(57)【要約】本発明は、インビトロで線毛を形成するための方法、およびこれら方法において使用するのに適したタンパク質を提供する。本発明はまた、これら方法によって生成される線毛および細菌疾患の（特に、連鎖球菌属によって引き起こされる状態の）処置および予防のためのこれら線毛を含む組成物を提供する。一局面において、少なくとも２つの部分を連結するための方法が提供され、この方法は、インビトロでこの少なくとも２つの部分と線毛関連ソルターゼＣ酵素とを、ソルターゼ媒介性ペプチド転移反応が起こるのに適した条件下で接触させる工程を包含し、ここでこの線毛関連ソルターゼＣ酵素は、露出した活性部位を含む。
2015509713.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの部分を連結するための方法であって、該方法は、インビトロで該少なくとも２つの部分と線毛関連ソルターゼＣ酵素とを、ソルターゼ媒介性ペプチド転移反応が起こるのに適した条件下で接触させる工程を包含し、ここで該線毛関連ソルターゼＣ酵素は、露出した活性部位を含む、方法。
【請求項２】
前記線毛関連ソルターゼＣ酵素は、連鎖球菌属に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記連鎖球菌属が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（ＧＢＳ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ（肺炎球菌）およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＧＡＳ）からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記線毛関連ソルターゼＣ酵素は、ソルターゼＣ１酵素（ｓｒｔＣ１）、ソルターゼＣ２酵素（ＳｒｔＣ２）もしくはソルターゼＣ３酵素（ＳｒｔＣ３）である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記線毛関連ソルターゼＣ酵素の変異は、ｌｉｄの一部もしくは全ての欠失を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記変異は、ＰＩ−２ａのＧＢＳソルターゼＣ１酵素のアミノ酸配列（配列番号３）の８４位、８５位および／もしくは８６位におけるアミノ酸の欠失、または別の線毛関連ソルターゼＣ酵素のアミノ酸配列の対応する位置におけるアミノ酸の欠失を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記変異は、ＰＩ−２ａのＧＢＳソルターゼＣ１酵素のアミノ酸配列（配列番号３）の８４位、８５位および／もしくは８６位におけるアミノ酸の置換、または別のソルターゼＣ酵素のアミノ酸配列の対応する位置におけるアミノ酸の置換を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記線毛関連ソルターゼＣ酵素は、配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０および７１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、または該アミノ酸配列からなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも２つの部分は、ＬＰｘＴＧモチーフおよびピリンモチーフを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも２つの部分は、グラム陽性細菌由来である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも２つの部分は、同じグラム陽性細菌由来であるか、または異なるグラム陽性細菌由来である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも２つの部分は、連鎖球菌ポリペプチドである、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも２つの部分は、連鎖球菌骨格タンパク質および／もしくは付属タンパク質である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも２つの部分は、（ａ）配列番号７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、もしくは９７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して、５０％またはそれより高い同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有するか；または（ｂ）これら配列のうちの１つの少なくとも「ｎ」個連続するアミノ酸のフラグメントであって、ここで「ｎ」は、２０またはそれより大きい（例えば、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０もしくはそれより大きい；例えば、２０もしくはそれより大きい；または例えば、５０もしくはそれより大きい；または例えば、８０もしくはそれより大きい）であるものである、アミノ酸配列を含むかまたは該アミノ酸配列からなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法から得られたかもしくは得ることができる、人工線毛。
【請求項１６】
骨格タンパク質ＧＢＳ５９の少なくとも２つの改変体を含む人工線毛であって、該少なくとも２つの改変体が、Ｂ群連鎖球菌株２６０３、Ｈ３６Ｂ、５１５、ＣＪＢ１１１、ＣＪＢ１１０およびＤＫ２１からなる群より選択される、人工線毛。
【請求項１７】
医療において使用するための、請求項１５または１６に記載の人工線毛。
【請求項１８】
連鎖球菌感染を予防もしくは処置することにおいて使用するための、請求項１５または１６に記載の人工線毛。
【請求項１９】
連鎖球菌感染の処置もしくは予防を必要とする患者において連鎖球菌感染を処置もしくは予防するための方法であって、該方法は、有効量の請求項１５または１６に記載の人工線毛を該患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２０】
少なくとも２つの部分が、Ｘが任意のアミノ酸であるアミノ酸モチーフＬＰＸＴＧを含む第１の部分と、少なくとも１個のアミノ酸を含む第２の部分とを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１の部分は、第１のポリペプチドであり、前記第２の部分は、第２のポリペプチドである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドは、グラム陽性細菌由来である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドは、同じグラム陽性細菌由来であるか、または異なるグラム陽性細菌由来である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドは、連鎖球菌ポリペプチドである、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドは、連鎖球菌骨格タンパク質および／もしくは付属タンパク質である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１の部分もしくは前記第２の部分のいずれかが、検出可能な標識を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記検出可能な標識は、蛍光標識、放射性標識、化学発光標識、リン光標識、ビオチン標識、もしくはストレプトアビジン標識である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１の部分もしくは前記第２の部分のいずれかは、ポリペプチドであり、他の部分は、細胞表面上のタンパク質もしくは糖タンパク質である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１の部分もしくは前記第２の部分のいずれかは、ポリペプチドであり、他の部分は、固体支持体に結合体化されたアミノ酸を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１の部分もしくは前記第２の部分のいずれかは、ポリペプチドであり、他の部分は、ポリヌクレオチドに結合体化された少なくとも１個のアミノ酸を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１の部分もしくは前記第２の部分は、ポリペプチド鎖のＮ末端およびＣ末端であり、連結は、環状ポリペプチドの形成を生じる、請求項２０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ピリンモチーフは、アミノ酸ＹＰＡＮを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項３３】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ由来のＰＩ−２ｂソルターゼＣ１もしくはＰＩ−２ｂソルターゼＣ２酵素と、Ｘが任意のアミノ酸であるアミノ酸モチーフＬＰＸＴＧを含む部分とを含む、キット。
【請求項３４】
請求項２０〜３１のいずれか１項に記載の方法から得られたかもしくは得ることができる、結合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、線毛をインビトロで形成するための方法、ならびにこれら方法における使用に適した変異型ソルターゼ酵素およびタンパク質を提供する。本発明はまた、これら方法によって生成される線毛、ならびに細菌性疾患の、特に、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓによって引き起こされる状態の処置および予防のために、これら線毛を含む組成物を提供する。本発明はまた、タンパク質を連結するための一般的方法および上記方法における使用のためのソルターゼ酵素を提供する。
【背景技術】
【０００２】
大部分の細菌性病原体は、それらの表面から延び、宿主コロニー形成の間に組織への細菌の最初の接着をしばしば担う、長い線維状の構造物である線毛（ｐｉｌｉ）（線毛（ｆｉｍｂｒａｅ）としても公知）を含む。グラム陰性細菌は、長年にわたって、ピリンサブユニット間の非共有結合的相互作用によって代表的には形成される線毛を有することが公知であった。より近年になって、グラム陽性細菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細菌が挙げられる）も、線毛特異的病原性アイランド（ｐｉｌｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｉｓｌａｎｄ）によってコードされるソルターゼによるサブユニットの共有結合を通じて、代表的には形成される線毛を有することを示した。
【０００３】
グラム陽性細菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（もしくは「Ｂ群連鎖球菌」、「ＧＢＳ」と略記）は、例えば、３つの線毛改変体（各々、別個の病原性アイランド（ＰＩ−１、ＰＩ−２ａもしくはＰＩ−２ｂ）によってコードされる）を有する［１，２］。各病原性アイランドは、ｉ）線毛の３つの構造成分（線毛骨格タンパク質（ＢＰ））および２つの付属タンパク質（ＡＰ１およびＡＰ２）をコードする遺伝子；ならびにｉｉ）線毛のアセンブリに関与する２つのソルターゼタンパク質（ＳｒｔＣ１およびＳｒｔＣ２）をコードする遺伝子、からなる。全てのＧＢＳ株は、これら３つの病原性アイランドのうちの少なくとも１つを有する。
【０００４】
類似の病原性アイランドは、他のグラム陽性細菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓもしくは「Ａ群連鎖球菌」（「ＧＡＳ」と略記）、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎球菌としても公知）を含む）にも存在する。肺炎球菌の病原性アイランドは、線毛の３つの構造成分（ＲｒｇＡ、ＲｒｇＢおよびＲｒｇＣ）ならびに線毛形成を触媒する３つのソルターゼ（ＳｒｔＣ１、ＳｒｔＣ２およびＳｒｔＣ３）をコードする。ＧＡＳにおいて、上記ＦＣＴ領域は、上記骨格タンパク質およびアクセサリータンパク質をコードし、これらタンパク質の重合はまた、ソルターゼ（ＳｒｔＣ１）によって媒介される。
【０００５】
これらグラム陽性細菌における線毛構造は、興味深いワクチン候補であると考えられており、線毛構造物に由来する精製組換えタンパク質の免疫原性を評価することに関する研究が行われてきた。アセンブリされた線毛内でそれらの天然形態にあるこれらタンパク質を研究することもまた望ましいが、現在、これを行う唯一の方法は、細菌から野生型線毛を精製するという骨の折れるプロセスによるものである。従って、本発明の１つの目的は、野生型線毛を精製する必要なく、組換え線毛をインビトロで生成するためのプロセスを提供することである。
【０００６】
上記で考察される連鎖球菌は、重篤な疾患と関連している。ＧＢＳは、菌血症、ならびに免疫不全個体および新生児における髄膜炎の原因である。ＧＡＳは、よくあるヒトの病原体であり、疾患の徴候がない正常なヒトのうちの５〜１５％の間で存在すると概算される。しかし、宿主防御が不全である場合もしくはＧＡＳが無防備な組織もしくは宿主に導入される場合、急性感染が起こる。ＧＡＳによって引き起こされる疾患としては、産褥熱、猩紅熱、丹毒、咽頭炎、膿痂疹、壊死性筋膜炎、筋炎および連鎖球菌中毒性ショック症候群が挙げられる。肺炎球菌は、成人および５歳より上の小児における急性細菌性髄膜炎の最も一般的な原因である。
【０００７】
これら連鎖球菌に対するタンパク質ベースのワクチンの開発に向けて研究が行われてきたが、現在、タンパク質ベースのワクチンは市販されていない。従って、連鎖球菌感染に対して有効なワクチンが未だに必要である。本発明のさらなる目的は、連鎖球菌感染に対するワクチンの開発において使用され得る免疫原性組成物を提供することである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｒｏｓｉｎｉら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００６）６１（１）：１２６〜１４１
【非特許文献２】Ｍａｒｇａｒｉｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（２００９）１９９：１０８〜１１５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
第１の局面において、本発明は、少なくとも２つの部分を連結するための方法を提供し、上記方法は、上記少なくとも２つの部分と、線毛関連ソルターゼＣ酵素とをインビトロで、ソルターゼ媒介性ペプチド転移反応が起こるのに適した条件下で接触させる工程を包含し、ここで上記線毛関連ソルターゼＣ酵素は、露出した活性部位を含む。
【００１０】
詳細には、上記線毛関連ソルターゼＣ酵素は、連鎖球菌属に由来し、より詳細には、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（ＧＢＳ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ（肺炎球菌）およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＧＡＳ）由来である。さらにより詳細には、上記線毛関連ソルターゼＣ酵素は、ソルターゼＣ１酵素（ｓｒｔＣ１）、ソルターゼＣ２酵素（ＳｒｔＣ２）もしくはソルターゼＣ３酵素（ＳｒｔＣ３）である。
【００１１】
特定の実施形態において、上記線毛関連ソルターゼＣ酵素の変異は、ｌｉｄの一部もしくは全ての欠失を含む。詳細には、上記変異は、ＰＩ−２ａのＧＢＳソルターゼＣ１酵素のアミノ酸配列（配列番号３）の８４位、８５位および／もしくは８６位にあるアミノ酸の欠失、または別の線毛関連ソルターゼＣ酵素のアミノ酸配列の対応する位置にあるアミノ酸の欠失を含む。
【００１２】
他の実施形態において、上記変異は、ＰＩ−２ａのＧＢＳソルターゼＣ１酵素のアミノ酸配列（配列番号３）の８４位、８５位および／もしくは８６位にあるアミノ酸の置換、または別のソルターゼＣ酵素のアミノ酸配列の対応する位置にあるアミノ酸の置換を含む。
【００１３】
詳細には、上記線毛関連ソルターゼＣ酵素は、配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０および７１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなる。
【００１４】
本発明の一実施形態において、上記方法は、組換え線毛もしくは人工線毛をインビトロで形成するための方法である。この、上記少なくとも２つの部分は、ＬＰｘＴＧモチーフおよびピリンモチーフを含む。例えば、上記ピリンモチーフは、アミノ酸ＹＰＡＮを含み得る。本明細書で開示される任意のソルターゼ認識モチーフにおける「Ｘ」は、任意の標準アミノ酸もしくは非標準アミノ酸であり得、あらゆるバリエーションが開示される。いくつかの実施形態において、Ｘは、生体において見いだされるタンパク質で最も一般に見いだされる２０種の標準アミノ酸から選択される。上記認識モチーフがＬＰＸＴＧもしくはＬＰＸＴである場合、Ｘは、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｎ、Ｑ、Ｋ、もしくはＲであり得る。特に、Ｘは、ＬＰＸＴＧもしくはＬＰＸＴモチーフにおいてＫ、Ｓ、Ｅ、Ｌ、Ａ、Ｎから選択される。
【００１５】
詳細には、上記少なくとも２つの部分は、グラム陽性細菌由来である。上記少なくとも２つの部分は、グラム陽性細菌の同じ株もしくはタイプに由来してもよいし、グラム陽性細菌の異なる株もしくはタイプに由来してもよい。さらにより詳細には、上記少なくとも２つの部分は、連鎖球菌ポリペプチドである。なおさらにより詳細には、上記少なくとも２つの部分は、連鎖球菌骨格タンパク質および／もしくは付属タンパク質である。
【００１６】
例えば、上記少なくとも２つの部分は、（ａ）配列番号７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、もしくは９７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して、５０％またはそれより高い同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有するか；または（ｂ）これら配列のうちの１つの少なくとも「ｎ」個連続したアミノ酸のフラグメントであって、ここで「ｎ」は、２０またはそれより大きい（例えば、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０もしくはそれより大きい；例えば、２０もしくはそれより大きい；または例えば、５０もしくはそれより大きい；または例えば、８０もしくはそれより大きい）であるフラグメントである、アミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなる。
【００１７】
本発明の他の局面において、前述の方法から得られたかもしくは得ることができる人工線毛もしくは組換え線毛が提供される。一実施形態において、骨格タンパク質ＧＢＳ５９の少なくとも２つの改変体を含む、人工線毛もしくは組換え線毛が提供される。詳細には、上記少なくとも２つの改変体は、Ｂ群連鎖球菌株２６０３、Ｈ３６Ｂ、５１５、ＣＪＢ１１１、ＣＪＢ１１０およびＤＫ２１から選択される。さらにより詳細には、上記人工線毛もしくは組換え線毛は、連鎖球菌株２６０３、Ｈ３６Ｂ、５１５、ＣＪＢ１１１、ＣＪＢ１１０およびＤＫ２１から選択されるＧＢＳ骨格タンパク質ＧＢＳ５９の少なくとも１つの改変体、ならびにＲｒｇＡ、ＲｒｇＢおよびＲｒｇＣからなる群より選択されるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ由来の少なくとも１つの骨格タンパク質を含むキメラ線毛である。他の実施形態において、人工線毛もしくは組換え線毛は、ＧＢＳ８０および／もしくはＧＢＳ１５２３をさらに含む。
【００１８】
本発明の詳細な局面において、上記人工線毛もしくは組換え線毛は、医療に使用するためのものであり、さらにより詳細には、連鎖球菌感染を予防もしくは処置することにおいて使用するためのものである。従って、別の実施形態において、連鎖球菌感染の処置もしくは予防を必要とする患者において連鎖球菌感染を処置もしくは予防するための方法が提供され、上記方法は、有効量の、本発明の方法によって形成された人工線毛もしくは組換え線毛を患者に投与する工程を包含する。
【００１９】
本発明の第２の局面において、上記少なくとも２つの部分は、アミノ酸モチーフＬＰＸＴＧを含む第１の部分（ここでＸは、任意のアミノ酸である）、および少なくとも１個のアミノ酸を含む第２の部分を含む方法が提供される。
【００２０】
詳細には、上記第１の部分は、第１のポリペプチドであり、上記第２の部分は、第２のポリペプチドである。特定の実施形態において、上記第１のポリペプチドおよび上記第２のポリペプチドは、グラム陽性細菌由来である。例えば、上記第１のポリペプチドおよび上記第２のポリペプチドは、グラム陽性細菌の同じタイプもしくは株由来であってもよいし、グラム陽性細菌の異なるタイプもしくは株に由来してもよい。いくつかの実施形態において、上記第１のポリペプチドおよび上記第２のポリペプチドは、連鎖球菌ポリペプチドである。例えば、上記第１のポリペプチドおよび上記第２のポリペプチドは、連鎖球菌骨格タンパク質および／もしくは付属タンパク質であり得る。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態において、上記第１の部分もしくは上記第２の部分のいずれかは、検出可能な標識を含む。非限定的例によれば、上記検出可能な標識は、蛍光標識、放射性標識、化学発光標識、リン光標識、ビオチン標識、もしくはストレプトアビジン標識であり得る。いくつかの実施形態において、上記第１の部分もしくは上記第２の部分は、ポリペプチドであり得、他の部分は、細胞表面上のタンパク質もしくは糖タンパク質であり得る。なおさらなる実施形態において、上記第１の部分もしくは上記第２の部分のいずれかは、ポリペプチドであり、他の部分は、固体支持体に結合体化されたアミノ酸を含む。まだなおさらなる実施形態において、上記第１の部分もしくは上記第２の部分のいずれかは、ポリペプチドであり、他の部分は、ポリヌクレオチドに結合体化された少なくとも１個のアミノ酸を含む。
【００２２】
本発明の方法は、第１の部分のＮ末端を第２の部分のＮ末端に連結するために使用され得る。本発明の方法は、第１の部分のＣ末端を第２の部分のＣ末端に連結するために使用され得る。あるいは、上記第１の部分および上記第２の部分は、ポリペプチド鎖のような部分のＮ末端およびＣ末端であり、連結は、環状ポリペプチドの形成を生じる。従って、本明細書で記載される方法から得られたかもしくは得ることができる結合体が提供される。
【００２３】
本発明の他の局面において、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ由来のソルターゼＣ１もしくはソルターゼＣ２酵素、およびアミノ酸モチーフＬＰＸＴＧを含む部分（ここでＸは、任意のアミノ酸である）を含むキットが提供される。
本発明の別の局面において、そのｌｉｄ領域に変異を含む連鎖球菌属由来のソルターゼＣ酵素、詳細には、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（ＧＢＳ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ（肺炎球菌）もしくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＧＡＳ）に由来する、連鎖球菌属由来のソルターゼＣ酵素が提供される。さらにより詳細には、連鎖球菌属由来のソルターゼＣ酵素は、ソルターゼＣ１酵素、ソルターゼＣ２酵素もしくはソルターゼＣ３酵素である。特定の実施形態において、連鎖球菌属由来のソルターゼＣ酵素が提供される（ここで上記変異は、上記ソルターゼＣ酵素のｌｉｄ領域の一部もしくは全ての欠失を含む）。詳細には、上記変異は、ＰＩ−２ａのＧＢＳソルターゼＣ１酵素のアミノ酸配列（配列番号３）の８４位、８５位および／もしくは８６位にあるアミノ酸の欠失、または別のソルターゼＣ酵素のアミノ酸配列の対応する位置にあるアミノ酸の欠失を含む。他の実施形態において、連鎖球菌属由来のソルターゼＣ酵素（ここで上記変異は、ＰＩ−２ａのＧＢＳソルターゼＣ１酵素のアミノ酸配列（配列番号３）の８４位、８５位および／もしくは８６位にあるアミノ酸の置換、または別のソルターゼＣ酵素のアミノ酸配列の対応する位置にあるアミノ酸の置換を含む）が提供される。
【００２４】
詳細には、そのｌｉｄ領域において変異を含み、上記ソルターゼＣ酵素が、配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０もしくは７１から選択されるアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなる、連鎖球菌属由来のソルターゼＣ酵素が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１−１】ＧＢＳソルターゼＣ配列のアラインメント（ｌｉｄ領域の位置は、太字および下線を付して示す）。
【図１−２】ＧＢＳソルターゼＣ配列のアラインメント（ｌｉｄ領域の位置は、太字および下線を付して示す）。
【図１−３】ＧＢＳソルターゼＣ配列のアラインメント（ｌｉｄ領域の位置は、太字および下線を付して示す）。
【図１−４】ＧＢＳソルターゼＣ配列のアラインメント（ｌｉｄ領域の位置は、太字および下線を付して示す）。
【図１−５】ＧＢＳソルターゼＣ配列のアラインメント（ｌｉｄ領域の位置は、太字および下線を付して示す）。
【図１−６】ＧＢＳソルターゼＣ配列のアラインメント（ｌｉｄ領域の位置は、太字および下線を付して示す）。
【図１−７】ＧＢＳソルターゼＣ配列のアラインメント（ｌｉｄ領域の位置は、太字および下線を付して示す）。
【図２−１】Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＧＡＳ）のソルターゼＣ配列のアラインメント（ｌｉｄ領域の位置は、太字および下線を付して示す）。
【図２−２】Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＧＡＳ）のソルターゼＣ配列のアラインメント（ｌｉｄ領域の位置は、太字および下線を付して示す）。
【図３】Ａ：ＧＢＳ線毛２ａの骨格タンパク質（ＢＰ−２ａ）、ＧＢＳ５９（株５１５、ＴＩＧＲ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  ＳＡＬ＿１４８６）において同定された保存されたアミノ酸モチーフ。ピリンモチーフ：高度に保存されたリジン残基（Ｌｙｓ１８９）を含む；Ｅ−ｂｏｘ：高度に保存されたグルタミン酸残基（Ｇｌｕ５８９）を含む；ソーティングシグナル：６４１〜６４６位に位置した残基ＩＰＱＴＧＧを含む。Ｂ：ＧＢＳ線毛２ａの骨格タンパク質を認識する抗体（α−ＢＰ）で行ったイムノブロット（ＢＰ−２ａの上記ピリンモチーフのＬｙｓ１８９が、野生型ソルターゼＣによる線毛重合に必要とされることを示す）。Ｌｙｓ１８９においてＡｌａでの置換を有する変異型ＢＰ−２ａ（ＢＰＫ１８９Ａ）をコードするプラスミドを生成した。骨格タンパク質を欠いているＧＢＳ変異体株（ＧＢＳΔＢＰ）を、このプラスミド（レーン２）、もしくは野生型ＢＰ−２ａ（ＢＰＷＴ）をコードするコントロールプラスミド（レーン１）で形質転換した。＊は、モノマーの重合していないＢＰ−２ａタンパク質に対応するタンパク質バンドの位置を示す。高分子量タンパク質バンド（重合したＢＰ−２ａに対応）は、野生型ＢＰ−２ａをコードするプラスミドで形質転換したＧＢＳの細胞抽出物においてのみ検出可能である（レーン１）。Ｃ：ＧＢＳ線毛２ａの骨格タンパク質を認識する抗体（α−ＢＰ）（レーン１、２および３）もしくはＧＢＳ線毛２ａの付属タンパク質を認識する抗体（α−ＡＰ１）（レーン４および５）で行ったイムノブロット（ＢＰ−２ａのＩＰＱＴＧモチーフが線毛重合に必要とされることを示す）。ＩＰＱＴＧソーティングシグナルの欠失を有する変異型ＢＰ−２ａ（ＢＰΔＩＰＱＴＧ）をコードするプラスミドを生成した。骨格タンパク質を欠いているＧＢＳ変異体株（ＧＢＳΔＢＰ）を、このプラスミドで形質転換した（レーン３および４）。コントロールとして、野生型ＢＰ−２ａ（ＢＰＷＴ）をコードするコントロールプラスミド（レーン１）、またはプラスミドなし（ΔＢＰ）（レーン２および５）を使用した。＊は、モノマーの重合していないＢＰ−２ａタンパク質に対応するタンパク質バンドの位置を示す。三角は、モノマーＡＰ１タンパク質に対応するタンパク質バンドを示す。ボックスは、ＢＰ−２ａ−ＡＰ１結合体に対応するタンパク質バンドを示す。重合したＢＰ−２ａに対応する高分子量タンパク質バンドは、野生型ＢＰ−２ａをコードするプラスミドで形質転換されたＧＢＳの細胞抽出物でのみ検出可能である。
【図４】Ａ：野生型ＧＢＳソルターゼが野生型骨格タンパク質のインビトロでの重合を触媒しないことを示すタンパク質ゲル。種々の濃度（２５μＭ、１００μＭおよび２００μＭ）の組換え骨格タンパク質（ＢＰ）を、３７℃で、ＰＩ−２ａの野生型ソルターゼＣ１（ＳｒｔＣ１ＷＴ）とともに、０時間、２４時間および４８時間にわたってインキュベートした。上記反応混合物に含まれるタンパク質を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離し、可視化した。重合したＢＰに対応する高分子量バンドの形成は、検出不能であった。＊は、モノマーＢＰを示す。＃は、ＳｒｔＣ１ＷＴを示す。レーン１：ＢＰ  ２５μＭ＋ＳｒｔＣ１ＷＴ  ｔ０、レーン２：ＢＰ  ２５μＭ＋ＳｒｔＣ１ＷＴ  ｔ２４ｈ、レーン３：ＢＰ  ２５μＭ＋ＳｒｔＣ１ＷＴ  ｔ４８ｈ；レーン４：ＢＰ  １００μＭ＋ＳｒｔＣ１ＷＴ  ｔ０、レーン５：ＢＰ  １００μＭ＋ＳｒｔＣ１ＷＴ  ｔ２４、レーン６：ＢＰ  １００μＭ＋ＳｒｔＣ１ＷＴ  ｔ４８ｈ；レーン７：ＢＰ  ２００μＭ＋ＳｒｔＣ１ＷＴ  ｔ０、レーン８：ＢＰ  ２００μＭ＋ＳｒｔＣ１ＷＴ  ｔ２４。Ｂ：野生型骨格タンパク質（ＢＰ）が触媒性ソルターゼ活性の非存在下でＢＰ−ＢＰホモダイマーを形成し得ることを示す（このことは、パネルＡにおいて認められるさらなるバンドを説明する）タンパク質ゲル。種々の濃度（２５μＭおよび１００μＭ）の組換えＢＰを、０時間、２４時間、４８時間および７２時間にわたってインキュベートし、上記反応混合物に含まれるタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって可視化した。レーン１：ＢＰ  ２５μＭ  ｔ０ｈ、レーン２：ＢＰ  ２５μＭ  ｔ２４ｈ、レーン３：ＢＰ  ２５μＭ  ｔ４８ｈ、レーン４：ＢＰ  ２５μＭ  ｔ７２；レーン５：ＢＰ  １００μＭ  ｔ０ｈ、レーン６：ＢＰ  １００μＭ  ｔ２４ｈ、レーン７：ＢＰ  １００μＭ  ｔ４８ｈ、レーン８：ＢＰ  １００μＭ  ｔ７２ｈ。
【図５−１】Ａ：ｌｉｄ領域において変異を有する変異型ＧＢＳソルターゼが、野生型骨格タンパク質（ＢＰ）のインビトロでの重合を触媒し得ることを示すタンパク質ゲル。種々の濃度（１００μＭおよび２００μＭ）の組換えＢＰを、８６位においてチロシンからアラニンへの置換を有するＰＩ−２ａの変異型ソルターゼＣ１（ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ）とともに、０時間、２４時間もしくは４８時間にわたってインキュベートし、上記反応混合物に含まれるタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって可視化した。＊は、モノマーＢＰを示す。重合したＢＰに対応する高分子量バンド（≧２６０ｋＤａ）は、２４時間もしくは４８時間のインキュベーション後に検出可能であった。レーン１：ＢＰ  １００μＭ＋ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ  ｔ０ｈ、レーン２：ＢＰ  １００μＭ＋ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ  ｔ２４ｈ、レーン３：ＢＰ  １００μＭ＋ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ  ｔ４８ｈ；レーン４：ＢＰ  ２００μＭ＋ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ  ｔ０ｈ、レーン５：ＢＰ  ２００μＭ＋ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ  ｔ２４ｈ。Ｂ：重合したＢＰのパターンが野生型細菌（ここではＧＢＳ株５１５）由来の線毛に含まれるＢＰポリマーに類似することを示す、ＧＢＳ線毛２ａの骨格タンパク質を認識する抗体（αＢＰ）で行ったイムノブロット。＊は、モノマーＢＰを示す。レーン１：ＢＰ、レーン２：ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ、レーン３：ＢＰ＋ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ、レーン４：ＧＢＳ５１５野生型線毛。Ｃ：ＢＰ重合の効率に対する種々の濃度のＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａの効果を示すタンパク質ゲル。１０μＭ、５０μＭもしくは１００μＭのＳｒｔＣ１Ｙ８６ＡをＢＰと混合し、０時間、４８時間、３日間および４日間にわたってインキュベートし、上記反応混合物に含まれるタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって可視化した。＊は、モノマーＢＰを示す。Ｄ：ＢＰ重合の効率に対する種々の濃度のＢＰの効果を示すタンパク質ゲル。２５μＭ、５０μＭもしくは１００μＭのＢＰを、２５μＭのＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａと混合し、０時間、３日間、５日間および７日間にわたってインキュベートし、上記反応混合物に含まれるタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって可視化した。＊は、モノマーＢＰを示す。
【図５−２】Ａ：ｌｉｄ領域において変異を有する変異型ＧＢＳソルターゼが、野生型骨格タンパク質（ＢＰ）のインビトロでの重合を触媒し得ることを示すタンパク質ゲル。種々の濃度（１００μＭおよび２００μＭ）の組換えＢＰを、８６位においてチロシンからアラニンへの置換を有するＰＩ−２ａの変異型ソルターゼＣ１（ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ）とともに、０時間、２４時間もしくは４８時間にわたってインキュベートし、上記反応混合物に含まれるタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって可視化した。＊は、モノマーＢＰを示す。重合したＢＰに対応する高分子量バンド（≧２６０ｋＤａ）は、２４時間もしくは４８時間のインキュベーション後に検出可能であった。レーン１：ＢＰ  １００μＭ＋ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ  ｔ０ｈ、レーン２：ＢＰ  １００μＭ＋ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ  ｔ２４ｈ、レーン３：ＢＰ  １００μＭ＋ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ  ｔ４８ｈ；レーン４：ＢＰ  ２００μＭ＋ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ  ｔ０ｈ、レーン５：ＢＰ  ２００μＭ＋ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ  ｔ２４ｈ。Ｂ：重合したＢＰのパターンが野生型細菌（ここではＧＢＳ株５１５）由来の線毛に含まれるＢＰポリマーに類似することを示す、ＧＢＳ線毛２ａの骨格タンパク質を認識する抗体（αＢＰ）で行ったイムノブロット。＊は、モノマーＢＰを示す。レーン１：ＢＰ、レーン２：ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ、レーン３：ＢＰ＋ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ、レーン４：ＧＢＳ５１５野生型線毛。Ｃ：ＢＰ重合の効率に対する種々の濃度のＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａの効果を示すタンパク質ゲル。１０μＭ、５０μＭもしくは１００μＭのＳｒｔＣ１Ｙ８６ＡをＢＰと混合し、０時間、４８時間、３日間および４日間にわたってインキュベートし、上記反応混合物に含まれるタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって可視化した。＊は、モノマーＢＰを示す。Ｄ：ＢＰ重合の効率に対する種々の濃度のＢＰの効果を示すタンパク質ゲル。２５μＭ、５０μＭもしくは１００μＭのＢＰを、２５μＭのＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａと混合し、０時間、３日間、５日間および７日間にわたってインキュベートし、上記反応混合物に含まれるタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって可視化した。＊は、モノマーＢＰを示す。
【図５−３】Ａ：ｌｉｄ領域において変異を有する変異型ＧＢＳソルターゼが、野生型骨格タンパク質（ＢＰ）のインビトロでの重合を触媒し得ることを示すタンパク質ゲル。種々の濃度（１００μＭおよび２００μＭ）の組換えＢＰを、８６位においてチロシンからアラニンへの置換を有するＰＩ−２ａの変異型ソルターゼＣ１（ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ）とともに、０時間、２４時間もしくは４８時間にわたってインキュベートし、上記反応混合物に含まれるタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって可視化した。＊は、モノマーＢＰを示す。重合したＢＰに対応する高分子量バンド（≧２６０ｋＤａ）は、２４時間もしくは４８時間のインキュベーション後に検出可能であった。レーン１：ＢＰ  １００μＭ＋ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ  ｔ０ｈ、レーン２：ＢＰ  １００μＭ＋ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ  ｔ２４ｈ、レーン３：ＢＰ  １００μＭ＋ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ  ｔ４８ｈ；レーン４：ＢＰ  ２００μＭ＋ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ  ｔ０ｈ、レーン５：ＢＰ  ２００μＭ＋ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ  ｔ２４ｈ。Ｂ：重合したＢＰのパターンが野生型細菌（ここではＧＢＳ株５１５）由来の線毛に含まれるＢＰポリマーに類似することを示す、ＧＢＳ線毛２ａの骨格タンパク質を認識する抗体（αＢＰ）で行ったイムノブロット。＊は、モノマーＢＰを示す。レーン１：ＢＰ、レーン２：ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ、レーン３：ＢＰ＋ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ、レーン４：ＧＢＳ５１５野生型線毛。Ｃ：ＢＰ重合の効率に対する種々の濃度のＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａの効果を示すタンパク質ゲル。１０μＭ、５０μＭもしくは１００μＭのＳｒｔＣ１Ｙ８６ＡをＢＰと混合し、０時間、４８時間、３日間および４日間にわたってインキュベートし、上記反応混合物に含まれるタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって可視化した。＊は、モノマーＢＰを示す。Ｄ：ＢＰ重合の効率に対する種々の濃度のＢＰの効果を示すタンパク質ゲル。２５μＭ、５０μＭもしくは１００μＭのＢＰを、２５μＭのＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａと混合し、０時間、３日間、５日間および７日間にわたってインキュベートし、上記反応混合物に含まれるタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって可視化した。＊は、モノマーＢＰを示す。
【図６】インビトロで重合した線毛構造物が成功裏に精製され得ることを示すタンパク質ゲル。２５μＭのＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａを、１００μＭのＢＰ−２ａと、３７℃で７日間にわたってインキュベートした。上記混合物に含まれるタンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィーによって画分へと分離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって可視化した。精製された重合ＢＰを含む高分子量画分（白四角）が最初に溶出し、続いて、モノマーＢＰ（＊）およびＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ（×）が溶出する。
【図７】変異型ソルターゼ酵素が種々のグラム陽性細菌由来の線毛タンパク質を重合することを示すタンパク質ゲル。Ａ：２５μＭのＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ（ＰＩ−２ａのＧＢＳソルターゼＣ１）を、１００μＭのＧＢＳの骨格タンパク質ＰＩ−１（ＧＢＳ  ８０ともいわれる）とともに３７℃で７日間にわたってインキュベートし、上記反応混合物に含まれるタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって可視化した。コントロールとして、ＳｒｔＣ１Ｙ８６ＡもしくはＧＢＳ  ８０単独を、同じ条件下でインキュベートした。＊は、モノマーＢＰを示す。レーン１：ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ、レーン２：ＢＰ  ＰＩ−１、レーン３：ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ＋ＢＰ  ＰＩ−１。Ｂ：２５μＭのＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ（ＰＩ−２ａのＧＢＳ  ソルターゼＣ１）を、５０μＭもしくは１００μＭのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の線毛タンパク質（ＲｒｇＢともいわれる）とともに、３７℃で３日間にわたってインキュベートし、上記反応混合物に含まれるタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって可視化した。コントロールとして、ＳｒｔＣ１Ｙ８６ＡもしくはＲｒｇＢ単独を、同じ条件下でインキュベートした。＊は、モノマーＲｒｇＢを示す。レーン１：ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ、レーン２：ＲｒｇＢ、レーン３：ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ＋ＲｒｇＢ（５０μＭ）、レーン４：ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ＋ＲｒｇＢ（１００μＭ）。
【図８】ＧＢＳ株５１５のＰＩ−２ａおよびＧＢＳ株Ａ９０９のＰＩ−２ｂに由来する相同性ＳｒｔＣ１ソルターゼの対形式の配列アラインメント。触媒性三つ組（一重下線）が保存されている一方で、標準ｌｉｄモチーフ（二重下線）は、ＰＩ−２ｂ  ＳｒｔＣ１に存在しない。代わりに、ｌｉｄ機能を摸倣するようであるトリプトファンが存在する。
【図９】：ＰＩ−２ｂのＳｒｔＣ２ソルターゼ（ＳＡＫ＿１４３７）およびＰＩ−２ａのＳｒｔＣ１ソルターゼ（ＳＡＬ＿１４８４）の対形式のアラインメント。ＳｒｔＣ２は、ｌｉｄ配列（ボックスで囲んで強調）、およびＣ末端膜貫通ドメインを欠いている。３個のシステイン残基が、ＰＩ−２ｂ  ＳｒｔＣ２配列に存在する（×で印を付けている）。
【図１０】ＰＩ−２ａアイランドが欠失されたＧＢＳ  ５１５に由来する変異体株（５１５Δ２ａ）およびＳｒｔＣ１およびＢＰ遺伝子、もしくはＢＰ遺伝子のみを含むプラスミドによって補完した野生型Ａ９０９株に由来する変異体株の培養物からの総タンパク質抽出物のウェスタンブロット。ＢＰに対する抗体を使用した。高分子量シグナルは、上記補完した株における線毛重合を示す。Ｍ：マーカー；レーン１：５１５Δ２ａ；レーン２：５１５Δ２ａ＋ＢＰ；レーン３：５１５Δ２ａ＋ＢＰ＋ＳｒｔＣ１；レーン４：５１５Δ２ａ＋ＢＰ＋ＳｒｔＣ１；レーン５：Ａ９０９＋ＢＰ；レーン６：Ａ９０９＋ＢＰ＋ＳｒｔＣ１。
【図１１】重合反応物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。レーン１：ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ＋ＢＰ−２ａ−５１５；レーン２：ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ＋ＢＰ−２ａ−Ｈ３６Ｂ；レーン３：ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ＋ＢＰ−２ａ−ＣＪＢ１１１；レーン４：マーカー；レーン５：ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ＋ＢＰ−２ａ−５１５−Ｈ３６Ｂ−ＣＪＢ１１１。
【図１２】図１２Ａ：ＢＰ−１に対するポリクローナル抗体でのウェスタンブロット。レーン１：ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ；レーン２：ＢＰ−２ａ−５１５改変体；レーン３：ＢＰ−２ａ−Ｈ３６Ｂ改変体；レーン４：ＢＰ−１；レーン５：ＲｒｇＢ；レーン６：ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ＋ＢＰ−１；レーン７：ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ＋ＢＰ−２ａ−５１５＋ＢＰ−１；レーン８：ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ＋ＢＰ−２ａ−Ｈ３６Ｂ＋ＢＰ−１；レーン９：ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ＋ＲｒｇＢ；レーン１０：ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ＋ＢＰ−２ａ−５１５＋ＲｒｇＢ；レーン１１：ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ＋ＢＰ−２ａ−Ｈ３６Ｂ＋ＲｒｇＢ。図１２Ｂ：ＲｒｇＢに対するポリクローナル抗体でのウェスタンブロット。レーン１：ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ；レーン２：ＢＰ−２ａ−５１５改変体；レーン３：ＢＰ−２ａ−Ｈ３６Ｂ改変体；レーン４：ＢＰ−１；レーン５：ＲｒｇＢ；レーン６：ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ＋ＢＰ−１；レーン７：ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ＋ＢＰ−２ａ−５１５＋ＢＰ−１；レーン８：ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ＋ＢＰ−２ａ−Ｈ３６Ｂ＋ＢＰ−１；レーン９：ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ＋ＲｒｇＢ；レーン１０：ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ＋ＢＰ−２ａ−５１５＋ＲｒｇＢ；レーン１１：ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ＋ＢＰ−２ａ−Ｈ３６Ｂ＋ＲｒｇＢ。
【図１３】変異型ＳｒｔＣは、ＩＰＱＴＧ配列でタグ付けした緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を重合し得る。
【図１４】図１４Ａ：上記ＬＰＸＴＧモチーフは、インビトロでの線毛重合に必須である。上記ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａと組換えＢＰ−２ａ  ΔＩＰＱＴＧとの間の、３７℃でのインキュベーションのＴ０、４８および７２時間での反応の進行。ＳｒｔＣ１Ｙ８６ＡおよびＢＰ−２ａ  ΔＩＰＱＴＧの両方の濃度を、それぞれ、２５μＭおよび１００μＭに固定した。ＬＰＸＴＧ様モチーフがＢＰ重合に必要であることを示す高分子量パターンの形成は同定できなかった。コントロールとして、上記ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ（左側）およびＢＰ−２ａ  ΔＩＰＱＴＧ（右側）を単独でインキュベートした。図１４Ｂ：ピリンモチーフのリジンは、インビトロでの線毛重合に必須ではない。上記ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ（２５μＭ）および上記組換えＢＰ−２ａ  Ｋ１８９Ａ（１００μＭ）を、３７℃において種々の時点（０、４８ｈおよび７２ｈ）で混合し、上記反応物をＳＤＳ−ＰＥＧＥによって分析した。上記ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａは、上記リジン１８９とは異なる別の求核剤を使用したことを示す高分子量のパターンが同定できた。図１４Ｃ：ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａと、ＢＰ−２ａタンパク質の存在下でのみインビボで重合され得る（データは示さず）上記付属タンパク質（ＡＰ１−２ａおよびＡＰ２−２ａ）の組換え形態とを混合した場合、いくつかのＨＭＷ構造が形成された。これらデータは、ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａが、上記酵素と上記ＬＰＸＴＧ様ソーティングシグナルとの間のアシル中間体を分離するために、異なる求核剤を使用し得ることを実証する。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
（発明の詳細な説明）
グラム陽性細菌における線毛関連Ｃソルターゼの構造研究から、これら酵素の多くの活性部位が、基質の非存在下で移動性の「ｌｉｄ」領域によって覆われているアミノ酸の触媒性三つ組を含むことが実証された。従って、線毛関連ソルターゼの特徴は、活性部位へのアクセスをブロックする、すなわち、上記活性部位を封入するだけではなく、触媒性の割れ目自体の中で相互作用して、「アンカー」として働く２個の重要な残基（一般には、Ａｓｐおよび疎水性アミノ酸）をも有するｌｉｄの存在である。一般に、ｌｉｄ領域に対応する配列は、今日までに特徴付けられた全ての線毛関連ソルターゼにおいて同定され得る。特に、このｌｉｄ構造は、ＧＢＳ  ＰＩ−１、ＰＩ−２ａおよびＰＩ−２ｂ由来のソルターゼＣ１酵素に［３］、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のソルターゼＣ１、ソルターゼＣ２およびソルターゼＣ３酵素に［４，５］、ならびにＧＡＳ由来のソルターゼＣ１酵素に存在することが実証された。ＧＢＳ  ＰＩ−２ａ由来のソルターゼＣ１酵素におけるｌｉｄ領域の変異は、補完研究［３］において線毛生成に対して有害な影響を有しないことが示されたが、今までに、変異型ソルターゼがインビトロでタンパク質を重合する能力に向けての研究は行われてこなかった。
【００２７】
本発明者らは、ソルターゼＣ酵素が野生型ソルターゼＣ酵素よりインビトロで有効にタンパク質を重合し得、例えば、組換え線毛の生成を生じ得ることを今や見いだした。野生型ソルターゼＣ酵素は、基質の非存在下で閉じたコンフォメーションで上記活性部位を封入する「移動性のｌｉｄ」領域を含む。例えば、ＳｒｔＣ１のｌｉｄは、３個の残基、Ａｓｐ８４、Ｐｒｏ８５およびＴｙｒ８６を有し、これら残基は、活性部位および周りの残基と相互作用する。従って、ソルターゼＣ酵素は、インビトロでは不活性であり、ピリン骨格および付属タンパク質のような部分を連結もしくは重合できない。そこで本発明者らは、上記ｌｉｄ領域を変異させることによって、上記触媒部位が露出され得、これら変異した酵素をインビトロで活性にすることを発見した。以下で考察されるように、そして驚くべきことに、これら変異した酵素は、それらの野生型対応物より活性であり、さらにより驚くべきことに、より広い範囲のアミノ酸を認識し得る。詳細には、本発明の変異した酵素は、「ｌｉｄ」によって封入されていない露出した触媒部位を有するかもしくは含み、ペプチド転移反応を触媒して、アシル酵素中間体をインビトロで形成するのに利用できる。
【００２８】
本発明の方法は、従って、現在使用される骨の折れる精製手順の必要なく、人工線毛もしくは組換え線毛を生成するために使用され得る。驚くべきことに、これら変異型ソルターゼＣ酵素はまた、上記変異型ソルターゼＣ酵素自体と同じ細菌に由来するタンパク質だけでなく、グラム陽性細菌のような種々の供給源に由来するタンパク質を重合するために使用され得る。さらに、これら方法から生じる線毛は、免疫原性であり、上記線毛の成分タンパク質が由来するグラム陽性細菌によって引き起こされる疾患を処置もしくは予防するためのワクチンの開発において使用され得る。
【００２９】
上記線毛内のいくつかのピリンサブユニットは、自発的に形成するタンパク質内イソペプチド結合（おそらく、上記線毛の構造を安定化させる）を含む。従って、ワクチンの文脈において、侵襲／感染の間に免疫系が遭遇するものを摸倣する人工線毛もしくは組換え線毛構造の形態にあるタンパク質での被験体の免疫化はまた、さらなるエピトープ（例えば、三次元構造に基づく構造エピトープもしくはコンフォメーション性エピトープ）の存在に関して利点を有し得る。このような構造エピトープもしくはコンフォメーション性エピトープは、上記線毛タンパク質が単離され精製された形態を含む組成物中で、または結合体（例えば、糖結合体）として提供される場合に、サブユニットワクチンにはなくてもよい。従って、上記重合した線毛タンパク質は、タンパク質単独の構造から推定できない三次元エピトープを含み得る。
【００３０】
（変異型ソルターゼＣ酵素）
本発明の方法において使用される変異型ソルターゼＣ酵素は、連鎖球菌属の野生型ソルターゼＣ酵素に由来する。上記変異型ソルターゼＣ酵素は、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（ＧＢＳ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ（肺炎球菌）もしくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＧＡＳ）の野生型ソルターゼＣ酵素に由来し得る。上記変異型ソルターゼＣ酵素は、ソルターゼＣ１酵素、ソルターゼＣ２酵素もしくはソルターゼＣ３酵素に由来し得る。上記変異型ソルターゼＣ酵素は、ｌｉｄ領域を含む野生型連鎖球菌ソルターゼＣ酵素に由来する。上記ｌｉｄ領域は、基質の非存在下でソルターゼＣ酵素の活性部位において見いだされるアミノ酸の触媒性三つ組を覆う約１５〜１８アミノ酸の構造上のループである。上記ｌｉｄ領域は、上記酵素のＮ末端に位置するシグナルペプチドおよび膜貫通（ＴＭ）領域と上記酵素のＣ末端に位置する正に荷電したドメインとの間の、上記ソルターゼＣ酵素の可溶性コアドメイン内に位置する。種々の野生型連鎖球菌ソルターゼＣ酵素における上記ｌｉｄ領域の位置は、以下の表にまとめられる。これら配列は、全て、Ｎ末端シグナルペプチドを含む野生型配列である。
【００３１】
【表１】
2015509713.tif 000003
【００３２】
他の連鎖球菌ソルターゼＣ酵素における上記ｌｉｄ領域の位置は、構造分析によって、もしくはより単純には、これら酵素の配列と表１において示される既知の位置でｌｉｄ領域を有する連鎖球菌タンパク質の配列とのアラインメントによって、当業者によって容易に決定され得る。図１は、上記ｌｉｄ領域の位置を強調して、ＧＢＳソルターゼＣ酵素のアラインメントを提供する。図２は、ＧＡＳおよび肺炎球菌に由来するソルターゼＣ酵素の類似のアラインメントを提供する。ｌｉｄ領域を有するこれら図中に示される上記ソルターゼＣ酵素のうちのいずれも、本発明の方法において使用され得る。
【００３３】
本発明の方法において使用される連鎖球菌属由来のソルターゼＣ酵素は、そのｌｉｄ領域に変異を有する。上記変異は、上記野生型ソルターゼＣ酵素のアミノ酸配列に対する、上記変異型ソルターゼＣ酵素のｌｉｄ領域のアミノ酸配列中の置換、欠失もしくは挿入であり得る。
【００３４】
（欠失変異体）
上記変異が欠失である場合、上記変異は、上記野生型ソルターゼＣ酵素のｌｉｄ領域の一部もしくは全ての欠失を含み得る。上記ｌｉｄ領域は、代表的には、約１５〜１８アミノ酸の長さであり、変異は、上記ｌｉｄ領域から１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個以上のアミノ酸の欠失、または上記ｌｉｄ領域中の全てのアミノ酸の欠失を含み得る。
【００３５】
上記変異は、上記ソルターゼＣ酵素の活性部位における触媒性三つ組と相互作用すると推測される位置にあるアミノ酸の欠失を含む。例えば、上記変異は、ＰＩ−２ａのＧＢＳソルターゼＣ１酵素のアミノ酸配列（配列番号３）の８４位、８５位および／もしくは８６位にあるアミノ酸の欠失、または他のソルターゼＣ酵素のアミノ酸配列において対応する位置にあるアミノ酸の欠失を含み得る。上記変異は、従って、ＰＩ−２ａのＧＢＳソルターゼＣ１酵素のアミノ酸配列（配列番号３）の、ｉ）８４位にあるアミノ酸；ｉｉ）８５位にあるアミノ酸；ｉｉｉ）８６位にあるアミノ酸；ｉｖ）８４位および８５位にある２個のアミノ酸；ｖ）８４位および８６位にある２個のアミノ酸；ｖｉ）８５位および８６位にある２個のアミノ酸；またはｖｉｉ）８４位、８５位および８６位にある３個のアミノ酸、の欠失、または別のソルターゼＣ酵素のアミノ酸配列の対応する位置にあるアミノ酸の欠失を含み得る。ＰＩ−２ａのＧＢＳソルターゼＣ１酵素のアミノ酸配列（配列番号３）の８４位、８５位および８６位に対応する位置にあるアミノ酸は、アラインメントによって容易に決定され得る。
【００３６】
ＰＩ−２ａのＧＢＳソルターゼＣ１酵素のアミノ酸配列（配列番号３）の８４位、８５位および８６位に対応する位置にあるアミノ酸は、以下：
−ＰＩ−１のＧＢＳソルターゼＣ１（配列番号１）の９０位、９１位および９２位、
−ＰＩ−１のＧＢＳソルターゼＣ２（配列番号２）の８４位、８５位および８６位、
−ＰＩ−２ａのＧＢＳソルターゼＣ２（配列番号４）の８８位、８９位および９０位、
−ＰＩ−２ｂのＧＢＳソルターゼＣ１（配列番号５）の５３位、５４位および５５位、
−肺炎球菌ソルターゼＣ１（配列番号６）の５８位、５９位および６０位、
−肺炎球菌ソルターゼＣ２（配列番号７）の５０位、５１位および５２位、
−肺炎球菌ソルターゼＣ３（配列番号８）の７４位、７５位および７６位、または
−ＧＡＳソルターゼＣ１（配列番号９）の４６位、４７位および４８位、
で、それぞれ見いだされる。
【００３７】
あるいは、上記変異は、上記ｌｉｄ領域におけるアミノ酸の全ての欠失を含み得る。上記欠失は、残っているソルターゼ配列内の位置におけるさらなる変化を含み得る。例えば、上記ソルターゼは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個以上のさらなるアミノ酸位置での置換、欠失もしくは挿入を含み得る。さらなる例示によれば、上記ソルターゼは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個未満のさらなるアミノ酸位置もしくはその間の任意の範囲での置換、欠失もしくは挿入を含み得る。
【００３８】
特に、上記変異は、野生型酵素における上記ｌｉｄ領域のＮ末端である野生型ソルターゼＣ酵素のシグナルペプチドおよび／もしくは膜貫通ドメインの一部もしくは全ての欠失をさらに含み得る。上記膜貫通ドメインは、２個のαヘリックスを含む。上記変異は、これら２個のαヘリックスのうちの一方もしくは両方の欠失を含み得、必要に応じて、上記膜貫通ドメインのＮ末端側にあるシグナルペプチドの欠失もまた含み得る。例えば、上記変異は、ｌｉｄ領域の一部もしくは全ての欠失、および上記ｌｉｄ領域のＮ末端側にある１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個以上のアミノ酸の欠失を含み得る。さらなる例示によれば、上記変異は、ｌｉｄ領域の一部もしくは全ての欠失、および上記ｌｉｄ領域のＮ末端側にある１０個未満、２０個未満、３０個未満、４０個未満、５０個未満、６０個未満、７０個未満、８０個未満、９０個未満のアミノ酸、またはその間の任意の範囲の欠失を含み得る。いくつかの実施形態において、上記変異は、上記ｌｉｄ領域のアミノ酸の全て、および上記ｌｉｄ領域のＮ末端側にあるアミノ酸の全ての欠失を含む。本発明のこの実施形態における上記ソルターゼＣ酵素は、従って、野生型ソルターゼＣ酵素のＣ末端／正に荷電したドメインからなる。
【００３９】
上記変異は、任意のさらなる変異の非存在下で上記の欠失からなり得る。例えば、上記変異は、ｌｉｄ領域の一部もしくは全ての欠失、ｌｉｄ領域および上記シグナルペプチドおよび／もしくは膜貫通ドメインの一部もしくは全ての欠失、またはｌｉｄ領域および任意のさらなる変異の非存在下でのＮ末端領域全体の一部もしくは全ての欠失からなり得る。上記変異が、ａ）上記ｌｉｄ領域および上記シグナルペプチド／膜槓子ドメインの全ての欠失、ｂ）上記ｌｉｄ領域およびＮ末端領域全体の全ての欠失、ならびにｃ）上記シグナルペプチド／膜貫通ドメインおよび本発明の方法における使用に適した触媒性三つ組のアミノ酸の欠失からなるときのソルターゼＣ酵素の配列の例は、以下の表２に提供される。
【００４０】
【表２】
2015509713.tif 000004
【００４１】
本発明の方法において使用される変異型ソルターゼ酵素は、従って、配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、もしくは３６から選択されるアミノ酸配列を含み得るかもしくは上記アミノ酸配列からなり得る。本発明の方法において使用される変異型ソルターゼ酵素はまた、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個もしくは１０個のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を除いて、配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、もしくは３６から選択されるアミノ酸配列を含み得るかもしくは上記アミノ酸配列からなり得る。
【００４２】
（置換変異体）
上記変異は、上記野生型ソルターゼＣ酵素配列と比較して、上記ｌｉｄ領域において１個以上のアミノ酸置換を含み得る。上記置換は、上記置換が通常のｌｉｄ機能をなくすように、触媒部位にあるアミノ酸と相互作用すると推定される上記ｌｉｄ領域中の位置にあり得る。上記変異は、ＰＩ−２ａのＧＢＳソルターゼＣ１酵素のアミノ酸配列（配列番号３）の８４位、８５位および／もしくは８６位にあるアミノ酸の置換、または他のソルターゼＣ酵素のアミノ酸配列の対応する位置にあるアミノ酸の置換を含み得る。上記変異は、従って、ＰＩ−２ａのＧＢＳソルターゼＣ１酵素のアミノ酸配列（配列番号３）の、ｉ）８４位にあるアミノ酸；ｉｉ）８５位にあるアミノ酸；ｉｉｉ）８６位にあるアミノ酸；ｉｖ）８４位および８５位にある２個のアミノ酸；ｖ）８４位および８６位にある２個のアミノ酸；ｖｉ）８５位および８６位にある２個のアミノ酸；またはｖｉｉ）８４位、８５位および８６位にある３個のアミノ酸、の置換、または別のソルターゼＣ酵素のアミノ酸配列の対応する位置にあるアミノ酸の置換を含み得る。ＰＩ−２ａのＧＢＳソルターゼＣ１酵素のアミノ酸配列（配列番号３）の８４位、８５位および８６位に対応する位置にあるアミノ酸は、アラインメントによって容易に決定され得る。
【００４３】
ＰＩ−２ａのＧＢＳソルターゼＣ１酵素のアミノ酸配列（配列番号３）の８４位、８５位および８６位に対応する位置にあるアミノ酸は、以下：
−ＰＩ−１のＧＢＳソルターゼＣ１（配列番号１）の９０位、９１位および９２位、
−ＰＩ−１のＧＢＳソルターゼＣ２（配列番号２）の８４位、８５位および８６位、
−ＰＩ−２ａのＧＢＳソルターゼＣ２（配列番号４）の８８位、８９位および９０位、
−ＰＩ−２ｂのＧＢＳソルターゼＣ１（配列番号５）の５３位、５４位および５５位、
−肺炎球菌ソルターゼＣ１（配列番号６）の５８位、５９位および６０位、
−肺炎球菌ソルターゼＣ２（配列番号７）の５０位、５１位および５２位、
−肺炎球菌ソルターゼＣ３（配列番号８）の７４位、７５位および７６位、または
−ＧＡＳソルターゼＣ１（配列番号９）の４６位、４７位および４８位、
でそれぞれ見いだされる。
【００４４】
８４位および／もしくは８５位および／もしくは８６位に対応する位置での上記置換は、これら位置にある野生型残基をアラニン残基で置換することを含み得る。
【００４５】
上記ソルターゼが、ＰＩ−１のＧＢＳソルターゼＣ１（配列番号１）である場合、上記変異は、９０位にあるアスパラギン酸残基をアラニン残基で置換すること（Ｄ９０Ａ）および／または９１位にあるプロリン残基をアラニン残基で置換すること（Ｐ９１Ａ）、および／または９２位にあるチロシン残基をアラニン残基で置換すること（Ｙ９２Ａ）を含み得る。
【００４６】
上記ソルターゼが、ＰＩ−１のＧＢＳソルターゼＣ２（配列番号２）である場合、上記変異は、８４位にあるアスパラギン酸残基をアラニン残基で置換すること（Ｄ８４Ａ）および／または８５位にあるプロリン残基をアラニン残基で置換すること（Ｐ８５Ａ）、および／または８６位にあるフェニルアラニン残基をアラニン残基で置換すること（Ｆ８６Ａ）を含み得る。
【００４７】
上記ソルターゼが、ＰＩ−２ａのＧＢＳソルターゼＣ１（配列番号３）である場合、上記変異は、８４位にあるアスパラギン酸残基をアラニン残基で置換すること（Ｄ８４Ａ）および／または８５位にあるプロリン残基をアラニン残基で置換すること（Ｐ８５Ａ）、および／または８６位にあるチロシン残基をアラニン残基で置換すること（Ｙ８６Ａ）を含み得る。
【００４８】
上記ソルターゼが、ＰＩ−２ａのＧＢＳソルターゼＣ２（配列番号４）である場合、上記変異は、８８位にあるアスパラギン酸残基をアラニン残基で置換すること（Ｄ８８Ａ）および／または８９位にあるプロリン残基をアラニン残基で置換すること（Ｐ８９Ａ）、および／または９０位にあるチロシン残基をアラニン残基で置換すること（Ｙ９０Ａ）を含み得る。
【００４９】
上記ソルターゼが、ＰＩ−２ｂのＧＢＳソルターゼＣ１（配列番号５）である場合、上記変異は、５３位にあるメチオニン残基をアラニン残基で置換すること（Ｍ５３Ａ）および／または５４位にあるリジン残基をアラニン残基での置換すること（Ｋ５４Ａ）、および／または５５位にあるトリプトファン残基をアラニン残基で置換すること（Ｗ５５Ａ）を含み得る。
【００５０】
上記ソルターゼが、肺炎球菌ソルターゼＣ１（配列番号６）である場合、上記変異は、５８位にあるアスパラギン酸残基をアラニン残基で置換すること（Ｄ５８Ａ）および／または５９位にあるプロリン残基をアラニン残基で置換すること（Ｐ５９Ａ）、および／または６０位にあるトリプトファン残基をアラニン残基で置換すること（Ｗ５５Ａ）を含み得る。
【００５１】
上記ソルターゼが、肺炎球菌ソルターゼＣ２（配列番号７）である場合、上記変異は、５０位にあるアスパラギン酸残基をアラニン残基で置換すること（Ｄ５０Ａ）および／または５１位にあるプロリン残基をアラニン残基で置換すること（Ｐ５１Ａ）、および／または５２位にあるフェニルアラニン残基をアラニン残基で置換すること（Ｆ５２Ａ）を含み得る。
【００５２】
上記ソルターゼが、肺炎球菌ソルターゼＣ２（配列番号８）である場合、上記変異は、７４位にあるアスパラギン酸残基をアラニン残基で置換すること（Ｄ７４Ａ）および／または７５位にあるプロリン残基をアラニン残基で置換すること（Ｐ７５Ａ）、および／または７６位にあるフェニルアラニン残基をアラニン残基で置換すること（Ｆ７６Ａ）を含み得る。
【００５３】
上記ソルターゼが、ＧＡＳソルターゼＣ１（配列番号９）である場合、上記変異は、４６位にあるアスパラギン酸残基をアラニン残基で置換すること（Ｄ４６Ａ）および／または４８位にあるフェニルアラニン残基をアラニン残基で置換すること（Ｆ４８Ａ）を含み得る。上記ＧＡＳソルターゼＣ１酵素は、４７位にアラニン残基を既に含んでいる。
【００５４】
上記変異は、ＰＩ−２ａのＧＢＳソルターゼＣ１酵素のアミノ酸配列（配列番号３）の８４位および／もしくは８５位および／もしくは８６位に対応する位置以外の位置においてさらなるアミノ酸変化を含み得る。例えば、上記変異は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個以上のさらなるアミノ酸位置において置換を含み得る。代わりにもしくはこれらさらなる置換に加えて、上記置換は、欠失および／もしくは挿入を含み得る。特に、上記変異は、ＰＩ−２ａのＧＢＳソルターゼＣ１酵素のアミノ酸配列（配列番号３）の８４位および／もしくは８５位および／もしくは８６位に対応する位置にある置換、ならびにａ）上記シグナルペプチドおよび／もしくは膜貫通ドメイン、またはｂ）上記野生型ソルターゼ酵素のＮ末端領域全体の欠失を含み得る。
【００５５】
上記ソルターゼは、任意のさらなる変異の非存在下で８４位および／もしくは８５位および／もしくは８６位にある置換からなり得る。ＰＩ−２ａのＧＢＳソルターゼＣ１酵素のアミノ酸配列（配列番号３）のｌｉｄ領域の８４位および／もしくは８６位に等しい位置にある置換からなり、本発明の方法において使用するのに適した上記シグナルペプチド／膜貫通領域の欠失からもなるソルターゼＣ酵素の配列の例は、以下の表３に提供される。
【００５６】
【表３】
2015509713.tif 000005
【００５７】
本発明の方法において使用される変異型ソルターゼ酵素は、従って、配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０もしくは７１から選択されるアミノ酸配列を含み得るかまたは上記アミノ酸はからなり得る。本発明の方法において使用される変異型ソルターゼ酵素はまた、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個もしくは１０個のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を除いて、配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０もしくは７１から選択されるアミノ酸配列を含み得るかまたは上記アミノ酸配列からなり得る。
【００５８】
上記の本発明の方法における使用に適した変異型ソルターゼＣ酵素はまた、それ自体が本発明の実施形態である。詳細には、ソルターゼ変異体は、ＳｒｔＣ１Ｙ９２ＡおよびＳｒｔＣ２Ｆ８６Ａである。なぜなら、これら酵素の安定性はより高く、それらが例えば、ＳｒｔＣ１−ΔＮＴおよびＳｒｔＣ２−ΔＮＴ欠失変異体と比較してより良好に発現されかつより可溶性であるからである。上記Ｙ９２ＡおよびＦ８６Ａ変異体の切断反応のＶｍａｘは、上記ＳｒｔＣ１−ΔＮＴおよびＳｒｔＣ２−ΔＮＴ変異体（これらは、精製するのもより難しい）のものより低かったので、それは驚くべきことである。
【００５９】
（ソルターゼ作用）
ソルターゼは、例えば、ピリンタンパク質のＬＰＸＴＧモチーフを切断し、ピリンサブユニットのような１つの部分のＣ末端を、次の部分もしくはサブユニットのＬｙｓ側鎖ＮＨ２基に共有結合する。２つの認識事象が、このソルターゼ作用に関与している。第１に、上記基質タンパク質のソルターゼ認識モチーフ（ＬＰＸＴＧもしくは改変体）は、認識されかつ結合されなければならない。第２に、アクセプター基質（これに、上記基質タンパク質が転移される）は、認識されかつ結合されなければならず、特定のアミノ基が、チオアシル中間体を攻撃する位置にもたらされなければならない。
【００６０】
（変異型ソルターゼＣ酵素により重合される細菌ポリペプチド）
上記の変異型ソルターゼＣ酵素は、１個以上のポリペプチドを重合するために使用され得る。上記変異型ソルターゼＣ酵素は、上記１個以上のポリペプチドとインビトロで接触させられ、インキュベーション期間の後、例えば、ＳＤＳゲル上の高分子量バンドのパターンを同定することによって、重合したポリペプチドが検出される。インキュベーションは、３７℃で行われ得る。インキュベーションは、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日以上にわたって行われ得る。上記ポリペプチドおよび上記変異型ソルターゼＣ酵素は、還元剤、例えば、ＤＴＴ  １ｍＭの存在下でインキュベートされて、上記変異型ソルターゼＣ酵素の触媒性システインを活性なまま保持し得る。インキュベーションは、ほぼｐＨ７〜８で行われ得る。
【００６１】
本発明の変異型ソルターゼＣ酵素とは対照的に、上記野生型ソルターゼＣ酵素は、インビトロでポリペプチドを重合しない。疑いを回避するために、用語「インビトロ」の使用は、細胞自体の存在を要求することなく、線毛重合をもたらすための、細胞の単離および／もしくは精製された成分（例えば、酵素）の使用をいう。
【００６２】
本発明の変異型ソルターゼＣ酵素によって重合されるポリペプチドは、代表的には、ＬＰｘＴＧモチーフを含む。それらは、線毛アセンブリに重要であることが示されたピリンモチーフ（コンセンサス  ＷｘｘｘＶｘＶｙＰＫ）モチーフおよび／もしくはＥ−Ｂｏｘモチーフ（コンセンサス  ＹｘＬｘＥＴｘＡＰｘＧＹ）をさらに含み得る［６］。特に、上記ポリペプチドは、例えば、上記ピリンモチーフにおいて見いだされる保存されたリジン（Ｋ）残基を含み得る。他の実施形態において、上記ポリペプチドは、上記ピリンモチーフにおいて保存されたリジン（Ｋ）残基を含まない。すなわち、ここで上記保存されたリジン残基の存在は、排除される。いくつかの実施形態において、本発明の変異型ソルターゼＣ酵素によって重合されるポリペプチドは、Ｎ末端グリシン残基を含み得る。他の配列モチーフは、当業者に明らかであり、非限定的な例によれば：ＬＰＥＴＧＧ、ＬＰＸＴ、ＬＰＸＴＧ、ＬＰＫＴＧ、ＬＰＡＴＧ、ＬＰＮＴＧ、ＩＰＱＴＧ、ＩＱＴＧＧＩＧＴを含み得る。
【００６３】
本発明の変異型ソルターゼＣ酵素によって重合され得るポリペプチドの例としては、グラム陽性細菌由来のポリペプチド（例えば、グラム陽性細菌の線毛において見いだされる上記骨格タンパク質および付属タンパク質）が挙げられる。特に、上記変異型ソルターゼＣ酵素は、ＧＢＳ、ＧＡＳもしくはＳｔｒｅｐｔｏｃｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来する線毛において見いだされる骨格タンパク質と接触させられ得る。例えば、上記変異型ソルターゼＣ酵素は、ＧＢＳ  ＰＩ−１由来の骨格タンパク質（ＧＢＳ８０／ＳＡＧ０６４５）、ＧＢＳ  ＰＩ−２ａ由来の骨格タンパク質（ＧＢＳ５９／ＳＡＧ１４０７）、ＧＢＳ  ＰＩ−２ｂ由来の骨格タンパク質（Ｓｐｂ１／ＳＡＮ１５１８）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の骨格タンパク質（ＲｒｇＢ）、もしくはＧＡＳ由来の骨格タンパク質（ｆｅｅ６、ｓｐｙ１２８、ｏｒｆ８０、ｅｆｔＬＳＬＡ）と接触させられ得る。
【００６４】
代わりにもしくはさらに、上記変異型ソルターゼＣ酵素は、ＧＢＳ、ＧＡＳもしくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来する線毛において見いだされる付属タンパク質と接触させられ得る。例えば、上記変異型ソルターゼＣ酵素は、ＧＢＳ  ＰＩ−１由来の付属タンパク質１（ＡＰ−１）（ＧＢＳ１０４）、ＧＢＳ  ＰＩ−２ａ由来のＡＰ−１（ＧＢＳ６７／ＳＡＧ１４０８）、ＧＢＳ  ＰＩ−２ｂ由来のＡＰ−１（ＳＡＮ１５１９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＡＰ−１（ＲｒｇＡ）もしくはＧＡＳ由来のＡＰ−１（ｃｐａ）、ＧＢＳ  ＰＩ−１由来の付属タンパク質２（ＡＰ−２）（ＧＢＳ５２）、ＧＢＳ  ＰＩ−２ａ由来のＡＰ−２（ＧＢＳ１５０／ＳＡＧ１４０４）、ＧＢＳ  ＰＩ−２ｂ由来のＡＰ−２（ＳＡＮ１５１６）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＡＰ−２（ＲｒｇＣ）またはＧＡＳ由来のＡＰ−２（ｓｐｙ１３０、ｏｒｆ８２、ｏｒｆ２）と接触させられ得る。
【００６５】
本発明の変異型ソルターゼＣ酵素は、野生型骨格タンパク質および付属タンパク質の配列のホモログ、フラグメントもしくは改変体を重合するために使用され得るが、ただし、これらホモログ、フラグメントおよび改変体が、変異型ソルターゼＣ酵素による重合に必要な上記の配列を保持することを条件とする。例えば、本発明の方法において使用され得るこれらポリペプチドの改変体としては、上記膜貫通ドメインが、野生型配列と比較して欠失された、骨格タンパク質および／もしくは付属タンパク質が挙げられる。上記膜貫通ドメインの欠失に加えて、もしくは上記欠失の代わりに、改変体は、重合を促進するためにＮ末端でのグリシン残基の付加を含み得る。
【００６６】
非限定的例によれば、本発明の変異型ソルターゼ酵素によって重合され得るこれらポリペプチドのうちのいくつかの配列は、参照のために以下に提供される。本発明の変異型ソルターゼによって重合され得るさらなるポリペプチドの配列は、当業者によって容易に決定され得る。これらポリペプチドのさらなる詳細は、参考文献［７］に提供される。
【００６７】
（ＰＩ−１のＢＰ（ＧＢＳ８０））
２６０３株において見いだされるとおりの全長ＧＢＳ８０のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号７２として与えられる。野生型ＧＢＳ８０は、配列番号７２のアミノ酸１〜３７においてＮ末端リーダー配列もしくはシグナル配列の領域を含む。上記ＧＢＳ８０のリーダー配列もしくはシグナル配列の領域の１個以上のアミノ酸は、除去され得る（例えば、配列番号７３）。
【００６８】
（ＰＩ−２ｂのＢＰ（ＧＢＳ１５２３／ＳＡＮ１５１８））
元々の「ＧＢＳ１５２３」（ＳＡＮ１５１８；Ｓｐｂｌ）配列は、細胞壁表面アンカーファミリータンパク質として註釈が付けられた（ＧＩ：７７４０８６５１を参照のこと）。参考目的で、ＣＯＨ１株において見いだされるとおりの全長ＧＢＳ  １５２３のアミノ酸配列は、本明細書で配列番号１１０として与えられる。本発明とともに使用するための好ましいＧＢＳ１５２３ポリペプチドは、（ａ）配列番号１１０に対して６０％またはそれより高い同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有する；そして／または（ｂ）配列番号１１０の少なくとも「ｎ」個連続したアミノ酸のフラグメントを含む（ここで「ｎ」は、７またはそれより大きい（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより大きい））、アミノ酸配列を含む。
【００６９】
上記野生型配列は、配列番号１１０のアミノ酸４６８〜４７２において細胞壁アンカーを示すアミノ酸モチーフ（ＬＰＳＴＧ）を含む。保存されたグルタミン酸残基を含むＥボックスはまた、残基４２３にある保存されたグルタミン酸とともに、配列番号１１０のアミノ酸４１９〜４２９において同定された。上記Ｅボックスモチーフは、オリゴマー線毛様構造の形成に重要であり得るので、ＧＢＳ１５２３の有用なフラグメントは、上記保存されたグルタミン酸残基を含み得る。ＣＡＡからＡＡＡへのコードヌクレオチド配列におけるコドンの変異の結果として、配列番号１１０の４１位にあるグルタミン（Ｑ）がリジン（Ｋ）で置換されているＧＢＳ１５２３の変異体が、同定された。この置換は、ＧＢＳ１５２３配列およびＧＢＳ１５２３フラグメント（例えば、配列番号１１２）に存在し得る。シグナル配列領域がないＧＢＳ１５２３  ＣＯＨ１のさらなる改変体は、配列番号１１１として提供される。
【００７０】
（ＧＢＳ  ＰＩ−２ａのＢＰ（ＧＢＳ５９））
２６０３株において見いだされるとおりの全長ＧＢＳ５９のアミノ酸配列は、本明細書で配列番号７４として与えられる。ＧＢＳ５９の改変体は、株Ｈ３６Ｂ、５１５、ＣＪＢ１１１、ＤＫ２１およびＣＪＢ１１０に存在する。Ｈ３６Ｂ、５１５、ＣＪＢ１１１、ＣＪＢ１１０およびＤＫ２１株において見いだされるとおりの全長ＧＢＳ５９のアミノ酸配列は、配列番号７５、７６、７７、７８、および７９として与えられる。
【００７１】
（ＧＢＳ  ＰＩ−２ｂのＢＰ（Ｓｐｂ１））
ＣＯＨ１株において見いだされるとおりの全長Ｓｂｐ１のアミノ酸配列は、本明細書で配列番号８０として与えられる。野生型Ｓｐｂ１は、Ｎ末端リーダーもしくはシグナル配列領域を含む。上記Ｓｐｂ１のリーダーもしくはシグナル配列領域の１個以上のアミノ酸は、除去され得る（例えば、配列番号８１）。
【００７２】
（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＢＰ（ＲｒｇＢ））
上記ＲｒｇＢ線毛サブユニットは、少なくとも３個のクレードを有する。３つのクレードの参照アミノ酸配列は、本明細書で配列番号８２、８３および８４である。
【００７３】
（ＧＢＳ  ＰＩ−１のＡＰ−１（ＧＢＳ１０４／ＳＡＧ０６４９））
２６０３株において見いだされるとおりの全長ＧＢＳ１０４のアミノ酸配列は、本明細書で配列番号８５として与えられる。
【００７４】
（ＧＢＳ  ＰＩ−２ａのＡＰ−１（ＧＢＳ６７））
２６０３株において見いだされるとおりの全長ＧＢＳ６７のアミノ酸配列は、本明細書で配列番号８６として与えられる。ＧＢＳ６７の改変体（ＳＡＩ１５１２）は、株Ｈ３６Ｂに存在する。Ｈ３６Ｂ株において見いだされるとおりの全長ＧＢＳ６７のアミノ酸配列は、配列番号８７として与えられる。ＧＢＳ６７の改変体はまた、株ＣＪＢ１１１、５１５、ＮＥＭ３１６、ＤＫ２１およびＣＪＢ１１０に存在する。上記ＣＪＢ１１１、５１５、ＮＥＭ３１６、ＤＫ２１およびＣＪＢ１１０株において見いだされるとおりの全長ＧＢＳ６７のアミノ酸配列は、本明細書で配列番号８８、８９、９０、９１、および９２として与えられる。
【００７５】
（ＧＢＳ  ＰＩ−２ｂのＡＰ−１（ＧＢＳ１５２４／ＳＡＮ１５１９））
ＣＯＨ１株において見いだされるとおりの全長ＧＢＳ１５２４（ＳＡＮ１５１９）のアミノ酸配列は、本明細書で配列番号９３として与えられる。
【００７６】
（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＡＰ−１（ＲｒｇＡ））
全長ＲｒｇＡのアミノ酸配列は、本明細書で配列番号９４として与えられる。
【００７７】
（ＧＢＳ  ＰＩ−１のＡＰ−２（ＧＢＳ０５２／ＳＡＧ０６４６））
２６０３株において見いだされるとおりの全長ＧＢＳ０５２／ＳＡＧ０６４６のアミノ酸配列は、本明細書で配列番号９５として与えられる。
【００７８】
（ＧＢＳ  ＰＩ−２ａのＡＰ−２（ＧＢＳ１５０／ＳＡＧ１４０４））
２６０３株において見いだされるとおりの全長ＧＢＳ１５０／ＳＡＧ１４０４のアミノ酸配列は、本明細書で配列番号９６として与えられる。
【００７９】
（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａのＡＰ−２（ＲｒｇＣ））
全長ＲｒｇＣのアミノ酸配列は、本明細書で配列番号９７として与えられる。
【００８０】
本発明とともに使用するためのポリペプチドは、従って、（ａ）配列番号７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、もしくは９７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して、または上記で記載される任意の他の骨格タンパク質もしくは付属タンパク質の配列に対して、５０％またはそれより高い同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有する；あるいは（ｂ）これら配列のうちの１つの少なくとも「ｎ」個連続したアミノ酸のフラグメントである（ここで「ｎ」は、２０またはそれより大きい（例えば、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０もしくはそれより大きい；例えば、２０もしくはそれより大きい；または例えば、５０もしくはそれより大きい；または例えば、８０もしくはそれより大きい））、アミノ酸配列を含み得るかもしくは上記アミノ酸配列からなり得る。あるいは、「ｎ」は、２０未満もしくは２５未満、３０未満、３５未満、４０未満、５０未満、６０未満、７０未満、８０未満、９０未満、１００未満もしくは１５０未満である。
【００８１】
本発明の方法は、配列番号７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、もしくは９７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して５０％の同一性を有する少なくとも１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種もしくは１７種のポリペプチドの、あるいはこれら配列のうちの１つの少なくとも「ｎ」個連続したアミノ酸のフラグメント（ここで「ｎ」は、２０またはそれより大きい（例えば、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０もしくはそれより大きい；例えば、２０もしくはそれより大きい；または例えば、５０もしくはそれより大きい；または例えば、８０もしくはそれより大きい））の、重合を含み得る。
【００８２】
本発明の方法は、配列番号７４、７５、７６、７７、７８および７９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して５０％の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有する１種、２種、３種、４種、５種もしくは６種のポリペプチドの、あるいはこれら配列のうちの１つの少なくとも「ｎ」個連続したアミノ酸のフラグメント（ここで「ｎ」は、２０またはそれより大きい（例えば、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０もしくはそれより大きい；例えば、２０もしくはそれより大きい；または例えば、５０もしくはそれより大きい；または例えば、８０もしくはそれより大きい））の、重合を含み得る。
【００８３】
本発明の方法は、配列番号８２、８３および８４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して５０％の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有する１種、２種、もしくは３種のポリペプチドの、あるいはこれら配列のうちの１つの少なくとも「ｎ」個連続したアミノ酸のフラグメント（ここで「ｎ」は、２０またはそれより大きい（例えば、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０もしくはそれより大きい；例えば、２０もしくはそれより大きい；または例えば、５０もしくはそれより大きい；または例えば、８０もしくはそれより大きい））の、重合を含み得る。
【００８４】
これら骨格タンパク質および付属タンパク質のアミノ酸フラグメントは、上記で提供される配列のうちの、例えば、最大で３０個まで、最大で４０個まで、最大で５０個まで、最大で６０個まで、最大で７０個まで、最大で８０個まで、最大で９０個まで、最大で１００個まで、最大で１２５個まで、最大で１５０個まで、最大で１７５個まで、最大で２００個まで、最大で２５０個まで、最大で３００個まで、最大で３５０個まで、最大で４００個まで、最大で４５０個まで、最大で５００個まで、最大で５５０個まで、最大で６００個まで、最大で６５０個まで、最大で７００個まで、最大で７５０個まで、最大で８００個まで、最大で８５０個まで、最大で９００個まで、最大で９５０個まで、最大で１０００個まで、最大で１１００個まで、最大で１２００個まで、最大で１３００個まで、最大で１４００個まで、最大で１５００個までの連続したアミノ酸残基のアミノ酸配列を含み得る。他のフラグメントは、１個以上のポリペプチドドメイン、例えば、上記膜貫通ドメインを省いている。
【００８５】
本発明の変異型ソルターゼＣ酵素は、線毛を形成するために、野生型連鎖球菌ソルターゼＣ酵素によってインビボで骨格タンパク質およびアクセサリータンパク質の重合に類似した様式で、これらポリペプチドを重合する。これら方法に従って生成された上記重合したポリペプチドは、従って、連鎖球菌によってインビボで生成された線毛に構造的に類似である。
【００８６】
グラム陽性細菌の線毛は、ピリンサブユニットのうちの２つもしくは３ついずれかのタイプから構築される。２成分線毛において、線毛のシャフトは、メジャーなピリンサブユニットの複数コピーによって形成される一方で、線毛の先端は、代表的には、アドヘシンとして機能しているマイナーな「先端」ピリンサブユニットの単一コピーを含む。３成分線毛は、類似であるが、それらはまた、細胞壁に共有結合しているマイナーな「基底」ピリンサブユニットを含む。いくつかの透過型電子顕微鏡検査（ＥＭ）および免疫金標識研究から、おそらく、上記ソルターゼ酵素は、認識する基質が雑多であるので、上記マイナーな「基底」ピリンサブユニットがまた、線毛のシャフト全体に散在しているという結論がもたらされた。。
【００８７】
上記変異型ソルターゼＣ酵素は、モノマー線毛の形成をもたらす１種のポリペプチドと接触させられ得る。例えば、上記変異型ソルターゼ酵素は、ＧＢＳ８０、ＧＢＳ５９もしくはＲｒｇＢと接触させられ得、それぞれ、ＧＢＳ８０、ＧＢＳ５９もしくはＲｒｇＢのサブユニットを含むモノマー線毛の形成がもたらされる。上記ポリペプチドがグラム陽性細菌に由来する場合、そのポリペプチドを重合するために使用される上記変異型ソルターゼ酵素は、同じグラム陽性細菌由来である必要はない。従って、ＧＢＳに由来する変異型ソルターゼＣ酵素は、ＧＢＳ由来のタンパク質だけでなく、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／もしくはＧＡＳ由来であるタンパク質をも重合するために使用され得る。いくつかの線毛タンパク質の改変体（例えば、ＧＢＳ５９）は、一般的に交差防御性ではない。従って、個々の線毛内のこれら改変体のうちの少なくとも２種、３種、４種、５種、６種以上の組み合わせを重合する能力は有利であり、例えば、より複雑な組成物の必要性、または交差防御性を達成するためにタンパク質融合物の使用を回避する。詳細には、インビトロで重合した線毛は、ＧＢＳ株である５１５、ＣＪＢ１１１、Ｈ３６Ｂ、２６０３、ＤＫ２１および０９０に由来するＧＢＳ５９改変体の組み合わせ、より詳細には、ＧＢＳ株である５１５、ＣＪＢ１１１、Ｈ３６Ｂおよび２６０３に由来するＧＢＳ５９改変体の組み合わせを含み得る。ＧＢＳ５９のうちの２種以上の改変体を含むこのような線毛は、天然には見いだされない。なぜなら、野生型細菌の株は、骨格タンパク質の唯一の改変体（ＢＰ−２ａ／ＧＢＳ５９）を発現するからである。
【００８８】
あるいは、上記変異型ソルターゼＣ酵素は、１種、２種、３種、４種、５種以上のグラム陽性細菌に由来し得る２種、３種、４種、５種以上の異なるポリペプチドと接触させられ得、キメラ線毛の形成がもたらされる。上記変異型ソルターゼＣ酵素は、その細菌由来の天然の連鎖球菌線毛中に組み合わせにおいて見いだされる単一のグラム陽性細菌に由来する上記骨格タンパク質およびアクセサリータンパク質と接触させられ得、天然に存在する線毛に対して構造が同一であるキメラ線毛を生じる。このようなキメラ線毛は、線毛をグラム陽性細菌から単離するために現在使用される骨の折れる精製プロセスなしに、線毛特性の研究を可能にするための有用なツールである。
【００８９】
さらに、上記で考察されるように、本発明の方法によって生成されるモノマー線毛およびキメラ線毛の三次元構造は、それらを個々の組換えタンパク質の投与と比較して、免疫化の目的に関して特に簡便かつ有効にする。実際に、防御アッセイから、これら線毛は、これが由来した連鎖球菌属の細菌に対して防御を誘導するにあたってモノマー組換えタンパク質より有効であることが示された。上記線毛は、モノマー組換えタンパク質において再現されない、インビボで線毛に存在するエピトープを含み、詳細には、このようなエピトープは、構造エピトープであることがこの理由であり得ると仮定される。
【００９０】
本発明は、本発明の方法を使用して得られたかもしくは得ることができる線毛を含む。いくつかの局面において、これら線毛で見いだされるポリペプチドの組み合わせは、連鎖球菌において天然に存在する線毛で見いだされるポリペプチドの組み合わせとは異なる。本発明の方法に従って生成され得る線毛の例としては、上記の連鎖球菌属の骨格タンパク質および／もしくは付属タンパク質を含むかまたはこれらからなる線毛が挙げられる。いくつかの実施形態において、これら線毛は、ＧＢＳ、ＧＡＳもしくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅにおいて見いだされる天然に存在する線毛で見いだされるポリペプチドの組み合わせを含まない。特に、インビトロで重合した線毛は、それらの組成に関して、天然に存在する線毛とは異なる。例えば、アシル酵素中間体が野生型ソルターゼに結合されないが、本発明の変異型ソルターゼには結合されるからである。他の場合において、インビトロで重合した線毛は、細胞壁／膜成分（例えば、脂質ＩＩもしくはＭｕｒＮＡｃ−Ｎ−アセチル−ムラミン酸のようなペプチドグリカンの前駆体）を含まない。さらに別の場合では、インビトロで重合した線毛は、天然で見いだされない線毛タンパク質の組み合わせを含む。従って、インビトロで重合した線毛は、天然に存在するものとは区別され得る。従って、用語「人工の」とは、合成の、もしくは非細胞由来の組成、詳細には、インビトロで合成されかつ、連鎖球菌属のような天然の細菌において見いだされる構造とは同一でない構造に言及する。
【００９１】
（線毛を含む免疫原性組成物）
本発明は、本発明の方法によって得られ得るかもしくは得ることができる上記の線毛を含む免疫原性組成物を提供する。用語「免疫原性」とは、上記線毛が、被験体（好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒトもしくはマウス）を免疫化するために使用される場合、上記線毛を構成するポリペプチドに対して免疫応答（例えば、細胞媒介性および／もしくは抗体応答）を誘発し得ることを意味するために使用される。詳細には、上記免疫応答は、防御免疫を提供する防御免疫応答である。
【００９２】
本発明の免疫原性組成物は、ワクチンとして有用であり得る。本発明に従うワクチンは、予防的（すなわち、感染を防止するため）もしくは治療的（すなわち、感染を処置するため）のいずれかであり得るが、代表的には、予防的である。予防的ワクチンは、疾患からの完全な防御を保証しない。なぜなら、たとえ患者が抗体を発生させるとしても、免疫系が上記感染を撃退し得る前に、遅れもしくは遅延があり得るからである。従って、および疑いを回避するためにも、用語予防ワクチンはまた、例えば、このような感染の重篤度もしくは継続期間を低減することによって、将来的な感染の影響を改善するワクチンに言及し得る。
【００９３】
用語「感染に対する防御」および／もしくは「防御免疫を提供する」とは、被験体の免疫系が、免疫応答を誘発し、感染を撃退するように刺激された（例えば、ワクチン接種によって）ことを意味する。詳細には、誘発された免疫応答は、多くの種々の細菌株に対する感染を撃退し得る。ワクチン接種された被験体は、従って、感染し得るが、コントロール被験体より上記感染をよりよく撃退し得る。
【００９４】
組成物は、従って、薬学的に受容可能であり得る。それらは、通常、抗原に加えて、成分を含む。例えば、それらは、代表的には、１種以上の薬学的に受容可能なキャリアおよび／もしくは賦形剤を含む。このような成分の詳細な考察は、参考文献［８］において入手可能である。
【００９５】
組成物は、一般に、水性形態で哺乳動物に投与される。しかし、投与前に、上記組成物は、非水性形態であってもよい。例えば、いくつかのワクチンは、水性形態で製造され、その後、それらは充填され、同様に水性形態で分配され、そして投与されるが、他のワクチンは、製造の間に凍結乾燥され、使用時に水性形態へと再構成される。従って、本発明の組成物は、乾燥させられ得る（例えば、凍結乾燥処方物）。
【００９６】
上記組成物は、保存剤（例えば、チメロサールもしくは２−フェノキシエタノール）を含み得る。しかし、上記ワクチンが水銀物質を実質的に含まないべきである（すなわち、５μｇ／ｍｌ未満）、例えば、チメロサールを含まないべきであることは好ましい。水銀を含まないワクチンは、より好ましい。保存剤を含まないワクチンは、特に好ましい。
【００９７】
熱安定性を改善するために、組成物は、温度保護剤を含み得る。このような薬剤のさらなる詳細は、以下に提供される。
【００９８】
張度を制御するために、生理学的塩（例えば、ナトリウム塩）を含むことは、好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、これは、１〜２０ｍｇ／ｍｌの間、例えば、約１０±２ｍｇ／ｍｌ  ＮａＣｌで存在し得る。存在し得る他の塩としては、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム二水和物（ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが挙げられる。
【００９９】
組成物は、一般に、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、好ましくは、２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの質量オスモル濃度を有し、より好ましくは、２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内に入る。
【０１００】
組成物は、１種以上の緩衝液を含み得る。代表的な緩衝液としては、リン酸緩衝液；Ｔｒｉｓ緩衝液；ホウ酸緩衝液；コハク酸緩衝液；ヒスチジン緩衝液（特に、水酸化アルミニウムアジュバントとともに）；もしくはクエン酸緩衝液が挙げられる。緩衝液は、代表的には、５〜２０ｍＭ範囲で含まれる。
【０１０１】
組成物のｐＨは、一般に、５．０〜８．１の間、より代表的には、６．０〜８．０の間、例えば、６．５〜７．５の間、もしくは７．０〜７．８の間である。
【０１０２】
上記組成物は、好ましくは無菌である。上記組成物は、好ましくは、非発熱性であり、例えば、＜１  ＥＵ（エンドトキシンユニット、標準尺度）／用量、および好ましくは、＜０．１  ＥＵ／用量を含む。上記組成物は、好ましくは、グルテンを含まない。
【０１０３】
上記組成物は、単回の免疫化のための材料を含んでいてもよいし、複数回の免疫化のための材料を含んでいてもよい（すなわち、「複数用量」キット）。保存剤を含めることは、複数用量の配置には好ましい。複数用量組成物に保存剤を含める代替として（もしくはそれに加えて）、上記組成物は、材料を取り出すための無菌アダプターを有する容器に含められ得る。
【０１０４】
ヒトワクチンは、代表的には、約０．５ｍｌの投与容積で投与されるが、半用量（すなわち、約０．２５ｍｌ）が小児に投与されてもよい。
【０１０５】
本発明の免疫原性組成物はまた、１種以上の免疫調節剤を含み得る。好ましくは、上記免疫調節剤のうちの１種以上は、１種以上のアジュバントを含む。上記アジュバントは、以下でさらに考察される、ＴＨ１アジュバントおよび／もしくはＴＨ２アジュバントを含み得る。
【０１０６】
本発明の組成物において使用され得るアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
・無機塩（ｍｉｎｅｒａｌ  ｓａｌｔ）（塩酸塩（例えば、オキシヒドロキシド）、リン酸塩（例えば、ヒドロキシホスフェート、オルトホスフェート）および硫酸塩などを含む、例えば、アルミニウム塩およびカルシウム塩）［例えば、参考文献９の第８章よび第９章を参照のこと］；
・水中油型エマルジョン（例えば、スクアレン−水エマルジョン）、ＭＦ５９（５％  スクアレン、０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、および０．５％  Ｓｐａｎ  ８５、マイクロフルイダイザーを使用してサブミクロン粒子に処方）［参考文献９の第１０章、参考文献１０〜１３、参考文献１４の第１０章および参考文献１５の第１２章もまた参照のこと］、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を含む；
・サポニン処方物［参考文献９の第２２章］、例えば、ＱＳ２１［１６］およびＩＳＣＯＭ［参考文献９の第２３章］；
・ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）［１７〜２３］；
・細菌誘導体もしくは微生物誘導体、例えば、腸内細菌のリポポリサッカリド（ＬＰＳ）の非毒性誘導体、リピドＡ誘導体［２４，２５］、免疫刺激性オリゴヌクレオチド［２６−３１］、例えば、ＩＣ−３１ＴＭ［３２］（２６マー配列５’−（ＩＣ）１３−３’  （配列番号４６）を含むデオキシヌクレオチド、および１１マーアミノ酸配列ＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ（配列番号４７）を含むポリカチオン性ポリマーペプチド）、ならびにＡＤＰ−リボシル化毒素およびその無毒化誘導体［３３−４２］；
・インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２［４３，４４］、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、ならびに腫瘍壊死因子のようなサイトカインを含むヒト免疫モジュレーター；
・生体接着剤および粘膜接着剤、例えば、キトサンおよびその誘導体、エステル化ヒアルロン酸ミクロスフェア［４５］もしくは粘膜接着剤、例えば、ポリ（アクリル酸）の架橋誘導体、ポリビニルアルコール、ポリビニルピリリドン、ポリサッカリドおよびカルボキシメチルセルロース［４６］；
・生分解性でありかつ非毒性である物質（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）から形成される微粒子（すなわち、約１００ｎｍ〜約１５０μｍ直径、より好ましくは、約２００ｎｍ〜約３０μｍ直径、および最も好ましくは、約５００ｎｍ〜約１０μｍ直径の粒子）；
・リポソーム［参考文献９の第１３章および第１４章、参考文献４７−４９］；
・ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル［５０］；
・ＰＣＰＰ処方物［５１および５２］；
・ムラミルペプチド（Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−ｌ−アラニル−ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、およびＮ−アセチルムラミル−ｌ−アラニル−ｄ−イソグルタミニル−ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）が挙げられる）；ならびに
・イミダゾキノロン化合物（イミキモドおよびそのホモログ（例えば、「Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ  ３Ｍ」）が挙げられる）［５３および５４］。
【０１０７】
本発明の免疫原性組成物およびワクチンはまた、上記で同定されたアジュバントのうちの１種以上の局面の組み合わせを含み得る。例えば、以下のアジュバント組成物は、本発明において使用され得る：（１）サポニンおよび水中油型エマルジョン［５５］；（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）［５６］；（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；（４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて、＋ステロール）［５７］；（５）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／もしくは水中油型エマルジョンとの組み合わせ［５８］；（６）ＳＡＦ（サブミクロンエマルジョンへと微小流動化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅ）されたか、またはより大きな粒度のエマルジョンを生成するためにボルテックスされたかのいずれかの、１０％  スクアラン、０．４％  Ｔｗｅｅｎ  ８０ＴＭ、５％  プルロニック−ブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含む）。（７）２％  スクアレン、０．２％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、ならびにモノホスホリルリピド（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｉｐｉｄ）Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ）からなる群に由来する１種以上の細菌細胞壁成分を含む、ＲｉｂｉＴＭ  アジュバントシステム（ＲＡＳ），（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）；ならびに（８）１種以上の無機塩（例えば、アルミニウム塩）＋ＬＰＳの非毒性誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）。免疫刺激剤として作用する他の物質は、参考文献９の第７章に開示されている。
【０１０８】
水酸化アルミニウムおよび／もしくはリン酸アルミニウムアジュバントの使用は、特に好ましく、抗原は、一般に、これら塩に吸着される。リン酸カルシウムは、別の好ましいアジュバントである。他の好ましいアジュバントの組み合わせとしては、Ｔｈ１およびＴｈ２アジュバントの組み合わせ（例えば、ＣｐＧとミョウバン、もしくはｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄとミョウバン）が挙げられる。リン酸アルミニウムと３ｄＭＰＬとの組み合わせが使用され得る（これは、肺炎球菌の免疫化において有効であると報告された［５９］）。
【０１０９】
本発明の組成物は、細胞媒介性免疫応答および体液性免疫応答の両方を誘発し得る。この免疫応答は、好ましくは、長期間持続する（例えば、中和）抗体および感染への曝露の際に迅速に応答し得る細胞媒介性免疫を誘導する。
【０１１０】
Ｔ細胞の２タイプ（ＣＤ４細胞およびＣＤ８細胞）が、一般に、細胞媒介性免疫および体液性免疫を開始および／もしくは増強するために必要と考えられる。ＣＤ８  Ｔ細胞は、ＣＤ８共レセプターを発現し得、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）と一般にいわれる。ＣＤ８  Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子上で提示される抗原を認識しこれと相互作用し得る。
【０１１１】
ＣＤ４  Ｔ細胞は、ＣＤ４共レセプターを発現し得、Ｔヘルパー細胞と一般にいわれる。ＣＤ４  Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合される抗原性ペプチドを認識し得る。ＭＨＣクラスＩＩ分子と相互作用する際に、上記ＣＤ４細胞は、サイトカインのような因子を分泌し得る。これら分泌されたサイトカインは、Ｂ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、マクロファージ、および免疫応答に関与する他の細胞を活性化し得る。ヘルパーＴ細胞もしくはＣＤ４＋細胞は、２つの機能的に別個のサブセットへとさらに分けられ得る：ＴＨ１表現型およびＴＨ２表現型であり、これらは、そのサイトカインおよびエフェクター機能が異なる。
【０１１２】
活性化ＴＨ１細胞は、細胞性免疫を増強し（抗原特異的ＣＴＬ生成における増大を含む）、従って、細胞内感染に応じて、特に価値がある。活性化ＴＨ１細胞は、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−βのうちの１種以上を分泌し得る。ＴＨ１免疫応答は、マクロファージ、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞、およびＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を活性化することによって、局所炎症反応を生じ得る。ＴＨ１免疫応答はまた、ＩＬ−１２でＢ細胞およびＴ細胞の増殖を刺激することによって、上記免疫応答を拡げるように作用し得る。ＴＨ１刺激Ｂ細胞は、ＩｇＧ２ａを分泌し得る。
【０１１３】
活性化ＴＨ２細胞は、抗体生成を増強し、従って、細胞外感染への応答に価値がある。活性化ＴＨ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０のうちの１種以上を分泌し得る。ＴＨ２免疫応答は、ＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡの生成、および将来的な防御のために記憶Ｂ細胞を生じ得る。
【０１１４】
増強された免疫応答は、増強されたＴＨ１免疫応答およびＴＨ２免疫応答のうちの１つ以上を含み得る。
【０１１５】
ＴＨ１免疫応答は、ＣＴＬの増大、ＴＨ１免疫応答と関連するサイトカインのうちの１種以上（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−β）の増大、活性化マクロファージの増大、ＮＫ活性の増大、またはＩｇＧ２ａの生成の増大のうちの１つ以上を含み得る。好ましくは、上記増強されたＴＨ１免疫応答は、ＩｇＧ２ａ生成の増大を含む。
【０１１６】
ＴＨ１免疫応答は、ＴＨ１アジュバントを使用して誘発され得る。ＴＨ１アジュバントは、一般に、アジュバントなしの抗原での免疫化と比較して、増大したＩｇＧ２ａ生成レベルを誘発する。本発明における使用に適したＴＨ１アジュバントとしては、例えば、サポニン処方物、ビロソームおよびウイルス様粒子、腸内細菌リポポリサッカリド（ＬＰＳ）の非毒性誘導体、免疫刺激性オリゴヌクレオチドが挙げられ得る。免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド）は、本発明における使用に好ましいＴＨ１アジュバントである。
【０１１７】
ＴＨ２免疫応答は、ＴＨ２免疫応答と関連するサイトカインのうちの１種以上の（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０）の増大、またはＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡの生成および記憶Ｂ細胞の増大のうちの１つ以上を含み得る。好ましくは、上記増強されたＴＨ２免疫応答は、ＩｇＧ１生成の増大を含む。
【０１１８】
ＴＨ２免疫応答は、ＴＨ２アジュバントを使用して誘発され得る。ＴＨ２アジュバントは、一般に、アジュバントなしの抗原での免疫化と比較して、増大したＩｇＧ１生成レベルを誘発する。本発明における使用に適したＴＨ２アジュバントとしては、例えば、ミネラル含有組成物、オイルエマルジョン、およびＡＤＰリボシル化毒素およびその無毒化誘導体が挙げられる。ミネラル含有組成物（例えば、アルミニウム塩）は、本発明における使用に好ましいＴＨ２アジュバントである。
【０１１９】
好ましくは、本発明は、ＴＨ１アジュバントおよびＴＨ２アジュバントの組み合わせを含む組成物を含む。好ましくは、このような組成物は、増強されたＴＨ１応答および増強されたＴＨ２応答、すなわち、アジュバントなしでの免疫化と比較して、ＩｇＧ１生成およびＩｇＧ２ａ生成の両方の増大を誘発する。さらにより好ましくは、上記ＴＨ１アジュバントおよびＴＨ２アジュバントの組み合わせを含む組成物は、単一のアジュバントでの免疫化と比較して（すなわち、ＴＨ１アジュバント単独での免疫化もしくはＴＨ２アジュバント単独での免疫化と比較して）、増大したＴＨ１免疫応答および／もしくは増大したＴＨ２免疫応答を誘発する。
【０１２０】
上記免疫応答は、ＴＨ１免疫応答およびＴＨ２免疫応答のうちの一方もしくは両方であり得る。好ましくは、免疫応答は、増強されたＴＨ１応答および増強されたＴＨ２応答のうちの一方もしくは両方を提供する。
【０１２１】
上記増大した免疫応答は、全身免疫応答および粘膜免疫応答のうちの一方もしくは両方であり得る。好ましくは、上記免疫応答は、増強された全身免疫応答および増強された粘膜免疫応答のうちの一方もしくは両方を提供する。好ましくは、上記粘膜免疫応答は、ＴＨ２免疫応答である。好ましくは、上記粘膜免疫応答は、ＩｇＡの生成の増大を含む。
【０１２２】
本発明の組成物は、種々の形態で調製され得る。例えば、上記組成物は、注射剤として、液体の溶液もしくは懸濁物のいずれかとして、調製され得る。注射の前に液体ビヒクル中の溶液もしくは懸濁物に適した固体形態もまた、調製され得る（例えば、凍結乾燥組成物もしくは噴霧−凍結乾燥組成物）。上記組成物は、局所投与のために、例えば、軟膏剤、クリームもしくは散剤として、調製され得る。上記組成物は、経口投与のために、例えば、錠剤もしくはカプセル剤として、スプレーとして、またはシロップ剤（必要に応じて、矯味矯臭されている）として、調製され得る。上記組成物は、肺投与のために、例えば、微細な散剤もしくはスプレーを使用する吸入器として調製され得る。上記組成物は、坐剤もしくはペッサリーとして調製され得る。上記組成物は、非経口もしくは針なしでの投与（例えば、皮内投与）のために、固体剤形として調製され得る。上記組成物は、鼻、耳もしくは眼への投与のために、例えば、滴剤として、調製され得る。上記組成物は、組み合わせた組成物が、患者に投与する直前に再構成されるように設計されたキット形態にあり得る。このようなキットは、液体形態にある１種以上の抗原および１種以上の凍結乾燥抗原を含み得る。
【０１２３】
組成物が使用直前に調製される予定であり（例えば、成分が凍結乾燥形態で提示されている場合）、キットとして提示されている場合、上記キットは、２本のバイアルを含んでいてもよいし、１本の準備の整った充填されたシリンジおよび１本のバイアルを含んでいてもよい。上記シリンジの内容物は、注射前にバイアルの内容物を再活性化するために使用される。
【０１２４】
ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的に有効な量の上記線毛、ならびに必要な場合には、任意の他の成分を含む。「免疫学的に有効な量」とは、個体へのその量の投与が、単一用量において、もしくは一連のものの一部としてのいずれでも、処置もしくは予防に有効であることを意味する。この量は、上記処置される個体の健康状態および身体的状態、年齢、処置される個体の分類群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、上記個体の免疫系が抗体を合成する能力、所望される防御の程度、ワクチンの処方、処置している医師の医療的状況の評価、ならびに他の関連要因に依存して変動する。上記量が、慣用的な治験を介して決定され得る比較的広い範囲に入ることは、予測される。免疫学的に有効な量の例は、おおよそ０．１μｇ〜１０μｇの線毛、例えば、０．５μｇ〜１０μｇの線毛である。
【０１２５】
上述のように、組成物は、温度保護剤を含み得、この成分は、アジュバント添加（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）組成物（特に、ミネラルアジュバント（例えば、アルミニウム塩）を含むもの）において特に有用であり得る。参考文献６０に記載されるように、液体温度保護剤は、その凝固点を下げるために、例えば、０℃未満へと凝固点を下げるために、水性ワクチン組成物に添加され得る。従って、上記組成物は、熱分解を阻害するために、０℃未満で（しかしその凝固点より高い）貯蔵され得る。上記温度保護剤はまた、無機塩アジュバントを、凍結融解後の凝塊形成もしくは沈降から保護しながら、上記組成物の凍結を可能にし、また、高温（例えば、４０℃より高い）において上記組成物を保護し得る。出発水性ワクチンおよび上記液体温度保護剤は、上記液体温度保護剤が最終混合物のうちの１〜８０容積％を形成するように混合され得る。適切な温度保護剤は、ヒトへの投与に安全であるべきであり、水中で容易に混和性／可溶性であるべきであり、上記組成物中の他の成分（例えば、抗原およびアジュバント）を損傷すべきではない。例としては、グリセリン、プロピレングリコール、および／もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。適切なＰＥＧは、２００〜２０，０００Ｄａの範囲に及ぶ平均分子量を有し得る。好ましい実施形態において、上記ポリエチレングリコールは、約３００Ｄａの平均分子量を有し得る（「ＰＥＧ−３００」）。
【０１２６】
（処置方法、およびワクチン投与）
本発明はまた、哺乳動物において免疫応答を惹起するための方法を提供し、上記方法は、有効量の本発明の組成物、または本発明の線毛を投与する工程を包含する。上記免疫応答は、好ましくは、防御的であり、好ましくは、抗体および／もしくは細胞媒介性免疫を含む。上記方法は、ブースター応答を惹起し得る。
【０１２７】
本発明はまた、例えば、被験体（例えば、哺乳動物）において免疫応答を惹起することにおいて使用するための、医薬として使用するための免疫原性組み合わせ物もしくは組成物を提供する。
【０１２８】
本発明はまた、哺乳動物において免疫応答を惹起するための医薬の製造における、本発明の線毛の使用を提供する。
【０１２９】
これら使用および方法により上記哺乳動物において免疫応答を惹起することによって、上記哺乳動物は、上記線毛中のポリペプチドが由来する細菌によって引き起こされる疾患から防御され得る。特に、上記哺乳動物は、連鎖球菌（ＧＡＳ、ＧＢＳおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅが挙げられる）によって引き起こされる疾患から防御され得る。本発明はまた、本発明の免疫原性組成物が予め充填された送達デバイスを提供する。
【０１３０】
上記哺乳動物は、好ましくは、ヒト、大型の獣医学上の哺乳動物（例えば、ウマ、ウシ、シカ、ヤギ、ブタ）および／もしくは飼い慣らされたペット（例えば、イヌ、ネコ、アレチネズミ、ハムスター、モルモット、チンチラ）である。最も好ましくは、上記哺乳動物は、ヒト（例えば、ヒト患者）である。上記ワクチンが予防用である場合、上記ヒトは、小児（例えば、よちよち歩きの幼児もしくは乳児）またはティーンエイジャーであり得る；上記ワクチンが治療用である場合、上記ヒトは、ティーンエイジャーもしくは成人であり得る。小児用に意図されたワクチンはまた、成人に、例えば、安全性、投与量、免疫原性などを評価するために投与され得る。哺乳動物（例えば、ヒト、例えば、患者）は、疾患自体に由来するリスクがあり得るか、または妊娠している雌性（例えば、女性）であり得る（「母体免疫化」）かのいずれかであり得る。妊娠している雌性のワクチン接種は、新生児（新生仔）の哺乳動物に抗体媒介性受動防御を提供する手段として有利であり得る。母体受動免疫は、天然に獲得される受動免疫の１タイプであり、妊娠の間にその母親によって胎児へと伝達される抗体媒介性免疫をいう。母体抗体（ＭａｔＡｂ）は、胎盤の細胞にあるＦｃＲｎレセプターによって胎児へと胎盤を通過して渡る。これは、妊娠３ヶ月くらいで起こる。詳細には、上記抗体は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）もしくは免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）である。ＩｇＧｙ抗体アイソタイプは、妊娠の間に胎盤を通過し得る。受動免疫はまた、母乳中に見いだされるＩｇＡ抗体の移行を介して提供され得、それは乳児の消化管へと移り、新生児が自身の抗体を合成できる様になるまで、細菌感染から防御する。
【０１３１】
治療的処置の効力をチェックする１つの方法は、本発明の組成物の投与後に感染をモニターすることを含む。予防処置の効力をチェックする１つの方法は、上記組成物の投与後に、本発明の線毛中の抗原に対する免疫応答を、全身で（例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの生成レベルをモニターする）および／もしくは粘膜で（例えば、ＩｇＡの生成レベルをモニターする）モニターすることを含む。代表的には、抗原特異的血清抗体応答は、免疫化後に、しかしチャレンジ前に決定されるのに対して、抗原特異的粘膜抗体応答は、免疫化後かつチャレンジ後に決定される。
【０１３２】
本発明の組成物の免疫原性を評価する別の方法は、イムノブロットおよび／もしくはマイクロアレイによって患者血清もしくは粘膜分泌物をスクリーニングするために、上記タンパク質を組換え発現することである。上記タンパク質と上記患者サンプルとの間の陽性反応は、上記患者が問題のタンパク質に対する免疫応答を開始したことを示す。この方法はまた、抗原内の免疫優勢（ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ）抗原および／もしくはエピトープを同定するために使用され得る。
【０１３３】
本発明の組成物の効力はまた、感染動物モデル（例えば、モルモットもしくはマウス）を上記ワクチン組成物でチャレンジすることによって、インビボで決定され得る。
【０１３４】
本発明の組成物は、一般に、患者に直接投与される。直接送達は、非経口注射（例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、もしくは組織の間質空間に）、または粘膜に（例えば、直腸、経口（例えば、錠剤、スプレー）、膣、局所、経真皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）または経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、鼻内、眼、耳、肺もしくは他の粘膜投与）によって達成され得る。
【０１３５】
本発明は、全身および／もしくは粘膜免疫を誘発するために、好ましくは、増強された全身および／もしくは粘膜免疫を誘発するために、使用され得る。
【０１３６】
好ましくは、上記増強された全身および／もしくは粘膜免疫は、増強されたＴＨ１および／もしくはＴＨ２の免疫応答に反映される。好ましくは、上記増強された免疫応答は、ＩｇＧ１および／もしくはＩｇＧ２ａおよび／もしくはＩｇＡの生成の増大を含む。
【０１３７】
投与量は、単一用量スケジュールもしくは複数用量スケジュールによってであり得る。複数用量は、一次免疫化スケジュールおよび／もしくはブースター免疫化スケジュールにおいて使用され得る。複数用量スケジュールにおいて、種々の用量は、同じもしくは異なる投与経路（例えば、非経口初回刺激（ｐｒｉｍｅ）および粘膜追加刺激（ｂｏｏｓｔ）、粘膜初回刺激および非経口追加刺激など）によって与えられ得る。複数用量は、代表的には、少なくとも１週間（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）離して投与される。
【０１３８】
本発明に従って調製されるワクチンは、小児および成人の両方を処置するために使用され得る。従って、ヒト患者は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、もしくは少なくとも５５歳であり得る。上記ワクチンを受けるのに好ましい患者は、高齢者（例えば、≧５０歳、≧６０歳、および好ましくは、≧６５歳）、若年者（例えば、≦５歳）、入院患者、ヘルスケアワーカー、軍隊および軍の職員、妊娠女性、慢性疾患患者、もしくは免疫不全患者である。上記ワクチンは、これら群に関してのみ適切であるわけではないが、集団においてより一般的に使用され得る。
【０１３９】
本発明によって生成されるワクチンは、他のワクチン（例えば、麻疹ワクチン、ムンプス・ワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、結合体化Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅタイプｂワクチン、不活化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌結合型ワクチン（例えば、四価Ａ−Ｃ−Ｗ１３５−Ｙワクチン）、ＲＳウイルスワクチンなど）と実質的に同時（例えば、同じ医療相談の間に、またはヘルスケア専門家およびワクチン接種施設への訪問の間に）に患者に投与され得る。
【０１４０】
（本発明の組成物のさらなる抗原性成分）
本発明はまた、少なくとも１種のさらなる抗原をさらに含む組成物を提供する。
【０１４１】
特に、本発明はまた、本発明のポリペプチドおよび以下のさらなる抗原のうちの１種以上を含む組成物を提供する：
−Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５および／もしくはＹ（好ましくは、４種全て）に由来する糖抗原。
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の糖抗原もしくはポリペプチド抗原［例えば、６１，６２］。
−Ａ型肝炎ウイルス由来の抗原（例えば、不活性化ウイルス）［例えば、６４，６５］。
−Ｂ型肝炎ウイルス由来の抗原（例えば、表面抗原および／もしくはコア抗原［例えば、６５，６６］。
−ジフテリア抗原（例えば、ジフテリアトキソイド）［例えば、参考文献６７の第３章］もしくはＣＲＭ１９７変異体［例えば、６８］。
−破傷風抗原（例えば、破傷風トキソイド）［例えば、参考文献６７の第４章］
−所望により、また、ペルタクチンおよび／または凝集原２および３とも組み合わせた、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓに由来する百日咳ホロトキシン（ＰＴ）および線維状ヘマグルチニン（ＦＨＡ）など、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓに由来する抗原［例えば、参考文献６９＆７０］）。
−Ｂ型Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに由来する糖抗原［例えば、７１］。
−ＩＰＶなど、ポリオ抗原（複数可）［例えば、７２，７３］。
−麻疹抗原、ムンプス抗原、および／または風疹抗原［例えば、参考文献６７の第９章、第１０章および第１１章］。
−ヘマグルチニン表面タンパク質および／またはノイラミニダーゼ表面タンパク質など、インフルエンザ抗原（複数可）［例えば、参考文献６７の第１９章］。
−Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ由来の抗原［例えば、７４］。
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌）由来のタンパク質抗原［例えば、７５，７６］。
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌）由来の糖抗原。
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群連鎖球菌）由来の抗原［例えば、７６，７７，７８］。
−Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ由来の抗原［例えば、７９］。
−Ｅ．ｃｏｌｉ由来の抗原。
【０１４２】
上記組成物は、これらさらなる抗原のうちの１種以上を含み得る。
【０１４３】
毒性タンパク質抗原は、必要であれば無毒化され得る（例えば、化学的手段および／もしくは遺伝的手段による百日咳毒素の無毒化［７０］）。
【０１４４】
ジフテリア抗原が上記組成物に含まれる場合、破傷風抗原および百日咳抗原を含むこともまた、好ましい。同様に、破傷風抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および百日咳抗原を含むこともまた、好ましい。同様に、百日咳抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および破傷風抗原を含むこともまた、好ましい。ＤＴＰの組み合わせは、従って、好ましい。
【０１４５】
糖抗原は、好ましくは、結合体の形態にある。上記結合体のキャリアタンパク質としては、ジフテリア毒素、破傷風毒素、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質［８０］、合成ペプチド［８１，８２］、熱ショックタンパク質［８３，８４］、百日咳タンパク質［８５，８６］、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のプロテインＤ［８７］、サイトカイン［８８］、リンホカイン［８８］、連鎖球菌タンパク質、ホルモン［８８］、増殖因子［８８］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素ＡもしくはＢ［８９］、鉄取り込みタンパク質［９０］などが挙げられる。好ましいキャリアタンパク質は、ジフテリア毒素のＣＲＭ１９７変異体である［９１］。
【０１４６】
上記組成物中の抗原は、代表的には、各々、少なくとも１μｇ／ｍｌの濃度で存在する。一般に、任意の所定の抗原の濃度は、その抗原に対する免疫応答を誘発するために十分である。
【０１４７】
本発明の免疫原性組成物においてタンパク質抗原を使用する代替手段として、上記抗原をコードする核酸（好ましくは、ＤＮＡ、例えば、プラスミドの形態にある）が使用され得る。
【０１４８】
抗原は、好ましくは、アルミニウム塩に吸着される。
【０１４９】
驚くべきことに、本発明者らは、上記ピリンモチーフが、このモチーフの存在が必須である上記野生型ソルターゼ（上記変異体が由来している）とは対照的に、本発明の変異型ソルターゼによる重合に必要とされないことを発見した。さらに、本発明の変異型ソルターゼは、上記酵素と上記ＬＰＸＴＧ様ソーティングシグナルとの間のアシル中間体を分離するために、種々の求核剤を使用し得る。対照的に、上記変異型ソルターゼが由来する野生型ソルターゼは、リジン残基の存在を必要とする。本発明の変異型ソルターゼは、ペプチド転移反応を触媒し、ＧＢＳ線毛タンパク質のポリマーを形成するにあたって、インビトロで有効である。本発明の変異型ソルターゼは、種々のタンパク質工学適用においてさらに有用である。本発明のソルターゼとグラム陽性細菌における他の線毛関連ソルターゼとの間の構造の差異は、新たな機能性を提供し得、新たなインビトロでの方法が行われることを可能にし得るか、または重合および連結反応がより効率的に行われることを可能にし得る。
【０１５０】
本発明の変異型ソルターゼ酵素は、上記ＬＰＸＴＧ認識モチーフ（もしくは上記で挙げたもの）を含む任意の部分と、上記ペプチド転移反応を完了させるために求核剤を提供し得るアミノ酸残基を含む任意の部分との間の連結反応を行うために有用である。実施例に示されるように、本発明の変異型ソルターゼは、上記ＬＰＸＴＧモチーフを含む、骨格タンパク質および付属タンパク質を切断し、重合し得る。以前の研究では、細菌ソルターゼは、ペプチド転移反応を完了させるために求核剤を提供する単一のアミノ酸のみを必要とすることが示された（Ｐｒｏｆｔ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０１０，３２：１〜１０；Ｐｏｐｐら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９，１５，ＷＯ２０１０／０８７９９４）。
【０１５１】
本発明の方法の特定の実施形態において、連結状態にある上記第１の部分もしくは上記第２の部分のいずれかは、ポリペプチドであり、他の部分は、細胞の表面上のタンパク質もしくは糖タンパク質である。本発明のソルターゼは、ポリペプチドを細胞表面上のタンパク質に結合するために使用され得る。これは、例えば、細胞表面の特定のタンパク質を標識するために、特に有用であり得る。特定の実施形態において、上記細胞は、ＬＰＸＴＧモチーフを有する目的の表面タンパク質を発現するようにトランスフェクトされた。次いで、このモチーフは、本発明のソルターゼを使用する連結のために標的とされ得る。あるいは、上記タンパク質標識は、上記モチーフを含み得る。
【０１５２】
（線毛タンパク質以外の基質の連結のためのソルターゼの使用）
本発明の他の実施形態において、本発明の変異型ソルターゼは、タンパク質を固体支持体に連結するために使用され、上記第１の部分もしくは上記第２の部分のいずれかは、ポリペプチドであり、他の部分は、固体支持体に結合体化されたアミノ酸を含む。このような共有結合は、広範な洗浄が行われることを可能にする。特定のこのような実施形態において、上記タンパク質は、ＬＰＸＴＧモチーフを含み、上記固体支持体は、これに結合体化されたアミノ酸（例えば、リジン）を有する。特定の実施形態において、上記固体支持体は、ビーズ（例えば、ポリスチレンビーズもしくは金ビーズ）もしくは粒子（例えば、ナノ粒子）である。
【０１５３】
同様に、本発明の方法は、ポリペプチド鎖の環化を可能にする。このような実施形態において、上記第１の部分および上記第２の部分は、ポリペプチド鎖のＮ末端およびＣ末端であり、連結は、環状ポリペプチドの形成を生じる。
【０１５４】
細菌ソルターゼはまた、タンパク質改変および工学適用のために特に興味深い。ソルターゼは、骨格タンパク質と付属タンパク質との間のペプチド転移反応を触媒することによって、インビボでのピリン形成を促進する。ソルターゼは、認識モチーフ（例えば、ＬＰＸＴＧ）を認識して切断し、標的タンパク質とアミド結合を形成する。上記認識モチーフを利用することによって、種々のタンパク質工学機能が行われ得る。ソルターゼを使用して行われる連結反応は融通が利き、効率的であり、匹敵する化学連結技術より少ない工程しか必要としない。従って、本発明の別の目的は、タンパク質工学適用のために改善されたソルターゼを提供することである。ソルターゼ媒介性ペプチド転移（Ｓｏｒｔａｇｇｉｎｇ）技術は、当該分野で公知である。
【０１５５】
上記ソルターゼ変異体に加えて、他のソルターゼ酵素が連結のために使用され得る（例えば、ＧＢＳ病原性アイランドＰＩ−２ｂに由来する上記ソルターゼＳｒｔＣ１およびＳｒｔＣ２）。
【０１５６】
ＰＩ−２ｂの野生型ＳｒｔＣ１のアミノ酸配列は、配列番号５に示される。詳細には、ＳｒｔＣ１は、本発明の方法において使用される場合、シグナルペプチドもＮ末端膜貫通ドメインも含まない（配列番号９８、配列番号９９もしくは配列番号１００にあるとおり）。特定の好ましい実施形態において、本発明の方法において使用されるとおりのＳｒｔＣ１は、配列番号１０１を含み、これは、クローニングされた可溶性ドメインに対応する。ＳｒｔＣ１は、配列番号１０１を含み、これは、クローニングされた可溶性ドメインに対応する。特定の実施形態において、ＳｒｔＣ１は、Ｗ５５Ｆ変異（配列番号１０２にあるとおり）を有し得る。Ｗ５５は、ＳｒｔＣ１の活性を調節するにあたって重要であり得る。なぜならそれは、標準ソルターゼｌｉｄモチーフが連鎖球菌ソルターゼにおいて通常見いだされる領域に位置するからである。Ｗ５５は、他のソルターゼにおいて見いだされるｌｉｄの機能を摸倣し得る。特定の実施形態において、本発明の方法において使用されるとおりのＳｒｔＣ１は、Ｃ１８８Ａ変異（配列番号１０３にあるとおり）を有し得る。Ｃ１８８は、触媒性システインであり得る。
【０１５７】
ＰＩ−２ｂの野生型ＳｒｔＣ２のアミノ酸配列は、配列番号１０５に示される。特定の実施形態において、本発明の方法において使用されるとおりのＳｒｔＣ２は、そのシステインがアラニンで置換されていることがある（配列番号１０６にあるとおり）。本発明の特定の実施形態において、本発明の方法において使用されるとおりのＳｒｔＣ２は、シグナルペプチドもＮ末端膜貫通ドメインも含まない（配列番号１０８もしくは配列番号１０９にあるとおり）。当業者は、任意のシグナルペプチドもしくはＮ末端膜貫通ドメインを同定し得る。
【０１５８】
本発明とともに使用するためのＰＩ−２ｂ  ソルターゼＣ１およびソルターゼＣ２酵素は、従って、（ａ）配列番号５、９８，１００、１０１、１０２、１０３、１０５、１０６、１０８および１０９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して、７０％またはそれより高い同一性（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有する；または（ｂ）これら配列のうちの１つの少なくとも「ｎ」個連続したアミノ酸のフラグメント（ここで「ｎ」は、１００以上（例えば、１２０、１５０、１７０もしくは１９０以上）である）であるアミノ酸配列を含み得るか、または上記アミノ酸配列からなり得る。本発明とともに使用するためのＰＩ−２ｂ  ソルターゼＣ１およびソルターゼＣ２酵素は、連結および重合反応を行う能力を保持している。ＳｒｔＣ１およびＳｒｔＣ２をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１０４および配列番号１０７に提供される。特定の認識モチーフとしては、以下が挙げられ得る：ＬＰＥＴＧＧ、ＬＰＸＴＧ、ＬＰＸＴ、ＬＰＫＴＧ、ＬＰＡＴＧ、ＬＰＮＴＧ、ＬＰＥＴ、ＶＰＤＴ、ＩＰＱＴ、ＹＰＲＲ、ＬＰＭＴ、ＬＡＦＴ、ＬＰＱＴ、ＮＳＫＴ、ＮＰＱＴ、ＮＡＫＴ、ＮＰＱＳ、ＬＰＫＴ、ＬＰＩＴ、ＬＰＤＴ、ＳＰＫＴ、ＬＡＥＴ、ＬＡＡＴ、ＬＡＥＴ、ＬＡＳＴ、ＬＰＬＴ、ＬＳＲＴ。
【０１５９】
（一般）
本発明の実施は、別段示されなければ、当該分野の技量の範囲内の従来の化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の方法を使用する。このような技術は、文献中に十分に説明されている。例えば、参考文献９２〜９９などを参照のこと。用語「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、もっぱらＸからなってもよいし、さらなる何かを含んでいてもよい（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【０１６０】
用語「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」とは、上記組成物、方法もしくは構造が、さらなる成分、工程および／もしくは部分を含み得るが、それは、上記さらなる成分、工程および／もしくは部分が、本願組成物、方法もしくは構造の基本的かつ新規な特徴を本質的に変化させない場合に限ることを意味する。用語「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、一般に、特許請求される発明が、特許請求の範囲に具体的に記載されるそれら要素に限定される（および均等論が適用可能である限りにおいて、それらの等価物を含み得る）を意味すると解釈される。
【０１６１】
数値ｘに関連する用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１６２】
２つのアミノ酸配列の間のパーセンテージ配列同一性への言及は、整列したときに、そのパーセンテージのアミノ酸が、２つの配列を比較したときに同一であることを意味する。このアラインメントおよびパーセントホモロジーもしくは配列同一性は、当該分野で公知のソフトウェアプログラム（例えば、参考文献１００の第７．７．１８節に記載されるもの）を使用して決定され得る。好ましいアラインメントは、ギャップオープンペナルティー  １２およびギャップ伸長ペナルティー  ２、６２のＢＬＯＳＵＭマトリクスで、アフィンギャップ検索を使用してＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される。上記Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、参考文献１０１に開示されている。第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドのパーセント同一性は、一般に、上記第１のおよび第２のポリペプチドとの間のマッチした位置の数を計数し、その数を最も短いポリペプチドの全長で除算して、続いて、その得られた値に１００を乗算することによって決定される。ポリペプチドのフラグメントに関しては、この値は、通常、約１００％であり、従って、ほとんど意味をなさない。従って、本発明のフラグメントの状況においては、用語「参照ポリペプチドの割合」（パーセンテージとして表される）が使用される。参照ポリペプチドの割合は、上記フラグメントと参照ポリペプチドとの間のマッチした位置の数を計数し、その数を上記参照ポリペプチドの全長で除算し、続いて、その得られた値に１００を乗算することによって計算される。詳細には、フラグメントは、９０、８０、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５未満、または上記参照ポリペプチドの配列のうちの２０％未満を含む。
【実施例】
【０１６３】
（実施例１：ＧＢＳ  ＳｒｔＣ１の機能調節：上記ｌｉｄ領域における単一の変異がインビトロでのＢＰ重合を増強する）
（要旨）
細胞表面線毛は、重要な毒性因子であり、有望なワクチン候補である。グラム陽性細菌は、骨格および付属ピリン基質からのソルターゼＣ触媒性ペプチド転移機構を介して、線毛を産生する。個々のサブユニットの共有結合的架橋のために、特定の残基および／もしくはモチーフ（例えば、上記ピリンモチーフおよび保存されたＬＰｘＴＧソーティングシグナル）が、絶対的に必要である。ＰＩ−２ａのＧＢＳソルターゼＣ１（ＳｒｔＣ１）の部位指向性変異誘発は、組換えＳｒｔＣ１の活性化においてｌｉｄ調節部位のＴｙｒ８６の特異的関与を明らかにする。この実施例は、組換えＢＰ高分子量線毛構造が、触媒性の酵素濃度を使用して、インビトロで得られ得ることを示す。これは、上記ｌｉｄの存在によるソルターゼＣ酵素の自己阻害の直接的な証拠を提供し、ソルターゼ活性変異体によって重合される組換え線毛を使用することによって、線毛アセンブリを研究する分野が開かれ、病原性細菌から多量の野生型線毛を精製する必要性を低減する。
【０１６４】
（背景）
Ｂ群連鎖球菌（ＧＢＳ）、もしくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅは、新生児において生命を脅かす疾患の主な原因であり、妊娠していない成人、高齢者もしくは免疫不全の成人においても、侵襲性の疾患の一般的な原因になりつつある［１０２］。線毛（細菌表面から突出している長いフィラメント状の線維）は、重要な毒性因子および潜在的なワクチン候補として、グラム陽性病原体において発見された。ＧＢＳの８つの配列決定されたゲノムの分析から、２つのゲノムアイランド（各々、３種の異なる線毛をコードする）が同定された［１０３；１］。さらに、「ハウスキーピング」ソルターゼＡ（ＳｒｔＡ）をコードするｓｒｔＡ遺伝子座は、全ての分析したＧＢＳ株における種々のゲノム領域に存在する［１０３］。各線毛ゲノムアイランドは、３種のＬＰＸＴＧタンパク質をコードする：主な線毛サブユニットを表す骨格タンパク質（ＢＰ）、および２つの付属タンパク質（ＡＰ１およびＡＰ２）。さらに、各アイランドは、少なくとも２種のクラスＣソルターゼをコードし、各々、上記付属タンパク質のうちの一方に対して特異性を有する［１；１０４］。いくつかのピリン関連ソルターゼ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＳｒｔＣ１−３［４］、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｏｒｉｓ由来のＡｃＳｒｔＣ−１［１０５］およびＳ．ｓｕｉｓ由来のＳｒｔＣ１（１０６））の結晶構造が近年解明され、上記Ｓ．ｓｕｉｓ  ＳｒｔＣ１のみが、開いた活性部位のコンフォメーションにある。さらに、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｓｐｙ＿０１２９の結晶構造が解明された。このことから、上記Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｓｐｙ＿０１２９が、他の特徴付けられたピリン特異的ソルターゼ（これは、クラスＣに属する）とは異なるクラスＢソルターゼファミリーに属することが示された。本発明者らは、以前に、ＧＢＳ  ＳｒｔＣ１−２ａの構造的および機能的特徴付けを報告した。ＧＢＳ  ＳｒｔＣ１−２ａ（その触媒性ドメインを含む）の可溶性コアの結晶構造から、ＳｒｔＣ１は、Ｈｉｓ１５７−Ｃｙｓ２１９−Ａｒｇ２２８から構成され、線毛線維形成に必須であり、そしてインビボでソルターゼ活性に不要な「ｌｉｄ」として公知のループによって覆われる触媒性三つ組を使用することが示されている［３］。さらに、上記結晶構造は、ＳｒｔＣ１が上記活性部位を立体的にブロックする上記ｌｉｄの存在によって、自己不活性化酵素として折りたたまれることを示唆する。酵素調節および活性における上記ｌｉｄ領域の機能はなお不明であるが、重合に適切な線毛タンパク質を選択するにあたって一定の役割を有すると想定される。この研究において、本発明者らは、触媒性酵素濃度を使用することによって、効率的な組換えＢＰ高分子量構造を初めて示す。
【０１６５】
（方法）
（細菌株および増殖条件）
ＧＢＳ  ５１５株および変異体を、トッド・ヘビットブロス（ＴＨＢ）中もしくは５％  ヒツジ血液を補充したトリプチケースソイアガー（ＴＳＡ）中、３７℃で増殖させた。
【０１６６】
（組換えタンパク質のクローニング、発現および精製）
タンパク質ＳｒｔＣ１４３−２９２（シグナルおよび膜貫通ドメインなしの配列番号３）、ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ（配列番号４８）およびＳｒｔＣ１ΔＬＩＤ（配列番号１２）を、Ｈｉｓ−ＭＢＰ、ＴＥＶ切断可能、融合タンパク質として発現し、以前に記載されたとおり［３］精製した。組換えＢＰ３０−６４９（上記ピリンモチーフおよび上記ソーティングシグナルの両方を含む）を、ｓｐｅｅｄＥＴベクターにクローニングし、以前に記載されたとおり［１０７］発現させ、ＢＰＫ１８９Ａを、野生型ＢＰ３０−６４９を使用して、ＰＩＰＥ部位指向性変異誘発によって生成した。組換えＢＰ３０−６４０（Ｃ末端のＬＰｘＴＧモチーフを欠いている）を、ｓｐｅｅｄＥＴベクターにクローニングし、Ｎ末端のＨｉｓ−ｔａｇ、ＴＥＶ切断可能、融合タンパク質として、野生型ＢＰのために使用した同じプロトコルを使用して発現させ、精製した。
【０１６７】
（抗血清）
上記ＢＰ−２ａおよびＡＰ１−２ａタンパク質に特異的な抗血清を、ＣＤ１マウスを精製組換えタンパク質で免疫化することによって生成した［１０７，１０８］。
【０１６８】
（補完ベクターの構築および部位特異的変異誘発）
ＢＰのＧＢＳノックアウト（ＫＯ）変異体株を、以前に報告されたとおりに［１］生成した。野生型ＢＰに対応する補完ベクターＤＮＡフラグメント（ＳＡＬ＿１４８６）の生成のために、遺伝子をＧＢＳ  ５１５ゲノムからＰＣＲ増幅し、上記生成物を、Ｅ．ｃｏｌｉ−連鎖球菌シャトルベクタ−ｐＡＭ４０１／ｇｂｓ８０Ｐ＋Ｔ（以前に記載され［１１，２７］、ｇｂｓ８０遺伝子のプロモーター領域およびターミネーター領域を含む（ＴＩＧＲ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  ＳＡＧ＿０６４５））へと、クローニングした。ｐＡＭ＿ＢＰの部位指向性変異誘発を、ＰＩＰＥ（ポリメラーゼ不完全プライマー伸長）法［１９］を使用して行った。上記補完ベクターｐＡＭ＿ＢＰΔＬＰＸＴＧおよびｐＡＭ＿ＢＰＫ１８９Ａを、ＫＯ株ΔＢＰへとエレクトロポレーションした。ウェスタンブロッティングでＢＰ発現をチェックすることによって、補完を確認した。
【０１６９】
（ウェスタンブロット分析）
対数増殖期中期の細菌細胞を、４００Ｕのムタノリシン（ｍｕｔａｎｏｌｙｓｉｎ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＣＯＭＰＬＥＴＥプロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ）を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中に再懸濁した。次いで、上記混合物を、３７℃で１時間にわたってインキュベートし、３回の凍結融解サイクルによって細胞を溶解した。細胞デブリを遠心分離によって除去し、タンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によって決定した。総タンパク質抽出物（２０μｇ）もしくは組換え線毛を、３〜８％もしくは４〜１２％  ＮｕＰＡＧＥプレキャストゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロースに転写した。膜を、ＢＰタンパク質およびＡＰ１タンパク質に対して指向されるマウス抗血清（１：１，０００希釈）でプローブし、続いて、ウサギ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化２次抗体（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）でプローブした。次いで、Ｏｐｔｉ−４ＣＮ基質キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、バンドを可視化した。
【０１７０】
（結果）
（推定ピリンモチーフにおけるリジン１８９およびＢＰ−２ａのＩＰＱＴＧソーティングシグナルは、野生型ソルターゼＣによる線毛形成に必須である）
ＧＢＳ線毛２ａ、ＢＰ−２ａ（株５１５，ＴＩＧＲ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  ＳＡＬ＿１４８６）の骨格タンパク質において、本発明者らは、高度に保存されたリジン残基（Ｌｙｓ１８９）を含む推定ピリンモチーフおよびＣ末端ソーティングモチーフとして残基６４１〜６４６にあるＩＰＱＴＧＧモチーフを同定した（図３Ａ）。各残基／モチーフの線毛アセンブリにおける具体的な寄与を調査するために、本発明者らは、部位特異的変異誘発、およびＧＢＳノックアウト（ＫＯ）変異体株の補完研究において以前使用したベクターｐＡＭ４０１へのＰＩＰＥ（ポリメラーゼ不完全プライマー伸長）変異誘発法を使用する補完研究を使用した。特異的変異／欠失のＰＣＲによる導入のためのテンプレートとして、本発明者らは、上記ＢＰ−２ａ遺伝子を有する補完ベクター（ｐＡＭ＿ＢＰ）を使用した。
【０１７１】
上記ピリンモチーフ中のＬｙｓ１８９およびＢＰ−２ａの細胞壁ソーティングシグナル（ＣＷＳＳ）中の上記ＩＰＱＴＧＧモチーフの役割を評価するために、本発明者らは、上記ピリンモチーフのリジン残基のアラニンでの置換を有する変異した骨格タンパク質を発現するプラスミド（ｐＡＭ＿ＢＰＫ１８９Ａ）および上記ＩＰＱＴＧソーティングシグナルの全体の欠失を有する第２のプラスミド（ｐＡＭ＿ＢＰΔＩＰＱＴＧ）を生成した。上記Ｋ１８９およびＢＰ−２ａの上記Ｃ末端ソーティングシグナルの両方が、線毛重合および高分子量構造への付属タンパク質組み込みに絶対的に必要とされた（図３Ｂ）。上記Ｋ１８９をアラニンに変異させた場合には、上記ＢＰのモノマー形態のみを同定することができたのに対して、上記ソーティングシグナルＩＰＱＴＧを上記ＢＰにおいて欠失させた場合には、ＢＰのモノマー形態に加えて、より高分子量のバンドもまた認められた（図３Ｃ）。ＢＰおよびＡＰ１に対して惹起された抗体で行ったイムノブロットから、ＳＤＳ処理に耐性である、このより高分子量のバンドは、上記骨格タンパク質（ＢＰ）および主要付属タンパク質（ＡＰ１）の両方を含むことが示された（図３Ｃ）。上記ＢＰの重合は、そのソーティングシグナルが欠失された場合には生じ得ないが、上記ＢＰのピリンモチーフは、上記ＢＰピリンモチーフと上記ＡＰ１ソーティングシグナルとの間の共有結合を形成するためになお利用可能である。
【０１７２】
（ＬＰＸＴＧ様ソーティングシグナルは、ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ変異体によりインビトロで媒介されるペプチド転移反応に必須であるが、上記ピリンモチーフは必須でない）
インビトロ重合反応における上記ピリンモチーフ中のＬｙｓ１８９および上記ＩＰＱＴＧソーティングシグナルの具体的寄与を調査するために、本発明者らは、ＢＰ−２ａタンパク質の変異形態、それぞれ、上記ＩＰＱＴＧ領域の欠失および上記Ｌｙｓ１８９のアラニンでの置換を有するＢＰΔＩＰＱＴＧおよびＢＰＫ１８９ＡをＥ．ｃｏｌｉにおいて発現し、精製した。上記活性ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａと上記組換えＢＰΔＩＰＱＴＧ変異体とを混合した後、ＨＭＷポリマーは検出できなかった。このことから、重合反応は、上記ソーティングシグナルの切断、およびＳｒｔＣ１Ｙ８６ＡとＩＰＱＴＧモチーフとの間のアシル中間体の形成を介して起こることが確認された（図１４Ａ）。対照的に、上記活性ＳｒｔＣ１Ｙ８６ＡをＢＰＫ１８９Ａとともにインキュベートした反応では、ＨＭＷポリマーが認められ得た。このことから、上記ピリンモチーフのＬｙｓ残基（Ｋ１８９）が、ＧＢＳにおいて起こることとは異なって、インビトロでの重合に必須ではないことが示された（図１４Ｂ）。さらに、ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａを、ＢＰ−２ａタンパク質の存在下でのみインビボで重合が起こり得る（データは示さず）、付属タンパク質（ＡＰ１−２ａおよびＡＰ２−２ａ）の組換え形態と混合した場合、いくつかのＨＭＷ構造が形成された（図１４Ｃ）。これらデータは、ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａが、上記酵素と上記ＬＰＸＴＧ様ソーティングシグナルとの間でアシル中間体を分離するために、異なる求核剤を使用し得ることを実証する。従って、上記ピリンモチーフは必要とされないので、驚くべきことに、この知見は、上記変異型酵素がより広い範囲の反応において使用され得、ＬＰＸＴＧモチーフが付加されたタンパク質との反応を触媒し得ることを示唆する。
【０１７３】
（野生型ＳｒｔＣ１−２ａは、組換えＢＰ重合をインビトロで誘導できない）
ＧＢＳ表面に線毛が存在するということは、細胞壁調製物（ここでＧＢＳ  ＢＰモノマーが共有結合され、上記線毛骨格を形成する［１］）のイムノブロット分析によって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で高分子量バンドのラダーによって特徴付けられる。それは、ＳｒｔＣ１のｌｉｄが開いた活性コンフォメーションを誘導する上記骨格−タンパク質基質との相互作用であるという仮定を試験するために、本発明者らは、勾配ＳＤＳゲル上での高分子量バンドのパターンを検索することによって、組換えＳｒｔＣ１（ｒ−ＳｒｔＣ１）および組換え骨格タンパク質（ｒ−ＢＰ）のインビトロでの機能的な活性を試験した（１０７）。上記ピリンモチーフＫ１８９および上記Ｃ末端ＬＰｘＴＧ認識部位を有する組換えＧＢＳ主要ピリンサブユニットＢＰを、ＷＴ  ＳｒｔＣ１と種々の割合で混合し、３７℃で種々の時間にわたってインキュベートしたところ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＳｒｔＣ１のために使用した酵素はまた、多量に達した［４］。しかし、これらサンプルのＳＤＳ−ｐａｇｅ分析は、線毛ポリマーを表し得る高分子量バンドを形成しなかった（図４Ａ）が、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに関して以前に記載された［４］とおりｒＳｒｔＣ１およびｒＢＰによって形成されるヘテロダイマーおよびＳｒｔＣ１の非存在下でも形成されるダイマーＢＰ−ＢＰの形成と適合した複合体の形成のみを示した（図４Ｂ）。
【０１７４】
（ＢＰ高分子量構造は、組換えＳｒｔＣ１  ｌｉｄ変異体によってインビトロでアセンブリされ得る）
上記触媒性システインが、Ｔｙｒ８６の芳香族環によってロックされているという本発明者らの仮説を確証するために、本発明者らは、組換えＳｒｔＣ−１Ｙ８６Ａ［３］を、組換え精製ＢＰと混合することによって同じ実験を行い、このソルターゼ変異体がＧＢＳ  ＢＰモノマーを重合する能力を試験した。２６０ｋＤａを超える分子量を有し、ＳＤＳ−ｐａｇｅによって目に見えるバンドの代表的な線毛パターンは、モノマーｒ−ＢＰをｒＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａとインキュベートした場合に生成できた（図５Ａ）。反応を４８時間後にクエンチし、αＢＰ抗体を使用して、ウェスタンブロットによって分析し、ＧＢＳ  ５１５株の野生型線毛と比較して、ＢＰ重合の代表的ラダーをチェックした（図５Ｂ）。
【０１７５】
上記ＢＰモノマーの一部が反応の１０日後にプロセシングされないままであるので、本発明者らは、より多量の酵素が、モノマーＢＰのポリマー構造での完全な変換を達成し得るか否かを試験した。
【０１７６】
本発明者らは、１０μＭ〜１００μＭの酵素濃度を固定したＢＰ濃度と混合したところ、組換えＢＰポリマー形成の速度が変化しないことを見いだした（図５Ｃ）。重合反応のために固定した酵素濃度  ２５μＭを使用して、モノマーＢＰの濃度を変動させて同様に試験した（図５Ｄ）。
【０１７７】
（組換えＳｒｔＣ１ｙ８６Ａ変異体によるインビトロでのＢＰ高分子量構造形成は、ＬＰＸＴＧモチーフおよびピリンモチーフによって媒介される）
上記ＢＰの重合が、正しいモチーフを介して起こることを確証するために、インビトロでの重合を、ｒ−ＢＰΔＬＰＸＴＧおよびｒ−ＢＰＫ１８９ＡをＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａとともにインキュベートすることによって試験し、上記重合が、上記ＬＰＸＴＧソーティングシグナルの切断、そしてその後の次のサブユニットのピリンモチーフへの連結を介して起こることが確認した。
【０１７８】
（大スケール組換えＢＰ  ＨＭＷ構造の生成および精製）
グラム陽性病原体からの線毛精製は、非常に困難かつ時間がかかるものであり、少量の物質の精製を可能にするに過ぎない。本発明者らは、５０μｌ反応容積でＢＰ重合を達成できたので、組換え線毛生成のスケールアップを試みた。本発明者らは、最良の反応条件が２５μＭの酵素および１００μＭのＢＰを使用することによって達成されることを見いだした。上記反応容積も重要である。なぜなら、最大１００μｌまでの反応を使用すると、ＢＰ重合の効率が低下するからである。本発明者らは、各１００μｌにおいて、総量６．５ｍｇの純粋なＢＰに関して基質および酵素のこれら濃度を使用して、１０回の反応を行い、７日間にわたって上記反応を還元剤の存在下でインキュベートした。この時間の後、上記反応物のプール（合計１ｍｌ）を、ゲル濾過により分離した。２つの画分（大部分は高分子量線毛を含む）を、上記モノマーＢＰおよびＳｒｔＣ１から単離し、定量したところ、０．５ｍｇの線毛を含んだ（図６）。図７は、変異型ソルターゼ酵素が、種々のグラム陽性細菌に由来する線毛タンパク質を重合することを示す。ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ（ＰＩ−２ａのＧＢＳソルターゼＣ１）を、ＧＢＳのＰＩ−１の骨格タンパク質（ＧＢＳ  ８０ともいわれる）（図７Ａ）もしくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の線毛タンパク質（ＲｒｇＢともいわれる）（図７Ｂ）とともにインキュベートした。
【０１７９】
（結論）
グラム陽性細菌において、線毛の共有結合は、特定のソルターゼの作用を要する。ＧＢＳにおける上記線毛２ａ生合成は、上記ＢＰを重合し、かつ付属タンパク質基質特異性を示す２つのソルターゼ酵素（ＳｒｔＣ−１およびＳｒｔＣ−２）によって促進される。以前、本発明者らは、Ｈｉｓ、ＣｙｓおよびＡｒｇ残基から構成される三つ組が、ＳｒｔＣ−１活性に必須であることを示した。さらに、その結晶構造は、ＧＢＳ  ＳｒｔＣ１が、触媒ポケットにおける上記ｌｉｄの存在によって自己阻害されることを明らかに示す。近年、本発明者らのグループが、組換えＧＢＳ  ＳｒｔＣ１  ＷＴおよびｌｉｄ変異体と混合した自己クエンチ蛍光ペプチドを使用して基質切断をモニターすることによって、ＧＢＳ  ＳｒｔＣ１の触媒活性を測定したところ、上記ｌｉｄ変異体がＷＴよりもさらに活性であることを見いだした。これらデータは、ｌｉｄ変異体でのインビボ実験によれば、ソルターゼＣの活性化が、上記ｌｉｄを上記触媒部位から移動させる（これは、タンパク質基質によって誘導され得る）ことを生じるコンフォメーション変化によって起こり得ることを示唆した。
【０１８０】
これら観察から出発して、本発明者らが、組換え骨格線毛タンパク質と混合した組換えＧＢＳ  ＳｒｔＣ１  ＷＴおよびｌｉｄ変異体を使用して、インビトロ実験を行ったところ、ＷＴ  ＳｒｔＣ１酵素が組換えＢＰタンパク質重合を誘導できないことを観察した。酵素活性化は、インビトロでのＢＰ重合および組換え線毛形成を増強する組換えＳｒｔＣ１−２ａの上記ｌｉｄ領域における単一の変異を介して、インビトロで達成された。これら実験は、ＳｒｔＣに関して、線毛サブユニットの認識および重合の裏にある機構が、線毛シャフトタンパク質と上記ソルターゼとの間の相互作用にのみ依存できなかったことを示唆する。なぜなら上記酵素活性化は、ＳｒｔＣ１ＷＴと上記ＢＰとを単に混合することによってはインビトロで達成できなかったからである。上記ｌｉｄ変異体での実験から、上記ｌｉｄの存在、および特に、このループ中のＴｙｒ８６の存在は、ＢＰ重合を妨げることが示されている。本発明者らの研究は、上記ｌｉｄの存在によるソルターゼＣ酵素の自己阻害の初めての直接的な証拠を提供し、ソルターゼ活性変異体によって重合された組換え線毛を使用することによって線毛アセンブリの研究の分野を拓き、病原性細菌から多量の野生型線毛のに精製する必要性を低減する。さらに、グラム陽性細菌上の多くの表面毒性因子の係留が、ソルターゼ活性によって媒介され、従って、これら酵素は、新規な抗感染治療の設計の魅力的な標的である。
【０１８１】
（実施例２：インビトロで重合した線毛を使用する免疫化研究）
上記インビトロで重合した線毛構造は、マウスでの免疫化研究において使用され得る。例えば、１０μｇの精製組換え線毛は、アジュバント（例えば、ミョウバン）と混合され得、最終容積２００μｌでマウスへと注射され得る。これに続いて、１回以上のブースター免疫化が行われ得る。次いで、上記マウスは、上記線毛構造に対する免疫応答に関して分析され得る。この免疫応答は、上記モノマー線毛タンパク質が元々由来した細菌に対して防御的であり得る。
【０１８２】
本発明の方法に従って生成されたＧＢＳ５９を含むモノマー線毛をミョウバンと組み合わせて、マウスを免疫化し、防御免疫応答を、ＧＢＳでのその後のチャレンジの後に評価した、免疫化研究を行った。その結果を、線毛形態にない組換えＧＢＳ５９およびミョウバン、上記ＳｒｔＣＭ１（Ｙ８６Ａ）変異体およびミョウバン、ＣｒｍＩａおよびミョウバンを使った類似のプロトコルを使用した免疫化と比較した。上記免疫化実験の結果を、以下の表４に提供する。
【０１８３】
【表４】
2015509713.tif 000006
【０１８４】
これら結果は、本発明の方法に従って上記変異型ソルターゼＣ酵素を使用して生成されたＧＢＳ５９線毛が、上記組換えモノマータンパク質よりＧＢＳに対して防御免疫応答を生じさせることにおいて、顕著により有効であり、そしてＣＲＭ  Ｉａの使用と等価であることを示す。
【０１８５】
（実施例３：ＢＰ−２ａ（ＧＢＳ５９）改変体のインビトロでの重合）
本発明者らは、上記ソルターゼ変異体が、配列番号７４、７５、７６、７７、７８および７９に対応するＧＢＳ５９のＧＢＳ  ＢＰモノマーの改変体を重合する能力を試験した。
【０１８６】
（細菌株および増殖条件）
この研究において使用したＧＢＳ株は、２６０３  Ｖ／Ｒ（血清型Ｖ）、５１５（Ｉａ）、ＣＪＢ１１１（Ｖ）、Ｈ３６Ｂ（血清型Ｉｂ）、５４０１（ＩＩ）および３０５０（ＩＩ）であった。細菌を、３７℃で、トッド・ヘビットブロス（ＴＨＢ；Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）もしくは５％  ヒツジ血液を補充したトリプチケースソイアガー中で増殖させた。
【０１８７】
（組換えタンパク質のクローニング、発現、精製および抗血清）
ゲノムＤＮＡを、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を使用して、製造業者の説明書に従って、グラム陽性細菌用の標準プロトコルによって単離した。全長組換えＢＰ−２ａタンパク質（５１５、ＣＪＢ１１１および２６０３対立遺伝子改変体（それぞれ、ＴＩＧＲ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  ＳＡＬ１４８６、ＳＡＭ１３７２およびＳＡＧ１４０７）に対応する）を、Ｍａｒｇａｒｉｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２００９，１９９：１０８〜１１５に報告されるとおりに生成したと同時に、全長Ｈ３６Ｂ改変体（ＴＩＧＲ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  ＳＡＩ＿１５１１）を、ＤＮＡ供給源として株Ｈ３６Ｂを使用して、ｐＥＴ２４ｂ＋（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。上記シグナルペプチドなしのコード領域および上記ＬＰＸＴＧモチーフから始まる３’末端配列を増幅するために、プライマーを設計した。
【０１８８】
組換えタンパク質発現に関して、培養物を、ｐＥＴクローンに関しては１ｍＭ  ＩＰＴＧで、もしくはＳｐｅｅｄＥＴクローンに関しては０．２％  アラビノースでの誘導後、２５℃で５時間にわたって維持した。全ての組換えタンパク質を、アフィニティークロマトグラフィーおよびゲル濾過によって精製した。簡潔には、細胞を遠心分離によって採取し、「溶解緩衝液」（ＰＢＳ中に１０ｍＭ  イミダゾール、１ｍｇ／ｍｌ  リゾチーム、０．５ｍｇ／ｍｌ  ＤＮＡｓｅおよびＣＯＭＰＬＥＴＥインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含む）中で溶解した。上記溶解物を遠心分離によって清澄にし、１０ｍＭ  イミダゾールを含むＰＢＳ中で予備平衡したＨｉｓ−Ｔｒａｐ  ＨＰカラム（Ａｒｍｅｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に加えた。タンパク質溶離を、２０ｍＭ  イミダゾール緩衝液および５０ｍＭ  イミダゾール緩衝液を使用する２回の洗浄工程の後に、２５０ｍＭ  イミダゾールを含む同じ緩衝液を使用して行った。次いで、溶離したタンパク質を濃縮し、ＰＢＳ中で予備平衡化したＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にロードした。
【０１８９】
ＣＤ１マウスを、以前に記載されるように（ＷＯ９０／０７９３６）上記精製組換えタンパク質で免疫化することによって、各タンパク質に特異的な抗血清を生成した。プールした血清中のタンパク質特異的免疫応答（総Ｉｇ）を、ＥＬＩＳＡによってモニターした。
【０１９０】
先のように、本発明者らは、１０〜１００μＭの酵素濃度を固定したＢＰ濃度と混合したところ、組換えＧＢＳ５９ポリマー形成の速度を変化させないことを見いだした。ＧＢＳ５９改変体モノマーを、１：１：１：１：１：１比で混合した。重合反応のための２５μＭという固定酵素濃度を使用して、モノマーＢＰ  ＧＢＳ５９の改変体について種々の濃度の混合物もまた試験した。
【０１９１】
（ＢＰ−２ａの３種の改変体（Ｈ３６Ｂ、５１５、ＣＪＢ１１１）でのインビトロ重合）
ＢＰ−２ａ（改変体Ｈ３６Ｂ、５１５、ＣＪＢ１１１）濃度：各３５μＭ−合計１０５μＭ。
ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ濃度：２５μＭ
緩衝液：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７，５−１００ｍＭ  ＮａＣｌ−１ｍＭ  ＤＴＴ
反応総容積  １００μｌ
３７℃で４８時間にわたるインキュベーション  。
【０１９２】
２６０ｋＤａより高い分子量を有し、ＳＤＳ−ｐａｇｅによって目に見えるバンドの代表的線毛パターンは、モノマーｒ−ＢＰの改変体の混合物をｒＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａとともにインキュベートした場合に生成できた（図１１）。４８時間後に反応をクエンチし、αＢＰ抗体を使用するウェスタンブロットによって分析し、野生型線毛と比較して、ＢＰ重合の代表的ラダーをチェックした。上記ＧＢＳ５９改変体の各々を含む線毛を作り、免疫化に使用した。上記手順の後のマウスのワクチン接種は、上記３種のＧＢＳ株の各々でのチャレンジから成功裏に保護した。対照的に、１種のみの改変体形態でワクチン接種したマウスは、その特定の株でのチャレンジからしか防御されなかった。驚くべきことに、これら人工線毛は、上記組換えモノマータンパク質よりＧＢＳに対して防御免疫応答を生成することにおいてより有効であった。
【０１９３】
（実施例４：骨格タンパク質（ＢＰ−２ａ＋線毛１  ＢＰ（ＢＰ−１）および／もしくはＰｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ  ＲｒｇＢ）のうちの２つの型でのインビトロ重合）
上記で概説した手順の後に、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅおよびＰｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓの両方に由来する骨格タンパク質を含むキメラ線毛を調製した：
ＢＰ濃度：各５０μＭ−合計１００μＭ。
ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ濃度：２５μＭ
緩衝液：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７，５−１００ｍＭ  ＮａＣｌ−１ｍＭ  ＤＴＴ
反応総容積  １００μｌ
３７℃で４８時間にわたるインキュベーション  。
【０１９４】
図１２Ａおよび図１２Ｂに示されるように、ＨＭＷバンドの存在は、変異型ソルターゼＣ酵素が細菌の他の株／タイプに由来するタンパク質を重合する能力を示す。上記の手順後のマウスのワクチン接種は、Ｂ群連鎖球菌およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａの両方でのチャレンジから成功裏に防御した（データは示さず）。本発明のソルターゼはまた、ＧＢＳ６７およびＧＢＳ５９の組み合わせを重合できた。
【０１９５】
（実施例４：変異型ＳｒｔＣは、ＧＦＰ−ＩＰＱＴＧを重合し得る）
上記「ＩＱＴＧＧＩＧＴ」配列を、変異誘発を使用して、ＧＦＰタンパク質のＤＮＡ配列のＣ末端に付加した：
【０１９６】
【化１】
2015509713.tif 000007
【０１９７】
【化２】
2015509713.tif 000008
【０１９８】
（組換え「ＧＦＰ−ＩＱＴＧＧＩＧＴ」の生成：発現および精製）
３０℃でのｂｉｏｓｉｌｔａ培地を使用するＬＢ＋カナマイシン３０ｕｇ／ｍｌ中で、ＨＫ１００におけるＧＦＰ−ＩＰＱＴＧＧＩＧＴ発現、アラビノース  ０．１５％（最終）での誘導。精製：標準ＩＭＡＣ  。
【０１９９】
（ＧＦＰ−ＩＱＴＧＧＩＧＴおよびＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ重合反応：）
２５ｕＭ  ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａと、２５〜５０μＭもしくは１００ｕＭ  ＧＦＰ−ＩＰＱＴＧＧＩＧＴとを、緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ＤＴＴ  １ｍＭ）中で７２時間にわたって、３７℃においてｔｅｒｍｏｍｉｘｅｒ中で混合する。反応容積  ５０μｌ。
図１３に示されるように、上記ＳｒｔＣ１Ｙ８６Ａ変異体は、ＧＦＰ−ＩＰＱＴＧを重合できた。
【０２００】
（実施例５：組換えＰＩ−２ｂ  ＳｒｔＣ１およびＳｒｔＣ２タンパク質は、インビトロで活性であり、線毛タンパク質のＬＰＸＴＧ様モチーフを有する蛍光ペプチドを切断し得る）
全長ＳｒｔＣ１およびＣ２を、Ｈｉｓ−ＭＢＰ−タグと融合させてクローニングした（株ＣＯＨ１をテンプレートとして使用）。次いで、組換え酵素をＥ．ｃｏｌｉで発現させ、ＩＭＡＣもしくはＩＭＡＣおよびＭＢＰ−トラップカラムで精製した。精製ソルターゼでのＦＲＥＴアッセイを、触媒活性を評価するために、上記ＰＩ−１骨格タンパク質の、およびＰＩ−１マイナー付属タンパク質のＬＰＸＴＧソーティングモチーフを有する合成蛍光ペプチドを使用して行った。上記ＰＩ−２ｂ  ＳｒｔＣ１およびＳｒｔＣ２酵素は、上記蛍光ペプチドを切断し得る。これらデータは、上記ＰＩ−２ｂ  ＳｒｔＣ１およびＳｒｔＣ２酵素がインビトロで活性であり、タンパク質を連結および重合することでの使用に適していることを実証する。
【０２０１】
以下のプロトコルおよび条件を使用した：
ＳｒｔＣ１酵素の精製−  ＩＭＡＣ
−ＳｒｔＣ１−ＭＢＰ−Ｈｉｓ構築物を発現するＲｏｓｅｔｔａ細胞の３リットルの培養物
−ペレットを集めて溶解した
−１０ｍＭ  イミダゾールを、３０ｍｌ  溶解物に添加した。
−カラム：５ｍｌ×４フロー（約５ｍｌ／分）
−溶解物をロードし、フロースルーを集めた
−１０ｍＭ  イミダゾールを含む緩衝液１５ｍｌで洗浄した（最初の３ｍｌは、上記カラムのデッドボリュームである）
−２０ｍＭ  イミダゾールを含む緩衝液１５ｍｌで洗浄した
−３００ｍＭ  イミダゾール緩衝液１０ｍｌで溶離した
−１ｍＭ  ＤＴＴを添加した
−タンパク質を、６０００ｒｐｍにおいて４℃で２０分間にわたってａｍｉｃｏｎで濃縮した
−最終タンパク質濃度は、１．７８ｍｇ／ｍｌであった。
【０２０２】
ＳｒｔＣ２酵素の精製−ＩＭＡＣ
−ＳｒｔＣ２−ＭＢＰ−Ｈｉｓ構築物を発現するＲｏｓｅｔｔａ細胞の３リットルの培養物
−２カラム（細胞溶解物を有する３０ｍｌのペレット＋２０ｍｌの緩衝液  １０ｍＭ）５０ｍｌ  ＦＴ
−２０ｍｌの緩衝液１０ｍＭで予め洗い流した
−５０ｍｌの緩衝液１０ｍＭで洗浄した
−１５０ｍｌの緩衝液２０ｍＭで洗浄した
−溶離緩衝液  ３００ｍＭ：  ５ｍｌデッドボリューム、１０ｍｌ  溶離液２＋２０μｌ  ＤＴＴ  １Ｍ、１０ｍｌ  溶離液３
−溶離液１および溶離液３を合わせたのに対して、１０ｍｌの３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭおよびＴｒｉｓ  ｐＨ８を１０ｍｌの溶離液２に添加した。
【０２０３】
ＳｒｔＣ２酵素の精製−ＭＢＰ−トラップ
−２カラムを、ＭＢＰ−トラップに使用した
−上記カラムを、マルトースを含む緩衝液（Ｔｒｉｓ  ５０ｍＭ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８  マルトース  １００ｍＭ）５０ｍｌで洗浄した
−５０ｍｌ  Ｕｒｅａ  ８  ｍ  ｐＨ８−Ｔｒｉｓ  ５０  ｍＭで洗浄した
−蒸留水（８０ｍｌ）で洗浄した
−水で１：２に希釈したＴｒｉｓ緩衝液  ５０ｍＭ  ｐＨ８、３００ｍＭ  ＮａＣｌ  ２５ｍｌで平衡化した
−溶離液２をロードした
−溶離液１＋溶離液３をロードした
−洗浄した
−マルトースを含む緩衝液で溶離した。
【０２０４】
ＦＲＥＴ分析
ｔｅｒｍｏｆｌｕｏｒプラスチックでプレートを閉じた。
１）５０μｌ  緩衝液（３００ｍＭ  ＮａＣｌ＋５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８）＋５０μｌ  １５１５＋１μｌ  ＢＰペプチド
２）５０μｌ  緩衝液（３００ｍＭ  ＮａＣｌ＋５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８）＋５０μｌ  １５１５＋１μｌ  ＡＰ２ペプチド
３）１００μｌ  １５１５＋１μｌ  ＢＰペプチド
４）１００μｌ  １５１５＋１μｌ  ＡＰ２ペプチド
５）１００μｌ  溶離緩衝液（３００ｍＭ  イミダゾール）＋１μｌ  ＢＰペプチド
６）１００μｌ  溶離緩衝液（３００ｍＭ  イミダゾール）＋１μｌ  ＡＰ２ペプチド  。
【０２０５】
本発明者らは、２００μｌ［１．７８ｍｇ／ｍｌ］の濃縮タンパク質＋２μｌ  ＢＰおよびＡＰ２のＬＰＸＴＧペプチドを使用し、コントロールとして、タンパク質の代わりに溶離緩衝液  ３００ｍＭ  イミダゾールを使用した。
【０２０６】
Ｔｅｃａｎプレートリーダー−  １０分ごとの測定で３００サイクル、最適に関しては３７℃の温度［３４〜３７．５℃］および波長［４００ｎｍ〜６００ｎｍ］を、５００ｎｍまでにもたらされた最大吸収で得た。
【０２０７】
（実施例６：ＳｒｔＣ１は、ＢＰを重合するために有効である）
ＳｒｔＣ１の活性を、いかなる線毛をも発現しない変異型ＧＢＳ株（５１５Δ２ａ）を使用することによってさらにアッセイした。この株を、ＢＰ単独もしくはＢＰとＰＩ−２ｂ  ＳｒｔＣ１をコードする遺伝子を有する補完ベクターＰＡＭｐ８０／ｔ８０で形質転換した。上記補完ベクターが線毛重合を回復させる能力を、ウェスタンブロットによって分析した。図１０に示されるように、ＢＰ単独でのトランスフェクションは、いかなる重合も生じなかった。しかし、ＢＰおよびＳｒｔＣ１でのトランスフェクションは、高分子量ポリマーの形成を生じた。株Ａ９０９（これは、線毛２ｂを発現する）を、陽性コントロールとして使用した。
【０２０８】
図１０は、上記５１５Δ２ａ変異体株からおよびＳｒｔＣ１およびＢＰ遺伝子、もしくはＢＰ遺伝子単独を含むプラスミドで補完した上記野生型Ａ９０９株からの膜調製物のウェスタンブロットを提供する。ＳｒｔＣ１に対する抗体を使用した。３０ｋＤａで予測されたシグナルから、ＳｒｔＣ１の発現および正確な局在化が確認される。
【０２０９】
これらデータは、ＰＩ−２ｂ  ＳｒｔＣ１が線毛を重合するにあたって有効であることを示す。
【０２１０】
以下のプロトコルおよび条件を使用した：
エレクトロポレーション
１００μｌの上記Ａ９０９株および５１５Δ２ａ株を、Ｓｐｂ１（ＢＰ−ＰＩ−２ｂ）もしくはＳｐｂ１＋ＳｒｔＣ１（ＰＩ−２ｂ）の３／７μｌで形質転換した。
【０２１１】
接種
１０ｍｌ  ＴＨＢ＋ｃｌｍ  グリセロール中。
細胞をペレットにし、２５ｍｌ  ＰＢＳで洗浄した
−９４０μｌ  ＴＲＩＳ  ｐＨ  ６．８、５０ｍＭ＋６０μ（１０Ｕ／μｌ）
−３７℃で２時間、振盪。
【０２１２】
ＧＢＳ抽出物のゲルおよびウェスタンブロット
−１０の抽出物を、１０分間にわたって最大速度で遠心分離した
−３０μｌ  上清＋１５μｌのＬＤＳ＋５μｌの還元剤
−ペレットを、２％  緩衝液（ＴＲＩＳ  ５０ｍＭ  ＳＤＳ  ｐＨ８  ３００ｍｍ  ＮａＣｌ）中で再懸濁した
−ウェスタンブロットおよび膜を洗浄した
−水で洗浄した
−５％ミルクで２時間撹拌
−ＰＢＳですすいだ
−膜ごとに５ｍｌのミルク１％＋抗体（培養上清に関しては抗Ｓｐｂ１およびペレットに関しては抗ＳｒｔＣ１）をいれた
−振盪しながら冷所にて一晩静置した
−１０ｍｌのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ０．０５％で１０分間にわたって３回洗浄した
−ＰＢＳで５分間にわたって洗浄した
−２０ｍｌの１％  ミルク＋Ｐ１６１抗マウス抗体および撹拌しながら１時間にわたって静置した
−ＰＢＳで洗浄した
−発色溶液を調製した（１０ｍｌ＝９ｍｌ  水＋１ｍｌ  希釈物＋２００μｌ  サンプル基質＋）−５ｍｌ／膜。
【０２１３】
【表５−１】
2015509713.tif 000009
【０２１４】
【表５−２】
2015509713.tif 000010
【０２１５】
【表５−３】
2015509713.tif 000011
【０２１６】
【表５−４】
2015509713.tif 000012
【０２１７】
【表５−５】
2015509713.tif 000013
【０２１８】
【表５−６】
2015509713.tif 000014
【０２１９】
【表５−７】
2015509713.tif 000015
【０２２０】
【表５−８】
2015509713.tif 000016
【０２２１】
【表５−９】
2015509713.tif 000017
【０２２２】
【表５−１０】
2015509713.tif 000018
【０２２３】
【表５−１１】
2015509713.tif 000019
【０２２４】
【表５−１２】
2015509713.tif 000020
【０２２５】
【表５−１３】
2015509713.tif 000021
【０２２６】
【化３】
2015509713.tif 000022
【０２２７】
【化４】
2015509713.tif 000023
【０２２８】
【化５】
2015509713.tif 000024
【図１−１】
2015509713.tif 000025
【図１−２】
2015509713.tif 000026
【図１−３】
2015509713.tif 000027
【図１−４】
2015509713.tif 000028
【図１−５】
2015509713.tif 000029
【図１−６】
2015509713.tif 000030
【図１−７】
2015509713.tif 000031
【図２−１】
2015509713.tif 000032
【図２−２】
2015509713.tif 000033
【図３Ａ】
2015509713.tif 000034
【図３Ｂ】
2015509713.tif 000035
【図３Ｃ】
2015509713.tif 000036
【図４Ａ】
2015509713.tif 000037
【図４Ｂ】
2015509713.tif 000038
【図５Ａ】
2015509713.tif 000039
【図５Ｂ】
2015509713.tif 000040
【図５Ｃ】
2015509713.tif 000041
【図５Ｄ】
2015509713.tif 000042
【図６】
2015509713.tif 000043
【図７Ａ】
2015509713.tif 000044
【図７Ｂ】
2015509713.tif 000045
【図８】
2015509713.tif 000046
【図９】
2015509713.tif 000047
【図１０】
2015509713.tif 000048
【図１２Ａ】
2015509713.tif 000049
【図１２Ｂ】
2015509713.tif 000050
【図１３】
2015509713.tif 000051
【図１４Ａ】
2015509713.tif 000052
【図１４Ｂ】
2015509713.tif 000053
【図１４Ｃ】
2015509713.tif 000054
【図１１】
2015509713.tif 000055
【配列表】
2015509713000001.app
【国際調査報告】
2015509713.tif 000056
2015509713.tif 000057
2015509713.tif 000058
2015509713.tif 000059