(57)【要約】本発明は、組成物中のリボ核酸の配列および／または量を決定するキットおよび方法に関するものであって、以下の工程：ｉ．リボ核酸分子（ＲＮＡ）を含む組成物を提供する工程、ｉｉ．２つの部分の核酸ハイブリダイゼーションプローブを、ＲＮＡとハイブリダイズさせる工程であって、ここで、プローブの各々が、ａ．３’テールを有する第一の核酸分子であって、テールが、組成物中のＲＮＡとハイブリダイズしない第一の核酸分子と、ｂ．５’テールを有する第二の核酸分子であって、テールが、組成物中のＲＮＡとハイブリダイズしない第二の核酸分子とを含み、ｉｉｉ．ハイブリダイズされた第一の核酸分子を、ハイブリダイズされた第二の核酸と共有結合させる工程、ｉｖ．第一の核酸分子の第一の３’テールおよび第二の核酸分子の第二の５’テールに特異的であるプライマーを用いて、結合した分子を増幅する工程などを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物中のリボ核酸の配列および／または量を決定する方法であって、以下の工程：
ｉ．１つまたはそれより多くのリボ核酸分子（ＲＮＡ）を含む組成物を提供する工程、
ｉｉ．１つまたはそれより多くの２つの部分の核酸ハイブリダイゼーションプローブを、該１つまたはそれより多くのＲＮＡとハイブリダイズさせる工程であって、ここで、該プローブの各々が、
ａ．３’テールを有する第一の核酸分子（ＤＮＡ）であって、該テールが、該組成物中のＲＮＡとハイブリダイズしない、第一の核酸分子と、
ｂ．５’テールを有する第二の核酸分子（ＤＮＡ）であって、該テールが、該組成物中のＲＮＡとハイブリダイズしない、第二の核酸分子とを含み、
ｃ．ここで、該第一および該第二の核酸分子が、それらの標的ＲＮＡとハイブリダイズする場合、２〜１０００ヌクレオチドの間で互いに離れた単一の１本鎖ＲＮＡ分子にある、工程、
ｉｉｉ．該ハイブリダイズされた第一の核酸分子を、該ハイブリダイズされた第二の核酸と共有結合させる工程であって、該結合は、逆転写およびその後のライゲーションによって行われる、工程、
ｉｖ．該第一の核酸分子の該第一の３’テールおよび該第二の核酸分子の該第二の５’テールに特異的であるプライマーを用いて、該結合した分子を増幅する工程、
ｖ．該増幅工程（ｉｖ）の前に、増幅産物を配列決定する工程を包含し、
ｖｉ．標的ＲＮＡのハイブリッドおよび工程（ｉｉｉ）の結合した分子が、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドに特異的である抗体を用いて該ハイブリッドを捕捉することにより単離される、方法。
【請求項２】
前記ＲＮＡが、前記増幅工程（ｉｖ）の前に酵素的に消化される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第一および第二の核酸分子のテールが、１０〜５０ヌクレオチドの間である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第一の核酸分子および／または第二の核酸分子が、前記標的ＲＮＡと結合しないことが確認されたさらなるバーコード配列を含み、該配列が３〜２０の間の長さである、請求項１〜３いずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記第一の核酸分子および前記第二の核酸分子が、ヒトの核酸配列、ウイルスの配列、細菌の配列、動物の配列および植物の配列からなる群から選択される核酸配列に特異的である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記配列が、ｍＲＮＡ配列、エクソン−エクソン接合部ならびに／または５’および３’ＵＴＲ領域である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
適用される次世代配列決定法が、合成による配列決定、ピロシークエンシング、サンガー配列決定、オリゴライゲーションによる配列決定、半導体技術または１分子リアルタイム（ＳＭＲＴＴＭ）配列決定からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
３’テールを有する第一の核酸分子であって、該テールが前記組成物中のＲＮＡとハイブリダイズしない第一の核酸分子および５’テールを有する第二の核酸分子であって、該テールが前記組成物中のＲＮＡとハイブリダイズしない第二の核酸分子の濃度が、１ｆＭ〜１０００ｎＭの間である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ｉ．３’テールを有する第一の核酸分子（ＤＮＡ）であって、該テールが前記組成物中のＲＮＡとハイブリダイズしない第一の核酸分子、
ｉｉ．５’テールを有する第二の核酸分子（ＤＮＡ）であって、該テールが前記組成物中のＲＮＡとハイブリダイズしない第二の核酸分子、
ｉｉｉ．二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド分子に特異的である抗体、
および
ｉｖ．逆転写酵素および／またはＤＮＡリガーゼを含み、ここで、該第一および該第二の核酸分子が、それらの標的ＲＮＡとハイブリダイズする場合、２〜１０００ヌクレオチドの間で互いに離れた単一の１本鎖ＲＮＡ分子上にある、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学、診断学、および、より具体的には発現プロファイリングの分野である。
【背景技術】
【０００２】
長年にわたって、トランスクリプトーム分析の分野における研究は、ノーザンブロット法を使用するＲＮＡの候補遺伝子に基づいた検出から、マイクロアレイの到来によって駆り立てられた高処理量の発現プロファイリングへと進歩してきた。２００６年以来、次世代シークエンシング技術は、高処理量発現データが１塩基分解能で取得される細胞のトランスクリプトームの多次元的な検査の機会を提供することによって、トランスクリプトミクスに革命をもたらした。表１に、遺伝子発現プロファイリングのマイルストーンを要約する。
【０００３】
【表１Ａ】
2015500012.tif 000002
【０００４】
【表１Ｂ】
2015500012.tif 000003
多数のプロトコルおよび市販キットが、次世代配列決定による、ｍＲＮＡ配列決定（ｍＲＮＡ−ｓｅｑ）のため開発されてきた。通常、標準のトランスクリプトーム分析のフローチャートは、１１の工程を含む（工程の数および順序は、いくつかのプロトコルおよびプラットフォームについてわずかに異なり得る。ＲＮＡのライゲーションに基づく小ＲＮＡ配列決定のためのライブラリプロトコルは、異なるワークフローに従いうための、ここでは考慮されない）：
（１）全ＲＮＡの単離；
（２）ｒＲＮＡの除去および／またはｍＲＮＡの濃縮
（３）断片化およびサイズ選択
（４）逆転写酵素反応によるｃＤＮＡの合成
（５）第二鎖ＤＮＡ合成
（６）末端修復
（７）アダプターライゲーション
（８）断片ライブラリのＰＣＲ濃縮
（９）その後の配列決定のためのクラスター生成（例えば、ｅｍＰＣＲまたは架橋増幅（ｂｒｉｄｇｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ））
（１０）配列決定および
（１１）データ分析
全ＲＮＡの大部分は、ｒＲＮＡ分子からなるため、ｍＲＮＡの濃縮および／またはｒＲＮＡの除去は、成功したｃＤＮＡライブラリの生成および最小の重複性での配列決定の重要な工程である。
【０００５】
ヒトのような複雑な生物の全てのトランスクリプトームプロファイリングについて、多くの配列決定リードが行われなければならない。ヒトのトランスクリプトームについて、Ｉｌｌｍｉｎａ配列決定プラットフォームにおいて導出される実験データに基づいて、表２は、明確な分析目標についての要求されるリード数および配列決定戦略の概要を示す。
【０００６】
【表２】
2015500012.tif 000004
次世代配列決定プラットフォームおける大量並行（ｍａｓｓｉｖｅ  ｐａｒａｌｌｅｌ）配列決定についての非常に高い能力、およびゲノミクス分野における全世界の努力は、ヒトゲノムおよびその発現プロファイルについての現代の知識の極めて大きな改善へと導いた。したがって、スプライシング変異体を含むほとんどすべての転写物が、たった数年で発見されると予測される。
【０００７】
しかしながら、複雑なトランスクリプトームの完全な分析は、いまだ費用がかかり、労働集約的であり、生物学的かつ医学的に関連する情報のデータ分析および抽出を含む。
【０００８】
さらに、ＲＮＡの抽出から始まり、配列決定までの多くの作業工程は、時間がかかり、間違えやすく、比較研究を難しくする。最終的には、多くのＮＧＳ装置は、１度の配列決定の実行の範囲内で、すべての複雑なトランスクリプトームについて十分なリードを行う能力を有していない。
【０００９】
本発明は、当該分野における以下の改善を達成し、それは、作業工程の数の減少によって、ＮＧＳ装置におけるＲＮＡ配列決定のための試料調製の顕著な改善へと導き、ｍＲＮＡの濃縮／精製、ｒＲＮＡの除去を必要としない。アダプターライゲーションは必要ない。当該方法は、現在、標的遺伝子の発現プロファイリング（遺伝子パネル指向アッセイ（ｇｅｎｅ  ｐａｎｅｌ  ｏｒｉｅｎｔｅｄ  ａｓｓａｙｓ））によって、配列決定の能力が制限されるＮＧＳ装置に対処し、当該方法は、インデックス化（ｉｎｄｅｘｉｎｇ）、遺伝子発現レベルの分析、既知（実施例１および２）および未知（実施例３）のスプライス部位の変異体の分析、ならびにそれらの定量化によって、多重分析を可能とし、当該定量化には、１塩基分解能、およびそれによるＳＮＰの検出（実施例３を参照）を含む。当該方法は、大きなデジタルダイナミックレンジを提供する。
【００１０】
さらに、特許文献１とは対照的に、補助を必要とせず、検出されるハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドよりもむしろ重要である、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＲＮＡの配列が決定される。この違いは非常に重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第７，３６１，４８８号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
定義
本明細書中の「組成物」は、少なくとも１つまたはそれよりも多くのリボ核酸分子を含む水性溶液である。
【００１３】
「３’テールを有する第一の核酸分子であって、上記（該）テールは、組成物中のＲＮＡとハイブリダイズしない、第一の核酸分子」とは、標的が組成物中に存在する場合、第一の部分がそのＲＮＡの標的と（特異的に）結合することが可能であり、第二の部分が組成物中のＲＮＡと結合しない２つの部分を有するオリゴヌクレオチドである。
【００１４】
「５’テールを有する第二の核酸分子であって、上記（該）テールは、組成物中のＲＮＡとハイブリダイズしない、第二の核酸分子」とは、標的が組成物中に存在する場合、第一の部分がそのＲＮＡの標的と（特異的に）結合することが可能であり、第二の部分が組成物中のＲＮＡと結合しない２つの部分を有するオリゴヌクレオチドである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
図面の説明
【図１Ａ】全トランスクリプトームライブラリの生成および配列決定についての標準的なＲＮＡの試料調製のワークフローが示される。Ｂ．本発明の実施例１についての簡略化されたワークフロー。捕捉ＤＮＡプローブは、標的ｍＲＮＡとの相同性を有するヌクレオチドの配列（薄青、濃青および茶のレーン）とトランスクリプトームとの相同性を有さない５’ユニバーサルアダプターテール（赤）とトランスクリプトームとの相同性を有さない３’ユニバーサルアダプターテール（緑）とからなる。ハイブリダイゼーション後のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは、常磁性のビーズに結合した抗体（青のＹ）によって捕捉される。最終的に、捕捉されたオリゴヌクレオチドのライブラリは、ユニバーサルプライマーを用いて増幅され、クラスター生成、配列決定プライマーのアニーリング、および必要に応じて試料のマルチプレックス（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ）化を可能とするインデックス化のための配列モチーフを導入する。
【図１Ｂ】全トランスクリプトームライブラリの生成および配列決定についての標準的なＲＮＡの試料調製のワークフローが示される。Ｂ．本発明の実施例１についての簡略化されたワークフロー。捕捉ＤＮＡプローブは、標的ｍＲＮＡとの相同性を有するヌクレオチドの配列（薄青、濃青および茶のレーン）とトランスクリプトームとの相同性を有さない５’ユニバーサルアダプターテール（赤）とトランスクリプトームとの相同性を有さない３’ユニバーサルアダプターテール（緑）とからなる。ハイブリダイゼーション後のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは、常磁性のビーズに結合した抗体（青のＹ）によって捕捉される。最終的に、捕捉されたオリゴヌクレオチドのライブラリは、ユニバーサルプライマーを用いて増幅され、クラスター生成、配列決定プライマーのアニーリング、および必要に応じて試料のマルチプレックス（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ）化を可能とするインデックス化のための配列モチーフを導入する。
【図２】実施例１−実験１についての実験ワークフローが示されている。２桁の幅における様々な量のプローブは、一定量の全ＲＮＡとハイブリダイズした。捕捉実験の結果は、捕捉されたプローブおよびｍＲＮＡ（標的および非特異的）両方の定量による２つの独立した実験において分析された。
【図３Ａ】２つの異なる実験（上段：１回目の実験、下段：繰り返された２回目の実験）に由来する捕捉されたハイブリダイゼーションプローブの増幅プロット（左）および融解曲線（右）が示されている。類似する増幅曲線およびｃｔ値は、捕捉されたオリゴプローブの量が類似していることを示している。融解曲線は、ハイブリダイゼーション前のオリゴ混合物と類似する。これは、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ後に得られる増幅プロットが、使用されるプローブに特異的であることを示している。
【図３Ｂ】２つの異なる実験（上段：１回目の実験、下段：繰り返された２回目の実験）に由来する捕捉されたハイブリダイゼーションプローブの増幅プロット（左）および融解曲線（右）が示されている。類似する増幅曲線およびｃｔ値は、捕捉されたオリゴプローブの量が類似していることを示している。融解曲線は、ハイブリダイゼーション前のオリゴ混合物と類似する。これは、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ後に得られる増幅プロットが、使用されるプローブに特異的であることを示している。
【図４Ａ】２つの独立した実験（上段：１回目の実験；下段：２回目の実験）のＳｙｂｒＧｒｅｅｎの増幅プロットが示されている。左：ＡＣＴ  ｃＤＮＡ（標的領域）の増幅プロット。右：ＲＰＴ１３ａ  ｃＤＮＡ（標的外の領域）についての増幅プロット。Ｋで示されるコントロールの反応は、ハイブリダイゼーションしていない２００ｎｇの全ＲＮＡを使用して、ｃＤＮＡの合成後に行われた。コントロールの反応のためのテンプレートの量は、ハイブリダイゼーション後に得られる量と比較できない。それゆえ、ｃｔ値も同様に比較できない。
【図４Ｂ】２つの独立した実験（上段：１回目の実験；下段：２回目の実験）のＳｙｂｒＧｒｅｅｎの増幅プロットが示されている。左：ＡＣＴ  ｃＤＮＡ（標的領域）の増幅プロット。右：ＲＰＴ１３ａ  ｃＤＮＡ（標的外の領域）についての増幅プロット。Ｋで示されるコントロールの反応は、ハイブリダイゼーションしていない２００ｎｇの全ＲＮＡを使用して、ｃＤＮＡの合成後に行われた。コントロールの反応のためのテンプレートの量は、ハイブリダイゼーション後に得られる量と比較できない。それゆえ、ｃｔ値も同様に比較できない。
【００１６】
捕捉されたＡＣＴ  ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡの増幅プロットおよびｃｔ値は、非常に類似しており、ハイブリダイゼーションで使用されたプローブの量に依存しない。標的外の領域（ＲＰＬ１３ａ  ｍＲＮＡ）由来のｃＤＮＡについての増幅プロットおよびｃｔ値は、ネガティブコントロール（プローブのないハイブリダイゼーション）と同一であり、成功した標的ＲＮＡの濃縮を示している。ネガティブコントロールの増幅曲線の原因は、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ  ＰＣＲの性質および／またはビーズによるプローブなしでのある程度の非特異的な捕捉において見られ得る。
【図５】ハイブリダイゼーション後のｑＰＣＲデータおよび標的および標的外のｍＲＮＡの逆転写酵素（ＲＴ）反応のカラムチャートが、示されている。
【図６】実施例１−実験２についての実験ワークフローが示されている。５０ｎｇ〜１０００ｎｇの間の幅の様々な量の全ＲＮＡを、０．７ｎｍｏｌの捕捉プローブ混合物（それぞれ５．５ｐｍｏｌ）とハイブリダイズさせた。捕捉されたプローブは、実験１のように、それぞれＳｙｂｒＧｒｅｅｎ  ｑＰＣＲまたは逆転写酵素反応およびＳｙｂｒＧｒｅｅｎ  ｑＰＣＲによって、正確に分析された。
【図７】捕捉されたプローブオリゴ（ｐｒｏｂｅ  ｏｌｉｇｏ）の定量についての２つの独立した実験のＳｙｂｒＧｒｅｅｎ  ｑＰＣＲの結果が示されている。ｑＰＣＲは、プローブのテール状の（ｔａｉｌｅｄ）配列のホモログであるプライマーを使用して行われた。ｃｔ値の決定に加えて、解離曲線は、ＰＣＲ産物の特異性を示すように作られた（詳細については、添付のＲＳＥ０２０５のプロトコルを参照のこと）。残念ながら、テンプレートなしでのＰＣＲの実験は、部分的に増幅産物を生じさせた。しかしながら、これらのコントロールについて得られたｃｔ値は、テンプレートを有する試料について得られるｃｔ値と比較して顕著に高く、それゆえ、本発明者らは、その結果に対する有意な影響を予期しない。
【図８】図８は、選択されたＲＮＡのＲＴ−ｑＰＣＲの結果を示している。ＡＣＴ遺伝子のｍＲＮＡは、標的ＲＮＡの検出のために選ばれ、標的外としてＲＰＬ１３ａ遺伝子のｍＲＮＡと比較した。捕捉されたＲＰＬ１３ａのｍＲＮＡの収量は、ほとんど均一のままである一方で、ＡＣＴ遺伝子の捕捉されたｍＲＮＡの収量は、ハイブリダイゼーションに使用される全ＲＮＡの量と相関する。
【００１７】
捕捉されたＲＮＡの逆転写後のランダムの９ｍｅｒのプライマーを用いたＳｙｂｒＧｒｅｅｎ  ｑＰＣＲの結果が示されている。減少したｃｔ値によって示されるように、ＲＮＡの量の増加にともなって、捕捉されたＲＮＡの収量が増加した。ハイブリダイゼーションに使用される全ＲＮＡの量および捕捉された標的ＲＮＡ（ＡＣＴ遺伝子からのｍＲＮＡの検出）が、強い相関を示す一方で、ＲＰＬ１３ａ遺伝子からの標的外のｍＲＮＡの収量は、ほとんど一定のままである。２倍量の全ＲＮＡとのハイブリダイゼーションは、標的ＲＮＡについて約−１のデルタｃｔ値にした。ハイブリダイゼーションが行われない試料について得られるｃｔ値は、使用されるＲＮＡの量が異なるために、捕捉実験から得られたデータと比較し得ない。
【図９】本発明の実施例２についての一般的なワークフローが示されている。ハイブリダイゼーションおよびライゲーションが媒介する遺伝子発現プロファイリング。青、黒、茶およびピンクの長いレーンは、標的ｍＲＮＡを示している。同じ色における短いレーンおよび矢印は、標的に対して逆相補的なオリゴプローブを示している。オリゴＡの５’末端のリン酸化は、示されていない。赤および緑の短いレーンおよび矢印は、それぞれ、プローブのユニバーサル５’および３’テールを示している。濃縮ＰＣＲおよび特異的な末端を配列決定するためのプライマーは、それぞれ赤および黄または緑および薄青で示されており、プローブのテールに対する相同性を示す。
【図１０】結果の予測を含むＲＮＡテンプレート上のハイブリダイゼーション後のオリゴヌクレオチドのライゲーションについての実験計画が、示されている。矢印およびレーンの同じ色は、相同配列を有するプライマーおよびプローブを示している。プローブＤＤＸ５６ＡおよびＤＤＸ６７Ａの５’末端のリン酸化は、示されていない。
【図１１】異なるバッファーの系におけるＳｙｂｒＧｒｅｅｎ  ＰＣＲ後のＲＮＡテンプレートＤＤＸ５６およびＤＤＸ６７上のハイブリダイズおよび連結されたオリゴプローブＤＤＸ６７Ａ＋Ｂのｃｔ値が、示されている。
【図１２】本発明の実施例３についてのワークフローの模式図が示されている。
【図１３】本発明の実施例３−実験４についてのワークフローが示されている。
【図１４】ＰＣＲ濃縮（エンドポイントＰＣＲ（ｅｎｄｐｏｉｎｔ  ＰＣＲ））後の生成されるプローブのＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００の分析が示されている。緑でタグをつけられたＰＣＲプライマーのペアで示される断片は、分析できると予測され、赤でタグをつけられたプライマーのペアで示される断片は、分析できない予測された。予測された断片のみが正しいサイズで検出された。
【図１５】図１５〜２０は、成功した融合プローブオリゴの配列クロマトグラムを示している。すべてのＰＣＲ断片は、ＰＣＲ増幅プライマーを使用して、両方の鎖上で配列決定された。すべての場合において、予測された配列が発見され、ＲＴポリメラーゼおよびリガーゼ反応の正確さを示した。ハイブリダイゼーション：  Ａ１テンプレート：  ＲＮＡ  ＤＤＸ５６  プローブ：  ＤＤＸ５６Ｅ＋Ｆ配列決定プライマー：  Ｍ１３ｆ
【図１６】ハイブリダイゼーション：  Ａ２テンプレート：  ＲＮＡ  ＤＤＸ６７  プローブ：  ＤＤＸ６７Ｅ＋Ｆ配列決定プライマー：  ｐＵＣＦ
【図１７】ハイブリダイゼーション：  Ｂ１テンプレート：  ＲＮＡ  ＤＤＸ５６  プローブ：  ＤＤＸ５６Ｃ＋Ｄ配列決定プライマー：  ｐＵＣＦ
【図１８】ハイブリダイゼーション：  Ｂ２テンプレート：  ＲＮＡ  ＤＤＸ６７  プローブ：  ＤＤＸ６７Ｇ＋Ｈ配列決定プライマー：  Ｍ１３ｆ
【図１９】ハイブリダイゼーション：  Ｃ１テンプレート：  ＲＮＡ  ＤＤＸ５６  プローブ：  ＤＤＸ５６Ｅ＋Ｆ配列決定プライマー：  Ｍ１３ｆ
【図２０】ハイブリダイゼーション：  Ｃ２テンプレート：  ＲＮＡ  ＤＤＸ６７  プローブ：  ＤＤＸ６７Ｊ＋Ｋ配列決定プライマー：  ｐＵＣＦ
【図２１】本発明（実施例３）のワークフローの模式図。Ｉ．全ＲＮＡ。ＩＩ．標的に特異的なＤＮＡプローブの混合物との全ＲＮＡのハイブリダイゼーション。テール状のプローブＡおよびＢは、それらの標的に対して、ある距離においてマッチする。ＩＩＩ．ＡＴＰ存在下でのＲＴポリメラーゼ反応およびライゲーションによって、オリゴヌクレオチドＡおよびＢの間のギャップを埋める。プローブＢの５’末端のリン酸化は、示されていない。ＩＶ．抗体に基づいたＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの精製による、新しく合成されたｃＤＮＡ分子の濃縮。Ｖ．変性およびＲＮＡｓｅ処置による新しく合成されたＤＮＡの遊離。ＶＩ．配列決定前のＰＣＲによる標的ｃＤＮＡの濃縮。
【図２２】バーコードが付されたプローブの分子とのＲＮＡのハイブリダイゼーション。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の詳細な説明
本発明は、組成物中のリボ核酸の配列の決定および／または定量の方法において、リボ核酸の配列の決定および／または定量の方法に関するものであって、この方法は以下の工程：
（ｉ）１つまたはそれより多くのリボ核酸分子（ＲＮＡ）を含む組成物を提供する工程、
（ｉｉ）１つまたはそれより多くの２つの部分の核酸ハイブリダイゼーションプローブを、上記１つまたはそれより多くのＲＮＡとハイブリダイズさせる工程であって、ここで、上記プローブの各々が、
（ａ）３’テールを有する第一の核酸分子（ＤＮＡ）であって、上記テールが、上記組成物中のＲＮＡとハイブリダイズしない、第一の核酸分子と、
（ｂ）５’テールを有する第二の核酸分子（ＤＮＡ）であって、上記テールが、上記組成物中のＲＮＡとハイブリダイズしない、第二の核酸分子とを含み、
（ｃ）ここで、上記第一および上記第二の核酸分子が、それらの標的ＲＮＡとハイブリダイズする場合、２〜１０００ヌクレオチドの間で互いに離れた単一の１本鎖ＲＮＡ分子にある、工程、
（ｉｉｉ）ハイブリダイズされた第一の核酸分子を、ハイブリダイズされた第二の核酸と共有結合させる工程であって、上記結合は、逆転写およびその後のライゲーションによって行われる、工程、
（ｉｖ）上記第一の核酸分子の上記第一の３’テールおよび上記第二の核酸分子の上記第二の５’テールに特異的であるプライマーを用いて、結合した分子を増幅する工程、
（ｖ）好ましくは、次世代配列決定によって、増幅工程（ｉｖ）の前に、増幅産物を配列決定する工程を包含し、
（ｖｉ）標的ＲＮＡのハイブリッドおよび工程（ｉｉｉ）の結合した分子が、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドに特異的である抗体を用いて上記ハイブリッドを捕捉することにより単離される。
【００１９】
上記２つの核酸分子は、理想的には２〜１０００の間、５〜５００の間、最も好ましくは３５〜１５０ヌクレオチドの間で離される。２つの分子は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であるか、または抗体が、機能的で、かつハイブリッドと結合するようなＤＮＡを含む。
【００２０】
米国特許第７、３６１、４８８号は、ＲＮＡの標的とハイブリダイズした核酸プローブが、一緒に連結され、その後増幅され、そして検出される方法を開示する。この方法の欠点は、もともと反応に加えられたプローブによって、検出が行われることである。新規のｉｎ  ｖｉｖｏの配列が、決定されず（既知の配列のみが検出可能である）、特定のＲＮＡが存在していたというプローブの検出に基づいて、誰かが推測しなければならなく、検出は、単に間接的なだけである。新規かつ未知の配列は、検出することができない。しかし、そのＲＮＡが存在していたのか。米国特許第７、３６１、４８８号の方法を使用する場合、それは不明なままである。本発明は、セクションの工程が、例えばｍＲＮＡ転写物からの定められたＲＮＡの範囲の実際の配列決定を初めて可能とし、この問題を解決する。
【００２１】
本発明のプローブおよびプライマーは、ポリアデニル化ｍＲＮＡの標的配列またはその他の種からのＲＮＡと、本発明のプローブとのハイブリダイゼーションが生じるように、ポリアデニル化ｍＲＮＡの標的配列または別の種からのＲＮＡと少なくとも相補的である部分を有するように設計される。以下で、概説するように、相補性は完全である必要はない；任意の数のミスマッチの塩基対（ｂａｓｅ  ｐｅｒ）が存在し得、このミスマッチにより、本発明の１本鎖核酸におけるポリアデニル化ｍＲＮＡの標的配列の間のハイブリダイゼーションが評価される（ｉｎｔｅｒｖｉｅｗ）。しかしながら、変異の数が多すぎるために、ハイブリダイゼーションが起こり得ない場合、その配列は、相補的なポリアデニル化ｍＲＮＡの標的配列ではない（同じことが別の種からのＲＮＡにあてはまる）。それゆえ、請求項１に記載のプローブは、本明細書において、そのプローブが、通常の反応条件下でハイブリダイズするために、ポリアデニル化ｍＲＮＡ（またはその他の種からのＲＮＡ）と十分に相補的であることを意味する「実質的に相補的」でなければならなく、好ましくは要求される特異性を与えなければならない。
【００２２】
高、中および低ハイブリダイゼーションの条件を含む様々なハイブリダイゼーションの条件が、本発明において使用され得る；例えばＭａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｎｇ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９８９およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙのショートプロトコルを参照のこと。
【００２３】
ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、異なる環境において異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般的には、ストリンジェントな条件は、決まったイオン強度での特異的な配列の熱融点（ｔｈｅｒｍａｌ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ）（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低くなるように選択される。Ｔｍは、標的と相補的であるプローブの５０％が、平衡状態でポリアデニル化ｍＲＮＡの標的配列とハイブリダイズする温度（決まったイオン強度、ｐＨ、核酸濃度下）である（標的配列が、Ｔｍで過剰に存在する場合、プローブの５０％が平衡状態で占有されている）。ストリンジェントな条件は、ｐＨ７〜８．３で、塩濃度が約１．０Ｍ未満のナトリウムイオンであり、典型的には約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、温度は、短いプローブ（例えば１０〜５０ヌクレオチド）について少なくとも約３０℃であり、そして長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドよりも長い）については少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件は、らせん不安定化剤の添加（ｕｄｉｔｉｏｎ）によっても、本明細書中に優先的に達成され得る。
【００２４】
上で指定されるような方法は、本明細書中において、特に多重様式において使用される標的プローブとも呼ばれる多数の２つの部分の核酸ハイブリダイゼーションプローブを使用する。複数のこれらのプローブが使用され、１０またはそれより多くのそのようなプローブを意味する。好ましくは、１５〜１００の間、さらに好ましくは、１００〜５００の間、さらに好ましくは１００〜１０００の間である。
【００２５】
上で概説したように、第一の核酸分子は、３’テールを有しており、第二の核酸分子は５’テールを有している。これらは、いわゆるユニバーサルプライミング部位（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｓｉｔｅ）である。「ユニバーサルプライミング部位」とは、本明細書中では、増幅のためのＰＣＲプライマーと結合するプローブの配列が意味する。それぞれのプローブは、好ましくは、上流のユニバーサルプライミング部位および下流のユニバーサルプライミング部位を含む。本明細書中において、これらは、上記第一の核酸分子および上記第二の核酸分子に位置する。また、「上流」および「下流」は、特定の５’または３’の方向を意味するものではなく、系の方向に依存する。好ましくは、単一の上流ユニバーサルプライミング部位および単一の下流ユニバーサルプライミング部位のみが、上記プローブにおいて使用される。これらの配列は、一般的に、特定のアッセイおよび宿主ゲノムを考慮して、できる限り特有になるように選ばれ、そのアッセイの特異性を保証する。
【００２６】
ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドに特異的である抗体を用いて、上記ハイブリッドを捕捉することによって単離が行われ、上記抗体が、磁性粒子のようなある種の固体相に結合することが好まれる。
【００２７】
ＲＮＡが、増幅工程（ｉｖ）の前に酵素的に消化される場合、さらに優れた結果が達成される。
【００２８】
３’テールを有する第一の核酸分子であって、上記テールが組成物中のＲＮＡとハイブリダイズしない第一の核酸分子、および５’テールを有する第二の核酸分子であって、上記テールが組成物中のＲＮＡとハイブリダイズしない第二の核酸分子の長さは、好ましくは、５〜１００ヌクレオチドの間、好ましくは１０〜５０ヌクレオチドの間、さらに好ましくは１５〜３０ヌクレオチドの間である。
【００２９】
これらの分子のテールであって、上記テールが組成物中のＲＮＡとハイブリダイズしないテールは、好ましくは、５〜１００ヌクレオチドの間、好ましくは１０〜５０の間、さらに好ましくは１５〜３０ヌクレオチドの間である。
【００３０】
１つの任意選択の実施形態において、第一の核酸分子および／または第二の核酸分子は、標的ＲＮＡと結合しないことが確認されたさらなるバーコード配列を含む（図２２も参照のこと）。
【００３１】
このさらなるバーコード配列は、好ましくは、５〜６ヌクレオチドの長さであり、それは３〜２０、５〜８ヌクレオチドの間の長さであり得る。その他の長さも想定され得る。
【００３２】
これらの分子のバーコードは、プローブのユニバーサルテールと特定の標的配列との間のランダムなヌクレオチドの導入によって、生成される。それは、標的ＲＮＡ分子由来の断片と、配列の偏りを生じさせるＰＣＲ増幅中に生成されるコピーとの間の識別を可能とする（図２２）。そのようなバーコードは、それぞれプローブＡまたはＢの両方に組み込まれ得る。例えば：５個のランダムのヌクレオチドからなるバーコードは、最大で４５＝１０２４のＲＮＡ分子のコピーの識別を可能とし、４５個のランダムのヌクレオチドを有する２つのバーコードは、それぞれ、４５*４５＝１、０４８、５７６分子の識別を可能とする。
【００３３】
３’テールを有する第一の核酸分子であって、上記テールが組成物中のＲＮＡとハイブリダイズしない第一の核酸分子、および５’テールを有する第二の核酸分子であって、上記テールが組成物中のＲＮＡとハイブリダイズしない第二の核酸分子は、ヒトの核酸配列、ウイルスの配列、細菌の配列、動物の配列および植物の配列からなる群から選択される核酸配列に特異的である。それゆえ、その特異的な配列は、ヒトの核酸配列、ウイルスの配列、細菌の配列、動物の配列および植物の配列に特異的であり得る。
【００３４】
本発明のプローブおよびプライマーは、ハイブリダイゼーションが生じ得るように、ポリＡ関連ｍＲＮＡの標的配列または別の種からのＲＮＡと少なくとも相補的である部分を有するように設計される。
【００３５】
好ましくは、特異的である配列は、ｍＲＮＡであり、それは、エクソン−エクソン接合部ならびに／または５’および３’ＵＴＲ領域であり得る。
【００３６】
好ましくは、適用される次世代配列決定法は、
（ｉ）Ｉｌｌｕｍｉｎａ：ＨｉＳｅｑ  ２０００、  ＨｉＳｅｑ  １０００、  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩｘ、  ＭｉＳｅｑ、  ＨｉＳｃａｎＳＱ（化学：合成による配列決定）、
（ｉｉ）Ｒｏｃｈｅ：Ｒｏｃｈｅ  ４５４  ＦＬＸ、  ＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒ（化学：ピロシークエンシング（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ））、
（ｉｉｉ）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：  ＳＯＬｉＤ  ５５００  Ｓｅｒｉｅｓ（化学：オリゴライゲーション（ｏｌｉｇｏ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）による配列決定）、
（ｉｖ）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：  ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ  ＰＧＭ（化学：半導体技術）
（ｖ）Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ：  ＰａｃＢｉｏ  ＲＳ  ｓｙｓｔｅｍ（化学：１分子、リアルタイム（ＳＭＲＴＴＭ）配列決定）、からなる群から選択される。言い換えると、配列決定法は、合成による配列決定、ピロシークエンシング、サンガー配列決定、オリゴライゲーションによる配列決定、半導体技術または１分子リアルタイム（ＳＭＲＴＴＭ）配列決定であり得る。好ましくは、使用される次世代配列決定法のリード長は、できる限り長いが、このことが必要というわけではない。それらは、例えば、シングルエンドで３６または１５０塩基まで、あるいは２×３６〜２×１５０塩基までのペアエンド（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、シングルエンドで５０塩基まで、または７５塩基のペアエンド：７５ｂｐ×３５ｂｐ（ＳＯＬｉＤ）、４００〜５００塩基まで（Ｒｏｃｈｅ）、あるいは１００〜２００塩基までのシングルエンドまたはペアエンド（Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ）であり得る。
【００３７】
Ｉｌｌｕｍｉｎａのシングルエンドで、１５０塩基まで読むか、またはペアエンドで３００塩基（２×１５０塩基）まで読むのが好ましい。
【００３８】
好ましくは、次世代配列決定法において、２５〜５００塩基が、１リードあたりに読まれ、好ましくは、２５〜２００ヌクレオチドの間、さらに好ましくは２５〜１５０ヌクレオチドの間が、１リードあたりに読まれる。シングルリードの代わりに、ペアエンドリードが適用され得る。
【００３９】
この方法はまた、ある程度まで、３’テールを有する第一の核酸分子であって、上記テールが組成物中のＲＮＡとハイブリダイズしない第一の核酸分子および５’テールを有する第二の核酸分子であって、上記テールが組成物中のＲＮＡとハイブリダイズしない第二の核酸分子の濃度に依存し、理想的には、１ｆＭ〜１０００ｎＭの間である。
【００４０】
本発明はまた、３’テールを有する第一核酸分子であって、上記テールが組成物中のＲＮＡとハイブリダイズしない第一核酸分子、５’テールを有する第二の核酸分子であって、上記テールが組成物中のＲＮＡとハイブリダイズしない第二の核酸分子および二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド分子に特異的である抗体を含むキットに関し、上記第一および上記第二の核酸分子が、それらの標的ＲＮＡハイブリダイズする場合、２〜１０００ヌクレオチドの間で互いに離れた単一の１本鎖ＲＮＡ分子上にある。
【００４１】
本発明は、実施例３および図１２によって、最良に例示される。その他の実施例および図は、本発明のより良い理解に役立つ。
【実施例】
【００４２】
実施例１−ハイブリッドの捕捉技術によるｍＲＮＡプロファイリング：
５’および３’末端にユニバーサルアダプターを含有する特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドを、標的ｍＲＮＡとハイブリダイズさせて、その後ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドと結合する抗体を用いて捕捉した。ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子の磁気分離後、精製されたプローブライブラリを、配列決定の前にＰＣＲによって濃縮した（図１）。
【００４３】
興味の対象であるｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションのためのＤＮＡプローブを、比較できる熱力学的性質によって、特異的に設計した。過剰のオリゴヌクレオチドとのＲＮＡのハイブリダイゼーションおよびその後のＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの精製は、配列決定を介するＤＮＡプローブの数の決定によって標的ｍＲＮＡの定量を可能とする。
【００４４】
エクソン−エクソン接合部上のプローブの配置および適切なハイブリダイゼーションの条件の調整によって、別個のｍＲＮＡに対する選択性を増加させ得る。さらに、それは、ｍＲＮＡの異なるスプライス変異体の発現プロファイリングを可能とする。
【００４５】
実施例１−実験１：様々な量のハイブリッド捕捉プローブとの全ＲＮＡのハイブリダイゼーション
試料：白血病のヒトＴ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）からの全ＲＮＡ
標的：以下の遺伝子のｍＲＮＡ：ＧＡＰＤＨ、  ＡＣＴＢ、  ＣＢＬ、  ＣＥＢＰＡ１、  ＮＲＡＳ
標的外：遺伝子ＲＰＬ１３ａのｍＲＮＡ
標的および標的外の配列、ハイブリダイゼーションのためのプローブおよびＳｙｂｒＧｒｅｅｎ  ｑＰＣＲのためのハイブリダイゼーションに関する記載は、添付書類中に見られ得る。
【００４６】
方法および結果：
図２は、実施例１−実験１の実験ワークフローについての概要を示している。実験の詳細は、添付書類（ＲＳＥ０２０４）において見られ得る。
【００４７】
捕捉されたプローブの分析：
０．０７ｎｍｏｌ、０．７ｎｍｏｌおよび７ｎｍｏｌでの２桁異なる量のプローブを、５００ｎｇの全ＲＮＡとハイブリダイズさせたが、すべての場合において、比較できるプローブの量を捕捉した（図３）。これは、捕捉されたプローブの量は、ハイブリダイゼーションの反応におけるＲＮＡの量のみに依存することを示している。捕捉されたオリゴプローブの定量は、標的ｍＲＮＡの発現レベルの決定に適している。
【００４８】
捕捉されたｍＲＮＡの分析：
異なる量のプローブとのハイブリダイゼーションの後、捕捉された標的ＲＮＡについての類似するｃｔ値が得られ、これは、過剰なプローブに依存しない成功した濃縮を示す（図４）。図５は、カラムチャートにおけるデータを要約する。
【００４９】
実施例１−実験２：過剰のハイブリッド捕捉プローブとの様々な量の全ＲＮＡのハイブリダイゼーションを、以下のように行った：
試料：白血病のヒトＴ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）からの全ＲＮＡ
標的：以下の遺伝子のｍＲＮＡ：ＧＡＰＤＨ、  ＡＣＴＢ、  ＣＢＬ、  ＣＥＢＰＡ１、  ＮＲＡＳ
標的外：遺伝子ＲＰＬ１３ａのｍＲＮＡ
方法および結果：
図６は、実験ワークフローを要約する。
【００５０】
ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ  ｑＰＣＲによるハイブリダイズしたプローブの分析：
本発明者らの予測に従って、過剰なプローブオリゴとの様々な量のＲＮＡのハイブリダイゼーションの後、捕捉されたＲＮＡおよび捕捉されたプローブ両方の収量は、開始ＲＮＡの量と相関するべきである。捕捉されたハイブリダイゼーション産物の収量は、ＲＮＡの量の増加にともなって増加し、このことは、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ−ｑＰＣＲ後のｃｔ値の減少によって示される。図７において、２つの独立した実験の結果を、捕捉されたプローブの定量について要約する。ＲＮＡの量の倍増は、捕捉されたプローブについて約１のｃｔ値の減少を生じさせた。
【００５１】
実施例２−ＲＮＡテンプレート上のオリゴヌクレオチドプローブのライゲーションによるｍＲＮＡのプロファイリング：
原理：
プローブは、２つのテール状のオリゴヌクレオチドからなる。オリゴＢは、ユニバーサル５’テールおよび標的に特異的な３’の配列を含有する。オリゴＡは、標的に特異的な５’末端およびユニバーサル３’テールからなる。両方のテールは、それらの塩基の組成において異なる。加えて、オリゴＡの５’末端をリン酸化する。両方のオリゴは、標的ＲＮＡ分子上のギャップができないように、直接近傍にマッチし、オリゴＡのリン酸化された５’末端とオリゴＢの３’末端とのライゲーションを可能とする。ハイブリダイゼーションおよびライゲーションの後、融合したオリゴプローブを、配列決定装置のプラットフォームの特異的な増幅プライマーを使用して、標準的なＰＣＲを介して増幅し得る（図９）。直接近傍に、および／または正しい順番でハイブリダイズしないプローブは、濃縮ＰＣＲによって増幅されない。その後、濃縮されたプローブを配列決定し得る。プローブの設計は、古典的なプライマー設計の規則に従う。プローブの配列は、それらの標的領域に特異的であるべきである。例えば、標的ｍＲＮＡの異なるスプライス変異体上のプライミングを可能とし、他方で、異なる遺伝子から転写されたＲＮＡ上の複数のプライミングを回避するべきである。おそらく不十分なＲＮＡ精製によって生じるゲノムＤＮＡへの意図されない任意のハイブリダイゼーションを防止するために、オリゴプローブＡおよびＢの両方は、２つの隣接するエクソンのスプライス部位の接合部上で、ｍＲＮＡとハイブリダイズするべきである。これは、その後の配列決定およびクラスター形成によって、標的遺伝子についての異なるスプライス変異体の発現プロファイリングを可能とする。
【００５２】
実施例２−実験３：ＲＮＡテンプレート上の近接するオリゴヌクレオチドのライゲーション
この考えが実行可能であるかどうかの評価のためのモデル実験を以下のように設計した：
人工ＲＮＡの産生：
一方の末端にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を有する２つのＰＣＲ断片（ＤＤＸ５６およびＤＤＸ６７）を、ヒトｇＤＮＡをテンプレートとして使用して、テール状のプライマー（それぞれＬＲＴ７＿ＤＤＸ０６．ｐ１＿０１  ＋  ＬＲ＿ＤＤＸ５．ｑ１＿０１およびＬＲ＿ＤＤＸ０７．ｐ１＿０１  ＋  ＬＲＴ７＿ＤＤＸ０６．ｑ１＿０１）を用いて産生し、その後Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写した（ゲノムＤＮＡを参照のこと）。両方のＰＣＲ断片由来の精製されたＲＮＡを、ハイブリダイゼーションおよびライゲーション実験にテンプレートとして使用した。
【００５３】
２つの別々のオリゴヌクレオチドからなるテール状のＤＮＡプローブをそれぞれ、図９に示されるようなそれらの標的ｍＲＮＡ  ＤＤＸ５６およびＤＤＸ６７について設計した。ＤＤＸ５６およびＤＤＸ６７についてのプローブのプライマーテールは、それらの配列組成において異なり、プローブに特異的なＰＣＲプライマーを用いた増幅によって、オリゴ混合物における別個のライゲーションの相手の検出を可能とする。模式的なワークフローを図１０に示し、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ  ＰＣＲ後の結果を、ＲＮＡテンプレートＤＤＸ６７上のプローブ混合物のハイブリダイゼーションおよびライゲーションについて、図１１に要約する。ライゲーションされたプローブＤＤＸ６７Ａ＋ＢとライゲーションされなかったプローブＤＤＸ５６Ａ＋Ｂとの間のｃｔ値の差は、異なる実験において、１０μＭのＡＴＰを含有するライゲーションバッファー中のハイブリダイゼーションおよびライゲーションの後、比較することができる。同様の結果が、１０μＭのＡＴＰを含有するＲＴポリメラーゼバッファーを用いて得られた。１０〜１５の間のデルタｃｔは、ＲＮＡテンプレート上のＤＮＡオリゴのハイブリダイゼーションおよびライゲーションが成功したことを示している。高いＰＣＲのバックグラウンドのために、オリゴプローブＤＤＸ５６Ａ＋Ｂのハイブリダイゼーションおよびライゲーションの後、定量的な影響の実証のための実験をまだ行っていなかった。増加した選択性を有する改善された実験もまた、ＤＮＡ合成を用いたＲＮＡ／ＤＮＡのハイブリダイゼーションおよびＲＮＡテンプレート上のオリゴプローブのライゲーションの組み合わせによって設計した（実施例３実験４および５）。
【００５４】
実施例３−ＲＮＡテンプレート上のテール状のオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション、逆転写酵素反応およびその後のライゲーションによるｍＲＮＡのプロファイリング：
原理：
プローブを、オリゴＡおよびＢが、それらのＲＮＡ標的に対して別個の距離においてマッチすることを除き、実施例２のように設計する。それゆえ、ハイブリダイゼーション後、ポリメラーゼの工程は、ライゲーションの前に、両方のプローブオリゴの間のギャップを埋めることを必要とする（図１２）。
【００５５】
このさらなるＤＮＡ合成の工程は、上記の実施例と比較して、いくつかの利点を提供する：
・ＰＣＲによって増幅され得るプローブ断片を産生する選択性を改善する。ＰＣＲで増幅可能な断片の産生は、両方のプローブオリゴの正しいプライミング、両方のオリゴの間のギャップの正しい充填、および標的に特異的なオリゴ末端のライゲーションを必要とする。
【００５６】
・１組のプローブのペアを使用して、保存された隣接するエクソン領域上の位置によって、異なるスプライシングの現象をモニターすることができるため、標的遺伝子の完全なスプライシングのプロファイリングのためのプローブの数が減少し得る。
・さらに、オリゴの総数の減少は、より多くの発現プロファイルを並行してモニタリングすることを可能とする。
・既知のスプライシング変異体のプロファイリングに加えて、新しいスプライスの形態が、配列決定によって発見され得る。
【００５７】
実施例３−実験４：標的ＲＮＡとハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブの１工程でのポリメラーゼおよびリガーゼ反応の実現可能性
図１２に従って、人工ＲＮＡ  ＤＤＸ５６およびＤＤＸ６７（実施例２を参照のこと）について、それぞれ３３、４０および４８塩基の距離においてそれらのＲＮＡ標的上にマッチする異なるプローブオリゴを設計する。
【００５８】
ＲＮＡ  ＤＤＸ５６について、ＲＮＡ  ＤＤＸ５６に対する同一の配列相同性を有するが異なるテールを有するプローブＤＤＸ５６Ｃ＋ＤおよびＤＤＸ５６Ｅ＋Ｆを合成した。
【００５９】
ＲＮＡ  ＤＤＸ６７について、３つのプローブを設計した。プローブＤＤＸ６７Ｇ＋ＨおよびＤＤＸ６７Ｊ＋Ｋは、テールの配列においてのみ異なり、他方でプローブＤＤＸ６７Ｅ＋Ｆは、ＲＮＡ６７の異なる場所に位置する。プローブおよびテンプレートに従って、３つの異なるハイブリダイゼーション実験Ａ、ＢおよびＣを設定した（図１３）。ＲＴポリメラーゼ反応およびライゲーションの後、融合したプローブを、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００におけるキャピラリー電気泳動（図１４）、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ（本明細書にはデータを示していない；結果についての添付のＲＳＥ０２１８を参照のこと）およびサンガー配列決定（図１５〜２０）によって分析した。
【００６０】
実施例３−実験５：標的ＲＮＡテンプレートの量と融合したオリゴプローブとの間の相関を評価するためのモデル実験
プローブＤＤＸ５６Ｅ＋ＦおよびＤＤＸ６７Ｊ＋Ｋの混合物を異なる量のＲＮＡ  ＤＤＸ５６およびＤＤＸ６７とハイブリダイズさせた（図１６）。プローブの融合産物を、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ（図１７）を用いて定量して、キャピラリー電気泳動によるそれらの特異性を調べた。
【００６１】
分子バーコードを、プローブのユニバーサルテールと標的に特異的な配列との間のランダムなヌクレオチドの導入によって生成し、標的ＲＮＡ分子由来の断片と、配列の偏りを生じさせるＰＣＲ増幅中に生成されるコピーとの間の識別を可能とする（図１３）。そのようなバーコードを、それぞれプローブＡまたはＢ両方に組み込み得る。例えば：５個のランダムのヌクレオチドからなるバーコードは、最大で４５＝１０２４のＲＮＡ分子のコピーの識別を可能とし、４５個のランダムのヌクレオチドを有する２つのバーコードは、それぞれ、４５*４５＝１、０４８、５７６分子の識別を可能とする。
【図１Ａ】
2015500012.tif 000005
【図１Ｂ】
2015500012.tif 000006
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2015500012.tif 000014
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
2015500012.tif 000025
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
2015500012.tif 000029
【国際調査報告】
2015500012.tif 000030
2015500012.tif 000031
2015500012.tif 000032
2015500012.tif 000033