(57)【要約】  アグロバクテリウムを形質転換体として使用すると植物の形質転換率を増大させる方法が、記載される。この方法は、植物細胞を、界面活性剤を含有する液体培地中でアグロバクテリウム細胞に曝露させることを含む。幾つかの方法は、植物細胞を、アグロバクテリウム細胞に曝露させた後に連続光に曝露させることを含む。これらの方法に有用な植物の例として、トウモロコシ植物（例えば、未成熟トウモロコシ胚）が挙げられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物細胞を、界面活性剤を含有する液体培地中でアグロバクテリウム細胞に曝露させることを含む植物細胞の形質転換方法であって、前記界面活性剤が液体培地中に０．００１重量％〜０．０８重量％の濃度を有する、植物細胞の形質転換方法。
【請求項２】
さらに追加の界面活性剤を含む、請求項１に記載の植物細胞の形質転換方法。
【請求項３】
前記界面活性剤が、アジュバント、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、油系界面活性剤、両性界面活性剤、または高分子界面活性剤である、請求項１に記載の植物細胞の形質転換方法。
【請求項４】
前記界面活性剤が非イオン性トリシロキサン界面活性剤である、請求項１に記載の植物細胞の形質転換方法。
【請求項５】
前記界面活性剤が、トリシロキサンアルコキシレート、エトキシル化ダイズ油、アルコールエトキシレートＣ−１３、Ｃ１２−Ｃ１４−アルキルジメチルベタイン、またはジ−ｓｅｃ−ブチルフェノールエチレンオキシド・プロピレンオキシドブロックコポリマーである、請求項１に記載の植物細胞の形質転換方法。
【請求項６】
前記植物細胞がトウモロコシ細胞である、請求項１に記載の植物細胞の形質転換方法。
【請求項７】
前記植物細胞が未成熟胚由来である、請求項１に記載の植物細胞の形質転換方法。
【請求項８】
前記未成熟胚が長さで１．５ｍｍ以上および２．５ｍｍ以下である、請求項７に記載の植物細胞の形質転換方法。
【請求項９】
前記植物細胞を、前記アグロバクテリウム細胞に曝露させた後に連続光に曝露させる、請求項１に記載の植物細胞の形質転換方法。
【請求項１０】
植物細胞の形質転換方法であって、
界面活性剤を含有する液体培地を調製し（前記界面活性剤は、液体培地中に０．００１重量％〜０．０８重量％の濃度を有する）、
アグロバクテリウム細胞を、前記液体培地に懸濁させ、および
植物細胞を、前記界面活性剤を含有する液体培地中で前記アグロバクテリウム細胞に曝露させる、
ことを含む植物細胞の形質転換方法。
【請求項１１】
前記アグロバクテリウム細胞を、界面活性剤を含有する前記液体培地に懸濁させる前に固形培地から擦り取る、請求項１０に記載の植物細胞の形質転換方法。
【請求項１２】
前記アグロバクテリウム細胞を、界面活性剤を含有する前記液体培地に懸濁させる前に液体増殖培地で増殖させる、請求項１０に記載の植物細胞の形質転換方法。
【請求項１３】
さらに追加の界面活性剤を含む、請求項１０に記載の植物細胞の形質転換方法。
【請求項１４】
前記界面活性剤が、アジュバント、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、油系界面活性剤、両性界面活性剤、または高分子界面活性剤である、請求項１０に記載の植物細胞の形質転換方法。
【請求項１５】
前記界面活性剤が、非イオン性トリシロキサン界面活性剤である、請求項１０に記載の植物細胞の形質転換方法。
【請求項１６】
前記界面活性剤が、トリシロキサンアルコキシレート、エトキシル化ダイズ油、アルコールエトキシレートＣ−１３、Ｃ１２−Ｃ１４−アルキルジメチルベタイン、またはジ−ｓｅｃ−ブチルフェノールエチレンオキシド・プロピレンオキシドブロックコポリマーである、請求項１０に記載の植物細胞の形質転換方法。
【請求項１７】
前記植物細胞が、トウモロコシ細胞である、請求項１０に記載の植物細胞の形質転換方法。
【請求項１８】
前記植物細胞が、未成熟胚由来である、請求項１０に記載の植物細胞の形質転換方法。
【請求項１９】
前記未成熟胚が長さで１．５〜２．５ｍｍである、請求項１８に記載の植物細胞の形質転換方法。
【請求項２０】
前記植物細胞を、前記アグロバクテリウム細胞に曝露させた後に連続光に曝露させる、請求項１０に記載の植物細胞の形質転換方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年１２月１５日付で出願された米国仮特許出願第６１／５７６，１３８号の利益を請求する。
【背景技術】
【０００２】
植物の形質転換は、一般に、外来遺伝子を安定に維持し、発現させる稔性後代植物を得ることが可能であるように、植物で発現可能な外来遺伝子を植物細胞に導入するのに必要とされ、利用される方法を包含する。単子葉植物および双子葉植物の分類の多数のメンバーが、形質転換されている。遺伝子組換え（transgenic）農作物、ならびに果樹および野菜が、商業的に重要である。このような作物としては、トウモロコシ、イネ、ダイズ、キャノーラ、ヒマワリ、アルファルファ、モロコシ、コムギ、ワタ、落花生、トマト、ジャガイモなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０００３】
外来遺伝物質を植物細胞に導入するために、および導入された遺伝子を安定に維持し、発現する植物を得るために、幾つかの技法が公知である。このような方法として、微粒子表面にコーティングされた遺伝物質の細胞内への直接的な加速挿入が挙げられる（例えば、米国特許第４，９４５，０５０号および米国特許第５，１４１，１３１号明細書）。他の形質転換技術として、ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）技術が挙げられる（例えば、米国特許第５，３０２，５２３号および米国特許第５，４６４，７６５号明細書参照）。また、エレクトロポレーション技術も、植物を形質転換させるのに使用されている。例えば、国際公開第８７／０６６１４号、米国特許第５，４７２，８６９号、米国特許第５，３８４，２５３号、国際公開第９２／０９６９６号、および国際公開９３／２１３３５号参照。さらに、植物プロトプラストと、輸送させるべきＤＮＡを含有するリポソームとの融合、ＤＮＡの直接注入、およびその他の可能な方法を用いてもよい。
【０００４】
挿入されたＤＮＡは、植物ゲノムに一旦組み込まれると、次の世代の全体を通じて通常は比較的安定である。形質転換細胞は、植物の内部で通常の方法で成長する。形質転換細胞は、胚細胞を形成し、１つまたは複数の形質転換された形質を後代植物に伝えることができる。このような植物は、標準的な方法で成長させることができ、同一の形質転換遺伝因子または他の遺伝因子を有する植物と交配させてもよい。得られるハイブリッド個体は、対応する表現型特性、例えば植物害虫の摂食を抑制する能力を有する。
【０００５】
また多数の代替技術を、ＤＮＡを宿主植物細胞に挿入するために使用できることもできる。これらの技術として、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）によって輸送されるＴ−ＤＮＡを形質転換剤として用いる形質転換が挙げられるが、これに限定されない。植物は、例えば米国特許第５，１７７，０１０号、米国特許第５，１０４，３１０号、欧州特許出願公告第０１３１６２４号、欧州特許出願第１２０５１６号、欧州特許出願公告第１５９４１８号、欧州特許出願第１７６１１２号、米国特許第５，１４９，６４５号、米国特許第５，４６９，９７６号、米国特許第５，４６４，７６３号、米国特許第４，９４０，８３８号、米国特許第４，６９３，９７６号、欧州特許出願第１１６７１８号、欧州特許出願第２９０７９９号、欧州特許出願第３２０５００号、欧州特許出願第６０４６６２号、欧州特許出願第６２７７５２号、欧州特許出願第０２６７１５９号、欧州特許出願第０２９２４３５号、米国特許第５，２３１，０１９号、米国特許第５，４６３，１７４号、米国特許第４，７６２，７８５号、米国特許第５，００４，８６３号、および米国特許第５，１５９，１３５号明細書に記載されているように、アグロバクテリウム技術を使用して形質転換させてもよい。植物細胞の形質転換のためのＴ−ＤＮＡ含有ベクターの使用は、鋭意研究されており、欧州特許出願第１２０５１６号明細書；Ａｎらの論文（1985, EMBO J.,4:277-284）；Ｆｒａｌｅｙらの論文（1986, Crit. Rev. Plant Sci.,4:1-46）およびＬｅｅとＧｅｌｖｉｎの論文（2008, Plant Physiol., 146:325-332）に十分に記載されており、この分野で十分に確立されている。
【０００６】
アグロバクテリウム属種（Agrobacterium spp.）による植物細胞の形質転換における重要な最初の工程は、形質転換させるべき宿主植物の細胞への細菌細胞の密接な接触、結合、または付着である。細胞−細胞の結合の後の、アグロバクテリウム（Agrobacterium）から植物細胞へのＴ−ＤＮＡ転移の生物学は、公知である。例えば、Gelvin, 2003, Microbiol. Molec. Biol. Rev.,67:16-37；およびGelvin, 2009, Plant Physiol., 150:1665-1676参照。最低でも、少なくともＴ−ＤＮＡの右側境界反復配列（しかし、多くの場合にはＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミドの右側境界反復配列と左側境界反復配列の両方）が、植物細胞に挿入されることが望まれる遺伝子のフランキング領域として結合されるだろう。左側および右側Ｔ−ＤＮＡ境界反復配列は、Ｔ−ＤＮＡ転移に必要とされる重要なシス作用配列である。種々のトランス作用要素が、アグロバクテリウムゲノム全体の中にコードされている。これらの中の主要なものは、ｖｉｒ遺伝子によってコードされているタンパク質であり、これらは、通常、ＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミドの一連のオペロンとして認められる。種々のＴｉプラスミドおよびＲｉプラスミドは、ｖｉｒ遺伝子の補体において幾分異なり、例えばｖｉｒＦは、必ずしも存在しているとは限らない。ｖｉｒ遺伝子によってコードされるタンパク質は、種々様々な機能を行う、例えば、数例を挙げると、植物細胞／細菌の相互作用の認識およびシグナル伝達、ｖｉｒ遺伝子転写の誘導、ＩＶ型分泌チャンネルの形成、Ｔ−ＤＮＡ境界反復配列の認識、Ｔ鎖の形成、Ｔ鎖の植物細胞内への転移、Ｔ鎖の植物細胞核内への取込み、およびＴ鎖の植物核染色体内への組込みを行う。例えば、Tzfira and Citovsky, 2006, Curr. Opin. Biotechnol. 17:147-154参照。
【０００７】
アグロバクテリウム株を形質転換に使用すると、植物細胞内に挿入すべきＤＮＡは、特別なプラスミド内に、例えば中間（シャトル）ベクター内またはバイナリーベクター内のいずれかにクローン化することができる。中間ベクターは、アグロバクテリウム細胞内では独立して複製できないが、一般的な大腸菌（Escherichia coli）分子クローニング株内では操作および複製することができる。このような中間ベクターが、右側および左側Ｔ−ＤＮＡ境界反復配列領域によって組立てられる（framed）配列であって、形質転換植物細胞の選択に機能的な選択マーカー、クローニングリンカー、クローニングポリリンカー、または植物細胞の形質転換に予定される遺伝子のための導入部位として機能することができる他の配列を含んでいてもよい配列を含むことは、広く知られている。植物に転移することが望まれる遺伝子のクローニングおよび操作は、このようにシャトルベクターをクローニングベクターとして使用して、大腸菌（E. coli）において標準的な方法で容易に行うことができる。最終的に操作されたシャトルベクターは、その後に、さらなる研究のためにアグロバクテリウム植物形質転換株に導入することができる。中間ベクターは、ヘルパープラスミド（細菌接合を介して）により、エレクトロポレーションで、化学的に介在させた直接ＤＮＡ形質転換で、または他の公知の方法でアグロバクテリウムに転移することができる。シャトルベクターは、ＴｉまたはＲｉプラスミドあるいはその誘導体と中間プラスミドの間で相同性である配列による相同的組換えによってＴｉまたはＲｉプラスミドあるいはその誘導体に組込むことができる。それによってこの相同的組換え（すなわち、プラスミド組込み）イベントは、アグロバクテリウム内で改変シャトルベクターを安定に維持する手段を、複製の起点および共組込みプラスミドのＴｉまたはＲｉプラスミド部分によって提供される他のプラスミド維持機能と共に提供する。ＴｉまたはＲｉプラスミドはまた、Ｔ−ＤＮＡの転移に必要なｖｉｒ遺伝子を含むｖｉｒ領域も含む。ｖｉｒ領域を保有するプラスミドが、Ｔ−ＤＮＡ領域（右側および左側Ｔ−ＤＮＡ境界反復配列を含む）を欠失している変異ＴｉまたはＲｉプラスミド（ヘルパープラスミド）であることは、広く知られている。機能的ｖｉｒ遺伝子を有し、Ｔ領域および関連要素の全部または実質的に全部を欠損しているこのようなｐＴｉ誘導プラスミドを、本明細書ではヘルパープラスミドと記述的にいう。
【０００８】
スーパーバイナリー系は、シャトルベクター／相同的組換え系の特殊な例である（Ｋｏｍａｒｉらによって２００６年に、Methods in Molecular Biology (K.Wang, ed.) No.343:Agrobacterium Protocols, pp.15-41；およびKomori et al., 2007, Plant Physiol. 145:1155-1160に総説されている）。ＬＢＡ４４０４（ｐＳＢ１）株は、２つの独立複製プラスミド、ｐＡＬ４４０４およびｐＳＢ１を内部に有する（harbor）。ｐＡＬ４４０４は、（ＴｉプラスミドｐＴｉＡＣＨ５由来の）完全なｖｉｒ遺伝子セットを含有するが、Ｔ−ＤＮＡ領域を有していない（したがって、Ｔ−ＤＮＡ左側および右側境界反復配列を有していない）Ｔｉ−プラスミド誘導ヘルパープラスミドである。プラスミドｐＳＢ１は、ｐＴｉＢｏ５４２由来である追加の部分ｖｉｒ遺伝子セットを提供する。この部分ｖｉｒ遺伝子セットは、ｖｉｒＢオペロンおよびｖｉｒＣオペロン、ならびに遺伝子ｖｉｒＧおよびｖｉｒＤ１を含む。スーパーバイナリー系で使用されるシャトルベクターの一例は、ｐＳＢ１１であり、これは、植物細胞形質転換に予定されている遺伝子のための導入部位として働き、Ｔ−ＤＮＡ右側境界および左側境界反復配列領域に隣接しているクローニングポリリンカーを含有する。シャトルベクターｐＳＢ１１は、アグロバクテリウムでは独立して複製することができないが、ｐＳＢ１およびｐＳＢ１１に存在する共通配列同士の相同的組換えによってｐＳＢ１に組み込まれた場合には共組込みプラスミドとして安定に維持される。したがって、改変ｐＳＢ１１ベクターのＬＢＡ４４０４（ｐＳＢ１）に導入された完全改変Ｔ−ＤＮＡ領域は、２つの異なるアグロバクテリウムＴｉプラスミド源（ｐＴｉＡＣＨ５およびｐＴｉＢｏ５４２）由来であるＶｉｒタンパク質によって植物細胞に生産的に作用され、転移される。スーパーバイナリー系と共に用いられるアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）宿主株は、ＬＢＡ４４０４（ｐＳＢ１）である。スーパーバイナリー系は、単子葉植物種の形質転換において特に有用であることが証明されている。Hiei et al., (1994) Plant J., 6:271-282；およびIshida et al., (1996) Nat. Biotechnol.,14:745-750参照。
【０００９】
アグロバクテリウムＴｉプラスミドが内部に有するｖｉｒ遺伝子の他に、別の染色体にある病原性調節遺伝子（ｃｈｖ遺伝子と呼ばれる）が、アグロバクテリウム細胞と植物細胞の相互作用の特定の態様を調節することが公知であり、このように全体的な植物形質転換率に影響を及ぼす（Pan et al., 1995, Molec. Microbiol. 17:259-269）。病原性および付着に必要とされる染色体にある遺伝子の幾つかは、２９キロベースに及ぶ染色体座に一緒にまとめられている（Matthysse et al., 2000, Biochim. Biophys. Acta, 1490:208-212）。
【００１０】
植物を形質転換させるための多数の技術の他に、外来遺伝子と接触させる組織の型もまた変化させ得る。このような組織として、胚形成組織、カルス組織Ｉ型およびＩＩ型、胚軸および分裂組織を挙げ得るが、これらに限定されない。ほぼ全ての植物組織が、当業者の範囲内の適切な技術を使用して脱分化の間に形質転換させ得る。植物形質転換の分野の当業者には、多数の方法が形質転換植物の産生に利用できること、および多数の方法が種々の宿主植物種の間の生物学的相違に対応するために変更および特殊化し得ることが理解されるだろう。植物外植片（例えば、複数の葉、茎のセグメント、分裂組織、根だけではなく、プロトプラストまたは懸濁培養細胞）が、ＤＮＡの植物細胞へ転移のためのアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を用いて有利に培養できる。
【００１１】
カルス培養物
植物組織培養物は、ＤＮＡを植物細胞に転移するためのアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を用いて有利に培養し得、一般に、複数の器官片、例えば葉または根からなっていてもよいし、または特定の細胞型、例えば花粉または胚乳であってもよい全植物の無菌片から開始される。外植片の多数の特徴が、培養開始の効率に影響を及ぼすことが公知である。的確な条件が見出されるならば、どんな植物組織でも外植片として使用できると考えられる。一般に、より若く、より迅速に成長する組織（または発育の初期段階の組織）が、最も有効である。適切な培地で培養された外植片は、細胞の組織化されていない成長および分裂塊（カルス）を生じることができる。培養において、カルスは、定期的に新しい培地で継体培養することを条件として、多かれ少なかれ無期限に維持することができる。カルス形成中に、形態学（カルスは、通常、未分化実質細胞から構成される）および代謝の両方においてある程度の脱分化がある。
【００１２】
カルス培養物は、植物バイオテクノロジーにおいて極めて重要である。培地中の植物ホルモン比の操作は、苗条、根、または体細胞胚の発育をもたらすことができ、これらからその後に全植物を産生（再生）させることができる。カルス培養物はまた、細胞懸濁物を開始させるのにも使用でき、植物形質転換研究において種々様々な方法で使用される。
【００１３】
細胞懸濁培養物
カルス培養物は、大まかに言えば、２つのカテゴリー：コンパクトまたはフライアブル（friable）の中の１つに入る。コンパクトカルスでは、細胞は、密に凝集しており、これに対してフライアブルカルスでは、細胞は、相互にゆるく会合しているだけであり、カルスは柔らかくなり、容易にばらばらに砕ける。フライアブルカルスは、細胞懸濁培養物を形成するために接種材料を提供する。幾つかの植物種または特定の細胞型由来の外植片は、フライアブルカルスを形成しない傾向があり、細胞懸濁を開始することを困難にする。カルスの脆砕性は、時には、培地成分を操作することによって、反復継代培養することによって、または半固形培地（低濃度のゲル化剤を有する培地）で培養することによって改善することができる。フライアブルカルスを液体培地に入れ、次いで攪拌すると、単一の細胞および／または細胞の小塊が、培地に放出される。的確な条件下で、これらの放出細胞は、増殖と分裂を続け、最終的に細胞懸濁培養物を生成する。細胞懸濁物は、三角フラスコにバッチ培養物として比較的簡単に維持することができ、新しい培地に反復継代培養することによって増殖する。継代培養後に、細胞が分裂し、培養物のバイオマスが特徴的な方法で増加する。細胞懸濁培養物は、ＤＮＡを植物細胞に転移するためのアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）遺伝子を用いて有利に培養できる。
【００１４】
茎頂および分裂組織培養
苗条（これは、茎頂分裂組織を含有する）の先端は、インビトロで培養して、脇芽または不定芽のいずれかから苗条の塊を産生させることができ、ＤＮＡを植物細胞に転移するためのアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を用いて有利に培養できる。苗条分裂組織培養物は、穀類の再生に使用される（実生は、提供材料として使用できる）。
【００１５】
胚培養
胚は、カルス培養物または体細胞胚を生じさせるために外植片として使用できる。未成熟胚および成熟胚の両方が、外植片として使用できる。未成熟胚由来の胚形成カルスは、単子葉植物の再生において使用される組織であり、ＤＮＡを植物細胞に転移するためのアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を用いて有利に培養し得る。未成熟胚は、分化して全植物の組織および器官を産生することができるカルス細胞を生じるために細胞分裂できる無傷組織である。未成熟胚は、Ｎｅｕｆｆｅｒらの方法（1982, Growing maize for genetic purposes. In: Maize for Biological Research. W.F. Sheridan, Ed., UNIVERSITY PRESS, University of North Dakota, Grand Forks, ND）を使用して成熟トウモロコシ植物の受精した穂から、例えば受粉した植物から得ることができる。トウモロコシ由来の未成熟胚を単離するための典型的な方法は、ＧｒｅｅｎとＰｈｉｌｌｉｐｓによって記載されている（Crop Sci.,15:417-421(1976)）。未成熟胚は、好ましくは、無菌方法を使用して発生過程の穂から単離され、使用するまで滅菌培地中で保持される。未成熟胚の形質転換におけるアグロバクテリウムの使用は、ＳｉｄｏｒｏｖとＤｕｎｃａｎによって開示されており（2009, Methods in Molecular Biology: Transgenic Maize, vol.526 Chapter 4, M. Paul Scott(Ed.)）、米国特許第５，９８１，８４０号明細書に開示されている。
【００１６】
小胞子培養
半数体（haploid）組織は、花粉または葯を外植片として使用することによってインビトロで培養することができ、ＤＮＡを植物細胞に転移するためのアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を用いて有利に培養し得る。カルスと胚は、両方共に花粉から生じさせることができる。２つのアプローチが、培養物を半数体組織からインビトロで生成させるのに採用できる。第一の方法では、葯（花粉を包み込み、含む体細胞組織）を、固形培地で培養する。その後に成熟葯の裂開によって花粉由来の胚が生じる。葯の裂開は、的確な段階でのその単離と的確な培養条件の両方に依存する。幾つかの種では、自然裂開への依存は、葯の壁を切断することによって回避できる。第二の方法では、葯を液体培地で培養し、葯から放出された花粉を、胚を形成するために誘導できる。未成熟花粉も、発生過程の葯から抽出し、直接培養できる。
【００１７】
穀物（イネ、コムギ、オオムギおよびトウモロコシ）の多くは、花粉または葯の培養のための植物成長調節剤を補足した培地を必要とする。小胞子外植片からの再生は、直接胚形成によってまたはカルス段階およびその後の胚形成によって得ることができる。
【００１８】
半数体組織培養物も、雌性配偶体（胚珠）から開始することができる。幾つかの場合には、花粉または葯を使用する方法よりも効率的な方法がある。
【００１９】
半数体培養物から得られる植物は、半数体ではないかもしれない。これは、培養期間中の染色体倍加の結果である。多くの場合に半数体植物は、半数体組織からの再生の望まれる結果ではないので、染色体倍加（これは、コルヒチンのような化学薬品を用いて処理することによって誘導できる）が、好都合であり得る。このような植物は、同一半数体ゲノムの２つのコピーを含有するので、多くの場合、二ゲノム性半数体と呼ばれる。
【００２０】
ＤＮＡを植物細胞に転移するためのアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を用いた培養による前述の植物材料のいずれかの形質転換の後に、全植物は、適当な増殖条件および培地（これは、形質転換植物細胞の選択のための抗生物質または除草剤を含有していてもよい）に置いた後に感染植物材料から再生させてもよい。次いで、そのようにして得られる植物は、挿入ＤＮＡの存在について試験することができる。
【００２１】
細胞形質転換（植物細胞形質転換を包含する）は、特定の細胞で機能するだろう発現ベクターのコンストラクションを含んでいてもよい。このようなベクターは、調節要素（例えば、プロモーター）の制御下の遺伝子、または調節要素（例えば、プロモーター）に操作によって連結された遺伝子を含有するＤＮＡを含んでいてもよい。発現ベクターは、１つまたはそれ以上のこのような操作によって連結された遺伝子／調節要素の組み合わせを含有していてもよい。ベクター（１つまたは複数）は、プラスミドの形態であってもよく、単独でまたは他のプラスミドと組み合わせて使用して、導入遺伝子（１つまたは複数）を植物細胞の遺伝物質に組み込むために本明細書に記載の形質転換方法を使用して形質転換細胞を提供することができる。
【００２２】
植物細胞発現ベクターは、遺伝子マーカーを含有する形質転換細胞をネガティブ選択（すなわち、選択マーカー遺伝子を含んでいない細胞の増殖の阻止）によるかまたはポジティブ選択（すなわち、遺伝子マーカーによってコードされる産生物のスクリーニング）によるかいずれかによって回収することを可能にする調節要素（例えば、プロモーター）に操作によって連結された少なくとも１つの遺伝子マーカーを含んでいてもよい。植物形質転換に適した多数の選択マーカー遺伝子が、形質転換技術において周知であり、このような選択マーカー遺伝子として、例えば、抗生物質または除草剤であってもよい選択性化学薬剤を代謝解毒する酵素をコードする遺伝子、または阻害剤に感受性でない改変された標的をコードする遺伝子が挙げられる。幾つかのポジティブ選択方法も、当分野で公知である。したがって、個々に用いられる選択マーカー遺伝子は、形質転換細胞の選択を可能にし得、これに対して挿入ＤＮＡを含有していない細胞の増殖は、選択性化合物によって抑制することができる。特定の選択マーカー遺伝子の好みによる選択は、当業者の自由裁量であるが、選択マーカーとして機能できるだろう本明細書に列記していない任意の他の遺伝子だけでなく、以下の選択マーカーのいずれかを使用してもよい。選択マーカーの例として、カナマイシン、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、メトトレキセート、ホスフィノトリシン（ビアラホス）、グリホセート、イミダゾリノン類、スルホニル尿素類およびトリアゾロピリミジン系除草剤、例えばクロロスルフロン、ブロモキシニル、およびダラポンに対する抵抗性または耐性が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
選択マーカーの他に、レポーター遺伝子を使用することが望ましいものであり得る。ある場合には、レポーター遺伝子は、選択マーカー無しで使用してもよい。レポーター遺伝子は、典型的には受容生物または組織に増殖優位性を提供しない遺伝子である。レポーター遺伝子は、典型的には、若干の表現型の変化または酵素特性を提供するタンパク質をコードする。適当なレポーター遺伝子として、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ホタルルシフェラーゼ、または蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ、本質的に米国特許第７，９５１，９２３号明細書に開示されている）をコードするものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
利用する形質転換技術に関係なく、外来遺伝子は、ベクター中に植物プロモーターを含むことによって植物細胞中で外来遺伝子を発現するのに適合させた遺伝子転移ベクターに組み込むことができる。植物プロモーターの他に、種々様々な起源由来のプロモーターが、外来遺伝子を発現させるために植物細胞において効果的に使用できる。例えば、細菌起源のプロモーター、例えばオクトピンシンターゼプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、マンノピンシンターゼプロモーター；ウイルス起源のプロモーター、例えばカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーターおよび１９Ｓプロモーター、サトウキビ桿状ウイルス由来のプロモーターなどが使用され得る。植物由来のプロモーターとして、リブロース−１，６−ビスリン酸（ＲＵＢＰ）カルボキシラーゼ小サブユニット（ｓｓｕ）、β−コングリシニンプロモーター、ファゼオリンプロモーター、ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ヒートショックプロモーター、ＡＤＦ（アクチン脱重合因子）プロモーター、および組織特異的プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。プロモーターはまた、転写効率を改善し得るある一定のエンハンサー配列要素を含んでいてもよい。典型的なエンハンサーとして、アルコールデヒドロゲナーゼ１（ＡＤＨ１）イントロン１およびＡＤＨ１−イントロン６が挙げられるが、これらに限定されない。構成的プロモーター（constitutive promoter）を使用してもよい。構成的プロモーターは、ほぼ全ての細胞型においておよびほぼ全ての時間で連続的な遺伝子発現を指示する（例えば、アクチン、ユビキチン、ＣａＭＶ３５Ｓ）。組織特異的プロモーターは、特定の細胞または組織型、例えば葉または種子において遺伝子発現に関与する。使用され得る他のプロモーターの例として、特定の植物組織および器官で活性であるだけではなく植物の発育のある一定の段階の間に活性であるものが挙げられる。このようなプロモーターの例として、根特異的プロモーター、花粉特異的プロモーター、胚特的プロモーター、トウモロコシの毛特異的プロモーター、綿花特異的プロモーター、種子胚乳特異的プロモーターおよび師部特異的プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
ある一定の環境下では、誘導性プロモーターを使用することが望ましいものであり得る。誘導性プロモーターは、特定のシグナル、例えば：物理的刺激（例えば、ヒートショック遺伝子）；光（例えば、リブロース−ビス−リン酸１，５−カルボキシラーゼ）；ホルモン（例えば、グルココルチコイド）；抗生物質（例えば、テトラサイクリン）；代謝産物；およびストレス（例えば、干ばつ）に応じて遺伝子の発現に関与する。また、植物中で機能する他の望ましい転写および翻訳要素、例えば５’未翻訳リーダー配列、ならびに３’ＲＮＡ転写終止およびポリアデニル酸付加シグナル配列を使用してもよい。当分野で公知の任意の適当な植物特異的遺伝子転移ベクターを使用してもよい。
【００２６】
昆虫抵抗性（ＩＲ）形質を含む遺伝子組換え作物が、北米の至る所でトウモロコシおよびワタ植物において普及しており、これらの形質の使用は、全世界に広がりつつある。ＩＲ形質と除草剤耐性（ＨＴ）形質を兼ね備える商業的遺伝子組換え作物が、多数の種子会社によって開発されている。これらの組換え作物は、バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）（Ｂ.ｔ．）殺虫性タンパク質によって付与されるＩＲ形質と、ＨＴ形質、例えばアセトラクテートシンターゼ（ＡＬＳ）阻害剤、例えばスルホニル尿素類、イミダゾリノン類、トリアゾロピリミジン、スルホンアニリド類など、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）阻害剤、例えばビアラホス、グルホシネートなど、４−ヒドロキシピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）阻害剤、例えばメソトリオン、イソキサフルトールなど、５−エノールピルビニルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）阻害剤、例えばグリホセートなど、およびアセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）阻害剤、例えばハロキシホップ、キザロホップ、ジクロホップなどに対する耐性との組み合わせを含む。遺伝子組換えによって提供されるタンパク質が、除草剤化学分類、例えばフェノキシ酸系除草剤およびピリジルオキシ酢酸系オーキシン除草剤（国際公開第２００７／０５３４８２号参照）、またはフェノキシ酸系除草剤およびアリールオキシフェノキシプロピオン酸系除草剤（国際公開第２００５／１０７４３７号参照）に対する植物耐性を提供する別の例が公知である。ＩＲ形質によって多数の害虫問題をコントロールできることは、重要な商業製品概念であり、昆虫防除形質と雑草防除形質が同一植物において兼ね備えられると、この製品概念の利便性が高められる。また、改善された価値は、Ｂ.ｔ.殺虫性タンパク質によって付与されるＩＲ形質と、１つまたはそれ以上の追加ＨＴ形質、例えば前述のＨＴ形質と、さらに１つまたはそれ以上の追加入力形質（例えば、Ｂ.ｔ.誘導殺虫性タンパク質または他の殺虫性タンパク質によって付与される他の昆虫抵抗性、ＲＮＡｉなどのようなメカニズムによって付与される昆虫抵抗性、病害抵抗性、ストレス耐性、改善された窒素利用など）、または出力形質（例えば、高い油分含有量、健康的な油組成、栄養改善など）とを単一植物が兼ね備えることによって得てもよい。このような組み合わせは、従来の育種（例えば、育種スタック）によって得てもよいし、または複数の遺伝子の同時導入を含む新規な形質転換イベント（例えば、分子スタック）として一緒に得てもよい。利点として、生産者および／または消費者に副次的利益を提供する作物植物における害虫管理能力および改善された雑草防除が挙げられる。したがって、本開示の方法は、改良された作物品質の完全な農学的パッケージを含む形質と、任意の数の農学的問題を柔軟におよび費用効率的に管理する能力との組み合わせを有する形質転換植物を提供するのに使用できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２７】
【特許文献１】米国特許第４，９４５，０５０号明細書
【特許文献２】米国特許第５，１４１，１３１号明細書
【特許文献３】米国特許第５，３０２，５２３号明細書
【特許文献４】米国特許第５，４６４，７６５号明細書
【特許文献５】国際公開第８７／０６６１４号
【特許文献６】米国特許第５，４７２，８６９号明細書
【特許文献７】米国特許第５，３８４，２５３号明細書
【特許文献８】国際公開第９２／０９６９６号
【特許文献９】国際公開９３／２１３３５号
【特許文献１０】米国特許第５，１７７，０１０号明細書
【特許文献１１】米国特許第５，１０４，３１０号明細書
【特許文献１２】欧州特許出願公告第０１３１６２４号明細書
【特許文献１３】欧州特許出願第１２０５１６号号明細書
【特許文献１４】欧州特許出願公告第１５９４１８号明細書
【特許文献１５】欧州特許出願第１７６１１２号明細書
【特許文献１６】米国特許第５，１４９，６４５号明細書
【特許文献１７】米国特許第５，４６９，９７６号明細書
【特許文献１８】米国特許第５，４６４，７６３号明細書
【特許文献１９】米国特許第４，９４０，８３８号明細書
【特許文献２０】米国特許第４，６９３，９７６号明細書
【特許文献２１】欧州特許出願第１１６７１８号明細書
【特許文献２２】欧州特許出願第２９０７９９号明細書
【特許文献２３】欧州特許出願第３２０５００号明細書
【特許文献２４】欧州特許出願第６０４６６２号明細書
【特許文献２５】欧州特許出願第６２７７５２号明細書
【特許文献２６】欧州特許出願第０２６７１５９号明細書
【特許文献２７】欧州特許出願第０２９２４３５号明細書
【特許文献２８】米国特許第５，２３１，０１９号明細書
【特許文献２９】米国特許第５，４６３，１７４号明細書
【特許文献３０】米国特許第４，７６２，７８５号明細書
【特許文献３１】米国特許第５，００４，８６３号明細書
【特許文献３２】米国特許第５，１５９，１３５号明細書
【特許文献３３】欧州特許出願第１２０５１６号明細書
【特許文献３４】米国特許第５，９８１，８４０号明細書
【特許文献３５】米国特許第７，９５１，９２３号明細書
【特許文献３６】国際公開第２００７／０５３４８２号
【特許文献３７】国際公開第２００５／１０７４３７号
【非特許文献】
【００２８】
【非特許文献１】An et al, 1985, EMBO J., 4:277-284.
【非特許文献２】Fraley et al., 1986, Crit. Rev. Plant Sci., 4:1-46
【非特許文献３】Lee and Gelvin, 2008, Plant Physiol., 146:325-332
【非特許文献４】Gelvin, 2003, Microbiol. Molec. Biol. Rev., 67:16-37
【非特許文献５】Gelvin, 2009, Plant Physiol., 150:1665-1676
【非特許文献６】Tzfira and Citovsky, 2006,Curr. Opin. Biotechnol.,17:147-154
【非特許文献７】Komari et al., 2006, Methods in Molecular Biology (K. Wang, ed.) No.343:Agrobacterium Protocols, pp.15-41；
【非特許文献８】Komori et al., 2007, Plant Physiol., 145:1155-1160
【非特許文献９】Hiei et al., (1994) Plant J., 6:271-282
【非特許文献１０】Ishida et al., (1996) Nat. Biotechnol., 14:745-750
【非特許文献１１】Pan et al., 1995, Molec. Microbiol., 17:259-269
【非特許文献１２】Matthysse et al., 2000, Biochim. Biophys. Acta., 1490:208-212
【非特許文献１３】Neuffer et. Al., 1982, Growing maize for genetic purposes. In: Maize for Biological Research., W.F. Sheridan, Ed. UNIVERSITY PRESS, University of North Dakota, Grand Forks, ND
【非特許文献１４】Green and Phillips, Crop Sci., 15:417-421(1976)
【非特許文献１５】Sidorov & Duncan, 2009, Methods in Molecular Biology: Transgenic Maize, vol.526 Chapter 4, M.Paul Scott (Ed.)
【発明の概要】
【００２９】
植物細胞の形質転換方法を記載する。これらの方法は、植物細胞を、界面活性剤を含有する液体培地中でアグロバクテリウム細胞に曝露させることを含む。アグロバクテリウム細胞は、固形培地から擦り取ることができるし、または界面活性剤を含有する液体培地に懸濁させる前に液体増殖培地（liquid growth medium）で増殖させることができる。界面活性剤の濃度は、０．００１重量％〜０．０８重量％の範囲内にあることができる。界面活性剤は、非イオン性トリシロキサン界面活性剤であることができ、２つ以上の界面活性剤を使用できる。植物細胞は、トウモロコシ細胞であることができる。植物細胞は、アグロバクテリウム細胞に曝露させた後に連続光に曝露させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】界面活性剤ＢＲＥＡＫ−ＴＨＲＵ（登録商標）Ｓ２３３を、共培養の前に、アグロバクテリウム細胞（プラスミドｐＥＰＳ１０８３を内部に有する）の懸濁物を作成するために使用する感染培地に加える場合のトウモロコシ未成熟胚の形質転換の促進を表す棒グラフである。
【図２】界面活性剤ＢＲＥＡＫ−ＴＨＲＵ（登録商標）Ｓ２３３を、共培養の前に、アグロバクテリウム細胞の懸濁物を作成するために使用する感染培地に加える場合のトウモロコシ未成熟胚の形質転換の促進を表す棒グラフである。図２に示す各実験に使用したプラスミドは、以下を含む：実験１＝ｐＥＰＳ１０５３；ＧＯＩ＝ＩＰＴ、選択マーカー＝ａａｄ１。実験２＝ｐＥＰＳ１０３８；ＧＯＩ＝ＧＦ１４、選択マーカー＝ａａｄ１。実験３および実験４＝ｐＥＰＳ１０２７；ＧＯＩ無し、選択マーカー＝ａａｄ１。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
アグロバクテリウムを使用する場合の植物での形質転換率を増大させる方法が記載される。この方法は、植物細胞を、界面活性剤を含有する液体培地中でアグロバクテリウム細に曝露させることを含む。幾つかの方法は、植物細胞を、アグロバクテリウム細胞に曝露させた後に連続光に曝露させることを含む。これらの方法に有用な植物の例として、トウモロコシ植物および未成熟トウモロコシ胚が挙げられる。
【００３２】
アグロバクテリウムの菌株は、その種々の種の植物細胞を形質転換させる能力において相互に異なる。考慮されるアグロバクテリウム株／宿主植物の特定の組み合わせに関係なく、アグロバクテリウムは、形質転換中に宿主細胞への付着によって作用する。McCullen and Binns, 2006, Ann. Rev. Cell. Dev. Biol., 22:101-127；およびCitovsky et al., 2007, Cell. Microbiol., 9:9-20参照。このような理由で、植物細胞に対するアグロバクテリウム細胞の結合を高める方法、例えば界面活性剤を使用する本明細書に開示した方法は、形質転換効率の増大を生じ得る。植物細胞に対するアグロバクテリウム細胞の結合の促進は、種々の植物種のように種々の種および組織型について異なり、さらに単一種の植物の種々の組織は、これらの細胞壁の化学的および生化学的組成において異なることができる。さらに、このような相違はまた、単一の植物組織の種々の発育段階の間に変化し得る。
【００３３】
さらに、細菌の種々の属および種、実際には細菌種の種々の株は、多くの場合、これらの細胞壁の化学的および生化学的組成において異なり、これらの相違は、細菌増殖サイクルの間に変化することができる。したがって、本明細書に開示した方法による植物形質転換効率の増大は、界面活性剤がアグロバクテリウム細胞壁と植物細胞壁の間の疎水性反発相互作用を低下させる能力に起因し得、このようにして緊密な細胞−細胞相互作用を生じさせる。
【００３４】
したがって、高められた形質転換効率が観察し得るように植物組織の培養の種々の相の間に、種々のアグロバクテリウム株の細胞（およびこのような細胞の種々の増殖期）と種々の宿主植物の細胞および組織との間の細胞−細胞の相互作用を促進させるために種々の界面活性剤の間の化学的相違を利用し得る。
【００３５】
界面活性剤は、幾つかの化学分類に属し、植物形質転換の分野の当業者には、種々の化学分類の界面活性剤が、種々の植物宿主について植物形質転換効率を高めるのに使用され得ることが理解されるだろう。本明細書に開示した方法に有用なこれらの化学分類からの界面活性剤の例として、アジュバンド、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、油系界面活性剤、両性界面活性剤、および高分子界面活性剤が挙げられる。本明細書に記載の方法に有用な好ましい界面活性剤の例は、非イオン性トリシロキサン界面活性剤、例えばＥｖｏｎｉｋ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ(エッセン、独国）製のＢＲＥＡＫ−ＴＨＲＵ（登録商標）Ｓ２３３である。本明細書に記載の方法に有用な別の好ましい界面活性剤の例として、トリシロキサンアルコキシレート、エトキシル化ダイズ油、アルコールエトキシレートＣ−１３、Ｃ１２−Ｃ１４−アルキルジメチルベタイン、およびジ−ｓｅｃ−ブチルフェノールエチレンオキシド・プロピレンオキシドブロックコポリマーが挙げられる。表１に、本明細書に記載の方法を実施するのに使用され得る種々の化学タイプの界面活性剤の非限定的リストを示す。
【００３６】
【表１】
2015502156.tif 000002
2015502156.tif 000003
2015502156.tif 000004
本明細書に開示した方法は、アグロバクテリウム（例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens））による未成熟トウモロコシ胚のような植物において形質転換効率を劇的に高めるために界面活性剤の形質転換促進特性を利用する。本明細書に記載の方法について使用する界面活性剤は、上記で提案したように、形質転換効率を高めるだろう細胞−細胞の相互作用を促進する能力に基づいて選択される。液体培地の界面活性剤の濃度は、０．００１重量％〜０．０８重量％、０．００１重量％〜０．０７重量％、０．００１重量％〜０．０６重量％、０．００１重量％〜０．０５重量％、０．００１重量％〜０．０４重量％、０．００１重量％〜０．０３５重量％、０．００１重量％〜０．０３重量％、０．００１重量％〜０．０２５重量％、０．００１重量％〜０．０２重量％、０．００１重量％〜０．０１５重量％、０．００１重量％〜０．０１重量％、または０．００５重量％〜０．０１重量％であることができる。
【００３７】
１つまたはそれ以上の追加界面活性剤も、本明細書に記載の方法で使用することができる。示されるように、形質転換効率は、植物種および組織型ならびにアグロバクテリウム株を含め種々様々な因子に依存する。関係する相互作用の型を考慮に入れると、２つまたはそれ以上の界面活性剤の系が、高められた形質転換効率を提供することができる。２つまたはそれ以上の界面活性剤の系で使用される追加の界面活性剤を、例えば表１から選択することができる。
【００３８】
本明細書に記載の方法は、単子葉植物および双子葉植物を含め種々様々な植物種および品種に広く適用できる。重要な作物として、トウモロコシ、イネ、ダイズ、キャノーラ、ヒマワリ、アルファルファ、モロコシ、コムギ、ワタ、落花生、トマト、ジャガイモなどが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書の方法は、発育の種々の段階の細胞、例えば未成熟胚について使用できる。したがって、本明細書に記載の方法は、トウモロコシ未成熟胚を形質転換させるのに使用できる。本明細書に記載の方法で使用する未成熟胚のサイズは、変化させることができる。例えば、未成熟胚は、長さで１．５ｍｍ以上および２．５ｍｍ以下であることができる。
【００３９】
本明細書に記載の方法に従ってアグロバクテリウムに曝露後に細胞を維持する外部環境は、調節することができる。例えば、温度、ｐＨ、および本明細書に記載の方法に従って形質転換の後に細胞を置く増殖培地の他の成分は、変化させることができ、一般に当業者に周知である。これらの変数の１つは、光に対する曝露である。本明細書に記載の方法は、植物細胞を、一般的な１８時間の明／６時間の暗のプロトコールまたはあるいはアグロバクテリウム細胞に対する曝露後に連続光に曝露することを含むことができる。例えば、本明細書に記載の方法に従って処理された細胞は、処理後数週間、例えば植物標本の再生および小植物単離段階まで２４時間白色蛍光灯（white fluorescent light）条件に曝露させることができる。
【００４０】
さらなる方法は、界面活性剤を含有する液体培地を調製し、この液体培地にアグロバクテリウム細胞を懸濁させ、および植物細胞を、界面活性剤を含有する液体培地中でアグロバクテリウム細胞に曝露させることを含む。アグロバクテリウム細胞は、界面活性剤を含有する液体培地に懸濁させる前に固形培地から擦り取ることができる。さらに、アグロバクテリウム細胞は、界面活性剤を含有する液体培地に懸濁する前に液体増殖培地で増殖させることができる。
【００４１】
アグロバクテリウムを使用して植物を形質転換させるプロトコールおよび方法は、分子生物学の当業者には周知である。植物の形質転換におけるアグロバクテリウムの使用について公知の任意の型の方法が、本明細書に記載の方法と共に使用できる。以下の実施例は、本明細書に記載の方法の有効性を実証する方法の実施形態を提供するが、特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。
【００４２】
本明細書で言及または引用した全ての特許、特許出願、仮出願、および刊行物は、これらが本明細書の明示的な教示と矛盾しない程度までこれらの全体を参照することによって組み込まれる。
【実施例】
【００４３】
以下の実施例は、特許請求の範囲を実施するための手順を例証する。本明細書に記載の実施例および実施形態は、単に例示を目的とするものであり、これらを考慮した種々の変更または変化が、当業者には示唆されるだろうし、特許請求の精神および範囲内に含まれるべきである。特に明記しない限りは、％は、全て重量により、溶媒混合割合は、全て容量による。温度は、全て摂氏温度である。
【００４４】
実施例１
スーパーバイナリーベクターの生成のためのアグロバクテリウム形質転換
アグロバクテリウムスーパーバイナリー系は、単子葉植物宿主の形質転換に有利に使用される。スーパーバイナリーベクターを構築し、確証するための方法は、十分に開示されており、参照することにより本明細書に組み込まれる（日本たばこ産業株式会社（東京、日本）から入手できるプラスミドｐＳＢ１の操作マニュアル、バージョン３．１）。標準的な分子生物学的方法および微生物学的方法を使用して、スーパーバイナリープラスミドを生成させた。スーパーバイナリープラスミドの構造の検証／確認は、プラスミドｐＳＢ１の操作マニュアルに提案されている方法を使用して行った。
【００４５】
種々のスーパーバイナリープラスミドを内部に有するアグロバクテリウム株を、この研究で使用した。これらのプラスミドは全て、選択マーカー／除草剤耐性遺伝子としてＡＡＤ１タンパク質（米国特許第７，８３８，７３３号明細書）のコード配列（ＣＤＳ）を含有しており、その発現は、本質的に米国特許第５，６４１，８７６号明細書およびＧＥＮＢＡＮＫ（商標）登録番号ＥＵ１５５４０８．１に開示されているように、イネアクチン１プロモーターおよび関連イントロン１の転写制御下にあった。転写の終止およびａａｄ１ ｍＲＮＡのポリアデニル化は、本質的にＧＥＮＢＡＮＫ（商標）登録番号ｇｂ|Ｌ３５９１３．１|ＭＺＥＬＩＰＡＳＥの塩基９２１−１２７７として開示されおよび米国特許第７,１７９,９０２号明細書に開示されているように、トウモロコシリパーゼ３’ＵＴＲによって決定された。また、スーパーバイナリープラスミドは、発現が形質転換率に影響を及ぼすことが予期されていなかった遺伝子を内部に有していた。特に、プラスミドｐＥＰＳ１０８３では、ＹＦＰタンパク質（本質的に米国特許第７,９５１,９２３号明細書に開示されている）をコードするＣＤＳ（その転写は、関連イントロン１と共にトウモロコシユビキチン１プロモーターによって制御された；米国特許第５,５１０,４７４号明細書）、およびそのｍＲＮＡは、トウモロコシＰｅｒ５ ３’ＵＴＲ（米国特許第６,３８４,２０７号明細書）によって終止された）が、形質転換を監視し、相対形質転換効率を調べるためにビジュアル（visual）マーカーとして有利に使用された。ここで開示された方法を例証するのに使用した別のスーパーバイナリープラスミド（プラスミドｐＥＰＳ１０１３、ｐＥＰＳ１０１８、ｐＥＰＳ１０２８、ｐＥＰＳ１０３６、ｐＥＰＳ１０３８、ｐＥＰＳ１０５９、ｐＥＰＳ１０６４、ｐＥＰＳ１０６６、ｐＥＰＳ１０６８、ｐＥＰＳ６００４、およびｐＥＰＳ６００８）は、ダウアグロサイエンス（Ｄｏｗ  ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）所有権のタンパク質をコードするＣＤＳを内部に有しており、その発現は、ＹＦＰ  ＣＤＳについて使用したものと同じ転写／終止要素により制御された。
【００４６】
ＹＦＰの発現を使用して、幾つかの実験において形質転換の効率を測定した。形質転換効率％は、処理した胚の数で除算し、１００倍した、ＹＦＰの発現を示したカルスの数として算出した。ＹＦＰの発現は、蛍光顕微鏡オリンパスＳＺＸ１２（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｉｎｃ．；Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ、ＰＡ）またはライカＭ１６５ＦＣ（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．；Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）を使用して、５１４ｎｍでの励起および５２７ｎｍで測定される発光の範囲をカバーするＹＦＰフィルターを用いて視覚観察により測定した。
【００４７】
ＹＦＰ遺伝子を欠損しているスーパーバイナリープラスミドを内部に有するアグロバクテリウム株を用いた別の実験では、形質転換効率は、ハロキシホップに対する抵抗性によって選択された胚から産生された後代植物のＴＡＱＭＡＮ（登録商標）分析（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に従って算出した。使用したＴＡＱＭＡＮ（登録商標）要素は、ａａｄ１コード領域に特異的であった。形質転換効率は、決定され、処理した胚の数で除算し、１００倍したＴＡＱＭＡＮ（登録商標）−陽性イベントの数から算出した。この目的の「イベント」は、１つまたはそれ以上のＴＡＱＭＡＮ（登録商標）検証植物を産生した胚であるとみなした。個々の胚は、どのくらい多くの植物が産生され得るかに関係なく１つのイベントであるとみなした。
【００４８】
実施例２
アグロバクテリウム株によるトウモロコシの形質転換（形質転換プロトコール１）
基本的な研究の流れを以下の通りに要約する。幼若胚が長さで約１.４〜１.９ｍｍである発育段階のトウモロコシの未成熟穂から、胚を取り出す。種々の形質転換条件を比較する場合には、単一の穂から単離された胚のほぼ同じ数の胚を、全ての処理の間で分ける。胚を、アグロバクテリウム細胞を含有し、界面活性剤を含有する（または、比較のために含有していない）懸濁物と共にインキュベートし、次いで固形培地プレートに移し、３〜５日間共培養する。処理した胚を、抗生物質（アグロバクテリウム細胞の抑制および殺滅のため）と、遺伝的に形質転換されたトウモロコシ組織および植物の選択的単離用の化合物とを含有する培地に移す。トウモロコシ組織（通常は、カルスであるが、これに限定されない）を、選択培地で植物が再生されるまで成長させる。これらの植物を、これらの遺伝形質転換を確認するために試験し、所定の改変（modification）を有する植物を種子生産のために成熟まで成長させる。
【００４９】
未成熟胚産生
同系交配Ｂ１０４由来の種子を、ＳＵＮＳＨＩＮＥ  ＣＵＳＴＯＭ  ＢＬＥＮＤ  １６０（ＳＵＮ  ＧＲＯ  ＨＯＲＴＩＣＵＬＴＵＲＥ；Ｂｅｌｌｅｖｕｅ、ＷＡ）を入れてある４ガロンのポットに植えた。高圧ナトリウムランプとメタルハライドランプの組み合わせを使用して温室で１６時間：８時間の明：暗光周期を用いて、植物を成長させた。形質転換用の未成熟胚を得るために、制御された同胞受粉を行った。未成熟胚を、受粉後１０〜１３日で単離した。その時の胚は、大きさで約１.４〜１.９ｍｍであった。トウモロコシの穂を、ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０（５００ｍＬ当たり１滴または２滴）と共に５０％市販漂白剤（ＣＬＯＲＯＸ（登録商標）、５.２５％次亜塩素酸ナトリウム）に１０分間浸すことによって殻皮と毛を取り除いた後に表面滅菌し、滅菌水で３回洗浄した。
【００５０】
未成熟胚を、懸濁アグロバクテリウム細胞を有する感染培地２ｍＬと必要に応じて界面活性剤とを入れた微小遠心分離管に直接に無菌単離した。この胚を、界面活性剤を含有する（または、対照実験については含有していない）アグロバクテリウム細胞の懸濁物と共に５〜３０分間インキュベートした。
【００５１】
スーパーバイナリーベクターを含有するアグロバクテリウム細胞の懸濁物を、最初に、菌叢として前記細胞を、ＹＥＰ（ｇｍ／Ｌ：酵母抽出液、５；ペプトン、１０；ＮａＣｌ、５；寒天、１５）を５０ｍｇ／Ｌ スペクチノマイシン；１０ｍｇ／Ｌ リファンピシン；および５０ｍｇ／Ｌ ストレプトマイシンと共に含有する固形寒天プレートで、２５℃で４日間増殖させるかまたは２８℃で３日間増殖させることにより調製した。（幾つかの実験では、アグロバクテリウム細胞を、固形ＬＢ培地（ＳＩＧＭＡ  ＡＬＤＲＩＣＨ；セントルイス、ＭＯ）２０ｇｍ／Ｌで、上記の抗生物質と共に増殖させた）。この培養物は、同一条件下で確立された単一コロニー分離株から画線した。１または２白金耳量の細胞を、前記菌叢から擦り取り、次いで感染培地（Infection Medium）（ＩｆＭ）に６００ｎｍで０．３５〜０．４５の光学密度（ＯＤ６００）まで（穏やかに上下にピペット操作することによって）均一に再懸濁させた。感染培地は、ｐＨ５．２で、４.３３ｇｍ／Ｌ ＭＳ塩；１Ｘ ＩＳＵ変性ＭＳビタミン；６８．４ｇｍ／Ｌ スクロース；３６ｇｍ／Ｌ グルコース；７００ｍｇ／Ｌ Ｌ−プロリン；３．３ｍｇ／Ｌ ジカンバ−ＫＯＨ；および１００μＭ アセトシリンゴン（ＤＭＳＯ中で調製した）を含有する。実験に応じて、適量の界面活性剤溶液（例えば、最終濃度０．０１％のＢＲＥＡＫ−ＴＨＲＵ（登録商標）Ｓ２３３）を、細胞を懸濁させた後の感染培地に加えた。
【００５２】
アグロバクテリウムと胚の溶液を、室温で５〜３０分間インキュベートし、次いで胚を共培養培地に移した。共培養培地は、ｐＨ５.８で、４.３３ｇｍ／Ｌ ＭＳ塩；１Ｘ ＩＳＵ変性ＭＳビタミン；３０ｇｍ／Ｌ スクロース；７００ｍｇ／Ｌ Ｌ−プロリン；１００ｍｇ／Ｌ ｍｙｏ−イノシトール；３.３ｍｇ／Ｌ ジカンバ−ＫＯＨ；１００ｍｇ／Ｌ カゼイン酵素加水分解物；１５ｍｇ／Ｌ ＡｇＮＯ３；１００μＭ アセトシリンゴン；および３ｇｍ／Ｌ ＧＥＬＺＡＮ（商標）を含有する。共培養インキュベーションは、２４時間白色蛍光灯（約５０μＥｍ−２ｓ−１）の下で、２５℃で３〜４日間であった。
【００５３】
休止および選択
共培養後に、胚（３６個の胚／プレート）を、ｐＨ５．８で４.３３ｇｍ／Ｌ ＭＳ塩；１Ｘ ＩＳＵ変性ＭＳビタミン；３０ｇｍ／Ｌ スクロース；７００ｍｇ／Ｌ Ｌ−プロリン；ＫＯＨ中３.３ｍｇ／Ｌ ジカンバ−；１００ｍｇ／Ｌ ｍｙｏ−イノシトール；１００ｍｇ／Ｌ カゼイン酵素加水分解物；１５ｍｇ／Ｌ ＡｇＮＯ３；０.５ｇｍ／Ｌ ＭＥＳ；２５０ｍｇ／Ｌ カルベニシリン；および２.３ｇｍ／Ｌ ＧＥＬＺＡＮ（商標）を含有する新しい非選択休止培地に注意深く移した。インキュベーションを、２４時間白色蛍光灯（約５０μＥｍ−２ｓ−１）の中で、２８℃で７日間続けた。
【００５４】
７日の休止期間の後に、胚を選択培地に移した。植物で発現可能なａａｄ１選択マーカー遺伝子を含有するスーパーバイナリープラスミドを用いて形質転換させたトウモロコシ組織の選択のために、胚（３６個/プレート）を、最初に選択培地Ｉに移した。この選択培地Ｉは、１００ｎＭ Ｒ−ハロキシホップ酸（０.０３６２ｍｇ／Ｌ）を含有する休止培地（Resting Medium）（上記）を含んでいた。胚を、１週間インキュベートし（２８℃；連続光）、次いで５００ｎＭ Ｒ−ハロキシホップ酸（０.１８１０ｍｇ／Ｌ）を有する休止培地を含んだ選択培地ＩＩに移し、そこで胚を連続光の下でさらに７日間インキュベートした。この時点で、胚を新しい選択培地ＩＩに移し、インキュベーションをさらに１週間上記のように続けた。
【００５５】
トウモロコシ形質転換の当業者には、別の植物で発現可能な選択マーカー遺伝子（例えば、除草剤耐性遺伝子）を使用する場合には別の形質転換植物の選択方法が利用できることが理解されるだろう。
【００５６】
予備再生（Pre-regeneration）
選択プロセスの後に、培養物を、ｐＨ５．８で、４.３３ｇｍ／Ｌ ＭＳ塩；１Ｘ ＩＳＵ変性ＭＳビタミン；４５ｇｍ／Ｌ スクロース；３５０ｍｇ／Ｌ Ｌ−プロリン；１００ｍｇ／Ｌ ｍｙｏ−イノシトール；５０ｍｇ／Ｌ カゼイン酵素加水分解物；１．０ｍｇ／Ｌ ＡｇＮＯ３；０.２５ｇｍ／Ｌ ＭＥＳ；ＮａＯＨ中０.５ｍｇ／Ｌ ナフタレン酢酸；エタノール中２.５ｍｇ／Ｌ アブシシン酸；１ｍｇ／Ｌ ６−ベンジルアミノプリン；２５０ｍｇ／Ｌ カルベニシリン；および２.５ｇ／Ｌ ＧＥＬＺＡＮ（商標）を含有する予備再生培地に移した。インキュベーションを、上記のように連続白色蛍光灯の下で、２８℃で７日間続けた。
【００５７】
再生および小植物体単離
再生のために、培養物を、ｐＨ５．８で４.３３ｇｍ／Ｌ ＭＳ塩；１Ｘ ＩＳＵ変性ＭＳビタミン；６０ｇｍ／Ｌ スクロース；１００ｍｇ／Ｌ ｍｙｏ−イノシトール；１２５ｍｇ／Ｌ カルベニシリン；２.５ｇｍ／Ｌ ＧＥＬＺＡＮ（商標）；および５００ｎＭ Ｒ−ハロキシホップ酸を含有する再生培地に移し、小植物体を、連続白色蛍光灯の下で、２８℃で３週間、再生させ、成長させた。
【００５８】
小植物体が適当な成長段階に達した際に、これを鉗子とメスを用いて切り出し、ｐＨ５．８で４.３３ｇｍ／Ｌ ＭＳ塩；１Ｘ ＩＳＵ変性ＭＳビタミン；３０ｇｍ／Ｌ スクロース；１００ｍｇ／Ｌ ｍｙｏ−イノシトール；３.０ｇｍ／Ｌ ＧＥＬＺＡＮ（商標）を含有する再生培地ＩＩに移し、前記のように連続白色蛍光の下で、２８℃でインキュベートして、苗条と根のさらなる成長と発育を可能にさせた。
【００５９】
種子生産
植物を、ＭＥＴＲＯ−ＭＩＸ ３６０無土壌生育培地（soilless growing medium）（ＳＵＮ  ＧＲＯ  ＨＯＲＴＩＣＵＬＴＵＲＥ；ＢＥＬＬＥＶＵＥ、ＷＡ）に移し、生育室内で寒気にさらして強くした。次いで、植物を、ＳＵＮＳＨＩＮＥ  ＣＵＳＴＯＭ  ＢＬＥＮＤ  １６０土壌混合物に移植し、温室で開花まで成長させた。種子生産のための制御された受粉を行った。
【００６０】
実施例３
アグロバクテリウム株によるトウモロコシの形質転換（形質転換プロトコール２）
基本的な研究の流れを以下の通りに要約する。幼若胚が長さで約１.８〜２．４ｍｍである発育段階のトウモロコシの未成熟穂から、胚を取り出す。種々の形質転換条件を比較する場合には、単一の穂から単離された胚のほぼ同じ数の胚を、処理全ての間で分ける。胚を、アグロバクテリウム細胞を含有し、界面活性剤を含有する（または、比較のために含有していない）懸濁物と共にインキュベートし、次いで固形培地プレートに移し、１〜４日間共培養する。処理した胚を、抗生物質（アグロバクテリウム細胞の抑制および殺滅のため）と、遺伝的に形質転換されたトウモロコシ組織および植物の選択的単離用の化合物とを含有する培地に移す。トウモロコシ組織（通常は、カルスであるが、これに限定されない）を、選択培地で植物が再生されるまで成長させる。これらの植物を、これらの遺伝的形質転換を確認するために試験し、所定の改変を有する植物を種子生産のために成熟まで成長させる。
【００６１】
未成熟胚産生
トウモロコシ同系交配系Ｂ１０４（１９８０年代初頭に商業発売されたアイオワ州品種）由来の種子を、ＳＵＮＳＨＩＮＥ  ＣＵＳＴＯＭ  ＢＬＥＮＤ  １６０（ＳＵＮ  ＧＲＯ  ＨＯＲＴＩＣＵＬＴＵＲＥ；Ｂｅｌｌｅｖｕｅ、ＷＡ）を入れてある４ガロンのポットに植えた。高圧ナトリウムランプとメタルハライドランプとの組み合わせを使用して温室で１６時間：８時間の明：暗光周期を用いて、植物を成長させた。形質転換用の未成熟胚を得るために、制御された同胞受粉を行った。未成熟胚を、受粉後１０〜１３日で単離した。その時の胚は、大きさで約１.８〜２．４ｍｍであった。トウモロコシの穂を、ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０（５００ｍＬ当たり１滴または２滴）と共に５０％市販漂白剤（ＣＬＯＲＯＸ（登録商標）、６.１５％次亜塩素酸ナトリウム）に１０分間浸すことによって殻皮と毛を取り除いた後に表面滅菌し、滅菌水で３回洗浄した。
【００６２】
別法として、トウモロコシの穂は、新たに調製した７０％エタノール溶液を用いて穂が完全に浸されるまで噴霧することによって表面滅菌することができる。使用前に、穂を滅菌トランスファーフード内で１時間半風乾してエタノール溶液を完全に蒸発させる。
【００６３】
未成熟胚を、懸濁アグロバクテリウム細胞を有する感染培地２ｍＬと必要に応じて界面活性剤とを入れた微小遠心分離管に直接に無菌単離した。この胚を、界面活性剤を含有する（または、対照実験ついては含有していない）アグロバクテリウム細胞の懸濁物と共に５〜３０分間インキュベートした。
【００６４】
スーパーバイナリーベクターを含有するアグロバクテリウム細胞の懸濁物を、最初に、細胞を５０ｍｇ／Ｌ スペクチノマイシン；１０ｍｇ／Ｌ リファンピシン；および５０ｍｇ／Ｌ ストレプトマイシンを含有するＬＢ培地（ＳＩＧＭＡ  ＡＬＤＲＩＣＨ；セントルイス、ＭＯ）２０ｇｍ／Ｌの１２５ｍＬ中で（２５０ｍＬバッフル付フラスコ中で）、２５℃で６時間振盪させながら（暗中２５０ｒｐｍ）増殖させることによって調製した。この培養物は、２５ｍＬのオーバーナイト培養物（同じ培地で増殖させた）を、新しい培地に１：５希釈することによって確立された。細胞を、３６００ｒｐｍで、４℃で１５分間遠心分離することによってペレット化し、次いで接種培地（Inoculation Medium）（ＩｎＭ）に６００ｎｍで約１．０の光学密度（ＯＤ６００）まで（穏やかに上下にピペット操作することによって）均一に再懸濁させた。接種培地は、ｐＨ５．２で２.２ｇｍ／Ｌ ＭＳ塩（Frame et al., 2011, Genetic Transformation Using Maize Immature Zygotic Embryos. In Plant Embryo Culture Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology., T.A. Thorpe and E.C. Yeung,(Eds), Springer Science and Business Media, LLC. pp327-341）;１Ｘ ＩＳＵ変性ＭＳビタミン(Frame et al.,2011 上記)；６８.４ｇｍ／Ｌ スクロース；３６ｇｍ／Ｌ グルコース；１１５ｍｇ／Ｌ Ｌ−プロリン；１００ｍｇ／Ｌ ｍｙｏ−イノシトール；および２００μＭ アセトシリンゴン（ＤＭＳＯ中で調製した）を含有する。実験に応じて、適量の界面活性剤溶液（例えば、最終濃度０．０１％のＢＲＥＡＫ−ＴＨＲＵ（登録商標）Ｓ２３３）を、細胞を懸濁させた後の感染培地に加えた。
【００６５】
アグロバクテリウムと胚の溶液を、室温で５〜１５分間インキュベートし、次いで胚を共培養培地に移した。共培養培地は、ｐＨ５．８で、４.３３ｇｍ／Ｌ ＭＳ塩；１Ｘ ＩＳＵ変性ＭＳビタミン；３０ｇｍ／Ｌ スクロース；７００ｍｇ／Ｌ Ｌ−プロリン；ＫＯＨ中３．３ｍｇ／Ｌ ジカンバ（３，６−ジクロロ−ｏ−アニス酸または３，６−ジクロロ−２−メトキシ安息香酸）；１００ｍｇ／Ｌ ｍｙｏ−イノシトール；１００ｍｇ／Ｌ カゼイン酵素加水分解物；１５ｍｇ／Ｌ ＡｇＮＯ３；ＤＭＳＯ中１００μＭ アセトシリンゴン；および３ｇｍ／Ｌ ＧＥＬＺＡＮ（商標）（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）を含有していた。共培養インキュベーションは、連続白色蛍光灯（約５０μＥｍ−２ｓ−１）の下で、２５℃で３〜４日間であった。
【００６６】
休止および選択
共培養後に、胚（３６個の胚／プレート）を、ｐＨ５．８で４.３３ｇｍ／Ｌ ＭＳ塩；１Ｘ ＩＳＵ変性ＭＳビタミン；３０ｇｍ／Ｌ スクロース；７００ｍｇ／Ｌ Ｌ−プロリン；ＫＯＨ中３.３ｍｇ／Ｌ ジカンバ；１００ｍｇ／Ｌ ｍｙｏ−イノシトール；１００ｍｇ／Ｌ カゼイン酵素加水分解物；１５ｍｇ／Ｌ ＡｇＮＯ３；０.５ｇｍ／Ｌ ＭＥＳ（（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸一水和物（ＰＨＹＴＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ  ＬＡＢＲ．；Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ））；２５０ｍｇ／Ｌ カルベニシリン；および２.３ｇｍ／Ｌ ＧＥＬＺＡＮ（商標）を含有する非選択休止培地に注意深く移した。インキュベーションを、前記のように連続白色蛍光灯条件で、２８℃で７日間続けた。
【００６７】
７日の休止期間の後に、胚を選択培地に移した。植物で発現可能なａａｄ１選択マーカー遺伝子を含有するスーパーバイナリープラスミドを用いて形質転換させたトウモロコシ組織の選択のために、胚（１８個の胚／プレート）を、最初に、休止培地（上記）からなり、１００ｎＭ Ｒ−ハロキシホップ酸（０.０３６２ｍｇ／Ｌ）を含有する選択培地Ｉに移した。胚を、１週間インキュベートし、次いで選択培地ＩＩ（これは、休止培地（上記）からなり、５００ｎＭ Ｒ−ハロキシホップ酸（０.１８１０ｍｇ／Ｌ）を有する）に移し、そこでさらに２週間インキュベートした。形質転換分離株が、２４時間白色蛍光灯（約５０μＥｍ−２ｓ−１）条件下で、２８℃で約４〜６週間にわたって得られた。回収した分離株は、再生の開始および更なる分析のための新しい予備再生培地に移した。
【００６８】
トウモロコシ形質転換の当業者には、別の植物で発現可能な選択マーカー遺伝子（例えば、除草剤耐性遺伝子）を使用する場合には別の形質転換植物の選択方法が利用できることが理解されるだろう。
【００６９】
予備再生
選択プロセスの後に、培養物を、ｐＨ５．８で４.３３ｇｍ／Ｌ ＭＳ塩；１Ｘ ＩＳＵ変性ＭＳビタミン；４５ｇｍ／Ｌ スクロース；３５０ｍｇ／Ｌ Ｌ−プロリン；１００ｍｇ／Ｌ ｍｙｏ−イノシトール；５０ｍｇ／Ｌ カゼイン酵素加水分解物；１．０ｍｇ／Ｌ ＡｇＮＯ３；０.２５ｇｍ／Ｌ ＭＥＳ；ＮａＯＨ中０.５ｍｇ／Ｌ ナフタレン酢酸；エタノール中２.５ｍｇ／Ｌ アブシシン酸；１ｍｇ／Ｌ ６−ベンジルアミノプリン；２５０ｍｇ／Ｌ カルベニシリン；２.５ｇｍ／Ｌ ＧＥＬＺＡＮ（商標）および５００ｎＭ Ｒ−ハロキシホップ酸を含有する予備再生培地に移した（カルス６〜８個／プレート）。インキュベーションを、連続白色蛍光灯（約５０μＥｍ−２ｓ−１）の下で、２８℃で７〜１４日間続けた。
【００７０】
再生および小植物体単離
再生のために、培養物を、ｐＨ５．８で４.３３ｇｍ／Ｌ ＭＳ塩；１Ｘ ＩＳＵ変性ＭＳビタミン；６０ｇｍ／Ｌ スクロース；１００ｍｇ／Ｌ ｍｙｏ−イノシトール；１２５ｍｇ／Ｌ カルベニシリン；３.５ｇｍ／Ｌ ＧＥＬＬＡＮ  ＧＵＭ  Ｇ４３４（ＰＨＹＴＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ  ＬＡＢＲ．）；および５００ｎＭ Ｒ−ハロキシホップ酸を含有する一次再生培地に移し（最大でＰＨＹＴＡＴＲＡＹ（商標）（ＰＨＹＴＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ  ＬＡＢＲ．）当たりカルス１２個）、小植物体を、最大３週間まで再生させ、成長させた。
【００７１】
小植物体が長さで３〜５ｃｍに達した際に、これを、ｐＨ５．８で４.３３ｇｍ／Ｌ ＭＳ塩；１Ｘ ＩＳＵ変性ＭＳビタミン；３０ｇｍ／Ｌ スクロース；１００ｍｇ／Ｌ ｍｙｏ−イノシトール；３.５ｇｍ／Ｌ ＧＥＬＬＡＮ  ＧＵＭ  Ｇ４３４；およびＮａＯＨ中０．５ｍｇ／Ｌ インドール酢酸を含有する植物生育培地に移し、苗条と根のさらなる成長および発育を可能にさせた。
【００７２】
種子生産
植物を、ＭＥＴＲＯ−ＭＩＸ３６０無土壌生育培地（ＳＵＮ  ＧＲＯ  ＨＯＲＴＩＣＵＬＴＵＲＥ；ＢＥＬＬＥＶＵＥ、ＷＡ）に移植し、生育室内で寒気にさらして強くした。次いで、植物を、ＳＵＮＳＨＩＮＥ  ＣＵＳＴＯＭ  ＢＬＥＮＤ  １６０土壌混合物に移植し、温室で開花まで成長させた。種子生産のための制御された受粉を行った。
【００７３】
実施例４
液体培地で増殖させたアグロバクテリウム細胞を使用する形質転換効率
アグロバクテリウムスーパーバイナリー株ＬＢＡ４４０４（ｐＥＰＳ１０８３）を使用して、トウモロコシ未成熟胚を実施例２（形質転換プロトコール１）に開示した方法で形質転換させた。アグロバクテリウム細胞をＹＥＰ寒天プレートから擦り取り、感染培地（ＩｆＭ）に再懸濁させた場合に得られる形質転換効率について、液体培地ＬＢで増殖させ、遠心分離により収集し、ＩｆＭに再懸濁させたアグロバクテリウム細胞を使用して同時に行った実験と対比して比較を行った。比較形質転換効率は、前記プロセスの種々の段階で、形質転換実験の開始後１〜５週間目に処理組織片の黄色蛍光スポット（ＹＦＰ+）の数をカウントすることによって測定した。表２に、得られた結果を要約する。
【００７４】
【表２】
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表２に要約した結果は、液体培地から新たに収集したアグロバクテリウム細胞を使用するトウモロコシ胚の感染は、寒天プレートから擦り取った細胞を使用して得られる形質転換効率よりも著しく高い形質転換効率を提供することを実証する。
【００７５】
実施例５
形質転換プロトコール１に対する界面活性剤の添加による形質転換効率の向上
アグロバクテリウムスーパーバイナリー株ＬＢＡ４４０４（ｐＤＡＢ１０８６５２）を使用して、実施例２に開示した方法でトウモロコシ未成熟胚を形質転換させた。プラスミドｐＤＡＢ１０８６５２は、ＹＦＰコード領域を含有し（その発現は、ＺｍＵｂｉｌプロモーターによって駆動される）、イネアクチン１プロモーターの発現制御下でａａｄ１除草剤耐性コード領域も内部に有する。アグロバクテリウム細胞を、界面活性剤を欠損しているＩｆＭに懸濁した場合に得られる形質転換効率について、添加界面活性剤ＢＲＥＡＫ−ＴＨＲＵ（登録商標）Ｓ２３３を種々の濃度で含有するＩｆＭを用いて同時に行った実験と対比して比較を行った。形質転換効率は、ハロキシホップ選択の４週間後に蛍光セクター（各カルスは、単一の胚から生じる）を用いてカルスをカウントすることによって算出した。この時点では、蛍光セクターが大きく、したがって組織は、安定に形質転換されたセクターを表した。表３に要約した結果は、界面活性剤の使用は、形質転換効率を増大させること、および使用した界面活性剤の濃度に対して増大効果の感受性があることを実証する。
【００７６】
【表３】
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アグロバクテリウムスーパーバイナリー株ＬＢＡ４４０４（ｐＥＰＳ１０８３）を使用して、トウモロコシ未成熟胚を実施例２（形質転換プロトコール１）に開示した方法で形質転換させた。アグロバクテリウム細胞を、界面活性剤を欠損しているＩｆＭに懸濁させた場合に得られる形質転換効率について、ＩｆＭ中で添加界面活性剤の存在下で同時に行った実験と対比して比較を行った。比較形質転換効率は、前記プロセスの種々の段階で、形質転換実験の開始後１〜５週間目に、処理した組織片の黄色蛍光スポット（ＹＦＰ+）の数をカウントすることによって測定した。表４に、得られた結果を要約する。
【００７７】
幾つかの実験では、アグロバクテリウム細胞を、懸濁および穏やかな遠心分離による共培養段階の前にＩｆＭ（界面活性剤を有するか、または有していない）で洗浄した（表４では「洗浄」）。さらに、実験５（表４）では、（実施例２で明記したような１００μＭよりもむしろ）２００μＭアセトシリンゴンを使用してｖｉｒ遺伝子発現を誘導し、アグロバクテリウム細胞を、ＹＥＰ培地よりもむしろ適切な抗生物質を有するＬＢ培地のプレートで増殖させた。
【００７８】
【表４】
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表４に要約した実験は、固形培地プレートから擦り取ったアグロバクテリウム細胞を再懸濁させるために使用した感染培地に界面活性剤ＢＲＥＡＫ−ＴＨＲＵ（登録商標）Ｓ２３３を存在させると、未成熟胚の形質転換効率を劇的に増大させることを明確に示す。さらにまた、界面活性剤ＴＡＣＴＩＣ（商標）は、形質転換効率を高めることに対して陽性ではあるが劇的ではない効果を有する。
【００７９】
この開示の方法の別の例証では、未成熟トウモロコシ胚を、実施例２の方法でアグロバクテリウム株ＬＢＡ４４０４（ｐＥＰＳ１０８３）の細胞を用いて形質転換させた。形質転換効率を、未成熟胚から発育するカルスのＹＦＰ＋スポットまたはセクターの出現によってモニターした。図１の左側には、固体寒天プレートから擦り取ったアグロバクテリウム細胞を使用する５つの実験（実験１〜５）を示し、図１の右側には、アグロバクテリウム細胞を液体増殖培地から収集した３つの実験（実験６〜９）の結果を示す。一体とした実験１〜５では、形質転換効率は、収集した穂の９個全て（１００％）からの胚では増大し、形質転換効率の増大は、上記９個の穂のうちの６個の穂（６７％）からの胚では統計学的に有意であった（フィッシャーの正確確率ｐ＜−０．０５）。一体とした実験６〜９（液体増殖させたアグロバクテリア）では、収集した穂の８個全て（１００％）からの胚は、形質転換効率において統計学的に有意な増大を示した。したがって、図１に要約した結果から、感染培地に対するＢＲＥＡＫ−ＴＨＲＵ（登録商標）Ｓ２３３の添加は、トウモロコシ未成熟胚の形質転換効率を劇的に増大させ、幾つかの場合においては９０％を超える形質転換効率をもたらすことが明らかである。
【００８０】
この開示の方法の別の例証では、未成熟トウモロコシ胚を、実施例２の方法で種々のプラスミド（これらは全て、ａａｄ１選択マーカー遺伝子を含有していた）を内部に有するアグロバクテリウム株ＬＢＡ４４０４の細胞を用いて形質転換させた。前の通りに、実験処理は、０.０１％界面活性剤ＢＲＥＡＫ−ＴＨＲＵ（登録商標）Ｓ２３３を使用した形質転換効率または使用しない形質転換効率を比較した。胚を再生させ、植物産生に対するハロキシホップ選択による方法全てを採用した。このように、データは、図１に要約した段階よりも実質的に後の段階で収集した。形質転換効率％は、遺伝子組換え植物（「イベント）」）を産生した胚の数を、処理した未熟胚の数で除算し、１００倍することによって算出した。このために、胚は、複数の遺伝子組換え植物を産生した場合でも、単一のイベントとしてカウントした。寒天プレートから擦り取ったアグロバクテリウム細胞を使用する３つの実験の結果を、図２（実験１、２および３）に示す。また、図２に、アグロバクテリウム細胞を液体培地で増殖させ、遠心分離により収集し、ＩＭ（ＢＲＥＡＫ−ＴＨＲＵ（登録商標）Ｓ２３３を有するか、または有していない）に再懸濁させた実験（実験４）の結果を示す。図２の対になったバーは、個々の穂からの胚の応答を示す。
【００８１】
図２のデータから、ＢＲＥＡＫ−ＴＨＲＵ（登録商標）Ｓ２３３界面活性剤の添加は、アグロバクテリウム細胞の先の増殖形態とは関係なくおよび形質転換プラスミドの遺伝子組成とは関係なく、トウモロコシ未成熟胚のアグロバクテリウム介在形質転換効率の劇的な増大をもたらすことが明らかである。一体とした実験１、２および３では、形質転換効率は、収集した２６個の穂のうちの２３個（８８％）からの胚において増大し、形質転換効率の増大は、２６個の穂のうちの１２個（４６％）からの穂において統計学的に有意であった（フィッシャーの正確確率ｐ＜−０．０５）。実験４（液体増殖させたアグロバクテリア）では、収集した１２個の穂のうちの１０個（８３％）からの胚は、形質転換効率の増大を示し、この増大は、１２個の穂のうちの１個（８％）で統計学的に有意であった。
【００８２】
実施例６
種々の化学分類の界面活性剤の形質転換促進作用の比較
表１に、幾つかの化学分類の界面活性剤の非限定的リストを提供する。未成熟胚の形質転換実験を、実施例３に提供したような形質転換プロトコール２を使用して行った。種々のプラスミドを内部に有するアグロバクテリウム細胞を、ＢＲＥＡＫ−ＴＨＲＵ（登録商標）Ｓ２３３または種々の別の界面活性剤（全て０.０１％の濃度で）を含有する接種培地（ＩｎＭ）に懸濁させ、ａａｄ１遺伝子のＴａｑｍａｎ（登録商標）アッセイにより測定される形質転換率を、実験の開始後７〜１０週間比較した。形質転換効率％は、遺伝子組換え植物（「イベント」）を産生した胚の数を、処理した未熟胚の数で除算し、１００倍することによって算出した。このために、胚は、複数の遺伝子組換え植物を産生した場合でも、単一のイベントとしてカウントした。図５に、得られた形質転換効率を示す。
【００８３】
【表５】
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表５に要約した結果は、ＢＲＥＡＫ−ＴＨＲＵ（登録商標）Ｓ２３３の使用は、液体培地で増殖させ、それから収集したアグロバクテリウム接種細胞を再懸濁させるために使用した接種培地に含有させた場合には、試験した他の界面活性剤の大部分を用いて得られた形質転換効率よりも優れた形質転換効率を提供することを実証する。３つの実験（実験２、実験９、および実験１１）では、観察された形質転換効率は、使用した２つの界面活性剤の間でほぼ同じであった。
【００８４】
実施例７
形質転換は、種々の作業者により得られる
トウモロコシ形質転換の当業者には、植物の形質転換方法は、多くの場合、実験について何か月または何年にわたって習得される相当な専門知識を必要とすることが理解されるだろう。種々の作業者によって手順が実施される方法における不一致のために、形質転換効率は、広い範囲にわたって変化し得る。したがって、種々の作業者によって種々の時間で得られる形質転換効率の予測可能性を向上させるトウモロコシ形質転換手順を提供することが都合がよい。トウモロコシ未成熟胚の形質転換を、実施例３の方法（種々のプラスミドを内部に有するアグロバクテリウム株ＬＢＡ４４０４）を使用し、および接種培地にＢＲＥＡＫ−ＴＨＲＵ（登録商標）Ｓ２３３を含有させて数か月の期間にわたって行った。形質転換効率は、得られたハロキシホップ耐性カルス組織のカウントから評価した。表６に、得られた結果を要約する。
【００８５】
【表６】
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表６に要約した結果は、実施例３に開示した形質転換プロトコールが、接種培地にＢＲＥＡＫ−ＴＨＲＵ（登録商標）Ｓ２３３を含有させて実施された場合には、形質転換効率の作業者−作業者間の変動を減少させるしっかりとした（robust）予測可能な方法を提供することを示す。また、方法の改良された予測可能性は、所定の結果（例えば、得られた形質転換イベントの数）を得るために実験の規模（例えば、処理しなければならない胚の数）のより正確な決定を可能にする。
【００８６】
本発明は、発明の幾つかの態様の例証として意図する本明細書に開示した実施形態による範囲に限定されるものではなく、機能的に均等である任意の実施形態が、本発明の範囲内に入る。本明細書に示し、記載した方法に加え、方法の種々の変更は、当業者には明らかになるだろうし、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図される。さらにまた、本明細書に開示した方法の複数の工程のある一定の代表的な組み合わせが、単に前記の実施形態において具体的に考察されるだけであるが、前記方法の複数の工程の他の組み合わせは、当業者には明らかになるだろうし、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図される。したがって、複数の工程の組み合わせは、おそらく本明細書に明確に記述されているだろう；しかし、複数の工程の他の組み合わせは、たとえ明確に記述されていないとしても包含される。数値が明確に列挙されている場合には、列挙された数値とほぼ同じ分量または量である数値もまた本発明の範囲内にあると理解されるべきある。数値の範囲が列挙されている場合には、その範囲の列挙された上限と下限の間に入るそれぞれの整数値およびその分数もまた、このような数値の間のそれぞれの下位範囲と共に具体的に開示される。本明細書で使用する用語「含む（comprising）」およびその変形は、用語「包含する（または含む）（including）」およびその変形と同義的に使用され、オープン非限定的用語である。本明細書で使用する用語「変更する」または「改変する」、あるいはその任意の形は、改変する、変更する、置き換える、欠失する、置換する、除去する、変化させる、または形質転換することを意味する。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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