(57)【要約】  パーフォリン２（Ｐ２）は、線維芽細胞、ミクログリア、およびマクロファージによって発現し、例えば、マイコバクテリア・スメグマチス、Ｍ．アビウム、サルモネラ属、ＭＲＳＡ（薬剤耐性ブドウ球菌）、大腸菌などの細菌を殺傷するのに重要であることが発見された。スクリーニングアッセイによって同定された化合物を、Ｐ２に対するこれらの化合物の効果に基づいて選択する。感染性疾患、特に、細菌および抗生物質耐性細菌によるものの治療におけるこれらの化合物の使用も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
パーフォリン２（Ｐ２）の機能、活性、または発現を調節する方法であって、Ｐ２の発現、機能、または活性に関連する１つまたは複数の分子の機能、活性、または発現を調節する少なくとも１つの薬剤の有効量を患者に投与し；Ｐ２の機能または発現を調節する；ことを含む方法。
【請求項２】
Ｐ２の機能、活性、または発現に関連する１つまたは複数の分子は、ｓｒｃ、ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｍ（Ｕｂｃ１２）、ＧＡＰＤＨ、Ｐ２１ＲＡＳ／ｇａｐ１ｍ（ＲＡＳＡ２）、ガレクチン３、ユビキチンＣ（ＵＣＨＬ１）、プロテアソーム、ｖｐｓ３４、ＡＴＧ５、ＡＴＧ７、ＡＴＧ９Ｌ１、ＡＴＧ１４Ｌ、ＡＴＧ１６Ｌ、ＬＣ３、Ｒａｂ５、またはそれらの断片を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分子は、Ｐ２の転写または翻訳を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
薬剤は、低分子、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、修飾ペプチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、合成分子、天然分子、有機または無機分子、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
候補治療剤を同定する方法であって、ｓｒｃ、ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｍ（Ｕｂｃ１２）、ＧＡＰＤＨ、Ｐ２１ＲＡＳ／ｇａｐ１ｍ（ＲＡＳＡ２）、ガレクチン３、ユビキチンＣ（ＵＣＨＬ１）、プロテアソーム、ｖｐｓ３４、ＡＴＧ５、ＡＴＧ７、ＡＴＧ９Ｌ１、ＡＴＧ１４Ｌ、ＡＴＧ１６Ｌ、ＬＣ３、Ｒａｂ５、またはそれらの断片を含む１つまたは複数の標的分子を発現する細胞を接触させ；当該分子の発現、機能、または活性を測定し；当該分子の発現、機能、または活性を対照と比較し；そして、パーフォリン２の発現、機能、または活性を調節する候補治療剤を同定する；ことを含む方法。
【請求項６】
１つまたは複数の標的分子の発現、機能、または活性を調節することにより、パーフォリン２（Ｐ２）分子の発現、機能、または活性を調節する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
標的分子は、ポリヌクレオチドまたはそれらの発現産物である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
候補治療剤を同定する方法であって、アッセイ表面を、ｓｒｃ、ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｍ（Ｕｂｃ１２）、ＧＡＰＤＨ、Ｐ２１ＲＡＳ／ｇａｐ１ｍ（ＲＡＳＡ２）、ガレクチン３、ユビキチンＣ（ＵＣＨＬ１）、プロテアソーム、ｖｐｓ３４、ＡＴＧ５、ＡＴＧ７、ＡＴＧ９Ｌ１、ＡＴＧ１４Ｌ、ＡＴＧ１６Ｌ、ＬＣ３、Ｒａｂ５、それらの断片、またはそれらに関連する分子を含む１つまたは複数の標的分子に接触させ；当該標的分子を、１つまたは複数の候補治療剤に接触させて、１つまたは複数の標的分子またはそれらに関連する分子に結合またはハイブリダイズする薬剤を同定する：ことを含む方法。
【請求項９】
同定した候補治療剤を、パーフォリン２分子の発現、機能、または活性の調節についてアッセイする、請求項１８に記載の方法。
【請求項１０】
同定した候補薬剤を、感染性生物の複製の阻害、増殖の阻害、または死滅についてアッセイする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
感染性生物は、細胞内細菌または細胞外細菌である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
感染性疾患生物に罹患している患者を治療する方法であって、患者に、請求項１または請求項８に記載の方法によって同定された薬剤の治療的有効量を投与することを含む方法。
【請求項１３】
パーフォリン２タンパク質をコードする遺伝子の破壊を含むトランスジェニックマウス。
【請求項１４】
前記破壊は、パーフォリン２タンパク質をコードする前記遺伝子のヘテロ接合性またはホモ接合性破壊を含む、請求項１３に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１５】
前記破壊は、ホモ接合性破壊を含み、前記ホモ接合性破壊は、前記トランスジェニックマウスにおける前記遺伝子を不活性化し、機能的パーフォリン２タンパク質の発現を阻害する、請求項１４に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１６】
前記トランスジェニックマウスは、野生型マウスと比較して、細胞内病原体による感染に対する感受性の増加を示す、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１７】
請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のトランスジェニックマウス由来の器官、組織、細胞、または細胞株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由でテキストファイルとして提出された配列表の参照
配列表の公式コピーは、情報交換用米国標準コード（ＡＳＣＩＩ）を遵守して、ファイル名４３０３３３ｓｅｑｌｉｓｔ．ｔｘｔのもとに２０１３年３月１２日に作成しサイズが２ＫＢのテキストファイルとして、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で本明細書と同時に提出された。ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で提出された配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府からの補助金についての表明
本発明は、国立衛生研究所により授与された認可番号ＣＡ１０９０９４の下に政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、抗生物質および創薬の分野に関する。具体的には、本発明は、細菌感染に対する身体の自然防御を増強するのに有用な方法および化合物に関する。
【背景技術】
【０００４】
パーフォリンは、ＣＤ８Ｔ−細胞およびＮＫ細胞の顆粒中に見られる細胞溶解性のタンパク質である。脱顆粒化の際に、パーフォリンは、自身を標的細胞の細胞膜に挿入することにより孔を形成する。本発明者らの研究室でのパーフォリンのクローニング（Ｌｉｃｈｔｅｎｈｅｌｄ，Ｍ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８８．Ｎａｔｕｒｅ  ３３５：４４８−４５１；Ｌｏｗｒｅｙ，Ｄ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８９．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：２４７−２５  １）およびＳｈｉｎｋａｉ  ｅｔ  ａｌ（Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）  ３３４：５２５−５２７）により、補体成分Ｃ９とパーフォリンとの相同性についての仮定が確立された（ＤｉＳｃｉｐｉｏ，Ｒ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８４．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１：７２９８−７３０２）。
【０００５】
パーフォリン１およびパーフォリン２（Ｐ２）の両者とも、親水性で、水溶性の前駆体として合成される孔形成因子である。両者とも、脂質二重層内に挿入し層内で重合し、膜を貫通する大きな水充填孔を形成することができる。この水充填孔は、円筒状のタンパク質ポリマーで構成される。
【０００６】
円筒の内側は水充填孔を形成するため、親水性の表面でなくてはならないが、一方、円筒の外側は脂質コアの内部に固定されているため疎水性でなくてはならない。この孔構造は、両親媒性ヘリックス（ヘリックスターンヘリックス）によって形成されると考えられている。これは、パーフォリンおよびＣ９そして膜攻撃複合体（ＭＡＣ）を形成する他の補体タンパク質間で最も保存されているタンパク質ドメイン、いわゆるＭＡＣ−Ｐｆ（膜侵襲複合体／パーフォリン）ドメインの一部である。
【０００７】
ヒトおよびマウスのマクロファージで発現し、ＭＡＣ／Ｐｆドメインを有するタンパク質が予測されるｍＲＮＡ（Ｍｐｇ１またはＭｐｅｇ１−マクロファージ発現遺伝子と命名）が、Ｓｐｉｌｓｂｕｒｙにより初めて説明された（Ｂｌｏｏｄ（１９９５）  ８５：１６２０−１６２９）。続いて、同じｍＲＮＡ（ＭＰＳ−１と命名）が、実験的プリオン疾患において上方制御されていることが発見された。Ｄｅｓｊａｒｄｉｎのグループは、ラテックスビーズを与えたマクロファージから単離されたファゴソーム膜のタンパク質組成を、２次元ゲル電気泳動と質量分析法により分析した（Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５２：１６５−１８０，２００１）。著者らは、ＭＰＳ−１タンパク質に対応するタンパク質スポットを発見した。Ｍａｈらは、アワビ軟体動物を分析し、Ｍｐｅｇ１遺伝子ファミリーに相同なｍＲＮＡを血液中に発見し（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３１６：４６８−４７５，２００４）、これから予想されるタンパク質は、ＣＴＬパーフォリンと同様の機能を持っているが、軟体動物の自然免疫系の一部であると示唆した。
【発明の概要】
【０００８】
本明細書中に記載するのは、Ｐ２の発現または活性の調節に関連する組成物および方法であり、細菌感染を治療するために有用なものも含む。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１Ａ〜１Ｃは、パーフォリン２がＲＯＳおよびＮＯの殺菌効果を増強することを示す。細胞内殺菌は、１０ｍＭのＮＡＣでＲＯＳを、１０ｍＭのＬ−ＮＡＭＥでＮＯを、またはＰ２特異的ｓｉＲＮＡのプールでＰ２をブロックすることによって阻害された。ゲンタマイシン保護アッセイを、図２Ａ〜２Ｆに示すように行った。Ｐ２  ｓｉＲＮＡまたはスクランブルｓｉＲＮＡでのトランスフェクションから２４時間後。ＰＥＭは、大腸菌（図１Ａ）、ネズミチフス菌（図１Ｂ）、またはＭ．スメグマチス（図１Ｃ）に感染させた。阻害剤は、感染の１時間前に添加してアッセイの間保持した。細胞を溶解し、感染から１および５時間後にＣＦＵを測定した。図示したデータは、二回繰り返して行った３つの実験の平均である。アスタリスクは、スチューデントｔ検定に基づく有意性（ｐ＜０．０５）を示す。
【００１０】
【図２】図２Ａ〜２Ｆは、パーフォリン２が孔形成タンパク質であることを示す。（図２Ａ）Ｐ２のドメイン構造；ＴＭ、膜貫通ドメイン；Ｃｙｔｏ、細胞質ドメイン。中性のリンタングステン酸Ｎａでネガティブ染色した重合パーフォリン２による膜傷害の電子顕微鏡写真。（図２Ｂ）膜に結合した重合Ｐ２の外観。染色された孔は９．２ｎｍの内径を有することに注目。（図２Ｃ）重合が不完全な複合体（矢印）を高倍率で示したもの。（図２Ｄ）矢印は、三次元形状の輪郭を示す斜視図における珍しいポリＰ２複合体の斜視図を指す。（図２Ｅ、２Ｆ）膜に結合したポリＰ２の２つの側面図。（図２Ｇ）比較のために図２Ａのパーフォリン２と同じ倍率でギ酸ウラニルにより染色したＣＴＬ３の膜に結合したパーフォリン１（Ｐ１）。Ｐ１の孔の直径（１６ｎｍ）はＰ２（９．２ｎｍ）よりも大きいことに注目。
【００１１】
【図３】図３Ａ〜３Ｉは、パーフォリン２がマクロファージやミクログリアにおける細胞内メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、ネズミチフス菌、Ｍ．アビウム、Ｍ．スメグマチス、および大腸菌を殺傷することを示す。方法で指示するように細胞を感染させ、洗浄し残っている細胞外細菌を除去し、ゲンタマイシンを添加した。細胞内生存は、指示した時点における細胞の溶解、およびコロニー形成単位（ＣＦＵ）の測定により決定した。（図３Ａ〜３Ｄ）：Ｐ２  ｓｉＲＮＡプールによりＲＡＷ、ＰＥＭ、およびＢＶ−２ミクログリア細胞中のＰ２をノックダウンすると、病原性細菌は細胞内で生存できるが、ノックダウンしないと殺傷される。（図３Ｅ）：Ｐ２のノックダウン、Ｐ２  ｓｉＲＮＡ処理後のＲＡＷ細胞におけるＰ２タンパク質発現のウェスタンブロット分析。（図３Ｆおよび３Ｇ）：Ｐ２−ＲＦＰ融合タンパク質の過剰発現により、ベクター対照と比較して細菌殺傷が増強する。（図３Ｈ）：マクロファージにおける内因性Ｐ２のノックダウンおよびＰ２−ＲＦＰ融合タンパク質を用いた補完により、Ｍ．スメグマチスに対する殺傷活性が回復する。（図３Ｉ）：ＲＡＷ細胞におけるＰ２補完アッセイにおけるＰ２およびＰ２−ＲＦＰ発現のウェスタンブロット分析。示すグラフは、３回繰り返した３つ以上の実験の平均である。アスタリスクは、スチューデントｔ検定に基づく有意性（ｐ＜０．０５）を示す。
【００１２】
【図４】図４Ａ〜４Ｄは、マクロファージにおける細胞内のパーフォリン２−ＧＦＰの局在を示す。ＲＡＷ細胞は、Ｐ２−ＧＦＰでトランスフェクトし、２４時間後に固定および種々の細胞オルガネラについて染色した。Ｐ２−ＧＦＰは、ＥＲ（図４Ａ）ならびにゴルジ膜およびトランスゴルジ網（図４Ｂ）に共局在するが、細胞膜（図４Ｃ）またはリソソーム（図４Ｄ）には共局在しない。画像下のパネルは、オーバーレイ（左パネル）で示す断面を単一カラー画像で示したものである。共局在は、オーバーレイ中で黄色く表示される。
【００１３】
【図５】図５Ａ、５Ｂは、ＲＮＡおよびタンパク質レベルでＰ２をノックダウンした定量値を示す。図５ＡではＲＡＷ細胞、図５ＢではＰＥＭ中において、ｓｉＲＮＡはスクランブル対照と比べ、Ｐ２のノックダウンに介在した。棒グラフは、定量的ＴＡＱＭＡＮ（商標）ＲＴ−ＰＣＲによって測定した各種細胞における相対的なＰ２  ｍＲＮＡの発現を示す。Ｐ２  ｍＲＮＡレベルはＧＡＰＤＨにより正規化される。ウェスタンブロット分析により、タンパク質レベルが処理した試料のｍＲＮＡ発現に対応することが示される。細胞はトランスフェクションから２４時間後に回収して分析した。
【００１４】
【図６】図６は、ＲＯＳおよびＮＯの阻害剤は、細菌増殖を直接的に阻害しないことを示す。大腸菌、ネズミチフス菌、およびＭ．スメグマチスを、ＮＡＣ（１０ｍＭ）またはＬ−ＮＡＭＥ（１０ｍＭ）の存在下または非存在下のＩＭＤＭ＋１０％ＦＢＳ中で５時間増殖させた。細菌増殖は、培養培地へ阻害剤を添加してから１および４時間後に６００ｎｍのＯＤで分光光度計により測定した。
【００１５】
【図７】図７は、パーフォリン２が系統発生的に保存されていることを示す。いくつかの種（ベクターＮＴＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から予測されるタンパク質配列のアラインメント。ＭＡＣＰＦおよびＰ２ドメインを四角で囲み、膜貫通ドメインを四角で囲んで黄色くハイライトする。細胞質ドメインで保存されたチロシンおよびセリンを、それぞれピンクおよびグレーでハイライトする。赤字および黄色のハイライトは、すべての種で同一であることを示し、青のハイライトは、４つ以上の配列において同一であること示し、緑は、保存的置換を示す。
【００１６】
【図８】図８は、Ｐ２−ＧＦＰのトランスフェクションおよびタンパク質発現の確認である。２９３細胞内にトランスフェクトされたＰ２−ＧＦＰ発現のウェスタンブロット分析。Ｐ２−ＧＦＰは、Ｐ２の細胞質ドメインに対して作成したポリクローナル抗血清（Ｐ２  ｃｙｔｏ）、市販のペプチド抗血清（Ｐ２  Ａｂｃａｍ）、および抗ＧＦＰ抗体を用いて検出した。Ｐ２−ＧＦＰは、約１１０ｋＤという予想通りのサイズに移動した。
【００１７】
【図９】図９Ａ〜９Ｄは、Ｐ２が、マクロファージ、樹状細胞、およびミクログリア細胞、ならびに細胞株における細胞内殺菌活性を媒介することを示す。ＢＭＤＭ／ＤＣをマウス骨髄からＧＭ−ＣＳＦの存在下で１０日間分化させた後、ＬＰＳ（１ｍｇ／ｍｌ）およびＩＦＮγ（１００Ｕ／ｍｌ）（図９Ａ）またはポリ（Ｉ：Ｃ）（３ｍｇ／ｍｌ）（図９Ｂ）で４８時間刺激した。（図９Ｃ）ＢＶ２ミクログリア細胞をＩＦＮγ（１００Ｕ／ｍｌ）で２４時間刺激した。（図９Ｄ）ＲＡＷ細胞をＬＰＳ（１ｎｇ／ｍｌ）およびＩＦＮγ（１００Ｕ／ｍｌ）で２４時間刺激した。細胞を指示した時点で回収し、ＧＡＰＤＨに対するＰ２メッセージ発現についてＴＡＱＭＡＮ（商標）ＲＴ−ＰＣＲで解析した。
【００１８】
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｅは、Ｐ２をノックダウンすることで細胞内殺菌活性が阻害されることを示す。（図１０Ａ〜１０Ｃ）Ｐ２  ｓｉＲＮＡ（斜線の棒）またはスクランブルｓｉＲＮＡ対照（黒色の棒）で処理したＲＡＷ細胞をそれぞれＭＯＩ１０でＭ．スメグマチス、ＭＲＳＡ、およびネズミチフス菌に感染させた。（図１０Ｄおよび１０Ｅ）ＰＥＭおよびＢＭＤＭ／ＤＣを、Ｐ２ｓｉＲＮＡまたはスクランブルｓｉＲＮＡ対照で処理し、ＭＯＩ１０でＭ．スメグマチスに感染させた。生存している細胞内細菌をゲンタマイシン保護アッセイで決定し、指示した時点でＣＦＵアッセイによって計数した。示すグラフは、細胞：細菌の組み合わせ毎の少なくとも３回の実験の平均である。エラーバーは、２〜３回の繰り返しの標準誤差を表す。アスタリスクは、スチューデントｔ検定に基づく有意性を示す。
【００１９】
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｆは、Ｐ２−ＲＦＰの過剰発現により細胞内殺菌活性が増加することを示す。指示の細胞を、材料と方法に示すようにＰ２−ＲＦＰ融合タンパク質を含有するベクター（黒色の棒）または対照空ベクター（斜線の棒）でトランスフェクトし、ＭＯＩ１０で指示の細菌に感染させた。生存している細菌を指示した時点でＣＦＵアッセイによって計数した。示すグラフは、細胞：細菌の組み合わせ毎の少なくとも３回の実験の平均である。エラーバーは、２〜３回の繰り返しの標準誤差を表す。アスタリスクは、スチューデントｔ検定に基づく有意性を示す。
【００２０】
【図１２】図１２Ａ、１２Ｂは、内因性Ｐ２をノックダウンした細胞へＰ２−ＲＦＰをトランスフェクトすると、細胞内殺菌活性が回復されること示す。図１２ＡではＢＭＤＭ／ＤＣ、図１２ＢではＲＡＷ細胞を、材料と方法に示すように。Ｐ２の３’ＵＴＲを標的とするｓｉＲＮＡおよびＰ２−ＲＦＰ融合タンパク質を含有するベクターまたは空ベクターのみと共に同時トランスフェクトし、指示の細菌に感染させた。赤線は、細胞内細菌の生存に対するＰ２ＲＦＰの効果をＲＦＰベクター対照と比較して示すものである。黒線は、細菌の生存率に対するＰ２  ｓｉＲＮＡ（３’ＵＴＲ標的のみ）での処理の効果を、スクランブルｓｉＲＮＡ対照と同じ実験で比較して表す。エラーバーは、２〜３回繰り返した３〜４の個々の実験の標準誤差を表す。
【００２１】
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｃは、Ｐ２が初期エンドソームマーカーまたは核と共局在しないことを示す。（図１３Ａ）一過性トランスフェクトし、ＲＡＷ細胞で発現させたＰ２−ＧＦＰ（左パネル）およびＧＦＰ（右パネル）の示差染色パターン。Ｐ２−ＧＦＰは、初期エンドソーム（ＥＥＡ−１、赤）（図１３Ｂ）または核（Ｈｏｅｃｈｓｔ、赤）（図１３Ｃ）と共局在しない。画像は、Ｌｅｉｃａ  ＳＰ５倒立共焦点顕微鏡および４０倍の対物レンズを用いて撮影した。
【００２２】
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｊは、パーフォリン２  ｍＲＮＡが１型および２型インターフェロンによって上方制御されることを示す。マウス胚線維芽細胞（図１４Ａ）、直腸癌細胞株（図１４Ｂ）、筋芽細胞細胞株（図１４Ｃ）、および卵巣細胞株（図１４Ｄ）を、１００Ｕ／ｍｌのインターフェロン−α、インターフェロン−β、およびインターフェロン−γで１４時間処理した。ＬＰＳは１ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−１αは１０Ｕ／ｍｌ、ＩＬ−１βは１ｎｇ／ｍｌ、そしてＴＮＦαは２０ｎｇ／ｍＬで処理した。ヒト胚性腎臓細胞株（図１４Ｅ）および子宮頸癌細胞株（図１４Ｆ）を、１５０Ｕ／ｍｌのヒトＩＦＮ−α、１００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−βおよび１００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γで処理した。ＢＶ２ミクログリア細胞株を１００Ｕ／ｍｌのマウスインターフェロン−γで１４時間刺激し、Ｐ２  ｍＲＮＡおよびタンパク質を上方制御した。ｍＥＦをＩＦＮ−γで１４時間処理した（ｍＥＦ）後、２５ｍＭ  ＭＧ−１３２で１時間処理した（ｍＥＦ＋ＭＧ１３２）（図１４Ｇ）。ヒト初代角化細胞を、指示した組換えヒトＩＦＮで処理し、タンパク質発現について解析した（図１４Ｈ）。ｍＥＦを大腸菌またはＭ．スメグマチスで処理した。指示した時点で細胞を回収し、ＴＡＱＭＡＮ（商標）ＰＣＲによってＰ２  ｍＲＮＡについて解析し、未感染対照と比較した。（図１４Ｉ）ｍＥＦを刺激しない、または１００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γで１４時間刺激した。刺激後、ｍＥＦをＭ．スメグマチスに感染させ、指示した時点でコロニー形成単位について分析した。
【００２３】
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｆは、細菌上のポリパーフォリン２の孔を示す。ｍＥＦをマウスインターフェロン−γで１４時間処理してから、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（図１５Ａ、１５Ｂ）またはＭ．スメグマチス（図１５Ｄ、１５Ｅ）に感染させた。感染から５時間後、ｍＥＦを界面活性剤で溶解し、無傷の細菌を回収し、透過型電子顕微鏡用にネガティブ染色した。Ｐ２  ｃＤＮＡを過剰発現しているＨＥＫ２９３細胞膜を処理しポジティブ対照として使用した（図１５Ｃ）。大腸菌上の補体の孔である膜侵襲複合体（ＭＡＣ）を、比較のために示す（図１５Ｆ）。
【００２４】
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｌは、内因性パーフォリン２をノックダウンすると細胞内細菌増殖が増強することを示す。マウス直腸癌ＣＭＴ−９３を、Ｐ２  ｓｉＲＮＡプールまたはＰ２−ＲＦＰで一過性トランスフェクトした。スクランブルｓｉＲＮＡまたはＲＦＰもトランスフェクトしそれぞれＰ２  ｓｉＲＮＡおよびＰ２−ＲＦＰの対照として解析した。全てのトランスフェクションは、感染の２４時間前に行った。感染の１４時間前に細胞を１００Ｕ／ｍｌの種特異的なＩＦＮ−γと共にインキュベートした。感染後の指示した時点で細胞を溶解しＣＦＵ分析用にプレーティングした。（図１６Ａ〜１６Ｄ）ｍＥＦを感染の２４時間前に、Ｐ２  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、ｓｉＲＮＡ耐性Ｐ２−ＲＦＰ  ｃＤＮＡで補完した。感染の１４時間前にインターフェロン−γを添加した。ｍＥＦを後期対数期のネズミチフス菌に感染させた。感染後の指示した時点で、ｍＥＦを溶解しコロニー形成単位について分析した。感染の２４時間前に、マウス星状細胞（図１６Ｆ）、ヒト膵臓癌（図１６Ｇ）、ヒト膀胱癌（図１６Ｈ）、マウス筋芽細胞（図１６Ｉ）、ヒト子宮頚癌（図１６Ｊ）、マウス卵巣癌（図１６Ｋ）、ヒト臍帯静脈内皮細胞（図１６Ｌ）を種特異的なＰ２  ｓｉＲＮＡまたはスクランブルｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、感染の１４時間前に種特異的なＩＦＮ−γで刺激した。細胞は、指示の細菌に感染させ、指示の時点で溶解してＣＦＵを決定した。
【００２５】
【図１７】図１７Ａ〜１７Ｊは、Ｐ２がリゾチームに対する細胞内細菌の感受性を増加させることを示す。（図１７Ａ〜１７Ｃ）Ｍ．スメグマチスをミドルブロック７Ｈ１１寒天プレート上にプレーティングし位相光顕微鏡（５０倍の倍率）で撮影したマイクロコロニーの代表的な画像。（図１７Ａ）ｍＥＦとのインキュベーション前にプレーティングしたＭ．スメグマチス。（図１７Ｂ）氷上で対照（リゾチーム無）と共にインキュベーションしＩＦＮ−γで前活性したｍＥＦに感染させて５時間後にプレーティングしたＭ．スメグマチス。（図１７Ｃ）溶解してから氷上でリゾチームと共にインキュベーションしＩＦＮ−γで前活性したｍＥＦに感染させて５時間後にプレーティングしたＭ．スメグマチス。（図１７Ｄ）Ｍ．スメグマチスに感染させたｍＥＦに対するリゾチームの影響の定量値。パーセンテージはそれぞれプレーティングした試料について感染から５時間後のものである。結果は、各操作を繰り返した５つの実験から成る。１０００個の細菌を膨らんでいる形態と正常な形態に区分して計数し、膨らんでいる菌体の割合を記録した。（図１７Ｅ〜１７Ｇ）感染の２４時間前にスクランブルｓｉＲＮＡ（図１７Ｅ）、Ｐ２  ｓｉＲＮＡ（図１７Ｆ）、およびＰ２−ＲＦＰ（図１７Ｇ）でトランスフェクトし、ＩＦＮ−γで１４時間刺激してから、ＭＲＳＡに感染させたｍＥＦ。指示した時点で、真核細胞を溶解して細胞内細菌を回収し、６個の等量の画分に分けた。これらの等量の細菌溶解物の半分はリゾチームで処理し、残りの半分は緩衝液を添加した。３０分間氷上でインキュベートしてリゾチームを活性化し、細菌をプレーティングしてリゾチームの効果を分析した。（図１７Ｈ〜１７Ｊ）マウス直腸癌細胞株ＣＭＴ−９３を、スクランブルｓｉＲＮＡ（図１７Ｈ）、Ｐ２  ｓｉＲＮＡ（図１７Ｉ）、またはＰ２−ＲＦＰ（図１７Ｊ）で一過性トランスフェクトし、ＩＦＮ−γで刺激した。処理後、これらの細胞をＭ．スメグマチスに感染させた。指示した時点で、真核細胞を溶解し、リゾチーム介在性の殺傷について分析した。
【００２６】
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｉは、Ｐ２がヒトおよびマウス組織において１型および２型インターフェロンにより誘導可能であることを示す。（図１８Ａ〜１８Ｄ）マウスＰ２  ｍＲＮＡの転写は、直腸癌細胞（図１８Ａ）、黒色腫細胞（図１８Ｂ）、初代髄膜線維芽細胞（図１８Ｃ）、初代星状細胞（図１８Ｄ）において１型および２型インターフェロンで処理することにより誘導可能である。（図１８Ｅ〜１８Ｉ）膀胱癌（図１８Ｅ、１８Ｆ）、膵臓癌（図１８Ｇ）、初代角化細胞（図１８Ｈ）、および臍帯静脈内皮細胞（図１８Ｉ）において１型および２型インターフェロンで処理することによるヒトＰ２  ｍＲＮＡの誘導。
【００２７】
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｇは、Ｐ２  ｓｉＲＮＡによるｍＲＮＡノックダウンの効率を示す。Ｐ２転写物は、以下の条件で測定した：トランスフェクションなし、Ｐ２  ｓｉＲＮＡまたはスクランブルｓｉＲＮＡによるトランスフェクション。全ての細胞を１００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γで１４時間刺激した（図１９Ａ〜１９Ｄ）。以下のマウス株は、ｓｉＲＮＡ処理後にＰ２をノックダウンする代表的なサンプルである：ｍＥＦ（図１９Ａ）、直腸癌（図１９Ｂ）、髄膜線維芽細胞（図１９Ｃ）、および星状細胞（図１９Ｄ）。さらに、以下のヒト細胞株は、ヒトＰ２特異的ｓｉＲＮＡを用いたノックダウンＰ２転写物の代表的なサンプルとなる：ＨＵＶＥＣ（Ｅ）、膵臓癌（図１９Ｆ）、および膀胱癌（図１９Ｇ）。\は、Ｐ２転写物が４５サイクルのｑＲＴ−ＰＣＲにより検出されなかったことを示す。
【００２８】
【図２０】図２０Ａ、図２０Ｂは、Ｐ２をノックダウンすると、真核細胞を殺傷する細胞内細菌のスムーズな複製が可能になることを示す。Ｍ．スメグマチスで感染させた後ｓｉＲＮＡで処理したｍＥＦのトリパンブルー排除で決定した絶対生細胞数（図２０Ａ）および生存率（図２０Ｂ）。４つの個別の実験から示されたデータ。
【００２９】
【図２１−１】図２１Ａ〜２１Ｌは、パーフォリン２をノックダウンすると、種々な種類の細胞において細胞内細菌の増殖が増強することを示す。以下の細胞を、感染の２４時間前にＰ２  ｓｉＲＮＡまたはスクランブルｓｉＲＮＡで一過性トランスフェクトした：（図２１Ａ〜２１Ｃ）マウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞、（図２１Ｄ〜２１Ｆ）マウス卵巣ＭＯＶＡＣ５００９、（図２１Ｇ〜２１Ｉ）ヒトＨｅＬａ子宮頸癌、（図２１Ｊ〜２１Ｌ）ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）。感染の１４時間前に、細胞を１００Ｕ／ｍｌの種特異的ＩＦＮ−γでインキュベートした。感染後の指示した時点で、細胞をＣＦＵ分析用に溶解しプレーティングした。
【図２１−２】図２１Ｍ〜２１ＡＦは、パーフォリン２をノックダウンすると、種々な種類の細胞において細胞内細菌の増殖が増強することを示す。以下の細胞を、感染の２４時間前にＰ２  ｓｉＲＮＡまたはスクランブルｓｉＲＮＡで一過性トランスフェクトした：（図２１Ｍ〜２１Ｐ）マウス卵巣ＭＯＶＡＣ５４４７、（図２１Ｑ〜２１Ｔ）ＣＴ−２６直腸癌、（図２１Ｕ〜２１Ｘ）マウスＢ１６Ｆ１０黒色腫、（図２１Ｙ〜２１ＡＢ）ヒトＭＩＡ−ＰａＣａ−２膵臓癌、（図２１ＡＣ〜２１ＡＦ）ヒトＵＭ−ＵＣ−９膀胱癌。感染の１４時間前に、細胞を１００Ｕ／ｍｌの種特異的ＩＦＮ−γでインキュベートした。感染後の指示した時点で、細胞をＣＦＵ分析用に溶解しプレーティングした。
【００３０】
【図２２】図２２Ａ〜２２Ｃは、Ｐ２の補完により内因性Ｐ２をノックダウンした細胞における殺傷活性が回復することを示す。Ｐ２  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしｓｉＲＮＡ耐性Ｐ２  ｃＤＮＡと共にコトランスフェクトしたｍＥＦ細胞は、（図２２Ａ）Ｍ．スメグマチス、（図２２Ｂ）大腸菌、および（図２２Ｃ）ＭＲＳＡに対する殺傷活性を回復できる。
【００３１】
【図２３】図２３Ａ〜２３Ｃは、リゾチームのみでは、ＣＦＵが低下しないことを示す。ＭＲＳＡ（図２３Ａ）、大腸菌（図２３Ｂ）、およびＭ．スメグマチス（図２３Ｃ）をリゾチームで処理して、各細菌のリゾチームに対する感受性を測定した。３つの別々の実験を、リゾチーム添加有無の条件下３０分間氷上でインキュベーションした前後のＣＦＵ計測数で示す。
【００３２】
【図２４】図２４Ａ〜２４Ｌは、リゾチームがパーフォリン２の殺菌作用を増強させることを示す。パーフォリン２は、パーフォリン２なしでは無反応であった細菌に対するリゾチームの殺菌活性を調節できる。大腸菌に感染させたｍＥＦ（図２４Ａ〜２４Ｃ）、Ｍ．スメグマチスに感染させたｍＥＦ（図２４Ｄ〜２４Ｆ）、大腸菌に感染させたＣＭＴ−９３（図２４Ｇ〜２４Ｉ）、およびＭＲＳＡに感染させたＣＭＴ−９３のリゾチーム活性が増加した。
【００３３】
【図２５】図２５Ａ〜Ｃは、Ｐ２の欠損が制御不能で致命的な細菌増殖をもたらすことを示す。（ａ）Ｐ２+/+（白四角）、Ｐ２-/-（白丸）、およびＰ２+/-（白三角）同腹子の日毎の体重測定値。経口胃投与により２０ｍｇのストレプトマイシンを投与して１０５または１０２ネズミチフス菌ＲＬ１４４に２４時間感染させたマウスｎ＝１０および１５（解析：各々につき対応のない複数のｔ検定）。（ｂ）腸から血液、肝臓、および脾臓へのネズミチフス菌の伝播（解析：クラスカル・ウォリス検定）。（ｃ）遺伝的Ｐ２-/-ＰＥＭ（黒三角）では、ｓｉＲＮＡでＰ２をノックダウンしたＰＥＭ（黒菱形）と比較してネズミチフス菌複製の制御ができない；材料および方法に記載したＣＦＵアッセイ（解析：対応のないｔ検定）。
【００３４】
【図２６】図２６Ａ〜Ｆは、Ｐ２は普遍的に発現し、ネズミチフス菌、マイコバクテリウム・スメグマチスとアビウム、およびＭＲＳＡに対し殺菌力があることを示す。（ａ）ヒト血液由来のＰＭＮおよびマクロファージのウェスタンブロット分析、ならびにｓｉＲＮＡで処理したＨＬ６０由来のＰＭＮのウェスタンブロットおよびＣＦＵアッセイ。Ｐ２特異的（黒四角）およびスクランブル対照（白丸）ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨＬ６０／ＰＭＮ細胞を指示した細菌に感染させ、ＣＦＵを指示した時点に記載の方法で分析した。（ｂ）図示の細菌に感染後ＩＦＮ−γで誘導した腸上皮ＣＭＴ９３細胞のＣＦＵアッセイ。細胞は、Ｐ２−ＲＦＰ（白三角）またはＲＦＰ（黒菱形）のプラスミド−ｃＤＮＡを用いてＰ２特異的（黒四角）またはスクランブル対照（白丸）ｓｉＲＮＡでトランスフェクトして、感染前にＩＦＮ−γで一晩刺激した。（ｃ）（ｄ）初代ヒト臍帯内皮細胞細胞（ＨＵＶＥＣ）または子宮頸部上皮細胞（ＨｅＬａ）においてＩＦＮ−γで誘導されたＰ２は、Ｍ．スメグマチス（および他の図示しない細菌）を殺傷する。（ｅ）Ｐ２−ＲＦＰをトランスフェクトしたＲＡＷマクロファージによるＭ．アビウムの完全な除去。（ｆ）Ｐ２−ＲＦＰを用いたＭＥＦにおける内因性Ｐ２ノックダウンの補完。サルモネラ菌による感染後Ｐ２  ｓｉＲＮＡおよびＰ２−ＲＦＰでトランスフェクトし、ＩＦＮ−γで活性化したＭＥＦのＣＦＵアッセイおよびウェスタンブロット分析；Ｐ２  ｓｉＲＮＡ＋ＲＦＰ（白菱形）、Ｐ２  ｓｉＲＮＡ＋Ｐ２−ＲＦＰ（白四角）、およびスクランブルｓｉＲＮＡ＋ＲＦＰ（黒三角）。ｔ検定による統計。
【００３５】
【図２７】図２７Ａ〜Ｅは、細菌がＰ２をブロックするメカニズムを有することを示している。（ａ）サルモネラは、（ＩＦＮによって活性化されていない）天然ＭＥＦにおいてＰ２  ｍＲＮＡの誘導をブロックする。図示のサルモネラおよび大腸菌株による感染後の相対的なＰ２  ｍＲＮＡレベル。（ｂ）Ｃ．トラコマチスは、ＨｅＬａ細胞においてＩＦＮ−γ介在性のＰ２  ｍＲＮＡ発現の誘導をブロックする。クロラムフェニコール（Ｃｍ）で処理したクラミジアはＰ２  ｍＲＮＡを誘導する。データは、３つの試料の平均±標準偏差として示す。（ｃ）腸内病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）がＣＩＦプラスミドを有する場合、Ｐ２介在性の殺傷をブロックする。（ｄ）非治癒性かつ慢性的な潰瘍の縁から切除した真皮および表皮のＰ２メッセージレベル。皮膚試料は、慢性皮膚潰瘍に隣接した部分および離れた部分の半分ずつに分割し、隣接した部分および離れた部分のＰ２  ｍＲＮＡレベル比を示す。ｔ検定による統計。ｎ＝１０。
【００３６】
【図２８】図２８Ａ〜Ｄは、Ｐ２が細菌を含有する液胞へ移行することを示す。（ａ）膜小胞内のＰ２の貫通方向および哺乳動物種における細胞質ドメインの配列の保存性から予測されるタンパク質ドメインの構造。（ｂ）Ｐ２  ｓｉＲＮＡおよび一過性Ｐ２−ＧＦＰ（緑）でトランスフェクトしサルモネラ菌による感染から５分後のＢＶ２の代表的な共焦点画像；ＤＡＰＩによるＤＮＡ染色を白色で示す。細胞全体を示す１．２μの３つの縦切片を示す。（ｃ）Ｐ２  ｓｉＲＮＡおよび一過性Ｐ２−ＲＦＰ（赤）でトランスフェクトし大腸菌−ＧＦＰ（緑）で５分間感染させた後、固定および画像化したＢＶ２ミクログリア細胞の代表的な共焦点画像。（ｄ）未感染細胞におけるＰ２−ＧＦＰの核周辺の局在；蛍光および対応する位相画像を示す。
【００３７】
【図２９】図２９Ａ〜Ｃは、パーフォリン２による孔の形成を示す。（ａ）Ｈｅｋ−２９３膜内のポリＰ２孔の電子顕微鏡写真。白い矢印は、９．２±０．５ｎｍの内径が染色された孔を有する典型的なポリマー環構造を示す。黒い矢印は、不完全で不規則に重合した複合体を指す。中性のリンタングステン酸Ｎａによるネガティブ染色。（ｃ，ｄ）ＩＦＮ−γで誘導したＭＥＦ感染後のＭ．スメグマチス（ｃ）およびＭＲＳＡ（ｄ）上の重合Ｐ２による膜傷害の電子顕微鏡写真。細菌の膜を方法に記載のように単離し、ネガティブ染色し透過型電子顕微鏡で観察した。白い矢印は、細菌の細胞壁上に染色された黒い円形部分を指しており、これは重合したＰ２と推定される白く狭い境界に囲まれている。黒い矢印は、不規則なポリマーを指す。
【００３８】
【図３０】図３０：（Ａ）直腸上皮癌細胞においてＰ２  ｓｉＲＮＡでノックダウンすることにより、ネズミチフス菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ、臨床分離株）、およびマイコバクテリウム・スメグマチスの細胞内複製が起こる。Ｐ２−ＲＦＰが過剰発現すると、細胞内細菌の殺傷が増加する。（Ｂ）内因性Ｐ２をノックダウンした場合、Ｐ２−ＲＦＰをトランスフェクトすることによりｍＥＦにおける殺傷活性が回復するが、ＲＦＰをトランスフェクトしても回復しない。（Ｃ）Ｐ２のノックダウンおよびＰ２−ＲＦＰによる補完についてのウェスタンブロット。感染の２４時間前に細胞をＰ２  ３’ＵＴＲに特異的なＰ２  ｓｉＲＮＡまたはスクランブルｓｉＲＮＡで内因性Ｐ２  ３’ＵＴＲを欠くＲＦＰまたはＰ２−ＲＦＰと共にトランスフェクトした。１６時間前に細胞を１００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γと共にインキュベートしＰ２−ＲＮＡを誘導した。０時間目に、細胞を３０のＭＯＩで細菌と共に１時間インキュベートし、洗浄して外部の細菌を除去し、ゲンタマイシンで再度プレーティングして細胞外細菌の増殖を防止した。指示した時間に宿主細胞をＮＰ４０で溶解し、溶解物中のＣＦＵを決定した。注目すべきは、Ｐ２  ｓｉＲＮＡによりＰ２をノックダウンすると、細胞内ＣＦＵが増加しＰ２のブロックにより（示されているようにサルモネラを除いた）細菌の複製が可能になり、これにより宿主細胞の死に至ることが示唆されることである。Ｐ２をノックダウンした場合、Ｐ２−ＲＦＰ（Ｐ２のＣ末端にＲＦＰが融合）を用いたトランスフェクションにより細胞内細菌（左の３つのパネル）の殺傷が増加、またはＰ２の活性が回復するが、ＲＦＰではそうはならない。
【００３９】
【図３１】図３１：Ｐ２をノックダウンし、ＲＯＳおよびＮＯのみが存在している場合（赤丸）の細胞内細菌の複製。Ｐ２、ＲＯＳ、およびＮＯが存在する場合（緑丸）、殺傷は良好である。Ｐ２＋ＮＯ（黒三角）またはＰ２＋ＲＯＳ（菱形）の場合の殺傷は中程度である。Ｐ２をノックダウンする効果（右パネル）。細胞：ＩＦＮで処理したチオグリコール酸誘発性の腹腔マクロファージおよびネズミチフス菌。
【００４０】
【図３２】図３２：（ａ）Ｐ２−ＧＦＰ、ＲＡＳＡ２、およびＬＣ３−ＲＦＰは、エンドサイトーシスされた細菌上に共局在する。上部２つのパネル：ＩＦＮで活性化しＤＡＰＩ（ＤＮＡ）およびＲＡＳＡ−２抗体で染色し、Ｐ２−ＧＦＰおよびＬＣ３−ＲＦＰでトランスフェクトしたＢＶ２。その他すべてのパネル：ネズミチフス菌を１００：１で５分間感染させた後、パラホルムアルデヒドで固定したＢＶ２。パネルは蛍光標識で示す。ＤＡＰＩ染色およびＰ２−ＧＦＰによって示す１つの細胞外細菌（矢印）といくつかの殺傷された細胞内細菌（アスタリスク）に注目。ＲＡＳＡ２とＬＣ３−ＲＦＰの共局在。（ｂ）ＩＦＮで活性化したＢＶ２の感染から５分以内におけるＰ２−ＲＦＰの大腸菌−ＧＦＰを含む液胞への移行（フェーズの矢印）。
【００４１】
【図３３】図３３：Ｐ２−ＧＦＰでトランスフェクトし、ＲＡＳＡ２抗体で染色した休止非感染ＲＡＷ細胞の核周囲膜の内側／上側におけるＰ２およびＲＡＳＡ２の共局在。
【００４２】
【図３４】図３４：（ａ）ＩＦＮを用いたｍＥＦの活性化により、Ｐ２  ｍＲＮＡ発現が増加し（左、Ｔａｑｍａｎ  ＰＣＲ）、マイコバクテリアの細胞内殺傷が増強される（右、ゲンタマイシン保護アッセイ）。（ｂ）野生型の生きたサルモネラ菌は、ｍＥＦにおけるＰ２誘導を抑制する。熱殺菌サルモネラ、ＰｈｏＰ変異型サルモネラ、および大腸菌Ｋ１２は、Ｐ２を誘導する。ｍＥＦを感染させ、１時間後に洗浄し、ゲンタマイシンにプレーティングした。
【００４３】
【図３５】図３５：（ａ）ｓｉＲＮＡによるＲＡＳＡ２のノックダウンにより、ＢＶ２によるマイコバクテリアの細胞内殺傷が阻害され、細胞内複製が可能になる（黒棒）。（ｂ）抗ＧＦＰを用いたＰ２−ＧＦＰの免疫沈降およびＰ２−ＧＦＰをトランスフェクトしたＲＡＷ細胞におけるＲＡＳＡ２の破壊。
【００４４】
【図３６】図３６：ｍＥＦは、細胞内のＭＲＳＡを殺傷し真核生物膜上のポリＰ２と同様の細胞壁傷害を生じる。左パネル：感染から４時間後にｍＥＦの界面活性剤を用いた溶解により得られるＭＲＳＡの細胞壁。ギ酸ウラニルによるネガティブ染色。右：ＨＥＫ２９３膜上のポリＰ２複合体。リンタングステン酸Ｎａによるネガティブ染色。スケールバー：４００Å。直径が細胞壁／膜の孔と同程度（９０Å）であることに注目。
【００４５】
【図３７】図３７：Ａｔｇ１４ＬまたはＰ２をｓｉＲＮＡによりノックダウンすると、ＢＶ２ミクログリアにおける細胞内細菌の殺傷がブロックされ複製が可能になる。ゲンタマイシン保護アッセイの決定によるマイコバクテリアの細胞内殺傷または生存。
【００４６】
【図３８】図３８：（ａ）Ｐ２、（ｂ）Ａｔｇ１４Ｌ、（ｃ）Ａｔｇ１６Ｌ、（ｄ）Ａｔｇ５をｓｉＲＮＡによりノックダウンすると、ｍＥＦにおけるサルモネラ菌の複製が可能になる。ｍＥＦでは、サルモネラ菌はその細胞内複製がＰ２により阻害されているが、Ｐ２がノックダウンされると複製する。同様の効果は、オートファジーのノックダウンについても報告されており、これは我々が示すデータと一致している。
【００４７】
【図３９】図３９：３−ＭＡはｖｐｓ３４を阻害し、Ｐ２のノックダウン（ａ〜ｃにおける赤線）と同様にｍＥＦにおけるサルモネラ菌の複製（ｃにおける青線）を可能にする。バフィロマイシン（青、パネルｂ）は、スクランブルｓｉＲＮＡ（青、パネルａ）と同様にサルモネラ菌のＰ２介在性の静菌を阻害しない。
【００４８】
【図４０】図４０：パーフォリン２メカニズムのモデル。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
詳細な説明
定義
本発明を詳細に説明する前に、本明細書における発明を説明するのに使用する用語の意味及び範囲を例示および定義付けするために以下のように定義する：
【００５０】
用語「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」とは、任意の活性を、例えば、増加（ｉｎｃｒｅａｓｅ）、増強（ｅｎｈａｎｃｅ）、アゴナイズ（ａｇｏｎｉｚｅ）（アゴニストとして作用）、促進（ｐｒｏｍｏｔｅ）、上方制御、低下（ｄｅｃｒｅａｓｅ）、減少（ｒｅｄｕｃｅ）、抑制、ブロック、下方制御、またはアンタゴナイズ（ａｎｔａｇｏｎｉｚｅ）（アンタゴニストとして作用）することを意味する。調節は、活性をベースライン値よりも１倍、２倍、３倍、５倍、１０倍、１００倍等より多く「増加」または「上方制御」することがある。調節は、活性をベースライン値より低く「低下」または「下方制御」することもある。本明細書で使用する場合、「低下」または「下方制御」とは、適切な対照と比較して少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％減少させることを意味する。また、調節は、活性をベースライン値に正規化することもある。
【００５１】
本明細書で使用する場合、「医薬的に許容される」成分／担体等は、過度の有害な副作用（例えば、毒性、刺激、もしくはアレルギー反応など）を伴わず、合理的な利益／リスク比を持ってヒトおよび／または動物での使用に適するものである。
【００５２】
本明細書で使用する場合、用語「安全かつ有効な量」とは、本発明の方法で使用した場合に、過度の有害な副作用（例えば、毒性、刺激、もしくはアレルギー反応など）を伴わず、合理的な利益／リスク比を持って、所望の治療的応答を得るのに十分な成分の量を指す。「治療的有効量」とは、所望の治療的応答を得るのに有効な本発明の化合物の量を意味する。
【００５３】
用語「患者」または「個体」は、本明細書において交換可能に使用され、治療すべき哺乳動物対象を意味し、ヒト患者が好ましい。いくつかの場合において、本発明の方法は、実験動物、ならびに獣医学的用途（例えば、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、およびブタ）、疾患動物モデルの開発、例えば、マウス、ラット、およびハムスターを含むげっ歯類や霊長類を含むがそれらに限られない、における使用に見られる。
【００５４】
「治療」とは、発症を予防、あるいは障害の病理または症状を変化させる意図で行われる介入のことである。従って、「治療」は、治療的処置、そして予防または防止的手段の両方を指す。
【００５５】
「標的分子」は、パーフォリン２の発現、機能、または活性に影響または調節する任意の分子を含む。例えば、表１に記載のもの、および現在未同定のものが含まれる。
【００５６】
本発明は、従来の分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、免疫学、細胞生物学、および当該技術分野におけるその他の関連技術を採用できる。例えば、とりわけ以下を参照のこと：Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．３ｒｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（２００５）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．における現在のプロトコル：Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ；Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（２００５）  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．における現在のプロトコル：Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ；Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（２００５）  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．における現在のプロトコル：Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ；Ｃｏｉｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（２００５）  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．における現在のプロトコル：Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ；Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（２００５）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．における現在のプロトコル  ：  Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ；Ｅｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（２００５）  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．における現在のプロトコル：Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ；Ｈａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９９）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ：  Ｏｘｆｏｒｄ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（２０００）  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．４ｔｈ  ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ。上記の現在のプロトコルは、毎年数回更新される。
【００５７】
治療用組成物
実施形態は、パーフォリン２の発現、機能、または活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で調節する化合物の同定に関する。取られたアプローチの１つは、Ｐ２の発現、機能、または活性を調節する分子を同定することであった。これらの分子は、以下の実施例のセクションで詳述する酵母ハイブリッドシステムに基づいて同定した。候補治療剤によるパーフォリン２の発現、機能、または活性の調節は、病原性生物、特に開発され抗生物質に対する耐性が生じやすいと思われるもの、例えば、細菌、による感染の予防または治療に有効であろう。
【００５８】
一実施形態では、パーフォリン２（Ｐ２）の機能、活性、または発現をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで調節する方法であって、Ｐ２の発現、機能、または活性に関連する１つまたは複数の標的分子の機能、活性、または発現を調節する少なくとも１つの薬剤の有効量を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞に接触させるかまたは患者に投与することを含む方法、が提供される。
【００５９】
別の実施形態では、パーフォリン２の発現、機能、または活性を調節する少なくとも１つの薬剤を同定する方法であって、パーフォリン２の発現、機能、または活性に関連する１つまたは複数の標的分子を発現する細胞を、少なくとも１つの薬剤に接触させ；パーフォリン２の発現、機能、または活性に関連する１つまたは複数の標的分子の発現、機能、または活性を測定し；そして、１つまたは複数の標的分子の発現、機能、または活性を対照と比較することを含み、ここで前記１つまたは複数の標的分子の発現、機能、または活性を調節する少なくとも１つの薬剤に接触させることにより、パーフォリン２の発現、機能、または活性を調節する薬剤を同定する方法が提供される。
【００６０】
いくつかの実施形態では、Ｐ２の機能、活性、または発現に関連する１つまたは複数の標的分子は、ｓｒｃ、ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｍ、ＧＡＰＤＨ、Ｐ２１ＲＡＳ／ｇａｐ１ｍ、ガレクチン３、ユビキチンＣ（ＵＣＨＬ１）、プロテアソーム、ｖｐｓ３４、ＡＴＧ５、ＡＴＧ７、ＡＴＧ９Ｌ１、ＡＴＧ１４Ｌ、ＡＴＧ１６Ｌ、ＬＣ３、Ｒａｂ５、それらの断片、またはそれらに関連する分子を含む。標的分子に関連する分子は、これら標的分子が関与する様々な経路に関する任意の細胞内分子、これらの分子に関連する分子、シグナル伝達経路、これら標的分子の転写および翻訳を調節する分子であり得る。
【００６１】
別の実施形態では、少なくとも１つの薬剤は、パーフォリン２の発現、機能、または活性に関連する１つまたは複数の標的分子の発現、機能、または活性を上方制御する。あるいは、少なくとも１つの薬剤は、パーフォリン２の発現、機能、または活性に関連する１つまたは複数の標的分子の発現、機能、または活性を下方制御する。
【００６２】
いくつかの実施形態では、Ｐ２の機能、発現、または活性に関連する１つまたは複数の標的分子の機能、活性、または発現を上方制御する少なくとも１つの薬剤を投与することにより、Ｐ２の発現、機能、または活性を上方制御する。
【００６３】
いくつかの実施形態では、Ｐ２の機能、発現、または活性に関連する１つまたは複数の分子の機能、活性、または発現を下方制御する少なくとも１つの薬剤を投与することにより、Ｐ２の発現、機能、または活性を下方制御する。
【００６４】
場合によっては、いくつかの標的分子を上方制御し、他の標的分子の機能、活性、または発現を阻害または一定に保つことが望ましい場合がある。したがって、いくつかの実施形態では、Ｐ２の機能、発現、または活性に関連する２つの分子の機能、活性、または発現を独立して上方制御または下方制御する少なくとも１つの薬剤を投与することにより、Ｐ２の発現、機能、または活性を上方制御する。
【００６５】
別の実施形態では、Ｐ２の機能、発現、または活性に関連する２つの分子の機能、活性、または発現を独立して上方制御または下方制御する少なくとも１つの薬剤を投与することにより、Ｐ２の発現、機能、または活性を下方制御する。
【００６６】
別の実施形態では、Ｐ２の機能、発現、または活性に関連する２つの分子の機能、活性、または発現を独立して上方制御または下方制御する少なくとも２つの薬剤の組み合わせを投与することにより、Ｐ２の発現、機能、または活性を上方制御する。
【００６７】
いくつかの実施形態では、Ｐ２の機能、発現、または活性に関連する２つの分子の機能、活性、または発現を独立して上方制御または下方制御する少なくとも２つの薬剤の組み合わせを投与することにより、Ｐ２の発現、機能、または活性を下方制御する。
【００６８】
別の実施形態では、Ｐ２の発現、機能、または活性の調節は、Ｐ２分子の発現、機能、または活性を直接調節する薬剤を投与する任意の工程を含む。かかる分子は、Ｐ２の転写または翻訳を阻害するものであり得る。例えば、参照により本明細書にその全体が組み込まれる米国公報第２００９０１４２７６８号を参照のこと。
【００６９】
別の実施形態では、薬剤は、低分子、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、修飾ペプチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、合成分子、天然分子、有機もしくは無機分子、またはそれらの組み合わせを含む。
【００７０】
他の態様では、パーフォリン２の発現、機能、または活性に関連する１つまたは複数の標的分子は、感染性生物に由来する。いくつかの実施形態では、感染性生物は細菌である。特定の実施形態では、細菌は、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．）であり得る。更に別の実施形態では、１つまたは複数の標的分子は、ＰｈｏＰまたはデアミダーゼであり得る。
【００７１】
パーフォリン２の発現、機能、または活性に関連する１つまたは複数の標的分子が感染性生物に由来するような場合、１つまたは複数の標的分子の発現、機能、または活性を下方制御することによりパーフォリン２の発現、機能、または活性を上方制御することがあり得る。あるいは、１つまたは複数の標的分子の発現、機能、または活性を上方制御することによりパーフォリン２の発現、機能、または活性を下方制御することがあり得る。
【００７２】
本発明の別の態様は、パーフォリン２の発現、機能、または活性を最終的に調節する分子の発現、機能、または活性を調節する化合物または候補治療剤をスクリーニングする方法に関する。化合物は、例えば、パーフォリン２タンパク質を発現するように細胞を誘導する、Ｐ２の組み立てを可能にする、正確な組み立てを可能にする、Ｐ２の移動を可能にする、等であってもよい。好ましい候補治療剤は、マクロファージなどの免疫細胞におけるＰ２の発現を増加して、その抗菌効力を増強する。
【００７３】
このように、これらの実施形態は、Ｐ２の発現、機能、または活性を増大、例えば、細胞におけるＰ２  ｍＲＮＡの翻訳を増加させるのに有効な化合物をスクリーニングするための方法に関する。好ましくは、かかる化合物は、Ｐ２に関連する分子を標的とする。かかる方法は、その最も基本的な形態において、特定の標的分子を発現する細胞および内因性または外因性のパーフォリン２遺伝子またはｃＤＮＡを、それぞれ、検査化合物に曝露して、パーフォリン２タンパク質の生成の増加をもたらすか否かを決定することを含む。
【００７４】
一実施形態では、候補治療剤を同定する方法は、ｓｒｃ、ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｍ、ＧＡＰＤＨ、Ｐ２１ＲＡＳ／ｇａｐ１ｍ、ガレクチン３、ユビキチンＣ（ＵＣＨＬ１）、プロテアソーム、またはそれらの断片を含む１つまたは複数の標的分子を発現する細胞を接触させ；当該分子の発現、機能、または活性を測定し；当該分子の発現、機能、または活性を対照と比較する；ことを含む。好ましくは、候補治療剤は、１つまたは複数の標的分子の発現、機能、または活性を調節する。別の実施形態では、候補治療剤は、複数の標的分子の発現、機能、または活性を調節する。好ましくは、候補治療剤は、１つまたは複数の標的分子の発現、機能、または活性を上方制御する。いくつかの態様では、候補治療剤は、１つまたは複数の標的分子の発現、機能、または活性を下方制御する。
【００７５】
好ましい実施形態では、１つまたは複数の標的分子の発現、機能、または活性を調節することにより、パーフォリン２（Ｐ２）の発現、機能、または活性分子を調節する。好ましくは、１つまたは複数の標的分子の発現、機能、または活性を上方制御することによりパーフォリン２（Ｐ２）分子の発現、機能、または活性を上方制御する。いくつかの態様では、１つまたは複数の標的分子の発現、機能、または活性を下方制御することによりパーフォリン２（Ｐ２）分子の発現、機能、または活性を下方制御する。
【００７６】
別の実施形態では、パーフォリン２の発現、機能、または活性を調節する候補薬剤を同定する方法は、アッセイ表面を、ｓｒｃ、ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｍ、ＧＡＰＤＨ、Ｐ２１ＲＡＳ／ｇａｐ１ｍ、ガレクチン３、ユビキチンＣ（ＵＣＨＬ１）、プロテアソーム、ｖｐｓ３４、ＡＴＧ５、ＡＴＧ７、ＡＴＧ９Ｌ１、ＡＴＧ１４Ｌ、ＡＴＧ１６Ｌ、ＬＣ３、Ｒａｂ５、ＰｈｏＰ、デアミダーゼ、それらの断片、またはそれらに関連する分子を含む１つまたは複数の標的分子に接触させ；当該標的分子を、当該１つまたは複数の候補薬剤に接触させて、１つまたは複数の標的分子またはそれらに関連する分子に結合またはハイブリダイズする薬剤を同定し；そして、１つまたは複数の候補薬剤を、パーフォリン２の発現、機能、または活性の調節についてアッセイすることにより、候補薬剤を同定する：ことを含む。
【００７７】
標的分子に対するその効果を測定することによって、ある治療剤を候補と見なしたら、その薬剤をさらに、パーフォリン２分子に対しスクリーニングする。これらは、アッセイ表面上に配置されたペプチドまたはオリゴヌクレオチドによるもの、例えばバイオチップであってもよく、またはＰ２を発現する細胞の形態であってもよい。好適な候補治療剤は、Ｐ２分子の発現、機能、または活性を上方制御、そしてまた細菌などの感染性生物の殺傷性を増加させる。いくつかの態様では、同定した候補治療剤は、Ｐ２分子の発現、機能、または活性を下方制御する。
【００７８】
別の実施形態では、Ｐ２分子の発現、機能、または活性をアッセイするためのアッセイは、細胞アッセイ、免疫アッセイ、酵母ハイブリッドシステムアッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイ、核酸ベースのアッセイ、ハイスループットスクリーニングアッセイ、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、同定した候補薬剤を、感染性生物、例えば、細菌の複製の阻害、増殖の阻害、または死滅についてアッセイする。
【００７９】
細胞を使用する方法では、対照細胞、標的分子を発現する１つまたは複数のベクターを含む検査細胞、標的分子が内因性である細胞、パーフォリン２発現ベクターを有する細胞、またはそれらの任意の組み合わせを設ける。この方法では、検査細胞を、検査化合物と接触させるが、一方、対照細胞は接触させない。技術者は、その後、可能性のある治療剤または候補治療剤を同定するための出力読み出しパラメータ（ｏｕｔｐｕｔ  ｒｅａｄｏｕｔ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ）として標的分子の発現を利用する場合、検査細胞が検査化合物の非存在下で増殖させた対照細胞よりも多くのレポータータンパク質を産生すれば、治療剤としての可能性がある検査化合物として同定できる。そのような検査化合物は、微生物および腫瘍細胞に対する闘いにおいて身体自体の免疫系を増強するのに有効な抗生物質あるいは抗癌化合物であると推定される。また、検査は、その後細胞を共培養において細菌等の微生物を殺傷すせる能力について検査することにより、さらに機能レベルで決定することを含み得る。
【００８０】
感染性細菌の例としては、これらに限定されないが：大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、腸内病原性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅ．ｃｏｉｌ、ＥＰＥＣ）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、ＭＲＳＡ）、マイコバクテリウム・アビウム・イントラセルラーエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ａｖｉｕｍ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ヘリコバクター・ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、ライム病ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ、ＢＣＧ）、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、モラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔｈａｒｒａｌｉｓ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌ、Ｅ．ｃｏｌｉ）、および梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）；次のような感染性真菌類：クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ヒストプラズマカプ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、コクシジオイデス虫（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）、ブラストミセス・デルマティティディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）；および次のような感染性原生生物：熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、クルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）、ドノバンリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｖａｎｉ）およびトキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）；ならびに、例えば、ヒストプラズマ症、カンジダ症、クリプトコッカス症、ブラストミセス症、およびコクシジオイデス症を引き起こすような感染性真菌類；ならびに、カンジダ属（すなわち、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｃ．パラプシローシス（Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、Ｃ．クルセイ（Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ）、Ｃ．グラブラータ（Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、またはＣ．ルシタニエ（Ｃ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ））；トルロピシス属（すなわち、Ｔ．グラブラータ（Ｔ．ｇｌａｂｒａｔａ））；アスペルギルス属（すなわち、Ａ．フミガルス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｌｕｓ））、ヒストプラズマ属（すなわち、Ｈ．カプスラーツム（Ｈ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ））；クリプトコッカス属（すなわち、Ｃ．ネオフォルマンス（Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ））；ブラストミセス属（すなわち、Ｂ．デルマティティジス（Ｂ．ｄｅｒｍａｔｉｌｉｄｉｓ））；フザリウム属；トリコフィトン属、シュ−ドアレシェリア・ボイディイ（Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ  ｂｏｙｄｉｉ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｓ）、およびスポロトリクックス・シエンキ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｅｋｉｉ）が挙げられる。
【００８１】
スクリーニングアッセイ
パーフォリン２（Ｐ２）の発現、機能、または活性について薬剤をスクリーニングするためのアッセイは、Ｐ２の抗菌効果を増加または低下させる分子の同定に基づく。このように、相互作用してＰ２の抗菌活性に影響を与える分子に影響を与える任意の分子が、治療用の候補薬剤となる。
【００８２】
一実施形態では、スクリーニングは、標的分子を発現する各細胞培養物を、メンバー化合物の多様なライブラリーに接触させることを含む。化合物または「候補治療剤」または「薬剤」は、任意の有機、無機、低分子、タンパク質、抗体、アプタマー、核酸分子、または合成化合物であり得る。
【００８３】
候補薬剤は多数の化学クラスを含むが、典型的には、低分子有機化合物を含む有機化合物、オリゴヌクレオチドを含む核酸、およびペプチドである。低分子有機化合物は、好適には、例えば約４０または５０より大きく約２，５００より小さい分子量を有しうる。候補薬剤は、タンパク質および／またはＤＮＡと相互作用する化学官能基を含んでもよい。
【００８４】
候補薬剤は、合成または天然化合物のライブラリーを含む多種多様なリソースから得ることができる。例えば、多数の手段が、ランダム化オリゴヌクレオチドの発現を含む多種多様な有機化合物および生体分子のランダムなそして指向的な合成に利用できる。あるいは、例えば、細菌、真菌、および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが利用可能、または容易に作成される。
【００８５】
化学的ライブラリー：コンビナトリアル化学の発展が数百〜数千の個々の化合物の迅速かつ経済的な合成を可能にしている。これらの化合物は、典型的に、効率的なスクリーニングのために設計された低分子の中規模ライブラリーに配置される。コンビナトリアル法を用いて、新規化合物の同定に適する無作為ライブラリーを作成することができる。加えて、前もって決定した生物学的活性を有する単一の親化合物に由来する小さく多様性の低いライブラリーを作成することもできる。いずれの場合も、重要な酵素の阻害剤など、コンビナトリアル化学により生成され、治療に関連する生物学的分子を特異的に標的とする効率的なスクリーニングシステムが欠如すると、これらのリソースを最適に使用する妨げとなる。
【００８６】
コンビナトリアル化学的ライブラリーとは、試薬などの化学的「ビルディングブロック」の数を組み合わせることによって、化学的合成または生物学的合成のいずれかによって生成された多様な化学化合物のコレクションのことである。例えば、ポリペプチドライブラリなどの線形コンビナトリアル化学的ライブラリーは、化学的ビルディングブロックのセット（アミノ酸）を、所定の化合物長（すなわち、ポリペプチド化合物におけるアミノ酸の数）について、多数の組み合わせかつあらゆる可能な方法で組み合わせることによって形成される。何百万もの化学化合物が、このような化学的ビルディングブロックのコンビナトリアル混合によって合成できる。
【００８７】
「ライブラリー」は２〜５０，０００，０００個の多様なメンバー化合物を含み得る。好ましくは、ライブラリーは、少なくとも４８個の多様な化合物、好ましくは９６個以上の多様な化合物、より好ましくは３８４個以上の多様な化合物、より好ましくは、１０，０００個以上の多様な化合物、好ましくは１００，０００個より多くの多様なメンバー、そして最も好ましくは、１，０００，０００個より多くの多様なメンバー化合物を含む。「多様な（ｄｉｖｅｒｓｅ）」とは、ライブラリー中の化合物の５０％超が、ライブラリーの他のメンバーと同一ではない化学構造を有することを意味する。好ましくは、ライブラリー中の化合物の７５％超、より好ましくは９０％超、そして最も好ましくは約９９％超が、コレクションの他のメンバーと同一ではない化学構造を有する。
【００８８】
コンビナトリアル化学的ライブラリーの調製は当業者に公知である。レビューについては、以下を参照のこと：Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ  ９６：５５５−６００，１９９６；Ｋｅｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｗｉｔｈ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｓｈａｐｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  １９：５７−６４，１９９４；Ｊａｎｄａ，Ｔａｇｇｅｄ  ｖｅｒｓｕｓ  ｕｎｔａｇｇｅｄ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９１：１０７７９−８５，１９９４；Ｌｅｂｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｅ−ｂｅａｄ−ｏｎｅ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ３７：１７７−９８，１９９５；Ｅｉｃｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅ，ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ，ａｎｄ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，Ｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ．１５：４８１−９６，１９９５；Ｃｈａｂａｌａ，Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｎｏｖｅｌ  ｔａｇｇｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｌｅａｄｓ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：６３２−９，１９９５；Ｄｏｌｌｅ，Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍｏｌ  Ｄｉｖｅｒｓ．２：２２３−３６，１９９７；Ｆａｕｃｈｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｎｏｎｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｅａｄ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｕｓｉｎｇ  ｒｏｂｏｔｉｃａｌｌｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，Ｃａｎ  Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７５：６８３−９，１９９７；Ｅｉｃｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  Ｔｏｄａｙ  １：  １７４−８０，１９９５；およびＫａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，Ｃｏｍｂ  Ｃｈｅｍ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ  ４：５３５−４３，２００１。
【００８９】
化学的に多様なライブラリーを作成するために他の化学物質を用いることもできる。そのような化学物質としては、これらに限定されないが、ペプチド（例えば、ＰＣＴ国際公報第ＷＯ９１／１９７３５号）、コードされたペプチド（例えば、ＰＣＴ国際公報第ＷＯ９３／２０２４２号）、ランダム生体オリゴマー（例えば、ＰＣＴ国際公報第ＷＯ９２／０００９１号）、ベンゾジアゼピン（例えば、米国特許第５，２８８，５１４号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドのようなダイバーソーマー（Ｈｏｂｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６９０９−６９１３（１９９３））；ビニル性ポリペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：６５６８（１９９２））；β−Ｄ−グルコーススカフォールディングを有する非ペプチド性ペプチドミメティックス（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：９２１７−９２１８（１９９２））；小化合物ライブラリーの類似有機合成物（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２６６１（１９９４））；オリゴカルバメート（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３（１９９３））；および／またはペプチジルホスホネート（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：６５８（１９９４））；核酸ライブラリー（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ参照）；ペプチド核酸ライブラリー（例えば、米国特許第５，５３９，０８３号参照）；抗体ライブラリー（例えば、Ｖａｕｇｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４（３）：３０９−３１４（１９９６）およびＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７参照）；炭水化物ライブラリー（例えば、Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：１５２０−１５２２（１９９６）および米国特許第５，５９３，８５３号参照）；小有機分子ライブラリー（例えば、ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ，Ｂａｕｍ  Ｃ＆Ｅ  Ｎｅｗｓ，Ｊａｎｕａｒｙ  １８，ｐａｇｅ  ３３（１９９３）参照）；イソプレノイド（米国特許第５，５６９，５８８号）；チアゾリジノンおよびメタチアザノン（米国特許第  ５，５４９，９７４号；ピロリジン（米国特許第５，５２５，７３５号および同第５，５１９，１３４号）；モルホリノ化合物（米国特許第５，５０６，３３７号）；ならびにベンゾジアゼピン（米国特許第第５，２８８，５１４号）；などが挙げられる。
【００９０】
コンビナトリアルライブラリーを調製する装置は、市販されている（例えば、３５７  ＭＰＳ，３９０  ＭＰＳ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ  Ｋｙ．，Ｓｙｍｐｈｏｎｙ，Ｒａｉｎｉｎ，Ｗｏｂｕｒｎ，Ｍａｓｓ．，４３３Ａ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．，９０５０  Ｐｌｕｓ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．参照）。さらに、多数のコンビナトリアルライブラリー自体も市販されている（例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．，Ａｓｉｎｅｘ，Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕ，Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．，ＣｈｅｍＳｔａｒ，Ｌｔｄ．，Ｍｏｓｃｏｗ，ＲＵ，３Ｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｅｘｔｏｎ，Ｐａ．，Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｍｄ．参照）。
【００９１】
低分子：低分子検査化合物は、最初から有機または無機の化学的ライブラリーのメンバーであり得る。本明細書で使用する場合、「低分子」は、約３，０００ダルトン未満の分子量の小さい有機または無機分子を指す。低分子は、天然物またはコンビナトリアル化学的ライブラリーのメンバーであり得る。多様な分子のセットを用いて、電荷、芳香族性、水素結合、柔軟性、サイズ、側鎖の長さ、疎水性、および剛性といった様々な機能をカバーすべきである。低分子を合成するのに適したコンビナトリアル技術は当該分野で公知であり、例えば、Ｏｂｒｅｃｈｔ  ａｎｄ  Ｖｉｌｌａｌｇｏｒｄｏ，Ｓｏｌｉｄ−Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｍａｌｌ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−Ｗｅｉｇｈｔ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ−Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９９８）に例示されるものが挙げられ、そして「スプリットおよびプール」または「平行」合成技術、固相および溶液相技術、および符号化技術といったものも挙げられる（例えば、Ｃｚａｒｎｉｋ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏ．，１：６０（１９９７）参照）。加えて、数多くの低分子ライブラリーが市販されている。
【００９２】
好ましい実施形態では、ハイスループットスクリーニングとして、１つまたは複数の標的分子および／またはＰ２を発現する誘導性または非誘導性のプロモーターを有するベクターを含む細胞に対し化合物をアッセイする。使用する細胞は、内因的に標的分子および／またはＰ２を発現する細胞であってもよい。レポーター分子は、同じ分子であっても異なる分子であってもよいが、好ましくは異なる分子である。
【００９３】
別の態様では、本発明は、細胞を分析するための方法であって：１つまたは複数の蛍光またはルシフェラーゼレポーター分子を含む複数の細胞を含む位置のアレイを設け；細胞を含むそれぞれの位置において複数の細胞をスキャンして、細胞内のレポーター分子からの信号を取得し；信号をデジタルデータに変換し；そして、デジタルデータを利用して、細胞内のレポーター分子の分布、環境、または活性を決定する；ことを含む、方法を提供する。
【００９４】
新規創薬パラダイムの主な要素は、細胞内イオン、代謝物、巨大分子、およびオルガネラの時間的および空間的な分布、含有量、および活性を測定するために使用され、継続的に成長している蛍光および発光試薬のファミリーである。これらの試薬のクラスには、固定された生細胞における分子の分布および量を測定する標識試薬、時間および空間内におけるシグナル伝達事象を報告する環境指標、ならびに生細胞内の標的分子活性を測定する蛍光タンパク質バイオセンサーが含まれる。単一の細胞において複数の試薬を組み合わせたマルチパラメータアプローチは、創薬のための強力で新しいツールである。
【００９５】
この方法は、特定の細胞成分に対する蛍光または発光分子の親和性の高さに依存する。特定の成分に対する親和性は、イオン的相互作用、（タンパク質ベースの発色団、フルオロフォア、およびび発光団とのキメラ融合を含む）共有結合、ならびに疎水性相互作用、電位、そして場合によっては、単純に細胞成分内で捕捉するといった物理的な力によって支配される。発光プローブは、低分子、標識された巨大分子、または緑色蛍光タンパク質キメラを含むがこれらに限定されない遺伝子操作タンパク質であり得る。
【００９６】
当業者は、タンパク質、リン脂質、ＲＮＡおよびＤＮＡハイブリダイズプローブなどの蛍光標識された生体分子を含むがこれらに限定されない、本発明において使用できる多様な蛍光レポーター分子を認識するであろう。同様に、結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）または会合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）について特定の化学的性質を持って特異的に合成された蛍光試薬が、蛍光レポーター分子として使用されている（Ｂａｒａｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２７４９７−２７５００；Ｓｏｕｔｈｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０），Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  １１：４１８−４３０；Ｔｓｉｅｎ（１９８９）  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２９  Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ（ｅｄｓ．），ｐｐ．１２７−１５６）。蛍光標識された抗体は、細胞または組織など複雑な分子の混合物中で単一の分子標的への結合について高度に特異的なので、特に有用なレポーター分子である。
【００９７】
発光プローブは、生細胞内で合成することができるか、あるいは拡散、促進されたまたは能動的な輸送、シグナル配列を介した輸送、およびエンドサイトーシスまたはピノサイトーシス取り込みを含む、いくつかの非物理的な様式を介して細胞内に輸送できる。当該技術分野で周知の物理的バルクロード方法を使用して、発光プローブを生細胞内にロードすることもできる（Ｂａｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０７：１７−２０；Ｂｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ２４：２２６−２３３；ＭｃＮｅｉｌ（１９８９）  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２９，Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ（ｅｄｓ．），ｐｐ．１５３−１７３）。これらの方法には、エレクトロポレーション、そしてスクレープローディング、ビーズローディング、衝撃ローディング、シリンジローディング、高張および低張ローディングなど他の機械的方法が含まれる。加えて、以前から記述されているように、細胞を遺伝子操作して、目的のタンパク質に結合したＧＦＰなどのレポーター分子を発現させることができる（Ｃｈａｌｆｉｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｓｈｅｒ  Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，４９１，０８４；Ｃｕｂｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０：４４８−４５５）。
【００９８】
一旦細胞内に入ると、発光プローブが、標的ドメインとの特異的かつ高親和性の相互作用またはシグナル配列を介した輸送など他の様式での分子標的の結果として、標的ドメインに蓄積する。蛍光標識されたレポーター分子は、レポーターの位置、量、および化学的環境を決定するのに有用である。例えば、レポーターが、親油性の膜環境にあるか、またはより水性の環境にあるかを判定することができる（Ｇｉｕｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２４：４０５−４３４；Ｇｉｕｌｉａｎｏ  ａｎｄ  Ｔａｙｌｏｒ（１９９５），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２７．１−１６）。レポーターのｐＨ環境を決定できる（Ｂｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０４：１０１９−１０３３；Ｇｉｕｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７），Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６７：３６２−３７１）。例えば、キレート基を有するレポーターがＣ  ａ++などのイオンに結合しているか否かを判定できる（Ｂｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），Ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３０，Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ（ｅｄｓ．），ｐｐ．１５７−１９２；Ｓｈｉｍｏｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８），Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｔｏｋｙｏ）  ２５１：４０５−４１０；Ｔｓｉｅｎ（１９８９）  Ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３０，Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ（ｅｄｓ．），ｐｐ．１２７−１５６）。
【００９９】
さらに、生物内の特定の種類の細胞は、特異的に標識可能で、かつ他の種類の細胞には生じない成分を含んでいてもよい。したがって、レポーター分子は、特定の細胞内における特定の成分のみならず、細胞の種類が混合している集団内において特定の細胞を標識するように設計できる。
【０１００】
当業者は、蛍光を測定するための様々な方法を認識するであろう。例えば、いくつかの蛍光リポーター分子は、励起または発光スペクトルの変化を示し、いくつかは、一つの蛍光レポーターが蛍光を失う一方第２のレポーターが蛍光を得る共鳴エネルギー移動を示し、いくつかは、蛍光の消失（消光）または出現を示し、いくつかは回転運動を示す（Ｇｉｕｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２４：４０５−４３４；Ｇｉｕｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２７：１−１６）。
【０１０１】
全体の手順は完全に自動化することができる。例えば、試料物質のサンプリングは、試料容器から試料を吸引し、吸引した試料の少なくとも一部を検査細胞培養物（例えば、遺伝子発現が調節されている細胞培養物）に送達することを含む複数の工程で達成できる。サンプリングは、追加の工程、特に好ましくは、試料調製工程を含んでもよい。１つのアプローチでは、一度に１つの試料のみを自動サンプラープローブ内に吸引し、一度に１つの試料のみがプローブ内に存在する。別の実施形態では、複数の試料を、溶媒によって分離した自動サンプラープローブ内に吸引してもよい。さらに他の実施形態では、複数のプローブを並行して自動サンプリングに用いてもよい。
【０１０２】
一般的な場合、サンプリングは、手動、半自動、又は自動で実施できる。試料は、例えば、ピペットまたは注射器型の手動プローブを用いて、手動により試料容器から吸引し、その後手動で評価システムの充填口または注入口に送達できる。半自動プロトコルでは、プロトコルのいくつかの様式（例えば、送達）は自動で実施できるが、他のいくつかの様式は、手動による介入が必要である（例えば、プロセス制御ライン前の試料の吸引）。しかし、好ましくは、試料を、完全に自動化された方法、例えば、自動サンプラーを用いて、試料容器から吸引し、評価システムに送達する。
【０１０３】
本発明によれば、１つまたは複数のシステム、方法、またはその両方を使用して、複数の試料材料を同定する。手動または半自動化システムおよび方法が可能であるが、好ましくは自動化されたシステムまたは方法を補充する。所定のプロトコルに従って、固体、流体、液体、または気体の形で物質を取り扱い、接触させ、分注し、または他の方法で操作するための所定の動作を自動またはプログラム可能な方法で設ける様々なロボットまたは自動システムが利用可能である。このようなシステムは、材料の機械的特性を決定するシステムを支援するために、ハードウェア、ソフトウェア、または両方を含めるように適合させるかまたは拡張してもよい。ロボットシステムを拡張するためのハードウェアおよびソフトウェアとしては、センサ、トランスデューサ、データ取得、操作ハードウェア、データ取得、および操作ソフトウェア等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。代表的なロボットシステムは、ＣＡＶＲＯ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓから市販されている（例えば、Ｍｏｄｅｌ  ＮＯ．ＲＳＰ９６５２）またはＢｉｏＤｏｔ（Ｍｉｃｒｏｄｒｏｐ  Ｍｏｄｅｌ  ３０００）。
【０１０４】
一般に、自動化システムとしては、合成、組成、位置情報等の情報、または基質に対して位置させる物質のライブラリーに関連する他の情報を用いプログラム可能で適切なプロトコル設計および実行ソフトウェアが挙げられる。プロトコル設計および実行ソフトウェアは、通常、ロボットまたは他の自動化された装置もしくはシステムを制御するロボット制御ソフトウェアと通信している。また、プロトコル設計および実行ソフトウェアは、応答を測定するハードウェアからデータを収集するデータ収集ハードウェア／ソフトウェアとも通信している。データをデータベースに収集したら、解析ソフトウェアを使用してデータを分析、より具体的には、候補薬剤の特性を決定してもよいし、またはデータを手動で分析してもよい。
【０１０５】
医薬組成物
パーフォリン２の発現、機能、または活性を調節するか、あるいは、パーフォリン２の発現、機能、または活性に関連する１つまたは複数の標的分子の発現、機能、または活性を調節する薬剤の治療的有効量を投与することを含む、感染性疾患生物による感染に罹患している患者を治療する方法をさらに提供する。
【０１０６】
好ましい実施形態では、感染性疾患生物に罹患している患者を治療する方法は、ｓｒｃ、ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｍ（Ｕｂｃ１２）、ＧＡＰＤＨ、Ｐ２１ＲＡＳ／ｇａｐ１ｍ（ＲＡＳＡ２）、ガレクチン３、ユビキチンＣ（ＵＣＨＬ１）、プロテアソーム、ｖｐｓ３４、ＡＴＧ５、ＡＴＧ７、ＡＴＧ９Ｌ１、ＡＴＧ１４Ｌ、ＡＴＧ１６Ｌ、ＬＣ３、Ｒａｂ５、パーフォリン２、それらの断片、またはそれらに関連する分子を含む１つまたは複数の標的分子の発現、機能、または活性を調節する薬剤の治療的有効量を患者に投与することを含む。
【０１０７】
ｓｒｃ、ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｍ（Ｕｂｃ１２）、ＧＡＰＤＨ、Ｐ２１ＲＡＳ／ｇａｐ１ｍ（ＲＡＳＡ２）、ガレクチン３、ユビキチンＣ（ＵＣＨＬ１）、プロテアソーム、ｖｐｓ３４、ＡＴＧ５、ＡＴＧ７、ＡＴＧ９Ｌ１、ＡＴＧ１４Ｌ、ＡＴＧ１６Ｌ、ＬＣ３、Ｒａｂ５、パーフォリン２またはそれらに関連する任意の分子の活性多様体（ｖａｒｉａｎｔｓ）および断片は、本明細書で提供される方法で使用できる。かかる活性多様体は、本明細書で示す様々な標的分子のいずれかに対し、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を含み得て、ここで当該活性多様体は、生物学的活性を保持しており、従ってパーフォリン２の発現、機能、または活性を調節する。
【０１０８】
別の好ましい実施形態では、化合物は、本明細書で具現された方法により同定される治療剤を含む。
【０１０９】
本発明はまた、１つまたは複数の治療剤を含有する医薬組成物を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、内服に適しており、本発明の薬理学的に活性な薬剤の有効量を、単独であるいは１つまたは複数の医薬的に許容される担体と組み合わせて含む。薬剤は、毒性を有していたとしても非常に低いという点で特に有用である。病理を有する患者は、例えば、本発明の方法で治療する患者、哺乳動物、より具体的には、ヒトであり得る。実施において、薬剤は、所望の生物学的活性を発揮するのに十分であろう量で投与される。
【０１１０】
本発明の医薬組成物は、例えば、互いに独立して異なる標的分子に作用し得る複数の薬剤を含んでもよい。いくつかの例では、本発明の１つまたは複数の化合物を含む本発明の医薬組成物は、例えば、抗炎症剤、免疫賦活剤、化学療法剤、抗菌剤等の他の有用な組成物と組み合わせて投与される。さらに、本発明の組成物は、細胞毒性剤、細胞増殖抑制性剤、又は化学療法剤、例えば、上述のようなアルキル化剤、代謝拮抗剤、有糸分裂阻害剤、または細胞傷害性の抗生物質等とを組み合わせて投与してもよい。一般に、このような組み合わせで使用するためには、現在利用可能な既知の治療剤の剤形が適切であろう。
【０１１１】
併用療法（Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）（または「同時療法（ｃｏ−ｔｈｅｒａｐｙ）」）は、治療用組成物および少なくとも第二の薬剤を、これらの治療剤の共同作用により有益な効果をもたらすための特定の治療計画の一部として投与することを含む。組合せの有益な効果としては、治療剤の組合せから生じる薬物動態学的または薬力学的共同作用が挙げられるがそれらに限定されない。併用療法におけるこれらの治療剤の投与は、典型的には、規定された期間（選択された組合せに応じ、通常は数分、数時間、数日、または数週間）にわたり行われる。
【０１１２】
併用療法は、一般的ではないものの、２つ以上のこれらの治療剤を別々の単独治療計画の一部として投与した結果、本発明の組合せが偶発的かつ場合により生じることをも包含する意図である場合もある。併用療法は、これらの治療剤または少なくとも２つの治療剤を、実質的に同時に投与することに加え、順次、すなわち、各治療剤を異なる時間に投与することも包含する意図である。実質的に同時に投与することは、例えば、対象に、各治療剤を一定の比率で有する１つのカプセル、または各治療剤を有するそれぞれのカプセルをいくつか投与することによって達成できる。各治療剤を順次または実質的に同時に投与することは、局所経路、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、および粘膜組織を介する直接吸収を含むがこれらに限定されない任意の適切な経路によって行うことができる。治療剤は、同じ経路または異なる経路によって投与できる。例えば、選択した組み合わせの第一治療剤を注射により投与し、その組み合せの他の治療剤を局所投与してもよい。
【０１１３】
薬剤は、医薬的に有用な組成物を調製するための公知の方法に従って製剤化することができ、これにより当該化合物を、医薬的に許容される担体ビヒクルと混合して組み合わせる。治療用製剤は、所望の純度を有する有効成分を、任意の生理学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）と、混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で貯蔵用に調製される。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる用量及び濃度ではレシピエントに対し非毒性であり、例えば、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；および／またはＴＷＥＥＮ(商標)（ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，Ｎ．Ｊ．）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ(商標)（ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｏｕｎｔ  Ｏｌｉｖｅ，Ｎ．Ｊ．）、またはＰＥＧなどの非イオン性界面活性剤；が挙げられる。
【０１１４】
生体内投与に使用される製剤は、滅菌済みでかつ発熱物質非含有でなくてはならない。これは、凍結乾燥および再構成の前または後に滅菌濾過膜を通し濾過することによって容易に達成される。
【０１１５】
投与経路は、例えば静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、または病巣内経路、局所投与による注射または注入、あるいは持続放出系など公知の方法に従う。
【０１１６】
本発明の医薬組成物の投薬量および所望の薬剤濃度は、意図する特定の用途に応じて変更できる。適切な用量又は投与経路の決定は、通常の医師の技術の範囲内である。動物実験により、ヒト治療に有効な用量の決定について信頼できる指標を設ける。効果的な用量の種間スケーリングは、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ，Ｊ．ａｎｄ  Ｃｈａｐｐｅｌｌ，Ｗ．“Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ  ｓｃａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ”  Ｉｎ  Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｙａｃｏｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８９，ｐｐ．４２−９が定める原則に従って行うことができる。
【０１１７】
本発明の経口投与用の製剤は、所定量の活性薬剤をそれぞれ含有するカプセル、カシェ剤、または錠剤などの個別単位として；粉末または顆粒として；水性液体もしくは非水性液体を用いる活性薬剤の溶液または懸濁液として；水中油型液体エマルジョンまたは油中水型液体エマルジョンとして；あるいはボーラスなどとして提供してもよい。
【０１１８】
経口投与用の組成物（例えば錠剤およびカプセル）について、用語「許容される担体」には、例えば、結合剤、例えば、シロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、ポリビニルピロリドン（ポビドン）、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロース、およびデンプン；充填剤および担体、例えば、トウモロコシデンプン、ゼラチン、ラクトース、スクロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸二カルシウム、塩化ナトリウム、およびアルギン酸：ならびに滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、および他の金属ステアリン酸塩、ステアリン酸グリセロール、ステアリン酸、シリコーン液、タルク、ワックス、油、およびコロイド状シリカ；等の一般的な賦形剤等のビヒクルが含まれる。ペパーミント、ウィンターグリーン油、チェリーフレーバーなどの香料を使用することもできる。剤形を容易に認識できるように色剤を加えることが望ましいことがある。錠剤はまた、当該分野で周知の方法によってコーティングしてもよい。
【０１１９】
錠剤は、場合により１つまたは複数の補助成分と共に、圧縮または成形によって作製してもよい。圧縮錠剤は、場合により結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、防腐剤、界面活性剤または分散剤と混合して、粉末または顆粒などの自由流動形態で適切な機械を用いて活性薬剤を圧縮することによって調製することができる。成形錠剤は、適切な機械を用いて、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化合物の混合物を成形することによって作製してもよい。錠剤は、場合により、コーティングまたは刻み目をつけてもよいし、活性薬剤の徐放または制御放出をもたらすように製剤化してもよい。
【０１２０】
経口投与に適した他の製剤には、香味基剤、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガカント、の中に活性剤を含むロゼンジ（ｌｏｚｅｎｇｅｓ）；ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアなどの不活性基剤中に活性薬剤を含むトローチ（ｐａｓｔｉｌｌｅｓ）；ならびに、適切な液体担体中に活性薬剤を含むマウスウォッシュ；が挙げられる。
【０１２１】
非経口製剤は、一般的に滅菌されているだろう。
【０１２２】
制御または持続性放出組成物には、親油性デポー（例えば、脂肪酸、ワックス、オイル）の製剤が挙げられる。また、ポリマーでコーティングされた粒子状組成物（例えば、ポロキサマーまたはポロキサミン）、および組織特異的受容体、リガンド、または抗原に対する抗体に結合した化合物、あるいは組織特異的受容体のリガンドに結合した化合物も本明細書に包含される。本明細書に示す組成物の他の実施形態には、非経口、経肺、鼻経、および経口を含む種々の投与経路用としての、粒子状形態、保護コーティング、プロテアーゼ、阻害剤または浸透促進剤が含まれる。
【０１２３】
投与する場合、化合物は、しばしば、迅速に粘膜表面または循環系から除去されることにより薬理学的活性が比較的短命になることがある。したがって、治療効果を維持するために、比較的大量の生物学的に有効な化合物を高頻度で投与することが必要な場合がある。ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンまたはポリプロリン等の水溶性ポリマーの共有結合により修飾された化合物は、静脈内注射後の血液中半減期が、対応する非修飾化合物よりも実質的に長いことが知られている。また、このような修飾により、水溶液中の化合物の溶解度を増加させ、凝集を排除し、化合物の物理的および化学的安定性を高め、そして化合物の免疫原性及び反応性を大幅に減少させることができる。その結果、所望のｉｎ  ｖｉｖｏの生物学的活性が、かかるポリマーと化合物の結合体の投与により、修飾されていない化合物よりも低頻度または低用量で達成され得る。
【０１２４】
十分な量として、約１μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、または約５００ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇが挙げられるがこれらに限定されない。量は、１０ｍｇ／ｋｇであってもよい。組成物の医薬的に許容される形態には、医薬的に許容される担体が含まれる。
【０１２５】
有効成分を含有する治療用組成物の調製は、当該技術分野においてよく理解されている。典型的には、このような組成物が、液体溶液または懸濁液のいずれかで、鼻咽頭に送達されるポリペプチドのエアロゾルまたは注射剤として調製されるが、注射前に液体に溶かして溶液または懸濁液にするのに適した固体形態で調製してもよい。調製物は乳化してもよい。有効治療成分は、しばしば、医薬的に許容されかつ有効成分に適合する賦形剤と混合される。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせである。また、必要に応じて、組成物は、湿潤剤または乳化剤、有効成分の有効性を増強するｐＨ緩衝剤などの少量の補助物質を含んでもよい。
【０１２６】
有効成分は、中和され医薬的に許容される塩の形態として治療用組成物に製剤化できる。医薬的に許容される塩としては、例えば、塩酸またはリン酸等の無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等の有機酸で形成される酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基と形成される）が挙げられる。また、遊離カルボキシル基から形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導され得る。
【０１２７】
本明細書に示す治療用組成物の１つまたは複数の成分は、非経口、経粘膜、例えば、経口、経鼻、経肺、または経直腸、あるいは経皮的に導入してもよい。好ましくは、投与は、例えば、静脈内注射、そしてこれらに限定されないが細動脈内、筋肉内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、および頭蓋内投与を含む非経口である。本明細書で提供する治療用組成物に関して使用される用語「単位用量」は、ヒトの単位用量として適する物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な希釈剤、すなわち、担体またはビヒクルと関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性物質を含む。
【０１２８】
別の実施形態では、有効化合物は、小胞、特にリポソームに送達される（一般例として、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３；Ｔｒｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３−３６５（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，ｉｂｉｄ．，ｐｐ．３１７−３２７の記載を参照）。
【０１２９】
さらに別の実施形態では、治療用化合物は、制御放出系で送達できる。例えば、タンパク質は、静脈内注入、移植可能な浸透圧ポンプ、経皮パッチ、リポソーム、または他の投与様式を用いて投与することができる。一実施形態では、ポンプを用いてもよい（Ｌａｎｇｅｒ，ｓｕｐｒａ；Ｓｅｆｔｏｎ（１９８７）  ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１；Ｂｕｃｈｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７；Ｓａｕｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４参照）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用できる（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｐｐａｓ（１９８３）  Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１；Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１；Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５参照）。さらに別の実施形態では、制御放出系は、治療の標的、すなわち、脳または腫瘍、つまり全身用量の一部のみを必要とする箇所、の近傍に配置することができる（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，ｓｕｐｒａ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）参照）。他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３によるレビューに記載されている。
【０１３０】
上記のように有効成分を投与することにより感染性疾患生物の感染に対する治療計画が有効な対象は、好ましくはヒトであるが、任意の動物であり得る。よって、当業者によって容易に理解できるように、本明細書が提供する方法および医薬組成物は、特に哺乳動物、ネコ科またはイヌ科動物などのペット、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、およびブタなどの家畜、（野生または動物園にいるかを問わず）野生動物、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ等などを含む研究動物、すなわち、獣医学的用途の動物、などを含むががこれらに限定されない任意の動物への投与に適している。
【０１３１】
本明細書で提供する治療方法および組成物では、有効成分を治療上有効な用量で設ける。当該技術分野でよく知られているように、治療上有効な用量は、患者の特徴（年齢、体重、性別、状態、合併症、他の疾患など）に基づいて、通常の知識を有する医療従事者が決定できる。また、更なる研究が日々行われているので、様々な患者における様々な状態の治療に適切な用量レベルに関するより具体的な情報が出てくるであろうし、当業者は、対象の治療状況、年齢、および一般的な健康状態を考慮して、適切な用量を確認できるであろう。一般に、静脈内注射または注入についての用量は、腹腔内、筋肉内、または他の投与経路の場合よりも低くてもよい。投与スケジュールは、循環半減期および使用される製剤に依存して変化し得る。組成物は、投与製剤に適合する様式で治療的有効量が投与される。投与に必要とされる有効成分の正確な量は、医師の判断に依存し、各個体に特有である。しかし、適切な用量は、１日当たり個体の体重キログラム当たり有効成分が約０．１〜２０ミリグラム、好ましくは約０．５〜約１０ミリグラム、より好ましくは１〜数ミリグラムの範囲であり、投与経路に依存する。初回投与およびブースター注射についての適切な治療計画も変化し得るが、代表的には、初回投与をしてから１時間以上の間隔で反復投与し、その後に注射またはその他の投与を行う。あるいは、血液中１０ナノモル〜１０マイクロモルの濃度を維持するのに十分な連続静脈内注入を行う。
【０１３２】
本明細書で示す少なくとも１つのタンパク質および他の治療的に有効な薬剤、例えば、抗生物質または化学療法剤などを含む乾燥粉末製剤も考えられる。
【０１３３】
参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．１９９０（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ  １８０４２）のＣｈａｐｔｅｒ  ８９において一般的に記載されている経口固体剤形も本明細書で使用する意図である。固体剤形には、錠剤、カプセル剤、丸剤、トローチまたはロゼンジ、カシェ剤またはペレットが挙げられる。また、リポソームまたはプロテイノイド封入体（例えば、米国特許第４，９２５，６７３号で報告されているプロテイノイド微小球のような）は、本発明の組成物を調合するのに使用できる。リポソーム封入体を使用してもよいし、リポソームを種々のポリマーで誘導体化してもよい（例えば、米国特許第５，０１３，５５６号）。治療用に可能な固体剤形は、参照により本明細書に組み込まれるＭａｒｓｈａｌｌ，Ｋ．Ｉｎ：  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｇ．Ｓ．Ｂａｎｋｅｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｔ．Ｒｈｏｄｅｓ  Ｃｈａｐｔｅｒ  １０，１９７９に記載されている。一般に、製剤は、１つまたは複数の成分（あるいはそれらの化学修飾形態）、および胃環境に対し保護が可能で腸において生物学的に活性な物質の放出が可能な不活性成分が含まれる。
【０１３４】
また、上記の誘導体化された１つまたは複数の成分は、経口剤形であることを特に意図する。１つまたは複数の成分を化学的に修飾して誘導体の経口送達が有効になるようにしてもよい。一般的に、化学的な修飾は、成分分子自体の少なくとも１部分に結合させ、その部分により、（ａ）タンパク質分解の阻害、および（ｂ）胃または腸から血流への取り込みを可能にするという意図である。また、１つまたは複数の成分の全体的な安定性の増加、および体内の循環時間の増加も望まれる。そのような部分の例としては、ポリエチレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびポリプロリンが挙げられる。Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ（１９８１  “Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｂｄｕｃｔｓ”  Ｉｎ：  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇｓ，Ｈｏｃｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ，ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ｐｐ．３６７−３８３；Ｎｅｗｍａｒｋ，ｅｔ  ａｌ．（１９８２）  Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４：１８５−１８９を参照のこと。使用可能な他のポリマーとしては、ポリ−１，３−ジオキソランおよびポリ−１，３，６−チオキソカンが挙げられる。医薬的使用に好ましいのは、上記のように、ポリエチレングリコール部分である。
【０１３５】
成分（または誘導体）を放出する位置は、胃、小腸（十二指腸、空腸、もしくは回腸）、または大腸であってもよい。当業者は、胃では溶解せず、十二指腸内または腸内の他の箇所で材料を放出する製剤が利用可能である。好ましくは、放出は、タンパク質（または誘導体）を保護すること、あるいは生物学的に活性な物質を胃環境を越えて腸内などで放出させるかのいずれかを行うことにより、胃環境の有害な影響から回避する。
【０１３６】
完全な胃耐性を保証するには、少なくともｐＨ５．０に耐えうるコーティングが必須である。腸溶コーティングとして使用される一般的な不活性成分の例としては、セルロースアセテートトリメリテート（ＣＡＴ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、ＨＰＭＣＰ５０、ＨＰＭＣＰ５５、ポリビニルアセテートフタレート（ＰＶＡＰ）、オイドラギットＬ３０Ｄ、アクアテリック、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）、オイドラギットＬ、オイドラギットＳ、およびシェラックがある。これらのコーティングは混合フィルムとして用いてもよい。
【０１３７】
コーティングまたはコーティング混合物は、胃に対する保護を意図しない錠剤に使用してもよい。例えば、糖コーティング、または錠剤を飲み込みやすくするコーティングが挙げられる。カプセルは、乾燥薬、即ち粉薬の送達用については、（ゼラチンのような）ハードシェルから構成してもよく、液体形態については、ソフトゼラチンシェルを使用してもよい。カシェのシェル材料は、厚めのデンプンまたは他の食用紙であってもよい。丸剤、ロゼンジ、成形錠剤、または錠剤粉薬については、モイストマッシング技術を使用できる。
【０１３８】
ペプチド治療剤は、約１ｍｍの粒子サイズの顆粒またはペレット形態の微粒子として製剤に含めてもよい。また、カプセル投与用材料の製剤を、粉末、軽く圧縮されたプラグ、または錠剤としてもよい。治療剤は圧縮によって調製してもよい。
【０１３９】
不活性物質を用いて治療剤を希釈または体積を増加してもよい。これらの希釈剤としては、炭水化物、特にマンニトール、α−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、修飾デキストランおよびデンプンが挙げられる。また、三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウムおよび塩化ナトリウムなど特定の無機塩を充填剤として使用してもよい。いくつかの市販の希釈剤には、Ｆａｓｔ−Ｆｌｏ、Ｅｍｄｅｘ、ＳＴＡ−Ｒｘ  １５００、Ｅｍｃｏｍｐｒｅｓｓ、およびＡｖｉｃｅｌｌがある。
【０１４０】
治療剤を固体剤形に製剤化する場合、崩壊剤を加えてもよい。崩壊剤として使用する物質には、デンプンをベースとした市販の崩壊剤であるＥｘｐｌｏｔａｂなどのデンプンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。デンプングリコール酸ナトリウム、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラミロペクチン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジの皮、酸型カルボキシメチルセルロース、天然スポンジ、およびベントナイトがすべて使用可能である。崩壊剤のもう１つの形態は、不溶性陽イオン交換樹脂である。崩壊剤および結合剤として粉末ガムを使用してもよく、例として、寒天、Ｋａｒａｙａ、トラガカントなどの粉末ガムが挙げられる。アルギン酸およびそのナトリウム塩も、崩壊剤として有用である。治療剤を結合し硬質の錠剤を形成するために結合剤を使用してもよく、結合剤としては、アラビアゴム、トラガカント、デンプン、ゼラチンなどの天然産物由来の物質が挙げられる。その他には、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）、およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）が挙げられる。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）およびヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）は両者とも、アルコール性溶液中で使用して治療剤を顆粒化できる。
【０１４１】
製剤化工程中の固着を防ぐために、治療剤の製剤に減摩剤を加えてもよい。治療剤とダイ壁との間の層として滑沢剤を使用してもよく、滑沢剤としてはマグネシウム塩およびカルシウム塩を含むステアリン酸、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、流動パラフィン、植物油およびワックスが挙げられるが、これらに限定されない。ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、種々の分子量のポリエチレングリコール、Ｃａｒｂｏｗａｘ４０００および６０００などの可溶性滑沢剤も使用できる。
【０１４２】
製剤化中の薬剤の流動特性を改善でき、圧縮の際の再配置を補助するための流動促進剤を加えてもよい。流動促進剤としては、デンプン、タルク、発熱性シリカ、水和ケイ酸アルミニウムが挙げられる。
【０１４３】
治療剤を水性環境に溶解するのを補助するために、界面活性剤を湿潤剤として加えてもよい。界面活性剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム、およびジオクチルスホン酸ナトリウムなどのアニオン性界面活性剤が挙げられる。塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムなどのカチオン性界面活性剤を使用してもよい。界面活性剤として製剤中に含めることができる非イオン性界面活性剤の候補としては、ラウロマクロゴール４００、ポリオキシル４０ステアレート、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０、および６０、モノステアリン酸グリセロール、ポリソルベート４０、６０、６５、および８０、ショ糖脂肪酸エステル、メチルセルロース、およびカルボキシメチルセルロースが挙げられる。これらの界面活性剤は、タンパク質または誘導体の製剤中に単独でまたは様々なの比率の混合物として存在しうる。
【０１４４】
タンパク質（または誘導体）の取込みを強化する可能性のある添加剤として、例えば、脂肪酸のオレイン酸、リノール酸、およびリノレン酸が挙げられる。
【０１４５】
一実施形態では、方法は、パーフォリン２の発現、機能、または活性に関連し本明細書に記載の様々な標的分子のいずれか、あるいはパーフォリン２の発現、機能、または活性に関連する１つまたは複数の標的分子の機能または活性を調節する本明細書に記載の様々な薬剤のいずれかを対象に投与するためのウイルスの使用を含む。投与は、例えば、組換えレトロウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス、組換えアデノウイルス、および組換え単純ヘルペスウイルスなど、本明細書に示す標的分子または薬剤のいずれかを発現するウイルスを使用することにより行うことができる（例えば、Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６（１９９３），Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１５７５（１９８８），ＬａＳａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：９８８（１９９３），Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５（１９９０），Ｂｒｅａｋｆｉｅｌｄ  ａｎｄ  Ｄｅｌｕｃａ，Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ  ３：２０３（１９９１）参照）。
【０１４６】
本明細書で提供する種々の標的分子または薬剤のいずれかをコードする遺伝子は、例えば、アデノウイルスベクター（例えば、Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１１４９８（１９９３），Ｋｏｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：２１５（１９９４），Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：４０３（１９９３），Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．５：１３０（１９９３），およびＺａｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ７５：２０７（１９９３））、アデノ随伴ウイルスベクター（Ｆｌｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１０６１３（１９９３））、森林熱ウイルスやシンドビスウイルスのようなアルファウイルス（Ｈｅｒｔｚ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｊ．Ｖｉｒ．６６：８５７（１９９２），Ｒａｊｕ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｊ．Ｖｉｒ．６５：２５０１（１９９１），およびＸｉｏｎｇ  ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１１８８（１９８９））、ヘルペスウイルスベクター（例えば、米国特許第４，７６９，３３１号、第４，８５９，５８７号、第５，２８８，６４１号、および第５，３２８，６８８号）、パルボウイルスベクター（Ｋｏｅｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐ．５：４５７（１９９４））、ポックスウイルスベクター（Ｏｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９３：６５３（１９９３），Ｐａｎｉｃａｌｉ  ａｎｄ  Ｐａｏｌｅｔｔｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：４９２７（１９８２））、カナリアポックスウイルスまたはワクシニアウイルスのようなポックスウイルス（Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈ  ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：３１７（１９８９）、およびＦｌｅｘｎｅｒ  ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５６９：８６（１９８９））、ならびにレトロウイルス（例えば、Ｂａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  ７９：７２９（１９９３），Ｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：８３（１９９３），Ｔａｋａｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ  ３３：４９３（１９９２），Ｖｉｌｅ  ａｎｄ  Ｈａｒｔ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：９６２（１９９３），Ｖｉｌｅ  ａｎｄ  Ｈａｒｔ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：３８６０（１９９３）、およびＡｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，３９９，３４６号）を含む組換えウイルスベクターを用いて送達できる。種々の実施形態内で、ウイルスベクター自体、またはウイルスベクターを含むウイルス粒子のいずれかを、以下に記載される方法で利用してもよい。
【０１４７】
系の一例として、二本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノウイルスが、異種核酸分子の送達について十分に研究されている遺伝子導入ベクターとして挙げられる（Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４３：１６１（１９９４）；Ｄｏｕｇｌａｓ  ａｎｄ  Ｃｕｒｉｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４：４４（１９９７）参照）。アデノウイルス系は、（ｉ）比較的大きなＤＮＡ挿入体を収容する能力、（ｉｉ）高力価まで増殖する能力、（ｉｉｉ）広範な種類の哺乳類細胞を感染させる能力、および、（ｉｖ）遍在的、組織特異的、および調節可能なプロモーターを含む様々な多くのプロモーターと共に使用できる能力、を含むいくつかの利点を提供する。加えて、アデノウイルスは血流中で安定しているため、静脈内注射により投与可能である。
【０１４８】
アデノウイルスゲノムの一部が欠失したアデノウイルスベクターを用いて、挿入物は、直接的ライゲーション、または同時トランスフェクトされたプラスミドとの相同組換えによって、ウイルスＤＮＡに組み込まれる。例えば、必須のＥ１遺伝子がウィルスベクターから欠失しており、そして、Ｅ１遺伝子が宿主細胞によってもたらされない限り、ウイルスが複製しない系が挙げられる。無傷の動物に静脈内投与すると、アデノウイルスは主に肝臓を標的とする。Ｅ１遺伝子の欠失を有するアデノウイルス送達系は宿主細胞内で複製できないものの、宿主の組織は、コードされた異種タンパク質を発現および処理する。対応する遺伝子が分泌シグナル配列を含む場合、宿主細胞は、異種タンパク質を分泌する。分泌されたタンパク質は、異種遺伝子を発現する組織（例えば、高度に血管新生された肝臓）から血液循環に入る。
【０１４９】
さらに、ウイルス遺伝子の種々の欠失を含むアデノウイルスベクターを、ベクターに対する免疫応答を減少または排除するために使用できる。このようなアデノウイルスは、Ｅ１が欠失しており、それに加えて、Ｅ２ＡまたはＥ４も欠失している（Ｌｕｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２０２２（１９９８）；Ｒａｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ９：６７１（１９９８））。Ｅ２ｂの欠失もまた、免疫応答を減少させることが報告されている（Ａｍａｌｆｉｔａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９２６（１９９８））。アデノウイルスゲノムの全体を欠失させることによって、非常に大きな異種ＤＮＡの挿入物を収容できる。全てのウイルス遺伝子が欠失している、いわゆる「ガットレス」アデノウイルスの作成は、大きい異種ＤＮＡの挿入物を挿入するのに特に有利である（レビューについては、Ｙｅｈ．ａｎｄ  Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１１：６１５（１９９７）参照）。
【０１５０】
治療用遺伝子を発現できる組換えウイルスの高力価ストックは、標準的な方法を用いて、感染した哺乳動物細胞から得ることができる。例えば、組換え単純ヘルペスウイルスは、Ｂｒａｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２０４３（１９９１），Ｈｅｒｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１２１１（１９９４），Ｖｉｓａｌｌｉ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｔ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８５：４１９（１９９１），Ｇｒａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３０：２４７４（１９８９），Ｂｒａｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．３６：２０９（１９９２）、およびＢｒｏｗｎ  ａｎｄ  ＭａｃＬｅａｎ（ｅｄｓ．），ＨＳＶ  Ｖｉｒｕｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７）に記載のようにＶｅｒｏ細胞中で調製できる。
【０１５１】
組換えウイルスで処理する対象がヒトの場合、治療は、好ましくは、体細胞遺伝子治療である。即ち、組換えウイルスによるヒトの好ましい処理は、ヒト生殖細胞系の一部を形成することができ連続して次世代に受け継がれる核酸分子を細胞に導入すること（すなわち、ヒト生殖系遺伝子治療）を伴わない。
【０１５２】
感染性生物
本明細書で使用する場合、「感染性生物」は、例えば、細菌、ウイルス、真菌、寄生生物、および原生動物が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１５３】
重篤なヒト疾患を引き起こす特に好ましい細菌は、グラム陽性生物である黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉ）、およびＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ならびに、グラム陰性菌である緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）、キサントモナス・マルトフィリア（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、腸内病原性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅ．ｃｏｉｌ）（ＥＰＥＣ）、エンテロバクター属、クレブシエラ肺炎菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）を含むクラミジア属、およびサルモネラ属である。
【０１５４】
別の好ましい実施形態では、細菌はグラム陰性細菌である。例として、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）；バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）；キサントモナス・マルトフィリア（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌａ）；大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）；エンテロバクター属；クレブシエラ肺炎（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）；サルモネラ属が挙げられる。
【０１５５】
本発明はまた、マイコバクテリウム属、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、ニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）、クルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）、ブルーストリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）、リーシュマニア・メキシカーナ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍｅｘｉｃａｎａ）、クロストリジウム・ヒストリチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、口蹄疫ウイルス、およびクリチディア・ファシキュラータ（Ｃｒｉｔｈｉｄｉａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｔａ）による感染を含む疾患、ならびに骨粗しょう症、自己免疫、住血吸虫症、マラリア、腫瘍転移、異染性白質萎縮症、筋ジストロフィーおよび筋萎縮症を治療するための方法を提供する。
【０１５６】
他の例としては、動物およびヒトに対する病原性原虫、アピコンプレックス門または肉質べん毛虫亜門の細胞内で活性な寄生虫、トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉａ）、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、バベシア（Ｂａｂｅｓｉａ）、およびタイレリア（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ）、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉａ）、肉胞子虫（Ｓａｃｒｏｃｙｓｔｉｄａ）、アメーバ（Ａｍｏｅｂａ）、コクシジウム（Ｃｏｃｃｉｄｉａ）およびトリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｄｉａ）属が含まれる。これらの化合物は、例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）によって引き起こされる熱帯熱マラリア（Ｍａｌａｒｉａ  ｔｒｏｐｉｃａ）、３日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）または卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ）によって引き起こされる３日熱マラリア（Ｍａｌａｒｉａ  ｔｅｒｔｉａｎａ）、および４日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ）によって引き起こされる４日熱マラリアの治療に適している。また、トキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）によって引き起こされるトキソプラズマ症、例えば、戦争イソスポーラ（Ｉｓｏｓｐｏｒａ  ｂｅｌｌｉ）によって引き起こされるコクシジウム症，肉胞子虫（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｕｉｈｏｍｉｎｉｓ）によって引き起こされる腸肉胞子虫症（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｓａｒｃｏｓｐｏｒｉｄｉｏｓｉｓ）、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）によって引き起こされる赤痢、クリプトスポリジウム・パルバム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）によって引き起こされるクリプトスポリジウム症、クルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）によって引き起こされるシャーガス病、ローデシアトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ  ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅ）またはガンビアトリパノソーマ（ｇａｍｂｉｅｎｓｅ）によって引き起こされる睡眠病、皮膚および内臓ならびに他の形態のリーシュマニア症の治療に適している。また、ウシ東海岸熱を引き起こす病原体であるタイレリア・パルバ（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ  ｐａｒｖａ）、コンゴトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｏｎｇｏｌｅｎｓｅ  ｃｏｎｇｏｌｅｎｓｅ）またはトリパノソーマ・ビバックス（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｖｉｖａｘ  ｖｉｖａｘ）、アフリカでナガナ牛病を引き起こすブルーストリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ  ｂｒｕｃｅｉ）、スーラ病を引き起こすエバンストリパノゾーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ  ｅｖａｎｓｉ）、牛や水牛のテキサス熱を引き起こす病原体であるバベシア・ビゲミナ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｉｇｅｍｉｎａ）、欧州ウシバベシア症ならびにイヌ、ネコ、ヒツジのバベシア症を引き起こす病原体であるバベシア・ボビス（Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｏｖｉｓ）、ヒツジ、ウシ、およびブタの肉胞子虫症を引き起こす病原体であるサルコシスティス・オビカニス（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ  ｏｖｉｃａｎｉｓ）およびオビフェリス（ｏｖｉｆｅｌｉｓ）、ウシおよび鳥にクリプトスポリジウム症を引き起こす病原体であるクリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉａ）、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタおよび鳥、特にニワトリおよび七面鳥にコクシジウム症を引き起こす病原体であるアイメリアおよびイソスポラ種のような獣医学的原性原虫に感染した動物の治療に適している。リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）には、リケッチア・フェリス（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｆｅｌｉｓ）、リケッチア・プロワツェキイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、リケッチア・リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、発疹熱リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｔｙｐｈｉ）、リケッチア・コノリ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｃｏｎｏｒｉｉ）、リケッチア・アフリケ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ａｆｒｉｃａｅ）などの種が含まれ、チフス、リケッチア痘瘡、ボタン熱、南アフリカダニ熱、ロッキー山紅斑熱、オーストラリアマダニチフス、フリンダーズ島紅斑熱およびクイーンズランドマダニチフス等の疾患を引き起こす。これらの疾患の治療において、本発明の化合物は、他の薬剤と組み合わせることができる。
【０１５７】
本発明に係るヒトの疾患を引き起こすかまたは関連する特に好ましい真菌としては、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、ヒストプラズマ・ネオフォルマンス（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）、およびとペニシリウム・マルネッフェイ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍａｒｎｅｆｆｅｉ）が挙げられる（しかし、これらに限定されない）。
【０１５８】
トランスジェニック動物
パーフォリン２の機能的活性は、トランスジェニック的に評価することができる。この点で、トランスジェニックマウスモデルを使用することができる。パーフォリン２遺伝子は、トランスジェニックマウスを用いた相補性試験に使用することができる。候補遺伝子の野生型座位に対応するウイルスベクター、またはコスミドクローン（もしくはファージクローン）を含むトランスジェニックベクターは、単離されたパーフォリン２遺伝子を用いて構築することができる。コスミドは、公開された手順（Ｊａｅｎｉｓｃｈ（１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１４６８−１４７４）を用いて、トランスジェニックマウスに導入することができる。遺伝的な意味で、導入遺伝子はサプレッサー突然変異として作用する。
【０１５９】
あるいは、パーフォリン２遺伝子の発現が破壊されたトランスジェニック動物モデルを調製することができる。遺伝子産物の表現型効果を評価するための一つの標準的な方法は、遺伝子を欠失または不活性化するノックアウト技術を用いることである。本明細書で使用する場合、用語「破壊（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）」または「ノックアウト（ｋｎｏｃｋｏｕｔ）」は、細胞内のＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質の少なくとも一部の発現の部分的または完全な阻害を指す。「部分的な」阻害または不活性化とは、遺伝子発現が、当該遺伝子が破壊されていない（すなわち、野生型）の遺伝子発現と比較し、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上減少することを意味する。「完全な阻害」とは、機能的タンパク質が全く発現されない（すなわち、遺伝子発現の１００％が阻害される）ことを意味する。
【０１６０】
ノックアウトには、ヘテロ接合性変異およびホモ接合性変異の両方が含まれる。本明細書で使用する場合、「ヘテロ接合性」遺伝子の破壊またはノックアウトには、１つの欠損アレルと１つの野生型アレルが含まれる。「ホモ接合性」遺伝子の破壊またはノックアウトには、２つの欠損アレルが含まれる。例えば、ホモ接合性ノックアウトマウスには、遺伝子のアレルの両方の破壊が含まれ、ヘテロ接合性ノックアウトマウスには、遺伝子の一方のアレルの破壊が含まれる。遺伝子またはノックアウトについて本明細書で使用する場合、「野生型」とは、天然かつ非変異または非破壊型の遺伝子を指す。
【０１６１】
本明細書では、パーフォリン２遺伝子が破壊されているトランスジェニック動物を提供する。一実施形態では、パーフォリン２タンパク質をコードする遺伝子の破壊を含むトランスジェニックマウスを提供する。いくつかの実施形態では、パーフォリン２遺伝子の破壊は、ヘテロ接合性またはホモ接合性であり得る。
【０１６２】
具体的な実施形態では、ホモ接合性破壊によりトランスジェニックマウスにおけるパーフォリン２遺伝子が不活性化し、機能的パーフォリン２タンパク質の発現が阻害される。
【０１６３】
別の実施形態では、遺伝子破壊により、パーフォリン２遺伝子が部分的に不活性化される。具体的な実施形態では、遺伝子破壊はヘテロ接合性である。
【０１６４】
かかる実施形態では、トランスジェニックパーフォリン２ノックアウトマウスは、野生型マウスと比較して、細胞内病原体による感染に対する感受性の増加を示す。
【０１６５】
また、本明細書は、パーフォリン２遺伝子の破壊を含むトランスジェニックマウス由来の器官、組織、細胞、または細胞株を提供する。
【０１６６】
あるいは、組換え技術を用いて、ナンセンスおよびアンバー変異といった変異、または不活性タンパク質の発現をもたらす変異を導入することができる。別の実施形態では、パーフォリン２遺伝子は、野生型動物においてアンチセンス方向で発現された場合の表現型の効果を試験することによって検査することができる。このアプローチでは、野生型アレルの発現が抑制されることにより変異型の表現型になる。ＲＮＡ×ＲＮＡの二重鎖形成（アンチセンス−センス）は、通常のｍＲＮＡの処理を妨げる結果、野生型遺伝子の効果を部分的または完全に排除する。この技術は、組織培養におけるＴＫ合成を阻害し、そしてショウジョウバエのクルッペル変異およびマウスのシバラー変異の表現型を生じさせるために使用される（Ｉｚａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ（１９８４）  ３６：１００７−１０１５；Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５：５６９−５９７；Ｋａｔｓｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：５９３−５９５）。このアプローチの重要な利点は、同族のｍＲＮＡ全体の発現を効果的に阻害するために発現される必要があるのは遺伝子の小さな部分のみであることである。アンチセンス導入遺伝子は、それ自身のプロモーターまたは正しい種類の細胞で発現される他のプロモーターの制御下に置かれ、そしてＳＶ４０ポリＡ部位の上流に置かれる。この導入遺伝子は、トランスジェニックマウスを作製するため、または遺伝子ノックアウト技術を用いることにより使用される。
【０１６７】
本開示では、本発明の好ましい実施形態を記載するが、その多様な実施形態のうちいくつかの例のみしか記載していない。本発明は、様々な他の組み合わせおよび環境での使用が可能であり、本明細書で示される発明概念の範囲内における変更および修正が可能であることを理解すべきである。従って、例えば、当業者は、日常的な実験を用いて本明細書に記載の特定の物質および手順についての多くの均等物を認識または確認することができるだろう。このような均等物は、本発明の範囲内であると考えられる。
【０１６８】
本出願で引用される全ての刊行物および特許文献は、各刊行物または特許文献を個々に示したかのように、同程度ですべての目的のために適切な部分において参考として援用される。本明細書の様々な参考文献の引用は、出願人が、いかなる特定の参照もその発明に対する「先行技術」であると認めるものではない。
【０１６９】
本明細書中に開示の方法および組成物の非限定的な例は、以下の通りである。
１．パーフォリン２（Ｐ２）の機能、活性、または発現をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで調節する方法であって、Ｐ２の発現、機能、または活性に関連する１つまたは複数の分子の機能、活性、または発現を調節する少なくとも１つの薬剤の有効量を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞に接触させるかまたは患者に投与し；そしてＰ２の機能または発現を調節することを含む方法。
【０１７０】
２．Ｐ２の機能、活性、または発現に関連する１つまたは複数の分子は、ｓｒｃ、ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｍ、ＧＡＰＤＨ、Ｐ２１ＲＡＳ／ｇａｐ１ｍ、ガレクチン３、ユビキチンＣ（ＵＣＨＬ１）、プロテアソーム、またはそれらの断片を含む、実施形態１に記載の方法。
【０１７１】
３．Ｐ２の機能、発現、または活性に関連する１つまたは複数の分子の機能、活性、または発現を上方制御する少なくとも１つの薬剤を投与することにより、Ｐ２の発現、機能、または活性を上方制御する、実施形態２に記載の方法。
【０１７２】
４．Ｐ２の機能、発現、または活性に関連する１つまたは複数の分子の機能、活性、または発現を下方制御する少なくとも１つの薬剤を投与することにより、Ｐ２の発現、機能、または活性を下方制御する、実施形態２に記載の方法。
【０１７３】
５．Ｐ２の機能、発現、または活性に関連する２つの分子の機能、活性、または発現を独立して上方制御または下方制御する少なくとも１つの薬剤を投与することにより、Ｐ２の発現、機能、または活性を上方制御する、実施形態２に記載の方法。
【０１７４】
６．Ｐ２の機能、発現、または活性に関連する２つの分子の機能、活性、または発現を独立して上方制御または下方制御する少なくとも１つの薬剤を投与することにより、Ｐ２の発現、機能、または活性を下方制御する、実施形態２に記載の方法。
【０１７５】
７．Ｐ２の機能、発現、または活性に関連する２つの分子の機能、活性、または発現を独立して上方制御または下方制御する少なくとも２つの薬剤の組み合わせを投与することにより、Ｐ２の発現、機能、または活性を上方制御する、実施形態２に記載の方法。
【０１７６】
８．Ｐ２の機能、発現、または活性に関連する２つの分子の機能、活性、または発現を独立して上方制御または下方制御する少なくとも２つの薬剤の組み合わせを投与することにより、Ｐ２の発現、機能、または活性を下方制御する、実施形態２に記載の方法。
【０１７７】
９．Ｐ２分子の発現、機能、または活性を直接調節する薬剤を投与する任意の工程を含む、実施形態２に記載の方法。
【０１７８】
１０．分子は、Ｐ２の転写または翻訳を阻害する、実施形態９に記載の方法。
【０１７９】
１１．薬剤は、低分子、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、修飾ペプチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、合成分子、天然分子、有機または無機分子、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態１に記載の方法。
【０１８０】
１２．候補治療剤を同定する方法であって、ｓｒｃ、ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｍ、ＧＡＰＤＨ、Ｐ２１ＲＡＳ／ｇａｐ１ｍ、ガレクチン３、ユビキチンＣ（ＵＣＨＬ１）、プロテアソーム、またはそれらの断片を含む１つまたは複数の標的分子を発現する細胞を接触させ；当該分子の発現、機能、または活性を測定し；当該分子の発現、機能、または活性を対照と比較し；そして、候補治療剤を同定する；ことを含む方法。
【０１８１】
１３．候補治療剤は、１つまたは複数の標的分子の発現、機能、または活性を調節する、実施形態１２に記載の方法。
【０１８２】
１４．候補治療剤は、複数の標的分子の発現、機能、または活性を調節する、実施形態１２に記載の方法。
【０１８３】
１５．候補治療剤は、１つまたは複数の標的分子の発現、機能、または活性を上方制御する、実施形態１２に記載の方法。
【０１８４】
１６．候補治療剤は、１つまたは複数の標的分子の発現、機能、または活性を下方制御する、実施形態１２に記載の方法。
【０１８５】
１７．１つまたは複数の標的分子の発現、機能、または活性を調節することにより、パーフォリン２（Ｐ２）の発現、機能、または活性分子を調節する、実施形態１２に記載の方法。
【０１８６】
１８．１つまたは複数の標的分子の発現、機能、または活性を上方制御することによりパーフォリン２（Ｐ２）分子の発現、機能、または活性を上方制御する、実施形態１７に記載の方法。
【０１８７】
１９．１つまたは複数の標的分子の発現、機能、または活性を下方制御することによりパーフォリン２（Ｐ２）分子の発現、機能、または活性を下方制御する、実施形態１７に記載の方法。
【０１８８】
２０．標的分子は、ポリヌクレオチドまたはそれらの発現産物である、実施形態１２に記載の方法。
【０１８９】
２１．候補治療剤を同定する方法であって、アッセイ表面を、ｓｒｃ、ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｍ、ＧＡＰＤＨ、Ｐ２１ＲＡＳ／ｇａｐ１ｍ、ガレクチン３、ユビキチンＣ（ＵＣＨＬ１）、プロテアソーム，それらの断片、またはそれらに関連する分子を含む１つまたは複数の標的分子に接触させ；当該標的分子を、１つまたは複数の候補治療剤に接触させて、１つまたは複数の標的分子またはそれらに関連する分子に結合またはハイブリダイズする薬剤を同定する；ことを含む方法。
【０１９０】
２２．同定した候補治療剤を、パーフォリン２分子の発現、機能、または活性の調節についてアッセイする、実施形態２１に記載の方法。
【０１９１】
２３．同定した候補治療剤は、Ｐ２分子の発現、機能、または活性を上方制御する、実施形態２２に記載の方法。
【０１９２】
２４．同定した候補治療剤は、Ｐ２分子の発現、機能、または活性を下方制御する、実施形態２２に記載の方法。
【０１９３】
２５．Ｐ２分子の発現、機能、または活性をアッセイするためのアッセイは、細胞アッセイ、免疫アッセイ、酵母ハイブリッドシステムアッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイ、核酸ベースのアッセイ、ハイスループットスクリーニングアッセイ、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態２２に記載の方法。
【０１９４】
２６．同定した候補薬剤を、感染性生物の複製の阻害、増殖の阻害、または死滅についてアッセイする、実施形態２２に記載の方法。
【０１９５】
２７．感染性生物は、細胞内細菌または細胞外細菌である、実施形態２６に記載の方法。
【０１９６】
２８．感染性疾患生物に罹患している患者を治療する方法であって、患者に、実施形態１または実施形態２１に記載の方法によって同定された薬剤の治療的有効量を投与することを含む方法。
【０１９７】
２９．実施形態１または実施形態２１に記載の方法によって同定される化合物。
【０１９８】
３０．実施形態２９に記載の化合物を含む医薬組成物。
【０１９９】
３１．病原体感染の危険がある個体を同定する方法であって、患者試料を得て、ｓｒｃ、ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｍ、ＧＡＰＤＨ、Ｐ２１ＲＡＳ／ｇａｐ１ｍ、ガレクチン３、ユビキチンＣ（ＵＣＨＬ１）、プロテアソーム、パーフォリン２、それらの断片、またはそれらに関連する分子を含む１つまたは複数の分子をアッセイし；そして、その発現、機能、または活性を正常対照と比較することを含む方法。
【０２００】
３２．対照と比べ、発現レベルが下方制御されたあるいは活性または機能が低下したと同定された個体を、感染の危険性があると予測する、実施形態３１に記載の方法。
【０２０１】
３３．パーフォリン２の発現、機能、または活性を調節する少なくとも１つの薬剤を同定する方法であって、（ａ）パーフォリン２の発現、機能、または活性に関連する１つまたは複数の標的分子を発現する細胞を、少なくとも１つの薬剤と接触させ；（ｂ）パーフォリン２の発現、機能、または活性に関連する前記１つまたは複数の標的分子の発現、機能、または活性を測定し；そして（ｃ）前記１つまたは複数の標的分子の発現、機能、または活性を対象と比較することを含み、ここで、少なくとも１つの薬剤を接触させることで、前記１つまたは複数の標的分子の発現、機能、または活性を調節することにより、パーフォリン２の発現、機能、または活性を調節する前記薬剤を同定する、方法。
【０２０２】
３４．パーフォリン２の発現、機能、または活性に関連する１つまたは複数の標的分子は、ｓｒｃ、ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｍ（Ｕｂｃ１２）、ＧＡＰＤＨ、Ｐ２１ＲＡＳ／ｇａｐ１ｍ（ＲＡＳＡ２）、ガレクチン３、ユビキチンＣ（ＵＣＨＬ１）、プロテアソーム、ｖｐｓ３４、ＡＴＧ５、ＡＴＧ７、ＡＴＧ９Ｌ１、ＡＴＧ１４Ｌ、ＡＴＧ１６Ｌ、ＬＣ３、Ｒａｂ５、またはそれらの断片を含む、実施形態３３に記載の方法。
【０２０３】
３５．少なくとも１つの薬剤は、パーフォリン２の発現、機能、または活性に関連する前記１つまたは複数の標的分子の発現、機能、または活性を上方制御する、実施形態３３または３４のいずれかに記載の方法。
【０２０４】
３６．１つまたは複数の標的分子の発現、機能、または活性を上方制御することで、パーフォリン２の発現、機能、または活性を上方制御する、実施形態３５に記載の方法。
【０２０５】
３７．少なくとも１つの薬剤は、パーフォリン２の発現、機能、または活性に関連する前記１つまたは複数の標的分子の発現、機能、または活性を下方制御する、実施形態３３または３４のいずれかに記載の方法。
【０２０６】
３８．１つまたは複数の標的分子の発現、機能、または活性を下方制御することで、パーフォリン２の発現、機能、または活性を下方制御する、実施形態３７に記載の方法。
【０２０７】
３９．パーフォリン２の発現、機能、または活性に関連する少なくとも２つの標的分子の発現、機能、または活性を独立して上方制御または下方制御する少なくとも１つの薬剤により、パーフォリン２の発現、機能、または活性を上方制御する、実施形態３３または３４のいずれかに記載の方法。
【０２０８】
４０．パーフォリン２の発現、機能、または活性に関連する少なくとも２つの標的分子の機能、活性、または発現を独立して上方制御または下方制御する少なくとも１つの薬剤により、パーフォリン２の発現、機能、または活性を下方制御する、実施形態３３または３４のいずれかに記載の方法。
【０２０９】
４１．パーフォリン２の発現、機能、または活性に関連する２つの標的分子の発現、機能、または活性を独立して上方制御または下方制御する少なくとも２つの薬剤の組み合わせにより、パーフォリン２の発現、機能、または活性を上方制御する、実施形態３３または３４のいずれかに記載の方法。
【０２１０】
４２．パーフォリン２の発現、機能、または活性に関連する２つの標的分子の発現、機能、または活性を独立して上方制御または下方制御する少なくとも２つの薬剤の組み合わせにより、パーフォリン２の発現、機能、または活性を下方制御する、実施形態３３または３４のいずれかに記載の方法。
【０２１１】
４３．薬剤は、低分子、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、修飾ペプチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、合成分子、天然分子、有機または無機分子、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態３３〜４２のいずれかに記載の方法。
【０２１２】
４４．パーフォリン２の発現、機能、または活性に関連する１つまたは複数の標的分子は、感染性生物に由来する、実施形態３３に記載の方法。
【０２１３】
４５．前記感染性生物は細菌である、実施形態４４に記載の方法。
【０２１４】
４６．少なくとも１つの薬剤は、１つまたは複数の標的分子の発現、機能、または活性を下方制御する、実施形態４４または４５のいずれかに記載の方法。
【０２１５】
４７．少なくとも１つの薬剤は、１つまたは複数の標的分子の発現、機能、または活性を上方制御する、実施形態４４または４５のいずれかに記載の方法。
【０２１６】
４８．１つまたは複数の標的分子の発現、機能、または活性を下方制御することによりパーフォリン２の発現、機能、または活性を上方制御する、実施形態４６に記載の方法。
【０２１７】
４９．１つまたは複数の標的分子の発現、機能、または活性を上方制御することによりパーフォリン２の発現、機能、または活性を下方制御する、実施形態４７に記載の方法。
【０２１８】
５０．パーフォリン２の発現、機能、または活性に関連する少なくとも２つの標的分子の発現、機能、または活性を独立して上方制御または下方制御する少なくとも１つの薬剤により、パーフォリン２の発現、機能、または活性を上方制御する、実施形態４４または４５のいずれかに記載の方法。
【０２１９】
５１．パーフォリン２の発現、機能、または活性に関連する少なくとも２つの標的分子の発現、機能、または活性を独立して上方制御または下方制御する少なくとも１つの薬剤により、パーフォリン２の発現、機能、または活性を下方制御する、実施形態４４または４５のいずれかに記載の方法。
【０２２０】
５２．細菌は、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、実施形態４４に記載の方法。
【０２２１】
５３．パーフォリン２の発現、機能、または活性に関連する１つまたは複数の標的分子は、ＰｈｏＰまたはデアミダーゼを含む、実施形態４４または４５のいずれかに記載の方法。
【０２２２】
５４．パーフォリン２の発現、機能、または活性を調節する候補薬剤を同定する方法であって、（ａ）アッセイ表面を、ｓｒｃ、ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｍ、ＧＡＰＤＨ、Ｐ２１ＲＡＳ／ｇａｐ１ｍ、ガレクチン３、ユビキチンＣ（ＵＣＨＬ１）、プロテアソーム、ｖｐｓ３４、ＡＴＧ５、ＡＴＧ７、ＡＴＧ９Ｌ１、ＡＴＧ１４Ｌ、ＡＴＧ１６Ｌ、ＬＣ３、Ｒａｂ５、ＰｈｏＰ、デアミダーゼ、それらの断片、またはそれらに関連する分子を含む１つまたは複数の標的分子に接触させ；（ｂ）当該標的分子を、当該１つまたは複数の候補薬剤に接触させて、１つまたは複数の標的分子またはそれらに関連する分子に結合またはハイブリダイズする薬剤を同定し；そして、（ｃ）前記１つまたは複数の候補薬剤を、パーフォリン２の発現、機能、または活性の調節についてアッセイすることにより、前記候補薬剤を同定する；ことを含む方法。
【０２２３】
５５．同定した候補治療剤は、パーフォリン２の発現、機能、または活性を上方制御する、実施形態５４に記載の方法。
【０２２４】
５６．同定した候補治療剤は、パーフォリン２の発現、機能、または活性を下方制御する、実施形態５４に記載の方法。
【０２２５】
５７．パーフォリン２分子の発現、機能、または活性をアッセイするためのアッセイは、細胞アッセイ、免疫アッセイ、酵母ハイブリッドシステムアッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイ、核酸ベースのアッセイ、ハイスループットスクリーニングアッセイ、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態５４に記載の方法。
【０２２６】
５８．同定した候補薬剤を、感染性生物の複製の阻害、増殖の阻害、または死滅についてアッセイする、実施形態５４に記載の方法。
【０２２７】
５９．感染性生物は、細胞内細菌または細胞外細菌である、実施形態５８に記載の方法。
【０２２８】
６０．病原体感染の危険がある個体を同定する方法であって、患者試料を得て、ｓｒｃ、ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｍ、ＧＡＰＤＨ、Ｐ２１ＲＡＳ／ｇａｐ１ｍ、ガレクチン３、ユビキチンＣ（ＵＣＨＬ１）、プロテアソーム、パーフォリン２、ｖｐｓ３４、ＡＴＧ５、ＡＴＧ７、ＡＴＧ９Ｌ１、ＡＴＧ１４Ｌ、ＡＴＧ１６Ｌ、ＬＣ３、Ｒａｂ５、それらの断片、またはそれらに関連する分子を含む１つまたは複数の分子をアッセイし；そして、その発現、機能、または活性を正常対照と比較することを含む方法。
【０２２９】
６１．対照と比べ、発現レベルが下方制御されたあるいは活性または機能が低下したと同定された個体を、感染の危険性があると予測する、実施形態６０に記載の方法。
【０２３０】
６２．パーフォリン２タンパク質をコードする遺伝子の破壊を含むトランスジェニックマウス。
【０２３１】
６３．前記破壊は、パーフォリン２タンパク質をコードする前記遺伝子のヘテロ接合性またはホモ接合性破壊を含む、実施形態６２に記載のトランスジェニックマウス。
【０２３２】
６４．前記破壊は、ホモ接合性破壊を含み、前記ホモ接合性破壊は、前記トランスジェニックマウスにおける前記遺伝子を不活性化し、機能的パーフォリン２タンパク質の発現を阻害する、実施形態６３に記載のトランスジェニックマウス。
【０２３３】
６５．前記トランスジェニックマウスは、野生型マウスと比較して、細胞内病原体による感染に対する感受性の増加を示す、請求項６２〜６４のいずれかに記載のトランスジェニックマウス。
【０２３４】
６６．実施形態６２〜６４のいずれかに記載のトランスジェニックマウス由来の器官、組織、細胞、または細胞株。
【実施例】
【０２３５】
実施例１：マクロファージおよびミクログリアにおける孔形成タンパク質が、病原性細胞内細菌を殺傷する。
本実施例は、Ｍｐｅｇ１が、重合により膜を貫通する孔を形成し、パーフォリン２（Ｐ２）と命名された新規孔形成タンパク質をコードすることを示している。マクロファージにおいてＰ２は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、ＭＲＳＡ）、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ、Ｍａ）、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍｓｍ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｔ）、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含む病原性細菌に対し強力な細胞内殺傷活性を有する。また、Ｐ２は、活性酸素種（ＲＯＳ）および一酸化窒素（ＮＯ）の殺菌活性も可能にした。
【０２３６】
材料と方法
プラスミド構築物：マウスＭｐｅｇ−１  ｃＤＮＡの完全コード領域を、いくつかのＥＳＴクローンから構築し、ｐＥＧＦＰ−Ｎ３プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に挿入した。単量体ＲＦＰをＧＦＰの代わりにクローニングしたものをいくつかの実験で使用した。
【０２３７】
細胞株および初代細胞：ＨＥＫ−２９３（ＡＴＣＣ）、ＲＡＷ２６４．７（ＡＴＣＣ）、および細胞株を、１０％ＦＢＳを補充したＩＭＤＭ中に保持した。初代マクロファージを腹膜または骨髄から得た。チオグリコール酸誘導性の腹腔マクロファージ：１．５ｍｌの３％チオグリコール酸溶液をＣ５７／Ｂ６マウスに腹腔内注射した。４日後、腹膜細胞を回収し、マクロファージ細胞を付着により精製した。骨髄由来マクロファージ：骨髄をＣ５７ＢＬ／６マウスの長骨から洗い流した。赤血球をＡＣＫ緩衝液に溶解し、細胞ペレットを２０ｎｇ／ｍｌ顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ，ＵＳＡ）を含む完全培地中に再懸濁した（１０6細胞／ｍｌ）。４日目に非付着細胞を回収し、新鮮な完全培地中に再プレーティングした。実験用に細胞が準備できるまで（通常は第７〜１０日目）、新鮮な培地を３日毎に添加した。
【０２３８】
ネガティブ染色透過型顕微鏡検査：Ｎ２キャビテーションおよび分画遠心によって、Ｐ２ＧＦＰでトランスフェクトした２９３細胞から膜を単離した。膜は、小量の中性トリス緩衝食塩水中に再懸濁し、３７℃で１００μｇ／ｍｌトリプシンで１時間処理してから洗浄し、そして５％の中性リンタングステン酸Ｎａで３０秒間ネガティブ染色した。画像は、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＣＭ１０透過型電子顕微鏡で５２，０００倍の初期倍率で撮影した。
【０２３９】
ゲンタマイシン保護アッセイ：ネズミチフス菌株ＬＴ２Ｚ、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・スメグマチス（ＡＴＣＣ）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、およびＫ１２大腸菌を、ルリアブロス（ＬＢ）（ネズミチフス菌、黄色ブドウ球菌、および大腸菌）またはミドルブロック７Ｈ９ブロス（マイコバクテリア）中で１６〜１８時間振盪しながら３７℃でグリセロールストックから増殖してその後感染させた。ネズミチフス菌については、培養物をその後ＬＢで１：３３に希釈し、そしてさらに３時間増殖させて侵襲的な表現型を誘導した。マクロファージまたはミクログリア細胞をプレーティングし（１２ウェルのプレート一枚当たり５×１０5細胞／ウェル）、そしてＬＰＳ（１ｎｇ／ｍｌ）およびＩＦＮ−γ（１００Ｕ／ｍｌ）で一晩刺激した。翌日、細胞を３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターで、３０分間（ネズミチフス菌）または１時間（他のすべての細菌）、指示したＭＯＩで感染させた。細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含有する新鮮な培地を添加した。２時間後、ゲンタマイシンの濃度を５μｇ／ｍｌに低下させた。ゲンタマイシンを追加した後、指示した時点で、細胞をＰＢＳで洗浄し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含む水で溶解、希釈し、寒天プレートに三連でプレーティングし、ＣＦＵを決定した。
【０２４０】
ＲＴ−ＰＣＲ：ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ）の説明書に従い細胞から抽出した。１μｇのＲＮＡを、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ逆転写キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡに変換した。ＲＴ−ＰＣＲは、マウスＭｐｅｇ−１およびハウスキーピング対照遺伝子としてのＧＡＰＤＨについて、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。全てのアッセイは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００  ＰＣＲプラットフォーム上で実施した。
【０２４１】
抗体：ウサギ抗Ｍｐｅｇ１および抗ＧＦＰポリクローナル抗体をＡｂｃａｍから入手し、ウェスタンブロット分析に使用した。ウサギ抗Ｐ２（細胞質ドメイン）抗血清は、２１ｓｔ  Ｃｅｎｔｕｒｙより作製したものを得た。
【０２４２】
ＲＮＡ干渉：３つのＰ２特異的に化学合成された１９ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ二重鎖を、Ｓｉｇｍａから入手した。２つのｓｉＲＮＡは、Ｐ２の３’ＵＴＲに相補的で、もう１つはコード領域に相補的であった。配列を次に示す：ＣＣＡＣＣＵＣＡＣＵＵＵＣＵＡＵＣＡＡ（配列番号１）、ＧＡＧＵＡＵＵＣＵＡＧＧＡＡＡＣＵＵＵ（配列番号２）、およびＣＡＡＵＣＡＡＧＣＵＣＵＵＧＵＧＣＡＣ（配列番号３）。マクロファージおよびミクログリア細胞へのｓｉＲＮＡのトランスフェクションは、Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｏｎｚａ）を用いて製造元の説明書に従い行った。全てのトランスフェクションは、４×１０6個の細胞および最終濃度が１μＭのｓｉＲＮＡを用いて行った（Ｐ２特異的ｓｉＲＮＡをプールした）。トランスフェクション後直ちに細胞を１０％ＦＢＳを含有し抗生物質を含まないＩＭＤＭにプレーティングした。
【０２４３】
共焦点顕微鏡：生細胞を画像化するために、ＲＡＷ細胞をＰ２ＧＦＰでヌクレオフェクトし、ガラス底ディッシュ内でＮｏ．１．５カバーガラス（ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐ．）を用いＬＰＳ（１ｎｇ／ｍｌ）およびＩＦＮ−γ（１００Ｕ／ｍｌ）で一晩刺激した。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、オルガネラを標識した。小胞体（ＥＲ）標識では、ＥＲ−ＴＲＡＣＫＥＲ（商標）Ｂｌｕｅ−Ｗｈｉｔｅ  ＤＰＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、１μΜの作業濃度で３７℃３０分間使用した。他の全ての染色では、トランスフェクトした細胞を室温で１５分間３％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、０．５％サポニンで透過し、１０％正常ヤギ血清でブロックし、そして一次抗体および二次抗体と共にインキュベートした。抗ＣＤ１０７ａ（ＬＡＭＰ−１）（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、抗ＣＤ１１ｂ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、抗ｇｏｌｇｉｎ９７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、抗ＥＥＡ１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、抗ＧＭ１３０（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して細胞オルガネラを同定した。二次抗体は、全てヤギで上昇した。画像を、電動ステージ付のＬｅｉｃａ  ＳＰ５倒立共焦点顕微鏡で撮影し、Ｌｅｉｃａアプリケーションスイートの改良型蛍光ソフトウェアを用いて分析した。
【０２４４】
結果と考察
マクロファージは、Ｍｐｅｇ１  ｍＲＮＡを構成的に転写する。Ｍｐｅｇ１  ｍＲＮＡからは、典型的に細胞溶解性孔形成タンパク質で見られるＭＡＣＰＦドメインを有するタンパク質が予測される。ＭＡＣＰＦドメインの主に見られるメンバーは、細胞外細菌を殺傷する膜攻撃複合体の孔形成補体成分Ｃ９、ならびにウイルス感染細胞や腫瘍細胞を殺傷するＴおよびＮＫリンパ球の孔形成分子であるパーフォリン１である。孔の形成は、構造変化を介したＭＡＣＰＦドメインの重合によって達成され、これにより４個の両親媒性β鎖の膜挿入が起こり、穿孔され標的細胞の死へつながる。本実施例では、Ｍｐｅｇ１が、重合により集合して膜を貫通する孔を形成するパーフォリン２（Ｐ２）と命名された新規孔形成タンパク質をコードすることを示している。マクロファージにおいてＰ２は、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ならびにメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）の臨床分離株を含む細胞内の病原性細菌に対し強力な殺傷活性を有する。重要なことに、Ｐ２は、ＲＯＳおよびＮＯの抗菌活性にも寄与している。
【０２４５】
マクロファージにおける殺菌性応答について現在理解されているのは、ファゴソーム内のＲＯＳおよびＮＯ等の酸化メカニズムならびにファゴソームとリソソームとの融合が介在していることである。細菌の細胞内殺傷におけるＲＯＳおよびＮＯと比較したＰ２の役割を評価するために、各殺菌エフェクターを、個別にまたはＰ２と組み合わせてブロックし、ゲンタマイシン保護アッセイを利用して腹腔マクロファージ（ＰＥＭ）における細胞内細菌の生存を感染後１および５時間で測定した（図１Ａ〜１Ｃ）。ゲンタマイシンは、膜不透過性であり、細胞外培地中にのみ存在する。ＲＯＳまたはＮＯの阻害あるいはＰ２により、異なる細菌に対し個々に異なる効果があった。阻害剤を存在させずにＰＥＭにネズミチフス菌を使用すると、１時間後に細胞内に存在する細菌の９０％までが５時間後には死滅した（〜１０％生存率、図１Ａ）。抗酸化剤およびＲＯＳスカベンジャーのＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）によりＲＯＳをブロックして５時間後には、ネズミチフス菌の１時間のレベルと比べ〜８０％の生存が可能であった。このことによりＲＯＳの助けがなくとも殺傷されたのはたったの２０％であったことがわかる。一酸化窒素シンターゼ阻害剤ＮG−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステル塩酸塩（Ｌ−ＮＡＭＥ）によるＮＯのブロックはＮＡＣと同様の効果を有する。一方、Ｐ２特異的ｓｉＲＮＡを用いたトランスフェクションによりＰ２をノックダウンすると（図５Ａおよび５Ｂにノックダウン効率のデータを示す）、例えＲＯＳおよびＮＯがブロックされていなくとも、殺傷がすべて阻害され、ネズミチフス菌の細胞内複製が可能になった（図１Ａ）。重要なことに、Ｐ２ノックダウンとＮＡＣまたはＬ−ＮＡＭＥとの組合せは、単独のＰ２のブロックのみによってもたらされる上述の細胞内複製を更に増加させることはなく、このことよりＰ２は、抗菌経路におけるＲＯＳおよびＮＯの両者の介在物であることが示唆される。言い換えると、Ｐ２なしでは、ＲＯＳおよびＮＯはネズミチフス菌の殺傷にほとんど影響を及ぼさないということである。
【０２４６】
阻害剤が存在しないと、感染から５時間後でＭ．スメグマチスの約３０％が生存しており、ＰＥＭによる殺傷に対し相対的に抵抗性があることが示される（図ＩＢ）。ＲＯＳまたはＮＯをブロックすると、それらの生存率が６０％まで増大するので、殺傷に対し３０％の寄与度があることが証明された。一方、Ｐ２をノックダウンすると、Ｍ．スメグマチスについては、ほとんどすべての殺菌活性が阻害されて、Ｐ２がＲＯＳとＮＯの毒性に介在することをさらに示唆している（図１Ｂ）。非病原性大腸菌Ｋ１２は、阻害剤が存在しない場合、ＰＥＭによる殺傷に対し最も感受性が高い（１００％の殺傷、図１Ｃ）。ＲＯＳおよびＮＯの阻害またはＰ２のノックダウンにより、それぞれ、３０％まで、４０％まで、および６０％までの生存が可能になり、非病原性大腸菌は、カタラーゼおよび酸化防止剤の生産といったＲＯＳおよびＮＯ耐性メカニズムに加えてより強固な細胞壁により防御可能な病原性細菌に比べて、Ｐ２が存在しない場合ＲＯＳおよびＮＯに対してより感受性が高いことが示唆される。阻害剤は、ＰＥＭの非存在下で、細菌増殖に対し影響を及ぼさなかった（図６）。このデータは、Ｐ２により細菌の外側細胞壁が損傷すると、ＲＯＳおよびＮＯのアクセスが容易になることで基礎となる細菌構造に不可逆的な損傷が起こり、その結果、感染から最初の５時間の間に細菌が死滅するということを証明するものである。この状況は、グランザイム介在性の細胞死に必要なパーフォリン１、および細菌プロテオグリカン層へリゾチームのアクセスを可能にして構造の崩壊をもたらす補体のＭＡＣと類似する。
【０２４７】
Ｐ２は、海綿動物からヒトまで高度に保存されており（図７）、基本的な機能として重要であることを示している。ＭＡＣＰＦドメインのＣ末端が、ここでＰ２ドメインと呼ばれる新規な保存ドメインであり（図２Ａ）、すべてのパーフォリン２オルソログで保存されているが、他のいかなるタンパク質ドメインに対しても相同性を示さない。免疫系の他の可溶性孔形成物質とは異なり、Ｐ２は、典型的な貫通配列および細胞質ドメインを含む１型膜タンパク質である。エフェクター−ＭＡＣＰＦドメインは、先端がＥＲの内腔または出芽輸送小胞の方を向いている。短い細胞質ドメインが、細胞の細胞質内に延び、古典的な調節エレメントを提示しているのだが、このことについてはＰ２重合のメカニズムを決定するために現在研究中である。
【０２４８】
Ｐ２が膜結合孔を生成したか否かを決定するために、完全なオープンリーディングフレームを組み立て、細胞質ドメインのＣ末端に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を融合させて、ＨＥＫ−２９３細胞へトランスフェクトした。Ｐ２−ＧＦＰは、Ｐ２に対する市販のポリクローナル抗ペプチド抗血清、Ｐ２の細胞質ドメインに対し我々が作成したポリクローナル抗血清、または抗ＧＦＰ抗体を用いたイムノブロットにより検出した（図８）。Ｐ２−ＧＦＰ蛍光膜は、細胞溶解および分画遠心法により得られ、トリプシンで処理する。これにより膜タンパク質は除去されるが、パーフォリン１およびＭＡＣ孔は除去されない。トリプシンは、Ｐ２の細胞内ドメインを切断するが、Ｐ２孔は切断しないので、約２０万倍の倍率でネガティブ染色電子顕微鏡検査した図２Ｂに示すように、Ｐ２孔は膜に結合したままである。この写真は、第一の物理的証拠を代表するものであり、Ｐ２が実際に細胞溶解活性を有する孔形成タンパク質であることを示す画像である。同様にトリプシン処理した非トランスフェクト２９３細胞由来の対照膜は、孔複合体を欠いていた（図示せず）。中空円筒ポリＰ２複合体は、９．２ｎｍの平均内径を有し、これに比較して、ポリパーフォリン１は１６ｎｍの直径そしてポリＣ９は、１０ｎｍの直径を有していた（図２Ｇ）。微細構造は、１２〜１４プロトマーのポリマー組成物を示しているようだ。不完全に組み立てられた孔は、重合プロセスを示す（図２Ｃ、矢印）。側面図では、複合体が外側に１２または２５ｎｍのいずれか分突出している（図２Ｅおよび２Ｆ；平行の矢印）。
【０２４９】
ＰＥＭに加え、骨髄由来のマクロファージ／樹状細胞（ＢＭＤＭ／ＢＭＤＣ）およびマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）およびミクログリア（ＢＶ２）細胞株は、ゲンタマイシン保護アッセイの測定によると、貪食されたＭＲＳＡ、マイコバクテリア、ネズミチフス菌、および大腸菌に対し強力な細胞内殺傷メカニズムを有する（図３Ａ〜３Ｉ）。マクロファージ、ＢＭＤＭ／ＤＣ、およびミクログリアは、構成的にＰ２を発現し、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）およびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）処理の際に、Ｐ２  ｍＲＮＡおよびタンパク質発現を上方制御する（図９Ａ〜９Ｄ）。Ｐ２を、Ｐ２特異的ｓｉＲＮＡを用いたトランスフェクションによりＲＡＷ、ＢＶ２、ＢＭＤＭ／ＤＣ、またはＰＥＭ中でノックダウンし、スクランブルｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞と細胞内殺菌活性について比較した。Ｐ２  ｍＲＮＡのノックダウン効率は、８０〜９５％であり（図５Ａ、５Ｂ）、そしてタンパク質では９０％超であった（図３Ｅ）。Ｐ２をノックダウンすると、ＲＡＷ、ＢＶ２、ＢＭＤＭ／ＢＭＤＣ、およびＰＥＭ細胞において細菌の細胞内殺傷が強く阻害された（図３Ａ〜３Ｄおよび図１０Ａ〜１０Ｅ）。Ｐ２のノックダウンは、高病原性Ｍ．アビウム、ＭＲＳＡ、およびネズミチフス菌、ならびに非病原性大腸菌およびＭ．スメグマチスの細胞内殺菌を阻害した（図３Ａ〜３Ｄ）。細胞生存率は、トランスフェクション後または感染期間中では、ノックダウンによる影響について対照細胞と違いがなかった（図示せず）。ＲＡＷのトランスフェクションによるＰ２−ＲＦＰの過剰発現により、Ｍ．アビウムの細胞内殺傷が増加しており、これはＰ２の細胞内殺傷機能と一貫する（図３Ｆ、３Ｇ、および図１１Ａ〜１１Ｆ）。細胞生存率は、トランスフェクション後および感染期間中では、Ｐ２−ＲＦＰの発現について、対照細胞と同等であった（図示せず）。細胞内殺傷活性が減少した原因となり得るＰ２ノックダウンにより受ける可能性のある他の細胞成分への望ましくない影響を排除するために、内因性Ｐ２を、Ｐ２の３’ＵＴＲと相補的なＰ２  ｓｉＲＮＡでノックダウンし、Ｐ２の３’ＵＴＲを欠くＰ２−ＲＦＰ  ｃＤＮＡを用いたトランスフェクションによりＰ２活性を再構成した（図３Ｈ、および図１２Ａ、１２Ｂ）。ウェスタンブロットで確認したところ、内因性Ｐ２のノックダウンおよびＰ２−ＲＦＰの補充により、細胞内殺菌活性は完全に回復し（図３１）、Ｐ２は細胞内細菌破壊の原因であることが示された。
【０２５０】
Ｐ２の細胞内局在を決定するには、マクロファージをＰ２−ＧＦＰでトランスフェクションすることが必要である。Ｐ２に対する市販のポリクローナル抗ペプチド抗体は、天然Ｐ２を認識しない（データは示さず）。これまでのところ、天然Ｐ２に対するモノクローナル抗体の作成は成功していない。これはおそらく高度に保存されているためであろう（図５Ａ、５Ｂ）。Ｐ２−ＧＦＰの過剰発現による人為的な影響を回避するために、ＲＡＷ細胞を、Ｐ２−ＧＦＰの発現が依然として低い初期の時点である一過性トランスフェクション後に分析した。ＧＦＰ単独とは異なり、Ｐ２−ＧＦＰは主に、ＥＲ、ゴルジ、およびトランスゴルジ網膜に局在し、細胞膜、リソソーム、および初期エンドソームからは除外されていた（図４Ａ〜４Ｄおよび図１３Ａ〜１３Ｃ）。報告されているＥＲ膜とファゴソーム膜との融合により、Ｐ２のファゴソーム膜へのアクセスが可能になる。ここにおいて、Ｊ７７４マウス細胞株の精製ファゴソーム中にラテックス粒子が含まれることが質量分析により検出された。従って、Ｐ２は、細胞内細菌のファゴソーム内部の殺傷に必要な場所に存在する。
【０２５１】
本明細書の研究では、マクロファージは新規孔形成タンパク質であるパーフォリン２を含んでおり、パーフォリン２は、膜結合しており、広範囲の病原性細菌種に対し強力な細胞内殺菌機能を有することを確立する。Ｐ２の存在によってＲＯＳおよびＮＯの殺菌活性が強く増強され、Ｐ２の細胞壁損傷活性により、リゾチームを含む低分子のアクセスが可能となり、細菌のペプチドグリカン層または内膜およびＤＮＡが攻撃される。Ｐ２の重合活性化の分子メカニズムは知られていないが、Ｐ２の細胞質ドメインの機能に着目した本格的な研究が行われている。Ｐ２および細胞内細菌の長い進化的な拮抗作用を考えると、Ｐ２の攻撃を回避するための細胞内病原体の回避戦略を研究することが非常に関心を集めるだろう。
【０２５２】
Ｐ２は、原始海綿動物および他の無脊椎海洋生物にすでに存在し元々備わっている先天性の免疫防御のための孔形成タンパク質であるようだ。Ｐ２は、事実上すべての体細胞で誘導可能で、それらの体細胞を細胞内細菌の増殖から保護するものである。古代からＰ２が、先天性の免疫防御の重要な抗菌成分であり続けている。
【０２５３】
実施例２：Ｐ２の調節
ｓｒｃキナーゼがＰ２の活性化の要因であり、オートファジーが細菌の殺傷に重要であるだろうと仮定した。さらに、酵母ツーハイブリッドシステムを用いて、Ｐ２の細胞質ドメインと相互作用する７個のタンパク質が同定されたことにより、これらがＰ２の活性化に関与している証拠となる。これらのタンパク質を表１に示す。
【０２５４】
Ｐ２は、殺傷のためのＰ２の活性化に関与する膜貫通ドメインを有する。Ｐ２は、高度に保存されたＹとＳ、そして保存されたＲＫＹＫＫＫ（配列番号４）ドメイン（ＧＴＲＫＹＫＫＫＥＹＱＥＩＥＥ；配列番号６）を有する。
【０２５５】
ｓｒｃ、ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｍ（Ｕｂｃ１２）、ＧＡＰＤＨ、Ｐ２１  ＲＡＳ／ｇａｐ  １ｍ（ＲＡＳＡ２）、ガレクチン３、およびＵＣＨＬ１をノックダウンすると、ミクログリアおよび線維芽細胞による細菌の殺傷が妨害された。よって、これらの分子は、細菌のＰ２に依存する殺傷を活性化するのに重要である。また、ＡＴＧ１４をノックダウンしても、Ｐ２が介在する殺傷が妨害され、これがＰ２１  ＲＡＳおよびオートファジーへつながっている。小さな薬物または生物製剤を用いてこれらのＰ２活性タンパク質を調節（ブロックまたは増強）することにより、Ｐ２活性が増加または低下するであろう。Ｐ２は全ての組織でなくとも多くの組織において発現されるので、抗微生物制御に極めて重要なのは明らかである。同時に、調節がうまくいかないと、自己攻撃的な自己免疫疾患（上方制御された活性）または免疫不全（下方制御）につながる可能性がある。病原性細菌は、活性化カスケードをブロックすることにより、Ｐ２の活性化を妨害する可能性がある。このような妨害に対抗するのは、薬剤耐性菌による感染患者を治療および治癒することになり得るだろう。
【０２５６】
要約すると、Ｐ２活性化の分子メカニズムは、広範囲の病気に有用である新薬開発の可能性が高い（ｄｒｕｇｇａｂｌｅ）標的を提供する。
【０２５７】
【表１】
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【０２５８】
実施例３：体細胞が、タンパク質パーフォリン２の孔形成による殺菌機能に介在する。
マクロファージ、樹状細胞、およびミクログリアは、病原性細胞内細菌を殺傷するパーフォリン２（Ｐ２）と命名された孔形成タンパク質を構成的に発現する。Ｐ２は、膜を損傷することにより細菌を殺傷し、活性酸素種（ＲＯＳ）および一酸化窒素（ＮＯ）の殺菌効果を増強する。これにより物理的損傷を起こし細菌の感受性の高い層へアクセスさせることが証明される。上皮細胞、線維芽細胞、および他の非造血由来細胞は、細菌が侵入すると、オートファジー関連メカニズムおよび抗菌性化合物を利用することにより細胞内細菌感染を除去する。これらの実験以前は、非造血細胞はＰ２を発現して細菌を除去するために利用することができるのか否かが不明であった。これは、初代ヒト角化細胞が構成的にＰ２  ｍＲＮＡを発現すること、そしてこれまでに分析した全ての体細胞は、１型および２型インターフェロンによりＰ２  ｍＲＮＡを発現するように誘導できることを示す最初の報告である。また、Ｐ２特異的ｓｉＲＮＡにより内因性Ｐ２をノックダウンすると、殺菌活性が阻害される。この細菌活性はＰ２−ＲＦＰを補充すると回復されるが、ＲＦＰを補充しても回復されない。
【０２５９】
材料と方法
ヒト細胞：以下の細胞を使用した。臍帯静脈内皮細胞、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２膵臓癌細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１４２０）、ＵＭ−ＵＣ−３膀胱癌細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７４９）、ＵＭ−ＵＣ−９膀胱癌細胞２３、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）、および初代角化細胞。ＨＵＶＥＣをＬｏｎｚａ  ＥＧＭ−２  ｂｕｌｌｅｔキットで増殖させた。初代ヒト角化細胞は、先に記載のように増殖させた（Ｗｉｅｎｓ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８０，２７９４９−２７９５９，ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ５０４０４９２００（２００５））。他のすべての細胞は、ＡＴＣＣの推奨に従って増殖させた。全ての細胞を、５％ＣＯ2を含む加湿雰囲気中３７℃で培養した。
【０２６０】
マウス細胞：ＣＴ２６直腸癌細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２６３８）、ＣＭＴ−９３直腸癌細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２２３）、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−６４７５）、Ｎｅｕｒｏ２ａ神経芽腫細胞、ＣＡＴＨ．ａ神経芽腫細胞。卵巣癌のＭＯＶＣＡＲ５００９およびＭＯＶＣＡＲ５０４７を、Ｆｏｘ  Ｃｈａｓｅ癌センターから購入した。ＮＩＨ／３Ｔ３線維芽細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５８）、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７７２）、初代髄膜線維芽細胞、および初代星状細胞を先に記載のように単離した（Ｓａｂｉｃｈｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｕｒｏｌｏｇｙ  １７５，１１３３−１１３７，ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ００２２−５３４７（０５）００３２３−Ｘ（２００６）；Ｔｏｍｉｃ−Ｃａｎｉｃ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｗｏｕｎｄ  ｒｅｐａｉｒ  ａｎｄ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ：  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ［ａｎｄ］  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １５，７１−７９，ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１５２４−４７５Ｘ．２００６．００１８７．ｘ（２００７））。すべての細胞株は、ＡＴＣＣのガイドラインに従って増殖させ、５％ＣＯ2を含む加湿雰囲気中３７℃で培養した。
【０２６１】
化学物質：ＭＧ−１３２、ニワトリ卵白リゾチーム、およびリポ多糖（ＬＰＳ）は、Ｓｉｇｍａから購入した。組換えマウスＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、組換えヒトＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−βはｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈから購入した。組換えヒトＩＦＮ−αはＲ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓから購入した。マウスＩＬ−１βは、指示する場合１０Ｕ／ｍＬとなるように補充した。マウスＩＬ−１βは、１ｎｇ／ｍｌとなるようにした。マウスＴＮＦαは、２０ｎｇ／ｍｌとなるように補充した。マウスＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、およびＩＦＮ−γは、１００Ｕ／ｍｌとなるように補充した。ヒトＩＦＮ−αは、指示する場合１５０Ｕ／ｍｌの濃度となるように補充した。ヒトＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−γは、１００Ｕ／ｍｌの濃度となるように補充した。ＬＰＳを１ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した。
【０２６２】
プラスミド構築物：ネズミＭｐｅｇ−１  ｃＤＮＡの完全コード領域を、いくつかのＥＳＴクローンから構築し、ｐＥＧＦＰ−Ｎ３プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に挿入した。単量体ＲＦＰを、ＧＦＰの代わりにクローニングし、いくつかの実験で使用した。
【０２６３】
ネガティブ染色透過型電子顕微鏡検査：ｍＥＦをＩＦＮ−γ（１００Ｕ／ｍＬ）で１４時間刺激し、そして、記載の細菌株に３０の感染多重度で５時間感染させた。原核生物膜は、１％Ｉｇｅｐａｌを含むｄｄＨ２Ｏを用いてｍＥＦを溶解して回収した。溶解物は、２００ｇで１０分間遠心分離し、無傷の細菌をペレット化した。得られたペレットを、最小ｄｄＨ２Ｏ中で再懸濁し、洗浄し、そして３％ギ酸ウラニル（ＵＦ）で３０秒間ネガティブ染色した。画像は、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＣＭ１０透過型電子顕微鏡で５２，０００倍の初期倍率で撮影した。
【０２６４】
抗体：ウサギ抗Ｍｐｅｇ１ポリクローナル抗体をＡｂｃａｍから入手し、ウェスタンブロット分析に使用した。
【０２６５】
ｑＲＴ−ＰＣＲ：ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ）の説明書に従い細胞から抽出した。１μｇのＲＮＡを、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ逆転写キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて同社のプロトコルに従いｃＤＮＡに変換した。ｑＲＴ−ＰＣＲは、マウスＭｐｅｇ−１およびハウスキーピング対照遺伝子としてＧＡＰＤＨについて、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。ヒト組織については、ヒトＭｐｅｇ１およびＧａｐＤＨプローブを利用した。全てのアッセイは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００  ＰＣＲプラットフォーム上で実施した。
【０２６６】
ＲＮＡ干渉：マウス細胞については、３つのｍｐｅｇ１特異的に化学合成された１９ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ二重鎖を、Ｓｉｇｍａから入手した。２つのｓｉＲＮＡは、Ｐ２の３’ＵＴＲに相補的で、もう１つはコード領域に相補的であった。配列を次に示す：ＣＣＡＣＣＵＣＡＣＵＵＵＣＵＡＵＣＡＡ（配列番号１）、ＧＡＧＵＡＵＵＣＵＡＧＧＡＡＡＣＵＵＵ（配列番号２）、およびＣＡＡＵＣＡＡＧＣＵＣＵＵＧＵＧＣＡＣ（配列番号３）。反応の対照としてスクランブルｓｉＲＮＡも作製した。ヒト細胞については、３つのヒトｍｐｅｇｌ特異的サイレンサー選択ｓｉＲＮＡをＡｍｂｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から購入した。そのサイレンサー選択番号はｓ６１０５３、ｓ４７８１０、ｓ６１０５４である。Ａｍｂｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のサイレンサー選択陰性対照＃２も使用した。
【０２６７】
トランスフェクション：一過性トランスフェクションを、Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｏｎｚａ）を用いて各細胞株について最適化された製造元のプロトコルに従い行った。
【０２６８】
ゲンタマイシン保護アッセイ：ネズミチフス菌株ＬＴ２Ｚ、マイコバクテリウム・スメグマチス、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、および大腸菌Ｋ１２株を、ルリアブロス（ネズミチフス菌、黄色ブドウ球菌、および大腸菌）またはミドルブロック７Ｈ９ブロス（Ｍ．スメグマチス）中で２４時間振盪しながら３７℃でグリセロールストックから増殖した。ネズミチフス菌、黄色ブドウ球菌、および大腸菌については、培養物をその後ＬＢで１：３３に希釈し、そしてさらに３時間増殖させて感染前に対数期に到達させた。真核細胞は、各細胞について最適化されたＬｏｎｚａのプロトコルに従ってトランスフェクトし、トランスフェクト後１２ウェルプレートにプレーティングした。その後、細胞をＩＦＮ−γ（１００Ｕ／ｍｌ）で１４時間刺激した。細胞を３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターで、３０分間（ネズミチフス菌）または１時間（黄色ブドウ球菌、大腸菌、およびＭ．スメグマチス）、１０〜６０の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。感染後、細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含有する新鮮な培地を添加した。２時間後、培地のゲンタマイシンの濃度を５μｇ／ｍｌに低下させた。指示した時点で、細胞をＰＢＳで洗浄し、１％Ｉｇｅｐａｌを含むｄｄＨ２Ｏで溶解、希釈し、ＬＢ寒天プレート（ネズミチフス菌、黄色ブドウ球菌、大腸菌）またはミドルブロック７Ｈ１１プレート（Ｍ．スメグマチス）に三連でプレーティングし、十分なコロニーが増殖してからＣＦＵを決定した。
【０２６９】
リゾチームの殺傷活性：上述のゲンタマイシン保護アッセイに続き、溶解後に溶解物を６個の等量の画分に分け、その半分をリゾチームの最終濃度が４０μｇ／ｍｌとなるようにし、残りには等量の緩衝液を加えた。すべての画分は、３０分間氷上でインキュベートしてから、ＣＦＵ分析用に二連でプレーティングをした。
【０２７０】
統計解析：まず、データを、コルモゴロフ・スミルノフ検定（Ｋ−Ｓ検定）に従って解析し、ガウス分布が存在するかどうかを決定した。得られた統計を使用して、データを各実験における独立変数の数に応じて解析した。両群間で比較し、データがＫ−Ｓ検定によるガウス分布にフィットする場合、対応のないｔ検定を用いた。ガウス分布が存在しない場合、マン・ホイットニー検定を行い統計的有意性を評価した。３つ以上の群の解析では、ガウス分布が存在する場合、ボンフェローニポストホック検定を応用したｏｎｅ−ｗａｙで対応なしのＡＮＯＶＡを行った。ガウス分布が存在しない場合、ボンフェローニポストホック検定を使用したクラスカル・ウォリス検定を行った。
【０２７１】
結果と考察
今日までに分析されたヒトおよびマウスの初代細胞および細胞株は全て、インターフェロンの誘導によりＰ２  ｍＲＮＡを急速に発現する（図１４Ａ〜１４Ｊ、表２、および図１８Ａ〜１８Ｉ）。刺激していない初代マウス胚性線維芽細胞（ｍＥＦ）は、ＴＡＱＭＡＮ（商標）ＰＣＲによる３９サイクル後でも、検出可能レベルのＰ２  ｍＲＮＡを発現しない（図１４Ａ）。インターフェロン（ＩＦＮα、β、またはγ）は、添加によりそれぞれ単独でＰ２  ｍＲＮＡを上方制御し、一緒に添加すると高レベルのＰ２  ｍＲＮＡを誘導した。対照的に、ＬＰＳ、ＩＬ−１α、およびＴＮＦαはｍＥＦ中のＰ２  ｍＲＮＡを誘導しない。個体差があるものの、検査したマウスおよびヒト由来の初代細胞および確立細胞株の全てにおいて、このパターンのＰ２誘導がみられた（図１４Ａ〜１４Ｆ、図１８Ａ〜１８Ｉ、および表２の完全なリスト）。ＩＦＮによるＰ２  ｍＲＮＡの強力な上方制御にも関わらず、Ｐ２タンパク質は、プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２を添加しない限り、インターフェロンで活性化したｍＥＦのウェスタンブロット分析によって検出されない（図１４Ｇ）。このことは、急速なＰ２タンパク質のターンオーバーは、プロテアソームの分解を介して生じていることの証明となる。これらの発見の例外が、Ｐ２  ｍＲＮＡおよびタンパク質を構成的に発現する初代ヒト角化細胞で起こる（図１４Ｈ）。
【０２７２】
ＬＰＳは、ｍＥＦ中でＰ２  ｍＲＮＡを誘導できないが、ｍＥＦを大腸菌Ｋ１２またはマイコバクテリウム（Ｍ．スメグマチス）と共にインキュベーションすると、１０時間目でかなりのＰ２  ｍＲＮＡレベルの上方制御が検出され、２４時間以内にＰ２  ｍＲＮＡ発現の強い増加が見られた（図１４Ｉ）。２型ＩＦＮを用いたＰ２の前誘導により、ゲンタマイシン保護アッセイにおいて、ｍＥＦは１〜５時間以内で急速にＭ．スメグマチスの細胞内殺傷が可能となった（図１４Ｊ）。ゲンタマイシンは、無傷の細胞において、この期間中膜不透過性である。対照的に、非誘導のｍＥＦをＭ．スメグマチスと共にインキュベートすると、マイコバクテリアの細胞内殺菌は約１６時間まで遅延し、効率性が低かった（図１４Ｊ）。Ｐ２  ｍＲＮＡレベルと細胞内殺菌活性との関連による因果関係が示唆される。
【０２７３】
細菌がＰ２を介在して殺傷されるなら、（１）ｍＥＦにより殺傷された細菌の細胞壁上に傷害が電子顕微鏡でみられる、および（２）Ｐ２  ｍＲＮＡをＰ２  ｓｉＲＮＡでノックダウンすることにより細胞内殺傷が阻害されることが予測される。感染から５時間後に宿主細胞を界面活性剤により溶解して、細胞内Ｍ．スメグマチスまたはメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を２型ＩＦＮ誘発性ｍＥＦから単離した。コロニー形成の欠如によって示されるように（図１４Ｊ）、この時点で細胞内マイコバクテリアの大部分が死滅している。遠心分離によって細胞溶解物から細菌を分離する。膜結合Ｐ２ポリマーは、ポリパーフォリン１およびポリＣ９と同様に、トリプシン切断に対し抵抗性があるので、細菌ペレットをトリプシンおよびリゾチームで処理し、次いで２５０，０００倍の倍率でネガティブ染色電子顕微鏡により検査した。マイコバクテリアやブドウ球菌の膜の画像は、ポリＰ２について予想される形態に準じた傷害を示し（図１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｄ、１５Ｅ）、これらの画像は、ＨＥＫ２９３膜上のＰ２が安定して過剰発現する陽性対照（図１５Ｃ）および補体膜侵襲複合体（ＭＡＣ）による大腸菌の傷害（図１５Ｆ）に類似していた。円形または不規則に融合したクラスターであり、ネガティブ染色し平均内径が９〜１０ｎｍの傷害が、ＭＲＳＡ細胞壁の背景上に見られ（図１５Ａの矢印）、図１５Ｂにより高倍率で示す。これ以外の背景は滑らかであった。類似した膜傷害がＭ．スメグマチス膜上にも見られる。これらを２つの倍率で示す（図１５Ｄおよび図１５Ｅの矢印）。Ｐ２傷害のクラスターが、細菌膜上でパッチ状に見られ、細菌がＰ２を有する膜と局部的に接触し、その結果、Ｐ２の重合およびポリＰ２の細胞外壁への挿入が起こって、傷害が顕微鏡上に見えるようになることが示唆される。直腸上皮癌細胞ＣＭＴ９３は、ゲンタマイシン保護アッセイにおいて、Ｍ．スメグマチス、ＭＲＳＡの臨床分離株、ネズミチフス菌、および大腸菌Ｋ１２を殺傷する（図１６Ａ〜１６Ｄ）。ＲＦＰをタグ付けしたＰ２−ＲＦＰを用いてＣＭＴ９３をトランスフェクトすると殺傷力が増強されるがＲＦＰ単独では増強されない。対照的に、Ｐ２  ｓｉＲＮＡにより殺菌活性が除去されるが、スクランブルｓｉＲＮＡでトランスフェクトしても除去されない。このことにより大腸菌以外の全ての試験細菌は細胞内で複製する。ＭＲＳＡおよびＭ．スメグマチスは、数時間後この複製により宿主細胞を殺し、ゲンタマイシンを含む培地中に放出され、ここで当該抗生物質によって殺傷される。アッセイは、ほとんどの場合、最初の５時間に限られており、この間にほとんどのＰ２依存性殺傷が起こる。内因性Ｐ２を欠いている細胞における細菌の殺傷は、内因性Ｐ２の３’ＵＴＲの欠失によるノックダウンに耐性のＰ２−ＲＦＰをトランスフェクトすることによって回復できた(図１６〜Ｅ）。
【０２７４】
構成的または誘導的にＰ２  ｍＲＮＡを発現するすべてのマウスおよびヒト細胞は、４つの細菌株の全てを殺傷できる。図１６Ｆ〜１６Ｌおよび補足図２０Ａ〜２０Ｂの例に示すように、Ｐ２  ｓｉＲＮＡは細胞内殺傷活性を阻害するので、細菌のＰ２介在性細胞内殺傷は、細胞内細菌の侵入を阻止する自然免疫の重要な要素であることの証明となる。
【０２７５】
位相差光学顕微鏡によりプレーティングした細菌を検査すると、コロニー形成アッセイにおけるコロニーの早期決定および計数が可能になり、肉眼で見えるコロニーを形成するのに２〜３日を要していたところ顕微鏡だとプレーティングから１２時間後で既に検出できるマイコバクテリアについて特に時間の節約になる。このようにＭ．スメグマチスを検査すると、宿主細胞から単離した細菌の大部分は５時間後には腫脹しこの膨らんだ菌体はコロニーを形成しないことに注目した。これは、それらの細菌が死滅していることを示している（図１７Ａ、１７Ｂ）。培養物から新鮮なままプレーティングした生存マイコバクテリアは、コルク栓のような形態（図１７Ａ）を有し、コロニーを形成できた（図示せず）。５時間目に単離したマイコバクテリアにｉｎ  ｖｉｔｒｏ氷上で３０分間リゾチームを加えた（図１７Ｃ）ところ、膨らんだ菌体の大部分が消失しそれらの溶解は起こったが、少数のコロニー形成初期生菌のコルク栓状の形態には影響なかった（図１７Ｃの矢印）ことが示された。細菌の細胞壁中のポリＰ２による傷害は、したがって、リゾチーム溶菌に対する感受性を仲介している。感受性はすべての細菌を計数し、膨らんだ菌体についてリゾチーム添加ありなしの場合の割合を計ることによって定量される（図１７Ｅ）。
【０２７６】
リゾチームの影響下でのＰ２による細胞壁への損傷の効果について、さらに、Ｍ．スメグマチス、ＭＲＳＡ、および大腸菌を使用したｍＥＦおよびＣＭＴ９３細胞におけるＰ２のノックダウンおよびＰ２の過剰発現より研究したところ、これらの細菌は損傷を受けていない場合は全てリゾチーム耐性であった（図１７Ｅ〜１７Ｊ、図２３Ａ〜２３Ｃ）。通常のＰ２レベルを含む、スクランブルｓｉＲＮＡ対照では、宿主細胞の界面活性剤による溶解後の様々な時点で得られた細菌に対しリゾチームを添加すると、コロニー数が有意に減少した（図１７Ｅおよび１７Ｈ）ので、いくつかの細菌は細胞壁を損傷しているが、ポリＰ２による細胞壁の損傷によりアクセスが可能になったリゾチームにより細菌が溶解されない限り、修復可能であることがわかる。リゾチームの殺菌効果は、Ｐ２をＰ２  ｓｉＲＮＡによってノックダウンする場合検出されない（図１７Ｆおよび１７Ｉ）ので、ポリＰ２介在性の細胞壁の損傷はないものの、この殺菌効果は内因性Ｐ２と共にＰ２−ＲＦＰが過剰発現されると顕著になりＰ２介在性の細胞壁の損傷につながっている（図１７Ｇおよび１７Ｊ）ことが示唆される。
【０２７７】
上記のデータは、明らかにすべての細胞がキラー細胞となり、孔形成タンパク質パーフォリン２を利用して細胞内細菌の侵入を排除する能力を有することを示している。Ｐ２は非常に早期に作用し、脂質層への挿入および重合によって細菌の細胞壁に損傷を与える。脂質層への挿入および重合は、補体による膜攻撃におけるＣ９の重合、ならびにウイルス感染細胞および腫瘍細胞へのＣＴＬによる攻撃におけるパーフォリン１ポリマーの重合と類似する。３つの孔形成因子は全てＭＡＣＰＦドメインが共通することが示される。ＭＡＣＰＦドメインは、パーフォリン１の重合を引き起こすことが示されており、パーフォリン２と同じ機能を介在している可能性が高い。ＭＡＣのポリＣ９による孔により血清リゾチームがアクセスできるようになり、これが、細菌溶解および構造崩壊をもたらす。これは、ポリパーフォリン１の孔によりグランザイムがアクセスできるようになり、これが、複数のアポトーシスおよび非アポトーシス経路による細胞死を仲介するのと似ている。同様に、ポリパーフォリン２の孔によりリゾチーム、ＲＯＳ、ＮＯ、そしておそらくは他の抗菌化合物がアクセスできるようになり、これにより、細菌の死滅が増強される。孔形成タンパク質による物理的な膜の損傷は、このように免疫防御の一般的な様式である。物理的な攻撃を介して、パーフォリン２は細胞内細菌を殺傷し、ＭＡＣは細胞外細菌を殺傷し、パーフォリン１はウイルス感染細胞を殺傷する。全ての場合において、孔形成因子による細胞壁／膜の損傷は、細菌殺傷を完了するための追加的な細胞傷害性分子の入口として機能する。ＭＡＣ／ＰＦドメインが共通する３つの孔形成因子のうち、パーフォリン２は、海綿動物および他の無脊椎動物に既に存在しており最古のものと思われる。これは、細胞質ドメインからの膜貫通シグナル伝達により活性化される膜貫通タンパク質であるという点で他の２つの孔形成因子とは異なる。シグナル伝達機構の解明により、Ｐ２活性を増強または減少する薬剤標的を発見し、細菌の逃避メカニズムが明らかになる可能性がある。
【０２７８】
【表２】
2015516400.tif 000003
【０２７９】
実施例４：パーフォリン２は、致命的な細菌感染から防御している
反応性酸素および窒素の中間体ならびに透過性増加タンパク質は、重要な抗菌エフェクターであるが、追加的な殺菌エフェクターも存在すると考えられている。ここで、我々は、孔形成タンパク質パーフォリン２は、細胞内細菌の複製に対する防御に必須であることを示す。パーフォリン２は、身体全体にわたってまんべんなくグラム陽性および陰性菌そして抗酸菌を殺傷する。パーフォリン２欠損マウスは、通常のマウスでは殺菌される経口胃サルモネラの感染により死亡する。パーフォリン２は、ＭＡＣＰＦキラードメインが、感染の際に細菌を含有する液胞に移行する膜小胞の内腔の方向を向いた膜貫通タンパク質である。パーフォリン２により殺傷された細菌は、細胞壁にクラスタ化された９０Åの孔を有する。この孔より細菌の活性酸素および窒素の中間体に対する感受性がより高くなる。患者において非治癒性かつ慢性的な感染皮膚潰瘍では、病原性細菌がパーフォリン２の発現または活性化を妨害し、パーフォリン２のレベルを抑制している。パーフォリン２の作用経路を研究することは、生命を脅かす細菌感染に対する新しいアプローチの機会を提供することになるだろう。
【０２８０】
パーフォリン２がノックアウトされたマウスでは、サルモネラ菌の複製が制御されなくなり死に至る。
生体内におけるパーフォリン２の生物学的な重要性を決定するために、我々は相同組換えによりパーフォリン２ノックアウト（Ｐ２-/-）マウスを作製した。マウスは、Ｃ５７Ｂ１６および１２９の混合株由来であり、これらは少数のＭＨＣ抗原に違いがあり、多様性が制限されたものである。Ｐ２-/-マウスは、病原体を含まない条件下では正常に発育し生殖する。ホモ接合型Ｐ２-/-、ヘテロ接合型Ｐ２+/-、および野生型Ｐ２+/+の同腹子に、ネズミチフス菌（サルモネラ菌）を経口で胃に接種し上述のように免疫性をテスト（チャレンジ）した。ストレプトマイシンで前処理してから２４時間後のＰ２+/+マウスに１０5個のストレプトマイシン耐性サルモネラ菌を感染させると、感染後最初の５日間で軽度に体重減少（＜１０％）したが、その後９日目には完全に回復した（図２５ａ）。対照的に、ホモ接合型Ｐ２-/-マウスは、出血性の下痢を発症し、それにより５日または６日目まで体重減少が進行したので、この時点でさらなる苦痛をなくし、分析するために安楽死させた。１０2個のサルモネラ菌によるチャレンジでさえも、Ｐ２-/-マウスでは、進行性の疾患が起こり死に致った。Ｐ２+/-同腹子は、Ｐ２+/+同腹子よりも重篤な疾患となったが回復した（図２５ａ）。
【０２８１】
ネズミチフス菌に感染したＰ２-/-マウスの重度の体重減少は、血液中の高い細菌力価および多臓器感染に関連していた（図２５ｂ）。病理組織学的検査により、小腸および大腸における上皮バリアの完全な溶解や大規模な細胞浸潤が示され、細菌を除去することはできなかった（図示せず）。
【０２８２】
ＩＦＮ−γにより活性化されたＰ２-/-マウス（Ｐ２-/-ＰＥＭ）からの腹膜滲出マクロファージによるサルモネラ菌の除去についても、インビトロで分析した。ＰＥＭを１時間感染させ洗浄した後、指示された時間インキュベートし、溶解し、ＣＦＵを決定した。サルモネラ菌は、Ｐ２-/-ＰＥＭにおいて非常に多く複製した。対照的に、Ｐ２+/+ＰＥＭでは、その数は４時間で約５０％減少した後、安定的した。ヘテロ接合型Ｐ２+/-ＰＥＭのみでサルモネラ菌の複製が遅れていた。比較のために、野生型ＰＥＭについてｓｉＲＮＡでＰ２をノックダウンすると、Ｐ２-/-ＰＥＭと類似していた。これによりノックダウン技術が確認できた（図２５ｃ）。
【０２８３】
インターフェロンは、全ての細胞においてパーフォリン２を誘導し、殺菌活性を可能にする。
Ｐ２-/-マウスでは、サルモネラ菌が急速に広まり、Ｐ２-/-マウスにおけるいずれの細胞も、細菌の浸潤を止めることができないことが示唆された。したがって、我々は、どの種類の細胞が構成的にＰ２を発現またはＰ２を発現するように誘導可能なのかを検討した。表２は、データをまとめたものである。ＰＭＮ、マクロファージ、樹状細胞、およびミクログリアは、パーフォリン２  ｍＲＮＡおよびタンパク質を構成的に発現し、これはさらに、ＩＦＮ−γおよびＬＰＳによって上方制御される（図示せず）。ヒト初代角化細胞および慢性創傷の縁から採取した組織試料由来の角化細胞（図２７）も同様に構成的にＰ２を発現する。試験した他の全ての細胞および細胞株は、ＩＦＮ−α、−β、または−γで処理した場合のみＰ２  ｍＲＮＡを発現した。Ｐ２を発現する全ての細胞は、細胞内細菌感染を制御することができるが、Ｐ２がｓｉＲＮＡでノックダウンされると破壊される。ヒトＰＭＮおよびマクロファージは、構成的にＰ２タンパク質を発現する（図２６ａ）。ＨＬ６０からレチノイン酸によって誘導されたＰＭＮにおいてパーフォリン２をノックダウンすると、殺菌活性が有意に阻害され、ＭＲＳＡ、Ｍ．スメグマチス、およびネズミチフス菌の細胞内複製が可能になる（図２６ａ）。同様に、Ｐ２をノックダウンすると、腸上皮細胞（直腸癌ＣＭＴ９３）（図２６ｂ）、ヒト内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（図２６ｃ）、およびヒト子宮頸癌上皮細胞ＨｅＬａ細胞（図２６ｄ）の細胞内細菌の殺傷が有意に阻害される。Ｐ２−ＧＦＰのトランスフェクションによりＰ２の発現を上昇させると、マイコバクテリウム・アビウムを除去するために重要な殺菌活性が増加する（図２６ｅ）。Ｐ２の３’非翻訳領域に特異的なｓｉＲＮＡでノックダウンした内因性Ｐ２は、Ｐ２−ＧＦＰまたはＰ２−ＲＦＰを用いたトランスフェクションによって補完され、ＭＥＦ（図２６ｆ）または貪食細胞（図示せず）において完全に殺菌活性が再構築される。我々のデータは、Ｐ２は、普遍的に発現するまたは誘導可能で、検査した少なくとも３種類の細菌を殺傷するかまたはそれらの細胞内複製を阻害するために必要であることを累積的に示している。
【０２８４】
細菌は、パーフォリン２の誘導および活性化をブロック可能である。
Ｐ２の強力な殺菌作用により、細胞内細菌はパーフォリン２を回避するための戦略を進化させなければならないことが示唆される。原則的に、細菌は、非貪食細胞においてパーフォリン２の転写をブロックすることができ、これによりパーフォリン２発現細胞において構成的に下方制御を引き起こし、またはパーフォリン２の活性化および重合を妨害する。天然ＭＥＦを実験室株大腸菌Ｋ１２に感染させると、Ｐ２  ｍＲＮＡの迅速な誘導およびその後の細胞内細菌の殺傷が起こる。大腸菌とは異なり、生きた野生型ネズミチフス菌（サルモネラ菌）は、ＭＥＦにおいてＰ２  ｍＲＮＡの誘導を引き起こすことはない（図２７ａ）。対照的に、熱殺菌されたかまたはＰｈｏＰ突然変異体のネズミチフス菌は、大腸菌と同程度にＭＥＦにおいてＰ２  ｍＲＮＡを誘導する。これにより、ネズミチフス菌はＰ２の誘導を積極的に抑制することが示唆されている。同様に、偏性細胞内細菌であるクラミジア・トラコマティスによるＨｅＬａ細胞の感染も、Ｐ２の発現を誘導しない。外因性のＩＦＮによるＰ２の誘導は、ｄｅ  ｎｏｖｏクラミジアのタンパク質合成を必要とするメカニズムを介して積極的に抑制される（図２７ｂ）。ＥＰＥＣはエンドサイトーシスをブロックすることができるが、貪食細胞は、この阻害を克服できる（図２７ｃ）。エンドサイトーシスされたＥＰＥＣは、それらがユビキチン様分子であるＮＥＤＤ８を不活性化するデアミダーゼをコードするＣｉｆプラスミド（図２７ｄ）を有する場合にのみ、パーフォリン２から保護される。ＮＥＤＤ８は、ＮＦκＢの活性化など多くの基本的な細胞経路に関与するｃｕｌｌｉｎ−ｒｉｎｇ型ユビキチンＥ３リガーゼ（ＣＲＬ）を活性化するのに必要である。ＮＥＤＤ化はＮＥＤＤ８特異的Ｅ２リガーゼＵｂｃ１２によって行われる。Ｐ２の細胞質ドメインは、酵母ツーハイブリッドシステムではＵｂｃ１２と相互作用し、Ｐ２と共に免疫沈降される（補足図２７）ことより、ＣＲＬのＵｂｃ１２介在性ＮＥＤＤ化はパーフォリン２介在性の殺傷に必要であり、ＣＩＦがこのステップをブロックすることが示唆される。
【０２８５】
表２に示すように、角化細胞は、パーフォリン２  ｍＲＮＡおよびタンパク質を構成的に発現することで、感染に対する皮膚のバリア機能へ寄与することが示唆される。我々は、非治癒性かつ慢性的な皮膚潰瘍を有する細菌負荷が高い１０人の患者の真皮および表皮中のＰ２発現レベルを調べた。傷や傷の縁を切除する外科的創面切除を、標準的な治療の一環として行った。その後、切除した皮膚を、創傷に隣接した部分と正常な皮膚に隣接した部分とに等分し、真皮と表皮とに分離し、Ｐ２  ｍＲＮＡレベルをＴａｑＭａｎ−ＰＣＲによって定量した。パーフォリン２のｍＲＮＡレベルは、正常な皮膚に隣接する細胞と比較して慢性潰瘍に隣接する皮膚の表皮細胞では約３５倍低かった。対照的に、下層の真皮では、Ｐ２ｍＲＮＡの比率は真逆であり、創傷に隣接した部分のＰ２  ｍＲＮＡレベルが４倍高かった（図２７ｄ）。データは、細菌負荷が高い慢性皮膚潰瘍でＰ２レベルが影響を受け、治癒の遅延に関連している可能性があることを示している。
【０２８６】
パーフォリン２は、活性酸素および窒素種の殺菌活性を増強する。
現在のパラダイムでは、細胞内細菌は、活性酸素および窒素種により、そして貪食された細菌がリソソームと融合するによって殺傷されることが示唆される。ここでは、我々は、各エフェクター経路およびそれらの相乗効果による殺菌効率を分析する。我々は、個別に各エフェクターをブロックし、ネズミチフス菌（サルモネラ菌）およびＭ．スメグマチスの細胞内生存および複製または細胞内殺傷について測定した。これらの実験を、腸上皮細胞（ＣＭＴ９３）（図示せず）およびＩＦＮ−γで活性化したＰＥＭ（図２７ｅ）を用いて実施したところ、実質的に同一の結果であった。まず、我々は、ＩＦＮ−γで活性化しＬＰＳで刺激したＰＥＭは、ＲＯＳとＮＯを生産し、この生産はノックダウンによるＰ２  ｓｉＲＮＡによって影響されないことを確認した。そして、使用したＲＯＳおよびＮＯの阻害剤は、ＲＯＳまたはＮＯのブロックに特異的かつ活性であったことも確認した（図示せず）。３つのエフェクターが全てスクランブルｓｉＲＮＡでトランスフェクションした細胞において活性である場合、ＰＥＭは感染後の最初の４時間で細胞内サルモネラ菌の約９０％を殺傷できる（図２７ｅ、実線）。Ｐ２をノックダウンすると、サルモネラ菌に対する殺菌活性が完全に破壊され、それらの細胞内複製が可能になった（図２７ｅ、破線）。ＮＡＣおよびＮＡＭＥを用いて追加的にＲＯＳおよびＮＯを阻害しても、さらなる効果を示さなかった。また、Ｐ２の存在下でＮＯまたはＲＯＳを阻害すると（スクランブルｓｉＲＮＡ、青と緑の実線）、有意に殺菌活性が減少するが、Ｐ２の存在下では、細菌の複製はブロックされたままであった。Ｍ．スメグマチスは４時間以内のほうが殺菌エフェクターによる殺傷に対する耐性がより高い。それにもかかわらず、パーフォリン２のノックダウンによりＭ．スメグマチスの殺傷は有意に阻害され、追加的にＲＯＳまたはＮＯをブロックしてもそれ以上の効果がなかった。Ｐ２のノックダウンをせずに、ＲＯＳまたはＮＯをブロックしても、マイコバクテリアに対する殺菌活性への影響は制限され顕著ではなかった。対照的に、非病原性の実験用大腸菌Ｋ１２は、Ｐ２がなくてもＲＯＳおよびＮＯによる細胞内殺傷に対して感受性があるが、Ｐ２の存在する場合よりも有意に効率が低かった。データでは、パーフォリン２が活性酸素および窒素種、そしてリゾチームと相乗作用することが示唆され、これは、以前に細菌が個々のエフェクターによる影響が異なると示されたことと一致する。
【０２８７】
パーフォリン２は、細菌を含有する液胞へ移行する。
感染していない場合、パーフォリン２は、核周辺の小胞を区画する膜に埋め込まれて格納される（図２８ｂ）。したがって、パーフォリン２は、殺傷のために、細菌感染の場所に輸送されなければならない。パーフォリン２は、短く高度に保存された細胞質ドメインを有し、この細胞質ドメインが細胞質タンパク質と相互作用して、Ｐ２の移行および重合を引き起こす（図２８ａ）。しかし、ＹからＦに変異すると（図２８ａに赤い矢印で示す）Ｐ２の殺菌活性がブロックされる。よって、ここにＰ２の活性化に重要な機能があることが示唆される（図示せず）。
【０２８８】
我々は、共焦点顕微鏡により細菌を含有する液胞へのパーフォリン２の移行について検査した。これらの実験では、内因性パーフォリン２をＢＶ２細胞においてノックダウンし、Ｐ２−ＧＦＰを用いて一過性トランスフェクションにより再構成する。ＢＶ２を、エンドサイトーシスを誘導することにより細胞に積極的に侵入するサルモネラ菌に感染させた（図２８ｂ）。この実験では、ＤＡＰＩで細菌ＤＮＡを染色することにより細菌を画像化し（見やすくするために白で示す）、共局在をＰ２−ＧＦＰで画像化する。感染から５分後にはすでに、いくつかのサルモネラ菌はエンドサイトーシスされ、明らかに溶菌していた。これは、エンドサイトーシスされたサルモネラ菌の放出したＤＮＡをＤＡＰＩ染色した「クラウド」によって示される。３つの１．２μ厚さの切片により、溶菌したサルモネラ菌の数（８個）およびＤＡＰＩおよびＰ２−ＧＦＰによって明らかにされた放出したＤＮＡを含むエンドサイトーシス小胞の大きさが示される。１．２μ切片の下方の細胞外にＤＡＰＩによって染色された１つの無傷のサルモネラ菌（矢印）の桿菌状の構造が見られる（左のパネル）が、上の２つの１．２μ切片には見られない。また我々は、Ｐ２の移行について、ＧＦＰ標識した大腸菌の感染によりＰ２−ＲＦＰで一過性トランスフェクトしたＢＶ２を分析した。感染から５分以内に、Ｐ２が細菌を含有する液胞膜および細菌上に見られた（図２８ｂ）。蛍光の強さにより、パーフォリン２はこの部位で非常に濃縮されていることがわかり、特異的な標的化メカニズムがあることが示唆される。細菌は、断片化されており、検出可能なＧＦＰを放出したことが、蛍光が液胞内に拡散していることによりわかる。データにより、細菌を含有する液胞へのパーフォリン２の移行は、感染から数分以内に完了し、液胞の内側にある細菌の断片化およびそれらのＤＮＡの放出に関連していることが示された。これは細菌の細胞壁上のＰ２の攻撃および孔形成と一致する。
【０２８９】
パーフォリン２は、細菌の細胞壁に９０Å以下の孔を形成する。
感染の数分以内に、パーフォリン２はそのエフェクタードメインが内腔の方を向いた状態で細菌を囲む膜上に蓄積するという発見により、パーフォリン２が、補体Ｃ９およびとパーフォリン１と同様の細胞傷害性のメカニズムで細菌の細胞壁に重合し、水充填孔を作成することによって、他の殺菌因子の透過を促進し、その細菌を死に至らしめることができることということが示唆される。我々は、今まで報告されていなかったパーフォリン２の孔形成能力を決定した。我々は、Ｃ９またはパーフォリン１モノマーと類似したパーフォリン２のモノマーが細胞傷害性ではないこと、そして、その孔形成にＰ２の細胞質ドメインと未知のシグナル伝達タンパク質との特異的相互作用を介するＰ２の重合が必要であることを推論した。パーフォリン２の細胞質ドメインは、保存されたＲＫＹＫＫＫ配列（配列番号４）を含み（図２８ａ、青い矢印）、膜の反対側にあるＰ２の重合を誘発するタンパク分解性切断部位として機能し得る膜貫通ドメインの隣にある。これは、Ｐ２−ＧＦＰでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞から、分画遠心法および低レベルのトリプシンでそれらを短時間処理して細胞質ドメインを切断することにより、パーフォリン２−ＧＦＰを有する膜を精製することによって検査した（図示せず）。トリプシン処理したパーフォリン２−ＧＦＰ−膜の電子顕微鏡検査により、８５〜９５Åの平均内径を持つ典型的な貫通孔が示される（図２９ａ、白矢印）。さらに、重合中にパーフォリン２の融合によって形成された半環状で８の字形の不規則な構造（黒矢印）は、環が閉じて終了するまで継続する重合プロセスと一致する。Ｃ９およびパーフォリン１と同様に、閉環は、膜タンパク質の立体障害によってブロックされ得る。トランスフェクトされていない細胞は、このような孔を有していなかった（図示せず）。これらのデータは、パーフォリン２が実際に、液胞の内部にある細菌の細胞壁に孔を形成することが潜在的に可能な孔形成膜貫通タンパク質であることを直接示している。パーフォリン２は、小胞の内腔の方向に向いているＭＡＣＰＦドメインを有する膜タンパク質であるので、孔の形成は、小胞内部のＭＡＣＰＦドメインに接触している膜に起こるのであろう。
【０２９０】
Ｐ２孔が殺傷された細菌上に集合していることを検査するために、我々は、感染から３時間後、ＩＦＮで活性化しパーフォリン２が十分なＭＥＦを低張性で非イオン性の界面活性剤により溶解することにより、細胞内細菌を得た。細菌の細胞壁は、リン脂質二重層とは異なり、穏やかな界面活性剤による溶解に耐性であり、遠心分離により得られ、電子顕微鏡によって画像化される。Ｍ．スメグマチスの細胞壁では、多くのクラスタ化された約９０Åの孔が見られ（図２９ｂ白矢印）、これらはしばしば不規則な構造（黒矢印）を有する。Ｍ．スメグマチスの剛性の細胞壁による立体障害が、パーフォリン２ポリマーの閉環をしばしば妨害しているようであり、これにより、ポリマーが不規則になるようだ。孔の外側のＭ．スメグマチスの細胞壁のネガティブ染色による表面染色は、最も小なく、マイコバクテリアの細胞壁で既に知られた疎水性と一致している。黄色ブドウ球菌の細胞壁は、対照的に、ネガティブ染色がより付着しているので、マイコバクテリアの細胞壁よりも親水性であるようだ。不規則性（黒矢印）およびパーフォリン２孔の大きさの違い（図２９ｃ）による判断だと、黄色ブドウ球菌の細胞壁はリン脂質膜よりも剛性である。
【０２９１】
材料と方法
プラスミド構築物
マウスｍｐｅｇ１  ｃＤＮＡの完全コード領域を、いくつかのＥＳＴクローンから構築し、ｐＥＧＦＰ−Ｎ３プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に挿入した。単量体ＲＦＰ（Ｒ．Ｆｌａｖｅｌｌ，Ｙａｌｅ）を、ＧＦＰの代わりにクローニングし、いくつかの実験で使用した。
【０２９２】
細胞株および初代細胞
ＲＡＷ２６４．７、Ｊ７７４、ＨＬ−６０、およびＨＥＫ−２９３細胞株を、ＡＴＣＣから得た。ＢＶ２ミクログリア細胞株は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＭｉａｍｉのＤｒ．Ｊ．Ｂｅｔｈｅａ氏から譲渡した。全ての細胞を、ＡＴＣＣの推奨に従って５％ＣＯ2を含む加湿雰囲気中、３７℃で培養した。ＨＬ−６０は、先の記載のように、レチノイン酸を用いてＰＭＮ表現型へ分化させた。マウス初代マクロファージは、先の記載のように、チオグリコール酸誘発性の腹腔または骨髄から得た。ヒトマクロファージおよびＰＭＮを新鮮な健康なドナーのＰＢＭＣから単離した。ヒトマクロファージは、先の記載のように単球から分化させた。ヒトＰＭＮは、先の記載のように単離した。マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）は、先の記載のように単離した。
【０２９３】
細菌株：
ネズミチフス菌株ＬＴ２Ｚ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＭｉａｍｉのＤｒ．Ｇ．Ｐｌａｎｏ氏から譲渡）、Ｋ１２大腸菌、およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＭｉａｍｉのＤｒ．Ｌ．Ｐｌａｎｏ氏から譲渡）は、ルリアブロス（ＬＢ）で増殖した。
Ｍ．アビウム・イントラセルラーレ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＭｉａｍｉのＤｒ．Ｔ．Ｃｌｅａｒｙ氏から譲渡）、およびＭ．スメグマチス（ＡＴＣＣ）は、ミドルブロック７Ｈ９ブロスで増殖した。
【０２９４】
化学物質およびサイトカイン
リポ多糖（ＬＰＳ）は、Ｓｉｇｍａから購入し１ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用した。組換えヒトおよびマウスＩＦＮ−γはｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈから購入し、１００Ｕ／ｍｌの最終濃度で使用した。Ｎ−アセチルシステインおよびＬ−ＮＡＭＥいずれもＳｉｇｍａから購入した。
【０２９５】
抗体
ウサギ抗Ｍｐｅｇ１、ヒト抗Ｍｐｅｇ１、および抗ＧＦＰポリクローナル抗体をＡｂｃａｍから入手し、ウェスタンブロット分析に使用した。ウサギ抗パーフォリン２（細胞質ドメイン）抗血清は、２１ｓｔ  Ｃｅｎｔｕｒｙより作製したものを得た。
【０２９６】
ｑＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ）の説明書に従い細胞から抽出した。１μｇのＲＮＡを、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ逆転写キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて同社のプロトコルに従いｃＤＮＡに変換した。ｑＲＴ−ＰＣＲは、マウスｍｐｅｇ１、ＧＡＰＤＨ、およびβ−アクチンについて、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。ヒト組織ついては、ヒトｍｐｅｇ１、ＧＡＰＤＨ、およびβ−アクチンプローブを利用した。全てのアッセイは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００  ＰＣＲプラットフォーム上で実施した。
【０２９７】
ゲンタマイシン保護アッセイ
細胞内殺菌活性を応用した。簡単に言うと、細菌を、ルリアブロス（ＬＢ）中で１６〜１８時間（ネズミチフス菌、黄色ブドウ球菌、および大腸菌）またはミドルブロック７Ｈ９ブロス中で２４時間（マイコバクテリア）振盪しながら３７℃で増殖してその後感染させた。ネズミチフス菌、大腸菌、および黄色ブドウ球菌については、培養物をその後ＬＢで１：３３に希釈し、そしてさらに３時間増殖させて対数期に到達させ、ネズミチフス菌については侵襲的な表現型を誘導した。真核細胞は、各細胞について最適化されたＬｏｎｚａのプロトコルに従ってトランスフェクトし、トランスフェクト後１２ウェルプレートにプレーティングした。ＲＡで分化させたＨＬ−６０細胞には刺激を与えなかった。ＲＡＷ２６４．７細胞は、ＬＰＳ（１ｎｇ／ｍｌ）およびＩＦＮ−γ（１００Ｕ／ｍｌ）で１４時間刺激し、マクロファージ系統に分化させた。他の全ての細胞は種特異的なＩＦＮ−γ（１００Ｕ／ｍｌ）で刺激した。細胞を３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターで、３０分間（ネズミチフス菌）または１時間（黄色ブドウ球菌、大腸菌、およびＭ．スメグマチス）、１０〜６０の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。感染後、細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含有する新鮮な培地を添加した。２時間後、培地のゲンタマイシンの濃度を５μｇ／ｍｌに低下させた。指示した時点で、細胞をＰＢＳで洗浄し、１％Ｉｇｅｐａｌを含むｄｄＨ２Ｏで溶解、希釈し、ＬＢ寒天プレート（ネズミチフス菌、黄色ブドウ球菌、大腸菌）またはミドルブロック７Ｈ１１プレート（マイコバクテリア）に三連でプレーティングし、十分なコロニーが増殖してからＣＦＵを決定した。
【０２９８】
ゲンタマイシン非含有細胞内細菌殺傷アッセイ
ゲンタマイシン保護アッセイを変更して、ゲンタマイシン非含有細胞内細菌殺傷アッセイを作成した。上記の変更には、感染において９０〜１００％のコンフルエンスを達成するように真核細胞をプレーティングすること、および感染多重度（ＭＯＩ）を５〜１５に減少することが含まれた。侵入時間は変更せず、ネズミチフス菌については３０分、黄色ブドウ球菌、大腸菌、およびＭ．スメグマチスについては１時間とし、感染は、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターで行った。細胞外細菌を確実に最大除去するために、洗浄工程を変更し、細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、付着した細胞外細菌を除去しやすくするようトリプシン処理し、そして氷冷ＰＢＳでさらに３回洗浄した。４時間ごとに培地を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、その後、新鮮な培地を再度追加した。指示した時点で、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、１％Ｉｇｅｐａｌを含むｄｄＨ２Ｏで溶解、希釈し、ＬＢ寒天プレート（ネズミチフス菌、黄色ブドウ球菌、大腸菌）またはミドルブロック７Ｈ１１プレート（マイコバクテリア）に三連でプレーティングし、十分なコロニーが増殖してからＣＦＵを決定した。
【０２９９】
ＲＮＡ干渉
マウス細胞については、３つのパーフォリン２特異的に化学合成された１９ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ二重鎖を、Ｓｉｇｍａから入手した。２つのｓｉＲＮＡは、パーフォリン２の３’ＵＴＲに相補的で、もう１つはコード領域に相補的であった。配列を次に示す：ＣＣＡＣＣＵＣＡＣＵＵＵＣＵＡＵＣＡＡ（配列番号１）、ＧＡＧＵＡＵＵＣＵＡＧＧＡＡＡＣＵＵＵ（配列番号２）、およびＣＡＡＵＣＡＡＧＣＵＣＵＵＧＵＧＣＡＣ（配列番号３）。反応の対照としてスクランブルｓｉＲＮＡも作製した。ヒト細胞については、３つのヒトパーフォリン２特異的サイレンサー選択ｓｉＲＮＡをＡｍｂｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から購入した。そのサイレンサー選択番号は、ｓ６１０５３、ｓ４７８１０、ｓ６１０５４である。Ａｍｂｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のサイレンサー選択陰性対照＃２も使用した。すべての細胞へのｓｉＲＮＡのトランスフェクションは、Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｏｎｚａ）を用いて製造元の指示に従い行った。全てのトランスフェクションは、指定する場合、１〜４×１０6個の細胞、最終濃度が３００ｎＭのｓｉＲＮＡ（パーフォリン２特異的ｓｉＲＮＡをプールした）、および２μｇのプラスミドＤＮＡを用いて行った。トランスフェクション後直ちに細胞を抗生物質を含まない培地にプレーティングした。
【０３００】
ネガティブ染色透過型電子顕微鏡検査
原核生物膜：膜は、Ｎ2キャビテーションおよび分画遠心によって安定的にトランスフェクトしたパーフォリン２−ＧＦＰ  ＨＥＫ−２９３細胞から単離した。膜は、小量の中性トリス緩衝食塩水中に再懸濁し、３７℃で１００μｇ／ｍｌトリプシンで１時間処理してから洗浄し、そして５％の中性リンタングステン酸Ｎａで３０秒間ネガティブ染色した。画像は、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＣＭ１０透過型電子顕微鏡で５２，０００倍の初期倍率で撮影した。
【０３０１】
細菌膜：ＭＥＦをＩＦＮ−γ（１００Ｕ／ｍｌ）で１４時間刺激し、表示の細菌株を３０の感染多重度（ＭＯＩ）で５時間感染させた。原核膜を、１％Ｉｇｅｐａｌを含むｄｄＨ２ＯでＭＥＦを溶解することにより回収した。溶解物は、２００ｇで１０分間遠心分離し、無傷の細菌をペレット化した。無傷の細菌を、その後、ポリトロンで剪断して無傷の細菌を破壊し膜を分離した。得られたペレットを、３７℃で１時間、１００μｇ／ｍｌのトリプシンで処理し、沈殿させ、そして最小ｄｄＨ２Ｏで再懸濁し、３％ギ酸ウラニルで３０秒間ネガティブ染色した。画像は、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＣＭ１０透過型電子顕微鏡で５２，０００〜１６８，０００倍の初期倍率で撮影した。
【０３０２】
共焦点顕微鏡検査
パーフォリン２−ＧＦＰを局在化するために、ＲＡＷ２６４．７細胞をパーフォリン２−ＧＦＰで一過性トランスフェクトし、ガラス底のディッシュ内でＮｏ．１．５カバーガラス（ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐ）を用いＬＰＳ（１ｎｇ／ｍｌ）およびＩＦＮ−γ（１００Ｕ／ｍｌ）で一晩刺激した。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、オルガネラを標識した。小胞体（ＥＲ）の標識では、ＥＲ−Ｔｒａｃｋｅｒ（商標）Ｂｌｕｅ−Ｗｈｉｔｅ  ＤＰＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１μΜの作用濃度で３７℃で３０分間使用した。他の全ての染色では、トランスフェクトした細胞を室温で１５分間、３％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、０．５％サポニンで透過し、１０％正常ヤギ血清でブロックし、そして一次抗体および二次抗体と共にインキュベートした。抗ＣＤ１０７ａ（ＬＡＭＰ−１）（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、抗ＣＤ１１ｂ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、抗ｇｏｌｇｉｎ９７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、抗ＥＥＡ１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、抗ＧＭ１３０（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ），およびＨｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して細胞オルガネラを同定した。二次抗体は、全てヤギで上昇した。標本を、ＰＢＳ中に保持し、電動ステージとＬｅｉｃａ  ＤＦＣ４９５カメラ付のＬｅｉｃａ  ＳＰ５  ＳＰ５倒立共焦点顕微鏡にて室温で撮影した。画像を、Ｌｅｉｃａアプリケーションスイートの改良型蛍光ソフトウェアを用い、デコンボリューション処理を応用して分析した。
【０３０３】
パーフォリン２−ＲＦＰおよび大腸菌の局在を画像化するため、ＢＶ２細胞をパーフォリン２−ＲＦＰおよび内因性パーフォリン２の３’ＵＴＲを標的とするｓｉＲＮＡで共トランスフェクトし、カバーガラスに付着させた後ＩＦＮ−γ（１００Ｕ／ｍｌ）で一晩刺激した。細胞は、１００のＭＯＩでＧＦＰ−大腸菌に５分感染させ、この時点で細胞をＰＢＳで２回洗浄し、室温で１５分間、３％ＰＦＡで固定した。Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉａを用いて個々のカバーガラスをスライドにマウントし、電動ステージ付のＬｅｉｃａ  ＳＰ５倒立共焦点顕微鏡およびＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ７１０倒立共焦点顕微鏡にて室温で撮影した。画像を、Ｌｅｉｃａアプリケーションスイートの改良型蛍光ソフトウェアを用いて分析した。
【０３０４】
Ｌｅｉｃａ  ＳＰ５共焦点顕微鏡は、プランアポクロマート６３ｘ／１．４ＮＡ対物レンズ、４０５、４８８、５６１ｎｍレーザー（Ｃｙ５またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７を含む場合６３３ｎｍレーザー）を使用した。画素サイズは、２Ｄナイキストサンプリングを得るために、６０ｎｍとした（５００ｎｍの光に対する回折限界は２１４ｎｍ）。
【０３０５】
Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７１０共焦点顕微鏡は、プランアポクロマート６３ｘ／１．４ＮＡ対物レンズ、４０５、４８８、５６１ｎｍレーザー（Ｃｙ５またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７を含む場合６３３ｎｍレーザー）を使用した。画素サイズは、２Ｄナイキストサンプリングを得るために、６０ｎｍとした（５００ｎｍの光に対する回折限界は２１４ｎｍ）。
【０３０６】
実施例５：細胞内細菌の除去におけるＲＡＳＡ２／ＧＡＰ１Ｍ  Ｐ２間の相互作用の関数を決定する。
マクロファージ、ミクログリア、ｍＥＦ、ＨｅＬａ、および他の新鮮な外植細胞あるいは細胞株におけるＰ２  ｓｉＲＮＡによるＰ２のノックダウンにより、病原性ネズミチフス菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、マイコバクテリウム・スメグマチス（図３０Ａ）、およびマイコバクテリウム・アビウム（図示せず）等の細胞内細菌の殺傷および除去をブロックすることが、ゲンタマイシン保護アッセイおよび抗生物質の非存在下での測定（図示せず）によりわかった。図３０の直腸上皮細胞（Ａ）またはマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）（Ｂ）では、感染の２４時間前に、Ｐ２の３’ＵＴＲに特異的な２つのｓｉＲＮＡのプール、またはＰ２  ＲＮＡおよびタンパク質をノックダウンするスクランブルｓｉＲＮＡを用いて、一過性トランスフェクトした（図３１Ｃ）。Ｐ２の補完について（Ｂ）、細胞を、Ｐ２  ｓｉＲＮＡおよびノックダウン耐性Ｐ２−ＲＦＰ（内因性Ｐ２の３’ＵＴＲを発現していない）、または対照ＲＦＰと共にトランスフェクトした。Ｐ２−ＲＦＰは、モノマーＤｓＲｅｄ（ＲＦＰ）を有しＰ２がＣ末端にタグされた融合タンパク質である。トランスフェクトしたＰ２−ＲＦＰは、細菌殺傷の点で完全に活性である（図３０Ｂ、Ｃ）。１６時間目に、ＩＦＮ−γを加えＰ２  ｍＲＮＡを誘導した（Ｐ２  ｍＲＮＡは、Ｐ２  ｓｉＲＮＡが存在する場合に抑制される）。時刻０において、細胞を、１個の細胞あたり３０〜５０個の細菌という感染多重度（ＭＯＩ）で病原性ＭＲＳＡ、ネズミチフス菌、またはマイコバクテリウム・スメグマチスを３０〜６０分間感染させた。細胞内感染の後、細胞外の細菌をＰＢＳで洗い流し、そして細菌の細胞外の複製を防止するために細胞をゲンタマイシンに再プレーティングした。宿主細胞は、感染直後およびそれ以降のいくつかの時点で、穏やかな界面活性剤（ＮＰ４０）で溶解し、生存している細菌を反復コロニー形成アッセイによってカウントした。穏やかな界面活性剤は、宿主細胞の膜を溶解するが、細菌の細胞壁は溶解しない。
【０３０７】
直腸上皮細胞において（図３０）、対照のスクランブルｓｉＲＮＡによるトランスフェクションはＰ２に影響を与えず、細胞内細菌を殺傷する上皮細胞の能力を阻害しない一方、Ｐ２  ｓｉＲＮＡは殺傷をブロックし宿主細胞を殺傷する細胞内複製を可能にする。内因性Ｐ２に加えＰ２−ＲＦＰが発現すると、細菌の殺傷が増強した（図３０Ａ）。内因性Ｐ２をノックダウンした場合、Ｐ２−ＲＦＰによる補完により殺傷能が回復される（図３０Ｂ）。先天的な防御メカニズムから予想されるように、Ｐ２は、グラム陰性とサルモネラ菌、グラム陽性ブドウ球菌、および抗酸性のマイコバクテリアなどの非常に様々な細胞外壁を有する細菌を殺傷することが可能である。
【０３０８】
ＲＯＳおよびＮＯは、ファゴソーム内の細菌を殺傷することが知られているエフェクターである。したがって、我々は、ネズミチフス菌、マイコバクテリア、およびＭＲＳＡについて、ＩＦＮ−γで活性化した腹腔マクロファージの殺菌活性に対する、Ｐ２，ＲＯＳ（ＮＡＣを用いる）、またはＮＯ（ＮＡＭＥを用いる）のいずれかをブロックする効果を直接比較した（図３１）。データは、全細菌で類似しているので、ネズミチフス菌についてのものを示す。図３１では、Ｐ２、ＲＯＳ、およびＮＯを阻害しない場合、優れた細胞内殺菌がある（図３１のＰ２、ＲＯＳ、ＮＯで示す線）。Ｐ２の非存在下では、細菌は、ＲＯＳおよびＮＯがあるにもかかわらず複製する。ＮＡＣを用いたＲＯＳの阻害またはＮＡＭＥを用いたＮＯの阻害により、殺傷活性が遅延されるので、ＲＯＳおよびＮＯの両方がＰ２介在性の殺傷を増強することが示唆される。
【０３０９】
Ｐ２の非存在下で細菌は細胞内で複製するので、データによりＰ２は細胞内の病原性細菌を殺傷するのに重要であることが示される（図３０および図３１、赤色のＲＯＳとＮＯの曲線）。これは重要な違いである。細菌が継続的に複製することにより宿主細胞が死滅すると、生体内で他の細胞に感染を広げる。我々は、これまでテストしたすべてのヒトおよびマウス貪食細胞および非貪食細胞ならびに細胞株（表２）がパーフォリン２を用いて細胞内細菌を除去することを示すデータを有する。非貪食細胞はオートファジーにより細胞内細菌を除去する。我々のデータは、Ｐ２はオートファジーと協働して細菌を死に至らしめ得ることを示す。
【０３１０】
Ｐ２−ＧＦＰは、核周辺の小胞を区画する膜中にある休止中のＢＶ２（図３２ａ、上部２つのパネル）およびＲＡＷ細胞（図３３）に局在する膜貫通タンパク質である。Ｐ２−ＧＦＰ（緑色）は、オレンジ色（黄色として見られる）のＲＡＳＡ２と部分的に共局在する（図３２ａおよび３３）。ＬＣ３−ＲＦＰ（赤色）は、ＲＡＳＡ２またはＰ２よりも均一である。核をＤＡＰＩ染色により青色で示す。
【０３１１】
サルモネラ菌は、ＩＩＩ型分泌システムを用いてエンドサイトーシスを誘導することにより細胞に５分以内に積極的に侵入する。細菌を図３２ａ下の全てパネルにおいて（見やすくするために）白く示すＤＡＰＩ（ＤＮＡ）染色により可視化できる。無傷の細胞外サルモネラ菌は、桿菌状の外観を有する（白矢印）。ＩＦＮで活性化したＢＶ２（マクロファージ由来ミクログリア）をネズミチフス菌と共に５分間インキュベーションした後、いくつかのサルモネラ菌は、細胞によりエンドサイトーシスされてすでにそのＤＮＡを放出しているように見える（ＤＡＰＩおよびＰ２−ＧＦＰパネル中の星印、矢印で示す細胞外サルモネラ菌と形態を比較する）。これは、Ｐ２−ＧＦＰによって殺傷されているからである可能性が最も高い。内在化している細菌は、液胞中に存在し、その膜がＰ２−ＧＦＰ、ＲＡＳＡ−２およびＬＣ３−ＧＦＰで染色されている。この実験では、内因性Ｐ２は、ｓｉＲＮＡでノックダウンされており、そしてトランスフェクトＰ２−ＧＦＰを用いて再構成されていた。また、トランスフェクション混合物は、ＬＣ３−ＲＦＰを含んでいた。同様のデータは、大腸菌についても示されている（図３２ｂ）。これらのデータは、液胞内の細菌の殺傷にＰ２が介在し、ＲＡＳＡ２がＰ２の移行に関与しており、そしてオートファジーのマーカーとしてのＬＣ３がＰ２介在性の細胞内細菌の殺傷におけるオートファジーに関与していることを示唆しているということを直接サポートするものである。
【０３１２】
これらのデータは、貪食細胞について収集したものである。現在、我々は細菌除去について非貪食細胞におけるオートファジーに依存性のこれらのメカニズムを決定したい。その研究は、Ｐ２をオートファジーと関連させ、そしてオートファジーにおける致死の分子的メカニズムを解明する可能性がある。
【０３１３】
エンドサイトーシスされた細菌は、初めは原形質膜に近くにあり、ここで感染の数分以内にオートファジーが開始される。細菌を含有する液胞上のＲａｂ５は、オートファジーに関連するＰＩ３キナーゼであるｖｐｓ３４を補完する。ＰＩ３ＰおよびＰＩ（３，４，５）Ｐ３世代は、液胞をそれぞれファゴソームおよびオートファゴソームへ成熟させるのに必要である。我々は、ＲＡＳＡ２が核周辺膜から移行して液胞上のＰＩＰ３に結合することを示す。ＲＡＳＡ２は、多数のシグナル伝達経路におけるＲａｓＧＴＰａｓｅｓの機能に典型的な分子スイッチをもたらしている可能性がある。ＲＡＳＡ２は、このスイッチでＰ２を小胞輸送および液胞への移行をさせているのかもしれない。液胞にｖｐｓ３４を補充したＲａｂ５もＰ２を輸送することができるが、他のメカニズムも可能である。
【０３１４】
ｍＥＦおよびＢＶ２ミクログリアにおけるパーフォリン２およびＧＡＰ１Ｍ／ＲＡＳＡ２の画像解析。
細胞内においてＲＡＳＡ２がＰ２の細胞質ドメインと相互作用することを酵母ツーハイブリッドシステムで検証するために、我々は、ＲＡＷマクロファージにおける２つのタンパク質の局在を決定した。マクロファージは、構成的にＰ２を発現する。共局在を決定するために、我々は、Ｐ２の細胞質ドメインのＣ末端にリンカーを介して融合したＰ２−ＧＦＰ融合タンパク質を作成した。Ｐ２−ＧＦＰは、補完アッセイにおいて細胞内細菌の殺傷に機能する（図３０Ｂ、図３１）。Ｐ２−ＧＦＰは、ＲＡＷ細胞の核周辺膜小胞に局在しており（図３３、上）、ＲＡＳＡ２（図３３、中央）と類似する。画像をマージすると、Ｐ２−ＧＦＰおよびＲＡＳＡ２が多数の核周囲小胞に共局在しているように見える（図３３、下）。我々は、ＲＡＳＡ２がｖｐｓ３４リン酸化の際に細菌を含有する液胞に移行していることを示す。
【０３１５】
我々は、今後、細菌感染時のＲＡＳＡ２の局在および移行を決定する予定である。ＲＡＳＡ２は（異なるレベルではあるが）構成的に、ほとんどまたは全ての細胞において発現され、その局在は特異的な抗体により決定することができる（図３３参照）。我々は、感染後ＲＡＳＡ２移行の動態を決定した後、図３２のようにＰ２−ＧＦＰ（または−ＲＦＰ）でトランスフェクトし、２または３色の画像解析（蛍光標識した細菌を用いる）により、Ｐ２移行とＲＡＳＡ２移行との関係を測定する予定である。
【０３１６】
Ｒａｂ５は、ＰＩ３−キナーゼｖｐｓ３４を補充し、その細胞質および核周囲から細菌を含有する液胞へ局在化する。ホスファチジル・イノシトールによるリン酸化を介してＶｐｓ３４は、ＲＡＳＡ２の移行のためのイノシトールリン酸のコードを提供することができる。我々は、ｖｐｓ３４阻害剤３−ＭＡがＲＡＳＡ２およびＰ２の移行をブロックするか否かを決定する予定である。我々は、ＢＶ２、天然ｍＥＦ、またはＩＦＮで前もって活性化したｍＥＦにおけるＲＡＳＡ２の細胞内の位置に対する細菌感染の効果を決定する予定である。細胞内細菌は、それらの細胞内生存を強化するために小胞の輸送を操作する。サルモネラ菌は、生存を可能にするサルモネラ菌を含む液胞（ＳＣＶ）を生成するためにＰＩ３Ｐの生成を増加させるが、一方マイコバクテリアは液胞の成熟およびリソソームとの融合を防止するために、ＰＩ３Ｐの発生を低減する。異なる細菌種は、したがってＲＡＳＡ２の移行を操作でき、それにより液胞へのＰ２の補充を遅延または阻止できる可能性がある。
【０３１７】
ＢＶ２ミクログリアにおける移行を天然（休息）ｍＥＦおよびＩＦＮで前もって活性化したｍＥＦと比較して、細菌エンドサイトーシスが同様の応答を引き起こすか否か、そしてＩＦＮを用いてｍＥＦを前もって活性化することがＲＡＳＡ２の移行に関する応答の動態および質を変化させるか否かを判断する予定である。ＩＦＮは、細胞内細菌の攻撃におけるＰ２の機能に必要な天然非貪食細胞中に多くの因子を含む可能性のある多数の遺伝子を誘導する。図３４ａ（左パネル）に示すように、ＩＦＮで前もって活性化したｍＥＦは感染から２時間以内にほとんどのＭ．スメグマチスを殺傷し、一方、天然ｍＥＦは１２時間後にようやく殺傷し始める。ＲＡＳＡ２移行に関するこの動態も、この遅延を同様に反映するものである。
【０３１８】
また、我々は、Ｒａｂ５およびｖｐｓ３４をノックダウンし、ＣＦＵアッセイによってＲＡＳＡ２の移行および細菌の細胞内殺菌に対する効果を決定する予定である。
【０３１９】
我々は、ＩＦＮで前もって活性化したｍＥＦは、Ｐ２の移行および殺傷の活性化におけるメカニズムにおいて貪食ＢＶ２に匹敵すると考えている。ＲＡＳＡ２の補充および移行が必要な場合、活性化ｍＥＦおよびＢＶ２は類似すると予想される。天然ｍＥＦにおいて、Ｐ２が最初に誘導されなくてはならないので、ＲＡＳ２Ａ２およびＰ２は、同期していない可能性がある。ｍＥＦ中で死んでいない生存サルモネラ菌は、Ｐ２  ｍＲＮＡの誘導をブロックし（図３４ｂ）、非貪食細胞中のサルモネラ菌を保護するメカニズムが設けられている。別々の研究で、我々は、Ｐ２の抑制に関与するネズミチフス菌の病原性遺伝子について調査している（例えば、図３４ｂのＰｈｏＰを参照のこと）。また、我々は、クラミジアがＰ２の誘導を抑制するというデータを有している（データは示さず）。これらの知見は、細菌が細胞内で住みかを設けたい場合、Ｐ２を抑制しなければならないという我々の考えを支持するものである。
【０３２０】
細菌感染後初期の事象についてさらなる洞察を得るために、我々は、Ｒａｂ５およびｖｐｓ３４を画像する予定で、それらは細菌の液胞へ移行するものと予想される。
【０３２１】
ＲＡＳＡ２をｓｉＲＮＡでノックダウンすることによる細胞内細菌の殺傷に対する効果の分析。
Ｐ２の誘導、補充、移行、活性化、または重合に必要な任意の分子をブロックすることもまた、細胞内細菌の殺傷を阻止すると考えられる。ＲＡＳＡ２がＰ２の移行、活性化、および／または殺傷に必要な場合は、そのノックダウンにより、細胞内細菌の殺傷が阻害されるはずである。このことについて、細胞内Ｍ．スメグマチスを殺傷するＢＶ２ミクログリア細胞を用いた最初の実験で検査した（図３５ａ）。ＲＡＳＡ２のノックダウンは、Ｐ２のノックダウンと同様に細胞内殺傷を完全にブロックし、細胞内複製を可能にしたので、ＲＡＳＡ２は、細胞内細菌の殺傷に重要であることが示唆される。
【０３２２】
加えて、Ｒａｂｌ、Ｒａｂ５、Ｒａｂ７、およびＲａｂ１１、ならびにｖｐｓ３４をノックダウンし、ゲンタマイシン保護アッセイにおいてそれらの細菌殺傷への効果について決定する予定である。
【０３２３】
ＲＡＳＡ２の要件について、ｑＰＣＲによりＲＡＳＡ２メッセージレベルを測定することによって、ＩＦＮ前活性化と不活性化（天然）ｍＥＦおよび直腸上皮細胞ＣＭＴ９３においてさらに検査する予定である。我々はまた、ゲンタマイシン保護−ＣＦＵアッセイにおいてｓｉＲＮＡによるノックダウンの後、ＭＲＳＡ、Ｍ．スメグマチス、およびネズミチフス菌の細胞内殺傷または生存についても分析する予定である。
【０３２４】
共免疫沈降によるＰ２とＲＡＳＡ２との生化学的相互作用。
我々は、抗ＲＡＳＡ２モノクローナル抗体でＢＶ２−およびｍＥＦ−溶解物を免疫沈降し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離、そして抗Ｐ２抗体を用いた免疫ブロッティングをする予定である。また、これらの研究は、それぞれＰ２−ＧＦＰのトランスフェクト、および抗ＧＦＰを用いた免疫沈降、ならびに抗ＧＦＰおよび抗ＲＡＳＡ２を用いた免疫ブロッティング（図３５ｂ）の後に実施する。ＧＦＰトランスフェクション（Ｐ２を融合していない）は、対照として機能する（図示せず）。実験は、ＩＦＮ前誘導あり及びなし、そして細菌感染あり及びなしで実施する。また、我々は、Ｐ２−ＧＦＰ免疫沈降物でタンパク質を染色することによってさらなるタンパク質バンドを探し、質量分析によってそれらを特徴づける予定である。ＧＦＰ免疫沈降物は対照として機能する。我々はまた、Ｐ２の細胞質ドメインおよびＲＡＳＡ２の突然変異体の変異解析を実施する予定である。
【０３２５】
Ｐ２−ＧＦＰとＲＡＳＡ２間の直接的な生化学的相互作用が、Ｐ２−ＧＦＰでトランスフェクトしたＲＡＷ細胞における共免疫沈降によって確認されたので（図３５ｂ）、突然変異実験が実施できるだろう（図示していないが、ＧＦＰ対照はＲＡＳＡ２を共免疫沈降しなかった）。これにより、Ｐ２／ＲＡＳＡ２と複合体となり得るＲａｂ５またはｖｓｐ３４およびオートファジータンパク質（ａｉｍ２）の存在について免疫沈降物をプローブすることが可能になるだろう。また、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって（対照としてＧＦＰ析出物を使用）Ｐ２−ＧＦＰ免疫沈降物を分析し、その後、ゲルのタンパク質染色を行いこれまでに述べた成分に対応していないタンパク質のバンドの存在を決定する予定である。さらなるバンドが存在する場合、我々は、質量分析によってそれらを分析し、それらの性質を決定する予定である。
【０３２６】
細菌殺傷におけるＲＡＳＡ２の変異分析。
ＲＡＳＡ２は、Ｎ末端セグメント内に２つのＣ２ドメイン（Ｃ２ＡおよびＣ２Ｂ）を有しており、そこからＣ末端方向へＲａｓＧａｐドメインおよびＰＨ／Ｂｔｋドメインが続く。Ｃ２ドメインは、細胞膜へタンパク質を標的にすることに関与するタンパク質構造ドメインであるが、ＲＡＳＡ２におけるそれらの機能についてはあまり研究されていない。ＰＨ−Ｂｔｋドメインは、ＰＩＰの結合に必要である。ＲＡＳＡ２は、可溶性のＩＰ（３，４，５）Ｐ３、ＰＩ（１，３，４，５，６）Ｐ５、ＩＰ６に結合するが、ＩＰ（１，４，５）Ｐ３には結合しない。また、ＲＡＳＡ２は、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３にも結合するので、その結合にはイノシトール３リン酸化が必要であることが示唆される。ＲＡＳＡ２が内在性膜上でｖｐｓ３４により構成的に合成されるＰｔｄＩｎｓＰ（３）Ｐに結合するか否かについては、知られていない。
【０３２７】
細菌殺傷および細菌を含む液胞へのＰ２の移行（図３２）におけるＲＡＳＡ２の機能ドメインの役割を調べるために、我々は機能的ドメインΔＣ２Ａ、ΔＣ２Ｂ、ΔＣ２Ａ、Ｂ、ΔＲａｓＧＡＰ、ΔＰＨ−Ｂｔｋを欠失させる予定である。分析のために、３’ＵＴＲを標的とするｓｉＲＮＡおよび３’ＵＴＲを欠くＲＡＳＡ２の欠失構築物を用いて再構成された細胞を用いて内因性ＲＡＳＡ２をノックダウンする予定である（図３０でＰ２−ＲＦＰについて示すものと同様）。
【０３２８】
Ｐ２およびＲＡＳＡ２移行に対する細菌種の効果。
図３５におけるＰ２の移行は、ネズミチフス菌および実験用株大腸菌Ｋ１２の感染によるものである。我々はまた、サルモネラ菌、マイコバクテリア、および他の細菌を用いて、野生型および変異型Ｐ２、ならびに野生型および変異型ＲＡＳＡ２の移行をそれぞれ決定する予定である。マイコバクテリアは、ＰＩ３Ｐの生成と液胞の成熟を妨害する。サルモネラ３型分泌エフェクターＳｏｐＢは、液胞の成熟を妨げ、サルモネラ菌を含む液胞、ＳＣＶ内の細胞内生存を増強するというＰＩ３Ｐに対する複数の効果を有する。サルモネラ菌を含む液胞に対しＰＩ３Ｐを変化させると、Ｐ２およびＲＡＳＡ２の移行の両方に対し、大腸菌に対する場合よりも影響を及ぼす可能性がある。
【０３２９】
我々は、ＲＡＳＡ２のＰＨ−ＢｔｋドメインおよびＲａｓＧａｐドメインの両方とも、細菌の殺傷に不可欠であると考えている。ＰＩＰ３発生時に細菌を含有する液胞へＲＡＳＡ２が移行すると考えられる。ＲａｓＧＡＰは通常、スイッチレギュレータとして作動し、細菌を含有する液胞にＰ２を移行する機能を果たし得る。ＲａｓＧＡＰまたはＣ２ドメインは、Ｐ２／ＲＡＳＡ２の相互作用に必要である可能性があり、このことは共免疫沈降および酵母ツーハイブリッド分析によってアッセイされるだろう。
【０３３０】
その後の研究において、我々は酵母ツーハイブリッドスクリーニングにおける餌としてＲＡＳＡ２およびその欠失変異体を使用して、Ｒａｂｓおよび液胞ソーティングネキシンといったＲＡＳＡ２の機能を補助する更なる候補を同定する予定である。
【０３３１】
Ｐ２−ＲＦＰの細胞質ドメインの変異分析。
マウスＰ２の細胞質配列において保存されているアミノ酸は（ＲＫＹＫＫＫ配列番号４）（ハイライト）であり、それに続いて、保存されたＹ、そして酸性ＥＩＥＥＱＥ（配列番号５）があり、その後保存されたＳが続き、Ｃ末端の近くに追加的なＳがある（図２８Ａ）。いくつかのキナーゼファミリーを、潜在的なリン酸化部位についてのアルゴリズムを用いて同定した。我々は、Ｐ２の細胞質ドメインは、細菌感染時に、細菌を含有する液胞へのＰ２の移行および細菌を死に至らしめる細胞壁でのＰ２の重合をもたらす信号を受けることを示す。我々は、（ａ）ＫＹＫＫ（配列番号７）をＱＹＱＱ（配列番号８）に；（ｂ）保存されたＹをＦに、そして（ｃ）２個の保存されたＳをＡ（ブロック）またはＤ（構成的に活性）に変異させる予定である（図２８ａ参照）。我々はすでにフローサイトメトリーによる決定においてＰ２−ＲＦＰにおけるＹからＦへの変異が安定して発現されるが、ｓｉＲＮＡによる内因性Ｐ２のノックダウンを補完するために使用する場合、細菌殺傷活性が破壊されることを確立した。
【０３３２】
我々は、発現および安定性、細菌の殺傷、および細菌を含有する液胞へのＰ２の移行に対するＰ２−ＲＦＰ変異の効果を決定する予定である。加えて、我々は共免疫沈降によるＲＡＳＡ２との相互作用（図３５ｂ）および液胞へのＲＡＳＡ２の移行能に対するＰ２変異の効果を決定する予定である。
【０３３３】
Ｐ２−ＲＦＰにおいてＫＹＫＫをＱＹＱＱに、または保存されたＹをＦに変異させると（図２８ａ）、Ｐ２−ＲＦＰの殺傷活性は損失するが、フローサイトメトリーによる発現レベルは正常であった（データは示さず）。これらの実験では、内因性Ｐ２の３’ＵＴＲに特異的なｓｉＲＮＡを用いたトランスフェクト、および天然３’ＵＴＲを欠く変異Ｐ２−ＲＦＰプラスミドｃＤＮＡを用いた同時トランスフェクトにより内因性Ｐ２をノックダウンした。変異Ｐ２とＲＡＳＡ２との相互作用については、共免疫沈降によって決定される（図３５ｂ）。保存されたＳからＤへの変異（リン酸化を模倣する）は、Ｐ２の殺傷活性を増加させた（データは示さず）。他の部分を変異させＣ末端配列の欠失部位を増加させれば、殺傷における機能およびＲＡＳＡ２の相互作用の分析ができるようになるだろう。我々は、Ｐ２がＲＡＳＡ２と相互作用できなくなるような変異により、Ｐ２介在性の殺傷がブロックされるだろうと考えている。しかし、ＲＡＳＡ２との相互作用を妨害しない変異であっても、Ｐ２の機能をブロックする可能性もある。後者の効果は、Ｐ２の重合を誘発するがＲＡＳＡ２との相互作用および移行には影響しない細胞質ドメインの機能によるものである可能性がある。
【０３３４】
実施例６：Ｐ２介在性の細胞内細菌の殺傷へつながるオートファジーの解析
オートファジー（ゼノファジー）は感染によって活性化される。オートファジーの細胞内開始部位は、オートファゴソームへと成長するファゴフォアーの核形成部位を決定するｖｐｓ３４複合体によるイノシトールの３位をＰＩ（３，４，５）Ｐ３やＰＩ３Ｐへリン酸化することによって決定される。
【０３３５】
感染後、ＲＡＢ５は、イノシトールの３位をリン酸化する細菌を含有する液胞にＰＩ３キナーゼであるｖｐｓ３４を補充し、ＰＩ（３，４，５）Ｐ２およびＰＩ（３）Ｐを生成する。オートファジー膜小胞輸送のためのｇｅｆは、ＴＲＡＰＰＩＩＩ複合体であり、我々はその成分とＶｐｓ３４、ＲＡＳＡ２、Ｐ２、およびＲａｂ１との相互作用を検討する予定である。Ｖｐｓ３４のリン酸化は、おそらくＰ２との相互作用と共にＲＡＳＡ２の結合を可能にし（図３５ｂ）、そしてまた、非貪食細胞における初期のオートファゴソームの核形成部位として働く。貪食細胞では、同じ配列によりＲＡＳＡおよびＰ２が細菌を含有する液胞へともたらされ、これがファゴソームに成熟する可能性がある。例えばサルモネラ・エンテリカ血清型ネズミチフス菌および結核菌などの病原性細菌は、オートファジーまたはファゴソーム成熟における初期段階を操作する病原性遺伝子を有している。
【０３３６】
ＬＣ３は、哺乳動物細胞における初期および後期オートファゴソームに関連したオートファジーの優れたマーカーである。ホスファチジルエタノールアミンへのＬＣ３のリンクは、Ｅ３様Ａｔｇ１６Ｌ−Ａｔｇ１７−Ａｔｇ５複合体によって触媒される。また、Ａｔｇ１６Ｌ複合体は、ｍＥＦにおけるネズミチフス菌の細胞内複製を防止するのに必要なＡｔｇ９Ｌ１と共にオートファジー二重膜の形成に必要である。最終段階は、酸性化およびリソソームとの融合である。我々は、Ｐ２がオートファゴソームに補充され、ＬＣ３と共局在しうることを示す（図３２）。
【０３３７】
オートファゴソームへのＰ２の侵入ポイントの決定。
オートファジーは、オートファジー膜の段階的な組み立ておよびその後のリソソームとの融合により媒介される。我々は、感染性オートファジーにおいて、Ｐ２が細菌を含有する液胞および／または初期のオートファゴソームに補充され、ここで、膜貫通ドメインを介してＰ２が膜に繋留したまま細菌を死に致らしめていることを示す（図２８ａを参照）。Ｐ２により殺傷された細菌は、細胞壁に孔があるので、パーフォリン２の重合により穿孔されたことが強く示唆される（図３７）。ＭＲＳＡは、感染後に４時間界面活性剤を用いて溶解することによりｍＥＦから得られ、電子顕微鏡により分析したところ、典型的に９０Åの細胞壁の孔が見られ（図３６左パネル）、これは真核生物膜のＰ２孔の大きさと類似していた（図３６の右パネル）。Ｐ２による孔と推定されるものも、ｍＥＦで殺傷したマイコバクテリアの細胞壁に存在する（データは示さず）。Ｐ２孔は、ＲＯＳ、ＮＯ、およびリゾチームを細菌の細胞壁を通して透過させやすくして殺傷を完了する可能性がある。Ｐ２／オートファジーのリンクについての我々の示唆によれば、Ｐ２の補充前の段階におけるオートファジーをブロックすると細菌の殺傷がブロックされるであろう。Ｐ２が補充され重合した後にオートファジーの段階をブロックしても、殺傷が損なわれることはないだろう。Ａｔｇ１４Ｌはオートファジーにおけるｖｐｓ３４  ＰＩ３−キナーゼ複合体の標的成分である。Ｐ２のノックダウンと同様に、ｓｉＲＮＡによりＡｔｇ１４Ｌをノックダウンさせると、完全に活性なＰ２を存在させても、ＢＶ２におけるマイコバクテリアの殺傷がブロックされる（図３７）。
【０３３８】
ＢＶ２は貪食細胞である。図３７のデータは、ｖｐｓ３４／Ａｔｇ１４Ｌが、オートファジーに依存するｍＥＦにおいて必要である（図３８ｂ）のと同様に、貪食細胞による細菌の殺傷に必要であることを示唆している。細菌のファゴサイトーシスおよびオートファジーの初期の段階は類似しており、非貪食細胞および貪食細胞におけるＰ２補充に関する共通のメカニズムを反映している可能性がある。データは、Ｐ２が、オートファジーおよびファゴサイトーシスの両方によって細菌を殺傷させるエフェクターであるという仮説と一致する。Ｐ２は、それぞれ、オートファジーの開始または液胞のファゴソームへの成熟の開始と共に補充される。
【０３３９】
さらにオートファゴソームへのＰ２の侵入ポイントを決定するために、我々は、オートファジー膜上のホスファチジルエタノールアミンにＬＣ３を結合するのに必要なオートファジーの成分であるＡｔｇ５およびＡｔｇ１６Ｌ１をノックダウンする予定である。
【０３４０】
図３８のデータは、Ａｔｇ１４Ｌ（図３８ｂ）、Ａｔｇ１６Ｌ（図３８ｃ）、およびＡｔｇ５（図３８ｄ）が、サルモネラ菌の殺傷および静菌性を保つために必要であることを示唆している。それらをノックダウンすると、ｍＥＦにおいてサルモネラ菌の細胞内複製が可能になる。ｍＥＦにおいてサルモネラ菌の複製を防止するのにＡｔｇ１４Ｌが必要である（図３８）。Ａｔｇｌ４Ｌは、オートファジーを開始するＰＩ３−キナーゼ−ｖｐｓ３４複合体の構成要素である。ｖｐｓ３４−ＰＩ３−キナーゼ酵素活性の関与を確認するために、我々は、ＰＩ３−キナーゼ遮断剤であるワートマニンまたは選択的なｖｐｓ３４阻害剤である３−メチルアデニン（３−ＭＡ）使用する予定である。両者ともオートファジーをブロックすることが知られている。３−ＭＡは、Ｐ２のノックダウンと同様にサルモネラ菌の複製を可能にするので、ｖｐｓ３４の酵素活性が細菌の細胞内殺菌に必要であることが示唆される。対照的に、バフィロマイシンは、殺菌／静菌活性を妨害しない。バフィロマイシンは、酸性化およびリソソームの融合を防ぐことができるが、ｍＥＦによるサルモネラ菌の殺傷に必要ではない（図３９）。
【０３４１】
Ｐ２のノックダウンとオートファジーのブロックは、両者ともｍＥＦにおける細菌の細胞内殺菌を防止し、それらの複製を可能にする。この発見についての最も簡単な説明は、両方のプロセスが、細菌の制御に必要であり、互いにリンクしているだろうということである。Ｐ２は、オートファジーと協調して細菌を死に致らしめている可能性がある。図３７〜３９のデータは、Ａｔｇ１４Ｌ−ｖｐｓ３４の後だがファゴソームとリソソームの融合前にＰ２が作用する場所を示す。Ａｔｇ５またはＡｔｇ１６Ｌのノックダウンにより、ｍＥＦにおけるサルモネラ菌の複製が可能になる。これは公表された報告と一致する。Ａｔｇ５は、ホスファチジルエタノールアミンへＬＣ３が結合したＡｔｇ１６Ｌ複合体の一部として必要である。したがって、ＬＣ３の脂質化は、Ｐ２介在性のサルモネラ菌の殺傷に必要である可能性がある。また、Ａｔｇ１６Ｌ複合体は、Ａｔｇ９Ｌ１と共に二重膜の形成に必要である。ノックアウトｍＥＦにおいてＡｔｇ９Ｌ１が存在しないと、細胞内のサルモネラ菌の複製が促進される。Ａｔｇ９Ｌ１は、Ａｔｇ１６Ｌ複合体と共に、ＬＣ３で修飾されたオートファジー二重膜の形成に必要である主要な脂質小胞ドナーの１つである可能性がある。Ａｔｇ９は、酵母において、Ａｔｇ２３およびＡｔｇ２７の補助によりゴルジ複合体由来の細胞質に存在し、直径が３００〜６００Åの膜小胞にある多膜貫通タンパク質である。酵母Ａｔｇ２３および２７のホモログは、哺乳動物では記述がない。Ａｔｇ９Ｌ１は、酵母Ａｔｇ９に対する哺乳類のホモログである。膜貫通タンパク質Ｐ２（図２８ａ）は、Ａｔｇ１６およびＬＣ３を必要とし二重膜の形成を開始する工程において、Ａｔｇ９Ｌ１−小胞と共にＲＡＳＡ−２によって細菌を含有する液胞に補充可能である。Ｐ２−小胞は、Ａｔｇ９Ｌ１−小胞と融合することができるか、あるいはＲＡＳＡ２、Ｒａｂ５、もしくはＲａｂ７および／または別の成分が関与するかもしれない同じ輸送経路によって別々に補充される可能性もある。
【０３４２】
画像化によるオートファジーにおけるＰ２移行およびＬＣ３の決定。
図３２は、感染の５分以内に細菌を含有する液胞へＰ２が移行する例を示す。この実験では、内因性Ｐ２をｓｉＲＮＡでノックダウンし、同時に細胞をＰ２−ＲＦＰでトランスフェクトした。１６時間後、細胞をＧＦＰ発現大腸菌Ｋ１２に感染させ、感染後５分間パラホルムアルデヒドで固定し、共焦点顕微鏡によって撮影した。図３２ａは、Ｐ２およびＬＣ３が、感染の５分以内に細菌を含有する液胞上に共局在していることを示す。
【０３４３】
ファゴソームまたはオートファゴソームへのＬＣ３の結合を測定するために、我々はＬＣ３−ＧＦＰを用いてｍＥＦ、ＢＶ２、およびＲＡＷを永続的にトランスフェクトする予定である。我々の研究は、主に、天然ｍＥＦおよびＩＦＮ誘発性のｍＥＦに焦点を当てる予定である。ＢＶ２および生細胞を対照として使用する。Ａｔｇ５、７、９Ｌ１、１４Ｌ、または１６Ｌをノックダウンし、細胞をサルモネラ菌、ＭＲＳＡ、またはマイコバクテリアに感染させ、反応を固定により停止する予定である。
【０３４４】
ＩＦＮ誘導性のｍＥＦにおけるノックダウンおよび画像化による細菌殺傷におけるＰ２およびＡＴＧ９Ｌ１との関係についての研究。
ＡＴＧ９Ｌ１は、ＩＦＮによってＰ２を発現するよう誘導していないｍＥＦにおけるサルモネラ菌の細胞内複製を遅延させるのに必要である。我々は、Ｐ２が存在しない場合、細菌がｍＥＦにおいて複製するだろうこと、そして図３４ｂにおいてサルモネラ菌がＰ２誘導を抑制していることを示した。したがって、我々は、Ｐ２発現を誘導したまたはしない野生型およびＡＴＧＬ１ノックダウン細胞を用いた画像化によって、ＡＴＧ９Ｌ１の役割を研究する予定である。我々はまた、Ｐ２−ＧＦＰまたは／およびＡＳＡ２を用いた共免疫沈降についても観察する予定である。ＡＴＧ９Ｌ１は６０〜９０ｎｍ以下の脂質小胞に埋め込まれた６個の膜貫通性タンパク質であるので、Ｐ２と相互作用し、同様の移行経路を用いている可能性のある候補である。
【図１】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１５Ａ−１５Ｆ】
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【図１６】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２７】
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【図３４】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図８】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１７】
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【図２６】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３５】
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【図４０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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