(57)【要約】本発明は、幼若動物の生殖腺成熟を阻害する方法であって、免疫学的に活性な分子（ＩＡＭ）または免疫学的に活性な分子をコードする核酸を含むベクターをこの幼若動物に投与することを含み、このＩＡＭがこの生殖腺内の標的タンパク質に特異的であり、これに結合し、またはその標的タンパク質に対する免疫応答を引き起こし、これによりこの生殖腺成熟を阻害する方法と、このような方法における使用のための分子と、を提供する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
幼若動物の生殖腺成熟を阻害する方法であって、免疫学的に活性な分子（ＩＡＭ）または免疫学的に活性な分子をコードする核酸を含むベクターを前記幼若動物に投与することを含み、前記ＩＡＭが前記生殖腺内の標的タンパク質に特異的であり、これに結合し、またはその標的タンパク質に対する免疫応答を引き起こし、これにより前記生殖腺成熟を阻害する、前記方法。
【請求項２】
前記免疫応答が、前記動物でのＢ細胞および／またはＴ細胞の刺激を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項３】
前記免疫応答が、前記標的タンパク質に特異的である抗体の生成、および／または前記標的タンパク質へのＴ細胞の結合を含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項４】
前記幼若動物の妊性の不可逆的減少を引き起こす、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＩＡＭが、抗原、抗体またはＦａｂもしくはｓｃＦｖ断片を含むその断片、あるいは二重特異性抗体、三重特異性抗体、ミニボディ、もしくは単一ドメイン抗体等の遺伝子操作変異体である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記ＩＡＭが抗原性ペプチドである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチドが１０〜４０アミノ酸の長さである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＩＡＭが異種抗原である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＩＡＭが担体タンパク質に連結されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的タンパク質が、構造的細胞表面タンパク質、細胞表面受容体、細胞相互作用タンパク質、シグナル伝達タンパク質、またはビタミン担体タンパク質である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的タンパク質が、透明帯Ｃ（ｚｐｃ）、ａ−キナーゼアンカータンパク質４（ＡＫＡＰ４）、精液精子尾部外側の密集繊維遺伝子３（ｏｄｆ３）、ＩＢ骨形態形成タンパク質受容体（Ａｌｋ６ｂ）、ビテロゲニン受容体（ＶｔｇＲ）、マンノース６−リン酸受容体（Ｍ６ＰＲ）、リンパ球抗原７５（ＣＤ２０５／Ｌｙ７５）、ラムノース結合レクチン１（ＳＴＬ１）、ラムノース結合レクチン２（ＳＴＬ２）、コネキシン４３（Ｃｘ４３）、精巣特異的タンパク質１（Ｔｐｘ−１／ＣＲＩＳＰ２）、インスリン様増殖因子３（ＩＧＦ３）、増殖分化因子９（ＧＤＦ９）、生殖腺体細胞由来増殖因子（ＧＳＤＦ）、抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）、インヒビンαサブユニット（ｉｎｈα）、骨形態形成タンパク質１５（ＢＭＰ１５）、リボフラビン担体タンパク質（ＲＣＰ）、精液精子接着分子１（ＳＰＡＭ１／ＰＨ−２０）、および精液精子関連抗原（１〜８）（ＳＰＡＧ８）からなるリストから選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記標的タンパク質が性別特異的でない、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記幼若動物が養殖動物である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記幼若動物が脊索動物である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記幼若動物が魚類である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記幼若動物が、タイセイヨウサケ（Ｓａｌｍｏ  ｓａｌａｒ）、ニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｍｙｋｉｓｓ）、タイセイヨウダラ（Ｇａｄｕｓ  ｍｏｒｈｕａ）、およびタイセイヨウオヒョウ（Ｈｉｐｐｏｇｌｏｓｓｕｓ  ｈｉｐｐｏｇｌｏｓｓｕｓ）からなるリストから選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
本明細書中の表１または２で定義されるペプチドを含む、または前記ペプチドからなる、１０〜４０アミノ酸の長さのペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は動物の、具体的には、魚類の、生殖腺成熟を阻害する方法に関連する。このような方法は、処置された動物の妊性を減少させることができる。
【背景技術】
【０００２】
ヒト人口の上昇および野生魚類群体の乱獲は、ヒトによる消費のために魚類の生産を増大させようとする、商業的養殖への大きな圧力が存在することを意味する。養殖魚の、市場サイズに達する前の性的成熟は、生産者が挙げる最も大きな問題の１つである。例えば、タイセイヨウダラでは、成熟は誕生して２年目に起こり、成長、状態、および魚肉の質の喪失をもたらす。また、生産場所から逃れた魚は天然の個体群を遺伝的に汚染し、それらの適応度に影響を与え得る。性的成熟後、エネルギーは筋肉成長の代わりに生殖腺成長に費やされる。他方で、生殖不能は食物エネルギーの筋肉への変換を増大させ、生殖腺の発達に転換される食物エネルギーを最小限にする。それゆえ、生殖不能の誘発は水産養殖産業では大きな関心事である。
【０００３】
生殖不能魚を生産するために最もよく使用される技術は、三倍性の誘発である。しかしながら、これは、各種について個々に開発されなければならない、いつでも生殖不能をもたらすわけではない、かつそれは多くの場合、発達上の奇形をもたらすので福祉問題を生ずる、扱いにくい手順である。
【０００４】
Ｓｌａｎｃｈｅｖら（ＰＮＡＳ（２００５）１０２，４０７４−４０７９）は、始原生殖細胞（ＰＧＣ）の除去が性的生殖不能個体の開発をもたらす、可能な代替アプローチを説明した。この研究では、ＰＧＣの生存に重要な遺伝子である、ｄｅａｄ  ｅｎｄの転写産物に対して方向付けられたアンチセンス分子が胚に注入された。ｄｅａｄ  ｅｎｄ転写産物の遺伝的ノックダウンをとおしたＰＧＣの除去は、いくつかの魚種で示されているが、この技術は高価なモルホリノオリゴヌクレオチドを使用し、それらは個々の単一の胚で、発生の１細胞段階の辺りで手動で微量注入され、このことは、これが大量方法に容易に変換され得ないことを意味する。
【０００５】
さらなるアプローチでは、標的化細胞除去が、ゼブラフィッシュ生殖腺で不妊を誘発するための有効な技術として示されている。この技術は、組織特異的プロモータの制御下でニトロレダクターゼ酵素（Ｎｔｒ）を発現するトランスジェニック系を用いて開発された。プロドラッグ、メトロニダゾール（Ｍｅｔ）のデリバリーに際して、ＮｔｒはＭｅｔを、細胞死を引き起こす細胞毒に変換する（Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ２４０：１９２９−１９３７）。有効ではあるが、ヒトの食物連鎖においてこのような機構を用いる、可能性のある技術は、ＧＭＯ技術およびヒトの健康を考慮して認識問題に直面するであろう。
【０００６】
養殖魚で生殖不能を誘発するためのさらなるアプローチは、米国特許第７，１９４，９７８号中に記載されている。ここで、生殖腺の発達は生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン系を妨害することにより中断される。これは、幼魚をＧＡＢＡまたはＧＡＢＡアゴニストに浸すことにより達成され、このことは早期発生中の生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子発現を変え、これは今度は生殖腺発達を阻害する。しかしながら、水産養殖産業はこの方法を取っていない。
【０００７】
上記の策の代替として、本発明者は免疫機構により生殖腺発達を損なう方法を提案する。免疫避妊ワクチンは多くの種で有効であることが示されているが（Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ６６［２０１１］４０−５０）、このプロセスは典型的に可逆的であり、成熟した配偶子の受精能力に影響を与えるために性的に成熟した動物が標的にされる。対照的に、幼若体における生殖腺発達を標的にすることにより、妊性の喪失は不可逆であることができる。さらに、これらの先行技術ワクチンは個体数成長を制限する目的を与え得る一方で、それらは生殖腺成熟および魚肉の質に対する関連効果を妨げないので、それらは水産養殖に好適ではない。
【発明の概要】
【０００８】
したがって、第１の態様において、本発明は以下のものを提供する。
【０００９】
幼若動物の生殖腺成熟を阻害する方法であって、免疫学的に活性な分子（ＩＡＭ）または免疫学的に活性な分子をコードする核酸を含むベクターをこの幼若動物に投与することを含み、この分子は生殖腺で標的タンパク質に結合する、または生殖腺で標的タンパク質に結合する抗体の生成を刺激する、方法。この投与はこの幼若動物で不可逆的な不妊をもたらすことができる。投与の成功はこの動物で妊性の減少をもたらすであろう。このような減少は典型的に不可逆である。
【００１０】
理論に束縛されるものではないが、投与（すなわち、ワクチン接種）は、Ｂ細胞およびＴ細胞両方を含み得る、免疫応答を誘発するであろうと考えられる。Ｂ細胞は抗体を分泌し、抗体は標的タンパク質に結合し、その機能を妨害する。Ｔ細胞は、例えば、細胞表面上の標的タンパク質への結合をとおして、細胞除去を直接的に引き起こすことができる。
【００１１】
したがって、別の見方では、本発明は、幼若動物の生殖腺成熟を阻害する方法であって、免疫学的に活性な分子（ＩＡＭ）または免疫学的に活性な分子をコードする核酸を含むベクターをこの幼若動物に投与することを含み、このＩＡＭが生殖腺内の標的タンパク質に特異的であり、これに結合し、またはその標的タンパク質に対する免疫応答を引き起こし、これにより生殖腺成熟を阻害する、方法を提供する。
【００１２】
好ましくは、免疫応答は、Ｂ細胞の活性化、および生殖腺で標的タンパク質に結合する抗体の生成、ならびに／またはＴ細胞の刺激、具体的には、生殖腺での標的タンパク質へのＴ細胞結合を含む。標的タンパク質への特異的なＴ細胞結合は、Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体をとおしてであることができ、このような結合は細胞死を引き起こすことができる。両方の細胞種の活性化は、マーカー遺伝子の上方調節により実施例で示される。
【００１３】
標的動物は幼若体である。すなわち、それらはまだ性的に成熟していない、その種の若い形態であるが、それらは表現型としては成体形に似ている。サケ類では、幼若段階はパーおよびスモルト段階と呼ばれる。幼若体では、成体と比較して、生殖腺の配偶子は成熟しておらず、それゆえ、生殖のために放出され得ない。したがって、幼若体は生殖腺の身体的構造のいくつかまたは全てを有してよいが、この生殖腺は、配偶子が成熟していない、または自然な生殖に参加することができない点で成熟していない。概して、生殖腺の発達は早くも胚の段階で開始し得る一方で、生殖腺の最終的な形態学的組織化は幼若段階で起こる。
【００１４】
成熟配偶子の欠損をとおした生殖無能に加えて、当業者は、例えば、ゼブラフィッシュではＭａａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｉｓｈ  Ｂｉｏｌｏｇｙ６２，８９５−９０６により、サケ類ではＤｚｉｅｗｕｌｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．１，４７−６１により記載されるような、生殖腺の研究をとおした幼若状態を評価する技術を知っている。したがって、生殖腺未熟は組織学的検査により、特に配偶子の検査をとおして決定することができる。配偶子の形態は、それらが成熟するにつれて変化する。例えば、完全に成熟した卵母細胞は時には段階Ｖとして分類される。精巣では、成熟配偶子は形態学的に明らかなスパーマトーザである。
【００１５】
下等および多くの高等脊椎動物の一般的な分類として、発生段階は（１）半数体配偶子、（２）胚、（３）幼体、（４）幼若体、および（５）成体である。したがって、胚または幼体は「幼若体」ではない。
【００１６】
幼若体の標的化は本発明の鍵となるものであり、種親、すなわち、性的に成熟した動物への、または胚への投与に基づく妊性の制御に対するアプローチと対照され得る。選択される投与経路により、幼若体以外の動物はＩＡＭに暴露され、かつ／またはＩＡＭを受容してもよいが、このような動物は本発明の方法の標的動物ではない。好ましくは、動物個体群内の幼若動物のみが投与される。
【００１７】
幼若体および生殖腺発達を標的にすることにより、標的動物での不可逆的不妊を達成することができる。このことは、性的に成熟した動物に投与され、妊性に対して一時的効果を有する、多くの免疫避妊薬と対照され得る。「不可逆的」不妊により、投与の成功後、この動物の寿命中、不妊を維持するために投与を続ける必要がないことを意味する（最初の処置は多数の投与を含んでもよいが）。生殖腺の自然な成熟が損なわれたため、生殖腺は効果的に永久に発育遅延し、幼若状態で一時停止し、または萎縮もしくは損傷を経験することさえあり得る。このような変化は不可逆的不妊をもたらし得る。
【００１８】
それにもかかわらず、任意の処置された個体群で、ある割合の動物がいくらかの程度の生殖能を保持し（または復帰し）得ることが理解されるであろう。したがって、「不妊」はこのことに基づいて理解される。個々の動物が処置され得る一方で、処置レジメンの成功は概して、個体群レベルで判断されるであろう。したがって、本発明の方法は典型的に、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、またはさらに少なくとも８０％の、個体群の生殖パフォーマンスの減少をもたらすであろう。全体としての個体群の受精能におけるこれらの変化は、例えば、生殖腺の完全な発育遅延から、生殖能のいくらかのまたは中程度の発育遅延および減少まで、様々な個々の応答を反映するであろう。好ましくは、処置された個体群中の４０％以下、より好ましくは２０％以下、またはさらに１０％の動物が処置後に正常な妊性を示すであろう。好ましくは、処置された動物のいくらか、例えば、これらの動物の少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０または６０％は生殖不能、すなわち、完全に不妊であろう。
【００１９】
したがって、さらなる態様では、本発明は、幼若動物個体群で生殖腺成熟を阻害する方法であって、免疫学的に活性な分子（ＩＡＭ）または免疫学的に活性な分子をコードする核酸を含むベクターをこの個体群に投与することを含み、この分子が生殖腺の標的タンパク質に結合し、または生殖腺の標的タンパク質に結合する抗体の生成を刺激する、方法を提供する。投与は好ましくは、この個体群で不可逆的に減少された生殖能力をもたらす。生殖パフォーマンスまたは能力は、同様の無処理の個体群に対して、および／または過去の標準状態に対して測定することができる。
【００２０】
別の見方では、本発明は、幼若動物個体群で生殖腺成熟を阻害する方法であって、免疫学的に活性な分子（ＩＡＭ）または免疫学的に活性な分子をコードする核酸を含むベクターをこの個体群に投与することを含み、このＩＡＭが生殖腺内の標的タンパク質に特異的であり、これに結合し、またはその標的タンパク質に対する免疫応答を引き起こし、これによりこの個体群中の動物の生殖腺成熟を阻害する、方法を提供する。
【００２１】
本発明の方法は妊性の減少、好ましくは妊性の不可逆的減少を引き起こすことができる。したがって、別の見方では、本発明は、幼若動物または幼若動物個体群で妊性を減少させる方法であって、免疫学的に活性な分子（ＩＡＭ）または免疫学的に活性な分子をコードする核酸を含むベクターをこの動物または動物個体群に投与することを含み、このＩＡＭが生殖腺内の標的タンパク質に特異的であり、これに結合し、またはその標的タンパク質に対する免疫応答を引き起こし、これによりこの動物（単数または複数）の生殖腺成熟を阻害する、方法を提供する。
【００２２】
好ましくは、本発明の方法は、生殖腺成長についてのエネルギー消費の減少のための筋肉成長の向上の結果として、畜産、具体的には水産養殖の産出高を改善する。したがって、別の見方では、本発明は、幼若動物または幼若動物個体群の筋肉成長を向上させる方法であって、免疫学的に活性な分子（ＩＡＭ）または免疫学的に活性な分子をコードする核酸を含むベクターをこの動物または動物個体群に投与することを含み、このＩＡＭが生殖腺内の標的タンパク質に特異的であり、これに結合し、またはその標的タンパク質に対する免疫応答を引き起こし、これによりこの動物（単数または複数）の生殖腺成熟を阻害する、方法を提供する。
【００２３】
筋肉成長の向上は対照群と比較して決定することができ、典型的に本発明の方法の長期的利益である。個々の動物の全体重量はより少なくてもよいが、いくつかの動物での、具体的には魚類での生殖腺の、重量に対する顕著な寄与から、筋肉の、食用の価値の高い魚肉の割合がそれでも増大され得る。
【００２４】
本発明の方法に従って、生殖腺成熟が阻害される。典型的に、正常な生殖腺の形態（および機能）の顕著な欠陥があり、正常な成体と比較して生殖腺質量の減少をもたらす。これらの動物は好ましくは、他の点では成体の大きさまで発達し、筋肉質量成長は好ましくは、正常な発達と同様に、またはさらに優れた様式で進行するであろう。幼若状態を確認する文脈で上記に議論されるように、生殖腺を分析し、成熟の阻害を確認し得る形態学的特徴を決定する技術が存在する。ホルモンレベルの測定は生殖腺成熟の阻害の成功を確認する代替の方法を提供するであろう。放出可能な配偶子の欠損、またはこれらの減少は生殖腺成熟の阻害の鍵となる標識である。生殖腺成熟が完全に妨げられた場合、この動物が性的に成熟するのに十分な週齢、月齢、年齢（適切なように）であるという事実にもかかわらず、配偶子は生殖のためにそこから放出され得ない。不妊の文脈で上記に議論されるように、個々の動物は生殖腺成熟のより多いまたはより少ない阻害を経験してもよく、成功は典型的に個体群レベルで判断されるであろうことが理解されるであろう。好ましくは、処置された動物のほとんど（例えば、少なくとも６０、または７０％）がいくらかの阻害を示すであろうし、いくらか、例えば、これらの動物の少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０または６０％が完全な阻害を示すであろう。
【００２５】
標的タンパク質は生殖腺で見られ、典型的に、生殖腺でのみまたは生殖腺で優勢に発現される点で、生殖腺に特異的である。標的タンパク質は典型的に生殖腺の発達または維持において構造的または調節的役割を有し、生殖細胞系タンパク質、または例えば、生殖腺構造全体での配偶子の支持的な体細胞のタンパク質のいずれかである。支持的な体細胞としては、精巣のセルトリ細胞およびライディッヒ細胞、ならびに卵巣の卵胞細胞および顆粒膜細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
標的タンパク質は、生殖腺の構造または機能でそれが果たす、または果たし得る役割のために選択された既知のタンパク質である。ＩＡＭはこの特異的標的タンパク質に対して反応性であるように、例えば、これに結合するように、この標的タンパク質に対して反応性の抗体を生成するように、かつ／またはこの標的タンパク質に特異的なＴ細胞応答を禁じるように設計される。したがって、ＩＡＭは所定の標的タンパク質に特異的である。本発明の方法は標的タンパク質の選択、およびその標的タンパク質に特異的なＩＡＭの設計または選択を含んでもよい。
【００２７】
好ましくは、ＩＡＭは抗原性ペプチド、好ましくは、組換え技術により、または新規ペプチド合成により作成されたペプチドである。この場合、ペプチド配列は所定のものであり、標的タンパク質のアミノ酸配列に基づく。天然配列の分析がなされ、抗原性が予想され得る。投与される抗原性ペプチドは異種抗原であってよい。すなわち、その配列は抗原性を向上させるために天然配列の相当領域とは異なる。抗原性ペプチドは便利には、１０〜４０アミノ酸、好ましくは１０〜２５アミノ酸、より好ましくは１２〜２０アミノ酸の長さである。抗原性ペプチドは、本明細書でさらに記載されるように、担体タンパク質に接合してもよい。ペプチドは典型的に、標的タンパク質の断片であり、または異種抗原の場合には、標的タンパク質の短い抗原性領域に対応する。したがって、ＩＡＭは好ましくは標的タンパク質全体ではなく、合成物であり、天然分子ではない。
【００２８】
（同じまたは異なる標的タンパク質に対する）１つ超のＩＡＭ、例えば、１つ超の抗原が投与され得ることが可能である一方で、各場合には、ＩＡＭは、このＩＡＭの設計、選択、および／または生成で選択され、使用された特異的標的タンパク質を有するであろう。したがって、動物に投与される調合物の反応性、例えば、抗原性は制御され、予期しない交差反応性により引き起こされる任意の副作用がなく、予想可能である。
【００２９】
生殖腺内の単一のタンパク質を標的にすることが生殖腺成熟、ならびにこれにより機能および妊性の基礎的な欠陥を引き起こすことができるということは、本発明の驚くべき利点である。
【００３０】
生殖腺トランスクリプトームのデータベースが存在し、例えば、ゼブラフィッシュについてはＳｒｅｅｎｉｖａｓａｎ  ｅｔ  ａｌ  ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ６（４），ｅ １８１８１により示されている。好適な標的はこのようなデータベースおよび文献から特定することができる。原理は、生殖腺の発達が生殖腺発達に関連する鍵となるタンパク質に対する免疫化をとおして中断されることである。
【００３１】
好適な標的タンパク質は構造的細胞表面タンパク質、細胞表面受容体、細胞相互作用タンパク質、シグナル伝達タンパク質、およびビタミン担体タンパク質を含む。細胞表面受容体は特に好ましく、理論に束縛されるものではないが、ＢおよびＴ細胞両方が仲介する効果がこの範疇の標的タンパク質について生殖腺成熟を損なうと考えられる。シグナル伝達タンパク質は、対照的に、Ｂ細胞により分泌される抗体に依存する傾向があり、一方で、標的タンパク質が構造的表面タンパク質であるときＴ細胞応答は生殖腺欠陥で最も重要な役割を果たすと考えられる。各範疇の標的の例は以下に与えられる。シグナル伝達リガンドはさらなるクラスの好ましい標的タンパク質である。
【００３２】
構造的表面タンパク質：
透明帯Ｃ−Ａ卵母細胞に局在する糖タンパク質。これは卵母細胞構造および受精の両方で役割を果たす。免疫化されたとき、受精の予防、および卵巣病理の両方の証拠がある。
【００３３】
Ａ−キナーゼアンカータンパク質４（ＡＫＡＰ４）−これは精液精子鞭毛に関連付けられる構造タンパク質である。これは脊椎動物でよく保存されており、ゼブラフィッシュ精巣で発現される。
【００３４】
精液精子尾部外側の密集繊維遺伝子３（ｏｄｆ３）−ヒトでは、このタンパク質は精液精子尾部の構造の主要な構成成分である。この遺伝子はゼブラフィッシュ精巣で強く上方調節される。
【００３５】
細胞表面受容体：
ＩＢ骨形態形成タンパク質受容体（Ａｌｋ６ｂ）−これは、生殖細胞形成、発達、および成熟で重要な役割を果たす、ＢＭＰシグナル伝達の受容体である。これは生殖細胞、精母細胞、ならびに段階ＩおよびＩＩの卵母細胞で発現される。ゼブラフィッシュ変異は生殖細胞分化を妨げ、生殖細胞腫瘍をもたらす。
【００３６】
ビテロゲニン受容体（ＶｔｇＲ）−ビテロゲニン（Ｖｔｇ）は卵母細胞発達に必須である。ＶｔｇＲ（単数または複数）は、Ｖｔｇ、およびリボフラビン等の他の重要な栄養素の、細胞への取り込みを促進するために卵母細胞により発現されるリポタンパク質受容体である。
【００３７】
マンノース６−リン酸受容体（Ｍ６ＰＲ）−この受容体は精母細胞、精子細胞、およびセルトリ細胞の表面で見られる。これは生殖細胞−セルトリ細胞相互作用で仲介物質の役割を果たすと考えられる。
【００３８】
リンパ球抗原７５（ＣＤ２０５／Ｌｙ７５）−このタンパク質はマクロファージマンノース受容体（ＭＭＲ）ファミリーに属する受容体である。哺乳類では、その役割は樹状細胞と関連付けられた抗原取り込み、プロセッシング、および提示を特徴とする。魚類では、ＣＤ２０５は生殖細胞ならびに早期段階の精原細胞および卵母細胞の表面上で発現される。
【００３９】
ラムノース結合レクチン−（ＳＴＬ１／ＳＴＬ２）−これらはニジマス卵母細胞の表面上で見られる。これらの正確な生理学上の機能は未知である。これらの転写産物はゼブラフィッシュ卵巣で上方調節されることが示された。
【００４０】
細胞相互作用タンパク質：
コネキシン４３（Ｃｘ４３）−コネキシンは、会合して細胞間ギャップ接合部を形成する膜貫通タンパク質である。Ｃｘ４３は精巣および卵巣で見られる優勢なコネキシンである。
【００４１】
精巣特異的タンパク質１（Ｔｐｘ−１／ＣＲＩＳＰ２）−セルトリ細胞および精細胞の相互作用に重要な精巣特異的接着分子。
【００４２】
精液精子接着分子１（ＳＰＡＭ１／ＰＨ−２０）−ヒアルロニダーゼ（酵素）活性を有する精液精子細胞表面受容体。これは、精液精子が、（哺乳類で）卵母細胞を囲むヒアルロン酸富化卵丘細胞層を貫通することを可能にする。これは精液精子透明帯接着に関連する。
【００４３】
精液精子関連抗原（１〜８）（ＳＰＡＧ８）−精液精子細胞表面受容体。これは（ＰＨ−２０と同様に）精子の先体領域に局在し、（哺乳類で）精子形成で役割を果たす。
【００４４】
シグナル伝達リガンド：
インスリン様増殖因子３（ＩＧＦ３）−ＩＧＦ３は硬骨魚類でのみ見られる生殖腺特異的インスリン様増殖因子サブタイプである。これは卵巣機能、特に卵母細胞成熟に連接されている。他の研究は、これが生殖腺ステロイド産生の調節に関連することを示している。
【００４５】
増殖分化因子９（ＧＤＦ９）−ＧＤＦ９は形質転換増殖因子βファミリーの卵母細胞特異的増殖因子である。これは初期成長段階中の卵母細胞で強く発現される。
【００４６】
生殖腺体細胞由来増殖因子（ＧＳＤＦ）−ＧＳＤＦは顆粒膜細胞およびセルトリ細胞の両方により発現される増殖因子である。これは生殖細胞増殖で重要な役割を果たす。
【００４７】
抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）−ＡＭＨは増殖および分化因子の形質転換増殖因子βファミリーの１構成員である。これは雄性決定で重要な役割を果たす。
【００４８】
インヒビンαサブユニット（ｉｎｈα）−ｉｎｈαは増殖および分化因子の形質転換増殖因子βファミリーの１構成員である。これは初期卵母細胞成長、卵胞形成、および卵黄形成中に顆粒膜細胞により発現される。
【００４９】
骨形態形成タンパク質１５（ＢＭＰ１５）−ＢＭＰ１５は増殖および分化因子の形質転換増殖因子βファミリーの１構成員である。このシグナル伝達は哺乳類の雌で正常な妊性に重要である。
【００５０】
ビタミン担体タンパク質：
リボフラビン担体タンパク質（ＲＣＰ）−リボフラビン（Ｂ２）は胚発生に重要なビタミンである。ビタミン沈着を効果的に予防する、ＲＣＰについての免疫化は哺乳類での免疫避妊薬として有効であった。
【００５１】
上記標的の多くは魚類に特異的であるが、相当するタンパク質は他の種の生殖腺に、例えば、哺乳類に存在し、これらはさらなる好適な標的を示す。
【００５２】
本発明の方法は抗体または他の抗原結合分子の、標的タンパク質に結合し、その正常な機能を妨害する能力を利用し、この場合に、このことは生殖腺成熟の阻害を引き起こす。生殖腺成熟の阻害は、例えば、細胞毒性Ｔ細胞の刺激を含む、導入された抗原に対する他の自己免疫応答によってもまた引き起こすことができる。用語「免疫学的に活性な分子」（ＩＡＭ）は抗体および抗原の両方、およびＦａｂまたはｓｃＦｖ断片等の抗体断片、ならびに二重特異性抗体、三重特異性抗体、ミニボディ、および単一ドメイン抗体等の遺伝子操作変異体を含む。分子ライブラリの作成およびアフィニティスクリーニングの最近の進歩は、ある抗原標的に特異的なアフィニティを有する結合タンパク質の特定は比較的簡単であることを意味している。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであってよい。
【００５３】
投与されたＩＡＭは幼若動物で標的タンパク質に結合し、もしくは標的タンパク質に結合する抗体生成を刺激し、または標的タンパク質に結合するＴ細胞等の、細胞毒性細胞の生成を刺激し得る。動物で抗体作成を駆り立てるために使用される抗原は、Ａｂ生成を含む、免疫応答を向上させるために標的種の抗原とは異なってよいが（すなわち、異種抗原）、生成される抗体が問題の幼若動物で標的タンパク質に結合するために、同様の種でも十分である（例えば、ゼブラフィッシュについてタイセイヨウサケ、および逆もまた同様）。これは古典的ワクチンモデルである。実施例に記載されるように、標的タンパク質配列内からの抗原性ペプチドの選択方法は本分野で既知である（例えば、Ｈｏｐｐ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ７８，３８２４−３８２８）。
【００５４】
あるいは、標的タンパク質に対する抗体はホスト動物で作成され、この幼若動物に投与されてもよい。動物の免疫系は導入された抗原に対する抗体を作成し、有効な濃度が調節され得る一方で、遅延が全くないので、これは即時衝撃の利点を有する。他の状況では、抗原の投与は、それらは典型的に生成するのが安く、体腔に容易に投与され、より広い自己免疫応答を禁じ得るので、好ましくあり得る。
【００５５】
本明細書の実験の節は、ＩＡＭの作成プロトコルについて詳細を提供する。さらに、上記に議論される標的タンパク質の多くに対する、具体的にはＺｐｃに対する、いくつかの市販の抗体がある。好適な抗原ベースのワクチンはＫｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ（上記）に記載されている。ＳｐａｙＶａｃはＺｐに対するさらなる抗原ベースのワクチンである。また、可逆的な免疫避妊薬の成功は霊長類でｅｐｐｉｎを標的にすることにより示されており（Ｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．［２００４］Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０６，５６９９，ｐｐ１１８９−１１９０）、このことは本発明の方法に従って幼若体を処置することにおけるこのようなワクチンの役割を示唆する。同様に、国際公開第ＷＯ００／３７１００号は、性的に成熟した魚類および鳥類の免疫避妊ワクチンとして透明帯の硬骨魚類ホモログの使用を教示する。
【００５６】
好ましい抗原性ペプチド（ＩＡＭ）は表１および２で特定され、これらの分子およびそれら（ただし、標的タンパク質全長ではない）を組み込むより大きなペプチド、ならびに担体タンパク質に接合されたこれらのペプチドは本発明のさらなる態様を構成する。表２のペプチドはこれらの実施形態で好ましい。
【００５７】
ワクチンアプローチでは、補助剤、例えば、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、ＭＦ８９、Ｇｅｒｂｕ、Ｔｉｔｅｒｍａｘ、またはＭｏｎｔａｎｉｄｅが好ましく、共投与される。
【００５８】
ＩＡＭ、例えば、精製抗体もしくは抗血清または抗原は任意の好適な担体または調合物中で、例えば、ＰＢＳ等の単純な緩衝液中でまたはリポソームもしくはＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）等の目的に合わせた送達媒体中で投与してもよい。抗原は便利に、微粒子もしくはウイルス様粒子、または細菌ゴーストまたは生きた細菌もしくはウイルスベクターで送達してもよい。ＫｅｒｒらはＢｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（１９９９）６１，６０３−６１３で、ウサギ成体においてではあるが、生殖腺タンパク質に対する抗体を作成するための抗原または抗原を発現するウイルスの送達の成功技術を説明する。しかしながら、好ましくは、ＩＡＭは細菌またはウイルスベクターの部分として投与されず、具体的には好ましくは、生きたベクターで投与されない。
【００５９】
投与される抗原は、おそらく１０以下、またはさらにそれより少ないアミノ酸、好ましくは１０〜２０アミノ酸の、単一のエピトープから構成されてもよい。便利には、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＰｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｔｏｏｌを、抗原を設計するために使用してもよい。このような小抗原は便利に、マレイミド活性化ＫＬＨ等の、担体タンパク質に連結され得る。このような接合は便利に、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈにより提供されるような、キットを用いて行われる。
【００６０】
ＩＡＭの直接投与の代替として、ＩＡＭをコードする核酸分子、具体的には抗原をコードするＤＮＡワクチン、例えば、細菌、ウイルス、またはプラスミドベクターを送達することは好ましくあり得る。このようなベクターは当業者に周知である。好適なウイルスワクチンは欠肢を利用するもの、粘液腫等のポックスウイルス、またはワクシニアウイルスを含む。Ｈａｒｄｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ７１，１０２−１１１は、免疫避妊薬用ウイルスベクターを説明し、このような分子および技術は本発明の方法に準用して適用する。
【００６１】
投与はワクチンの送達のための、またはより一般的には生物学的医薬の送達のための、任意の便利な手段であってよい。投与は粘膜表面を経由して、具体的には経口投与によって、または非経口経路を経由して、例えば、皮下、腹腔内、筋内、静脈内、もしくは皮内経路によってもよい。注入および経口の投与方法は好ましい経路である。魚類では、投与は好ましくは注入によるが、経口、具体的にはウイルスベースのワクチンで、より好ましくは例えば腹腔、例えば骨盤帯後部への、腹腔内注入によって、または例えば背びれ下の、筋内注入によってもよい。筋内投与は抗体の送達に特に好適である。
【００６２】
投与は好ましくは単一の用量であるが、繰り返される１回、またはそれ以上の回数（例えば、２〜５回）等の、多数の用量（ブースター用量）であってよい。
【００６３】
投与は動物飼料中であってよく、１つ以上の飼料原料および本明細書に定義されるＩＡＭまたはＩＡＭをコードする核酸を含む動物飼料調合物は本発明のさらなる態様である。好ましい飼料調合物は魚類飼料である。典型的に、飼料は、任意に微量栄養素を伴う、炭水化物、タンパク質、繊維、および／または脂質の源を含むであろう。本発明の分子および組成物を、幼若魚を飼っているタンク中の水に添加することは有益であり得る。
【００６４】
抗体または抗原の投与は典型的に、体重０．１ｇ当たり０．２〜１０μｌ、例えば、１〜５μｌの調合物の送達を含むであろう。
【００６５】
ＩＡＭまたはＩＡＭをコードする核酸を含む調合物は典型的に溶液、懸濁物、または乳濁液であろう。好適な希釈物または担体は本分野で周知である。
【００６６】
本発明に従って処置される動物は非ヒト動物、典型的にはヒトの食物連鎖の動物、すなわち、ヒトが消費し、ヒトが養殖する動物である。好ましい動物は脊索動物であり、哺乳類または非哺乳類であってよい。特に好ましいものは魚類、特に硬骨魚類、具体的には養殖魚である。養殖動物、畜産（陸生または水生）、および家畜または害虫動物は好適な標的である。特に興味深い種はタイセイヨウサケ（Ｓａｌｍｏ  ｓａｌａｒ）、ニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｍｙｋｉｓｓ）、タイセイヨウダラ（Ｇａｄｕｓ  ｍｏｒｈｕａ）、およびタイセイヨウオヒョウ（Ｈｉｐｐｏｇｌｏｓｓｕｓ  ｈｉｐｐｏｇｌｏｓｓｕｓ）を含む。ゼブラフィッシュ等の実験種もまた興味深い。
【００６７】
雄および雌動物の両方が本発明に従って標的にすることができ、時には標的タンパク質としてただ１つまたは他方が性別特異的であり得るが、いくつかの標的タンパク質、例えばＧＳＤＦ（生殖腺体細胞由来因子）は性別特異的ではなく、性別特異的ではないＩＡＭは本発明に従って特に好ましい。単一のＩＡＭまたは単一の標的タンパク質が雄および雌の両方で生殖腺成熟を阻害するために使用され得ることは本発明のさらなる驚くべき利点である。雌を標的にすることは好ましくあり得る。
【００６８】
本発明は、免疫学的に活性な分子（ＩＡＭ）または免疫学的に活性な分子をコードする核酸を含むベクターを提供し、この分子は、幼若動物の生殖腺成熟の阻害での使用のために、生殖腺の標的タンパク質に結合し、または生殖腺の標的タンパク質に結合する抗体の生成を刺激する。
【００６９】
さらなる態様では、本発明は、免疫学的に活性な分子（ＩＡＭ）または免疫学的に活性な分子をコードする核酸を含むベクターを提供し、このＩＡＭは、幼若動物の生殖腺成熟の阻害での使用のために、生殖腺内の標的タンパク質に特異的であり、これに結合することができ、またはその標的タンパク質に対する免疫応答を引き起こすことができる。
【００７０】
またさらなる態様では、本発明は、免疫学的に活性な分子（ＩＡＭ）または免疫学的に活性な分子をコードする核酸を含むベクターを提供し、この分子は、幼若動物での妊性の不可逆的減少での使用のために、生殖腺内の標的タンパク質に結合し、または生殖腺内の標的タンパク質に結合する抗体の生成を刺激する。
【００７１】
またさらなる態様では、本発明は、免疫学的に活性な分子（ＩＡＭ）または免疫学的に活性な分子をコードする核酸を含むベクターを提供し、このＩＡＭは、幼若動物での妊性の不可逆的減少での使用のために、生殖腺内の標的タンパク質に特異的であり、これに結合することができ、またはその標的タンパク質に対する免疫応答を引き起こすことができる。
【００７２】
上記に記載される方法の好ましい態様は、これらの使用に等しく適用する。これらの使用はまた、幼若動物個体群に適用される方法に、準用して適用する。代替の使用は妊性を減少させること、および筋肉成長を向上させることを含む。
【００７３】
さらなる態様では、本発明は、幼若動物で妊性を（不可逆的に）減少させる、または幼若動物で筋肉成長を向上させるための、幼若動物の生殖腺成熟を阻害するための剤の製造における、本明細書で定義されるＩＡＭの使用を提供する。
【００７４】
上記に定義されるＩＡＭおよびこれらをコードする核酸分子は本発明のさらなる態様を構成し、これらを含む組成物、具体的には医薬調合物または飼料調合物、およびこれらの使用もまた本発明のさらなる態様を構成する。好ましい医薬調合物は、任意に補助剤もまた含有する、ワクチン調合物である。
【００７５】
いくつかの実施形態では、雄生殖腺の標的タンパク質は好ましく、あるいは雌標的タンパク質が選択される場合、これらは透明帯／放射帯を含まず、具体的にはＺＰ−３（またはこれに相当するタンパク質）は含まれない。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
本発明はここで、以下の非限定的な実験の節および実施例で、ならびに以下の図を参照して、さらに説明される。
【００７７】
【図１】試験抗原で免疫化された幼若ゼブラフィッシュの平均重量（Ａ）および長さ（Ｂ）の分布を示す。図（Ａ）では、１５日目のデータは左側のバーで、３０日目のデータは右側のバーで示される。図（Ｂ）では、０日目のデータは左側のバーで、１５日目のデータは中央のバーで、３０日目のデータは右側のバーで示される。アステリスクは対照群と有意に異なる変異体を示す（ｐ＜０．０５）。Ｔバーは標準偏差を示す。
【図２】落射蛍光下でのｔｇ（ｖａｓ：：ｅｇｆｐ）ゼブラフィッシュ生殖腺の卵巣（Ａ）および精巣（Ｂ）のＧＦＰシグナルを示す。卵巣では、段階ＩＢ卵母細胞が見られる。ＧＦＰタンパク質は細胞質に一過性に分布し、特に強いシグナルが核の周りに見える（矢印）。精巣では、精原細胞（Ｓｇ）でのみ強いシグナルが観察され、一方で、精母細胞（Ｓｃ）のシグナルは明らかにより弱い。目盛りバーは１００μｍを示す。
【図３】処置後１５日目のゼブラフィッシュの前卵黄形成卵巣発達（段階ＩＢ）の表示を示す。正常な発達パターンでは、より進んだ段階が卵巣の内側にあり、一方で早期段階は縁に優勢に密集する。図３Ａは、対照魚３６．８ｍｇ、１７．２ｍｍの組織切片を示す。図３Ｂは、対照魚（５７．９ｍｇ、２０．０ｍｍ）のＡｐｏＴｏｍｅ画像を示す。図３Ｃは、抗ＣＤ２０５処置魚（６９．４ｍｇ、２１．０ｍｍ）の卵巣のＡｐｏＴｏｍｅ画像を示す。図３Ｃは、様々な発達段階が混成していることを示す。Ｐｏｃ１−段階１の初期卵母細胞、Ｐｏｃ２−段階２の初期卵母細胞、Ｏｏ−卵原細胞。目盛りバーは５０μｍ（図３Ａ）および１００μｍ（図３Ｂおよび３Ｃ）を示す。
【図４】処置後３０日目の、処置されたゼブラフィッシュの前卵黄形成卵母細胞および卵黄形成卵母細胞（段階ＩＩ〜ＩＶ）での閉鎖および萎縮を示す。図４Ａは、対照魚（２１６ｍｇ、２９．９ｍｍ）、表層胞段階（段階ＩＩＩ）の正常な発達を示す。２つの卵胞は厚い放射帯を有する。図４Ｂは、同じ発達段階の抗ＣＤ２０５処置魚（２４１ｍｇ、３０．５ｍｍ）の卵巣を示す。放射帯がより薄く、放射帯の陥入は閉鎖を示し、萎縮性卵胞が見られる。図４Ｃは、抗ＣＤ２０５処置魚（２２２ｍｇ、３０．４ｍｍ）の、卵巣発達の段階ＩＩの、卵巣の萎縮性卵胞を示す。図４Ｄは、萎縮を伴う、抗ＧＳＤＦｂ処置魚（３２６ｍｇおよび３１．９ｍｍ）の前卵黄形成卵母細胞および卵黄形成卵母細胞を示す。萎縮性卵胞および放射帯の閉鎖性陥入はそれぞれ、黒色および白色の矢印で示される。矢印の頭は放射帯を指す。
【図５】抗ＣＤ２０５処置ゼブラフィッシュの発達中の生殖腺の炎症を示す。図５Ａは、処置後１５日の、腹膜細胞（矢印）の精巣への侵入を示す（魚サイズ１６５ｍｇ、２６．６ｍｍ）。図５Ｂは、好酸性顆粒球および他の腹膜細胞の、段階ＩＩの卵巣の生殖腺間質（矢印）への侵入を示す（魚サイズ８１ｍｇ、２２．９ｍｍ）。図５Ｃは、表層胞段階卵母細胞を示す（魚サイズ２４１ｍｇ、３０．５ｍｍ）。放射帯の陥入（白色矢印）は閉鎖プロセスを示す。卵胞の進行した萎縮（黒色矢印）もまた好酸性顆粒球（Ｅｇ）の侵入に伴って見られる。（Ｄ）段階ＩＩの卵巣への好酸性顆粒球の侵入（矢印）（魚サイズ１２８ｍｇ、２５．１ｍｍ）。図５Ｂ〜５Ｄは処置後３０日である。
【図６】ゼブラフィッシュ精巣発達の遅延を示す。図６Ａは、処置後１５日の対照雄（７８ｍｇ、２１．５ｍｍ）の正常に発達している精巣の表示を示す。図６Ｂは、処置後３０日の抗ＧＳＤＦｂ処置雄（１３２ｍｇ、２５．５ｍｍ）の遅延した発達を示す。分化の初期相である、未分化な始原生殖細胞および中に成長した間質が見られる。図６Ｃは、処置後３０日の抗ＧＤＦ９ｂ処置雄（９９ｍｇ、２３．８ｍｍ）の遅延した発達を示す。分化精原細胞の早期段階および精母細胞相の開始が見られる。図６Ｄは、処置後３０日の抗ＧＳＤＦｃ処置雄（１０９ｍｇ、２４．１ｍｍ）の遅延した発達を示す。分化精原細胞の早期段階および精母細胞相の開始が見られる。ＳｇＡ−精原細胞Ａ型、ＳｇＢ−精原細胞Ｂ型、Ｓｃｌ−精母細胞、減数分裂前期の細糸期、Ｓｃｚ−精母細胞、減数分裂前期の接合期、Ｓｃｐ−太糸期段階の精母細胞、Ｓｄ−精子細胞、Ｇｃ−未分化始原生殖細胞、Ｓ−間質。
【図７】処置後３０日目の抗ＣＤ２０５ゼブラフィッシュの卵巣のＢｃｌ２相互作用キラー（Ｂｉｋ）アポトーシスタンパク質の存在を示す落射蛍光シグナルを示す。図７Ａは、落射蛍光下でシグナルを有しない、段階Ｉｂ卵母細胞からなる典型的な対照（魚サイズ１４０ｍｇ、２５．７ｍｍ）を示す。図７Ｂ〜７Ｄは、２匹の抗ＣＤ２０５処置魚（Ｂ魚サイズ７１ｍｇ、２１．１ｍｍ；Ｃ、Ｄ魚サイズ１９３ｍｇ、２７．９ｍｍ）の段階Ｉｂ卵母細胞を示す。核を囲む白色の輪は小胞体内のＢｉｋタンパク質の存在を示す。強いアポトーシスシグナルは卵母細胞を囲む卵胞細胞でもまた検出される。矢印の頭は卵母細胞の小胞体中に存在するＢｉｋタンパク質を示し、核を囲む発現を示す白色の輪が示される。矢印は卵胞細胞での強いＢｉｋ発現を示す。目盛りバーは１００μｍを示す。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
プロトコルは例示のためにゼブラフィッシュについて記載されるが、他の魚種に、および実際に他の動物種に、準用して適用する。
【実施例】
【００７９】
実施例１−生殖腺成熟の初期阻害研究
魚：
ゼブラフィッシュを標準条件下で養殖する。処置の効果を評価するために、生殖細胞系（卵巣または精巣）状態を、蛍光タンパク質の発現をとおして蛍光下で視覚化する。いくつかのゼブラフィッシュトランスジェニック系は生殖細胞系特異的蛍光タンパク質発現を伴って存在する。それらはＴｇ（ｖａｓａ：ＤｓＲｅｄ２−ｖａｓａ）、Ｔｇ（ｋｏｐ：ＥＧＦＰ−ＵＴＲｎａｎｏｓ）ｅｒＩ、およびＴｇ（ｖａｓａ：ｖａｓａ−ＥＧＦＰ）ｚｆ４５を含む。生殖細胞系での向上したＧＦＰ発現のためのＴｇ（ｖａｓａ：ｖａｓａ−ＥＧＦＰ）ｚｆ４５系、および透明表現型のためのｍｉｆｔａ（遺伝子別名、ｎａｃｒｅ）−／−系は好ましい。これらのゼブラフィッシュ系の代替として、キメラｍＲＮＡ構築物ゼブラフィッシュｖａｓａ−３’ＵＴＲ−ＧＦＰが使用され、これは生殖細胞系の視覚化のために、Ｓａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ ５０，６９１−７００のプロトコルに従って、ゼブラフィッシュ胚に微量注入される。
【００８０】
ＩＡＭ：
本明細書で議論される生殖腺標的タンパク質についてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＰｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｔｏｏｌを用いて調製された標的合成抗原を、Ｖａｃｃｉｎｅ１５，１８５８−１８６２でＭｉｌｌｅｒら（１９９８）により説明されるように担体タンパク質に連結する。
【００８１】
あるいは、標的タンパク質に対するポリクローナル抗体を、Ｐｒａｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３９，１９７−２０６のプロトコルに従って、ワクチン接種のために調製する。
【００８２】
免疫化：
抗体をベースにした技術：
各標的タンパク質について、６０匹の幼若６週齢ゼブラフィッシュの１群を２つの群に分け、対照群は、０．０８ｍｇ．ｍｌ-1緩衝ＭＳ２２２溶液中での浸漬により麻酔し、Ｋｉｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｚｕａｌｉｚｅｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ４２，ｄｏｉ：１０．３７９１／２１２６に従って、ただし、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１２０ｍＭ塩化ナトリウム、および２．５ｍＭ塩化カリウムを含有するＰＢＳを伴って、顕微操作器に付属されたＨａｍｉｌｔｏｎ１０μｌマイクロシリンジを使用するよう改変して、腹腔内または筋内注入する。注入体積は０．１ｇ体質量当たり０．２〜５μｌであり、注入は実体顕微鏡下で行う。実験群は、３ｍｇ．ｍｌ-1ポリクローナル抗血清または非免疫血清を含有するＰＢＳを、または非関連タンパク質に対するｍＡｂ／ｐＡｂを注入すること以外は、上記のように処置する。これらの試験分子は市販されており、または市販のサービスを用いて所望の標的に対して開発される。
【００８３】
抗原をベースにした技術：
補助剤試験のために、６週齢ゼブラフィッシュに様々な補助剤を注入し（各試験補助剤当たり３０匹の魚）、銘々の免疫応答を伴う生存を比較する。最も良い補助剤をワクチン接種試験に選択する。
【００８４】
ワクチン接種のための魚を２つの群に配置する。３０匹の魚の１群はＰＢＳで偽ワクチン接種し、一方で、３０匹の魚の別の群は受精後６週目に標的抗原を注入する。上記の抗体ベースの技術について説明されるように、魚は腹腔内でワクチン接種される。注入後３週毎に、サンプルを回収するので、ゼブラフィッシュの成熟周期をとおして行う観察期間中に３つのサンプリング点がある。より多くの注入（すなわち、ブースター注入）が必要とされる場合、それらは別のバッチの幼若体で毎週繰り返されるであろう。適用ウィンドウは、およそ６週〜８週齢である。最も傑出した処置変異体では、１００個体の個体群が成体期へのさらなる発達のために創生される。
【００８５】
免疫化の評価：
抗体タイターはＥＬＩＳＡ法を用いて測定する。
【００８６】
生殖腺発達の検査：
生殖腺の形態学的発達を、Ｍａａｃｋ  ａｎｄ  Ｓｅｇｎｅｒ（２００３）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｉｓｈ  Ｂｉｏｌｏｇｙ６２，８９５−９０６の方法に従って、組織学について評価する。ＤＩＧ標識化アンチセンスプローブの、選択された生殖腺特異的遺伝子へのインサイチュハイブリダイゼーションは、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｍａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ５，６５５−６６７により説明される手順に従って行う。ＧＦＰ標識化生殖細胞系の視覚化は、Ｓａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ５０，６９１−７００により説明されるように、落射蛍光顕微鏡下でインビボで行う。性的に成熟した対照魚のサイズおよび週齢に達した個体を、生殖能について試験する。評価は、対照個体群と比較した、配偶子生成能、配偶子の量（産まれた卵の数および回収された精液精子の体積）および質（卵および精液精子の受精成功）に基づく。
【００８７】
実施例２−詳細な生殖腺成熟阻害研究
材料および方法
免疫化の標的：
硬骨魚類での標的化生殖腺除去のための可能性のある候補として、６つの標的を試験した。それらの標的のうちの２つ、透明帯Ｃ（ＺＰＣ）およびリボフラビン担体タンパク質（ＲＣＰ）は哺乳類モデルで有効であることが確立されている。それらを、成体ゼブラフィッシュについての試験で正の対照として使用した。
【００８８】
４つの標的、インスリン様増殖因子３（ＩＧＦ３）、増殖分化因子９（ＧＤＦ９）、生殖腺体細胞由来増殖因子（ＧＤＳＦ）、およびリンパ球抗原７５（ＣＤ２０５）を、幼若ゼブラフィッシュで試験するために選択した。
【００８９】
魚および飼育：
全ての飼育および実験手順は、ノルウェー動物実験規則（Ｔｈｅ  Ｎｏｒｗｅｇｉａｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｃｔ，Ｎｏ．７３  ｏｆ  ２０  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １９７４）に従って行い、国家動物研究局（Ｕｔｖａｌｇ  ｆｏｒ  ｆｏｒｓoｋ  ｍｅｄ  ｄｙｒ，ｆｏｒｓoｋｓｄｙｒｕｔｖａｌｇｅｔ，Ｎｏｒｗａｙ）の魚類の維持および繁殖についての一般認可（Ｇｏｄｋｊｅｎｎｉｎｇ  ａｖ  ａｖｄｅｌｉｎｇ  ｆｏｒ  ｆｏｒｓoｋｓｄｙｒ）１７番により認可された。魚を３つの棚の独立型研究再循環システム（Ａｑｕａｔｉｃ  Ｈａｂｉｔａｔｓ，Ａｐｏｐｋａ  ＦＬ，ＵＳＡ）で飼い、標準のゼブラフィッシュ手順（Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ（２０００）Ｔｈｅ  Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  Ｂｏｏｋ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｏｒｅｇｏｎ  Ｐｒｅｓｓ）を用いて維持した。水温は２８．０±１．０℃で維持した。研究目的に使用した成体魚に毎日２回乾燥フレーク（Ｔｅｔｒａ，Ｍｅｌｌｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を与えた。一腹の魚を、産卵前１ヶ月間、ＳＤＳ４００ゼブラフィッシュ特別食（Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｄｉｅｔ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｅｓｓｅｘ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）および新たに孵化したホウネンエビ（Ａｒｔｅｍｉａ）ノープリウス幼生で慣らした。幼若ゼブラフィッシュを標準の繁殖技術（Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ，２０００）を用いて生成した。孵化後、ゼブラフィッシュ幼体を細かい網の隔壁を有する１Ｌタンクで飼い、水流を制限した。孵化後５日目に開始して、魚をＳＤＳ１００ゼブラフィッシュ特別食（Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｄｉｅｔ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）を用いて離乳させた。１４日目〜２１日目に、これらに、ＳＤＳ１００およびホウネンエビノープリウス幼生の混合物を与えた。２１日目後、これらにホウネンエビノープリウス幼生のみを与えた。
【００９０】
抗原送達の手順を開発し、最適化するための初期実験のために、混合系統の成体ゼブラフィッシュをＦｅｂｏ  Ｎｏｒｇｅ  ＡＳ（Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）から得た。それらを繁殖させ、成体および幼若体の両方を実験に使用した。
【００９１】
幼若ゼブラフィッシュのワクチン接種である主要な実験のために、３つの同系繁殖系統からの成体ゼブラフィッシュ（ＴＡＢ、Ｎａｃｒｅ−／−、ｔｇ（ｖａｓ：：ｅｇｆｐ））をノルウェー獣医学校（Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）から得た。ＴＡＢ系（Ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ／ＡＢ）は参照野生型系統であった。ｔｇ（ｖａｓ：：ｅｇｆｐ）系は、以前に確立したトランスジェニック系からの子孫であった（Ｋｒoｖｅｌ  ａｎｄ  Ｏｌｓｅｎ（２００２）Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１１６，１４１−５０）。一腹の魚を、１０Ｌタンク中で２０匹の魚／タンクの密度で１：１の性別比率で飼った。
【００９２】
注入生存可能性試験：
ワクチン送達方法としての腹腔内注入の実用性を調べるために、幼若魚および成体魚の両方に注入し、注入後７日間（７ｄｐｉ）生存についてモニターした。幼若体試験について、受精後８週目の２２匹の魚（２７．４ｍｍ±１５．２、平均±標準偏差）を２つの群にランダムに分けた。処置群はリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）の注入を受け、一方で、対照群は疑似注入を受けた。Ｋｉｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．，ｅ２１２６により以前に説明されるように、冷水浴を麻酔として使用した。実験魚は、それらが物理的刺激に非応答性になるまで水に入れておいた。魚を浴槽から除去し、湿ったペーパータオル上で重量を測定し、その後、ペトリ皿内の濡れたスポンジに移した。各魚に、１０μＬシリンジ（カタログ番号７６３５−０１、Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｂｏｎａｄｕｚ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を３４ｇの針（カタログ番号２０７４３４、Ｈａｍｉｌｔｏｎ）で装備して用いて、ＰＢＳを腹腔内注入した。最初の魚に４．０μＬ  ＰＢＳを注入したが、即座にエキソプタルミアの兆候を示した。この魚は回復し、０日目を過ぎて生存したが、次の注入体積は１．０μＬに下げた。注入後、魚を２５℃の水温の回復タンクに戻した。対照魚に、冷水による麻酔、重量測定、１０秒間濡れたスポンジ上に置くことを含む、疑似注入手順を行い、その後、回復タンクに移した。
【００９３】
成体魚試験では、２年齢ゼブラフィッシュを５つの群に分けた。疑似注入（ＮＣ）、ＰＢＳ、ＰＢＳと１：１で乳化した不完全フロイントアジュバント（ＦＩＡ、カタログ番号Ｆ５５０６、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＰＢＳと１：１で乳化した完全フロイントアジュバント（ＦＣＡ、カタログ番号Ｆ５８８１、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびＰＢＳ中のマレイミド活性化キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ、カタログ番号Ｋ０３８３、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（１．０ｍｇ／ｍＬ）と１：１で乳化したＦＣＡ。注入手順は、注入体積を５．０μＬまで増大させ、５０μＬシリンジ（カタログ番号７６３７−０１、Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｂｏｎａｄｕｚ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を２６ｇの針（カタログ番号７８０４−０４、Ｈａｍｉｌｔｏｎ）で装備して投与した点を除いては、以前に説明されるとおりであった。７日間にわたる生存を記録した。
【００９４】
成体魚ワクチン接種試験：
ワクチン調製：
実験ワクチンは、ＫＬＨに接合された合成ペプチドからなった。以下の表１は成体ゼブラフィッシュのワクチン接種試験に使用されたペプチドのアミノ酸配列を示す。各ペプチドを、予想される抗原性に基づいて完全な銘々のアミノ酸配列から選択した（Ｈｏｐｐ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ７８，３８２４−３８２８）。ペプチドは８０％超の純度で市販で合成され（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｕｌｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、マレイミド活性化接合キット（カタログ番号ＭＢＫ１、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて製造業者のプロトコルに従ってＫＬＨに接合された。接合後、タンパク質接合体をカラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５Ｍ、カタログ番号Ｂ４７８３、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を通して単離し、ＰＢＳで溶離した。連結効率をシステイン標準分析からの４１２ｎｍでの吸収を、接合前および後の各ペプチドシステイン吸収価と比較することにより決定した。最終タンパク質濃度は２８０ｎｍでの吸収を測定することにより見積もった。ペプチド−ＫＬＨ接合体は、使用直前まで−２０℃で保存した。融解後、接合体をＰＢＳ中に希釈し（１．０ｍｇ／ｍＬ）、ＦＣＡと１：１の比率でボルテックスにより乳化した。
【表１】
2015510878.tif 000003
【００９５】
免疫化：
全部で、４８５匹のゼブラフィッシュ（４２．８±２．５ｍｍ、平均±標準偏差）を、４種の処置のうちの１種またはＰＢＳ／ＦＣＡ対照で免疫化した。雄魚の限定的入手可能性のために、雌ゼブラフィッシュのみをこの実験に考慮した。各処置群は最初は１０５匹の魚からなり、一方で、対照群は６５匹の魚を有した。免疫化前に、ゼブラフィッシュを、１５０ｍｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ3）で緩衝した１５０ｍｇ／Ｌ  ＭＳ−２２２（トリカイン、Ｓｉｇｍａ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）の浴槽中で麻酔した。魚は、それらが物理的刺激に非応答性になったが、鰓蓋の動きは維持しているとき、外科的麻酔（段階ＩＩＩ）にあると考えられた（Ｍａｔｔｈｅｗｓ＆Ｔｒｅｖａｒｒｏｗ（２００２）Ｌａｂ．Ａｎｉｍ．，３１，３４−４０）。魚を浴槽から除去し、ペトリ皿内の濡れたスポンジ上に置いた。ワクチン注入を胸鰭のすぐ下に腹腔内で行った。全ての注入は１０．０μＬ（５．０μｇペプチド−ＫＬＨ）体積であった。
【００９６】
サンプリング：
ゼブラフィッシュを免疫化直前にサンプリングした。処置魚をその後、３０日間１０日毎にサンプリングし、一方で、対照魚は２０日目にサンプリングした。サンプリング前に、魚は緩衝ＭＳ−２２２（２００ｍｇ／Ｌ）の過量投与を受け、鰓蓋の動きの休止後１０分間この溶液中に残された。この浴槽からの除去に際して、魚を軽くたたいて乾かし、重量および尾叉長測定を取った。死亡を確実にするために、魚をその後、体腔を開く前に断頭した。体をＰＢＳで簡単に洗浄し、その後、４％パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．４）溶液中で４℃で一晩固定した。次の日、組織をＰＢＳ中で洗浄し、生殖腺を切除し、重量を測定した。
【００９７】
幼若ゼブラフィッシュワクチン接種試験：
ワクチン調製：
４つの標的タンパク質のためのペプチドを、Ｈｏｐｐ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ（１９８１）ＰＮＡＳ，７８，３８２４−８で詳述されるように、予想される抗原性に基づいて設計した。以下の表２は、幼若ゼブラフィッシュのワクチン接種試験に使用されたペプチドのアミノ酸配列を示す。特注ペプチドは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃにより合成され、ＫＬＨに接合された。到着に際して、凍結乾燥ペプチドをＰＢＳ中に溶解し、タンパク質溶解性により１０．０または５．０ｍｇ／Ｌいずれかのストック溶液を作成した。処置はＦＣＡ中に１：１で乳化した、単一抗原または抗原の組み合わせのいずれかからなった。
【表２】
2015510878.tif 000004
【００９８】
免疫化：
各同系繁殖系統からの幼若ゼブラフィッシュを、約１５ｍｍの全長に基づいて孵化後５〜７週間の間に選択した。全部で、３８４匹の魚（１５．５±２．８ｍｍ）を、６種の処置のうちの１つまたはＰＢＳ／ＦＣＡ対照で免疫化した（表３）。抗ＩＧＦ３処置は、混合された全ての３つのペプチド（すなわち、表２で示されるＩＧＦ３（Ａ）、ＩＧＦ３（Ｂ）、およびＩＧＦ（Ｃ））からなり、各個々のペプチドは０．８３ｍｇ／ｍＬの最終ワクチン濃度を有した。抗ＧＳＤＦおよび抗ＧＤＦ９処置について、（Ｂ）および（Ｃ）ペプチドは個々に注入され、２．５ｍｇ／ｍＬの最終濃度を有した。抗ＧＳＤＦおよび抗ＧＤＦ９処置両方で、ペプチド（Ａ）は使用されなかった。高い溶解性のために、ＣＤ２０５（Ｂ）およびＣＤ２０５（Ｃ）ペプチドを混合し、抗ＣＤ２０５処置で２．５ｍｇ／ｍＬの最終濃度を保持した。選択された魚を、等分の重炭酸ナトリウムで緩衝した５０ｍｇ／Ｌ  ＭＳ−２２２（トリカイン、Ｓｉｇｍａ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）を含有するタンク水のペトリ皿中で麻酔した。各麻酔された魚を初めに個々に写真に撮り、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｚｏｏｍ  ｖ．１６実体顕微鏡を用いて全長を測定した。ｔｇ（ｖａｓ：：ｅｇｆｐ）系統からの魚もまた緑色蛍光タンパク質シグナルについてスクリーニングし、その後、濡れたスポンジに移し、３４ｇの針で装備した５０μＬシリンジを用いて２．０μＬの実験ワクチンを注入した。注入後、１０分間、回復をモニターするために、魚をタンク水のペトリ皿に移し、その後、飼育タンクに戻した。
【００９９】
注入後１５日目に、抗ＩＧＦ３を除く、全ての処置からの各魚はブースターワクチン接種を受けた。抗ＩＧＦ３と対にされた、いくつかの対照魚もまた、ブースターを受けなかった。ワクチン接種体積が１．０μＬまで減少され、ＦＩＡが補助剤として使用されたことを除いては、上記のようにブースター注入後に同じプロトコルを行った。
【０１００】
以下の表３は、幼若体ワクチン接種試験に使用された魚の分布を提供する。３つの同系繁殖系統からの魚：ＴＡＢ（Ｔ）、ｎａｃｒｅ−／−（Ｎ）、およびｔｇ（ｖａｓ：：ｅｇｆｐ）（Ｖ）を実験に使用した。処置名は、大文字の標的タンパク質、および括弧内の表２に記載される特異的抗原（単数または複数）からなる。
【表３】
2015510878.tif 000005
【０１０１】
魚サンプリング：
注入後１５および３０日目に、ゼブラフィッシュを定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、組織学、および免疫組織化学（ＩＨＣ）のためにサンプリングした。サンプリング前に、全ての魚を緩衝ＭＳ−２２２（１００ｍｇ／Ｌ）中で安楽死させ、それにより、それらは、写真に撮り、ＧＦＰシグナルについてスクリーニングし、重量を測定し、（全長を）測定することができた。
【０１０２】
ＴＡＢ系統魚を、それらの遺伝的均一性および野生型参照系統としての確立した知名度から、ｑＰＣＲ分析のために単独で使用した。ｑＰＣＲに使用予定の各魚について、生殖腺ｍＲＮＡシグナルを、可能な限り多くの非関連組織を除去することにより改善した。幼若体生殖腺の繊細な性質のために、それはそれだけで解剖され得なかった。代わりに、消化系、心臓、および頭腎を頭部および尾部に沿って除去した。これにより、サンプル中に体幹筋肉組織、浮袋、腎臓、および生殖腺組織のみが残った。これらのサンプルのそれぞれを１．５ｍＬエッペンドルフ管に入れ、液体窒素中で凍結した。サンプルを、ＲＮＡ抽出まで、−８０℃で保存した。
【０１０３】
ｎａｃｒｅ −／−およびｔｇ（ｖａｓ：：ｅｇｆｐ）系統からの魚を視覚的観察に使用した。サンプリング時、最初の測定が取られた後、組織学およびＩＨＣに使用予定の魚を胸鰭のすぐ後ろで断頭し、切り取った。体腔を切開し、その後、ブアン溶液または４％ＰＦＡ溶液のいずれかに魚を入れた。両方の技術用のサンプルを、固定するために４℃で一晩置いた。固定されたサンプルを、エタノールの一連の勾配（５０％〜最大１００％）で脱水した。
【０１０４】
定量的リアルタイムＰＣＲ：
トータルＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｕ．Ｋ．）を用いて製造業者のプロトコルに従って抽出した。初めに、ＲＮＡの完全さを１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上の電気泳動を用いて評価した。好適なサンプルをその後、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｖｅｎ＆Ｗｅｒｎｅｒ  ＡＳ，Ｋｒｉｓｔｉａｎｓａｎｄ，Ｎｏｒｗａｙ）を用いて定量した。約１μｇのトータルＲＮＡをＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ逆転写キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｎｙｄａｌｅｎ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いたｃＤＮＡ合成に使用した。全てのサンプルをＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ逆転写キットで供給されるｇＤＮＡワイプアウト緩衝液で５分間処理し、ゲノムＤＮＡ汚染を除去した。ｃＤＮＡの２０倍希釈物をさらなる分析に使用した。
【０１０５】
ｑＰＣＲ分析に選択された６つの遺伝子は、Ｔ細胞受容体アルファ定常（ｔｃｒａｃ）、免疫グロブリンカッパ定常（ｉｇｋｃ）、ｖａｓａ（ｖａｓａ）、生殖腺体細胞由来因子（ｇｓｄｆ）、インヒビンアルファ（ｉｎｈα）、および抗ミュラー管ホルモン（ａｍｈ）であった。参照に使用された遺伝子はベータアクチン（β−ａｃｔｉｎ）および伸長因子１アルファ（ｅｆ１α）であった。Ｔｃｒａｃおよびｉｇｋｃは、それぞれ、ＴおよびＢ細胞のマーカーとして両方とも確立されている（Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８，９−２８）。Ｖａｓａは保存された生殖細胞マーカーであり（Ｙｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２４，３１５７−６５）、一方で、ｇｓｄｆ、ｉｎｈα、およびａｍｈは顆粒膜細胞およびセルトリ細胞で特に発現される（Ｇａｕｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｇｅｎｅ，４７２，７−１７、Ｐｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，１３８，７０９−１９、Ｓｈｉｂａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０），Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ，１０，２８３−９、およびＲｏｄｒiｇｕｅｚ−Ｍａｒi  ｅｔ  ａｌ．（２００５）ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．，６，ｅ１００１０３４）。ｑＰＣＲ増幅のための各標的遺伝子に特異的なプライマーは、Ｎｅｔｐｒｉｍｅｒソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｅｍｉｅｒｂｉｏｓｏｆｔ．ｃｏｍ／ｎｅｔｐｒｉｍｅｒ）を用いて手動で、または文献から取って設計した。具体的には、βアクチンおよびｅｆ１αプライマーは、Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ｓｉｎｉｃａ，３９，３８４−９０で詳述されるように以前から使用されており、ｉｎｈαプライマーは、Ｐｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）で以前から使用されている。表４は、使用されたプライマーのヌクレオチド配列を示す。可能なとき、プライマーは、可能性のある汚染ゲノムＤＮＡの増幅を避けるために１つのイントロン／エクソン境界まで伸びるように設計した（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０，２３−３２）。
【表４】
2015510878.tif 000006
【０１０６】
ＲＴ−ｑＰＣＲをＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で９６ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行った。ＳＹＢＲ緑色ベース検出を、９５℃で１５分間、続いて９５℃で１５秒間、６３℃で２０秒間、および７２℃で２０秒間の４５周期の熱周期条件下で行った。逆転写酵素なし、テンプレートなし、および正のプレート対照を伴って、全てのサンプルを二重で行った。５点標準曲線（希釈１：１〜１：８１）を、ＰＣＲ反応効率を計算するために使用した。反応特異性を融解曲線分析により評価した。周期閾（ＣT）値をＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ソフトウェアを用いて、蛍光強度のあるレベルを１に設定して、決定した。参照遺伝子（β−ａｃｔｉｎおよびｅｆ１α）を、ｇｅＮｏｒｍを用いて、データ正規化のために調べた（Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３，３４．１−３４．１１）。安定値は０．７９６であると計算された。標的遺伝子についての生のｑＰＣＲデータをその後、参照遺伝子の幾何平均により補正した。
【０１０７】
生殖腺組織学：
以前に固定されたサンプルを伝統的な組織学をとおして、または生殖腺全体として光学薄片化を用いて調べた。組織学のために、サンプルをパラフィンろうに埋め込み、回転式ミクロトーム（Ｍｉｃｒｏｍ  ＨＭ３５５Ｓ，ＭＩＣＲＯＭ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて系統的に薄片化した（５〜７μｍの厚みの薄片）。薄片化に続いて、この薄片中の生殖腺の外観を最適化するために顕微鏡観察を行った。スライド上への標本の接着を改善するために、スライドを（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でコーティングした。サンプルをＲｏｂｏｔ  Ｓｌｉｄｅ  Ｓｔａｉｎｅｒ（Ｍｉｃｒｏｍ  ＨＭＳ  ７６０Ｘ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中でＨｅａｍａｔｏｘｙｌｉｎ−エオシンで染色し、Ｐｅｒｔｅｘマウンティング媒体（Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて乗せた。サンプルについての評価および画像化は、光学顕微鏡Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ ５１（ＯＬＹＭＰＵＳ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏ．ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＯｌｙｍｐｕｓ画像化ソフトウェアＣｅｌｌ  Ｂ（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｓｏｆｔ．Ｉｍａｇｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の使用によりなされた。
【０１０８】
ｔｇ（ｖａｓ：：ｅｇｆｐ）系統からのいくつかの個体は薄片化しなかった。代わりに、固定した生殖腺をＰＢＳ中で再水和し、魚全体から解剖して取り、１滴の５０％グリセロール／ＰＢＳと共にスライドガラス上に置いた。カバーガラスをこの生殖腺上に置き、光学薄片化をＡｐｏＴｏｍｅ．２で装備したＡｘｉｏＺｏｏｍ．Ｖ１６顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行った。
【０１０９】
免疫組織化学（ＩＨＣ）：
３０ｄｐｔ群からの対照および抗ＣＤ２０５卵巣もまた、ホールマウントＩＨＣを用いて調べた。光学薄片化を用いて以前に画像化された卵巣全体をＢｃｌ２相互作用キラー（Ｂｉｋ）タンパク質の存在について染色した。Ｂｉｋは生存促進因子により通常抑制される小胞体に局在するアポトーシス促進性タンパク質である。
【０１１０】
ホールマウントＩＨＣ手順は、基本的にはＤｒａｐｅｒ（２０１２）Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，８５（３），６１５−２５により説明されるように、以下の改変を伴って行った。使用した一次抗体は、抗ゼブラフィッシュＢｉｋタンパク質に特異的なウサギポリクローナルＩｇＧ（Ａｎａｓｐｅｃ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）であった。一次抗体を１：１５０に希釈し、４℃で一晩投与した。使用した二次抗体は、１：５００希釈のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４ヤギ抗ウサギＩｇＧ、室温で５時間であった。ＩＨＣ手順の完了後、生殖腺を、ＡｐｏＴｏｍｅ．２およびＤｓＲｅｄフィルターで装備したＡｘｉｏＺｏｏｍ．Ｖ１６顕微鏡を用いて画像化した。
【０１１１】
統計分析：
データは平均±標準偏差として示される。手順は、Ｚａｒ（１９９９）Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌに従った。魚の重量、長さ、および遺伝子発現の相対値に対する処置の効果を試験するために、ＡＮＯＶＡを使用した。等分散性はレーベン検定を用いて試験した。フィッシャー最小有意差検定を群間の差を調査するために事後検定として使用した。ピアソン積率相関係数ｒを遺伝子発現間の関係を調査するために使用した。有意効果はｐ＜０．０５で考えられた。
【０１１２】
結果
注入生存性試験：
以下の表５は、ＰＢＳ（補助剤対照）、ＰＢＳと１：１で乳化した不完全フロイントアジュバント（ＦＩＡ）、ＰＢＳと１：１で乳化した完全フロイントアジュバント（ＦＣＡ）、およびＰＢＳ中のキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と１：１で乳化したＦＣＡの腹腔内注入後７日間にわたるゼブラフィッシュの生存を提供する。疑似群（ＮＣ）もまた創生された。
【表５】
2015510878.tif 000007
【０１１３】
注入直後、ほとんどの処置は１００％生存を示し、幼若体ＰＢＳおよび成体ＦＣＡ／ＫＬＨ群のそれぞれ１個体のみが死亡した。死亡は次の日に観察され、成体ＦＩＡ、ＰＢＳ、およびＮＣ処置で最も顕著に観察された。
【０１１４】
成体ゼブラフィッシュワクチン接種試験：
以下の表６は、透明帯Ｃ（ＺＰＣ）、リンパ球抗原７５（ＣＤ２０５）、インスリン様増殖因子３（ＩＧＦ３）、およびリボフラビン担体タンパク質（ＲＣＰ）をワクチン接種した成体ゼブラフィッシュ雌の総重量、尾叉長、および生殖腺体細胞指標（ＧＳＩ％）を示す。サンプリングを０日目（対照）、処置後１０、２０、および３０日目に行った。処置後２０日目に、ＰＢＳ注入対照を追加して行った。Ｎ＝処置当たりの魚の数、Ｓ．Ｄ．＝標準偏差。下線字体は対照より有意に低い値を示し、一方で、太字体は対照より有意に高い値を示す（ｐ＜０．０５）。
【表６】
2015510878.tif 000008
【０１１５】
処置後１０日目に、魚の重量（Ｆ(4,120)＝４．０、ｐ＝０．００４）およびＧＳＩ％（Ｆ(4,113)＝７．８、ｐ＜０．００１）に対する処置の有意な効果が見られた。抗ＺＰＣおよび抗ＣＤ２０５処置からの魚は、対照と比較して、有意により低い重量を有した。処置された魚の長さは対照と異ならなかった。抗ＺＰＣおよび抗ＣＤ２０５処置での総重量の喪失は、両方の処置の魚のＧＳＩ％が対照より有意に低かったので、生殖腺重量の喪失から生じた。
【０１１６】
処置後２０日目に、魚の重量および長さの有意差は見られなかった。ＧＳＩ％に対する処置の効果は有意であった（Ｆ(5,134)＝５．２、ｐ＜０．００１）。抗ＺＰＣ変異体からの魚は対照より有意に低いＧＳＩ％を有した。抗ＺＰＣおよび抗ＣＤ２０５処置からの魚のＧＳＩ％は、ＰＢＳ注入対照のＧＳＩ％より有意に低かった。他の処置は非注入対照またはＰＢＳ注入対照のいずれとも異ならなかった。
【０１１７】
処置後３０日目に、魚重量（Ｆ(4,119)＝４．２、ｐ＝０．００３）およびＧＳＩ（Ｆ(4,107)＝８．８、ｐ＜０．００１）に対する処置の有意な効果が観察された。ＺＰＣおよびＩＧＦ３処置からの魚は対照魚より有意に重かった。しかしながら、これらのＧＳＩは対照と有意差がなかった。ＣＤ２０５で処置した魚のＧＳＩは任意の他の処置より有意に低く、また、対照より有意に低かった。
【０１１８】
幼若ゼブラフィッシュワクチン接種試験：
性別分布：
性別、重量、および長さの比較を、参照ＴＡＢ系統のみを用いて行った。性別分布に対する処置の効果は見られなかった。概して、雌：雄の割合は５５：４５であり、期待される５０：５０比率から逸脱しなかった。
【０１１９】
魚成長に対する処置の効果：
０日目の魚は、注入直前に、水外手順へのこれらの暴露を最小限にするために、長さのみを測定した。１５日および３０日目に、長さおよび重量の両方を測定した。０日目の魚は均一であり、ＡＮＯＶＡから、長さにおける有意差はなかった。１５日目に、抗ＧＳＤＦｃ処置からの魚は対照より有意に軽かったが、長さにおける有意差は記録されなかった。３０日目に、成長速度のより明確な遅延が観察された。６種の処置変異体からの４種からの魚は、対照より有意に軽かった。これらのうち、２種の変異体（抗ＧＳＤＦｃおよび抗ＣＤ２０５ｂｃ）からの魚は、対照魚より有意に短かった（図１）。
【０１２０】
性別で偏った遺伝子発現：
以下の表７ａおよび７ｂは、幼若ゼブラフィッシュ生殖腺での転写産物の性別で偏った発現を示す（ｎ＝１１３）。雄および雌生殖腺での相対的遺伝子発現は、倍変化に沿って与えられる。有意な雌／雄の偏りは下線字体を用いて示され、有意な雄／雌の偏りは太字体を用いて示される。中間または変遷相の生殖腺はこの分析から除いた。
【表７ａ】
2015510878.tif 000009
【表７ｂ】
2015510878.tif 000010
【０１２１】
６つの調査された遺伝子からの５つは、幼若ゼブラフィッシュ生殖腺で有意に性別で偏った発現を示した。ｔｃｒａｃ（Ｆ(2,112)＝６．７、ｐ＜０．００１）、ｖａｓａ（Ｆ(2,113)＝２１．６、ｐ＜０．００１）、ｇｓｄｆ（Ｆ(2,113)＝５４．３、ｐ＜０．００１）、ｉｎｈα（Ｆ(2,110)＝１０．８、ｐ＜０．００１）、およびａｍｈ（Ｆ(2,112)＝３３．０、ｐ＜０．００１）。ｔｃｒａｃおよびｖａｓａの発現は雌に偏り、一方で、ｇｓｄｆ、ｉｎｈα、およびａｍｈの発現は雄に偏った。ｉｇｋｃ発現でのみ、性別の有意な効果が見られなかった。
【０１２２】
以下の表８ａ〜表８ｃは、調査された遺伝子（全ての変異体、ｎ＝１１１）の相対的発現間の相関（ピアソン積率相関係数ｒ）を示す。有意なｒ値（ｐ＜０．０５）は太字体で示される。雌転写産物内の相関は二重下線字体で示され、雄に偏った転写産物内の相関は下線字体で示される。
【表８ａ】
2015510878.tif 000011
【表８ｂ】
2015510878.tif 000012
【表８ｃ】
2015510878.tif 000013
【０１２３】
相関パターンは対照（ｎ＝３１）および処置群（ｎ＝８０）で同様であった。転写産物相対的存在量間の相関は次のパターンをとった。精巣で豊富なｇｓｄｆ、ｉｎｈα、およびａｍｈは対照および処置群の両方で互いに高い正の相関を示し、一方で、卵巣で豊富なｔｃｒａｃおよびｖａｓａは高く、かつ正に相関した。それゆえ、遺伝子発現に対するワクチン接種の効果の分析は雄および雌について別々に行った。
【０１２４】
幼若ゼブラフィッシュ生殖腺での遺伝子発現に対するワクチン接種の効果：
表９ａおよび９ｂは、抗原でのワクチン接種後の幼若ゼブラフィッシュ生殖腺での遺伝子発現を示す。表９ａは、処置後１５日の遺伝子発現を示し、表９ｂは、処置後３０日の遺伝子発現を示す。ブースター注入は、１５日後に、抗ＩＧＦ３処置を除く全てに適用された。正規化相対平均値および標準偏差が与えられる。転写産物存在量の上方調節および下方調節は、対照値の倍変化（Ｆ−ｃ）として表され、それぞれ、正の数または負の数として示される。処置値および対照値間の有意差は太字体で示される。抗ＩＧＦ３処置での遺伝子発現は、ブースター注入を受けなかった対照（ブースターなし）と比較した。
【表９ａ】
2015510878.tif 000014
【表９ｂ】
2015510878.tif 000015
【０１２５】
概して、遺伝子発現は全ての変異体内で高い変動を示した。それゆえ、群間の平均発現の差は、しばしば相当なものではあるが、いつでも有意ではなかった。それにもかかわらず、処置の効果はいくつかの変異体で明らかに見られ、発達進歩および特定の処置に関連する遺伝子発現の、ある一定のパターンが観察された。
【０１２６】
時間での差示的発現：精巣では、全ての処置でのｔｃｒａｃの発現は、対照と比較して、処置後１５日目（１５ｄｐｔ）に下方調節されたが、３０ｄｐｔでは上方調節された。ａｍｈの場合では逆で、上方調節が１５ｄｐｔで起こり（抗ＣＤ２０５を除いて）、続いて３０ｄｐｔでの下方調節が起こった。卵巣では、ｉｇｋｃ発現は逆の関係を示した。１５ｄｐｔで下方調節された変異体（抗ＧＤＦ９）は３０ｄｐｔで上方調節され、１５ｄｐｔで上方調節された変異体（抗ＧＳＤＦおよび抗ＣＤ２０５）は３０ｄｐｔで下方調節された。
【０１２７】
生殖腺での差示的発現：３０ｄｐｔでの抗ＧＳＤＦｃ、抗ＧＤＦ９ｂ、抗ＧＤＦ９ｃ、および抗ＣＤ２０５ｂｃ変異体でのｔｃｒａｃの発現は精巣で上方調節されたが、卵巣では下方調節された。３０ｄｐｔでの抗ＧＳＤＦｂ処置では、ｖａｓａの発現は精巣では下方調節されたが、卵巣では有意に上方調節された。同様に、ｉｎｈαの発現は精巣では有意に下方調節されたが、卵巣では有意に上方調節された。
【０１２８】
ｔｃｒａｃの発現：１５ｄｐｔで、精巣および卵巣での発現は、対照と比較して全ての処置で下方調節された（抗ＧＳＤＦｂ処置の卵巣を除いて）。３０ｄｐｔで、６種の処置のうちの４種での発現が下方調節された卵巣とは反して、精巣での発現は全ての処置で上方調節された。抗ＧＤＦ９ｃ（１５ｄｐｔ）および抗ＣＤ２０５ｂｃ（３０ｄｐｔ）変異体の卵巣で有意な下方調節が見られた。抗ＧＳＤＦｂ変異体（３０ｄｐｆ）で有意な上方調節が観察された。
【０１２９】
ｉｇｋｃの発現：１５ｄｐｔで、発現は、抗ＧＤＦ９処置を除いては、精巣および卵巣の両方で概して上方調節された。３０ｄｐｔで、全ての変異体の精巣で、および抗ＧＤＦ９変異体の卵巣で、上方調節があった。卵巣（抗ＣＤ２０５ｂｃ処置）で１５ｄｐｔで、および抗ＧＤＦ９処置の精巣で３０ｄｐｔで、有意な上方調節が見られた。
【０１３０】
ｖａｓａの発現：１５ｄｐｔで、ｖａｓａは、抗ＧＳＤＦｂの卵巣を除く、全ての変異体で下方調節された。３０ｄｐｔで、いくつかの変異体では上方調節があった。卵巣（１５ｄｐｔの抗ＧＤＦ９ｃおよび３０ｄｐｔの抗ＣＤ２０５ｂｃ）で有意な下方調節が観察された。３０ｄｐｔの抗ＧＳＤＦｂ処置の卵巣で有意な上方調節が見られた。
【０１３１】
ｇｓｄｆの発現：処置および組織に従って変動する発現が、対照値からの低めの変動で、観察された。３０ｄｐｔで、抗ＧＤＦ９ｃ処置卵巣で、有意な上方調節が観察された。
【０１３２】
ｉｎｈαの発現：１５ｄｐｔで、抗ＧＳＤＦ変異体の上方調節、および抗ＧＤＦ９ｃでの下方調節は精巣および卵巣の両方で一定であった。抗ＧＤＦ９ｃ処置の卵巣での有意な下方調節が見られた。３０ｄｐｔで、全ての処置の精巣での有意な下方調節が見られた。また、６種の処置のうちの４種の卵巣で下方調節があったが、これは抗ＣＤ２０５ｂｃでのみ有意であった。
【０１３３】
ａｍｈの発現：１５ｄｐｔで、変動する発現、ほとんどの場合、上方調節が両方の組織で見られた。３０ｄｐｔで、ａｍｈは、抗ＧＳＤＦｂの卵巣を除いては、全ての処置の両方の組織で下方調節された。精巣では、抗ＧＤＦ９ｂ処置以外の全ては有意な下方調節をもたらした。卵巣では、抗ＧＤＦ９ｃおよび抗ＣＤ２０５ｂｃ処置で有意な下方調節が観察された。
【０１３４】
１５ｄｐｔでの処置効率：雄生殖腺では有意な効果は見られず、このことは遺伝子発現の高い変動をもたらしたが、それにもかかわらず、処置のいくつかは対照と比較して遺伝子発現の数倍の変化をもたらした。例えば、抗ＧＤＦ９ｂ（ｔｃｒａｃおよびｉｇｋｃ、それぞれ、２．５および３．６倍下方調節）、および抗ＣＤ２０５ｂｃ（ｉｇｋｃの２．８倍上方調節、およびｖａｓａの３．８倍下方調節）。１５ｄｐｔで卵巣では、抗ＧＤＦ９ｃは６つの遺伝子からの３つの発現に対する有意な効果を示した（ｔｃｒａｃ、ｖａｓａ、およびｉｎｈαの下方調節）。
【０１３５】
３０ｄｐｔでの処置効率：効果は１５ｄｐｔサンプルより明らかであった。全ての変異体（抗ＩＧＦ３およびいくつかの対照魚を除いて）は１５ｄｐｔでブースター注入を受けた。ブースターを受けた対照とブースターを受けていない対照との比較は、ブースター注入がｉｇｋｃ発現にのみ有意に影響し、それを５．６倍上昇させたことを示した。このため、抗ＩＧＦ３処置での遺伝子発現は非ブースター対照のみと比較した。
【０１３６】
精巣では、全ての処置は、雄に偏った遺伝子（ｇｓｄｆ、ｉｎｈα、およびａｍｈ（抗ＧＳＤＦｂ処置のｇｓｄｆ発現を除いて））で下方調節、および免疫関連遺伝子（ｔｃｒａｃおよびｉｇｋｃ（抗ＩＧＦ３処置のｉｇｋｃ発現を除いて））で上方調節をもたらした。卵巣では、パターンはより変動的であった。抗ＣＤ２０５ｂｃ処置は、精巣および卵巣の両方でｉｎｈαおよびａｍｈ、および卵巣でｔｃｒａｃおよびｖａｓａの有意な下方調節をもたらした。抗ＧＤＦ９ｃは、精巣でｉｎｈαおよびａｍｈの有意な下方調節、およびｉｇｋｃの上方調節をもたらしたが、一方で、卵巣では、この変異体でａｍｈが有意に下方調節され、ｇｓｄｆが有意に上方調節された。抗ＧＤＦ９ｂおよび抗ＧＳＤＦｃは精巣のみで有意な効果を示した（抗ＧＤＦ９ｂ処置でｉｇｋｃは上方調節され、ｉｎｈαは下方調節され、抗ＧＳＤＦｃ処置でｉｎｈαおよびａｍｈは下方調節された）。抗ＧＳＤＦｂは、精巣でｉｎｈαおよびａｍｈの有意な下方調節、および卵巣でｔｃｒａｃ、ｖａｓａ、およびｉｎｈαの有意な上方調節をもたらした。抗ＩＧＦ３処置は、精巣でｉｎｈα、およびａｍｈ、およびｉｇｋｃで有意な下方調節をもたらした。
【０１３７】
幼若ゼブラフィッシュ生殖腺組織の組織学的検査:
ｔｇ（ｖａｓ：：ｅｇｆｐ）系統魚の精巣および卵巣両方の検査は、生殖細胞での強いＧＦＰ発現を示した（図２および３）。卵巣では、検査された全ての段階（段階ＩＢ（図２Ａ）、段階ＩＡ、ＩＩ、およびＩＩＩ（データは示されていない））で、卵母細胞の細胞質全体をとおして発現が見られた。精巣では、精原細胞で発現が強く、一過性であったが、しかしながら、精母細胞では発現が著しく、より弱かった（図２Ｂ）。
【０１３８】
対照魚および処置魚の間の生殖腺形態を比較すると、処置のいくらかの組織病理学的効果が、卵巣および精巣組織の両方で見られた。これらの効果は概して、初期卵巣の組織化、放射帯発達、卵巣の閉鎖および萎縮、精巣および卵巣両方での炎症、ならびに精巣の発達遅延に関連した。
【０１３９】
対照魚では、初期成長相中のゼブラフィッシュ卵巣の一般的な形態は、卵巣の中心部で、より大きな、さらに発達した初期卵母細胞（Ｐｏｃ２）を示し、一方で、より小さな（Ｐｏｃ１）初期卵母細胞は縁で発達していた（図３Ａ、Ｂ）。卵巣は卵母細胞の均一な分布を維持した。このパターンは、処置後１５日目にサンプリングされた全ての対照魚で観察された（図３Ｂで代表される、ｎ＝７）。対照的に、処置後１５日目の抗ＣＤ２０５群からのゼブラフィッシュはしばしば、卵巣全体をとおして様々な段階が混成した初期卵母細胞を有した（４匹のサンプリングされた魚のうちの３匹中で視覚化された効果、図３Ｃで代表される）。ＧＦＰシグナルを用いて生殖腺の形態について検査した残りの処置群では、この効果は抗ＩＧＦ３および抗ＧＤＦ９ｂ処置で明らかではなかった。他の処置は検査しなかった。
【０１４０】
処置後３０日までに、前卵黄形成（段階ＩＩ、ＩＩＩ）および卵黄形成（段階ＩＶ）卵母細胞での閉鎖および萎縮が、抗ＣＤ２０５および抗ＧＳＤＦｂ処置魚で観察された。また、対照と比較して、段階ＩＩＩ卵母細胞のより薄い放射帯が、抗ＣＤ２０５処置魚で観察された（図４）。残りの変異体では、明らかな徴候は観察されなかった。
【０１４１】
腹膜細胞の生殖腺内への浸潤で現れ、しばしば好酸性顆粒球の浸潤を伴い、ことによると肉芽腫性炎症を示す、炎症はいくつかの処置で、主に抗ＣＤ２０５で観察された（図５）。卵巣では、好酸性顆粒球の浸潤は、閉鎖および萎縮プロセスと関連付けられた（例えば、図５Ｃ）。
【０１４２】
精巣では、処置効果は遅延発達により現れた（図６）。いくつかの処置、主に抗ＧＤＦ９ｂならびに抗ＧＳＤＦｂおよびｃでは、いくつかの比較的大きな雄魚（２３ｍｍ超の全長）の精巣は分化の初期段階のままであり、一方で、この大きさの対照雄は精子細胞段階の、またはさらに精子を生成する、精巣を通常有した。この効果は抗ＣＤ２０５および抗ＧＤＦ９ｃ処置雄では観察されなかった。
【０１４３】
幼若ゼブラフィッシュ生殖腺組織の免疫組織化学的検査：
対照魚および３０ｄｐｔ抗ＣＤ２０５魚両方の、ｔｇ（ｖａｓ：：ｅｇｆｐ）系統魚の卵巣の検査はＢｉｋシグナルの存在を示した（図７）。対照魚の卵巣では（図７Ａ）、段階Ｉｂ卵母細胞および卵胞細胞はＢｉｋタンパク質の乏しい発現を示した。対照的に、処置魚の段階Ｉｂ卵母細胞および卵胞細胞両方のシグナルはかなり、より強かった（図７Ｂ、Ｃ、Ｄ）。落射蛍光シグナルの強さに加えて、抗ＣＤ２０５処置卵巣で観察された特徴は卵母細胞内側のシグナルの存在を含み、これらの細胞の多くではっきりと環のように見える、卵母細胞核の周りのシグナルの凝縮を伴った。このシグナルは核を囲む小胞体内でのＢｉｋの期待される局在化に対応した。また、卵母細胞を囲む卵胞細胞内の強いシグナル発現が処置魚の卵巣で観察された。
【０１４４】
解釈
生殖細胞タンパク質（ＣＤ２０５およびＩＧＦ３）および支持体細胞タンパク質（ＧＳＤＦおよびＧＤＦ９）に対する処置は変動する効果を示したが、概して、それらは自己免疫応答を誘発し、これはその結果、生殖腺発達に影響した。このことは以下のことから結論付けることができる。
−処置の効果としての、生殖細胞および支持顆粒膜細胞またはセルトリ細胞のマーカーである転写産物の減少、
−生殖腺重量の喪失からおそらく生ずる、類推によって成体試験に対する、重量における遅延、
−生殖腺の形態学および組織学で観察される病理学的特徴、
−生殖細胞および体細胞の両方で起こるアポトーシスプロセスの強度。
【０１４５】
効果はＦＳＨ非依存的であった。ＦＳＨ（卵胞刺激ホルモン）は卵巣および精巣発達両方の主要な制御因子である。ＦＳＨは魚類で早期生殖細胞増殖および分化に影響する遺伝子の調節に関わっており、これらの因子はＩｇｆ経路（例えば、ｉｇｆ３）、およびＴｇｆβ経路（例えば、ｇｓｄｆ、ａｍｈ、およびｉｎｈα）等の、主要な調節経路に属する。また、ＦＳＨはセルトリ細胞増殖を刺激することが示唆されている。ＦＳＨはマス精巣でｉｎｈα発現を上方調節し、ａｍｈ発現の下方調節を誘発する（Ｓａｍｂｒｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，５０，１−１８）。私たちの研究では、ａｍｈおよびｉｎｈα発現に対する処置の相乗効果を主に観察し、このことはＦＳＨ刺激とは異なる機構を示唆する。生殖細胞増殖でのＧＳＤＦの役割はＦＳＨ調節経路を含まないという証拠がある（Ｓａｍｂｒｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３））。本研究では、抗ＧＳＤＦでの処置は３０ｄｐｆの生殖腺でａｍｈおよびｉｎｈαに対して有意な下方調節をもたらし、このことはまた、遺伝子発現に対する処置の効果は生殖腺刺激ホルモン仲介ではないという結論を支持する。結果として、生殖腺発達の妨害は、生殖腺発達で重要な標的タンパク質に対する免疫化、および生ずる免疫応答の結果であるにちがいない。
【０１４６】
体細胞−生殖細胞シグナル伝達クロストークのために、生殖細胞標的に対する免疫化は体性支持細胞に影響し、逆もまた同様であった。セルトリ細胞および顆粒膜細胞は通常の始原細胞種に由来する。インヒビンアルファは脳下垂体でＦＳＨ分泌を調節する、生殖腺からの内分泌ホルモンとして機能する。ゼブラフィッシュでは、ｉｎｈαは体性卵胞細胞で優勢に発現され、卵胞形成に伴って増大する。ａｍｈ発現はメダカの生殖細胞除去生殖腺の体細胞で検出されず、このことは生殖細胞からのシグナル伝達が体細胞でのａｍｈ発現を維持するために必要であることを示す。それゆえ、抗ＣＤ２０５および抗ＧＤＦ９処置で観察された、卵巣および精巣両方での有意な下方調節は、生殖細胞への有効な処置により引き起こされる、生殖腺での体細胞−生殖細胞系クロストークの妨害から生じ得る。
【０１４７】
私たちの、抗ＣＤ２０５および抗ＧＤＦ９（生殖細胞タンパク質）処置の結果は、以下の機構を示唆する。
−１５ｄｐｔでは、生殖細胞の早期分化段階に対する処置の効果が、ｉｇｋｃ発現（Ｂ細胞マーカー）の上昇、ｖａｓａ発現（生殖細胞マーカー）の減少で現れ、免疫機構（生殖腺での炎症反応および関連付けられる病理で現れる）による生殖細胞発達に対する直接的効果を示す。標的タンパク質は生殖細胞に関連するので、ｉｎｈαおよびａｍｈの発現で現れる、支持体細胞（セルトリおよび顆粒膜）に対する効果はわずかであった。
−３０ｄｐｔでは、生殖細胞に対する長期持続性効果（ｖａｓａ発現の減少、生殖腺組織病理、集中的なアポトーシス、および重量の進行性の遅延により現れる）は、生殖細胞からセルトリ細胞および顆粒膜細胞へのシグナル伝達の崩壊をもたらし、したがって、セルトリ細胞および顆粒膜細胞の発達に影響した（ｉｎｈαおよびａｍｈ発現の減少、ならびに集中的なアポトーシスで現れる）。
【０１４８】
セルトリ細胞および顆粒膜細胞生成シグナルに対する抗ＧＳＤＦおよび抗ＩＧＦ３処置の結果は、以下の機構を示唆する。
−１５ｄｐｔでは、免疫化（ｉｇｋｃ転写産物の上昇したレベルで現れる）は、関連転写産物の代償的転写（セルトリ／顆粒膜関連ｉｎｈａおよびａｍｈ発現の上方調節により現れる）、および同時の生殖腺発達の遅延（精巣発達の組織学的遅延で現れる）をもたらした。
−３０ｄｐｔでは、さらなる自己免疫反応（上昇したｉｇｋｃ発現で現れる）は、セルトリ細胞の分解（ｉｎｈａおよびａｍｈ発現の減少で現れる）をもたらし、一方で、顆粒膜細胞では、より少ない効果しか観察されなかった。
【０１４９】
結論として、いくつかの分析の結果は、幼若ゼブラフィッシュ生殖腺の生殖細胞および支持体細胞の選択された標的タンパク質に対するワクチン接種は、免疫反応を誘発し、これは、その結果として、生殖腺発達の妨害を引き起こすことを示す。免疫反応の誘発は、免疫遺伝子（Ｂ細胞およびＴ細胞関連の両方）の発現の上昇、生殖腺組織学で観察された病理学的特徴（グラニュロマストウス様炎症反応）、およびイミュノヒクトケミストリ（アポトーシス促進性タンパク質の強い発現）から結論付けることができる。生殖腺発達の妨害は、マーカーである、または生殖腺の生殖細胞でおよび支持体細胞で優勢に発現される遺伝子の発現の減少、閉鎖、萎縮、異常な細胞分布、および発達遅延を含む組織病理学的特徴、重量の遅延から結論付けることができる。まとめると、これらの結果は、注入されたＩＡＭは生殖腺細胞に対する自己免疫反応を誘発し、これは生殖腺発達に影響したことを示す。
【０１５０】
本実施例で使用されたＩＡＭは、免疫反応の誘発および生殖腺発達の妨害の点で、雄および雌生殖腺の両方で有効性を示したことは注目すべきことである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2015510878.tif 000024
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