(57)【要約】  痛みを予防、改善または治療する薬物の製造のためのα5サブユニットを含有するγ-アミノ酪酸A受容体の逆作動薬の用途を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
痛みを予防、改善または治療する薬物の製造のためのα5サブユニットを含有するγ-アミノ酪酸A受容体の逆作動薬またはその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項２】
前述のα5サブユニットを含有するγ-アミノ酪酸A受容体の逆作動薬は、選択的に当該受容体のベンゾジアゼピン結合部位と結合するリガンドであることを特徴とする請求項1に記載の使用。
【請求項３】
前述のα5サブユニットを含有するγ-アミノ酪酸A受容体の逆作動薬は、式（I）または（II）の構造を有する化合物またはその薬学的に許容される塩であることを特徴とする請求項1に記載の使用。
【化４３】
2015509935.tif 000047
ただし、R1aはハロゲン、またはC1-6アルキル基、C3-7シクロアルキル基、C4-7シクロアルケニル、C6-8ビシクロアルキル基、C6-10アリール基、C3-7ヘテロシクロアルキル基、1、2もしくは3個が窒素である6個の原子を含有する芳香族環または1、2もしくは3個が独立に酸素、窒素もしくは硫黄から選ばれ、且つそのうち酸素もしくは硫黄が1個以下である5個の原子を含有する芳香族環を有するヘテロアリール基、あるいはジ（C1-6）アルキルアミノ基を表し、これらの基のいずれもハロゲン、R3、OR3、OC(O)R3、NR4R5、NR4R5(C1-6)アルキル基、NR4R5C(O)、NR4R5C(O)(C1-6)アルキル基、CN、シアノ(C1-6)アルキル基またはR6から選ばれる置換基で任意に置換されてもよい。
R1bは、C1-6アルキル基、C3-7シクロアルキル基、C4-7シクロアルケニル基、アリール基、C3-7ヘテロシクロアルキル基、ヘテロシクロアリール基、ジ（C1-6）アルキルアミノ基を表す。
R3は、C2-6アルキル基、C2-6アルケニル基、C2-6アルキニル基、C3-6シクロアルキル基、C3-6シクロアルキル（C1-6）アルキル基、シアノ（C1-6）アルキル基、ヒドロキシ（C1-6）アルキル基を表し、且つR3は任意に1、2もしくは3-位がフッ素で置換されている。
R4とR5は、それぞれ独立に水素、C1-6アルキル基、C2-6アルケニル基、C2-6アルキニル基、C3-6シクロアルキル基またはCF3で、あるいはR4とR5は、両者と結合した窒素原子と一緒に4-7員の複素脂肪族環を形成し、当該脂肪族環は、前述窒素原子とO、NおよびSから任意に選ばれる1個のヘテロ原子とを含有し、前述環は、1個または複数個のR3基で任意に置換されてもよい。
R6は、C6-10アリール基、C6-10アリール（C1-6）アルキル基、ヘテロアリール基またはヘテロアリール（C1-6）アルキル基で、ここで、ヘテロアリール基は、以上のように定義されており、且つR6は、独立にハロゲン原子、ならびに無置換あるいは1個、2個または3個のハロゲン原子で置換されたC1-4アルキル基、C2-4アルケニル基、C2-4アルキニル基、C1-4アルコキシ基、C2-4アルケニルオキシ基およびC2-4アルキニルオキシ基から選ばれる1個、2個または3個で置換されている。
X'は、NR4R5で、あるいはX'は、独立に酸素、窒素および硫黄から選ばれる1、2、3もしくは4個のヘテロ原子を含有する5員複素芳香族環、または1、2もしくは3個の窒素原子を含有する6員複素芳香族環で、前述の5員複素芳香族環において、ヘテロ原子のうち最多1個が酸素または硫黄で、前述5または6員複素芳香族環は、任意にベンゼン環またはピリジン環に縮合し、且つ任意にRw及び/又はRy及び/又はRzで置換されており、ここで、Rwは、ハロゲン、R3、OR3、OC(O) R3、C(O)OR3、NR4R5、NR4C(O)R5、OH、トリ(C1-6アルキル基)シリルC1-6アルコキシC1-4アルキル基、CNまたはR6で、Ryは、ハロゲン、R3、OR3、OC(O) R3、NR4R5、NR4C(O) R5、NR4 R5(C1-6)アルキル基またはCNで、Rzは、R3、OR3、OC(O)R3で、X'がピリジン誘導体の場合、当該ピリジン環が任意にN-オキシドの形から選ばれ、且つX'がテトラゾール誘導体の場合、C1-4アルキル基で保護されていることを前提とし、あるいはX'は、独立にハロゲン、シアノ基、C1-6アルキル基、C2-6アルケニル基、C2-6アルキニル基およびC3-6シクロアルキル基から選ばれる1、2もしくは3個で任意に置換されたフェニル基である。
Z'は、独立に酸素、窒素および硫黄から選ばれる1、2もしくは3個のヘテロ原子を含有する5員複素芳香族環で、最多1個のヘテロ原子が酸素または硫黄で、且つ1個の原子が酸素または硫黄の場合も、少なくとも1個の窒素原子が存在することを前提とし、あるいはZ'は、2もしくは3個の窒素原子を含有する、ピラジン以外の6員複素芳香族環で、前述環のいずれかは、任意にハロゲン、R3、OR3、OC(O)R3、NR4R5、NR4R5(C1-6)アルキル基、NR4R5C(O)、NR4R5C(O)(C1-6)アルキル基、CN、シアノ(C1-6)アルキル基またはR6から選ばれる1個または複数個で任意に置換されている。
【請求項４】
前述のα5サブユニットを含有するγ-アミノ酪酸A受容体の逆作動薬は、式（III）または（V）で表される構造を有する化合物またはその薬学的に許容される塩であることを特徴とする請求項3に記載の使用。
【化４４】
2015509935.tif 000048
ただし、R1cは、臭素、チエニル基、t-ブチル基、フェニル基またはフリル基を表す。R1dは、アリール基、C1-6アルキル基、C3-7シクロアルキル基を表す。X1は、1、2もしくは3個の窒素原子を含有する5員複素環で、ヘテロ原子のうち最多1個が酸素または硫黄で、あるいはX1は、1、2もしくは3個の窒素原子を含有する6員複素芳香族環で、前述5または6員複素芳香族環の前述環のいずれかは、任意にC1-6アルキル基、アミノ基、ピリジニル基、CF3、アリール（C1-6）アルキル基、ピリジニル（C1-6）アルキル基、ハロゲン、シアノ基、シアノ（C1-6）アルキル基、メチロール基、ヒドロキシ基またはそのケト互変異性体から選ばれる1個または複数個で任意に置換されている。Z1は、ヒドロキシ基、ハロゲン、ヒドロキシ基またはアミノ基で置換されたC1-C4アルキル基、C2-C4アルケニル基、C2-C4アルキニル基、C1-C4アルコキシ基を表す。
【請求項５】
前述のα5サブユニットを含有するγ-アミノ酪酸A受容体の逆作動薬は、以下の化合物またはその薬学的に許容される塩であることを特徴とする請求項3に記載の使用。
【化４５】
2015509935.tif 000049
【請求項６】
前述のα5サブユニットを含有するγ-アミノ酪酸A受容体の逆作動薬は、以下の化合物またはその薬学的に許容される塩であることを特徴とする請求項3に記載の使用。
【化４６】
2015509935.tif 000050
【請求項７】
前述のα5サブユニットを含有するγ-アミノ酪酸A受容体の逆作動薬は、式（VI）の構造を有する化合物またはその薬学的に許容される塩であることを特徴とする請求項1に記載の使用。
【化４７】
2015509935.tif 000051
R1は、ハロゲン、C1-7アルキル基、C2-7アルキニル基、シクロアルキル基、C1-7アルコキシ基、OCF3、-NHR、-NHC（O）Rまたは-NHSO2Rで、Rは、水素、C1-7アルキル基、ハロゲンで置換されたC1-7アルキル基、ヘテロアリール基、-(CH2)nO-C1-7アルキル基、-NH-C1-7アルキル基で、R2は、ハロゲン、水素、-C(O)O(C1-4)アルキル基、C(O)NHCH2CCH、C(O)NHCH2CH2、SO2CH2CH3、C1-7アルキル基、ハロゲンで置換されたC1-7アルキル基、シアノ基、C3-6シクロアルキル基で、nは、0、1、2または3である。
【請求項８】
前述のα5サブユニットを含有するγ-アミノ酪酸A受容体の逆作動薬は、以下の化合物から選ばれることを特徴とする請求項7に記載の使用。
【化４８】
2015509935.tif 000052
【請求項９】
前述のα5サブユニットを含有するγ-アミノ酪酸A受容体の逆作動薬は、以下の化合物が好ましいことを特徴とする請求項1に記載の使用。
【化４９】
2015509935.tif 000053
【請求項１０】
前述のα5サブユニットを含有するγ-アミノ酪酸A受容体の逆作動薬は、末梢神経で発現されたα5サブユニットを含有するγ-アミノ酪酸A受容体と結合するが、中枢で発現されたα5-サブユニットを含有するγ-アミノ酪酸A受容体と有効に結合しないことを特徴とする請求項1に記載の逆作動薬。
【請求項１１】
前述の痛みは、末梢神経に関連する慢性痛であることを特徴とする請求項1に記載の使用。
【請求項１２】
前述の慢性痛は、神経因性疼痛、炎症性疼痛および癌性疼痛であることを特徴とする請求項1に記載の使用。
【請求項１３】
前述の痛みの病症は、頭痛、面部痛、頚痛、肩痛、背痛、胸痛、腹痛、背部痛、腰痛、下肢痛、筋肉・骨格痛、体躯痛、血管痛、痛風、関節炎痛、身体表現性障害に関連する痛み、内臓痛、感染病による痛み、多箇所骨痛、鎌状赤血球性貧血、自己免疫疾患、多発性硬化症または炎症に関連する痛み、急・慢性炎症痛、癌性疼痛、神経因性疼痛、損傷または手術による痛み、癌性痛、侵害受容性疼痛、糖尿病、末梢神経障害、疱疹後神経痛、三叉神経痛、腰部または子宮頸神経根障害、舌咽神経痛、自律神経反射性疼痛、反射性交感神経性ジストロフィー、神経根裂離、癌、化学損傷、毒素、栄養失調、ウイルスまたは細菌感染、退行性骨関節症、あるいはこれらの組合せを含む。
【請求項１４】
（1）完全のγ-アミノ酪酸A受容体機能を有するα5サブユニットを含有するγ-アミノ酪酸A受容体を含むシステムを提供する工程と、
（2）候補物質を工程（1）のシステムに投与し、候補物質とα5サブユニットを含有するγ-アミノ酪酸A受容体の結合の状況を観察し、候補物質がα5サブユニットを含有するγ-アミノ酪酸A受容体と結合する場合、当該候補物質を痛みを予防、改善または治療する潜在薬物とする工程と、
を含む、痛みを予防、改善または治療する薬物を選別する方法。
【請求項１５】
工程（1）は、γ-アミノ酪酸A受容体が完全のγ-アミノ酪酸A受容体機能を有する、α1サブユニットを含有するγ-アミノ酪酸A受容体を含むシステム、α2サブユニットを含有するγ-アミノ酪酸A受容体を含むシステム及び/又はα3サブユニットを含有するγ-アミノ酪酸A受容体を含むシステムから選ばれる対照群を設ける工程を含み、
工程（2）で、前述方法は、α5サブユニットを含有するγ-アミノ酪酸A受容体を含むシステムで候補物質とα5サブユニットを含有するγ-アミノ酪酸A受容体の結合の状況を検出し、対照群と比較し、候補物質とα5サブユニットを含有するγ-アミノ酪酸A受容体の結合の阻害定数Kiが統計学的に候補物質とα1、α2またはα3サブユニットを含有するγ-アミノ酪酸A受容体の結合の阻害定数Kiよりも低い場合、当該候補物質を痛みを予防、改善または治療する潜在薬物とすることを含む、を含むことを特徴とする請求項17に記載の方法。
【請求項１６】
工程（1）は、γ-アミノ酪酸A受容体が完全のγ-アミノ酪酸A受容体機能を有する、α1サブユニットを含有するγ-アミノ酪酸A受容体を含むシステム、α2サブユニットを含有するγ-アミノ酪酸A受容体を含むシステム及び/又はα3サブユニットを含有するγ-アミノ酪酸A受容体を含むシステムから選ばれる対照群を設ける工程を含み、
工程（2）で、前述方法は、電気生理的方法によって候補物質のγ-アミノ酪酸がγ-アミノ酪酸A受容体によって誘導する電流に対する抑制を検出し、被検物質がα5サブユニットを含有するγ-アミノ酪酸A受容体による電流を顕著に抑制するが、α1またはα2またはα3を含有するγ-アミノ酪酸A受容体によって誘導する電流を顕著に抑制しない場合、当該候補物質を痛みを予防、改善または治療する潜在薬物とすることを含むを含むことを特徴とする請求項17に記載の方法。
【請求項１７】
必要とする患者に安全有効量のα5サブユニットを含有するγ-アミノ酪酸A受容体の逆作動薬またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、痛みを予防、改善または治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物技術の分野に属し、具体的に、痛みを治療・緩和する物質に関する。
【背景技術】
【０００２】
痛みは、触、圧、熱や冷と異なる感覚表現である。患者は、通常、鋭い痛み、鈍い痛み、ひりひりする痛み、刺されるような痛み、割れるような痛みや灼けるような痛みなどの用語で痛みを形容する。通常、神経障害による、痛覚過敏として表れる痛みを「神経因性疼痛」と、侵害受容器への刺激による痛みを「侵害性疼痛」と言う。
【０００３】
臨床では、痛みは、急性痛と慢性痛の二種類に分かれる。急性痛は、皮膚、身体構造や内臓の損傷及び/又は疾患による有害な刺激、あるいは実際に組織損傷が生じない筋肉や内臓の機能異常によるものである。一方、慢性痛は、急性疾患の通常の経過または損傷の治癒の合理的な時間を超えるもの、あるいは継続的な痛みを起こす慢性の病理過程に関わるもの、あるいは痛みが一定の間隔で数ヶ月か数年再発し、治癒したはずの時まだ存在するものと定義されている。本発明の目的に関して、慢性痛は、慢性の緩和しないものでもよく、再発するものでもよいが、急性痛と慢性痛との定義の違いは、言語的なものだけでなく、重要な臨床関連性があり、例えば、急性痛が好適に抑えられないと、慢性痛に発展する。
【０００４】
急性痛と慢性痛は、病院学の機序、病理学および診断・治療の面で異なる。急性痛の一過性と比べ、慢性痛は、身体構造または内臓における慢性の病理過程、あるいは末梢または中枢神経系または両者の長時間の、時には永久的な機能損傷によるものである。また、慢性痛は、心理学の機序及び/又は環境要素によるものもある。
【０００５】
急性痛とは、通常、非神経疾患性疼痛で、関節炎性疼痛、筋肉・骨格の痛み、術後疼痛や線維筋痛のような通常の疾患を含む。これらの痛みのうちの大半は軟組織や骨の損傷によるものと思われ、例えば、関節炎性疼痛、筋肉・骨格の痛みや術後疼痛は、正常に機能する神経系において炎症を起こすので、痛みは炎症過程の結果だけである。
【０００６】
慢性痛は、神経因性疼痛、炎症性疼痛および癌性疼痛を含む。これらの痛みは、痛覚過敏及び/又は異常痛覚に関連するが、中では、痛覚過敏とは、典型的な有害刺激に対する感受性の上昇で、異常痛覚とは、典型的な非有害刺激に対する感受性の上昇である。
【０００７】
身体因性疼痛は、末梢の感覚神経の損傷や感染によるもので、末梢神経損傷、ヘルペスウイルス感染、糖尿病、焼灼痛、血管・神経叢の裂離、神経痛、手足の切断や結節性脈管炎による痛みを含むが、これらに限定されない。神経因性疼痛は、慢性の環境中毒、ヒト免疫不全ウイルス感染、甲状腺の機能衰退、尿毒症またはビタミン欠乏で生じる神経損傷によるものもあるが、その臨床所見は、炎症性痛、骨関節痛、三叉神経痛、癌性疼痛、糖尿病性神経障害、むずむず脚症候群、帯状疱疹後神経痛、焼灼痛、腕血管神経叢裂離、後頭神経痛、痛風、幻肢、火傷及び他の様態の神経痛、神経性・自発性疼痛症候群を含むが、これらに限定されない。
【０００８】
神経因性疼痛は、通常、末梢または中枢神経系の損傷または病変による慢性痛と思われている。神経因性疼痛に関連する病変は、長時間の末梢または中枢ニューロンの敏感化、神経系の抑制及び/又は亢進機能の損傷に関連する中枢の敏感化、並びに副交感神経と交感神経の神経系の間の異常の相互作用を含む。多くの臨床症状が神経因性疼痛に関わり、または神経因性疼痛の基礎となるが、例えば、糖尿病、切断術の術後疼痛、腰痛、癌、化学損傷や毒素、他の重大手術、外傷性損傷の圧迫による末梢神経損傷、栄養欠乏、感染（例えば帯状疱疹、HIV）などがある。
【０００９】
痛みを感じさせる刺激レベルは、「痛覚閾値」と呼ばれる。鎮痛剤は、意識を失わせずに患者の痛覚閾値を上げることで痛みを緩和する薬物である。痛覚過敏となった個体において、鎮痛剤は、抗痛覚過敏作用を有する。現在、米国食品医薬品局（FDA）に許可された処方鎮痛剤は、オピオイド系と抗炎症薬の二種類の薬物に分かれる。麻酔薬は、別の分類となる。オピオイド系鎮痛剤は、生体の内在性オピオイド系物質、すなわちエンドルフィンとエンケファリン（生体によって生成される、痛みの軽減に貢献するもの）を模擬して作用し、中枢及び末梢神経系のオピオイド受容体に作用することによって痛みを阻止する。抗炎症薬は、非選択性非ステロイド性抗炎症鎮痛剤と特異的なCOX-2阻害剤を含み、生体の損傷によるプロスタグランジンなどの化学伝達物質で生じる炎症を軽減するものである。
【００１０】
全部のオピオイド系鎮痛剤のうち、モルヒネは依然として最も広く使用されている鎮痛剤である。しかし、その治療特性の他、呼吸抑制、胃腸運動の低下（便秘の原因となる）、吐き気や嘔吐を含む欠点もある。耐性と物理的依存性もオピオイド系化合物の臨床使用を制限している。抗炎症系鎮痛剤は、アスピリンおよび他のサリチル酸化合物を含み、炎症過程の拡大を阻止し、かつ一時的に痛みを軽減することができるが、前述薬物は神経因性疼痛に対する効果が顕著ではない。そして、多くの抗炎症薬、特に非ステロイド性抗炎症薬は、胃腸管に副作用を起こし、特に経口投与の場合、この副作用は胃腸管の潰瘍や糜爛を引き起こし、これらの症状が通常見られない副作用は、入院が必要になるほど、ひいては死に至るほどひどくなることがある。ガバペンチン（Gabapentin）は、いま神経因性疼痛を治療する第一線の臨床薬物で、広く使用されている。ガバペンチンは、眠気、目眩、歩行不安定や疲労感を含む顕著な副作用を有し、これらの副作用は投与の初期で見られることが多い。児童は、たまにいらいらして起こりやすくなるが、投与を止めると消える。
【００１１】
これらの事実から、優れた安全性と薬物耐性を有し、且つ嗜癖性がない、より有効な鎮痛剤が必要である。理想的な鎮痛剤は、患者の痛みに対する感覚を軽減または除去し、各種類の痛みが生じた時、痛覚が無くなり、経口投与でも他の投与様態でもその作用は満足でき、副作用を最小限にし、あるいは無くし、且つ薬物耐性と薬物依存の傾向がない。
【００１２】
γ-アミノ酪酸（GABA）は、哺乳動物の中枢神経系において重要な抑制性神経伝達物質で、自然界に2種類のGABA受容体があるが、一種類はリガンド依存性イオンチャネルのスーパーファミリーに属するGABAA受容体で、もう一種類は、Gタンパク質共役受容体のスーパーファミリーに属するGABAB受容体である。哺乳動物におけるGABAA受容体のサブユニットは、α1-6、β1-4、γ1-3、δ、ε、θやρ1-2などのサブユニットが発見され、中では、αサブユニット、βサブユニットおよびγサブユニットは完全の機能型GABAA受容体の形成にとって不可欠で、αサブユニットはベンゾジアゼピンとGABAA受容体の結合に非常に重要である。ベンゾジアゼピンと結合できるのは、主に、α1、α2、α3またはα5サブユニットを含有するGABAA受容体であるが、α1サブユニットを含有するGABAA受容体は、主に安定と筋弛緩の作用を仲介し、α2とα3を含有する受容体は、主に抗痙攣の作用を仲介することを報告した文献がある。GABAA受容体の疼痛における作用に関する研究が幅広く、特にGABAA受容体の作動薬が中枢神経系で痛みを抑制することができるが、2008年にα2とα3サブユニットを含有するGABAA受容体の作動薬が脊髄のレベルで神経因性疼痛と炎症性疼痛を顕著に抑制することが報告された。GABAA受容体の阻害薬または逆作動薬は、痛みを抑制できるかどうか、まだ明らかではない。GABAはラットまたは人体の末梢神経系において興奮性の電流を引き起こし、GABAA受容体の作動薬であるMuscimolが低投与量ではホルマリンで誘導された痛みを抑制することができるが、高投与量ではホルマリンで誘導された痛みを促進することを報告した文献がある。GABAA受容体の疼痛における作用はまだ明らかではないが、GABAA受容体の中枢神経系における幅広い発現はリガンドの痛みの治療への応用を制限している。
【００１３】
α5を含有するGABAA受容体（α5-GABAA受容体）は、哺乳動物の大脳のGABAA受容体に占める比率が5％未満で、大脳皮質における発現レベルが非常に低いが、大脳の海馬組織におけるGABAA受容体に占める比率が20％超で、他の大脳区域ではほとんど発現されない。以前の研究は、α5-GABAA受容体が認知に関連することを示唆した(非特許文献１)。
【００１４】
α5-GABAA受容体の大脳の海馬組織における特異的な分布と機能の研究を考え、MSD社を含む多くの製薬会社がα5-GABAA受容体のリガンドの研究に従事し、続々と大量の化合物、特にα5-GABAA受容体に対する化合物が合成され、認知に関連する疾患の治療が期待されている。A5IとMRK016は、MSD社によって開発された認知関連疾患を治療する化合物であるが、A5Iは、臨床II期実験で化合物の溶解度が低すぎるため、腎臓毒性が生じることが分かり、一方、MRK016は、安全性に問題があり、I期臨床実験で、当該薬物が頭重感、頭痛や吐き気・嘔吐などの副作用を引き起こすことがわかった。
【００１５】
α5-GABAA受容体の末梢神経系における作用に関し、関連する報告はまだない。末梢神経系は、体性神経系と自律神経系で構成される。体性神経系は、感覚神経系（求心性神経）と運動神経系（遠心性神経）の二種類に分かれ、身体の各部に分布する。神経インパルスを末梢から神経中枢に伝達するニューロンを一次感覚ニューロンと呼び、感覚神経系において、胸神経だけは一本ずつ肋骨の下縁に沿い、肋間神経を形成し、胸壁と腹壁の皮膚と筋肉を支配する。他の感覚神経は、隣接の数本の神経が合わせて頚神経叢、腕神経叢、腰神経叢や仙骨神経叢などの神経叢を形成し、各神経叢からさらに多くの神経に分かれ、それぞれ頸部、上胸、上肢、下肢や会陰部の皮膚や筋肉などに分布する。後根神経節の一次感覚ニューロンは、細胞の直径の大きさによって異なる機能群に分かれ、通常、小細胞、中細胞および大細胞と分かれる。通常、中細胞・小細胞は、傷害性感受（痛み）を伝達する細胞とされ、一部の中細胞・小細胞の遊離神経終末は傷害性または持続性刺激に敏感で、傷害性感受器と呼ばれる。α5-GABAA受容体は主に小さいニューロンで発現され、且つ神経切断モデルで発現が向上することがわかったが(非特許文献２)、傷害または痛みと密接に関連するかどうかは本分野ではまだ深く研究されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国特許US 6355638
【特許文献２】国際出願WO 9850385 A1
【特許文献３】国際出願WO 92/22652
【特許文献４】国際出願WO 94/13799
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Collinson Nら, Enhanced learning and memory and altered GABAergic synaptic transmission in mice lacking the alpha 5 subunit of the GABAA receptor J Neurosci. 2002 Jul. 1; 22(13): 5572-80.
【非特許文献２】Xiao HSら, Identification of gene expression profile of dorsal root ganglion in the rat peripheral axotomy model of neuropathic pain.” Proc Natl Acad Sci U.S.A. 2002 Jun 11; 99(12): 8360-5.
【非特許文献３】Jones Pら, Pharmacokinetics and metabolism studies on (3-tert-butyl-7-(5-methylisoxazol-3-yl)-2-(1-methyl-1H-,2,4-triazol-5-ylmethoxy) pyrazolo[1,5-d][1,2,4]triazine, a functionally selective GABAA alpha5 inverse agonist for cognitive dysfunction. Bioorg Med Chem Lett. 2006 Feb 15; 16(4): 872-5.
【非特許文献４】Chambers MSら, An orally bioavailable, functionally selective inverse agonist at the benzodiazepine site of GABAA alpha5 receptors with cognition enhancing properties. J Med Chem. 2004 Nov 18; 47(24): 5829-32.
【非特許文献５】Sternfeld Fら, Selective, orally active gamma-aminobutyric acidA alpha5 receptor inverse agonists as cognition enhancers. J Med Chem. 2004 Apr 22; 47(9): 2176-9.
【非特許文献６】Atack JRら, In vitro and in vivo properties of 3-tert-butyl-7-(5-methylisoxazol-3-yl)-2-(1-methyl-1H-1,2,4-triazol-5-ylmethoxy) -pyrazolo[1,5-d]-[1,2,4]triazine (MRK-016)，a GABAA receptor alpha5 subtype-selective inverse agonist. J Pharmacol Exp Ther. 2009 Nov; 331(2): 470-84.
【非特許文献７】Goeders NEとKuhar MJ, Benzodiazepine binding in vivo with [3H]Ro 15-1788. Life Sci, 1985 Jul, 37(4): 345-355.
【非特許文献８】Wafford K A，Whiting P JおよびKemp J A , Differences in affinity and efficacy of benzodiazepine receptor ligands on recombinant GABAA receptor subtypes. 1993 Feb, Mol. Pharmacol 43(2) 40-244.
【非特許文献９】J.  Sambrookら編著、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」(科学出版社、2002年)
【非特許文献１０】Decosterd IおよびWoolf CJ. Spared nerve injury: an animal model of persistent peripheral neuropathic pain. 2000 Aug; Pain 87(2): 149-58.
【非特許文献１１】Chaplan SRら, Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods. 1994 Jul; 53(1): 55-63.
【非特許文献１２】Ladarolaら, "Differential activation of spinal cord dynorphin and enkephalin neurons during hyperalgesia:evidence using cDNA hybridization.” Brain Res. 1988，vol.455，No.2，pp:205-12.
【非特許文献１３】Munro Gら, A question of blance-positive versus negative allosteric modulation of GABAA receptor subtypes as drive of analgesi efficacy in rat model of inflammatory and neuropathic pain. Neuropharmacology. 2011 Jul-Aug;  61(1-2):  121-32.
【非特許文献１４】Ballard TMら, RO4938581, a novel cognitive enhancer acting at GABAA alpha5 subunit-containing receptors. Psychopharmacology (Berl). 2009 Jan; 202(1-3): 207-23.
【非特許文献１５】Culot Mら, An in vitro blood-brain barrier model for high throughput (HTS) toxicological screening. Toxicol In Vitro. 2008 Apr; 22(3): 799-811.
【発明の概要】
【００１８】
本発明の目的は、痛みを治療・緩和する物質および方法を提供し、同時に新しい鎮痛剤の選別方法を提出することである。
【００１９】
本発明の第一は、痛みを予防、改善（緩和）または治療する薬物の製造のためのα5-GABAA受容体の逆作動薬またはその薬学的に許容される塩の用途を提供する。
【００２０】
一つの好適な例において、前述のα5-GABAA受容体の逆作動薬は、選択的に当該受容体のベンゾジアゼピン結合部位と結合するリガンドである。
【００２１】
もう一つの好適な例において、前述のα5-GABAA受容体のリガンドは、α5-GABAA受容体と結合する能力がα1またはα2またはα3サブユニットを含有するGABAA受容体と結合する能力よりも高い。
【００２２】
もう一つの好適な例において、前述のα5-GABAA受容体のリガンドは、α5-GABAA受容体を逆作動する効率がα1またはα2またはα3サブユニットを含有するGABAA受容体を逆作動する効率よりも高い。
【００２３】
もう一つの好適な例において、前述のα5-GABAA受容体の逆作動薬は、式（I）および（II）の構造で表される構造を有する化合物またはその薬学的に許容される塩である。
【００２４】
【化１】
2015509935.tif 000002
【００２５】
ただし、R1aはハロゲン、またはC1-6アルキル基、C3-7シクロアルキル基、C4-7シクロアルケニル基、C6-8ビシクロアルキル基、C6-10アリール基、C3-7ヘテロシクロアルキル基、1、2もしくは3個が窒素である6個の原子を含有する芳香族環または1、2もしくは3個が独立に酸素、窒素もしくは硫黄から選ばれ、且つそのうち酸素もしくは硫黄が1個以下である5個の原子を含有する芳香族環を有するヘテロアリール基、あるいはジ（C1-6）アルキルアミノ基を表し、これらの基のいずれもハロゲン、R3、OR3、OC(O)R3、NR4R5、NR4R5(C1-6)アルキル基、NR4R5C(O)、NR4R5C(O)(C1-6)アルキル基、CN、シアノ(C1-6)アルキル基またはR6から選ばれる置換基で任意に置換されてもよい。
【００２６】
R1bは、C1-6アルキル基、C3-7シクロアルキル基、C4-7シクロアルケニル基、アリール基、C3-7ヘテロシクロアルキル基、ヘテロシクロアリール基、ジ（C1-6）アルキルアミノ基を表す。
【００２７】
R3は、C2-6アルキル基、C2-6アルケニル基、C2-6アルキニル基、C3-6シクロアルキル基、C3-6シクロアルキル（C1-6）アルキル基、シアノ（C1-6）アルキル基、ヒドロキシ（C1-6）アルキル基を表し、且つR3は任意に1、2もしくは3-位がフッ素で置換されている。
【００２８】
R4とR5は、それぞれ独立に水素、C1-6アルキル基、C2-6アルケニル基、C2-6アルキニル基、C3-6シクロアルキル基またはCF3で、あるいはR4とR5は、両者と結合した窒素原子と一緒に4-7員の複素脂肪族環を形成し、当該脂肪族環は、前述窒素原子とO、NおよびSから任意に選ばれる1個のヘテロ原子とを含有し、前述環は、1個または複数個のR3基で任意に置換されてもよい。
【００２９】
R6は、C6-10アリール基、C6-10アリール（C1-6）アルキル基、ヘテロアリール基またはヘテロアリール（C1-6）アルキル基で、ここで、ヘテロアリール基は、以上のように定義されており、且つR6は、独立にハロゲン原子、ならびに無置換あるいは1個、2個または3個のハロゲン原子で置換されたC1-4アルキル基、C2-4アルケニル基、C2-4アルキニル基、C1-4アルコキシ基、C2-4アルケニルオキシ基およびC2-4アルキニルオキシ基から選ばれる1個、2個または3個で置換されている。
【００３０】
X'は、NR4R5で、あるいはX'は、独立に酸素、窒素および硫黄から選ばれる1、2、3もしくは4個のヘテロ原子を含有する5員複素芳香族環、または1、2もしくは3個の窒素原子を含有する6員複素芳香族環で、前述の5員複素芳香族環において、ヘテロ原子のうち最多1個が酸素または硫黄で、前述5または6員複素芳香族環は、任意にベンゼン環またはピリジン環に縮合し、且つ任意にRw及び/又はRy及び/又はRzで置換されており、ここで、Rwは、ハロゲン、R3、OR3、OC(O) R3、C(O)OR3、NR4R5、NR4C(O)R5、OH、トリ(C1-6アルキル基)シリルC1-6アルコキシC1-4アルキル基、CNまたはR6で、Ryは、ハロゲン、R3、OR3、OC(O) R3、NR4R5、NR4C(O) R5、NR4 R5(C1-6)アルキル基またはCNで、Rzは、R3、OR3、OC(O)R3で、X'がピリジン誘導体の場合、当該ピリジン環が任意にN-オキシドの形から選ばれ、且つX'がテトラゾール誘導体の場合、C1-4アルキル基で保護されていることを前提とし、あるいはX'は、独立にハロゲン、シアノ基、C1-6アルキル基、C2-6アルケニル基、C2-6アルキニル基およびC3-6シクロアルキル基から選ばれる1、2もしくは3個で任意に置換されたフェニル基である。
【００３１】
Z'は、独立に酸素、窒素および硫黄から選ばれる1、2もしくは3個のヘテロ原子を含有する5員複素芳香族環で、最多1個のヘテロ原子が酸素または硫黄で、且つ1個の原子が酸素または硫黄の場合も、少なくとも1個の窒素原子が存在することを前提とし、あるいはZ'は、2もしくは3個の窒素原子を含有する、ピラジン以外の6員複素芳香族環で、前述環のいずれかは、任意にハロゲン、R3、OR3、OC(O)R3、NR4R5、NR4R5(C1-6)アルキル基、NR4R5C(O)、NR4R5C(O)(C1-6)アルキル基、CN、シアノ(C1-6)アルキル基またはR6から選ばれる1個または複数個で任意に置換されている。
【００３２】
もう一つの好適な例において、前述のα5-GABAA受容体の逆作動薬は、さらに式（I）および（II）で表される構造を有する化合物の異性体、前駆体を含む。
【００３３】
もう一つの好適な例において、前述のα5-GABAA受容体の逆作動薬は、式（III）または（V）で表される構造を有する化合物またはその薬学的に許容される塩である。
【００３４】
【化２】
2015509935.tif 000003
【００３５】
ただし、R1cは、臭素、チエニル基、t-ブチル基、フェニル基またはフリル基を表す。R1dは、アリール基、C1-6アルキル基、C3-7シクロアルキル基を表す。X1は、1、2もしくは3個の窒素原子を含有する5員複素環で、ヘテロ原子のうち最多1個が酸素または硫黄で、あるいはX1は、1、2もしくは3個の窒素原子を含有する6員複素芳香族環で、前述5または6員複素芳香族環の前述環のいずれかは、任意にC1-6アルキル基、アミノ基、ピリジニル基、CF3、アリール（C1-6）アルキル基、ピリジニル（C1-6）アルキル基、ハロゲン、シアノ基、シアノ（C1-6）アルキル基、メチロール基、ヒドロキシ基またはそのケト互変異性体から選ばれる1個または複数個で任意に置換されてもよい。Z1は、ヒドロキシ基、ハロゲン、ヒドロキシ基またはアミノ基で置換されたC1-C4アルキル基、C2-C4アルケニル基、C2-C4アルキニル基、C1-C4アルコキシ基を表す。
【００３６】
もう一つの好適な例において、前述のα5-GABAA受容体の逆作動薬は、さらに式（IIIおよびV）で表される構造を有する化合物の異性体、前駆体を含む。
【００３７】
もう一つの好適な例において、前述のα5-GABAA受容体の逆作動薬は、以下の化合物またはその薬学的に許容される塩である。
【００３８】
【化３】
2015509935.tif 000004
【００３９】
もう一つの好適な例において、前述のα5-GABAA受容体の逆作動薬は、好ましくは以下の化合物またはその薬学的に許容される塩である。
【００４０】
【化４】
2015509935.tif 000005
【００４１】
もう一つの好適な例において、前述のα5-GABAA受容体の逆作動薬は、式（VI）で表される構造を有する化合物またはその薬学的に許容される塩である。
【００４２】
【化５】
2015509935.tif 000006
【００４３】
ただし、R1は、ハロゲン、C1-7アルキル基、C2-7アルキニル基、シクロアルキル基、C1-7アルコキシ基、OCF3、-NHR、-NHC（O）Rまたは-NHSO2Rで、Rは、水素、C1-7アルキル基、ハロゲンで置換されたC1-7アルキル基、ヘテロアリール基、-(CH2)nO-C1-7アルキル基、-NH-C1-7アルキル基で、R2は、ハロゲン、水素、-C(O)O(C1-4)アルキル基、C(O)NHCH2CCH、C(O)NHCH2CH2、SO2CH2CH3、C1-7アルキル基、ハロゲンで置換されたC1-7アルキル基、シアノ基、C3-6シクロアルキル基で、nは、0、1、2または3である。
【００４４】
もう一つの好適な例において、前述のα5-GABAA受容体の逆作動薬は、以下の化合物またはその薬学的に許容される塩である。
【００４５】
【化６】
2015509935.tif 000007
【００４６】
もう一つの好適な例において、前述のα5-GABAA受容体の逆作動薬は、好ましくは以下の化合物またはその薬学的に許容される塩である。
【００４７】
【化７】
2015509935.tif 000008
【００４８】
もう一つの好適な例において、前述のα5-GABAA受容体の逆作動薬は、末梢神経で発見されたα5-GABAA受容体と結合するが、中枢神経で発見されたα5-GABAA受容体と有効的に結合しない。
【００４９】
もう一つの好適な例において、前述の痛みは、末梢神経に関連する慢性痛である。
【００５０】
もう一つの好適な例において、前述の慢性痛は、神経因性疼痛、炎症性疼痛および癌性疼痛である。
【００５１】
もう一つの好適な例において、前述の痛みの病症は、頭痛、面部痛、頚痛、肩痛、背痛、胸痛、腹痛、背部痛、腰痛、下肢痛、筋肉・骨格痛、体躯痛、血管痛、痛風、関節炎性疼痛、身体表現性障害に関連する痛み、内臓痛、感染病（例えばAIDSや帯状疱疹後神経痛）による痛み、多箇所骨痛、鎌状赤血球性貧血、自己免疫疾患、多発性硬化症または炎症に関連する痛み、急・慢性炎症痛、癌性疼痛、神経因性疼痛、損傷または手術による痛み、癌性痛、侵害受容性疼痛、糖尿病、末梢神経障害、疱疹後神経痛、三叉神経痛、腰部または子宮頸神経根障害、舌咽神経痛、自律神経反射性疼痛、反射性交感神経性ジストロフィー、神経根裂離、癌、化学損傷、毒素、栄養失調、ウイルスまたは細菌感染、退行性骨関節症、あるいはこれらの組合せを含むが、これらに限定されない。
【００５２】
本発明のもう一つは、
（1）完全のGABAA受容体機能を有するα5-GABAA受容体を含むシステムを提供する工程と、
（2）候補物質を工程（1）のシステムに投与し、候補物質とα5-GABAA受容体の結合の状況を観察し、候補物質がα5-GABAA受容体と結合する場合、当該候補物質を痛みを予防、改善または治療する潜在薬物とする工程と、
を含む、痛みを予防、改善または治療する薬物を選別する方法を提供する。
【００５３】
一つの好適な例において、前述のα5-GABAA受容体との結合は、選択的にベンゾジアゼピン結合部位と結合するものである。
【００５４】
もう一つの好適な例において、前述の候補物質は、中枢で発現されたα5-GABAA受容体と有効に結合しない。
【００５５】
もう一つの好適な例において、前述の候補物質は、動物体の血液脳関門を少量で通過するか、通過しない物質で、動物体内の組織分布で、候補化合物の大脳組織における分布が血漿組織における分布の50％よりも低い。
【００５６】
もう一つの好適な例において、前述のα5-GABAA受容体は、GABAA受容体のα5サブユニット、βサブユニット（たとえばβ2、β3）、γサブユニット（たとえばγ1、γ3）からなる。
【００５７】
もう一つの好適な例において、前述の工程（2）は、候補物質がGABAがGABAA受容体によって誘導する電流を（たとえば、20％以上、好ましくは40％以上、より好ましくは50％以上）抑制する状況を観察し、候補物質がGABAがGABAA受容体によって誘導する電流を抑制する場合、当該候補物質を痛みを予防、改善または治療する潜在薬物とすることを含む。
【００５８】
もう一つの好適な例において、工程（1）は、GABAA受容体が完全のGABAA受容体機能を有する、α1サブユニットを含有するGABAA受容体を含む（例えば発現する）システム、α2サブユニットを含有するGABAA受容体を含む（例えば発現する）システム及び/又はα3サブユニットを含有するGABAA受容体を含む（例えば発現する）システムから選ばれる対照群を設ける工程を含み、且つ、工程（2）で、前述方法は、α5-GABAA受容体を含む（例えば発現する）システムで候補物質とα5-GABAA受容体の結合の状況を検出し、対照群と比較し、候補物質とα5-GABAA受容体の結合阻害定数Ki(nM)（拮抗剤と受容体の結合能力を表す物理定数で、小さいほど、結合能力が強い）が統計学的に候補物質とα1、α2またはα3サブユニットを含有するGABAA受容体の結合阻害定数Kiよりも低い場合（たとえば、20％以上低い、好ましくは40％以上低い、より好ましくは60％以上低い、更に好ましくは80％以上低い）、当該候補物質を痛みを予防、改善または治療する潜在薬物とすることを含む。
【００５９】
もう一つの好適な例において、前述の候補物質は、α5-GABAA受容体のリガンドの中枢における結合を有効に阻害することができない（例えば、同位元素標識方法によってこのような結合を同定する）。実験動物に一定の投与量の候補物質と既知のα5-GABAA受容体の標識（例えば、同位元素標識）されてもよい特異的リガンドを投与した後、当該候補物質が既知のα5-GABAA受容体の特異的リガンドの中枢における分布を抑制するかどうかを検出し、候補物質が既知のα5-GABAA受容体の特異的リガンドの中枢における分布を60％未満に抑制する場合、当該候補物質を痛みを予防、改善または治療する潜在薬物とする。
【００６０】
もう一つの好適な例において、前述の候補物質が有効に血液脳関門を通過せず、候補物質の大脳および血漿における分布比率が50％未満の場合、当該候補物質を痛みを予防、改善または治療する潜在薬物とする。
【００６１】
もう一つの好適な例において、工程（1）は、GABAA受容体が完全のGABAA受容体機能を有する、α1サブユニットを含有するGABAA受容体を含む（例えば発現する）システム、α2サブユニットを含有するGABAA受容体を含む（例えば発現する）システム及び/又はα3サブユニットを含有するGABAA受容体を含む（例えば発現する）システムから選ばれる対照群を設ける工程を含み、且つ、工程（2）で、前述方法は、電気生理的方法によって候補物質のGABAがGABAA受容体によって誘導する電流に対する抑制を検出し、被検物質がα5-GABAA受容体による電流を顕著に（たとえば、20％以上、好ましくは40％以上、より好ましくは50％以上）抑制するが、α1またはα2またはα3を含有するGABAA受容体によって誘導する電流を顕著に抑制しない場合、当該候補物質を痛みを予防、改善または治療する潜在薬物とすることを含む。
【００６２】
もう一つの好適な例において、前述の候補物質は、小分子化合物（例えばγ-アミノ酪酸Aの逆作動薬）、ポリペプチド、リガンドを含むが、これらに限定されない。
【００６３】
もう一つの好適な例において、前述のシステムは、細胞システム（または細胞培養物システム）（例えば後根神経節細胞）、亜細胞システム、溶液システム、組織システム、器官システムまたは動物システムから選ばれる。
【００６４】
本発明の好ましい様態として、前述の方法は、さらに、得られた潜在物質に対してさらなる細胞実験及び/又は動物試験を行い、さらに痛みを予防、改善または治療するのに本当に有用な物質を選別・確定することを含む。
【００６５】
本発明のもう一つは、必要とする患者に安全有効量のα5-GABAA受容体の逆作動薬またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、痛みを予防、改善または治療する方法を提供する。
【００６６】
一つの好適な例において、前述のα5-GABAA受容体の逆作動薬またはその薬物的に許容される塩は、経口投与、皮下注射、経皮吸収型貼付剤、鼻内投与または自動注射装置によって投与される。
【００６７】
本発明の他の主旨は、本文の公開される内容によって、この分野の技術者にとっては明らかになっている。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図1は、神経部分損傷（Spared Nerve Injury、SNI）条件で、GABAA受容体のα5サブユニットのタンパク質の後根神経節における発現が向上した。  Aは、免疫組織化学の実験でGABAA受容体のα5サブユニットのタンパク質の発現の状況を測定した。  Bは、イムノブロットの実験でGABAA受容体のα5サブユニットのタンパク質レベルを測定した。
【図２】図1は、完全フロインドアジュバント（CFA）で誘導された炎症性疼痛モデルの条件で、GABAA受容体のα5サブユニットのタンパク質の後根神経節における発現が向上した。  Aは、免疫組織化学の実験でGABAA受容体のα5サブユニットのタンパク質の発現の状況を測定した。  Bは、イムノブロットの実験でGABAA受容体のα5サブユニットのタンパク質レベルを測定した。
【図３】図3は、後根神経節におけるGABAA受容体のα5サブユニットのタンパク質が坐骨神経に輸送することが可能である。  Aは、免疫組織化学の実験でGABAA受容体のα5サブユニットのタンパク質の発現の状況を測定した。  Bは、イムノブロットの実験でGABAA受容体のα5サブユニットのタンパク質の坐骨神経、後根神経節細胞、後根神経および脊髄後角におけるタンパク質レベルを測定した。
【図４】図4は、SNIで誘導された疼痛モデルにおいて、MRK016またはMRK016-M3を投与して有効に神経因性疼痛を抑制した。  Aは、SNIモデルの構築から7日後、MRK016を皮下注射した後の異なる時点における機械痛の閾値である。  Bは、投与量依存試験でMRK016-M3の神経因性疼痛に対する抑制効果を測定した。  Cは、ガバペンチンの神経因性疼痛の治療の有効性および有効投与量の分析である。  Dは、SNIの構築から10日後のラットを実験動物とし、ラットの足の裏にMRK016-M3を注射し、神経因性疼痛を抑制する有効性分析である。  Eは、GABAA受容体のα5サブユニットのmRNAに対するsiRNAを鞘内注射し、ノックアウトを実施した後のα5-GABAA受容体の後根神経節における発現の状況を検出した。  Fは、GABAA受容体のα5サブユニットのmRNAに対する特異的なsiRNAの鞘内注射は、疼痛閾値を顕著に向上させ、対照のsiRNAは顕著な鎮痛効果がなかった。  Gは、GABAA受容体のα5サブユニットのmRNAに対する特異的なsiRNAを鞘内注射する条件で、MRK016-M3で疼痛閾値を顕著に向上させず、対照のsiRNAを注射した場合、MRK016-M3で疼痛閾値を顕著に向上させた。
【図５】図5は、CFAで誘導された炎症性疼痛モデルにおいて、MRK016またはMRK016-M3を投与することによって、ラットの疼痛反応を抑制できた。  Aは、まず、ラットの熱痛閾値と機械痛閾値を検出した後、当日にGABAA受容体のα5サブユニットのmRNAに対するsiRNAまたは対照siRNAを注射し、2日目にラットの右足の裏に100μlのCFAを注射し、さらに毎日ラットの熱痛閾値を検出した。  Bは、まず、ラットの熱痛閾値と機械痛閾値を検出した後、当日にGABAA受容体のα5サブユニットのmRNAに対するsiRNAを注射し、2日目にラットの右足の裏に100μlのCFAを注射し、さらに毎日ラットの機械痛閾値を検出した。  Cは、炎症性疼痛モデルの7日目に、MRK016（2mg/kg体重）を腹腔注射し、当該化合物が有効に機械痛を抑制することがわかった。  Dは、炎症性疼痛モデルの3日目に、MRK016（2mg/kg体重）を腹腔注射し、当該化合物が有効に熱痛を抑制することがわかった。  Eは、炎症性疼痛モデルの構築から3日後、熱痛を検出したところ、MRK016-M3投与の1時間後痛みを顕著に抑制した。  Fは、炎症性疼痛モデルの構築から7日後、機械痛を検出したところ、MRK016-M3投与の1時間後痛みを顕著に抑制した。
【図６】図6は、α5-GABAA受容体のリガンドA5Iで神経因性疼痛と炎症性疼痛を治療した。  Aは、α5IAのSNIモデルにおける鎮痛作用を検出した。α5IA（3mg/kg体重）では、顕著に神経因性疼痛を抑制でき、モルヒネ（10mg/kg体重）を陽性対照とした。  Bは、α5IAの連続注射で、耐性反応が生じなかった。SNIモデル構築から14日後、6日投与を続け、それぞれ投与の1-3時間後疼痛閾値を検出した。  Cは、炎症性疼痛モデルの構築から3日後、A5Iの腹腔注射（3mg/kg体重）も、熱痛を有効に治療することができた。  Dは、炎症性疼痛モデルの構築から7日後、A5Iの腹腔注射（3mg/kg体重）も、機械痛を有効に治療することができた。
【図７】図7は、α5-GABAA受容体の異なるリガンド（C2、C3およびC4）で神経因性疼痛と炎症性疼痛を治療した。  Aは、異なるリガンド（C2、C3およびC4）の化学構造式である。  Bは、SNIモデルの構築から14日後、それぞれC2、C3またはC4を皮下注射し、1時間後それぞれ当該系列の薬物の鎮痛効果を検出したところ、当該系列の薬物はいずれも痛みを有効に治療することができた。  Cは、炎症性疼痛モデルの構築から7日後、それぞれC2、C3またはC4を皮下注射し、1時間後それぞれ当該系列の薬物の機械痛に対する鎮痛効果を検出したところ、当該系列の薬物はいずれも痛みを有効に治療することができた。  Dは、炎症性疼痛モデルの構築から3日後、それぞれC2、C3またはC4を皮下注射し、1時間後当該系列の薬物の熱痛に対する鎮痛効果を検出したところ、当該系列の薬物はいずれも痛みを有効に治療することができた。
【図８】図8は、α5-GABAA受容体の異なるリガンド（C5、C6、C7およびC8）で神経因性疼痛と炎症性疼痛を治療した。  Aは、異なるリガンド（C5、C6、C7およびC8）の化学構造式である。  Bは、SNIモデルの構築から14日後、それぞれC5、C6、C7またはC8を皮下注射し、1時間後当該系列の薬物の鎮痛効果を検出したところ、当該系列の薬物はいずれも神経因性疼痛を有効に治療することができた。  Cは、炎症性疼痛モデルの構築から7日後、C5、C6、C7またはC8を皮下注射し、1時間後当該系列の薬物の機械痛に対する鎮痛効果を検出したところ、当該系列の薬物はいずれも痛みを有効に治療することができた。  Dは、炎症性疼痛モデルの構築から3日後、C5、C6、C7またはC8を皮下注射し、1時間後当該系列の薬物の熱痛に対する鎮痛効果を検出したところ、当該系列の薬物はいずれも痛みを有効に治療することができた。  Eは、SNIモデルの構築から14日後、それぞれ1mg/kgまたは3mg/kgの投与量でC5を皮下注射した後、異なる時点で化合物C5の鎮痛効果を検出したところ、いずれも痛みを有効に治療することができた。モルヒネを陽性対照とし、10mg/kg体重の投与量で皮下注射した。  Fは、化合物C5はペンテトラゾール（Pentetrazol）で誘導された癲癇には効果がなかった。当該試験において、まず、それぞれ、1mg/kg、3mg/kg、10mg/kgおよび15mg/kgという異なる投与量の化合物C5を皮下注射した。0.5時間後、それぞれ100mg/kgのペンテトラゾールを注射し、試験結果から、異なる投与量の化合物C5はペンテトラゾールで誘導された痙攣発作に対して反応次数と潜伏期間に影響がないことが証明された。
【発明を実施するための形態】
【００６９】
本発明者は、深く研究したところ、初めて、末梢神経のα5-GABAA受容体に対する逆作動薬で痛みを治療する、新規な痛みを治療する方法を見出した。
【００７０】
本発明は、GABAA受容体のα5サブユニットのタンパク質が主に末梢の神経叢または坐骨神経に輸送され、SNIモデルとCFAで誘導された炎症性疼痛モデルの条件で当該遺伝子のタンパク質の発現が上昇することを開示する。本発明者は、それらの血液脳関門を少量で通過するか、通過しないGABAA受容体の逆作動薬は、末梢神経のα5-GABAA受容体と結合し、神経因性疼痛と炎症性疼痛を抑制することができると仮設を立てた。GABAA受容体のα5サブユニットが主に神経系で発現されることを考えると、このような化合物は、理論上、副作用がないか、副作用が小さい鎮痛薬物である。
【００７１】
用語
ここで用いられるように、「α5サブユニットを含有するγ-アミノ酪酸A受容体」、「α5-GABAA受容体」、「α5サブユニットを含有するGABAA受容体」は、入れ替えて使用することができる。
【００７２】
ここで用いられるように、「γ-アミノ酪酸A受容体」、「GABAA受容体」は、入れ替えて使用することができる。
【００７３】
ここで用いられるように、「α5サブユニットを含有するGABAA受容体のリガンド」は、α5-GABAA受容体と結合することができ、疼痛反応を調節できる化合物と定義されている。
【００７４】
ここで用いられるように、「α5サブユニットを含有するGABAA受容体の逆作動薬」とは、α5-GABAA受容体と結合することができ、且つGABAのα5-GABAA受容体に対する作用を阻害することができる化合物を指す。
【００７５】
ここで用いられるように、「治療」は、予防性投与も含み、一旦前述病症が生じると、前述病症を緩和または解消する。
【００７６】
ここで用いられるように、「患者」は、任意の温血動物と定義されており、例えば、マウス、モルモット、イヌ、ウマや人が挙げられるが、これらに限定されず、前述患者は、人が望ましい。
【００７７】
ここで用いられるように、「急性痛」は、皮膚、身体構造や内臓の損傷及び/又は疾患による有害な刺激で生じる痛み、あるいは実際に組織損傷が生じない筋肉や内臓の機能異常による痛みと定義されている。
【００７８】
ここで用いられるように、「慢性痛」は、急性疾患の通常の経過または損傷の治癒の合理的な時間を超えるもの、あるいは継続的な痛みを起こす慢性の病理過程に関わるもの、あるいは痛みが一定の間隔で数ヶ月か数年再発し、治癒したはずの時または通常の治療過程を超えた後、まだ存在する痛みと定義されている。痛みの経過時間の長さは、痛みの性質と痛みに関連する治療過程によるもので、痛みが通常の治療過程を超えると、痛みは慢性のものである。慢性痛は、頭痛、面部痛、頚痛、肩痛、胸痛、腹痛、背部痛、腰痛、下肢痛、筋肉・骨格痛、身体表現性障害に関連する痛み、内臓痛、有痛性糖尿病性神経障害、血管痛、痛風、関節炎性疼痛、癌性痛、自律神経反射性疼痛、感染病（例えばエイズや帯状疱疹後神経痛）による痛み、自己免疫疾患（リウマチ）による痛み、急・慢性炎症による痛み、術後疼痛や火傷後疼痛を含むが、これらに限定されない。
【００７９】
本発明で開示された薬物は、有効に以上のように定義された慢性痛を治療することができ、且つ本発明で開示された薬物は、痛覚過敏、異常疼痛、痛覚増加や疼痛記憶増加を含む他の病症に伴う異痛を治療することができるため、この発明はその痛みの治療を改善する。
【００８０】
ここで用いられるように、「頭痛」は、原発性頭痛と続発性頭痛に分けられ、原発性頭痛は、緊張型頭痛、片頭痛や群発頭痛を含むが、続発性頭痛は他の疾患によるものである。頭面部の痛みに敏感な組織が病変し、あるいは刺激を受けた時、各種の頭痛が生じ、これらの痛みに敏感な組織は、頭皮、面部、口腔や咽喉などに分布し、主に頭部の筋肉または血管であるため、大量の神経線維を含有し、痛みに比較的に敏感なので、これらの組織が侵害されると、頭痛が生じる。
【００８１】
ここで用いられるように、「面部痛」は、三叉神経痛、非定型顔面痛、顔面神経麻痺や顔面痙攣を含むが、これらに限定されない。
【００８２】
ここで用いられるように、「三叉神経痛」は、独特な慢性痛性疾患で、疼痛性チックとも呼ばれ、三叉神経が分布する区域で短時間で、発作的で、再発する電撃のような激しい痛み、同側の顔面痙攣が伴うこともある。三叉神経痛は、原発性と続発性の二種類に分かれ、原発性三叉神経痛とは、臨床で神経系の所見（サイン）がなく、検査で器質性病変がないもので、続発性三叉神経痛とは、臨床で神経系の所見が見られ、検査で器質性病変があるもので、たとえば腫瘍や炎症などが挙げられる。
【００８３】
ここで用いられるように、「非定型顔面痛」とは、複数の病因による痛みを指す。持続的な焼灼痛が見られ、間欠性ではなく、特定の動作や触発刺激と関係なく、痛みは大体両側で、よく三叉神経の分布範囲を超え、ひいては頸部皮膚まで影響する。病因は、鼻洞炎、悪性腫瘍、顎や頭蓋底の感染などの原因刺激または三叉神経の損傷によって痛みが生じる。
【００８４】
ここで用いられるように、「頚痛、背痛、肩痛」とは、急・慢性筋挫傷や骨関節の退行性変性や外傷などによる痛みを指す。首、肩および上肢の痛みを引き起こす通常の疾患は、頚肩筋筋膜炎、項靭帯炎、頚椎症、肩関節周囲炎、胸郭出口症候群、上腕骨外側上顆炎などがあり、また自己免疫疾患による痛みはよく関節リウマチ、強直性脊椎炎やリウマチ性関節炎などの疾患で見られ、他の頚痛、背痛、肩痛の原因となる疾患は、さらに、頸部・肩部の腫瘍、神経炎、動・静脈の疾患や各種の感染、および胸・腹腔臓器の病変による関連痛などがある。
【００８５】
ここで用いられるように、「胸、腹および背部痛」とは、胸・腹部の内臓、胸・腹壁組織の疾患による痛みを指し、肋間神経痛、肋軟骨炎、狭心症、腹痛（急性腹部内臓痛）や腰・背部筋筋膜症候群を含むが、これらに限定されない。
【００８６】
ここで用いられるように、「腰・下肢痛」とは、下背、腰仙、仙腸、骨盤、臀部および下肢の痛みを指す。腰・下肢痛は、通常、独立の疾患ではなく、複数の疾患の共有特徴で、臨床所見が多様で、病因が非常に複雑で、退行性と損傷が多く、腰椎椎間板ヘルニア、急性腰部捻挫、坐骨神経痛、骨質粗しょう症、第3腰椎横突起症候群、梨状筋症候群、変形性膝関節症、尾骨痛や踵痛などに関する痛みを含むが、これらに限定されない。
【００８７】
ここで用いられるように、「筋肉・骨格痛」は、筋筋膜痛、創傷による痛みや慢性局所疼痛症候群を含むが、これらに限定されない。
【００８８】
ここで用いられるように、「有痛性糖尿病」とは、糖尿病と併発する神経障害による痛みを指すが、糖尿病における神経障害は少なくとも一部が血流減少と高血糖によるものである。一部の糖尿病患者は、神経病変が起きないが、他の患者は早期で発生し、糖尿病性神経障害の痛みは、一つまたは複数の病巣部位の単神経障害と全身性多発神経障害に分かれ、前述多発神経障害は拡散的で対称的でもよく、通常、主に感覚方式に関する（Merrit's Textbook of Neurology、第9版）。糖尿病性神経障害の所見は、植物神経機能障害を含み、心臓、平滑筋および腺体を含む調節障害が生じ、低血圧、下痢、便秘やインポテンツを引き起こす。糖尿病性神経障害は、通常、段階的に発展するが、早期では、神経末梢区に、植物神経障害や感覚神経障害の時、足部に、脳神経障害の時、面部や目の周囲に、間欠性疼痛や刺痛が現れ、次の段階では、痛みが強くなって頻度が高くなり、最後にある区域で痛覚を失った時、無痛性神経障害が生じ、損傷の表現としての痛みがないため、厳重な組織損傷が生じる危険性が大幅に上昇する。
【００８９】
ここで用いられるように、「内臓痛」は、過敏性腸症候群（IBS）、慢性疲労症候群（CFS）、炎症性腸疾患（IBD）や間質性膀胱炎が伴うか伴わない痛みを含むが、これらに限定されない。
【００９０】
ここで用いられるように、「血管痛」は、以下の一種または複数種の要素による痛みである。第一は、組織の不適な灌注。一時または連続の局所虚血を引き起こすが、たとえば運動時肢体の筋肉に局所虚血が生じる。第二は、遅発性変化。たとえば、皮膚または腹部の内臓に潰瘍または壊疽が生じる。第三は、大血管径の突然または加速の変化。たとえば、動脈瘤に変化が生じる。第四、主動脈の破裂。その結果、血液が流出し、腹膜または胸膜の壁層における侵害受容線維を刺激する。第五は、動脈における注射が動脈内皮を刺激することによる激しい痙攣。第六は、静脈還流の損害。その結果、筋区画の迅速な拡張によって大量の水腫が生じる(Bonica's Management of Pain、第一卷(第二版))。実例は、閉塞性動脈硬化症、閉塞性血栓性血管炎、急性動脈閉塞、塞栓、先天性動静脈瘤、血管攣縮性疾患、レイノー病、先端紫藍、急性静脈閉塞、血栓性静脈炎、静脈瘤様腫脹やリンパ水腫を含むが、これらに限定されない。
【００９１】
ここで用いられるように、「癌性疼痛」とは、悪性腫瘍の発展過程に現れる痛みで、癌性疼痛の発生は、癌の発展によって直接生じる痛み、癌治療後生じる痛みおよび癌患者の疼痛性疾患の併発という三種の機序があると思われる。
【００９２】
ここで用いられるように、「自律神経反射性疼痛」とは、「反射性交感神経性萎縮症」による痛みを指す。反射性交感神経性萎縮症とは、生体が急・慢性損傷を受けた後、激しい自発の痛みがあり、触覚と痛覚が過敏になり、腫れと血行障害が伴い、これによって皮膚と筋肉・骨格の栄養障害と萎縮などの症状が生じる。
【００９３】
ここで用いられるように、「術後疼痛」とは、身体の疾患そのものおよび手術による組織損傷に対する一種の複雑な生理反応を指し、心理と行為上の不愉快な経験として現れる。
【００９４】
ここで用いられるように、「関節炎性疼痛」は、骨関節炎、関節リウマチ、関節強直性脊椎炎、乾癬性関節症、痛風、偽痛風、伝染性関節炎、腱炎、滑液包炎、骨損害や関節軟部組織炎症などの疾患による痛みを含むが、これらに限定されない。
【００９５】
ここで用いられるように、「帯状疱疹後神経痛」とは、帯状疱疹の皮疹が癒合した後、元の皮疹区の皮下に長期間に存在する激しい痛みを指す。
【００９６】
ここで用いられるように、「傷害性疼痛」は、侵害受容器への刺激によって伝達した組織の損害過程による痛み、あるいは侵害受容器の延長した興奮による痛みである。侵害受容器の延長した興奮による痛みは、侵害受容器の継続の有害刺激またはその敏感化または両者によるものでもよく、あるいはこれらの要素によって発生し、且つその持久性、各種の反射機序および他の要素によって延長したものでもよい。
【００９７】
ここで用いられるように、「痛覚」とは、有害刺激を探測する神経機序を指す。痛覚は、末梢神経末梢によって傷害刺激を伝達する工程とこれらの信号を中枢神経系に伝達する工程との二つの工程に関する。
【００９８】
ここで用いられる用語「アルキル基」とは、飽和の、直鎖または分枝鎖の脂肪族水素化炭素基を指す。例えば、アルキル基は、メチル基、エチル基、n-プロピル基、iso-プロピル基、n-ブチル基、iso-ブチル基、t-ブチル基を含むが、これらに限定されない。前述の「アルキル基」は、好ましくはC1-8アルキル基、より好ましくはC1-6アルキル基、さらに好ましくはC1-4アルキル基である。
【００９９】
ここで用いられる用語「アルケニル基」とは、炭素-炭素二重結合を少なくとも一つ含有する、少なくとも2個の炭素原子（好ましくは2-6個の炭素原子）を有する直鎖または分枝鎖の水素化炭素基を指す。前述の「アルケニル基」は、好ましくはC2-8アルケニル基、より好ましくはC2-6アルケニル基、さらに好ましくはC2-4アルケニル基である。
【０１００】
ここで用いられる用語「アルキニル基」とは、炭素-炭素三重結合を少なくとも一つ含有する、少なくとも2個の炭素原子（好ましくは2-8個の炭素原子、より好ましくは2-6個の炭素原子、さらに好ましくは2-4個の炭素原子）を有する直鎖或いは分枝鎖の炭化水素基を指す。
【０１０１】
ここで用いられる用語「ハロゲン」とは、F、Cl、BrまたはI、特にF、ClまたはBrを指す。
【０１０２】
ここで用いられる用語「アルコキシ基」とは、酸素を含有するアルキル基を指すが、例えばメトキシ基、エトキシ基、n-プロポキシ基、iso-プロポキシ基などが挙げられる。好ましくは2-8個の炭素原子、より好ましくは2-6個の炭素原子、さらに好ましくは2-4個の炭素原子を有する。
【０１０３】
ここで用いられる用語「シクロアルキル基」とは、3〜7個の炭素原子を有するシクロアルキル基を指すが、例えばシクロプロピル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基やシクロヘプチル基などが挙げられる。
【０１０４】
ここで用いられる用語「シクロアルケニル基」は、「シクロアルキル基」のように定義されており、且つ不飽和の炭素-炭素二重結合を少なくとも一つ含有する。
【０１０５】
ここで用いられる用語「アリール基」とは、芳香族系を指すが、単環あるいは元々縮合または連結した芳香族多環でもよく、少なくとも一部が縮合または連結した環が共役の芳香族系を形成する。アリール基は、フェニル基、ナフチル基を含むが、これらに限定されない。
【０１０６】
ここで用いられる用語「複素環」とは、安定した4-7員の単環或いは安定した多環式複素環を指すが、この複素環は飽和、部分的に不飽和或いは不飽和のものであり、かつ炭素原子とN、O及びS原子から選ばれる1-4個のヘテロ原子からなるものでもよい。NとS原子は酸化されてもよい。また、複素環は任意な多環を含めてもよい。ここで、上述複素環はいずれも芳香環に縮合してもよい。
【０１０７】
ここで用いられる用語「ヘテロアリール基」とは、複素環のアリール基を指す。
【０１０８】
ここで用いられる用語「異性体」は、配座異性体、光学異性体（例えばエナンチオマーとジアステレオマー）、幾何異性体（例えばシス-トランス異性体）を含む。
【０１０９】
α5サブユニットを含有するγ-アミノ酪酸A受容体の逆作動薬およびその用途
α5-GABAA受容体の逆作動薬に対する研究は既に十数年が経ち、次々と新規な化合物が合成され、以前の研究では、学習記憶（認知）に関連する疾患を治療することができると思われる。
【０１１０】
本発明者は、深く研究した結果、α5-GABAA受容体の逆作動薬が有効に痛みを抑制することができることを見出した。α5-GABAA受容体の逆作動薬として、α5-GABAA受容体と結合することができるもので、α5-GABAA受容体のベンゾジアゼピン結合部位と結合することができる化合物がα5-GABAA受容体の逆作動薬になれる。好ましくは有効に血液脳関門を通過し中枢神経系におけるα5-GABAA受容体と結合することができない化合物である。
【０１１１】
GABAA受容体のα5サブユニットのタンパク質は、後根神経節で発現され、且つ主に末梢に輸送されるが、GABAA受容体のα5サブユニットのタンパク質は、CFAで誘導される炎症性疼痛モデルとSNIモデルにおいて発現が上昇する。遺伝子操作でGABAA受容体のα5サブユニットのタンパク質の後根神経節における発現をノックアウトすると、顕著に炎症性疼痛と神経因性疼痛を抑制することができる。そして、α5-GABAA受容体の逆作動薬を投与すると、顕著に炎症性疼痛と神経因性疼痛を抑制することができる。
【０１１２】
前述のα5-GABAA受容体の逆作動薬は、α5-GABAA受容体と結合する能力がα1またはα2またはα3サブユニットだけを含有するGABAA受容体と結合する能力よりも高い。
【０１１３】
本発明の好適な様態として、本発明は、構造式（IおよびII）で表されるα5-GABAA受容体の逆作動薬を提供する。
【０１１４】
【化８】
2015509935.tif 000009
【０１１５】
ここで、各基の定義は、上述と同様である。
【０１１６】
本発明のもう一つの好適な様態として、本発明は、構造式（II）で表されるα5-GABAA受容体の逆作動薬を提供する。より好ましくは、構造式（III）または構造式（IV）で表される構造を有する。
【０１１７】
【化９】
2015509935.tif 000010
【０１１８】
ここで、各基の定義は、上述と同様である。
【０１１９】
α5-GABAA受容体の逆作動薬は、さらに、WO 2011/107812 A2、WO 2010/112475 A1、WO 2010/104843 A2、WO 2010/002451 A1、WO 2010/127978 A1 ,WO 2010/127968 A1、WO 2010/097368 A1、WO 2010/125042 A1、WO 2010/028769 A1,WO 2010/094669 A1、WO 2010/127976 A1、WO 2010/127975 A1、WO 2009/000662 A1、WO 2009/071464 A1、WO 2009/071476 A1、WO 2009/071477 A1、WO 2008/154438 A1、WO 2008/154442 A1、WO 2008/154447 A1、WO 2007074089 A1、WO 2007/071598 A1、WO 2007/074078 A2、WO 2010/127974 A1、WO 2007/137954 A1、WO 2007/042420 A1、WO 2007/054444 A2、WO 2007/042421 A1、WO 2007/039389 A1、 WO 2007/082806 A1、WO 2006/078891 A2、WO 2006/045430 A1、WO 2006/045429 A1、WO 2006/040038-A1、WO 2006/063708 A1,WO 2005/080355 A1、WO 2005/084439 A1、WO 2005/108401 A1、WO 2004/041808 A1、WO 2004/014865 A1,WO 2004/014891 A1、WO 2004/074259 A1、WO 2004/039802、WO 2004/014865 A1、WO 2004/043930 A1、WO 2004/087137 A1,WO2004076452-A1,WO 2004/031174 A1、WO 2004031174 A1、WO 2004/107863 A1、WO2004065388-A1、WO 2003/093263 A1、WO 2003/086406 A1、WO 2003/093273 A1、WO 2003/087099 A1,WO 2003/048132 A1、WO 2003/066634 A1、WO 2003/008418 A1、WO 2003/097643 A1、 WO 2003/044018 A1、WO 2003/006471、WO 2003/004018 A1、WO 2003/093272 A1、WO 2003/099816 A1、WO 2003/099817 A1、WO 2002/081474 A1、WO 2002/020480 A1、WO 2002/076987 A1、WO 2002/076983 A1、WO 2002/000623 A2、WO 2002/006285 A1、WO 2002/016363 A1、WO 2002/020492 A1、WO 2002/094834 A1、WO 2002/042305 A1、WO 2002/074773 A1、WO 2002/094834 A1、WO 2002/002557 A2、WO 2001/038331 A2、WO 2001/092257 A1、WO 2001/018001 A1、WO 2001/016103 A1、WO 2001/044250 A1、WO 2001/092258 A1、WO 2001/090108 A1、WO 2001/051492 A1、WO 2000/027849 A2、WO 2000/029412 A1、WO 2000/012505 A2、WO 2000/077008 A2,WO 2000/059905 A1、WO 1999/006400 A1、WO 1999/006399 A1、WO 1999/006401 A1、WO 1998/004560 A1、WO 1998/024435 A1、WO 1998/018792 A1、WO 1996/025948 A1、WO 1996/008494 A1、US 6511987、US 6297256、US 2004/0058970 A1、US 7176203、US 2010/0216752 A1、US 2008/0064748 A1、US 2002/0103371 A1，US 2008/0064748 A1、US 6395905、US 2004/0235844 A1、US 2004/0006226 A1、EP 1451161 B1、US 2006/0040940 A1、US 2006/0058303 A1、AU 2003/276424、AU 2003/282222、US 2006/0041125 A1、US 7148222、US 6395766、AU 2002/343110、US 6642229、US 2003/0176449 A1、US 2004/0110778 A1、US 2003/0220348 A1、US 2008/0167324 A1、EP 1368342 B1、US 2010/652435 A、US2004006226-A1 US2010130481-A1、US2008033061-A1という特許に記載のものを含むが、本発明における「α5サブユニットを含有するGABAA受容体の逆作動薬」は、以上の特許に記載の化合物を含むが、これらに限定されない。
【０１２０】
中でも、科学文献で顕著な逆作動薬の効果があると明らかに報告された化合物を表1に示す。
【０１２１】
【表１】
2015509935.tif 000011
【０１２２】
顕著な逆作動薬の効果があるが、有効に血液脳関門を通過できない薬物は、以下のものである。
【０１２３】
【化１０】
2015509935.tif 000012
【０１２４】
MRK016は、体内でMRK016-M1、MRK016-M2、MRK016-M3などの多種の構造に代謝されることを報告した文献がある(非特許文献３)。MRK016-M3とMRK016-M2は、顕著なα5-GABAA受容体の逆作動効果があるが、有効に大脳におけるα5-GABAA受容体と結合することができない。これは、有効に血液脳関門を通過しないα5-GABAA受容体の逆作動薬は、有効に炎症性疼痛と神経因性疼痛を治療することができ、安全性が高い薬物であることを説明した。
【０１２５】
本発明者は、さらに、化合物
【０１２６】
【化１１】
2015509935.tif 000013
【０１２７】
は、有効に炎症性疼痛と神経因性疼痛を抑制することができるが、ほとんど血液脳関門を通過せず、直接中枢の機能に影響しないため、中枢に副作用が小さく、且つ痛みを有効に治療することができる薬物であることを見出した。これらの化合物は、本発明における好適な化合物とする。
【０１２８】
本発明は、さらに、以上に挙げた各種の化合物の異性体、ラセミ体、薬学的に許容される塩、水和物または前駆体を含む。
【０１２９】
前述の「薬学的に許容される塩」とは、上述化合物と無機酸、有機酸、アルカリ金属またはアルカリ土類金属などとの反応によって形成される塩を指す。これらの塩は、（1）塩酸、臭化水素酸、沃化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸のような無機酸と形成された塩、（2）酢酸、乳酸、クエン酸、コハク酸、フマル酸、グルコン酸、安息香酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、シュウ酸、コハク酸、酒石酸、マレイン酸やアルギニンのような有機酸と形成された塩を含むが、これらに限定されない。他の塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属（例えばナトリウム、カリウム、カルシウムまたはマグネシウム）と形成された塩、アンモニウム塩または水溶性のアミン塩（例えばN-メチルグルカミン）、低級アルカノールのアンモニウム塩および他の薬学的に許容されるアミン塩（例えばメチルアミン塩、エチルアミン塩、プロピルアミン塩、ジメチルアミン塩、トリメチルアミン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、t-ブチルアミン塩、エチレンジアミン塩、ヒドロキシエチルアミン塩、ジヒドロキシエチルアミン塩、トリヒドロキシエチルアミン塩、およびそれぞれモルホリン、ピペラジン、リシンから形成されたアミン塩）、あるいは他の通常の「プロドラッグ」の様態を含む。化合物は、一つ或いは複数の不斉中心を有する。そのため、これらの化合物は、ラセミ体の混合物、単独のエナンチオマー、単独のジアステレオマー、ジアステレオマーの混合物、シス・トランス異性体として存在する。
【０１３０】
前述の「化合物の前駆体」は、適切の方法で投与された後、この化合物の前駆体が患者の体内で代謝或いは化学反応を経て構造式Iの化合物の一つ、或いは化学構造式Iの化合物の一つからなる塩又は溶液に変化することを指す。化合物の前駆体は、前述化合物のカルボン酸エステル、炭酸エステル、リン酸エステル、硝酸エステル、硫酸エステル、スルホンエステル、スルホキシドエステル、アミノ化合物、カルバメート、アゾ化合物、ホスファミド、グルコシド、エーテル、アセタールなどの様態を含むが、これらに限定されない。
【０１３１】
本発明の化合物の製造方法は、当業者に既知のものである。例えば、非特許文献４および特許文献１（Pyrazolo[1,5-d][1,2,4] triazines for enhancing cognition）では、MRK-016の化学合成方法が公開された。非特許文献３では、MRK016-M3の化学合成方法が公開された。非特許文献５および特許文献２では、α5IAの合成・同定が公開された。非特許文献６では、MRK016、MRK016-M3、α5IAはいずれもベンゾジアゼピン結合部位と結合する選択性α5の逆作動薬であることが公開されたが、MRK016（MRK-016）およびその主な代謝物（M1、M2、M3）のGABAA受容体の各サブタイプとの結合親和性(Affinity)和有効性(Efficacy)を表1に示す。
【０１３２】
選別方法
α5-GABAA受容体の逆作動薬が選択的にα5-GABAA受容体と結合することによって、痛みを抑制する作用を発揮することが知られた以上、この特徴に基づいてα5-GABAA受容体と結合する物質を選別することができる。その後、前述の物質から、痛みの抑制に本当に有用な薬物を見つけることができる。
【０１３３】
そのため、本発明は、（1）完全のGABAA受容体機能を有する、α5-GABAA受容体を含むシステムを提供する工程と、（2）候補物質を工程（1）のシステムに投与し、候補物質とα5-GABAA受容体の結合の状況を観察し、候補物質がα5-GABAA受容体と結合する場合、当該候補物質を痛みを予防、改善または治療する潜在薬物とする工程と、を含む、痛みを予防、改善または治療する薬物を選別する方法を提供する。前述のGABAA受容体のα5サブユニットを含むシステムは、例えば細胞（例えば後根神経節細胞）システムでもよいが、前述の細胞は、内在性のGABAA受容体のα5サブユニットを発現する細胞でもよく、組換えのGABAA受容体のα5サブユニットを発現する細胞でもよい。前述のGABAA受容体のα5サブユニットのシステムは、亜細胞システム、溶液システム、組織システム、器官システムまたは動物システム（例えば、動物モデル、好ましくは非ヒト哺乳動物の動物モデル、例えばマウス、ウサギ、ヒツジ、サルなど）などでもよい。
【０１３４】
本発明の好適な様態において、選別する時、GABAA受容体のα5サブユニットと候補物質の結合の状況の違いを観察しやすくするために、前述候補物質を添加しないα5-GABAA受容体のシステムである対照群を設けてもよい。
【０１３５】
前述の候補物質は、小分子化合物（例えばGABAA受容体の逆作動薬）、ポリペプチド、リガンドを含むが、これらに限定されない。好ましくは、前述の候補物質は、動物体の血液脳関門を通過しない物質である。
【０１３６】
本発明の好ましい様態として、前述の方法は、さらに、得られた潜在物質に対してさらなる細胞実験及び/又は動物試験を行い、さらに痛みを予防、改善または治療するのに本当に有用な物質を選別・確定することを含む。
【０１３７】
一方、本発明は、さらに、前述選別方法で得られた痛みを抑制する物質を含む。
【０１３８】
化合物が受容体または受容体の一部のサブユニットと結合するかどうかという検出は、本分野で既知の技術である。化合物がα5-GABAA受容体の逆作動薬または拮抗剤であるかどうかという検出は、多くの研究が行われたが、例えば特許文献３および特許文献４において、GABAA受容体のα5、β3およびγ2と合わせて化合物が当該受容体と結合するかどうか検出するが、薬物の選別過程では、通常、Goedersらの非特許文献７に記載の方法が使用される。α5-GABAA受容体と結合するリガンドが拮抗剤、作動薬、それとも逆作動薬であるかという検出も、多くの研究が行われたが、非特許文献８に記載の方法を参照してもよい。選別薬物が血液脳関門を通過するかどうかという検出方法は多く、非特許文献３では、候補化合物が(3H)Ro-15-1788(α5-GABAA受容体の標識された特異性逆作動薬)の大脳における結合を抑制することが検出でき、MRK016が有効に(3H)Ro-15-1788の中枢における結合を抑制することができるが、MRK016-M3は顕著に(3H)Ro-15-1788の中枢における結合を抑制することができないことが報告された。異なる組織における薬物を検出する方法によって検出してもよいが、例えば、薬物の大脳と血漿における分布の比率を検出することによって、薬物が有効に血液脳関門を通過するかどうか確認することができる。
【０１３９】
治療方法
本発明は、痛みを治療する方法を提供することによって、安全で有効な急性痛と慢性痛の治療に満足する。本発明によって提供される痛みを治療する方法によれば、このような治療を必要とする患者に有効量のα5-GABAA受容体の逆作動薬を投与することを含む。
【０１４０】
本発明は、特に痛みに苦しむ年寄りの患者、肝臓機能および腎臓機能がよくない人たちに適する。大多数の年寄りにとって、慢性痛は、よく見られる病症で、痛みは、通常、中高年の器官の老化および病変に伴う症状と思われる。年寄りの痛みは、主に骨関節系の四肢関節、背部、頸部疼痛、頭痛および他の慢性病による痛みを含むが、最も多い所見は関節痛、硬直および活動制限で、医学では変形性骨関節症と呼ばれる。退行性骨関節症は、関節軟骨退行性変性と骨増殖（骨増殖体または骨棘）を含み、50歳以上の人では、発症率が心臓病だけに次ぎ、65歳以上の人では、発症率が60％〜90％に達する。骨関節炎は、最も見られる痛みの原因である。60歳以上の年寄りのうち80％以上は、骨関節炎の所見、例えば関節痛、活動時の音、歩行障害と早朝硬直、重篤の場合、関節腫れなどがある。しかし、年寄りの患者は、通常、高血圧、糖尿病や心臓病のような他の慢性病が伴い、相応の疾患を治療するために同時に異なる複数種の薬物を服用する必要があり、且つ年寄りの薬物耐性が低く、不良反応が生じやすい。
【０１４１】
本発明は、痛み、具体的に、急性痛と慢性痛を治療する方法を提供する。当該方法は、α5-GABAA受容体のリガンドを薬物として痛みを治療するが、これらの薬物は、経口投与、皮下注射、経皮吸収型貼付剤、鼻内投与または自動注射装置によって投与されてもよい。当該方法では、痛みを治療するリガンドは、α5-GABAA受容体の逆作動薬で、特異的にα5-GABAA受容体に作用し、有効に血液脳関門を通過できないが、同時にα1またはα2またはα3を含有するGABAA受容体の拮抗剤または逆作動薬でもよい。実施において、当該リガンドは、GABAA受容体の拮抗剤でもよい。
【０１４２】
本発明における痛みを治療する方法は、経口投与や非腸管などの多くの剤型として投与することができる。そのため、本発明に係る化合物は、注射投与、即ち、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、十二指腸内または腹腔内の投与によって使用することができる。本発明に係る化合物は、さらに、鼻内吸入のような吸入投与によって使用してもよい。また、本発明の化合物は、経皮投与によって使用してもよい。
【０１４３】
組成物
本発明の化合物は、薬物組成物を製造することができ、薬用担体は、固体または液体でもよく、固体製剤は、散剤、錠剤、丸剤、カプセル、カシェ剤、坐剤および分散可能な顆粒剤を含み、固体担体は、一種または複数種の物質でもよく、希釈剤、矯味剤、粘着剤、防腐剤、錠剤崩壊剤またはコーティング剤としてもよい。散剤において、担体は、微細の固体で、本発明の化合物と微細の活性成分が混合物に存在する。錠剤において、この化合物は必要な粘着担体と適切な比率で混合し、且つ必要な形状と大きさにプレスする。散剤と錠剤には、好ましくは5〜70％の活性化合物を含有するが、適切な担体は、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、乳糖、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックスやココア脂などである。同様に、カシェ剤または錠剤、タブレット剤、散剤、カプセル、丸剤、カシェ剤と錠剤は、経口投与に適する固体剤型である。
【０１４４】
坐剤を製造するため、まず、低融点ワックス、脂肪酸グリセリンまたはココア脂の混合物を溶解させ、且つ攪拌でこの活性化合物成分を均一に分散させ、さらに溶解した均一の混合物を適切な大きさの型に入れ、冷却し、これによって硬化する。溶液様態の製剤は、溶液、懸濁剤および乳剤を含み、例えば水または水含有プロピレングリコール溶液が挙げられる。非腸管注射液体製剤は、水含有ポリエチレングリコール溶液で製造することができる。経口投与に適する水含有溶液は、活性成分を水に溶解させ、且つ必要によって適切な着色剤、矯味剤、乳化剤および増稠剤を入れて製造することができる。
【０１４５】
経口投与に適する水含有懸濁剤は、微細の活性成分を水含有粘性物質に分散させて製造することができるが、例えば天然または合成のゴム、樹脂、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロースナトリウムおよびほかの周知の懸濁剤が挙げられる。
【０１４６】
使用直前に経口投与の液体製剤にする固体様態の製剤も含まれる。これらの液体様態は、溶液、懸濁剤および乳剤を含み、活性成分の他、これらの製剤は、着色剤、矯味剤、安定剤、緩衝剤、合成または天然の甘味料、分散剤、増稠剤や溶解助剤などを含んでもよい。この薬物製剤は、単位剤型が好ましいが、この剤型において、さらに適切な量の活性成分を含有する単位剤量に分けるが、この単位剤量は、包装した製剤でもよく、当該包装は、一定の量の製剤を含み、例えば包装した錠剤、カプセルや小瓶またはカプセルにおける散剤が挙げられる。この単位剤型は、カプセル、錠剤、カシェ剤または錠剤そのものでもよく、あるいは包装様態における適切な量の任意のこれらの散剤が存在してもよい。
【０１４７】
単位剤量の製剤における活性成分の量は、具体的な応用および活性成分の有効性によって変わるが、0.01mg〜約0.1gに調節することができる。例えば、医薬用途では、当該薬物は、0.1〜約3mgのカプセルで毎日3回投与してもよく、必要なとき、組成物は、さらに、ほかの相容する治療剤を含んでもよい。
【０１４８】
治療用途では、本発明の化合物は、開始剤量として毎日0.001mg〜10mg/kg体重である。しかし、これらの剤量は、患者の需要、治療する病症の重篤度および使用する化合物によって変わるが、一般的に、最初は当該化合物の最適剤量未満の比較的に低い剤量で治療し、その後、すこしずつ剤量を増やして最適な効果に達し、便宜上、必要によって一日の全剤量を一日に数回に分けて投与することもできる。
【０１４９】
本発明の薬物組成物は、さらに、同時に他の治療薬または助剤を併用してもよいが、モルヒネ、ガバペンチンなどを含むが、これらに限定されない。
【０１５０】
そのため、本発明は、有効で顕著な副作用がない、痛みを治療する薬物を提供するが、本発明のもう一つの目的は、特殊の患者群、例えば年寄り、肝臓または腎臓の機能衰退を患った人、または心臓・血管疾患の患者に、高度の安全性を有する薬物を提供することである。
【０１５１】
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。下述実施例で具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、例えば、非特許文献９に記載の条件などの通常の条件に、或いは、メーカーのお薦めの条件に従う。特に断らない限り、％と部は、重量で計算される。
【０１５２】
別の定義がない限り、本文に用いられるすべての専門用語と科学用語は、本分野の技術者に知られている意味と同様である。また、記載の内容と類似或いは同等の方法及び材料は、いずれも本発明に用いることができる。ここで記載の好ましい実施方法及び材料は例示のためだけである。
【実施例】
【０１５３】
I．実験方法：
（1）動物
オスSDラット（200-250g）を6匹ずつカゴに入れ、動物をすべて12時間明暗循環（即ち、毎日12時間の照明と12時間の暗黒）に置き、任意に食べ物と水を食べさせた。全部の試験は、いずれも観察者が薬物治療を知らない状態で行われる。
【０１５４】
（2）動物モデル
神経部分損傷モデル（SNI）：  10％抱水クロラールを腹腔注射してラットを麻酔し、ラットの後肢上縁で皮膚を切開し、縦に筋肉を分離し、坐骨神経の主幹およびその下の分枝―脛骨神経、総腓骨神経および腓腹神経を露出させ、脛骨神経と総腓骨神経を結紮して切断し、細い腓腹神経を残し、同時に一切の損傷を避けた。筋肉、皮膚を順番に縫合し、さらに抗菌予防のために抗生物質を腹腔注射し、具体的な方法は、非特許文献１０を参照する。
【０１５５】
完全フロインドアジュバント（CFA）で誘導された炎症性疼痛モデル：10％抱水クロラールを腹腔注射して麻酔し（0.3ml/100g体重）、両後肢の足指および足裏にCFAを200μl皮下注射した。CFA液の調製方法：米国Sigma社が販売するCFA液（結核菌(Mycobacterium tuberculosis)の生理食塩水：油懸濁液）を使用した。
【０１５６】
坐骨神経と後根神経の結紮モデル：正常ラットに10％抱水クロラールを注射してラットを麻酔し、ラットの後肢上縁で皮膚を切開し、縦に筋肉を分離し、坐骨神経の主幹を露出させ、腸線で結紮した。後根神経を結紮し、臀背部の毛を剃った後、通常のアルコール消毒を行い、第3と第4腰椎のところに縦に2cm切開し、背骨の両側の筋肉組織を鈍的分離し、拡張器で筋肉と皮膚を張り、手術視野を十分に露出させ、手術鉗子で第3腰椎を破壊し、第5と第6腰椎の後根神経を露出させ、腸線で結紮した。24時間後、ラットを灌注した後、それぞれ後根神経節、後根神経、脊髄後角および坐骨神経を採取した。
【０１５７】
ペンテトラゾールで誘導された癲癇試験：  まず、ラットにC5または70％PGE400を注射し、半時間後ラットにさらに塩水に溶解させた100mg/kgのペンテトラゾールを皮下注射した後、ラットの痙攣反応を観察した。痙攣の採点は、Fatholahi分級法を使用した。0級は、無反応で、1級は、口と面部の律動的痙攣で、2級は、体躯の波動様の移動性痙攣で、3級は、全身の筋肉痙攣、臀部の挙上で、4級は、体躯の一方への転がりで、5級は、仰向きで全身の硬直痙攣発作である。毎回投与した後、30分間観察した。ラットの発作の最大の級数およびペンテトラゾール注射から誘導された最大反応級数までの潜伏期間を統計した。
【０１５８】
ラットの脛骨の癌性疼痛モデルは、臨床患者の転移性癌の痛みを反映するモデルである。正常ラットに10％抱水クロラールを注射してラットを麻酔し、ラットの後肢上縁で皮膚を切開し、縦に筋肉を分離し、脛骨を露出させ、脛骨の骨髄腔に同種ラットの3×103のMRMT-1乳癌細胞を注射し、手術から14日後、ラットに顕著な痛覚過敏反応が現れた。
【０１５９】
（3）免疫組織化学およびイムノブロットの実験
免疫組織化学の実験において、異なる時点でモデルラットを手術して固定液で灌注した後、1.5時間固定し、10％ショ糖で24時間以上浸漬した組織を低温保持装置でスライサーによって14μmの切片に切り、-20℃の冷蔵庫で保存した。切片を抗体（抗α5-GABAA受容体(Santa Cruz)ヤギ由来抗体、有効希釈比1：100〜200）と一晩インキュベートした後、0.01MのPBSで3回洗浄し、さらに第二抗体を入れて40分間インキュベートした後、0.01MのPBSで3回洗浄し、光を避けて保存した。最後に、顕微鏡で観察し、写真を撮った。免疫蛍光強度は、Image-pro定量分析の免疫蛍光強度とした。
【０１６０】
イムノブロットの実験において、採取した後根神経節をRIPA（50 mM Tris(pH7.4)、150 mM NaCl、1％ Triton X-100、1％デオキシコール酸ナトリウム(sodium deoxycholate)、0.1％ SDS、およびオルトバナジン酸ナトリウム(sodium orthovanadate)、フッ化ナトリウム(sodium fluoride)、EDTA、ロイペプチン(leupeptin)などの複数種の阻害剤）で溶解し、100℃で5分間加熱してタンパク質を変性させ、タンパク質が冷却した後、10-20μlのサンプルを吸い取って調製後のゲルの穴に入れた。その後、まず、電圧60ボルトのままで30分間電気泳動を行い、サンプルが上下層のゲルの境界を超えた時電圧を90ボルトとし、ブロモフェノールブルーが下層のゲルの下縁に達するまで電気泳動を続けた。電気泳動終了後、目的バンドを含有するSDSゲルを切り取り、膜転写操作を行い、即ち、電気転写で、負電荷が付いたタンパク質を正電極が付いたPVDF膜に転写し、5％脱脂粉乳を含有するブロック液で1時間ブロックして抗体の非特異的な結合を減少した。ブロック終了後、PVDF膜を第一抗体を含有するブロック液に浸漬し、4℃一晩、または室温で1-2時間インキュベートした後、PVDF膜をTBST溶離液で合計1時間で3回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼが付いた第二抗体と室温で1時間インキュベートした。第二抗体のインキュベート終了後、またTBST溶離液で1時間洗浄し、最後に光を避けた条件で、PVDF膜を西洋ワサビペルオキシダーゼ基質ECL-PLUSと5分間反応させ、蛍光が生じ、さらにX線フィルムでPVDF膜における蛍光信号を得た。フィルムを現像液と定着剤で定着させた。
【０１６１】
（4）痛みの検出方法
ラットの熱痛覚過敏の定量検出法：  ラットの足裏にCFA液を注射して24時間後から始め、熱痛覚過敏の定量検出法によってラットの熱放射刺激に対する足逃避反応を測定した。ラットの熱痛閾値を検出するため、ラットを透明ガラス板を有する有機ガラス箱に置き、熱放射装置（BME-410C、CAMS）でラットの足裏を刺激した。熱痛閾値は、ラットの足裏に光を照射してから、ラットが反射して逃避するまでの時間とした。
【０１６２】
ラットの機械痛覚過敏の定量検出法：  ラットの足裏にCFA液を注射して24時間後から始め、機械痛覚過敏の定量検出法によってラットの正常で無害の機械刺激に対する足逃避反応を測定した。非特許文献１１に記載の方法を参照して評価してもよいが、当該方法では、異なる湾曲力（1-50gに相当する力範囲）のvon Frey線維で無害の機械刺激を与え、ラットを金属網の底板を有する有機ガラス箱に置き、von Frey線維で前述下肢の足裏の表面に足裏の表面と垂直となるようにやや前述下肢に抵抗する力を与え、毎匹の下肢の足裏は2-3秒維持し、前述下肢が突然回避すると、陽性反応と記録した。通常刺激を10回与え、50％（5-6回の回避/10回の刺激）の足回避反射を起こす重量の平均値を閾値とする。CFA炎症5-7日後、再び機械痛覚過敏の閾値を測定し、これらの動物に痛覚過敏が現れたかどうか確認した。
【０１６３】
（5）薬物溶解
MRK 016、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8等の化合物またはα5IA（A5I）を70％（PGE400:水＝70：30の体積比）のPGE400に溶解させ、剤量は、MRK 016が2 mg/kgまたはA5Iが3 mg/kg、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8化合物の剤量が3 mg/kg体重とし、注射剤にした。
【０１６４】
MRK016-M3を10％（PGE400:水＝10：90の体積比）のPGE400に溶解させ、剤量は、それぞれ10 mg/kg、3 mg/kg、1 mg/kg、0.3 mg/kgとし、経口投与溶液にした。
【０１６５】
化合物
【０１６６】
【化１２】
2015509935.tif 000014
【０１６７】
を30％（PGE400:水＝30：70の体積比）のPGE400に溶解させ、剤量が3 mg/kgとし、注射剤にした。
【０１６８】
（6）α5-GABAA遺伝子のノックアウト実験
EX500に記載の方法に従い、siRNAを注射可能な溶液に調製した。次に、ラットを麻酔し、さらにsiRNA溶液を第5または第6腰椎の位置から脊髄に注射した。siRNA注射から3日後、第5または第6腰椎の後根神経節を採取し、GABAA受容体のα5サブユニットのタンパク質の発現強度を検出した。
【０１６９】
α5-GABAA受容体mRNAに対するsiRNA配列は、5'GGUGCGAACAGACAUCUAUTT 3'である。対照siRNA配列は、5'UUCUCCGAACGUGUCACGUTT 3'である。
【０１７０】
（7）データ統計
行動学のデータ統計方法は、unpaired t-testで、*p<0.05は、有意差を表す。
【０１７１】
II．実施例
実施例1、GABAA受容体のα5サブユニットのSNIモデル条件における発現の上昇
SNIモデルにおいて、免疫組織化学の実験とイムノブロットの実験によってGABAA受容体のα5サブユニットのタンパク質の発現状況を測定し、結果を図1に示す。
【０１７２】
免疫組織化学の実験から、SNIモデルは、GABAA受容体のα5サブユニットのタンパク質の発現の上昇を誘導することができることが示された。免疫組織化学の実験において、SNIモデル構築から14日後、GABAA受容体のα5サブユニットのタンパク質の発現が上昇し、対照は正常ラットの後根神経節の切片（正常）で、図1Aに示す。結果から、GABAA受容体のα5サブユニットの後根神経節における細胞の発現が上昇し、より興味深いのは、小細胞では、GABAA受容体のα5サブユニットのタンパク質の蛍光信号強度の上昇が特に顕著であったことが示された。
イムノブロットの実験から、SNIモデルにおいて、時間の経過に従って、GABAA受容体のα5サブユニットのタンパク質の合計量が顕著に上昇したことが示され、図1Bに示す。
【０１７３】
実施例2、GABAA受容体のα5サブユニットの炎症性疼痛モデルにおける発現の上昇
CFAで誘導された炎症性疼痛モデルにおいて、免疫組織化学の実験とイムノブロットの実験によってGABAA受容体のα5サブユニットのタンパク質の発現状況を測定し、結果を図2に示す。
【０１７４】
免疫組織化学の実験から、CFA注射から2日後、後根神経節において、CFAで誘導された炎症性疼痛モデルは、GABAA受容体のα5サブユニットのタンパク質の発現の上昇を促進することができることが示され、図2Aに示す。
【０１７５】
免疫組織化学の実験において、GABAA受容体のα5サブユニットのタンパク質の後根神経節における小細胞での発現が上昇したことがわかった。統計から、GABAA受容体のα5サブユニットの後根神経節における細胞の発現比率が上昇したことが示された。イムノブロットの実験から、GABAA受容体のα5サブユニットのタンパク質量は、炎症性疼痛モデルにおいて顕著に増加した（図2B）ことが示され、グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素（GAPDH）を陽性対照とした。
【０１７６】
実施例3、GABAA受容体のα5サブユニットのタンパク質が後根神経節で発現され、且つ坐骨神経に輸送される
坐骨神経と後根神経の結紮モデルにおいて、GABAA受容体のα5サブユニットのタンパク質量の状況を観察し、結果を図3に示す。
【０１７７】
図3Aは、GABAA受容体のα5サブユニットのタンパク質が坐骨神経に輸送されるが、ほとんど後根神経に輸送されないことを示す。CGRP（カルシトニン遺伝子関連ペプチド）は、坐骨神経と後根神経に沿って輸送できるポリペプチドとして、実験の陽性対照とした。イムノブロットの結果から、坐骨神経、後根神経節細胞、後根神経および脊髄後角におけるGABAA受容体のα5サブユニットのタンパク質量が顕著に増加したことが示された。
【０１７８】
図3Bから、坐骨神経におけるGABAA受容体のα5サブユニットのタンパク質量は、後根神経よりも顕著に高く、脊髄におけるGABAA受容体のα5サブユニットのタンパク質量がより少ないことを示すが、グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素（GAPDH）を陽性対照とした。
【０１７９】
実施例4、α5-GABAA受容体の特異的な逆作動薬は有効に神経因性疼痛を抑制することができる
SNIモデルは、直接に外傷や圧傷による、あるいは間接に感染、癌、代謝疾患、毒素、栄養欠乏、免疫機能障害や筋肉・骨格の変化（musculoskeletal changes）のような一連の疾患による神経損傷に関連する神経因性疼痛を模擬した。神経因性疼痛は、現在、臨床で最も治療しにくい痛みの一つで、患者の生活品質に大きく影響する。ガバペンチンは、いま神経因性疼痛を治療する第一線の薬物であるが、眠気、目眩、歩行不安定や疲労感などの副作用に繋がる。
【０１８０】
本発明者は、化合物MRK016およびその代謝物MRK016-M3は、有効に痛みを抑制できることを見出した。SNIモデル構築から7日後、MRK016の皮下注射によって有効に神経因性疼痛を抑制することができ、結果から、投与から1時間後、顕著に痛みを抑制できたことが示され、図4Aに示す。
【０１８１】
本発明者は、MRK016-M3が神経因性疼痛を抑制することができるかどうかを検出した。剤量依存試験によって、MRK016-M3も有効に神経因性疼痛を抑制できることを見出し、図4Bに示す。当該実験において、本発明者は、SNIモデル構築から10日〜20日のラットを実験動物とし10 mg/kg、3 mg/kgおよび1 mg/kgの剤量で、経口投与から1時間後、いずれも顕著に機械痛閾値を抑制することができた。
【０１８２】
同時に、本発明者は、SNIモデル構築から11日のラットを実験動物とし、ガバペンチンの神経因性疼痛の治療効果を検出したところ、ガバペンチンが有効に神経因性疼痛を治療できたことがわかり、図4Cに示す。しかし、MRK016-M3の使用剤量は、ガバペンチンよりもずっと少ないのに、痛みの治療効果が同等である。
【０１８３】
さらにMRK016-M3が末梢神経によって作用することを確認するため、本発明者は、SNIモデル構築から10日のラットを実験動物とし、局所投与し、ラットの足裏にMRK016-M3(1mg/ml)を100μl注射したところ、同様に顕著に神経因性疼痛を抑制でき、図4Dに示す。
【０１８４】
当該薬物がα5-GABAA受容体によって作用することを証明するため、遺伝子ノックアウト実験によってα5-GABAA受容体のSNIモデルにおける作用を検証した。本発明者は、GABAA受容体のα5サブユニットのmRNAに対するsiRNAを鞘内注射したところ、統計からこの方法で顕著にGABAA受容体のα5サブユニットのタンパク質の後根神経節における発現をノックアウトできたことがわかり、図4Eに示す。
【０１８５】
イムノブロットの実験によって、特異的なsiRNAを注射した後、顕著にGABAA受容体のα5サブユニットのタンパク質の後根神経節における発現を低下させたが、対照siRNAでは、GABAA受容体のα5サブユニットのタンパク質に顕著な変化がなかったことを見出した。グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素（GAPDH）を陽性対照とした。SNIモデルにおいて、GABAA受容体のα5サブユニットのmRNAに対する特異的なsiRNAを鞘内注射することによって、顕著に疼痛閾値を上げたが、非特異的なsiRNAは痛みに顕著な影響がなかったことがわかり、図4Fに示す。当該実験において、本発明者は、SNIモデル構築から7日後、ラットの脊髄にGABAA受容体のα5サブユニットに対するsiRNAを注射し、さらにSNIモデル構築から9日、11日、13日、15日および17日の時点で、それぞれラットの疼痛閾値を検出した。さらにMRK016-M3がα5-GABAA受容体によって慢性痛を抑制することを検証するため、SNIモデル構築から4日後、ラットの疼痛閾値を検出し、さらに対照siRNAとGABAA受容体のα5サブユニットに対するsiRNAを注射し、4日後MRK016-M3のラットの疼痛閾値に対する影響を検出したところ、本発明者の結果から、対照siRNAを注射したラットでは、MRK016-M3（経口投与、3mg/kg）は顕著に神経因性疼痛を抑制できたが、GABAA受容体のα5サブユニットに対する特異的なsiRNAを注射したラットでは、MRK016-M3（経口投与、3mg/kg）は顕著な効果がなかったことが示され、図4Gに示す。
【０１８６】
上述機序から、当業者は、GABAがα5-GABAA受容体によって生物学的機能を発揮することを阻害する物質であれば、痛みを予防・治療する潜在物質であることが理解できる。
【０１８７】
非特許文献３では、MRK016およびその代謝物MRK016-M3は、類似のα5-GABAA受容体に対する逆作動効果を有するが、MRK016は大脳に蓄積するが、一方、MRK016-M3は大脳に入ってα5-GABAA受容体と結合することが困難であることが報告された。これは、MRK016-M3は有効に中枢で発現されたα5-GABAA受容体と結合することができないため、中枢系の副作用にならず、有効に疼痛反応を抑制することができ、潜在の臨床鎮痛剤であることを示唆する。
【０１８８】
同時に、当該実験によって、同様に、末梢神経のα5-GABAA受容体に作用する逆作動薬も、神経因性疼痛を治療することができることが証明された。上述結論によって、α5-GABAA受容体と結合できるが、血液脳関門を通過しない特異的な逆作動薬は、有効に神経因性疼痛を抑制し、潜在の臨床鎮痛剤の選別に新しい選別方法を提供したことが説明された。
【０１８９】
実施例5、α5-GABAA受容体の逆作動薬の炎症性疼痛の治療
炎症性疼痛は、通常、組織または器官の病変による炎症で生じる痛みで、急性痛と慢性痛がある。動物試験において、組織損傷性病理疼痛モデルは、臨床炎性疼痛と類似のモデルで、中では、CFAで誘導された炎症性疼痛モデルは、臨床における慢性炎症性疼痛の各指標を反映する。このモデルにおいて、CFA注射後2-3時間で注射部位の皮膚に炎症反応が生じ、6-24時間でピークに達し、痛覚過敏と水腫が1-2週間続く（非特許文献１２）が、このモデルでは、炎症性疼痛の特徴が顕著で、持続時間が長い。本発明者は、化合物MRK016およびその代謝物MRK016-M3は、有効に炎症性疼痛を抑制できることを見出した。
【０１９０】
GABAA受容体のα5サブユニットに対するsiRNAを脊髄注射することによって、GABAA受容体のα5サブユニットの後根神経節における発現を抑制し、有効に炎症性疼痛の発生を抑制し、図5AおよびBに示す。当該実験において、本発明者は、まず、ラットの熱痛閾値と機械痛閾値を検出した後、当日にGABAA受容体のα5サブユニットに対するsiRNAを注射し、2日目にラットの右足の裏に100μlのCFAを注射し、さらに毎日ラットの熱痛と機械痛の閾値を検出した。結果から、GABAA受容体のα5サブユニットの後根神経節における発現を抑制することで、顕著に炎症性疼痛を抑制できることが示された。
【０１９１】
上述結果から、当業者は、GABAがα5-GABAA受容体によって生物学的機能を発揮することを阻害する物質であれば、痛みを予防・治療する潜在物質であることが理解できる。
【０１９２】
MRK016(2mg/kg体重)の腹腔注射は、有効に炎症性疼痛を抑制することができた。当該実験において、炎症性疼痛モデルの7日目は、機械痛に比較的に敏感な時期で、本発明者は、MRK016(2mg/kg体重)を腹腔注射したところ、当該化合物が有効に機械痛を抑制できたことがわかった（図5C）。炎症性疼痛モデルの3日目は、熱痛に比較的に敏感な時期で、MRK016（2mg/kg体重）を腹腔注射したところ、当該化合物が有効に熱痛を抑制できたことがわかった（図5D）。実験結果から、MRK016は投与後1時間で顕著に炎症性疼痛を抑制できたことがわかった。
【０１９３】
MRK016-M3の経口投与も有効に炎症性疼痛を抑制することができるが、本発明者は、それぞれ炎症性疼痛モデルの構築から3日目に熱痛を、炎症性疼痛モデルの構築から7日目に機械痛を検出したところ、MRK016-M3は投与後1時間で顕著に炎症性疼痛を抑制できたことが示され、図5EおよびFに示す。
【０１９４】
同時に、当該実験によって、同様に、末梢神経のα5-GABAA受容体に作用する逆作動薬も、炎症性疼痛を治療することができることが証明された。当該実験によって、α5-GABAA受容体と結合できるが、血液脳関門を通過しない特異的な逆作動薬は、有効に炎症性疼痛を抑制し、潜在の臨床鎮痛剤の選別に新しい選別方法を提供したことが説明された。
【０１９５】
実施例6、α5-GABAA受容体の逆作動薬A5Iの神経因性疼痛と炎症性疼痛の治療
α5IA(A5I)は、MSD（Merk）社によって開発されたα5-GABAA受容体に対する特異的な逆作動薬である。臨床II期実験で、当該薬物は、水溶性の問題によって、ある程度の毒性問題が生じたことがわかった。
【０１９６】
非特許文献１３では、当該化合物は痛みの治療に効果がないことが報告された。ここで、本発明者は、A5IのSNIおよび炎症性疼痛モデルにおける鎮痛作用を検出した。データから、A5I(3mg/kg体重)の腹腔注射は、有効に神経因性疼痛を治療できたことが示され、図6Aに示す。当該実験において、SNIモデル構築から14日後、A5I(3mg/kg体重)を皮下注射し、投与後0.5時間、1時間、2時間、3時間および24時間で、ラットの疼痛閾値を検出したところ、当該化合物が有効に神経因性疼痛を抑制することが証明された。
【０１９７】
A5Iの連続投与によって耐性が生じない。当該実験において、SNIモデル構築から14日後、6日投与を続け、それぞれ投与の1-3時間後疼痛閾値を検出したところ、6日投与を続けた後、依然として有効に痛みを治療できたことがわかり、図6Bに示す。
【０１９８】
CFAで誘導された炎症性疼痛モデルにおいて、本発明者は、A5I(3mg/kg体重)の腹腔注射も有効に神経因性疼痛を治療できたことがわかり、図6CおよびDに示す。当該実験において、炎症性疼痛モデルの構築から3日後、A5Iの熱痛に対する影響を検出し、投与後0.5、1.0、2.0および3.0時間で疼痛閾値を検出したが、炎症性疼痛モデルの構築から7日後、A5Iの機械痛の疼痛閾値に対する影響を検出し、投与後0.5、1.0、2.0および24時間で疼痛閾値を検出した。
【０１９９】
実施例7、薬物の選別
（1）細胞レベルの選別
ヒト腎上皮細胞系293細胞系またはL(tk-)細胞系を含む細胞系でGABAA受容体の異なるサブユニットを発現させた。前述細胞を培地で培養し、この細胞を痛みを抑制する薬物の選別のための細胞モデルとした。完全の機能型GABAA受容体を構成するには、一つのαサブユニット、βサブユニットおよびγサブユニットが不可欠である。
【０２００】
この実施例において、本発明者は、以下の細胞モデルを構築した。
（a）293細胞系で同時にα5サブユニット（タンパク質配列はGenBank登録番号NM_001165037.1を参照）、β3サブユニット（タンパク質配列はGenBank登録番号NM_021912.4を参照）およびγ2サブユニット（タンパク質配列はGenBank登録番号NM_198904.2を参照）を発現させ、α5-GABAA受容体を構成した。
（b）293細胞系で同時にα1サブユニット（タンパク質配列はGenBank登録番号NM_001127648.1を参照）、β3サブユニットおよびγ2サブユニットを発現させ、α1サブユニットを含有するGABAA受容体を構成した。
（c）293細胞系で同時にα2サブユニット（タンパク質配列はGenBank登録番号NM_000813.2を参照）、β3サブユニットおよびγ2サブユニットを発現させ、α2サブユニットを含有するGABAA受容体を構成した。
（d）293細胞系で同時にα3サブユニット（タンパク質配列はGenBank登録番号NM_000808.3を参照）、β3サブユニットおよびγ2サブユニットを発現させ、α3サブユニットを含有するGABAA受容体を構成した。
上述（a）-（d）は、いずれも完全の機能を有するGABAA受容体を構成することができる。
【０２０１】
その後、細胞膜を採取し、タンパク質濃度を検出し、それぞれ被検物質と放射性標識化合物（例えば1 nM [3H]Ro-0151788）の競争結合を検出し、被検物質のKi値を算出した。上述方法は、非特許文献１４に報告された方法を参照する。テスト群における候補物質とα5-GABAA受容体の結合阻害定数Ki(nM)は、他のサブユニット（α1サブユニット、α2サブユニットまたはα3サブユニット）を含有する受容体のKiよりも低い場合、当該候補物質を痛みを予防、改善または治療する潜在薬物とする。当業者は、α5-GABAA受容体のリガンドのα5-GABAA受容体と結合する能力の評価に用いられる方法を多く知っているが、上述の方法をふくむが、これに限られない。
【０２０２】
本発明者は、電気生理的方法によって被検物質の逆作動効率を検出した。当該方法は、非特許文献１４に報告された方法を参照する。被検物質が顕著にGABAがα5-GABAA受容体によって誘導する電流を抑制するが、同時に顕著にGABAがα1またはα2またはα3を含有するGABAA受容体によって誘導する電流を抑制できない場合、当該候補物質を痛みを予防、改善または治療する潜在薬物とする。当業者は、α5-GABAA受容体のリガンドのα5-GABAA受容体に対する逆作動の効率の評価に用いられる方法を多く知っているが、上述の方法をふくむが、これに限られない。
【０２０３】
体外血液脳関門モデル（blood-brain barrier model、BBBM）に対して被検物質が有効に血液脳関門を通過するかどうか、検出した。この実験において、脳毛細血管内皮細胞（Brain microvessl endothelial cell）と星状膠細胞を一緒に培養した後、被検物質が有効に細胞膜を通過するかどうか検出したが、具体的な方法は関連文献を参照する（非特許文献１５）。
【０２０４】
MRK016、MRK016-M3、α5IAを候補物質として使用してテストし、結果を表2に示す。MRK016、MRK016-M3、α5IAの各サブタイプのGABAA受容体に対する親和性が類似であったが、α5-GABAA受容体に対する逆作動効率（Efficacy）がα1またはα2またはα3を含有するGABAA受容体に対する逆作動効率よりもずっと高いことで、哺乳動物の痛みの抑制に有用な物質である。好ましくは、MRK016-M3は、顕著に血液脳関門を通過しないため、理論上、副作用のない有効な鎮痛剤である。
【０２０５】
そのため、テスト群における候補物質とγ-アミノ酪酸Aのα5サブユニットの結合定数Ki(nM)は、他のサブユニット（α1サブユニット、α2サブユニットまたはα3サブユニット）よりも低い場合、当該候補物質を痛みを予防、改善または治療する潜在薬物とする。あるいは、被検物質は顕著にGABAがα5サブユニットを含有するGABAA受容体によって誘導する電流を抑制できるが、同時に顕著にGABAがα1またはα2またはα3を含有するGABAA受容体によって誘導する電流を抑制できない場合、当該候補物質を痛みを予防、改善または治療する潜在薬物、あるいは同時にできるものとする。以上、いずれも当該候補物質が痛みを予防、改善または治療する潜在薬物であることが示された。
【０２０６】
【表２】
2015509935.tif 000015
【０２０７】
逆作動効率は、候補物質のGABAがα5-GABAA受容体によって誘導される電流に対する抑制効率＝(候補物質が存在する場合のGABAがα5-GABAA受容体によって誘導される電流強度−候補物質が存在しない場合のGABAがα5-GABAA受容体によって誘導される電流強度)/候補物質が存在しない場合のGABAがα5-GABAA受容体によって誘導される電流強度である。
【０２０８】
（2）動物レベルの選別
候補物質を皮下注射、腹腔注射（または経口投与）によって動物に投与し、処理後の適切な時点で、候補物質の動物体内の分布を測定した。以下の二種類の方法で被検化合物の中枢α5-GABAA受容体との結合効率を測定することができる。
【０２０９】
第一種の方法は、被検物質の動物体内の薬物分布を測定する。この方法では、被検物質が同位体標識物質、例えば(3H)Ro-15-1788の大脳海馬組織における結合と競争する、それともそれを抑制するかどうか、測定するが、抑制効率は60％以下でなければならない。実験動物に一定の剤量の候補物質と(3H)Ro-15-1788を投与した後、当該候補物質が既知α5-GABAA受容体の特異的なリガンドの中枢における分布を抑制するかどうか測定し、候補物質が(3H)Ro-15-1788の中枢における分布を60％未満に抑制する場合、該候補物質を痛みを予防、改善または治療する潜在薬物とする。該候補物質が副作用が小さい痛みを治療する潜在薬物であることが示される。その結果、
【０２１０】
【化１３】
2015509935.tif 000016
【０２１１】
は、有効に(3H)Ro-15-1788の中枢における結合を抑制することができず、抑制効率が12％程度であった(非特許文献３)。
【０２１２】
第二種の方法は、被検化合物の動物体内の組織分布を測定する。まず、被検物質を注射（または経口投与）によって動物体内に投与した後、注射から0.25-2.0時間後大脳組織と血漿組織を採取し、クロマトグラフィー-タンデム質量分析（LC-MS）の方法によって薬物の濃度を検出し、化合物の大脳組織と血漿組織の比率（brain/plasma ratio）が0.5未満の場合、該候補物質を副作用が小さい、痛みを治療できる潜在薬物とする。その結果、
【０２１３】
【化１４】
2015509935.tif 000017
【０２１４】
の二つの化合物の大脳組織と血漿組織の比率が0.5未満で、該候補物質が副作用が小さい、痛みを治療できる潜在薬物であることが示された。
【０２１５】
実施例8、(3-(3-t-ブチル-2-((2-メチル-2H-1,2,4-トリアゾール-3-イル)メチル)ピラゾロ[1,5-d][1,2,4]トリアジン-7-イル)イソオキサゾール-5-イル)メタノールおよぼその類似体の製造
中間体1：  4-t-ブチル-3-ホルミル-1H-ピラゾール  4-トルエンスルホナート
（a）3-t-ブチル-4-ヒドロキシ-2(5H)-フラノン（3-tert-butyl-4-hydroxyfuran-2(5H)
-one）
【０２１６】
【化１５】
2015509935.tif 000018
【０２１７】
4-ヒドロキシ-2(5H)-フラノン(4.0 g、40 mmol)と2-メチル-2-プロパノール(3.0 g、40 mmol)を45℃で15分間撹拌した後、この混合液を濃硫酸で45℃で迅速に処理し、さらにこの溶液を45℃で続けて48時間撹拌した。その後、混合液を水（10 mL）で希釈し、エチルエーテルで抽出し（10 mL×3）、有機層を硫酸マグネシウム（MgSO4）で乾燥した。溶媒を蒸発させて残留物をシリカゲルでクロマトグラフィーにかけ、ヘキサン：酢酸エチル＝20：1から10：1までで溶離し、白色固体として産物の3-t-ブチル-4-ヒドロキシ-2(5H)-フラノンを1.85g得た。
【０２１８】
（b）4-t-ブチル-3-(ヒドロキシメチル)-1H-ピラゾール-5-オール
(4-tert-butyl-3-(hydroxymethyl)-1H-pyrazol-5-ol)
【０２１９】
【化１６】
2015509935.tif 000019
【０２２０】
3-t-ブチル-4-ヒドロキシ-2(5H)-フラノン（2.2 g、14 mmol）を常温でエタノール(22 mL)に溶解させた後、ヒドラジン水和物(4.1 g、70 mmol)をいれ、78℃で72時間撹拌した。反応溶液を蒸発させ、さらに水（20 mL）で洗浄した後、酢酸エチルで抽出し(20 mL×3)、有機層をMgSO4で乾燥し、減圧で蒸発させ、白色固体として産物（4-t-ブチル-3-(ヒドロキシメチル)-1H-ピラゾール-5-オール）を2g得た。
【０２２１】
（c）4-t-ブチル-3-(ヒドロキシメチル)-1H-ピラゾール  4-トルエンスルホナート
4-tert-butyl-3-(hydroxymethyl)-1H-pyrazol-5-yl 4-methylbenzenesulfonate)
【０２２２】
【化１７】
2015509935.tif 000020
【０２２３】
4-t-ブチル-3-(ヒドロキシメチル)-1H-ピラゾール-5-オール(2.0 g、12 mmol)をDCM(40 mL)で常温で撹拌した後、p-トルエンスルホニルクロリド（TsCl）(2.7 g、14 mmol)を入れた。トリエチルアミンEt3N (1.55 g、2.12 mL)を一滴ずつ入れた。さらに、常温で20時間撹拌した。その後、混合液を塩水（20 mL）で洗浄し、DCMで抽出し（10 mL×3）、有機層を硫酸マグネシウム（MgSO4）で乾燥した。残留物をシリカゲルでクロマトグラフィーにかけ、DCM：MeOH＝30：1で溶離し、黄色固体として産物の4-t-ブチル-3-(ヒドロキシメチル)-1H-ピラゾール  4-トルエンスルホナートを2.7g得た。
【０２２４】
4-t-ブチル-3-ホルミル-1H-ピラゾール-5-イル  4-トルエンスルホナート
(4-tert-butyl-3-formyl-1H-pyrazol-5-yl 4-methylbenzenesulfonate)
【０２２５】
【化１８】
2015509935.tif 000021
【０２２６】
4-t-ブチル-3-(ヒドロキシメチル)-1H-ピラゾール  4-トルエンスルホナート(100 mg、 0.31 mmol)を常温でCHCl3(2 mL)に溶解させた後、MnO2(70 mg、0.8 mmol)を入れた。この溶液を70℃で48時間撹拌した。さらにMnO2(34 mg、0.4 mmol)を入れた。さらに70℃で6時間撹拌した。室温に冷却し、前述混合物をろ過してろ液を蒸発させ、残留物をシリカゲルでクロマトグラフィーにかけ、DCM：MeOH＝50：1で溶離し、黄色固体として産物の4-t-ブチル-3-ホルミル-1H-ピラゾール-5-イル  4-トルエンスルホナートを30mg得た。
【０２２７】
中間体2：  5-クロロメチル-1-メチル-1H-1,2,4-トリアゾール
（a）(2-メチル-2H-1,2,4,-トリアゾール-3-イル)メタノール
[(2-methyl-2H-1,2,4-triazol-3-yl)methanol ]
【０２２８】
【化１９】
2015509935.tif 000022
【０２２９】
1-メチル-1H-1,2,4,-トリアゾール(200 mg、1.8 mmol)とホルマリン(1 mL)を135℃で密閉容器で一晩均一に混合した。室温に冷却し、減圧でろ液を蒸発させ、残留物をシリカゲルでクロマトグラフィーにかけ、DCM：MeOH＝20：1で溶離し、白色固体として産物の(2-メチル-2H-1,2,4,-トリアゾール-3-イル)メタノールを140mg得た。
【０２３０】
（b）5-クロロメチル-1-メチル-1H-1,2,4-トリアゾール
[5-(chloromethyl)-1-methyl-1H-1,2,4- triazole]
【０２３１】
【化２０】
2015509935.tif 000023
【０２３２】
(2-メチル-2H-1,2,4,-トリアゾール-3-イル)メタノール(300 mg、2.7 mmol)を氷の上に置いた不活性ガスのアルゴン下の塩化チオニルSOCl2 (5 mL)に入れた。混合液を80℃で1時間加熱した。減圧で蒸発させた後、残留物をt-ブチルメチルエーテル（TBME）で研磨してろ過し、白色固体として産物の5-クロロメチル-1-メチル-1H-1,2,4-トリアゾールを380mg得た。
【０２３３】
中間体3
（a）5-ヒドロキシメチルイソオキサゾール-3-カルボン酸エチル
（ethyl 5-(hydroxymethyl) wasoxazole-3- carboxylate）
【０２３４】
【化２１】
2015509935.tif 000024
【０２３５】
クロロキシミド酢酸エチル(8.0 g、53 mmol)をクロロホルム(80 mL)に溶解させた後、常温でプロパルギルアルコール(9.0 g、158 mmol)を入れた。15分間後、トリエチルアミン(10.7 g、105.6 mmol)を入れ、45℃で48時間撹拌した。反応溶液を蒸発させ、残留物をシリカゲルでクロマトグラフィーにかけ、ヘキサン：EtOAc＝3：1で溶離し、白色油状物として産物の5-ヒドロキシメチルイソオキサゾール-3-カルボン酸エチルを4g得た。
【０２３６】
（b）5-ヒドロキシメチルイソオキサゾール-3-カルボヒドラジド
（5-(hydroxymethyl)wasoxazole-3-carbohydrazide）
【０２３７】
【化２２】
2015509935.tif 000025
【０２３８】
5-ヒドロキシメチルイソオキサゾール-3-カルボン酸エチル(4.3 g、25 mmol)をエタノール(43 mL)に溶解させた後、常温でヒドラジン水和物(3.7 g、63 mmol)を入れた。室温で3h撹拌した。反応溶液をろ過し、エタノール(10 mL)で洗浄し、サージポンプで乾燥し、白色固体として産物の5-ヒドロキシメチルイソオキサゾール-3-カルボヒドラジドを3.4g得た。
【０２３９】
（c）5-((t-ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)イソオキサゾール-3-カルボヒドラジド
[5-((tert-butyldimethylsilyloxy)methyl)isoxazole-3-carbohydrazide]
【０２４０】
【化２３】
2015509935.tif 000026
【０２４１】
5-ヒドロキシメチルイソオキサゾール-3-カルボヒドラジド(550 mg、3.5 mmol)を乾燥DMF(15 mL)に溶解させた後、イミダゾール(380 mg、5.6 mmol)を入れた。t-BuMe2SiCl (630 mg、4.2 mmol)をDMFに溶解させ、-10℃で上述溶液に滴下した。室温で反応溶液を一晩均一に混合した。反応はそれぞれ冷水と酢酸エチルで終了させた。水層を酢酸エチル（50 mL×2）で抽出した。この有機層を塩水で洗浄し（20 mL×2）、さらに硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して蒸発させ、淡黄色固体として5-((t-ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)イソオキサゾール-3-カルボヒドラジドを0.9ｇ得た。
【０２４２】
合成工程1
（a）3-t-ブチル-7-(5-((t-ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)イソオキサゾール-3-イル)ピラゾロ[1,5-d][1,2,4]トリアジン-2-イル 4-トルエンスルホナート
（3-tert-butyl-7-(5-((tert-butyldimethylsilyloxy)methyl)isoxazol-3-yl)pyrazolo
[1,5-d][1,2,4]triazin-2-yl 4-methylbenzenesulfonate）
【０２４３】
【化２４】
2015509935.tif 000027
【０２４４】
5-((t-ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)イソオキサゾール-3-カルボヒドラジド(850 mg、3.1 mmol)と4-t-ブチル-3-ホルミル-1H-ピラゾール  4-トルエンスルホナート(1.1 g、2.8 mmol)をキシレン(20 mL)で加熱してアルゴンの条件で72時間還流させた。加熱したメタノールで蒸発して得た残留物を研磨した後、得られた沈殿物をろ過して固体を収集し、減圧乾燥し、褐色固体として目的中間体を750mg得た。母液を濃縮し、残留物をシリカゲルでクロマトグラフィーにかけ、DCM：MeOH＝200：1で溶離し、褐色泡状物質として精製した中間産物を200mg得た。
【０２４５】
（b）3-t-ブチル-7-(5-(ヒドロキシメチル)イソオキサゾール-3-イル)ピラゾロ[1,5-d]
[1,2,4]トリアジン-2-オール（3-tert-butyl-7-(5-(hydroxymethyl)isoxazol-3-yl)pyrazolo[1,5-d][1,2,4] triazin
-2-ol）
【０２４６】
【化２５】
2015509935.tif 000028
【０２４７】
3-t-ブチル-7-(5-((t-ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)イソオキサゾール-3-イル)ピラゾロ[1,5-d][1,2,4]トリアジン-2-イル 4-トルエンスルホナート(800 mg、1.4 mmol)をメタノール(20 mL)に溶解させた後、4 NのNaOH水溶液(1 mL)を入れた。混合反応溶液をアルゴンの条件で、60℃で2時間反応させ、室温に冷却した。2NのHCl水溶液(2.5 mL)を入れた。前述混合物をろ過してろ液を蒸発させ、残留物をシリカゲルでクロマトグラフィーにかけ、DCM：MeOH＝20：1で溶離し、産物を得た。混合有機物を塩水で2回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して産物を360mg得たが、そのまま次ぎの反応に使用した。
【０２４８】
（c）(3-(3-t-ブチル-2-((2-メチル-2H-1,2,4-トリアゾール-3-イル)メチル)ピラゾロ[1,5-d][1,2,4]トリアジン-7-イル)イソオキサゾール-5-イル)メタノール（(3-(3-tert-butyl-2-((2-methyl-2H-1,2,4-triazol-3-yl)methoxy)pyrazolo[1,5-d]
[1,2,4]triazin-7-yl)isoxazol-5-yl)methanol）
【０２４９】
【化２６】
2015509935.tif 000029
【０２５０】
3-t-ブチル-7-(5-(ヒドロキシメチル)イソオキサゾール-3-イル)ピラゾロ[1,5-d][1,2,4]トリアジン-2-イル(360 mg、1.2 mmol)をDMF(10 mL)に溶解させ、5-クロロメチル-1-メチル-1H-1,2,4-トリアゾール塩酸塩(250 mg、1.5 mmol)を入れ、さらに炭酸カリウム(1 g、7.5 mmol)を入れた。反応溶液をアルゴンの条件で70℃で5時間加熱した。溶媒を蒸発させてトルエンを共沸し、そして残留物を酢酸ヘキシル（EtOAc）と水の間で分配させ、有機相を分離した。水層を酢酸ヘキシル（30 mL×2）で抽出した。混合有機物を塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させて固体物質を得た。残留物をシリカゲルでクロマトグラフィーにかけ、DCM：MeOH＝50：1で溶離し、黄色粉末固体として産物を260g得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 9.60 (s, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.22 (s, 1H), 5.85 (m, 1H), 5.62 (s, 2H), 4.74 (s, 2H), 3.91(s, 3H), 1.45 (s, 9H), -0.02 (s, 6H); ESI-MS: m/z 385 [M+H]+.
【０２５１】
上述の方法で以下の化合物を合成することができる。
3-t-ブチル-7-(5-(ヒドロキシメチル)イソオキサゾール-3-イル)ピラゾロ[1,5-d][1,2,4]トリアジン-2-オールと2-クロロメチルピリジン塩酸塩を使用し、上述と類似の方法で以下の化合物(C2)(3-(3-t-ブチル-2-(2-ピリジルメトキシ)-3,3a-2H-ピリゾロ[1,5-d][1,2,4]トリアジン-7-イル)イソオキサゾール-5-イル)メタノールを合成することができるが、以下の図の通りである。 m/z 381 [M+H]+.
【０２５２】
【化２７】
2015509935.tif 000030
【０２５３】
同様に、以下の化合物3(C3)(3-(3-t-ブチル-2-(3-ピリジルメトキシ)-3,3a-2H-ピラゾロ[1,5-d][1,2,4]トリアジン-7-イル)イソオキサゾール-5-イル)メタノールを合成することができる。 m/z 381 [M+H]+.
【０２５４】
【化２８】
2015509935.tif 000031
【０２５５】
化合物4(C4)(3-(3-t-ブチル-2-(4-ピリジルメトキシ)-3,3a-2H-ピラゾロ[1,5-d][1,2,4]トリアジン-7-イル)イソオキサゾール-5-イル)メタノールを合成することができる。 m/z 381 [M+H]+.
【０２５６】
【化２９】
2015509935.tif 000032
【０２５７】
実施例9、C2、C3、C4化合物が神経因性疼痛と炎症性疼痛を抑制することができる
C2、C3、C4化合物をそれぞれ70％（PGE400:水＝70：30の体積比）のPGE400に溶解させ、剤量が3 mg/kgとし、注射剤にした。
【０２５８】
ここで、本発明者は、C2、C3、C4（図7A）化合物のSNIモデルと炎症性疼痛モデルにおける治療・鎮痛作用を測定した。
図7Aは、化合物C2、C3、C4の化学構造式を示す。
図7Bでは、C2、C3、C4化合物の腹腔注射は、有効に神経因性疼痛を治療できたことが示された。この実験において、SNIモデルの構築から14日後、それぞれC2、C3、C4化合物（3mg/kg体重）を皮下注射し、投与1時間後ラットの疼痛閾値を検出したところ、このような化合物は神経因性疼痛を有効に治療できることが証明された。
【０２５９】
CFAで誘導された炎症性疼痛モデルにおいて、本発明者は、モデル構築から3または7日後、C2、C3またはC4化合物（3mg/kg体重）を腹腔注射し、1時間後注射した薬物の熱痛または機械痛に対する影響を検出したところ、図7CおよびDのように、当該系列の化合物はいずれも熱痛または機械痛を有効に治療することができた。
【０２６０】
実施例10、[3-[6-(ピリジン-2-メチル)-1,2,4-トリアゾロ[3,4-a]フタラジン-3-イル]イソオキサゾール-5-イル]メタノールおよびその類似体の製造
【０２６１】
【化３０】
2015509935.tif 000033
【０２６２】
1、中間体4：  1-(1-クロロフタラジン-4-イル)の製造
中間体1：  1-(1-クロロフタラジン-4-イル)
（a）1,4-ジクロロフタラジン（1,4-dichlorophthalazine）
【０２６３】
【化３１】
2015509935.tif 000034
【０２６４】
イソベンゾフラン(5.92 g、0.04 mol)を酢酸(22 mL)に溶解させ、ヒドラジン(2.8 mL, 0.044 mol)を滴下し、4時間還流させた。室温に冷却し、ろ過し、エタノールで洗浄した後、減圧で蒸発させ、白色固体として産物の2,3-ジヒドロフタラジン-1,4-ジオン（2,3-dihydrophathalazine-1,4-dione、6.13 g、収率：94.6％）を得た。この産物をPOCl3（50 mL）に溶解させ、110℃で3時間攪拌して均一に混合し、室温に冷却した後、ゆっくり冷水に注いた。ろ過し、水で洗浄し、THFの条件で再結晶し、白色固体として1,4-ジクロロフタラジンを得た。
【０２６５】
（b）1-(1-クロロフタラジン-4-イル)ヒドラジン
（1-(1-chlorophthalazin-4-yl)hydrazine）
【０２６６】
【化３２】
2015509935.tif 000035
【０２６７】
ヒドラジン一水和物(5.6 mL、0.17 mol)をエタノール(150 mL)で沸騰させた後、1,4-ジクロロフタラジン(3.0 g, 0.015 mol)を入れ、加熱して0.5時間還流させた。混合液を室温に冷却し、ろ過して固形物を収集し、エチルエーテルで洗浄した。石油エーテル/酢酸エチルの条件で再結晶させ、淡黄色固体として産物の1-(1-クロロフタラジン-4-イル)ヒドラジンを得た。
【０２６８】
中間体2：  5-ヒドロキシメチルイソオキサゾール-3-カルボン酸
（5-(hydroxymethy)isozazole-3-carboxylic acid）
【０２６９】
【化３３】
2015509935.tif 000036
【０２７０】
（a）5-ヒドロキシメチルイソオキサゾール-3-カルボン酸エチルを得る方法は実施例8を参照する。5-ヒドロキシメチルイソオキサゾール-3-カルボン酸エチル（実施例8を参照する。1.5 g、8.76 mmol）と1 M 水酸化ナトリウム（18 mL、18 mmol）を常温で1.5時間撹拌した。塩水（40 mL）を入れ、6N塩酸でpH値を2に調製した。酢酸エチル（60 mL×6）で抽出した。さらに硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発させ、白色固体として産物の5-ヒドロキシメチルイソオキサゾール-3-カルボン酸を得た（1.2 g、収率95％）。
【０２７１】
工程1：
（a）N'-(1-クロロフタラジン-4-イル)-5-(ヒドロキシメチル)イソオキサゾール-3-カルボヒドラジド（N'-(1-chlorophthalzin-4-yl)-5-(hydroxymethy)isoxazole-3-carbohydrazide）
【０２７２】
【化３４】
2015509935.tif 000037
【０２７３】
乾燥塩化メチレンCH2Cl2(100 mL)に5-ヒドロキシメチルイソオキサゾール-3-カルボン酸(770 mg、5.4 mmol)とトリエチルアミン(1.1 g、10.8 mmol、2当量)を溶解させ、0℃でビス(2-オキソ-3-オキサゾリジニル)ホスフィン酸クロリド（BOP-Cl、1.47 g、5.4 mmol、1当量)を入れた。0℃で0.5時間撹拌した。さらに1-(1-クロロフタラジン-4-イル)ヒドラジン(943 mg、4.86 mmol、0.9当量)を入れた。混合液を0℃で2時間攪拌し、さらに室温で一晩撹拌した。蒸発させ、固形残留物を水とエチルエーテルで洗浄し、黄色固体として産物のN'-(1-クロロフタラジン-4-イル)-5-(ヒドロキシメチル)イソオキサゾール-3-カルボン酸エチル（900 mg、収率:60％）を得た。
【０２７４】
（b）(3-(6-クロロ-1,2,4-トリアゾロ[3,4-a]フタラジン-3-イル)イソオキサゾール-5-イル)メタノール（(3-(6-chloro-[1,2,4]triazolo[3,4-a]phthalazin-3-yl)isoxazol-5-yl)methanol）
【０２７５】
【化３５】
2015509935.tif 000038
【０２７６】
N'-(1-クロロフタラジン-4-イル)-5-(ヒドロキシメチル)イソオキサゾール-3-カルボン酸エチル（900 mg、2.82 mmol)とエチルアミンキニジン(154 mg、0.13 mmol、0.4当量)をキシレン(60 mL)で3時間還流させた。DCM (CH2Cl2)を懸濁液に入れ、均一の混合液を得た。有機相を水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した後、蒸発させ、黄色固体として産物の(3-(6-クロロ-1,2,4-トリアゾロ[3,4-a]フタラジン-3-イル)イソオキサゾール-5-イル)メタノール(300 mg、収率：35％)を得た。
【０２７７】
（c）[3-[6-(ピリジン-2-メチル)-1,2,4-トリアゾロ[3,4-a]フタラジン-3-イル]-イソオキサゾール-5-イル]-メタノール（[3-[6-(Pyridin-2-ylmethoxy)-[1,2,4]triazolo[3,4-a]phthalazin-3-yl]-isoxazol-5-yl]-methanol）
【０２７８】
【化３６】
2015509935.tif 000039
【０２７９】
ピリジン-2-イルメタノール(300 mg、1 mmol)をDMF(30 mL)に入れ、室温でNaH (80 mg、2 mmol、2当量)を入れた。混合液を室温で15分間撹拌した。(3-(6-クロロ-1,2,4-トリアゾロ[3,4-a]フタラジン-3-イル)イソオキサゾール-5-イル)メタノール(164 mg、1.5 mmol、1.5当量)を入れ、室温で1時間撹拌した。冷水で反応を終了させ、且つ濃縮した。残留物をシリカゲルでクロマトグラフィーにかけ、産物C5を得た（50mg、収率：13.4％）。1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) δ:8.64(d,1H), 8.63-8.60(d,1H), 8.53-8.33(d,1H), 8.13(t,1H),  7.99 (t, 1H), 7.87 (t,1H), 7.76(d,1H), 7.41-7.39(t,1H), 7.15(s,1H), 5.87(t,1H), 5.71 (s,2H), 4.74-4.73(d,2H). m/z(ESI+)375(M+H+).
【０２８０】
上述と類似の方法で以下の化合物を合成した。
【０２８１】
化合物6（C6）：[3-[6-(ピリジン-3メチル)-1,2,4-トリアゾロ[3,4-a]フタラジン-3-イル]イソオキサゾール-5-イル]メタノール  m/z(ESI+)375(M+H+).
【０２８２】
【化３７】
2015509935.tif 000040
【０２８３】
化合物7（C7）：[3-[6-(ピリジン-4-メチル)-1,2,4-トリアゾロ[3,4-a]フタラジン-3-イル]イソオキサゾール-5-イル]メタノール  m/z(ESI+)375(M+H+).
【０２８４】
【化３８】
2015509935.tif 000041
【０２８５】
化合物8（C8）：[3-[6-(2-ブロモフェニル)-1,2,4-トリアゾロ[3,4-a]フタラジン-3-イル]イソオキサゾール-5-イル]メタノール1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 8.60(d,1H), 8.27(d, 1H), 8.13(t, 1H), 7.99(d, 1H), 7.85(d, 1H), 7.50(t, 1H), 7.47(t, 1H), 7.41(t, 1H), 7.21(s, 1H), 5.85(t, 1H), 5.71(s, 2H), 4.75(d, 2H); 4.75(d, 2H);
【０２８６】
【化３９】
2015509935.tif 000042
【０２８７】
実施例11、C5、C6、C7、C8化合物が神経因性疼痛と炎症性疼痛を抑制することができる
上述実施例で合成された化合物C5、C6、C7およびC8をそれぞれ70％PGE400に溶解させ、剤量がそれぞれ3 mg/kg体重とし、注射剤にした。
本発明者は、C5、C6、C7およびC8化合物のSNIモデルと炎症性疼痛モデルにおける鎮痛作用を測定した。
図8Aは、化合物C5、C6、C7およびC8の化学構造式を示す。
図8Bでは、C5、C6、C7およびC8化合物の腹腔注射は、有効に神経因性疼痛を治療できたことが示された。この実験において、SNIモデルの構築から14日後、それぞれC5、C6、C7およびC8化合物（3mg/kg体重）を皮下注射し、投与1時間後ラットの疼痛閾値を検出したところ、このような化合物は神経因性疼痛を有効に治療できることが証明された。
【０２８８】
CFAで誘導された炎症性疼痛モデルにおいて、本発明者は、モデル構築から3または7日後、C5、C6、C7およびC8化合物（3mg/kg体重）を腹腔注射し、1時間後注射した薬物の熱痛または機械痛に対する影響を検出したところ、図8CおよびDに示すのように、当該系列の化合物はいずれも熱痛と機械痛を有効に治療することができた。
【０２８９】
C5は、行動学の測定で、鎮痛効果が最も好適であった。図8Eでは、それぞれ1mg/kg体重と3mg/kg体重の剤量でC5を皮下注射した後、投与後0.5時間、1時間、2時間、3時間、6時間および12時間の時点で、ラットの疼痛閾値を検出したところ、この化合物が神経因性疼痛を有効に治療できることが証明された。この試験において、モルヒネを陽性対照とし、10mg/kgの剤量で皮下注射した。同時に、本発明者は、C5が大脳中枢反応に影響するかどうか測定し、C5が潜在的に癲癇反応を誘導するかどうか測定したが、図8Fでは、C5は、1 mg/kg、3 mg/kg、10 mg/kgおよび15 mg/kgの剤量でペンテトラゾールで誘導された癲癇に作用しないことがわかった。これは、C5が有効に痛みを治療することができ、且つ潜在の中枢副作用がないことを示唆する。
【０２９０】
実施例12、一種類のα5-GABAA受容体の逆作動薬の鎮痛効果の検証
α5-GABAA受容体の逆作動薬は、学習記憶に関連する疾患の治療に広く使用されており、F.H.L.社は、一連の関連化合物を出願し、且つ文献では、
【０２９１】
【化４０】
2015509935.tif 000043
【０２９２】
は、潜在薬物として、臨床I期試験が行われることが報告された。ここで、本発明者は、文献(Knust Hら, The discovery and unique pharmacological profile of RO4938581 and RO4882224 as potent and selective GABAA alpha5 inverse agonists for the treatment of cognitive dysfunction. Bioorg Med Chem letter. 2009 Oct 15; 19(20): 5940-4)と米国特許(US 2006/0084642 A1，US 2007/0082890 A1等)に従って下述表に示された化合物を合成した。ラットの慢性痛モデルにおいて、この種類の化合物の痛みに対する作用を測定した。下述図に示されるように、以下の化合物をそれぞれPGE400:水＝30：70の体積比のPGE400に溶解させ、剤量が3 mg/kg体重とし、注射剤にした。
【０２９３】
SNIモデルと炎症性疼痛モデルにおける治療・鎮痛作用。行動データから、以下の化合物（3mg/kg体重）の腹腔注射は、神経因性疼痛を有効に治療できることが示された。この実験において、SNIモデルの構築から14日後、以下の化合物（3mg/kg体重）を皮下注射し、投与1時間後ラットの疼痛閾値を検出したところ、この系列の化合物は神経因性疼痛を有効に治療できることが証明された。CFAで誘導された炎症性疼痛モデルにおいて、本発明者は、モデル構築から3または7日後、以下の化合物（3mg/kg体重）を腹腔注射し、1時間後注射した薬物の熱痛または機械痛に対する影響を検出したところ、以下に示されるように、当該系列の化合物はいずれも熱痛または機械痛を有効に治療することができた。
【０２９４】
同時に、本発明者は、この種類の化合物のラット組織における分布を測定した。まず、被検物質を動物体内に皮下注射した後、注射から1時間後大脳組織と血漿組織を採取し、クロマトグラフィー-タンデム質量分析（LC-MS）の方法によって薬物の濃度を検出し、化合物の大脳組織と血漿組織の比率（brain/plasma ratio）が0.1未満の場合、該候補物質を副作用が小さい、痛みを治療できる潜在薬物とする。本発明者の試験によって、
【０２９５】
【化４１】
2015509935.tif 000044
【０２９６】
などはほとんど血液脳関門を通過しないことがわかった。
【０２９７】
【表３】
2015509935.tif 000045
【０２９８】
表3における各化合物は、いずれも顕著な鎮痛効果を有する。中でも、化合物
【０２９９】
【化４２】
2015509935.tif 000046
【０３００】
は、有効にCFAで誘導された炎症性疼痛を抑制することができ、且つSNIで誘導された神経因性疼痛を抑制することもできる。この三つの化合物は、ほとんど血液脳関門を通過しないため、直接中枢機能に影響せず、中枢の副作用が小さい、有効に痛みを治療する薬物である。
【０３０１】
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、この分野の技術者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の様態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるべきである。
【図１】
2015509935.tif 000054
【図２】
2015509935.tif 000055
【図３】
2015509935.tif 000056
【図４Ａ】
2015509935.tif 000057
【図４Ｂ】
2015509935.tif 000058
【図４Ｃ】
2015509935.tif 000059
【図４Ｄ】
2015509935.tif 000060
【図４Ｅ】
2015509935.tif 000061
【図４Ｆ】
2015509935.tif 000062
【図４Ｇ】
2015509935.tif 000063
【図５Ａ】
2015509935.tif 000064
【図５Ｂ】
2015509935.tif 000065
【図５Ｃ】
2015509935.tif 000066
【図５Ｄ】
2015509935.tif 000067
【図５Ｅ】
2015509935.tif 000068
【図５Ｆ】
2015509935.tif 000069
【図６Ａ】
2015509935.tif 000070
【図６Ｂ】
2015509935.tif 000071
【図６Ｃ】
2015509935.tif 000072
【図６Ｄ】
2015509935.tif 000073
【図７Ａ】
2015509935.tif 000074
【図７Ｂ】
2015509935.tif 000075
【図７Ｃ】
2015509935.tif 000076
【図７Ｄ】
2015509935.tif 000077
【図８Ａ】
2015509935.tif 000078
【図８Ｂ】
2015509935.tif 000079
【図８Ｃ】
2015509935.tif 000080
【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【国際調査報告】
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2015509935.tif 000085
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2015509935.tif 000090
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