(57)【要約】  ＳＴＩＮＧのモジュレーターは、免疫反応をアップレギュレートまたはダウンレギュレートすることが可能である。そのようなモジュレーターの投与を用いて、直接または他の作用剤との組合せのいずれかで被験体における疾患または他の望ましくない病態を治療することが可能である。
2015516989.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異常ＳＴＩＮＧ機能に関連付けられる疾患または障害を有する被験体の免疫反応を変調する方法において、ＳＴＩＮＧ機能を変調する作用剤と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を、前記医薬組成物が前記被験体の異常ＳＴＩＮＧ機能を改善するのに有効な量で、前記被験体に投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記作用剤がＳＴＩＮＧ機能を増加させる低分子であることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、前記作用剤がＳＴＩＮＧ機能を減少させる低分子であることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、前記作用剤が細胞内条件下でＳＴＩＮＧに結合する核酸分子であることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項５に記載の方法において、前記核酸分子が４０〜１５０塩基対長の一本鎖ＤＮＡであることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法において、前記核酸分子が４０〜１５０塩基対長の二本鎖ＤＮＡであることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法において、前記核酸分子が６０〜１２０塩基対長の二本鎖ＤＮＡであることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項５に記載の方法において、前記核酸分子が８０〜１００塩基対長の二本鎖ＤＮＡであることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項５に記載の方法において、前記核酸分子が８５〜９５塩基対長の二本鎖ＤＮＡであることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項４に記載の方法において、前記核酸分子がヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項４に記載の方法において、前記核酸分子が前記核酸分子の膜貫通輸送を促進する分子に関連付けられることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法において、前記疾患または障害がＤＮＡ依存性炎症性疾患であることを特徴とする方法。
【請求項１３】
炎症性免疫細胞で浸潤された癌性腫瘍を有する被験体の癌を治療する方法において、ＳＴＩＮＧの機能および発現をダウンレギュレートする作用剤と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を、前記医薬組成物が前記癌性腫瘍に浸潤する炎症性免疫細胞の数を少なくとも５０％低減するのに有効な量で、前記被験体に投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権利
本明細書に記載の発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）により授与された助成金第Ｒ０１Ａ１０７９３３６号に基づいて米国政府の支援を受けた。米国政府は、本発明に関する一定の権利を有する。
【０００２】
本発明の実施形態は、被験体において先天性免疫および適応免疫を変調するための、ならびに／または免疫関連障害、癌、自己免疫を治療するための、感染症を治療および予防するための、組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
病原体侵入に対する細胞宿主防御反応には、抗病原体遺伝子の誘導をもたらす、リポ多糖または鞭毛タンパク質を含むウイルス核酸や細菌細胞壁成分などの病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）の検出が主に必要とされる。たとえば、ウイルスＲＮＡは、小胞体（ＥＲ）および／またはエンドソームに存在する膜結合Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）（たとえば、ＴＬＲ３および７／８）により、またはレチノイン酸誘導遺伝子１（ＲＩＧ−Ｉ）として参照されるＴＬＲ非依存性細胞内ＤＥｘＤ／ＨボックスＲＮＡヘリカーゼもしくは黒色腫分化関連抗原５（ＩＦＩＨ１およびヘリカードとしても参照されるＭＤＡ５）により、検出可能である。これらのイベントの結果、下流シグナリングイベント（その多くは未知のままである）が活性化され、Ｉ型ＩＦＮを含む、ＮＦ−κＢ依存性遺伝子およびＩＲＦ３／７依存性遺伝子の転写がもたらされる。
【発明の概要】
【０００４】
先天性免疫反応で重要な役割を果たす分子ＳＴＩＮＧ（インターフェロン遺伝子のスティミュレーター）は、主に小胞体（ＥＲ）に存在する５つの推定膜貫通（ＴＭ）領域を含み、ＮＦ−κＢおよびＩＲＦ３の両方の転写経路を活性化させてＩ型ＩＦＮを誘導するとともに発現後に強力な抗ウイルス状態を発揮することが可能である。米国特許出願第１３／０５７，６６２号明細書および国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５２７６７号パンフレットを参照されたい。ＳＴＩＮＧの損失により、Ｉ型ＩＦＮを活性化するポリＩＣの能力が低下し、標的相同組換えによりＳＴＩＮＧの欠如したネズミ胚性線維芽細胞（−／−ＭＥＦ）が生成され、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）感染症に罹患しやすくなった。ＳＴＩＮＧの不在下ではＤＮＡ媒介Ｉ型ＩＦＮ反応が阻害されたことから、ＳＴＩＮＧは、ウイルス、細菌、および細胞に感染可能な他の病原体に由来するＤＮＡを認識するうえで重要な役割を果たしうることが示唆された。酵母ツーハイブリッドおよび共免疫沈降の研究の結果、ＳＴＩＮＧは、ＲＩＧ−Ｉと相互作用すること、かつ翻訳後にＥＲ膜を横切るタンパク質移行に必要とされるトランスロコン関連タンパク質（ＴＲＡＰ）複合体のメンバーＳｓｒ２／ＴＲＡＰβと相互作用すること、が示唆された。ＴＲＡＰβのＲＮＡｉ破壊により、ＳＴＩＮＧ機能が阻害され、ポリＩＣに反応するＩ型ＩＦＮの産生が妨害された。
【０００５】
さらなる実験の結果、ＳＴＩＮＧは、それ自体が病原体由来ＤＮＡやアポトーシスＤＮＡなどの一本鎖および二本鎖のＤＮＡを含めて核酸に結合し、ＤＮＡ媒介関節炎や癌などの炎症病態において炎症誘発性遺伝子発現を調節するうえで中心的な役割を果たすことが示された。本明細書には、ＳＴＩＮＧの発現または機能をアップレギュレートする種々の新しい方法および組成物が、ＳＴＩＮＧと相互作用する他の細胞分子のさらなる特徴付けと共に、記載されている。これらの発見により、免疫系および他の系を調節する新しいアジュバント、ワクチン、および療法の設計が可能になる。
【０００６】
本明細書には、異常ＳＴＩＮＧ機能に関連付けられる疾患または障害を有する被験体において免疫反応を変調する方法が記載されている。本方法は、ＳＴＩＮＧ機能を変調する作用剤と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を、医薬組成物が被験体の異常ＳＴＩＮＧ機能を改善するのに有効な量で、被験体に投与するステップを含みうる。作用剤は、ＳＴＩＮＧ機能を増加もしくは減少させる低分子または細胞内条件下でＳＴＩＮＧに結合する核酸分子でありうる。ＳＴＩＮＧ結合核酸分子は、４０〜１５０塩基対長の一本鎖ＤＮＡまたは４０〜１５０、６０〜１２０、８０〜１００、もしくは８５〜９５塩基対長の二本鎖ＤＮＡまたはそれよりも長いものでありうる。ＳＴＩＮＧ結合核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性でありうる。たとえば、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドで構成されうる。それはまた、膜貫通輸送を促進する分子に関連するものでありうる。本方法では、疾患または障害は、ＤＮＡ依存性炎症性疾患でありうる。
【０００７】
本明細書にはまた、炎症性免疫細胞が浸潤した癌性腫瘍を有する被験体において癌を治療する方法も記載されている。本方法は、ＳＴＩＮＧの機能および発現をダウンレギュレートする作用剤と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を、医薬組成物が、癌性腫瘍に浸潤する炎症性免疫細胞の数を少なくとも５０％（たとえば、少なくとも５０、６０、７０、８０、もしくは９０％、または炎症性細胞浸潤の低減が組織診もしくは走査により検出可能に低減されるまで）低減するのに有効な量で、被験体に投与するステップを含みうる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１Ａ〜Ｇは、ＳＴＩＮＧ依存性先天性免疫シグナリングを示している。図１Ａ：ヒトテロメラーゼ線維芽細胞（ｈＴＥＲＴ−ＢＪ１）を種々のヌクレオチド（３μｇ／ｍＬ）で１６時間トランスフェクトした。内因性ＩＦＮβレベルを測定した。効率的トランスフェクションを保証するために、ｈＴＥＲＴ−ＢＪ１細胞をＦＩＴＣコンジュゲート化ｄｓＤＮＡ９０でトランスフェクトして蛍光顕微鏡法により検査した。図１Ｂ：ｈＴＥＲＴ−ＢＪ１細胞をモック、ランダム、または２種の非依存性ヒトＳＴＩＮＧ  ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ３または４）で３日間トランスフェクトし、続いてｄｓＤＮＡ９０トランスフェクション（３μｇ／ｍＬ）を１６時間行った。内因性ＩＦＮβレベルを測定した。β−アクチンを対照として用いて、ｈＳＴＩＮＧタンパク質のサイレンシングを免疫ブロッティングにより実証した。図３６Ｃ：初代ＳＴＩＮＧ＋／＋、ＳＴＩＮＧ−／−、ＳＴＡＴ１＋／＋、またはＳＴＡＴ１−／−ＭＥＦをｄｓＤＮＡ９０（３μｇ／ｍＬ）でまたはそれなしで３時間トランスフェクトした。全ＲＮＡを精製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｅｎｔｒｉｘ  ＢｅａｄＣｈｉｐ  Ａｒｒａｙ（Ｍｏｕｓｅ  ＷＧ６  バージョン２）により遺伝子発現を検査した。図１Ｄ：ｈＴＥＲＴ−ＢＪ１細胞をＮＳまたはＳＴＩＮＧ  ｓｉＲＮＡで処理した。３日後、細胞をｄｓＤＮＡ９０、ｓｓＤＮＡ９０、またはｓｓＤＮＡ４５（３μｇ／ｍＬ）で処理した。１６時間後、ＩＦＮβｍＲＮＡレベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定した。図１Ｅ：ｈＴＥＲＴ−ＢＪ１細胞をＮＳまたはＳＴＩＮＧ  ｓｉＲＮＡで処理した。３日間で、細胞をｄｓＤＮＡ９０、ｓｓＤＮＡ９０、またはｓｓＤＮＡ４５（３μｇ／ｍＬ）で処理した。１６時間後、内因性ＩＦＮβレベルを測定した。図１Ｆ：初代ＳＴＩＮＧ＋／＋またはＳＴＩＮＧ−／−ＭＥＦをｄｓＤＮＡ９０（３μｇ／ｍＬ）でまたはそれなしでトランスフェクトした。３時間後、図１Ｃと同一に行った。図１Ｇ：ｈＴＥＲＴ−ＢＪ１細胞をｄｓＤＮＡ９０（３μｇ／ｍＬ）でまたはそれなしで３時間処理し、抗ＨＡ抗体でおよびカルレティキュリンをＥＲマーカーとして染色した。
【図２】図２Ａ〜Ｊは、ＳＴＩＮＧがＤＮＡに結合することを示している。図２Ａ：２９３Ｔ細胞を指示プラスミドでトランスフェクトした。細胞溶解物をビオチン−ｄｓＤＮＡ９０アガロースで沈降させ、抗ＨＡ抗体を用いて免疫ブロットすることにより分析した。図２Ｂ：ＳＴＩＮＧ突然変異体の概略図。図２Ｃ：図２Ａと同一である。図２Ｄ：図２Ａと同一である。ＤＮＡに結合できないＳＴＩＮＧ変異体は、赤色で表示されている。図２Ｅ：ｈＴＥＲＴ−ＢＪ１細胞をビオチンコンジュゲート化ｄｓＤＮＡ９０（Ｂ−ｄｓＤＮＡ９０、３μｇ／ｍＬ）で６時間トランスフェクトし、そしてＤＳＳで処理した。ストレプトアビジンアガロースを用いて溶解物を沈降させ、抗ＨＡ抗体を用いて免疫ブロットすることにより分析した。図２Ｆ：ＳＴＩＮＧを２９３Ｔ細胞で発現させ、３６時間後、溶解物をコンペティターｄｓＤＮＡ９０、ポリ（Ｉ：Ｃ）、Ｂ−ＤＮＡ、またはｓｓＤＮＡ９０の存在下でｄｓＤＮＡ９０アガロースと共にインキュベートし、そして抗ＨＡ抗体を用いて免疫ブロットすることにより分析した。図２Ｇ：２９３Ｔ細胞をＨＡタグ付きのＳＴＩＮＧ、ＧＦＰ、またはＴＲＥＸ１でトランスフェクトした。細胞を溶解し、ビオチン標識されたｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡをストレプトアビジンアガロースビーズと共に添加した。抗ＨＡ抗体を用いて免疫ブロットすることにより沈降物を分析した。図２Ｈ：２９３Ｔ細胞をＩＦＮβ−ルシフェラーゼおよびＳＴＩＮＧ変異体でトランスフェクトし、ルシフェラーゼ活性を測定した。図２Ｉ：ｈＴＥＲＴ−ＢＪ１細胞をｄｓＤＮＡ９０でトランスフェクトし、ホルムアルデヒドで架橋した。ＳＴＩＮＧを沈降させ、ｄｓＤＮＡ９０特異的プライマーを用いてＰＣＲにより結合ＤＮＡを検出した。ＮＣ：陰性対照。ＰＣ：陽性対照、ｄｓＤＮＡ９０。図２Ｊ：ＳＴＩＮＧ＋／＋またはＳＴＩＮＧ−／−ＭＥＦをｄｓＤＮＡ９０でトランスフェクトし、次いで図２Ｉと同一に行った。エラーバーは、標準偏差を表す。データは、少なくとも２つの独立した実験に対応する。
【図３】図３Ａ〜３Ｈは、ＴＲＥＸ１がＳＴＩＮＧシグナリングの陰性レギュレーターであることを示している。図３Ａ：ｓｉＲＮＡ処理ｈＴＥＲＴ−ＢＪ１細胞におけるＳＴＩＮＧおよび／またはＴＲＥＸ１ノックダウンを確認する免疫ブロット。図３Ｂ：ｓｉＲＮＡ処理ｈＴＥＲＴ−ＢＪ１細胞をｄｓＤＮＡ９０（３μｇ／ｍＬ）でトランスフェクトした。１６時間後、内因性ＩＦＮβレベルを測定した。＊Ｐ＜０．０５。図３Ｃ：ｓｉＲＮＡ処理ｈＴＥＲＴ−ＢＪ１細胞にＨＳＶ−１を感染させ（感染多重度＝１）、ウイルス力価を測定した。＊Ｐ＜０．０５。図３８Ｄ：ｓｉＲＮＡ処理ｈＴＥＲＴ−ＢＪ１細胞にγ３４．５欠失ＨＳＶを感染させ、ウイルス力価を測定した。図３Ｅ：ＳＴＩＮＧノックダウンを確認する、ＮＳまたはＳＴＩＮＧ  ｓｉＲＮＡ処理されたＴＲＥＸ１＋／＋またはＴＲＥＸ１−／−ＭＥＦの免疫ブロット。図３Ｆ：ｓｉＲＮＡ処理されたＴＲＥＸ１＋／＋またはＴＲＥＸ１−／−ＭＥＦをｄｓＤＮＡ９０で処理し、１６時間後、ＩＦＮβレベルを測定した。＊Ｐ＜０．０５。図３Ｇ：ｓｉＲＮＡ処理されたＴＲＥＸ１＋／＋またはＴＲＥＸ１−／−ＭＥＦにＨＳＶ−１を感染させ（感染多重度＝１）、ウイルス力価を測定した。＊Ｐ＜０．０５。図３Ｈ：ｄｓＤＮＡ９０でまたはそれなしでトランスフェクトされたｈＴＥＲＴ−ＢＪ１細胞の抗ＴＲＥＸ１抗体または抗ＳＴＩＮＧ抗体を用いた免疫蛍光分析。＊Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定。エラーバーで標準偏差を表した。データは、少なくとも２つの独立した実験に対応する。
【図４】図４Ａ〜Ｊは、ＴＲＥＸ１がオリゴサッカリルトランスフェラーゼ複合体に会合することを示している。図４Ａは、ＴＲＥＸ１の概略図を示している。赤色は、ＲＰＮ１結合部位を表す。図４Ｂは、ＳＴＩＮＧの概略図を示している。赤色は、ＤＡＤ１結合部位を表す。図４Ｃ：ＲＰＮ１は、酵母ツーハイブリッド解析においてＴＲＥＸ１と相互作用する（１．ｐＧＢＫＴ７、２．ｐＧＢＫＴ７−ＮＦＡＲ  Ｍ９、３．ｐＧＢＫＴ７−ＴＲＥＸ１、４．ｐＧＢＫＴ７−ＳＴＩＮＧ全長、５．ｐＧＢＫＴ７−ＳＴＩＮＧ  Ｃ末端）。図４Ｄ：２９３Ｔ細胞をＴＲＥＸ１−ｔＧＦＰおよびＲＰＮ１−Ｍｙｃで共トランスフェクトした。抗Ｍｙｃ抗体を用いて溶解物を免疫沈降させ、免疫ブロッティングにより分析した。図４Ｈ：ｈＴＥＲＴ−ＢＪ１細胞をｄｓＤＮＡ９０（３μｇ／ｍＬ）でまたはそれなしで処理した。トランスフェクションの６時間後、抗ＳＴＩＮＧ抗体または抗ＤＡＤ１抗体を用いて免疫蛍光により細胞を検査した。図４Ｉ：指示抗体を用いたスクロース勾配遠心分離後のミクロソーム画分の免疫ブロット分析。Ｉ：入力。図４Ｊ：ｈＴＥＲＴ−ＢＪ１細胞をＴＲＥＸ１、Ｓｅｃ６１Ａ１、ＴＲＡＰβ、ＮＳ、またはＳＴＩＮＧ  ｓｉＲＮＡで処理した。７２時間後、細胞をｄｓＤＮＡ９０（３μｇ／ｍＬ）で１６時間処理し、次いで内因性ＩＦＮβレベルを測定した。＊Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定。エラーバーで標準偏差を表した。データは、少なくとも２つの独立した実験に対応する。
【図５】図５Ａ〜Ｇは、細胞質ＤＮＡがｈＴＥＲＴ−ＢＪ１細胞でＳＴＩＮＧ依存性遺伝子を誘導することを示している。図５Ａ：ｈＴＥＲＴ−ＢＪ１細胞をＳＴＩＮＧ  ｓｉＲＮＡで処理した。３日後、細胞をｄｓＤＮＡ９０でまたはそれなしで３時間処理した。全ＲＮＡを精製し、Ｈｕｍａｎ  ＨＴ−１２＿Ｖ４＿Ｂｅａｄ  Ｃｈｉｐを用いて遺伝子発現に関して検査した。図５Ｂ〜Ｇ：ｈＴＥＲＴ−ＢＪ１細胞を図５Ａと同様に処理した。ＩＦＮβ（図５Ｂ）、ＰＭＡＩＰ１（図５Ｃ）、ＩＦＩＴ１（図５Ｄ）、ＩＦＩＴ２（図５Ｅ）、ＩＦＩＴ３（図５Ｆ）、およびＰＴＧＥＲ４（図５Ｇ）に関して全ＲＮＡをリアルタイムＰＣＲにより検査した。ＴａｑＭａｎ  ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。＊Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定。エラーバーで標準偏差を表した。データは、少なくとも２つの独立した実験に対応する。
【図６】図６Ａ〜Ｈは、ＳＴＩＮＧ依存性遺伝子がＭＥＦで細胞質ＤＮＡにより誘導されることを示している。初代ＳＴＡＴ１＋／＋またはＳＴＡＴ１−／−ＭＥＦをｄｓＤＮＡ９０、ＩＦＮα、またはｄｓＤＮＡ９０とＩＦＮαで処理した。全ＲＮＡを精製し、ＩＦＮβ（図６Ａ）、ＩＦＩＴ１（図６Ｂ）、ＩＦＩＴ２（図６Ｃ）、ＩＦＩＴ３（図６Ｄ）、ＣＸＣＬ１０（図６Ｅ）、ＧＢＰ１（図６Ｆ）、ＲＳＡＤ２（図６Ｇ）、およびＣＣＬ５（図６Ｈ）に関してリアルタイムＰＣＲにより検査した。＊Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定。エラーバーで標準偏差を表した。データは、少なくとも２つの独立した実験に対応する。
【図７】図７Ａ〜Ｈは、細胞質ＤＮＡがＭＥＦでＳＴＩＮＧ依存性遺伝子を誘導することを示している。図７Ａ〜Ｈでは、ＳＴＩＮＧ＋／＋またはＳＴＩＮＧ−／−ＭＥＦをｄｓＤＮＡ４５、ｄｓＤＮＡ９０、ｓｓＤＮＡ４５、またはｓｓＤＮＡ９０でまたはそれなしで３時間処理した。全ＲＮＡを精製し、ＩＦＮβ（図７Ａ）、ＩＦＩＴ１（図７Ｂ）、ＩＦＩＴ２（図７Ｃ）、ＩＦＩＴ３（図７Ｄ）、ＣＣＬ５（図７Ｅ）、ＣＸＣＬ１０（図７Ｆ）、ＲＳＡＤ２（図７Ｇ）、またはＧＢＰ１（図７Ｈ）に関してリアルタイムＰＣＲにより検査した。＊Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定。エラーバーで標準偏差を表した。データは、少なくとも２つの独立した実験に対応する。
【図８】図８Ａ〜Ｄは、ＳＴＩＮＧの局在化および二量化を示している。図８Ａ：ＳＴＩＮＧ−ＨＡを安定に発現するＭＥＦをｓｓＤＮＡ４５、ｄｓＤＮＡ４５、ｓｓＤＮＡ９０、またはｄｓＤＮＡ９０で処理した。３時間後、抗ＨＡ抗体または抗カルレティキュリン抗体を用いて細胞を染色した。図８Ｂ：２９３Ｔ細胞をＳＴＩＮＧ−ＨＡおよびＭｙｃ−ＳＴＩＮＧでトランスフェクトした。溶解物を抗Ｍｙｃ抗体により沈降させ、抗ＨＡ抗体を用いて免疫ブロットすることにより分析した。図８Ｃ。ｈＴＥＲＴ−ＢＪ１細胞を架橋剤ＤＳＳでまたはそれなしで処理した。細胞溶解物を抗ＳＴＩＮＧ抗体を用いた免疫ブロットに付した。図８Ｄ：２９３Ｔ細胞を指示プラスミドでトランスフェクトし、ＤＳＳで処理した。抗ＨＡ抗体を用いて免疫ブロットすることにより細胞溶解物を分析した。
【図９】図９Ａ〜Ｉは、ＤＮＡウイルスがＭＥＦでＳＴＩＮＧ依存性遺伝子を誘導することを示している。図９Ａ：ＭＥＦにγ３４．５欠失ＨＳＶを３時間感染させた（感染多重度＝１）。全ＲＮＡを精製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｅｎｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ｃｈｉｐアレイ（Ｍｏｕｓｅ  ＷＧＳ  バージョン２）を用いて遺伝子発現に関して検査した。図９Ｂ〜Ｉ：ＳＴＩＮＧ＋／＋、ＳＴＩＮＧ−／−、またはＳＴＡＴ−／−／ＳＴＩＮＧ＋／＋ＭＥＦをｄｓＤＮＡ９０、ＨＳＶ、またはγ３４．５欠失ＨＳＶでまたはそれなしで３時間処理した。全ＲＮＡを精製し、ＩＦＮβ（図９Ｂ）、ＩＦＩＴ１（図９Ｃ）、ＩＦＩＴ２（図９Ｄ）、ＩＦＩＴ３（図９Ｅ）、ＣＣＬ５（図９Ｆ）、ＣＸＣＬ１０（図９Ｇ）、ＲＳＡＤ２（図９Ｈ）、またはＧＢＰ１（図９Ｉ）に関してリアルタイムＰＣＲにより検査した。エラーバーは、標準偏差を表す。
【図１０】図１０Ａ〜Ｆは、ＳＴＩＮＧがＩＲＦ３／７およびＮＦκ−Ｂと相互作用することを示している。図１０Ａ：ＳＴＩＮＧ依存性ｄｓＤＮＡ９０刺激性遺伝子のプロモーター領域のＩＲＦ７結合部位。図１０Ｂ〜Ｄ：モック処理またはｄｓＤＮＡ９０処理されたＳＴＩＮＧ＋／＋またはＳＴＩＮＧ−／−ＭＥＦから核抽出物を単離し、ＩＲＦ３（図１０Ｂ）、ＩＲＦ７（図１０Ｃ）、およびＮＦ−κＢ（図１０Ｄ）の活性化に関して製造業者の説明書に従って検査した。核抽出物キット、ＴｒａｎｓＡＭ  ＩＲＦ３、ＴｒａｎｓＡＭ  ＩＲＦ７、およびＴｒａｎｓＡＭＮＦκＢファミリーＥｌｉｓａキットは、Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ製であった。＊Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定。エラーバーで標準偏差を表した。データは、少なくとも２つの独立した実験に対応する。図１０Ｅ：ＳＴＩＮＧ＋／＋またはＳＴＩＮＧ−／−ＭＥＦをポリ（Ｉ：Ｃ）、ｄｓＤＮＡ９０、またはＨＳＶ１で処理し、細胞を抗ＩＲＦ３抗体により染色した。図１０Ｆ。ＳＴＩＮＧ＋／＋またはＳＴＩＮＧ−／−ＭＥＦをｄｓＤＮＡ９０またはＨＳＶ１で処理し、細胞を抗ｐ６５抗体により染色した。ＳＴＩＮＧの損失は、ポリ（Ｉ：Ｃ）媒介先天性免疫シグナリングに影響を及ぼさなかった。
【図１１】図１１Ａ〜Ｆは、ＳＴＩＮＧがｉｎ  ｖｉｔｒｏでＤＮＡに結合することを示している。図１１Ａ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳産物をビオチンコンジュゲート化ｄｓＤＮＡ９０で沈降させ、抗ＨＡ抗体により免疫ブロットした。図１１Ｂ：ＳＴＩＮＧ変異体の概略図。図１１Ｃ、１１Ｄ：図１１Ａと同一である。ａａ２４２〜３４１の欠如したＳＴＩＮＧ変異体（赤色）は、ＤＮＡに結合できなかった。図１１Ｅ〜Ｆ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳産物をビオチンコンジュゲート化ｓｓＤＮＡ９０で沈降させ、抗ＨＡ抗体により免疫ブロットした。
【図１２】図１２Ａ〜Ｇは、ＳＴＩＮＧがｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでＤＮＡに結合することを示している。ｈＴＥＲＴ  ＢＪ１細胞をビオチン−ｄｓＤＮＡ９０でトランスフェクトし、ＵＶにより架橋した。細胞を溶解し、ストレプトアビジンアガロースにより沈降させ、免疫ブロッティングにより分析した。図１２Ｂ〜Ｃ  ｈＴＥＲＴ−ＢＪ１細胞をＩＦＩ１６（図１２Ｂ）またはＳＴＩＮＧ（図１２Ｃ）ｓｉＲＮＡで処理し、次いで図１２Ａと同一に行った。図１２Ｄ：ＳＴＩＮＧ＋／＋またはＳＴＩＮＧ−／−ＭＥＦを図１２Ａと同様に処理した。図１２Ｅ：ＳＴＩＮＧ−Ｆｌａｇ発現２９３Ｔ細胞をビオチン−ｄｓＤＮＡ９０でまたはそれなしで処理し、ＤＳＳにより架橋した。溶解物を沈降させ、免疫ブロッティングにより分析した。図１２Ｆ：２９３Ｔ細胞をｄｓＤＮＡ９０またはｓｓＤＮＡ９０でトランスフェクトし、ＵＶまたはＤＳＳにより架橋し、次いで沈降させ、免疫ブロッティングにより分析した。図１２Ｇ：ＳＴＩＮＧ−Ｆｌａｇ発現２９３Ｔ細胞を溶解し、ｄｓ０ＮＡ９０またはポリ（Ｉ：Ｃ）およびビオチン−ｄｓＤＮＡ９０アガロースと共にインキュベートし、次いで図１２Ｅと同一に行った。
【図１３】図１３Ａ〜Ｃは、ＳＴＩＮＧがウイルスＤＮＡに結合することを示している。図１３Ａ：ＨＳＶ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、またはアデノウイルス（ＡＤＶ）のオリゴヌクレオチド配列。図１３Ｂ〜Ｃ：２９３Ｔ細胞を指示プラスミドでトランスフェクトした。細胞溶解物をｂｉｏｌｉｎ−ｄｓＤＮＡ９０、ビオチン−ＨＳＶ  ＤＮＡ１２０ｍｅｒ、ビオチン−ＡＤＶ  ＤＮＡ１２０ｍｅｒ、またはビオチン−ＣＭＶ  ＤＮＡ１２０ｍｅｒアガロースで沈降させ、抗ＨＡ抗体を用いて免疫ブロットすることにより分析した。
【図１４】図１４Ａ〜Ｃは、ＳＴＩＮＧがＤＮＡに結合することを示している。図１４Ａ：ＳＴＩＮＧ  ＥＬＩＳＡの概略図。図１４Ｂ：ＳＴＩＮＧ  ＥＬＩＳＡの一実施形態に係るプロセス。図１４Ｃ：ｄｓＤＮＡ９０の結合能をＥＬＩＳＡにより測定した。＊Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定。エラーバーで標準偏差を表した。データは、少なくとも２つの独立した実験に対応する。
【図１５】図１５Ａ〜Ｄは、ＴＲＥＸ１がＳＴＩＮＧシグナリングの負のレギュレーターであることを示している。図１５Ａ：ｈＴＥＲＴ−ＢＪ１細胞をＴＲＥＸ１、ＳＴＩＮＧ、またはＳＴＩＮＧおよびＴＲＥＸ１  ｓｉＲＮＡで処理した。３日後、細胞にＨＳＶ−Ｌｕｃを４８時間感染させた（感染多重度＝１）。溶解物をルシフェラーゼ活性に関して測定した。図１５Ｂ：初代ＴＲＥＸ１＋／＋またはＴＲＥＸ−／−ＭＥＦをＮＳまたはＳＴＩＮＧ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。３日後、細胞にＨＳＶ−Ｌｕｃを４８時間感染させた（感染多重度＝１）。溶解物を測定した。図１５Ｃ：初代ＴＲＥＸ１＋／＋またはＴＲＥＸ１−／−ＭＥＦを野生型ＴＲＥＸ１でトランスフェクトした。４８時間後、細胞にＨＳＶを感染させ、ＨＳＶ複製を測定した。ＴＲＥＸ１発現を免疫ブロッティングにより検査した。＊Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定。エラーバーで標準偏差を表した。データは、少なくとも２つの独立した実験に対応する。図１５Ｄ：ＳＴＩＮＧ＋／＋またはＳＴＩＮＧ−／−ＭＥＦをｄｓＤＮＡ９０でまたはそれなしで３時間処理した。全ＲＮＡを精製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｅｎｔｒｉｘ  Ｂｅａｄ  Ｃｈｉｐアレイ（Ｍｏｕｓｅ  ＷＧ６  バージョン２）により遺伝子発現に関して検査した。
【図１６】図１６は、ＳＴＩＮＧがＴＲＥＸ−／−ＭＥＦでｓｓＤＮＡ９０媒介ＩＦＮβ産生を調節することを示している。ｓｉＲＮＡ処理ＴＲＥＸ１＋／＋またはＴＲＥＸ１−／−ＭＥＦをｓｓＤＮＡ４５またはｓｓＤＮＡ９０で処理し、１６時間後、ＩＦＮβレベルを測定した。＊Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定。エラーバーで標準偏差を表した。データは、少なくとも２つの独立した実験に対応する。
【図１７】図１７Ａ〜Ｈは、ＴＲＥＸ１がＳＴＩＮＧ依存性遺伝子の負のレギュレーターではないことを示している。図１７Ａ：ＴＲＥＸ１＋／＋またはＴＲＥＸ１−／−ＭＥＦをＨＳＶ１、ＩＦＮα、ｄｓＤＮＡ９０、三リン酸ＲＮＡ（ＴＰＲＮＡ）、およびＶＳＶで処理した。ＴＰＲＮＡおよびＶＳＶは、ＩＦＮ誘導遺伝子を弱く活性化した。全ＲＮＡを精製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｅｎｔｒｉｘ  Ｂｅａｄ  Ｃｈｉｐアレイ（Ｍｏｕｓｅ  ＷＧ６  バージョン２）により遺伝子発現に関して検査した。図１７Ｂ〜Ｈ：ＩＦＮβ（図１７Ｂ）、ＩＦＩＴ１（図１７Ｃ）、ＩＦＩＴ２（図１７Ｄ）、ＩＦＩＴ３（図１７Ｅ）、ＣＣＬ５（図１７Ｆ）、ＣＸＣＬ１０（図１７Ｇ）、ＲＳＡＤ２（図１７Ｈ）に関して全ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより検査した。ＩＦＮ誘導遺伝子の有意差は、ＴＲＥＸ１欠如細胞で観測されなかった。＊Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定。エラーバーで標準偏差を表した。データは、少なくとも２つの独立した実験に対応する。
【図１８】図１８Ａ〜Ｄは、ＴＲＥＸ１がオリゴサッカリルトランスフェラーゼ複合体に会合することを示している。ＩＦＮ処理ｈＴＥＲＴ  ｃＤＮＡライブラリーを用いて酵母ツーハイブリッドライブラリー（ＡＨ１０９）を開発した。全長ＴＲＥＸ１をベイトとして用いてライブラリーをスクリーニングした。約５００万個のｃＤＮＡ発現酵母をスクリーニングした（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）。３つの独立した酵母接合手順に基づいて４４個のクローンを単離した。ＲＰＮ１を合計８回（スクリーン１で３回、スクリーン２で２回、およびスクリーン３で３回）単離した。ＲＰＮ１以外のクローンの大部分は、再試験後、ＩＲＥＸ１と相互作用できなかった。これらの８つのＲＰＮ１単離クローンのうち、４つのクローンはａａ２５８〜３９７、２つのクローンはａａ２２０〜３９０、および２つのクローンはａａ２４０〜３６７をコードしていた。ＴＲＥＸ１変異体を発生させ、ＴＲＥＸ１（ａａ２４１〜３６９）とＲＰＮ１（ａａ２５６〜３９７）との相互作用をマッピングした。ＤＡＤ１を単離するために、ＳＴＩＮＧのＣ末端領域（ａａ１７３〜３７９）を用いて同一のライブラリーをスクリーニングした。２４個の単離クローン（全長ＤＡＤＩ）が２回見いだされた。ＤＡＤ１以外のクローンの大部分は、再確認試験後、ＳＴＩＮＧと相互作用しなかった。全長ＤＡＤ１は、ＳＴＩＮＧの領域２４２〜３１０への会合が見られた。図１８Ａ：ＴＲＥＸ１突然変異体の概略図。図１８Ｂ：ＴＲＥＸ１またはＴＲＥＸ１〜４に融合されたＧＡＬ４結合ドメインは、酵母ツーハイブリッドスクリーニングにおいてＧＡＬ４活性化ドメインに融合されたＲＰＮ１と相互作用する。図１８Ｃ：ＳＴＩＮＧ突然変異体の概略図。図１８Ｄ。ＳＴＩＮＧ−Ｃ末端またはＳＴＩＮＧ−Ｃ２に融合されたＧＡＬ４結合ドメインは、酵母ツーハイブリッドスクリーニングにおいてＧＡＬ４活性化ドメインに融合されたＤＡＤ１と相互作用する。
【図１９】図１９Ａ〜Ｃは、ＴＲＥＸ１およびＳＴＩＮＧがオリゴサッカリルトランスフェラーゼ複合体に会合することを示している。図１９Ａ：２９３Ｔ細胞をＴＲＥＸ１−ｔＧＦＰおよびＲＰＮ１−Ｍｙｃで共トランスフェクトした。溶解物を抗ｔＧＦＰ抗体またはＩｇＧ対照で免疫沈降させ、指示抗体を用いて免疫ブロットすることにより分析した。図１９Ｂ：２９３Ｔ細胞をＭｙｃ−ＳＴＩＮＧまたはＧＦＰ−ＤＡＤ１で共トランスフェクトし、細胞を溶解した。溶解物を抗Ｍｙｃ抗体またはＩｇＧ対照で免疫沈降させ、抗ＧＦＰ抗体を用いて免疫ブロットした。図１９Ｃ：２９３Ｔ細胞をＴＲＥＸ１−ｔＧＦＰおよびＲＰＮ１−Ｍｙｃ、ＧＦＰ−ＤＡＤ１、またはＳＴＩＮＧ−ＨＡで共トランスフェクトした。溶解物を抗ｔＧＦＰ抗体またはＩｇＧ対照により免疫沈降させ、抗ｔＧＦＰ抗体、抗Ｍｙｃ抗体、抗ＧＦＰ抗体、または抗ＨＡ抗体を用いて免疫ブロットすることにより分析した。
【図２０】図２０は、ＴＲＥＸ１が小胞体に局在化することを示している。ｈＴＥＲＴ−ＢＪ１細胞をＲＰＮ１−Ｍｙｃでトランスフェクトした。４８時間後、抗ＴＲＥＸ１抗体（赤色）、抗Ｍｙｃ抗体（緑色）、または小胞体マーカーとして抗カルレティキュリン抗体（青色）を用いて免疫蛍光により細胞を検査した。
【図２１】図２１Ａ〜Ｈは、２９３Ｔ細胞で外因的に発現されたＳＴＩＮＧがｄｓＤＮＡ９０反応を再構成することを示している。図２１Ａ：２９３Ｔ細胞に対照レンチウイルスまたはｈＳＴＩＮＧレンチウイルスを感染させた。感染１日後、細胞をｄｓＤＮＡ９０で処理した。６時間後、抗ＳＴＩＮＧ抗体または抗カルレティキュリン抗体を用いて細胞を染色した。図２１Ｂ：細胞溶解物（図５６Ａから）を抗ＳＴＩＮＧ抗体を用いた免疫ブロットに付した。図２１Ｃ〜Ｄ：レンチウイルス感染２９３Ｔ細胞をｄｓＤＮＡ９０で６時間刺激した。全ＲＮＡを精製し、ＩＦＮβ（図２１Ｃ）またはＩＦＩＴ２（図２１Ｄ）に関してリアルタイムＰＣＲにより検査した。図２１Ｅ：対照またはｈＳＴＩＮＧレンチウイルスで安定に形質導入された２９３Ｔ細胞をフロー図に示されるようにブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）実験に付した。図２１Ｆ：細胞溶解物（図２１Ｅから）を抗ＳＴＩＮＧ抗体を用いた免疫ブロットに付した。図２１Ｇ：細胞溶解物（図２１Ｅから）をＩＦＮβ−ルシフェラーゼ活性に関して測定した。図２１Ｈ：初代ＳＴＩＮＧ−／−ＭＥＦに対照またはｍＳＴＩＮＧを安定に形質導入した。細胞をｄｓＤＮＡ９０で処理し、内因性ＩＦＮβレベルをＥＬＩＳＡにより測定した。＊Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定。エラーバーで標準偏差を表した。データは、少なくとも２つの独立した実験に対応する。
【図２２】図２２は、トランスロコンメンバーがＨＳＶ１複製を調節することを示している。ｈＴＥＲＴ−ＢＪ１細胞をＴＲＥＸ１、Ｓｅｃ６１Ａ１、ＴＲＡＰβ、ＮＳ、またはＳＴＩＮＧ  ｓｉＲＮＡで処理した。
【図２３】図２３Ａ〜Ｃは、ＩＦＩ１６がｈＴＥＲ−ＢＪ１細胞でｄｓＤＮＡ９０によるＩＦＮ産生に必要とされないことを示している。図２３Ａ：ｈＴＥＲＴ−ＢＪｔ細胞をＮＳ、ＩＦＩ１６、ＳＴＩＮＧ、またはＴＲＥＸ１  ｓｉＲＮＡで処理した。３日後、細胞を溶解し、発現レベルに関して免疫ブロッティングにより検査した。図２３Ｂ：ｓｉＲＮＡ処理ｈＴＥＲＴ−ＢＪ１細胞をｄｓＤＮＡ９０で刺激し、ＩＦＮβ産生をＥＬＩＳＡにより測定した。図２３Ｃ：ｓｉＲＮＡ処理ｈＴＥＲＴ−ＢＪ１細胞にＨＳＶ−ルシフェラーゼを感染させた（感染多重度＝０．１）。感染２日後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を測定した。＊Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定。エラーバーで標準偏差を表した。データは、少なくとも２つの独立した実験に対応する。
【図２４】図２４は、ＳＴＩＮＧ細胞ベースのアッセイの一実施形態を示している。
【図２５】図２５は、薬剤「Ａ」がＳＴＩＮＧ輸送を誘導することを示している。
【図２６】図２６は、薬剤「Ｘ」がＩＦＮβ  ｍＲＮＡ産生を阻害することを示している。
【図２７】図２７は、ＳＴＩＮＧが細胞質ＤＮＡに反応してリン酸化されることを示す概略図である。ｈＴＥＲＴ−ＢＪ１細胞を４μｇ／ｍＬのＩＳＤで６時間トランスフェクトした。細胞溶解物をＴＮＥ緩衝液中に調製し、抗ＳＴＩＮＧ抗体による免疫沈降に付し、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。ゲルをＣＢＢで染色し、次いでＳＴＩＮＧを含むバンドをＨａｒｖａｒｄ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙでｍＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析した。異なる種由来のＳＴＩＮＧアミノ酸配列のアライメントおよび質量分析により同定されたリン酸化部位。セリン３４５、３５８、３６６、および３７９が質量分析により同定された。セリン３５８およびＳ３６６は、ＳＴＩＮＧ機能に重要である。
【図２８】図２８は、ＳＴＩＮＧのセリン３６６（Ｓ３６６）が細胞質ＤＮＡ経路におけるＩＦＮβ産生に重要であることを示している。突然変異体ＳＴＩＮＧをコードするプラスミドおよびレポータープラスミドで２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。３６時間後、ルシフェラーゼ活性を測定した。ＳＴＩＮＧ−／−ＭＥＦ細胞を突然変異体ＳＴＩＮＧで再構成し、次いで、培養培地中のＩＦＮβの量をＥＬＩＳＡにより測定した。Ｓ３６６は、ＳＴＩＮＧによるＩＦＮ産生に重要であり、Ｓ３５８もまた、おそらく重要な役割を果たす。
【図２９】図２９Ａ〜Ｄは、ＳＴＩＮＧ欠損マウスがＤＭＢＡ誘発炎症および皮膚腫瘍形成に耐性であることを示している。ＳＴＩＮＧ＋／＋およびＳＴＩＮＧ−／−マウスの剃毛背部にアセトン処理または１０μｇＤＭＢＡ処理のいずれかを２０週間にわたり毎週１回行った。図２９Ａ：ＳＴＩＮＧ欠損動物は、皮膚癌を引き起こすＤＮＡ損傷剤に耐性である。皮膚腫瘍なしのマウスのパーセントをカプラン・マイヤー曲線に示した。図２９Ｂ：各処理群の代表的マウスの写真を示した。図２９Ｃ：モック処理またはＤＭＢＡ処理された皮膚／皮膚腫瘍の生検試料でＨ＆Ｅ染色により病理組織学的検査を行った。２０倍の倍率で画像を得た。図２９Ｄ：発癌性物質に暴露されたＳＴＩＮＧ発現マウスにおけるサイトカインアップレギュレーション。モック処理またはＤＭＢＡ処理された皮膚／皮膚腫瘍の生検試料から抽出されたＲＮＡを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｅｎｔｒｉｘ  ＢｅａｄＣｈｉｐ  Ａｒｒａｙ（Ｍｏｕｓｅ  ＷＧ６  バージョン２）によりデュプリケート方式で、分析した。全遺伝子発現を分析した。最も変動しやすい遺伝子を選択した。行は、個別の遺伝子を表し、列は、個別のサンプルを表す。擬似カラーは、転写レベルが平均よりも少ないか、平均に等しいか、または平均よりも多いかを表す（それぞれ、緑色、黒色、および赤色）。遺伝子発現の変化倍率は、ｌｏｇ１０スケールで−５〜５の範囲内である。サイトカインは、ＳＴＩＮＧ欠損動物の皮膚で観測されなかった。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書には、異常ＳＴＩＮＧ機能に関連付けられる疾患または障害を有する被験体において免疫反応を変調するための方法および組成物が記載されている。以下に記載の好ましい実施形態には、この組成物および方法の適応が例示されている。それにもかかわらず、この実施形態の説明から、本発明の他の態様を以下に提供される説明に基づいて作成および／または実施することが可能である。
【００１０】
異常ＳＴＩＮＧ機能に関連付けられる疾患または障害を有する被験体（たとえば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタなど）において免疫反応を変調するための方法および組成物は、ＳＴＩＮＧ機能を変調する作用剤と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を必要とする。ただし、その量は、医薬組成物が被験体において異常ＳＴＩＮＧ機能を改善するのに有効な量である。
【００１１】
異常ＳＴＩＮＧ機能に関連付けられる疾患または障害は、ＳＴＩＮＧの機能および発現の欠損した細胞が疾患または障害の身体症状を引き起こすものまたはそれを増悪するもののいずれかでありうる。通常、そのような疾患または障害、たとえば、炎症病態、自己免疫病態、癌（たとえば、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、卵巣癌、白血病癌、肺癌、子宮内膜癌、または肝臓癌）、アテローム硬化症、関節炎（たとえば、骨関節炎または関節リウマチ）、炎症性腸疾患（たとえば、潰瘍性結腸炎またはクローン病）、末梢血管疾患、脳血管偶発症候（発作）、慢性炎症が存在するもの、炎症性細胞浸潤を有する病変により特徴付けられるもの、脳にアミロイド斑が存在するもの（たとえば、アルツハイマー病）、アイカルディ・グチエール症候群、若年性関節炎、骨粗鬆症、筋萎縮性側索硬化症、または多発性硬化症は、免疫系細胞により媒介される。
【００１２】
作用剤は、ＳＴＩＮＧの機能および発現を増加もしくは減少させる低分子（すなわち、５００、１０００、もしくは２０００ダルトン未満の分子量を有する有機もしくは無機の分子）または細胞内条件下（すなわち、ＳＴＩＮＧが正常に位置する細胞内条件下）でＳＴＩＮＧに結合する核酸分子でありうる。作用剤はまた、一本鎖（ｓｓ）または二本鎖（ｄｓ）のＲＮＡまたはＤＮＡでありうるＳＴＩＮＧ結合核酸分子でありうる。好ましくは、核酸は、４０〜１５０、６０〜１２０、８０〜１００、もしくは８５〜９５塩基対長であるか、またはそれよりも長い。ＳＴＩＮＧ結合核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性でありうる。たとえば、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドで構成されうるか、または環状ジヌクレオチド形態でありうる。それはまた、膜貫通輸送を促進する分子に関連するものでありうる。
【００１３】
炎症性免疫細胞で浸潤された癌性腫瘍を有する被験体において癌を治療するための方法および組成物は、ＳＴＩＮＧの機能および発現をダウンレギュレートする作用剤と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を必要とする。ただし、その量は、医薬組成物が、癌性腫瘍に浸潤する炎症性免疫細胞の数を少なくとも５０％（たとえば、少なくとも５０、６０、７０、８０、もしくは９０％、または炎症性細胞浸潤の低減が組織診もしくは走査により検出可能に低減されるまで）低減するのに有効な量である。
【００１４】
本明細書に記載の組成物は、経口投与、直腸投与、腟投与、局所投与、経真皮投与、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、吹送投与、髄腔内投与、および鼻腔内投与をはじめとするさまざまな経路により投与可能な医薬組成物を作製するために、１種以上の薬学的に許容可能な担体または賦形剤と共に含まれうる。本発明で使用するのに好適な製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１７ｔｈ  ｅｄ．（１９８５）に見いだされる。
【００１５】
活性成分は、賦形剤と混合可能であるか、賦形剤により希釈可能であるか、および／またはカプセル剤、サシェ剤、ペーパー剤、もしくは他の容器の形態をとりうる担体内に封入可能である。賦形剤が希釈剤として機能する場合、それは、活性成分に対する媒体、担体、または媒質として作用する固体材料、半固体材料、または液体材料でありうる。組成物は、錠剤、丸剤、粉末剤、ロゼンジ剤、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、サスペンジョン剤、エマルジョン剤、溶液剤、シロップ剤、エアロゾル剤（固体としてまたは液体媒質中）、軟膏剤、軟質および硬質のゼラチンカプセル剤、坐剤、無菌注射用溶液剤、鼻腔内投与用の無菌液剤（たとえば、スプレー装置）、または無菌パッケージ化粉末剤の形態をとりうる。製剤は、滑沢剤、たとえば、タルク、マグネシウムステアレート、および鉱油、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、保存剤、たとえば、メチルベンゾエートおよびプロピルヒドロキシベンゾエート、甘味剤、および風味剤を追加的に含みうる。本発明に係る組成物は、当技術分野で公知の手順を利用することにより、患者への投与後に活性成分の急速放出、持続放出、または遅延放出を提供するように製剤化可能である。
【００１６】
錠剤などの固形製剤を調製するために、組成物を医薬賦形剤と混合して化合物の均一混合物を含有する固形プレ製剤組成物を形成することが可能である。錠剤または丸剤を被覆して、さもなければ配合して、遷延作用の利点を与える製剤を提供しうる。たとえば、錠剤または丸剤は、内側投与成分と外側投与成分とを含み、後者は、前者を覆う包囲体の形態をとりうる。胃内での崩壊に耐えるようにかつ内側成分をインタクトな状態で十二指腸内に送るかまたはその放出を遅延するように機能する腸溶層により、二成分を分離することが可能である。そのような腸溶層または腸溶コーティングに対してさまざまな材料を使用することが可能であり、そのような材料としては、いくつかの高分子酸および高分子酸とシェラック、セチルアルコール、セルロースアセテートなどの材料との混合物が挙げられる。
【００１７】
液体形態の製剤としては、サスペンジョン剤およびエマルジョンが挙げられる。血清中半減期を増大させるために、製剤をカプセル化したり、リポソームのルーメンに導入したり、コロイドとして調製したり、またはリポソームの層に組み込んだりしうる。たとえば、Ｓｚｏｋａらの米国特許第４，２３５，８７１号明細書、同第４，５０１，７２８号明細書、および同第４，８３７，０２８号明細書（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、リポソームを調製するためにさまざまな方法が利用可能である。
【００１８】
組成物は、好ましくは、活性成分のユニット製剤の形態で製剤化される。患者への投与量は、投与されるもの、投与の目的（たとえば、予防または治療）、患者の状態、投与の方式などに依存して異なるであろう。それらはすべて、認定医および認定薬剤師の技能の範囲内である。治療用途では、組成物は、疾患およびその合併症を治癒したりまたはその症状を少なくとも部分的に停止させたりするのに十分な量で、すでに疾患に罹患している患者に投与される。この使用に有効な量は、治療される疾患病態に依存するであろう。さらには、症状の重症度、患者の年齢、体重、および全身状態などの因子に依存して担当臨床医が判断されるであろう。
【００１９】
本明細書に挙げられた文書はすべて、参照により本明細書に組み込まれる。本出願に引用された出版物および特許文書はすべて、あたかもそれぞれ個別の出版物または特許文書が個別に示されたのと同程度まで、あらゆる目的で参照により組み込まれる。本文書に種々の参照文献を引用することにより、出願人は、いかなる特定の参照文献も本発明に対する「先行技術」であることを容認するものではない。発明の組成物および方法の実施形態は、以下の実施例で例示される。
【実施例】
【００２０】
実施例１：先天性免疫を調節する細胞質ＤＮＡとのトランスロコン関連ＳＴＩＮＧ複合体
線維芽細胞、マクロファージ、および樹状細胞（ＤＣ）で細胞質ｄｓＤＮＡさらにはＤＮＡウイルスおよび細胞内細菌に反応するＩ型ＩＦＮの産生に不可欠であることが実証されたＳＴＩＮＧ（インターフェロン遺伝子のスティミュレーター）として参照される小胞体（ＥＲ）の新しい膜貫通成分の単離については、すでに記載された（米国特許出願第１３／０５７，６６２号明細書および国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５２７６７号パンフレットを参照されたい）。ネズミ細胞でＳＴＩＮＧ依存性Ｉ型ＩＦＮシグナリングを活性化するのに必要とされるｄｓＤＮＡの最小サイズは、ネズミ細胞で約４５塩基対であることが確認された。しかしながら、正常ヒト細胞（ｈＴＥＲＴ）では、Ｉ型ＩＦＮを完全に活性化するために約９０塩基対のｄｓＤＮＡ（本明細書ではインターフェロン刺激性ｄｓＤＮＡ９０として参照される）が必要とされることが観測された。ＲＮＡｉノックダウン手順を用いて、ＳＴＩＮＧは、ｈＴＥＲＴでＩ型ＩＦＮの産生に実際に不可欠であることがさらに確認された（図１Ｂ）。ｍＲＮＡ発現を測定するマイクロアレイ手順を用いたさらなる分析から、細胞質ｄｓＤＮＡは、ｈＴＥＲＴ細胞でＩ型ＩＦＮのほかに広範にわたる一連の先天性免疫遺伝子を誘導可能であることが示唆された（図５Ａ〜Ｇ）。ｈＴＥＲＴでのＳＴＩＮＧのＲＮＡｉノックダウンが細胞質ｄｓＤＮＡによる刺激を大きく排除したので、ＩＦＩＴファミリーのメンバーを含むこれらの先天性分子の誘導は、ＳＴＩＮＧ依存性であるように思われた（図５Ａ〜Ｇ）。細胞質ｄｓＤＮＡがＳＴＩＮＧ依存的にさまざまな先天性免疫遺伝子を誘導することは、ＳＴＩＮＧ＋／＋または−／−ネズミ胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を用いて確認された（図１Ｃ）。これらのｍＲＮＡの誘導がＳＴＩＮＧ依存性遺伝子（ＳＤＧ）でありかつＩ型ＩＦＮ依存性オートクリンまたはパラクリンシグナリングにより刺激されないことを確認するために、Ｉ型ＩＦＮシグナリング欠損ＳＴＡＴ１−／−ＭＥＦを同様にｄｓＤＮＡで処理してＳＤＧの産生が影響されない状態を維持することを検証した（図１Ｃ）。逆転写酵素（ＲＴ）ＰＣＲ分析によりアレイ結果を確認した（図６Ａ〜Ｈおよび７Ａ〜Ｈ）。４５ヌクレオチドのｓｓＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ４５）は、先天性免疫遺伝子産生をｈＴＥＲＴＳでは弱くＭＥＦではさらに弱く誘導することが確認された。しかしながら、９０ヌクレオチドを含むトランスフェクトｓｓＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ９０）は、ｈＴＥＲＴ細胞でＩ型ＩＦＮを含めて一連の遺伝子をよりロバストに活性化することが観測された（図１Ｄ、１Ｅ）。細胞質ｓｓＤＮＡ９０がＳＴＩＮＧ依存的に先天性免疫遺伝子の産生を誘導することは、ＳＴＩＮＧ＋／＋または−／−ネズミ胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を用いて同様に確認された（図１Ｆおよび７Ａ〜Ｈ）。ＳＴＩＮＧは、おそらくヒト細胞およびネズミ細胞の両方のＥＲでホモ二量体として存在し、細胞質ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡリガンドの存在下でＥＲから核周囲領域に移行してＩ型ＩＦＮ依存性転写因子を活性化することが観測された（図１Ｇおよび８Ａ〜Ｅ）。ＨＳＶ１は、ＳＴＩＮＧ依存的に先天性免疫遺伝子産生を活性化することが同様に観測された（図９Ａ〜Ｉ）。ＳＤＧの多くは、それらのプロモーター領域にＩＲＦ７結合部位を含有することが確認された（図１０Ａ〜Ｆ）。したがって、トランスフェクトプラスミドＤＮＡを含めて細胞質ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡは、ＳＴＩＮＧに依存する広範にわたる一連の先天性免疫関連遺伝子の転写を強力に誘導可能である。
【００２１】
ＳＴＩＮＧ自体がＤＮＡ種に会合しうる可能性をさらに評価するために、２９３Ｔ細胞をＳＴＩＮＧでトランスフェクトし、細胞溶解後、ビオチン標識ｄｓＤＮＡ９０を用いてＳＴＩＮＧのＣ末端領域（ａａ１８１〜３４９）を沈降させうることを観測した（図２Ａ）。ＳＴＩＮＧのＮ末端領域（ａａ１〜１９５）および３つの同様にＨＡタグ付けされた対照（ＧＦＰ、ＮＦＡＲ１、およびＩＰＳ１）は、ｄｓＤＮＡ９０に会合しなかった。ＤＮＡ結合エキソヌクレアーゼＴＲＥＸ１は、陽性対照として機能した。さらなる一連の広範な研究から、ＳＴＩＮＧのアミノ酸領域２４２〜３４１は、この領域の欠如したＳＴＩＮＧ変異体が核酸に会合できなかったので、おそらくｄｓＤＮＡへの結合に関与することが示唆された（図２Ｂ〜Ｄ）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現されたＳＴＩＮＧもまた、高塩かつ高界面活性剤の条件下でｄｓＤＮＡに結合した（同様に領域２４２〜３４１の欠如した変異体を除く）（図１１Ａ〜Ｆ）。ビオチン標識ｄｓＤＮＡ９０をｈＴＥＲＴにトランスフェクトし、そのような細胞を可逆架橋試薬（ＤＳＳ）またはＵＶ光で処理することにより、ＳＴＩＮＧがおそらく二量体としてｄｓＤＮＡと複合体を形成しうることを示すさらなる証拠を得た。両方の処理の場合で、ＳＴＩＮＧは、細胞溶解後、ＤＮＡへの会合を維持することが観測された（図２Ｅおよび図１２Ａ〜Ｇ）。ｈＴＥＲＴ細胞でＳＴＩＮＧのＲＮＡｉノックダウンを行うと、観測された結合は排除され、ＳＴＩＮＧ−ＤＮＡ複合体は、野生型ＭＥＦ（＋／＋）でのみ同様に観測され、ＳＴＩＮＧの欠如したＭＥＦ（−／−）では観測されなかった（図１２Ａ〜Ｇ）。ＨＳＶ１、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、さらにはアデノウイルス（ＡＤＶ）に関連するｄｓＤＮＡの競争実験から、ＳＴＩＮＧはまた、ｄｓＤＮＡたけでなくｓｓＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ９０）にも結合しうるが、ｄｓＲＮＡには結合しえないことが示唆されることが同様に確認された（図２Ｆ）。このことは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＳＴＩＮＧを発現させてｓｓＤＮＡ９０との会合を観測することにより、確認された（図２Ｇ）。分析されたＳＴＩＮＧ変異体はすべて、２９３Ｔ細胞でＩＦＮ型プロモーターを活性化する能力が欠如していた（図２Ｈ）。また、ｄｓＤＮＡをｈＴＥＲＴまたはＭＥＦ細胞にトランスフェクトし、ホルムアルデヒドで処理して細胞タンパク質を核酸に架橋した。ＳＴＩＮＧプルダウンに続く後続のＣＨＩＰ分析から、トランスフェクトＤＮＡは、ｄｓＤＮＡ９０特異的プライマーを用いて決定したとき、ＳＴＩＮＧに直接会合可能であることがさらに確認された（図２Ｉおよび２Ｊ）。ＳＴＩＮＧは、ＥＬＩＳＡアッセイでビオチン標識ＤＮＡに結合しうることが観測された（図１４Ａ〜Ｃ）。ｓｓＤＮＡおよびｄｓＤＮＡ媒介先天性シグナリングイベントは、ＳＴＩＮＧに依存することがデータから示唆され、さらに、ＳＴＩＮＧ自体がこれらの核酸構造に複合体化してこれらのイベントの誘発を支援しうることを示す証拠が示唆された。
【００２２】
３’→５’ＤＮＡエキソヌクレアーゼＴＲＥＸ１もまた、ＥＲ関連分子であり、それがなければ免疫系を活性化しうるチェックポイント活性化ｓｓＤＮＡ種の分解に重要である。ｈＴＥＲＴ細胞でＴＲＥＸ１をサイレンシングするために使用されるＲＮＡｉは、ｄｓＤＮＡ９０によるＩ型ＩＦＮのＳＴＩＮＧ依存性産生を有意に増加させた（図３Ａおよび３Ｂ）。付随的に、ｄｓＤＮＡウイルスＨＳＶ１の複製は、おそらくＩ型ＩＦＮおよび抗ウイルスＩＦＮ刺激遺伝子（ＩＳＧ）の産生の増加に起因して、ＴＲＥＸ１の欠如したｈＴＥＲＴ細胞で大幅に低減された（図３ＣおよびＤ）。ルシフェラーゼ遺伝子を発現する組換えＨＳＶからのルシフェラーゼ発現もまた、ＴＲＥＸ１をサイレンシングするためにＲＮＡｉで処理されたｈＴＥＲＴ感染細胞で有意に低下した（図１５Ａ〜Ｄ）。これらの観測がＴＲＥＸ１欠損ＭＥＦを用いて拡張されたことから、細胞質ｄｓＤＮＡ依存性遺伝子誘導は、ＴＲＥＸ１の不在下で大きく増加し、かつＨＳＶ１複製は、有意に低減されることが同様に示唆された（図３Ｅ〜Ｇ）。ＳＴＩＮＧがＴＲＥＸ１の不在下で観測されたＩ型ＩＦＮの産生の増加に関与していたかを決定するために、ＴＲＥＸ１欠如ｈＴＥＲＴまたはＴＲＥＸ１−／−ＭＥＦでＳＴＩＮＧをサイレンシングし、これらの細胞を細胞質ｄｓＤＮＡまたはＨＳＶ１で処理した。ＳＴＩＮＧの欠如したＴＲＥＸ１欠損細胞（ｈＴＥＲＴおよびＭＥＦの両方）でＩ型ＩＦＮ産生の大幅な低減が、結果から示唆されたことから、ＴＲＥＸ１の不在下で観測されたＩ型ＩＦＮのレベルの増加は、ＳＴＩＮＧ依存性であることが示唆される（図３Ａ〜Ｆ）。同様に、ＴＲＥＸ−／−ＭＥＦでＳＴＩＮＧのＲＮＡｉノックダウンを行っても、ｓｓＤＮＡ９０媒介Ｉ型ＩＦＮ産生および先天性遺伝子刺激が排除されることが確認された（図１６）。ＴＲＥＸ１およびＳＴＩＮＧは、ＥＲに共局在化されることが、共焦点分析から確認された（図３Ｈ）。しかしながら、細胞質ｄｓＤＮＡは、ＳＴＩＮＧと同様にＥＲから核周囲領域へのＴＲＥＸ１の輸送を強力に誘導しなかった（図３Ｈ）。したがって、共免疫沈降分析により決定したとき、ＳＴＩＮＧおよびＴＲＥＸ１は、ロバストに相互作用しないことが観測された。非刺激条件下のＴＲＥＸ１＋／＋または−／−ＭＥＦでは、ＳＴＩＮＧ依存性遺伝子の発現の劇的な差は、確認されなかった（図１７Ａ〜Ｈ）。しかしながら、ＴＲＥＸ１はｄｓＤＮＡ誘導遺伝子であり、このことは、確認されており、ＳＴＩＮＧ依存的にアップレギュレート可能である（図１７Ａ〜Ｈ）。したがって、ｄｓＤＮＡ種は、ＳＴＩＮＧおよびアクセサリー分子と複合体を形成して、輸送イベントと、ＴＲＥＸ１を含む一次先天性免疫遺伝子の誘導に関与する転写因子ＩＲＦ３／７およびＮＦ−κＢを活性化する下流シグナリングイベントと、を媒介する可能性が高い。ＳＴＩＮＧ活性化ＴＲＥＸ１がＥＲ領域に存在し、アクチベーターｄｓＤＮＡを分解して負のフィードバックの形で細胞質ｄｓＤＮＡシグナリングを抑制することが、証拠から示唆される。したがって、ＴＲＥＸ１は、ＳＴＩＮＧの負のレギュレーターである。
【００２３】
ＳＴＩＮＧは、トランスロコン複合体の一部としてＥＲに存在し、トランスロコン関連タンパク質β（ＴＲＡＰβ）に会合することが、本明細書のデータから実証された。トランスロコン複合体は、ＴＲＡＰα、β、γ、およびδに結合されたＳｅｃ６１α、β、およびγを含み、リボソームに結合可能である。分泌タンパク質および膜タンパク質は、エクスポートされる前に適正なフォールディングおよびグリコシル化のためにＥＲ内に移行される。ＴＲＥＸ１結合パートナーを同定するために、全長ＴＲＥＸ１をツーハイブリッド酵母スクリーンでベイトとして使用した。ＴＲＥＸ１は、６８ｋＤａのＩ型膜貫通タンパク質かつオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＳＴ）複合体のメンバーであるリボホリンＩ（ＲＰＮ１）として参照されるタンパク質と反復的に相互作用することが、結果から示唆された（図４Ａ〜Ｅ、図１８Ａ〜Ｄ）。ＯＳＴ複合体は、トランスロコンを介してＥＲに入ると、新生ポリペプチドのアスパラギン残基へのマンノースオリゴ糖の転移を触媒する。ＲＰＮ１、ＲＰＮ２、ＯＳＴ４８、ＯＳＴ４、ＳＴＴ３Ａ／Ｂ、ＴＵＳＣ３、およびＤＡＤ１を含めて、少なくとも７種のタンパク質がＯＳＴ複合体を含む。重要なこととして、ＳＴＩＮＧをベイトとして用いた類似のスクリーンでは、ＳＴＩＮＧはまた、１６ｋＤａの膜貫通タンパク質であるＤＡＤ１（アポトーシス細胞死に対するディフェンダー）に会合しうることが確認された（図１４Ｆ〜Ｈ）。酵母ツーハイブリッド法を用いたこれらの会合のさらなる分析から、膜貫通領域を含むＴＲＥＸ１のＣ末端領域（アミノ酸２４１〜３６９）がＲＰＮ１のアミノ酸２５８〜３９７への結合に関与することが示唆された（図１８Ａ〜Ｄ）。さらに、ＳＴＩＮＧのアミノ酸２４２〜３１０は、全長ＤＡＤ１との会合に関与した（図１８Ａ〜Ｄ）。共免疫沈降研究から、これらの分子の相互作用が確認された（図４Ｄおよび４Ｇおよび図２９Ａ〜Ｃ）。さらなる共免疫沈降実験から、ＴＲＥＸ１とＤＡＤ１との会合が示唆された（図１９Ａ〜Ｃ）。共焦点分析から、細胞内に共局在化されたＴＲＥＸ１およびＲＰＮ１は、細胞質ｄｓＤＮＡに反応して輸送されないことが確認された（図４Ｅおよび図２０）。同様に、ＳＴＩＮＧおよびＤＡＤ１は、細胞のＥＲ内に共局在化されたが、後者の分子は、細胞質ｄｓＤＮＡの存在下でＳＴＩＮＧをエンドソーム区画に連行しなかった（図４Ｈ）。ＥＲを含む細胞ミクロソーム区画を分画により単離し、スクロース勾配分析により検査した。ＴＲＥＸ１およびＳＴＩＮＧは、ＥＲマーカーであるＲＰＮ１およびＲＰＮ２、ＤＡＤ１、ならびにカルレティキュリンと共分画されるが、核ヒストンＨ３とは共分画されないことが、この研究から示唆されたことから、それらの細胞内局在化は、トランスロコン／ＯＳＴ複合体の成分から識別できないことが確認された（図４Ｉ）。したがって、ＴＲＥＸ１は、ＳＴＩＮＧを含むＥＲのＯＳＴ／トランスロコン複合体にターゲッティングされ、この会合は、ＲＰＮ１との会合を介して行われるが、ＴＲＥＸ１のＴＭ領域は、ＥＲへのＴＲＥＸ１の局在化に関与することが分かった。ＯＳＴ、ＴＲＡＰ、またはＳＲＰ（シグナル認識ペプチド）複合体のメンバーがｄｓＤＮＡ依存性シグナリングに影響を及ぼすかを同定するために、ＲＮＡｉスクリーンを行ってこれらの成分の発現をサイレンシングした。しかしながら、ＳＴＩＮＧ（ＤＮＡ媒介Ｉ型ＩＦＮ産生に不可欠、図２１Ａ〜Ｈ）の抑制およびＴＲＥＸ１の抑制（Ｉ型ＩＦＮ産生を大きく増加させる）以外では、Ｓｅｃ６１αおよびＴＲＡＰβのサイレンシングのみが、シグナリングおよびＨＳＶ１複製に有意に影響を及ぼしたことから、この経路の制御におけるこれらのトランスロコンメンバーの役割が実証された（図４Ｊおよび図２２）。細胞質ＤＮＡセンシングにも関与するＩＦＩ１６のサイレンシングは、少なくともｈＴＥＲＴ細胞では、ｄｓＤＮＡ依存性シグナリングをロバストに抑制しないことが観測された（図２３Ａ〜Ｃ）。ＩＦＩ１６レスキューの損失は、ＳＴＩＮＧの損失と同様に、ＴＲＥＸ１の不在下でｄｓＤＮＡによるＩＦＮ産生を拡大させた（図２３Ａ〜Ｃ）。しかしながら、ＩＦＩ１６を低減させたところより効果的なＨＳＶ１遺伝子発現が可能になったことから、ウイルス複製に影響を及ぼすこの分子の重要な役割が確認された。また、ＲＰＮ１または２をサイレンシングしても、ＨＳＶ１遺伝子発現の増加がもたらされるが、Ｉ型ＩＦＮ産生に有意に影響を及ぼさなかったことから、ＯＳＴのこれらの成分は、主にＮ−グリコシル化に関与しうることが実証された。
【００２４】
ＳＴＩＮＧは、プラスミドベースのＤＮＡおよび遺伝子療法ベクターを含みうる細胞質細胞内ｓｓＤＮＡおよびｄｓＤＮＡと複合体を形成可能であり、広範にわたる一連の先天性免疫遺伝子、たとえば、Ｉ型ＩＦＮ、ＩＦＩＴファミリー、ならびに抗ウイルス活性および適応免疫反応の開始に重要なさまざまなケモカインの誘導を調節可能であることが、データから実証される。ＳＴＩＮＧ活性化は、クラスリン被覆エンドソーム区画へのＴＢＫ１のエスコートを促進して、いまだに十分に解明されていない機序によりＩＲＦ３／７を活性化する可能性が高い。ＴＲＥＸ１は、細胞内に低レベルで存在するように思われ、それ自体は、ＳＴＩＮＧにより誘導可能である。翻訳後、ＴＲＥＸ１は、非活性化ＳＴＩＮＧ（同様にＯＳＴ／トランスロコン複合体に存在する）にごく近接してＯＳＴ複合体に局在化し、そこでおそらく、それがなければＳＴＩＮＧ作用を誘発可能なＤＮＡ種を分解する。この時点ではＳＴＩＮＧとＴＲＥＸ１とを含むトランスロコン／ＯＳＴ複合体の成分は、細胞質ｓｓＤＮＡおよびｄｓＤＮＡ媒介先天性免疫シグナリングを調節する。ＴＲＥＸ１が損失するとＩ型ＩＦＮ産生の増加を介して自己免疫障害が現われるので、この疾患は、ＳＴＩＮＧ活性を介して誘発される可能性がある。
【００２５】
実施例２：ＳＴＩＮＧモジュレーター
ＳＴＩＮＧの発現、機能、活性などを変調する作用剤を同定するために、薬剤ライブラリーをスクリーニングした。図２４は、ＳＴＩＮＧ細胞ベースアッセイのステップを示している。
【００２６】
ライブラリーは、ＢｉｏＭｏｌ  ＩＣＣＢ既知生物活性剤ライブラリー（５００種の標的）、薬理活性化合物のＬＯＰＡＣ１２８０（商標）ライブラリー、Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｃｒｅｅｎ−Ｗｅｌｌ（商標）ホスファターゼ阻害剤ライブラリー（３３種の既知ホスファターゼ阻害剤）を含んでいた。
【００２７】
ＭｉｃｒｏＳｏｕｒｃｅスペクトルコレクション  ２０００種の成分、５０％の薬剤成分、３０％の天然物、２０％の他の生物活性成分、ＥＭＤ：ＩｎｈｉｂｉｔｏｒＳｅｌｅｃｔ（商標）９６ウェルプロテインキナーゼ阻害剤ライブラリーＩ、ＩｎｈｉｂｉｔｏｒＳｅｌｅｃｔ（商標）９６ウェルプロテインキナーゼ阻害剤ライブラリーＩＩ、ＩｎｈｉｂｉｔｏｒＳｅｌｅｃｔ（商標）９６ウェルプロテインキナーゼ阻害剤ライブラリーＩＩＩａ、キナーゼライブラリーＢキナーゼＴｒｕｅＣｌｏｎｅコレクション、キナーゼ欠損ＴｒｕｅＣｌｏｎｅコレクション。
【００２８】
１種の薬剤（「薬剤Ａ」と称される）は、ＳＴＩＮＧ輸送を誘導することが、結果から示された（図６０）。他の薬剤（「薬剤Ｘ」と称される）は、ＩＦＮβ  ｍＲＮＡ産生を阻害した（図６１）。
表２：以下のものがＳＴＩＮＧ阻害剤として同定された。
2015516989.tif 000003
2015516989.tif 000004
【００２９】
ＳＴＩＮＧのアクチベーターは、ジヒドロウアバインおよびＢＮＴＸマレエート塩水和物を含んでいた。
【００３０】
実施例３：ＳＴＩＮＧは自己ＤＮＡ依存性炎症性疾患を発症する
骨髄誘導マクロファージ（ＢＭＤＭ）をＳｔｉｎｇ＋／＋およびＳｔｉｎｇ−／−マウスから取得し、ＳＴＩＮＧ経路を活性化する９０塩基対ｄｓＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ９０）でまたはデキサメタゾン（Ｄｅｘ）処理胸腺細胞に由来するアポトーシスＤＮＡ（ａＤＮＡ）でそれらをトランスフェクトした。両方のタイプのＤＮＡによりＢＭＤＭおよび通常の樹状細胞（ＢＭＤＣ）でＳＴＩＮＧ依存的にＩＦＮβの産生が強力に誘導されることが観測された。ＤＮＡマイクロアレイ実験から、ａＤＮＡは、ＢＭＤＭでＴＮＦαさらにはＩＦＮβなどの広範にわたる一連の先天性免疫サイトカインおよび炎症関連サイトカインのＳＴＩＮＧ依存性産生を誘発することが確認された（表３）。これらのデータは、ａＤＮＡで処理されたＳｔｉｎｇ＋／＋またはＳｔｉｎｇ−／−ＢＭＤＭでサイトカイン産生を測定することにより確認された。したがって、ＳＴＩＮＧは、ＢＭＤＭさらにはＢＭＤＣでアポトーシスＤＮＡ媒介炎症誘発性遺伝子産生を促進可能である。
【００３１】
表３は、アポトーシスＤＮＡ（ａＤＮＡ）で処理されたＢＭＤＭでより高発現された遺伝子の遺伝子発現を示している。
2015516989.tif 000005
【００３２】
ＳＴＩＮＧがＤＮアーゼＩＩ関連炎症性疾患で一定の役割を果たすかを決定するために、ＲＮＡｉを用いてＴＨＰ１細胞またはＢＭＤＭでＳＴＩＮＧおよび／またはＤＮアーゼＩＩをノックダウンしたところ、ＤＮアーゼＩＩの損失によりａＤＮＡに反応してＳＴＩＮＧ依存的にＩ型ＩＦＮを含むサイトカインのアップレギュレーションが促進されることが分かった。ＤＮアーゼＩＩ−／−マウスは、通常、出生前に死亡するので、ＤＮアーゼＩＩ−／−、Ｓｔｉｎｇ−／−、またはＳｔｉｎｇ−／−ＤＮアーゼＩＩ−／−ＤＫＯの１７日胚（Ｅ１７日）を分析した。ＲＴ−ＰＣＲおよび免疫ブロットを含めて、遺伝子型解析から、胚は、Ｓｔｉｎｇ、ＤＮアーゼＩＩ、または両方の機能性遺伝子が欠如していることが確認された。ＤＮアーゼＩＩ−／−胚は、以上に記載したように、貧血を呈することが観測され、Ｓｔｉｎｇ−／−ＤＮアーゼＩＩ−／−ＤＫＯ胚またはこの表現型が顕著に欠如した対照とは有意な相違を示した。致死的貧血は、発生時における赤血球新生のＩ型ＩＦＮ阻害に起因することが報告されてきた。続いて、ＤＮアーゼＩＩ−／−胚の肝臓は、高レベルのサイトカインの産生に関与する貪食されたアポトーシス細胞で満たされた多数の浸潤マクロファージを含有することが、ヘマトキシリンおよびエオシン染色により観測された。対照マウスとは対照的に、Ｓｔｉｎｇ−／−ＤＮアーゼＩＩ−／−胚の肝臓は、類似の表現型を呈した。ＴＵＮＥＬ（末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ媒介ｄＵＴＰビオチンニック末端標識化）による胎仔肝臓の分析から、Ｓｔｉｎｇ−／−ＤＮアーゼＩＩ−／−胚およびＤＮアーゼＩＩ欠損ただし非野生型の胎仔の肝臓は、多数の大きい不適切に消化された死細胞を含有することが確認された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析から、野生型マウスまたはＤＮアーゼＩＩ−／−マウスの胚のマクロファージは、アポトーシス細胞を十分に貪食することが示唆された。しかしながら、貪食されたアポトーシス細胞のＤＮＡは、野生型マクロファージのリソソームでは効率的に分解されるが、ＤＮアーゼＩＩ−／−マクロファージは、貪食された核を蓄積してＤＮＡを消化できない。このイベントは、先天性免疫シグナリング経路の刺激および自己免疫関連サイトカインの産生をもたらす。このことを考慮して、アポトーシス細胞の貧食およびＤＮＡの消化を行うかに関して、ＤＮアーゼＩＩおよびＳＴＩＮＧの両方が欠如した胚性肝臓由来マクロファージの能力を評価した。Ｓｔｉｎｇ−／−ＤＮアーゼＩＩ−／−マクロファージは、ＤＮアーゼＩＩ−／−マクロファージと同様に、野生型マウスまたはＳｔｉｎｇ−／−マウスから採取された対照マクロファージと比較して、デキサメタゾン処理されたアポトーシス胸腺細胞からの貪食された核を消化できないことが確認された。したがって、Ｓｔｉｎｇ−／−ＤＮアーゼＩＩ−／−胚性マウスの肝臓から採取されたマクロファージは、ＤＮアーゼＩＩ−／−マクロファージと類似して、同様に、貪食されたアポトーシス細胞を消化する能力を示さない。
【００３３】
胚性マウスの肝臓でｍＲＮＡ発現レベルを分析することにより、以上の分析を補完した。この研究から、野生型胚またはＳｔｉｎｇ−／−胚の肝臓でごくわずかな炎症性遺伝子産生が示唆された。しかしながら、ＤＮアーゼＩＩ−／−胚の肝臓は、異常に高レベルのサイトカイン関連ｍＲＮＡを含有することが観測された。重要なこととして、Ｓｔｉｎｇ−／−ＤＮアーゼＩＩ−／−マウスの肝臓では、ＤＮアーゼＩＩ−／−マウスと比較して、先天性免疫遺伝子発現活性のレベルが劇的に低減された。これらの結果は、ＲＴ−ＰＣＲにより胚性肝臓で所定の先天性免疫遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを解析することにより、確認された。たとえば、ＩＦＮβの産生は、ＤＮアーゼＩＩ−／−マウスと比較して、Ｓｔｉｎｇ−／−ＤＮアーゼＩＩ−／−マウスで数分の１に低減された。２’−５’オリゴアデニル酸シンテターゼ（ＯＡＳ）、テトラトリコペプチドリピートを有するインターフェロン誘導タンパク質（ＩＦＩＴ）インターフェロン誘導タンパク質２７（ＩＦＩ２７）、ユビキチン様モディファイヤー（ＩＳＧ１５）などのインターフェロン刺激遺伝子（ＩＳＧ）の産生もまた、劇的に低減された。ＴＮＦαやＩＬ１βなどの炎症誘発性サイトカインもまた、ＤＮアーゼＩＩ−／−マウスと比較して、Ｓｔｉｎｇ−／−およびＳｔｉｎｇ−／−ＤＮアーゼＩＩ−／−の胚性肝臓で低減された。先天性免疫遺伝子の産生は、ＳＴＩＮＧの不在下で劇的に抑制されたが、いくつかの遺伝子の存在は、アレイ分析により決定したとき、Ｓｔｉｎｇ−／−ＤＮアーゼＩＩ−／−マウスで低レベルではあるがわずかに増加した状態を維持した。これは、分析された動物間でのｍＲＮＡ発現の変動によるかまたはおそらく他の経路の刺激によるものであろう。これらの遺伝子の多くは、ＮＦ−κＢ経路およびインターフェロン調節因子（ＩＲＦ）経路により調節される。したがって、これらの転写因子の機能を１４日胚（Ｅ１４日）から発生させたＳｔｉｎｇ−／−ＤＮアーゼＩＩ−／−または対照のネズミ胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）で評価した。ほとんどの場合、細胞質ＤＮＡに暴露された時、Ｓｔｉｎｇ−／−ＤＮアーゼＩＩ−／−ＭＥＦでＮＦ−κＢ活性（ｐ６５リン酸化）の欠損が観測された。細胞質ＤＮＡだけでなくアポトーシスＤＮＡに暴露された時も、Ｓｔｉｎｇ−／−ＤＮアーゼＩＩ−／−ＢＭＤＭで同一の欠損が得られた。このことは、ＮＦ−κＢさらにはＩＲＦ３もまた、ｄｓＤＮＡへの暴露後、Ｓｔｉｎｇ−／−ＤＮアーゼＩＩ−／−ＭＥＦでは移行できないが、対照ＭＥＦでは移行できることに注目することにより、確認された。したがって、ＳＴＩＮＧは、おそらく、致死的胚性赤血球新生の誘発に関与する自己ＤＮＡ誘導炎症性サイトカイン産生の制御に関与する。
【００３４】
自己ＤＮＡにより促進される致死的赤血球新生を媒介するうえでのＳＴＩＮＧの重要性を強調するために、ＤＮアーゼＩＩ−／−マウスがＳＴＩＮＧの不在下で出生可能であるかを評価した。重要なこととして、Ｓｔｉｎｇ−／−バックグラウンドに交配した場合、ＤＮアーゼＩＩ−／−マウスが明白なメンデルの頻度で出生されることが観測された。ＰＣＲ遺伝子型解析、ノーザンブロット解析、ＲＴ−ＰＣＲ解析、および免疫ブロット解析から、後代マウスでＤＮアーゼＩＩおよびＳＴＩＮＧの欠損が確認された。Ｓｔｉｎｇ−／−ＤＮアーゼＩＩ−／−ダブルノックアウトマウス（ＤＫＯ）は、正常に成長するように思われ、対照マウスと比較して、類似のサイズおよび体重を呈したが、Ｓｔｉｎｇ−／−マウスは、依然として不明な理由でややより大きいことが確認された。予備的免疫学的評価からもまた、Ｓｔｉｎｇ−／−ＤＮアーゼＩＩ−／−ＤＫＯ動物は、Ｓｔｉｎｇ−／−マウスおよび野生型マウスに類似して、類似のＣＤ４＋／ＣＤ８＋プロファイルを共有したが、ＤＫＯは、加齢に伴って巨脾症の発症が認められることが示唆された。巨脾症はまた、Ｉ型ＩＦＮシグナリングの欠如した生存ＤＮアーゼＩＩ欠損マウス（ＤＮアーゼＩＩ−／−Ｉｆｎａｒ１−／−マウス）でも認められ、赤髄の腫脹が原因であると報告されてきた。しかしながら、Ｓｔｉｎｇ−／−ＤＮアーゼＩＩ−／−マウスの血清の分析から、一般的な測定可能な低レベルのサイトカインが産生されるため、８週齢の対照マウスと比較して、検出可能な異常サイトカイン産生は、示唆されなかった。これらの研究を通じて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、Ｓｔｉｎｇ−／−ＤＮアーゼＩＩ−／−マクロファージは、ＤＮアーゼＩＩ−／−マクロファージと同様に、野生型マウスまたはＳｔｉｎｇ−／−マウスから採取された対照マクロファージと比較して、アポトーシス胸腺細胞（Ｄｅｘ＋）からの貪食された核を消化できないことが確認された。ＷＴ胸腺細胞を標的（Ｄｅｘ−）として使用した場合、ＤＮアーゼＩＩ−／−Ｓｔｉｎｇ−／−マクロファージ内の未消化のＤＮＡの蓄積は、それほど顕著ではなかった。したがって、Ｓｔｉｎｇ−／−ＤＮアーゼＩＩ−／−マウスに由来するＢＭＤＭもまた、アポトーシス細胞のＤＮＡを消化できないが、ＤＮアーゼＩＩ−／−ＢＭＤＭとは対照的に、炎症性サイトカイン反応を生成しない。
【００３５】
ＤＮアーゼＩＩ＋／−マウスとＩ型ＩＦＮ欠損Ｉｆｎａｒ１−／−マウスとを交配することによりＤＮアーゼＩＩ媒介胚致死を回避することが可能であるが、得られる後代は、未消化ＤＮＡが先天性免疫シグナリング経路を活性化してＴＮＦαなどの炎症性サイトカインの産生を誘発するので、出生の約８週間後、重症多発性関節炎（関節炎スコア２）に罹患する。重要なこととして、Ｓｔｉｎｇ−／−ＤＮアーゼＩＩ−／−マウスは、出生後、多発性関節炎の徴候がなんら現れないことが確認された。関節炎スコアは、Ｓｔｉｎｇ−／−ＤＮアーゼＩＩ−／−では、１２ヶ月齢まで約０（スコアなし）に維持されたが、これとは対照的に、報告されたＤＮアーゼＩＩ−／−Ｉｆｎａｒ１−／−マウスでは、類似の期間後、７までの関節炎スコアを呈した。ＤＮアーゼＩＩ−／−Ｓｔｉｎｇ−／−マウスの脾臓組織および胸腺組織のＨ＆Ｅ染色およびＴＵＮＥＬ染色では、アポトーシスＤＮＡをも含有する浸潤マクロファージの存在が示されたが、６ヶ月齢のＳｔｉｎｇ−／−ＤＮアーゼＩＩ−／−マウスの関節の組織診断では、関節構造にパンヌス浸潤の証拠がなく、正常な硬骨（Ｂ）  滑膜関節（Ｓ）、および軟骨（Ｃ）の構造を呈した。Ｓｔｉｎｇ−／−ＤＮアーゼＩＩ−／−マウスの血清からのＴＮＦα、ＩＬ１β、およびＩＬ６のレベルは、ＳＴＩＮＧの欠如したＢＭＤＭでの我々のアレイ解析から予想されるように、低レベルの状態を維持した（表３）。Ｓｔｉｎｇ−／−ＤＮアーゼＩＩ−／−マウスの関節内では、ＣＤ４、ＣＤ６８、またはＴＲＡＰ陽性の細胞浸潤の証拠は、存在しなかった。また、Ｓｔｉｎｇ−／−ＤＮアーゼＩＩ−／−マウスの血清の分析から、リウマチ因子（ＲＦ）、抗ｄｓＤＮＡ抗体、またはＭＭＰ３のレベルの上昇は、示唆されなかった。したがって、ＳＴＩＮＧの損失により、自己ＤＮＡ媒介多発性関節炎に関与する炎症誘発性サイトカイン産生が回避される。
【００３６】
ＳＴＩＮＧは、たとえば、アイカルディ・グチエール症候群（ＡＧＳ）などの炎症性疾患に関与する。ＡＧＳは、遺伝的に決定される脳症であり、基底核および白質の石灰化、脱髄により特徴付けられる。脳脊髄液中の高レベルのリンパ球およびＩ型ＩＦＮ。特徴は、慢性感染症によく似ている。Ｉ型ＩＦＮの血清中レベルもまた、自己免疫症候群の全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）で上昇する。ＡＧＳは、３’−５’ＤＮＡエキソヌクレアーゼＴＲＥＸ１の突然変異により引き起こされる。ＴＲＥＸ１機能が損失すると、ＤＮＡ種は、細胞のＥＲ内に蓄積し、細胞質ＤＮＡセンサー（ＳＴＩＮＧ）を活性化する。ＴＲＥＸ１は、このＤＮＡ源を消化して先天性免疫遺伝子活性化を防止する（ハウスキーピング機能）。
【００３７】
ＳＴＩＮＧがアポトーシス欠損マウスで炎症性疾患に関与すると思われることを考慮して、次に、他の型の自己ＤＮＡ誘発疾患がＳＴＩＮＧ経路の活性化を介して起こるかを評価した。たとえば、３’修復エキソヌクレアーゼ１（Ｔｒｅｘ１）欠損患者は、脳脊髄液中に高レベルのＩ型ＩＦＮ産生が存在することにより特徴付けられる致死的脳炎を引き起こすアイカルディ・グチエール症候群（ＡＧＳ）に罹患する。Ｔｒｅｘ１欠損マウスは、サイトカイン産生の誘発および致死的炎症性悪性心筋炎の誘発を行ういまだに特徴付けられていない自己ＤＮＡ（おそらく通常はＴｒｅｘ１により消化される）が細胞内ＤＮＡセンサーを活性化するので、約１０週間のメジアン寿命を呈する。ＳＴＩＮＧの損失によりＴｒｅｘ１−／−マウスの寿命を伸ばすことが可能であるが、その原因は不明であることが、最近のデータから示唆される。これらの研究を拡張し、ｄｓＤＮＡ９０に暴露されたＴｒｅｘ１欠損ＢＭＤＣ（Ｔｒｅｘ１−／−ＢＭＤＣ）でＩ型ＩＦＮ産生のレベルがわずかに増加することを確認した。重要なこととして、ＳＴＩＮＧの損失（Ｓｔｉｎｇ−／−Ｔｒｅｘ１−／−ＢＭＤＣ）により、Ｔｒｅｘ１欠損ＢＭＤＭでＩ型ＩＦＮ産生を増加させるＤＮＡの能力が排除された。興味深いことに、Ｔｒｅｘ１−／−マウスと比較してＳｔｉｎｇ−／−Ｔｒｅｘ１−／−、Ｓｔｉｎｇ−／＋Ｔｒｅｘ１−／−の心臓のサイズ減少が観測された。また、心筋炎の証拠は、Ｔｒｅｘ１−／−単独と比較してＳｔｉｎｇ−／−Ｔｒｅｘ１−／−で劇的に低減されることが確認された。それに加えて、Ｔｒｅｘ１−／−マウスの血清中にかなり蔓延していることが観測された抗核自己抗体（ＡＮＡ）は、Ｓｔｉｎｇ−／−Ｔｒｅｘ１−／−マウスの血清中にはほぼ完全に不在であった。Ｓｔｉｎｇ−／−Ｔｒｅｘ１−／−、Ｓｔｉｎｇ−／＋Ｔｒｅｘ１−／−の心臓中の炎症誘発性遺伝子のレベルがＴｒｅｘ１−／−マウスと比較して劇的に低減されることが、マイクロアレイ解析から実証された。まとめると、これらのデータから、ＳＴＩＮＧは、Ｔｒｅｘ１欠損マウスおよびおそらくＡＧＳで炎症誘発性遺伝子誘導に関与することが示唆される。
【００３８】
実施例４：ＳＴＩＮＧのＳ３６６に対するキナーゼのスクリーニング
基質としての２種のペプチド（Ａ３６６およびＳ３６６）に対して、２１７種のプロテインキナーゼ標的の活性を評価した。プロテインキナーゼを各ペプチドおよび次いで３３Ｐ−ＡＴＰと混合し、活性（ＣＰＭ）を測定した。以下のキナーゼは、ＳＴＩＮＧ中のＳ３６６をリン酸化するものとして同定された。このセリンを標的とするキナーゼの同定は、薬剤発見の道を開く。この会合を標的とする薬剤は、ＳＴＩＮＧ活性を阻害しうる。また、治療目的でＳＴＩＮＧ活性を阻害するために使用しうる。ＳＴＩＮＧの過剰活性は、癌を増悪する可能性のある炎症性疾患をもたらしうる。
【００３９】
表４：ＳＴＩＮＧのＳ３６６に対するキナーゼのスクリーニング
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【００４０】
実施例５：ＳＴＩＮＧは炎症関連癌に関与する
ＳＴＩＮＧ  ＷＴおよびＳＴＩＮＧ−／−の動物をＤＮＡ損傷剤で処理したところ、ＳＴＩＮＧの欠如したマウスは、腫瘍形成に対して耐性であった。この理由は、樹状細胞、マクロファージなどの浸潤免疫細胞が、壊死またはアポトーシスを受けた損傷細胞を貧食し、そのような細胞のＤＮＡまたは他のリガンドが、ＳＴＩＮＧおよび腫瘍形成を促進するサイトカインの産生を活性化することにある。ＳＴＩＮＧは、多種多様な他の癌で腫瘍進行の促進に関与しうる。
【００４１】
図２９Ａ〜Ｄは、ＳＴＩＮＧ欠損マウスがＤＭＢＡ誘発炎症および皮膚腫瘍形成に耐性であることを示している。ＳＴＩＮＧ＋／＋およびＳＴＩＮＧ−／−マウスの剃毛背部にアセトン処理または１０μｇＤＭＢＡ処理のいずれかを２０週間にわたり毎週１回行った。図２９Ａ：ＳＴＩＮＧ欠損動物は、皮膚癌を引き起こすＤＮＡ損傷剤に耐性である。皮膚腫瘍なしのマウスのパーセントをカプラン・マイヤー曲線に示した。図２９Ｂ：各処理群の代表的マウスの写真を示した。図２９Ｃ：モック処理またはＤＭＢＡ処理された皮膚／皮膚腫瘍の生検試料でＨ＆Ｅ染色により病理組織学的検査を行った。２０倍の倍率で画像を得た。図２９Ｄ：発癌性物質に暴露されたＳＴＩＮＧ発現マウスにおけるサイトカインアップレギュレーション。モック処理またはＤＭＢＡ処理された皮膚／皮膚腫瘍の生検試料から抽出されたＲＮＡを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｅｎｔｒｉｘ  ＢｅａｄＣｈｉｐ  Ａｒｒａｙ（Ｍｏｕｓｅ  ＷＧ６  バージョン２）によりデュプリケート方式で、分析した。全遺伝子発現を分析した。最も変動しやすい遺伝子を選択した。行は、個別の遺伝子を表し、列は、個別のサンプルを表す。擬似カラーは、転写レベルが平均よりも少ないか、平均に等しいか、または平均よりも多いかを表す。遺伝子発現の変化倍率は、ｌｏｇ１０スケールで−５〜５の範囲内である。サイトカインは、ＳＴＩＮＧ欠損動物の皮膚で観測されなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図２９−３】
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【国際調査報告】
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