、プルロニック類、トリトンなどの非イオン性界面活性剤、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール（ｔｙｌｏｘａｐａｌ）またはポリエチレングリコールを包含する。そのような投薬製剤は１ｍｇ／ｍｌから１６０ｍｇ／ｍｌまでの範囲の化合物、例えばＡｂ１３１‐ＤＭ１の濃度を含み得る。
【０１７７】
注射用の無菌組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ  ｅｄ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ  １９９０）に記載されるような従来の薬務に従って製剤され得る。例えば、水、または、ゴマ油、ピーナッツ油、もしくは綿実油のような天然植物油またはエチルオレエートのような合成脂肪性ビヒクルなどのようなビヒクル中での活性化合物の溶解または懸濁が望ましくあり得る。緩衝剤、保存剤、抗酸化剤などは許容された薬務に従って組み込まれ得る。
【０１７８】
持続性放出調製物の適切な例には、複合体化抗体を含有する固形疎水性高分子からなる、造形物品、フィルムまたはマイクロカプセルの形状である半透過性マトリックスが挙げられる。持続放出マトリックスの例にはポリエステル、ヒドロゲル（例えば、Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，（１９８１）１５：１６７−２７７およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，（１９８２）１２：９８−１０５によって記載されるポリ（２‐ヒドロキシエチル‐メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド類（米国特許第３，７７３，９１９号、欧州特許第５８，４８１号）、Ｌ‐グルタミン酸とγエチル‐Ｌ‐グルタミン酸塩の共重合体（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，（１９８３）  ２２：５４７−５５６）、非分解性エチレン‐ビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、上掲）、リュープロン・デポー（ＬＵＰＲＯＮ  Ｄｅｐｏｔ）（商標）などの分解性乳酸‐グリコール酸共重合体（乳酸‐グリコール酸共重合体と酢酸ロイプロリドから構成される注射可能ミクロスフィア）、およびポリ‐Ｄ‐（−）‐３‐ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号）が挙げられる。
【０１７９】
エチレン‐ビニルアセテートおよび乳酸‐グリコール酸などの重合体が１００日を超える期間にわたる分子の放出を可能とする一方、ある特定のヒドロゲルはより短い期間にタンパク質を放出する。封入されたタンパク質が長期間体内に留まるとき、それらは、３７℃での水分への曝露の結果として変性または凝集することがあり得、生物活性を喪失することになり、免疫原性の変化の可能性が生じる。合理的な戦略が、関与する機序に応じてタンパク質安定化のために考案され得る。例えば、凝集機構がジスルフィド交換を介する分子間Ｓ‐Ｓ結合形成であることが分かった場合、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分含量を制御し、適切な添加物を使用し、そして、特定の高分子マトリックス組成物を開発することによって安定化が達成され得る。
【０１８０】
持続放出される組成物には、懸濁状態で結晶を維持することができる、適切な製剤中に懸濁された抗体の結晶からなる調製物も含まれる。これらの調製物は皮下または腹腔内に注射されると持続放出効果をもたらすことができる。他の組成物にはリポソームに封入された抗体も含まれる。そのような抗体を含有するリポソームはそれ自体が公知の方法によって調製される：米国特許第ＤＥ３，２１８，１２１号、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９８５）８２：３６８８−３６９２、Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９８０）７７：４０３０−４０３４、欧州特許第５２，３２２号、欧州特許第３６，６７６号、欧州特許第８８，０４６号、欧州特許第１４３，９４９号、１４２，６４１号、日本国特許出願第８３−１１８００８号、米国特許第４，４８５，０４５号、および第４，５４４，５４５号、および欧州特許第１０２，３２４号。
【０１８１】
本明細書における組成物および方法に従う治療用物質の投与は、移動、送達、寛容性などの改善をもたらすために製剤に組み込まれる適切な担体、賦形剤、および他の薬剤と共に実施されることが理解される。多数の適切な製剤が、全ての薬剤師に知られている処方集、すなわち、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ  ｅｄ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９０））、特にその中のＢｌｏｃｋ，Ｌａｗｒｅｎｃｅによる第８７章の中に見出され得る。これらの製剤には、例えば、粉剤、ペースト剤、軟膏、ゼリー剤、ワックス剤、油剤、脂質剤、脂質（陽イオン性または陰イオン性）含有小胞（例えば、リポフェクチン（商標））、ＤＮＡ複合体、無水吸収ペースト剤、水中油乳剤および油中水乳剤、カルボワックス乳剤（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固形ゲル剤、およびカルボワックスを含有する半固形混合物が含まれる。前述の混合物のうちのいずれも、製剤中の有効成分が処方によって不活化されず、製剤が投与経路と生理的に適合し、許容可能であることを条件として、本発明に従う処置および治療において適切であり得る。薬剤師によく知られている製剤、賦形剤、および担体に関連するその他の情報についてＢａｌｄｒｉｃｋ  Ｐ．“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ｔｈｅ  ｎｅｅｄ  ｆｏｒ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｇｕｉｄａｎｃｅ．”Ｒｅｇｕｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３２（２）：２１０−８（２０００）、Ｗａｎｇ  Ｗ．“Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２０３（１−２）：１−６０（２０００）、Ｃｈａｒｍａｎ  ＷＮ  “Ｌｉｐｉｄｓ，ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  ｄｒｕｇｓ，ａｎｄ  ｏｒａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ−ｓｏｍｅ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ．”Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．８９（８）：９６７−７８（２０００）、Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．“Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．５２：２３８−３１１（１９９８）、およびそれらの中の引用文献も参照のこと。
【０１８２】
本発明の治療用物質、例えばＡｂ１３１‐ＤＭ１は併用療法において使用されることもあり得る。併用療法は、哺乳類動物への外科手術の実施、放射線治療の実施、原発性状況における全脳放射線治療の実施、再発性状況における局所的放射線治療の実施、原発性状況および再発性状況におけるテモゾロミドの投与、ベバシズマブの投与、イリノテカンの投与、ＰＣＶ、プロカバジン（ｐｒｏｃａｂａｚｉｎｅ）、ロムスチン［ＣＣＮＵ］、ビンクリスチンの投与、グリアデル・ウェファー（ＢＣＮＵをしみ込ませたポリフェプロザン）の移植、チロシンキナーゼ阻害剤の投与、放射線増感剤の投与、ワクチン系治療法の実施、抗体薬物複合体の投与または原発性状況または再発性状況におけるＢｉＴＥの投与、または標的化薬物の投与によるその哺乳類動物の治療の前、その治療と組み合わせて、またはその治療の後に本発明の治療用分子、例えばＡｂ１３１‐ＤＭ１をその哺乳類動物、好ましくはヒトへ投与することを包含する。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、Ａｂ１３１‐ＤＭ１などの本発明の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ薬物複合体と組み合わせて哺乳類動物に投与される治療用分子は、リンドペピムート（Ｒｉｎｄｏｐｅｐｉｍｕｔ）のような抗ＥＧＦＲｖＩＩＩワクチン、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体、別の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体、または抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ二特異的Ｔ細胞結合剤などの別の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ治療用分子である。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、Ａｂ１３１‐ＤＭ１などの本発明の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ薬物複合体と組み合わせて哺乳類動物に投与される治療用分子は、パニツムマブ、セツキシマブ、他の抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＥＧＦＲワクチン、抗ＥＧＦＲ抗体薬物複合体または抗ＥＧＦＲ二特異的Ｔ細胞結合剤のような抗ＥＧＦＲ治療用分子である。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、Ａｂ１３１‐ＤＭ１などの本発明の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ薬物複合体と組み合わせて哺乳類動物に投与される治療用分子はシルツキシマブ（ｓｉｌｔｕｘｉｍａｂ）のような抗インターロイキン‐６抗体、トシリズマブのような抗インターロイキン‐６受容体抗体、抗インターロイキン‐６抗体薬物複合体もしくは抗インターロイキン‐６受容体抗体薬物複合体、または抗インターロイキン‐６二特異的Ｔ細胞結合剤もしくは抗インターロイキン‐６受容体二特異的Ｔ細胞結合剤などの抗インターロイキン‐６治療用分子である。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、Ａｂ１３１‐ＤＭ１などの本発明の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ薬物複合体と組み合わせて哺乳類動物に投与される治療用分子は抗インターロイキン‐８抗体、などの抗インターロイキン‐８受容体抗体、抗インターロイキン‐８抗体薬物複合体もしくは抗インターロイキン‐８受容体抗体薬物複合体、または抗インターロイキン‐８二特異的Ｔ細胞結合剤もしくは抗インターロイキン‐８受容体二特異的Ｔ細胞結合剤などの抗インターロイキン‐８治療用分子である。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体、例えばＡｂ１３１‐ＤＭ１は、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ、抗ＥＧＦＲ、抗インターロイキン‐６、抗インターロイキン６受容体、抗インターロイキン‐８または抗インターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｎ）‐８受容体治療用分子が哺乳類動物に投与される前に、その投与と組み合わせて、またはその投与の後に、またはそれ以外にも投与される。
【０１８８】
そのような併用療法は、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する腫瘍、肺癌、乳癌、結腸癌、胃癌、腎臓癌、頭頸部癌、前立腺癌、卵巣癌、神経膠芽腫、退形成星状細胞腫、星状細胞腫またはグリア細胞成分を含む腫瘍、特に神経膠芽腫、退形成星状細胞腫、星状細胞腫、再発神経膠芽腫、再発退形成星状細胞腫、乏突起神経膠腫（ｏｌｉｇｏｄｅｎｒｏｇｌｉｏｍａ）、乏突起星状細胞腫、神経膠肉腫、混合膠腫、毛様細胞性星状細胞腫、多形性黄色星状細胞腫、上衣下巨細胞性星状細胞腫、星状芽細胞腫、海綿芽細胞腫、大脳神経膠腫症、または神経節膠腫（ｇａｎｇｌｉｇｌｉｏｍａ）もしくは退形成神経節膠腫を含む神経膠性腫瘍を有する哺乳類動物の治療に有用である。
【０１８９】
複合体化抗体の調製
本明細書に記載されるような複合体化抗体は、下に記載されるように、および米国特許第７，６２８，９８６号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、ゼノマウス（登録商標）技術の利用を介して調製された。それで、そのようなマウスはヒトの免疫グロブリン分子と抗体を産生することができ、マウスの免疫グロブリン分子と抗体を産生することができない。同じことを達成するために利用される技術が、本明細書において開示される特許、特許出願、および参照文献に開示される。しかしながら、とりわけマウスの遺伝子導入体の作製とそれに由来する抗体についての一つの実施形態が、１９９６年１２月３日に出願された米国特許出願第０８／７５９，６２０号、および１９９８年６月１１日に公開された国際特許出願第９８／２４８９３号、および２０００年１２月２１日に公開された国際特許出願第００／７６３１０号に開示される。それらの開示は参照によりここに組み込まれる。Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：１４６−１５６（１９９７）も参照のこと。その文献の開示は参照によりここに組み込まれる。
【０１９０】
そのような技術を使用することによって、様々な抗原に対する完全ヒトモノクローナル抗体が精製され得る。１つの実施形態では、ゼノマウス（登録商標）系列のマウスを目的の抗原（例えば、ＥＧＦＲｖＩＩＩ）で免疫し、抗体を発現したマウスからリンパ細胞（例えば、Ｂ細胞）を回収し、そして、そのような細胞を骨髄型の細胞株と融合して不死ハイブリドーマ細胞株を調製し、そして、そのようなハイブリドーマ細胞株を、その目的の抗原に特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を特定するためにスクリーニングおよび選択する。本明細書は、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的な抗体を産生する複数のハイブリドーマ細胞株を作製するための方法を提供する。さらに、本明細書は、そのような細胞株によって産生された抗体の特徴解析（そのような抗体の重鎖および軽鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を含む）を提供する。
【０１９１】
あるいは、ハイブリドーマを作製するために骨髄腫細胞に融合される代わりに、免疫されたゼノマウス（登録商標）系列のマウスから単離された、回収された細胞によって産生される抗体は最初の抗原、好ましくはＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質に対する反応性についてさらにスクリーニングを受ける。そのようなスクリーニングにはＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質を用いるＥＬＩＳＡ、全長型ＥＧＦＲｖＩＩＩを安定的に発現するＮＲ６  Ｍ細胞に対するインビトロ結合、およびＮＲ６  Ｍ細胞内における抗体によるＥＧＦＲｖＩＩＩ受容体の内部移行が含まれる。次に、目的の抗体を分泌する１種類のＢ細胞を、ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的溶血プラークアッセイ（Ｂａｂｃｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｉ９３：７８４３−７８４８（１９９６））を用いて単離する。溶解の目標とされた細胞は、好ましくは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原で被覆されたヒツジ赤血球細胞（ＳＲＢＣ）である。目的の免疫グロブリンを分泌するＢ細胞培養物と補体が存在する場合、プラークの形成は、標的細胞の特異的なＥＧＦＲｖＩＩＩ介在性溶解を表す。そのプラークの中央にある１個の抗原特異的形質細胞を単離することができ、そして、その１個の形質細胞から、その抗体の特異性をコードする遺伝情報が単離される。分泌された抗体の可変領域をコードするＤＮＡは、逆転写酵素ＰＣＲを用いてクローン化され得る。次に、そのようなクローン化ＤＮＡは、適切な発現ベクター、好ましくはｐｃＤＮＡなどのベクターカセット、より好ましくは免疫グロブリン重鎖および軽鎖の定常ドメインを含有するそのようなｐｃＤＮＡベクターにさらに挿入され得る。次に、作製されたベクターは宿主細胞、好ましくはＣＨＯ細胞に形質移入され、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適切であるように改変された従来の栄養培地中で培養され得る。本明細書において、我々は、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的な抗体を産生する複数の種類の１個の形質細胞の単離について説明する。さらに、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の特異性をコードする遺伝物質が単離され、適切な発現ベクターに導入され、次に宿主細胞へ形質移入される。
【０１９２】
ゼノマウス・マウス由来のＢ細胞は、抗体ディスプレイライブラリーの作製に用いられ得る遺伝物質の供給源として使用されることもあり得る。そのようなライブラリーはバクテリオファージ内に、酵母内に、またはリボソームディスプレイによりインビトロで当技術分野において通常の技術を用いて作製され得る。超免疫ゼノマウス・マウスは、それから高親和性抗原反応性抗体を単離することができる宝庫であり得る。したがって、ＥＧＦＲｖＩＩＩに対して超免疫されたゼノマウス・マウスを使用して、ＥＧＦＲｖＩＩＩに対する高親和性抗体を単離することができる抗体ディスプレイライブラリーを作製することができる。そのようなライブラリーであれば、ｐｅｐ３オリゴペプチドに対してスクリーニングすることが可能であろう。そして、結果として得られた抗体は、もともとのディスプレイ抗原への特異性を確認するためにＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する細胞に対するスクリーニングを受ける。次に、完全ＩｇＧ抗体を、組換えＤＮＡ技術を用いて発現させることができる。例えば、国際公開第９９／５３０４９号を参照のこと。
【０１９３】
例えば、本発明の複合体化抗体の抗体は形質移入細胞から作製され得る。細胞（一過性の発現には２９３細胞、および安定的な発現にはＣＨＯ細胞）を、本願の図８に示されるＡｂ１３１‐ＤＭ１複合体の重鎖および軽鎖をコードするプラスミドで形質移入することができる。形質移入細胞の条件培地を、細胞と細胞破片を除去することにより回収することができる。清澄化された条件培地をプロテインＡ‐セファロースカラムに負荷することができる。所望により、まずその培地を濃縮し、次にプロテインＡセファロースカラムに負荷することができる。非特異的結合は大量のＰＢＳの洗浄により取り除かれ得る。プロテインＡカラム上の結合抗体タンパク質はプロテインＡカラムから標準的な酸性抗体溶出（５０ｍＭクエン酸、ｐＨ３．０）により回収され得る。プロテインＡセファロースプール中の凝集した抗体タンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーまたはＳＰ‐セファロース樹脂などの陽イオン交換樹脂による結合イオン交換クロマトグラフィーによって除去され得る。抗体は過剰量のカラム体積の緩衝液を用いて溶出され得る。
【０１９４】
概して、上記の細胞株により産生される抗体はヒトκ軽鎖と共に完全にヒトのＩｇＧ１重鎖またはＩｇＧ２重鎖を有した。１つの実施形態では、それらの抗体は高親和性を有し、固相または溶液相により測定すると、通常、約１０−９から約１０−１３ＭまでのＫｄを有した。他の実施形態では、それらの抗体は約１０−６から約１０−８Ｍまでのより低い親和性を有した。
【０１９５】
当業者によって理解されるように、本実施形態に従う抗体は、ハイブリドーマ細胞株以外の細胞株において発現し得る。特定の抗体をコードする配列が適切な哺乳類宿主細胞の形質転換のために用いられ得る。形質転換は、例えばウイルス（またはウイルスベクター）へのポリヌクレオチドのパッケージング、およびウイルス（またはベクター）による宿主細胞の形質導入を含む、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するためのどのような公知の方法によってもよく、または、米国特許第４，３９９，２１６号、第４，９１２，０４０号、第４，７４０，４６１号、および第４，９５９，４５５号（それらの特許はここに参照により本明細書に組み込まれる）に例示されるような当技術分野において公知の形質移入法によってもよい。使用される形質転換法は形質転換される宿主に依存する。異種性ポリヌクレオチドの哺乳類細胞への導入方法は当技術分野において周知であり、それらにはデキストラン介在性形質移入、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン介在性形質移入、プロトプラスト融合、電気穿孔、リポソーム中へのポリヌクレオチド（複数可）の封入、およびＤＮＡの細胞核への直接マイクロインジェクションが含まれる。
【０１９６】
発現宿主として利用可能な哺乳類細胞株は当技術分野において周知であり、それらには、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）、および多数の他の細胞株を含むが、これらに限定されない、米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手可能である多数の不死化細胞株が含まれる。特に好ましい細胞株は、どの細胞株が高い発現レベルを有し、Ａｂ１３１‐ＤＭ１複合体などの、構成的なＥＧＦＲｖＩＩＩ結合特性を有する抗体を産生するか判定することを介して選択される。
【実施例】
【０１９７】
次の実施例は、実施された実験および達成された結果を含み、例示のみを目的として提供され、本発明を限定するものと解釈されてはならない。
【０１９８】
ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的抗体を作製するための戦略は、抗原（ペプチド、様々な可溶性タンパク質、抗原発現細胞）の組合せを用いるゼノマウス・マウスの免疫を最初に含み、ハイブリドーマを作製するための融合か、またはゼノマックス（商標）／スラム（商標）技術によるＢ細胞の単離のどちらかを介する抗体産生細胞の単離が続いた。抗体産生細胞をＥＬＩＳＡによる特異性についての一次スクリーンの対象とし、そして、ＦＭＡＴおよび／またはＦＡＣＳによる細胞表面結合についての二次スクリーンの対象とした。次に、内部移行アッセイを実施して薬物送達に有用であろう抗体を特定した。抗体の親和性を測定した。ある特定の抗体をエピトープマッピングのために選択した。加えて、ある特定の抗体を、そのような抗体の癌の治療に対する効力を分析するインビトロ試験およびインビボ試験のために選択した。
【０１９９】
［実施例１］
抗原の調製
Ａ．  ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＰＥＰ３‐ＫＬＨ抗原の調製
実施例２に関連して、１４マーヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＰＥＰ３（ＬＥＥＫＫＧＮＹＶＶＴＤＨＣ（配列番号５６））ペプチドがＲ＆Ｄシステムズ社によってカスタム合成された。次に、ＰＥＰ３ペプチドをスカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）に次のように複合体化した：ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＰＥＰ３・（２００ｍｃｇ）（Ｒ＆Ｄ社）を５０ｍｃｇのスカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ；Ｐｉｅｒｃｅ社、イリノイ州、ロックフォード）と混合し、蒸留水を用いて最終体積を１６５ｍｃｌにした。２５０ｍｃｌの複合体化緩衝液（０．１Ｍ  ＭＥＳ、０．９Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．７）を添加し、そして、２５ｍｃｌの１‐エチル‐３‐［３‐ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ、Ｐｉｅｒｃｅ社、イリノイ州、ロックフォード）の１０ｍｇ／ｍｌストック溶液を添加することによってＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＰＥＰ３とＫＬＨを架橋した。複合体を室温で２時間インキュベートし、反応しなかったＥＤＣを、ｐＨ７．４のＰＢＳを用いて１ｋＤａフィルター（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｆｉｌｔｅｒ；ミリポア社、マサチューセッツ州、ベッドフォード）を通す遠心分離により除去した。
【０２００】
実施例３に関連して、１４マーヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＰＥＰ３（ＬＥＥＫＫＧＮＹＶＶＴＤＨＣ（配列番号５６））ペプチドがカスタム合成された。次に、ＰＥＰ３ペプチドをＫＬＨに次のように複合体化した：ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＰＥＰ３（２００ｍｃｇ）を５０ｍｃｇのスカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ；Ｐｉｅｒｃｅ社、イリノイ州、ロックフォード）と混合し、蒸留水を用いて最終体積を１６５ｍｃｌにした。２５０ｍｃｌの複合体化緩衝液（０．１Ｍ  ＭＥＳ、０．９Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．７）を添加し、そして、２５ｍｃｌの１‐エチル‐３‐［３‐ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ、Ｐｉｅｒｃｅ社、イリノイ州、ロックフォード）の１０ｍｇ／ｍｌストック溶液を添加することによってＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＰＥＰ３とＫＬＨを架橋した。複合体を室温で２時間インキュベートし、反応しなかったＥＤＣを、ｐＨ７．４のＰＢＳを用いて１ｋＤａフィルター（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｆｉｌｔｅｒ；ミリポア社、マサチューセッツ州、ベッドフォード）を通す遠心分離により除去した。
【０２０１】
Ｂ．  Ｂ３００．１９／ＥＧＦＲｖＩＩＩ形質移入体
Ｂ３００．１９／ＥＧＦＲｖＩＩＩ形質移入体を調製するため、最初に野生型ＥＧＦＲをＡ４３１細胞からクローン化し、そして、残基６〜２７３をコードするコドンを欠失し、欠失の接合部において作製されるグリシン残基をコードするコドンを有するＥＧＦＲｖＩＩＩをコードするようにＥＧＦＲ遺伝子を修飾した。その欠失は、欠失後に生じるコドンがＧＧＴ（グリシン）であるように欠失ＧＴＴ（バリン）とＣＧＴ（アルギニン）の周囲のコドンの内部で生じる（Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ．４（２）：１４８−５８（１９９８））。
【０２０２】
１．  野生型ＥＧＦＲコンストラクトのクローン化
ポリＡ＋ｍＲＮＡが、ミクロファーストＲＮＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、オンタリオ州、バーリントン）を使用してＡ４３１（ＡＴＣＣ）細胞から抽出された。全ｃＤＮＡを、ランダムｐｄＮ６プライマーとＭ‐ＭｕＬＶ逆転写酵素（ＮＥＢ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、マサチューセッツ州、ビバリー）を使用してポリＡ＋ｍＲＮＡから合成した。２．３ｋｂのＰＣＲ産物を、次のプライマー：
センス５’‐ＧＧＡＴＣＴＣＧＡＧＣＣＡＧＡＣＣＧＧＡＡＣＧＡＣＡＧＧＣＣＡＣＣＴＣ‐３’；（配列番号６２）
アンチセンス５’‐ＣＧＧＡＴＣＴＣＧＡＧＣＣＧＧＡＧＣＣＣＡＧＣＡＣＴＴＴＧＡＴＣＴＴ‐３’（配列番号６３）
を使用し、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを使用してＡ４３１のｃＤＮＡから増幅した。
【０２０３】
そのＰＣＲ産物をＸｈｏＩで消化し、ゲル精製し、そして、ＸｈｏＩで線状化したプラスミドｐＷＢＦＮＰ（国際特許出願第９９／４５０３１号を参照のこと。その特許出願の開示は参照によりここに組み込まれる）にライゲーションしてプラスミド野生型ＥＧＦＲ／ｐＷＢＦＮＰを得た。
【０２０４】
２．  ＥＧＦＲｖＩＩＩコンストラクトの作製
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、マサチューセッツ州、ビバリー）でリン酸化されたＣ２９５３８とＣ２９５３９を含むプライマー対Ｃ１３６５９／Ｃ２９５３８およびＣ２９５３９／Ｃ１４２８８（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）：
Ｃ１３６５９：５’‐ＣＧＧＡＴＧＡＡＴＴＣＣＣＡＧＡＣＣＧＧＡＣＧＡＣＡＧＧＣＣＡＣＣＴＣ‐３’（センス）（配列番号６４）；
Ｃ２９５３８：５’‐ＣＴＴＴＣＴＴＴＴＣＣＴＣＣＡＧＡＧＣＣ‐３’（アンチセンス）（配列番号６５）；
Ｃ２９５３９：５’‐ＧＴＡＡＴＴＡＴＧＴＧＧＴＧＡＣＡＧＡＴＣ‐３’（センス）（配列番号６６）；
Ｃ１４２８８：５’‐ＣＧＧＡＴＣＴＣＧＡＧＣＴＣＡＡＧＡＧＡＧＣＴＴＧＧＴＴＧＧＧＡＧＣＴ‐３’（アンチセンス）（配列番号６７）
を使用してプラスミド野生型ＥＧＦＲ／ｐＷＢＦＮＰテンプレートから増幅されたＰＣＲ産物をライゲーションしてＥＧＦＲ細胞外ドメインのアミノ酸６〜２７３をコードする配列に欠失を導入し、そして、それを発現ベクターｐＷＢＤＨＦＲ２（国際特許出願第９９／４５０３１号を参照のこと。その特許出願の開示は参照によりここに組み込まれる）にサブクローン化した。
【０２０５】
その欠失の５’末端を表す２３２ｂｐの断片を、プライマー対Ｃ１３６５９／Ｃ２９５３８を使用し、Ｐｆｕポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、マサチューセッツ州、ビバリー）を使用して野生型ＥＧＦＲ／ｐＷＢＦＮＰテンプレートから増幅して作製した。そのＰＣＲ産物をＥｃｏＲ１（ＮＥＢ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、マサチューセッツ州、ビバリー）で消化し、そして、ゲル精製した。その欠失の３’末端を表す１２７３ｂｐの断片を、プライマー対Ｃ２９５３９／Ｃ１４２８８を使用し、Ｐｆｕポリメラーゼを使用して野生型ＥＧＦＲ／ｐＷＢＦＮＰおよびそのテンプレートから増幅して作製した。そのＰＣＲ産物をＸｈｏ１（ＮＥＢ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、マサチューセッツ州、ビバリー）で消化し、そして、ゲル精製した。断片をＥｃｏＲ１／Ｘｈｏ１で消化したｐＷＢＤＨＦＲ２にＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、マサチューセッツ州、ビバリー）を用いてライゲーションしてコンストラクトＥＧＦＲｖＩＩＩ／ｐＷＢＤＨＦＲを得た。
【０２０６】
ＥＧＦＲの細胞内ドメインを結果生じたコンストラクトに次のように導入した：１５６６ｂｐのＤｒａＩＩＩ／ＸｈｏＩ断片をプラスミド野生型ＥＧＦＲ／ｐＷＢＦＮＰから単離し、ＤｒａＩＩＩ／ＸｈｏＩで消化したＥＧＦＲｖＩＩＩ／ｐＷＢＤＨＦＲにライゲーションしてＥＧＦＲｖＩＩＩ‐ＦＬ／ｐＷＢＤＨＦＲを得た。
【０２０７】
３．  Ｂ３００．１９細胞のＥＧＦＲｖＩＩＩ‐ＦＬ／ｐＷＢＤＨＦＲによる形質移入
Ｂ３００．１９細胞（８×１０６個）を形質移入毎に７００μｌのＤＭＥＭ／ＨＩ培地の中で使用した。２０μｇのＥＧＦＲｖＩＩＩ‐ＦＬ／ｐＷＢＤＨＦＲと２μｇのＣＭＶ‐ＰｕｒｏプラスミドＤＮＡを添加した。細胞を、Ｂｉｏ‐Ｒａｄジーンパルサーを用いて３００ボルト／９６０μＦで電気穿孔した。電気穿孔の後に細胞を氷上で１０分間冷却し、その後に１０ｍｌの非選択培地（ＤＭＥＭ／ＨＩグルコース、１０％ＦＢＳ、５０μＭ  ＢＭＥ、２ｍＭ  Ｌ‐グルタミン、１００ユニットのペニシリン‐Ｇ／ｍｌ、１００ユニットのＭＣＧストレプトマイシン／ｍｌ）を加えた。細胞を３７℃、７．５％ＣＯ２で４８時間培養した。
【０２０８】
培養後、細胞を９６ウェルプレート中に２×１０４、０．４×１０４、および０．０８×１０４細胞／ウェルで選択培地（ＤＭＥＭ／ＨＩグルコース、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ‐グルタミン、５０μＭ  ＢＭＥ、１００ユニットのペニシリン‐Ｇ／ｍｌ、１００ユニットのＭＣＧストレプトマイシン／ｍｌ、２μｇ／ｍｌピューロマイシン）に分割し、そして、１４日間選択培地の中で選択して安定なクローンを作製した。ピューロ耐性クローンを、Ｅ７５２ｍＡｂ（抗ＥＧＦＲ抗体、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｏｎｃｏｌ  Ｈｅｍａｔｏｌ．，３８（１）：１７−２３（２００１）に記載される）とヤギ抗ヒトＩｇＧ  ＰＥを用いて染色し、その後、ＦＡＣＳバンテージ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）で分析した。
【０２０９】
Ｃ．  ＥＧＦＲｖＩＩＩ‐ＲｂＦｃ発現コンストラクトの構築
ＥＧＦＲｖＩＩＩウサギＦｃ融合タンパク質を作製するため、我々はまずウサギＦｃをコードするＤＮＡを含有するベクターを構築した。これを、ＥＧＦＲｖＩＩＩをコードするＤＮＡとライゲーションした。このアプローチは下でより詳細に記載されている。
【０２１０】
１．  ＲｂＦｃ／ｐｃＤＮＡ３．１  Ｈｙｇｒｏの構築
プライマー１３２２／８６７（下記）を使用してウサギＩｇＧのヒンジ‐ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインをコードする７２１ｂｐの断片を増幅した：
＃１３２２（センス）：５’‐ＧＧＴＧＧＣＧＧＴＡＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＡＣＣＧＴＴＧＣＧ‐３’（配列番号６８）；
＃８６７（アンチセンス）：５’‐ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＧＣＧＧＧＡ‐３’（配列番号６９）。
【０２１１】
結果生じたＰＣＲ産物をＫｐｎＩとＮｏｔＩで消化し、ゲル精製し、そして、ＫｐｎＩ／ＮｏｔＩで消化したｐｃＤＮＡ３．１（＋）／Ｈｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、オンタリオ州、バーリントン）にライゲーションしてプラスミドＲｂＦｃ／ｐｃＤＮＡ３．１  Ｈｙｇｒｏを得た。
【０２１２】
２．  ＥＧＦＲｖＩＩＩ‐ＲｂＦｃ／ｐＣＥＰ４の構築
プライマー１２９０／１２９３（下記）を使用し、Ｐｆｕポリメラーゼを使用してＥＧＦＲｖＩＩＩ‐ＦＬ／ｐＷＢＤＨＦＲプラスミドテンプレートから１１６５ｂｐの産物を増幅した：
＃１２９０（センス）：５’‐ＣＴＡＣＴＡＧＣＴＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＧＡＣＣＣＴＣＣＧＧＧＡ‐３’（配列番号７０）；
＃１２９３（アンチセンス）：５’‐ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＣＧＧＣＧＡＴＧＧＡＣＧＧＧＡＴＣ‐３’（配列番号７１）。
【０２１３】
そのＰＣＲ産物をＮｈｅＩとＫｐｎＩで消化し、ゲル精製し、そして、ＮｈｅＩ／ＫｐｎＩで消化したＲｂＦｃ／ｐｃＤＮＡ３．１  ＨｙｇｒｏにライゲーションしてプラスミドＥＧＦＲｖＩＩＩ‐ＲｂＦｃ／ｐｃＤＮＡ３．１  Ｈｙｇｒｏを得た。
【０２１４】
２１７０ｂｐのＳｎａＢＩ／ＸｈｏＩ断片をＥＧＦＲｖＩＩＩ‐ＲｂＦｃ／ｐｃＤＮＡ３．１  Ｈｙｇｒｏから単離し、ＳｎａＢＩ／ＸｈｏＩで消化したｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、オンタリオ州、バーリントン）にサブクローン化してプラスミドＥＧＦＲｖＩＩＩ‐ＲｂＦｃ／ｐＣＥＰ４を得た。
【０２１５】
３．  ２９３Ｆ  ＥＧＦＲｖＩＩＩ‐ＲｂＦｃ安定細胞株の作製
プラスミドＥＧＦＲｖＩＩＩ‐ＲｂＦｃ／ｐＣＥＰ４を次のようにリン酸カルシウム形質移入により２９３Ｆ細胞（Ｇｉｂｃｏ社、ニューヨーク州、グランドアイランド）に導入した：形質移入の１日前に１×１０６個の２９３Ｆ細胞をゼラチン被覆した１００ｍｍの組織培養ペトリディッシュに蒔き、そして、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。細胞に１０ｍｌの新しい非選択培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ‐グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、１００Ｕ／ｍｌ  ＭＣＧストレプトマイシン）を形質移入の２〜３時間前に加えた。形質移入試薬を次のように微量遠心管中に調製した：１０μｇのＤＮＡ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ‐ＲｂＦｃ／ｐＣＥＰ４）を６２μｌの２Ｍリン酸カルシウムおよび脱イオン水と混合して５００μｌの最終体積にした。別のチューブピペットにおいて、形質移入試薬を移すために５００μｌの２×ＨＢＳを引き入れ、使用した。
【０２１６】
形質移入が実行されるまで５％ＣＯ２の恒温器の中に細胞を放置することにより適正なｐＨを維持しながらそのチューブピペットの中の溶液を細胞に一滴ずつ添加した。形質移入から１５〜２０時間後に細胞をＰＢＳで洗浄し、そして、１０ｍｌの新しい２９３Ｆ非選択培地を加えた。発現細胞を、形質移入から４８〜７２時間後にトリプシンを用いて回収し、そして、細胞を９６ウェルプレートの中に０．０８×１０４細胞／ウェルで、２９３Ｆ選択培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ‐グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、１００Ｕ／ｍｌ  ＭＣＧストレプトマイシン、２５０ｕｇ／ｍｌハイグロマイシン）の中で１４日間培養した。
【０２１７】
ハイグロマイシン耐性クローンを、捕捉抗体として抗ＥＧＦＲ抗体Ｅ７６３（米国特許第６，２３５，８８３号）を１μｇ／ｍｌで用い、１：１００に希釈したヤギ抗ウサギＩｇＧ  ＨＲＰＯ（ＣａｌＴａｇ社）を用いて検出するＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。
【０２１８】
Ｄ．  マレイミド複合体化によるＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＰＥＰ３のＯＶＡへの複合体化
抗体の力価決定（実施例３）に使用されたＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド‐ＯＶＡは次のように作製された：
２０７μｇのＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＰＥＰ３を、Ｐｉｅｒｃｅ社（番号２０２９１）から購入した計量済みＤＴＴを用いて還元した。１本のバイアルの７．７ｍｇの計量済みＤＴＴを、１００μＬの脱イオン水を使用して溶解した。そのＤＴＴのストックをＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＰＥＰ３に添加した。反応体積を、ｐＨ７．４のＰＢＳを用いて６００μＬにした。その反応物を室温で３０分間回転させた。
【０２１９】
Ｇ１０カラムを、５グラムのＧ１０セファデックスビーズを計量し、そして、４０ｍＬのＰＢＳを添加、混合し、そして、室温で１０分間放置し、次に１０００ｒｐｍで１０分間ビーズを遠心することで調製した。上清を取り除き、さらに２０ｍＬのＰＢＳを添加した。ビーズを１０００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清を取り除き、充分なＰＢＳを添加してＧ１０セファデックスビーズの５０％泥状物を作製した。５ｍＬのその５０％泥状物混合物を５ｍＬのスピンカラムに加え、そして、そのカラムを１４ｍＬのポリプロピレンチューブに入れた。カラムを１０００ｒｐｍで３分間遠心した。別の３ｍＬのＰＢＳを加え、カラムを再度１０００ｒｐｍで３分間遠心した。そのポリプロピレンチューブを新しいチューブと交換し、そして、その時点でカラムが使用可能になった。
【０２２０】
ＤＴＴを還元ペプチドから取り除いた。ペプチドの還元のための３０分の反応時間の後、カラム当たり３００μＬの還元ペプチドを添加した。そのカラムを１０００ｒｐｍで３分間遠心した。さらに２５０μＬのＰＢＳを各カラムに添加し、再度１０００ｒｐｍで３分間遠心した。還元ペプチドを１４ｍＬのポリプロピレンチューブに収集した。
【０２２１】
還元ペプチドをマレイミド活性化ＯＶＡに複合体化し、そして、エッペンドルフチューブに収集した。２ｍｇのマレイミド活性化ＯＶＡ（Ｐｉｅｒｃｅ社：７７１２６番、イリノイ州、ロックフォード）をマレイミド複合体化緩衝液で溶解して１０ｍｇ／ｍＬのストックを作製した。４１４μｇのマレイミド活性化ＯＶＡをそのエッペンドルフチューブ中の還元ペプチドに添加した。５００μＬのマレイミド複合体化緩衝液をその反応物に添加した。その反応物を室温で２時間インキュベートさせ、次に２ｍｇのシステインを添加して、存在するかもしれないあらゆる活性マレイミドを抑制した。そのシステインを室温でさらに３０分間反応させた。次にその複合体を、１×のｐＨ７．４のＰＢＳを使用して１０Ｋ遠心カラムで３回洗浄した。これにより、ＯＶＡに複合体化されなかったあらゆる遊離ペプチドと遊離システインが除去された。複合体を、ゲル負荷用チップを用いて遠心カラムから取り出し、エッペンドルフチューブに移した。最後に、１×のｐＨ７．４のＰＢＳを用いてその複合体を所望の濃度にした。作製された複合体は１４．５：１（ペプチド：ＯＶＡ）のモル比を有した。
【０２２２】
［実施例２］
ハイブリドーマの作製による抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の産生
γ‐１定常領域を有する抗体を産生する８匹のゼノマウス・マウス（ゼノマウスＧ１マウス）を第０日に免疫し、このプロトコルに従い第１１日、第２１日、第３２日、第４４日、および第５４日に追加免疫し、そして、融合を第５８日に実施した。全ての免疫は、全ての注射について、尾の基部への皮下投与と腹腔内投与により実施された。第０日の免疫は、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）（Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州、セントルイス）と１：１（体積／体積）で混合した発熱性物質が含まれていないＤＰＢＳ中に懸濁した１．５×１０７個のＢ３００．１９／ＥＧＦＲｖＩＩＩ形質移入細胞（実施例１Ａ）を用いて実施された。第１１日、第２１日、および第３２日の追加免疫は、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）（Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州、セントルイス）と１：１（体積／体積）で混合されたＤＰＢＳ中の１．５×１０７個のＢ３００．１９／ＥＧＦＲｖＩＩＩ形質移入細胞を用いて実施された。第４４日の追加免疫は、ＩＦＡと１：１（体積／体積）で混合されたＤＰＢＳ中の５μｇのＰＥＰ３（ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド）‐ＫＬＨ複合体（実施例１）を用いて実施され、そして、第５４日の最後の追加免疫は、アジュバント無しのＤＰＢＳ中の５μｇのＰＥＰ３（ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド）‐ＫＬＨ複合体を用いて実施された。
【０２２３】
第５８日にマウスを安楽死させ、次に鼠蹊リンパ節と腰部リンパ節を回収した。組織グラインダーを用いるそれらのリンパ節の機械的破砕によりリンパ球を放出させ、次にＣＤ９０の陰性選択によりリンパ球からＴ細胞を取り除いた。融合は、洗浄した濃縮化Ｂ細胞とＡＴＣＣから購入した非分泌性骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞、カタログ番号ＣＲＬ１５８０（Ｋｅａｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３：１５４８−１５５０（１９７９））を１：１の比率で混合することにより実施された。その細胞混合物を８００ｇでの遠心分離により穏やかに沈殿させた。上清を完全に除去した後、それらの細胞を２〜４ｍＬのプロナーゼ溶液（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ社、カタログ番号５３７０２；ＰＢＳ中に０．５ｍｇ／ｍｌ）で２分間以下の間処理した。次に、３〜５ｍｌのＦＢＳを添加して酵素活性を停止させ、そして、その懸濁液を、電気細胞融合溶液、ＥＣＦＳ（０．３Ｍショ糖、Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号Ｓ７９０３、０．１ｍＭ酢酸マグネシウム、Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号Ｍ２５４５、０．１ｍＭ酢酸カルシウム、Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号Ｃ４７０５（ミズーリ州、セントルイス））を用いて４０ｍｌの総体積に調節した。
【０２２４】
上清を遠心分離の後に除去し、そして、細胞を４０ｍｌのＥＣＦＳ中での再懸濁により洗浄した。この洗浄ステップを繰り返し、細胞を再度ＥＣＦＳ中に再懸濁して２×１０６細胞／ｍｌの濃度にした。電気細胞融合は、カリフォルニア州、サンディエゴのＧｅｎｅｔｒｏｎｉｃ社のフュージョン・ジェネレーター、モデルＥＣＭ２００１を使用して実施された。使用された融合チャンバーのサイズは２．０ｍｌであり、次の機器設定を用いた：アラインメント条件：電圧：５０ｖ、時間：５０秒、膜破壊：電圧：３０００ｖ、時間：３０マイクロ秒、融合後保持時間：３秒。融合後に細胞を、ＨＡＴを含有するＤＭＥＭ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、１５％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）に再懸濁し、そして、３７℃で空気中に１０％のＣＯ２での培養のためにＬ‐グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、ＯＰＩ（オキサロ酢酸、ピルビン酸、ウシインスリン）（全てＳｉｇｍａ社、ミズーリ州、セントルイスより）およびＩＬ‐６（ベーリンガー・マンハイム社）を添加した。
【０２２５】
細胞をウェル当たり４×１０４細胞で平底９６ウェル組織培養プレートに蒔いた。培養物をＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）添加培地中に２週間維持した後にＨＴ（ヒポキサンチンおよびチミジン）添加培地に移した。ハイブリドーマをＨＡＴ培地における生存により選択し、そして、抗原反応性についてＥＬＩＳＡにより上清をスクリーニングした。そのＥＬＩＳＡの形式は抗原被覆プレート（ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド‐ＯＶＡ被覆プレートおよび逆スクリーンとして野生型ＥＧＦｒペプチド‐ＯＶＡ被覆プレート）上での上清のインキュベーション、およびホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識マウス抗ヒトＩｇＧ（表２．１を参照のこと）を使用するＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的結合の検出を必要とした。
【０２２６】
【表１】
2015500205.tif 000002
【０２２７】
見られるように、少なくとも４つの抗原特異的ハイブリドーマ、１３．１、１３．２、１３．３、および１３．４が検出された。ＥＬＩＳＡアッセイのＥＧＦＲｖＩＩＩ特異性について陽性であるこれらのハイブリドーマは、３００．１９非形質移入親細胞とＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する安定形質移入３００．１９細胞との間でそれらに対するＦＡＣＳにより確認された。
【０２２８】
クローン化は、限界希釈プレーティング法を用いて選択された抗原陽性ウェルに対して実施された。プレートを単一コロニーの増殖について目視で検査し、次に、単一コロニーウェルの上清を抗原特異的ＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、そして、上記のようにＦＡＣＳで確認した。高反応性クローンをアッセイし、Ｌｕｍｉｎｅｘ機器を使用する多重ＥＬＩＳＡによりヒトγ鎖とκ鎖の純度を検証した。ＥＬＩＳＡとＦＡＣＳアッセイにおけるＥＧＦＲｖＩＩＩ特異性に基づき、クローン１３．１．２がさらなるスクリーニングと分析のための最も有望な候補として選択された。１３．１．２抗体の重鎖と軽鎖のヌクレオチド配列とアミノ酸配列が図３Ｌに示されており、配列番号１３７および１３９は重鎖と軽鎖の核酸であり、配列番号１３８および１４０は重鎖と軽鎖のアミノ酸配列である。加えて、その１３．１．２の重鎖配列と軽鎖配列の、それらの由来である生殖系列配列との比較が図４および５に示されている。
【０２２９】
［実施例３］
ゼノマックス技術の使用による抗体の作製
ゼノマウス動物の免疫
抗ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩヒトモノクローナル抗体は、γ‐１定常領域を有する抗体を産生するゼノマウス・マウス（ゼノマウスＧ１マウス）、γ‐２定常領域を有する抗体を産生するゼノマウス・マウス（ゼノマウスＸＭＧ２マウス）、およびγ‐４定常領域を有する抗体を産生するゼノマウス・マウス（ゼノマウスＧ４マウス）を順次免疫することにより開発された。
【０２３０】
ゼノマックス技術によりモノクローナル抗体を作製するため、ゼノマウスＧ１群とＸＭＧ２マウス群をＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＰＥＰ３（実施例１Ａ）とＥＧＦＲｖＩＩＩ発現３００．１９細胞（実施例１Ｂ）で、または細菌により発現されたＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質の細胞外ドメイン（ＥＧＦＲｖＩＩＩ‐ＥＣＤ）（Ｂｉｇｎｅｒ博士、デューク大学）とＥＧＦＲｖＩＩＩ発現３００．１９細胞で、またはＥＧＦＲｖＩＩＩ‐ウサギＦｃ融合タンパク質（ＥＧＦＲｖＩＩＩ‐ＲｂＦｃ）（実施例１Ｃ）とＥＧＦＲｖＩＩＩ発現３００．１９細胞で、またはＥＧＦＲｖＩＩＩ‐ＲｂＦｃで、足蹠（ＦＰ）のみを介して、または皮下注射による尾の基部、および腹膜内（ＢＩＰ）を介して免疫した。
【０２３１】
足蹠免疫のため、初回免疫はマウス当たり１０×１０６個のＥＧＦＲｖＩＩＩ発現３００．１９細胞を用い、または用いず、およびタイターマックス・ゴールド（Ｓｉｇｍａ社、オンタリオ州、オークビル）と１：１（体積／体積）で混合した１０μｇのＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＰＥＰ３またはＥＧＦＲｖＩＩＩ‐ＥＣＤまたはＥＧＦＲｖＩＩＩ‐ＲｂＦｃを用い、または用いなかった。後の追加免疫は初回免疫に使用された免疫原の半量を用いて実施された。最初の４回の追加免疫は、マウス毎に下の表３．１に示されるように、ミョウバン（Ｓｉｇｍａ社、オンタリオ州、オークビル）と混合した免疫原を利用し、一晩吸着させて行った。この後に表３．１に示されるようにタイターマックス・ゴールド中の各免疫原を用いる１回の注射、ミョウバンを用いる１回の注射、次にＰＢＳ中の免疫原からなる最終追加免疫が続く。具体的には、動物は第０日、第３日、第７日、第１０日、第１４日、第１７日、第２１日、および第２４日に免疫された。それらの動物は第１９日に採血され、血清が得られ、回収選択のために抗体力価が決定された。それらの動物は第２８日に回収された。
【０２３２】
【表２】
2015500205.tif 000003
【０２３３】
初回の各免疫原によるＢＩＰ免疫は、足蹠免疫について記載されているように、マウス毎に完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ、Ｓｉｇｍａ社、オンタリオ州、オークビル）と１：１（体積／体積）で混合された。その後の追加免疫はまずマウス毎に各免疫原を不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ、Ｓｉｇｍａ社、オンタリオ州、オークビル）と１：１（体積／体積）で混合して行われ、続いてマウス毎にＰＢＳ中の最終追加免疫によって行われた。それらの動物は、下の表３．２に示されているように、第０日、第１４日、第２８日、第４２日、第５６日、および第７５日（最終追加免疫）に免疫された。それらの動物は第６３日に採血され、血清が得られ、回収選択のために抗体力価が決定された。それらの動物は第７８日に回収された。
【０２３４】
【表３】
2015500205.tif 000004
【０２３５】
抗体力価の決定による回収用動物の選択
抗ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の力価はＥＬＩＳＡにより決定された。ＥＧＦＲｖＩＩＩ‐ＲｂＦｃ（２．５μｇ／ｍｌ）または対照ＲｂＦｃ（２μｇ／ｍｌ）またはＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド‐ＯＶＡ（２μｇ／ｍｌ）（実施例１）または対照ＯＶＡ（４μｇ／ｍｌ）を４℃で一晩Ｃｏｓｔａｒラボコート・ユニバーサル結合ポリスチレン９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、マサチューセッツ州、アクトン）に被覆させた。結合しなかった抗原を含有する溶液を除去し、そして、それらのプレートをＵＶ光（３６５ｎｍ）で４分間（４０００マイクロジュール）処理した。それらのプレートを蒸留水で５回洗浄した。ＥＧＦＲｖＩＩＩで免疫したゼノマウス（登録商標）動物または無感作ゼノマウス（登録商標）動物に由来する血清について、最初の１：１００希釈物から２％ミルク／ＰＢＳ中に２分の１ずつ希釈したものを二つ組で力価決定した。最後のウェルはブランクにした。それらのプレートを蒸留水で５回洗浄した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、Ｐｉｅｒｃｅ社、イリノイ州、ロックフォード）複合体化抗体を室温で１時間１μｇ／ｍＬの終濃度で添加した。それらのプレートを蒸留水で５回洗浄した。それらのプレートを、ＴＭＢ発色基質（メリーランド州、ゲイザースバーグ）を３０分間添加することにより現像し、そして、１Ｍリン酸の添加によりそのＥＬＩＳＡを停止した。個々のゼノマウス（登録商標）動物の特定の抗体力価を４５０ｎｍの光学密度から決定した。その抗体力価は表３．３および３．４に示されている。その抗体力価は血清の相互希釈を表し、それ故、数が大きくなるほど、ｈＥＧＦＲｖＩＩＩに対する液性免疫応答が上昇する。
【０２３６】
皮下注射による尾の基部、および腹膜内を介して免疫されたマウスについて、抗体力価は、プレートをＥＧＦＲｖＩＩＩ‐ＲｂＦｃ（２．０μｇ／ｍｌ）または対照ＲｂＦｃ（２．５μｇ／ｍｌ）で被覆したことを除いて、まさに上記のように決定された。
【０２３７】
【表４】
2015500205.tif 000005
2015500205.tif 000006
2015500205.tif 000007
【０２３８】
表３．３の第５群の全てのゼノマウス動物および第６群のゼノマウス動物０７４３−５は血清学に基づいてゼノマックス回収物として選択された。
【０２３９】
【表５】
2015500205.tif 000008
2015500205.tif 000009
2015500205.tif 000010
【０２４０】
ゼノマウス動物（０６９５−１、０６９５−３および０６９５−４）は表３．４中の血清学データに基づいて回収物として選択された。
【０２４１】
Ｂ細胞の選択
上で考察した動物に由来するＢ細胞を回収し、培養した。ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド特異的抗体を分泌するＢ細胞をＢａｂｃｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：７８４３−７８４８（１９９６）に記載されるように単離した。ＥＬＩＳＡを用いて主要なＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド‐ＯＶＡ特異的ウェルを特定した。ゼノマウス動物に由来する約５百万個のＢ細胞を５００または１５０または５０細胞／ウェルの割合で２４５９６ウェルプレート中において培養し、そして、抗原特異的ウェルを特定するためにＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド‐ＯＶＡについてスクリーニングした。約５１５ウェルがバックグランドよりも有意に高いＯＤを示した。それらのウェルのうちの代表的な試料が表３．５に示されている。
【０２４２】
【表６】
2015500205.tif 000011
【０２４３】
２４４か所のＯＤ＞０．５のＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド‐ＯＶＡ‐ＥＬＩＳＡ陽性ウェルが、ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド特異的であることを確認するためにＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド‐ＯＶＡとＯＶＡに対して再度スクリーニングされた。これらの結果の代表的な例が表３．６に示されている。
【０２４４】
【表７】
2015500205.tif 000012
【０２４５】
制限抗原アッセイおよび分析
制限抗原分析は、Ｂ細胞培養上清中に存在する抗原特異的抗体を全ての他の抗原特異的抗体と比べて親和性の等級付けを行う方法である。非常に少ない抗原被覆が存在する場合では、最も親和性が高い抗体だけが平衡状態で少しでも検出可能な程度まで結合することができるはずである。（例えば、国際特許出願第０３／４８７３０号を参照のこと）。
【０２４６】
ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド‐ＯＶＡを９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上で３つの濃度、７．５ｎｇ／ｍｌ、１．５ｎｇ／ｍｌおよび０．０３ｎｇ／ｍｌでプレートに４℃で一晩被覆させた。各プレートを蒸留水で５回洗浄し、その後、５０μｌの０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中の１％ミルクをそのプレートに添加し、続いて４μｌのＢ細胞上清を各ウェルに添加した。振盪器上に室温で１８時間後、それらのプレートを再度蒸留水で５回洗浄した。各ウェルに５０μｌのヤギ抗ヒト（Ｆｃ）‐ＨＲＰを１μｇ／ｍｌで添加した。室温で１時間後、それらのプレートを再度蒸留水で５回洗浄し、そして、５０μｌのＴＭＢ基質を各ウェルに添加した。反応を各ウェルへの５０μＬの１Ｍリン酸の添加により停止し、そして、４５０ｎｍの波長でそれらのプレートを読み取った。結果は表３．７に示されている。
【０２４７】
【表８】
2015500205.tif 000013
【０２４８】
制限抗原分析による結果は高抗原アッセイにおいて得られた総ＯＤと比較された。親和性の相対的等級付けは、高抗原アッセイにおいて得られたＯＤに対する制限抗原アッセイにおいて得られたＯＤの比をとることによって行われた。高い比を有する抗体ほど最高の親和性を有する。表３．７は、高抗原アッセイＯＤに対する制限抗原アッセイＯＤ（０．０３ｎｇ／ｍｌの最低抗原播種濃度についてのもの）に基づいて等級付けられたＢ細胞培養上清の試料を示す。
【０２４９】
ＦＭＡＴによる天然型細胞結合アッセイ
ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド‐ＯＶＡ‐ＥＬＩＳＡ陽性ウェル上清を、ＮＲ６細胞（ＮＲ６  Ｍ細胞）（Ｂａｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｌｉｇａｎｄ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，ｕｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ，ｃｅｌｌ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ａ  ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｍｕｔａｎｔ  ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｇｅｎｅ．Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．６（１０）：１２５１−９（１９９５）を参照のこと）上に安定的に発現する天然型のＥＧＦＲｖＩＩＩに結合するそれらの能力について分析した。ＮＲ６  Ｍ細胞をウェル当たり８０００細胞で蒔き、９６ウェルＦＭＡＴプレート中で一晩培養した。次に、培地を取り除き、ウェル中に１５μｌを残した。１５μｌのＢ細胞培養上清を添加し、そして、１μｇ／ｍｌの終濃度の１５μｌの抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ  Ｃｙ５をウェルに添加した。次に、そのプレートを４℃で２時間インキュベートしたままにした。細胞を１５０μｌのＰＢＳで洗浄し、固定した後にＦＭＡＴで読み取った。結果は総蛍光強度として表された（表３．８）。ヒト抗ＥＧＦＲｖＩＩＩモノクローナル抗体１３．１．２を１μｇ／ｍｌの終濃度から始まる陽性対照として用い、陰性対照は同じ濃度のＰＫ１６．３．１であった。試験された２４４試料のうちの１３４試料がＮＲ６  Ｍ細胞に結合し、そのうちの６２試料が８０００よりも高い総蛍光を有した。これらの１３４結合体のうちの６つが偽陽性であった。
【０２５０】
同じ種類の天然型結合アッセイをＮＲ６  野生型細胞（ＥＧＦ受容体を発現するＮＲ６細胞）（Ｂａｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｌｉｇａｎｄ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，ｕｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ，ｃｅｌｌ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ａ  ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｍｕｔａｎｔ  ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｇｅｎｅ．  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．６（１０）：１２５１−９（１９９５）を参照のこと）に対して行い、結合が野生型受容体への結合に起因することを排除した（表３．８）。ＡＢＸ‐ＥＧＦを陽性対照として用い、同じ濃度のＰＫ１６．３．１を陰性対照抗体として用いた。１３４個のＮＲ６  Ｍ結合体のうちの３つがＮＲ６  野生型細胞へ強固に結合していた。ＥＬＩＳＡにおいてＥＧＦＲｖＩＩＩペプチドに結合した２４４ウェルのうちの１９０ウェルは細胞上の天然型にも結合した。例が表３．８に示されている。
【０２５１】
【表９】
2015500205.tif 000014
【０２５２】
表３．８において、ウェル１８７Ａ４由来の上清は野生型結合体として特定されている。１４１Ｃ６はＮＲ６  Ｍ細胞結合について偽陽性であった。ウェル１２９Ｈ６および１８３Ｅ１１は天然型の結合を有しない強力なペプチド結合体である。
【０２５３】
内部移行アッセイ
トップ６０の天然型結合Ｂ細胞培養上清を、受容体を内部移行するそれらの能力についてさらにアッセイした。ＮＲ６  Ｍ細胞を８０００細胞／ウェルの割合で９６ウェルＦＭＡＴプレートに蒔き、そして、一晩培養した。培地を取り出し、総体積３０μｌの培地中の１０〜１５μｌのＢ細胞培養上清を二つ組で添加した。次に、１５μｌの二次抗体（１．５μｇ／ｍｌの終濃度のＳＳ  Ａｌｅｘａ６４７抗ヒトＩｇＧ  Ｆａｂ）を添加し、そして、その混合物を氷上で１時間インキュベートした。無関係のＢ細胞培養上清を培養培地の効果を見るために使用した。ヒト抗ＥＧＦＲｖＩＩＩモノクローナル抗体１３．２．１を１μｇ／ｍｌ（終濃度）から始まる陽性対照として用い、陰性対照は同じ濃度のＰＫ１６．３．１（ヒト抗ＫＬＨ  ＩｇＧ２抗体）であった。インキュベーション後、それらの細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、５０μｌの培地をウェルの全てに添加し、二つ組のうちの１つを３７℃で３０分間インキュベートし、他方を氷上に放置した。インキュベーション後、培地を取り除き、１００μｌの冷５０ｍＭグルタチオンを３７℃でインキュベートされた組に添加し、そして、１００μｌの冷培地を他の組に添加し、次に両方の組を氷上で１時間放置した。次に、それらの細胞を１００μｌの冷ＰＢＳで洗浄し、その後、１％パラホルムアルデヒドで固定し、そして、ＦＭＡＴで読み取った。結果は、（グルタチオンが存在する場合の総蛍光）／（グルタチオンが存在しない場合の総蛍光）×１００として計算される内部移行の％として表された。代表的な情報が表３．９に示されている。
【０２５４】
【表１０】
2015500205.tif 000015
【０２５５】
ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的溶血プラークアッセイ
多数の特別な試薬がこのアッセイの実施に必要とされた。これらの試薬は次のように調製された。
【０２５６】
１．  ヒツジ赤血球細胞（ＳＲＢＣ）のビオチン化。ＳＲＢＣをＲＰＭＩ培地中に２５％ストックとして貯蔵した。２５０μｌのＳＲＢＣ充填細胞沈澱が１．０ｍｌのＳＲＢＣを新しいエッペンドルフチューブ中に分割することにより得られた。それらのＳＲＢＣを微量遠心管で８０００ｒｐｍ（６８００ｒｃｆ）のパルススピンにより沈殿させ、上清を取り除き、その沈殿を１．０ｍｌのｐＨ８．６のＰＢＳに再懸濁し、そして、遠心分離を繰り返した。洗浄サイクルを２回反復し、その後、ＳＲＢＣ沈澱を１５ｍｌのファルコンチューブに移し、そして、ｐＨ８．６のＰＢＳで５ｍｌにした。別の５０ｍｌのファルコンチューブにおいて、２．５ｍｇのスルホ‐ＮＨＳビオチンを４５ｍｌのｐＨ８．６のＰＢＳに添加した。一旦、ビオチンが完全に溶解したら、その５ｍｌのＳＲＢＣを添加し、そのチューブを室温で１時間回転させた。ＳＲＢＣを３０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を取り除いた。それらのビオチン化ＳＲＢＣをエッペンドルフチューブに移し、そして、ｐＨ７．４のＰＢＳを用いることを除いて上記のように３回洗浄し、その後、１５ｍｌのファルコンチューブ内において免疫細胞培地（ＲＰＭＩ１６４０）で５ｍｌにした（５％Ｂ‐ＳＲＢＣストック）。ストックを必要になるまで４℃で貯蔵した。
【０２５７】
２．  Ｂ‐ＳＲＢＣのストレプトアビジン（ＳＡ）被覆。５％Ｂ‐ＳＲＢＣストックのうちの１ｍｌを新しいエッペンドルフチューブに移した。それらのＢ‐ＳＲＢＣ細胞を上記のように３回洗浄し、そして、５％（体積／体積）の終濃度を与えるように１．０ｍｌのｐＨ７．４のＰＢＳに再懸濁した。１０μｌの１０ｍｇ／ｍｌストレプトアビジン（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ社、カリフォルニア州、サンディエゴ）ストック溶液を添加し、そのチューブを混合し、そして、室温で２０分間回転させた。洗浄ステップを繰り返し、ＳＡ‐ＳＲＢＣを１ｍｌのｐＨ７．４のＰＢＳに再懸濁した（５％（体積／体積））。
【０２５８】
３．  ＳＡ‐ＳＲＢＣのＥＧＦＲｖＩＩＩ被覆。ＳＡ‐ＳＲＢＣを１０μｇ／ｍｌのビオチン化ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド‐ＯＶＡで被覆し、混合し、そして、室温で２０分間回転させた。それらのＳＲＢＣを上記のように１．０ｍｌのｐＨ７．４のＰＢＳで２回洗浄した。それらのＥＧＦＲｖＩＩＩ被覆ＳＲＢＣを５％（体積／体積）の終濃度までＲＰＭＩ（＋１０％ＦＣＳ）に再懸濁した。
【０２５９】
４．  免疫蛍光法（ＩＦ）によるＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド‐ＳＲＢＣの質の判定。１０μｌの５％ＳＡ‐ＳＲＢＣと１０μｌの５％ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド被覆ＳＲＢＣをそれぞれ４０μｌのＰＢＳを含有する別々の新しい１．５ｍｌエッペンドルフチューブに添加した。対照ヒト抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を４５μｇ／ｍｌでＳＲＢＣの各試料に添加した。それらのチューブを室温で２５分間回転させ、次にそれらの細胞を１００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。それらの細胞を５０μｌのＰＢＳに再懸濁し、Ａｌｅｘａ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、オレゴン州、ユージーン）に複合体化された４０ｍｃｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体とインキュベートした。それらのチューブを室温で２５分間回転させ、次に１００μｌのＰＢＳで洗浄し、そして、それらの細胞を１０μｌのＰＢＳに再懸濁した。１０μｌの染色された細胞を清浄な顕微鏡用スライドグラスに点状に配置し、カバーグラスで覆い、蛍光下で観察し、そして、０〜４の任意尺度で点数化した。
【０２６０】
５．  形質細胞の調製。目的の免疫グロブリンを分泌するＢ細胞クローンを含有すると様々なアッセイによりそれまでに特定された単一の微量培養ウェルの内容物を回収した。１００〜１０００μｌのピペットマンを使用し、３７℃のＲＰＭＩ（１０％ＦＣＳ）を添加することによりそのウェルの内容物を回収した。細胞をピペット操作により再懸濁し、次に新しい１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移した（約５００〜７００μｌの最終体積）。それらの細胞を微量遠心管中において室温、２５００ｒｐｍ（６６０ｒｃｆ）で１分間遠心し、次にそのチューブを１８０°回転させ、そして、再度２５００ｒｐｍで１分間遠心した。凍結培地を取り除き、そして、免疫細胞を１００μｌのＲＰＭＩ（１０％ＦＣＳ）に再懸濁し、その後、遠心した。このＲＰＭＩ（１０％ＦＣＳ）による洗浄を反復し、細胞を６０μｌのＲＰＭＩ（１０％ＦＣＳ）に再懸濁し、そして、すぐに使えるときになるまで氷上で貯蔵した。
【０２６１】
６．  形質細胞の顕微操作。スライドグラス（２×３インチ）を前もってシリコン・エッジを用いて調製し、室温で一晩硬化させた。使用前、約５μｌのシグマコート（Ｓｉｇｍａ社、オンタリオ州、オークビル）をガラス表面上に均一にぬぐい、乾燥させ、その後激しくぬぐってそれらのスライドを処理した。６０μｌの細胞試料にそれぞれ６０μｌのＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド被覆ＳＲＢＣ（５％体積／体積ストック）、ＲＰＭＩ（１０％ＦＣＳ）中に調製された４×モルモット補体（Ｓｉｇｍａ社、オンタリオ州、オークビル）ストック、および４×強化血清ストック（１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ中において１：１５０の比率）を添加した。混合物を調製したスライド上に点状に配置し（１０〜１５μｌ）、そして、その点を未希釈のパラフィン油で覆った。それらのスライドを３７℃で少なくとも４５分間インキュベートした。ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的形質細胞はプラークにより特定化され、顕微操作によりそれらの細胞を回収した（表３．１０を参照のこと）。
【０２６２】
【表１１】
2015500205.tif 000016
【０２６３】
組換え抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の単一細胞ＰＣＲ、クローン化、発現、精製、および特徴解析
可変領域をコードする遺伝子を顕微操作された単一形質細胞に対するＲＴ‐ＰＣＲにより回収した。ｍＲＮＡを抽出し、そして、逆転写酵素ＰＣＲを実施してｃＤＮＡを作製した。可変重鎖および可変軽鎖をコードするｃＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて特異的に増幅した。ヒト可変重鎖領域をＩｇＧ１発現ベクターにクローン化した。このベクターは、ヒトＩｇＧ１の定常ドメインをｐｃＤＮＡ３．１＋／Ｈｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、オンタリオ州、バーリントン）の多重クローン化部位へクローン化することにより作製された。ヒト可変軽鎖領域をＩｇＫ発現ベクターにクローン化した。これらのベクターは、ヒトＩｇＫの定常ドメインをｐｃＤＮＡ３．１＋／Ｎｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、オンタリオ州、バーリントン）の多重クローン化部位へクローン化することにより作製された。次に、重鎖発現ベクターと軽鎖発現ベクターを６０ｍｍディッシュの７０％集密ヒト胚性腎臓２９３細胞に共リポフェクトし、形質移入細胞に元の形質細胞と同一の特異性を有する組換え抗体を２４〜７２時間分泌させた。上清（３ｍＬ）をＨＥＫ２９３細胞から回収し、そして、完全抗体の分泌が、ヒトＩｇＧを特異的に検出するサンドイッチＥＬＩＳＡにより実証された（表３．１１）。特異性はＥＬＩＳＡを用いて組換え抗体のＥＧＦＲｖＩＩＩへの結合により評価された（表３．１１）。
【０２６４】
【表１２】
2015500205.tif 000017
【０２６５】
分泌ＥＬＩＳＡ試験を次のように実施した。抗体分泌には２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｈ＋Ｌを、そして、抗原結合には１．５μｇ／ｍｌのＥＧＦＲｖＩＩＩ‐ＲｂＩｇ  Ｆｃ融合タンパク質をＣｏｓｔａｒラボコート・ユニバーサル結合ポリスチレン９６ウェルプレートに被覆させ、そして、４℃で一晩保った。それらのプレートを蒸留水で５回洗浄した。組換え抗体を７つのウェルについて未希釈のミニリポフェクション上清から１：２で用量設定した。それらのプレートを蒸留水で５回洗浄した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的ＨＲＰ‐複合体化抗体を室温で１時間１μｇ／ｍＬの終濃度で分泌プレートに添加し、そして、１μｇ／ｍｌのウサギ抗ヒトＦｃを室温で１時間用いて結合プレートを検出した。それらのプレートを蒸留水で５回洗浄した。ＴＭＢを３０分間添加してそれらのプレートを現像し、そして、１Ｍリン酸の添加によりＥＬＩＳＡを停止した。各ＥＬＩＳＡプレートを分析して４５０ｎｍでの各ウェルの光学密度を決定した。
【０２６６】
配列決定および配列分析
クローン化重鎖ｃＤＮＡおよび軽鎖ｃＤＮＡの両方向の配列を決定し、分析してそれらの抗体の生殖系列配列起源を判定し、生殖系列配列からの変化を特定した。そのような配列は図３Ａ〜３Ｋと（配列番号３４〜５５）に提供される。重鎖配列と軽鎖配列、およびそれらが由来する生殖系列配列のそれぞれの比較が図４〜７に提供される。加えて、ハイブリドーマ由来１３．１．２抗体の配列が図４および５においてその生殖系列配列と比較される。
【０２６７】
本明細書における考察から理解されるように、１３１抗体と１３．１．２抗体のそれぞれがＥＧＦＲｖＩＩＩへの非常に高い親和性を有し、細胞によってよく取り込まれ、そして、毒素に複合体化されると細胞殺滅に非常に有効であるように見える。興味深いことに、それらの抗体のそれぞれは、ゼノマウス・マウスの異なる免疫において、そして、異なる技術を利用して作製されたにもかかわらず、非常に類似した生殖系列遺伝子に由来する。しかしながら、エピトープマッピング研究（本明細書に記載される）に基づくと、それらの抗体のそれぞれはＥＧＦＲｖＩＩＩ分子上のわずかに異なるエピトープに結合するようであり、結合に必須であるＥＧＦＲｖＩＩＩ上のわずかに異なる残基を有するようである。これらの結果は、生殖系列遺伝子の利用はＥＧＦＲｖＩＩＩを標的とする抗体治療薬の作製にとって重要であり、そして、これらの構造上の知見に基づいて、抗体と他の治療薬のさらなる設計を可能とするような形で小さな変化が抗体の結合と効果を改変することができることを示す。
【０２６８】
抗ＥＧＦＲｖＩＩＩモノクローナル抗体の細胞上に発現された天然型ＥＧＦＲｖＩＩＩへの結合
この例では、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体のＮＲ６  Ｍ細胞への結合を測定した。具体的には、ゼノマックス由来ＩｇＧ１組換え抗体の未定量の上清をＮＲ６  Ｍ細胞とＮＲ６  野生型細胞に結合するそれらの能力についてアッセイした。細胞を１００００／ウェルで蒔き、そして、ＦＭＡＴ９６ウェルプレート中において３７℃で一晩培養した。培地を除去し、４０μｌの（下方に用量設定した）ミニリポ上清を添加し、それらの細胞を氷上で１時間インキュベートした。ヒト１３．１．２ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体とＡＢＸ  ＥＧＦ（Ｅ７．６．３、米国特許第６，２３５，８８３号）抗体を陽性対照として添加した。ＰＫ１６．３．１抗体を陰性対照として使用した。それらの細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、二次抗体（ＳＳ  Ａｌｅｘａ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ）を１μｇ／ｍｌでウェル当たり４０μｌ添加し、そして、氷上で１時間インキュベートした。次に、それらの細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、固定し、そして、ＦＭＡＴにより読み取った。全ての抗体をＮＲ６  野生型細胞に対する逆スクリーニングにより結合特異性について試験した。
【０２６９】
組換え抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の精製
より大規模な生産について、重鎖発現ベクターおよび軽鎖発現ベクター（ディッシュ当たり２．５μｇの各鎖）を、ＨＥＫ２９３細胞が７０％集密である１０枚の１００ｍｍディッシュにリポフェクトした。形質移入細胞を３７℃で４日間培養し、上清（６ｍＬ）を回収し、そして、６ｍＬの新しい培地と取り換えた。第７日において、上清を取り出し、そして、初回回収物とまとめた（１０プレートから総計で１２０ｍＬ）。各抗体を、プロテインＡセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ニュージャージー州、ピスカタウェイ）親和性クロマトグラフィー（１ｍＬ）を用いて上清から精製した。抗体をプロテインＡカラムから５００ｍｃＬのｐＨ２．５の０．１Ｍグリシンで溶出した。溶離液をｐＨ７．４のＰＢＳ中において透析し、そして、濾過滅菌した。その抗体を非還元ＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより分析して純度と収率を評価した。濃度はＯＤ２５０におけるＵＶ分析によっても測定された。
【０２７０】
組換え抗ＥＧＦＲｖＩＩＩモノクローナル抗体によるＥＧＦＲｖＩＩＩ受容体の内部移行
ゼノマックス由来ＩｇＧ１組換え抗体を以前に記載されたように発現し、精製し、そして、定量した。抗体は、ＮＲ６  Ｍ細胞中にＥＧＦＲｖＩＩＩ受容体を内部移行するそれらの能力についてさらにアッセイされた。２５０，０００個のＮＲ６  Ｍ細胞を９６ウェルＶ底プレートにおいて三つ組で０．２５μｇ／ｍｌの一次抗体（ＳＣ９５、ＳＣ１３１、ＳＣ１３３、ＳＣ１３９、ＳＣ１５０、ＳＣ１７０、ＳＣ２１１、ＳＣ２３０、ＳＣ２５０および対照としてヒト１３．１．２）と氷上で７分間インキュベートした。それらの細胞をＰＢＳ中の冷１０％ＦＣＳで洗浄し、３μｇ／ｍｌのＦａｂ濃度の二次抗体（ＳＳ  Ａｌｅｘａ抗ヒトＩｇＧ  Ｆａｂ）を添加し、氷上で７分間インキュベートした。それらの細胞をＰＢＳ中の冷１０％ＦＣＳで１回洗浄し、その後、冷培地に再懸濁した。次に、その三つ組のうちの二組を３７℃でインキュベートし、残りの組を４℃で１時間インキュベートした。その後、４℃でインキュベートされた細胞と３７℃でインキュベートされた細胞の１つの組を、（以前に述べたように）グルタチオンを用いて氷上で１時間処理した。次に、細胞を洗浄および１００μｌのＰＢＳ中の冷１％ＦＣＳに再懸濁し、そして、ＦＡＣＳにより分析した。内部移行の％を、ＦＡＣＳ分析から得られた幾何平均より計算した：［（グルタチオン有りで３７℃における平均−グルタチオン有りで４℃における平均）／（グルタチオン無しで３７℃における平均−グルタチオン有りで４℃における平均）］。ＮＡは、ＦＡＣＳ分析を実施したが、データが表３．１２において提供されなかったことを意味する。
【０２７１】
【表１３】
2015500205.tif 000018
【０２７２】
１３．１．２は、ＥＧＦＲｖＩＩＩエピトープ向けのハイブリドーマ作製（実施例２）により以前に作製され、本実験において陽性対照として使用された抗体である。表３．１２におけるこれらの結果は、効率的に取り込まれた（７０〜８０％）抗体とそうではなかった（２２％以下）抗体の２つの組の抗体の存在を示す。
【０２７３】
［実施例４］
抗体１３１‐ＤＭ１複合体化
１３１抗体の精製
１３１抗体（図８Ｂの重鎖と図８Ｄの軽鎖を含む）は哺乳類細胞培養物２９３６‐Ｅ細胞において一時的に発現し、その抗体を２５ｍＭトリス、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４中に平衡化したＭａｂセレクトＳｕＲｅカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に負荷した。次に、結合した１３１抗体を有するそのカラムを３つの洗浄ステップ、すなわち、最初の平衡化緩衝液洗浄、続く２５ｍＭトリス、５００ｍＭ  Ｌ‐アルギニン、ｐＨ７．５による洗浄、および最後の平衡化緩衝液による洗浄により洗浄した。１３１抗体を１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ３．５で溶出した。その抗体を含有する画分をプールし、１Ｍトリス、ｐＨ８．０を用いて５．０の最終ｐＨに調節した。次にその抗体を複合体化緩衝液（２ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．５）に透析した。
【０２７４】
ＳＭＣＣによる１３１抗体の修飾
精製された１３１抗体をアミン反応性リンカーであるスクシンイミジル‐４‐（Ｎ‐マレイミドメチル）シクロヘキサン‐１‐カルボキシレート（ＳＭＣＣ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で修飾してチオール反応性マレイミド基を導入した。その抗体を１２モル当量のＳＭＣＣで処理し、室温で９０分間インキュベートし、反応混合物を、セファデックスＧ‐２５微細樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を含有するＨｉｐｒｅｐ  ２６／１０脱塩化ラムで脱塩した。
【０２７５】
ＳＭＣＣ結合１３１抗体のＤＭ１との複合体化
ＳＭＣＣ修飾化１３１抗体をマレイミド基当たり１．７モル当量のＤＭ１（免疫原）で処理し、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０で緩衝し、最終反応混合物中において３％ＤＭＡ（体積／体積）に調節した。反応混合物を室温で一晩、最大で２０時間までインキュベートした。その反応混合物を２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．５で平衡化したスーパーデックス２００ゲル濾過カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に負荷した。画分を収集し、単量体抗体含有画分をプールし、そして、アッセイした。抗体当たりの結合したＤＭ１分子のモル比が２５２ｎｍと２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより決定され、そして、異なる複合体化ロットについて、抗体当たり３．０〜３．５個のＤＭ１分子の間であることが判明した。
【０２７６】
［実施例５］
抗体１３１‐ＤＭ１の結合特異性
ＥＧＦＲ陽性、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陰性Ａ４３１細胞およびＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性Ｕ８７ｖＩＩＩ細胞を単離し、計数した。１×１０６個の細胞を各チューブに加え、洗浄した。細胞にＦＡＣＳ洗浄緩衝液（ＰＢＳ、２％胎児ウシ血清、０．０２％アジ化ナトリウム）を添加し、続いて１８００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を廃棄することにより細胞を洗浄した。細胞を抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体（１３１抗体）、抗体１３１‐ＤＭ１複合体、ＥＧＦＲｖＩＩＩにも結合する抗野生型ＥＧＦＲ抗体、または対照ＩｇＧ１抗体のいずれかの一次抗体と４℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、次に二次抗体である抗ヒトＩｇＧ抗体Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州、カールスバッド）と４℃で１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ洗浄緩衝液に再懸濁し、そして、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを用いて分析した。
【０２７７】
図９によって示されるように、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体（黒色の破線）、Ａｂ１３１‐ＤＭ１複合体（黒色の実線）、抗ＥＧＦＲ抗体（灰色の一点鎖線）は全てＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞に結合する。抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体もＡｂ１３１‐ＤＭ１も抗ＥＧＦＲ抗体と対照的にＥＧＦＲ（野生型）過剰発現細胞に結合しない。
【０２７８】
［実施例６］
抗体１３１‐ＤＭ１の内部移行
Ｕ２５１ｖＩＩＩ細胞をウェル当たり１０，０００細胞で９６ウェルプレートに２００μＬの成長培地（１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ）と共に蒔き、測定日に９０％の細胞集密に達するように３７℃、５％ＣＯ２で３日間培養した。Ａｂ１３１‐ＤＭ１複合体を細胞に５μｇ／ｍＬの濃度、４℃で２０分間添加した。抗ヒトＩｇＧ  Ｆａｂ’  Ａｌｅｘａ４８８（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ社、ニューヨーク州、ヤップハンク）とＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州、カールスバッド）をアッセイ培地中の細胞に４℃で２０分間添加した。細胞をアッセイ培地で２回洗浄し、その後、３７℃で１．５時間インキュベートした。細胞を固定し、ＢＤサイトフィックス／サイトパーム・キット（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カリフォルニア州、サンディエゴ）を用いて透過処理を行い、細胞をＢＤ洗浄緩衝液で軽く１回洗浄し、続いてフィックス／パーム溶液を添加した。細胞を抗ＥＥＡ１抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カリフォルニア州、サンディエゴ）と０．５μｇ／ｍＬで、室温で２０分間インキュベートした。細胞をＢＤ洗浄緩衝液で洗浄し、抗マウスＡｌｅｘａ５６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州、カールスバッド）を細胞に添加した。細胞を室温で２０分間インキュベートし、２回のＢＤ緩衝液溶液の洗浄ステップが続いた。共局在についての細胞画像を、浜松（Ｈａｍａｍｕｔｓｕ）デジタルカメラに連結したＬｅｉｃａ蛍光顕微鏡とＯｐｅｎｌａｂ画像解析ソフトウェア（Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ社、マサチューセッツ州、レキシントン）を用いて撮った。
【０２７９】
０時間の時点では、Ａｂ１３１‐ＤＭ１複合体が結合したＥＧＦＲｖＩＩＩ受容体はＵ２５１ｖＩＩＩ細胞の表面上に見ることができる。１．５時間のインキュベーション後、Ａｂ１３１‐ＤＭ１複合体はその細胞表面から細胞質へ取り込まれ、そして、エンドソームに共局在した。
【０２８０】
［実施例７］
Ａｂ１３１‐ＤＭ１複合体はＵ２５１ｖＩＩＩ細胞の増殖を阻害する
Ｕ２５１細胞およびＵ２５１ｖＩＩＩ細胞をウェル当たり５００細胞で９６ウェル組織培養プレートに１００μＬの成長培地（１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ）と共に蒔き、３７℃、５％ＣＯ２で４時間培養した。４時間の培養後、抗体、対照複合体、または培地のみを用量漸増して細胞に添加した。細胞ＡＴＰレベルの測定前に細胞を連続的に３７℃、５％ＣＯ２で４日間培養した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ‐Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州、マディソン）緩衝液と基質を約６０分間で室温（ＲＴ）に平衡化した。プレートを３７℃の恒温器から取り出し、室温で３０分間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ‐Ｇｌｏ緩衝液をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ‐Ｇｌｏ基質と混合してＣｅｌｌＴｉｔｅｒ‐Ｇｌｏ試薬を作製した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ‐Ｇｌｏ試薬を両方のプレートの各ウェルにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ‐Ｇｌｏ試薬の培地に対する１：１の比率で添加した。プレートをプレート振盪器に設置し、ゆっくりと２分間振盪した。発光の測定前にプレートを１０分間インキュベートした。発光を、Ｗａｌｌａｃ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ２１０３多重標識リーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社、マサチューセッツ州、ウォルサム）とウェル当たり０．１秒の読み込み時間を用いて測定した。統計分析を、Ｐｒｉｓｍ４．０１（ＧｒａｐｈＰａｄ社、カリフォルニア州、サンディエゴ）を用いて実施した。発光の結果をｙ軸にプロットし、ｎＭ単位のＤＭ１同等物の濃度の対数をｘ軸にプロットした。ＩＣ５０値を用量反応曲線から、対数変換濃度データの非線形回帰分析（シグモイド曲線フィット）を用いることにより決定した。
【０２８１】
図１０に示されているように、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現Ｕ２５１ｖＩＩＩ細胞ではＡｂ１３１‐ＤＭ１は０．０６８ｎＭのＤＭ１同等物、または３．０ｎｇ／ｍＬのＡｂ１３１‐ＤＭ１というＩＣ５０でかなりの細胞増殖阻害を引き起こした。対照複合体では細胞増殖阻害は観察されなかった。
【０２８２】
［実施例８］
Ａｂ１３１‐ＤＭ１複合体がＤ３１７異種移植片におけるリン酸化ヒストンＨ３レベルを上昇させた
Ｄ３１７ヒト神経膠芽腫異種移植片（継代２１３）を担持する動物を安楽死させ、無菌条件下で腫瘍を取り出した。腫瘍を、１３ゲージの移植用套管針に適合する同様の大きさに合わせた断片に切断した。腫瘍を継代数２１４になるように無感作ＣＢ‐１７／ＳＣＩＤマウスの脇腹に移植した。腫瘍測定：長さと幅を電子デジタルカリパスで測定した。腫瘍体積（ｍｍ３）＝［（Ｗ２×Ｌ）／２］であり、この式で幅（Ｗ）は、２回の測定値のうちの小さい方として定義され、長さ（Ｌ）は、２回の測定値のうちの大きい方として定義される。腫瘍体積を測定し、そして、移植後第１４日では腫瘍体積は４２匹の動物において２５８から８７５ｍｍ３までの範囲であった。その後、動物を処置開始のために６匹ずつの動物からなる群にランダム化した。処置は第１４日に尾部静脈を介して静脈内経路で実施された。動物にビヒクル、５．３ｍｇ／ｋｇおよび１６．７ｍｇ／ｋｇ（それぞれ、８０μｇのＤＭ１／ｋｇおよび２５０μｇのＤＭ１／ｋｇ）のＡｂ１３１‐ＤＭ１、または１７．８ｍｇ／ｋｇ（２５０μｇのＤＭ１／ｋｇ）の対照複合体のいずれかを投与した。動物に、群の体重を用いてｋｇ当たり１０ｍＬの体積で投薬した。腫瘍、および動物の体重を、処置投与後４０時間に起きる安楽死の前に測定した。
【０２８３】
投与から４０時間後、動物を安楽死させて各動物から腫瘍を採取し、腫瘍を１０％中性緩衝ホルマリン中で固定し、日常の手法で処理し、そして、パラフィンブロックに包埋した。リン酸化ヒストンＨ３免疫組織化学では、各腫瘍の４〜６ミクロンの切片を帯電スライドグラス上に配置し、脱パラフィン化し、そして、再水和した後にＤｅｃｌｏａｋｅｒ圧力計（Ｂｉｏｃａｒｅ社）中のＤｉｖａ溶液（Ｂｉｏｃａｒｅ社、番号ＤＶ２００４Ｇ１）を用いて抗原回復を行った。切片を抗リン酸化ヒストンＨ３抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ／Ｕｐｓｔａｔｅ社、番号０６−５７０）と１μｇ／ｍｌで、室温で１時間インキュベートし、そして、抗ウサギＥｎｖｉｓｉｏｎ（Ｄａｋｏ社、Ｋ４００３）およびＤＡＢ（Ｄａｋｏ社、３４６８）を使用し、続いてヘマトキシリンを使用する対比染色により結合を可視化した。Ａｐｅｒｉｏ  ＳｃａｎＳｃｏｐｅ  ＸＴを使用してスライドをデジタルスキャンし、そして、処置群について知らされていない専門獣医病理学者がＩｍａｇｅＳｃｏｐｅソフトウェアを使用して結果生じた画像上に手書きで各切片内の生存腫瘍の輪郭を描いた。その生存腫瘍領域内のリン酸化ヒストンＨ３陽性細胞の数を、ＩＨＣ  Ｎｕｃｌｅａｒアルゴリズムを用いて定量化し、そして、生存腫瘍領域のｍｍ２当たりの陽性細胞の数として表した。
【０２８４】
処置群におけるｍｍ２当たりのリン酸化ヒストンＨ３陽性細胞の平均数を対照群において観察された数とＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ第５．０４版（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、カリフォルニア州、サンディエゴ）を使用するマン・ホイットニー検定を用いて比較した。
【０２８５】
図１１に示されているように、Ａｂ１３１‐ＤＭ１を用いる処置により、ビヒクルまたは対照複合体で処置された動物と比べて陽性リン酸化ヒストンＨ３細胞の数が有意に上昇することになった。
【０２８６】
［実施例９］
異種移植片モデルにおけるＡｂ１３１‐ＤＭ１複合体
下の例４６Ａ、４６Ｂおよび４６Ｃでは、腫瘍の長さと幅を電子デジタルカリパスで測定した。腫瘍体積（ｍｍ３）は［（Ｗ２×Ｌ）／２］として計算された。この式で幅（Ｗ）は、２回の測定値のうちの小さい方として定義され、長さ（Ｌ）は、２回の測定値のうちの大きい方として定義される。動物に、群の体重を用いてｋｇ当たり１０ｍＬの体積で投薬した。腫瘍体積、および動物の体重を週に２回または３回測定した。腫瘍負荷が体重の１０％に近づいたときに動物を安楽死させた。腫瘍体積は平均値±標準誤差として表され、そして、時間の関数としてグラフにプロットされた。増殖曲線間の観察された差異の統計的有意性は、ダネット調節多重ポストホック比較を用いる対数変換腫瘍体積データの反復測定共分散分析により評価された。その分析は、基線対数腫瘍体積、日にち、処置、および日にち処置間相互作用というモデル効果を有するＳＡＳのｍｉｘｅｄプロシジャ；日にちがｒｅｐｅａｔｅｄ値であり、動物がｓｕｂｊｅｃｔであり、Ｔｏｅｐｌｉｔｚが共分散構造であるｒｅｐｅａｔｅｄステートメント；および対照群を他の処置群に比較するダネット分析を行うためのｌｓｍｅａｎｓステートメントを用いて行われた。容量が大きくなるほど大きい分散を有する傾向があるのでデータを対数変換し、そして、処置前のあり得る腫瘍体積の差異を説明するモデルにおける共分散として基線対数腫瘍体積を含んだ。ＳＡＳ  ｖ９．１（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社、ノースカロライナ州、ケアリー）と連動するＪＭＰソフトウェア  ｖ７．０を使用して全ての統計計算を行った。
【０２８７】
実施例９Ａ：Ｕ２５１ｖＩＩＩ異種移植片モデルにおけるＡｂ１３１‐ＤＭ１複合体
Ｕ２５１ｖＩＩＩ皮下異種移植片におけるＡｂ１３１の効力を決定するため、移植のための充分な生存細胞が得られるまで、Ｕ２５１ｖＩＩＩ細胞をインビトロで増殖させた。細胞を、胎児ウシ血清を含まず、ＢＤ成長因子低下マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カリフォルニア州、サンディエゴ）と１：１で混合したＤＭＥＭに、１００×１０６細胞／ｍＬの終濃度に達するように再懸濁した。ＣＤ‐１  ｎｕ／ｎｕマウスの脇腹に１００μＬのその細胞／マトリゲル溶液、すなわち１０×１０６個の細胞を移植した。腫瘍体積を測定し、そして、第１８日では６０匹の動物において腫瘍体積は１７２から４７６ｍｍ３の範囲であった。その後、これらの６０匹の動物を処置開始前に１０匹ずつの動物からなる群にランダム化した。対照複合体、非複合体化１３１抗体、およびＡｂ１３１‐ＤＭ１による処置は移植後第１８日に尾部静脈を介して静脈内経路で実施された。
【０２８８】
動物は、１つの群で１４．４ｍｇ／ｋｇの対照複合体の単回静脈内投与、別の群で１．７ｍｇ／ｋｇのＡｂ１３１‐ＤＭ１の単回静脈内投与、別の群で５．６ｍｇ／ｋｇのＡｂ１３１‐ＤＭ１の単回静脈内投与、および別の群で１７ｍｇ／ｋｇのＡｂ１３１‐ＤＭ１の単回静脈内投与を受けた。腫瘍体積は上記のように週に２回測定された。図１２に示されているように、５．６または１７ｍｇ／ｋｇのＡｂ１３１‐ＤＭ１を用いる処置によって、ビヒクルまたは対照複合体で処置された動物と比べて腫瘍成長に著しい遅れが引き起こされた。腫瘍の退縮が５．６および１７ｍｇ／ｋｇのＡｂ１３１‐ＤＭ１で観察され、完全な退縮が１７ｍｇ／ｋｇで観察された。どの動物でも体重減少に対する効果は観察されなかった。
【０２８９】
実施例９Ｂ：Ｄ３１７異種移植片モデルにおけるＡｂ１３１‐ＤＭ１複合体
Ｄ３１７腫瘍断片をＣＢ‐１７／ＳＣＩＤマウスにおいて段階的に継代培養した。Ｄ３１７ヒト神経膠芽腫異種移植片を担持する動物を安楽死させ、無菌条件下で腫瘍を取り出した。腫瘍を、１３ゲージの移植用套管針に適合する同様の大きさに合わせた断片に切断した。腫瘍を無感作ＣＢ‐１７／ＳＣＩＤマウスの脇腹に移植した。腫瘍体積を移植後に測定し、そして、第１１日では４２匹の動物において腫瘍体積は１０６から３７３ｍｍ３までの範囲であった。その後、４２匹の動物を処置開始のために７匹ずつの動物からなる６群にランダム化した。処置は移植後第１１日と第１８日に尾部静脈を介して静脈内経路で実施された。動物はビヒクル、２０．５ｍｇ／ｋｇの抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体１３１、４．９、９．８または２０．５ｍｇ／ｋｇ（それぞれ、６０、１２０、および２５０μｇのＤＭ１／ｋｇ）のＡｂ１３１‐ＤＭ１複合体、または１７．８ｍｇ／ｋｇ（２５０μｇのＤＭ１／ｋｇ）の対照複合体を受容した。第１５日に、大きい腫瘍体積のため、ビヒクル群の１匹の動物、１３１抗体群の２匹の動物、対照複合体群の３匹の動物、９．８ｍｇ／ｋｇのＡｂ１３１‐ＤＭ１の用量群の１匹の動物、および４．９ｍｇ／ｋｇのＡｂ１３１‐ＤＭ１の用量群の２匹の動物を安楽死させた。第１８日に、大きい腫瘍体積のため、ビヒクルを投与されたマウス、対照複合体を投与されたマウス、１３１抗体を投与されたマウス、および４．９ｍｇ／ｋｇのＡｂ１３１‐ＤＭ１の用量群の全ての残りのマウスを安楽死させた。大きい腫瘍サイズのため、９．８ｍｇ／ｋｇのＡｂ１３１‐ＤＭ１の用量群の２匹の動物を安楽死させた。第１８日に９．８ｍｇ／ｋｇのＡＢ１３１‐ＤＭ１の用量群の残りの４匹のマウスと２０．５ｍｇ／ｋｇの用量のＡＢ１３１‐ＤＭ１群の７匹全てのマウスに２回目の用量を静脈内投与した。マウスの体重および腫瘍体積を、第２９日に終了した試験期間を通してモニターした。
【０２９０】
図１３に示されているように、２０．５ｍｇ／ｋｇの用量のＡｂ１３１‐ＤＭ１複合体を用いる処置により、ビヒクルで処置された動物と比べて腫瘍成長に著しい遅れが引き起こされたが、１３１抗体と対照複合体は効果を有しなかった。
【０２９１】
実施例９Ｃ：Ｄ３１７異種移植片モデルにおけるＡｂ１３１‐ＤＭ１複合体を用いる用量反応実験
Ｄ３１７細胞を、胎児ウシ血清を含まず、ＢＤ成長因子低下マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カリフォルニア州、サンディエゴ）と１：１で混合したＤＭＥＭに、１×１０６細胞／ｍＬの終濃度に達するように再懸濁した。ＣＢ‐１７／ＳＣＩＤマウスの脇腹に２００μＬのその細胞／マトリゲル溶液、すなわち０．２×１０６細胞を移植した。移植後第９日に腫瘍体積を測定し、１３７〜３１３ｍｍ３の範囲を有する５０匹の動物をランダム化し、そして、処置した。マウスは、移植後第９日にビヒクル、２６．８ｍｇ／ｋｇ（３７５μｇのＤＭ１／ｋｇ）の対照複合体、または７．３、１４．６、もしくは２２ｍｇ／ｋｇ（それぞれ、１２５、２５０、もしくは３７５μｇのＤＭ１／ｋｇ）のＡｂ１３１‐ＤＭ１複合体のいずれかの単回静脈内注射を受けた。
【０２９２】
図１４に示されているように、全ての用量でのＡｂ１３１‐ＤＭ１を用いる処置により、腫瘍成長に著しい遅れが引き起こされ、退縮が２２ｍｇ／ｋｇの用量で観察された。対照複合体は効果を有しなかった。
【０２９３】
実施例９Ｄ：Ａｂ１３１‐ＤＭ１複合体で処置されたＤ３１７異種移植片モデルにおけるＭＲＩの見かけ上の拡散係数
本試験において、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）の見かけの拡散係数（ＡＤＣ）が、神経膠芽腫の同所性モデルにおけるＡｂ１３１‐ＤＭ１処置の結果としての腫瘍組織における構造変化の早期読み出し情報として試験された。
【０２９４】
第０日にＣＢ１７  ＳＣＩＤマウスにＤ３１７ヒト神経膠芽腫細胞（１００，０００細胞／マウス）を脳の右半球への定位的注射により移植した。第７日にマウスをＭＲＩで画像撮影し、そして、腫瘍体積に基づいて５処置群にランダム化した。マウスをビヒクル、６．５、１１、または２２ｍｇ／ｋｇのＡｂ１３１‐ＤＭ１の週に２回の静脈内投与により、またはテモゾロミド１０ｍｇ／ｋｇの週に５日間毎日の経口投与により処置した（Ｎ＝８／群）。その後、マウスを第１４日と第２１日にＭＲＩで画像撮影した。全てのマウスにおける腫瘍体積を、全腫瘍体積にわたる多重スライスＴ２強調ＲＡＲＥ（弛緩増強高速獲得）画像における高強度領域を手作業でトレースすることにより評価した。ビヒクル処置群および２２ｍｇ／ｋｇのＡｂ１３１‐ＤＭ１処置群における各腫瘍のＭＲＩの見かけの拡散係数の平均を、全腫瘍体積にわたる手作業でトレースした領域を用いて拡散強調スピンエコー画像（ｂ＝１００、３００、７００、１０００、および１２００秒／ｍｍ２）から計算した。
【０２９５】
Ａｂ１３１‐ＤＭ１の腫瘍体積に対する用量依存的効果が第２１日に観察されたが、第１４日では群間に腫瘍体積の有意な差異は存在しなかった。第２１日では、成長がビヒクルと比べてテモゾロミド処置群とＡｂ１３１‐ＤＭ１処置群（２２および１１ｍｇ／ｋｇ）の両方において阻害された（ｐ＜０．０００１）。平均ＭＲＩ  ＡＤＣ値はＡｂ１３１‐ＤＭ１（２２ｍｇ／ｋｇ）を用いる処置の後では第１４日（２３％、対ビヒクルｐ＜０．０１）と第２１日（３２％、対ビヒクルｐ＜０．０００１）の両方で有意に高かったが、どの時点でもビヒクル群のＭＲＩ  ＡＤＣに重大な変化は生じなかった。
【０２９６】
Ａｂ１３１‐ＤＭ１は、マウスの脳に同所的に注入されたＤ３１７細胞の用量依存的増殖阻害を示す。Ａｂ１３１‐ＤＭ１処置後の腫瘍の見かけの拡散係数の上昇は腫瘍成長の測定可能な阻害の前に起こり、ＭＲＩ  ＡＤＣが治療効力の早期バイオマーカーであることを裏付けている。そのデータはＭＲＩ  ＡＤＣが腫瘍体積の減少よりも早い治療効果のバイオマーカーであることを裏付ける。
【０２９７】
［実施例１０］
変異形上皮成長因子受容体変異形ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）を発現する再発悪性神経膠腫を有する対象におけるＡＢ１３１‐ＤＭ１の安全性、忍容性、薬物動態学および薬力学を評価する第Ｉ相ヒト初回投与試験
単一の薬剤Ａｂ１３１‐ＤＭ１の非盲検連続用量探索的試験において、Ａｂ１３１‐ＤＭ１は、再発ＧＢＭおよび／またはＡＡを有する対象において３週間に１回（Ｑ３Ｗ）静脈内（ＩＶ）投与される。その試験に登録された有資格対象は、試験第１日に開始する６０分の点滴としてＡｂ１３１‐ＤＭ１を静脈内に３週間に１回受容する。最初の２回のＡｂ１３１‐ＤＭ１の投与の後、および、用量制限毒性の評価のための２８日の期間が無事完了すると、対象は第５週の間にＭＲＩによるそれらの腫瘍の放射線医学的評価を受ける。例えば、マクドナルド基準による進行性疾患（ＰＤ）のＸ線撮影の証拠が無い、対象が試験投薬に対して不耐性になっていない、または臨床的進行の徴候および症状が、治験責任医師が判定したときに明らかではない場合、Ａｂ１３１‐ＤＭ１（Ｑ３Ｗ）での投与は第７週に再開し得る。その後のＭＲＩによる腫瘍の評価は第９週とその後８週間ごとに行われる。
【０２９８】
参加登録は、腫瘍組織におけるＥＧＦＲｖＩＩＩ発現の証拠を示す患者に限定される。加えて、マクドナルド診断基準による測定可能な疾患進行を確認するＭＲＩによる放射線医学的評価もその試験への参加に必要とされる。
【０２９９】
適応型用量探索が（実際的な連続再評価法［ＣＲＭ］  ［Ｚｈｏｕ，  ２００２］を用いる）本試験で用いられ、そして、可能な場合は、ＡＢ１３１‐ＤＭ１の最大忍容用量（ＭＴＤ）の決定、ならびに安全性、忍容性、ＰＫおよびＰＤの評価に向けられる。ＭＴＤは、用量制限毒性（ＤＬＴ）の可能性が２５％以下である最大用量として定義される。
【０３００】
安全な用量増加を保証するため、どの時点でも最大用量の増加は現行の用量の２倍以下である。用量探索において使用される予め規定された名目用量は０．５、１．０、２．０、３．０、４．０および５．０ｍｇ／ｋｇのＡＢ１３１‐ＤＭ１（ＩＶ；Ｑ３Ｗ）である。中間用量（０．５ｍｇ／ｋｇの倍数）と代替的な投与頻度も必要に応じて使用され得る。
【０３０１】
その投与計画の有効性は、マクドナルド診断基準（Ｍａｃｄｏｎａｌｄ  ＤＲ，Ｃａｓｃｉｎｏ  ＴＬ，Ｓｃｈｏｌｄ  ＳＣ  Ｊｒ，Ｃａｉｒｎｃｒｏｓｓ  ＪＧ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｓｕｐｒａｔｅｎｔｏｒｉａｌ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｇｌｉｏｍａ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．１９９０；８：１２７７−１２８０を参照のこと）、または神経腫瘍学反応評価（ＲＡＮＯ）基準（Ｗｅｎ  ＰＹ，Ｍａｃｄｏｎａｌｄ  ＤＲ，Ｒｅａｒｄｏｎ  ＤＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｕｐｄａｔｅｄ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒＨｉｇｈ−Ｇｒａｄｅ  Ｇｌｉｏｍａｓ：Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２０１０；２８：１９６３−１９７２を参照のこと）を用いて放射線医学的に評価され得る。
【０３０２】
参照による引用
特許、特許出願、論文、教科書などを含む、本明細書において引用されるあらゆる参照文献、およびそれらの中で引用される参照文献は、既にされていない限り、ここにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０３０３】
同等物
前述の記載と実施例は本発明のある特定の好ましい実施形態を詳述し、そして、本発明者らによって企図される最良の形態を説明する。しかしながら、前述のことが本文中でどんなに詳細に見えようと、本発明は多数の方法で実施され得、そして、本発明は添付の特許請求の範囲およびそのあらゆる同等物に従って解釈されるべきであると理解される。
【図１Ａ】
2015500205.tif 000019
【図１Ｂ】
2015500205.tif 000020
【図１Ｃ】
2015500205.tif 000021
【図１Ｄ】
2015500205.tif 000022
【図１Ｅ】
2015500205.tif 000023
【図２】
2015500205.tif 000024
【図３Ａ】
2015500205.tif 000025
【図３Ｂ】
2015500205.tif 000026
【図３Ｃ】
2015500205.tif 000027
【図３Ｄ】
2015500205.tif 000028
【図３Ｅ】
2015500205.tif 000029
【図３Ｆ】
2015500205.tif 000030
【図３Ｇ】
2015500205.tif 000031
【図３Ｈ】
2015500205.tif 000032
【図３Ｉ】
2015500205.tif 000033
【図３Ｊ】
2015500205.tif 000034
【図３Ｋ】
2015500205.tif 000035
【図３Ｌ】
2015500205.tif 000036
【図４】
2015500205.tif 000037
【図５】
2015500205.tif 000038
【図６Ａ−１】
2015500205.tif 000039
【図６Ａ−２】
2015500205.tif 000040
【図６Ａ−３】
2015500205.tif 000041
【図６Ａ−４】
2015500205.tif 000042
【図７Ａ−１】
2015500205.tif 000043
【図７Ａ−２】
2015500205.tif 000044
【図７Ａ−３】
2015500205.tif 000045
【図７Ａ−４】
2015500205.tif 000046
【図８Ａ】
2015500205.tif 000047
【図８Ｂ】
2015500205.tif 000048
【図８Ｃ】
2015500205.tif 000049
【図８Ｄ】
2015500205.tif 000050
【図８Ｅ】
2015500205.tif 000051
【図９】
2015500205.tif 000052
【図１０】
2015500205.tif 000053
【図１１】
2015500205.tif 000054
【図１２】
2015500205.tif 000055
【図１３】
2015500205.tif 000056
【図１４】
2015500205.tif 000057
【配列表】
2015500205000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年8月28日(2014.8.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍を有する哺乳類動物を治療するための医薬組成物であって、適用すべき抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体を、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で含む、前記医薬組成物。
【請求項２】
前記抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体が、少なくとも０．１、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５．４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、または９．５ｍｇ／ｋｇから１１．０ｍｇ／ｋｇ以下の用量で適用される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体が、少なくとも０．５〜１ｍｇ／ｋｇ、０．１〜２ｍｇ／ｋｇ、２〜３ｍｇ／ｋｇ、３〜４ｍｇ／ｋｇ、４〜５ｍｇ／ｋｇ、５〜６ｍｇ／ｋｇ、６〜７ｍｇ／ｋｇ、７〜８ｍｇ／ｋｇ、８〜９ｍｇ／ｋｇ、９〜１０ｍｇ／ｋｇ、１．５〜２．５ｍｇ／ｋｇ、２．５〜３．５ｍｇ／ｋｇ、３．５〜４．５ｍｇ／ｋｇ、４．５〜５．５ｍｇ／ｋｇまたは５．５〜６．５ｍｇ／ｋｇの用量で適用される、請求項１〜２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体が、静脈内、ボーラス注射、脳内、または持続性放出により適用される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体が、少なくとも週に２回、少なくとも週に１回、少なくとも２週に１回、少なくとも３週に１回、または少なくとも４週に１回適用される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記哺乳類動物における前記腫瘍が、ＥＧＦＲｖＩＩＩ．Ｉを発現する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記哺乳類動物における前記腫瘍が、肺癌、乳癌、結腸癌、胃癌、腎臓癌、頭頸部癌、前立腺癌、卵巣癌、神経膠芽腫、退形成星状細胞腫、星状細胞腫またはグリア細胞成分を含む腫瘍、特に神経膠芽腫、退形成星状細胞腫、星状細胞腫またはグリア細胞成分を含む腫瘍である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記哺乳類動物における前記腫瘍が、神経膠芽腫または退形成星状細胞腫である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記哺乳類動物における前記腫瘍が、再発神経膠芽腫または再発退形成星状細胞腫である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記哺乳類動物における前記腫瘍が、乏突起神経膠腫（ｏｌｉｇｏｄｅｎｒｏｇｌｉｏｍａ）、乏突起星状細胞腫、神経膠肉腫、混合膠腫、毛様細胞性星状細胞腫、多形性黄色星状細胞腫、上衣下巨細胞性星状細胞腫、星状芽細胞腫、海綿芽細胞腫、大脳神経膠腫症、または神経節膠腫（ｇａｎｇｌｉｇｌｉｏｍａ）もしくは退形成神経節膠腫を含む神経膠性腫瘍である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記哺乳類動物が、前記抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体の最初の適用から３か月よりも長く、４か月よりも長く、５か月よりも長く、または６か月よりも長く生存する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記哺乳類動物における前記腫瘍が、前記抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体の最初の適用から３か月後、４か月後、５か月後、または６か月後に進行していなかった、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記哺乳類動物が、前記抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体の最初の適用前の前記哺乳類動物における循環腫瘍細胞のレベルと比べて減少している循環腫瘍細胞のレベルを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記哺乳類動物が、前記抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体の最初の適用前の前記哺乳類動物における腫瘍に特有のエキソソームのレベルと比べて低下している腫瘍に特有のエキソソームのレベルを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記哺乳類動物における腫瘍のサイズが、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体の最初の適用前の腫瘍のサイズと比べて抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体の適用後に減少する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記哺乳類動物における腫瘍のサイズが、前記抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体の最初の適用前の前記哺乳類動物における腫瘍のサイズと比べて少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％減少する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記哺乳類動物が、完全奏功または部分奏功を示す、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記哺乳類動物が、前記抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体の最初の適用から６か月間の無増悪生存期間を示す、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
マクドナルド診断基準またはＲＡＮＯ診断基準によって評価される、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体の抗体が、抗体１３１である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体の抗体が、配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体に複合体化された薬物が、放射性同位体、化学療法薬、毒素またはそれらの断片もしくは異型体である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体が、少なくとも１〜１０個、少なくとも１〜５個、少なくとも３〜４個または少なくとも３〜５個のマイタンシノイドＤＭ１分子に複合体化されている、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記薬物が、切断不可能リンカー基を介して前記抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体に複合体化されている、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記薬物が、スクシンイミジル‐４‐（Ｎ‐マレイミドメチル）シクロヘキサン‐１‐カルボキシレート（ＳＭＣＣ）を介して前記抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体に複合体化されている、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体が、図８Ａ、８Ｂおよび８Ｄに示されているＡｂ１３１‐ＤＭ１であり、図８Ｂに示されている完全長重鎖および図８Ｄに示されている完全長軽鎖を含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体が、配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、前記抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体がＭＣＣリンカーによって３〜５個のマイタンシノイドに複合体化されている、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記の適用ステップを、前記哺乳類動物への外科手術の実施、放射線治療の実施、原発性状況における全脳放射線治療の実施、再発性状況における局所的放射線治療の実施、原発性状況および再発性状況におけるテモゾロミドの適用、ベバシズマブの適用、イリノテカンの適用、ＰＣＶ、プロカバジン（ｐｒｏｃａｂａｚｉｎｅ）、ロムスチン［ＣＣＮＵ］、ビンクリスチンの適用、グリアデル・ウェファー（ＢＣＮＵをしみ込ませたポリフェプロザン）の移植、チロシンキナーゼ阻害剤の適用、放射線増感剤の適用、ワクチン系治療法の実施、原発性状況または再発性状況における抗体薬物複合体の適用または二特異的Ｔ細胞増強剤の適用、または標的化薬物の適用による前記哺乳類動物の治療の前に、前記哺乳類動物の治療と組み合わせて、または前記哺乳類動物の治療の後に実施する、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記哺乳類動物がヒトである、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
2015500205.tif 000058
2015500205.tif 000059