(57)【要約】  本発明は、対象に、シアノバクテリアのオシラトリア属種の細胞から得ることができる極性糖脂質（ＣｙＰ）を含む組成物を投与することを含む、疼痛および／または慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を処置および／または予防する方法に関する。
2015510905.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
疼痛および／または慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の処置および／または予防に使用するための、シアノバクテリアのオシラトリア属種の細胞から得ることができる極性糖脂質（ＣｙＰ）を含む組成物。
【請求項２】
前記極性糖脂質が、リポ多糖（ＬＰＳ）である、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項３】
前記極性糖脂質が、シアノバクテリアのオシラトリア属種から抽出される、請求項１または２に記載の使用のための組成物。
【請求項４】
前記極性糖脂質が：
ａ）前記シアノバクテリアを用意する工程；
ｂ）前記シアノバクテリアから極性糖脂質を抽出する工程；
ｃ）工程（ｂ）の極性糖脂質を沈殿させる工程；および
ｄ）工程（ｃ）の抽出され沈殿させた極性糖脂質を精製する工程
を含む方法によってシアノバクテリアのオシラトリア属種から得ることができる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項５】
工程（ｂ）が、カオトロピック剤とクロロホルムのような非プロトン性有機溶媒とを含む変性溶液での処置を含む、請求項４に記載の使用のための組成物。
【請求項６】
前記方法が：
ｉ）遠心分離によって培養培地からシアノバクテリアを収集後に得られる凍結乾燥濃縮物のような、シアノバクテリアの濃縮物を用意する工程；
ｉｉ）前記濃縮物を溶液中に懸濁する工程；
ｉｉｉ）場合により、マイクロ波および／または遠心分離のような液体／固体分離で処置して、液相（上清と称する）を収集する工程；
ｉｖ）シアノバクテリアの懸濁液または上清を、カオトロピック剤とクロロホルムのような非プロトン性有機溶媒とを含む変性溶液と混合する工程；
ｖ）工程（ｉｖ）で得られた溶液をインキュベートする工程；
ｖｉ）好ましくは遠心分離によって液体／液体分離を行い、水性の液相を収集する工程；
ｖｉｉ）例えば上清に塩とアセトンのような有機溶媒とを添加することにより、糖脂質画分を沈殿させる工程；
ｖｉｉｉ）水性溶液中に沈殿物を再懸濁する工程；
ｉｘ）場合により、（ｖｉｉｉ）で得られた溶液をイソプロパノールのような有機溶媒で処置し、遠心分離し、好ましくは遠心分離によって液相を収集する工程；および
ｘ）イオン交換カラムに通過させ、極性糖脂質を含む画分を収集する工程
を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項７】
前記極性糖脂質が、変性性のカオトロピック剤で抽出すること、総重量の５％以下の核酸夾雑レベルに達するまでヌクレアーゼで抽出物を処置すること、カットオフが３０ＫＤａの装置で分子分離すること、それに続いてより高い分子量の画分を回収することを含む方法によってシアノバクテリアのオシラトリア属種から得ることができる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項８】
変性性のカオトロピック剤で抽出することを含む方法であって、該抽出工程が、以下の工程ｂ）で説明されているようにして行われ、ヌクレアーゼ処置が、以下の工程ｇ）で説明されているようにして行われ、分子分離が、以下の工程ｋ）で説明されているようにして行われ、さらに該方法が、以下の工程ａ）、ｃ）〜ｆ）、ｅ）、ｈ）〜ｊ）、およびｌ）〜ｍ）、すなわち：
ａ）場合により凍結乾燥させたシアノバクテリアのオシラトリア属種の濃縮物を、好ましくは１：１から１：２の間に含まれる体積比で水性溶液に懸濁する工程；
ｂ）シアノバクテリアの懸濁液を、カオトロピック剤、極性プロトン性有機溶媒、好ましくはフェノール、およびクロロホルムのような非プロトン性有機溶媒を含む、２〜４倍体積、好ましくは約３倍体積の変性溶液と混合する工程、
ｃ）６０分よりも短い時間でインキュベートする工程；
ｄ）遠心分離して上清と称する液相を収集する工程；
ｅ）上清に塩と有機溶媒、好ましくはアセトンとを添加することにより糖脂質画分を沈殿させ、沈殿物（またはペレット）を水で希釈したエタノールで洗浄する工程；
ｆ）好ましくは緩衝化された、水性溶液中に沈殿物を再懸濁する工程；
ｇ）ヌクレアーゼ、好ましくはエンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ、それに続いてプロテアーゼ、好ましくはプロテイナーゼＫで処置する工程；
ｈ）塩と有機溶媒、好ましくはアセトンとを添加することにより糖脂質相を沈殿させる工程；
ｉ）場合により、水で希釈したエタノールでペレットを洗浄し、イオン性界面活性剤、好ましくはデオキシコール酸ナトリウムと第四級アンモニウム塩とを含む水性溶液中に再懸濁する工程；
ｊ）工程ｂ）〜ｆ）で説明されるようにして水性溶液から再抽出する工程；
ｋ）カットオフが３０ＫＤａの装置で分子分離する工程；
ｌ）高分子量の極性糖脂質画分を水または緩衝化水性溶液で回収し、核酸夾雑またはタンパク質夾雑レベルを検査する工程；
ｍ）核酸夾雑が総重量の５％未満の画分を回収し使用する工程
を含む、前記方法によってシアノバクテリアのオシラトリア属種の細胞から得ることができる、請求項７に記載の使用のための極性糖脂質を含む組成物。
【請求項９】
主要な糖脂質成分の脂肪酸としてステアリン酸（Ｃ１８：０、オクタデカン酸）および／またはパルミチン酸（Ｃ１６：０、ヘキサデカン酸）を含む極性糖脂質の混合物を含み、ここでこれらのうち少なくとも１種は、ラムノースまたはその誘導体の少なくとも１つの単位を含む糖と結合している、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項１０】
前記極性糖脂質の混合物が、糖脂質混合物の総脂質画分に対して５０％〜８０％のステアリン酸（Ｃ１８：０、オクタデカン酸）および／または１５％〜４０％のパルミチン酸（Ｃ１６：０、ヘキサデカン酸）を含む、請求項９に記載の使用のための組成物。
【請求項１１】
前記極性糖脂質の混合物が、糖脂質混合物の総脂質画分に対して６５〜７５％のステアリン酸（Ｃ１８：０、オクタデカン酸）および／または２０〜３２％のパルミチン酸（Ｃ１６：０、ヘキサデカン酸）を含む、請求項９または１０に記載の使用のための組成物。
【請求項１２】
前記シアノバクテリアのオシラトリア属種が、Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ（ＣＣＡＰ）に寄託番号１４５９／４５で寄託されたオシラトリア属種である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項１３】
疼痛の処置および／または予防のための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用のための極性糖脂質を含む組成物。
【請求項１４】
神経障害性疼痛の処置および／または予防のための、請求項１３に記載の使用のための極性糖脂質を含む組成物。
【請求項１５】
末梢神経障害性疼痛、中枢神経障害性疼痛、または混合性（末梢および中枢）神経障害性疼痛の処置および／または予防のための、請求項１３に記載の使用のための極性糖脂質を含む組成物。
【請求項１６】
糖尿病、後天性免疫不全症候群または癌によって引き起こされる神経障害性疼痛の処置および／または予防のための、請求項１３に記載の使用のための極性糖脂質を含む組成物。
【請求項１７】
ＣＯＰＤの処置および／または予防のための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用のための極性糖脂質を含む組成物。
【請求項１８】
薬学的に許容される添加剤、希釈剤、および／または他の安定剤をさらに含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の使用のための極性糖脂質を含む組成物。
【請求項１９】
経口、静脈内（ｉ．ｖ．）、吸入または局所投与用である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の使用のための極性糖脂質を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疼痛および／または慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の処置および／または予防に使用するための、シアノバクテリアのオシラトリア属種（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）の細胞から得ることができる極性糖脂質（ＣｙＰ）を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
シアノバクテリア、またはいわゆるラン藻類は、独特な特性を有する活性成分の自然源である。シアノバクテリア由来の低分子量糖脂質抽出物は、例えばモノガラクトシルジアシルグリセロール（ＭＧＤＧ）、ジガラクトシルジアシルグリセロール（ＤＧＤＧ）、スルホキノボシルジアシルグリセロール（ＳＱＤＧ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）などのグリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）の脂肪酸エステルのクラスに属する脂質成分を含有することがよく知られている。このような様々なシアノバクテリアから調製された低分子量の抽出物は、例えば特許出願の特許文献１で説明されているような抗炎症特性、および非特許文献１で説明されているような抗腫瘍特性などの様々な種類の生物活性を有することが示されている。加えて、シアノバクテリアから抽出されたスルホリピドはさらに、抗ＨＩＶ活性も示している（非特許文献２）。
【０００３】
特許出願の特許文献２および特許文献３は、淡水シアノバクテリアのオシラトリア属種から抽出され、ＬＰＳ様の構造を有する高分子量（３３ｋＤａ）の極性糖脂質（ここでは「ＶＢ３３２３」とも称される）を含む糖脂質画分の調製物を説明している。この高度に精製された極性糖脂質調製物は、シアノバクテリアのオシラトリア・プランクトスリックス（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  Ｐｌａｎｋｔｈｏｔｒｉｘ）種の細胞から抽出でき、このような調製物は、１つまたはそれ以上のラムノース単位を含む高分子量糖脂質種が少なくとも１種存在することを特徴とする。さらに、例えばブラッドフォード法によって検査した場合、このような調製物中のタンパク質夾雑が総重量の２％以下であることを特徴とし、特にタンパク質夾雑がないことを特徴とし、さらに、核酸夾雑が、総重量の５％以下であること、特に総重量の３％以下であることを特徴とし、細胞外のＡＴＰレベルの低下を引き起こすＡＴＰシンターゼ（ＡＴＰ−ＳＸ）に対する阻害活性を検出することが可能であった。
【０００４】
特許出願の特許文献２および特許文献３に、この糖脂質抽出物が有力な抗炎症活性を有するということが示されている。より正確には、糖脂質抽出物は、有力なＴＬＲ４アンタゴニスト活性を有し、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびサルモネラ・アボルタス・エクイ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ  ｅｑｕｉ）由来ＬＰＳなどの、ヒト樹状細胞でＴＬＲ４受容体ＬＰＳアゴニストによって誘発される炎症促進作用に拮抗することができ、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）由来ＬＰＳの炎症促進性作用に拮抗することができることが示されている。このようなＴＬＲ４に対する作用の他にも、ＶＢ３３２３はさらに、細胞表面ＡＴＰシンターゼの活性を部分的に阻害して、細胞外のＡＴＰレベルの低下をもたらすことも示されている。
【０００５】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、細菌性病原体構造の認識と、その免疫認識および刺激に関与する細胞への侵入とに関する主要な経路のうちの１つである。さらに、近年の研究によれば、存在し得る病原体に対する炎症性反応の開始だけでなく、ストレスを受けた組織または傷害組織によって活性化される応答においても、ＴＬＲが重要な役割を果たすことが示されている。ＴＬＲ４は、炎症の増幅に関与する主要な受容体である。特に、ＴＬＲ４は、細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）に対する先天性免疫応答に関与する受容体であることがわかっているが、ＴＬＲ４は、ストレスおよび／または組織の損傷に応答して生産された内因性分子によって活性化される細胞内シグナル伝達において重要な役割を有することが実証されている。これらの分子のうちいくつかは、例えばヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）および高移動度グループタンパク質Ｂ１（ＨＭＧＢ１）などの壊死細胞によって放出されるメディエータであり、他のものとしては、例えばビグリカン、ヒアルロン酸のフラグメント、およびテネイシン−Ｃなどの細胞外マトリックスの生成物がある。
【０００６】
ＡＴＰは、他の重要な内因性炎症促進性メディエータであり、このようなメディエータの下方制御は、ＴＬＲ４アンタゴニスト活性との相乗効果で炎症性の状態を軽減することにおいて関連する役割を有する。ＡＴＰシンターゼ酵素は、肝細胞、ニューロン、星状細胞、線維芽細胞、免疫細胞、および内皮細胞などの多くの様々な細胞型で発現され、腫瘍細胞の形質膜上では特に高レベルで発現される。
【０００７】
それゆえに、特許出願の特許文献２および特許文献３は、炎症促進性の状態の活性化によって引き起こされる多数の様々な急性または慢性状態を処置するための、オシラトリア・プランクトスリックス種から抽出される糖脂質画分の使用を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＥＰ１５７１２０３
【特許文献２】ＷＯ２０１０／０１０１７２
【特許文献３】ＷＯ２０１０／０９４６９３
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｓｈｉｒａａｓｈｉら、１９９３年、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、４１：１６６４〜６６頁
【非特許文献２】Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔ．、１９８９年、８１：１２５４〜１２５８頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明において特徴的な実施形態は、対象に、シアノバクテリアのオシラトリア属種の細胞から得られる、または得ることができる極性糖脂質（ＣｙＰ）を含む組成物を投与することを含む、疼痛および／または慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を処置および／または予防する方法を含む。極性糖脂質は、典型的には、シアノバクテリアのオシラトリア属種から抽出されるリポ多糖（ＬＰＳ）である。
【００１１】
本方法の一実施形態において、極性糖脂質は、（ａ）シアノバクテリアを用意する工程；（ｂ）前記シアノバクテリアから極性糖脂質を抽出する工程；（ｃ）工程（ｂ）から極性糖脂質を沈殿させる工程；および（ｄ）工程（ｃ）の抽出され沈殿させた極性糖脂質を精製する工程を含む方法によって、シアノバクテリアのオシラトリア属種から得ることができる。具体的な実施形態において、工程（ｂ）は、カオトロピック剤と非プロトン性有機溶媒とを含む変性溶液での処置を含む。
【００１２】
他の実施形態において、本方法は：ｉ）シアノバクテリアの濃縮物を用意する工程；ｉｉ）前記濃縮物を溶液中に懸濁する工程；ｉｉｉ）場合により、マイクロ波および／または液体／固体分離で処置して、液相（上清と称する）を収集する工程；ｉｖ）シアノバクテリアの懸濁液または上清を、カオトロピック剤と非プロトン性有機溶媒とを含む変性溶液と混合する工程；ｖ）工程（ｉｖ）で得られた溶液をインキュベートする工程；ｖｉ）液体／液体分離を行い、水性の液相を収集する工程；ｖｉｉ）糖脂質画分を沈殿させる工程；ｖｉｉｉ）水性溶液中に沈殿物を再懸濁する工程；ｉｘ）場合により、工程（ｖｉｉｉ）で得られた溶液を有機溶媒で処置し、遠心分離し、液相を収集する工程；およびｘ）イオン交換カラムに通過させ、極性糖脂質を含む画分を収集する工程を含む。
【００１３】
追加の実施形態において、極性糖脂質は、変性性のカオトロピック剤で抽出すること、総重量の５％以下の核酸夾雑レベルに達するまでヌクレアーゼで抽出物を処置すること、カットオフが３０ＫＤａの装置で分子分離すること、それに続いてより高い分子量の画分を回収することを含む方法によってシアノバクテリアのオシラトリア属種から得ることができる。具体的な実施形態において、極性糖脂質は、変性性のカオトロピック剤で抽出することを含む方法であって、該抽出工程が、以下の工程ｂ）で説明されているようにして行われ、ヌクレアーゼ処置は、以下の工程ｇ）で説明されているようにして行われ、分子分離は、以下の工程ｋ）で説明されているようにして行われ、さらに該方法が、以下の追加の工程ａ）、ｃ）〜ｆ）、ｅ）、ｈ）〜ｊ）、およびｌ）〜ｍ）、すなわち：ａ）シアノバクテリアのオシラトリア属種の濃縮物を、１：１から１：２の間の体積比で水性溶液に懸濁する工程；ｂ）シアノバクテリアの懸濁液を、カオトロピック剤、極性プロトン性有機溶媒、および非プロトン性有機溶媒を含む２〜４倍体積の変性溶液と混合する工程；ｃ）６０分よりも短い時間でインキュベートする工程；ｄ）液相（上清と称する）を遠心分離して収集する工程；ｅ）上清に塩と有機溶媒とを添加することにより糖脂質画分を沈殿させ、沈殿物（またはペレット）を水で希釈したエタノールで洗浄する工程；ｆ）水性溶液中に沈殿物を再懸濁する工程；ｇ）ヌクレアーゼ、それに続いてプロテアーゼで処置する工程；ｈ）塩と有機溶媒とを添加することにより糖脂質相を沈殿させる工程；ｉ）場合により、水で希釈したエタノールでペレットを洗浄し、イオン性界面活性剤と第四級アンモニウム塩とを含む水性溶液中に再懸濁する工程；ｊ）工程ｂ）〜ｆ）で説明されるようにして水性溶液から再抽出する工程；ｋ）カットオフが３０ＫＤａの装置で分子分離する工程；ｌ）高分子量の極性糖脂質画分を水または緩衝化水性溶液で回収し、核酸夾雑またはタンパク質夾雑レベルを検査する工程；ｍ）核酸夾雑が総重量の５％未満の画分を回収し使用する工程を含む、前記方法によってシアノバクテリアのオシラトリア属種の細胞から得られる。
【００１４】
さらなる実施形態において、本組成物は、主要な糖脂質成分の脂肪酸としてステアリン酸（Ｃ１８：０、オクタデカン酸）および／またはパルミチン酸（Ｃ１６：０、ヘキサデカン酸）を含む極性糖脂質の混合物を含み、ここでこれらのうち少なくとも１種は、ラムノースまたはその誘導体の少なくとも１つの単位を含む糖と結合している。具体的な実施形態において、極性糖脂質の混合物は、糖脂質混合物の総脂質画分に対して５０％〜８０％のステアリン酸（Ｃ１８：０、オクタデカン酸）および／または１５％〜４０％のパルミチン酸（Ｃ１６：０、ヘキサデカン酸）を含む。他の具体的な実施形態において、極性糖脂質の混合物は、糖脂質混合物の総脂質画分に対して６５〜７５％のステアリン酸（Ｃ１８：０、オクタデカン酸）および／または２０〜３２％のパルミチン酸（Ｃ１６：０、ヘキサデカン酸）を含む。
【００１５】
一実施形態において、シアノバクテリアのオシラトリア属種は、Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ（ＣＣＡＰ）に寄託番号１４５９／４５で寄託されたオシラトリア属種である。
【００１６】
他の実施形態において、本方法は、疼痛の処置および／または予防のためである。具体的な実施形態において、本方法は、神経障害性疼痛の処置および／または予防のためである。他の具体的な実施形態において、本方法は、末梢神経障害性疼痛、中枢神経障害性疼痛、または混合性（末梢および中枢）神経障害性疼痛を処置および／または予防するためである。さらなる具体的な実施形態において、本方法は、糖尿病、後天性免疫不全症候群または癌によって引き起こされる神経障害性疼痛を処置および／または予防するためである。
【００１７】
一実施形態において、本方法は、ＣＯＰＤの処置および／または予防のためである。
【００１８】
一実施形態において、本組成物は、薬学的に許容される添加剤、希釈剤および／または他の安定剤をさらに含む。
【００１９】
他の実施形態において、本組成物は、経口、静脈内（ｉ．ｖ．）、吸入または局所投与用である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１ＡおよびＢは、フロイント完全アジュバントモデルにおける機械的アロディニアおよび温熱性痛覚過敏に対するＶＢ３３２３の急性処置の作用を示すグラフである。
【図２】図２ＡおよびＢは、ＦＣＡモデルにおける機械的アロディニアおよび足浮腫に対するＶＢ３３２３での長期間の経口治療処置の作用を示すグラフである。
【図３】図３ＡおよびＢは、マウスの体重と臓器のグロスの形態学的評価に対するＶＢ３３２３での長期間の経口治療処置の作用を示すグラフである。
【図４】図４ＡおよびＢは、坐骨神経結紮モデルにおける機械的アロディニアおよび温熱性痛覚過敏に対するＶＢ３３２３での長期間処置の作用を示すグラフである。
【図５】マウスの体重に対するＶＢ３３２３での長期間処置の作用を示すグラフである。
【図６】大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）−ＬＰＳとのインキュベート中のＴＮＦα放出に対するＶＢ３３２３の作用を示すグラフである。
【図７】３つの異なるＶＢ３３２３のバッチのＮＭＲプロファイルである。
【図８】体重変化に対するＶＢ３３２３処置の作用を示すグラフである（ＣＯＰＤモデルマウス）。
【図９】ＣＯＰＤモデルマウスにおける肺水腫（肺の重量）に対するＶＢ３３２３処置の作用を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
糖脂質混合物の治療的使用
本発明の発明者らは、オシラトリア属種由来の糖脂質画分、ＶＢ３３２３が、動物の疼痛モデルにおいて疼痛を緩和することを示した。特に、本発明者らは、糖脂質混合物を用いた急性処置は、フロイントアジュバントにより誘導されたマウス慢性炎症モデルにおいて温熱性痛覚過敏と機械的アロディニアの両方を強く且つ用量依存的に低下させたことを示した（実施例２）。本発明者らは、本明細書で説明されているような糖脂質調製物での長期間処置は、機械的アロディニアを有意に低下させたことを示した（実施例３）。最後に、本発明者らは、糖脂質調製物での長期間処置は、坐骨神経結紮により誘導されたマウス神経障害性疼痛モデルにおいて温熱性痛覚過敏と機械的アロディニアの両方を有意に低下させたことを示した（実施例５）。
【００２２】
それゆえに、このような糖脂質を含む組成物は、疼痛の処置および／または予防、特に神経障害性疼痛の処置および／または予防のために有利に使用できる。
【００２３】
神経障害性疼痛は、末梢もしくは中枢神経系へのダメージまたは末梢もしくは中枢神経系の機能不全に起因する。したがって神経障害性疼痛は、末梢神経障害性疼痛、中枢神経障害性疼痛、または混合性（末梢および中枢）神経障害性疼痛に分類できる。
【００２４】
神経障害性疼痛は、例えば末梢神経にダメージを与える糖尿病、後天性免疫不全症候群または癌などの神経損傷または神経疾患によって引き起こされることが多い。診断は、組織損傷に対する激しい疼痛、異常感覚（例えば、灼熱感（ｂｕｒｎｉｎｇ）、ピリピリ感（ｔｉｎｇｌｉｎｇ））、および神経学的検査中に検出される神経損傷の徴候によって示される。神経障害性疼痛の共通する症状の１つは接触性アロディニアであり、これは、通常は疼痛を感じない触覚刺激に対する疼痛応答を特徴とする。
【００２５】
神経障害性疼痛は、オピオイドに対して応答するが、処置は、アジュバント薬物（例えば抗うつ薬、抗痙攣薬、バクロフェン、局所用薬物）でなされることが多い。
【００２６】
疼痛は、あらゆるレベルの末梢または中枢神経系への損傷後に発生する可能性があり、交感神経系が関与している可能性がある（交感的に維持された疼痛を引き起こす）。具体的な症候群としては、帯状疱疹後神経痛、神経根引き抜き損傷、疼痛を伴う外傷性の単神経障害、疼痛を伴う多発性神経障害（特に糖尿病による）、中枢性疼痛症候群（あらゆるレベルの神経系における実質的に全ての病変によって引き起こされる可能性がある）、術後疼痛症候群（例えば乳房切除術後症候群、開胸術後症候群、幻肢痛）、ならびに複合性局所疼痛症候群（反射性交感神経性ジストロフィーおよびカウザルギー）が挙げられる。
【００２７】
それゆえに、糖脂質混合物を含む組成物は、末梢神経障害性疼痛、中枢神経障害性疼痛、または混合性（末梢および中枢）神経障害性疼痛の処置および／または予防のために有利に使用できる。特に、糖脂質混合物を含む組成物は、糖尿病、後天性免疫不全症候群または癌によって引き起こされる神経障害性疼痛を処置および／または予防するのに使用できる。
【００２８】
本発明者らはさらに、オシラトリア属由来糖脂質画分は、ヒト気管支の実質組織の培養物において大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）−ＬＰＳにより誘導されたＴＮＦ−αの放出を阻害することを示した（実施例７）。慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、細菌または細菌産物（ＬＰＳ）によって引き起こされる慢性炎症である。ヒト気管支の実質組織の培養物で得られた結果から、ＶＢ３３２３は、インビボで、細菌または細菌産物（ＬＰＳ）により誘導された炎症を阻害する可能性があり、それによって、ＣＯＰＤの予防および／または処置が可能になることが示される。
【００２９】
それゆえに、本発明において特徴的な他の態様は、ＣＯＰＤの処置および／または予防のための、糖脂質を含む組成物の使用である。
【００３０】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、炎症性反応によって引き起こされる部分的に可逆的な気流制限である。症状は、数年にわたり発現する喀痰を伴う咳と呼吸困難である。一般的な徴候としては、呼吸音の減少、自発呼吸の呼気相の延長、および喘鳴が挙げられる。通常の処置としては、気管支拡張剤、コルチコステロイド、ならびに必要に応じてＯ２および抗生物質が挙げられる。診断から１０年以内に患者の約５０％が死亡する。
【００３１】
ＣＯＰＤは、慢性閉塞性気管支炎と肺気腫を含む。多くの患者が、両方の特徴を有する。
【００３２】
慢性閉塞性気管支炎は、気流閉塞を伴う慢性気管支炎である。肺活量計によって気流閉塞の事実が発覚した場合、慢性気管支炎は、慢性閉塞性気管支炎になる。慢性喘息性気管支炎は、慢性的な喀痰を伴う咳、喘鳴、および部分的に可逆的な気流閉塞を特徴とする類似の重複する状態であるが、喘息の既往がある喫煙者で圧倒的に多く発生する。いくつかのケースにおいて、慢性閉塞性気管支炎と慢性喘息性気管支炎との区別は不明瞭である。
【００３３】
肺気腫は、弾性収縮力の損失、および肺胞中隔の損失、および放射線状の気道牽引を招く肺実質の破壊であり、そのために気道虚脱の傾向が強まる。それに続いて肺の過膨張、気流制限、および空気捕らえ込み現象が起こる。気腔が大きくなり、最終的に嚢胞が生じる可能性もある。
【００３４】
したがって本発明は、疼痛および／または慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の処置および／または予防に使用するための、シアノバクテリアのオシラトリア属種の細胞から得られるか、または得ることができる糖脂質、特に極性糖脂質を含む組成物に関する。
【００３５】
本発明はまた、疼痛および／またはＣＯＰＤの処置および／または予防方法にも関し、前記方法は、それらを必要とする対象に、本明細書で説明されているような極性糖脂質の混合物を含む組成物を投与する工程を含む。特に本組成物は、治療有効量で投与される。
【００３６】
本組成物は、薬学的に許容される添加剤、希釈剤、および／または他の安定剤を含んでいてもよいし、どのような好適な経路で投与されてもよい。特定の投与経路としては、経口、静脈内（ｉ．ｖ．）もしくは局所投与、または吸入による投与が挙げられる。
【００３７】
細胞株での、加えてヒト血液から単離したＰＢＭＣでの細胞毒性アッセイで検査した場合、タンパク質夾雑レベルが総重量の２％以下であり、特にタンパク質夾雑がなく、さらに核酸夾雑レベルが総重量の５％以下であり、特に総重量の３％までの本明細書において説明されているようにして調製されたシアノバクテリアの極性糖脂質を含む組成物は、哺乳動物細胞に対して細胞毒性ではない。インビトロにおいて、最小限の有効濃度よりも１００倍高い濃度（１００μｇ／ｍｌ）まで本組成物は細胞毒性がないことが細胞系で試験された。それゆえに、患者にとっての安全性を確実にしつつ、疼痛および／またはＣＯＰＤの処置および／または予防のためにこのような組成物を使用することが想定される。
【００３８】
さらに本発明者らは、ＶＢ３３２３での長期間処置は、フロイントアジュバントにより誘導されたマウス慢性炎症モデルにおいて、有意な体重の変化と臓器の変質をまったく誘導せず（実施例４）、坐骨神経結紮により誘導されたマウス神経障害性疼痛モデルにおいて慢性疼痛により誘導された体重減少を軽減することを示した（実施例６）。これらのデータはさらに、神経障害性疼痛および／またはＣＯＰＤの処置および／または予防のための治療的化合物としての極性糖脂質混合物の使用可能性を裏付けている。
【００３９】
対象は、ヒトであってもよいし、または例えばネコ、イヌ、げっ歯類、霊長類、ウシ、ヒツジもしくはウマなどのヒト以外の哺乳動物であってもよい。所定の実施形態において、対象は、ヒトであり、例えば子供、女性または男性である。
【００４０】
本明細書で使用されるように、用語「処置」または「処置すること」は、このような用語が適用される障害もしくは状態、またはこのような障害もしくは状態の症状のうち１つまたはそれ以上を元に戻すこと、緩和すること、またはそれらの進行を抑制することを示す。「予防」または「予防すること」は、このような用語が適用される障害もしくは状態、またはこのような障害もしくは状態の症状のうち１つまたはそれ以上の出現を予防することを意味する。
【００４１】
オシラトリア属由来極性糖脂質の治療有効量は、当業者によって容易に決定できる。治療有効量は、例えば対象の年齢、体重、状態などによって決まる可能性がある。また治療上有効な１日用量は、典型的には０．０１ｍｇから５０ｍｇの間、例えば０．１ｍｇから５ｍｇの間、例えば０．３ｍｇから３ｍｇの間のオシラトリア属由来極性糖脂質を含んでいてもよい。
【００４２】
極性糖脂質を含む組成物の特徴
特許出願ＷＯ２０１０／０１０１７２およびＷＯ２０１０／０９４６９３は、２００８年７月９日にＢｌｕｅｇｒｅｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ｓ．ｒ．ｌ．、ｖｉａ  Ｍａｓｓｅｎａ  １５、２０１２５  Ｍｉｌａｎｏ、Ｉｔａｌｙによって、Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ（ＣＣＡＰ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）に寄託番号１４５９／４５で寄託されたシアノバクテリアのオシラトリア属種の細胞からの抽出により得ることができる、または得られた極性糖脂質の高度に精製された調製物は、１つまたはそれ以上のラムノース単位を含む高分子量の糖脂質種が少なくとも１種存在することを特徴とすることを示している。
【００４３】
したがって、本発明で使用される糖脂質を含む組成物は、例えばシアノバクテリアのオシラトリア・プランクトスリックス（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  Ｐｌａｎｋｔｏｔｈｒｉｘ）種などのシアノバクテリアのオシラトリア属種の細胞から得られ得るか、または得ることができる。このような極性糖脂質調製物は、科学文献では「ＣｙＰ」と称されることもある。
【００４４】
前記シアノバクテリアのオシラトリア属種は、例えばＣｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ（ＣＣＡＰ）に寄託されたあらゆるオシラトリア属種であってもよく、例えば寄託番号１４５９／４５、１４５９／４３、または１４５９／４４で寄託された株などであってもよい。
【００４５】
具体的な実施形態において、前記オシラトリア属種は、Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ（ＣＣＡＰ）に寄託番号１４５９／４５で寄託された種である。
【００４６】
他の具体的な実施形態において、前記シアノバクテリアのオシラトリア属種は、淡水シアノバクテリアである。特に、シアノバクテリアのオシラトリア属種は、イタリアのヴァレーゼ湖（Ｌａｋｅ  Ｖａｒｅｓｅ）に存在するシアノバクテリアであってもよい。例えば、前記シアノバクテリアは、Ｐｏｍａｔｉら、Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．２０００年；３６：５５３〜５６２頁、Ｍａｃａｇｎｏら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２００６年；２０３（６）：１４８１〜９２頁、Ｊｅｍｍｅｔｔら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００８年；７６（７）：３１５６〜６３頁、およびＴｈｏｒｇｅｒｓｅｎら、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８年；４５（１３）：３５５３〜７頁で説明されているような、オシラトリア・プランクトスリックス（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  Ｐｌａｎｋｔｏｔｈｒｉｘ）ＦＰ１種であってもよい。
【００４７】
本発明に係る糖脂質は、極性糖脂質である。特に、本組成物に含まれる極性糖脂質は、リポ多糖（ＬＰＳ）であってもよい。
【００４８】
前記極性糖脂質を含む組成物は、例えば、画分、抽出物、糖脂質の混合物、調製物、および／または医薬組成物であってもよい。
【００４９】
シアノバクテリアのオシラトリア属種の細胞からこのような極性糖脂質（ＣｙＰ）を含む組成物を得るのに使用できる方法は当業者に周知であり、例えば、Ｙｉら、Ａｎａｌｙｓｔ．２０００年；１２５（４）：６５１〜６頁、Ｍａｃａｇｎｏら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２００６年；２０３（６）：１４８１〜９２頁、Ｊｅｍｍｅｔｔら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００８年；７６（７）：３１５６〜６３頁、およびＴｈｏｒｇｅｒｓｅｎら、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８年；４５（１３）：３５５３〜７頁で説明されているものがある。
【００５０】
具体的な実施形態において、極性糖脂質は、シアノバクテリアのオシラトリア属種から抽出されたものでもよい。
【００５１】
特に、極性糖脂質を含む組成物は：
ａ）前記シアノバクテリアを用意する工程；
ｂ）前記シアノバクテリアから極性糖脂質を抽出する工程；
ｃ）工程（ｂ）から極性糖脂質を沈殿させる工程；および
ｄ）工程（ｃ）からの抽出され沈殿させた極性糖脂質を精製する工程
を含む第一の方法によってシアノバクテリアのオシラトリア属種から得ることができ得る。
【００５２】
一実施形態において、工程（ｂ）は、カオトロピック剤とクロロホルムのような非プロトン性有機溶媒とを含む変性溶液での処置を含む。
【００５３】
他の実施形態において、極性糖脂質を含む組成物を得る方法は：
ｉ）遠心分離によって培養培地からシアノバクテリアを収集後に得られる凍結乾燥濃縮物のような、シアノバクテリアの濃縮物を用意する工程；
ｉｉ）前記濃縮物を溶液中に懸濁する工程；
ｉｉｉ）場合により、マイクロ波および／または遠心分離のような液体／固体分離で処置して、液相（上清と称する）を収集する工程；
ｉｖ）シアノバクテリアの懸濁液または上清を、カオトロピック剤とクロロホルムのような非プロトン性有機溶媒とを含む変性溶液と混合する工程；
ｖ）工程（ｉｖ）で得られた溶液をインキュベートする工程；
ｖｉ）例えば遠心分離などによって液体／液体分離を行い、水性の液相を収集する工程；
ｖｉｉ）例えば上清に塩とアセトンのような有機溶媒とを添加することにより、糖脂質画分を沈殿させる工程；
ｖｉｉｉ）水性溶液中に沈殿物を再懸濁する工程；
ｉｘ）場合により、（ｖｉｉｉ）で得られた溶液をイソプロパノールのような有機溶媒で処置し、遠心分離し、例えば遠心分離などによって液相を収集する工程；および
ｘ）イオン交換カラムに通過させ、極性糖脂質を含む画分を収集する工程
を含む。
【００５４】
他の具体的な実施形態において、極性糖脂質は、特許出願ＷＯ２０１０／０９４６９３（参照によって具体的に本明細書に組み入れられる）で説明されているように、オシラトリア属種の培養物から調製できる。この第二の方法において、細菌のペレットは、まず例えば有機溶媒とカオトロピック剤との混合物などの変性剤、例えばフェノールとグアニジニウムチオシアネートとの混合物で処置され、続いて除タンパク剤で処置される。この過程はさらに、総重量の５％以下の核酸夾雑レベル、例えば総重量の３％以下の核酸夾雑レベル、または総重量の２％以下の核酸夾雑レベルに達するまでヌクレアーゼで処置することを特徴とし、加えて、カットオフが３０ＫＤａの装置で分子分離する工程、それに続いてより高い分子量の画分を回収する工程を特徴とする。一実施形態において、極性糖脂質の混合物を含む組成物は、総重量の２％以下のタンパク質夾雑レベルを示す。特に、前記組成物は、タンパク質夾雑物質を含まない。
【００５５】
特に、極性糖脂質を含む組成物は、変性性のカオトロピック剤で抽出すること、総重量の５％以下の核酸夾雑レベル、例えば総重量の３％以下の核酸夾雑レベルに達するまでヌクレアーゼで抽出物を処置すること、カットオフが３０ＫＤａの装置で分子分離すること、それに続いてより高い分子量の画分を回収することを含む方法によって、シアノバクテリアのオシラトリア属種から得られてもよく、または得ることができる。
【００５６】
より正確には、オシラトリア属種の培養物から得られた極性糖脂質を含む組成物は、例えば以下のように調製できる。
【００５７】
培養培地中で、例えばＢＧ−１１培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｃ３０６１）中で、２５℃の温度で、青みを帯びた白色の光の下で、５ｕｍｏｌ．ｍ−２．秒−１の光強度で、連続して２４時間の光照射計画で、シアノバクテリアを増殖させる。定常増殖期に達したら、例えば遠心分離によりシアノバクテリアの培養物を堆積させ（ペレット化）；抽出前に、堆積物（またはペレット）を凍結または凍結乾燥させてもよい。融解または再水和（凍結乾燥の場合）した後、堆積物を以下の工程：
ａ）ペレットを例えば１：１から１：２の間に含まれる体積の水または水性溶媒で希釈することにより、再懸濁する工程；
ｂ）糖脂質混合物を含有する細胞抽出物（上清とも称する）を得て、例えばＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ  Ｐ．およびＭａｃｋｅｙ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９５年、１９（６）：９４２〜５頁）で説明されているような変性剤などの変性剤を含有し、例えばフェノールなどの極性プロトン性有機溶媒をベースとする試薬、ならびに例えばＴｒｉｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｔ３９３４）などのカオトロピック剤（例えばグアニジニウムチオシアネート）または例えばＴｒｉｚｏｌ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの類似の試薬、ならびにクロロホルムのような非プロトン性有機溶媒を、シアノバクテリアの水性懸濁液の体積を約１として、抽出溶液を２〜４倍体積、抽出溶液を例えば約３倍体積、およびクロロホルムを約０．５〜１倍体積の比率で含む適切な体積の溶液と、再懸濁したペレットを上記で説明したようにして混合する工程；
ｃ）少なくとも５分以上、例えば少なくとも１０分、ただし６０分を超えない長さの時間で、室温で、細胞抽出物をインキュベートする工程；
ｄ）例えばおよそ２０００×ｇで遠心分離し、極性糖脂質画分を含有する上清（水相）を収集する工程
で処理する。このような上清は、例えば、電気泳動および銀染色によって測定してもよいし、または例えばＬＰＳの存在下で単球／マクロファージから誘導されたＴＨＰ１細胞株におけるＴＮＦ−アルファ生産の阻害、もしくはＡＴＰシンターゼ（ＡＴＰ−ＳＸ）への結合もしくはその活性の阻害などの生物活性アッセイによって測定してもよい。さらに、（収集されたおよその体積に等しい量の）水または水性緩衝液を添加し、続いてサンプルを再度遠心分離することによって、ｄ）で遠心分離により得られたペレットを再抽出してもよい。次いで、この第二の上清を前の上清と合わせて、プールしたサンプルを：
ｅ）塩、例えば酢酸ナトリウム（最終的に５〜２０ｍＭ）と、アセトンのような有機溶媒とを、これも例えば約２倍の体積の量で添加することにより沈殿させて、それに続いて上述した条件と同じ条件下で遠心分離し、水で希釈したエタノール、例えば７０％のエタノールで少なくとも１回または２回ペレットを洗浄する工程、
ｆ）例えば緩衝化水性溶液などの溶液、例えば５０ｍＭのトリス中にペレットを再懸濁する工程、
ｇ）エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ（例えばＤＮアーゼおよびＲＮアーゼ）を使用して核酸夾雑物質を酵素的に処置し、それに続いてプロテアーゼ、例えばプロテイナーゼＫで、例えば１００μｇ／ｍｌで、十分な時間（３７℃で少なくとも１時間）消化することによりタンパク質夾雑物質を酵素的に処置する工程
を含むさらなる工程で処理する。
【００５８】
酵素消化の後、サンプルを再度遠心分離し、上清を収集し、さらに塩（例えば酢酸ナトリウム、最終的に約１０ｍＭ）と、適切な体積（例えば２倍の体積）のアセトンのような有機溶媒との添加により沈殿させ、再度遠心分離し、それに続いて水中に、または例えばデオキシコレート（ＤＯＣ）などの少なくとも１種の界面活性剤を含有し、さらに例えばテトラエチルアンモニウムなどのカチオン性界面活性剤を含有する水性溶液中にペレットを再懸濁し；この材料を、セクションｂ）に記載の（変性性の）抽出溶液で再度抽出し、次いで上記で説明したようにして酢酸ナトリウム／アセトンでさらに沈殿させ、７０％のエタノールで洗浄し、水または水性溶液中に再懸濁し、カットオフが３０ｋＤａのフィルター（または他の好適な装置）の使用により分子分離させることによりフィルターを通過する材料を除去し、核酸夾雑レベルが総重量の５％よりも低い、保持液中の、水または緩衝化水性溶液中のより高い分子量の糖脂質画分を回収する。
【００５９】
したがって、極性糖脂質を含む組成物は、変性性のカオトロピック剤を含む方法であって、抽出工程が、以下の工程ｂ）で説明されているようにして行われ、ヌクレアーゼ処置は、以下の工程ｇ）で説明されているようにして行われ、分子分離は、以下の工程ｋ）で説明されているようにして行われ、さらに該方法が、以下の工程ａ）、ｃ）〜ｆ）、ｅ）、ｈ）〜ｊ）、およびｌ）〜ｍ）、すなわち：
ａ）場合により凍結乾燥させたシアノバクテリアのオシラトリア属種（番号１４５９／４５）の濃縮物を、例えば１：１から１：２の間に含まれる体積比で水性溶液に再懸濁する工程；
ｂ）シアノバクテリアの懸濁液を、カオトロピック剤、例えばフェノールなどの極性プロトン性有機溶媒、およびクロロホルムのような非プロトン性有機溶媒を含む、２〜４倍体積、例えば約３倍体積の変性溶液と混合する工程、
ｃ）６０分よりも短い時間でインキュベートする工程；
ｄ）遠心分離して上清と称する液相を収集する工程；
ｅ）上清に塩とアセトンのような有機溶媒とを添加することにより、糖脂質画分を沈殿させ、沈殿物（またはペレット）を水で希釈したエタノールで洗浄する工程；
ｆ）例えば緩衝液などの水性溶液中に沈殿物を再懸濁する工程；
ｇ）例えばエンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼなどのヌクレアーゼ、それに続いて例えばプロテイナーゼＫなどのプロテアーゼで処置する工程；
ｈ）塩とアセトンのような有機溶媒とを添加することにより糖脂質相を沈殿させる工程；
ｉ）場合により、水で希釈したエタノールでペレットを洗浄し、例えばデオキシコール酸ナトリウムなどのイオン性界面活性剤と第四級アンモニウム塩とを含む水性溶液中に再懸濁する工程；
ｊ）工程ｂ）〜ｆ）で説明されるようにして水性溶液から再抽出する工程；
ｋ）カットオフが３０ＫＤａの装置で分子分離する工程；
ｌ）高分子量の極性糖脂質画分を水または緩衝化水性溶液で回収し、核酸夾雑またはタンパク質夾雑レベルを検査する工程；
ｍ）核酸夾雑が総重量の５％未満、例えば３％未満の画分を回収し使用する工程
を含む、前記方法によってシアノバクテリアのオシラトリア属種の細胞から得られ得るか、または得ることができる。
【００６０】
このようにして得られた糖脂質画分の活性は、例えばＴＨＰ１のような、例えばＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−アルファおよび／またはＩＬ−１ベータなどのサイトカインを生産する細胞における、ＬＰＳ（Ｐ．ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）または大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）由来）により誘導された炎症促進性の活性の阻害に基づく生物学的試験によって測定してもよいし、および／または例えば電気泳動などの生化学アッセイによって測定してもよい。あるいは、このようにして得られた糖脂質画分の活性は、例えば、ヒトＴＬＲ−４遺伝子とＮＦ−ｋＢ−誘導型ＳＥＡＰレポーター遺伝子とを安定して共発現するように操作された細胞における、ＬＰＳにより誘導されたＴＬＲ４介在ＮＦ−ｋＢ活性化に対するそれらの阻害作用を測定することによって評価してもよい。また糖脂質画分活性は、実施例７でなされたように、ヒト肺実質でＬＰＳとインキュベートした後のＴＮＦ−α放出に対するそれらの阻害作用を測定することによって観察してもよい。
【００６１】
ＷＯ２０１０／０９４６９３はさらに、上記で説明した方法により得られた本発明に係る糖脂質を含む抽出物の分析に基づく特徴を説明している。
【００６２】
極性糖脂質画分の糖質（ｓｕｇａｒ）の分析から、糖成分（１００％とする）中、ラムノースは、典型的には２０〜４０％であり、グルコース（Ｇｌｃ）は、２０〜４０％であり、キシロース（Ｘｙｌ）は、５〜１０％であり、マンノース（Ｍａｎ）は、３〜５％であり、ガラクトース（Ｇａｌ）は、３〜５％であり、グルコサミン（ＧｌｃＮ）は、０．５〜１％であり、ガラクツロン酸（ＧａｌＡ）は、１〜６％であることが示され、これらの糖質は単純糖質であってもよく、またはより典型的には、これらは複合糖質および／または糖質誘導体である。糖残基の定性分析および定量分析は、メタノール−塩酸（１ＭのＨＣｌ／ＭｅＯＨ）で糖脂質混合物を８０℃で２０時間加水分解し、ヘキサンで抽出し、ピリジンと無水酢酸でアセチル化した後に、アセチル化メチル配糖体をＧＣ−ＭＳ分析することによって行ってもよいし、および／または２Ｍのトリフルオロ酢酸で１２０℃で１時間処置し、それに続いて水素化ホウ素ナトリウムで１時間処置し、それに続いてピリジンと無水酢酸でアセチル化した後に得られたアルジトールアセテートを分析することによって行ってもよい。
【００６３】
糖脂質混合物の主要な糖脂質成分の分析的な解析から、以下の相対的な組成（重量／重量パーセンテージ）が示された：
−  糖：ラムノース５１％、ガラクツロン酸１５％、マンノース１１％、ガラクトース１１％、キシロース４％、グルコース４％、グルコサミン４％；ならびに
−  脂肪酸：オクタデカン酸、（Ｃ１８：０、５５％）；ヘキサデカン酸および３−ヒドロキシヘキサデカン酸（Ｃ１６：０＋Ｃ１６（３ＯＨ））、３５％）；３−ヒドロキシウンデカン酸（Ｃ１５（３ＯＨ））、１０％）。
【００６４】
元素分析から、炭素４１％、水素６．５％、および窒素４％の存在が示された。
【００６５】
それゆえに、極性糖脂質は、ラムノースまたはその誘導体の少なくとも１つの単位を含み、さらに３０ｋＤａより大きい分子量で、例えば３０から４０ｋＤａの間、例えば３２から３４ｋＤａの間（約３３ｋＤａ）の分子量を有することを特徴とする可能性があり、この場合、分子量は、例えばＤＯＣ−ＰＡＧＥ、それに続いて銀塩での染色によって決定できる。
【００６６】
特に、本発明において特徴的な組成物は、主要な糖脂質成分の脂肪酸としてステアリン酸（Ｃ１８：０、オクタデカン酸）および／またはパルミチン酸（Ｃ１６：０、ヘキサデカン酸）を含む極性糖脂質の混合物を含んでいてもよく、ここでこれらのうち少なくとも１種は、ラムノースまたはその誘導体の少なくとも１つの単位を含む糖と結合している。
【００６７】
このような脂肪酸は、例えばそれらの飽和した形態で存在しており、これらは、典型的にはそれぞれ糖脂質混合物の総脂質画分に対してそれぞれ（総脂質画分を１００として）５０％〜８０％のステアリン酸および／または１５％〜４０％のパルミチン酸を含む量で存在し、さらにより典型的には、このような脂肪酸は、それぞれ６５から７５％の間および２０から３２％の間に含まれる量で存在する。他の脂肪酸鎖は、１５％を超えない量で存在していてもよく、典型的には、ラウロレイン酸（Ｌａｕｒｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）（もしくはドデセン酸（ｄｏｄｅｃｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）（Ｃ１２：１））または３−ヒドロキシウンデカン酸を、１０％を超えない量で、例えば脂質画分の５％以下の量で含む。脂肪酸の分析は、ＷＯ２０１０／０９４６９３で説明されているように、化合物をメタノール−塩酸（１ＭのＨＣｌ／ＭｅＯＨ）で８０℃で２０時間加水分解し、ヘキサン相中にメチルエステルとして抽出した後、ＧＣ−ＭＳによって実行できる。
【００６８】
糖脂質混合物は、典型的にはリン脂質と遊離の脂質を含まない。さらに糖脂質混合物は、例えば、シアノバクテリアのチラコイド膜に特有の、一般的に１ｋＤａよりも低い分子量を有するグリセロールの脂肪酸誘導体（モノガラクトシルジアシルグリセロール（ＭＧＤＧ）、ジガラクトシルジアシルグリセロール（ＤＧＤＧ）、スルホキノボシルジアシルグリセロール（ＳＱＤＧ））などの低分子量糖脂質も含まない場合がある。
【００６９】
医薬組成物
本化合物は十分な水溶性を有するため、特に液剤に関する分野の専門家に周知の水性添加剤および希釈剤を含む医薬組成物における治療的使用が可能である。糖脂質抽出物は、水と例えばＤＭＳＯなどの非プロトン性溶媒との両方で希釈でき、水性溶液中で安定である。さらに、糖脂質抽出物は、熱安定性でもある。
【００７０】
したがって、糖脂質を医薬組成物に配合してもよい。本発明に係る組成物は、例えば０．１から１００μｇ／ｍｌの間、例えば１から５０μｇ／ｍｌの間、例えば４から２０μｇ／ｍｌの間に含まれる濃度でオシラトリア属種由来の糖脂質抽出物を含む。
【００７１】
経口、静脈内（ｉ．ｖ．）、および局所投与の場合、患者に投与される糖脂質抽出物の１日用量は、典型的には０．０１から５０ｍｇの間、例えば０．１から５ｍｇの間、例えば０．３から３ｍｇの間に含まれる。
【００７２】
さらに、具体的な態様の１つにおいて、これらの組成物は、薬学的に許容される添加剤、希釈剤、および／または他の活性成分、ならびに安定剤を含む。特に、糖脂質抽出物は、経口、静脈内（ｉ．ｖ．）、吸入または局所投与に適した医薬的に許容される担体と結合していてもよい。
【００７３】
用語「薬学的に許容される担体」は、本明細書で使用される場合、必要に応じて動物またはヒトに投与した場合、不利な、または他の不都合な反応を起こさない溶媒、分散媒、コーティング、等張剤、および吸収遅延剤などを包含する。
【００７４】
経口用剤形としては、例えば、固体の形態、付着錠（ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｔａｂｌｅｔ）、バイオフィルムまたはクリーム剤、軟膏剤、およびペースト剤などが挙げられる。一実施形態において、経口用剤形は、錠剤であり、例えば米国特許第５，２４４，６６３号で説明されている錠剤である。
【００７５】
担体としてはさらに、これらに限定されないが、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、香料、着色剤、保存剤などが挙げられる。好適な崩壊剤としては、乾燥スターチ、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、ラクトース、加えて架橋ポリビニルピロリドン、例えばクロスポビドンなど（例えばＰｏｌｙｐｌａｓｄｏｎｅ（商標）．ＸＬ、これは、ＧＡＦから入手可能である）、架橋カルボン酸メチルセルロース、例えばクロスカルメロース（ｃｒｏｓｃａｒｍｅｌｏｓｅ）など（例えば、Ａｃ−ｄｉ−ｓｏｌ（商標）、これは、ＦＭＣから入手可能である）、アルギン酸、およびカルボキシメチルスターチナトリウム（例えばＥｘｐｌｏｔａｂ（商標）、これは、Ｅｄｗａｒｄ  Ｍｅｄｅｌｌ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．から入手可能である）、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、ならびにアルギン酸が挙げられる。結合剤は、使用される場合、付着を強化するものである。このような結合剤の例としては、これらに限定されないが、スターチ、ゼラチン、ならびに例えばスクロース、デキストロース、糖蜜、およびラクトースなどの糖質などが挙げられる。好ましい滑沢剤は、ステアレートおよびステアリン酸である。
【００７６】
好ましい添加剤は、ラクトース、マンニトール、およびクロスカルメロースである。
【００７７】
剤形に組み込むことができる追加の成分は公知であるか、または当業者には明白であると予想される；例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第１９版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、１９９５年）を参照されたい。
【００７８】
具体的な実施形態において、医薬組成物は、液体の形態である。
【００７９】
水性懸濁液を調製するために、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン、および様々なそれらの組み合わせなどの希釈剤と共に、様々な甘味剤または矯味矯臭剤、着色物質、所望に応じて乳化剤および／もしくは懸濁化剤を使用してもよい。グリセリンが好ましい。
【００８０】
さらなる態様によれば、本混合物は、上記で説明したのと同じ治療目的で、獣医学的使用のための組成物の調製にも好適である。
【００８１】
〔実施例１〕
材料および方法
ＶＢ３３２３
ＶＢ３３２３をＢｌｕｅｇｒｅｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｍｉｌａｎｏ、Ｉｔａｌｙ）から得た。ＶＢ３３２３は、リポ多糖（ＬＰＳ）を含む糖脂質画分の組成物に相当し、前記糖脂質画分は、Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ（ＣＣＡＰ）に寄託番号１４５９／４５で寄託されたオシラトリア属の株から抽出された。図７に、３つの異なるＶＢ３３２３のバッチのＮＭＲプロファイルを示す。
【００８２】
疼痛およびＣＯＰＤに関して使用されるモデル
実施例１から６で使用された動物モデルは当業界周知である。標準的手法を使用して実験を行った。以下、この坐骨神経結紮マウスモデルと侵害受容試験をさらに説明する。実施例７および８で使用された細胞モデルは、それに対応する実施例で説明される。
【００８３】
坐骨神経結紮
体重２８±３ｇのＣ５７ＢＬ／６Ｎ、Ｃｒｌ  ＢＲマウス（野生型）を、ペントバルビタールナトリウム（６５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で麻酔し、外科的に処理した。簡単に言えば、大腿中央部で、坐骨神経の三分岐部分の近位で総坐骨神経を露出させ、その周りを、神経弓上の循環が保たれるように約１ｍｍの間隔で４本の結紮糸で緩く縛った。マウスにおいて、両方の後脚で短い単収縮が観察されるまで結紮糸で縛った。対照として擬似の動物（結紮なしで坐骨を露出させた）を使用した。
【００８４】
侵害受容試験
特殊な機器（Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅ、Ｖａｒｅｓｅ、Ｉｔａｌｙ）を使用したＨａｒｇｒｅａｖｅｓの方法（足底試験（ｐｌａｎｔａｒ  ｔｅｓｔ））に従って放射熱刺激に対する脚の逃避反射の潜時を記録することにより温熱性痛覚過敏を評価した（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓら、１９８８年）。ガラスのプラットフォーム上の透明なアクリル製ボックスに動物を置き、そのまま順応させた。プラットフォームを介して後脚の足底面に一定強度の放射熱源を当てた。脚の逃避反射を検出して潜時を秒単位で示す光電池により刺激への応答を記録した。ＣＣＩモデルで、ＣＦＡ注射前、ＣＦＡ注射から７日および１４日後（最後の薬物処置から２４時間後）、または様々な時間で注射された後脚とその反対側の後脚で温熱性痛覚過敏を評価した。
【００８５】
ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ（Ｖｉｌｌｅｔｔｉら、２００３年）によって説明されている機械的な刺激に対する反応を測定する機器（Ｐｌａｎｔａｒ  Ａｅｓｔｈｅｓｉｏｍｅｔｅｒ、Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅ、Ｉｔａｌｙ）を使用した方法に従って、機械的アロディニアを検査した。簡単に言えば、マウスを金属メッシュのテーブルに置き、順応後に、マウスが脚を引っ込めるまで機械的な力を段階的に高めながら（２０秒の期間にわたり５０ｇ）足底面に対して電子針（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ｎｅｅｄｌｅ）を押し当てた。ＣＣＩモデルで、ＦＣＡ注射の前、ＦＣＡ注射から７日および１４日後（最後の薬物処置から２４時間後）、または様々な時間で注射された後脚と反対側の後脚で逃避反射の閾値をグラムで測定することにより、機械的アロディニアを評価した。
【００８６】
〔実施例２〕
ＶＢ３３２３は、ＦＣＡ処置マウスにおいて温熱性痛覚過敏と機械的アロディニアの両方を強く且つ用量依存的に低下させた
足底内部へのフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）の注射から１４日後、マウスのＦＣＡ処置した脚は、熱による逃避反射の潜時と機械的アロディニアの閾値の両方における有意な減少（約５０％）を示した。
【００８７】
ＦＣＡ投与から１４日目に、経口用ＶＢ３３２３（３０および１００ｍｇ／ｋｇ）を投与してから２時間（２８および６７％の回復）ならびに６時間（それぞれ１５％および６９％回復）後に、経口用ＶＢ３３２３は、有意に且つ用量依存的に機械的アロディニアを阻害した。同じ実験で、ＶＢ３３２３は、２時間（１９および８０％の回復）ならびに６時間（３９および３８％の回復）で温熱性痛覚過敏に対する活性を示した。１０ｍｇ／ｋｇ（腹腔内）のＶＢ３３２３は、１００ｍｇ／ｋｇの用量と同様に、機械的アロディニアと温熱性痛覚過敏の両方を低下させることができた。
【００８８】
〔実施例３〕
ＶＢ３３２３を３０ｍｇ／ｋｇで用いた長期間処置は、機械的アロディニアを有意に低下させた
足底内部へのフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）で処置したマウスにおいて、ＶＢ３３２３（３０ｍｇ／ｋｇ、７日間）での長期間経口処置は、ＦＣＡ投与から１４日目に機械的アロディニア（５９％の回復）を有意に低下させた。最後のＶＢ３３２３処置から２４時間後にこの作用を検査した。
【００８９】
〔実施例４〕
グロスの形態学的評価によれば、ＶＢ３３２３での長期間処置は、有意な体重の変化と臓器の変質をまったく誘導しなかった
ＶＢ３３２３処置から毎日、マウスの体重をモニターした。最後のＶＢ３３２３処置から２４時間後に処分した動物で、グロスの形態学的評価と脾臓重量による臓器の変質を評価した。
【００９０】
ＶＢ３３２３での長期間処置は、上述したパラメーターの変化をまったく誘導しなかった。
【００９１】
〔実施例５〕
ＶＢ３３２３は、機械的アロディニアおよび温熱性痛覚過敏を有意に低下させた
慢性神経因性疼痛のモデルである坐骨神経の慢性絞扼損傷を行ってから１４日後、マウスの結紮した脚は、熱による逃避反射の潜時と機械的アロディニアの閾値の両方における有意な減少（約５０％）を示した。経口ＶＢ３３２３（１０および３０ｍｇ／ｋｇ／日、８日間）は、その最後の投与から２時間後に、アロディニア（４５および５０％の回復）ならびに温熱性痛覚過敏（４２および４３％の回復）を有意に阻害した。
【００９２】
このモデルにおいて、ＶＢ３３２３の単回投与後ではアロディニアに対する作用はなく、温熱性痛覚過敏に対する作用はわずかであった。ＶＢ３３２３の活性は繰り返しの投与の後に確認され、重要な治療活性を示唆している。
【００９３】
〔実施例６〕
ＶＢ３３２３での長期間処置により、慢性疼痛によって誘導された体重減少が軽減された
坐骨神経結紮によって引き起こされた神経障害性疼痛は、マウスの体重の低下をもたらした（基準の体重からの差分％、約４）。
【００９４】
ＶＢ３３２３での長期間処置により、慢性疼痛により誘導された体重減少を軽減した（１０および３０ｍｇ／ｋｇ／日、８日間）。
【００９５】
総合すると、実施例１から６の結果から、ＶＢ３３２３は、疼痛、特に神経障害性および／または慢性疼痛の処置を可能にすることが実証された。
【００９６】
〔実施例７〕
ＶＢ３３２３は、ヒト気管支実質におけるＬＰＳによって誘導されたＴＮＦα放出を阻害した
Ｓａｎ  Ｇｅｒａｒｄｏ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｍｏｎｚａ、Ｉｔａｌｙで癌腫の切除を受けた患者からヒト実質性肺組織を得た。患者は、放射線治療、またはステロイド、オピオイドもしくは化学療法での長期間処置を受けていなかった。全ての実質組織試料を、腫瘍から遠い部位から得た。この研究は、Ｓａｎ  Ｇｅｒａｒｄｏ  ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｍｏｎｚａ  Ｉｔａｌｙの施設内倫理委員会によって承認されており、全ての志願者はインフォームドコンセントを受けた。切除された肺組織を腫瘍、太い気道、胸膜、および目に見える血管から切り離し、クレブス緩衝液（組成は、ｎＭで：ＮａＣｌが１１８．４、ＫＣｌが４．７、ＣａＣｌ２が２．５、ＫＨ２ＰＯ４が１．２、ＮａＨＣＯ３が２５、グルコースが１１．７である）で数回洗浄する間に解剖用のはさみを使用して２ｍｍの断片に細かく刻んだ。６つの外植片（総重量は約３０ｍｇ）を、培養用バイオリアクター（Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ／ＮＡＳＡ  ＵＳＡ）で、１％のペニシリン、１％のストレプトマイシン、および１％のゲンタマイシンを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地と共に、３７℃で、５％の二酸化炭素／空気中で１６時間インキュベートした。次いで組織を、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で刺激するか、または細胞培養培地のみで４時間維持した。ＴＮＦの中和のために、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで刺激する前に１時間、０．０１、０．１、または１μＭのＶＢ３３２３と共に組織をインキュベートした。肺の組織片と上清を回収し、分析まで両方を−８０℃で保存した。組織片の重さを量り、総組織重量を決定して、放出されたサイトカインのレベルを正規化した。酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）によって上清中のＴＮＦアルファのレベルを測定し、組織重量に従って濃度を補正した。ヒトＴＮＦ−特異的ＥＬＩＳＡキット（検出限界は組織１ｍｇあたり０．２ｐｇ）をＰｉｒｃｅから購入し、製造元のプロトコールに従って各ＥＬＩＳＡを行った。
【００９７】
ＶＢ３３２３は、濃度依存的に（０．０１、０．１、または１μＭ）、ヒト気管支の実質組織の培養物において大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）−ＬＰＳにより誘導されたＴＮＦアルファの放出を０．１μＭのＩＣ５０で阻害した。ＴＮＦアルファ放出の阻害に関して、同じ濃度の参照標準デキサメタゾン（６９％）と比較したところ、１μＭのＶＢ３３２３がそれより有効であった（８９％）。
【００９８】
デキサメタゾンは、ヒトにおいてＣＯＰＤを処置するために使用される薬物である。このたび本発明者らは、ＶＢ３３２３は、デキサメタゾンよりも有効であることを見出した。それゆえに、ＶＢ３３２３は、ＣＯＰＤの処置にとって極めて有望な薬物である。
【００９９】
〔実施例８〕
ＶＢ３３２３は、マウス気管支の実質においてＬＰＳによって誘導されたＴＮＦα放出を阻害した
動物（ＢＡＬＢ／ｃ雄マウス、体重２０〜２２ｇ）を頸部脱臼により処分した。肋骨を切って胸郭を開いた。外科用ピンセットで心臓をクランプし、外科用はさみを使用して肺と心臓を胸腔から切り離し、それらを冷たいクレブス溶液（組成は、ｎＭで：ＮａＣｌが１１８．４、ＫＣｌが４．７、ＣａＣｌ２が２．５、ＫＨ２ＰＯ４が１．２、ＮａＨＣＯ３が２５、グルコースが１１．７である）に入れた。太い気道と目に見える血管を切除した。肺を３０ｍｇの断片に分けて（マウス１匹あたり約５つの断片）、メスを使用して細かく刻んだ（断片１つを約２ｍｍ３の６つの断片にした）。２４ウェルプレートのウェル（２．０ｃｍ２）１つあたり１ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０培地（ＲＰＭＩ−１６４０＋抗生物質抗真菌剤溶液１００×、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に、３７℃で、５％の二酸化炭素／空気中で、１６時間、６つの外植片（総重量３０ｍｇ）をインキュベートした。次いで培地を新鮮な培地で交換し、組織を化合物で１時間処置した。１時間後、１００ｎｇ／ｍｌの大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）由来ＬＰＳ０５５：Ｂ５（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で組織を刺激した。ＬＰＳ刺激から４時間後、上清を回収し、ＥＬＩＳＡ分析まで−８０℃で保存した。組織学的／免疫組織化学的分析のために６つの組織外植片のうち３つを１０％のホルマリン緩衝液中で固定した。残りの３つの組織外植片をＲＮＡ−ｌａｔｅｒ緩衝液中に一晩入れて、その後−８０℃で保存した。
【０１００】
マウスＴＮＦ特異的ＥＬＩＳＡキット（検出限界は組織１ｍｇあたり０．２ｐｇ）をＰｉｒｃｅから購入し、製造元のプロトコールに従って各ＥＬＩＳＡを行った。
【０１０１】
マウス気管支の実質組織の培養物において、ＶＢ３３２３は、１μＭで、ＥＣｏｌｉのＬＰＳにより誘導されたＴＮＦアルファの放出を阻害した。同じ濃度の参照標準デキサメタゾン（６７％）の活性と類似した６８％の活性を示した。
【０１０２】
この実験から、ＶＢ３３２３は、ＣＯＰＤの処置にとって極めて有望な薬物であることが確認された。
【０１０３】
〔実施例９〕
マウスのＣＯＰＤモデルにおける経口用ＶＢ３３２３の作用
タバコの煙／オゾン曝露の組み合わせ：
使用された動物は、Ｂａｌｂ／ＣＢＹＪマウス（雌、１５〜１７週齢）であった。動物をタバコの煙とオゾンとの組み合わせに晒した。簡単に言えば、１回目の３日間のタバコの煙（ＣＳ）に順化させた後、４種の調査用タバコの主流煙（２Ｒ４Ｆ）およびオゾン（Ｏ３）を１．７ＬＰＭ（リットル／分の空気）の希釈空気と混合し、ＣＳ＋Ｏ３に動物を２０分晒した。その後、１時間の回復期間を設けた。手順をさらに２回繰り返した（合計の１日の曝露は１時間）。ＣＳ＋Ｏ３曝露の総持続時間は１４日間であった。
【０１０４】
動物の処置：
曝露期間（ＣＳ順化およびＣＳ＋Ｏ３曝露）の間中ずっと動物は処置を受けた。１回目のＣＳまたはＣＳ＋Ｏ３曝露の１時間前にＶＢ３３２３（１０ｍｇ／ｋｇ／日）を毎日与えた。擬似（未処置）の動物およびＣＳ＋Ｏ３対照動物を媒体で処置した。
【０１０５】
測定したパラメーター：
様々なパラメーターを測定した：
−  体重の変化を１日１回測定した。
−  最後のＣＳ＋Ｏ３曝露の１８〜２４時間後における静的および動的な肺機能（ＦＲＣ（機能的残気量）、ＴＬＣ（全肺容量）、ＦＥＶ２０／ＦＶＣ［２０秒間の努力呼気肺活量）／［努力呼気肺活量］）を測定するために、肺機能試験（Ｂｕｘｃｏ）を行った。
−  最後のＣＳ＋Ｏ３曝露の５時間後に行われた気管支肺胞洗浄液によって肺の炎症を測定した。総細胞数と好中球数を評価した。
【０１０６】
結果：
図８において、ＴＬＲ４アンタゴニストのＶＢ３３２３処置は、ＣＳ＋Ｏ３曝露によって誘導された体重の低下に対して軽度であるが有意な効能を示した。
【０１０７】
図９において、ＴＬＲ４アンタゴニストのＶＢ３３２３処置は、ＣＳ＋Ｏ３曝露によって誘導された肺水腫を有意に改善した。
【０１０８】
他の実験を実行したところ、ＴＬＲ４アンタゴニストでの処置は、肺気腫／過膨張および気道閉塞の予測となる静的または動的な肺機能パラメーターに対して効能がなかったことが示された。
【０１０９】
ＴＬＲ４アンタゴニストのＶＢ３３２３の経口投与（１０ｍｇ／ｋｇ／日、２週間）は、タバコの煙／オゾンによって誘導された体重の低下の軽度の低下をもたらし、ＣＳ＋Ｏ３によって誘導された肺水腫を有意に改善した。
【０１１０】
ＶＢ３３２３の経口投与は、気管支肺胞洗浄液で評価したところ、ＣＳ＋Ｏ３によって誘導された気道炎症に対する効果はなかった。この結果は、低用量での試験および／またはＶＢＲ３２２を吸入法の代わりに経口で投与したことによって説明することも可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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