(57)【要約】本発明は、乾燥アモルファス性沈殿タンパク質粒子を調製する新規な方法を提供することに関する。特に、方法は、透明で泡のない濃縮タンパク質溶液を提供するために再構成することができる、乾燥タンパク質製剤において使用するのに適した、アモルファス性沈殿タンパク質粒子を提供する。
2015500869.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質、スクロース、アルギニン、およびグルタミン酸またはラクトビオン酸を含む乾燥アモルファス性沈殿粒子の調製方法であって、
ｉ）（ａ）約５０ｍｇ／ｍｌを超える質量濃度のタンパク質、
（ｂ）タンパク質の質量濃度の約３０％〜約９５％の間の質量濃度のスクロース、
（ｃ）約５０ｍＭ未満のモル濃度のアルギニン、
（ｄ）約５０ｍＭ未満のモル濃度のグルタミン酸またはラクトビオン酸、
（ｅ）場合により、界面活性剤
を含む沈殿用水溶液を調製するステップ、
（ｉｉ）約１５℃〜約５０℃の範囲の温度において、沈殿用水溶液と、少なくとも１２倍の体積の１種または複数のプロトン性有機溶媒とを一緒にして、各々が、タンパク質、スクロース、アルギニン、およびグルタミン酸またはラクトビオン酸を含む、混和性溶媒混合物およびアモルファス性沈殿粒子の懸濁液を生成するステップ、
（ｉｉｉ）懸濁液を濃縮する、かつ／または残存溶媒を除去して、タンパク質を含む乾燥アモルファス性沈殿粒子を単離するステップ
を含み、
前記粒子が再構成されて、１４０ｍｇ／ｍｌを超えるタンパク質濃度で、前記タンパク質の皮下投与に適した水溶液を形成することができる
方法。
【請求項２】
プロトン性有機溶媒が、イソブタノール、イソプロパノール、２−メチル−２，４−ペンタンジオール、およびそれらの混合物から独立して選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
プロトン性有機溶媒が、イソブタノールである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
グルタミン酸、もしくはラクトビオン酸、またはアルギニンが、約２５ｍＭ未満のモル濃度で独立して存在している、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
タンパク質が、治療用または診断用タンパク質である、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
タンパク質が、モノクローナル抗体またはそのコンジュゲートである、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
タンパク質を含む乾燥アモルファス性沈殿粒子が、超臨界流体抽出または真空もしくは空気乾燥により、懸濁液からもたらされる、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
沈殿用水溶液が、少なくとも２０倍の体積の１種または複数のプロトン性有機溶媒、または２０倍の体積のイソブタノールと一緒にされる、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかにより調製した乾燥アモルファス性沈殿タンパク質粒子の再構成の際に形成する、＞１４０ｍｇ／ｍｌのタンパク質を含む前記水溶液のオスモル濃度が、１０００ｍＯｓｍｏｌｓ／ｋｇ未満、８００ｍＯｓｍｏｌｓ／ｋｇ未満、または６００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ未満である、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
請求項１から８のいずれかにより調製される乾燥アモルファス性沈殿タンパク質粒子の再構成の際に形成する、＞１４０ｍｇ／ｍｌのタンパク質を含む前記水溶液について測定した滑り力が、２０℃の温度、１００μｌ／ｓでこの溶液が標準的な２７Ｇ１／２インチのシリンジニードルを通過すると、＜１５Ｎである、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
乾燥アモルファス性沈殿タンパク質粒子が、約１８０ｍｇ／ｍｌ超、約２２０ｍｇ／ｍｌ超、約２６０ｍｇ／ｍｌ超、または約３００ｍｌ超のタンパク質濃度に再構成される、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
乾燥アモルファス性沈殿タンパク質粒子が、約１２０ｍｇ／ｍｌ〜約３５０ｍｇ／ｍｌの間、または約１８０ｍｇ／ｍｌ〜約３００ｍｇ／ｍｌの間の濃度に再構成される、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ｉ）乾燥アモルファス性タンパク質粒子を適切な再構成用容器に移送するステップ、または乾燥アモルファス性タンパク質粒子を適切な再構成用容器中で調製するステップ、
ｉｉ）適量の水性賦形剤を再構成用容器に添加するステップ、
ｉｉｉ）適切な相対遠心力で、十分な時間、再構成用容器を遠心分離にかけ、水性賦形剤への乾燥アモルファス性沈殿タンパク質粒子製剤の完全なまたはほぼ完全な再構成物を得て、最小限の発泡を示すまたは発泡を示さないタンパク質溶液を生成するステップ
を含む、請求項１から１２のいずれかに記載の乾燥アモルファス性沈殿タンパク質粒子の再構成方法。
【請求項１４】
ステップ（ｉ）およびステップ（ｉｉ）の順序が反対であっても組み合わせてもよく、賦形剤を容器に移送させ、次いで乾燥アモルファス性沈殿タンパク質粒子を添加し、乾燥アモルファス性沈殿タンパク質粒子と賦形剤との事前形成混合物を容器に移送させる、請求項１３に記載の乾燥アモルファス性沈殿タンパク質粒子の再構成方法。
【請求項１５】
ｉ）適量の水性賦形剤を適切な再構成用容器に添加するステップ、
ｉｉ）乾燥アモルファス性沈殿タンパク質製剤を再構成用容器に移送するステップ、または乾燥アモルファス性沈殿タンパク質製剤を再構成用容器中で調製するステップ、
ｉｉｉ）適切な相対遠心力で、十分な時間、再構成用容器を遠心分離にかけ、水性賦形剤への乾燥アモルファス性沈殿タンパク質粒子製剤の完全なまたはほぼ完全な再構成物を得て、最小限の発泡を示すまたは発泡を示さないタンパク質溶液を生成するステップ
を含む、請求項１から１３のいずれかに記載の乾燥アモルファス性沈殿タンパク質粒子の再構成方法。
【請求項１６】
再構成済みタンパク質溶液が、約３０分未満、約２０分未満、約１０分〜約１５分の間、約５分〜約１０分の間、または約５分未満で十分に再構成される、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１７】
再構成時間の短縮が、静止、もしくは連続的、または断続的な手動かき混ぜプロトコルと比較して、極めて高い濃度のタンパク質溶液について、少なくとも約２５％〜少なくとも約９０％、または少なくとも約５０％〜少なくとも約９０％である、請求項１３から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
得られたタンパク質溶液が、穏やかな混合にさらされて、いかなる残余濃度差異も除去される、請求項１３から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
再構成用容器が、滅菌バイアル、瓶、管、または単一チャンバシリンジもしくは二重チャンバシリンジである、請求項１３から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
再構成用の賦形剤が、注射用の水（ＷＦＩ）、蒸留水、脱イオン水；注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）；注射用静菌水（ＢＷＦＩ）；等張剤および／または界面活性剤を含有している水性緩衝液；ステップ（ｉ）において使用されるものと同じタンパク質の溶液である、請求項１３から１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
再構成用の賦形剤が、ステップ（ｉ）において使用されるものと同じタンパク質またはタンパク質の混合物の溶液である、請求項１３から１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
（ｉ）ａ）約５０ｍｇ／ｍｌを超える質量濃度のタンパク質、
ｂ）タンパク質の質量濃度に対して約４０％〜約９５％の質量濃度において、約１７０Ｄａを超える分子量の添加剤、
ｃ）緩衝液、
ｄ）約５０ｍＭ未満のモル濃度の陽イオン性沈殿安定化用添加物、および／または約５０ｍＭ未満のモル濃度の陰イオン性沈殿安定化用添加物、
ｅ）場合により、追加の界面活性剤、追加の緩衝液、または塩
を含む沈殿用水溶液を調製するステップ、
（ｉｉ）約１５℃〜約５０℃の範囲の温度において、水溶液を１２倍超の体積のプロトン性有機溶媒と一緒にするかまたは混合して、水溶液の固体成分を共沈殿させ、これによりアモルファス性タンパク質含有粒子の懸濁液を形成するステップ、および
懸濁液からアモルファス性沈殿タンパク質含有粒子を乾燥粉末の形態で単離するステップ
による高濃度のタンパク質溶液に再構成するのに適した乾燥アモルファス性沈殿タンパク質製剤の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アモルファス性沈殿タンパク質粒子を含む、乾燥タンパク質製剤を調製する方法を提供することに関する。特に、方法は、透明で泡のない濃縮タンパク質溶液を提供するために再構成することができる、乾燥タンパク質製剤を提供する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体などの治療用タンパク質は、バイオ製薬産業にとって重要な薬物であり、幅広い範囲の適応症に標的となる、開発中の治療用タンパク質が多数存在している。通常、上市されている治療用タンパク質は、溶液として非経口的に投与され、また処置物は、病院で医療専門家から点滴経由または注射経由で対象に投与するか、あるいは自己投与することができる。
【０００３】
溶液中での安定性に乏しい治療用タンパク質は、乾燥状態で安定化されることが多い。この安定化効果は、タンパク質ごとに変動することがあるが、流動性の低減、立体配座の安定性の向上、および水を触媒とする分解経路の防止または低減を含むことができる。
【０００４】
タンパク質が、乾燥タンパク質製剤（凍結乾燥粉末またはケーキなど）として乾燥状態で保管される場合、それらは、溶液として患者に投与することができるようになる前に、最も一般には、水性賦形剤に再溶解して戻す必要がある。注射用の水などの賦形剤を適量で添加することにより、乾燥タンパク質製剤を溶解する際の、タンパク質溶液の形成は一般に、再構成と呼ばれる。この再構成過程は、賦形剤の添加に始まり、通常、乾燥タンパク質製剤を粉末またはケーキからタンパク質の溶液に変換する。好ましくは、再構成過程の完了時には、形成したタンパク質溶液は、光学的に透明であるか、または乳白色となることになるが、いかなる目視可能な粒子も含有すべきではない。この再構成過程は、薬物の投与を受けるために、患者が不合理な時間待機する必要がないよう、非常に迅速に完了すべきである。
【０００５】
患者への投与を適切なものとするために、タンパク質濃度の高い溶液はまた、薬学的に許容される添加剤だけを含むこと、ならびにタンパク質完全性、注射可能性、および注射に許容可能なオスモル濃度の維持などの他の基準を満足する必要もある。したがって、泡の形成がなく、かつ最小限の手作業による介入で、合理的な時間でやはり再構成することができる、これらの基準を満足している安定な乾燥粉末製剤を製造することができる方法が必要とされている。
【０００６】
非経口投与により送達するための高濃度溶液調製に使用するのに適したものとするため、乾燥タンパク質製剤は、非経口的に承認されている添加剤しか含有していない：合理的な期間をかけて再構成することができる：加工後のタンパク質完全性および生物活性の適切な維持、ならびに保管時の分解に対して高い耐性を示す：再構成時に、良好な透明性、およびタンパク質の乾燥前に存在しているものに対して、タンパク質の凝集状態への変化が最小を示す、高濃度タンパク質溶液を生成することが望ましい。タンパク質の投与量が注射をするのに痛いものとなることを避けるために、乾燥タンパク質製剤が高濃度のタンパク質溶液を生成し、この溶液中に存在している添加剤の濃度が、投与すべきタンパク質濃度で再構成する場合、約８００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ未満、好ましくは約６００Ｏｓｍｏｌ／ｋｇ未満のオスモル濃度を有する溶液を提供することがやはり非常に望ましい。高濃度タンパク質溶液が、合理的な速度および力を使用して、適切な内径の皮下注射用ニードル（２７Ｇ、または好ましくはそれより細い）を使用して注射することができるよう、乾燥タンパク質製剤が良好な注射可能性を示す高濃度タンパク質溶液を生成することも重要である。これは、標的とするシリンジおよびニードルにより、実際の滑り力を測定することにより求めることができる。溶液を患者により注射可能とするためには、滑り力は、通常、３０Ｎ未満、好ましくは１５Ｎ未満にすべきである。
【０００７】
これらの要件の一部またはすべては、凍結乾燥粉末をベースとする、乾燥タンパク質製剤により満足し得る。しかし、約１４０ｍｇ／ｍｌ〜約３５０ｍｇ／ｍｌの範囲の、非常に高いタンパク質濃縮物を目標とする場合、凍結乾燥調製物を使用してこれらの要件をすべて実現するのは次第に困難になり、また、さらには、こうした調製物は通常、所望の再構成時間よりも長くなることを示す。
【０００８】
一般に、タンパク質よりもおよそ３倍多い質量の添加剤を使用して、タンパク質完全性を十分に保護し、かつ良好な保管安定性を示す凍結乾燥製剤を調製することが望ましい。しかし、高濃度の溶液に関するオスモル濃度の要件を満足するために、乾燥製剤中の添加剤の質量は、通常、タンパク質の質量と同じであるか、またはそれより少ないことが必要となることになり、そうして、適切な凍結乾燥粉末を調製することは非常に困難となり得る。７２ｍｇ／ｍｌという適度に高い濃度に迅速に再構成することができる、タンパク質被覆微結晶（ＰＣＭＣ）をベースとする乾燥製剤が、以前に開示されている。すなわち、ＷＯ２００８１３２４３９Ａ２の８６〜８７頁の実施例１５において、添加剤のグリシンが、およそ７２ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃縮物を含む溶液を形成するために溶解することができる、タンパク質充填量２９％ｗ／ｗを有するＰＣＭＣ乾燥粉末を調製するためのコア結晶材料として例示された。しかし、これらの実験では、生成した溶液のオスモル濃度の説明はなかった。グリシンは比較的低分子量（７５Ｄａ）を有しており、これらの粒子の再構成の際には、１００ｍｇ／ｍｌの溶液中に存在しており、１３００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇを超える予想オスモル濃度を与える。こうした高オスモル濃度を有する溶液は、患者に送達された場合、容認できない痛みをもたらすことが予期される。さらに、容認できない高オスモル濃度を示した溶液を生成することなく、こうした製剤による、１４０ｍｇ／ｍｌ超のものなどのより一層高い濃度の溶液を形成することは可能ではない。したがって、非経口送達のために上記の要件をやはり満足しながらも、非常に高い濃縮物に迅速に再構成することができる乾燥製剤の調製の代替的な方法が必要であることは明白である。こうした製剤を再構成するための改善方法も必要である。
【０００９】
再構成時における、目視可能または準目視可能な粒子の存在は、１つまたは複数の製品製造工程（充填、凍結または乾燥など）の間、または製造後の出荷および保管の間、あるいは再構成過程自体の間に、タンパク質凝集物の形成に至る分解過程が発生したことを示し得るものである。製造、出荷、および保管の間に粒子が生成するリスクを最小限にすることを確実とするため、上市されている治療用タンパク質製品の開発中に、多大な注意が払われることに留意すべきである。これは、治療用タンパク質の投与溶液中に存在している粒子（特に、変性タンパク質を含有しているもの）は、タンパク質薬物に対する望ましくない免疫応答を患者が発症するリスクをかなり高める見込みがあるからである。免疫原性の問題は、治療用タンパク質のクリアランスを中和するかまたは増強する抗薬物抗体の発生を含み得るか、あるいは薬物の集積をもたらし得る。
【００１０】
乾燥タンパク質製剤を再構成する特有の方法は、目視可能または準目視可能な粒子を形成し得る、タンパク質の凝集を引き起こすリスクをもたらすことが知られている。したがって、タンパク質／賦形剤の混合物を震とう、または激しく撹拌すると、恐らく、タンパク質の変性またはアンフォールディングを両方引き起こす恐れがあるせん断応力および／またはバブルの生成により、再構成が不十分な製品をもたらし得ることは、当分野では周知である。したがって、治療用タンパク質の医薬製品インサート中に提供されている再構成の指示書は、「震とうしないように」と、具体的に明記している。あまりに激しく震とうまたは撹拌したタンパク質溶液は、通常、持続性の泡層を含有し、この場合、乾燥タンパク質製剤粉末の再構成中に放出されるか、あるいは震とうまたは撹拌により直接形成する気泡が、変性タンパク質の存在により安定化される。
【００１１】
乾燥タンパク質製剤に関して提供される再構成の指示は、タンパク質ごとに細かく変動するが、共通する再構成ステップの以下の例は、以下の薬物、すなわちバイアル中の乾燥製品として提供される、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）（パリビズマブ）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）、Ｆｕｚｅｏｎ（登録商標）（エンフビルチド）、およびＸｏｌａｉｒ（登録商標）（オマリズマブ）の製品インサートで見いだされることになる：手作業により再構成；かき混ぜ（穏やかに）または回転（穏やかに）；震とう不可；泡の回避；透明または乳白色の溶液；微粒子のないこと。
【００１２】
したがって、治療用タンパク質の乾燥粉末製剤の再構成は、通常、手作業により実施され、その方法がタンパク質の分解なしに再現性よく実施されるのを確実とするため、担当者の技量および経験に依存する。３０分未満などの合理的な時間で十分な再構成を実現するために、「バイアルを穏やかにかき混ぜる」ことが必要であると明記されることが多い。しかし、これを正しく行わない場合、一部のわずかなタンパク質が分解する可能性を伴う「過剰の発泡」が発生する恐れがある。したがって、乾燥タンパク質製剤の再構成をする担当者は、生じた泡のレベルが過剰か否かの判定も行いながら、穏やかなかき混ぜを実現する適切な技法を適用しなければならない。さらに、投与時の特定の治療用タンパク質溶液が免疫応答を生じる場合、患者は、今後、その薬物からなんらかの治療的恩恵をもはや得ることができないことになるというリスクが存在する。
【００１３】
したがって、再構成が不良な治療用タンパク質を不注意に投与するリスクを低減するか、または予防する、乾燥タンパク質製剤のための改善された再構成方法を開発する明白な必要性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、再構成に適した多用量の治療用タンパク質を含有している、薬学的に許容される製剤を調製する方法であって、再構成が不良な治療用タンパク質を不注意に投与するリスクを低減するかまたは予防する；乾燥粉末製剤として許容される安定性を有する；完全性の高いタンパク質を含有している溶液を生成する；良好な注射可能性を有する溶液を生成する；許容されるオスモル濃度を有する溶液を生成する；合理的な時間で再構成することができる；泡の形成なしに再構成することができる；最小限の手作業の介入により再構成することができる、方法を提供することである。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、非経口送達のための、乾燥タンパク質製剤の高濃度品へのより迅速な再構成方法であって、再構成が不良な治療用タンパク質を不注意に投与するリスクを低減するかまたは予防する；安定な乾燥粉末製剤を生成する；完全性の高いタンパク質を含有している溶液を生成する；良好な注射可能性を有する溶液を生成する；許容されるオスモル濃度を有する溶液を生成する；合理的な時間で再構成することができる；泡の形成なしに再構成することができる；最小限の手作業の介入により再構成することができる、方法を提供することである。
【００１６】
本発明の目的はまた、泡の形成がなく、かつ最小限の手作業の介入により、短時間／合理的な時間で、乾燥タンパク質製剤を高濃度タンパク質溶液に再構成することが実現可能な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、
ｉ）ａ）約５０ｍｇ／ｍｌを超える質量濃度のタンパク質、
ｂ）タンパク質の質量濃度に対し、約４０％〜約９５％の質量濃度において、約１７０Ｄａを超える分子量の添加剤、
ｃ）緩衝液、
ｄ）約５０ｍＭ未満のモル濃度の陽イオン性沈殿安定化用添加物、および／または約５０ｍＭ未満のモル濃度の陰イオン性沈殿安定化用添加物、
ｅ）場合により、追加の界面活性剤、追加の緩衝液、または塩
を含む沈殿用水溶液を調製するステップ、
ｉｉ）約１５℃〜約５０℃の範囲の温度において、１２倍超の体積のプロトン性有機溶媒と一緒にするかまたは混合して、水溶液の固体成分を共沈殿させ、これによりアモルファス性タンパク質含有粒子の懸濁液を形成するステップ、および
ｉｉｉ）懸濁液からアモルファス性沈殿タンパク質含有粒子を、乾燥粉末の形態で単離するステップ
により、高濃度のタンパク質溶液に再構成するのに適した乾燥アモルファス性沈殿タンパク質製剤の調製方法を提供する。
【００１８】
本発明はさらに、
（ｉ）ａ）約５０ｍｇ／ｍｌを超える質量濃度のタンパク質、
ｂ）タンパク質の質量濃度に対して約４０％〜約９５％の質量濃度において、約１７０Ｄａを超える分子量の添加剤、
ｃ）約５０ｍＭ未満のモル濃度の陽イオン性沈殿安定化用添加物、
ｄ）約５０ｍＭ未満のモル濃度の陰イオン性沈殿安定化用添加物、
ｅ）場合により、追加の界面活性剤、緩衝液、または塩
を含む沈殿用水溶液の調製するステップ、
（ｉｉ）約１５℃〜約５０℃の範囲の温度において、水溶液を１２倍超の体積のプロトン性有機溶媒と一緒にするかまたは混合して、水溶液の固体成分を共沈殿させ、これによりアモルファス性タンパク質含有粒子の懸濁液を形成するステップ、および
ｉｉｉ）該懸濁液から乾燥アモルファス性タンパク質含有粒子を乾燥粉末の形態で単離するステップ
により、高濃度のタンパク質溶液に再構成するのに適した乾燥タンパク質製剤の調製方法を提供する。
【００１９】
さらなる態様によれば、本発明はさらに、タンパク質、スクロース、アルギニン、およびグルタミン酸またはラクトビオン酸を含む、好ましい乾燥アモルファス性沈殿タンパク質粒子を調製する方法を提供する。
【００２０】
タンパク質、スクロース、アルギニン、およびグルタミン酸またはラクトビオン酸を含み、１２０ｍｇ／ｍｌを超えるタンパク質濃度で、前記タンパク質を皮下投与するのに適した水溶液を形成するために再構成することができる、乾燥アモルファス性沈殿粒子を調製する方法は、以下のステップを含む：
（ｉ）（ａ）約５０ｍｇ／ｍｌを超える質量濃度のタンパク質、
（ｂ）タンパク質の質量濃度の約３０％〜約９５％の間の質量濃度のスクロース、
（ｃ）約５０ｍＭ未満のモル濃度のアルギニン、
（ｄ）約５０ｍＭ未満のモル濃度のグルタミン酸またはラクトビオン酸、
（ｅ）場合により、界面活性剤
を含む沈殿用水溶液の調製するステップ、
（ｉｉ）約１５℃〜約５０℃の範囲の温度において、沈殿用水溶液と、１２倍以上の体積の１種または複数のプロトン性有機溶媒とを一緒にして、各々が、タンパク質、スクロース、アルギニン、およびグルタミン酸またはラクトビオン酸の混合物を含む、混和性溶媒混合物およびアモルファス性沈殿粒子の懸濁液を生成するステップ、ならびに
（ｉｉｉ）該懸濁液を濃縮する、および／または残存溶媒を除去して、タンパク質を含む乾燥アモルファス性沈殿粒子を単離するステップ。
【００２１】
沈殿タンパク質粒子を乾燥粉末の形態で単離する、または懸濁液を濃縮する、および／もしくは残存溶媒を除去する、任意の適切な方法は、本明細書で詳述した粒子の調製法に従って使用することができる。本明細書で使用するための単離、濃縮および／または溶媒除去の好ましい方法は、超臨界流体抽出および／または真空乾燥もしくは空気乾燥である。
【００２２】
さらなる態様によれば、本発明は、皮下投与による送達に適した治療用タンパク質の濃度の高いかまたは極めて濃度の高い溶液を含有する、薬学的に許容される製剤であって、前記製剤が、以下で定義する新規再構成方法に従い、乾燥タンパク質製剤の再構成により調製される、製剤を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、それぞれＸＢ１ＡからＸＢ１Ｅの再構成溶を含むバイアルＡからＥを例示している。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明の製剤において使用するための陽イオン性および／または陰イオン性安定化添加物はそれぞれ、約５０ｍＭ未満、または好ましくは約２５ｍＭ未満のモル濃度で独立して存在することができる。
【００２５】
本明細書で使用するタンパク質の質量濃度は、それが溶解している水溶液の単位体積当たりの存在している特定のタンパク質の質量として定義され、本明細書では、ｍｇ／ｍｌの単位で表される。
【００２６】
乾燥製剤として製剤化することができる任意のタンパク質は、本明細書の方法に従って、乾燥アモルファス性沈殿タンパク質の調製に使用することができる。特に、凍結乾燥したタンパク質粉末またはケーキ；沈殿タンパク質の粉末またはケーキ；真空乾燥粉末またはケーキ；空気乾燥粉末またはケーキ；スプレードライ粉末またはケーキ；および超臨界流体乾燥粉末またはケーキの調製について当分野で公知のタンパク質が、本明細書における使用に適している。
【００２７】
乾燥タンパク質製剤と組み合わせた利用性について当分野で公知の、任意の適切な緩衝液、塩、界面活性剤、またはそれらの混合物を本明細書において使用することができる。好ましい添加物は、Ｔｗｅｅｎ８０および／または酸化防止剤を含む、ポリソルベートなどの非経口的に承認されている界面活性剤である。
【００２８】
任意の適切な陽イオン性および陰イオン性沈殿安定化添加物、極性有機溶媒、および適切な添加剤は、本明細書で詳述される乾燥アモルファス性沈殿タンパク質粒子の調製方法のいずれかにおいて使用することができる。
【００２９】
本明細書で使用するための好ましい極性有機溶媒は、アルコールおよびジオール（イソブタノール、イソプロパノール、および２−メチル−２，４−ペンタンシオールを含む）などのプロトン性有機溶媒、ならびにそれらの混合物である。本明細書で使用するための最も好ましいプロトン性有機溶媒は、イソブタノールである。イソブタノールは、スクロースを含むアモルファス性沈殿粒子の形成を促進するように思われ、また、製造コストを低下させるという追加的な利点をもたらすことになるグリーン燃料として幅広く入手可能となる見込みもあるからである。したがって、本発明は、本明細書で詳述される乾燥製剤のいずれかを調製する方法であって、有機溶媒が、プロトン性有機溶媒またはプロトン性有機溶媒の混合物である；有機溶媒がアルコールおよびジオール、ならびにそれらの混合物から独立して選択されるプロトン性有機溶媒である；有機溶媒がイソブタノール、イソプロパノール、および／または２−メチル−２，４−ペンタンジオール、ならびにそれらの混合物から独立して選択されるプロトン性有機溶媒である；有機溶媒がイソブタノールである、方法が提供される。
【００３０】
本明細書で使用するための好ましい陽イオン性沈殿安定化添加物は、アルギニンである。好ましい陰イオン性沈殿安定化添加物は、グルタミン酸およびラクトビオン酸から独立して選択される。これらの好ましい沈殿安定化添加物は、良好なタンパク質完全性をもたらし、高分子量を有し、かつ非経口的に承認されているものである。再構成溶液が許容されるオスモル濃度限界値内を維持するのを確実とするため、沈殿安定化添加物の各々は、沈殿用水溶液中、約５０ｍＭ未満、好ましくは約２５ｍＭ未満のモル濃度で、好ましくは存在すべきである。したがって、本発明は、本明細書で詳述される乾燥製剤のいずれかの調製方法であって、沈殿安定化添加物の各々が、沈殿用水溶液中、約５０ｍＭ未満、好ましくは約２５ｍＭ未満のモル濃度で存在している方法を提供する。乾燥タンパク質製剤を調製するために共沈殿を使用する特定の利点は、所望の場合、沈殿した水溶液中に存在しているタンパク質の濃度が、再構成済み溶液中の標的タンパク質濃度よりもかなり低くすることができる点にある。したがって、本明細書にける方法を使用すると、約３０〜約１４０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約５０ｍｇ／ｍｌ超、より好ましくは約８０ｍｇ／ｍｌ超の範囲の質量濃度を有するタンパク質溶液を使用して、再構成すると約１４０〜約３５０ｍｇ／ｍｌの範囲のタンパク質濃縮物をもたらすことができる、乾燥タンパク質製剤を調製することが可能である。より低いタンパク質濃度の水溶液の製造は、はるかに一層直接的であり、可逆的および不可逆的な凝集という潜在的な問題を最小限にする。
【００３１】
本明細書において使用するのに適したタンパク質には、＜５ＫＤａのペプチド、５〜５０ＫＤａの小タンパク質、５０〜２００ＫＤａの中タンパク質、および＞２００ＫＤａの大タンパク質が含まれる。好ましいタンパク質には、関節炎、クーロン病、およびアルツハイマー病などの慢性状態のために開発されたものなどの治療用タンパク質、診断用タンパク質が含まれる。好ましいタンパク質は、１ｍｇ／ｋｇ超、もしくは５ｍｇ／ｋｇ超、または１０ｍｇ／ｋｇ超などの高い治療的用量で送達することが、通常、必要となろう。したがって、好ましいタンパク質は、中タンパク質または大タンパク質である。好ましいタンパク質のクラスは、モノクローナル抗体、および薬物−タンパク質コンジュゲートなどのそれらのコンジュゲート、ならびに融合タンパク質である。放射線標識タンパク質などの、閉ループ中かつ迅速に濃縮して製剤化することが必要となり得るタンパク質も好ましい。
【００３２】
乾燥粉末製剤として調製した以下の治療用タンパク質または診断用タンパク質のいずれか１つまたは組合せは、本明細書で詳述される本発明の再構成方法に従って使用することができる：抗体；非抗体タンパク質；免疫グロブリン；免疫グロブリン様タンパク質；成長因子；融合タンパク質、キメラタンパク質、酵素；ホルモン；サイトカイン、Ｆｃ−誘導化タンパク質または薬物；および組換え抗原。適切な抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、天然品、組換え品、ヒト、ヒト化、キメラ、多重特異性、または単一鎖とすることができる。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭのクラスからの免疫グロブリンを使用することができる。適切なＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２Δａ、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む、任意のアイソタイプとすることができる。抗体−薬物コンジュゲートもまた使用することができる。抗体の誘導体もまた使用することができ、これらには組換えＤＮＡ技法、または無傷の抗体の酵素的もしくは化学的開裂により産生する、抗原結合部分が含まれる。抗原結合部分には、特に、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２、Ｆｖ、ｄＡｂ、および相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、単一鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、二重特異性抗体、および特異性抗原の結合をポリペプチドに付与するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含有しているポリペプチドが含まれる。
【００３３】
修飾グリコシル化されているポリペプチド、グリコシル化されていないポリペプチド（非グリコシル化）などの天然タンパク質のアナログを含むことができる。化学修飾して、例えば、水溶性ポリマー（例えば、ペグ化）、放射性核種、あるいは他の診断用もしくは標的または治療用部位に結合させた天然のポリペプチドまたはアナログポリペプチドの誘導体も含むことができる。
【００３４】
記載されている遠心分離の再構成方法から恩恵を受けることができる、上市されている乾燥タンパク質製剤には、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）（パリビズマブ）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）、Ｆｕｚｅｏｎ（登録商標）（エンフビルチド）、Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）（オマリズマブ）、Ｒａｐｔｉｖａ（登録商標）（エファリズマブ）、およびＩｌａｒｉｓ（登録商標）（カナキヌマブ）が含まれる。
【００３５】
乾燥アモルファス性タンパク質製剤の調製のための本明細書における沈殿法を使用する追加的な利点は、ポリソルベートおよび他の界面活性剤をプロトン性有機溶媒に溶解することにより除去するか、または顕著に低減することができる点である。乾燥タンパク質製剤を作製する過程の間に界面活性剤を除去または低減すると、乾燥状態における安定化にとって有利となることがある。発泡の可能性を低下させる他に、ポリソルベートは、自動酸化、エチレンオキシドサブ単位における開裂、および脂肪酸エステル結合の加水分解を受けることが報告されている。自動酸化により、ヒドロペルオキシドの形成、側鎖開裂、およびギ酸などの短鎖酸の最終的な形成がもたらされ、これらはすべて、バイオ医薬製品の安定性に影響を及ぼし得る。
【００３６】
本明細書に記載されている通り、本発明はさらに、
ｉ）乾燥タンパク質製剤を適切な再構成用容器に移送するステップ、または乾燥タンパク質製剤を適切な再構成用容器中で調製するステップ、
ｉｉ）適量の水性賦形剤を再構成用容器に添加するステップ、
ｉｉｉ）適切な相対遠心力で、十分な時間、再構成用容器を遠心分離にかけ、水性賦形剤への乾燥タンパク質製剤の完全なまたはほぼ完全な再構成物を得て、最小限の発泡を示すタンパク質溶液を生成するステップ
を含み、
ステップ（ｉ）およびステップ（ｉｉ）の順序は、反対であっても組み合わせてもよく、賦形剤を容器に移送させ、次いで乾燥タンパク質を添加し、乾燥タンパク質と賦形剤との事前形成混合物を容器に移送させ、
乾燥タンパク質製剤を本発明による方法に従って調製する、
乾燥タンパク質製剤の再構成方法を提供する。
【００３７】
乾燥タンパク質を再構成用容器中で賦形剤に添加する場合、本発明は、
ｉ）適量の水性賦形剤を適切な再構成用容器に添加するステップ、
ｉｉ）乾燥タンパク質製剤を再構成用容器に移送するステップ、または乾燥タンパク質製剤を再構成用容器中で調製するステップ、および
ｉｉｉ）適切な相対遠心力で、十分な時間、再構成用容器を遠心分離にかけ、水性賦形剤への乾燥タンパク質製剤の完全なまたはほぼ完全な再構成物を得て、最小限の発泡を示すタンパク質溶液を生成するステップ
を含み、また
乾燥タンパク質製剤を本発明による方法に従って調製する、乾燥タンパク質製剤の再構成方法を提供する。
【００３８】
本発明の方法により提供される再構成溶液は、好ましくは均一であり、光学的に透明であり、かつ目視可能な粒子を含んでいない。
【００３９】
本発明者らは、乾燥アモルファス性沈殿タンパク質粒子を調製する上記方法は、非経口投与用の濃度の高いタンパク質溶液の調製に関連する課題の多くを解決するが、非常に高いタンパク質濃縮物を目標とする場合、最も明白なさらなる課題、すなわち再構成時間が依然として残ることを認識している。これは、高いタンパク質濃度（＞１４０ｍｇ／ｍｌ）では３０分（ｍｉｎ）を超え、および非常に高いタンパク質濃度（２００ｍｇ／ｍｌ）では６０分を超えることがある。３０分より長い再構成時間は、患者または医師にとって望ましいものではない。
【００４０】
なおさらなる態様によれば、本発明は、乾燥アモルファス性沈殿タンパク質粒子を再構成する新規な方法を提供する。有利には、この新規方法は、非常に望ましい時間枠内で、乾燥タンパク質製剤から再構成済みタンパク質溶液を提供する。このさらなる再構成方法によれば、再構成済みタンパク質溶液は、通常、約３０分未満、好ましくは約２０分未満、好ましくは約１０分〜約１５分の間、より好ましくは約５分〜約１０分の間、とりわけ約５分未満で調製することができる。
【００４１】
場合により、遠心分離器から再構成用容器を取り出す際には、穏やかな混合過程を溶液に適用して均一性を確実にすることができる。こうして、穏やかな混合により、遠心分離後に存在し得るいかなる濃度勾配も除くことになり、かつ、例えばバイアルまたはシリンジを用いて、５〜３０秒などの短時間で、わずかな角度での手間の穏やかなかき混ぜまたは回転により実施することができる。したがって、本出願人は、本発明によりタンパク質溶液の以下の調製、および患者への送達のためにバイアルからシリンジに溶液を移送するか、もしくはシリンジにより患者に送達するか、または保管のために適切な入れ物に移送する前に再構成用容器をわずかな角度で穏やかな回転にさらすことは、全体を通して一定の濃度を有する溶液を提供する利点を立証することができることをさらに見いだした。この遠心分離後のステップの追加的な利点は、タンパク質の移送の間、容器の側面に留まっている、いかなる最小量の乾燥タンパク質製剤（すなわち残余粉末細片）も含まれ得ることである。
【００４２】
したがって、本発明はさらに、上で定義したさらなる再構成方法であって、得られたタンパク質溶液が穏やかな混合にさらされて、いかなる残余濃度差異も除かれるステップを場合により含む、方法を提供する。
【００４３】
泡には、再構成済み溶液の表面周辺における泡の十分な層と部分的な層の両方が含まれる。本発明の方法により調製される再構成済みタンパク質溶液は、最小限の発泡を示す。最小限の発泡には、実質的に泡を含まない溶液が含まれる。溶液表面、または溶液内部に少しのバブルが存在することは、持続的な泡を構築するとは見なされず、また実質的に泡を含まない定義の範囲内に含まれている。
【００４４】
有利には、本発明の方法は、乾燥タンパク質からの再構成済み製剤であって、最小限の発泡を示し、かつ持続的な泡を含まない、製剤を提供する。上で示した通り、再構成済み溶液中の持続的な泡の存在は、タンパク質完全性の低下、すなわちタンパク質の凝集に関連する変性、および免疫応答の可能性と関連する恐れがある。したがって、本方法は、現在の方法に対して、タンパク質の変性リスクの低減を提供する。
【００４５】
したがって、本発明はさらに、上で定義したさらなる再構成方法であって、最小限の泡を示すか、または泡を示さない、乾燥タンパク質由来の再構成済み製剤を提供する方法を提供する。
【００４６】
任意の適切な乾燥タンパク質製剤、または乾燥タンパク質製剤の組合せは、以下を含む本発明の再構成方法において使用することができる：凍結乾燥タンパク質粉末またはケーキ；沈殿タンパク質粉末またはケーキ；真空乾燥粉末またはケーキ；空気乾燥粉末またはケーキ；スプレードライ粉末またはケーキ；および超臨界流体乾燥粉末またはケーキ。本明細書の再構成方法に使用するための好ましい乾燥製剤は、上で詳述した本発明の方法により調製した、アモルファス性沈殿タンパク質粒子である。
【００４７】
したがって、本発明はさらに、上で説明されている方法であって、乾燥タンパク質製剤の混合物が、適切な再構成用容器に移送され、かつ前記乾燥タンパク質製剤の混合物が、同じタンパク質の異なる乾燥製剤または２種以上のタンパク質の乾燥製剤とすることができる方法を提供する。
【００４８】
本発明はさらに、１種または複数の乾燥タンパク質製剤の、同時ではあるが独立した再構成方法であって、この製剤が、個別の再構成用容器中で、同じかまたは異なる製剤とすることができる、方法を提供する。
【００４９】
本発明の再構成方法において使用するのに適した水性賦形剤には、注射用の水（ＷＦＩ）、蒸留水、脱イオン水；注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）；および注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、すなわち適切な抗微生物性保存剤を含む滅菌水が含まれる。水性賦形剤は、１種または複数の緩衝液、界面活性剤、塩、安定化剤、またはそれらの混合物をさらに含んでもよい。本発明の再構成方法において使用するのに適した、緩衝液、界面活性剤、塩、および安定化剤は、当分野で周知のものから選択することができる。存在する場合、緩衝液、界面活性剤、塩、もしくは安定化剤、またはそれらの混合物を含む、水性賦形剤の相対量は、標的とする再構成済みタンパク質溶液の濃度に依存することになる。特定のどのような水性賦形剤においても使用するのに適した緩衝液、界面活性剤、塩、および安定化剤の選択は、再構成すべき特定の乾燥タンパク質製剤に依存することになる。
【００５０】
本出願人らは、極めて高い濃度のタンパク質の再構成済み溶液を調製する場合、再構成すべきものと同じタンパク質の水溶液を含む水性賦形剤のそうした使用が有利であることを見いだした。
【００５１】
水性賦形剤中にタンパク質を含む再構成方法の一例は、本明細書では、実施例７において提示されている。
【００５２】
したがって、本発明はさらに、
ｉ）乾燥タンパク質製剤を適切な再構成用容器に移送するステップ、または乾燥タンパク質製剤を適切な再構成用容器中で調製するステップ、
ｉｉ）ステップ（ｉ）において使用したものと同じタンパク質の溶液を適量、再構成用容器に添加するステップ、
ｉｉｉ）適切な相対遠心力で、十分な時間、再構成用容器を遠心分離にかけ、水性賦形剤への乾燥タンパク質製剤の完全なまたはほぼ完全な再構成物を得て、最小限の発泡を示すタンパク質溶液を生成するステップ、
を含み、
ステップ（ｉ）およびステップ（ｉｉ）の順序は、反対であっても組み合わせてもよく、賦形剤を容器に移送させ、次いで乾燥タンパク質を添加し、乾燥タンパク質と賦形剤との事前形成混合物を容器に移送させ、
（ｉｉ）の水性タンパク質溶液が、場合により、１種または複数の緩衝液、界面活性剤、塩、安定化剤、またはそれらの混合物を含むことができる、
乾燥アモルファス性沈殿タンパク質製剤の再構成方法を提供する。
【００５３】
ステップ（ｉ）および（ｉｉ）について記載されている、本発明の再構成方法に従って使用される乾燥アモルファス性沈殿タンパク質製剤および水性賦形剤の量により、得られる再構成済み溶液中のタンパク質濃度が決まることになる。
【００５４】
本出願人はまた、本発明の再構成方法は、タンパク質溶液の目標濃度が向上し、かつ固体乾燥タンパク質製剤の体積が大きくなるにつれて、ますます有利になることも見いだした。
【００５５】
高い（約１００ｍｇ／ｍｌ超）、および非常に高い（約１４０ｍｇ／ｍｌ〜約３５０ｍｇ／ｍｌ）濃度のタンパク質溶液は、例えば、単回の低容量注射による送達によるものなどの非経口投与用の薬物製剤の調製において、とりわけ望ましい。
【００５６】
こうした濃度の高い、および非常に濃度の高い条件では、固体の乾燥アモルファス性沈殿タンパク質製剤と添加した水性賦形剤との混合は、従来的な再構成プロトコルを使用して実現するのは困難になっている。
【００５７】
本発明による改善された再構成方法を使用して、従来的なプロトコルに付随する困難が、遠心分離による再構成により回避される。本出願人は、固体の相対量が非常に高い場合でさえ、効果的な再構成が、再構成用容器中で本明細書において改善された方法を使用して実現することを見いだした。以下の実施例１および実施例３は、従来的なプロトコルによりもたらされる方法と比較して、本方法による濃度の高い（＞２００ｍｇ／ｍｌ）タンパク質溶液の再構成の利点を例示している。実施例７は、本発明による再構成方法により、乾燥アモルファス性沈殿タンパク質製剤の、非常に高いタンパク質濃度（＞２５０ｍｇ／ｍｌ）への迅速な再構成を実証している。
【００５８】
認識される通り、完全な再構成は、当業者が、乾燥アモルファス性沈殿タンパク質粒子製剤が十分に再構成され、かつさらなる作業は何も必要としないと判断した場合に、言い換えると、光学的に透明と見なされる場合に実現する。十分に再構成された試料は、通常、均一溶液であるか、または均一分散液となろう。ほぼ完全な再構成は、乾燥アモルファス性沈殿タンパク質粒子製剤が完全な再構成に非常に近いと、当業者が判断した場合、起こることになる。例えば、ほぼ完全な再構成は、十分に再構成されていない少量の物質が依然として留まっている場合か、またはこの溶液が均一ではない場合に起こることがある。残存している少量の物質（通常、もともと存在している乾燥製剤の総量の５％未満、または１％未満）は、再構成用容器の壁に付着して留まっていることがあり、また溶液のレベルより上に存在していることもある。通常、光学的に透明な溶液をもたらすために、本明細書に記載されている再構成用容器をかき混ぜるなどのさらなる穏やかな混合過程を適用することにより、ほぼ完全な再構成に至る、試料の完全な再構成を実現することが可能である。
【００５９】
疑念を回避するため、完全な再構成および完全な溶解により、光学的に透明と見なされる溶液がもたらされる。同様に、ほぼ完全な再構成、およびほぼ完全な溶解により、当業者が完全な再構成または完全な溶解に非常に近いと判断する溶液がもたらされる。本明細書で定義する、再構成および溶解という用語は、互換的である。本明細書で定義する、完全な再構成／溶解は、乾燥製剤が十分に溶解して、光学的に透明な溶液を生成する場合に、起こることがある。この光学的に透明な溶液は、１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に希釈すると、１０ＮＴＵ未満の濁度を示すべきである。好ましくは、完全な再構成／溶解は、本明細書で示される、初期処理の際か、穏やかなかき混ぜ後のどちらかで得ることができよう。
【００６０】
したがって、本発明の再構成方法は、有利には、乾燥アモルファス性沈殿タンパク質製剤の、高濃度（約１００ｍｇ／ｍｌ超）、特に約１４０ｍｇ／ｍｌ〜約３５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約１９０ｍｇ／ｍｌ〜約３５０ｍｇ／ｍｌ、とりわけ約２００ｍｇ／ｍｌ〜約３００ｍｇ／ｍｌの範囲の非常に高濃度のタンパク質溶液への迅速な再構成に使用することができる。特に、本発明の方法は、静止もしくは連続的または断続的な手動かき混ぜプロトコルと比較すると、非常に高いタンパク質濃度の溶液について、再構成時間が少なくとも約２５％の短縮を提供することができる。好ましくは、本発明の方法は、静止もしくは連続的または断続的な手動かき混ぜプロトコルと比較すると、非常に高いタンパク質濃度の溶液について、再構成時間が少なくとも約５０％、または少なくとも約９０％の短縮を提供することができる。したがって、本発明は、静止もしくは連続的または断続的な手動かき混ぜプロトコルと比較すると、非常に高いタンパク質濃度の溶液について、再構成時間が少なくとも約２５％〜少なくとも約９０％、より好ましくは約５０％〜約９０％の短縮をする方法を提供する。
【００６１】
本発明によれば、本明細書の再構成方法に従って、対応する乾燥アモルファス性沈殿タンパク質製剤から調製する場合、濃度が高いかまたは極めて濃度が高いタンパク質の、迅速に再構成された実質的に泡を含まない溶液が提供される。
【００６２】
遠心分離器において再構成用容器に適用される相対遠心力は、乾燥アモルファス性沈殿タンパク質製剤の水性賦形剤中への部分的または完全な浸漬、かつ好ましくは再構成過程の促進を引き起こすのに十分となるよう必要なものである。重力（倍重力または×ｇ）の単位で表される相対遠心力（ＲＣＦ）は、遠心分離器のローター速度が増加するにつれて、増加する。多くの微量遠心分離器は、速度（分あたりの回転数、ＲＰＭ）に関して設定するのみで、相対遠心力に関しては設定しない。したがって、適切な設定が実験に使用されているのを確実とするために、変換式が必要である。ＲＰＭとＲＣＦとの間の関係は、以下の通りである；
ＲＣＦ＝（１．１１８×１０−５）ＲＳ２
ここで、ＲＣＦは、相対遠心力であり、Ｒは、ローターの半径（センチメートル（ｃｍ））であり、Ｓは、遠心分離器の速度（分当たりの回転数（ＲＰＭ））である。ＲＣＦの値は、倍重力（×ｇ）の単位で一般に値が付けられる。一例として、７ｃｍの半径を有するローターを有する微量遠心分離器で５，０００ＲＰＭにおける試料の遠心分離は、１，９５７×ｇの相体遠心分離力をもたらすことになる。
【００６３】
小スケールでは、適切な相体重力は、卓上型遠心分離器または微量遠心分離器などの実験室用遠心分離器中、再構成用容器を遠心分離にかけることにより、都合よく実現することができる。タンパク質を濃縮するためのより大きなスケールの工程の場合、デカンタ型遠心分離器などの工業用遠心分離器が使用されてもよい。本発明の方法による濃縮タンパク質溶液の再構成は、約１０×ｇ〜約１０，０００×ｇ、好ましくは約２５０×ｇ〜約５０００×ｇの相体遠心分離力で、遠心分離によりもたらすことができる。
【００６４】
再構成用容器が事前充てん型シリンジなどの独特な形状である場合、ローター内部でしっかりと保持されるよう、適切な挿入器が必要となることがある。こうした適切な挿入器の必要性、および調製は、熟練した製剤配合者の裁量の範囲内にある。あるいは、特注装置を使用して、再構成用容器に求心加速度を適用することができる。
【００６５】
本方法の適用に必要な遠心分離力は中程度であるため、バイアル、瓶、遠心分離管、およびシリンジを含む、多くのタイプの再構成用容器が使用に適している。好ましい再構成用容器は、バイアル、または事前充てん済みシリンジ、単一チャンバシリンジもしくは二重チャンバシリンジなどのシリンジなどの乾燥タンパク質製品用の充填仕上げプロトコルと両立できるものである。
【００６６】
滅菌製品の調製に関すると、滅菌再構成用容器内に封入されている滅菌乾燥タンパク質製剤に、滅菌水性賦形剤を無菌で添加するのが好ましい。
【００６７】
発泡がない／実質的に泡を含まない／発泡が最小限の、高濃度送達用の治療用乾燥アモルファス性沈殿タンパク質製剤を再構成するための単純な自動化方法を使用することができることは、医療従事者、または慢性状態を有する自己投与患者に対して大きな潜在的な利益をもらし、また本発明のさらなる態様である。再構成が完了するまで、バイアルまたはシリンジを断続的にかき混ぜる時間を消費しなければならないこと（すなわち、再現性よく実施するのが非常に困難であり、かつ不都合な発泡を潜在的に一部生成することが多い方法）よりもむしろ、患者または専門家が、提示されている製品の再構成の指針に従って、乾燥タンパク質製剤に水性賦形剤を単に加えて、バイアルまたはシリンジを所定の時間および特定の温度で、遠心分離器に入れることができる。警告信号を使用して、例えば再構成が完了していると、看護師、患者、または医師に警告を促すことができ、また遠心分離器から取り出す際には、高濃度タンパク質溶液は、例えば皮下注射により即座に投与する準備が整っている。好ましくは、遠心分離器は薬物の供給と共に提供され、また最も適切な条件を使用して再構成を実行するよう事前プログラム化がなされている。あるいは、多製品遠心分離器が、各製品に関してプログラム化されている、特有の遠心分離器再構成用プロトコルにより使用することができる。賦形剤は、自動化装置により乾燥タンパク質製剤に加えることもでき、また、最後の穏やかな混合ステップがやはり自動化されていてもよいことも予期される。これにより、完全な再構成過程を手作業による介入なしに行うことが可能になると思われる。
【００６８】
本発明の再構成方法は、非常に温度に敏感な分子の再構成に有利に使用することができる。したがって、温度制御可能な遠心分離器を使用すると、再構成を４℃などの低温で有利に実施することができる。これは、手動かき混ぜプロトコルを使用して実現するのが、非常に困難であると思われる。
【００６９】
上記方法により調製される乾燥アモルファス性沈殿タンパク質粒子製剤は、本発明の再構成方法を使用して、通常、高タンパク質濃度に迅速に再構成されて、透明な溶液をもたらすことができる。
【００７０】
さらなる態様によれば、本発明はやはり、本発明の再構成方法に従い、高い濃度または極めて高い濃度のタンパク質溶液に再構成するのに適した乾燥アモルファス性沈殿タンパク質粒子であって、乾燥アモルファス性沈殿タンパク質粒子は、本明細書に記載されている皮下投与に適した高い濃度のタンパク質溶液に再構成するための乾燥アモルファス性沈殿タンパク質製剤を調製する好ましい方法か、または上で実質的に記載した高い濃度のタンパク質溶液に再構成するのに適した乾燥アモルファス性沈殿タンパク質粒子の調製方法によるもののどちらか一方に従って調製される、タンパク質粒子を提供する。
【実施例】
【００７１】
以下の実施例は、本発明において使用するための方法および製剤の具体的な実施形態を例示したものであり、それらに関して限定する意図はない。
【実施例１】
【００７２】
高タンパク質濃度に再構成するための乾燥共沈殿タンパク質製剤の調製
【００７３】
共沈殿したタンパク質は、ＰｍＡｂ１（ヒト化モノクローナル抗体）、ＩｇＧ２Δアイソタイプ、およびＰｍＡｂ２（ヒトモノクローナル抗体）、ＩｇＧ２アイソタイプとした。
【００７４】
この実施例、および他の実施例において使用するための乾燥粉末タンパク質製剤は、表１に詳述されているタンパク質、スクロース、および他の添加物（緩衝液、安定化剤、および界面活性剤など）を含む水溶液から調製した。続いて、この水溶液に２０倍より多い体積の溶媒（イソブタノール（２−メチル−１−プロパノール））を組み合わせて、かつ速やかに混合することにより共沈殿させた。この水溶液および溶媒は、約２０℃の同じ温度とした。
【００７５】
回分の混合方法または連続流の混合方法のどちらかを使用して、水溶液と溶媒を一緒にすることができる。以下は、この実施例において乾燥共沈殿タンパク質製剤の調製に使用した回分法の代表例である。デュランフラスコ１２５ｍｌに必要な体積の溶媒（通常、６０ｍｌ）を入れた。ここに、４５ｍｍの磁気撹拌子を加えた。溶媒および撹拌子を含有するフラスコを磁気撹拌器の上部に置き、１５００ｒｐｍで撹拌した。タンパク質共沈殿剤／緩衝液／界面活性剤を含む水溶液（通常、３ｍｌ）を、渦の中心部に安定した滴下により溶媒に加えた。水溶液の添加終了後、半形成懸濁液を約１〜約５分間混合し、沈殿工程が完了するのを確実にした。
【００７６】
対応する連続流の沈殿法は、タンパク質被覆微結晶の調製に関して当分野において既に記載されている適切なインラインミキサーを使用し、ポンプ注入した水性混合物の液流とポンプ注入した２０倍超の水混和性有機溶媒流（例えば、イソブタノール）とを組み合わせることになる。
【００７７】
得られた沈殿タンパク質含有粒子の溶媒懸濁液を膜フィルターまたはフィルターチューブを使用して、バルク溶媒から単離した。ろ過した粒子は、室温で空気により乾燥するかまたは真空乾燥する、あるいは超臨界流体二酸化炭素による抽出により乾燥した。フィルターチューブにより、抽出により単離した、ろ過した粒子を乾燥するため、フィルターチューブをＴｈａｒ超臨界流体抽出用器具に移し、超臨界ＣＯ２を通常、２４ｇ／分のＣＯ２、１００ｂａｒ、４５℃で９０分、粉末に流し、次いで０．５ｂａｒ／１０秒の速度で除圧した。
【００７８】
乾燥後、粉末を膜フィルターおよびフィルターチューブから保管用バイアルに移した。必要な場合、ろ過ケーキを壊さないで、それ全体を注意深くバイアルに移してもよい。
【００７９】
表１は、代表的な乾燥粉末タンパク質製剤を共沈殿するために使用した水溶液の組成をまとめている。理論的な負荷量百分率は、溶媒中に溶解している界面活性剤、ポリソルベート２０（ＰＳ２０）およびＴｗｅｅｎ８０を除く水性混合物中の成分すべてが沈殿したと仮定することにより算出する。この実施例およびその後の実施例に関する測定されたタンパク質負荷量は、水溶液中に既知質量の粉末を溶解して、測定したＵＶ吸光度およびタンパク質に関するモル消光定数を使用することによりタンパク質濃度を測定することによって求めた。
【００８０】
【表１−１】
2015500869.tif 000003
【表１−２】
2015500869.tif 000004
結果の考察
【００８１】
スクロースの質量濃度よりも低いタンパク質の質量濃度を含む水溶液を使用する共沈殿による乾燥タンパク質製剤の調製は、粘質性ゲルまたは密着性ワックス粉末になることがわかった（製剤ＸＢ＿ＲＥＣＯＮ＿１８＿１、ＸＢ＿ＲＥＣＯＮ＿１８＿２、およびＸＢ＿ＲＥＣＯＮ＿１８＿３）。さらに、約３９％ｗ／ｗの理論タンパク質負荷量を有する製剤ＸＢ＿ＲＥＣＯＮ＿１８＿１は、この工程中、失われたタンパク質の質量の１／４を示す、約３０％の測定タンパク質負荷量を与えた。こうした損失は、製造過程において、持続可能ではないと思われる。これらの製剤の理論タンパク質負荷量は、ＷＯ２００４／０６２５６０Ａ２の２４頁に開示されている通り、タンパク質被覆微結晶を調製するのに好ましい範囲であると以前に報告されている１〜４０％ｗ／ｗの範囲にあった。これらの不良な結果は、当分野の教示に基づくと、スクロースがタンパク質の乾燥粉末製剤を調製するための共沈殿剤として適しているとは見なされない可能性があるという、本出願人の見解を支持している。実際に、本発明の前は、恐らく（上で記載されている）観察された挙動は、スクロースは溶媒中で沈殿および／または結晶化の速度が本質的に遅いことを示しているので、水混和性溶媒を使用するタンパク質粒子の共沈殿に対する好ましい添加剤と見なされていなかった。
【００８２】
表２に示される通り、本発明者らは、水溶液中のタンパク質の質量濃度が向上し、スクロース質量濃度よりも高い場合、スクロースおよびタンパク質の共沈殿を首尾よく実施することができ、かつ乾燥粉末は良好な収率で直接的に単離することができることを、今や驚くべきことに見いだした。表１に示されている、残存している沈殿タンパク質粒子製剤の測定タンパク質負荷量は、５４〜６５％ｗ／ｗの範囲にあり、理論タンパク質負荷量と類似している。恐らくは、試行実験において一般に使用されていると思われるものよりもかなり高いタンパク質濃度が必要となることが観察されているので、このスクロースに関する挙動の驚くべき変化は、以前には報告されていなかった。測定および理論負荷量の密接な相関は、タンパク質、スクロース、および添加剤の混合物が、一緒に共沈殿し、粒子を形成したことを示している。重大なことに、ＳＥＭ画像、および粉末Ｘ線回折（ＰＳＲＤ）により、これらの粒子が完全に、またはほとんど実質的にアモルファスであることが示されている。ＰＸＲＤトレースは、特徴のない幅広いピーク（ハロ）を示す一方、ＳＥＭは、粒子が１００ミクロン以下の直径を有する球状またはドーナツ状の形状であることを示している。したがって、それらは、結晶コアを含有し、通常、非球状で棒状または板状を形成する以前に開示されているタンパク質被覆微結晶とは明らかに異なっている。それにもかかわらず、実施例２において以下に実証されている通り、これらの高い負荷粒子内部に含有されているタンパク質は、９５％の水混和性プロトン性溶媒にさらされていても、完全性が非常に高く維持されていること、および凝集が最小限となることを依然として示している。重要なことには、タンパク質、スクロース、および添加剤を含む、乾燥アモルファス性沈殿粒子を含有しているこれらの粉末は、高いタンパク質濃度に再構成するのに非常に適していることがわかっている。
【００８３】
スクロースを含む高負荷乾燥アモルファス性沈殿タンパク質粒子を調製するこの新規な方法は、タンパク質を製剤化するための驚くべきかつ有利な経路を提供する。特に、上記方法は、高い濃度（実施例２に示されている、１２０ｍｇ／ｍｌ超、または２００ｍｇ／ｍｌ超のタンパク質など）でタンパク質を皮下投与するのに適した水溶液を形成するために再構成することができる、乾燥製剤を調製する魅力的な方法として使用することができる。
【実施例２】
【００８４】
高いタンパク質濃度への乾燥アモルファス性沈殿タンパク質製剤の再構成
【００８５】
スクロースを含むアモルファス性沈殿タンパク質粒子が高濃度に再構成され得るか、およびそうする際にそれらがタンパク質完全性を維持するかどうかを検討した。沈殿粒子は、実施例１において記載されている通り調製した。２０℃の温度において、表１に詳述されている様々な組成の水溶液を、２０倍を超える体積のイソブタノールと迅速に一緒にした。得られた混和性溶媒混合物の各々は、アモルファス性沈殿粒子の懸濁液を含有しており、続いて、この粒子は、超臨界二酸化炭素により溶媒混合物を抽出することにより乾燥すると、本発明の乾燥アモルファス性沈殿タンパク質製剤を与えた。次に、これらの製剤の各々は、約２００ｍｇ／ｍｌの標的濃度に再構成され、再構成時間、濁度、オスモル濃度およびモノマー含有量を測定した。
【００８６】
再構成はかき混ぜ再構成プロトコルを使用して実現し、この場合、賦形剤（脱イオン水）を加え、３０秒間待機した後、作業台の表面上にバイアルの底を維持して、バイアルを手により１０回かき混ぜた。５分ごとに、バイアルをさらに１０回手でかき混ぜた。オスモル濃度は、Ｇｏｎｏｔｅｃ  Ｏｓｍｏｍａｔ  ０３０を使用して、凝固点降下によって測定し、また、濁度は、Ｈａｃｈ  Ｌａｎｇｅ  ２１００  ＡＮ濁度測定器を使用して測定し、測定は両方とも当分野において公知の標準的方法に従って実施した。モノマー含有量および濁度の測定に関しては、溶液を１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度まで希釈した。モノマー含有量は、当分野で公知の方法に従って、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して測定した。結果を表２に示す。
【００８７】
【表２】
2015500869.tif 000005
【００８８】
ＰｍＡｂ１製剤は、およそ２００ｍｇ／ｍｌという高い標的濃度では、標準的なかき混ぜ方法を使用すると、アモルファス性沈殿タンパク質製剤を再構成するのに７２分を超える時間がかかることが分かり得る。したがって、この工程を完了するのに試料を一晩置いた。より有望なことに、約９７．９％〜約９８．６％の範囲の試料すべてについて、初期再構成が高い濃度までなされたことを考慮すると、一旦再構成すると、観察されるモノマー含有量は良好であった。同様に、観察された濁度は低く、目視可能な粒子の形成を示す証拠はないことを示していた。最後に、試料の１つを除いて、観察されたオスモル濃度は、約６００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇより低かったが、これは溶液が皮下注射に許容されるのに十分低い。
【００８９】
これらの結果は、タンパク質、スクロース、アルギニン、およびグルタミン酸またはラクトビオン酸のどちらかを含むアモルファス性沈殿粒子を含有している乾燥製剤のすべてについて、ＰｍＡｂ１（タンパク質）は、沈殿、超臨界流体乾燥、および高濃縮物への再構成という全体のサイクルの間、良好な完全性を維持していることを実証している。類似した結果は、ＰｍＡｂ２製剤について得られた。そのようにして生成した溶液は、確かに、皮下投与に適している可能性はあるが、それらの再構成時間は、多くの市販製品にとって、長すぎる可能性が高い。
【実施例３】
【００９０】
再構成済み沈殿粒子から調製した濃縮タンパク質溶液の注射可能性およびオスモル濃度
【００９１】
本発明の方法により調製されるアモルファス性沈殿タンパク質粒子の皮下投与に対する適合性は、それらの滑り力およびオスモル濃度を測定することにより求めた。沈殿粒子は、実施例１に記載されている通り調製した。表１に示されている組成物の水溶液を、２０℃の温度で２０倍を超える体積の溶媒（イソブタノール）と迅速に一緒にした。得られた混和性溶媒混合物は、超臨界二酸化炭素により溶媒混合物を抽出することにより乾燥したアモルファス性沈殿粒子の懸濁液を含有していた。各組成物に関すると、測定したタンパク質負荷量（ＭＰＬ）（実施例１を参照されたい）は、理論タンパク質負荷量（ＴＰＬ）と密接に対応していることが見いだされ、沈殿粒子の組成は、元の水溶液中に存在している固体の組成と非常に類似していることを示していた。したがって、各粒子は、タンパク質、スクロース、アルギニン、およびグルタミン酸またはラクトビオン酸の混合物を含む。
【００９２】
Ｓｔａｂｌｅ  Ｍｉｃｒｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のテクスチャアナライザー（ＴＡ−ＸＴＰＬＵＳ）を使用し、共沈殿法により生成した乾燥アモルファス性タンパク質製剤の再構成の際に形成される溶液の注射可能性を評価した。このテクスチャアナライザーは、皮下用ニードルによるシリンジから特定のタンパク質溶液を押し出すのに必要な力、いわゆる滑り力を直接測定する。特定のタンパク質溶液と同様に、測定される滑り力は、使用されるシリンジ、ニードルの寸法、プランジャーが圧縮される温度および速度に依存することになる。
【００９３】
これらを一緒にしたパラメータにより、ニードルにより溶液を押し出す速度が求まる。これらのパラメータを固定することによって、同じ速度で同じニードルにより押し出した場合の、様々な溶液の注射可能性を比較することが可能となる。さらに、同じく固定された条件下で、既知の粘度の標準溶液について得られた滑り力を測定することにより、他の濃縮したタンパク質溶液に関して報告されている粘度データと比較することも可能である。
【００９４】
この実施例において滑り力測定を行うために使用した条件は、以下の通りであった。Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、Ｓ．Ａ．のＰｌａｓｔｉｐａｋ  １ｍＬシリンジ（３０９６０２）；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ２７Ｇ１／２ニードル（３００６３５）。この実施例において注射可能性の測定を行うために使用したテクスチャアナライザー条件は、以下の通りであった。３４５ｍｍ／分の押出速度；１７．５ｍｍの押出距離。これらのパラメータを使用して、体積３５０μｌの溶液を約３．６秒でシリンジから押し出した。したがって、約９７μｌ／ｓで２７Ｇニードルに溶液を通し、１０〜１５ｍｍの間で測定した平均力を滑り力として採用した。実験は約２０℃の温度で行った。
【００９５】
実施例２に記載されている、高い濃度のタンパク質溶液を作製するためのアモルファス性沈殿タンパク質粒子の様々な乾燥粉末製剤の再構成後に測定した滑り力は、表３に示されている。試料のタンパク質濃度およびオスモル濃度は、当分野で公知の方法により測定した。試料のオスモル濃度は、Ｇｏｎｏｔｅｃ  Ｏｓｍｏｍａｔ  ０３０および当分野で公知の標準測定技法を使用して、凝固点降下方法により測定した。
【００９６】
得られた結果は、溶液が約２００ｍｇ／ｍｌより高いタンパク質濃度、および約６００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ未満のオスモル濃度を有する、アモルファス性沈殿粒子の再構成により生成し得ることを実証している。
【００９７】
この結果はまた、本発明による乾燥アモルファス性沈殿粒子から調製かつ再構成した濃縮タンパク質溶液は、２０℃において１００μｌ／ｓの流量で、２７Ｇ１／２インチのニードルに通すと、１５Ｎよりもかなり低い滑り力を有する良好な注射可能性を示すことも示している。
【００９８】
【表３】
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【実施例４】
【００９９】
乾燥アモルファス性沈殿タンパク質製剤の再構成が、遠心分離方法を使用すると加速し得るかどうかの測定
【０１００】
実施例１に従い、調製および超臨界流体抽出により乾燥した乾燥アモルファス性沈殿タンパク質製剤ＸＢＣＥＮＲＥＣ１＿８２（表１）の試料は、当分野で公知の従来的なかき混ぜ方法または新規遠心分離方法のいずれかに従って再構成した。
【０１０１】
実験方法
タンパク質６２．８％ｗ／ｗを含む、乾燥沈殿製剤ＸＢＣＥＮＲＥＣ１＿８２は、同じ６ｍｌのガラス製凍結乾燥用バイアル中、２２℃の周囲温度で行った５つの同時再構成実験において試験した。各実験において、およそ同じ測定質量（３１８ｍｇ）の乾燥粉末およびおよそ同じ体積（７５０μｌ）の脱イオン水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｅｌｉｘ  １０  ｓｙｓｔｅｍから、＞１５ΜΩ）を使用した。
【０１０２】
バイアルＸＢ１Ａ、ＸＢ１Ｂ、およびＸＢ１Ｃのバイアル中で、乾燥粉末（上記）に水を加えた一方、バイアルＸＢ１ＤおよびＸＢ１Ｅでは、２７Ｇのニードルを備えたシリンジを使用して乾燥粉末の下に水を注射した。次に、バイアルＸＢ１ＡおよびＸＢ１Ｄを再構成工程の間、静置し、写真を定期的に撮影した。バイアルＸＢ１ＢおよびＸＢ１Ｅは、ＡＬＣ  Ｒｅｆｒｉｇｅｒａｔｅｄ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ＰＫ１３０Ｒ遠心分離器（Ｔ５３５、Ｐ５１０カップおよび４片のＦａｌｃｏｎチューブアダプターを備えた４倍型スイングアウトローター）に注意深く置き、２２℃の温度、２５００ｒｐｍで遠心分離にかけた。遠心分離中、バイアルの底を和らげるため、丸めた紙の栓をアダプターの底に置いた。バイアルに適用した相対遠心力は、約１０００×ｇと見積もった。１０分後、遠心分離器を停止し、バイアルＸＢ１ＢおよびＸＢ１Ｅを取り出し、写真を撮影した。賦形剤を加えた後、バイアルＸＢ１Ｃを静かに３０秒間静置し、次に手により１０回穏やかにかき混ぜた。十分な再構成が達成されるまで、この手による処理を５分ごとに繰り返した。図１に示される通り、１０分後にバイアルすべての写真を撮影した。
【０１０３】
図１は、それぞれＸＢ１ＡからＸＢ１Ｅの再構成溶を含むバイアルＡからＥを例示している。
【０１０４】
結果の考察
図１に例示した１０分後、本発明の方法に従って処理したバイアルＸＢ１ＢおよびＸＢ１Ｅは、光学的に透明な、泡を含まない濃縮タンパク質溶液を含有した。これにより、賦形剤をタンパク質に添加するか、タンパク質を賦形剤に添加する、本発明の方法を使用すると、泡を含まない溶液の再構成または提供の迅速さに有意な差がないことが確認された。図１にも例示されている通り、静置したバイアルＸＢ１ＡおよびＸＢ１Ｄは、目立った質量の不溶粉末を依然として含有していることが観察され、これにより、この再構成方法は、静置プロトコルを使用して、１０分の時点では、決して完全とは言えない状態であることが実証された。図１は、手によりかき混ぜたバイアルＸＢ１Ｃは、静置バイアルＸＢ１ＡおよびＸＢ１Ｄよりはるかに残存粉末が少ないが、この再構成方法は、１０分間で不完全とは言えない状態であること、およびやはり手の繰り返しによるかき混ぜプロトコルは、泡層をかなり発生させることを例示している。
【０１０５】
これらの結果は、本発明の再構成方法は、現在使用中の静止または手によるかき混ぜプロトコルのどちらかに対する再構成時間について有意な利点をもたらすことを実証している。
【０１０６】
一晩放置後、バイアルＸＢ１ＡおよびＸＢ１Ｂから一定分量を採取し、タンパク質濃度を測定した。この一定分量の相対組成物のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）測定を使用し、現在使用中の静止（静置）プロトコルに対する本発明の再構成方法のタンパク質完全性に対する効果を決定した。どちらかの方法により調製された試料間に、区別可能な差異は観察されなかった。
【０１０７】
これらの結果により、本発明の方法による、水性賦形剤による乾燥アモルファス性共沈殿タンパク質製剤の再構成は、驚くほどかつ有利により短時間の再構成時間をもたらして、静置または手によるかき混ぜプロトコルのいずれかよりも高いタンパク質濃度溶液が調製されるばかりでなく、単に溶液を静置するのと同じタンパク質完全性を与える、透明な泡を含まない溶液も生成することが確認される。
【実施例５】
【０１０８】
実施例２において記載されている方法に従って、４種の乾燥タンパク質製剤ＸＢＣＥＮＲＥＣ１＿８６＿１＋２〜ＸＢＣＥＮＲＥＣ１＿８６＿７＋８（表２）を調製し、超臨界流体抽出により乾燥した。手によるかき混ぜ再構成プロトコルまたは遠心分離器再構成プロトコルのいずれかにより、これらの乾燥粉末から＞２００ｍｇ／ｍｌの溶液を調製するのに必要な再構成時間の比較を行った。両方のプロトコルに、再構成用容器として、６ｍｌの透明ガラス製バイアル（Ｃｈｒｏｍａｃｏｌ、ｃｒｉｍｐ  ｔｏｐ、６−ＣＶ）を使用した。遠心分離器による再構成方法に関して、水性賦形剤（脱イオン水）をバイアル中の乾燥粉末に加え、次に、ＡＬＣ  Ｒｅｆｒｉｇｅｒａｔｅｄ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ＰＫ１３０Ｒ遠心分離器（Ｔ５３５、Ｐ５１０カップおよび４片のＦａｌｃｏｎチューブアダプターを備えた４倍型スイングアウトローター）に注意深く置き、２２℃の温度で、２５００ｒｐｍで遠心分離にかけた。遠心分離中、バイアルの底を和らげるため、丸めた紙の栓をアダプターの底に置いた。遠心分離器を停止して５分、１０分および１５分後、バイアルを注意深く取り出し、写真を撮影した。賦形剤の添加から、目視可能な粒子を含有していない完全な透明溶液を形成するまでの再構成時間を記録した。タンパク質濃度、オスモル濃度、濁度、およびモノマー含有量を、上で詳述した技法に従って各再構成溶液について測定し、表４にまとめている。
【０１０９】
【表４】
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【０１１０】
これらの結果は、本発明の遠心分離方法が、タンパク質、スクロース、および沈殿安定化添加物を含む、乾燥アモルファス性沈殿粒子の４種の異なる製剤を、非常に高い濃度（＞２００ｍｇ／ｍｌ）に再構成するためにかかった時間を有意に短縮することができることを実証している。遠心分離はまた、再構成の間、バブルまたは泡の形成を防止することも実証した。
【実施例６】
【０１１１】
遠心分離を使用する、アモルファス性沈殿タンパク質の乾燥粉末およびケーキの再構成
【０１１２】
製剤ＸＢＣＥＮＲＥＣ１＿８４（表１）のタンパク質溶液を再構成するのにかかった時間の比較を行い、ここでは、乾燥粉末の類似質量に関して、および圧縮乾燥粉末の類似質量を用いて、かき混ぜプロトコルおよび遠心分離器再構成プロトコルにより、前記溶液を実施例２の方法に従って調製し、自立乾燥ケーキを形成させた。使用した再構成手順は、実施例３と同じとした。再構成溶液を１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に希釈した後、濁度およびモノマー含有量を、当分野で公知の標準的方法により測定した。結果を表５に示している。試料のタンパク質濃度、濁度、およびモノマー含有量は、当分野で公知の方法により測定した。モノマー含有量は、試料を１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に希釈した後、サイズ排除クロマトグラフィーによって測定した。濁度も１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で測定した。
【０１１３】
沈殿に使用したＰｍＡｂ１の水溶液中のタンパク質のモノマー含有量は、９８．８％であった。
【０１１４】
【表５】
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【０１１５】
これらの結果は、乾燥粉末として、または乾燥ケーキとしてのどちらかで調製した乾燥タンパク質製剤を用いて、遠心分離再構成方法を有利に使用することができることを示している。
【実施例７】
【０１１６】
溶解タンパク質を含有している水性賦形剤への乾燥アモルファス性沈殿タンパク質製剤の再構成
【０１１７】
２つのバイアル（各々が、ＰｍＡｂ１の１２０ｍｇ／ｍｌ水溶液を７５０μｌ含有している）を調製し、その各々に、実施例２に記載した通り調製した乾燥粉末製剤ＸＢＣＥＮＲＥＣ１＿８４を２９３ｍｇ加えた。３０秒後、バイアルの１つを、作業台上にバイアルの底を維持しながら、手により１０回かき混ぜた。このかき混ぜを、粉末が再構成されるまで、５分ごとに繰り返した。第２のバイアルをＡＬＣ  Ｒｅｆｒｉｇｅｒａｔｅｄ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ＰＫ１３０Ｒ遠心分離器（Ｔ５３５、Ｐ５１６カップおよび４片のＦａｌｃｏｎチューブアダプターを備えた４倍型スイングアウトローター）に注意深く置き、２２℃の温度で、２５００ｒｐｍで遠心分離にかけた。再構成が完了するまで、各バイアルを５分ごとに目視評価した。１０分および１５分後に各バイアルの写真を撮影した。試料のタンパク質濃度、濁度、およびモノマー含有量を測定した。モノマー含有量は、試料を１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に希釈した後、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により測定した。試料を１０ｍｇ／ｍｌに希釈した後、濁度も測定した。沈殿を行うために使用した水溶液中のＰｍＡｂ１のモノマー含有量は、９８．８％であった。結果を表６に提示している。
【０１１８】
【表６】
2015500869.tif 000009
【０１１９】
この実験により、乾燥アモルファス性沈殿タンパク質製剤の、同じタンパク質の溶液への遠心分離器の補助による再構成を使用すると、３０分未満で、泡を含まないの非常に高いタンパク質濃度の溶液を生成することができることが実証されている。
【実施例８】
【０１２０】
タンパク質、スクロース、アルギニン、およびラクトビオン酸を含む、乾燥アモルファス性粒子の連続流による沈殿および乾燥。
【０１２１】
水溶液は、ＰｍＡｂ１を１２０ｍｇ／ｍｌ、スクロースを７０ｍｇ／ｍｌ、ラクトビオン酸を５．５ｍｇ／ｍｌ、アルギニンを２．７ｍｇ／ｍｌ、およびポリソルベート２０を０．２ｍｇ／ｍｌ含有している水溶液を調製した。
【０１２２】
水性ライン用５０５Ｌ低パルスヘッドおよび５２０ＲＥＨ  ４〜７ｂａｒを備えた２つのＷａｔｓｏｎ  Ｍａｒｌｏｗ５２０ＤＵポンプ、内径３．２ｍｍのシリコーン製管材とプラスチック製クロスピースミキサー（Ｋａｒｔｅｌｌからのもの）に連結した溶媒ライン用６０〜１００ｐｓｉヘッドからなる、連続流の共沈殿システムを使用し、沈殿粒子のバルク回分を連続流沈殿により生成した。水性タンパク質溶液を５０ｍＬ／分の流量でポンプ注入する一方、溶媒（イソブタノール）を９５０ｍｌ／分の流量でポンプ注入し、全流量１０００ｍＬ／分を得た。約２５０ｍＬの懸濁液が１５秒間の操作で生成した。最初の沈殿後、得られた懸濁液を磁気撹拌ユニットにより１分間混合し、沈殿工程を完了するのを確実にした。その後、懸濁液の一定分量６３ｍＬを４７ｍｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｄｕｒａｐｏｒｅ  ＰＶＤＦ膜（孔径０．４５μｍ）上でろ過し、６本の管による乾燥操作（ＳＣＦＥ容器間で均質な乾燥を確実なものとするために、ブランクとして２本の追加の管を含ませた）でＳＣＦＥ乾燥するため、１２ｍＬ／１．０μｍのろ過抽出用管に移送した。ＳＣＦＥ乾燥条件は、以下の通りとした：ＣＯ２流量２４ｇ／分；温度４５℃；圧力＝１００ｂａｒ；除圧速度＝０．５ｂａｒ／１０秒。
【０１２３】
４つの回分の粉末を生成して、乾燥後ブレンドし、合わせたＭＰＬ６１．６％ｗ／ｗを記録した。賦形剤７５０μＬを使用して、３２４．８ｍｇの粉末（ｍＡｂ２００ｍｇと等価）を再構成した。試料を２５００ｒｐｍで３０秒間、軸方向に回転し、次に従来の回転軸において、４０００ｒｐｍ（２６８３ＣＦ）で９．５分間回転した。
【０１２４】
再構成時間は１０分間と測定され、測定濃度は２３２ｍｇ／ｍＬであり、測定オスモル濃度は、２００ｍｇ／ｍｌにおいて５９１ｍＯｓｍ／ｋｇであり、またモノマー含有量は９８．１５％であった。ストック物質のモノマー含有量は、９８．８７％と測定された。
【０１２５】
これらの結果は、タンパク質、スクロース、および保護添加物を含む乾燥アモルファス性沈殿粒子を調製する連続方法と、前記粒子の非常に高い濃度への迅速な再構成方法との本発明による組合せを使用し、非常に高い濃度で、タンパク質を非経口送達するのに適した溶液をもたらすことができることを実証している。
【図１】
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【国際調査報告】
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2015500869.tif 000012