(57)【要約】  本発明は、ウイルスの膜ガングリオシドに含まれるシアリルラクトース分子のＣＤ１６９／シアロアドヘシン受容体への結合を阻害することにより、ＣＤ１６９／シアロアドヘシン表面受容体を発現する細胞内へのウイルスの侵入を阻止するための方法および組成物に関する。本発明はまた、樹状細胞に担持された目的抗原に基づくワクチン組成物に関し、これによってワクチンがＣＤ１６９／シアロアドヘシンを発現する細胞内へのウイルスの侵入を阻止できる組成物と共に提供される。本発明はさらに、診断薬／治療薬がＣＤ１６９／シアロアドヘシンに結合している、エンベロープバイロンへ特異的に送達される診断用および治療用組成物に関す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンベロープウイルスにより引き起こされる感染に関連した疾病の治療または予防に用いられる、シアロアドヘシンおよびシアリルラクトース間相互作用阻害剤。
【請求項２】
前記阻害剤が、シアリルラクトース、シアリルラクトース成分を含む分子、抗シアロアドヘシン抗体、およびシアリルラクトース結合分子からなる群から選択されるものであるか、またはシアリルラクトース成分を含む分子を含む小胞である、請求項１に記載の用途の阻害剤。
【請求項３】
前記シアリルラクトース成分を含む分子が、４個未満のシアル酸を有するガングリオシドである、請求項２に記載の用途の阻害剤。
【請求項４】
前記エンベロープウイルスのエンベロープ中の少なくとも幾つかの脂質がシアリルラクトースを含むものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の用途の阻害剤。
【請求項５】
前記エンベロープウイルスが、好ましくはＨＩＶであるレトロウイルス、およびフィロウイルスファミリーのウイルスからなる群から選択されるものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の用途の阻害剤。
【請求項６】
前記ＨＩＶがＨＩＶ−１である、請求項５に記載の用途の阻害剤。
【請求項７】
前記ＨＩＶによる感染に関連する疾病がＡＩＤＳである、請求項４に記載の用途の阻害剤。
【請求項８】
抗原を担持した抗原提示細胞と、シアロアドヘシンおよびシアリルラクトース間相互作用阻害剤とを含んでなる、組成物またはパーツキット。
【請求項９】
前記阻害剤が、シアリルラクトース、シアリルラクトース成分を含む分子、抗シアロアドヘシン抗体、およびシアリルラクトース結合分子からなる群から選択されるものである、請求項８に記載の組成物またはパーツキット。
【請求項１０】
前記シアリルラクトース成分を含む分子が、４個未満のシアル酸を有するガングリオシドである、請求項９に記載の組成物またはパーツキット。
【請求項１１】
前記抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の組成物またはパーツキット。
【請求項１２】
前記抗原がウイルス抗原である、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の組成物またはパーツキット。
【請求項１３】
前記ウイルス抗原がＨＩＶ抗原である、請求項１２に記載の組成物またはパーツキット。
【請求項１４】
医薬に用いられる、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の組成物またはパーツキット。
【請求項１５】
請求項８〜１２のいずれか一項に記載の組成物もしくはパーツキットを含む、免疫原またはワクチン。
【請求項１６】
抗原提示細胞に担持された抗原に対する免疫応答が必要とされる疾病の治療に用いられる、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の組成物またはパーツキット。
【請求項１７】
抗原提示細胞に担持された抗原に対する免疫応答を誘導する方法に用いられる、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の組成物またはパーツキット。
【請求項１８】
サンプル中のエンベロープウイルスを検出または単離する方法であって、
（ｉ）前記サンプルを、シアロアドヘシンまたはその機能的に等価な変異体であって、シアリルラクトースへの結合能を実質的に保持する変異体と接触させ、そして
（ｉｉ）前記シアロアドヘシンまたはその機能的に等価な変異体に結合したウイルスを検出または単離すること
を少なくとも含んでなる、方法。
【請求項１９】
前記シアロアドヘシンが固定化されてなるものである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記エンベロープウイルスが、レトロウイルスおよびフィロウイルスファミリーのウイルスからなる群から選択されるものである、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記レトロウイルスがＨＩＶである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＨＩＶがＨＩＶ−１である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
固定化されたシアロアドヘシンまたはその機能的に等価な変異体であって、シアリルラクトースへの結合能を実質的に保持する変異体を含んでなる、キット。
【請求項２４】
シアロアドヘシンまたはその機能的に等価な変異体であって、シアリルラクトースへの結合能を実質的に保持する変異体と、治療薬または診断薬とを含んでなる、コンジュゲート。
【請求項２５】
前記治療薬が抗ＨＩＶ剤である、請求項２４に記載のコンジュゲート。
【請求項２６】
医薬に用いられる、請求項２４または２５に記載のコンジュゲート。
【請求項２７】
ＨＩＶの感染により引き起こされる疾病の治療に用いられる、請求項２４または２５に記載のコンジュゲート。
【請求項２８】
前記診断薬が、検出可能な標識である、請求項２４に記載のコンジュゲート。
【請求項２９】
目的化合物を抗原提示細胞へ送達する方法であって、前記抗原提示細胞と、前記目的化合物を含む脂質微粒子とを接触させる工程を少なくとも含んでなり、前記脂質粒子がシアリルラクトース成分を含む分子を少なくとも含むものである、方法。
【請求項３０】
前記シアリルラクトース成分を含む分子が、４個未満のシアル酸基を含有するガングリオシドである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記目的化合物が抗原または抗レトロウイルス剤である、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗原がＨＩＶ抗原である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
エンベロープウイルスによって引き起こされる感染に関連する疾病の治療または予防に用いられる、シアロアドヘシン阻害剤。
【請求項３５】
前記シアロアドヘシン阻害剤が、シアロアドヘシンに特異的なｉＲＮＡ、シアロアドヘシンに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびシアロアドヘシンに特異的なリボザイムからなる群から選択されるものである、請求項３４に記載の用途のシアロアドヘシン阻害剤。
【請求項３６】
前記エンベロープウイルスのエンベロープ中の少なくとも幾つかの脂質がシアリルラクトースを含むものである、請求項３４または３５に記載の用途のシアロアドヘシン阻害剤。
【請求項３７】
前記エンベロープウイルスが、レトロウイルスおよびフィロウイルスファミリーのウイルスからなる群から選択されるものである、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の用途のシアロアドヘシン阻害剤。
【請求項３８】
前記レトロウイルスがＨＩＶである、請求項３７に記載の用途のシアロアドヘシン阻害剤。
【請求項３９】
前記ＨＩＶがＨＩＶ−１である、請求項３８に記載の用途のシアロアドヘシン阻害剤。
【請求項４０】
前記ＨＩＶによる感染に関連する疾病がＡＩＤＳである、請求項３９に記載の用途のシアロアドヘシン阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス膜ガングリオシド中のシアリルラクトース分子のＣＤ１６９受容体への結合を阻害することにより、ＣＤ１６９細胞表面受容体を発現する細胞内へのウイルスの侵入を阻止する方法に関する。本発明はまた、前記結合の阻害剤、および本発明による阻害剤を含む医薬組成物、ならびにこれらの製造方法および診断用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
樹状細胞（ＤＣ）は粘膜内の病原体を捕捉し、その後二次リンパ組織へと遊走し、そこで適応免疫応答を効率的に誘導するために必要な成熟した表現型を獲得する。抗原の取り込みと提示に対する成熟ＤＣ（ｍＤＣ）の潜在的役割は、効率的な抗原の捕捉と抗原提示経路への移送であると示唆される。エンドサイトーシスのダウンレギュレーションは成熟ＤＣの特徴であると考えられているが、炎症状態において、ｍＤＣは病原体への事前の曝露に依存することなく、抗原を捕捉、処理、および提示することが証明されつつある。Ｍｅｌｌｍａｎ  Ｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２００１；１０６：２５５−２５８，Ｐｌａｔｔ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２０１０；１０７：４２８７−４２９２およびＤｒｕｔｍａｎ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０；１８５：２１４０−２１４６参照。このシナリオは特に、ＨＩＶ−１によって引き起こされるような慢性の感染症に関連する可能性があり、ここでは腸管腔からの細菌の移行が増大することで、全身的にＤＣが刺激され、これが持続的な抗ウイルス性の免疫応答に寄与すると考えられる。Ｂｒｅｎｃｈｌｅｙ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００６；１２：１３６５−１３７１参照。
【０００３】
逆説的には、ｍＤＣにＨＩＶ−１が捕捉されることはまた、ＤＣ−Ｔ−細胞シナプス内のＴ細胞への感染性ウイルスの効率的な提示によって、リンパ組織内へのウイルスの播種を致命的に増大させると考えられ、このため、トランス感染による疾病の発生および進行が促進される。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの試験により、ＨＩＶとＴ細胞とを低ＭＯＩでインキュベートする際にＤＣを共存させると、Ｔ細胞はさらにより効率的に感染することが示されている。このようなトランス感染の作用機序はある程度議論の対象となっている。ＤＣの成熟によって増大する、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０に依存しないウイルスの結合および取り込みの作用機序については、当該技術分野において既に特定されている。Ｉｚｑｕｉｅｒｄｏ−Ｕｓｅｒｏｓ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００９；１１３：２７３２−２７４１参照。加えて、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ  ｅＧＦＰを発現する蛍光ウイルス様粒子（ＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰ）は、ｍＤＣ内で野生型ＨＩＶ−１と同じ輸送経路をたどることによって、ｍＤＣへの侵入を制御する分子パターンを共用する。Ｉｚｑｕｉｅｒｄｏ−Ｕｓｅｒｏｓ  ＮＪ．Ｖｉｒｏｌ．２００７；８１：７５５９−７５７０．参照。しかしながら、ＨＩＶ−１がｍＤＣ内に取り込まれ、蓄積される正確な作用機序についてはこれまで知られていない。
【０００４】
したがって、ＤＣがＨＩＶを取り込む作用機序を同定することによって、この取り込みを阻害するための有用な手段の開発が可能となり、よって、ＤＣによるＣＤ４＋Ｔ細胞のトランス感染を減少させることができる。
【発明の概要】
【０００５】
第１の態様によれば、本発明は、エンベロープウイルスにより引き起こされる感染に関連する疾病の治療または予防に用いられる、シアロアドヘシンおよびシアリルラクトース間相互作用阻害剤に関する。
【０００６】
別の態様によれば、本発明は、抗原を担持した抗原提示細胞およびシアロアドヘシンおよびシアリルラクトース間相互作用阻害剤を含んでなる、組成物またはパーツキットに関する。
【０００７】
さらなる態様によれば、本発明は、サンプル中のエンベロープウイルスを検出または単離する方法に関し、この方法は、
（ｉ）前記サンプルを、シアロアドヘシンまたはその機能的に等価な変異体であって、シアリルラクトースへの結合能を実質的に保持する変異体と接触させ、
（ｉｉ）前記シアロアドヘシンまたはその機能的に等価な変異体に結合したウイルスを検出または単離することを少なくとも含んでなるものである。
【０００８】
さらなる態様によれば、本発明は、固定化されたシアロアドヘシン、またはその機能的に等価な変異体であって、シアリルラクトースへの結合能を実質的に保持する変異体を含んでなるキットに関する。
【０００９】
別の態様によれば、本発明は、シアロアドヘシン、またはその機能的に等価な変異体であって、シアリルラクトースへの結合能を実質的に保持する変異体と、治療薬または診断薬とを含んでなるコンジュゲートに関する。
【００１０】
さらに別の態様によれば、本発明は、目的化合物を抗原提示細胞へ送達するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法に関し、この方法は、前記抗原提示細胞と、前記目的化合物を含む脂質微粒子とを接触させる工程を少なくとも含み、前記脂質粒子がシアリルラクトース成分を含む分子を少なくとも含むものである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】ｍＤＣを介したウイルスの捕捉にはガングリオシドが必要であることを示した図である。ＭＴ４由来のＨＩＶＮＬ４．３から得た脂質抽出物中のガングリオシド検出。（Ａ）ＵＰＬＣ／ＴＯＦ  ＥＳＩ（＋）分析により得た、３回の異なるウイルス単離の代表的なクロマトグラムの５．３から６．５分の範囲に相当する部分的な質量スペクトル（８５０ないし１５５０ａｍｕ）。同定した目的化合物それぞれの［Ｍ＋Ｈ］＋および［Ｍ＋Ｎａ］＋イオンを示す。各化合物の保持時間を略語の後に示す。選択した時間範囲は、Ｎ  ヘキサデカノイル（Ｎ−Ｃ１６）種に対応するものである。
【図１ＢＣ】（Ｂ）５．５６分にて得られたＧＤ１の正確な質量イオンクラスター。（Ｃ）電荷状態２の式Ｃ８２Ｈ１４４Ｎ４Ｏ３９に対応する正確な質量イオンクラスター。Ｎ−Ｃ２２、Ｎ−Ｃ２４、およびＮ−Ｃ２４：１種もまた観察された。
【図１ＤＥ】（Ｄ）ＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰ、およびＣｅｒ、ＧＭ３、ＧＭ２、ＧＭ１、またはＰＳを含む別々の蛍光ＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄの、ｍＤＣによる捕捉の比較。総数２×１０５のＤＣを、０．２ｍｌ中で１００μＭのＬＵＶ、または７５ｎｇのＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰＧａｇにより３７℃にて４時間パルスし、ＰＢＳで洗浄後、ＦＡＣＳによりｔＲｅｄまたはｅＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを調べた。データは、少なくとも６ドナーから得た細胞による独立した５実験の平均値およびＳＥＭを示す。成熟ＤＣは、ＣｅｒまたはφＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄよりも、ＧＭ３を含むＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄを有意に多量捕捉した（Ｐ＜０．０００１、対応ｔ検定）。成熟ＤＣは、陰性に荷電したＰＳ−ＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄよりも、ＧＭ１を含むＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄを有意に多量捕捉した（Ｐ＝０．００８１、対応ｔ検定）。（Ｅ）７５ｎｇのＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰＧａｇと、量（μＭ）を徐々に減少させたＧＭ２を含むＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄとの捕捉の競合。コントロールとして、Ｃｅｒを含むかまたは含まない最大濃度のＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄ（１００μＭ）を用いた。細胞を３７℃にて４時間インキュベートし、洗浄後、ＦＡＣＳによりｅＧＦＰおよびｔＲｅｄ陽性細胞のパーセンテージを確定した。データは、少なくとも４ドナーから得た細胞による独立した３実験の平均値およびＳＥＭを示す。ＧＭ２を含むＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄが多量に存在すると、ｍＤＣが捕捉するＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰの量はより少なかった（Ｐ＜０．０００１、対応ｔ検定）。
【図２Ａ】ｍＤＣ内のＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰと同じ区画への、ガングリオシドを含むＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄの輸送を示した図である。（Ａ）ＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰまたはガングリオシドを含むＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄへ別々に４時間曝露した後の、異なった捕捉パターンを有するｍＤＣのパーセンテージ。データは、異なる５ドナーから得た１００を超える細胞の平均値およびＳＥＭを示す。
【図２Ｂ】（Ｂ）異なる３ドナーのｍＤＣ由来の少なくとも１０の小胞を分析することによって得た、ガングリオシドを含むＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄと共存するＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰのパーセンテージ、およびＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰと共存するガングリオシドを含むＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄのパーセンテージの定量化。
【図３】ガングリオシドを含むＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄは、秩序液体に依存することなく、ｍＤＣによって捕捉されることを示した図である。（Ａ）Ｃｅｒ、ＧＭ３、ＧＭ２、またはＧＭ１を含むかまたは含まないＬＵＶＰＯＰＣ−ｔＲｅｄの、ｍＤＣによる捕捉の比較。総数２×１０５のＤＣを、１００μＭのＬＵＶにより３７℃にて４時間パルスし、ＰＢＳで洗浄後、ＦＡＣＳによりｔＲｅｄ陽性細胞のパーセンテージを調べた。データは、少なくとも６ドナーから得た細胞による独立した３実験の平均値およびＳＥＭを示す。成熟ＤＣは、ＣｅｒまたはＬＵＶＰＯＰＣ−ｔＲｅｄよりも、ＧＭ３を含むＬＵＶＰＯＰＣ−ｔＲｅｄを有意に多量捕捉した（Ｐ値はグラフに示す、対応ｔ検定）。（Ｂ）ガングリオシドを含むＬＵＶＰＯＰＣ−ｔＲｅｄへ４時間曝露した後の、異なったリポソーム捕捉パターンを有するｍＤＣのパーセンテージ。
【図４】ガングリオシド複合体のｍＤＣによる捕捉パターンを示した図である。（Ａ）ＧＭ１；ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、およびＧＱ１ｂのようなポリシアロガングリオシド；ＰＳ；ならびにＣｅｒを含む別々のＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄの、ｍＤＣによる捕捉の比較。総数２×１０５のＤＣを、１００μＭのＬＵＶにより３７℃にて４時間パルスし、ＰＢＳで洗浄後、ＦＡＣＳによりｔＲｅｄ陽性細胞のパーセンテージを調べた。データは、６ドナーから得た細胞による独立した２実験の平均値およびＳＥＭを示す。成熟ＤＣは、ＧＱ１ｂを含むＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄよりも、ＧＭ１を含むＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄを有意に多量捕捉した（Ｐ＜０．０００１、対応ｔ検定）。これらの実験に用いたＬＵＶ内のガングリオシドの略図を本図面の隣に示す。（Ｂ）７５ｎｇのＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰＧａｇと、１００μＭの、異なるポリシアロガングリオシドＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄとの間の捕捉の競合。細胞を３７℃にて４時間インキュベートし、洗浄後、ＦＡＣＳによりｅＧＦＰおよびｔＲｅｄ陽性細胞のパーセンテージを決定した。データは、６ドナーから得た細胞による独立した２実験の平均値およびＳＥＭを示す。ＧＭ１を含むＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄの存在下では、同濃度のＧＱ１ｂを含むＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄの存在下よりも、ｍＤＣが捕捉するＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰの量は少なかった（Ｐ＜０．０００１、対応ｔ検定）。
【図５ＡＢ】ガングリオシドに存在するウイルス付着ドメインの同定を示した図である。（Ａ）Ｃｅｒ、ＧＭ１、またはシアル酸を含まないＧＭ１（アシアロＧＭ１）を含む別々のＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄの、ｍＤＣによる捕捉の比較。総数２×１０５のＤＣを、１００μＭのＬＵＶにより３７℃にて４時間パルスし、ＰＢＳで洗浄後、ＦＡＣＳによりｔＲｅｄ陽性細胞のパーセンテージを調べた。データは、９ドナーから得た細胞による独立した３実験の平均値およびＳＥＭを示す。成熟ＤＣは、アシアロＧＭ１を含むＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄよりも、ＧＭ１を含むＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄを有意に多量捕捉した（Ｐ＜０．０００１、対応ｔ検定）。（Ｂ）シアル酸を除くためにノイラミニダーゼで処理したかまたは処理していない、ＧＭ３を含むＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄおよびＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰの、ｍＤＣによる捕捉の比較。総数２×１０５のＤＣを、ウェルシュ菌ノイラミニダーゼＯＮで処理したかまたは処理していない、２５μＭのＬＵＶおよび７５ｎｇのＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰＧａｇにより３７℃にて２時間パルスし、ＰＢＳで洗浄後、ＦＡＣＳによりｔＲｅｄおよびｅＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを調べた。データは、５ドナーから得た細胞による独立した２実験の平均値およびＳＥＭを示す。成熟ＤＣは、ノイラミニダーゼ処理粒子よりも、無処理粒子を有意に多量捕捉した（Ｐ値はグラフに示す、対応ｔ検定）。
【図５ＣＤ】（Ｃ）ＧａｌＣｅｒ、ＧＭ４、ＧＭ３、またはＧＭ１を含む別々のＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄの、ｍＤＣによる捕捉の比較。総数２×１０５のＤＣを、１００μＭのＬＵＶにより３７℃にて４時間パルスし、洗浄後、ＦＡＣＳによりｔＲｅｄ陽性細胞のパーセンテージを調べた。データは、９ドナーから得た細胞による独立した３実験の平均値およびＳＥＭを示す。成熟ＤＣは、ＧａｌＣｅｒまたはＧＭ４を含むＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄよりも、ＧＭ１を含むＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄを有意に多量捕捉した（Ｐ＜０．０００１、対応ｔ検定）。これらの実験のためのＬＵＶ内に存在する分子の略図を下図に示す。（Ｄ）１０ｍＭの可溶性ラクトース、または５ないし１０ｍＭのＧＭ３炭水化物極性頭部基と共にプレインキュベートしたｍＤＣによる、ＧＭ３を含むＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄおよびＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰの捕捉を、モック処理したｍＤＣによるＬＵＶ／ＶＬＰの捕捉レベル（１００％に設定）に対し標準化して、相対的に示したグラフ。ＧＭ３極性頭部基による処理で、ｍＤＣが捕捉する粒子は減少した（Ｐ値はグラフに示す、対応ｔ検定）。データは、少なくとも９ドナーから得た細胞による独立した三実験の平均値およびＳＥＭを示す。
【図６Ａ】ガングリオシドの構造を示した図である。本試験で用いたアシアロ−、モノ−、ジ−、トリ−、およびテトラシアロガングリオシドの２Ｄモデル。
【図６Ｂ】図６Ａに同じ。
【図６Ｃ】図６Ａに同じ。
【図７ＡＢ】テキサスレッドを含むＬＵＶの蛍光を比較した図である。グラフに示した分子を含むＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄ、またはＬＵＶＰＯＰＣ−ｔＲｅｄの、６０８ｎｍにおける最大蛍光発光。（Ａ）図１および２で使用したＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄの比較。（Ｂ）図３で使用したＬＵＶＰＯＰＣ−ｔＲｅｄの比較。
【図７ＣＤ】（Ｃ）図４で使用したＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄの比較。（Ｄ）図５で使用したＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄの比較。データは、異なるＬＵＶ調製物の、少なくとも２の独立した測定の平均値およびＳＥＭを示す。
【図８】ＣＨＯ細胞株内で産生されたＶＬＰの捕捉を示した図である。ガングリオシドＧＭ３のみを合成できるＣＨＯ細胞株内で産生されたＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰの捕捉。総数２×１０５のＤＣを、７５ｎｇのスクロース−ペレット化したＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰＧａｇと共に３７℃にて４時間インキュベートし、洗浄後、ＦＡＣＳによりｅＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを調べた。データは、３ドナーから得た細胞による２実験のうち代表的な１実験の平均値およびＳＥＭを示す。
【図９】Ｒａｊｉ  Ｂ細胞へのシグレックのトランスフェクションを示した図である。表示したシグレックの発現プラスミド、またはモックをトランスフェクトしたＲａｊｉ細胞による、ＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰの捕捉。トランスフェクトしたＲａｊｉ細胞は、１０μｇ／ｍｌの表示したｍＡｂと共にプレインキュベートした後でＶＬＰに曝露した。データは、４回のトランスフェクションで得た細胞による２実験の平均値およびＳＥＭを示す。
【図１０】シアリルラクトースによるブロッキング効果を示した図である。シグレック１発現プラスミド、またはモックをトランスフェクトしたＲａｊｉ細胞による、ＶＬＰＨＩＶＧａｇ−ｅＧＦＰの捕捉。細胞を、表示した濃度のシアリルラクトース、または可溶性ラクトースと共にプレインキュベートした後でＶＬＰに曝露した。データは、３回のトランスフェクションの平均値およびＳＥＭを示す。
【図１１】ＬＰＳ  ｍＤＣに発現したシグレック１が、ガングリオシドを含む様々な小胞、例えばＨＩＶ−１ウイルス様粒子、リポソーム、およびエキソソームを捕捉することを示した図である。濃度を徐々に減少させたα−シグレック１  ｍＡｂである７Ｄ２と共に３７℃にて３０分間プレインキュベートした後でＶＬＰに曝露したＬＰＳ  ｍＤＣによる、ＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰの捕捉。データは、６ドナーから得た細胞による三実験の平均値およびＳＥＭを示す。
【図１２】少なくとも１００倍モル過剰の、表示したヒト組み換えタンパク質で予め処理したかまたは処理せず、２μｇ／ｍｌのα−シグレック１  ｍＡｂである７Ｄ２の存在下、または非存在下でプレインキュベートしたＬＰＳ  ｍＤＣによるＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰの捕捉を示した図である。シグレック１４とシグレック５は、Ｖ−セットドメインにおいて１００％のアミノ酸相同性を有することに留意されたい。データは、９ドナーから得た細胞による三実験の平均値およびＳＥＭを示す。
【図１３】α−シグレック１  ｍＡｂである７−２３９によるブロッキング効果を示した図である。（Ａ）濃度を徐々に減少させたα−シグレック１  ｍＡｂである７−２３９と共に３７℃にて３０分間プレインキュベートした後でＶＬＰに曝露したＬＰＳ  ｍＤＣによる、ＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰの捕捉。データは、４ドナーからの平均値およびＳＥＭを示す。（Ｂ）１０μｇ／ｍｌの、表示したｍＡｂと共に３７℃にて３時間プレインキュベートした後でＶＬＰに曝露したＬＰＳ  ｍＤＣによる、ＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰの捕捉。データは、７ドナーから得た細胞による二実験の平均値およびＳＥＭを示す。
【図１４】シグレック１の発現停止によってウイルスの捕捉およびトランス感染は遮断されるが、シグレック１の新たな発現によってこれが救出されることを示した図である。シグレック１の干渉。モックの形質導入、または標的をもたないか、もしくは２種の異なるシグレック１に特異的なｓｈＲＮＡの形質導入後に、ＣＤ１４、ＨＬＡ−ＤＲ、シグレック１、またはＶＬＰの捕捉が観察されるＬＰＳ  ｍＤＣのパーセンテージ。データは、少なくとも４ドナーから得た細胞による四実験の平均値およびＳＥＭを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、ウイルスまたは小胞の膜に含まれるシアル化されたガングリオシドの、ｍＤＣによる特異的捕捉の決定因子としての新規な役割を、明確に特定した。この捕捉は、露出シアリルラクトース部分に依存するものであり、この部分は、この病原体に関連する、新規な分子パターンであることが初めて同定された。感染細胞の細胞膜から出芽する全てのエンベロープウイルスは、シアリルラクトースを含むガングリオシドを排除しない限り、既知の作用機序によってｍＤＣ内に捕捉され得ることが示唆されたことから、ガングリオシドは細胞膜リピドームの重要な成分である。
【００１３】
ガングリオシドを有する小胞またはビリオンの効率的な捕捉は、ｍＤＣ（おそらくその他の細胞も）の細胞表面に存在する特異的受容体、例えばＣＤ１６９細胞表面受容体が、ビリオンまたは小胞の膜上のシアリルラクトース成分を認識するという、本発明に開示されるようなモデルを支持するものである。小胞のガングリオシドの特異的認識により、細胞内区画への取り込みが誘発され得る。続いて、取り込まれた物質は表面に再循環され得るか（ＨＩＶ−１によるＴ細胞の感染にみられるように）、または抗原提示経路へ送られ得る。
【００１４】
１．一般的な用語および表現に対する定義
本明細書で用いられる用語「ＡＩＤＳ」は、ＨＩＶ感染の症候性の段階を指し、これには後天性免疫不全症候群（一般にＡＩＤＳとして知られる）および「ＡＲＣ」、すなわちＡＩＤＳ関連症候群の両方が含まれる。Ａｄｌｅｒ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｊ．１９８７；２９４：１１４５−１１４７参照。ＡＩＤＳの免疫学的および臨床的症状は当該技術分野において公知であり、これには例えば、免疫不全に起因する日和見感染および癌が含まれる。
【００１５】
本明細書で用いられる用語「抗体」は、認識された免疫グロブリン遺伝子の全てまたは一部によりコードされる１つまたは以上のタンパク質からなるタンパク質を指し、これにはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ならびにそれらの抗原結合性断片、例えば、Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂ断片、および単鎖抗体が含まれるが、これらに限定されない。抗体との用語には、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ならびに遺伝的に改変された抗体、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、ヒト抗体、および二重特異性抗体のような既知の抗体のいずれの型も含まれる。
【００１６】
本明細書で用いられる用語「抗ＨＩＶ剤」、「ＨｌＶ阻害剤」、および「ＨＩＶ抗ウイルス剤」は、哺乳類の細胞のような細胞内でのＨＩＶの複製を阻害できるか、または、ＨＩＶ感染、すなわちＡＩＤＳ、疾病またはそれから発生するかもしくはそれに付随する状態の治療、予防、または発症もしくは進行の遅延に有効な、任意の化合物またはその薬剤的に許容される塩を指す。本発明による使用に適した抗ＨＩＶ剤には、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、ＨＩＶ逆転写酵素阻害剤、ＨＩＶ侵入阻害剤、およびＨＩＶ免疫原が含まれるが、これらに限定されない。
【００１７】
本明細書で用いられる用語、抗体の「抗原結合領域」には、特異的抗原に結合する、合成されたかまたは遺伝的に改変されたポリペプチド、例えば軽鎖の可変領域からなるポリペプチド、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」断片、軽鎖および重鎖の可変領域がペプチドリンカーによって連結された組換え単鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）、および超可変領域を模倣したアミノ酸残基からなる最小認識単位もまた含まれる。
【００１８】
本明細書で用いられる用語「抗原担持」は、樹状細胞または前駆細胞を、ペプチド、ポリペプチド、リポペプチド、ＤＮＡ（ネイキッド、もしくはプラスミドベクター内にあるもの）、またはＲＮＡと共に、あるいは、抗原を発現する組換え細菌またはウイルス（例えばワクシニア、アデノウイルス、もしくはレンチウイルス）と共に、それらの抗原エピトープが担持され、ＭＨＣによって細胞表面に発現されるようにインキュベートすることで、抗原を樹状細胞に送達する方法を指す。
【００１９】
本明細書で用いられる用語「抗原提示細胞（ＡＰＣ）」は、抗原をプロセシングし、そしてＭＨＣ分子（ＭＨＣクラスＩ分子、またはＭＨＣクラスＩＩ分子）を介して提示することができる任意の細胞を指す。ＡＰＣは、抗原をプロセシングし、そしてＭＨＣクラスＩ分子およびＭＨＣクラスＩＩ分子を介して抗原を提示することができる。特に、抗原提示細胞には、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、上皮細胞、線維芽細胞、グリア細胞、および当業者により同定可能なさらなる細胞が含まれる。好ましくは、ＡＰＶは樹状細胞である。
【００２０】
本明細書で用いられる用語「抗レトロウイルス剤」には、レトロウイルに対する効果を示す任意の薬理学的、生物学的、または細胞性の薬剤が含まれる。
【００２１】
本明細書で用いられる用語「アンチセンス核酸」は、癌遺伝子をコードするＤＮＡおよびＲＮＡの塩基配列に相補的なオリゴヌクレオチドを指すことが意図される。標的細胞に発現させたアンチセンス核酸は、その標的核酸へ特異的に結合し、転写、ＲＮＡプロセシング、輸送、および／または翻訳を阻害する。ポリヌクレオチドによりターゲティングされた二重鎖（ｄｓ）ＤＮＡは三重らせんの形成を誘導し、ターゲティングされたＲＮＡは二重らせんの形成を誘導する。
【００２２】
本明細書で用いられる用語「自己の」は、ドナー被験体に由来する任意の材料であって、後に同じ個体へ再導入される材料を指す。
【００２３】
本明細書で用いられる用語「組成物」は、少なくとも２成分を含む材料組成物、および異なる成分の任意の量による組み合わせから直接的または間接的に得られる任意の生成物を指す。当業者は、組成物が単一の製剤として調合され得るか、または併用調製物として同時使用するために組み合わせてよい、それぞれの成分が独立した製剤として示され得ることを認識するであろう。組成物は、それぞれの成分が独立に調合され包装される、パーツキットであってよい。
【００２４】
本明細書で用いられる用語「含んでいる」、または「含む」は、一般的に許容される特許実務に従い、「からなる」も包含する。
【００２５】
本明細書で用いられる用語「コンジュゲート」は、各化合物の作用がコンジュゲートで維持されるように共有結合された２つまたはそれ以上の化合物を指す。
【００２６】
本明細書で用いられる用語「樹状細胞」（ＤＣ）は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはホストもしくは被験体内に存在するか、または造血幹細胞もしくは単球から誘導できる抗原提示細胞である。樹状細胞およびその前駆体は、様々なリンパ器官（例えば脾臓、リンパ節）から、かつ骨髄および末梢血からも分離できる。ＤＣは、樹状細胞の体部から複数の方向へ伸びる薄いシート状の特徴的な形態（ラメリポディア）を有する。典型的には、樹状細胞はＭＨＣおよび共刺激分子（例えばＢ７−１およびＢ７−２）を高レベルで発現する。樹状細胞はＴ細胞の抗原特異的な分化をｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導でき、かつＴ細胞の一次応答をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで開始できる。本明細書で用いられる用語「樹状細胞」には、未熟または成熟樹状細胞を問わず、分化した樹状細胞が含まれる。これらの細胞は、特定の細胞表面マーカー（例えばＣＤ１１ｃ、ＭＨＣクラスＩＩ、ならびに少なくとも低レベルのＣＤ８０およびＣＤ８６）の発現によって特徴付けられる。加えて樹状細胞は、それらがアロ応答および混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を刺激する能力によって機能的に特徴付けられる。「樹状細胞調製物」との表現は、前記細胞のパルスに適した培地中にある、被験体から得た樹状細胞を含む組成物を指す。
【００２７】
本明細書で用いられる表現「ＨＩＶ感染に関連する疾病」には、被験体がＡＩＤＳにかかった状態と同様に、ＨＩＶに感染した被験体が疾病の徴候または症状のいずれも示さない状態も含まれる。したがって、本発明の組成物を感染の臨床的徴候を示さない被験体へ投与した際には、これが疾病の発症を阻止し得ることから、予防的活性を有することとなる。該組成物は、このような被験体において感染および健常ＣＤ４＋Ｔ細胞の破壊を予防するかまたは遅延させることができる。該組成物はまた、極端に少ないＣＤ４＋Ｔ細胞数、ならびにマイコバクテリア属、ニューモシスチス・カリニ、およびニューモシスチスとクリプトコッカスのような病原体の日和見感染の繰り返しのような、後天性免疫不全疾患の症状発現の予防および遅延にも向けられる。有益な、または望ましい臨床結果には、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の絶対数の増加（１０〜３５２０の範囲）、循環する免疫細胞の総数に対するＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージの増大（１〜５０パーセントの範囲）、および／または感染していない被験体の正常ＣＤ４＋Ｔ細胞数のパーセンテージとして表されるＣＤ４＋Ｔ細胞数の増加（１〜１６１パーセントの範囲）が含まれるが、これらに限定されない。「治療」もまた、感染した被験体の生存を、該被験体がＨＩＶを標的としたいずれの治療も受けなかった場合と比較して延長させることを意味する。
【００２８】
本明細書で用いられる「二重鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」は、２本の鎖から構成されるＲＮＡ分子を指す。二重鎖分子には、二重鎖構造を形成するため、それ自身とは逆方向に倍加する単鎖ＲＮＡ分子から構成されるものも含まれる。例えば、プレｍｉＲＮＡと称される、単鎖ｍｉＲＮＡが由来する前駆体分子のステムループ構造（Ｂａｒｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．２００４．Ｃｅｌｌ  １１６：２８１−２９７）には、ｄｓＲＮＡ分子が含まれる。
【００２９】
本明細書で用いられる表現「エンベロープウイルスにより引き起こされる感染に関連する疾病」には、
（１）マールブルグウイルスにより引き起こされるマールブルグウイルス病（マールブルグ出血熱、すなわちＭＨＦ）およびエボラウイルスにより引き起こされるエボラウイルス病（エボラ出血熱、すなわちＥＨＦ）を含む、フィロウイルス科のファミリーに属するエンベロープウイルスにより引き起こされる疾病、および
（２）レトロウイルス科のファミリーに属するエンベロープウイルスにより引き起こされる疾病が含まれるが、これらに限定されない。
【００３０】
エンベロープウイルスの感染により引き起こされるその他の疾病には、デング熱、デング出血熱（ＤＨＦ）、黄熱病、デング熱、急性および慢性Ｃ型肝炎、ベネズエラ出血熱、ブラジル出血熱、ボリビア出血熱、リンパ球性脈絡髄膜炎、ラッサ熱、ハンタウイルス肺症候群（ＨＰＳ）、髄膜炎、およびインフルエンザが含まれるが、これらに限定されない。
【００３１】
本明細書で用いられる用語「エンベロープウイルス」は、ウイルスタンパク質を含み、かつウイルスカプシドを囲む脂質二重層である外膜、すなわちエンベロープを有する動物ウイルスのいずれかを指す。代表的なエンベロープウイルスには、ポックスウイルス科、ヘパドナウイルス科、トガウイルス科、アレナウイルス科、フラビウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、コロナウイルス科、レトロウイルス科、およびボルナウイルス科のファミリーメンバーが含まれるが、これらに限定されない。
【００３２】
本明細書で用いられる用語「エピトープ」は、免疫グロブリンへ特異的に結合できるか、または主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）タンパク質（例えばクラスＩ、またはクラスＩＩ）によってＴ細胞受容体に提示される、タンパク質決定因子のいずれかを指す。エピトープの決定因子は一般に、特定のアミノ酸による側基をＴ細胞受容体に提示するＭＨＣ分子の溝内に適合する５〜３０アミノ酸の短いペプチドであり、この溝（例えば溝の特異的な電荷特性により）、ペプチド側基、およびＴ細胞受容体内にはその他の特定の残基が結合する。
【００３３】
本明細書で用いられる用語「ガングリオシド」または「シアロガングリオシド」は、１分子あたり数個の単糖単位を含むスフィンゴ糖脂質を指す。ガングリオシドまたはガングリオシド誘導体に含まれてよい適切な単糖単位の例としては、Ｄ−ガラクトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、グルコース、およびＮ−アセチルノイラミン酸が挙げられる。特に好ましくは、特に、Ｃ−１上の酸素によって結合する糖残基、およびＣ−２上の窒素によって結合する、飽和または不飽和であってよい短い（特にＣ２−Ｃ１８）脂肪酸を有する、スフィンゴシン（２−アミノ−４−オクタデセン−１，３−ジオール、スフィング−４−エニン）の誘導体であるガングリオシドである。さらに好ましくは、
（ｉ）以下の一般式：
【化１】
2015500854.tif 000002
（式中、Ｒ１は長鎖脂肪酸残基、特にＣ６−Ｃ３０、さらに好ましくはＣ８−Ｃ２４の脂肪酸残基、Ｒ２は長鎖アルキル残基、特にＣ６−Ｃ３０、さらに好ましくはＣ８−Ｃ２４のアルキル残基、およびＲ３はＨである）
で表されるＮ−アシルスフィンゴシン（セラミド）、および
（ｉｉ）セラミド末端の一級水酸基に結合する１以上のＮ−アセチルノイラミン酸（例えばＮ−アセチルノイラミン酸、ＮＡＮＡ、シアル酸）を有するオリゴ糖鎖、を含むガングリオシドである。単数または複数のＮ−アセチルノイラミン酸残基は、シアル酸における可能な位置のいずれか、およびオリゴ糖分子における可能な位置のいずれかを介して、オリゴ糖に結合してよい。好ましい実施形態によれば、Ｎ−アセチルノイラミン酸は、シアル酸の２位の水酸基によってオリゴ糖に結合する（シアル酸構造の番号付けはカルボン酸塩の炭素から始まり、鎖に沿って進む）。別の好ましい実施形態によれば、シアル酸は、オリゴ糖の一部を形成するガラクトース残基の３位または６位の水酸基を介してオリゴ糖に結合する。好ましい実施形態によれば、「Ｎ−アセチルノイラミン酸」はα２，３−シアリル−またはα２，６−シアリル−オリゴ糖を形成する。
【００３４】
本明細書で用いられる用語「ＨＩＶ」には、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２ならびにＳＩＶが含まれる。「ＨＩＶ−１」は、１型ヒト免疫不全ウイルスを意味する。ＨＩＶ−１には、細胞外ウイルス粒子およびＨＩＶ−１感染細胞に関連するＨＩＶ−１の形態が含まれるが、これらに限定されない。ＨＩＶ−１ウイルスは、既知の主要な亜型（クラスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、およびＨ）のいずれか、または実験室内の系統や初代分離株が含まれる分類外の亜型（Ｏ群）を意味してよい。「ＨＩＶ−２」は、２型ヒト免疫不全ウイルスを意味する。ＨＩＶ−２には、細胞外ウイルス粒子およびＨＩＶ−２感染細胞に関連するＨＩＶ−２の形態が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で用いられる用語「ＳＩＶ」は、サル、チンパンジー、およびその他の非ヒト霊長類に感染するＨＩＶ様ウイルスである、サル免疫不全ウイルスを指す。ＳＩＶには、細胞外ウイルス粒子およびＳＩＶ感染細胞に関連するＳＩＶの形態が含まれるが、これらに限定されない。
【００３５】
本明細書で用いられる用語「ＨＩＶ免疫原」は、被験体に免疫応答を引き起こすことのできるＨＩＶ由来のタンパク質またはペプチド抗原を指す。本発明に従った使用のためのＨＩＶ免疫原は、ＨＩＶ分離株のいずれからも（例えば、初代または培養ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、もしくはＨＩＶ−３分離株、系統、またはクレードのいずれからも）選択されてよい。
【００３６】
本明細書で用いられる用語「ＨＩＶ感染」は、当業者に公知のＨＩＶ試験（例えばＨＩＶ  ＥＩＡ、ウェスタンブロット、ＰＣＲ試験）を用いたウイルスの検出によって確認された、ＨＩＶ抗体、ＨＩＶ抗原、またはＨＩＶ核酸の被験体内における存在を指す。
【００３７】
本明細書で用いられる用語「免疫原」は、単独で、またはアジュバントと併用して免疫応答を誘導できる物質もしくは材料（抗原を含む）を指す。ワクチンにより引き起こされる免疫応答は、液性または細胞性の免疫応答であってよいことが理解されるであろう。本明細書における表現「液性免疫応答」は、Ｔ細胞およびその分泌産物により仲介される、単数または複数の外来抗原に対する免疫応答を説明するために用いられる。本明細書における表現「細胞性免疫応答」は、Ｂ細胞により産生される抗体により仲介される、単数または複数の外来抗原に対する免疫応答を説明するために用いられる。ワクチンは全身性または局所性に投与される。本発明の組成物投与について以前に記載したように、ワクチンは単回投与によって、または複数回投与のブーストによって投与できる。本明細書で用いられる用語「予防する」、「予防している」、および「予防」は、動物における病的細胞出現の減少を指す。予防は完全なものであり得る（例えば被験体内における病的細胞の完全な不在）。予防は、例えば被験体における病的細胞の出現が本発明を用いない場合の出現よりも少ないといったように、部分的であってもよい。予防はまた、病態への感受性の低下も指す。
【００３８】
本明細書で用いられる表現「シアロアドヘシンとシアリルラクトースの相互作用に対する阻害剤」は、シアロアドヘシンとシアリルラクトースとの結合を阻害できるいずれかの分子もしくは化合物、またはシアリルラクトースを含有するその他のいずれかの化合物を指す。阻害剤は、シアロアドヘシンまたはシアリルラクトースのいずれかに、シアロアドヘシンとシアリルラクトースとの結合の親和性よりも高い親和性によって特異的に結合できる。本発明で用いられる表現「特異的結合」は、非特異的結合よりも有意に高い親和性を有する２つの分子の間の三次元構造の間の相補性の存在によって第１の分子が第２の分子へ特異的に結合する能力を指し、前記第１および第２の分子の結合は、好ましくは前記分子のいずれかが反応混合物中のその他の分子へ結合する前に起こる。前記結合によりもたらされる複合体の解離定数（ＫＤ）が１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、または１０−１５Ｍ未満であるとき、２つの分子の結合は高い親和性を有することが理解されるであろう。
【００３９】
本明細書で用いられる用語「干渉ＲＮＡ」は、結合してｍＲＮＡのプロセシングを阻害する分子、例えばｍＲＮＡの翻訳を阻害するか、またはｍＲＮＡを分解する分子による特異的なｍＲＮＡの破壊がもたらす、選択的な転写後の遺伝子の発現停止の手段を指す。適切な干渉ＲＮＡには、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、内在性のマイクロＲＮＡおよび人工のマイクロＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。例えば干渉ＲＮＡには、ＲＮＡの下流のプロセシング機序に関係なく、ｓｉＲＮＡとして予め同定された配列が含まれる（すなわち、ｓｉＲＮＡはｍＲＮＡの切断をもたらすｉｎ  ｖｉｖｏプロセシングの特異的方法であると考えられているが、このような配列は、本明細書に記載する隣接配列との関連で、ベクター内に取り込むことができる）。
【００４０】
本明細書で用いられる用語「単離」は、ウイルス粒子が産生される培地中から、ウイルス粒子を部分的または完全に取り出すことを指す。
【００４１】
本明細書で用いられる用語「レクチン」は、炭水化物、または糖タンパク質およびグリコシル化されたナノ構造のような、炭水化物により修飾された構造へ結合できる、抗体とは異なるいずれかのタンパク質を指す。
【００４２】
本明細書で用いられる用語「脂質微小胞」または「リポソーム」は、脂質外層を含む顕微鏡的な小胞を指す。脂質外層は脂質単層または二重層である。脂質外層が脂質単層である場合、リポソームはミセルとも称される。リポソームは１以上の脂質膜を有し得る。本発明は、単層リポソームと称される、単一層のリポソーム、および多重膜リポソームと称される、多層のリポソームの両方を企図する。
【００４３】
本明細書で互換的に用いられる用語「マイクロＲＮＡ」および「ｍｉＲＮＡ」は内在性のＲＮＡであり、それらのあるものはタンパク質をコードする遺伝子の発現を転写後レベルで調節することが知られている。内在性マイクロＲＮＡは、ゲノム内に天然に存在する低分子ＲＮＡであり、これによるｍＲＮＡの生産的利用の調節が可能である。人工マイクロＲＮＡとの用語には、内在性マイクロＲＮＡ以外のいずれかのＲＮＡ配列が含まれ、これによるｍＲＮＡの生産的利用の調節が可能である。マイクロＲＮＡ配列については、引用することにより本明細書の開示の一部とされる、Ｌｉｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１７，ｐ．９９１−１００８（２００３）、Ｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９，１５４０（２００３）、Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ａｍｂｒｏｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４，８６２（２００１）、Ｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４，８５８−８６１（２００１）、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２，７３５−７３９（２００２）、Ｌａｇｏｓ  Ｑｕｉｎｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４，８５３−８５７（２００１）、およびＬａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ，ＲＮＡ，９，１７５−１７９（２００３）のような刊行物に記載されている。複数のマイクロＲＮＡも、前駆体分子内に取り込むことができる。さらに、ｍｉＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉ経路を通した内在性遺伝子の発現調節目的のため、人工ｍｉＲＮＡおよび低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を送達する輸送手段として、細胞内にｍｉＲＮＡ様ステムループを発現させることができる。本明細書で用いられる用語「シアリルラクトース成分を含む分子」は、その構造内にシアル酸成分に結合するβ−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコース成分を含むいずれかの分子を指す。好ましい実施形態によれば、β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコース成分はオリゴ糖の一部を形成し、ここでガラクトピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコース成分は、鎖の末端の２個の単糖残基を形成し得るか、または両端のさらなる単糖残基に結合し得る。ガラクトピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコース成分を含むオリゴ糖は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の単糖残基を含み得る。オリゴ糖はこのように提供されるか、またはガングリオシドの一部を形成する。
【００４４】
本明細書で用いられる用語「百分率（％）配列同一性」は、比較ウィンドウ上で最適に整列された２つの配列を比較することによって決定されるが、ここでは比較ウィンドウ内のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の断片が、２つの配列の最適なアラインメントに対する参照配列（付加および欠失を含まない）に比較して、付加または欠失（例えばギャップまたはオーバーハング）を含み得る。パーセンテージは、同一のアミノ酸残基または核酸残基が両配列に存在することによって一致する位置の数を決定することによって算出され、一致する位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージが得られる。配列を整列するためのアルゴリズムは当該技術分野において公知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎローカル相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ−Ｌｉｐｍａｎ類似性探索法、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行、または用手でのアラインメントおよび目視での検査によって実行できる。Ｓｍｉｔｈ  Ｔ，Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ｍ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．１９８１；２：４８２−４８９；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｓ，Ｗｕｎｓｃｈ  Ｃ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９７０；４８：４４３−４５３；Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｗ，Ｌｉｐｍａｎ  Ｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９８８；８５：２４４４−２４４８；Ｔａｔｕｓｏｖａ  Ｔ，Ｍａｄｄｅｎ  Ｔ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９９９；１７４：２４７−２５０；ｔｈｅ  ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ  ａｎｄ  ＴＦＡＳＴＡ  ｐｒｏｇｒａｍｓ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳ；Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，“Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，４ｔｈ  Ｅｄ．（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳ，１９９７）参照。
【００４５】
本明細書で互換的に用いられる用語「薬剤的に許容される担体」、「薬剤的に許容される希釈剤」、「薬剤的に許容される賦形剤」、および「薬剤的に許容されるビヒクル」は、無毒の固体、半固体、または液体の注入剤、希釈剤、カプセル用材料、もしくは従来のいずれかの製剤補助剤を指す。薬剤的に許容される担体は、レシピエントに対して用いられる投与量および濃度においては本質的に無毒であり、製剤のその他の成分に適合性である。例えば、酸化剤およびポリペプチドに対して有害であることが知られるその他の化合物は、通常ポリペプチドを含む製剤のための担体には含まれない。
【００４６】
本明細書で用いられる用語「リン脂質」は、１以上のリン酸基を含む脂質を指す。天然のリン脂質は両親媒性であり、各分子が親水性部分と疎水性部分からなる。本明細書の用語「リン脂質」には、このような化合物の薬剤的に許容される塩およびエステル誘導体が含まれる。リン脂質がグリセロール骨格およびスフィンゴシンを含む脂質であるスフィンゴ脂質を有有する際には、リン脂質はホスホグリセリド（すなわちグリセロリン脂質）中のアルコールの型に従って分類できる。生体膜中には、両方のクラスが存在する。ホスホグリセリドは、天然に最も豊富に見出されるリン脂質のクラスであり、ホスファチジルコリン（例えばレシチン）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、およびカルジオリピンが含まれるが、これらに限定されない。ホスホグリセリドのそれぞれの型における構造の多様性は、鎖長および脂肪酸エステル基の飽和度の可変性によるものである。
【００４７】
本明細書で用いられる用語「プロテアーゼ阻害剤」は、ウイルスのポリタンパク質前駆体（例えばウイルスのＧＡＧおよびＧＡＧ  Ｐｏｌポリタンパク質）を、感染性のＨＩＶ−１に見出される個々の機能的タンパク質へとタンパク質分解性に切断するために必用な酵素である、ＨＩＶ−１プロテアーゼを指す。
【００４８】
本明細書で用いられる用語「レトロウイルス」は、そのＲＮＡゲノムからＤＮＡを産生する逆転写酵素を介して宿主細胞内で複製するＲＮＡウイルスであることにより特徴付けられる、レトロウイルス科のファミリーに属するウイルスを指す。
【００４９】
本明細書で用いられる用語「逆転写酵素阻害剤」は、ウイルスのゲノムＨＩＶ−１  ＲＮＡのプロウイルスのＨＩＶ−１  ＤＮＡへの変換を触媒する酵素である、ＨＩＶ−１逆転写酵素の活性を阻害するいずれかの化合物を指す。
【００５０】
本明細書で用いられる用語「リボザイム」は、ＤＮＡ、またはさらに典型的にはＲＮＡの特定の塩基配列をターゲティングし、切断することのできる、ＲＮＡに基づいた酵素を指す。
【００５１】
本明細書で用いられる「ｓｈＲＮＡ」、または「低分子ヘアピンＲＮＡ」（ステムループとも称される）は、ｓｉＲＮＡの１つの型である。一つの実施形態によればこれらのｓｈＲＮＡは、短い、例えば約１９ないし約２５ヌクレオチドのアンチセンス鎖と、それに続く約５ないし約９ヌクレオチドのヌクレオチドループおよび相似性のセンス鎖から構成される。あるいは、センス鎖はヌクレオチドループ構造の前に置かれ、アンチセンス鎖がそれに続いてもよい。
【００５２】
本明細書で用いられる「ｓｉＲＮＡ」は、ｓｉＲＮＡが存在するかまたは発現する同じ細胞に標的遺伝子であるｓＥＨが存在するかまたは発現する際に、遺伝子、すなわち標的遺伝子の発現を低下または阻害する能力をもつ二重鎖ＲＮＡを形成する核酸を意味する。二重鎖ＲＮＡであるｓｉＲＮＡは、相補性鎖によって形成され得る。一つの実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、二重鎖ｓｉＲＮＡを形成できる核酸を指す。ｓｉＲＮＡの配列は完全長の標的遺伝子、またはそのサブ配列に対応し得る。典型的には、ｓｉＲＮＡは少なくとも約１５〜５０ヌクレオチドの長さである（例えば二重鎖ｓｉＲＮＡの各相補性配列は約１５〜５０ヌクレオチドの長さであり、二重鎖ｓｉＲＮＡは約１５〜５０塩基対の長さ、好ましくは約１９〜３０塩基ヌクレオチド、好ましくは約２０〜２５ヌクレオチドの長さ、例えば２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドの長さである）。本明細書で互換的に用いられる用語「シアロアドヘシン」、「シアル酸結合Ｉｇ様レクチン１」、「シグレック１」、ＣＤ１６９は、シアル酸に結合して、高度に保存されたアルギニン残基とシアル酸のカルボキシレート基の間に塩橋を形成する、１７の免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインから構成されるＩ型レクチンを指す。Ｍａｙ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １９９８；１：７１９−７２８参照。本発明に従った使用に適したシアロアドヘシン変異体には、ヒトシアロアドヘシン（アクセッション番号Ｑ９ＢＺＺ２によりＵｎｉＰｒｏｔデータベースに記載）、ブタシアロアドヘシン（アクセッション番号Ａ７ＬＣＪ３によりＵｎｉＰｒｏｔデータベースに記載）、およびマウスシアロアドヘシン（アクセッション番号Ｑ６２２３０によりＵｎｉＰｒｏｔデータベースに記載）が含まれる。
【００５３】
本明細書で用いられる用語「シアロアドヘシン阻害剤」は、シアロアドヘシンの濃度および／または活性の低下をもたらす、いずれかの分子を指す。阻害剤には、シアロアドヘシンタンパク質の量を減少させる分子、およびシアロアドヘシンをコードするｍＲＮＡの量を減少させる分子が含まれるが、これらに限定されない。
【００５４】
本明細書で用いられる用語「シアリルラクトース」は、シアル酸成分に結合したラクトース成分（β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコース）を含む分子を指す。シアル酸は、シアル酸における可能な位置のいずれか、およびラクトース分子における可能な位置のいずれかを介して、ラクトースに結合してよい。好ましい実施形態によれば、シアル酸は、シアル酸の２位の水酸基によってラクトースに結合する（シアル酸構造の番号付けはカルボン酸塩の炭素から始まり、鎖に沿って進む）。別の好ましい実施形態によれば、シアル酸は、ラクトース分子の３位または６位の水酸基によってラクトースに結合する。好ましい実施形態によれば、「シアリルラクトース」はα２，３−シアリル−ラクトース、またはα２，６−シアリル−ラクトースである。シアリルラクトースは、真核生物または原核生物に由来してよい。好ましくは、シアリルラクトースは真核生物に由来する。真核細胞または原核細胞は、病原性または非病原性であってよい。
【００５５】
本明細書で用いられる用語「被験体」には、抗原提示細胞を有することが示されるかまたは予想される、全ての動物が含まれることが意図される。特定の実施形態によれば、被験体は哺乳類、ヒトもしくは非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、雌ウシ、その他の家畜、またはげっ歯類（例えばマウス、ラット、モルモット）である。用語「被験体」および「個体」は、本明細書では互換的に用いられる。
【００５６】
本明細書で用いられる用語「治療」は、本明細書に記載されるように、病態への感受性を終結、阻止、寛解、または減少させることを目的とした、治療法のいずれかの型を指す。好ましい実施形態によれば、治療との用語は、本明細書で定義される疾患または状態の予防的な治療（すなわち病態への感受性を減少させるための治療法）に関する。したがって、「治療」、「治療する」、およびそれらと同等な用語は、ヒトを含む哺乳類における病的状態または疾患に対するいずれかの治療において、望ましい薬理学的、または生理学的効果を得ることを指す。該効果は、疾患もしくはその症状を完全または部分的に予防する点で予防的であってよく、かつ／または、疾患および／または疾患に起因する有害作用を部分的または完全に治癒させる点で治療的であってよい。すなわち「治療」には、（１）被験体における疾患の発生または再発を予防すること、（２）例えば疾患の発生を抑止するように、疾患を妨げること、（３）例えば、失われ、欠損したか、もしくは欠陥のある機能を回復させるかまたは修復することによって、または非効率的な過程を刺激することによって疾患またはその症状を後退させることで、ホストがもはや疾患またはその症状を患うことのないように、疾患もしくは少なくともそれに付随する症状を停止または終結させること、または（４）疾患もしくはそれに付随する症状を、軽減、緩和、または寛解することが含まれ、ここで、寛解する、は、少なくとも炎症、疼痛、または免疫不全のようなパラメータの規模を縮小させることを指す、広い意味で用いられる。
【００５７】
本明細書で用いられる用語「ワクチン」および「ワクチン組成物」は、脊椎動物に投与して防御免疫反応を誘導するために適した形態である、本発明による複合体または組成物を含有する製剤を指す。該複合体または組成物は、感染を予防もしくは寛解させるため、または感染の少なくとも１の症状を減少させるため、または本発明の複合体または組成物の、別の用量による効力を増大させるための、免疫の誘導に十分なものである。
【００５８】
本明細書で用いられる用語「膣クリーム」は、膣路への投与に適した半固体の製剤を指す。膣クリームを調製するためには、当該技術分野において公知である様々なクラスの賦形剤またはビヒクルを用いることができる。賦形剤は、製剤成分に有害な影響を与えない、天然または合成の材料を含む。限定はされないが、本明細書で用いられる適切な担体としては、精製水、白色軟パラフィン、粘膜付着性ポリマー、流動パラフィン、ポリソルベート６０、ステアリン酸ソルビタン、シリコーン、ワックス、石油、ゼリー、ポリエチレングリコール、およびその他の様々な材料が、使用する製剤の特異的な型に応じて挙げられる。
【００５９】
本明細書で用いられる用語「発現ベクター」は、ベクター上の転写調節配列に連結された配列からのＲＮＡまたはポリペプチドの発現を導くベクターを指す。発現される配列はしばしば細胞に対して異種性であるが、必ずしもそうではない。発現ベクターは追加のエレメントを含んでもよく、例えば発現ベクターが２つの複製系を有することで、これを２つの生物内で、例えば発現のためにヒト細胞内で、かつクローニングおよび増幅のために原核生物ホスト内で維持することができる。
【００６０】
本明細書で用いられる用語「ウイルス侵入の阻害剤」は、ウイルスの細胞内への侵入を妨げることのできる、いずれかの化合物を指す。
【００６１】
本明細書で用いられる用語「ウイルス性の免疫原」は、本発明の不活化方法によって得た、不活化されたＨＩＶの全ウイルス粒子を指す。
【００６２】
２．シアロアドヘシンとシアリルラクトースの相互作用に対する阻害剤を用いた、本発明の治療法
本発明は、成熟樹状細胞（ｍＤＣ）によるＨＩＶ−１の取り込みには、ＨＩＶ−１の膜に含まれるガングリオシドが必要であることを開示する。特に、ｍＤＣによる取り込みの決定因子成分として、特定のウイルスガングリオシドに存在するシアリルラクトース分子が同定された。加えて本発明は、ＤＣのような幾つかの免疫細胞に存在する細胞接着タンパク質であるシアロアドヘシン（ＣＤ１６９、シグレック１）が、ＨＩＶ−１表面のシアリルラクトース分子に付着することで、ｍＤＣによるウイルスの取り込みが可能になることを開示する。したがって、シアロアドヘシンとシアリルラクトースの相互作用が、ＨＩＶ−１のｍＤＣ内への侵入を可能にするものである。その結果、ｍＤＣによるＣＤ４＋Ｔ細胞のトランス感染を遮断することでＨＩＶの拡散を阻止するために、この相互作用の阻害を利用することができる。エンベロープウイルスは、感染細胞の膜からの出芽によってそのエンベロープを獲得するため、ウイルスエンベロープの組成は、ウイルスが出芽した細胞の組成を反映し得る。生体膜にはガングリオシドが含まれることから、ウイルスエンベロープにもガングリオシドが含まれることが予想される。その上、ＨＩＶ−１およびその他の幾つかのウイルス（例えばＳＦＶ、ＶＳＶ、ＭｕＬＶ）の膜内には、ガングリオシドＧＭ３が既に検出された。Ｃｈａｎ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００８；８２：１１２２８−１１２３８、およびＫａｌｖｏｄｏｖａ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００９；８３：７９９６−８００３参照。したがって、本発明において同定した、ｍＤＣによるＨＩＶの取り込みの機序は、どのようなエンベロープウイルスの取り込みにも関連し得るため、シアロアドヘシンとシアリルラクトースの相互作用に対する阻害剤の使用は、どのようなエンベロープウイルスによる感染の予防にも有用であり得る。このように、第１の態様によれば、本発明は、エンベロープウイルスによって引き起こされる感染に関連する疾病の治療または予防に使用するための、シアロアドヘシンとシアリルラクトースの相互作用に対する阻害剤に関する。
【００６３】
別の実施形態によれば、本発明は、エンベロープウイルスによって引き起こされる感染に関連する疾病を治療する薬剤の調製のための、シアロアドヘシンとシアリルラクトースの相互作用に対する阻害剤の使用に関する。
【００６４】
別の態様によれば、本発明は、エンベロープウイルスによって被験体に引き起こされる感染に関連する疾病を、該被験体の必要に応じて治療または予防するための方法であって、シアロアドヘシンとシアリルラクトースの相互作用に対する阻害剤を前記被験体に投与することを含む方法に関する。
【００６５】
本発明における使用に適した阻害剤は、シアロアドヘシンとシアリルラクトースの相互作用を検出するための既知のいずれかのアッセイを用いて、またはシアリルラクトースを含有するその他のいずれかの化合物を用いて同定できる。例えば、本発明に従って使用するための阻害剤は、本発明の実施例５に記載のアッセイを用いて同定できるが、このアッセイは、その構造内にシアリルラクトースを含有する脂質を含む大型の単層小胞を有する成熟樹状細胞によって行われる捕捉に対する、該阻害剤の阻害能の決定に基づくものである。その構造内にシアリルラクトースを含有し、大型の単層小胞内に取り込まれ得る脂質としては、ＧＭ１、ＧＭ２、ＧＭ３、ＧＤ１ｂ、およびＧＴ１ｂのような、シアリルラクトース成分を含有するモノ−、ジ−、およびトリシアリルガングリオシドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
本発明に従った使用に適する阻害剤としては、シアリルラクトース、シアリルラクトース成分を含む分子、抗シアロアドヘシン抗体、抗シアリルラクトース抗体、およびシアリルラクトース成分を含む分子を含む小胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
好ましい実施形態によれば、本発明に従って使用する阻害剤はシアリルラクトースである。
【００６８】
好ましい実施形態によれば、シアリルラクトース成分を含む分子は、４個未満のシアル酸を有するガングリオシドである。
【００６９】
シアロアドヘシンおよびシアリルラクトース間相互作用阻害剤として好適に用いられるガングリオシドを表１に示す。
【００７０】
【表１】
2015500854.tif 000003
【００７１】
本発明はまた、骨格鎖、特にセラミド骨格鎖に対して以下の官能基のうちの１以上が置換または付加される、ガングリオシド誘導体の使用も企図される：
１）アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアリールラジカルに結合したハライド原子、
２）アルコール基（一級、二級、または三級）、
３）エーテル基、
４）カルボニル官能基（例えばアルデヒドまたはケトン）、
５）カルボン酸基、
６）カルボン酸無水物基、
７）カルバモイル基、
８）ハロホルミル基、
９）シアノ基、ラクトン基を含むエステル基
１０）ベンジル、フェニル、トシル、トリル、またはスルホニル基、
１１）アミノ基（一級、二級、または三級）、
１２）イソシアネート、シアネート、チオイソシアネート、チオシアネート、カーバメート、または
１３）アジドまたはジアゾ基。
【００７２】
別の実施形態によれば、「シアロアドヘシンとシアリルラクトースの相互作用に対する阻害剤」は、シアロアドヘシンまたはシアリルラクトースに特異的な抗体である。
【００７３】
本発明には上述した異なる型の抗体断片の使用もまた含まれるが、これらの断片には、シアロアドヘシンに結合し、シアロアドヘシンとシアリルラクトースを含有する分子との相互作用を阻止する能力が実質的に保存されている。用語「抗体断片」には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、およびナノボディのような抗体断片が含まれる。
【００７４】
別の実施形態によれば、シアロアドヘシンとシアリルラクトースの相互作用に対する阻害剤は、特異的な抗シアロアドヘシン抗体である７Ｄ２（Ａｂｃａｍより入手可能、カタログ番号：ａｂ１８６１９）、またはその断片である。別の実施形態によれば、シアロアドヘシンとシアリルラクトースの相互作用に対する阻害剤は、特異的な抗シアロアドヘシン抗体である７−２３９（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅより入手可能、カタログ番号：１２−１６９９−４１）、またはその断片である。
【００７５】
別の実施形態によれば、シアロアドヘシンとシアリルラクトースの相互作用に対する阻害剤は、シアリルラクトース結合分子である。このタイプの分子は、エンベロープウイルスの表面に見出されるシアリルラクトースに結合して、そのシアロアドヘシンとの相互作用を阻止できる。適切なシアリルラクトース結合分子としては、シアリルラクトース結合レクチンおよび抗シアリルラクトース抗体が挙げられるが、これらに限定されない。適切なシアリルラクトース結合レクチンとしては、シアロアドヘシンまたはその細胞外ドメイン、セイヨウニワトコ（エルダーベリー）樹皮レクチン（α２，６−結合を有するシアリルラクトースに特異的）、イヌエンジュレクチン（α２，３−シアリル結合を有するシアリルラクトースに特異的）、およびコレラ菌ノイラミニダーゼまたはそのレクチン様ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７６】
別の実施形態によれば、シアロアドヘシンとシアリルラクトースの相互作用に対する阻害剤は、シアリルラクトース成分を含む分子を含む小胞である。
【００７７】
一つの実施形態によれば、小胞はリポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子である。一つの実施形態によれば、小胞はリポソームである。リポソームは、主に脂質二重層から構成され得る人工的に調製された小胞であり、栄養素および医薬製剤を投与するための送達手段として使用され得る。リポソームは異なる大きさであってよく、例えば、直径数百ナノメートルあってよく、かつ狭い水性の区画で区切られた一連の同心円状の二重層を含んでよい多重膜小胞（ＭＬＶ）、直径５０ｎｍ未満であってよい小型単層小胞（ＳＵＶ）、および直径５０ないし５００ｎｍであってよい大型単層小胞（ＬＵＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。リポソームの設計には、不健全な組織へのリポソームの付着を改善するため、または限定はされないが、エンドサイトーシスのような現象を活性化させるため、オプソニンまたはリガンドが含まれてよいが、これらに限定されない。医薬製剤の送達を改善するため、リポソームのｐＨは低いかまたは高くてもよい。好ましい実施形態によれば、小胞は大型単層小胞である。
【００７８】
ＭＬＶは、溶媒の注入、脂質の水和、逆相蒸発、凍結乾燥、または凍結と融解の繰り返しによって調製できる。ＳＵＶまたはＬＵＶは、例えば超音波処理によって、規定の孔径を有するポリカーボネートフィルターを通した押出によって、フレンチプレス細胞破砕器を用いて、すなわちＭＬＶを高圧下で小さな開口部に通過させることによって、またはエーテルもしくはアルコールのような溶媒を用いた溶媒注入法によって調製されてよい。形成され得るその他の型の小胞としては、単層小胞（ＵＬＶ）、大型単層小胞（ＬＵＶ）；透析、カラムクロマトグラフィー、バイオビーズＳＭ−２、逆相蒸発（ＲＥＶ）により溶媒除去を行ったかもしくは行わずに調製した、安定な多層小胞（ＳＰＬＶ）、少層小胞（ＯＬＶ）；脂質膜を適切な塩（例えば硫酸アンモニウム）の水溶液と共にボルテックスする工程、得られた懸濁液を均質化して、小型単層小胞（ＳＵＶ）の懸濁液を形成する工程、およびＳＵＶの前記懸濁液を液体窒素中で、次に水中で繰り返し凍結および融解してＭＷを形成する工程によって調製した、直径が少なくとも１ミクロンの、高圧押出により形成した中型単層小胞、または巨大多小胞（ＭＷまたはＧＭＷ、米国特許第６，１６２，４６２号）リポソームが挙げられる。リポソームを調製するためのこれらの方法、およびその他の方法は全て当該技術分野において公知である。
【００７９】
本発明に従った適切な小胞は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（以下「ＤＯＰＥ」と称する）、パルミトイルオレオイルグリセロホスホコリン（以下「ＰＯＰＣ」と称する）、コレステロール（以下「ＣＨＯＬ」と称する）、Ｏ，Ｏ’−ジテトラデカノイル−Ｎ−（ａ−トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド（以下「ＤＣ−６−１４」と称する）、水素化精製卵黄ホスファチジルコリン、水素化精製大豆ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、および１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリンからなる群から選択される、少なくとも１のリン脂質からなる１以上の膜を含む。好ましいリポソームは、ＰＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＣＨＯＬ、およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）を含むＬＵＶである。本発明に従った、ＬＵＶ中のＰＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＣＨＯＬ、ＳＭ、およびシアリルラクトース含有成分の含有量の比（モル比）は、ＰＯＰＣ：ＤＰＰＣ：ＣＨＯＬ：ＳＭ：シアリルラクトース含有成分＝２５：１６：１０：４５：４である。本発明で使用するための小胞に取り込むことのできるシアリルラクトース成分を含む適切な分子としては、表１に示したガングリオシドおよびその誘導体のいずれをも含む、上述した分子のいずれもが挙げられる。幾つかの実施形態によれば、その構造内にシアリルラクトースを含有し、ＬＵＶ内に取り込まれ得る分子としては、ＧＭ１、ＧＭ２、ＧＭ３、ＧＤ１ｂ、およびＧＴ１ｂのような、シアリルラクトース成分を含有するモノ−、ジ−、およびトリシアリルガングリオシドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
一つの実施形態によれば、エンベロープウイルスにより引き起こされる感染に関連する疾病は、Ｉ型フィロウイルス科のウイルスにより引き起こされる疾病である。Ｉ型フィロウイルス科のウイルスは、一本鎖で、かつ非分節（−）のセンスＲＮＡゲノムを有し、ヒトおよび非ヒト霊長類に重篤な出血熱を引き起こす。幾つかの態様によれば、フィロウイルス科のウイルスはエボラウイルス、例えばエボラウイルスのコートジボワール（ＣＩ）、スーダン（Ｓ）、ザイール（Ｚ）、またはレストン（Ｒ）種である。さらなる態様によれば、フィロウイルス科のウイルスはマールブルグウイルスである。
【００８１】
別の実施形態によれば、エンベロープウイルスにより引き起こされる感染に関連する疾病は、オルトミクソウイルス科のウイルス、例えばインフルエンザウイルス、ソゴトウイルス、ドーリウイルス、または伝染性サケ貧血ウイルスにより引き起こされる疾病である。例えば幾つかの態様によれば、本明細書で説明される方法は、ヒト被験体のＡ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、またはＣ型インフルエンザウイルスによる感染を治療もしくは予防するために用いられる。幾つかの態様によれば、Ａ型インフルエンザウイルスは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、またはＨ５Ｎ１の亜型である。
【００８２】
別の実施形態によれば、エンベロープウイルスにより引き起こされる感染に関連する疾病は、パラミクソウイルス科のウイルス、例えばパラインフルエンザウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、センダイウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ムンプスウイルス、風疹（麻疹）ウイルス、ヘンドラウイルス、ニパーウイルス、トリニューモウイルス、またはイヌジステンパーウイルスにより引き起こされる疾病である。
【００８３】
別の実施形態によれば、エンベロープウイルスにより引き起こされる感染に関連する疾病は、ラブドウイルス科のウイルス、例えば狂犬病ウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、モコラウイルス、ドゥベンヘイジウイルス、ヨーロッパコウモリウイルス、サケ伝染性造血器壊死症ウイルス、ウイルス性出血性敗血症ウイルス、コイ春ウイルス血症ウイルス、またはスネークヘッドラブドウイルスにより引き起こされる疾病である。
【００８４】
別の実施形態によれば、エンベロープウイルスにより引き起こされる感染に関連する疾病は、ボルナウイルス科のウイルス、例えばボルナ病ウイルスにより引き起こされる疾病である。
【００８５】
別の実施形態によれば、エンベロープウイルスにより引き起こされる感染に関連する疾病は、ブニヤウイルス科のウイルス、例えばブニヤンベラウイルス、ハンタンウイルス、クリミア・コンゴウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、またはサシチョウバエ熱ウイルスにより引き起こされる疾病である。
【００８６】
別の実施形態によれば、エンベロープウイルスにより引き起こされる感染に関連する疾病は、アレナウイルス科のウイルス、例えばラッサ熱ウイルス、イッピーウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、モバラウイルス、モペイアウイルスのような旧世界アレナウイルス、または、フニンウイルス（アルゼンチン出血熱）、サビアウイルス（ブラジル出血熱）、アマパリウイルス、フレクサルウイルス、グアナリトウイルス（ベネズエラ出血熱）、マチュポウイルス（ボリビア出血熱）、ラチノウイルス、オリベロスウイルス、パラナウイルス、ピチンデウイルス、ピリタルウイルス、タカリベウイルス、タミアミウイルス、もしくはホワイトウォーターアロヨウイルスのような新世界アレナウイルスにより引き起こされる疾病である。幾つかの態様によれば、アレナウイルス科のウイルスは、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、ラッサ熱ウイルス、フニンウイルス、マチュポウイルス、サビアウイルス、またはグアナリトウイルスである。
【００８７】
別の実施形態によれば、エンベロープウイルスにより引き起こされる感染に関連する疾病は、アルボウイルスにより引き起こされる疾病である。アルボウイルスは、主に節足動物の媒介動物（例えば蚊、サシチョウバエ、ノミ、ダニ、シラミ）によって伝染されるエンベロープＲＮＡウイルスの、４００を超える大きな群から構成される。幾つかの態様によれば、アルボウイルスは、アルファウイルス（例えばベネズエラウマ脳炎ウイルス、またはシンドビスウイルス）、またはルビウイルス（例えば風疹ウイルス）のようなトガウイルス科のウイルスである。例えば幾つかの態様によれば、本明細書で説明する化合物は、先天性風疹症候群（ＣＲＳ）、ならびに低出生体重、難聴、および流産のような、それに関連する症状を治療または予防するため、妊娠中の被験体に投与される。
【００８８】
別の実施形態によれば、エンベロープウイルスにより引き起こされる感染に関連する疾病は、フラビウイルス科のウイルス、例えばフラビウイルス、ペスチウイルス、ヘパシウイルス、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、または日本脳炎（ＪＥ）ウイルスにより引き起こされる疾病である。
【００８９】
別の実施形態によれば、エンベロープウイルスにより引き起こされる感染に関連する疾病は、Ｃ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎様ウイルスのようなヘパシウイルスにより引き起こされる疾病である。
【００９０】
別の実施形態によれば、エンベロープウイルスにより引き起こされる感染に関連する疾病は、ヘンドラウイルスまたはニパーウイルスのようなヘニパウイルスにより引き起こされる疾病である。
【００９１】
別の実施形態によれば、エンベロープウイルスにより引き起こされる感染に関連する疾病は、ブニヤウイルス科の（−）センスＲＮＡウイルス、例えばオルソブニヤウイルス、ハンタウイルス、フレボウイルス、またはナイロウイルスにより引き起こされる疾病である。
【００９２】
別の実施形態によれば、エンベロープウイルスにより引き起こされる感染に関連する疾病は、アレナウイルス、例えばリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ラッサ熱ウイルス、フニンウイルス、マチュポウイルス、またはグアナリトウイルスにより引き起こされる疾病である。
【００９３】
幾つかの態様によれば、エンベロープウイルスにより引き起こされる感染に関連する疾病は日本脳炎ウイルス、例えばアルファイウイルス、日本脳炎ウイルス、ココベラウイルス、コウタンゴウイルス、クンジンウイルス、マレー渓谷脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ストラトフォードウイルス、ウスツウイルス、またはウエストナイルウイルスにより引き起こされる疾病である。
【００９４】
好ましい実施形態によれば、エンベロープウイルスにより引き起こされる感染に関連する疾病は、レトロウイルス科のファミリーに属するウイルスにより引き起こされる疾病である。さらに好ましい実施形態によれば、エンベロープウイルスは、オルソレトロウイルス亜科に属するウイルスである。さらになお好ましい実施形態によれば、エンベロープウイルスはレンチウイルス属に属する。さらに好ましい実施形態によれば、エンベロープウイルスは霊長類レンチウイルス、特にヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）である。
【００９５】
幾つかの態様によれば、エンベロープウイルスにより引き起こされる感染に関連する疾病は日本脳炎ウイルス、例えばアルファイウイルス、日本脳炎ウイルス、ココベラウイルス、コウタンゴウイルス、クンジンウイルス、マレー渓谷脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ストラトフォードウイルス、ウスツウイルス、またはウエストナイルウイルスにより引き起こされる疾病である。
【００９６】
好ましい実施形態によれば、エンベロープウイルスにより引き起こされる感染に関連する疾病は、レトロウイルス科のファミリーに属するウイルスにより引き起こされる疾病である。さらに好ましい実施形態によれば、エンベロープウイルスは、オルソレトロウイルス亜科に属するウイルスである。さらになお好ましい実施形態によれば、エンベロープウイルスはレンチウイルス属に属する。さらに好ましい実施形態によれば、エンベロープウイルスは霊長類レンチウイルス、特にヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）である。
【００９７】
レトロウイルスの例としては、以下のウイルス属が挙げられるが、これらに限定されない：アルファレトロウイルス（例えばトリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ））、ベータレトロウイルス（例えばマウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ＳＲＶ、ＨＥＲＶ−Ｋ、およびＪＲＳＶ）、ガンマレトロウイルス（例えばマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ＧＡＬＶ、ＰＥＲＶ、およびＨＥＲＶ−Ｗ）、デルタレトロウイルス（例えばウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、および癌の原因となるヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−ｌｌ））、イプシロンレトロウイルス（例えばウォールアイ皮膚肉腫ウイルス（ＷＤＳＶ）およびＳｎＲＶ）、レンチウイルス（例えばヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ−２）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶｍａｃおよびＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ＥＩＡＶ、およびＭＶＶ）、およびスプーマウイルス（例えばサル泡沫状ウイルス（ＳＦＶｃｐｚおよびＳＦＶａｇｍ）、ＦＦＶ、およびＢＦＶ）。
【００９８】
好ましい実施形態によれば、エンベロープウイルスは、前記エンベロープウイルスのエンベロープ中の少なくとも幾らかの脂質がシアリルラクトースを含むウイルスである。さらに好ましい実施形態によれば、エンベロープウイルスは、ウイルスエンベロープ中にガングリオシドを含み、このガングリオシドは少なくとも１のシアリルラクトース成分を含有する。さらになお好ましい実施形態によれば、このガングリオシドは４個未満のシアリルラクトース分子を含有する。さらに別の実施形態によれば、ウイルスはそのエンベロープ中に、表１に示すガングリオシドを１以上含有する。
【００９９】
好ましい実施形態によれば、「エンベロープウイルスにより引き起こされる感染に関連する疾病」は、ＨＩＶウイルスに関連する疾病である。
【０１００】
本発明はさらに、ＨＩＶ感染に関連する症状を予防するか、または減少させることに関する。これらの症状としては、ＨＩＶ感染の軽度の症候性段階に関連する症状、例えば、帯状疱疹、皮膚発疹および爪感染、口の痛み、鼻および喉の反復性の感染、ならびに体重減少が挙げられる。加えて、ＨＩＶ感染の主要な症候性段階に関連するさらなる症状として、例えば、口腔および膣鵞口瘡（カンジダ）、持続性の下痢、体重減少、持続性の咳および結核の再活動化、またはヘルペス（単純ヘルペス）のような反復性のヘルペス感染も挙げられる。本発明に従って治療可能な末期ＡＩＤＳのその他の症状としては、例えば、下痢、悪心および嘔吐、鵞口瘡および口内炎、持続性かつ反復性の膣感染症および子宮頸癌、持続性全身性リンパ節腫脹（ＰＧＬ）、重篤な皮膚感染症、いぼおよび白癬、呼吸器感染症、肺炎、特にニューモシスチス・カリニ肺炎（ＰＣＰ）、帯状疱疹（ｈｅｒｐｅｓ  ｚｏｓｔｅｒ）（すなわち帯状疱疹（ｓｈｉｎｇｌｅｓ））、疼痛、しびれ、または手足の「ピリピリ感」のような神経系の問題、神経性の異常、カポジ肉腫、リンパ腫、結核、またはその他の日和見感染症が挙げられる。
【０１０１】
本発明の阻害剤の有益な効果としては、例えば、ＨＩＶに曝露された個体の初感染を予防または遅延させること、ＨＩＶに感染した個体のウイルス担持を減少させること、ＨＩＶ感染の無症状期を持続させること、抗レトロウイルス療法（ＡＲＴ）によって減少したＨＩＶ感染患者のウイルス量を低く維持すること、薬物を投与していない患者およびＡＲＴにより治療した患者において、ＨＩＶ−１特異的および非特異的な両方のＣＤ４  Ｔ細胞数を増加させること、またはＣＤ４  Ｔ細胞数の減少を小さくすること、ＡＩＤＳを患う個体の全体的な健康状態または生活の質を上げること、およびＡＩＤＳを患う個体の平均余命を伸ばすことが挙げられる。治療がＡＩＤＳの抑制に有効か否かを決定するため、医師は、免疫の効果を、治療前の患者の状態もしくは治療を受けていない患者に予想される状態と比較することができるか、または治験において、ワクチンによる治療を受けた者と受けていない者とを比較することができる。
【０１０２】
本発明の方法において、本発明の化合物を１以上の追加の抗ＨＩＶ剤と併用することは有用であり得る。これらの追加化合物には、本発明の化合物、または例えばＨＩＶ感染の症状を治療、予防、または減少することが知られている市販の化合物が含まれてよい。
【０１０３】
限定はされないが、例として本発明の化合物は、以下の抗ＨｌＶ剤の１以上と併用してもよい。
１）併用薬剤：エファビレンツ、エムトリシタビン、またはテノホビルジソプロキシルフマル酸塩（Ａｔｒｉｐｌａ（登録商標）／ＢＭＳ、Ｇｉｌｅａｄ）；ラミブジンまたはジドブジン（コンビビル（登録商標）／ＧＳＫ）；アバカビルまたはラミブジン（エプジコム（登録商標）／ＧＳＫ）；アバカビル、ラミブジン、またはジドブジン（トリジビル（登録商標）／ＧＳＫ）；エムトリシタビン、テノホビルジソプロキシルフマル酸塩（ツルバダ（登録商標）／Ｇｉｌｅａｄ）。
２）侵入および融合阻害剤：マラビロク（セルセントリ（登録商標）、シーエルセントリ（登録商標）／Ｐｆｉｚｅｒ）；ペンタフシドまたはエンフビルチド（フゼオン（登録商標）／Ｒｏｃｈｅ、Ｔｒｉｍｅｒｉｓ）。幾つかの実施形態によれば、ウイルスの侵入阻害剤は融合阻害剤、ＣＤ４受容体結合阻害剤、ＣＤ４模倣物、またはｇｐ１２０模倣物である。幾つかのさらなる実施形態によれば、ウイルスの侵入阻害剤はｇｐ４１アンタゴニスト、ＣＤ４モノクローナル抗体、または、例えばジンクフィンガー阻害剤のようなＣＣＲ５アンタゴニストのサブクラスを含む、ＣＣＲ５アンタゴニストである。さらに別の実施形態によれば、ウイルスの侵入阻害剤はＣＸＣＲ４共受容体アンタゴニストである。
３）インテグラーゼ阻害剤：ラルテグラビルまたはＭＫ−０５１８（アイセントレス（登録商標）／Ｍｅｒｃｋ）。
４）逆転写酵素阻害剤：本発明に従った組成物における使用に適した逆転写酵素阻害剤は、エムトリシタビン、カプラビリン、テノホビル、ラミブジン、ザルシタビン、デラビルジン、ネビラピン、ジダノシン、スタブジン、アバカビル、アロブジン、ジドブジン、エムトリシタビンのラセミ体、アプリシタビン、エミビリン、エルブシタビン、ＴＭＣ−２７８、ＤＰＣ−０８３、アムドキソビル、（−）−ベータ−Ｄ−２，６−ジアミノ−プリンジオキソラン、ＭＩＶ−２１０（ＦＬＧ）、ＤＦＣ（デクセルブシタビン）、ジオキソランチミジン、カラノイドＡ、エトラビリン（ＴＭＣ−１２５）、Ｌ６９７６３９、アテビルジン（Ｕ８７２０１Ｅ）、ＭＩＶ−１５０、ＧＳＫ−６９５６３４、ＧＳＫ−６７８２４８、ＴＭＣ−２７８、ＫＰ１４６１、ＫＰ−１２１２、ロデノシン（ＦｄｄＡ）、５−［（３，５−ジクロロフェニル）チオ］−４−イソプロピル−ｌ−（４−ピリジルメチル）イミダゾール−２−メタノールカルバミン酸、（−）−Ｉ２−Ｄ−２，６−ジアミノプリンジオキソラン、ＡＶＸ−７５４、ＢＣＨ−１３５２０、ＢＭＳ−５６１９０（（４Ｓ）−６−クロロ−４−［（ｌＥ）−シクロプロピルエテニル］−３，−４−ジヒドロ−４−トリフルオロメチル−２（ｌＨ）−キナゾリノン）、ＴＭＣ−１２０、およびＬ６９７６３９からなる群から選択される１以上の化合物であり、該化合物を併用療法に用いる場合には、該化合物はＨＩＶの治療に有効な量で含まれる。
５）プロテアーゼ阻害剤：本発明に従ったｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドとの併用に適したプロテアーゼ阻害剤は、リトナビル、ロピナビル、サキナビル、アンプレナビル、ホスアンプレナビル、ネルフィナビル、チプラナビル、インジナビル、アタザナビル、ＴＭＣ−１２６、ダルナビル、モゼナビル（ＤＭＰ−４５０）、ＪＥ−２１４７（ＡＧ１７７６）、Ｌ−７５６４２３、ＫＮＩ−２７２、ＤＰＣ−６８１、ＤＰＣ−６８４、テリナビル（ＳＣ−５２１５１）、ＢＭＳ  １８６３１８、ドロキシナビル（ＳＣ−５５３８９ａ）、ＤＭＰ−３２３、ＫＮＩ−２２７、１−［（２−ヒドロキシエトキシ）メチル］−６−（フェニルチオ）−チミン、ＡＧ−１８５９、ＲＯ−０３３−４６４９、Ｒ−９４４、ＤＭＰ−８５０、ＤＭＰ−８５１、およびブレカナビル（ＧＷ６４０３８５）からなる群から選択される。本発明の化合物との併用に好ましいプロテアーゼ阻害剤としては、サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、ロピナビル、アタザナビル、ダルナビル、ブレカナビル、ホスアンプレナビル、およびチプラナビルが挙げられる。このような併用の特に有用なものとしては、例えば、ＡＺＴ＋３ＴＣ；ＴＤＦ＋３ＴＣ；ＴＤＦ＋ＦＴＣ；ＡＢＣ＋３ＴＣ；およびアバカビル＋３ＴＣが挙げられる。
【０１０４】
加えて、本発明に従った組成物は、ワクチン、遺伝子療法、サイトカイン、ＴＡＴ阻害剤、および免疫修飾剤からなる群から選択される抗レトロウイルス剤を、併用療法に用いた際にＨＩＶの治療に有効な量で、さらに含んでよい。
【０１０５】
加えて、本発明に従った組成物は、抗真菌薬、抗菌薬、抗悪性腫瘍薬、抗原虫薬、ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤、ＤＮＡ合成阻害剤、抗ＨＩＶ抗体、ＨＩＶアンチセンス薬、ＩＬ−２アゴニスト、α−グルコシダーゼ阻害剤、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤、アポトーシスアゴニスト、アポトーシス阻害剤、およびコリンエステラーゼ阻害剤からなる群から選択される抗感染薬をさらに含んでよく、該化合物を併用療法に用いる場合には、該化合物はＨＩＶの治療に有効な量で含まれる。
【０１０６】
加えて、本発明に従った組成物は、ペンタミジンイセチオン酸塩、自己ＣＤ８＋の点滴、γ−インターフェロン免疫グロブリン、胸腺ペプチド、ＩＧＦ−Ｉ、抗Ｌｅｕ３Ａ、自家ワクチン接種、生物的刺激、体外光泳動、シクロスポリン、ラパマイシン、ＦＫ−５６５、ＦＫ−５０６、ＧＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、温熱療法、イソプリノシン、ｒＶＩＧ、ＨＩＶＩＧ、受動免疫療法、およびポリオワクチンによる過剰免疫からなる群から選択される免疫修飾物質をさらに含んでよく、該化合物を併用療法に用いる場合には、該化合物はＨＩＶの治療に有効な量で含まれる。
【０１０７】
本発明に従った阻害剤と抗ＨＩＶ剤との併用により、ＨＩＶ活性に相乗的効果がもたらされ得る。相乗的効果は、例えば、シグモイドＥｍａｘ、Ｌｏｅｗｅ、および半数効果方程式のような、適切な方法を用いて算出され得る。Ｈｏｌｆｏｒｄ  Ｋ，Ｓｃｈｅｉｎｅｒ  Ｌ，Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．１９８１；６：４２９−４５３，Ｌｏｅｗｅ  Ｓ，Ｍｕｉｓｃｈｎｅｋ  Ｈ，Ａｒｃｈ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９２６；１１４：３１３−３２６、およびＣｈｏｕ  Ｔ，Ｔａｌａｌａｙ  Ｃ，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇｕｌ．１９８４；２２：２７−５５）参照。上記の各方程式を実験データに適用して、対応するグラフを作成することで、薬物の併用効果を評価する助けとなるであろう。上記の方程式に対応するグラフは、それぞれ濃度効果曲線、アイソボログラム曲線、およびコンビネーションインデックス曲線である。
【０１０８】
本発明に従った阻害剤は、薬剤的に許容される担体をさらに含んでよい。適切な担体としては、水、デキストロース、グリセロール、生理食塩水、エタノール、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。担体には、製剤の有効性を増強する、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、または補助剤のような追加の薬剤を含有させることができる。補助剤は例えば、ＡｌＫ（ＳＯ４）２、ＡｌＮａ（ＳＯ４）２、ＡｌＮＨ４（ＳＯ４）、シリカ、ミョウバン、Ａｌ（ＯＨ）３、Ｃａ３（ＰＯ４）２、カオリン、炭素、水酸化アルミニウム、ムラミルジペプチド、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＤＭＰ）、Ｎ−アセチル−ｎｏｒ−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ  １１６８７、ｎｏｒ−ＭＤＰとも称される）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ  １９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥとも称される）、２パーセントのスクアレン／Ｔｗｅｅｎ−８０（登録商標）エマルション中のＲＩＢＩ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）、リピドＡを含む、リポ多糖およびその様々な誘導体、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント、メルクアジュバント６５、ポリヌクレオチド（例えばポリＩＣおよびポリＡＵ酸）、結核菌由来のワックスＤ、コリネバクテリウム・パルバム、百日咳菌、およびブルセラ属のファミリーに見出される物質、Ｔｉｔｅｒｍａｘ、ＩＳＣＯＭＳ、Ｑｕｉｌ  Ａ、ＡＬＵＮ、リピドＡ誘導体、コレラ毒素誘導体、ＨＳＰ誘導体、ＬＰＳ誘導体、合成ペプチド基質すなわちＧＭＤＰ、インターロイキン１、インターロイキン２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１およびＱＳ−２１、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ポリＩ：Ｃ、ならびにＧＭ−ＣＳＦからなる群から選択される。Ｈｕｎｔｅｒ  Ｒ，米国特許第５，５５４，３７２号、およびＪａｇｅｒ  Ｅ，Ｋｎｕｔｈ  Ａ，国際公開第１９９７０２８８１６号参照。
【０１０９】
本発明に従った阻害剤は筋肉内、皮下、または静脈内注射、および経口、経鼻、または肛門内投与のような、当業者に公知のいずれかの方法によって投与できる。Ｂａｎｇａ  Ａ，Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，“Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”（Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，ＰＡ，ＵＳ，１９９５）参照。阻害剤がその効果を発揮する時間を延長させるため、阻害剤は、植込錠、油性注射、または粒子状の系として提供できる。粒子状の系は、微粒子、マイクロカプセル、ミクロスフェア、ナノカプセル、または同様の粒子であってよい。上記のＢａｎｇａ，１９９５参照。合成ポリマーを基にした粒子状の担体は、制御された放出に加えて、免疫応答を増強するアジュバントとしても作用することが知られている。アルミニウム塩もまた、免疫応答を引き起こすアジュバントとして使用できる。
【０１１０】
本発明に従った阻害剤は、殺菌組成物として処方されてよい。殺菌組成物は、正確な投与量を個別に投与するために適した単位剤形として処方することができる。パルス投与については、開示する免疫原を含む免疫原組成物をボーラス投与した後、開示する免疫原を被験体に投与しない期間を経て、２回目のボーラス投与を行う。阻害剤の治療上有効な量は、単一用量として投与できるか、または複数回用量として、例えば治療期間内に毎日投与できる。特定の、限定されない例によれば、開示する免疫原を含む免疫原組成物のパルス投与は、一日の間、一週間の間、または一か月の間投与される。殺菌組成物は、効果（例えばＨＩＶ−１感染の徴候、症状、または臨床検査結果の改善）が望まれるときにはいつでも投与できる。一般に用量は、疾病の症状または徴候を、被験体に許容されない毒性をもたらすことなく治療または寛解させるために十分なものである。全身性投与または局所投与を用いることができる。
【０１１１】
治療用に有効な量は、疾病の重症度、および年齢、体重、患者の全身状態、ならびにその他の臨床的因子に依存し得る。したがって、適切な治療用投与計画の最終決定は、担当医師によって為されるであろう。典型的には、医薬組成物のｉｎ  ｓｉｔｕ投与に有用な量についての有用な指針は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで用いられる投与量によって提供され、特定の疾患を治療するために有効な投与量の決定には動物モデルが用いられてよい。Ｇｉｌｍａｎ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，“Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ‘ｓ：Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”，８ｔｈ  Ｅｄ．（Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳ，１９９０）及びＧｅｎｎａｒｏ  Ａ，Ｅｄ．，“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，１８ｔｈ  Ｅｄ．（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳ，１９９０）参照。典型的には、阻害剤の用量範囲は約０．１μｇ／ｋｇ体重ないし約１００ｍｇ／ｋｇ体重である。その他の適切な範囲には、約１μｇ／ｋｇないし１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量が含まれる。一例として、用量は約１．０μｇないし約５０ｍｇ、例えば一被験体あたり１ｍｇのペプチドのような、１μｇないし１ｍｇである。投薬スケジュールは、ペプチドに対する被験体の感受性および疾病の進行速度のような臨床的因子に依存して、毎日から一年に一回のようにほとんど投与しない場合まで変動し得る。したがって、被験体は開示する治療用分子の初回用量を投与された後、２回目の用量を（またはさらに多い用量を）ある時点で、例えば少なくとも一日後、少なくとも一週間後に投与されてよい。
【０１１２】
本明細書に開示する医薬組成物は、用量単位として調製し、投与できる。固体の用量単位としては、錠剤、カプセル、経皮送達系、および坐薬が挙げられる。治療に必要な量の投与は、個別の用量単位または幾つかのそれよりも小さな用量単位の単回投与、およびさらに分割した用量の、特定の間隔での複数回投与の両方により行うことができる。適切な単回の、または分割された用量としては、約０．０１、０．１、０．５、１、３、５、１０、１５、３０、または５０μｇ  タンパク質／ｋｇ／日が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１３】
治療への応用では、治療上有効な量の阻害剤が、ＨＩＶへの曝露もしくは感染の前または後に、被験体へ投与される。曝露前に投与する場合、治療への応用は予防的投与（例えばワクチンの形として）と称することができる。組成物の単回または複数回の投与は、被験体に必要とされ、かつ許容される投与量および頻度に応じて行われる。一つの実施形態によれば、投与はボーラスによる単回投与であるが、別の実施形態によれば、防御免疫反応のような治療上の結果が達成されるまで定期的に投与され得る。一般に用量は、疾病の症状または徴候を、被験体に許容されない毒性をもたらすことなく治療または寛解させるために十分なものである。全身性投与または局所投与を用いることができる。
【０１１４】
本発明に開示する殺菌組成物を、その他の薬剤、例えばタンパク質、ペプチド、抗体、およびその他の抗ＨＩＶ剤と共に投与することは有利な可能性がある。このような抗ＨＩＶ治療薬の例としては、アバカビル、ＡＺＴ、ジダノシン、エムトリシタビン、ラミブジン、スタブジン、テノホビル、ザルシタビン、もしくはジドブジンのようなヌクレオシド逆転写酵素阻害剤；デラビルジン、エファビレンツ、またはネビラピンのような非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤；アンプレナビル、アタザナビル、インジナビル、ロピナビル、ネルフィナビル、ホスアンプレナビル、リトナビル、サキナビル、もしくはチプラナビルのようなプロテアーゼ阻害剤；またはエンフビルチドのような融合タンパク質阻害剤が挙げられる。特定の実施形態によれば、阻害剤はその他の抗ＨＩＶ治療薬と同時に投与される。特定の実施形態によれば、免疫原性組成物はその他の抗ＨＩＶ治療薬と連続的に、例えばその他の薬剤よりも前または後に投与される。当業者は、連続的投与が、直後、または適切な期間の後、例えば数時間、数日、数週間、数か月、または数年後をも意味し得ることを承知するであろう。
【０１１５】
本発明の医薬組成物は、エアロゾル、フォーム、スプレー、ペースト、ゲル、ゼリー、クリーム、坐薬、錠剤、ペッサリー、タンポン、または膣リングのような装置を含む幾つかの形で、膣内に投与されてよい。これらは即時放出または制御された放出用の形であってよい。フォーム、クリーム、およびゲルが好ましい形である。膣内投与に適した組成物およびそれらの調製方法は当該技術分野において公知である。Ｖｉｃｋｅｒｙ  Ｂ，ｅｔａｌ．，米国特許第４，３６８，１８６号、Ｇａｚｚａｎｉ  Ｇ，米国特許第４，３７１，５１８号、Ｔｉｃｅ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，３８９，３３０号、Ｊｏｙｃｅ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，４１５，５８５号、およびＲｉｌｅｙ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，５５１，１４８号参照。
【０１１６】
特に好ましい実施形態によれば、医薬組成物は膣内へ局所投与される。典型的には、局所投与は膣性交の開始前、適切には膣性交の開始前０ないし６０分、好ましくは０ないし５分に行われる。投与は、女性の膣内および膣領域の周囲（例えば大陰唇、小陰唇、陰核のような個々の解剖学的部位）に行われ得る。
【０１１７】
当該技術分野において公知の医薬クリームは、粘調な液体、または水中油型もしくは油中水型いずれかの半固体エマルションである。クリーム基剤は水で洗い流すことができ、かつ油相、乳化剤、および水相を含む。ときおり「内」相とも称される油相は、一般にワセリン、およびセチルまたはステアリルアルコールのような脂肪アルコールから構成され；水相は、必ずしもそうではないが一般にはその容量が油相のそれを超えており、一般に保湿剤を含有する。クリーム製剤中の乳化剤は、一般に非イオン性、陰イオン性、陽イオン性、または両性の界面活性剤である。
【０１１８】
例えば適切なビヒクル基剤としては、炭化水素基剤または油性基剤、吸収性基剤、水により除去可能な基剤、および水溶性基剤が挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態によれば、ビヒクル基剤は非刺激性、非着色性、安定性、非ｐＨ依存性、および／または本発明に従った阻害剤に対して適合性である。
【０１１９】
担体が固体である、直腸内投与に適した医薬製剤が、単位用量坐薬として最も好ましく提供される。適切な担体としては、当該技術分野において通常用いられるカカオバターおよびその他の材料が挙げられる。坐薬は、有効成分を、軟化もしくは融解した単数または複数の担体と混合した後、鋳型内で冷却して形作る従来法によって形成されてよい。
【０１２０】
別の実施形態によれば、本発明は組成物の肛門内への局所投与に関する。肛門内投与に適した組成物は、膣内投与に関して上に記載したような、フォーム、クリーム、またはゼリーである。肛門内投与の場合には、肛門内全体に組成物を実質的に均一に分布させる塗布器の使用が好ましい可能性がある。例えば適切な塗布器は、通常その長さに沿って分布する穴を有する、長さ２．５ないし２５ｃｍ、好ましくは５ないし１０ｃｍの管である。
【０１２１】
別の実施形態によれば、本方法は医薬組成物の経口投与により行われてよい。適切な経口投与は、口腔洗浄薬または含嗽薬の形である組成物を投与することによって行われる。経口投与は、歯科処置の間の感染を予防することが特に好ましい。組成物の適切な投与は、歯科処置の開始直前、および処置期間を通して定期的に行われる。口中への局所投与に適した製剤としては、風味の付いた基剤、通常はスクロースおよびアカシア、またはトラガカント中に有効成分を含む舐剤；不活性の基剤、例えばゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシア中に有効成分を含むトローチ；および適切な液体担体中に有効成分を含む口腔洗浄薬が挙げられる。
【０１２２】
組成物が坐薬（膣坐薬を含む）の形である際、該坐薬は通常１ないし５グラム、好ましくは約３グラムであり、坐薬全体が投与され得ることに留意されたい。膣錠剤は、適切には１ないし５グラム、好ましくは約２グラムであり、錠剤全体が投与され得る。組成物が膣クリームである際、適切には０．１ないし２グラム、好ましくは約０．５グラムのクリームが投与され得る。組成物が水溶性の膣クリームである際、適切には０．１ないし２グラム、好ましくは約０．６グラムが投与され得る。組成物が膣スプレー・フォームである際、適切には０．１ないし２グラム、好ましくは約０．５グラムのスプレー・フォームが投与され得る。組成物が肛門クリームである際、適切には０．１ないし２グラム、好ましくは約０．５グラムのクリームが投与され得る。組成物が肛門スプレー・フォームである際、適切には０．１ないし２グラム、好ましくは約０．５グラムのスプレー・フォームが投与され得る。組成物が口腔洗浄薬または含嗽薬である際、適切には１ないし１０ｍｌ、好ましくは約５ｍｌが投与され得る。
【０１２３】
本組成物は、徐放組成物の形であってもよい。本実施形態によれば、膣または肛門に対して阻害剤の有効な濃度をもたらす速度で有効成分を放出し得る前記阻害剤が、組成物に取り込まれる。Ｌｅｗ  Ｄ，Ｅｄ．，“Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ”（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳ  １９８１），Ｐｆｉｓｔｅｒ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．１９８６；３：２２９−２３３，Ｌａｎｃｅ  Ｗ、米国特許第５，２４８，７００号、Ｂｅｈａｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，１８５，１５５号、およびＶｉｅｇａｓ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，１４３，７３１号参照。
【０１２４】
本組成物はまた、膣または肛門性交のようなあるイベントに反応して、本発明の阻害剤を放出する形であってもよい。例えば組成物は、性交の機械的行動によって破壊される、小胞すなわちリポソーム内の阻害剤を含有してもよい。リポソームを含む組成物は当該技術分野において公知である。Ｄｅａｍｅｒ  Ｄ，Ｕｓｔｅｒ  Ｐ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ：ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，Ｏｓｔｒｏ  Ｍ，Ｅｄ．，“Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ”（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳ，１９８３，ｐｐ．  ２７−５１），Ｂｒｅｉｍｅｒ  Ｄ，Ｓｐｅｉｓｅｒ  Ｐ，Ｅｄｓ．，“Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳ，１９８５，ｐｐ．３４５−３５８），Ｓｅｓｓａ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７０；２４５：３２９５−３３００，ａｎｄ  Ｊａｎｏｆｆ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，２３１，１１２号参照。
【０１２５】
本組成物を、子宮内避妊具（ＩＵＤ）、膣避妊具、膣リング、膣スポンジ、ペッサリー、またはコンドームのような物へ付随させることも、実現されるべきである。ＩＵＤまたは膣避妊具の場合、徐放または機械的放出組成物が好ましい可能性があるが、コンドームの場合には、機械的放出組成物が好ましい。
【０１２６】
別の実施形態によれば、本発明により、ＨＩＶ感染の予防に有用な新規装置が提供される。特に本装置は、適切な身体部分、または適切な身体の腔内に配置した際に阻害剤を放出するものである。したがって本発明により、阻害剤を含有するか、または阻害剤が付随するＩＵＤ、膣避妊具、膣スポンジ、ペッサリー、またはコンドームが提供される。
【０１２７】
したがって本発明に従った装置は、１以上の阻害剤を含有するＩＵＤであってよい。Ｒａｍｗｅｌｌ  Ｐ，米国特許第３，８８８，９７５号、およびＢｅｒｔｈｅｔ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，２８３，３２５号参照。この装置は、阻害化合物を含み、これを時間制御された方法で放出する膣内スポンジであってよい。Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  Ｔ，米国特許第３，９１６，８９８号、およびＢａｒｒｏｗｓ  Ｔ，米国特許第４，３６０，０１３号参照。該装置は、阻害剤を放出する膣ディスペンサーであってもよい。Ｗｏｎｇ  Ｐ，米国特許第４，９６１，９３１号参照。
【０１２８】
本装置は、阻害剤によってコートされたコンドームであってもよい。好ましい実施形態によれば、コンドームは、阻害剤と、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化メチルベンゼトニウム、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ベンザルコニウムブロミド、ノニルフェニルエーテル類、ラウリルエーテル類、およびオクトキシノール類から任意に選択される殺精子剤とを含む、潤滑剤または貫通増強剤によってコートされる。しかしながら、コンドームは適切な潤滑剤（すなわちコンドームの機械的な強度特性を損ねることなく、かつラテックスが影響を受けて多孔性となることがないもの）と共に使用することが推奨される。例えば、欧州特許出願公開第０  ４５７  １２７（Ａ）号には、コンドームのラテックスを処理するためのシリコーン油を基にした潤滑剤について記載され、欧州特許出願公開第０  ４７５  ６６４（Ａ）号には、潤滑組成物およびそのコンドームとの併用について記載され、仏国特許出願公開第２  ６６６  ５８７（Ａ）号には、ポリジメチルシロキサンを含む潤滑剤について記載される。組成物、およびその他の潤滑剤および貫通増強剤の調製については、当該技術分野において公知である。Ｃｏｐｐｅｒ  Ｅ，米国特許第４，５５７，９３４号、Ｃｏｏｐｅｒ  Ｅ，米国特許第４，９５４，４８７号；Ｊａｍｅｓ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，４９９，１５４号、およびＫｅｌｌｙ  Ｐ，米国特許第５，２０８，０３１号参照。
【０１２９】
３．シアロアドヘシンの阻害剤を用いた、本発明の治療法
本発明は、ＤＣのような幾つかの免疫系細胞の表面に存在する細胞接着タンパク質であるシアロアドヘシン（ＣＤ１６９、シグレック１）が、ＨＩＶ−１表面のシアリルラクトース分子に付着して、ｍＤＣによるウイルスの取り込みを可能にすることを開示する。したがって、細胞におけるシアロアドヘシンの発現を減少させることは、細胞へのＨＩＶ−１の侵入を阻害し、その結果、ｍＤＣによるＣＤ４＋Ｔ細胞のトランス感染を遮断してＨＩＶの拡散を阻止するために利用できる。このことは、例えば本発明の実施例７において、シアロアドヘシンに特異的なｓｈＲＮＡを用いてＤＣにおけるシアロアドヘシン発現を停止させると、シアロアドヘシン発現が劇的に減少し、かつシアリルラクトース含有ガングリオシドを含むＶＬＰの、前記細胞による捕捉が失われることによって示される。したがって別の態様によれば、本発明は、エンベロープウイルスによって引き起こされる感染に関連する疾病の治療または予防に使用するための、シアロアドヘシン阻害剤に関する。別の態様によれば、本発明は、エンベロープウイルスによって引き起こされる感染に関連する疾病を治療する薬剤の調製のための、シアロアドヘシン阻害剤の使用に関する。別の態様によれば、本発明は、エンベロープウイルスによって被験体に引き起こされる感染に関連する疾病を、該被験体の必要に応じて治療または予防するための方法であって、シアロアドヘシンの阻害剤を前記被験体に投与することを含む方法に関する。
【０１３０】
幾つかの実施形態によれば、シアロアドヘシン阻害剤は、シアロアドヘシンに特異的な干渉ＲＮＡであるか、またはこのような干渉ＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含むベクターである。
【０１３１】
幾つかの実施形態によれば、シアロアドヘシン阻害剤は、シアロアドヘシンに特異的なｓｉＲＮＡである。ｓｉＲＮＡは化学的に合成できるか、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって得ることができる。ｓｉＲＮＡは、典型的には１５ないし４０ヌクレオチドの長さのＲＮＡ二重鎖から構成され、１ないし６ヌクレオチドの、３’および／または５’オーバーハンギング領域を含み得る。オーバーハンギング領域の長さは、ｓｉＲＮＡ分子の全長には依存しない。本発明のｓｉＲＮＡは、シアロアドヘシンｍＲＮＡの予め選択された領域と実質的に相同である。前記の干渉を引き起こすために適したｓｉＲＮＡとしては、ＲＮＡにより形成されたｓｉＲＮＡ、および以下のような様々な化学修飾を含むｓｉＲＮＡが挙げられる：
−天然の結合とは異なるヌクレオチド間の結合、例えばホスホロチオエート結合を有するｓｉＲＮＡ、
−フルオロフォアのような機能的試薬を有するｓｉＲＮＡ鎖の複合体、
−様々なヒドロキシル官能基による２’位の修飾を用いた、ｓｉＲＮＡ鎖の末端、特に３’末端の修飾、
−Ｏ−アルキル化成分のような修飾された糖を２’位に有するヌクレオチド、例えば２’−Ｏ−メチルリボースｐ２’−Ｏ−フルオロリボース、
−ハロゲン化塩基（例えば５−ブロモウラシルおよび５−ヨードウラシル）、アルキル化塩基（例えば７−メチルグアノシン）のような修飾塩基を有するヌクレオチド。
【０１３２】
本発明のｓｉＲＮＡは、当業者に公知の一連の技術を用いて得ることができる。例えばｓｉＲＮＡは、従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機内で、ホスホラミダイト基で保護されたリボヌクレオシドから開始して、化学的に合成できる。
【０１３３】
別の実施形態によれば、シアロアドヘシン阻害剤はｓｈＲＮＡ（低分子ヘアピン型ＲＮＡ）である。ＲＮＡは、典型的には短いアンチセンス配列（１９ないし２５ヌクレオチド）、それに続く５ないし９ヌクレオチドのループ、それに続くセンス鎖を含む。ｓｈＲＮＡは、従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機内で、ホスホラミダイト基で保護されたリボヌクレオシドから化学的に合成できるか、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によってポリヌクレオチドから得ることができる。以前から記載されているように、ｓｈＲＮＡは、ヘアピン領域を除去してｓｉＲＮＡを生じさせるＲＮａｓｅダイサーによって細胞内で処理される。ｓｉＲＮＡの場合について以前から記載されているように、ｓｈＲＮＡもまた特徴的な化学修飾を含んでよい。
【０１３４】
別の実施形態によれば、シアロアドヘシン阻害剤はｍｉＲＮＡである。本発明での使用に適したｍｉＲＮＡは、１９ないし約２４ヌクレオチド、好ましくは２１または２２ヌクレオチドから構成される。ｍｉＲＮＡは、高度な特異性によってＲＮＡ転写物にハイブリダイズするように設計できる。ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡに対して１００％の同一性を示すか、またはただ一つの非相補性ヌクレオチドが、ｍｉＲＮＡ鎖におけるその位置に応じて阻害の程度を減少させられるのであれば、実質的な同一性（すなわち少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、またはそれを超えるミスマッチを有する）を示すように、好ましく設計される。ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの非翻訳５’領域、コード領域、または３’領域を標的とするように設計できる。
【０１３５】
ｍｉＲＮＡによる効率的なプロセシングおよび作用は、典型的には、前記ｍｉＲＮＡがＺｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（ＲＮＡ，２００３，９：１１２−１２３）によって記載されるようなある構造的要件を有する場合にのみ可能である。本発明のｍｉＲＮＡは、予め選択されたｍＲＮＡの標的配列によってステム領域が置換されたｍｉｒＲ−３０構造に好ましく基づく。ｍｉＲ−３０はループ領域に存在することが望ましいが、ループ領域が、ｍｉＲ−３０に出現するループ配列に対して７０％を超えた、好ましくは７９％を超えた、さらに好ましくは８６％を超えた、およびさらに好ましくは９３％を超えた同一性を有するといったように、幾らかの変動が許容可能であることから、絶対的に必要ではない。パーセント同一性は、上記のいずれかの方法を用いて決定できる。
【０１３６】
別の実施形態によれば、シアロアドヘシン阻害剤は、シアロアドヘシンに特異的なｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドである。ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドの場合には、該ポリヌクレオチドには、ｓｈＲＮＡならびにｍｉＲＮＡｓの、ヘアピンまたはステムループ領域によって結合したセンスおよびアンチセンス鎖を含む配列が含まれる。ｓｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドの場合には、該ポリヌクレオチドには２つの転写単位が含まれ、それぞれはｓｉＲＮＡにおいて形成される鎖（センスおよびアンチセンス）のうち一本の転写を調節するプロモーターによって構成される。ｓｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、収束性または発散性の転写単位を含んでよい。発散性転写ポリヌクレオチドでは、ｓｉＲＮＡを形成するそれぞれのＤＮＡ鎖をコードする転写単位が、それぞれのＤＮＡ鎖の転写が同じかまたは異なっていてよい自身のプロモーターに依存するように、ポリヌクレオチド内にタンデムに位置する（Ｗａｎｇ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：５１０３−５１０６およびＬｅｅ，Ｎ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０：５００−５０５）。収束性転写ポリヌクレオチドでは、ｓｉＲＮＡを生じるＤＮＡ領域が、２つの逆転したプロモーターに隣接するＤＮＡ領域であるセンスおよびアンチセンス鎖を形成する。センスおよびアンチセンスＲＮＡ鎖の転写後、これらは機能的ｓｉＲＮＡに相当するハイブリッドを形成し得る。
【０１３７】
原則的には、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｓｉＲＮＡの発現には、それがｓｉＲＮＡを発現する細胞に適合するプロモーターであれば、どのようなプロモーターでも使用できる。好ましい実施形態によれば、シアロアドヘシンに特異的なｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、ＣＤ１１ｃプロモーター、ＤＣ−ＳＴＡＭＰプロモーター、およびファスシンプロモーターのような、樹状細胞に特異的なプロモーターを含む。逆転した転写単位を含むポリヌクレオチドに適した、その他のプロモーターの組み合わせとしては、２個のＵ６プロモーター（Ｔｒａｎ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，２００３，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３：２１）、１個のマウスＵ６プロモーターおよび１個のヒトＨ１プロモーター（Ｚｈｅｎｇ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１：１３５−１４０、および国際公開第２００５０２６３２２号）、ならびに１個のヒトＵ６プロモーターおよび１個のマウスＨ１プロモーター（Ｋａｙｋａｓ，Ａ．＆Ｍｏｏｎ，Ｒ．，２００４，ＢＭＣ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，５：１６）が挙げられる。好ましい実施形態によれば、センスおよびアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖は、異なったプロモーターにより調節される。さらになお好ましい実施形態によれば、両方の転写単位は収束性の様式によって方向付けられる。
【０１３８】
幾つかの実施形態によれば、シアロアドヘシン阻害剤は、シアロアドヘシンに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０１３９】
アンチセンスコンストラクトは、シアロアドヘシン遺伝子のプロモーターおよびその他の調節領域、エクソン、イントロン、またはエクソン−イントロンの境界にも結合するように設計されてよい。アンチセンスＲＮＡコンストラクト、またはこのようなアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ、例えばヒト被験体を含むホスト動物内、のいずれかによる宿主細胞内で、遺伝子の転写もしくは翻訳または両方を阻害するために用いられてよい。「相補性ヌクレオチド」を含む核酸配列は、標準的なワトソン−クリックによる相補性の法則に従って、塩基対を形成できるものである。すなわち、比較的大きなプリンが比較的小さなピリミジンと塩基対を形成するが、その組み合わせとしては、グアニンがシトシンと対になり（Ｇ：Ｃ）、ＤＮＡの場合にはアデニンがチミンと対になるか（Ａ：Ｔ）、またはＲＮＡの場合にはアデニンがウラシルと対になる（Ａ：Ｕ）のみである。
【０１４０】
アンチセンスコンストラクト作製には、遺伝子配列の全てまたは一部が用いられてよいが、統計的には、どのような配列でも１７塩基の長さであれば、ヒトゲノム内ではただ１回のみ発生するはずであるため、唯一の標的配列を特定するためには十分である。比較的短いオリゴマーは作製しやすく、かつｉｎ  ｖｉｖｏでの到達性も増大するが、ハイブリダイゼーションの特異性の決定にはその他の多くの因子が関連する。オリゴヌクレオチドの、その相補性の標的に対する結合親和性と配列特異性の両方は、長さが長いほど増大する。８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれを超える塩基対のオリゴヌクレオチドを使用することが意図される。所定のアンチセンス核酸が、対応する宿主細胞遺伝子のターゲティングに有効であるか否かについては、単にコンストラクトをｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験して、内在遺伝子の機能が影響を受けているか否か、または相補性配列を有する関連遺伝子の発現が影響を受けているか否かについて決定することにより、容易に判定できる。
【０１４１】
特定の実施形態によれば、その他のエレメント、例えば、Ｃ−５プロピンピリミジンを含むアンチセンスコンストラクトの使用が望まれるであろう。ウリジンおよびシチジンのＣ−５プロピン類似体を含むオリゴヌクレオチドが、高い親和性でＲＮＡに結合し、かつ遺伝子発現の強力なアンチセンス阻害剤となることが示されている（引用することにより本明細書の開示の一部とされる、Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０：１５１０−１５１３，１９９３）。
【０１４２】
幾つかの実施形態によれば、シアロアドヘシン阻害剤は、シアロアドヘシンに特異的な標的化リボザイムである。本発明の好ましい実施形態によれば、リボザイムは、植物のウイロイドに由来する小さなＲＮＡ分子である、ハンマーヘッド型リボザイムである（Ｓｙｍｏｎｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：６４１−６７１，１９９２；Ｃｌｏｕｅｔ−Ｄ’Ｏｒｖａｌ  ａｎｄ  Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，ＲＮＡ，２：４８３−４９１，１９９６；Ｈａｓｅｌｏｆｆ  ａｎｄ  Ｇｅｒｌａｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９１，１９８８；Ｊｅｆｆｒｉｅｓ  ａｎｄ  Ｓｙｍｏｎｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：１３７１−１３７７，１９８９；Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：５９６−６００，１９８７；全て引用することにより本明細書の開示の一部とされる）。その他の実施形態によれば、リボザイムは、グループＩイントロン、ヘアピンリボザイム、ＶＳ  ＲＮＡ、デルタ肝炎ウイルスリボザイム、またはＲｎａｓｅ  Ｐ−ＲＮＡリボザイム（ＲＮＡガイド配列との会合による）であってよい。ヘアピンモチーフの例は、Ｈａｍｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：２９９，１９９０、およびＨａｍｐｅｌ  ａｎｄ  Ｔｒｉｔｚ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：４９２９，１９８９に記載され；デルタ肝炎ウイルスモチーフの例は、Ｐｅｒｒｏｔｔａ  ａｎｄ  Ｂｅｅｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：１６，１９９２に記載され；ＲＮＡｓｅＰモチーフ（外部のガイド配列に会合する）の例は、Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，６２４，８２４号に記載され；ニューロスポラ  ＶＳ  ＲＮＡリボザイムモチーフの例は、Ｓａｖｉｌｌｅ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｃｅｌｌ  ６１：６８５−６９６，１９９０，Ｓａｖｉｌｌｅ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８８２６−８８３０，１９９１，Ｃｏｌｌｉｎｓ  ａｎｄ  Ｏｌｉｖｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：２７９５−２７９９，１９９３に記載され；グループＩイントロンは、Ｃｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，３５４，８５５号に記載される。上記のモチーフは本発明を限定するものとみなされてはならず、当業者は、本明細書で用いられる可能性のあるリボザイムが、標的ｍＲＮＡに対して相補性である、特異的な基質結合部位を有することを認識するであろう。このようなリボザイムは、分子にＲＮＡ切断活性を付与する酵素部分も含んでいる。該酵素部分は、基質結合部位の内側またはその周囲に存在する。
【０１４３】
本発明に従い、シアロアドヘシン阻害剤を用いて治療および／または予防できる、エンベロープウイルスにより引き起こされる感染に付随する疾病には、シアロアドヘシンとシアリルラクトースとの相互作用の阻害剤を用いる方法に関連して上に述べた、いずれの疾病も含まれる。
【０１４４】
幾つかの実施形態によれば、エンベロープウイルスにより引き起こされる感染に関連する疾病は、Ｉ型フィロウイルス科のウイルスによって、オルトミクソウイルス科のウイルスによって、パラミクソウイルス科のウイルスによって、ラブドウイルス科のウイルスによって、ボルナウイルス科のウイルスによって、ブニヤウイルス科のウイルスによって、アレナウイルス科のウイルスによって、アルボウイルスによって、フラビウイルス科のウイルスによって、ヘパシウイルスによって、ヘニパウイルスによって、レトロウイルス科に属するウイルスによって引き起こされる疾病である。さらに好ましい実施形態によれば、エンベロープウイルスは、オルソレトロウイルス亜科に属するウイルスである。さらになお好ましい実施形態によれば、エンベロープウイルスは、レンチウイルス属に属するウイルスである。さらに好ましい実施形態によれば、エンベロープウイルスは霊長類レンチウイルスであり、特にヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）である。
【０１４５】
幾つかの実施形態によれば、シアロアドヘシン阻害剤は１以上の追加の抗ＨＩＶ剤と併用してよい。これらの追加化合物には、本発明の化合物、または例えばＨＩＶ感染の症状を治療、予防、または軽減することが知られている市販の化合物が含まれてよい。適切な抗ＨＩＶ剤は、シアロアドヘシンとシアリルラクトースとの相互作用の阻害剤を用いる方法に関連して記載したものである。
【０１４６】
幾つかの実施形態によれば、シアロアドヘシン阻害剤は抗感染薬と併用してよい。幾つかの実施形態によれば、シアロアドヘシン阻害剤は免疫修飾物質と併用してよい。
【０１４７】
適切な医薬担体、投与経路、製剤、および投与計画は、シアロアドヘシンとシアリルラクトースとの相互作用の阻害剤を用いる方法に関連して詳細に記載されており、これらは本方法に対して同等に応用可能である。
【０１４８】
４．本発明の組成物およびその治療上の使用
本発明は、樹状細胞によるＨＩＶの取り込みに適用されるものである。この取り込みには、ウイルスエンベロープにみられるガングリオシドと、樹状細胞の表面に存在するＣＤ１６９との相互作用が必要であることが見出されてきた。内部に移行したウイルスは、処理され、樹状細胞の表面に提示されることで適応免疫応答を誘導できるか、またはＣＤ４＋Ｔ細胞に移送される。したがって、目的抗原を担持した樹状細胞およびＣＤ１６９とウイルスエンベロープ上のガングリオシドとの相互作用に対する阻害剤を含む組成物を提供することにより、樹状細胞による適応免疫応答の誘導が可能となる一方で、ＨＩＶを内部移行させ、かつＣＤ４＋Ｔ細胞のトランス感染を促進する樹状細胞の能力は遮断される。したがって別の態様によれば、本発明は、抗原を担持した抗原提示細胞およびシアロアドヘシンとシアリルラクトースの相互作用に対する阻害剤を含む、組成物またはパーツキットに関する。
【０１４９】
本発明に適した樹状細胞は様々な型であってよく、限定はされないが、骨髄系ＤＣ（ｍｙＤＣ）、形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）、ランゲルハンス細胞、および間質性ＤＣが挙げられる。最も強力なプロフェッショナルＡＰＣは、骨髄系に由来するＤＣである。したがって好ましい実施形態によれば、ＤＣは骨髄系ＤＣである。
【０１５０】
樹状細胞の前駆細胞および／または樹状細胞を含む出発細胞集団を得るため、樹状細胞の前駆細胞または樹状細胞を含む細胞、組織、または臓器のサンプルを、当該技術分野において公知の方法を用いて１以上の被験体から分離する。このような出発細胞集団は１被験体から得てよいか、または１以上のドナーからのものをプールしてもよい。
【０１５１】
一つの実施形態によれば、樹状細胞または樹状細胞の前駆細胞を含む出発細胞集団は、脾臓組織に由来する。一つの実施形態によれば、樹状細胞または樹状細胞の前駆細胞を含む出発細胞集団は、胸腺組織に由来する。一つの実施形態によれば、樹状細胞または樹状細胞の前駆細胞を含む出発細胞集団は、骨髄に由来する。一つの実施形態によれば、樹状細胞または樹状細胞の前駆細胞を含む出発細胞集団は、末梢血（例えば全血）または分離した白血球に由来する。一つの実施形態によれば、出発細胞集団には樹状細胞の前駆細胞が含まれる。一つの実施形態によれば、樹状細胞の前駆細胞を含む細胞集団は、当該技術分野において公知の技術である標準的な単核細胞白血球分離法を用いて、末梢血から収集できる。次に、樹状細胞の前駆細胞が採取できる（例えば、連続的な浮遊密度遠心分離工程を用いて）。例えば、白血球分離による産物を浮遊密度溶液（比重＝１．０７７ｇ／ｍＬ）上に重層し、１，０００ｇにて２０分間遠心分離することにより、赤血球および顆粒球を除去できる。界面の細胞を回収して洗浄した後、第２の浮遊密度溶液（比重＝１．０６５ｇ／ｍＬ）上に重層し、８０５ｇにて３０分間遠心分離することにより、血小板ならびに低密度の単球およびリンパ球を除去できる。得られた細胞ペレットには、樹状細胞の前駆細胞が濃縮されている。
【０１５２】
別の実施形態によれば、樹状細胞を含む出発細胞集団は、当該技術分野において公知の方法を用いて得ることができる。このような集団には、骨髄系樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、または単球の培養によって得た樹状細胞（例えばＭＯ−ＤＣ、ＭＤＤＣ）が含まれてよい。一つの実施形態によれば、樹状細胞または樹状細胞の前駆細胞は、このような細胞が含まれる混合細胞集団に由来してもよい（例えば循環、組織、または臓器に由来してもよい）。特定の実施形態によれば、ＤＣまたは樹状細胞の前駆細胞を含む混合細胞集団は、ＤＣまたは樹状細胞の前駆細胞が細胞集団の５０％を超えるように（例えば５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、またはそれを超えるように）濃縮される。幾つかの実施形態によれば、本明細書に記載される樹状細胞は、細胞集団内の幾つかの、または全ての非樹状細胞から分離することで精製される。代表的な実施形態によれば、細胞は、樹状細胞または樹状細胞の前駆細胞を含む出発集団が少なくとも５０％以上の樹状細胞または樹状細胞の前駆細胞を含むように（例えば純度が５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、またはそれを超えるように）精製されてよい。
【０１５３】
一つの実施形態によれば、樹状細胞は当該技術分野において公知の技術を用いて分離できる。Ｉｎａｂａ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９；８６：３．７．１−３．７．１９、およびＷｏｏ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １９９４；５８：４８４−４９１４参照。当業者は、前述の樹状細胞または樹状細胞の前駆細胞を含む細胞の分離方法に、実験法の過度な練習を行うことなく、改変を加えることができる。一つの実施形態によれば、樹状細胞は、その表面に存在する抗原（例えば特定の樹状細胞の場合ではＣＤ１１ｃ）に対して蛍光標識細胞分取を用いることにより精製できる。一つの実施形態によれば、出発細胞集団内に存在するＤＣはＣＤ１１ｃを発現する。別の実施形態によれば、出発細胞集団内に存在するＤＣまたは樹状細胞の前駆細胞はクラスＩＩ分子を発現する。出発細胞集団は、様々な細胞表面マーカー（例えばＣＤ１１ｃを含む）の発現について、当該技術分野において公知の技術を用いてモニターされてよい。
【０１５４】
別の実施形態によれば、樹状細胞および／または樹状細胞の前駆細胞を含む細胞集団は、血中にＰＢＭＣとして存在する多能性細胞から得ることができる。多能性細胞は、血液から最も容易に得ることができるが、骨髄および脾臓組織を含む、それらが存在するいずれかの組織からも取得可能である。典型的には、これらの多能性細胞はＣＤ１４、ＣＤ３２、ＣＤ６８、およびＣＤ１１ｂ単球マーカーを弱く発現し、ＣＤ４０およびＣＤ８６のようなアクセサリー分子の発現はみられない。
【０１５５】
一つの実施形態によれば、樹状細胞に免疫寛容原性または免疫原性を誘導するための、プロトコルに記載される少なくとも１の薬剤を用いた処理の前、処理中、または処理後に、当該技術分野において公知の方法を用いて、樹状細胞の前駆細胞を樹状細胞に分化させることができる。例えば、多能性細胞をＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４またはＩＬ−１３の組み合わせのようなサイトカインの存在下で培養すると、未熟樹状細胞が生じる。別の実施形態によれば、この目的のためにＦＬＴ３リガンドを用いることができる。例えば、一つの実施形態によれば、樹状細胞または樹状細胞の前駆細胞を含む出発細胞集団は、ＤＣの分化を促進する１以上の薬剤の存在下で、ｅｘ  ｖｉｖｏにて培養できる。一つの実施形態によれば、ＤＣの発生を促進するため、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４のうち１以上が用いられる（例えば十分な分化を誘導するためには、１〜１５日、２〜１０日、３〜９日、４〜８日、もしくは５〜６日、またはそれ以外の期間培養する）。一つの実施形態によれば、誘導された樹状細胞は完全に分化している（免疫寛容原性の樹状細胞もしくは免疫原性の樹状細胞が誘導される前、その間、またはその後のいずれかの時点）。
【０１５６】
別の実施形態によれば、ＤＣまたはＤＣ前駆体を含む出発細胞集団は、ＰＢＭＣから得ることができる。適切な試薬（例えばＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（商標）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ウプサラ、スウェーデン）による差次的沈降のような方法を用いて血液からＰＢＭＣを得る方法は公知であり、本発明での使用に適している。本発明の好ましい実施形態によれば、多能性細胞は、ＰＢＭＣの集団から血小板ならびにＴおよびＢリンパ球を除去することで得られる。非多能性細胞の除去を達成するためには、様々な方法が使用され得る。一方法によれば、除去すべき細胞（例えばＴまたＢリンパ球）に特異的な抗体で標識した免疫磁気ビーズが、ＰＢＭＣ集団から直接または間接的にＴおよびＢ細胞を除去するために用いられてよい。Ｔ細胞は、ノイラミニダーゼで処理した赤血球のロゼット形成によっても、ＰＢＭＣ集団から除去され得る。Ｏ’Ｄｏｈｅｒｔｙ  Ｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９３；１７８：１０６７−１０７８参照。
【０１５７】
上で説明したように、未熟樹状細胞の培養細胞は、多能性細胞を、その分化を促進するサイトカインの存在下で、所望の分化レベルに達するために十分な期間（例えば１〜１０日、２〜９日、３〜８日、または４〜７日）培養することによって取得され得る。一例として、それぞれの濃度が約２００ないし約２０００Ｕ／ｍｌ、約５００ないし約１０００Ｕ／ｍｌ、または約８００Ｕ／ｍｌ（ＧＭ−ＣＳＦ）および１０００Ｕ／ｍｌ（ＩＬ−４）であるＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の組み合わせにより、著しい数の未熟樹状細胞が得られる。ＧＭ−ＣＳＦ（１０〜２００ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−４（５〜５０ｎｇ／ｍｌ）の組み合わせもまた用いることができる。サイトカインの濃度は培養の異なる段階で変化させることが望ましい場合もあり、例えば初代培養細胞の培養中のＩＬ−４の濃度（１０００Ｕ／ｍｌ）は、確立された培養中の濃度（培養２日後では５００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４）よりも高い。ＩＬ−１３のようなその他のサイトカインが、ＩＬ−４の代替となる可能性がある。別の実施形態によれば、この目的のためにＦＬＴ３リガンドを用いることができる。この目的のためのその他のプロトコルが当該技術分野において公知である。
【０１５８】
接着性の血液単核画分からこれらの未熟樹状細胞を得る方法については、当該技術分野において公知である。Ｒｏｍａｎｉ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９４；１８０（１）：８３−９３、およびＳａｌｌｕｓｔｏ  Ｆ，Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ  Ａ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９４；１７９：１１０９−１１１８参照。簡単に述べると、リンパ球を除去したＰＢＭＣを、それぞれの濃度が約８００ないし１０００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４のようなサイトカインを含み、ＩＬ−４が約１０００Ｕ／ｍｌで含まれる完全培地中で、約１００万細胞／ｃｍの密度にて組織培養プレートにまく。未熟樹状細胞の別の供給源は、樹状細胞の前駆細胞が増殖する培養である。Ｓｔｅｉｎｍａｎ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．，国際公開第１９９３０２０１８５号参照。増殖しているＣＤ３４＋前駆細胞から調製した樹状細胞は、成熟細胞の特性を発現する樹状細胞へと成熟することから、樹状細胞が多能性である発生段階も通過していると考えられる。
【０１５９】
一つの実施形態によれば、未熟樹状細胞を樹状細胞の成熟因子に接触させることにより、樹状細胞を含む出発細胞集団内の成熟樹状細胞を濃縮できる。本明細書で言及するように、樹状細胞の成熟因子は、実際には単独で、または別の薬剤と共に、例えば補助剤、ＴＬＲアゴニスト、ＣＤ４０アゴニスト、インフラマソーム活性化因子、炎症性サイトカインのうち１以上、またはそれらの組み合わせと共に、未熟樹状細胞を成熟させるように作用する１以上の特異的物質である。
【０１６０】
樹状細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からｉｎ  ｖｉｔｒｏにて発生させることができるが、そのために用いるプロトコルは、基本的に、細胞の接着が可能なようにＰＢＭＣを培養瓶内にまくことにより構成される。その後細胞をインターロイキン４（ＩＬ４）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）によって処理すると、おおよそ１週間で細胞の未熟樹状細胞（ｉＤＣ）への分化が誘導され得る。任意に、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）によって処理した細胞は成熟可能である。
【０１６１】
樹状細胞は、多くの適切な供給源から標準的な方法を用いて得ることができる。樹状細胞分離のための供給源としては、末梢血、脊髄、腫瘍浸潤細胞、腫瘍周辺組織浸潤細胞、リンパ節、胸腺、脾臓、皮膚の生検、臍帯血、末梢血から得た単球、末梢血から得たＣＤ３４またはＣＤ１４陽性細胞、およびその他のいずれかの適切な組織または体液が挙げられる。
【０１６２】
任意に、樹状細胞の安定細胞培養を用いることができる。例えば、樹状様細胞／腫瘍細胞ハイブリドーマおよび複数の樹状様細胞／腫瘍細胞ハイブリッドが利用されてよい。Ｆａｌｏ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，欧州特許第１１６８９２４号参照。これらのハイブリッドおよびハイブリドーマは、腫瘍細胞と樹状様細胞の融合により産生される。例えば、自己の腫瘍細胞株由来の不死化腫瘍細胞と、自己のＨＬＡに一致したアロジェニック樹状様細胞とを融合することができる。自己の腫瘍細胞株は、原発腫瘍およびその転移から得ることができる。あるいは、自己の不死化樹状様細胞またはＨＬＡが一致したアロジェニック樹状様細胞株と、自己の腫瘍細胞とを融合することができる。Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，国際公開第２００２０４８１６７号参照。使用可能な別の細胞株はＣＢ１である。Ｐａｇｌｉａ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９３；１７８：１８９３−１９０１参照。
【０１６３】
本発明に従った組成物の、抗原を担持した樹状細胞は、樹状細胞調製物と、所望の抗原を含む免疫原性組成物とを、ウイルス性の免疫原による前記細胞のパルスに適した条件下で接触させることにより調製される。
【０１６４】
本明細書が意図するように、本発明には、ＡＰＣへ担持して免疫応答を誘発するために適したいずれかの抗原の使用が含まれてよい。一つの実施形態によれば、微生物抗原が用いられてよい。抗原性の分子は例えば、限定はされないが、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原虫抗原、アレルゲンすなわち環境性抗原、分化抗原、腫瘍抗原、胚性抗原、癌遺伝子および変異型腫瘍抑制遺伝子の抗原、染色体転座からもたらされる独特な腫瘍抗原、またはそれらの誘導体であってよい。抗原性ポリペプチドは、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原虫抗原、アレルゲンすなわち環境性抗原、分化抗原、または腫瘍抗原の、免疫原性断片であってもよい。適切な抗原の例を以下に挙げるが、これらに限定されるものではない：
１）ウイルス抗原：ウイルスに対する免疫応答を引き起こすことのできるウイルス抗原としては、動物およびヒトのレトロならびにレンチウイルス抗原、例えばＨＩＶ−１の抗原すなわちＨＩＶ−１抗原（例えばｔａｔ、ｎｅｆ、ｇｐ１２０またはｇｐ１６０、ｇｐ４０、ｐ２４、ｇａｇ、ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｒｅｖ）、または前初期タンパク質（例えばＨＳＶ１またはＨＳＶ２由来のＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ＩＣＰ４、ＩＣＰ３６）、Ｂ型肝炎ウイルスの抗原（例えばＢ型肝炎表面抗原または肝炎コア抗原）、Ｃ型肝炎ウイルスの抗原（例えばコア、Ｅ１、ＮＳ３、またはＮＳ５抗原）、パラミクソウイルス由来の抗原（例えばＦおよびＧタンパク質、またはそれらの誘導体のような、呼吸器合胞体ウイルス由来の抗原）、パラインフルエンザウイルス由来の抗原、風疹ウイルス由来の抗原（例えばタンパク質ＥｌおよびＥ２）、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ヒトパピローマウイルス（例えばＨＰＶ６、１１、１６、１８由来の抗原、例えばＬＩ、Ｌ２、Ｅｌ、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７）、フラビウイルス由来の抗原（例えば黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス由来の抗原）、またはインフルエンザウイルス感染細胞由来の抗原（例えばＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、またはＭタンパク質、またはそれらの組み合わせ）、ロタウイルス抗原（例えばＶＰ７ｓｃおよびその他のロタウイルス成分）、および類似のウイルス由来の抗原が挙げられる。Ｆｉｅｌｄｓ  Ｂ，Ｋｎｉｐｅ  Ｄ．Ｅｄｓ．，“Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ”，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９１）参照。
２）細菌抗原：細菌抗原としては、淋菌および髄膜炎菌を含むナイセリア属由来の抗原（例えばトランスフェリン結合タンパク質、ラクトフェリン結合タンパク質、ＰｉＩＣ、およびアドヘシン）；化膿性連鎖球菌由来の抗原（例えばＭタンパク質またはその断片、およびＣ５Ａプロテアーゼ）；ストレプトコッカス・アガラクチア、ストレプトコッカス・ミュータンス由来の抗原；軟性下疳菌由来の抗原；ブランハメラ・カタラーリスとしても知られるＭ．カタラーリスを含むモラクセラ属由来の抗原（例えば高および低分子量アドへシンならびにインベイシン）；百日咳菌、パラ百日咳菌、および気管支敗血症菌を含むボルデテラ属由来の抗原（例えばパータクチン、百日咳毒素またはその誘導体、線維状赤血球凝集素、アデニル酸シクラーゼ、線毛）；結核菌、Ｍ．ボビス、らい菌、Ｍ．アビウム、パラ結核菌、スメグマ菌を含むマイコバクテリウム属由来の抗原；在郷軍人病菌を含むレジオネラ属由来の抗原；（例えばＥＳＡＴ６、抗原８５Ａ、−Ｂ、または−Ｃ、ＭＰＴ４４、ＭＰＴ５９、ＭＰＴ４５、ＨＳＰ１０、ＨＳＰ６５、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ７５、ＨＳＰ９０、ＰＰＤ  １９ｋＤａ［Ｒｖ３７６３］、ＰＰＤ  ３８ｋＤａ［Ｒｖ０９３４］）；腸毒素を有する大腸菌由来の抗原（例えば定着因子、易熱性毒素またはその誘導体、耐熱性毒素またはその誘導体）、腸管出血性大腸菌および腸管病原性大腸菌由来の抗原（例えば志賀毒素様の毒素またはその誘導体）を含むエシェリキア属由来の抗原；コレラ菌を含むビブリオ属由来の抗原（例えばコレラ毒素またはその誘導体）；Ｓ．ソネイ、志賀赤痢菌、Ｓ．フレックスネリを含むシゲラ属由来の抗原；Ｙ．エンテロコリチカを含むエルシニア属由来の抗原（例えばＹｏｐタンパク質）；ペスト菌、仮性結核菌由来の抗原；Ｃ．ジェジュニを含むカンピロバクター属由来の抗原（例えば毒素、アドへシン、およびインベイシン）；チフス菌、サルモネラ菌、およびＳ．ボンゴリを含むサルモネラ属由来の抗原；リステリア菌を含むリステリア属由来の抗原；ピロリ菌を含むヘリコバクター属由来の抗原（例えばウレアーゼ、カタラーゼ、空胞化毒素）；緑膿菌を含むシュードモナス属由来の抗原；黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌を含むスタフィロコッカス属由来の抗原；フェカリス菌、フェシウム菌を含むエンテロコッカス属由来の抗原；破傷風菌由来の抗原（例えば破傷風毒素およびその誘導体）、ボツリヌス菌由来の抗原（例えばボツリヌス毒素およびその誘導体）、Ｃ．ディフィシル由来の抗原（例えばクロストリジウム毒素ＡまたはＢおよびそれらの誘導体）を含むクロストリジウム属由来の抗原；炭疽菌を含むバチルス属由来の抗原（例えば炭疽毒素およびその誘導体）；ジフテリア菌を含むコリネバクテリウム属由来の抗原（例えばジフテリア毒素およびその誘導体）；ライム病菌由来の抗原（例えばＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）；Ｂ．ガリニ由来の抗原（例えばＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、Ｂ．アフゼリ由来の抗原（例えばＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、Ｂ．アンダーソニイ由来の抗原（例えばＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ、および回帰熱ボレリア由来の抗原を含むボレリア属由来の抗��；Ｅ．エクイおよびヒト顆粒球エーリキア症の病原体を含むエーリキア属由来の抗原；Ｒ．リケッチイを含むリケッチア属由来の抗原；Ｃ．トラコマティス由来の抗原（例えばＭＯＭＰ、ヘパリン結合タンパク質）、クラミジア・ニューモニエ由来の抗原（例えばＭＯＭＰ、ヘパリン結合タンパク質）、オウム病クラジミア由来の抗原、を含むクラミジア属由来の抗原；Ｌ．インターロガンスを含むレプトスピラ属由来の抗原；梅毒トレポネーマ由来の抗原（例えば希外膜タンパク質）、Ｔ．デンティコラ由来の抗原、Ｔ．ヒオディセンテリア由来の抗原を含むトレポネーマ属由来の抗原；結核菌由来の抗原（例えばＲｖ２５５７、Ｒｖ２５５８、ＲＰＦｓ：Ｒｖ０８３７ｃ、Ｒｖ１８８４ｃ、Ｒｖ２３８９ｃ、Ｒｖ２４５０、Ｒｖ１００９、ａｃｅＡ（Ｒｖ０４６７）、ＰｓｔＳ１、（Ｒｖ０９３２）、ＳｏｄＡ（Ｒｖ３８４６）、Ｒｖ２０３１ｃ  １６ｋＤａｌ．、Ｔｂ  Ｒａ１２、Ｔｂ  Ｈ９、Ｔｂ  Ｒａ３５、Ｔｂ３８−１、Ｅｒｄ  １４、ＤＰＶ、ＭＴＩ、ＭＳＬ、ｍＴＴＣ２、およびｈＴＣＣ１）；クラミジア由来の抗原（例えば高分子量タンパク質（ＨＷＭＰ）、ＯＲＦ３（ＥＰ３６６４１２）、および推定上の膜タンパク質（Ｐｍｐｓ））；肺炎球菌由来の抗原（ＰｓａＡ、ＰｓｐＡ、ストレプトリジン、コリン結合タンパク質、タンパク質抗原であるニューモリシン、およびそれらの変異解毒型誘導体）を含むストレプトコッカス属由来の抗原；Ｂ型インフルエンザ菌由来の抗原（例えばＰＲＰおよびその複合体）、非定型インフルエンザ菌由来の抗原（例えばＯＭＰ２６、高分子量アドへシン、Ｐ５、Ｐ６、タンパク質Ｄおよびリポタンパク質Ｄ、ならびにフィンブリンおよびフィンブリン由来のペプチド、またはそれらの複数コピー変異体もしくは融合タンパク質）を含むヘモフィルス属由来の抗原が挙げられる。
３）真菌抗原：真菌抗原としては、Ｃ．アルビカンスを含むカンジダ属由来の抗原；ヒストプラズマ菌抗原（例えば熱ショックタンパク質６０（ＨＳＰ６０）およびその他のヒストプラズマ菌抗原成分）；Ｃ．ネオフォルマンスを含むクリプトコッカス属由来の抗原（例えば莢膜多糖およびその他のクリプトコッカス菌抗原成分）；コクシジオイデス菌抗原（例えば球状体抗原およびその他のコクシジオイデス菌抗原成分）；ならびに白癬菌抗原（例えばトリコフィチンおよびその他のコクシジオイデス菌抗原成分）が挙げられる。
４）原虫抗原：原虫抗原としては、熱帯熱マラリア原虫由来の抗原（例えばメロゾイト表面抗原、スポロゾイト表面抗原、スポロゾイト周囲抗原、ガメトサイト／ガメト表面抗原、血液ステージ抗原ｐｆ，５５／ＲＥＳＡ）およびその他のプラスモジウム抗原成分（例えばＲＴＳ．Ｓ、ＴＲＡＰ、ＭＳＰ１、ＡＭＡ１、ＭＳＰ３、ＥＢＡ、ＧＬＵＲＰ、ＲＡＰ１、ＲＡＰ２、セクエストリン、ＰｆＥＭＰ１、Ｐｆ３３２、ＬＳＡ１、ＬＳＡ３、ＳＴＡＲＰ、ＳＡＬＳＡ、ＰｆＥＸＰ１、Ｐｆｓ２５、Ｐｆｓ２８、ＰＦＳ２７／２５、Ｐｆｓ１６、Ｐｆｓ４８／４５、Ｐｆｓ２３０、およびプラスモジウム属におけるそれらの類似体）を含むプラスモジウム属由来の抗原；トキソプラズマ属およびトキソプラズマ原虫由来の抗原（例えばＳＡＧ２、ＳＡＧＳ、Ｔｇ３４、ｐ３０、およびその他のトキソプラズマ抗原成分）；住血吸虫抗原（例えばグルタチオン−Ｓ−転移酵素、パラミオシン、およびその他の住血吸虫抗原成分）；リーシュマニアの主要抗原およびその他のリーシュマニア抗原（例えばｇｐ６３、リポホスホグリカンおよびそれに付随するタンパク質、ならびにその他のリーシュマニア抗原成分）；クルーズトリパノソーマ抗原（例えば７５〜７７ｋＤａ抗原、５６ｋＤａ抗原、およびその他のトリパノソーマ抗原成分）；赤痢アメーバを含むエントアメーバ属由来の抗原；ネズミバベシアを含むバベシア属由来の抗原；クルーズトリパノソーマを含むトリパノソーマ属由来の抗原；ランブル鞭毛虫を含むジアルジア属由来の抗原；森林型熱帯リーシュマニアを含むリーシュマニア属由来の抗原；Ｐ．カリニを含むニューモシスチス属由来の抗原；膣トリコモナスを含むトリコモナス属由来の抗原；マンソン住血吸虫を含むシストソーマ属由来の抗原が挙げられる。
５）アレルゲンすなわち環境性抗原：アレルゲンすなわち環境性抗原としては、花粉アレルゲン（例えば樹木、薬草、雑草、およびイネ花粉アレルゲン）、昆虫アレルゲン（例えば吸入抗原、唾液および毒液アレルゲン）、動物の毛髪およびフケアレルゲン、ならびに食物アレルゲンのような天然アレルゲンが挙げられる。樹木、イネ、および雑草に由来する重要な花粉アレルゲンの起源は、分類学上のブナ属、ハンノキ属、ハシバミ属、シデおよびオリーブ属、ヒマラヤスギ（スギ属およびビャクシン属）、スズカケノキを含む、ブナ目、モクセイ目、マツ目、およびスズカケノキ科、分類学上のイネ目（例えばドクムギ属、アワガエリ属、イチゴツナギ属、ギョウギシバ属、カモガヤ属、シラゲガヤ属、クサヨシ属、ライムギ属、およびモロコシ属のイネ）、分類学上のキク目およびイラクサ目（例えばブタクサ属、ヨモギ属、およびヒカゲミズ属の薬草）である。使用され得るその他のアレルゲンとしては、ヒョウヒダニ属およびシワダニのハウスダストダニ類由来のアレルゲン、貯蔵庫ダニ（例えばケナガコナダニ、イエニクダニ、およびサヤアシニクダニ）由来のアレルゲン、ゴキブリ由来のアレルゲン、小昆虫およびノミ（例えばチャバネゴキブリ、ゴキブリ類、ユスリカ属、およびイヌノミ属）由来のアレルゲン、哺乳類（例えばネコ、イヌ、およびウマ）由来のアレルゲン、鳥類由来のアレルゲン、刺したり咬んだりする昆虫（例えば分類学上の膜翅目（ミツバチ上科）、スズメバチおよびアリ（スズメバチ上科）を含むハチ目）由来のものを含む毒アレルゲンが挙げられる。使用され得るさらにその他のアレルゲンとしては、真菌（例えばアルテルナリア属およびクラドスポリウム属）由来の吸入アレルゲンが挙げられる。
６）腫瘍抗原：腫瘍抗原としては、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、シクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−００１７−１Ａ／ＧＡ７３３、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）およびその抗原エピトープＣＡＰ−１およびＣＡＰ−２、ｅｔｖ６、ａｍ１１、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）およびその抗原エピトープＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２、およびＰＳＡ−３、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３−ζ鎖、腫瘍抗原のＭＡＧＥファミリー（例えばＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ３（ＭＡＧＥ−Ｂ３）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ４（ＭＡＧＥ−Ｂ４）、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＭＡＧＥ−Ｃ３、ＭＡＧＥ−Ｃ４、ＭＡＧＥ−Ｃ５）、腫瘍抗原のＧＡＧＥファミリー（例えばＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、ＧＡＧＥ−８、ＧＡＧＥ−９）、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ−１、ＮＡＧ、ＧｎＴ−Ｖ、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、チロシナーゼ、ｐ５３、ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ２１ｒａｓ、ＲＣＡＳ１、α−フェトプロテイン、Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン、γ−カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ｇｐ１００Ｐｍｅ１１１７、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｃｄｃ２７、大腸腺腫症タンパク質（ＡＰＣ）、フォドリン、コネキシン３７、免疫グロブリンイディオタイプ（Ｉｇ−イディオタイプ）、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２およびＧＤ２ガングリオシド、ヒトパピローマウイルスタンパク質のようなウイルス産物、腫瘍抗原のＳｍａｄファミリー、ｌｍｐ−１、Ｐ１Ａ、ＥＢＶをコードする核抗原（ＥＢＮＡ）−１、脳型グリコーゲンホスホリラーゼ、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−３、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−１およびＣＴ−７、ならびにｃ−ｅｒｂＢ−２、急性リンパ性白血病（ｅｔｖ６、ａｍ１１、シクロフィリンｂ）、Ｂ細胞リンパ腫（Ｉｇ−イディオタイプ）、神経膠腫（Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン、γ−カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ）、膀胱癌（ｐ２ｌｒａｓ）、胆道癌（ｐ２ｌｒａｓ）、乳癌（ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２）、子宮頸癌（ｐ５３、ｐ２ｌｒａｓ）、大腸癌（ｐ２ｌｒａｓ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２、ＭＵＣファミリー）、結腸直腸癌（結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−００１７−１Ａ／ＧＡ７３３、ＡＰＣ）、絨毛癌（ＣＥＡ）、上皮細胞癌（シクロフィリンｂ）、胃癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２、ｇａ７３３糖タンパク質）、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫（ｌｍｐ−１、ＥＢＮＡ−１）、肺癌（ＣＥＡ、ＭＡＧＥ−３、ＮＹ−ＥＳＯ−１）、リンパ系細胞由来の白血病（シクロフィリンｂ）、メラノーマ（ｐ１５タンパク質、ｇｐ７５、癌胎児性抗原、ＧＭ２およびＧＤ２ガングリオシド、��ｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、ｃｄｃ２７、ＭＡＧＥ−３、ｐ２ｌｒａｓ、ｇｐ１００Ｐｍｅ１１１７）、骨髄腫（ＭＵＣファミリー、ｐ２ｌｒａｓ）、非小細胞肺癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２）、上咽頭癌（ｌｍｐ−１、ＥＢＮＡ−１）、卵巣癌（ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２）、前立腺癌（前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）およびその抗原性エピトープであるＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２、およびＰＳＡ−３、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２、ｇａ７３３糖タンパク質）、腎癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２）、子宮頚部および食道の扁平上皮癌（ヒトパピローマウイルスタンパク質のようなウイルス産物）、精巣癌（ＮＹ−ＥＳ０−１）、およびＴ細胞白血病（ＨＴＬＶ−１エピトープ）が挙げられる。
【０１６５】
好ましい実施形態によれば、本発明の抗原を担持した樹状細胞を得るために用いる抗原はウイルス抗原である。さらに好ましい実施形態によれば、ウイルス抗原はＨＩＶ抗原である。
【０１６６】
既述されるように、ＨＩＶ分離株は別々の遺伝的亜型に分類される。ＨＩＶ−１には少なくとも１０の亜型（Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＰＬ、Ｆ２、Ｇ、Ｈ、ｊ、およびＫ）が存在することが知られている。Ｔａｙｌｏｒ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２００８；３５９（１８）：１９６５−１９６６参照。ＨＩＶ−２は少なくとも５の亜型（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥ）を含むことが知られている。亜型Ｂは、全世界の男性同性愛者および静脈内への薬物使用者におけるＨＩＶの流行に関連している。ＨＩＶ−１免疫原、実験室用に適応させた分離株、試薬、およびエピトープの位置づけのほとんどは、亜型Ｂについてのものである。ＨＩＶ感染症の新たな発生率が高いサハラ以南のアフリカ、インド、および中国の地域では、ＨＩＶ−１亜型Ｂによる感染の割合は低く、最も一般的に感染が起こる亜型は、亜型ＨＩＶ−１Ｃのようである。したがって特定の実施形態によれば、特定の亜型（例えばＨＩＶ−１亜型ＢまたはＣ）から免疫原を選択することが好ましい場合がある。単一の免疫組成物中に、複数のＨＩＶ亜型（例えばＨＩＶ−１亜型ＢおよびＣ、ＨＩＶ−２亜型ＡおよびＢ、またはＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、もしくはＨＩＶ−３亜型の組み合わせ）に由来する免疫原が含まれていることが、望ましいと考えられる。
【０１６７】
適切なＨＩＶ免疫原としては、ＨＩＶエンベロープ（ｅｎｖ；例えばＮＣＢＩ参照配列、ＮＰＪ３５７８５６）、ｇａｇ（例えばｐ６、ｐ７、ｐ１７、ｐ２４、ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＤ３９４００Ｊ）、ｐｏｌによりコードされるプロテアーゼ（例えばＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０３３６６）、ｎｅｆ（例えばＧｅｎＢａｎｋ−ＣＡＡ４１５８５Ｊ、Ｓｈｕｇａｒｓ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９３；６７（８）：４６３９−４６５０）、ならびにそれらの変異体、誘導体、および融合タンパク質が挙げられる。Ｇｏｍｅｚ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００７；２５：１９６９−１９９２参照。適切な系統および組み合わせは所望により当業者が選択してよい。
【０１６８】
本発明の、「パルスした樹状細胞」としても知られる、抗原を担持した樹状細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで樹状細胞を抗原に曝露することによって産生される。樹状細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏでパルスする場合には、樹状細胞を培養皿にまき、十分な量の抗原に十分な時間曝露して、抗原を樹状細胞に結合させる。抗原の樹状細胞への結合を達成するのに必要な量および時間は当該技術分野において公知であるか、または本明細書に開示する方法を用いて決定されてよい。抗原への曝露後、樹状細胞に存在する抗原を検出するためには、当業者に公知であるその他の方法、例えば免疫アッセイすなわち結合アッセイが用いられてよい。
【０１６９】
本発明のさらなる実施形態によれば、樹状細胞によって特定のタンパク質が発現されるように、樹状細胞にベクターをトランスフェクトしてもよい。樹状細胞によって発現されたタンパク質は、処理され、細胞表面に提示され得る。トランスフェクトされた樹状細胞は、ベクターがコードするタンパク質に対する免疫応答を引き起こすための免疫原性組成物として用いられてよい。ベクターは、それに対する免疫応答が望まれるタンパク質をコードし、かつ発現させる特定のポリヌクレオチドを含むように調製されてよい。好ましくは、細胞を感染させるためにレトロウイルスベクターが用いられる。さらに好ましくは、細胞を感染させるためにアデノウイルスベクターが用いられる。
【０１７０】
別の実施形態によれば、樹状細胞上の受容体により認識されるタンパク質またはその一部をコードするようにウイルスベクターを改変すると、ベクターは樹状細胞の標的となり得るため、ベクターが樹状細胞受容体に結合してベクターのエンドサイトーシスが開始され、ウイルスベクターの核酸によりコードされる抗原のプロセシングおよび提示が可能となる。ウイルスにより送達される核酸はウイルスに対して未変性であってよく、これが樹状細胞に発現されると、処理されて樹状細胞のＭＨＣ受容体に提示されるウイルスタンパク質をコードする。
【０１７１】
本明細書で意図されるように、宿主細胞にポリヌクレオチドをトランスフェクトするためには、様々な方法を用いることができる。そのような方法としては、リン酸カルシウム沈降、リポフェクション、微粒子銃、微量注入法、エレクトロポレーション、コロイド分散系（すなわち高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型乳剤、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質に基づいた系）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの方法は当該技術分野において理解されるものであり、公開されている文献には当業者がこれらを実行できるように記載されている。
【０１７２】
別の実施形態によれば、担持樹状細胞を産生しない場合には、抗原をコードするポリヌクレオチドを発現ベクター内にクローン化して、該ベクターを樹状細胞内に導入できる。入手可能な公開文献には、細胞内に核酸を導入するための様々な型のベクターおよび方法について論じられている。例えば発現ベクターは、物理的、化学的、または生物学的手段によって宿主細胞内に導入できる。Ｂｒｏｗｎ  Ｔ，“Ｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”（Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＧＢ，１９９５）；Ｗａｔｓｏｎ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ”，２ｎｄ  Ｅｄ．（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳ，１９９２）；Ａｌｂｅｒｔｓ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ”（Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳ，２００８）；Ｉｎｎｉｓ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，“ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳ，１９９０）；Ｅｒｌｉｃｈ  Ｈ，Ｅｄ．，“ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ”（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳ，１９８９）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ＵＳ，１９８９）；Ｂｉｓｈｏｐ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＧＢ，１９８７）；Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ  Ｗ，Ｅｄ．，“Ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ，ＭＡ，ＵＳ，１９８７）；Ｄａｖｉｓ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳ，１９８６），Ｓｃｈｌｅｅｆ  Ｍ，Ｅｄ．，“Ｐｌａｓｍｉｄ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ”（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，ＤＥ，２００１）参照。
【０１７３】
抗原をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの導入によって、パルスされた細胞が得られることは容易に理解できる。本発明には、限定はされないが、タンパク質、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡの形での全抗原を樹状細胞に担持する方法を含む、樹状細胞をパルスするための様々な方法が含まれる。しかしながら、本発明を、樹状細胞をパルスするために用いる抗原の特定の形に限定されるものと解釈してはならない。本発明はむしろ、抗原を担持した樹状細胞を得るための、当該技術分野において公知であるその他の方法も包含する。好ましくは、樹状細胞は規定の抗原をコードするｍＲＮＡをトランスフェクトされる。その配列が既知である遺伝子産物に対応するｍＲＮＡは、転写反応に関連した適切なプライマーと逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで迅速に産生できる。樹状細胞へのｍＲＮＡのトランスフェクションにより、パルスされたＡＰＣを得るためのその他の抗原担持技術を超えた利点が提供される。例えば、顕微鏡的な量の組織（すなわち腫瘍組織）からＲＮＡを増幅可能であれば、多数の患者へのワクチン接種へとＡＰＣの使用を拡大できる。
【０１７４】
樹状細胞が目的抗原によっていったんパルスされると、この免疫原によってパルスされた樹状細胞は回収される。免疫原によってパルスされた樹状細胞を回収するためには、様々な方略、例えば成熟細胞に発現するＣＤ８０のようなマーカーを利用した免疫分離を用いることができる。
【０１７５】
目的抗原がいったん未熟樹状細胞内に担持されると、前記細胞は、サイトカイン、ＴＬＲ（ｔｏｌｌ様受容体）リガンド、およびその他の薬剤を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで成熟させることができる。例えば当業者は、ＤＣを成熟させてＨＩＶの免疫療法に用いるために、炎症誘発性サイトカインであるＩＬ−１β、ＩＬ−６、およびＴＮＦαとプロスタグランジンＥ２とを組み合わせたカクテルを使用してよいことを知っている。ＤＣを成熟させるための別の組み合わせは、炎症性サイトカインであるＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、およびＩＦＮαとｄｓＲＮＡポリＩ：Ｃ（αＤＣＩと称される）である。得られた産物は、治療用または予防用ワクチンとしての使用に適する。
【０１７６】
細胞表面マーカーの発現は、例えば従来の方法および装置を用いるフローサイトメトリーによって決定できる。例えば、当該技術分野において公知である市販の抗体および通常のプロトコルを用いたＣａｌｉｂｕｒ  ＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーター、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｏ．，フランクリン・レイクス、ニュージャージー州、米国）システムが使用可能である。したがって、フローサイトメトリーにおいて、特異的な細胞表面マーカーのシグナルがバックグラウンドシグナルを上回る細胞を選択できる。バックグラウンドシグナルは、従来のＦＡＣＳ分析における各表面マーカーの検出に用いられる特異的抗体と同じアイソタイプである非特異的抗体によって得られるシグナル強度と定義される。マーカーが陽性であるとみなすためには、従来の方法および装置により観察される特異的シグナルの強度が、バックグラウンドシグナルの強度よりも２０％を超える、好ましくは３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、５００％、１０００％、５０００％、１００００％、またはそれを超える必要がある。
【０１７７】
前記樹状細胞ワクチンは、好ましくは被験体由来のものである。抗原を用いた最も有効な免疫療法ワクチンは、自己のＨＩＶ（すなわち、それぞれのホストに独特なウイルスの疑似種）に基づく。今日までに得られた抗ＨＩＶ免疫療法試験における最も印象的な結果では、患者自身のウイルスに由来する不活化されたＨＩＶウイルス粒子の全体を担持した樹状細胞（ＤＣ）を用いていた。樹状細胞も同じ患者から得たものであった。好ましい実施形態によれば、調製された樹状細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ１４＋単球を単離した被験体自身に由来する。
【０１７８】
用語「シアロアドヘシンとシアリルラクトースの相互作用に対する阻害剤」については上で定義した。好ましい実施形態によれば、阻害剤は、シアリルラクトース、シアリルラクトース成分を含む分子、および抗シアロアドヘシン抗体からなる群から選択される。別の好ましい実施形態によれば、シアリルラクトース成分を含む分子は、４個未満のシアル酸を有するガングリオシドである。別の好ましい実施形態によれば、シアリルラクトースを含有し、かつ４個未満のシアル酸を有するガングリオシドは、表１に示すいずれかのガングリオシド、または表１に示すガングリオシドのいずれかの組み合わせから選択される。好ましい実施形態によれば、本発明の組成物は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、またはそれを超えるガングリオシドを含み、前記ガングリオシドは表１に示すガングリオシドから選択されるか、またはシアリルラクトースを有するその他のいずれかのガングリオシドに相当する。
【０１７９】
本発明に従った組成物およびパーツキットは、被験体に、抗原提示細胞に担持された抗原に対する免疫応答を引き起こすために用いることができる。抗原提示細胞は、被験体にＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞のプライミングを誘導するワクチンとして作用するが、シアロアドヘシンとシアリルラクトースの相互作用に対する阻害剤が存在するとこれが阻止されるため、被験体がＨＩＶに感染している場合には、抗原提示細胞はいずれのウイルスも取り込まず、患者のＣＤ４＋Ｔ細胞が再感染することはない。したがって該組成物およびパーツキットは、ＨＩＶ感染に関連する疾病の治療に特に有用であり（ＨＩＢ抗原または抗原の混合物を担持した抗原提示細胞を用いる場合）、これらは疾病の原因となる細胞の一部を構成する抗原に対する免疫応答の刺激を促進することによってＨＩＶ感染に随伴性の疾病の治療にも有用である一方、免疫原／ワクチン組成物の一部を構成する抗原提示細胞によるＨＩＶの取り込みを阻止することによって、ＨＩＶのさらなる拡散を最小限にする。
【０１８０】
したがって別の態様によれば、本発明は、医療に使用するための、本発明に従った組成物またはパーツキットに関する。
【０１８１】
別の態様によれば、本発明は、本発明に従った組成物もしくはパーツキットを含む、免疫原またはワクチンに関する。
【０１８２】
別の態様によれば、本発明は、抗原提示細胞に担持された抗原に対する免疫応答が必要とされる疾病の治療または予防に使用するための、本発明に従った組成物またはパーツキットに関する。
【０１８３】
別の態様によれば、本発明は、抗原提示細胞に担持された抗原に対する免疫応答が必要とされる疾病を患う被験体を治療する薬剤を調製するための、本発明に従った組成物またはパーツキットに関する。
【０１８４】
好ましい実施形態によれば、組成物またはパーツキットが投与される被験体は、ＨＩＶに感染した患者である。
【０１８５】
別の態様によれば、本発明は、単数または複数の抗原に対する免疫応答が必要とされる疾病に罹患した被験体を治療するための方法に関し、該方法は本発明に従った組成物またはパーツキットを前記被験体に投与することを含み、ここで前記組成物またはパーツキット中の抗原提示細胞には、免疫応答が必要とされるものに対する前記単数または複数の抗原が担持される。
【０１８６】
本発明の樹状細胞ワクチンは、治療用ワクチン、すなわち、既にＨＩＶに感染してＡＩＤＳを発病した被験体に投与して、該被験体の免疫応答を調節することで、闘病を補助する物質となり得る。治療用ＨＩＶワクチンは、ＨＩＶに対する現在の抗レトロウイルス治療の補助的な、または代替の選択肢としての有望な方略を示すものである。
【０１８７】
本発明の樹状細胞ワクチンは、既にＨＩＶに感染してはいるが、ＡＩＤＳを発病していない被験体に投与するように作られた予防用ＡＩＤＳワクチンとなり得る。
【０１８８】
ＨＩＶに対する免疫応答の発生は、例えばウイルス量、Ｔ細胞の増殖、Ｔ細胞の生存、Ｔ細胞によるサイトカインの分泌、または抗原特異的抗体の産生増大（例えば抗体濃度）を測定することによって評価されてよい。
【０１８９】
刺激されたＴ細胞の検出方法は当業者に公知であり、当業者は、抗原への応答によるＴ細胞への刺激を評価するために適したいずれの方法を用いてもよいことを容易に理解できる。以下に記載する手順を、適切な方法の幾つかの例として示す：
１）酵素免疫スポット法（ＥＬＩＳｐｏｔ）：非接着性細胞を、前培養したウェルから所望の抗サイトカイン捕捉抗体（抗体；例えば抗ＩＦＮ、抗ＩＬ−１０、抗ＩＬ−２、抗ＩＬ−４）によってコートされたウェルに移す。ビオチン化二次抗体とストレプトアビジン−アルカリホスファターゼおよびＮＢＴ−ＢＣＩＰのような標準的な比色法または蛍光定量法によって発色を行い、スポットを計数する。ＥＬＩＳｐｏｔの読み取りを、スポット形成細胞（ＳＦＣ）／１０６ＰＢＭＣとして表す。
２）上清のサイトカインアッセイ：培養上清中に放出されたサイトカインを、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ＢＤ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｂｅａｄ  ａｒｒａｙ、Ｂｉｏｒａｄ  Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘアッセイ、およびその他の方法のような、様々な方法によって測定する。
３）ＨＬＡクラスＩＩ四量体：この手順によれば、市販の試薬（例えばＭＨＣ  Ｃｌａｓｓ  ＩＩ  Ｕｌｔｉｍｅｒｓ（商標）、ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ  Ｌｔｄ、オックスフォード、英国）または研究室製の試薬（例えばＮｏｖａｋ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９９；１０４：Ｒ６３−Ｒ６７）のいずれかを用いて、特異的なペプチドエピトープを認識する抗原反応性Ｔ細胞が検出される。
４）活性化マーカー（例えばＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ１３７）の発現上昇：この手順によれば、抗原認識後に抗原特異的Ｔ細胞の膜上に露出する活性化マーカーの差次的発現によって抗原特異的Ｔ細胞応答が検出される。
５）サイトカイン捕捉アッセイ：この系は、サイトカイン応答に応じて抗原特異的Ｔ細胞を可視化する、ＥＬＩＳｐｏｔに代わる有効な方法である（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ、ベルギッシュ・グラートバッハ、独国）。加えて、これは目的Ｔ細胞の直接の選別およびクローニングを可能にする。
６）ＣＤ１５４アッセイ：この手順は、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の検出に限定される。Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００５；１１：１１１３−１１１１７およびＦｒｅｎｔｓｃｈ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００５；１１：１１１８−１１２４参照。
７）ＣＤ１０７アッセイ：この手順により、細胞傷害性を有する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の可視化が可能になる。Ｂｅｔｔｓ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００３；２８１：６５−７８参照。
８）ＣＦＳＥ希釈アッセイ：この手順は、抗原特異的Ｔ細胞（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋）を、それらの抗原認識後の増殖に従って検出する。Ｍａｎｎｅｒｉｎｇ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００３；２８３：１７３−１８３参照。
【０１９０】
５．エンベロープウイルスの検出および単離方法
シアロアドヘシンと、エンベロープウイルスのエンベロープに見出される特定のガングリオシドに存在するシアリルラクトース成分との相互作用を同定することにより、ウイルスのシアロアドヘシンへの結合能を決定することで前記ウイルスの検出が可能になり、かつ、シアロアドヘシンに結合したウイルスをサンプル中のその他の成分から分離することで前記ウイルスの単離が可能になる。本発明の検出および単離方法によれば、タンパク質マーカーよりもむしろエンベロープの脂質マーカーを用いてＨＩＶウイルス粒子を同定できる。このことは重要である。何故なら、ウイルスタンパク質マーカーは感染の間高率に変異しており、異なる患者のウイルス感染を検出するか、または個々の患者からウイルスを単離する際に、単一のウイルス検出系は有効でない可能性があるためである。したがってこの方法は、サンプルからＨＩＶを検出または単離するための診断用アッセイとして有用である。このように別の実施形態によれば、本発明は、サンプル中のエンベロープウイルスを検出するための方法に関し、該方法は、
（ｉ）前記サンプルを、シアロアドヘシン、またはシアリルラクトースへの結合能を実質的に保持する、シアロアドヘシンの機能的に等価な変異体と接触させ、そして
（ｉｉ）前記シアロアドヘシンもしくはその機能的に等価な変異体に結合したウイルスを検出する工程を少なくとも含んでなる。
【０１９１】
用語「機能的に等価な変異体」がシアロアドヘシンに関する場合、この用語は、シアロアドヘシンの骨格内に、シアリルラクトースまたはシアリルラクトースを含有する分子への結合能が実質的に保存されているという条件で、１以上のアミノ酸の修飾、挿入、または欠失を有するシアロアドヘシン由来の全てのポリペプチドとして理解される。
【０１９２】
シアリルラクトースへの結合活性を実質的に保持する、シアロアドヘシンの機能的に等価な変異体のシアリルラクトースに対する親和性は、少なくとも１０１５Ｍ−１、１０１４Ｍ−１、１０１３Ｍ−１、１０１２Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、または１０９Ｍ−１である。別の実施形態によれば、本発明での使用に適したシアロアドヘシンの機能的に等価な変異体には、シアリルラクトースまたはシアリルラクトースを含有する分子に対する天然のシアロアドヘシンの結合活性の、少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、またはそれ未満の結合活性を示す変異体が含まれる。
【０１９３】
シアロアドヘシンの機能的に等価な変異体の適切なものは、シアロアドヘシンのシアリルラクトースへの、またはシアリルラクトースを含有するガングリオシドを表面に有する、ガングリオシド含有細胞への結合親和性を決定するための標準的なアッセイを用いて同定できる。例えばシアロアドヘシンの機能的に等価な変異体の適切なものは、固定化シアロアドヘシンの、異なる結合のシアル酸（たとえばＮｅｕＡｃａ２−３Ｇａｌｂ１−３ＧａｌＮＡｃ、ＮｅｕＡｃａ２−３Ｇａｌｂ１−３（４）ＧｌｃＮＡｃ、またはＮｅｕＡｃａ２−６Ｇａｌｂ１−４ＧｌｃＮＡｃ）を含有するように誘導体化されたヒト赤血球への結合能に基づいた固相アッセイを用いて同定できる。  Ｖｉｎｓｏｎ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６；２７１：９２６７−９２７２）参照。アッセイのコントロールとして、誘導体化されていない赤血球を用いることができる。シアロアドヘシンの機能的に等価な変異体の適切なものは、あるいは、シアロアドヘシンを含む固定化融合タンパク質の、ポリアクリルアミドを含有する複合糖質（例えばＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ、またはＮｅｕＡｃα２，６Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ）への結合を検出する固相アッセイを用いて同定できる。Ｈａｒｔｎｅｌｌ  Ａ，ｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００１；９７：２８８−２９６参照。
【０１９４】
機能的に等価な変異体は、シアロアドヘシンに対して少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％よりも高い同一性を示すものであってもよい。
【０１９５】
第１の工程で、本発明に従った診断法は、エンベロープウイルスを含むことが疑われるサンプルをシアロアドヘシンに接触させることを含む。
【０１９６】
本発明の方法に従って分析されるサンプルとしては、体液（例えば血清、血液、尿、唾液、膵液、脳脊髄液、精液）である生体試料、および流動性の生体試料のいずれか（例えば組織または生検抽出物、糞便抽出物、痰）が挙げられ、本発明のアッセイに用いられてもよいと考えられる。最も好ましくは、アッセイされる生体試料は血清または血漿である。
【０１９７】
結合に基づく検出アッセイには、典型的には検出試薬が結合する固相材料の使用が含まれるが、該アッセイは固定化されていない抗原および抗体の結合（すなわち液相免疫アッセイ）を含むように適応されてもよい。固相を反応混合物から取り除くことにより（例えば洗浄によって）、過剰のサンプル、アッセイ用試薬、およびその他の物質から反応生成物が分離される。したがって好ましい実施形態によれば、シアロアドヘシンまたはその機能的に等価な変異体は固定化される。
【０１９８】
本発明のアッセイには、様々な固相支持体のいずれかが用いられてよい。固相支持体に適した材料は、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、またはその他の合成ポリマーのような合成物、セルロースのような天然ポリマー、およびセルロースアセテートまたはニトロセルロースのような誘導体化された天然ポリマー、ならびにガラス、特にガラス繊維である。支持体は、球形、棒状、管、およびマイクロアッセイまたはマイクロタイタープレートの形を取ることができる。ペーパーストリップのようなシート様構造、小プレート、および膜が適すると思われる。担体の表面は、水溶液に対して透過性または不透過性であってよい。
【０１９９】
好ましい実施形態によれば、エンベロープウイルスは、ＨＩＶおよびエボラウイルスからなる群から選択される。さらに好ましい実施形態によれば、ＨＩＶはＨＩＶ−１である。
【０２００】
第２の工程において、本発明に従った検出法は、前記シアロアドヘシンまたはその機能的に等価な変異体に結合したエンベロープウイルスの検出を含む。
【０２０１】
エンベロープウイルス粒子の検出は、当該技術分野において公知の様々な技術を用いて行うことができ、エンベロープウイルスゲノムの検出、さらに好ましくはエンベロープウイルス核酸（すなわち場合によりＲＮＡまたはＤＮＡ）の検出およびエンベロープウイルスタンパク質の検出が挙げられる。ＲＮＡおよびタンパク質の発現を検出する方法は当該技術分野において公知であり、その概要は上に記載した。一態様によれば、エンベロープウイルスはＨＩＶである。別の実施形態によれば、ＨＩＶの検出は、１以上のＨＩＶタンパク質に対する抗体の結合によって行われる。検出に用いるために適したＨＩＶタンパク質としては、ＨＩＶエンベロープに存在するポリペプチド（ｅｎｖ；例えばＮＣＢＩ参照配列、ＮＰＪ３５７８５６）、ｇａｇ（例えばｐ６、ｐ７、ｐ１７、ｐ２４、ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＤ３９４００Ｊ）、ｐｏｌによりコードされるプロテアーゼ（例えばＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０３３６６）、ｎｅｆ（例えばｆｅｎＢａｎｋ−ＣＡＡ４１５８５Ｊ、Ｓｈｕｇａｒｓ，１９９３、上記）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０２】
本発明の好ましい実施形態によれば、シアロアドヘシンまたはその機能的に等価な変異体は固相支持体に結合され（すなわち固定化）、抗ＨＩＶ抗体の有無を調べる生体試料と接触した状態でインキュベートされる。非特異的結合を減少させるため、ブロッキング剤が添加されてよい。
【０２０３】
シアロアドヘシンまたはその機能的に等価な変異体は、生体試料と共に未結合の状態でインキュベートされ、次に固相支持体に結合（すなわち固定化）されてもよいことが理解されるであろう。続いて支持体はさらに好ましく処理され（例えば洗浄により）、非特異的に結合した成分が実質的に除去される。このような処理に続いて、シアロアドヘシンまたはその機能的に等価な変異体とエンベロープウイルスとの間に複合体が形成され得る。
【０２０４】
本発明に従って用いてもよい固相アッセイの一つの型は、サンドイッチアッセイである。サンドイッチアッセイでは、固相に存在する標識が、サンプル中に存在する検体の量と直接比例する。このような型のアッセイフォーマットでは、固相上の標識の様子がさらに容易に検出されるため、一般には特に低濃度の検体を可視化するために好ましい。
【０２０５】
次に、検出可能なように標識された抗体（エンベロープウイルス成分に結合可能である）を好ましく添加し、存在する可能性のあるいずれかのエンベロープウイルスに抗体が結合するために十分な条件下で支持体をインキュベートする。続いて支持体をさらに好ましく処理し（例えば洗浄により）、いずれの未結合抗体も実質的に除去する。試験サンプル中にエンベロープウイルスが存在する場合には、抗体とエンベロープウイルスとが免疫複合体を形成し得る。このようなアッセイでは、支持体に結合した抗体の検出は、試験されるサンプル中のエンベロープウイルスの存在を示している。Ｓｃｈｕｕｒｓ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，０１６，０４３号、およびＰａｎｋｒａｔｚ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，８７６，９３５号参照。抗体は、非ヒト種から単離した天然の免疫グロブリン（例えばマウス抗ヒトＩｇＧ抗体、ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体、ヤギ抗ヒトＩｇＭ抗体）であってよいか、または組み換えもしくは合成によって産生できる。抗体は未変化の免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片（例えばＦＡｂ、Ｆ（Ａｂ）２）であってよい。所望により、そのような抗体と共に、またはその代わりに、その他の結合分子（エンベロープウイルスに結合可能である）が用いられてよい。例えば抗体をビオチン化して、標識したアビジンまたはストレプトアビジンを二次抗体の代わりに用いてもよい。
【０２０６】
未結合のものを分離する工程を除き、化学的結合アッセイに必要な時間と機器を減らすため、均一なアッセイフォーマットが代わりに用いられてよい。このようなアッセイでは、結合ペアのうちの１成分がなお固定化されるが、結合ペアの第２成分の存在が、未結合のものを分離することなく検出される。均一な光学的方法の例としては、蛍光クエンチングの検出を通して操作するＥＭＩＴ法（Ｓｙｖａ，Ｉｎｃ．，サニーベール、カリフォルニア州、米国）；光散乱の変化を検出することにより操作するレーザーネフェロメトリーラテックス粒子凝集法（Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ  ＧｍｂＨ、マールブルグ、独国）；ＬＰＩＡラテックス粒子凝集法（三菱化学株式会社、東京、日本）；ＴＤＸ蛍光脱分極法（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，アボット・パーク、イリノイ州、米国）；および蛍光エネルギー転移法（ＣｉｓＢｉｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＳＡ、パリ、フランス）が挙げられる。このようなアッセイのいずれも、本発明の目的に沿うように適応されてよい。
【０２０７】
本発明の結合アッセイは、競合アッセイとして設定されてよい。競合アッセイでは、試験サンプル中に存在するエンベロープウイルスの濃度が高いほど、固相に存在する標識の量は少なくなる。
【０２０８】
サンドイッチアッセイと同様の様式で、競合アッセイは、標識されたエンベロープウイルスを規定量提供すること、および支持体への結合に対して標識抗体と競合し得る同型のエンベロープウイルスが含まれるか否かについて決定することによって実施できる。このような競合アッセイでは、捕捉された標識エンベロープウイルスの量は、試験サンプル中に存在する検体の量とは反比例する。
【０２０９】
このようなアッセイフォーマットの全てにおいて、アッセイ試薬の少なくとも１成分が好ましく標識されるか、または光の発生もしくは消光によって検出される。このような成分は、使用する免疫アッセイのフォーマットに応じて、二次抗体、抗ＨＩＶ抗体、または抗ＨＩＶ抗体に結合するペプチドであってよい。放射性同位元素結合アッセイフォーマット（例えば放射性免疫測定法）には、このような標識として放射性同位元素が用いられており、シグナルは、蛍光または蛍光性成分の存在下での光の発生により検出可能である。Ｌｕｃａｓ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，６９８，４１１号、およびＬａｎｄｒｕｍ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，９７６，８２２号参照。酵素結合アッセイフォーマット（例えばＥＬＩＳＡ）には、標識として酵素が用いられており、シグナルは、発色性または蛍光性成分の存在下での色または光の発生により検出可能である。常磁性標識、着色した粒子として用いられる材料、ラテックス粒子、セレニウムおよび金のようなコロイド性金属、および色素粒子のようなその他の標識もまた用いられてよい。Ｌｅｕｖｅｒｉｎｇ  Ｊ，米国特許第４，３１３，７３４号、Ｇｒｉｂｎａｕ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，３７３，９３２号、およびＢａｕｇｈｅｒ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，５０１，９８５号参照。検出可能な標識（すなわち酵素免疫アッセイまたはＥＭ）としては、酵素（特にアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、またはウレアーゼ）の使用が好ましい。
【０２１０】
酵素標識の存在は、発色性基質（蛍光、ＵＶ、可視光線を発生または吸収するものを含む）の使用を通し、酵素標識の触媒作用に反応して検出され得る。酵素がアルカリホスファターゼである場合、基質としては、化学発光基質、例えばＡＭＰＰＤ（登録商標）（３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３’’−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン）、ＣＤＰ−ｓｔａｒ（登録商標）（４−クロロ−３−（メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン｝−４−イル）フェニルホスフェート・二ナトリウム）、およびＣＳＰＤ（登録商標）（３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン｝−４−イル）フェニルホスフェート・二ナトリウム）；発色性基質、例えばｐ−ニトロフェニルリン酸、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、４−ニトロブルーテトラゾリウムクロリド（ＮＢＴ）、およびヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）が挙げられる。
【０２１１】
さらに好ましくは、化学標識が用いられてよい（例えばコロイド金、ラテックスビーズ標識）。標識は、多重検出器、多重パスフィルター、格子、または異なるスペクトルの蛍光を用いて検出できる。Ｗａｒｄ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，７５９，７８１号参照。酵素標識としては、ペルオキシダーゼを、特に発色性基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ＯＰＤ、またはＡＢＴＳとあわせて用いることが特に好ましい。抗体を標識する酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合には、過ヨウ素酸塩による技術、またはヘテロ二官能性の試薬を用いることが可能である。Ｎａｋａｎｅ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１９７４；２２：１０８４−１０９０、およびＩｓｈｉｋａｗａ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ．１９８３；４９（３）：２０９−３２７参照。
【０２１２】
本発明のアッセイにおいて用いられる材料は、キットの調製に理想的に適したものである。このようなキットには、バイアルまたはチューブのような、１以上のコンテナー手段が含まれてよく、それぞれのコンテナー手段はアッセイ試験を実現する際に用いられる、別々の要素の一つを含む。例えばコンテナー手段の一つは、シアロアドヘシンまたはその機能的に等価な変異体を含んでよく、第２のコンテナーは、検出可能に標識された可溶性の抗エンベロープウイルスを、好ましくは凍結乾燥の形で、または溶液中に含んでよい。加えて、キットには１以上のコンテナーが含まれてもよく、各コンテナーは、（異なる）予め決定された量のエンベロープウイルス、またはシアリルラクトース成分含有ガングリオシドを含む脂質粒子を含む。後者のコンテナーは、未知量のエンベロープウイルスを含むサンプルから得た結果を適用できる標準曲線を準備するために用いることができる。
【０２１３】
キットの使用に当たり、使用者には、測定可能な未知量のエンベロープウイルスを含むことが疑われるサンプルの予め計量した量、第２のコンテナー内の検出可能に標識された抗体の予め計量した量をコンテナーへ加えることのみが要求される。適切な時間インキュベートした後に形成された免疫複合体を（サンプルがエンベロープウイルスを含んでいた場合）上清から分離して、この免疫複合体または上清に対し、放射活性の計数、酵素基質の添加および発色、または化学標識（例えばコロイド金、ラテックスビーズ）の含有によって検出を行う。
【０２１４】
別の実施形態によれば、本発明は、エンベロープウイルスをサンプルから単離するための方法を提供し、該方法は、
（ｉ）前記サンプルを、シアロアドヘシン、またはシアリルラクトースへの結合能を実質的に保持する、シアロアドヘシンの機能的に等価な変異体と接触させ、そして
（ｉｉ）前記シアロアドヘシンもしくはその機能的に等価な変異体に結合したウイルスを単離する工程を少なくとも含んでなる。
【０２１５】
好ましい実施形態によれば、シアロアドヘシンまたはその機能的に等価な変異体をマトリックスに結合させて、例えば培養細胞から、または血液および肝臓のような生物組織から、エンベロープウイルスを親和性精製するために用いてよい。シアロアドヘシンまたはその機能的に等価な変異体は、例えば、基質または支持体に付着させるか、または固定化させてよい。次にエンベロープウイルスの決定因子を含む溶液を、シアロアドヘシンとエンベロープウイルスとの複合体形成に適した時間と条件で、固定化されたシアロアドヘシンに接触させる。接触の工程で用いられる条件は調節される（例えばｐＨ、または塩濃度、すなわち溶液中のイオン強度によって）。シアロアドヘシンまたはその変異体の量が限度を超えないように注意しなければならない（すなわち満足に吸着されるように、フローは十分に遅くなければならない）。この工程で、溶液中のその他の成分は、原則的には妨げられずに通り過ぎる。続いて、残っているかまたは弱く結合している物質を除くため、マトリックスを任意に洗浄する（例えば水溶液により）。
【０２１６】
次の工程で、結合した複合体から未結合の物質を分離する。続いて支持体からエンベロープウイルスを分離する。分離（ａｋａ溶出）は、通常、溶出剤として示される第２溶液を用いて行われ、この溶液は脱離（すなわちシアロアドヘシンまたはその変異体からのＨＩＶの放出）を起こす条件下でマトリックスを通過する。このような条件は一般にｐＨまたは塩濃度（例えばイオン強度、疎水性）の変化によって提供される。勾配溶出および段階的溶出のような、様々な溶出スキームが知られている。溶出は、マトリックス上のＨＩＶを置換し得る競合物質を含む第２溶液によっても行うことができる。
【０２１７】
好ましい実施形態によれば、エンベロープウイルスは、ＨＩＶおよびエボラウイルスからなる群から選択される。さらに好ましい実施形態によれば、ＨＩＶはＨＩＶ−１である。
【０２１８】
別の実施形態によれば、本発明は、固定化されたシアロアドヘシン、またはシアリルラクトースへの結合能を実質的に保持する、シアロアドヘシンの機能的に等価な変異体を含むキットを提供する。固定化されたシアロアドヘシン、またはその機能的に等価な変異体は、サンプル中のエンベロープウイルスの検出、およびエンベロープウイルスの単離に有用である。
【０２１９】
シアロアドヘシンが結合する支持体は、例えば別々の粒子、好ましくは多孔性かつ球状の粒子；モノリス；または膜の形である。本発明は、アフィニティークロマトグラフィーの実行に適した系も包含し、この系には、上で定義した分離マトリックスカラムの使用が含まれる。カラムは、分析用の規模、または大規模なクロマトグラフィーに適した大きさであってよい。
【０２２０】
適切な支持体材料は公知である。一つの実施形態によれば、支持体は天然ポリマー（例えばアガロース、アルギン酸塩、カラギーナン、ゼラチン）である。このような天然ポリマーは、所望により冷却するか、または二価の金属イオンの添加、および化学架橋剤の添加によって、物理的な架橋ネットワークが自発的に形成されることが知られている。これらの支持体は、逆懸濁ゲル化のような標準的方法に従って容易に調製される。Ｈｊｅｒｔｅｎ  Ｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １９６４；７９（２）：３９３−３９８参照。別の実施形態によれば、支持体は、架橋された合成ポリマー（例えばスチレン、またはスチレン誘導体、ジビニルベンゼン、アクリルアミド、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、ビニルエステル、ビニルアミド）から構成される。このようなポリマーもまた、標準的方法に従って容易に産生される。Ａｒｓｈａｄｙ  Ｒ，Ｃｈｉｍｉｃａ  ｅ  Ｌ’ｌｎｄｕｓｔｒｉａ  １９８８；７０（９）：７０−７５参照。したがって要約すれば、支持体材料は、本発明のｇｐ１２０結合化合物を共有結合できるものであれば、原則的にはどのような材料でもよい（例えば上述のポリマー、シリカ、セラミックのような無機材料）。
【０２２１】
公知の方法の多くでは、適切な官能基を通してリガンドを支持体に固定化できる。結合方法の的確な選択は、固定化されるリガンドの構造に依存する。一つの実施形態によれば、支持体は親水性の表面を有し、これが多孔性である場合には、細孔の表面もまた親水性である。このことは、非特異的なタンパク質相互作用を回避するか、または少なくとも減少させるために有利である。また、リガンドを結合できる基が該表面に高密度に存在していればなお有利である。このような結合基は一般には水酸基であるが、グラフト処理が可能な二重結合を有する基、アミン、チオール、またはエポキシドのようなその他の遊離基もまた含まれ得る。支持体材料の表面特性が望ましくないものであれば、リガンドを結合させる前に、表面を親水性のポリヒドロキシ−官能性材料でコートすることが可能である。親和性リガンドを適切な支持体に結合させて分離用マトリックスを調製するための技術および考察については、当該技術分野において公知である。Ｂｅｒｇ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，国際公開第１９９８０３３５７２号参照。
【０２２２】
６．本発明のコンジュゲート
シアロアドヘシンが、エンベロープウイルスのエンベロープに見出されるガングリオシドに存在するシアリルラクトース残基に特異的なリガンドとして同定されたことにより、目的化合物をシアロアドヘシンに結合させて、前記化合物をエンベロープウイルスにターゲティングするために、シアロアドヘシンを用いることが可能になる。シアロアドヘシンまたはその機能的に等価な変異体はさらに、治療用薬物に、またはエンベロープウイルスの同定を可能にする色素、蛍光分子、診断用酵素、もしくは放射性標識物質に、または治療の標的であるエンベロープウイルスに結合させることができる（すなわち直接に、またはスペーサー分子を介して）。
【０２２３】
したがって別の実施形態によれば、本発明は、シアロアドヘシン、またはシアリルラクトースへの結合能を実質的に保持する、シアロアドヘシンの機能的に等価な変異体と、治療薬とを含むコンジュゲートに関する。
【０２２４】
好ましい実施形態によれば、治療薬は抗ＨＩＶ剤である。別の好ましい実施形態によれば、抗ＨＩＶ剤は、侵入および融合阻害剤、インテグラーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、およびプロテアーゼ阻害剤からなる群から選択される。
【０２２５】
本発明のコンジュゲートは、当業者に公知のいずれかの方法を用いて得ることができる。このように、シアロアドヘシンまたは前記タンパク質の変異体は、いずれかの標準的方法を用いて得ることが可能である。例えばシアロアドヘシンは、ポリペプチドが自然に発生するか（例えばマクロファージ）、またはｃＤＮＡからの組み換えによって、例えば大腸菌、出芽酵母、またはピキア・パストリスのような異種生物内での発現によって発生する細胞からの精製によって得ることができる。精製されたシアロアドヘシンまたはその機能的に等価な変異体の十分な量がいったん得られると、次に目的化合物を結合させなければならない。結合は様々な方法によって行うことができる。一つの可能性は、官能基を目的薬剤へ、前記成分の活性を妨げない位置において直接結合することである。本発明における官能基とは、分子の特徴的な化学反応に関与する、前記分子内の特異的な原子による基を指すことが理解される。官能基の例としては、ヒドロキシ、アルデヒド、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、カルボキサミド、第一級、第二級、第三級、および第四級アミン、アミノオキシ、アジド、アゾ（ジイミド）、ベンジル、炭酸塩、エステル、エーテル、グリオキシリル、ハロアルキル、ハロホルミル、イミン、イミド、ケトン、マレイミド、イソシアン化物、イソシアネート、カルボニル、硝酸塩、亜硝酸塩、ニトロ、ニトロソ、過酸化物、フェニル、ホスフィン、リン酸塩、ホスホノ、ピリジル、硫化物、スルホニル、スルフィニル、チオエステル、チオール、および酸化型の３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）基が挙げられるが、これらに限定されない。前記の基の例としては、Ａｐｏ  Ａ分子のチオール基と特異的に反応するマレイミドまたはグリオキシリル基、およびＥＤＡ分子の第一級アミノ基と反応する酸化型の３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）基が挙げられる。
【０２２６】
治療薬をシアロアドヘシンまたはその機能的に等価な変異体に結合させるもう一つの可能性は、ホモまたはヘテロ二官能性基の使用である。二官能性基は、最初に治療的活性を有する化合物に結合され、次にシアロアドヘシンに結合されるか、あるいは二官能性基をシアロアドヘシンに結合して、次に治療薬に結合することも可能である。この型のコンジュゲートの実例としては、ケトン−オキシムとして知られるコンジュゲートが挙げられ、ここではコンジュゲートの第１成分がヘテロ二官能性基に存在するケトン基に結合するアミノオキシ基を含み、この二官能性基が次にコンジュゲートの第２成分のアミノ基に結合する。Ｌａｍ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第２００５０２５５０４２号参照。
【０２２７】
別の実施形態によれば、シアロアドヘシンと治療薬とを結合させるために用いられる薬剤は、光分解性、化学的、熱的、または酵素的に処理するものであってよい。特に標的細胞内の酵素によって加水分解され得る結合剤の使用に興味がもたれ、これによれば治療的活性を有する化合物は細胞内でのみ放出される。ＭｃＣａｌｌ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，国際公開第２００４０５４６２２、Ｃｈｉｅｎ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，国際公開第２００６１０７６１７号、Ｃｈａｎ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，国際公開第２００７０４６８９３号、およびＧｏｖｉｎｄａｎ  Ｓ，国際公開第２００７１１２１９３号参照。
【０２２８】
治療的活性を有する化合物が、オリゴペプチド、ペプチドおよびタンパク質の両方を含む天然ペプチドの化合物である好ましい実施形態によれば、当業者に広く知られた方法を用いて、タンパク質が第２のポリペプチドに共有結合できるようにポリペプチド鎖を化学修飾することが可能である。したがって２つのポリペプチドを共有結合させるために適した方法としては、システイン成分に存在するチオール基を介した結合に基づく方法、リジン成分に存在する第一級アミノ基を介した結合に基づく方法、ＮおよびＣ末端部分を介した結合に基づく方法を用いることができる。Ｍｏｒｓｅｍａｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，８０９，１８６号参照。ポリペプチドがその他の化合物に結合できるように修飾する適切な試薬としては、グルタルアルデヒド（すなわち化合物の、ポリペプチドのＮ末端への結合を可能にする）、カルボジイミド（すなわち化合物の、ポリペプチドのＣ末端への結合を可能にする）、Ｎ末端およびシステイン成分を活性化させるサクシニミドエステル（例えばＭＢＳ、ＳＭＣＣ）、チロシン成分を活性化させるベンジジン（ＢＤＢ）、およびグリコシル化されたタンパク質中の炭水化物成分を活性化させる過ヨウ素酸塩が挙げられる。
【０２２９】
治療的活性を有する化合物が天然のペプチドである特定の場合には、コンジュゲートをコードする本発明の遺伝子コンストラクトを用いて、単一の工程で前記コンジュゲートを発現させることが可能であり、そのために前記コンストラクトは、異種生物内での発現に適したベクター内へ、転写調節エレメント、および任意に翻訳調節エレメントと共に導入される。本発明の発現カセット内の転写調節エレメント、および任意の翻訳調節エレメントには、それらが作動的に結合されたヌクレオチド配列の転写を誘導するプロモーター、ならびに転写の時間および場所を適切に調節するために必用であるかまたは適したその他の配列、例えば開始および終止シグナル、切断部位、ポリアデニル化シグナル、複製起点、転写エンハンサー、または転写サイレンサーが含まれる。本発明に従った発現カセットおよび組み換えベクターの構築に用いる前記エレメントおよびベクターは、一般に、使用する宿主細胞に従って選択される。
【０２３０】
本発明の組成物は、治療される哺乳類（ヒトを含む）へ、当該技術分野において公知のいずれかの手段によって（例えば経口的、鼻腔内、皮下、筋肉内、皮内、静脈内、動脈内、非経口的に、またはカテーテル法によって）投与されてよい。
【０２３１】
本発明はさらに、１以上のウイルス阻害剤をターゲティングして、ウイルス感染、好ましくはＨＩＶ／ＡＩＤＳウイルス感染に対する相乗効果を得るための担体としての、シアロアドヘシンまたはその機能的に等価な変異体を含む組成物の使用に関する。本実施形態の枠内では、ウイルス阻害剤は、侵入および融合阻害剤、インテグラーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、およびプロテアーゼ阻害剤からなる群から選択される。
【０２３２】
さらに一般的には、本発明は、シアロアドヘシンと、従来使用される適切な検出可能標識、例えば蛍光標識、発光標識、化学発光標識、酵素標識、放射性標識、または光吸収標識との複合体に関する。
【０２３３】
本発明の複合体は、エンベロープウイルスの感染に関連する疾病の治療または予防に対する被験体の必要に応じて、被験体に投与されてよい。したがって別の態様によれば、本発明は、エンベロープウイルスの感染により引き起こされる疾病の治療に使用するための、本発明に従った複合体に関する。
【０２３４】
別の態様によれば、本発明は、エンベロープウイルスの感染により引き起こされる疾病を治療する薬剤を製造するための、本発明に従った複合体の使用に関する。
【０２３５】
別の態様によれば本発明は、エンベロープウイルスの感染により引き起こされる疾病を患う被験体を、その必要に応じて治療する方法に関し、該方法は、本発明に従った複合体を前記被験体に投与することを含む。
【０２３６】
好ましい実施形態によれば、エンベロープウイルスの感染により引き起こされる疾病は、フィロウイルス科ファミリーのウイルスにより引き起こされる疾病、およびレトロウイルスにより引き起こされる疾病からなる群から選択される。
【０２３７】
好ましい実施形態によれば、エンベロープウイルスはＨＩＶであり、この場合に複合体はＨＩＶ感染に関連する疾病の治療のために用いられる。
【０２３８】
７．目的化合物の、抗原提示細胞への送達方法
別の実施形態によれば、本発明は、目的化合物を抗原提示細胞に送達する方法に関し、この方法は、前記抗原提示細胞と前記化合物を含む脂質微小胞とを接触させる工程を含み、ここで前記脂質粒子は、シアリルラクトース成分を含有する分子を少なくとも一つ含んでなるものである。
【０２３９】
本発明の方法を用いて抗原提示細胞に送達できる化合物として以下のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない：
１）抗原。適切な抗原としては、上に定義したウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原虫抗原、アレルゲンすなわち環境性抗原、または腫瘍抗原のうち１以上が挙げられる。
２）上に定義した抗レトロウイルス剤。好ましくは、抗レトロウイルス剤は侵入および融合阻害剤、インテグラーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、およびプロテアーゼ阻害剤からなる群から選択される。
３）核酸（例えばｄｓＲＮＡ、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、プラスミド、アンチセンス、およびリボザイム）。
４）放射性同位元素、例えば１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、９９ｍＴｃ、および３２Ｐ。このような組成物は、例えば、樹状細胞の活性異常を伴う自己免疫疾患の被験体を治療するために有用である。毒素による樹状細胞の消失により、自己免疫疾患（例えば多発性硬化症、関節リウマチ、自己免疫疾患）が緩和される場合がある。
５）酵素活性を有する毒素およびその断片、例えばジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の未結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファサルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、アメリカヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰ  Ｉ、ＰＡＰ  ＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテシン。このような組成物は、例えば、樹状細胞の活性異常を伴う自己免疫疾患の被験体を治療するために有用である。毒素による樹状細胞の消失により、自己免疫疾患（例えば多発性硬化症、関節リウマチ）が緩和される場合がある。
６）免疫抑制剤、例えば特定のグルココルチコイド（例えばデキサメタゾン、タクロリムス、シクロスポリンＡ）。共刺激分子（すなわちＣＤ８０およびＣＤ８６）の発現および炎症性サイトカイン（すなわちＩＬ−６およびＴＮＦ−α）の分泌を減少させることによって、ＤＣの成熟およびアロ刺激能を阻害する。
７）検出可能な基を有する化合物。検出可能な基は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、または化学的手段のような、検出可能な物理的または化学的特性を有するいずれかの物質であってよい。本発明の有用な標識としては、蛍光色素（例えばフルオレセインイソチオシアネート、アレクサ色素、テキサスレッド、ローダミン）、放射性標識および発色性標識、例えばコロイド金もしくは色ガラス、またはプラスチック（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス）ビーズが挙げられる。
【０２４０】
好ましい実施形態によれば、目的化合物は抗原である。第２の態様によれば、化合物は抗レトロウイルス剤である。好ましくは、化合物は抗原である。
【０２４１】
リポソームの産生に適した試薬としては、リン脂質が挙げられるがこれに限定されるものではない。リポソームは、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、またはこれらの組み合わせを含有し得る。
【０２４２】
本発明に従ったリポソームの調製に適したグリセロリン脂質としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：
１）不飽和脂肪酸、例えばジステアロイル−ホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ｌ，２−ジステアロイル−ｓ／ｚ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＣ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、および／またはホスファチジルグリセロール（ＰＧ）を含有するグリセロリン脂質、
２）飽和脂肪酸、例えばジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、およびジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）を含有するグリセロリン脂質もまた、リポソーム産生に使用できる、および
３）飽和および不飽和脂質、例えば１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）および１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）を含有するグリセロリン脂質。
【０２４３】
本発明に従ったリポソームの調製に適したスフィンゴ脂質としては、スフィンゴミエリンが挙げられるがこれに限定されるものではない。
【０２４４】
陽イオンリポソームが好ましい場合にはステアリルアミンを用いることができ、陰イオンのリポソームが望ましい場合には、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ＰＧ、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ＰＡ、およびカルジオリピン（ＣＬ）のような、天然の酸性脂質を添加することができる。幾つかの実施形態によれば、リポソームの二重層を安定化させるために、コレステロールを含有させてもよい。多価不飽和の天然脂質を用いる場合には、限定はされないがα−トコフェロール、またはβ−ヒドロキシトルイジン（ＢＨＴ）のような抗酸化剤を少量含有させてもよい。
【０２４５】
リポソームの大きさの範囲は、２０ナノメートルから１０００ナノメートルを超える。したがってリポソームは、２０ｎｍ、２５ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、２５０ｎｍ、３００ｎｍ、３５０ｎｍ、４００ｎｍ、４５０ｎｍ、５００ｎｍ、５５０ｎｍ、６００ｎｍ、６５０ｎｍ、７００ｎｍ、７５０ｎｍ、８００ｎｍ、８５０ｎｍ、９５０ｎｍ、または１００ｎｍであってよい。代表的な実施形態によれば、リポソームの範囲は１００ｎｍないし２００ｎｍである。リポソームの大きさは、超音波処理および濾過のような方法によって調節できる。リポソームは多様であり、異なる大きさおよび脂質組成物によって形成できる。Ｂａｓｕ  Ｓ，Ｂａｓｕ  Ｍ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１９９，“Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ  Ｇ，Ｅｄ．（Ｉｎｆｏｒｍａ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳ，２００６）参照。
【０２４６】
異なる成分の比は、随意に調整してよいことが理解されるであろう。好ましい実施形態によれば、リポソームには、シアリルラクトース成分を含有する分子に加え、グリセロ脂質、コレステロール、およびスフィンゴミエリンが含まれる。
【０２４７】
好ましい実施形態によれば、グリセロ脂質とコレステロールの比は４１／４５である。好ましい実施形態によれば、グリセロ脂質とスフィンゴ脂質（好ましくはスフィンゴミエリン）の比は４１／１０である。別の実施形態によれば、コレステロールとスフィンゴ脂質の比は９／２（ｗ／ｗ）である。
【０２４８】
好ましい実施形態によれば、グリセロ脂質は１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、またはそれらの組み合わせである。さらに好ましい実施形態によれば、リポソームはＰＯＰＣとＤＰＰＣを２５／１６の比で含有する。別の実施形態によれば、リポソームは、２５％ｍｏｌのＰＯＰＣ、１６％ｍｏｌのＤＰＰＣ、４５％ｍｏｌのコレステロール、および１００％ｍｏｌとするために十分なスフィンゴミエリンを含有する。好ましい実施形態によれば、リポソームは４％のガングリオシドを含有し、この場合のスフィンゴミエリンの含有量は１０％である。
【０２４９】
本発明における使用に適したガングリオシドとしては、シアリルラクトース残基および４個未満のシアル酸残基を含有するいずれかのガングリオシドが挙げられる。好ましい実施形態によれば、シアリルラクトース成分を含有する分子は、４個未満のシアル酸基を含有するガングリオシドである。さらに好ましい実施形態によれば、ガングリオシドは表１に示すものである。さらになお好ましい実施形態によれば、ガングリオシドはＧＭ１、ＧＭ２、ＧＭ３、ＧＤ１ｂ、およびＧＴ１ｂからなる群から選択される。
【０２５０】
リポソームのコアは水性で、抗原提示細胞に送達される化合物を保持するために用いられる。好ましい実施形態によれば、化合物は抗原性のポリペプチド、例えばウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原虫抗原、アレルゲンすなわち環境性抗原、分化抗原、または腫瘍抗原の免疫原性断片である。さらに好ましい実施形態によれば、抗原はウイルス抗原である。さらになお好ましい実施形態によれば、抗原はＨＩＶ抗原である。
【０２５１】
好ましい実施形態によれば、抗原提示細胞はシアロアドヘシンを発現する細胞である。さらに好ましい実施形態によれば、抗原提示細胞は樹状細胞である。
【０２５２】
一つの実施形態によれば、本明細書に記載される方法は、ｅｘ  ｖｉｖｏでの治療法において用いられる。例えば、目的化合物を含む脂質微小胞であって、前記脂質粒子がシアリルラクトース成分を含有する少なくとも１分子である脂質微小胞を免疫細胞（例えばシアロアドヘシンを発現する細胞、さらに好ましくは樹状細胞）とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させ、化合物を該細胞に取り込ませることができる。次に、疾患（例えば癌または自己免疫疾患）を治療するため、該細胞は患者に移入される（例えば注射によって）。一つの実施形態によれば、免疫細胞（例えば樹状細胞）は患者から抽出され、目的化合物を含む脂質微小胞と接触させて、薬剤を該細胞内に取り込ませる。
【０２５３】
あるいは、目的化合物を含む脂質微小胞は、当業者に公知の方法により、ｉｎ  ｖｉｖｏにて化合物を細胞に送達するためにも用いることができる。ｉｎ  ｖｉｖｏ投与のために、脂質微小胞は典型的には非経口投与される（すなわち関節内、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、または例えば埋め込み装置による皮下投与）。特定の実施形態によれば、医薬組成物は、ボーラス投与によって静脈内または腹腔内に投与される。Ｓｔａｄｌｅｒ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，２８６，６３４号参照。細胞内への核酸送達方法も、当該技術分野において公知である。Ｓｔｒａｕｂｒｉｎｇｅｒ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳ，１９８３，ｐｐ．５１２−５２７），Ｍａｎｎｉｎｏ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９８８；６：６８２−６９０，Ｎｉｃｏｌａｕ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．１９８９；６：２３９−２７１参照。脂質に基づいた治療法を施すための更に別の方法については、以前に記載されている。Ｒａｈｍａｎ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第３，９９３，７５４号、Ｓｅａｒｓ  Ｂ，米国特許第４，１４５，４１０号、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｓ，米国特許第４，２２４，１７９号、Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，２３５，８７１号、Ｌｅｎｋ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，５２２，８０３号、およびＦｏｕｎｔａｉｎ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，５８８，５７８号参照。
【０２５４】
別の実施形態によれば、目的化合物を含む脂質微小胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて化合物を細胞に送達するためにも用いることができる。
【０２５５】
上で言及した全ての刊行物は、引用することによりその全体が本明細書の開示の一部とされる。
【実施例】
【０２５６】
本発明について全体的に記載してきたが、本発明は以下の実施例の参照によってさらに容易に理解できるであろう。ただしこれらの実施例は説明の目的で提示されるのであり、特に断らない限り、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０２５７】
一般手順
１．ＨＩＶ−１の単離およびマススペクトロメトリー分析
ＨＩＶ−１ＮＬ４−３を感染させたＭＴ−４細胞と未感染細胞とを共培養した。細胞壊死効果が現れる前にウイルスを回収し、精製した。上記のＬｏｒｉｚａｔｅ，２００９参照。簡単に述べると、培地を濾過により浄化した後、２０％（ｗ／ｗ）スクロースのクッションを用いた超遠心分離法によって粒子を濃縮した。濃縮されたＨＩＶ−１を、ＯｐｔｉＰｒｅｐ（商標）勾配（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ  ＰｏＣ、オスロ、ノルウェー）を用いた速度勾配遠心分離によってさらに精製した。
【０２５８】
目に見えるウイルス画分を回収し、遠心分離によって濃縮した。最終的に得たペレットを１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）緩衝液中に再懸濁した後、液体窒素中で迅速に凍結して、−８０℃で保管した。脂質組成を分析するために、融解したサンプルをメタノール中に再懸濁し、ＵＰＬＣと、エレクトロスプレーイオン化を用いた直交加速飛行時間型質量分析計（ＬＣＴ  Ｐｒｅｍｉｅｒ；Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．，ミルフォード、マサチューセッツ州、米国）との組み合わせによって評価した。Ｗモードにおける質量範囲ｍ／ｚ５０〜１５００による陽イオン化モードを用いてデータを取得した。公称の機器解像度１１５００（ＦＷＨＭ）において、０．１５秒の走査時間および０．０１秒の走査間遅延を用いた。ロックスプレー検量体としてロイシン−エンケファリンを用いた。
【０２５９】
２．初代細胞培養
ＨＩＶ−１血清反応陰性の被験体から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を取得し、ＣＤ１４＋ポジティブセレクション磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ、ベルギッシュ・グラートバッハ、独国）を用いて単球集団を分離した（＞９７％  ＣＤ１４＋）。これらの細胞を、１，０００Ｕ／ｍｌの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ）の存在下で培養することにより、ＤＣを得た。５日目のｉＤＣを、１００ｎｇ／ｍｌのリポポリサッカライド（ＬＰＳ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，セントルイス、ミズーリ州、米国）の存在下でさらに２日間培養してｍＤＣに分化させた。７日目に、以前の記載に従ってＤＣの免疫表現型を決定した。上記のＩｚｑｕｉｅｒｄｏ−Ｕｓｅｒｏｓ，２００７参照。単球からｉＤＣへの適切な分化は、ＣＤ１４の消失およびＤＣ−ＳＩＧＮの取得の基づいて決定し、一方でＤＣの成熟化は、ＣＤ８３、ＣＤ８６、およびＨＬＡ−ＤＲの発現上昇に基づいて決定した。
【０２６０】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＨＩＶ−１血清反応陰性のドナーから取得し、単球集団、または骨髄系ＤＣを分離して、Ｉｚｑｕｉｅｒｄｏ−Ｕｓｅｒｏｓ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．，２００７，８１：７５５９−７５７０）の記載に従って培養した。単球由来の成熟ＤＣは、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、またはＩＴＩＰ（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘから入手した３００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−１β、１，０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−６、および１，０００ＩＵ／ｍｌ  ＴＮＦ−アルファ、ならびにＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した１μｇ／ｍｌ  ＰＧＥ２）と共に４８時間分化させることで得た。ＬＰＳによる骨髄系ＤＣは、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳと共に２４時間分化させることで得た。自己の、および異種性のＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＲｏｓｓｅｔｔｅＳｅｐ  α−ＣＤ８＋カクテル（幹細胞）を用いてＰＢＭＣから濃縮し、１０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２（Ｒｏｃｈｅ）を加えたＲＰＭ１＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で維持した。
【０２６１】
３．細胞株、プラスミド、およびウイルスストック
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞株はＤ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，カールスバッド、カリフォルニア州、米国）中で維持し、ＣＨＯおよびＭＴ４細胞はそれぞれα−ＭＥＭおよびＲＰＭＩ培地中で維持した。全ての培地は、１０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン、および１０μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，カールスバッド、カリフォルニア州、米国）を含んでいた。ＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰは、分子クローンｐＧａｇ−ｅＧＦＰ（ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ、ＮＩＨ、ベセスダ、メリーランド州、米国）をトランスフェクトすることによって得た。Ｔ７５フラスコ内のＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に、リン酸カルシウム（ＣａｌＰｈｏｓ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，フランクリン・レイクス、ニュージャージー州、米国）を用いて、３０μｇのプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。７×１０６のＣＨＯ細胞と４０μｇのプラスミドＤＮＡを用いて、エレクトロポレーションを行った（０．２４Ｋｖおよび９５０μＦ）。ＶＬＰを含む上清を濾過して（Ｍｉｌｌｅｘ  ＨＶ、０．４５μｍ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，ビレリカ、マサチューセッツ州、米国）、使用時まで−８０℃で凍結した。濃縮ＶＬＰを用いる試験のため、培地を回収して濾過により浄化した後、２０％（ｗ／ｗ）スクロースを用いた超遠心分離法（ＳＷ３２ローターを使用して、２８，０００ｒｐｍ、２時間、４℃）によって粒子を濃縮した。最終的に得たペレットを１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ  ７．４（Ｈｅｐｅｓ−ナトリウム緩衝液）中に再懸濁した後、液体窒素中で迅速に凍結して、−８０℃で保管した。感染性ウイルスストックおよびＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰのｐ２４Ｇａｇ含有量を、ＥＬＩＳＡ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｉｎｃ．，ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）および定量的ウェスタンブロットによって決定した。検出は、研究室製のウサギ抗カプシドｐＡｂ、および標準物質として精製Ｇａｇタンパク質を用い、ＬｉＣｏＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙシステムによって行った。
【０２６２】
ＨＥＫ−２９３ＴおよびＴＺＭ−ｂｌ（米国国立衛生研究所［ＮＩＨ］  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍを通してＪＣ  Ｋａｐｐｅｓ、Ｘ  Ｗｕから、およびＴｒａｎｚｙｍｅ  Ｉｎｃ．から入手した）は、Ｄ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で維持した。Ｒａｊｉ  Ｂ細胞株（Ｙ．ｖａｎ  Ｋｏｏｙｋから供与された）は、ＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。Ｒａｊｉ  ＤＣ−ＳＩＧＮ  Ｂ細胞株（Ｙ．ｖａｎ  Ｋｏｏｙｋから供与された）は、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えたＲＰＭＩ中で維持した。全ての培地は、１０％ＦＢＳ、１００ＩＵ／ｍｌ  ペニシリン、および１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎより入手）を含んでいた。ＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰおよびＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−Ｃｈｅｒｒｙは、以前の記載に従って得た（Ｉｚｑｕｉｅｒｄｏ−Ｕｓｅｒｏｓ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １１３：２７３２−２７４１）。ＨＩＶＮＬ４−３は、分子クローンｐＮＬ４−３（ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ  の  Ｍ．Ｍａｒｔｉｎより入手した）をトランスフェクトすることによって得た。ＨＩＶＮＬ４−３−Ｃｈｅｒｒｙは、ｐＣＨＩＶおよびｐＣＨＩＶ  ｍＣｈｅｒｒｙを１：１の比で共トランスフェクトすることによって得た（Ｌａｍｐｅ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３６０：９２−１０４）。エンベロープ糖タンパク質をもたないＨＩＶＮＬ４−３は、随所に記載されている方法によって得た（上記のＩｚｑｕｉｅｒｄｏ−Ｕｓｅｒｏｓ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．）。ウイルスストックおよびＶＬＰのｐ２４Ｇａｇ含有量は、ＥＬＩＳＡ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によるか、または定量的ウェスタンブロットによって決定した［Ｉｚｑｕｉｅｒｄｏ−Ｕｓｅｒｏｓ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ  １０：ｅ１００１３１５．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｂｉｏ．１００１３１５］。感染性アッセイに用いたＨＩＶＮＬ４−３は、［Ｌｉ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：１０１０８−１０１２５］の記載に従い、ＴＺＭ−ｂＩレポーター細胞株を用いて、用量設定を行った。
【０２６３】
４．リポソームの産生
大型の単層小胞（ＬＵＶ）は、以前に記載されている押出法に従って調製した。Ｍａｙｅｒ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｖｅｓｉｃｌｅｓ  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １９８６；８５８：１６１−１６８参照。脂質およびガングリオシドは、市販品を購入した（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．，アラバスター、アラバマ州、米国；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，サンタクルーズ、カリフォルニア州、米国）。ＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄの脂質組成は、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）が２５ｍｏｌ％：１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）が１６ｍｏｌ％：脳スフィンゴミエリン（ＳＭ）が１４ｍｏｌ％：コレステロール（Ｃｈｏｌ）が４５ｍｏｌ％であり、Ｃｅｒ、ＰＳ、またはガングリオシドが存在する場合には（４ｍｏｌ％）、ＳＭの量は１０ｍｏｌ％に減少した。ＬＵＶＰＯＰＣ−ｔＲｅｄの脂質組成は、４ｍｏｌ％のＣｅｒ、ＧＭ３、ＧＭ２、もしくはＧＭ１を含むかまたは含まない、９６ｍｏｌ％のＰＯＰＣである。全てのＬＵＶは、２ｍｏｌ％の１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＨＰＥ）−テキサスレッド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，カールスバッド、カリフォルニア州、米国）を含んでいた。脂質をクロロホルム：メタノール（２：１）中に混合し、窒素下で乾燥させた。微量の有機溶媒を、減圧下で１ないし２時間ポンピングすることにより除去した。続いて、乾燥させた脂質膜を１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）中に分散させ、１０サイクルの凍結−融解に供した後、サーモバレル押出機（Ｌｉｐｅｘ押出機；Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．，バーナビー、カリフォルニア州）を用いて、２枚重ねた孔径１００ｎｍのポリカーボネート膜（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．，プレザントン、カリフォルニア州、米国）を通して１０回押出した。同等の蛍光強度を示す、同濃度のＬＵＶによってｍＤＣをパルスするため、テキサスレッドを含むＬＵＶの濃度をＢｏｔｔｃｈｅｒのリン酸測定法に従って定量し、次にＳＬＭ  Ａｍｉｎｃｏ  ｓｅｒｉｅｓ  ２  蛍光光度計（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．，ロチェスター、ニューヨーク州、米国）を用いて、励起光５８０ｎｍの設定により蛍光放出スペクトルを記録した。Ｂｏｔｔｃｈｅｒ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  １９６１；２４：２０３−２０４参照。
【０２６４】
５．リポソームおよびＶＬＰの捕捉アッセイ
全ての捕捉実験は、ｍＤＣを一定の速度で平行してパルスすることにより行い、１００μＭの様々なＬＵＶｔＲｅｄ調製物およびウェスタンブロットにより定量した７５ｎｇのＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰＧａｇ（ＥＬＩＳＡによる推定で、２，５００ｐｇのＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰｐ２４Ｇａｇ）を用いて、２×１０５細胞を３７℃にて４時間パルスした。よく洗浄した後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，フランクリン・レイクス、ニュージャージー州、米国）を用いたＦＡＣＳによって陽性ＤＣを取得し、得られたデータをＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｏ．，フランクリン・レイクス、ニュージャージー州、米国）を用いて分析した。全ての分析において、死細胞および細片を除外するため、前方散乱光および側方散乱光によるゲーティングを採用した。
【０２６５】
競合実験は、２×１０５のｍＤＣを、７５ｎｇのＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰＧａｇと共に、最終濃度１×１０６細胞／ｍｌで、量を徐々に減少させたＧＭ２含有ＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄ、または１００μＭのＣｅｒ含有およびＰＳ含有ＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄの存在下で、３７℃で４時間インキュベートすることにより行った。あるいは細胞を、７５ｎｇのＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰＧａｇ、ならびにＧＭ１、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ、Ｃｅｒ、およびＰＳを含むかまたは含まない１００μＭのＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄと共にインキュベートした。次に細胞を、以前の記載に従ってＦＡＣＳにより分析した。
【０２６６】
６．ＶＬＰおよびＬＵＶのノイラミニダーゼによる処理
総数２×１０５のＤＣを、２５μＭのＧＭ３含有ＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄ、およびスクロースでペレットにした７５ｎｇのＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰＧａｇによって、３７℃で２時間パルスした後、１００または５０ｍＵの、ウェルシュ菌第Ｘ因子由来のノイラミニダーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，セントルイス、ミズーリ州、米国）によって３７℃で１２時間処理したか、または処理しなかった。１２時間のインキュベーションは、ガラスコートされたプレート（ＳＭＩ−ＬａｂＨｕｔ  Ｌｔｄ．，チャーチャム、グロスタシャー、英国）内のＨｅｐｅｓ−ナトリウム緩衝液中で行い、反応はＦＣＳを含んだＲＰＭＩを添加することによって停止させた。細胞を洗浄し、ＦＡＣＳによってｔＲｅｄおよびｅＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを評価した。
【０２６７】
７．ラクトースおよびＧＭ３極性頭部基によるｍＤＣの処理
ｍＤＣは５ないし１０ｍＭのラクトース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，セントルイス、ミズーリ州、米国）および可溶性ＧＭ３炭水化物頭部基（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ  Ｌｔｄ．，コンプトン、バークシャー、英国）と共に、またはそれらなしで室温にて３０分間プレインキュベートした。次に細胞を５０μＭのＧＭ３含有ＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄ、およびスクロースでペレットにした７５ｎｇのＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰＧａｇによって、試験する化合物の最終濃度５ないし１０ｍＭにて、３７℃で２時間パルスした。以前の記載に従って、細胞をＦＡＣＳで分析した。
【０２６８】
８．ガングリオシドのエネルギー構造の最小化および統計分析
Ｃｈｅｍ３Ｄ  Ｕｌｔｒａソフトウェア（ＣａｍｂｒｉｄｇｅＳｏｆｔ  Ｃｏｒｐ．，ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国）を用い、ＭＭ２力場および最急降下アルゴリズムによって真空中の最小エネルギー構造を算出した。最小二乗平均平方根勾配を０．１に設定し、最小および最大移動をそれぞれ０．００００１および１．０に設定した。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ．５ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｉｎｃ．，ラホヤ、カリフォルニア州、米国）を用いて行った。
【０２６９】
９．ＤＣへの形質導入
ＶＳＶ−ＧシュードタイプＳＩＶ３レンチベクター（Ａ．Ｃｉｍａｒｅｌｌｉから供与された）を、Ｇｏｕｊｏｎ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，２００６，１３：９９１−９９４の記載に従って産生した。分離した単球（５×１０５）にＳＩＶ３粒子を感染させ、２種の異なるシグレック１に特異的なｓｈＲＮＡ、または１種の未標的ｓｈＲＮＡコントロールであるＭＩＳＳＩＯＮレンチウイルス形質導入粒子（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）により、ＭＯＩ＝５０にて形質導入を行った。形質導入した単球をＬＰＳ  ｍＤＣに分化させ、以前の記載に従ってＶＬＰの捕捉およびＨＩＶ−１のトランス感染を評価した。適切な表現型を示すＤＣの成熟化を、上記のＩｚｑｕｉｅｒｄｏ−Ｕｓｅｒｏｓ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．に従って評価した。同じｐＬＫＯ．１−ｐｕｒｏベクターの骨格内にクローン化されたＧＦＰレポーター遺伝子を有するレンチウイルス形質導入粒子（ＭＩＳＳＩＯＮ  ＴｕｒｂｏＧＦＰコントロール形質導入粒子）を、ＦＡＣＳによる形質導入効率の評価に使用した（細胞を用いた場合、７日目では推定７５％〜９８％）。
【０２７０】
１０．表面に発現するシグレック１のＦＡＣＳによる分析
ＤＣを１ｍｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ（Ｂａｘｔｅｒ，Ｈｙｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏ）によってブロッキングした後、抗シグレック１−ＰＥ７−２３９  ｍＡｂ（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）を製造者の指示に従って用いて、４℃で２０分間染色した。サンプルをＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって分析し、得られたデータをＣｅｌｌＱｕｅｓｔおよびＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて評価した。
【０２７１】
１１．トランス感染のアッセイ
上に記載したようにＤＣを処理し、ＨＩＶＮＬ４−３によってパルスした。よく洗浄した後、細胞をＴＺＭ−ｂｌ  ＣＤ４＋標的細胞株と共培養することで、トランス感染について調べた。パルスした単球由来のＤＣもしくは骨髄系ＤＣを、１：１または５：１の比で、それぞれ四重または二重に共培養した。Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ  ＦＬルミノメーター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、４８時間後にルシフェラーゼ活性について細胞をアッセイした（ＢｒｉｇｈｔＧｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍ；Ｐｒｏｍｅｇａ）。ＨＩＶ−１によるパルスを行っていない共培養、またはレポーターＣＤ４＋細胞のみから構成されるバックグラウンド値を、それぞれのサンプルから差し引いた。パルスした細胞の増殖性感染の可能性または再感染現象を検出するため、一部のＤＣを、０．５μＭのプロテアーゼ阻害剤であるサキナビルの存在下で共培養した。
【０２７２】
１２．シグレックコンストラクトのトランスフェクション
Ａｍａｘａ  ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを製造者の推奨に従って用い、シグレック１、シグレック５、またはシグレック７のコード領域を含むベクター骨格ｐＣＭＶ６−Ｅｎｔｒｙ（Ｏｒｉｇｅｎｅ）を、Ｒａｊｉ細胞（２×１０６）にトランスフェクトした。トランスフェクション後３６時間目に、上に述べたようにＶＬＰの捕捉およびＨＩＶ−１のトランス感染（２：１の比において）について細胞を評価した。指示される場合には、ＶＬＰによるパルスの３０分前に、細胞を、濃度を徐々に減少させた３’−シアリルラクトース（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ）またはラクトース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と共にプレインキュベートした。エンベロープ欠損ウイルスを用いた実験では、ＥＬＩＳＡにより推定した１００ｎｇのｐ２４Ｇａｇによって５×１０５細胞を３７℃にて４時間パルスし、前述のようにＶＬＰの捕捉およびＨＩＶ−１のトランス感染（２：１の比において）について評価した。Ｒａｊｉ細胞について記載したように、Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＨＥＫ−２９３Ｔ細胞にトランスフェクションを行い、２４時間後に評価した。ＨＥＫ−２９３Ｔのトランス感染について異なるルミノメーターを用いて試験し（Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）、得られたデータを１００％に標準化した。両細胞型のトランスフェクション効率を評価するため、抗シグレック１−ＰＥ  ７−２３９  ｍＡｂ、抗シグレック７−ＰＥ  ５−３８６  ｍＡｂ（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）、および抗シグレック５／１４−ＰＥ  １Ａ５  ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）によって細胞を染色し、ＦＡＣＳによる評価を行った。安定化Ｒａｊｉ  ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞を、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ−ＰＥ  ＤＣＮ４６  ｍＡｂ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）により標識した。
【０２７３】
１３．  統計分析
統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ．５ソフトウェアにより、対応ｔ検定（ｐ＜０．０１を有意であるとみなす）、またはスピアマンの順位相関係数を用いて行った。
【０２７４】
実施例１
ＨＩＶ−１の外殻または小胞膜内のガングリオシドは、ｍＤＣの取り込みを生じさせるウイルスの付着因子として作用する。
スフィンゴ糖脂質は、ＨＩＶ−１が出芽すると考えられるラフト様細胞膜ドメインに多く存在する。この前提に基づき、ｍＤＣによるＨＩＶ−１の捕捉に対するスフィンゴ糖脂質の潜在的役割について調べた。Ｔ細胞株ＭＴ−４由来のＨＩＶＮＬ４．３におけるＧＭ３の存在を、マススペクトロメトリーにより確認した。加えて、ＨＩＶ−１膜中にはＧＭ１、ＧＭ２、およびＧＤ１を含む幾つかのその他のガングリオシドもまた検出された。図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃ参照。
【０２７５】
ＨＩＶ−１の外殻または小胞膜内のガングリオシドが、ｍＤＣの取り込みを生じさせるウイルスの付着因子として作用するか否かを調べるため、ＨＩＶ−１の大きさおよび脂質組成を模倣し、かつ異なるガングリオシドを含有する大型の単層小胞（ＬＵＶ）をテキサスレッド（ｔＲｅｄ）で標識したものを調製した（ＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄ）。図６、およびＬｏｒｉｚａｔｅ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００９；２８４：２２２３８−２２２４７参照。全てのＬＵＶは同等の蛍光強度を示した。図７参照。ＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄまたはＶＬＰのいずれかにより、成熟ＤＣを３７℃にて４時間パルスした後、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）によって蛍光細胞のパーセンテージを決定した。ｍＤＣは高いパーセンテージで蛍光ＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰを捕捉した。図１Ｄ参照。ＣＨＯ細胞株から産生されるＶＬＰもまた、ｍＤＣによって効率的に捕捉された。図８参照。ｍＤＣへの取り込みは、ガングリオシドを含有することが以前に示されたマウスレトロウイルス  ＭｕＬＶに対してもさらに観察された。Ｃｈａｎ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．２００８；８２：１１２２８−１１２３８参照。
【０２７６】
一方で、ＨＩＶ−１の主要な脂質成分を含んでいるが、ガングリオシドは含まないＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄに対して、ｍＤＣによる有意な取り込みは観察されなかった。図１Ｄ参照。ｍＤＣへの取り込みは、セラミド（Ｃｅｒ）を含有するＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄに対しても観察されないままであった（Ｐ＜０．０００１、対応ｔ検定）。図１Ｄ参照。ＬＵＶにＧＭ３、ＧＭ２、またはＧＭ１のようなモノシアロガングリオシドが含まれている場合の結果は全く異なっており、ｍＤＣはこれらのリポソームを、ＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰに対する場合と同じ効率で捕捉した。図１Ｄ参照。この捕捉が単に、陰性に荷電したガングリオシドと、ｍＤＣ表面の電荷との静電気的な相互作用ではないことを確実にするため、陰性に荷電したホスファチジルセリン（ＰＳ）を含有するＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄを平行して分析したが、ｍＤＣはこれを捕捉しなかった（Ｐ＝０．００８１、対応ｔ検定）。図１Ｄ参照。これらの結果により、モノシアロガングリオシドはｍＤＣによる小胞の捕捉を仲介すること、およびこの過程には炭水化物頭部基が必須であることが明らかになった。
【０２７７】
実施例２
ガングリオシドを含有する大型の単層小胞およびＶＬＰは、共通したｍＤＣ内への侵入機構を利用し、かつｍＤＣ内の同じ区画に達する。
ガングリオシドを含むＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄおよびＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰ（およびＨＩＶ−１）が、共通したｍＤＣ内への侵入機構を利用しているか否かを決定するため、幾つかの競合実験を行った。量を徐々に減少させたＧＭ２含有ＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄおよび一定量のＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰにより、成熟ＤＣを３７℃にて４時間パルスした。よく洗浄した後、ｅＧＦＰ陽性細胞およびｔＲｅｄ陽性細胞のパーセンテージをＦＡＣＳによって決定した。ＧＭ２−含有ＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄは、ＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰのｍＤＣ内への取り込みに対して、用量依存性に効率的に競合した（Ｐ＜０．０００１、対応ｔ検定）。図１Ｅ参照。Ｃｅｒを含むか、またはスフィンゴ糖脂質を含まないＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄは、ＶＬＰの取り込みに対して競合しなかった。図１Ｅ参照。このことから、ＧＭ含有ＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄとＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰとは、炭水化物頭部基に依存する、共通したｍＤＣ内への侵入機構を利用している。
【０２７８】
次に、ＧＭ含有ＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄおよびＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰがｍＤＣ内の同じ区画に達するか否かについて、回転円板を用いた共焦点顕微鏡法によって調べた。以前には、ｍＤＣ内へ捕捉されたＨＩＶ−１のパターンは、ランダム、偏向、またはサック様区画の３タイプとして記載されている。Ｉｚｑｕｉｅｒｄｏ−Ｕｓｅｒｏｓ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００７；８１：７５５９−７５７０参照。同パターンはＧＭ含有ＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄについても観察され、異なるパターンを示すｍＤＣのパーセンテージは、使用した粒子を問うことなく同様であった。このように、ＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰとＧＭ含有ＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄとは、ｍＤＣ内部への取り込みについて競合するだけではなく、それらが輸送されるｍＤＣ内部の区画についても類似している。ＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰおよびＧＭ含有ＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄが同じ区画内へ捕捉されるか否かを決定するため、ｍＤＣをＧＭ含有ＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄと共に３７℃にて３時間プレインキュベートした後、続いてＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰと共にさらに３時間インキュベートした。固定した細胞を共焦点顕微鏡で観察することにより、ＶＬＰとＧＭ含有ＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄ（ＧＭ１、ＧＭ２、またはＧＭ３のいずれかを含有）とは、同じ細胞内区画に広く共存していることが明らかになった。図２参照。
【０２７９】
実施例３
小胞の外側の脂質構成は、ｍＤＣによる捕捉に影響しない。
ＨＩＶ−１の膜内で、ガングリオシドは秩序液体膜（ｌｉｑｕｉｄ− ｏｒｄｅｒｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ）内に埋め込まれている。上記のＬｏｒｉｚａｔｅ，２００９およびＣｈａｎ，２００８参照。したがって、粒子膜の秩序液体または特定の脂質組成（ガングリオシド以外）がｍＤＣの捕捉に影響するか否かについて評価した。脂質ラフトにおけるガングリオシドとコレステロールとの相互作用がガングリオシドの立体構造に影響を与え、その細胞受容体としての活性を変化させることが知られている。上記のＬｉｎｇｗｏｏｄ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１１；７：２６０−２６２，Ｓｉｍｏｎｓ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｂｉｏｌ．２０１１，Ｓｉｍｏｎｓ，２０００、およびＢｒｏｗｎ，２０００参照。成熟ＤＣを、様々なガングリオシドを含むかまたは含まない、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）から構成されるＬＵＶＰＯＰＣ−ｔＲｅｄと共にインキュベートした。図３Ａ参照。ＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄとは対照的に、ＬＵＶＰＯＰＣ−ｔＲｅｄは秩序液体膜構造を有する。ＬＵＶＰＯＰＣ−ｔＲｅｄは、ＧＭ１、ＧＭ２、またはＧＭ３のいずれかが存在する場合には、ＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄと同様の効率的な捕捉結果を示したが、Ｃｅｒを含有するＬＵＶＰＯＰＣ−ｔＲｅｄ、またはガングリオシドを含まないＬＵＶＰＯＰＣ−ｔＲｅｄは捕捉されなかった。図３Ａ参照。さらに、ランダムに、偏向して、またはサック様区画内に捕捉された粒子を示すｍＤＣのパーセンテージは、ここでも異なる粒子間でよく類似していた。図３Ｂ参照。これらの結果は、ガングリオシド含有ＬＵＶが、その外側の脂質構成に関わらず、ＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰと同じ捕捉および輸送経路を使用していることを示しており、このことからガングリオシド自体がｍＤＣによる捕捉に関与する重要分子であることが示唆された。
【０２８０】
実施例４
炭水化物頭部基の異なる位置に存在するシアル酸を３個まで有するガングリオシド複合体は、ｍＤＣによる取り込みのための共通する構造を有する決定因子である。
ｍＤＣによる効率的な認識に必用とされる分子構造についてさらなる洞察を得るため、さらなるガングリオシド複合体を有するＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄを産生した。これらのＬＵＶは、炭水化物極性頭部基の多様な位置に２、３、および４個のシアル酸基を含んでいた（ジ、トリ、およびテトラシアロガングリオシド）。２または３個のシアル酸を有するガングリオシド（それぞれＧＤ１ｂおよびＧＴ１ｂ）を含有する同量のＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄによってパルスした成熟ＤＣは、これらの粒子をＧＭ１−ＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄと同じ効率で捕捉した。４個のシアル酸を有するガングリオシド（ＧＱ１ｂ）を含有するＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄは、ほとんど全く捕捉されなかった。図４Ａ参照。したがって、ＧＤ１ｂまたはＧＴ１ｂを有するＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄは、ｍＤＣによる取り込みにおいてＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰと効率的に競合したが、ＧＱ１ｂ、ＰＳ、またはＣｅｒを有するＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄとは競合しなかった。図４Ｂ参照。これらの結果により、炭水化物頭部基の異なる位置に存在するシアル酸を３個まで有するガングリオシド複合体は、ｍＤＣによる取り込みのための共通する構造を有する決定因子であることが示された。
【０２８１】
Ｃｅｒ含有ＬＵＶにみられる負の表現型により、ｍＤＣによる捕捉には特に炭水化物頭部基が必要であることが示された。以前から、シアル酸はある種のウイルスに対する細胞受容体として同定されてきた。Ｗｅｉｓ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９８８；３３３：４２６−４３１参照。そのため、ｍＤＣによる捕捉におけるシアル酸の重要性について調べた。ｍＤＣと、同濃度のＣｅｒ、ＧＭ１、またはＧＭ１を含むが、シアル酸基（アシアロＧＭ１）を含まないＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄとのインキュベーションにより、捕捉はシアル酸に依存することが明らかになった。図５Ａ参照。加えて、ＧＭ３含有ＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄおよびＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰをｉｎ  ｓｉｔｕでノイラミニダーゼ処理することにより、ｍＤＣによる粒子の捕捉は有意に減少した。図５Ｂ参照。このように、ガングリオシド中のシアル酸成分は、ｍＤＣによる特異的認識に不可欠なものである。炭水化物頭部基のその他の成分の必要性について評価するため、ＧＭ４（ＧＭ３のグルコース成分を欠いたもの）またはＧａｌＣｅｒ（ＧＭ３のグルコースおよびシアル酸成分の両方を欠いたもの）のいずれかを含むＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄを調製した。図５Ｃ参照。成熟ＤＣをＧＭ４含有、またはＧａｌＣｅｒ含有ＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄと共にインキュベートしても、わずかにバックグラウンドレベルのリポソームの捕捉しか示されなかったことから、スフィンゴ脂質のグルコース成分もまたＤＣによる捕捉には必要であることが示された。図５Ｃ参照。
【０２８２】
実施例５
可溶性炭水化物は、ｍＤＣによるＨＩＶ−１の分子認識と競合する。
炭水化物成分が、ＨＩＶ−１捕捉のための分子認識の決定因子であれば、可溶性炭水化物はＶＬＰおよびＬＵＶの取り込みと競合するはずである。ＧＭ３含有ＬＵＶＨＩＶ−ｔＲｅｄまたはＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰのｍＤＣによる捕捉は、可溶性ＧＭ３の存在下で完全に遮断されたが、同濃度のラクトース（シアル酸基を含まない）は影響を示さなかった。図５Ｄ参照。まとめると、これらのデータにより、ガングリオシドのシアリルラクトース成分は、ｍＤＣによる効率的なＨＩＶ−１の認識および捕捉に必要とされる分子的決定因子であることが明確に示された。図５Ｄにおける競合に必要とされる可溶性ＧＭ３の濃度はＬＵＶ中のガングリオシドの濃度に比較して高いことから（ＬＵＶ中のガングリオシドの濃度は〜１０００倍低い；図１Ｃ）、膜内のＣｅｒに対するシアリルラクトースの付着によって高い結合親和性が得られることが示唆される。加えて、Ｃｅｒ自体の親水性成分が認識ドメインの一部となり、ｍＤＣに対する結合親和性を直接高め得る。
【０２８３】
認識ドメインの構造的決定因子をさらに理解するため、試験したガングリオシドのエネルギー最小化３Ｄモデルを構築した。図５ｅ参照。これらのモデルにより、シアリルラクトースはＧＭ１、ＧＭ２、ＧＭ３、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂにおいては露出しているが、ＧＭ４およびアシアロＧＭ１では欠如していることが示された。図６参照。
【０２８４】
実施例６
シグレック１を発現する細胞は、ＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰを効率的に捕捉できる。
Ｒａｊｉ  Ｂ細胞株はシグレック１を内在性に発現しないため、シグレック１の非特異的な発現上昇なしに効率的にトランスフェクトできることから、これをトランスフェクションに用いた。Ｒａｊｉ  Ｂ細胞株へのシグレック１発現ベクターのトランスフェクションによって、シグレック１陽性細胞集団内へのＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰの捕捉は有意に増大し、この効果は抗シグレック１  ｍＡｂである７Ｄ２による前処置で無効となった（ｐ＝０．０００５；図９）。シグレック１をトランスフェクトした細胞のうちのシグレック１陰性集団、または続くシグレック５またはシグレック７の発現プラスミドのトランスフェクションでは、捕捉の増大はみられなかった（図９）。シアリルラクトースとのプレインキュベーションもまた、シグレック１をトランスフェクトしたＲａｊｉ  細胞によるＶＬＰの捕捉を遮断した（図１０）。抗シグレック１  ｍＡｂである７Ｄ２の用量設定により、ＶＬＰの捕捉に対する用量依存性の阻害が明らかにされた（図１１）。ｍＡｂ  ７Ｄ２により仲介された阻害の特異性は、このｍＡｂを異なるシグレックタンパク質と共にプレインキュベートすることによって確認した。精製されたシグレック１とのプレインキュベーションによってＶＬＰの捕捉は完全に回復したが、精製されたシグレック７、５／１４およびＣＤ８３とのプレインキュベーションでは効果はみられなかった（図１２）。７Ｄ２のＦａｂ断片がＶＬＰの捕捉を遮断しなかったことから、７Ｄ２  ｍＡｂによって認識されるエピトープは実際のウイルス結合部位ではない可能性があるが、別の抗シグレック１  ｍＡｂである７−２３９による用量設定によって、ＶＬＰの捕捉の阻害が用量依存性に確認された（図１３Ａ）。
【０２８５】
実施例７
シグレック１の発現が停止すると、ＤＣによるＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰの捕捉は低下する。
ＨＩＶ−１の捕捉およびトランス感染に対するシグレック１の役割が重要であることを確認するため、相補性実験を行った。すなわち、ＬＰＳ  ｍＤＣにおけるシグレック１の発現レベルをＲＮＡ干渉によって低下させ、この受容体を発現しない細胞にシグレック１をトランスフェクトした。本アプローチにおいては、様々なｓｈＲＮＡをコードするレンチウイルス粒子とｖｐｘを発現するレンチウイルスとをＤＣに共感染させることにより、制限因子であるＳＡＭＨＤ１の影響を少なくしてＤＣの生産的な感染を促した。２種の異なるシグレック１特異的なｓｈＲＮＡの形質導入によって、シグレック１の表面発現と同時にＶＬＰＨＩＶ−Ｇａｇ−ｅＧＦＰの捕捉が大幅に低下したが、非標的ｓｈＲＮＡコントロールの形質導入によってはこれがみられなかった（図１４）。
【図１Ａ】
2015500854.tif 000004
【図１ＢＣ】
2015500854.tif 000005
【図１ＤＥ】
2015500854.tif 000006
【図２Ａ】
2015500854.tif 000007
【図２Ｂ】
2015500854.tif 000008
【図３】
2015500854.tif 000009
【図４】
2015500854.tif 000010
【図５ＡＢ】
2015500854.tif 000011
【図５ＣＤ】
2015500854.tif 000012
【図６Ａ】
2015500854.tif 000013
【図６Ｂ】
2015500854.tif 000014
【図６Ｃ】
2015500854.tif 000015
【図７ＡＢ】
2015500854.tif 000016
【図７ＣＤ】
2015500854.tif 000017
【図８】
2015500854.tif 000018
【図９】
2015500854.tif 000019
【図１０】
2015500854.tif 000020
【図１１】
2015500854.tif 000021
【図１２】
2015500854.tif 000022
【図１３】
2015500854.tif 000023
【図１４】
2015500854.tif 000024
【国際調査報告】
2015500854.tif 000025
2015500854.tif 000026
2015500854.tif 000027
2015500854.tif 000028
2015500854.tif 000029
2015500854.tif 000030
2015500854.tif 000031