(57)【要約】  【解決手段】  グラフェンデバイス（例えば、電界効果トランジスタ、つまりＦＥＴｓ）とタンパク質などの生体分子とのナノ電子接触面を特徴とするデバイスおよび方法が提供され、このデバイスおよび方法は、前記生体分子と無機成分の機能性を合わせたバイオ電子デバイスを生産する経路を提供する。１つの典型的な応用では、蛍光タンパク質によりグラフェンＦＥＴｓを官能化し、前記タンパク質の光吸収スペクトルにより定義される波長で光に反応するハイブリッドを得ることができる。また前記デバイスは、特定の検体に選択的に結合する生体分子と電子通信したグラフェンを含むことができる。  【選択図】      図１２
2015500482.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デバイスであって、
グラフェン骨格と電子通信する生体分子と、
励起照射の特定波長前後に光吸収ピークを有する生体分子と
を有するデバイス。
【請求項２】
請求項１記載のデバイスにおいて、前記生体分子がタンパク質を有するものであるデバイス。
【請求項３】
請求項２記載のデバイスにおいて、前記タンパク質が１若しくはそれ以上の結合パートナーに選択的に結合するものであるデバイス。
【請求項４】
請求項２記載のデバイスにおいて、前記タンパク質がヒスチジンタグを有するものであるデバイス。
【請求項５】
請求項２記載のデバイスにおいて、前記タンパク質がペプチド配列により前記グラフェンに結合するものであるデバイス。
【請求項６】
請求項２記載のデバイスにおいて、前記タンパク質はキチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、エピトープタグ、またはその組み合わせを有するものであるデバイス。
【請求項７】
請求項６記載のデバイスにおいて、前記エピトープタグがＶ５タグ、ｃ−ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、またはその組み合わせを有するものであるデバイス。
【請求項８】
請求項２記載のデバイスにおいて、前記タンパク質が反応性アミノ酸を有するものであるデバイス。
【請求項９】
請求項２記載のデバイスにおいて、前記グラフェンがジイミド活性化によるアミド化を有するものであるデバイス。
【請求項１０】
請求項２記載のデバイスであって、さらに、システイン−グラフェン結合を有するデバイス。
【請求項１１】
請求項２記載のデバイスであって、さらに、前記タンパク質とグラフェン間のアミド結合、前記タンパク質とグラフェン間のイミン結合、前記タンパク質とグラフェン間のチオ尿素結合、前記タンパク質とグラフェン間のアミノアルコール結合を有するデバイス。
【請求項１２】
請求項２記載のデバイスにおいて、前記タンパク質は蛍光タンパク質、融合タンパク質、またはその両方を有するものであるデバイス。
【請求項１３】
請求項１２記載のデバイスにおいて、前記蛍光タンパク質は緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、青緑色蛍光タンパク質、またはその任意の組み合わせを有するものであるデバイス。
【請求項１４】
請求項１２記載のデバイスにおいて、前記タンパク質が蛍光レドックス補因子を有するものであるデバイス。
【請求項１５】
請求項１４記載のデバイスにおいて、前記タンパク質は、フラビンタンパク質、鉄が亜鉛で置換されているヘム含有タンパク質、またはその任意の組み合わせを有するものであるデバイス。
【請求項１６】
請求項１２記載のデバイスにおいて、前記タンパク質がトリプトファンを有するものであるデバイス。 
【請求項１７】
請求項１記載のデバイスにおいて、前記生体分子と前記グラフェン骨格との間の電子通信は、ニッケル−ニトリロ酢酸基とヒスチジン残基との間の相互作用を含むものであるデバイス。
【請求項１８】
請求項１記載のデバイスにおいて、前記グラフェン骨格はシート、リボン、シリンダー、プレートレット、またはその任意の組み合わせを有するものであるデバイス。
【請求項１９】
請求項１記載のデバイスにおいて、前記グラフェン骨格は、前記グラフェン骨格の電気的特徴をモニターするデバイスと電子通信するものであるデバイス。
【請求項２０】
請求項１記載のデバイスにおいて、前記励起照射の特定波長は約１ｎｍ〜約９００ｎｍの波長であるデバイス。
【請求項２１】
方法であって、
生体分子とグラフェン骨格とが互いに電子通信するように、生体分子をグラフェン骨格に接触させる工程
を有する方法。
【請求項２２】
請求項２１記載の方法において、前記生体分子とグラフェン骨格は、互いに結合する構造、互いに配位する構造、またはその両方を有するものである方法。
【請求項２３】
請求項２１記載の方法において、前記生体分子がタンパク質を有するものである方法。
【請求項２４】
請求項２３記載の方法において、前記タンパク質がヒスチジン残基を有するものである方法。
【請求項２５】
請求項２１記載の方法において、前記ヒスチジン残基は、前記グラフェンと結合する１若しくはそれ以上の分子と相互作用するものである方法。
【請求項２６】
請求項２５記載の方法において、前記分子が金属を有するものである方法。
【請求項２７】
請求項２１記載の方法であって、さらに、前記グラフェン骨格の１若しくはそれ以上のカルボン酸基を処理する工程を有する方法。
【請求項２８】
請求項２１記載の方法において、前記タンパク質と前記グラフェン骨格との間の電子通信は、ニッケル−ニトリロ酢酸基とヒスチジン残基との間の相互作用を含むものである方法。
【請求項２９】
デバイスであって、
結合パートナーと選択的に結合する生体分子と電子通信するグラフェン骨格を有し、
前記グラフェン骨格は、前記生体分子の電気的特徴の変化を検出することができる生体分子と電子通信するものであるデバイス。
【請求項３０】
請求項２９記載のデバイスにおいて、前記生体分子はタンパク質、受容体、リガンド、酵素、抗体、またはその任意の組み合わせを有するものであるデバイス。
【請求項３１】
方法であって、
照明波長でデバイスを照射する工程であって、前記デバイスは特定の照明波長前後に光吸収ピークを有する感光性タンパク質を有し、前記感光性タンパク質はグラフェン骨格と電子通信するものである、前記照射する工程と、
前記デバイスの電気的特徴の変化を検出する工程と
を有する方法。
【請求項３２】
請求項３２記載の方法であって、さらに、前記タンパク質をサンプルに接触させる工程を有する方法。
【請求項３３】
請求項３１記載の方法において、前記サンプルは前記タンパク質に相補的な結合パートナーを含むものである方法。
【請求項３４】
方法であって、
結合パートナーと選択的に結合する生体分子と電子通信するグラフェン骨格を有するデバイスにサンプルを接触させる工程であって、前記グラフェン骨格は前記タンパク質の電気的特徴の変化を検出することができるデバイスと電子通信するものである、前記接触させる工程と、
前記生体分子と結合パートナーとの間の結合と関連した前記デバイスの電気的特徴の変化をモニターする工程と
を有する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権利
本研究は、米国国立科学財団の助成金ＩＧＥＲＴ  ＤＧＥ−０２２１６６４およびＮＳＥＣ  ＤＭＲ０８−３２８０２による支援を受けた。政府は本発明に対して一定の権利を有する。
【０００２】
本開示は、グラフェン素材、バイオ電子デバイス、およびタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００３】
グラフェンはその電子的、機械的、および熱的性質が注目を集めており、例えば超高速光検出器および光変調器などの光学的および光電子的応用に利用できる可能性もある。光検知器または光吸収器では、デバイスの反応波長を調整することが望ましい。ただし、グラフェン単分子層は可視および赤外の範囲でπα＝２．３％（α＝微細構造定数）の一定の吸収を示すため、このグラフェンの応用には問題がある。したがって、グラフェンを基本とした光電子デバイスには、長年にわたる切実な要求がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
これらの長年にわたる切実な要求を受け、本開示では、グラフェン骨格と電子通信した生体分子、つまり、特定の励起照明波長の前後に光吸収ピークを有する生体分子を有するデバイスを提供する。
【０００５】
本開示では方法も提供し、前記方法は生体分子とグラフェン骨格が互いに電子通信するように、前記生体分子とグラフェン骨格を接触させる工程を含む。
【０００６】
デバイスも提供され、前記デバイスは結合パートナーと選択的に結合する生体分子と電子通信したグラフェン骨格を含み、前記グラフェン骨格は前記生体分子の電気的特徴の変化を検出することのできる生体分子と電子通信している。  
さらに方法が提供され、前記方法は、照明波長でデバイスを照射する工程であって、前記デバイスは特定の照明波長の前後に光吸収ピークを有する感光性タンパク質を有し、前記感光性タンパク質はグラフェン骨格と電子通信する工程と、前記デバイスの電気的特徴の変化を検出する工程とを有するものである。  
また、方法が提供され、前記方法は、結合パートナーと選択的に結合する生体分子と電子通信したグラフェン骨格を有するデバイスにサンプルを接触させる工程であって、前記グラフェン骨格が前記タンパク質の電気的特徴の変化を検出することのできるデバイスと電子通信する工程と、前記生体分子と結合パートナーとの結合に関連した前記デバイスの電気的特徴の変化をモニターする工程とを含むものである。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
発明の概要、および以下の発明を実施するための形態は、添付の図面と併せて読むとさらに理解される。本発明を図示する目的で、本発明の実施形態に典型的な図に示されているが、本発明は開示された特定の方法、組成物、およびデバイスに限定されるものではない。さらに、図は必ずしも原寸に比例して描かれていない。以下は図の説明である。
【図１】図１は、Ｈｉｓ標識Ｇタンパク質による官能化前（ａ）および後（ｂ）の単層グラフェンのＡＦＭを図示しており、（ｃ）高さのラインスキャンは（ａ）および（ｂ）に示されている。（ｄ）グラフェン（下部）とタンパク質のヒスチジンタグ（上部）との化学カップリングの概略図。
【図２】図２は、融合タンパク質ＧＳＴ−ＢＴ５による官能化に必要な各工程後のグラフェンＦＥＴのグラフェンＦＥＴの電流ゲート電圧（Ｉ−ＶＧ）：調整時（黒色）、ジアゾニウム処理後（赤色破線）、Ｎｉ−ＮＴＡ結合後（緑色点線）、およびタンパク質（ＧＳＴ−ＢＴ５）溶液にインキュベーション後（青色鎖線）。バイアス電圧は１ｍＶである。（差し込み図）異なる照明条件でのＧＦＰ−ＧＦＥＴのＩ−ＶＧ特徴：照明なし（黒色）、４０５ｎｍ（紫色のデータ）、５３２ｎｍ（緑色のデータ）、および６３２ｎｍ（赤色のデータ）で照明。照明強度は各波長で約７０ｍＷ／ｃｍ２。バイアス電圧は１０ｍＶである。
【図３】図３は、タンパク質の光吸収スペクトルにより決定した緑色および黄色蛍光タンパク質（それぞれ、ＧＦＰおよびＹＥＰ）を組み込んだＧＦＥＴハイブリッドの光電流反応（％ΔＩ／Ｉ）を示している。４０５ｎｍ（紫色のデータ）、５３２ｎｍ（緑色のデータ）、および６３２ｎｍ（赤色のデータ）の照明に対する反応が示されている。（ａ）ＧＦＰ−ＧＦＥＴに対する反応。１００秒から５０秒間サンプルに照明を当て、５０秒間照明を消した。紫色の照明のみが検出可能な反応を引き起こしている。差し込み図：ＧＦＰの測定吸収スペクトル。実験に用いた波長は適切な色の点で示している。（ｂ）ＹＦＰ−ＧＦＥＴハイブリッドの光電流反応。５０秒から５０秒間サンプルに照明を当て、５０秒間照明を消した。緑色の照明のみが検出可能な反応を引き起こしている。差し込み図：、ＹＦＰの測定吸収スペクトルであり、点は使用波長を示している。
【図４】図４は、４−カルボキシベンゼンジアゾニウムテトラフルオロボラート溶液にインキュベートする前（ａ）および後（ｂ）の単層グラフェンのＡＦＭ画像を示している。ｚスケールは１０ｎｍである。（ｃ）ラインスキャンの高さプロフィールを（ａ）黒および（ｂ）青で示している。
【図５】図５は、タンパク質のインキュベートを除く全官能化工程前（ａ）および後（ｂ）のＡＦＭ画像を示している。ｚスケールは１５ｎｍである。（ｃ）これによる高さのラインスキャン。
【図６】図６は、（ａ）官能化プロセス後の単層グラフェンのＡＦＭ画像を示しており、前記ジアゾニウムのインキュベーション工程は省略し、後の化学的工程はそのまま変化なしとした。ｚスケールは１５ｎｍである。（ｂ）ラインスキャンの高さプロフィールを（ａ）に示している。
【図７】図７は、非Ｈｉｓ標識Ｇタンパク質による官能化前（ａ）および後（ｂ）の単層グラフェンのＡＦＭ画像を示している。ｚ軸のスケールは１５ｎｍである。（ｃ）ラインスキャンの高さプロフィールを（ａ）黒および（ｂ）青で示している。
【図８】図８は、（ａ）元の状態のグラフェンのラマンスペクトルおよび（ｂ）ジアゾニウム官能化後の同一グラフェンのラマンスペクトルを示している。
【図９】図９は、Ｈｉｓ標識Ｇタンパク質による官能化前（ａ）および後（ｂ）の単層グラフェンのラマンスペクトロスコピーを示している。
【図１０】図１０は、ジアゾニウムおよびＮｉ−ＮＴＡにより官能化したグラフェンＦＥＴの光電流反応を図示している（ただし、蛍光タンパク質は使用していない）。
【図１１】図１１は、２週間後に同じデバイスで測定した電流と時間のパーセント変化を図示している。
【図１２】図１２は、ポリヒスチジン標識タンパク質を用いたグラフェン官能化の典型的な反応スキームを図示している。
【図１３】図１３は、グラフェン基質に結合するタンパク質または他の生体分子の典型的なスキームを図示している。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、本開示の一部を成す添付の図および例と関連して、以下の詳細な説明を参照することにより、より容易に理解することができる。本発明は、本明細書に説明および／または図示される特定のデバイス、方法、応用、条件、またはパラメーターに限定されることはなく、本明細書で使用される専門用語は例によってのみ特定の実施形態を説明する目的であり、請求された発明を限定する意図はないことは理解されるものとする。また、添付の請求項を含む本明細書で使用されるとおり、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には複数の言及も含み、文脈からそうでないことが明示されている場合を除き、特定の数値の言及は少なくともその特定の値を含む。「複数」の用語は、本明細書に使用されるとおり、２以上を意味する。値の範囲が表されている場合、別の実施形態には１つの特定の値から、および／または他の特定の値までを含む。同様に、値が「約」の先行詞を使用して近似値として表されている場合、特定の値が別の実施形態を形作ることは理解される。すべての範囲は包含的で組み合わせることができ、本明細書で引用したすべての文書は、いかなる目的においてもこの参照によりその全体が組み込まれる。
【０００９】
明確にするために別の実施例の内容で本明細書に説明された本発明の特定の特徴は、単一の実施例と組み併せて提供されてもよいことは理解されることとする。逆に、簡潔にするため、単一の実施例の内容で説明される本発明の様々な特徴は、別に、または適当な小さな組み合わせで提供されてもよい。さらに、範囲で述べられた値の言及は、この範囲内にそれぞれ、すべての値を含む。
【００１０】
本明細書では、光学的に活性な生体分子（例えば、タンパク質）をグラフェンと電子通信させるデバイスおよび関連する方法、また、検体認識能力を有する生体分子をグラフェンと電子通信させるデバイスおよび方法が提示される。そのような生体分子には、疾患バイオマーカーを検出することができる嗅覚受容体、抗体、または抗体フラグメントも含む。酵素も開示されるデバイスおよび方法で使用するのに適した生体分子である。酵素とその基質との相互作用の特異性のため、酵素は特に開示されるデバイスおよび方法で使用するのに適している。
【００１１】
本開示では、まずデバイスを提示し、前記デバイスにはグラフェン骨格と電子通信した生体分子を含み、前記生体分子は特定の励起照明波長の前後に光学吸収ピークを有する。
【００１２】
タンパク質、抗体、および抗体フラグメントは、特に開示されるデバイスに適した生体分子であると考えられる。前記生体分子（タンパク質など）は１若しくはそれ以上の結合パートナーに選択的に結合することができる。抗体、酵素、リガンド、および受容体はこの目的に特に適していると考えられる。前記開示されたデバイスおよび方法に使用される生体分子は、本来は天然から単離するか、合成することができることは理解されるものとする。
【００１３】
前記デバイスに使用されるタンパク質または他の生体分子にはヒスチジンタグを含んでいてもよい。ヒスチジンにより促進したタンパク質とグラフェンとの結合は特に適していると考えられるが、生体分子とグラフェンが互いに電子通信する唯一の方法ではない。実施形態によっては、添付の典型的な図で示されたように、前記生体分子と前記グラフェン骨格の電子通信がニッケル−ニトリロ酢酸基とヒスチジン残基との相互作用を含む。
【００１４】
場合によっては、タンパク質がペプチド配列によってグラフェンと結合することができる。１つの実施形態では、ファージディスプレイペプチドライブラリを用いて同定した配列など、特異的なペプチド配列を加えてタンパク質をグラフェンに結合することができる。
【００１５】
グラフェンはそれ自体、結合を促す構造を有するように修飾することができる。そのような構造には、糖、抗体、キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、エピトープタグなどを含む。適切なエピトープタグには、Ｖ５タグ、ｃ−ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、またはその組み合わせを含む。開示されたデバイスで使用されるタンパク質には、反応性アミノ酸を含み、これには光反応性アミノ酸を含む。
【００１６】
前記開示されたデバイスのグラフェンには、ジイミドで活性化されたグラフェンと生体分子とのアミド化を含む。また前記デバイスには、前記グラフェンと生体分子との間のシステイン−グラフェン結合も含む。そのような結合は、ジアゾニウム、ＥＤＣ  ＮＨＳ、ＰＤＥＡ  ａｋａ  ２−（２−ピルジニルジチオ）エタンアミンと前記タンパク質のチオール支持領域を処理することで達成することができる。
【００１７】
様々な結合を使用し、生体分子をグラフェンに結合することができる。特定の典型的結合および化学的構造を図１３に示しており、前記生体分子とグラフェン間のアミド結合、前記生体分子とグラフェン間のイミン結合、前記生体分子とグラフェン間のチオ尿素結合、前記生体分子とグラフェン間のアミノアルコール結合を含む。
【００１８】
前記生体分子がタンパク質を有する実施形態では、前記タンパク質が蛍光タンパク質、融合タンパク質、またはその両方である。蛍光タンパク質は緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、青緑色蛍光タンパク質、またはそのいずれの組み合わせであってもよい。タンパク質には蛍光レドックス補因子を含めることもできる。タンパク質には、フラビンタンパク質、鉄が亜鉛で置換されているヘム含有タンパク質などを含めることもできる。タンパク質には蛍光を発することが知られているトリプトファンを含めることもできる。
【００１９】
前記生体分子の励起照明波長は１ｎｍ〜約１５００ｎｍ、または約２００〜９００ｎｍ、または３００〜７００ｎｍとすることができる。様々なタンパク質が異なる励起ピーク波長を有し、緑色蛍光タンパク質は４００ｎｍ、高感度緑色蛍光タンパク質は４８８ｎｍ、黄色蛍光タンパク質は５２５ｎｍ、赤色蛍光タンパク質は５５７ｎｍ、青緑色蛍光タンパク質は４５８ｎｍ、トリプトファン含有タンパク質は２８０ｎｍ、フラビンモノヌクレオチド含有タンパク質は４５０ｎｍである。タンパク質は１つ、２つ、またはそれ以上の波長を有することもある。
【００２０】
開示されたデバイスのグラフェンはシート、リボン、シリンダー、プレートレット、または実際上、他のいかなる配置であってもよい。前記グラフェンは単原子の厚さであるか、または複数原子の厚さを有することもある。前記グラフェンは複数のシートを有していてもよい。前記デバイスのグラフェンは、前記グラフェン骨格の電気的特徴をモニターするデバイスと適切に電子通信している。
【００２１】
方法も提供される。これらの方法には、前記タンパク質とグラフェン骨格が互いに電子通信するように、生体分子をグラフェン骨格に接触させる工程も含む。前記生体分子とグラフェン骨格は、互いに結合している、互いに配位している、またはその両方の１若しくはそれ以上の構造を適切に有する。前記生体分子（例えば、タンパク質）にはヒスチジン残基を含み、ヒスチジン残基は前記グラフェンと結合する１若しくはそれ以上の分子と相互作用することができ、この分子は金属とすることもできる。
【００２２】
前記方法では、前記グラフェン骨格に１若しくはそれ以上のカルボン酸基を含むことができる。使用者は、糖、抗体、キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、エピトープタグなどをグラフェンに結合してもよい。実施形態によっては、添付の典型的な図で示されたように、前記タンパク質と前記グラフェン骨格の電子通信がニッケル−ニトリロ酢酸基とヒスチジン残基との相互作用を含む。
【００２３】
本発明は追加のデバイスも提供する。これらのデバイスは、結合パートナーと選択的に結合する生体分子と電子通信したグラフェン骨格を適切に含み、前記グラフェン骨格は前記生体分子の電気的特徴の変化を検出することのできるデバイスと電子通信している。
【００２４】
前記生体分子は適切にはタンパク質である。前記タンパク質は、前記環境中の他のタンパク質（癌バイオマーカーなど）または分子を認識する能力を適切に特徴としている。嗅覚受容体または小分子に結合する他のタンパク質は、そのような応用に特に適していると考えられる。受容体、リガンド、抗体、抗原、酵素、または抗体フラグメントも、すべてこれらのデバイスに適した生体分子であると考えられる。前記使用者は、前記グラフェンを、デバイスの電気的特徴の変化をモニターするデバイスと電子通信させることができる。このようにして、標的が前記グラフェンと電子通信している生体分子に結合する場合、前記デバイスの電気的特徴の関連する変化（例えば、伝導度／抵抗性）を検出し、記録する。一例として、抗原Ｘに相補的な抗体を含む本開示に従うデバイスは、抗原Ｘを含むか、含まないサンプルに接触させることができる。抗原Ｘがある場合、前記抗原は前記抗体に結合する。前記結合は今度は前記デバイスの電気的特徴を変化させ、これが前記デバイスによって記録される。前記抗原が前記サンプルに存在しない場合、前記デバイスの電気的特徴は一定のままであり、前記使用者は検体が存在しないことを理解する。
【００２５】
前記デバイスは、グラフェンと電子通信した１つ、２つ、またはそれ以上の生体分子検出装置を含むように構成することができる。前記生体分子は、検体が異なるとその結合親和性も異なるため、２若しくはそれ以上の検体の有無を同時に検出することができるデバイスの構成が可能である。前記デバイスは同じ検体を検出するため、複数の生体分子を提供することもでき、そのため、前記デバイスにやや冗長性をもたらす。
【００２６】
方法も提供される。これらの方法には、照明波長でデバイスを照射する工程であって、前記デバイスは特定の照明波長の前後に光吸収ピークを有する感光性タンパク質を有し、前記感光性タンパク質はグラフェン骨格と電子通信するものである工程と、前記デバイスの電気的特徴の変化を検出する工程とを含む。適切なタンパク質は本明細書の別の場所で説明されているが、蛍光タンパク質が特に適していると考えられる。前記使用者は前記タンパク質をサンプルに接触させることもできる。そのようなサンプルには、他のタンパク質および他の検体など、前記タンパク質に相補的な結合パートナーを含む。例えば、本明細書の別の場所で説明されているとおり、前記使用者はグラフェンに結合した抗体を有するデバイスを、前記抗体に相補的な検体を含むサンプルに接触させることができる。前記使用者は、前記抗体と検体との結合に関連した電気的特徴（伝導度など）の変化を検出することができる。
【００２７】
また、使用者は、結合パートナーと選択的に結合する生体分子と電子通信したグラフェン骨格を有するデバイスにサンプルを接触させ、前記グラフェン骨格は電気前記タンパク質の電気的特徴の変化を検出することのできるデバイスと電子通信しており、前記生体分子と結合パートナーとの結合に関連した前記デバイスの電気的特徴の変化をモニターする。
【００２８】
前記開示された方法およびデバイスに関する特定の実施形態について、特定の波長に光吸収のピークを有する蛍光タンパク質を使用する場合、グラフェンの電界効果トランジスタ（ＧＦＥＴ）はタンパク質の光学的励起の電気的励起をすべて高感度で電気的に読み出す。したがって、前記アプローチにより一連のバイオ／ナノハイブリッド光検出器を形成することができ、それぞれタンパク質成分により定義された波長範囲に感度を示す。異なる機能性（例えば、液相または気相での特定のバイオマーカーまたは小分子の化学的親和性）のタンパク質を使用することで、例えば医学的診断、自国の保安などの様々な応用に適するようにすることができる。
【００２９】
典型的な実験は、酸化したシリコン基質の機械的剥離によって生成したグラフェンで行った。グラフェン単層は原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）およびラマン分光法による調査によって選択した。デバイスは、グラフェンと容易に共有結合を形成するカルボキシル化ジアゼパム塩により官能化した。官能化に関するさらなる情報は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４２２９０号および米国特許出願第６１／５２９，３４１号に見ることができ、いずれもあらゆる目的において、この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００３０】
タンパク質−炭素ナノチューブハイブリッドで行われたように、得られたカルボン酸基を１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩／スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＥＤＣ／ｓＮＨＳ）で活性化した後、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）を結合した。デバイスの製造は、ＮｉイオンをＮＴＡ錯体に加え、タンパク質溶液にインキュベートすることで完了した（図１（ｄ）参照）。市販のヒスチジン標識タンパク質（Ｇタンパク質（２６．１ｋＤａ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、および黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）と融合タンパク質はすべてグラフェンデバイスに結合させることに成功し、前記アプローチのロバスト性と多応用性を明らかにしている。前記Ｈｉｓ標識（組み換え型）融合タンパク質は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６個のヒスチジン残基、および人工ヘム結合タンパク質の「ＢＴ５」から成る。
【００３１】
図１（ａ）および１（ｂ）は、Ｈｉｓ標識Ｇタンパク質による官能化前後の同じグラフェン単層のＡＦＭ画像であり、一方、図１（ｃ）は示されているラインスキャンの高さプロフィールを示している。官能化グラフェンのベースラインの高さが約２ｎｍ上昇している、新しいベースラインの上３．４±０．４ｎｍの高さに粒子が出現している、という２つの変化が観察される。他の実験では、ジアゾニウム溶液にインキュベートする前後のグラフェン単層のＡＦＭが約０．５ｎｍの高さ上昇することを示しており、初期の報告と一致していた。約２ｎｍの高さの上昇はＮＴＡ結合時にみられ、粒子は観察されなかった（データ図示せず）。いかなる単一の理論にも縛られることはないが、図１（ｂ）のベースラインの高さの上昇とＮＴＡ層およびＨｉｓ標識結合タンパク質を有する粒子とを関連付けることができる。前記ハイブリッド中のタンパク質の方向および図１（ｄ）のデバイス構造に関する請求は、追加実験により確認され、前記ジアゾニウムの工程を省略すると、前記グラフェン表面に分子は見られず、前記タンパク質にＨｉｓタグがないと、前記Ｎｉ−ＮＴＡ分子層に結合しない。
【００３２】
バイオ／ナノハイブリッドデバイスについては、電子ビームリソグラフィーによりＧＦＥＴｓを製造した。熱アニーリングにより望まない残基を除去する配慮を取った。図２は、その後の処理工程により融合タンパク質ＧＳＴ−ＢＴ５が結合する前後のＧＦＥＴの電流−ゲート電圧（Ｉ−ＶＧ）データを示している。アニーリングしたＧＦＥＴ  Ｉ−ＶＧは、両極性の挙動と、孔および電子のキャリア移動度が約２０００ｃｍ２／Ｖ−ｓであることを示している。中性ポイント（ＶＮ）はゲート電圧約２０Ｖで発生し、これはＶＧ＝０のドープキャリア密度１．６×１０１２／ｃｍ２に対応する。ジアゾニウム処理後（破線データ）、前記デバイスは正孔移動度約３００ｃｍ２／Ｖｓでｐ型であるようにみえ、ＶＮは８０Ｖを超え、最大ゲート電圧を使用した。キャリア移動度の低下はｓｐ２結合の開裂とカルボキシベンゼン基の結合によって形成した不具合に起因し、ラマンスペクトルで見られたＤ結合強度の上昇がこの事実を支持している。周囲環境で形成したナノスケール水層の結合カルボキシベンゼン基の脱プロトン化のため、前記ＶＮシフトは前記グラフェン環境の負電荷増加と一致している。この後のＮｉ−ＮＴＡ（青の破線）およびＧＳＴ−ＢＴ５（緑の点線）の結合はキャリア移動度に影響していないが、ＧＦＥＴ伝導度は約２５％低下し、これは結合した分子によるキャリア散乱の増加と一致している。
【００３３】
タンパク質−ＧＦＥＴバイオ／ナノハイブリッドは両成分の機能性を合わせている。光活性タンパク質の組み込みにより、光応答が望みの波長範囲に合ったハイブリッドが形成する。
【００３４】
図２（差し込み図）は、暗所で７０ｍＷ／ｃｍ２の強度で３種類の波長の光（４０５ｎｍ、５３２ｎｍ、および６３２ｎｍ、紫色、緑色、赤色と呼ぶ）に感光した場合に測定したＧＦＰ−ＧＦＥＴハイブリッドのＩ−ＶＧデータを示している。紫色の照射のみで大きなＩ−ＶＧシフトが観察され、緑色または赤色光の変化はごくわずかである。この波長依存性の光応答はＧＦＰの光吸収スペクトルと一致し、４００ｎｍ付近にピークがあり、５００ｎｍ以上の波長では吸収がほとんどない（図３ａの差し込み図、色の付いた点は使用した波長を示している）。Ｉ−ＶＧシフトの原因がＧＦＰの光励起に対するＧＦＥＴの電子反応とされることもある。ＧＦＰは光誘起電子ドナーであることが報告されているため、観察された電流の低下は、光励起によるＧＦＰの電荷再分配と関連した正味の双極子、またはＧＦＰ−ＧＦＥＴの電荷移動を反映している可能性がある。
【００３５】
図３のデータは、光電流反応を前記タンパク質成分の光学的特性により決定したバイオ／ナノハイブリッドの情報を示している。測定はＶＧ＝０およびＶＢ＝１０ｍＶにおいて、周囲環境下で行った。図３（ａ）では、時間１００秒から、ＧＦＰ−ＧＦＥＴハイブリッドに特定波長の光を５０秒間照射し、次に６０秒間消灯し、３サイクル行って再現性を判断した。前記反応は、暗所での電流ベースラインからＤＣ電流の分数電荷として示される。緑色および赤色の照射では、前記光応答がシステムノイズの範囲内である（<０．１％）。対照的に、紫色の照射では、およそ−６％の明確な反応が誘導される。ハイブリッドデバイスの最大光応答波長は、蛍光タンパク質を選択することでコントロールされることが示された。黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）−ＧＦＥＴハイブリッド（図３（ｂ））では、緑色でデバイスを照射した場合に強い伝導変調が発生しているが、ＹＦＰの吸収スペクトルから予想されるとおり、紫色または赤色光による励起では応答がごくわずかである（図３ｂ、差し込み図）。ＦＰ−ＧＦＥＴデバイスは安定で、寿命は２週間を超える。
【００３６】
前記開示された方法は、Ｈｉｓ標識タンパク質をグラフェンＦＥＴに結合させる、着実なで再現性のあるプロセスである。これは今度は、両成分の望ましい機能性を組み込んだバイオ／ナノハイブリッドを構成する経路を提供する。ＡＦＭ、ラマンスペクトロスコピー、および比較対照実験を利用し、ハイブリッド構造を確認し、輸送測定によりタンパク質結合の電子的影響を評価した。
【００３７】
前記方法により可能となる機能の例として、ＦＰ−ＧＦＥＴハイブリッドが新しいクラスの調節可能な光検出器を提示することが証明され、これは、結合したＦＰの吸収スペクトルにより決定される波長範囲の光電流反応を示す。
【００３８】
典型的な材料および方法
以下は開示されたデバイスおよび方法の具体例である。これらは実例とするためにのみ示しており、本開示の範囲は制限しない。
【００３９】
１．タンパク質の官能化スキーム
図１２は典型的な官能化プロセスを図示している。１０．７６ｍＭの４−カルボキシベンゼンジアゾニウムテトラフルオロボラート（Ｂｅｓｔ  Ｗｅｓｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ）溶液に５５℃で１時間浸漬し、続いて、アセトン、メタノール、脱イオン（ＤＩ）水で順にすすぐことで、酸化ケイ素基質の単層グラフェンを修飾し、カルボキシベンゼン基を共有結合させた。次に、前記チップを室温で１５分間、２ｍＭのＥＤＣ（Ｓｉｇｍａ）／５ｍＭのＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）活性化バッファー（０．１Ｍの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）ナトリウム塩、０．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液（ＨＣＬでｐＨを６．０に調節）にインキュベートし、カルボキシベンゼンのカルボン酸を活性化した。この後直ちに、前記チップを活性化バッファーで洗い、１１．３ｍＭのＮα，Ｎα−ビス（カルボキシメチル）−Ｌ−リシン水和物（ＮＴＡ−ＮＨ２（Ａｌｄｒｉｃｈ））溶液に入れ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨをＮａＯＨで７．３５に調節）で２時間調整した。終了後、前記チップを水で洗い、１１．３ｍＭのＮｉＣｌ２（Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液に３０分間入れ、ＤＩ水で洗い、風乾した。
【００４０】
Ｈｉｓ標識タンパク質溶液をチップ表面にピペットで載せた後、室温で３０分間インキュベートした。前記溶液の液滴は十分に大きく、３０分間の蒸発による容積変化は無視できた。前記チップをＤＩ水で洗い、非特異的に結合したタンパク質を除去し、風乾した。
【００４１】
ＧＦＰはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入し、ＹＦＰはＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから購入した。Ｈｉｓ標識Ｇタンパク質はｂｉｏ−Ｗｏｒｌｄから購入し、対照実験用の非Ｈｉｓ標識Ｇタンパク質はＰｒｏＳｐｅｃ−Ｔａｎｙ  ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ  Ｌｔｄ．から購入した。
【００４２】
２．官能化スキームの異なる段階のグラフェンのＡＦＭ
２．１  ジアゾニウム塩溶液にインキュベート後のグラフェンのＡＦＭ
上述の通り、単層グラフェンサンプルを５５℃の水浴で４−カルボキシベンゼンジアゾニウムテトラフルオロボラート塩溶液にインキュベートした。図４（ａ）（４（ｂ））は、官能化前（後）のグラフェンのＡＦＭ画像である。グラフェンの見かけの高さは約０．５ｎｍ増加し（カルボキシベンゼン基と結合、図１２参照）、その表面は若干、より粗面となっている。
【００４３】
タンパク質溶液へのインキュベーションを除く、全官能化工程後のグラフェンのＡＦＭ
図５（ａ）（５（ｂ））は、タンパク質溶液へのインキュベーションを除く全結合化学工程前（後）のグラフェン単層のＡＦＭスキャンである。図Ｓ２（ｂ）のグラフェンの見かけの高さは約１．８ｎｍ増加し、ＮＴＡ分子層の結合を反映し、図１（ｃ）および図１２の主文の帰属の理由となっている。粒子様の特徴は数カ所しか観察されず、図１（ｂ）の粒子様の特徴はＨｉｓタグによりタンパク質にグラフェンが結合した点であるという解釈と一致している。
【００４４】
３．官能化スキームを確認するための比較対照実験
３．１  ジアゾニウムインキュベーション工程の省略
他のすべての官能化工程は前述の通り行い、ジアゾニウムインキュベーション工程を省略した実験を行った。図６（ａ）は前記サンプルのＡＦＭ画像であり、図６（ｂ）はそれに伴うラインスキャンである。グラフェンの見かけの高さは約１．５ｎｍであり、おそらくＮｉ−ＮＴＡ分子の残りの層が低密度であるため、単層グラフェンに予想される高さ（典型的には約０．８〜１ｎｍ）よりごくわずかに高くなっている。明らかとなったタンパク質の特徴はない。この比較対照実験は、グラフェン表面に活性化結合部位を形成するためには、ジアゾニウムのインキュベーションが必要であることを証明している。
【００４５】
３．２  陰性対照としての非ｈｉｓ標識タンパク質の使用
グラフェンは図１２に示すとおり官能化したが、陰性対照として非ｈｉｓ標識Ｇタンパク質（ＰＲＯ−４０２、ＰｒｏＳｐｅｃ  Ｌｔｄ）を使用した。図７（ａ）（７（ｂ））は、官能化後のスキャン前（後）のグラフェンのＡＦＭ画像である。グラフェンの見かけの高さは約１．８ｎｍ上昇し、ＮＴＡ単層が存在することを示していた（上述の図５、６参照）。タンパク質様の特徴は観察されず、図１２に示すとおり、前記Ｈｉｓタグにより方向が制御されたタンパク質結合が起こっているという根拠を示している。
【００４６】
４．ラマンスペクトロスコピーによる特徴決定
４．１  ジアゾニウムインキュベーション後のグラフェンのラマンスペクトロスコピー
図８（ａ）はグラフェン単層のラマンスペクトルであり、基本的にＤピークがないことを示している。図９（ｂ）はジアゾニウムインキュベーション後の同じグラフェン層のラマンスペクトルである。Ｄ／Ｇ比はジアゾニウムによる官能化後に１桁以上増加し、タンパク質で官能化したグラフェンの結果同様、カルボキシベンゼン基を用いた修飾により、有意なレベルのｓｐ３結合炭素を示している（図１２参照）。
【００４７】
４．１  Ｈｉｓ標識Ｇタンパク質による官能化後のグラフェンのラマンスペクトロスコピー
図９は、元の状態のグラフェン単層のラマンスペクトル（図Ｓ６（ａ））およびＨｉｓ標識Ｇタンパク質による官能化後の同サンプルのラマンスペクトル（図９（ｂ））を示している。官能化後のスペクトルはジアゾニウムインキュベーション後と非常に類似しており（図８（ｂ））、Ｄピークの上昇がｓｐ２グラフェンネットワークの結合開裂を反映しているという解釈を支持している。
【００４８】
５．蛍光タンパク質を用いずにジアゾニウムおよびＮｉ−ＮＴＡにより官能化したグラフェンＦＥＴ（ＧＦＥＴ）の光電流反応
ＧＦＥＴを調製し、タンパク質インキュベーション工程を除く、図１２のすべての官能化工程を行った。図１０は、前記デバイスにおいて、これらの実験に用いたいずれの波長でも検出可能な光電流反応はないことを示している。これは、光電流応答が使用した蛍光タンパク質の光吸収スペクトルに由来するという本文の解釈を確認している。
【００４９】
６．デバイスの寿命が２週間以上であることを証明する測定
図１１は、本文図３（ａ）の同じデバイスを２週間後に測定した光電流応答を示している。紫色照射に対するデバイスの反応は、基本的に前記デバイスを作成直後に観察された反応と同一であり、２週間の時間尺度でＧＦＰ−ＧＦＥＴハイブリッドの挙動がほとんど変化していないことを示している。
【００５０】
さらなる参考文献
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Ａｌｅｘｅｙ  Ｍ．  Ｂｏｇｄａｎｏｖ，  Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｓ．  Ｍｉｓｈｉｎ，  Ｉｌｉａ  Ｖ．  Ｙａｍｐｏｌｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｒｅ  ｌｉｇｈｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｄｏｎｏｒｓ，"  Ｎａｔ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ５  （７），  ４５９−４６１  （２００９）．
【図１】
2015500482.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2015500482.tif 000009
【図８】
2015500482.tif 000010
【図９】
2015500482.tif 000011
【図１０】
2015500482.tif 000012
【図１１】
2015500482.tif 000013
【図１２】
2015500482.tif 000014
【図１３】
2015500482.tif 000015
【国際調査報告】
2015500482.tif 000016