(57)【要約】  本発明は、約３０ｎｍの直径を有するキメラヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）に関する。本発明は、本発明のキメラＨＰＶ  ＶＬＰの対象への投与によるＨＰＶ感染および／または子宮頸癌の処置および／または予防の方法にさらに関する。
2015500229.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
約３０ｎｍの直径を有するキメラヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、該キメラＨＰＶ  ＶＬＰは、ヒトコドン最適化ヌクレオチド配列によってコードされるキメラＨＰＶ  １６  Ｌ１／Ｌ２ポリペプチドを含み、該キメラＨＰＶ  １６  Ｌ１／Ｌ２ポリペプチドは、ＨＰＶ  １６  Ｌ１ポリペプチドの残基４１４から挿入された約１３アミノ酸から約２６アミノ酸のＨＰＶ  Ｌ２ペプチドを含むＨＰＶ  １６  Ｌ１ポリペプチドをさらに含み、そして、該挿入されたＨＰＶ  Ｌ２ペプチドのアミノ酸は、ＨＰＶ  １６  Ｌ１ポリペプチドの対応するアミノ酸を置換する、キメラヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項２】
挿入されたＨＰＶ  Ｌ２ペプチドが、
（ｉ）配列番号：７のヒトコドン最適化ヌクレオチド配列によってコードされる配列番号：３の１３アミノ酸ペプチド；
（ｉｉ）          配列番号：９のヒトコドン最適化ヌクレオチド配列によってコードされる配列番号：５の２０アミノ酸ペプチド；および
（ｉｉｉ）配列番号：８のヒトコドン最適化ヌクレオチド配列によってコードされる配列番号：４の２６アミノ酸ペプチド
からなる群から選択される、請求項１に記載のキメラＨＰＶ  ＶＬＰ。
【請求項３】
キメラＨＰＶ  １６  Ｌ１／Ｌ２ポリペプチドをコードするヒトコドン最適化ヌクレオチド配列が、核局在化シグナルを不足させるように修飾されている、請求項１または２に記載のキメラＨＰＶ  ＶＬＰ。
【請求項４】
キメラＨＰＶ  １６  Ｌ１／Ｌ２ポリペプチドが、配列番号：２２、配列番号：２３および配列番号：２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１から３のいずれかに記載のキメラＨＰＶ  ＶＬＰ。
【請求項５】
キメラＨＰＶ  １６  Ｌ１／Ｌ２ポリペプチドが、配列番号：２６、配列番号：２７および配列番号：２８からなる群から選択されるヒトコドン最適化ヌクレオチド配列によってコードされる、請求項４に記載のキメラＨＰＶ  ＶＬＰ。
【請求項６】
キメラＨＰＶ  １６  Ｌ１／Ｌ２ポリペプチドが、植物において発現され、植物から回収される、請求項１から５のいずれかに記載のキメラＨＰＶ  ＶＬＰ。
【請求項７】
キメラＨＰＶ  １６  Ｌ１／Ｌ２ポリペプチドが、植物の葉緑体に標的化される、請求項６に記載のキメラＨＰＶ  ＶＬＰ。
【請求項８】
約３０ｎｍの直径を有するキメラＨＰＶ  ＶＬＰを生産する方法であって、
（ｉ）キメラＨＰＶ  １６  Ｌ１／Ｌ２ポリペプチドをコードするキメラヒトコドン最適化ヌクレオチド配列を提供する工程、ここで、該キメラＨＰＶ  １６  Ｌ１／Ｌ２ポリペプチドは、キメラＨＰＶ  １６  Ｌ１／Ｌ２ポリペプチドの残基４１４から挿入された約１３アミノ酸から約２６アミノ酸のＨＰＶ  Ｌ２ペプチドを有するＨＰＶ  １６  Ｌ１ポリペプチドを含み、そして、該挿入されたＨＰＶ  Ｌ２ペプチドのアミノ酸は、ＨＰＶ  １６  Ｌ１ポリペプチドの対応するアミノ酸を置換する；
（ｉｉ）キメラヒトコドン最適化ヌクレオチド配列を植物においてポリペプチドを発現することに適している発現ベクターにクローニングする工程；
（ｉｉｉ）植物細胞を工程（ｉｉ）の発現ベクターで形質転換するか、または植物細胞に工程（ｉｉ）の発現ベクターを浸潤する工程；
（ｉｖ）発現されたキメラＨＰＶ  １６  Ｌ１／Ｌ２ポリペプチドが約３０ｎｍの直径を有するキメラＨＰＶ  ＶＬＰに集合するように、工程（ｉｉｉ）の植物細胞においてキメラＨＰＶ  １６  Ｌ１／Ｌ２ポリペプチドを発現する工程；および
（ｖ）該植物細胞から該キメラＨＰＶ  ＶＬＰを回収する工程
を含む方法。
【請求項９】
工程（ｉｉ）の発現ベクターが、細胞質から植物の葉緑体細胞へ発現されたキメラＨＰＶ  １６  Ｌ１／Ｌ２ポリペプチドを指向するためのポリペプチドをコードする標的化配列をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
発現ベクターが、発現ベクターのコード配列に作動可能に連結したプロモーターおよび他のレギュレーターなどを含む、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
植物における転写後遺伝子サイレンシングを阻害することに適しているサプレッサータンパク質での植物細胞の共浸潤(co-infiltration)または共形質転換(co-trans形成)の工程をさらに含む、請求項８から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
サプレッサータンパク質が、トマトスポッテッドウイルトウイルス(tomato spotted wilt virus)のＮＳｓタンパク質またはトマトブッシースタントウイルス(tomato bushy stunt virus)のｐ１９である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
挿入されたＨＰＶ  Ｌ２ペプチドが、
（ｉ）配列番号：７のヒトコドン最適化ヌクレオチド配列によってコードされる配列番号：３の１３アミノ酸ペプチド；
（ｉｉ）          配列番号：９のヒトコドン最適化ヌクレオチド配列によってコードされる配列番号：５の２０アミノ酸ペプチド；および
（ｉｉｉ）配列番号：８のヒトコドン最適化ヌクレオチド配列によってコードされる配列番号：４の２６アミノ酸ペプチド
からなる群から選択される、請求項８から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
対象におけるＨＰＶ感染または子宮頸癌を予防または処置する方法であって、治療有効量の請求項１から７のいずれかに記載のキメラＨＰＶ  ＶＬＰを該対象に投与することを含む方法。
【請求項１５】
対象における免疫応答を引き起こす工程をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
免疫応答が中和抗体応答または細胞毒性Ｔリンパ球応答である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
免疫応答が、対象に存在する複数のＨＰＶタイプに対する交差防御免疫応答である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
対象がヒトである、請求項１４から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
対象におけるＨＰＶ感染または子宮頸癌を予防または処置する方法における使用のための請求項１から７のいずれかに記載のキメラＨＰＶ  ＶＬＰであって、該方法は、治療有効量のキメラＨＰＶ  ＶＬＰを対象に投与することを含む、キメラＨＰＶ  ＶＬＰ。
【請求項２０】
方法が、対象における免疫応答を引き起こす工程をさらに含む、請求項１９に記載のキメラＨＰＶ  ＶＬＰ。
【請求項２１】
免疫応答が、中和抗体応答または細胞毒性Ｔリンパ球応答である、請求項２０に記載のキメラＨＰＶ  ＶＬＰ。
【請求項２２】
免疫応答が、対象に存在する複数のＨＰＶタイプに対する交差防御免疫応答である、請求項２０に記載のキメラＨＰＶ  ＶＬＰ。
【請求項２３】
対象がヒトである、請求項１９から２２のいずれかに記載のキメラＨＰＶ  ＶＬＰ。
【請求項２４】
対象におけるＨＰＶ感染または子宮頸癌を予防または処置する方法における使用のための医薬の製造における請求項１から７のいずれかに記載のキメラＨＰＶ  ＶＬＰの使用であって、該方法は、治療有効量の該医薬を該対象に投与することを含む、使用。
【請求項２５】
方法が、対象における免疫応答を引き起こす工程をさらに含む、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
免疫応答が、中和抗体応答または細胞毒性Ｔリンパ球応答である、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
免疫応答が、対象に存在する複数のＨＰＶタイプに対する交差防御免疫応答である、請求項２５に記載の使用。
【請求項２８】
対象がヒトである、請求項２４から２７のいずれかに記載の使用。
【請求項２９】
請求項１から７のいずれかに記載のキメラＨＰＶ  ＶＬＰおよび薬学的に許容される担体またはアジュバントを含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本発明は、約３０ｎｍの直径を有するキメラヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）ならびに本発明のキメラＨＰＶ  ＶＬＰの投与によるＨＰＶ感染および／または子宮頸癌の処置および／または予防の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
子宮頸癌は、ＨＰＶ感染によって主に引き起こされ、世界中の女性中で３番目に多い癌である（Ferlayら, 2010）。結果として、ＨＰＶワクチン開発は、予防の癌研究の優先事項である。Ｌ１メジャーカプシドタンパク質は、免疫優勢であり、本物のビリオンと構造的および免疫学的に類似であるＶＬＰに自己集合するため、予防ワクチンの抗原の選択肢である。ＶＬＰでのワクチン接種は、動物およびヒトの両方において中和抗体（ＮＡｂ）の高い力価を引き起こし、２つの多価ＨＰＶ  Ｌ１  ＶＬＰベースの予防ワクチンは、許可されており、ワクチンタイプＨＰＶ−１６および１８感染ならびに関連疾患の予防において高度に有効である（Schillerら, 2008)。
【０００３】
現在のＬ１  ＶＬＰベースのＨＰＶワクチンの高い有効性にもかかわらず、タイプ特異性（Brownら, 2009; Wheelerら, 2009）、治療効果の不足（FUTURE II Study Group, 2007; Hildersheimら, 2007）およびワクチンの高いコスト（Schillerら, 2008）は、特に子宮頸癌の負担の＞８０％の発展途上国において、幅広い適用を制限させている（Parkin and Bray, 2006）。したがって、多数の発癌ＨＰＶタイプを含むように保護を広げ、確立されたＨＰＶ感染および癌性病変を取り除くように治療効果を改善する手頃な第２世代ＨＰＶワクチンの緊急性がある。
【０００４】
広範囲の予防ＨＰＶワクチンは、交差中和するＬ２エピトープを使用して開発することができる。Ｌ２エピトープは、Ｌ１の表面領域に組み込み、集合させたＬ１の表面上にＬ２ペプチドを提示するＬ１／Ｌ２キメラを作製することができる（ＷＯ  ０３／０９７６７３；Kawanaら, 1999, 2003; Slupetzkyら, 2007; Kondoら, 2007, 2008）。
【０００５】
外来抗原の大規模生産のための植物発現系の使用は、高レベルタンパク質発現および最適化のための一時的発現の使用への決定的な傾向で（Rybicki, 2009）、ワクチン生産のためのコスト的に有効な代替として提案されている（Fischerら, 2004）。いくつかのグループは、植物においてＨＰＶ−１６  Ｌ１を発現させている（Biemeltら, 2003；ＷＯ  ２００６／１１９５１６； Macleanら, 2007）。
【０００６】
植物系の実際的な制限は、組換えタンパク質の低収量、潜在的に、タンパク質不安定性または低レベル発現の結果である（Fischerら, 2004; Obembeら, 2011）。植物発現組換えタンパク質は、経済的に実行可能とされる全可溶性タンパク質（ＴＳＰ）の１％以上である必要性を生じると推測される（Fischerら, 2004）。これは、これらの系が組換えタンパク質の低収量としばしば関連するため、核形質転換トランスジェニック植物を使用する組換えタンパク質の発現の特に問題となる（Rybicki, 2009）。
【０００７】
ＨＰＶ−１６  Ｌ１は、核形質転換ジャガイモおよびタバコ植物においてトランスジェニックにて発現されたが、ＨＰＶ−１６  Ｌ１の低発現レベル（＜１％  ＴＳＰ）が一貫して報告されており、誘導された免疫応答は比較的弱かった（Biemeltら, 2003; Varsaniら, 2003b; Varsaniら, 2006a）。
【０００８】
しかしながら、Ｌ１遺伝子のヒトコドン最適化および葉緑体への標的化は、トランスジェニックおよびアグロバクテリウム媒介一時的タバコ発現系の両方において、最大約１７％のＴＳＰに、ＨＰＶ−１６  Ｌ１発現を有意に改善される（Macleanら, 2007）。
【０００９】
植物由来のＨＰＶワクチンの最近の開発は、植物における最初のＨＰＶ−１６  Ｌ１  キメラの発現であった。Ｌ１／Ｅ６／Ｅ７  キメラは、いくつかのＥ６およびＥ７エピトープにＣ−末端にて融合したＨＰＶ−１６  Ｌ１からなり、それは、トランスジェニックトマトにおいて発現された（Paz De la Rosaら, 2009）。しかしながら、収量は低く（０．０５−０．１％  ＴＳＰ）、したがって、商業的に実施可能でなかった。
【００１０】
ＷＯ  ２０１１／０７７３７１は、昆虫、植物または酵母発現系におけるＨＰＶ  Ｌ１タンパク質と比較して、増加した発現レベルでキメラ  ＨＰＶ  Ｌ１ポリペプチドを生産するための方法を記載している。ヒトコドン最適化Ｌ１／Ｌ２キメラは、約５５ｎｍの植物形成ＶＬＰにおいてＨＰＶ  Ｌ１およびＢＰＶ  Ｌ２（アミノ酸１−８８）から生産されたが、他のＨＰＶ  Ｌ１／Ｌ２キメラは、約１７ｎｍの直径のカプソメアを形成することができたのみであった。
【００１１】
カプソメアは室温で安定であるが、それらは、ＶＬＰと比較して２０から４０倍低い体液性免疫応答を誘導することができるのみである（Thonesら, 2008）。したがって、発現系において商業的に実施可能であるレベルで発現される、Ｌ１およびＬ２を含むキメラＶＬＰを開発することが有益である。このようなキメラＶＬＰは、キメラカプソメアよりも、精製することが容易で有り、より良い免疫原性である可能性がある。
【発明の概要】
【００１２】
発明の概要
本発明の第１の局面において、約３０ｎｍの直径のサイズを有するキメラヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、該キメラＨＰＶ  ＶＬＰは、ヒトコドン最適化ヌクレオチド配列によってコードされるキメラＨＰＶ  １６  Ｌ１／Ｌ２ポリペプチドを含み、該キメラＨＰＶ  １６  Ｌ１／Ｌ２ポリペプチドは、ＨＰＶ  １６  Ｌ１ポリペプチドの残基４１４から挿入された約１３アミノ酸から約２６アミノ酸のＨＰＶ  Ｌ２ペプチドを含むＨＰＶ  Ｌ１ポリペプチドをさらに含み、そして、該挿入されたＨＰＶ  Ｌ２ペプチドのアミノ酸は、ＨＰＶ  １６  Ｌ１ポリペプチドの対応するアミノ酸を置換する、キメラヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供する。
【００１３】
例えば、挿入されたＨＰＶ  Ｌ２ペプチドは、配列番号：７に記載されているヒトコドン最適化ヌクレオチド配列によってコードされる１３アミノ酸  ＬＶＥＥＴＳＦＩＤＡＧＡＰ  ペプチド（配列番号：３）、または、配列番号：９に記載されているヒトコドン最適化ヌクレオチド配列によってコードされる２０アミノ酸  ＱＬＹＫＴＣＫＱＡＧＴＣＰＰＤＩＩＰＫＶ  ペプチド（配列番号：５）、または、配列番号：８に記載されているヒトコドン最適化ヌクレオチド配列によってコードされる２６アミノ酸  ＧＧＬＧＩＧＴＧＳＧＴＧＧＲＴＧＹＩＰＬＧＴＲＰＰＴ  ペプチド（配列番号：４）であり得る。
【００１４】
好ましくは、挿入されたＨＰＶ  Ｌ２ペプチドは、配列番号：７に記載されているヒトコドン最適化ヌクレオチド配列によってコードされる１３アミノ酸  ＬＶＥＥＴＳＦＩＤＡＧＡＰ  ペプチド（配列番号：３）である。
【００１５】
ＨＰＶタイプ１６  Ｌ１タンパク質はさらに、核局在化シグナルを不足させるように修飾されたヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【００１６】
好ましくは、ＨＰＶ−１６  Ｌ１／Ｌ２ポリペプチドは、配列番号：２２、配列番号：２３または配列番号：２４、またはそれらの変異体もしくは誘導体に示されるアミノ酸配列を含む。
【００１７】
好ましくは、ＨＰＶ−１６  Ｌ１ポリペプチドは配列番号：１に示され、ＨＰＶ−１６  Ｌ１ポリペプチドは配列番号：２に示されるヒトコドン最適化ＨＰＶ−１６  Ｌ１ポリヌクレオチド配列によってコードされる。
【００１８】
約３０ｎｍ直径のキメラＨＰＶ  ＶＬＰは、植物発現系から精製された植物発現キメラＨＰＶ  ＶＬＰであり得る。好ましくは、発現キメラＶＬＰは、植物の葉緑体に標的化され得る。
【００１９】
本発明のさらなる局面において、本発明の３０ｎｍ直径のキメラＨＰＶ  ＶＬＰおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００２０】
該組成物はまた、アジュバントを含み得る。
【００２１】
本発明のさらなる局面において、約３０ｎｍ直径のサイズを有するキメラＨＰＶ  ＶＬＰを生産する方法であって、
（ｉ）キメラＨＰＶ  １６  Ｌ１／Ｌ２ポリペプチドをコードするキメラヒトコドン最適化ヌクレオチド配列を提供する工程、ここで、該キメラＨＰＶ  １６  Ｌ１／Ｌ２ポリペプチドは、キメラＨＰＶ  １６  Ｌ１／Ｌ２ポリペプチドの残基４１４から挿入された約１３アミノ酸から約２６アミノ酸のＨＰＶ  Ｌ２ペプチドを有するＨＰＶ  １６  Ｌ１ポリペプチドを含み、そして、該挿入されたＨＰＶ  Ｌ２ペプチドのアミノ酸は、ＨＰＶ  １６  Ｌ１ポリペプチドの対応するアミノ酸を置換する；
（ｉｉ）キメラヒトコドン最適化ヌクレオチド配列を植物においてポリペプチドを発現することに適している発現ベクターにクローニングする工程；
（ｉｉｉ）植物細胞を工程（ｉｉ）の発現ベクターで形質転換するか、または植物細胞に工程（ｉｉ）の発現ベクターを浸潤する工程；
（ｉｖ）発現されたキメラＨＰＶ  １６  Ｌ１／Ｌ２ポリペプチドが均一状態および約３０ｎｍの直径を有するキメラＨＰＶ  ＶＬＰに集合するように、工程（ｉｉｉ）の植物細胞においてキメラＨＰＶ  １６  Ｌ１／Ｌ２ポリペプチドを発現する工程；および
（ｖ）該植物細胞から該キメラＨＰＶ  ＶＬＰを回収する工程
を含む方法を提供する。
【００２２】
該発現ベクターは、好ましくは、発現ベクターのコード配列に作動可能に連結したプロモーターおよび他のレギュレーターなどを含む。
【００２３】
好ましくは、工程（ｉｉ）の発現ベクターは、植物細胞の葉緑体への標的化に適しており、工程（ｉｖ）において、発現キメラＨＰＶタンパク質は、植物葉緑体に標的化される。
【００２４】
工程（ｉｉｉ）は、植物における転写後遺伝子サイレンシングを阻害することに適しているサプレッサータンパク質を植物細胞に導入することをさらに含み得る。好ましくは、サプレッサータンパク質は、トマトスポッテッドウイルトウイルスのＮＳｓタンパク質またはトマトブッシースタントウイルスのｐ１９である。
【００２５】
例えば、挿入されたＨＰＶ  Ｌ２ペプチドは、配列番号：７に記載されているヒトコドン最適化ヌクレオチド配列によってコードされる１３アミノ酸  ＬＶＥＥＴＳＦＩＤＡＧＡＰ  ペプチド（配列番号：３）、または配列番号：９に記載されているヒトコドン最適化ヌクレオチド配列によってコードされる２０アミノ酸  ＱＬＹＫＴＣＫＱＡＧＴＣＰＰＤＩＩＰＫＶ  ペプチド（配列番号：５）、または配列番号：８に記載されているヒトコドン最適化ヌクレオチド配列によってコードされる２６アミノ酸  ＧＧＬＧＩＧＴＧＳＧＴＧＧＲＴＧＹＩＰＬＧＴＲＰＰＴ  ペプチド（配列番号：４）であり得る。
【００２６】
好ましくは、挿入されたＨＰＶ  Ｌ２ペプチドは、配列番号：７に記載されているヒトコドン最適化ヌクレオチド配列によってコードされる３アミノ酸  ＬＶＥＥＴＳＦＩＤＡＧＡＰ  ペプチド（配列番号：３）である。
【００２７】
本発明のさらなる局面において、対象におけるＨＰＶ感染および／または子宮頸癌を予防および／または処置する方法における使用のための本発明の約３０ｎｍ直径のキメラＨＰＶ  ＶＬＰを提供する。
【００２８】
さらに具体的には、キメラＨＰＶ  ＶＬＰは、対象における免疫応答、例えば、中和抗体および／またはＣＴＬ応答を引き起こす方法における使用のためであり得る。好ましくは、キメラＨＰＶ  ＶＬＰは、対象において複数のＨＰＶタイプに対する交差防御免疫応答を引き起こすことにおける使用のためである。
【００２９】
本発明のさらなる局面において、対象におけるＨＰＶ感染および／または子宮頸癌を予防および／または処置する方法における使用のための医薬の製造における本発明の規則的に成形された約３０ｎｍ直径のキメラＨＰＶ  ＶＬＰの使用を提供する。
【００３０】
さらに具体的には、該医薬は、対象における免疫応答、例えば、中和抗体および／またはＣＴＬ応答を引き起こす方法における使用のためであり得る。好ましくは、該医薬は、対象において複数のＨＰＶタイプに対する交差防御免疫応答を引き起こすことにおける使用のためである。
【００３１】
本発明のさらなる局面において、対象におけるＨＰＶ感染および／または子宮頸癌を予防および／または処置する方法であって、予防または治療有効量の本発明の均一状態の約３０ｎｍ直径のキメラＨＰＶ  ＶＬＰを対象に投与する工程を含む方法を提供する。
【００３２】
さらに具体的には、該方法は、対象における免疫応答、例えば、中和抗体および／またはＣＴＬ応答を引き起こすことを含み得る。好ましくは、該方法は、対象において複数のＨＰＶタイプに対する交差防御免疫応答を引き起こすことを含む。
【００３３】
該対象は好ましくはヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、ＨＰＶキメラ植物発現構築物を作製するために使用されたプラスミドを示す。Ｃ）ｐＧＡ４構築物からのＨＰＶキメラ遺伝子を、アグロバクテリウム植物発現ベクターに直接的にサブクローニングした：Ａ）ｐＴＲＡｋｃ−ｒｂｃｓ１−ｃＴＰ、Ｂ）ｐＴＲＡｃおよびＤ）ｐＲＩＣ３。植物発現のために必要なベクターエレメントは、該図において示されている。Ｐ３５ＳＳ：重複転写エンハンサーを含むＣａＭＶ  ３５Ｓ  プロモーター、ＣＨＳ：カルコンシンターゼ５’非翻訳領域、ｐＡ３５Ｓ：外来遺伝子発現のためのＣａＭＶ  ３５Ｓ  ポリアデニル化シグナル、ＣｏｌＥ１ｏｒｉ：大腸菌複製起点、ＲＫ２ｏｒｉ：アグロバクテリウム複製起点、ｂｌａ：アンピシリン／カルベニシリン−耐性遺伝子、およびＬＢ／ＲＢ：Ｔ−ＤＮＡ組み込みのための左および右境界。ｐＴＲＡｃベクターは、ＳＡＲ：タバコ  Ｒｂ７  スカフォールド結合領域に隣接する発現カセットを含む。加えて、ｐＴＲＡｋｃ−ｒｂｃｓ１−ｃＴＰベクターは、ｎｐｔ  ＩＩ：カナマイシン−耐性遺伝子、Ｐｎｏｓ／ｐＡｎｏｓ：ノパリン合成遺伝子のプロモーター／ポリアデニル化シグナル、およびｒｂｃｓ１−ｃＴＰ：ルビスコ小サブユニット遺伝子ｒｂｃＳ１のジャガイモ葉緑体輸送ペプチド配列を含む。ｐＲＩＣ３ベクターは、ＬＩＲ：ＢｅＹＤＶ長遺伝子間領域、ＳＩＲ：ＢｅＹＤＶ短遺伝子間領域、およびＲｅｐ／ＲｅｐＡ：ＢｅＹＤＶ繰り返し遺伝子を含む。
【００３５】
【図２】図２は、ＮＳｓサイレンシングサプレッサー有り（＋）または無し（−）のいずれかで、ベンサミアナタバコにおける浸潤１−９日後（ｄｐｉ）の葉緑体標的化Ｌ１／Ｌ２キメラ発現時間試験を示す。粗葉抽出物中のＬ１／Ｌ２キメラ  Ａ）Ｌ１／Ｌ２（１０８−１２０）、Ｂ）Ｌ１／Ｌ２（５６−８１）、Ｃ）Ｌ１／Ｌ２（１７−３６）およびＤ）Ｌ１／Ｌ２  ＢＰＶ（１−８８）を、ＣａｍＶｉｒ１ウェスタンブロット分析により検出した。Ｍ＝左側に示されたｋＤａにおいてサイズを有するタンパク質マーカー。ＮＳｓネガティブコントロール＝ｐＢＩＮ−ＮＳｓ浸潤粗植物抽出物（５ｄｐｉ）。ポジティブコントロール：ベンサミアナタバコ（＋）＝植物由来のＨＰＶ−１６  Ｌ１。黒色の矢印はＬ１／Ｌ２キメラの位置（〜５６ｋＤａ）を示し、灰色の矢印は破壊されたタンパク質を示す。
【００３６】
【図３】図３ａ）は、３つの植物発現ベクター：ｐＴＲＡｃ、ｐＴＲＡｋｃ−ｒｂｃｓ１−ｃＴＰおよびｐＲＩＣ３を使用して発現されるＬ１／Ｌ２キメラのウェスタンブロットを示す。キメラをＮＳｓと共発現させ、５ｄｐｉ発現させ、ＣａｍＶｉｒ１で検出した。ＨＰＶ−１６  Ｌ１は、ｐＴＲＡｃおよびｐＴＲＡｋｃ−ｒｂｃｓ１−ｃＴＰに対するポジティブ発現コントロールとして発現させ（ｐＲＩＣ３構築物に利用できない）、ネガティブ発現コントロールはＮＳｓ浸潤植物であった。Ｍ＝左側にｋＤａにおいて示されたタンパク質のサイズを有するタンパク質マーカー。黒色の矢印はＬ１／Ｌ２キメラまたはＨＰＶ−１６  Ｌ１（〜５６ｋＤａ）を示し；ｂ）は、３つの植物発現ベクター：ｐＴＲＡｃ、ｐＴＲＡｋｃ−ｒｂｃｓ１−ｃＴＰおよびｐＲＩＣ３を使用して発現されたＬ１／Ｌ２キメラの比較を示す。エラーバーは標準偏差を示す。
【００３７】
【図４】図４は、３つの異なる植物発現ベクター：ｐＴＲＡｃ、ｐＴＲＡｋｃ−ｒｂｃｓ１−ｃＴＰおよびｐＲＩＣ３を使用して発現されるＬ１／Ｌ２キメラの集合物を示す。タンパク質を、ＮＳｓサイレンシングサプレッサーと共発現させ、５ｄｐｉ抽出した。（構造特異的Ｈ１６．Ｖ５  ＭＡｂにより検出される）高秩序構造、例えば、カプソメアまたはＶＬＰに集合されたキメラを、（線形特異的Ｈ１６．Ｊ４  ＭＡｂにより検出される）全キメラタンパク質のパーセントとして示した。ＨＰＶ−１６  Ｌ１はポジティブ発現コントロールとして示され、ネガティブ発現コントロールはＮＳｓ浸潤植物であった。エラーバーは標準偏差を示す。
【００３８】
【図５】図５は、植物生産ワクチン抗原の純度を示す。Ａ）クマシー染色タンパク質ゲル。Ｂ）ＨＰＶ抗原のウェスタンブロット検出。Ｍ＝左側に示されたｋＤａにおいてサイズを有するタンパク質マーカー。Ｃ＝浄化された粗植物抽出物。Ｐ＝精製された抗原。Ｖ１＝Ｌ１／Ｌ２（１０８−１２０）、Ｖ２＝Ｌ１／Ｌ２（５６−８１）、Ｖ３＝Ｌ１／Ｌ２（１７−３６）、Ｖ４（＋）＝ＨＰＶ−１６  Ｌ１およびＶ５（−）＝ＮＳｓ浸潤植物抽出物。黒色の矢印はＨＰＶ抗原を示し、白色の矢印は植物タンパク質ルビスコを示す。
【００３９】
【図６】図６は、粗および精製サンプル中の全可溶性タンパク質（ＴＳＰ）および全ＨＰＶタンパク質を示す。ＴＳＰは、Ｌｏｗｒｙアッセイを使用して決定し、ＨＰＶタンパク質は、Ｈ１６．Ｊ４（線形エピトープ特異的）で検出した。Ｖ１：Ｌ１／Ｌ２（１０８−１２０）、Ｖ２：Ｌ１／Ｌ２（５６−８１）、Ｖ３：Ｌ１／Ｌ２（１７−３６）、Ｖ４：ＨＰＶ−１６  Ｌ１（ポジティブコントロール）、Ｖ５：ＮＳｓ植物抽出物（ネガティブコントロール）。エラーバーは標準偏差を示す。
【００４０】
【図７】図７は、ＣａｍＶｉｒ１免疫捕捉された粗および精製ワクチン抗原の透過型電子顕微鏡写真を示す。Ａ）Ｖ１：Ｌ１／Ｌ２（１０８−１２０）、Ｂ）Ｖ２：Ｌ１／Ｌ２（５６−８１）、Ｃ）Ｖ３：Ｌ１／Ｌ２（１７−３６）、Ｄ）Ｖ４：ＨＰＶ−１６  Ｌ１（ポジティブコントロール）、Ｅ）Ｖ５：ＮＳｓ植物抽出物（ネガティブコントロール）。グリッドを、Ｚｅｉｓｓ  ９１２  Ｏｍｅｇａ  Ｃｒｙｏ  ＥＦＴＥＭにて見た。左のスケールバー＝５０ｎｍ、右のスケールバー＝２００ｎｍ。右の灰色の矢印はＨＰＶ−１６カプソメア（〜１０ｎｍ）を示し、白色の矢印はカプソメア集合物または小ＶＬＰ（〜３０ｎｍ）を示し、暗灰色の矢印はフルサイズの(full-sized)ＶＬＰ（〜５５ｎｍ）を示す。
【００４１】
【図８】図８は、ＣａｍＶｉｒ１免疫捕捉された粗ワクチン抗原Ｌ１／Ｌ２（５６−８１）の透過型電子顕微鏡写真を示す。グリッドを、Ｚｅｉｓｓ  ９１２  Ｏｍｅｇａ  Ｃｒｙｏ  ＥＦＴＥＭにて見た。スケールバー＝１００ｎｍ。
【００４２】
【図９】図９は、被覆抗原として昆虫細胞生産ＨＰＶ−１６  Ｌ１を使用するマウス血清のダイレクトＥＬＩＳＡを示す。Ｖ１＝Ｌ１／Ｌ２（１０８−１２０）、Ｖ２＝Ｌ１／Ｌ２（５６−８１）、Ｖ３＝Ｌ１／Ｌ２（１７−３６）、Ｖ４＝ＨＰＶ  Ｌ１（＋ワクチンコントロール）、Ｖ５＝植物抽出物（−ワクチンコントロール）。Ａ）全ワクチンに対するマウス抗血清の滴定。Ｂ）ＥＬＩＳＡポジティブコントロール  ＭＡｂｓ  Ｈ１６．Ｖ５およびＣａｍＶｉｒ１に対して得られた値を示すグラフ。Ｃ）１：５０希釈でのワクチン前採血吸光度値。マーカーはトリプリケートサンプルの平均値を示し、エラーバーは標準偏差を示す。
【００４３】
【図１０】図１０は、マウス血清による１：１００のでの大腸菌発現Ｈｉｓタグ化ＨＰＶ−１６  Ｌ２のウェスタンブロット検出を示す。Ｍ＝ｋＤａにおいてタンパク質サイズを有するタンパク質マーカー。Ｖ１＝Ｌ１／Ｌ２（１０８−１２０）、Ｖ２＝Ｌ１／Ｌ２（５６−８１）、Ｖ３＝Ｌ１／Ｌ２（１７−３６）、Ｖ４＝ＨＰＶ  Ｌ１（＋  ワクチンコントロール）、Ｖ５＝植物抽出物（ワクチンコントロール）。ＰＢ＝前採血血清。ＦＢ＝最終採血血清。ウェスタンブロットコントロールに対して：＋ｖｅ＝マウス抗−Ｈｉｓ（１：２０００；  Ｓｅｒｏｔｅｃ）、−ｖｅ＝一次抗体なし。黒色の矢印はＬ２（〜８０ｋＤａ）を示す。
【００４４】
【図１１】図１１は、ＨＰＶ−１６  ＰｓＶ中和アッセイを示す。Ｖ１−Ｖ５でワクチン接種したマウス由来のプール血清を、ＨＰＶ−１６  ＰｓＶｓを中和する能力について試験した。Ａ）Ｖ１＝Ｌ１／Ｌ２（１０８−１２０）、Ｂ）Ｖ２＝Ｌ１／Ｌ２（５６−８１）、Ｃ）Ｖ３＝Ｌ１／Ｌ２（１７−３６）、Ｄ）Ｖ４＝ＨＰＶ−１６  Ｌ１（＋ｖｅ  ワクチンコントロール）、Ｅ）Ｖ５＝ＮＳｓ−浸潤植物抽出物（−ｖｅ  ワクチンコントロール）。Ｆ）Ｈ１６．Ｖ５＝＋ｖｅ  中和コントロール。細胞コントロール＝ｖｅ  感染／ＳＥＡＰ  発現コントロール。ＰｓＶコントロール＝＋ｖｅ  感染／ＳＥＡＰ  発現コントロール。サンプルをトリプリケートにおいてアッセイし、エラーバーは標準偏差を示す。
【００４５】
【図１２】図１２は、ＨＰＶ−１８  ＰｓＶ中和アッセイを示す。Ａ）Ｖ１＝Ｌ１／Ｌ２（１０８−１２０）、Ｂ）Ｖ２＝Ｌ１／Ｌ２（５６−８１）、Ｃ）Ｖ３＝Ｌ１／Ｌ２（１７−３６）、Ｄ）Ｖ４＝ＨＰＶ−１６  Ｌ１、Ｅ）Ｖ５＝ＮＳｓ−浸潤植物抽出物（−ｖｅ  ワクチンコントロール）。Ｆ）ウサギ抗サーバリックス血清＝＋ｖｅ  中和コントロール。
【００４６】
【図１３】図１３は、ＨＰＶ−４５  ＰｓＶ中和アッセイを示す。Ａ）Ｖ１＝Ｌ１／Ｌ２（１０８−１２０）、Ｂ）Ｖ２＝Ｌ１／Ｌ２（５６−８１）、Ｃ）Ｖ３＝Ｌ１／Ｌ２（１７−３６）、Ｄ）Ｖ４＝ＨＰＶ−１６  Ｌ１、Ｅ）Ｖ５＝ＮＳｓ−浸潤植物抽出物（−ｖｅ  ワクチンコントロール）。Ｆ）Ｈ４５．Ｎ５＝＋ｖｅ  中和コントロール。
【００４７】
【図１４】図１４は、ＨＰＶ−５２  ＰｓＶ中和アッセイを示す。Ａ）Ｖ１＝Ｌ１／Ｌ２（１０８−１２０）、Ｂ）Ｖ２＝Ｌ１／Ｌ２（５６−８１）、Ｃ）Ｖ３＝Ｌ１／Ｌ２（１７−３６）、Ｄ）Ｖ４＝ＨＰＶ−１６  Ｌ１、Ｅ）Ｖ５＝ＮＳｓ−浸潤植物抽出物（−ｖｅ  ワクチンコントロール）。Ｆ）Ｈ５２．Ｃ１＝＋ｖｅ  中和コントロール。
【００４８】
【図１５】図１５は、ＨＰＶ−１６  Ｌ１のアミノ酸（配列番号：１）を示す。
【００４９】
【図１６】図１６は、ＨＰＶ−１６  Ｌ１のヒトコドン最適化ヌクレオチド配列（配列番号：２）を示す。
【００５０】
【図１７】図１７は、ＨＰＶ  Ｌ１配列に挿入されたＬ２（１０８−１２０）エピトープ  のアミノ酸配列（配列番号：３）を示す。
【００５１】
【図１８】図１８は、ＨＰＶ  Ｌ１配列に挿入されたＬ２（５６−８１）エピトープのアミノ酸配列（配列番号：４）を示す。
【００５２】
【図１９】図１９は、ＨＰＶ  Ｌ１配列に挿入されたＬ２（１７−３６）エピトープのアミノ酸配列（配列番号：５）を示す。
【００５３】
【図２０】図２０は、ＨＰＶ  Ｌ１配列に挿入されたＬ２  ＢＰＶ（１−８８）エピトープのアミノ酸配列（配列番号：６）を示す。
【００５４】
【図２１】図２１は、ＨＰＶ  Ｌ１配列に挿入されたＬ２（１０８−１２０）のヒトコドン最適化ＤＮＡヌクレオチド配列（配列番号：７）を示す。
【００５５】
【図２２】図２２は、ＨＰＶ  Ｌ１配列に挿入されたＬ２（５６−８１）のヒトコドン最適化ＤＮＡヌクレオチド配列（配列番号：８）を示す。
【００５６】
【図２３】図２３は、ＨＰＶ  Ｌ１配列に挿入されたＬ２（１７−３６）のヒトコドン最適化ＤＮＡヌクレオチド配列（配列番号：９）を示す。
【００５７】
【図２４】図２４は、ＨＰＶ  Ｌ１配列に挿入されたＬ２  ＢＰＶ（１−８８）のヒトコドン最適化ＤＮＡヌクレオチド配列（配列番号：１０）を示す。
【００５８】
【図２５】図２５は、ＨＰＶ  １６  Ｌ１／Ｌ２（１０８−１２０）キメラポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：２２）を示す。
【００５９】
【図２６】図２６は、ＨＰＶ  １６  Ｌ１／Ｌ２（５６−８１）キメラポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：２３）を示す。
【００６０】
【図２７】図２７は、ＨＰＶ  １６  Ｌ１／Ｌ２（１７−３６）キメラポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：２４）を示す。
【００６１】
【図２８】図２８は、ＨＰＶ  １６  Ｌ１／Ｌ２  ＢＰＶ（１−８８）キメラポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：２５）を示す。
【００６２】
【図２９】図２９は、ＨＰＶ  １６  Ｌ１／Ｌ２（１０８−１２０）キメラポリペプチドをコードするヒトコドン最適化ＤＮＡヌクレオチド配列（配列番号：２６）を示す。
【００６３】
【図３０】図３０は、ＨＰＶ  １６  Ｌ１／Ｌ２（５６−８１）キメラポリペプチドをコードするヒトコドン最適化ＤＮＡヌクレオチド配列（配列番号：２７）を示す。
【００６４】
【図３１】図３１は、ＨＰＶ  １６  Ｌ１／Ｌ２（１７−３６）キメラポリペプチドをコードするヒトコドン最適化ＤＮＡヌクレオチド配列（配列番号：２８）を示す。
【００６５】
【図３２】図３２は、ＨＰＶ  Ｌ１／Ｌ２  ＢＰＶ（１−８８）キメラポリペプチドをコードするヒトコドン最適化ＤＮＡヌクレオチド配列（配列番号：２９）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
発明の詳細な説明
本発明は、本発明の全ての態様ではないが、いくつかの態様が示されている図面を基準にして、以下により完全に記載されている。
【００６７】
記載されている本発明は、記載されている特定の態様に限定されるべきでなく、修飾および他の態様が本発明の範囲内に含まれることを意図する。特定の用語が本明細書において使用されているが、それらは、限定の目的のためでなく、総括的および説明的な意味のみにおいて使用される。
【００６８】
本明細書において使用される用語は、他に記載のない限り、当分野において認識されている意味を有する。
【００６９】
本発明は、規則的成形および約３０ｎｍ直径のサイズを有するキメラヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ならびに、本発明のキメラＨＰＶ  ＶＬＰの投与によるＨＰＶ感染および／または子宮頸癌の処置および／または予防の方法を提供する。特に、規則的に成形された３０ｎｍ直径のキメラＨＰＶ  ＶＬＰは、ヒトコドン最適化ヌクレオチド配列によってコードされる約１３アミノ酸から約２６アミノ酸のＨＰＶ  Ｌ２ペプチドがアミノ酸残基４１４で挿入されており、それにより、対応するＨＰＶ  Ｌ１アミノ酸を置換する、ＨＰＶタイプ  １６  Ｌ１タンパク質を含む。
【００７０】
Ｌ１メジャーカプシドタンパク質は、現在の予防ＨＰＶワクチンの基礎を形成するウイルス様粒子（ＶＬＰ）に自発的に自己集合する（Schillerら, 2008）。組換えＶＬＰは、哺乳動物、昆虫、酵母、細菌および植物を含むいくつかの種々の宿主系において発現されている。
【００７１】
ＨＰＶ−１６  Ｌ１  Ｃ−末端ヘリックス４（ｈ４）は、ＶＬＰ集合において役割を果たし、残基４１４−４２６間に位置する（Varsaniら, 2003a）。これらのモチーフの除去は、カプソメア形成をもたらし、ＶＬＰへのさらなる自己集合を防止する（Bishopら, 2007）。さらに、高度に保存されているシステイン残基１７５および４２８間にジスルフィド結合が存在し、これらのシステインの突然変異はＶＬＰよりもむしろカプソメアの形成をもたらす（Liら, 1998; McCarthyら, 1998; Sappら, 1998; Fliggeら, 2001; Varsani ら, 2006b）。しかしながら、該試験において、ｉｔ  ｗａｓ  ｓｈｏｗｎ  ｔｈａｔ  ヒトコドン最適化ヌクレオチド配列によってコードされる約１３アミノ酸から約２６アミノ酸のＨＰＶ  Ｌ２ペプチドの挿入が、アミノ酸残基４１４で挿入され、それにより、対応するＨＰＶ  Ｌ１  アミノ酸を置換するとき、約３０ｎｍ直径の小さい規則的に成形されたキメラＶＬＰに成功裏に集合させることができた。
【００７２】
（酵母または昆虫細胞において現在発現される）市販のＨＰＶワクチンは、高価な生産および精製プロトコールの部分的な結果として、高価である（Schillerら, 2008）。加えて、複雑な精製方法および大規模な前処理は、集合させたＬ１タンパク質の安定性および回収に影響し得、変性させたＬ１は、中和抗体を誘導しない。結果として、低コスト発現系および単純な生産および精製プロセスを使用するワクチン抗原の生産が、あらゆる市販のタンパク質生産系において高い優先度を維持している。
【００７３】
本発明は、本発明の範囲を多少なりとも限定すると解釈すべきでない以下の実施例によって記載されている。
【実施例】
【００７４】
実施例１：Ｌ１キメラの一時的植物発現
方法および材料
植物発現ベクター
３種のバイナリーアグロバクテリウム植物発現ベクターを使用して、ＨＰＶキメラ発現を最適化した：ｐＴＲＡｃおよびｐＴＲＡｋｃ−ｒｂｃｓ１−ｃＴＰ（Ｐｒｏｆ．  Ｒａｉｎｅｒ  Ｆｉｓｃｈｅｒ；Ｆｒａｕｎｈｏｆｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｅｃｏｌｏｇｙ，  Ｇｅｒｍａｎｙによって提供された）およびマメ黄萎ジェミニウイルス（ＢｅＹＤＶ）ベクターｐＲＩＣ３（Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｈａｌｌｅｙ−Ｓｔｏｔｔによって作製された）。２種は、発現されたタンパク質を、細胞質（ｐＴＲＡｃ）または葉緑体（ｐＴＲＡｋｃ−ｒｂｃｓ１−ｃＴＰ）のいずれかに標的化する非複製性ベクターであり（Macleanら, 2007）、第３のものは、自己複製性細胞質標的化ベクター（ｐＲＩＣ３）である。ｐＲＩＣ３ベクターは、サイズが小さくされ、植物において導入遺伝子発現の同様の増幅を示した、第３世代のｐＲＩＣベクターである（Regnardら, 2010）。
【００７５】
ベクターは、植物におけるタンパク質発現に必要ないくつかの要素を含む（図１）。ｐＴＲＡｋｃ−ｒｂｃｓ１−ｃＴＰベクター（図１Ａ）は、ｐＴＲＡｃ（図１Ｂ）の誘導体であり、ジャガイモｒｂｃＳ１遺伝子の葉緑体トランジットペプチド配列を含む。ｐＲＩＣ３（図１Ｄ）は、自己複製に必要なＢｅＹＤＶ複製関連タンパク質を含む（Regnardら, 2010）。
【００７６】
Ｌ１キメラの合成
この研究に使用された４種のＨＰＶ−１６  Ｌ１／Ｌ２キメラは、表１に記載されている。キメラは、南アフリカのＨＰＶ−１６  Ｌ１分離株遺伝子配列（ＳＡＬＩ：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１７７６７９）およびアミノ酸４１４（「Ｆ−位置」と表される）のｈ４ヘリックス中に位置するＬ２エピトープからなる。これらのキメラ遺伝子は、Ｄｒ  Ｉｎｇａ  Ｈｉｔｚｅｒｏｔｈ  （Ｐｌａｎｔ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｇｒｏｕｐ，  ＵＣＴ）によって、ハイスループット遺伝子アセンブリーを使用するＧＥＮＥＡＲＴ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）によってコンピュータで設計され、ヒトコドン最適化され、合成された。合成されたＬ２エピトープ配列は、Ｆ位置中のＬ１配列を置換し、Ｌ１タンパク質中に簡単には挿入されなかった。
【００７７】
【表１】
2015500229.tif 000003
【００７８】
Ｌ１キメラ遺伝子のサブクローニング
ＨＰＶ−１６  Ｌ１／Ｌ２、キメラ配列を、キメラ遺伝子に隣接する３’ＸｈｏＩと、５’ＢｓｐＨＩ、ＭｌｕＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素（ＲＥ）部位のいずれかを使用してｐＧＡ４ベクターから切り出した（図１Ｃ）。ＨＰＶ遺伝子を、ｐＴＲＡｃについてはＡｆｌＩＩＩおよびＸｈｏＩ（図１Ｂ）、ｐＴＲＡｋｃ−ｒｂｃｓ１−ｃＴＰについてはＭｌｕＩおよびＸｈｏＩ（図１Ａ）ならびにｐＲＩＣ３についてはＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ（図１Ｄ）を使用して植物発現ベクターに指向的にサブクローニングした。ＤＨ５−α化学的にコンピテントな大腸菌（E. coli）細胞（Ｅ．ｃｌｏｎｉ（商標）、Ｌｕｃｉｇｅｎ）を、キメラプラスミド構築物で形質転換し、アンピシリン耐性（１００μｇ／ｍｌ）を使用して組換え体を選択した。ｐＴＲＡｃ  ＨＰＶ−１６  Ｌ１／Ｌ２キメラ構築物Ｌ１／Ｌ２（１０８−１２０）、Ｌ１／Ｌ２（５６−８１）およびＬ１／Ｌ２（１７−３６）は、Ｍａｒｋ  Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ（Ｐｌａｎｔ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｇｒｏｕｐ，  ＵＣＴ）によって提供された。この研究に使用されたプラスミド構築物は、表２に要約されている。
【００７９】
【表２】
2015500229.tif 000004
【００８０】
組換えＬ１キメラ同定
Ｌ１キメラ組換えクローンを、異なるＬ２エピトープと結合する、ｐＴＲＡｃベクター特異的プライマーおよびキメラ特異的プライマーを使用して、コロニーＰＣＲによってスクリーニングした（表３）。ＰＣＲは、３ｍＭの最終ＭｇＣｌ２濃度中、１μＭの各プライマーを使用し、ＧｏＴａｑ  Ｆｌｅｘｉ  ＤＮＡポリメラーゼキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者の使用説明書のとおりに使用して実施した。
【００８１】
【表３】
2015500229.tif 000005
【００８２】
ベクター特異的プライマーを使用するコロニーＰＣＲ
ｐＴＲＡｃベクター特異的プライマー（Ｍａｒｋ  Ｗｈｉｔｅｈｅａｄによって設計された）は、遺伝子挿入を検出するために多重クローニング部位（ＭＣＳ）の上流および下流と結合する。ＰＣＲプロフィールは、９５℃で３分間の初期変性工程と、それに続く９５℃で３０秒、５９℃で３０秒および７２℃で３分間の２５サイクルと、７２℃で３分間の最後の伸長工程からなるものとした。ＰＣＲ産物は、０．８％  ＴＢＥアガロースゲルで分離し、臭化エチジウムを使用して検出した。
【００８３】
エピトープ特異的プライマーを使用するコロニーＰＣＲ
ＨＰＶ  Ｌ２エピトープ特異的プライマー（Ｍａｒｉｅｔａ  Ｂｕｒｇｅｒによって設計された）を使用して、組換えｐＴＲＡｋｃ−ｒｂｃｓ１−ｃＴＰおよびｐＲＩＣ３クローン中の正しいキメラ挿入断片を確認した。ＰＣＲプロフィールは、９５℃で２分間の初期変性工程と、それに続く９５℃で３０秒間、５５℃（Ｌ１／Ｌ２キメラ）で２０秒間および７２℃で３０秒間の２５サイクルと、７２℃で３分間の最後の伸長工程からなるものとした。ＰＣＲ産物は、１．２％  ＴＢＥアガロースゲルで分離し、臭化エチジウムを使用して検出した。
【００８４】
制限酵素消化
組換え体は、１．５ｋｂのキメラ遺伝子挿入断片の両側に隣接するＲＥ部位（ｐＴＲＡｋｃ−ｒｂｃｓ１−ｃＴＰクローンのＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩまたはｐＲＩＣ３クローンのＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ）を使用する制限酵素消化によって確認した。組換えＤＮＡ（〜５００μｇ）を、製造業者の使用説明書（Ｒｏｃｈｅ／Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）のとおり反応あたり１Ｕの酵素を使用して３７℃で１−２時間消化した。消化されたＤＮＡを、０．８％  ＴＢＥアガロースゲルで分離し、臭化エチジウムで染色した。
【００８５】
Ｌ１キメラの配列決定
ｐＴＲＡｋｃ−ｒｂｃｓ１−ｃＴＰ組換え体中のＨＰＶキメラ遺伝子挿入断片を、ｐＴＲＡｃベクター特異的プライマーを使用して配列決定した。配列を、ＤＮＡＭＡＮマルチプルアラインメントソフトウェアを使用してＨＰＶキメラ配列とアラインした。
【００８６】
アグロバクテリウム形質転換
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ＧＶ３１０１：：ｐＭＰ９０ＲＫ細胞を、ShenおよびForde（1989）によって記載された方法を使用してエレクトロコンピテントにした。アグロバクテリウムの形質転換は、Macleanら（2007）によって記載されるように実施し、組換えクローンを、抗生物質選択（５０μｇ／ｍｌカルベニシリン、５０μｇ／ｍｌリファンピシンおよび３０μｇ／ｍｌカナマイシン）によってスクリーニングした。形質転換の成功は、コロニーＰＣＲおよび制限酵素消化（上記のとおり）によって確認した。
【００８７】
ベンサミアナタバコのアグロインフィルトレーション
Macleanら（2007）に記載されるような浸潤のために、Ａ．ツメファシエンス組換えキメラ培養物ならびにトマト黄化壊疽病ウイルス（ＴＳＷＶ）ＮＳｓサイレンシングサプレッサーをコードするｐＢＩＮ−ＮＳｓ  プラスミドを含むＡ．ツメファシエンスＬＢＡ４４０４培養物（Takedaら, 2002）を調製した。アグロバクテリウム細胞を、浸潤培地（水中、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＭＥＳ、３％スクロースおよび１５０μＭ  アセトシリンゴン、ｐＨ５．６）に希釈し、個々のアグロバクテリウムキメラ株について０．２５の最終ＯＤ６００を得、Ａ．ツメファシエンスＬＢＡ４４０４（ｐＢＩＮ−ＮＳｓ）と共浸潤される構築物の０．５のＯＤ６００と組み合わせた。株を、２２℃で２時間インキュベートして、浸潤に先立ってｖｉｒ遺伝子を発現させた。
【００８８】
細菌懸濁液を、葉の腹側から背軸性の空気間隙に注入することによって、６週齢のベンサミアナタバコの葉をアグロインフィルトレーションした（Macleanら, 2007）。植物を、２２℃で１６時間明、８時間暗条件下で所望の期間、増殖させた。キメラ発現時間試験を、浸潤１−９日後（ｄｐｉ）で実施し、キメラは、ＮＳｓサイレンシングサプレッサーと共発現するか、共発現しなかった。各キメラには別個の植物を使用し、同一植物の別個の葉を、比較ベクター発現のためにｐＴＲＡｃ、ｐＴＲＡｋｃ−ｒｂｃｓ１−ｃＴＰまたはｐＲＩＣ３キメラ構築物のいずれかを用いて浸潤した。
【００８９】
植物からのタンパク質抽出
アグロインフィルトレーションした葉から、エッペンドルフチューブのキャップを使用して切断したリーフディスクを回収し（ディスクあたり〜１０ｍｇ、構築物あたり３ディスク）、液体窒素中で砕いた。リーフ物質を、ディスクあたり２５０μｌの、プロテアーゼ阻害剤（ＥＤＴＡ不含完全プロテアーゼ阻害剤；Ｒｏｃｈｅ）を含む１．５Ｍ  ＮａＣｌ高塩ＰＢＳ（ＨＳ  ＰＢＳ）抽出バッファーに再懸濁した。粗植物抽出物を、１３，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって２回浄化し、上清を−２０℃で保存した。
【００９０】
植物によって発現されたＬ１キメラのウエスタンブロット検出
植物抽出物を、ローディングバッファー（Sambrookら, 1989）中、９５℃で５分間インキュベートし、１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、セミドライエレクトロブロッティングによってニトロセルロースメンブレンに移した。メンブレンを、ブロッキングバッファー（１×ＰＢＳ、ｐＨ７．６中、５％  スキムミルク、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）中、室温で３０分間ブロッキングし、ブロッキングバッファーで希釈した抗Ｌ１一次抗体中、４℃で一晩インキュベートした。ＨＰＶ−１６  Ｌ１タンパク質を、アミノ酸２３０−２３６に位置するＬ１線形エピトープＧＦＧＡＭＤＦ（McLeanら, 1990）と結合するマウスモノクローナル（ＭＡｂ）ＣａｍＶｉｒ１（１：１００００；Ａｂｃａｍ，ＵＫ）またはＬ１タンパク質のＦＧループ内のアミノ酸２６１−２８０に位置する線形エピトープ（Christensenら, 1996）と結合するＨ１６．Ｊ４（１：２５００）のいずれかを用いて検出した。両結合部位は、Ｌ２エピトープ挿入によって破壊されない。
【００９１】
メンブレンを、ブロッキングバッファーを用いて４×１５分、洗浄し、ブロッキングバッファーで希釈した二次ヤギ抗マウスアルカリホスファターゼコンジュゲート（１：１００００；Ｓｉｇｍａ）中、室温で２時間インキュベートした。メンブレンを、洗浄バッファー（１×ＰＢＳ、ｐＨ７．６中、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて４×１５分、最後に洗浄し、塩化ニトロブルーテトラゾリウム／５−ブロマ−４−クロロ−３−インドイルホスフェート基質（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質；Ｒｏｃｈｅ）を用いて発色させた。ＧｅｎｅＴｏｏｌｓ（ＳＹＮＧＥＮＥ）を使用する抗Ｌ１ウエスタンブロットで検出されたバンドの密度を測定することによって、キメラ発現を比較した。
【００９２】
捕獲ＥＬＩＳＡによるキメラ定量化
ベンサミアナタバコから抽出したＬ１キメラを、改変ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）ブロッキングＥＬＩＳＡ法（Studentsovら, 2002）を使用する捕獲ＥＬＩＳＡによって定量化した。手短には、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐマイクロタイタープレートを、１：２０００マウス抗ＨＰＶ−１６  Ｌ１  ＭＡｂ（ＣａｍＶｉｒ１またはＨ１６．Ｊ４のいずれか）を用い、４℃で一晩コーティングし、ＰＶＡを用いてブロッキングした。ウェルに植物抽出物を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。これに、洗浄工程およびウサギ抗ＨＰＶ−１６ポリクローナル血清（１：１０００）の添加を続けた。プレートを４℃で一晩インキュベートし、ＨＰＶ−１６  Ｌ１タンパク質を、ブタ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート（１：５０００；ＤＡＫＯ）および１．２−フェニレンジアミンジヒドロクロリド基質（ＯＰＤ；ＤＡＫＯ；Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて検出した。
【００９３】
市販のＨＰＶワクチンＣｅｒｖａｒｉｘを、ポジティブＥＬＩＳＡコントロールとして、およびＨＰＶ−１６  Ｌ１  ＶＬＰ標準として使用した。各サンプルは、トリプリケートにおいて解析し、Ｃｅｒｖａｒｉｘ標準曲線を使用して定量化した。各サンプル中に存在するキメラタンパク質の量（ｍｇ）は、植物組織のキログラムあたりのキメラ（ｍｇ／ｋｇ）として表した。
【００９４】
ウシ血漿γグロビンＩｇＧタンパク質標準（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用し、ローリータンパク質アッセイ（Ｂｉｏｒａｄ  ＤＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ；Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ａｓｓａｙプロトコール）を製造業者の使用説明書のとおりに使用して、各粗葉抽出物の総可溶性タンパク質（ＴＳＰ）を決定した。相対キメラ収率を算出し、これでは、ＥＬＩＳＡによって定量されたキメラタンパク質（ｍｇ）は、葉組織質量およびタンパク質抽出効率の相違を説明するようＴＳＰのパーセンテージとして表した。
【００９５】
キメラ発現収率の統計分析
異なる植物発現ベクターを使用するキメラ発現における統計的有意差を、ＡＮＯＶＡおよびＦｉｓｃｈｅｒ  ＬＳＤ  Ｐｏｓｔ  Ｈｏｃ試験を使用して決定した。有意差は、ｐ＜０．０１で統計的に有意で報告された。
【００９６】
キメラ集合
ＨＰＶタンパク質の高次免疫原性構造への集合を、上記のＨ１６．Ｊ４およびＨ１６．Ｖ５捕獲ＥＬＩＳＡを使用して評価した。Ｈ１６．Ｊ４  ＭＡｂは、アミノ酸２６１−２８０を含むＬ１線形エピトープ（Christensenら, 1996）と結合し、従って、植物抽出物中に存在する総ＨＰＶタンパク質が得られる。Ｈ１６．Ｖ５は、必須アミノ酸２６０−２９０を含み、Ｌ１残基Ｐｈｅ−５０、Ａｌａ−２６６およびＳｅｒ−２８２（Whiteら, 1999）と特異的に結合する立体構造Ｌ１エピトープ（Christensenら, 1996, 2001）と結合し、従って、集合したＨＰＶタンパク質の検出に使用される。異なるベクターを使用して発現されたキメラの集合を比較するために、集合したＨＰＶタンパク質の量を、総ＨＰＶタンパク質のパーセンテージとして表した。
【００９７】
結果
Ｌ１キメラクローンの確認
Ｌ１キメラ（表１）を、ｐＴＲＡｋｃ−ｒｂｃｓ１−ｃＴＰおよびｐＲＩＣ３植物発現ベクターに成功裏にクローニングし、大腸菌およびアグロバクテリウムＧＶ３１０１に形質転換した。
【００９８】
ｐＴＲＡｋｃ−ｒｂｃｓ１−ｃＴＰ組換えクローンを、ＭＣＳの上流および下流と結合するｐＴＲＡｃ特異的プライマーまたは異なるＬ２エピトープと結合するキメラ特異的プライマーを使用するコロニーＰＣＲによってスクリーニングした。すべてのキメラが、表３に予測されるような予想されるサイズの断片を生成した。
【００９９】
クローンを、キメラ遺伝子挿入断片の両側に隣接するＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ  ＲＥ部位を使用する制限酵素（ＲＥ）消化によってさらに確認した。予想されるように、すべてのキメラが、１．５ｋｂの遺伝子挿入断片を含んでいた。クローンを配列決定し、個々のキメラを、ＤＮＡＭＡＮマルチプル配列アラインメントソフトウェアを使用して確認した。
【０１００】
ｐＲＩＣ３組換えクローンを、キメラエピトープ特異的プライマーを使用するコロニーＰＣＲおよびＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ制限酵素消化によって同様に確認した。すべてのキメラが、表３に記載される０．２−０．６ｋｂのキメラ特異的ＰＣＲバンドおよびＲＥ消化において１．５ｋｂの遺伝子断片を生成した。従って、すべてのＨＰＶキメラが、ｐＴＲＡｋｃ−ｒｂｃｓ１−ｃＴＰおよびｐＲＩＣ３植物発現ベクターに成功裏にサブクローニングされた。
【０１０１】
ベンサミアナタバコにおけるＬ１キメラ発現の最適化
ＮＳｓサイレンシングサプレッサーとの共発現
ベンサミアナタバコ葉緑体に標的化されるＨＰＶ−１６  Ｌ１／Ｌ２発現を、浸潤１−９日後（ｄｐｉ）タイムトライアルにおいて調べた。キメラを、ＮＳｓサイレンシングサプレッサータンパク質とともに（＋）またはそれを伴わずに（−）のいずれかで発現させて、キメラ発現に対するその効果を調べた。発現を、抗Ｌ１  ＭＡｂ  ＣａｍＶｉｒ１を使用するウエスタンブロッティングによって分析した。すべてのＬ１／Ｌ２キメラが、予測された〜５６ｋＤａのＬ１バンドを有すると検出されたが（図２）、Ｌ１／Ｌ２（１０８−１２０）は、その他のキメラよりも高く流れた。
【０１０２】
すべてのキメラが、サイレンシングサプレッサータンパク質ＮＳｓと共浸潤される場合に発現の長期間の増大を示し（図２Ａ−Ｄ）、翻訳後遺伝子サイレンシングの防止および植物におけるタンパク質蓄積の増強において有効であったということを示唆する。直線エピトープに特異的なＭＡｂ  Ｈ１６．Ｊ４を使用するＥＬＩＳＡ検出によって、結果が確認され、Ｌ１／Ｌ２収率が最大１６倍増大した（データは示さず）。ＮＳｓを有さないキメラ発現は、１−３ｄｐｉで検出され、３−５ｄｐｉでピークとなったが、ＮＳｓと共発現されたキメラは、３ｄｐｉで検出され、発現は５−７ｄｐｉでピークとなった。５−９ｄｐｉの間に発現がわずかに低減し、これは、発現レベルの緩やかな減少があることを示唆する（ＥＬＩＳＡ結果、データは示さず）。結果として、さらなる実験では、すべてのキメラをＮＳｓと共発現させた。
【０１０３】
Ｌ１／Ｌ２（１７−３６）キメラについて、いくつかの高分子バンドが検出され、これは、葉緑体シグナル配列（ｃＴＰ）が切断されていない可能性があるか、またはキメラがグリコシル化された可能性があると示唆する。しかし、図２Ｃにおいて、その後のウエスタンブロットで解析されたＬ１／Ｌ２（１７−３６）は、これらの高分子量バンドを示さず、これは、タンパク質が部分的に変性されたことを示唆する。
【０１０４】
ＢＰＶ  Ｌ２アミノ酸１−８８エピトープを含むＬ１／Ｌ２キメラは、ＨＰＶ−１６  Ｌ２エピトープを含むキメラと比較して低い発現レベルを有していた。Ｌ１／Ｌ２  ＢＰＶ（１−８８）ウエスタンブロットでのバンドは、その他のキメラ（図２Ａ−Ｃ）に必要な１５分の発色時間と比較して、発色の１６時間後にやっと可視化できた（図２Ｄ）。ＥＬＩＳＡ定量化によって、Ｌ１／Ｌ２  ＢＰＶ（１−８８）は、４０ｍｇ／植物組織１ｋｇの最大収率に達したと推定されたが、その他のＬ１／Ｌ２キメラについては、１０００−４６００ｍｇ／ｋｇの高発現収率が推定された（データは示さず）。さらに、Ｌ１／Ｌ２  ＢＰＶ（１−８８）植物抽出物は、Ｌ１分解と関連する特徴的な〜４５ｋＤａのバンドを含んでおり（図２Ｄ）、これは、Ｌ１／Ｌ２  ＢＰＶ（１−８８）は、この発現系では不安定であるということを示唆する。これらの結果は、種々のタイムトライアルから得られたいくつかのＬ１／Ｌ２  ＢＰＶ（１−８８）ウエスタンブロットによって確認された。
【０１０５】
Ｌ１／Ｌ２キメラ収率に対する葉緑体標的化の効果
葉緑体へのＨＰＶタンパク質の標的化は、植物発現収率を大幅に改善し得る（Macleanら, 2007）。葉緑体標的化の重要性を調べるために、ｐＴＲＡｃ（細胞質標的化）およびｐＴＲＡｋｃ−ｒｂｃｓ１−ｃＴＰ（葉緑体標的化）Ｌ１／Ｌ２キメラ構築物を、３−９ｄｐｉライムトライアルにおいてベンサミアナタバコにｐＢＩＮ−ＮＳｓと共浸潤した。Ｌ１／Ｌ２  ＢＰＶ（１−８８）キメラは、その他のＬ１／Ｌ２キメラと比較した場合にベンサミアナタバコにおいては極めて低い発現しか示さないのでこの研究には含まれなかった。
【０１０６】
ウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡデータは、一貫して、細胞質に標的化されるＬ１／Ｌ２キメラの低い発現を実証し、キメラ３ｄｐｉの最大発現および２０−４５ｍｇ／植物組織１ｋｇの収率（データは示さず）を有していた。細胞質に標的化されるＬ１／Ｌ２（１０８−１２０）、Ｌ１／Ｌ２（５６−８１）およびＬ１／Ｌ２（１７−３６）の発現は、ローディングに先立って３倍希釈され、ポジティブコントロールとして含まれた葉緑体に標的化されるＬ１／Ｌ２（１０８−１２０）キメラと比較して弱く検出された。キメラ収率の比較は、Ｌ１／Ｌ２キメラ発現が、葉緑体に標的化された場合に４０−８０倍増大したことを示す。これらの結果を考慮し、ｐＴＲＡｋｃ−ｒｂｃｓ１−ｃＴＰベクターを使用してさらなるキメラ発現研究を行った。
【０１０７】
自己複製性ｐＲＩＣ３植物発現ベクターを使用する最適化
特に、低発現性Ｌ１／Ｌ２  ＢＰＶ（１−８８）について、キメラ収率を改善しようとして、ＮＳｓの存在下で３−９ｄｐｉタイムトライアルにおいて、植物発現ベクターｐＲＩＣ３（自己複製性細胞質標的化ベクター）をｐＴＲＡｋｃ−ｒｂｃｓ１−ｃＴＰ（非複製性葉緑体標的化ベクター）と比較した。
【０１０８】
両ベクターの最大キメラ収率は、３−５ｄｐｉで得られた。ＨＰＶ−１６  Ｌ２エピトープアミノ酸１０８−１２０、５６−８１および１７−３６を含有する３種のＬ１／Ｌ２キメラは、自己複製性ｐＲＩＣ３ベクターと比較して、葉緑体標的化ｐＴＲＡｋｃ−ｒｂｃｓ−ｃＴＰベクターを使用して良好に発現された。Ｌ１／Ｌ２  ＢＰＶ（１−８８）は、どちらのベクターについても高度に発現されず、両構築物の分解が見られた。
【０１０９】
ＥＬＩＳＡ定量化は、自己複製性ｐＲＩＣ３ベクターが、キメラの大部分について発現収率を改善しなかったことを示す。収率は、ｐＴＲＡｋｃ−ｒｂｃｓ１−ｃＴＰベクターを使用すると最大３倍高く、これは、キメラ高発現では、発現されたタンパク質を最終的に細胞質に標的化するｐＲＩＣ３ベクターよりも葉緑体標的化がより有効であるということを示唆する。Ｌ１／Ｌ２  ＢＰＶ（１−８８）発現レベルは、ＮＳｓネガティブコントロールと同様であり、これは、植物は、Ｌ１／Ｌ２  ＢＰＶ（１−８８）の生産のための実行可能な系ではないということを示唆し、Ｌ１／Ｌ２  ＢＰＶ（１−８８）の発現は、さらに探求されなかった。
【０１１０】
ｐＴＲＡｋｃ−ｒｂｃｓ１−ｃＴＰおよびｐＲＩＣ３ベクターを使用する発現最適化から得られた結果は、表４に要約されている。Ｌ１／Ｌ２（１０８−１２０）、Ｌ１／Ｌ２（５６−８１）およびＬ１／Ｌ２（１７−３６）は、高度に発現された。予備タイムトライアルにおいて発現を最大化することが示されたパラメータは、ＮＳｓとの共発現、５ｄｐｉ抽出および発現されたＬ１／Ｌ２タンパク質を葉緑体に標的化するためのｐＴＲＡｋｃ−ｒｂｃｓ−ｃＴＰベクターの使用である。
【０１１１】
【表４】
2015500229.tif 000006
【０１１２】
Ｌ１／Ｌ２キメラの比較ベクター発現
３種の高発現Ｌ１／Ｌ２キメラを、マウス免疫原性研究のためのワクチン抗原として選択した：Ｌ１／Ｌ２（１０８−１２０）、Ｌ１／Ｌ２（５６−８１）およびＬ１／Ｌ２（１７−３６）。３種の生物学的リピートを含む最終発現研究を実施してＬ１／Ｌ２結果を確認し、統計的に妥当なデータを得た。３種のベクター（ｐＴＲＡｃ、ｐＴＲＡｋｃ−ｒｂｃｓ１−ｃＴＰおよびｐＲＩＣ３）すべてを、各Ｌ１／Ｌ２ワクチン抗原の発現について直接比較し、ＨＰＶ−１６  Ｌ１をポジティブコントロールとして含め（ｐＴＲＡｃおよびｐＴＲＡｋｃ−ｒｂｃｓ１−ｃＴＰ構築物が利用可能であった）、ＮＳｓが浸潤された植物は、ネガティブコントロールとして働いた。キメラをＮＳｓと共発現させ、５ｄｐｉで抽出した。
【０１１３】
植物に対する発現の効果
５ｄｐｉでの抽出の前の浸潤された葉の検査によって、自己複製性ｐＲＩＣ３ベクターは、植物の健康に対して有害作用を有することが示唆された。ｐＲＩＣ３を用いて浸潤された葉は、黄／茶色であり、浸潤された領域で葉組織の壊死が見られた。これは、同様にキメラを植物細胞質に標的化したｐＴＲＡｃ葉では、より少ない程度で観察された。ｐＴＲＡｋｃ−ｒｂｃｓ−ｃＴＰ葉は、最も健康であると思われ、ＮＳｓが浸潤されたネガティブコントロールの葉と浸潤されていない葉は似ており、これは、葉緑体におけるキメラの蓄積が、植物の健康に対してあまり影響を与えないことを示唆する（示されていない結果）。ＮＳｓが浸潤された葉が、浸潤されていない葉と同様に見えたので（シリンジ注射マーキングを除いて）、浸潤は、植物の健康に対して観察可能な効果を有さないと思われる。これらの結果は、すべてのタイムトライアルについて一貫して観察された。
【０１１４】
ＨＰＶタンパク質のウエスタンブロット検出
ＨＰＶタンパク質を、抗Ｌ１ウエスタンブロッティングによって検出した（図３ａ）。ＮＳｓが浸潤された植物抽出物（ネガティブコントロール）は、検出されず、植物によって誘導されたＨＰＶ−１６  Ｌ１（ポジティブコントロール）は、葉緑体に標的化するベクターを使用して検出された。種々のベクターを使用する発現を、最高発現収率を一貫して与えるｐＴＲＡｋｃ−ｒｂｃｓ１−ｃＴＰと、続いて、ｐＲＩＣ３、次いで、ｐＴＲＡｃと直接比較した。
【０１１５】
ＨＰＶタンパク質のＥＬＩＳＡ定量化
捕獲ＥＬＩＳＡを使用し、ＣａｍＶｉｒ１を使用してＨＰＶキメラを定量化した。Ｌ１／Ｌ２キメラおよびＨＰＶ−１６  Ｌ１収率は、図３ｂに示されている。ＡＮＯＶＡおよびＦｉｓｃｈｅｒ  ＬＳＤ  Ｐｏｓｔ  Ｈｏｃ試験を使用して、３種の植物発現ベクターを使用するキメラ発現における統計的有意差を調べた。有意差は、ｐ＜０．０１で統計的に有意で報告された。
【０１１６】
ｐＴＲＡｋｃ−ｒｂｃｓ１−ｃＴＰを使用するＬ１／Ｌ２キメラおよびＨＰＶ−１６  Ｌ１の葉緑体に標的化される発現は、ＮＳｓが浸潤されたネガティブコントロール（ｐ＝０．０００−０．００２）および細胞質に標的化するｐＴＲＡｃベクター（ｐ＝０．０００−０．００４）よりも有意に高い収率をもたらした。さらに、ｐＴＲＡｋｃ−ｒｂｃｓ１−ｃＴＰは、ｐＲＩＣ３と比較してＬ１／Ｌ２（５６−８１）発現を有意に改善した（ｐ＝０．００６）。ｐＲＩＣ３ベクターは、ｐＴＲＡｃと比較していずれのキメラの発現も統計的に改善されなかった。
【０１１７】
最適化実験と比較して（図２、表４）、比較タイムトライアルは、キメラ発現において同様の傾向を実証した。葉緑体に標的化されたＬ１／Ｌ２キメラは、最高の収率をもたらし（１０４０−１３１０ｍｇ／ｋｇ；２−３％  ＴＳＰ）、キメラ発現を、細胞質に標的化するベクターｐＴＲＡｃ（５０−２６０ｍｇ／ｋｇ；＜１％  ＴＳＰ）と比較して最大２８倍、自己複製性ベクターｐＲＩＣ３（１９０−６６０ｍｇ／ｋｇ；＜１％  ＴＳＰ）と比較して最大７倍改善した。
【０１１８】
細胞質に標的化されるキメラ収率は、自己複製性ベクターｐＲＩＣ３を使用すると非複製性ｐＴＲＡｃベクターと比較して最大４倍改善された。これは、ベクターの自己複製がキメラ発現を改善するが、葉緑体への標的化が、植物においてキメラ発現を増大するための優れた戦略であるようであると示唆する。
【０１１９】
葉緑体に標的化されるＨＰＶ−１６  Ｌ１は、より高い平均収率を実証したが（１７１０ｍｇ／ｋｇ、４％  ＴＳＰ）、Ｌ１／Ｌ２キメラとＬ１の間の相違は、統計的に有意ではなく、これは、Ｌ２エピトープ置換は、葉緑体における組換えタンパク質の発現および蓄積に影響を及ぼさないようであることを示す。しかし、ウエスタンブロッティング（３ａ）およびＥＬＩＳＡ発現データ（図３ｂ）は、一貫して、Ｌ１／Ｌ２（５６−８１）よりも、高レベルの細胞質に局在するＬ１／Ｌ２（１０８−１２０）およびＬ１／Ｌ２（１７−３６）を示し、これは、より短いＬ２配列置換を有する（それぞれ、１３および２０個のアミノ酸）Ｌ１／Ｌ２（１０８−１２０）およびＬ１／Ｌ２（１７−３６）キメラは、２６個のアミノ酸配列置換を有するＬ１／Ｌ２（５６−８１）よりも、良好に発現され、より大きな安定性を有し得るということを示唆する。
【０１２０】
ＨＰＶタンパク質の集合
カプソメアまたはＶＬＰなどの高次構造へのキメラ集合を、Ｈ１６．Ｊ４（線形エピトープ特異的ＭＡｂ）およびＨ１６．Ｖ５（立体構造エピトープ特異的ＭＡｂ）捕獲ＥＬＩＳＡを使用して評価した。各ベクター構築物について、Ｖ５によって検出された立体構造ＨＰＶタンパク質の量を、Ｊ４によって検出された総ＨＰＶタンパク質のパーセンテージとしてとして表した（図４）。
【０１２１】
発現されたキメラの低いパーセンテージが、Ｈ１６．Ｖ５によって検出される高次構造に集合された。ネガティブコントロールとして使用されたＮＳｓ植物抽出物は、Ｈ１６．Ｊ４またはＨ１６．Ｖ５  ＭＡｂと結合しなかった（データは示さず）。低発現性ｐＴＲＡｃキメラが、最高割合の集合されたタンパク質を有し（１１−１８％）、高発現性ｐＴＲＡｋｃ−ｒｂｃｓ１−ｃＴＰキメラが続く（５−９％）と思われる。ｐＲＩＣ３キメラは、高パーセンテージの集合されたタンパク質を含まなかった（＜２％）。ｐＴＲＡｋｃ−ｒｂｃｓ１−ｃＴＰキメラは、最高パーセンテージの集合されたタンパク質を含まなかったが、より高い発現収率が、それぞれ、ｐＴＲＡｃおよびｐＲＩＣ３よりも最大４０×および４×多い集合されたタンパク質をもたらす。これは、ｐＴＲＡｋｃ−ｒｂｃｓ１−ｃＴＰが、免疫原性Ｌ１／Ｌ２キメラの生産のために使用する最良のベクターであるというさらなる証拠を提供する。
【０１２２】
考察
植物におけるＬ１キメラ一時的発現の最適化
アグロバクテリウム媒介性の一時的な系を使用して植物において、Ｌ１キメラのすべてが成功裏に発現された（図２）。ＮＳｓサイレンシングサプレッサーの使用、アグロインフィルトレーションによって送達される自己複製性ウイルスベクターの使用および発現されたタンパク質の葉緑体への標的化を含めた、いくつかの方法を使用して植物におけるキメラ発現を最適化した。
【０１２３】
ＮＳｓサイレンシングサプレッサーとの共発現
アグロバクテリウム媒介性の一時的発現は、通常、浸潤後６０−７２時間（〜３日）でピークとなり、次いで、宿主植物において転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）を引き起こした結果として急速に減少する（Voinnet, 2001）。ＰＴＧＳは、外来ＲＮＡ分子が、配列特異的に認識され、分解される適応抗ウイルス植物防御機構である（Meins, 2000;SijenおよびKooter, 2000）。対抗防御戦略として、多数の植物ウイルスは、この機構の種々の工程を抑制する進化したタンパク質を有する（Voinnet, 2001）。ＰＴＧＳ応答は、植物細胞質における導入遺伝子ｍＲＮＡ蓄積を低減し、アグロバクテリウム媒介性の一時的発現の効率を制限するが（de Carvalhoら, 1992;Van Bloklandら, 1994）、ウイルスサイレンシングサプレッサーとのタンパク質の共発現は、ＰＴＧＳ応答を抑制し、高レベルの一時的発現を可能にし、導入遺伝子のより高い収率（場合によっては、５０倍）および長期発現をもたらすことが示されている（Voinnetら, 2003）。
【０１２４】
トマト黄化壊疽病ウイルス（ＴＳＷＶ）サイレンシングサプレッサーＮＳｓとの共浸潤は、ＰＴＧＳを抑制し、一時的発現を増大させる（Takedaら, 2002）。この効果は、Ｌ１／Ｌ２キメラの一時的発現において同様に観察された（図２）。キメラは、通常、ウイルスサイレンシングサプレッサーの不在下では３−５ｄｐｉで最大発現レベルを示した。しかし、ＮＳｓとの共発現は、キメラの発現の長期の増大を示し、それによって発現レベルが、最大１６倍増大し、５−７ｄｐｉでピークとなった。
【０１２５】
自己複製性ＢｅＹＤＶベクターの使用
細胞質ＨＰＶ−１６  Ｌ１収率は、自己複製性ｐＲＩＣベクターを使用することによって５０％改善した（Regnardら, 2010）。結果として、第３世代ｐＲＩＣ３ベクターをキメラ収率を改善するための可能性のある戦略として調べた。３種のＬ１／Ｌ２キメラを調べた：Ｌ１／Ｌ２（１０８−１２０）、Ｌ１／Ｌ２（５６−８１）およびＬ１／Ｌ２（１７−３６）。すべてのキメラが、ｐＲＩＣ３（自己複製性ベクター）を使用すると、ｐＴＲＡｃ（非複製性ベクター）と比較してより高い発現レベルを実証し、これは、導入遺伝子増幅が、植物細胞質におけるＬ１／Ｌ２収率を改善することを示唆する（図３ａおよびｂ）。しかし、葉緑体標的化は、Ｌ１／Ｌ２キメラの高レベル蓄積においてより効率的であり（図３ｂ）、ｐＲＩＣ３が浸潤された葉では、葉組織の眼に見える壊死が観察され、これは、ベクターの自己複製が、植物の健康に負に影響を及ぼすことを示唆する。
【０１２６】
Ｌ１キメラの葉緑体標的化
Ｌ１キメラは、ｐＴＲＡｋｃ−ｒｂｃｓ１−ｃＴＰベクターを使用すると葉緑体に標的化された。葉緑体トランジットペプチド（ｃＴＰ）は、発現されるキメラと融合され、オルガネラへの侵入の際に葉緑体ストロマプロセシングペプチダーゼ（ＳＰＰ）によって切断される（RobinsonおよびEllis, 1984）。葉緑体におけるタンパク質の高レベル蓄積に関与するいくつかの因子がある：（ａ）細胞プロテアーゼからの保護、（ｂ）プラスチドにおける異なるタンパク質加水分解機構および（ｃ）Ｌ１の正しいフォールディングを補助し、従って、タンパク質安定性を改善する保護的プラスミド特異的シャペロン（Fernandez-San Millanら, 2008）。この研究では、葉緑体標的化は高度に有効であり、Ｌ１／Ｌ２キメラ収率を、細胞質に標的化されるキメラと比較して４０−８０倍増大させた（図３ａ）。
【０１２７】
抗Ｌ１ウエスタンブロットにおいて検出された、葉緑体に標的化されたキメラは、〜５６ｋＤａのバンドを生成し（図２）、これは、蓄積されたタンパク質からシグナルペプチドが効率的に除去されたことを示唆する。Ｌ１／Ｌ２（１０８−１２０）は、ウエスタンブロットでその他のキメラよりも高く流れるが（図２）、並行して分析された、ｐＴＲＡｃを用いて発現された細胞質に局在するＬ１／Ｌ２（１０８−１２０）および昆虫細胞によって発現されたＬ１／Ｌ２（１０８−１２０）（データは示さず）が、同様のバンドパターンを示したので、この現象は、シグナルペプチドの不十分な切断によって引き起こされるのではない。
【０１２８】
恐らくは、キメラのグリコシル化または不十分な変性の結果として、Ｌ１／Ｌ２（１７−３６）キメラについて、〜６５ｋＤａのより高分子量が検出された（図２）。ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）において生産されたＨＰＶ−１６  Ｌ１のグリコシル化型が、McLeanら（1990）によって記載されており、それによれば、ＣａｍＶｉｒ１によって、Ｌ１について２つのバンド：５６ｋＤａのＬ１主要バンドおよび〜６４ｋＤａのわずかなバンドが検出された。続いて、Ｎ−グリコシル化阻害剤ツニカマイシンの存在下で感染させた場合には、さらなるバンドは、細胞溶解物から除去された。植物はグリコシル化経路を含むが（Rybicki, 2009）、その後のウエスタンブロットは、単一の〜５６ｋＤａのバンドを示し、これは、最初の実験では、Ｌ１／Ｌ２（１７−３６）キメラが、グリコシル化ではなく部分的に変性されたことを示唆する（図３ａ）。
【０１２９】
植物発現ベクターの直接比較
２つの戦略が、植物によって発現されるＬ１収率を最大５３０−５５０ｍｇ／ｋｇに増大させた（ｉ）タンパク質を葉緑体に標的化すること（Macleanら, 2007）または（ｉｉ）アグロインフィルトレーションによって送達される自己複製性ＢｅＹＤＶ由来発現ベクターの使用（Regnardら, 2010）。これは、Ｌ１ベースのキメラを使用してこれらの戦略を直接比較した最初の研究であった。植物発現ベクターｐＲＩＣ３（自己複製性、細胞質標的化ベクター）を使用するキメラ発現レベルを、ｐＴＲＡｋｃ−ｒｂｃｓ１−ｃＴＰと直接比較した。比較目的でｐＴＲＡｃ（非複製性、細胞質標的化ベクター）を使用する発現を含め、ＨＰＶ−１６  Ｌ１をポジティブコントロールとして使用した（図３ａおよびｂ）。
【０１３０】
葉緑体標的化は、キメラの大部分について最高収率をもたらし（図３ａおよびｂ）、Ｌ１／Ｌ２キメラ発現を、両方とも発現されたタンパク質を細胞質に標的化するｐＲＩＣ３に対して最大７倍、ｐＴＲＡｃに対して２８倍改善した（図３ｂ）。統計分析は、葉緑体に標的化されたＬ１／Ｌ２収率は、細胞質に標的化されたＬ１／Ｌ２収率よりも有意に高い（ｐ＜０．０１）ことを示した。しかし、葉緑体に標的化されたキメラと、自己複製性ｐＲＩＣ３ベクターを使用して発現されたキメラ間の収率の相違は、Ｌ１／Ｌ２（５６−８１）についてのみ有意であった。これらの結果は、ｐＴＲＡｋｃ−ｒｂｃｓ１−ｃＴＰが、ＨＰＶキメラの高レベル生産のために使用する最良のベクターであるという証拠を提供する。
【０１３１】
Ｌ１／Ｌ２キメラの発現
ＨＰＶ−１６  Ｌ２エピトープを含む高度に発現されるＬ１／Ｌ２キメラ
Ｌ１／Ｌ２（１０８−１２０）、Ｌ１／Ｌ２（５６−８１）およびＬ１／Ｌ２（１７−３６）キメラは高度に発現され、収率は、その他のキメラより最大２０倍高かった（表４）。結果として、これらの３種のＬ１／Ｌ２キメラを、マウス免疫原性研究のためのワクチン抗原として選択した。
【０１３２】
葉緑体に標的化されるＬ１／Ｌ２キメラは、一貫して、〜１２００ｍｇ／植物組織１ｋｇ（２−３％  ＴＳＰ）の最高キメラ収率を実証した。ＨＰＶ−１６  Ｌ１は、Ｌ１／Ｌ２キメラよりも高い収率を実証したが、相違は統計的に有意ではなかった（図３ｂ）。これは、Ｌ２エピトープは、葉緑体におけるＨＰＶタンパク質の発現および蓄積に大きく影響を及ぼさないということを示す。さらに、キメラ収率は、アグロバクテリウム媒介性タバコ発現系を使用して生産された、公開されたＨＰＶ−１６  Ｌ１収率よりも〜２倍高く（Macleanら, 2007;Regnardら, 2010）、これらのキメラの生産は、商業的に実行可能である（＞１％  ＴＳＰ;Fischerら, 2004）。
【０１３３】
高次構造への集合は、タンパク質分解に対する低い感受性と関連しており（Chenら, 2000）、Ｌ１／Ｌ２の高蓄積は、集合の結果としてであり得るという仮説を立てた。立体構造特異的Ｈ１６．Ｖ５  ＭＡｂは、集合したタンパク質と結合し（Christensenら, 1996）、これを使用して、高次構造への集合を検出できる（Carterら, 2003;Wangら 2003;Rydingら, 2007）。すべての植物によって発現されたＬ１／Ｌ２キメラおよびＨＰＶ−１６  Ｌ１コントロールは、低割合の集合したタンパク質（＜２０％  ＴＳＰ）を含むと思われ、これは、タンパク質の大部分は、集合していないＬ１モノマーとして存在するということを示唆する。しかし、Ｌ１／Ｌ２（５６−８１）およびＬ１／Ｌ２（１７−３６）キメラは両方とも、Ｈ１６．Ｖ５の結合にとって重要であることが示されているＬ１  Ｃ末端領域アミノ酸４２８−４８３と重複するＬ２配列を含み（Varsaniら, 2006b）、これは、このＭＡｂは、キメラ集合の検出に適していない可能性があり、比較定量化には使用できないことを示唆する。
【０１３４】
ＢＰＶ  Ｌ２アミノ酸１−８８エピトープを有するＬ１／Ｌ２キメラの不安定性
Ｌ１／Ｌ２  ＢＰＶ（１−８８）キメラは、ＨＰＶ−１６  Ｌ２エピトープを含むキメラと比較して低い発現レベルを有していた（図２）。Ｌ１／Ｌ２  ＢＰＶ（１−８８）は、Ｈ１６．Ｊ４  ＭＡｂを用いてプロービングされたウエスタンブロットで検出され、４０ｍｇ／植物組織１ｋｇの低い収率を示したが（図２、示されていないＥＬＩＳＡデータ）、ＥＬＩＳＡ定量化によって推定された発現レベルは、ＮＳｓネガティブコントロールと同様であった。さらに、葉緑体に標的化されたＬ１／Ｌ２  ＢＰＶ（１−８８）は部分分解されたが（図２Ｄ）、これは、いくつかのＨＰＶ  Ｌ１発現研究においてこれまでに記載されている（Hagenseeら, 1993;Sasagawaら, 1995;Liら, 1997;Kohlら, 2007）。
【０１３５】
これらの結果は、Ｌ１／Ｌ２  ＢＰＶ（１−８８）は、十分に発現されず、本植物発現系では安定でもないという証拠を提供する。Ｌ１／Ｌ２  ＢＰＶ（１−８８）キメラは、最大のＬ２配列置換を含み、８８残基のエピトープがＬ１の全Ｃ末端領域を置換した（表１）。ＨＰＶ  Ｌ１  Ｃ末端領域は、ＶＬＰ集合において役割を果たしており（Zhouら, 1991b;Varsaniら, 2006b;Bishopら, 2007）、Ｃ末端領域の欠失は、分解に対して感受性がより低い高次構造への集合を妨げる（Chenら, 2000）。Ｌ１  Ｃ末端領域の、外来エピトープ配列での配列置換は、ＨＰＶキメラ発現のための有効な戦略ではなく、植物は、Ｌ１／Ｌ２  ＢＰＶ（１−８８）発現にとって実行可能な系ではない。
【０１３６】
実施例２：ＨＰＶ抗原の精製および集合
方法および材料
抗原の大規模一時的発現および抽出
ベンサミアナタバコ植物（２−４週齢）を、Macleanら（2007）によって記載されるようにＮＳｓサイレンシングサプレッサータンパク質をコードするＡ．ツメファシエンスＬＢＡ４４０４（ｐＢＩＮ−ＮＳｓ）およびＨＰＶ−１６  Ｌ１またはＬ１／Ｌ２キメラをコードするアグロバクテリウムＧＶ３１０１株を用いて真空浸潤した。植物を２２℃、１６時間明、８時間暗で５日間成長させた。
【０１３７】
浸潤された葉を採取し、秤量し、乳鉢および乳棒を使用して液体窒素中で砕いた。０．５Ｍ  ＮａＣｌおよびプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ  完全ＥＤＴＡ不含）を含むＰＢＳ抽出バッファーを、１：４（ｗ／ｖ）の比で添加し、サンプルを氷上、ワーリングブレンダー中で１０分間ホモジナイズした。ホモジネートを、氷上で２０秒の間隔で６回の超音波処理および静置で超音波処理し（マクロチップ超音波処理；レベル８；Ｈｅａｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ−Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ，  Ｉｎｃ．  Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ  モデル  Ｗ−２２５  Ｒ）、溶解物をＭｉｒａｃｌｏｔｈ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）の二重層を通して濾過した。粗抽出物を１３，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって２回浄化した。ペレットを１ｍｌ  ＰＢＳに再懸濁し、−７０℃で保存した。上清およびペレットをウエスタンブロッティングによって調べて、ＨＰＶ抗原の上清への局在性をチェックした。
【０１３８】
ＨＰＶ抗原のパイロット精製
植物によって発現されたＬ１ワクチン抗原の精製のために、いくつかの方法を調べた。クロスフロー精密濾過ならびにスクロースおよび塩化セシウム密度勾配を使用する超遠心などのサイズに基づく方法、ならびにＬ１およびＬ１ベースのキメラの迅速精製のための、一段階陽イオン交換およびヘパリンクロマトグラフィーを試験した。０．５Ｍ  ＮａＣｌを含むＰＢＳで抽出されたＬ１タンパク質を、クロマトグラフィーに先立って低塩ＰＢＳ（ＬＳ  ＰＢＳ：１０ｍＭ  ＮａＣｌ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で１０×希釈して、カラムとのＬ１結合を可能にした。マウス免疫原性研究における下流適用のために、限外濾過を利用して、抗原を濃縮し、クロマトグラフィー画分を脱塩した。
【０１３９】
全体に、ヘパリンクロマトグラフィーを使用する精製およびＭａｃｒｏｓｅｐ（登録商標）限外濾過スピンチューブを使用するダイアフィルトレーションが、部分精製されたＬ１およびＬ１ベースのキメラを得るための最良の戦略であり、その後のマウス免疫学的実験に向けてワクチン抗原を調製するためにこれらの方法を使用した。
【０１４０】
ワクチン抗原の精製
サンプル調製
ベンサミアナタバコにおいてＨＰＶ−１６  Ｌ１およびＬ１ベースのキメラを発現させ、抽出バッファーとしてＬＳ  ＰＢＳを使用して実施例１において上記のように抽出した。Ｌ１／Ｌ２（１０８−１２０）、Ｌ１／Ｌ２（５６−８１）、Ｌ１／Ｌ２（１７−３６）、ＨＰＶ−１６  Ｌ１およびＮＳｓが浸潤された植物抽出物の二重浄化した粗上清（それぞれ、ワクチン１−５）を、クロマトグラフィーに先立って０．２２μｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターを通して濾過して、あらゆる細片を除去した。
【０１４１】
ヘパリンクロマトグラフィー
ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  １０を使用してクロマトグラフィーを実施した。手順は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅカラム使用説明書マニュアルにおいて推奨されるとおりにたどり、０．５ｍｌ／分の流速を維持した。カラムを、１０カラム容量（ｃｖ）の低塩洗浄バッファー（ＬＳ  ＰＢＳ：１０ｍＭ  ＮａＣｌ  ＰＢＳ）を用いて平衡化し、その後、サンプルをロードした。予めパッケージングされた１ｍｌのＨｉＴｒａｐヘパリン陽イオン交換カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ，  Ｓｗｅｄｅｎ）に粗抽出物（１０−２０ｍｌ）をロードし、１０ｃｖのＬＳ  ＰＢＳ洗浄バッファーを用いてカラムを洗浄した。１０ｃｖの０−１００％の、１．５Ｍ  ＮａＣｌを含む高塩ＰＢＳ（ＨＳ  ＰＢＳ）溶出バッファーがカラムに適用される直線イオン強度勾配を使用するパイロット実験において、各ＨＰＶ抗原の溶出プロフィールを最適化した。ひとたび、＜５０％  ＨＳ  ＰＢＳがカラムに適用された時点で、すべての抗原が溶出したことが確立されると、ワクチン抗原の精製に５０％段階溶出勾配（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ）を適用した。段階溶出勾配は、１０ｃｖの５０％  ＨＳ  ＰＢＳと、それに続く、１０ｃｖの１００％  ＨＳ  ＰＢＳとした。カラムを、５ｃｖの蒸留水および５ｃｖの２０％エタノールを用いて最後に洗浄した。画分（１ｍｌ）を集め、ウエスタンドットブロットによって分析した。
【０１４２】
精製されたＨＰＶ抗原のウエスタンドットブロット検出
ドットブロットは、実施例１において上記のように実施した。ＣａｍＶｉｒ１（１：１００００）を使用して、Ｌ１を検出し、Ｃｅｒｖａｒｉｘをポジティブコントロールとして使用した。高濃度の精製抗原を含む溶出画分をプールし、−７０℃で保存した。ＮＳｓが浸潤された植物抽出物（Ｖ５：ネガティブコントロール）について、溶出タンパク質ピークに対応した画分をプールし、Ｌ１ポジティブコントロールワクチン（Ｖ４）ドットブロットで試験して、Ｌ１を含まないことを確認した。
【０１４３】
限外濾過による精製抗原サンプルの脱塩
５０％  ＨＳ  ＰＢＳ溶出バッファー（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ）中の精製抗原を、マウスワクチン接種に先立って脱塩した。１０ｋＤａ  ＭＷＣＯフィルター（Ｍａｃｒｏｓｅｐ（登録商標）Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  １０Ｋ  Ｏｍｅｇａ，  ＰＡＬＬ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を備えた限外濾過スピンチューブを使用してサンプルを７０００ｇで１５−３０分間遠心分離することによって、精製Ｌ１画分を迅速に濃縮、脱塩した。Ｌ１抗原を含む保持液をＬＳ  ＰＢＳで希釈し、サンプルが市販のＰＢＳに見られるものと同様のＮａＣｌ濃度（〜０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）を含むまで、限外濾過によって製造業者の使用説明書のとおりに数回再濃縮した。保持液および濾液画分の両方を調べた。
【０１４４】
抗原純度の分析
精製を評価するためのＨＰＶ抗原のクマシー染色およびウエスタンブロット検出
各ワクチン抗原の粗抽出物および精製サンプルを、クマシー染色およびウエスタンブロット解析によって比較した。サンプルを上記の実施例１に記載のとおりに調製し、２つの１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質ゲルに等容量をロードした。一方のゲルは、クマシー溶液を用い、室温で一晩染色し、３７℃で２×２時間脱染した。もう一方のゲルは、ニトロセルロースメンブレンにブロットし、ＣａｍＶｉｒ１を用いてプロービングした。
【０１４５】
総可溶性タンパク質定量化
ネガティブコントロールワクチン（Ｖ５：ＮＳｓが浸潤された植物抽出物）は、抗Ｌ１ウエスタンブロッティングによって定量化できなかった。結果として、Ｂｉｏｒａｄローリータンパク質アッセイを使用して（先に実施例１において記載された）各ワクチン抗原の総可溶性タンパク質（ＴＳＰ）の量を決定して、ＴＳＰがすべてのワクチンについて同様であることを確認した。
【０１４６】
ＴＳＰに対する抗原の濃縮を調べるための捕獲ＥＬＩＳＡによるＨＰＶ抗原の検出
線形エピトープ特異的モノクローナル抗体（ＭＡｂ）Ｈ１６．Ｊ４を使用して、捕獲ＥＬＩＳＡを実施例１に記載のとおりに実施した。粗サンプルおよび精製サンプルの両方において、ＥＬＩＳＡによって決定されたＨＰＶ抗原収率を、対応するＴＳＰ収率と比較して、抗原濃縮を調べた。
【０１４７】
精製ワクチン抗原のウエスタンブロット定量化
ワクチンＣｅｒｖａｒｉｘ（４０μｇ／ｍｌの昆虫細胞によって生産されたＨＰＶ−１６  Ｌ１を含有する）の希釈系列を使用して、植物によって生産されたＨＰＶ抗原（Ｖ１−４）を定量化した。抗原のいくつかの希釈物を分析して、標準曲線の直線範囲内に生じる定量化を確実にした。等容積の精製抗原およびＣｅｒｖａｒｉｘ希釈物を、１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードし、タンパク質をニトロセルロースメンブレンにブロットし、ＣａｍＶｉｒ１（１：１００００）を用いてＨＰＶ抗原を検出した。
【０１４８】
デンシトメトリー（ＧｅｎｅＴｏｏｌｓ，  Ｓｙｎｇｅｎｅ，  Ｓｙｎｏｐｔｉｃｓ  Ｌｔｄ）を使用して、抗原を定量化し（Airesら, 2006;Bazanら, 2009によって行われたように）、Ｃｅｒｖａｒｉｘ希釈系列によって作成された標準曲線を使用してサンプル中に存在するＨＰＶタンパク質の量を調べた。定量されたＨＰＶ抗原を、−７０℃で保存した。
【０１４９】
抗原の細胞質発現および抽出
キメラＨＰＶ  Ｌ１／Ｌ２タンパク質が、葉緑体とは対照的に細胞質に標的化される場合に、小さいウイルス様粒子も形成されるかどうかを確立するために、ベンサミアナタバコ植物を、サイレンシングサプレッサーＮＳｓと一緒にｐＲＩＣ  Ｌ１／Ｌ２（１０８−１２０）；Ｌ１／Ｌ２（５６−８１）およびＬ１／Ｌ２（１７−３６）を有する組換えアグロバクテリウムを用い、上記の方法を使用して浸潤した。３−５日後、浸潤された葉を採取し、挽き砕き、遠心分離によって細胞細片を除去した。
【０１５０】
透過型電子顕微鏡による構造解析
精製ワクチン抗原のアリコートを、マウスワクチン接種のために調製されているかのように前処理した。抗原を４℃で一晩解凍し、必要な濃度にＰＢＳに再懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートした。
【０１５１】
精製の効果を調べるために、各抗原の、前処理された精製抗原および粗植物抽出物をＰＢＳで１０×希釈し、ＣａｍＶｉｒ１（１：１０００）、Ｌ１モノマーおよび集合したＬ１タンパク質の両方と結合する線形エピトープ特異的ＨＰＶ−１６  Ｌ１抗体を使用して免疫捕捉し（McLeanら, 1990）、グロー放電炭素コーティング銅グリッドで捕獲した。２％酢酸ウラニルを用いてタンパク質をネガティブ染色し、Ｚｅｉｓｓ  ９１２  Ｏｍｅｇａ  Ｃｒｙｏ  ＥＦＴＥＭで観察した。
【０１５２】
結果
植物によって発現されたＨＰＶ抗原の精製
浄化された抽出物中のＨＰＶ抗原の検出
Ｌ１およびＬ１／Ｌ２キメラの浄化上清への局在がウエスタンブロット解析によって確認された。クマシー染色されたタンパク質ゲルは、上清中のＲｕｂｉｓｃｏの多量の存在およびペレット中に存在するいくつかの夾雑タンパク質の除去を示した（データは示さず）。
【０１５３】
ＨＰＶ抗原のパイロット精製
Ｌ１／Ｌ２キメラは、Ｌ１とは対照的に種々の構造に集合するようであるので、サイズに基づく技術を使用する精製は、大部分は不成功であり、ワクチン抗原間で再現性がない。さらに、タンパク質分解が検出され、従って、代替法としてクロマトグラフィーを使用する精製を調べた。
【０１５４】
ＳＰＦＦまたはＰＯＲＯＳ  ５０ＨＳカラムを使用する陽イオン交換クロマトグラフィーは、Ｌ１ベースのキメラの精製においては不成功であったが、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーは、すべてのワクチン抗原を精製した。クロスフロー濾過または遠心分離スピンカラムのいずれかによる２つの限外濾過ベースの方法を使用して、クロマトグラフィー画分中の塩の濃縮および除去を調べた。クロスフロー限外濾過は有効であったが、この方法は、時間に関してコストがかかり、相当なタンパク質分解が検出され、その結果、スピンカラムが優先的に使用された。従って、ヘパリンクロマトグラフィーおよび遠心分離限外濾過は、その後のマウス免疫学的実験に向けてワクチン抗原を精製するための最良の戦略と考えられた。
【０１５５】
ヘパリンクロマトグラフィーを使用する精製
ワクチン抗原を、ＨＰＶ抗原の溶出のために高ＮａＣｌ勾配を使用するヘパリンクロマトグラフィーによって、浄化した粗植物上清から精製した。段階溶出勾配は、直線０−１００％  １．５Ｍ  ＮａＣｌ勾配を使用して各ＨＰＶ抗原のために最適化した。すべてのＨＰＶ抗原は、０．４５−０．７５Ｍ  ＮａＣｌの間で溶出した（データは示さず）。結果として、マウス免疫原性研究に向けて、５０％（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ）段階勾配を使用して、ワクチン抗原を精製した。溶出液画分中の精製ＨＰＶ抗原の検出を、ＣａｍＶｉｒ１ドットブロットを使用して調べた。
【０１５６】
ＨＳ  ＰＢＳ溶出バッファーがカラムに適用され、これらの画分が、精製ＨＰＶ抗原を含んでいた場合に、吸光度ピークが検出された。ＮＳｓが浸潤された植物抽出物（ネガティブコントロール）のグラフを含めたその他のワクチン抗原のクロマトグラムは、同様であった。これは、ＨＰＶ抗原は、他の夾雑植物タンパク質と共精製されたことを示す。
【０１５７】
部分精製されたＨＰＶ抗原（またはネガティブコントロールのために共溶出される植物タンパク質）を含む画分をプールし、次いで、限外濾過スピンカラムを使用して脱塩した。ウエスタンドットブロットは、ＨＰＶ抗原が成功裏に保持され、濃縮されたことを示した（データは示さず）。
【０１５８】
ワクチン抗原の純度
精製サンプルを粗植物抽出物と比較することによってワクチン抗原の純度を調べた。これは、サンプル中に存在する総タンパク質を示すためにクマシー染色を（図５Ａ）、ＨＰＶ抗原を検出し、抗原収率の減少を示すためにウエスタンブロット解析を（図５Ｂ）使用して行った。Ｌ１／Ｌ２（１０８−１２０）キメラ（Ｖ１）は、その他のＬ１／Ｌ２キメラ（Ｖ２−３）およびＬ１コントロール（Ｖ４）よりも高く流れることは留意されたい。
【０１５９】
図５は、精製サンプルが、精製手順の結果としてＬ１について富化されたことを示す。クマシー染色されたゲルは、精製サンプル中の総タンパク質の大きな減少を示し、一方で、ウエスタンブロット結果は、精製後の抗原収率においてわずかな減少のみがあることを示す。ネガティブコントロール（Ｖ５：ＮＳｓが浸潤された植物抽出物）では、Ｌ１抗原は検出されなかった。
【０１６０】
精製抗原Ｖ１およびＶ３（Ｖ２およびＶ４よりも濃縮された）について、図５Ａにおいてさらなるクマシー染色されたタンパク質バンドが検出され、従って、これが、精製サンプルは、いくつかの夾雑植物タンパク質を含むということを実証するので、サンプルは部分精製されただけであった。また、ＮＳｓネガティブコントロール（Ｖ５）は、ウエスタンブロットでは検出されなかったが、精製ＮＳｓサンプルにおいて、いくつかの同様のクマシーバンドは見られた。
【０１６１】
精製サンプル中のＨＰＶ抗原の富化
（ａ）ＮＳｓネガティブコントロール（ＨＰＶ抗原と共精製された植物タンパク質を含有する）のＴＳＰが、その他のワクチン抗原と比較して同様であったことを確実にするために、（ｂ）精製後のＨＰＶ抗原富化を調べるために精製抗原のＴＳＰを決定した。精製ＨＰＶワクチン抗原（Ｖ１−４）のＴＳＰは、同様であったが、ＮＳｓ植物抽出物ネガティブコントロール（Ｖ５）のＴＳＰは、恐らくは、より多い溶出液画分がプールされたことまたはより大きな限外濾過濃縮（データは示さず）の結果として、ほぼ２倍高かった。結果として、１×ＰＢＳでそれに応じて希釈された。
【０１６２】
線形特異的Ｈ１６．Ｊ４  ＭＡｂを使用する捕獲ＥＬＩＳＡを使用して、粗サンプルおよび精製サンプル中に存在するＨＰＶ抗原の量を推定した。ＴＳＰおよびＨＰＶ抗原の富化に対する精製の効果を調べるために、粗サンプルおよび精製サンプル両方について、Ｈ１６．Ｊ４によって検出されたＨＰＶ収率をＴＳＰ収率と直接比較した（図６）。
【０１６３】
図６は、予想されたように、植物抽出物の精製が、ＴＳＰおよび総ＨＰＶタンパク質の両方を減少させることを実証する。しかし、ＴＳＰに対して、精製サンプル（Ｖ１−４）ではＨＰＶ抗原の最大５倍の富化があり、これは、ヘパリンクロマトグラフィーは、夾雑タンパク質の大きな割合を除去することにおいて有効であることを示唆する。ＮＳｓが浸潤された植物抽出物（Ｖ５）は、精製を用いた場合にＴＳＰの同様の低減を示し、「精製された」ネガティブコントロール中のＴＳＰの量は、ＨＰＶワクチン抗原について得られたレベル内にある（Ｖ１−４）。
【０１６４】
精製ＨＰＶ抗原のウエスタンブロット定量化
ＨＰＶ抗原は、デンシトメトリーおよび市販のワクチンＣｅｒｖａｒｉｘを標準として使用してウエスタンブロッティングによって定量化した（データは示さず）。精製抗原バッチの一部において、特に、何回かの凍結−解凍サイクルの後に、〜４５ｋＤａのバンドとして見ることができる、いくらかのＬ１タンパク質分解が検出された。しかし、マウス免疫原性研究に向けて調製されたサンプルでは、全長５６ｋＤａ  Ｌ１バンドのみを定量化した。
【０１６５】
精製ワクチン抗原の構造分析
粗サンプルおよび精製サンプルの両方において植物の葉緑体（choloroplasts）において生産されたＬ１およびＬ１／Ｌ２キメラの構造的集合物を免疫捕獲透過型電子顕微鏡によって分析した（図７）。粗サンプルから、細胞質において生産されたＬ１／Ｌ２キメラの構造的集合物を、免疫捕獲透過型電子顕微鏡によって分析した（図８）。抗原精製は、特に、Ｌ１／Ｌ２（１０８−１２０）およびネガティブコントロール（それぞれ、図７ＡおよびＥ）について夾雑バックグラウンドタンパク質の除去をもたらした。ネガティブコントロール（ＮＳｓが浸潤された植物抽出物）と比較して、すべてのＨＰＶ抗原は、二次ＨＰＶ構造、カプソメア（〜１０ｎｍ）、カプソメア凝集物、小さいＶＬＰ（〜３０ｎｍ）またはフルサイズのＶＬＰ（５５ｎｍ）のいずれかを含むようであった。
【０１６６】
精製Ｌ１／Ｌ２（１０８−１２０）は、形は定型であるが、サイズ（〜３０ｎｍ）が変わる小さいキメラＶＬＰ（ｃＶＬＰ）に集合したのに対し、Ｌ１／Ｌ２（５６−８１）は、ＶＬＰ様構造が、粗抽出物において見られたが、カプソメアおよびいくらかの凝集物のみを含むと思われた。精製Ｌ１／Ｌ２（１７−３６）は、無定形ｃＶＬＰおよび粗抽出物と対照的に高い割合のカプソメア凝集物の混合集団を含んでおり、これは、精製が、高次構造の形成を促進したことを示唆する。精製Ｖ４、ＨＰＶ−Ｌ１ポジティブコントロールは、これまでの研究に記載されたとおり、特徴的なＶＬＰ（〜５０ｎｍ）に集合した（Biemeltら, 2003;Macleanら, 2007）。
【０１６７】
考察
Ｌ１の安定性は、複数の精製工程によって負に影響を受けるが、ストリンジェント精製は、ワクチンの商業的生産にとって必要である。ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーが、集合されたＬ１を選択的に精製するために利用され得、一段階クロマトグラフィー法を使用する精製戦略が、ＨＰＶワクチンの迅速な費用効率の高い生産にとって理想的であろう。この研究は、マウスにおけるその後の免疫原性研究に向けた、植物によって発現されたＨＰＶ−１６  Ｌ１および３種のＬ１／Ｌ２キメラのヘパリンクロマトグラフィーを使用する精製を報告する。
【０１６８】
Ｌ１／Ｌ２キメラ精製の最適化
ＨＰＶ−１６  Ｌ１およびＬ１ベースのキメラは、粗抽出物上清に局在しており、種々の方法を使用して精製した。サイズに依存する精製方法を使用して、植物によって発現されたＨＰＶ  Ｌ１を精製したが（Biemeltら, 2003;Macleanら, 2007;Fernandez-San Millanら, 2008）、これらの方法は、Ｌ１／Ｌ２キメラ精製には効果的ではなく、抗原間で再現性がなかった。Ｌ１ベースのキメラは、スクロースおよびＣｓＣｌ密度勾配超遠心の両方を使用して、いくつかの画分において広く検出され、これは、Ｌ１／Ｌ２キメラが、カプソメア、凝集物およびＶＬＰなどの異種高次構造に集合したことを示す。さらに、集合の程度は、キメラおよびＬ１ポジティブコントロールの間で異なると思われた。これは、透過型電子顕微鏡によって確認され（図７）、これは、種々のＬ１／Ｌ２キメラとＬ１コントロール間の個別の相違を示した。
【０１６９】
表面電荷に基づいた、またはプロテオグリカンヘパリンに対する親和性のいずれかによるクロマトグラフィーは、ＨＰＶ  Ｌ１を選択的に精製するための次の戦略であった。酵母によって発現されたＨＰＶ  Ｌ１の精製のための陽イオン交換クロマトグラフィーの使用は、Ｐ−１１ホスホセルロース（Kimら, 2009, 2010）またはＰＯＲＯＳ  ５０ＨＳカラム（Cookら, 1999）を使用して実証されている。対照的に、植物によって発現されたＬ１／Ｌ２キメラは、強力な陽イオン交換ＨｉＴｒａｐ  ＳＰＦＦカラムまたはＰＯＲＯＳ  ５０ＨＳカラムのいずれを使用しても効率的に精製されなかった。Ｌ１／Ｌ２タンパク質の大部分は、いずれのカラムとも結合しなかったが、小さい割合のタンパク質が、ＰＯＲＯＳ  ５０ＨＳ樹脂と強力に、不可逆的に結合した。この現象は、Cookら（1999）によって記載されており、それによって、ＨＰＶ−１１  Ｌ１の１０％が樹脂と結合せず、０．５Ｍ  ＮａＯＨを使用してＰＯＲＯＳ  ５０ＨＳカラムをストリッピングせずには４５−６５％を回収できなかった。
【０１７０】
結果として、Ｌ１／Ｌ２キメラの不十分な精製の理由は、明らかではないが、陽イオン交換クロマトグラフィーは、さらに探求されなかった。正に帯電した残基を含む、２つのＨＰＶ−１６  Ｌ１塩基性Ｃ末端領域：アミノ酸４７３−４８８および４９２−５０５がある（Zhouら, 1991b;Sunら, 1995, 2010）。Ｌ２配列挿入は、Ｌ１のＣ末端中の主要な塩基性領域と重複せず、アミノ酸４１４−４３９の最大２６残基を置換した。可能性ある説明は、挿入されたＬ２エピトープのアミノ酸組成によってか、またはタンパク質集合の相違によって、Ｌ１の全体表面電荷が影響を受けたということである。さらに、粗植物抽出物は、カラムとより強力に結合し、ＨＰＶ  Ｌ１結合を打ち破ったいくつかの夾雑タンパク質を含んでいた可能性がある。
【０１７１】
ワクチン抗原の精製
その後のマウスにおける免疫原性研究に向けて、ヘパリンクロマトグラフィーを使用してワクチン抗原を精製した（Joyceら, 1999によって記載された;Bazanら, 2009;Johnsonら, 2009;Kimら, 2009, 2010）。ヘパリンは、Ｌ１およびＬ１／Ｌ２キメラの両方と、同様の方法で可逆的に結合し（データは示さず）、すべての抗原が０．７５Ｍ  ＮａＣｌを用いて溶出した。これは、ヘパリンによって結合されたＨＰＶ−１６  Ｌ１が、０．５−１．２Ｍ  ＮａＣｌの間で溶出した他の研究と比較できる（Bazanら, 2009;Kimら, 2010;Baekら, 2011）。
【０１７２】
ヘパリンは、Ｌ１のＣ末端には存在しない立体構造モチーフとの結合によって、集合したＬ１タンパク質を選択的に精製し（Fleuryら, 2009）、Ｌ２配列置換によって影響されない。変性したＬ１は、中和抗体の生産を引き起こさないので（Kirnbauerら, 1992;Suzichら, 1995;Breitburdら, 1995）、これは、ワクチン生産にとって特に有益である。さらに、Kimら（2010）は、ヘパリンクロマトグラフィーを使用するＨＰＶ−１６  Ｌ１の精製は、高い回収率をもたらし（〜６０％）、免疫原性ＶＬＰを生産する（直径２５−６５ｎｍ）ことを実証した。
【０１７３】
ヘパリン精製されたサンプルの純度を、クマシー染色およびＣａｍＶｉｒ１を使用するＬ１のウエスタンブロット検出によって調べた（図５）。精製されたサンプルは、粗サンプルに対して比較すると、総タンパク質の相当な減少および抗原収率の比較的小さい減少があったので、Ｌ１またはＬ１／Ｌ２キメラについて富化された。これは、Ｈ１６．Ｊ４捕獲ＥＬＩＳＡおよびＴＳＰアッセイによって確認された（図６）。
【０１７４】
サンプルは部分精製され、精製されたネガティブコントロール中にも存在する（Ｖ５、図５Ａ）、いくつかの夾雑植物タンパク質を含んでいた（Ｖ１およびＶ２、図５Ａ）。夾雑物はまた、ヘパリンクロマトグラフィーを使用する酵母によって発現されたＨＰＶ−１６  Ｌ１の精製においても観察された（Kimら, 2010）。結果として、ヘパリンクロマトグラフィーを使用する一段階法は、高度に精製されたＨＰＶ  Ｌ１およびＬ１／Ｌ２キメラを得るには十分ではない。Kimら（2010）は、共精製された酵母に由来する夾雑タンパク質は、追加の陽イオン交換および疎水性相互作用クロマトグラフィー工程によって完全に除去されなかったということを実証し、これは、夾雑物の多くが、Ｌ１と同様の等電点および疎水性プロフィールを有することを示唆する。さらに、追加のクロマトグラフィー工程は、Ｌ１回収を〜１０％に減少させた。しかし、純粋なＨＰＶ−１６  Ｌ１は、ヘパリンクロマトグラフィーに先立つ、酵母によって発現されたＨＰＶ−１６  Ｌ１の硫酸アンモニウム沈殿、植物によって発現されたＨＰＶ  Ｌ１ベースのタンパク質を使用するさらなる精製研究において調べられなくてはならない方法によって得られた。
【０１７５】
抗原のウエスタンブロット定量化
精製された抗原を、デンシトメトリーを使用するウエスタンブロット解析（Heidebrechtら, 2009によって論じられた）によって定量化し、ＣａｍＶｉｒ１によって検出されたＬ１バンドおよびＨＰＶ−１６  Ｌ１標準としての市販のワクチンＣｅｒｖａｒｉｘの強度を測定した（データは示さず）。
【０１７６】
精製された抗原のバッチの一部において、特に、数回の凍結−解凍サイクル後に、Ｌ１分解が検出された。これは、高濃度のＶ１、Ｖ２およびＶ４で見られた。しかし、抗原タンパク質の大部分は、分解されず、フルサイズの５６ｋＤａのＬ１バンドのみを定量化して、マウスが同様の用量の全長抗原を用いて免疫処置されるのを確実にした。他のグループは、昆虫細胞（Kirnbauerら, 1992）、酵母（Cookら, 1999）および細菌（Zhangら, 1998）において発現された場合の同様のＨＰＶ−１６  Ｌ１分解パターンを報告した。さらなる精製研究のための検討事項として、抽出およびダイアフィルトレーションバッファーの塩濃度があるが、これは、低塩条件ではＶＬＰ解体が起こるからである（Murataら, 2009）。塩濃度を０．５または１Ｍ  ＮａＣｌに高めることは、ＶＬＰを安定化し得（Machら, 2006）、精製されたサンプルにおいて観察された分解を減少させ得る。
【０１７７】
ワクチン抗原の集合
植物細胞の葉緑体において生産された植物に由来するＨＰＶ−１６  Ｌ１およびＬ１／Ｌ２キメラの集合を、免疫捕獲電子顕微鏡を使用して分析した（図７）。精製は、一部のバックグラウンドタンパク質を除去すると思われ、すべての植物によって発現されたＬ１／Ｌ２キメラおよびＬ１ポジティブコントロールは、カプソメア、凝集物およびＶＬＰなどの高次構造に集合した。
【０１７８】
植物によって発現されたＨＰＶ−１６  Ｌ１  ＶＬＰは、タバコ葉緑体に局在している場合には、通常、直径〜５５ｎｍであった（Macleanら, 2007;Fernandez-San Millanら, 2008;Lenziら, 2008）。この研究では、ＨＰＶ−１６  Ｌ１は、フルサイズのＶＬＰ（〜５０ｎｍ、図７  Ｄｉｉ）に集合した。
【０１７９】
キメラのＶＬＰへの集合は、Ｌ２エピトープの長さによって影響を受けるようであり、Ｌ１／Ｌ２（１０８−１２０）、Ｌ１／Ｌ２（１７−３６）およびＬ１／Ｌ２（５６−８１）はそれぞれ、１３、２０および２６残基のエピトープ置換を含んでいた。植物によって発現された、最も短いＬ２エピトープを有するＬ１／Ｌ２（１０８−１２０）は、Ｌ１  ＶＬＰよりも小さい、直径〜３０ｎｍの個別のｃＶＬＰに成功裏に集合した（Chenら, 2000）図７Ａ)。対照的に、Ｌ１／Ｌ２（１７−３６）は、カプソメア凝集物を主に形成したが、より大きな無定形ＶＬＰ様構造の存在は、小さいｃＶＬＰの部分集合があり得るということを示唆する（図７Ｃ）。最後に、最も長いＬ２エピトープを有するＬ１／Ｌ２（５６−８１）は、主にカプソメアに集合した（図７Ｂ）。
【０１８０】
Ｌ１／Ｌ２（１０８−１２０）はまた、昆虫細胞
においても発現されており、ＣｓＣｌによって精製されたキメラは、直径〜３０ｎｍの個別のｃＶＬＰではなく、無定形ＶＬＰおよびカプソメア凝集物に集合することが示された（Varsaniら, 2003a）。
【０１８１】
ｐＲＩＣ発現ベクターを使用する植物の浸潤の結果として、細胞質に標的化されるキメラは、検出可能なＬ１／Ｌ２（５６−８１）ＶＬＰの形成をもたらした（図８）。これは、本明細書に記載されたキメラＶＬＰはまた、植物の細胞質においても形成され得ることを示す。
【０１８２】
実施例３：Ｌ１／Ｌ２キメラの免疫原性
この研究では、マウスを、植物由来のＬ１および交差中和性Ｌ２エピトープアミノ酸１０８−１２０、５６−８１および１７−３６を含む３種のＬ１／Ｌ２キメラ候補ワクチンを用いて免疫処置した。キメラの免疫原性を、キメラ集合に関して分析し、相同ＨＰＶ−１６および異種ＨＰＶ−１８、４５および５２ＰｓＶｓに対する抗Ｌ１、抗Ｌ２および保護的ＮＡｂを引き起こすその能力を調査した。
【０１８３】
方法および材料
マウスの免疫処置
Ｓｏｕｔｈ  Ａｆｒｉｃａｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｅｒｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｕｎｉｔ（Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ，  Ｓｏｕｔｈ  Ａｆｒｉｃａ）から得た雌のＣ５７／ＢＬ６マウスを、ケープタウン大学、健康科学学部（Health Science Faculty, University of Cape Town）における動物ユニット（Animal Unit）中で、Ｂｉｏｓａｆｔｙ  Ｌｅｖｅｌ  ２（ＢＳＬ−２）条件下で維持した。この研究の許可は、研究倫理委員会、ケープタウン大学（Research Ethics Committee, University of Cape Town）によって与えられた（ＡＥＣ  ００８／０３７）。
【０１８４】
マウス（７−８週齢）を免疫処置して、植物由来のＨＰＶ−１６  Ｌ１／Ｌ２候補ワクチンに対する体液性抗体応答を調べた。コントロールは、植物によって発現されたＨＰＶ−１６  Ｌ１（ポジティブコントロール）およびＮＳｓによって浸潤された植物抽出物（ネガティブコントロール）を含んでいた。Ｌ１／Ｌ２（１０８−１２０）キメラ（ＳＡＦとして公開された;Varsani et al., 2003a）は、本発明者らの実験室によって、抗Ｌ１応答を引き起こし（illicit）、従って、さらなるポジティブコントロールとして働くことが示された。ワクチン接種の詳細は、表５に示されている。
【０１８５】
【表５】
2015500229.tif 000007
【０１８６】
精製されたワクチン抗原を、１００μｌのダルベッコのＰＢＳ（ＤＰＢＳ；Ｓｉｇｍａ）中、１０μｇの用量を含むよう調整した。各ワクチン中の総可溶性タンパク質（ＴＳＰ）を、上記の実施例１において論じられたように、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを使用して評価して、ネガティブワクチンコントロールが、その他のＨＰＶワクチンと比較して同様のＴＳＰを含むことを確実にした（表５）。ワクチンを、シリンジ押し出し技術を使用して１：１容量比でフロイントの不完全アジュバント（ＦＩＡ）中でワクチン抗原をホモジネートすることによって調製した（Kohら, 2006）。
【０１８７】
マウスを、ワクチンあたり５匹のマウスの２群に分け、右側腹部、左側腹部または鼠径部位に皮下注射した。事前出血をワクチン接種（０日目）の１２日前に採取し、６２日目（ワクチン接種後〜９週間）の最終出血を得る前に、マウスに１３、２７、４１および４８日目にブーストした（試験出血を得るよりもブーストするよう決定された４８日目を除いて、およそ２週間毎）。血清を単離し、−７０℃で保存した。
【０１８８】
マウス血清中の抗Ｌ１抗体のＥＬＩＳＡ検出
昆虫細胞によって生産されたＨＰＶ−１６  Ｌ１の調製
昆虫細胞によって生産されたＨＰＶ−１６  Ｌ１を、マウス血清中の抗Ｌ１抗体を検出するためのＥＬＩＳＡ抗原として使用した。夾雑植物タンパク質に対する抗体のバックグラウンド検出を避けるために、植物によって発現されたＬ１の代わりに昆虫細胞によって発現されたＬ１を使用した。２７℃でＳＦ９００１１血清不含培地（Ｇｉｂｃｏ）中で振盪しながらヨトウガ（Spodoptera frugiperda）（Ｓｆ−９）細胞を増殖させ、１．０の多重感染度（ＭＯＩ）および１×１０６個細胞／ｍｌの細胞密度で感染させた。９６時間後に細胞を遠心分離（１０００×ｇで５分間）によって回収し、ペレットをＤＰＢＳで洗浄し、−７０℃で保存した。
【０１８９】
細胞を、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＥＤＴＡ不含）を含む高塩ＰＢＳ（０．８Ｍ  ＮａＣｌ  １×ＰＢＳ）中に４×１０６個細胞／ｍｌに再懸濁することおよび氷上で５×２０秒間隔の超音波処理および静置で超音波処理することと（マクロチップ超音波処理；レベル５；Ｈｅａｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ−Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ，  Ｉｎｃ．  Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ  モデル  Ｗ−２２５  Ｒ）によってＨＰＶ−１６  Ｌ１を抽出した。細胞溶解物を、遠心分離（５０００ｇで５分間）によって浄化して、細胞細片を除去し、上清を使用して遠心分離工程を反復した。市販のワクチンＣｅｒｖａｒｉｘ（２０μｇ  ＨＰＶ−１６  Ｌ１）を、ＨＰＶ−１６  Ｌ１のウエスタンブロット定量化のためのＨＰＶ−１６  Ｌ１標準として使用し（上記のように）、ＣａｍＶｉｒ１（１：１００００；Ａｂｃａｍ（登録商標））を用いてＬ１を検出した。
【０１９０】
抗Ｌ１抗体のＥＬＩＳＡ検出
抗Ｌ１抗体力価を直接ＥＬＩＳＡによって決定した。９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）を、１×ＰＢＳで希釈した１００μｌ／ウェル（３０ｎｇ）の昆虫細胞によって生産されたＨＰＶ−１６  Ｌ１抗原を用いてコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを、ブロッキングバッファー（１×ＰＢＳ中、１％スキムミルク；２００μｌ／ウェル）を用いて室温で２時間ブロッキングし、次いで、ＰＢＳを用いて４回洗浄した。
【０１９１】
マウス血清を、分析のためにワクチン（１０匹のマウス／ワクチン）にプールした。最終出血マウス血清を、１：５０−１：５１２００の希釈の範囲でトリプリケートにおいてブロッキングバッファーで４倍系列で希釈した。プールした事前出血血清を、１：５０希釈で試験し、ネガティブコントロールとして用いた。希釈した血清をウェルに添加し（１００μｌ／ウェル）、室温で２時間インキュベートした。ポジティブコントロールウェルは、抗Ｌ１抗体の１：５０希釈；線形および立体構造エピトープの両方と結合するＣａｍＶｉｒ１（Ａｂｃａｍ（登録商標））（McLeanら, 1990）と、立体構造エピトープと特異的に結合するＨ１６．Ｖ５  ＭＡｂ（Christensenら, 1996）の両方を含んでいた。抗体を含まないブランクウェルを、バックグラウンドコントロールとして含めた。
【０１９２】
４回のＰＢＳ洗浄工程後、ウェルに、ブロッキングバッファーで希釈したヤギ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（１：２０００；Ｓｉｇｍａ）を添加し（１００μｌ／ウェル）、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ（２００μｌ／ウェル）で４回洗浄し、ウェルあたり１００μｌのＯ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（ＯＰＤ）（ＤＡＫＯ；Ｄｅｎｍａｒｋ）を添加した。プレートを、室温、暗所で３０分間発色させ、０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を用いて反応を停止させ、４９０ｎｍでの吸光度を検出した。抗Ｌ１結合力価は、１：５０で希釈された対応する事前出血血清のものよりも高い吸光度読み取り値をもたらす最大血清希釈の逆数として表した。
【０１９３】
統計解析
両側、対応のないｔ検定を使用して、ネガティブコントロールワクチンと比較して最終出血抗Ｌ１応答の統計的有意性を算出した（ｐ＝０．０１）。一元配置分散分析法（ＡＮＯＶＡ）を使用して、ワクチンおよびＦｉｓｈｅｒ  ＬＳＤ、シチメンチョウＨＳＤを比較し、ボンフェローニ試験を使用して、有意性を決定した（ｐ＝０．０１）。
【０１９４】
抗Ｌ２抗体のウエスタンブロット検出
大腸菌によって生産されたＨＰＶ−１６  Ｌ２の調製
大腸菌（Ｄａｖｉｄ  Ｍｕｔｅｐｆａによって提供された）においてｐＰｒｏＥＸ  ｈｔｂベクターを使用して生産されたＨｉｓタグをつけたＨＰＶ−１６  Ｌ２タンパク質を、マウス血清中の抗Ｌ２抗体のウエスタンブロット検出に使用した。大腸菌培養物を、０．６のＯＤ６００に３７℃で振盪しながら増殖させ、次いで、０．６ｍＭイソ−プロピル−β−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加によって誘導した。３時間後、細胞を遠心分離（４℃、３８００ｇで１５分）によって回収し、ペレットを保持し、秤量した。
【０１９５】
細胞を、４容量の溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５、５ｍＭ  β−メルカプトエタノール）に再懸濁することによって封入体を抽出し、フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）およびリゾチーム（Ｒｏｃｈｅ）を、それぞれ、０．４ｍＭおよび０．０８μｇ／μｌの終濃度に添加した。細胞を氷上で２０分間インキュベートし、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを１％に添加し、溶液が粘稠性となるまで細胞を３７℃で２０分間さらにインキュベートした。ＤＮアーゼおよびＲＮアーゼを、それぞれ、４μｇ／ｍｌおよび４０μｇ／ｍｌに添加し、粘性が排除されるまで、細胞を室温で３０分間インキュベートした。
【０１９６】
微量遠心機中、１３，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間の遠心分離によって封入体を集め、ペレットを１ｍｌの溶解バッファー（２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、３．１２５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００２５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ）に再懸濁し、室温で１０分間溶解させた。サンプルを、１３，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離し、ペレットをＰＢＳを用いて４回洗浄した。ペレットを、ペレットの重量の１容量のＰＢＳに再懸濁し、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）標準を使用するクマシー染色によって定量化し、−２０℃で保存した。
【０１９７】
抗Ｌ２抗体のウエスタンブロット検出
大腸菌によって生産されたＨＰＶ−１６  Ｌ２抗原を、５×ローディングバッファー中、９５℃で５分間インキュベートし、１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。１０ウェルコームを使用する代わりに、２ウェルコーム；タンパク質マーカーのための小さいウェルおよび一緒に融合した９ウェルからなり、従って、タンパク質が幅一杯に均一に広がることを可能にした単一の広いウェルをもたらす大きいウェルを使用した。
【０１９８】
大腸菌によって発現されたＨｉｓタグをつけたＨＰＶ−１６  Ｌ２抗原（２．５ｍｇ）を、上記の実施例１に記載されるように、１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し（Sambrookら, 1989）、セミドライエレクトロブロッティングによってニトロセルロースメンブレンに移した。次いで、ウエスタンブロッティングプロトコールを改変し、それによって、Ｌ２タンパク質（〜８０ｋＤａ）を含む５５−１３０ｋＤａの間のメンブレンの部分を１２の同様のサイズのストリップに分け、種々の血清を用いてプロービングした。メンブレンストリップを、２５ウェル組織培養プレート中の個々のウェルに移し、ブロッキングバッファー中、室温で４時間インキュベートした。
【０１９９】
個々の事前出血および最終出血マウス血清を、ワクチンにプールし（ワクチンあたり１０匹のマウス）、メンブレンストリップを、ポジティブコントロールマウス抗Ｈｉｓ抗体（１：２０００，Ｓｅｒｏｔｅｃｈ）またはブロッキングバッファーで１：１００希釈されたプールされたマウス血清を用いてプロービングした。血清を異なるウェルに添加し、振盪しながら室温で一晩インキュベートした。次いで、ストリップを、ブロッキングバッファーを用いて４×１０分間洗浄し、アルカリホスファターゼにコンジュゲートされた二次ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（１：５０００；Ｓｉｇｍａ）を用いて、室温で２時間プロービングした。個々のストリップを、洗浄バッファーを用いてさらに４×１０分間、洗浄し、次いで、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて発色させた。
【０２００】
デンシトメトリー（ＧｅｎｅＴｏｏｌｓ，  Ｓｙｎｇｅｎｅ，  Ｓｙｎｏｐｔｉｃｓ，  Ｌｔｄ）を使用して、各Ｌ２バンドの吸光度強度を測定した。値を、ネガティブコントロールワクチンと関連する値を使用して非特異的バックグラウンド吸光度に対して正規化した。ＨＰＶ−１６  Ｌ１最終出血において観察された値の＞２×の吸光度値を有するＬ２バンドを有する血清が、抗Ｌ２応答を引き起こした。
【０２０１】
ＨＰＶ偽ビリオン中和アッセイ
中和アッセイのための調製
ＨＰＶ偽ビリオン（ＰｓＶ）中和アッセイのために使用したプロトコールは、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ技術ファイルのＤｒ  Ｊｏｈｎ  Ｓｃｈｉｌｌｅｒの研究室から採用し、ＨＰＶ  Ｌ１／Ｌ２  ｐＳｈｅＬＬプラスミドおよびｐＹＳＥＡＰリポータープラスミドは、親切にもＤｒ  Ｊｏｈｎ  Ｓｃｈｉｌｌｅｒによって提供された。
【０２０２】
ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素消化を使用してｐＹＳＥＡＰプラスミドをチェックした（上記の実施例１に記載されるとおり）。ＨＰＶ  Ｌ１／Ｌ２  ｐＳｈｅＬＬプラスミドは、サイズが同様であり、同様の制限酵素部位を有し、従って、ＨＰＶ  Ｌ１およびＬ２遺伝子の上流および下流と結合する２セットのｐＳｈｅＬＬベクター特異的プライマーを使用してプラスミドを配列決定して、その同一性を確認した（表６）。ＤＮＡＭＡＮ配列解析ソフトウェアを使用して、配列を、ＨＰＶ  Ｌ１／Ｌ２  ｐＳｈｅＬＬプラスミド配列およびＨＰＶ  Ｌ１またはＬ２遺伝子配列とアラインした。
【０２０３】
【表６】
2015500229.tif 000008
【０２０４】
ｐＹＳＥＡＰプラスミドおよびＨＰＶ−１６、１８、４５および５２ｐＳｈｅＬＬプラスミドの両方について、適当な抗生物質選択下で増殖させた大腸菌培養物からエンドトキシンを含まないプラスミドＤＮＡ（ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ（登録商標）Ｘｔｒａ  Ｍｉｄｉ  ＥＦ，  Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を調製し（表７）、ＤＮＡを−７０℃で保存した。
【０２０５】
【表７】
2015500229.tif 000009
【０２０６】
ＨＥＫ２９３ＴＴ細胞のトランスフェクション
ＨＥＫ２９３ＴＴ細胞系統は親切にも、Ｄｒ  Ｊｏｈｎ  Ｓｃｈｉｌｌｅｒによって提供された。ＨＰＶ  ＰｓＶｓは、２０１０年６月に改訂された「パピローマウイルスベクター（偽ウイルス）の生産」プロトコールに記載されるとおりに生産した。
【０２０７】
ＨＥＫ２９３ＴＴ細胞を、１％  ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｇｉｂｃｏ）および１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を含む完全高グルコースダルベッコの改変イーグル培地（ｃＤＭＥＭ）で培養した。ＴＴ抗原（ｃＤＭＥＭ−Ａｂ）を選択するために、ｃＤＭＥＭ培地に、１％非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１００ユニット／ペニシリン１ｍｌ（Ｇｉｂｃｏ）、１００μｇ／ストレプトマイシン１ｍｌ（Ｇｉｂｃｏ）、１０μｇ／Ｆｕｎｇｉｎ（商標）１ｍｌ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）および２５０μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ（Ｒｏｃｈｅ）を補充した。細胞の解凍および継代はプロトコールに記載されるとおりに行った。
【０２０８】
細胞を、翌日、５０−７０％コンフルエンスに達するよう、１７５ｃｍ２フラスコ中に、ｃＤＭＥＭ（抗生物質またはハイグロマイシンＢを含まない）中で予めプレーティングした。トランスフェクション当日、細胞に新鮮なｃＤＭＥＭを添加し、エンドトキシンを含まないプラスミドＤＮＡのアリコートを、氷上で解凍した。トランスフェクション混合物は、以下のとおりに調製した：白キャップコニカルチューブ（Ｓｔｅｒｉｌｉｎ）中の５．７ｍｌのＧｌｕｔａＭＡＸを有するＤＭＥＭ（血清不含培地）に１７５μｌのＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）を添加し、室温で５分間インキュベートした。合計４０μｇのＤＮＡを添加し（２０μｇの各プラスミド）、混合物を、室温でさらに３０分間インキュベートし、次いで、細胞に滴加した。フラスコを、５％  ＣＯ２加湿インキュベーター中、３７℃で４０−４８時間インキュベートし、トランスフェクションの６時間後に培地を変更した（ｃＤＭＥＭ）。
【０２０９】
偽ビリオンの抽出
偽ビリオンを、トランスフェクションの４０−４８時間後に回収した。細胞を、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を用いるトリプシン処理によって集め、ｃＤＭＥＭの添加によって不活化した。細胞を円錐底のポリスチレンのＳｔｅｒｉｌｉｎチューブに移し（偽ビリオンが、ポリプロピレンチューブに非特異的に吸着するので）、カウントし、１２００ｒｐｍで８分間遠心分離した。ペレットを、０．５ｍｌのＤＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて洗浄し、１．５ペレット容積のＤＰＢＳ−Ｍｇ（さらなる９．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を有するＤＰＢＳ）に再懸濁して、＞１００×１０６個細胞／ｍｌの高い細胞密度を達成した。
【０２１０】
再懸濁したペレットに１０％  Ｂｒｉｊ−５８（Ｓｉｇｍａ）を、０．５％（ｗ／ｖ）の終濃度に添加し、ベンゾナーゼ（Benzonase）（Ｓｉｇｍａ）およびプラスミド−セーフ（Plasmid-Safe）（商標）ＡＴＰ依存性ＤＮアーゼ（エピセントル（Epicentre））の両方を、それぞれ、０．５％（ｖ／ｖ）および０．２％（ｖ／ｖ）に添加した。Ｃｈｒｉｓ  Ｂｕｃｋの「ＨＰＶおよびポリオーマウイルスの改善された成熟」プロトコールを使用して、滅菌硫酸アンモニウム（１Ｍ、ｐＨ９．０）を２５ｍＭの終濃度に添加し、分子間Ｌ１ジスルフィド結合の形成を促進した。混合物を３７℃で１５分間インキュベートして、溶解を可能にし、次いで、偽ビリオン成熟にとって好ましい温度に一晩移した（ＨＰＶ−１６および１８については２５℃、ＨＰＶ−４５および５２については３７℃）。
【０２１１】
成熟した溶解物を氷上で５分間冷却し、溶解物の最終ＮａＣｌ濃度を８５０ｍＭに調整し、氷上でさらに１０分間インキュベートした。溶解物を、３０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離することによって浄化した。上清を集め、ペレットを、等ペレット容量の高塩ＤＰＢＳ（０．８Ｍ  ＮａＣｌ）に再懸濁し、再度遠心分離することによって再抽出した。上清をプールし、再度遠心分離し、白キャップのポリスチレンチューブに移し、氷上で維持した。
【０２１２】
偽ビリオンの精製
ＰｓＶは、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ密度勾配遠心分離によって精製する。Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（６０％  ｗ／ｖ  イオジキサノール溶液；Ｓｉｇｍａ）を、ＤＰＢＳで４６％（ｗ／ｖ）Ｏｐｔｉｐｒｅｐ保存溶液に希釈し、０．６２５Ｍ  ＮａＣｌを０．８Ｍ  ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２を０．９ｍＭ、ＭｇＣｌ２を０．５ｍＭおよびＫＣｌを２．１ｍＭの終濃度に補充した。高塩ＤＰＢＳ（０．８Ｍ  ＮａＣｌ）を使用して、保存溶液を２７％、３３％および３９％  Ｏｐｔｉｐｒｅｐに希釈し、薄壁５ｍｌポリアロマー超遠心機チューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ）中に１．５ｍｌの段階で、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ希釈物（２７−３９％）を下に重ねることによって３段階勾配を調製した。勾配を、室温で４時間拡散させた。二重浄化した細胞上清を、直線化されたＯｐｔｉｐｒｅｐ勾配上に層にし、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＳＷ５５ｔｉローター中、１６℃、５０，０００ｒｐｍ（２３４，０００×ｇ）で３．５時間遠心分離した。チューブの底にシリンジニードルを刺し、画分を白キャップポリスチレンチューブ中に集めた。第１の画分は、〜０．７５ｍｌ、画分２−１１は、各〜０．２５ｍｌであり、画分１２は勾配の残部を含んでいた。
【０２１３】
画分をスクリーニングするためのプロトコールは、ＨＰＶのタイプに特異的な抗Ｌ１ドットブロットを使用して、ＨＰＶ  Ｌ１、カプシド中に存在する主要なタンパク質の存在を検出するよう改変された（Buckら, 2008）。各画分をニトロセルロースメンブレン上にスポットし（０．５μｌ）、Ｃｅｒｖａｒｉｘ（ＨＰＶ−１６  Ｌ１）、大腸菌によって生産されたＨｉｓタグをつけたＨＰＶ−１６  Ｌ２または勾配に最初にロードされた浄化されたＨＰＶ−１６、１８、４５または５２上清を、ポジティブコントロールとして使用した。
【０２１４】
メンブレンを、ブロッキングバッファー中、室温で３０分間ブロッキングし、次いで、ブロッキングバッファーで希釈された適当な一次抗Ｌ１抗体を用いて、室温で一晩プロービングした。ＣａｍＶｉｒ１（１：５０００；Ａｂｃａｍ）を使用してＨＰＶ−１６を検出した。さらに、ウサギ抗ＨＰＶ−１６  Ｌ２血清が利用可能であり、これを使用して、ＨＰＶ−１６画分（１：２０００）中のＬ２を検出した。Ｈ１６．Ｉ２３、Ｈ４５．Ｎ５、Ｈ５２．Ｃ１およびＨ５２．Ｄ１１  ＭＡｂは、親切にも、Ｄｒ  Ｎｅｉｌ  Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎによって提供され、これを使用して、それぞれ、ＨＰＶ−１８、４５および５２を検出した（１：２０００；Christensenら, 1996）。メンブレンを、１：１０，０００二次抗体（アルカリホスファターゼとコンジュゲートしているヤギ抗マウスＩｇＧまたはヤギ抗ウサギアルカリホスファターゼコンジュゲート；Ｓｉｇｍａ）を用いてプロービングし、上記のように、洗浄し、発色させた。高濃度のＬ１を含むピーク画分を、ポリスチレンチューブ中にプールし、力価測定のために−７０℃で保存した。
【０２１５】
偽ビリオンの電子顕微鏡
精製されたＨＰＶ  ＰｓＶを、電子顕微鏡を使用して分析した。ＰｓＶ（１：１０００）を、グロー放電炭素コーティング銅グリッドに捕獲し、２％酢酸ウラニルを用いて染色し、Ｚｅｉｓｓ  ＥＭ  ９１２  ＣＲＹＯ  ＥＦＴＥＭを使用して観察した。
【０２１６】
偽ビリオン力価測定
ＰｓＶ力価測定および中和アッセイは、力価測定にＮＡｂが含まれなかった点を除いて、「パピローマウイルス中和アッセイ」プロトコールに基づいていた。ＳＥＡＰアッセイにおける頑強なシグナルに必要なＰｓＶの最小量を決定するための中和アッセイに先立って、ＰｓＶ保存液を力価測定した。
【０２１７】
ＨＥＫ２９３ＴＴ細胞を、ｃＤＭＥＭ−Ａｂ中で７０−８０％コンフルエンスに増殖させ、記載されるように集め、ＤＰＢＳを用いて洗浄し、中和培地（ＨＥＰＥＳを含み、フェノールレッドまたはピルビン酸ナトリウムを含まない、１０％ウシ胎児血清；Ｇｉｂｃｏを補充した高グルコースｃＤＭＥＭ）で３．０×１０５個細胞／ｍｌに希釈した。細胞を、９６ウェル組織培養処理プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ）中に予めプレーティングし、内側の各ウェルに、１００μｌの細胞懸濁液を入れ、内側ウェルからの蒸発を避けるために外側のウェルに１５０μｌのフェノールレッドを含むＤＭＥＭを入れた。細胞を、３７℃で３−４時間インキュベートし、その後、ＰｓＶを添加した。
【０２１８】
非処理滅菌９６ウェルポリスチレンプレート（Ｎｕｎｃ）中で、ＰｓＶの段階希釈を、中和培地（１：２５０−１：６４０００の二重希釈）で調製し、トリプリケートにおいて試験した。ＰｓＶ希釈物を、Ｓｃｈｉｌｌｅｒプロトコールに概説されるように、予めプレーティングした細胞（１００μｌ／ウェル）に添加し、各プレートは、６つの偽ビリオンを含まないネガティブコントロールウェル（細胞コントロール）を含んでいた。プレートを、加湿ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７２時間インキュベートした。
【０２１９】
容積を、製造業者のプロトコールにおいて与えられたものの０．６容積に調整した点を除いて（改訂されたＳｃｈｉｌｌｅｒプロトコールにおいて行われたように）Ｇｒｅａｔ  ＥｓｃＡＰｅ（商標）ＳＥＡＰ化学発光キット２．０（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）をマニュアル使用説明書に従って使用して、ＳＥＡＰ活性を検出した。上清（１２５μｌ）を、滅菌未処理９６ウェルポリスチレン（polysterene）プレート（Ｎｕｎｃ）に移し、１０００×ｇで５分間遠心分離した。浄化した上清（１５μｌ）を白色９６ウェルＯｐｔｉｐｌａｔｅ（９６Ｆ  ｗｈｉｔｅ  ｍａｘｉｓｏｒｂルミノメータープレート；Ｎｕｎｃ）に移し、各ウェルに４５μｌの１×希釈バッファーを添加し、プレートを６５℃で３０分間インキュベートした。プレートを氷上で５分間冷却し、次いで、ウェルあたり６０μｌの基質を添加し、室温で２０分間インキュベートした。ＳＥＡＰ生産を、マイクロプレートルミノメーター（Ｄｉｇｅｎｅ  ＤＭＬ  ２０００）を使用して検出した。中和アッセイのために選択されたＰｓＶ希釈は、力価測定曲線の直線範囲内に生じるＰｓＶの最小量を使用したものとした。ＨＰＶ−５２力価は極めて低いので、１：１２５−１：４０００で再力価測定した。
【０２２０】
偽ビリオン中和アッセイ
インビトロ（in vitro）中和アッセイを使用して、マウス血清におけるＨＰＶ特異的抗体応答を検出し、エンドポイント中和力価を決定した。
【０２２１】
含まれるコントロール：
（ａ）細胞コントロール（ネガティブ感染コントロール）：  細胞培養上清のバックグラウンド読み取り値を得るために、細胞を中和培地のみ（血清または偽ビリオンなし）とともにインキュベートした。このコントロールと関連している発光値は、０％  ＰｓＶ中和に相当した。
【０２２２】
（ｂ）ＰｓＶコントロール（ポジティブＰｓＶ感染コントロール）：  細胞感染に先立って、ＰｓＶを、中和バッファー中で事前インキュベートした。このコントロールと関連する値は、１００％  ＰｓＶ中和に相当した。
【０２２３】
（ｃ）アッセイに使用されるＨＰＶ型ＰｓＶを中和することが知られているＭＡｂまたは抗血清（ポジティブ中和アッセイコントロール）：ＰｓＶを、事前に決定された中和力価に広がるはずである（０−１００％中和）６種の希釈物とともに事前インキュベートした。
【０２２４】
（ｄ）事前出血：ＰｓＶを、プールされたマウス事前出血とともに事前インキュベートした（ネガティブコントロール）。
【０２２５】
ＰｓＶ中和アッセイに使用される中和希釈範囲を決定するために、試験血清中和アッセイに先立ってＮＡｂポジティブコントロール（表８）を力価測定した。ＨＰＶ−１６、４５および５２中和コントロールは、Ｈ１６．Ｖ５、Ｈ４５．Ｎ５、Ｈ５２．Ｃ１およびＨ５２．Ｄ１１  ＭＡｂとした。ＨＰＶ−１８コントロールは、本発明者らの研究室のウサギ抗Ｃｅｒｖａｒｉｘ血清とした。
【０２２６】
【表８】
2015500229.tif 000010
【０２２７】
植物によって生産されたＨＰＶ−１６キメラ候補ワクチンを用いて免疫処置されたマウスから得た血清をプールし（１０匹のマウス／ワクチン）、ＨＰＶ−１６ならびにＨＰＶ−１８、４５および５２の中和について試験した。プールされたワクチン血清を１：５０−１：１２８００の範囲でトリプリケートにおいて４倍希釈した。事前出血もプールし、１：５０の最低希釈でネガティブコントロールとしてトリプリケートにおいて試験した。血清の段階希釈を滅菌非処理９６ウェル組織培養プレートにおいて調製した（１：１０−１：２５６０）。
【０２２８】
ＰｓＶを、中和バッファーで、力価測定アッセイにおいて事前に決定された濃度に希釈した。別の未処理９６ウェルプレートでは、各ウェルに、１００μｌの希釈されたＰｓＶを添加し、トリプリケートのウェルに２５μｌの希釈された血清（またはＰｓＶコントロールウェルについては中和バッファー）を添加し、その結果、事前に希釈された血清のさらなる１：５希釈となった。ＰｓＶおよび血清を４℃で１時間インキュベートして、感染性ＰｓＶの中和を可能にし、次いで、事前にプレーティングされたＨＥＫ−２９３ＴＴプレート中の各ウェルに１００μｌを添加した（細胞コントロールウェルについては中和バッファー）。プレートを、３７℃の加湿ＣＯ２インキュベーター中でさらに７２時間インキュベートした。
【０２２９】
上清を上記のように回収し、ＳＥＡＰの存在についてアッセイした。中和力価は、ＳＥＡＰ活性を、血清とともに事前インキュベートしていないコントロールサンプルと比較して少なくとも５０％低下させる最大血清希釈の逆数として述べられた。
【０２３０】
結果
ＨＰＶ−１６  Ｌ１に対する体液性免疫応答
ＨＰＶ−１６  Ｌ１に対して引き起こされた抗体の検出を、昆虫細胞によって発現されたＨＰＶ−１６  Ｌ１をコーティング抗原として使用して直接ＥＬＩＳＡによって行った（図９）。抗Ｌ１力価は、１：５０の対応する事前出血血清のものよりも高い吸光度読み取り値を含む最大血清希釈の逆数として表した。
【０２３１】
Ｌ１／Ｌ２（５６−８１）キメラおよびネガティブコントロールワクチン（Ｖ２およびＶ５；図９Ａ）ならびにワクチン事前出血（図９Ｃ）については、抗Ｌ１応答は検出されなかった。比較すると、ＥＬＩＳＡ  ＭＡｂ（Ｈ１６．Ｖ５、ＣａｍＶｉｒ１、図９Ｂ）および植物由来のＬ１ポジティブコントロール（Ｖ４、図９Ａ）は、良好な応答を示し、植物由来Ｌ１／Ｌ２（１７−３６）およびＬ１／Ｌ２（１０８−１２０）キメラは両方とも、それぞれ、２００および１２８００の抗Ｌ１力価を引き起こした（Ｖ３およびＶ１、図９Ａ）。ＨＰＶ−１６  Ｌ１は、最高の抗Ｌ１力価（１２８００−５１２００）を引き起こしたが、Ｌ１／Ｌ２（１０８−１２０）は、同様の応答を示し（それぞれ、Ｖ４およびＶ１、図９Ａ）、これは、Ｌ２アミノ酸１０８−１２０エピトープの挿入は、その他のキメラと比較して、Ｌ１免疫原性に対してあまり効果がなかったということを示唆する。さらに、Ｌ１／Ｌ２（１０８−１２０）およびＨＰＶ−１６  Ｌ１抗Ｌ１応答は、その対応する事前出血およびＮＳｓが浸潤された植物抽出物から統計的に有意であった（ｐ＝０．０１）。
【０２３２】
ＨＰＶ−１６  Ｌ２エピトープに対する体液性免疫応答
大腸菌によって生産されたＨｉｓタグをつけたＨＰＶ−１６  Ｌ２タンパク質に対する抗Ｌ２応答を、ウエスタンブロッティングを使用して調べた。各ワクチンのために個々のマウス血清をプールし、抗Ｌ２応答について分析した（図１０）。
【０２３３】
ネガティブワクチンコントロールから得られた抗血清（Ｖ５；植物抽出物）およびこの実験においてさらなるネガティブＬ２コントロールとして役立つＬ１ワクチンコントロール（Ｖ４；植物によって発現されたＨＰＶ−１６  Ｌ１）の両方において、〜８０ｋＤａのＬ２バンドと同様の非特異的バンドが検出された（図１０）。キメラ抗血清を使用して強いＬ２バンドが検出されたので（図１０）すべてのキメラワクチン（Ｖ１−３）は、抗Ｌ２応答を示すようであった。しかし、Ｌ１／Ｌ２（１０８−１２０）およびＬ１／Ｌ２（１７−３６）キメラ（それぞれ、Ｖ１およびＶ３）のみが、決定的な抗Ｌ２応答を示し、Ｌ２バンドは、ＨＰＶ−１６  Ｌ１（Ｖ４）の強度の＞２×であった。
【０２３４】
中和アッセイ
プラスミド分析
制限酵素消化および配列決定を使用して、ｐＹＳＥＡＰおよびＨＰＶ−１６、１８、４５および５２  Ｌ１／Ｌ２  ｐＳｈｅＬＬプラスミドの同一性を確認した（データは示さず）。
【０２３５】
Ｏｐｔｉｐｒｅｐ精製および精製された画分におけるＨＰＶ  ＰｓＶ検出
２７−３９％のＯｐｔｉｐｒｅｐ直線勾配での密度勾配超遠心によって、ＨＰＶ  ＰｓＶを、浄化した細胞上清から精製した。勾配から上に３分の１に明るい灰色のバンドがかすかに見え、チューブの底から画分を集めた。
【０２３６】
画分を、ＨＰＶタイプ特異的抗Ｌ１ドットブロットを使用してＰｓＶの存在についてスクリーニングし、ＣａｍＶｉｒ１およびＨＰＶ−１６  Ｌ２に対するウサギ抗血清を使用し、Ｃｅｒｖａｒｉｘおよび大腸菌によって生産されたＨｉｓタグのついたＨＰＶ−１６  Ｌ２をコントロールとして使用して、ＨＰＶ−１６  Ｌ１およびＬ２を検出した。Ｈ１６．Ｉ２３、Ｈ４５．Ｎ５、Ｈ５２．Ｃ１およびＨ５２．Ｄ１１  ＭＡｂを使用し、最初の浄化された細胞上清をＨＰＶタイプ特異的コントロールとして使用してＨＰＶ−１８、４５および５２をそれぞれ検出した（データは示さず）。
【０２３７】
Ｌ２タンパク質は、共集合されたＬ１／Ｌ２  ＶＬＰにおいて、Ｌ１カプシド表面の内部に局在しているので、ＨＰＶ−１６は、Ｈ１６．Ｖ５を使用して画分３−５で検出され、ＨＰＶ−１６  Ｌ２抗血清を用いて弱く検出された（Buckら, 2008）。ＨＰＶ−１８、４５および５２  Ｌ１は、画分５−７、４−６および６−１０において、それぞれ強く検出された。ＰｓＶ画分をプールし、電子顕微鏡によって調べ、中和アッセイに使用した。
【０２３８】
電子顕微鏡解析
プールしたＰｓＶサンプルを、透過型電子顕微鏡によって調べ、その集合、形態学および精製を決定した（データは示さず）。すべてのＨＰＶタイプは、球状ＰｓＶ（５５ｎｍ）に集合した。ＨＰＶ−４５  ＰｓＶは、もっぱら、十分に集合したＰｓＶ粒子として存在するようであった。ＨＰＶ−１６および１８  ＰｓＶは、一部のカプソメアおよび凝集物が見られたが、主に集合した。ＨＰＶ−５２  ＰｓＶは、恐らくは、ＨＥＫ２９３ＴＴ細胞における低いＨＰＶ−５２  Ｌ１およびＬ２発現の結果として、大きな割合のカプソメア凝集物および部分的なＰｓＶを含んでいた。
【０２３９】
ＨＰＶ  ＰｓＶ力価測定
精製されたＰｓＶを力価測定して、中和アッセイに使用されるべきＰｓＶ希釈を決定した。使用された希釈は、力価測定曲線の直線範囲内に頑強なシグナルを示すＰｓＶの最小量とした。
【０２４０】
ＨＰＶ−１６および１８  ＰｓＶについて、力価測定曲線の直線範囲は、希釈１：２５０−１：１０００の間に生じ（データは示さず）、従って、中和アッセイには１：５００を選択した。ＨＰＶ−４５  ＰｓＶは最高力価を有しており、直線範囲は、１：５００−１：２０００の希釈の間に生じ、従って、さらなる研究には１：１０００を選択した（データは示さず）。ＨＰＶ−５２  ＰｓＶは、より低い希釈を使用して再度力価測定されなければならなかった。直線範囲は、１：１２５−１：２５０の希釈の間に生じ（データは示さず）、ＨＰＶ−５２中和アッセイでは１：２００希釈を使用した。
【０２４１】
ポジティブコントロール中和抗体の力価測定
ＮＡｂポジティブコントロールを、中和アッセイに先立って、その中和能力をチェックし、適した希釈範囲を決定するためにマウス抗血清を用いて試験した。すべてのポジティブコントロール抗体は中和し、試験された希釈範囲内で直線関係を示した（表９）。
【０２４２】
【表９】
2015500229.tif 000011
【０２４３】
ＨＰＶ  ＰｓＶ中和アッセイ
植物によって生産されたＨＰＶ−１６  Ｌ１およびＬ１／Ｌ２キメラを用いて免疫処置されたマウスから得た血清を、ＨＰＶ−１６  ＰｓＶの相同中和およびＨＰＶ−１８、４５および５２  ＰｓＶに対する異種交差防御について試験した（図１０−１３）。すべてのポジティブコントロールＮＡｂは、ＨＰＶ−１６、１８、４５および５２  ＰｓＶを成功裏に中和し（図１０−１３Ｆ）、これは、中和アッセイ結果が妥当であったことを実証する。中和力価は、血清を用いて処理されなかったコントロールサンプルと比較して、ＳＥＡＰ活性を＞５０％低下させる血清の最高希釈として定義した。
【０２４４】
ＨＰＶ−１６
ＨＰＶ−１６  ＰｓＶ中和アッセイから得られた結果が、図１１に示されている。植物由来ＨＰＶ−１６  Ｌ１血清（Ｖ４；図１１Ｄ）は、Ｈ１６．Ｖ５ポジティブコントロール（図１１Ｆ）を摸倣し、ＨＰＶ−１６  ＰｓＶを強力に中和し、同様の中和曲線を有するＬ１／Ｌ２（１０８−１２０）が続いた（Ｖ１；図１１Ａ）。ネガティブコントロール（Ｖ５；図１１Ｅ）と同様の中和曲線を有するＬ１／Ｌ２（５６−８１）およびＬ１／Ｌ２（１７−３６）は両方とも、ＨＰＶ−１６  ＮＡｂを引き起こさないと思われた（Ｖ２−３；図１１Ｂ−Ｃ）。
【０２４５】
ＨＰＶ−１８
すべてのワクチンから得た抗血清は、ＨＰＶ−１８  ＰｓＶを中和しなかった（図１２）。Ｌ１／Ｌ２（５６−８１）およびＬ１／Ｌ２（１７−３６）キメラ（Ｖ２−３、図１２Ｂ−Ｃ）は、タイプ特異的ＨＰＶ−１６  Ｌ１ワクチンおよびネガティブコントロール（Ｖ４−５、図１２Ｄ−Ｅ）と同様の中和曲線を生じた。Ｌ１／Ｌ２（１０８−１２０）は、幾分かの中和活性を有すると思われ、＜８００の逆数血清希釈が、発光読み取り値を、事前出血および中和されていないＨＰＶ−１８  ＰｓＶコントロール（Ｖ１；図１２Ａ）のものよりも低く低下させた。しかし、キメラは、ＳＥＡＰレベルを＞５０％低下させなかった。
【０２４６】
ＨＰＶ−４５
ＨＰＶ−４５  ＰｓＶ中和アッセイから得られた結果（図１３）は、Ｌ１／Ｌ２キメラワクチン（Ｖ１、Ｖ２およびＶ３；図１３Ａ−Ｃ）のうちいずれも、相当な力価のＨＰＶ−４５  ＮＡｂを引き起こさず、ＨＰＶ−１６  Ｌ１およびネガティブワクチンコントロール（Ｖ４−５；図１３Ｄ−Ｅ）と同様の中和曲線を有していたことを示唆する。
【０２４７】
ＨＰＶ−５２
ＨＰＶ−５２  ＰｓＶ中和アッセイ（図１４）は、Ｌ１／Ｌ２（５６−８１）血清が、ＨＰＶ−１６  Ｌ１およびネガティブコントロール血清（Ｖ４−５；図１４Ｄ−Ｅ）について見られるように、ＨＰＶ−５２（Ｌ２；図１４Ｃ）を中和しなかったという証拠を提供する。Ｌ１／Ｌ２（１０８−１２０）およびＬ１／Ｌ２（１７−３６）キメラワクチンは、低逆数希釈(reciprocal dilution)（５０−２００）で幾分かの中和活性を有すると思われ、中和されていないＨＰＶ−５２  ＰｓＶコントロール（Ｖ１およびＶ３；図１４ＡおよびＣ）と比較して、ＳＥＡＰレベルを＞５０％低下させた。
【０２４８】
アッセイは成功したが、Ｈ５２．Ｃ１  ＮＡｂコントロール（図１４Ｆ）によって示されるように、トリプリケートのサンプル間で、はるかに多い変動があり、傾向線を確立することが困難であった。これは、複製間の小さい相違を誇張した可能性がある、ＨＰＶ−５２  ＰｓＶの部分精製および低濃度に起因する可能性がある。Ｖ１、Ｖ２およびＶ４（図１４Ａ−ＢおよびＤ）は、Ｖ３、Ｖ５およびＨ５２．Ｃ１（図１４ＣおよびＥ−Ｆ）とは異なるプレートで分析されたので、ＨＰＶ−５２  ＰｓＶ感染コントロールの値は、ワクチン間で異なる。時間的制約のために、このアッセイが反復されることが妨げられた。
【０２４９】
表１０には、植物由来ワクチンによって引き起こされたＨＰＶ−１６、１８、４５および５２  ＰｓＶ中和抗体力価がまとめられている。Ｌ１／Ｌ２（１０８−１２０）は、相同ＨＰＶ−１６  ＮＡｂおよび抗血清によって交差中和される異種ＨＰＶ−５２  ＰｓＶを引き起こし、これは、このワクチンが、防御にとって最も有望であることを示唆する。Ｌ１／Ｌ２（１７−３６）キメラは、低レベルの交差中和ＨＰＶ−５２  ＮＡｂを引き起こしたが、相同ＨＰＶ−１６  ＮＡｂは検出されず、これは、ＨＰＶ−１６  Ｌ１に対する免疫原性が損なわれた可能性があることを示唆する。Ｌ１／Ｌ２（５６−８１）は、ＮＡｂを引き起こさなかった。ＨＰＶワクチンはいずれも、系統学的に関連するＨＰＶのタイプ１８および４５に対する交差中和抗体を引き起こさなかった。
【０２５０】
【表１０】
2015500229.tif 000012
【０２５１】
ワクチン免疫原性の全体像
構造的集合（上記の実施例２を参照のこと）、抗Ｌ１およびＬ２体液性応答およびＬ１／Ｌ２キメラ抗血清において検出されたＨＰＶタイプＮＡｂが表１１にまとめられている。ＶＬＰへの集合は、より高い抗Ｌ１およびＨＰＶ−１６  ＰｓＶ中和力価と関連していると思われ、これは、集合がＬ１免疫原性と関連していることを示唆する。
【０２５２】
【表１１】
2015500229.tif 000013
【０２５３】
考察
植物由来ＨＰＶ−１６  Ｌ１（Macleanら, 2007;Fernandez-San Millanら, 2008）およびＬ１ベースのキメラ（Paz De la Rosaら, 2009）は、免疫原性ＶＬＰに集合し、中和抗体（ＮＡｂ）の生産を引き起こす。この研究では、ＨＰＶ−１６  Ｌ１のｈ４領域中に、交差中和ＨＰＶ−１６  Ｌ２アミノ酸１０８−１２０、５６−８１または１７−３６エピトープを含む３種の植物由来Ｌ１／Ｌ２キメラの免疫原性を分析した。マウスを、フロイントの不完全アジュバント中、１０μｇの植物由来抗原を用いて皮下に免疫処置し、７週間以内に４回のブースターワクチン接種を施した。
【０２５４】
体液性免疫応答
この研究では、植物由来Ｌ１／Ｌ２キメラによって引き起こされた体液性抗Ｌ１およびＬ２応答を分析して、Ｌ２ペプチドが提示される場合に、Ｌ２挿入がＬ１免疫原性を損なうかどうかを決定した。
【０２５５】
マウス抗血清におけるＬ１およびＬ２抗体の検出は、昆虫細胞によって発現されたＨＰＶ−１６  Ｌ１または大腸菌によって発現されたＨｉｓタグが付けられたＬ２抗原のいずれかを使用して、それぞれ、直接ＥＬＩＳＡ（図９）およびウエスタンブロッティング（図１０）によって行った。植物由来ＨＰＶ−１６  Ｌ１は、研究では抗Ｌ１ポジティブコントロールとして働き、最高の抗Ｌ１応答を引き起こし、１２８００−５１２００の力価を有していた（図９Ａ）。これらの結果は、部分精製された植物由来ＨＰＶ−１６  Ｌ１  ＶＬＰを使用する他のマウス免疫原性研究（力価＝２００００−４０９６０;Macleanら, 2007;Fernandez-San Millanら, 2008）と同様である。
【０２５６】
ネガティブコントロールワクチン（Ｖ５：ＮＳｓが浸潤された植物抽出物）およびワクチン事前出血（Ｖ１−５  ＰＢ）は、抗Ｌ１応答を示さなかった（図９）。しかし、ネガティブコントロールから得た抗血清（Ｖ４−５、図１０）は、大腸菌によって発現されたＨｉｓタグが付けられたＨＰＶ−１６  Ｌ２抗原を検出し、従って、Ｈｉｓタグが付けられたＬ２タンパク質と結合する血清中の非特異的抗体の存在を実証する。これは、恐らくは、夾雑植物タンパク質を含むワクチンをもたらす抗原の部分精製に起因する。それにもかかわらず、ネガティブコントロールバンドは、Ｌ１／Ｌ２（１０８−１２０）およびＬ１／Ｌ２（１７−３６）キメラに対するバンドよりも明確ではなく、これは、これらのＬ１／Ｌ２キメラは、抗Ｌ２応答を引き起こしたということを示唆する。
【０２５７】
Ｌ１／Ｌ２（１０８−１２０）は、特徴的な〜３０ｎｍのｃＶＬＰに集合し、最も成功したキメラワクチンであり（表１１）、最高の抗Ｌ１応答を引き起こし、〜１２８００の力価（図９Ａ）および抗Ｌ２応答（図１０）を有していた。さらに、Ｌ１／Ｌ２（１０８−１２０）およびＨＰＶ−１６  Ｌ１抗血清のみが、事前出血およびＮＳｓが浸潤された植物抽出物（ネガティブコントロール）と比較して、有意な抗Ｌ１応答を実証した（ｐ＝０．０１）。Varsaniら（2003a）によって解析された昆虫細胞によって発現されたＬ１／Ｌ２（１０８−１２０）キメラは、植物由来キメラと比較してより高い抗Ｌ１力価（＞２０４８００）を引き起こしたが、１０×高い用量が使用された（１００μｇ対１０μｇ）。一緒に考えると、Ｌ２アミノ酸１０８−１２０ペプチドが、Ｌ１  ｃＶＬＰの表面に効率的に提示されるという強力な証拠がある。
【０２５８】
Ｌ１／Ｌ２（１７−３６）ワクチンは、比較的弱い抗Ｌ１応答を引き起こし、〜２００の力価を有していたが（図９Ａ）、強力な抗Ｌ２応答を引き起こし（図１０）、これは、Ｌ２ペプチドが、集合したＬ１の表面に提示されることを示唆する。同様に、Ｌ２アミノ酸２０−３８ペプチドの、細菌チオレドキシン（Ｔｒｘ）との融合は、アミノ酸５６−１２０を含む他のＴｒｘ−Ｌ２ペプチド（Rubioら, 2009）と比較して、強力な抗Ｌ２応答を引き起こし、ＨＰＶ−１６  Ｌ２アミノ酸１７−３６ペプチドに対するＲＧ−１  ＭＡｂは、ウエスタンブロッティングおよびＥＬＩＳＡにおいてＬ２を検出することが示されている（Gambhiraら, 2007）。
【０２５９】
Ｌ１／Ｌ２（５６−８１）カプソメアワクチンは、最低血清希釈１：５０で検出可能な抗Ｌ１応答を引き起こさず（図９Ａ）、抗Ｌ２応答は、不確定であり（図１０）、抗Ｌ１およびＬ２応答は両方とも、ワクチン事前出血（Ｖ１−５  ＰＢ）およびネガティブコントロール（図９−１０）と同様であった。結果として、植物由来Ｌ１／Ｌ２（５６−８１）は、大腸菌によって発現されたＴｒｘ−Ｌ２融合ペプチド（Rubioら, 2009）およびＢＰＶ−１  Ｌ１  ＶＬＰのＤＥループ中に同様のＬ２エピトープを含む昆虫細胞によって発現されたＬ１／Ｌ２キメラとは異なり（Slupetzkeyら, 2007;Schellenbacherら, 2009）、免疫原性ではないと思われる。
【０２６０】
偽ビリオン中和アッセイ
Ｌ２エピトープアミノ酸１０８−１２０、５６−８１および１７−３６を含むＬ１／Ｌ２キメラを、ＨＰＶ−１６、１８、４５および５２  ＰｓＶを中和する抗体を引き起こすその能力について調べた。この研究において分析されたＬ２エピトープのすべてが、相同ＨＰＶ−１６を中和し、ＨＰＶ−５２を交差中和する（Kawanaら, 2003;Slupetzkyら, 2007;Kondoら, 2007, 2008;Gambhiraら, 2007;Schellenbacherら, 2009）抗体を引き起こすことが示されている。さらに、Ｌ２アミノ酸５６−８１は、ＨＰＶ−１８を交差中和し、Ｌ２アミノ酸１７−３６は、ＨＰＶ−１８および４５の両方を交差中和する（Gambhiraら, 2007;Kondoら, 2007, 2008;Alphsら, 2008;Schellenbacherら, 2009;Rubioら, 2009）。
【０２６１】
ＨＰＶ−１６  Ｌ１は、キメラ候補ワクチンの骨格であり、子宮頸癌の大部分を引き起こすのでＨＰＶ−１６を選択し、系統学的に関連するＨＰＶ−１８およびＨＰＶ−４５が続いた。ＨＰＶ−１６、１８および４５は、アフリカでは子宮頸癌の４８％、２３％および１０％と、世界中の子宮頸癌の６１％、１０％および６％と関連している（de Sanjoseら, 2010）。ＨＰＶ−５２は、アフリカでは５番目（３％）にすぎないが、世界中では６番目（６％）であり、ＨＰＶ−５２は、南アフリカの女性では、低悪性度および高悪性度子宮頸部病変において高度に蔓延していることが示されており、従って、ＨＰＶ−５２交差中和は地域で有意なものである（Allanら, 2008）。
【０２６２】
相同ＨＰＶ−１６中和
植物由来Ｌ１／Ｌ２（５６−８１）およびＬ１／Ｌ２（１７−３６）は、検出可能なＨＰＶ−１６  ＮＡｂ力価を引き起こさず、事前出血およびＮＳｓが浸潤された植物抽出物と同様の結果を示した（図１１）。これまでの研究は、ＢＰＶ−１またはＨＰＶ−１６  Ｌ１が引き起こしたＨＰＶ−１６  ＮＡｂの表面領域に局在するＨＰＶ−１６  Ｌ２ペプチドアミノ酸１７−３６、１８−３８、５６−７５または６９−８１を含むＬ１／Ｌ２キメラを示した（Slupetzkeyら, 2007;Kondoら, 2008;Schellenbacherら, 2009）。しかし、挿入部位は、この研究において使用したものとは異なっており、キメラはｃＶＬＰに集合した。さらに、ＨＰＶ−１６  Ｌ２アミノ酸７３−８４に対するＭＡｂは、この研究においてＬ１／Ｌ２（５６−８１）キメラについて得られた結果と同様に、非中和性であるとわかり、ＨＰＶ−１６  ＰｓＶを中和しなかった（Gambhiraら, 2007）。
【０２６３】
この研究では、Ｌ１／Ｌ２（１０８−１２０）およびＨＰＶ−１６  Ｌ１のみが、Ｈ１６．Ｖ５（ポジティブ中和コントロール）と同様にＨＰＶ−１６  ＰｓＶを中和し、それぞれ、５０−５００および５００−５０００の力価を示した（表１０）。これらの結果は、植物由来ＨＰＶ  Ｌ１抗原を使用する他のマウス免疫原性研究と一致する。同様の用量またはより高い用量の植物由来ＨＰＶ−１６  Ｌ１  ＶＬＰが、４００−１６００のＨＰＶ−１６  ＮＡｂ力価を引き起こし（Macleanら, 2007;Fernandez-San Millanら, 2008）、植物由来Ｌ１／Ｅ６／Ｅ７  ｃＶＬＰＳは、血球凝集アッセイを使用して〜４００のＨＰＶ−１６  ＮＡｂ力価を引き起こした（Paz De la Rosaら, 2009）。さらに、ＨＰＶ−１６  Ｌ２アミノ酸１０８−１２０ペプチドを用いるヒトの免疫処置は、１００−１０００のＨＰＶ−１６  ＮＡｂ力価を引き起こすことが示され（Kawanaら, 2003）、Ｌ２エピトープアミノ酸１０８−１２０（Slupetzkeyら, 2007）またはＬ２アミノ酸７５−１１２および１１５−１５４（Schellenbacherら, 2009）を含有するＬ１／Ｌ２キメラから得られたマウス抗血清は、相同ＨＰＶ−１６  ＰｓＶを中和し、＜１０００の力価を有していた。従って、本研究において得られた力価は、他の発現系において生産されたＬ１／Ｌ２キメラワクチンによって報告された範囲内である。
【０２６４】
異種ＨＰＶ−１８、４５および５２中和
系統学的に関連するＨＰＶ−１８および４５  ＰｓＶに対する中和活性は、すべてのＨＰＶワクチンについて検出されなかった（図１２−１３）。同様に、Ｌ１／Ｌ２（５６−８１）抗血清は、ＨＰＶ−５２  ＰｓＶを中和しなかった（図１４）。Ｌ１／Ｌ２（１０８−１２０）およびＬ１／Ｌ２（１７−３６）は、低ＨＰＶ−５２  ＮＡｂ力価（５０−２００）を引き起こすと思われたが、恐らくは、部分集合したＰｓＶの精製のために、アッセイにおいて、はるかに多い変動があり、アッセイは、結果を確認するために反復されなければならない。
【０２６５】
これまでの研究は、Ｌ２アミノ酸５６−８１ペプチドを含むＬ１／Ｌ２キメラが、ＨＰＶ−１８および５２の両方を交差中和することを実証した（Kondoら, 2008）。しかし、キメラは、Ｌ１／Ｌ２（５６−８１）とは異なりｃＶＬＰに集合し、これは、ＶＬＰ集合が、高ＮＡｂ力価の生産を誘導するために重要であることを示唆する。さらに、Ｌ２アミノ酸１７−３６または１８−３６を含有するＬ１／Ｌ２キメラ（Kondoら, 2008;Schellenbacherら, 2009）は、ＨＰＶ−１８、４５および５２に対するＮＡｂを引き起こす。しかし、Ｌ２ペプチドは、ＤＥループ中に挿入され（Schellenbacherら, 2009）、Kondoら（2008）によって実施された研究について、投与量は述べられなかった。この研究では、マウスにおいて植物由来Ｌ１／Ｌ２（１７−３６）によって引き起こされた低ＨＰＶ−５２  ＮＡｂ力価は、昆虫細胞において発現された同様のＬ１／Ｌ２キメラによって引き起こされた力価（Schellenbacherら, 2009）に匹敵するものであり、これは、発現系が、抗原のＨＰＶ−５２を交差中和する能力に影響を及ぼさないことを示唆する。
【０２６６】
植物由来Ｌ１／Ｌ２（１０８−１２０）キメラは、ＨＰＶ−５２  ＮＡｂを引き起こすと思われ、Ｌ２アミノ酸１０８−１２０ペプチドが、ヒトにおいて、それぞれ、５０−１０００のＨＰＶ−５２  ＮＡｂ力価を引き起こすことが示されたという証拠によって支持される、交差防御ＨＰＶワクチンとしての可能性を有し得る（Kawanaら, 2003）。ＨＰＶ−１６  Ｌ２アミノ酸１０８−１２０が、ＨＰＶ−４５を交差中和するという証拠はないが、同様のＬ２アミノ酸９６−１１５または７５−１１２エピトープを含むＬ１／Ｌ２キメラは、系統学的に関連するＨＰＶ−１８を交差中和した（Kondoら, 2008;Schellenbacherら, 2009）。しかし、研究において報告されたＮＡｂ力価は低く（＜１００）、引き起こされたＨＰＶ−１８  ＮＡｂは、Ｌ１／Ｌ２（１０８−１２０）抗血清中では低すぎて検出できないということがあり得る。
【０２６７】
参考文献
【表１２】
2015500229.tif 000014
【表１３】
2015500229.tif 000015
【表１４】
2015500229.tif 000016
【表１５】
2015500229.tif 000017
【図１】
2015500229.tif 000018
【図２】
2015500229.tif 000019
【図３】
2015500229.tif 000020
【図４】
2015500229.tif 000021
【図５】
2015500229.tif 000022
【図６】
2015500229.tif 000023
【図７】
2015500229.tif 000024
【図８】
2015500229.tif 000025
【図９】
2015500229.tif 000026
【図１０】
2015500229.tif 000027
【図１１】
2015500229.tif 000028
【図１２】
2015500229.tif 000029
【図１３】
2015500229.tif 000030
【図１４】
2015500229.tif 000031
【図１５】
2015500229.tif 000032
【図１６】
2015500229.tif 000033
【図１７】
2015500229.tif 000034
【図１８】
2015500229.tif 000035
【図１９】
2015500229.tif 000036
【図２０】
2015500229.tif 000037
【図２１】
2015500229.tif 000038
【図２２】
2015500229.tif 000039
【図２３】
2015500229.tif 000040
【図２４】
2015500229.tif 000041
【図２５】
2015500229.tif 000042
【図２６】
2015500229.tif 000043
【図２７】
2015500229.tif 000044
【図２８】
2015500229.tif 000045
【図２９】
2015500229.tif 000046
【図３０】
2015500229.tif 000047
【図３１】
2015500229.tif 000048
【図３２】
2015500229.tif 000049
【配列表】
2015500229000001.app
【国際調査報告】
2015500229.tif 000050
2015500229.tif 000051
2015500229.tif 000052
2015500229.tif 000053