(57)【要約】  ドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリキルアルファ−１，３マンノシルトランスフェラーゼ（Ａｌｇ３ｐ）活性を欠損した組換え宿主細胞中で産生される組換え糖タンパク質のパウチマンノースまたは複合型Ｎ−グリカンの産生量およびＮ−グリコシル化部位占有率を増加させる方法が開示される。詳細には、宿主細胞中でのＯＳ−９ファミリー遺伝子の発現の破壊を含む組換え宿主細胞が提供される。これらの組換え宿主細胞は、その結果、組換え糖タンパク質を生産するために用いられ得る。さらなる実施形態において、組換え宿主細胞は、少なくとも１の異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをさらに過剰発現し、これは、特定の実施形態において、酵母オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体の少なくとも１の必須タンパク質の突然変異の致死表現型を機能的に抑制する能力がある。【選択図】図１７
2015502144.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）内在性ドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリキルアルファ−１，３マンノシルトランスフェラーゼ（ＡＬＧ３）遺伝子の発現の破壊、および
（ｂ）内在性骨肉腫９（ＯＳ−９）ファミリー遺伝子またはホモログの破壊
を含む、宿主細胞。
【請求項２】
宿主細胞が酵母または糸状菌である、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項３】
宿主細胞がＰ．パストリスのｏｃｈ１変異体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＯＳ−９ファミリー遺伝子がＹＯＳ９遺伝子である、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項５】
内在性ドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリキルアルファ−１，３マンノシルトランスフェラーゼ（ＡＬＧ３）および内在性骨肉腫９（ＯＳ−９）ファミリー遺伝子またはホモログの発現の破壊が、遺伝子を欠失させることまたは破壊することにより達成される、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項６】
宿主細胞が、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１の核酸分子および異種糖タンパク質をコードする核酸分子をさらに包含する、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項７】
単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼがリーシュマニア属種のＳＴＴ３Ａタンパク質、ＳＴＴ３Ｂタンパク質、ＳＴＴ３Ｃタンパク質、ＳＴＴ３Ｄタンパク質またはそれらの組み合わせである、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項８】
単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼがリーシュマニア・メジャーＳＴＴ３Ｄタンパク質である、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項９】
宿主細胞が異種タンパク質をコードする核酸分子をさらに包含する、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
宿主細胞が１または複数の哺乳動物様またはヒト様のＮ−グリカンを含む糖タンパク質を産生するように遺伝子操作されている、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
（ａ）内在性ドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリキルアルファ−１，３マンノシルトランスフェラーゼ（ＡＬＧ３）遺伝子の発現の破壊、内在性骨肉腫９（ＯＳ−９）ファミリー遺伝子またはホモログの発現の破壊および異種糖タンパク質をコードする核酸分子を包含する宿主細胞を用意すること、ならびに
（ｂ）異種糖タンパク質を発現させるための条件下で宿主細胞を培養して異種糖タンパク質を産生させること
を含む、異種糖タンパク質を生産する方法。
【請求項１２】
宿主細胞が異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１の核酸分子をさらに包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼが、リーシュマニア属種のＳＴＴ３Ａタンパク質、ＳＴＴ３Ｂタンパク質、ＳＴＴ３Ｃタンパク質、ＳＴＴ３Ｄタンパク質またはそれらの組み合わせである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼが、リーシュマニア・メジャーＳＴＴ３Ｄタンパク質である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
宿主細胞が酵母または糸状菌である、請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
宿主細胞がＰ．パストリスのｏｃｈ１変異体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ＯＳ−９ファミリー遺伝子がＹＯＳ９遺伝子である、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
内在性ドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリキルアルファ−１，３マンノシルトランスフェラーゼ（ＡＬＧ３）および内在性骨肉腫９（ＯＳ−９）ファミリー遺伝子またはホモログの発現の破壊が、遺伝子を欠失させることまたは破壊することにより達成される、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
宿主細胞が１または複数の哺乳動物様またはヒト様のＮ−グリカンを含む糖タンパク質を産生するように遺伝子操作されている、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
疾患治療用の薬剤の製造のための、
（ａ）内在性ドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリキルアルファ−１，３マンノシルトランスフェラーゼ（ＡＬＧ３）遺伝子の発現の破壊、および
（ｂ）内在性骨肉腫９（ＯＳ−９）ファミリー遺伝子またはホモログの破壊
を含む宿主細胞の使用。
【請求項２１】
宿主細胞がエンドマンノシダーゼ活性をさらに発現する、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
宿主細胞がエンドマンノシダーゼ活性をさらに発現する、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
宿主細胞がエンドマンノシダーゼ活性をさらに発現する、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリキルアルファ−１，３マンノシルトランスフェラーゼ（Ａｌｇ３ｐ）活性を欠損した組換え宿主細胞中で産生される組換え糖タンパク質のパウチマンノース（ｐａｕｃｉｍａｎｎｏｓｅ）または複合型Ｎ−グリカンの産生量およびＮ−グリコシル化部位占有率を増加させる方法に関する。詳細には、本発明は、宿主細胞中でのＯＳ−９ファミリー遺伝子の発現の破壊を含む組換え宿主細胞を提供する。さらなる実施形態において、組換え宿主細胞は、少なくとも１の異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをさらに過剰発現し、これは、特定の実施形態において、酵母オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体の少なくとも１の必須タンパク質の突然変異の致死表現型を機能的に抑制する能力がある。
【背景技術】
【０００２】
組換えヒトタンパク質の生産が可能になったことにより、ヒトの医療は大きく進歩しており、依然として創薬の活発な領域である。多くの治療用タンパク質は、適切な構造−機能活性およびヒト血清中でのその後の安定性を確保するため、タンパク質の特定のアスパラギン残基へのグリカンの翻訳後付加（Ｎ−グリコシル化）を必要とする。ヒトにおける治療用途の場合、糖タンパク質はヒト様のＮ−グリコシル化を必要とする。ヒト様の糖タンパク質プロセシングを模倣することができる哺乳動物細胞株（例として、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト網膜細胞）には、低いタンパク質力価、長い発酵時間、不均一な生産物および継続的なウイルスの封じ込めなど、いくつかの欠点がある。それ故、短い発酵時間で高いタンパク質力価を生じさせるだけでなく、ヒト様の糖タンパク質を産生することもできる発現系を用いるのが望ましい。
【０００３】
真菌の宿主、例えばサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または例えばピキア・パストリスなどのメチロトローフ酵母などは、治療用タンパク質発現のための異なる利点を有しており、例えば、これらは内在性タンパク質を大量に分泌せず、異種タンパク質を産生させるための強い誘導性プロモーターが利用可能であり、動物血清の使用を伴わずに合成培地中で増殖させることができ、および高力価の組換えタンパク質を産生することができる（Ｃｒｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２４：４５−６６（２０００））。しかしながら、酵母中で発現したグリコシル化タンパク質は、一般に、「高マンノース」グリカンをもたらす付加的なマンノース糖を含有する。これらの高マンノースＮ−グリカンはある特定の個体に投与された場合に有害な応答をもたらすことがあるため、酵母は一般に、ヒトでの使用が意図される治療用糖タンパク質の生産に用いられなかった。しかしながら、ヒト様のＮ−グリカンを産生するように酵母を遺伝子操作する方法は、米国特許第７，０２９，８７２号および第７，４４９，３０８号中に、米国特許出願公開第２００４０２３００４２号、第２００４０１７１８２６号、第２００５０１７０４５２号、第２００５０２０８６１７号、第２００５０２０８６１７号および第２００６０２８６６３７号中に記載されている方法と共に、記載されている。これらの方法は、酵母型Ｎ−グリカンの代わりにヒト様の複合型またはハイブリッドＮ−グリカンを優勢に有する治療用糖タンパク質を産生することができる組換え酵母を構築するのに用いられている。
【０００４】
遺伝子操作酵母は哺乳動物様またはヒト様のＮ−グリカンを有する糖タンパク質を産生することができるが、糖タンパク質上のＮ−グリカン付着部位の占有率は幅広く変動し、一般に、哺乳動物細胞中で産生される糖タンパク質におけるこれら同部位の占有率より低いことが見出されている。このことは、ピキア・パストリス中で産生される様々な組換え抗体について観察されている。しかしながら、Ｎ−グリカン付着部位の占有率の変動はまた、哺乳動物細胞においても同様に観察されている。例えば、Ｇａｗｌｉｔｚｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ−ｏｃｃｕｐａｎｃｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ＣＨＯ  ｃｅｌｌｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．１０３：１１６４−１１７５（２００９）は、Ｎ−グリコシル化部位占有率がＣＨＯ細胞中で産生される個別の糖タンパク質の個別の部位によって変動することがあること、および増殖条件の改変によりこれらの部位における占有率の制御が可能であることを開示した。国際出願公開第ＷＯ２００６１０７９９０号は、ドリコール結合オリゴ糖の合成経路を用いて真核細胞のタンパク質Ｎ−グリコシル化を改善する方法を開示している。Ｎ−グリコシル化部位占有率の制御については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１７２６：１２１−１３７（２００５）により概説されている。
【０００５】
しかしながら、特定の遺伝的バックグラウンドを有する組換え宿主細胞中で産生される治療用タンパク質のＮ−グリコシル化部位占有率を増加させる方法へのニーズはなお存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第７，０２９，８７２号明細書
【特許文献２】米国特許第７，４４９，３０８号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００４０２３００４２号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００４０１７１８２６号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００５０１７０４５２号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２００５０２０８６１７号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２００５０２０８６１７号明細書
【特許文献８】米国特許出願公開第２００６０２８６６３７号明細書
【特許文献９】国際出願第２００６１０７９９０号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃｒｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２４：４５−６６（２０００）
【非特許文献２】Ｇａｗｌｉｔｚｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ−ｏｃｃｕｐａｎｃｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ＣＨＯ  ｃｅｌｌｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．１０３：１１６４−１１７５（２００９）
【非特許文献３】Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１７２６：１２１−１３７（２００５）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリキルアルファ−１，３マンノシルトランスフェラーゼ（Ａｌｇ３ｐ）活性を欠損した組換え宿主細胞中で産生される組換え糖タンパク質のパウチマンノースまたは複合型Ｎ−グリカンの産生量およびＮ−グリコシル化部位占有率を増加させる方法を提供する。詳細には、本発明は、宿主細胞中でのＯＳ−９ファミリー遺伝子の発現の破壊を含む組換え宿主細胞を提供する。これらの組換え宿主細胞は、その結果、パウチマンノースまたは複合型Ｎ−グリカンを優勢に有する組換え糖タンパク質を生産するために用いられ得る。さらなる実施形態において、組換え宿主細胞は、少なくとも１の異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをさらに過剰発現し、これは、特定の実施形態において、酵母オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体の少なくとも１の必須タンパク質の突然変異の致死表現型を機能的に抑制する能力がある。例えば、宿主細胞は、リーシュマニア属種（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐ．）のＳＴＴ３Ａタンパク質（ＬｍＳＴＴ３Ａ）、ＳＴＴ３Ｂタンパク質（ＬｍＳＴＴ３Ｂ）、ＳＴＴ３Ｄタンパク質（ＬｍＳＴＴ３Ｄ）またはそれらの組み合わせである少なくとも１の単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをさらに発現し得る。少なくとも１のリーシュマニア属種ＳＴＴ３、例えばＬｍＳＴＴ３Ｄを発現する組換え宿主細胞は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼを発現しない組換え宿主細胞よりもＮ−グリコシル化部位占有率が高い糖タンパク質を産生する。パウチマンノースＮ−グリカンまたは複合型Ｎ−グリカンを優勢に産生するように遺伝子操作された組換え宿主細胞において、組換え宿主細胞により産生される糖タンパク質組成物中のハイブリッドＮ−グリカンのモルパーセントは、ＯＳ−９ファミリー遺伝子を発現する宿主細胞中に存在するであろう量と比べて低減するであろう。
【０００９】
それ故、上記の１の態様において、内在性ドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリキルアルファ−１，３マンノシルトランスフェラーゼ（ＡＬＧ３）遺伝子の発現の破壊、内在性骨肉腫９（ＯＳ−９）ファミリー遺伝子またはそのホモログの発現の破壊、および異種糖タンパク質をコードする核酸分子を包含し、内在性ＯＴａｓｅ複合体を構成するタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子を発現する組換え宿主細胞を用意すること；ならびに異種糖タンパク質を発現させるための条件下で宿主細胞を培養して異種糖タンパク質を産生させることを含む、組換え宿主細胞中で異種糖タンパク質を生産する方法が提供される。
【００１０】
上記のさらなる態様において、内在性ドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリキルアルファ−１，３マンノシルトランスフェラーゼ（ＡＬＧ３）遺伝子の発現の破壊、内在性骨肉腫９（ＯＳ−９）ファミリー遺伝子またはそのホモログの発現の破壊、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１の核酸分子および異種糖タンパク質をコードする核酸分子を包含する組換え宿主細胞を用意すること；ならびに異種糖タンパク質を発現させるための条件下で宿主細胞を培養して異種糖タンパク質を産生させることを含む、宿主細胞中で哺乳動物様またはヒト様の複合型またはハイブリッドＮ−グリカンを持つ異種糖タンパク質を生産する方法が提供される。
【００１１】
上記方法のさらなる態様において、宿主細胞は、ピキア・パストリス、ピキア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピキア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピキア・コクラマエ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピキア・メンブラナエファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピキア・オプンティアエ（Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピキア・サーモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピキア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピキア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピキア・ピペリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピキア・スティプティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・ミヌータ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミヌータ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ）、ピキア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピキア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クリベロマイセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、クリベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）よりなる群から選択される。他の態様において、宿主細胞は、昆虫、植物または哺乳動物の宿主細胞である。
【００１２】
上記のさらなる態様において、内在性ドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリキルアルファ−１，３マンノシルトランスフェラーゼ（ＡＬＧ３）遺伝子の発現の破壊、内在性骨肉腫９（ＯＳ−９）ファミリー遺伝子またはそのホモログの発現の破壊、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１の核酸分子および異種糖タンパク質をコードする核酸分子を包含し、内在性ＯＴａｓｅ複合体を構成するタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子を発現する組換え下等真核生物宿主細胞を用意すること；ならびに異種糖タンパク質を発現させるための条件下で宿主細胞を培養して異種糖タンパク質を産生させることを含む、下等真核生物宿主細胞中で異種糖タンパク質を生産する方法が提供される。
【００１３】
上記方法のさらなる態様において、下等真核生物宿主細胞は、ピキア・パストリス、ピキア・フィンランディカ、ピキア・トレハロフィラ、ピキア・コクラマエ、ピキア・メンブラナエファシエンス、ピキア・オプンティアエ、ピキア・サーモトレランス、ピキア・サリクタリア、ピキア・グエルクウム、ピキア・ピペリ、ピキア・スティプティス、ピキア・メタノリカ、ピキア・ミヌータ（オガタエア・ミヌータ、ピキア・リンドネリ）、ピキア属種、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス属種、ハンゼヌラ・ポリモルファ、クリベロマイセス属種、クリベロマイセス・ラクティス、カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼ、トリコデルマ・リーゼイ、クリソスポリウム・ラクノウェンス、フザリウム属種、フザリウム・グラミネウム、フザリウム・ベネナタムおよびニューロスポラ・クラッサよりなる群から選択される。
【００１４】
上記のさらなる態様において、内在性ドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリキルアルファ−１，３マンノシルトランスフェラーゼ（ＡＬＧ３）遺伝子の発現の破壊、内在性ＹＯＳ９遺伝子またはそのホモログの発現の破壊および異種糖タンパク質をコードする核酸分子を包含する組換え酵母宿主細胞を用意すること；ならびに異種糖タンパク質を発現させるための条件下で宿主細胞を培養して異種糖タンパク質を産生させることを含む、組換え酵母宿主細胞中で異種糖タンパク質を生産する方法が提供される。
【００１５】
上記方法において、組換え酵母宿主細胞は、酵母のＮ−グリカンパターンを持つ糖タンパク質を産生するか、または酵母は高マンノシル化（ｈｙｐｅｒｍａｎｎｏｓｙｌａｔｉｏｎ）を欠くが高マンノースのＮ−グリカンを産生する酵母パターンを持つ糖タンパク質を産生するように遺伝子操作されている。例えば、酵母を、α１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性、例として、Ｏｃｈ１ｐ活性を欠損するように遺伝子操作することができる。さらなる態様において、酵母は、哺乳動物様またはヒト様のＮ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するように遺伝子操作される。
【００１６】
さらなる実施形態において、宿主細胞は、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１の核酸分子および異種糖タンパク質をコードする核酸分子をさらに包含する。特定の態様において、単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、ＯＴａｓｅ複合体、例えば、酵母ＯＴａｓｅ複合体の少なくとも１の必須タンパク質の突然変異の致死表現型を機能的に抑制する能力がある。さらなる態様において、ＯＴａｓｅ複合体の必須タンパク質は、サッカロマイセス・セレビシエおよび／またはピキア・パストリスのＳＴＴ３遺伝子座、ＷＢＰ１遺伝子座、ＯＳＴ１遺伝子座、ＳＷＰ１遺伝子座もしくはＯＳＴ２遺伝子座、またはそれらのホモログによりコードされる。特定の態様において、単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア属種のＳＴＴ３Ａタンパク質、ＳＴＴ３Ｂタンパク質、ＳＴＴ３Ｃタンパク質、ＳＴＴ３Ｄタンパク質またはそれらの組み合わせである。特定の態様において、単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア・メジャーのＳＴＴ３Ａタンパク質、ＳＴＴ３Ｂタンパク質、ＳＴＴ３Ｄタンパク質またはそれらの組み合わせである。特定の態様において、単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア・メジャーＳＴＴ３Ｄタンパク質である。さらなる態様において、例としての単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア・メジャーＳＴＴ３Ｄタンパク質であり、これは、サッカロマイセス・セレビサエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）ＯＴａｓｅ複合体の少なくとも１の必須タンパク質の致死表現型を機能的に抑制する（またはレスキューもしくは補完する）能力がある。さらなる態様において、内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を構成するタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子が発現される。
【００１７】
上記方法のさらなる態様において、酵母宿主細胞は、ピキア・パストリス、ピキア・フィンランディカ、ピキア・トレハロフィラ、ピキア・コクラマエ、ピキア・メンブラナエファシエンス、ピキア・オプンティアエ、ピキア・サーモトレランス、ピキア・サリクタリア、ピキア・グエルクウム、ピキア・ピペリ、ピキア・スティプティス、ピキア・メタノリカ、ピキア・ミヌータ（オガタエア・ミヌータ、ピキア・リンドネリ）、ピキア属種、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス属種、ハンゼヌラ・ポリモルファ、クリベロマイセス属種、クリベロマイセス・ラクティスおよびカンジダ・アルビカンスよりなる群から選択される。
【００１８】
上記のさらなる態様において、内在性ドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリキルアルファ−１，３マンノシルトランスフェラーゼ（ＡＬＧ３）遺伝子の発現の破壊、内在性ＹＯＳ９遺伝子またはそのホモログの発現の破壊および異種糖タンパク質をコードする核酸分子を包含し、内在性ＯＴａｓｅ複合体を構成するタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子を発現する組換え宿主細胞を用意すること；ならびに異種糖タンパク質を発現させるための条件下で宿主細胞を培養して異種糖タンパク質を産生させることを含む、組換え酵母宿主細胞中で異種糖タンパク質を生産する方法が提供される。
【００１９】
上記方法において、組換え酵母宿主細胞は、酵母のＮ−グリカンパターンを持つ糖タンパク質を産生するか、または酵母は高マンノシル化を欠くが高マンノースのＮ−グリカンを包含する酵母パターンを持つ糖タンパク質を産生するように遺伝子操作されている。例えば、酵母を、α１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性、例として、Ｏｃｈ１ｐ活性を欠損するように遺伝子操作することができる。さらなる態様において、酵母は、哺乳動物様またはヒト様のＮ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するように遺伝子操作される。
【００２０】
さらなる実施形態において、宿主細胞は、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１の核酸分子および異種糖タンパク質をコードする核酸分子をさらに包含する。特定の態様において、単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、ＯＴａｓｅ複合体、例えば、酵母ＯＴａｓｅ複合体の少なくとも１の必須タンパク質の突然変異の致死表現型を機能的に抑制する能力がある。さらなる態様において、ＯＴａｓｅ複合体の必須タンパク質は、サッカロマイセス・セレビシエおよび／またはピキア・パストリスのＳＴＴ３遺伝子座、ＷＢＰ１遺伝子座、ＯＳＴ１遺伝子座、ＳＷＰ１遺伝子座もしくはＯＳＴ２遺伝子座、またはそれらのホモログによりコードされる。特定の態様において、単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア属種のＳＴＴ３Ａタンパク質、ＳＴＴ３Ｂタンパク質、ＳＴＴ３Ｃタンパク質、ＳＴＴ３Ｄタンパク質またはそれらの組み合わせである。特定の態様において、単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア・メジャーのＳＴＴ３Ａタンパク質、ＳＴＴ３Ｂタンパク質、ＳＴＴ３Ｄタンパク質またはそれらの組み合わせである。特定の態様において、単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア・メジャーＳＴＴ３Ｄタンパク質である。さらなる態様において、例としての単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア・メジャーＳＴＴ３Ｄタンパク質であり、これは、サッカロマイセス・セレビサエＯＴａｓｅ複合体の少なくとも１の必須タンパク質の致死表現型を機能的に抑制する（またはレスキューもしくは補完する）能力がある。さらなる態様において、内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を構成するタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子が発現される。
【００２１】
上記方法のさらなる態様において、酵母宿主細胞は、ピキア・パストリス、ピキア・フィンランディカ、ピキア・トレハロフィラ、ピキア・コクラマエ、ピキア・メンブラナエファシエンス、ピキア・オプンティアエ、ピキア・サーモトレランス、ピキア・サリクタリア、ピキア・グエルクウム、ピキア・ピペリ、ピキア・スティプティス、ピキア・メタノリカ、ピキア・ミヌータ（オガタエア・ミヌータ、ピキア・リンドネリ）、ピキア属種、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス属種、ハンゼヌラ・ポリモルファ、クリベロマイセス属種、クリベロマイセス・ラクティスおよびカンジダ・アルビカンスよりなる群から選択される。
【００２２】
上記のさらなる態様において、内在性ドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリキルアルファ−１，３マンノシルトランスフェラーゼ（ＡＬＧ３）遺伝子の発現の破壊、内在性ＹＯＳ９遺伝子またはそのホモログの発現の破壊および異種糖タンパク質をコードする核酸分子を包含し、内在性ＯＴａｓｅ複合体を構成するタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子を発現する組換え糸状菌宿主細胞を用意すること；ならびに異種糖タンパク質を発現させるための条件下で宿主細胞を培養して異種糖タンパク質を産生させることを含む、糸状菌宿主細胞中で異種糖タンパク質を生産する方法が提供される。糸状菌宿主細胞は、Ｎ−グリカンが糸状菌パターンを有する糖タンパク質を産生するか、または哺乳動物様またはヒト様のＮ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するように遺伝子操作される。
【００２３】
さらなる実施形態において、宿主細胞は、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１の核酸分子および異種糖タンパク質をコードする核酸分子をさらに包含する。特定の態様において、単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、ＯＴａｓｅ複合体、例えば、酵母ＯＴａｓｅ複合体の少なくとも１の必須タンパク質の突然変異の致死表現型を機能的に抑制する能力がある。さらなる態様において、ＯＴａｓｅ複合体の必須タンパク質は、サッカロマイセス・セレビシエおよび／またはピキア・パストリスのＳＴＴ３遺伝子座、ＷＢＰ１遺伝子座、ＯＳＴ１遺伝子座、ＳＷＰ１遺伝子座もしくはＯＳＴ２遺伝子座、またはそれらのホモログによりコードされる。特定の態様において、単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア属種のＳＴＴ３Ａタンパク質、ＳＴＴ３Ｂタンパク質、ＳＴＴ３Ｃタンパク質、ＳＴＴ３Ｄタンパク質またはそれらの組み合わせである。特定の態様において、単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア・メジャーのＳＴＴ３Ａタンパク質、ＳＴＴ３Ｂタンパク質、ＳＴＴ３Ｄタンパク質またはそれらの組み合わせである。特定の態様において、単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア・メジャーＳＴＴ３Ｄタンパク質である。さらなる態様において、例としての単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア・メジャーＳＴＴ３Ｄタンパク質であり、これは、サッカロマイセス・セレビサエＯＴａｓｅ複合体の少なくとも１の必須タンパク質の致死表現型を機能的に抑制する（またはレスキューもしくは補完する）能力がある。さらなる態様において、内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を構成するタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子が発現される。
【００２４】
上記のさらなる態様において、糸状菌宿主細胞は、アスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼ、トリコデルマ・リーゼイ、クリソスポリウム・ラクノウェンス、フザリウム属種、フザリウム・グラミネウム、フザリウム・ベネナタムおよびニューロスポラ・クラッサよりなる群から選択される。
【００２５】
上記方法のいずれか１のさらなる実施形態において、宿主細胞は、図１７中に示される１または複数のＮ−グリカンを含む糖タンパク質を産生するように遺伝子操作される。上記方法のいずれか１のさらなる態様において、宿主細胞は、Ｇ０、Ｇ１、Ｇ２、Ａ１またはＡ２から選択される、示される１または複数の哺乳動物様またはヒト様の複合型Ｎ−グリカンを含む糖タンパク質を産生するように遺伝子操作される。さらなる実施形態において、宿主細胞は、二分岐（ｂｉｓｅｃｔｅｄ）Ｎ−グリカンを有するか、または多アンテナ（ｍｕｌｔｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）Ｎ−グリカンを有する１または複数の哺乳動物様またはヒト様の複合型Ｎ−グリカンを含む糖タンパク質を産生するように遺伝子操作される。他の実施形態において、宿主細胞は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から選択される１または複数の哺乳動物様またはヒト様のハイブリッドＮ−グリカンを含む糖タンパク質を産生するように遺伝子操作される。さらなる実施形態において、Ｎ−グリカン構造は、パウチマンノース（Ｇ−２）構造Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（ＧＳ１．３）構造からなる。
【００２６】
上記方法のいずれか１の特定の実施形態において、異種糖タンパク質は、例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）；サイトカイン、例えばインターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγおよびインターフェロンωなど；ならびに顆粒球−コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）；顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；凝固因子、例えば因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸおよびヒトプロテインＣなど；アンチトロンビンＩＩＩ；トロンビン；可溶性ＩｇＥ受容体α鎖；免疫グロブリン、例えばＩｇＧ、ＩｇＧ断片、ＩｇＧ融合体およびＩｇＭなど；免疫接着物質および他のＦｃ融合タンパク質、例えば可溶性ＴＮＦ受容体−Ｆｃ融合タンパク質など；ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質；インターロイキン；ウロキナーゼ；キマーゼ；尿素トリプシンインヒビター；ＩＧＦ結合タンパク質；上皮増殖因子；成長ホルモン放出因子；アネキシンＶ融合タンパク質；アンジオスタチン；血管内皮増殖因子−２；骨芽前駆細胞抑制因子−１；オステオプロテジェリン；α−１−アンチトリプシン；α−フェトプロテイン；ＤＮａｓｅ  ＩＩ；ヒトプラスミノーゲンのクリングル３；グルコセレブロシダーゼ；ＴＮＦ結合タンパク質１；卵胞刺激ホルモン；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ；膜貫通アクティベーターおよびカルシウムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンド；グルカゴン様タンパク質１；またはＩＬ−２受容体アゴニストであることができる。さらなる態様において、異種糖タンパク質は、１または複数のＮ−グリコシル化部位を含むように改変されているが、通常はＮ−グリコシル化されないタンパク質である。例えば、糖タンパク質は、Ｎ−グリコシル化部位がインスリンアミノ酸配列中に導入されているインスリンであり得る。
【００２７】
上記方法のいずれか１のさらなる実施形態において、異種タンパク質は抗体であり、その例としては、限定されるものではないが、抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＲＳＶ（呼吸合胞体ウイルス）抗体、抗ＴＮＦα抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＣＤ３受容体抗体、抗ＣＤ４１  ７Ｅ３抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＥＧＦ受容体抗体または抗ＣＤ２０抗体が挙げられる。
【００２８】
上記方法のいずれか１の特定の態様において、宿主細胞は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ（ＧｎＴ）Ｉ、ＧｎＴ  ＩＩ、ＧｎＴ  ＩＩＩ、ＧｎＴ  ＩＶ、ＧｎＴ  Ｖ、ＧｎＴ  ＶＩ、ＵＤＰ−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）、フコシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼからなる群のメンバーに由来するグリコシダーゼ、マンノシダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼ活性の１または複数の触媒ドメインをコードする１または複数の核酸分子を包含する。特定の実施形態において、マンノシダーゼは、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）マンノシダーゼＩＡ、Ｃ．エレガンスマンノシダーゼＩＢ、Ｄ．メラノガスター（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）マンノシダーゼＩＡ、Ｈ．サピエンス（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）マンノシダーゼＩＢ、Ｐ．シトリナム（Ｐ．ｃｉｔｒｉｎｕｍ）マンノシダーゼＩ、マウスマンノシダーゼＩＡ、マウスマンノシダーゼＩＢ、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）マンノシダーゼＩＡ、Ａ．ニデュランスマンノシダーゼＩＢ、Ａ．ニデュランスマンノシダーゼＩＣ、マウスマンノシダーゼＩＩ、Ｃ．エレガンスマンノシダーゼＩＩ、Ｈ．サピエンスマンノシダーゼＩＩおよびマンノシダーゼＩＩＩよりなる群から選択される。
【００２９】
上記方法のいずれか１のある態様において、少なくとも１の触媒ドメインは、触媒ドメインおよび細胞標的化シグナルペプチドを含む融合タンパク質を形成することにより局在化される。融合タンパク質は、少なくとも１の遺伝的構築物によりコードすることができ、この遺伝的構築物は、細胞標的化シグナルペプチドをコードするＤＮＡ断片と酵素活性を有する触媒ドメインをコードするＤＮＡ断片とをインフレームでライゲーションすることにより形成される。標的化シグナルペプチドの例としては、限定されるものではないが、ＥＲまたはゴルジの膜結合タンパク質、回収シグナル、ＩＩ型膜タンパク質、Ｉ型膜タンパク質、膜貫通ヌクレオチド糖トランスポーター、マンノシダーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、グルコシダーゼ、マンノシルトランスフェラーゼおよびホスホマンノシルトランスフェラーゼが挙げられる。
【００３０】
上記方法のいずれか１の特定の態様において、宿主細胞は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター、ＵＤＰ−ガラクトーストランスポーター、ＧＤＰ−フコーストランスポーター、ＣＭＰ−シアル酸トランスポーターおよびヌクレオチドジホスファターゼよりなる群から選択される１または複数の酵素をコードする１または複数の核酸分子をさらに包含する。
【００３１】
上記方法のいずれか１のさらなる態様において、宿主細胞は、α１，２−マンノシダーゼ活性、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ（ＧｎＴ）Ｉ活性、マンノシダーゼＩＩ活性およびＧｎＴ  ＩＩ活性をコードする１または複数の核酸分子を包含する。
【００３２】
上記方法のいずれか１のなおさらなる態様において、宿主細胞は、α１，２−マンノシダーゼ活性、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ（ＧｎＴ）Ｉ活性、マンノシダーゼＩＩ活性、ＧｎＴ  ＩＩ活性およびＵＤＰ−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）活性をコードする１または複数の核酸分子を包含する。
【００３３】
上記方法のいずれか１のさらなる態様において、宿主細胞では、マンノシルトランスフェラーゼおよびホスホマンノシルトランスフェラーゼよりなる群から選択される１または複数の酵素の活性が欠乏している。なおさらなる態様において、宿主細胞は、１，６マンノシルトランスフェラーゼ、１，３マンノシルトランスフェラーゼおよび１，２マンノシルトランスフェラーゼよりなる群から選択される酵素を発現しない。
【００３４】
上記方法のいずれか１の特定の態様において、宿主細胞は、ピキア・パストリスのｏｃｈ１変異体である。
【００３５】
宿主細胞の特定の態様において、宿主細胞はα１，２−マンノシダーゼ活性および異種糖タンパク質をコードする１または複数の核酸分子を包含し、この宿主細胞は糖タンパク質上のＮ−グリカンに対する検出可能なホスホマンノシルトランスフェラーゼ活性を欠損しまたは呈さないが、このことはα１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性およびβ１，２−マンノシルトランスフェラーゼ活性を惹起する。さらなる態様において、宿主細胞は、α１，２−マンノシダーゼ活性およびエンドマンノシダーゼ活性をコードする１または複数の核酸分子を包含する。
【００３６】
（ａ）内在性ドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリキルアルファ−１，３マンノシルトランスフェラーゼ（ＡＬＧ３）遺伝子の発現の破壊および（ｂ）内在性骨肉腫９（ＯＳ−９）ファミリー遺伝子またはそのホモログの発現の破壊を含む宿主細胞がさらに提供される。さらなる実施形態において、宿主細胞は、異種糖タンパク質をコードする第二の核酸分子を包含する。
【００３７】
（ａ）内在性ドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリキルアルファ−１，３マンノシルトランスフェラーゼ（ＡＬＧ３）遺伝子の発現の破壊および（ｂ）内在性骨肉腫９（ＯＳ−９）ファミリー遺伝子またはそのホモログの発現の破壊を含む下等真核生物宿主細胞がさらに提供される。さらなる実施形態において、宿主細胞は、異種糖タンパク質をコードする第二の核酸分子を包含する。
【００３８】
（ａ）内在性ドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリキルアルファ−１，３マンノシルトランスフェラーゼ（ＡＬＧ３）遺伝子の発現の破壊および（ｂ）内在性骨肉腫９（ＯＳ−９）ファミリー遺伝子またはそのホモログの発現の破壊を含む酵母宿主細胞がさらに提供される。さらなる実施形態において、宿主細胞は、異種糖タンパク質をコードする第二の核酸分子を包含する。
【００３９】
（ａ）内在性ドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリキルアルファ−１，３マンノシルトランスフェラーゼ（ＡＬＧ３）遺伝子の発現の破壊および（ｂ）内在性骨肉腫９（ＯＳ−９）ファミリー遺伝子またはそのホモログの発現の破壊を含む酵母宿主細胞がさらに提供される。さらなる実施形態において、宿主細胞は、異種糖タンパク質をコードする第二の核酸分子を包含する。
【００４０】
（ａ）内在性ドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリキルアルファ−１，３マンノシルトランスフェラーゼ（ＡＬＧ３）遺伝子の発現の破壊および（ｂ）内在性骨肉腫９（ＯＳ−９）ファミリー遺伝子またはそのホモログの発現の破壊を含む糸状菌宿主細胞がさらに提供される。さらなる実施形態において、宿主細胞は、異種糖タンパク質をコードする第二の核酸分子を包含する。
【００４１】
（ａ）内在性ドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリキルアルファ−１，３マンノシルトランスフェラーゼ（ＡＬＧ３）遺伝子の発現の破壊を含む糸状菌宿主細胞がさらに提供される。さらなる実施形態において、宿主細胞は、異種糖タンパク質をコードする第二の核酸分子を包含する。
【００４２】
さらなる実施形態において、宿主細胞は、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１の核酸分子および異種糖タンパク質をコードする核酸分子をさらに包含する。特定の態様において、単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、ＯＴａｓｅ複合体、例えば、酵母ＯＴａｓｅ複合体の少なくとも１の必須タンパク質の突然変異の致死表現型を機能的に抑制する能力がある。さらなる態様において、ＯＴａｓｅ複合体の必須タンパク質は、サッカロマイセス・セレビシエおよび／またはピキア・パストリスのＳＴＴ３遺伝子座、ＷＢＰ１遺伝子座、ＯＳＴ１遺伝子座、ＳＷＰ１遺伝子座もしくはＯＳＴ２遺伝子座、またはそれらのホモログによりコードされる。特定の態様において、単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア属種のＳＴＴ３Ａタンパク質、ＳＴＴ３Ｂタンパク質、ＳＴＴ３Ｃタンパク質、ＳＴＴ３Ｄタンパク質またはそれらの組み合わせである。特定の態様において、単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア・メジャーのＳＴＴ３Ａタンパク質、ＳＴＴ３Ｂタンパク質、ＳＴＴ３Ｄタンパク質またはそれらの組み合わせである。特定の態様において、単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア・メジャーＳＴＴ３Ｄタンパク質である。さらなる態様において、例としての単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア・メジャーＳＴＴ３Ｄタンパク質であり、これは、サッカロマイセス・セレビサエＯＴａｓｅ複合体の少なくとも１の必須タンパク質の致死表現型を機能的に抑制する（またはレスキューもしくは補完する）能力がある。さらなる態様において、内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を構成するタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子が発現される。
【００４３】
（ａ）内在性ドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリキルアルファ−１，３マンノシルトランスフェラーゼ（ＡＬＧ３）遺伝子の発現の破壊、および（ｂ）内在性骨肉腫９（ＯＳ−９）ファミリー遺伝子またはそのホモログの発現の破壊；および（ｃ）異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする第一の核酸分子を含み；ならびに内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を構成するタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子を発現する宿主細胞がさらに提供される。さらなる実施形態において、宿主細胞は、異種糖タンパク質をコードする第二の核酸分子を包含する。
【００４４】
（ａ）内在性ドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリキルアルファ−１，３マンノシルトランスフェラーゼ（ＡＬＧ３）遺伝子の発現の破壊、（ｂ）内在性骨肉腫９（ＯＳ−９）ファミリー遺伝子またはそのホモログの発現の破壊；および（ｃ）異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする第一の核酸分子を含み；ならびに内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を構成するタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子を発現する下等真核生物宿主細胞がさらに提供される。さらなる実施形態において、宿主細胞は、異種糖タンパク質をコードする第二の核酸分子を包含する。
【００４５】
（ａ）内在性ドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリキルアルファ−１，３マンノシルトランスフェラーゼ（ＡＬＧ３）遺伝子の発現の破壊、（ｂ）内在性ＹＯＳ９遺伝子またはそのホモログの発現の破壊；および（ｃ）異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする第一の核酸分子を含み；ならびに内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を構成するタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子を発現する酵母宿主細胞がさらに提供される。さらなる実施形態において、宿主細胞は、異種糖タンパク質をコードする第二の核酸分子を包含する。
【００４６】
（ａ）内在性ドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリキルアルファ−１，３マンノシルトランスフェラーゼ（ＡＬＧ３）遺伝子の発現の破壊、（ｂ）内在性ＹＯＳ９遺伝子またはそのホモログの発現の破壊；および（ｃ）酵母オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体の少なくとも１の必須タンパク質の突然変異の致死表現型を機能的に抑制する能力がある異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする第一の核酸分子を含み；ならびに内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を構成するタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子を発現する酵母宿主細胞がさらに提供される。さらなる実施形態において、宿主細胞は、異種糖タンパク質をコードする第二の核酸分子を包含する。
【００４７】
（ａ）内在性ドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリキルアルファ−１，３マンノシルトランスフェラーゼ（ＡＬＧ３）遺伝子の発現の破壊、（ｂ）内在性骨肉腫９（ＯＳ−９）ファミリー遺伝子またはそのホモログの発現の破壊；および（ｃ）異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする第一の核酸分子を含み；ならびに内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を構成するタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子を発現する糸状菌宿主細胞がさらに提供される。さらなる実施形態において、宿主細胞は、異種糖タンパク質をコードする第二の核酸分子を包含する。
【００４８】
（ａ）内在性ドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリキルアルファ−１，３マンノシルトランスフェラーゼ（ＡＬＧ３）遺伝子の発現の破壊、（ｂ）内在性骨肉腫９（ＯＳ−９）ファミリー遺伝子またはそのホモログの発現の破壊；および（ｃ）酵母または糸状菌のオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体の少なくとも１の必須タンパク質の突然変異の致死表現型を機能的に抑制する能力がある異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする第一の核酸分子を含み；ならびに内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を構成するタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子を発現する糸状菌宿主細胞がさらに提供される。さらなる実施形態において、宿主細胞は、異種糖タンパク質をコードする第二の核酸分子を包含する。
【００４９】
特定の態様において、単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、ＯＴａｓｅ複合体、例えば、酵母ＯＴａｓｅ複合体の少なくとも１の必須タンパク質の突然変異の致死表現型を機能的に抑制する能力がある。さらなる態様において、ＯＴａｓｅ複合体の必須タンパク質は、サッカロマイセス・セレビシエおよび／またはピキア・パストリスのＳＴＴ３遺伝子座、ＷＢＰ１遺伝子座、ＯＳＴ１遺伝子座、ＳＷＰ１遺伝子座もしくはＯＳＴ２遺伝子座、またはそれらのホモログによりコードされる。特定の態様において、単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア属種のＳＴＴ３Ａタンパク質、ＳＴＴ３Ｂタンパク質、ＳＴＴ３Ｃタンパク質、ＳＴＴ３Ｄタンパク質またはそれらの組み合わせである。特定の態様において、単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア・メジャーのＳＴＴ３Ａタンパク質、ＳＴＴ３Ｂタンパク質、ＳＴＴ３Ｄタンパク質またはそれらの組み合わせである。特定の態様において、単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア・メジャーＳＴＴ３Ｄタンパク質である。さらなる態様において、例としての単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア・メジャーＳＴＴ３Ｄタンパク質であり、これは、サッカロマイセス・セレビサエＯＴａｓｅ複合体の少なくとも１の必須タンパク質の致死表現型を機能的に抑制する（またはレスキューもしくは補完する）能力がある。さらなる態様において、内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を構成するタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子が発現される。
【００５０】
さらなる実施形態において、宿主細胞は、エンドマンノシダーゼ活性（例として、完全長エンドマンノシダーゼであるか、または細胞標的化シグナルペプチドと融合したエンドマンノシダーゼ触媒ドメインを含むキメラエンドマンノシダーゼであり、この細胞標的化シグナルペプチドは通常はこの触媒ドメインと関連せず、宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体に対してエンドマンノシダーゼ活性を標的化するように選択される。例えば、米国特許第７，３３２，２９９号を参照されたい）および／またはグルコシダーゼＩＩ活性（完全長グルコシダーゼＩＩであるか、または細胞標的化シグナルペプチドと融合したグルコシダーゼＩＩ触媒ドメインを含むキメラグルコシダーゼＩＩであり、この細胞標的化シグナルペプチドは通常はこの触媒ドメインと関連せず、宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体に対してグルコシダーゼＩＩ活性を標的化するように選択される。例えば、米国特許第６，８０３，２２５号を参照されたい）をさらに発現する。特定の態様において、宿主細胞は、ＡＬＧ６（α１，３−グルコシラトランスフェラーゼ（α１，３−ｇｌｕｃｏｓｙｌａｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ））遺伝子の欠失または破壊（ａｌｇ６Δ）をさらに包含し、このａｌｇ６Δはａｌｇ３Δ宿主細胞中の糖タンパク質のＮ−グリカン占有率を増加させることが示されている（例えば、Ｄｅ  Ｐｏｕｒｃｑ  ｅｔ  ａｌ．，ＰｌｏＳＯｎｅ  ２０１２；７（６）：ｅ３９９７６．Ｅｐｕｂ  ２０１２  Ｊｕｎ  ２９を参照されたい。この文献は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）をＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（ＧＳ１．３）またはパウチマンノースＮ−グリカン構造を有する糖タンパク質を産生するように遺伝子操作することを開示している）。ピキア・パストリスＡＬＧ６をコードする核酸配列は、ＥＭＢＬデータベース中で、アクセッション番号ＣＣＣＡ３８４２６で開示されている。さらなる態様において、宿主細胞は、ＯＣＨ１遺伝子の欠失または破壊（ｏｃｈ１Δ）をさらに包含する。
【００５１】
上記方法のいずれか１のさらなる実施形態において、宿主細胞は、図１７中に示される１または複数のＮ−グリカンを含む糖タンパク質を産生するように遺伝子操作される。上記方法のいずれか１のさらなる態様において、宿主細胞は、Ｇ０、Ｇ１、Ｇ２、Ａ１またはＡ２から選択される、示される１または複数の哺乳動物様またはヒト様の複合型Ｎ−グリカンを含む糖タンパク質を産生するように遺伝子操作される。さらなる実施形態において、宿主細胞は、二分岐Ｎ−グリカンを有するか、または多アンテナＮ−グリカンを有する１または複数のヒト様の複合型Ｎ−グリカンを含む糖タンパク質を産生するように遺伝子操作される。他の実施形態において、宿主細胞は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から選択される１または複数の哺乳動物様またはヒト様のハイブリッドＮ−グリカンを含む糖タンパク質を産生するように遺伝子操作される。さらなる実施形態において、Ｎ−グリカン構造は、パウチマンノース（Ｇ−２）構造Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（ＧＳ１．３）構造からなる。
【００５２】
上記宿主細胞のいずれか１の特定の実施形態において、異種糖タンパク質は、例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）；サイトカイン、例えばインターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγおよびインターフェロンωなど；ならびに顆粒球−コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）；顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；凝固因子、例えば因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸおよびヒトプロテインＣなど；アンチトロンビンＩＩＩ；トロンビン；可溶性ＩｇＥ受容体α鎖；免疫グロブリン、例えばＩｇＧ、ＩｇＧ断片、ＩｇＧ融合体およびＩｇＭなど；免疫接着物質および他のＦｃ融合タンパク質、例えば可溶性ＴＮＦ受容体−Ｆｃ融合タンパク質など；ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質；インターロイキン；ウロキナーゼ；キマーゼ；尿素トリプシンインヒビター；ＩＧＦ結合タンパク質；上皮増殖因子；成長ホルモン放出因子；アネキシンＶ融合タンパク質；アンジオスタチン；血管内皮増殖因子−２；骨芽前駆細胞抑制因子−１；オステオプロテジェリン；α−１−アンチトリプシン；α−フェトプロテイン；ＤＮａｓｅ  ＩＩ；ヒトプラスミノーゲンのクリングル３；グルコセレブロシダーゼ；ＴＮＦ結合タンパク質１；卵胞刺激ホルモン；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ；膜貫通アクティベーターおよびカルシウムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンド；グルカゴン様タンパク質１；ならびにＩＬ−２受容体アゴニストよりなる群から選択することができる。さらなる態様において、糖タンパク質は、少なくとも１のＮ−結合グリコシル化部位を含むように改変されている、通常はＮ−グリコシル化されないタンパク質である。例えば、少なくとも１のＮ−結合グリコシル化部位を含むように改変されたインスリンである。
【００５３】
上記宿主細胞のいずれか１のさらなる実施形態において、異種タンパク質は抗体であり、その例としては、限定されるものではないが、抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＲＳＶ（呼吸合胞体ウイルス）抗体、抗ＴＮＦα抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＣＤ３受容体抗体、抗ＣＤ４１  ７Ｅ３抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＥＧＦ受容体抗体または抗ＣＤ２０抗体が挙げられる。
【００５４】
上記宿主細胞の特定の態様において、宿主細胞は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ（ＧｎＴ）Ｉ、ＧｎＴ  ＩＩ、ＧｎＴ  ＩＩＩ、ＧｎＴ  ＩＶ、ＧｎＴ  Ｖ、ＧｎＴ  ＶＩ、ＵＤＰ−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）、フコシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼからなる群のメンバーに由来するグリコシダーゼ、マンノシダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼ活性の１または複数の触媒ドメインをコードする１または複数の核酸分子を包含する。特定の実施形態において、マンノシダーゼは、Ｃ．エレガンスマンノシダーゼＩＡ、Ｃ．エレガンスマンノシダーゼＩＢ、Ｄ．メラノガスターマンノシダーゼＩＡ、Ｈ．サピエンスマンノシダーゼＩＢ、Ｐ．シトリナムマンノシダーゼＩ、マウスマンノシダーゼＩＡ、マウスマンノシダーゼＩＢ、Ａ．ニデュランスマンノシダーゼＩＡ、Ａ．ニデュランスマンノシダーゼＩＢ、Ａ．ニデュランスマンノシダーゼＩＣ、マウスマンノシダーゼＩＩ、Ｃ．エレガンスマンノシダーゼＩＩ、Ｈ．サピエンスマンノシダーゼＩＩおよびマンノシダーゼＩＩＩよりなる群から選択される。
【００５５】
上記宿主細胞のいずれか１のある態様において、少なくとも１の触媒ドメインは、触媒ドメインおよび細胞標的化シグナルペプチドを含む融合タンパク質を形成することにより局在化される。融合タンパク質は、少なくとも１の遺伝的構築物によりコードすることができ、この遺伝的構築物は、細胞標的化シグナルペプチドをコードするＤＮＡ断片と酵素活性を有する触媒ドメインをコードするＤＮＡ断片とをインフレームでライゲーションすることにより形成される。標的化シグナルペプチドの例としては、限定されるものではないが、ＥＲまたはゴルジの膜結合タンパク質、回収シグナル、例えばＨＤＥＬまたはＫＤＥＬなど、ＩＩ型膜タンパク質、Ｉ型膜タンパク質、膜貫通ヌクレオチド糖トランスポーター、マンノシダーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、グルコシダーゼ、マンノシルトランスフェラーゼおよびホスホマンノシルトランスフェラーゼに対するものが挙げられる。
【００５６】
上記宿主細胞のいずれか１の特定の態様において、宿主細胞は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター、ＵＤＰ−ガラクトーストランスポーター、ＧＤＰ−フコーストランスポーター、ＣＭＰ−シアル酸トランスポーターおよびヌクレオチドジホスファターゼよりなる群から選択される１または複数の酵素をコードする１または複数の核酸分子をさらに包含する。
【００５７】
上記宿主細胞のいずれか１のさらなる態様において、宿主細胞は、α１，２−マンノシダーゼ活性、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ（ＧｎＴ）Ｉ活性、マンノシダーゼＩＩ活性およびＧｎＴ  ＩＩ活性をコードする１または複数の核酸分子を包含する。
【００５８】
上記宿主細胞のいずれか１のなおさらなる態様において、宿主細胞は、α１，２−マンノシダーゼ活性、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ（ＧｎＴ）Ｉ活性、マンノシダーゼＩＩ活性、ＧｎＴ  ＩＩ活性およびＵＤＰ−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）活性をコードする１または複数の核酸分子を包含する。
【００５９】
宿主細胞の特定の態様において、宿主細胞はα１，２−マンノシダーゼ活性および異種糖タンパク質をコードする１または複数の核酸分子を包含し、この宿主細胞は糖タンパク質上のＮ−グリカンに対する検出可能なホスホマンノシルトランスフェラーゼ活性を欠損しまたは呈さないが、このことはα１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性およびβ１，２−マンノシルトランスフェラーゼ活性を惹起する。さらなる態様において、宿主細胞は、α１，２−マンノシダーゼ活性およびエンドマンノシダーゼ活性をコードする１または複数の核酸分子を包含する。
【００６０】
上記宿主細胞のいずれか１のさらなる態様において、宿主細胞は、ピキア・パストリス、ピキア・フィンランディカ、ピキア・トレハロフィラ、ピキア・コクラマエ、ピキア・メンブラナエファシエンス、ピキア・オプンティアエ、ピキア・サーモトレランス、ピキア・サリクタリア、ピキア・グエルクウム、ピキア・ピペリ、ピキア・スティプティス、ピキア・メタノリカ、ピキア属種、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス属種、ハンゼヌラ・ポリモルファ、クリベロマイセス属種、クリベロマイセス・ラクティス、カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼ、トリコデルマ・リーゼイ、クリソスポリウム・ラクノウェンス、フザリウム属種、フザリウム・グラミネウム、フザリウム・ベネナタム、ニューロスポラ・クラッサ、植物細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞よりなる群から選択される。
【００６１】
上記宿主細胞のいずれか１のなおさらなる態様において、宿主細胞は、マンノシルトランスフェラーゼおよびホスホマンノシルトランスフェラーゼよりなる群から選択される１または複数の酵素の検出可能な活性が欠乏しているか、またはこれを呈さない。なおさらなる態様において、宿主細胞は、１，６マンノシルトランスフェラーゼ、１，３マンノシルトランスフェラーゼおよび１，２マンノシルトランスフェラーゼよりなる群から選択される酵素を発現しない。
【００６２】
上記宿主細胞のいずれか１の特定の態様において、宿主細胞は、ピキア・パストリスである。さらなる態様において、宿主細胞は、ピキア・パストリスのｏｃｈ１変異体である。
【００６３】
本明細書中の方法および宿主細胞は、組成物中の糖タンパク質のＮ−グリコシル化部位のうちの少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％が占有されている糖タンパク質組成物を生産するのに用いることができる。
【００６４】
さらに、本明細書中の方法および宿主細胞は、組成物中の糖タンパク質のＮ−グリコシル化部位のうちの少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％が占有されている糖タンパク質組成物であって、さらなる態様においてフコースを欠いた哺乳動物様またはヒト様のＮ−グリカンを有する糖タンパク質組成物を生産するのに用いることができる。
【００６５】
さらに、方法および酵母または糸状菌の宿主細胞は、哺乳動物様またはヒト様のＮ−グリカンを産生するように遺伝子操作され、これらは、組成物中の糖タンパク質のＮ−グリコシル化部位のうちの少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％が占有されている糖タンパク質組成物であって、さらなる態様においてフコースを欠いた哺乳動物様またはヒト様のＮ−グリカンを有する糖タンパク質組成物を生産するのに用いることができる。
【００６６】
いくつかの態様において、フコシル化された哺乳動物様またはヒト様のＮ−グリカンを産生するように遺伝子操作された酵母または糸状菌の宿主細胞は、組成物中の糖タンパク質のＮ−グリコシル化部位のうちの少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％が占有されている糖タンパク質組成物であって、さらなる態様においてフコースを有する哺乳動物様またはヒト様のＮ−グリカンを有する糖タンパク質組成物を生産するのに用いることができる。
【００６７】
本明細書中の方法および宿主細胞は、組成物中の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の抗体分子が占有された両Ｎ−グリコシル化部位を有する抗体組成物を生産するのに用いることができる。
【００６８】
さらに、本明細書中の方法および宿主細胞は、組成物中の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の抗体分子が占有された両Ｎ−グリコシル化部位を有し、Ｎ−グリカンがフコースを欠く抗体組成物を生産するのに用いることができる。
【００６９】
さらに、本明細書中の方法および酵母または糸状菌の宿主細胞は、組成物中の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の抗体分子が占有された両Ｎ−グリコシル化部位を有し、Ｎ−グリカンがフコースを欠く抗体組成物を生産するのに用いることができる。
【００７０】
さらに、哺乳動物様またはヒト様のＮ−グリカンを産生するように遺伝子操作された方法および酵母または糸状菌の宿主細胞は、組成物中の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の抗体分子が占有された両Ｎ−グリコシル化部位を有し、抗体がフコースを欠く哺乳動物様またはヒト様のＮ−グリカンを有する抗体組成物を生産するのに用いることができる。いくつかの態様において、フコシル化された哺乳動物様またはヒト様のＮ−グリカンを産生するように遺伝子操作された酵母または糸状菌の宿主細胞は、組成物中の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の抗体分子が占有された両Ｎ−グリコシル化部位を有し、抗体がフコースを持つ哺乳動物様またはヒト様のＮ−グリカンを有する抗体組成物を生産するのに用いることができる。
【００７１】
特定の実施形態において、抗体は、抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＲＳＶ（呼吸合胞体ウイルス）抗体、抗ＴＮＦα抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＣＤ３受容体抗体、抗ＣＤ４１  ７Ｅ３抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＥＧＦ受容体抗体または抗ＣＤ２０抗体よりなる群から選択される抗体を含む。
【００７２】
本明細書中に記載される宿主細胞および方法により生産される、１またはそれ以上の糖タンパク質を含む組成物がさらに提供される。
【００７３】
特定の実施形態において、本明細書中で提供される糖タンパク質組成物は、二分岐種および多アンテナ種などの、フコシル化されたおよびフコシル化されていないハイブリッドおよび複合型のＮ−グリカンを有する糖タンパク質を含み、これらとしては、限定されるものではないが、例えばＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２などのＮ−グリカンが挙げられる。
【００７４】
特定の実施形態において、本明細書中で提供される糖タンパク質組成物は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２よりなる群から選択される少なくとも１のハイブリッドＮ−グリカンを有する糖タンパク質を含む。特定の態様において、ハイブリッドＮ−グリカンは、組成物中の優勢なＮ−グリカン種である。さらなる態様において、ハイブリッドＮ−グリカンは、組成物中のハイブリッドＮ−グリカンの約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％を構成する特定のＮ−グリカン種である。
【００７５】
特定の実施形態において、本明細書中で提供される糖タンパク質組成物は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２よりなる群から選択される少なくとも１の複合型Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を含む。特定の態様において、複合型Ｎ−グリカンは、組成物中の優勢なＮ−グリカン種である。さらなる態様において、複合型Ｎ−グリカンは、組成物中の複合型Ｎ−グリカンの約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％を構成する特定のＮ−グリカン種である。
【００７６】
特定の実施形態において、Ｎ−グリカンはフソシル化（ｆｕｓｏｓｙｌａｔｅｄ）されている。一般に、フコースは、Ｎ−グリカンの還元末端におけるＧｌｃＮＡｃとのα１，３−結合、Ｎ−グリカンの還元末端におけるＧｌｃＮＡｃとのα１，６−結合、Ｎ−グリカンの非還元末端におけるＧａｌとのα１，２−結合、Ｎ−グリカンの非還元末端におけるＧｌｃＮａｃとのα１，３−結合、またはＮ−グリカンの非還元末端におけるＧｌｃＮＡｃとのα１，４−結合において存在する。
【００７７】
それ故、上記糖タンパク質組成物の特定の態様において、グリコフォームはα１，３−結合もしくはα１，６−結合フコースで存在してＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）およびＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）よりなる群から選択されるグリコフォームを生じさせ；α１，３−結合もしくはα１，４−結合フコースで存在してＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃｌ−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２よりなる群から選択されるグリコフォームを生じさせ；またはα１，２−結合フコースで存在してＧａｌ（Ｆｕｃ）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２（Ｆｕｃ１−２）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌ２（Ｆｕｃ１−２）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＡＮＡ２Ｇａｌ２（Ｆｕｃ１−２）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２よりなる群から選択されるグリコフォームを生じさせる。
【００７８】
上記のさらなる態様において、複合型Ｎ−グリカンは、フコシル化されたおよびフコシル化されていない二分岐種および多アンテナ種をさらに包含する。
【００７９】
さらなる態様において、糖タンパク質は、高マンノースＮ−グリカンを含み、これらとしては、限定されるものではないが、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカン構造からなるＮ−グリカンが挙げられる。
【００８０】
本発明は、疾患治療用の薬剤の製造のための、（ａ）内在性ドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリキルアルファ−１，３マンノシルトランスフェラーゼ（ＡＬＧ３）遺伝子の発現の破壊、および（ｂ）内在性骨肉腫９（ＯＳ−９）ファミリー遺伝子またはホモログの破壊を含む宿主細胞の使用を提供する。
【００８１】
本発明は、疾患治療用の薬剤の製造のための、上述の宿主細胞のいずれか１の使用を提供する。
【００８２】
定義
本明細書中で用いられる用語「Ｎ−グリカン」および「グリコフォーム」は交換可能に用いられ、Ｎ−結合オリゴ糖、例えば、ポリペプチドのアスパラギン残基にアスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合により付着したものを指す。Ｎ−結合糖タンパク質は、タンパク質中のアスパラギン残基のアミド窒素に結合したＮ−アセチルグルコサミン残基を含有する。糖タンパク質上で見出される優勢な糖は、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸（例として、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（ＮＡＮＡ））である。糖基のプロセシングは、Ｎ−結合糖タンパク質の場合、翻訳と同時にＥＲの内腔の中で起こり、翻訳後にゴルジ体中で継続する。
【００８３】
Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の共通の五糖コアを有する（「Ｍａｎ」はマンノースを指し、「Ｇｌｃ」はグルコースを指し、および「ＮＡｃ」はＮ−アセチルを指し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを指す）。通常、Ｎ−グリカン構造は、非還元末端を左側に、還元末端を右側にして表される。Ｎ−グリカンの還元末端は、タンパク質上のグリコシル化部位を含むＡｓｎ残基に付着する末端である。Ｎ−グリカンは、「トリアムノース（ｔｒｉａｍｍｎｏｓｅ）コア」、「五糖コア」または「パウチマンノースコア」とも呼ばれるＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ３」）コア構造に付加される末梢の糖（例として、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、フコースおよびシアル酸）を含む分岐（アンテナ）の数に関して、異なる。Ｎ−グリカンは、その分岐した構成成分に従って分類される（例として、高マンノース、複合型またはハイブリッド）。「高マンノース」型のＮ−グリカンは、５またはそれより多いマンノース残基を有する。「複合」型のＮ−グリカンは、典型的に、「トリマンノース」コアの１，３マンノースアームに付着した少なくとも１のＧｌｃＮＡｃおよび１，６マンノースアームに付着した少なくとも１のＧｌｃＮＡｃを有する。複合型Ｎ−グリカンはまた、シアル酸または誘導体（例として、「ＮＡＮＡ」または「ＮｅｕＡｃ」、ここで「Ｎｅｕ」はノイラミン酸を指し、「Ａｃ」はアセチルを指す）で修飾されていてもよいガラクトース（「Ｇａｌ」）またはＮ−アセチルガラクトサミン（「ＧａｌＮＡｃ」）残基を有してもよい。複合型Ｎ−グリカンはまた、「二分岐」ＧｌｃＮＡｃおよびコアフコース（「Ｆｕｃ」）を含む鎖内置換を有してもよい。複合型Ｎ−グリカンはまた、「トリマンノースコア」上に複数のアンテナを有してもよく、これはしばしば「多アンテナグリカン」と呼ばれる。「ハイブリッド」のＮ−グリカンは、トリマンノースコアの１，３マンノースアームの末端上に少なくとも１のＧｌｃＮＡｃを、およびトリマンノースコアの１，６マンノースアーム上に０またはそれより多いマンノースを有する。これら様々なＮ−グリカンは、「グリコフォーム」とも呼ばれる。
【００８４】
複合型Ｎ−グリカンに関して、用語「Ｇ−２」、「Ｇ−１」、「Ｇ０」、「Ｇ１」、「Ｇ２」、「Ａ１」および「Ａ２」は、以下のことを意味する。「Ｇ−２」はＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはパウチマンノースとして特徴付けることができるＮ−グリカン構造を指し、用語「Ｇ−１」はＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴付けることができるＮ−グリカン構造を指し、用語「Ｇ０」はＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴付けることができるＮ−グリカン構造を指し、用語「Ｇ１」はＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴付けることができるＮ−グリカン構造を指し、用語「Ｇ２」はＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴付けることができるＮ−グリカン構造を指し、用語「Ａ１」はＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴付けることができるＮ−グリカン構造を指し、および用語「Ａ２」はＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴付けることができるＮ−グリカン構造を指す。特に指示がない限り、用語「Ｇ−２」、「Ｇ−１」、「Ｇ０」、「Ｇ１」、「Ｇ２」、「Ａ１」および「Ａ２」は、Ｎ−グリカンの還元末端においてＧｌｃＮＡｃ残基に付着したフコースを欠くＮ−グリカン種を指す。用語が「Ｆ」を包含する場合、「Ｆ」は、Ｎ−グルシアン（ｇｌｃｙａｎ）種がＮ−グリカンの還元末端においてＧｌｃＮＡｃ残基上にフコース残基を含有することを指し示す。例えば、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆ、Ａ１ＦおよびＡ２Ｆは全て、Ｎ−グリカンが、Ｎ−グリカンの還元末端においてＧｌｃＮＡｃ残基に付着したフコース残基をさらに包含することを指し示す。下等真核生物、例えば酵母および糸状菌などは、通常、フコースを生じさせるＮ−グリカンを産生しない。
【００８５】
多アンテナＮ−グリカンに関して、用語「多アンテナＮ−グリカン」は、Ｎ−グリカンの１，６アームもしくは１，３アームの非還元末端を構成するマンノース残基上にＧｌｃＮＡｃ残基を、またはＮ−グリカンの１，６アームおよび１，３アームの非還元末端を構成する各マンノース残基上にＧｌｃＮＡｃ残基をさらに含むＮ−グリカンを指す。したがって、多アンテナＮ−グリカンは、式ＧｌｃＮＡｃ（２−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（２−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（２−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２により特徴付けることができる。用語「１−４」は、１、２、３または４残基を指す。
【００８６】
二分岐Ｎ−グリカンに関して、用語「二分岐Ｎ−グリカン」は、ＧｌｃＮＡｃ残基がＮ−グリカンの還元末端においてマンノース残基と結合しているＮ−グリカンを指す。二分岐Ｎ−グリカンは、式ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２により特徴付けることができ、ここで各マンノース残基はその非還元末端においてＧｌｃＮＡｃ残基と結合している。対照的に、多アンテナＮ−グリカンがＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴付けられる場合、この式は、２つのＧｌｃＮＡｃ残基がＮ−グリカンの２つのアームのうちの一方の非還元末端においてマンノース残基と結合しており、１つのＧｌｃＮＡｃ残基がＮ−グリカンの他方のアームの非還元末端においてマンノース残基と結合していることを指し示す。
【００８７】
本明細書中で用いられる略語は、当該技術分野において一般的に用いられるものであり、例としては、上記の糖の略語を参照されたい。他の一般的な略語としては、「ＰＮＧａｓｅ」または「グリカナーゼ」または「グルコシダーゼ」が挙げられ、これらは全てペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（ＥＣ３．２．２．１８）を指す。
【００８８】
本明細書中で用いられる用語「糖タンパク質」は、１または複数のＮ−グリカンが付着した任意のタンパク質を指す。したがって、この用語は、当該技術分野において糖タンパク質として一般に認識されるタンパク質、および、例えば１または複数のＮ−結合グリコシル化部位を含むように改変されたインスリンといった１または複数のＮ−結合グリコシル化部位を含有するように遺伝子操作されているタンパク質の両方を指す。
【００８９】
本明細書中で用いられる「ヒト化糖タンパク質」または「ヒト様の糖タンパク質」は、４個より少ないマンノース残基を有するＮ−グリカンが付着したタンパク質および少なくとも５個のマンノース残基を有する合成糖タンパク質中間体（これもまた有用であり、さらにインビトロまたはインビボで扱うことができる）を二者択一的に指す。好ましくは、本発明によって生産される糖タンパク質は、少なくとも３０モル％、好ましくは少なくとも４０モル％、より好ましくは５０、６０、７０、８０、９０またはさらには１００モル％のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２中間体を、少なくとも一時的に含有する。これは、例として、本発明の宿主細胞を「より良い」、すなわち、より効率的なグリコシル化酵素を発現するように操作することにより達成し得る。例えば、マンノシダーゼは、タンパク質がグリコシル化される宿主細胞中の部位において存在する条件下で最適な活性を有するように選択され、好ましくは、活性が望まれる宿主細胞の細胞小器官に対して酵素を標的化することにより、宿主細胞内に導入される。
【００９０】
本明細書中で用いられる用語「組換え宿主細胞」（「発現宿主細胞」、「発現宿主系」、「発現系」または単に「宿主細胞」）は、組換えベクターが導入されている細胞を指すことが意図される。かかる用語は、特定の対象細胞だけでなく、かかる細胞の後代をも指すことを意図するものであることが理解されるべきである。突然変異または環境の影響のいずれかに起因して後続の世代においてある改変が生じることがあるため、かかる後代は、実際には親細胞と同一でないこともあるが、本明細書中で用いられる用語「宿主細胞」の範囲内に依然として包含される。組換え宿主細胞は、培地中で増殖された単離細胞または細胞株であってもよく、または生きた組織もしくは生物中に存在する細胞であってもよい。好ましい宿主細胞は、酵母および真菌である。
【００９１】
糖タンパク質の調製物中に存在するグリカンの「モルパーセント」を指す場合、この用語は、Ｎ−結合オリゴ糖のプール中に存在する特定のグリカンのモルパーセントを意味し、このＮ−結合オリゴ糖は、タンパク質調製物をＰＮＧａｓｅで処理し、次いでグリコフォーム組成物により影響されない方法により定量する（例えば、ＰＮＧａｓｅで放出されたグリカンプールを蛍光タグ、例えば２−アミノベンズアミドなどで標識し、次いで高速液体クロマトグラフィーまたはキャピラリー電気泳動により分離して、次いで蛍光強度によりグリカンを定量する）場合に放出されるものである。例えば、５０モルパーセントのＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｇａｌ２ＮＡＮＡ２は、放出されたグリカンの５０パーセントがＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｇａｌ２ＮＡＮＡ２であり、残りの５０パーセントが他のＮ−結合オリゴ糖からなることを意味する。実施形態において、糖タンパク質の調整物中の特定グリカンのモルパーセントは、２０％から１００％の間であり、好ましくは２５％超、３０％超、３５％超、４０％超または４５％超であり、より好ましくは５０％超、５５％超、６０％超、６５％超または７０％超であり、最も好ましくは７５％超、８０％超、８５％超、９０％超または９５％超である。
【００９２】
用語「操作可能に連結された」発現制御配列は、発現制御配列が目的の遺伝子を制御するように目的の遺伝子と近接している結合を指し、同様に目的の遺伝子を制御するようにトランスで（ｉｎ  ｔｒａｎｓ）または距離をおいて作用する発現制御配列を指す。
【００９３】
用語「発現制御配列」または「制御性配列」は交換可能に用いられ、本明細書中で用いられる場合、操作可能に連結されたコーディング配列の発現に影響を与えるのに必要なポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列は、核酸配列の転写、転写後イベントおよび翻訳を制御する配列である。発現制御配列としては、適当な転写開始配列、終結配列、プロモーター配列およびエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えばスプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグナルなど；細胞質のｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を高める配列（例として、リボソーム結合部位）；タンパク質の安定性を高める配列；ならびに望まれる場合、タンパク質の分泌を高める配列が挙げられる。かかる制御配列の性質は宿主生物によって異なり、原核生物において、かかる制御配列は一般に、プロモーター、リボソーム結合部位および転写終結配列を包含する。用語「制御配列」は、最小限、その存在が発現のために必須である全ての成分を包含することが意図され、さらにその存在が有利である付加的な成分、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列を包含することもできる。
【００９４】
用語「トランスフェクトする」、「トランスフェクション」、「トランスフェクトすること」などは、真核生物細胞内への異種核酸の導入を指し、この真核生物細胞は高等および下等真核生物細胞の両方である。歴史的に、用語「形質転換」が酵母または真菌細胞内への核酸の導入を記述するのに用いられているが、しかしながら、本明細書中の用語「トランスフェクション」は、酵母および真菌細胞などの任意の真核細胞内への核酸の導入を指すのに用いられる。
【００９５】
用語「真核性」は、有核の細胞または生物を指し、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、動物細胞および下等真核生物細胞を包含する。
【００９６】
用語「下等真核生物細胞」は、酵母および糸状菌を包含する。酵母および糸状菌としては、限定されるものではないが、ピキア・パストリス、ピキア・フィンランディカ、ピキア・トレハロフィラ、ピキア・コクラマエ、ピキア・メンブラナエファシエンス、ピキア・ミヌータ（オガタエア・ミヌータ、ピキア・リンドネリ）、ピキア・オプンティアエ、ピキア・サーモトレランス、ピキア・サリクタリア、ピキア・グエルクウム、ピキア・ピペリ、ピキア・スティプティス、ピキア・メタノリカ、ピキア属種、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス属種、ハンゼヌラ・ポリモルファ、クリベロマイセス属種、クリベロマイセス・ラクティス、カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼ、トリコデルマ・リーゼイ、クリソスポリウム・ラクノウェンス、フザリウム属種、フザリウム・グラミネウム、フザリウム・ベネナタム、フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）およびニューロスポラ・クラッサ、ピキア属種、任意のサッカロマイセス属種、ハンゼヌラ・ポリモルファ、任意のクリベロマイセス属種、カンジダ・アルビカンス、任意のアスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、トリコデルマ・リーゼイ、クリソスポリウム・ラクノウェンス、任意のフザリウム属種およびニューロスポラ・クラッサが挙げられる。
【００９７】
本明細書中で用いられる用語「抗体」、「免疫グロブリン」、「免疫グロブリン（複数）」および「免疫グロブリン分子」は交換可能に用いられる。各免疫グロブリン分子は、その特異的な抗原に結合することを可能にする固有の構造を有するが、全ての免疫グロブリンは本明細書中で記載されるものと同じ全体構造を有する。基本的な免疫グロブリン構造単位は、サブユニットの四量体を含むことが知られている。各四量体は２つの同一なポリペプチド鎖ペアを有し、各ペアは１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部は、抗原認識に主に関与する約１００から１１０個またはそれより多いアミノ酸の可変領域を包含する。各鎖のカルボキシ末端部は、エフェクター機能に主に関与する定常領域を規定する。軽鎖はカッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンとして分類され、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥとしての抗体のアイソタイプを規定する。
【００９８】
軽鎖および重鎖は、可変領域および定常領域に細分される（全般的には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８９），Ｃｈ．７を参照されたい）。各軽鎖／重鎖ペアの可変領域は、抗体結合部位を形成する。したがって、インタクトな抗体は２つの結合部位を有する。二官能性抗体または二重特異性抗体におけるものを除いて、２つの結合部位は同一である。鎖は全て比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同一の一般構造を示し、これは、３つの高頻度可変領域によりつなげられたもので、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる。各ペアの２つの鎖からのＣＤＲは、フレームワーク領域により整列され、特異的なエピトープへの結合を可能にする。この用語は自然に存在する形態を包含し、同様に断片および誘導体を包含する。この用語の範囲内には、免疫グロブリン（Ｉｇ）のクラス、すなわち、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭおよびＩｇＤが包含される。また、この用語の範囲内には、ＩｇＧのサブタイプ、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４が包含される。この用語は最も広い意味で用いられ、単一のモノクローナル抗体（アゴニスト抗体およびアンタゴニスト抗体を包含する）を包含し、同様に複数のエピトープまたは抗原と結合する抗体組成物を包含する。この用語は、具体的には、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を包含する）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）に及び、およびＣＨ２ドメインのＮ−結合グリコシル化部位を含む重鎖免疫グロブリン定常領域のＣＨ２ドメインの少なくとも一部またはその変異体を含有する、または含有するように改変されるかぎりにおいて、抗体断片に及ぶ。この用語内には、Ｆｃ領域のみを含む分子、例えば免疫接着物質（米国特許出願公開第２００４／０１３６９８６号、この開示は参照により本明細書中に組み込まれる）、Ｆｃ融合体および抗体様分子などが包含される。
【００９９】
用語「Ｆｃ断片」は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含有する抗体の「結晶性断片」Ｃ末端領域を指す。用語「Ｆａｂ断片」は、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬおよびＣＬドメインを含有する抗体の「抗原結合断片」領域を指す。
【０１００】
本明細書中で用いられる用語「モノクローナル抗体（ｍＡｂ）」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量存在し得る、可能な自然に存在する突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であるが、これは単一の抗原部位に対するものであるからである。そのうえ、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に包含する従来の（ポリクローナル）抗体調製物と対照的に、各ｍＡｂは、抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、例えばハイブリドーマ培養により他の免疫グロブリンを混入させずに生産することができる点で有利である。用語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られるという抗体の特性を指し示しており、何らかの特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるものではない。例えば、本発明によって用いられるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５により最初に記述されたハイブリドーマ法によって作成してもよく、または組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい。この開示は参照により本明細書中に組み込まれる）により作成してもよい。
【０１０１】
用語「抗体」または「免疫グロブリン」の範囲内の用語「断片」は、その断片が標的分子に特異的に結合する能力を維持するかぎりにおいて、様々なプロテアーゼでの消化により生産されるもの、化学的な切断および／または化学的な解離により生産されるもの、ならびに組換えで生産されるものを包含する。かかる断片のなかには、Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２および一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片がある。以下、用語「免疫グロブリン」はまた、用語「断片」も同様に包含する。
【０１０２】
免疫グロブリンは、配列が改変されているが標的分子に特異的に結合する能力を維持している免疫グロブリンまたは断片をさらに包含し、これらとしては、種間キメラ抗体およびヒト化抗体；抗体融合体；ヘテロマー抗体複合体および抗体融合体、例えばジアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）（二重特異性抗体）、一本鎖ジアボディおよびイントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）が挙げられる（例えば、Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，（Ｍａｒａｓｃｏ，ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｉｎｃ．，１９９８を参照されたい）。
【０１０３】
用語「触媒抗体」は、生化学反応を触媒する能力がある免疫グロブリン分子を指す。触媒抗体は当該技術分野で周知であり、Ｓｃｈｏｃｈｅｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許出願第７，２０５，１３６号；第４，８８８，２８１号；第５，０３７，７５０号、Ｂａｒｂａｓ，ＩＩＩ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許出願第５，７３３，７５７号；第５，９８５，６２６号；および第６，３６８，８３９中に記載されている（これらの開示は全て、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１０４】
抗体および抗体−抗原複合体と免疫系の細胞との相互作用、ならびに抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、免疫複合体のクリアランス（食作用）、Ｂ細胞による抗体産生ならびにＩｇＧ血清半減期などの種々の応答は、それぞれ以下に規定される：Ｄａｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４（１９９７）；Ｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｇｈｅｔｉｅ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：７７−９４（１９９５）；Ｃｏｘ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：３３９−３４５（２００１）；Ｈｅｙｍａｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．８８：１５７−１６１（２００３）；およびＲａｖｅｔｃｈ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：１２１−１２５（１９９７）。
【０１０５】
本明細書中で用いられる用語「から本質的になること」は、述べられた整数または整数の群の包含を示唆するが、その述べられた整数に大幅に影響もしくは変化を与える改変または他の整数を除外するものと理解される。Ｎ−グリカンの種に関して、述べられたＮ−グリカン「から本質的になること」という用語は、Ｎ−グリカンが糖タンパク質のアスパラギン残基に直接的に結合するＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）においてフコシル化されているか否かにかかわらず、そのＮ−グリカンを包含すると理解されるものである。
【０１０６】
本明細書中で用いられる用語「優勢に」またはその変形、例えば「優勢」または「優勢である」は、糖タンパク質をＰＮＧａｓｅで処理し、放出されたグリカンを質量分析、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳまたはＨＰＬＣにより分析した後の全中性Ｎ−グリカンのモルパーセント（％）が最も高いグリカン種を意味すると理解されるものである。言い換えれば、句「優勢に」は、個々の実体、例えば、特定のグリコフォームが、いずれの他の個々の実体よりも高いモルパーセントで存在することとして定義される。例えば、組成物が４０モルパーセントの種Ａ、３５モルパーセントの種Ｂおよび２５モルパーセントの種Ｃからなる場合、この組成物は種Ａを優勢に含み、種Ｂは次に優勢な種となる。いくつかの宿主細胞は、中性Ｎ−グリカン、および荷電Ｎ−グリカン、例えばマンノシルホスフェートなどを含む組成物を産生し得る。それ故、糖タンパク質の組成物は、複数の荷電Ｎ−グリカンおよび非荷電または中性のＮ−グリカンを包含することができる。本発明において、優勢なＮ−グリカンが決定されるのは、組成物中の全ての複数の中性Ｎ−グリカンの状況においてである。したがって、本明細書中で用いられる「優勢なＮ−グリカン」は、組成物中の全ての複数の中性Ｎ−グリカンのうち、優勢なＮ−グリカンが特定の構造であることを意味する。
【０１０７】
本明細書中で用いられる、特定の糖残基、例えばフコースまたはガラクトースなど「を本質的に含まない」という用語は、糖タンパク質組成物がかかる残基を含有するＮ−グリカンを実質的に欠くことを指し示すのに用いられる。純度の点で表現すると、本質的に含まないとは、かかる糖残基を含有するＮ−グリカン構造の量が１０％を超えず、好ましくは５％未満であり、より好ましくは１％未満であり、最も好ましくは０．５％未満であることを意味し、ここでパーセンテージは重量パーセント、またはモルパーセントである。したがって、本発明による糖タンパク質組成物中のＮ−グリカン構造の実質的に全てが、例えば、フコース、もしくはガラクトース、またはそれらの両方を含まない。
【０１０８】
本明細書中で用いられるように、糖タンパク質組成物が特定の糖残基、例えばフコースまたはガラクトースなどを「欠く」または「欠いている」のは、検出可能な量のかかる糖残基がいずれの時点においてもＮ−グリカン構造上に存在しない場合である。例えば、本発明の好ましい実施形態において、糖タンパク質組成物は、上で定義するような酵母などの下等真核生物（例えば、ピキア属種、サッカロマイセス属種、クリベロマイセス属種、アスペルギルス属種）により産生されるが、これらの生物の細胞はフコシル化Ｎ−グリカン構造を産生するのに必要とされる酵素を持たないため、糖タンパク質組成物は「フコースを欠く」ものとなる。したがって、用語「フコースを本質的に含まない」は、用語「フコースを欠いている」を包含する。しかしながら、組成物は、組成物が一時的にフコシル化Ｎ−グリカン構造を含有した場合、または限定的であるが検出可能な量の上記のようなフコシル化Ν−グリカン構造を含有する場合であっても、「フコースを実質的に含まない」ものであり得る。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１Ａ】図１Ａ〜Ｅは、野生型株ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０から始まるＡＬＧ３を操作したＰ．パストリス株（ＧＳ５．０）の系統を示す。これらの株は、ガラクトース末端の複合型Ｎ−グルシアンを有する糖タンパク質を産生する能力がある。
【図１Ｂ】図１Ａ〜Ｅは、野生型株ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０から始まるＡＬＧ３を操作したＰ．パストリス株（ＧＳ５．０）の系統を示す。これらの株は、ガラクトース末端の複合型Ｎ−グルシアンを有する糖タンパク質を産生する能力がある。
【図１Ｃ】図１Ａ〜Ｅは、野生型株ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０から始まるＡＬＧ３を操作したＰ．パストリス株（ＧＳ５．０）の系統を示す。これらの株は、ガラクトース末端の複合型Ｎ−グルシアンを有する糖タンパク質を産生する能力がある。
【図１Ｄ】図１Ａ〜Ｅは、野生型株ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０から始まるＡＬＧ３を操作したＰ．パストリス株（ＧＳ５．０）の系統を示す。これらの株は、ガラクトース末端の複合型Ｎ−グルシアンを有する糖タンパク質を産生する能力がある。
【図１Ｅ】図１Ａ〜Ｅは、野生型株ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０から始まるＡＬＧ３を操作したＰ．パストリス株（ＧＳ５．０）の系統を示す。これらの株は、ガラクトース末端の複合型Ｎ−グルシアンを有する糖タンパク質を産生する能力がある。
【図２】図２は、ピキア・パストリスアルコールオキシダーゼＩ（ＡＯＸ１）プロモーターおよびＳ．セレビシエＣＹＣ転写終結配列の制御下にあるＬｍＳＴＴ３Ｄ  ＯＲＦをコードするプラスミドｐＧＬＹ６３０１のマップを示す。このプラスミドは、ＵＲＡ６遺伝子座を標的とするロールイン（ｒｏｌｌ−ｉｎ）ベクターである。形質転換体の選択には、Ｐ．パストリスＲＰＬ１０プロモーターおよびＳ．セレビシエＣＹＣ転写終結配列の制御下にあるＳ．セレビシエＡＲＲ３  ＯＲＦによりコードされるヒ素抵抗性を用いる。
【図３】図３は、Ｐ．パストリスＧＡＰＤＨプロモーターおよびＳ．セレビシエＣＹＣ転写終結配列の制御下にあるＬｍＳＴＴ３Ｄ  ＯＲＦをコードするプラスミドｐＧＬＹ６２９４のマップを示す。このプラスミドはＴＲＰ１遺伝子座を標的とするΚΙΝΚΟベクターであり、ＴＲＰ１  ＯＲＦの３’末端はＰ．パストリスＡＬＧ３転写終結配列に隣接する。形質転換体の選択には、アシュビア・ゴシピー（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）ＴＥＦ１プロモーター（ＰＴＥＦ）およびアシュビア・ゴシピーＴＥＦ１終結配列（ＴＴＥＦ）の制御下にあるストレプトマイセス・ノーセイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｕｒｓｅｉ）ノーセオトリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）アセチルトランスフェラーゼ（ＮＡＴ）ＯＲＦによりコードされるノーセオトリシン抵抗性を用いる。
【図４】図４は、抗ＲＳＶ抗体の軽鎖および重鎖をコードするｐＧＬＹ６５６４のマップを示す。このプラスミドは、ＴＲＰ２遺伝子座を標的とするロールインベクターである。重鎖をコードするＯＲＦは、Ｐ．パストリスＡＯＸ１プロモーターおよびＳ．セレビシエＣＹＣ転写終結配列の制御下にある。軽鎖をコードするＯＲＦは、Ｐ．パストリスＡＯＸ１プロモーターおよびＰ．パストリスＡＯＸ１転写終結配列の制御下にある。形質転換体の選択には、Ｐ．パストリスＴＥＦ１プロモーターおよびＳ．セレビシエＣＹＣ終結配列の制御下にあるゼオシン抵抗性タンパク質（ゼオシンＲ）ＯＲＦによりコードされるゼオシン抵抗性を用いる。
【図５】図５は、プラスミドｐＧＬＹ７１４０のマップを示す。このプラスミドはＹＯＳ９遺伝子座を標的とするノックアウトベクターであって、ｌａｃＺリピート（ｌａｃＺリピート）に隣接したＰ．パストリスＵＲＡ５遺伝子または転写単位（ＰｐＵＲＡ５）を含み、これは、一方の側ではＰ．パストリスＹＯＳ９遺伝子の５’ヌクレオチド配列（ＰｐＹＯＳ９−５’）と、他方の側ではＰ．パストリスＹＯＳ９遺伝子の３’ヌクレオチド配列（ＰｐＹＯＳ９−３’）と隣接している。
【図６】図６は、プラスミドｐＧＬＹ５５０８のマップを示す。このプラスミドはＡＬＧ３遺伝子座を標的とするノックアウトベクターであって、ｌａｃＺリピート（ｌａｃＺリピート）に隣接したＰ．パストリスＵＲＡ５遺伝子または転写単位（ＰｐＵＲＡ５）を含み、これは、一方の側ではＰ．パストリスＡＬＧ３遺伝子の５’ヌクレオチド配列（ＰｐＡＬＧ３−５’）と、他方の側ではＰ．パストリスＡＬＧ３遺伝子の３’ヌクレオチド配列（ＰｐＡＬＧ３−３’）と隣接している。
【図７Ａ】図７Ａ〜Ｅは、野生型株ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０から始まるＡＬＧ３を操作したＰ．パストリス株（ＧＳ２．１）の系統を示す。これらの株は、パウチマンノースＮ−グリカンを有する糖タンパク質を産生する能力がある。
【図７Ｂ】図７Ａ〜Ｅは、野生型株ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０から始まるＡＬＧ３を操作したＰ．パストリス株（ＧＳ２．１）の系統を示す。これらの株は、パウチマンノースＮ−グリカンを有する糖タンパク質を産生する能力がある。
【図７Ｃ】図７Ａ〜Ｅは、野生型株ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０から始まるＡＬＧ３を操作したＰ．パストリス株（ＧＳ２．１）の系統を示す。これらの株は、パウチマンノースＮ−グリカンを有する糖タンパク質を産生する能力がある。
【図７Ｄ】図７Ａ〜Ｅは、野生型株ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０から始まるＡＬＧ３を操作したＰ．パストリス株（ＧＳ２．１）の系統を示す。これらの株は、パウチマンノースＮ−グリカンを有する糖タンパク質を産生する能力がある。
【図７Ｅ】図７Ａ〜Ｅは、野生型株ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０から始まるＡＬＧ３を操作したＰ．パストリス株（ＧＳ２．１）の系統を示す。これらの株は、パウチマンノースＮ−グリカンを有する糖タンパク質を産生する能力がある。
【図８】図８は、プラスミドｐＧＬＹ３４１９（ｐＳＨ１１１０）のマップを示す。プラスミドｐＧＬＹ３４３０（ｐＳＨ１１１５）は、ｌａｃＺリピート（ｌａｃＺリピート）に隣接したＰ．パストリスＵＲＡ５遺伝子または転写単位（ＰｐＵＲＡ５）を含む発現カセットを含有する組み込みベクターであって、この発現カセットは、一方の側ではＰ．パストリスＢＭＴ１遺伝子の５’ヌクレオチド配列（ＰＢＳ１  ５’）と、他方の側ではＰ．パストリスＢＭＴ１遺伝子の３’ヌクレオチド配列（ＰＢＳ１  ３’）と隣接している。
【図９】図９は、プラスミドｐＧＬＹ３４１１（ｐＳＨ１０９２）のマップを示す。プラスミドｐＧＬＹ３４１１（ｐＳＨ１０９２）は、ｌａｃＺリピート（ｌａｃＺリピート）に隣接したＰ．パストリスＵＲＡ５遺伝子または転写単位（ＰｐＵＲＡ５）を含む発現カセットを含有する組み込みベクターであって、この発現カセットは、一方の側ではＰ．パストリスＢＭＴ４遺伝子の５’ヌクレオチド配列（ＰｐＰＢＳ４  ５’）と、他方の側ではＰ．パストリスＢＭＴ４遺伝子の３’ヌクレオチド配列（ＰｐＰＢＳ４  ３’）と隣接している。
【図１０】図１０は、プラスミドｐＧＬＹ３４２１（ｐＳＨ１１０６）のマップを示す。プラスミドｐＧＬＹ４４７２（ｐＳＨ１１８６）は、ｌａｃＺリピート（ｌａｃＺリピート）に隣接したＰ．パストリスＵＲＡ５遺伝子または転写単位（ＰｐＵＲＡ５）を含む発現カセットを含有し、この発現カセットは、一方の側ではＰ．パストリスＢＭＴ３遺伝子の５’ヌクレオチド配列（ＰｐＰＢＳ３  ５’）と、他方の側ではＰ．パストリスＢＭＴ３遺伝子の３’ヌクレオチド配列（ＰｐＰＢＳ３  ３’）と隣接している。
【図１１】図１１は、Ｎ末端においてキメラタンパク質を分泌経路および細胞からの分泌物に標的化するためのＳ．セレビシエαＭＡＴｐｒｅシグナルペプチド（ａＭＡＴＴｒＭａｎ）と融合したＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）α−１，２−マンノシダーゼ触媒ドメインをコードするプラスミドｐＧＬＹ１１６２カセットのマップを示す。
【図１２】図１２は、抗Ｈｅｒ２抗体の軽鎖および重鎖をコードするｐＧＬＹ６８３３のマップを示す。このプラスミドは、ＴＲＰ２遺伝子座を標的とするロールインベクターである。軽鎖および重鎖をコードするＯＲＦは、Ｐ．パストリスＡＯＸ１プロモーターおよびＰ．パストリスＣＩＴ１転写終結配列の制御下にある。形質転換体の選択には、Ｐ．パストリスＴＥＦ１プロモーターおよびＳ．セレビシエＣＹＣ終結配列の制御下にあるゼオシン抵抗性タンパク質（ゼオシンＲ）ＯＲＦによりコードされるゼオシン抵抗性を用いる。
【図１３】図１３は、ピキア・パストリスアルコールオキシダーゼＩ（ＡＯＸ１）プロモーターおよびＳ．セレビシエＣＹＣ転写終結配列の制御下にあるＬｍＳＴＴ３Ａ  ＯＲＦをコードするプラスミドｐＧＬＹ６２９９のマップを示す。このプラスミドは、ＵＲＡ６遺伝子座を標的とするロールインベクターである。形質転換体の選択には、Ｐ．パストリスＲＰＬ１０プロモーターおよびＳ．セレビシエＣＹＣ転写終結配列の制御下にあるＳ．セレビシエＡＲＲ３  ＯＲＦによりコードされるヒ素抵抗性を用いる。
【図１４】図１４は、ピキア・パストリスアルコールオキシダーゼＩ（ＡＯＸ１）プロモーターおよびＳ．セレビシエＣＹＣ転写終結配列の制御下にあるＬｍＳＴＴ３Ｂ  ＯＲＦをコードするプラスミドｐＧＬＹ６３００のマップを示す。このプラスミドは、ＵＲＡ６遺伝子座を標的とするロールインベクターである。形質転換体の選択には、Ｐ．パストリスＲＰＬ１０プロモーターおよびＳ．セレビシエＣＹＣ転写終結配列の制御下にあるＳ．セレビシエＡＲＲ３  ＯＲＦによりコードされるヒ素抵抗性を用いる。
【図１５】図１５は、ピキア・パストリスアルコールオキシダーゼＩ（ＡＯＸ１）プロモーターおよびＳ．セレビシエＣＹＣ転写終結配列の制御下にあるＬｍＳＴＴ３Ｃ  ＯＲＦをコードするプラスミドｐＧＬＹ１１１９１のマップを示す。このプラスミドは、ＵＲＡ６遺伝子座を標的とするロールインベクターである。形質転換体の選択には、Ｐ．パストリスＲＰＬ１０プロモーターおよびＳ．セレビシエＣＹＣ転写終結配列の制御下にあるＳ．セレビシエＡＲＲ３  ＯＲＦによりコードされるヒ素抵抗性を用いる。
【図１６】図１６は、ピキア・パストリスアルコールオキシダーゼＩ（ＡＯＸ１）プロモーターおよびＳ．セレビシエＣＹＣ転写終結配列の制御下にあるＬｍＳＴＴ３Ａ、ＬｍＳＴＴ３ＢおよびＬｍＳＴＴ３ＤのＯＲＦをコードするプラスミドｐＧＬＹ１０１５３のマップを示す。このプラスミドは、ＵＲＡ６遺伝子座を標的とするロールインベクターである。形質転換体の選択には、Ｐ．パストリスＲＰＬ１０プロモーターおよびＳ．セレビシエＣＹＣ転写終結配列の制御下にあるＳ．セレビシエＡＲＲ３  ＯＲＦによりコードされるヒ素抵抗性を用いる。
【図１７】図１７は、モチーフＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ中のアスパラギン残基に付着することができるＮ−グリカン構造の例を示しており、ここでＸａａはプロリン以外であるか、またはインビトロで任意のアミノ酸に付着する、任意のアミノ酸である。組換え宿主細胞は、特定のＮ−グリカン種を優勢に有する糖タンパク質を産生するように遺伝子改変することができる。
【発明を実施するための形態】
【０１１０】
本発明は、ドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリキルアルファ−１，３マンノシルトランスフェラーゼ活性（Ａｌｇ３ｐ）をコードするＡＬＧ３遺伝子の発現を欠く組換え宿主細胞中で産生量およびＮ−グリコシル化部位占有率を増加させる、同様に複合型またはパウチマンノース（Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）のいずれかといったＮ−グリカンの質を向上させる、宿主細胞および方法を提供する。ＡＬＧ３発現を欠く組換え宿主細胞中のＮ−グリコシル化部位占有率の増加およびＮ−グリカンの質の向上は、組換え宿主細胞中の骨肉腫９（ＯＳ−９）ファミリー遺伝子またはそのホモログの発現を破壊することにより達成される。ＯＳ−９遺伝子に対するホモログとしては、限定されるものではないがサッカロマイセス・セレビシエ、ピキア・パストリス、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、カエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）およびホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）などの生物のゲノム中で見出される類似構造のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを包含する。
【０１１１】
ＹＯＳ９はヒト遺伝子ＯＳ−９の酵母ホモログであり、骨肉腫において過剰発現している（Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３５２７４−３５２８１（２００２）；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＹ７０３８３）。ＹＯＳ９遺伝子は、レクチンタンパク質であるＹｏｓ９ｐをコードするが、これは、サッカロマイセス・セレビシエ中でＥＲ関連分解（ＥＲＡＤ）経路に関わることが示されており、この経路は、サイトゾル中でミスフォールドされた糖タンパク質を検出して分解の標的とする、ＥＲ中の品質管理経路である（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．１６：７４１−７５１（２００５）を参照されたい）。Ｑｕａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ３２：８７０−８７７（２００８）は、ＥＲＡＤ経路において、ミスフォールドされた糖タンパク質は末端のα１，６−結合マンノースを有するＮ−グリカンを含有するように修飾されることを示した。Ｙｏｓ９ｐは、これらの末端α１，６−結合マンノース残基を含有するＮ−グリカンを認識し、それらを有する糖タンパク質を分解の標的とするセンサータンパク質である。ａｌｇ３Δ株において、Ｎ−結合グリコシル化部位に転移されるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２オリゴ糖もまた末端のα１，６−結合マンノース残基を有し、これが糖タンパク質をＥＲＡＤ経路の基質にし得る（Ｃｌｅｒｃ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１８４：１５９−１７２（２００９））。サッカロマイセス・セレビシエＹｏｓ９ｐタンパク質は配列番号４３中に示されるアミノ酸配列を有し、これは配列番号４４中に示されるＹＯＳ９ヌクレオチド配列によりコードされる。ピキア・パストリスＹｏｓ９ｐタンパク質は配列番号４５中に示されるアミノ酸配列を有し、これは配列番号４６中に示されるＹＯＳ９ヌクレオチド配列によりコードされる。アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｅｓ）Ｙｏｓ９ｐタンパク質は配列番号４７中に示されるアミノ酸配列を有し、これは配列番号４８中に示されるＹＯＳ９ヌクレオチド配列によりコードされる。シゾサッカロマイセス・ポンベＹｏｓ９ｐタンパク質は配列番号４９中に示されるアミノ酸配列を有し、これは配列番号５０中に示されるＹＯＳ９ヌクレオチド配列によりコードされる。
【０１１２】
本発明において、ＡＬＧ３遺伝子発現を欠く組換え宿主細胞中でのＹＯＳ９遺伝子発現の破壊は、組換え糖タンパク質の産生量を増加させ、したがって、ＥＲまたはゴルジ体に対して標的化されたα１，２−マンノシダーゼ活性を包含するようにさらに改変された宿主細胞中のパウチマンノースＮ−グリカンの産生量を改善し、またはこれらの宿主細胞が、宿主細胞にヒト様Ｎ−グリコシル化パターンを有する、または特定のＮ−グリカン構造を優勢に有する糖たんぱく質を産生させることを可能にするもう１つのグリコシル化酵素を包含するようにさらに改変される場合に複合型Ｎ−グリカンの産生量を改善する。
【０１１３】
Ａｌｇ３ｐタンパク質活性を呈さない、またはＡＬＧ３遺伝子からの発現が破壊された宿主細胞の構築は、米国特許出願公開第２００５０１７０４５２号または第２０１００２２７３６３号中に記載されており、これらの文献は参照により本明細書中に組み込まれる。Ａｌｇ３ｐはＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリキルアルファ−１，３マンノシルトランスフェラーゼであり、これは、マンノース残基をアルファ−１，３結合中の脂質結合Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（図１７、ＧＳ１．３）のアルファ−１，６アームのマンノース残基にトランスフェラーゼすることで脂質結合Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２の合成のための前駆体である脂質結合Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２（図１７、ＧＳ１．４）を産生し、この脂質結合Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２は次いでオリゴサッカリルトランスフェラーゼにより糖タンパク質のアスパラギン残基に転移され、その後にグルコース（Ｇｌｃ）残基が取り除かれる。Ａｌｇ３ｐタンパク質活性を欠く宿主細胞において、脂質結合Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２オリゴ糖は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼにより糖タンパク質のアスパラギン残基に転移され得る。α１，２−マンノシダーゼをさらに包含するかかる宿主細胞において、糖タンパク質に付着したＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２オリゴ糖は、トリマンノース（パウチマンノース）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造（図１７、ＧＳ２．１）に切り取られる。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（ＧＳ１．３）構造は、図１７中に示されるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（ＧＳ２．０）と区別可能であり、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリキルアルファ−１，３マンノシルトランスフェラーゼ（Ａｌｇ３ｐ）を発現する宿主細胞中で産生される。
【０１１４】
ａｌｇ３Δｙｏｓ９Δ宿主細胞中で産生されるパウチマンノースＮ−グリカンまたは複合型Ｎ−グリカンを含む糖タンパク質のＮ−グリコシル化部位占有率は、宿主細胞中で１または複数の異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼを発現させることにより実質的に増加され得るものであり、特定の実施形態において、これら異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼのうちの少なくとも１は酵母オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体の少なくとも１の必須タンパク質の突然変異の致死表現型を機能的に抑制する能力がある。参照により本明細書中に組み込まれる国際出願公開第ＷＯ２０１１１０６３８９号は、糖タンパク質を発現するように遺伝子操作された組換え下等真核生物宿主細胞中で産生される糖タンパク質のＮ−グリコシル化部位占有率を増加させる方法を開示する。詳細には、この方法は、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼを過剰発現する組換え宿主細胞を提供するものであり、特定の実施形態において、この異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは酵母オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体の少なくとも１の必須タンパク質の突然変異の致死表現型を機能的に抑制する能力がある。
【０１１５】
Ｎａｓａｂ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  １９：３７５８−３７６８  （２００８）は、４つのリーシュマニア・メジャーのＳＴＴ３タンパク質の各々を個別にサッカロマイセス・セレビシエ中で発現させたところ、それらのうちの３つ、ＬｍＳＴＴ３Ａタンパク質、ＬｍＳＴＴ３Ｂタンパク質およびＬｍＳＴＴ３Ｄタンパク質は酵母ＳＴＴ３遺伝子座の欠失を補完することができることを見出した。加えて、ＬｍＳＴＴ３Ｄ発現は、様々な必須ＯＴａｓｅサブユニットをコードする遺伝子の一重および二重の欠失の致死表現型を抑制した。ＬｍＳＴＴ３タンパク質は酵母ＯＴａｓｅ複合体内に取り込まれなかったが、代わりに、酵母細胞の内在性多量体酵素を置き換える能力があるホモダイマー酵素を形成した。この結果は、これらの単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは原核生物の酵素に似ている一方で、これらは真核生物のグリコシル化のための典型的な基質、すなわち、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ  Ｎ−グリコシル化認識部位およびドリコールピロリン酸結合高マンノースオリゴ糖を用いることを指し示す。
【０１１６】
それ故、本発明の特定の実施形態において、少なくとも１の異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（例えば、ＬｍＳＴＴ３Ａタンパク質、ＬｍＳＴＴ３Ｂタンパク質またはＬｍＳＴＴ３Ｄよりなる群から選択されるもの）をコードするオープンリーディングフレームは、組換えａｌｇ３Δｙｏｓ９Δ宿主細胞中で恒常的にまたは誘導されて過剰発現し、この宿主細胞中では、内在性宿主細胞ＳＴＴ３遺伝子の発現などの、その細胞自身のオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を構成するタンパク質をコードするその細胞自身の内在性遺伝子の発現が引き続き起こっている。したがって、宿主細胞は、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼ、および内在性宿主細胞ＳＳＴ３タンパク質などの内在性宿主細胞ＯＴａｓｅ複合体の両方を発現する。そのうえ、組換え酵母、糸状菌、藻類または植物の宿主細胞に関して、宿主細胞は、複合型および／またはハイブリッドＮ−グリカンを含む哺乳動物様またはヒト様のグリコシル化パターンを含む糖タンパク質を産生し、宿主細胞の内在性グリコシル化パターンを有する糖タンパク質を産生しないようにさらに遺伝子操作することができる。
【０１１７】
本発明は、哺乳動物様またはヒト様の複合型Ｎ−グリカンを産生するように遺伝子操作されたピキア・パストリスａｌｇ３Δｙｏｓ９Δ宿主細胞を用いて本明細書中で例示されている。しかしながら、本発明は、他の酵母ｏｓｔ細胞（限定されるものではないが、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ、オガタエア・ミヌータおよびピキア・パストリスなど）または糸状菌（限定されるものではないが、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）など）に適用することができるが、これらは、酵母もしくは真菌のＮ−グリカン（高マンノシル化Ｎ−グリカンもしくは高マンノースＮ−グリカンのいずれか）を有する糖タンパク質を産生するか、または宿主細胞中で産生される糖タンパク質の全体的なＮ−グリコシル化部位占有率を改善するために哺乳動物様もしくはヒト様の高マンノース、複合型もしくはハイブリッドＮ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するように遺伝子操作されている。そのうえ、本発明はまた、これらの植物または哺乳動物発現系中で産生される糖タンパク質、とりわけ２より多いＮ−結合グリコシル化部位を有する糖タンパク質の全体的なＮ−グリコシル化部位占有率を改善するために、植物および哺乳動物の発現系に適用することもできる。
【０１１８】
オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を構成するタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子の発現としては、内在性ＳＴＴ３タンパク質またはホモログをコードする内在性宿主細胞遺伝子の発現が挙げられる。酵母宿主細胞の場合、ＯＴａｓｅ複合体を構成するタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子が発現しており、これは内在性ＳＴＴ３遺伝子の発現を包含する。現在、サッカロマイセス・セレビシエＯＴａｓｅ複合体を構成するタンパク質をコードする遺伝子としては、ＯＳＴ１、ＯＳＴ２、ＯＳＴ３、ＯＳＴ４、ＯＳＴ５、ＯＳＴ６、ＷＢＰ１、ＳＷＰ１およびＳＴＴ３が挙げられることが知られており（例えば、Ｓｐｉｒｉｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５６：６２８−６３７（１９９７）を参照されたい）、ピキア・パストリスにおいては、ＯＴａｓｅ複合体としては、少なくともＯｓｔ１ｐ、Ｏｓｔ２ｐ、Ｏｓｔ３ｐ、Ｏｓｔ４ｐ、Ｏｓｔ６ｐ、Ｗｂｐ１、Ｓｗｐ１ｐおよびＳｔｔ３ｐが挙げられるように思われる（前掲したＳｈｕｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｏｐ．ｃｉｔ．を参照されたい）。
【０１１９】
一般に、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、ＯＴａｓｅ複合体、例えば、酵母ＯＴａｓｅ複合体の少なくとも１の必須タンパク質の突然変異の致死表現型を機能的に抑制する能力がある。したがって、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、ＯＴａｓｅ複合体の少なくとも１の必須タンパク質の致死突然変異を機能的に補完またはレスキューする能力がある。さらなる態様において、ＯＴａｓｅ複合体の必須タンパク質は、サッカロマイセス・セレビシエおよび／またはピキア・パストリスのＳＴＴ３遺伝子座、ＷＢＰ１遺伝子座、ＯＳＴ１遺伝子座、ＳＷＰ１遺伝子座もしくはＯＳＴ２遺伝子座、またはそれらのホモログによりコードされる。一般に、本明細書中のＮ−グリコシル化部位占有率を増加させる方法において用いることができる異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、特定の実施形態においてサッカロマイセス・セレビシエおよび／またはピキア・パストリスＯＴａｓｅ複合体の少なくとも１の必須タンパク質の致死表現型を機能的に抑制する（またはレスキューもしくは補完する）能力がある異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼである。例えば、さらなる態様において、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア・メジャーＳＴＴ３Ｄタンパク質であり、これは、サッカロマイセス・セレビシエまたはピキア・パストリスＯＴａｓｅ複合体の少なくとも１の必須タンパク質の致死表現型を機能的に抑制する（またはレスキューもしくは補完する）能力がある。それ故、特定の宿主細胞の場合、特定の異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、その単一サブユニット異種オリゴサッカリルトランスフェラーゼが酵母ＯＴａｓｅ複合体の少なくとも１の必須タンパク質の致死表現型を抑制する能力があるという条件で、特定の宿主細胞中での発現に好適である。さらなる態様において、異種単一サブユニット異種オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、その単一サブユニット異種オリゴサッカリルトランスフェラーゼがサッカロマイセス・セレビシエおよび／またはピキア・パストリスＯＴａｓｅ複合体の少なくとも１の必須タンパク質の致死表現型を抑制する能力があるという条件で、特定の宿主細胞中での発現のために選択される。必須タンパク質としては、ＯＳＴ１、ＯＳＴ２、ＷＢＰ１、ＳＷＰ１およびＳＴＴ３が挙げられる。
【０１２０】
本明細書中で用いられる致死突然変異としては、ＯＴａｓｅ複合体の必須タンパク質をコードする遺伝子の欠失もしくは破壊、または必須タンパク質を機能しなくするコーディング配列中の突然変異が挙げられる。この用語は、ｓｈＲＮＡまたはＲＮＡｉを用いて機能的必須タンパク質の産生を抑止するノックダウン変異をさらに包含することができる。
【０１２１】
それ故、本発明は、ドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリキルアルファ−１，３マンノシルトランスフェラーゼ活性（Ａｌｇ３ｐ）活性および骨肉腫９（ＯＳ−９）ファミリー遺伝子またはそのホモログの活性を呈さず、異種組換えタンパク質をコードする核酸分子をさらに包含する組換え宿主細胞を提供する。さらなる実施形態において、宿主細胞は、恒常的なまたは誘導性のプロモーターに操作可能に連結された少なくとも１の異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（例えば、ＬｍＳＴＴ３Ａタンパク質、ＬｍＳＴＴ３Ｂタンパク質およびＬｍＳＴＴ３Ｄよりなる群から選択されるもの）をコードする核酸分子をさらに包含する。
【０１２２】
特定の態様において、組換え宿主細胞は、ドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリキルアルファ−１，３マンノシルトランスフェラーゼ活性（ＡＬＧ３）遺伝子および骨肉腫９（ＯＳ−９）ファミリー遺伝子またはそのホモログの遺伝子を発現せず、異種組換えタンパク質をコードする核酸分子をさらに包含する。さらなる実施形態において、宿主細胞は、恒常的なまたは誘導性のプロモーターに操作可能に連結された少なくとも１の異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（例えば、ＬｍＳＴＴ３Ａタンパク質、ＬｍＳＴＴ３Ｂタンパク質およびＬｍＳＴＴ３Ｄよりなる群から選択されるもの）をコードする核酸分子をさらに包含する。
【０１２３】
上記の特定の態様において、宿主細胞は下等真核生物である。さらなる態様において、下等真核生物は、ピキア・パストリス、ピキア・フィンランディカ、ピキア・トレハロフィラ、ピキア・コクラマエ、ピキア・メンブラナエファシエンス、ピキア・オプンティアエ、ピキア・サーモトレランス、ピキア・サリクタリア、ピキア・グエルクウム、ピキア・ピペリ、ピキア・スティプティス、ピキア・メタノリカ、ピキア属種、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス属種、ハンゼヌラ・ポリモルファ、オガタエア・ミヌータ、クリベロマイセス属種、クリベロマイセス・ラクティス、カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼ、トリコデルマ・リーゼイ、クリソスポリウム・ラクノウェンス、フザリウム属種、フザリウム・グラミネウム、フザリウム・ベネナタムおよびニューロスポラ・クラッサよりなる群から選択される。様々な酵母、例えばオガタエア・ミヌータ、クリベロマイセス・ラクティス、ピキア・パストリス、ピキア・メタノリカおよびハンゼヌラ・ポリモルファなどは細胞培養にとりわけ好適であり、その理由は、これらは高細胞密度まで増殖させることができ、大量の組換えタンパク質を分泌するからである。同じく、糸状菌、例えばアスペルギルス・ニガー、フザリウム属種、ニューロスポラ・クラッサおよび他のものなどは、本発明の糖タンパク質を工業スケールで生産するのに用いることができる。
【０１２４】
なおさらなる態様において、宿主細胞は、マンノシルトランスフェラーゼおよびホスホマンノシルトランスフェラーゼよりなる群から選択される１または複数の酵素の活性が欠乏している。なおさらなる態様において、宿主細胞は、１，６マンノシルトランスフェラーゼ、１，３マンノシルトランスフェラーゼおよび１，２マンノシルトランスフェラーゼよりなる群から選択される酵素を発現しない。
【０１２５】
上記宿主細胞のいずれか１の特定の態様において、宿主細胞は酵母宿主細胞であり、これらとしては、限定されるものではないが、ピキア・パストリス、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、オガタエア・ミヌータおよびサッカロマイセス・セレビシエが挙げられる。特定の態様において、宿主細胞は、ピキア・パストリス、シゾサッカロマイセス・ポンベ、オガタエア・ミヌータまたはサッカロマイセス・セレビシエのｏｃｈ１変異体である。酵母において、骨肉腫９（ＯＳ−９）ファミリー遺伝子はＹＯＳ９遺伝子であり、これはＹｏｓ９ｐタンパク質をコードする。したがって、本発明は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリキルアルファ−１，３マンノシルトランスフェラーゼ活性（Ａｌｇ３ｐ）活性およびＹｏｓ９ｐタンパク質またはそのホモログの活性を呈さず、異種組換えタンパク質をコードする核酸分子をさらに包含する組換え酵母宿主細胞を提供する。さらなる実施形態において、宿主細胞は、恒常的なまたは誘導性のプロモーターに操作可能に連結された少なくとも１の異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（例えば、ＬｍＳＴＴ３Ａタンパク質、ＬｍＳＴＴ３Ｂタンパク質またはＬｍＳＴＴ３Ｄよりなる群から選択されるもの）をコードする核酸分子をさらに包含する。
【０１２６】
組換え酵母宿主細胞の特定の態様において、ドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリキルアルファ−１，３  マンノシルトランスフェラーゼ活性（ＡＬＧ３）遺伝子およびＹＯＳ９遺伝子またはそのホモログの発現は破壊されており、宿主細胞は異種組換えタンパク質をコードする核酸分子をさらに包含する。さらなる実施形態において、宿主細胞は、恒常的なまたは誘導性のプロモーターに操作可能に連結された少なくとも１の異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（例えば、ＬｍＳＴＴ３Ａタンパク質、ＬｍＳＴＴ３Ｂタンパク質またはＬｍＳＴＴ３Ｄよりなる群から選択されるもの）をコードする核酸分子をさらに包含する。
【０１２７】
本明細書中で開示される宿主細胞を用いて組換え糖タンパク質を生産する方法がさらに提供される。一般に、この方法は、Ａｌｇ３ｐ活性および骨肉腫９（ＯＳ−９）ファミリー遺伝子またはそのホモログの活性を呈さない組換え宿主細胞を用意すること、ならびに組換え糖タンパク質をコードする核酸分子を宿主細胞内に導入することを含む。組換え宿主細胞は培地中で、組換え糖タンパク質を発現させるのに十分な時間、培養または発酵される。さらなる実施形態において、組換え糖タンパク質は培地中に分泌され、この培地から組換え糖タンパク質を回収して培地中の他の成分から精製することができる。特定の態様において、宿主細胞は、恒常的なまたは誘導性のプロモーターに操作可能に連結された少なくとも１の異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（例えば、ＬｍＳＴＴ３Ａタンパク質、ＬｍＳＴＴ３Ｂタンパク質またはＬｍＳＴＴ３Ｄよりなる群から選択されるもの）をコードする核酸分子をさらに包含する。
【０１２８】
方法の特定の態様において、宿主細胞は下等真核生物である。さらなる態様において、下等真核生物は、ピキア・パストリス、ピキア・フィンランディカ、ピキア・トレハロフィラ、ピキア・コクラマエ、ピキア・メンブラナエファシエンス、ピキア・オプンティアエ、ピキア・サーモトレランス、ピキア・サリクタリア、ピキア・グエルクウム、ピキア・ピペリ、ピキア・スティプティス、ピキア・メタノリカ、ピキア属種、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス属種、ハンゼヌラ・ポリモルファ、オガタエア・ミヌータ、クリベロマイセス属種、クリベロマイセス・ラクティス、カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼ、トリコデルマ・リーゼイ、クリソスポリウム・ラクノウェンス、フザリウム属種、フザリウム・グラミネウム、フザリウム・ベネナタムおよびニューロスポラ・クラッサよりなる群から選択される。様々な酵母、例えばオガタエア・ミヌータ、クリベロマイセス・ラクティス、ピキア・パストリス、ピキア・メタノリカおよびハンゼヌラ・ポリモルファなどは、細胞培養にとりわけ好適であり、その理由は、これらは高細胞密度まで増殖させることができ、大量の組換えタンパク質を分泌するからである。同じく、糸状菌、例えばアスペルギルス・ニガー、フザリウム属種、ニューロスポラ・クラッサおよび他のものなどは、本発明の糖タンパク質を工業スケールで生産するのに用いることができる。
【０１２９】
なおさらなる態様において、宿主細胞は、マンノシルトランスフェラーゼおよびホスホマンノシルトランスフェラーゼよりなる群から選択される１または複数の酵素の活性が欠乏している。なおさらなる態様において、宿主細胞は、１，６マンノシルトランスフェラーゼ、１，３マンノシルトランスフェラーゼおよび１，２マンノシルトランスフェラーゼよりなる群から選択される酵素を発現しない。
【０１３０】
上記方法のいずれか１の特定の態様において、宿主細胞は酵母宿主細胞であり、これらとしては、限定されるものではないが、ピキア・パストリス、シゾサッカロマイセス・ポンベ、オガタエア・ミヌータおよびサッカロマイセス・セレビシエが挙げられる。特定の態様において、宿主細胞は、ピキア・パストリス、シゾサッカロマイセス・ポンベ、オガタエア・ミヌータまたはサッカロマイセス・セレビシエのｏｃｈ１変異体である。酵母において、骨肉腫９（ＯＳ−９）ファミリー遺伝子はＹＯＳ９遺伝子であり、これはＹｏｓ９ｐタンパク質をコードする。
【０１３１】
したがって、本発明は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリキルアルファ−１，３マンノシルトランスフェラーゼ活性（Ａｌｇ３ｐ）活性およびＹｏｓ９ｐタンパク質またはそのホモログの活性を呈さず、異種組換えタンパク質をコードする核酸分子をさらに包含する組換え酵母宿主細胞を用意することを含む、組換え糖タンパク質を生産する方法をさらに提供する。組換え宿主細胞は培地中で、組換え糖タンパク質を発現させるのに十分な時間、培養または発酵される。さらなる実施形態において、組換え糖タンパク質は培地中に分泌され、この培地から組換え糖タンパク質を回収して培地中の他の成分から精製することができる。さらなる実施形態において、宿主細胞は、恒常的なまたは誘導性のプロモーターに操作可能に連結された少なくとも１の異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（例えば、ＬｍＳＴＴ３Ａタンパク質、ＬｍＳＴＴ３Ｂタンパク質またはＬｍＳＴＴ３Ｄよりなる群から選択されるもの）をコードする核酸分子をさらに包含する。
【０１３２】
方法の特定の態様において、ドリキル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリキルアルファ−１，３マンノシルトランスフェラーゼ活性（ＡＬＧ３）遺伝子およびＹＯＳ９遺伝子またはそのホモログの遺伝子の発現が破壊されている組換え酵母宿主細胞が提供され、この宿主細胞は、異種組換えタンパク質をコードする核酸分子をさらに包含する。組換え宿主細胞は培地中で、組換え糖タンパク質を発現させるのに十分な時間、培養または発酵される。さらなる実施形態において、組換え糖タンパク質は培地中に分泌され、この培地から組換え糖タンパク質を回収して培地中の他の成分から精製することができる。さらなる実施形態において、宿主細胞は、恒常的なまたは誘導性のプロモーターに操作可能に連結された少なくとも１の異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（例えば、ＬｍＳＴＴ３Ａタンパク質、ＬｍＳＴＴ３Ｂタンパク質またはＬｍＳＴＴ３Ｄよりなる群から選択されるもの）をコードする核酸分子をさらに包含する。
【０１３３】
上記の組換え宿主細胞は、Ｎ−グリコシル化パターンが哺乳動物様であるか、またはヒト様であるか、またはヒト化しているか、または特定のＮ−グリカン種が優勢である糖タンパク質を発現する能力がある宿主細胞を提供するための、以下の遺伝子操作の任意の組み合わせをさらに包含し得る。このことは、選択された内在性グリコシル化酵素を除去すること、および／またはＧｅｒｎｇｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．により米国特許第７，４４９，３０８号中に記載されているように外来性酵素を供給することにより達成され得るものであり、この開示は参照により本明細書中に組み込まれる。酵母中のＯ−グリコシル化を低減させる一般的方法は、国際出願第ＷＯ２００７０６１６３１号中に記載されている。このように、特定の望まれるグリコフォームが組成物中で優勢である糖タンパク質組成物を生産することができる。望まれる場合、グリコシル化の付加的な遺伝的操作を、コアフコシル化を伴ってまたは伴わずに糖タンパク質を産生することができるように、行うことができる。下等真核生物宿主細胞、例えば酵母などの使用は、これらの細胞が糖タンパク質の優勢なグリコフォームが組成物中で糖タンパク質のうちの３０モルパーセント超のものとして存在し得るように糖タンパク質の比較的均質な組成物を産生することができるという点でさらに有利である。特定の態様において、優勢なグリコフォームは、組成物中に存在する糖タンパク質の４０モルパーセント超、５０モルパーセント超、６０モルパーセント超、７０モルパーセント超、最も好ましくは８０モルパーセント超で存在し得る。かかるものは、選択された内在性グリコシル化酵素を除去すること、および／またはＧｅｒｎｇｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．により米国特許第７，０２９，８７２号および米国特許第７，４４９，３０８号中に記載されているように外来性酵素を供給することにより達成することができ、これらの開示は参照により本明細書中に組み込まれる。例えば、宿主細胞は、α１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性を枯渇させるように選択または操作することができ、この活性はそうでなければ糖タンパク質上のＮ−グリカン上にマンノース残基を付加する。例えば、酵母において、かかるα１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性はＯＣＨ１遺伝子によりコードされ、ＯＣＨ１の欠失または破壊は、酵母、例えばピキア・パストリスまたはサッカロマイセス・セレビシエなどにおける高マンノースまたは高マンノシル化Ｎ−グリカンの産生を阻害する（例えば、Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第７，０２９，８７２号；Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第６，８０３，２２５号；およびＣｈｉｂａ  ｅｔ  ａｌ．、ＥＰ１２１１３１０Ｂ１を参照されたい。これらの開示は参照により本明細書中に組み込まれる）。
【０１３４】
１の実施形態において、宿主細胞は、細胞標的化シグナルペプチドと融合したα１，２−マンノシダーゼ触媒ドメインをさらに包含し、この細胞標的化シグナルペプチドは通常はこの触媒ドメインと関連せず、宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体に対してα１，２−マンノシダーゼ活性を標的化するように選択される。組換え糖タンパク質が宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体を通過することで、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えば、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを優勢に含む組換え糖タンパク質組成物が生産される。例えば、その開示が参照により本明細書中に組み込まれる米国特許出願公開第２００５／０１７０４５２号は、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生する能力がある下等真核生物宿主細胞を開示する。
【０１３５】
さらなる実施形態において、直前の宿主細胞は、細胞標的化シグナルペプチドと融合したＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩまたはＧｎＴ  Ｉ）触媒ドメインをさらに包含し、この細胞標的化シグナルペプチドは通常はこの触媒ドメインと関連せず、宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体に対してＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性を標的化するように選択される。組換え糖タンパク質が宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体を通過することで、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えばＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを優勢に含む組換え糖タンパク質組成物が生産される。その開示が参照により本明細書中に全て組み込まれる米国特許第７，０２９，８７２号、米国特許第７，４４９，３０８号および米国特許出願公開第２００５／０１７０４５２号は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生する能力がある下等真核生物宿主細胞を開示する。上記細胞中で産生される糖タンパク質をヘキサミニダーゼを使用してインビトロで処理することで、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質を生産することができる。
【０１３６】
さらなる実施形態において、直前の宿主細胞は、細胞標的化シグナルペプチドと融合したＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ（ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩまたはＧｎＴ  ＩＩ）触媒ドメインをさらに包含し、この細胞標的化シグナルペプチドは通常はこの触媒ドメインと関連せず、宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体に対してＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ活性を標的化するように選択される。組換え糖タンパク質が宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体を通過することで、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えばＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを優勢に含む組換え糖タンパク質組成物が生産される。その開示が参照により本明細書中に全て組み込まれる米国特許第７，０２９，８７２号および第７，４４９，３０８号ならびに米国特許出願公開第２００５／０１７０４５２号は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生する能力がある下等真核生物宿主細胞を開示する。上記細胞中で産生される糖タンパク質を末端のＧｌｃＮＡｃ残基を取り除くヘキソサミニダーゼを使用してインビトロで処理することで、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質を生産することができ、または、ヘキソサミニダーゼを宿主細胞中で糖タンパク質と共発現させることで、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質を生産することができる。
【０１３７】
さらなる実施形態において、直前の宿主細胞は、細胞標的化シグナルペプチドと融合したガラクトシルトランスフェラーゼ触媒ドメインをさらに包含し、この細胞標的化シグナルペプチドは通常はこの触媒ドメインと関連せず、宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体に対してガラクトシルトランスフェラーゼ活性を標的化するように選択される。組換え糖タンパク質が宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体を通過することで、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２もしくはＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームまたはそれらの混合物を含む組換え糖タンパク質、例えばＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームもしくはＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームまたはそれらの混合物を優勢に含む組換え糖タンパク質組成物が生産される。その開示が参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第７，０２９，８７２号および米国特許出願公開第２００６／００４０３５３号は、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生する能力がある下等真核生物宿主細胞を開示する。上記細胞中で産生される糖タンパク質をガラクトシダーゼを使用してインビトロで処理することで、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えばＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを優勢に含む組換え糖タンパク質組成物を生産することができ、または、ガラクトシダーゼを宿主細胞中で糖タンパク質と共発現させることで、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えばＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを優勢に含む組換え糖タンパク質組成物を生産することができる。
【０１３８】
さらなる実施形態において、直前の宿主細胞は、細胞標的化シグナルペプチドと融合したシアリルトランスフェラーゼ触媒ドメインをさらに包含し、この細胞標的化シグナルペプチドは通常はこの触媒ドメインと関連せず、宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体に対してシアリルトランスフェラーゼ活性を標的化するように選択される。組換え糖タンパク質が宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体を通過することで、Ｓｉａ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームもしくはＳｉａＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームまたはそれらの混合物を優勢に含む組換え糖タンパク質が生産される。下等真核生物宿主細胞、例えば酵母および糸状菌などの場合、宿主細胞は、Ｎ−グリカンに転移させるためのＣＭＰ−シアル酸を提供する手段をさらに包含することが有用である。その開示が参照により本明細書中に組み込まれる米国特許出願公開第２００５／０２６０７２９号は、ＣＭＰ−シアル酸合成経路を有するように下等真核生物を遺伝子操作する方法を開示し、その開示が参照により本明細書中に組み込まれる米国特許出願公開第２００６／０２８６６３７号は、シアル化糖タンパク質を産生させるように下等真核生物を遺伝子操作する方法を開示する。上記細胞中で産生される糖タンパク質をノイラミニダーゼを使用してインビトロで処理することで、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームもしくはＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームまたはそれらの混合物を優勢に含む組換え糖タンパク質を生産することができ、または、ノイラミニダーゼを宿主細胞中で糖タンパク質と共発現させることで、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームもしくはＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームまたはそれらの混合物を優勢に含む組換え糖タンパク質を生産することができる。
【０１３９】
さらなる態様において、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを有する糖タンパク質を作る能力がある上記の宿主細胞は、細胞標的化シグナルペプチドと融合したマンノシダーゼＩＩＩ触媒ドメインをさらに包含することができ、この細胞標的化シグナルペプチドは通常はこの触媒ドメインと関連せず、宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体に対してマンノシダーゼＩＩＩ活性を標的化するように選択される。組換え糖タンパク質が宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体を通過することで、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えばＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを優勢に含む組換え糖タンパク質組成物が生産される。その開示が参照により本明細書中に全て組み込まれる米国特許第７，６２５，７５６号は、マンノシダーゼＩＩＩ酵素を発現し、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを優勢に有する糖タンパク質を産生する能力がある下等真核生物宿主細胞の使用を開示する。
【０１４０】
前述の宿主細胞のいずれか１は、ＧｎＴ  ＩＩＩ、ＧｎＴ  ＩＶ、ＧｎＴ  Ｖ、ＧｎＴ  ＶＩおよびＧｎＴ  ＩＸよりなる群から選択される１または複数のＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼをさらに包含することで、二分岐（ＧｎＴ  ＩＩＩ）および／または多アンテナ（ＧｎＴ  ＩＶ、Ｖ、ＶＩおよびＩＸ）のＮ−グリカン構造を有する糖タンパク質、例えば米国特許第７，５９８，０５５号および米国特許出願公開第２００７／００３７２４８号中に開示されているものなどを産生することができ、これらの開示は参照により本明細書中に全て組み込まれる。
【０１４１】
一般に、酵母および糸状菌は、フコースを包含するＮ−グリカンを有する糖タンパク質を作ることができない。それ故、本明細書中で開示されるＮ−グリカンは、宿主細胞がＧＤＰ−フコースを合成するための経路およびフコシルトランスフェラーゼを包含するように特に改変されていないかぎり、フコースを欠くものとなる。それ故、Ｎ−グリカンがフコースを包含する糖タンパク質を有することが望ましい特定の態様において、上述の宿主細胞のいずれか１は、フコシルトランスフェラーゼ、およびフコースを産生してＥＲまたはゴルジにフコースを転移させるための経路を包含するようにさらに改変される。そのＮ−グリカンのうちの１または複数がフコシル化されている糖タンパク質を産生する能力を持つようにピキア・パストリスを改変する方法の例は、国際出願公開第ＷＯ２００８１１２０９２号中に開示されており、この開示は参照により本明細書中に組み込まれる。本発明の特定の態様において、ピキア・パストリス宿主細胞は、ＧＤＰ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ、ＧＤＰ−ケト−デオキシ−マンノース−エピメラーゼ／ＧＤＰ−ケト−デオキシ−ガラクトース−レダクターゼ、ＧＤＰ−フコーストランスポーターおよびフコシルトランスフェラーゼを含むフコシル化経路を包含するようにさらに改変される。特定の態様において、フコシルトランスフェラーゼは、α１，２−フコシルトランスフェラーゼ、α１，３−フコシルトランスフェラーゼ、α１，４−フコシルトランスフェラーゼおよびα１，６−フコシルトランスフェラーゼよりなる群から選択される。
【０１４２】
様々な前述の宿主細胞が、１または複数の糖トランスポーター、例えばＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター（例えば、クリベロマイセス・ラクティスおよびムス・ムスクルス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター）、ＵＤＰ−ガラクトーストランスポーター（例えば、ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ＵＤＰ−ガラクトーストランスポーター）およびＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（例えば、ヒトシアル酸トランスポーター）などをさらに包含する。下等真核生物宿主細胞、例えば酵母および糸状菌などは上記トランスポーターを欠くため、下等真核生物宿主細胞、例えば酵母および糸状菌などは上記トランスポーターを包含するように遺伝子操作するのが好ましい。
【０１４３】
宿主細胞としては、ホスホマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子ＰＮＯ１およびＭＮＮ４Ｂ（例えば、米国特許第７，１９８，９２１号および第７，２５９，００７号を参照されたい。これらの開示は参照により本明細書中に全て組み込まれる）の一方または両方を欠失させることまたは破壊することによりホスホマンノース残基を有する糖タンパク質を除去するように遺伝子操作されたピキア・パストリスがさらに挙げられ、これは、さらなる態様において、ＭＮＮ４Ａ遺伝子を欠失させることまたは破壊することをも包含することができる。破壊としては、特定の酵素をコードするオープンリーディングフレームを破壊すること、またはオープンリーディングフレームの発現を破壊すること、またはアンチセンスＲＮＡなどの干渉ＲＮＡを用いてβ−マンノシルトランスフェラーゼおよび／もしくはホスホマンノシルトランスフェラーゼのうちの１もしくは複数をコードするＲＮＡの翻訳を抑止することが挙げられる。宿主細胞としては、特定のＮ−グリカン構造を産生するように改変された上述の宿主細胞のいずれか１をさらに挙げることができる。
【０１４４】
宿主細胞としては、タンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ：タンパク質（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子）（ＰＭＴ）（米国特許第５，７１４，３７７号を参照されたい。この開示は参照により本明細書中に組み込まれる）のうちの１もしくは複数を欠失させることもしくは破壊することにより糖タンパク質のＯ−グリコシル化を制御するように遺伝子操作された、または、その開示が参照により本明細書中に組み込まれる国際出願公開第ＷＯ２００７０６１６３１号中で開示されているように、Ｐｍｔｐ阻害剤および／もしくはα１，２マンノシダーゼの存在下で増殖させた下等真核生物細胞（例として、酵母、例えばピキア・パストリスなど）がさらに挙げられる。破壊としては、Ｐｍｔｐをコードするオープンリーディングフレームを破壊すること、またはオープンリーディングフレームの発現を破壊すること、またはアンチセンスＲＮＡなどの干渉ＲＮＡを用いてＰｍｔｐのうちの１もしくは複数をコードするＲＮＡの翻訳を抑止することが挙げられる。宿主細胞としては、特定のＮ−グリカン構造を産生するように改変された上述の宿主細胞のいずれか１をさらに挙げることができる。
【０１４５】
Ｐｍｔｐ阻害剤としては、限定されるものではないが、ベンジリデンチアゾリジンジオンが挙げられる。用いることができるベンジリデンチアゾリジンジオンの例は、５−［［３，４−ビス（フェニルメトキシ）フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸、５−［［３−（１−フェニルエトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸および５−［［３−（１−フェニル−２−ヒドロキシ）エトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸である。
【０１４６】
特定の実施形態において、少なくとも１の内在性ＰＭＴ遺伝子の機能または発現が低減され、破壊されまたは欠失される。例えば、特定の実施形態において、ＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３およびＰＭＴ４遺伝子よりなる群から選択される少なくとも１の内在性ＰＭＴ遺伝子の機能もしくは発現は低減され、破壊されもしくは欠失され、または宿主細胞は１もしくは複数のＰＭＴ阻害剤の存在下で培養される。さらなる実施形態において、宿主細胞は１または複数のＰＭＴ遺伝子欠失または破壊を包含し、この宿主細胞は１または複数のＰｍｔｐ阻害剤の存在下で培養される。これらの実施形態の特定の態様において、宿主細胞はまた、分泌型α−１，２−マンノシダーゼを発現する。
【０１４７】
ＰＭＴ欠失もしくは破壊および／またはＰｍｔｐ阻害剤は、Ｏ−グリコシル化占有率を低減させることにより、すなわち、グリコシル化された糖タンパク質上のＯ−グリコシル化部位の総数を低減させることにより、Ｏ−グリコシル化を制御する。細胞により分泌されるα−１，２−マンノシダーゼをさらに追加することは、糖タンパク質上にあるＯ−グリカンのマンノース鎖長を低減させることにより、Ｏ−グリコシル化を制御する。したがって、ＰＭＴ欠失もしくは破壊および／またはＰｍｔｐ阻害剤を分泌型α−１，２−マンノシダーゼの発現と組み合わせることは、占有率および鎖長を低減させることにより、Ｏ−グリコシル化を制御する。特定の環境において、ＰＭＴ欠失または破壊、Ｐｍｔｐ阻害剤およびα−１，２−マンノシダーゼの特定の組み合わせは経験的に決定されるが、それは、特定の異種糖タンパク質（例えば抗体）は異なる効率で発現してゴルジ体を通じて輸送され得るものであり、したがってＰＭＴ欠失または破壊、Ｐｍｔｐ阻害剤およびα−１，２−マンノシダーゼの特定の組み合わせを必要し得るためである。別の態様において、１または複数の内在性マンノシルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子が欠失される。欠失（複数可）は、分泌型α−１，２−マンノシダーゼおよび／もしくはＰＭＴ阻害剤を提供することと組み合わせることができ、または分泌型α−１，２−マンノシダーゼおよび／もしくはＰＭＴ阻害剤を提供することの代わりであることもできる。
【０１４８】
したがって、Ｏ−グリコシル化の制御は、本明細書中に開示される宿主細胞中で特定の糖タンパク質を、より良好な総産生量で、または適切に組み立てられた糖タンパク質の産生量で、産生するのに有用であることができる。Ｏ−グリコシル化の低減または除去は、糖タンパク質、例えば全抗体などの組み立ておよび輸送に有益な効果があるように思われるが、それは、これらが分泌経路を通過して細胞表面に輸送されるためである。したがって、Ｏ−グリコシル化が制御されている細胞において、適切に組み立てられた糖タンパク質、例えば抗体断片などの産生量は、Ｏ−グリコシル化が制御されていない宿主細胞において得られる産生量と比べて増加する。
【０１４９】
α−マンノシダーゼに抵抗性である、β−結合マンノース残基を持つＮ−グリカンおよびＯ−グリカンの可能性を低減させるまたは除去するため、組換えの糖鎖操作されたピキア・パストリス宿主細胞は、β−マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子（例として、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４）のうちの１または複数を欠失させるまたは破壊することにより、α−マンノシダーゼ抵抗性Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を除去するように遺伝子操作される（米国特許第７，４６５，５７７号、米国特許第７，７１３，７１９号および国際出願公開第ＷＯ２０１１０４６８５５号を参照されたい。これらの各々は参照により本明細書中に組み込まれる）。ＢＭＴ２ならびにＢＭＴ１、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４のうちの１または複数の欠失または破壊もまた、宿主細胞タンパク質に対する抗体への検出可能な交差反応性を低減させ、または除去する。
【０１５０】
特定の実施形態において、宿主細胞は、米国特許出願公開第２００５０１７０４５２号またはＵＳ２０１００２２７３６３中に記載されるように、Ａｌｇ３ｐタンパク質活性を呈さないか、またはＡＬＧ３遺伝子からの発現の欠失または破壊（例として、宿主細胞をａｌｇ３Δにするための、Ａｌｇ３ｐをコードするオープンリーディングフレームの欠失または破壊）を有し、これらの文献は参照により本明細書中に組み込まれる。Ａｌｇ３ｐはＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリキルアルファ−１，３マンノシルトランスフェラーゼであり、これは、マンノース残基をアルファ−１，３結合中の脂質結合Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（図１７、ＧＳ１．３）のアルファ−１，６アームのマンノース残基にトランスフェラーゼすることで脂質結合Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２の合成のための前駆体である脂質結合Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２（図１７、ＧＳ１．４）を産生し、この脂質結合Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２は次いでオリゴサッカリルトランスフェラーゼにより糖タンパク質のアスパラギン残基に転移され、その後にグルコース（Ｇｌｃ）残基が取り除かれる。Ａｌｇ３ｐタンパク質活性を欠く宿主細胞において、脂質結合Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２オリゴ糖は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼにより糖タンパク質のアスパラギン残基に転移され得る。α１，２−マンノシダーゼをさらに包含するかかる宿主細胞において、糖タンパク質に付着したＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２オリゴ糖は、トリマンノース（パウチマンノース）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造（図１７、ＧＳ２．１）に切り取られる。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（ＧＳ１．３）構造は、図１７中に示されるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（ＧＳ２．０）と区別可能であり、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリキルアルファ−１，３マンノシルトランスフェラーゼ（Ａｌｇ３ｐ）を発現する宿主細胞中で産生される。
【０１５１】
それ故、欠失または破壊ＡＬＧ３遺伝子（ａｌｇ３Δ）および少なくとも１のＮ−グリコシル化部位を有するインスリンまたはインスリンアナログをコードする核酸分子の包含；ならびにインスリンまたはインスリンアナログを発現させるための条件下で宿主細胞を培養してＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（ＧＳ１．３）構造を優勢に有するＮ−グリコシル化されたインスリンまたはインスリンアナログを産生させることを含む、下等真核生物宿主細胞中でＮ−グリコシル化されたインスリンまたはインスリンアナログおよびこれらの組成物を生産する方法が提供される。さらなる実施形態において、宿主細胞は、エンドマンノシダーゼ活性（例として、完全長エンドマンノシダーゼであるか、または細胞標的化シグナルペプチドと融合したエンドマンノシダーゼ触媒ドメインを含むキメラエンドマンノシダーゼであり、この細胞標的化シグナルペプチドは通常はこの触媒ドメインと関連せず、宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体に対してエンドマンノシダーゼ活性を標的化するように選択される。例えば、米国特許第７，３３２，２９９号を参照されたい）および／またはグルコシダーゼＩＩ活性（完全長グルコシダーゼＩＩであるか、または細胞標的化シグナルペプチドと融合したグルコシダーゼＩＩ触媒ドメインを含むキメラグルコシダーゼＩＩであり、この細胞標的化シグナルペプチドは通常はこの触媒ドメインと関連せず、宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体に対してグルコシダーゼＩＩ活性を標的化するように選択される。例えば、米国特許第６，８０３，２２５号を参照されたい）をさらに発現する。特定の態様において、宿主細胞は、ＡＬＧ６（α１，３−グルコシラトランスフェラーゼ）遺伝子の欠失または破壊（ａｌｇ６Δ）をさらに包含し、このａｌｇ６Δはａｌｇ３Δ宿主細胞中の糖タンパク質のＮ−グリカン占有率を増加させることが示されている（例えば、Ｄｅ  Ｐｏｕｒｃｑ  ｅｔ  ａｌ．，ＰｌｏＳＯｎｅ  ２０１２；７（６）：ｅ３９９７６．Ｅｐｕｂ  ２０１２  Ｊｕｎ  ２９を参照されたい。この文献は、ヤロウィア・リポリティカをＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（ＧＳ１．３）またはパウチマンノースＮ−グリカンの構造を有する糖タンパク質を産生するように遺伝子操作することを開示している）。ピキア・パストリスＡＬＧ６をコードする核酸配列は、ＥＭＢＬデータベース中で、アクセッション番号ＣＣＣＡ３８４２６で開示されている。さらなる態様において、宿主細胞は、ＯＣＨ１遺伝子の欠失または破壊（ｏｃｈ１Δ）をさらに包含する。
【０１５２】
ＡＬＧ３遺伝子の欠失または破壊（ａｌｇ３Δ）、ならびに細胞標的化シグナルペプチドと融合したα１，２−マンノシダーゼ触媒ドメインを含むキメラα１，２−マンノシダーゼをコードする核酸分子であって、この細胞標的化シグナルペプチドが通常はこの触媒ドメインと関連せず、宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体に対してα１，２−マンノシダーゼ活性を標的化してキメラα１，２−マンノシダーゼを過剰発現させるように選択される核酸分子および少なくとも１のＮ−グリコシル化部位を有するインスリンまたはインスリンアナログをコードする核酸分子の包含；ならびにインスリンまたはインスリンアナログを発現させるための条件下で宿主細胞を培養してＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を優勢に有するＮ−グリコシル化されたインスリンまたはインスリンアナログを産生させることを含む、下等真核生物宿主細胞中でＮ−グリコシル化されたインスリンまたはインスリンアナログおよびこれらの組成物を生産する方法がさらに提供される。さらなる実施形態において、宿主細胞は、エンドマンノシダーゼ活性（例として、完全長エンドマンノシダーゼであるか、または細胞標的化シグナルペプチドと融合したエンドマンノシダーゼ触媒ドメインを含むキメラエンドマンノシダーゼであり、この細胞標的化シグナルペプチドは通常はこの触媒ドメインと関連せず、宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体に対してエンドマンノシダーゼ活性を標的化するように選択される）および／またはグルコシダーゼＩＩ活性（完全長グルコシダーゼＩＩであるか、または細胞標的化シグナルペプチドと融合したグルコシダーゼＩＩ触媒ドメインを含むキメラグルコシダーゼＩＩであり、この細胞標的化シグナルペプチドは通常はこの触媒ドメインと関連せず、宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体に対してグルコシダーゼＩＩ活性を標的化するように選択される）をさらに発現または過剰発現する。特定の態様において、宿主細胞は、ＡＬＧ６遺伝子の欠失または破壊（ａｌｇ６Δ）をさらに包含する。さらなる態様において、宿主細胞は、ＯＣＨ１遺伝子の欠失または破壊（ｏｃｈ１Δ）をさらに包含する。実施例６は、完全長エンドマンノシダーゼを過剰発現するａｌｇ３Δピキア・パストリス宿主細胞の構築を示し、これはパウチマンノースＮ−グリカンを有するインスリンアナログを産生した。同様の宿主細胞は、他の酵母または糸状菌においても構築し得る。
【０１５３】
さらなる実施形態において、上記のａｌｇ３Δ宿主細胞は、先に開示されるような付加的な哺乳動物またはヒトのグリコシル化酵素（例として、ＧｎＴ  Ｉ、ＧｎＴ  ＩＩ、ガラクトシラトランスフェラーゼ（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌａｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ）をさらに包含して、特定のハイブリッドまたは複合型のＮ−グリカンを優勢に有するＮ−グリコシル化されたインスリンまたはインスリンアナログを産生し得る。
【０１５４】
糖タンパク質の産生量は、場合により、哺乳動物もしくはヒトのシャペロンタンパク質をコードする核酸分子を過剰発現させることにより、または１もしくは複数の内在性シャペロンタンパク質をコードする遺伝子を１もしくは複数の哺乳動物もしくはヒトのシャペロンタンパク質をコードする核酸分子で置き換えることにより、改善することができる。加えて、宿主細胞中の哺乳動物またはヒトのシャペロンタンパク質の発現はまた、細胞中のＯ−グリコシル化を制御するように思われる。したがって、シャペロンタンパク質をコードする少なくとも１の内在性遺伝子の機能が低減または除去されている宿主細胞が本明細書中にさらに包含され、少なくとも１の哺乳動物またはヒトのシャペロンタンパク質ホモログをコードするベクターが宿主細胞中で発現される。内在性宿主細胞シャペロンおよび哺乳動物またはヒトのシャペロンタンパク質を発現する宿主細胞もまた包含される。さらなる態様において、下等真核生物宿主細胞は、酵母または糸状菌の宿主細胞である。産生量を改善するため、および組換えタンパク質のＯ−グリコシル化を低減または制御するためにヒトシャペロンタンパク質が導入された宿主細胞のシャペロンの使用の例は、国際出願公開第ＷＯ２００９１０５３５７号および第ＷＯ２０１００１９４８７号中に開示されている（この開示は参照により本明細書中に組み込まれる）。
【０１５５】
それ故、本明細書中で開示される方法は、図１７中に示される少なくともＮ−グリカンを含む糖タンパク質を産生するように遺伝子操作された任意の宿主細胞を用いることができる。本明細書中で開示される方法は、優勢なＮ−グリカンが複合型Ｎ−グリカン、ハイブリッドＮ−グリカンおよび高マンノースＮ−グリカンよりなる群から選択される糖タンパク質を産生するように遺伝子操作された任意の宿主細胞を用いることができ、ここで複合型Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（パウチマンノース）、ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＳｉａ（１−４）Ｇａｌ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２よりなる群から選択される。さらなる実施形態において、宿主細胞は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（ＧＳ１．３）構造からなるＮ−グリカン構造を優勢に有する糖タンパク質を産生する。一般に、この株は、図１７中に示されるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（ＧＳ２．０）構造を産生するものと予想されないものである。
【０１５６】
酵母を遺伝子操作する場合、選択マーカーは、薬剤抵抗性マーカーおよび酵母宿主細胞に必須細胞栄養分、例としてアミノ酸を合成させる遺伝機能を包含する組換え宿主細胞を構築するのに用いることができる。酵母中で一般に用いられる薬剤抵抗性マーカーとしては、クロラムフェニコール、カナマイシン、メトトレキサート、Ｇ４１８（ジェネテシン）、ゼオシンなどが挙げられる。酵母宿主細胞に必須細胞栄養分を合成させる遺伝機能は、対応するゲノム機能において栄養要求性変異を有する利用可能な酵母株と共に用いられる。一般的な酵母選択マーカーは、ロイシン（ＬＥＵ２）、トリプトファン（ＴＲＰ１およびＴＲＰ２）、プロリン（ＰＲＯ１）、ウラシル（ＵＲＡ３、ＵＲＡ５、ＵＲＡ６）、ヒスチジン（ＨＩＳ３）、リジン（ＬＹＳ２）、アデニン（ＡＤＥ１またはＡＤＥ２）などを合成するための遺伝機能をもたらす。他の酵母選択マーカーとしてはＳ．セレビシエからのＡＲＲ３遺伝子が挙げられ、この遺伝子は、亜ヒ酸塩の存在下で増殖される酵母細胞に亜ヒ酸塩抵抗性を付与する（Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ，１３：８１９−８２８（１９９７）；Ｗｙｓｏｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３００６１−３００６６（１９９７））。いくつかの好適な組み込み部位として米国特許第７，４７９，３８９号（この開示は参照により本明細書中に組み込まれる）中に列挙されているものが挙げられ、これは、サッカロマイセス・セレビシエおよび他の酵母または真菌について公知の遺伝子座に対するホモログを包含する。酵母内にベクターを組み込む方法は周知である（例えば、米国特許第７，４７９，３８９号、米国特許第７，５１４，２５３号、米国特許出願公開第２００９０１２４００号およびＷＯ２００９／０８５１３５を参照されたい。これらの開示は参照により本明細書中に全て組み込まれる）。挿入部位の例としては、限定されるものではないが、ピキアＡＤＥ遺伝子、ピキアＴＲＰ（ＴＲＰ１からＴＲＰ２を包含する）遺伝子、ピキアＭＣＡ遺伝子、ピキアＣＹＭ遺伝子、ピキアＰＥＰ遺伝子、ピキアＰＲＢ遺伝子およびピキアＬＥＵ遺伝子が挙げられる。ピキアのＡＤＥ１およびＡＲＧ４遺伝子はＬｉｎ  Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２６３：１５９−１６９（２００１）および米国特許第４，８１８，７００号中に記載されており（これらの開示は参照により本明細書中に組み込まれる）、ＨＩＳ３およびＴＲＰ１遺伝子はＣｏｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ  １４：８６１−８６７（１９９８）中に記載されており、ＨＩＳ４はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ５６１８０中に記載されている。
【０１５７】
酵母細胞の形質転換は当該技術分野で周知であり、例えば、それ自体公知の方法でのプロトプラスト形成およびその後の形質転換により達せられ得る。細胞を培養するのに用いられる培地は、酵母生物を増殖させるのに好適な任意の従来の培地であり得る。
【０１５８】
上記宿主細胞および宿主細胞を用いる方法のいずれか１の特定の実施形態において、組換え異種タンパク質は治療用のタンパク質または糖タンパク質であり、これは、特定の実施形態において、例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）；サイトカイン、例えばインターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγおよびインターフェロンωなど；ならびに顆粒球−コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）；顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；凝固因子、例えば因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸおよびヒトプロテインＣなど；アンチトロンビンＩＩＩ；トロンビン；可溶性ＩｇＥ受容体α鎖；免疫グロブリン、例えばＩｇＧ、ＩｇＧ断片、ＩｇＧ融合体およびＩｇＭなど；免疫接着物質および他のＦｃ融合タンパク質、例えば可溶性ＴＮＦ受容体−Ｆｃ融合タンパク質など；ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質；インターロイキン；ウロキナーゼ；キマーゼ；尿素トリプシンインヒビター；ＩＧＦ結合タンパク質；上皮増殖因子；成長ホルモン放出因子；アネキシンＶ融合タンパク質；アンジオスタチン；血管内皮増殖因子−２；骨芽前駆細胞抑制因子−１；オステオプロテジェリン；α−１−アンチトリプシン；α−フェトプロテイン；ＤＮａｓｅ  ＩＩ；ヒトプラスミノーゲンのクリングル３；グルコセレブロシダーゼ；ＴＮＦ結合タンパク質１；卵胞刺激ホルモン；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ；膜貫通アクティベーターおよびカルシウムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンド；グルカゴン様タンパク質１；インスリン、ならびにＩＬ−２受容体アゴニストよりなる群から選択され得る。
【０１５９】
上記宿主細胞のいずれか１のさらなる実施形態において、治療用糖タンパク質は抗体であり、その例としては、限定されるものではないが、抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＲＳＶ（呼吸合胞体ウイルス）抗体、抗ＴＮＦα抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＣＤ３受容体抗体、抗ＣＤ４１  ７Ｅ３抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＥＧＦ受容体抗体または抗ＣＤ２０抗体が挙げられる。
【０１６０】
以下の実施例は、本発明のさらなる理解を促すことを意図したものである。
【実施例】
【０１６１】
実施例１
誘導性のまたは恒常的なプロモーターに操作可能に連結されたリーシュマニア・メジャーＳＴＴ３Ｄ（ＬｍＳＴＴ３Ｄ）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする発現カセットを含むプラスミドを以下のように構築した。
【０１６２】
ＬｍＳＴＴ３Ｄをコードするオープンリーディングフレーム（配列番号１）は、ＧｅｎｅＡｒｔ  ＡＧ，Ｂｒａｎｄｅｎｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙにより、Ｐ．パストリス中での最適な発現のためにコドン最適化され、合成された。ＬｍＳＴＴ３Ｄをコードするコドン最適化された核酸分子はｐＧＬＹ６２８７と命名され、配列番号２中に示されるヌクレオチド配列を有する。
【０１６３】
プラスミドｐＧＬＹ６３０１（図２）は、Ｐ．パストリス中のＵＲＡ６遺伝子座を標的とするロールイン組み込みプラスミドである。ＬｍＳＴＴ３Ｄをコードする発現カセットは、Ｐ．パストリス中での有効な発現のためにコドン最適化されたＬｍＳＴＴ３Ｄ  ＯＲＦをコードする核酸分子を含み、この核酸分子は、５’末端において誘導性Ｐ．パストリスＡＯＸ１プロモーター配列を有する核酸分子（配列番号３）に、および３’末端においてＳ．セレビシエＣＹＣ転写終結配列を有する核酸分子（配列番号４）に操作可能に連結されている。形質転換体を選択するため、このプラスミドはＳ．セレビシエＡＲＲ３  ＯＲＦをコードする発現カセットを含み、ここでＯＲＦをコードする核酸分子（配列番号５）は、５’末端においてＰ．パストリスＲＰＬ１０プロモーター配列を有する核酸分子（配列番号６）に、および３’末端においてＳ．セレビシエＣＹＣ転写終結配列を有する核酸分子に操作可能に連結されている。このプラスミドは、ＵＲＡ６遺伝子座を標的とする核酸分子（配列番号７）をさらに包含する。５’末端においてＥｃｏＲＩ部位に、および３’末端においてＦｓｅＩ部位に隣接したコドン最適化されたＬｍＳＴＴ３Ｄ  ＯＲＦ（ｐＧＬＹ６２８７）をコードするＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩおよびＦｓｅＩで消化されたプラスミドｐＧＦＩ３０ｔ内にクローニングすることにより、プラスミドｐＧＬＹ６３０１を構築した。
【０１６４】
プラスミドｐＧＬＹ６２９４（図３）は、ＴＲＰ１遺伝子座の発現を破壊することなく、Ｐ．パストリス中のこの遺伝子座を標的とするＫＩＮＫＯ組み込みベクターである。ＫＩＮＫＯ（ノックアウトをほとんどまたは全く伴わないノックイン（Ｋｎｏｃｋ−Ｉｎ  ｗｉｔｈ  ｌｉｔｔｌｅ  ｏｒ  Ｎｏ  Ｋｎｏｃｋ−Ｏｕｔ））組み込みベクターは、標的の遺伝子座において遺伝子の発現を破壊することなく、この標的の遺伝子座内への異種ＤＮＡの挿入を可能にするものであり、米国特許出願公開第２００９０１２４０００号中に記載されている。ＬｍＳＴＴ３Ｄをコードする発現カセットは、ＬｍＳＴＴ３Ｄ  ＯＲＦをコードする核酸分子を含み、この核酸分子は、５’末端において恒常的Ｐ．パストリスＧＡＰＤＨプロモーター配列を有する核酸分子（配列番号８）に、および３’末端においてＳ．セレビシエＣＹＣ転写終結配列を有する核酸分子に操作可能に連結されている。形質転換体を選択するため、このプラスミドは、ノーセオトリシン抵抗性（ＮＡＴＲ）ＯＲＦ（元々はＥＲＯＳＣＡＲＦ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ＧｍｂＨ，Ｄａｉｍｌｅｒｓｔｒａｓｓｅ  １３ａ，Ｄ−６１３５２  Ｂａｄ  Ｈｏｍｂｕｒｇ，ＧｅｒｍａｎｙからのｐＡＧ２５に由来するものであり、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ  １５：１５４１（１９９９）を参照されたい。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＲ３１３８７．１およびＣＡＲ３１３８３．１）をコードする発現カセットを含み、ここでＯＲＦをコードする核酸分子（配列番号９）は、５’末端においてアシュビア・ゴシピーＴＥＦ１プロモーター配列を有する核酸分子（配列番号１０）に、および３’末端においてアシュビア・ゴシピーＴＥＦ１終結配列を有する核酸配列（配列番号１１）に操作可能に連結されている。この２つの発現カセットは、一方の側ではＰ．パストリスＡＬＧ３終結配列を有する核酸分子（配列番号１３）に連結された停止コドンで終わるＴｒｐ１ｐをコードするＯＲＦの５’領域からのヌクレオチド配列を含む核酸分子（配列番号１２）に、他方の側ではＴＲＰ１遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列を含む核酸分子（配列番号１４）に隣接している。５’末端においてＮｏｔＩ部位に、および３’末端においてＰａｃＩ部位に隣接したコドン最適化されたＬｍＳＴＴ３Ｄ  ＯＲＦ（ｐＧＬＹ６２８７）をコードするＤＮＡ断片をＮｏｔＩおよびＦｓｅＩで消化されたプラスミドｐＧＬＹ５９７内にクローニングすることにより、プラスミドｐＧＬＹ６２９４を構築した。ノーセオトリシン抵抗性ＯＲＦ（ＮＡＴ）をコードする核酸分子を含む発現カセットを、アシュビア・ゴシピーＴＥＦ１プロモーター（ＰＴＥＦ）およびアシュビア・ゴシピーＴＥＦ１終結配列（ＴＴＥＦ）に操作可能に連結した。
【０１６５】
上記プラスミドは、以下の実施例中で示されるように、ＬｍＳＴＴ３Ｄ発現カセットをＰ．パストリス内に導入して、ここで産生される糖タンパク質上のＮ−グリコシル化部位占有率を増加させるのに用いることができる。
【０１６６】
実施例２
遺伝子操作されたピキア・パストリス株ＹＧＬＹ１４４０１、ＹＧＬＹ１８４４５、ＹＧＬＹ２８１５８およびＹＧＬＹ２０２２８は、全て、ガラクトース末端の複合型Ｎ−グリカンを産生する能力を持つように遺伝子操作された宿主細胞中で組換えヒト抗ＲＳＶ抗体を産生する株である。株ＹＧＬＹ１８４４５はＬｍＳＴＴ３Ｄを過剰発現し、株ＹＧＬＹ２８１５８はゲノム内に組み込まれた遺伝子の２つのコピーからＬｍＳＴＴ３Ｄを過剰発現し、ＹＧＬＹ２０２２８はＬｍＳＴＴ３ＤおよびＬｍＳＴＴ３Ａを発現する。これらの株の構築を図１Ａ〜１Ｌ中に模式的に図示する。簡潔には、これらの株を以下のように構築した。
【０１６７】
一般に、これらの株は、以前に記載された方法を用いて野生型ピキア・パストリス株ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０から構築した（例えば、米国特許第７，４４９，３０８号；米国特許第７，４７９，３８９号；米国特許出願公開第２００９０１２４０００号；ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２００９０８５１３５号；Ｎｅｔｔ  ａｎｄ  Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｙｅａｓｔ  ２０：１２７９（２００３）；Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００：５０２２（２００３）；Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：１２４４（２００３）を参照されたい）。全てのプラスミドは、標準的な分子生物学的手法を用いて、ｐＵＣ１９プラスミド中で作られた。Ｐ．パストリス中での発現のために最適化されたヌクレオチド配列の場合、天然のヌクレオチド配列をＧＥＮＥＯＰＴＩＭＩＺＥＲソフトウェア（ＧｅｎｅＡｒｔ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により解析して、その結果をＰ．パストリス発現のためにコドンが最適化されたヌクレオチド配列を作成するのに用いた。酵母株をエレクトロポレーション（エレクトロポレーターの製造業者ＢｉｏＲａｄにより推奨される標準的な技術を用いたもの）により形質転換した。株ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０で始まる一連の形質転換から、株ＹＧＬＹ８３２３を生み出した。株ＹＧＬＹ８３２３は、ガラクトース末端のＮ−グリカンを優勢に有する糖タンパク質を産生する能力がある。野生型ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０株からのこの株の構築は、国際出願公開第ＷＯ２０１１１０６３８９号の実施例２中に詳細に記載されており、この文献は参照により本明細書中に組み込まれる。
【０１６８】
プラスミドｐＧＬＹ６５６４（図４）は、Ｐ．パストリス中のＴＲＰ２遺伝子座を標的とする、抗ＲＳＶ抗体の軽鎖および重鎖をコードするロールイン組み込みプラスミドである。抗ＲＳＶ重鎖をコードする発現カセットは、Ｐ．パストリス中での有効な発現のためにコドン最適化された重鎖ＯＲＦをコードする核酸分子（配列番号１５）を含み、この核酸分子は、５’末端においてサッカロマイセス・セレビシエ接合因子プレシグナル配列をコードする核酸分子（配列番号３３）に操作可能に連結されて今度はそのＮ末端において誘導性Ｐ．パストリスＡＯＸ１プロモーター配列を有する核酸分子と融合しており、および３’末端においてＳ．セレビシエＣＹＣ転写終結を有する核酸分子に操作可能に連結されている。抗ＲＳＶ軽鎖をコードする発現カセットは、Ｐ．パストリス中での有効な発現のためにコドン最適化された軽鎖ＯＲＦをコードする核酸分子（配列番号１６）を含み、この核酸分子は、５’末端においてサッカロマイセス・セレビシエ接合因子プレシグナル配列をコードする核酸分子に操作可能に連結されて今度はそのＮ末端において誘導性Ｐ．パストリスＡＯＸ１プロモーター配列を有する核酸分子と融合しており、および３’末端においてＰ．パストリスＡＯＸ１転写終結配列を有する核酸分子（配列番号１７）に操作可能に連結されている。形質転換体を選択するため、このプラスミドはゼオシンＯＲＦをコードする発現カセットを含み、ここではＯＲＦをコードする核酸分子（配列番号１８）が５’末端においてＳ．セレビシエＴＥＦプロモーター配列を有する核酸分子（配列番号３６）に、および３’末端においてＳ．セレビシエＣＹＣ転写終結配列を有する核酸分子に操作可能に連結されている。このプラスミドは、ＴＲＰ２遺伝子座を標的化するための核酸分子をさらに包含する。
【０１６９】
株ＹＧＬＹ１４４０１は、抗ＲＳＶ抗体をコードするプラスミドｐＧＬＹ６５６４をＹＧＬＹ８３２３内に形質転換することにより、作成した。得られた株から株ＹＧＬＹ１４４０１を選択した。この株において、抗ＲＳＶ重鎖および軽鎖をコードする発現カセットは、ピキア・パストリスＴＲＰ２遺伝子座（ＰｐＴＲＰ２）に対して標的化される。この株は、ＬｍＳＴＴ３Ｄ発現カセットを包含しない。株ＹＧＬＹ１４４０１を５−ＦＯＡの存在下で対抗選択して、ＵＲＡ５遺伝子を喪失してｌａｃＺリピートのみを残している株ＹＧＬＹ１５８２０を得た。
【０１７０】
株ＹＧＬＹ１５８２０をプラスミドｐＧＬＹ７１４０（図５）で形質転換したが、このプラスミドは、ＹＯＳ９遺伝子座を標的とし、ｌａｃＺリピートを含む核酸分子（配列番号４２）に隣接したＰ．パストリスＵＲＡ５遺伝子を含む核酸分子（配列番号４１）または転写単位を含有するノックアウトベクターであり、これは今度は一方の側ではＹＯＳ９遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列を含む核酸分子（配列番号１９）に、他方の側ではＹＯＳ９遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列を含む核酸分子（配列番号２０）に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ７１４０をＳｆｉＩで線状化し、線状化されたプラスミドを株ＹＧＬＹ１５８２０内に形質転換して、ｌａｃＺリピートに隣接したＵＲＡ５遺伝子が二重交差相同組換えによりＹＯＳ９遺伝子座内に挿入されているいくつかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ１５０１９を選択した。
【０１７１】
株ＹＧＬＹ１７３２７は、Ｐ．パストリスＧＡＰＤＨプロモーターの制御下にあるＬｍＳＴＴ３Ｄ  ＯＲＦをコードするＫＩＮＫＯプラスミドであるプラスミドｐＧＬＹ６２９４を株ＹＧＬＹ１５０１９内に形質転換することにより作成したが、ここでＬｍＳＴＴ３ＤはＰ．パストリス中のＴＲＰ１遺伝子座を標的とする。株ＹＧＬＹ１７３２７を５−ＦＯＡの存在下で対抗選択して、ＵＲＡ５遺伝子を喪失してｌａｃＺリピートのみを残している株ＹＧＬＹ１７３３１を得た。
【０１７２】
株ＹＧＬＹ１８４４５は、ＡＬＧ３遺伝子座を標的とし、ｌａｃＺリピートを含む核酸分子に隣接したＰ．パストリスＵＲＡ５遺伝子または転写単位を含む核酸分子を含有するノックアウトベクターであるプラスミドｐＧＬＹ５５０８（図６）を形質転換することにより作成したが、この核酸分子は、今度は一方の側ではＡＬＧ３遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列を含む核酸分子（配列番号２１）に、他方の側ではＡＬＧ３遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列を含む核酸分子（配列番号２２）に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ５５０８をＳｆｉＩで線状化し、線状化されたプラスミドを株ＹＧＬＹ１７３３１内に形質転換して、ｌａｃＺリピートに隣接したＵＲＡ５遺伝子が二重交差相同組換えによりＡＬＧ３遺伝子座内に挿入されているいくつかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ１８４４５を選択した。
【０１７３】
本明細書中に開示される適当な株の、上記ＬｍＳＴＴ３Ｄ発現／組み込みプラスミドベクターでの形質転換は、基本的に以下のように行った。適当なピキア・パストリス株を５０ｍＬのＹＰＤ培地（酵母エキス（１％）、ペプトン（２％）およびブドウ糖（２％））中で、ＯＤが約０．２から６になるまで一晩増殖させた。氷上で３０分間のインキュベーションの後、細胞を２５００〜３０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によりペレット化した。培地を取り除き、細胞を氷冷滅菌１Ｍソルビトールで３回洗浄し、その後に０．５ｍＬの氷冷滅菌１Ｍソルビトール中に再懸濁した。１０μＬの線状化ＤＮＡ（５〜２０μｇ）および１００μＬの細胞懸濁液をエレクトロポレーションキュベット中で合わせて、氷上で５分間インキュベートした。エレクトロポレーションは予め設定されたピキア・パストリスプロトコール（２ｋＶ、２５μＦ、２００Ω）に従ってＢｉｏ−Ｒａｄ  ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ中で行い、直後に１ｍＬのＹＰＤＳ回収培地（ＹＰＤ培地＋１Ｍソルビトール）を加えた。形質転換された細胞を室温（２４℃）で４時間から一晩の間、回収し、その後に選択培地上に細胞を蒔いた。
【０１７４】
株ＹＧＬＹ１８４４５を次いで上記のように、誘導性ＡＯＸ１プロモーターの制御下にあるＬｍＳＴＴ３ＤをコードするｐＧＬＹ６３０１で、または誘導性ＡＯＸ１プロモーターの制御下にあるＬｍＳＴＴ３ＡをコードするｐＧＬＹ６２９９で形質転換して、実施例３中に記載されるように株ＹＧＬＹ２８１５８およびＹＧＬＹ２０２２８をそれぞれ得た。
【０１７５】
実施例３
ＬｍＳＴＴ３ＡをコードするＯＲＦが誘導性ＰｐＡＯＸ１プロモーターに操作可能に連結された発現カセットを含む組み込み／発現プラスミドｐＧＬＹ６２９９、またはＬｍＳＴＴ３ＤをコードするＯＲＦが誘導性ＰｐＡＯＸ１プロモーターに操作可能に連結された発現カセットを含むｐＧＬＹ６３０１を、それぞれＳｐｅＩで線状化し、線状化されたプラスミドをピキア・パストリス株ＹＧＬＹ１８４４５内に形質転換して、表１中に示されるように、株ＹＧＬＹ２０２２８およびＹＧＬＹ２８１５８をそれぞれ得た。形質転換は、基本的に実施例２中に記載されるように行った。
【表１】
2015502144.tif 000003
【０１７６】
表１は、ＰｐＹＯＳ９およびＰｐＡＬＧ３のＯＲＦが欠失し、ＬｍＳＴＴ３Ｄが恒常的ＧＡＰＤＨプロモーターの制御下にある株ＹＧＬＹ１８４４５、ＹＧＬＹ２０２２８およびＹＧＬＹ２８１５８から得られた抗ＲＳＶ抗体組成物のパーセントＮ−グリカン部位占有率を示す。株ＹＧＬＹ２０２２８は誘導性ＡＯＸ１プロモーターの制御下にあるＬｍＳＴＴ３Ａを包含し、株ＹＧＬＹ２８１５８はＬｍＳＴＴ３Ｄの付加的なコピーを包含するが誘導性ＡＯＸ１プロモーターの制御下にある。
【表２】
2015502144.tif 000004
【０１７７】
表２は、株ＹＧＬＹ１４４０１および株ＹＧＬＹ２０２２８から得られた抗ＲＳＶ抗体組成物のＮ−グリカンの比較を示す。株ＹＧＬＹ１４４０１はＬｍＳＴＴ３ＤおよびＬｍＳＴＴ３Ａをコードする発現カセットを包含しない一方、株ＹＧＬＹ２０２２８は恒常的ＧＡＰＤＨプロモーターの制御下にあるＬｍＳＴＴ３Ｄおよび誘導性ＡＯＸ１プロモーターの制御下にあるＬｍＳＴＴ３Ａを包含し、ＰｐＹＯＳ９  ＯＲＦおよびＰｐＡＬＧ３  ＯＲＦが欠失している。株ＹＧＬＹ２０２２８はＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（ＧＳ１．３）Ｎ−グリカンを産生することが予想される一方、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（ＧＳ２．０）Ｎ−グリカンを例えあったとしてもほとんど産生しないと予想されるが、これは、ＡＬＧ３破壊が、糖タンパク質中のＮ−結合グリコシル化部位に転移された後にα１，２−マンノシダーゼによりＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（ＧＳ２．０）に変換することができる脂質結合構造の形成を妨げるためである（ＧＳ２．０およびＧＳ１．３の構造について図１７を参照されたい）。この図は、ＹＧＬＹ２０２２８が検出可能なＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（ＧＳ２．０）Ｎ−グリカンをほとんどまたは全く産生しなかったことを示す。しかしながら、ＹＧＬＹ２０２２８から得られた抗体組成物中のＮ−グリカンは、それぞれ約４．５モル％のＭ３（ＧＳ２．１）およびＭ４  Ｎ−グリカン（アルファ１，２−結合マンノースが１個少ないＧＳ１．３）、１．５モル％のＧＳ３．１＋１個のグルコースが１，３アームの末端に結合したもの、ならびに２．９モル％のＧＳ３．１＋２個のグルコースが１，３アームの末端に結合したものを包含した。
【０１７８】
実施例４
パウチマンノースＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（ＧＳ２．１）構造を産生する能力がある株を構築し、ＬｍＳＴＴオリゴサッカリルトランスフェラーゼの様々な組み合わせの存在下で株中で発現された抗体のＮ−グリコシル化の産生量および質の評価において用いた。この株をＹＧＬＹ２４５４１と命名した。その構築を図７Ａ〜Ｅ中に模式的に図示する。簡潔には、これらの株は以下のように構築した。
【０１７９】
開始株ＹＧＬＹ１６−３の構築は、国際出願公開第ＷＯ２０１１１０６３８９号の実施例２中に詳細に記載されており、この文献は参照により本明細書中に組み込まれる。プラスミドｐＧＬＹ３４１９（図８）は、ｌａｃＺリピートに隣接したＰ．パストリスＵＲＡ５遺伝子を含む発現カセットを含有する組み込みベクターであり、この発現カセットは、一方の側ではＰ．パストリスＢＭＴ１遺伝子の５’ヌクレオチド配列（配列番号２３）と、他方の側ではＰ．パストリスＢＭＴ１遺伝子の３’ヌクレオチド配列（配列番号２４）と隣接している。プラスミドｐＧＬＹ３４１９を線状化し、線状化されたプラスミドを株ＹＧＬＹ１６−３内に形質転換して、ＵＲＡ５発現カセットが二重交差相同組換えによりＢＭＴ４遺伝子座内に挿入されているいくつかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ６６９７を選択し、５−ＦＯＡの存在下で対抗選択して、ＵＲＡ５遺伝子を喪失してｌａｃＺリピートのみを残している株ＹＧＬＹ６７１９を得た。この株は、ＢＭＴ２遺伝子およびＢＭＴ１遺伝子が破壊されている。
【０１８０】
プラスミドｐＧＬＹ３４１１（図９）は、ｌａｃＺリピートに隣接したＰ．パストリスＵＲＡ５遺伝子を含む発現カセットを含有する組み込みベクターであり、この発現カセットは、一方の側ではＰ．パストリスＢＭＴ４遺伝子の５’ヌクレオチド配列（配列番号２５）と、他方の側ではＰ．パストリスＢＭＴ４遺伝子の３’ヌクレオチド配列（配列番号２６）と隣接している。プラスミドｐＧＬＹ３４１１を線状化し、線状化されたプラスミドを株ＹＧＬＹ６７１９内に形質転換して、ＵＲＡ５発現カセットが二重交差相同組換えによりＢＭＴ４遺伝子座内に挿入されているいくつかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ６７４３を選択し、５−ＦＯＡの存在下で対抗選択して、ＵＲＡ５遺伝子を喪失してｌａｃＺリピートのみを残している株ＹＧＬＹ６７７３を得た。この株は、ＢＭＴ２遺伝子、ＢＭＴ１遺伝子およびＢＭＴ４遺伝子が破壊されている。
【０１８１】
プラスミドｐＧＬＹ３４２１（図１０）は、ｌａｃＺリピートに隣接したＰ．パストリスＵＲＡ５遺伝子を含む発現カセットを含有する組み込みベクターであり、この発現カセットは、一方の側ではＰ．パストリスＢＭＴ３遺伝子の５’ヌクレオチド配列（配列番号２７）と、他方の側ではＰ．パストリスＢＭＴ３遺伝子の３’ヌクレオチド配列（配列番号２８）と隣接している。プラスミドｐＧＬＹ３４２１を線状化し、線状化されたプラスミドを株ＹＧＬＹ６７３３内に形質転換して、ＵＲＡ５発現カセットが二重交差相同組換えによりＢＭＴ４遺伝子座内に挿入されているいくつかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ７７５４を選択し、５−ＦＯＡの存在下で対抗選択して、ＵＲＡ５遺伝子を喪失してｌａｃＺリピートのみを残している株ＹＧＬＹ８２５２を得た。この株は、ＢＭＴ２遺伝子、ＢＭＴ１遺伝子、ＢＭＴ４遺伝子およびＢＭＴ３遺伝子が破壊されている。
【０１８２】
プラスミドｐＧＬＹ１１６２（図１１）は、ＰＲＯ１遺伝子座の発現を破壊することなくこの遺伝子座を標的とし、Ｎ末端においてキメラタンパク質を分泌経路および細胞からの分泌物に標的化するためのＳ．セレビシエαＭＡＴｐｒｅシグナルペプチド（ａＭＡＴＴｒＭａｎ）と融合したＴ．リーゼイα−１，２−マンノシダーゼ触媒ドメインをコードする発現カセットを含有するＫＩＮＫＯ組み込みベクターである。ａＭＡＴＴｒＭａｎをコードする発現カセットは、５’末端においてＳ．セレビシエａＭＡＴｐｒｅシグナルペプチドをコードする核酸分子（配列番号３３）と融合したＴ．リーゼイ触媒ドメインをコードする核酸分子（配列番号２９）を含み、この核酸分子は、５’末端においてＰ．パストリスＡＯＸ１プロモーターを含む核酸分子に、および３’末端においてＳ．セレビシエＣＹＣ転写終結配列を含む核酸分子に操作可能に連結されている。このカセットは、一方の側ではＰＲＯ１遺伝子の完全ＯＲＦの５’領域からのヌクレオチド配列を含む核酸分子（配列番号３０）であって、その後にＰ．パストリスＡＬＧ３終結配列が続く核酸分子に隣接しており、および他方の側ではＰＲＯ１遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列を含む核酸分子（配列番号３１）に隣接している。
【０１８３】
プラスミドｐＧＬＹ１１６２を線状化し、線状化されたプラスミドを株ＹＧＬＹ８２５２内に形質転換して、ＵＲＡ５発現カセットが二重交差相同組換えによりＰＲＯ１遺伝子座内に挿入されているいくつかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ８２９２を選択し、５−ＦＯＡの存在下で対抗選択して、ＵＲＡ５遺伝子を喪失してｌａｃＺリピートのみを残している株ＹＧＬＹ９０６０を得た。
【０１８４】
株ＹＧＬＹ９０６０をプラスミドｐＧＬＹ７１４０で形質転換して、ｌａｃＺリピートに隣接したＵＲＡ５遺伝子が二重交差相同組換えによりＹＯＳ９遺伝子座内に挿入されているいくつかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ２３３２８を選択した。この株を５−ＦＯＡの存在下で対抗選択して、ＵＲＡ５遺伝子を喪失してｌａｃＺリピートのみを残している株ＹＧＬＹ２３３６０を得た。
【０１８５】
株ＹＧＬＹ２４５４１は、ｐＧＬＹ５５０８を株ＹＧＬＹ２３３６０内に形質転換することにより作成し、ｌａｃＺリピートに隣接したＵＲＡ５遺伝子が二重交差相同組換えによりＡＬＧ３遺伝子座内に挿入されているいくつかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ２４５４１を選択した。
【０１８６】
実施例５
実施例４中で得られた株ＹＧＬＹ２４５４１を、様々なＬｍＳＴＴ３オリゴサッカリルトランスフェラーゼの存在下で産生された抗体のＮ−グリコシル化を評価するための抗体を発現するいくつかの株の構築に用いた。これらの株の構築は以下のようなものである。
【０１８７】
プラスミドｐＧＬＹ６８３３（図１２）は、Ｐ．パストリス中のＴＲＰ２遺伝子座を標的とする、抗Ｈｅｒ２抗体の軽鎖および重鎖をコードするロールイン組み込みプラスミドである。抗Ｈｅｒ２重鎖をコードする発現カセットは、Ｐ．パストリス中での有効な発現のためにコドン最適化された重鎖ＯＲＦをコードする核酸分子（配列番号３２）を含み、この核酸分子は、５’末端においてサッカロマイセス・セレビシエ接合因子プレシグナル配列をコードする核酸分子（配列番号３３）に操作可能に連結されて今度はそのＮ末端において誘導性Ｐ．パストリスＡＯＸ１プロモーター配列を有する核酸分子と融合しており、および３’末端においてＰ．パストリスＣＩＴ１転写終結配列を有する核酸分子（配列番号３４）に操作可能に連結されている。抗Ｈｅｒ２軽鎖をコードする発現カセットは、Ｐ．パストリス中での有効な発現のためにコドン最適化された軽鎖ＯＲＦをコードする核酸分子（配列番号３５）を含み、この核酸分子は、５’末端においてサッカロマイセス・セレビシエ接合因子プレシグナル配列をコードする核酸分子に操作可能に連結されて今度はそのＮ末端において誘導性Ｐ．パストリスＡＯＸ１プロモーター配列を有する核酸分子と融合しており、および３’末端においてＰ．パストリスＣＩＴ１転写終結配列を有する核酸分子に操作可能に連結されている。形質転換体を選択するため、このプラスミドはゼオシンＯＲＦをコードする発現カセットを含み、ここではＯＲＦをコードする核酸分子（配列番号１８）が５’末端においてＳ．セレビシエＴＥＦプロモーター配列を有する核酸分子（配列番号３６）に、および３’末端においてＳ．セレビシエＣＹＣ転写終結配列を有する核酸分子に操作可能に連結されている。このプラスミドは、ＴＲＰ２遺伝子座を標的化するための核酸分子（配列番号３７）をさらに包含する。プラスミドｐＧＬＹ６８３３を株ＹＧＬＹ２４５４１内に形質転換し、抗Ｈｅｒ２抗体を発現するいくつかの株を得て、それらから株ＹＧＬＹ２６３６２を選択した。
【０１８８】
プラスミドｐＧＬＹ６２９９（図１３）は、Ｐ．パストリス中のＵＲＡ６遺伝子座を標的とするロールイン組み込みプラスミドである。ＬｍＳＴＴ３Ａをコードする発現カセットは、Ｐ．パストリス中での有効な発現のためにコドン最適化されたＬｍＳＴＴ３Ｄ  ＯＲＦをコードする核酸分子（配列番号３８）を含み、この核酸分子は、５’末端において誘導性Ｐ．パストリスＡＯＸ１プロモーター配列を有する核酸分子に、および３’末端においてＳ．セレビシエＣＹＣ転写終結配列を有する核酸分子に操作可能に連結されている。形質転換体を選択するため、このプラスミドはＳ．セレビシエＡＲＲ３  ＯＲＦをコードする発現カセット（配列番号５）を含み、ここではＯＲＦをコードする核酸分子は５’末端においてＰ．パストリスＲＰＬ１０プロモーター配列を有する核酸分子（配列番号６）に、および３’末端においてＳ．セレビシエＣＹＣ転写終結配列を有する核酸分子に操作可能に連結されている。プラスミドｐＧＬＹ６２９９を株ＹＧＬＹ２６３６２内に形質転換し、抗Ｈｅｒ２抗体およびＬｍＳＴＴ３Ａを発現するいくつかの株を得て、それらから株ＹＧＬＹ２７２９４〜２７２９６を選択した。
【０１８９】
プラスミドｐＧＬＹ６３００（図１４）は、Ｐ．パストリス中のＵＲＡ６遺伝子座を標的とするロールイン組み込みプラスミドである。ＬｍＳＴＴ３Ｂをコードする発現カセットは、Ｐ．パストリス中での有効な発現のためにコドン最適化されたＬｍＳＴＴ３Ｂ  ＯＲＦをコードする核酸分子（配列番号３９）を含み、この核酸分子は、５’末端において誘導性Ｐ．パストリスＡＯＸ１プロモーター配列を有する核酸分子に、および３’末端においてＳ．セレビシエＣＹＣ転写終結配列を有する核酸分子に操作可能に連結されている。形質転換体を選択するため、このプラスミドはＳ．セレビシエＡＲＲ３  ＯＲＦをコードする発現カセット（配列番号５）を含み、ここではＯＲＦをコードする核酸分子は５’末端においてＰ．パストリスＲＰＬ１０プロモーター配列を有する核酸分子（配列番号６）に、および３’末端においてＳ．セレビシエＣＹＣ転写終結配列を有する核酸分子に操作可能に連結されている。プラスミドｐＧＬＹ６３００を株ＹＧＬＹ２６３６２内に形質転換し、抗Ｈｅｒ２抗体およびＬｍＳＴＴ３Ｂを発現するいくつかの株を得て、それらから株ＹＧＬＹ２７２９７〜２７２９９を選択した。
【０１９０】
プラスミドｐＧＬＹ１１１９１（図１５）は、Ｐ．パストリス中のＵＲＡ６遺伝子座を標的とするロールイン組み込みプラスミドである。ＬｍＳＴＴ３Ｃをコードする発現カセットは、Ｐ．パストリス中での有効な発現のためにコドン最適化されたＬｍＳＴＴ３Ｃ  ＯＲＦをコードする核酸分子（配列番号４０）を含み、この核酸分子は、５’末端において誘導性Ｐ．パストリスＡＯＸ１プロモーター配列を有する核酸分子に、および３’末端においてＳ．セレビシエＣＹＣ転写終結配列を有する核酸分子に操作可能に連結されている。形質転換体を選択するため、このプラスミドはＳ．セレビシエＡＲＲ３  ＯＲＦをコードする発現カセット（配列番号５）を含み、ここではＯＲＦをコードする核酸分子は５’末端においてＰ．パストリスＲＰＬ１０プロモーター配列を有する核酸分子（配列番号６）に、および３’末端においてＳ．セレビシエＣＹＣ転写終結配列を有する核酸分子に操作可能に連結されている。プラスミドｐＧＬＹ１１１９１を株ＹＧＬＹ２６３６２内に形質転換し、抗Ｈｅｒ２抗体およびＬｍＳＴＴ３Ｃを発現するいくつかの株を得て、それらから株ＹＧＬＹ２７３００〜２７３０２を選択した。
【０１９１】
プラスミドｐＧＬＹ１０１５３（図１６）は、Ｐ．パストリス中のＵＲＡ６遺伝子座を標的とし、それぞれピキア・パストリスＡＯＸ１プロモーターおよびＳ．セレビシエＣＹＣ転写終結配列の制御下にあるＬｍＳＴＴ３Ａ、ＬｍＳＴＴ３ＢおよびＬｍＳＴＴ３Ｄ  ＯＲＦをコードするロールイン組み込みプラスミドである。形質転換体を選択するため、このプラスミドはＳ．セレビシエＡＲＲ３  ＯＲＦをコードする発現カセットを含み、ここではＯＲＦをコードする核酸分子は５’末端においてＰ．パストリスＲＰＬ１０プロモーター配列を有する核酸分子に、および３’末端においてＳ．セレビシエＣＹＣ転写終結配列を有する核酸分子に操作可能に連結されている。プラスミドｐＧＬＹ１０１５３を株ＹＧＬＹ２４５４１内に形質転換し、いくつかの株を得て、それらから株ＹＧＬＹ２４５５８を選択した。株ＹＧＬＹ２４５５８をプラスミドｐＧＬＹ６８３３で形質転換し、抗Ｈｅｒ２抗体およびＬｍＳＴＴ３Ａ、ＬｍＳＴＴ３Ｂ、ＬｍＳＴＴ３Ｄを発現するいくつかの株を得て、それらから株ＹＧＬＹ２６３６３〜２６３６４を選択した。
【０１９２】
株ＹＧＬＹ２４５４１をプラスミドｐＧＬＹ６３０１で形質転換し、いくつかの株を得て、それらから株ＹＧＬＹ２５６３６を選択した。この株をプラスミドｐＧＬＹ６８３３で形質転換し、抗Ｈｅｒ２抗体およびＬｍＳＴＴ３Ｄを発現するいくつかの株を得て、それらから株ＹＧＬＹ２６３６５を選択した。
【０１９３】
表３は、ＡＯＸ１プロモーターの制御下にある個々のＬｍＳＴＴ３を保持するａｌｇ株から得られた抗ＨＥＲ２抗体組成物のＮ−グリカン部位占有率の比較を示す。ＬｍＳＴＴ３Ｄはａｌｇ株バックグラウンドにおいてＮ−グリカン部位占有率が１００％にまで改善されることを実証し、ＬｍＳＴＴ３Ａもまた顕著にＮ−グリカン部位占有率を改善する。
【表３】
2015502144.tif 000005
【０１９４】
表４は、ＡＯＸ１プロモーターの制御下にある個々のＬｍＳＴＴ３を保持するａｌｇ株中で産生された抗ＨＥＲ２抗体組成物のＮ−グリカン分析を示す。優勢なＮ−グリカン構造はＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２であるが、ここではＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（ａｌｇ３ノックアウト）がＴ．リーゼイα−１，２−マンノシダーゼキメラ酵素によりＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に変換されるが、この酵素は、Ｎ末端においてキメラタンパク質を分泌経路および細胞からの分泌物に標的化するためのＳ．セレビシエαＭＡＴｐｒｅシグナルペプチド（ａＭＡＴＴｒＭａｎ）と融合したその触媒ドメインを含む。
【表４】
2015502144.tif 000006
【０１９５】
マイクロチップＣＥ−ＳＤＳ試料の調製は以下のようなものであった。ＩｇＧ試料（１００〜２００μｇ）を約１００μＬに濃縮し、１％  ＳＤＳを添加した１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９．０でバッファーを交換した。次いで試料を２μＬのＢｅｃｋｍａｎより提供された１０ｋＤａ内部標準と共に、５μＬのベータメルカプトエタノールを加えて還元し、３分間沸騰させた。
【０１９６】
Ｌａｂｃｈｉｐ  ＧＸＩＩ（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＣＡ）による分離方法は以下のようなものであった。
【０１９７】
還元した試料は、裸溶融シリカキャピラリー（３０．２ｃｍ、５０μｍ  Ｉ．Ｄ．）で、還元されたＩｇＧのために製造業者が推奨する方法に従って、逆極性方向で、注入口から２０．２ｃｍの検出ウインドウを使用して、分析した。各サイクルについて、キャピラリーは、０．１Ｎ  ＮａＯＨ、０．１Ｎ  ＨＣｌ、ＨＰＬＣグレード水および製造業者が提供するＳＤＳＭＷゲルバッファーで最初にプレコンディショニングを行う。５ｋＶの電圧を２０秒間かけることにより、試料を動電学的に導入する。電気泳動は、定圧で、４９７ボルト／ｃｍの場の強度で、再循環液体冷却剤を用いて２５℃に維持したキャピラリー温度で行う。生成する電流は約２７μａｍｐである。１０ｎｍバンド幅の２２０ｎｍ、２Ｈｚでピーク検出を記録した。占有率は、グリコシル化重鎖に相当する補正ピーク面積のパーセンテージにより決定した。
【０１９８】
Ｎ−グリコシル化占有率分析は、以下のようなものであった。
【０１９９】
約１〜２ｍｇ／ｍＬの抗体試料（５μＬ）を、５０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を補充したＨＴ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｌａｂｃｈｉｐ（登録商標）キットに備えられた７μＬの試料バッファーに加えた。試料混合物を次いで７５℃で１５分間インキュベートした。マイクロチップ分析の前に、脱イオン化ＨＰＬＣグレード水（３５μＬ）を試料混合物に加え、サイズ分離用装置に入れた。Ｎ−グリコシル化占有率は、グリコシル化重鎖（ＧＨＣ）に相当する補正ピーク面積のパーセンテージにより決定した。重鎖および軽鎖の比（Ｈ：Ｌ）は、軽鎖の補正ピーク面積に対するＧＨＣおよび非グリコシル化重鎖（ＮＧＨＣ）の総補正ピーク面積から計算した。不純物は、ＧＨＣ、ＮＧＨＣまたは軽鎖に属さないタンパク質バンドの総補正ピーク面積として報告した。
【０２００】
組換え宿主細胞を増殖させるためのＤａｓＧｉｐプロトコールは実質的に以下のようなものである。
【０２０１】
アガープレート上の酵母パッチ（単一コロニーから単離されたもの）から０．５Ｌバッフル付フラスコ中の０．１Ｌの４％  ＢＳＧＹに、接種シードフラスコを接種した。シードフラスコを１８０ｒｐｍ、２４℃（Ｉｎｎｏｖａ  ４４，Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で４８時間増殖させた。培養は、１Ｌ（ｆｅｄｂａｔｃｈ−ｐｒｏ，ＤＡＳＧＩＰ  ＢｉｏＴｏｏｌｓ）バイオリアクタ中で行った。容器に０．２２μｍでろ過した４％  ＢＳＧＹ培地を０．５４Ｌ充填し、１２１℃で４５分間オートクレーブした。滅菌および冷却の後、通気、撹拌および温度をそれぞれ０．７ｖｖｍ、４００ｒｐｍおよび２４℃に設定した。３０％水酸化アンモニウムを用いてｐＨを６．５に調整し、制御した。準備が整ったバイオリアクタの接種は、シードフラスコからの６０ｍＬを使用して無菌的に行った。撹拌を徐々に上げて２０％の溶存酸素（ＤＯ）飽和度を維持した。溶存酸素の鋭い上昇により示される最初のグリセロール負荷の消費後、５ｍｇ／Ｌビオチンおよび３２．３ｍｇ／Ｌ  ＰＭＴｉ−４を含有する５０重量／重量％のグリセロール溶液の供給を始動し、３．６８ｍＬ／時で８時間行った。グリセロール流加回分期の間、０．３７５ｍＬのＰＴＭ２塩を手作業で注入した。  グリセロール流加回分の終了後に、０．５時間の飢餓期間および誘導期の開始が続いた。２．５ｍｇ／Ｌのビオチンおよび６．２５ｍＬ／ＬのＰＴＭ２塩を含有する５０容積／容積％のメタノール溶液の連続供給を、２．１６ｍＬ／時の定速で始めた。０．２５ｍＬの１．９ｍｇ／ｍＬ  ＰＭＴｉ−４（メタノール溶液）の注入を、各々誘導の２４時間後に加えた。一般に、誘導の３６〜１１０時間以内に個々の発酵物を回収した。培養液を８５００ｒｐｍで４０分間の遠心分離（Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ＲＣ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により清澄化させ、結果として得られた上清を精製に供した。
【０２０２】
１００ｍＭソルビトールを添加した４％  ＢＳＧＹ
【表５】
2015502144.tif 000007
【０２０３】
ＰＴＭ２塩
【表６】
2015502144.tif 000008
【０２０４】
ＰＭＴｉ−４は、米国特許出願公開第２０１１００７６７２１号中に実施例４化合物として開示されているＰＭＴ阻害剤である。ＰＭＴｉ−４は以下の構造を有する。
【化１】
2015502144.tif 000009
【０２０５】
実施例６
本実施例では、株ＹＧＬＹ２９３６５の構築を記述する。株ＹＧＬＹ２９３６５は、Ｂ（−２）位およびＢ２８位においてＧＳ２．１（Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）Ｎ−グリカンを持つグリコシル化されたインスリンアナログ前駆体を産生する能力がある。グリコシル化されたインスリン前駆体は、インビトロでプロセシングして、グリコシル化されたインスリンアナログ２１０−２−Ｂにすることができる。２１０−Ｂ−２は、アミノ酸配列Ｎ＊ＧＴＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＮ＊Ｋ（配列番号５６）を有する天然のインスリンＡ鎖およびＢ鎖（ｄｅｓ（Ｂ３０））を含むヘテロダイマーであり、１位および３１位におけるＡｓｎ残基Ｎ＊（Ｂ−２およびＢ２８）はＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（パウチマンノース）Ｎ−グリカンとβ１結合中で各々共有結合する。
【０２０６】
株ＹＧＬＹ２９３６５の構築は、株ＹＧＬＹ９０６０で始まる多数の遺伝的改変の産物である。
【０２０７】
株ＹＧＬＹ２４５４２は、プラスミドｐＧＬＹ５５０８を形質転換することにより作成したが、このプラスミドは、ＡＬＧ３遺伝子座を標的とし、ｌａｃＺリピートを含む核酸分子に隣接したＰ．パストリスＵＲＡ５遺伝子または転写単位を含む核酸分子を含有するノックアウトベクターであり、これは今度は一方の側ではＡＬＧ３遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列を含む核酸分子に、他方の側ではＡＬＧ３遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列を含む核酸分子に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ５５０８をＳｆｉＩで線状化し、線状化されたプラスミドを株ＹＧＬＹ２３３６０内に形質転換して、ｌａｃＺリピートに隣接したＵＲＡ５遺伝子が二重交差相同組換えによりＡＬＧ３遺伝子座内に挿入されているいくつかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ２４５４２を選択した。
【０２０８】
プラスミドｐＧＬＹ１０１５３は、Ｐ．パストリス中のＵＲＡ６遺伝子座を標的とし、ＬｍＳＴＴ３Ａ、ＬｍＳＴＴ３ＢおよびＬｍＳＴＴ３Ｄ  ＯＲＦをコードするロールイン組み込みプラスミドである。ＬｍＳＴＴ３タンパク質の過剰発現は、インスリンアナログのＮ−グリコシル化部位占有率を高め得る。ＬｍＳＴＴ３Ａをコードする発現カセットは、Ｐ．パストリス中での有効な発現のためにコドン最適化されたＬｍＳＴＴ３Ｄ  ＯＲＦをコードする核酸分子を含み、この核酸分子は、５’末端において誘導性Ｐ．パストリスＡＯＸ１プロモーター配列を有する核酸分子に、および３’末端においてＳ．セレビシエＣＹＣ転写終結配列を有する核酸分子に操作可能に連結されている。ＬｍＳＴＴ３Ｂをコードする発現カセットは、Ｐ．パストリス中での有効な発現のためにコドン最適化されたＬｍＳＴＴ３Ｂ  ＯＲＦをコードする核酸分子を含み、この核酸分子は、５’末端において誘導性Ｐ．パストリスＡＯＸ１プロモーター配列を有する核酸分子に、および３’末端においてＳ．セレビシエＣＹＣ転写終結配列を有する核酸分子に操作可能に連結されている。ＬｍＳＴＴ３Ｄをコードする発現カセットは、Ｐ．パストリス中での有効な発現のためにコドン最適化されたＬｍＳＴＴ３Ｄ  ＯＲＦをコードする核酸分子を含み、この核酸分子は、５’末端において誘導性Ｐ．パストリスＡＯＸ１プロモーター配列を有する核酸分子に、および３’末端においてＳ．セレビシエＣＹＣ転写終結配列を有する核酸分子に操作可能に連結されている。形質転換体を選択するため、このプラスミドはＳ．セレビシエＡＲＲ３  ＯＲＦをコードする発現カセットを含み、ここではＯＲＦをコードする核酸分子は５’末端においてＰ．パストリスＲＰＬ１０プロモーター配列を有する核酸分子に、および３’末端においてＳ．セレビシエＣＹＣ転写終結配列を有する核酸分子に操作可能に連結されている。プラスミドｐＧＬＹ１０１５３を株ＹＧＬＹ２４５４２内に形質転換し、いくつかの株を得て、それらから株ＹＧＬＹ２４５６１を選択した。株ＹＧＬＹ２４５６１を５−ＦＯＡの存在下で対抗選択して、ＵＲＡ５遺伝子を喪失してｌａｃＺリピートのみを残している株ＹＧＬＹ２４５８６を得た。
【０２０９】
株ＹＧＬＹ２４５８６を、ＡＴＴ１遺伝子を破壊するプラスミドｐＧＬＹ５９３３で形質転換した。ＡＴＴ１遺伝子の破壊は、発酵中の細胞の適応度の改善をもたらし得る。このプラスミドの顕著な特徴は、一方の末端ではＡＴＴ１遺伝子の５’すなわち上流領域を含む核酸分子（配列番号５１）と、他の末端ではＡＴＴ１遺伝子の３’すなわち下流領域を含む核酸分子（配列番号５２）と隣接した上記のＵＲＡ５発現カセットを含むことである。ＹＧＬＹ２４５８６をプラスミドｐＧＬＹ５９３３で形質転換して、いくつかの株を結果として得て、それらから株ＹＧＬＹ２７３０３を選択した。
【０２１０】
プラスミドｐＧＬＹ１１０９９は、ＴＲＰ２またはＡＯＸ１ｐ遺伝子座を標的とし、インスリン前駆体融合タンパク質をコードする発現カセットを包含するロールイン組み込みプラスミドであり、このプラスミドはＳ．セレビシエアルファ接合因子シグナル配列およびプロペプチドを含むが、これらはＮＧＴ（−２）トリペプチド付加およびＰ２８Ｎ置換を持つヒトインスリンＢ鎖と融合したＮ末端スペーサーペプチドと融合しており、このヒトインスリンＢ鎖はヒトインスリンＡ鎖（配列番号５５）と融合したアミノ酸配列ＡＡＫからなるＣ−ペプチドと融合している。株ＹＧＬＹ２７３０３をプラスミドｐＧＬＹ１１０９９で形質転換し、いくつかの株を得て、それらから株ＹＧＬＹ２８１３７を選択した。
【０２１１】
プラスミドｐＧＬＹ１２０２７は、Ｐ．パストリス中のＵＲＡ６遺伝子座を標的とし、マウスエンドマンノシダーゼＯＲＦをコードするロールイン組み込みプラスミドである。完全長マウスエンドマンノシダーゼをコードする発現カセットは、Ｐ．パストリス中での有効な発現のためにコドン最適化された完全長マウスエンドマンノシダーゼＯＲＦをコードする核酸分子（配列番号５３）を含み、この核酸分子は、５’末端において誘導性Ｐ．パストリスＡＯＸ１プロモーター配列を有する核酸分子に、および３’末端において転写終結配列、例えばピキア・パストリスＡＯＸ１転写終結配列（配列番号５４）に操作可能に連結されている。形質転換体を選択するため、このプラスミドは、アシュビア・ゴシピーＴＥＦ１プロモーター（配列番号１０）およびＡ．ゴシピーＴＥＦ１終結配列（配列番号１１）に操作可能に調節されたＮＡＴＲ発現カセット（配列番号９）を包含する。このプラスミドは、ＵＲＡ６遺伝子座を標的とするための前述のような核酸分子をさらに包含する。株ＹＧＬＹ２８１３７をプラスミドｐＧＬＹ１２０２７で形質転換し、いくつかの株を作成して、それらから株ＹＧＬＹ２９３６５を選択した。
【０２１２】
株ＹＧＬＹ２９３６５の発酵の後、インスリンアナログ前駆体を細胞を含まない発酵上清から精製し、ＬｙｓＣエンドプロテイナーゼでプロセシングして、インビトロおよびインビボでの試験用のｄｅｓ（Ｂ３０）ヘテロダイマー２１０−２−Ｂを得た。
【０２１３】
２１０−Ｂ−２ヘテロダイマーを培養培地から得て、Ｎ−グリカン組成を決定した。２１０−Ｂ−２アナログを含む組成物は、約９３〜１００％のＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２および約０から７％のＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２を含有した。
【０２１４】
配列
実施例中で開示される株のいくつかを得るのに用いた配列を以下の表中に提供する。
【表７】
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【０２１５】
本発明は例示された実施形態を参照して本明細書中に記載されるが、本発明はこれらに限定されないと理解されるべきである。当該技術分野における通常の技量を有し本明細書中の教示を利用する当業者は、その範囲内の付加的な改変および実施形態を認識するものである。それ故、本発明は、本明細書に添付された特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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