(57)【要約】  本開示は、バイオリアクター培養プロセスにおいて、少なくとも３つのパラメーターを修飾することによって、モノクローナル抗体の調製物中の凝集物を低下させるための方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗デルタ様リガンド４（ＤＬＬ４）モノクローナル抗体を産生するための方法であって、
約３７℃の温度、約７．０のｐＨ、および約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏの出発重量オスモル濃度で、前記抗体を発現する哺乳動物細胞を培養するステップであって、
前記抗体が、
ａ）配列番号：７において記載される重鎖可変（ＶＨ）ドメインおよび配列番号：８において記載される軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、または
ｂ）配列番号：１において記載されるアミノ酸配列を含むＶＨドメイン相補性ドメイン領域（ＣＤＲ）１、配列番号：２において記載されるアミノ酸配列を含むＶＨドメインＣＤＲ２、および配列番号：３において記載されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、ならびに配列番号：４において記載されるアミノ酸配列を含むＶＬドメインＣＤＲ１、配列番号：５において記載されるアミノ酸配列を含むＶＬドメインＣＤＲ２、および配列番号：６において記載されるアミノ酸配列を含むＶＬドメインＣＤＲ３を含む上記ステップ、ならびに
培養上清から、発現された前記抗ＤＬＬ４抗体を回収するステップを含む上記方法。
【請求項２】
抗デルタ様リガンド４（ＤＬＬ４）モノクローナル抗体を産生するための方法であって、
約３６．５℃の温度、約６．８５のｐＨ、および約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏの出発重量オスモル濃度で、前記抗体を発現する哺乳動物細胞を培養するステップであって、
前記抗体が、
ａ）配列番号：７において記載される重鎖可変（ＶＨ）ドメインおよび配列番号：８において記載される軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、または
ｂ）配列番号：１において記載されるアミノ酸配列を含むＶＨドメイン相補性ドメイン領域（ＣＤＲ）１、配列番号：２において記載されるアミノ酸配列を含むＶＨドメインＣＤＲ２、および配列番号：３において記載されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、ならびに配列番号：４において記載されるアミノ酸配列を含むＶＬドメインＣＤＲ１、配列番号：５において記載されるアミノ酸配列を含むＶＬドメインＣＤＲ２、および配列番号：６において記載されるアミノ酸配列を含むＶＬドメインＣＤＲ３を含む上記ステップ、ならびに
培養上清から、発現された前記抗ＤＬＬ４抗体を回収するステップを含む上記方法。
【請求項３】
回収された前記抗ＤＬＬ４抗体が、ＳＥＣ−ＨＰＬＣで決定される５％未満の凝集物を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
回収された前記抗ＤＬＬ４抗体が、ＳＥＣ−ＨＰＬＣで決定される２％未満の凝集物を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記培養の間に、２つの部分に分かれた供給材料により、前記細胞に材料供給するステップをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記哺乳動物細胞株が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＮＳＯ、またはＰＥＲ．Ｃ６細胞株から選ばれる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞株が、ＣＨＯである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記抗ＤＬＬ４抗体の回収が、前記抗体のアフィニティー精製を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記アフィニティー精製が、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記培養上清における前記抗体の力価が、少なくとも３ｇ／Ｌである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記培養上清における前記抗体の力価が、少なくとも４ｇ／Ｌである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記培養上清における前記抗体の力価が、少なくとも５ｇ／Ｌである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記培養上清における前記抗体の力価が、少なくとも６ｇ／Ｌである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記培養上清における前記抗体の力価が、少なくとも７ｇ／Ｌである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗ＤＬＬ４抗体が、配列番号：７において記載されるＶＨドメインおよび配列番号：８において記載されるＶＬドメインを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗ＤＬＬ４抗体が、配列番号：１において記載されるアミノ酸配列を含むＶＨドメインＣＤＲ１、配列番号：２において記載されるアミノ酸配列を含むＶＨドメインＣＤＲ２、および配列番号：３において記載されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、ならびに配列番号：４において記載されるアミノ酸配列を含むＶＬドメインＣＤＲ１、配列番号：５において記載されるアミノ酸配列を含むＶＬドメインＣＤＲ２、および配列番号：６において記載されるアミノ酸配列を含むＶＬドメインＣＤＲ３を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
プロテインＡ精製モノクローナル抗体産物中の凝集物含有量を約５％未満まで低下させるための方法であって、
ａ）約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏの出発重量オスモル濃度を有する培養培地において、約３７℃の温度および約７．０のｐＨで、前記抗体を発現する哺乳動物細胞株を培養するステップであって、
前記細胞株が、配列番号：１のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号：２のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号：３のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、配列番号：４のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号：５のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号：６のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む抗ＤＬＬ４抗体を発現し、かつ
培養プロセスが、前記細胞に材料供給するために、２つの部分に分かれた供給材料を使用することを含む上記ステップ、
ｂ）培養上清から、発現された前記抗体を回収するステップ、ならびに
ｃ）アフィニティークロマトグラフィーを使用して、発現された前記抗体を精製するステップを含む上記方法。
【請求項１８】
プロテインＡ精製モノクローナル抗体産物中の凝集物含有量を約５％未満まで低下させるための方法であって、
ａ）約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏの出発重量オスモル濃度を有する培養培地において、約３６．５℃の温度および約６．８５のｐＨで、前記抗体を発現する哺乳動物細胞株を培養するステップであって、
前記細胞株が、配列番号：１のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号：２のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号：３のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、配列番号：４のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号：５のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号：６のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む抗ＤＬＬ４抗体を発現し、かつ
培養プロセスが、前記細胞に材料供給するために、２つの部分に分かれた供給材料を使用することを含む上記ステップ、
ｂ）培養上清から、発現された前記抗体を回収するステップ、ならびに
ｃ）アフィニティークロマトグラフィーを使用して、発現された前記抗体を精製するステップを含む方法。
【請求項１９】
前記アフィニティークロマトグラフィーが、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞である、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体が、配列番号：７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインおよび配列番号：８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
精製された前記抗ＤＬＬ４抗体が、ＳＥＣ−ＨＰＬＣで決定される２％未満の凝集物を含む、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記培養上清における前記抗体の力価が、少なくとも３ｇ／Ｌである、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記培養上清における前記抗体の力価が、少なくとも４ｇ／Ｌである、請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記培養上清における前記抗体の力価が、少なくとも５ｇ／Ｌである、請求項１７〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記培養上清における前記抗体の力価が、少なくとも６ｇ／Ｌである、請求項１７〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記培養上清における前記抗体の力価が、少なくとも７ｇ／Ｌである、請求項１７〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
抗ＤＬＬ４モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の凝集物を低下させるための方法であって、バイオリアクターにおいて、３６．５℃の温度、６．８のｐＨ、および３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏの出発重量オスモル濃度を含む条件下での、同じｍＡｂ産生ＣＨＯ細胞の培養よりも、少ない凝集物を産生する温度、ｐＨ、および重量オスモル濃度の条件下で、前記抗ＤＬＬ４ｍＡｂを分泌するＣＨＯ細胞を培養するステップを含み、
前記抗ＤＬＬ４抗体が、配列番号：１のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号：２のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号：３のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、配列番号：４のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号：５のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号：６のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む、上記方法。
【請求項２９】
より少ない凝集物を産生する条件が、
ａ）ｐＨ７．０、温度３４℃、および出発重量オスモル濃度４００ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏまたは
ｂ）ｐＨ６．８５、温度３５．５℃、および出発重量オスモル濃度３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏまたは
ｃ）ｐＨ６．７、温度３７℃、および出発重量オスモル濃度４００ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏまたは
ｄ）ｐＨ６．７、温度３４℃、および出発重量オスモル濃度３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏまたは
ｅ）ｐＨ７．０、温度３７℃、および出発重量オスモル濃度３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏまたは
ｆ）ｐＨ７．０、温度３７℃、および出発重量オスモル濃度４００ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏまたは
ｇ）ｐＨ６．８５、温度３５．５℃、および出発重量オスモル濃度３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏまたは
ｈ）ｐＨ７．０、温度３４℃、および出発重量オスモル濃度３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏまたは
ｉ）ｐＨ６．７、温度３７℃、および出発重量オスモル濃度３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏまたは
ｊ）ｐＨ６．８５、温度３６．５℃、および出発重量オスモル濃度３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏのうちの１つを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記培養が、２つの部分に分かれた供給材料により、前記細胞に材料供給するステップを含む、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗ＤＬＬ４抗体が、配列番号：７に示されるアミノ酸配列を含むＶＨドメインおよび配列番号：８に示されるアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
ＳＥＣ−ＨＰＬＣで決定される約１．４％未満の凝集物を含む、請求項１〜３１のいずれか１つによって産生される抗体組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モノクローナル抗体産生の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、重要な種類の生物医薬である。それらは、最もよく売れている種類の生物学的製剤のうちの１つに相当し、米国の販売を合わせると、２００９年では約１６９億ドルに達する（Ａｇｇａｒｗａｌ，２０１０）。ＭＡｂは、とりわけ様々なタイプの癌および慢性炎症性状態の治療のための診断薬としておよび薬剤として、一般に使用されている。現在、ｍＡｂは、他の従来の治療よりも有効で、安全で、かつ便利な、多くの新しい治療の選択肢を患者に提供している（Ｊａｉｎ  ＆  Ｋｕｍａｒ，２００８）。
【０００３】
ヒトデルタ様抗原４（「ＤＬＬ４」）に対する抗体は、様々な癌の治療を含む治療上の適用を有する抗体の１つである。ＤＬＬ４に対して特異的ないくつかのヒトモノクローナル抗体は、米国特許出願第２０１０／０１９６３８５０号明細書において記載される。
【０００４】
治療上の適用のためのＭＡｂは、チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞を使用して発現させることができる。そのようなｍＡｂをコードする遺伝子は、クローニングし、臨床上および商業上の使用のための、十分な量のｍＡｂの産生を可能にするＣＨＯ細胞株にトランスフェクトすることができる。ｍＡｂをコードする遺伝子によりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞クローンは、発現およびタンパク質アフィニティー（たとえばプロテインＡ）精製に際して、容認できないほど高いレベルの抗体凝集物をもたらし得る。
【０００５】
ＭＡｂ凝集は、治療用タンパク質産生における主な関心事である。世界保健機構（ＷＨＯ）の基準は、市販の静脈内免疫グロブリン産物における凝集物レベルを５％未満に制限している（Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。混入物と考えると、凝集物は、産物の純度および質を低下させる。それらは、患者において免疫原性の応答を引き起こし得る（Ｂａｒｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。そのうえ、凝集物は、毛細管を機械的にブロックし、虚血後の患者において微小循環の低下を引き起こし得る（Ｓｈｅｌｌｅｋｅｎｓ，２００５；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，２００６）。したがって、凝集物を、ＷＨＯの限度未満の許容できるレベルまで低下させることができない場合、治療上の可能性を有する抗体は、開発が停止され得る。
【０００６】
凝集物は、哺乳動物細胞、たとえばＣＨＯ細胞の培養の間を含めて、製造プロセスにおけるあらゆるステップで形成され得る。細胞培養段階でｍＡｂについての凝集を低下させることができた場合、それにより、下流の製造の負担を有意に低下させ、実質的な、全体的なプロセス収率の改善をもたらすと思われるので、これは、非常に有益であろう。
【０００７】
したがって、細胞培養の間に凝集物の形成を低下させる、ＤＬＬ４  ｍＡｂを発現するＣＨＯ細胞についての発酵プロセスが、本明細書において議論される。発酵プロセスは、５％未満の凝集レベルを有する培養物からプロテインＡ精製産物をもたらすことができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許出願第２０１０／０１９６３８５０号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ａｇｇａｒｗａｌ，２０１０
【非特許文献２】Ｊａｉｎ  ＆  Ｋｕｍａｒ，２００８
【非特許文献３】Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９
【非特許文献４】Ｂａｒｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０
【非特許文献５】Ｓｈｅｌｌｅｋｅｎｓ，２００５
【非特許文献６】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，２００６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に従って、本発明によって包含される実施形態は、抗ＤＬＬ４モノクローナル抗体を産生するための方法を提供する。モノクローナル抗体を発現する哺乳動物細胞は、約３６．５℃の温度、約６．８５のｐＨ、および約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏの出発重量オスモル濃度で培養される。他の実施形態において、モノクローナル抗体を発現する哺乳動物細胞は、約３７℃の温度、約７．０のｐＨ、および約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏの出発重量オスモル濃度で培養される。発現された抗体は、培養上清から回収される。
【００１１】
本発明によって包含される他の実施形態は、抗ＤＬＬ４モノクローナル抗体の凝集物を低下させるための方法である。抗ＤＬＬ４モノクローナル抗体を分泌するＣＨＯ細胞は、バイオリアクターにおいて、３６．５℃の温度、６．８のｐＨ、および３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏの出発重量オスモル濃度を含む条件下での、同じｍＡｂ産生ＣＨＯ細胞の培養よりも、少ない凝集物を産生する温度、ｐＨ、および重量オスモル濃度の条件下で培養される。抗ＤＬＬ４モノクローナル抗体は、配列番号：１のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号：２のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号：３のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、配列番号：４のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号：５のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号：６のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む。
【００１２】
方法は、複数の部分に分かれた供給材料を含むことができる。複数の部分に分かれた供給材料は、２つの部分に分かれた供給材料を含むことができる。その代わりに、方法は、単一の供給材料を含むことができる。グルコースは、グルコースレベルをコントロールするために培養物に追加することができる。グルコースが、その方法において追加される場合、グルコースの追加は、供給材料と考えられない。
【００１３】
先の全般的な説明および以下の詳細な説明の両方は、例示的かつ説明的なものにすぎず、請求項を限定するものではないということを理解されたい。
【００１４】
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付の図面は、本発明によって包含される、いくつかの実施形態を例証し、その説明と一緒に、本発明の原理のいくつかについて説明する役目を果たす。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】抗体単量体および凝集物のピークを示すＨＰＬＣプロファイルを示す図である。
【図２】異なる細胞培養条件を有する１２個の１Ｌバイオリアクターの間で比較した凝集物レベルを示す図である。
【図３】図３Ａ−Ｆは、線形モデルにおける、細胞培養パラメーターとしての温度、重量オスモル濃度、およびｐＨならびに力価および凝集物のレベル（プロテインＡ精製後）に対するそれらの影響の間の関係を示す実験計画法（ＤｏＥ）予測プロファイラー（Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ（ＤｏＥ）ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｒ）を示す図である。
【図４】以前の（赤色／下の線）および新しい最適化された（緑色／上の線）発酵プロセスにおいて観察された細胞増殖パターンを示す図である。
【図５】２４×１０６生細胞／ｍＬよりも高いピーク生細胞数に達することなく、２％未満の凝集レベルおよび６ｇ／Ｌより高い力価を実現するための細胞培養プロセスについての作業中のウィンドウを示す実験計画法等高線プロファイラー（Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  Ｃｏｎｔｏｕｒ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ）を示す図である。
【図６】二次モデルにおける、細胞培養パラメーターとしての温度、重量オスモル濃度、およびｐＨならびに力価および凝集物のレベル（プロテインＡ精製後）に対するそれらの影響の間の関係を示す等高線図を示す図である。等高線図は、ｐＨ（Ｘ軸）、温度（Ｙ軸）、および重量オスモル濃度（プロットの上に示す）の関数としての、力価（上のプロット）および凝集物（下のプロット）の範囲予測を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明によって包含される、様々な実施形態について、ここで言及する。
【００１７】
本開示は、細胞培養物からまたはアフィニティー精製細胞培養上清から回収される抗ＤＬＬ４モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の凝集物を低下させるための方法を提供する。凝集物はまた、単一の供給材料を使用するバイオリアクターにおいて、３６．５℃の温度、６．８のｐＨ、および３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏの出発重量オスモル濃度を含む条件下でｍＡｂを分泌する同じ哺乳動物細胞株の培養よりも、少ない凝集物を産生する温度、ｐＨ、および重量オスモル濃度の条件下でｍＡｂを分泌する第１の哺乳動物細胞株を培養することによって、低下させてもよい。必要であれば、第１の哺乳動物細胞株よりも低いレベルのｍＡｂ凝集物を産生する第２の哺乳動物細胞株が、選択され、第１の哺乳動物細胞株と置換されてもよい。
【００１８】
抗ＤＬＬ４  ｍＡｂの凝集物を低下させるｐＨ、温度、および出発重量オスモル濃度培養条件は、ｐＨ７．０、温度３４℃、および出発重量オスモル濃度４００ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２ＯまたはｐＨ６．８５、温度３５．５℃、および出発重量オスモル濃度３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２ＯまたはｐＨ６．７、温度３７℃、および出発重量オスモル濃度４００ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２ＯまたはｐＨ６．７、温度３４℃、および出発重量オスモル濃度３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２ＯまたはｐＨ７．０、温度３７℃、および出発重量オスモル濃度３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２ＯまたはｐＨ７．０、温度３７℃、および出発重量オスモル濃度４００ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２ＯまたはｐＨ６．８５、温度３５．５℃、および出発重量オスモル濃度３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２ＯまたはｐＨ７．０、温度３４℃、および出発重量オスモル濃度３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２ＯまたはｐＨ６．７、温度３７℃、および出発重量オスモル濃度３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２ＯまたはｐＨ６．８５、温度３６．５℃、および出発重量オスモル濃度３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏであってもよい。
【００１９】
５％以下まで抗ＤＬＬ４  ｍＡｂの凝集物を低下させるｐＨ、温度、および出発重量オスモル濃度培養条件は、約６．８０〜約７．００のｐＨ、約３２０〜約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏの重量オスモル濃度、および約３４．５℃〜約３６．５℃の温度であってもよい。
【００２０】
抗ＤＬＬ４  ｍＡｂは、清澄後に細胞培養物から回収されてもよく、および／またはたとえば、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを利用してアフィニティー精製されてもよい。
【００２１】
本明細書において開示される様々な態様の他のいくつかの実施形態において、培養温度が、３７℃であってもよく、または約３６．５℃であってもよい。一実施形態において、培養温度は、約３７．０℃である。他の実施形態において、培養温度は、バイオリアクター培養システムの誤差範囲内で３７．０℃で保持される。さらに他の実施形態において、培養温度は、ＤＡＳＧＩＰ  １Ｌ流加バイオリアクターの誤差範囲内で３７．０℃で保持される。さらに他の実施形態において、培養温度は、３７．０℃±０．１であってもよい。一実施形態において、培養温度が、３７℃である。
【００２２】
本明細書において開示される様々な態様の他のいくつかの実施形態において、培養温度が、３６．５℃であってもよく、または約３６．５℃であってもよい。一実施形態において、培養温度は、約３６．５℃である。他の実施形態において、培養温度は、バイオリアクター培養システムの誤差範囲内で３６．５℃で保持される。さらに他の実施形態において、培養温度は、ＤＡＳＧＩＰ  １Ｌ流加バイオリアクターの誤差範囲内で３６．５℃で保持される。さらに他の実施形態において、培養温度は、３６．５℃±０．１であってもよい。一実施形態において、培養温度は、３６．５℃である。
【００２３】
本明細書において開示される様々な態様のいくつかの実施形態において、培養ｐＨは、約７．０である。一実施形態において、培養ｐＨは、バイオリアクター培養システムの誤差範囲内で７．０で保持される。他の実施形態において、培養ｐＨは、ＤＡＳＧＩＰ  １Ｌ流加バイオリアクターにおいて７．０±０．１で保持される。一実施形態において、培養ｐＨは、７．０である。本明細書において開示される様々な態様のいくつかの実施形態において、培養ｐＨは、約６．８５である。一実施形態において、培養ｐＨは、バイオリアクター培養システムの誤差範囲内で６．８５で保持される。他の実施形態において、培養ｐＨは、ＤＡＳＧＩＰ  １Ｌ流加バイオリアクターにおいて６．８５±０．１で保持される。一実施形態において、培養ｐＨは、６．８５である。ｐＨは、たとえば、アルカリ溶液、炭酸水素ナトリウム、またはＣＯ２ガスを追加することによって、培養プロセスの間に調節されてもよい。
【００２４】
本明細書において開示される様々な態様のいくつかの実施形態において、培養の開始時の培養培地の重量オスモル濃度は、約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏである。一実施形態において、培養の開始時の培養培地の重量オスモル濃度は、３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏ±１．０．である。他の実施形態において、培養の開始時の培養培地の重量オスモル濃度は、３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏである。一実施形態において、培養培地が、無動物タンパク質培地である。培地の重量オスモル濃度は、たとえば、ＮａＣｌなどのような塩を追加することによって、調節することができる。培養培地は、当技術分野においてよく知られている任意のものであってもよく、または使用者による注文生産の培地であってもよい。
【００２５】
本明細書において開示される様々な態様のいくつかの実施形態において、培養プロセスは、２部に分かれた供給材料を含んでいてもよい。これらの実施形態において、供給材料は、２つの部分に分かれた（つまり、２つの別々の容器中に保存された）濃縮物として存在し、各部の濃縮物が、培養物に対して個々に追加される。抗体産生の当業者は、市販で入手可能な供給材料を識別することができ、細胞培養プロセスのための供給材料を注文により開発してもよい。供給材料は、培地またはアミノ酸、ビタミン、鉄、脂質、および微量元素などのような、グループ分けされた培地構成要素を含有してもよい。供給材料は、１部または２部または３部またはより多くの部分に分かれて、細胞に送達されてもよい。市販で入手可能な供給材料は、ＩＳ  ＣＨＯ  ＦＥＥＤ  ＣＤＴＭ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＣＨＯ  ＣＤ  ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む。
【００２６】
本明細書において開示される様々な態様の一実施形態において、３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏの出発重量オスモル濃度を有する、無動物タンパク質培地は、バイオリアクターにおいてｍＡｂ分泌細胞を培養するために使用され、温度は、３７．０℃に設定され、ｐＨは、培養の間、７．０±０．１で保持され、培養プロセスは、２部に分かれた供給材料を含む。
【００２７】
本明細書において開示される様々な態様の他の実施形態において、３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏの出発重量オスモル濃度を有する、無動物タンパク質培地は、バイオリアクターにおいてｍＡｂ分泌細胞を培養するために使用され、温度は、３６．５０℃に設定され、ｐＨは、培養の間、６．８５±０．１で保持され、培養プロセスは、２部に分かれた供給材料を含む。
【００２８】
本明細書において開示される様々な態様の一実施形態において、方法は、抗ＤＬＬ４  ｍＡｂを発現する培養細胞の上清中の抗ＤＬＬ４  ｍＡｂの凝集物のパーセンテージを低下させ、抗ＤＬＬ４  ｍＡｂ凝集物低下パーセンテージは、細胞培養上清のサンプルにおいてまたは清澄後の細胞培養上清のサンプルにおいてまたは清澄およびアフィニティー精製後の細胞培養上清のサンプルにおいて測定されてもよい。他の実施形態において、抗ＤＬＬ４抗体の凝集物のパーセンテージの低下は、清澄後に細胞から上清中に回収される凝集物の低下であってもよく、凝集物パーセンテージは、清澄された細胞培養上清のサンプルから決定されてもよく、またはアフィニティー精製後に、清澄された細胞培養上清のサンプルから決定されてもよい。抗ＤＬＬ４抗体の凝集物の低下は、ＤＬＬ４  ｍＡｂを発現する細胞のアフィニティー精製細胞培養上清から回収される凝集物の低下であってもよい。凝集物パーセンテージは、アフィニティー精製細胞培養上清のサンプルから決定されてもよい。
【００２９】
ｍＡｂを発現する細胞の上清が清澄される場合、より大きな粒子、たとえば細胞デブリまたは細胞は、収集される細胞培養上清から除去される。細胞培養上清を清澄するための方法は、当業者らに知られており、流動ろ過（ｆｌｏｗ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、深層ろ過、遠心分離、および遠心分離とそれに続く１以上のろ過ステップを含む。
【００３０】
ｍＡｂを発現する細胞の上清またはｍＡｂを発現する細胞の清澄された上清は、アフィニティー精製されてもよい。当業者は、抗体を精製するために使用されてもよい様々なアフィニティー精製方法を十分に知っている。これらは、限定するものではないが、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、またはプロテインＬアフィニティークロマトグラフィーによる精製を含む。当業者らはまた、アフィニティークロマトグラフィー方法が、固定された抗原、つまりｍＡｂが特異的に結合するＤＬＬ４を用いる方法を含むことをも知っている。
【００３１】
本開示の他の態様は、プロテインＡ精製ｍＡｂ産物中の凝集物含有量を約５％未満まで低下させるための方法を提供する。該方法は、約３７℃の温度でおよび約７．０のｐＨで、約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏの出発重量オスモル濃度を有する培養培地において、抗ＤＬＬ４  ｍＡｂを発現する哺乳動物細胞株を培養するステップを含む。本開示の他の態様は、プロテインＡ精製ｍＡｂ産物中の凝集物含有量を約５％未満まで低下させるための方法を提供する。該方法は、約３６．５℃の温度でおよび約６．８５のｐＨで、約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏの出発重量オスモル濃度を有する培養培地において、抗ＤＬＬ４  ｍＡｂを発現する哺乳動物細胞株を培養するステップを含む。哺乳動物細胞株は、それぞれ配列番号：１、配列番号：２、および配列番号：３において記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインならびにそれぞれ配列番号：４、配列番号：５、および配列番号：６において記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む抗ＤＬＬ４抗体を発現する。培養プロセスは、培養の間に細胞に材料供給するために、２つの部分に分かれた供給材料を利用することを含み、それによって、培養上清における凝集物形成を低下させる。次いで、哺乳動物細胞株によって発現される抗体は、培養上清から回収される。抗体は、アフィニティークロマトグラフィーステップ、たとえばプロテインＡを使用して精製されてもよい。
【００３２】
いくつかの実施形態において、凝集物含有量は、ＨＰＬＣ−ＳＥＣによって測定される。一実施形態において、凝集物含有量は、約５％、約４％、約３％、または約２％未満である。一実施形態において、凝集物含有量は、約１．２％、１．３％、約１．４％、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、または約１．９％である。
【００３３】
本開示はまた、抗ＤＬＬ４モノクローナル抗体を産生するための方法であって、約３７℃の温度および約７のｐＨで、約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏの出発重量オスモル濃度を有する培養培地において、配列番号：７において記載される抗体重鎖可変ドメインおよび配列番号：８において記載される軽鎖可変ドメインを発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を培養するステップ、培養プロセスの間に細胞に材料供給するために、２つの部分に分かれた供給材料を使用するステップ、ならびに培養上清から、発現された抗ＤＬＬ４抗体を回収するステップを含む方法も提供する。
【００３４】
本開示はまた、抗ＤＬＬ４モノクローナル抗体を産生するための方法であって、約３６．５℃の温度および約６．８５のｐＨで、約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏの出発重量オスモル濃度を有する培養培地において、配列番号：７において記載される抗体重鎖可変ドメインおよび配列番号：８において記載される軽鎖可変ドメインを発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を培養するステップ、培養プロセスの間に細胞に材料供給するために、２つの部分に分かれた供給材料を使用するステップ、ならびに培養上清から、発現された抗ＤＬＬ４抗体を回収するステップを含む方法も提供する。
【００３５】
発現された抗体は、プロテインＡクロマトグラフィーによって培養上清から回収されてもよい。
【００３６】
本開示はまた、抗ＤＬＬ４モノクローナル抗体を産生するための方法であって、
（ａ）約３７℃および約ｐＨ７．０で、培養培地において、抗ＤＬＬ４  ｍＡｂを発現する哺乳動物細胞株を培養するステップであって、
抗ＤＬＬ４抗体が、それぞれ配列番号：１、配列番号：２、および配列番号：３において記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびにそれぞれ配列番号：４、配列番号：５、および配列番号：６において記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含み、
培養培地が、約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏの出発重量オスモル濃度を有する上記ステップ、
（ｂ）培養プロセスの間に細胞に材料供給するために、２つの部分に分かれた供給材料を使用するステップ、ならびに
（ｃ）培養上清から、発現された抗体を回収するステップを含む方法も提供する。
【００３７】
他の実施形態において、本開示はまた、抗ＤＬＬ４モノクローナル抗体を産生するための方法であって、
（ａ）約３６．５℃および約ｐＨ６．８５で、培養培地において、抗ＤＬＬ４  ｍＡｂを発現する哺乳動物細胞株を培養するステップであって、
抗ＤＬＬ４抗体が、それぞれ配列番号：１、配列番号：２、および配列番号：３において記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびにそれぞれ配列番号：４、配列番号：５、および配列番号：６において記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含み、
培養培地が、約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏの出発重量オスモル濃度を有する上記ステップ、
（ｂ）培養プロセスの間に細胞に材料供給するために、２つの部分に分かれた供給材料を使用するステップ、ならびに
（ｃ）培養上清から、発現された抗体を回収するステップを含む方法をも提供する。
【００３８】
本開示はまた、抗ＤＬＬ４モノクローナル抗体を産生するための方法であって、約３７℃の温度および約７．０のｐＨで、約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏの出発重量オスモル濃度を有する培養培地において、抗体重鎖および軽鎖を発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を培養するステップであって、ＣＨＯ細胞が、２部に分かれた供給材料を使用して、培養プロセスの間に材料供給される上記ステップ、ならびに培養上清から抗体を回収するステップを含む方法も提供する。
【００３９】
本開示はまた、抗ＤＬＬ４モノクローナル抗体を産生するための方法であって、約３６．５℃の温度および約６．８５のｐＨで、約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏの出発重量オスモル濃度を有する培養培地において、抗体重鎖および軽鎖を発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を培養するステップであって、ＣＨＯ細胞が、２部に分かれた供給材料を使用して、培養プロセスの間に材料供給されるステップ、ならびに培養上清から抗体を回収するステップを含む方法も提供する。
【００４０】
本明細書において提供される培養上清からｍＡｂを回収することによって、ｍＡｂを産生するための任意の態様において、回収ステップは、プロテインＡによりｍＡｂを精製するステップを含んでいてもよい。プロテインＡ精製ｍＡｂは、約５％、約４％、約３％、または約２％未満の凝集物含有量を有していてもよい。一実施形態において、プロテインＡ精製ｍＡｂは、約１．２％、約１．３％、約１．４％、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、または約１．９％の凝集物含有量を有する。
【００４１】
本明細書において記載される態様または実施形態のいずれかにおいて、抗体を発現する哺乳動物細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、またはＰＥＲ．Ｃ６（ＥＣＡＣＣ  ｎｏ．９６０２２９４０）細胞から選ばれてもよい。一実施形態において、哺乳動物細胞株は、ＣＨＯである。ＣＨＯ細胞株は、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞（Ｌｏｎｚａ）であってもよい。
【００４２】
ｍＡｂを分泌する細胞株は、ｍＡｂを発現する適切な遺伝子によりトランスフェクトされてもよい。
【００４３】
本明細書において記載される態様または実施形態のいずれかにおいて、ｍＡｂ産物中の凝集物のパーセンテージまたは単量体のパーセンテージが決定される場合、これらのパーセンテージは、フィールドフロー分画、超遠心分析法、動的光散乱法、サイズ排除クロマトグラフィー、または当技術分野において知られている他の方法などのような技術を利用して決定されてもよい。たとえば、パーセンテージは、総ｍＡｂ量中の単量体および凝集物の量を定量化するために、プロテインＡ精製ｍＡｂサンプルのＨＰＬＣ−ＳＥＣ分析を用いて決定されてもよい。
【００４４】
本開示はまた、記載される培養方法のいずれかに従って産生される抗ＤＬＬ４  ｍＡｂを提供する。本開示は、方法に従って産生されるＤＬＬ４  ｍＡｂを含む組成物をさらに提供する。
【００４５】
抗ＤＬＬ４  ｍＡｂ産物または組成物は、プロテインＡ精製後に約１．４％未満の凝集物を含んでいてもよい。凝集物のパーセンテージは、ＨＰＬＣ−ＳＥＣによって決定されてもよい。
【００４６】
本開示はまた、本明細書において記載される方法によって産生される抗ＤＬＬ４  ｍＡｂおよび薬学的に許容できるキャリヤを含む、それから本質的になる、またはそれからなる医薬組成物をも提供する。
【００４７】
様々な態様または実施形態のいずれかにおいて、抗ＤＬＬ４  ｍＡｂが、ＤＬＬ４に結合するヒトＩｇＧ１  ｍＡｂであるｍＡｂであってもよい。ｍＡｂは、それぞれ配列番号：１、配列番号：２、および配列番号：３において記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３アミノ酸配列を含む可変重鎖アミノ酸配列、ならびにそれぞれ配列番号：４、配列番号：５、および配列番号：６において記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３アミノ酸配列を含む可変軽鎖アミノ酸配列を含む抗ＤＬＬ４抗体であってもよい。
【００４８】
他の態様または実施形態において、ｍＡｂは、配列番号：７の配列を含む重鎖ポリペプチドを含む抗ＤＬＬ４抗体であってもよい。ｍＡｂは、配列番号：８の配列を含む軽鎖ポリペプチドを含む抗ＤＬＬ４抗体であってもよい。ｍＡｂは、配列番号：７の配列を含む重鎖ポリペプチドおよび配列番号：８の配列を含む軽鎖ポリペプチドを含む抗ＤＬＬ４抗体であってもよい。抗ＤＬＬ４  ｍＡｂは、完全ヒトモノクローナル抗体であってもよい。
【００４９】
さらに他の態様または実施形態において、ｍＡｂは、２００８年９月１７日に第ＰＴＡ−９５０１号の下でＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ２１Ｈ３ＶＨと命名されたプラスミドにおけるポリヌクレオチドによってコードされる抗体の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのＣＤＲを含む可変重鎖アミノ酸配列を含む抗ＤＬＬ４抗体である。
【００５０】
さらに他の態様または実施形態において、ｍＡｂは、２００８年９月１７日に第ＰＴＡ−９５００号の下でＡＴＣＣに寄託されたＭａｂ２１Ｈ３ＶＬＯＰと命名されたプラスミドにおけるポリヌクレオチドによってコードされる抗体の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのＣＤＲを含む可変軽鎖アミノ酸配列を含む抗ＤＬＬ４抗体である。
【００５１】
他の態様または実施形態において、ｍＡｂは、２００８年９月１７日に第ＰＴＡ−９５０１号の下でＡＴＣＣに寄託されたＭａｂ２１Ｈ３ＶＨと命名されたプラスミドにおけるポリヌクレオチドによってコードされる抗体の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのＣＤＲを含む可変重鎖アミノ酸配列を含み、かつ２００８年９月１７日に第ＰＴＡ−９５００号の下でＡＴＣＣに寄託されたＭａｂ２１Ｈ３ＶＬＯＰと命名されたプラスミドにおけるポリヌクレオチドによってコードされる抗体の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのＣＤＲを含む可変軽鎖アミノ酸配列を含む抗ＤＬＬ４抗体である。ｍＡｂは、２００８年９月１７日に第ＰＴＡ−９５０１号の下でＡＴＣＣに寄託されたＭａｂ２１Ｈ３ＶＨと命名されたプラスミドにおけるポリヌクレオチドによってコードされる３つすべての重鎖ＣＤＲアミノ酸配列および２００８年９月１７日に第ＰＴＡ−９５００号の下でＡＴＣＣに寄託されたＭａｂ２１ＶＬＯＰと命名されたプラスミドにおけるポリヌクレオチドによってコードされる３つすべての軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む抗ＤＬＬ４抗体であってもよい。ｍＡｂは、２００８年９月１７日に第ＰＴＡ−９５０１号の下でＡＴＣＣに寄託されたＭａｂ２１Ｈ３ＶＨと命名されたプラスミドにおけるポリヌクレオチドによってコードされる重鎖アミノ酸配列および２００８年９月１７日に第ＰＴＡ−９５００号の下でＡＴＣＣに寄託されたＭａｂ２１ＶＬＯＰと命名されたプラスミドにおけるポリヌクレオチドによってコードされる軽鎖アミノ酸配列を含む抗ＤＬＬ４抗体であってもよい。
【００５２】
細胞培養物またはアフィニティー精製細胞培養上清から回収される抗ＤＬＬ４モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の凝集物を低下させるための様々な方法は、ｍＡｂ力価の増加をさらにもたらしてもよい。該方法は、ｍＡｂ力価を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１２５％、少なくとも１５０％、少なくとも１７５％、または少なくとも２００％増加させてもよい。ｍＡｂ力価は、少なくとも１ｇ／Ｌ、少なくとも２ｇ／Ｌ、少なくとも３ｇ／Ｌ、少なくとも４ｇ／Ｌ、少なくとも５ｇ／Ｌ、少なくとも５．５ｇ／Ｌ、少なくとも６ｇ／Ｌ、少なくとも６．２５ｇ／Ｌ、少なくとも６．５ｇ／Ｌ、少なくとも６．７５ｇ／Ｌ、少なくとも７ｇ／Ｌ、少なくとも７．２５ｇ／Ｌ、少なくとも７．５ｇ／Ｌ、少なくとも７．７５ｇ／Ｌ、少なくとも８ｇ／Ｌ、または少なくとも８．５ｇ／Ｌであってもよい。
【００５３】
当業者らが、ＣＤＲ決定を容易に達成することができることに注意されたい。たとえばＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｍｄ．（１９９１），ｖｏｌｓ．１−３を参照されたい。Ｋａｂａｔは、多数の種の抗体アイソタイプ由来の免疫グロブリン鎖のマルチプル配列アライメントを提供する。アライメントされた配列は、単一のナンバリング方式、Ｋａｂａｔのナンバリング方式に従って、ナンバリングされる。Ｋａｂａｔの配列は、１９９１年の公開から更新されており、電子配列データベースとして利用可能である（最新のダウンロード可能なバージョンは１９９７）。あらゆる免疫グロブリン配列は、Ｋａｂａｔ参照配列とのアライメントを実行することによって、Ｋａｂａｔに従ってナンバリングすることができる。したがって、Ｋａｂａｔのナンバリング方式は、免疫グロブリン鎖をナンバリングするための共通のシステムを提供する。
【００５４】
本明細書において開示される、凝集物を低下させるためのプロセスおよびそれによって産生される産物に関するさらなる実施形態、特徴などは、さらに詳細に以下に提供される。
【００５５】
用語
他に定義されない限り、本明細書において使用される科学用語および技術用語は、当業者らによって一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によって他に必要とされない限り、単数の用語は、多数を含み、複数の用語は、単数を含むものとする。全般的に、本明細書において記載される細胞培養および組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質化学およびオリゴヌクレオチド化学またはポリヌクレオチド化学、ならびにハイブリダイゼーションに関して利用される命名法ならびにそれらの技術は、当技術分野においてよく知られており、また、一般に使用されるものである。
【００５６】
標準的な技術は、典型的に、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換（たとえばエレクトロポレーション、リポフェクション）に使用される。酵素反応および精製技術は、メーカーの説明書に従ってまたは当技術分野において一般に達成されるようにまたは本明細書において記載されるように実行されてもよい。前述の技術および手順は、当技術分野においてよく知られており、本明細書の全体にわたって引用され、議論される様々な一般的ななおよびより具体的な参考文献において記載される従来の方法に従って、全般的に実行される。たとえば、参照によって本明細書において組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１））を参照されたい。本明細書において記載される分析化学、有機合成化学、ならびに医薬品化学および薬化学に関して利用される命名法ならびにそれらの実験手順および技術は、当技術分野においてよく知られていており、一般に使用されるものである。標準的な技術は、化学合成、化学分析、医薬調製、製剤、および送達ならびに患者の治療に使用される。
【００５７】
本開示に従って利用されるように、以下の用語は、他に指示されない限り、以下の意味を有することが理解されるものとする。
【００５８】
本明細書において使用される用語「および／または」は、他方を伴うまたは伴わない、２つの特定の特徴または構成要素のそれぞれについての詳細な開示として解釈されたい。たとえば、「Ａおよび／またはＢ」は、まさにそれぞれが個々に述べられるかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、ならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢのそれぞれの詳細な開示として解釈されたい。
【００５９】
あらゆる値（数の範囲の下のおよび上の端を含む）に関して本明細書において使用される用語「約」は、±１０％（およびその間の値、たとえば±０．５％、±１％、±１．５％、±２％、±２．５％、±３％、±３．５％、±４％、±４．５％、±５％、±５．５％、±６％、±６．５％、±７％、±７．５％、±８％、±８．５％、±９％、±９．５％）までの偏差の許容範囲を有する任意の値を意味する。
【００６０】
本明細書においておよび添付の請求項において使用されるように、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「または」、および「その」は、文脈が他に明確に要求しない限り、複数の指示物を含む。
【００６１】
用語「抗体」は、抗原鎖の抗原決定基の特徴に対して相補的である、内部の表面形状および電荷分布を有する三次元結合スペースを有するポリペプチド鎖のフォールディングから形成される少なくとも１つの結合ドメインから構成されるポリペプチドまたはポリペプチドの群を指す。天然の抗体は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。それぞれの軽鎖は、１つの共有結合のジスルフィド結合によって重鎖に連結されるが、ジスルフィド連結の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で異なる。それぞれの重鎖および軽鎖はまた、規則的に間隔が置かれた鎖内ジスルフィド架橋を有する。それぞれの重鎖は、一方の端に、可変ドメイン（ＶＨ）とそれに続く多くの定常ドメインを有する。それぞれの軽鎖は、一方の端に可変ドメイン（ＶＬ）およびその他方の端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと並んでおり、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと並んでいる。軽鎖は、軽鎖定常領域のアミノ酸配列に基づいて、ラムダ鎖またはカッパ鎖として分類される。カッパ軽鎖の可変ドメインはまた、ＶＫとして本明細書において示されてもよい。用語「可変領域」はまた、重鎖または軽鎖の可変ドメインについて記載するために使用されてもよい。特定のアミノ酸残基は、軽鎖および重鎖可変ドメインの間で境界面を形成すると考えられる。それぞれの軽鎖／重鎖ペアの可変領域は、抗体結合部位を形成する。そのような抗体は、限定されるものではないが、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウスなどを含む、任意の哺乳動物に由来してもよい。
【００６２】
抗体は、免疫グロブリン分子、つまり抗原結合部位を含有する分子を含む。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（たとえばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはサブクラスのものとすることができる。
【００６３】
「ヒト抗体」は、ヒトに由来する抗体、または抗原投与（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）に応じてヒト抗体を産生するように操作されたトランスジェニック生物から得られる抗体である。ヒト抗体はまた、重鎖および軽鎖が、ヒトＤＮＡの１以上の供給源に由来するヌクレオチド配列によってコードされる抗体を含んでいてもよい。完全ヒト抗体は、遺伝子もしくは染色体トランスフェクション方法、ファージディスプレー技術（たとえば米国特許第５，９６９，１０８号明細書）、またはインビトロ活性化Ｂ細胞（たとえば米国特許第５，５６７，６１０号明細書および米国特許第５，２２９，２７５号明細書）によって構築することができる。抗体は、任意の種由来のものであってもよい。
【００６４】
用語「ｍＡｂ」は、モノクローナル抗体を指す。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、形質転換細胞、またはトランスフェクションもしくは他の技術によって抗体をコードする遺伝子を発現させるために作製された細胞などのような、単一の細胞供給源に由来する抗体である。
【００６５】
適した哺乳動物細胞株の例は、チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）、ＮＳ０、またはＰＥＲ．Ｃ６（ＥＣＡＣＣ  ｎｏ．９６０２２９４０）細胞株を含む。これらの哺乳動物細胞株のいずれも、通常、関心のあるｍＡｂの重鎖および軽鎖またはそのフラグメントをコードする、１以上の組換えベクターによりトランスフェクトすることができる。トランスフェクトされた細胞は、細胞培養培地（上清）の中に、コードされた重鎖および軽鎖を含むｍＡｂを分泌する。
【００６６】
本開示の方法および組成物における使用に適したｍＡｂの例は、それぞれが参照によって組み込まれる米国特許出願公開第２０１０／０１９６３８５号明細書または国際公開第２０１０／０３２０６０号パンフレットにおいて記載されるヒト抗ＤＬＬ４抗体である。あるそのような抗ＤＬＬ４  ｍＡｂの例の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、米国特許出願公開第２０１０／０１９６３８５号明細書の配列番号：３０および配列番号：５０においてそれぞれ記載される。本明細書において提供される方法および組成物における使用に適したモノクローナル抗体の他の例は、ＣＤＲ１：ＮＹＧＩＴ（配列番号：１）；ＣＤＲ２：ＷＩＳＡＹＮＧＮＴＮＹＡＱＫＬＱＤ（配列番号：２）；およびＣＤＲ３：ＤＲＶＰＲＩＰＶＴＴＥＡＦＤＩ（配列番号：３）を含む重鎖可変ドメイン、ならびにＣＤＲ１：ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＹＦＶＹ（配列番号：４）；ＣＤＲ２：ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号：５）；およびＣＤＲ３：ＡＡＷＤＤＳＬＳＧＨＷＶ（配列番号：６）を含む軽鎖可変ドメインを含む抗ＤＬＬ４抗体を含む。一実施形態において、本明細書において提供される方法および組成物における使用に適した抗ＤＬＬ４  ｍＡｂが、配列番号：７において記載される重鎖可変ドメインおよび配列番号：８において記載される軽鎖可変ドメインを含む。
【００６７】
配列番号：７：
【化１】
2015510397.tif 000002
【００６８】
配列番号：８：
【化２】
2015510397.tif 000003
【００６９】
用語「ＤＬＬ４」は、デルタ様タンパク質４前駆物質、ショウジョウバエデルタ相同体４、ｈｄｅｌｔａ２、ＭＧＣ１２６３４４、またはＵＮＱ１８９５／ＰＲＯ４３４１としても知られているＤＬＬ４タンパク質である分子を指す。
【００７０】
用語「結合フラグメント」は、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン抗体、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、所望の生物学的活性を示す抗体フラグメント、ジスルフィド安定化可変領域（ｄｓＦｖ）、二量体可変領域（二特異性抗体）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、細胞内抗体、直鎖抗体、単鎖抗体分子、および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）ならびに上記のもののいずれかのエピトープ結合フラグメントを含む。抗体の「結合フラグメント」は、組換えＤＮＡ技術によってまたはインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的切断によって産生される。当業者らは、本明細書において提供される方法および組成物において有用であろう「結合フラグメント（複数可）」の例について十分に知っている。
【００７１】
本明細書において記載される抗体は、薬学的に許容できるキャリヤとの混合物で調製することができる。
【００７２】
本発明の実施形態は、抗体の滅菌医薬製剤を含む。滅菌製剤は、たとえば、抗体の凍結乾燥および再構成の前のまたはその後の、滅菌ろ過膜でのろ過によって生成することができる。抗体は、通常、凍結乾燥形態でまたは溶液中に保存されるであろう。治療用抗体組成物は、通常、滅菌アクセスポートを有する容器、たとえば、皮下注射針によって貫通可能な栓などのような、製剤のとり出しを可能にするアダプターを有する静脈注射用溶液バッグまたはバイアルの中に配置される。
【００７３】
「治療上有効な」量は、対象に対して、いくらかの改善または有益性をもたらす量である。他の方法で述べると、「治療上有効な」量は、少なくとも１つの臨床症状における、いくらかの軽減、緩和、および／または減少をもたらす量である。さらに、当業者らは、いくらかの有益性が対象に対してもたらされる限り、治療効果が完全であるまたは根治的である必要がないことを十分に理解するであろう。
【実施例】
【００７４】
行った実験および実現された結果を含む以下の実施例は、説明的な目的のみのために提供され、本明細書における教示を限定するものとして解釈されない。
【００７５】
関心のあるｍＡｂを産生する細胞株は、ルーチン的にクローニングされ、さらなる増殖および分析のために、培養物から個々細胞を選択することによって、さらにサブクローニングされる。産生されるｍＡｂは、クローンの間で同じままである（たとえば、それは同じアミノ酸配列を有する）が、産生されるｍＡｂのレベル（力価）および形成される凝集物のレベルは、共に、クローンの間で異なり得る。そのため、多くのクローンを調製し、それらのｍＡｂ産生特徴を決定し、次いで、大規模開発のために単一のクローンを選択することは、標準的な手段となる。１つのまたは少量の他のクローンを予備として選択してもよい。この選択プロセスは、時間もかかり、費用もかかる。
【００７６】
ヒト抗ＤＬＬ４  ｍＡｂのＣＨＯサブクローンを調製すると、クローンのいくつかは、同じＤＮＡ配列によりトランスフェクトした他のクローンの産生と比較して、単量体に比べて高いパーセンテージの凝集物を産生した。
【表１】
2015510397.tif 000004
【００７７】
表１において示されるように、クローン３１−１２１は、特に高いレベルの凝集物を産生した。他のクローンのように、それは、配列番号：７において記載される重鎖可変ドメインおよび配列番号：８において記載される軽鎖可変ドメインを含む。それは、９．０の等距離点を有し、かつ単量体として、１４８ｋＤａである。
【００７８】
凝集物レベルを低下させるであろう培養プロセスを、クローン３１−１２１に対して開発することができたら、それは、商業上の開発に可能性として有用なクローンとなるであろう。そのうえ、クローン３１−１２１について凝集物レベルを低下させた培養条件は、抗体を発現する他のクローンを使用して産生される凝集物のレベルを低下させることを合理的に期待することができた。
【００７９】
実施例１
細胞培養パラメーターならびにプロテインＡ精製後の凝集物のレベルおよび組成の関係
ｍＡｂ生産性プロファイルを減少させることなく、発酵プロセスにおける凝集のレベルを低下させる方法を開発した。発酵時により高い単量体純度のｍＡｂを産生することは、下流の精製プロセスにとって有益であり、最終プロセスの収率の改善をもたらすであろう。
【００８０】
細胞培養
細胞培養維持：クローン３１−１２１細胞は、５０ｍＬの無動物タンパク質培地（Ｍ１８）を含有する２５０ｍＬ振盪フラスコ中で維持した。細胞は、グルタミンシンテターゼ阻害剤Ｌ−メチオニンスルホキシイミン（ＭＳＸ）を補足した、インハウスの無動物タンパク質培地（Ｍ１８）において３×１０５生細胞／ｍＬの細胞播種で播種した。細胞培養物は、３６．５℃の５％のＣＯ２／９５％空気の大気中で、１４０ｒｐｍで、継続的振盪下で維持し、３日ごとに継代した。
【００８１】
１Ｌバイオリアクターにおける細胞培養プロセス：細胞培養プロセスは、２つのブロックの６つの１Ｌ流加バイオリアクター（ＤＡＳＧＩＰ  ＡＧ、Ｊｕｌｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において実行した。細胞は、何も補足していないＭ１８培地において８〜１０×１０５生細胞／ｍＬの細胞密度で播種した。細胞培養物は、１５０ｒｐｍ、次いで７日目から１７５ｒｐｍの継続的な撹拌下で維持した。溶存酸素、ｐＨ、および温度は、適切なプローブを使用して、オンラインで測定した。この情報は、溶存酸素を維持するために酸素散布を活性化し、ｐＨを維持するためにＣＯ２散布またはアルカリの汲み上げを活性化し（０．１ｐＨ単位のデッドバンドで）、および温度を維持するためにブランケットの加熱を活性化するために使用した。そのうえ、サンプルを、細胞数（（Ｖｉ−Ｃｅｌｌ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ｐＨ、ガス、および栄養素分析のオフライン測定（ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ  ＦＬＥＸ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＮＯＶＡ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）のために採取した。グルコースレベルが４ｇ／Ｌ未満に減少した場合、バイオリアクターにグルコースを毎日補足した。グルコース補充に加えて、試験したバイオリアクターの実行および条件に依存して、培養物に、２つの異なるタイプの供給材料（１部構成の供給材料（Ｍ２０ａ）または２部に分かれた供給材料）を材料供給した。
【００８２】
プロテインＡ精製
１４日間の培養物の細胞培養上清を、遠心分離ならびに１．２μｍ、０．４５μｍ、および０．２μｍポアサイズ細胞膜フィルターによる濾過（ｆｉｌｔｅｒｉａｔｉｏｎ）によって清澄した。清澄した培養物を、プロテインＡアフィニティーカラムにかけた。
【００８３】
プロテインＡ精製は、Ｖａｎｔａｇｅ−Ｌ  １１カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）に充填したＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して実行した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラムは、リン酸緩衝食塩水により平衡化し、次いで、清澄した細胞培養上清を、樹脂１リットル当たり３０ｇのｍＡｂの容量まで装填した。次いで、カラムは、低ｐＨで溶出する前に再平衡化（ｒｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ）および２回の洗浄ステップにかけた。プロテインＡ精製実行はすべて、Ｕｎｉｃｏｒｎ  ６ソフトウェアを使用してコントロールしたＡＫＴＡ  ａｖａｎｔを使用して実行した（共にＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）。
【００８４】
プロテインＡ精製からの溶出液を、低ｐＨウイルス不活性化ステップにかけた。溶出液は、非滴定Ｔｒｉｓ溶液を使用してｐＨ５．０に中和する前に、酢酸を使用して滴定した。次いで、中和した溶出液を、保存する前に、０．２μｍフィルターを使用してろ過した。
【００８５】
サンプルにおける凝集物のＳＥＣ−ＨＰＬＣ解析
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、医薬タンパク質凝集物の検出および定量化のための業界標準技術である（Ｇａｂｒｉｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｍａｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。ＳＥＣは、ＵＶ２８０検出装置を装備したＡｇｉｌｅｎｔ  １１００に接続されたＴＳＫｇｅｌ  ３０００  ＳＷＸＬカラム（７．８ｍｍ×３０．０ｃｍ；ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＳＷＸＬガードカラム（６．０ｍｍ×４．０ｃｍ；ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実行した。溶出は、ＨＰＬＣシステム上でのクロマトグラフィー分離のために、１．０ｍＬ／分の流速で、ｐＨ６．８の０．１Ｍリン酸ナトリウムおよび０．１Ｍ硫酸ナトリウムバッファーを使用して実行した。使用前に、カラムは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）のＢｉｏＲａｄゲルろ過標準物質を使用して較正した。
【００８６】
サンプルは、関心のあるピーク（ｍＡｂ単量体ピークまたは凝集物ピーク）について曲線の下の面積を測定することによって互いに比較した。
【数１】
2015510397.tif 000005
【００８７】
サンプル中の凝集物のパーセンテージは、総ＩｇＧ（単量体および凝集物）ピーク面積によって総凝集物ピーク面積を割ることによって計算した。
【数２】
2015510397.tif 000006
【００８８】
凝集物形成およびｍＡｂ力価に対する培養パラメーターの影響についてのＤｏＥ分析
最初の試験は、凝集物形成に対する影響についてスクリーニングした供給材料タイプ、最初の培地重量オスモル濃度、および播種細胞密度などのようなパラメーターを用いて、振盪フラスコ中で実行した（データ示さず）。温度、ｐＨ、および撹拌速度などのような他の因子は、これらのパラメーターを厳密にコントロールすることができるバイオリアクターシステムを必要とした。得られた結果に基づくと、培地の温度、ｐＨ、および出発重量オスモル濃度は、凝集物形成に対してかなりの影響を及ぼす主なプロセス細胞培養因子であった。振盪フラスコ実験の間に、使用される供給材料のタイプは、ｍＡｂ凝集物形成に影響を与えることに関して、重要な役割を果たすようには見られなかった。しかしながら、２部に分かれた供給材料の使用は、ｍＡｂ力価に関して有益な効果をもたらすように見られた。その結果、２部に分かれた供給材料を、すべてのさらなる実験のために使用した。
【００８９】
次いで、凝集物レベルの結果を、実験計画法（「ＤｏＥ」）ＪＭＰ統計ツール（ＳＡＳ、Ｃａｒｙ、ＮＣ、ＵＳＡ）によって分析した。ＤｏＥは、主なおよび軽微な要因を区別するのに非常に有効であることが分かった。ＤｏＥはまた、プロセス最適化を実行するのに、最も経済的で最も正確な方法の１つとして知られている。ＤｏＥは、ある変量がプロセスに影響を与えるという統計的検証を提供するだけではなく、ＤｏＥはまた、プロセス変量の間の相互関係の理解を促進し、変量の相互作用およびプロセスに対するそれらの重要性に基づいて、最適条件を示す。
【００９０】
３つの変量因子を、ＤｏＥ完全要因計画中に含めた：培地の温度、ｐＨ、および出発重量オスモル濃度。培地重量オスモル濃度は、ＮａＣｌを追加することによって増加させた。変量のそれぞれについての範囲を、表２に示す。これらの入力変量に基づいて、１２回の実行（８つの端点、２つの中央点、ならびに単一の供給材料および２つの部分に分かれた供給材料を比較する２つの反応器）からなる実験マトリックスを生成した（ＳＡＳ、Ｃａｒｙ、ＮＣ、ＵＳＡのＪＭＰソフトウェアを使用）。表３は、それぞれの実行についてのバイオリアクター条件を提供する。実験は、２つのブロックの６つのバイオリアクターにおいて実行した。
【表２】
2015510397.tif 000007
【表３】
2015510397.tif 000008
【００９１】
１２個の発酵槽はすべて、１４日目に収集し、細胞および大きな粒子を除去するために清澄した。次いで、１２個のバイオリアクターのそれぞれからの抗体産物は、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製した。プロテインＡ溶出液の凝集物含有量は、１２回の実験の実行にわたって比較した（図２）。
【００９２】
３つの凝集物ピーク（６．３分、６．６分、および７．２分のＳＥＣ−ＨＰＬＣ上での保持時間を有する）の組成パーセンテージは、産生された総ＩｇＧ（単量体および凝集物のピーク）から計算した。１％よりもわずかに高い〜６％超の範囲にわたる、凝集物レベルにおける興味ある変動が観察された。
【００９３】
異なる細胞培養条件を用いるバイオリアクター実行後に得られた凝集物レベルの結果は、ＤｏＥベースのソフトウェア統計ツール（ＪＭＰ  ＳＡＳ、Ｃａｒｙ  ＮＣ、ＵＳＡ）を使用して分析した。ＤｏＥソフトウェアは、試験因子およびｍＡｂ凝集ならびに最終ｍＡｂ力価の関係を説明する線形数学モデルを生成するために使用した。図３Ａ〜Ｆは、凝集（パネルＡ、Ｂ、Ｃ）および最終ｍＡｂ力価（パネルＤ、Ｅ、およびＦ）の両方について選ばれた範囲内での、試験因子である温度（パネルＡ、Ｄ）、ｐＨ（パネルＢ、Ｅ）、および重量オスモル濃度（パネルＣ、Ｆ）の関係を示す、ＤｏＥ生成予測プロファイラーを示す。プロファイラーは、ｐＨおよび温度のレベルが増加すると、凝集は減少する（パネルＡおよびＢ）が、ｍＡｂ力価は増加する（パネルＤおよびＥ）ことを示した。Ｍ１８細胞培養培地の出発重量オスモル濃度および凝集レベルの間で観察された有意な相関性はなかった（パネルＣ）。しかしながら、低重量オスモル濃度は、最終ｍＡｂ力価にとって有益であった（パネルＦ）。
【００９４】
ＤｏＥ予測プロファイラーは、より少ない凝集を実現するために、細胞を、低重量オスモル濃度および高温および高ｐＨを有する培地中で培養するべきであることを示す。試験因子の選ばれた範囲内では、ＤｏＥ予測プロファイラーは、細胞を、３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏの出発重量オスモル濃度を有する培地中で培養し、ｐＨ７．０および３７℃で培養するべきであることを示す。これらの条件は、わずか１．０３％までｍＡｂ凝集を低下させ、８．３ｇ／Ｌまで最終ｍＡｂ濃度を増加させることが予測された。
【００９５】
異なる細胞培養条件を用いるバイオリアクター実行後に得られた凝集物レベルの結果は、試験因子およびｍＡｂ凝集ならびに最終ｍＡｂ力価の関係を説明する二次モデルを生成するために、ＤｏＥベースのソフトウェア統計ツール（ＪＭＰ  ＳＡＳ、Ｃａｒｙ  ＮＣ、ＵＳＡ）を使用して、さら分析した。図６は、凝集および最終ｍＡｂ力価の両方について選ばれた範囲内での、試験因子である温度、ｐＨ、および重量オスモル濃度の関係を示すＤｏＥ生成等高線図を示す。等高線図は、凝集を減少させ、ｍＡｂ力価を増加させるために、ｐＨ、温度、および重量オスモル濃度レベルを最適化することができることを示した。
【００９６】
試験因子の選ばれた範囲内では、ＤｏＥ等高線図は、細胞を、３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏの出発重量オスモル濃度を有する培地中で培養し、ｐＨ６．８５および３６．５℃の温度で培養するべきであることを示す。
【００９７】
公開データに基づいて、ｍＡｂ凝集は、３７℃と比較した場合、３４℃で維持された培養物において低下するであろうということが期待された。培養温度の増加は、生物製剤タンパク質の酸化または脱アミドなどのような化学反応を促進するはずである。それはまた、タンパク質凝集を促し得る他の因子である、免疫グロブリンの温度誘発性のアンフォールディングをも引き起こし得る（Ｍａｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｂｒａｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。より低い培養温度もまた、細胞増殖を遅らせ（この研究のために実行した実験において観察された）、正確なタンパク質フォールディングのために、より多くの時間を与えるはずである。しかしながら、この研究から生成されたデータは、より高い温度で維持された培養物おいて、より低いレベルのｍＡｂ凝集が生じるという逆の効果を示した。これは、細胞が増殖する方法、したがって、ｍＡｂ凝集についてのいくつかの細胞内メカニズムに、温度が影響を与えていることを示すであろう。
【００９８】
細胞培養培地ｐＨは、タンパク質表面上の電荷分布に影響を与えることによって、ｍＡｂ分子の間の静電的相互作用に影響を及ぼし得る。システムｐＨを低下させ、ｍＡｂの等電点からさらに移動させることによって、電荷密度の増加が、分子間の同様の電荷の反発作用のレベルの増加をもたらすであろうということを期待することができた。これは、さらには、ｍＡｂ凝集を低下させることを予想することができた。この研究において実行した実験の結果は、しかしながら、６．８５または７．０まで培地ｐＨを増加させることにより、実際に、ｍＡｂ凝集レベルの低下がもたらされたことを示した。細胞培養培地ｐＨを７．２の値まで増加させた場合、ｍＡｂ凝集レベルのさらなる低下が観察された（データ示さず）。この観察は、酸性条件下でタンパク質切断が支持されるという事実によって説明され得る（Ｉｄｉｃｕｌａ−Ｔｈｏｍａｓ  ＆  Ｂａｌａｊｉ，２００７）。そのため、細胞培養培地ｐＨを非常に弱い酸性（ｐＨ６．７）から、中性およびわずかにアルカリの条件（ｐＨ７．２）まで増加させることによって、タンパク質凝集に至り得るこれらの化学反応が予防された。
【００９９】
実施例２
新しい発酵プロセスおよび高い凝集物レベルを生成した以前のプロセスの間の比較
ＤｏＥに基づいた研究の結果によって予測されるように、細胞は、最適化された条件下でバイオリアクター中で培養した。この新しいプロセスの実行を、この特定のクローンにより高レベルの凝集物を生成した以前の基本ケースのプロセスと比較した。凝集物組成および最終ｍＡｂ力価に加えて、プロセスの間に達したピーク生細胞数（ＶＣＮ）、投入したアルカリ溶液およびグルコース溶液の量、ならびに容器に散布したＯ２についての要求量を比較した（表３）。以前のプロセスは、Ｍ２０ａの単一の供給材料、培養温度について３６．５℃、ｐＨ６．８、および３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏの出発重量オスモル濃度を有する培地を利用した。新しい発酵プロセスは、２部に分かれた供給材料、培養温度について３６．５℃または３７℃、および６．８５または７．０のｐＨならびに３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏの出発重量オスモル濃度を有する培養培地を利用した。
【表４】
2015510397.tif 000009
【０１００】
ＤｏＥモデリングによって予測されるように、凝集レベルは、最適化細胞培養条件下で、許容できるレベルまで有意に低下した。そのうえ、以前の基本ケースのプロセスと比較した場合、最終産物力価における２倍を超える増加もまた、実現された。最終凝集レベルおよび最終力価の両方は、最適化プロセスについての予測値に近かった（上記を参照されたい）。
【０１０１】
細胞増殖に関して、細胞は、より高い細胞密度まで増殖し（図４）、基本ケースのプロセスと比較した場合に、最適化発酵条件下で、より多くのグルコース、アルカリ溶液、および酸素を要求した。高いＶＣＮは、おそらく、新しい最適化細胞培養プロセスにより観察された、より高い栄養素要求量（つまり酸素、アルカリ、およびグルコース溶液）についての主な理由であったと思われる。これらの要求量を低下させることができる可能性のある作業条件を同定するために、プロセス応答および制約条件としてＶＣＮを追加することができる。２％未満のｍＡｂ凝集レベルおよび６ｇ／Ｌを超えるｍＡｂ力価を実現することができる細胞培養プロセスについての作業ウィンドウを示すＤｏＥ等高線プロファイラーの例を図５に示す。ピークＶＣＮに基づくさらなる制約条件もまた、このパラメーターが、先に詳述した、より高い栄養必要量に対して有する影響を反映するために、追加した。
【０１０２】
発酵プロセスの３つの作業パラメーター（重量オスモル濃度、ｐＨ、温度）のみを改変し、かつ供給材料のタイプを変化させることによって、約１％〜６％の範囲にわたるｍＡｂ凝集レベルおよび３．１ｇ／Ｌ〜７．５ｇ／Ｌの範囲にわたるｍＡｂ力価の差異を観察することが可能であった。供給材料のタイプのみを変化させることによって（Ｍ２０ａから２部に分かれた供給材料に）、ｍＡｂ凝集レベルが、およそ７５％低下したこともまた、観察された（表３、条件１１および１２）。
【０１０３】
これらのデータは、細胞培養パラメーターにおける小さな変化が、ｍＡｂ凝集物の形成に対して大きな影響を及ぼすことができることを実証する。試験因子はすべて、容易に操作することができるパラメーターであり、そのため、このアプローチは、治療用タンパク質を産生する他の細胞培養プロセスに適用可能である。
【０１０４】
細胞培養プロセスの間の抗体凝集のメカニズムが何であるかおよび複数のメカニズムが存在するかどうかについては、なお不明瞭である。しかしながら、細胞培養パラメーターの小さな変化でさえ、ｍＡｂ凝集物の形成に対して大きな影響を及ぼす。同定された因子は、水溶液におけるタンパク質の溶解性を改変するために容易に操作することができる。
【０１０５】
本発明の他の実施形態は、本明細書において開示される本発明の明細書および実施の考慮から当業者らに明白であろう。本明細書および実施例は、例示的なものであるとしか見なされず、本発明の真の範囲および精神は、以下の請求項によって示されることが意図される。
【０１０６】
実施形態
実施形態１．抗デルタ様リガンド４（ＤＬＬ４）モノクローナル抗体を産生するための方法であって、
約３７℃の温度、約７．０のｐＨ、および約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏの出発重量オスモル濃度で、抗体を発現する哺乳動物細胞を培養するステップであって、
抗体が、
ａ）配列番号：７において記載される重鎖可変（ＶＨ）ドメインおよび配列番号：８において記載される軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、または
ｂ）配列番号：１において記載されるアミノ酸配列を含むＶＨドメイン相補性ドメイン領域（ＣＤＲ）１、配列番号：２において記載されるアミノ酸配列を含むＶＨドメインＣＤＲ２、および配列番号：３において記載されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３ならびに配列番号：４において記載されるアミノ酸配列を含むＶＬドメインＣＤＲ１、配列番号：５において記載されるアミノ酸配列を含むＶＬドメインＣＤＲ２、および配列番号：６において記載されるアミノ酸配列を含むＶＬドメインＣＤＲ３を含む上記ステップ、ならびに
培養上清から、発現された抗ＤＬＬ４抗体を回収するステップを含む上記方法。
【０１０７】
実施形態２．抗デルタ様リガンド４（ＤＬＬ４）モノクローナル抗体を産生するための方法であって、
約３６．５℃の温度、約６．８５のｐＨ、および約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏの出発重量オスモル濃度で、抗体を発現する哺乳動物細胞を培養するステップであって、
抗体が、
ａ）配列番号：７において記載される重鎖可変（ＶＨ）ドメインおよび配列番号：８において記載される軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、または
ｂ）配列番号：１において記載されるアミノ酸配列を含むＶＨドメイン相補性ドメイン領域（ＣＤＲ）１、配列番号：２において記載されるアミノ酸配列を含むＶＨドメインＣＤＲ２、および配列番号：３において記載されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３ならびに配列番号：４において記載されるアミノ酸配列を含むＶＬドメインＣＤＲ１、配列番号：５において記載されるアミノ酸配列を含むＶＬドメインＣＤＲ２、および配列番号：６において記載されるアミノ酸配列を含むＶＬドメインＣＤＲ３を含む上記ステップ、ならびに
培養上清から、発現された抗ＤＬＬ４抗体を回収するステップを含む方法。
【０１０８】
実施形態３．回収された抗ＤＬＬ４抗体が、ＳＥＣ−ＨＰＬＣで決定される５％未満の凝集物を含む、実施形態１または２に記載の方法。
【０１０９】
実施形態４．回収された抗ＤＬＬ４抗体が、ＳＥＣ−ＨＰＬＣで決定される２％未満の凝集物を含む、先の実施形態のいずれかに記載の方法。
【０１１０】
実施形態５．培養の間に、２つの部分に分かれた供給材料により、細胞に材料供給するステップをさらに含む、先の実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１１１】
実施形態６．哺乳動物細胞株が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＮＳ０、またはＰＥＲ．Ｃ６細胞株から選ばれる、先の実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１１２】
実施形態７．細胞株が、ＣＨＯである、実施形態６に記載の方法。
【０１１３】
実施形態８．抗ＤＬＬ４抗体の回収が、抗体のアフィニティー精製を含む、先の実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１１４】
実施形態９．アフィニティー精製が、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを含む、実施形態８に記載の方法。
【０１１５】
実施形態１０．培養上清における抗体の力価が、少なくとも３ｇ／Ｌである、先の実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１１６】
実施形態１１．培養上清における抗体の力価が、少なくとも４ｇ／Ｌである、先の実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１１７】
実施形態１２．培養上清における抗体の力価が、少なくとも５ｇ／Ｌである、先の実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１１８】
実施形態１３．培養上清における抗体の力価が、少なくとも６ｇ／Ｌである、先の実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１１９】
実施形態１４．培養上清における抗体の力価が、少なくとも７ｇ／Ｌである、先の実施形態のいずれかに記載の方法。
【０１２０】
実施形態１５．抗ＤＬＬ４抗体が、配列番号：７において記載されるＶＨドメインおよび配列番号：８において記載されるＶＬドメインを含む、先の実施形態のいずれかに記載の方法。
【０１２１】
実施形態１６．抗ＤＬＬ４抗体が、配列番号：１において記載されるアミノ酸配列を含むＶＨドメインＣＤＲ１、配列番号：２において記載されるアミノ酸配列を含むＶＨドメインＣＤＲ２、および配列番号：３において記載されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、ならびに配列番号：４において記載されるアミノ酸配列を含むＶＬドメインＣＤＲ１、配列番号：５において記載されるアミノ酸配列を含むＶＬドメインＣＤＲ２、および配列番号：６において記載されるアミノ酸配列を含むＶＬドメインＣＤＲ３を含む、実施形態１〜１４のいずれかに記載の方法。
【０１２２】
実施形態１７．プロテインＡ精製モノクローナル抗体産物中の凝集物含有量を約５％未満まで低下させるための方法であって、
ａ）約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏの出発重量オスモル濃度を有する培養培地において、約３７℃の温度および約７．０のｐＨで、抗体を発現する哺乳動物細胞株を培養するステップであって、
細胞株が、配列番号：１のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号：２のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号：３のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、配列番号：４のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号：５のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号：６のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む抗ＤＬＬ４抗体を発現し、かつ
培養プロセスが、細胞に材料供給するために、２つの部分に分かれた供給材料を使用することを含む上記ステップ、
ｂ）培養上清から、発現された抗体を回収するステップ、ならびに
ｃ）アフィニティークロマトグラフィーを使用して、発現された抗体を精製するステップを含む上記方法。
【０１２３】
実施形態１８．プロテインＡ精製モノクローナル抗体産物中の凝集物含有量を約５％未満まで低下させるための方法であって、
ａ）約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏの出発重量オスモル濃度を有する培養培地において、約３６．５℃の温度および約６．８５のｐＨで、抗体を発現する哺乳動物細胞株を培養するステップであって、
細胞株が、配列番号：１のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号：２のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号：３のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、配列番号：４のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号：５のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号：６のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む抗ＤＬＬ４抗体を発現し、かつ
培養プロセスが、細胞に材料供給するために、２つの部分に分かれた供給材料を使用することを含む上記ステップ、
ｂ）培養上清から、発現された抗体を回収するステップ、ならびに
ｃ）アフィニティークロマトグラフィーを使用して、発現された抗体を精製するステップを含む上記方法。
【０１２４】
実施形態１９．アフィニティークロマトグラフィーが、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを含む、実施形態１７または１８に記載の方法。
【０１２５】
実施形態２０．哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞である、実施形態１７〜１９のいずれかに記載の方法。
【０１２６】
実施形態２１．抗体が、配列番号：７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインおよび配列番号：８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、実施形態１７〜２０のいずれかに記載の方法。
【０１２７】
実施形態２２．精製された抗ＤＬＬ４抗体が、ＳＥＣ−ＨＰＬＣで決定される２％未満の凝集物を含む、実施形態１７〜２１のいずれかに記載の方法。
【０１２８】
実施形態２３．培養上清における抗体の力価が、少なくとも３ｇ／Ｌである、実施形態１７〜２２のいずれか１つに記載の方法。
【０１２９】
実施形態２４．培養上清における抗体の力価が、少なくとも４ｇ／Ｌである、実施形態１７〜２３のいずれか１つに記載の方法。
【０１３０】
実施形態２５．培養上清における抗体の力価が、少なくとも５ｇ／Ｌである、実施形態１７〜２４のいずれか１つに記載の方法。
【０１３１】
実施形態２６．培養上清における抗体の力価が、少なくとも６ｇ／Ｌである、実施形態１７〜２５のいずれか１つに記載の方法。
【０１３２】
実施形態２７．培養上清における抗体の力価が、少なくとも７ｇ／Ｌである、実施形態１７〜２６のいずれかに記載の方法。
【０１３３】
実施形態２８．抗ＤＬＬ４モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の凝集物を低下させるための方法であって、単一の供給材料を使用するバイオリアクターにおいて、３６．５℃の温度、６．８のｐＨ、および３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏの出発重量オスモル濃度を含む条件下での、同じｍＡｂ産生ＣＨＯ細胞の培養よりも、少ない凝集物を産生する温度、ｐＨ、および重量オスモル濃度の条件下で、抗ＤＬＬ４ｍＡｂを分泌するＣＨＯ細胞を培養するステップを含み、
抗ＤＬＬ４抗体が、配列番号：１のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号：２のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号：３のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、配列番号：４のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号：５のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号：６のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む、上記方法。
【０１３４】
実施形態２９．より少ない凝集物を産生する条件が、
ａ）ｐＨ７．０、温度３４℃、および出発重量オスモル濃度４００ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏまたは
ｂ）ｐＨ６．８５、温度３５．５℃、および出発重量オスモル濃度３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏまたは
ｃ）ｐＨ６．７、温度３７℃、および出発重量オスモル濃度４００ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏまたは
ｄ）ｐＨ６．７、温度３４℃、および出発重量オスモル濃度３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏまたは
ｅ）ｐＨ７．０、温度３７℃、および出発重量オスモル濃度３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏまたは
ｆ）ｐＨ７．０、温度３７℃、および出発重量オスモル濃度４００ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏまたは
ｇ）ｐＨ６．８５、温度３５．５℃、および出発重量オスモル濃度３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏまたは
ｈ）ｐＨ７．０、温度３４℃、および出発重量オスモル濃度３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏまたは
ｉ）ｐＨ６．７、温度３７℃、および出発重量オスモル濃度３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏまたは
ｊ）ｐＨ６．８５、温度３６．５℃、および出発重量オスモル濃度３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏ
のうちの１つを含む、実施形態２８に記載の方法。
【０１３５】
実施形態３０．培養が、２つの部分に分かれた供給材料により、細胞に材料供給するステップを含む、実施形態２８または２９に記載の方法。
【０１３６】
実施形態３１．抗ＤＬＬ４抗体が、配列番号：７に示されるアミノ酸配列を含むＶＨドメインおよび配列番号：８に示されるアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、実施形態２８〜３０のいずれかに記載の方法。
【０１３７】
実施形態３２．抗体組成物が、ＳＥＣ−ＨＰＬＣで決定される約１．４％未満の凝集物を含む、先の実施形態のいずれかによって産生される抗体組成物。
【０１３８】
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【図１】
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【図２】
2015510397.tif 000011
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
2015510397000001.app
【国際調査報告】
2015510397.tif 000016
2015510397.tif 000017
2015510397.tif 000018
2015510397.tif 000019