(57)【要約】  様々な疾患の処置に有用なオキシランアミンが本明細書において開示される。オキシランアミンは、医薬組成物の製造において有用である。本医薬組成物は、脂質膜を有するウイルスによって引き起こされる疾患の処置または予防のために使用され得るか、あるいは、本医薬組成物は、細胞増殖または免疫制御を必要とする疾患のために使用され得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式：
2015537012.tif 000007
（式中、
Ｘは、ＯまたはＳを表し、
Ｒ１は、独立して、水素；１つもしくは複数のハロゲン原子または１つもしくは複数の基Ｒ５によって任意選択で置換された、６個までの炭素原子を含有する直鎖または分枝状アルキル、アルケニルまたはアルキニル基；あるいは、１つもしくは複数の基Ｒ５または１つもしくは複数のハロゲン原子によって任意選択で置換された、３〜７個の炭素原子を含有するシクロアルキルまたはシクロアルケン基を表し、
Ｒ２は、３〜２４個の炭素原子を含有する直鎖または分枝状アルキル、アルケニルまたはアルキニル基を表し、前記基は、１つもしくは複数のハロゲン原子、３〜６個の炭素原子を含有するシクロアルキル基、または１つもしくは複数の基Ｒ５によって任意選択で置換されており、
Ｒ３およびＲ４は、独立して、水素、６個までの炭素原子を含有する直鎖または分枝状アルキル、アルケニルまたはアルキニル基（前記基は、１つまたは複数のハロゲン原子によって任意選択で置換されている）を表すこともできるし、あるいは、これらが結合する窒素原子と一緒にまたはＲ１と一緒に、窒素、酸素および硫黄から選択される３個までの環へテロ原子を含有する５〜７員飽和または不飽和複素環式環を形成することもでき、前記環は、ハロゲン、ニトロ、−Ｓ（Ｏ）ｐＲ６、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルコキシ、Ｃ１〜４ハロアルキル、Ｃ１〜４ハロアルコキシ、＝Ｏ、および＝ＮＯ−Ｒ５から選択される１つまたは複数の基によって任意選択で置換されており、前記環内に存在する硫黄原子は−ＳＯ２−または−ＳＯ−基の形態であり得ることが理解され、
Ｒ５は、１つまたは複数のハロゲン原子によって任意選択で置換された、６個までの炭素原子を含有する直鎖または分枝状アルキル基、Ｃ１〜４アルコキシ、あるいは１つまたは複数のハロゲン原子によって任意選択で置換された、２〜６個の炭素原子を含有する直鎖または分枝状アルケニルまたはアルキニル基を表し、
Ｒ６は、１つまたは複数のハロゲン原子によって任意選択で置換された、６個までの炭素原子を含有する直鎖または分枝状アルキル基を表し、
ｐは０、１、または３である）
の化合物およびその薬学的に許容可能な塩。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物において、Ｒ２が、５個以上の炭素原子を含有する直鎖または分枝状アルキルまたはアルケニル基を表すことを特徴とする化合物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の化合物において、Ｒ２が、１〜４個の二重結合を有する直鎖または分枝状アルケニル基を表すことを特徴とする化合物。
【請求項４】
請求項３に記載の化合物において、前記アルケニル基のメチル端部から数えて第３番目、第６番目、または第９番目の炭素原子に二重結合が位置していることを特徴とする化合物。
【請求項５】
請求項１乃至４の何れか１項に記載の化合物において、式
2015537012.tif 000008
を有することを特徴とする化合物。
【請求項６】
請求項５に記載の化合物において、Ｒ２が、
2015537012.tif 000009
であることを特徴とする化合物。
【請求項７】
請求項１乃至６の何れか１項に記載の組成物において、請求項１乃至６の何れか１項に記載の化合物と、薬学的に許容可能な助剤とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項８】
請求項１乃至６の何れか１項に記載の化合物において、治療による人体または動物体の処置方法において使用するためのものであることを特徴とする化合物。
【請求項９】
請求項１乃至６の何れか１項に記載の化合物において、ウイルス感染の予防または処置において使用するためのものであることを特徴とする化合物。
【請求項１０】
請求項１乃至９の何れか１項に記載の化合物において、前記ウイルスが、脂質膜を有するウイルスの群から選択されることを特徴とする化合物。
【請求項１１】
請求項１乃至６の何れか１項に記載の化合物において、前記ウイルスが、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、インフルエンザウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）であることを特徴とする化合物。
【請求項１２】
請求項１乃至６の何れか１項に記載の化合物において、細胞の増殖において使用するためのものであることを特徴とする化合物。
【請求項１３】
請求項１乃至１２の何れか１項に記載の化合物において、手術創または熱傷などの創傷、口腔内の疾患、歯周病、眼または眼の付属器における感染、口唇ヘルペス、および咽頭炎の処置のために使用されることを特徴とする化合物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の化合物において、前記歯周病が、歯肉炎、歯周炎、および口臭の中から選択されることを特徴とする化合物。
【請求項１５】
請求項１乃至６の何れか１項に記載の化合物において、サイトカインに対して感受性の疾患の処置において使用するためのものであることを特徴とする化合物。
【請求項１６】
請求項１５に記載の化合物において、前記サイトカインが、ＩＬ−６、ＣＣＬ−３およびＩＬ−１０を含む群から選択されることを特徴とする化合物。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載の化合物において、サイトカインに対して感受性の前記疾患が、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、うつ病、アルツハイマー病、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、自己免疫疾患、慢性炎症性増殖性疾患、冠動脈疾患、血液系および固形悪性腫瘍、喘息、関節炎、肺炎、乾癬または多発性硬化症であることを特徴とする化合物。
【請求項１８】
請求項１乃至６の何れか１項に記載の化合物において、マラリアの予防または処置において使用するためのものであることを特徴とする化合物。
【請求項１９】
請求項１乃至６の何れか１項に記載の化合物において、メチシリン耐性スタフィロコックス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）またはメチシリン感受性スタフィロコックス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＭＳＳＡ）によって引き起こされる感染の予防または処置において使用するためのものであることを特徴とする化合物。
【請求項２０】
請求項１乃至６の何れか１項に記載の化合物において、医薬組成物を調製するためのものであることを特徴とする化合物。
【請求項２１】
請求項１乃至６の何れか１項に記載の化合物を含む医薬組成物において、ゲル、クリーム、マウスウォッシュ、チューインガム、練り歯磨き、香膏、硬膏、リップ軟膏、スプレー、軟膏、カプセル、ドロップ、または錠剤として処方されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項２２】
ウイルスまたはプラスモディウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）感染の処置または予防のための方法において、脂質膜を有するウイルスまたはプラスモディウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）によって引き起こされる疾患を患っている人に、前記疾患を治癒または軽減させるのに十分な量の請求項１乃至６の何れか１項に記載の化合物を含む、ある量の医薬組成物が投与されることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス、寄生虫、および細菌によって引き起こされる疾患の処置を含むいくつかの目的のために使用され得る、新規のオキシランミデス（ｏｘｉｒａｎ  ｍｉｄｅｓ）に関する。本明細書において開示される化合物は、増殖作用によって軽減される疾患の処置における用途も見出す。例としては、口腔内の疾患および熱傷が挙げられる。植物のフェヌグリーク（Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ  ｆｏｅｎｕｍ−ｇｒａｅｃｕｍ）から新規のアルカミドが単離された。
【背景技術】
【０００２】
フェヌグリーク（Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ  ｆｏｅｎｕｍ−ｇｒａｅｃｕｍ）（本明細書では、コロハまたはＴＦＧとも呼ばれる）は、マメ科に属する一年草である。ＴＦＧ種子は、カレーならびに伝統的なインドおよびアジア料理の一部の主要成分である。ＴＦＧ種子は、タンパク質、ステロイド系サポニン、フラバノイド（ｆｌａｖａｎｏｉｄ）、タンニン酸、ステアリン酸、植物油、アルカロイドトリゴネリンおよび４−ヒドロキシイソロイシンを含む植物化学物質が豊富である（Ｄｕｋｅ，２００１、Ｓｋａｌｔｓａ，２００２）。
【０００３】
民間伝承話ならびに古来および伝統の医学では、泌乳刺激、香辛料、分娩の補助、消化不良、全般的健康の改善、および代謝の改善を含む、ＴＦＧ種子およびＴＦＧ抽出物の多数の使用が記載されている（Ｂａｓｃｈら，２００３、Ｕｌｂｒｉｃｈｔら，２００７）。インビトロ研究では、ＴＦＧ種子抽出物はアポトーシスおよび細胞死を誘発し得ると共に、保護効果を有し得ることが示されている。ＴＦＧ抽出物はＣｈａｎｇ肝細胞をエタノール媒介毒性から保護する（Ｋａｖｉａｒａｓａｎら，２００６）が、ＴＦＧ抽出物は、主にステロイド成分によって、細胞株Ｈ−６０にアポトーシスおよび細胞死も誘発し得る（Ｈｉｂａｓａｍｉら，２００３）。ＴＦＧ抽出物の抗微生物活性が報告されている。ＴＦＧの芽からの抽出物は、胃細菌ヘリコバクター・ピロリ（ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）に対するインビトロの抗菌効果を有することが示されている（Ｒａｎｄｈｉｒら，２００４、Ｒａｎｄｈｉｒ  ＆  Ｓｈｅｔｔｙ，２００７）。しかしながら、今日まで、ＴＦＧ抽出物の抗ウイルス効果についての報告は示されていない。
【０００４】
ＨＳＶ−２およびＨＩＶ−１はいずれも終生の潜伏感染を確立し、どちらのウイルスについても有効なワクチンは存在しないし、どんな治療も開発されていない。世界的に推定３３００万人がＨＩＶ−１に感染し、５億人を超える人がＨＳＶ−２に感染している（Ｌｏｏｋｅｒら，２００８、ＵＮＡＩＤＳ，２０１０）。ＨＩＶ−１感染は最終的に、免疫応答の悪化、日和見感染の攻撃（共同で死をもたらす）を特徴とする後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に至る。ＨＳＶ−２は非常に一般的であり、重要なヒト病原体であり、性器粘膜の局所感染を引き起こすが、ＨＳＶ−２は皮膚および咽頭にも感染し得る。通常、ＨＳＶによる感染は良性であり、自然治癒する（ｓｅｌｆ−ｌｉｍｉｎｇ）。しかしながら、免疫力が低下した患者（例えば、ＨＩＶ患者、移植患者など）および新生児では、感染は、急性壊死性脳炎および髄膜炎を含む、中枢神経系における重症感染を生じ得る（Ｒｏｉｚｍａｎら，２００７）。さらに、ＨＳＶ−２はＨＩＶ−１感染の重要な補因子であり、従って、ＨＳＶ−２感染の阻害は恐らくＨＩＶ−１の蔓延を低減し得る（Ｆｒｅｅｍａｎら，２００６、Ｒｅｂｂａｐｒａｇａｄａら，２００７）。従って、ＨＩＶ−１およびＨＳＶ−２に対する二重作用化合物および予防薬の開発は、ウイルスの蔓延を阻害するための重要な目標であり得る。
【０００５】
本発明のアルカミド化合物は、ＴＦＧの抽出物に由来する。これらの化合物は、本明細書において初めて単離および特徴付けされた。
【０００６】
本発明は、ウイルス関連疾患、細胞増殖によって治癒または軽減され得る疾患、および免疫調節によって処置され得る疾患を含む種々の疾患の処置のための新規の化合物を提供することを目的とする。このような疾患を処置するための新規の化合物を提供する必要性は依然として存在している。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、以下の一般式：
2015537012.tif 000002
（式中、
Ｘは、ＯまたはＳを表し、
Ｒ１は、独立して、水素；１つもしくは複数のハロゲン原子または１つもしくは複数の基Ｒ５によって任意選択で置換された、６個までの炭素原子を含有する直鎖または分枝状アルキル、アルケニルまたはアルキニル基；あるいは、１つもしくは複数の基Ｒ５または１つもしくは複数のハロゲン原子によって任意選択で置換された、３〜７個の炭素原子を含有するシクロアルキルまたはシクロアルケン基を表し、
Ｒ２は、３〜２４個の炭素原子を含有する直鎖または分枝状アルキル、アルケニルまたはアルキニル基を表し、前記基は、１つもしくは複数のハロゲン原子、３〜６個の炭素原子を含有するシクロアルキル基、または１つもしくは複数の基Ｒ５によって任意選択で置換されており、
Ｒ３およびＲ４は、独立して、水素、６個までの炭素原子を含有する直鎖または分枝状アルキル、アルケニルまたはアルキニル基（前記基は、１つまたは複数のハロゲン原子によって任意選択で置換されている）を表すこともできるし、あるいは、これらが結合する窒素原子と一緒にまたはＲ１と一緒に、窒素、酸素および硫黄から選択される３個までの環へテロ原子を含有する５〜７員飽和または不飽和複素環式環を形成することもでき、前記環は、ハロゲン、ニトロ、−Ｓ（Ｏ）ｐＲ６、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルコキシ、Ｃ１〜４ハロアルキル、Ｃ１〜４ハロアルコキシ、＝Ｏ、および＝ＮＯ−Ｒ５から選択される１つまたは複数の基によって任意選択で置換されており、前記環内に存在する硫黄原子は−ＳＯ２−または−ＳＯ−基の形態であり得ることが理解され、
Ｒ５は、１つまたは複数のハロゲン原子によって任意選択で置換された、６個までの炭素原子を含有する直鎖または分枝状アルキル基、Ｃ１〜４アルコキシ、あるいは１つまたは複数のハロゲン原子によって任意選択で置換された、２〜６個の炭素原子を含有する直鎖または分枝状アルケニルまたはアルキニル基を表し、
Ｒ６は、１つまたは複数のハロゲン原子によって任意選択で置換された、６個までの炭素原子を含有する直鎖または分枝状アルキル基を表し、
ｐは０、１、または３である）
の新規のアルカミド化合物およびその薬学的に許容可能な塩に関する。
【０００８】
「薬学的に許容可能な塩」という用語は、治療用途の塩の形成のために当該技術分野において知られており、そして受け入れられているカチオンまたはアニオンの塩を意味する。塩基との適切な塩には、アルカリ金属（例えば、ナトリウムおよびカリウム）、アルカリ土類金属（例えば、カルシウムおよびマグネシウム）、アンモニウムおよびアミン（例えば、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、オクチルアミン、モルホリンおよびジオクチルメチルアミン）の塩が含まれる。例えば、アミノ基を含有する式（Ｉ）の化合物によって形成される適切な酸付加塩には、無機酸との塩、例えば塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩および硝酸塩、ならびに有機酸（例えば、酢酸）との塩が含まれる。
【０００９】
式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物はエノール互変異性形態で存在することができ、これは、エノール二重結合のまわりに幾何異性体を生じさせ得る。さらに、特定の場合には、上記置換基は、光学異性および／または立体異性に寄与し得る。このような形態およびその混合物は全て、本発明によって包含される。
【００１０】
特許請求の範囲を含む本明細書中の記号の定義において、他に規定されない限り、以下の定義は一般に式（Ｉ）中のラジカルに当てはまる：「ハロゲン」はフッ素、塩素、臭素またはヨウ素原子を意味し、「アルキル基」は、１〜６個の炭素原子を含有する直鎖または分枝鎖基を意味する。
【００１１】
複素環式環は、ピリジン、ピロール、イミダゾール、オキサジブ（ｏｘａｚｉｂｅ）、チアジン、ピリミジン、ピペラジン、アジリジン、アジリン、ピペリジン、ジアジリン、オキサゾルジン（ｏｘａｚｏｌｄｉｎｅ）、イミダゾリジン、チアゾリジン、イソオキサゾリジン、ピラゾリジン、イソチアゾリジン、オキサゾール、チアゾール、イソオキサゾール、ピラゾール、イソチアゾール、モルホリン、ピペラジン、チアジン、オキサジン、ピラジン、ピリダジン、ジアゼチジン、アゼピン、アゼパン、トリアジン、テトラジン、トリアジン、テトラジン、トリアジン、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシル、プリン、ピリミジン、インドール、ベンゾイミダゾール、ベンゾトリアゾール、またはキノリン基を含むことができる。
【００１２】
本発明の特定の態様では、Ｒ１は、水素、あるいは１〜３個の炭素原子を有する直鎖または分枝状アルキルである。好ましい態様では、Ｒ１は水素である。
【００１３】
Ｒ２は、本発明の特定の態様では、５個までの炭素原子（例えば、５〜２０個の炭素原子など）を有する直鎖または分枝状アルキルまたはアルケニルを表し得る。Ｒ２がアルケニルである場合、１〜４個の二重結合が存在することができ、二重結合はシス配置およびトランス配置であり得る。二重結合は、メチル末端から数えて３番目、６番目、または９番目の炭素原子に位置し得る。
【００１４】
Ｒ３およびＲ４は、適切には、水素、あるいは１〜３個の炭素原子を有する直鎖または分枝状アルキルである。本発明の好ましい態様では、Ｒ３およびＲ４は同一である。
【００１５】
本発明の特定の態様では、式（Ｉ）の化合物は、好ましくは、以下の式：
2015537012.tif 000003
によって表されるタイプを有する。
【００１６】
一般式（Ｉ）および（ＩＩ）に従う化合物は、任意の適切な方法で得ることができる。第１の態様では、化合物は化学合成によって得られる。別の態様では、化合物は、コロハなどの天然源から得られる。化合物をコロハから得る場合、一般に水性抽出物が最初に得られ、本発明の化合物はこの抽出物から単離される。
【００１７】
水性抽出物は、種子を粉砕し、粉砕した種子に熱水または沸騰水を注ぎ、固体粒子をろ過して除去することによって得ることができる。また抽出物は、始めに、湿潤または水性条件下で種子を３時間〜７日間インキュベートすることにより種子を発芽させることによって得ることもできる。種子の発芽の後、種子は７０℃以上の温度を有する温水、好ましくは沸騰水で処理される。固体部分をろ過して除去した後、透明な抽出物が得られる。
【００１８】
抽出物は初めにエタノールによって処理され、植物残渣の大部分および多糖類を抽出物から沈殿させることができる。沈殿物は、沈降または遠心分離によって除去することができる。より容易な貯蔵のために、溶媒は蒸発されるか、あるいは他の方法で除去されて、粉末が生成され得る。あるいは、エタノール処理された抽出物は直接次のプロセスで使用され得る。
【００１９】
粉末は続いて水中に懸濁され、塩酸などの強酸によってｐＨ１〜４、好ましくはｐＨ２に酸性化される。酸性化抽出物は、ヘプタンのような水と非混和性の有機溶媒により抽出される。攪拌の後、有機層および水層は分離され、水層はアルカリ剤で処理されて、ｐＨ９よりも高いｐＨ、好ましくは約ｐＨ１０を得る。アルカリ性の水相は水と非混和性の有機溶媒により再度抽出され、攪拌される。減圧下での蒸発などの蒸発により溶媒を除去することによって、回収された有機相から固体粉末が得られる。
【００２０】
本発明の態様では、活性化合物（Ｉ）は、市販の物質から出発して、化学合成により調製される。第１のステップでは、脂肪アルデヒドまたはケトン化合物がニトロアルキルと反応されて、隣接の炭素においてＯＨ基およびＮＯ２基で置換されたアルカン鎖を得ることができる。第２のステップでは、ＯＨ基の脱離によって二重結合が形成され得る。任意選択で、ＯＨ基は最初に酸触媒の存在下で酸、通常はギ酸、酢酸、または無水酢酸と反応されてエステルを形成し、その後脱離反応が実施される。第３のステップでは、二重結合と、Ｈ２Ｏ２のような過酸化物およびＮａＯＨのような塩基の混合物とを反応させることによって、オキシラン環が形成される。最後のステップでは、ＮａＢＨ４などの適切な還元剤によって、ニトロ基がアミンに還元される。反応は、任意選択で、Ｃｏ２＋などの触媒の存在下で実施され得る。
【００２１】
本発明の化合物は、様々な疾患の処置のために使用され得る。第１の態様では、本発明の化合物は、ウイルスによって引き起こされる疾患を治癒させるために使用され得る。現在、脂質エンベロープ膜を有するウイルスは、本発明の化合物の影響を特に受けやすいと考えられている。このようなウイルスの例としては、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、インフルエンザウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）が挙げられる。
【００２２】
本発明の別の態様では、化合物は、細胞の増殖を必要とする疾患の処置のために使用され得る。このような疾患には、手術創もしくは熱傷などの創傷、口腔疾患、または歯周病が含まれる。
【００２３】
本発明の第３の態様では、化合物は、免疫関連の欠陥によって引き起こされる疾患を処置するために使用され得る。より具体的には、本発明の化合物は、インターロイキン−６、インターロイキン−１０、ＣＣＬ３およびインターロイキン−１２によって影響される疾患を処置するために使用され得る。ＩＬ−６は、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、うつ病、アルツハイマー病、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、自己免疫疾患、口腔内疾患、冠動脈疾患、ウイルス、細菌または原生動物による感染の進行、ならびに血液系および固形悪性腫瘍などの多くの疾患に関連する。マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）−１αとも呼ばれるＣＣＬ３は、ＭＩＰ−１ＣＣケモカインサブファミリーの４つのメンバーの１番目である。ＣＣＬ３は単球／マクロファージを炎症部位に引き付けることができ、潜在的に、ＣＣＲ５連結によるＨＩＶ−１の単球／マクロファージ取込みを阻害し得る。従って、現在、本明細書において開示される化合物は、喘息、関節炎、または多発性硬化症などの種々の炎症疾患の処置において適用され得ると考えられている。
【００２４】
本発明の第４の態様では、式Ｉの化合物は、抗生物質として使用され得る。特に、本発明の化合物は、ＭＲＳＡ（メチシリン耐性スタフィロコックス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  Ａｕｒｅｕｓ））およびＭＳＳＡ（メチシリン感受性スタフィロコックス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  Ａｕｒｅｕｓ））に対する効果を示した。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、抽出物から単離された注釈の付いた化合物のＮＭＲデータ。
【図２】図２は、ＴＦＧ抽出物の抗ウイルス効果。ベロ細胞を播種し、一晩培養した後、ＴＦＧ抽出物と共にまたは対照としてＰＢＳと共に３０分間プレインキュベートしたＨＳＶ−２株ＭＳに感染させた。２４時間後に細胞を固定し、染色し、ウイルスプラークをカウントした。全ての数字は、３つの独立した実験の平均＋／−ＳＤを示す。
【図３】図３は、Ｔｚｍｂｌ−ＨＩＶ−１レポーター細胞を播種し、一晩培養した後、ＨＩＶ−１株８９．６またはＪＲ−ＣＳＦに感染させた。感染前に、指示濃度のＴＦＧ抽出物と共に６０分間、または対照としてＰＢＳと共にウイルスをプレインキュベートした。全ての数字は、２つの独立した実験の平均＋／−ＳＤを示す。
【図４】図４は、インフルエンザＡに対するＴＦＧ抽出物の抗ウイルス効果。ＭＲＣ−５線維芽細胞を播種し、一晩培養した後、ＰＢＳ（対照、ＣＴＲ）または１００倍もしくは３０倍に希釈したＴＦＧ抽出物で処理したＣＭＶ株ＡＤ１６９に感染させた。感染の３日後に細胞を固定し、ＣＭＶタンパク質の蓄積について染色した。蛍光顕微鏡を用いて感染細胞の数をカウントした。数字は、同様の結果を示す３つの独立した実験の１つの平均＋／−ＳＤを表す。
【図５】図５は、ヒトサイトメガロウイルスに対するＴＦＧ抽出物の抗ウイルス効果。ＭＤＣＫ細胞を播種し、一晩培養した後、ＰＢＳ（対照、ＣＴＲ）または１００倍もしくは３０倍に希釈したＴＦＧ抽出物で処理したインフルエンザＡに感染させた。蛍光染色を用いて感染細胞の数を定量化した。数字は、同様の結果を示す２つの独立した実験の１つの平均＋／−ＳＤを表す。
【図６】図６は、ＴＦＧ抽出物の毒性および細胞増殖効果の評価。ベロ細胞を指示濃度のＴＦＧ抽出物で２日間処理し、ＭＴＴアッセイを用いて細胞生存率を評価した。
【図７】図７は、ＴＦＧ抽出物の毒性および細胞増殖効果の評価。ヒトケラチノサイトＨａＣａＴ細胞を指示濃度のＴＦＧ抽出物で２日間処理し、ＭＴＴアッセイを用いて細胞生存率を評価した。
【図８】図８は、ヒトＰＢＭＣを指示濃度のＴＦＧ抽出物で処理し、２日間のインキュベーションの後、セル・タイター・グロー（ｃｅｌｌ  ｔｉｔｒｅ  ｇｌｏｗ）を用いて生存率について細胞をアッセイした。図示されるデータは、２つの独立した実験の平均＋／−ＳＤを表す。
【図９】図９は、熱安定性ＴＦＧ抽出物の抗ウイルス効果は、主に、ウイルスとの直接相互作用による。時間０で実施したＨＳＶ−２感染の前、それと同時、またはその後に、ベロ細胞をＴＦＧ抽出物（２０μｇ／ｍｌ）で処理した。ウイルス感染の２４時間後に細胞をクリスタルバイオレットにより染色し、続いてウイルスプラークをカウントした。
【図１０】図１０は、ＨＳＶ−２を添加する前に、ベロ細胞にＴＦＧ抽出物（２０μｇ／ｍｌ）または等価の熱処理ＴＦＧ抽出物を添加した。２４時間後に細胞を染色し、プラークの数をカウントした。図中のデータは、３つの独立した実験の平均＋／−ＳＤを表す。
【図１１】図１１は、脂質の添加は、ＴＦＧ抽出物の抗ウイルス効果を阻害する。サンプル当たり３０μｌのＴＦＧ抽出物（１００μｇ／ｍｌ）を指示体積のリポフェクタミン２０００と共に２０分間インキュベートした。その後すぐに、抽出物をＨＳＶ−２と共に３０分間インキュベートし、その後ベロ細胞を感染させた。２４時間後に細胞を染色し、ウイルスプラークを数えた。データは、４つの独立した実験の平均＋／−ＳＤを表す。
【図１２】図１２は、ＴＦＧ抽出物は、炎症促進性ＩＬ−６およびＣＣＬ３の分泌を誘発および増大させる。Ａ〜Ｄ）ＴＦＧ抽出物（１０μｇ／ｍｌまたは２０μｇ／ｍｌ）の存在または非存在下で、新たに調製したＰＢＭＣを、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｒ８４８（０．５μｇ／ｍｌ）またはＴＮＦ−□（２５ｎｇ／ｍｌ）または対照としての培地で刺激した。２０時間後に細胞培地を収集した。ＥＬＩＳＡを用いて、分泌されたＩＬ−６およびＣＣＬ３のレベルを測定した。Ｅ）単球ＴＨＰ−１細胞を播種し、ＴＦＧ抽出物（２０μｇ／ｍｌまたは２００μｇ／ｍｌ）の存在または非存在下で、ＴＮＦ−□（２５ｎｇ／ｍｌ）または対照としての培地で刺激した。２０分後に細胞培地を収集した。ＥＬＩＳＡを用いて、分泌されたＣＣＬ３のレベルを測定した。図示されるデータは、４〜６つのドナー（Ａ〜Ｄ）または４つの独立した実験（Ｅ）の平均＋／−ＳＤを表す。
【図１３】図１３は、ヒト初代細胞におけるＴＦＧ抽出物によるＩＬ−１０およびＩＬ−１２に対する効果。ＴＦＧ抽出物（１０μｇ／ｍｌまたは２０μｇ／ｍｌ）の存在または非存在下で、新たに調製したＰＢＭＣをＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｒ８４８（０．５μｇ／ｍｌ）またはＴＮＦ−□（２５ｎｇ／ｍｌ）または対照としての培地で刺激した。２０時間後に細胞培地を収集した。ＥＬＩＳＡを用いて、分泌されたＩＬ−１０（Ａ〜Ｃ）およびＩＬ−１２（ＤおよびＥ）のレベルを測定した。図示されるデータは、６つのドナー（Ａ〜Ｃ）または４つのドナー（ＤおよびＥ）の平均＋／−ＳＤを表す。
【図１４】図１４は、膣ＨＳＶ−２感染によるＴＦＧ抽出物のインビボ効果。０．５ｍｇ／ｍｌのＴＦＧ抽出物を含有するゲル（Ａ）または２．５ｍｇ／ｍｌのＴＦＧ抽出物を含有するゲル（Ｂ）によりマウスを処置した。ＨＳＶ−２（株３３３、６．６７×１０４ｐｆｕ／マウス）による膣の暴露の１２時間前および１２時間後に、ＴＦＧ抽出物を適用した。感染後毎日、標準スコアリングシステムを用いて疾患の重症度を点数化した。図示されるデータは、Ａについては２つの別々の実験およびＢについては１つの実験の平均＋／−ＳＤを表す。
【図１５】図１５は、２−メチル−３−ノニルオキシラン−２−アミンまたはＤＭＳＯの存在下におけるＰ．ファルシパルム（Ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の成長速度。４８時間後に、取り込まれた［３Ｈ］−ヒポキサンチンの量を測定して、寄生赤血球の数と相関させた。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本明細書に記載される化合物は、種々のウイルス関連疾患の処置のために使用され得る。ウイルス感染は、ウイルスによって引き起こされる感染を指す。細菌とは違って、ウイルスの複製は宿主細胞に依存し、転写因子および翻訳機構などの宿主システムを用いる。ウイルスによって引き起こされる最も一般的なヒト疾患には、風邪、流感、口唇ヘルペス、およびいぼが含まれる。
【００２７】
本発明に従う一実施形態では、本明細書に開示される化合物は、風邪、流感、口唇ヘルペス、およびいぼなどのウイルス感染の処置において使用される。
【００２８】
本明細書に記載される化合物により処置され得るウイルス関連疾患の特定の例としては、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）が挙げられる。単純ヘルペスウイルス１および２（ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２）は本明細書に記載される化合物によって処置され得るが、本発明の好ましい態様では、疾患はＨＳＶ−２によって引き起こされる。ＨＳＶ−１（大部分の口唇ヘルペスを生じる）およびＨＳＶ−２（大部分の性器ヘルペスを生じる）はいずれも遍在性かつ伝染性である。これらは、感染者がウイルスを産生および排出する際に蔓延することができる。
【００２９】
単純ヘルペスウイルス感染の症状には、口、唇または性器の皮膚または粘膜における水様の疱疹が含まれる。病変は、ヘルペス性疾患の特徴である痂皮により治癒する。時折、ウイルスは激増中に非常に軽度または非定型の症状を起こすことがある。しかしながら、向神経性および神経浸潤性ウイルスのように、ＨＳＶ−１および−２は潜伏性になってニューロンの細胞体の免疫系から隠れることによって体内で存続する。初期または一次感染の後、一部の感染者はウイルスの再活性化または激増の散発性エピソードを経験する。激増の際、神経細胞内のウイルスは活性になり、ニューロン軸索を介して皮膚へ輸送され、そこでウイルスの複製および排出が生じ、新しいただれを引き起す。
【００３０】
ヘルペスウイルスの構造は、エンベロープと呼ばれる脂質二重層に覆われたカプシドと呼ばれる正二十面体のタンパク質ケージ内に包まれた、比較的大きい二本鎖の線状ＤＮＡゲノムからなる。エンベロープは、テグメントによってカプシドに結合される。この完全な粒子はビリオンとして知られている。現在、本発明の化合物は脂質二重層との相互作用によってその作用を発揮すると考えられている。
【００３１】
ＨＳＶは、細胞表面におけるＭＨＣクラスＩの抗原提示を妨害することによって免疫系を回避する。ＨＳＶは、ＨＳＶによるＩＣＰ−４７［１５］の分泌によって誘発されるＴＡＰトランスポーターの遮断によってこれを達成する。ＴＡＰは、細胞表面のＣＤ８＋ＣＴＬによる認識のためにゴルジ装置によって輸送される前に、ＭＨＣクラスＩ分子の完全性を保持する。
【００３２】
ヘルペスウイルスは生涯の感染を確立し、現在のところウイルスを身体から根絶させることはできない。処置は通常、ウイルスの複製を妨害し、激増に関連する病変の身体的重症度を低減し、他者への伝染の機会を低下させる汎用性抗ウイルス薬を必要とする。従って、本発明の化合物は、明らかに、現在の汎用性抗ウイルス薬よりも効率的な処置方法、あるいは少なくともその代替手段を提供する必要性を満たす。
【００３３】
本発明の化合物によって治癒または軽減され得る別の疾患はインフルエンザである。流感として一般に知られているインフルエンザは、オルトミクソウイルス科のＲＮＡウイルスであるインフルエンザウイルスによって引き起こされる鳥類および哺乳類の感染性疾患である。インフルエンザという用語には、インフルエンザＡ、インフルエンザＢまたはインフルエンザＣウイルスのいずれかによって引き起こされる疾患が含まれる。最も一般的な症状は、悪寒、発熱、咽頭炎、筋痛、頭痛（多くの場合、重症）、咳嗽、脱力／疲労および全身不快感である。他のインフルエンザ様の病気（特に、風邪）と混同されることが多いが、インフルエンザは、違うタイプのウイルスによって引き起こされる、より重篤な疾患である。インフルエンザは、特に子供において、悪心および嘔吐症状を起こし得る。
【００３４】
通常、インフルエンザは、ウイルスを含有するエアロゾルを作り出す咳またはくしゃみによって空気を介して伝染される。またインフルエンザは、鳥の糞または鼻汁との直接接触によって、あるいは汚染表面との接触を介して伝染され得る。空気で運ばれるエアロゾルはほとんどの感染を引き起こすと考えられているが、どの伝染手段が最も重要であるかは完全に明らかなわけではない。
【００３５】
インフルエンザウイルス粒子の内部にはＲＮＡゲノムが存在し、リボ核（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｒ）タンパク質に結合している。カプシドは遺伝物質を包囲し、脂質エンベロープはカプシドの外側に存在する。脂質エンベロープの上には、ヘマグルチニンおよびイオンチャネルを含む種々のタンパク質が存在する。現在、本発明の化合物は、脂質膜との相互作用によってその作用を発揮すると推測される。
【００３６】
また本発明の化合物は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）によって引き起こされる疾患を処置するためにも使用され得る。いぼは、ヒトパピローマウイルス感染（ＨＰＶ）感染に関連する一般的な良性表皮性病変である。いぼは様々な状態を指し、その状態を引き起こすパピローマウイルスのタイプ、モルホロジー、指、足、顔（例えば、唇または瞼の近く）または性器部などの身体における様相が異なる。いぼの例としては、ＨＰＶ１、２、４、２７、および２９によって引き起こされる普通のいぼ（尋常性疣贅）、ＨＰＶ３、１０、２８、および４９によって引き起こされる平坦ないぼ（扁平疣贅）、ＨＰＶ１によって引き起こされる糸状または指状いぼ、手掌および足底いぼ（疣贅、足疣贅）、モザイクいぼ、ならびに性器いぼ（性病性いぼ、尖圭コンジローマ、尖圭疣贅）が挙げられる。
【００３７】
痛みを伴うことに加えて、いぼは美容上の問題でもあり得る。いぼの効果的な処置は存在せず、利用できる処置が終了してから数か月または数年後に再発することが多い。
【００３８】
本発明に従う好ましい実施形態では、本明細書に開示される化合物は、指、足、顔（例えば、唇または瞼の近く）または性器部にあるいぼなどのいぼの処置のために使用される。
【００３９】
本発明の別の態様では、本明細書に開示される化合物によってヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）関連疾患が処置される。ＨＩＶは、進行性の免疫系の不全によって生命にかかわる日和見感染および癌が猛威を振るうようになったヒトの状態である後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を引き起こすレンチウイルスである。ＨＩＶには、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２を含むいくつかのサブタイプが含まれる。
【００４０】
ＨＩＶは、ヘルパーＴ細胞（特に、ＣＤ４＋Ｔ細胞）、マクロファージ、および樹状細胞などの、ヒト免疫系の生命維持に必要な細胞を感染させる。ＨＩＶ感染は、３つの主要なメカニズム：第１の、ウイルスによる感染細胞の直接的な死滅と、第２の、感染細胞におけるアポトーシス速度の増大と、第３の、感染細胞を認識するＣＤ８細胞毒性リンパ球による感染ＣＤ４＋Ｔ細胞の死滅とによって、低レベルのＣＤ４＋Ｔ細胞をもたらす。ＣＤ４＋Ｔ細胞の数が臨界レベルを下回って減少すると、細胞性免疫が喪失され、身体は徐々に日和見感染の影響をより受け易くなる。
【００４１】
ＨＩＶウイルス粒子は直径約１２０ｎｍのほぼ球形であり、赤血球よりも約６０倍小さいがそれでもウイルスとしては大きい。これは、２，０００コピーのウイルスタンパク質ｐ２４で構成された円錐形カプシドによって封入されるウイルスの９つの遺伝子をコードする２コピーのプラス一本鎖ＲＮＡで構成される。一本鎖ＲＮＡは、ヌクレオカプシドタンパク質ｐ７、ならびに逆転写酵素、プロテアーゼ、リボヌクレアーゼおよびインテグラーゼなどのビリオンの発生に必要とされる酵素に強固に結合している。ウイルスタンパク質ｐ１７で構成されるマトリックスはカプシドを包囲し、ビリオン粒子の完全性を保証する。
【００４２】
これは次に、新たに形成されるウイルス粒子が細胞から生まれる際にヒト細胞の膜から採取されたリン脂質と呼ばれる脂肪分子の２つの層で構成されるウイルスエンベロープによって包囲される。現在、本発明の化合物はリン脂質二重層と相互作用して、その作用を発揮すると考えられている。特定の作用形態は、現在、発明者らには分かっていない。
【００４３】
本発明の化合物は、細胞の増殖を必要とする疾患を含む様々な疾患および障害を治療するために使用され得る。治癒されるか症状が軽減され得る疾患の一例は歯周病である。歯周炎（歯周症（ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｓｉｓ）、歯周症（ｐａｒａｄｅｎｔｏｓｉｓ）、膿漏（ｐｙｏｒｒｈｅａ））は、歯を支持する靱帯および骨の炎症および感染を含む歯肉炎の進行に起因する歯科障害である。
【００４４】
何年もの間処置せずに放置すると、歯を支持する骨の喪失、そして最終的には歯の喪失をもたらし得る。この状態は１つまたは複数の歯を含み得る。
【００４５】
歯肉炎は、歯肉の発赤、腫れおよび出血し易さは別として、ほとんどまたは全く不快感に関連しない。歯肉炎は、多くの場合、不適切な口腔衛生により歯の上の歯垢内に細菌が残り、歯肉に炎症を起こすことで生じる。歯肉炎は、専門的な処置および良好な在宅での口腔ケアによって改善される。歯肉炎が治療されずに放置されると、歯垢は歯肉線の下側で蔓延および成長することができ、状態は歯周炎まで進行し得る。歯垢内の細菌により放出される毒素は歯肉内で炎症反応を開始させ、これは慢性化して、歯を支持する骨を破壊し得る。歯肉は歯から離れ、感染するポケット（歯と歯肉の間の空間）を形成する。疾患が進行するにつれてポケットは深くなり、より多くの歯肉組織および骨が破壊される。多くの場合、この破壊プロセスは非常に穏やかな兆候を有する。最終的に、歯はグラグラするようになり、除去しなければならないかもしれない。
【００４６】
慢性歯周炎は、最も頻繁に発生する歯周炎の形態であると認識される。慢性歯周炎は、歯の支持組織内の炎症、進行性の付着および骨の喪失をもたらし、ポケットの形成および／または歯茎（歯肉）の後退を特徴とする。これは成人において広く見られ、成人の歯の喪失の主な原因であるが、疾患はあらゆる年齢で発生し得る。付着喪失の進行は通常ゆっくり起こるが、急速に進行する期間が生じ得る。
【００４７】
侵襲性歯周炎は、それ以外は臨床的に健康である患者に影響を与える状態である。一般的な特徴には、急速な付着喪失および骨破壊および家族集積性が含まれる。歯周炎は多くの場合若くして発症し、糖尿病または骨粗鬆症などのいくつかの全身性疾患の１つに関連する（全身性疾患の徴候としての歯周炎）。壊死性歯周病は、歯肉組織の壊死、歯周靱帯および歯槽骨を特徴とする感染の別の形態である。この状態は、ほとんどの場合、ＨＩＶ感染、栄養障害および免疫抑制を含むがこれらに限定されない全身状態に関連する。
【００４８】
歯垢に加えて、歯肉の健康に影響を与える他の因子には、喫煙、遺伝的性質、妊娠、思春期、ストレス、薬物療法、歯の食いしばり／歯ぎしり、栄養不足、糖尿病および他の全身性疾患が含まれる。
【００４９】
歯肉炎は通常、良好なセルフケアにより消失する。対照的に、歯周炎は繰返される専門家の治療を必要とする。良好な口腔衛生を用いる人は、歯肉線の２〜３ミリメートル（１／１２インチ）下側しかきれいにすることができない。歯科医は、スケーリングおよび根面平滑化（ｒｏｏｔ  ｐｌａｎｎｉｎｇ）を用いて４〜６ミリメートル（１／５インチ）の深さまでポケットをきれいにして、歯石および罹患した歯根表面を徹底的に除去することができる。５ミリメートル（１／４インチ）以上のポケットについては、多くの場合手術が必要とされる。歯科医または歯周病専門医は、外科的（歯周フラップ手術）に、歯肉線よりも下側の歯に接近して歯を徹底的にきれいにし、感染によって引き起こされる骨欠損を矯正することができる。また歯科医または歯周病専門医は、歯肉の残りが歯に強固に再付着するように、感染および分離した歯肉の一部を除去する（歯肉切除）こともでき、その後人は自宅で歯垢を除去することができる。歯科医は、特に膿瘍が発生している場合には、抗生物質（例えば、テトラサイクリンまたはメトロニダゾールなど）を処方することができる。また歯科医は、高濃度の薬物が罹患領域に到達することができるように、抗生物質含侵材料（フィラメントまたはゲル）を深い歯肉ポケット挿入することもできる。歯周膿瘍は突発的な骨破壊を生じるが、手術および抗生物質による即時の処置により、損傷を受けた骨の多くは元に戻ることができる。手術後に口が痛む場合、一時的に、ブラッシングおよびフロッシングの代わりに１日２回、１分間のクロルヘキシジン口内洗浄液が使用され得る。
【００５０】
患者がその歯の大部分の周囲に５ミリメートル（１／４インチ）以上の深さのポケットを有すれば、何年にもわたってその歯の全てを失う危険があるであろう。このことが確認されず、患者が進行性の歯周病に気付かないままでいると、数年後、患者は歯の大部分が急にグラグラするようになり、その大部分または全てを引き抜く必要があり得ることに驚くかもしれない。
【００５１】
歯肉炎、歯周炎（侵襲性および慢性）、全身性疾患の兆候としての歯周炎、および壊死性歯周病の、テトラサイクリンを用いる全身的な薬剤処置は、処置中に、テトラサイクリン耐性菌株の急速な出現、および影響を受けない病原体（例えば、カンジダなど）の過剰増殖の発生などのいくつかの不都合に関連する。テトラサイクリンによる歯周感染の短期間の処置は無効であることが多い。一般に嫌気性細菌に対する非常に有効な抗微生物組成物であるペニシリンは、歯周感染において重要な細菌種（例えば、Ｐ．ジンジバリス（ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）に対して無効であることが示されている。
【００５２】
現在使用される外科的および非外科的な治療についての上記の制限および不都合により、これらの歯の状態の有効な処置に対してまだ満たされていない必要性が明らかにされる。
【００５３】
本発明に従う１つの非常に好ましい実施形態は、歯肉炎、歯周炎（侵襲性および慢性）、全身性疾患の兆候としての歯周炎、および壊死性歯周病などの歯周病の処置のための、本明細書に記載される化合物の使用に関する。
【００５４】
口臭（または臭い息）は、「朝の息」などの非常に一般的な一時的な状態である。より深刻で持続的な状態である慢性口臭は、通常、特定のタイプの口腔細菌の持続的な過密によって引き起こされる。慢性口臭は、本明細書に記載される歯周病に関連することが多い。
【００５５】
本発明に従う一実施形態では、本明細書に記載される化合物は、口臭の処置のために使用される。好ましい実施形態では、前記口臭は慢性口臭である。
【００５６】
本発明の別の態様では、細胞を増殖させる能力は、創傷の処置を刺激するために使用される。「創傷」という用語は、皮膚または粘膜（例えば、口腔粘膜、胃粘膜および腸粘膜など）の病変を指す。創傷は、感染、損傷、または手術の結果であり得る。本発明に従う創傷には、慢性創傷および潰瘍も含まれる。
【００５７】
本発明に従う１つの好ましい実施形態は、手術創、切創、穿通創、穿刺創、擦過創、慢性創傷、または潰瘍などの創傷を処置するため、あるいはその感染を防止するための、本明細書に記載される化合物の使用に関する。
【００５８】
また創傷は、咬創にも起因し得る。ヒトおよび哺乳類（主にイヌおよびネコであるが、リス、アレチネズミ、ウサギ、モルモット、およびサルでもある）の咬創が一般的であり、時折、著しい病的状態および身体障害を引き起こす。手、四肢、および顔が最も頻繁に影響を受けるが、ヒトの咬創は、時折、乳房および性器を含むこともある。組織の外傷に加えて、刺咬性生物の口腔細菌叢からの感染も主要な関心事である。
【００５９】
本発明に従う一実施形態では、本明細書に開示される化合物は、ヒトまたは哺乳類、好ましくはイヌによって引き起こされる咬創の処置のために使用される。
【００６０】
驚くことに、本発明に従う化合物により処置された創傷は、より速く治癒することが判明した。さらに、瘢痕形成が限られるか、あるいは存在しない。瘢痕は、損傷後に正常な皮膚を置換する繊維組織（線維症）の領域であり、皮膚および身体の他の組織における創傷修復の生物学的プロセスに起因する。現在、本発明の化合物によって刺激される細胞増殖の増大は、より速い治癒の観察に対する説明であると考えられている。
【００６１】
本発明の態様によると、本明細書に開示される化合物は、炎症促進性ＩＬ−６およびＣＣＬ３のレベルの増大によって軽減または治癒される疾患を処置するために使用され得る。
【００６２】
インターロイキン−６（ＩＬ−６）は、外傷および感染への応答、ならびに炎症および悪性腫瘍の発生および進行を含むいくつかの生理学的および病理学的なプロセスに関与する多形サイトカインである。ＩＬ−６は、糖尿病（Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ  ＯＰ，Ｍａｎｄｒｕｐ−Ｐｏｕｌｓｅｎ  Ｔ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２００５）．”Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  ａｎｄ  ｄｉａｂｅｔｅｓ：ｔｈｅ  ｇｏｏｄ，ｔｈｅ  ｂａｄ，ｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔ？”．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５４  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１１４−２４．ｄｏｉ：１０．２３３７／ｄｉａｂｅｔｅｓ．５４．ｓｕｐｐｌ＿２．Ｓ１１４．ＰＭＩＤ  １６３０６３２９）、アテローム性動脈硬化症（Ｄｕｂｉｎｓｋｉ  Ａ，Ｚｄｒｏｊｅｗｉｃｚ  Ｚ（Ａｐｒｉｌ  ２００７）．”［Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ］”（ｉｎ  Ｐｏｌｉｓｈ）．Ｐｏｌ．Ｍｅｒｋｕｒ．Ｌｅｋａｒｓｋｉ  ２２（１３０）：２９１−４．ＰＭＩＤ  １７６８４９２９）、うつ病（Ｄｏｗｌａｔｉ  Ｙ，Ｈｅｒｒｍａｎｎ  Ｎ，Ｓｗａｒｄｆａｇｅｒ  Ｗ，Ｌｉｕ  Ｈ，Ｓｈａｍ  Ｌ，Ｒｅｉｍ  ＥＫ，Ｌａｎｃｔｏｔ  ＫＬ（Ｍａｒｃｈ  ２０１０）．”Ａ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｊｏｒ  ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ”．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ６７（５）：４４６−４５７．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｐｓｙｃｈ．２００９．０９．０３３．ＰＭＩＤ  ２００１５４８６）、アルツハイマー病（Ｓｗａｒｄｆａｇｅｒ  Ｗ，Ｌａｎｃｔｏｔ  Ｋ，Ｒｏｔｈｅｎｂｕｒｇ  Ｌ，Ｗｏｎｇ  Ａ，Ｃａｐｐｅｌｌ  Ｊ，Ｈｅｒｒｍａｎｎ  Ｎ（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２０１０）．”Ａ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ”．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ６８（１０）：９３０−９４１．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｐｓｙｃｈ．２０１０．０６．０１２．ＰＭＩＤ  ２０６９２６４６．）、全身性エリテマトーデス（Ｔａｃｋｅｙ  Ｅ，Ｌｉｐｓｋｙ  ＰＥ，Ｉｌｌｅｉ  ＧＧ（２００４）．”Ｒａｔｉｏｎａｌｅ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｉｎ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ”．Ｌｕｐｕｓ  １３  （５）：３３９−３４３．ｄｏｉ：１０．１１９１／０９６１２０３３０４ｌｕ１０２３ｏａ．ＰＭＣ  ２０１４８２１．ＰＭＩＤ  １５２３０２８９）、関節リウマチ（Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ  Ｎ（Ｍａｙ  ２００６）．”Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ”．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ１８（３）：２７７−２８１．ｄｏｉ：１０．１０９７／０１．ｂｏｒ．００００２１８９４９．１９８６０．ｄ１．ＰＭＩＤ  １６５８２６９２）、自己免疫疾患（Ｉｓｈｉｈａｒａ  Ｋ，Ｈｉｒａｎｏ  Ｔ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．２００２  Ａｕｇ−Ｏｃｔ；１３（４−５）：３５７−６８．ＩＬ−６  ｉｎ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ））、口腔内疾患（Ｎｉｂａｌｉ  Ｌ，Ｆｅｄｅｌｅ  Ｓ，Ｄ’Ａｉｕｔｏ  Ｆ，Ｄｏｎｏｓ  Ｎ  Ｏｒａｌ  Ｄｉｓ．２０１２  Ａｐｒ；１８（３）：２３６−４３．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１６０１−０８２５．２０１１．０１８６７．ｘ．Ｅｐｕｂ  ２０１１  Ｎｏｖ  ４．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  ｉｎ  ｏｒａｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ）、冠動脈疾患（Ｌｉｍ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  ９，３１３（Ｊｕｎｅ  ２０１２）｜ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｃａｒｄｉｏ．２０１２．４６  Ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ：ＩＬ−６  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｌｉｎｋｅｄ  ｗｉｔｈ  ＣＨＤ）、ウイルス、細菌または原生動物による感染の進行、ならびに血液系および固形悪性腫瘍（Ｂａｒｔｏｎ  ＢＥ（Ａｕｇｕｓｔ  ２００５）．”Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  ａｎｄ  ｎｅｗ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａＴｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ，ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  ｐａｒａｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ”．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｔａｒｇｅｔｓ  ９（４）：７３７−７５２．ｄｏｉ：１０．１５１７／１４７２８２２２．９．４．７３７．ＰＭＩＤ  １６０８３３４０）などの多数の疾患に関連する。
【００６３】
マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）−１αとも呼ばれるＣＣＬ３は、ＭＩＰ−１ＣＣケモカインサブファミリーの４つのメンバーの１番目である。ＣＣＬ３は単球／マクロファージを炎症部位へ引き付けることができ、ＣＣＲ５連結によるＨＩＶ−１の単球／マクロファージ取込みを潜在的に阻害し得る。従って、現在、本明細書に開示される化合物は、喘息、関節炎、または多発性硬化症などの種々の炎症疾患の処置において適用され得ると考えられている。
【００６４】
ＭＩＰ−１タンパク質は、Ｇタンパク質共役受容体スーパーファミリーに属する細胞表面ＣＣケモカイン受容体（細胞当たり３×１０４〜５×１０５の受容体）に結合することによって、その生物学的効果を媒介する。
【００６５】
受容体結合は、高親和性相互作用と、それに続く一連の細胞内事象を伴い、走化性、脱顆粒、食作用、およびメディエータ合成を含む広範な標的細胞機能を急速にもたらす。シグナル伝達事象はＧタンパク質複合体によって開始され、ＧαおよびＧβγサブユニットへのその解離が生じる。
【００６６】
ＭＩＰ−１ファミリーのメンバーは、主に炎症促進性細胞を補充することによって、損傷または感染の部位で急性および慢性の炎症性宿主応答を編成する。これらは炎症組織への循環からのＴ細胞走化性のために重要であり、単球、樹状細胞、およびＮＫ細胞の経内皮遊走の制御においても重要な役割を果たす。
【００６７】
従って、ＭＩＰ−１タンパク質が、喘息、肉芽腫形成、創傷治癒、関節炎、多発性硬化症、肺炎、および乾癬を含む多数の炎症状態および疾患の発症において重要な役割を果たすのは驚くことではない（Ｍｕｒｄｏｃｈ，Ｃ．，＆  Ｆｉｎｎ，Ａ．（２０００）．Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｂｌｏｏｄ，９５，３０３２−３０４３）。例えば、マスト細胞由来のＴＮＦαによって皮膚損傷部位に補充される好中球から放出されるＣＣＬ３は、皮膚の肉芽腫形成のマウスモデルンにおけるマクロファージ流入の重大なメディエータであることが見出された（ｖｏｎ  Ｓｔｅｂｕｔ，Ｅ．，Ｍｅｔｚ，Ｍ．，Ｍｉｌｏｎ，Ｇ．，Ｋｎｏｐ，Ｊ．，＆  Ｍａｕｒｅｒ，Ｍ．（２００３）．Ｅａｒｌｙ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｌｕｘ  ｔｏ  ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｇｒａｎｕｌｏｍａ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｎ  ＭＩＰ−１α／β  ｒｅｌｅａｓｅｄ  ｆｒｏｍ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ  ｂｙ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ＴＮＦα．Ｂｌｏｏｄ，１０１，２１０−２１５）。またＣＣＬ３は、皮膚の創傷修復において、治癒を促進する重大なマクロファージ化学誘引物質であると思われ（ＤｉＰｉｅｔｒｏ，Ｌ．Ａ．，Ｂｕｒｄｉｃｋ，Ｍ．，Ｌｏｗ，Ｑ．Ｅ．，Ｋｕｎｋｅｌ，Ｓ．Ｌ．，＆  Ｓｔｒｉｅｔｅｒ，Ｒ．Ｍ．（１９９８）．ＭＩＰ−１ａｌｐｈａ  ａｓ  ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｗｏｕｎｄ  ｒｅｐａｉｒ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１０１，１６９３−１６９８．）、アレルギー性喘息のモデルにおいて抗原依存性の好塩基球走化性、ヒスタミン放出および好酸球増加症の発生の一因となる（Ｖｅｎｇｅ，Ｌａｍｐｉｎｅｎ，Ｈａｋａｎｓｓｏｎ，Ｒａｋ，＆  Ｖｅｎｇｅ，１９９６，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−５  ａｎｄ  ＲＡＮＴＥＳ  ａｓ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｓｔｈｍａｔｉｃ  ｌｕｎｇ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，９７，１１１０−１１１５）。またＭＩＰ−１タンパク質は、ウイルス（例えば、インフルエンザ）（Ｍｅｎｔｅｎ，Ｐ．，Ｗｕｙｔｓ，Ａ．，＆  ｖｏｎ  Ｄａｍｍｅ，Ｊ．（２００２）．Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１３，４５５−４８１）または寄生虫（Ａｌｉｂｅｒｔｉ，Ｊ．，Ｒｅｉｓ  ｅ  Ｓｏｕｓａ，ｃ．，Ｓｃｈｉｔｏ，Ｍ．，Ｈｉｅｎｙ，Ｓ．，Ｗｅｌｌｓ，Ｔ．，Ｈｕｆｆｎａｇｌｅ，Ｇ．Ｂ．，＆  Ｓｈｅｒ，Ａ．（２０００）．ＣＣＲ５  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ａ  ｓｉｇｎａｌ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−１２  ｂｙ  ＣＤ８  ａｌｐｈａ＋  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１，８３−８７）などの感染性病原体に対する炎症反応を誘発することによって健康を増進することができる。例えば、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）感染において、ＣＣＬ３およびＣＣＬ４（およびＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ）は、ＣＣＲ５に結合することによって樹状細胞からのＩＬ−１２放出を増大させ、その結果Ｔｈ１免疫の増強および寄生虫の排除がもたらされる（Ｖｅｎｇｅら，１９９６）。一方で、ＭＩＰ−１受容体ＣＣＲ３およびＣＣＲ５は、ＣＤ４＋標的細胞においてＭ−向性ＨＩＶ−１ウイルスの重要な共受容体であるのでＨＩＶ−１感染を促進する（Ｈｏｒｕｋ，Ｒ．（２００３）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｇｅｎｔｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２９，３６９−３７５）。
【００６８】
本発明の化合物は、場合によって、二重または多重に作用する薬物であると見なすことができ、ＨＩＶ−１またはＨＳＶ−２などのいくつかの疾患の処置を同時に扱うために使用され得る。ＨＩＶ−１およびＨＳＶ−２はいずれも性感染するので、本発明の化合物は、局所適用のために安定な溶液中に混合され得る。１つの選択肢は、皮膚適用のためのゲル製剤、または膣もしくは直腸内に適用される殺菌剤ゲルとしての製剤である。後者の溶液はいくつかの性感染される病原体を遮断または不活性化し得る。
【００６９】
本発明に従う化合物は、マラリアの処置または予防における使用にも適している。マラリアは、プラスモディウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）属の原生生物によって引き起こされる蚊媒介性の感染性疾患である。本発明は、Ｐ．ファルシパルム（ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、Ｐ．ビバックス（ｖｉｖａｘ）、Ｐ．オバレ（ｏｖａｌｅ）、Ｐ．ノウレシ（ｋｎｏｗｌｅｓｉ）およびＰ．マラリアエ（ｍａｌａｒｉａｅ）を含むプラスモディウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の任意の種によって引き起こされるマラリア疾患の処置または予防を含む。本発明の好ましい態様では、本発明に従う化合物は、Ｐ．ファルシパルム（ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）によって引き起こされるマラリアの予防または処置のために使用される。感染されるものの中で、Ｐ．ファルシパルム（ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）は最も一般的な同定された種であり（約７５％）、その次がＰ．ビバックス（ｖｉｖａｘ）（約２０％）である。Ｐ．ファルシパルム（ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）は、死亡の大部分の原因である。
【００７０】
プラスモディウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種は特定の生活環を有し、その一部は感染後にヒトの体内で起こる。本発明は、その生活環の全ての段階、特にヒトの体内で起こる生活環段階におけるプラスモディウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種に対する処置を含む。プラスモディウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の生活環において、メスのハマダラ蚊（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｍｏｓｑｕｉｔｏ）（固有宿主）は、運動性感染形態（スポロゾイトと呼ばれる）をヒトなどの脊椎動物宿主（第２宿主）に感染させ、従って伝染ベクターとしての役割を果たす。スポロゾイトは、血管を通って肝臓の細胞（肝細胞）まで移動し、そこで数千のメロゾイトを無性生殖的に再生する。これらは新しい赤血球を感染させて一連の無性増殖サイクルを開始させ、これにより、８〜２４の新しい感染性メロゾイトが生成され、その際に細胞が破裂し、感染サイクルが新たに始まる。生殖母体形成と呼ばれるプロセスにおいて、他のメロゾイトは未熟配偶子、すなわちガメトサイトに発達する。受精された蚊が感染者を刺すと、その血液からガメトサイトが採取され、蚊の腸内で成熟される。オスおよびマメスのガメトサイトは融合し、接合体（オーキネート）を形成し、これは新しいスポロゾイトに発達する。スポロゾイトは、昆虫の唾液腺に移動し、新しい脊椎動物宿主を感染させる準備ができる。スポロゾイトは、蚊が次の血液ミールを摂取する際に、唾液と一緒に皮膚に注入される。このタイプの伝染は、時折、前方ステーショントランスファー（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｓｔａｔｉｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）と呼ばれることもある。
【００７１】
本発明の態様では、本発明に従う化合物は抗菌剤として使用され得る。化合物は種々の細菌に対する一般的効果を有し、従って広範な用途を有することが予期される。従って、本発明の化合物は、任意選択で適切に処方された後に消毒剤として使用され得る。消毒剤は、病院内の部屋（例えば、外科医の部屋または手術室など）を含む種々のタイプの区画を消毒するために使用され得る。また、消毒薬によって、浴室を含む家庭内の部屋が清掃され得る。消毒され得る他の部屋には、豚および乳牛などの家畜用の小屋、ならびに研究室が含まれる。試験によって、本発明の化合物は、特定のタイプのスタフィロコックス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、例えば、メチシリン耐性スタフィロコックス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）、およびメチシリン感受性スタフィロコックス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＭＳＳＡ）などの量を低減する良好な能力を示すことが支持された。
【００７２】
ＭＲＳＡは、ヒトにおいて処置が困難ないくつかの感染の原因となる細菌である。これは、オキサシリン耐性スタフィロコックス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＯＲＳＡ）とも呼ばれる。ＭＲＳＡは、通常、自然淘汰のプロセスを通して、ペニシリン（メチシリン、ジクロキサシリン、ナフシリン、オキサシリンなど）およびセファロスポリンを含むベータ−ラクタム抗生物質への耐性を生じたスタフィロコックス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）のあらゆる株に対して使用される。これらの抗生物質に抵抗することができない株は、メチシリン感受性スタフィロコックス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、またはＭＳＳＡとして分類される。ＭＲＳＡは、開放創、侵襲的デバイス、および弱まった免疫系を有する患者が一般社会よりも高い感染の危険性を有する、病院、刑務所およびナーシングホームにおいて特に厄介である。このような耐性の進化は抗生物質耐性を有さないスタフィロコックス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の株よりも生物を本質的に毒性にすることはないが、耐性によってＭＲＳＡ感染は標準タイプの抗生物質による治療が困難になり、従ってより危険である。従って、本発明は、スタフィロコックス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒａｕｓ）による感染を患う患者またはその感染の危険がある患者に本発明に従う化合物を投与することによる、ＭＲＳＡおよびＭＳＳＡのような処置が困難な疾患の処置方法を提唱する。
【００７３】
本発明に従う化合物は、任意の医薬品形態で、そして任意の適切な薬学的に許容可能な添加剤と共に処方され得る。
【００７４】
本発明に従う化合物を含む医薬組成物は、特定の薬剤の目的および投与様式に応じて、いくつかの異なる方法で処方され得る。好ましい投与様式に従う組成物を処方することは十分に当業者の範囲内である。
【００７５】
本発明に従う抽出物を含む薬剤は、任意の従来の技術によって、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １９９５，Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ編，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａに記載されるように調製され得る。
【００７６】
薬剤は、従来使用されている任意の薬学的に許容可能な添加剤などの薬学的に許容可能な添加剤を含むことができ、これは、特定の製剤、意図される投与経路などに従って選択すべきである。例えば、薬学的に許容可能な添加剤は、Ｎｅｍａら，１９９７において言及される添加剤のいずれかであり得る。さらに、薬学的に許容可能な添加剤は、例えばインターネットアドレスｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｃｄｅｒ／ｄｒｕｇ／ｉｉｇ／ｄｅｆａｕｌｔ．ｈｔｍにおいて入手可能であるＦＤＡの「不活性成分リスト」からの任意の承認された添加剤であり得る。
【００７７】
本発明の一つの好ましい実施形態は、創傷、口唇ヘルペス、いぼ、ざ瘡、おむつかぶれ、直腸、性器などの局部的な表面の限定された領域における局所適用のために処方される医薬組成物を提供することである。
【００７８】
上述した前記実施形態では、薬剤は、軟膏、ローション、クリーム、バス混合物、ゲル、ペースト、乳液、懸濁液、エアロゾル、スプレー、フィルム、フォーム、セラム、綿棒、綿撒糸、パッド、パッチ、粉末、ペースト、リニメント、種々のエマルション、ポリッジ、または局所投与に適切な別の製剤として処方され得る。
【００７９】
局所投与のためのこのような組成物はさらに、キャリア、界面活性剤、防腐剤、安定剤、緩衝剤、賦形剤および乳化剤などの、このタイプの投与に適した生理学的に許容可能な成分を含み得る。局所送達系に適した成分は、好ましくは、レシピエントに過剰または不可避な刺激または痛みを引き起こさない成分から選択される。キャリアは希釈剤を含み、医薬品成分が溶解、分散または分配される媒体を提供する。
【００８０】
本発明に従う薬剤は、キャリア、例えば水性液体ベース、非水性液体ベース、水溶性ゲル、鉱油ベース、エマルション、軟膏、クリーム、ゲルまたはローション、液体中の固体粒子の懸濁液などを含むことができるが、これらに限定されない。
【００８１】
薬物の局所的な利用可能性は、キャリア（ゲル、クリーム−親水性）中に溶解するその能力、および皮膚バリア（すなわち、角質層−疎水性）に浸透するその能力を含む種々の因子に依存し、従って独特の疎水性−親水性バランスを必要とする。製剤は、輸送プロセス（媒体への溶解および皮膚全体の拡散）のいずれかまたは両方を容易にするために浸透増強剤および可溶化剤などの賦形剤の添加を必要とし得る。薬物の経皮送達を増大するために、アルコール、脂肪アルコール、脂肪酸、モノ−、ジ−またはトリ−グリセリド、グリセロールモノエーテル、シクロデキストリンおよび誘導体、ポリマー、生体接着剤、テルペン、キレート剤および界面活性剤などの添加剤が開示されている。このような賦形剤を使用することも本発明の範囲内である。
【００８２】
経皮送達を増大するためのあらゆる方法（上述のものに限定されない）は、本発明の範囲内に含まれる。従って、本発明に従う薬剤は、イオン性および／または非イオン性界面活性剤などの界面活性剤を含み得る。適切な非イオン性界面活性剤には、例えば、脂肪アルコールエトキシラート（アルキルポリエチレングリコール）；アルキルフェノールポリエチレングリコール；アルキルメルカプタンポリエチレングリコール；脂肪アミンエトキシラート（アルキルアミノポリエチレングリコール）；脂肪酸エトキシラート（アシルポリエチレングリコール）；ポリプロピレングリコールエトキシラート（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）；脂肪酸アルキロールアミド（脂肪酸アミドポリエチレングリコール）；アルキルポリグリコシド、Ｎ−アルキル−、Ｎ−アルコキシポリヒドロキシ脂肪酸アミド、特にＮ−メチル−脂肪酸グルカミド、スクロースエステル；ソルビトールエステル、ソルビトールポリグリコールエーテルおよびレシチンのエステルが含まれる。イオン性界面活性剤には、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリン酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル、ラウレス−９、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）およびスルホコハク酸ジオクチルナトリウムが含まれる。
【００８３】
アルコールには、エタノール、２−プロパノールおよびポリオール、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、プロピレングリコール、グリセロール、プロパンジオールが含まれるが、これらに限定されない。
【００８４】
局所投与による薬物送達を増強するための方法は、本発明と共に適用することができ、フェヌグリーク（Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ  ｆｏｅｎｕｍ−ｇｒａｅｃｕｍ）の抽出物などの薬剤の活性成分の吸収を増大し、その代謝を最小限にし、そして／あるいはその半減期を長くする任意の手段を含み得る。このような手段には、リポソームタイプのトランスポーター、ＩＳＣＯＭ、ナノ粒子、ミクロスフェア、ヒドロゲル、オルガノゲル、ポリマーまたは他のマイクロカプセル化技術の使用が含まれる。
【００８５】
本発明に従う局所送達のための薬剤は、任意の適切な量、例えば重量により０．０１〜５０ｗｔ％、好ましくは０．１〜３０ｗｔ％の本発明に従う化合を含み得る。
【００８６】
本発明の別の好ましい実施形態は、マウスウォッシュなどの経口投与のために処方された薬剤を提供することである。
【００８７】
１つの好ましい実施形態では、薬剤は、例えば本発明に従う化合物を液体中に溶解または分散させることによって、マウスウォッシュとして処方される。
【００８８】
液体は、任意の有用な液体であり得るが、多くの場合、液体は水性液体であることが好ましい。さらに、液体は無菌であることが好ましい。無菌は、任意の従来の方法、例えばろ過、照射または加熱によって付与することができる。
【００８９】
感染または感染する危険の増大を伴う上記の臨床状態の処置のために本発明の化合物を含む薬剤およびその使用を供給することは、本発明の範囲内に含まれる。限定はされないが例えば、微生物種による感染を伴う、あるいは微生物種により感染される危険のある臨床症状である。本発明の一実施形態では、化合物は少なくとも１つの第２の活性成分と同時に投与される。好ましくは、本発明の化合物および第２の活性成分は同じ薬剤中に存在する。あるいは、これらは各成分のキットで供給されてもよい。好ましくは、前記第２の活性成分は、抗微生物薬、例えば、防腐剤、抗生物質、抗真菌剤、抗寄生虫剤または抗ウイルス剤である。
【００９０】
本発明に従う実施形態では、本発明の化合物は練り歯磨き中の構成要素である。
【００９１】
本発明によると、化合物は、「薬学的に有効な投薬量」の組成物中に存在する。薬学的に有効な投薬量は、処置を必要としている被験者において所望の生物学的効果を誘発するのに必要な量を指す。
【００９２】
本発明に従う薬剤は、１日１回または２回以上投与され得る。例えば、１日２〜１０回、例えば１日２〜７回、例えば１日２〜５回、例えば１日２〜４回、例えば１日２〜３回の範囲で投与され得る。
【００９３】
本発明に従う薬剤は、１週間または１週間を超える処置期間、例えば、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間または８週間を超える処置期間の間、被験者に投与され得る。再発する被験者には処置が繰り返され得る。
【実施例】
【００９４】
実施例１
フェヌグリーク（Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ  ｆｏｅｎｕｍ−ｇｒａｅｃｕｍ）種子からの抽出物の調製を次のように実施した：５００ｇのフェヌグリーク（Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ  ｆｏｅｎｕｍ−ｇｒａｅｃｕｍ）の種子を２．５ｌの水中に約２４時間浸漬した。予浸の後、種子を２０分間調理し、種子の残りを混合物から除去した。抽出物を冷却した。
【００９５】
抽出物を約８００ｍｌのエタノールで処理し、多糖類および植物残渣を沈殿させた。混合物を９０００ｒｐｍの遠心分離にかけた。レミニセンス（ｒｅｍｉｎｉｓｃｅｎｃｅ）を収集し、エタノールを水の一部と一緒に蒸発させた。続いて、セルロースフィルタ（０．４５μｍ）により抽出物をろ過した。このプロセスにより、約１８ｇ／ｌの乾燥物質含量を得た。水性抽出物を凍結乾燥させ、粉末が得られた。
【００９６】
１Ｍ塩酸を用いて、１０ｍｇ／ｍｌの濃度で水中に溶解した５ｍｌの粉末をｐＨ２に調整し、１０ｍｌのヘプタンと混合した。混合物を攪拌し、水相を単離し、炭酸ナトリウム水を用いてｐＨ１０に調整した。この水層をヘプタン（５ｍｌ）と共に攪拌し、有機相を収集した。有機相を２つの画分に分離し、窒素下での蒸発にさらした。画分の一方を化学分析に使用し（実施例２）、他方を生物学的アッセイに使用した（実施例３）。
【００９７】
実施例２
実施例１からのバイアルの化学分析：
ＬＣＭＳ分析
ＭＳ検出器を有するＳｕｍｍｉｔ４
陽イオン化
カラム：Ｐｒｉｍｅｓｅｐ  Ｄ
溶離液Ａ：０．１Ｍギ酸
溶離液Ｂ：アセトニトリル
ＳＣＡＮモード、５０〜１０００ａｍｕ
ＧＣＭＳ分析
ＭＳＤ検出器を有するＡｇｉｌｅｎｔ  ＧＣ
カラム：ｆ．ｅｋｓ．Ｚｅｂｒｏｎ  ＺＢ−Ｗａｘ（ｎｒ．２７）
ＳＣＡＮモード  ５０〜５５０ａｍｕ
【００９８】
ＬＣ−ＭＳおよびＧＣＭＳ分析により、実施例１で調製した活性画分のサンプル中に、同じモチーフを有するいくつかの化合物が存在することが示された。サンプル中の分子は以下の組成を有した。
Ｃ１８Ｈ３５ＮＯ
Ｃ１６Ｈ３３ＮＯ
Ｃ１４Ｈ２９ＮＯ
Ｃ１２Ｈ２９ＮＯ
Ｃ１０Ｈ２７ＮＯ
【００９９】
ＤＭＳＯ−ｄ６およびメタノール−ｄ６中の画分１Ａのサンプルの１ＨＮＭＲをそれぞれ作成した。ＮＨ２基に一致する６．８８ｐｐｍにおけるシグナルは、ＤＭＳＯ−ｄ６サンプルでは検出されたが、メタノール−ｄ６サンプルでは消失した。複数の化合物のうちの１つを詳細な分析のために選択した。図１は、同定された化合物の構造と１ＨＮＭＲ図との間の相対応を示す。
2015537012.tif 000004
【０１００】
ＬＣ−ＭＳおよびＧＣＭ分析で同定された５つの化合物は、以下の化学式で表すことができる。
2015537012.tif 000005
【０１０１】
実施例３
実施例１からのバイアルをＨＳＶ−２活性について試験した。
【０１０２】
１０％の熱失活ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および５０Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を含有するＤｕｌｂｅｃｃｏのＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中で、ベロ腎臓上皮細胞を成長させた。ウイルスプラークアッセイのために、ベロ細胞を２４ウェルプレートに７〜９×１０５細胞／ウェルの密度で播種して、一晩培養した後、９５％コンフルエンスを得た。ベロ細胞内でＨＳＶ−２株を増幅させ、以前に記載されたように（Ａｎｋら，２００６）、ウイルス滴定により定量化した。遺伝子導入の２４時間後に細胞培地を新しくし、遺伝子導入の４８時間後に、ウイルスを含有する上清を収集し、０．４５μｍフィルタによりろ過し、−８０℃で貯蔵した。
【０１０３】
標準ベロ細胞プラークアッセイを用いて、直接抗ウイルス活性を評価した。実施例１からの第２のバイアルを０．００５％のギ酸を含有する水中で再構成し、続いて１／１０体積の１０×ＰＢＳを添加した。３０μｌの溶液を３０μｌのＨＳＶ−２溶液と混合した。混合物を室温で３０分間インキュベートした。インキュベートした混合物５０μｌを９５％コンフルエントのベロ細胞に添加した。インキュベーションの２４時間後、ＰＢＳ中４％ホルムアルデヒド（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｅｐｐｅｌｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて細胞を１０分間固定し、ＰＢＳ／１０％ＥｔＯＨ中０．５％のクリスタルバイオレット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で染色し、その後ウイルスプラークを数えた。
【０１０４】
プラークを４段階スケール（−、＋、＋＋、＋＋＋）で評価した。実施例２で同定された化合物を含有するバイアルは、最大限の活性（＋＋＋）を示した。活性は希釈により減少し、Ｓ字型用量応答曲線の存在を示した。実施例１からのバイアルの内容物と、ＬＣ−ＭＳ分画からの他の希釈画分との組み合わせによって、最大限の活性のために実施例１からのバイアルの内容物が必要であることが明らかにされた。
【０１０５】
実施例４
材料および方法
細胞
ベロ腎臓上皮細胞、ヒト肺胞癌上皮Ａ５４９細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞およびヒトケラチノサイトＨａＣａＴ細胞は、１０％の熱失活ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および５０Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を含有するＤｕｌｂｅｃｃｏのＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中で成長させた。ＴＬＲ４を安定して発現するＨＥＫ２９３細胞は、１０％の熱失活ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、５０Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）および５００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含有するＤＭＥＭ中で成長させた。ヒト単球ＴＨＰ−１細胞およびヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１０％の熱失活ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を追加したＲＰＭＩ１６４０（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中で培養した。ＰＢＭＣ精製のために、白血球が豊富なバフィーコートをＳｋｅｊｂｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋから入手するか、あるいは新たに採取した血液細胞から精製した。Ｉｓｏｐａｑｕｅ−Ｆｉｃｏｌｌ分離によってＰＢＭＣを精製し、１０％のＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を含有するＲＰＭＩ１６４０成長培地中で凍結させるか、あるいは直接使用した。実験の前にＰＢＭＣを注意深く解凍し、刺激実験および生存率アッセイのために、９６ウェル培養プレートにＰＢＭＣを２×１０５細胞／ウェルの密度で播種し、一晩培養した後、さらに処置した。さらなる処置の６時間前に、ＴＨＰ−１細胞を１×１０５細胞／９６ウェルの密度で播種した。生存率アッセイのために、ＨａＣａＴおよびベロ細胞を１×１０４細胞／ウェルの密度で播種した。ウイルスプラークアッセイのために、２４ウェルプレートにベロ細胞を７〜９×１０５細胞／ウェルの密度で播種し、一晩培養した後９５％のコンフルエンスを得た。
【０１０６】
ウイルス
ＨＳＶ−２株をベロ細胞内で増幅させ、以前に記載されたように（Ａｎｋら，２００６）、ウイルス滴定により定量化した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内にＨＩＶ−１株８９．６およびＪＲ−ＣＳＦを生じさせた。簡単には、ＨＥＫ２９３Ｔを５×１０４／ｃｍ２で播種し、リン酸カルシウム沈殿を用いて、１０μｇのＨＩＶ−１プラスミド／Ｔ８０ボトル（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）により遺伝子導入した。ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ，ＵＳＡによって、ＨＩＶ−１株８９．６およびＪＲ−ＣＳＦのためのプラスミドを得た。遺伝子導入の２４時間後に細胞培地を新しくし、遺伝子導入の４８時間後に、ウイルスを含有する上清を収集し、０．４５μｍフィルタによりろ過し、−８０℃で貯蔵した。以前に記載されたように（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄら，２０１１）、ＴＺＭ−ｂｌ細胞におけるウイルス感染力を決定した。
【０１０７】
ＭＴＴおよびセル・タイター・グロー（ｃｅｌｌ  ｔｉｔｅｒ  ｇｌｏｗ）細胞毒性アッセイ
接着細胞における毒性を評価するために、９６ウェルプレートに細胞を播種し、一晩保持した後、ＴＦＧ抽出物を適用した。４８時間のインキュベーションの後、細胞を（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）（ＭＴＴ）基質で染色した。簡単には、０．５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を含有する培地中で、細胞を３時間インキュベートした。続いて、１：１体積の９６％ＥｔＯＨおよびＤＭＳＯにより細胞を溶解させ、５７０ｎｍにおける吸光度を読み取ることによって細胞生存を定量化した。セル・タイター・グロー（ＣＴＧ）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｎａｃｋａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて非接着性ＴＨＰ−１細胞およびＰＢＭＣに対して生存率の定量化を実施した。２０μｌのＴＨＰ−１細胞懸濁液を白色プレート（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｓｋｏｖｌｕｎｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に移した。続いて、２５μｌのＣＴＧ試薬を添加し、プレートを振とうさせ、発光シグナルのレベルを測定した。ＰＢＭＣについては、細胞を含有する５０μｌの培地に５０μｌのＣＴＧ試薬を添加し、その後、５０μｌの溶液を白色プレートに移し、１０分間放置して発光シグナルを安定化させた。Ｆｌｕｓｔｅｒ  Ｏｍｅｇａプレートリーダー（ＢＭＧ  Ｌｅｂｅｃｈ，Ｒｏｔｅｎｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、生存率の尺度としてルシフェラーゼ活性を定量化した。
【０１０８】
ＨＳＶ−２プラークアッセイ
標準ベロ細胞プラークアッセイを用いて、ＴＦＧ種子抽出物の直接抗ウイルス活性を評価した。ＨＳＶ−２（株ＭＳ）を添加する前または後に９５％コンフルエントの細胞を抽出物で処理するか、あるいは細胞に添加する前にＴＦＧ抽出物を指示時間および濃度でプレインキュベートした。脂質添加による実験のために、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を、ＴＦＧ抽出物およびウイルスの混合物またはウイルス単独に、指示濃度で２０分間添加した。ＴＦＧ抽出物の加熱処理を５６℃で２０分間実施した。対照培養物はＰＢＳを与えるか、あるいはウイルスをＰＢＳと混合した。インキュベーションの２４時間後、ＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒド（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｅｐｐｅｌｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて細胞を１０分間固定し、ＰＢＳ／１０％ＥｔＯＨ中０．５％のクリスタルバイオレット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で染色し、その後ウイルスプラークを数えた。
【０１０９】
ＴＺＭ−ｂｌ  ＨＩＶ感染力アッセイ
Ｈｅｌａ由来のＴＺＭーｂｌ細胞を用いて、抗ＨＩＶ感染力を評価した。ＴＺＭ−ｂｌ細胞は、ＨＩＶ−１の長い末端反復配列（ＬＴＲ）の制御下で、ＨＩＶ受容体ＣＤ４、ならびに共受容体ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４を発現し、ルシフェラーゼβ−ガラクトシダーゼレポーター系を内部に有する。９６ウェル培養プレートにＴＺＭ−ｂｌ細胞を１×１０４細胞／ウェルの密度で播種し、一晩培養した。細胞をＨＩＶ−１株８９．６またはＪＲＣＳＦ（ＴＣＩＤ５０または５５０）に感染させた。ウイルスを細胞に添加する前に、ウイルスを指示濃度のＴＦＧ抽出物と共に室温で６０分間プレインキュベートした。３日後に培地を除去し、ウイルスを不活性化するために、細胞を９０μｌのＰＢＳ中０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０と共に少なくとも４５分間インキュベートした。９０μｌのｂｒｉｔｅｌｉｔｅ  ｐｌｕｓ試薬（Ｐｅｒｋｉｎｇ−Ｅｌｍｅｒ，Ｓｋｏｖｌｕｎｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）／ウェルを用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。混合した後、１５０μｌの溶液を白色９６ウェルプレート（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｓｋｏｖｌｕｎｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に移した。ＦＬＵＯｓｔａｒ  Ｏｍｅｇａプレートリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ、Ｏｒｔｅｎｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ルシフェラーゼ活性を定量化した。
【０１１０】
ＣＭＶアッセイ
ＴＦＧ抽出物と共にプレインキュベートしたＣＭＶに、あるいは対照としてＰＢＳに、コンフルエントなＭＲＣ−５細胞を３０分間感染させた。感染の３日後に細胞をＰＢＳで洗浄し、固定し、８０％アセトンで１０分間透過処理した。洗浄した後、細胞を１：１０希釈モノクローナル抗ＣＭＶ抗体（クローンＤＤＧ９＋ＣＣＨ２、Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）と共に３０分間インキュベートし、続いて、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＦ（ａｂ）２抗体（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）と共に３０分間インキュベートした。蛍光顕微鏡によりＣＭＶ陽性細胞を可視化した。
【０１１１】
インフルエンザＡウイルスアッセイ
９６ウェル培養プレートに播種したＭＤＣＫ細胞に添加する前に、ウイルスをＴＦＧ抽出物と共に室温で３０分間インキュベートした。適切なインキュベーション時間の後、ＩＭＡＧＥＮキット（Ｏｘｏｉｄ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いるウイルスタンパク質のための蛍光染色によって感染細胞の数を可視化し、蛍光顕微鏡法を用いて感染細胞の数をカウントした。
【０１１２】
刺激実験
ＴＬＲ４リガンドＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＴＬＲ７／８リガンドＲ８４８（０．５μｇ／ｍｌ、ＩｎＶｉｖｏＧｅｎ，Ｔｏｕｌｏｕｓｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、またはＴＮＦ−α（２５ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ）による刺激の前に、細胞を指示濃度のＴＦＧ抽出物で３０分間前処理した。２０時間後に細胞培養上清を収集し、ＥＬＩＳＡによる分析まで−８０℃で貯蔵した。
【０１１３】
ＥＬＩＳＡ
ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１αのためのＤｕｏｓｅｔ  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ）、またはＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２ｐ４０／ｐ７０のためのＣｙｔｏｓｅｔ  ＥＬＩＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて、収集した細胞培養上清をアッセイした。ＥＬＩＳＡは、製造業者により指定されるように実施した。
【０１１４】
マウスおよびＴＦＧゲル
この研究で使用したマウスは、７週齢のＣ５７ＢＬ／６メス（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｍ＆Ｂ，Ｒｙ，Ｄｅｎｍａｒｋ）であった。記載される動物実験は全て、Ｔｈｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  Ｉｎｓｐｅｃｔｏｒａｔｅ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）により審査および承認された（承認番号２００９／５６１／１６４１）。０．５および２．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度を有するＴＦＧ抽出物ゲルを、ＰＢＳ中に希釈した１０ｍｇ／ｍｌのＴＦＧ抽出物から調製し、続いてヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）ゲル溶液（一般的なＨＥＣプラセボゲル、ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ，ＵＳＡ）と混合した。対照群については、ＰＢＳ中に希釈した一般的なＨＥＣプラセボゲルを用いた。ＨＳＶ−２感染に対して敏感にマウスを同調させるために、ＨＳＶ−２感染の５日前に１０ｍｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳ中に希釈したメドロキシプロゲステロンの２００μＬの皮下投与によってマウスを前処理した（Ｄｅｐｏ−Ｐｒｏｖｅｒａ、Ｐｆｉｚｅｒ，Ｂａｌｌｅｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）。２０μｌのＩｓｃｏｖｅｓ培地（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中で送達された致死量の株３３３ＨＳＶ−２（６．６７×１０４ｐｆｕ／マウス）により膣内感染を達成した。
【０１１５】
マウス膣感染研究
マウスを２つの群に分けてケージに入れ、一方には２０μｌのＴＦＧ種子抽出物膣内ゲルを与え、他方にはＨＥＣプラセボゲルを与えた。ＨＳＶ−２感染の１２時間前および１２時間後にゲルを適用した。ゲル適用および感染のためにイソフルラン（２−クロロ−２−（ジフルオロメトキシ）−１，１，１−トリフルオロ−エタン）によりマウスに麻酔をかけた。ゲルまたはウイルスの吸収を可能にするために、マウスは、各適用の後５〜１０分間麻酔したままにした。経過観察は、体重および以下のスケールに基づいた疾患スコアの毎日の監視を包含した。０：健康、１：性器の紅斑、２：中程度の性器感染、３：化膿性性器病変および／または全体的に悪い状態、４：後肢麻痺（安楽死に至る）。
【０１１６】
結果
ＨＳＶ−２、ＨＩＶ−１およびＣＭＶに対するＴＦＧ種子抽出物の抗ウイルス効果
ＨＳＶ−２およびＨＩＶ−１に対するＴＦＧ抽出物の直接抗ウイルス効果を決定するために、漸減濃度の抽出物によりウイルスを前処理し、続いて細胞を感染させた。適切なインキュベーション時間の後、ＨＳＶ−２についてはプラークカウント、そしてＨＩＶ−１についてはルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて、感染のレベルを定量化した。ＴＦＧ抽出物は、ＨＳＶ−２（図２）およびＨＩＶ−１（図３）の両方を効率的に阻害する。ＨＩＶ−１の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）は、プレインキュベーションチューブでは４０μｇ／ｍｌ、細胞培養プレートでは３８０ｎｇ／ｍｌであった。ＨＳＶ−２のＩＣ５０は遥かに低く、プレインキュベーションチューブでは約３００ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０であり、細胞培養ウェルでは３０ｎｇ／ｍｌの濃度になる。結論として、ＴＦＧ抽出物は、主要なヒト病原体のＨＩＶ−１およびＨＳＶ−２によるウイルス感染を効率的に阻害する。
【０１１７】
細胞増殖に対するＴＦＧ抽出物の選択的効果および細胞毒性の評価
細胞成長に対する抽出物の毒性および効果を取り扱うために、漸増濃度で化合物を異なる細胞培養物およびヒト初代細胞に添加し、刺激の２日後に生存率を評価した。ベロ細胞（図６）およびヒトＰＢＭＣ（図８）については、ＴＦＧ抽出物は１００〜２００μｇ／ｍｌの濃度範囲内の５０％毒性濃度（ＴＤ５０）であった。ヒトケラチノサイト細胞株ＨａＣａＴは、１００μｇ／ｍｌよりも大きいのＴＤ５０を有した（図７）。
【０１１８】
興味深いことに、上皮ベロ細胞は３０〜７０μｇ／ｍｌのＴＦＧ濃度範囲で増殖の増大を示し（図６）、ＨａＣａＴケラチノサイトについても同様の傾向が見られ、ＴＦＧ抽出物を含まない対照と比較して、５０μｇ／ｍｌのＴＦＧ抽出物濃度において細胞数の一貫した増大を有した（図７）。同様の傾向は図８においてＰＢＭＣ細胞について観察され得る。結論として、ＴＦＧ抽出物は、ＨＳＶ−２に対する抗ウイルス活性の全範囲（プレインキュベーションチューブにおいて０．１〜２．５μｇ／ｍｌ、図６）において非毒性であり、抗ＨＩＶ−１の抗ウイルス活性の上限範囲（プレインキュベーションチューブにおいて１０〜４０μｇ／ｍｌ、図７）において非毒性である。さらにデータは、ＴＦＧ抽出物の特定の濃度における増殖効果を示唆する。
【０１１９】
主にウイルスとの直接相互作用による急速な抗ウイルス効果
次に、観察された効果が直接的な殺ウイルス効果であるか、あるいは侵入および複製の阻害を含む感染における後の時点の効果であるかを決定した。従って、感染の２時間前から感染の２時間後までの範囲でＴＦＧ抽出物（２０μｇ／ｍｌ）を添加するいくつかの実験を実施した。最大抗ウイルス効果は、感染の時点で抽出物が適用される場合に見られた（図９）。抗ウイルス効果は、ＴＦＧ抽出物が感染時点よりも前または後に添加されると徐々に低下し、抽出物を含まない対照と比較して、抽出物が感染の１時間前または１時間後に添加されると抗ウイルス活性は５０〜５５％であり、ＴＦＧ抽出物が感染の２時間前または２時間後に添加されると抗ウイルス効果は３０〜３５％であった。ＴＦＧ抽出物はウイルスと一緒に適用されたときにその効果を最も効率的に発揮することが分かったので、次に、効率的な抗ウイルス効果に必要なインキュベーション時間を調査することが望まれた。ベロ細胞に添加する前に、ＨＳＶ−２をＴＦＧ抽出物（１μｇ／ｍｌ）と共に３０秒間または５分間インキュベートした。抽出物は非常に急速に作用し、わずか数秒のインキュベーション時間でウイルスレベルは１５〜８５％低減され、ウイルスおよびＴＦＧ抽出物の５分間のインキュベーションの結果、ウイルス感染は実質的に全くないことが分かった。結論として、ＴＦＧ抽出物はウイルスとの直接相互作用によって作用し、恐らくＴＦＧ抽出物はウイルス粒子を直接妨害し、感染の初期段階を阻害する。次に、ＴＧＦ抽出物の安定性を決定した。５６℃に加熱した抽出物（図１０）および溶液中での数週間の貯蔵後の抽出物（データは示されない）において、抗ＨＳＶ−２効果は損なわれないことが分かった。集合的に、データはＴＦＧ抽出物が非常に安定であることを示し、作用のメカニズムはウイルス粒子との直接相互作用および／または初期感染段階の阻害によるものであることが示唆される。
【０１２０】
ＴＦＧ植物抽出物の抗ウイルス効果が脂質競合により阻害される
ＴＦＧ抽出物は恐らくウイルス粒子と直接相互作用をし、そして／あるいは感染の初期段階を妨害することが分かり、そして特定の抗ウイルス化合物は、ＨＳＶ−２およびＨＩＶ−１を含むエンベロープのあるウイルス上の脂質膜と直接相互作用することが分かっている（Ｗｏｌｆら，２０１０）ので、脂質が、観察される抗ウイルス効果を妨害し得るかどうかを調査した。脂質の添加は抗ウイルス効果を強力に低減することが分かった（図１１）。結論として、データは、ＴＦＧ抗ウイルス効果がウイルス膜との直接相互作用によるものであることを示唆する。
【０１２１】
ＴＦＧ抽出物は炎症促進性ＩＬ−６およびＣＣＬ３のレベルの増大を媒介する
ＴＦＧ植物抽出物の医学的な可能性を評価するために、続いて、ヒト細胞における炎症および生来のサイトカイン応答に対する抽出物の効果を調査した。細胞表面ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）活性化を引き起こす細菌内毒素／リポ多糖（ＬＰＳ）による、およびエンドソームに位置するＴＬＲ７／８のリガンドであるＲ８４８による刺激の前に、１０μｇ／ｍｌまたは２０μｇ／ｍｌのＴＦＧ抽出物または培地で３０分間ヒトＰＢＭＣを前処理した。さらに、炎症性メディエータＴＮＦ−αによって細胞を刺激した。ＴＦＧ抽出物は、ヒトＰＢＭＣにおいてＩＬ−６およびＣＣＬ３／ＭＩＰ−１αを誘発した（図１２Ａおよび１２Ｄ）。同様に、ヒト単球ＴＨＰ−１細胞は、ＴＦＧ抽出物（５０および５００μｇ／ｍｌ）による刺激の後、ＣＣＬ３により応答する（図１２Ｅ）。さらに、ＴＦＧ抽出物の添加は、ＰＢＭＣおよびＴＨＰ−１細胞の両方において、ＬＰＳ−、Ｒ８４８−およびＴＮＦ−αにより引き起こされるＩＬ−６およびＣＣＬ３応答を増大させた（図１２Ａ〜Ｅ）。結論として、生来の病原体センサーのＴＬＲ４およびＴＬＲ７／８の誘発の後、ならびにＴＮＦ−α刺激の後に、ＴＦＧ種子抽出物は炎症促進性ＩＬ−６およびＣＣＬ３を誘発し、ＩＬ−６およびＣＣＬ３の産生を増大させる。
【０１２２】
ＩＬ−１０およびＩＬ−１２分泌に対するＴＦＧ種子抽出物の効果
ＴＦＧ種子抽出物のより広い免疫調節効果を評価するために、炎症および抗ウイルス応答の重要な調節因子であるＩＬ−１０およびＩｌ−１２の分泌を調査した。ＩＬ−１０は炎症の一般的な抑制因子であり、ＩＬ−１２は効率的な抗ウイルス応答の重要な調節因子である（Ｃｏｕｐｅｒら，２００８、Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ，２００３、Ｗａｔｆｏｒｄら，２００３）。ＴＦＧ抽出物の存在下または非存在下で、ＬＰＳ、Ｒ８４８またはＴＮＦ−αによりＰＢＭＣを刺激した。ＩＬ−１０分泌もＩＬ−１２分泌も、ＴＦＧ抽出物（１０および２０μｇ／ｍｌ）によって有意に誘発されなかった（図１３Ａ、ＣおよびＤ）。またＬＰＳに誘発されるＩＬ−１０およびＩＬ−１２もＴＦＧ抽出物の存在による影響を受けなかった（図１３ＡおよびＤ）。しかしながら、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２のＲ８４８による誘発はＴＦＧ抽出物によって増強された（図１３ＢおよびＥ）。同様に、ＴＮＦ−αに誘発されるＩＬ−１０はＴＦＧ種子抽出物の存在下で増大された。総合して、データは、ＴＦＧはＩＬ−１０またはＩＬ−１２を単独では誘発しないが、ＴＦＧ抽出物は、Ｒ８４８またはＴＮＦ−α刺激によるＩＬ−１０およびＩＬ−１２のレベルを選択的に増大させることを示唆する。
【０１２３】
ＴＦＧを含有する殺菌剤はＨＳＶ−２による膣感染を阻害する
インビボのＴＦＧ抽出物の直接的な可能性を評価するために、マウス膣チャレンジモデルにおいてＴＦＧ殺菌剤を使用した。ＨＳＶ−２感染の１２時間前および１２時間後に、０．５または２．５μｇ／ｍｌのＴＦＧ抽出物を含有するゲルをマウスに適用した。その後毎日、標準臨床スコアを用いてマウスを点数化した。０．５μｇ／ｍｌのＴＦＧゲルを用いる実験では、実験のうち２つのＴＦＧゲルは臨床スコアを低下させたが、３番目は有意な効果を示さなかった。０．５μｇ／ｍｌのＴＦＧゲルを用いる実験の平均は図１４Ａに示される。２．５μｇ／ｍｌのＴＦＧ抽出物を含有するゲルを用いると、同様に、ＴＦＧ含有ゲルを与えたマウスでは重症度の低い疾患が見出された（図１４Ｂ）。結論として、データは、ゲルで処方されたＴＦＧ抽出物が膣チャレンジモデルにおいてＨＳＶ−２感染を減弱し得ることを示す。
【０１２４】
考察
ＨＳＶ−２およびＨＩＶ−１は、世界中の人々の大部分に影響を与えるヒト病原体である。ウイルスは潜伏感染をもたらす。いずれのウイルスについても、治療もワクチンも有効でない。さらに、ウイルスの蔓延は、特に世界の発展途上地域では制御するのが困難である。結果として、ウイルス感染および蔓延の代替の制限方法は極めて重要である。
【０１２５】
本明細書において、我々は、マメ科ＴＧＦ（コロハ）からの種子の抽出物がＨＳＶ−２およびＨＩＶ−１に対する抗ウイルス活性を有することを示した（図２および３）。我々は、抽出物が非毒性濃度でＨＳＶ−２およびＨＩＶ−１に対して活性であることを見出し（図６〜８）、メカニズムがウイルスエンベロープとの直接相互作用によるものであることを提唱した（図９および１０）。ＨＳＶ−２およびＨＩＶ−１は洗剤に対して感受性である（Ｋｒｅｂｓら，１９９９、Ｚｅｉｔｌｉｎら，１９９７）ので、抗ウイルス効果は例えばサポニンによる洗剤効果であると我々は考えた。しかしながら、抗ウイルスＨＳＶ−２効果は、ＰＢＳ中１００ｎｇ／ｍｌのＴＦＧ抽出物を下回る非常に低い濃度で見出され、これは、試験した全ての細胞について見られる毒性効果範囲よりも実質的に低い。従って、我々は、洗剤効果が抗ＨＳＶ−２効果の主要な原因であることを排除した。しかしながら、プレインキュベーション段階における抗ウイルス性ＴＦＧ抽出物の濃度（チューブ濃度、図３）は、インキュベーションの２日後にＴＺＭ−ｂｌ細胞において見出される細胞毒性濃度の範囲内にあるので、抗ＨＩＶ−１効果が部分的に洗剤効果に媒介されることは排除できない。ウイルスおよび細胞と接触するＴＦＧ溶液はｐＨ中性であり、緩衝溶液中にあるので、ｐＨ依存性効果を排除した。
【０１２６】
抗ウイルス効果のメカニズムから判断して、我々は、ＴＦＧ抽出物が感染の時点で存在する場合に最も効果的に作用することを見出した（図９）。データはウイルスとの直接相互作用を示唆したが、安定性が高く、感染の２時間前および２時間後にＴＦＧが添加される両方の場合に抗ウイルス効果が観察されるので、ＴＦＧ抽出物の抗ウイルス効果が細胞培養において持続性であることも示した。抗ウイルス効果のメカニズムから判断して、我々は、ＴＦＧ抽出物への脂質の添加が抽出物の抗ウイルス効果を妨害することを見出し（図４）、従って、ＴＦＧ抽出物中の抗ウイルス化合物が脂質膜に結合することが示唆された。
【０１２７】
抗ウイルス効果に加えて、我々は、ＴＦＧ抽出物がいくつかの方法で細胞に影響を与えることを見出した：ｉ）１００μｇ／ｍｌの濃度において細胞生存率／細胞成長を制限する、ｉｉ）特定の濃度範囲で特定の細胞の増殖を誘発する、およびｉｉｉ）サイトカイン応答を誘発及び増大することによって免疫応答を調節する。特に、我々は、１００〜２００μｇ／ｍｌよりも高いＴＦＧ濃度が、試験した細胞における細胞生存率または細胞成長を低下させることを見出した（図６〜８）。
【０１２８】
興味深いことに、我々は、４０〜７０μｇ／ｍｌの範囲におけるベロ細胞の細胞増殖効果も観察し（図６）、５０μｇ／ｍｌのＴＦＧ濃度においてヒトケラチノサイトＨａＣａＴ細胞にも同様の傾向が見られた（図７）。ウイルス感染は上皮細胞の溶解およびケラチノサイト層の破損を引き起こし得るので、知見は興味深い。ＴＦＧ抽出物成分が、ＴＦＧ抽出物によって見られる抗ウイルス効果に加えていくらかの創傷治癒効果を有し得ると推測するのは魅惑的である。例えば皮膚および粘膜のＨＳＶ−２感染による創傷の治癒効果は有利であろう。ベロ細胞およびＨａＣａｔ細胞の場合、ＴＦＧ抽出物に誘発される細胞数の増大のメカニズムは分かっていない。しかしながら、１つの効果はエストロゲン受容体系による成長因子の刺激であろう。これはケラチノサイトについて最近示された（Ｒｏｃｋら，２０１２）。
【０１２９】
ヒト細胞培養物におけるＴＦＧ抽出物の免疫調節効果を調査した。ＴＦＧ抽出物は炎症促進性ＩＬ−６およびＣＣＬ３のレベルを誘発したが、免疫調節性ＩＬ−１０およびＩＬ−１２は誘発しなかった。しかしながら、ＬＰＳに誘発されるＩＬ−１０およびＩＬ−１２のレベルがＴＦＧ抽出物の存在の影響を受けないこと（図１３Ａおよび１３Ｂ）を除いて、ＴＦＧ抽出物の存在は、ＩＬ−６、ＣＣＬ３、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２の分泌レベルを高めた（図１２Ａ〜１２Ｄならびに１３Ｂ、１３Ｃおよび１３Ｅ）。我々は、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２がＬＰＳ刺激中にＴＦＧ抽出物による影響を受けず、ＴＬＲ７／８（Ｒ８４８）およびＴＮＦ−αに誘発されるＩＬ−１０およびＩＬ−１２がＴＦＧ抽出物によって高められる理由を説明することができない。１つの説明は、さらなる刺激に対して細胞の感受性を低減し得る細菌内毒素によるわずかな汚染であろう（Ｒａｎｄｏｗら，１９９５）。しかしながら、我々は、ＴＦＧ抽出物の存在下でもＣＣＬ３およびＩＬ−６レベルがＬＰＳ刺激後に増大するので、ありそうもない説明を見出す。さらに、我々は、ＴＬＲ４が安定して遺伝子導入されたＨＥＫ２９３細胞においてＬＰＳ応答を少しも検出できなかった（データは示されない）。ＰＢＭＣは異質性細胞集団なので、もう１つの説明は、ＴＦＧ抽出物がＴＮＦ−α、ＬＰＳおよびＲ８４８に応答して別の細胞に影響を与えることである。ＰＢＭＣと同様に単球様ＴＨＰ−１細胞がＣＣＬ３により応答することが分かるので、ＴＦＧ抽出物に媒介される炎症促進性サイトカインの増大は、ＴＦＧ抽出物の単球との相互作用によってある程度媒介される可能性がある。
【０１３０】
Ｂｉｎ−Ｈｅｆｅｅｘらは、マウスにおけるＴＦＧ抽出物の免疫刺激効果を報告した。誘発された免疫刺激効果は遅延過敏性応答を増大し、マクロファージの食作用機能をインビトロで増大した（Ｂｉｎ−Ｈａｆｅｅｚら，２００３）。我々のデータおよびＢｉｎ−Ｈｅｆｅｅｚらからのデータは、ＴＦＧが、単球およびマクロファージを含む骨髄系列のセンチネル免疫調節因子を介して生来のレベルで部分的に作用することを示唆する。集合的なデータは、新しい薬物または処置を開発する場合に、免疫機能のＴＦＧ調節を考慮しなければないことを示唆する。炎症誘発能力は局所的な抗微生物効果を生成するためにポジティブであり得るが、炎症は、局所的に適用されるクリームおよびゲルにはネガティブでもあり得る。例えば、ＨＩＶ−１の場合、殺菌剤に誘発される炎症は有害であり、ＨＩＶ−１感染のための活性化細胞および適用部位への付加的な標的細胞の補充の両方を提供し得る（Ｆｉｃｈｏｒｏｖａ，２００４）。恐らく、サイトカイン誘発化合物は、膣クリーム中で使用する前に我々のＴＦＧ抽出物から除去されなければならない。炎症性サイトカインの増大を示す我々の結果は、サポニンに媒介されるＴＦＧメタノール抽出物の存在下でホルボール−１２−ミリスタート−１３−アセタート（ＰＭＡ）に誘発されるＴＮＦ−αの低減を示す他の研究と対照的である（Ｋａｗａｂａｔａら，２０１１）。さらに、ＴＦＧ種子抽出物は内分泌系と相互作用をすることができ（Ｓｒｅｅｊａら，２０１０）、従って、樹状細胞（ＤＣ）の成熟に悪影響を与えること、および形質細胞様ＤＣからのＴＬＲ応答を増強することを含む、いくつかのエストロゲン受容体に制御される免疫応答を制御し得る（Ｅｓｃｒｉｂｅｓｅら，２００８、Ｓｅｉｌｌｅｔら，２０１２）。ＴＦＧが一般的な生来のサイトカイン応答に影響を与えるかどうか、そして免疫調節がインビボの関連性を有するかどうかを決定することが残っている。
【０１３１】
局所適用のためのＴＦＧ抽出物の使用についての最初の概念実証を行うために、我々は、マウスＨＳＶ−２膣チャレンジモデルにおいてＴＦＧ種子抽出物を含有する殺菌剤ゲルを評価した。我々は、０．５および２．５μｇ／ｍｌ  ｂｏｔの濃度のＴＦＧを含有するゲルが、ＨＳＶ−２進行に対していくらかのプラスの効果を有することを見出した（図１４Ａおよび１４Ｂ）。我々は致死量のＨＳＶ−２を使用し、これは、ＴＦＧ群における感染マウスの理由であり得る。別の理由はＴＦＧ抽出物の異型遺伝子性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）である可能性があり、抽出物中に、ＨＳＶ−２感染をインビボで増大させる化合物もあり、ウイルスを限定する化合物もあるのかどうかは分かっていない。マウスは完全ではなかったので。
【０１３２】
ＴＦＧ抽出物の内容物が植物の地理学と、抽出物を作るために使用される手順とに依存して異なり得ることは強調されるべきである（Ｔａｙｌｏｒら，２００２）。調製におけるこれらの差異、ならびに種子および植物の植物化学物質含有量の違いのために、ある研究から別の研究へ結果を推定することは非常に難しい。
【０１３３】
要約すると、ＴＦＧの抗ウイルス効果、細胞刺激性効果および免疫調節性効果に関して本研究は新しい知識を提供する。我々の知る限り、我々の研究は、ＴＦＧ抽出物の抗ウイルス効果と、抽出物がサイトカインバランスに影響を与え得る方法とを示す本当に最初の研究である。研究は、マウスにおける予備の概念実証研究と一緒に、ＨＳＶ−２およびＨＩＶ−１などの主要なヒト病原体に対する抗微生物クリームおよび殺菌剤のさらなる開発の基礎を構成し得る。さらに結果は、ＴＦＧ抽出物の化学物質含有量のさらなる研究を保証する。
【０１３４】
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Ｗｏｌｆ，Ｍ．Ｃ．，Ｆｒｅｉｂｅｒｇ，Ａ．Ｎ．，Ｚｈａｎｇ，Ｔ．，Ａｋｙｏｌ−Ａｔａｍａｎ，Ｚ．，Ｇｒｏｃｋ，Ａ．，Ｈｏｎｇ，Ｐ．Ｗ．，Ｌｉ，Ｊ．，Ｗａｔｓｏｎ，Ｎ．Ｆ．，Ｆａｎｇ，Ａ．Ｑ．，Ａｇｕｉｌａｒ，Ｈ．Ｃ．，Ｐｏｒｏｔｔｏ，Ｍ．，Ｈｏｎｋｏ，Ａ．Ｎ．，Ｄａｍｏｉｓｅａｕｘ，Ｒ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｐ．，Ｗｏｏｄｓｏｎ，Ｓ．Ｅ．，Ｃｈａｎｔａｓｉｒｉｖｉｓａｌ，Ｓ．，Ｆｏｎｔａｎｅｓ，Ｖ．，Ｎｅｇｒｅｔｅ，Ｏ．Ａ．，Ｋｒｏｇｓｔａｄ，Ｐ．，Ｄａｓｇｕｐｔａ，Ａ．，Ｍｏｓｃｏｎａ，Ａ．，Ｈｅｎｓｌｅｙ，Ｌ．Ｅ．，Ｗｈｅｌａｎ，Ｓ．Ｐ．，Ｆａｕｌｌ，Ｋ．Ｆ．，Ｈｏｌｂｒｏｏｋ，Ｍ．Ｒ．，Ｊｕｎｇ，Ｍ．Ｅ．＆  Ｌｅｅ，Ｂ．（２０１０）．Ａ  ｂｒｏａｄ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｅｎｔｒｙ  ｏｆ  ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０７，３１５７−３１６２．
Ｚｅｉｔｌｉｎ，Ｌ．，Ｗｈａｌｅｙ，Ｋ．Ｊ．，Ｈｅｇａｒｔｙ，Ｔ．Ａ．，Ｍｏｅｎｃｈ，Ｔ．Ｒ．＆  Ｃｏｎｅ，Ｒ．Ａ．（１９９７）．Ｔｅｓｔｓ  ｏｆ  ｖａｇｉｎａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｃｉｄｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｉｔａｌ  ｈｅｒｐｅｓ  ｍｏｄｅｌ．Ｃｏｎｔｒａｃｅｐｔｉｏｎ  ５６，３２９−３３５．
【０１３５】
実施例５
抽出物によるプラスモディウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）増殖の阻害
アモジアキン感受性株Ｋ１を用いる修正型［３Ｈ］−ヒポキサンチン取込みアッセイ（Ｓｃａｌａ，Ｆ．，Ｆａｔｔｏｒｕｓｓｏ，Ｅ．，Ｍｅｎｎａ，Ｍ．，ＴａｇｌｉａｌａｔｅｌａーＳｃａｆａｔｉ，Ｏ．，Ｔｉｅｒｎｅｙ，Ｍ．，Ｋａｉｓｅｒ，Ｍ．，Ｔａｓｄｅｍｉｒ，Ｄ．，２０１０．Ｂｒｏｍｏｐｙｒｒｏｌｅ  ａｌｋａｌｏｉｄｓ  ａｓ  ｌｅａｄ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｐｒｏｔｏｚｏａｎ  ｐａｒａｓｉｔｅｓ．Ｍａｒｉｎｅ  Ｄｒｕｇｓ  ８，２１６２−２１７４）によって、Ｐ．ファルシパルム（ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の赤血球期に対して抽出物希釈のインビトロ活性を試験した。正の対照として使用される標準薬はアモジアキンであった。
【０１３６】
簡単には、５％のＡｌｂｕｍａｘ（ヒポキサンチンを含まない）と共にＲＰＭＩ１６４０培地でインキュベートされた寄生虫培養物を、マイクロタイタープレート中の連続希釈抽出物にさらした。低酸素雰囲気中３７℃におけるインキュベーションの４８時間後に、０．５μＣｉの３Ｈ−ヒポキサンチンを各ウェルに添加した。培養物をさらに２４時間インキュベートした後、それをガラス繊維フィルタ上に収集し、蒸留水で洗浄した。ＢｅｔａｐｌａｔｅＴＭ液体シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて放射活性をカウントした。結果を各薬物濃度においてカウント数／分（ＣＰＭ）／ウェルとして記録し、未処置の対照の百分率で表した。グラフにプロットした用量反応曲線からＩＣ５０値を計算した。得られた各ＩＣ５０値は、二重に実施した少なくとも２つの別々の実験の平均（変動は最大２０％）である。
【０１３７】
結果は、１６０倍の希釈において、抽出物は５１．５ＣＰＭの値を得るが、参照薬（アモジアキン）は４７．５ＣＰＭの活性を示すことを示す。従って、抽出物は、参照薬の活性と同様の抗マラリア原虫活性を示す。
【０１３８】
実施例６
２−メチル−３−ノニルオキシラン−２−アミンの調製
２−ニトロ−ドデカン−３−オール
５８．１ｇ（０．３７ｍｏｌ）のデカナール（０．３７ｍｏｌ）、５５．８ｇ（０．７４ｍｏｌ）のニトロエタン、および１．７５ｇ（１９ｍｏｌ）のフッ化カリウムを４００ｍＬの２−プロパノールと混合し、室温で４８時間攪拌した。無水ＭｇＳＯ４を添加し、混合物をろ過し、真空内で濃縮した。収量  ８０．８ｇ（９４％）。
文献データに従うＮＭＲ（Ｄ．Ｌ．Ｈａｉｒｅ，Ｅ．Ｇ．Ｊａｎｚｅｎ：Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．６０，１５１４（１９８２））。
【０１３９】
酢酸２−ニトロドデカン−３−イル
０℃に予冷した１．１５（１１．３ｍｍｏｌ）の無水酢酸に、２．４ｇ（１０．４ｍｍｏｌ）２−ニトロ−ドデカン−３−オールを攪拌しながら添加した。１滴の濃硫酸を添加し、攪拌をさらに３時間継続した。混合物を水中に注ぎ、ジエチルエーテルで抽出した。有機相をＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、真空内で濃縮して１．７７ｇ（６２％）を得た。
文献データに従うＮＭＲ（Ｄ．Ｌ．Ｈａｉｒｅ，Ｅ．Ｇ．Ｊａｎｚｅｎ：Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．６０，１５１４（１９８２））。
【０１４０】
（Ｅ／Ｚ）−２−ニトロドデカ−２−エン
２．７０ｇ（１０ｍｍｏｌ）の酢酸２−ニトロドデカン−３−イル、７５ｍＬのｔｅｒｔ−ブタノールおよび１．６ｇ（１２ｍｍｏｌ）を３５℃で１０時間攪拌し、水中に注ぎ、ジエチルエーテルで抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、真空内で濃縮し、酢酸エチル／ヘキサン勾配を用いたＳｉｌｉｃａｇｅｌ６０におけるドライカラムクロマトグラフィによって精製した。収量：１．２（５６％）。
文献データに従うＮＭＲ（Ｎ．Ｏｎｏ，Ｋ．Ｍａｒｕｙａｍａ：Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．６１，４４７０−４４７２（１９８８））。
【０１４１】
２−メチル−２−ニトロ−３−ノニルオキシラン
１．８７ｇ（８．８０ｍｍｏｌ）（Ｅ／Ｚ）−２−ニトロドデカ−２−エンを４０ｍＬのメタノール中に溶解させ、０℃に冷却した。５ｍＬの３０％のＨ２Ｏ２および７．５ｍＬの２ＭのＮａＯＨの混合物を激しい攪拌下でゆっくり添加し、これを１時間継続した。混合物を冷たい１ＭのＨＣｌ中に注ぎ、ジエチルエーテルで抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、真空内で濃縮して、１．６８ｇ（８３％）の生成物を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ３．４５（ｔ，１Ｈ）；１．９５（ｓ，３Ｈ）；１．５９（ｍ，４Ｈ）；１．３７（ｍ，１２Ｈ）；０．８９（ｔ，３Ｈ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ８７．９６；６３．１０；３３．８７；３１．８５；２９．３９；２９．３５；２９．２３；２９．１２；２９．０５；２８．９１；２４．６８；２２．６４；１４．０８；１３．６７。
【０１４２】
２−メチル−３−ノニルオキシラン−２−アミン
３０ｍＬのヘキサン中の０．６９ｇ（３ｍｍｏｌ）の２−メチル−２−ニトロ−３−ノニルオキシランを、１９％のＨ２Ｏ、１０ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏおよび０．２３ｇのＮａＢＨ４を含有する６ｇのＡｌ２Ｏ３の混合物に添加した。この混合物を３０℃で１時間攪拌し、ろ過し、ジエチルエーテルで洗浄し、真空内で濃縮した。収量：０．６０ｇ（定量的）。
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ３．３６（ｄｄ，１Ｈ）；１．８６（ｓ，２Ｈ）；１．４９（ｍ，４Ｈ）；１．３７（ｍ，１２Ｈ）；０．８１（ｔ，３Ｈ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ８７．９７；６３．１１；３１．８４；２９．４０；２９．３６；２９．２４；２９．１４；２７．８８；２５．８０；２２．６６；１４．１０；１３．７１。
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【０１４３】
実施例７
２−メチル−３−ノニルオキシラン−２−アミンによるプラスモディウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の増殖の阻害
実施例６で得られた１５．３ｍｇの２−メチル−３−ノニルオキシラン−２−アミンを１００μｌのＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）と混合して貯蔵液を得た。１００ｕＬの貯蔵液を４００ｕＬの寄生虫培地と混合することによって第１の溶液を調製した。続いて、この溶液を１５希釈系列（各希釈系列は３倍に希釈）で希釈した。実施例６で使用したものと同じプロトコルをこの実験にも適用した。
【０１４４】
特に、Ｐ．ファルシパルム（ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の生命状態の尺度として［３Ｈ］−ヒポキサンチンの取込みを使用した。トリゾール処理によって寄生虫を環状期に同調させ、次に１回の複製サイクル、すなわち４８時間にわたって［３Ｈ］−ヒポキサンチンを含有する１００ｕＬの成長培地中５％のヘマトクリットにおいて０．３％の寄生虫血でインキュベートした。各実験を３重に実施した。
【０１４５】
実験の結果は図１５に示されており、２−メチル−３−ノニルオキシラン−２−アミンの存在下におけるＰ．ファルシパルム（ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の成長速度の濃度依存性の阻害が示される。
【０１４６】
実施例８
ＭＲＳＡまたはＭＳＳＡに対する２−メチル−３−ノニルオキシラン−２−アミンの効果
実施例６で得られた１５．３ｍｇの２−メチル−３−ノニルオキシラン−２−アミンを１００μｌのＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）と混合して貯蔵液を得た。ＭＲＳＡ（メチシリン耐性スタフィロコックス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ））およびＭＳＳＡ（メチシリン感受性スタフィロコックス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ））のＭＩＣ（最小阻止濃度）を決定するために貯蔵液を使用した。
【０１４７】
ＭＲＳＡ値およびＭＳＳＡ値を希釈系列で測定し、それぞれ３８．３ｍｇ／ｍｌおよび９．６ｍｇ／ｍｌであった。従って、試験化合物は２つの試験微生物に対して抗微生物性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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