(57)【要約】  本発明は、ラビリントペプチンおよびその機能的誘導体の組換え産生のための方法に関する。さらに、本発明は、ラビリントペプチンの新規機能的誘導体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
放線菌、特にアクチノマヅラス・ナミビエンシスの、少なくとも１種のラビリントペプチン（ｌａｂ）遺伝子クラスター、特に配列番号１３９による配列を有する遺伝子クラスターを含む核酸であって、ここで：
（ａ）該核酸は、ストレプトマイセス細胞における発現のための構成的プロモーター、特にｅｒｍＥプロモーターをさらに含み、ここで、該遺伝子クラスターは、該プロモーターの制御下にあり、
ならびに／または
（ｂ）ＬａｂＡ１および／もしくはＬａｂＡ２もしくはそれらの機能的誘導体をコードする核酸は、ＬａｂＡ１および／もしくはＬａｂＡ２のリーダー・ペプチドのＣ末端アミノ酸がメチオニンで置換されるように変異し、
ならびに／または
（ｃ）該核酸は、少なくとも１つのハイブリッド遺伝子配列をさらに含み、ここで、該ハイブリッド遺伝子配列は：
（ｉ）ＬａｂＡ２リーダー配列およびＬａｂＡ１プレペプチドもしくはその機能的誘導体を含むプレプロペプチドをコードし、ならびに／もしくは
（ｉｉ）ＬａｂＡ１リーダー配列およびＬａｂＡ２プレペプチドもしくはその機能的誘導体を含むプレプロペプチドをコードする
上記核酸。
【請求項２】
（ａ）ラビリントペプチン（ｌａｂ）遺伝子クラスターが、遺伝子ｌａｂＫＣ、ｌａｂＡ１、ｌａｂＡ２、ｌａｂＴ１およびｌａｂＴ２を含み、ならびに／または
（ｂ）ＬａｂＡ１および／もしくはＬａｂＡ２をコードする核酸が、配列番号１４０もしくは配列番号１４１による配列を有するか、もしくは配列番号１４０および／もしくは配列番号１４１に対して、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、なおより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を示す配列を有する、
請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
請求項１または２に記載の核酸を含むベクター。
【請求項４】
（ａ）配列番号１４３による配列を有するｐＬａｂ、もしくは配列番号１４３による配列を有するｐＵＷＬａｂ、もしくは配列番号１４４による配列を有するｐＬａｂＡｍｐであり、および／または
（ｂ）遺伝子クラスターが構成的プロモーターの制御下になるように、少なくとも１つのｌａｂ遺伝子クラスターを挿入することによってｐＵＷＬｏｒｉＴから取得可能である、
請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターで形質転換された細菌細胞、特にストレプトマイセス細胞または大腸菌細胞、より好ましくはストレプトマイセス・リビダンス細胞またはストレプトマイセス・アルブス細胞。
【請求項６】
少なくとも１種のラビリントペプチンまたはその機能的誘導体を産生する方法であって、以下：
（ａ）請求項４に記載のベクターで形質転換されたストレプトマイセス細胞、好ましくはストレプトマイセス・リビダンス細胞またはストレプトマイセス・アルブス細胞を培養培地中で培養する工程、
（ｂ）少なくとも１種のラビリントペプチンまたはその機能的誘導体を含む培養培地を収集する工程、および
（ｃ）少なくとも１種のラビリントペプチンまたはその機能的誘導体を該培養培地から場合により精製する工程
を含む上記方法。
【請求項７】
（ａ）請求項３もしくは４に記載のベクターが、ＬａｂＡ１および／もしくはＬａｂＡ２もしくはそれらの機能的誘導体をコードする核酸を含み、ここで、該核酸は、ＬａｂＡ１および／もしくはＬａｂＡ２のリーダー・ペプチドのＣ末端アミノ酸がメチオニンで置換されるように変異し、ならびに／または
（ｂ）請求項４もしく５に記載のベクターが、以下：
（ｉ）ＬａｂＡ２リーダー配列およびＬａｂＡ１プレペプチドもしくはその機能的誘導体を含むプレプロペプチドをコードするハイブリッド核酸、ならびに／もしくは
（ｉｉ）ＬａｂＡ１リーダー配列およびＬａｂＡ２プレペプチドもしくはその機能的誘導体を含むプレプロペプチドをコードするハイブリッド核酸
から選択される少なくとも１つのハイブリッド核酸、
好ましくは（ｉｉ）を含む、
請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項６または７に記載の方法によって取得可能である、１種より多いラビリントペプチンまたはその機能的誘導体の混合物。
【請求項９】
以下：
（ａ）そのリーダー配列のＣ末端アミノ酸がメチオニンであるラビリントペプチン・プレプロペプチド・ラビリントペプチンもしくはその機能的誘導体、
または
（ｂ）そのリーダー配列のＣ末端アミノ酸がメチオニンであるラビリントペプチン・プレプロペプチドもしくはその機能的誘導体をコードする核酸
から選択される化合物。
【請求項１０】
以下：
（ａ）配列番号１〜２４のいずれかによる配列を含む核酸、ならびに／または
（ｂ）（ａ）の核酸によってコードされ、配列番号１３２によるＬａｂＡ１プレプロペプチドとも配列番号１３５によるＬａｂＡ２プレプロペプチドとも異なる配列を有するラビリントペプチン・プレプロペプチドの機能的誘導体、ならびに／または
（ｃ）（ａ）の核酸によってコードされ、配列番号１３４によるＬａｂＡ１プレペプチドとも配列番号１３７によるＬａｂＡ２プレペプチドとも配列番号１３８によるＬａｂＡ３プレペプチドとも異なる配列を有し、リーダー配列を欠くか、もしくはリーダー配列、特に配列番号１３３もしくは配列番号１３６によるリーダー配列の、少なくともＮ末端の８０％、特に９０％、より好ましくは９５％を欠くラビリントペプチン・プレペプチドの機能的誘導体、ならびに／または
（ｄ）以下：
ＬａｂＡ１＿Ｎ２Ａ、ＬａｂＡ１＿Ｖ５Ａ、ＬａｂＡ１＿Ｗ６Ａ、ＬａｂＡ１＿Ｅ７Ａ、ＬａｂＡ１＿Ｔ１１Ａ、ＬａｂＡ１＿Ｖ１５Ａ、ＬａｂＡ１＿Ｐ１６Ａ、ＬａｂＡ１＿Ｆ１７Ａ、
ＬａｂＡ２＿Ｄ２Ａ、ＬａｂＡ２＿Ｗ３Ａ、ＬａｂＡ２＿Ｌ５Ａ、ＬａｂＡ２＿Ｅ７Ａ、ＬａｂＡ２＿Ｔ１１Ａ、ＬａｂＡ２＿Ｇ１２Ａ、ＬａｂＡ２＿Ｌ１４Ａ、ＬａｂＡ２＿Ｆ１５Ａ、
ＬａｂＡ１＿Ｖ５ｄｅｌ、ＬａｂＡ１＿Ｗ６ｉｎｓＶ、ＬａｂＡ１＿Ｐ１６ｄｅｌ、ＬａｂＡ１＿Ｐ１６ｉｎｓＶ、
ＬａｂＡ１＿Ｓ４Ｔ、Ｍ−ＬａｂＡ１＿Ｓ４Ｔ、ＡＭ−ＬａｂＡ１＿Ｓ４Ｔ、ＮＲ−ＬａｂＡ２＿Ｍ（ＳＧ２０）、
Ｒ−ＬａｂＡ２＿Ｍ（ＳＧ２０）、ＬａｂＡ１＿Ｖ１５Ｓ、Ｍ−ＬａｂＡ１＿Ｖ１５Ｓ、ＬａｂＡ１＿Ｔ１１Ｓ（Ｓｅｒ）、ＬａｂＡ１＿Ｗ６Ｙ、ＬａｂＡ１＿Ａ３Ｈ、ＬａｂＡ１＿Ｃ２０ｉｎｓＡ、
ＬａｂＡ１＿Ｓ１０ｉｎｓＡ、ＬａｂＡ１＿Ｃ２０ｄｅｌ、ＬａｂＡ１＿Ｓ１ｉｎｓＣ、Ｄ−ＬａｂＡ１／Ａ２（ＳＧ１１）、
ＡＤ−ＬａｂＡ１／Ａ２（ＳＧ１１）、Ｒ−ＬａｂＡ２／Ａ１（ＳＧ１１）、ＮＲ−ＬａｂＡ２／Ａ１（ＳＧ１１）、およびＥＮＲ−ＬａｂＡ２／Ａ１（ＳＧ１１）
から選択されるラビリントペプチン・ペプチドの機能的誘導体
から選択される化合物。
【請求項１１】
少なくとも１種のラビリントペプチンまたはその機能的誘導体の組換え発現のための、少なくとも１つのストレプトマイセス・リビダンス細胞および／またはストレプトマイセス・アルブス細胞の使用。
【請求項１２】
細菌感染、ＨＩＶ感染または疼痛、特に神経障害性疼痛の処置および／または予防における使用のための、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の混合物または化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラビリントペプチン（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｏｐｅｐｔｉｎ）およびその機能的誘導体の組換え産生のための方法に関する。さらに、本発明は、ラビリントペプチンの新規機能的誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ランチビオティックは、ブドウ球菌、乳酸桿菌および放線菌などの細菌からリボソームにより合成されるペプチドである。ランチビオティックの共通の構造的特徴は、このペプチドにコンフォメーション的安定性を付与する非標準アミノ酸ランチオニン（Ｌａｎ）である。ラビリントペプチンは、砂漠細菌アクチノマヅラ・ナミビエンシス（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ  ｎａｍｉｂｉｅｎｓｉｓ）から単離されたクラスＩＩＩランチビオティックである。これらは、ラビオニン（ｌａｂｉｏｎｉｎ）と称される独自の炭素環式の翻訳後修飾されたアミノ酸を有する、新たな型のランチビオティックの最初の代表である。ラビオニンの化学構造は以下のとおりである：
【化１】
2015502164.tif 000002
【０００３】
生物学的特徴付けにより、ラビリントペプチンＡ２（ＬａｂＡ２）が、ｉｎ  ｖｉｖｏの神経障害性疼痛モデルにおいて効能を明らかにすることが示された。これらの化合物は、薬物発見のための新たなリードとみなされ得るので、その生物活性にとって重要なモチーフを同定するために、構造−機能相関研究を実施する強い必要性がある。しかし、複雑な翻訳後修飾の存在に起因して、ランチビオティック・アナログの化学合成は、込み入っている、効率的でないなどであり、ラビリントペプチンについては全く知られていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、ラビリントペプチンの組換え産生を可能にする方法ならびにラビリントペプチンの機能的誘導体の生成のための方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、放線菌、特にアクチノマヅラス・ナミビエンシス（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａｓ  ｎａｍｉｂｉｅｎｓｉｓ）の、少なくとも１つのラビリントペプチン（ｌａｂ）遺伝子クラスター、特に配列番号１３９による配列を有する遺伝子クラスターを含む核酸に関し、ここで：
（ａ）核酸は、ストレプトマイセス細胞における発現のための構成的プロモーター、特にｅｒｍＥプロモーターをさらに含み、ここで、遺伝子クラスターは、前記プロモーターの制御下にあり、
ならびに／または
（ｂ）ＬａｂＡ１および／もしくはＬａｂＡ２もしくはそれらの機能的誘導体をコードする核酸は、ＬａｂＡ１および／もしくはＬａｂＡ２のリーダー・ペプチドのＣ末端アミノ酸がメチオニンで置換されるように変異し、
ならびに／または
（ｃ）核酸は、少なくとも１つのハイブリッド遺伝子配列をさらに含み、ここで、ハイブリッド遺伝子配列は：
（ｉ）ＬａｂＡ２リーダー配列およびＬａｂＡ１プレペプチドもしくはその機能的誘導体を含むプレプロペプチドをコードし、ならびに／もしくは
（ｉｉ）ＬａｂＡ１リーダー配列およびＬａｂＡ２プレペプチドもしくはその機能的誘導体を含むプレプロペプチドをコードする。
【０００６】
好ましい実施形態では、これらのストレプトマイセス細胞は、ストレプトマイセス・リビダンス細胞およびストレプトマイセス・アルブス細胞から選択され、特にこれらの細胞は、ストレプトマイセス・リビダンス細胞である。
【０００７】
ＬａｂＡ１および／またはＬａｂＡ２ならびにそれらの機能的誘導体は、実施例２〜４に示されるように、組換え産生によって首尾よく産生され得ることが見出された。特に、その発現は、ストレプトマイセスにおける発現のための構成的プロモーターｅｒｍＥを使用して首尾よく実施された。
【０００８】
このｌａｂ遺伝子クラスターは、遺伝子ｌａｂＫＣ、ｌａｂＡ１、ｌａｂＡ２、ｌａｂＴ１およびｌａｂＴ２を含む。構造遺伝子ｌａｂＡ１およびｌａｂＡ２は、それぞれラビリントペプチンＡ１／Ａ３およびラビリントペプチンＡ２プレプロペプチドをコードする。ｌａｂＴ１およびｌａｂＴ２は、トランスポーター・タンパク質に対する相同性を有するタンパク質をコードする。遺伝子ｌａｂＫＣは、ラビリントペプチンの翻訳後修飾に必要な、従って成熟ラビリントペプチンの生成に必要な、Ｎ末端リアーゼ・ドメイン、Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ・ドメインおよびＣ末端推定ランチオニン・シクラーゼ・ドメインを有する三機能性タンパク質をコードする。
【０００９】
ネイティブのｌａｂＡ１および／またはｌａｂＡ２遺伝子は、それぞれ配列番号１４０および配列番号１４１による配列を有する。成熟ＬａｂＡ１およびＬａｂＡ２を生じるこれらの遺伝子の発現は、実施例によるストレプトマイセス細胞における組換え発現によって首尾よく実施できた。さらに、機能的誘導体が生成できた。
【００１０】
従って、さらなる実施形態では、ＬａｂＡ１および／もしくはＬａｂＡ２をコードする核酸は、配列番号１４０もしくは配列番号１４１による配列を有するか、または配列番号１４０および／もしくは配列番号１４１に対して、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、なおより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を示す配列を有する。
【００１１】
さらに、リーダー・ペプチドの最後のＣ末端アミノ酸をメチオニンに変異させることが、リーダー・ペプチドの残留アミノ酸なしの成熟ＬａｂＡ１およびＬａｂＡ２の産生を驚くべきことに生じることを、実施例において示すことができた。
【００１２】
プロペプチド配列ＬａｂＡ２をコードする核酸を、ＬａｂＡ１のリーダー・ペプチドをコードする核酸に転移させること、およびプロペプチド配列ＬａｂＡ１をコードする核酸を、ＬａｂＡ２のリーダー・ペプチドをコードする核酸に転移させることによって、ハイブリッド・プレプロペプチドを生成することが可能であることもまた、驚くべきことに示すことができた。
【００１３】
さらなる実施形態では、本発明は、上記の核酸構築物を含むベクター、特にプラスミドに関する。実施例において、ベクターｐＵＷＬａｂおよびｐＬａｂは、ストレプトマイセス種におけるラビリントペプチンおよびその誘導体の発現に首尾よく使用された。これらのベクターは、実施例に記載されるように、遺伝子クラスターが構成的プロモーターｅｒｍＥの制御下になるように、ｌａｂ遺伝子クラスターを挿入することによって、公知のベクターｐＵＷＬｏｒｉＴから出発して構築された。
【００１４】
従って、好ましい実施形態では、本発明のベクターは：
（ａ）配列番号１４３による配列を有するｐＬａｂ、もしくは配列番号１４３による配列を有するｐＵＷＬａｂ、もしくは配列番号１４４による配列を有するｐＬａｂＡｍｐであり、および／または
（ｂ）遺伝子クラスターが構成的プロモーターの制御下になるように、少なくとも１つのｌａｂ遺伝子クラスターを挿入することによってｐＵＷＬｏｒｉＴから取得可能である。
【００１５】
特に、このベクターはプラスミドである。
【００１６】
実施例１に記載されるように、いくつかの成功しなかった試みの後、ラビリントペプチンおよびその機能的誘導体の発現を、上記ベクターを使用して、ストレプトマイセス・リビダンス細胞およびストレプトマイセス・アルブス細胞の形質転換（実施例２〜４）によって達成することができた。特に、これらのベクターは二機能性であり、従って、大腸菌における複製および増殖のためにも使用され得る。
【００１７】
従って、本発明は、本発明によるベクターで形質転換された細菌細胞、特にストレプトマイセス細胞または大腸菌細胞、より好ましくはストレプトマイセス・リビダンス細胞またはストレプトマイセス・アルブス細胞にさらに関する。
【００１８】
ストレプトマイセス細胞または大腸菌細胞を形質転換する方法は、当業者に公知である。特に、実施例の材料および方法の節において説明されるような形質転換方法が使用され得る。
【００１９】
別の実施形態では、本発明は、少なくとも１種のラビリントペプチンまたはその機能的誘導体の組換え発現のための、少なくとも１つのストレプトマイセス・リビダンス細胞および／またはストレプトマイセス・アルブス細胞の使用に関する。
【００２０】
さらなる実施形態では、本発明は、少なくとも１種のラビリントペプチンまたはその機能的誘導体を産生する方法に関し、この方法は、以下：
（ａ）本発明によるベクターで形質転換されたストレプトマイセス細胞、好ましくはストレプトマイセス・リビダンス細胞またはストレプトマイセス・アルブス細胞を培養培地中で培養する工程、
（ｂ）少なくとも１種のラビリントペプチンまたはその機能的誘導体を含む培養培地を収集する工程、および
（ｃ）少なくとも１種のラビリントペプチンまたはその機能的誘導体を培養培地から場合により精製する工程
を含む。
【００２１】
細菌細胞を培養する方法は、当業者に公知である。特に、実施例の材料および方法の節において説明されるような培養方法および培地が使用され得る。アクチノマヅラ・ナミビエンシス細胞およびストレプトマイセス細胞は、当業者に公知の適切な培地中で培養され得る。特に、実施例に開示されるような、ＭＳ、Ｒ２ＹＥ、Ｒ５またはＫＭ４から好ましくは選択される寒天培地が使用され得る。別の好ましい実施形態では、液体培地、特にＹＥＭＥ、ＣＲＭ、ＫＭ４またはＭ５２９４から選択される液体培地が、例えば実施例に開示されるように使用され得る。アクチノマヅラ・ナミビエンシス細胞およびストレプトマイセス細胞は、約１０℃〜約４０℃で、好ましくは約２０℃〜約３５℃で、より好ましくは約２５℃〜３０℃で、最も好ましくは約２８℃で培養され得る。大腸菌を培養する方法は、当該分野で公知である。特に、実施例に記載されるようなＬＢ培地が使用され得る。細胞培養物には、選択のために適切な場合、抗生物質が補充され得る。
【００２２】
細胞は、特に、使用される細胞の種および型に依存して、約３０分間〜約６か月間、特に約１日間〜約３か月間、好ましくは約３日間〜約６週間培養され得る。例えば大腸菌細胞は、通常１〜２日間増殖され、ストレプトマイセス種の細胞は、通常３日間〜３週間増殖される。
【００２３】
別の好ましい実施形態では、本発明のベクターは、ＬａｂＡ１および／もしくはＬａｂＡ２またはそれらの機能的誘導体をコードする核酸を含み、ここで、この核酸は、ＬａｂＡ１および／またはＬａｂＡ２のリーダー・ペプチドのＣ末端アミノ酸がメチオニンで置換されるように変異している。かかる構築物は、リーダー・ペプチド由来のアミノ酸なしの成熟ペプチドの発現を可能にし得る。
【００２４】
別の好ましい実施形態では、本発明のベクターは、以下：
（ｉ）ＬａｂＡ２リーダー配列およびＬａｂＡ１プレペプチドもしくはその機能的誘導体を含むプレプロペプチドをコードするハイブリッド核酸、ならびに／または
（ｉｉ）ＬａｂＡ１リーダー配列およびＬａｂＡ２プレペプチドもしくはその機能的誘導体を含むプレプロペプチドをコードするハイブリッド核酸
から選択される少なくとも１つのハイブリッド核酸、
好ましくは（ｉｉ）
を含む。
【００２５】
かかるハイブリッド分子は特に、実施例４に示されるように、より高い量のＬａｂＡ２またはその機能的誘導体を発現させるために適している。
【００２６】
核酸中に変異を導入する方法は、当該分野で周知である。例えば、実施例の材料および方法の節に記載されるような部位特異的変異誘発が実施され得る。
【００２７】
ラビリントペプチンまたはその機能的誘導体を検出する方法もまた、当該分野で公知である。例えば、実施例の材料および方法の節ならびに実施例２〜４に示されるように、ウエスタン・ブロッティングなどの免疫学的方法ならびに／またはＬＣ−ＭＳおよび／もしくはＭＳ／ＭＳおよび／もしくはＧＣ−ＭＳが使用され得る。
【００２８】
クローニングおよびＤＮＡ増幅実験のために、種々の方法が先行技術において記載されている。特に、ＰＣＲは、実施例の材料および方法の節に記載されるように、増幅およびクローニングのために使用され得る。制限エンドヌクレアーゼおよび／またはリガーゼの使用を含むクローニングのための方法もまた、当該分野で公知である。好ましい方法は、実施例の材料および方法の節において記載されている。
【００２９】
いくつかの実施形態では、大腸菌細胞およびストレプトマイセス細胞の両方において増殖され得る二機能性ベクターが使用される。
【００３０】
細菌を形質転換する方法は、当該分野で周知である。例えば、大腸菌細胞は、実施例に開示されるように、エレクトロポレーションまたは化学的形質転換によって形質転換され得る。ストレプトマイセス株は、特にプロトプラストを使用して形質転換され得る。特に、プロトプラストが調製され得、その後ＰＥＧ補助された形質転換が行われ得る。接合もまた使用され得る。かかるプロトコールは、実施例に開示されている。
【００３１】
本発明は、本発明の方法によって取得可能な、１種より多いラビリントペプチンまたはその機能的誘導体の混合物にさらに関する。
【００３２】
多数の新規ラビリントペプチン誘導体が、実施例に従って生成できた。
【００３３】
従って、１実施形態では、本発明は、以下：
（ａ）そのリーダー配列のＣ末端アミノ酸がメチオニンであるラビリントペプチン・プレプロペプチド・ラビリントペプチンもしくはその機能的誘導体、
または
（ｂ）そのリーダー配列のＣ末端アミノ酸がメチオニンであるラビリントペプチン・プレプロペプチドまたはその機能的誘導体をコードする核酸
から選択される化合物に関する。
【００３４】
さらなる実施形態では、本発明は、配列番号１〜２４のいずれかによる配列を含む核酸に関し、好ましくはこの核酸は、配列番号１〜２４のいずれかによる配列からなる。
【００３５】
さらなる実施形態では、本発明は、配列番号１〜２４のいずれかによる配列を含む核酸によってコードされるラビリントペプチン・プレプロペプチドの機能的誘導体に関し、このプレプロペプチドは、配列番号１３２によるＬａｂＡ１プレプロペプチドとも配列番号１３５によるＬａｂＡ２プレプロペプチドとも異なる配列を有する。
【００３６】
実施例３および４に示されるように、配列番号１〜２４による核酸分子を使用して、ストレプトマイセス細胞において多数の変異形態のラビリントペプチンを発現させることが、驚くべきことに可能であった。これらのカセットは、ストレプトマイセス細胞における形質転換および発現のために、適切なベクター中に挿入できた。
【００３７】
配列番号１（ＳＧ２）および配列番号５（ＳＧ６）による配列を含む核酸の使用が特に好ましい。これらのカセットは特に、ｌａｂＡ１および／またはｌａｂＡ２遺伝子の部位特異的変異誘発を実施するために有用であった。
【００３８】
別の好ましい実施形態では、配列番号３および／または配列番号６による配列を含む核酸が使用され得る。かかる構築物は、ＬａｂＡ２およびその機能的誘導体を発現させるために有用であった。
【００３９】
別の実施形態では、本発明は、配列番号１〜２４のいずれかによる配列を含む核酸によってコードされるラビリントペプチン・プレペプチドの機能的誘導体に関し、このプレペプチドは、配列番号１３４によるＬａｂＡ１プレペプチドとも配列番号１３７によるＬａｂＡ２プレペプチドとも配列番号１３８によるＬａｂＡ３プレペプチドとも異なる配列を有し、このプレペプチドは、リーダー配列を欠くか、またはリーダー配列の少なくともＮ末端の８０％、特に９０％、より好ましくは９５％を欠き、特に、このリーダー配列は、配列番号１３３もしくは配列番号１３６による配列を有する。
【００４０】
別の実施形態では、本発明は、誘導体、特に以下：
ＬａｂＡ１＿Ｎ２Ａ、ＬａｂＡ１＿Ｖ５Ａ、ＬａｂＡ１＿Ｅ７Ａ、ＬａｂＡ１＿Ｔ１１Ａ、ＬａｂＡ１＿Ｖ１５Ａ、ＬａｂＡ１＿Ｐ１６Ａ、ＬａｂＡ１＿Ｆ１７Ａ、ＬａｂＡ２＿Ｄ２Ａ、ＬａｂＡ２＿Ｗ３Ａ、ＬａｂＡ２＿Ｌ５Ａ、ＬａｂＡ２＿Ｗ６Ａ、ＬａｂＡ２＿Ｅ７Ａ、ＬａｂＡ２＿Ｔ１１Ａ、ＬａｂＡ２＿Ｇ１２Ａ、ＬａｂＡ２＿Ｌ１４Ａ、ＬａｂＡ２＿Ｆ１５Ａ、ＬａｂＡ１＿Ｖ５ｄｅｌ、ＬａｂＡ１＿Ｗ６ｉｎｓＶ、ＬａｂＡ１＿Ｐ１６ｄｅｌ、ＬａｂＡ１＿Ｐ１６ｉｎｓＶ、ＬａｂＡ１＿Ｓ４Ｔ、Ｍ−ＬａｂＡ１＿Ｓ４Ｔ、ＡＭ−ＬａｂＡ１＿Ｓ４Ｔ、ＮＲ−ＬａｂＡ２＿Ｍ（ＳＧ２０）、Ｒ−ＬａｂＡ２＿Ｍ（ＳＧ２０）、ＬａｂＡ１＿Ｖ１５Ｓ、Ｍ−ＬａｂＡ１＿Ｖ１５Ｓ、ＬａｂＡ１＿Ｔ１１Ｓ（Ｓｅｒ）、ＬａｂＡ１＿Ｗ６Ｙ、ＬａｂＡ１＿Ａ３Ｈ、ＬａｂＡ１＿Ｃ２０ｉｎｓＡ、ＬａｂＡ１＿Ｓ１０ｉｎｓＡ、ＬａｂＡ１＿Ｃ２０ｄｅｌ、ＬａｂＡ１＿Ｓ１ｉｎｓＣ、Ｄ−ＬａｂＡ１／Ａ２（ＳＧ１１）、ＡＤ−ＬａｂＡ１／Ａ２（ＳＧ１１）、Ｒ−ＬａｂＡ２／Ａ１（ＳＧ１１）、ＮＲ−ＬａｂＡ２／Ａ１（ＳＧ１１）、およびＥＮＲ−ＬａｂＡ２／Ａ１（ＳＧ１１）
から選択されるラビリントペプチン・ペプチドの機能的誘導体に特に関する。
【００４１】
別の実施形態では、本発明は、アクセッション番号ＤＳＭ２４１８４で寄託されたストレプトマイセス・リビダンス細胞に関する。さらなる実施形態では、本発明は、ＬａｂＡ１、ＬａｂＡ２および／もしくはＬａｂＡ３ならびに／またはそれらの誘導体、特にそれらの機能的誘導体を産生するための、アクセッション番号ＤＳＭ２４１８４で寄託されたストレプトマイセス・リビダンス細胞の使用に関する。
【００４２】
別の実施形態では、本発明は、アクセッション番号ＤＳＭ２４５８０で寄託されたストレプトマイセス・リビダンス細胞に関する。さらなる実施形態では、本発明は、この細胞によって産生されるＬａｂＡ２誘導体、特にこの細胞によって産生されるＬａｂＡ２＿Ｌ１４Ａ分子に関する。
【００４３】
別の実施形態では、本発明は、アクセッション番号ＤＳＭ２４５８１で寄託されたストレプトマイセス・リビダンス細胞に関する。さらなる実施形態では、本発明は、この細胞によって産生されるＬａｂＡ２誘導体、特にこの細胞によって産生されるＬａｂＡ２＿Ｆ１５Ａ分子に関する。
【００４４】
本発明によれば、「ＬａｂＡ＃＿§Ｘ＆」は、ＬａｂＡ＃バリアントを意味すると理解され、ここで、ＬａｂＡ＃のプレペプチドのアミノ酸番号Ｘは、§から＆へと変異している。例えば、ＬａｂＡ１＿Ｎ２Ａでは、ＬａｂＡ１プロペプチドのアミノ酸番号２は、ＮからＡへと変異している。
【００４５】
アミノ酸の番号は、Ｎ末端から開始して計算されると理解される。
【００４６】
本発明によれば、「ＬａｂＡ＃＿§Ｘｄｅｌ」は、ＬａｂＡ＃バリアントを意味すると理解され、ここで、§である、ＬａｂＡ１のプレペプチドのアミノ酸番号Ｘは、欠失されている。例えば、「ＬａｂＡ１＿Ｖ５ｄｅｌ」は、ＬａｂＡ１バリアントを意味すると理解され、ここで、バリンである、ＬａｂＡ１のプレペプチドのアミノ酸番号５は、欠失されている。
【００４７】
本発明によれば、「ＬａｂＡ＃＿§Ｘｉｎｓ＆」は、ＬａｂＡ＃バリアントを意味すると理解され、ここで、アミノ酸＆は、ＬａｂＡ＃のプレペプチドのアミノ酸番号Ｘの前に挿入され、元のアミノ酸番号Ｘ（＆）をＸ＋１位に押し出す。例えば、「ＬａｂＡ１＿Ｐ１６ｉｎｓＶ」は、ＬａｂＡ１バリアントを意味すると理解され、ここで、アミノ酸バリンは、ＬａｂＡ１のプレペプチドのアミノ酸番号１６の前に挿入され、元のアミノ酸番号１６（プロリン）を１７位に押し出す。
【００４８】
本発明によれば、「§−ＬａｂＡ＃」は、Ｎ末端にさらなるアミノ酸§を有する、ＬａｂＡ＃と理解される。かかるさらなるアミノ酸は、完全にはプロセシングされていないリーダー配列に起源し得る。
【００４９】
本発明によれば、「ＬａｂＡ２／Ａ１」は、ＬａｂＡ２リーダー配列およびＬａｂＡ１プレペプチド配列からなるハイブリッドと理解される。従って、ＬａｂＡ１／Ａ２は、ＬａｂＡ１リーダー配列およびＬａｂＡ２プレペプチド配列からなるハイブリッドと理解される。
【００５０】
ラビリントペプチンＬａｂＡ１およびＬａｂＡ２は、抗菌効果、抗ウイルス効果および抗疼痛効果を有することが示された。さらに、ＬａｂＡ２（Ａ）およびＬａｂＡ２＿Ｌ１４Ａは、本適用において抗疼痛活性を示すことが示されている（図２７）。従って、本発明は、細菌感染、ＨＩＶ感染または疼痛、特に神経障害性疼痛の処置および／または予防における使用のための、本発明の混合物または化合物にも関する。さらに、本発明は、細菌感染、ＨＩＶ感染または疼痛、特に神経障害性疼痛の処置および／または予防のための医薬の調製のための、本発明の混合物または化合物の使用にも関する。本発明はまた、有効量の本発明の混合物または化合物を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物、特にヒトにおいて、細菌感染、ＨＩＶ感染または疼痛、特に神経障害性疼痛を処置および／または予防する方法に関する。
【００５１】
これらのペプチドは、当該分野で熟練された方法に従って製剤化され得る。好ましくは、これらの化合物および混合物は、例えば水または生理食塩水などの医薬上許容可能な担体と一緒になって、医薬組成物として存在する。
【００５２】
ラビリントペプチンＬａｂＡ１およびＬａｂＡ２は、ＷＯ２００８／０４０４６９Ａ１に開示されている。さらに、ラビリントペプチンの化学構造および活性は、Ｍｅｉｎｄｌら（２０１０）にまとめられている。
【００５３】
用語「ラビリントペプチン」は、ＬａｂＡ１ペプチド、ＬａｂＡ２ペプチドおよびＬａｂＡ３ペプチドを包含すると理解される。
【００５４】
用語「成熟ラビリントペプチン」は、リーダー配列またはその一部を欠き、翻訳後修飾を受けた、ラビリントペプチンまたはその機能的誘導体と理解される。特に、成熟ラビリントペプチンは、１つまたはそれ以上のラビオニン・アミノ酸を含む。
【００５５】
成熟ＬａｂＡ１の構造は以下のとおりである：
【化２】
2015502164.tif 000003
ここで、Ｄｈｂはジデヒドロブチリンであり、Ｌａｂはラビオニンである。
【００５６】
成熟ＬａｂＡ２の構造は以下のとおりである：
【化３】
2015502164.tif 000004
ここで、Ｌａｂはラビオニンである。
【００５７】
ラビオニン環ＡおよびＡ’は、環Ａについては、Ｎ末端から開始するアミノ酸番号１（Ｌａｂ１）のαＣ原子とアミノ酸番号４（Ｌａｂ４）のαＣ原子との間のメチレン基によって形成され、環Ａ’については、Ｎ末端から開始するアミノ酸番号１０（Ｌａｂ１０）のαＣ原子とアミノ酸番号１３（Ｌａｂ１３）のαＣ原子との間のメチレン基によって形成される。環ＢおよびＢ’環は、チオエーテル架橋によって形成される。
【００５８】
Ｄｈｂの構造は以下のとおりである：
【化４】
2015502164.tif 000005
【００５９】
ＬａｂＡ３もまた記載されている（Ｍｅｉｎｄｌら、上記）。ＬａｂＡ３は、成熟ＬａｂＡ１と比較して、Ｎ末端においてさらなるＡｓｐ残基を保有している。
【００６０】
ＬａｂＡ１：Ｃ92Ｈ119Ｎ23Ｏ25Ｓ4（２０７３．７６２４ａｍｕ）
ＬａｂＡ２：Ｃ85Ｈ110Ｎ20Ｏ24Ｓ4（１９２２．６９３０ａｍｕ）
ラビオニン：Ｃ9Ｈ16Ｎ3Ｏ6Ｓ
【００６１】
ラビリントペプチンの「機能的誘導体」は、配列番号１３４によるＬａｂＡ１、配列番号１３７によるＬａｂＡ２もしくは配列番号１３８によるＬａｂＡ３のプレペプチド配列と比較して、および／または配列番号１３２によるＬａｂＡ１もしくは配列番号１３５によるＬａｂＡ２のプレプロペプチド配列と比較して、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を示すペプチドと理解される。好ましくは、機能的誘導体は、ＷＯ２００８／０４０４６９Ａ１の実施例１５、１６および１７に従って決定されるように、ＬａｂＡ１、ＬａｂＡ２および／またはＬａｂＡ３の抗細菌活性、抗ウイルス活性および／または抗疼痛活性の少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約５０％、なおより好ましくは少なくとも約９０％を示す。特に、機能的誘導体は、１つまたはそれ以上の、特に１つ、２つ、３つまたは４つの、リーダー配列のアミノ酸を含むが、完全なリーダー配列は含まない、ラビリントペプチンを包含する。機能的誘導体はまた、他の放線菌由来のｌａｂＡ１またはｌａｂＡ２のオルソログである。
【００６２】
本発明による「プレプロペプチド」は、リボソーム機構による翻訳により取得され得る、完全な翻訳されたコード領域の長さを有するペプチドと理解される。プレプロペプチドは、リーダー配列を含み、翻訳後修飾を含まない。
【００６３】
本発明による「プロペプチド」は、リーダー配列を欠く、翻訳後修飾を含まないペプチドと理解される。
【００６４】
本発明による「リーダー配列」は、アクチノマヅラ・ナミビエンシス細胞におけるペプチド・プロセシングの間に放出されるペプチド配列と理解される。従って、リーダー配列は、成熟ＬａｂＡ１中にも成熟ＬａｂＡ２中にも存在しない。ＬａｂＡ１およびＬａｂＡ２のネイティブ・リーダー配列は、それぞれ配列番号１３３および配列番号１３６に示される。
【００６５】
本発明による「約」は、実験誤差の範囲、特に±５％または±１０％を意味すると理解される。
【００６６】
ＤＳＭ２４１８４は、アクセッション番号ＤＳＭ２４１８４でＤＳＭＺ  Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨに寄託されたストレプトマイセス・リビダンス株に関する。この株は、ｌａｂ遺伝子クラスターを含む。
【００６７】
ＤＳＭ２４５８０は、アクセッション番号ＤＳＭ２４５８０でＤＳＭＺ  Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨに寄託されたストレプトマイセス・リビダンス株に関する。この株は、誘導体ＬａｂＡ２＿Ｌ１４Ａを発現する。
【００６８】
ＤＳＭ２４５８１は、アクセッション番号ＤＳＭ２４５８１でＤＳＭＺ  Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨに寄託されたストレプトマイセス・リビダンス株に関する。この株は、誘導体ＬａｂＡ２＿Ｆ１５Ａを発現する。
【００６９】
配列番号１３２は、ＬａｂＡ１プレプロペプチドの配列を示す。
【００７０】
配列番号１３３は、ＬａｂＡ１リーダー・ペプチドの配列を示す。
【００７１】
配列番号１３４は、リーダー配列を欠く、ＬａｂＡ１プレペプチドの配列を示す。
【００７２】
配列番号１３５は、ＬａｂＡ２プレプロペプチドの配列を示す。
【００７３】
配列番号１３６は、ＬａｂＡ２リーダー・ペプチドの配列を示す。
【００７４】
配列番号１３７は、リーダー配列を欠く、ＬａｂＡ２プレペプチドの配列を示す。
【００７５】
配列番号１３８は、ＬａｂＡ３プレペプチドの配列を示す。
【００７６】
配列番号１３９は、ｌａｂ遺伝子クラスターの配列を示す。
【００７７】
配列番号１４０は、アクチノマヅラ・ナミビエンシスのｌａｂＡ１遺伝子の配列を示す。
【００７８】
配列番号１４１は、アクチノマヅラ・ナミビエンシスのｌａｂＡ２遺伝子の配列を示す。
【００７９】
配列番号１４２は、ｐＵＷＬａｂの配列を示す。
【００８０】
配列番号１４３は、ｐＬａｂの配列を示す。
【００８１】
配列番号１４４は、ｐＬａｂＡｍｐの配列を示す。
【００８２】
配列番号１６２は、ｐＵＷＬｏｒｉＴの配列を示す。
【００８３】
残りの配列は以下の実施例に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】ラビリントペプチン様ペプチドを仮定としてコードする遺伝子クラスターを示す図である。
【図２】Ａ）ｌａｂ遺伝子クラスターの一部が、プライマー対Ｉ〜ＶＩの使用によって増幅されたことを示す写真である。Ｂ）ストレプトマイセス・セリカラー組込み変異体についてプライマーＩ〜ＶＩを用いたＰＣＲ後に取得されたＤＮＡ断片を示す図である。Ｃ）サザン・ブロッティング、１−コスミドＫＨ、２−ストレプトマイセス・セリカラーｗｔ、３−ｃｌ．３Ａ*、４）クローン３Ｂ*、５−クローン３Ｃ*、６−クローン３Ｄ*、７−クローン３Ｅ*、８−クローン４Ａ*、９−クローン４Ｂ*、１０−ＤｉｇＶＩＩマーカー、*ストレプトマイセス・セリカラー／コスミドＫＨを示す図である。
【図３】ベクターｐＵＷＬｏｒｉＴへのクローニングのためのｌａｂ遺伝子クラスターの増幅に使用したプライマーを示す図である。
【図４】ｌａｂ遺伝子クラスター全体を保有するベクターｐＵＷＬａｂを生成するためのクローニング戦略を示す図である。
【図５】制限消化によるベクターｐＵＷＬの正確さの検証を示す図である。
【図６】ウエスタン・ブロットによるＬａｂＡ２の検出を示す図である。レーン：１および４）分子サイズ・マーカー（１０〜１７０ｋＤａ）、２）ストレプトマイセス・リビダンス（ＭＳ寒天プレート由来の細菌細胞の抽出物）、３）ストレプトマイセス・リビダンス／ｐＵＷＬａｂ（ＭＳ寒天プレート由来の細菌細胞の抽出物）、５）アクチノマヅラ・ナミビエンシス（液体培養培地Ｍ５２９４から取得された上清）。
【図７Ａ】アクチノマヅラ・ナミビエンシスの液体培養物におけるＬａｂＡ１およびＬａｂＡ２の検出を示す図である（９ｄ、培地ＫＭ４）。Ａ）トータル・イオン・クロマトグラム（ＴＩＣ）。
【図７Ｂ】アクチノマヅラ・ナミビエンシスの液体培養物におけるＬａｂＡ１およびＬａｂＡ２の検出を示す図である（９ｄ、培地ＫＭ４）。Ｂ）ＬａｂＡ１およびＬａｂＡ２のＭＳスペクトル（ＬａｂＡ１：［Ｍ＋２Ｈ］2+＝１０３８．３；ＬａｂＡ２：［Ｍ＋２Ｈ］2+＝９６２．９）。
【図７Ｃ】アクチノマヅラ・ナミビエンシスの液体培養物におけるＬａｂＡ１およびＬａｂＡ２の検出を示す図である（９ｄ、培地ＫＭ４）。Ｃ）二重荷電ＬａｂＡ１に対応する範囲ｍ／ｚ１０３７．５〜１０３８．５にわたる抽出イオン・クロマトグラム。
【図７Ｄ】アクチノマヅラ・ナミビエンシスの液体培養物におけるＬａｂＡ１およびＬａｂＡ２の検出を示す図である（９ｄ、培地ＫＭ４）。Ｄ）二重荷電ＬａｂＡ２に対応する範囲ｍ／ｚ９６２．０〜９６３．０にわたる抽出イオン・クロマトグラム。
【図８Ａ】ストレプトマイセス・リビダンス／ｐＵＷＬａｂの液体培養物におけるＬａｂＡ１誘導体およびＬａｂＡ２誘導体の検出を示す図である（９ｄ、培地ＹＥＭＥ）。Ａ）トータル・イオン・クロマトグラム（ＴＩＣ）。
【図８Ｂ】ストレプトマイセス・リビダンス／ｐＵＷＬａｂの液体培養物におけるＬａｂＡ１誘導体およびＬａｂＡ２誘導体の検出を示す図である（９ｄ、培地ＹＥＭＥ）。Ｂ）二重荷電Ｄ−ＬａｂＡ１に対応する範囲ｍ／ｚ１０９５．５〜１０９６．５にわたる抽出イオン・クロマトグラム。
【図８Ｃ】ストレプトマイセス・リビダンス／ｐＵＷＬａｂの液体培養物におけるＬａｂＡ１誘導体およびＬａｂＡ２誘導体の検出を示す図である（９ｄ、培地ＹＥＭＥ）。Ｃ）二重荷電ＮＲ−ＬａｂＡ２に対応するｍ／ｚ範囲１０９７．５〜１０９８．５にわたる抽出イオン・クロマトグラム。
【図８Ｄ】ストレプトマイセス・リビダンス／ｐＵＷＬａｂの液体培養物におけるＬａｂＡ１誘導体およびＬａｂＡ２誘導体の検出を示す図である（９ｄ、培地ＹＥＭＥ）。Ｄ）Ｄ−ＬａｂＡ１およびＡＤ−ＬａｂＡ２のＭＳスペクトル（Ｄ−ＬａｂＡ１：［Ｍ＋２Ｈ］2+＝１０９６．１；ＡＤ−ＬａｂＡ１：［Ｍ＋２Ｈ］2+＝１１３１．７）。
【図８Ｅ】ストレプトマイセス・リビダンス／ｐＵＷＬａｂの液体培養物におけるＬａｂＡ１誘導体およびＬａｂＡ２誘導体の検出を示す図である（９ｄ、培地ＹＥＭＥ）。Ｅ）ＮＲ−ＬａｂＡ２のＭＳスペクトル（ＮＲ−ＬａｂＡ１：［Ｍ＋２Ｈ］2+＝１０９８．２）。
【図９】構築物ｐＬａｂを取得するための戦略を示す図である。ｐＬａｂは、異なるラビリントペプチン・バリアントの調製に適切である。
【図１０】ｐＬａｂＡｍｐを取得するためのクローニング戦略を示す図である。
【図１１】ｐＬａｂ＿ＳＧ２／ＳＧ３／ＳＧ４／ＳＧ５／ＳＧ６ベクターを取得するために使用したクローニング戦略を示す図である。Ａ．ＰａｓＩおよびＥｃｏ４７ＩＩＩによるｐＬａｂＡｍｐの制限消化；アガロース・ゲルからの１３．４ｋｂｐ断片の単離。Ｂ．ＰａｓＩおよびＥｃｏ４７ＩＩＩによる、合成遺伝子（ＳＧ）を保有するｐＭＫ／ｐＭＡの制限消化；ゲルからの３７４ｂｐ（ｐＭＫ＿ＳＧ２について）／３７１ｂｐ（ｐＭＡ＿ＳＧ３）／２１２ｂｐ（ｐＭＡ＿ＳＧ４）断片の単離。Ｃ．ｐＬａｂＡｍｐへの合成遺伝子のライゲーション。Ｄ．ＰＣＲおよび配列決定によるクローンの正確さの検証。
【図１２Ａ】５ｄおよび３週間の増殖の後の、ベクターｐＬａｂ＿ＳＧ２を保有するストレプトマイセス・リビダンスの液体培養物（培地Ｒ２ＹＥ）におけるＬａｂＡ１およびその誘導体の検出を示す図である。Ａ）トータル・イオン・クロマトグラム（５ｄ齢の培養物）。
【図１２Ｂ】５ｄおよび３週間の増殖の後の、ベクターｐＬａｂ＿ＳＧ２を保有するストレプトマイセス・リビダンスの液体培養物（培地Ｒ２ＹＥ）におけるＬａｂＡ１およびその誘導体の検出を示す図である。Ｂ）二重荷電ＬａｂＡ１に対応する範囲ｍ／ｚ１０３７．５〜１０３８．５にわたる抽出イオン・クロマトグラム（５ｄ齢の培養物）。
【図１２Ｃ】５ｄおよび３週間の増殖の後の、ベクターｐＬａｂ＿ＳＧ２を保有するストレプトマイセス・リビダンスの液体培養物（培地Ｒ２ＹＥ）におけるＬａｂＡ１およびその誘導体の検出を示す図である。Ｃ）ＬａｂＡ１およびＬａｂＡ１誘導体のＭＳスペクトル（ＬａｂＡ１：［Ｍ＋２Ｈ］2+＝１０３８．４；Ｍ−ＬａｂＡ１：［Ｍ＋２Ｈ］2+＝１１０４．１；ＡＭ−ＬａｂＡ１：［Ｍ＋２Ｈ］2+＝１１３９．５）（５ｄ齢の培養物）。
【図１２Ｄ】５ｄおよび３週間の増殖の後の、ベクターｐＬａｂ＿ＳＧ２を保有するストレプトマイセス・リビダンスの液体培養物（培地Ｒ２ＹＥ）におけるＬａｂＡ１およびその誘導体の検出を示す図である。Ｄ）トータル・イオン・クロマトグラム（３週齢の培養物）。
【図１２Ｅ】５ｄおよび３週間の増殖の後の、ベクターｐＬａｂ＿ＳＧ２を保有するストレプトマイセス・リビダンスの液体培養物（培地Ｒ２ＹＥ）におけるＬａｂＡ１およびその誘導体の検出を示す図である。Ｅ）二重荷電ＬａｂＡ１に対応する範囲ｍ／ｚ１０３７．５〜１０３８．５にわたる抽出イオン・クロマトグラム（３週齢の培養物）。
【図１２Ｆ】５ｄおよび３週間の増殖の後の、ベクターｐＬａｂ＿ＳＧ２を保有するストレプトマイセス・リビダンスの液体培養物（培地Ｒ２ＹＥ）におけるＬａｂＡ１およびその誘導体の検出を示す図である。Ｆ）ＬａｂＡ１のＭＳスペクトル（ＬａｂＡ１：［Ｍ＋２Ｈ］2+＝１０３８．２）（３週齢の培養物）。
【図１３】野生型（ｐＬａｂ）ならびに合成遺伝子ＳＧ２およびＳＧ３中に存在するラビリントペプチン・プレプロペプチドのアミノ酸配列の比較を示す図である。
【図１４Ａ】ベクターｐＬａｂ＿ＳＧ３を保有するストレプトマイセス・リビダンスの液体培養物におけるＬａｂＡ１誘導体およびＬａｂＡ２誘導体の検出を示す図である（３週、培地Ｒ２ＹＥ）。Ａ）トータル・イオン・クロマトグラム（ＴＩＣ）。
【図１４Ｂ】ベクターｐＬａｂ＿ＳＧ３を保有するストレプトマイセス・リビダンスの液体培養物におけるＬａｂＡ１誘導体およびＬａｂＡ２誘導体の検出を示す図である（３週、培地Ｒ２ＹＥ）。Ｂ）二重荷電ＬａｂＡ１に対応する範囲ｍ／ｚ１０３７．５〜１０３８．５にわたる抽出イオン・クロマトグラム。
【図１４Ｃ】ベクターｐＬａｂ＿ＳＧ３を保有するストレプトマイセス・リビダンスの液体培養物におけるＬａｂＡ１誘導体およびＬａｂＡ２誘導体の検出を示す図である（３週、培地Ｒ２ＹＥ）。Ｃ）ＬａｂＡ１誘導体およびＬａｂＡ２誘導体のＭＳスペクトル（ＬａｂＡ１：［Ｍ＋２Ｈ］2+＝１０３８．１；Ａ−ＬａｂＡ１：［Ｍ＋２Ｈ］2+＝１０７３．７；ＡＡ−ＬａｂＡ１：［Ｍ＋２Ｈ］2+＝１１０９．５；ＡＤ−ＬａｂＡ２：［Ｍ＋２Ｈ］2+＝１０５５．６）。
【図１５】合成遺伝子ＳＧ３、ＳＧ３（Ｍ）およびＳＧ６の図形表示を示す図である。
【図１６Ａ】ストレプトマイセス・リビダンス／ＳＧ６の液体培養物におけるＬａｂＡ２誘導体およびＬａｂＡ１誘導体の検出を示す図である（ＮＺアミン培地、３週齢の培養物）。Ａ）トータル・イオン・クロマトグラム（ＴＩＣ）。
【図１６Ｂ】ストレプトマイセス・リビダンス／ＳＧ６の液体培養物におけるＬａｂＡ２誘導体およびＬａｂＡ１誘導体の検出を示す図である（ＮＺアミン培地、３週齢の培養物）。Ｂ）二重荷電ＬａｂＡ２に対応する範囲ｍ／ｚ９６２．０〜９６３．０にわたる抽出イオン・クロマトグラム。
【図１６Ｃ】ストレプトマイセス・リビダンス／ＳＧ６の液体培養物におけるＬａｂＡ２誘導体およびＬａｂＡ１誘導体の検出を示す図である（ＮＺアミン培地、３週齢の培養物）。Ｃ）ＬａｂＡ２のＭＳスペクトル（ＬａｂＡ２：［Ｍ＋２Ｈ］2+＝９６２．１３；ＬａｂＡ２：［Ｍ＋Ｈ］+＝１９２２．３０）。
【図１６Ｄ】ストレプトマイセス・リビダンス／ＳＧ６の液体培養物におけるＬａｂＡ２誘導体およびＬａｂＡ１誘導体の検出を示す図である（ＮＺアミン培地、３週齢の培養物）。Ｄ）二重荷電Ｒ−ＬａｂＡ１に対応する範囲ｍ／ｚ１１１５．５〜１１１６．５にわたる抽出イオン・クロマトグラム。
【図１６Ｅ】ストレプトマイセス・リビダンス／ＳＧ６の液体培養物におけるＬａｂＡ２誘導体およびＬａｂＡ１誘導体の検出を示す図である（ＮＺアミン培地、３週齢の培養物）。Ｅ）ＬａｂＡ１誘導体のＭＳスペクトル（Ｒ−ＬａｂＡ１：［Ｍ＋２Ｈ］2+＝１１１５．４３；ＮＲ−ＬａｂＡ１：［Ｍ＋２Ｈ］2+＝１１７２．３５；ＥＮＲ−ＬａｂＡ１：［Ｍ＋２Ｈ］2+＝１２３６．７４）。
【図１７】野生型（ｐＬａｂ）ならびに合成遺伝子ＳＧ４およびＳＧ５中に存在するラビリントペプチン・プレプロペプチドのアミノ酸配列の比較を示す図である。
【図１８】異なるラビリントペプチン誘導体を調製する戦略を示す図である。Ａ）部位特異的変異誘発による、合成オリゴヌクレオチドへの所望の変異の導入。Ｂ、Ｃ）ＰａｓＩ制限部位とＥｃｏ４７ＩＩＩ制限部位との間の断片の増幅（Ｉｎｆｕｓｉｏｎプライマー）。Ｄ）ｌａｂ遺伝子クラスター全体を含むプラスミドｐＬａｂの制限消化（酵素ＰａｓＩおよびＥｃｏ４７ＩＩＩを用いる）。Ｄ）新たなラビリントペプチン誘導体の発現のための構築物を取得するためのライゲーション非依存的クローニング（ＬＩＣ）；ＳＧ−合成遺伝子、*−変異。
【図１９】さらなるＳＡＲ研究のために調製されたＬａｂＡ１（Ａ）およびＬａｂＡ２（Ｂ）のアラニン・スキャニング変異体を示す図である。
【図２０】ＮＺアミン培地中での８日間（Ａ、Ｃ）および２１日間（Ｂ、Ｄ）の増殖後のＬａｂＡ１（Ａ、Ｂ）およびＬａｂＡ２（Ｃ、Ｄ）のアラニン変異体についての産生収量の比較を示す図である。Ａ、Ｂ）以下を保有するｐＬａｂ：１．ＳＧ２、２．ＬａｂＡ１＿Ｎ２Ａ、３．ＬａｂＡ１＿Ｗ６Ａ、４．ＬａｂＡ１＿Ｅ７Ａ、５．ＬａｂＡ１＿Ｔ１１Ａ、６．ＬａｂＡ１＿Ｖ１５Ａ、７．ＬａｂＡ１＿Ｐ１６Ａ、８．ＬａｂＡ１＿Ｆ１７Ａ；Ｃ、Ｄ）以下を保有するｐＬａｂ：１．ＳＧ６、２．ＬａｂＡ２＿Ｄ２Ａ、３．ＬａｂＡ２＿Ｅ７Ａ、４．ＬａｂＡ２＿Ｔ１１Ａ、５．ＬａｂＡ２＿Ｌ１４Ａ、６．ＬａｂＡ２＿Ｆ１５Ａ。
【図２１】Ａ環およびＡ’環の柔軟性を検証するために調製したＬａｂＡ１変異体を示す図である。Ａ環またはＡ’環のサイズにおける変化を有するラビリントペプチンＡ１誘導体（ペプチド：ＬａｂＡ１＿Ａ２ｄｅｌ、ＬａｂＡ１＿Ｎ２ｉｎｓＮ、ＬａｂＡ１＿Ｎ２ｉｎｓＤ、ＬａｂＡ１＿Ａ３ｉｎｓＡ、ＬａｂＡ１＿Ｇ１２ｄｅｌ）のいずれも、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析によって検出できなかった。
【図２２】Ｂ環およびＢ’環の柔軟性を検証するために調製されたＬａｂＡ１変異体を示す図である。Ｂ環およびＢ’環のサイズにおける変化を有する全てのラビリントペプチン誘導体（ペプチド：ＬａｂＡ１＿Ｖ５ｄｅｌ、ＬａｂＡ１＿Ｗ６ｉｎｓＶ、ＬａｂＡ１／Ａ２、ＬａｂＡ１＿Ｐ１６ｄｅｌ、ＬａｂＡ１＿Ｐ１６ｉｎｓＶ）の産生が、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析によって検出できた。
【図２３】さらなる置換を示す図である。ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ分析により、ペプチド：ＬａｂＡ１＿Ｔ１１Ｓ、ＬａｂＡ１＿Ｖ１５Ｓ、ＬａｂＡ１＿Ａ３Ｈ、ＬａｂＡ１＿Ｗ６Ｙの産生が明らかになった。ペプチド：ＬａｂＡ１＿Ｅ７Ｒ、ＬａｂＡ１＿Ｓ４Ａ、ＬａｂＡ１＿Ｓ１３Ａの産生は観察されなかった。
【図２４】Ｃ環の柔軟性を評価するために調製された変異体を示す図である。ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ分析により、ペプチド：ＬａｂＡ１＿Ｃ２０ｄｅｌ、ＬａｂＡ１＿Ｓ１ｉｎｓＣ、ＬａｂＡ１＿Ｓ１０ｉｎｓＡおよびＬａｂＡ１＿Ｃ２０ｉｎｓＡの産生が明らかになった。
【図２５】ＬａｂＡ１ハイブリッドおよびＬａｂＡ２ハイブリッドの図形表示を示す図である。ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ分析により、ラビリントペプチン・ハイブリッド：ＬａｂＡ／Ａ２およびＬａｂＡ２／Ａ１の存在が明らかになった。
【図２６】ＬａｂＡ１＿ＡＢＡ’Ｂ’ＡＢおよびＬａｂＡ１＿ＡＢＡ’Ｂ’ＡＢＡ’Ｂ’の図形表示を示す図である。ＬａｂＡ１＿ＡＢＡ’Ｂ’ＡＢの産生もＬａｂＡ１＿ＡＢＡ’Ｂ’ＡＢＡ’Ｂ’の産生も、ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ分析によって検出できなかった。
【図２７】ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおけるラビリントペプチンＡ２およびその構造的アナログの抗疼痛活性の評価を示す図である：ＬａｂＡ２（Ａ）、ＬａｂＡ２＿Ｌ１４Ａ（Ｂ）およびＬａｂＡ２＿Ｆ１５Ａ（Ｃ）についてのＩＣ５０決定。ＩＣ５０は、チャネルの５０％を遮断する物質の濃度である。
【図２８】ＬａｂＡ２＿Ｌ１４Ａの構造を示す図である。
【図２９】ＬａｂＡ２＿Ｌ１４Ａの1Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図３０Ａ】ＬａｂＡ２およびその変異体ＬａｂＡ２＿Ｌ１４ＡのＨＳＱＣスペクトルの比較を示す図である：αプロトン領域およびメチル基領域。実験条件：２８５ＫにおいてＴｒｉｓ緩衝液ｐＤ８．０。Ａ、Ｂ）ＨＳＱＣスペクトル−αエリア（Ａ：ＬａｂＡ２、Ｂ：ＬａｂＡ２＿Ｌ１４Ａ）。
【図３０Ｂ】ＬａｂＡ２およびその変異体ＬａｂＡ２＿Ｌ１４ＡのＨＳＱＣスペクトルの比較を示す図である：αプロトン領域およびメチル基領域。実験条件：２８５ＫにおいてＴｒｉｓ緩衝液ｐＤ８．０。Ａ、Ｂ）ＨＳＱＣスペクトル−αエリア（Ａ：ＬａｂＡ２、Ｂ：ＬａｂＡ２＿Ｌ１４Ａ）。
【図３０Ｃ】ＬａｂＡ２およびその変異体ＬａｂＡ２＿Ｌ１４ＡのＨＳＱＣスペクトルの比較を示す図である：αプロトン領域およびメチル基領域。実験条件：２８５ＫにおいてＴｒｉｓ緩衝液ｐＤ８．０。Ｃ、Ｄ）ＨＳＱＣスペクトル−メチル・エリア（Ｃ：ＬａｂＡ２、Ｄ：ＬａｂＡ２＿Ｌ１４Ａ）。
【図３０Ｄ】ＬａｂＡ２およびその変異体ＬａｂＡ２＿Ｌ１４ＡのＨＳＱＣスペクトルの比較を示す図である：αプロトン領域およびメチル基領域。実験条件：２８５ＫにおいてＴｒｉｓ緩衝液ｐＤ８．０。Ｃ、Ｄ）ＨＳＱＣスペクトル−メチル・エリア（Ｃ：ＬａｂＡ２、Ｄ：ＬａｂＡ２＿Ｌ１４Ａ）。
【図３１】ベクターｐＣＬＬ４の構築を示す図である。ｐＣＬＬ４は、２つの機能的な複製起点を含んでいる：プラスミドｐＡｋｉｊｌ（アクチノマヅラ・キジャニタ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ  ｋｉｊａｎｉｔａ））由来およびプラスミドｐＢＲ３２２由来。（９０）からの図面。
【図３２】ｐＫ１８ｍｏｂＸｙｌＥのマップを示す図である。ｐＫ１８ｍｏｂＸｙｌＥは、遺伝子不活化実験のためのベクターである。これは、遺伝子ｘｙｌＥをｐＫ１８ｍｏｂ２中にクローニングすることによって構築した。
【図３３】ｐＳＥＴ１５２ｅｒｍＥのマップを示す図である。ｐＳＥＴ１５２ｅｒｍＥは、バクテリオファージΦＣ３１付着部位において部位特異的に組み込み得る（９１）（９２）。
【図３４】ｅｒｍＥ*プロモーターの制御下にｌａｂ遺伝子クラスターを保有するｐＵＷＬａｂのマップを示す図である。
【図３５】Ａ）ＬａｂＡ１の部位特異的変異誘発に使用した、合成遺伝子ＳＧ２を保有するベクターｐＭＫであるｐＭＫ＿ＳＧ２のマップを示す図である。Ｂ）ＬａｂＡ２の部位特異的変異誘発に使用した、合成遺伝子ＳＧ６を保有するベクターｐＭＫであるｐＭＫ＿ＳＧ６のマップを示す図である。
【図３６Ａ】Ａ）アクチノマヅラ・ナミビエンシスから単離されたＬａｂＡ１、ｍ／ｚ１０３８．９［Ｍ＋２Ｈ］２＋のＭＳ／ＭＳを示す図である。
【図３６Ｂ】Ｂ）ストレプトマイセス・リビダンス／ｐＵＷＬａｂによって産生されたＤ−ＬａｂＡ１（ＹＥＭＥ培地中での９ｄ培養物からの上清）、ｍ／ｚ１０９６．４［Ｍ＋２Ｈ］２＋のＭＳ／ＭＳを示す図である。
【図３６Ｃ】Ｃ）ＬａｂＡ１についての計算されたおよび実測された断片質量を示す図である。
【図３６Ｄ】Ｄ）ストレプトマイセス・リビダンス／ｐＵＷＬａｂによって産生されたＤ−ＬａｂＡ１（ＹＥＭＥ培地中での９ｄ培養物からの上清）についての計算されたおよび実測された断片質量、ｍ／ｚ１０９６．４［Ｍ＋２Ｈ］２＋のＭＳ／ＭＳを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００８５】
〔実施例〕
材料：
細菌株
【表１】
2015502164.tif 000006
【００８６】
抗体
一次抗体：ラビリントペプチンＡ２およびラビリントペプチンＡ２リーダー・ペプチドに対する、ウサギにおいて産生されたポリクローナル抗体は、標準的な方法に従ってＢｉｏＧｅｎｅｓ（Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって生成された。
【００８７】
二次抗体：ヤギにおいて産生された市販の抗ウサギＩｇＧアルカリ・ホスファターゼ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｍｕｎｃｈｅｎ）。
【００８８】
材料：
【表２】
2015502164.tif 000007
【００８９】
【表３】
2015502164.tif 000008
【００９０】
【表４】
2015502164.tif 000009
【００９１】
選択マーカー：Ａｍ、アプラマイシン；Ａｐ、アンピシリン；Ｃｍ、クロラムフェニコール；Ｋｍ、カナマイシン；Ｔｈ、チオストレプトン。
【００９２】
オリゴヌクレオチドおよび合成遺伝子
全てのプライマーは、ｂｉｏｍｅｒｓ．ｎｅｔ  ＧｍｂＨ（Ｕｌｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成された。凍結乾燥したプライマーを、無菌Ｈ2Ｏｄｄ中に溶解させて、濃度１００ｐｍｏｌ／μｌを達成した。
【００９３】
【表５】
2015502164.tif 000010
【００９４】
【表６】
2015502164.tif 000011
【００９５】
【表７】
2015502164.tif 000012
【００９６】
【表８】
2015502164.tif 000013
【００９７】
【表９】
2015502164.tif 000014
【００９８】
【表１０】
2015502164.tif 000015
【００９９】
全ての合成遺伝子は、Ｇｅｎｅａｒｔ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成された。合成遺伝子の配列を以下にまとめる。
aac(3)IV
ACGCGTCGATTATCTCGAGAATGACCACTGCTGTGAGCGGTTTGCCTTGGCGGACAGGTGGCTCAAGGAGAAGAGCCTTCAGAAGGAAGGTCCAGTCGGTCATGCCTTTGCTCGGTTGATCCGCTCCCGCGACATTGTGGCGACAGCCCTCGGTCAACTGGGCCGAGATCCGTTGATCTTCCTGCATCCGCCAGAGGCGGGATGCGAAGAATGCGATGCCGCTCGCCAGTCGATTGGCTGAGCTCATGAGCGGAGAACGAGATGACGTTGGAGGGGCAAGGTCGCGCTGATTGCTGGGGCAACACGTGGAGCGGATCGGGGATTGTCTTTCTTCAGCTCGCTGATGATATGCTGACGCTCAATGCGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGGCACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGAGCTTCTAGA (配列番号25)
【０１００】
ＸｂａＩ（ＴＣＴＡＧＡ）およびＭｌｕＩ（ＡＣＧＣＧＴ）に下線を付す。変化したＰａｓＩ制限部位（ＣＣＣＴＣＧＧ）およびＥｃｏ４７ＩＩＩ制限部位（ＡＧＣＧＧＴ）に下線を付す。
【０１０１】
以下の配列において、それぞれのプレペプチド配列を太字で示す。ＰａｓＩ制限部位（ＣＣＣＴＧＧＧ）およびＥｃｏ４７ＩＩＩ制限部位（ＡＧＣＧＣＴ）に下線を付す。ｌａｂＡ１遺伝子は黒字で示し、ｌａｂＡ２遺伝子は、黒の背景で白字で示す。プロペプチド配列は太字で示す。
【化５】
2015502164.tif 000016
【０１０２】
【化６】
2015502164.tif 000017
【０１０３】
ストレプトマイセス・スキャビエリ（Ｓ．ｓｃａｂｉｅｉ）由来のＲａｍＳ２プレプロペプチド配列を小文字で示す。
【化７】
2015502164.tif 000018
【０１０４】
【化８】
2015502164.tif 000019
【０１０５】
【化９】
2015502164.tif 000020
【０１０６】
ストレプトマイセス・スキャビエリ由来のＲａｍＳ２プレペプチド配列を小文字で示す。
【化１０】
2015502164.tif 000021
【０１０７】
ストレプトマイセス・セリカラー由来のＳａｐＢプレペプチド配列を小文字で示す。
【化１１】
2015502164.tif 000022
【０１０８】
【化１２】
2015502164.tif 000023
【０１０９】
方法
標準的な分子生物学的方法を、Ｓａｍｂｒｏｏｋおよび共同研究者（１９８９）に従って使用したが、本明細書では詳細に記載しない。温度条件を特定していない場合、実験を室温で実施したことを意味する。
【０１１０】
微生物学的方法：
大腸菌の増殖条件および保存
大腸菌株を、適切な抗生物質を補充したＬＢ培地中で増殖させた。培養物を、１６０ｒｐｍで振盪しながら３７℃でインキュベートした。大腸菌を、１０％グリセリン中で−８０℃で保存した。
【０１１１】
ストレプトマイセスおよびアクチノマヅラ・ナミビエンシスの増殖条件および保存
ストレプトマイセスおよびアクチノマヅラ・ナミビエンシスを、２８℃で異なる寒天培地（ＭＳ、Ｒ２ＹＥ、Ｒ５、ＫＭ４など）上で、および１６０ｒｐｍで振盪しながら２８℃で異なる液体培地（ＹＥＭＥ、ＣＲＭ、ＫＭ４、Ｍ５２９４など）中で増殖させた。５０ｍｌの細菌培養物を、よりよい通気のためにコイルを備えた２５０ｍｌまたは３００ｍｌのフラスコ中で培養した。組換えプラスミドを含むストレプトマイセスを、アプラマイシン（２５μｇ／ｍｌまたは５０μｇ／ｍｌ）の存在下で増殖させた。接合後に調製された第１の培養物について、ストレプトマイセスをまた、ナリジクス酸（２５μｇ／ｍｌ）を用いて増殖させた。アクチノマヅラ・ナミビエンシスの培養のためには、抗生物質は使用しなかった。ストレプトマイセスならびにアクチノマヅラ・ナミビエンシスを、５％スクロースを添加した１０％グリセリン中で−８０℃で保存した。
【０１１２】
分子生物学的方法：
大腸菌からのプラスミドＤＮＡの調製
大腸菌プラスミドＤＮＡを、生産者のプロトコールに従ってＧｅｎｅＪＥＴ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用して精製した。
【０１１３】
ストレプトマイセスからのプラスミドＤＮＡの調製
ストレプトマイセスからのプラスミドＤＮＡを、Ｋｉｅｓｅｒら、２０００（１０）に記載されるプロトコールに従って、アルカリ溶解およびフェノール沈殿によって単離した。第１の工程は、総体積５００μｌのＴＥＳＬＲにおける、５ｍｌの培養物由来の菌糸体の再懸濁および３７℃で３０分間のインキュベーションである。次いで、２５０μｌのＮａＯＨ．３／ＳＤＳを添加し、この混合物を直ぐにボルテックスした。７０℃での開放チューブの１５分間のインキュベーション後、それらを３７℃に冷却する必要がある。次の工程は、８０μｌの酸フェノール／クロロホルムの添加、ボルテックスによる乳化、および１０分間の遠心分離である。ここで、上清（７００μｌ）を、５０μｌの酢酸ナトリウムおよび４５０μｌのイソプロパノールを含む新たな遠心チューブに移した。かかる混合物をボルテックスし、１０分間遠心分離した。得られた沈殿物を、７０μｌのＴＥ中にここで溶解させた。この後に、３Ｍ酢酸カリウム（１４μｌ）、酸フェノール／クロロホルム（１４μｌ）の添加、乳化およびボルテックスを行った。次いで、上部水相を、５６μｌの３Ｍ酢酸カリウムおよび６３０μｌのＴＥを含む新たなチューブに移した。その後、４６０μｌのイソプロパノールを添加し、この混合物を５分間遠心分離してペレットを得たが、このペレットは、１．２ｍｌの０℃エタノールで洗浄し、１５０μｌのＴＥ中に溶解させるべきである。１５０μｌの５Ｍ酢酸アンモニウムをＤＮＡ溶液に添加し、次いでこの溶液を混合し遠心分離した。その後、上清（ペレットは廃棄すべきである）を新たなチューブに移した。この後に、６６０μｌのエタノールの添加および１０分間の遠心分離を行った。最後に、得られたペレットを、１ｍｌの７０％エタノールで洗浄し、乾燥させ、５０μｌのＴＥ中に溶解させた。
【０１１４】
ストレプトマイセスからのゲノムＤＮＡの調製
ストレプトマイセスからのゲノムＤＮＡの調製のために、Ｋｉｅｓｅｒら、２０００（１０）に記載される塩析手順を適用した。３０ｍｌの細菌培養物を、１００ｍｌフラスコ中で、グリシン（終濃度０．５％）を含む標準的なストレプトマイセス培地（ＴＳＢ、ＣＲＭ、ＹＥＭＥなど）中で増殖させた。開始時に、７ｍｌの培養物由来の菌糸体を、１．２５ｍｌのＳＥＴ緩衝液中に再懸濁させる必要がある。次いで、２５μｌのリゾチーム溶液を添加し、かかる混合物を、３７℃で６０分間インキュベートした（最終リゾチーム濃度は２ｍｇ／ｍｌである）。次の工程は、３５μｌのプロテイナーゼＫ溶液の添加（最終プロテイナーゼ濃度は０．５ｍｇ／ｍｌである）、混合、１５０μｌの１０％ＳＤＳの添加（最終ＳＤＳ濃度は１％である）、反転による混合、および５５℃で２時間のインキュベーションである。全インキュベーション時間の間に、サンプルを時々反転させることが重要である。その後、５００μｌの５Ｍ  ＮａＣｌを添加し、このサンプルを反転により完全に混合し、３７℃に冷却した。次に、１．２５ｍｌのクロロホルムを添加した。かかる調製された混合物は、２０℃で３０分間にわたり反転により混合する必要がある。次いで、１５分間の遠心分離（２０℃で４５００×ｇ）後、上清を新たなチューブに移した。この後、０．６体積のイソプロパノールの添加が続いた。反転による３分間の混合の後、ＤＮＡを、封止したパスツール・ピペット上に巻き取り、１．２５ｍｌの７０％エタノール中でリンスし、風乾させることができた。最後に、ＤＮＡを、５５℃で１００μｌの水中に溶解させた。
【０１１５】
ＤＮＡ濃度を測定する
ＤＮＡ濃度を、λ＝２６０ｎｍでＵＶ分光光度法によって測定した（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ  ２１００  ｐｒｏ  Ｃｌａｓｓｉｃ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。サンプルを、１６回希釈した（７５μｌの水中に５μｌのサンプル）。純粋なＤＮＡは、１．８〜１．９のＡ２６０／Ａ２８０比を生じる。
【０１１６】
アガロース・ゲル電気泳動
アガロース・ゲル電気泳動を、長さによるＤＮＡ断片の混合集団の分離およびサイズの推定のために使用した。核酸分子を、電場を適用して、負に荷電した分子をアガロース・マトリックスを通って移動させることによって分離した。より短い分子はより速く移動し、より長い分子よりも遠くまで移動するが、これは、より短い分子はゲルの孔を通ってより容易に移動するからである。サンプルを、１０％のローディング緩衝液の添加によって調製した。このローディング緩衝液は、ウェルへのロードを容易にするために、サンプルに色および密度を与えた。異なるアガロース濃度を使用した：１ｋｐより小さいＤＮＡ断片については２％アガロース・ゲル、コスミドの制限消化後に取得されるＤＮＡ断片については０．８％アガロース・ゲル。全ての他の目的のために、１％アガロース・ゲルを調製した。ゲルを、ＴＡＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ／酢酸塩／ＥＤＴＡ）中で水平タンク（Ｍｉｎｉ−Ｓｕｂ  Ｃｅｌｌ  ＧＴ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ、Ｍｕｎｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において泳動した。ＤＮＡ断片の分離を、５０Ｖと９０Ｖとの間の電圧を使用することによって達成した。電気泳動後、ゲルを、エチジウム・ブロマイド浴中でインキュベートした。ＤＮＡバンドを、ＵＶ光（λ＝３１５ｎｍ）の使用によって可視化した。分子量マーカーとして、２−ｌｏｇ  ＤＮＡマーカー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ  ａｍ  Ｍａｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。
【０１１７】
アガロース・ゲルからのＤＮＡ抽出
ＤＮＡ断片を、ＦｅｒｍｅｎｔａｓのＧｅｎｅＪｅｔ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットの使用によってアガロース・ゲルから単離した。
【０１１８】
ＤＮＡの制限酵素消化
ＦｅｒｍｅｎｔａｓおよびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓの制限消化酵素を使用した。制限消化を、製造業者の推奨に従って実施した。
【０１１９】
大腸菌中へのＤＮＡの導入
大腸菌ＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２のエレクトロポレーション
大腸菌を、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を含む１０ｍｌのＬＢ培地中で３７℃で一晩増殖させた。次の日、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）および２０ｍＭ  ＭｇＳＯ4を含む１０ｍｌのＬＢ培地に、この一晩培養物由来の１００μｌの大腸菌を接種した。細菌を、約０．４のＯＤ600になるまで、１６０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で増殖させた。その後、細胞を、４，０００ｒｐｍで５分間の４℃での遠心分離によって回収し、ペレットを、１０ｍｌの氷冷１０％グリセリン中で穏やかに混合することによって再懸濁した。次いで、細胞懸濁物を再度遠心分離し、ペレットを、５ｍｌの氷冷１０％グリセリン中に再懸濁した。別の遠心分離工程後、ペレットを、残りの約１００μｌの１０％グリセリン中で再懸濁した。エレクトロポレーションのために、５０μｌのかかる取得された細胞懸濁物を、１００〜３００ｎｇのプラスミドＤＮＡと混合した。実験を、２００Ω、２５μＦおよび２，５ｋＶに設定した電力供給ユニット（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、０．２ｃｍの氷冷エレクトロポレーション・キュベットにおいて実施した。直後に、ショックを与えた細胞に、１ｍｌの氷冷ＬＢを添加した。細菌を、３７℃で１時間振盪しながらインキュベートし、次いでそれらを、アプラマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天上に広げた。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。
【０１２０】
化学的形質転換
大腸菌ストックは、氷上で解凍すべきである。次いで、アリコート細菌懸濁物（チューブ当たり５０μｌまたは１００μｌ）に、１〜５μｌのＤＮＡミックスを添加し（例えば、単離されたプラスミド、ライゲーション・ミックス）、細菌を氷上で３０分間インキュベートした。その後、ヒート・ショックを行った：サンプルを、４２℃で２分間インキュベートした。次いで、サンプルを直ぐに氷上に移した。１０分後、１ｍｌのＬＢ培地を添加した。サンプルを、１６０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。最後の工程は、適切な抗生物質を含む寒天プレート上での細菌懸濁物のプレーティングである。プレートを、３７℃で一晩インキュベートした。
【０１２１】
ストレプトマイセスおよびアクチノマヅラ・ナミビエンシス中へのＤＮＡの導入
プロトプラストの調製および形質転換
プロトプラストの調製
２５ｍｌの培地（ストレプトマイセスについてＹＥＭＥおよびＴＳＢ；アクチノマヅラ・ナミビエンシスについてＫＭ４およびＣＲＭ；０．５％のグリシンを含む）に、クリオストック（ｃｒｙｏｓｔｏｃｋ）または寒天プレート培養物由来の細菌を接種し、数日間増殖させた。培養物が適切な増殖相に達した時点で、２０ｍｌの培養物を遠心分離すべきである（２，０００ｒｐｍ、１０分間）。次いで、ペレットを、１５ｍｌの１０．３％スクロース中に再懸濁し、上記と同じ条件で遠心器においてスピンした。この工程を２回繰り返した。遠心分離工程後、菌糸体を、ストレプトマイセスについては１〜２ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含む４ｍｌのＰ緩衝液またはＬ緩衝液中に再懸濁し、アクチノマヅラ・ナミビエンシスについてはＰ緩衝液（一般に使用される１０％溶液の代わりに、２０％のショ糖を含む）中に可溶化されたセロシル（ｃｅｌｌｏｓｙｌ）（１ｍｇ／ｍｌ）とリゾチーム（０，５ｍｇ／ｍｌ）との混合物中に再懸濁した。かかる懸濁物を、プロトプラストが顕微鏡下で観察されるようになるまで、２８℃、３０℃または３７℃のいずれかでインキュベートした。後に、細胞を、３回吸い込み吸い出し、さらに１５分間インキュベートした。この後、Ｐ緩衝液の添加が続き、再度細胞を吸い込み吸い出し、さらに１５分間インキュベートした。次に、プロトプラストを、原綿を通して濾過し（フィルター・チューブを使用する）、プラスチック・チューブに移し、穏やかに遠心分離した（１，０００ｇ、７分間）。ここで、上清を廃棄し、プロトプラストを１ｍｌのＰ緩衝液中に懸濁した。かかる調製されたプロトプラストは、凍結されまたは直接的に形質転換され得る。
【０１２２】
プロトプラストのＰＥＧ補助された形質転換
１回の形質転換につき、５０μｌのプロトプラスト・サンプルを使用すべきである。形質転換実験の直前にプロトプラストをスピン・ダウンすることが推奨される。まず、５μｌのＤＮＡ溶液をプロトプラストに添加し、チューブをタッピングすることによって直ぐに混合すべきである。次に、２００μｌのＴ緩衝液（*）を添加し、ピペッティングで上下させて混合した。次いで、プロトプラストを、２枚の乾燥Ｒ２ＹＥプレート上に広げ、２８℃でインキュベートした。次の日（１４〜２０時間後）、プレートを選択のためにオーバーレイした。（*）緩衝液Ｔの調製のために、２つの異なるＰＥＧを使用した：ＰＥＧ  １０００（Ｒｏｔｈ）およびＰＥＧ  ３３５０（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）。
【０１２３】
大腸菌からの接合
最初に、大腸菌ＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２のコンピテント細胞は、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）の存在下で調製されることが必要である。これらの細胞を、エレクトロポレーションによってｏｒｉＴ含有ベクターで形質転換した。得られたコロニーは、それぞれカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）およびアプラマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含む１０ｍｌのＬＢ培地中に接種し、一晩増殖させるべきである。次の日、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）、アプラマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含む１０ｍｌのＬＢ培地（１回の接合のため）に、一晩培養物（この一晩培養物は１：１００希釈されている）を接種した。細菌を、０．４〜０．６のＯＤ600になるまで３７℃で増殖させた。次いで、大腸菌細胞を、１０ｍｌのＬＢ培地で２回洗浄した。遠心分離工程後、上清を廃棄し、ペレットを、５００μｌのＬＢ培地中に再懸濁した。大腸菌細胞を洗浄しながら、各接合のために、およそ１０8のストレプトマイセス胞子を、５００μｌのＬＢ培地に添加し、かかる懸濁物を、５０℃で１０分間ヒート・ショックにかけた。（菌糸体断片を接合に使用する場合、細菌を、３ｍｌの２０％グリセリンを使用して、ＭＳ寒天上で増殖している３〜４ｄ齢の培養物から収集した。およそ０．５ｍｌの菌糸体断片を各接合に使用した。菌糸体断片の場合、ヒート・ショックは省略される。）その後、５００μｌの大腸菌細胞を、５００μｌのヒート・ショックにかけた胞子または菌糸体断片に添加した。混合後、ほとんどの上清を注ぎ捨て、ペレットを残留培地中に再懸濁した。ここで、細菌懸濁物をＭＳ寒天＋１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2上にプレートした。このプレートを、２８℃で１６〜２０時間インキュベートした。次の日、このプレートに、１ｍｌの水、または０．５ｍｇのナリジクス酸および１ｍｇのアプラマイシンを含む４ｍｌの軟寒天をオーバーレイした。インキュベーションを、潜在的な接合完了体がそのプレート上で観察されるまで、次の数日間２８℃で継続した。
【０１２４】
アクチノマヅラ・ナミビエンシスを用いた直接的形質転換の試み
実験を、ＭａｄｏｎおよびＨｕｔｔｅｒ、１９９１（１１）に記載されるプロトコールに従って実施した。
【０１２５】
アクチノマヅラ・ナミビエンシス菌糸体の直接的形質転換
ＫＭ４培地中のアクチノマヅラ・ナミビエンシス・プレ培養物１００ｍｌに、ＫＭ４寒天プレート上で増殖している細菌を接種し、振盪しながら（１６０ｒｐｍ）２８℃で１日間インキュベートした。次の日、１００ｍｌのＫＭ４培地にプレ培養物を接種し、オービタル・シェーカー中で１６０ｒｐｍで２８℃で３日間インキュベートした。培養物のアリコート（１０ｍｌ）を、１５ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブ中で５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。その後、菌糸体（１つのＦａｌｃｏｎチューブから）を、４ｍｌの２０％グリセリン水溶液中に再懸濁し、−２８℃で保存するか、または形質転換実験に直接使用した。形質転換の直前に、菌糸体懸濁物を解凍し、２５ｍｌのＴＥ緩衝液中で３回洗浄した。次いで、ペレットを、０．６ｍｌのＴＥ緩衝液中に再懸濁した。菌糸体および形質転換混合物は、室温で調製すべきである。１００μｌのＴＥ菌糸体懸濁物に、以下を添加した：１０μｌの０．２Ｍ  ＭｇＣｌ2、６０μｌの４．１７Ｍ  ＣｓＣｌ、４μｌの仔ウシ胸腺ＤＮＡ、最大１０μｌのプラスミドＤＮＡ（ｐＳＥＴ１５２：９６ｎｇ、３２０ｎｇ；ｐＵＷＬｏｒｉＴ：１１７ｎｇ、３９０ｎｇ）および１００μｌの最終体積になるまでのＴＥ緩衝液。この後、ＴＥ緩衝液中７０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ−３３５０を２００μｌ添加した。各構成要素を添加した後、この混合物を完全に混合した。この形質転換混合物を、２８℃で９０分間インキュベートし、次いで、４２℃で５分間インキュベートし、最後に室温に冷却した。形質転換混合物の全内容物を、３ｍｌのＲ２Ｌオーバーレイ培地に直接添加し、Ｓ２７Ｍ寒天プレート上にプレートした。プレートを、層流キャビネットにおける１５分間のインキュベーションによって乾燥させた。２８℃で１８時間のインキュベーション後、各プレートに、１ｍｇのアプラマイシンを含む１．５ｍｌの水をオーバーレイした。新しいＳ２７Ｍ寒天プレートを使用することが重要である。好ましくは、形質転換の当日に寒天プレートを調製し、層流キャビネットにおいて３時間乾燥させる。
【０１２６】
アクチノマヅラ・ナミビエンシス・プロトプラストの直接的形質転換
節４．２．３．１に記載された方法で調製されたプロトプラストを使用した。Ｐ緩衝液中の再凍結されたプロトプラスト１００μｌに、以下を添加した：１０μｌの０．２Ｍ  ＭｇＣｌ2、６０μｌの４．１７Ｍ  ＣｓＣｌ、４μｌの仔ウシ胸腺ＤＮＡ、最大１０μｌのプラスミドＤＮＡ（９６ｎｇ、１６０ｎｇのｐＳＥＴ１５２および１１７ｎｇ、１９５ｎｇのｐＵＷＬｏｒｉＴ）および１００μｌの最終体積になるまでのＴＥ緩衝液。この後、ＴＥ緩衝液中７０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧを２００μｌ添加した。各構成要素を添加した後、この混合物を完全に混合した。この形質転換混合物を、２８℃で４０分間インキュベートし、次いで、４２℃で５分間インキュベートし、最後に室温に冷却した。形質転換混合物の全内容物を、３ｍｌのＲ２Ｌオーバーレイ培地に直接添加し、Ｓ２７Ｍ寒天プレート上にプレートした。プレートを、層流キャビネットにおける１５分間のインキュベーションによって乾燥させた。２８℃で１８時間のインキュベーション後、各プレートに、１ｍｇのアプラマイシンを含む１．５ｍｌの水をオーバーレイした。
【０１２７】
菌糸体のエレクトロポレーション
僅かに改変したプロトコールを、ストレプトマイセス・ラマウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒａｍｏｕｓ）について以前に刊行されたように使用した（１０）。
【０１２８】
アクチノマヅラ・ナミビエンシスのプレ培養物に、ＫＭ４寒天プレート由来の細菌を接種し、２８℃で振盪しながら（１６０ｒｐｍ）１日間ＫＭ４培地中でインキュベートした。次の日、３つの異なる培養物に、５ｍｌのプレ培養物を接種した：５０ｍｌのＣＲＭ培地、グリシン（終濃度０．５％）を含むＣＲＭ培地５０ｍｌ、１００ｍｌのＫＭ４培地。これらの培養物を、オービタル・シェーカー中で１６０ｒｐｍで４日間２８℃でインキュベートした。次いで、菌糸体を、遠心分離（４℃、１０，０００ｒｐｍ）によって収集し、細胞を、５０ｍｌの氷冷１０．３２％スクロース中に再懸濁し、再遠心分離した。この工程を２回繰り返した。その後、菌糸体を、１５ｍｇのセロシルを含む１５％グリセリン４ｍｌ中に再懸濁した。３７℃で３時間のインキュベーション後、この菌糸体を、７ｍｌの氷冷１５％グリセリンで２回洗浄した。後に、ペレットを、２ｍｌの３０％ＰＥＧ  １０００、１０％グリセリン、５％スクロース中に再懸濁した。エレクトロポレーションのために、プラスミドＤＮＡを含むかかる懸濁物５０μｌを、ピペッティングによって混合した（９６ｎｇおよび１９２ｎｇのｐＳＥＴ１５２；１１７ｎｇおよび２３４ｎｇのｐＵＷＬｏｒｉＴ）。サンプルは氷上に置くべきである。エレクトロポレーションを、Ｐｕｌｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（並列抵抗４００Ω、２５μＦキャパシタ）に接続したＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）からの２ｋＶの電気パルスを使用して、０．２ｃｍの氷冷エレクトロポレーション・キュベットにおいて実施した。パルスした菌糸体を、１ｍｌの氷冷ＫＭ４培地で直後に希釈し、これを、２８℃で振盪しながら３時間インキュベートした。細菌希釈物を、ＫＭ４培地上にプレートした。次の日、各プレートに、１ｍｇのアプラマイシンを含む１ｍｌの水をオーバーレイした。
【０１２９】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
これらの研究の間、２種のＤＮＡポリメラーゼを使用した：Ｔａｑ（Ｑｉａｇｅｎ）およびＨｅｒｃｕｌａｓｅ  ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、誤取り込みを引き起こし得る３’から５’のエキソヌクレアーゼ活性を有さないので、これは、コロニーＰＣＲ、ＰＣＲによる陽性形質転換体の検証、およびＤＩＧ標識したＤＮＡプローブの調製のためにのみ使用した。部位特異的変異誘発、クローニングおよび配列決定に使用する断片の増幅などの他の全ての適用のために、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ  ＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した。標準的な反応組成物およびサーマル・サイクラー条件を以下にまとめる：
【０１３０】
【表１１】
2015502164.tif 000024
【０１３１】
【表１２】
2015502164.tif 000025
【０１３２】
部位特異的変異誘発
ラビリントペプチン変異体を、部位特異的変異誘発によって調製した。全ての実験について、僅かに改変した、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）が開発したＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
Ｓｙｓｔｅｍ（ＱＣＭ）である以前に記載された手順（１２）を使用した。この二段階手順は、点変異、欠失および目的の配列への挿入の効率的な導入を可能にする。プライマーの設計のために、プログラムＰｒｉｍｅｒＸを使用した。この手順は、２つの段階からなる。段階１では、２つの伸長反応を、別々のチューブ中で実施した；１つはフォワード・プライマーを含み、もう１つはリバース・プライマーを含む。引き続いて、これら２つの反応を混合し、１マイクロリットルのポリメラーゼを添加し、別のＰＣＲを実施した（第２のＰＣＲ）。ＰＣＲ後、１μｌのＤｐｎＩを添加し、３７℃で１時間インキュベートした。５マイクロリットルの最終ＰＣＲ産物を、５０μｌのＤＨ５α細胞中に形質転換し、適切な体積を、アンピシリンまたはカナマイシンのいずれかを含むＬＢ寒天プレート上に広げた。
【０１３３】
【表１３】
2015502164.tif 000026
【０１３４】
クローニング実験
ＤＮＡ断片のライゲーション
ＤＮＡ断片のライゲーションのために、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＦｅｒｍｅｎｔａｓまたはＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎ  ＢｉｏＬａｂｓのもの）を使用した。実施した反応のほとんどにおいて、挿入物対ベクターの分子比は、３：１または５：１であった。反応混合物を、１６℃で２〜１６時間インキュベートした。
【０１３５】
ＬＩＣ（ライゲーション非依存的クローニング）
全てのＬＩＣ実験を、Ｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．ａ  Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）のために確立されたプロトコールに従って実施した。ＬＩＣは、分子クローニングの１形態であり（１３〜１４）、線状化ベクター中へのＰＣＲ断片または複数の断片の方向性のクローニングを可能にする。重要なことに、ＰＣＲ断片のさらなる処理（例えば、制限消化、リン酸化）は必要とされない。この方法の背後に存在する主要な概念は、発現ベクター中の非常に特異的な１０〜１５塩基の単一オーバーハングを作り出すため、およびＰＣＲ産物中の相補的オーバーハングもまた作り出すための、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼの３’→５’活性の使用である。ＰＣＲ産物中の１５ｂｐの重複は、所望の配列の増幅のためのプライマーを設計することによって、工学的に操作され得る。挿入物（ＰＣＲ産物）とベクターとのアニーリングを、ＤＮＡ断片を単に混合することによって、リガーゼの非存在下で実施する。
【０１３６】
【表１４】
2015502164.tif 000027
【０１３７】
【表１５】
2015502164.tif 000028
【０１３８】
サザン・ブロッティング
サザン・ブロットは、ＤＮＡサンプル中の特異的ＤＮＡ配列の検出のための方法である。サザン・ブロッティングは、電気泳動分離されたＤＮＡ断片の、フィルター・メンブレンへの転移と、プローブ・ハイブリダイゼーションによる引き続く断片検出とを組み合わせる。これらの研究において、サザン・ブロッティングを使用して、ストレプトマイセスのゲノムＤＮＡへのコスミドＭ１１０４の組込みを証明した。まさに最初の工程は、ストレプトマイセス野生型株（陰性コントロール）およびコスミドＭ１１０４保有ストレプトマイセスのゲノムＤＮＡの制限消化であった。陽性コントロールとして、大腸菌ＤＨ５α／コスミドＭ１１０４から単離したコスミドＭ１１０４を使用した。コスミドＭ１１０４ならびにストレプトマイセス・リビダンスおよびストレプトマイセス・セリカラーのゲノムＤＮＡを、ＢａｍＨＩで断片化した。ストレプトマイセス・アルブスのゲノムＤＮＡの消化のために、酵素ＳａｃＩを使用した。取得されたＤＮＡ断片を、アガロース・ゲルでの電気泳動（６０Ｖ、９０分間）によって分離した。ＤＮＡ断片のサイズを推定するために、ＤＩＧ標識したＤＮＡ分子量マーカーＶＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）を使用した。このゲルを、エチジウム・ブロマイドによって染色し、写真をとった後、水で洗い流した。その後、このゲルを、４℃で振盪しながら異なる溶液中でインキュベートした：最初にサザンＩにおいて２０分間、次いでサザンＩＩにおいて３０分間、最後にサザンＩＩＩにおいて３０分間。かかる調製されたＤＮＡを、ナイロン・メンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）上で一晩転移させた。これを行うために、ナイロン・メンブレンのシートを、ゲルの上部に置いた。メンブレンおよびゲルの上部にペーパー・タオルのスタックおよび重し（５００ｇ）を置くことによって、圧力をゲルに均等にかけ、ゲルとメンブレンとの間の良好かつ均等な接触を確実にした。２０×ＳＳＣ緩衝液を使用して、封止を確実にし、ゲルの乾燥を防止した。次いで、高い水ポテンシャルの領域から低い水ポテンシャルの領域への毛細管作用（ティッシュ・ペーパー）によって転移された緩衝液を、ゲルからメンブレン上へとＤＮＡを移動させるために使用した；イオン交換相互作用は、ＤＮＡの負の荷電およびメンブレンの正の荷電に起因して、ＤＮＡをメンブレンに結合させた。次の日、このメンブレンをＵＶ照射（２分間）に曝露させ、転移されたＤＮＡをメンブレンに恒久的に付着させた。メンブレンを、６５℃で４時間、１００ｍｌのＣｈｕｒｃｈ  Ｂｕｆｆｅｒ（６５℃に予め加熱した）と共にインキュベートした。次いで、Ｃｈｕｒｃｈ  Ｂｕｆｆｅｒを除去し、メンブレンをハイブリダイゼーション・プローブに曝露させた。プローブとして、ＤＩＧ標識したコスミドＭ１１０４を使用した（以下を参照のこと）。ジゴキシゲニンの使用により、アルカリ・ホスファターゼ・コンジュゲート化抗体を用いた呈色反応によるプローブ−標的ハイブリッドの検出の可能性が生じた。アルカリ・ホスファターゼの基質として、ＮＢＴ／ＢＣＩＰミックスを使用した。まず、コスミドＭ１１０４（８μｇ）を、制限酵素ＭｌｙＩで消化して、８００〜１００���ｂｐのサイズを有する断片を取得した。制限消化後、４μｌの水を添加し、ＤＮＡ断片を、１００℃で１０分間のインキュベーションによって変性させ、後に氷上で冷却した。次いで、ＤＩＧ標識したヌクレオチドを、Ｋｌｅｎｏｗ酵素を含む４μｌのＤＩＧ  Ｈｉｇｈ  Ｐｒｉｍｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｒｏｃｈｅ）、ランダム化オリゴヌクレオチドおよびＤＩＧ−１１−ｄＵＴＰと混合することによって、コスミドＭ１１０４配列に取り込んだ。かかるミックスを、３７℃で１６時間インキュベートした。その後、標識されたＤＮＡの濃度を、ブロット・メンブレンによって計算し、標準と比較した。使用の直前に、プローブを変性させ（１００℃、５分間）、５０ｍｌのＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ）に添加して、２５ｎｇ／ｍｌの終濃度にした。６５℃で一晩のインキュベーション後、プローブ溶液を除去し、メンブレンを、最初に２×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳと共に１５分間（２回）、次に０．５×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳと共に１５分間（２回）、振盪しながらインキュベートした。その後、このメンブレンを、５０ｍｌの洗浄緩衝液で５分間洗浄し、その後、２０ｍｌの抗ＤＩＧ抗体溶液中で３０分間インキュベートした。次いで、このメンブレンを、１００ｍｌの洗浄緩衝液で２回洗浄した（各１５分間）。その後、このメンブレンを、１００ｍｌの検出緩衝液と共に５分間インキュベートし、次いで、２００μｌのＮＢＴ／ＢＣＩＰを含む検出緩衝液のさらなる一部分（１０ｍｌ）を添加した。このメンブレンを、紫色が現れるまで、基質と共にインキュベートした。この反応を、水で洗浄することによって停止させた。
【０１３９】
Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン・ブロッティング
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動）は、電気泳動移動度（ポリペプチド鎖の長さまたは分子量の関数）に従ってタンパク質を分離するために広く使用される技術である。ＳＤＳの結合に起因して単位質量当たり同一の荷電を有するサンプルのＳＤＳゲル電気泳動は、サイズによる分画を生じる。この方法を、異種株におけるＬａｂＡ２の検出のために使用した。ＬａｂＡ２は小さいペプチド（２．１ｋＤａ）であるので、評判が良く一般に使用されるグリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ系の使用によって適切な分離を達成することは不可能であった。この状況において、ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ（変性条件下）を、Ｓｃｈａｇｇｅｒおよびｖｏｎ  Ｊａｇｏｗ、１９８７（１５）に記載されるプロトコールに従って実施した。サンプルを、サンプル・ローディング緩衝液中での寒天プレート抽出物または液体細胞培養物由来の上清およびペレットのいずれかのインキュベーション（１：１の比）によって調製した。次いで、サンプルを、９５℃で５分間加熱し、ＲＴに冷却した。濃縮ゲルおよび分離ゲルを、それぞれゲル当たり１５ｍＡおよび２０ｍＡの一定の電流下で泳動した。タンパク質サイズを推定するために、ＰａｇｅＲｕｌｅｒ  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用した。
【０１４０】
【表１６】
2015502164.tif 000029
【０１４１】
ゲル電気泳動によるタンパク質の分離後、半乾燥ウエスタン・ブロットを実施した。ウエスタン・ブロッティング実験の間に、タンパク質をメンブレンに転移させ、それらを、標的タンパク質に対して特異的な抗体を使用してプローブした。まず、タンパク質およびペプチドを、ゲルから、ニトロセルロース製のメンブレン（Ｗｈａｔｍａｎ）上に移動させた。このメンブレンをゲルの上部に置き、濾紙のスタックをその上部に置いた。全スタックを、毛細管作用によって濾紙を上がって移動する緩衝溶液中に置いて、濾紙にタンパク質をもたらした。この「ブロッティング」プロセスの結果として、タンパク質は、検出のために薄い表面層上に曝露された。ＬａｂＡ２は小さいペプチドであり、標準的な転移条件を使用した場合にはメンブレンを通り抜け得るので、転移工程（２５分間、５０ｍＡ）を最適化する必要があった。非特異的結合の遮断を、ブロッキング緩衝液中にメンブレンを１時間置くことによって達成した。その後、メンブレンを、１％ＢＳＡおよび一次抗体を含むＴＮＴ緩衝液３０ｍｌ中で、４℃で一晩インキュベートした。成熟ＬａｂＡ２またはＬａｂＡ２リーダー・ペプチドに対するポリクローナル抗体を使用した。異なる濃度の抗体を試験したが、これら両方についての最良の結果は、抗体を１：２５００希釈した時に取得された。次の日、メンブレンを、１％ＢＳＡを含むＴＮＴ緩衝液３０ｍｌで３回洗浄した（各回１０分間）。洗浄する工程の後、メンブレンを、１％ＢＳＡおよび６μｌの二次抗体を含むＴＮＴ緩衝液３０ｍｌ中で２時間インキュベートした。二次抗体として、市販の抗ウサギＩｇＧアルカリ・ホスファターゼ抗体を使用した。次いで、メンブレンを、３０ｍｌのＴＮＴ緩衝液で３回洗浄し（各回１０分間）、着色沈殿物が観察されるまで、検出溶液と共にインキュベートした。ブロットの発色を、可溶性色素を水によって洗浄して除くことによって停止させた。
【０１４２】
分析方法：
ＭＳ分析のためのサンプル調製
固体寒天培養物からのサンプル調製
固体培地上で増殖させた細菌について、寒天の小片を切断し（ほぼ１ｃｍ2）、３０分間の超音波処理によって、５００μｌのメタノールまたはメタノール：アセトン（１：１）を用いて抽出した。その後、サンプルを遠心分離し、可溶性画分をＭＳ分析に使用した。プレート全体の内容物が抽出された時点で、１５ｍｌのメタノールまたはメタノール：アセトン（１：１）を使用した。
【０１４３】
液体培養物からのサンプル調製
第１の工程は、上清からの細菌細胞の分離であった。この上清を、ＭＳ測定に直接使用したか、またはメタノール中に事前に希釈した（１：１）。菌糸体を、メタノールまたはメタノール：アセトン（１：１）で抽出し、３０分間超音波処理し、遠心分離した。可溶性画分をＭＳ分析に使用した。菌糸体抽出に使用した溶媒の量は、ペレットの重量に依存した。
【０１４４】
ＳＰＥ（固相抽出）
いくつかのサンプルについて、ＳＰＥを実施した。毎回、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−ＮａｇｅｌのＣｈｒｏｍａｂｏｎｄ  Ｃ１８カートリッジ（１ｍｌ／１００ｍｇ）を使用した。ＳＰＥ手順の条件を以下のようにまとめる：
【０１４５】
【表１７】
2015502164.tif 000030
【０１４６】
ラビリントペプチン・バリアントの質量分析
ＨＰＬＣ−ＥＳＩ
ラビリントペプチンを、ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳの使用によって検出した。ＬＣ−ＭＳシステムを、ＱＴＲＡＰ  ２０００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）またはＱ−Ｔｏｆ  ＩＩ（Ｔｈｅ  Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）のいずれかに連結させた１１００  Ｓｅｒｉｅｓ  ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ）で構成した。勾配の予定表を以下に示す：
【０１４７】
【表１８】
2015502164.tif 000031
【０１４８】
【表１９】
2015502164.tif 000032
【０１４９】
ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ
Ｏｒｂｉｔｒａｐは、質量スペクトルを取得するための、高速フーリエ変換（ＦＦＴ）を使用する静電型イオン・トラップである。これは、偽陽性ペプチド同定を顕著に低減させる、高い質量精度（２〜５ｐｐｍ）および質量分解能（１５０，０００）を提供する。ＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による測定後に、質量を取得した。勾配の予定表を以下に示す：
【表２０】
2015502164.tif 000033
【０１５０】
ＭＳ／ＭＳ
これらの研究において、ＭＳ／ＭＳ実験を使用して、異種株ストレプトマイセス・リビダンス／ｐＵＷＬａｂから取得されたラビリントペプチンを、天然の産生体アクチノマヅラ・ナミビエンシスから単離したラビリントペプチンと比較した。より良い断片化を取得するために、ＬａｂＡ１の環Ｃ中のジスルフィド架橋を破壊した。サンプルを、ＮａＨＣＯ3（２０ｍＭ）およびＤＴＴ（０．５Ｍ）溶液と共にインキュベートした。かかる混合物を、５０℃で１時間インキュベートした。遠心分離後、可溶性画分は、ＭＳ／ＭＳ実験に使用する準備ができていた。実験を、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２６０  ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に連結されたＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｒｅｍｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して記録した。クロマトグラフィー分離のために、２０分間で５％から１００％までのＡＣＮ＋０．１％ＨＣＯＯＨ（溶媒Ｂ）の線形溶媒勾配と共に、Ｖｙｄａｃ  ２１８Ｍ  Ｃ１８  ５ｕ、１５０ｍｍ×２．１ｍｍカラム（Ｇｒａｃｅ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＵＳＡ）を使用した。溶媒Ａは水（０．１％ＨＣＯＯＨ）であった。ＭＳ／ＭＳスペクトルを、ＨＣＤセルにおける断片化を用いてＦＴＭＳモードで記録した（２３％の正規化された衝突エネルギーを使用した）。
【０１５１】
〔実施例１〕
アクチノマヅラ・ナミビエンシスにおけるＤＮＡの導入
これは、ラビリントペプチン・バリアントの生成のためのプロトコールを確立することを目的とした。全合成は、分取量のラビリントペプチンを生成するために実行可能なアプローチではないので、生物学的アプローチを選択した。最初に、アクチノマヅラ・ナミビエンシス・ゲノムの変異を、ラビリントペプチンの多様性の生成を可能にするように計画した。この戦略を選択するための重要な議論は、ランチビオティックの化学合成が非常に挑戦的であり、産業的に実行困難なままであるという事実に基づいた。例えば、最も研究されたランチビオティックであるナイシンについてさえ、商業的生産は、その天然の産生体（ラクトコッカス・ラクティス）を使用した生合成に依存するが、その化学合成は、以前にも記載されている（１６）。
【０１５２】
アクチノマヅラは、稀な放線菌の中で最も優勢な属に属する（１７）。これが、この属が薬理学的に活性な化合物のためのスクリーニング・プログラムにおける最も重要な標的の１つである理由である。しかし、他の放線菌株とは対照的に、多用途の遺伝子操作系の欠如に主に基づいて、遺伝子発現の基本的側面について入手可能な情報はほとんどない。これに関して、適切なクローニング・ベクターおよび形質転換方法の欠如は、アクチノマヅラを用いた遺伝子研究に負の影響を与える。特定の放線菌における生合成遺伝子の分子分析では、異なる形質転換系が報告されている（例えば、ポリエチレン・グリコール誘導されたプロトプラスト形質転換、エレクトロポレーションによる形質転換および直接的形質転換）。示された研究において、ストレプトマイセスのための精巧な方法を使用して、アクチノマヅラ・ナミビエンシスへのＤＮＡ転移の方法を確立した。この選択は、アクチノマヅラおよびストレプトマイセスの両方が放線菌に属するという事実に基づいており、ストレプトマイセスにおける遺伝子操作の方法は、非常に十分に記載されている。
【０１５３】
【表２１】
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【０１５４】
プラスミド
試験した８つ全ての抗生物質のうち、アクチノマヅラ・ナミビエンシスは、アプラマイシン（５０μｇ／ｍｌ）に対してのみ感受性であったので、アプラマイシン耐性遺伝子を、本研究において使用したベクターについての選択可能マーカーとして使用した。最初に、ＤＮＡがアクチノマヅラ・ナミビエンシス中に導入され得る方法を確立するために、ストレプトマイセス株について典型的なクローニング・ベクターを使用した。ストレプトマイセスにおいて自己複製できるプラスミドｐＵＷＬｏｒｉＴおよびバクテリオファージΦＣ３１付着部位において部位特異的に組み込み得るプラスミドｐＳＥＴ１５２（１８）（７）を使用した。アクチノマヅラ・ナミビエンシスにおけるΦＣ３１付着部位の存在を証明するために、ＰＣＲ実験を実施した（プライマー：ａｔｔＢ＿Ｆｏｒ（５’−ＣＧＧＴＣＴＣＧＡＡＧＣＣＧＣＧＧＴＧＣ−３’）およびａｔｔＢ＿Ｒｅｖ（５’−ＧＣＣＣＧＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＣＧＡＧ−３’）、予測されるＰＣＲ産物：２６０ｂｐ）。アクチノマヅラスとストレプトマイセスとは関連しているものの、ストレプトマイセスの複製起点（ｏｒｉ）は、アクチノマヅラ・ナミビエンシスには認識されない可能性がなお存在する（９）。類似の困難性の記載は、文献（１７）中に見出すことができる。これは、アクチノマヅラ株のレプリコンを保有するベクターの使用を導いた：ｐＳＥＴｅｒｍＥΔＨｉｎｄＩＩＩ＿ｏｒｉＣＬＬ４、ｐＫ１８ｍｏｂＸｙｌＥ＿ｏｒｉｐＣＬＬ４およびｐＣＬＬ４＿ｏｒｉ＿ａｐｒａ。ＬａｂＫＣ改変酵素をコードする断片を有する非複製プラスミドｐＫ１８ｍｏｂ２もまた、アクチノマヅラ・ナミビエンシスの形質転換に使用した。
【０１５５】
ベクターｐＫ１８ｍｏｂ２＿ｌａｂＫＣを生成するために、ｌａｂＫＣ遺伝子の断片を、プライマーＳＴＫ＿ＲＴＰＣＲ＿ｆｗおよびＳＴＫ＿ＲＴＰＣＲ＿ｒｖを用いて増幅して、１５４７ｂｐ長のＰＣＲ断片を取得した。ＰＣＲ産物を、ベクターｐＤｒｉｖｅ中にクローニングして、ｐＤｒｉｖｅ＿ｌａｂＫＣを取得した。ｐＤｒｉｖｅ＿ｌａｂＫＣをＥｃｏＲＩで切断し、ｌａｂＫＣ含有断片をベクターｐＫ１８ｍｏｂ２にクローニングした。
【０１５６】
ベクターｐＣＬＬ４は、２つの機能的複製起点を含む（９）。１つはプラスミドｐＡｋｉｊｌ（アクチノマヅラ・キジャニタＡＴＣＣ  ３１５８８から単離された）から供給され、もう１つはプラスミドｐＢＲ３２２（大腸菌ＤＨ１０Ｂから精製された）から供給される。ｐＣＬＬ４は、大腸菌において複製可能であり（アンピシリンに対する耐性を提供する）、アンピシリンに対する耐性の発現が可能であり、かつストレプトマイセス・リビダンスにおいて複製可能であり、チオストレプトンに対する耐性の発現が可能であった。ｐＣＣＬ４配列に関する情報の欠如が、このベクターの使用を困難にしている。さらに、上述のように、アクチノマヅラ・ナミビエンシスは、チオストレプトンに対して感受性ではない。３つの構築物を調製して、アプラマイシン耐性遺伝子と共に、アクチノマヅラ属由来の複製起点の使用を可能にした：ｐＳＥＴｅｒｍＥΔＨｉｎｄＩＩＩ＿ｏｒｉＣＬＬ４、ｐＫ１８ｍｏｂＸｙｌＥ＿ｏｒｉｐＣＬＬ４およびｐＣＬＬ４＿ｏｒｉ＿ａｐｒａ。
【０１５７】
ｐＳＥＴｅｒｍＥΔＨｉｎｄＩＩＩ＿ｏｒｉＣＬＬ４およびｐＫ１８ｍｏｂＸｙｌＥ＿ｏｒｉｐＣＬＬ４を構築するために、プラスミドｐＵＣ１８およびｐＣＬＬ４をＫｐｎＩで消化した。次いで、ｐＣＬＬ４由来の０．９ｋｂｐ断片をｐＵＣ１８中にクローニングして、ｐＵＣ１８＿ｏｒｉｐＣＬＬ４を得た。ｐＵＣ１８＿ｏｒｉｐＣＬＬ４を、引き続きＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化して、予め同じ制限酵素で消化したベクターｐＳＥＴｅｒｍＥΔＨｉｎｄＩＩＩおよびｐＫ１８ｍｏｂＸｙｌＥにクローニングして、それぞれｐＳＥＴｅｒｍＥΔＨｉｎｄＩＩＩ＿ｏｒｉＣＬＬ４およびｐＫ１８ｍｏｂＸｙｌＥ＿ｏｒｉｐＣＬＬ４を取得した。
【０１５８】
ｏｒｉＴおよびアプラマイシン耐性遺伝子を含む断片を、ＥｃｏＲＩ制限部位およびＰｓｔＩ制限部位に対してクローニングすることによって、ベクターｐＣＬＬ４＿ｏｒｉ＿ａｐｒａを調製した。この断片を、プライマーｐＫ１８ｍｏｂ＿ＥｃｏＲＩ＿ｆｏｒ（５’−ＣＡＴＣＴＣＧＡＡＴＴＣＣＧＣＴＣＡＴＧＡＧＣＴＣＡＧ−３’）およびｐＫ１８ｍｏｂ＿ＥｃｏＲＩ＿ｒｅｖ（５’−ＡＧＴＴＡＴＣＧＡＧＡＴＣＴＧＣＡＧＧＡＧＣＴＣＴＴＴＧＧ−３’）を用いてＰＣＲによって増幅した。次いで、ｐＣＬＬ４＿ｏｒｉ＿ａｐｒａを、ＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２中に形質転換し、ストレプトマイセス・リビダンスとの接合に使用した。この実験により、ｐＣＬＬ４＿ｏｒｉ＿ａｐｒａが、接合によって首尾よく転移されること、および細菌におけるその存在が、アプラマイシンによる選択によって検証できることが示された。
【０１５９】
プラスミドＤＮＡによる、アクチノマヅラ・ナミビエンシス・プロトプラストのＰＥＧ補助された形質転換：
多くの著者が、再生および形質転換頻度に影響を与えるパラメータを調査しており、個々のストレプトマイセス種について条件を最適化することを試みてきた（１９〜２０）。特に重要なものは、プロトプラスト形成の時点での菌糸体の増殖相、菌糸体および再生中のプロトプラストがインキュベートされる温度、形質転換１回当たり使用されるプロトプラストの数、再生プレートの乾燥度、および培地の組成である。プロトプラストの生成、形質転換および再生のために、ストレプトマイセスについての標準的なプロトコール（上記を参照のこと）を、いくつかの改変と共に使用した。アクチノマヅラ・ナミビエンシスを、毎回、２つの異なる種の培地ＣＲＭおよびＹＥＭＥにおいて、１６０ｒｐｍで回転させながら２８℃で増殖させた。培地組成の種々の改変を試験した。菌糸体を、０．５％、１％および１．５％のグリシンの存在下で増殖させた。プロトプラスト形成は、グリシン（１％）がＣＲＭ増殖培地中に存在した場合に、最も効率的であった。プロトプラストの効率的な調製のためには、菌糸体の齢および生理学的状態が重要である。ストレプトマイセス・リビダンスにおける最良の形質転換頻度は、「後期対数」期まで増殖した菌糸体から調製されたプロトプラストで得られるが、ストレプトマイセス・パルブルスのトランスフェクションには、プロトプラストは、かなり若い菌糸体に由来する必要があったことが記載されている。アクチノマヅラ・ナミビエンシスが対数期にある場合を推定するために、増殖曲線を準備した。アクチノマヅラ・ナミビエンシス細胞はクラスターを形成するので、単にＯＤを測定することはできず、その代わり、６時間毎に１ｍｌの培養物を遠心分離し、ペレットを計量した。別の重要な工程は、溶解性酵素の使用である。ストレプトマイセスについて、リゾチームの使用は、満足できる結果を生じる。驚くべきことに、アクチノマヅラ・ナミビエンシス・プロトプラストは、リゾチームとのインキュベーション後には観察されなかった。延長されたインキュベート時間（１、２、３時間）も増加したインキュベーション温度（３７℃）およびリゾチーム濃度（２、１０、５０および１００ｍｇ／ｍｌ）も、助けにはならなかった。アクチノマヅラ・ナミビエンシスは、リゾチームに対して極端に抵抗性であるが、プロトプラスト形成のためのプロトコールを開発することが可能であった。アクチノマヅラ・ナミビエンシスをセロシルまたはセロシル／リゾチーム混合物で処理した時に、プロトプラストが形成された。セロシルは、ストレプトマイセス・セリカラー由来の細菌リゾチームである。セロシルは、黄色ブドウ球菌、およびニワトリ型、ガチョウ型またはファージ型のリゾチームによって加水分解されない他の細菌の細胞壁を分解できるので、かなり興味深い（２１）。プロトプラストの形成のための最良の条件は、アクチノマヅラ・ナミビエンシスを、０．５％または１％の最終濃度のグリシンを含むＣＲＭ培地中で増殖させ、細胞を、Ｐ緩衝液（標準的な１０％の代わりに２０％のショ糖を含む）中に可溶化したセロシル（１ｍｇ／ｍｌ）とリゾチーム（０．５ｍｇ／ｍｌ）との混合物と共に２８℃で２時間インキュベートした場合に得られた。プロトプラストからの生存細胞の再生に最適な条件を決定するために、Ｒ２ＹＥオーバーレイ培地およびＰＷＰオーバーレイ培地を試験した。軟寒天のオーバーレイを有するＰＷＰプレート上での増殖だけが、首尾よい再生に必要な菌叢を生じた。プロトプラストのトランスフェクションに関する研究により、形質転換混合物におけるポリエチレン・グリコール（ＰＥＧ）の存在が、高頻度のプラスミドＤＮＡ形質転換に絶対的に必要であるという発見が導かれた（２２）。最も頻繁には、ＰＥＧ  ３３５０およびＰＥＧ  １０００が使用される。アクチノマヅラ・ナミビエンシス・プロトプラストの形質転換能を試験するために、重合の程度が異なるＰＥＧ（３３５０、１０００、６０００）およびまた異なる供給業者（ＳｉｇｍａおよびＲｏｔｈ）からのＰＥＧを試験したが、これは、異なる供給源由来のＰＥＧのバッチが必ずしも等価ではないということが以前に報告されているからである。プラスミドＤＮＡとして、以下のベクターを使用した：ｐＳＥＴ１５２、ｐＵＷＬｏｒｉＴおよびｐＫ１８ｍｏｂ２＿ｌａｂＫＣ。不成功の形質転換は、宿主中の活性な制限系の結果であり得るので、プラスミドを、大腸菌ＥＴ１２５６７などの雌親（ｄａｍ）ドナーから単離した。形質転換実験を、凍結プロトプラストおよびまた新たに調製されたプロトプラストの使用によって実施した。種々の形質転換条件およびベクターを使用したが、形質転換体は取得されなかった。
【０１６０】
大腸菌とアクチノマヅラ・ナミビエンシスとの間の属間接合
低い形質転換頻度の理由の１つは、宿主中の活性な制限系の結果であり得る。この障壁は、一本鎖形態でＤＮＡを宿主中に導入するための属間接合（２３）の使用によって克服できる。接合の別の利点は、それが単純であり、プロトプラストの形成および再生のための手順の開発に依存しないことである。大腸菌とグラム陽性細菌との間での、シャトル・プラスミドの最初の接合性転移は、Ｔｒｉｅｕ−Ｃｕｏｔら（２４）によって報告された。大腸菌からストレプトマイセスへのプラスミドの属間転移は、Ｍａｚｏｄｉｅｒら（１９８９）（２５）（２６）によって最初に記載された。後に、この方法は、多数の異なるストレプトマイセス株、ならびにアミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）（２７）、アクチノプラネス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）（２８）、ノノムラエア（Ｎｏｎｏｍｕｒａｅａ）（２９）、サッカロポリスポラ、アクチノマヅラ、ミクロモノスポラ、ノカルジアおよびロドコッカス（３０）などの他の放線菌に首尾よく適用されてきた。
【０１６１】
接合実験を、上記プロトコールに従って実施した。シャトル・プラスミドとして、非メチル化大腸菌ドナーＥＴ１２５６７由来のｐＳＥＴ、ｐＵＷＬｏｒｉＴ、ｐＣＬＬ４＿ｏｒｉ＿ａｐｒａを使用した。第１の実験を、胞子を使用して実施した。アクチノマヅラ・ナミビエンシスは胞子形成株として記載されているが（３１）、多数の異なる培地を試験して、合理的な量の胞子を取得する必要があった。以下の培地を使用した：ＩＳＰ１、ＩＳＰ２、ＩＳＰ３、ＩＳＰ４、ＩＳＰ５、ＩＳＰ７、ＭＳ、ＳＭおよび胞子形成培地。胞子形成は、ＩＳＰ４および胞子形成培地上でのみ観察されたが、胞子形成培地上での増殖だけが、満足のいく結果を与えた。菌糸体断片は、調製にはあまり便利ではないものの、より高い数の組換え体を生じ得るので、胞子ならびに菌糸体断片を接合に使用した。菌糸体断片を、寒天プレート（ＡＳ１およびＭＳ寒天プレート）上または液体培養物（ＫＭ４およびＴＳＢ培地）中で増殖させた細菌から調製した。
【０１６２】
接合完了体は、接合後に大腸菌ＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２／ｐＳＥＴ１５２から取得されただけであった。クローンの正確さを、ＰＣＲ反応によって検証した。プライマーｐＳＥＴｐｒｏｏｆ＿ｆｏｒ（５’−ＣＧＡＧＣＣＧＧＡＡＧＣＡＴＡＡＡＧＴＧ−３’）およびｐＳＥＴｐｒｏｏｆ＿ｒｅｖ（５’−ＧＣＴＴＧＧＡＧＣＧＡＡＣＧＡＣＣＴＡＣ−３’）を使用して、ｐＳＥＴ１５２の５９１ｂｐ断片を増幅した。この結果は、ストレプトマイセスに特徴的なベクターが、アクチノマヅラ・ナミビエンシスにおいて複製でき、この株におけるさらなる遺伝子操作に使用され得ることを実証している。接合完了体は取得されたものの、より高い収量で接合を可能にするプロトコールを確立する強い必要性がなおも存在する。
【０１６３】
アクチノマヅラ・ナミビエンシスの直接的形質転換
アクチノマヅラ・ナミビエンシス形質転換の方法を見出すために使用される別の方法は、アミコラトプシス・ジャポニカム（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）について以前に記載された直接的形質転換であった（２７）。これは、標準的な技術では形質転換する傾向がなかった種々のアミコラトプシス株（１１、３２）について有効な方法である。この方法は、ポリエチレン・グリコール、カルシウム・イオンおよび担体として機能している仔ウシ胸腺ＤＮＡの存在下において、プラスミドＤＮＡと一緒にプロトプラストをインキュベートすることによって細菌が形質転換され得るという観察に基づく。この手順の最も重要なパラメータは、培養物の齢であることが示されている。例えば、アミコラトプシス・ジャポニカム（２７）は、初期定常期の菌糸体を使用した場合に最も高いトランスフェクション効率を示したが、ノカルディア・ラクタムデュランス（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓ）の最適な培養物齢は、培養物が対数期にある時であった（３３）。プラスミドｐＳＥＴおよびｐＵＷＬｏｒｉＴを用いて上記プロトコールに従って、アクチノマヅラ・ナミビエンシスが後期対数期にある時に実験を実施した。形質転換体は取得されなかった。
【０１６４】
菌糸体のエレクトロポレーション
細胞とＤＮＡとの懸濁物に対する、一過的なメンブレンの孔の形成およびＤＮＡの取り込みを生じる短時間の高電圧パルスの適用は、エレクトロポレーションと呼ばれる。プロトプラストの形成および再生のための条件を開発する必要性を除外することは可能であり得るが、他方では、エレクトロポレーションのための適切な条件は、株特異的であり得る。電気的形質転換は、アクチノマイセス種（３４）のために、例えば、いくつかのストレプトマイセス種の菌糸体（３５〜３６）、ストレプトマイセス・リビダンス・プロトプラスト（３７）およびさらにはストレプトマイセス出芽胞子（３８）の形質転換のために開発された。アクチノマヅラ・ナミビエンシスのエレクトロポレーションのために、ストレプトマイセス・リモサス（１０）のための僅かに改変されたプロトコールを適用した。エレクトロポレーション（プラスミドｐＳＥＴ１５２ｅｒｍＥおよびｐＵＷＬｏｒｉＴを用いる）を、菌糸体断片ならびにプロトプラストに対して実施した。形質転換体は取得されなかった。
【０１６５】
まとめ
アクチノマヅラ・ナミビエンシスを用いた研究は、この株に対する遺伝子転移法が利用可能でないことに起因して妨げられた。この研究では、いくつかの形質転換プロトコールを試験したが、この問題に対する満足のいく解法を与えたプロトコールはなかった。しかし、プロトプラストの接合および形質転換のためのプロトコールを部分的に最適化することが可能であった。アクチノマヅラ・ナミビエンシス・プロトプラストの形成のための方法を、セロシルまたはセロシルとリゾチームとの混合物の使用によって確立した。プロトプラスト形質転換後の形質転換体の欠如は、プロトプラストの不十分な再生に起因し得る。菌糸体からの接合は、１つの接合完了体を生じた。かかる低い効率は、この方法に再現性がなく信頼性がないことを示すが、他方では、アクチノマヅラ・ナミビエンシス中に外来ＤＮＡを導入することが可能であるという証拠である。この実験からの別の重要な情報は、ストレプトマイセスに特徴的なベクター（例えば、ｐＳＥＴ１５２）が、アクチノマヅラ・ナミビエンシスにおける遺伝子操作に使用され得るということである。これはアクチノマヅラ属に必ずしも当てはまらない（９）ので、重要である。これらの研究は、異なる形質転換法が多くの放線菌に対して確立されているものの、異なる株についての最適な条件は顕著に異なり得るので、汎用的とはなお程遠いことを示している。
【０１６６】
〔実施例２〕
ストレプトマイセスにおけるラビリントペプチンの異種発現
アクチノマヅラ・ナミビエンシスの遺伝子操作のための効率的なプロトコールの開発は、その天然の産生体におけるラビリントペプチンの遺伝子工学的操作の可能性を基本的に妨害する、満足のいかない結果を生じた。目的の生物が、増殖が遅いまたは遺伝的に扱いにくい場合、一般的な戦略は、より適切な宿主において生合成遺伝子クラスター全体の発現を確立することである（３９〜４０）。同じ戦略に従った。ラビリントペプチン発現のための異種宿主として、ストレプトマイセスを選択した。これらの研究に使用した株は、取扱いが容易であり、遺伝子操作技術が十分記載されている（１０）。いくつかの特徴により、ストレプトマイセスは、異種宿主としての良い候補になっている。重要なことに、ストレプトマイセス種およびアクチノマヅラ種は放線菌に属し、これらは共に、類似のコドン使用頻度を用いるＧＣリッチ株である。さらに、ストレプトマイセス属は、広範な種々の二次代謝物を産生する能力を示す（４１）。アクチノマヅラスにおける遺伝子操作に関する情報は非常に限定的であるが、２つのストレプトマイセス株（ストレプトマイセス・カルジノスタティクス（Ｓ．ｃａｒｚｉｎｏｓｔａｔｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス・グロビスポラス（Ｓ．ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ））における、アクチノマヅラ・マヅラエ（Ａ．ｍａｄｕｒａｅ）由来の生合成遺伝子クラスターの補完が報告されている（４２）。別の重要な問題は、成熟ラビリントペプチンを取得するために、リーダー・ペプチドが除去される必要があるという事実に起因している。リーダー・ペプチドの切断を担うプロテアーゼをコードし得る候補遺伝子は、ｌａｂ遺伝子クラスター中では同定されてこなかった。ラビリントペプチン・リーダー・ペプチドは、バチルス・スブチリス由来のスブチリシンについて既に記載されているように（４３）、細胞外非特異的プロテアーゼによって切断されることが可能である。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析により、ｌａｂ遺伝子クラスターと相同な遺伝子クラスターが、ストレプトマイセス・セリカラー、ストレプトマイセス・アベルミティリス、ストレプトマイセス・グリセウスおよびサッカロポリスポラ・エリスラエアなどの他の放線菌（図１）中にも存在することが明らかになった。異種宿主として選択されたストレプトマイセス株由来のプロテアーゼは、アクチノマヅラ・ナミビエンシス由来のプロテアーゼを補完することができるようなので、この知見は特に興味深い。全てのこれらの特徴は、非病原性の性質および確立された発酵技術と共に、ストレプトマイセスを、ラビリントペプチンを産生するための当然の選択肢にしている。
【０１６７】
ｌａｂ遺伝子クラスターを保有するコスミドＭ１１０４の異種発現：
ストレプトマイセス染色体中へのコスミドＭ１１０４の組込み
ラビリントペプチンの異種発現を可能にする構築物（コスミドＭ１１０４）は、Ｔｉｍｏ  Ｓｃｈｍｉｅｄｅｒｅｒ博士の博士研究の間に既に調製されている（４４）。λ−Ｒｅｄ媒介性の組換え（２、５）によって、ファージΦＣ３１のインテグラーゼ遺伝子（ｉｎｔ）および付着部位（ａｔｔＰ）（４５）（４６）を、完全なｌａｂ遺伝子クラスターを含むコスミド１１０４中に導入した。コスミドＭ１１０４は、異種宿主：ストレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマイセス・アルブスおよびストレプトマイセス・セリカラーの染色体中に、部位特異的に組み込まれた。コスミドＭ１１０４の形質転換を、Ｋｉｅｓｅｒら、２０００（１０）に記載されたプロトプラストのＰＥＧ補助された形質転換によって実施した。アプラマイシンに対して耐性の取得されたクローンから、ストレプトマイセス・セリカラーについて７つのクローン、ストレプトマイセス・アルブスについて３つのクローン、およびストレプトマイセス・リビダンスについて２つのクローンを、さらなる実験のために選択した。
【０１６８】
ＰＣＲおよびサザン・ブロットによる取得された組込み変異体の検証
組込み変異体を、ＰＣＲおよびサザン・ブロットによって検証した。全てのクローンを、同じ様式で処理した。ゲノムＤＮＡを、僅かに改変された（１０）に記載された塩析手順によって単離した。コスミドＭ１１０４およびストレプトマイセス宿主株のゲノムＤＮＡを、ＢａｍＨＩ（ストレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマイセス・セリカラー）またはＳａｃＩ（ストレプトマイセス・アルブス）のいずれかを用いて断片化した。ＤＮＡブロットを、ＭｌｙＩを用いて消化しＤＩＧ標識したコスミドＭ１１０４でプローブした。野生型株およびコスミドＭ１１０４を保有する異種宿主のプロファイルを比較した。コスミドＭ１１０４を用い、ストレプトマイセス・セリカラー由来の総ＤＮＡを用いたサザン・ハイブリダイゼーション実験は、ハイブリダイゼーション・シグナルを示さず、これは、ストレプトマイセス・セリカラーが、導入されたコスミドと相同なＤＮＡを有さなかったことを示している。この知見は、宿主における潜在性の遺伝子の活性化または補完のいずれかの可能性を排除する。類似の結果が、異種宿主として使用した２つの他の株ストレプトマイセス・リビダンスおよびストレプトマイセス・アルブスについて取得された。ＰＣＲによって変異体中への組込み事象を検証するために、６つのプライマー対を設計した。プライマーの配列および予測されるＰＣＲ産物の長さを以下に記載する。この実験により、全ての予測されたＤＮＡ断片が、プライマー対Ｉ〜ＶＩを用いたＰＣＲの後に、組込み変異体について観察できたが、野生型については観察できなかったことが示された。例を図２Ｂに示す。ＰＣＲおよびサザン・ブロット分析により、顕著な欠失および再編成が組込み変異体内で起こらなかったことが証明された。
【０１６９】
組込み変異体のＰＣＲ検証に使用したプライマー：
【表２２】
2015502164.tif 000035
【０１７０】
異種株の培養およびラビリントペプチンの検出
組込み変異体および親宿主株を、以下にまとめるいくつかの異なる産生培地中で培養した。産生レベルはクローン間で変動し得るので、１つより多い独立した組込み体を単離し、ラビリントペプチン産生について試験した。産生を、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳおよびウエスタン・ブロッティング分析によって試験した。ウエスタン・ブロッティングのために、ＬａｂＡ２リーダー・ペプチドに対する抗体およびまた成熟ＬａｂＡ２に対する抗体を使用した。これにより、完全に改変されたＬａｂＡ２だけでなく、付着したリーダー・ペプチドを有するそのプレプロペプチドおよび完全に改変されたＬａｂＡ２の検出もまた可能になった。付着したリーダー・ペプチドを有するＬａｂＡ２を検出する可能性は、ｌａｂ遺伝子クラスターにおけるリーダー・ペプチド切断を担うプロテアーゼの欠如（コスミドＭ１１０４の境界においてこの機能を果たすプロテアーゼもまた、同定できなかった）に起因して、非常に重要であった。ウエスタン・ブロット・プロトコール、ＬＣ−ＭＳ法およびサンプル調製の方法は、上記されている。代謝物の分析により、組込み変異体が、いずれのラビリントペプチンもラビリントペプチン誘導体も産生しなかったことが示された。
【０１７１】
コスミドＭ１１０４の異種発現に使用した株および増殖条件：
【表２３】
2015502164.tif 000036
【０１７２】
ベクターｐＵＷＬａｂを使用することによるラビリントペプチンの異種発現：
ベクターｐＵＷＬａｂの構築および検証
ｌａｂ遺伝子クラスター全体を、プライマーｌａｂ−ｆｗ／ｒｅｖ（図３）およびＨｅｒｃｕｌａｓｅ−ＩＩ−Ｆｕｓｉｏｎ−ＤＮＡポリメラーゼを使用するＰＣＲによって、コスミド１１０４から増幅した。重要なことに、プライマーｌａｂ−ｆｗは、ストレプトマイセスに特徴的なＲＢＳ（ｌａｂＫＣ遺伝子の開始コドンの５ｂｐ上流のＧＧＡＧＧ配列）の付加を可能にした。こうして取得されたＰＣＲ産物（６．４ｋｂ）を、酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化し、構成的ｅｒｍＥプロモーター（４７）の制御下で、大腸菌−ストレプトマイセス・シャトル・ベクターｐＵＷＬｏｒｉＴ中に直接クローニングし、新たなベクターｐＵＷＬａｂ（１３．８ｋｂ）を得た（図４）。構築物の正確さを、制限消化および配列決定反応（プライマー：ＩｋｏＲｅｖ１、ＬａｂＫＣ＿Ｆｗ２、ＬａｂＫＣ＿Ｆｗ３、ＬａｂＫＣ＿Ｆｗ４、ＬａｂＫＣ＿Ｆｗ５、ＬａｂＫＣ＿Ｆｗ６、ＩｋｏＲｅｖ３’、ＩｋｏＲｅｖ４’、ＩｋｏＦｗ４’）によって確認した。ｐＵＷＬａｂを、４つの異なる制限酵素（ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＶ、ＮｏｔＩ、ＰｓｔＩ）で消化した。これらの全てについて、予測されたＤＮＡ断片が、図５に示すように観察できた。配列決定反応はまた、いずれの誤りも示さなかった（配列決定に使用したプライマーを以下にまとめる）。次いで、プラスミドｐＵＷＬａｂを、メチル化欠損大腸菌株ＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２に形質転換した。最後に、所望の構築物を、いくつかのストレプトマイセス株（ストレプトマイセス・セリカラーＭ１４５、ストレプトマイセス・リビダンスＺＸ７、ストレプトマイセス・アルブスＣＢ８９、ストレプトマイセス・アベルミティリスＤＳＭ４６４９２、ストレプトマイセス・グリセウスＤＳＭ４０２３６）に、接合によって首尾よく形質転換した。
【０１７３】
ｌａｂ遺伝子クラスターの増幅およびｐＵＷＬａｂの配列決定に使用したプライマー：
【表２４】
2015502164.tif 000037
【０１７４】
異種株の培養およびラビリントペプチンの検出
プラスミドｐＵＷＬａｂで形質転換した変異体および親宿主株を、異なる産生培地中で培養した。各株について、２つの型の液体培養物（ＹＥＭＥ、Ｍ５２９４）および固体寒天プレート（Ｒ２ＹＥ、ＫＭ４）を調製した。ラビリントペプチンの発現を、ウエスタン・ブロッティング実験および質量分析（ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ、ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ−ＭＳ）によって試験した。実施した全ての実験を以下にまとめる：
【０１７５】
【表２５】
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【０１７６】
少なくとも３つのクローンを試験し、多くの異なる増殖条件を適用したが、ベクターｐＵＷＬａｂを保有するストレプトマイセス・セリカラー、ストレプトマイセス・アベルミティリスおよびストレプトマイセス・グリセウスについて、ラビリントペプチンの発現は観察されなかった。幸い、二次代謝物の分析により、形質転換されていない宿主株とは対照的に、ｐＵＷＬａｂを含有するストレプトマイセス・リビダンスおよびストレプトマイセス・アルブスがラビリントペプチンを蓄積したが、ストレプトマイセス・リビダンスにおける発現だけが、十分な量の所望の産物を与えたことが示された。以下に、ストレプトマイセス・リビダンスにおける発現からの結果を示す。
【０１７７】
ウエスタン・ブロッティングを、成熟ＬａｂＡ２またはＬａｂＡ２リーダー・ペプチドのいずれかに対して惹起された抗体を用いて実施した。ＬａｂＡ２は、たった２．１ｋＤａの質量を有するペプチドである。小さい分子量は、ウエスタン・ブロッティング技術の使用による良好な検出に困難をもたらし得る。陽性コントロールとして、純粋なＬａｂＡ２またはアクチノマヅラ・ナミビエンシスの液体培養物由来の上清を使用した。野生型培養抽出物が、陰性コントロールとして機能した。シグナルは、ストレプトマイセス・リビダンス／ｐＵＷＬａｂ培養物（液体培地および寒天培地）について、完全に改変されたＬａｂＡ２に対する抗体とのインキュベーション後にのみ観察されたが、野生型については観察されなかった（図６）。
【０１７８】
ストレプトマイセス・リビダンス野生型およびストレプトマイセス・リビダンス／ｐＵＷＬａｂのＬＣ−ＭＳスペクトルの比較により、後者の培養物濾液中の未知の化合物が明らかになった。クロマトグラムの評価から、ｌａｂ遺伝子クラスターを含むクローンが、野生型には存在しない物質を産生していることが明らかであった。新たな化合物が、試験した全ての増殖条件下で検出された：液体培養物中（上清中およびペレット中）およびまた寒天プレート上。これらの代謝物は、ラビリントペプチンと類似の保持時間を有する（図７、８を参照のこと）。驚くべきことに、それらの質量は、ＬａｂＡ１およびＬａｂＡ２に特徴的な質量には対応しなかった。さらなる分析により、これらの不可解な産物は、リーダー・ペプチドに由来するさらなるアミノ酸を有するラビリントペプチン誘導体であることが明らかになった。ストレプトマイセス・リビダンスは、Ｎ末端ＡｌａまたはＡｌａ−Ａｓｐオーバーハングを有する成熟ＬａｂＡ１を発現することができた（図８）。観察されたＬａｂＡ１誘導体間の比は、培養段階に依存する。増殖の開始の時点では、２つのさらなるアミノ酸を有するＬａｂＡ１が主な産物である。ストレプトマイセス・リビダンス／ｐＵＷＬａｂの２週齢の培養物では、１つのさらなるＮ末端アミノ酸のみを有するＬａｂＡ１が主な産物である。完全に改変されたＬａｂＡ２の発現もまた、成功した。Ｎ末端Ａｓｎ−Ａｒｇオーバーハングを有するＬａｂＡ２誘導体が検出された（図８）。これらの結果は、リーダー配列が、異種株ストレプトマイセス・リビダンスから寄与される非特異的プロテアーゼによってプロセシングされ得るが、天然の産生体とは異なる切断部位の配列が現れることを示唆している。さらに、観察された結果を支持するために、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳおよびＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ実験を実施した。本発明者らの仮説の正確さを確認するために、ＭＳ／ＭＳ測定およびＬＴＱ／Ｔｒａｐ測定などのさらなる実験を実施した。タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）分析を使用して、ストレプトマイセス・リビダンス／ｐＵＷＬａｂの培養物において観察されたＬａｂＡ１の正体をさらに確認した。２つのサンプルを測定し、比較した。コントロール・サンプルは、ストレプトマイセス・リビダンス／ｐＵＷＬａｂの９ｄ液体培養物（培地ＹＥＭＥ）由来の上清を指す、アクチノマヅラ・ナミビエンシスの培養ブロスから単離されたＬａｂＡ１であった。ＬＣ−ＭＳスペクトルにおいて観察された分子量は、異種宿主株がＤ−ＬａｂＡ１およびＡＤ−ＬａｂＡ１を産生し得るという予測を可能にした。より高齢の培養物中のＤ−ＬａｂＡ１の産生レベルはより高かったので、ＭＳ／ＭＳ実験はこの誘導体に焦点を当てた。ＭＳ／ＭＳ測定を実施する前に、ラビリントペプチン中のジスルフィド架橋を還元した。断片化パターンは、提唱された環のトポロジーと一致し、野生型ＬａｂＡ１のＭＳＭＳ断片化と類似している。高分解能ＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析を使用して、ストレプトマイセス・リビダンス／ｐＵＷＬａｂの９ｄ液体培養物（培地Ｍ５２９４）由来の上清を調査した。Ｄ−ＬａｂＡ１、ＡＤ−ＬａｂＡ１およびＮＲ−ＬａｂＡ２に属する単一荷電��オンの分子式を同定および計算することが可能であった。取得された相対誤差は、完全に許容可能な値を有する。これらの結果は、図３６に示すように、ＬＣ−ＭＳ（図８）およびＭＳ／ＭＳ実験からの結果と一致する。
【０１７９】
ＬＣ−ＥＳＩ−ＯｒｂｉＴｒａｐ−ＭＳから取得された実験データと比較した、正確な分子量測定による分子式の提唱。
【表２６】
2015502164.tif 000039
【０１８０】
まとめ
コスミドＭ１１０４の使用によるラビリントペプチンの異種発現は失敗した。１つの説明は、アクチノマヅラ・ナミビエンシス由来のプロモーターが、ストレプトマイセスによって認識されなかったことである（９）。しかし、他の株の使用は、ｌａｂ遺伝子クラスターの異種発現のための効率的な方法の発見を生じることができた可能性がある。多くの産生培地を試験したものの、ラビリントペプチン発現の欠如は、最適でない増殖条件の使用によって引き起こされ得る。興味深いことに、ｌａｂ遺伝子クラスターは、ラビリントペプチンに対する相同性を示すランチビオティックにとって重要な役割を果たすと思われる調節遺伝子を含まない。例えば、ストレプトマイセス・セリカラーにおける気菌糸形成を担うｒａｍ遺伝子クラスターは、２成分の応答調節因子（ＲａｍＲ）を含み、その破壊は、野生型株と比較して、分化の発生において１２〜２４時間遅延した株を生じる（４８）。
【０１８１】
ストレプトマイセス・アルブスおよびストレプトマイセス・リビダンスにおけるベクターｐＵＷＬａｂの異種発現は、ＬａｂＡ１誘導体およびＬａｂＡ２誘導体の産生を生じた。ストレプトマイセス・セリカラー、ストレプトマイセス・グリセウスおよびストレプトマイセス・アベルミティリスの培養物におけるラビリントペプチンの欠如は、異種発現が、予測できない方法であることを示している。ストレプトマイセス・アルブスおよびストレプトマイセス・リビダンスにおいて発現されるラビリントペプチンは、リーダー・ペプチド由来のさらなるアミノ酸を含むが、プロテアーゼをコードする候補遺伝子がｌａｂ遺伝子クラスター中で同定されていないので、これは驚くべきことではない。かかる現象は、他のランチビオティック、例えば、遺伝子クラスターの境界におけるプロテアーゼもまた有さないアクタガルジン（ａｃｔａｇａｒｄｉｎｅ）（４９）について既に記載されている。ストレプトマイセス・リビダンス中のアクタガルジン遺伝子クラスターの発現は、ａｌａ（０）−アクタガルジン（さらなるＮ末端アラニンを有するアクタガルジン）の産生を生じた。ラビリントペプチンにおけるさらなるアミノ酸の存在は、異種宿主におけるｐＵＷＬａｂ構築物の主な欠点である。これは、その生物学的特性に負の影響を与え得、どんな場合にも、クロマトグラフィー法による分離にとっての問題を引き起こし得る。幸い、この問題は、以下の実施例において解決された。
【０１８２】
〔実施例３〕
新規ラビリントペプチンの効率的な生成のための方法を確立する
ランチビオティックは、変更されたアミノ酸側鎖を有する新規化合物の生成のためのテンプレートとして使用され得る。これは、これらの化合物がリボソームに合成され、従って、部位特異的変異誘発によって改変され得るという事実に起因する。多酵素複合体とは対照的に、リボソーム起源のランチビオティックは、それらを、現在の最新の技術による生物工学的操作のための優れた候補にしている。２つの主な戦略が、工学的に操作されたランチビオティックの産生のために開発されている。これらの戦略は、例えばナイシン（５０〜５１）、ムタシン（ｍｕｔａｃｉｎ）ＩＩ（５２）、エピデルミン（５３）およびＰｅｐ５（５４）バリアントの生成に、既に適用されている。
【０１８３】
第１の方法は、宿主株における構造遺伝子のプラスミド由来の相補的コピーを含み、第２の方法は、遺伝子置換手順を使用することによる、変異したコピーによる野生型遺伝子の置換を含む。補完戦略を使用するために、野生型プレプロペプチドをコードする構造遺伝子を最初に不活化することが望ましい。これらの系全てにおいて、この構造遺伝子は、プラスミドにコードされ、その発現は、ランチビオティックの生合成に関与する他の酵素から独立して発生する。この系の利点は、関与する配列が、種々の分子生物学的技術によってより容易に操作されることである。成熟ランチビオティックの過剰産生は、より高いプロセシング誤差率を生じ得るか、または宿主免疫系が対処し得るよりも高い抗菌活性を生じ得るので、構造遺伝子が多コピーのプラスミド上で発現される場合、問題が生じ得る。天然の産生体が新規ランチビオティックの発現に使用される場合でさえ、変異したペプチドの収量は、野生型ペプチドについて観察される収量よりもかなり低いことがしばしばである。
【０１８４】
第２の戦略は、新たなプレプロペプチドによる野生型構造遺伝子の置換に基づく。この場合、新たな構造遺伝子は、その天然のゲノム位置で発現される。遺伝子置換アプローチの利点は、変化していない遺伝子量および調節応答が維持されることである。遺伝子置換アプローチは、構造遺伝子と生合成遺伝子と免疫遺伝子との間のバランスを維持する利点もまた有する。しかし、これは非常に時間のかかる手順である。
【０１８５】
一般に、より良い結果は、補完によるよりも遺伝子置換によって取得される。この現象は、ナイシンの場合にも観察された（５５）。これの可能な理由は、下流遺伝子からの構造ｎｉｓＡ遺伝子の転写の脱共役が、生合成遺伝子の発現に対して、および結果として産生レベルに対して、負の影響を有し得ることである。補完戦略も置換戦略も、産生収量における顕著な低下のない新規ランチビオティックの容易かつ高速の生成の可能性を与えないので、科学者は、新たな解法をなおも探している。Ｌｉｎら、２０１１（５６）は、大腸菌の発現系に全体として基づくボビシン（ｂｏｖｉｃｉｎ）ＨＪ５０の半ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生合成（ＳＩＶＢ）を記載している。大腸菌における発現は、容易な遺伝子操作を促進するが、この方法は、未だ完全ではない。第１に、これは、高い量の新規ランチビオティックを取得することができず、第２に、これは、各反応のために酵素および基質を精製する必要があるので、コストを増加させる。
【０１８６】
ストレプトマイセスにおける異種発現のためのベクターｐＬａｂの構築
アクチノマヅラ・ナミビエンシスへのＤＮＡ転移の方法の欠如は、ラビリントペプチン誘導体の生成のためのこの株の使用を妨害している。しかし、ベクターｐＵＷＬａｂは、異種株における新規ペプチドの発現のための道を驚くべきことに開いた、ストレプトマイセス・リビダンスにおけるラビリントペプチンの満足いく量の発現を可能にする。リボソーム起源のペプチドに起因して、バリアント生成は、構造遺伝子のみの変異誘発によって達成され得る。さらに、プレプロペプチドをコードするｐＵＷＬａｂの一部のみを改変する必要がある場合、新規ペプチドの生成の、少なくとも２つの可能な方法が存在する。第１の戦略は、ｐＵＷＬａｂ中のプレプロペプチド配列のノック・アウト、および次いで、ラビリントペプチン・プレプロペプチドをコードする遺伝子のみを保有する小さいプラスミドによる補完である。この状況では、変異体は、部位特異的変異誘発によって容易に生成できた。しかし、ラビリントペプチンの発現は、ｐＵＷＬａｂが使用される場合よりもかなり低い可能性が非常に高いので、この方法は却下された。第１に、ノック・アウトは、下流遺伝子に対する極性効果を有し得た。第２に、ｌａｂＡ２とｌａｂＴ１との間の短い非コード・セグメント中に位置する逆方向反復が検出された。構造遺伝子と下流生合成遺伝子との間のステム・ループ構造の存在は、多数の他のランチビオティックの特徴である（５７）（５８）。ステム・ループ構造は、ランチビオティック産生の収量に影響を与えるリボヌクレアーゼによる分解からｍＲＮＡを保護することによって、ｍＲＮＡを安定化し得る（５９）ことが確立されている。高い発現レベルを維持するために、変異体の生成のための別の方法を検討した。これは、テンプレートとして発現ベクターｐＵＷＬａｂを使用する部位特異的変異誘発を含む。しかし、ｐＵＷＬａｂは、１３．８ｋｂｐのサイズを有する比較上大きなプラスミドであるので、１つの深刻な複雑さが生じた。この状況では、部位特異的変異誘発実験は、１つの工程では実施できず、これが手順全体を複雑化し、実験の時間を顕著に延長させる。この状況では、ｌａｂＡ１遺伝子およびｌａｂＡ２遺伝子を特異的に切り出すために使用できるｐＵＷＬａｂ配列中の制限部位を決定することが重要であった。次いで、これらの遺伝子を、簡便な部位特異的変異誘発実験を可能にするより小さいプラスミド中にサブクローニングできた。変異の導入後、新規ラビリントペプチン・プレプロペプチドをコードする配列を、ｐＵＷＬａｂに戻しクローニングすることができた。幸い、適切な制限酵素を見出すことが可能であった。ＰａｓＩおよびＥｃｏ４７ＩＩＩを、プレプロペプチド・コード領域を正確に切り出すために使用できた。これらの酵素の制限部位は、ｐＵＷＬａｂ配列中に２回現れる。望ましくない領域からＰａｓＩ制限部位およびＥｃｏ４７ＩＩＩ制限部位を除去するために、合成遺伝子ａａｃ（３）ＩＶを使用した。これは、２つのサイレントな点変異（ＣＧＣ→ＣＧＧ（Ａｒｇ）、ＣＴＧ→ＣＴＣ（Ｌｅｕ））を有するａｃｃ３（ＩＶ）遺伝子の一部を含む。ＰａｓＩ認識配列ＣＣＣＴＧＧＧを、この酵素がそれ以上認識できないＣＣＣＴＣＧＧに変化させた。Ｅｃｏ４７ＩＩＩ認識配列ＡＧＣＧＣＴもまた、ＡＧＣＧＧＴ配列を生成する単一の点変異によって破壊した。合成遺伝子ａａｃ（３）ＩＶを、ＭｌｕＩ制限部位およびＸｂａＩ制限部位を介してｐＵＷＬａｂにクローニングして、ｐＬａｂを取得した（クローニング戦略は図９に示す）。
【０１８７】
ｐＬａｂは、ＰａｓＩ部位およびＥｃｏ４７ＩＩＩ部位の使用によって新たなプレプロペプチド配列のクローニングを可能にするが、これは未だ最適な構築物ではない。これら２つの制限酵素によるｐＬａｂの消化後、２つのＤＮＡ断片が取得される：１３４３１ｂｐおよび３６８ｂｐ。新たなプレプロペプチド配列をｐＬａｂにクローニングするために、最初に、消化されたベクターを単離する必要がある。しかし、消化されたｐＬａｂと消化されていないｐＬａｂとの間を分取アガロース電気泳動ゲル上で識別することは困難である。この状況では、ｐＬａｂを過剰消化し、ライゲーションのために過剰量の調製された挿入物を使用することができた。残念ながら、ＰａｓＩがスター活性（制限酵素が、規定された認識配列と同一ではない配列を切断する能力）を示すので、これは不可能であった。このことは、各クローニング実験の後、取得されたプラスミドは、野生型配列を有するものを排除するために、配列決定する必要があることを意味する。この問題を克服するために、ｌａｂＡ１およびｌａｂＡ２を、ＰａｓＩおよびＥｃｏ４７ＩＩＩで切断し、次いで、これらの酵素を使用して、構築物ｐＭＡ＿ＳＧ３由来のアンピシリン耐性をコードするＤＮＡ断片をクローニングした（図１０）。かかる取得されたｐＬａｂＡｍｐベクターは、いくつかの利点を有する。第１に、Ａｍｐは２３５９ｂｐのサイズを有するので、消化されたベクターと消化されていないベクター（１３４２８ｂｐ）との間をゲル上で識別することが可能である。第２に、アンピシリン・レプリカ・プレートの調製によって、未消化ベクターに由来する偽陽性を排除する可能性が生じる。変異した配列を保有する細菌は、アプラマイシンに対してのみ耐性であるが、ｐＬａｂＡｍｐを有する細菌は、アプラマイシンおよびまたアンピシリンに対して耐性である。
【０１８８】
ＬａｂＡ１の工学的操作のためのテンプレートの最適化
実施例２に記載したように、ｐＬａｂ構築物の欠点は、発現されたラビリントペプチンが、そのＮ末端に１つまたは２つのアミノ酸をさらに含むことである。これらのアミノ酸の存在は、生物学的活性を変更し得、かかるペプチドの精製における顕著な問題を引き起こす。この制限を克服するために、２つの主な戦略を調査した。第１の着想は、宿主プロテアーゼによって適切にプロセシングできるように、リーダー配列を改変することであった。新規ラビリントペプチンは次いで細菌培養物から直接単離され得、さらなる改変を全く必要としないので、これは、最良の選択肢をおそらく構成する。第２の戦略は、不正確にプロセシングされたペプチドの化学的分解に基づく。この方法はさらなる工程を必要とするものの、第１の方法よりも予測可能性が高い。ベクターを取得するために使用したクローニング戦略を図１１に示す。異種株ストレプトマイセス・リビダンス由来の未知のプロテアーゼは、最初にＡｌａ−Ａｌａ間で、次にＡｌａ−Ａｓｐ間で、ラビリントペプチンＡ１リーダー配列を切断することができる。しかし、天然の産生体アクチノマヅラ・ナミビエンシスについて観察されているように、これらは、Ａｓｐ−Ｓｅｒ間の切断を実施することができない。この観察に基づいて、ストレプトマイセス・リビダンスは、Ａｌａ−Ａｌａ結合を切断することができるという仮説を立てた。この仮説を調査するために、リーダー・ペプチド由来の最後のアミノ酸（Ａｓｐ）がＡｌａで置換された合成遺伝子ＳＧ３を設計した。ＳＧ３を、ｐＬａｂＡｍｐにクローニングして、ベクターｐＬａｂ＿ＳＧ３を作り出した（図１１において上に示したクローニング戦略に従った）。ストレプトマイセス・リビダンスにおけるｐＬａｂ＿ＳＧ３の発現は、この構築物の使用が、ＡＡ−ＬａｂＡ１およびＡ−ＬａｂＡ１の発現を可能にすることを示した。２〜３週間の増殖の後、ＡＡ−ＬａｂＡ１とＡ−ＬａｂＡ１との間の比は、主要産物としてＡ−ＬａｂＡ１を与えるようにシフトする。興味深いことに、より高齢の培養物では、ＬａｂＡ１に対応する分子量もまた見出すことができた。ｐＬａｂ＿ＳＧ３の使用は、任意のさらなるアミノ酸なしのＬａｂＡ１の発現を可能にするが、ＬａｂＡ１の量は、この構築物をさらなる研究に使用できないほど低かった。可能な切断部位の予測を可能にする他のデータは利用可能でなかったので、ストレプトマイセス・リビダンスにおいて完全にプロセシングされたラビリントペプチンを取得する戦略は、計画のこの段階で却下された。
【０１８９】
別の戦略は、Ｎ末端メチオニンを除去するＣＮＢｒを用いる後の反応を可能にするさらなるアミノ酸を有するラビリントペプチンを単離することであった（６０）。この方法に従うために、まず、リーダー・ペプチド中の最後のＣ末端アミノ酸としてＭｅｔを有するラビリントペプチンを発現させる必要がある。合成遺伝子ＳＧ２を順序付け、ｌａｂＡ１遺伝子において、ＡｓｐコドンをＭｅｔで置換し、ｌａｂＡ２遺伝子において、Ｍｅｔコドンを、リーダー・ペプチド由来の最後のＣ末端アミノ酸とプレペプチド由来の最初のアミノ酸との間に挿入した（図１３）。予期しない場合、ストレプトマイセス・リビダンス／ＳＧ２培養物において観察されたペプチド（図１２を参照のこと）：１週齢の培養物では、ＡＭ−ＬａｂＡ１、Ｍ−ＬａｂＡ１およびまたＬａｂＡ１が検出できた。より高齢の培養物（２〜３週齢）では、ほぼ全てのＡＭ−ＬａｂＡ１およびＭ−ＬａｂＡ１が、ＬａｂＡ１に変換された。興味深いことに、ＬａｂＡ２の発現は検出されなかった。Ｍｅｔの付加は、ＬａｂＡ２の発現を完全に無効にすると思われる。類似の結果がｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで得られた。
【０１９０】
ｐＬａｂ＿ＳＧ２の使用は、アクチノマヅラ・ナミビエンシスにおけるのと同じ方法で、ストレプトマイセス・リビダンスにおけるＬａｂＡ１の発現を可能にする。この構築物の別の利点は、ストレプトマイセス・リビダンス／ｐＬａｂ＿ＳＧ２培養物中にＬａｂＡ２が存在しないことであり、これがＬａｂＡ１の単離をより容易にしている。ＳＧ２を、以下の部位特異的変異誘発によって、ほぼ全てのＬａｂＡ１誘導体の生成のためのテンプレートとして使用した。
【０１９１】
ストレプトマイセス・リビダンス／ｐＬａｂ＿ＳＧ２およびストレプトマイセス・リビダンス／ｐＬａｂ＿ＳＧ３の上清において観察されたペプチド（ＮＤ−検出されず）：
【表２７】
2015502164.tif 000040
【０１９２】
ＬａｂＡ２の工学的操作のためのベクター・テンプレートの最適化
ＬａｂＡ１リーダー・ペプチドのタンパク質分解性プロセシングのために確立された方法がＬａｂＡ２に適用できるかどうかを検証することが重要であった。遺伝子ＳＧ３の使用（図１３、１４および１５）は、ＬａｂＡ２プレペプチドがＬａｂＡ１リーダー・ペプチドに付着された場合に、ペプチドＡＤ−ＬａｂＡ２の発現が可能であることを示した。別の工程は、ＭｅｔでのＡｓｐの置換（ＬａｂＡ１についてのＳＧ２と同様に）によってＳＧ３（Ｍ）を生成することであった。これは、ＰＣＲのためにプライマーＤ２０Ｍ＿ｆｗ（５’−ＣＡＧＣＴＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＣＴＧＧＡＧＣ−３’）およびＤ２０Ｍ＿ｒｖ（５’−ＧＣＴＣＣＡＧＴＣＧＧＡＣＡＴＧＧＣＧＧＣＣＧＡＧＣＴＧ−３’）を用い、テンプレートとしてＳＧ３を用いた部位特異的変異誘発によって達成した。ストレプトマイセス・リビダンス／ｐＬａｂ＿ＳＧ３は、リーダー配列由来のさらなるアミノ酸のないＬａｂＡ２を発現できたが、発現レベルは高くなかった。これは、野生型についても、ＬａｂＡ１の発現がＬａｂＡ２よりも高い異種株についても観察された。より高い発現レベルは、ｌａｎクラスター中の遺伝子の配置に起因している可能性がある。低いＬａｂＡ２発現の問題を克服するために、ｌａｂＡ１およびｌａｂＡ２の順序が交換された遺伝子ＳＧ６を設計した。実際、ｐＬａｂ＿ＳＧ６の使用によるＬａｂＡ２発現は、ｐＬａｂ＿ＳＧ３（Ｍ）を用いたときより高かった。ストレプトマイセス・リビダンス／ｐＬａｂ＿ＳＧ６は、図１６に示すように、ＬａｂＡ２だけでなくＬａｂＡ１誘導体もまた発現した。ＳＧ６を、以下の実施例に記載するように、ほぼ全てのＬａｂＡ２誘導体の生成に使用した。
【０１９３】
ストレプトマイセス・リビダンス／ｐＬａｂ＿ＳＧ３、ストレプトマイセス・リビダンス／ｐＬａｂ＿ＳＧ６およびストレプトマイセス・リビダンス／ｐＬａｂ＿ＳＧ３（Ｍ）の上清において観察されたペプチド：
【表２８】
2015502164.tif 000041
【０１９４】
単一のラビリントペプチンの発現
ＬａｂＡ１およびＬａｂＡ２は類似の分子であるので、単離および下流のプロセシングの目的のために、ＬａｂＡ１とＬａｂＡ２とのミックスを発現しないが、一度に単一のラビリントペプチン誘導体のみを発現する系を有することが有用である。かかる可能性を、２つの異なる方法で試験した。第１はｐＬａｂ／ＳＧ４の使用により、ｌａｂＡ１は存在したがｌａｂＡ２は存在しなかった。第２の構築物は、リーダー・ペプチドのＣ末端アミノ酸としてＭｅｔを有する、ＬａｂＡ１リーダー・ペプチドに付着されたＬａｂＡ２プレペプチドをコードする配列のみを含むｐＬａｂ／ＳＧ５であった（図１７を参照のこと）。ＬａｂＡ１誘導体の発現は、ストレプトマイセス・リビダンス／ｐＬａｂ＿ＳＧ４の培養物中では検出されず、ＬａｂＡ２誘導体もまた、ストレプトマイセス・リビダンス／ｐＬａｂ＿ＳＧ５培養物中では観察されなかった。これらの結果は、プレプロペプチドをコードする両方の遺伝子が、ラビリントペプチン発現に必要であることを示す。この現象は、未だ説明されていないが、おそらくはｍＲＮＡの安定化に起因する。１種のラビリントペプチンのみを発現するための最良の方法は、ＳＧ２遺伝子においてＬａｂＡ２についてなされたように、リーダーの配列とプレペプチドの配列との間にＭｅｔを挿入することであると思われる。このデータは、構造遺伝子のノック・アウトを必要とする補完戦略がおそらくは失敗することを実証している。
【０１９５】
ストレプトマイセス・リビダンス／ｐＬａｂ＿ＳＧ４およびストレプトマイセス・リビダンス／ｐＬａｂ＿ＳＧ５の培養物におけるラビリントペプチン誘導体の検出（ＮＤ−検出されず）：
【表２９】
2015502164.tif 000042
【０１９６】
まとめると、関連の研究において非常に頻繁に見出される３つの主要な問題を克服する、ラビリントペプチンの工学的操作のための方法を確立することが可能であった。まず最初に、設計された方法は、ｌａｂ遺伝子クラスター中に可能な限り少ない変化を導入するので、高レベルの発現が維持できた。これは、引き続くペプチド単離および生物学的活性試験に関して、非常に重要な態様である。さらに、クローニング戦略を、非常に効率的になるように設計した。ベクターｐＬａｂＡｍｐの使用により、変異した構造遺伝子を含む断片のクローニングのみによる、ラビリントペプチン・バリアントの高速かつ容易な生成が可能になる。小さいプラスミド（ｐＭＫまたはｐＭＡ）上のｌａｂＡ１遺伝子およびｌａｂＡ２遺伝子は、部位特異的変異誘発によって容易に操作される。この研究において提唱された系の使用により変異体を作り出す能力は、本明細書に記載される生成された新規ラビリントペプチンの数によって実証される。
【０１９７】
第３のおそらくは最も困難な問題は、任意のさらなるＮ末端オーバーハングのないラビリントペプチンを発現させることであった。この研究の間に、異種宿主における正確なリーダー・ペプチド除去を可能にする新たなプロセシング部位が発見された。最も重要なことに、導入された改変は、ＬａｂＫＣ酵素によるプロセシングに対して検出可能な影響を有さなかった。この戦略は、リーダーと構造ペプチドとの間にＭｅｔ残基を導入し、リーダー・ペプチドを交換することによって、野生型ＬａｂＡ１およびＬａｂＡ２の産生を完全に制御することができた。構築物を工学的に操作して、ただ１種のラビリントペプチンの産生を強制することも可能であった。
【０１９８】
提示された結果は、ランチビオティック産生のための異種発現系の確立およびこれらの化合物のｉｎ  ｖｉｖｏ工学的操作が、容易かつ単純な課題ではないことをさらに実証している。最良の戦略が、生化学的直感を試行錯誤アプローチと組み合わせることであることは、類似の研究においても真であると思われる。
【０１９９】
〔実施例４〕
新たなラビリントペプチンの工学的操作
生物学的活性を示す天然産物の新たなバリアントを生成することが常に望まれる。体系的に導入された変化は、作用様式の理解およびさらには薬物候補に関するファルマコフォア・モデルの構築において有益であり得る。さらに、合理的に設計された改変は、活性、安定性またはＡＤＭＥプロファイルなどのいくつかの興味深い特性を調整することができる。ランチビオティックは、そのリボソーム起源およびその生合成に関与する酵素の乱雑な基質特異性（６１〜６２）に起因して、多数の変化を受け入れる可能性を有する、工学的操作のための良好な標的であると思われる。改変は、異なる方法、例えば、化学合成、産生株の遺伝子改変、天然に産生される化合物に対する化学的改変および半合成を使用することによって、導入できた。示された研究のために、主に合成の試みに関連する困難の結果として、生物学的アプローチを選択した。しかし、ランチビオティックの首尾よい合成の報告が存在し、例えば、ナイシンＡ（６３）およびラクトシン（ｌａｃｔｏｃｉｎ）Ｓ（６４）の全合成が、首尾よく実施された。それにもかかわらず、これらの方法は、なお高価で多工程であり、薬物開発目的のために十分に効率的ではない。
【０２００】
ランチビオティックの工学的操作は、発現系が、構造遺伝子だけでなく、生合成酵素タンパク質、免疫タンパク質および調節タンパク質をコードする遺伝子についても開発される必要があるという事実に主に起因して、多くの障害に直面する。十分に開発された発現系でさえ、最終産物の首尾よい発現を保証するものではない。適用され得る変異の数が限定されることが示されている（６５）。多くの設計された変異体は、ペプチドと生合成酵素または分泌機構との乱された相互作用におそらく起因して、産生できなかった（６５）。全てのこれらの制限にもかかわらず、多種多様の異なるランチビオティック・バリアントが報告され特徴付けられており、最も著名な例は以下である：ナイシン（５０〜５１）、Ｐｅｐ５（５４）、エピデルミン（５３）、ムタシンＩＩ（５２）、アクタガルジン（４９）、ラクチシン（ｌａｃｔｉｃｉｎ）３１４７（６６）、メルサシジン（ｍｅｒｓａｃｉｄｉｎ）（６７）。残念ながら、ほとんどの場合において、取得された誘導体は、改善された特性を示さなかった。最も著しい変異体の１つを、イソロイシンでのグルタミン酸（Ｇｌｕ４）の置換によって、スブチリンについて調製した。この誘導体は、天然ペプチドよりもおよそ３〜４倍高い活性を有し、化学的安定性および生物学的安定性における５７倍の増加を示す（６８）。いくつかの目覚ましい変異体を、ナイシンについても調製した。Ｄｈａ５のＤｈｂへの変換によって調製されたナイシン誘導体は、野生型ナイシンＺよりも高い、酸触媒された化学的分解に対する抵抗性を有する（６８）。同様に、中性ｐＨでのナイシンの溶解度は、変異誘発によって増強されていた（６８）。このランチビオティックに関する研究により、遺伝子工学的操作の使用が、特定の標的生物に関して、化合物の抗菌活性をモジュレートできることが実証された。ナイシン変異体Ｇ１８Ｔ／Ｍ１７Ｑは、バチルス・セレウスおよびストレブトコッカス・サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に対し、ナイシンよりも活性がおよそ４分の１の低さであったが、ミオティス・フラバス（Ｍ．ｆｌａｖｕｓ）に対し、野生型ナイシンよりも２倍活性が高かった（６８）。
【０２０１】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの変異体の生成に関する問題（例えば、免疫タンパク質および調節タンパク質は、機能的でなければならず、変異したペプチドは、プロテアーゼによって分解され得る）を克服するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを開発した。このｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの別の利点は、そこで使用されるランチビオティック生合成酵素が、ｉｎ  ｖｉｖｏ方法におけるよりもさらに高い柔軟性を示すことである。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアプローチによって生成される生合成中間体は一般に、分子レベルでの生合成機構の解明を可能にする生体分析法によってより具体的に特徴付けることができる（６９）。このエリアにおける成功は、ラクチシン４８１（６１）、ヌカシン（ｎｕｋａｃｉｎ）ＩＳＫ−１（７０）、ムタシンＩＩ（７０）、ルミノコッシン（ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｉｎ）Ａ（７０）、ナイシン（７１）、ハロデュラシン（ｈａｌｏｄｕｒａｃｉｎ）（７２）、ラビリントペプチン（７３）、ベネズエリン（ｖｅｎｅｚｕｅｌｉｎ）（７４）およびプロクロロコッカスＭＩＴ９３１３由来のランチペプチド（ｌａｎｔｉｐｅｐｔｉｄｅ）（７５）についての、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおける活性の再構築を含む。いくつかの場合には、複数の試みにもかかわらず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を再構築することは不可能であった（報告された例：ＲａｍＣ、ＮｉｓＡ）。これらの利点が、限定量の最終産物によってしばしば制限されるという事実もまた、言及に値する。
【０２０２】
ランチビオティックの工学的操作を非常に興味深いものにしている別の理由は、化学的安定性、タンパク質分解安定性および代謝安定性を提供する特徴的な構造モチーフであるランチオニンの存在である。いくつかの研究により、環状ランチオニンが、非ランチビオティック・ペプチドの安定性および活性の両方を増加させることが示されている（７６〜７７）。これは、このモチーフが、新たな治療ペプチドの設計のための構造的コアとして使用され得ることを示唆している。さらに、ラビリントペプチン構造中で同定された、最近報告されたラビオニン・アミノ酸は、さらにより高いコンフォメーション的制約を提供し、神経障害性疼痛およびウイルス疾患に対する新規生物学的活性を担うと考えられる。上記実施例において記載したように、本発明者らは、それぞれＬａｂＡ１およびＬａｂＡ２の生物工学的操作のためのテンプレートとして容易に使用され得るベクターｐＬａｂ＿ＳＧ２およびｐＬａｂ＿ＳＧ６の構築に成功した。これは、ＳＡＲ研究目的のためおよび改変酵素の基質特異性を試験するための、ラビリントペプチン様ペプチドの発現を可能にする。私が知る限り、これは、抗菌活性とは異なる生物学的機能を実証するランチビオティックの工学的操作の最初の報告である。これらは、ラビオニンを含む変異体の生成に関する最初のｉｎ  ｖｉｖｏ研究でもある。
【０２０３】
変異体の生成のための戦略
全てのラビリントペプチン誘導体を、図１８に示したのと同じ方法で生成した。第１の工程は、ＰａｓＩおよびＥｃｏ４７ＩＩＩを用いた制限消化による線状化ベクターｐＬａｂＡｍｐの調製であった。次いで、ｌａｂ遺伝子クラスター（１３．４ｋｐｂ）を含み構造遺伝子を含まないベクターの断片を、アガロース・ゲルから抽出した。アガロース・ゲル単離後のＤＮＡ回収からの収量は、通常は非常に低いので、クローニング実験のほとんどを、ＧｅｎｅＪＥＴ（商標）ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を用いて精製された制限混合物全体を使用して実施した。所望の挿入物を、Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  １およびＩｎｆｕｓｉｏｎ＿ｒｖプライマーを使用した、適切なテンプレート・プラスミドからのＰＣＲ反応によって提供した。反応条件を最適化して、単一の産物のみを取得し、これを直接使用して、ライゲーション非依存的クローニング・アプローチ（ＬＩＣ、（１３〜１４））を用いて最終構築物（ｐＬａｂ＿Ａ１＿ｍまたはｐＬａｂ＿Ａ２＿ｍ、ここで、ｍは、それぞれＬａｂＡ１またはＬａｂＡ２中の改変を示す）を調製した。全ての構築物を、配列決定および／または制限消化によって検証した。多くの場合、高いＧＣ含量および二次構造の存在に起因して、ｐＬａｂ＿Ａ１／２＿ｍを用いた配列決定反応は失敗した。この問題を克服するために、ラビリントペプチン・プレプロペプチドをコードする領域を、Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  １およびＩｎｆｕｓｉｏｎ＿ｒｅｖプライマーを用いたＰＣＲによって増幅し、単離し、プライマーＩｎｆｕｓｉｏｎ  １を用いて配列決定した。
【０２０４】
２つの主要な型のテンプレート・プラスミドを使用して変異体を生成した。ｌａｂＡ１およびｌａｂＡ２の部位特異的変異誘発を実施するために、構造遺伝子を、上記プラスミド上に提供した：ｐＭＫ＿ＳＧ２およびｐＭＫ＿ＳＧ６。これらのベクターの小さいサイズ（ｐＭＫ＿ＳＧ２：２６７０ｂｐ、図３５Ａを参照のこと；ｐＭＫ＿ＳＧ６：２６６４ｂｐ、図３５Ｂを参照のこと）は、アミノ酸の容易な交換を可能にする。プライマーを設計する間、ストレプトマイセスのコドン使用頻度（以下を参照のこと）を検討し、最も高頻度のコドンを使用した。全ての構築物を、ｐＭＡプライマーを用いた配列決定によって確認した。正確な挿入物を、上記のように、ＰＣＲによって増幅し、最終構築物の調製に使用した。より複雑なバリアントを調製するために使用した第２の型のプラスミド・テンプレートを、プラスミドｐＭＫ＿ＳＧｘ（「ｘ」は、バリアント番号を指す）上に提供した。この場合、ＰａｓＩ部位とＥｃｏ４７ＩＩＩ部位との間の構造遺伝子は、ＤＮＡの酵素的合成と化学合成との組合せによって調製し（７８）、ｐＭＫプラスミド中に既にクローニングされたＧＥＮＥＡＲＴ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ  Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。
【０２０５】
ストレプトマイセス属のコドン使用頻度（ＣＵ）（８８）。ＣＵ−ストレプトマイセスにおけるコドン使用頻度（％）。
【０２０６】
【表３０】
2015502164.tif 000043
【０２０７】
本研究において変異コードを指定するために使用した用語の意味の説明：
【表３１】
2015502164.tif 000044
【０２０８】
ＬａｂＡ１およびＬａｂＡ２のアラニン・スキャニング変異誘発
構造−活性相関（ＳＡＲ）研究は、標的分子の異なる部分の重要性およびその生物活性に対する寄与を評価する。これは、その特性を改善し得る後の合理的改変を可能にする。ＳＡＲ研究は、薬物開発プロセスの間のリード化合物のファルマコフォア・モデルを構築するためにも有用であり得る。ＳＡＲ研究を実施するための最も重要な要件は、構造的アナログの入手可能性である。リボソーム合成されたペプチドの場合、新たなペプチドの生成をもたらす遺伝子操作は、合成アプローチよりもより効率的であることが非常に多い。しかし、最も重要な問題は、翻訳後修飾機構による認識および適切なプロセシングである。ペプチドおよびタンパク質のＳＡＲ研究のために最も広く使用される戦略の１つは、アラニン・スキャニングであり、ここでは、関連の残基が、Ａｌａによって１つずつ交換される。ほとんどの場合、Ａｌａは、二次構造を乱すことも、極端な立体的変化もしくは静電的変化を導入することもないので、合理的な選択肢である（７９）。
【０２０９】
ラビリントペプチンの変異体を生成するために上に提示された戦略を、アラニン・スキャニング手順に適用した。調査したペプチドは、興味深い抗ウイルス活性を示し、神経障害性疼痛（マウス・モデル）に対する顕著な活性を示すので、この実験は、引き続くＳＡＲ研究のための出発点である。さらに、アラニン・スキャニングはこの場合、単離およびさらなる活性研究にとって重要な問題である、生合成のための各残基の重要性に関する情報をさらに提供する。以前の研究は、ランチオニン形成に関与する残基が改変された場合、ランチビオティック変異体の産生レベルが、顕著に低減されたまたは完全に抑制されたことを示した（６６）。これは、ランチオニン環の存在が、分泌系による認識にとって重要であること（５３、８０）、および分解を抑制するのに必要なタンパク質分解安定性を提供し得ることを示している。これらの知見に基づき、この研究では、環（Ｘ線結晶構造によれば、ランチオニン、ラビオニンおよびジスルフィド）の形成に関与しないアミノ酸のみを、Ａｌａで置換した。
【０２１０】
ＬａｂＡ１についての９つの変異体およびまたＬａｂＡ２についての９つの変異体の生成を達成した。２つのＬａｂＡ１変異体（ＬａｂＡ１＿Ｇ１２ＡおよびＬａｂＡ１＿Ｔ１８Ａ）について、部位特異的変異誘発実験を数回繰り返しても、必要な変異を導入することは不可能であった。全ての実施した変異を図１９にまとめる。変異したペプチドの産生を検出するために、ＬＣ−ＭＳを使用した。各場合において、液体培養物中およびＭＳプレート由来の抽出物中のペプチドの存在が検証された。興味深いことに、ＬａｂＡ１変異体およびＬａｂＡ２変異体は、液体培養物中で観察された産生において、かなりの差異を示した。ＬａｂＡ１変異体に対応する分子量は、３つの試験した培地全て（ＹＥＭＥ、Ｒ２ＹＥ、ＮＺアミン）において見出された。ＬａｂＡ２変異体は、ＮＺアミン培地中でのみ十分な量で産生された（ＴｒｐをＡｌａで置換した変異体を除く）。全ての場合において、観察された分子量は、理論的に計算された分子量と一致していた。他の工学的に操作されたペプチドについてなされた観察と一致して、ＬａｂＡ１変異体およびＬａｂＡ２変異体の産生収量は、かなり変動した（８１）。図２０は、ＮＺアミン培地中での８日間および２１日間の増殖の後の、ＬａｂＡ１およびＬａｂＡ２のアラニン変異体の産生レベルにおける変化を示す。ラビリントペプチン産生に対する影響を有し得るさらなる因子を排除するために、全ての培養を同じ日に開始し、同じ型のフラスコ中で細菌を増殖させた。提示された定量は、導入された変異がＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ調査におけるイオン化効率を変化させないという仮説により、ＬＣ−ＭＳによって実施した。測定は、ポジティブ・モードで実施し、変異した残基はどれも塩基性でなかったので、これは、非常に合理的な仮説であった。ＬａｂＡ１ならびにＬａｂＡ２について、トリプトファンがアラニンで置換された全ての変異体は、微量でのみ産生された。この結果は、これらのペプチドが、修飾系および／または分泌系によって効率的には認識されないことを示し得る。代替的な説明は、これらの残基が、環形成に必要な適切なペプチド・コンフォメーションにとって重要であることであり得る。別の興味深い知見は、ＬａｂＡ２のＴｒｐ３に関する。図１９に示すように、アラニンでのこの残基の置換は、ＬａｂＡ２のＡ環を、ＬａｂＡ１のＡ環と非常に類似したものにする（ＬａｂＡ１についてジペプチドＡｓｎ−ＡｌａおよびＬａｂＡ２についてＡｓｐ−Ａｌａ）。しかし、この場合であっても、両方のペプチドが同じ酵素によって改変されるので、なおさらに驚くべきことに、Ｔｒｐ置換後に産生は顕著に抑制される。
【０２１１】
ＮＭＲ分光法による、ＬａｂＡ２から誘導された変異体ペプチドＬａｂＡ２＿Ｌ１４Ａの構造的特徴付け
変異体ペプチドＬａｂＡ２＿Ｌ１４Ａ（Ｌｅｕ１４がＡｌａによって置換されている；図２８を参照のこと）中の置換の位置を、天然のラビリントペプチンＡ２について取得されたＮＭＲスペクトル（図２９）との比較によって同定した。ＮＭＲスペクトルの分析は、部分的に極端な線広がりによって妨げられる。部分的プロトンおよび炭素割り当てを、２８５ＫにおけるＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ８．０、５０ｍモル濃度）中でのＬａｂＡ２＿Ｌ１４ＡおよびＬａｂＡ２の化学シフトを示す以下の表に与える：
【０２１２】
【表３２】
2015502164.tif 000045
【０２１３】
【表３３】
2015502164.tif 000046
【０２１４】
炭素の化学シフトは、ＨＳＱＣスペクトルから取得されたものである。ＴＳＰは内部標準として使用されてきた（1Ｈについて０．００ｐｐｍ、13Ｃについて−１．７６ｐｐｍ）。第４級炭素は割り当てられていない（ＨＭＢＣスペクトルなし）。ＬａｂＡ２およびその変異体ＬａｂＡ２＿Ｌ１４ＡについてのＨＳＱＣスペクトルの比較（図３０）により、ＬａｂＡ２＿Ｌ１４Ａが１４位で置換されている（即ち、ロイシンがアラニンで置き換えられている）ことが明らかになった。
【０２１５】
Ｓｅｒ／Ｓｅｒ／Ｃｙｓモチーフのモジュレーション
ラビリントペプチンの任意の合理的な改変のために、単一残基の重要性についての知識だけでなく、より劇的な変化に対する構造感受性についての一般的な情報もまた、重要である。Ｘ線構造は、ｌａｂ遺伝子クラスターに対する相同性を示す遺伝子クラスター由来の構造ペプチドのアラインメントと一緒になって、このペプチド中に２回現れるＳｅｒ−Ｘｘｘ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ−（Ｘｘｘ）n−Ｃｙｓモチーフを示す多数の保存された残基を明らかにする。このモチーフは、この構造中の重要な環形成コアを示す。ラビリントペプチン様ペプチドは、可変性のＢ環、Ｂ’環および保存されたＡ環、Ａ’環からなると考えられる。環が実際に変化を受け入れる程度を決定するために、拡張されたまたは低減された環サイズを有するバリアントを生成した。モデル系として、ＬａｂＡ１を用いた変異体のみを、図２１および２２に示すように調製した。適切な合成遺伝子が順序付けられるまたはｐＭＫ＿ＳＧ２ベクターが部位特異的変異誘発によって改変される、以前に記載された戦略を選択した。挿入物を増幅するために、プライマーＩｎｆｕｓｉｏｎ  １およびＩｎｆｕｓｉｏｎ  ２を使用した。Ａ環およびＡ’環のサイズが増加または減少され得るかどうかを検証するために、６つの異なるＬａｂＡ１バリアントを生成した。環サイズを増加させるために、Ａ環について２つの異なる位置における３つの異なるアミノ酸（Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ａｌａ）を、Ａ’環について単一の位置における１つのアミノ酸（Ａｌａ）を、挿入のために選択した。環サイズを減少させるために、ＡｌａおよびＧｌｙを、それぞれＡ環およびＡ’環において除去した。これらのペプチドはいずれも、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析によって細菌培養物中では観察されなかった。
【０２１６】
Ｔｈｒによる、Ｌａｂ形成に関与するＳｅｒの置換
ＬａｂＫＣ酵素がＳｅｒ→Ｔｈｒ置換を受容できるかどうかを調査することは、興味深いことであった。本発明者らは、環形成に関与するＳｅｒ残基（１位、４位および１３位）がＴｈｒによって置換されたＬａｂＡ１変異体を作り出した。ＬＣ−ＭＳによる１位および１３位におけるＴｈｒ変異体の発酵サンプルの分析は、ランチビオティック産生の証拠を示さなかったが、これは、脱水または環形成機構のいずれかに対する高い特異性を示唆した。変異体ＬａｂＡ１＿Ｓ４Ｔについて、微量の予測されたペプチドのみが検出された。
【０２１７】
ＬａｂＡ１の部分構造の発現
一般に、ペプチドは、分解およびバイオアベイラビリティに関する問題に主に起因して、劣った薬物である（８２）。大きい分子量（ＬａｂＡ１について２０７３．７ＤａおよびＬａｂＡ２について１９２２．７Ｄａ）に関して、生物活性を保持しながらラビリントペプチンのサイズを低減させることが、非常に望ましい。ここで、本発明者らは、サイズ低減に関する結果を示す。ＬａｂＡ１＿ｗｅｓｔを発現させるために、停止コドンを、部位特異的変異誘発によってＣｙｓ８の後に導入した。実験を、ｐＭＫ＿ＳＧ２をテンプレートとして用いて実施した。ＬａｂＡ１＿ｅａｓｔを発現させるために、合成遺伝子ＳＧ７を順序付けた。ｐＬａｂ＿ＳＧ７は、ＬａｂＡ１についてのリーダー・ペプチドを有するＬａｂＡ１＿ｅａｓｔの発現を可能にし、ここで、リーダー・ペプチド由来の最後のＣ末端アミノ酸はＭｅｔで置換されていた。驚くべきことに、ＬａｂＡ１＿ｅａｓｔペプチドもＬａｂＡ１＿ｗｅｓｔペプチドも、適切なベクターを保有する異種宿主ストレプトマイセス・リビダンスによって発現されなかった。これらの発現問題を克服するために、合成遺伝子ＳＧ２０を順序付けた。これは、さらなるＭｅｔ残基を有するＬａｂＡ１＿ＭおよびＬａｂＡ２＿Ｍの発現を可能にした。ＬａｂＡ１＿Ｍの場合、Ｍｅｔ残基を、環Ｂと環Ｃとの間に挿入した。ＬａｂＡ２＿Ｍについて、環Ｃを、ＣｙｓのＭｅｔでの置換によって除去した。これらの構築物では、短縮型バリアントを取得するために、化学的切断を導入すべきである。ＬａｂＡ１＿Ｍの発現は観察されなかった。しかし、ＬａｂＡ２＿Ｍを発現させることは可能である。この産物は、ＭｅｔのＣ末端側で切断するＣＮＢｒ（８９）を用いた化学反応による切断に供することができる。
【０２１８】
Ｓｅｒ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ／Ｃｙｓモチーフ
ラビリントペプチンの生合成機構は、Ｓｅｒ−Ｘｘｘ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ−（Ｘｘｘ）n−Ｃｙｓコアを有するラビオニン・モチーフを生成することができる。さらなる実験において、本発明者らは、同じ機構がＳｅｒ−Ｘｘｘ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ−Ｘｘｘ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ−Ｘｘｘ−Ｘｘｘ−Ｘｘｘ−Ｃｙｓから「二重ラビオニン環」を形成できるかどうかを検証することに興味を持った。この問題に回答するために、合成遺伝子ＳＧ１５を使用した。ｐＬａｂ＿ＳＧ１５は、さらなるＶａｌ−Ｓｅｒ−Ａｌａトリペプチドが環Ｂ中に導入されたＬａｂＡ１＿Ｗ６ｉｎｓＶＳＡおよびさらなるＳｅｒが環Ｂ’中に導入されたＬａｂＡ１＿Ｐ１６ｉｎｓＳをコードする。ＬａｂＡ１＿Ｗ６ｉｎｓＶＳＡの発現もＬａｂＡ１＿Ｐ１６ｉｎｓＳの発現も観察されず、これは、このモチーフが、さらなるラビオニン環を形成することができないだけでなく、ネイティブ様架橋形態の産生もまた妨害することを意味している。
【０２１９】
さらなる置換
ラビリントペプチンの翻訳後修飾の間に、全ての利用可能なＳｅｒおよびＴｈｒ（Ａ’環内に位置するものを除く）は脱水を受ける。ラビリントペプチン生合成装置がさらなるＳｅｒもまた脱水し得るかどうかの問題に取り組むために、変異体ＬａｂＡ１＿Ｔ１１ＳおよびＬａｂＡ１＿Ｖ１５Ｓを調製した。この研究を実施するための主な理由は、構造中のデヒドロアミノ酸の導入の可能性を調査することであった（８３）。ＬａｂＡ１＿Ｔ１１Ｓを、ｐＬａｂ＿ＳＧ１６構築物の使用によって発現させた。ＬａｂＡ１＿Ｖ１５Ｓをコードするベクターを、テンプレートとしてｐＭＫ＿ＳＧ２を用いプライマーＬａｂＡ１＿Ｖ１５Ｓ＿ｆｗ／ｒｖを用いて、部位特異的変異誘発によって調製した。ＭＳ分析により、ＬａｂＡ１＿Ｔ１１Ｓ中ならびにＬａｂＡ１＿Ｖ１５Ｓ中のさらなるセリンが、脱水されていないことが明らかになった。Ｒｉｎｋら（８４〜８５）による研究における３７のランチビオティックの一次構造の分析は、スレオニンよりも高頻度でセリン残基が脱水を免れることを示した。これらの知見は、ラビリントペプチンについて示された結果と一致している。しかし、ＬａｂＫＣがセリン／スレオニンの位置の間を識別し得ること、およびより多くの変異体が最終結論を引き出すために調査されなければならないこともまた、考慮に入れるべきである。さらなる置換の影響を同様に調査した（図２３を参照のこと）。ベクターＬａｂＡ１＿Ａ３Ｈ／Ｅ７Ｒ／Ｗ６Ｙ／Ｓ４Ａ／Ｓ１３Ａを生成するためのＬａｂＡ１への適切な変異の導入を、部位特異的変異誘発によって実施した。テンプレートとして、ｐＭＡ＿ＳＧ２を使用した。Ａｌａ３をＨｉｓで置換して、イオン化可能なアミノ酸の付加がラビリントペプチン生合成の負の影響を有し得るかどうかを検証した。かかる置換が許容されることを示す、ＬａｂＡ１＿Ａ３Ｈが検出された。しかし、単回の実験から取得された情報を一般化することはできない。負に荷電したＧｌｕ７を、正に荷電したＡｒｇで置換した。ＬａｂＡ１＿Ｅ７Ｒの産生は検出されず、これは、この置換が生合成を妨害したことを示唆している。Ｔｒｐ６→Ｔｙｒの置換を有する変異体（ＬａｂＡ１＿Ｗ６Ｙ）は、Ｔｒｐ６→Ａｌａ（ＬａｂＡ１＿Ｗ６Ａ）よりもかなり高い収量で産生され、これは、トリプトファンの置換によってラビリントペプチンの多様性を増加させることが可能であるが、全ての置換が許容されるわけではないことを示している。この知見は、翻訳後プロセシングおよび生合成機構のために分子中の各アミノ酸の重要性を理解することを全体として必要とするので、ランチビオティックの合理的な生物工学的操作が、単純な課題ではないことを示している。
【０２２０】
４位および１３位におけるＳｅｒをＡｌａで置換して、ラビオニン形成の破壊が、Ｓｅｒ１とＣｙｓ８との間およびＳｅｒ１０とＣｙｓ１９との間の両方でのランチオニン環の形成を生じるかどうかを検証した。ＬａｂＡ１＿Ｓ４ＡおよびＬａｂＡ１＿Ｓ１３Ａの発現は観察されなかった。
【０２２１】
環Ｃ変異についての研究
Ｃ環の柔軟性を確認するために使用した全ての変異体を、テンプレートとしてｐＭＫ＿ＳＧ２を用いる部位特異的変異誘発によって生成した。図２４に示した全てのペプチドの発現が観察された。ＬａｂＡ１＿Ｃ２０ｄｅｌを検出する可能性は、ジスルフィド架橋が、ストレプトマイセス・リビダンスのタンパク質分解性環境において安定なラビリントペプチンを取得するために必要でないことを示している。ＬａｂＡ１＿Ｓ１ｉｎｓＣは、分子の西部分中にもジスルフィド架橋を作り出す可能性を示す。この場合、ジスルフィド結合の存在を、観察された分子量（２つのプロトンに対応する約２Ｄａ）にのみ基づいて推論した。変異体ＬａｂＡ１＿Ｓ１０ｉｎｓＡおよびＬａｂＡ１＿Ｃ２０ｉｎｓＡは、環Ｃのサイズは増大され得るが、これらのバリアントの産生レベルは顕著により低かったことを示している。
【０２２２】
ラビリントペプチン・ハイブリッドの生成
この仕事において実施された研究の大多数は、ＬａｂＡ１に関している。この状況では、ＬａｂＡ１について収集された知識がＬａｂＡ２の工学的操作にも使用できるかどうかを評価することが重要であった。この問題に対する回答を提供するために、遺伝子ＳＧ１１を合成した。ｐＬａｂ＿ＳＧ１１は、それぞれ未改変のＬａｂＡ１およびＬａｂＡ２リーダー・ペプチドを伴って発現されるＬａｂＡ１／Ａ２（図２５）およびＬａｂＡ２／Ａ１（図２５）ハイブリッド分子をコードする。両方のペプチドが、ストレプトマイセス・リビダンス／ｐＬａｂ＿ＳＧ１１の培養物中で検出され、これは、ＬａｂＡ１についてなされた観察が、ＬａｂＡ２にも当てはまり得ることを示唆した。この研究において調査された別の興味深い態様は、ラビリントペプチンを繰り返し拡張することが可能であるかどうかを評価することであった。これは、基質のポリマー性の性質に起因する可能性があり得た。ＬａｎＭについて提示された生合成酵素の作用の配分様式（６９）もまた、この可能性を支持する。合成遺伝子ＳＧ９およびＳＧ１０を設計して、図２６に示すペプチドを生成した。ＬａｂＡ１＿ＡＢＡ’Ｂ’ＡＢＡ’Ｂ’もＬａｂＡ１＿ＡＢＡ’Ｂ’ＡＢＡ’Ｂ’も検出できなかった。ラビリントペプチン生合成機構が、クラスＩＩＩに属するサイレントなランチビオティック（それに関する構造および産生条件が未知である、天然の供給源から単離することが困難であるもの）の産生に使用できるかどうかを試験するために、合成遺伝子ＳＧ８を順序付けた。ＳＧ８は、仮説上のランチビオティックＲａｍＳ２をコードする。これは、ストレプトマイセス・スカビエス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｃａｂｉｅｓ）ゲノムＤＮＡのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析の間に見出された。ＲａｍＳ２の生合成を担う遺伝子クラスター全体は、ｌａｂ遺伝子クラスターに対する相同性を示す。ストレプトマイセス・リビダンス／ｐＬａｂ＿ＳＧ８由来の上清およびまた細胞抽出物の分析は、ＲａｍＳ２に対応し得るペプチドの産生を明らかにしなかった。
【０２２３】
まとめると、アラニン・スキャニング研究により、環形成に関与しないアミノ酸のほとんどが、Ａｌａで容易に置換できることが示された。唯一の例外は、Ａｌａ置換がラビリントペプチンの産生を阻害したまたは微量での産生を生じた、Ｔｒｐ残基である。しかし、産生は、Ｔｒｐ残基をＴｙｒで置換したときに検出され、これは、これらの位置の保存が絶対的でない可能性があることを示している。ＧｌｎのＡｒｇへの置換は、産生を抑制する。別の調査された態様は、環形成のためのサイズ要件に関するものであった。環Ａおよび環Ａ’のサイズにおけるいずれの変化も許容されないことが実証された。しかし、環Ｂおよび環Ｂ’は、より弾力性があり、５、６、７、８員環が作り出された。ジスルフィド結合環Ｃが必要とされないことまたはジスルフィド結合環Ｃが分子の西部分に移動され得ることもまた示された。二重ラビオニン（２つの第４級炭素原子を含む）を形成する試みは、分子全体の任意の拡張同様、失敗した。
【０２２４】
生物工学的に操作されたラビリントペプチンの予測された分子量および観察された分子量のまとめ（ＮＤ−検出されず）：
【表３４】
2015502164.tif 000047
【０２２５】
【表３５】
2015502164.tif 000048
【０２２６】
【表３６】
2015502164.tif 000049
【０２２７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおけるラビリントペプチンＡ２ならびにその構造的アナログＬａｂＡ２＿Ｌ１４ＡおよびＬａｂＡ２＿Ｆ１５Ａの抗疼痛活性の評価（ｈＰ２Ｘ４＿ＨＥＫ−ＦＩＴＲ株化細胞に対するＬａｂＡ２、ＬａｂＡ２＿Ｌ１４ＡおよびＬａｂＡ２＿Ｆ１５ＡのＩＣ５０決定）
鎮痛剤としてのラビリントペプチンＡ２ならびにその誘導体、特にＬａｂＡ２＿Ｌ１４ＡおよびＬａｂＡ２＿Ｆ１５Ａの使用を、Ｐ２Ｘ４受容体に対するその阻害効果に基づいて、神経障害性疼痛について調査した（Ｎａｇａｔａ  Ｋら、２００９）。
【０２２８】
組換えヒトＰ２Ｘ４受容体を、ＨＥＫ細胞において発現させた（ｈＰ２Ｘ４＿ＨＥＫ−ＦＩＴＲ）。ｈＰ２Ｘ４発現を、ドキシサイクリン１μｇ／ｍｌを用いて２４時間〜４８時間誘導した。パッチ・クランプ実験は、ａｘｏｐａｔｃｈ−２００Ｂ増幅器およびｐＣｌａｍｐ  ｖ１０取得ソフトウェア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、標準的な条件下で実施した。細胞を、（単位はｍＭ）１３０  ＣｓＣｌ、４  ＮａＣｌ、１  ＭｇＣｌ2、１  ＣａＣｌ2、１０  ＥＧＴＡ（遊離Ｃａ2+＝６．７ｎＭ）および１０  ＨＥＰＥＳ（ＣｓＯＨを用いてｐＨ７．４）からなる外部溶液を用いて、継続的に表面灌流した。これを、（単位はｍＭ）１４５  ＮａＣｌ、４  ＫＣｌ、２  ＣａＣｌ2、１  ＭｇＣｌ2および１０  ＨＥＰＥＳ（ＮａＯＨを用いてｐＨ７．４）からなる低二価外部溶液で置き換えた。１０秒毎に１０μＭ  ＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ）の２５０ｍｓの適用を実施した。電流の安定化が達成された時点で、漸増濃度のラビリントペプチン（ＬａｂＡ２、ＬａｂＡ２＿Ｌ１４ＡおよびＬａｂＡ２＿Ｆ１５Ａ）を灌流した（０．３〜９０μＭ）。電流を、−６０ｍＶの保持電位で測定した。
【０２２９】
結果を、Ｏｒｉｇｉｎ７．５ソフトウェアを使用して計算した（図２７）。ＬａｂＡ２およびＬａｂＡ２＿Ｌ１４Ａは、それぞれ６．２μＭおよび３０μＭのＩＣ５０値でヒトＰ２Ｘ４受容体機能を阻害することが見出された。ＬａｂＡ２＿Ｆ１５ＡについてのＩＣ５０値は、使用した条件下では決定できなかった。この結果は、ＬａｂＡ２＿Ｆ１５ＡがＰ２Ｘ４受容体を遮断できないか、または抗疼痛薬物としての使用のためにそれを判別する高いＩＣ５０値ではあるがかかる受容体を遮断できることを示唆している。ＬａｂＡ２およびＬａｂＡ２＿Ｌ１４Ａは、疼痛、特に神経障害性疼痛の処置において有用であることが示された。
【０２３０】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３０Ｄ】
2015502164.tif 000097
【図３１】
2015502164.tif 000098
【図３２】
2015502164.tif 000099
【図３３】
2015502164.tif 000100
【図３４】
2015502164.tif 000101
【図３５】
2015502164.tif 000102
【図３６Ａ】
2015502164.tif 000103
【図３６Ｂ】
2015502164.tif 000104
【図３６Ｃ】
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【図３６Ｄ】
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【図２】
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【図５】
2015502164.tif 000108
【図６】
2015502164.tif 000109
【配列表】
2015502164000001.app
【国際調査報告】
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2015502164.tif 000111
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2015502164.tif 000113
2015502164.tif 000114
2015502164.tif 000115
2015502164.tif 000116