(57)【要約】【課題】【解決手段】本発明は、自己抗原タンパク質、即ち、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質、及びミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質の発現を制御する樹状細胞特異的プロモーターを含む、多発性硬化症の治療法において使用するための導入遺伝子発現構築物、特に自己不活性化レンチウイルスベクターに関する。【選択図】図1【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子であって、
i. ミエリン塩基性タンパク質、
ii. プロテオリピドタンパク質、及び
iii. ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質
の群から選択されるヒトタンパク質に含有される少なくとも9個のアミノ酸の連続した配列を含むポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する配列を含み、
前記オープンリーディングフレームは、DC-STAMPプロモーター配列の転写制御下にある、核酸分子。
【請求項２】
脱髄疾患、特に多発性硬化症の予防又は治療法に使用するための請求項1記載の核酸分子。
【請求項３】
請求項1記載の核酸配列、又は前記核酸配列の逆相補的配列を含むウイルス。
【請求項４】
前記ウイルスは、レンチウイルスである、請求項3記載のウイルス。
【請求項５】
前記レンチウイルスは、自己不活性化(SIN)レンチウイルスベクターである、請求項4記載のウイルス。
【請求項６】
脱髄疾患、特に多発性硬化症の予防又は治療法に使用するための請求項1記載の請求項3乃至5の何れかに記載のウイルス。
【請求項７】
請求項1記載の核酸配列を含む、単離樹状細胞。
【請求項８】
請求項4乃至5の何れかに記載の前記レンチウイルスにより形質導入された単離樹状細胞。
【請求項９】
患者から取得した抗原提示細胞を含む細胞調製物であって、前記抗原提示細胞が請求項1記載の核酸配列、又は請求項3乃至5の少なくとも1つに記載のウイルスを含むことを特徴とする、脱髄疾患、特に多発性硬化症の予防又は治療法において自家使用するための細胞調製物。
【請求項１０】
ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質、及びミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質から選択される2種類又は3種類の異なるヒトタンパク質をコードする核酸配列を含むことを特徴とする、請求項9記載の細胞調製物。
【請求項１１】
請求項1記載の核酸配列、又は請求項3乃至5の少なくとも1つに記載のウイルスを、前記患者由来の抗原提示細胞の調製物に導入する、脱髄疾患、特に多発性硬化症の予防又は治療法に使用するための細胞調製物を生産する方法。
【請求項１２】
請求項7又は8記載の単離樹状細胞、又は請求項9又は10記載の細胞調製物を含む、脱髄疾患の治療に使用するための医薬組成物。
【請求項１３】
前記ヒトタンパク質がミエリン塩基性タンパク質である請求項7記載の単離樹状細胞と、前記ヒトタンパク質がプロテオリピドタンパク質である請求項7記載の第2の単離樹状細胞と、前記ヒトタンパク質がミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質である請求項7記載の第3の単離樹状細胞とを含む、脱髄疾患、特に多発性硬化症の予防又は治療法において自家使用するための医薬組成物。
【請求項１４】
必要とする患者に請求項7記載の単離樹状細胞を投与するステップを備える、多発性硬化症を治療するための方法。
【請求項１５】
単離樹状細胞を投与する前記ステップは、部分的骨髄破壊療法と共に実施される、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
前記ヒトタンパク質がミエリン塩基性タンパク質である請求項8記載の第1の単離樹状細胞と、前記ヒトタンパク質がプロテオリピドタンパク質である請求項8記載の第2の単離樹状細胞と、前記ヒトタンパク質がミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質である請求項8記載の第3の単離樹状細胞とを含む医薬組成物。
【請求項１７】
必要とする患者に請求項8記載の単離樹状細胞を投与するステップを備える、多発性硬化症を治療する方法。
【請求項１８】
単離樹状細胞を投与する前記ステップは、部分的骨髄破壊療法と共に実施される、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
必要とする患者に請求項3乃至5の何れかに記載のウイルスを投与するステップを備える、多発性硬化症を治療する方法。
【請求項２０】
ウイルスを投与する前記ステップは、部分的骨髄破壊療法と共に実施される、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
前記部分的骨髄破壊療法は、ブスルファンの投与を含む、請求項15、18、又は20記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
多発性硬化症(multiple sclerosis, MS又はencephalomyelitis disseminata)の原因は不明であり、疾患の発生につながる発病過程は完全には理解されていない。現在の知識では、ミエリン成分又はミエリン産生細胞を標的とする、T細胞に媒介される自己免疫性の病因が支持されている。MS及びその動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)は、中枢神経系(central nervous system, CNS)内の抗原提示細胞(antigen presenting cells, APCs)及び自己反応性リンパ球の活性化及び蓄積を特徴とする。自己反応性T細胞により認識されることが知られている一部のミエリンタンパク質には、ミエリン塩基性タンパク質(myelin basic protein, MBP)、プロテオリピドタンパク質(proteolipid protein, PLP)、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(myelin oligodendrocyte glycoprotein, MOG)が含まれる。
【０００２】
ミエリン塩基性タンパク質(myelin basic protein, MBP)は、オリゴデンドロサイト及びシュワン細胞のミエリン鞘の主成分である。ヒトオルソログの遺伝的データは、米国国立生物工学情報センター(NCBI)において遺伝子ID 4155として公開されている。ヒトMBPタンパク質データは、UniProtにおいてP02686として利用できる。
【０００３】
プロテオリピドタンパク質(PLP、リポフィリン)は、中枢神経系由来の主要ミエリンタンパク質であり、ミエリンの多層構造の形成又は維持において重要な役割を果たす。ヒトオルソログの遺伝的データは、NCBI遺伝子ID 5354として公開されている。ヒトMBPタンパク質データは、UniProtにおいてP60201として利用できる。
【０００４】
ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)は、ミエリン鞘に構造的完全性をもたらす上で役割を果たすと考えられる糖タンパク質である。ヒトオルソログの遺伝的データは、NCBI遺伝子ID 4340として公開されている。ヒトMBPタンパク質データは、UniProtにおいてQ16653として利用できる。
【０００５】
多発性硬化症の病因は、未だ完全に理解されておらず、現時点で利用可能な治癒的治療は存在しない。自家T細胞枯渇骨髄移植は、多発性硬化症患者に対する臨床試験において、効果があり有益であることが証明されている。しかしながら、自己反応性T細胞の再出現による疾患の再発は、特異的療法において、恒久的免疫寛容の誘導を考慮するべきであることを示唆している。しかしながら、幾つかの研究で実証されている抗ミエリンT細胞反応性パターン(抗原伝播)の動的変化、更には、改変ペプチドリガンドに基づく治療により寛容を安全に誘導することが困難であることから、多発性硬化症の抗原特異的免疫療法のための現行の戦略の有用性には疑問が生じている。
【背景技術】
【０００６】
自己免疫疾患の標準的治療は、全身性免疫抑制に依存する。しかしながら、上述した困難はあるものの、病原体及び癌と戦う免疫系の能力を維持する、新規の抗原特異的な治療形態を設計することが重要である。例えば、以前の研究では、MOG又はPLPを発現する標準的なガンマレトロウイルスベクターにより形質導入した骨髄由来HSCが、マウスをEAEから保護可能であることが明らかとなっている。これらの研究者は、様々な造血細胞においてMOG発現を媒介可能な構成的プロモーターを用いており、有害な副作用を発生させる恐れがある。この制限を克服するため、Koらは、cd11cプロモーターをガンマレトロウイルスベクターに関連して用いて、MOG発現を樹状細胞(dendritic cells, DCs)に方向付けた。この戦略は疾患の発生を遅延させたが、EAEの発生を防止していない(Ko et al., 2010, Eur. J. Immunol. 40, 3499-3509)。
【０００７】
Dreschら(J. Immunology 2008, 181; 4495-4506)は、DC特異的DC-STAMPプロモーターからEGFP又はオボアルブミン(ovalbumin, OVA)を発現する自己不活性化(self-inactivating, SIN)レンチウイルスベクターによる造血幹細胞(hematopoietic stem cells, HSC)の形質導入が、DCsに対する導入遺伝子発現の転写標的化と、免疫寛容の抗原特異的誘導とをもたらすことを実証した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ko et al., 2010, Eur. J. Immunol. 40, 3499-3509
【非特許文献２】Dresch et al., J. Immunology 2008, 181; 4495-4506
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、MSにおける自己抗原反応性免疫プロセスに対する寛容の導入を可能とすることにより、確立した自己免疫プロセスを逆転し、症状を軽減し、多発性硬化症の進行を停止する手段及び方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第1の態様によれば、核酸配列が提供される。この核酸配列は、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質、及びミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質の群から選択されるヒトタンパク質に含有される少なくとも9個のアミノ酸の連続した配列を含むポリペプチドをコードする発現配列を含む。前記発現配列は、DC-STAMPプロモーター配列の転写制御下にある。
【００１１】
本発明の第2の態様によれば、核酸配列を含むレンチウイルスが提供され、前記核酸配列は、DC-STAMPプロモーター配列の転写制御下にある、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質、及びミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質の群から選択されるヒトタンパク質に含有される少なくとも9個のアミノ酸の連続した配列を含むポリペプチドをコードする発現配列を含む。
【００１２】
本発明の第3の態様によれば、DC-STAMPプロモーター配列の転写制御下にある、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質、及びミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質の群から選択されるヒトタンパク質に含有される少なくとも9個のアミノ酸の連続した配列を含むポリペプチドをコードする発現核酸配列を含む、単離樹状細胞が提供される。
【００１３】
本発明の第4の態様によれば、脱髄疾患、特に多発性硬化症の治療のための医薬組成物が提供される。前記医薬組成物は、DC-STAMPプロモーター配列の転写制御下にある、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質、及びミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質の群から選択されるヒトタンパク質に含有される少なくとも9個のアミノ酸の連続した配列を含むポリペプチドをコードする発現核酸配列を含んだ単離樹状細胞を含む。
【００１４】
本発明の他の態様によれば、多発性硬化症を治療する方法が提供され、当該方法は、必要とする患者に本発明による単離樹状細胞を提供することを含む。
【００１５】
更に、本発明は、患者の多発性硬化症を治療するための細胞調製物を生産する方法に関し、当該方法は、前記患者に由来する抗原提示細胞(APC)の調製物に、本発明による発現核酸配列を導入するステップを備える。
【００１６】
「APCの調製物」とは、本明細書での使用において、APCを富化した任意の調製物を示し得る。こうした調製物は、当該技術分野において周知であり、その生産方法は、通例のものであると考えられる。例示的且つ非限定的な調製物の一種は、骨髄由来造血幹細胞(bone marrow derived hematopoietic stem cells, BM-HSC)である。BM-HSC調製物を調製する方法は、周知且つ通例のものであり、特に本明細書において例示している。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、樹状細胞に対して特異的なプロモーター配列により駆動された、自己抗原をコードする導入遺伝子の樹上細胞における発現が、自己免疫疾患の発生を防止し得るだけでなく、確立された自己免疫プロセスを元に戻し、脱髄疾患の進行を停止することが可能であるという驚くべき発見に基づく。
【００１８】
本発明は、樹状細胞特異的プロモーターからのMSに関与する抗原を発現するベクターによる造血幹細胞(HSC)の生体外改変により、恒久的な抗原特異的寛容が誘導されることを実証する。
【００１９】
本発明によれば、樹状細胞特異的プロモーターの転写制御下にあるヒト自己抗原をコードする発現核酸配列が提供される。
【００２０】
本発明に関連するDC特異的プロモーター配列は、ヒト未熟樹状細胞において、その制御下にあるコード配列を構成的に発現する核酸配列である。好適なDC特異的プロモーター配列は、DC-STAMPプロモーター配列、又はDC-STAMP遺伝子の5’非翻訳領域である(Hartgers et al., Eur. J. Immunol. 2000; 30, 3585-90参照)。特に好適なDC特異的プロモーター配列は、SEQ ID 02の配列である。他の好適なDC特異的プロモーター配列は、SEQ ID 19の配列である(GenBank受入番号AF305068)。対象となる更に他のDC-STAMPプロモーター領域は、Dreschら(前掲)に記載の適切なプライマを用いて、全ゲノムDNAからPCRにより容易に増幅することができる。
【００２１】
一実施形態によれば、当該発現配列は、DC特異的プロモーター配列の転写制御下にある、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質、及びミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質の群から選択されるヒト自己抗原、又はその一部をコードする。
【００２２】
一実施形態によれば、当該発現配列は、ミエリン塩基性タンパク質アイソフォーム1(SEQ ID 05及び20)又はそのフラグメントをコードする。他の実施形態によれば、当該発現配列は、ミエリン塩基性タンパク質アイソフォーム2(SEQ ID 35)、アイソフォーム3(SEQ ID 36)、アイソフォーム4(SEQ ID 06)、アイソフォーム5(SEQ ID 37)、アイソフォーム6(SEQ ID 38)、又はアイソフォーム7(SEQ ID 39)、或いはそのフラグメントをコードする。他の実施形態によれば、当該発現配列は、ミエリンプロテオリピドタンパク質アイソフォーム1(SEQ ID 07)又はそのフラグメントをコードする。他の実施形態によれば、当該発現配列は、ミエリンプロテオリピドタンパク質アイソフォームDM-20(SEQ ID 08)又はそのフラグメントをコードする。他の実施形態によれば、当該発現配列は、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質アイソフォーム1(SEQ ID 09)、アイソフォーム2(SEQ ID 10)、アイソフォーム3(SEQ ID 11)、アイソフォーム4(SEQ ID 12)、アイソフォーム5(SEQ ID 13)、アイソフォーム6(SEQ ID 14)、アイソフォーム7(SEQ ID 15)、アイソフォーム8(SEQ ID 16)、アイソフォーム9(SEQ ID 17)、又はアイソフォーム10(SEQ ID 18)、或いはそのフラグメントをコードする。
【００２３】
一実施形態によれば、発現核酸配列は、ヒト自己抗原の特定のポリペプチド部分のみをコードする。一実施形態において、前記ポリペプチド部分は、前記自己抗原の共通HLA Iエピトープを表す。他の実施形態において、前記ポリペプチド部分は、前記自己抗原の主要HLA Iエピトープを表す。一実施形態において、前記ポリペプチド部分は、前記自己抗原の共通HLA IIエピトープを表す。他の実施形態において、前記ポリペプチド部分は、前記自己抗原の主要HLA IIエピトープを表す。エピトープを予測する方法は、当該技術分野において公知であり、特にH.G.Rammensee、J.Bachmann、及びS.Stevanovic著の書籍「MHC Ligands and Peptide Motifs」に記載されている。
【００２４】
本発明において有用となり得る例示的且つ非限定的なMBP HLA Iエピトープには、MBP84-102、更に具体的にはMBP85-99(ENPVVHFFKNIVTPR、SEQ ID 21)(Hansen BE et al. Tissue Antigens. 2011 Mar;77(3):229-34)、MBP154-172(Martin R et al, J Immunol. 1990 Jul 15;145(2):540-8)、hMBP64-78(ARTAHYGSLPQKSHG、SEQ ID 22)、hMBP82-100(DENPVVHFFKNIVTPRTPP、SEQ ID 23)、hMBP111-129(LSRFSWGAEGQRPGFGYGG、SEQ ID 24)、及びhMBP138-151(HKGFKGVDAQGTLS、SEQ ID 25)(Kawamura K et al, J Immunol. 2008 Sep 1;181(5):3202-11)が含まれる。一部の実施形態では、本発明において使用されるポリヌクレオチド配列は、上述したMBP HLA Iエピトープの1つに含有される少なくとも9個のアミノ酸の連続した配列を発現する。他の実施形態では、本発明において使用されるポリヌクレオチド配列は、上述したMBP HLA Iエピトープの1つ以上を発現する。
【００２５】
本発明において有用となり得る例示的且つ非限定的なPLP HLA Iエピトープには、ヒトPLP31-70(CGCGHEALTGTEKLIETYFSKNYQDYEYLINVIHAFQYVI、SEQ ID 26)(Mangalam AK et al, Eur J Immunol. 2004 Jan;34(1):280-90)、更に具体的には40-60(GTEKLIETYFSKNYQDYEYLI、SEQ ID 27)(Pelfrey CM et al, J Neuroimmunol. 1993 Jul;46(1-2):33-42)、91-120(YTTGAVRQIFGDYKTTICGKGLSATVTGGQ、SEQ ID 28)、及び178-228(NTWTTCQSIAFPSKTSASIGSLCADARMYGVLPWNAFPGKVCGSNLLSICK、SEQ ID 29)が含まれる。一部の実施形態では、本発明において使用されるポリヌクレオチド配列は、上述したPLP HLA Iエピトープの1つに含有される少なくとも9個のアミノ酸の連続した配列を発現する。他の実施形態では、本発明において使用されるポリヌクレオチド配列は、上述したPLP HLA Iエピトープの1つ以上を発現する。
【００２６】
本発明において有用となり得る例示的且つ非限定的なMOGエピトープには、マウスMOGエピトープ1-21、35-55、67-87、104-117、及び202-218(Mendel I et al, Eur J Immunol. 1995 Jul;25(7):1951-9)、及びヒトMOGエピトープ99-107(FFRDHSYQE、SEQ ID 30)、15-23(LVGDEVELP、SEQ ID 31)、83-91(LRIRNVRFS、SEQ ID 32)、120-128(YWVSPGVLV、SEQ ID 33)、及び40-48(YRPPFSRVV、SEQ ID 34)(Forsthuber TG et al, Journal of Immunology, 2001, 167:7119-7125)が含まれる。一部の実施形態では、本発明において使用されるポリヌクレオチド配列は、上述したMOG HLA Iエピトープの1つに含有される少なくとも9個のアミノ酸の連続した配列を発現する。他の実施形態では、本発明において使用されるポリペプチド配列は、上述したMOG HLA Iエピトープの1つ以上を発現する。
【００２７】
他の実施形態において、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質、及びミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質のそれぞれの1つ以上の HLA Iエピトープを含むポリペプチドがコードされる。他の実施形態では、これら3つのタンパク質それぞれからの1つ以上の主要HLA Iエピトープが存在する。
【００２８】
一実施形態によれば、前記ポリペプチド部分は、少なくとも9、12、15、18、21、14、17、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175個、又は少なくとも200個のアミノ酸の長さの連続したアミノ酸配列である。
【００２９】
一実施形態によれば、発現核酸配列は、単離DNA配列として提供される。非限定的な例として、こうした単離DNA配列は、プラスミド、コスミド、又はミニ染色体として提供される。
【００３０】
他の実施形態によれば、発現核酸は、ウイルスベクターとして提供される。非限定的な例として、こうしたウイルスベクターは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、又はレトロウイルスである。
【００３１】
一実施形態によれば、DC特異的プロモーター配列の転写制御下にある、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質、及びミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質の群から選択されるヒト自己抗原をコードする発現核酸配列、又は前記発現核酸配列の逆相補的配列を含むレンチウイルスが提供される。
【００３２】
好適なレンチウイルスは、Loisら(Science 2002、295、868-872)が記述した自己不活性化(SIN)レンチウイルスである。SINレンチウイルスベクターが媒介する、HSCにおける導入遺伝子のゲノム組込みは、抗原を発現する「定常状態」の樹状細胞の一定の供給を支援する。非炎症状態の胸腺及び周辺における、こうした細胞による安定した抗原提示は、自己反応性T細胞を寛容化する可能性が高く、そのため、疾患の発生又は進行を防止する。例示的且つ非限定的なSINレンチウイルスの一種は、TATAボックスを含む、3’LTRのU3領域における欠失を含み、感染細胞内のプロウイルスにおいて、LTRの転写不活性化をもたらす(Myoshi H et al、J Virol. 1998 Oct;72(10):8150-7)。
【００３３】
本発明の他の態様は、本発明による発現核酸配列を含む単離樹状細胞に関する。
【００３４】
一実施形態において、樹状細胞は、DC-STAMPプロモーター配列の転写制御下にある、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質、及びミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質の群から選択されるヒト自己抗原をコードする発現核酸配列を含む。
【００３５】
本発明は、更に、患者から取得した抗原提示細胞を含むと共に、前記抗原提示細胞が本発明による核酸配列又は本発明によるウイルスを含むことを特徴とする細胞調製物を包含する。当該細胞調製物は、脱髄疾患、特に多発性硬化症の予防又は治療法において自家使用のために提供される。
【００３６】
一実施形態において、前記細胞調製物は、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質、及びミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質から選択される2種類又は3種類の異なるヒトタンパク質をコードする核酸配列を含む。
【００３７】
更に、本発明の範囲には、脱髄疾患、特に多発性硬化症の治療のための医薬組成物が含まれる。組成物は、DC-STAMPプロモーター配列の転写制御下にある、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質、及びミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質の群から選択されるヒト自己抗原に含有される少なくとも9個のアミノ酸の連続した配列を含むポリペプチドをコードする発現核酸配列を含んだ単離樹状細胞を含む。
【００３８】
本発明の更に他の態様によれば、脱髄疾患、特に多発性硬化症の治療法において使用する投薬計画が提供され、本発明の細胞調製物は、部分的骨髄破壊療法用の薬物と併せて投与される。
【００３９】
本発明の更に他の態様によれば、多発性硬化症を治療する方法が提供され、当該方法は、必要とする患者に本発明による単離樹状細胞を提供することを含む。
【００４０】
本発明の更に他の態様によれば、多発性硬化症を治療する方法が提供され、当該方法は、必要とする患者に本発明によるウイルスを提供することを含む。
【００４１】
特定の実施形態において、本発明の方法は、部分的骨髄破壊療法と併せて実施される。他の実施形態において、本発明の医薬組成物は、部分的骨髄破壊療法と併せた投与に適用される。同様に、本発明の生体外方法は、一部の実施形態において、部分的骨髄破壊療法と併せた投与に適用される医薬組成物を生産し得る。「部分的骨髄破壊療法と併せた」という用語は、医薬組成物及び部分的骨髄破壊療法の同時投与と、医薬組成物及び部分的骨髄破壊療法の時間的に近い投与との両方を含む。一般に、医薬組成物及び部分的骨髄破壊療法は、互いの48時間以内に投与される。
【００４２】
上述した部分的骨髄破壊療法は、好ましくは、ブスルファン等の部分的骨髄破壊剤の投与を含み得る。他の実施形態において、以下の作用剤の1つ以上が投与される: アルキル化剤(例えば、ナイトロジェンマスタード[メクロレタミン等]、シクロホスファミド、メルファラン、及びクロラムブシル)、スルホン酸アルキル(例えば、ブスルファン)、ニトロソウレア(例えば、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、及びストレプトゾシン)、トリアゼン(例えば、ダカルバジン)、代謝拮抗剤(例えば、メトトレキサート等の葉酸類似体)、ピリミジン類似体(例えば、フルオロウラシル及びシタラビン)、プリン類似体(例えば、フルダラビン、イダルビシン、シトシンアラビノシド、メルカプトプリン、及びチオグアニン)、ビンカアルカロイド(例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、及びビンデシン)、エピポドフィロトキシン(例えば、エトポシド及びテニポシド)、抗生物質(例えば、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、及びマイトマイシン)、ジブロモマンニトール、デオキシスパガリン、ジメチルミレラン、及びチオテパ。
【００４３】
特定の更に具体的な実施形態では、低用量ブスルファンを使用し得る。更に具体的な実施形態において、一日9mg/kg以下、更に好ましくは一日1乃至9mg/kgが使用される。他の実施形態において、ブスルファンは、0.8mg/kg/日以下、更に好ましくは0.1乃至0.8mg/kg/日で投与される。
【００４４】
本明細書に提示した戦略は、臨床応用に対して特に有望であり、これは患者の骨髄から単離された造血幹細胞が、遺伝子的に改変された免疫寛容誘発「定常状態」樹状細胞の恒久的且つ連続的産出のために改変されるためである。
【００４５】
以下の実施例は、このEAEにおけるミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)特異的寛容を誘導する戦略の有効性を実証する。MOG発現レンチウイルスベクター(DC-MOG)により形質導入したHSCを受容した全てのマウスは、免疫時にEAEから保護され(臨床スコア0)、対照ベクターにより形質導入したHSCを受容した全てのマウスは、EAEを発症した。組織学的分析により、罹患マウスでは、脳、脊髄、及び視神経における脱髄及び広範な炎症が明らかとなったが、処置済みマウスではならなかった。IFN-γ、TNF-α、及びIL-17を含む炎症性サイトカインは、寛容化マウスでは殆ど存在しなかったが、罹患マウスでは高レベルで存在した。結果からは、更に、DC-MOGにより形質導入したBM-HSCを受容したマウスが、MOG特異的T細胞の効率的な欠失と、Foxp3+調節性T細胞の生成とを示すことが明らかとなった。最も重要な点として、事前に確立されたEAEを有するマウスにおいて、部分的骨髄破壊条件下でのDC-MOGベクター形質導入HSCの移植は、疾患の持続性の臨床的改善をもたらした。
【００４６】
標的とされる特異的ヒト自己抗原や発現されるポリペプチドの長さ等の、単一の特徴の選択肢が本明細書において「実施形態」とされる場合は常に、こうした選択肢を自由に組み合わせて、本明細書に記載の方法又は医学的適用の個別の実施形態を形成し得ると理解されるべきである。
【００４７】
他の実施形態及び利点を引き出すことが可能な以下の各図及び説明は、本発明を如何なる形でも限定せず、例示するために記載されたものである。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図1は、(A)樹状細胞特異的プロモーター(DC-STAMP)から完全長マウスミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)を発現する、自己不活性化(SIN)レンチウイルスベクターDC-MOGの概略図を示し、LTRは、長末端反復、Ψは、パッケージングシグナルであり、また、(B) 5-フルオロウラシル処理済みC57BL/6ドナーマウスからの、DC-EGFPにより形質導入され致死量放射線照射同系受容マウス(lethally irradiated syngeneic recipient mice)に注入された、BM-HSCの細胞計数を示す。キメラの脾臓から単離されたcd11c+及びcd11c-細胞群における6週間後のEGFP陽性細胞のパーセンテージ(左)及び平均蛍光強度(MFI、右)を示す(X軸: 蛍光、対数目盛)。グラフは、2回の独立した実験の1回を示す。各実験は、1群当たり少なくとも3匹のマウスにより行った。バーは、平均値+SDを表す。
【図２】図2は、(A): DC-MOG又はDC-OVAベクターにより形質導入したBM-HSCを移植した、MOG免疫C57BL/6マウスの臨床スコア(平均値±SD)を示す。図示したグラフは、1群当たり5匹のマウスによる3回の独立した実験のうち1回を示す。(B)骨髄DCsをDC-MOGキメラから、移植の13週間後に調製した。DC-OVA群について、BM-DCsは、EAEのスコア3に到達後、動物の死亡時に調製した。3日間の培養後、増殖性の2D2 T細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーにより判定した。CFSEの希釈は、T細胞の増殖を示す。図示したヒストグラムは、個別のマウスからのものだが、データは、異なる2群のそれぞれから分析された少なくとも3匹の動物を表している。
【図３】図3は、DC-MOG及びDC-OVAキメラのCNSにおけるCD4 T細胞のパーセンテージを示す。バーは、1群当たりそれぞれ5匹及び3匹のマウスによる2回の独立した実験のうち1回の平均値+SDを表す。
【図４】(A)動物がEAEのスコア3に到達した後、或いは、保護マウスの場合、EAE導入後14日目に、脾細胞をDC-MOG及びDC-OVAキメラから単離し、MOG35-55ペプチドにより試験管内で再刺激した。表示したサイトカインの濃度は、12、24、36、及び48時間後に測定した。IFN-γの濃度は、PMAによる非特異的刺激時にも測定した。(B)CNSホモジネートにおける、表示したサイトカインの濃度。データは、1群当たり少なくとも3匹のマウスによる2回の独立した実験のうち1回の平均値+SDを表す。
【図５】図5は、DC-MOG又はDC-OVAベクター形質導入BM-HSCによる抗原特異的寛容誘導を示す。MOG及びOVAにより同時に免疫したキメラから単離した脾細胞を、MOG又はOVAペプチドにより刺激し、IFN-γ濃度を測定した。バーは、MOGペプチド刺激脾細胞におけるIFN-γ濃度を、OVAペプチド刺激脾細胞におけるIFN-γ濃度により除算した(MOG/OVA、左パネル)、又はその逆の(OVA/MOG、右パネル)、平均比+SDを表している。データは、それぞれ4匹のマウスによる2回の独立した実験のうち1回を表す。
【図６】図6は、DC-MOGキメラにおけるMOG35-55特異的T細胞の中枢及び抹消での欠失を示す。致死量放射線照射C57BL/6細胞に、2D2マウスからのDC-MOG又はDC-OVAベクター形質導入BM-HSCを移植した。6乃至8週間後、CD4 T細胞及び2D2 T細胞(Va3.2+及びVb11+)をCD4 T細胞についてゲートし、フローサイトメトリーにより定量化した。A. 脾臓におけるCD4 T細胞(左パネル)及び2D2 T細胞(右パネル)のパーセンテージ+SDを示し、1群当たり6匹のマウスによる3回の独立した実験のうち1回を表す。ヒストグラムは、個別の動物を表す。B. 脾臓及び胸腺におけるCD4 T細胞(上パネル)及び2D2 T細胞(下パネル)の絶対数を示す。バーは、1群当たり6匹のマウスによる3回の独立した実験のうち1回の値+SDを表す。
【図７】図7は、2D2 T細胞の活性化/調節状況を示す。A.CD25、CD69、CD44、及びCD62Lを、DC-MOG(無地のヒストグラム)及びDC-OVA(網掛けのヒストグラム)キメラの脾臓由来の2D2 T細胞について、フローサイトメトリーにより分析した。ヒストグラムは、個々のマウスからの代表的データを示す。B及びC.DC-MOG及びDC-OVAキメラ由来の2D2 T細胞を調節性のT細胞表現型について更に分析した(CTLA-4+及びFoxp3+)。Bに示したCTLA-4及びFoxp3陽性細胞(Treg)のパーセンテージ+SDは、1群当たり6匹のマウスによる2回の実験のうち1回を表す。ヒストグラムは、個々の動物を表す。脾臓及び胸腺におけるTregの絶対数+SDをCに示す。
【図８】図8は、事前に確立されたEAEの発生に対する遺伝子療法の効果を示す(治癒的プロトコル)。未処理のC57BL/6マウスをMOGペプチドにより免疫した。EAEの最初の症状が発生した後、4及び5日目に、動物をブスルファン(B)により条件付けし、2日後、部分的骨髄破壊条件下で同系マウス由来のDC-MOG又はDC-OVA形質導入BM-HSCを移植した。グラフは、2回の独立した実験のうち1回を表し、1群当たり少なくとも4匹のマウスの臨床スコア+SDを示す。
【実施例】
【００４９】
材料及び方法
【００５０】
マウス
【００５１】
C57BL/6(CD45.1及びCD45.2)及び2D2(CD45.2)マウスを、チューリッヒ大学ウイルス学研究所の動物施設において維持及び飼育した。2D2マウスは、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチド(MOG)35-55に対して特異的なトランスジェニックVα3.2/Vβ11 TCRsを有する。
【００５２】
SINレンチウイルスベクター
【００５３】
ヒトトランスフェリン受容体(htfr)の膜貫通ドメインと融合するEGFP又はオボアルブミン(OVA)を発現するSINレンチウイルスベクター(DC-EGFP、DC-OVA)は、それぞれ以前に記述されている(Dresch et al., J. Immunology 2008, 181; 4495-4506)。SINレンチウイルスベクターDC-MOGは、DC-STAMPプロモーター(配列プロトコル: SEQ ID 02参照)の制御下で完全長マウスMOG ORF (配列プロトコル: SEQ ID 01参照)を発現し、次のように構築された: MOG配列を、プライマ38(5’gtaccggtgccaccatggcctgtttgtggagctt3’、SEQ ID 03)及び39(5’aggaattcccaggaagacacaaccatcac3’、SEQ ID 04)を用いて、マウスMOG cDNAを含有するプラスミド(pFLC1、ImaGenes GmbH、ドイツ、ベルリン)からPCRにより増幅した。PCR産物をAgeI及びEcoRIにより消化し、DC-EGFPのAgeI及びEcoRI部位間に挿入した。ベクターストックを生成し、Dresch et al., 2008の記載通りに力価を定めた。
【００５４】
骨髄キメラ
【００５５】
少なくとも6週齢の雌C57BL/6又は2D2マウスの骨髄(BM)細胞を、5フルオロウラシル(150mg/kg体重)の静脈注射から4日後に採取した。当該細胞は、無血清造血幹細胞拡張培地(serum-free hematopoietic stem cell expansion medium, Stemline、Sigma-Aldrich)にペニシリン-ストレプトマイシンと、ヒトIL-6(25ng/ml)、ネズミIL-3(10 ng/ml)、及びネズミ幹細胞因子(50ng/ml)を含む増殖因子混合物とを補充したものにおいて2日間予備刺激した。当該細胞は、SINレンチウイルスベクターの無細胞ストック(感染多重度MOI=45)を用いたスピン感染(300×g、2時間、32℃)により、硫酸プロタミン(4μg/ml)存在下で形質導入した。形質導入後、1乃至3×106細胞/マウスを、致死量放射線照射(11Gy)C57BL/6受容動物に静脈注射した。キメラは、移植後3週間に亘りネオマイシンにより処置した。
【００５６】
EAEの誘導
【００５７】
予防的モデル。移植の8週間後に、MOGペプチド(ProSpec、イスラエル、レホヴォト、カタログID PRO-371)0.1mgを、完全フロイントアジュバントに5mg/mlの結核菌を補充したものにおいて乳化し、合計体積200μlとして骨髄キメラに皮下注射した。その後、動物には、300ngの百日咳毒素を腹腔内注射し、この注射を48時間後に繰り返した。マウスを、EAEの神経学的徴候について毎日監視し、次のように採点した: 0、臨床的徴候無し; 1、尾の脱力; 1.5、尾の脱力及び後肢虚弱; 2.0、片側の部分的後肢麻痺; 2.5、両側の部分的後肢麻痺; 3.0、完全な両後肢麻痺(動物は、この段階で死亡させた)。
【００５８】
治癒的モデル。EAEを、未処理の6週齢雌C57BL/6マウスにおいて上述したように誘導した。動物を疾患の徴候に関して毎日採点し、最初の症状が発生した後4日目及び5日目に20mg/kgのブスルファンにより条件付けした。ベクター形質導入BM-HSC(1乃至3×106細胞/マウス)を2回目のブスルファン処置後2日目に静脈注射した。
【００５９】
CNSの病理組織診断
【００６０】
脳及び視神経を4％ホルムアルデヒド中で固定し、パラフィンで包埋した。脊髄は椎骨内に残し、固定後2週間、25％EDTAにより脱灰後、パラフィン包埋した。組織化学的及び免疫組織化学的染色のために、厚さ3mmのスライドをキシロール及びアルコールにより脱パラフィン化し、ヘマトキシリン及びエオシンにより染色するか、或いは次のように処理した: 脱髄を評価するため、スライドをルクソールファストブルー中でインキュベートし、クリスタルバイオレットにより対比染色した。免疫組織化学的染色のため、スライドを以下の抗体により染色した: ラット抗マウス抗Mac3(マクロファージ、1:10、BD Pharmingen)、マウス抗SMI 32(神経フィラメント、1:400、Abcam、英国ケンブリッジ)、又はウサギ抗マウスCD3(T細胞、1:100、Ventana Medical Systems,Inc.、米国アリゾナ州ツーソン)。
【００６１】
骨髄由来樹状細胞及び試験管内T細胞増殖アッセイ
【００６２】
キメラからの骨髄細胞を、EAE誘導の6乃至8週間後に大腿骨及び脛骨から抽出した。当該細胞は、その後、6ウェルプレート内で、RPMI 1640培地に10％ウシ胎仔血清(FBS)、1％ペニシリン-ストレプトマイシン、0.1mM HEPES、及びDC分化因子GMC-SFを補充したものにおいて37℃で培養した。6日目に、2.5μM CFSE(カルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミジルエステル)により標識した2D2 T細胞をBM培養物に添加し、増殖を3日後にフローサイトメトリーにより分析した。
【００６３】
サイトカインの分析
【００６４】
サイトカインは、試験管内脾細胞刺激により測定した。このために、脾細胞を6ウェルプレート(ウェル当たり1×107細胞)内で、DMEMに10％FBS、1％ペニシリン-ストレプトマイシン、0.1mM HEPES、2mM L-グルタミン、0.01mM非必須アミノ酸を補充したものにおいて培養した。脾細胞を、MOG35-55ペプチド(PBS中5μg/ml、PROSPEC、イスラエル)により刺激した。陽性対照として、脾細胞を5μg/mlのPMAにより刺激し、陰性対照として、脾細胞をペプチド無しで培養した。上清を、刺激後12、24、48、及び72時間に収集し、-80℃で保存した。上清中のサイトカイン(GM-CSF、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-6、IL-17、TNF-α)は、FlowCytomix Mouse Th1/Th2 10plexキット(Bender MedSystems、オーストリア、ウィーン)を製造業者のプロトコルに従って用いて、フローサイトメトリーにより測定した。サイトカインは、CNSの上清中でも測定した。このために、脳及び脊髄をホモジネートして最終体積を1mg/μlとし、1200rpmで5分間遠心分離し、上清を直接分析するか、或いは-80℃で保存後に分析した。
【００６５】
DC-MOG又はDC-OVAベクター形質導入BM-HSCによる抗原特異的寛容誘導
【００６６】
抗原特異性を判定するために、サイトカイン応答を上述したように測定した。但し、脾細胞は、ベクター形質導入BM-HSC移植の8週間後にMOG及びOVA抗原により同時に以下のように免疫したキメラから単離した。 0.1mgのMOGペプチド(ProSpec)及び0.1mgのOVAタンパク質(NeoMPS、フランス、ストラスブール)を、完全フロイントアジュバントに5mg/mlの結核菌を補充したものにおいて乳化し、マウス当たりの合計体積を200μlとして皮下注射した。その後、動物には、300ngの百日咳毒素(Sigma Aldrich)を腹腔内注射し、この注射を48時間後に繰り返した。脾細胞は、動物がスコア3に達した時点、或いは、保護マウスの場合、最後の罹患動物が分析された14日後に単離した。
【００６７】
脳からのCD4 T細胞の単離
【００６８】
脳におけるCD4 T細胞の頻度を分析するため、当該臓器をDMEM中でホモジナイズし、1200rpmで10分間、室温において遠心分離した。ペレットを5mlの37％パーコール含有PBSに懸濁させ、2.5mlの70％パーコール含有PBSを慎重に添加した。試料を600gで20分間、室温において遠心分離して、界面内の白血球を採取し、PBSにより数回洗浄し、フローサイトメトリーにより分析した。
【００６９】
FACS分析
【００７０】
ドナーの生着及びキメラ化を、移植の6乃至8週間後に、胸腺におけるCD45.1対CD45.2のサイトメトリー解析により、APC共役抗CD45.1(A20、BD Biosciences)及びPE共役抗CD45.2(104、eBioscience)をそれぞれ用いて評価した。DCs及びEGFP導入遺伝子発現のDC特異性の分析のため、以下の抗体を用いた: ビオチン共役抗CD3(145-2C11、BD Biosciences)、PE共役抗CD11b(M1/70、BD Biosciences)、PerCP共役抗CD45(RA3-6120.1、BD Biosciences)、PE共役抗I-A[b]、(AF6-120.1、BD Biosciences)、ビオチン共役抗Ly-6G/Ly-6C(Gr-1、RB6-8C5、BD Biosciences)、FITC共役抗CD3(145-2C11、BD Biosciences)、APC共役抗CD11c(N418、BD Biosciences)、PerCP共役抗cD11c(N418、BD Biosciences)、PerCP共役抗CD8(53-6.7、BD Biosciences)、PE共役抗CD19(6D5、BD Biosciences)、PerCP/Cy5.5共役抗CD103(2E7、BD Biosciences)、PerCP共役抗F4/80(BM8、BD Biosciences)、PE-conjugated streptavidin(BD Biosciences)、PE/Cy7共役抗CD4(GK1.5、eBioscience)、PE/Cy5共役抗NK1.1(PK136、eBioscience)、及びAPC共役抗NK(Dx5、eBioscience)。Treg及び2D2 T細胞を含むT細胞は、以下の抗体により分析した: FITC共役抗Vα3.2(RR3/16、BD Biosciences)、PE共役抗Vβ11(KT11、BioLegend)、APC共役抗CD4(RM4-5、BD Biosciences)、PE共役抗CD152(UC10-4B9、BioLegend)、APC共役抗Foxp3+(APC抗マウス/ラットFoxp3染色セットキット、eBioscience)、APC共役抗CD25(PC61.5、eBioscience)、APC共役抗CD69、H1.2F3、BD Biosciences)、APC共役抗CD44(IM7、eBioscience)、APC共役抗CD62L(MEL-14、eBioscience)、FITC共役抗CD3(145-2C11、BD Biosciences)、APC共役抗CD4(RM4-5、BD Biosciences、PerCP共役抗CD8(53-6.7、BD Biosciences)。
【００７１】
統計的分析
【００７２】
統計的分析は、GraphPad Prismバージョン5.02ソフトウェアを用いた片側(図5、左パネル)又は両側(他の全ての統計分析)t検定により行った。データは、特に明記しない限り平均値±SDとして提示している。差は、p値が0.05未満である場合に有意とした。
【００７３】
結果
【００７４】
実施例1: SINレンチウイルスベクター媒介DC特異的抗原発現
【００７５】
DC特異的STAMPプロモーターを用いて、完全長ネズミMOGを発現するSINレンチウイルスを構築した(DC-MOG、図1A)。DC-STAMPプロモーターからEGFP又は膜標的(membrane targeted)OVAを発現する対照ベクター(DC-EGFP、DC-OVA)は、以前に記述されている(Dresch et al. 2008)。ベクター媒介MOG発現は、ベクター形質導入骨髄由来DCs(bone marrow derived DCs, BM-DC)の免疫蛍光分析により実証された(図示せず)。ベクター形質導入BM-DC並びにMOG35-55ペプチドを認識するT細胞受容体(Vα3.2及びVβ11鎖)に対してトランスジェニックである2D2マウスから単離されたCD4+ T細胞を用いたT細胞増殖アッセイが示す通り、ベクターコードMOGは機能性を有した(図示せず)。
【００７６】
DC-STAMPプロモーターが与える転写特異性は、以前に実証されており(Dresch et al., 2008)、ここでは次のように確認した: C57BL/6ドナーマウスからの骨髄由来造血幹細胞(BM-HSC)を、DC-EGFPにより形質導入した後、致死量放射線照射同系受容マウスに移植した。DC-EGFP形質導入BM-HSCの移植の6週間後に、EGFP蛍光を、cd11c+細胞の35％超において検出した一方、cd11c-細胞の5％未満がEGFP陽性となった。更に、当該5％のcd11c-細胞における平均蛍光強度(MFI)は、EGFP陽性のcd11c+細胞よりも有意に低かった(図1B)。脾臓におけるキメラ化は、少なくとも96％となった(図示せず)。
【００７７】
実施例2: DC-MOGベクター形質導入BM-HSCの移植はマウスをEAE疾患から保護する
【００７８】
次に、致死量放射線照射C57BL/6マウスに、同系ドナーからのDC-MOG又は対照ベクター(DC-EGFP又はDC-OVA)形質導入BM-HSCを移植した。8週間後、EAEを誘導し、疾患の臨床的徴候を1日に2回評価した。図2Aは、対照マウスにおいて、誘導後10日目辺りからEAEの発病が始まり(平均発病日10.5+1.3)、全ての動物が、発病後1週間未満で臨床スコア3に達したことを示している。重要な点として、DC-MOG形質導入BM-HSCを受容したマウスでは、神経学的症状が全く発生していないことである(臨床スコア0)。DC-MOGキメラは、誘導後少なくとも5週間はEAEを発病しておらず、これらの動物から単離したBM-DCsの存在下での2D2 T細胞の増殖により実証されるように、免疫系の再構成後、少なくとも13週間に亘り、MOG発現DCsの生産を継続した(図2B)。3回の独立した実験では、何れのDC-MOGキメラにおいても、臨床的症状の徴候が全く発生しておらず、一方、対照ベクター形質導入BM-HSCを受容したキメラは、全て臨床スコア3まで進行しており、この時点で死亡させた。
【００７９】
寛容化した動物の組織学的分析では、CNSの病変を示す証拠は存在しなかった。一方、対照ベクター形質導入BM-HSCを受容したキメラは、脳(図示せず)、視神経、及び脊髄内に広範な多巣性の炎症性浸潤及び脱髄を示した。中度から重度の脱髄及び軸索損傷が患部組織において観察され、それぞれミエリン及び神経フィラメントの染色により判定された。炎症プロセスには、マクロファージ及びT細胞の大量の浸潤が関与した。罹患動物のCNSにおけるCD4 T細胞の頻度は、保護マウスよりも7倍超高かった(図3)。脳内では、主に髄膜及び白質が関与し、灰白質は殆ど関与しなかった(図示せず)。脊髄では、脱髄及び炎症プロセスの強度は、尾部へ向けて増加していた(図示せず)。
【００８０】
罹患及び保護マウスの脾臓及びCNSにおけるサイトカイン生成パターンを分析した。図4Aに示したように、罹患DC-OVA対照ベクター形質導入BM-HSCキメラの脾臓におけるTh2サイトカイン(IL4、IL-5、IL-6)及び炎症性サイトカイン(IL-17、TNF-α、GM-CSF、及びIFN-γ)の濃度は、保護DC-MOGキメラのものより大幅に高かった。保護マウスにおけるサイトカイン生成の一般的障害の可能性は、PMAによる非特異的刺激時に、IFN-γ生成が罹患及び保護マウスからの脾細胞において同程度であったことから除外される(図4A)。CNSにおいて見られたサイトカインパターンは、脾臓におけるものと同等であり、但し、この組織では、保護(DC-MOG)及び罹患(DC-OVA)動物の両方でIL-17が検出できなかった(図4B)。
【００８１】
寛容の特異性は、DC-MOG又はDC-OVAベクター形質導入BM-HSCキメラをOVA及びMOGペプチドにより同時に免疫し、脾細胞のIFN-γ生成を測定することにより実証された。予想通り、DC-MOG寛容化キメラにおけるIFN-γ応答は、OVAペプチドによる刺激時には検出されたが、MOGペプチドによる刺激時には検出されず、一方、DC-OVA寛容化キメラにおけるサイトカイン応答は、MOGペプチドによる刺激時には得られたが、OVAペプチドによる刺激時には得られなかった(図5)。
【００８２】
DC-MOGベクター形質導入BM-HSCの移植は、MOG特異的T細胞の枯渇及び調節性T細胞の誘導をもたらす
【００８３】
寛容誘導の考えられるメカニズムを調査するために、致死量放射線照射C57BL/6マウスに、2D2ドナーから単離したBM-HSCにDC-MOG又はDC-OVAベクターを形質導入したものを移植し、キメラからのMOG特異的2D2 T細胞を6乃至8週間後に定量した。結果は、図6に示しており、次のように要約することができる: 2D2 T細胞は、対照ベクター(DC-OVA)形質導入BM-HSCを受けた動物と比較して、DC-MOGベクター形質導入BM-HSCを受けたキメラにおいて大幅に枯渇した。DC-MOG処理マウスでは、脾臓内の僅か約4％のCD4+ T細胞がVα3.2/Vβ11 TCRを含んでいたが、DC-OVA対照ベクター処理マウスの約55％がMOG35-55特異的TCRを含んでいた(図6A)。保護マウスの脾臓内の2D2 T細胞の総数は、罹患マウスのものよりも大幅に少なかった(図6B)。保護マウスでの2D2 T細胞の枯渇は、胸腺においては脾臓ほど顕著ではなかったが、しかしながら有意となった(図6B)。更に、脾臓内の残りの2D2 T細胞を更に分析すると、CD25、CD44、及びCD69の上方制御とCD62Lの僅かな下方制御とを特徴とする、DC-MOGキメラの抗原経験表現型が明らかとなった(図7A)。更に、残りの2D2 T細胞を調節性T細胞(Treg)表現型について分析し、DC-MOG処理マウスの脾臓において、残りの2D2 T細胞の50％超がCTLA-4及びFoxp3陽性であり、DC-OVA処理マウスから単離した2D2 T細胞の1％未満が、Treg表現型を示すことを発見した(図7B)。DC-MOG及びDC-OVAキメラの胸腺及び脾臓におけるTreg2D2 T細胞の絶対数を図7Cに示す。
【００８４】
DC-MOGベクター形質導入BM-HSCの移植は、確立されたEAEを改善する
【００８５】
MOG発現DCsを発生させるSINレンチウイルスベクター形質導入BM-HSCを移植する戦略が、確立されたEAEを治療する上でも有効となり得るかを調査した。この治癒的プロトコルのために、予防的プロトコルの説明と全く同様にMOGペプチドにより免疫することにより、未処理マウスにおいてEAEを確立した。最初の症状が観察された後4日及び5日目に、動物を、低用量ブスルファンにより条件付けし、材料及び方法において説明したDC-MOG又はDC-OVA形質導入BM-HSCを移植した。2回の独立した実験において、DC-MOG群の全ての動物で臨床的な改善が観察され、実験の全期間に亘って維持された(図8)。一方、対照群(DC-OVA)では臨床的改善は観察されず、臨床スコア3が移植後2日間を超えて維持された時点で動物を死亡させた。
【００８６】
これらの結果は、DC-MOGにより形質導入した自己BM-HSCの移植が、EAE/MSを治療する有望なアプローチであることを示している。この戦略は、病変の発生に関与する自己抗原が公知である他の自己免疫疾患の治療においても有用となる可能性がある。
【符号の説明】
【００８７】
[図1]
B
％EGFP positive cells: EGFP陽性細胞(％)
[図2]
A
Mean clinical score: 平均臨床スコア
Days after EAE induction: EAE誘導後の日数
B
# Cells: 細胞数
[図3]
％ CD4 T cells: CD4 T細胞(％)
[図4]
A
Hours: 時間
[図5]
IFN-γ ratio: IFN-γ比
[図6]
A
counts: 計数
B
Spleen: 脾臓
Thymus: 胸腺
cells: 細胞
[図7]
C
Spleen: 脾臓
Thymus: 胸腺
[図8]
Mean clinical score: 平均臨床スコア
Days after EAE induction: EAE誘導後の日数
【図３】
2015502135.tif 000002
【図４Ａ】
2015502135.tif 000003
【図６】
2015502135.tif 000004
【図１】
2015502135.tif 000005
【図２】
2015502135.tif 000006
【図４Ｂ】
2015502135.tif 000007
【図５】
2015502135.tif 000008
【図７】
2015502135.tif 000009
【図８】
2015502135.tif 000010
【配列表】
2015502135000001.app
【国際調査報告】
2015502135.tif 000011
2015502135.tif 000012
2015502135.tif 000013