(57)【要約】【課題】細胞培養液の提供。【解決手段】本発明は、細胞培養液に関し、さらに詳細には、細胞治療剤などのための安全かつ安定した有効な細胞培養液に関する。【選択図】図５
2015509725.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビタミン供給用輸液又は注射製剤と、
アミノ酸供給用輸液又は注射製剤と、
無機塩供給用輸液又は注射製剤と、
を混合して市販中の細胞培養液と類似した組成を持つ培養液を製造する段階を含む細胞培養液製造方法。
【請求項２】
前記ビタミン供給用輸液又は注射製剤は、タミフル注（セルトリオン製薬）、セーヌビット注射（バクスター）、ＩＮＦＵＶＩＴＥ  ＡＤＵＬＴ（Ｓａｎｄｏｚ  Ｃａｎａｄａ  Ｉｎｃ．）、Ｉｎｆｕｖｉｔｅ（Ｓａｎｄｏｚ  Ｃａｎａｄａ  Ｉｎｃ．）、Ｍ．Ｖ．Ｉ．ＡＤＵＬＴＴＭ（Ｈｏｓｐｉｒａ  Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ，Ｉｎｃ．）、Ｍ．Ｖ．Ｉ．注（エスエス）、Ｍ．Ｖ．Ｉ．キット、Ｍ．Ｖ．Ｉ．−９注（エスエス）、Ｍ．Ｖ．Ｉ．−３注（エスエス）、Ｍ．Ｖ．Ｉ．−１２キット（エスエス）、オーツカＭＶ注（大塚）、及びソービタ（扶桑）から構成された群から選択された品目、又はこれらの組み合わせであることを特徴とする、請求項１に記載の細胞培養液製造方法。
【請求項３】
前記アミノ酸供給用輸液又は注射製剤は、クリニミクス８５注射（一洋薬品）、中外トロパミン６％注（中外製薬）、中外ヘパタミン注（中外製薬）、カプソル注（種根堂）、永進イントラプシン１０％注（永進薬品）、プロアミン注１０％（ハンオールバイオファーマ）、ヘパビア注（大韓薬品工業）、リブソル注（新風製薬）、ハンオールモリヘパミン注（ハンオールバイオファーマ）、Ｎｅｐｈｒｉｓｏｌ  ５．６％（大韓薬品工業）、グラミン注（プレジニウスカビコリア）、Ｐｒｉｍｅｎｅ  １０％（バクスター）、ドクターラミン注（中外製薬）、アミノグル注（エムジーメディグリーン）、アミノベンインファント６％注（プレジニウスカビコリア）、アミノステリルケイイー１０％注（大韓薬品工業）、アミノプシンティピーエン注（永進薬品）、コンビプレクスエムシーティプラス注（中外製薬）、コンビフレクスエムシーティペリ注（中外製薬）、コンビフレクスエムシーティスペシャル注（中外製薬）、セロナミン注（大韓薬品工業）、５．４％ＮｅｐｈｒＡｍｉｎｅ（Ｒ）注射剤（Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）、Ａｍｉｎｏｓｙｎ（Ｒ）ＩＩ注射剤（Ｈｏｓｐｉｒａ，Ｉｎｃ．）、Ａｍｉｎｏｓｙｎ（Ｒ）Ｓｕｌｆｉｔｅ−Ｆｒｅｅ（Ｈｏｓｐｉｒａ，Ｉｎｃ．）、ＨｅｐａｔＡｍｉｎｅ（Ｒ）注射剤（Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）、ＴｒｏｐｈＡｍｉｎｅ（Ｒ）注射剤（Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）、ＡＭＩＮＯＳＹＮ（Ｒ）ＩＩ  ３．５％ｉｎ  ２５％デキストロース注射剤（Ｈｏｓｐｉｒａ，Ｉｎｃ．）、１０％Ｔｒａｖａｓｏｌ（Ｒ）注射剤（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、アミカリック  Ａｍｉｃａｌｉｑ（テルモ）アミゼットＸＢ（テルモ）、アミノフリード、アミニック、アミパレン、ＥＳ−Ｐｏｌｙｔａｍｉｎ  ポリタミン、イストール、モリアミンＳ、イスポールＳ１２％、アミン１２プロテアミン１２、アミン１２Ｘプロテアミン１２Ｘ、アミユー、プラスアミノ、マックアミン、及びモリプロンＦから構成された群から選択された製剤であることを特徴とする、請求項１に記載の細胞培養液製造方法。
【請求項４】
前記無機塩供給用輸液又は注射製剤は、大韓ハルトマンデクス注射液（大韓薬品工業）、ハルトマン液（大韓薬品工業）、ハルトマンデクス液（中外製薬）、ハルトマン溶液（中外製薬）、ＣＪハルトマン液（ＣＪ第一製糖）、ＣＪハルトマン−ディ液（ＣＪ第一製糖）、ビーブラウンハルトマン液（ビーブラウンコリア）、大韓滅菌生理食塩水、Ｌａｃｔａｔｅｄリンゲル注射液（Ｍｅｄｅｘ  Ｓｕｐｐｌｙ）、ブラウンＬａｃｔａｔｅｄリンゲル注射液（Ａｌｌｅｇｒｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ）、Ｐｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ（Ｒ）Ｍ及び５％デキストロース注射液、Ｌａｃｔａｔｅｄリンゲル及び５％デキストロース注射液、ＥＬ−３号（味の素製薬株式会社）、乳酸リンゲル液、リンゲル液（アイロム製薬株式会社）、ソリタ注（味の素製薬株式会社）、ソリタ−Ｔ１号輸液（味の素製薬株式会社）、ソリタ−Ｔ２号輸液（味の素製薬株式会社）、ソリタ−Ｔ３号輸液（味の素製薬株式会社）、ソリタ−Ｔ４号輸液（味の素製薬株式会社）、及びハルトマン液「コバヤシ」５００ｍｌ塩化カルシウム水化物から構成された群から選択された品目、又はこれらの組み合わせであることを特徴とする、請求項１に記載の細胞培養液製造方法。
【請求項５】
前記細胞培養液製造方法は、さらにブドウ糖、無機塩補充物質、及び抗生及び抗真菌薬をさらに含んで製造することを特徴とする、請求項１に記載の細胞培養液製造方法。
【請求項６】
ビタミン供給用輸液又は注射製剤と、
アミノ酸供給用輸液又は注射製剤と、
無機塩供給用輸液又は注射製剤と、
を含む細胞培養液組成物。
【請求項７】
前記細胞培養液組成物は、さらにブドウ糖、無機塩補充物質、及び抗生及び抗真菌剤をさらに含むことを特徴とする、請求項６に記載の細胞培養液組成物。
【請求項８】
前記組成物は、細胞及び組織の短期間又は長期間の一般保存液又は保管液として使用したり、又は場所を容易に移動する際に移動用溶液にすることを特徴とする、請求項６又は請求項７に記載の細胞培養液組成物。
【請求項９】
前記組成物は身体内に移植するための移植臓器を保存して移動する際に長期保存液の成分にすることを特徴とする、請求項６又は請求項７に記載の細胞培養液組成物。
【請求項１０】
前記組成物は、分子生物学的又は生化学的な実験プロトコルに使用される緩衝液の代用液体にすることを特徴とする、請求項６又は請求項７に記載の細胞培養液組成物。
【請求項１１】
一定の用途及び目的として用いられうる特徴を持つ酸素、二酸化炭素、オゾン、窒素、水素又は硫化水素ガスを溶液の中で砕切してマイクロ又はナノサイズの滴（バブル）に製作するマイクロバブル溶液又はナノバブル溶液の製作過程で請求項６又は請求項７の前記組成物を使用することを特徴とする、マイクロバブル溶液又はナノバブル溶液の製造方法。
【請求項１２】
請求項６又は請求項７の組成物に臍帯血（ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ）又は自家血（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｂｌｏｏｄ）に由来する血清を添加する段階を含む、細胞治療剤用完全培養液の製造方法。
【請求項１３】
請求項６又は請求項７の組成物及び臍帯血（ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ）又は自家血（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｂｌｏｏｄ）に由来する血清を含む、細胞治療剤用完全培養液組成物。
【請求項１４】
請求項６又は請求項７の前記細胞培養液組成物を用いて対象細胞を培養した後に得た条件培養液（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）をそのまま用い、又はその条件培養液を凍結乾燥及び滅菌処理して粉末状の物質で準備し、これら物質は、注射を含む生体内への移動方法を通じて治療、再生、健康増進の用途に使用され得ることを特徴とする、細胞培養液組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養液に関し、さらに詳細には、細胞治療剤などのための安全かつ安定した有効な細胞培養液に関する。
【０００２】
本発明は、保健福祉部の保健医療研究開発事業の支援により成されたものである（Ａ１２０２７５）。
【背景技術】
【０００３】
最初の動物細胞の培養（１９０７年）以降、現行の市販の培養液の組成は変化がなく、主に１９５０年代末から１９６０年代に開発された後、培養液のそのものの組成に関する研究は殆どなかった。
【０００４】
また、ヒトの細胞を体外で一定期間培養し、再び人体に戻す細胞治療剤のための細胞培養液も市販されている培養液を用いている場合が殆どである。
【０００５】
現在、市販の培養液の殆どは、ｐＨ指示剤及び調節のための物質（フェノールレッド、ＨＥＰＥＳ）などが含まれており、これら物質の中には人体に長期的に曝露された時の発ガン、奇形及び発達障害に対する安全性がまだ確認されていないため、潜在的な発ガン物質、毒性物質などとして作用する可能性があり、人体に直接使用できない危険な物質がある。また、細胞増殖を図るため、牛胎児血清（ＦＢＳ）などの異種動物由来（ＸＥＮＯＮ）物質を含む場合が多く、培養段階で異種由来の伝染病の感染が懸念されるなど生体由来の細胞治療剤の細胞材料の安全性を確保することができない。
【０００６】
したがって、現在、病院内で疾患治療のために既に許可されて臨床に使用されている様々な輸液製剤及び注射製剤を調査して細胞培養が可能な組成で培養液を開発するようになれば、細胞治療剤の培養過程の安全性を保障できる培養液の開発が可能である。
【０００７】
関連先行特許として特許文献１は、「細胞の保存液」に関するもので、細胞を凍結保存だけでなく冷蔵保存することを可能とし、また、細胞の保存性能が向上した細胞の保存液、及び前記保存液を用いた簡便な細胞の保存方法の提供を目的とし、前記目的は少なくとも糖類、ナトリウムイオン及びカリウムイオンを含み、前記含有されたナトリウムイオンのモル濃度がカリウムイオンのモル濃度に比べて同じ又は大きいことを特徴とする細胞の保存液によって実現され、これによって細胞を凍結保存だけでなく冷蔵保存することが可能となり、簡便な細胞の保存方法を提供することができ、また、本発明の細胞の保存液によって洗浄等の工程を経ず、細胞を前記保存液に懸濁したまま、培地に播種して細胞を培養することも可能になって簡便であると記載されている。
【０００８】
さらに他の関連先行特許として特許文献２は、「注射用人体軟組織充填剤、及びその製造方法」に関するもので、より具体的には、１）患者自身の皮膚から単離された真皮組織を消化させて単一細胞に分離する段階；２）前記で分離された真皮細胞を細胞外無血清培養を通じて増殖させて真皮幹細胞（ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｒｂｏｂｌａｓｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、真皮転移−増幅細胞（ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｉｔ−ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ  ｃｅｌｌ）、真皮繊維芽細胞（ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）及び／又はコラーゲンタンパク質を含む細胞培養液を得る段階；３）前記細胞培養液を遠心分離して細胞沈殿物を得る段階；及び４）前記細胞沈殿物をブドウ糖注射液又は任意の注射液に懸濁して注射懸濁液を製造する段階を含む、注射用人体軟組織充填剤の製造方法及びこの方法によって製造された注射用人体軟組織充填剤に関するものである。本発明の方法によって製造された人体軟組織充填剤は、自家真皮細胞を用いて免疫反応と副作用を誘発しないながら治療効果を長く持続することができ、無血清培養を通じて動物由来血清使用時の危険性を排除しつつコラーゲンタンパク質を大量に生産して迅速な治療効果を表すので、しわと傷跡を緩和し、治療することだけでなく、肌のつやと弾力性を改善することに有用に使用され得ると記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】韓国特許第１０２００６００５２１５８号公報
【特許文献２】韓国特許第１０２００７０１２２３１６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、前記問題点を解決し、前記必要性によって案出されたものであって、本発明の目的は安全かつ安定した有効な細胞培養液を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記目的を達成するため、本発明は、アミノ酸供給用輸液又は注射製剤、ビタミン供給用輸液又は注射製剤、無機塩供給用輸液又は注射製剤、ブドウ糖供給用輸液又は注射製剤、その他の補充物質輸液又は注射製剤、及び抗生及び抗真菌剤輸液又は注射製剤を混合して市販中の細胞培養液と類似した組成を持つ培養液を製造する段階を含む細胞培養液製造方法を提供する。
【００１２】
本発明の一実施例において、前記ビタミン供給用輸液又は注射製剤は、タミフル注（セルトリオン製薬）、セーヌビット注射（バクスター）、ＩＮＦＵＶＩＴＥ  ＡＤＵＬＴ（Ｓａｎｄｏｚ  Ｃａｎａｄａ  Ｉｎｃ．）、Ｉｎｆｕｖｉｔｅ（Ｓａｎｄｏｚ  Ｃａｎａｄａ  Ｉｎｃ．）、Ｍ．Ｖ．Ｉ．ＡＤＵＬＴＴＭ（Ｈｏｓｐｉｒａ  Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ，Ｉｎｃ．）、Ｍ．Ｖ．Ｉ．注（エスエス）、Ｍ．Ｖ．Ｉ．キット、Ｍ．Ｖ．Ｉ．−９注（エスエス）、Ｍ．Ｖ．Ｉ．−３注（エスエス）、Ｍ．Ｖ．Ｉ．−１２キット（エスエス）、オーツカＭＶ注（大塚）、及びソービタ（扶桑）から構成された群から選択された品目、又はこれらの組み合せであることが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００１３】
本発明の他の実施例において、前記アミノ酸供給用輸液又は注射製剤は、クリニミクス８５注射（一洋薬品）、中外トロパミン６％注（中外製薬）、中外ヘパタミン注（中外製薬）、カプソル注（鍾根堂）、永進イントラプシン１０％注（永進薬品）、プロアミン注１０％（ハンオールバイオファーマ）、ヘパビア注（大韓薬品工業）、リブソル注（新風製薬）、ハンオールモリヘパミン注（ハンオールバイオファーマ）、Ｎｅｐｈｒｉｓｏｌ  ５．６％（大韓薬品工業）、グラミン注（プレジニウスカビコリア）、Ｐｒｉｍｅｎｅ  １０％（バクスター）、ドクターラミン注（中外製薬）、アミノグル注（エムジーメディグリーン）、アミノベンインファント６％注（プレジニウスカビコリア）、アミノステリルケイイー１０％注（大韓薬品工業）、アミノプシンティピーエン注（永進薬品）、コンビプレクスエムシーティプラス注（中外製薬）、コンビフレクスエムシーティペリ注（中外製薬）、コンビフレクスエムシーティスペシャル注（中外製薬）、セロナミン注（大韓薬品工業）、５．４％ＮｅｐｈｒＡｍｉｎｅ注射剤（Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）、Ａｍｉｎｏｓｙｎ  ＩＩ注射剤（Ｈｏｓｐｉｒａ，Ｉｎｃ．）、Ａｍｉｎｏｓｙｎ  Ｓｕｌｆｉｔｅ−Ｆｒｅｅ（Ｈｏｓｐｉｒａ，Ｉｎｃ．）、ＨｅｐａｔＡｍｉｎｅ注射剤（Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）、ＴｒｏｐｈＡｍｉｎｅ注射剤（Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）、ＡＭＩＮＯＳＹＮ  ＩＩ  ３．５％ｉｎ  ２５％デキストロース注射剤（Ｈｏｓｐｉｒａ，Ｉｎｃ．）、１０％Ｔｒａｖａｓｏｌ注射剤（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、アミカリック  Ａｍｉｃａｌｉｑ（テルモ）アミゼットＸＢ（テルモ）、アミノフリード、アミニック、アミパレン、ＥＳ−Ｐｏｌｙｔａｍｉｎ  ポリタミン、イストール、モリアミンＳ、イスポールＳ１２％、アミン１２プロテアミン１２、アミン１２Ｘプロテアミン１２Ｘ、アミユー、プラスアミノ、マックアミン、及びモリプロンＦから構成された群から選択された製剤であることが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００１４】
本発明のさらに他の実施例において、前記無機塩供給用輸液又は注射製剤は、大韓ハルトマンデクス注射液（大韓薬品工業）、ハルトマン液（大韓薬品工業）、ハルトマンデクス液（中外製薬）、ハルトマン溶液（中外製薬）、ＣＪハルトマン液（ＣＪ第一製糖）、ＣＪハルトマン−ディ液（ＣＪ第一製糖）、ビーブラウンハルトマン液（ビーブラウンコリア）、大韓滅菌生理食塩水、Ｌａｃｔａｔｅｄリンゲル注射液（Ｍｅｄｅｘ  Ｓｕｐｐｌｙ）、ブラウンＬａｃｔａｔｅｄリンゲル注射液（Ａｌｌｅｇｒｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ）、Ｐｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ  Ｍ及び５％デキストロース注射液、Ｌａｃｔａｔｅｄリンゲル及び５％デキストロース注射液、ＥＬ−３号（味の素製薬株式会社）、乳酸リンゲル液、リンゲル液（アイロム製薬株式会社）、ソリタ注（味の素製薬株式会社）、ソリタ−Ｔ１号輸液（味の素製薬株式会社）、ソリタ−Ｔ２号輸液（味の素製薬株式会社）、ソリタ−Ｔ３号輸液（味の素製薬株式会社）、ソリタ−Ｔ４号輸液（味の素製薬株式会社）、及びハルトマン液「コバヤシ」５００ｍｌ塩化カルシウム水化物から構成された群から選択された品目であったり、これらの組み合わせであることが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００１５】
また、本発明の前記細胞培養液製造方法は、さらにブドウ糖供給用輸液又は注射製剤、その他の補充物質輸液又は注射製剤、及び抗生及び抗真菌剤輸液又は注射製剤をさらに含んで製造することが好ましいが、これに限定されるものではない。また、本発明は、ビタミン供給用輸液又は注射製剤、アミノ酸供給用輸液又は注射製剤、及び無機塩供給用輸液又は注射製剤を含む細胞培養液組成物を提供する。
【００１６】
本発明の他の実施例において、前記組成物は、細胞及び組織の短期間又は長期間の一般の保存液又は保管液として使用したり、又は場所を容易に移動する際に移動用溶液にすることが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００１７】
本発明のさらに他の実施例において、前記組成物は、身体内に移植をするための移植臓器を保存して移動するとき、臓器保存液の成分として使用することが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００１８】
本発明のさらに他の実施例において、前記組成物は、分子生物学的又は生化学的な実験プロトコルに使用される緩衝液の代用液体にすることが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００１９】
また、本発明は、一定の用途及び目的として用いられうる特徴を有する酸素、二酸化炭素、オゾン、窒素、水素又は硫化水素ガスを溶液の中で砕切してマイクロ又はナノサイズの滴（バブル）に製作するマイクロバブル溶液又はナノバブル溶液の製作過程において、前記組成物を使用することを特徴とするマイクロバブル溶液又はナノバブル溶液の製造方法を提供する。
【００２０】
また、本発明は、前記本発明の組成物に臍帯血（ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ）又は自家血（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｂｌｏｏｄ）に由来する血清を添加する段階を含む細胞治療剤用完全培養液の製造方法を提供する。
【００２１】
また、本発明は、前記本発明の組成物及び臍帯血（ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ）又は自家血（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｂｌｏｏｄ）に由来する血清を含む細胞治療剤用完全培養液組成物を提供する。
【００２２】
また、本発明は、前記本発明の前記細胞培養液組成物を用いて対象細胞を培養した後に得た条件培養液（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）をそのまま用い、又はその条件培養液を凍結乾燥及び滅菌処理して粉末状の物質で準備し、これら物質は、注射を含む生体内への移動方法を通じて治療、再生、健康増進の用途に使用され得ることを特徴とする細胞培養液組成物を提供する。
【００２３】
本発明に使用されたＦｌｕｉｄ−ｂａｓｅｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ（ＦＣＭ）の構成成分の薬品リストは、次の通りである。
【００２４】
無機塩類の供給のためには、下記の１）のｂａｓｅ溶液製品を主として、補完のために２）乃至５）の無機塩類成分を補充しうる。
【００２５】
１）Ｂａｓｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  
ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル又はガラス容器に入った無色透明の液
１）−１  大韓ハルトマンデクス注射液５００・１０００ミリリットル（大韓薬品工業）
１００ｍｌのうちＣａｌｃｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ２０ｍｇ、Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  ５ｇ、Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ３０ｍｇ、Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ６００ｍｇ、Ｓｏｄｉｕｍ  Ｌａｃｔａｔｅ  ６２０ｍｇ
１）−２  ハルトマン液５００・１０００ミリリットル（大韓薬品工業）
１ＬのうちＣａｌｃｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ０．２７ｇ、Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ０．４ｇ、Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ６ｇ、Ｓｏｄｉｕｍ  Ｌａｃｔａｔｅ  ３．２２ｇ
１）−３  ハルトマンデクス液（中外製薬）
１００ｍｌのうちＣａｌｃｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ２０ｍｇ、Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ３０ｍｇ、Ｓｏｄｉｕｍ  Ｌａｃｔａｔｅ  ６２０ｍｇ、Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  ５ｇ、Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ６００ｍｇ
１）−４  ハルトマン溶液（中外製薬）
１Ｌのうち、Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ０．２７ｇ、Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ０．４ｇ、Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ６ｇ、Ｓｏｄｉｕｍ  Ｌａｃｔａｔｅ  ３．２２ｇ
１）−５  ＣＪハルトマン液５００・１０００ミリリットル（ＣＪ第一製糖）
１ＬのうちＣａｌｃｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ０．２７ｇ、Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ０．４ｇ、Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ６ｇ、Ｓｏｄｉｕｍ  Ｌａｃｔａｔｅ  ３．２２ｇ
１）−６  ＣＪハルトマン−ディ液５００・１０００ミリリットル（ＣＪ第一製糖）
１００ｍｌのうちＣａｌｃｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ２０ｍｇ、Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  ５ｇ、Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ３０ｍｇ、Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ６００ｍｇ、Ｓｏｄｉｕｍ  Ｌａｃｔａｔｅ  ６２０ｍｇ
１）−７  ビーブラウンハルトマン液５００・１０００ミリリットル（ビーブラウンコリア）
１００ｍｌのうちＣａｌｃｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ０．０２７ｇ、Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ０．０４ｇ、Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ０．６ｇ、Ｓｏｄｉｕｍ  Ｌａｃｔａｔｅ  ０．３１２ｇ
１）−８  大韓滅菌生理食塩水５０・１００・１５０・２００・５００・１０００・３０００ミリリットル
２５０ｍｌのうちＳｏｄｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ２．２５ｇ
２）ＭｇＳＯ４  ａｎｈｙｄ．
無色透明の液を充填した無色透明のガラスアンプル又はプラスチック製水性注射剤容器
２）−１  大韓硫酸マグネシウム１０％・５０％注（大韓薬品工業）
２０ｍｌ／ＡのうちＭａｇｎｅｓｓｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ  ２ｇ
２）−２  マグネシン注射液（大元製薬）
２０ｍｌ／ＡのうちＭａｇｎｅｓｓｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ  １０ｇ
２）−３  第一製薬硫酸マグネシウム注射液５０％（第一製薬）
２０ｍｌ／ＡのうちＭａｇｎｅｓｓｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ  １０ｇ
２）−４  マシ注射１０・５０％（ヒューオンス）
２０ｍｌ／ＡのうちＭａｇｎｅｓｓｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ  １０ｇ
３）Ｆｅ（ＮＯ３）３・９Ｈ２Ｏ
濃い茶褐色の不透明な水溶性液が無色透明のバイアルに入った注射剤
３）−１  フェリンジェクト注２・１０ｍｌ
１ｍｌ当たりｆｅｒｒｉｃ  ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ  ｃａｒｂｏｘｙｍａｌｔｏｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  １８０ｍｇ（鉄として５０ｍｇ）
３）−２  ベノフェロム注（中外製薬）
５ｍｌ当たりｆｅｒｒｉｃ  ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ  ｓｕｃｒｏｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ２７００ｍｇ（鉄として２０ｍｇ／ｍｌ）
３）−３  フェロムメート液（中外製薬）
１ｍｌ／Ａ、５ｍｌのうちＦｅｒｒｉｃ  ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍａｌｔｏｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ３５７ｍｇ（１００ｍｇ  ａｓ  Ｆｅ３＋）
３）−４  フェロムキッド液（中外製薬）
１ｍｌ／Ａ、１００  ｍｌ当たりＦｅｒｒｉｃ  ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍａｌｔｏｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  １７．８５ｇ（５ｇ  ａｓ  Ｆｅ３＋）
３）−５  フェロムアイ液（中外新薬）
１００ｍｌのうちＦｅｒｒｉｃ  ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍａｌｔｏｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  １７．８５グラム
４）ＮａＨＣＯ３
無色アンプル内の無色液体又は無色透明のプラスチック製（ポリプロピレン、ポリエチレン）容器内の無色液体
４）−１  ディエイチデクス０．１５％２号液（大韓薬品工業）１２．６Ｌ／１００、Ｓｏｄｉｕｍ  Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  ５．８３ｇ
４）−２  プレゾール（ビー）液１０・１２．６リットル（大韓薬品工業）
１０Ｌ／１００、１０ＬのうちＳｏｄｉｕｍ  Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  ８４０ｇ
１２．６Ｌ／１００、１２．６ＬのうちＳｏｄｉｕｍ  Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  １０５８．４ｇ
４）−３  中外炭酸水素ナトリウム注８．４％（中外製薬）
２０ｍｌ／Ａ、Ｓｏｄｉｕｍ  Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  １．６８ｇ
４）−４  ヒューオンス炭酸水素ナトリウム注射液８．４％（ヒューオンス）
２０ｍｌ／Ａ、Ｓｏｄｉｕｍ  Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  １．６８ｇ
４）−５  大元炭酸水素ナトリウム注射液８．４％（大元製薬）
２０ｍｌ／Ａ、Ｓｏｄｉｕｍ  Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  １．６８ｇ
４）−６  第一炭酸水素ナトリウム注射液８．４％（第一製薬）
２０ｍｌ／Ａ、Ｓｏｄｉｕｍ  Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  １．６８ｇ
５）ＮａＨ２ＰＯ４・Ｎａ２ＨＰＯ４
無色透明の液剤
５）−１  レククリーン液（同仁堂製薬）
１ｍｌ／Ａ、Ｄｉｂａｓｉｃ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ６０ｍｇ、Ｍｏｎｏｂａｓｉｃ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  １６０ｍｇ
５）−２  ソルリン液（韓国ファーマ）
１ｍｌ／Ａ、Ｄｉｂａｓｉｃ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ６０ｍｇ、Ｍｏｎｏｂａｓｉｃ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  １６０ｍｇ
５）−３  フリートホスホソダ液（ユニメド製薬）
１ｍｌ／Ａ、Ｄｉｂａｓｉｃ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  １８０ｍｇ、Ｍｏｎｏｂａｓｉｃ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ４８０ｍｇ
５）−４  フリートイネマ（ユニメド製薬）
１ｍｌ／Ａ、Ｄｉｂａｓｉｃ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ６０ｍｇ、Ｍｏｎｏｂａｓｉｃ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  １６０ｍｇ
５）−５  コルクリーン液（太俊製薬）
１ｍｌ／Ａ、Ｄｉｂａｓｉｃ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  １８０ｍｇ、Ｍｏｎｏｂａｓｉｃ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ４８０ｍｇ
５）−６  コルクリーンエス液（太俊製薬）
１ｍｌ／Ａ、Ｄｉｂａｓｉｃ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ６０ｍｇ、Ｍｏｎｏｂａｓｉｃ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  １６０ｍｇ
５）−７  タメゾン注（国際薬品）
１ｍｌ／Ａ、Ｂｅｔａｍｅｔｈａｓｏｎｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ５．２ｍｇ（ｂｅｔａｍｅｔｈａｓｏｎｅとして４ｍｇ／ｍｌ）
５）−８  ハンオールベタメタゾン注（ハンオールバイオファーマ）
１ｍｌ／Ａ、Ｂｅｔａｍｅｔｈａｓｏｎｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ５．２ｍｇ（ｂｅｔａｍｅｔｈａｓｏｎｅとして４ｍｇ／ｍｌ）
５）−９  メディカベタメタゾンリン酸ナトリウム注（メディカコリア）
１ｍｌ／Ａ、Ｂｅｔａｍｅｔｈａｓｏｎｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ５．２ｍｇ（ｂｅｔａｍｅｔｈａｓｏｎｅとして４ｍｇ／ｍｌ）
５）−１０  東光ベタゾン注（東光製薬）
１ｍｌ／Ａ、Ｂｅｔａｍｅｔｈａｓｏｎｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ５．２ｍｇ（ｂｅｔａｍｅｔｈａｓｏｎｅとして４ｍｇ／ｍｌ）
【００２６】
その他の構成成分として
１）ブドウ糖は、下記の製品の中から一つを選択しうる。
無色アンプル内の無色液体又は無色透明のプラスチック製（ポリプロピレン、ポリエチレン）容器内の無色液体
１）−１  三省５％ブドウ糖注射液（三省製薬工業）
Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｎ／Ａ
１）−２  中外５０％ブドウ糖注射液１００・５００ｍｌ
１００ｍｌのうちＤｅｘｔｒｏｓｅ  ５０ｇ
１）−３  マロデクスディ注（日盛新薬）
デキストランＮ／Ａ、Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｎ／Ａ
１）−４  光明ブドウ糖注射液（ヒューオンス）
Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｎ／Ａ
１）−５  ミッシーコーラ５０液・７５液・１００液（同仁堂製薬）
Ｇｌｕｃｏｓｅ  ５０ｇ・７５ｇ・１００ｇ
１）−６  ディアソルエス液（太俊製薬）
１ｍｌのうちＧｌｕｃｏｓｅ  ０．５ｇ
１）−７  ヘマデクスディ注（三省製薬工業）
デキストランＮ／Ａ、Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｎ／Ａ
１）−８  大韓ブドウ糖注射液（５％）５０・１００・２００・５００・１０００ミリリットル
１００ｍｌのうちＤｅｘｔｒｏｓｅ  ５ｇ
大韓ブドウ糖注射液（１０％）５００・１０００ミリリットル
１００ｍｌのうちＤｅｘｔｒｏｓｅ  ５ｇ
大韓ブドウ糖注射液（２０％）
２０ｍｌ／Ａ、１００ｍｌのうちＤｅｘｔｒｏｓｅ  ２０ｇ
１）−９  グルオレンジ１００液（韓国マクナルティ）
１ｍｌ／Ａ、１ｍｌのうちＧｌｕｃｏｓｅ  ０．３３８ｇ
１）−１０  第一ブドウ糖注射液（第一製薬）
２０ｍｌ／Ａ、１００ｍｌのうちＤｅｘｔｒｏｓｅ  ２０ｇ
１）−１１  ＣＪ５％ブドウ糖注射液５０・１００・２００・５００・１０００ミリリットル
１００ｍｌのうちＤｅｘｔｒｏｓｅ  ５ｇ
１）−１２  中外５％５０・２００ミリリットル
１００ｍｌのうちＤｅｘｔｒｏｓｅ  ５ｇ
【００２７】
また、アミノ酸としては、下記製品の中から一つを選択しうる。
【００２８】
無色透明のガラス瓶に入った無色乃至淡黄色の透明な薬液として、輸液用ゴム栓をした注射剤
１）−１  クリニミクス８５注射・１リットル・１．５リットル（一洋薬品）
Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ８．５％（Ａ液１Ｌ）Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  ３３０ｇ（Ｂ液１Ｌ）
１）−２  中外トロファミン６％注・１００ミリリットル・２００ミリリットル（中外製薬）
１）−３  中外ヘパタミン注２５０ｍｌ（中外製薬）
１）−４  カプソル注２５０・５００ミリリットル（種根堂）
１）−５  永進イントラプシン１０％注２５０・５００ｍｌ（永進薬品）
１）−６  プロアミン注１０％（ハンオールバイオファーマ）
１）−７  ヘパビア注２５０・５００ｍｌ（大韓薬品工業）
１）−８  リブソル注５００ｍｌ（新風製薬）
１）−９  ハンオールモリヘパミン注（ハンオールバイオファーマ）
１）−１０  Ｎｅｐｈｒｉｓｏｌ  ５．６％（大韓薬品工業）
１）−１１  グラミン注２５０・５００ミリリットル（プレジニウスカビコリア）
１）−１２  Ｐｒｉｍｅｎｅ  １０％（バクスター）
１）−１３  ドクターラミン注（中外製薬）
１）−１４  アミノグル注２５０・５００・１０００ミリリットル（エムジーメディグリーン）
１）−１５  アミノベンインファント６％注（プレジニウスカビコリア）
１）−１６  アミノステリルケイイー１０％注（大韓薬品工業）
１）−１７  アミノプシンティピーエン注（永進薬品）
１）−１８  コンビプレクスエムシーティプラス注１２５０・１８７５ミリリットル（中外製薬）
１）−１９  コンビプレクスエムシーティペリ注１２５０・１８７５ミリリットル（中外製薬）
１）−２０  コンビプレクスエムシーティスペシャル注１２５０ミリリットル（中外製薬）
１）−２１  セロナミン注２５０ミリリットル（大韓薬品工業）
【００２９】
また、ビタミン類の供給源としては、下記製品を選択して使用しうる。
茶褐色のガラスバイアルに入った橙黄色の無臭の凍結乾燥粉末
１）−１  タミフル注（セルトリオン製薬）
１）−２  セーヌビット注射（バクスター）
また、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ製品としては、下記製品を選択しうる。
１）Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ  Ｂ
フンキゾン注射５０ミリグラム（韓国ビーエムエス製薬）
Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ  Ｂ  ５０ｍｇ
２）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  Ｓｕｌｆａｔｅ
種根堂硫酸ストレプトマイシン注（種根堂）
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  Ｓｕｌｆａｔｅ  １ｇ
３）Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  Ｇ  Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ
槿花ペニシリンジカリウム注射５００万Ｕ（槿花製薬）
また、浸透圧調節剤（Ｏｓｍｏｔｉｃｕｍ）として下記の構成成分を選択しうるが、
１）アルブミンとしては、
無色乃至浅黄色の透明な液が無色透明のバイアルに入った注射剤
１）−１  緑十字アルブミン注５％１００・２５０ミリリットル（緑十字）
１００ｍｌのうちＨｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ  ５ｇ
緑十字アルブミン注２０％５０・１００ミリリットル（緑十字）
１００ｍｌのうちＨｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ  ２０ｇ
１）−２  エスケーアルブミン５％注２５０ミリリットル（ＳＫケミカル）
１００ｍｌのうちＨｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ  ５ｇ
エスケーアルブミン２０％注５０・１００ミリリットル
１００ｍｌのうちＨｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ  ２０ｇ
２）デキストラン（コロイド溶液）としては、
若干の甘味のある無色の内容物が充填された無色ボトル
２）−１  ヘマデクスディ注（デキストラン４０注射液）（三省製薬工業）
デキストランＮ／Ａ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｎ／Ａ
２）−２  ＣＪデキストラン４０−ディ注射液（ＣＪ第一製糖）
５００ｍｌのうちＤｅｘｔｒａｎ  ４０  ５０ｇ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  ２５ｇ
を選ぶことができる。
【００３０】
本発明に対し、韓国以外に米国及び日本などで使用可能なビタミン供給用輸液又は注射製剤、アミノ酸供給用輸液又は注射製剤、及び無機塩供給用輸液又は注射製剤などの例を図１４乃至図１５及び図１６乃至図１７にそれぞれ示した。
【００３１】
本発明で「完全培養液」とは、実際に細胞を培養できる培養液を意味し、例えば、完全培養液＝市販培養液＋１０％血清の組成である。
【００３２】
以下、本発明を説明する。
【００３３】
本発明者らは、これまでの軟骨再生／修復のための細胞治療剤の開発を遂行してきて、この過程の中で得た知見に基づいて今後の再生医療の早期臨床化のために、細胞治療剤を含む各種の治療用細胞資源は、体外の培養過程を経るようになるが、毒性物質などを含んでいる殆どの市販培養液の利用から脱皮して、すでに医薬品として許可された輸液製剤及び注射液を用いて危険性のない培養液を製作する必要があると考えるようになった。
【００３４】
一般に、正常細胞及び細胞株を培養皿などの培養用の機資材内で保持又は増殖させるためには、適切に選ばれた完全な細胞培養液（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ）、又は無血清細胞培養液（ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ）によってなされる。完全な細胞培養液は、普通ＭＥＭ（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ）、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ）、Ｆ−１２Ｋ培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ培地（ＧＩＢＣＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、２００２  Ｃａｔａｌｏｇ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＮＹ：ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、２００２−２００３  Ｃａｔａｌｏｇ、Ｃａｍｂｒｅｘ、ＭＤ）などのような市販されている無血清の細胞培養液に全体の体積比約１０％の血清（ｓｅｒｕｍ）を混合したものをいう。主に用いられる血清は、牛から分離された牛胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ、別名ＦＢＳ）である。血清は、細胞増殖に非常に重要に関与すると思われる、知られたり知られていない様々な成分を含有していて、細胞培養においてほぼ必須的に使用される。したがって、たとえ培養機資材内で強制的適応過程を通じて細胞を無血清細胞培養液で保持又は増殖させることができるとしても（Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｄａｐｔｅｄ  ｔｏ  ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４，９７２−９７８（１９９３）；Ｈａｌｄａｎｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔａｂｌｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｆｒｏｍ  ＣＨＯ  ｃｅｌｌｓ  ａｄａｐｔｅｄ  ｔｏ  ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１５，３３６−３４６（１９９９）；Ｓｉｎａｃｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉａ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５，２４９−２５７（２０００））、細胞培養のより一般的な方式は、完全な細胞培養液を用いるものである。
【００３５】
また、本発明は、異種由来のＦｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｒｅｒｕｍ（ＦＢＳ）を使用しないｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ  ｓｅｒｕｍの原料を得るため、医療廃棄物として処理されている臍帯血（ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ）及び自家血（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｂｌｏｏｄ）の対象としてｓｅｒｕｍを準備して輸液製剤を基にしたｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｍｅｄｉｕｍを開発した。
【００３６】
Ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ培養液の製作の必要性は、細胞治療を目的として培養するときには、狂牛病などの危険性、今後の臨床試験の許可などの過程を考慮すると、異種物質の混入を最小限にすることが好ましい。
【００３７】
現行では、ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）が頻繁に使用されているが、本発明では、ＦＢＳを代替することができる、Ｈｕｍａｎ由来のｓｅｒｕｍ資源を開発（患者自身血液、臍帯血）する必要がある。
【００３８】
したがって、本発明は、ＦＢＳの代用として自家血液及び臍帯血由来の血清を用いて完全培養液（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｍｅｄｉｕｎ）を開発した。
【００３９】
参考までに、市販細胞培養用の培養液に対しては、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｓｉｔｅ／ｕｓ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ−ａｎｄ−Ｓｅｒｖｉｃｅｓ／Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／Ｃｅｌｌ−Ｃｕｌｔｕｒｅ／Ｍａｍｍａｌｉａｎ−Ｃｅｌｌ−Ｃｕｌｔｕｒｅ／Ｃｌａｓｓｉｃａｌ＿Ｍｅｄｉａ．ｈｔｍｌに詳しく記載されており、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、Ｆ−１０、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ  ｍｅｄｉｕｍ  １６４０等がある。
【００４０】
代表的な培養液のＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）の組成は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｓｉｔｅ／ｕｓ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／ｓｕｐｐｏｒｔ／Ｐｒｏｄｕｃｔ−Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ−Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｍｅｄｉａ＿ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ．１０．ｈｔｍｌに記載されており、その組成は、表１に記載されている。
【００４１】
【表１−１】
2015509725.tif 000003
【００４２】
【表１−２】
2015509725.tif 000004
【００４３】
本発明者らは、ＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）培養液の構成成分に基づいて、輸液製剤及び注射製剤を検討した。
【００４４】
先ず、ビタミンの供給源として基本成分は、タミフル注ＴＡＭＩＰＯＯＬ  ＩＮＪ．（セルトリオン製薬）を採択し、採択の理由は、これがＤＭＥＭ  Ｖｉｔａｍｉｎ必要成分８つのうち６つを満たし、欠乏した２つの成分であるイノシトール、コリン及び不足した葉酸は、個別輸液剤で補充可能であるためである。
【００４５】
また、ビタミンに対する代替可能品目としては、下記製品がある。
（イ）セーヌビット注射ＣＥＲＮＥＶＩＴ  ＩＮＪ．（バクスター）；必要成分のうち５つを満たし、ＤＭＥＭに含まれない微量の成分が７つとしてタミフル注が６つなのに比べて多かった。
また、ビタミン成分の補充のため、下記の３つの製品をそれぞれ又は組み合わせて使用しうる。
（イ）リビトル液（爪牙製薬）；タミフル注に欠乏しているイノシトールを１００ｍｌ当たり６０００ｍｇで補充する。
（ロ）Ｆｏｌｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ５ｍｇ  ｉｎ  １ｍｌ（ｐｈｅｂｒａ）；輸液剤の形態で溶液の製造が容易である。
（ハ）ピドキシン注（塩酸ピリドキシン）（大韓薬品工業）；ピリドキシン５０ｍｇを含むアンプル注射液としてタミフル注に不足のピリドキシン成分を補充する。
また、これらの成分の補充の代替可能な品目としては、下記の品目がある。
（イ）ウォルスビ液（同和薬品）；タミフル注欠乏成分であるイノシトールを１００ｍｌ当たり６０００ｍｇで補充する。
ＤＭＥＭ非添加物であるＣｙａｎｏｃｏｂａｌａｍｉｎが０．３ｍｇ含まれてリビトル液の３ｇより多い。
また、「アミノ酸」供給のために基本成分として、Ｐｒｉｍｅｎｅ１０％（バクスター）を採択した。この採択の理由は、この製品が幼小児用アミノ酸輸液剤としてＤＭＥＭに含まれた殆どのアミノ酸成分を含んでおり、必要な成分別の数値も似ているためである。
【００４６】
また、「無機塩」供給のために基本成分として下記５種の製品を単独又は組み合わせて使用しうる。
（イ）中外ハルトマン溶液（中外製薬）；Ｄｅｘｔｒｏｓｅ及びＤＭＥＭに含まれない無機質を含めず、カルシウム、カリウム及びナトリウムの数値が似ており、マグネシウムと鉄成分は、個別の補充が可能であるため、浸透圧を合わせやすい。
（ロ）大韓硫酸マグネシウム注１０％（大韓薬品）
（ハ）ペリンジェクト注（中外製薬）；ｍｌ当たりＦｅ５０ｍｇを含む高濃度の鉄分注射。
（ニ）大韓炭酸水素ナトリウム８．４％注（大韓薬品）；注射液形態であり、２０ｍｌのうちＳｏｄｉｕｍ  Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  １．６８ｍｇ含有。低廉な薬価。
（ホ）コルクリーン液（太俊製薬）；１ｍｌのうちｐＨを合わせるための成分としてＤｉｂａｓｉｃ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  １８０ｍｇとＭｏｎｏｂａｓｉｃ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ４８０ｍｇのみが含まれていて両成分間の割合が適当であるためである。
【００４７】
また、これら製品に対する代替可能品目としては、下記５種の製品を単独又は組み合わせて使用しうる。
（イ）ビーブラウンハルトマン液５００ｍｌ（ビーブラウンコリア）
（ロ）マグネシン注射液１０％（硫酸マグネシウム水化物）（大元製薬）
（ハ）ベノフェロム注（中外製薬）ｍｌ当たりＦｅ  ２０ｍｇ含有
（ニ）大元炭酸水素ナトリウム注射液（大元製薬）
（ホ）フォースパノル液（経口用リン酸ナトリウム液）（同仁堂製薬）
【００４８】
また、医療廃棄物として処理されている臍帯血（ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ）及び自家血（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｂｌｏｏｄ）の対象としてｓｅｒｕｍを準備し、前記輸液製剤を基にしたｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｍｅｄｉｕｍを開発した。
【発明の効果】
【００４９】
本発明から分かるように、本発明は、既に医薬品として許可された輸液製剤及び注射剤を用いて市販中の培養液と本発明の培養液の細胞の形態と成長の様相が相違して見えないため、市販の培養液代替などの用途として使用しうる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】本発明に使用された様々な組み合わせの細胞培養液を組成している輸液又は注射製剤であって、アミノ酸供給用輸液又は注射製剤、ビタミン供給用輸液又は注射製剤、無機塩供給用輸液又は注射製剤、ブドウ糖供給用輸液又は注射製剤、その他の補充物質輸液又は注射製剤、及び抗生及び抗真菌剤輸液又は注射製剤が含まれる。
【図２】アミノ酸供給用輸液又は注射製剤、ビタミン供給用輸液又は注射製剤、無機塩供給用輸液又は注射製剤、ブドウ糖供給用輸液又は注射製剤、その他の補充物質輸液又は注射製剤、及び抗生及び抗真菌剤輸液又は注射製剤をＤＭＥＭ−ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ（ＤＭＥＭ−ＨＧ）（１０３１３、Ｇｉｂｃｏ）と類似した構成成分と量になるように測定して製造したＦＣＭ−ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ（ＦＣＭ−ＨＧ）の組成を示す表である。
【図３】アミノ酸供給用輸液又は注射製剤、ビタミン供給用輸液又は注射製剤、無機塩供給用輸液又は注射製剤、ブドウ糖供給用輸液又は注射製剤、その他の補充物質輸液又は注射製剤、及び抗生及び抗真菌剤輸液又は注射製剤をＤＭＥＭ−ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ（ＤＭＥＭ−ＨＧ）（１０３１３、Ｇｉｂｃｏ）と類似した構成成分と量になるように測定して製造したＦＣＭ−ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ（ＦＣＭ−ＨＧ）の組成を示す表である。
【図４】図２〜図３に使用されたアミノ酸供給用輸液又は注射製剤、ビタミン供給用輸液又は注射製剤、無機塩供給用輸液又は注射製剤、ブドウ糖供給用輸液又は注射製剤、その他の補充物質輸液又は注射製剤、及び抗生及び抗真菌剤輸液又は注射製剤の写真である。
【図５】アミノ酸供給用輸液又は注射製剤、ビタミン供給用輸液又は注射製剤、無機塩供給用輸液又は注射製剤、ブドウ糖供給用輸液又は注射製剤、その他の補充物質輸液又は注射製剤、及び抗生及び抗真菌薬輸液又は注射製剤を組み合わせて製造された細胞培養液を示す写真であって、５ｍｌ  Ｐｒｉｍｅｎｅ  １０％ｉｎｆｕ．（Ｂａｘｔｅｒ、ＩＬ、ＵＳＡ）、１．２５ｍｌ  Ｔａｍｉｐｏｏｌ  ｉｎｊ．（Ｃｅｌｌｔｒｉｏｎ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）、５００ｍｌ  Ｈａｒｔｍａｎｎ’ｓ  ｓｏｌｎ．ｉｎｆｕ．（Ｄａｉ  Ｈａｎ  Ｐｈａｒｍ．Ｃｏ．，ＬＴＤ．、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）、４８５μＬ  ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ  １０％ｉｎｊ．（Ｄａｉ  Ｈａｎ  ＰＨａｒｍ．Ｃｏ．，ＬＴＤ．、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）、１μＬ  Ｆｅｒｉｎｊｅｃｔ  ｉｎｊ．（Ｃｈｏｏｎｇｗａｅ  Ｐｈａｒｍａ、Ｃｏ．，ＬＴＤ．、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）、２２ｍｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  ８．４％ｉｎｊ．（Ｈｕｏｎｓ  Ｃｏ．，ＬＴＤ、Ｇｙｕｎｇ  ｇｉ、Ｋｏｒｅａ）、１００μＬ  Ｃｏｌｃｌｅａｎ  ｉｎｊ．（Ｔａｅｊｏｏｎ  ＰＨａｒｍ  Ｃｏ．，ＬＴＤ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）、４．５ｍｌ  ５０％ｄｅｘｔｒｏｓｅ  ｉｎｊ．（Ｃｈｏｏｎｇｗａｅ  ＰＨａｒｍ．、Ｃｏ．，ＬＴＤ．、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）、１００，０００  ｕｎｉｔ／Ｌ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  Ｇ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｉｎｊ．（Ｇｕｎｈｗａ  ＰＨａｒ．Ｃｏ．，Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）、１００ｍｇ／Ｌ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｉｎｊ．（Ｃｈｏｎｇ  Ｋｕｎ  Ｄａｎｇ  Ｐｈａｒｍ．Ｃｏ．，ＬＴＤ．、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）、０．２５ｍｇ／Ｌ  ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎｅ  Ｂ  ｏｆ  Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ  ｉｎｊ．（ＢＭＳ  ＰＨａｒｍ．Ｋｏｒｅａ  Ｃｏ．，ＬＴＤ．、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）及び１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を混合し、０．２２μｍｆｉｌｔｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，ＮＹ、ＵＳＡ）でフィルターして製造する。
【図６】左側は、アミノ酸供給用輸液又は注射製剤、ビタミン供給用輸液又は注射製剤、無機塩供給用輸液又は注射製剤、ブドウ糖供給用輸液又は注射製剤、その他の補充物質輸液又は注射製剤、及び抗生及び抗真菌剤輸液又は注射製剤を組み合わせて製造された本発明の細胞培養液を用いた細胞培養写真で、右側は、市販のＤＭＥＭ−ＨＧ培地を使用した細胞培養写真である。
【図７】ｈｕｍａｎ  ｆａｔ  ｓｙｎｏｖｉｕｍ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ（ＦＳ−ＭＳＣｓ）の写真であって、Ａ、Ｂ、Ｃ：市販のＤＭＥＭ−ＨＧで培養したＨｕｍａｎ  Ｆａｔ  Ｓｙｎｏｖｉｕｍ  ｃｅｌｌ（左側から培養２４時間、４８時間、７２時間後）で、Ｄ、Ｅ、Ｆ：本発明のＦＣＭ−ＨＧで培養したＨｕｍａｎ  Ｆａｔ  Ｓｙｎｏｖｉｕｍ  ｃｅｌｌ（左側から培養２４時間、４８時間、７２時間後）の写真で、この結果から分かるように、市販中の培養液と本発明の培養液の細胞の形状と成長の様相が大幅に相違して見えず、特異な所見なしで類似していることが分かる。
【図８】図７のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆのｃｅｌｌをカウントして示したグラフであって、ＤＭＥＭ−ＨＧとＦＣＭ−ＨＧで培養したＨｕｍａｎ  Ｆａｔ  Ｓｙｎｏｖｉｕｍ  ｃｅｌｌは、時間の経過によって増殖した（２４時間、４８時間、７２時間）。ＤＭＥＭ−ＨＧで培養したＨｕｍａｎ  Ｆａｔ  Ｓｙｎｏｖｉｕｍ  ｃｅｌｌの数がＦＣＭ−ＨＧで培養したＨｕｍａｎ  Ｆａｔ  Ｓｙｎｏｖｉｕｍ  ｃｅｌｌより少し高かったが、統計学的な有意差は示さなかった（Ｐ＜０．０５）、細胞数測定器：ＡｃｃｕＣｈｉｐ  ｋｉｔ  ＡｄａｍＭＣｃｅｌｌｃｏｕｎｔｅｒ（ＮａｎｏＥｎＴｅｋＩｎｃ．、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）。
【図９】Ｈｕｍａｎ  Ｆａｔ  Ｓｙｎｏｖｉｕｍ  ｃｅｌｌを２４時間、４８時間、７２時間培養したＤＭＥＭ−ＨＧとＦＣＭ−ＨＧのｐＨを測定したグラフであって、Ｈｕｍａｎ  Ｆａｔ  Ｓｙｎｏｖｉｕｍ  ｃｅｌｌをそれぞれ培養したＤＭＥＭ−ＨＧとＦＣＭ−ＨＧは、時間の経過によってｐＨが次第に上昇する傾向を示す様相は同一であった（０時間、２４時間、４８時間、７２時間）。ＤＭＥＭ−ＨＧとＦＣＭ−ＨＧの比較の際、２群間の統計学的な有意差は示さなかった（Ｐ＜０．０５）、ｐＨ測定器：Ｍｅｔｔｌｅｒ  ＴｏｌｅｄｏＳｅｖｅｎＥａｓｙ  ｐＨ  ｍｅｔｅｒ。
【図１０】Ｈｕｍａｎ  Ｆａｔ  Ｓｙｎｏｖｉｕｍ  ｃｅｌｌを２４時間、４８時間、７２時間培養したＤＭＥＭ−ＨＧとＦＣＭ−ＨＧの浸透圧を測定したグラフであって、Ｈｕｍａｎ  Ｆａｔ  Ｓｙｎｏｖｉｕｍ  ｃｅｌｌをそれぞれ培養したＤＭＥＭ−ＨＧとＦＣＭ−ＨＧは時間の経過によって浸透圧が次第に上昇する傾向を示す様相は同一であった（培養０時間、２４時間、４８時間、７２時間）。ＤＭＥＭ−ＨＧとＦＣＭ−ＨＧの比較の際、２群間の統計学的な有意差は示さなかった（Ｐ＜０．０５）、浸透圧測定器：ＦｉｓｋｅＭｉｃｒｏ−Ｏｓｍｏｍｅｔｅｒ（Ｍｏｄｅｌ  ２１０）（ＦｉｓｋｅＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｉｎｃ．、ＭＡ、ＵＳＡ）。
【図１１】ｒａｔ  ｈｅａｒｔ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｈ９ｃ２（２−１）ｃｅｌｌｓ  ｌｉｎｅ（ＡＴＣＣ、ＶＡ、ＵＳＡ）の写真であって、Ａ、Ｂ、Ｃ：ＤＭＥＭ−ＨＧで培養したＲａｔ  Ｈ９ｃ２  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅの様子（左側から培養２４時間、４８時間、７２時間後）で、Ｄ、Ｅ、Ｆ：ＦＣＭ−ＨＧで培養したＲａｔ  Ｈ９ｃ２  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅの様子（左側から培養２４時間、４８時間、７２時間後）で、この結果から分かるように市販中の培養液と本発明の培養液の細胞の形状と成長の様相が相違して見えないため、特異な所見なしで類似することがわかる。
【図１２】本発明の培養に使用したＦＣＭ−ＨＧ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉａを１．５ｍｌのチューブに１ｍｌずつ分注して凍結乾燥した写真である。
【図１３】図１２の２０個の凍結乾燥粉末チューブを集めて５０ｍｌのチューブに集めたＦＣＭ−ＨＧ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉａ粉末であって、条件培養液（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）を凍結乾燥した粉末状の物質であって、この物質は、注射を含む生体内への移動方法を通じて治療、再生、健康増進の目的で使用されるものと予想される。
【図１４】米国で使用されうるビタミン供給用輸液又は注射製剤、アミノ酸供給用輸液又は注射製剤、無機塩供給用輸液又は注射製剤、ブドウ糖供給用輸液又は輸液製剤、無機塩補充物質、及び抗生及び抗真菌剤を含む輸液又は注射製剤のリストである。
【図１５】米国で使用されうるビタミン供給用輸液又は注射製剤、アミノ酸供給用輸液又は注射製剤、無機塩供給用輸液又は注射製剤、ブドウ糖供給用輸液又は輸液製剤、無機塩補充物質、及び抗生及び抗真菌剤を含む輸液又は注射製剤のリストである。
【図１６】日本で使用されうるビタミン供給用輸液又は注射製剤、アミノ酸供給用輸液又は注射製剤、無機塩供給用輸液又は注射製剤、ブドウ糖供給用輸液又は輸液製剤、無機塩補充物質、及び抗生及び抗真菌剤を含む輸液又は注射製剤リストである。
【図１７】日本で使用されうるビタミン供給用輸液又は注射製剤、アミノ酸供給用輸液又は注射製剤、無機塩供給用輸液又は注射製剤、ブドウ糖供給用輸液又は輸液製剤、無機塩補充物質、及び抗生及び抗真菌剤を含む輸液又は注射製剤リストである。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
以下、非限定的な実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。但し、下記実施例は、本発明を例示するための意図で記載されたものであって、本発明の範囲は、下記実施例により制限されるものと解釈されない。
【００５２】
実施例：Ｆｌｕｉｄ−ｂａｓｅｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ（ＦＣＭ）の製造
本発明のＦｌｕｉｄ−ｂａｓｅｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ（ＦＣＭ）を製造するため、無機塩（Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｓａｌｔｓ）を供給するための基本的な溶液としてビーブラウンハルトマン液５００・１０００ミリリットル（ビーブラウンコリア）を使用し、その製品は、１００ｍｌのうちＣａｌｃｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ０．０２７ｇ、Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ０．０４ｇ、Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ０．６ｇ、Ｓｏｄｉｕｍ  Ｌａｃｔａｔｅ  ０．３１２ｇを含む。
【００５３】
また、ＭｇＳＯ４  ａｎｈｙｄ．供給源として大韓硫酸マグネシウム１０％注（大韓薬品工業）を使用し、その製品は、２０ｍｌ／ＡのうちＭａｇｎｅｓｓｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ  ２ｇを含む。
【００５４】
また、Ｆｅ（ＮＯ３）３・９Ｈ２Ｏ供給源としてペリンジェクト注２・１０ｍｌを使用し、その製品は、１ｍｌ当たりｆｅｒｒｉｃ  ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ  ｃａｒｂｏｘｙｍａｌｔｏｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  １８０ｍｇ（鉄として５０ｍｇ）を含む。
【００５５】
また、ＮａＨＣＯ３供給源としてヒューオンス炭酸水素ナトリウム注射液８．４％（ヒューオンス）を使用し、その製品は、２０ｍｌ／Ａ、Ｓｏｄｉｕｍ  Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  １．６８ｇを含む。
【００５６】
また、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｎａ２ＨＰＯ４供給源としてコルクリーン液（太俊製薬）を使用し、その製品は、１ｍｌ／Ａ、Ｄｉｂａｓｉｃ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  １８０ｍｇ、Ｍｏｎｏｂａｓｉｃ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ４８０ｍｇを含む。
【００５７】
また、他の成分にブドウ糖供給源として中外５０％ブドウ糖注射液１００ｍｌを使用し、その製品は、１００ｍｌのうちＤｅｘｔｒｏｓｅ  ５０ｇを含む。
【００５８】
また、アミノ酸供給源としてＰｒｉｍｅｎｅ  １０％（バクスター）を使用し、その製品は、１０００ｍＬのうちＡｍｉｎｏａｃｅｔｉｃ  Ａｃｉｄ（Ｇｌｙｃｉｎｅ）４．００ｇ、Ｌ−ａｌａｎｉｎｅ  ８．００ｇ、Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ  ８．４０ｇ、Ｌ−ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ  ６．００ｇ、Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ  １．８９ｇ、Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ  １０．００ｇ、Ｌ−ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ３．８０ｇ、Ｌ−ｌｅｕｃｉｎｅ  １０．００ｇ、Ｌ−ｌｓｏｌｅｕｃｉｎｅ  ６．７０ｇ、Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ  ２２．００ｇ（Ｌ−リシンとして１１．００ｇ）、Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ２．４０ｇ、Ｌ−ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ＨＣｌ  ３．１８ｇ、Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ４．２０ｇ、Ｌ−ｐｒｏｌｉｎｅ  ３．００ｇ、Ｌ−ｓｅｒｉｎｅ  ４．００ｇ、Ｌ−ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ３．７０ｇ、Ｌ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ２．００ｇ、Ｌ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ０．４５ｇ、Ｌ−ｖａｌｉｎｅ  ７．６０ｇ、及びＴａｕｒｉｎｅ  ０．６０ｇを含む。
【００５９】
また、ビタミン供給源としてタミフル注（セルトリオン製薬）を使用し、その製品は、Ａｓｃｏｒｂｉｃ  Ａｃｉｄ  １００ｍｇ、Ｂｉｏｔｉｎ  ６０μｇ、Ｃｙａｎｏｃｏｂａｌａｍｉｎ  ５μｇ、Ｄｅｘｐａｎｔｈｅｎｏｌ  １５ｍｇ、Ｅｒｇｏｃａｌｃｉｆｅｒｏｌ  ２００Ｉ．Ｕ、Ｆｏｌｉｃ  Ａｃｉｄ  ４００μｇ、Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ  ４０ｍｇ、Ｐｙｒｉｄｏｘｉｎｅ  ＨＣｌ  ４．８６ｍｇ、Ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ    ３．６ｍｇ、Ｔｈｉａｍｉｎｅ  ＨＣｌ  ３．８１ｍｇ、ＴｏｃｏｐＨｅｒｏｌ  Ａｃｅｔａｔｅ  １０ｍｇ、及びＶｉｔａｍｉｎ  Ａ  ３３００Ｉ．Ｕを含み、Ｆｏｌｉｃ  Ａｃｉｄの補充のためにＦｏｌｉａｍｉｎ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（日本製品）を使用した。
【００６０】
また、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ供給源としてＡｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ  Ｂの供給のためにフンキゾン注射５０ミリグラム（韓国ビーエムエス製薬）を使用し、その製品は、Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ  Ｂ  ５０ｍｇを含み、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  Ｓｕｌｆａｔｅ供給のために種根堂硫酸ストレプトマイシン注（種根堂）を使用し、その製品は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  Ｓｕｌｆａｔｅ  １ｇを含み、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  Ｇ  Ｐｏｔａｓｓｉｕｍの供給のために槿花ペニシリンジカリウム注射５００万Ｕ（槿花製薬）を使用した。
【００６１】
本発明では、前記成分を図２及び図３に示された体積の比で混合してＦｌｕｉｄ−ｂａｓｅｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ（ＦＣＭ）を製造した。前記注射剤や輸液製剤の各成分を混合するときにはクリーンベンチ内で調剤して無菌状態を保持し、常温で混合した。混合後にはｃｏｒｎｉｎｇ  ｆｉｌｔｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ５００ｍｌを用いてフィルターした。
【００６２】
実験例：細胞培養の結果
前記実施例の本培養液は、図２及び図３の右側の成分分析表に表記したＤＭＥＭ−ＨＧ  １０３１３と同一及び／又は類似した成分を含む薬品の混合物であって、ＤＭＥＭの成分のうちＳｏｄｉｕｍ  Ｐｙｒｕｖａｔｅ、Ｌ−Ｃｙｓｔｉｎ  ＨＣｌ、Ｌ−Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ２Ｎａ２Ｈ２Ｏ、Ｃｈｏｌｉｎｅ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ｉ−Ｉｎｏｓｉｔｏｌの計５つの必須成分が欠落したり不足し、指示薬であるＰｈｅｎｏｌ  Ｒｅｄは除いた。また、ビタミン剤として使用したタミフル注には、微量のその他の成分が含まれている。本培養液でＲＩＮｍ、ＥＰＣ、ＰＳＹ、ＦＳ−ＭＳＣｓ、Ｈ９ｃ２（２−１）の５種のヒト由来、動物由来及び購入が可能な市販の細胞株の細胞を培養してそれぞれ１２時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後に細胞の状態を観察する実験を行なった。
【００６３】
前記細胞株のうちＲＩＮｍとＨ９ｃ２（２−１）は、ＡＴＣＣ会社から購入した細胞株であって、それぞれのカタログＮｏ．ＣＲＬ−２０５７（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ｒａｔ）Ｓｏｕｒｃｅ：Ｏｒｇａｎ−ｐａｎｃｒｅａｓ、Ｓｔｒａｉｎ−ＮＥＤＨ、Ｔｉｓｓｕｅ−ｉｓｌｅｔ  ｃｅｌｌ  ｔｕｍｏｒ、Ｄｉｓｅａｓｅ−ｉｎｓｕｌｉｎｏｍａ、Ｃｅｌｌ  Ｔｙｐｅ−ｂｅｔａ  ｃｅｌｌ）のカタログＮｏ．ＣＲＬ−１４４６（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ｒａｔ）Ｓｏｕｒｃｅ：Ｏｒｇａｎ−ｈｅａｒｔ、Ｓｔｒａｉｎ−ＢＤ１×、Ｔｉｓｓｕｅ−ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ）であり、ＥＰＣは、血管内皮−前駆細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）であって、参考文献を参考としてヒトの臍帯血を受けて実験室内の分離を通じて得て、ＰＳＹは、ｐｏｒｃｉｎｅ  ｓｙｎｏｖｉｕｍであって豚滑膜組織から、そしてＦＳ−ＭＳＣｓは、ヒト滑膜組織から参考文献を参考として実験室内でｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ１を用いて直接分離して培養した（Ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ３−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｃａｆｆｏｌｄ−ｆｒｅｅ  ｓｐｈｅｒｏｉｄ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｏｎ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、７：１、４２−４８、２０１０、Ｓａｎｇ−Ｍｏ  Ｋｗｏｎ、Ｊａｅ−Ｗｏｎ  Ｋｉｍ、ａｎｄ  Ｊｅｏｎｇ−Ｉｋ  Ｌｅｅ；Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｃａｆｆｏｌｄ−ｆｒｅｅ  ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ  ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ  ｓｙｎｏｖｉｕｍ＝ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｋｎｅｅ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｅｌｌｓ＆Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２２、２７５−２９０、２０１１、Ｊｅｏｎｇ  Ｉｋ  Ｌｅｅ、Ｍａｓａｔｏ  Ｓａｔｏ、Ｈｙｕｎ  Ｗｏｏ  Ｋｉｍ、ａｎｄ  Ｊｏｊｉ  Ｍｏｃｈｉｄａ）。
【００６４】
その結果を図７乃至図１１に示した。
【図２】
2015509725.tif 000005
【図３】
2015509725.tif 000006
【図８】
2015509725.tif 000007
【図９】
2015509725.tif 000008
【図１０】
2015509725.tif 000009
【図１４】
2015509725.tif 000010
【図１５】
2015509725.tif 000011
【図１６】
2015509725.tif 000012
【図１７】
2015509725.tif 000013
【図１】
2015509725.tif 000014
【図４】
2015509725.tif 000015
【図５】
2015509725.tif 000016
【図６】
2015509725.tif 000017
【図７】
2015509725.tif 000018
【図１１】
2015509725.tif 000019
【図１２】
2015509725.tif 000020
【図１３】
2015509725.tif 000021
【国際調査報告】
2015509725.tif 000022
2015509725.tif 000023
2015509725.tif 000024
2015509725.tif 000025