(57)【要約】  本発明は、少なくとも２４個であるが、好ましくは２６個である連続したアミノ酸を含んでなる、宿主細胞とのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）融合、または宿主細胞へのＨＩＶ侵入の阻害剤に関し；本発明はまた、前記アミノ酸を含んでなる医薬組成物にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎキャッピンググループに連結する少なくとも２４個の連続アミノ酸を含んでなるペプチドであって、前記Ｎキャッピンググループが、スクシニル、アセチル、ブタノイル、ペンタノイル、ヘキサノイルまたはイソバレリル群から選択され、前記２４個のアミノ酸の１番目が、前記Ｎキャッピンググループと直接連結するか、またはＥ、Ａまたはａの群から選択される追加的なアミノ酸を介して前記Ｎ−キャッピンググループと間接的に連結するかのいずれかであり、
１番目のアミノ酸がＣ、Ｈｃｙ、Ｃ（Ｂｚｌ）またはＮであり、
２番目のアミノ酸がＹであり、
３番目のアミノ酸が親油性アミノ酸であり、
４番目のアミノ酸がＡまたはＲに相当し、
５番目のアミノ酸がＣ、ＨｃｙまたはＬであり、
６番目のアミノ酸がＩであり、
７番目のアミノ酸が酸性アミノ酸であり、
８番目のアミノ酸がアラニンまたは酸性アミノ酸に相当し、
９番目のアミノ酸がＬであり、
１０番目のアミノ酸が親油性アミノ酸であり、
１１番目のアミノ酸が塩基性アミノ酸であり、
１２番目のアミノ酸がアラニンまたは塩基性アミノ酸であり、
１３番目のアミノ酸が親油性アミノ酸であり、
１４番目のアミノ酸がＱまたはＲであり、
１５番目のアミノ酸がＥであり、
１６番目のアミノ酸がＱであり、
１７番目のアミノ酸がＱであり、
１８番目のアミノ酸がＥであり、
１９番目のアミノ酸がＫであり、
２０番目のアミノ酸がＮであり、
２１番目のアミノ酸がＥであり、
２２番目のアミノ酸がＡであり、
２３番目のアミノ酸が親油性アミノ酸であり、
２４番目のアミノ酸がＬであり、；
任意選択的に前記２４番目のアミノ酸が、Ｒ、ｒ、Ｌ，ＴｂａまたはＫ（パルミトイル）群から選択されるアミノ酸と連結する、ペプチド。
【請求項２】
前記３番目のアミノ酸が、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｗ、Ｔｂａ、Ｎｖａ、ＡｂｕまたはＣｈａの群から選択され、
前記４番目のアミノ酸がＲまたはＡであり、
前記７番目のアミノ酸はＥまたはＤから選択され、
前記８番目のアミノ酸が、酸性アミノ酸である場合、Ｅに相当し、
前記１０番目のアミノ酸がＩまたはＴｂａから選択され、
前記１１番目のアミノ酸が、塩基性アミノ酸である場合、ＲまたはＫであり、
前記１２番目のアミノ酸が、塩基性アミノ酸である場合、ＲまたはＫであり、
前記１３番目のアミノ酸がＡ、ＮｖａまたはＡｂｕから選択され、
前記２３番目のアミノ酸がＡまたはＬである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記１番目のアミノ酸および前記５番目のアミノ酸が、互いに独立してＣまたはＨｃｙのいずれかであり、前記１番目および前記５番目のアミノ酸が、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ２１またはＢ２２を介して連結される、請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項４】
前記２４番目のアミノ酸に連結した前記アミノ酸Ｒが、コレステロールまたはパルミトイルまたはそれらのその誘導体に間接的に付着する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５】
前記アミノ酸Ｒと、前記コレステロールまたはパルミトイルまたはそれらのその誘導体との間にリンカーを有し、前記リンカーが２つ以上のアミノ酸を含んでなり、好ましくは前記リンカーが−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−（−ＧＳＧＣ−）または−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（−ＧＳＧＫ−）である、請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
前記アミノ酸配列が、二量体または三量体形状である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項７】
ペンタノイル−Ｅ−Ｃ−Ｙ−Ｌ−Ａ−Ｃ−Ｉ−Ｅ−Ａ−Ｌ−Ｉ−Ｒ−Ａ−Ａ−Ｑ−Ｅ−Ｑ−Ｑ−Ｅ−Ｋ−Ｎ−Ｅ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｒ−ＮＨ２、ペンタノイル−Ｅ−Ｃ−Ｙ−Ｌ−Ａ−Ｃ−Ｉ−Ｅ−Ｅ−Ｌ−Ｉ−Ｒ−Ｋ−Ａ−Ｑ−Ｅ−Ｑ−Ｑ−Ｅ−Ｋ−Ｎ−Ｅ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｒ−ＮＨ２またはＳｕｃ−ＥＣＹＬＲＣＩＥＥＬＩＲＫＡＱＥＱＱＥＫＮＥＡＡＬＲ−ＮＨ２の群から選択されるアミノ酸配列を有して、ペプチド中のシステイン（Ｃ）部分がＢ１を介して連結される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項８】
イソバレリル−Ｅ−Ｃ（Ｂｚｌ）−Ｙ−Ｌ−Ａ−Ｌ−Ｉ−Ｅ−Ｅ−Ｌ−Ｉ−Ｒ−Ｋ−Ａ−Ｑ−Ｅ−Ｑ−Ｑ−Ｅ−Ｋ−Ｎ−Ｅ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｒ−ＮＨ２のアミノ酸配列を有する、請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項９】
Ｓｕｃ−ＥＣＹＬＲＣＩＥＥＬＩＲＫＡＱＥＱＱＥＫＮＥＡＡＬＲＧＳＧＣ（コレステリルオキシカルボニルメチル）−ＮＨ２およびＡｃ−ＡＣＹＡＡＣＩＥＡＬＩＲＡＡＱＥＱＱＥＫＮＥＡＡＬＲＧＳＧＣ（コレステリルオキシカルボニルメチル）−ＮＨ２から選択されるアミノ酸配列を有し、前記ペプチドの位置１および位置５で前記システイン（Ｃ）部分がＢ１を介して連結される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１０】
・Ｓｕｃ−Ｅ−Ｃ−Ｙ−Ｌ−Ｒ−Ｃ−Ｉ−Ｅ−Ｅ−Ｌ−Ｉ−Ｒ−Ｋ−Ａ−Ｑ−Ｅ−Ｑ−Ｑ−Ｅ−Ｋ−Ｎ−Ｅ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｒ−ＧＳＧＫ（パルミトイル）−ＮＨ２
（式中、前記ペプチドの位置１および位置５で前記システイン（Ｃ）部分がＢ１を介して連結される）；
・Ｓｕｃ−Ｅ−Ｎ−Ｙ−Ｌ−Ｒ−Ｌ−Ｉ−Ｅ−Ｅ−Ｌ−Ｉ−Ｒ−Ｋ−Ａ−Ｑ−Ｅ−Ｑ−Ｑ−Ｅ−Ｋ−Ｎ−Ｅ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｒ−ＧＳＧＣ（コレステリルオキシカルボニルメチル）−ＮＨ２および
・Ｓｕｃ−Ｅ−Ｎ−Ｙ−Ｌ−Ｒ−Ｌ−Ｉ−Ｅ−Ｅ−Ｌ−Ｉ−Ｒ−Ｋ−Ａ−Ｑ−Ｅ−Ｑ−Ｑ−Ｅ−Ｋ−Ｎ−Ｅ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｒ−ＧＳＧＫ（パルミトイル）−ＮＨ２
から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１１】
ＨＩＶの宿主細胞との融合、またはＨＩＶの宿主細胞への侵入を阻害するための請求項１〜１０のいずれか一項に記載のペプチドの使用。
【請求項１２】
ヒトにおけるＨＩＶの宿主細胞との融合、またはＨＩＶの宿主細胞への侵入、またはＨＩＶ感染症を防止または治療する薬剤を製造するための請求項１〜１０のいずれか一項に記載のペプチドの使用。
【請求項１３】
薬学的に許容できる担体と共に、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のアミノ酸配列を有するペプチドを含んでなる医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも２４個であるが、好ましくは２６個である連続したアミノ酸を含んでなる、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の宿主細胞との融合、またはＨＩＶの宿主細胞への侵入の阻害剤に関し；本発明はまた、前記アミノ酸を含んでなる医薬組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＩＶ治療のための現行の治療法は、一般にウイルス酵素である逆転写酵素および／またはプロテアーゼを標的とする。しかし外被糖タンパク質などのＨＩＶのいくつかのその他の酵素または構造タンパク質もまた、感染において重要な役割を果たす。
【０００３】
ＨＩＶ外被糖タンパク質は、前駆ｇｐ１６０タンパク質のタンパク質分解的切断によって生じる、２つの関連サブユニット、ｇｐ１２０およびｇｐ４１からなる。それは、３つのｇｐ１２０サブユニットと３つのｇｐ４１サブユニットの複合体として、ウイルス膜に存在する。ウイルスと標的細胞の膜融合を媒介して、ＨＩＶが新しい細胞に感染できるようにするのが、ｇｐ４１サブユニットである。ｇｐ１２０サブユニットは、標的細胞の認識と受容体結合に関与する。
【０００４】
ｇｐ４１によって媒介される膜融合のプロセスは、糖タンパク質の立体構造変化を伴い、それは三量体ｇｐ４１（Ｎ−らせん）のＮ末端領域が細胞膜に侵入できるようにする。この挿入に続いて、３つのｇｐ４１サブユニット（Ｃ−らせん）のＣ末端領域は再度折り畳まれて、Ｎ−らせんに重なる。結果として生じる、６ヘリックス束と称される、ｇｐ４１のＮ−らせんとＣ−らせん領域間の六量体αらせん相互作用は、細胞およびウイルス膜を密接に近似させ、それは最終的に、ウイルス膜と細胞膜の融合をもたらす。
【０００５】
この安定６ヘリックス束の形成阻害は、ＨＩＶ感染症を予防する興味深いアプローチを提供する。ＨＩＶ外被は、外側の高度にグリコシル化されたｇｐ１２０タンパク質と、ｇｐ４１膜貫通糖タンパク質とから構成される、外被タンパク質を有する、脂質二重層から構成される。ｇｐ４１の分子配列は、いわゆる「７アミノ酸繰り返し」領域（ＨＲ１およびＨＲ２）を含む。
【０００６】
７アミノ酸繰り返しは、７個のアミノ酸の反復するパターンからなる構造モチーフである。宿主細胞へのＨＩＶの侵入は、ｇｐ１２０の細胞ＣＤ４受容体への結合と、引き続くケモカイン共受容体ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４への結合で始まる。これは一連の立体構造変化を引き起こし、それは細胞膜内に挿入されるｇｐ４１融合ドメインを露出させる。次にＨＲ２領域は、対応するＨＲ１領域によって形成される疎水性溝と結合して、前記安定６ヘリックス束が生じる。これは、融合および侵入のために、ウイルス膜と細胞膜を近接させる。したがって６−ヘリックス束生成に対する干渉は、ウイルスが細胞に侵入するのを妨げる。
【０００７】
ＨＩＶのＧｐ４１は、前記６ヘリックス束を形成するＨＲ１およびＨＲ２と称される２つの一続きのペプチドを含有し、その形成は、ウイルス膜と宿主細胞膜との融合の背後にある駆動力である。実際の６ヘリックス束は、内部コイルドコイルである３つの平行する一続きのＨＲ１と、外側で内部コイルドコイル溝に沿って逆平行に、それを補足する３つの一続きのＨＲ２からなる。
【０００８】
いわゆるＮ３６（ＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ）は、ＨＲ１の部分であり、いわゆるＣ３４（ＷＭＥＷＤＲＥＩＮＮＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬ）はＨＲ２の部分である。現行のペプチド性融合阻害剤の大部分はＨＲ２模倣体であって、Ｃ３４の類似体であり、またはその一部を含有する。ペプチド性ＨＲ１模倣体の抗ウイルス可能性もまた実証され、いずれもＮ１７（ＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ）とも称される、Ｎ３６の最後の１７個のアミノ酸を含有する。Ｎ３６由来ペプチドは、部分的には、それらが多数の荷電側鎖を含有するという理由で、これもまた三量体コイルドコイルであり好ましい溶解度特性を有するペプチド性タグと、通常は融合する。融合はこのようにして起きるので、コイルドコイルジッパーの典型例である７アミノ酸繰り返しが、順守される。このようなペプチド性タグの２つの例は、いわゆるＩＱ配列：（ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱＫＫＩＥＮＥＩＡＲＩＫＫ）と、いわゆるＩＺ配列：（ＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫ）である。ＨＩＶ融合を阻害する小型分子の検出を目的とする実験において、当業者は多数のペプチドを試験したが、そのいくつかは、ＨＲ１模倣体に関する公表された研究に由来する。
【０００９】
当該技術分野で公知のいわゆるＨＩＶ侵入またはＨＩＶ融合ペプチドに関わる問題の１つは、これらのペプチドの比較的低い抗ウイルス活性である。これらのペプチドの別の問題は、特に適切な医薬組成物へ調合すべき場合、前記ペプチド中の疎水性アミノ酸の存在に起因する、難溶解性である。結果として、これらのペプチドを含んでなる医薬組成物は、配合するのが困難であり、その結果、開発するのが困難である。
【００１０】
さらに当該技術分野では、いわゆるＨＩＶ侵入またはＨＩＶ融合ペプチドは、最適抗ウイルス活性のために、いわゆる「Ｋｉｍポケット」結合モチーフをＮ末端側に、脂質結合モチーフをＣ末端側に、含有すべきであると考えられている。どちらの部位も、抗ウイルス活性に不可欠と見なされている。（Ｅｃｋｅｒｔ  ａｎｄ  Ｋｉｍ，ＰＮＡＳ，２００１，ｖｏｌ．９８，ｎｏ２０，ｐｐ  １１１８７−１１１９２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、製剤処方の目的で、高い抗ウイルス活性と許容される溶解度の双方を有する、ペプチドベースおよび／または小型分子ベースのいわゆる融合または侵入ＨＩＶ阻害剤に対する、満たされていない医学的必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明によると、意外にも、Ｎ末端側のいわゆるＫｉｍポケット結合モチーフまたはＣ末端側の脂質結合モチーフを含有せず、Ｎキャッピンググループに連結する少なくとも２４個の連続アミノ酸を含んでなるペプチド誘導体が、低ｎＭ範囲においてＥＣ５０という極めて優れた効力を示し、前記Ｎキャッピンググループは、スクシニル、アセチル、ブタノイル、ペンタノイル、ヘキサノイルまたはイソバレリルの群から選択され、前記２４個のアミノ酸の１番目はＮキャッピンググループと直接連結するか、またはＥ、Ａまたはａの群から選択される追加的なアミノ酸を介して、前記Ｎ−キャッピンググループと間接的に連結するかのいずれかである。
【００１３】
本発明のペプチドの長さは、少なくとも２４個の連続アミノ酸長であり、Ｎキャッピンググループに連結して、前記Ｎキャッピンググループは、スクシニル、アセチル、ブタノイル、ペンタノイル、ヘキサノイルまたはイソバレリル群から選択され、前記２４個のアミノ酸の１番目は、Ｎキャッピンググループと直接連結するか、またはＥ、Ａまたはａの群から選択される追加的なアミノ酸を介して前記Ｎ−キャッピンググループと間接的に連結するかのいずれかであり、
１番目のアミノ酸はＣ、Ｈｃｙ、Ｃ（Ｂｚｌ）またはＮであり、
２番目のアミノ酸はＹであり、
３番目のアミノ酸は親油性アミノ酸であり、
４番目のアミノ酸はＡまたはＲに相当し、
５番目のアミノ酸はＣ、ＨｃｙまたはＬであり、
６番目のアミノ酸はＩであり、
７番目のアミノ酸は酸性アミノ酸であり、
８番目のアミノ酸はアラニンまたは酸性アミノ酸に相当し、
９番目のアミノ酸はＬであり、
１０番目のアミノ酸は親油性アミノ酸であり、
１１番目のアミノ酸は塩基性アミノ酸であり、
１２番目のアミノ酸はアラニンまたは塩基性アミノ酸であり、
１３番目のアミノ酸は親油性アミノ酸であり、
１４番目のアミノ酸はＱまたはＲであり、
１５番目のアミノ酸はＥであり、
１６番目のアミノ酸はＱであり、
１７番目のアミノ酸はＱであり、
１８番目のアミノ酸はＥであり、
１９番目のアミノ酸はＫであり、
２０番目のアミノ酸はＮであり、
２１番目のアミノ酸はＥであり、
２２番目のアミノ酸はＡであり、
２３番目のアミノ酸は親油性アミノ酸であり、
２４番目のアミノ酸はＬであり、
任意選択的に前記２４番目のアミノ酸は、Ｒ、ｒ、Ｌ、ＴｂａまたはＫ（パルミトイル）の群から選択されるアミノ酸に連結する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
さらなる実施形態では、本発明は、３番目のアミノ酸が、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｗ、Ｔｂａ、Ｎｖａ、ＡｂｕまたはＣｈａの群から選択され、
４番目のアミノ酸がＲまたはＡであり、
７番目のアミノ酸がＥまたはＤから選択され、
８番目のアミノ酸が、酸性アミノ酸である場合、Ｅに相当し、
１０番目のアミノ酸がＩまたはＴｂａから選択され、
１１番目のアミノ酸が、塩基性アミノ酸である場合、ＲまたはＫであり、
１２番目のアミノ酸が、塩基性アミノ酸である場合、ＲまたはＫであり、
１３番目のアミノ酸がＡ、ＮｖａまたはＡｂｕから選択され、
２３番目のアミノ酸がＡまたはＬである
前述のペプチドに関する。
【００１５】
別の実施形態では、本発明は、１番目のアミノ酸および５番目のアミノ酸が、互いに独立してＣまたはＨｃｙのいずれかであり、前記１番目のおよび前記５番目のアミノ酸が、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ２１またはＢ２２を介して連結される、上で定義されるペプチドに関する。これらのＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ２１またはＢ２２部分（対応する架橋構造のこれらの略号の意味については下記を参照されたい）に付着すると、そのＮ末端部分にループペプチド構造（ｉ−ｉ＋４側鎖体側鎖）を有する、本発明によるペプチドが得られ、これはいわゆるＣＬＩＰＳペプチド（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ＬＩｎｋｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｎｔｏ  ａ（ｈｅｔｅｒｏ）ａｒｏｍａｔｉｃ  Ｓｃａｆｆｏｌｄ）（（ヘテロ）芳香族骨格上の化学結合ペプチド）である。
【００１６】
本発明によるペプチドは、Ｃ末端アミノ酸で、コレステロールまたはパルミトイルまたはそれらのその誘導体と、直接または間接的に結合してもよい。代案としては、それらは、２つ以上のアミノ酸を含んでなるリンカーによって、連結されてもよい。好ましくはリンカーは、２、３、または４つのアミノ酸、より好ましくは４つのアミノ酸からなる。アミノ酸は、天然または合成アミノ酸であってもよい。リンカーは、好ましくはＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（−ＧＳＧＣ−）またはＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（−ＧＳＧＫ−）を含んでなってもよい。
【００１７】
したがって、本発明の一部は、２４番目のアミノ酸に連結するアミノ酸Ｒが、コレステロールまたはその誘導体と間接的に付着する、またはパルミトイルまたはその誘導体と間接的に付着する、上述したようなペプチドでもある。コレステロールは、Ｃ末端システイン−アミドまたはホモシステイン−アミドの側鎖にアセチルを介して結合し、すなわちコレステロールに付着するためのリンカーは、システイン−アミドまたはホモシステイン−アミドをそのＣ末端側に有しなくてはならない（下の図２を参照されたい）。
【００１８】
前記アミノ酸Ｒおよび前記コレステロールまたはその誘導体は、好ましくは２つ以上のアミノ酸、好ましくは２、３または４つのアミノ酸、より好ましくは−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−（−ＧＳＧＣ−）などの４つのアミノ酸を有するリンカーによって連結する。
【００１９】
代案としては、前記アミノ酸Ｒおよび前記パルミトイルまたはその誘導体は、好ましくは２つ以上のアミノ酸、好ましくは２、３または４つのアミノ酸、より好ましくは−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−（−ＧＳＧＫ−）などの４つのアミノ酸を有するリンカーによって連結する。
【００２０】
本発明によるペプチドは、それ自体が二量体または三量体形状のアミノ酸配列を含んでなる。本発明のペプチドは、例えば−Ｓ−Ｓ−架橋によって互いに化学的に連結する。
【００２１】
本発明による好ましいペプチドは、ペプチド中のシステイン（Ｃ）部分がＢ１によって連結される、ペンタノイル−ＥＣＹＬＡＣＩＥＡＬＩＲＡＡＱＥＱＱＥＫＮＥＡＡＬＲ−ＮＨ２、およびペプチド中のシステイン（Ｃ）部分がＢ１によって連結される、ペンタノイル−ＥＣＹＬＡＣＩＥＥＬＩＲＫＡＱＥＱＱＥＫＮＥＡＡＬＲ−ＮＨ２の群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００２２】
本発明による別の好ましいペプチドは、ペプチド中のシステイン（Ｃ）部分がＢ１によって連結される。Ｓｕｃ−ＥＣＹＬＲＣＩＥＥＬＩＲＫＡＱＥＱＱＥＫＮＥＡＡＬＲ−ＮＨ２である。
【００２３】
本発明による別の好ましいペプチドは、イソバレリル−Ｅ−Ｃ（Ｂｚｌ）−ＹＬＡＬＩＥＥＬＩＲＫＡＱＥＱＱＥＫＮＥＡＡＬＲ−ＮＨ２のアミノ酸配列を有する。
【００２４】
ペプチドの位置１および位置５でシステイン（Ｃ）部分がＢ１またはＢ３によって連結される、Ｓｕｃ−ＥＣＹＬＲＣＩＥＥＬＩＲＫＡＱＥＱＱＥＫＮＥＡＡＬＲＧＳＧＣ（コレステリル−オキシカルボニルメチル）−ＮＨ２およびＡｃ−ＡＣＹＡＡＣＩＥＡＬＩＲＡＡＱＥＱＱＥＫＮＥＡＡＬＲＧＳＧＣ（コレステリル−オキシカルボニルメチル）−ＮＨ２から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドもまた高度に好ましく、Ｂ１が最も好ましい結合である。
【００２５】
非常に好ましいのは、ペプチドの位置１および位置５でシステイン（Ｃ）部分がＢ１によって連結される、アミノ酸配列Ｓｕｃ−ＥＣＹＬＲＣＩＥＥＬＩＲＫＡＱＥＱＱＥＫＮＥＡＡＬＲＧＳＧＣ（コレステリル−オキシカルボニルメチル）−ＮＨ２を有するペプチドである。
【００２６】
・Ｓｕｃ−ＥＮＹＬＲＬＩＥＥＬＩＲＫＡＱＥＱＱＥＫＮＥＡＡＬＲＧＳＧＣ（コレステリル−オキシカルボニルメチル）−ＮＨ２
・Ｓｕｃ−ＥＮＹＬＲＬＩＥＥＬＩＲＫＡＱＥＱＱＥＫＮＥＡＡＬＲＧＳＧＫ（パルミトイル）−ＮＨ２
もまた、本発明による好ましいペプチドである。
【００２７】
さらに本発明によるペプチドは、好ましくは医薬組成物中で、ＨＩＶの宿主細胞との融合、またはＨＩＶの宿主細胞への侵入を阻害するために使用され、または使用され得る。
【００２８】
これらの医薬組成物は、薬学的に許容できる担体と共に、発明のペプチドを含んでなる。
【００２９】
定義：
「アミノ酸」という用語は、明細書および特許請求の目的で、および本発明によるペプチドに関して、少なくとも１つの遊離アミン基および少なくとも１つの遊離カルボキシル基を有して、アミンまたはカルボキシル基以外（例えばヒドロキシル、スルフヒドリルなど）の１つまたは複数の遊離化学反応基をさらに含んでなってもよい、分子を指すことが意図される。アミノ酸は、天然Ｌアミノ酸（本明細書で配列中の大文字として表される）、またはその対応するＤ鏡像異性体（本明細書で配列中の小文字として表される）、（合成）非天然アミノ酸（例えば配列中のＴｂａなどの３文字コードで表される）、修飾アミノ酸、アミノ酸誘導体、アミノ酸前駆体、および／または保存的置換であってもよい。当業者は、ペプチドに組み込まれるアミノ酸の選択は、抗ウイルス性ペプチドに求められる特定の物理的、化学的または生物学的特性にある程度依存することが分かるであろう。このような特性は、部分的には、ヘリシティおよび抗ウイルス活性の判定によって判定される。例えば当業者は、合成ペプチド中のアミノ酸が、天然の（Ｌ）アミノ酸およびその対応するＤ鏡像異性体、またはＴｂａなど非天然アミノ酸の１つまたは複数を含んでなってもよいことが分かるであろう。
【００３０】
「保存的置換」は、本明細書の用法では、意外な改善された生物学的活性を合成ペプチドが依然として示すような、合成ペプチド配列中の１つまたは複数のアミノ酸置換を意味する。これには、置換されるアミノ酸と、実質的に同一の電荷、サイズ、親水性、および／または芳香族性を有する、アミノ酸の置換が挙げられる。
【００３１】
「ＣＬＩＰＳ」ペプチドは、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ２１またはＢ２２部分の１つを介した、Ｎ末端部分における（その中で遊離チオール官能基が必要とされる）１番目と５番目のアミノ酸との連結から生じる、Ｎ末端部分のペプチド構造を含んでなる、本発明によるペプチドである。このようなＣＬＩＰＳペプチドを得る方法は、国際公開第２００４／０７７０６２号パンフレットに記載される。
【００３２】
「ＨＩＶ」という用語は、ヒト免疫不全ウイルス、より好ましくはＨＩＶ−１を指す。
【００３３】
「薬学的に許容できる担体」は、それが添加された本発明によるペプチドの生物学的活性を顕著に変化させない、担体媒質を意味する。このような担体は、例えば（緩衝）水、等張水性緩衝溶液、水性アルコールなどである。
【００３４】
「リンカー」という用語は、２つの異なる分子を作動可能に連結する分子ブリッジの機能を果たす化合物または部分を指す（例えばリンカーの一部分は本発明によるペプチドに結合し、リンカーの別の部分はコレステロールまたはその誘導体に結合する）。
【００３５】
「ＥＣ５０」（＝最大半量有効濃度）は、生物学的機能を阻害する化合物の有効性の尺度である。この定量的尺度は、所与の生物学的過程（または過程の構成要素、すなわち酵素、細胞、細胞受容体または微生物）を半分抑制するのに、特定の薬物またはその他の物質（阻害剤）がどれだけ必要であるかを示す。ＦＤＡによれば、ＥＣ５０は、生体外における５０％阻害に要する薬物濃度に相当する。
【００３６】
本明細書で使用される命名法
当該技術分野で公知のＬ天然アミノ酸については、以下の略号が使用された：
【００３７】
【表１】
2015502378.tif 000002
【００３８】
非天然アミノ酸については、以下の命名法（３文字コード）が使用された：
【００３９】
【表２】
2015502378.tif 000003
【００４０】
１番目のアミノ酸および５番目のアミノ酸がＣまたはＨｃｙのいずれかである本発明によるペプチドについて、前記アミノ酸ｈ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ２１またはＢ２２で連結され、これらの略号の説明は以下で明らかにされる：
【００４１】
【表３】
2015502378.tif 000004
【００４２】
本発明によるペプチドで使用されるキャッピンググループについては、以下の略称が使用され、下で説明される：
【００４３】
【表４】
2015502378.tif 000005
【００４４】
本発明によるペプチドは、下の表に列挙される：
明確化のために、下の表における番号付け「６３６〜６６１」は、ＨＩＶのｇｐ１６０中のアミノ酸の番号付けに対応する一方で、位置番号６３７は、本発明によるペプチド中の１番目とされたアミノ酸と見なされる。したがって例えば位置番号６４６は、本発明によるペプチド中の１０番目とされたアミノ酸であり、位置番号６６０は２４番目とされたアミノ酸と見なされる。
【００４５】
さらに、下の表中の任意選択のアミノ酸配列が、左端のそれぞれのＮキャッピンググループから開始して、右端でカルボキサミドによって終了することも明確化される。
【００４６】
【表５】
2015502378.tif 000006
【００４７】
本発明による好ましい７個のペプチドを、下に列挙する：
・ペンタノイル−Ｅ−Ｃ−Ｙ−Ｌ−Ａ−Ｃ−Ｉ−Ｅ−Ａ−Ｌ−Ｉ−Ｒ−Ａ−Ａ−Ｑ−Ｅ−Ｑ−Ｑ−Ｅ−Ｋ−Ｎ−Ｅ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｒ−ＮＨ２
１番目とされたアミノ酸（Ｃ）と５番目とされたアミノ酸（Ｃ）との結合は、Ｂ１を介する。
・ペンタノイル−Ｅ−Ｃ−Ｙ−Ｌ−Ａ−Ｃ−Ｉ−Ｅ−Ｅ−Ｌ−Ｉ−Ｒ−Ｋ−Ａ−Ｑ−Ｅ−Ｑ−Ｑ−Ｅ−Ｋ−Ｎ−Ｅ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｒ−ＮＨ２
１番目とされたアミノ酸（Ｃ）と５番目とされたアミノ酸（Ｃ）との結合は、Ｂ１を介する。
・イソバレリル−Ｅ−Ｃ（Ｂｚｌ）−Ｙ−Ｌ−Ａ−Ｌ−Ｉ−Ｅ−Ｅ−Ｌ−Ｉ−Ｒ−Ｋ−Ａ−Ｑ−Ｅ−Ｑ−Ｑ−Ｅ−Ｋ−Ｎ−Ｅ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｒ−ＮＨ２
・Ｓｕｃ−Ｅ−Ｃ−Ｙ−Ｌ−Ｒ−Ｃ−Ｉ−Ｅ−Ｅ−Ｌ−Ｉ−Ｒ−Ｋ−Ａ−Ｑ−Ｅ−Ｑ−Ｑ−Ｅ−Ｋ−Ｎ−Ｅ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｒ−ＧＳＧＣ（コレステリルオキシカルボニルメチル）−ＮＨ２
１番目とされたアミノ酸（Ｃ）と５番目とされたアミノ酸（Ｃ）との結合は、Ｂ１を介する。
・Ｓｕｃ−Ｅ−Ｃ−Ｙ−Ｌ−Ｒ−Ｃ−Ｉ−Ｅ−Ｅ−Ｌ−Ｉ−Ｒ−Ｋ−Ａ−Ｑ−Ｅ−Ｑ−Ｑ−Ｅ−Ｋ−Ｎ−Ｅ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｒ−ＧＳＧＫ（パルミトイル）−ＮＨ２
１番目とされたアミノ酸（Ｃ）と５番目とされたアミノ酸（Ｃ）との結合は、Ｂ１を介する。
・Ｓｕｃ−Ｅ−Ｎ−Ｙ−Ｌ−Ｒ−Ｌ−Ｉ−Ｅ−Ｅ−Ｌ−Ｉ−Ｒ−Ｋ−Ａ−Ｑ−Ｅ−Ｑ−Ｑ−Ｅ−Ｋ−Ｎ−Ｅ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｒ−ＧＳＧＣ（コレステリルオキシカルボニルメチル）−ＮＨ２
・Ｓｕｃ−Ｅ−Ｎ−Ｙ−Ｌ−Ｒ−Ｌ−Ｉ−Ｅ−Ｅ−Ｌ−Ｉ−Ｒ−Ｋ−Ａ−Ｑ−Ｅ−Ｑ−Ｑ−Ｅ−Ｋ−Ｎ−Ｅ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｒ−ＧＳＧＫ（パルミトイル）−ＮＨ２
【００４８】
最も望ましいのは、上の一覧からの次の２つのペプチドである：
・Ｓｕｃ−Ｅ−Ｎ−Ｙ−Ｌ−Ｒ−Ｌ−Ｉ−Ｅ−Ｅ−Ｌ−Ｉ−Ｒ−Ｋ−Ａ−Ｑ−Ｅ−Ｑ−Ｑ−Ｅ−Ｋ−Ｎ−Ｅ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｒ−ＧＳＧＣ（コレステリルオキシカルボニルメチル）−ＮＨ２
・Ｓｕｃ−Ｅ−Ｎ−Ｙ−Ｌ−Ｒ−Ｌ−Ｉ−Ｅ−Ｅ−Ｌ−Ｉ−Ｒ−Ｋ−Ａ−Ｑ−Ｅ−Ｑ−Ｑ−Ｅ−Ｋ−Ｎ−Ｅ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｒ−ＧＳＧＫ（パルミトイル）−ＮＨ２
【実施例】
【００４９】
本発明によるペプチドの調製
ペプチドのＦｍｏｃ−合成の基本手順：
Ｃ末端カルボキサミドがあるペプチドを、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）−フェノキシ（ＲｉｎｋＡｍｉｄｅ）樹脂を使用する、固相上のＦｍｏｃ−化学によって合成した。側鎖官能基は、Ｎ−Ｂｏｃ（Ｋ，Ｗ）、Ｏ−ｔ−Ｂｕ（Ｄ，Ｅ，Ｓ，Ｔ，Ｙ）、Ｎ−Ｔｒｔ（Ｈ，Ｎ，Ｑ）、Ｓ−Ｔｒｔ（Ｃ、Ｈｃｙ）、Ｓ−Ａｃｍ（Ｃ）またはＮ−Ｐｂｆ（Ｒ，ｒ）基として保護される。（Ａｃｍ：アセトアミドメチル、Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ．ブトキシカルボニル、ｔ−Ｂｕ：ｔｅｒｔ．ブチル、Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメトキシカルボニル、Ｐｂｆ：２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロ−ベンゾフラン−５−スルホニル、Ｔｒｔ：トリチル）
各アミノ酸カップリングステップにおいて、二重カップリングを使用して２０〜３０分間の活性化時間で、ＮＭＰ（Ｎ−メチル−２−ピロリドン）中の５倍の過剰なＨＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−ｙｌ）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート）／ＨＯＢｔ（ヒドロキシ−ベンゾ−トリアゾール）／Ｆｍｏｃ−アミノ酸／ＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）（１：１：１：２）を使用する、カップリングプロトコルを用いた。ペプチドのアセチル化は、樹脂と、ＮＭＰ（１：０．１：１０、ｖ／ｖ／ｖ）中のＡｃ２Ｏ（無水酢酸）／ＤＩＥＡとを室温で３０分間反応させて実施した。スクシニル化は、ペプチド−樹脂と、ＮＭＰ中の１０当量の無水コハク酸および２当量のＤＩＥＡとを反応させて実施した。ブタノイル、イソバレリル、ペンタノイル、およびヘキサノイルによるＮ末端キャッピングでは、アミノ酸カップリングと同じプロトコルを使用した。
【００５０】
ペプチドを樹脂から切断し、１３．３％（ｗ）フェノール、５％（ｖ）チオアニソール、２．５％（ｖ）１，２−エタンジチオール、および５％（ｖ）ｍｉｌｌｉＱ−Ｈ２Ｏを含有するＴＦＡ（トリフルオロ酢酸４０ｍＬ／ｍｍｏｌ樹脂）との室温で２〜３時間の反応によって、完全に脱保護した。氷冷ジエチルエーテル／ペンタン（１：１）による沈殿および洗浄と、それに続くＡＣＮ（アセトニトリル）／水（１：１）からの沈殿物質の凍結乾燥により粗製ペプチドがもたらされ、それを逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって精製した。
【００５１】
逆相ＨＰＬＣによる分取ペプチド精製：
Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋカートリッジ（２５×１００または４０×２１０ｍｍ、１５μｍ、Ｃ１８−１００Å、Ｗａｔｅｒｓ，ＵＳＡ）を装着したＷａｔｅｒｓ  ＲＣＭモジュールを使用して、４０または１００ｍＬ／分の流速で１％Ｂ／分の線形ＡＢ勾配（溶媒Ａ：水中の０．０５％ＴＦＡ、溶媒Ｂ：ＡＣＮ中の０．０５％ＴＦＡ）で、ペプチド精製を実施した（勾配の開始百分率は、分析ＨＰＬＣ中の滞留時間を基準にした）。ペプチド検出は、２１５ｎｍで実施した。純粋な画分を収集して凍結乾燥し、ペプチドのトリフルオロ酢酸塩を得た。
【００５２】
ペプチドによるＣＬＩＰＳ反応：
ＡＣＮおよび水（１：３）混合物中の０．５ｍＭの濃度の完全に脱保護されたペプチドと、１．２５当量のＣＬＩＰＳ試薬（α，α’−ジブロモ−ｏ−キシレン、α，α’−ジブロモ−ｍ−キシレン、α，α’−ジブロモ−ｐ−キシレン、１，４−ビス−（ブロモメチル）−ナフタレン、２，７−ビス−（ブロモメチル）−ナフタレン、またはベンジル臭化物）とを反応させて、いわゆるＣＬＩＰＳ反応の一例（図１に例示される）を実施し、水性０．２Ｍ炭酸水素アンモニウム溶液の添加によって反応混合物をｐＨ７〜８に調節した。１時間後、反応混合物を１０％ＴＦＡでクエンチした。精製前にＡＣＮを部分的に除去し（回転蒸発器）；疎水性ペプチドの場合はＡＣＮは除去しなかった。
【化１】
2015502378.tif 000007
【００５３】
例としてのコレステロール結合ペプチド８２の合成：
上述した一般合成プロトコルを使用して、固相（２５０μｍｏｌ＋６×１００μｍｏｌ）上で、ペプチド中間体Ｉ−１を合成した。Ｃ末端システインをＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨとして共役させた（Ｏｒｐｅｇｅｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋカートリッジ（４０×２１０ｍｍ、１５μｍ、Ｃ１８−１００Å、Ｗａｔｅｒｓ，ＵＳＡ）を装着したＷａｔｅｒｓ  ＲＣＭモジュール上で、１００ｍＬ／分の流速で、２２％から開始して２０分間で４２％Ｂの線形濃度勾配（溶媒Ａ：水中の０．０５％ＴＦＡ、溶媒Ｂ：ＡＣＮ中の０．０５％ＴＦＡ）で、粗製ペプチド（２７９３ｍｇ）を４バッチで精製した。純粋な画分を収集して減圧下で濃縮し（回転蒸発器）、ＡＣＮ／水（１：１）からの凍結乾燥後に、８２０ｍｇのＩ−１のトリフルオロ酢酸塩を得た。
【００５４】
ペプチド中間体Ｉ−１（８２０ｍｇ、２２５μｍｏｌ）を水（１１０ｍＬ）とＡＣＮ（３４０ｍＬ）との混合物に溶解して、ＡＣＮ（２８ｍＬ）中のα，α’−ジブロモ−ｐ−キシレン（７４ｍｇ、２８０μｍｏｌ）を添加し、水性炭酸水素アンモニウム溶液（５６ｍＬの０．２Ｍ溶液）の添加がそれに続いた。反応混合物を１時間撹拌して１０％ＴＦＡでｐＨ３に酸性化し、Ｄａｖｉｓｉｌ  Ｃ１８分取ＨＰＬＣカラム（５０×２７７ｍｍ  １６〜２４μｍ、１５０Å、Ｇｒａｃｅ，ＵＳＡ）上で、１２０ｍＬ／分の流速で、２０分間で２３％から４３％Ｂの直線濃度勾配（溶媒Ａ：水中の０．０５％ＴＦＡ、溶媒Ｂ：ＡＣＮ中の０．０５％ＴＦＡ）で、直接精製した。注入は１３％Ｂ中で、６０ｍＬ／分で５分間実施した。蒸発（回転蒸発器）および凍結乾燥（ＡＣＮ／水（１：１）からの）後、５７６ｍｇのＩ−２のトリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｔａｔｅ）塩が得られた。
【００５５】
ペプチド中間体Ｉ−２（５７６ｍｇ、１５４μｍｏｌ）を水性８Ｍグアニジウム塩酸塩溶液（１５．４ｍＬ）に溶解し、それに続いてメタノール（１２３ｍＬ）およびＩ２（１５．４ｍＬのメタノール中の３４ｍｇ／ｍＬ溶液、２ｍｍｏｌ）を激しく撹拌しながら添加した。１５分後、ＤＴＴ（ジチオスレイトール、７．７ｍＬ）を添加して、３８．５ｍＬの水性０．２Ｍ炭酸水素アンモニウム溶液を使用して反応混合物のｐＨをｐＨ≧７に調節した。メタノールを減圧下で蒸発させ（回転蒸発器）、得られた粗生成物をＤａｖｉｓｉｌ  Ｃ１８分取ＨＰＬＣカラム（５０×２７７ｍｍ、１６〜２４μｍ、１５０Å、Ｇｒａｃｅ，ＵＳＡ）上で、１２０ｍＬ／分の流速で、２０分間で２４％から４４％Ｂの直線濃度勾配（溶媒Ａ：水中の０．０５％ＴＦＡ、溶媒Ｂ：ＡＣＮ中の０．０５％ＴＦＡ）で精製した。注入は１４％Ｂ中で、６０ｍＬ／分で５分間実施した。蒸発（回転蒸発器）および凍結乾燥（ＡＣＮ／水（１：１）からの）後、４２１ｍｇのペプチド中間体Ｉ−３が得られた。
【００５６】
コレステロール（５ｍＬのＤＣＭ（ジクロロメタン）中の１６２ｍｇ、４２０μｍｏｌ）、ブロモ酢酸（２ｍＬのＤＣＭ中の５５．６ｍｇ、４００μｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノピリジン、１ｍＬのＤＣＭ中の５ｍｇ、４０μｍｏｌ）を激しく撹拌しながら混合した。ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジ、１ｍＬのＤＣＭ中の８２．５ｍｇ、４００μｍｏｌ）を添加して、反応混合物を室温で２時間撹拌した。濾過によって、沈殿を除去した。得られた濾液の半量をＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、１０ｍＬ）中のＩ−３溶液に添加し（４２０．１ｍｇ、０．１１５ｍｍｏｌ）、それに続いて、濃炭酸水素アンモニウム水溶液をｐＨが７になるまで添加した。完全な変換まで反応混合物を撹拌し（７０分間以上、ＬＣ−ＭＳによってモニターした）、引き続いてＴＦＡ（ｐＨ３）の添加によってクエンチした。窒素を吹き込んで、ＤＣＭの大部分を蒸発させた。Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋカートリッジ（４０×２１０ｍｍ、１５μｍ、Ｃ１８−１００Å、Ｗａｔｅｒｓ，ＵＳＡ）を装着したＷａｔｅｒｓ  ＲＣＭモジュール上で、１００ｍＬ／分の流速で、３０分間で４５％から７５％Ｂの線形濃度勾配（溶媒Ａ：水中の０．０５％ＴＦＡ、溶媒Ｂ：ＡＣＮ中の０．０５％ＴＦＡ）で、ペプチドを精製した。注入は３５％Ｂ中で、５０ｍＬ／分で５分間実施した。純粋な画分を減圧下で濃縮し（回転蒸発器）、ＡＣＮ／水（１：１）からの凍結乾燥は、２４５ｍｇのコレステロール連結ペプチド８２をトリフルオロ酢酸塩としてもたらした。
【化２】
2015502378.tif 000008
【００５７】
ＵＰＬＣ分析：
それぞれの方法で明記されるように、ＬＣポンプ、ダイオード−アレイ（ＤＡＤ）またはＵＶ検出器およびカラムを使用して、ＵＰＬＣ（超高速液体クロマトグラフィー）測定を実施した。必要に応じ、追加的な検出器を含めた（下の方法の表を参照されたい）。
【００５８】
カラムからのフローを、大気圧イオン源で構成された質量分析計（ＭＳ）に入れた。化合物の分子量（ＭＷ）の同定を可能にするイオンを得るために、調整パラメータ（例えばスキャニング範囲、保圧時間など）を設定することは、当業者の知識の範囲内である。適切なソフトウェアによって、データ取得を実施した。
【００５９】
ペプチドは、それらの実験的滞留時間（Ｒｔ）およびそれらの分子量によって説明される。ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ，ＵＳＡ）を使用して、ペプチドの全ての観察されたプロトン付加状態からの実験的質量対電荷（ｍ／ｚ）比から、分子量を計算した。
【００６０】
以下、「ＢＥＨ」は架橋エチルシロキサン／シリカハイブリッド、「ＤＡＤ」はダイオードアレー検出器、「Ｑ−Ｔｏｆ」は四重極飛行時間質量分光計、「ＳＱＤ」はシングル四重極検出器である。
【００６１】
【表６】
2015502378.tif 000009
【００６２】
使用アッセイと結果の説明：
・標準抗ウイルス実験「ＡＶＥ」（野性型ＨＩＶ株ＩＩＩＢ＋ＨＩＶ株ＨＸＢ２Ｄ部位特異的変異株Ｖ３８ＡおよびＱ４０Ｈ）
アッセイ原理
ＨＩＶ−１複製アッセイは、高度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）発現の誘導として、ウイルス複製（ＨＩＶ野性型ウイルス株ＩＩＩＢまたはＨＸＢ２Ｄ、またはｇｐ４１遺伝子中にＶ３８ＡまたはＱ４０Ｈ変異があるＨＩＶ変異ウイルス株ＨＸＢ２Ｄ）を測定する。指標ＭＴ４−ＬＴＲ−ＥＧＦＰ細胞は、ＨＩＶ−１ＬＴＲプロモーター配列の制御下にあるＥＧＦＰ遺伝子を含有する。ＨＩＶ−１感染の成功は、ウイルスＴａｔタンパク質の発現と、引き続くＥＧＦＰ発現の誘導をもたらす。ＨＩＶ−１感染を阻害する化合物／ペプチドは、未処置ＨＩＶ感染対照との比較で、ＥＧＦＰ発現を低下させることが予測される。
【００６３】
方法
連続４倍希釈の試験化合物／ペプチドを、ＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ、ＨＸＢ２Ｄ、またはＨＸＢ２Ｄ変異ウイルス（Ｖ３８ＡまたはＱ４０Ｈ））およびＭＴ４−ＬＴＲ−ＥＧＦＰ細胞に混合して、３７℃で培養した。３日後、アルゴンレーザースキャニング顕微鏡を使用して、ＥＧＦＰ発現についてウェルを検査した。ウイルス誘発性ＥＧＦＰシグナル（ＥＣ５０）の５０％を阻害する効果的な化合物／ペプチド濃度を、ＥＧＦＰシグナル対化合物濃度対数の線形補間によって測定した；（Ｔ２０、Ｃ３４、およびシフビルチドを参照化合物として添加した）。Ｖ３８ＡおよびＱ４０Ｈ変異ウイルスについて、変異ウイルスの基幹を構成する薬物感受性野性型株ＨＸＢ２Ｄと比較して、ＥＣ５０の倍数変化として結果を報告した。
【００６４】
・標準ＡＶＥ（５０％ヒト血清）
アッセイ原理
ＨＩＶ−１複製アッセイ（５０％ヒト血清使用）は、５０％ヒト血清の存在下における、高度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）発現の誘導として、ウイルス複製を測定する。指標ＭＴ４−ＬＴＲ−ＥＧＦＰ細胞は、ＨＩＶ−１ＬＴＲプロモーター配列の制御下にあるＥＧＦＰ遺伝子を含有する。ＨＩＶ−１感染の成功は、ウイルスＴａｔタンパク質の発現と、引き続くＥＧＦＰ発現の誘導をもたらす。ＨＩＶ−１感染を阻害する化合物／ペプチドは、未処置ＨＩＶ−感染対照との比較で、ＥＧＦＰ発現を低下させることが予測される。ヒト血清に結合する化合物／ペプチドは、アッセイにおいて、ウイルス阻害活性の低下を有することが予期される。
【００６５】
方法
連続４倍希釈の試験化合物／ペプチドをＨＩＶ−１およびＭＴ４−ＬＴＲ−ＥＧＦＰ細胞と混合して、５０％ヒト血清の存在下において３７℃で培養した。３日後、アルゴンレーザースキャニング顕微鏡を使用して、ＥＧＦＰ発現についてウェルを検査した。ウイルス誘発性ＥＧＦＰシグナル（ＥＣ５０）の５０％を阻害する効果的な化合物／ペプチド濃度を、ＥＧＦＰシグナル対化合物濃度対数の線形補間によって測定した；Ｔ２０、Ｃ３４、およびシフビルチドを参照化合物として添加した。結果は、ヒト血清なしのアッセイで得られたＥＣ５０と比較して、ＥＣ５０の倍数変化として報告した。
【００６６】
【表７】
2015502378.tif 000010
【００６７】
【表８】
2015502378.tif 000011
【００６８】
【表９】
2015502378.tif 000012
【００６９】
【表１０】
2015502378.tif 000013
【００７０】
【表１１】
2015502378.tif 000014
【配列表】
2015502378000001.app
【国際調査報告】
2015502378.tif 000015
2015502378.tif 000016
2015502378.tif 000017
2015502378.tif 000018