(57)【要約】  本発明は、余剰のジスルフィド結合を含む新規N末端修飾インスリン誘導体、それらを含む医薬組成物、およびそれらを作製する方法に関連している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド部、N末端修飾基およびアルブミン結合部分からなり、ペプチド部が、ヒトインスリン中に存在しない少なくとも1つのジスルフィド結合を有する、N末端修飾インスリン。
【請求項２】
ペプチド部、N末端修飾基およびアルブミン結合部分からなり、ペプチド部が、2つ以上のシステイン置換を有し、ヒトインスリンの3つのジスルフィド結合が保持される、N末端修飾インスリン。
【請求項３】
システイン置換の部位が、ヒトインスリン中に存在しない1つまたは複数の追加のジスルフィド結合の形成を可能にするために、導入されたシステイン残基が、フォールディングされたN末端修飾インスリンの三次元構造に入るように選択され、N末端修飾インスリンが、同じペプチド部、同じN末端修飾基および同じアルブミン結合部分を有するが、ヒトインスリン中に存在しない任意のジスルフィド結合のないインスリンペプチドのインスリン受容体親和性を少なくとも5%有する、請求項1または2に記載のN末端修飾インスリン。
【請求項４】
修飾基が、親インスリンのN末端とコンジュゲートしている、1モル当たり200g未満の分子量(MW)を各々有する1つまたは2つの有機置換基である、請求項1から3のいずれか一項に記載のN末端修飾インスリン。
【請求項５】
修飾基が、式V(A-鎖N末端について例示されている):
【化１】
2015502971.tif 000038
または、グリシン残基が伸長し、アルファ窒素が可視である、代替表示として:
【化２】
2015502971.tif 000039
中でY'およびZと指定され、Y'およびZが、インスリンペプチドのN末端アミノ酸と結合している、請求項1から4のいずれか一項に記載のN末端修飾インスリン。
【請求項６】
Y'およびZが、異なり、
Y'が、R-C(=X)-であり、
Zが、Hであり、
Rが、H、NH2、直鎖または分岐したC1〜C4アルキル、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジプロピルアミノ、ジメチルアンモニウム、ジエチルアンモニウムまたはジプロピルアンモニウムで置換されている直鎖または分岐したC2〜C4アルキル、CO2Hまたは-OCH2CO2H、C5〜C6シクロアルキル、置換C5〜C6シクロアルキル、5-または6員の飽和ヘテロシクリル、置換されている5-または6員の飽和ヘテロシクリルであり、
Xが、OまたはSである、請求項5に記載のN末端修飾インスリン。
【請求項７】
Y'およびZが、異なり、
Y'が、R-C(=X)-であり、
Zが、Hであり、
Rが、H、NH2、直鎖または分岐したC1〜C4アルキル、CO2Hまたは-OCH2CO2Hで置換されているC1〜C4アルキルであり、
Xが、Oである、請求項5または6に記載のN末端修飾インスリン。
【請求項８】
Y'およびZが、同じであり、メチルである、請求項5に記載のN末端修飾インスリン。
【請求項９】
N末端修飾基が、N,N-ジメチル、N,N-ジエチル、カルバモイル、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、グルタリル、およびジグリコリルからなる群から選択される、請求項1から8のいずれか一項に記載のN末端修飾インスリン。
【請求項１０】
システイン置換の位置が、A10CおよびB3Cである、請求項2から9のいずれか一項に記載のN末端修飾インスリン。
【請求項１１】
ペプチド部が、2つ以上のシステイン置換に加えて、A14E、B16H、B25H、desB27、およびdesB30からなる群から選択される1つまたは複数の置換アミノ酸を含む、請求項2から10のいずれか一項に記載のN末端修飾インスリン。
【請求項１２】
ペプチド部が、A10C、A14E、B3C、B16H、B25H、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B3C、B25H、desB27、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B3C、B25H、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B3C、desB27、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B3C、B16H、B25H、desB27、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B16H、desB27、desB30ヒトインスリンからなる群から選択される、請求項1から11のいずれか一項に記載のN末端修飾インスリン。
【請求項１３】
アルブミン結合部分が、一般式Acy-AA1n-AA2m-AA3p-(式IV)
(式中、
nは、0、または1から3までの範囲の整数であり;
mは、0、または1から10までの範囲の整数であり;
pは、0、または1から10までの範囲の整数であり;
Acyは、約14個から約20個までの炭素原子を含む脂肪酸または脂肪二酸であり;
AA1は、中性の直鎖または環状のアミノ酸残基であり;
AA2は、酸性のアミノ酸残基であり;
AA3は、中性のアルキレングリコール含有アミノ酸残基であり;
AA1、AA2およびAA3が式中に現れる順序は、独立して交換することができ;AA2は、式に従って数回現れることができ(例えば、Acy-AA2-AA32-AA2-);AA2は、式に従って数回独立して(=異なって)現れることができ(例えば、Acy-AA2-AA32-AA2-);Acy、AA1、AA2および/またはAA3の間の連結は、形式的に、Acy、AA1、AA2およびAA3の各々からの水素原子またはヒドロキシル基(水)の除去により得ることができるアミド(ペプチド)結合であり;ペプチド部への結合は、式IVのアシル部分におけるAA1、AA2、またはAA3残基のC末端から、または式IVの部分に存在するAA2残基の側鎖のうちの1つからであってよい)
を有する、請求項1から12のいずれか一項に記載のN末端修飾インスリン。
【請求項１４】
A1(Nα,Nα-ジメチル)、A10C、A14E、B1(Nα,Nα-ジメチル)、B3C、B25H、desB27、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル)、A10C、A14E、B1(Nα,Nα-ジメチル)、B3C、B25H、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
からなる群から選択される、請求項1から13のいずれか一項に記載のN末端修飾インスリン。
【請求項１５】
請求項1から14のいずれか一項に記載のN末端修飾インスリンを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、1つまたは複数の追加のジスルフィド結合を含む新規N末端修飾インスリン、およびそれらを作製する方法に関連している。
【背景技術】
【０００２】
真性糖尿病は、グルコースを利用する能力が部分的または完全に失われる代謝性障害である。障害は、例えば、インスリンを投与することにより治療することができる。
【０００３】
経口経路は、薬物投与のために群を抜いて広く使用される経路である。しかしながら、インスリンの投与は、胃腸(GI)管および腸粘膜における酵素分解、薬物排出ポンプ、腸粘膜からの不十分かつ変わりやすい吸収、ならびに肝臓における初回通過代謝などのいくつかの障壁のために、好ましい経口投与ではなく非経口経路に限定されることが多い。
【０００４】
ヒトインスリンは、2つのポリペプチド鎖、それぞれ21個および30個のアミノ酸残基を含有するA鎖およびB鎖からなる。A鎖およびB鎖は、2つのジスルフィド架橋により相互に連結している。ヒトインスリンは、循環へのその吸収を制限する複数のプロテアーゼの作用により、消化管の管腔内で急速に分解される。親水性でありかつタンパク質分解に対して安定化されたインスリン類似体は、天然インスリンと比較した場合に、動物モデルにおいてより高い生物学的利用能を示す。
【０００５】
タンパク質へのジスルフィド結合の組み込みは、タンパク質安定性を改善する自然の方法の1つである。安定性の同時増加とともに、タンパク質中への工学的作製に成功しているジスルフィド結合の多くの例もある。現在までに、インスリンにおける工学的に作製されたジスルフィド結合の報告はない。
【０００６】
WO 2008/145721は、アミノペプチダーゼおよびジペプチジルペプチダーゼによる分解から前記ペプチドを守るためにN末端修飾されたある種のペプチドに関連している。WO 2010/033220は、ポリマーおよび、場合により、炭素原子が最大で10個までの1つまたは複数の部分とカップリングしているペプチドコンジュゲートについて記載している。
【０００７】
治療用ペプチドの医薬組成物は、公共的使用に適しているために数年間の貯蔵寿命を有することが必要とされる。しかしながら、ペプチド組成物は、化学的および物理的な分解に対する感受性のために本質的に不安定である。
【０００８】
WO 08/145728、WO 2010/060667およびWO 2011/086093は、経口投与のための脂質医薬組成物の例を開示している。
【０００９】
医薬組成物は、最高で200ppmまでの濃度でアルデヒドおよびケトンを含有することが多い。アルデヒドおよびケトンは、インスリンと反応するので、組成物中のインスリンの広範な化学的分解を引き起こすことがある。結果として、インスリン組成物の貯蔵寿命は、3カ月未満になることがある。医薬薬物開発は、少なくとも2年間の貯蔵寿命を必要とする。
【００１０】
水性医薬組成物は、安定性目的のためにエチレンジアミンなどの化合物を含むことができることが知られている。例えば、WO 2006/125763は、緩衝剤としてエチレンジアミンを含む水性医薬ポリペプチド組成物について記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】WO 2008/145721
【特許文献２】WO 2010/033220
【特許文献３】WO 08/145728
【特許文献４】WO 2010/060667
【特許文献５】WO 2011/086093
【特許文献６】WO 2006/125763
【特許文献７】WO 2009/115469
【特許文献８】WO09115469
【特許文献９】WO05012347
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Stability of Protein Pharmaceuticals、Ahern. T.J.およびManning M.C.、Plenum Press、New York 1992
【非特許文献２】HudsonおよびAndersen、Peptide Science、76巻(4)、298〜308頁(2004)
【非特許文献３】Kaarsholm、N.C.ら、1993、Biochemistry、32、10773〜8
【非特許文献４】Holladayら、1977、Biochim. Biophys.Acta、494、245〜254
【非特許文献５】MelbergおよびJohnson、1990、Biochim. Biophys.Acta、494、245〜254
【非特許文献６】Morrisら、1968、Biochim. Biophys.Acta.、160、145〜155
【非特許文献７】Woodら、1975、Biochim. Biophys.Acta、160、145〜155
【非特許文献８】StricklandおよびMercola、1976、Biochemistry、15、3875〜3884
【非特許文献９】Ryleら、1955 Biochem J. 60、541〜56
【非特許文献１０】Kumazaki T、Ishii、S. 1990 J. Biochem (Tokyo) 17、414〜9
【非特許文献１１】Ota M、Ariyoshi、Y.、1995、Biosci. Biotech. Biochem. 59、1956〜7
【非特許文献１２】Yen、T.-Y.、Yan、H.、Macher、B.、2001 J Mass Spectrom. 37、15〜30
【非特許文献１３】GreeneおよびWuts、「Protective Groups in Organic Synthesis」、John Wiley & Sons、1999年
【非特許文献１４】「Organic Synthesis on Solid Phase」、F.Z. Dorwald、Wiley-VCH、2000年ISBN 3-527-29950-5
【非特許文献１５】「Peptides: Chemistry and Biology」、N. SewaldおよびH.-D. Jakubke、Wiley-VCH, 2002年  ISBN 3-527-30405-3
【非特許文献１６】「The Combinatorial Chemistry Catalog」1999年、Novabiochem AG
【非特許文献１７】Naikiら、Anal. Biochem. 177、244〜249、1989; Le-Vine、Methods Enzymol. 309、274〜284、1999
【非特許文献１８】Nielsenら、Biochemistry 40、6036〜6046、2001
【非特許文献１９】Santoro、M. M.、およびBolen、D. W. (1988) Biochemistry 27、8063〜8068
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかしながら、組成物へエチレンジアミンまたは他の安定化化合物を添加することなく、医薬組成物、特に、非水性脂質組成物中のインスリンを安定化するための方法は見いだされないままである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、ペプチド部、N末端修飾基およびアルブミン結合部分からなるN末端修飾インスリンに関連し、ペプチド部は、ヒトインスリン中に存在しない少なくとも1つのジスルフィド結合を有する。
【００１５】
一態様において、本発明は、ペプチド部、N末端修飾基およびアルブミン結合部分からなるN末端修飾インスリンに関連し、ペプチド部は2つ以上のシステイン置換を有し、ヒトインスリンの3つのジスルフィド結合は保持される。
【００１６】
一態様において、本発明は、2つ以上のシステイン置換を含むN末端修飾インスリンに関連し、ヒトインスリンの3つのジスルフィド結合は保持され、システイン置換の部位は、ヒトインスリン中に存在しない1つまたは複数の追加のジスルフィド結合の形成を可能にするために、導入されたシステイン残基が、フォールディングされたN末端修飾インスリンの三次元構造に入るように選択され、N末端修飾インスリンは、同じペプチド部、同じN末端修飾基および同じアルブミン結合部分を有するがヒトインスリン中に存在しない任意のジスルフィド結合のないインスリンペプチドのインスリン受容体親和性を少なくとも5%有する。一態様において、N末端修飾インスリンは、同じペプチド部、ヒトインスリン中に存在するジスルフィド結合、および同じアルブミン結合部分を有するがN末端修飾基のないインスリンペプチドのインスリン受容体親和性を少なくとも5%有する。
【００１７】
一態様において、本発明によるN末端修飾インスリンは、1モル当たり200g未満の分子量(MW)を各々有する1つまたは2つの有機置換基であり、親インスリンのN末端とコンジュゲートしている修飾基を含む。
【００１８】
本発明は、本発明によるN末端修飾インスリンを含む医薬組成物にも関する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、1つまたは複数のジスルフィド結合がインスリン中に工学的に作製されている、本明細書においてN末端保護インスリンとも命名されている新規N末端修飾インスリンに関連している。本発明による新規N末端修飾インスリンは、経口製剤における使用に特に適している。したがって、本発明のある態様は、1つまたは複数のジスルフィド結合がインスリン中に工学的に作製されている新規N末端修飾インスリンを含む経口医薬組成物も企図している。
【００２０】
一態様において、本発明のN末端修飾インスリンは、ペプチド部、N末端修飾基およびアルブミン結合部分からなる。
【００２１】
一態様において、本発明によるN末端修飾インスリンは、2つ以上のシステイン置換を有し、ヒトインスリンの3つのジスルフィド結合は保持される。
【００２２】
一態様において、本発明のN末端修飾インスリンは、側鎖を有する。一態様において、側鎖は、リシン残基のイプシロンアミノ基と結合している。一態様において、側鎖は、B-鎖におけるリシン残基のイプシロンアミノ基と結合している。
【００２３】
一態様において、本発明によるN末端修飾インスリンは、2つ以上のシステイン置換、保持されているヒトインスリンの3つのジスルフィド結合、B-鎖などにおけるリシン残基のイプシロンアミノ基と結合している側鎖を有する。
【００２４】
本発明の一態様において、システイン置換の部位は、ヒトインスリン中に存在しない1つまたは複数の追加のジスルフィド結合の形成を可能にするために、導入されたシステイン残基が、フォールディングされたN末端修飾インスリンの三次元構造に入るように選択される。
【００２５】
驚いたことに、本発明によるN末端修飾インスリンは、それらの痕跡量などのアルデヒドおよび/またはケトンを含む医薬組成物中で安定である一方、インスリンの生物学的特性および薬理学的特性は、親インスリン、すなわち、N末端修飾のない同様のインスリンと比較した場合に保持されることが発明者らにより見いだされた。
【００２６】
驚いたことに、本発明によるN末端修飾インスリンは、物理的に安定であり、フィブリル化への傾向はない一方、親インスリン、すなわちN末端修飾のない同様のインスリンと比較した場合、インスリンの生物学的特性および薬理学的特性は保持されることが、本発明者らにより見いだされた。
【００２７】
本発明の一態様において、本発明によるN末端修飾インスリンは、皮下注射インスリン療法のために水性製剤中で使用される。
【００２８】
本発明の一態様において、本発明によるN末端修飾インスリンは、水性製剤での注射療法としてまたは経口療法として超長時間作用性インスリンとして有用である。
【００２９】
一態様において、本発明によるN末端修飾インスリンのN末端修飾は、アルデヒドおよび/またはケトンに対する化学的安定性を付与することに加えて、インスリン受容体親和性を変えることができる。例えば、下に記載されているように、生理学的pHにおいて、N末端を中性にするかまたは負に荷電させるN末端修飾は、インスリン受容体に、より低い親和性を付与することができる。
【００３０】
本発明のさらなる態様は、経口で投与された場合に、満足のいく生物学的利用能を有する、本発明によるアシル化N末端修飾インスリンなど本発明によるN末端修飾インスリンを供給することに関する。同様の用量で与えられるN末端修飾のない同様のインスリン(親インスリン)の生物学的利用能と比較して、本発明の好ましいN末端修飾インスリンの生物学的利用能は同様である。一態様において、生物学的利用能は、追加のジスルフィド架橋はあるがN末端修飾のない同様の用量で与えられる同様のアシル化インスリンの生物学的利用能よりも少なくとも10%高く、一態様において、生物学的利用能は、親インスリンのそれよりも少なくとも20%高く、一態様において、生物学的利用能は、少なくとも25%高く、一態様において、生物学的利用能は、少なくとも30%高く、一態様において、生物学的利用能は、少なくとも35%高く、一態様において、生物学的利用能は、少なくとも40%高く、一態様において、生物学的利用能は、少なくとも45%高く、一態様において、生物学的利用能は、少なくとも50%高く、一態様において、生物学的利用能は、少なくとも55%高く、一態様において、生物学的利用能は、少なくとも60%高く、一態様において、生物学的利用能は、少なくとも65%高く、一態様において、生物学的利用能は、少なくとも70%高く、一態様において、生物学的利用能は、少なくとも80%高く、一態様において、生物学的利用能は、少なくとも90%高く、一態様において、生物学的利用能は、少なくとも100%高く、一態様において、生物学的利用能は、100%超高い。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「親インスリン」という用語は、N末端修飾のない同様のインスリンを意味するものとする。例えば、N末端修飾インスリンが、アシル化N末端修飾インスリンであれば、親インスリンは、ペプチド部が同じでかつアルブミン結合部分が同じであるがN末端修飾のないアシル化インスリンであり、または、例えば、N末端修飾インスリンが、アシル化されたプロテアーゼ安定化N末端修飾インスリンであれば、親インスリンは、ペプチド部が同じでかつアルブミン結合部分が同じであるがN末端修飾のないアシル化されたプロテアーゼ安定化インスリンである。
【００３２】
一態様において、生物学的利用能は、同様の用量で与えられる、ヒトインスリン中に存在しない任意のジスルフィド結合のない同様のアシル化インスリンおよびN末端修飾インスリンの生物学的利用能よりも少なくとも10%高く、一態様において、生物学的利用能は、ヒトインスリン中に存在しない任意のジスルフィド結合のない同様のアシル化インスリンおよびN末端修飾インスリンのそれよりも少なくとも20%高く、一態様において、生物学的利用能は、少なくとも25%高く、一態様において、生物学的利用能は、少なくとも30%高く、一態様において、生物学的利用能は、少なくとも35%高く、一態様において、生物学的利用能は、少なくとも40%高く、一態様において、生物学的利用能は、少なくとも45%高く、一態様において、生物学的利用能は、少なくとも50%高く、一態様において、生物学的利用能は、少なくとも55%高く、一態様において、生物学的利用能は、少なくとも60%高く、一態様において、生物学的利用能は、少なくとも65%高く、一態様において、生物学的利用能は、少なくとも70%高く、一態様において、生物学的利用能は、少なくとも80%高く、一態様において、生物学的利用能は、少なくとも90%高く、一態様において、生物学的利用能は、少なくとも100%高く、一態様において、生物学的利用能は、100%超高い。
【００３３】
本発明のさらなる態様は、経口で投与された場合に、静脈内投与として投与された場合と比べて満足のいく生物学的利用能を有する、本発明によるN末端修飾インスリンを供給することに関する。本発明の好ましい化合物の生物学的利用能(静脈内投与と比べて)は、N末端修飾インスリンが静脈内に投与された場合の生物学的利用能と比べて少なくとも0.3%、一態様において、少なくとも0.5%、一態様において、少なくとも1%、一態様において、少なくとも1.5%、一態様において、少なくとも2%、一態様において、少なくとも2.5%、一態様において、少なくとも3%、一態様において、少なくとも3.5%、一態様において、少なくとも4%、一態様において、少なくとも5%、一態様において、少なくとも6%、一態様において、少なくとも7%、一態様において、少なくとも8%、一態様において、少なくとも9%、一態様において、少なくとも10%である。
【００３４】
本発明のさらなる態様は、経口で投与された場合に、s.c. (皮下)投与として投与された場合と比べて満足のいく生物学的利用能を有する、本発明によるN末端修飾インスリンを供給することに関する。本発明好ましい化合物の生物学的利用能(皮下投与と比べて)は、N末端修飾インスリンが皮下に投与された場合の生物学的利用能と比べて少なくとも0.3%、一態様において、少なくとも0.5%、一態様において、少なくとも1%、一態様において、少なくとも1.5%、一態様において、少なくとも2%、一態様において、少なくとも2.5%、一態様において、少なくとも3%、一態様において、少なくとも3.5%、一態様において、少なくとも4%、一態様において、少なくとも5%、一態様において、少なくとも6%、一態様において、少なくとも7%、一態様において、少なくとも8%、一態様において、少なくとも9%、一態様において、少なくとも10%である。
【００３５】
本発明のさらなる態様は、皮下に投与された場合に、静脈内投与として投与された場合と比べて満足のいく生物学的利用能を有する本発明によるN末端修飾インスリンを供給することに関する。本発明の好ましい化合物の生物学的利用能は(静脈内投与と比べて)、N末端修飾インスリンが静脈内に投与された場合の生物学的利用能と比べて少なくとも10%、一態様において、少なくとも15%、一態様において、少なくとも20%、一態様において、少なくとも25%、一態様において、少なくとも30%、一態様において、少なくとも35%、一態様において、少なくとも40%、一態様において、少なくとも45%、一態様において、少なくとも50%、一態様において、少なくとも55%、一態様において、少なくとも60%、一態様において、少なくとも70%、一態様において、少なくとも80%、一態様において、少なくとも90%である。
【００３６】
インスリン生物学的利用能を測定するための標準的アッセイは、当業者に知られており、とりわけ、同じ種において経口でおよび静脈内に(i.v.)投与される対象とするインスリンの濃度についての相対的曲線下面積(AUC)の測定を包含する。血液(血漿)サンプルにおけるインスリン濃度の定量化は、例えば、抗体アッセイ(ELISA)を使用するか質量分析法により行うことができる。
【００３７】
本発明のさらなる態様は、満足のいく効力を有する、本発明によるN末端修飾インスリンを供給することに関する。ヒトインスリンの効力と比較して、本発明の好ましいN末端修飾インスリンの効力は、ヒトインスリンの効力の、少なくとも5%、一態様において、少なくとも10%、一態様において、少なくとも20%、一態様において、少なくとも30%、一態様において、少なくとも40%、一態様において、少なくとも50%、一態様において、少なくとも75%、一態様において、少なくとも100%であってよい。
【００３８】
見かけのインビボ効力は、対象とするインスリンの血液グルコース対時間プロファイルの、同様の用量で与えられる比較インスリンとの比較により測定することができる。インビボ効力を測定するための他の手段は、実施例中に与えられる。
【００３９】
インスリンインビトロ効力を測定するための標準的アッセイは、当業者に知られており、とりわけ、(1)インスリンの相対的効力が、例えば、ラット肝原形質膜画分などの細胞膜上に存在するインスリン受容体と特異的に結合している125I-インスリンの50%を置き換えるのに必要とされるインスリン類似体/誘導体に対するインスリンの比と定義されるインスリンラジオレセプターアッセイ;(2)相対的インスリン効力が、[3-3H]グルコースの有機抽出可能な材料(すなわち、脂質)への最大変換の50%を達成するのに必要とされるインスリン類似体/誘導体に対するインスリンの比と定義される、例えば、ラット脂肪細胞で実施される脂質生成アッセイ;(3)インスリン類似体/誘導体の相対的効力が、グルコース-1-[14C]の[14CO2]への最大変換の50%を達成するためのインスリン類似体/誘導体に対するインスリンの比と定義される単離脂肪細胞におけるグルコース酸化アッセイ;(4)インスリンまたはインスリン類似体/誘導体が、特異的抗インスリン抗体と結合するのに際して125I-インスリンと競合する有効性を測定することによりインスリン類似体/誘導体の免疫原性を決定することができるインスリンラジオイムノアッセイ;および(5)特異的インスリン抗体を保有するELISAアッセイなどの動物血漿サンプル中の抗体とのインスリンまたはインスリン類似体もしくは誘導体の結合を測定する他のアッセイを包含する。
【００４０】
本発明によるN末端修飾インスリンは、長期にわたる時間-作用プロファイルを有し、すなわち、ヒトインスリンよりも長く続く高血糖性の、例えば、糖尿病性の患者におけるインスリン効果を提供することがある。言い換えれば、時間-作用プロファイルが長期にわたるインスリンは、ヒトインスリンと比較してグルコースレベルの長期にわたる低下を有する。一態様において、本発明によるN末端修飾インスリンは、インスリン分子の単一投与後の約8時間から約2週間までにわたってインスリン効果を提供する。一態様において、インスリン効果は、約24時間から約2週間まで続く。一態様において、効果は、約24時間から約1週間まで続く。さらなる態様において、効果は、約1週間から約2週間まで続く。さらなる態様において、効果は、約1週間続く。さらなる態様において、効果は、約2週間続く。一態様において、効果は、約1日から約7日まで続く。一態様において、効果は、約1日から約3日まで続く。一態様において、効果は、約1日から約2日まで続く。一態様において、効果は、約2日から約3日まで続く。さらなる態様において、効果は、約7日から約14日まで続く。さらなる態様において、効果は、約7日続く。さらなる態様において、効果は、約14日続く。一態様において、効果は、約2日から約7日まで続く。一態様において、効果は、約3日から約7日まで続く。さらなる態様において、効果は、約3日続く。さらなる態様において、効果は、約4日続く。さらなる態様において、効果は、約5日続く。さらなる態様において、効果は、約6日続く。さらなる態様において、効果は、約7日続く。
【００４１】
一態様において、本発明によるN末端修飾インスリンは、インスリン分子の単一投与後の約8時間から約24時間までにわたってインスリン効果を提供する。一態様において、インスリン効果は、約10時間から約24時間まで続く。一態様において、効果は、約12時間から約24時間まで続く。さらなる態様において、効果は、約16時間から約24時間まで続く。さらなる態様において、効果は、約20時間から約24時間まで続く。さらなる態様において、効果は、約24時間続く。
【００４２】
一態様において、インスリン効果は、約24時間から約96時間まで続く。一態様において、インスリン効果は、約24時間から約48時間まで続く。一態様において、インスリン効果は、約24時間から約36時間まで続く。一態様において、インスリン効果は、約1時間から約96時間まで続く。一態様において、インスリン効果は、約1時間から約48時間まで続く。一態様において、インスリン効果は、約1時間から約36時間まで続く。
【００４３】
作用の持続期間(時間-作用プロファイル)は、血液グルコースが抑えられる時間により、または関連する薬物動態学的特性、例えば、t1/2またはMRT (平均滞留時間)を測定することにより測定することができる。
【００４４】
本発明のさらなる態様は、ヒトインスリンと比べて経口投与に続いて満足のいく長期にわたる作用を有する、本発明によるN末端修飾インスリンを供給することに関する。ヒトインスリンと比べて、本発明の好ましいN末端修飾インスリンの作用の持続時間は、少なくとも10%長い。一態様において、持続時間は、ヒトインスリンのそれよりも、少なくとも20%長く、一態様において、少なくとも25%長く、一態様において、少なくとも30%長く、一態様において、少なくとも35%長く、一態様において、少なくとも40%長く、一態様において、少なくとも45%長く、一態様において、少なくとも50%長く、一態様において、少なくとも55%長く、一態様において、少なくとも60%長く、一態様において、少なくとも65%長く、一態様において、少なくとも70%長く、一態様において、少なくとも80%長く、一態様において、少なくとも90%長く、一態様において、少なくとも100%長く、一態様において、100%超長い。
【００４５】
一態様において、LysB29(Nε-テトラデカノイル)desB30ヒトインスリンまたはA21Gly,B31Arg,B32Argヒトインスリンなどの1日1回インスリンと比較して、本発明の好ましいN末端修飾インスリンの作用の持続時間は、少なくとも10%長い。一態様において、持続時間は、LysB29(Nε-テトラデカノイル)desB30ヒトインスリンまたはA21Gly,B31Arg,B32Argヒトインスリンなどの1日1回インスリンのそれよりも、少なくとも20%長く、一態様において、少なくとも25%長く、一態様において、少なくとも30%長く、一態様において、少なくとも35%長く、一態様において、少なくとも40%長く、一態様において、少なくとも45%長く、一態様において、少なくとも50%長く、一態様において、少なくとも55%長く、一態様において、少なくとも60%長く、一態様において、少なくとも65%長く、一態様において、少なくとも70%長く、一態様において、少なくとも80%長く、一態様において、少なくとも90%長く、一態様において、少なくとも100%長く、一態様において、100%超長い。
【００４６】
一態様において、LysB29(Nε-テトラデカノイル)desB30ヒトインスリンまたはA21Gly,B31Arg,B32Argヒトインスリンなどの1日1回インスリンと比較して、本発明の好ましいN末端修飾インスリンの作用の持続時間は、少なくとも100%長い。一態様において、持続時間は、LysB29(Nε-テトラデカノイル)desB30ヒトインスリンまたはA21Gly,B31Arg,B32Argヒトインスリンなどの1日1回インスリンのそれよりも、少なくとも200%長く、一態様において、少なくとも250%長く、一態様において、少なくとも300%長く、一態様において、少なくとも350%長く、一態様において、少なくとも400%長く、一態様において、少なくとも450%長く、一態様において、少なくとも500%長く、一態様において、少なくとも550%長く、一態様において、少なくとも600%長く、一態様において、少なくとも650%長く、一態様において、少なくとも700%長く、一態様において、少なくとも800%長く、一態様において、少なくとも900%長く、一態様において、少なくとも1000%長く、一態様において、1000%超長い。
【００４７】
一態様において、本発明のN末端修飾インスリンは、タンパク質分解に対して、すなわち胃腸(GI)管または身体中の他での急速な分解に対して安定化される。一態様において、本発明のN末端修飾インスリンは、1つまたは複数の追加のジスルフィド結合のないN末端修飾インスリンと比べて、タンパク質分解に対して安定化される。一態様において、本発明のN末端修飾インスリンは、同様の用量で与えられる、追加のジスルフィド架橋はあるがN末端修飾のない同様のアシル化インスリンと比べて、タンパク質分解に対して安定化される。
【００４８】
タンパク質分解に対して安定化されるN末端修飾インスリンは、本明細書において、ヒトインスリンと比べて1つまたは複数のプロテアーゼによるより遅い分解を受ける本発明のN末端修飾インスリンとして理解されるべきである。一実施形態において、本発明によるN末端修飾インスリンは、ヒトインスリンと比べて1つまたは複数のプロテアーゼによるより遅い分解を受ける。本発明のさらなる実施形態において、本発明によるN末端修飾インスリンは、ペプシン(例えば、アイソフォームペプシンA、ペプシンB、ペプシンCおよび/またはペプシンFなど)、キモトリプシン(例えば、アイソフォームキモトリプシンA、キモトリプシンBおよび/またはキモトリプシンCなど)、トリプシン、インスリン分解酵素(IDE)、エラスターゼ(例えば、アイソフォーム膵エラスターゼIおよび/またはIIなど)、カルボキシペプチダーゼ(例えば、アイソフォームカルボキシペプチダーゼA、カルボキシペプチダーゼA2および/またはカルボキシペプチダーゼB)、アミノペプチダーゼ、カテプシンDおよびラット、ブタまたはヒトに由来する腸抽出物中に存在する他の酵素からなる群から選択される1つまたは複数の酵素による分解に対して安定化される。
【００４９】
一実施形態において、本発明によるN末端修飾インスリンは、キモトリプシン、トリプシン、インスリン分解酵素(IDE)、エラスターゼ、カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼおよびカテプシンDからなる群から選択される1つまたは複数の酵素による分解に対して安定化される。さらなる実施形態において、本発明によるN末端修飾インスリンは、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼおよびIDEからなる群から選択される1つまたは複数の酵素による分解に対して安定化される。さらなる実施形態において、本発明によるN末端修飾インスリンは、キモトリプシンおよびIDEからなる群から選択される1つまたは複数の酵素による分解に対して安定化される。さらなる実施形態において、本発明によるN末端修飾インスリンは、キモトリプシンおよびカルボキシペプチダーゼから選択される1つまたは複数の酵素による分解に対して安定化される。
【００５０】
「プロテアーゼ」または「プロテアーゼ酵素」は、タンパク質およびペプチドを分解し、例えば胃(ペプシン)、腸管腔(キモトリプシン、トリプシン、エラスターゼ、カルボキシペプチダーゼなど)またはGI管の粘膜表面(アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、エンテロペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼ、エンドペプチダーゼなど)、肝臓(インスリン分解酵素、カテプシンDなど)など、人体の様々な組織中でおよび他の組織中で見いだされる消化酵素である。
【００５１】
T1/2は、キモトリプシン、ペプシンおよび/またはカルボキシペプチダーゼAなどのプロテアーゼ酵素に対する、または組織抽出物(肝臓、腎臓、十二指腸、空腸、回腸、大腸、胃などから)などの酵素の混合物に対する、本発明によるN末端修飾インスリンのタンパク分解性安定性の尺度として決定することができる。本発明の一実施形態において、T1/2は、ヒトインスリンと比べて増加している。さらなる実施形態において、T1/2は、1つまたは複数の追加のジスルフィド結合のないN末端修飾インスリンと比べて増加している。さらなる実施形態において、T1/2は、ヒトインスリンと比べて少なくとも2倍増加している。さらなる実施形態において、T1/2は、1つまたは複数の追加のジスルフィド結合のないN末端修飾インスリンと比べて少なくとも2倍増加している。さらなる実施形態において、T1/2は、ヒトインスリンと比べて少なくとも3倍増加している。さらなる実施形態において、T1/2は、1つまたは複数の追加のジスルフィド結合のないN末端修飾インスリンと比べて少なくとも3倍増加している。さらなる実施形態において、T1/2は、ヒトインスリンと比べて少なくとも4倍増加している。さらなる実施形態において、T1/2は、1つまたは複数の追加のジスルフィド結合のないN末端修飾インスリンと比べて少なくとも4倍増加している。さらなる実施形態において、T1/2は、ヒトインスリンと比べて少なくとも5倍増加している。さらなる実施形態において、T1/2は、1つまたは複数の追加のジスルフィド結合のないN末端修飾インスリンと比べて少なくとも5倍増加している。さらなる実施形態において、T1/2は、ヒトインスリンと比べて少なくとも10倍増加している。さらなる実施形態において、T1/2は、1つまたは複数の追加のジスルフィド結合のないN末端修飾インスリンと比べて少なくとも10倍増加している。
【００５２】
「安定性」という用語は、本明細書において、組成物の貯蔵寿命について記載するためにN末端修飾インスリンを含む医薬組成物について使用される。「安定化された」または「安定な」という用語は、本発明のN末端修飾インスリンを指す場合、したがって、N末端修飾されていないインスリンを含む組成物と比べて、または1つもしくは複数の追加のジスルフィド結合のないインスリンと比べて、化学的安定性が増加したか、物理的安定性が増加したか、または物理的および化学的安定性が増加した組成物を指す。
【００５３】
一態様において、本発明によるN末端修飾インスリンは、改善された化学的安定性を有する。一態様において、本発明によるN末端修飾インスリンは、改善された物理的安定性を有する。一態様において、本発明によるN末端修飾インスリンは、改善された化学的および物理的安定性を有する。
【００５４】
一態様において、本発明によるN末端修飾インスリンは、ヒトインスリンと比べて改善された化学的および/または物理的安定性を有する。一態様において、本発明によるN末端修飾インスリンは、1つまたは複数の追加のジスルフィド結合のないN末端修飾インスリンと比べて、改善された化学的および/または物理的安定性を有する。一態様において、本発明によるN末端修飾インスリンは、追加のジスルフィド架橋はあるがN末端修飾のない同様のアシル化インスリンと比べて、改善された化学的および/または物理的安定性を有する。
【００５５】
本明細書で使用される「物理的安定性」という用語は、熱-機械的応力ならびに/または疎水性の表面および界面など不安定化している界面および表面との相互作用へのインスリンの暴露の結果として、N末端修飾インスリンがインスリンの生物的に不活性および/または不溶性の凝集体を形成する傾向を指す。したがって、物理的不安定性には、ヒトインスリンと比べて、高次構造の損失、凝集、フィブリル化、沈降および/または表面への吸着が挙げられるコンホメーション変化が関わる。インスリンなどのペプチドは、例えばフィブリル化による不安定性の傾向があることが知られている。N末端修飾インスリンを含む溶液の物理的安定性は、適当な容器(例えばカートリッジまたはバイアル)に充填された溶液を機械的/物理的応力(例えば、かき混ぜ)に異なる温度で様々な期間の間暴露した後で、例えば視覚検査、比濁法および/または濁り測定の従来の手段により評価することができる。溶液の視覚検査は、鋭い集中光の中で暗い背景を用いて実施される。溶液の濁りは、例えば0から3の段階で濁りの程度を格付けする視覚スコアにより特徴付けされる(濁りを示さない溶液は視覚スコア0に相当し、昼光の中で視覚的濁りを示す溶液は視覚スコア3に相当する)。溶液は、それが昼光の中で視覚的濁りを示す場合、タンパク質凝集に関して物理的不安定と分類される。あるいは、溶液の濁りは、当技術者によく知られている単純な濁り測定により評価することができる。本発明のN末端修飾インスリンの物理的安定性は、N末端修飾インスリンのコンホメーション状態の分光学的な薬剤またはプローブを使用することにより評価することもできる。プローブは、好ましくは、タンパク質の非天然配座異性体に優先的に結合する小分子である。タンパク質構造の小分子の分光学的プローブの1つの例は、チオフラビンTである。チオフラビンTは、アミロイドフィブリルの検出のために広く使用されてきた蛍光色素である。フィブリルおよびおそらく同様に他のタンパク質立体配置の存在下、チオフラビンTは、フィブリルタンパク質形態に結合されると、約450nmで新たな励起最大および約482nmで増強発光を引き起こす。非結合チオフラビンTは、本質的に、該波長で非蛍光性である。本発明のN末端修飾インスリンの物理的安定性は、例えば、実施例109に記載されているように決定することができる。
【００５６】
他の小分子は、タンパク質構造における天然状態から非天然状態への変化のプローブとして使用することができる。例えば、タンパク質の暴露された疎水性パッチに優先的に結合する「疎水性パッチ」プローブ。疎水性パッチは、一般に、その天然状態におけるタンパク質の三次構造内に埋められるが、タンパク質がアンフォールディングまたは変性し始めると暴露される。これらの小分子の分光学的プローブの例は、アントラセン、アクリジン、またはフェナントロリンなどの芳香族疎水性色素である。他の分光学的プローブは、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、およびバリンなど、疎水性アミノ酸のコバルト金属錯体など、金属-アミノ酸錯体である。
【００５７】
本明細書で使用されるN末端修飾インスリンの「化学的安定性」という用語は、天然のタンパク質構造と比較して生物学的効力が潜在的に低いかつ/または免疫原性特性が潜在的に増加した化学分解生成物の形成につながるタンパク質構造の化学的共有結合変化を指す。様々な化学分解生成物が、天然タンパク質のタイプおよび性質、ならびにタンパク質が暴露される環境に応じて形成されうる。化学分解の排除は、最もおそらく、完全に避けることができず、増加する量の化学分解生成物は、当業者によりよく知られているように医薬組成物の貯蔵および使用中に見られることが多い。大部分のタンパク質は、グルタミニル残基またはアスパラギニル残基中の側鎖アミド基が加水分解されて遊離カルボン酸を形成するプロセスである脱アミドを起こしやすい。他の分解経路には、2つ以上のタンパク質分子が、共有結合性のダイマー、オリゴマーおよびポリマー分解生成物につながるアミド基転移および/またはジスルフィド相互作用を通してお互いと共有結合している高分子量変換生成物が関わる(Stability of Protein Pharmaceuticals、Ahern. T.J.およびManning M.C.、Plenum Press、New York 1992)。酸化は、化学分解の別の変形形態として述べることができる。N末端修飾インスリンの化学的安定性は、異なる環境条件への暴露後の様々な時点において化学分解生成物の量を測定することにより評価することができる(分解生成物の形成は、例えば、温度を上げることにより加速されうることが多い)。各個別の分解生成物の量は、様々なクロマトグラフィー技法(例えば、SEC-HPLCおよび/またはRP-HPLC)を使用して分子サイズ、親水性、疎水性および/または電荷に応じて分解生成物を分離することにより決定されることが多い。
【００５８】
一実施形態において、本発明のN末端修飾インスリンは、凝集の傾向がほとんどまたは全くない。凝集傾向は、好ましくは、チオフラビンアッセイにおいて試験された場合、1つまたは複数の追加のジスルフィド結合のないヒトインスリンおよび/またはN末端修飾インスリンの凝集傾向に比べて有意に改善される。
【００５９】
一態様において、本発明によるN末端修飾インスリンは、例えばフォールディング安定性、コンホメーション安定性および/またはより高い溶融温度など、改善された熱力学的安定性を有する。
【００６０】
本明細書で使用される場合、N末端修飾インスリンは、前記誘導体の変性が、1つまたは複数の追加のジスルフィド結合のないヒトインスリンまたはN末端修飾インスリンと比較して、より高い温度および/または変性薬剤のより高い濃度など、より高い応力レベルを必要とするならば、改善された「熱力学的安定性」を有すると称される。
【００６１】
コンホメーション安定性は、例えばHudsonおよびAndersen、Peptide Science、76巻(4)、298〜308頁(2004)により記載されているような円二色性およびNMRにより評価することができる。溶融温度は、インスリン構造が可逆的または不可逆的に変化される温度として理解される。より高い溶融温度は、より安定な構造に対応する。溶融温度は、例えば、温度の関数として円二色性および/もしくはNMRにより、または示差走査熱量測定によりコンホメーション安定性を評価することにより決定することができる。熱力学的安定性は、例えばグアニジン塩酸塩など増加する濃度の変性薬剤の存在下でのCD分光法および/またはNMRにより決定することもできる。前に記載されているようなアンフォールディングの自由エネルギー(Kaarsholm、N.C.ら、1993、Biochemistry、32、10773〜8)は、そのような実験から決定することができる。タンパク質変性で、遠UV範囲(240〜218nm)における負のCDは、タンパク質アンフォールディングを伴う規則化二次構造の損失と一致して徐々に減少する(Holladayら、1977、Biochim. Biophys.Acta、494、245〜254; MelbergおよびJohnson、1990、Biochim. Biophys.Acta、494、245〜254)。近UV範囲(330〜250nm)におけるインスリンCDスペクトルは、ジスルフィド結合からの寄与があるチロシン発色団の環境を反映する(Morrisら、1968、Biochim. Biophys.Acta.、160、145〜155; Woodら、1975、Biochim. Biophys.Acta、160、145〜155; StricklandおよびMercola、1976、Biochemistry、15、3875〜3884)。インスリンのアンフォールディングの自由エネルギーは4.5kcal/molであると、そのような研究から以前に算出された(Kaarsholm、N.C.ら、1993、Biochemistry、32、10773〜8)。
【００６２】
近UV範囲(330〜250nm)におけるインスリンCDスペクトルは、ジスルフィド結合からの寄与があるチロシン発色団の環境を反映する。チロシン残基はインスリンダイマー表面の一部であるので、この領域での(特に276nmでの)モル楕円率の変化は、インスリンの会合状態に反映する。インスリンの会合状態を測定する別の方法は、当技術分野において知られており、実施例に記載されているような非解離条件下でのサイズ排除クロマトグラフィーの適用による。
【００６３】
N末端修飾インスリンのN末端修飾基の電荷は、N末端修飾インスリンが、親インスリンのインスリン受容体親和性と比較してインスリン受容体(IR)に対して保持されるか変化された親和性を有するように選ばれてよい。
【００６４】
例えば、生理学的pH(すなわち、pH7.4)において、中性であるか負に荷電しているN末端修飾基は、N末端修飾のない親インスリンと比較して低下したIR親和性をもたらすことがある。別の例として、生理学的pHにおいて、正に荷電しているN末端修飾基は、N末端修飾のない親インスリンと比較して保持されるかほんのわずかに低下したIR親和性をもたらすことがある。
【００６５】
本発明の一態様によると、本発明において使用するためのN末端修飾基は、生理学的pHにおいて中性であるか、または正に荷電しているか、または負に荷電しているかであってよい。
【００６６】
一態様において、本発明のN末端修飾インスリンは、ペプチド部、N末端修飾基およびアルブミン結合部分からなる。
【００６７】
本明細書に記載されているようなN末端修飾基に関して使用される場合の「生理学的pHにおいて正に荷電している」という用語は、N末端修飾ポリペプチドを含む溶液中で、N末端修飾基のうちの少なくとも10%が、生理学的pHにおいて+1の電荷を有することを意味する。一態様において、N末端修飾ポリペプチドの溶液中のN末端修飾基のうちの少なくとも30%が、生理学的pHにおいて+1の電荷を有する。さらなる態様において、N末端修飾ポリペプチドの溶液中のN末端修飾基のうちの少なくとも50%が、生理学的pHにおいて+1の電荷を有する。さらなる態様において、N末端修飾ポリペプチドの溶液中のN末端修飾基のうちの少なくとも70%が、生理学的pHにおいて+1の電荷を有する。さらなる態様において、N末端修飾ポリペプチドの溶液中のN末端修飾基のうちの少なくとも90%が、生理学的pHにおいて+1の電荷を有する。
【００６８】
生理学的pHにおいて正に荷電しているN末端修飾基の例は、N,N-ジメチルおよびN,N-ジエチルなどのN,N-ジ-C1〜4アルキル、N-アミジニル(amidinyl)、4-(N,N-ジメチルアミノ)ブタノイル、3-(1-ピペリジニル)プロピオニル、3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピオニル、およびN,N-ジメチル-グリシル:
【００６９】
【化１】
2015502971.tif 000002
【００７０】
を包含するが、それらに限定されるものではない。
【００７１】
本明細書で使用される場合、本明細書に記載されているようなN末端修飾基に関して使用される場合の「生理学的pHにおいて中性である」という用語は、N末端修飾インスリンを含む溶液中で、N末端修飾基のうちの少なくとも10%が、生理学的pHにおいて中性の電荷を有すること(すなわち、電荷は、0である)を意味する。一態様において、N末端修飾ポリペプチドの溶液中のN末端修飾基のうちの少なくとも30%が、生理学的pHにおいて中性の電荷を有する。さらなる態様において、N末端修飾ポリペプチドの溶液中のN末端修飾基のうちの少なくとも50%が、生理学的pHにおいて中性の電荷を有する。さらなる態様において、N末端修飾ポリペプチドの溶液中のN末端修飾基のうちの少なくとも70%が、生理学的pHにおいて中性の電荷を有する。さらなる態様において、N末端修飾ポリペプチドの溶液中のN末端修飾基のうちの少なくとも90%が、生理学的pHにおいて中性の電荷を有する。
【００７２】
生理学的pHにおいて中性であるN末端修飾基の例は、カルバモイル、チオカルバモイル、ならびにホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリルなどのC1〜4鎖アシル基、およびピログルタミル:
【００７３】
【化２】
2015502971.tif 000003
【００７４】
を包含するが、それらに限定されるものではない。
【００７５】
本明細書で使用される場合、本明細書に記載されているようなN末端修飾基に関して使用される場合の「生理学的pHにおいて負に荷電している」という用語は、N末端修飾インスリンを含む溶液中で、N末端修飾基のうちの少なくとも10%が、生理学的pHにおいて-1 (すなわち、マイナス1)の電荷を有することを意味する。一態様において、N末端修飾ポリペプチドの溶液中のN末端修飾基のうちの少なくとも30%が、生理学的pHにおいて-1の電荷を有する。さらなる態様において、N末端修飾ポリペプチドの溶液中のN末端修飾基のうちの少なくとも50%が、生理学的pHにおいて-1の電荷を有する。さらなる態様において、N末端修飾ポリペプチドの溶液中のN末端修飾基のうちの少なくとも70%が、生理学的pHにおいて-1の電荷を有する。さらなる態様において、N末端修飾ポリペプチドの溶液中のN末端修飾基のうちの少なくとも90%が、生理学的pHにおいて-1の電荷を有する。
【００７６】
生理学的pHにおいて負に荷電しているN末端修飾基の例は、オキサリル、グルタリル、ジグリコリル(他の名称: 3-オキソグルタリルおよびカルボキシメトキシアセチル)を包含するが、それらに限定されるものではない。
【００７７】
一態様において、本発明による生理学的pHにおいて負に荷電しているN末端修飾基は、マロニルでもスクシニルでもない。一態様において、本発明による生理学的pHにおいて負に荷電しているN末端修飾基は、マロニルではない。一態様において、本発明による生理学的pHにおいて負に荷電しているN末端修飾基は、スクシニルではない。
【００７８】
本発明の一態様において、N末端修飾が1つまたは複数の正に荷電しているN末端修飾基によるものである、N末端修飾インスリンが得られる。
【００７９】
本発明の一態様において、N末端修飾が1つまたは複数の負に荷電しているN末端修飾基によるものである、N末端修飾インスリンが得られる。
【００８０】
本発明の一態様において、N末端修飾が1つまたは複数の中性N末端修飾基によるものである、N末端修飾インスリンが得られる。
【００８１】
一態様において、ペプチド部が、インスリンのN末端のうちの1つ以外の位置においてアルブミン結合部分で置換されている、本発明によるN末端修飾インスリンが得られる。一態様において、アルブミン結合部分は、場合によりリンカーを介してインスリンと結合している脂肪酸または脂肪二酸からなる。リンカーは、脂肪酸または脂肪二酸とインスリンへの結合点の中間にある任意の適当な部分であってよく、その部分は、リンカー部分、スペーサーなどと呼ばれることもある。
【００８２】
一態様において、リンカーは、存在し、それらから水素原子および/またはヒドロキシル基が除去されたGly、D-Ala、L-Ala、D-αGlu、L-αGlu、D-γGlu、L-γGlu、D-αAsp、L-αAsp、D-βAsp、L-βAsp、βAla、4-アミノ酪酸、5-アミノ吉草酸、6-アミノヘキサン酸、D-Glu-α-アミド、L-Glu-α-アミド、D-Glu-γ-アミド、L-Glu-γ-アミド、D-Asp-α-アミド、L-Asp-α-アミド、D-Asp-β-アミド、L-Asp-β-アミド、または:
【００８３】
【化３】
2015502971.tif 000004
【００８４】
からなる群から選択される1つまたは複数の実体を含み、式中、qは、0、1、2、3または4であり、この実施形態において、あるいは、7-アミノヘプタン酸または8-アミノオクタン酸であってよく、式中、矢印は、プロテアーゼ安定化インスリンのアミノ基への結合点、または、より多くのリンカーが存在すれば、その方向への結合点を示す。
【００８５】
一態様において、リンカーは、存在し、ガンマ-Glu (γGlu)実体、1つまたは複数のOEG実体またはそれらの組合せを含む。
【００８６】
本明細書において、「脂肪酸」という用語は、少なくとも14個の炭素原子を有し、飽和または不飽和である直鎖か分岐した、脂肪族カルボン酸をカバーする。脂肪酸の非限定的な例は、ミリスチン酸、パルミチン酸、およびステアリン酸である。
【００８７】
本明細書において、「脂肪二酸」という用語は、少なくとも14個の炭素原子を有し、飽和または不飽和である直鎖か分岐した、脂肪族ジカルボン酸をカバーする。脂肪二酸の非限定的な例は、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、ヘプタデカン二酸、オクタデカン二酸、およびエイコサン二酸である。
【００８８】
本明細書に記載されているようなN末端修飾インスリンを含む経口医薬組成物も、本発明により企図されている。一態様において、経口医薬組成物は、1つまたは複数の脂質および本発明のN末端修飾インスリンを含む組成物である。
【００８９】
本発明のN末端修飾インスリンは、驚いたことに、脂質医薬製剤中で使用される場合に化学的に安定である。一態様において、本発明によるN末端修飾インスリンを含む脂質医薬製剤は、少なくとも2週間の使用および1年間の貯蔵に対して化学的に安定である。一態様において、本発明によるN末端修飾インスリンを含む脂質医薬製剤は、少なくとも4週間の使用および1年間の貯蔵に対して化学的に安定である。一態様において、本発明によるN末端修飾インスリンを含む脂質医薬製剤は、少なくとも4週間の使用および2年間の貯蔵に対して化学的に安定である。一態様において、本発明によるN末端修飾インスリンを含む脂質医薬製剤は、少なくとも6週間の使用および2年間の貯蔵に対して化学的に安定である。
【００９０】
水性医薬製剤においてインスリンを安定化するための一般的方法は、医薬製剤に亜鉛を添加し、それによって、亜鉛とのインスリン6量体を形成することであることは当業者に知られている。本発明による一態様において、本発明のN末端修飾インスリンを含み、亜鉛を含まないか痕跡量の亜鉛のみを含む医薬脂質組成物は、N末端修飾インスリンおよび亜鉛を含む水性医薬製剤と同様に化学的安定である。
【００９１】
驚いたことに、N末端修飾インスリン、1つまたは複数の脂質および、場合により、1つまたは複数の界面活性剤を含む非水性液体インスリン医薬組成物は、化学的に安定であることが見いだされた。一態様において、本発明の医薬組成物は、N末端修飾インスリン、1つまたは複数の脂質、1つまたは複数の界面活性剤および共溶媒を含む。本発明の一態様において、共溶媒は、プロピレングリコールである。
【００９２】
本発明の一態様において、N末端修飾インスリンは、組成物中の成分の総量の0.1から30% (w/w)までの間の濃度で医薬組成物中に存在する。別の態様において、N末端修飾インスリンは、0.5から20% (w/w)までの間の濃度で存在する。別の態様において、N末端修飾インスリンは、1から10% (w/w)までの間の濃度で存在する。
【００９３】
本発明の一態様において、N末端修飾インスリンは、0.2mMから100mMまでの間の濃度で医薬組成物中に存在する。別の態様において、N末端修飾インスリンは、0.5から70mMまでの間の濃度で存在する。別の態様において、N末端修飾インスリンは、0.5から35mMまでの間の濃度で存在する。別の態様において、N末端修飾インスリンは、1から30mMまでの間の濃度で存在する。
【００９４】
「脂質」という用語は、本明細書において、水とよりも油とより混ざる物質、材料または成分のために使用される。脂質は、水に溶けないかほとんど溶けないが、油または他の非極性溶媒に溶けやすい。
【００９５】
本発明のN末端修飾インスリンを含む医薬組成物のために使用される脂質は、1つまたは複数の親油性物質、すなわち、水とではなく油と均一な混合物を形成する物質を含むことができる。複数の脂質は、非水性脂質医薬組成物の親油性相を構成し、油態様を形成することがある。室温において、脂質は、固体、半固体または液体であってよい。例えば、固体脂質は、ペースト、粒状形態、粉末またはフレークとして存在することができる。2つ以上の賦形剤が、脂質を含んでいれば、脂質は、液体、固体、または両方の混合物であってよい。
【００９６】
固体脂質、すなわち、室温において固体または半固体である脂質の例は、下記を包含するが、それらに限定されるものではない:
1. Sasol Germany (Witten、Germany)からWITEPSOL HI5として市販されている水素化ココ-グリセリド(約33.5℃から約37℃の融点(m.p.))などのモノ-、ジ-およびトリグリセリドの混合物;脂肪酸トリグリセリドの例、例えば、C10〜C22脂肪酸トリグリセリドは、植物油などの天然油および水素化油を包含する;
2. Gattefosse Corp. (Paramus、NJ)からMONOSTEOL (約33℃〜約36℃の融点)として市販されているプロピレングリコール(PG)ステアレートなどのエステル;Gattefosse Corp.からHYDRINE (約44.5℃から約48.5℃の融点)として市販されているジエチレングリコールパルミトステアレート;
3. Gattefosse Corp.またはGelucire 33/01からLABRAFIL M2130 CSとして市販されている水素化パーム/パーム核油PEG-6エステル(約30.5℃から約38℃の融点)などのポリグリコシル化飽和グリセリド;
4. Cognis Corp. (Cincinnati、OH)からLANETTE 14として市販されているミリスチルアルコール(約39℃の融点)などの脂肪アルコール;脂肪酸の脂肪アルコールとのエステル、例えば、パルミチン酸セチル(約50℃の融点);例えば、約43℃の融点を有する、例えば、Uniqema (New Castle、Delaware)から商品名ARLAMOL ISMLの下で市販されているイソソルビドモノラウレート;
5.約33℃の融点を有する、例えば、UniqemaからBRIJ 52として市販されているポリオキシエチレン(2)セチルエーテル、または、例えば、約43℃の融点を有するUniqemaからBRIJ 72として市販されているポリオキシエチレン(2)ステアリルエーテルを包含するPEG-脂肪アルコールエーテル;
6.ソルビタンエステル、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、例えば、それぞれUniqemaからSPAN 40またはSPAN 60として市販されており、約43℃から48℃または約53℃から57℃および41℃から54℃の融点を有するソルビタンモノパルミテートまたはソルビタンモノステアレート;ならびに
7.グリセリルモノ-C6〜C14-脂肪酸エステル。これらは、グリセロールを植物油でエステル化することと、続く、分子蒸留により得られる。モノグリセリドは、対称モノグリセリド(すなわち、β-モノグリセリド)ならびに非対称モノグリセリド(α-モノグリセリド)の両方を包含するが、それらに限定されるものではない。それらは、同形グリセリド(脂肪酸構成要素が、主に単一脂肪酸からなる)ならびに混合グリセリド(脂肪酸構成要素が、様々な脂肪酸からなる)の両方も包含する。脂肪酸構成要素は、例えば、C8〜C14からの鎖長を有する飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸の両方を包含していてよい。特に適しているのは、例えば、Sasol North America (Houston、TX)からIMWITOR 312として市販されているグリセリルモノラウレート、(約56℃〜60℃の融点);SasolからIMWITOR 928として市販されているグリセリルモノジココエート(約33℃〜37℃の融点);IMWITOR 370として市販されているモノグリセリルシトレート、(約59〜約63℃の融点);または、例えば、SasolからIMWITOR 900として市販されているグリセリルモノステアレート(約56〜61℃の融点);または、例えば、SasolからIMWITOR 960として市販されている自己乳化性グリセロールモノステアレート(約56℃〜61℃の融点)である。
【００９７】
液体脂質および半固体脂質、すなわち、室温において液体または半固体である脂質の例は、下記を包含するが、それらに限定されるものではない:
1. Abitec Corp. (Columbus、OH)からCAPMUL MCMとして市販されている中鎖モノ-およびジグリセリド、グリセリルカプリレート/カプレートなどのモノ-、ジ-およびトリグリセリドの混合物;およびDANISCOからRYLO MG08 Pharmaとして市販されているグリセロールモノカプリレート、RYLO MG10 Pharmaとして市販されているグリセロールモノカプレート。
2.例えば、C6〜C18、例えば、C6〜C16例えば、C8〜C10、例えば、C8、脂肪酸のグリセリルモノ-またはジ脂肪酸エステル、またはそのアセチル化誘導体、例えば、Eastman Chemicals (Kingsport、TN)からのMYVACET 9-45もしくは9-08またはSasolからのIMWITOR 308もしくは312;
3.例えば、C8〜C20、例えば、C8〜C12、脂肪酸のプロピレングリコールモノ-またはジ-脂肪酸エステル、例えば、Abitec Corp.またはGattefosseからのLAUROGLYCOL 90、SEFSOL 218、またはCAPRYOL 90もしくはCAPMUL PG-8 (プロピレングリコールカプリレートと同じ);
4.ベニバナ油、ゴマ油、アーモンド油、ピーナッツ油、ヤシ油、コムギ胚芽油、トウモロコシ油、ヒマシ油、ココナッツ油、綿実油、ダイズ油、オリーブ油および鉱油などの油;
5.脂肪酸またはアルコール、例えば、C8〜C20、飽和またはモノ-もしくはジ-不飽和の、例えば、オレイン酸、オレイルアルコール、リノール酸、カプリン酸、カプリル酸、カプロン酸、テトラデカノール、ドデカノール、デカノール;
6.中鎖脂肪酸トリグリセリド、例えば、C8〜C12、例えば、MIGLYOL 812、または長鎖脂肪酸トリグリセリド、例えば、植物油;
7.例えば、Gattefosse CorpからLABRAFIL M2125 CSとして市販されているエステル交換されたエトキシル化植物油;
8.脂肪酸および一級アルコール、例えば、C8〜C20、脂肪酸およびC2〜C3アルコールのエステル化化合物、例えば、Nikko Chemicals (Tokyo、Japan)からNIKKOL VF-Eとして市販されているリノール酸エチル、酪酸エチル、カプリル酸エチルオレイン酸、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピルおよびカプリル酸エチル;
9.精油、またはスペアミント油、チョウジ油、レモン油およびペパーミント油などのそれらの特徴的な臭いを植物に与えるある種の揮発油のいずれか;
10.メントール、カルバクロールおよびチモールなどの精油の分画または構成要素;
11.トリアセチン、トリブチリンなどの合成油;
12.クエン酸トリエチル、クエン酸アセチルトリエチル、クエン酸トリブチル、クエン酸アセチルトリブチル;
13.ポリグリセロール脂肪酸エステル、例えば、Nikko Chemicalsからのジグリセリルモノオレエート、例えば、DGMO-C、DGMO-90、DGDO;ならびに
14.ソルビタンエステル、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、例えば、UniqemaからSPAN 20として市販されているソルビタンモノラウレート;
15.リン脂質、例えば、アルキル-O-リン脂質、ジアシルホスファチジン酸、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジ-O-アルキルホスファチジン酸、L-アルファ-リゾホスファチジルコリン(LPC)、L-アルファ-リゾホスファチジルエタノールアミン(LPE)、L-アルファ-リゾホスファチジルグリセロール(LPG)、L-アルファ-リゾホスファチジルイノシトール(LPI)、L-アルファ-ホスファチジン酸(PA)、L-アルファ-ホスファチジルコリン(PC)、L-アルファ-ホスファチジルエタノールアミン(PE)、L-アルファ-ホスファチジルグリセロール(PG)、カルジオリピン(CL)、L-アルファ-ホスファチジルイノシトール(PI)、L-アルファ-ホスファチジルセリン(PS)、リゾ-ホスファチジルコリン、リゾ-ホスファチジルグリセロール、LARODANから市販されているsn-グリセロホスホリルコリン、またはLipoid GmbHから市販されているダイズリン脂質(Lipoid S100)。
16.ポリグリセロールオレエート(GattefosseからのPlurol Oleique)などのポリグリセロール脂肪酸エステル。
【００９８】
本発明の一態様において、脂質は、モノ-、ジ-、およびトリグリセリドからなる群から選択される1つまたは複数である。さらなる態様において、脂質は、モノ-およびジグリセリドからなる群から選択される1つまたは複数である。さらなる態様において、脂質は、Capmul MCMまたはCapmul PG-8である。さらなる態様において、脂質は、Capmul PG-8である。さらなる態様において、脂質は、グリセロールモノカプリレート(DaniscoからのRylo MG08 Pharma)である。
【００９９】
一態様において、本発明のN末端修飾インスリンを含む医薬組成物のために使用される脂質は、以下からなる群から選択される。グリセロールモノ-カプリレート(例えば、Rylo MG08 Pharmaなど)およびグリセロールモノ-カプレート(例えば、DaniscoからのRylo MG10 Pharmaなど)からなる群から選択される。別の態様において、脂質は、プロピレングリコールカプリレート(例えば、AbitecからのCapmul PG8またはGattefosseからのCapryol PGMCもしくはCapryol 90など)からなる群から選択される。
【０１００】
本発明の一態様において、脂質は、組成物中のインスリンを包含する成分の総量の10%から90%(w/w)までの間の濃度で医薬組成物中に存在する。別の態様において、脂質は、10から80%(w/w)までの間の濃度で存在する。別の態様において、脂質は、10から60%(w/w)までの間の濃度で存在する。別の態様において、脂質は、15から50%(w/w)までの間の濃度で存在する。別の態様において、脂質は、15から40%(w/w)までの間の濃度で存在する。別の態様において、脂質は、20から30%(w/w)までの間の濃度で存在する。別の態様において、脂質は、約25%(w/w)の濃度で存在する。
【０１０１】
本発明の一態様において、脂質は、組成物中のインスリンを包含する成分の総量の100mg/gから900mg/gまでの間の濃度で医薬組成物中に存在する。別の態様において、脂質は、100mg/gから800mg/gまでの間の濃度で存在する。別の態様において、脂質は、100mg/gから600mg/gまでの間の濃度で存在する。別の態様において、脂質は、150mg/gから500mg/gまでの間の濃度で存在する。別の態様において、脂質は、150mg/gから400mg/gまでの間の濃度で存在する。別の態様において、脂質は、200mg/gから300mg/gまでの間の濃度で存在する。別の態様において、脂質は、約250mg/gの濃度で存在する。
【０１０２】
本発明の一態様において、共溶媒は、組成物中のインスリンを包含する成分の総量の0%から30%(w/w)までの間の濃度で医薬組成物中に存在する。別の態様において、共溶媒は、5%から30%(w/w)までの間の濃度で存在する。別の態様において、共溶媒は、10から20%(w/w)までの間の濃度で存在する。
【０１０３】
本発明の一態様において、共溶媒は、組成物中のインスリンを包含する成分の総量の0mg/gから300mg/gまでの間の濃度で医薬組成物中に存在する。別の態様において、共溶媒は、50mg/gから300mg/gまでの間の濃度で存在する。別の態様において、共溶媒は、100から200mg/gまでの間の濃度で存在する。
【０１０４】
本発明の一態様において、経口医薬組成物は、油もいかなる他の脂質構成成分もHLBが7未満の界面活性剤も含有しない。さらなる態様において、組成物は、油もいかなる他の脂質構成成分もHLBが8未満の界面活性剤も含有しない。さらなる態様において、組成物は、油もいかなる他の脂質構成成分もHLBが9未満の界面活性剤も含有しない。さらなる態様において、組成物は、油もいかなる他の脂質構成成分もHLBが10未満の界面活性剤も含有しない。
【０１０５】
本発明の液体非水性医薬組成物の非イオン性界面活性剤の各々の親水性-親油性バランス(HLB)は、10を超え、それにより、高いインスリンペプチド(N末端修飾インスリンなど)薬物負荷容量および高い経口生物学的利用能が達成される。一態様において、本発明による非イオン性界面活性剤は、HLBが11を超える非イオン性界面活性剤である。一態様において、本発明による非イオン性界面活性剤は、HLBが12を超える非イオン性界面活性剤である。
【０１０６】
本明細書で使用される「約」という用語は、プラスまたはマイナス10%などの、記述されている数値の妥当な近傍内であることを意味する。
【０１０７】
本発明のN末端修飾インスリンを含む医薬組成物として使用するための脂質医薬組成物の非限定的な例は、例えば、特許出願WO 08/145728、WO 2010/060667およびWO 2011/086093中に見いだすことができる。
【０１０８】
本発明によるN末端修飾インスリンのペプチド部は、ヒトインスリン中に存在しない少なくとも1つのジスルフィド結合を有する。
【０１０９】
ジスルフィド結合は、2つのチオール基のカップリングにより誘導され、本明細書において、2個の硫黄原子間の連鎖、すなわち全体的な連結性R-S-S-Rを有する構造と理解されるべきである。ジスルフィド結合は、連結ジスルフィド結合、SS結合またはジスルフィド架橋と呼ぶこともできる。ジスルフィド結合は、2つのシステインアミノ酸残基をペプチドに導入すること、それに続いて2つのチオール基をジスルフィド結合に酸化することにより作られる。そのような酸化は、化学的に実施することができるか(当業者により知られているように)、または例えば酵母におけるインスリン発現中に起こりうる。
【０１１０】
新たなシステイン残基をN末端修飾インスリンのペプチド部に導入する場合、システイン残基は、ヒトインスリン中に存在しない1つまたは複数の追加のジスルフィド結合の形成を可能にするために、フォールディングされたインスリン類似体の三次元構造に入れる。例えば、2つの新たなシステイン残基を入れるならば、三次元構造における新たなシステイン残基の近傍は、ジスルフィド結合が2個の新たなシステイン残基間に形成されうるようになっている。
【０１１１】
タンパク質(インスリンなど)におけるジスルフィド結合の数は、例えば実施例115に記載されているように正確なインタクト質量測定により容易に決定することができる。ジスルフィド結合の連結性は、ペプチドマッピングなど当技術分野において知られている標準的技法により検証する(決定する)ことができる。インスリンペプチドにおけるジスルフィド結合マッピングのための一般戦略には、下記のステップが含まれる。1)非還元インスリンを、可能であれば、1つのペプチド当たり単一ジスルフィド結合だけを含有するジスルフィド結合ペプチドに断片化すること。選択条件も、ジスルフィド結合の転位が回避されるようなものであり、2)ジスルフィド結合ペプチドを互いから分離すること、および3)個々のジスルフィド結合に関与するシステイン残基を同定すること。
【０１１２】
ヒトインスリンは、典型的には、2つのジスルフィド結合(A6-A11およびA7-B7)を含有するペプチドI、および単一ジスルフィド結合(A20-B19)を含有するペプチドIIを産生するGlu-Cプロテアーゼにより消化される。ペプチドI中にジスルフィド結合を明確に割り当てるため、さらなる断片化が必要である。タンパク質におけるCysCys結合を加水分解するため、酸加水分解(Ryleら、1955 Biochem J. 60、541〜56)、手動のエドマン分解(Kumazaki T、Ishii、S. 1990 J. Biochem (Tokyo) 17、414〜9)、またはサーモリシンを用いる延長消化(Ota M、Ariyoshi、Y.、1995、Biosci. Biotech. Biochem. 59、1956〜7)が以前には用いられた。ペプチドI中にジスルフィド結合を割り当てる代替の方法は、トリスカルボキシエチルホスフィンを用いる部分的還元(A7-B7ジスルフィド結合の還元)、還元システイン残基のアルキル化、続いて完全な還元、および異なるアルキル基を使用するシステインアルキル化である(Yen、T.-Y.、Yan、H.、Macher、B.、2001 J Mass Spectrom. 37、15〜30)。余剰のジスルフィド結合を含有するインスリンのジスルフィドマッピングのための戦略は、原則として、新たなジスルフィド結合を収容させるように各類似体について調整されたヒトインスリンについて上記に概説されているのと同じである。NMRまたはX線結晶学によるインスリン構造の決定は、ジスルフィド結合の連結性を検証するための代替手法である。インスリンのNMRおよび/またはX線構造を解析するための条件は以前に記載され、当技術分野において知られている。
【０１１３】
本発明の一態様において、ヒトインスリンの3つのジスルフィド結合が保持される、N末端修飾、アルブミン結合部分および少なくとも2つのシステイン置換を有するN末端修飾インスリンが提供される。
【０１１４】
「システイン置換」という用語により、本明細書において、ヒトインスリン中に存在するアミノ酸をシステインと置き換えることが意味される。例えば、A鎖中の10位におけるイソロイシン(IleA10)およびヒトインスリン(GlnB4)のB鎖の4位におけるグルタミンは、各々、システイン残基により置き換えることができる。「他のアミノ酸残基置換」という用語により、本明細書において、ヒトインスリン中に存在するアミノ酸をシステインでないアミノ酸と置き換えることが意味される。
【０１１５】
本発明により得られる追加のジスルフィド結合は、インスリンの同じ鎖の2つのシステイン、すなわちA-鎖中の2つのシステインもしくはB-鎖中の2つのシステインを連結させているか、または、インスリンのA-鎖中のシステインをB-鎖中のシステインと連結させていることがある。一態様において、少なくとも1つの追加のジスルフィド結合がA-鎖中の2つのシステインを連結させているか、またはB-鎖中の2つのシステインを連結させている、本発明によるN末端修飾インスリンが得られる。一態様において、少なくとも1つの追加のジスルフィド結合がA-鎖中のシステインをB-鎖中のシステインと連結させている、本発明によるN末端修飾インスリンが得られる。
【０１１６】
本明細書で使用される場合、「追加のジスルフィド結合」という用語は、ヒトインスリン中に存在しない1つまたは複数のジスルフィド結合を意味する。
【０１１７】
一実施形態において、本発明によるN末端修飾インスリンは、下記のインスリンペプチドからなる群から選択されるペプチド部を有する(ここで、「ペプチド部」は、N末端修飾および/または「アルブミン結合部分」もしくはアシル部分が含まれない本発明のN末端修飾インスリンの部分を意味する):
A10C、A14E、B1C、B16H、B25H、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14E、B1C、B25H、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14E、B2C、B16H、B25H、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14E、B2C、B25H、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14E、B3C、B16H、B25H、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14E、B3C、B25H、desB27、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14E、B3C、B25H、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14E、B3C、desB27、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14E、B3C、B16H、B25H、desB27、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14E、B3C、B16H、desB27、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14E、B4C、B16H、desB27、desB30ヒトインスリン
A10C、A14E、B4C、B16H、B25H、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14E、B4C、B25A、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14E、B4C、B25H、B28E、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14E、B4C、B25H、desB27、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14E、B4C、B25H、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14E、B4C、B25N、B27E、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14E、B4C、B25N、desB27、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14E、desB1、B4C、B25H、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14H、B4C、B25H、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14E、B1C、B16H、B25H、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14E、B2C、B16H、B25H、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14E、B3C、B16H、B25H、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14E、B4C、B16H、B25H、desB30ヒトインスリン
【０１１８】
一実施形態において、本発明によるN末端修飾インスリンは、下記のインスリンペプチドからなる群から選択されるペプチド部を有する。
A10C、A14E、B1C、B16H、B25H、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14E、B1C、B25H、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14E、B2C、B16H、B25H、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14E、B2C、B25H、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14E、B3C、B16H、B25H、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14E、B3C、B25H、desB27、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14E、B3C、B25H、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14E、B3C、desB27、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14E、B3C、B16H、B25H、desB27、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14E、B3C、B16H、desB27、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14E、B4C、B16H、desB27、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14E、B4C、B16H、B25H、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14E、B4C、B25A、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14E、B4C、B25H、B28E、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14E、B4C、B25H、desB27、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14E、B4C、B25H、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14E、B4C、B25N、B27E、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14E、B4C、B25N、desB27、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14E、desB1、B4C、B25H、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14H、B4C、B25H、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14E、B1C、B16H、B25H、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14E、B2C、B16H、B25H、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14E、B3C、B16H、B25H、desB30ヒトインスリン、
A10C、A14E、B4C、B16H、B25H、desB30ヒトインスリン
【０１１９】
本明細書で使用される「ヒトインスリン」という用語は、二次元および三次元構造および特性がよく知られているヒトインスリンホルモンを意味する。ヒトインスリンの三次元構造は、例えば、多くの異なる条件下でNMRおよびX線結晶学により決定され、これらの構造の多くは、タンパク質データバンクに蓄積されている(http://www.rcsb.org)。ヒトインスリン構造の非限定的な例は、T6構造(http://www.rcsb.org/pdb/explore.do?structureId=1MSO)およびR6構造(http://www.rcsb.org/pdb/explore.do?structureId=1EV3)である。ヒトインスリンは、A-鎖およびB-鎖と命名された2つのポリペプチド鎖を有する。A-鎖は21アミノ酸ペプチドであり、B-鎖は30アミノ酸ペプチドであり、2つの鎖はジスルフィド結合:A-鎖の7位におけるシステインとB-鎖の7位におけるシステインとの間の第1の架橋、およびA-鎖の20位におけるシステインとB-鎖の19位におけるシステインとの間の第2の架橋により連結されている。第3の架橋は、A-鎖の6位および11位におけるシステイン間に存在する。したがって「ヒトインスリンの3つのジスルフィド結合が保持されているN末端修飾インスリン」は、本明細書において、ヒトインスリンの3つのジスルフィド結合、すなわちA-鎖の7位におけるシステインとB-鎖の7位におけるシステインとの間のジスルフィド結合、A-鎖の20位におけるシステインとB-鎖の19位におけるシステインとの間のジスルフィド結合、およびA-鎖の6位および11位におけるシステイン間のジスルフィド結合を含むN末端修飾インスリンとして理解される。
【０１２０】
人体において、インスリンホルモンは、Cが31アミノ酸の連結ペプチドである立体配置:プレペプチド-B-ArgArg-C-LysArg-Aにおいて、24アミノ酸のプレペプチド、続いて86アミノ酸を含有するプロインスリンからなる単鎖前駆体プロインスリン(プレプロインスリン)として合成される。Arg-ArgおよびLys-Argは、A鎖およびB鎖から連結ペプチドを切断するための切断部位である。
【０１２１】
本発明の一態様において、ヒトインスリンの3つのジスルフィド結合が保持され、A-鎖のA9、A10およびA12からなる群から選択される位置における少なくとも1個のアミノ酸残基がシステインで置換されており、B-鎖のB1、B2、B3、B4、B5およびB6からなる群から選択される位置における少なくとも1個のアミノ酸残基がシステインで置換されており、側鎖がB-鎖中のリシン残基のイプシロンアミノ基と結合しており、場合によりB30位におけるアミノ酸が欠失している、2つ以上のシステイン置換を有するN末端修飾インスリンが提供される。本発明の一態様において、A-鎖のA10位におけるアミノ酸残基は、システインで置換されており、B-鎖のB1、B2、B3、およびB4からなる群から選択される位置における少なくとも1個のアミノ酸残基は、システインで置換されており、側鎖は、B-鎖中のリシン残基のイプシロンアミノ基と結合しており、場合によりB30位におけるアミノ酸は欠失している。本発明の一態様において、A-鎖のA9、A10およびA12からなる群から選択される位置における少なくとも1個のアミノ酸残基は、システインで置換されており、B-鎖のB1、B2、B3、B4、B5およびB6からなる群から選択される位置における少なくとも1個のアミノ酸残基は、システインで置換されており、A14、A21、B1、B3、B10、B16、B22、B25、B26、B27、B28、B29、B30、B31、B32からなる群から選択される位置における少なくとも1個のアミノ酸残基は、システインでないアミノ酸で置換されており、側鎖は、B-鎖中のリシン残基のイプシロンアミノ基と結合しており、場合によりB30位におけるアミノ酸は欠失している。
【０１２２】
B1またはB3がシステインである場合、同じアミノ酸は、システインでないアミノ酸であり得ないのに対して、例えばB1がシステインであるならば、B3は、本発明の態様によると、システインでないアミノ酸で置換されていてよく、逆もまた同様であることが理解される。
【０１２３】
本発明の一態様において、A-鎖のA10位におけるアミノ酸残基は、システインで置換されており、B-鎖のB1、B2、B3、およびB4からなる群から選択される位置における少なくとも1個のアミノ酸残基は、システインで置換されており、場合により少なくとも1個のアミノ酸残基は、システインでないアミノ酸で置換されており、側鎖は、B-鎖中のリシン残基のイプシロンアミノ基と結合しており、場合によりB30位のアミノ酸は欠失している。本発明の一態様において、A-鎖のA10位におけるアミノ酸残基は、システインで置換されており、B-鎖のB3およびB4からなる群から選択される位置における少なくとも1個のアミノ酸残基は、システインで置換されており、場合により少なくとも1個のアミノ酸残基は、システインでないアミノ酸で置換されており、側鎖は、B-鎖中のリシン残基のイプシロンアミノ基と結合しており、場合によりB30位のアミノ酸は欠失している。本発明の一態様において、A-鎖のA10位におけるアミノ酸残基は、システインで置換されており、B-鎖のB3位におけるアミノ酸残基は、システインで置換されており、場合により少なくとも1個のアミノ酸残基は、システインでないアミノ酸で置換されており、側鎖は、B-鎖中のリシン残基のイプシロンアミノ基と結合しており、場合によりB30位のアミノ酸は欠失している。本発明の一態様において、A-鎖のA10位におけるアミノ酸残基は、システインで置換されており、B-鎖のB4におけるアミノ酸残基は、システインで置換されており、場合により少なくとも1個のアミノ酸残基は、システインでないアミノ酸で置換されており、側鎖は、B-鎖中のリシン残基のイプシロンアミノ基と結合しており、場合によりB30位のアミノ酸は欠失している。
【０１２４】
一態様において、B30位が欠失している、本発明によるN末端修飾インスリンが得られる。
【０１２５】
本発明の一態様において、システインは、
A10C、B1C;
A10C、B2C;
A10C、B3C;
A10C、B4C;
A10C、B5C;および
B1C、B4C
からなる群から選択される、N末端修飾インスリンの2つの位置に置換されている。
【０１２６】
本発明の一態様において、システインは、
A10C、B1C;
A10C、B2C;
A10C、B3C;
A10C、B4C;および
B1C、B4C
からなる群から選択される、インスリン類似体の2つの位置に置換されている。
【０１２７】
本発明の一態様において、システインは、
A10C、B1C;
A10C、B2C;
A10C、B3C;および
A10C、B4C
からなる群から選択される、N末端修飾インスリンの2つの位置に置換されている。
【０１２８】
本発明の一態様において、システインは、
A10C、B3C;および
A10C、B4C
からなる群から選択される、インスリン類似体の2つの位置に置換されている。
【０１２９】
本発明の一態様において、システインは、A10CおよびB3Cである、インスリン類似体の2つの位置に置換されている。
【０１３０】
本発明の一態様において、システインは、A10CおよびB4Cである、インスリン類似体の2つの位置に置換されている。
【０１３１】
本発明の一態様において、本発明のN末端修飾インスリンは、システイン置換に加えて、A8E、A14E、A14H、A21G、B1G、B3Q、B3E、B3T、B3V、B3L、B16H、B16E、B25A、B25H、B25N、B27E、B27P、B28E、desB1、desB27、およびdesB30からなる群から選択される1つまたは複数のアミノ酸を含む。
【０１３２】
本発明の一態様において、本発明のN末端修飾インスリンは、システイン置換に加えて、A14E、A14H、A21G、desB1、B1G、B3Q、B3E、B16H、B16E、B25H、desB27、およびdesB30からなる群から選択される1つまたは複数のアミノ酸を含む。
【０１３３】
本発明の一態様において、本発明のN末端修飾インスリンは、システイン置換に加えて、A14E、desB1、B1G、B16H、B16E、B25H、desB27、およびdesB30からなる群から選択される1つまたは複数のアミノ酸を含む。
【０１３４】
本発明の一態様において、本発明のN末端修飾インスリンは、システイン置換に加えて、A14E、B16H、B25H、desB27、およびdesB30からなる群から選択される1つまたは複数のアミノ酸を含む。
【０１３５】
本明細書において、「アシル化インスリン」という用語は、場合によりリンカーを介して1つまたは複数のアルブミン結合部分をインスリンペプチドと結合することによるインスリンの修飾をカバーする。
【０１３６】
「アルブミン結合部分」とは、本明細書において、場合により、LysB29などのアミノ酸位置において、リンカーまたは等価物を介してインスリンと結合している脂肪酸または脂肪二酸からなる側鎖として理解される。
【０１３７】
一実施形態において、N末端修飾インスリンと結合している「アルブミン結合部分」は、一般式;
Acy-AA1n-AA2m-AA3p- (式IV)
を有し、
式中、nは、0または1から3までの範囲の整数であり;mは、0または1から10までの範囲の整数であり;pは、0または1から10までの範囲の整数であり;Acyは、約14個から約20個までの炭素原子を含む脂肪酸または脂肪二酸であり;AA1は、中性の直鎖または環状のアミノ酸残基であり;AA2は、酸性のアミノ酸残基であり;AA3は、中性の、アルキレングリコール含有アミノ酸残基であり;AA1、AA2およびAA3が式中に現れる順序は、独立して交換することができ;AA2は、式に従って数回現れることができ(例えば、Acy-AA2-AA32-AA2-);AA2は、式に従って数回独立して(=異なっている)現れることができ(例えば、Acy-AA2-AA32-AA2-);Acy、AA1、AA2および/またはAA3の間の連結は、形式的に、Acy、AA1、AA2およびAA3の各々からの水素原子またはヒドロキシル基(水)の除去により得ることができるアミド(ペプチド)結合であり;ペプチド部への結合は、式IVのアシル部分におけるAA1、AA2、またはAA3残基のC末端から、または式IVの部分に存在するAA2残基の側鎖のうちの1つからであってよい。
【０１３８】
本発明に従って使用されてよいアルブミン結合部分の非限定的な例は、例えば、特許出願WO 2009/115469中に見いだすことができ、WO 2009/115469の25頁、3行から始まる一節に記載されているようなアシル化ポリペプチドのアルブミン結合部分を包含する。
【０１３９】
本発明の一態様において、アルブミン結合部分は、
【０１４０】
【表１Ａ】
2015502971.tif 000005
【０１４１】
【表１Ｂ】
2015502971.tif 000006
【０１４２】
【表１Ｃ】
2015502971.tif 000007
【０１４３】
【表１Ｄ】
2015502971.tif 000008
【０１４４】
からなる群から選択される。
【０１４５】
本発明の一態様において、アルブミン結合部分は、
【０１４６】
【表２Ａ】
2015502971.tif 000009
【０１４７】
【表２Ｂ】
2015502971.tif 000010
【０１４８】
【表２Ｃ】
2015502971.tif 000011
【０１４９】
からなる群から選択される。
【０１５０】
本発明の一態様において、アルブミン結合部分は、
【０１５１】
【表３】
2015502971.tif 000012
【０１５２】
からなる群から選択される。
【０１５３】
「N末端修飾インスリン」とは、本明細書において、「N末端保護インスリン」と同じであり、本明細書でN末端保護基とも命名されている1つまたは複数のN末端修飾基を含むインスリンと本明細書で定義される。
【０１５４】
「N末端修飾基」とは、本明細書において、「N末端保護基」と同じであり、本発明によれば、インスリンのA-鎖および/またはB-鎖のN末端アミノ基とコンジュゲートしている場合に、例えば、医薬製剤中の賦形剤のうちの1つまたは複数のアルデヒド不純物と反応することから、それぞれ、インスリンのN末端アミノ酸の前記アミノ基(必ずしもそうとは限らないが、典型的には)、A-鎖およびB-鎖のグリシンおよびフェニルアラニンを守る基である。本発明の一態様において、N末端修飾は、親インスリンのN末端とコンジュゲートしている、1モル当たり200g未満のMWを有する1つまたは2つの有機置換基である。
【０１５５】
一態様において、本発明のN末端修飾インスリンは、示されているインスリンA-鎖N末端の最初の4個の残基(GIVE….)と共に式Vに図示されているような、少なくとも1つの、好ましくは、2つのN末端アミノ酸と結合しているN末端修飾基Y'およびZを含む。
【０１５６】
【化４】
2015502971.tif 000013
【０１５７】
または、グリシン残基が伸長し、アルファ窒素が可視である、代替表示として:
【０１５８】
【化５】
2015502971.tif 000014
【０１５９】
本発明の一態様において、Y'およびZは、異なり、
Y'は、R-C(=X)-であり、
Zは、Hであり、
Rは、H、NH2、直鎖または分岐したC1〜C4アルキル、(場合により、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジプロピルアミノ、トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、またはトリプロピルアンモニウムで置換されている)、C5〜C6シクロアルキル(場合により置換されている)、5-または6員の飽和ヘテロシクリル(場合により置換されている)であり、
Xは、OまたはSである。
【０１６０】
本発明の一態様において、Y'が、R-C(=X)-であり、Zが、Hである場合、インスリンは、desA1およびdesB1変異を含有することができる。
【０１６１】
本発明の別の態様において、Y'=Zは、C1〜C4アルキルである。
【０１６２】
本発明の一態様において、A-鎖およびB-鎖のN末端アミノ基のN末端保護基の各々は、同じである。
【０１６３】
本発明の一態様において、本発明の2つのN末端保護基の各々は、150Da未満の分子量を有している。
【０１６４】
本発明の一態様において、本発明のN末端保護基の各々は、生理学的pHにおいて正に荷電しており、すなわち、N末端保護基が、N末端アミノ基と結合/コンジュゲートしている場合、アミノ基、またはアミノ基上の置換基は、正電荷を有する。本発明の一態様において、N末端保護基は、ジメチル、ジエチル、ジ-n-プロピル、ジ-sec-プロピル、ジ-n-ブチル、ジ-i-ブチルなどからなる群から選択される。本発明の別の態様において、N末端保護基は、ジメチルおよびジエチルから選択される。本発明の別の態様において、N末端保護基は、ジメチルである。
【０１６５】
本発明の一態様において、N末端保護基は、N,N-ジメチルグリシル、N,N-ジメチルアミノブタノイル、N,N-ジメチルアミノプロピオニルおよび3-(1-ピペリジニル)プロピオニルからなる群から選択される。
【０１６６】
本発明の一態様において、本発明のN末端保護基の各々は、生理学的pHにおいてN末端アミノ基の正常な正の(または、部分的に正の)電荷を除去する。本発明の一態様において、本発明のN末端保護基の各々は、小さなアシル残基から選択される。本発明の一態様において、本発明のN末端保護基の各々は、ホルミル、アセチル、プロパノイル、およびブタノイル基から選択される。本発明の一態様において、本発明のN末端保護基の各々は、環状アシル残基、例えば、ピログルタミニル(= 5-オキソ-ピロリジン-2-オイル)基から選択される。
【０１６７】
本発明の一態様において、本発明のN末端保護基の各々は、生理学的pHにおいてN末端アミノ基の正常な正の(または、部分的に正の)電荷を除去する。本発明の一態様において、本発明のN末端保護基の各々は、カルバモイルおよびチオカルバモイルから選択される。本発明の一態様において、本発明のN末端保護基の各々は、カルバモイルである。
【０１６８】
本発明の一態様において、本発明のN末端保護基の各々は、生理学的pHにおいてN末端アミノ基の正常な正の(または、部分的に正の)電荷を除去する。本発明の一態様において、本発明のN末端保護基の各々は、オキサリル、グルタリル、またはジグリコリル(他の名称: 3-オキサグルタリル、カルボキシメトキシアセチル)から選択される。本発明の一態様において、本発明のN末端保護基の各々は、グルタリルおよびジグリコリル(他の名称: 3-オキサグルタリル、カルボキシメトキシアセチル)から選択される。本発明の一態様において、本発明のN末端保護基の各々は、グルタリルである。本発明の一態様において、本発明のN末端保護基の各々は、ジグリコリル(他の名称: 3-オキサグルタリル、カルボキシメトキシアセチル)である。
【０１６９】
本明細書で使用される場合、「コンジュゲート」という用語は、ポリペプチドへ置換基を結合させて前記ポリペプチドの特性を修飾するプロセスを示すことが意図されている。したがって、分子およびポリペプチドの「コンジュゲーション」または「コンジュゲーション生成物」とは、ポリペプチドのアミノ酸と結合している前記置換基のための用語であり、したがって、本明細書に記載されているような「置換基」とは、ポリペプチドと結合している置換基を意味する。
【０１７０】
「モノアルキル化」とは、本明細書において、ポリペプチドの遊離アミノ基との1つのアルキル置換基のコンジュゲーションとして理解されるべきであり、「ジアルキル化」とは、下に図示されているように、ポリペプチドの遊離アミノ基との2つのアルキル置換基のコンジュゲーションとして理解されるべきであり、ここで、「遊離アミノ基」とは、一級アミン、R-NH2、または二級アミン、R1-NH-R2 (式中、R、R1およびR2は、置換基を表す)として理解されるべきである。
【０１７１】
「グアニジニル化」とは、本明細書において、下に図示されているように、グアニジニル基へのアミノ基の変換をもたらす、ポリペプチドの遊離アミノ基とのアミジニル置換基(カルボキサミジンとも呼ばれることがある、すなわち、形態: RnC(=NR)NR2 (式中、Rnは、ポリペプチドである)の置換基)のコンジュゲーションとして理解されるべきである。
【０１７２】
【化６】
2015502971.tif 000015
【０１７３】
本発明で使用される「インスリン類似体」は、天然インスリン中に存在する少なくとも1つのアミノ酸残基を欠失させかつ/または置換することにより、および/または少なくとも1つのアミノ酸残基を付加することにより、天然に存在するインスリンの構造、例えば、ヒトインスリンのそれから形式的に誘導することができる分子構造を有するポリペプチドである。
【０１７４】
一態様において、本発明によるインスリン類似体は、ヒトインスリンと比べて8個未満の修飾(置換、欠失、付加)を含む。一態様において、インスリン類似体は、ヒトインスリンと比べて7個未満の修飾(置換、欠失、付加)を含む。一態様において、インスリン類似体は、ヒトインスリンと比べて6個未満の修飾(置換、欠失、付加)を含む。別の態様において、インスリン類似体は、ヒトインスリンと比べて5個未満の修飾(置換、欠失、付加)を含む。別の態様において、インスリン類似体は、ヒトインスリンと比べて4個未満の修飾(置換、欠失、付加)を含む。別の態様において、インスリン類似体は、ヒトインスリンと比べて3個未満の修飾(置換、欠失、付加)を含む。別の態様において、インスリン類似体は、ヒトインスリンと比べて2個未満の修飾(置換、欠失、付加)を含む。
【０１７５】
「インスリンの誘導体」は、例えば、インスリン骨格の1つまたは複数の位置に側鎖を導入することにより、またはインスリン中のアミノ酸残基の基を酸化もしくは還元することにより、または遊離カルボキシル基をエステル基もしくはアミド基に変換することにより、化学的に修飾された天然に存在するヒトインスリンまたはインスリン類似体である。他の誘導体は、ヒトインスリンまたはdesB30ヒトインスリンのB29位におけるなどの、遊離アミノ基またはヒドロキシ基をアシル化することにより得られる。したがって、アルブミン結合部分を含むインスリン分子は、この定義によるとインスリン誘導体である。
【０１７６】
したがって、インスリンの誘導体は、インスリンペプチドの1つまたは複数のアミノ酸と結合している側鎖などの少なくとも1つの共有結合修飾を含むヒトインスリンまたはインスリン類似体である。
【０１７７】
本明細書において、インスリンの命名は、下記の原則に従って行われる:名称は、ヒトインスリンと比べた変異および修飾(アシル化)として与えられる。アシル部分の命名については、ペプチド命名法として行われる。例えば、アシル部分（アルブミン結合部分）:
【０１７８】
【化７】
2015502971.tif 000016
【０１７９】
の命名は、例えば、「オクタデカンジオイル-γ-L-Glu-OEG-OEG」、「オクタデカンジオイル-γGlu-2×OEG」、「オクタデカンジオイル-gGlu-2×OEG」、「17-カルボキシヘプタデカノイル-γ-L-Glu-OEG-OEG」、または「17-カルボキシヘプタデカノイル-γ-L-Glu-2×OEG」であってよく、式中
OEGは、アミノ酸残基-NH(CH2)2O(CH2)2OCH2CO-の簡易表記であり、
γ-L-Glu (あるいは、g-L-Glu、gGlu、γGluまたはガンマ-L-Gluと表記される)は、アミノ酸ガンマグルタミン酸部分のL-体の簡易表記である。
【０１８０】
ガンマグルタミン酸部分のエナンチオマー形態が指定されていなければ、部分は、キラルなアミノ酸部分の立体配置が、DかまたはL(または、R/S用語法を使用していれば、RかまたはS)である純粋なエナンチオマーの形態であってよいか、エナンチオマーの混合物(DとL/RとS)の形態であってよい。
【０１８１】
修飾されたペプチドまたはタンパク質のアシル部分は、キラルなアミノ酸部分の立体配置が、DかまたはL(または、R/S用語法を使用していれば、RかまたはS)である純粋なエナンチオマーの形態であってよいか、エナンチオマーの混合物(DとL/RとS)の形態であってよい。本発明の一態様において、アシル部分は、エナンチオマーの混合物の形態である。一態様において、アシル部分は、純粋なエナンチオマーの形態である。一態様において、アシル部分のキラルなアミノ酸部分は、L体である。一態様において、アシル部分のキラルなアミノ酸部分は、D体である。
【０１８２】
「desB30ヒトインスリン」とは、B30アミノ酸残基を欠くヒトインスリンの類似体を意味する。「B1」、「A1」などは、それぞれインスリンのB-鎖中の1位(N末端から数えて)におけるアミノ酸残基およびインスリンのA-鎖中の1位(N末端から数えて)におけるアミノ酸基を意味する。具体的位置にあるアミノ酸残基は、例えば、B1位におけるアミノ酸残基が、フェニルアラニン残基であることを意味するPheB1またはB1Fとして表記されることもある。
【０１８３】
例えば、実施例1のインスリン(配列/構造が下に与えられている)は、ヒトインスリン中のIであるA10位におけるアミノ酸が、Cに変異され、ヒトインスリン中のA14位におけるアミノ酸、Yが、Eに変異され、ヒトインスリン中のB3位におけるアミノ酸、Nが、Cに変異され、ヒトインスリン中のB25位におけるアミノ酸、Fが、Hに変異され、A1位およびB1位におけるアミノ酸(それぞれ、グリシンおよびフェニルアラニン)が、N末端(アルファ)アミノ基の(形式的な)ジメチル化により修飾され、ヒトインスリン中のB27位におけるアミノ酸、Tが、欠失され、ヒトインスリン中のB29位におけるアミノ酸、Kが、残基オクタデカンジオイル-γGluにより、Nεと表記されるB29のリシン残基中のイプシロン窒素上でのアシル化により修飾され、ヒトインスリン中のB30位におけるアミノ酸、Tが、欠失されたことを示すために「A1(Nα,Nα-ジメチル),A10C,A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B3C,B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン」と命名される。下の式中のアスタリスクは、対象とする残基が、ヒトインスリンと比較して異なっている(すなわち、変異されている)ことを示す。あるいは、実施例1のインスリン(配列/構造が下に与えられている)は、A1位およびB1位にあるアミノ酸残基が、それぞれG (Gly)およびF (Phe)であることをさらに示すために「A1G(Nα,Nα-ジメチル),A10C,A14E,B1F(Nα,Nα-ジメチル),B3C,B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン」と命名することもできる。さらに、表記「Nα」および「Nε」は、それぞれ「N(アルファ)」または「N(a)」として、および「N(イプシロン)」または「N(eps)」と書くこともできる。
【０１８４】
配列番号1
【０１８５】
【化８】
2015502971.tif 000017
【０１８６】
同じインスリンは、代替表示:
【０１８７】
【化９】
2015502971.tif 000018
【０１８８】
で図示されてもよい。
【０１８９】
加えて、本発明のインスリンは、IUPAC命名法(OpenEye、IUPAC形式)に従っても命名される。この命名法によれば、上のアシル化N末端修飾インスリンには、下記の名称が割り当てられる:
N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０１９０】
N末端修飾の表記:
N末端修飾は、アルファアミノ基なしで描かれ、下の例に示されているように理解されるべきである。
【０１９１】
【化１０】
2015502971.tif 000019
【０１９２】
は、
【０１９３】
【化１１】
2015502971.tif 000020
【０１９４】
を意味し、
【０１９５】
【化１２】
2015502971.tif 000021
【０１９６】
は、
【０１９７】
【化１３】
2015502971.tif 000022
【０１９８】
を意味する。
【０１９９】
ポリペプチドの製造は、当技術分野においてよく知られている。本発明によるN末端修飾インスリンのペプチド部などのポリペプチドは、例えば、古典的ペプチド合成、例えば、t-BocもしくはFmoc化学反応を使用する固相ペプチド合成または他の十分に確立した技法により製造することができ、例えば、GreeneおよびWuts、「Protective Groups in Organic Synthesis」、John Wiley & Sons、1999年を参照されたい。ポリペプチドは、ポリペプチドをコード化するDNA配列を含有し、ペプチドの発現を可能にする条件下で適当な栄養培地中でポリペプチドを発現する能力のある宿主細胞を培養することを含む方法により製造することもできる。非天然アミノ酸残基を含むポリペプチドについては、組み換え細胞は、非天然アミノ酸が、例えば、t-RNA変異体の使用により、ポリペプチド中に組み込まれるように修飾されるべきである。
【０２００】
一般に、医薬組成物は、期限期日に達するまで使用および貯蔵中(推奨される使用条件および貯蔵条件に従って)に安定でなければならない。
【０２０１】
本発明の一態様において、本発明のN末端修飾インスリンを含む脂質医薬組成物などの医薬組成物は、6週間を超える使用に対しておよび2年間を超える貯蔵に対して安定である。
【０２０２】
本発明の別の態様において、本発明のN末端修飾インスリンを含む脂質医薬組成物などの医薬組成物は、4週間を超える使用に対しておよび2年間を超える貯蔵に対して安定である。
【０２０３】
本発明のさらなる態様において、本発明のN末端修飾インスリンを含む脂質医薬組成物などの医薬組成物は、4週間を超える使用に対しておよび3年間を超える貯蔵に対して安定である。
【０２０４】
本発明のさらなる態様において、本発明のN末端修飾インスリンを含む脂質医薬組成物などの医薬組成物は、2週間を超える使用に対しておよび2年間を超える貯蔵に対して安定である。
【０２０５】
一実施形態において、本発明のN末端修飾インスリンは、凝集する傾向をほとんどまたは全く有しない。凝集傾向は、好ましくは、チオフラビンアッセイにおいて試験される場合、ヒトインスリンおよび/または1つまたは複数の追加のジスルフィド結合のないN末端修飾インスリンの凝集傾向と比べて有意に改善される。一態様において、凝集傾向は、追加のジスルフィド架橋はあるがN末端修飾のない同様のアシル化インスリンの凝集傾向に比べて改善される。
【０２０６】
一態様において、本発明によるN末端修飾インスリンは、例えばフォールディング安定性、コンホメーション安定性および/またはより高い溶融温度など、改善された熱力学的安定性を有する。
【０２０７】
本明細書で使用される場合、N末端修飾インスリンの変性が、同様の用量で与えられるヒトインスリン、1つまたは複数の追加のジスルフィド結合のないN末端修飾インスリン、または追加のジスルフィド架橋はあるがN末端修飾のない同様のアシル化インスリンと比較して、変性薬剤のより高い温度および/またはより高い濃度など、より高い応力レベルを必要とするならば、前記N末端修飾インスリンは、改善された「熱力学的安定性」を有すると称される。
【０２０８】
コンホメーション安定性は、例えばHudsonおよびAndersen、Peptide Science、76巻(4)、298〜308頁(2004)により記載されているように、円二色性およびNMRにより評価することができる。溶融温度は、インスリン構造が可逆的または不可逆的に変化される温度として理解される。より高い溶融温度は、より安定な構造に対応する。溶融温度は、例えば、温度の関数として円二色性および/またはNMRによりコンホメーション安定性を評価することにより、または示差走査熱量測定により決定することができる。熱力学的安定性は、例えばグアニジン塩酸塩など、増加する濃度の変性薬剤の存在下でCD分光法および/またはNMRにより決定することもできる。以前に記載されているようなアンフォールディングの自由エネルギー(Kaarsholm、N.C.ら、1993、Biochemistry、32、10773〜8)は、そのような実験から決定することができる。タンパク質変性で、遠UV範囲(240〜218nm)における負のCDは、タンパク質アンフォールディングを伴う規則化二次構造の損失と一致して徐々に減少する(Holladayら、1977、Biochim. Biophys.Acta、494、245〜254; MelbergおよびJohnson、1990、Biochim. Biophys.Acta、494、245〜254)。近UV範囲(330〜250nm)におけるインスリンCDスペクトルは、ジスルフィド結合からの寄与があるチロシン発色団の環境を反映する(Morrisら、1968、Biochim. Biophys.Acta.、160、145〜155; Woodら、1975、Biochim. Biophys.Acta、160、145〜155; StricklandおよびMercola、1976、Biochemistry、15、3875〜3884)。インスリンのアンフォールディングの自由エネルギーは、4.5kcal/molであると、そのような研究から以前に算出された(Kaarsholm、N.C.ら、1993、Biochemistry、32、10773〜8)。
【０２０９】
近UV範囲(330〜250nm)におけるインスリンCDスペクトルは、ジスルフィド結合からの寄与があるチロシン発色団の環境を反映する。チロシン残基はインスリンダイマー表面の一部であるので、この領域で(特に276nmで)のモル楕円率の変化は、インスリンの会合状態に反映する。インスリンの会合状態を測定する別の方法は、当技術分野において知られており、実施例に記載されているような非解離条件下でのサイズ排除クロマトグラフィーの適用による。
【０２１０】
下記は、本発明による態様の非限定的なリストである:
1.ペプチド部、N末端修飾基およびアルブミン結合部分からなり、ペプチド部が、ヒトインスリン中に存在しない少なくとも1つのジスルフィド結合を有する、N末端修飾インスリン。
2.ペプチド部、N末端修飾基およびアルブミン結合部分からなり、ペプチド部が、2つ以上のシステイン置換を有し、ヒトインスリンの3つのジスルフィド結合が保持される、N末端修飾インスリン。
3.システイン置換の部位が、ヒトインスリン中に存在しない1つまたは複数の追加のジスルフィド結合の形成を可能にするために、導入されたシステイン残基が、フォールディングされたN末端修飾インスリンの三次元構造に入るように選択され、N末端修飾インスリンが、同じペプチド部、同じN末端修飾基および同じアルブミン結合部分を有するが、ヒトインスリン中に存在しない任意のジスルフィド結合のないインスリンペプチドのインスリン受容体親和性を少なくとも5%有する、態様1から2のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
4.インスリン受容体親和性が、同じペプチド部、同じN末端修飾基および同じアルブミン結合部分を有するが、ヒトインスリン中に存在しない任意のジスルフィド結合のないインスリンペプチドの少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも100%など、少なくとも10%である、態様1から3のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
5.修飾基が、親インスリンのN末端とコンジュゲートしている、1モル当たり200g未満の分子量(MW)を各々有する1つまたは2つの有機置換基である、態様1から4のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
6.修飾基が、式V(A-鎖N末端について例示されている):
【０２１１】
【化１４】
2015502971.tif 000023
【０２１２】
または、グリシン残基が伸長し、アルファ窒素が可視である、代替表示として:
【０２１３】
【化１５】
2015502971.tif 000024
【０２１４】
中でY'およびZと指定され、Y'およびZが、インスリンペプチドのN末端アミノ酸と結合している、態様1から5のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
7.Y'およびZが、異なり、
Y'が、R-C(=X)-であり、
Zが、Hであり、
Rが、H、NH2、直鎖または分岐したC1〜C4アルキル、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジプロピルアミノ、ジメチルアンモニウム、ジエチルアンモニウムまたはジプロピルアンモニウムで置換されている直鎖または分岐したC2〜C4アルキル、CO2Hまたは-OCH2CO2H、C5〜C6シクロアルキル、置換C5〜C6シクロアルキル、5-または6員の飽和ヘテロシクリル、置換されている5-または6員の飽和ヘテロシクリルであり、
Xが、OまたはSである、態様1から6のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
8.Y'およびZが、異なり、
Y'が、R-C(=X)-であり、
Zが、Hであり、
Rが、H、NH2、直鎖または分岐したC1〜C4アルキル、CO2Hまたは-OCH2CO2Hで置換されているC1〜C4アルキル、C5〜C6シクロアルキル、5-または6員の飽和ヘテロシクリルであり、
Xが、OまたはSである、態様1から7のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
9.Y'およびZが、異なり、
Y'が、R-C(=X)-であり、
Zが、Hであり、
Rが、H、NH2、直鎖または分岐したC1〜C4アルキル、CO2Hまたは-OCH2CO2Hで置換されているC1〜C4アルキルであり、
Xが、Oである、態様1から8のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
10.Y'およびZが、異なり、
Y'が、直鎖または分岐したC1〜C4アルキル、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジプロピルアミノ、トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウムまたはジプロピルアンモニウムで置換されている直鎖または分岐したC2〜C4アシル、5-または6員の飽和ヘテロシクリル、置換されている5-または6員の飽和ヘテロシクリル、アミジニルであり、
Zが、Hである、態様1から9のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
11.Y'およびZが、異なり、
Y'が、直鎖C1〜C4アルキル、5-または6員の飽和ヘテロシクリルであり、
Zが、Hである、態様1から10のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
12.Y'=Z=C1〜C4アルキルである、態様1から11のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
13.Y'およびZが、同じで、メチル、エチル、n-プロピル、sec-プロピル、n-ブチル、およびジ-i-ブチルからなる群から選択される、態様1から12のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
14.Y'およびZが、同じで、ジメチルおよびジエチルから選択される、態様1から13のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
15.Y'およびZが同じで、メチルである、態様1から14のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
16.N末端修飾が、生理学的pHにおいて正に荷電している、態様1から15のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
17.N末端修飾が、N,N-ジ-C1〜4アルキル、N-アミジニル、4-(N,N-ジメチルアミノ)ブタノイル、3-(1-ピペリジニル)プロピオニル、3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピオニル、N,N-ジメチル-グリシルからなる群から選択される、態様1から16のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
18.N末端修飾が、N,N-ジ-C1〜4アルキルである、態様1から17のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
19.N末端修飾が、N,N-ジメチルまたはN,N-ジエチルである、態様1から18のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
20.N末端修飾基が、マロニルでもスクシニルでもない、態様1から19のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
21.N末端修飾基が、マロニルではない、態様1から20のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
22.N末端修飾基が、スクシニルではない、態様1から21のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
23.N末端修飾基が、N,N-ジメチル、N,N-ジエチル、カルバモイル、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、グルタリル、およびジグリコリルからなる群から選択される、態様1から22のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
24.N末端修飾が、生理学的pHにおいて中性である、態様1から23のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
25.N末端修飾が、カルバモイル、チオカルバモイル、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、およびピログルタミルからなる群から選択される、態様1から24のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
26.N末端修飾が、カルバモイル、アセチル、プロピオニル、およびブチリルからなる群から選択される、態様1から25のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
27.N末端修飾が、カルバモイルである、態様1から26のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
28.N末端修飾が、アセチルである、態様1から27のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
29.N末端修飾が、生理学的pHにおいて負に荷電している、態様1から28のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
30.N末端修飾が、オキサリル、グルタリルおよびジグリコリルからなる群から選択される、態様1から29のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
31.N末端修飾が、オキサリル、グルタリルおよびジグリコリルからなる群から選択される、態様1から30のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
32.N末端修飾が、グルタリルである、態様1から31のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
33.N末端修飾が、ジグリコリルである、態様1から32のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
34.ペプチド部が、
A10C、B1C;
A10C、B2C;
A10C、B3C;
A10C、B4C;
A10C、B5C;および
B1C、B4C
からなる群から選択される位置において少なくとも2つのシステインで置換されているヒトインスリンである、態様1から33のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
35.システイン置換の
位置が、
A10C、B1C;
A10C、B2C;
A10C、B3C;
A10C、B4C;および
B1C、B4C
からなる群から選択される、態様1から34のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
36.システイン置換の位置が、
A10C、B1C;
A10C、B2C;
A10C、B3C;および
A10C、B4C
からなる群から選択される、態様1から35のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
37.システイン置換の位置が、
A10C、B3C;および
A10C、B4C
からなる群から選択される、態様1から36のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
38.システイン置換の位置が、A10CおよびB3Cである、態様1から37のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
39.少なくとも1つの疎水性アミノ酸が、親水性のアミノ酸で置換されているように変異をさらに含み、前記置換が、インスリンの1つまたは複数のプロテアーゼ切断部位内であるか、または近接している、態様1から38のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
40.ペプチド部が、2つ以上のシステイン置換に加えて、A8H、A14E、A14H、A21G、B1G、B3Q、B3E、B3T、B3V、B3L、B16H、B16E、B25A、B25H、B25N、B27E、B27P、B28E、desB1、desB27およびdesB30からなる群から選択される1つまたは複数の置換アミノ酸を含む、態様1から39のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
41.ペプチド部が、2つ以上のシステイン置換に加えて、A14E、A14H、A21G、desB1、B1G、B3Q、B3E、B16H、B16E、B25H、desB27、およびdesB30からなる群から選択される1つまたは複数の置換アミノ酸を含む、態様1から40のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
42.ペプチド部が、2つ以上のシステイン置換に加えて、A14E、desB1、B1G、B16H、B16E、B25H、desB27、およびdesB30からなる群から選択される1つまたは複数の置換アミノ酸を含む、態様1から41のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
43.ペプチド部が、2つ以上のシステイン置換に加えて、A14E、B16H、B25H、desB27、およびdesB30からなる群から選択される1つまたは複数の置換アミノ酸を含む、態様1から42のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
44.ペプチド部が、A10C、A14E、B1C、B16H、B25H、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B1C、B25H、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B2C、B16H、B25H、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B2C、B25H、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B3C、B16H、B25H、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B3C、B25H、desB27、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B3C、B25H、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B3C、desB27、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B3C、B16H、B25H、desB27、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B16H、desB27、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B4C、B16H、B25H、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B4C、B25A、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B4C、B25H、B28E、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B4C、B25H、desB27、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B4C、B25H、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B4C、B25N、B27E、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B4C、B25N、desB27、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、desB1、B4C、B25H、desB30ヒトインスリン;A10C、A14H、B4C、B25H、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B1C、B16H、B25H、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B2C、B16H、B25H、desB30ヒトインスリン;およびA10C、A14E、B4C、B16H、B25H、desB30ヒトインスリンからなる群から選択される、態様1から43のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
45.ペプチド部が、A10C、A14E、B3C、B16H、B25H、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B3C、B25H、desB27、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B3C、B25H、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B3C、desB27、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B3C、B16H、B25H、desB27、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B16H、desB27、desB30ヒトインスリンからなる群から選択される、態様1から44のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
46.アルブミン結合部分が、インスリン、場合によりリンカーを介して、ペプチド部のアミノ酸位置と結合している脂肪酸または脂肪二酸からなる側鎖である、態様1から45のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
47.ペプチド部が、ただ1つのリシン残基を含み、アルブミン結合部分が、場合によりリンカーを介して、前記リシン残基と結合している、態様1から46のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
48.アルブミン結合部分が、一般式Acy-AA1n-AA2m-AA3p-(式IV)
(式中、
nは、0、または1から3までの範囲の整数であり;
mは、0、または1から10までの範囲の整数であり;
pは、0、または1から10までの範囲の整数であり;
Acyは、約14個から約20個までの炭素原子を含む脂肪酸または脂肪二酸であり;
AA1は、中性の直鎖または環状のアミノ酸残基であり;
AA2は、酸性のアミノ酸残基であり;
AA3は、中性のアルキレングリコール含有アミノ酸残基であり;
AA1、AA2およびAA3が式中に現れる順序は、独立して交換することができ;AA2は、式に従って数回現れることができ(例えば、Acy-AA2-AA32-AA2-);AA2は、式に従って数回独立して(=異なっている)現れることができ(例えば、Acy-AA2-AA32-AA2-);Acy、AA1、AA2および/またはAA3の間の連結は、形式的に、Acy、AA1、AA2およびAA3の各々からの水素原子またはヒドロキシル基(水)の除去により得ることができるアミド(ペプチド)結合であり;ペプチド部への結合は、式IVのアシル部分におけるAA1、AA2、またはAA3残基のC末端から、または式IVの部分において存在するAA2残基の側鎖のうちの1つからであってよい)
を有する、態様1から47のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
49.A1(Nα,Nα-ジメチル)、A10C、A14E、B1(Nα,Nα-ジメチル)、B3C、B25H、desB27、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル)、A10C、A14E、B1(Nα,Nα-ジメチル)、B3C、B25H、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル)、A10C、A14E、B1(Nα,Nα-ジメチル)、B3C、B25H、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル)、A10C、A14E、B1(Nα,Nα-ジメチル)、B3C、B16H、B25H、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル)、A10C、A14E、B1(Nα,Nα-ジメチル)、B3C、desB27、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル)、A10C、A14E、B1G(Nα,Nα-ジメチル)、B3C、B25H、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル)、A10C、A14E、B1G(Nα,Nα-ジメチル)、B3C、B25H、desB27、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル)、A10C、A14E、B1G(Nα,Nα-ジメチル)、B3C、B16H、B25H、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル)、A10C、A14E、B1G(Nα,Nα-ジメチル)、B3C、desB27、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
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A1(Nα,Nα-ジメチル)、A10C、A14E、B1(Nα,Nα-ジメチル)、B3C、B25H、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
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A1(Nα,Nα-ジメチル)、A10C、A14E、B1(Nα,Nα-ジメチル)、B3C、desB27、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル)、A10C、A14E、B1(Nα,Nα-ジメチル)、B3C、B25H、desB27、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル)、A10C、A14E、B1(Nα,Nα-ジメチル)、B3C、B16H、B25H、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル)、A10C、A14E、B1G(Nα,Nα-ジメチル)、B3C、desB27、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル)、A10C、A14E、B1G(Nα,Nα-ジメチル)、B3C、B25H、desB27、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル)、A10C、A14E、B1G(Nα,Nα-ジメチル)、B3C、B25H、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル)、A10C、A14E、B1G(Nα,Nα-ジメチル)、B3C、B16H、B25H、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
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A1(Nα-カルバモイル)、A10C、A14E、B1(Nα-カルバモイル)、B4C、B25H、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-カルバモイル)、A10C、A14E、B1(Nα-カルバモイル)、B3C、desB27、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル)、A10C、A14E、B1(Nαカルバモイル)、B3C、B25H、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-カルバモイル)、A10C、A14E、B1(Nα,Nα-カルバモイル)、B3C、B16H、B25H、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-カルバモイル)、A10C、A14E、B1(Nα-カルバモイル)、B3C、B25H、desB27、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-カルバモイル)、A10C、A14E、B1(Nα-カルバモイル)、B3C、B25H、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-カルバモイル)、A10C、A14E、B1(Nα-カルバモイル)、B3C、B16H、B25H、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-カルバモイル)、A10C、A14E、B1(Nα-カルバモイル)、B3C、B25H、desB27、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-カルバモイル)、A10C、A14E、B1(Nα-カルバモイル)、B3C、desB27、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
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A1(Nα-カルバモイル)、A10C、A14E、B1(Nα-カルバモイル)、B3C、desB27、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
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A1(Nα-カルバモイル)、A10C、A14E、B1(Nα-カルバモイル)、B3C、B16H、B25H、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
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A1(Nα-グルタリル)、A10C、A14E、B1(Nα-グルタリル)、B3C、B25H、desB27、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-グルタリル)、A10C、A14E、B1(Nα-グルタリル)、B3C、B25H、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-グルタリル)、A10C、A14E、B1(Nα-グルタリル)、B3C、B16H、B25H、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
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A1(Nα-グルタリル)、A10C、A14E、B1(Nα-グルタリル)、B3C、desB27、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-グルタリル)、A10C、A14E、B1(Nα-グルタリル)、B3C、B25H、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-グルタリル)、A10C、A14E、B1(Nα-グルタリル)、B3C、B16H、B25H、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-ジグリコリル)、A10C、A14E、B1(Nα-ジグリコリル)、B3C、B25H、desB27、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-ジグリコリル)、A10C、A14E、B1(Nα-ジグリコリル)、B3C、desB27、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-ジグリコリル)、A10C、A14E、B1(Nα-ジグリコリル)、B3C、desB27、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-ジグリコリル)、A10C、A14E、B1(Nα-ジグリコリル)、B3C、B25H、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-ジグリコリル)、A10C、A14E、B1(Nα-ジグリコリル)、B3C、B16H、B25H、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-ジグリコリル)、A10C、A14E、B1(Nα-ジグリコリル)、B3C、B25H、desB27、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-ジグリコリル)、A10C、A14E、B1(Nα-ジグリコリル)、B3C、B25H、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-ジグリコリル)、A10C、A14E、B1(Nα-ジグリコリル)、B3C、B16H、B25H、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-ジグリコリル)、A10C、A14E、B1(Nα-ジグリコリル)、B3C、B25H、desB27、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-ジグリコリル)、A10C、A14E、B1(Nα-ジグリコリル)、B3C、desB27、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-ジグリコリル)、A10C、A14E、B1(Nα-ジグリコリル)、B3C、B25H、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-ジグリコリル)、A10C、A14E、B1(Nα-ジグリコリル)、B3C、B16H、B25H、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-ジグリコリル)、A10C、A14E、B1(Nα-ジグリコリル)、B3C、B25H、desB27、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-ジグリコリル)、A10C、A14E、B1(Nα-ジグリコリル)、B3C、desB27、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-ジグリコリル)、A10C、A14E、B1(Nα-ジグリコリル)、B3C、B25H、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-ジグリコリル)、A10C、A14E、B1(Nα-ジグリコリル)、B3C、B16H、B25H、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
からなる群から選択される、態様1から48のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
50.A1(Nα-カルバモイル)、A10C、A14E、B1(Nα-カルバモイル)、B3C、desB27、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-カルバモイル)、A10C、A14E、B1(Nα-カルバモイル)、B3C、desB27、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-カルバモイル)、A10C、A14E、B1(Nα-カルバモイル)、B3C、desB27、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-カルバモイル)、A10C、A14E、B1(Nα-カルバモイル)、B3C、desB27、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-アセチル)、A10C、A14E、B1(Nα-アセチル)、B3C、desB27、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-アセチル)、A10C、A14E、B1(Nα-アセチル)、B3C、desB27、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-アセチル)、A10C、A14E、B1(Nα-アセチル)、B3C、desB27、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-グルタリル)、A10C、A14E、B1(Nα-グルタリル)、B3C、desB27、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-グルタリル)、A10C、A14E、B1(Nα-グルタリル)、B3C、desB27、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-グルタリル)、A10C、A14E、B1(Nα-グルタリル)、B3C、desB27、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-グルタリル)、A10C、A14E、B1(Nα-グルタリル)、B3C、desB27、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-ジグリコリル)、A10C、A14E、B1(Nα-ジグリコリル)、B3C、desB27、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-ジグリコリル)、A10C、A14E、B1(Nα-ジグリコリル)、B3C、desB27、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-ジグリコリル)、A10C、A14E、B1(Nα-ジグリコリル)、B3C、desB27、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-ジグリコリル)、A10C、A14E、B1(Nα-ジグリコリル)、B3C、desB27、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
からなる群から選択される、態様1から49のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
51.A1(Nα-カルバモイル)、A10C、A14E、B1(Nα-カルバモイル)、B3C、desB27、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-カルバモイル)、A10C、A14E、B1(Nα-カルバモイル)、B3C、desB27、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-カルバモイル)、A10C、A14E、B1(Nα-カルバモイル)、B3C、desB27、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-カルバモイル)、A10C、A14E、B1(Nα-カルバモイル)、B3C、desB27、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-グルタリル)、A10C、A14E、B1(Nα-グルタリル)、B3C、desB27、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-グルタリル)、A10C、A14E、B1(Nα-グルタリル)、B3C、desB27、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-グルタリル)、A10C、A14E、B1(Nα-グルタリル)、B3C、desB27、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-グルタリル)、A10C、A14E、B1(Nα-グルタリル)、B3C、desB27、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-ジグリコリル)、A10C、A14E、B1(Nα-ジグリコリル)、B3C、desB27、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-ジグリコリル)、A10C、A14E、B1(Nα-ジグリコリル)、B3C、desB27、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-ジグリコリル)、A10C、A14E、B1(Nα-ジグリコリル)、B3C、desB27、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-ジグリコリル)、A10C、A14E、B1(Nα-ジグリコリル)、B3C、desB27、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
からなる群から選択される、態様1から50のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
52.A1(Nα,Nα-ジメチル)、A10C、A14E、B1(Nα,Nα-ジメチル)、B3C、B16H、B25H、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル)、A10C、A14E、B1G(Nα,Nα-ジメチル)、B3C、B16H、B25H、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル)、A10C、A14E、B1(Nα,Nα-ジメチル)、B3C、B16H、B25H、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル)、A10C、A14E、B1G(Nα,Nα-ジメチル)、B3C、B16H、B25H、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-カルバモイル)、A10C、A14E、B1(Nα-カルバモイル)、B3C、B16H、B25H、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-カルバモイル)、A10C、A14E、B1(Nα-カルバモイル)、B3C、B16H、B25H、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-アセチル)、A10C、A14E、B1(Nα-アセチル)、B3C、B16H、B25H、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-アセチル)、A10C、A14E、B1(Nα-アセチル)、B3C、B16H、B25H、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-グルタリル)、A10C、A14E、B1(Nα-グルタリル)、B3C、B16H、B25H、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-グルタリル)、A10C、A14E、B1(Nα-グルタリル)、B3C、B16H、B25H、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-ジグリコリル)、A10C、A14E、B1(Nα-ジグリコリル)、B3C、B16H、B25H、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα-ジグリコリル)、A10C、A14E、B1(Nα-ジグリコリル)、B3C、B16H、B25H、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
からなる群から選択される、態様1から51のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
53.A1(Nα,Nα-ジメチル)、A10C、A14E、B1(Nα,Nα-ジメチル)、B3C、B16H、B25H、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル)、A10C、A14E、B1G(Nα,Nα-ジメチル)、B3C、B16H、B25H、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル)、A10C、A14E、B1(Nα,Nα-ジメチル)、B3C、B16H、B25H、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル)、A10C、A14E、B1G(Nα,Nα-ジメチル)、B3C、B16H、B25H、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
からなる群から選択される、態様1から52のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
54.A1(Nα,Nα-ジメチル)、A10C、A14E、B1(Nα,Nα-ジメチル)、B3C、B16H、B25H、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル)、A10C、A14E、B1G(Nα,Nα-ジメチル)、B3C、B16H、B25H、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
からなる群から選択される、態様1から53のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
55.A1(Nα,Nα-ジメチル)、A10C、A14E、B1(Nα,Nα-ジメチル)、B3C、B25H、desB27、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル)、A10C、A14E、B1G(Nα,Nα-ジメチル)、B3C、B25H、desB27、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル)、A10C、A14E、B1(Nα,Nα-ジメチル)、B3C、B25H、desB27、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル)、A10C、A14E、B1G(Nα,Nα-ジメチル)、B3C、B25H、desB27、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル)、A10C、A14E、B1(Nα,Nα-ジメチル)、B3C、B25H、desB27、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル)、A10C、A14E、B1G(Nα,Nα-ジメチル)、B3C、B25H、desB27、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル)、A10C、A14E、B1(Nα,Nα-ジメチル)、B3C、B25H、desB27、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル)、A10C、A14E、B1G(Nα,Nα-ジメチル)、B3C、B25H、desB27、B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン
からなる群から選択される、態様1から54のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
56.上記明細書において具体的に記述されている化合物のいずれか1つである、態様1から55のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
57.態様1から56のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリンを含む医薬組成物。
58.経口医薬組成物である、態様57に記載の医薬組成物。
59. 1つまたは複数の脂質およびN末端修飾インスリンを含む経口医薬組成物。
60.N末端修飾インスリンが、ペプチド部、N末端修飾基および、場合により、アルブミン結合部分からなる、態様59に記載の経口医薬組成物。
61.無水である、態様59から60のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
62.脂質が、グリセロールモノ-カプリレート(例えば、Rylo MG08 Pharmaなど)およびグリセロールモノ-カプレート(例えば、DaniscoからのRylo MG10 Pharmaなど)からなる群から選択される、態様59から61のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。別の態様において、脂質は、プロピレングリコールカプリレート(例えば、AbitecからのCapmul PG8またはGattefosseからのCapryol PGMC、もしくはCapryol 90など)からなる群から選択される。
63.N末端修飾インスリン(a)、N末端修飾インスリンのための少なくとも1つの極性有機溶媒(b)、少なくとも1つの界面活性剤(c)、少なくとも1つの親油性構成成分(d)、および、場合により、少なくとも1つの固体親水性構成成分(e)を含む固体または半固体医薬組成物であり、自然に分散可能である、態様59から62のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
64.N末端修飾インスリン(a)、N末端修飾インスリンのための少なくとも1つの極性有機溶媒(b)、少なくとも1つの親油性構成成分(c)、および場合により、少なくとも1つの界面活性剤(d)を含む水を含まない液体医薬組成物であり、澄明な溶液の形態である、態様59から63のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
65.界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、態様59から64のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
66.界面活性剤が、ポロキサマーおよびPluronic F-127またはPluronic F-68などのポロキサマーの混合物からなる群から選択される固体界面活性剤である、態様59から65のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
67.親油性構成成分が、モノ-ジ-グリセリドである、態様59から66のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
68.親油性構成成分が、親油性構成成分がプロピレングリコールと混ぜられる場合に溶液が得られるように選択される、態様59から67のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
69.親油性構成成分が、モノ-および/もしくはジ-グリセリドまたはプロピレングリコールカプリレートである、態様59から68のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
70.少なくとも1つのN末端修飾インスリン、少なくとも1つの極性有機溶媒およびHLBが10を超える少なくとも2つの非イオン性界面活性剤を含む液体医薬組成物であり、油もいかなる他の液体構成成分もHLBが7未満の界面活性剤も含有しない、態様59から69のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
71.組成物が、水性媒体における希釈後にマイクロエマルジョンまたはナノエマルジョンを形成する、態様59から70のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
72.有機溶媒が、ポリオールからなる群から選択される、態様59から71のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
73.有機溶媒が、プロピレングリコール、グリセロールおよびそれらの混合物からなる群から選択される、態様59から72のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
74.有機溶媒が、プロピレングリコールである、態様59から73のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
75.前記非イオン性界面活性剤のうちの1つまたは複数が、C8脂肪酸(カプリレート)、C10脂肪酸(カプレート)またはC12脂肪酸(ラウレート)などの中鎖脂肪酸基を含む、態様59から74のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
76.前記非イオン性界面活性剤のうちの1つまたは複数が、Labrasol (カプリロカプロイルマクロゴールグリセリドとも命名される)、Tween 20 (ポリソルベート20またはポリエチレングリコールソルビタンモノラウレートとも命名される)、Tween 80 (ポリソルベート80とも命名される)、ジグリセロールモノカプリレート、ポリグリセロールカプリレートおよびCremophor RH 40からなる群から選択される、態様59から75のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
77.有機溶媒が、約1%から約15%までの量で存在する、態様59から76のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
78.修飾基が、親インスリンのN末端とコンジュゲートしている、1モル当たり200g未満の分子量(MW)を各々有する1つまたは2つの有機置換基である、態様59から77のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
79.修飾基が、式V:
【０２１５】
【化１６】
2015502971.tif 000025
【０２１６】
または、グリシン残基が伸長し、アルファ窒素が可視である、代替表示として:
【０２１７】
【化１７】
2015502971.tif 000026
【０２１８】
中でY'およびZと指定され、Y'およびZが、インスリンペプチドのN末端アミノ酸と結合している、態様59から78のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
80.Y'およびZが、異なり、
Y'が、R-C(=X)-であり、
Zが、Hであり、
Rが、H、NH2、直鎖または分岐したC1〜C4アルキル、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジプロピルアミノ、ジメチルアンモニウム、ジエチルアンモニウム、ジプロピルアンモニウムで置換されている直鎖または分岐したC2〜C4アルキル、CO2Hまたは-OCH2CO2H、C5〜C6シクロアルキル、置換C5〜C6シクロアルキル、5-または6員の飽和ヘテロシクリル、置換されている5-または6員の飽和ヘテロシクリルであり、
Xが、OまたはSである、態様59から79のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
81.Y'およびZが、異なり、
Y'が、R-C(=X)-であり、
Zが、Hであり、
Rが、H、NH2、直鎖または分岐したC1〜C4アルキル、CO2Hまたは-OCH2CO2Hで置換されているC1〜C4アルキル、C5〜C6シクロアルキル、5-または6員の飽和ヘテロシクリルであり、
Xが、OまたはSである、態様59から79のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
82.Y'およびZが、異なり、
Y'が、R-C(=X)-であり、
Zが、Hであり、
Rが、H、NH2、直鎖または分岐したC1〜C4アルキル、CO2Hまたは-OCH2CO2Hで置換されているC1〜C4アルキルであり、
Xが、Oである、態様59から79のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
83.Y'およびZが、異なり、
Y'が、直鎖または分岐したC1〜C4アルキル、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジプロピルアミノ、トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウムまたはジプロピルアンモニウムで置換されている直鎖または分岐したC2〜C4アシル、5-または6員の飽和ヘテロシクリル、置換されている5-または6員の飽和ヘテロシクリル、アミジニルであり、
Zが、Hである、態様59から79のいずれか一様態に記載の経口医薬組成物。
84.Y'およびZが、異なり、
Y'が、直鎖C1〜C4アルキル、5-または6員の飽和ヘテロシクリルであり、
Zが、Hである、態様59から79のいずれか一様態に記載の経口医薬組成物。
85.Y'=Z=C1〜C4アルキルである、態様59から79のいずれか一様態に記載の経口医薬組成物。
86.Y'およびZが、同じで、メチル、エチル、n-プロピル、sec-プロピル、n-ブチル、およびジ-i-ブチルからなる群から選択される、態様59から79のいずれか一様態に記載の経口医薬組成物。
87.Y'およびZが、同じで、ジメチルおよびジエチルから選択される、態様59から79のいずれか一様態に記載の経口医薬組成物。
88.Y'およびZが同じで、メチルである、態様59から79のいずれか一様態に記載の経口医薬組成物。
89.N末端修飾が、生理学的pHにおいて正に荷電している、態様59から79のいずれか一様態に記載の経口医薬組成物。
90.N末端修飾が、N,N-ジ-C1〜4アルキル、N-アミジニル、4-(N,N-ジメチルアミノ)ブタノイル、3-(1-ピペリジニル)プロピオニル、3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピオニル、およびN,N-ジメチル-グリシルからなる群から選択される、態様59から79のいずれか一様態に記載の経口医薬組成物。
91.N末端修飾が、N,N-ジ-C1〜4アルキルである、態様59から79のいずれか一様態に記載の経口医薬組成物。
92.N末端修飾が、N,N-ジメチルまたはN,N-ジエチルである、態様59から79のいずれか一様態に記載の経口医薬組成物。
93.N末端修飾基が、マロニルでもスクシニルでもない、態様59から92のいずれか一様態に記載の経口医薬組成物。
94.N末端修飾基が、マロニルではない、態様59から92のいずれか一様態に記載の経口医薬組成物。
95.N末端修飾基が、スクシニルではない、態様59から92のいずれか一様態に記載の経口医薬組成物。
96.N末端修飾基が、N,N-ジメチル、N,N-ジエチル、カルバモイル、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、グルタリル、およびジグリコリルからなる群から選択される、態様59から79のいずれか一様態に記載の経口医薬組成物。
97.N末端修飾が、カルバモイル、チオカルバモイル、短鎖アシル基、オキサリル、グルタリルおよびジグリコリルからなる群から選択される、態様59から79のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
98.N末端修飾が、カルバモイル、チオカルバモイル、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、ピログルタミル、オキサリル、グルタリルおよびジグリコリルからなる群から選択される、態様59から79のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
99.N末端修飾が、生理学的pHにおいて中性である、態様59から79のいずれか一様態に記載の経口医薬組成物。
100.N末端修飾が、カルバモイル、チオカルバモイル、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、およびピログルタミルからなる群から選択される、態様59から79のいずれか一様態に記載の経口医薬組成物。
101.N末端修飾が、カルバモイル、アセチル、プロピオニル、およびブチリルからなる群から選択される、態様59から79のいずれか一様態に記載の経口医薬組成物。
102.N末端修飾が、カルバモイルである、態様59から79のいずれか一様態に記載の経口医薬組成物。
103.N末端修飾が、アセチルである、態様59から79のいずれか一様態に記載の経口医薬組成物。
104.N末端修飾が、生理学的pHにおいて負に荷電している、態様59から79のいずれか一様態に記載の経口医薬組成物。
105.N末端修飾が、オキサリル、グルタリルおよびジグリコリルからなる群から選択される、態様59から79のいずれか一様態に記載の経口医薬組成物。
106.N末端修飾が、グルタリルである、態様59から79のいずれか一様態に記載の経口医薬組成物。
107.N末端修飾が、ジグリコリルである、態様59から79のいずれか一様態に記載の経口医薬組成物。
108.ペプチド部が、
A10C、B1C;
A10C、B2C;
A10C、B3C;
A10C、B4C;
A10C、B5C;および
B1C、B4C
からなる群から選択される位置において少なくとも2つのシステインで置換されているヒトインスリンである、態様59から107のいずれか一様態に記載の経口医薬組成物。
109.システイン置換の位置が、
A10C、B1C;
A10C、B2C;
A10C、B3C;
A10C、B4C;および
B1C、B4C
からなる群から選択される、態様59から108のいずれか一様態に記載の経口医薬組成物。
110.システイン置換の位置が、
A10C、B1C;
A10C、B2C;
A10C、B3C;および
A10C、B4C
からなる群から選択される、態様59から109のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
111.システイン置換の位置が、
A10C、B3C;および
A10C、B4C
からなる群から選択される、態様59から110のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
112.システイン置換の位置が、A10CおよびB3Cである、態様59から111のいずれか一様態に記載の経口医薬組成物。
113.少なくとも1つの疎水性アミノ酸が、親水性のアミノ酸で置換されているように変異をさらに含み、前記置換が、インスリンの1つまたは複数のプロテアーゼ切断部位内であるか、または近接している、態様59から112のいずれか一様態に記載の経口医薬組成物。
114.ペプチド部が、2つ以上のシステイン置換に加えて、A8H、A14E、A14H、A21G、B1G、B3Q、B3E、B3T、B3V、B3L、B16H、B16E、B25A、B25H、B25N、B27E、B27P、B28E、desB1、desB27およびdesB30からなる群から選択される1つまたは複数の置換アミノ酸を含む、態様59から113のいずれか一様態に記載の経口医薬組成物。
115.ペプチド部が、2つ以上のシステイン置換に加えて、A14E、A14H、A21G、desB1、B1G、B3Q、B3E、B16H、B16E、B25H、desB27、およびdesB30からなる群から選択される1つまたは複数の置換アミノ酸を含む、態様59から113のいずれか一様態に記載の経口医薬組成物。
116.ペプチド部が、2つ以上のシステイン置換に加えて、A14E、desB1、B1G、B16H、B16E、B25H、desB27、およびdesB30からなる群から選択される1つまたは複数の置換アミノ酸を含む、態様59から113のいずれか一様態に記載の経口医薬組成物。
117.ペプチド部が、2つ以上のシステイン置換に加えて、A14E、B16H、B25H、desB27、およびdesB30からなる群から選択される1つまたは複数の置換アミノ酸を含む、態様59から113のいずれか一様態に記載の経口医薬組成物。
118.ペプチド部が、A10C、A14E、B1C、B16H、B25H、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B1C、B25H、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B2C、B16H、B25H、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B2C、B25H、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B3C、B16H、B25H、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B3C、B25H、desB27、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B3C、B25H、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B3C、desB27、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B3C、B16H、B25H、desB27、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B16H、desB27、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B4C、B16H、B25H、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B4C、B25A、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B4C、B25H、B28E、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B4C、B25H、desB27、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B4C、B25H、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B4C、B25N、B27E、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B4C、B25N、desB27、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、desB1、B4C、B25H、desB30ヒトインスリン;A10C、A14H、B4C、B25H、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B1C、B16H、B25H、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B2C、B16H、B25H、desB30ヒトインスリン;およびA10C、A14E、B4C、B16H、B25H、desB30ヒトインスリンからなる群から選択される、態様59から117のいずれか一様態に記載の経口医薬組成物。
119.ペプチド部が、A10C、A14E、B3C、B16H、B25H、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B3C、B25H、desB27、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B3C、B25H、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B3C、desB27、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B3C、B16H、B25H、desB27、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B16H、desB27、desB30ヒトインスリンからなる群から選択される、態様59から117のいずれか一様態に記載の経口医薬組成物。
120.ペプチド部が、A10C、A14E、B1C、B16H、B25H、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B1C、B25H、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B2C、B16H、B25H、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B2C、B25H、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B3C、B16H、B25H、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B3C、B25H、desB27、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B3C、B25H、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B3C、desB27、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B3C、B16H、B25H、desB27、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B16H、desB27、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B4C、B16H、B25H、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B4C、B25A、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B4C、B25H、B28E、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B4C、B25H、desB27、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B4C、B25H、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B4C、B25N、B27E、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B4C、B25N、desB27、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、desB1、B4C、B25H、desB30ヒトインスリン;A10C、A14H、B4C、B25H、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B1C、B16H、B25H、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B2C、B16H、B25H、desB30ヒトインスリン;およびA10C、A14E、B4C、B16H、B25H、desB30ヒトインスリンからなる群から選択される、態様59から117のいずれか一様態に記載の経口医薬組成物。
121.ペプチド部が、A10C、A14E、B3C、B16H、B25H、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B3C、B25H、desB27、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B3C、B25H、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B3C、desB27、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B3C、B16H、B25H、desB27、desB30ヒトインスリン;A10C、A14E、B16H、desB27、desB30ヒトインスリンからなる群から選択される、態様59から117のいずれか一様態に記載の経口医薬組成物。
122.アルブミン結合部分が、インスリン、場合によりリンカーを介して、ペプチド部のアミノ酸位置において、結合している脂肪酸または脂肪二酸からなる側鎖である、態様59から121のいずれか一様態に記載の経口医薬組成物。
123.ペプチド部が、ただ1つのリシン残基を含み、アルブミン結合部分が、場合によりリンカーを介して、前記リシン残基と結合している、態様59から122のいずれか一様態に記載の経口医薬組成物。
124.アルブミン結合部分が、一般式Acy-AA1n-AA2m-AA3p-(式IV)
(式中、
nは、0、または1から3までの範囲の整数であり;
mは、0、または1から10までの範囲の整数であり;
pは、0、または1から10までの範囲の整数であり;
Acyは、約14個から約20個までの炭素原子を含む脂肪酸または脂肪二酸であり;
AA1は、中性の直鎖または環状のアミノ酸残基であり;
AA2は、酸性のアミノ酸残基であり;
AA3は、中性のアルキレングリコール含有アミノ酸残基であり;
AA1、AA2およびAA3が式中に現れる順序は、独立して交換することができ;AA2は、式に従って数回現れることができ(例えば、Acy-AA2-AA32-AA2-);AA2は、式に従って数回独立して(=異なっている)現れることができ(例えば、Acy-AA2-AA32-AA2-);Acy、AA1、AA2および/またはAA3の間の連結は、形式的に、Acy、AA1、AA2およびAA3の各々からの水素原子またはヒドロキシル基(水)の除去により得ることができるアミド(ペプチド)結合であり;ペプチド部への結合は、式IVのアシル部分におけるAA1、AA2、またはAA3残基のC末端から、または式IVの部分において存在するAA2残基の側鎖のうちの1つからであってよい)
を有する、態様59から123のいずれか一様態に記載の経口医薬組成物。
125.態様1から56のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン誘導体を製造する方法。
【０２１９】
本明細書で引用されている刊行物、特許出願、および特許を包含するすべての参考文献は、各参考文献が参照により組み込まれると個別にかつ具体的に指示され、本明細書にその全体が記載されているのと同じ程度に(法律で認められている最高の程度に)、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２２０】
すべての表題および小見出しは、本明細書において便宜のためのみに使用され、決して本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
【０２２１】
本明細書において提供されるありとあらゆる実施例、または例示的な言葉(例えば「など(such as)」)の使用は、単に、本発明をより良く解明することが意図されており、別段の主張がない限り、本発明の範囲に対する限定をもたらすものではない。明細書におけるどの言葉も、本発明の実施に不可欠として任意の主張されていない要素を指示していると解釈されるべきではない。
【０２２２】
本明細書における特許文書の引用および組み込みは、便宜のためのみに行われ、そのような特許文書の妥当性、特許性、および/または法的強制力のいかなる見解も反映しない。
【０２２３】
本発明は、適用可能な法律で認められているような本明細書に添付されている特許請求の範囲に列挙されている主題のすべての変更形態および等価形態を包含する。
【０２２４】
(実施例)
下記の実施例は、限定ではなく、例証のために提供される。
【０２２５】
本明細書で使用される略語は、下記のものである:βAlaは、ベータ-アラニルであり、Aocは、8-アミノオクタン酸であり、tBuは、tert-ブチルであり、CVは、カラム体積であり、DCMは、ジクロロメタンであり、DICは、ジイソプロピルカルボジイミドであり、DIPEA=DIEAは、N,N-ジイソプロピルエチルアミンであり、DMFは、N,N-ジメチルホルムアミドであり、DMSOは、ジメチルスルホキシドであり、EtOAcは、酢酸エチルであり、Fmocは、9-フルオレニルメチルオキシカルボニルであり、γGluは、ガンマL-グルタミルであり、HClは、塩酸であり、HOBtは、1-ヒドロキシベンゾトリアゾールであり、NMPは、N-メチルピロリドンであり、MeCNは、アセトニトリルであり、OEGは、[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エチルカルボニルであり、Suは、スクシンイミジル-1-イル=2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルであり、OSuは、スクシンイミジル-1-イルオキシ=2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルオキシであり、RPCは、逆相クロマトグラフィーであり、RTは、室温であり、TFAは、トリフルオロ酢酸であり、THFは、テトラヒドロフランであり、TNBSは、2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸であり、TRISは、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンであり、TSTUは、テトラフルオロホウ酸O-(N-スクシンイミジル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムである。
【０２２６】
下記の実施例および一般手順は、明細書および合成スキームで同定された中間体化合物および最終生成物に言及する。本発明の化合物の調製は、下記の実施例を使用して詳細に記載されるが、記載されている化学反応は、本発明の化合物の調製へのそれらの一般的適用性の観点から開示されている。たまに、反応は、本発明の開示されている範囲内に包含される各化合物に記載されているように適用可能でないことがある。これが生じる化合物は、当業者により容易に認識されるであろう。これらの場合に、反応は、当業者に知られている従来の改変により、すなわち、妨害する基の適切な保護により、他の従来の試薬に変えることにより、または反応条件の常法に従う改変により成功裏に行うことができる。あるいは、本明細書に開示されているかさもなければ従来の他の反応は、本発明の対応する化合物の調製に適用可能になるであろう。すべての調製方法において、すべての出発材料は、知られているか知られている出発材料から容易に調製することができる。すべての温度は、セ氏温度で記載され、別段の指示がない限り、すべての部および百分率は、収率へ言及する場合には重量により、すべての部は、溶媒および溶離液へ言及する場合には体積による。
【０２２７】
本発明の化合物は、当技術分野内で典型的である下記の手順のうちの1つまたは複数を用いることにより精製することができる。これらの手順は、必要とされれば、グラジエント、pH、塩、濃度、流量、カラムなどに関して改変されてよい。不純物プロファイル、対象とするインスリンの溶解性などの要因に応じて、これらの改変は、当業者により容易に認識され行われうる。
【０２２８】
酸性HPLCまたは脱塩後、化合物は、純粋な画分の凍結乾燥により単離される。
【０２２９】
中性HPLCまたは陰イオン交換クロマトグラフィー後、化合物は、脱塩され、等電pHにおいて沈降され、または酸性HPLCにより精製される。
【０２３０】
典型的な精製手順:
HPLCシステムは、下記からなるGilsonシステムである: 215型液体ハンドラー、322-H2型ポンプおよび155型UV検出器。検出は、典型的には、210nmおよび280nmにおける。
【０２３１】
Akta Purifier FPLCシステム(GE Health Care)は、下記からなる:P-900型ポンプ、UV-900型UV検出器、pH/C-900型pHおよび電導度検出器、Frac-950型フラクションコレクター。UV検出は、典型的には、214nm、254nmおよび276nmにおける。Akta Explorer Air FPLCシステム(Amersham BioGE Health Caresciences)は、下記からなる: P-900型ポンプ、UV-900型UV検出器、pH/C-900型pHおよび電導度検出器、Frac-950型フラクションコレクター。UV検出は、典型的には、214nm、254nmおよび276nmにおける。
酸性HPLC:
カラム: Phenomenex、Gemini、5μ、C18、110Å、250×30cm
流量: 20ml/分
溶離液: A:水中の0.1%TFA B: CH3CN中の0.1%TFA
グラジエント: 0-7.5分: 10%B
7.5-87.5分: 10%Bから60%B
87.5-92.5分: 60%B
92.5-97.5分: 60%Bから100%B
中性HPLC:
カラム: Phenomenex、Gemini、C18、5μm 250×30.00mm、110Å
流量: 20ml/分
溶離液: A:水性10mM TRIS中の20%CH3CN+15mM(NH4)SO4 pH=7.3 B: 80%CH3CN、20%水
グラジエント: 0-7.5分: 0%B
7.5-52.5分: 0%Bから60%B
52.5-57.5分: 60%B
57.5-58分: 60%Bから100%B
58-60分: 100%B
60-63分: 10%B
陰イオン交換クロマトグラフィー:
カラム: RessourceQ、6ml、
流量: 6ml/分
緩衝液A: 0.09%NH4HCO3、0.25%NH4OAc、42.5%エタノール  pH8.4
緩衝液B: 0.09%NH4HCO3、2.5%NH4OAc、42.5%エタノール  pH8.4
グラジエント: 30CVの間に100%Aから100%B
カラム: Source 30Q、30×250mm
流量: 80ml/分
緩衝液A: 50%エタノール中の15mM TRIS、30mM酢酸アンモニウム、pH7.5 (1.25mS/cm)
緩衝液B: 50%エタノール中の15mM TRIS、300mM酢酸アンモニウム、pH7.5 (7.7mS/cm)
グラジエント: 40CVにわたって15%Bから70%B
脱塩:
カラム: Daiso 200Å 15um FeFgel 304、30×250mm
緩衝液A: 20v/v%エタノール、0.2%酢酸
緩衝液B: 80%v/v%エタノール、0.2%酢酸
グラジエント: 1.5CVにわたって0〜80%B
流量: 80ml/分
カラム: HiPrep 26/10
流量: 10ml/分
グラジエント: 6CV
緩衝液: 10mM NH4HCO3
【０２３２】
一般式(II)のアシル化試薬の固相合成のための一般手順:
(II): Acy-AA1n-AA2m-AA3p-Act、
(式中、Acy、AA1、AA2、AA3、n、m、およびpは、上で定義されている通りであり、Actは、N-ヒドロキシスクシンイミド(OSu)、または1-ヒドロキシベンゾトリアゾールなどの活性エステルの脱離基であり、
アシル部分のAcyおよびAA2部分内のカルボン酸は、tert-ブチルエステルとして保護されている)。
【０２３３】
本発明による一般式(II)の化合物は、固相ペプチド合成の分野において当業者によく知られている手順を使用して固体支持体上で合成することができる。この手順は、ポリスチレン2-クロロトリチルクロリド樹脂へのFmoc保護アミノ酸の結合を含む。結合は、例えば、トリエチルアミンまたはN,N-ジイソプロピルエチルアミンのような三級アミンの存在下に遊離のN保護アミノ酸を使用して達成することができる(下の参考文献を参照)。このアミノ酸のC末端(樹脂と結合している)は、本発明の親インスリンとカップリングしている合成配列の末端部にあたる。樹脂へのFmocアミノ酸の結合後、Fmoc基は、例えば、ピペリジンまたはジエチルアミンのような二級アミンを使用して脱保護され、続いて、別の(または、同じ)Fmoc保護アミノ酸とカップリングされ、脱保護される。合成配列は、ヘキサデカン二酸、ヘプタデカン二酸、オクタデカン二酸またはエイコサン二酸のモノ-tert-ブチルエステルのようなモノ-tert-ブチル保護脂肪(α,ω)二酸のカップリングにより終了される。樹脂からの化合物の切断は、0.5〜5% TFA/DCM (ジクロロメタン中のトリフルオロ酢酸)のような希釈された酸、酢酸(例えば、DCM中の10%、またはHOAc/トリフルオロエタノール/DCM 1:1:8)、またはDCM中のヘキサフルオロイソプロパノールを使用して達成される(例えば、「Organic Synthesis on Solid Phase」、F.Z. Dorwald、Wiley-VCH、2000年ISBN 3-527-29950-5、「Peptides: Chemistry and Biology」、N. SewaldおよびH.-D. Jakubke、Wiley-VCH, 2002年  ISBN 3-527-30405-3または「The Combinatorial Chemistry Catalog」1999年、Novabiochem AG、およびその中に引用されている参考文献を参照)。これは、カルボン酸保護基として化合物中に存在するtert-ブチルエステルが脱保護されないことを保証している。最後に、C末端カルボキシル基(樹脂から解放された)は、例えば、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(OSu)として活性化され、本発明の親インスリンとの結合におけるカップリング試薬として直接かまたは精製後に使用される。この手順は、WO09115469中の実施例9に記載されている。
【０２３４】
あるいは、上の一般式(II)のアシル化試薬は、下に記載されているような溶液相合成により調製することができる。
【０２３５】
ヘキサデカン二酸、ヘプタデカン二酸、オクタデカン二酸またはエイコサン二酸のモノ-tert-ブチルエステルなどのモノ-tert-ブチル保護脂肪二酸は、例えば、下に記載されているようなOSu-エステルとしてまたはHOBt-エステルもしくはHOAt-エステルなどの当業者に知られている任意の他の活性化エステルとして活性化される。この活性エステルは、DIPEAまたはトリエチルアミンなどの適当な塩基の存在下にTHF、DMF、NMP (または、溶媒混合物)などの適当な溶媒中でアミノ酸AA1、モノ-tert-ブチル保護AA2、またはAA3のうちの1つとカップリングされる。中間体は、例えば、抽出手順により、またはクロマトグラフィー手順により単離される。得られる中間体は、活性化(上に記載されているように)および上に記載されているようなアミノ酸AA1、モノ-tert-ブチル保護AA2、またはAA3のうちの1つとのカップリングに再び供される。この手順は、望ましい保護中間体Acy-AA1n-AA2m-AA3p-OHが得られるまで繰り返される。これは、一般式(II) Acy-AA1n-AA2m-AA3p-Actのアシル化試薬を得るために、同様に活性化される。この手順は、WO09115469中の実施例11に記載されている。
【０２３６】
上の方法のいずれかにより調製されるアシル化試薬は、OSuエステルとしての活性化後に(tert-ブチル)脱保護することができる。これは、OSu-活性化tert-ブチル保護アシル化試薬のTFA処理により行うことができる。任意のインスリンのアシル化後、結果として生じる本発明の脱保護されたアシル化プロテアーゼ安定化インスリンが得られる。この手順は、WO09115469中の実施例16に記載されている。
【０２３７】
上の方法のいずれかにより調製される試薬が、OSuエステルとしての活性化後に(tert-ブチル)脱保護されなければ、任意のインスリンのアシル化は、対応する本発明のtert-ブチル保護アシル化インスリンを与える。本発明の脱保護されたアシル化インスリンを得るために、保護インスリンは、脱保護されなければならない。これは、本発明の脱保護されたアシル化インスリンを得るためのTFA処理により行うことができる。この手順は、WO05012347中の実施例1に記載されている。
【０２３８】
N末端保護のないアシル化インスリン(すなわち、本発明のN末端保護誘導体を調製するための出発材料)を調製するための方法は、WO 09115469で見いだすことができる。
【０２３９】
本発明のアシル化インスリンの還元N-メチル化のための調製のための一般手順(A)
アシル化インスリンを、場合により0.2Mクエン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液または希酢酸などの緩衝液を含有する、N-メチルホルムアミド、DMF、NMP、THFまたはDMSO (3.8ml)など極性の非プロトン性またはプロトン性の溶媒および水の混合物に、酸性pH(4近辺、広い耐性)で溶かし、混合物を、穏やかに撹拌する。37%水性ホルムアルデヒド溶液(5〜10以上の当量)、またはN,N-ジエチル誘導体が所望であればアセトアルデヒドを添加し、続いて、メタノールもしくは水中のシアノ水素化ホウ素ナトリウム(5〜10当量)またはTHFもしくはNMPなど中の2-.ピコリンボランのいずれかの新たに調製した溶液を添加する。混合物を、穏やかに撹拌する。反応の終了後、混合物を、1N塩酸の滴下添加によりpH2〜3まで注意深く酸性化する。生成物を、調製用HPLCまたはアニオン交換クロマトグラフィー(AIEC)により単離する。
【０２４０】
一般手順(A)は、実施例1において例証される。
【０２４１】
(実施例1)
一般手順(A):
A1(Nα,Nα-ジメチル)、A10C、A14E、B1(Nα,Nα-ジメチル)、B3C、B25H、desB27、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)。
【０２４２】
【化１８】
2015502971.tif 000027
【０２４３】
A10C、A14E、B3C、B25H、desB27、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン(0.35g)を、水(20mL)およびTHF(10mL)に溶かした。pHを1N NaOHで3.9に調整した。この溶液に、水性ホルムアルデヒド(37%、49μL)を添加し、続いて、THF (0.5mL)中の2-ピコリンボランの溶液をゆっくり滴下添加した。得られた混合物を、5時間にわたって室温で、および終夜5℃で放置した。混合物に、水中の30%アセトニトリルを二倍の体積まで添加し、pHを、1N塩酸で2.5に調整した。
【０２４４】
誘導体を、調製用HPLCにより精製した:
カラム: Phenomenex、Gemini、5μ、C18、110Å、Axia250×30cm
流量: 25ml/分
溶離液: A: 10%アセトニトリルを含有する水中の0,1% TFA
B: 60%アセトニトリルを含有する水中の0,1% TFA
グラジエント: 40分かけて20〜100% B
【０２４５】
純粋な画分をプールし、凍結乾燥した。乾燥材料を、40%アセトニトリル(50mL)を含有する水に溶かし、1N NaOHをpH=8まで添加し、凍結乾燥すると、表題インスリン誘導体0.28gが得られた。
LC-MS (エレクトロスプレー): (m+4)/4: 1506.2 (6020.8)
【０２４６】
同様に、下記の誘導体を調製した:
【０２４７】
(実施例2)
一般手順(A):
A1(Nα,Nα-ジメチル),A10C,A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B3C,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
LC-MS(エレクトロスプレー):m/z=1610.91 ((m+4)/4)。計算値: 1610.89
【０２４８】
(実施例3)
一般手順(A):
A1(Nα,Nα-ジメチル),A10C,A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B3C,B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)。
LC-MS (エレクトロスプレー):m/z=1531,35 ((m+4)/4)。計算値: 1531.29
【０２４９】
同様に、本発明の下記のインスリンを調製することができる:
【０２５０】
(実施例4)
一般手順(A):
A1(Nα,Nα-ジメチル),A10C,A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B3C,B16H,B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)。
【０２５１】
(実施例5)
一般手順(A):
A1(Nα,Nα-ジメチル),A10C,A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B3C,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)。
【０２５２】
(実施例6)
一般手順(A):
A1(Nα,Nα-ジメチル),A10C,A14E,B1G(Nα,Nα-ジメチル),B3C,B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,GlyB1,CysB3,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)。
【０２５３】
(実施例7)
一般手順(A):
A1(Nα,Nα-ジメチル),A10C,A14E,B1G(Nα,Nα-ジメチル),B3C,B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,GlyB1,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)。
【０２５４】
(実施例8)
一般手順(A):
A1(Nα,Nα-ジメチル),A10C,A14E,B1G(Nα,Nα-ジメチル),B3C,B16H,B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,GlyB1,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)。
【０２５５】
(実施例9)
一般手順(A):
A1(Nα,Nα-ジメチル),A10C,A14E,B1G(Nα,Nα-ジメチル),B3C,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,GlyB1,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)。
【０２５６】
(実施例10)
一般手順(A):
A1(Nα,Nα-ジメチル),A10C,A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B3C,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エトキシ]エトキシ]アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２５７】
(実施例11)
一般手順(A):
A1(Nα,Nα-ジメチル),A10C,A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B3C,B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エトキシ]エトキシ]アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB3,B25H],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２５８】
(実施例12)
一般手順(A):
A1(Nα,Nα-ジメチル),A10C,A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B3C,B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エトキシ]エトキシ]アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB3,B25H],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２５９】
(実施例13)
一般手順(A):
A1(Nα,Nα-ジメチル),A10C,A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B3C,B16H,B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エトキシ]エトキシ]アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB3,B16H,B25H],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２６０】
(実施例14)
一般手順(A):
A1(Nα,Nα-ジメチル),A10C,A14E,B1G(Nα,Nα-ジメチル),B3C,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エトキシ]エトキシ]アセチル]-[CysA10,GluA14,GlyB1,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２６１】
(実施例15)
一般手順(A):
A1(Nα,Nα-ジメチル),A10C,A14E,B1G(Nα,Nα-ジメチル),B3C,B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エトキシ]エトキシ]アセチル]-[CysA10,GluA14,GlyB1,CysB3,B25H],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２６２】
(実施例16)
一般手順(A):
A1(Nα,Nα-ジメチル),A10C,A14E,B1G(Nα,Nα-ジメチル),B3C,B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エトキシ]エトキシ]アセチル]-[CysA10,GluA14,GlyB1,CysB3,B25H],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２６３】
(実施例17)
一般手順(A):
A1(Nα,Nα-ジメチル),A10C,A14E,B1G(Nα,Nα-ジメチル),B3C,B16H,B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エトキシ]エトキシ]アセチル]-[CysA10,GluA14,GlyB1,CysB3,B16H,B25H],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２６４】
下記の誘導体を、上に記載されているように同様に調製した:
【０２６５】
(実施例18)
一般手順(A):
A1(Nα,Nα-ジメチル),A10C,A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B3C,B25H,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)。
LC-MS (エレクトロスプレー): (m+4)/4: 1506.2 (6020.1)
【０２６６】
下記の誘導体を、上に記載されているように同様に調製することができる:
【０２６７】
(実施例19)
一般手順(A):
A1(Nα,Nα-ジメチル),A10C,A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B3C,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)。
【０２６８】
(実施例20)
一般手順(A):
A1(Nα,Nα-ジメチル),A10C,A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B3C,B16H,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)。
【０２６９】
(実施例21)
一般手順(A):
A1(Nα,Nα-ジメチル),A10C,A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B3C,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)。
【０２７０】
(実施例22)
一般手順(A):
A1(Nα,Nα-ジメチル),A10C,A14E,B1G(Nα,Nα-ジメチル),B3C,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,GlyB1,CysB3,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)。
【０２７１】
(実施例23)
一般手順(A):
A1(Nα,Nα-ジメチル),A10C,A14E,B1G(Nα,Nα-ジメチル),B3C,B25H,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,GlyB1,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)。
【０２７２】
(実施例24)
一般手順(A):
A1(Nα,Nα-ジメチル),A10C,A14E,B1G(Nα,Nα-ジメチル),B3C,B16H,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,GlyB1,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)。
【０２７３】
(実施例25)
一般手順(A):
A1(Nα,Nα-ジメチル),A10C,A14E,B1G(Nα,Nα-ジメチル),B3C,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,GlyB1,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)。
【０２７４】
(実施例26)
一般手順(A):
A1(Nα,Nα-ジメチル),A10C,A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B3C,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エトキシ]エトキシ]アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２７５】
(実施例27)
一般手順(A):
A1(Nα,Nα-ジメチル),A10C,A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B3C,B25H,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エトキシ]エトキシ]アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB3,B25H],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２７６】
(実施例28)
一般手順(A):
A1(Nα,Nα-ジメチル),A10C,A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B3C,B16H,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エトキシ]エトキシ]アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB3,B16H,B25H],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２７７】
(実施例29)
一般手順(A):
A1(Nα,Nα-ジメチル),A10C,A14E,B1G(Nα,Nα-ジメチル),B3C,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エトキシ]エトキシ]アセチル]-[CysA10,GluA14,GlyB1,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２７８】
(実施例30)
一般手順(A):
A1(Nα,Nα-ジメチル),A10C,A14E,B1G(Nα,Nα-ジメチル),B3C,B25H,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エトキシ]エトキシ]アセチル]-[CysA10,GluA14,GlyB1,CysB3,B25H],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２７９】
(実施例31)
一般手順(A):
A1(Nα,Nα-ジメチル),A10C,A14E,B1G(Nα,Nα-ジメチル),B3C,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エトキシ]エトキシ]アセチル]-[CysA10,GluA14,GlyB1,CysB3,B25H],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２８０】
(実施例32)
一般手順(A):
A1(Nα,Nα-ジメチル),A10C,A14E,B1G(Nα,Nα-ジメチル),B3C,B16H,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エトキシ]エトキシ]アセチル]-[CysA10,GluA14,GlyB1,CysB3,B16H,B25H],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２８１】
本発明のアシル化インスリンのカルバモイル化のための調製のための一般手順(B)
アシル化インスリンを、生理学的pH近辺の緩衝液に溶かし、過剰のシアン酸ナトリウムまたはシアン酸カリウムを添加する。混合物を、反応の終了まで放置する。必要ならば、より多くのシアン酸塩を添加する。生成物を、調製用HPLC、イオン交換クロマトグラフィー、または脱塩により単離する。
【０２８２】
一般手順(B)は、下記の実施例において例証される。
【０２８３】
(実施例33)
一般手順(B):
A1(Nα-カルバモイル),A10C,A14E,B1(Nα-カルバモイル),B3C,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-カルバモイル,N{B1}-カルバモイル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エトキシ]エトキシ]アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２８４】
A10C、A14E、B3C、desB27、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン(0.18g)を、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.3 (5mL)に溶かし、シアン酸カリウム(0.12g)を添加した。混合物を、室温で16時間にわたって穏やかに撹拌した。pHを、1N塩酸で1に調整し、混合物を、調製用HPLCにより精製した:
カラム: Phenomenex、AXIA、5、C18、110、250×30cm
流量: 20ml/分
溶離液: A:水中0.1% TFA; B:アセトニトリル中0.1% TFA
グラジエント: 0〜7.5分: 25%B
7.5〜47.5分: 25%Bから55%B
47.5〜52.5分: 55%B
52.5〜57.5分: 55%Bから100%B
57.5〜60分: 100%B
【０２８５】
純粋な画分をプールし、凍結乾燥した。生成物を、水(50mL)に溶かし、pHを、0.1N水酸化ナトリウムで8に調整した。凍結乾燥すると、表題インスリン(70mg)が得られた
LC-MS (エレクトロスプレー): m/z = 1588,32 ((m+4)/4)。計算値: 1588.59
【０２８６】
(実施例34)
一般手順(B):
A1(Nαカルバモイル),A10C,A14E,B1(Nαカルバモイル),B3C,B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-カルバモイル,N{B1}-カルバモイル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタ-デカノイルアミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
A10C、A14E、B3C、B25H、desB27、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン(300mg)を、リン酸水素二ナトリウム緩衝液ph7.5 (2mmL、0.1M)およびアセトニトリル(3mL)に溶かした。pHを、1N水酸化ナトリウムで7.5に調整した。シアン酸カリウム(204mg)を添加し、混合物を、16時間にわたって室温で穏やかに撹拌した。混合物を、水で100mLに希釈した。pHを、1N塩酸で2.2に調整し、わずかに混濁した溶液は、アセトニトリル(20mL)の添加により澄明になった。混合物を脱塩した:
カラム: Daiso_200_15um_FEFgel304_ODDMS_30×250mm
緩衝液A:水中10%アセトニトリル、0.1% TFA
緩衝液B:水中60%アセトニトリル、0.1% TFA
【０２８７】
混合物を、カラムに適用し、1.5カラム体積(CV)緩衝液Aで溶離した。誘導体を、緩衝液B、1.5CVで溶離し、これにより、所望の誘導体を、フロントピーク(75mL)において単離した。
【０２８８】
混合物を、水(75mL)で希釈し、精製した:
カラム: Phenomenex Gemini-NX 5u C18 110A AXIA P 250×30mm
A緩衝液:水中10%アセトニトリル  + 0.1% TFA
B緩衝液:水中60%アセトニトリル  + 0.1% TFA
流量: 25ml/分
グラジエント: 40分かけて20〜100%B
【０２８９】
純粋な画分をプールし、凍結乾燥した。乾燥材料を、40%アセトニトリル(30mL)に溶かし、pHを、1N水酸化ナトリウムで8に調整した。凍結乾燥すると、表題化合物290mgが得られた。
LC-MS (エレクトロスプレー): m/z: 1513.7 (m+4)/4。計算値: 1513.5
【０２９０】
(実施例35)
一般手順(B):
A1(Nα-カルバモイル),A10C,A14E,B1(Nα-カルバモイル),B4C,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-カルバモイル,N{B1}-カルバモイル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB4,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２９１】
このインスリンを、上に記載されているように同様に調製した。
LC-MS (エレクトロスプレー): m/z: 1614.4 (m+4)/4。計算値: 1614.9
【０２９２】
(実施例36)
一般手順(B):
A1(Nα-カルバモイル),A10C,A14E,B1(Nα-カルバモイル),B3C,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-カルバモイル,N{B1}-カルバモイル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4R)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エトキシ]エトキシ]アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
LC-MS (エレクトロスプレー): m/z: 1516.05 (m+4)/4。計算値: 1516.01.
【０２９３】
同様に、本発明の下記のインスリンを調製することができる:
【０２９４】
(実施例37)
一般手順(B):
A1(Nαカルバモイル),A10C,A14E,B1(Nαカルバモイル),B3C,B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-カルバモイル,N{B1}-カルバモイル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタ-デカノイルアミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２９５】
(実施例38)
一般手順(B):
A1(Nα,Nα-カルバモイル),A10C,A14E,B1(Nα,Nα-カルバモイル),B3C,B16H,B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-カルバモイル,N{B1}-カルバモイル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタ-デカノイルアミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２９６】
(実施例39)
一般手順(B):
A1(Nα-カルバモイル),A10C,A14E,B1(Nα-カルバモイル),B3C,B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-カルバモイル,N{B1}-カルバモイル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エトキシ]エトキシ]アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２９７】
(実施例40)
一般手順(B):
A1(Nα-カルバモイル),A10C,A14E,B1(Nα-カルバモイル),B3C,B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-カルバモイル,N{B1}-カルバモイル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エトキシ]エトキシ]アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２９８】
(実施例41)
一般手順(B):
A1(Nα-カルバモイル),A10C,A14E,B1(Nα-カルバモイル),B3C,B16H,B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-カルバモイル,N{B1}-カルバモイル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エトキシ]エトキシ]アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２９９】
(実施例42)
一般手順(B):
A1(Nα-カルバモイル),A10C,A14E,B1(Nα-カルバモイル),B3C,B25H,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-カルバモイル,N{B1}-カルバモイル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナ-デカノイルアミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３００】
(実施例43)
一般手順(B):
A1(Nα-カルバモイル),A10C,A14E,B1(Nα-カルバモイル),B3C,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-カルバモイル,N{B1}-カルバモイル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３０１】
(実施例44)
一般手順(B):
A1(Nα-カルバモイル),A10C,A14E,B1(Nα-カルバモイル),B3C,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-カルバモイル,N{B1}-カルバモイル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナ-デカノイルアミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３０２】
(実施例45)
一般手順(B):
A1(Nα-カルバモイル),A10C,A14E,B1(Nα-カルバモイル),B3C,B16H,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-カルバモイル,N{B1}-カルバモイル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナ-デカノイルアミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３０３】
(実施例46)
一般手順(B):
A1(Nα-カルバモイル),A10C,A14E,B1(Nα-カルバモイル),B3C,B25H,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-カルバモイル,N{B1}-カルバモイル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]-アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３０４】
(実施例47)
一般手順(B):
A1(Nα-カルバモイル),A10C,A14E,B1(Nα-カルバモイル),B3C,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-カルバモイル,N{B1}-カルバモイル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エトキシ]エトキシ]アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３０５】
(実施例48)
一般手順(B):
A1(Nα-カルバモイル),A10C,A14E,B1(Nα-カルバモイル),B3C,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-カルバモイル,N{B1}-カルバモイル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]-アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３０６】
(実施例49)
一般手順(B):
A1(Nα-カルバモイル),A10C,A14E,B1(Nα-カルバモイル),B3C,B16H,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-カルバモイル,N{B1}-カルバモイル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]-アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３０７】
本発明のアシル化インスリンのN末端アシル化のための調製のための一般手順(C)
リシンアシル化インスリンを、場合により有機共溶媒を含有する緩衝液に溶かす。混合物のpHは、中性からアルカリ性まで(例えば、6〜8近辺から-対象とするインスリンの溶解度に応じて-最高で13または14まで)であってよく、例えば、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(OSu)として、過剰のアシル化試薬を添加する。混合物を、反応の終了まで放置する。必要ならば、より多くのアシル化試薬を添加する。生成物を、調製用HPLCにより単離する。
【０３０８】
あるいは、反応を、無水条件下、例えば、有機塩基、例えば、トリエチルアミンを含有するDMSO中で行うことができる。
【０３０９】
本発明の下記のインスリンは、この一般手順(C)に従って調製することができる。
【０３１０】
(実施例50)
一般手順(C):
A1(Nα-アセチル),A10C,A14E,B1(Nα-アセチル),B3C,B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-アセチル,N{B1}-アセチル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイル-アミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３１１】
(実施例51)
一般手順(C):
A1(Nα-アセチル),A10C,A14E,B1(Nα-アセチル),B3C,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-アセチル,N{B1}-アセチル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]-エトキシ]アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３１２】
(実施例52)
一般手順(C):
A1(Nα-アセチル),A10C,A14E,B1(Nα-アセチル),B3C,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-アセチル,N{B1}-アセチル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4R)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]-エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３１３】
(実施例53)
一般手順(C):
A1(Nα-アセチル),A10C,A14E,B1(Nα-アセチル),B3C,B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-アセチル,N{B1}-アセチル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイル-アミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３１４】
(実施例54)
一般手順(C):
A1(Nα-アセチル),A10C,A14E,B1(Nα-アセチル),B3C,B16H,B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-アセチル,N{B1}-アセチル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイル-アミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３１５】
(実施例55)
一般手順(C):
A1(Nα-アセチル),A10C,A14E,B1(Nα-アセチル),B3C,B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-アセチル,N{B1}-アセチル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]-エトキシ]アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３１６】
(実施例56)
一般手順(C):
A1(Nα-アセチル),A10C,A14E,B1(Nα-アセチル),B3C,B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-アセチル,N{B1}-アセチル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]-エトキシ]アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３１７】
(実施例57)
一般手順(C):
A1(Nα-アセチル),A10C,A14E,B1(Nα-アセチル),B3C,B16H,B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-アセチル,N{B1}-アセチル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]-エトキシ]アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３１８】
(実施例58)
一般手順(C):
A1(Nα-アセチル),A10C,A14E,B1(Nα-アセチル),B3C,B25H,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-アセチル,N{B1}-アセチル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイル-アミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３１９】
(実施例59)
一般手順(C):
A1(Nα-アセチル),A10C,A14E,B1(Nα-アセチル),B3C,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-アセチル,N{B1}-アセチル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナ-デカノイルアミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３２０】
(実施例60)
一般手順(C):
A1(Nα-アセチル),A10C,A14E,B1(Nα-アセチル),B3C,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-アセチル,N{B1}-アセチル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイル-アミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３２１】
(実施例61)
一般手順(C):
A1(Nα-アセチル),A10C,A14E,B1(Nα-アセチル),B3C,B16H,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-アセチル,N{B1}-アセチル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイル-アミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３２２】
(実施例62)
一般手順(C):
A1(Nα-アセチル),A10C,A14E,B1(Nα-アセチル),B3C,B25H,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-アセチル,N{B1}-アセチル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]-アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３２３】
(実施例63)
一般手順(C):
A1(Nα-アセチル),A10C,A14E,B1(Nα-アセチル),B3C,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-アセチル,N{B1}-アセチル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]-アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３２４】
(実施例64)
一般手順(C):
A1(Nα-アセチル),A10C,A14E,B1(Nα-アセチル),B3C,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-アセチル,N{B1}-アセチル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]-アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３２５】
(実施例65)
一般手順(C):
A1(Nα-アセチル),A10C,A14E,B1(Nα-アセチル),B3C,B16H,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-アセチル,N{B1}-アセチル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]-アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３２６】
(環状)カルボン酸無水物を使用する本発明のアシル化インスリンのN末端アシル化のための調製のための一般手順(D)
リシンアシル化インスリンを、場合によりトリエチルアミンまたはN,N-ジイソプロピルエチルアミンなどの有機塩基を含有する極性非プロトン性溶媒に溶かし、例えばコハク酸、グルタル酸またはジグリコール酸無水物としての過剰なアシル化試薬を添加する。混合物を、反応の終了まで放置する。必要ならば、より多くのアシル化試薬を添加する。生成物を、例えば、調製用HPLCによりまたは陰イオン交換クロマトグラフィーにより単離する。
【０３２７】
あるいは、手順(D)を、実施例55に例証されているようなN-ヒドロキシスクシンイミド活性化二酸(または、無水物)を使用して水性媒体中で行うことができる。
【０３２８】
下記の誘導体は、一般手順(D)に記載されているように調製することができる:
【０３２９】
(実施例66)
一般手順(D):
A1(Nα-グルタリル),A10C,A14E,B1(Nα-グルタリル),B3C,B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-グルタリル,N{B1}-グルタリル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイル-アミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３３０】
(実施例67)
一般手順(D):
A1(Nα-グルタリル),A10C,A14E,B1(Nα-グルタリル),B3C,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-グルタリル,N{B1}-グルタリル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]-エトキシ]アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３３１】
(実施例68)
一般手順(D):
A1(Nα-グルタリル),A10C,A14E,B1(Nα-グルタリル),B3C,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-グルタリル,N{B1}-グルタリル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4R)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]-エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３３２】
(実施例69)
一般手順(D):
A1(Nα-グルタリル),A10C,A14E,B1(Nα-グルタリル),B3C,B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-グルタリル,N{B1}-グルタリル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイル-アミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３３３】
(実施例70)
一般手順(D):
A1(Nα-グルタリル),A10C,A14E,B1(Nα-グルタリル),B3C,B16H,B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-グルタリル,N{B1}-グルタリル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイル-アミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３３４】
(実施例71)
一般手順(D):
A1(Nα-グルタリル),A10C,A14E,B1(Nα-グルタリル),B3C,B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-グルタリル,N{B1}-グルタリル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]-エトキシ]アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３３５】
(実施例72)
一般手順(D):
A1(Nα-グルタリル),A10C,A14E,B1(Nα-グルタリル),B3C,B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-グルタリル,N{B1}-グルタリル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]-エトキシ]アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３３６】
(実施例73)
一般手順(D):
A1(Nα-グルタリル),A10C,A14E,B1(Nα-グルタリル),B3C,B16H,B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-グルタリル,N{B1}-グルタリル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]-エトキシ]アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３３７】
(実施例74)
一般手順(D):
A1(Nα-グルタリル),A10C,A14E,B1(Nα-グルタリル),B3C,B25H,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-グルタリル,N{B1}-グルタリル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイル-アミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３３８】
(実施例75)
一般手順(D):
A1(Nα-グルタリル),A10C,A14E,B1(Nα-グルタリル),B3C,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-グルタリル,N{B1}-グルタリル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナ-デカノイルアミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３３９】
(実施例76)
一般手順(D):
A1(Nα-グルタリル),A10C,A14E,B1(Nα-グルタリル),B3C,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-グルタリル,N{B1}-グルタリル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイル-アミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３４０】
(実施例77)
一般手順(D):
A1(Nα-グルタリル),A10C,A14E,B1(Nα-グルタリル),B3C,B16H,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-グルタリル,N{B1}-グルタリル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイル-アミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３４１】
(実施例78)
一般手順(D):
A1(Nα-グルタリル),A10C,A14E,B1(Nα-グルタリル),B3C,B25H,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-グルタリル,N{B1}-グルタリル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]-アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３４２】
(実施例79)
一般手順(D):
A1(Nα-グルタリル),A10C,A14E,B1(Nα-グルタリル),B3C,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-グルタリル,N{B1}-グルタリル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]-アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３４３】
(実施例80)
一般手順(D):
A1(Nα-グルタリル),A10C,A14E,B1(Nα-グルタリル),B3C,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-グルタリル,N{B1}-グルタリル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]-アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３４４】
(実施例81)
一般手順(D):
A1(Nα-グルタリル),A10C,A14E,B1(Nα-グルタリル),B3C,B16H,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-グルタリル,N{B1}-グルタリル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]-アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３４５】
(実施例82)
一般手順(D):
A1(Nα-ジグリコリル),A10C,A14E,B1(Nα-ジグリコリル),B3C,B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-ジグリコリル,N{B1}-ジグリコリル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタ-デカノイルアミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３４６】
(実施例83)
一般手順(D):
A1(Nα-ジグリコリル),A10C,A14E,B1(Nα-ジグリコリル),B3C,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-ジグリコリル,N{B1}-ジグリコリル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]-エトキシ]アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３４７】
(実施例84)
一般手順(D):
A1(Nα-ジグリコリル),A10C,A14E,B1(Nα-ジグリコリル),B3C,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-ジグリコリル,N{B1}-ジグリコリル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4R)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]-エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３４８】
(実施例85)
一般手順(D):
A1(Nα-ジグリコリル),A10C,A14E,B1(Nα-ジグリコリル),B3C,B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-ジグリコリル,N{B1}-ジグリコリル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタ-デカノイルアミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３４９】
(実施例86)
一般手順(D):
A1(Nα-ジグリコリル),A10C,A14E,B1(Nα-ジグリコリル),B3C,B16H,B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-ジグリコリル,N{B1}-ジグリコリル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタ-デカノイルアミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３５０】
(実施例87)
一般手順(D):
A1(Nα-ジグリコリル),A10C,A14E,B1(Nα-ジグリコリル),B3C,B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-ジグリコリル,N{B1}-ジグリコリル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]-エトキシ]アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３５１】
(実施例88)
一般手順(D):
A1(Nα-ジグリコリル),A10C,A14E,B1(Nα-ジグリコリル),B3C,B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-ジグリコリル,N{B1}-ジグリコリル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]-エトキシ]アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３５２】
(実施例89)
一般手順(D):
A1(Nα-ジグリコリル),A10C,A14E,B1(Nα-ジグリコリル),B3C,B16H,B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-ジグリコリル,N{B1}-ジグリコリル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]-エトキシ]アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３５３】
(実施例90)
一般手順(D):
A1(Nα-ジグリコリル),A10C,A14E,B1(Nα-ジグリコリル),B3C,B25H,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-ジグリコリル,N{B1}-ジグリコリル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナ-デカノイルアミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３５４】
(実施例91)
一般手順(D):
A1(Nα-ジグリコリル),A10C,A14E,B1(Nα-ジグリコリル),B3C,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-ジグリコリル,N{B1}-ジグリコリル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３５５】
(実施例92)
一般手順(D):
A1(Nα-ジグリコリル),A10C,A14E,B1(Nα-ジグリコリル),B3C,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-ジグリコリル,N{B1}-ジグリコリル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナ-デカノイルアミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３５６】
(実施例93)
一般手順(D):
A1(Nα-ジグリコリル),A10C,A14E,B1(Nα-ジグリコリル),B3C,B16H,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-ジグリコリル,N{B1}-ジグリコリル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナ-デカノイルアミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３５７】
(実施例94)
一般手順(D):
A1(Nα-ジグリコリル),A10C,A14E,B1(Nα-ジグリコリル),B3C,B25H,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-ジグリコリル,N{B1}-ジグリコリル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]-アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３５８】
(実施例95)
一般手順(D):
A1(Nα-ジグリコリル),A10C,A14E,B1(Nα-ジグリコリル),B3C,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-ジグリコリル,N{B1}-ジグリコリル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]-アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３５９】
(実施例96)
一般手順(D):
A1(Nα-ジグリコリル),A10C,A14E,B1(Nα-ジグリコリル),B3C,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-ジグリコリル,N{B1}-ジグリコリル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]-アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３６０】
(実施例97)
一般手順(D):
A1(Nα-ジグリコリル),A10C,A14E,B1(Nα-ジグリコリル),B3C,B16H,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC(OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-ジグリコリル,N{B1}-ジグリコリル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]-アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３６１】
(実施例98)
本発明の選択されたN末端修飾インスリンのインスリン受容体親和性:
ヒトインスリン受容体に対する本発明のアシル化インスリン類似体の親和性は、SPAアッセイ(シンチレーション近接アッセイ)マイクロタイタープレート抗体捕捉アッセイにより決定される。SPA-PVT抗体結合性ビーズ、抗マウス試薬(Amersham Biosciences、カタログ番号PRNQ0017)を、結合緩衝液(100mM HEPES pH7.8;100mM塩化ナトリウム、10mM MgSO4、0.025% Tween-20) 25mlと混合する。単一のPackard Optiplate (Packard No.6005190)用の試薬ミックスは、1:5000に希釈された精製組み換えヒトインスリン受容体(エクソン11があるかまたはない) 2.4μl、試薬ミックス100μl当たり5000cpmに相当する量のA14Tyr [125I]-ヒトインスリンのストック溶液、1:1000希釈のF12抗体12μl、SPA-ビーズ3mlおよび合計12mlまでの結合緩衝液からなる。次いで、試薬ミックス合計100μlを、Packard Optiplate中の各ウェルに添加し、N末端修飾インスリンの希釈系列を、適切なサンプルからOptiplate中で作製する。次いで、サンプルを、穏やかに振盪させながら16時間にわたってインキュベートする。次いで、相を、1分にわたる遠心分離により分離し、プレートを、Topcounter中でカウントする。結合データは、GraphPad Prism 2.01 (GraphPad Software、San Diego、CA)における非線形回帰アルゴリズムを使用して適合させた。親和性は、ヒトインスリンの親和性に対して(百分率(%)で)表される。
【０３６２】
生理学的条件を模倣するために、結合緩衝液が1.5% HSAも含有する関連アッセイも使用する。
【０３６３】
【表４】
2015502971.tif 000028
【０３６４】
(実施例99)
本発明のN末端修飾インスリンの疎水性:
N末端修飾インスリンの疎水性は、定組成条件下での逆相HPLCの実行により見いだされる。N末端修飾インスリンの溶離時間を、同じ条件下で、疎水性が知られているヒトインスリン(本明細書においてHIと命名される)および別の誘導体と比較する。疎水性、k'relは、k'relderiv=((tderiv-t0)/(tref-t0))*k'relrefとして算出される。参照としてのHIを使用すると、k'relref=k'relHI=1。HPLCシステムの空隙時間、t0は、0.1mM NaNO3 5μlを注入することにより決定される。実行条件:
カラム: Lichrosorb RP-C18、5μm、4×250mm
緩衝液A: 0.1Mリン酸ナトリウム、pH7.3、10vol% CH3CN
緩衝液B: 50vol% CH3CN
注入体積: 5μl
実行時間:最大60分
【０３６５】
初期グラジエントを実行した後、誘導体および参照(例えば、HI)を実行するための定組成レベルを選択し、定組成条件下での誘導体および参照の溶離時間を、上の式で使用し、k'relderivを算出する。
【０３６６】
(実施例100)
十二指腸管腔酵素を使用するインスリン類似体の分解:
SPDラットからの十二指腸管腔酵素(十二指腸管腔内容物の濾過により調製される)を使用するインスリン類似体の分解。アッセイは、インスリン類似体および標準品に対して16ウェルが使用可能な96ウェルプレート(2ml)中でロボットにより行われる。インスリン類似体約15μMを、37℃において100mM Hepes、pH=7.4中で十二指腸酵素と共にインキュベートし、サンプルを、1、15、30、60、120および240分後に採取し、反応を、TFAの添加によりクエンチする。各点におけるインタクトなインスリン類似体を、RP-HPLCにより決定する。分解半減時間を、データの指数関数フィッティングにより決定し、各アッセイにおいて参照インスリン、A14E,B25H,desB30ヒトインスリンまたはヒトインスリンについて決定される半減時間に対して正規化する。分解のために添加される酵素の量は、参照インスリンの分解半減時間が60分と180分の間であるようになっている。結果は、同じ実験からの参照インスリンの分解半減時間により除されるラット十二指腸中のインスリン類似体についての分解半減時間(相対的分解速度)として与えられる。
【０３６７】
【表５】
2015502971.tif 000029
【０３６８】
(実施例101)
ラット脂肪細胞における脂質生成
本発明のインスリンのインビトロ効力の尺度として、脂質生成を使用することができる。
【０３６９】
初代ラット脂肪細胞を、精巣上体の脂肪体から摘出し、例えば、0.1%無脂肪HSAおよび標準品(ヒトインスリン、HI)かまたは本発明のインスリンを含有する緩衝液中で3H-グルコースと共にインキュベートする。標識グルコースは、用量依存的に抽出可能な脂質に変換され、完全な用量反応曲線をもたらす。結果は、標準品(HI)と比較した本発明のインスリンの95%信頼限界付きの相対的効力(%)として表される。
【０３７０】
データは、上の表に与えられている。
【０３７１】
一般に、本発明による試験されたインスリン誘導体について、得られた脂質生成データ(0.1% HSAの存在下)と、1.5% HSAの存在下で得られたインスリン受容体データとの間に非常に良好な一致があり、したがって、受容体結合が受容体活性化に翻訳されることを確証している。
【０３７２】
(実施例102)
脂質製剤で製剤化されるインスリン誘導体の化学的安定性:
脂質製剤で製剤化されるインスリン誘導体の化学的安定性を、ここに記載されているプロトコルに従って評価した。
【０３７３】
製剤の調製:
製剤(SNEDDS製剤)の組成:
試験されることになるインスリン(600nmol/g)
15%プロピレングリコール
30%ポリソルベート20
55%ジグリセロールモノカプリレート
【０３７４】
試験されることになるインスリン(pH7.5から凍結乾燥された)を、16時間にわたって暗所でプロピレングリコールに溶かす。ジグリセロールカプリレートを添加し、混合物を撹拌する。ポリソルベート20を添加し、混合物を、5分にわたって撹拌する。混合物を、均一になるまで穏やかにかき混ぜる。
【０３７５】
次いで、各製剤を、5つの気密カートリッジにアリコットし、数週間様々な温度で置いた。例が、下に与えられている。
【０３７６】
アッセイ:
純度およびHMWP分析のためのサンプル調製:
SNEDDS製剤を、室温に到達させる。SNEDDS製剤の各サンプルを、5% (v/v)エタノール中に希釈し、25μlのSNEDDS製剤を、エッペンドルフチューブ中に移し、移されたSNEDDS製剤の重量を書き留め、次いで、975μlの5% (v/v)エタノールを添加する。混合物を、ボルテックサーを使用して徹底的に混合する。
【０３７７】
サンプルを、下に記載されている方法を使用して純度およびHMWP含有量について分析した。
【０３７８】
純度方法:
カラム: Waters Acquity CSH C18カラム(2.1×150mm、1.7μm)
波長: 215nm
カラム温度: 50℃
流量: 0.3ml/分
実行時間: 60分
注入体積: 7μl
溶離液A: 0.09Mリン酸水素ジ-アンモニウム、pH3.6、10% (v/v)アセトニトリル
溶離液B: 80% (v/v)アセトニトリル
【０３７９】
【表６】
2015502971.tif 000030
【０３８０】
HMWP方法:
カラム: Waters Acquity BEH200 SECカラム、4.6×150mm
波長: 215nm
流量: 0.2ml/分
実行時間: 30分
カラム温度: 40℃
注入体積: 10μl
溶離液: 55% (v/v)アセトニトリル、0.05% TFA
【０３８１】
結果:
以下の表に、5℃および40℃での1週および3週のインキュベーション後の全不純物およびHMWPの増加が、それぞれリストされている:
【表７】
2015502971.tif 000031
【０３８２】
製剤A〜Eは、下記のインスリン誘導体を含有する:
A: N末端保護のない実施例1および実施例34の化合物: A10C、A14E、B3C、B25H、desB27、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン。
B:実施例34の化合物: A1(Nαカルバモイル)、A10C、A14E、B1(Nαカルバモイル)、B3C、B25H、desB27、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン。
C:実施例1の化合物: A1(Nα,Nα-ジメチル)、A10C、A14E、B1(Nα,Nα-ジメチル)、B3C、B25H、desB27、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu)、desB30ヒトインスリン。
D: N末端保護のない実施例11の化合物: A10C、A14E、B3C、B25H、desB27、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン。
E:実施例11の化合物: A1(Nα,Nα-ジメチル)、A10C、A14E、B1(Nα,Nα-ジメチル)、B3C、B25H、desB27、B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG)、desB30ヒトインスリン。
【０３８３】
N末端保護は、不純物の出現(形成)について測定されたような、およびN末端保護のない同様の化合物と比較してHMWP(高分子量生成物)の出現(形成)に対してより大きい程度までの両方の本発明の類似体を化学分解から保護することが結論づけられた。
【０３８４】
下記の図において、上の表のデータは、時間(1週および3週)の関数として、および温度(5℃および40℃)の関数として、不純物の形成およびHMWP生成物の形成の両方に関して、製剤AからEについてのグラフとして描かれた。
【０３８５】
(実施例103)
ラット薬物動態、静脈内ラットPK:
麻酔ラットに、様々な用量でインスリン類似体を静脈内に(i.v.)投与し、用いられた化合物の血漿濃度を、投与後4〜6時間または最高で48時間以上までにわたる指定された間隔でイムノアッセイまたは質量分析法を使用して測定する。続いて、薬物動態パラメータを、WinNonLin Professional (Pharsight Inc.、Mountain View、CA、USA)を使用して算出する。
【０３８６】
おおよそ200グラムの重さがある非絶食雄性ウィスターラット(Taconic)を使用する。
【０３８７】
体重を測定し、続いて、ラットを、Hypnorm/Dormicum (各化合物を、滅菌水中で1:1に別々に希釈し、次いで、混ぜる;実験日に新たに調製される)で麻酔する。麻酔は、2ml/kg Hypnorm/Dormicum混合物皮下により開始され、30分間隔での1ml/kg皮下の2回の維持用量および45分間隔での1ml/kg皮下の2回の維持用量が続く。必要とされれば、初めから終わりまでラットを軽い麻酔状態に保つために、さらなる用量1〜2ml/kg皮下が供給される。秤量および初期麻酔は、ラットを1つの部屋から別の部屋へと移動することにより動物にストレスを与えるのを避けるためにラット保持室内で行われる。
【０３８８】
(実施例104)
ラット薬物動態、小腸内注射に続くラットPK:
麻酔ラットに、インスリン類似体を小腸内に(空腸中に)投与する。用いられた化合物の血漿濃度ならびに血液グルコース変化を、投薬後4時間以上にわたって指定された間隔で測定する。続いて、薬物動態パラメータを、WinNonLin Professional (Pharsight Inc.、Mountain View、CA、USA)を使用して算出する。
【０３８９】
約18時間にわたって絶食させた250〜300gの重さがある雄性スプラーグドーリーラット(Taconic)を、初回用量としてのHypnorm-Dormicum皮下(クエン酸フェンタニル0.079mg/ml、フルアニソン2.5mg/mlおよびミダゾラム1.25mg/ml) 2ml/kg (試験物質投薬に先立つ-60分の時点まで)、20分後の1ml/kgと、続く、40分毎の1ml/kgを使用して麻酔する。
【０３９０】
小腸内注射モデルで試験されることになるインスリンは、上の胃管モデルについて製剤化されたように製剤化される。
【０３９１】
麻酔ラットを、37℃において安定化された恒温ブランケット上に置く。20cmのポリエチレンカテーテルを取り付けた1-mlシリンジに、インスリン製剤またはビヒクルを満たす。4〜5cmの正中切開を腹壁に行う。カテーテルを、腸壁の貫通により盲腸から約50cmの空腸中に穏やかに挿入する。腸内容物が存在すれば、適用部位を±10cm移動する。カテーテル先端を、腸セグメントの管腔内のおおよそ2cmに置き、結紮を使用せずに固定する。腸を、腹腔中で注意深く元に戻し、腹壁および皮膚を、各層にオートクリップで閉じる。時間0において、ラットに、カテーテルを介して試験化合物またはビヒクル0.4ml/kgを投与する。
【０３９２】
全血液グルコース濃度を決定するための血液サンプルを、尾端における毛細血管の穿刺によりヘパリン処置した10μlの毛細管に集める。血液グルコース濃度を、Biosen自動分析装置(EKF Diagnostic Gmbh、Germany)を使用してグルコースオキシダーゼ法により500μl分析緩衝液中の希釈後に測定する。平均血液グルコース濃度経過(平均±SEM)を、各化合物に対して作成する。
【０３９３】
サンプルを、血漿インスリン濃度を決定するために集める。血液サンプル100μlを、EDTAを含有する冷やしたチューブ中に抜き取る。サンプルを、遠心分離する(7000rpm、4℃、5分)まで氷上に保ち、血漿を、Micronicチューブ中にピペットで移し、次いで、アッセイまで20℃において凍結させる。インスリン類似体の血漿濃度を、個々の類似体について適切と考えられるか検証されているイムノアッセイで測定する。
【０３９４】
血液サンプルを、t=-10(血液グルコースのみのため)、t=-1(投薬直前)および投薬後4時間以上にわたって指定された間隔で抜き取る。
【０３９５】
(実施例105)
ヒトインスリンと比べた本発明のアシル化インスリン類似体の効力
実験日に238〜383gの重さがあるスプラーグドーリー雄性ラットを、クランプ実験のために使用する。ラットは、制御された周囲条件下で自由に餌を食べることができ、クランプ実験に先立って終夜にわたって(午後3時から)絶食させられる。
【０３９６】
実験プロトコル:
ラットを、外科手順に先立って少なくとも1週間にわたり動物施設において馴化させる。クランプ実験のおおよそ1週間前に、Tygonカテーテルを、頸静脈(注入のため)および頸動脈(血液採取のため)中にハロタン麻酔下で挿入し、露出させて頸部の裏に固定する。ラットに、手術後にStreptocilin vet. (Boehringer Ingelheim;0.15ml/ラット、筋肉内)を与え、回復期間中は動物ケアユニット(25℃)に入れる。無痛覚を得るために、アノルフィン(Anorphin) (0.06mg/ラット、皮下)を、麻酔中に投与し、リマディル(Rimadyl) (1.5mg/kg、皮下)を、麻酔からの完全な回復後(2〜3時間)後および2日にわたって1日1回再び投与する。
【０３９７】
実験日の午前7時に、終夜にわたって(前日の午後3時から)絶食させたラットを計量し、サンプリングシリンジおよび注入システム(Harvard 22 Basicポンプ、Harvard、およびPerfectum Hypodermicガラスシリンジ、Aldrich)につなぎ、次いで、ラットが実験の始まる前に約45分休む個々のクランプゲージに入れる。ラットは、全実験中にその通常の床敷上を自由に動くことができ、自由に飲料水を飲むことができる。血漿グルコースレベルを10分間隔で測定した30分の基礎的期間後、試験されることになるN末端修飾インスリンおよびヒトインスリン(ラット当たり1用量レベル、用量レベル当たりn=6〜7)を、300分にわたって一定速度にて注入する(静脈内)。場合により、試験されることになるN末端修飾インスリンの初回ボーラス注入が、血漿中の定常状態レベルに直ぐに到達させるために投与される。初回ボーラス注入の用量は、薬物動態当業者により静脈内ボーラス薬物動態から得られるクリアランスデータに基づいて算出することができる。血漿グルコースレベルを、初めから終わりまで10分間隔で測定し、正常血糖を維持するために、20%水性グルコースの注入を調整する。再懸濁させた赤血球のサンプルを、各ラットからプールし、頸動脈カテーテルを介して約1/2ml体積で戻す。
【０３９８】
各実験日に、試験されることになる個々のN末端修飾インスリンの溶液およびヒトインスリン溶液のサンプルを、クランプ実験の前および終了時に採取し、ペプチドの濃度を、HPLCにより確認する。ラットインスリンおよびC-ペプチドならびに試験されることになるN末端修飾インスリンおよびヒトインスリンの血漿濃度を、研究の前および終了時の関連時点に測定する。ラットを、ペントバルビタール過用量を使用して実験の終了時に殺す。
【０３９９】
(実施例106)
対照N末端修飾インスリンと比べた本発明のアシル化N末端修飾インスリンの効力、ラットへの皮下投与
雄性スプラーグドーリーラット(群当たりn=6)は、ビヒクルまたはインスリン誘導体の皮下単回用量を受ける(それぞれ、作用持続時間が中程度または作用持続時間が長い誘導体について、50nmolまたは200nmol/動物)。血液(舌下)を抜き取り、血漿を、それぞれ作用持続時間が中程度または作用持続時間が長い誘導体について、投薬後0、1、2、4、8、24および48または0、2、4、8、24、48、72、96時間目の時点で集める。血漿を、グルコースについてアッセイする。グルコース低下効果を、時間の関数として-デルタ血漿グルコースの曲線下面積として算出し、対照N末端修飾インスリンと比較する。
【０４００】
(実施例107)
イヌ薬物動態、静脈内イヌPK:
雄性ビーグル犬(おおよそ12kg)は、インスリン誘導体の静脈内単回用量(2nmol/kg)を受ける。血液を抜き取り、血漿を、投薬後の時点-0.17、0、0.083、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、8、10、12、16、24、32、48、72、96、120、144および168時間に集める。血漿サンプルを、サンドイッチイムノアッセイかまたはLCMSにより分析する。血漿濃度-時間プロファイルを、WinNonlin Professional 5.2 (Pharsight Inc.、Mountain View、CA、USA)を使用する非コンパートメント薬物動態解析により分析する。
【０４０１】
(実施例108)
イヌ薬物動態、経口投薬:
雄性ビーグル犬(おおよそ12kg)は、腸溶コーティングされたサイズ00のカプセルに製剤化されたインスリン誘導体の経口単回用量(120nmol/kg)を受ける。血液を抜き取り、血漿を、投薬後の時点0、15、30、45、60、75、90、105、120、135、150、165、180、210、240、270、300、360、480、600、720、1440分(24時間)、30時間、48時間および72時間に集める。血漿サンプルを、サンドイッチイムノアッセイかまたはLCMSにより分析する。血漿濃度-時間プロファイルを、WinNonlin Professional 5.2 (Pharsight Inc.、Mountain View、CA、USA)を使用する非コンパートメント薬物動態解析により分析する。
【０４０２】
(実施例109)
溶融温度決定
示差走査熱量測定(DSC)。
データ収集を、VP-DSC示差走査マイクロ熱量計(MicroCal、LLC、Northampton、MA)を使用して実施した。すべてのタンパク質走査(約200μM N末端修飾インスリン)を、1℃/分の走査速度および0.21MPaの過剰圧力にて15℃から120℃で基準細胞中にて2mMリン酸塩緩衝液で実施した。すべてのサンプルおよび基準物を、使用直前に脱ガスした。緩衝液-緩衝液基準走査を、濃度正常化より前に各サンプル走査から減算した。
【０４０３】
DSCデータは、図3および図4で示されている
【０４０４】
(実施例110)
フィブリル化の傾向の測定
チオフラビンT (ThT)フィブリル化アッセイのための一般手順:
原則
ペプチドの低い物理的安定性は、結局はゲル形成をもたらすサンプルにおいてよく規則化されたスレッド様巨大分子構造として観察されたように、アミロイドフィブリル形成につながることがある。これは、伝統的には、サンプルの視覚検査によって測定された。しかしながら、その種類の測定は、非常に主観的であり、観察者に依存する。そのため、小分子インジケータープローブの適用がとても好ましい。チオフラビンT (ThT)は、そのようなプローブであり、フィブリルに結合する場合に明瞭な蛍光サインを有する(Naikiら、Anal. Biochem. 177、244〜249、1989; Le-Vine、Methods Enzymol. 309、274〜284、1999)。フィブリル形成の時間経過は、下記の式を用いてS字状曲線により記載することができる(Nielsenら、Biochemistry 40、6036〜6046、2001):
【０４０５】
【数１】
2015502971.tif 000032
【０４０６】
ここで、Fは、時間tにおけるThT蛍光である。定数t0は、最大蛍光の50%に到達するために必要とされる時間である。フィブリル形成を記載する2つの重要なパラメータは、t0-2□によって算出されるラグタイムおよび見かけの速度定数kapp=1/.□〜である。
【０４０７】
ペプチドの部分的にフォールディングされた中間体の形成は、フィブリル化のための一般的開始機序として示唆される。それらの中間体はほとんど核生成しないことで、さらなる中間体が構築できる鋳型を形成し、フィブリル化が進む。ラグタイムは、核の臨界質量が累積される間隔に対応し、見かけ速度定数は、フィブリルそれ自体が形成される速度である。
【０４０８】
サンプル調製
サンプルを、各アッセイの前に新たに調製した。各類似体を、2mMリン酸ナトリウム、pH=7.4に溶かした。チオフラビンTを、1μMの最終濃度まで水中におけるストック溶液からのサンプルに添加した。200μlのサンプルアリコットを、96ウェルマイクロタイタープレート(Packard Optiplate(商標)-96、白色のポリスチレン)に置いた。通常、各サンプルの4つのレプリカ(1つの試験条件に対応する)を、ウェルの1つのカラムに入れた。プレートを、Scotch Pad (Qiagen)で密閉した。
【０４０９】
インキュベーションおよび蛍光測定
所定の温度でのインキュベーション、振盪、およびThT蛍光発光の測定を、Fluoroskan Ascent FLまたはVarioskan蛍光プレートリーダー(thermo Labsystems)のいずれかで行った。温度を、37℃に調整した。軌道振盪を、すべての示されたデータにおいて1mmの振幅で960rpmに調整した。蛍光測定を、444nmのフィルターを介する励起および485nmのフィルターを介する発光の測定を使用して行った。
【０４１０】
各実行を、10分にわたりアッセイ温度でプレートをインキュベートすることにより開始した。プレートを、典型的には45時間にわたり20分毎に測定した。各測定間に、プレートを振盪し、上に記載されているように加熱した。
【０４１１】
データ取扱い
測定データポイントを、さらなるプロセッシングのためにMicrosoft Excelフォーマットに保存し、曲線の描画およびフィッティングを、GraphPad Prismを使用して実施した。フィブリルの非存在下でのThTからの背景発光は無視できるものであった。データポイントは、典型的に、4つのサンプルの平均である。同じ実験(すなわち、同じプレート上のサンプル)において得られるデータだけが同じグラフに存在し、1つのアッセイの個々のサンプル間のフィブリル化の相対的測定、むしろ次いで異なるアッセイ間の比較を保証する。
【０４１２】
データセットは、方程式(1)にフィットすることができる。しかしながら、完全なS字状曲線は、通常、測定時間中に達成されないので、フィブリル化の程度は、4つのサンプルの平均として算出される様々な時点でのThT蛍光として表され、標準偏差で示される。
【０４１３】
ヒトインスリンについて前の実験で得られた結果:
【０４１４】
【表８】
2015502971.tif 000033
【０４１５】
従来技術のインスリン誘導体について得られた結果。ThTアッセイを、20時間の2倍のアッセイとして行った。記述されている時点は、最初の20時間部分の開始から測定される。
【０４１６】
【表９】
2015502971.tif 000034
【０４１７】
従来技術インスリン誘導体についてと同じ実験における本発明のインスリン誘導体について得られた結果
【０４１８】
【表１０】
2015502971.tif 000035
【０４１９】
ThTアッセイにおけるフィブリル化に対して試験された本発明によるインスリンはいずれも、時間の関数としての増加蛍光(の非存在)によって見られるようなフィブリル化の任意の兆候を示さなかったことは明らかである。これは非常に珍しく、これは、本発明の誘導体の有用性を過小表示している。
【０４２０】
(実施例111)
本発明のインスリン誘導体の化学的安定性:
インスリン誘導体の化学的安定性を、2mMリン酸塩中にて、pH=7.5、37℃で、最大で8週にわたりインスリン誘導体をインキュベートした後で評価する。高分子量生成物(HMWP)の形成を、0週後、2週後、4週後および場合により8週後のSEC HPLC分析により決定する。SEC方法の結果は、215nmでの全吸光度の百分率として37℃および5℃の開始サンプルでのHMWP形成間の差異として与えられる。化学分解生成物は、0週後、2週後、4週後および場合により8週後にRP HPLC分析により決定される。RP方法の結果は、215nmでの全吸光度の百分率として37℃および5℃の開始サンプルで観察された化学分解間の差異として与えられる。
【０４２１】
SEC-HPLC法:
溶媒: 500mM NaCl、10mM NaH2PO4、5mM H3PO4、50% (v/v) 2-プロパノール
流量: 0.5ml/分
実行時間: 30分
UV検出: 215nm
カラム: WatersからのインスリンHMWPカラム7.8×300mm
温度: 50℃
RP-HPLC法:
溶媒A: 0.09Mリン酸塩緩衝液、pH3.6 (リン酸水素ジ-アンモニウム)、10% MeCN (v/v)
溶媒B: 80% MeCN (v/v%)
流量: 0.3ml/分
実行時間: 33分
UV検出: 215nm
カラム: Waters Acquity BEH130 C18カラム1.7μm、150×2.1mm
温度: 50℃
グラジエント:
【０４２２】
【表１１】
2015502971.tif 000036
【０４２３】
【表１２】
2015502971.tif 000037
【０４２４】
B3へのジスルフィドを有するsは、一般に、B2へのジスルフィドを有するsより安定であるか、またはB1はより不安定であると結論づけられる。
【０４２５】
(実施例112)
X線構造決定:
結晶化条件の例は、下で与えられているが、しかしながら、正確な条件は、異なる誘導体に対して異なってよく、最適な条件は、多くの異なる条件をスクリーニングすることにより見いだされる。結晶を、例えば0.8M K/NaTartrate、0.1M Tris pH8.5、0.5% PEG MME 5000を含有するリザーバー溶液から、シッティングドロップ蒸気拡散方法により得る。データを、MarCCD検出器が備えられている回転アノード(Rigaku、MicroMax-007HF)で集め、XDS (J Appl Crystallogr 26: 795-800)により処理した。構造を、探索モデルとしてインハウス構造を有するMolrep (J Appl Crystallogr 30: 1022〜1025.)を使用する分子置換により解析する。データ精密化およびモデル構築を、プログラムRefmac (Acta Crystallogr D 53: 240〜255.)およびCoot (Acta Crystallogr D 60: 2126〜2132.)を使用して行う。
【０４２６】
(実施例113)
グアニジン塩酸塩変性:
余剰のジスルフィド結合を含有する選択されたN末端修飾インスリンのグアニジン塩酸塩変性に、円二色性(CD)分光法が続くことで、アンフォールディングの自由エネルギーを決定することができる。タンパク質変性で、遠UV範囲(240〜218nm)における負のCDは、タンパク質アンフォールディングを伴う規則化二次構造の損失と一致して徐々に減少する。ヒトインスリンの遠UV CDスペクトルは、タンパク質アンフォールディングおよび自己会合の両方に感度が高い(Holladayら、1977 Biochim. Biophys.Acta 494、245〜254.; MelbergおよびJohnson、1990、Biochim. Biophys.Acta 494、245〜254.)。pH8でこれらの現象を分離するために、GuHCl滴定を、異なるタンパク質濃度、例えば3μM、37μM、および250μMで実施する。これらの濃度で、インスリン類似体は、主に、モノマー、ダイマーおよびダイマーの混合物ならびにより高い凝集体として存在する。近UV範囲(330〜250nm)におけるインスリンCDスペクトルは、ジスルフィド連鎖から寄与のあるチロシン発色団の環境を反映する(Morrisら、1968、Biochim.Biophys. Acta. 160、145〜155.; Woodら、1975、Biochim. Biophys. Acta. 160、145〜155.; StricklandおよびMercola、1976、Biochemistry 15,3875〜3884.)。変性剤濃度の関数として近UV領域および遠UV領域の両方でのモル楕円率における変化のプロットを発生させる。アンフォールディングの自由エネルギーは、2つの状態モデルとフィットしたそのようなインスリン変性曲線から以前に算出された(Kaarsholm、N.C.ら1993 Biochemistry、32、10773〜8)。
【０４２７】
タンパク質濃度を、UV吸光度および/またはRP-HPLCおよび/またはSEC-HPLCにより決定する。変性サンプルを、異なる比のタンパク質およびGuHClストック溶液と、10mM Tris/C104-緩衝液、pH80とを組み合わせることにより調製する。タンパク質ストック溶液は、典型的には、10mM Tris/C104-中1.5mM、pH8.0である。GuHClストック溶液は、10mM Tris/C104-中8.25M(屈折率測定法により決定する)、pH8.0である。すべてのCDスペクトルを、25℃で記録する。遠UV CD変性サンプルを、250nmから218nm走査する。典型的な細胞路程およびタンパク質濃度は、それぞれ0.2cmおよび37pMである。近UV CD変性サンプルを、lcm路程および典型的に75pMタンパク質を使用して330nmから250nm走査する。すべてのスペクトルを、適切な溶媒ブランクの減算前にフーリエ変換アルゴリズムにより平坦化する。遠UV範囲において、Aeは、ペプチド結合のモル濃度に基づいているが、一方、近UVにおいて、Δεは、インスリンモノマーのモル濃度に標準化される。
【０４２８】
GuHCl変性曲線を、フォールディング/アンフォールディング転移は、平衡定数が、K=(ΔεN-Δε)/(Δε-ΔεU)を使用して各変性剤濃度で得ることができる二状態であることを推定することにより分析し、ここで、Δεは、CDおよびΔεNの観察値であり、ΔεUは、それぞれ所定のGuHCl濃度での天然形態およびアンフォールディング形態についてのCD値を表す(Pace、C. N. (1975) CRC Crit. Rev. Biochem. 3、1〜43.)。転移領域におけるGuHCl濃度でのΔεNおよびΔεUについての値を、転移領域への転移前および転移後のベースラインへの直線外挿、すなわち、それぞれΔεoNおよびΔεoUが切片であり、mNおよびmUが、転移前および転移後のベースラインの傾斜であるΔεN=ΔεoN+mN[GuHCl]およびΔεU=ΔεoU+mU[GuHCl]により得た。転移ゾーンにおける所定の変性剤濃度でのアンフォールディングの自由エネルギーは、ΔG=-RT In Kにより与えられる。我々は、変性剤濃度に対するΔGの線形依存と推定する:ΔGH2Oが、変性剤の非存在下でのΔGの値であり、mが、変性剤濃度に対するΔGの依存の尺度である、ΔG=ΔGH2O-m[GuHCl]。それ故に、転移ゾーンにおけるKから誘導されたΔG値は、0M変性剤に外挿し戻して、ΔGH2Oを与えることができる。完全なアンフォールディング曲線に関するΔεと[GuHCl]との間の関係は、方程式1で示される(Santoro、M. M.、およびBolen、D. W. (1988) Biochemistry 27、8063〜8068.):
Δε = {(ΔεoN + mN[GuHCl]) + (ΔεoU + mU[GuHCl]) exp[-(ΔGH2O-m[GuHCl])/RT)}/{(l + exp[-(ΔGH2O-m[GuHCl])/RT]}
【０４２９】
応答としてのΔεおよび独立変数としての[GuHCl]を用いて、この方程式を、例えばPC SASのNLIN手順(SAS Inc.、Cary、NC)を使用する非線形最小二乗分析にかける。次いで、6つのパラメータは、変性曲線:ΔεoN、ΔεoU、mN、mU、m、およびΔGH2Oを表している。加えて、変性曲線の中点におけるGuHCl濃度、Cmidは、ΔGH2O/mにより与えられる。次いで、ヒトインスリンと変異体インスリンとの間のアンフォールディングの自由エネルギーにおける差異を、ΔΔGH2O=ΔGH2O(変異体)-ΔGH2O(野生型)から算出することができる。
【０４３０】
(実施例114)
正確なインタクト質量決定:
LC-MS計器は、Acquity UPLCシステム(Waters、Milford、MA)およびSynapt G2質量分析計(Waters、Milford、MA)からなる。インスリン誘導体を、C18逆相HPLCカラムに適用し、0.05%トリフルオロ酢酸中のアセトニトリルの直線グラジエントを使用して分析する。HPLCからの流れを、2500V毛細管電位、110℃ソース温度、250℃脱溶媒和温度および50L/hのコーンガス流(N2)を用いるポジティブMS専用様式で作動するSynapt G2のエレクトロスプレー界面に直接適用する。m/z=100からm/z=3000のMSスペクトルを、1秒当たり2回獲得する。機器を、分析より前にNaIの標準的混合物により較正し、ロイシンエンケファリンのロックスプレーを、LC-MS分析中に適用する。インタクトなインスリン質量を、MaxEnt3アルゴリズムを使用するBioPharmaLynx 1.2 (Waters、Milford、MA)により再構成する。Orbitrap XL質量分析計(Thermo Fisher)を、Synapt G2の代わりに使用することができる。Orbitrap機器を、4kVのソース電圧、100μAのソース電流、40のシースガス流、10の補助ガス流、5のスイープガス流、20Vの毛細管電圧を用いるポジティブMS様式で作動する。すべてのMSパラメータを、最適な性能のための機器のチューニング中に調整し、上に与えられているものからわずかに逸脱してよい。この方法により得られる質量精度は、10ppmより良好である。
【０４３１】
カラム: Acquity BEH C18 1×150mm、1.7μm (Waters)
流量: 0.1ml/分
緩衝液A: 0.02% (v/v)または0.05% (v/v) TFA
緩衝液B:アセトニトリル中0.02% (v/v)または0.04% (v/v)のTFA
グラジエント: 2分間5% B; 12分で5%Bから50%B、1分で50%Bから90%B
UV検出: 215nm
【配列表】
2015502971000001.app
【国際調査報告】
2015502971.tif 000040
2015502971.tif 000041
2015502971.tif 000042
2015502971.tif 000043
2015502971.tif 000044