(57)【要約】  本発明は、工業微生物学およびアルコール生産分野に関する。より具体的には、本発明は、酢酸を含有する発酵培地中で培養した場合の、改変ブタノール経路と、発酵における副産物の生成経路中の遺伝子活性の妨害とを含有する組換え微生物による、改善されたブタノール異性体の生成に関する。実施形態では、組換え微生物は、Ｃ２補給剤として酢酸を含有する発酵培地中における成長速度が増大する。
2015510774.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ｉ）改変ブタノール生合成経路を含んでなる、組換え宿主細胞を提供するステップと；
ｂ）ｉ）発酵性炭素基質；および
ｉｉ）前記宿主細胞の改善された成長または改善されたブタノール生成の少なくとも１つに十分な量で、前記発酵培地に添加される酢酸
を含んでなる発酵培地に、ａ）の宿主細胞を接触させるステップと
を含んでなる、ブタノールを生成する方法であって、前記組換え宿主細胞が、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）活性を低下させるかまたは排除するように改変されており；
それによって前記改変ブタノール生合成経路を通じて、ブタノールが前記発酵性炭素基質から直接生成される、方法。
【請求項２】
ピルビン酸デカルボキシラーゼ酵素をコードする、少なくとも１つの内在性遺伝子が不活性化される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記内在性遺伝子が、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、ＰＤＣ６またはそれらの組み合わせである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記宿主細胞を改変するかまたは発達させて、それらの成長のための外来性二炭素基質の補給に対する要求を低下または排除する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記宿主細胞が、ホスホケトラーゼ活性があるポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドと、ホスホトランスアセチラーゼ活性があるポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドとを含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記組換え宿主細胞が、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を低下させるかまたは排除するように改変されている、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素をコードする内在性遺伝子が不活性化される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記内在性遺伝子が、ＡＬＤ２、ＡＬＤ３、ＡＬＤ４、ＡＬＤ５、ＡＬＤ６またはそれらの組み合わせである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ブタノール生成が改善される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
酪酸生成が低下される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ブタノール収率または有効力価が増大される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ブタノールが、イソブタノールまたは１−ブタノール、またはそれらの組み合わせである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ブタノール生合成経路が、
ａ）ピルビン酸からアセト乳酸（経路ステップａ）；
ｂ）ａ）のアセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸（経路ステップｂ）；
ｃ）ｂ）の２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸（経路ステップｃ）；
ｄ）ｃ）のα−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒド（経路ステップｄ）；および
ｅ）ｄ）のイソブチルアルデヒドからイソブタノール（経路ステップｅ）
への、基質から生成物への変換を含んでなり、
ｉ）ステップａ）の基質から生成物への変換が、アセト乳酸シンターゼ酵素によって遂行され；
ｉｉ）ステップｂ）の基質から生成物への変換が、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ酵素によって遂行され；
ｉｉｉ）ステップｃ）の基質から生成物への変換が、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ酵素によって遂行され；
ｉｖ）ステップｄ）の基質から生成物への変換が、α−ケト酸デカルボキシラーゼ酵素によって遂行され；
ｖ）ステップｅ）の基質から生成物への変換が、アルコールデヒドロゲナーゼ酵素によって遂行され；
それによって前記改変ブタノール生合成経路を通じて、イソブタノールがピルビン酸から直接生成される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ブタノール生合成経路が、
ａ）ピルビン酸からアセト乳酸（経路ステップａ）；
ｂ）ａ）のアセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸（経路ステップｂ）；
ｃ）ｂ）の２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸（経路ステップｃ）；
ｄ）ｃ）のα−ケトイソ吉草酸からイソブチリルＣｏＡ（経路ステップｆ）；および
ｅ）ｄ）のイソブチリルＣｏＡからイソブチルアルデヒド（経路ステップｇ）；
ｆ）ｅ）のイソブチルアルデヒドからイソブタノール（経路ステップｅ）
への、基質から生成物への変換を含んでなり、
ｉ）ステップａ）の基質から生成物への変換が、アセト乳酸シンターゼ酵素によって遂行され；
ｉｉ）ステップｂ）の基質から生成物への変換が、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ酵素によって遂行され；
ｉｉｉ）ステップｃ）の基質から生成物への変換が、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ酵素によって遂行され；
ｉｖ）ステップｄ）の基質から生成物への変換が、分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ酵素によって遂行され；
ｖ）ステップｅ）の基質から生成物への変換が、アシル化（ａｃｅｌｙｌａｔｉｎｇ）アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素によって遂行され；
ｖｉ）ステップｆ）の基質から生成物への変換が、アルコールデヒドロゲナーゼ酵素によって遂行され；
それによって前記改変生合成経路を通じて、イソブタノールがピルビン酸から直接生成される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記組換え宿主細胞が、細菌または酵母である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記組換え宿主細胞が酵母であり、前記改変ブタノール生合成経路の基質から生成物への変換を実行する２種以上の酵素が、ミトコンドリアに局在化しない、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記発酵培地が、ブタノールをさらに含んでなる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記発酵培地を前記組換え宿主細胞と接触させるステップの少なくとも一部が、嫌気的または微好気的条件下で実施される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記発酵培地を前記組換え宿主細胞と接触させるステップが、バッチまたは継続的発酵として実施される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ｃ）ブタノールを回収するステップをさらに含んでなる、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記回収が、蒸留、液液抽出、吸着、デカンテーション、浸透気化法またはそれらの組み合わせによる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法から生成される、ブタノール。
【請求項２３】
ａ）ｉ）改変ブタノール生合成経路を含んでなる、組換え宿主細胞；および
ｂ）ｉ）発酵性炭素基質；および
ｉｉ）ａ）の宿主細胞の改善された成長に、または改善されたブタノール生成に十分な量で、発酵培地に添加される酢酸
を含んでなる発酵培地
を含んでなる組成物であって、前記組換え宿主細胞が、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）活性、および任意選択的に、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を低下させるかまたは排除するように遺伝子操作されている、組成物。
【請求項２４】
ピルビン酸デカルボキシラーゼ酵素をコードする、少なくとも１つの内在性遺伝子が不活性化される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素をコードする内在性遺伝子が不活性化される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
前記内在性遺伝子が、ＡＬＤ２、ＡＬＤ３、ＡＬＤ４、ＡＬＤ５、ＡＬＤ６またはそれらの組み合わせである、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記内在性遺伝子が、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、ＰＤＣ６またはそれらの組み合わせである、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記組換え宿主細胞が、細菌または酵母である、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
前記発酵培地が、ブタノールをさらに含んでなる、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ブタノールが、イソブタノールまたは１−ブタノール、またはそれらの組み合わせである、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記発酵培地が、約０．０１ｍＭ〜約５００ｍＭの範囲のブタノールを含んでなる、請求項２９または３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記発酵培地が、約０．１ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲の酢酸を含んでなる、請求項２３〜３１のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、工業微生物学およびアルコール生産分野に関する。より具体的には、本発明は、酢酸を含有する発酵培地中で培養した場合の、改変ブタノール経路を含有する組換え微生物による、ブタノール異性体の発酵生産の改善に関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の定めにより、その内容全体を参照によって本明細書に援用する、２０１２年３月２３日に出願された、米国仮特許出願第６１／６１５，１７４号明細書の優先権を主張する。
【０００３】
ＥＦＳ−Ｗｅｂによって電子的に提出された配列表への言及
明細書と共に提出される、電子的に提出される配列表の内容（２０１２０３１５＿ＣＬ５６８１ＵＳＮＰ＿ＳＥＱＬＩＳＴ＿ＳＴ２５；サイズ：２９４，４８６；作成日：２０１３年３月１４日）は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００４】
ブタノールは、多様な用途がある重要な工業化学物質であり、燃料または燃料添加剤としてのその可能性は、特に重要である。ブタノールは、標準内燃機関内における燃焼時にＣＯ２のみをもたらし、ＳＯｘまたはＮＯｘがわずか、または皆無であることから、燃料または燃料添加剤として支持されている。ブタノールは四炭素アルコールであるが、それはガソリンと同様のエネルギー容量を有して、あらゆる化石燃料と混合し得る。さらにブタノールは、エタノールよりも腐食性が少なく、これまでのところ最も好ましい燃料添加剤である。
【０００５】
ブタノールはまた、燃料電池工業における水素流通問題に影響する可能性も有する。今日の燃料電池は、水素輸送と流通に付随する、安全上の懸念に悩まされている。しかしブタノールは、その水素含量について容易に改質し得て、燃料電池または車のどちらかに必要な純度で、既存の給油所を通じて流通され得る。ブタノールはまた、プラスチック工業における原料化学物質として、および食品およびフレーバ産業における食品等級抽出剤として有用である。毎年、１００〜１２０億ポンドのブタノールが石油化学的手段によって生産され、この汎用化学物質に対する需要は増大すると思われる。
【０００６】
オキソ合成、一酸化炭素の接触水素化（非特許文献１）およびメタノールとｎ−プロパノールのゲルベ縮合（非特許文献２）などのイソブタノールの化学合成法が、公知である。これらの方法は、石油化学物質に由来する出発原料を使用し、一般に高価で環境を損なう。植物由来原料からのイソブタノールの生産は、化石燃料の使用を最小化し得る。
【０００７】
イソブタノールは、酵母発酵の副産物として微量で生物学的に産生される。それは、酵母によるアミノ酸の不完全代謝の結果として生成する、「フーゼル油」の微量成分である。イソブタノールは、特にＬ−バリンの異化作用から生成される。Ｌ−バリンのアミン基が窒素源として使われた後に、結果として生じるα−ケト酸は脱炭酸され、いわゆるエールリッヒ経路の酵素によって、イソブタノールに還元される（非特許文献３（「Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ」）。発酵ブロスに２０ｇ／Ｌの濃度でＬ−バリンを提供することで、３ｇ／Ｌのイソブタノール収率が得られたと報告する、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎによって記載されるように、発酵培地への外来性Ｌ−バリンの付加は、イソブタノールの収率を増大させる。しかし原材料としてのバリンの使用には、工業規模イソブタノール生産にとっては、けた違いの費用がかかる。
【０００８】
糖類から直接、イソブタノールをはじめとするブタノーを生成する改変生合成経路を発現する微生物は、例えば特許文献１および２で先に記載されている。このようなブタノール産生菌は、ブタノール異性体の収率を最大化するために、発酵中の副産物生成に関与する特定遺伝子の中断をさらに含んでもよい。副産物生成に関与する遺伝子としては、エタノール生成に必要な遺伝子（特許文献３を参照されたい）およびイソ酪酸生成に必要な遺伝子（特許文献４を参照されたい）が挙げられる。エタノール生成に必要な遺伝子（例えばＰＤＣ遺伝子）が、中断されている微生物は、適切な成長のために外来性Ｃ２補給剤を要求する。Ｃ２補給剤に対するこの要求は、通常は、培地に少量のエタノールを添加することで満たされる。例えば、参照によって本明細書に援用する、特許文献５は、炭素源として２％グルコースを含有する培地中で成長できないが、小量のエタノールを添加したグルコース含有培地中では、非常に良好に成長することが発見された、ＰＤＣノックアウト酵母株を記載する。
【０００９】
状況によっては、ＰＤＣ遺伝子中断に加えて、イソ酪酸生成に必要な遺伝子（例えばＡＬＤ６）の中断があるブタノール産生菌は、エタノールがＣ２補給剤として使用されても、成長してブタノールを産生する能力に変化が生じることもある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第７，８５１，１８８号明細書
【特許文献２】米国特許第７，９９３，８８９号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００９０３０５３６３号明細書
【特許文献４】国際公開第２０１２／１２９５５５号パンフレット
【特許文献５】米国特許出願公開第２００９０３０５３６３号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｖｏｌ．５，ｐｐ．７１６−７１９（２００３）
【非特許文献２】Ｃａｒｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｃａｔａｌ．Ａ．Ｃｈｅｍ．，２２０：２１５−２２０（２００４）
【非特許文献３】Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２５７５２−２５７５６，１９９８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
このようなチャレンジへのアプローチは、例えばＣ２依存性を低下させるための株の遺伝子操作（例えば米国特許出願公開第２０１２０１５６７３５号明細書を参照されたい）などのように、当該技術分野で記載されているが、このような戦略を置き換えまたは補足する、代替または補足的な方法は、当該技術分野における進歩に相当するであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本明細書で提供されるのは、
ａ．ｉ．改変ブタノール生合成経路を含んでなる、組換え宿主細胞を提供するステップと；
ｂ．ｉ．発酵性炭素基質；および
ｉｉ．酢酸
を含んでなる発酵培地に、ａ）の宿主細胞を接触させるステップと
を含んでなる、ブタノールを生産する方法であって、
前記組換え宿主細胞が、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）活性、および任意選択的に、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を低下させるかまたは排除するように改変されており；それによって改変ブタノール生合成経路を通じて、ブタノールが発酵性炭素基質から直接生成される、方法である。実施形態では、酢酸が発酵培地に添加される。実施形態では、酢酸は、宿主細胞の成長に十分な量で存在する。実施形態では、酢酸は、改善されたブタノール生成に十分な量で存在する。実施形態では、酢酸が発酵培地に添加される。実施形態では、酢酸は、再生可能な原材料起源である。
【００１４】
本発明の一実施形態は、
ａ．ｉ．改変ブタノール生合成経路を含んでなる、組換え宿主細胞を提供するステップと；
ｂ．ｉ．発酵性炭素基質；および
ｉｉ．ａ）の宿主細胞の成長、およびブタノール生成に十分な量のＣ２補給剤としての、発酵培地に添加される酢酸
を含んでなる発酵培地に、ａ）の宿主細胞を接触させるステップと
を含んでなる、ブタノールを生成する方法を対象とし、
前記組換え宿主細胞が、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）活性、およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を低下させるかまたは排除するように改変されており；それによって改変ブタノール生合成経路を通じて、ブタノールが発酵性炭素基質から直接生成される、方法である。
【００１５】
本発明の一実施形態は、以下の基質から生成物への変換を含んでなる、イソブタノールを生成する方法を対象とする：
ａ）ピルビン酸からアセト乳酸への（経路ステップａ）；
ｂ）ａ）のアセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への（経路ステップｂ）；
ｃ）ｂ）の２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸への（経路ステップｃ）；
ｄ）ｃ）のα−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒドへの（経路ステップｄ）；および
ｅ）ｄ）のイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの（経路ステップｅ）；
ｉ）ステップａ）の基質から生成物への変換は、アセト乳酸シンターゼ酵素によって遂行され；
ｉｉ）ステップｂ）の基質から生成物への変換は、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ酵素によって遂行され；
ｉｉｉ）ステップｃ）の基質から生成物への変換は、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ酵素によって遂行され；
ｉｖ）ステップｄ）の基質から生成物への変換は、α−ケト酸デカルボキシラーゼ酵素によって遂行され；
ｖ）ステップｅ）の基質から生成物への変換は、アルコールデヒドロゲナーゼ酵素によって遂行され；
それによって改変生合成経路を通じて、イソブタノールがピルビン酸から直接生成される。
【００１６】
本発明の一実施形態は、以下の基質から生成物への変換を含んでなるイソブタノールを生産する方法対象とする：
ａ）ピルビン酸からアセト乳酸への（経路ステップａ）；
ｂ）ａ）のアセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への（経路ステップｂ）；
ｃ）ｂ）の２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸への（経路ステップｃ）；
ｄ）ｃ）からのα−ケトイソ吉草酸からイソブチリルＣｏＡへの（経路ステップｆ）；および
ｅ）ｄ）のイソブチリルＣｏＡからイソブチルアルデヒドへの（経路ステップｇ）；
ｆ）ｅ）のイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの（経路ステップｅ）；
ｉ）ステップａ）の基質から生成物への変換は、アセト乳酸シンターゼ酵素によって遂行され；
ｉｉ）ステップｂ）の基質から生成物への変換は、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ酵素によって遂行され；
ｉｉｉ）ステップｃ）の基質から生成物への変換は、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ酵素によって遂行され；
ｉｖ）ステップｄ）の基質から生成物への変換へ、分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ酵素によって遂行され；
ｖ）ステップｅ）の基質から生成物への変換は、アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素によって遂行され；
ｖｉ）ステップｆ）の基質から生成物への変換は、アルコールデヒドロゲナーゼ酵素によって遂行され；
それによって改変生合成経路を通じて、イソブタノールがピルビン酸から直接生成される。
【００１７】
本発明の一実施形態は、
ａ）ｉ）改変ブタノール生合成経路を含んでなる、組換え宿主細胞；
ｂ）ｉ）発酵性炭素基質；および
ｉｉ）ａ）の宿主細胞の成長およびブタノール生成に十分な量の酢酸を含んでなる発酵培地
を含んでなり、前記組換え宿主細胞が、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）活性、およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を低下させるかまたは排除するように改変されている、組成物を対象とする。
【００１８】
実施形態では、酢酸が発酵培地に添加される。実施形態では、酢酸は、再生可能な原材料起源である。実施形態では、酢酸および炭素基質のどちらも、再生可能な原材料起源である。
【００１９】
本発明の一実施形態は、組成物を対象とし、発酵培地はブタノールをさらに含んでなる。
【００２０】
本発明の一実施形態は、改変ブタノール生合成経路を通じて、ブタノールが発酵性炭素基質から直接生産される条件下に、上記組成物を保つステップを含んでなる、ブタノールを生成する方法を対象とする。
【００２１】
本発明の一実施形態は、本明細書で開示される方法から生成するブタノールを対象とする。
【００２２】
いくつかの実施形態では、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドは、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、ＰＤＣ６またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、ＡＬＤ２、ＡＬＤ３、ＡＬＤ４、ＡＬＤ５、ＡＬＤ６またはそれらの組み合わせである。
【００２３】
いくつかの実施形態では、成長のための外来性二炭素基質の補給に対する要求の低下または排除を含んでなるように、宿主細胞を改変するかまたは発達させる。
【００２４】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ホスホケトラーゼ活性があるポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチド、ホスホトランスアセチラーゼ活性があるポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチド、またはその両者を含んでなる。
【００２５】
いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、細菌または酵母である。
【００２６】
いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、イソブタノール生産条件に置かれる、ホールセル触媒である。
【００２７】
いくつかの実施形態では、生成するブタノールは、イソブタノールである。いくつかの実施形態では、生成するブタノールは、１−ブタノールである。
【００２８】
いくつかの実施形態では、方法は、ブタノールを回収するステップをさらに含んでなる。いくつかの実施形態では、回収は、蒸留、液液抽出、吸着、デカンテーション、浸透気化法またはそれらの組み合わせによる。いくつかの実施形態では、方法はまた、発酵培地から固形分を除去するステップを含んでなる。いくつかの実施形態では、除去するステップは、回収するステップの前に行われる。いくつかの実施形態では、除去は、遠心分離、濾過またはデカンテーションによる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】異なるイソブタノール生合成経路を描写する。「ａ」、「ｂ」、「ｃ」、「ｄ」、「ｅ」、「ｆ」、および「ｇ」と標識されるステップは、下述の基質から生成物への変換に対応する。ステップ「ａ」は、例えばアセト乳酸シンターゼによって触媒されてもよい。ステップ「ｂ」は、例えばアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼによって触媒されてもよい。ステップ「ｃ」は、例えばジヒドロキシ酸デヒドラターゼによって触媒されてもよい。ステップ「ｄ」は、例えば分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼによって触媒されてもよい。ステップ「ｅ」は、例えば分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい。ステップ「ｆ」は、例えば分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい。ステップ「ｇ」は、例えばアルデヒドデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい。
【図２】１−ブタノール生合成経路を描写する。「ａ」、「ｂ」、「ｃ」、「ｄ」、「ｅ」、および「ｆ」と標識されるステップは、下述の基質から生成物への変換に対応する。ステップ「ａ」は、例えばアセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼによって触媒されてもよい。ステップ「ｂ」は、例えば３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい。ステップ「ｃ」は、例えばクロトナーゼによって触媒されてもよい。ステップ「ｄ」は、例えばブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい。ステップ「ｅ」は、例えばブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい。ステップステップ「ｆ」は、例えばブタノールデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
公表された学術誌論文または抄録、または発行された対応する米国または外国特許出願、または外国特許、またはあらゆるその他の文献をはじめとする、本明細書に引用される全ての文献は、引用された文献中に提示される全てのデータ、表、数値、および文章を含めて、それぞれその全体を参照によって本明細書に援用する。
【００３１】
当業者は、単に通例の実験法を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの同等物を認識し、または見極めることができるであろう。このような同等物は、特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【００３２】
本明細書で提供されるのは、改変ブタノール生合成経路を発現し、発酵工程中の副産物生成に関与する１つまたは複数の遺伝子の中断を有する組換え微生物を使用する、酢酸が発酵培地に添加される、ブタノール異性体の発酵生産方法である。
【００３３】
本明細書で開示されるように、出願人らは、ＰＤＣ遺伝子欠失（および任意選択的にＡＬＤ６遺伝子欠失）を有するブタノール産生菌が、外来性（ｅｘｏｇｅｎｅｏｕｓ）Ｃ２補給剤として酢酸が添加された発酵培地中で培養されると、改善された成長速度またはブタノール異性体産生を有することを発見した。酢酸はエタノールよりも安価であるので、Ｃ２補給剤として酢酸を使用することは、ブタノール異性体の生産コストを低下させる。
【００３４】
実施形態では、ＰＤＣ−ＫＯ表現型がある宿主細胞は、それらの成長のための外来性二炭素基質補給に対する要求の低下または排除を含んでなってもよい。例えばＰＤＣ−ＫＯ表現型がある宿主細胞を、（例えばこれに限定されないが、ホスホケトラーゼ活性があるポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチド、および／またはホスホトランスアセチラーゼ活性があるポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含んでなるように）改変するかまたは発達させて、成長のためのＣ２補給剤に対する要求を低下または排除してもよい。このような実施形態では、少なくとも理論上は、Ｃ２栄養要求性を満たすために酢酸が絶対的に要求されなくてもよい一方で、実施例で実証されるように、本明細書で提供される方法は、このような宿主細胞を用いたブタノール生成に改善を提供し得る。
【００３５】
特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合は、定義を含めて本出願が優先される。また文脈上異なる解釈を要する場合を除き、単数形の用語には複数形が含まれるものとし、複数形の用語には単数形が含まれるものとする。本明細書で言及される全ての刊行物、特許、およびその他の参考文献は、あらゆる目的のために、その内容全体を参照によって援用する。
【００３６】
本明細書に開示されるものと類似したまたは同等の方法および材料を、本発明の実施または試験で使用し得るが、適切な方法および材料は下で開示されるとおりである。材料、方法、および実施例は例証のみを意図し、限定的であることは意図されない。本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明から、および特許請求の範囲から明白になるであろう。本発明をさらに定義するために、以下の用語および定義が、本明細書で提供される。
【００３７】
本明細書の用法では、「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語、またはあらゆるその他のバリエーションは、記述される整数または整数群の包含を暗示するが、あらゆるその他の整数または整数群の排除を暗示しないものと理解される。例えば要素の一覧を含んでなる組成物、混合物、工程、方法、物品、または装置は、必ずしもこれらの構成要件のみに限定されず、明示的に列挙されない、またはこのような組成物、混合物、工程、方法、物品、または装置に固有のその他の要素を含んでもよい。さらに特に断りのない限り、「または（ｏｒ）」は排他的「または（ｏｒ）」でなく包括的「または（ｏｒ）」を指す。例えば条件ＡまたはＢは、以下のいずれかによって満たされる：Ａが真で（または存在し）Ｂが偽であり（または存在せず）、Ａが偽で（または存在せず）Ｂが真であり（または存在する）、ＡおよびＢの双方が真である（または存在する）。
【００３８】
本明細書の用法では、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」という用語、または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」などのバリエーションは、明細書および特許請求の範囲全体を通じた用法で、あらゆる列挙された整数または整数群の包含を示唆するが、追加的な整数また整数群は、特定の方法、構造、または組成物に追加できない。
【００３９】
本明細書の用法では、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という用語、または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」などのバリエーションは、明細書および特許請求の範囲全体を通じた用法で、あらゆる列挙された整数または整数群の包含と、特定の方法の基本的または新規特性、構造、または組成物を実質的に変化させない、あらゆる列挙された整数または整数群の包含を示唆する。例えばＭ．Ｐ．Ｅ．Ｐ．§２１１１．０３を参照されたい。
【００４０】
さらに本発明の構成要件または構成要素に先行する不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、構成要件または構成要素の事例数（すなわち発生）に関して非制限的であることが意図される。したがって「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは少なくとも１つを含むものと解釈すべきであり、構成要件または構成要素の単数語形は、数が単数であることを明らかに意味する場合を除いて、複数もまた含む。
【００４１】
「発明」または「本発明」という用語は、本明細書の用法では非限定的用語であり、特定の発明のいずれかの単一実施形態を指すことは意図されず、本出願に記載される全ての可能な実施形態を包含する。
【００４２】
本明細書の用法では、本発明の成分または反応物質の量、または本明細書に記載される反応条件を修飾する「約」という用語は、例えば濃縮物または溶液を実際に作成するのに使用される、典型的な測定および液体取り扱い手順を通じて；これらの手順における不注意による誤りを通じて；組成物を作成しまたは方法を実施するのに用いられる成分の製造、起源または純度の違いを通じて、生じ得る数量の変動を指す。「約」という用語はまた、特定の最初の混合物から生じる組成物の異なる平衡条件のために、異なる量も包含する。「約」という用語によって修飾されるか否かを問わず、特許請求の範囲には量の同等物が含まれる。一実施形態では、「約」という用語は、報告される数値の１０％以内、時に報告される数値の５％以内を意味する。
【００４３】
場合によっては、「バイオマス」は、本明細書の用法では、典型的に単位ｇ／Ｌ乾燥細胞重量（ｄｃｗ）で提供される、発酵産物産生微生物の細胞バイオマスを指す。
【００４４】
「発酵産物」という用語は、１−ブタノール、イソブタノールなどをはじめとするが、これに限定されるものではない、あらゆる所望の対象産物を含む。
【００４５】
「ブタノール異性体」または「ブタノール」という用語は、１−ブタノール、イソブタノールまたはその混合物を指す。イソブタノールは、２−メチル−１−プロパノールとしてもまた知られている。
【００４６】
「ブタノール生合成経路」という用語は、本明細書の用法では、１−ブタノールまたはイソブタノールを生成する酵素経路を指す。例えばブタノール生合成経路は、参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，９９３，８８９号明細書で開示される。
【００４７】
「イソブタノール生合成経路」という用語は、イソブタノールを生成する酵素経路を指す。時折「イソブタノール生合成経路」は、「イソブタノール生成経路」の同意語として使用される。
【００４８】
「１−ブタノール生合成経路」という用語は、本明細書の用法では、１−ブタノールを生成するための酵素経路を指す。
【００４９】
「組換え宿主細胞」は、遺伝子操作されて生合成経路を発現する宿主細胞と定義され、宿主細胞は、未改変宿主細胞と比較してより多量の生合成産物を産生し、あるいは未改変宿主細胞によって通常生成されない生合成産物を産生する。
【００５０】
ブタノール生合成経路に適用される「改変」という用語は、改変ブタノール生合成経路を通じたピルビン酸からの炭素流が最大化され、それによって増大した量のブタノールが、発酵性炭素基質から直接生成するように操作された、ブタノール生合成経路を指す。このような改変としては、異種ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現、内在性ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの過剰発現、天然では細胞質ゾルに局在化しないタンパク質の細胞質局在化、補助因子の可用性の増大、競合的経路の活性低下などが挙げられる。
【００５１】
「発酵性炭素基質」という用語は、本明細書で開示されるものなどの、微生物によって代謝されることができる炭素源を指す。適切な発酵性炭素基質としては、グルコース、フルクトース、アラビノースまたはキシロースなどの単糖類をはじめとする糖類；乳糖またはスクロースなどのオリゴ糖類；デンプン、セルロース、リグノセルロースまたはヘミセルロースなどの多糖類；一炭素基質、脂肪酸；およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００５２】
「発酵培地」は、本明細書の用法では、水、発酵性炭素基質、溶解固形分、発酵産物、および発酵容器内に保持される材料の全てのその他の成分の混合物を意味し、発酵容器内では、存在する微生物によって、発酵性炭素基質から発酵産物、水、および二酸化炭素（ＣＯ２）への反応によって、発酵産物が生成される。時折、本明細書の用法では、「発酵ブロス」および「発酵混合物」という用語は、「発酵培地」の同意語として使用され得る。
【００５３】
「好気的条件」という用語は、本明細書の用法では、酸素存在下の成長条件を意味する。
【００５４】
「微好気的条件」という用語は、本明細書の用法では、低い溶存酸素レベルの成長条件を意味する。例えば酸素レベルは、空気飽和の約１％未満であってもよい。
【００５５】
「嫌気的条件」という用語は、本明細書の用法では、酸素不在下の成長条件を意味する。
【００５６】
「炭素基質」という用語は、本明細書で開示される組換え宿主細胞によって代謝されることができる炭素源を指す。炭素基質の非限定的例は、本明細書で提供され、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、エタノール、乳酸、コハク酸、グリセロール、二酸化炭素、酢酸、メタノール、グルコース、フルクトース、スクロース、キシロース、アラビノース、デキストロース、およびそれらの混合物が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００５７】
「Ｃ２補給剤」という用語は、発酵培地に添加されると２個の炭素原子を有する炭素源を指し、Ｃ２補給剤は、発酵工程における副産物生成に関与するタンパク質活性の妨害を有するブタノール生成菌の成長、および／またはブタノール生成を増大させる。Ｃ２補給剤の非限定的例としては、酢酸およびエタノールが挙げられる。
【００５８】
「ブタノール産生菌」という用語は、本明細書の用法ではブタノール異性体を産生できる微生物を指す。このような微生物は、典型的に、改変ブタノール生合成経路を含んでなる組換え微生物である。「イソブタノール産生菌」という用語は、本明細書の用法ではイソブタノール異性体を産生できる微生物を指す。このような微生物は、典型的に、改変イソブタノール生合成経路を含んでなる組換え微生物である。
【００５９】
「ＰＤＣノックアウト」という用語は、本明細書の用法では、ＰＤＣ活性が排除または低下されるように、ＰＤＣ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは遺伝子中に、またはＰＤＣ１、ＰＤＣ５またはＰＤＣ６活性、またはあらゆるそれらの組み合わせを有する内在性ポリペプチド中に、中断、欠失、変異、および／または置換を含んでなる宿主細胞を指す。
【００６０】
「ＡＬＤノックアウト」という用語は、本明細書の用法では、ＡＬＤ活性が排除または低下されるように、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは遺伝子中に、またはＡＬＤ２、ＡＬＤ３、ＡＬＤ４、ＡＬＤ５またはＡＬＤ６活性、またはあらゆるそれらの組み合わせを有する内在性ポリペプチド中に、中断、欠失、変異、および／または置換を含んでなる宿主細胞を指す。
【００６１】
本明細書の用法では、「改善されたブタノール生成」という用語は、収率、有効速度、有効力価または比生産性の少なくとも１つを増大させ、例えばイソ酪酸などの少なくとも１つの副産物の収率を低下させることをはじめとするが、これに限定されるものではない、ブタノール生成パラメータの改善を指す。酢酸に関する増大または低下は、酢酸不在下の適切な対照方法と比較して判定される。
【００６２】
本明細書の用法では、「収率」という用語は、ｇ／ｇでの炭素源あたりの生成物量を指す。収率は、グルコースを炭素源として例示されてもよい。特に断りのない限り、収率は、理論的収率の百分率として表されるものと理解される。微生物または代謝経路に関して、「理論的収率」は、生成物を生成するのに使用される代謝経路の化学量によって決まる、総基質量あたりで生じ得る最大生成物量と定義される。例えばグルコースからイソプロパノールへの典型的な変換の理論的収率は、０．３３ｇ／ｇである。したがって０．２９７ｇ／ｇのグルコースからのイソプロパノールの収率は、理論値の９０％または理論的収率の９０％として表される。本開示では、収率がグルコースを炭素源として例示される一方で、本発明はその他の炭素源に応用し得て、収率は、使用される炭素源に応じて変動してもよいものと理解される。当業者は、様々な炭素源について収率を計算し得る。
【００６３】
「有効力価」という用語は、本明細書の用法では、発酵培地１リットルあたりの発酵によって生成されるブタノール異性体の総量を指す。ブタノール異性体の総量は、（ｉ）発酵培地中のブタノールの量；（ｉｉ）有機抽出剤から回収されるブタノール異性体の量；および（ｉｉｉ）ガスストリッピングが使用される場合は、気相から回収されるブタノール異性体の量を含む。
【００６４】
「有効速度」という用語は、本明細書の用法では、発酵１時間あたりの発酵培地１リットルあたりの発酵によって生成されるブタノール異性体の総量を指す。
【００６５】
「比生産性」という用語は、本明細書の用法では、単位時間あたり細胞の１ｇの乾燥細胞重量あたりで生成されるブタノール異性体のグラム数を指す。
【００６６】
「成長速度」という用語は、本明細書の用法では、微生物が培地中で成長する速度を指す。組換え微生物の成長速度は、例えば６００ナノメートルで光学濃度を測定することで、モニターし得る。倍加時間を成長曲線の対数部分から計算して、成長速度の尺度として使用してもよい。
【００６７】
本発明で使用するためのポリペプチドおよびポリヌクレオチド
本明細書の用法では、「ポリペプチド」という用語は、単数形「ポリペプチド」ならびに複数形「ポリペプチド」を包含することが意図され、アミド結合（ペプチド結合としてもまた知られている）によって直線的に連結するモノマー（アミノ酸）から構成される分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、あらゆるアミノ酸の鎖または２つ以上の鎖群を指し、生成物の特定長を指さない。したがってアミノ酸の鎖または２つ以上の鎖群を指すのに使用されるペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、またはあらゆるその他の用語は、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれかの代わりに、またはそれと同義的に使用されてもよい。ポリペプチドは、天然の生物学的起源に由来してもよく、または組換え技術によって作成されてもよいが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されない。それは化学合成をはじめとする、あらゆる様式で作成されてもよい。本発明で使用されるポリペプチドは、完全長ポリペプチドおよびその断片を含んでなる。
【００６８】
「単離」ポリペプチドまたはその断片、変種、または誘導体は、その天然環境にないポリペプチドを意味する。特定の精製レベルは、必要とされない。例えば単離ポリペプチドは、その固有のまたは天然環境から取り出され得る。宿主細胞中で発現される、組換え的に生成されたポリペプチドおよびタンパク質は、本発明の目的で単離されていると見なされ、あらゆる適切な技術によって分離、分画、または部分的または実質的に精製された天然または組換えポリペプチドについても同様である。
【００６９】
本発明で使用するのに適したポリペプチドおよびその他の酵素、およびそれらの断片は、ポリヌクレオチドによってコードされる。「ポリヌクレオチド」という用語は、単数の核酸ならびに複数の核酸を包含することが意図され、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来ＲＮＡ、またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）などの単離核酸分子またはコンストラクトを指す。ポリヌクレオチドは、従来型リン酸ジエステル結合または非従来型結合（例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）などに見られるアミド結合）を含んでなってもよい。「核酸」という用語は、例えば、ポリヌクレオチド中に存在する、ＤＮＡまたはＲＮＡ断片などの任意選択の１つまたは複数の核酸断片を指す。本発明によるポリヌクレオチドは、さらに合成的に生成された分子を含む。本発明のポリヌクレオチドは、宿主細胞に天然であっても、または異種であってもよい。さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターなどの調節因子であってもよく、またはそれを含んでもよい。
【００７０】
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドまたは核酸は、ＤＮＡである。ＤＮＡの場合、常態ではポリペプチドをコードする核酸を含んでなるポリヌクレオチドは、１つまたは複数のコード領域と作動可能に結合する、プロモーターおよび／またはその他の転写または翻訳制御要素を含んでもよい。作動可能な結合では、遺伝子産物発現が制御配列の影響または制御下に置かれるように、例えばポリペプチドである遺伝子産物のコード領域が、１つまたは複数の制御配列と結合する。２つのＤＮＡ断片（ポリペプチドコード領域とそれに結合するプロモーターなど）は、プロモーター機能の誘発が、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらし、２つのＤＮＡ断片間の結合の性質が、遺伝子産物発現を誘導する発現制御配列の能力に干渉せず、またはＤＮＡテンプレートが転写される能力に干渉しなければ、「作動的に結合する」。したがってプロモーターが核酸の転写をもたらすことができれば、プロモーター領域は、ポリペプチドをコードする核酸と作動可能に結合する。プロモーターに加えて、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、および転写終結シグナルなどのその他の転写制御要素が、ポリヌクレオチドと作動可能に結合し得る。適切なプロモーターおよびその他の転写制御領域が、本明細書で開示される。
【００７１】
ポリヌクレオチド配列は「単離された」と称し得て、その中では、それはその天然環境から取り出されている。例えば、酵素活性（例えば基質をキシルロースに変換する能力）を有するポリペプチドまたはポリペプチド断片をコードして、ベクター中に含有される異種ポリヌクレオチドは、本発明の目的では、単離されていると見なされる。単離ポリヌクレオチドのさらなる例としては、異種宿主細胞中で維持される組換えポリヌクレオチド、または溶液中の（部分的または実質的）精製ポリヌクレオチドが挙げられる。本発明に従った単離ポリヌクレオチドまたは核酸としては、合成的に生成された分子がさらに挙げられる。ＤＮＡポリマーの形態の単離ポリヌクレオチド断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つまたは複数の部分を含んでなり得る。
【００７２】
「遺伝子」という用語は、特定のタンパク質として発現されることができ、任意選択的に、コード配列に先行する（５’非コード配列）および後続する（３’非コード配列）制御配列を含む、核酸断片を指す。
【００７３】
本明細書の用法では、「コード領域」または「ＯＲＦ」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる、核酸の部分である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されず、コード領域が存在する場合、その一部と見なされてもよいが、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’および３’非翻訳領域などのあらゆる側面に位置する配列などは、コード領域の一部でない。「適切な制御配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、配列中、または下流（３’非コード配列）に位置して、転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または結合コード配列の翻訳に影響を及ぼす、ヌクレオチド配列を指す。制御配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、およびステムループ構造を含み得る。
【００７４】
多様な翻訳制御要素が、当業者に知られている。これらとしては、リボソーム結合部位、翻訳開始および終止コドン、およびウイルス系由来要素（特に配列内リボソーム進入部位、またはＩＲＥＳ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは、一本鎖または二本鎖であってもよい。
【００７５】
ここでの用法では「形質転換」は、遺伝的に安定した遺伝形質をもたらす、宿主生物ゲノムへの核酸断片の転移を指す。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「組換え」または「形質転換」生物と称される。
【００７６】
「プラスミド」、「ベクター」、および「カセット」という用語は、細胞の中央代謝の一部ではない遺伝子を保有することが多く、通常は環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態である、染色体外要素を指す。このような要素は、あらゆる起源に由来する、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの、直鎖または環状の、自己複製配列、ゲノム一体化配列、ファージまたはヌクレオチド配列であってもよく、その中では、いくつかのヌクレオチド配列が独自構造に連結または組換えされており、それは選択された遺伝子産物のためのプロモーター断片およびＤＮＡ配列を、適切な３’非翻訳配列と共に細胞に導入できる。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を促進する要素を有する、特定のベクターを指す。「発現カセット」は、外来遺伝子を含有し、外来遺伝子に加えて、異種宿主中で遺伝子の増強された発現ができるようにする要素を有する、特定のベクターを指す。
【００７７】
本明細書の用法では、「天然」は、存在する場合、それ自身の制御配列と共にある、天然に見られる形態のポリヌクレオチド、遺伝子、またはポリペプチドを指す。
【００７８】
「内在性」という用語は、ポリヌクレオチド、遺伝子、またはポリペプチドに関して使用される場合、生物のゲノム中のその自然な位置にある、または天然ポリペプチドでは、ゲノム中のこの位置から転写および翻訳される、天然ポリヌクレオチドまたは遺伝子を指す。
【００７９】
「異種」という用語は、ポリヌクレオチド、遺伝子、またはポリペプチドに関して使用される場合、常態では宿主生物に見られない、ポリヌクレオチド、遺伝子、またはポリペプチドを指す。「異種」は、例えば生物のゲノム中のその自然な位置でない、対応する天然遺伝子と異なる形態で、起源生物に再導入された天然コード領域、またはその一部を含む。異種ポリヌクレオチドまたは遺伝子は、例えば遺伝子移入によって宿主生物に導入されてもよい。異種遺伝子は、天然宿主に再導入された非天然調節領域がある、天然コード領域を含んでもよい。「導入遺伝子」は、形質転換手順によってゲノムに導入された遺伝子である。
【００８０】
「制御配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、配列中、または下流（３’非コード配列）に位置して、転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または結合コード配列の翻訳に影響を及ぼす、ヌクレオチド配列を指す。制御配列としては、プロモーター、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、転写終結シグナル、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、およびステムループ構造が挙げられる。
【００８１】
「プロモーター」という用語は、機能性ＲＮＡのコード配列発現を制御できる核酸配列を指す。一般にコード配列は、プロモーター配列の３’に位置する。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来してもよく、または自然界に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素から構成されてもよく、またはさらに合成核酸断片を含んでなってもよい。当業者は、異なる組織または細胞型中で、または異なる発達段階で、または異なる環境的または生理的条件に答えて、異なるプロモーターが、遺伝子発現を誘導してもよいことを理解する。ほとんどの場合にほとんどの細胞型で遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。他方、「誘導性プロモーター」は、プロモーター特異的シグナルまたは分子によってプロモーターが誘発または活性化される場合に、遺伝子を発現させる。ほとんどの場合、制御配列の正確な境界は完全に画定されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が、同一のプロモーター活性を有してもよいこともさらに認識される。例えばＦＢＡ１遺伝子のプロモーター領域に由来する断片を指すために、「ＦＢＡ１プロモーター」を使用し得るものと理解される。
【００８２】
「ターミネーター」という用語は、本明細書の用法では、コード配列下流に位置するＤＮＡ配列を指す。これは、ポリアデニル化認識配列と、ｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことができる調節シグナルをコードするその他の配列とを含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響を及ぼすことで特徴付けられる。３’領域は、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または翻訳に影響し得る。ほとんどの場合、制御配列の正確な境界は完全に画定されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のターミネーター活性を有してもよいことが認識される。例えばＣＹＣ１遺伝子のターミネーター領域に由来する断片を指すために、「ＣＹＣ１ターミネーター」を使用し得るものと理解される。
【００８３】
「作動的に結合する」という用語は、一方の機能が他方の機能によって影響される、単一核酸断片上の核酸配列のつながりを指す。例えばプロモーターは、コード配列の発現に影響できる場合、そのコード配列と作動的に結合する（すなわちコード配列がプロモーターの転写調節下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンスオリエンテーションで、制御配列に作動的に結合し得る。
【００８４】
「発現」と言う用語は、ここでの用法では、発明の核酸断片から誘導されるセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指してもよい。
【００８５】
本明細書で使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）（以下“Ｍａｎｉａｔｉｓ”）；およびＳｉｌｈａｖｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｉｌｈａｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８４）；およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７）によって記載される。
【００８６】
ブタノール生合成経路
炭水化利用微生物は、中心的な代謝経路として、Ｅｍｂｄｅｎ−Ｍｅｙｅｒｈｏｆ−パーナス（ＥＭＰ）経路、エントナー・ドウドロフ経路、およびペントースリン酸回路を用いて、成長および維持のためのエネルギーおよび細胞前駆体を供給する。これらの経路には、中間体グリセルアルデヒド−３−リン酸、そして究極的にはピルビン酸が、直接、またはＥＭＰ経路と組み合わされて生成されるという共通点がある。引き続いて、ピルビン酸は、多様な手段を通じて、アセチル補酵素Ａ（アセチルＣｏＡ）に変換される。アセチルＣｏＡは、例えば脂肪酸、アミノ酸および二次代謝産物を生成する上で、主要中間体の役割を果たす。糖のピルビン酸への変換の複合反応は、エネルギー（例えばアデノシン−５’−三リン酸、ＡＴＰ）と、還元等価物（例えば還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ＮＡＤＨ、および還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ＮＡＤＰＨ）を生成する。ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨは、それらの酸化形態（それぞれＮＡＤ＋およびＮＡＤＰ＋）に再循環されなくてはならない。無機電子受容体（例えばＯ２、ＮＯ３−およびＳＯ４２−）の存在下で、還元等価物が利用されて、エネルギープールが増強されてもよく；代案としては、還元炭素副産物が生成されてもよい。
【００８７】
本発明で使用してもよい発酵性炭素源からのブタノール異性体の生成のための改変生合成経路は、例えば参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，８５１，１８８号明細書および米国特許第７，９９３，８８９号明細書に記載される。一実施形態では、改変ブタノール生合成経路は、
ａ）例えばアセト乳酸シンターゼによって触媒されてもよい、ピルビン酸からアセト乳酸への；
ｂ）例えばアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼによって触媒されてもよい、アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への；
ｃ）例えばジヒドロキシ酸デヒドラターゼによって触媒されてもよい、２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸への；
ｄ）例えばα−ケト酸デカルボキシラーゼによって触媒されてもよい、α−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒドへの；および
ｅ）例えばアルコールデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの
基質から生成物への変換を含んでなる、イソブタノール生合成経路である。
【００８８】
別の実施形態では、イソブタノール生合成経路は、
ａ）例えばアセト乳酸シンターゼによって触媒されてもよい、ピルビン酸からアセト乳酸への；
ｂ）例えばアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼによって触媒されてもよい、アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への；
ｃ）例えばジヒドロキシ酸デヒドラターゼによって触媒されてもよい、２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸への；
ｄ）例えば分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、α−ケトイソ吉草酸からイソブチリルＣｏＡへの；
ｅ）例えばアシル化（ａｃｅｌｙｌａｔｉｎｇ）アルデヒドデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、イソブチリルＣｏＡからイソブチルアルデヒドへの；および
ｆ）例えばアルコールデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの
基質から生成物への変換を含んでなる。
【００８９】
使用されてもよい１−ブタノール生成のための改変生合成経路としては、参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００８０１８２３０８号明細書に記載されるものが挙げられる。一実施形態では、１−ブタノール生合成経路は、
ａ）例えばアセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼによって触媒されてもよい、アセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡへの；
ｂ）例えば３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、アセトアセチルＣｏＡから３−ヒドロキシブチリルＣｏＡへの；
ｃ）例えばクロトナーゼによって触媒されてもよい、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡからクロトニルＣｏＡへの；
ｄ）例えばブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、クロトニルＣｏＡからブチリルＣｏＡへの；
ｅ）例えばブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、ブチリルＣｏＡからブチルアルデヒドへの；および
ｆ）例えばブタノールデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、ブチルアルデヒドから１−ブタノールへの
基質から生成物への変換を含んでなる。
【００９０】
一実施形態では、本発明は、植物由来炭素源からブタノールを生成して、ブタノールを生成する標準石油化学プロセスに付随する、環境に対する悪影響を回避する。一実施形態では、本発明は、改変ブタノール生合成経路を含んでなる組換え工業宿主細胞を使用して、ブタノールを生成する方法を提供する。
【００９１】
いくつかの実施形態では、ブタノール生合成経路は、組換え宿主細胞に異種である、少なくとも１つのポリヌクレオチド、少なくとも２つのポリヌクレオチド、少なくとも３つのポリヌクレオチド、または少なくとも４つのポリヌクレオチドを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞中における、ブタノール生合成経路の各基質から生成物への変換は、異種ポリペプチドによって触媒される。実施形態では、アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への基質から生成物への変換を触媒するポリペプチド、および／またはイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドは、補助因子としてＮＡＤＨを利用できる。
【００９２】
いくつかの実施形態では、ブタノール産生菌の改変ブタノール経路は、以下の酵素番号を有する酵素群から選択されるポリペプチドの少なくとも１つを含んでなってもよい：ＥＣ  ２．２．１．６、ＥＣ  １．１．１．８６、ＥＣ  ４．２．１．９、ＥＣ  ４．１．１．７２、ＥＣ  １．１．１．１、ＥＣ  １．１．１．２６５、ＥＣ  １．１．１．２、ＥＣ  １．２．４．４、ＥＣ  １．３．９９．２、ＥＣ  １．２．１．１０、ＥＣ  ２．３．１．９、ＥＣ  ２．３．１．１６、ＥＣ  １．１．１．３５、ＥＣ  １．１．１．１５７、ＥＣ  １．１．１．３６、ＥＣ  ４．２．１．１７、ＥＣ  ４．２．１．５５、ＥＣ  １．３．１．４４、ＥＣ  １．３．１．３８、およびＥＣ  １．２．１．５７。
【００９３】
いくつかの実施形態では、ブタノール産生菌の改変ブタノール経路は、アセト乳酸シンターゼ、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ、分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ、分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼ、アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼ、分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ、ブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、ブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ブタノールデヒドロゲナーゼ、およびブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼの酵素群から選択される、少なくとも１つのポリペプチドを含んでなる。
【００９４】
「アセトヒドロキシ酸シンターゼ」、「アセト乳酸シンターゼ」、および「アセト乳酸シンセターゼ」（「ＡＬＳ」と略記される）という用語は、アセト乳酸シンターゼの生物学的機能を有するあらゆるポリペプチドを指すために、本明細書で同義的に使用される。このようなポリペプチドとしては、ピルビン酸からアセト乳酸およびＣＯ２への変換を触媒するポリペプチドが挙げられる。アセト乳酸シンターゼの例は、ＥＣ番号２．２．１．６で知られている（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  １９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）。これらの未修飾酵素は、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＢ１５６１８およびＺ９９１２２、それぞれＮＣＢＩ（国立バイオテクノロジー情報センター）アミノ酸配列、ＮＣＢＩヌクレオチド配列）、クレブシエラ・ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ２５０７９およびＭ７３８４２）、およびラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ２５１６１およびＬ１６９７５）をはじめとするが、これに限定されるものではない、いくつかの起源から入手できる。
【００９５】
「ケトール酸レダクトイソメラーゼ」（「ＫＡＲＩ」）、「アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ」、および「アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ」という用語は、同義的に使用されて、ケトール酸レダクトイソメラーゼの生物学的機能を有するあらゆるポリペプチドを指す。このようなポリペプチドとしては、（Ｓ）−アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への反応を触媒できる、ポリペプチドが挙げられる。例示的なＫＡＲＩ酵素は、ＥＣ番号ＥＣ  １．１．１．８６（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  １９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）に分類されてもよく、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（配列番号１）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿４１８２２２およびＮＣ＿０００９１３）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ  ｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿０１３４５９およびＮＣ＿００１１４４）、メタノコッカス・マリパルディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＦ３０２１０およびＢＸ９５７２２０）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）（配列番号２）、およびバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＢ１４７８９およびＺ９９１１８）をはじめとするが、これに限定されるものではない、無数の微生物から入手できる。ＫＡＲＩとしては、アナエロスティペス・カカエ（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｃａｃｃａｅ）ＫＡＲＩ変種「Ｋ９Ｇ９」（配列番号１３２）、「Ｋ９Ｄ３」（配列番号１３３）、「Ｋ９ＪＢＰ４Ｐ」（配列番号１３０）、および「Ｋ９ＳＢ２−ＳＨ」（配列番号１２６）が挙げられる。ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）酵素は、参照によって本明細書に援用する、米国特許７，９１０，３４２第号明細書および米国特許第８，１２９，１６２号明細書；米国特許出願公開第２０１００１９７５１９号明細書；および国際公開第２０１１／０４１４１５号パンフレットに記載される。その中で開示されるＫＡＲＩの例は、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）コレラ、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＰＡＯ１、およびシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＰＦ５変異体からのものである。いくつかの実施形態では、ＫＡＲＩは、補因子としてＮＡＤＨを利用する。いくつかの実施形態では、ＫＡＲＩは、補因子としてＮＡＤＰＨを利用する。参照によって本明細書に援用する、国際公開第２０１２／１２９５５５号パンフレットは、本発明で有用なＫＡＲＩ変異株をさらに記載する。
【００９６】
「アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ」および「ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ」（「ＤＨＡＤ」）という用語は、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼの生物学的機能を有するあらゆるポリペプチドを指す。このようなポリペプチドとしては、２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸への変換を触媒するポリペプチドが挙げられる。例示的なジヒドロキシ酸デヒドラターゼは、ＥＣ番号４．２．１．９で知られている。このような酵素は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＹＰ＿０２６２４８およびＮＣ＿０００９１３）、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿０１２５５０およびＮＣ＿００１１４２）、Ｍ．マリパルディス（Ｍ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＦ２９８７４およびＢＸ９５７２１９）、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＢ１４１０５およびＺ９９１１５）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）（配列番号３）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）（配列番号４）、およびアカパンカビ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）をはじめとするが、これに限定されるものではない、無数の微生物から入手できる。参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２０１０００８１１５４Ａ１号明細書および米国特許第７，９９３，８８９号明細書は、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）からのＤＨＡＤ（配列番号１３１）をはじめとする、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）を記載する。適切なＤＨＡＤとしてはまた、「Ｌ２Ｖ４」（配列番号１３４）などのストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）の変種も挙げられる。
【００９７】
「分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ」または「α−ケト酸デカルボキシラーゼ」または「α−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ」または「２−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ」（「ＫＩＶＤ」）という用語は、２−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼの生物学的機能を有するあらゆるポリペプチドを指す。このようなポリペプチドとしては、α−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒドおよびＣＯ２への変換を触媒するポリペプチドが挙げられる。例示的な分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼは、ＥＣ番号４．１．１．７２で知られており、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＳ４９１６６、ＡＹ５４８７６０、ＣＡＧ３４２２６、およびＡＪ７４６３６４）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿４６１３４６およびＮＣ＿００３１９７）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿１４９１８９およびＮＣ＿００１９８８）、マクロコッカス・カセオリティカス（Ｍａｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）（配列番号５）、およびリステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａｇｒａｙｉ）（配列番号６）をはじめとするが、これに限定されるものではない、いくつかの起源から入手できる。
【００９８】
「分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼ」または「アルコールデヒドロゲナーゼ」（「ＡＤＨ」）という用語は、アルコールデヒドロゲナーゼの生物学的機能を有する、あらゆるポリペプチドを指す。このようなポリペプチドとしては、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒するポリペプチドが挙げられる。例示的な分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼはＥＣ番号１．１．１．２６５で知られているが、その他のアルコールデヒドロゲナーゼ（具体的にはＥＣ  １．１．１．１または１．１．１．２）にもまた分類されてもよい。アルコールデヒドロゲナーゼは、補因子としてＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨを使用してもよい。このような酵素は、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿０１０６５６、ＮＣ＿００１１３６、ＮＰ＿０１４０５１、およびＮＣ＿００１１４５）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿４１７４８４およびＮＣ＿０００９１３）、Ｃ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿３４９８９２、ＮＣ＿００３０３０、ＮＰ＿３４９８９１、およびＮＣ＿００３０３０）、Ｂ．インディカ（Ｂ．ｉｎｄｉｃａ）（配列番号７）およびＡ．キシロソキシダンス（Ａ．ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）（配列番号８）をはじめとするが、これに限定されるものではない、いくつかの起源から入手できる。参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開２００９０２６９８２３Ａ１第号明細書は、アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）からのアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）であるＳａｄＢを記載する。アルコールデヒドロゲナーゼとしては、（参照によって本明細書に援用する米国特許出願公開第２０１１０２６９１９９号明細書に記載される）ウマ肝臓ＡＤＨおよびベイジェリンキア・インディカ（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｋｉａ  ｉｎｄｉｃａ）ＡＤＨもまた挙げられる。
【００９９】
「ブタノールデヒドロゲナーゼ」という用語は、ブタノールデヒドロゲナーゼの生物学的機能を有するあらゆるポリペプチドを指す。このようなポリペプチドとしては、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換、または２−ブタノンから２−ブタノールへの変換を触媒するポリペプチドが挙げられる。ブタノールデヒドロゲナーゼは、幅広いアルコールデヒドロゲナーゼファミリーのサブセットである。ブタノールデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ依存性であってもよい。ＮＡＤＨ依存性酵素はＥＣ  １．１．１．１として知られており、例えばロドコッカス・ルーバー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｕｂｅｒ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＤ３６４７５およびＡＪ４９１３０７）から入手できる。ＮＡＤＰＨ依存性酵素はＥＣ  １．１．１．２として知られており、例えばピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＣ２５５５６およびＡＦ０１３１６９）から入手できる。さらにブタノールデヒドロゲナーゼは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ４１７４８４およびＮＣ＿０００９１３）から入手でき、シクロヘキサノールデヒドロゲナーゼはアシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）種（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＧ１００２６およびＡＦ２８２２４０）から入手できる。「ブタノールデヒドロゲナーゼ」という用語は、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨのいずれかを補助因子として使用して、ブチルアルデヒドから１−ブタノールへの変換を触媒する酵素も指す。ブタノールデヒドロゲナーゼは、例えば、Ｃ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿１４９３２５およびＮＣ＿００１９８８（注記：この酵素は、アルデヒドおよびアルコールデヒドロゲナーゼ活性の双方を持つ）、ＮＰ＿３４９８９１、ＮＣ＿００３０３０、ＮＰ＿３４９８９２、およびＮＣ＿００３０３０）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿４１７４８４およびＮＣ＿０００９１３）から入手できる。
【０１００】
「分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ」という用語は、分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼの生物学的機能を有するあらゆるポリペプチドを指す。このようなポリペプチドとしては、典型的にＮＡＤ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を電子受容体として使用して、α−ケトイソ吉草酸からソブチリルＣｏＡ（イソブチリル補酵素Ａ）への変換を触媒するポリペプチドが挙げられる。例示的な分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．２．４．４で知られている。このような分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼは、４つのサブユニットを含んでなり、全てのサブユニットからの配列は、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＢ１４３３６、Ｚ９９１１６、ＣＡＢ１４３３５、Ｚ９９１１６、ＣＡＢ１４３３４、Ｚ９９１１６、ＣＡＢ１４３３７、およびＺ９９１１６）およびシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ６５６１４、Ｍ５７６１３、ＡＡＡ６５６１５、Ｍ５７６１３、ＡＡＡ６５６１７、Ｍ５７６１３、ＡＡＡ６５６１８、およびＭ５７６１３）をはじめとするが、これに限定されるものではない、無数の微生物から入手できる。
【０１０１】
「アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼ」という用語は、アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼの生物学的機能を有する、あらゆるポリペプチドを指す。このようなポリペプチドとしては、典型的にＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨのいずれかを電子供与体として使用して、イソブチリルＣｏＡからイソブチルアルデヒドへの変換を触媒するポリペプチドが挙げられる。例示的なアシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．２．１．１０および１．２．１．５７で知られている。このような酵素は、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＤ３１８４１およびＡＦ１５７３０６）、Ｃ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿１４９３２５、ＮＣ＿００１９８８、ＮＰ＿１４９１９９、およびＮＣ＿００１９８８）、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ８９１０６およびＵ１３２３２）、およびサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＹＰ＿１４５４８６およびＮＣ＿００６４６１）をはじめとするが、これに限定されるものではない、複数の起源から入手できる。
【０１０２】
「アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ」という用語は、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼの生物学的機能を有する、あらゆるポリペプチドを指す。このようなポリペプチドとしては、２分子のアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡおよび補酵素Ａ（ＣｏＡ）への変換を触媒するポリペプチドが挙げられる。例示的なアセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼは、短鎖アシルＣｏＡとアセチルＣｏＡに対する基質選択性（順方向での反応）がある、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼであり、Ｅ．Ｃ．２．３．１．９に分類される［Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  １９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ］；しかし基質範囲のより広い酵素（Ｅ．Ｃ．２．３．１．１６）も同様に機能性である。アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼは、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿４１６７２８およびＮＣ＿０００９１３）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿３４９４７６．１、ＮＣ＿００３０３０、ＮＰ＿１４９２４２、およびＮＣ＿００１９８８、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿３９０２９７およびＮＣ＿０００９６４）、およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿０１５２９７およびＮＣ＿００１１４８）などのいくつかの起源から入手できる。
【０１０３】
「３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ」という用語は、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼの生物学的機能を有するあらゆるポリペプチドを指す。このようなポリペプチドとしては、アセトアセチルＣｏＡから３−ヒドロキシブチリルＣｏＡへの変換を触媒するポリペプチドが挙げられる。例示的な３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（３−Ｅｘａｍｐｌｅ  ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌ−ＣｏＡ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ）は、還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）−依存性であってもよく、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡまたは（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡに対する基質選択性がある。例示的な酵素は、それぞれＥ．Ｃ．１．１．１．３５およびＥ．Ｃ．１．１．１．３０に分類されてもよい。さらに、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼは、還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）依存性であってもよく、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡまたは（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡに対する基質選択性があり、それぞれＥ．Ｃ．１．１．１．１５７およびＥ．Ｃ．１．１．１．３６に分類される。３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼは、例えば、Ｃ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿３４９３１４およびＮＣ＿００３０３０）、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＢ０９６１４およびＵ２９０８４）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＹＰ＿２９４４８１およびＮＣ＿００７３４７）、およびアルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ２１９７３およびＪ０４９８７）などのいくつかの起源から入手できる。
【０１０４】
「クロトナーゼ」という用語は、クロトナーゼの生物学的機能を有するあらゆるポリペプチドを指す。このようなポリペプチドとしては、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡからクロトニルＣｏＡおよびＨ２Ｏへの変換を触媒するポリペプチドが挙げられる。例示的なクロトナーゼは、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡまたは（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡに対する基質選択性を有してもよく、それぞれＥ．Ｃ．４．２．１．１７およびＥ．Ｃ．４．２．１．５５に分類されてもよい。クロトナーゼは、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿４１５９１１およびＮＣ＿０００９１３）、Ｃ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿３４９３１８およびＮＣ＿００３０３０）、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＢ１３７０５およびＺ９９１１３）、およびアエロモナス・カビアエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＢＡＡ２１８１６およびＤ８８８２５）などのいくつかの起源から入手できる。
【０１０５】
「ブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ」という用語はブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼの生物学的機能を有するあらゆるポリペプチドを指す。このようなポリペプチドとしては、クロトニルＣｏＡからブチリルＣｏＡへの変換を触媒するポリペプチドが挙げられる。例示的なブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤＨ依存性、ＮＡＤＰＨ依存性、またはフラビン依存性であってもよく、それぞれＥ．Ｃ．１．３．１．４４、Ｅ．Ｃ．１．３．１．３８、およびＥ．Ｃ．１．３．９９．２に分類されてもよい。ブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼは、例えば、Ｃ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿３４７１０２およびＮＣ＿００３０３０）、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：Ｑ５ＥＵ９０およびＡＹ７４１５８２）、ストレプトミセス・コリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｌｌｉｎｕｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ９２８９０およびＵ３７１３５）、およびストレプトミセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＡ２２７２１およびＡＬ９３９１２７）などのいくつかの起源から入手できる。
【０１０６】
「ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ」という用語はブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼの生物学的機能を有する、あらゆるポリペプチドを指す。このようなポリペプチドとしては、補助因子としてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを使用して、ブチリルＣｏＡからブチルアルデヒドの変換を触媒するポリペプチドが挙げられる。ＮＡＤＨに対する選択性があるブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼは、Ｅ．Ｃ．１．２．１．５７として知られており、例えば、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＤ３１８４１およびＡＦ１５７３０６）、およびＣ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿１４９３２５およびＮＣ＿００１９８８）から入手できる。
【０１０７】
宿主細胞
ブタノール生成のための宿主細胞は、細菌および酵母から選択されてもよい。実施形態では、適切な宿主細胞としては、遺伝子修飾および組換え遺伝子発現に有用なあらゆる細菌または酵母細胞が挙げられる。適切な微生物宿主の選択基準としては、生成するブタノール異性体に対する内在性の耐性、高速なグルコース利用、遺伝子操作のための遺伝子ツール可用性、および安定した染色体変化を生じる能力が挙げられる。
【０１０８】
宿主を遺伝的に改変する能力は、あらゆる組換え微生物の生成に必須である。遺伝子移入技術の様式は、電気穿孔、接合、形質導入または自然形質転換であってもよい。広範な宿主接合性プラスミド、および薬物耐性マーカーが入手できる。クローニングベクターは、宿主中で機能し得る抗生物質耐性マーカーの性質に基づいて、宿主生物に合わせて調整される。
【０１０９】
微生物宿主はまた、炭素流動の競合経路を不活性化するために、様々な遺伝子を欠失させることで操作しなくてはならない。これは、不活性化を誘導するトランスポゾン、または染色体への組み込みベクターのどちらかの可用性を要求する。さらに産生宿主は、内在性ブタノール耐性を改善する変異が得られてもよいように、化学変異誘発に適するべきである。
【０１１０】
ブタノール異性体生成のために使用される微生物宿主細胞は、ブタノール異性体の収率が、ブタノール異性体の毒性によって制限されないように、好ましくは生成されるブタノール異性体に耐性がある。一実施形態では、イソブタノール生成のために使用される宿主は、イソブタノール耐性である。イソブタノール耐性がある適切な宿主株は、（参照によって本明細書に援用する）米国特許第７，９９３，８８９号明細書に記載されるように、株の固有の耐性に基づくスクリーニング法によって、同定されてもよい。
【０１１１】
イソブタノール生成のための微生物宿主はまた、単糖類、オリゴ糖類、および多糖類をはじめとする、炭水化物を高速に利用すべきである。大部分の微生物は、炭水化物を利用できる。しかし特定の環境微生物は、炭水化物を高い効率で利用し得ず、したがって適切な宿主ではない。
【０１１２】
上述の基準に基づいて、ブタノール生成のための適切な微生物宿主としては、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、乳酸桿菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、腸球菌属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、分裂酵母属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、クリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、およびサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のメンバーが挙げられるが、これに限定されるものではない。好ましい宿主としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、パエニバチルス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆ  ａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ガリナラム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クリベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クリベロミセス・サーモトレランス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）クリベロミセス・マルキシアナス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ），カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げら��る。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母は当該技術分野で公知であり、米国微生物系統保存機関（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）；オランダ微生物株保存センター（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）（ＣＢＳ）Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ；ＬｅＳａｆｆｒｅ；Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ＡＢ；Ｆｅｒｍ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ；Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ；Ｍａｒｔｒｅｘ；およびＬａｌｌｅｍａｎｄをはじめとするが、これに限定されるものではない、多様な供給元から入手できる。Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）としては、ＢＹ４７４１、ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ、エタノールＲｅｄ（登録商標）酵母、Ｆｅｒｍ  Ｐｒｏ（商標）酵母、Ｂｉｏ−Ｆｅｒｍ（登録商標）ＸＲ酵母、Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｐｒｅｓｔｉｇｅ  Ｂａｔｃｈ  Ｔｕｒｂｏアルコール酵母、Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ  Ｔｕｒｂｏ酵母、ＦｅｒＭａｘ（商標）Ｇｒｅｅｎ酵母、ＦｅｒＭａｘ（商標）Ｇｏｌｄ酵母、Ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃ（登録商標）酵母、ＢＧ−１、ＰＥ−２、ＣＡＴ−１、ＣＢＳ７９５９、ＣＢＳ７９６０、およびＣＢＳ７９６１が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１１３】
ブタノール生成のための宿主細胞
発酵性炭素基質のブタノール異性体への変換のための酵素経路をコードするのに必要な遺伝子を含有する組換え微生物は、当該技術分野で周知の技術を使用して構築してもよい。本発明では、例えば、アセト乳酸シンターゼ、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ、分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ、および分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼなどのブタノール生合成経路の１つの酵素をコードする遺伝子は、例えば米国特許第７，９９３，８８９号明細書に記載されるように、様々な起源から単離されてもよい。
【０１１４】
ひとたび妥当な経路遺伝子が同定され単離されたら、例えば米国特許第７，９９３，８８９号明細書に記載されるようにして、ブタノール生合成経路の妥当な酵素を宿主細胞に導入し、または操作して、ブタノール産生菌を作成してもよい。作成されたブタノール産生菌は、改変ブタノール生合成経路を含んでなる。いくつかの実施形態では、ブタノール産生菌は、改変イソブタノール生合成経路を含んでなるイソブタノール産生菌である。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、ブタノール産生菌は酵母である。いくつかの実施形態では、ブタノール産生菌は細菌である。いくつかの実施形態では、ブタノール産生菌はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、改変ブタノール産生菌は、ＥＣ  ２．２．１．６、ＥＣ  １．１．１．８６、ＥＣ  ４．２．１．９、ＥＣ  ４．１．１．７２、ＥＣ  １．１．１．１、ＥＣ  １．１．１．２６５、ＥＣ  １．１．１．２、ＥＣ  １．２．４．４、ＥＣ  １．３．９９．２、ＥＣ  １．２．１．１０、ＥＣ  ２．３．１．９、ＥＣ  ２．３．１．１６、ＥＣ  １．１．１．３５、ＥＣ  １．１．１．１５７、ＥＣ  １．１．１．３６、ＥＣ  ４．２．１．１７、ＥＣ  ４．２．１．５５、ＥＣ  １．３．１．４４、ＥＣ  １．３．１．３８、およびＥＣ  １．２．１．５７の酵素番号を有する一群の酵素から選択される、１つまたは複数のポリペプチドを含有する。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、改変イソブタノール産生菌は、アセト乳酸シンターゼ、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ、分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ、分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼ、アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼ、分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ、ブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、ブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ブタノールデヒドロゲナーゼ、およびブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼから選択される、１つまたは複数のポリペプチドを含有する。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、通常はミトコンドリアに局在化するブタノール生合成経路の酵素が、ミトコンドリアに局在化しない。いくつかの実施形態では、改変ブタノール生合成経路の酵素は細胞質ゾルに局在化する。いくつかの実施形態では、ミトコンドリア標的配列を除去することで、生合成経路の酵素が細胞質ゾルに局在化する。いくつかの実施形態では、ミトコンドリア標的化は、例えば参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，９９３，８８９号明細書に記載されるようにして、新しい開始コドンを作成することで排除される。いくつかの実施形態では、細胞質ゾルに局在化する生合成経路の酵素はＤＨＡＤである。いくつかの実施形態では、細胞質ゾルに局在化する生合成経路の酵素はＫＡＲＩである。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、改変ブタノール生合成経路の酵素は、補因子としてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを使用してもよく、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨは電子供与体として機能する。いくつかの実施形態では、ブタノール生合成経路の１つまたは複数の酵素は、電子供与体としてＮＡＤＨを利用する。いくつかの実施形態では、ブタノール生合成経路の１つまたは複数の酵素は、電子供与体としてＮＡＤＰＨを利用する。
【０１２０】
ブタノール産生菌の追加的な修飾
本明細書で提供されるブタノール産生菌は、１つまたは複数の追加的な修飾をさらに含んでなってもよい。例えばこのような修飾としては、改変ブタノール生合成経路を通じたブタノール異性体の発酵生産における、副産物生成に関与する遺伝子活性の妨害が挙げられる。ブタノール異性体の発酵生産における、副産物の生成に関与する遺伝子活性の妨害は、炭素流動の競合経路からの収率損失を低下させて、ブタノール生成を増大させる。いくつかの実施形態では、このような修飾としては、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼまたは双方の活性の妨害が挙げられる。
【０１２１】
「ピルビン酸デカルボキシラーゼ」という用語は、ピルビン酸デカルボキシラーゼの生物学的機能を有するあらゆるポリペプチドを指す。このようなポリペプチドとしては、ピルビン酸からアセトアルデヒドおよび二酸化炭素への脱炭酸を触媒するポリペプチドが挙げられる。ピルビン酸デカルボキシラーゼは、ＥＣ番号４．１．１．１で知られている。このようなポリペプチドは、当該技術分野で周知であり、国際公開第２０１２／１２９５５５号パンフレットで開示される方法によって判定され得る。これらの酵素は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）をはじめとするいくつかの酵母に見られる（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＡ９７５７５、ＣＡＡ９７７０５、およびＣＡＡ９７０９１）。ＰＤＣの追加的な例は、参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００９０３５３６３号明細書に提供される。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるブタノール産生菌は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内在性ポリヌクレオチドおよび／または遺伝子の、および／またはピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する内在性ポリペプチドの、修飾または中断を含んでなり得る。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるブタノール産生菌は、ＰＤＣ活性を有するポリペプチドをコードする、内在性ポリヌクレオチドまたは遺伝子の、またはＰＤＣ活性を有する内在性ポリペプチドの、欠失、変異、および／または置換を含んでなり得る。このような修飾、破壊、欠失、変異、および／または置換は、ＰＤＣ活性の低下または排除をもたらし得て、例えばＰＤＣノックアウト（ＰＤＣ−ＫＯ）表現型がもたらされる。
【０１２３】
酵母中の内在性ピルビン酸デカルボキシラーゼは、ピルビン酸をアセトアルデヒドに変換し、次にそれは酢酸を介して、エタノールまたはアセチルＣｏＡに変換される。酵母は、ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子を有してもよい。例えば、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、およびクリベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）には、ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする１つの遺伝子がある一方で、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）には、ＰＤＣ１、ＰＣＤ５および／またはＰＤＣ６遺伝子によってコードされるピルビン酸デカルボキシラーゼの３つのイソ酵素がある。いくつかの実施形態では、本発明の酵母細胞中で、少なくとも１つのＰＤＣ遺伝子が不活性化される。使用される酵母細胞が、２つ以上の発現される（活性）ＰＤＣ遺伝子を有する場合、活性ＰＤＣ遺伝子のそれぞれは修飾または不活性化され、それによってｐｄｃ細胞を生じさせてもよい。例えばＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中では、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、およびＰＤＣ６遺伝子が修飾または不活性化されてもよい。使用される発酵条件下で、ＰＤＣ遺伝子が活性でない場合、このような遺伝子を修飾または不活性化する必要はない。いくつかの実施形態では、欠失されまたは下方制御されるピルビン酸デカルボキシラーゼは、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、ＰＤＣ６、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。（参照によって本明細書に援用する）米国特許出願公開第２００９０３０５３６３号明細書および国際公開第２０１２／１２９５５５号パンフレットは、内在性ピルビン酸デカルボキシラーゼの改変をさらに記載し、参照によって本明細書に援用される。（参照によって本明細書に援用する）米国特許出願公開第２００９０３０５３６３号明細書は、細胞質ゾル局在化アセト乳酸シンターゼの発現と、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の実質的排除とのために、酵母を遺伝子操作することで増大させた、ピルビン酸からアセト乳酸への変換を開示する。酵素活性が低下している酵母は、様々な方法を使用して同定し得る。例えばガスクロマトグラフィーによるエタノール生成の測定をはじめとする一般的な方法を使用して、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性が低下している酵母を同定し得る。
【０１２４】
ピルビン酸デカルボキシラーゼと、少なくとも約７０〜７５％、少なくとも約７５〜８５％、少なくとも約８０〜８５％、少なくとも約８５％〜９０％、少なくとも約９０％〜９５％、または少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するピルビン酸デカルボキシラーゼタンパク質をコードするものなどのその他の標的遺伝子は、当業者に周知の文献およびバイオインフォマティクスデータベース中で同定されてもよい。ピルビン酸デカルボキシラーゼが修飾または欠失されているブタノール産生菌を同定する方法と並んで、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を妨害する方法は、米国特許出願公開第２００９０３０５３６３号明細書および国際公開第２０１２／１２９５５５号パンフレットに詳述される。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、ブタノール産生菌は、米国特許出願公開第２００９０３０５３６３号明細書および国際公開第２０１２／１２９５５５号パンフレットに記載されるような、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を低下させる修飾、および／またはＰＤＣ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子の中断、またはＰＤＣ遺伝子発現を制御する調節因子をコードする少なくとも１つの遺伝子の中断と、（参照によって本明細書に援用する）米国特許出願公開第２０１００１２０１０５号明細書に記載されるような、エントナー・ドウドロフ経路を通過する炭素流の増大、または還元等価物の均衡を提供する改変とを含んでなる。グルコース抑制が低下した場合に、成長および生成物収率が改善される、不活性化内在性ＰＤＣ遺伝子および改変生合成経路とがある酵母細胞は、参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２０１１０１２４０６０号明細書に記載される。
【０１２６】
「アルデヒドデヒドロゲナーゼ」という用語は、アルデヒドデヒドロゲナーゼの生物学的機能を有するあらゆるポリペプチドを指す。このようなポリペプチドとしては、アルデヒドの酸化（脱水素化）を触媒するポリペプチドが挙げられる（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：８２２−３０，１９９８；Ｎａｖａｒｒｏ−Ａｖｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ  １５：８２９−４２，１９９９；およびＳａｉｎｔ−Ｐｒｉｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５０：２２０９−２０，２００４）。このようなポリペプチドとしては、イソブチルアルデヒドからイソ酪酸への変換を触媒するポリペプチドが挙げられる。このようなポリペプチドとしてはまた、ＥＣ番号１．２．１．３、ＥＣ１．２．１．４または１．２．１．５に相当するポリペプチドも挙げられる。このようなポリペプチドは、当該技術分野で周知であり、国際公開第２０１２／１２９５５５号パンフレットで開示される方法によって判定され得る。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、ブタノール産生菌は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤ）および／またはアルデヒドオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、内在性ポリヌクレオチドまたは遺伝子中の欠失、変異および／または置換、あるいはアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性および／またはアルデヒドオキシダーゼ活性を有する内在性ポリペプチド中の欠失、変異および／または置換を含んでなり得る。いくつかの実施形態では、本発明の組換え宿主細胞はＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であり得て、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、ＡＬＤ２、ＡＬＤ３、ＡＬＤ４、ＡＬＤ５、ＡＬＤ６、またはそれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、クリベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）であり得て、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、ＫＬＬＡ０Ｆ００４４０、ＫＬＬＡ０Ｅ２３０５７、ＫＬＬＡ０Ｄ１００２１、ＫＬＬＡ０Ｄ０９９９９Ｇ、またはそれらの組み合わせであり得る。別の実施形態では、組換え宿主細胞は、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）であり得て、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、ＡＬＤ２、ＡＬＤ３、ＡＬＤ４、ＡＬＤ５、ＡＬＤ７、またはそれらの組み合わせであり得る。別の実施形態では、組換え宿主細胞は、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）であり得て、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、ＡｌｄＨであり得る。別の実施形態では、組換え宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり得て、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、ａｌｄＡ、ａｌｄＢ、ａｌｄＨ、またはそれらの組み合わせであり得る。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中のＡＬＤ６またはその相同体である。このような修飾、破壊、欠失、変異、および／または置換は、ＡＬＤ活性の低下または排除をもたらし得て、例えばＡＬＤ６ノックアウト（ＡＬＤ６−ＫＯ）表現型がもたらされる。組換え宿主細胞中で、修飾または不活性化の標的になり得るアルデヒドデヒドロゲナーゼポリヌクレオチド、遺伝子、およびポリペプチドの例は、国際公開第２０１２／１２９５５５号パンフレットでさらに詳細に提供される。
【０１２９】
特定のアルデヒドデヒドロゲナーゼの妨害は、例えばアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の内部および外部のプライマーを使用するＰＣＲスクリーニングによって、またはアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子配列に対してデザインされたプローブを使用するサザンブロット法によって確認し得る。代案としては、ガスクロマトグラフィー質量分光分析または液体クロマトグラフィーを利用して、イソブチルアルデヒドに曝露させた株をイソ酪酸生成の低下について、スクリーニングし得る。例えば、イソ酪酸生成が低下した株をスクリーニングする方法は、ａ）アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの修飾、および／またはアルデヒドオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの修飾を含んでなる株を提供するステップと；ｂ）細胞をイソブチルアルデヒドに接触させるステップと；ｃ）イソ酪酸生成を測定するステップとを含んでなり得る。イソ酪酸生成は、修飾のない対照株と比較して低下する。いくつかの実施形態では、測定は、ガスクロマトグラフィー質量分光分析を使用して実施される。アルデヒドデヒドロゲナーゼのポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドを欠失、変異および／または置換させる方法、およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の妨害を同定する方法は、例えば国際公開第２０１２／１２９５５５号パンフレットで詳述される。
【０１３０】
アルデヒドデヒドロゲナーゼと、少なくとも約７０〜７５％、少なくとも約７５〜８５％、少なくとも約８０〜８５％、少なくとも約８５％〜９０％、少なくとも約９０％〜９５％、または少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアルデヒドデヒドロゲナーゼタンパク質をコードするものなどのその他の標的遺伝子は、当業者に周知の文献およびバイオインフォマティクスデータベース中で同定されてもよい。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるブタノール産生菌は、国際公開第２０１２／１２９５５５号パンフレットに記載されるように、アルデヒドデヒドロゲナーゼおよび／またはアルデヒドオキシダーゼ活性の低下または排除を含んでなり得る。いくつかの実施形態では、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の低下または排除があるブタノール産生菌は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の低下または排除を含まないブタノール産生菌によって産生される同一異性体の収率または量よりも、高い収率または量で、改変生合成経路によってブタノール異性体を産生し得る。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるブタノール産生菌は、ブタノール異性体の発酵生産における、副産物の生成経路に関与するポリペプチドをコードする内在性ポリヌクレオチドまたは遺伝子に、欠失、変異、および／または置換を含んでなり得る。いくつかの実施形態では、ブタノール産生菌は、ブタノール異性体の発酵生産における副産物の生成経路に関与する内在性ポリペプチドに、１つまたは複数の欠失、変異、および／または置換を含んでなり得る。いくつかの実施形態では、これらの修飾は、ＦＲＡ２（鉄リプレッサータンパク質）、ＣＣＣ１（推定上の空胞Ｆｅ２＋／Ｍｎ２＋輸送体）またはＧＰＤ２（グリセロール−２−リン酸デヒドロゲナーゼ）をコードする遺伝子またはポリヌクレオチド、あるいはＦＲＡ２、ＣＣＣ１またはＧＰＤ２活性、またはそれらの組み合わせを有するポリペプチドにある。
【０１３３】
別の実施形態では、修飾としては、ピルビン酸利用生合成経路の一段階を触媒するポリペプチドをコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチドの組み込みが挙げられる。その他の修飾としては、アセト乳酸還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする内在性ポリヌクレオチド中の少なくとも１つの欠失、変異、および／または置換が挙げられる。実施形態では、アセト乳酸還元酵素活性を有するポリペプチドは、サッカロミセス・セレビシエのＹＭＲ２２６Ｃまたはその相同体である。
【０１３４】
実施形態では、宿主細胞は、国際公開第２０１１／１５９８５３号パンフレットに記載されるように、例えば配列番号２６２および２６３によってコードされるものなどの、ホスホケトラーゼ活性があるポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチド、および／またはホスホトランスアセチラーゼ活性があるポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含んでなり得る。その中で記載されるように、そのように改変されたＰＤＣ−ＫＯ細胞は、ＰＤＣ−ＫＯ細胞と比較して、それらの成長のための外来性二炭素基質補給に対する要求の低下または排除を示す。したがって、そして実施例で実証されるように、本明細書で提供される方法は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）活性を低下させるかまたは排除するように改変されて、成長のための外来性二炭素基質補給に対する要求の低下または排除を含んでなる組換え宿主細胞に、利点を提供する。
【０１３５】
発酵培地
本発明の発酵培地は、適切な発酵性炭素基質を含まなくてはならない。適切な発酵性炭素基質としては、グルコース、フルクトース、キシロース、またはアラビノースなどの単糖類；乳糖、マルトース、ガラクトース、またはスクロースなどのオリゴ糖類；デンプンまたはセルロースなどの多糖類；またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。適切な発酵性炭素基質としては、乳清透過液、コーンスティープリーカー、甜菜糖蜜、および大麦麦芽などの再生可能原料からの未精製混合物が挙げられる。さらに発酵性炭素基質は、主要生化学的中間体への代謝的変換が実証されている、二酸化炭素、またはメタノールなどの一炭素基質であってもよい。発酵性一炭素基質および二炭素基質に加えて、メチロトローフ生物は、代謝活性のために、メチルアミン、グルコサミン、および多様なアミノ酸などの、いくつかのその他の炭素含有化合物を利用することもまた知られている。例えばメチロトローフ酵母は、メチルアミンからの炭素を利用して、トレハロースまたはグリセロールを生成することが知られている（Ｂｅｌｌｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｃ１  Ｃｏｍｐｄ．，［Ｉｎｔ．  Ｓｙｍｐ．］，７ｔｈ  ｅｄ．，４１５−３２．Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｍｕｒｒｅｌｌ，Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎ；Ｋｅｌｌｙ，Ｄｏｎ  Ｐ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＵＫ（１９９３））。同様に、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）の様々な種が、アラニンまたはオレイン酸を代謝する（Ｓｕｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１５３：４８５−４８９（１９９０））。したがって本発明で用いられる炭素源は、多種多様な炭素含有基質を包含してもよく、生物体の選択によってのみ制限されることが考察される。その他の炭素基質としては、エタノール、乳酸、コハク酸、またはグリセロールが挙げられる。
【０１３６】
前述の発酵性炭素基質およびそれらの混合物の全てが、本発明に適することが意図されるが、好ましい発酵性炭素基質は、グルコース、フルクトース、およびスクロース、またはこれらと、キシロースおよびアラビノースなどのＣ５糖類との混合物である。スクロースは、サトウキビ、甜菜、キャッサバ、サトウモロコシ、およびそれらの混合物などの再生可能な糖原料に由来してもよい。グルコースおよびデキストロースは、コーン、小麦、ライ麦、大麦、オート麦、およびそれらの混合物などの穀物をはじめとする、デンプンベースの原材料の糖化を通じて、再生可能な穀物原料から得られてもよい。さらに例えば参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，９３２，０６３号明細書に記載されるように、発酵性糖類は、前処理および糖化工程を通じて、再生可能なセルロース系またはリグノセルロース系バイオマスから誘導されてもよい。バイオマスとしては、セルロースを含んでなり、任意選択的にヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖類および／または単糖類をさらに含んでなる、材料が挙げられる。バイオマスはまた、タンパク質および／または脂質などの追加的な成分を含んでなってもよい。バイオマスは単一起源に由来してもよく、またはバイオマスは２つ以上の起源に由来する混合物を含んでなり得て；例えばバイオマスは、トウモロコシ穂軸とトウモロコシ茎葉の混合物、または草と葉の混合物を含んでなってもよい。バイオマスとしては、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固形廃棄物、産業固形廃棄物、製紙業汚泥、庭ごみ、木材および林業廃棄物が挙げられるが、これに限定されるものではない。バイオマスの例としては、トウモロコシ穀粒、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ苞葉などの作物残渣、トウモロコシ茎葉、草本、小麦、麦藁、大麦、大麦藁、乾草、稲藁、スイッチグラス、古紙、糖サトウキビバガス、モロコシ、大豆、穀物製粉から得られる成分、樹木、枝、根、葉、木片、おがくず、灌木および低木、野菜、果物、花卉、家畜糞尿、およびそれらの混合物が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、発酵性炭素基質はトウモロコシに由来するグルコースである。いくつかの実施形態では、発酵性炭素基質は小麦に由来するグルコースである。いくつかの実施形態では、発酵性炭素基質はサトウキビに由来するスクロースである。いくつかの実施形態では、発酵性炭素基質はキシロースである。
【０１３８】
適切な炭素源に加えて、発酵培地は、適切なミネラル、塩、補助因子、緩衝液、およびイソブタノール生成に必要である培養物の成長と酵素経路の促進とに適する、当業者に知られているその他の構成要素を含有しなくてはならない。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、本発明の発酵培地は、補給剤として、組換え宿主細胞の成長に十分な量で、発酵培地に添加される、外来性Ｃ２源としての酢酸を含有する。いくつかの実施形態では、酢酸は、ブタノール生成を改善するのに十分な量で、発酵培地に添加される。いくつかの実施形態では、酢酸は、約０．１ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲で発酵培地に添加される。いくつかの実施形態では、発酵培地に添加される酢酸は、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．４ｍＭ、０．５ｍＭ、０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２．０ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭまたは５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、発酵培地中の糖とＣ２補給剤の比率は、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５または７０：３０である。いくつかの実施形態では、酢酸は、成長期、生産期、またはその双方において添加される。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、発酵培地は、ブタノールをさらに含有してもよい。いくつかの実施形態では、ブタノールは約０．０１ｍＭ〜約５００ｍＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ブタノールは、０．０１ｍＭ、１．０ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭ、１００ｍＭ、１１０ｍＭ、１２０ｍＭ、１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、１５０ｍＭ、１６０ｍＭ、１７０ｍＭ、１８０ｍＭ、１９０ｍＭ、２００ｍＭ、２１０ｍＭ、２２０ｍＭ、２３０ｍＭ、２４０ｍＭ、２５０ｍＭ、２６０ｍＭ、２７０ｍＭ、２８０ｍＭ、２９０ｍＭ、３００ｍＭ、３１０ｍＭ、３２０ｍＭ、３３０ｍＭ、３４０ｍＭ、３５０ｍＭ、３６０ｍＭ、３７０ｍＭ、３８０ｍＭ、３９０ｍＭ、４００ｍＭ、４１０ｍＭ、４２０ｍＭ、４３０ｍＭ、４４０ｍＭ、４５０ｍＭ、４６０ｍＭ、４７０ｍＭ、４８０ｍＭ、４９０ｍＭまたは５００ｍＭである。いくつかの実施形態では、ブタノールは、ブタノールの理論的収率の約０．０１％〜約１００％で、発酵培地中にで存在する。いくつかの実施形態では、発酵培地中に存在するブタノールは、ブタノールの理論的収率の０．０１％、０．５％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％である。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、改善されたブタノール生成は、収率、有効速度、有効力価、または比生産性の増大として現れる。実施形態では、収率、有効速度、有効力価、または比生産性の少なくとも１つが、少なくとも約３％、少なくとも約５％、または少なくとも約１０％増大する。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、改善されたブタノール生成は、副産物収率の低下として現れる。実施形態では、副産物収率が、少なくとも約３％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約７０％低下する。実施形態では、副産物はイソ酪酸である。
【０１４３】
発酵条件
典型的に細胞は、適切な培地中で約２０℃〜約４０℃の範囲の温度で成長させる。いくつかの実施形態では、細胞は、２０℃、２２℃、２５℃、２７℃、３０℃、３２℃、３５°Ｃ、３７℃または４０℃の温度で培養される。本発明の適切な成長培地としては、ルリア・ベルターニ（ＬＢ）ブロス、サブローデキストロース（ＳＤ）ブロス、酵母培地（ＹＭ）ブロス、または酵母窒素原礎培地と硫酸アンモニウムと（炭素／エネルギー源として）デキストロースとを含むブロス、または最大量のサッカロをミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株を培養するための最適比率のペプトンと酵母抽出物とデキストロースとの配合物であるＹＰＤ培地などの、一般的な商業的に調製された培地が挙げられる。その他の規定培地または合成増殖培地もまた使用してよく、特定の微生物の成長に適した培地は、微生物学または発酵化学当業者に知られている。例えば環状アデノシン２’：３’−一リン酸など、異化代謝産物抑制を直接または間接的に調節することが知られている作用薬の使用もまた、反応培地中に組み込まれてもよい。
【０１４４】
発酵のための適切なｐＨ範囲は、約ｐＨ３．０〜約ｐＨ９．０である。一実施形態では、約ｐＨ４．０〜約ｐＨ８．０が、初期条件のために使用される。別の実施形態では、約ｐＨ３．５〜約ｐＨ９．０が、初期条件のために使用される。一実施形態では、約ｐＨ４．５〜約ｐＨ６．５が、初期条件のために使用される。一実施形態では、約ｐＨ５．０〜約ｐＨ８．０が、初期条件のために使用される。酵母の発酵のための適切なｐＨ範囲は、典型的に約ｐＨ３．０〜約ｐＨ９．０である。その他の微生物の発酵のための適切なｐＨ範囲は、典型的に約ｐＨ３．０〜約ｐＨ７．５である。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、発酵培地と組換え微生物の接触は、嫌気的または微好気的条件下で実施される。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、高度成長対数期、中程度から静止遅滞期、定常期、定常成長期、およびそれらの組み合わせの成長期の１つまたは複数でブタノールが生成される。
【０１４７】
工業的バッチおよび連続発酵
いくつかの実施形態では、ブタノール異性体は、バッチまたは継続発酵を使用して生成されてもよい。イソブタノールなどのブタノール異性体は、バッチ発酵法を使用して生成されてもよい。古典的なバッチ発酵は閉鎖システムであり、そこでは培養液の組成が発酵の初めに設定され、発酵プロセス中に人為的に変更されない。したがって発酵プロセス開始時に培養液に所望の生物体または生物体群を接種して、システムには何も添加せずに発酵を生じさせる。しかし典型的には「バッチ」発酵は、炭素源の添加に関してバッチであり、ｐＨおよび酸素濃度などの因子の調節が試みられることが多い。バッチシステムでは、システムの代謝産物および生物体量組成は、発酵を停止させる時点まで常に変化する。バッチ培養内では、細胞は、静的な遅滞期から高い対数増殖期へ、そして最後に、増殖速度が減退または停止する静止期へと減速する。処置を施さない場合、静止期にある細胞はやがて死滅する。一般に対数期にある細胞が、最終生成物または中間体産生の大部分を担う。
【０１４８】
標準バッチ系の変法が、流加系である。流加発酵工程もまた本発明で使用するのに適し、発酵が進行するにつれて、基質が徐々に添加されることを除いては、典型的なバッチ系を構成する。流加バッチ系は、異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向があって、培地中に限定量の基質を有することが望ましい場合に、有用である。流加バッチ系の実際の基質濃度の測定は困難であるので、ｐＨ、溶存酸素、およびＣＯ２のような排ガスの分圧などの測定可能な要素の変化に基づいて推定される。バッチおよび流加発酵は一般的で、当該技術分野で周知であり、例は参照によって本明細書に援用する、Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ．（１９８９）（“Ｂｒｏｃｋ”）、またはＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６：２２７，（１９９２）にある。
【０１４９】
イソブタノールなどのブタノール異性体はまた、連続発酵法を使用して生成されてもよい。連続発酵は、バイオリアクターに規定発酵培地が継続的に添加される開放系であり、同時に等量の熟成培地が、処理のために取り出される。連続発酵は、一般に、細胞が主に対数成長期にある一定の高密度に培養を維持する。連続発酵は、細胞成長または最終生成物濃度に影響を及ぼす、１つの要素またはいくつもの要素の調節を可能にする。例えば１つの方法は、炭素源または窒素のレベルなどの制限的栄養物質を定率に保ち、全てのその他のパラメータを加減する。その他の系では、培地濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、増殖に影響を及ぼすいくつかの要素を継続的に変更し得る。連続システムは定常状態生育条件を維持することを目指すので、培地が抜き取られることによる細胞損失は、発酵中の細胞成長速度と均衡を保たなくてはならない。連続発酵工程のために栄養素と増殖因子を調節する方法、ならびに産物生成速度を最大化する技術は、工業微生物学の技術分野で周知であり、多様な方法が前出のＢｒｏｃｋに詳述される。
【０１５０】
イソブタノールをはじめとするブタノールの生産は、バッチ、流加、または連続工程を使用して実施してもよく、あらゆる既知の発酵様式が適切であることが意図される。さらに細胞をホールセル触媒として基質上に固定化し、イソブタノール生産のための発酵条件に置いてもよいことが考察される。
【０１５１】
発酵培地からブタノールを単離する方法（回収）
生物生産されたブタノール異性体は、当該技術分野で公知の方法を使用して、発酵培地から回収されてもよい。例えばＤｕｒｒｅ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４９：６３９−６４８（１９９８）、Ｇｒｏｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７：６１−７５（１９９２）、およびその中の参考文献を参照されたい。例えばブタノールは、蒸留、液液抽出、または膜ベースの分離などの方法を使用して発酵培地から単離されてもよい。参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００９０３０５３７０号明細書、米国特許出願公開第２０１１０３１２０４３号明細書、および米国特許出願公開第２０１１０３１２０４４号明細書は、発酵ブロスを水不混和性抽出剤に接触させて、水性相および有機相を含んでなる二相混合物を生成するステップを含んでなる、液液抽出を記載する。
【０１５２】
ブタノールを発酵ブロスから除去するために、原位置生成物除去（ＩＳＰＲ）もまた利用し得る。いくつかの実施形態では、ＩＳＰＲは液液抽出を含む。典型的に、抽出剤は、発酵ブロスと接触して、水性相および有機相を含んでなる二相混合物を生成する、飽和、一価不飽和、多不飽和（およびそれらの混合物）Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪アルデヒド、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸アミド、トリグリセリド、およびそれらの混合物からなる群から選択される有機抽出剤であり得る。抽出剤はまた、発酵ブロスと接触して、水性相および有機相を含んでなる二相混合物を生成する、飽和、一価不飽和、多不飽和（およびそれらの混合物）Ｃ４〜Ｃ２２脂肪アルコール、Ｃ４〜Ｃ２８脂肪酸、Ｃ４〜Ｃ２８脂肪酸のエステル、Ｃ４〜Ｃ２２脂肪アルデヒド、Ｃ４〜Ｃ２２脂肪酸アミド、およびそれらの混合物からなる群から選択される有機抽出剤であってもよい。スラリーからの遊離脂肪酸もまた、ＩＳＰＲ抽出剤としての役割を果たし得る。ＩＳＰＲ抽出剤（ＦＦＡ）は発酵ブロスと接触して、水相および有機相を含んでなる、二相混合物を形成する。発酵ブロス中に存在する生成物アルコールエステルは、有機相内に優先的に分配されて、アルコール含有有機相を形成する。
【０１５３】
ブタノール異性体は水と低沸点の共沸混合物を形成するので、蒸留を使用すると、混合物はその共沸性組成物にのみ分離され得る。蒸留を別の分離方法と組み合わせて使用して、共沸混合物周辺での分離を得てもよい。ブタノールを単離して精製するために組み合わせて使用してもよい方法としては、デカンテーション、液液抽出、吸着、および膜ベースの技術が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらにブタノール異性体は、共留剤を使用した共沸蒸留を使用して単離されてもよい（例えばＤｏｈｅｒｔｙ  ａｎｄ  Ｍａｌｏｎｅ，Ｃｏｎｃｅｐｔｕａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｄｉｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）を参照されたい）。
【０１５４】
デカンテーションと組み合わせて蒸留を使用して、ブタノールを単離し精製する場合、ブタノールを含有する発酵ブロスは、共沸性組成物に近くなるまで蒸留される。次に共沸性混合物を濃縮し、デカンテーションによってブタノールを発酵培地から分離する。デカントされた水相は、還流として第１の蒸留カラムに戻されてもよい。ブタノールに富む有機相は、第２の蒸留カラム中での蒸留によってさらに精製されてもよい。
【０１５５】
液液抽出と組み合わせて蒸留を使用する場合、ブタノールは適切な溶媒による液液抽出を使用して、発酵ブロスから抽出される。次にブタノール含有有機相を蒸留して、ブタノールを溶剤から分離する。
【０１５６】
吸着と組み合わせて蒸留を使用する場合、ブタノール含有発酵ブロスを共沸組成物近くに蒸留し、次に分子ふるいなどの吸着材の使用によって残留水を除去する（Ａｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  Ｂｉｏｍａｓｓ  ｔｏ  Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  Ｃｏ−Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｉｌｕｔｅ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｒｎ  Ｓｔｏｖｅｒ，Ｒｅｐｏｒｔ  ＮＲＥＬ／ＴＰ−５１０−３２４３８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｊｕｎｅ  ２００２）。
【０１５７】
浸透気化法と組み合わせて蒸留を使用する場合、ブタノールを含有する発酵ブロスを共沸性組成物に近く蒸留し、次に親水性膜を通過させる浸透気化法によって残りの水を除去する（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｓｃｉ．，２４５：１９９−２１０（２００４））。
【０１５８】
あらゆる段階のブタノール力価は、例えば参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００９０３０５３７０号明細書に記載されるような、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）またはガスクロマトグラフィーなどの当該技術分野で公知の方法によって測定し得る。
【０１５９】
固形物を除去する方法
発酵性炭素基質の発酵後、発酵培地中に残る乾燥固体残留物（または固形分）は、当該技術分野で公知の方法を使用して除去されてもよい。これらの固形分は、タンパク質、繊維、および油を含んでなり、乾燥醸造穀粒（ＤＤＧ）、醸造乾燥可溶物（ＤＤＳ）、および可溶物含有醸造乾燥穀物（ＤＤＧＳ）の３タイプであり得る。これらの固形分の内、ＤＤＧＳのみを、動物飼料産業で使用し得る。ＤＤＧＳは高い栄養価を有し、したがって動物飼料として適切である。
【０１６０】
固形物は、遠心分離、濾過、デカンテーションなどによって、発酵培地から除去されてもよい。固形物の除去に続いて、蒸留、共沸性蒸留、液液抽出、吸着、ガスストリッピング、膜蒸発、浸透気化法などの方法を使用して、ブタノールを発酵培地から単離してもよい。
【実施例】
【０１６１】
本発明を以下の実施例でさらに定義する。これらの実施例は、本発明の実施形態を示しながら、例証としてのみ提供されるものと理解すべきである。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的特性を見極め得て、その精神と範囲を逸脱することなく、本発明に様々な変更と修正を加えて、それを様々な用途と条件に適応させ得る。
【０１６２】
一般方法
細菌培養の維持および成長に適した材料および方法は、技術分野で周知である。以下の実施例で使用するのに適した技術は、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．，（１９９４））、またはＢｒｏｃｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９）に記載される。細菌細胞の増殖および維持のために使用される、全ての試薬、制限酵素および材料は、特に断りのない限り、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＨｉＭｅｄｉａ（Ｍｕｍｂａｉ，Ｉｎｄｉａ）、ＳＤ  Ｆｉｎｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｉｎｄｉａ）、またはタカラバイオ株式会社（日本、滋賀県）から得られた。
【０１６３】
培地中のイソブタノール濃度を測定する方法
培地中のイソブタノールの濃度は、いくつかの当該技術分野で公知の方法によって測定され得る。例えば特定の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法は、どちらもＷａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．）から購入された、屈折率（ＲＩ）検出があるＳｈｏｄｅｘ  ＳＨ−Ｇガードカラム付きＳｈｏｄｅｘ  Ｈ−１０１１カラムを利用した。クロマトグラフィーの分離は、流速０．５ｍＬ／分の移動相として０．０１ＭＨ２ＳＯ４を使用して、カラム温度５０℃で達成された。イソブタノールは、使用された条件下で４６．６分間の滞留時間を有した。代案としては、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）法が利用できる。例えば特定のＧＣ方法は、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）付きのＨＰ−ＩＮＮＯＷａｘカラム（３０ｍ×０．５３ｍｍ内径、１μｍフィルム厚、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌ．）を利用した。キャリアガスは、上部圧一定の１５０℃における測定で、流速４．５ｍＬ／分のヘリウムであった；注入器スプリットは、２００℃で１：２５であった；オーブン温度は、４５℃で１分間、１０℃／分で４５〜２２０℃、および２２０℃で５分間であり；ＦＩＤ検出は、２６ｍＬ／分のヘリウムメークアップガスにより２４０℃で用いられた。イソブタノールの滞留時間は、４．５分間であった。
【０１６４】
略語の意味は、次の通りである。「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｕＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「ｍｇ／ｍＬ」は１ミリリットルあたりのミリグラム数を意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」はマイクロモルを意味し、「ｋｇ」はキログラムを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ＰＣＲ」はポリメラーゼ連鎖反応を意味し、「ＯＤ」は光学濃度を意味し、「ＯＤ６００」は６００ｎｍの波長で測定された光学濃度を意味し、「ｋＤａ」はキロダルトンを意味し、「ｇ」は重力定数もまた意味し得て、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋｂｐ」はキロ塩基対を意味し、「ｋｂ」はキロベースを意味し、「％」は百分率を意味し、「％ｗ／ｖ」は重量／容積百分率を意味し、「％ｖ／ｖ」は容積／容積百分率を意味し、「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィーを意味し、「ｇ／Ｌ」は１リットルあたりグラム数を意味し、「μｇ／Ｌ」は１リットルあたりマイクログラム数を意味し、「ｎｇ／μＬ」は１マイクロリットルあたりナノグラム数を意味し、「ｐｍｏｌ／μＬ」は１マイクロリットルあたりピコモル数を意味し、「ＲＰＭ」は毎分回転数を意味し、「μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ」は１ミリグラムあたり１分あたりマイクロモル数を意味し、「ｗ／ｖ」は容積あたり重量を意味し、「ｖ／ｖ」は容積あたり容積を意味する。
【０１６５】
微生物株は、特に断りのない限り、ヴァージニア州マナッサスの米国微生物系統保存機関（ＡＴＣＣ）から得られた。
【０１６６】
以下の実施例で使用される特定のオリゴヌクレオチドプライマーは、表１に提供される。全てのオリゴヌクレオチドプライマーは、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，Ｔｅｘ．）、またはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ）によって合成された。
【０１６７】
【表１】
2015510774.tif 000003
【０１６８】
【表２】
2015510774.tif 000004
【０１６９】
【表３】
2015510774.tif 000005
【０１７０】
実施例で使用される株の構築
ＰＮＹ２０６８の構築
さらなる遺伝子操作のための宿主細胞として、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＰＮＹ０８２７株が使用される。ＰＮＹ０８２７は、米国微生物系統保存機関、Ｐａｔｅｎｔ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９において、２０１１年９月２２日にブダペスト条約の下にＡＴＣＣに寄託されて、特許寄託名ＰＴＡ−１２１０５を有する、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来株を指す。
【０１７１】
ＵＲＡ３の欠失および半数体への胞子形成
内在性ＵＲＡ３コード領域を欠失させるために、ｌｏｘＰ部位で挟まれたＰＴＥＦ１−ｋａｎＭＸ４−ＴＥＦ１ｔカセットを含有するｐＬＡ５４（配列番号９）から、欠失カセットをＰＣＲ増幅し、生体内で相同的組換させ、引き続いてＫＡＮＭＸ４マーカーを除去した。Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）およびプライマーＢＫ５０５（配列番号１０）およびＢＫ５０６（配列番号１１）を使用して、ＰＣＲを実施した。各プライマーのＵＲＡ３部分は、ｋａｎＭＸ４カセットの組み込みがＵＲＡ３コード領域の置換をもたらすように、ＵＲＡ３  ＡＴＧの１８０ｂｐ上流の５’領域およびコード領域の７８ｂｐ下流の３’領域から誘導された。標準遺伝子技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）を使用して、ＰＣＲ産物をＰＮＹ０８２７に形質転換し、３０℃で２％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌジェネテシン添加ＹＥＰ培地上において、形質転換体を選択した。プライマーＬＡ４６８（配列番号１２）およびＬＡ４９２（配列番号１３）を用いたコロニーＰＣＲによって、形質転換体をスクリーニングして、組み込みカセットの存在を確認した。遺伝子型ＭＡＴａ／α  ＵＲＡ３／ｕｒａ３：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰを有する、異型接合二倍体ＮＹＬＡ９８が得られた。半数体を得るために、標準法を使用してＮＹＬＡ９８に胞子形成させた（Ｃｏｄｏｎ  ＡＣ，Ｇａｓｅｎｔ−Ｒａｍｉｒｅｚ  ＪＭ，Ｂｅｎｉｔｅｚ  Ｔ．Ｆａｃｔｏｒｓ  ｗｈｉｃｈ  ａｆｆｅｃｔ  ｔｈｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｅｔｒａｄ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｂａｋｅｒ’ｓ  ｙｅａｓｔ．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９５  ＰＭＩＤ：  ７５７４６０１）。極微操作装置を使用して四分子を解体し、２％グルコースを添加した富化ＹＰＥ培地上で培養した。ウラシル欠損２％グルコース添加合成完全培地上に、４個の生存能力がある胞子を含有する四分子をパッチに植えて、プライマーＡＫ１０９−１（配列番号１４）、ＡＫ１０９−２（配列番号１５）、およびＡＫ１０９−３（配列番号１６）を使用する多重コロニーＰＣＲによって、交雑型を確認した。得られた同定半数体株は、ＮＹＬＡ１０３と称されて遺伝子型ＭＡＴα  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰを有し、ＮＹＬＡ１０６と称されて遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰを有する。
【０１７２】
Ｈｉｓ３の欠失
内在性ＨＩＳ３コード領域を欠失させるために、無瘢痕欠失カセットを使用した。Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用して、Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により調製されたＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７ＤゲノムＤＮＡをテンプレートとして、無瘢痕ＨＩＳ３欠失のためのＰＣＲカセットのための４つの断片を増幅した。ＨＩＳ３断片Ａは、ＨＩＳ３断片Ｂの５’末端との相同性がある５’テールを含有する、プライマーｏＢＰ４５２（配列番号１７）とプライマーｏＢＰ４５３（配列番号１８）によって増幅した。ＨＩＳ３断片Ｂは、ＨＩＳ３断片Ａの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４５４（配列番号１９）、およびＨＩＳ３断片Ｕの５’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４５５（配列番号２０）によって増幅した。ＨＩＳ３断片Ｕは、ＨＩＳ３断片Ｂの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４５６（配列番号２１）、およびＨＩＳ３断片Ｃの５’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４５７（配列番号２２）によって増幅した。ＨＩＳ３断片Ｃは、ＨＩＳ３断片Ｕの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４５８（配列番号２３）、およびプライマーｏＢＰ４５９（配列番号２４）によって増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。ＨＩＳ３断片ＡとＨＩＳ３断片Ｂを混合し、プライマーｏＢＰ４５２（配列番号１７）およびｏＢＰ４５５（配列番号２０）で増幅することで、ＨＩＳ３断片ＡＢをオーバーラップＰＣＲによって作成した。ＨＩＳ３断片ＵとＨＩＳ３断片Ｃを混合し、プライマーｏＢＰ４５６（配列番号２１）およびｏＢＰ４５９（配列番号２４）で増幅することで、ＨＩＳ３断片ＵＣをオーバーラップＰＣＲによって作成した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル上で精製し、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）がそれに続いた。ＨＩＳ３断片ＡＢとＨＩＳ３断片ＵＣとを混合し、プライマーｏＢＰ４５２（配列番号１７）およびｏＢＰ４５９（配列番号２４）で増幅することで、ＨＩＳ３  ＡＢＵＣカセットをオーバーラップＰＣＲによって作成した。ＰＣＲ産物は、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。ＮＹＬＡ１０６のコンピテント細胞をＨＩＳ３  ＡＢＵＣ  ＰＣＲカセットで形質転換して、ウラシル欠損２％グルコース添加合成完全培地上に３０℃で播種した。ヒスチジン欠損２％グルコース添加合成完全培地上における３０℃での形質転換体のレプリカ平板法によって、形質転換体をスクリーニングして、正しい組み込みを確認した。ゲノムＤＮＡプレップを作成し、５’末端のためのプライマーｏＢＰ４６０（配列番号２５）およびＬＡ１３５（配列番号２６）、および３’末端のためのプライマーｏＢＰ４６１（配列番号２７）およびＬＡ９２（配列番号２８）を使用したＰＣＲによって、組み込みを確認した。標準プロトコルに従って、２％グルコースおよび５−ＦＯＡを添加した合成完全培地上における３０℃での���板培養によって、ＵＲＡ３マーカーを再循環させた。マーカー除去は、５−ＦＯＡプレートからのコロニーをＳＤ−ＵＲＡ培地上にパッチで植えて、成長不在を立証することで確認した。ＰＮＹ２００３と称される、得られた同定株は、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δを有する。
【０１７３】
ＰＤＣ１の欠失
内在性ＰＤＣ１コード領域を欠失させるために、縮重ｌｏｘＰ部位で挟まれたＵＲＡ３マーカーを含有するｐＬＡ５９（配列番号２９）から、欠失カセットをＰＣＲ増幅し、生体内で相同組換えして、引き続いてＵＲＡ３マーカーを除去した。Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）およびプライマーＬＡ６７８（配列番号３０）およびＬＡ６７９（配列番号３１）を使用して、ＰＣＲを実施した。各プライマーのＰＤＣ１部分は、ＵＲＡ３カセット組み込みが、ＰＤＣ１コード領域の置換をもたらすが、コード領域の最初の５０ｂｐおよび最後の５０ｂｐは残すように、ＰＤＣ１開始コドンの５０ｂｐ下流の５’領域および停止コドンの５０ｂｐ上流の３’領域から誘導された。標準遺伝子技術を使用してＰＣＲ産物をＰＮＹ２００３に形質転換し、ウラシル欠損２％グルコース添加合成完全培地上で、形質転換体を３０℃で選択した。５’コード領域外部のプライマーＬＡ３３７（配列番号３２）およびＵＲＡ３の内部プライマーＬＡ１３５（配列番号２６）を使用したコロニーＰＣＲによって、形質転換体をスクリーニングして正しい組み込みを確認した。次に、ＧＰＤ１コード領域内部のプライマーＬＡ６９２（配列番号３３）およびＬＡ６９３（配列番号３４）を使用したコロニーＰＣＲによって、正の形質転換体をスクリーニングした。ＧＡＬ１プロモーター下のＣＲＥリコンビナーゼを含有するｐＬＡ３４（配列番号３５）で形質転換し、ヒスチジン欠損２％グルコース添加合成完全培地上に３０℃で播種することで、ＵＲＡ３マーカーを再循環させた。形質転換体を０．５％ガラクトース添加富栄養培地上に播種して、リコンビナーゼを誘導した。ウラシル欠損２％グルコース添加合成完全培地上に、コロニーをパッチで植えて成長不在を立証することで、マーカー除去を確認した。ＰＮＹ２００８と称される、得られた同定株は、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６を有する。
【０１７４】
ＰＤＣ５の欠失
内在性ＰＤＣ５コード領域を欠失させるために、縮重ｌｏｘＰ部位で挟まれたＵＲＡ３マーカーを含有するｐＬＡ５９（配列番号２９）から、欠失カセットをＰＣＲ増幅し、生体内で相同組換えして、引き続いてＵＲＡ３マーカーを除去した。Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）およびプライマーＬＡ７２２（配列番号３６）およびＬＡ７３３（配列番号３７）を使用して、ＰＣＲを実施した。各プライマーのＰＤＣ５部分は、ＵＲＡ３カセット組み込みが、ＰＤＣ５コード領域全体の置換をもたらすように、ＰＤＣ５開始コドンの５０ｂｐ上流の５’領域および停止コドンの５０ｂｐ下流の３’領域から誘導された。標準遺伝子技術を使用してＰＣＲ産物をＰＮＹ２００８に形質転換し、ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上で、形質転換体を３０℃で選択した。５’コード領域外部のプライマーＬＡ４５３（配列番号３８）およびＵＲＡ３の内部プライマーＬＡ１３５（配列番号２６）を使用したコロニーＰＣＲによって、形質転換体をスクリーニングして正しい組み込みを確認した。次に、ＧＰＤ５コード領域内部のプライマーＬＡ６９４（配列番号３９）およびＬＡ６９５（配列番号４０）を使用したコロニーＰＣＲによって、正の形質転換体をスクリーニングした。ＧＡＬ１プロモーター下のＣＲＥリコンビナーゼを含有するｐＬＡ３４（配列番号３５）で形質転換し、ヒスチジン欠損１％エタノール添加合成完全培地上に３０℃で播種することで、ＵＲＡ３マーカーを再循環させた。形質転換体を１％エタノールおよび０．５％ガラクトース添加富化ＹＥＰ培地上に播種して、リコンビナーゼを誘導した。ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上に、コロニーをパッチで植えて成長不在を立証することで、マーカー除去を確認した。ＰＮＹ２００９と称される、得られた同定株は、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６を有する。
【０１７５】
ＦＲＡ２の欠失
ＦＲＡ２欠失をデザインして、コード配列の３’末端から２５０ヌクレオチドを欠失させ、ＦＲＡ２コード配列の最初の１１３ヌクレオチドは無処理のままにした。インフレームの停止コドンは、欠失から７ヌクレオチド下流に存在する。Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用して、Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により調製されたＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７ＤゲノムＤＮＡをテンプレートとして、無瘢痕ＦＲＡ２欠失のためのＰＣＲカセットのための４つの断片を増幅した。ＦＲＡ２断片Ａは、ＦＲＡ２断片Ｂの５’末端との相同性がある５’テールを含有する、プライマーｏＢＰ５９４（配列番号４１）とプライマーｏＢＰ５９５（配列番号４２）によって増幅した。ＦＲＡ２断片Ｂは、ＦＲＡ２断片Ａの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５９６（配列番号４３）、およびＦＲＡ２断片Ｕの５’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５９７（配列番号４４）によって増幅した。ＦＲＡ２断片Ｕは、ＦＲＡ２断片Ｂの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５９８（配列番号４５）、およびＦＲＡ２断片Ｃの５’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５９９（配列番号４６）によって増幅した。ＦＲＡ２断片Ｃは、ＦＲＡ２断片Ｕの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ６００（配列番号４７）、およびプライマーｏＢＰ６０１（配列番号４８）によって増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。ＦＲＡ２断片ＡとＦＲＡ２断片Ｂを混合し、プライマーｏＢＰ５９４（配列番号４１）およびｏＢＰ５９７（配列番号４４）で増幅することで、ＦＲＡ２断片ＡＢをオーバーラップＰＣＲによって作成した。ＦＲＡ２断片ＵとＦＲＡ２断片Ｃを混合し、プライマーｏＢＰ５９８（配列番号４５）およびｏＢＰ６０１（配列番号４８）で増幅することで、ＦＲＡ２断片ＵＣをオーバーラップＰＣＲによって作成した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル上で精製し、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）がそれに続いた。ＦＲＡ２断片ＡＢとＦＲＡ２断片ＵＣを混合し、プライマーｏＢＰ５９４（配列番号４１）およびｏＢＰ６０１（配列番号４８）で増幅することで、ＦＲＡ２  ＡＢＵＣカセットをオーバーラップＰＣＲによって作成した。ＰＣＲ産物は、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。
【０１７６】
内在性ＦＲＡ２コード領域を欠失させるために、標準的な技術を使用して、上で得られた無瘢痕欠失カセットをＰＮＹ２００９に形質転換し、ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上に播種した。ゲノムＤＮＡプレップを作成し、５’末端のためのプライマーｏＢＰ６０２（配列番号４９）およびＬＡ１３５（配列番号２６）、およびプライマーｏＢＰ６０２（配列番号４９）およびｏＢＰ６０３（配列番号５０）を使用したＰＣＲによって全遺伝子座を増幅し、組み込みを確認した。標準プロトコルに従って、１％エタノールおよび５−ＦＯＡ（５−フルオロオロト酸）を添加した合成完全培地上における３０℃での平板培養によって、ＵＲＡ３マーカーを再循環させた。ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上に、５−ＦＯＡプレートからのコロニーをパッチで植えて成長不在を立証することで、マーカー除去を確認した。ＰＮＹ２０３７と称される、得られた同定株は、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δを有する。
【０１７７】
２  ｍｉｃｒｏｎプラスミドの付加
ＰｈｕｓｉｏｎＤＮＡポリメラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を使用して、ｐＬＡ５９（配列番号２９）から、ｌｏｘＰ７１−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰ６６マーカーをＰＣＲ増幅し、ＬＡ８１１ｘ８１７（配列番号５１、５２）およびＬＡ８１２ｘ８１８（配列番号５３、５４）２−ｍｉｃｒｏｎプラスミド断片と共に、３０℃のＳＥ−ＵＲＡプレート上で、ＰＮＹ２０３７株に形質転換した。得られたＰＮＹ２０３７  ２μ：：ｌｏｘＰ７１−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰ６６株を、ｐＬＡ３４（ｐＲＳ４２３：：ｃｒｅ）（ｐＬＡ３４とも称される）（配列番号３５）で形質転換し、ＳＥ−Ｈｉｓ−ＵＲＡプレート上において３０℃で選択した。形質転換体をＹＰ−１％ガラクトースプレート上にパッチに植えて、４８時間３０℃で成長させてＣｒｅリコンビナーゼ発現を誘導した。次に個々のコロニーをＳＥ−ＵＲＡ、ＳＥ−Ｈｉｓ、およびＹＰＥプレート上にパッチに植えて、ＵＲＡ３マーカー除去を確認した。ＰＮＹ２０５０と称される、得られた同定株は、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰ、  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ  ２−ｍｉｃｒｏｎを有する。
【０１７８】
ＧＰＤ２の欠失
内在性ＧＰＤ２コード領域を欠失させるために、縮重ｌｏｘＰ部位で挟まれたＵＲＡ３マーカーを含有するｐＬＡ５９（配列番号２９）から、欠失カセットをＰＣＲ増幅し、生体内で相同組換えして、引き続いてＵＲＡ３マーカーを除去した。Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）およびプライマーＬＡ５１２（配列番号５５）およびＬＡ５１３（配列番号５６）を使用して、ＰＣＲを実施した。各プライマーのＧＰＤ２部分は、ＵＲＡ３カセット組み込みが、ＧＰＤ２コード領域全体の置換をもたらすように、ＧＰＤ２開始コドンの５０ｂｐ上流の５’領域および停止コドンの５０ｂｐ下流の３’領域から誘導された。標準遺伝子技術を使用してＰＣＲ産物をＰＮＹ２０５０に形質転換し、ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上で、形質転換体を３０℃で選択した。５’コード領域外部のプライマーＬＡ５１６（配列番号５７）およびＵＲＡ３の内部のＬＡ１３５（配列番号２６）を使用したコロニーＰＣＲによって、形質転換体をスクリーニングして正しい組み込みを確認した。次に、ＧＰＤ２コード領域内部のプライマーＬＡ５１４（配列番号５８）およびＬＡ５１５（配列番号５９）を使用したコロニーＰＣＲによって、正の形質転換体をスクリーニングした。ＧＡＬ１プロモーター下のＣＲＥリコンビナーゼを含有するｐＬＡ３４（配列番号３５）で形質転換し、ヒスチジン欠損１％エタノール添加合成完全培地上に３０℃で播種することで、ＵＲＡ３マーカーを再循環させた。形質転換体を１％エタノールおよび０．５％ガラクトース添加富栄養培地上に播種して、リコンビナーゼを誘導した。ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上に、コロニーをパッチで植えて成長不在を立証することで、マーカー除去を確認した。ＰＮＹ２０５６と称される、得られた同定株は、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ  ２−ｍｉｃｒｏｎ  ｇｐｄ２Δを有する。
【０１７９】
ＹＭＲ２２６の欠失およびＡｌｓＳの組み込み
内在性ＹＭＲ２２６Ｃコード領域を欠失させるために、ＦＢＡ１プロモーターおよびＣＹＣ１ターミネーターがあるバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）種からの遺伝子アセト乳酸シンターゼを含有するｐＬＡ７１（配列番号６０）から組み込みカセットをＰＣＲ増幅し、縮重ｌｏｘＰ部位で挟まれたＵＲＡ３マーカーを生体内で相同組換えして、引き続いてＵＲＡ３マーカーを除去した。Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡのＫＡＰＡ  ＨｉＦｉと、プライマーＬＡ８２９（配列番号６１）およびＬＡ８３４（配列番号６２）とを使用して、ＰＣＲを実施した。各プライマーのＹＭＲ２２６Ｃ部分は、コーディング配列の最初の６０ｂｐと、停止コドンの４０９ｂｐ上流の６５ｂｐとに由来した。標準遺伝子技術を使用してＰＣＲ産物をＰＮＹ２０５６に形質転換し、ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上で、形質転換体を３０℃で選択した。５’コード領域外部のプライマーＮ１２５７（配列番号６３）およびＦＢＡ１プロモーター内部のプライマーＬＡ７４０（配列番号６９）を使用したコロニーＰＣＲによって、形質転換体をスクリーニングして、正しい組み込みを確認した。次にＹＭＲ２２６Ｃコード領域内部のプライマーＮ１２５７（配列番号６３）およびＬＡ８３０（配列番号６４）と、３’コード領域外部のプライマーＬＡ８３０（配列番号６４）と、ＵＲＡ３マーカー内部のＬＡ９２（配列番号２８）とを使用したコロニーＰＣＲによって、正の形質転換体をスクリーニングした。ＧＡＬ１プロモーター下のＣＲＥリコンビナーゼを含有するｐＬＡ３４（配列番号３５）で形質転換し、ヒスチジン欠損１％エタノール添加合成完全培地上に３０℃で播種することで、ＵＲＡ３マーカーを再循環させた。形質転換体を１％エタノールおよび０．５％ガラクトース添加富栄養培地上に播種して、リコンビナーゼを誘導した。ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上に、コロニーをパッチで植えて成長不在を立証することで、マーカー除去を確認した。得られた同定株ＰＮＹ２０６１は、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ  ２−ｍｉｃｒｏｎ  ｇｐｄ２Δｙｍｒ２２６ｃΔ：：ＰＦＢＡ１−ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６を有する。
【０１８０】
ＡＬＤ６の欠失およびＫｉｖＤの組み込み
内在性ＡＬＤ６コード領域を欠失させるために、雑種ＦＢＡ１プロモーターおよびＴＤＨ３ターミネーターがあるリステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）種からのｋｉｖＤ遺伝子を含有するｐＬＡ７８（配列番号６５）から組み込みカセットをＰＣＲ増幅し、縮重ｌｏｘＰ部位で挟まれたＵＲＡ３マーカーを生体内で相同組換えして、引き続いてＵＲＡ３マーカーを除去した。Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡのＫＡＰＡ  ＨｉＦｉと、プライマーＬＡ８５０（配列番号６６）およびＬＡ８５１（配列番号６７）とを使用して、ＰＣＲを実施した。各プライマーのＡＬＤ６部分は、コーディング配列の最初の６５ｂｐと、コード領域の最後の６３ｂｐに由来した。標準遺伝子技術を使用してＰＣＲ産物をＰＮＹ２０６１に形質転換し、ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上で、形質転換体を３０℃で選択した。５’コード領域外部のプライマーＮ１２６２（配列番号６８）およびＦＢＡ１プロモーター内部のプライマーＬＡ７４０（配列番号６９）を使用したコロニーＰＣＲによって、形質転換体をスクリーニングして、正しい組み込みを確認した。次に３’コード領域外部のプライマーＮ１２６３（配列番号７０）、およびＵＲＡ３マーカー内部のプライマーＬＡ９２（配列番号２８）を使用したコロニーＰＣＲによって、陽性形質転換体をスクリーニングした。ＧＡＬ１プロモーター下のＣＲＥリコンビナーゼを含有するｐＬＡ３４（配列番号３５）で形質転換し、ヒスチジン欠損１％エタノール添加合成完全培地上に３０℃で播種することで、ＵＲＡ３マーカーを再循環させた。形質転換体を１％エタノールおよび０．５％ガラクトース添加富栄養培地上に播種して、リコンビナーゼを誘導した。ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上に、コロニーをパッチで植えて成長不在を立証することで、マーカー除去を確認した。得られた同定株ＰＮＹ２０６５は、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ  ２−ｍｉｃｒｏｎ  ｇｐｄ２Δｙｍｒ２２６ｃΔ：：ＰＦＢＡ１−ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ａｌｄ６Δ：：（ＵＡＳ）ＰＧＫ１−ＰＦＢＡ１−ｋｉｖＤ＿Ｌｇ−ＴＤＨ３ｔ−ｌｏｘＰ７１を有する。
【０１８１】
ＡＤＨ１の欠失およびＡＤＨの組み込み
ＡＤＨ１は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中に存在する、内在性アルコールデヒドロゲナーゼである。下述するように、ｔｈｅ内在性ＡＤＨ１は、ベイジェリンキア・インディカからのアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）で置換される。
【０１８２】
内在性ＡＤＨ１コード領域を欠失させるために、ＩＬＶ５プロモーターおよびＡＤＨ１ターミネーターがあるベイジェリンキア・インディカ種からのアルコールデヒドロゲナーゼを含有するｐＬＡ６５（配列番号７１）から、組み込みカセットをＰＣＲ増幅し、縮重ｌｏｘＰ部位で挟まれたＵＲＡ３マーカーを生体内で相同組換えして、引き続いてＵＲＡ３マーカーを除去した。Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡのＫＡＰＡ  ＨｉＦｉと、プライマーＬＡ８５５（配列番号７２）およびＬＡ８５６（配列番号７３）とを使用して、ＰＣＲを実施した。各プライマーのＡＤＨ１部分は、ＡＤＨ１開始コドンの５０ｂｐ上流の５’領域およびコード領域の最後の５０ｂｐから誘導された。標準遺伝子技術を使用してＰＣＲ産物をＰＮＹ２０６５に形質転換し、ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上で、形質転換体を３０℃で選択した。５’コード領域外部のプライマーＬＡ４１４（配列番号７４）およびＩＬＶ５プロモーター内部のプライマーＬＡ７４９（配列番号７５）を使用したコロニーＰＣＲによって、形質転換体をスクリーニングして、正しい組み込みを確認した。次に３’コード領域外部のプライマーＬＡ４１３（配列番号７６）、およびＵＲＡ３マーカー内部のプライマーＬＡ９２（配列番号２８）を使用したコロニーＰＣＲによって、陽性形質転換体をスクリーニングした。ＧＡＬ１プロモーター下のＣＲＥリコンビナーゼを含有するｐＬＡ３４（配列番号３５）で形質転換し、ヒスチジン欠損１％エタノール添加合成完全培地上に３０℃で播種することで、ＵＲＡ３マーカーを再循環させた。形質転換体を１％エタノールおよび０．５％ガラクトース添加富栄養培地上に播種して、リコンビナーゼを誘導した。ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上に、コロニーをパッチで植えて成長不在を立証することで、マーカー除去を確認した。ＰＮＹ２０６６と称される、得られた同定株は、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ  ２−ｍｉｃｒｏｎ  ｇｐｄ２Δｙｍｒ２２６ｃΔ：：ＰＦＢＡ１−ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ａｌｄ６Δ：：（ＵＡＳ）ＰＧＫ１−ＰＦＢＡ１−ｋｉｖＤ＿Ｌｇ−ＴＤＨ３ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ａｄｈ１Δ：：ＰＩＬＶ５−ＡＤＨ＿Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６を有する。
【０１８３】
ｐｄｃ１Δ遺伝子座へのＡＤＨの組み込み
ｐｄｃ１Δ領域でＡＤＨの追加のコピーを組み込むために、ＡＤＨ１ターミネーターがあるベイジェリンキア・インディカ種からのアルコールデヒドロゲナーゼを含有するｐＬＡ６５（配列番号７１）から、組み込みカセットをＰＣＲ増幅し、縮重ｌｏｘＰ部位で挟まれたＵＲＡ３マーカーを生体内で相同組換えして、引き続いてＵＲＡ３マーカーを除去した。Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡのＫＡＰＡ  ＨｉＦｉと、プライマーＬＡ８６０（配列番号７７）およびＬＡ６７９（配列番号３１）とを使用して、ＰＣＲを実施した。各プライマーのＰＤＣ１部分は、ＰＤＣ１開始コドンの上流の５’領域の６０ｂｐと、停止コドンの１０３ｂｐ上流である５０ｂｐに由来した。内在性ＰＤＣ１プロモーターを使用した。標準遺伝子技術を使用してＰＣＲ産物をＰＮＹ２０６６に形質転換し、ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上で、形質転換体を３０℃で選択した。５’コード領域外部のプライマーＬＡ３３７（配列番号３２）およびＢｉＡＤＨ遺伝子内部のプライマーＬＡ１０９３（配列番号７８）を使用したコロニーＰＣＲによって、形質転換体をスクリーニングして、正しい組み込みを確認した。次に３’コード領域外部のプライマーＬＡ６８１（配列番号７９）、およびＵＲＡ３マーカー内部のプライマーＬＡ９２（配列番号２８）を使用したコロニーＰＣＲによって、陽性形質転換体をスクリーニングした。ＧＡＬ１プロモーター下のＣＲＥリコンビナーゼを含有するｐＬＡ３４（配列番号３５）で形質転換し、ヒスチジン欠損１％エタノール添加合成完全培地上に３０℃で播種することで、ＵＲＡ３マーカーを再循環させた。形質転換体を１％エタノールおよび０．５％ガラクトース添加富栄養培地上に播種して、リコンビナーゼを誘導した。ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上に、コロニーをパッチで植えて成長不在を立証することで、マーカー除去を確認した。ＰＮＹ２０６８と称される、得られた同定株は、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ  ２−ｍｉｃｒｏｎ  ｇｐｄ２Δ  ｙｍｒ２２６ｃΔ：：ＰＦＢＡ１−ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ａｌｄ６Δ：：（ＵＡＳ）ＰＧＫ１−ＰＦＢＡ１−ｋｉｖＤ＿Ｌｇ−ＴＤＨ３ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ａｄｈ１Δ：：ＰＩＬＶ５−ＡＤＨ＿Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ１Δ：：ＰＰＤＣ１−ＡＤＨ＿Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６を有する。
【０１８４】
イソブタノール産生株ＰＮＹ２２７０の構築
ｐＨＲ８１−ＩＬＶ５ｐ−Ｋ９ＳＢ２（配列番号８０）およびｐＹＺ０６７ＤｋｉｖＤＤｈＡＤＨ（配列番号８１）の２つのプラスミドによる細胞の形質転換によって、ＰＮＹ２０６８株（上述）から、ＰＮＹ２２７０株を作成した。プラスミドは、酢酸リチウム形質転換法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，ｐａｇｅ１１３）によって導入され、形質転換体は、ヒスチジンおよびウラシルが除去されて１％エタノールが炭素源として添加された、合成完全培地上で選択された。次にヒスチジンおよびウラシルが除去されて、炭素源としての２％エタノールと、Ｃ２補給剤としてのエタノール（０．０５％）または酢酸（２ｍＭ）のいずれかとが添加された、合成完全培地を含有するプレートに、形質転換体を移した。
【０１８５】
ｐＨＲ８１−ＩＬＶ５ｐ−Ｋ９ＳＢ２（配列番号８０）は、ｐＨＲ８１プラスミド主鎖中のＩＬＶ５プロモーターおよびＩＬＶ５ターミネーターによって駆動される、Ａ．カカエ（Ａ．ｃａｃｃａｅ）Ｋ９ＳＢ２  ＫＡＲＩ遺伝子を含有する。ｐＹＺ０６７ＤｋｉｖＤＤｈＡＤＨ（配列番号８１）は、ｐＲＳ４２３プラスミド主鎖中のＦＢＡ１プロモーターおよびＦＢＡ１ターミネーターによって駆動される、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ｉｌｖＤ遺伝子を含有する。
【０１８６】
イソブタノール産生株ＰＮＹ２０９２の構築
ＰＮＹ２０９２株は、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ  ２−ｍｉｃｒｏｎ  ｇｐｄ２Δ  ｙｍｒ２２６ｃΔ：：ＰＦＢＡ１
−ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６を有する、基本株ＰＮＹ２０６１（上述）を、プラスミドｐＨＲ８１−ＩＬＶ５ｐ−Ｒ８Ｂ２ｙ２（配列番号８２）およびｐＬＡ８４（配列番号８３）でプラスミド形質転換して構築した。
【０１８７】
ｐＨＲ８１−ＩＬＶ５ｐ−Ｒ８Ｂ２ｙ２（配列番号８２）は、ｐＨＲ８１プラスミド主鎖中のＩＬＶ５プロモーターおよびＩＬＶ５ターミネーターによって駆動される、Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）Ｒ８Ｂ２  ＫＡＲＩ（酵母のためにコドン最適化されている）を含有する。ｐＬＡ８４（配列番号８３）は、ＦＢＡ１プロモーターおよびＦＢＡ１ターミネーターによって駆動されるＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）からのＩｌｖＤと、ＧＰＭ１プロモーターおよびＡＤＨ１ターミネーターによって駆動されるＢ．インディカ（Ｂ．ｉｎｄｉｃａ）からのＡＤＨと、ｐＲＳ４２３プラスミド主鎖中のＴＤＨ３プロモーターおよびＴＤＨ３ターミネーターによって駆動されるＬ．グレイー（Ｌ．ｇｒａｙｉ）からのＫｉｖＤとを含有する。
【０１８８】
イソブタノール産生株ＰＮＹ２１１８、ＰＮＹ２１２０、およびＰＮＹ２３１８の構築
ＰＮＹ２０５０からのＰＮＹ２１１５構築
ＰＮＹ２０５０からのＰＮＹ２１１５  ［ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ６６／７１  ｆｒａ２Δ  ２−ｍｉｃｒｏｎ  ｐｌａｓｍｉｄ（ＣＥＮ．ＰＫ２）  ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ６Δ：：（ＵＡＳ）ＰＧＫ１−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＫＩＶＤ｜Ｌｇ（ｙ）−ＴＤＨ３ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ａｄｈ１Δ：：Ｐ［ＡＤＨ１］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ：：Ｐ［ＩＬＶ５］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６］  の構築は、次のようであった。
【０１８９】
Ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６
内在性ＰＤＣ１プロモーターを使用して、ａｌｓＳをＰＮＹ２０５０のｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ６６／７１遺伝子座に組み込むために、ＦＢＡ１プロモーターとＣＹＣ１ターミネーターがあるバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）種からの遺伝子アセト乳酸シンターゼを含有するｐＬＡ７１（配列番号６０）から、組み込みカセットをＰＣＲ増幅し、縮重ｌｏｘＰ部位で挟まれたＵＲＡ３マーカーを生体内で相同組換えして、引き続いてＵＲＡ３マーカーを除去した。ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉと、プライマー８９５（配列番号８４）および６７９（配列番号３１）とを使用して、ＰＣＲを実施した。各プライマーのＰＤＣ１部分は、コード配列上流の６０ｂｐおよび停止コドンの５３ｂｐ上流の５０ｂｐから誘導された。標準遺伝子技術を使用してＰＣＲ産物をＰＮＹ２０５０に形質転換し、ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上で、形質転換体を３０℃で選択した。３’コード領域外部のプライマー６８１（配列番号７９）およびＵＲＡ３遺伝子内部のプライマーＬＡ９２（配列番号２８）を使用したコロニーＰＣＲによって、形質転換体をスクリーニングして、正しい組み込みを確認した。次に陽性形質転換体をゲノムＤＮＡのためにプレップして、プライマーＮ２４５（配列番号８５）およびＮ２４６（配列番号８６）を使用したＰＣＲによって、スクリーニングした。ＧＡＬ１プロモーター下のＣＲＥリコンビナーゼを含有するｐＬＡ３４（配列番号３５）で形質転換し、ヒスチジン欠損１％エタノール添加合成完全培地上に３０℃で播種することで、ＵＲＡ３マーカーを再循環させた。形質転換体を１％エタノールおよび０．５％ガラクトース添加富栄養培地上に播種して、リコンビナーゼを誘導した。ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上に、コロニーをパッチで植えて成長不在を立証することで、マーカー除去を確認した。ＰＮＹ２０９０と称される、得られた同定株は、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ、  ｈｉｓ３Δ、  ｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６、  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ  ２−ｍｉｃｒｏｎ  Ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６を有する。
【０１９０】
Ｐｄｃ６Δ：：（ＵＡＳ）ＰＧＫ１−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＫＩＶＤ｜Ｌｇ（ｙ）−ＴＤＨ３ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６
内在性ＰＤＣ６コード領域を欠失させるために、雑種ＦＢＡ１プロモーターおよびＴＤＨ３ターミネーターがあるリステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）種からのｋｉｖＤ遺伝子を含有するｐＬＡ７８（配列番号６５）から組み込みカセットをＰＣＲ増幅し、縮重ｌｏｘＰ部位で挟まれたＵＲＡ３マーカーを生体内で相同組換えして、引き続いてＵＲＡ３マーカーを除去した。ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉと、プライマー８９６（配列番号８７）および８９７（配列番号８８）とを使用して、ＰＣＲを実施した。各プライマーのＰＤＣ６部分は、コード配列の６０ｂｐ上流およびコード領域の５９ｂｐ下流から誘導された。標準遺伝子技術を使用してＰＣＲ産物をＰＮＹ２０９０に形質転換し、ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上で、形質転換体を３０℃で選択した。ＰＤＣ６遺伝子の内部プライマーである、プライマー３６５（配列番号８９）および３６６（配列番号９０）を使用したコロニーＰＣＲによって、形質転換体をスクリーニングして、正しい組み込みを確認した。次に、遺伝子の５’末端外部のコロニーＰＣＲＮ６３８（配列番号９１）、およびＦＢＡ１プロモーター内部の７４０（配列番号６９）によって、生成物不在の形質転換体をスクリーニングした。次に正の形質転換体をゲノムＤＮＡのためにプレップして、ＰＤＣ６コーディング配列に対する２つの外部プライマーを用いて、ＰＣＲによってスクリーニングした。陽性組み込み体は、４７２０の生成物を生じる一方で、ＰＤＣ６野性型形質転換体は２１３０ｂｐの生成物を生じる。ＧＡＬ１プロモーター下のＣＲＥリコンビナーゼを含有するｐＬＡ３４で形質転換し、ヒスチジン欠損１％エタノール添加合成完全培地上に３０℃で播種することで、ＵＲＡ３マーカーを再循環させた。形質転換体を１％エタノールおよび０．５％ガラクトース添加富栄養培地上に播種して、リコンビナーゼを誘導した。ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上に、コロニーをパッチで植えて成長不在を立証することで、マーカー除去を確認した。得られた同定株は、ＰＮＹ２０９３と称され、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ  ２−ｍｉｃｒｏｎ  Ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  Ｐｄｃ６Δ：：（ＵＡＳ）ＰＧＫ１−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＫＩＶＤ｜Ｌｇ（ｙ）−ＴＤＨ３ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６を有する。
【０１９１】
Ａｄｈ１Δ：：Ｐ［ＡＤＨ１］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６
内在性ＡＤＨ１プロモーターを使用して、内在性ＡＤＨ１コード領域を欠失させ、ＢｉＡＤＨを組み込むために、ＩＬＶ５プロモーターおよびＡＤＨ１ターミネーターがあるベイジェリンキア種からのアルコールデヒドロゲナーゼを含有するｐＬＡ６５（配列番号７１）から、組み込みカセットをＰＣＲ増幅し、縮重ｌｏｘＰ部位で挟まれたＵＲＡ３マーカーを生体内で相同組換えして、引き続いてＵＲＡ３マーカーを除去した。ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉと、プライマー８５６（配列番号７３）および８５７（配列番号１１０）とを使用して、ＰＣＲを実施した。各プライマーのＡＤＨ１部分は、ＡＤＨ１開始コドンの５０ｂｐ上流の５’領域およびコード領域の最後の５０ｂｐから誘導された。標準遺伝子技術を使用してＰＣＲ産物をＰＮＹ２０９３に形質転換し、ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上で、形質転換体を３０℃で選択した。５’コード領域外部のプライマーＢＫ４１５（配列番号９２）およびＢｉＡＤＨ遺伝子内部のプライマーＮ１０９２（配列番号９３）を使用したコロニーＰＣＲによって、形質転換体をスクリーニングして、正しい組み込みを確認した。次に３’コード領域外部のプライマー４１３（配列番号７６）、およびＵＲＡ３マーカー内部のプライマー９２（配列番号２８）を使用したコロニーＰＣＲによって、陽性形質転換体をスクリーニングした。ＧＡＬ１プロモーター下のＣＲＥリコンビナーゼを含有するｐＬＡ３４（配列番号３５）で形質転換し、ヒスチジン欠損１％エタノール添加合成完全培地上に３０℃で播種することで、ＵＲＡ３マーカーを再循環させた。形質転換体を１％エタノールおよび０．５％ガラクトース添加富栄養培地上に播種して、リコンビナーゼを誘導した。ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上に、コロニーをパッチで植えて成長不在を立証することで、マーカー除去を確認した。ＰＮＹ２１０１と称される、得られた同定株は、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ  ２−ｍｉｃｒｏｎ  ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ６Δ：：（ＵＡＳ）ＰＧＫ１−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＫＩＶＤ｜Ｌｇ（ｙ）−ＴＤＨ３ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ａｄｈ１Δ：：Ｐ［ＡＤＨ１］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６を有する。
【０１９２】
Ｆｒａ２Δ：：Ｐ［ＩＬＶ５］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６
ＰＮＹ２１０１のｆｒａ２Δ遺伝子座にＢｉＡＤＨを組み込むために、ＩＬＶ５プロモーターおよびＡＤＨ１ターミネーターがあるベイジェリンキア・インディカ（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ  ｉｎｄｉｃａ）種からのアルコールデヒドロゲナーゼを含有するｐＬＡ６５（配列番号７１）から、組み込みカセットをＰＣＲ増幅し、縮重ｌｏｘＰ部位で挟まれたＵＲＡ３マーカーを生体内で相同組換えして、引き続いてＵＲＡ３マーカーを除去した。ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉと、プライマー９０６（配列番号９４）および９０７（配列番号９５）とを使用して、ＰＣＲを実施した。各プライマーのＦＲＡ２部分は、ＡＴＧに開始するコード配列の最初の６０ｂｐおよび停止コドンの５６ｂｐ下流から誘導された。標準遺伝子技術を使用してＰＣＲ産物をＰＮＹ２１０１に形質転換し、ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上で、形質転換体を３０℃で選択した。５’コード領域外部のプライマー６６７（配列番号９６）およびＩＬＶ５プロモーター内部のプライマー７４９（配列番号７５）を使用したコロニーＰＣＲによって、形質転換体をスクリーニングして、正しい組み込みを確認した。ＧＡＬ１プロモーター下のＣＲＥリコンビナーゼを含有するｐＬＡ３４（配列番号３５）で形質転換し、ヒスチジン欠損１％エタノール添加合成完全培地上に３０℃で播種することで、ＵＲＡ３マーカーを再循環させた。形質転換体を１％エタノールおよび０．５％ガラクトース添加富栄養培地上に播種して、リコンビナーゼを誘導した。ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上に、コロニーをパッチで植えて成長不在を立証することで、マーカー除去を確認した。ＰＮＹ２１１０と称される、得られた同定株は、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ６６／７１  ２−ｍｉｃｒｏｎ  ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ６Δ：：（ＵＡＳ）ＰＧＫ１−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＫＩＶＤ｜Ｌｇ（ｙ）−ＴＤＨ３ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ａｄｈ１Δ：：Ｐ［ＡＤＨ１］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ：：Ｐ［ＩＬＶ５］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６を有する。
【０１９３】
ＧＰＤ２欠失
内在性ＧＰＤ２コード領域を欠失させるために、縮重ｌｏｘＰ部位で挟まれたＵＲＡ３マーカーを含有するｐＬＡ５９（配列番号２９）から、欠失カセットをＰＣＲ増幅し、生体内で相同組換えして、引き続いてＵＲＡ３マーカーを除去した。ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉと、プライマーＬＡ５１２（配列番号５５）およびＬＡ５１３（配列番号５６）とを使用して、ＰＣＲを実施した。各プライマーのＧＰＤ２部分は、ＵＲＡ３カセット組み込みが、ＧＰＤ２コード領域全体の置換をもたらすように、ＧＰＤ２開始コドンの５０ｂｐ上流の５’領域および停止コドンの５０ｂｐ下流の３’領域から誘導された。標準遺伝子技術を使用してＰＣＲ産物をＰＮＹ２１１０に形質転換し、ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上で、形質転換体を３０℃で選択した。５’コード領域外部のプライマーＬＡ５１６（配列番号５７）およびＵＲＡ３の内部のＬＡ１３５（配列番号２６）を使用したコロニーＰＣＲによって、形質転換体をスクリーニングして正しい組み込みを確認した。次に、ＧＰＤ２コード領域内部のプライマーＬＡ５１４（配列番号５８）およびＬＡ５１５（配列番号５９）を使用したコロニーＰＣＲによって、正の形質転換体をスクリーニングした。ＧＡＬ１プロモーター下のＣＲＥリコンビナーゼを含有するｐＬＡ３４（配列番号３５）で形質転換し、ヒスチジン欠損１％エタノール添加合成完全培地上に３０℃で播種することで、ＵＲＡ３マーカーを再循環させた。形質転換体を１％エタノールおよび０．５％ガラクトース添加富栄養培地上に播種して、リコンビナーゼを誘導した。ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上に、コロニーをパッチで植えて成長不在を立証することで、マーカー除去を確認した。ＰＮＹ２１１５と称される、得られた同定株は、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ６６／７１  ｆｒａ２Δ  ２−ｍｉｃｒｏｎ  ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ６Δ：：（ＵＡＳ）ＰＧＫ１−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＫＩＶＤ｜Ｌｇ（ｙ）−ＴＤＨ３ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ａｄｈ１Δ：：Ｐ［ＡＤＨ１］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ：：Ｐ［ＩＬＶ５］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６を有する。
【０１９４】
ＰＮＹ２１１５からのＰＮＹ２１４５の構築
ｐｄｃ５Δ遺伝子座へのホスホケトラーゼ遺伝子カセットの追加的な組み込みと、ＣＥＮ．ＰＫからのオルソログのコドン最適化バージョンによる天然ＡＭＮ１遺伝子の置換によって、ＰＮＹ２１１５からＰＮＹ２１４５を構築した。組み込みコンストラクトを以下でさらに詳しく説明する。
【０１９５】
ｐｄｃ５Δ：：ＦＢＡ（Ｌ８）−ｘｐｋ１−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６
プライマーＮ１３４１およびＮ１３３８（配列番号１１２および１１３）を使用して、ｐＲＳ４２３：：ＴＥＦ（Ｍ４）−ｘｐｋ１＋ＥＮＯ１−ｅｕｔＤ（配列番号１１１）からのＴＥＦ（Ｍ４）−ｘｐｋ１−ＣＹＣ１ｔ遺伝子をＰＣＲ増幅して、３．１ｋｂの生成物を作成した。プライマーＮ１０３３ｃおよびＮ１３４２（配列番号１１４および１１５）によって、ｌｏｘＰが側面に位置するｐＬＡ５９（配列番号２９）からのＵＲＡ３遺伝子カセットを増幅し、１．６ｋｂの生成物を作成した。Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した追加的な１０サイクルのＰＣＲのために、ｘｐｋ１およびＵＲＡ３ＰＣＲ産物を組み合わせることで、プライマーなしにそれらを融合した。次に得られた反応混合物を、ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉおよびプライマーＮ１３４２およびＮ１３６４（配列番号１１５および１１６）によるＰＣＲ反応のためのテンプレートとして使用した。電気泳動アガロースゲル（Ｚｙｍｏキット）からの精製によって、４．２ｋｂのＰＣＲ産物を回収した。プライマーＮ１３６６およびＮ１３６８（配列番号１１８および１１９）を使用して、ＦＢＡプロモーター変異体Ｌ８（配列番号１１７）を増幅した。ｘｐｋ１：：ＵＲＡ３ＰＣＲ産物は、ＰＣＲの追加的な反復によって、ＦＢＡプロモーターと組み合わせた。得られた生成物をポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、ＥｃｏＲＶで消化され仔ウシ腸管ホスファターゼで処理されたｐＢＲ３２２にライゲートした。連結反応を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＳｔｂｌ３コンピテント細胞）に形質転換した。組み込みカセットは、配列決定によって確認した。組み込みのためのＤＮＡを調製するために、Ｋａｐａ  ＨｉＦｉおよびプライマーＮ１３７１およびＮ１３７２（配列番号１２０および１２１）によるＰＣＲ反応中で、プラスミドをテンプレートとして使用した。フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によって、ＰＣＲ産物を単離した（標準法を使用する；例えばＭａｎｉａｔａｓ，ｅｔ  ａｌ．）。５マイクログラムのＤＮＡを使用して、ＰＮＹ２１１５株を形質転換した。形質転換体をウラシル欠損培地（ウラシル除去合成完全培地、炭素源として１％エタノール添加）上で選択した。プライマーＢＫ９３およびＮ１１１４（配列番号１２２および１２３）によるＰＣＲ（ＪｕｍｐＳｔａｒｔ）を使用して、コロニーを組み込み事象についてスクリーニングした。２つのクローンを選択して、次の段階で使用した。ＧＡＬ１プロモーター下のＣＲＥリコンビナーゼを含有するｐＬＡ２５４（配列番号９７）で形質転換し、ヒスチジン欠損１％エタノール添加合成完全培地上に３０℃で播種することで、ＵＲＡ３マーカーを再循環させた。形質転換体を１％エタノール添加富栄養培地中で培養して、リコンビナーゼを抑制解除した。ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上に、パッチで植えて成長不在を立証することで、単一コロニー単離物についてマーカー除去を確認した。リコンビナーゼプラスミドｐＪＴ２５４の喪失は、ヒスチジン欠損１％エタノール添加合成完全培地上に、コロニーをパッチで植えることで確認した。適切なマーカー除去をＰＣＲ（プライマーＮ１６０ＳｅｑＦ５（配���番号１２４）およびＢＫ３８０（配列番号１２５）によって確認した。得られた１つのクローンは、ＰＮＹ２２９３と命名された。
【０１９６】
ａｍｎ１Δ：：ＡＭＮ１（ｙ）−ｌｏｘＰ７１／６６
ＣＥＮ．ＰＫ２からのＡＭＮ１遺伝子のコドン最適化バージョンで、ＡＭＮ１の内在性コピーを置換するために、ＣＥＮ．ＰＫ  ＡＭＮ１プロモーターと、ＡＭＮ１（ｙ）遺伝子（核酸配列番号９８；アミノ酸配列番号９９翻訳）と、ＣＥＮ．ＰＫＡＭＮ１ターミネーターとを含有する組み込みカセットをＳＯＥ  ＰＣＲによって組み立て、シャトルベクターｐＬＡ５９にサブクローニングした。ＡＭＮ１（ｙ）遺伝子は、ＤＮＡ２．０から注文され、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のためにコドン最適化された。完成したｐＬＡ６７プラスミド（配列番号１００）は、１）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を含有するｐＵＣ１９ベクター主鎖配列；２）ｌｏｘＰ７１およびｌｏｘＰ６６部位で挟まれたＵＲＡ３選択マーカー；および３）ＰＡＭＮ１（ＣＥＮ．ＰＫ）  −ＡＭＮ１（ｙ）−ｔｅｒｍＡＭＮ１（ＣＥＮ．ＰＫ）発現カセットを含有した。
【０１９７】
Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡのＫＡＰＡ  ＨｉＦｉおよびプライマーＬＡ７１２（配列番号１０１）およびＬＡ７４６（配列番号１０２）を使用することで、ＡＭＮ１（ｙ）−ｌｏｘＰ７１−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰ６６カセットのＰＣＲ増幅を実施した。標準遺伝子技術を使用してＰＣＲ産物をＰＮＹ２２９３に形質転換し、ウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上で、形質転換体を３０℃で選択した。対照（ＰＮＹ２２９３）と比較した凝集表現型の不在について、形質転換体を拡大観察した。上述したようにｐＪＴ２５４Ｃｒｅリコンビナーゼプラスミドを使用して、ＵＲＡ３マーカーを再循環させた。マーカー再循環後、クローンを再度拡大観察して、凝集表現型不在を確認した。得られた同定株ＰＮＹ２１４５は、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ５Δ：：Ｐ［ＦＢＡ（Ｌ８）］−ＸＰＫ｜ｘｐｋ１＿Ｌｐ−ＣＹＣｔ−ｌｏｘＰ６６／７１  ｆｒａ２Δ  ２−ｍｉｃｒｏｎ  ｐｌａｓｍｉｄ（ＣＥＮ．ＰＫ２）  ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ６Δ：：（ＵＡＳ）ＰＧＫ１−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＫＩＶＤ｜Ｌｇ（ｙ）−ＴＤＨ３ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ａｄｈ１Δ：：Ｐ［ＡＤＨ１］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ：：Ｐ［ＩＬＶ５］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ａｍｎ１Δ：：ＡＭＮ１（ｙ）を有する。
【０１９８】
ＰＮＹ２１１８およびＰＮＹ２１２０は、どちらも酵母−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シャトルベクターのＰＮＹ２１１５株への形質転換によって構築した。プラスミド形質転換体は、ウラシルまたはヒスチジンを含まず、１％エタノール（ｖ／ｖ）を唯一の炭素源として含有する、合成完全培地上に細胞を播種することで選択した。ＰＮＹ２１１８は、国際公開第２０１２／１２９５５５号パンフレットに記載されるプラスミドｐＹＺ０６７ΔｋｉｖＤΔｈＡＤＨ（配列番号１０３）、そしてｐＨＲ８１−ＩＬＶ５ｐ−Ｋ９ＪＢ４Ｐ（配列番号１０４）が導入されたクローンである。ＰＮＹ２１２０は、プラスミドｐＨＲ８１−ＩＬＶ５ｐ−Ｋ９ＳＢ２−ＳＨ（配列番号１０５）およびｐＹＺ０６７ΔｋｉｖＤΔｈＡＤＨが導入されたクローンである。ｐＨＲ８１−ＩＬＶ５ｐ−Ｋ９ＪＢ４ＰおよびｐＨＲ８１−ＩＬＶ５ｐ−Ｋ９ＳＢ２−ＳＨプラスミドは、ｐＨＲ８１（ＡＴＣＣ、＃８７５４１、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡから入手できる）をベースとして、ＫＡＲＩ発現のための遺伝子を含有する（それぞれ変種Ｋ９ＪＢ４Ｐ、配列番号１０６ｎｔおよび配列番号１０７タンパク質；およびＫ９ＳＢ２−ＳＨ、配列番号１２６）。プラスミドｐＹＺ０６７ΔｋｉｖＤΔｈＡＤＨは、ｐＲＳ４２３（ＡＴＣＣ＃７７１０４から入手できる）に由来して、ＤＨＡＤの発現のための遺伝子を含有する。
【０１９９】
ＰＮＹ２３１８は、ＰＮＹ２１４５をプラスミドｐＬＨ６８９−Ｌ２Ｖ４（配列番号１０８）およびｐＲＳ４１３：：ＢｉＡＤＨ−ｋｉｖＤ（配列番号１０９）で形質転換することで構築された。上述したようにＰＮＹ２１１８およびＰＮＹ２１２０の形質転換体が得られた。プラスミドｐＬＨ６８９−Ｌ２Ｖ４は、ｐＨＲ８１をベースとして、ＫＡＲＩ（Ｋ９ＪＢ４Ｐ変種、アミノ酸配列番号１０７；ＩＬＶ５プロモーター制御下にある）と、ＤＨＡＤ（Ｃ末端Ｌｕｍｉｏ（登録商標）タグを含んでなるＬ２Ｖ４変種、アミノ酸配列番号１２７；ＴＥＦ（Ｍ７）プロモーター制御下にある）との発現のための遺伝子を含有する。プラスミドｐＲＳ４１３：：ＢｉＡＤＨ−ｋｉｖＤは、ｐＲＳ４１３（ＡＴＣＣ＃）をベースとして、  ＢｉＡＤＨ（アミノ酸配列番号１２８；ＰＤＣ１プロモーター制御下にある）と、Ｌ．グレイー（Ｌ．ｇｒａｙｉ）ｋｉｖＤ（アミノ酸配列番号１２９、ＰＧＫ（ＵＡＳ）−ＦＢＡ１雑種プロモーター制御下にある）との発現のための遺伝子を含有する。
【０２００】
実施例１
ＰＮＹ２２７０によるイソブタノール産生
本実施例の目的は、Ｃ２補給剤としてエタノールまたは酢酸のいずれかを含有する成長培地中における、ＰＮＹ２２７０株による成長とイソブタノール産生を実証することである。
【０２０１】
ＰＮＹ２２７０は、プラットフォーム振盪機（２２０ｒｐｍ）内で、０．３％のグルコースと、２ｍＭの酢酸または０．３％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のエタノールのどちらかを添加した合成完全培地中で、好気的に３０℃で培養した（通気式１２５ｍｌフラスコ中の１０ｍｌの培地）。酢酸補給培地中の対数成長速度は、エタノール補給培地よりも４０％高かった。どちらの培地中の培養物も、光学濃度（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＢｉｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＡＧ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙを使用した測定による）がおよそ２になるまで培養した。次に培地を使用して、２％グルコースと、ＢＭＥビタミンと、２ｍＭ酢酸または０．０５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）エタノールのいずれかを添加した、血清バイアル内の合成完全培地（１５ｍｌバイアル内に１０ｍｌの培地）に接種して、０．２のＯＤから開始した。バイアルに栓をして圧着し、プラットフォーム振盪機（２２０ｒｐｍ）内において３０℃で培養した。４８時間後、圧着および栓を除去して光学濃度を測定し、培養濾液をイソブタノール生成についてＨＰＬＣで分析した。
【０２０２】
酢酸を含有する培地中で培養された株は、酢酸を含まない培地中で培養された株より高い濃度でイソブタノールを産生することが分かった（結果は下の表２に示される）。
【０２０３】
【表４】
2015510774.tif 000006
【０２０４】
実施例２
ＰＮＹ２０９２によるイソブタノール産生
本実施例の目的は、Ｃ２補給剤としてエタノールまたは酢酸のいずれかを含有する成長培地中における、ＰＮＹ２０９２株による成長とイソブタノール産生を実証することである。
【０２０５】
ＰＮＹ２０９２は、プラットフォーム振盪機（２２０ｒｐｍ）内で、０．３％のグルコースと、２ｍＭの酢酸または０．３％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のエタノールのどちらかを添加した合成完全培地中で、好気的に３０℃で培養した（通気式１２５ｍｌフラスコ中の１０ｍｌの培地）。酢酸補給培地中の対数成長速度は、エタノール補給培地よりも高かった。どちらの培地中の培養物も、光学濃度（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＢｉｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＡＧ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙを使用した測定による）がおよそ２になるまで培養した。次に培地を使用して、２％グルコースと、ＢＭＥビタミンと、２ｍＭ酢酸または０．０５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）エタノールのいずれかを添加した、血清バイアル内の合成完全培地（１５ｍｌバイアル内に１０ｍｌの培地）に接種して、０．２のＯＤから開始した。バイアルに栓をして圧着し、プラットフォーム振盪機（２２０ｒｐｍ）内において３０℃で培養した。４８時間後、圧着および栓を除去して光学濃度を測定し、培養濾液をＨＰＬＣで分析した。
【０２０６】
酢酸を含有する培地中で培養された株は、酢酸を含まない培地中で培養された株より高い濃度でイソブタノールを産生することが分かった（結果は下の表３に示される）。
【０２０７】
【表５】
2015510774.tif 000007
【０２０８】
実施例４
ＰＮＹ２１１８株およびＰＮＹ２１２０株によるイソブタノール産生
本実施例の目的は、Ｃ２補給剤としてエタノールまたは酢酸のいずれかを含有する培地中における、ＰＮＹ２１１８株およびＰＮＹ２１２０株によるイソブタノール産生を実証することである。
【０２０９】
株を培養して、次に、４７．３時間めの分析のためにサンプルを収集したこと以外は、実施例２で上述したように、血清バイアル内のイソブタノール生成について評価した。
【０２１０】
【表６】
2015510774.tif 000008
【０２１１】
実施例５
ＰＮＹ２３１８によるイソブタノール産生
本実施例の目的は、Ｃ２補給剤としてエタノールまたは酢酸のいずれかを含有する培地中における、ＰＮＹ２３１８株による成長とイソブタノール産生を実証することである。
【０２１２】
株を培養して、次に、上述の実験（実施例２および３）と同様にして、血清バイアル内のイソブタノール生成について評価した。この場合、ＰＮＹ２３１８は、成長のためのＣ２補給を要求しない。したがって株をＣ２ありまたはなしで培養し、次に再度Ｃ２ありまたはなしで血清バイアル内に接種した。サンプルを３６時間めの分析のために収集した。
【０２１３】
【表７】
2015510774.tif 000009
【図１】
2015510774.tif 000010
【図２】
2015510774.tif 000011
【配列表】
2015510774000001.app
【国際調査報告】
2015510774.tif 000012
2015510774.tif 000013
2015510774.tif 000014