(57)【要約】チオール基およびアミノ基を含む化合物（「チオール」）を選択的に検出するためのプローブを開示する。例示的チオールには、システイン、ホモシステイン、およびグルタチオンが含まれる。開示するプローブの態様は、1つまたは複数のチオールと溶液中で反応すると、吸光スペクトルおよび/または発光スペクトルにおいて検出可能な変化を生じる。検出を行うための方法およびキットも開示する。プローブは、''−''と示す各結合が一重または二重結合であり；R1、R3〜R6およびR8が独立して、水素、ヒドロキシル、チオール、低級アルキル、カルボキシアルキル、アミノ、アルコキシ、またはハロゲンであり；R2がα,β-不飽和脂肪族エステルであり；R7が酸素、硫黄、水素、ヒドロキシル、チオール、低級アルキル、カルボキシアルキル、アミノ、アルコキシ、もしくはハロゲンであるか、またはR7およびR8が一緒になってシクロアルキルもしくはアリール環を形成し；X1はCH2、S、NH、O、Se、Si(CH3)2、Ge(CH3)2、Sn(CH3)2、またはC(CH3)2であり；かつX2がCH、CH2、N、NH、またはCR9であり、ここでR9がアリールである、一般式を有する。2015516470.tif 000058
2015516470.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Iの化学構造を有する化合物：
2015516470.tif 000046
式中、
2015516470.tif 000047
と示す各結合が、原子価の要求を満たすのに必要な一重または二重結合であり；
R1、R3〜R6およびR8が独立して、H、ヒドロキシル、チオール、低級アルキル、カルボキシアルキル、アミノ、アルコキシ、またはハロゲンであり；
R2がα,β-不飽和脂肪族エステルであり；
R7が、O、S、H、ヒドロキシル、チオール、低級アルキル、カルボキシアルキル、アミノ、アルコキシ、もしくはハロゲンであるか、またはR7およびR8が一緒にシクロアルキルもしくはアリール環を形成し；
X1が、CH2、S、NH、O、Se、Si(CH3)2、Ge(CH3)2、Sn(CH3)2、またはC(CH3)2であり；かつ
X2が、CH、CH2、N、NH、またはCR9であり、ここでR9がアリールである。
【請求項２】
X1がOまたはSであり、かつR7がOもしくはSであるか、またはR7およびR8が一緒にアリール環を形成する、請求項1記載の化合物。
【請求項３】
R2がアクリル酸エステルである、請求項2記載の化合物。
【請求項４】
R1およびR3〜R6が独立してHまたは低級アルキルである、請求項2記載の化合物。
【請求項５】
R1が低級アルキルであり、かつR3〜R6がHである、請求項4記載の化合物。
【請求項６】
R7がOまたはSであり、かつR8がHである、請求項4記載の化合物。
【請求項７】
X1がOであり、X2がNまたはCR9であり、R1が低級アルキルまたはHであり、R2がアクリル酸エステルであり、R3〜R6がHであり、かつR7がOであり、かつR8がHであるか、またはR7およびR8が一緒にアリール環を形成する、請求項2記載の化合物。
【請求項８】
R7がOまたはSであり、かつX2がCH、CH2、NまたはNHである、請求項1記載の化合物。
【請求項９】
R7がOであり、かつX2がCHまたはNである、請求項8記載の化合物。
【請求項１０】
R2がアクリル酸エステルである、請求項8記載の化合物。
【請求項１１】
R7がOであり、かつX2がCHまたはNである、請求項10記載の化合物。
【請求項１２】
X1がOである、請求項11記載の化合物。
【請求項１３】
R1、R3〜R6、およびR8が独立してHまたは低級アルキルである、請求項12記載の化合物。
【請求項１４】
以下の化学構造を有する、請求項8記載の化合物：
2015516470.tif 000048
。
【請求項１５】
R7およびR8が一緒にアリール環を形成し、かつX2がCR9である化合物であって、一般式IIの化学構造を有する、請求項1記載の化合物：
2015516470.tif 000049
式中、
2015516470.tif 000050
が原子価の要求を満たすのに必要な一重または二重結合を示し、かつ
2015516470.tif 000051
が任意の一重結合を示し；
R2およびR11が独立してα,β-不飽和脂肪族エステルであり；
R10、R12、およびR13が独立して、H、ヒドロキシル、チオール、低級アルキル、カルボキシアルキル、アミノ、アルコキシ、またはハロゲンであり；
R14〜R17が独立して、H、アルキル、アシル、カルボキシル、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、または-SO3Hであり；かつ
R18が、H、ヒドロキシル、低級アルキル、低級アルコキシ、-SO3Hもしくは-COOR19であり、ここでR19がHもしくは低級アルキルであり、かつ環Bの
2015516470.tif 000052
と示す結合が二重結合であるか、またはR18が環BおよびEと共に環系を形成する1つもしくは複数の原子であり、かつ環Bの
2015516470.tif 000053
と示す結合が一重結合である。
【請求項１６】
R2およびR11がそれぞれアクリル酸エステルである、請求項15記載の化合物。
【請求項１７】
R18が-COOHであるか、またはR18が-C(O)O-であって、かつ環BおよびEと共に環系を形成する、請求項16記載の化合物。
【請求項１８】
R1、R3〜R6、R10およびR12〜R17が独立してHまたは低級アルキルである、請求項17記載の化合物。
【請求項１９】
R1が低級アルキルであり、かつR3〜R6、R10およびR12〜R17がHである、請求項18記載の化合物。
【請求項２０】
X1がOである、請求項18記載の化合物。
【請求項２１】
以下の化学構造を有する、請求項15記載の化合物：
2015516470.tif 000054
。
【請求項２２】
チオール基およびアミノ基を含む化合物を選択的に検出するための方法であって、以下の段階を含む、方法：
チオール基およびアミノ基を含む少なくとも1つの化合物を含む可能性がある試料を、請求項1〜21のいずれか一項記載の構造を有するプローブを含む溶液と合わせて、反応混合物を生成する段階；
試料とプローブとの間の反応を、反応混合物の吸光スペクトル、発光スペクトル、または両方において検出可能な変化を生じるのに有効な期間進行させ、ここで変化は化合物が存在することを示す段階；および
変化を検出する段階。
【請求項２３】
化合物がシステイン、ホモシステイン、グルタチオン、またはその組み合わせを含む、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
反応混合物が6〜7.5のpHを有する、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
有効な期間が60分以下である、請求項22記載の方法。
【請求項２６】
試料が血液、血液生成物、血液成分、尿、尿生成物、または尿成分を含む、請求項22記載の方法。
【請求項２７】
血漿を得る段階；
還元剤の添加により血漿を還元する段階；
血漿中のタンパク質を沈澱させる段階；
沈澱したタンパク質を血漿から分離して試料を生成する段階；および
その後試料を、プローブを含む溶液と合わせる段階
をさらに含む、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
全血を吸収性材料上にスポッティングし、血液を乾燥させることにより調製した乾燥血液スポットを得る段階；
乾燥血液スポットを溶媒で抽出して抽出物を生成する段階；
還元剤の添加により抽出物を還元して還元抽出物を生成する段階；
還元抽出物を分画して試料を得る段階；および
その後試料を、プローブを含む溶液と合わせる段階
をさらに含む、請求項26記載の方法。
【請求項２９】
変化を検出する段階が以下を含む、請求項22記載の方法：
（i）反応前の反応混合物の色を反応後の反応混合物の色と比較すること、
（ii）反応が有効な期間進行した後、1つまたは複数の波長で反応混合物の吸光度の変化を検出すること、
（iii）試料およびプローブを合わせた後の第一の時点での反応混合物の吸光スペクトルを、反応が有効な期間進行した後の反応混合物の吸光スペクトルと比較すること、
（iv）反応が有効な期間進行した後、1つまたは複数の波長で反応混合物の発光の変化を検出すること、
（v）試料およびプローブを合わせた後の第一の時点での反応混合物の発光スペクトルを、反応が有効な期間進行した後の溶液の発光スペクトルと比較すること、
（vi）またはその任意の組み合わせ。
【請求項３０】
プローブが下記である、請求項22記載の方法：
2015516470.tif 000055
。
【請求項３１】
化合物の検出が、580〜590nmで反応混合物の蛍光を検出することを含む、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
少なくとも1つの化合物がグルタチオンであり、かつ反応混合物がカチオン性界面活性剤をさらに含む、請求項30記載の方法。
【請求項３３】
界面活性剤が臭化セチルトリメチルアンモニウムまたは塩化ベンザルコニウムである、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
少なくとも1つの化合物がシステインであり、かつ反応混合物がカチオン性界面活性剤以外の界面活性剤をさらに含む、請求項30記載の方法。
【請求項３５】
界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムまたはポリエチレングリコールtert-オクチルフェニルエーテルである、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
反応混合物がジメチルスルホキシドをさらに含む、請求項30記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも1つの化合物がシステインであり、かつプローブが下記である、請求項22記載の方法：
2015516470.tif 000056
。
【請求項３８】
反応混合物がカチオン性界面活性剤をさらに含む、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
カチオン性界面活性剤が臭化セチルトリメチルアンモニウムである、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
チオール基およびアミノ基を含む少なくとも1つの化合物を検出するためのキットであって、請求項1〜21のいずれか一項記載の少なくとも1つのプローブを含むキット。
【請求項４１】
6〜7.5のpHを有する少なくとも1つの緩衝溶液をさらに含む、請求項40記載のキット。
【請求項４２】
少なくとも1つの緩衝溶液が界面活性剤をさらに含む、請求項41記載のキット。
【請求項４３】
界面活性剤が、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ドデシル硫酸ナトリウム、またはポリエチレングリコールtert-オクチルフェニルエーテルである、請求項42記載のキット。
【請求項４４】
その中でプローブと化合物との間の反応を実施しうる複数の使い捨て容器をさらに含む、請求項40記載のキット。
【請求項４５】
チオール基およびアミノ基を含む化合物と反応すると、吸光スペクトル、発光スペクトル、または両方において検出可能な変化を起こすのに有効な量のプローブを、複数の使い捨て容器中にあらかじめ秤量する、請求項44記載のキット。
【請求項４６】
（a）プローブと（b）システイン、ホモシステイン、グルタチオン、またはその組み合わせとの間の反応によって生じる変色を評価するための色比較図をさらに含む、請求項40記載のキット。
【請求項４７】
プローブが下記、またはその組み合わせである、請求項40記載のキット：
2015516470.tif 000057
。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本発明は、2012年2月23日提出の米国特許第仮出願第61/602,581号に対する優先権を主張し、この仮出願はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
分野
チオール基およびアミノ基を含む化合物を選択的に検出するためのプローブ、方法、およびキットの態様を開示する。
【０００３】
政府支援の認容
本発明は、米国立衛生研究所によって授与されたR01EB002044-11の下での政府支援により行った。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
背景
生体チオールは重要な機能を果たす。例えば、グルタチオン（GSH）は抗酸化剤として役立つ。これはDNAおよびRNAを損傷するフリーラジカルを捕捉することにより、細胞を酸化ストレスから保護する。これは細胞内の還元環境の維持、触媒作用、代謝、輸送、および遺伝子調節においても重要な役割を有する。GSHは低分子量細胞チオールのうち最も量が多い。これはミリモル濃度で存在するが、細胞外濃度は比較的低く、例えば、血漿中2〜20μMである。GSHは、アルツハイマー病、後天性免疫不全症候群、乾癬、癌、心血管疾患、心臓発作、肝損傷、白血球損失、パーキンソン病、および卒中を含む、酸化ストレスによって仲介されると考えられるいくつかの疾患に関連している。システイン（Cys）はタンパク質合成、解毒、および代謝過程に関与している。Cysの異常なレベルは、成長障害、アルツハイマー病、および心血管疾患などの多くの障害に関連している。Cys不足は成長遅延、毛髪色素脱失、浮腫、嗜眠、肝損傷、筋肉および脂肪損失、皮膚傷害、ならびに虚弱に関与している（Shahrokhian, Anal. Chem. 2001, 73:5972-5978（非特許文献1））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Shahrokhian, Anal. Chem. 2001, 73:5972-5978
【発明の概要】
【０００６】
概要
チオール基およびアミノ基を含む化合物（本明細書において「チオール」と呼ぶ）を選択的に検出するためのプローブの態様を開示する。例示的化合物には、システイン、ホモシステイン、およびグルタチオンなどの生体チオールが含まれる。開示するプローブの態様は、1つまたは複数のチオールと溶液中で反応すると、溶液の吸光スペクトルおよび/または発光スペクトルにおいて検出可能な変化を生じる。検出を行うための方法およびキットも開示する。
【０００７】
開示するプローブの態様は一般式Iの化学構造を有する。
2015516470.tif 000003
式中、
2015516470.tif 000004
と示す各結合は、原子価の要求を満たすのに必要な一重または二重結合であり；R1、R3〜R6およびR8は独立して、水素、ヒドロキシル、チオール、低級アルキル、カルボキシアルキル、アミノ、アルコキシ、またはハロゲンであり；R2はα,β-不飽和脂肪族エステルであり；R7は、酸素、硫黄、水素、ヒドロキシル、チオール、低級アルキル、カルボキシアルキル、アミノ、アルコキシ、もしくはハロゲンであるか、またはR7およびR8は一緒にシクロアルキルもしくはアリール環を形成し；X1は、CH2、S、NH、O、Se、Si(CH3)2、Ge(CH3)2、Sn(CH3)2、またはC(CH3)2であり；かつX2は、CH、CH2、N、NH、またはCR9であり、ここでR9はアリールである。
【０００８】
いくつかの態様において、プローブは、R7がOまたはSであり、かつX2がCH、CH2、N、またはNHである、一般式IAの構造を有する。
2015516470.tif 000005
【０００９】
一般式IAの1つの例示的プローブ（「プローブ8」）は以下の化学構造を有する
2015516470.tif 000006
。
【００１０】
いくつかの態様において、R7およびR8は一緒にアリール環を形成し、X2はCR9であり、かつプローブは一般式IIの化学構造を有する。
2015516470.tif 000007
式中、
2015516470.tif 000008
は原子価の要求を満たすのに必要な一重または二重結合を示し、かつ
2015516470.tif 000009
は任意の一重結合を示し；R2およびR11は独立してα,β-不飽和脂肪族エステルであり；R10、R12、およびR13は独立して、水素、ヒドロキシル、チオール、低級アルキル、カルボキシアルキル、アミノ、アルコキシ、またはハロゲンであり；R14〜R17は独立して、水素、アルキル、アシル、カルボキシル、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、または-SO3Hであり；かつR18は、水素、ヒドロキシル、低級アルキル、低級アルコキシ、-SO3Hもしくは-COOR19であり、ここでR19は水素もしくは低級アルキルであり、かつ環Bの
2015516470.tif 000010
と示す結合は二重結合であるか、またはR18は環BおよびEと共に環系を形成する1つもしくは複数の原子であり、かつ環Bの
2015516470.tif 000011
と示す結合は一重結合である。
【００１１】
一般式IIの1つの例示的プローブ（「プローブ5」）は以下の化学構造を有する：
2015516470.tif 000012
。
【００１２】
チオール基およびアミノ基を含む化合物を選択的に検出するための方法の態様は、以下の段階を含む：（i）チオール基およびアミノ基を含む少なくとも1つの化合物を含む可能性がある試料を、本明細書において開示するプローブを含む溶液と合わせることによって、反応混合物を調製する段階；（ii）試料とプローブとの間の反応を、反応混合物の吸光スペクトル、発光スペクトル、または両方において検出可能な変化を生じるのに有効な期間進行させ、ここで変化は化合物が存在することを示す段階；および（iii）変化を検出する段階。いくつかの例において、試料は血液、血液生成物もしくは成分、尿、または尿生成物もしくは成分を含む。いくつかの態様において、反応混合物は界面活性剤をさらに含み、界面活性剤はプローブ選択性に影響をおよぼし得る。
【００１３】
チオール基およびアミノ基を含む化合物を検出するためのキットの態様は、本明細書において開示する少なくとも1つのプローブを含む。キットは6〜7.5のpHを有する少なくとも1つの緩衝溶液、および任意に界面活性剤をさらに含んでいてもよい。いくつかの態様において、キットは、その中でプローブと化合物との間の反応を実施しうる複数の使い捨て容器を含む。チオール基およびアミノ基を含む化合物と反応すると、吸光スペクトル、発光スペクトル、または両方において検出可能な変化を起こすのに有効な量のプローブを、複数の使い捨て容器中にあらかじめ秤量してもよい。キットは、反応によって生じる変色を評価するための色比較図を含んでいてもよい。
【００１４】
本発明の前述のおよび他の目的、特徴、および利点は、添付の図面に関連して進める以下の詳細な説明からより明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】プローブ8をグルタチオン（GSH）と界面活性剤臭化セチルトリメチルアンモニウム（CTAB）存在下で反応させたときの、12員環9の生成を示す高分解能質量スペクトルであり；反応時間は5分であった。バックグラウンド：ネガティヴ；RT：0.01；AV：1；NL：1.75E5；T：FTMS - pESIフルマス[300.00〜400.00]。
【図２】図2A〜2Bは、緩衝化1.0mM CTAB中、プローブ5をシステイン（Cys）、ホモシステイン（Hcy）、GSH、および他のアミノ酸と反応させて得た蛍光スペクトル（λex＝550nm）を示し；システインの選択的検出が得られた。
【図３】1.0mM CTAB中でプローブ5と25分間反応させた後のCysの選択的検出を示すカラー写真である。
【図４】リン酸緩衝液（pH7.4、50mM）中、プローブ8をCys、Hcy、またはGSHと20分間反応させた後に得た吸光スペクトルを示す。
【図５】リン酸緩衝液（pH7.4、50mM）中、プローブ8をCys、Hcy、またはGSHと20分間反応させた後に得た蛍光スペクトル（λex＝565nm、λem＝587nm）を示し；時間依存的蛍光変化もモニターした（挿入図）。
【図６】pH7.4（リン酸緩衝液、50mM）で、プローブ8を様々な濃度のCysと反応させて得た蛍光スペクトルを示し；反応時間は60分。
【図７】pH7.4（リン酸緩衝液、50mM）で、Cysをプローブ8と反応させたときの、蛍光強度とCys濃度との間の関係を示すグラフであり；反応時間は60分。
【図８】リン酸緩衝液（50mM、pH7.4）中、プローブ8をCysと反応させたときの、3-カルボキシ-5-オキソペルヒドロ-1,4-チアゼピンの生成およびレゾルフィンの放出を示す高分解能質量スペクトルである。RT：0.09；AV：1；NL：7.21E7；T：FTMS - pESIフルマス[100.00〜500.00]。
【図９】リン酸緩衝液（50mM、pH7.4）中、プローブ8をHcyと反応させたときの、8員環の生成およびレゾルフィンの放出を示す高分解能質量スペクトルである。RT：0.11〜0.21；AV：7；NL：7.09E7；T：FTMS - pESIフルマス[100.00〜1000.00]。
【図１０】pH7.4で緩衝化した2.0mM CTAB中、Cys、Hcy、またはGSHと合わせたプローブ8の吸光スペクトルを示す。挿入図は、GSHの選択的検出を示すカラー写真であり；写真はCTAB添加直後に撮影した。
【図１１】緩衝化2.0mM CTAB中、プローブ8をCys、Hcy、GSH、および他のアミノ酸と反応させて得た蛍光スペクトル（λex＝565nm；λem＝587nm）を示し；GSHの選択的検出が得られた。挿入図は時間に対する蛍光のグラフである。
【図１２】10mMドデシル硫酸ナトリウムを含むリン酸緩衝化媒質（50mM、pH＝7.4）中でプローブ8をCys、Hcy、またはGSHと合わせたときの、蛍光発光（λex/λem＝565/590nm）の時間依存的変化を示すグラフである。
【図１３】0.3mMトリトンX-100を含むリン酸緩衝化媒質（50mM、pH＝7.4）中でプローブ8をCys、Hcy、またはGSHと合わせたときの、蛍光発光（λex/λem＝565/590nm）の時間依存的変化を示すグラフである。
【図１４】0.05mM塩化ベンジル-ジメチル-トリデシル-アザニウムを含むリン酸緩衝化媒質（50mM、pH＝7.4）中でプローブ8をCys、Hcy、またはGSHと合わせたときの、蛍光発光（λex/λem＝565/590nm）の時間依存的変化を示すグラフである。
【図１５】2mM CTABを含むリン酸緩衝化媒質（50mM、pH＝7.4）中でプローブ8をCys、Hcy、またはGSHと合わせたときの、蛍光発光（λex/λem＝565/590nm）の時間依存的変化を示すグラフである。
【図１６】2mM CTABを含むリン酸緩衝化媒質（50mM、pH＝7.4）中でプローブ8（2.5μM）を2当量のCys、Hcy、またはGSHと合わせたときに得た蛍光スペクトル（λex＝565nm）を示す。
【図１７】0.3mMトリトンX-100を含むリン酸緩衝化媒質（50mM、pH＝7.4）中でプローブ8（2.5μM）を2当量のCys、Hcy、またはGSHと合わせたときに得た蛍光スペクトル（λex＝565nm）を示す。
【図１８】10mM SDS、0.3mMトリトンX-100、0.05mM BC、または2mM CTABを含むリン酸緩衝化媒質（50mM、pH＝7.4）中でプローブ8（2.5μM）を2当量のGSHと合わせたときに得た蛍光スペクトルを示す。スペクトルは界面活性剤の添加直後に得：挿入図は同じ系の時間依存的蛍光変化（λem＝587nm）を示す。
【図１９】緩衝化2.0mM CTAB中、プローブ8をCys、Hcy、GSH、および他のアミノ酸と反応させて得た蛍光スペクトルを示し；GSHの選択的検出が得られた。
【図２０】pH7.4で緩衝化したDMSO/H2O 1：1中でプローブ8をCys、Hcy、またはGSHと合わせたときの、蛍光発光（λex/λem＝565/594nm）の時間依存的変化を示す。
【図２１】プローブ8の2μM Cys、2μM GSH、または2μM Cysおよび2μM GSHの組み合わせに対するCTAB仲介性反応の蛍光スペクトルを示す。
【図２２】pH7.4（リン酸緩衝液、50mM）で、GSHをプローブ8と、またはプローブ8および2μM Cysと反応させたときの、蛍光強度とGSH濃度との間の関係を示すグラフであり；反応時間は2分。
【図２３】緩衝化2.0mM CTAB中で、プローブ8を様々な濃度のGSHと反応させて得た蛍光スペクトルを示し；挿入図は、緩衝化2.0mM CTAB中で、GSHをプローブ8と反応させたときの、蛍光強度とGSH濃度との間の直線関係を示すグラフである。
【図２４】pH5.5〜8で緩衝化したCTAB媒質中のプローブ8の時間依存的吸光度変化（580nm）を示すグラフである。
【図２５】pH6.0、7.0、および8.0で緩衝化したCTAB媒質中のプローブ8の、1分後の吸光スペクトルを示す。
【図２６】pH6.0、7.0、および8.0で緩衝化したCTAB媒質中のプローブ8の、10分後の吸光スペクトルを示す。
【図２７】pH6.0で緩衝化したCTAB媒質中、Cys、Hcy、およびGSHと合わせたプローブ8の、20分後の吸光スペクトルを示す。
【図２８】pH6.0で緩衝化したCTAB媒質中、Cys、Hcy、およびGSHと合わせたプローブ8の、20分後の蛍光スペクトル（λex＝565nm）を示し；挿入図は時間依存的蛍光変化（λem＝587nm）を示す。
【図２９】pH7.4 HEPES緩衝溶液（0.1M）中、1.0mM CTAB存在下で、トリフェニルホスフィン、除タンパクヒト血漿、および還元除タンパク血漿と合わせたプローブ5の蛍光スペクトル（λex＝550nm）を示し；スペクトルは25分後に得た。
【図３０】pH6で緩衝化した（リン酸緩衝液、50mM）2.0mM CTAB媒質中のプローブ8（1.0μM）の較正曲線であり、蛍光強度（λex＝565nm、λem＝587nm）とGSH濃度（0.1〜1.2μM）との間の直線関係を示している。測定は混合の8分後に行った。
【図３１】pH6.0で緩衝化した（リン酸緩衝液、50mM）2.0mM CTAB媒質で希釈した10％除タンパク血漿にGSH（0〜1.0μM）を加えた後の、プローブ8（1.0μM）の蛍光スペクトル（λex＝565nm）を示す。測定は混合の8分後に行った。
【図３２】pH6.0で緩衝化した（リン酸緩衝液、50mM）2.0mM CTAB媒質で希釈した10％除タンパク血漿中で、プローブ8（1.5μM）をGSH（0〜2.0μM）またはGSH（2μM）およびCys（2μM）の混合物と反応させたときに得た蛍光スペクトル（λex＝565nm）を示す。
【図３３】pH6.0で緩衝化した（リン酸緩衝液、50mM）2.0mM CTAB媒質中で、プローブ8を乾燥血液スポット（DBS）抽出物と合わせたときに得た蛍光スペクトル（λex＝565nm）であり；プローブは抽出物中のGSHと反応した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
詳細な説明
本明細書において、生理的pHでGSHとCysとを選択的に検出し、区別しうる、プローブの態様を開示する。開示するプローブの態様は、生理的pHで他のアミノ酸およびチオール（例えば、Hcy）からGSHおよびCysを識別することもできる。開示するプローブの態様は、検出を容易にするためのフルオロフォア部分ならびにGSHおよび/またはCysと縮合-環化反応を起こすことが可能な部分（「環化部分」と呼ぶ）を含む。いくつかの態様において、環化部分はα,β-不飽和カルボニル部分であり、これはフルオロフォア部分に共有結合する。
【００１７】
I.  用語および定義
以下の用語および略語の説明は、本開示をより良く記載し、本開示の実施において当業者を誘導するために提供するものである。本明細書において用いられる「含む（comprising）」は「含む（including）」を意味し、単数形「1つの(a)」または「1つの(an）」または「この(the）」は、文脈が明らかにそうではないと示していないかぎり、複数の指示を含む。「または」なる用語は、文脈が明らかにそうではないと示していないかぎり、述べられた代替要素の1つの要素または複数の要素の組み合わせを意味する。
【００１８】
特に記載がないかぎり、本明細書において用いられるすべての技術および科学用語は、本開示が属する分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本開示の実施または試験において、本明細書に記載のものと類似または等価の方法および材料を用いうるが、適切な方法および材料を以下に記載する。材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定を意図するものではない。開示の他の特徴は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
【００１９】
特に記載がないかぎり、本明細書または特許請求の範囲において用いられる成分の量、分子量、パーセンテージ、温度、時間などを表すすべての数は、「約」なる用語で修飾されていると理解されるべきである。したがって、暗に、または明確に、そうではないと記載がないかぎり、示される数値パラメーターは、求められる所望の性質および/または標準の試験条件/方法の下での検出限界に依存しうる近似値である。態様を議論された先行技術から直接に、かつ明確に区別する場合、態様の数は、「約」なる用語が示されないかぎり、近似値ではない。
【００２０】
化学における他の一般用語の定義は、John Wiley & Sons, Inc.発行のRichard J. Lewis, Sr. (ed.), Hawley's Condensed Chemical Dictionary, 1997 (ISBN 0-471-29205-2)において見いだされるであろう。
【００２１】
本開示の様々な態様の再検討を容易にするために、以下の特定の用語の説明を提供する。
【００２２】
吸光度：化合物または物質による、それへの特定の波長の照射事象の保持；光が化合物もしくは物質を、または化合物もしくは物質の溶液を通過する際に吸収される、特定の波長の光の量の尺度。
【００２３】
アクリル酸エステル：一般式-OC(O)CR=CR'R''を有する基であり、ここでR、R'およびR''は個々に水素、ハロゲン、ヒドロキシル、低級アルコキシ、低級脂肪族、またはアリールである。
【００２４】
脂肪族：実質的に炭化水素に基づく化合物、またはそのラジカル（例えば、ヘキサンラジカルについてはC6H13）であり、その環式型を含み、さらに直鎖および分枝鎖配置、ならびにすべての立体および位置異性体も含む、アルカン、アルケン、アルキンを含む。特に記載がないかぎり、脂肪族基は1〜25個の炭素原子；例えば、1〜15個、1〜10個、1〜6個、または1〜4個の炭素原子を含む。「低級脂肪族」なる用語は、1〜10個の炭素原子を含む脂肪族基を意味する。脂肪族鎖は置換されていても無置換でもよい。脂肪族基は1つまたは複数の置換基（脂肪族鎖中の各メチレン炭素に対して最大2つの置換基、または脂肪族鎖中の-C=C-二重結合の各炭素に対して最大1つの置換基、または末端メチン基の炭素に対して最大1つの置換基）で置換されうる。例示的脂肪族置換基には、例えば、アミン、アミド、スルホンアミド、ハロゲン、シアノ、カルボキシル、ヒドロキシル、メルカプト、トリフルオロメチル、アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、チオアルコキシ、アリールアルキル、ヘテロアリール、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、または他の官能基が含まれる。
【００２５】
アルキル：飽和炭素鎖を有する炭化水素基。鎖は分枝でも非分枝でもよい。低級アルキルなる用語は、鎖が1〜10個の炭素原子を含むことを意味する。
【００２６】
アルコキシ：式-ORを有する官能基であり、ここでRはアルキル基である。低級アルコキシなる用語は、アルキル基が1〜10個の炭素原子を含むことを意味する。
【００２７】
芳香族またはアリール：典型的には交互の一重および二重結合を有する、不飽和、環式炭化水素である化合物または基。3つの二重結合を含む、6個の炭素の環であるベンゼンは、典型的な芳香族化合物である。
【００２８】
BC：塩化ベンザルコニウム、塩化ベンジル-ジメチル-トリデシル-アザニウム。
【００２９】
カルボキシアルキル：一般式-C(O)ORを有する基であり、ここでRはアルキル基である。
【００３０】
カルボキシル：一般式-COOHを有する基。
【００３１】
CTAB：臭化セチルトリメチルアンモニウム。
【００３２】
環化部分：本明細書において用いられる「環化部分」なる用語は、チオール基およびアミノ基を含む化合物などの、標的化合物と縮合-環化反応を起こすことが可能な分子の部分を意味する。
【００３３】
Cys：システイン。
【００３４】
検出する：作用物質（標的分子などの）が、例えば、試料中に存在するか否かを判定すること。「検出」とは、標的分子が生体試料中に存在するかどうかを判定するなどの、何かが存在するか、または存在しないかを判定する任意の方法を意味する。例えば、「検出」は、試料が特定の特徴を示すかどうかを判定するための視覚的または機械的装置の使用を含みうる。
【００３５】
有効な期間：本明細書において定義される有効な期間とは、化学反応を起こさせるのに十分な長さの時間である。本開示に関して、有効な期間は、チオール含有化合物の開示するプローブの態様との縮合およびその後のチオール含有化合物の環化を起こさせるのに十分な長さの時間である。
【００３６】
発光または発光シグナル：光源から発生する特定の波長の光。特定の例において、発光シグナルはフルオロフォアがその励起波長で光を吸収した後にフルオロフォアから放出される。
【００３７】
エステル：有機酸（一般式：RCO2H）から誘導された化学化合物であり、ここで-OH（ヒドロキシル）基の水素は脂肪族、アルキルまたはアリール基で置き換えられている。有機酸から誘導されたエステルの一般式を以下に示す：
2015516470.tif 000013
式中、RおよびR'は、脂肪族、置換脂肪族、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールなどを含む、実質的に任意の基を示す。エステル置換基は一般式-OC(O)Rを有する。
【００３８】
蛍光：より高い電子状態からより低い電子状態に移動中の原子または分子による可視放射の発光であり、ここでエネルギーの吸収と放出との間の間隔は10-8〜10-3秒である。蛍光は、原子または分子が励起光源（例えば、紫外線ランプ）からエネルギーを吸収し、次いでエネルギーを可視放射として放出する際に生じる。
【００３９】
フルオロフォアまたは蛍光原：蛍光色素などの蛍光が可能な化合物。「フルオロフォア」なる用語は、励起光源に曝露されると、分子に蛍光発光させる分子の部分も意味する。
【００４０】
官能基：分子の特徴的な化学反応を担う分子内の特定の原子群。例示的官能基には、アルカン、アルケン、アルキン、アレン、ハロ（フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード）、エポキシド、ヒドロキシル、カルボニル（ケトン）、アルデヒド、炭酸エステル、カルボキシラート、エーテル、エステル、ペルオキシ、ヒドロペルオキシ、カルボキサミド、アミン（一級、二級、三級）、アンモニウム、イミド、アジド、シアナート、イソシアナート、チオシアナート、ニトラート、亜硝酸化合物、ニトリル、ニトロアルカン、ニトロソ、ピリジル、ホスファート、スルホニル、スルフィド、チオール（スルフヒドリル）、ジスルフィドが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００４１】
GSH：グルタチオン。
【００４２】
Hcy：ホモシステイン。
【００４３】
HEPES：2-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル]エタンスルホン酸。
【００４４】
プローブ：本明細書において用いられる「プローブ」なる用語は、関心対象の分子（すなわち、存在および/または濃度を判定しようとする分子）と選択的に反応し、反応の結果、検出可能なシグナルまたは変化を生じることが可能な分子を意味する。検出可能なシグナルまたは変化には、プローブおよび/または関心対象の分子の吸光スペクトルおよび/または発光スペクトルにおける変化が含まれうる。
【００４５】
SDS：ドデシル硫酸ナトリウム。
【００４６】
置換基：反応の結果、分子内の別の原子に置き代わる原子または原子群。「置換基」なる用語は、典型的には、親炭化水素鎖または環上の水素原子に置き代わる原子または原子群を意味する。
【００４７】
置換（された）：典型的には水素原子の代わりに、それに結合した置換基を有する、アリール、もしくは脂肪族化合物、またはそのラジカルなどの基本的化合物。例えば、置換アリール化合物または置換基は、トルエンのように、アリールを基本とする閉環に結合した脂肪族基を有していてもよい。ここでも例示のためにすぎず、限定的ではないが、長鎖炭化水素は、1つまたは複数のハロゲン、アリール基、環式基、ヘテロアリール基またはヘテロ環式基などの、それに結合した置換基を有していてもよい。「無置換」と明確に言及されていないかぎり、本明細書において示す官能基（例えば、脂肪族、アルキル、アルコキシ、アミノ、アリール、シクロアルキル、エステルなど）は無置換または置換のいずれでもありうる。
【００４８】
界面活性剤：水または水性溶液に溶解した場合、表面張力を低下させる化合物。界面活性剤は典型的には、両親媒性有機化合物、すなわち、疎水性基と親水性基の両方を含む有機化合物である。界面活性剤は、それらの親水性基、またはヘッドによって特徴付けうる。非イオン性界面活性剤は、そのヘッドに形式電荷を含まない。イオン性界面活性剤は、実効電荷を有する親水性基を含む。電荷が負である場合、界面活性剤はアニオン性界面活性剤である。電荷が正である場合、これはカチオン性界面活性剤である。ヘッドが2つの反対に荷電した基を含む場合、これは双性イオン性界面活性剤である。
【００４９】
チオール：式-SHを有する官能基。化合物に関して本明細書において用いられる「チオール」なる用語は、チオール基およびアミノ基を含む化合物を意味する。
【００５０】
II.  代表的態様の概要
チオール基およびアミノ基を含む化合物（本明細書において「チオール」と呼ぶ）を選択的に検出するためのプローブの態様を開示する。例示的化合物には、システイン、ホモシステイン、およびグルタチオンなどの生体チオールが含まれる。開示するプローブの態様は、1つまたは複数のチオールと溶液中で反応すると、溶液の吸光スペクトルおよび/または発光スペクトルにおいて検出可能な変化を生じる。検出を行うための方法およびキットも開示する。
【００５１】
開示するプローブの態様は一般式Iの化学構造を有する。
2015516470.tif 000014
式中、
2015516470.tif 000015
と示す各結合は、原子価の要求を満たすのに必要な一重または二重結合であり；R1、R3〜R6およびR8は独立して、H、ヒドロキシル、チオール、低級アルキル、カルボキシアルキル、アミノ、アルコキシ、またはハロゲンであり；R2はα,β-不飽和脂肪族エステルであり；R7は、O、S、H、ヒドロキシル、チオール、低級アルキル、カルボキシアルキル、アミノ、アルコキシ、もしくはハロゲンであるか、またはR7およびR8は一緒にシクロアルキルもしくはアリール環を形成し；X1は、CH2、S、NH、O、Se、Si(CH3)2、Ge(CH3)2、Sn(CH3)2、またはC(CH3)2であり；かつX2は、CH、CH2、N、NH、またはCR9であり、ここでR9はアリールである。
【００５２】
いくつかの態様において、X1はOまたはSであり、かつR7はOもしくはSであるか、またはR7およびR8は一緒にアリール環を形成する。前述の態様のいずれか、またはすべてにおいて、R2はアクリル酸エステルでありうる。前述の態様のいずれか、またはすべてにおいて、R1およびR3〜R6は独立して、Hまたは低級アルキルでありうる。いくつかの態様において、R1は低級アルキルであり、かつR3〜R6はHである。いくつかの態様において、R7はOまたはSであり、かつR8はHである。前述の態様のいずれか、またはすべてにおいて、X1はOでありえ、X2はNまたはCR9でありえ、R1は低級アルキルまたはHでありえ、R2はアクリル酸エステルでありえ、R3〜R6はHでありえ、かつR7はOでありえ、かつR8はHでありうるか、またはR7およびR8は一緒にアリール環を形成しうる。
【００５３】
いくつかの態様において、R7はOまたはSであり、かつX2はCH、CH2、NまたはNHである。前述の態様のいずれか、またはすべてにおいて、R7はOでありえ、かつX2はCHまたはNでありうる。前述の態様のいずれか、またはすべてにおいて、R2はアクリル酸エステルでありうる。いくつかの態様において、R2はアクリル酸エステルであり、R7はOであり、かつX2はCHまたはNである。いくつかの態様において、R2はアクリル酸エステルであり、R7はOであり、X1はOであり、かつX2はCHまたはNである。R2がアクリル酸エステルである任意またはすべての態様において、R7はOであり、X1はOであり、かつX2はCHまたはNであり、R1、R3〜R6、およびR8は独立して、Hまたは低級アルキルでありうる。例示的プローブは以下の化学構造を有する。
2015516470.tif 000016
【００５４】
いくつかの態様において、R7およびR8は一緒にアリール環を形成し、かつX2はCR9である。そのような態様において、化合物は一般式IIの化学構造を有する：
2015516470.tif 000017
式中、
2015516470.tif 000018
は原子価の要求を満たすのに必要な一重または二重結合を示し、かつ
2015516470.tif 000019
は任意の一重結合を示し；R2およびR11は独立してα,β-不飽和脂肪族エステルであり；R10、R12、およびR13は独立して、水素、ヒドロキシル、チオール、低級アルキル、カルボキシアルキル、アミノ、アルコキシ、またはハロゲンであり；R14〜R17は独立して、水素、アルキル、アシル、カルボキシル、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、または-SO3Hであり；かつR18は、水素、ヒドロキシル、低級アルキル、低級アルコキシ、-SO3Hもしくは-COOR19であり、ここでR19は水素もしくは低級アルキルであり、かつ環Bの
2015516470.tif 000020
と示す結合は二重結合であるか、またはR18は環BおよびEと共に環系を形成する1つもしくは複数の原子であり、かつ環Bの
2015516470.tif 000021
と示す結合は一重結合である。
【００５５】
いくつかの態様において、R2およびR11はそれぞれアクリル酸エステルである。前述の態様のいずれか、またはすべてにおいて、R18は-RCOOHでありうるか、またはR18は-C(O)O-であり、かつ環BおよびEと共に環系を形成しうる。前述の態様のいずれか、またはすべてにおいて、R1、R3〜R6、R10およびR12〜R17は独立して、Hまたは低級アルキルでありうる。いくつかの態様において、R1は低級アルキルであり、かつR3〜R6、R10およびR12〜R17はHであり；任意に、X1はOである。一般式IIの1つの例示的プローブは以下の化学構造を有する。
2015516470.tif 000022
【００５６】
チオール基およびアミノ基を含む化合物を選択的に検出するための方法の態様は、以下の段階を含む：（i）チオール基およびアミノ基を含む少なくとも1つの化合物を含む可能性がある試料を、一般式Iの構造を有するプローブを含む溶液と合わせて、反応混合物を生成する段階；（ii）試料とプローブとの間の反応を、反応混合物の吸光スペクトル、発光スペクトル、または両方において検出可能な変化を生じるのに有効な期間進行させ、ここで変化は化合物が存在することを示す段階；および（iii）変化を検出する段階。いくつかの例において、化合物はシステイン、ホモシステイン、グルタチオン、またはその組み合わせである。
【００５７】
前述の態様のいずれか、またはすべてにおいて、有効な期間は≦60分でありうる。前述の態様のいずれか、またはすべてにおいて、試料は血液、血液生成物もしくは成分、尿、または尿生成物もしくは成分を含みうる。1つの態様において、方法は、血漿を得る段階、還元剤の添加により血漿を還元する段階、血漿中のタンパク質を沈澱させる段階、沈澱したタンパク質を血漿から分離して試料を生成する段階、およびその後試料を、プローブを含む溶液と合わせる段階をさらに含む。別の態様において、方法は、全血を吸収性材料上にスポッティングし、血液を乾燥させることにより調製した乾燥血液スポットを得る段階、乾燥血液スポットを溶媒で抽出して抽出物を生成する段階、還元剤の添加により抽出物を還元して還元抽出物を生成する段階、還元抽出物を分画して試料を得る段階、およびその後試料を、プローブを含む溶液と合わせる段階をさらに含む。
【００５８】
前述の態様のいずれか、またはすべてにおいて、変化を検出する段階は以下を含みうる：（i）反応前の反応混合物の色を反応後の反応混合物の色と比較すること、（ii）反応が有効な期間進行した後、1つまたは複数の波長で反応混合物の吸光度の変化を検出すること、（iii）試料およびプローブを合わせた後の第一の時点での反応混合物の吸光スペクトルを、反応が有効な期間進行した後の反応混合物の吸光スペクトルと比較すること、（iv）反応が有効な期間進行した後、1つまたは複数の波長で反応混合物の発光の変化を検出すること、（v）試料およびプローブを合わせた後の第一の時点での反応混合物の発光スペクトルを、反応が有効な期間進行した後の溶液の発光スペクトルと比較すること、（vi）またはその任意の組み合わせ。
【００５９】
前述の態様のいずれか、またはすべてにおいて、プローブはプローブ8でありうる。いくつかの態様において、化合物を検出する段階は、580〜590nmで反応混合物の蛍光を検出することを含む。いくつかの態様において、プローブがプローブ8であり、かつ化合物がグルタチオンである場合、反応混合物はカチオン性界面活性剤をさらに含む。例示的カチオン性界面活性剤には、臭化セチルトリメチルアンモニウムおよび塩化ベンザルコニウムが含まれる。いくつかの態様において、プローブがプローブ8であり、かつ化合物がシステインである場合、反応混合物はカチオン性界面活性剤以外の界面活性剤，例えば、ドデシル硫酸ナトリウムまたはポリエチレングリコールtert-オクチルフェニルエーテルをさらに含む。特定の態様において、反応混合物はジメチルスルホキシドをさらに含む。
【００６０】
前述の態様のいずれか、またはすべてにおいて、化合物はシステインでありえ、かつプローブはプローブ5でありうる。いくつかの態様において、反応混合物は臭化セチルトリメチルアンモニウムをさらに含む。
【００６１】
チオール基およびアミノ基を含む少なくとも1つの化合物を検出するためのキットの態様は、一般式Iの構造を有する、開示するプローブの態様を含む。いくつかの態様において、キットは6〜7.5のpHを有する少なくとも1つの緩衝溶液をさらに含む。緩衝溶液は界面活性剤を含んでいてもよい。いくつかの態様において、界面活性剤は、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ドデシル硫酸ナトリウム、またはポリエチレングリコールtert-オクチルフェニルエーテルである。
【００６２】
前述の態様のいずれか、またはすべてにおいて、キットは、その中でプローブと化合物との間の反応を実施しうる複数の使い捨て容器をさらに含んでいてもよい。いくつかの態様において、チオール基およびアミノ基を含む化合物と反応すると、吸光スペクトル、発光スペクトル、または両方において検出可能な変化を起こすのに有効な量のプローブを、複数の使い捨て容器中にあらかじめ秤量する。
【００６３】
前述の態様のいずれか、またはすべてにおいて、キットは、（a）プローブと（b）システイン、ホモシステイン、グルタチオン、またはその組み合わせとの間の反応によって生じる変色を評価するための色比較図を含んでいてもよい。前述の態様のいずれか、またはすべてにおいて、プローブはプローブ5またはプローブ8でありうる。
【００６４】
III. 共役付加-環化の概要
システインは特定のアクリラートと縮合を起こして、置換1,4-チアゼピンを生成することが可能である（Blondeau et al., Can. J. Chem. 1971, 49, 3866-3876；Leonard et al., J. Org. Chem. 1966, 31, 3928-3935）。反応は、スキーム1に例示するとおり、Cysがアクリラート（1：Rはメチルなどのアルキル）に共役付加してチオエーテル（2a）を生成することを含み、これはさらに分子内環化を起こして所望の化合物3a（3-カルボキシ-5-オキソペルヒドロ-1,4-チアゼピン）を得ることができる。
2015516470.tif 000023
システイン（Cys）およびホモシステイン（Hcy）は構造的に関連しているが、Hcyの側鎖に1つの過剰のメチレン基が存在することで異なる。Hcyからは類似のチオエーテル（2b）が生成する（Khatik, Org. Lett. 2006, 8, 2433-2436）。しかし、8員環（3b）を生成する分子内環化は、Cysの場合の7員環に比べて動力学的に不利であり、すなわち、ホモシステインの環化率はシステインの環化率よりも低いと予想される。
【００６５】
CysおよびHcyに対してGSHの高度に選択的な検出を達成するために、7員環または8員環よりも大きい12員環の生成を支持する手ごわい問題を克服する必要があろう。臭化セチルトリメチルアンモニウム（CTAB）ミセルは大きい環の分子内閉環を触媒して、環のサイズに基づいて予想される動力学を逆転させうると報告されている（Wei et al., Langmuir, 1991, 7, 1336-1339）。GSHはカチオン性CTABミセルの表面に結合することが可能である（Huang et al., Langmuir, 2005, 23, 1518-1522）。
【００６６】
本明細書において、GSHまたはCysを選択的に検出するために用いうるプローブの態様、ならびにプローブの作成法および使用法を開示する。プローブのいくつかの態様は、生体媒質中のGSHまたはCysを検出するのに適している。
【００６７】
IV. プローブ
生体チオールの選択的検出のために有用なプローブを開示する。開示するプローブのいくつかの態様は、励起されると長波長（例えば、550〜700nm）発光を起こし、生体試料（例えば、血液、血漿、尿、またはその生成物もしくは成分）中のチオールを選択的に検出するために適切となる。開示するプローブはフルオロフォア部分ならびにチオール基およびアミノ基を含む化合物と縮合-環化反応を起こすことが可能な環化部分を含む。反応前は、プローブは無色で非蛍光である。環化が起こった後、環化部分およびチオール含有化合物は脱離し、それによりフルオロフォアを放出する。放出されたフルオロフォアは溶液中で着色して見える。いくつかの態様において、プローブは共役付加およびミセル触媒による大環状環形成/脱離の連鎖を起こす。
【００６８】
開示するプローブの態様は一般式Iの化学構造を有する：
2015516470.tif 000024
式中、
2015516470.tif 000025
と示す各結合は、原子価の要求を満たすのに必要な一重または二重結合であり；R1、R3〜R6およびR8は独立して、水素、ヒドロキシル、チオール、低級アルキル、カルボキシアルキル、アミノ、アルコキシ、またはハロゲンであり；R2はα,β-不飽和脂肪族エステルであり；R7は、酸素、硫黄、水素、ヒドロキシル、チオール、低級アルキル、カルボキシアルキル、アミノ、アルコキシ、もしくはハロゲンであるか、またはR7およびR8は一緒にシクロアルキルもしくはアリールを形成し；X1は、CH2、S、NH、O、Se、Si(CH3)2、Ge(CH3)2、Sn(CH3)2、またはC(CH3)2であり；かつX2は、CH、CH2、N、NH、またはCR9であり、ここでR9はアリールである。R2はチオール基およびアミノ基を含む化合物と反応することが可能な環化部分である。
【００６９】
いくつかの態様において、X1はOまたはSであり、かつR7はOもしくはSであるか、またはR7およびR8は一緒にアリール環を形成する。1つの態様において、R2はアクリル酸エステルであり、X1はOまたはSであり、かつR7はOもしくはSであるか、またはR7およびR8は一緒にアリール環を形成する。別の態様において、R1およびR3〜R6は独立して、Hまたは低級アルキルであり、X1はOまたはSであり、かつR7はOもしくはSであるか、またはR7およびR8は一緒にアリール環を形成する。1つの例において、R1は低級アルキルであり、かつR3〜R6はHである。別の態様において、X1はOまたはSであり、R7はOまたはSであり、かつR8はHである。さらに別の態様において、X1はOであり、X2はNまたはCR9であり、R1は低級アルキルまたはHであり、R2はアクリル酸エステルであり、R3〜R6はHであり、かつR7はOであり、かつR8はHであるか、またはR7およびR8は一緒にアリール環を形成する。
【００７０】
いくつかの態様において、プローブは、R7がOまたはSであり、かつX2がCH、CH2、N、またはNHである、一般式IAの構造を有する。
2015516470.tif 000026
1つの態様において、R2はアクリル酸エステルである。別の態様において、X2はCHまたはNであり、かつR7はOである。さらに別の態様において、R2はアクリル酸エステルであり、X2はCHまたはNであり、かつR7はOである。さらに別の態様において、R2はアクリル酸エステルであり、R7はOであり、X1はOであり、かつX2はCHまたはNである。別の態様において、R2はアクリル酸エステルであり、R7はOであり、X1はOであり、X2はCHまたはNであり、かつR1、R3〜R6、およびR8は独立して、Hまたは低級アルキルである。1つの態様において、R2は無置換アクリル酸エステルであり、X1はOであり、X2はNであり、R7はOであり、かつR1、R3〜R6、およびR8はHである（すなわち、「プローブ8」）。
2015516470.tif 000027
【００７１】
いくつかの態様において、R7およびR8は一緒にアリール環を形成し、X2はCR9であり、かつプローブは一般式IIの化学構造を有するセミナフトフルオレセイン（SNF）である：
2015516470.tif 000028
式中、
2015516470.tif 000029
は原子価の要求を満たすのに必要な一重または二重結合を示し、かつ
2015516470.tif 000030
は任意の一重結合を示し；X1およびR1〜R6は前に規定したとおりであり；R2およびR11は独立してα,β-不飽和脂肪族エステルであり；R10、R12、およびR13は独立して、水素、ヒドロキシル、チオール、低級アルキル、カルボキシアルキル、アミノ、アルコキシ、またはハロゲンであり；R14〜R17は独立して、水素、アルキル、アシル、カルボキシル、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、または-SO3Hであり；かつR18は、水素、ヒドロキシル、低級アルキル、低級アルコキシ、-SO3Hもしくは-COOR19であり、ここでR19は水素もしくは低級アルキルであり、かつ環Bの
2015516470.tif 000031
と示す結合は二重結合であるか、またはR18は環BおよびEと共に環系を形成する1つもしくは複数の原子であり、かつ環Bの
2015516470.tif 000032
と示す結合は一重結合である。R2およびR11はチオール基およびアミノ基を含む化合物と反応することが可能な環化部分である。
【００７２】
1つの態様において、R2およびR11はそれぞれアクリル酸エステルである。別の態様において、R2およびR11はそれぞれアクリル酸エステルであり、かつR18は-COOHであるか、またはR18は-C(O)O-であって、環BおよびEと共に環系を形成する。さらに別の態様において、R2およびR11はそれぞれアクリル酸エステルであり、R1、R3〜R6、R10およびR12〜R17は独立して、Hまたは低級アルキルであり、かつR18は-COOHであるか、またはR18は-C(O)O-であって、環BおよびEと共に環系を形成する。さらに別の態様において、X1はOであり、R2およびR11はそれぞれアクリル酸エステルであり、R1、R3〜R6、R10およびR12〜R17は独立して、Hまたは低級アルキルであり、かつR18は-COOHであるか、またはR18は-C(O)O-であって、環BおよびEと共に環系を形成する。別の態様において、R2およびR11はそれぞれアクリル酸エステルであり、R1は低級アルキルであり、R3〜R6、R10およびR12〜R17はHであり、かつR18は-COOHであるか、またはR18は-C(O)O-であって、環BおよびEと共に環系を形成する。1つの態様において、X1はOであり、R2およびR11はそれぞれアクリル酸エステルであり、R1はメチルであり、R3〜R6、R10およびR12〜R17はHであり、かつR18は-C(O)O-であって、環BおよびEと共に環系を形成する（すなわち、「プローブ5」）。
2015516470.tif 000033
【００７３】
V. チオール検出および使用法
操作のいかなる特定の理論にも縛られたくはないが、プローブ5を用いて、スキーム2に示すメカニズムによりCysを選択的に検出することができる。プローブ5は、無色、非蛍光の化合物である。プローブ上のアクリラート基はそれぞれ、Cysとの縮合、環化、脱離、およびキサンテン色素スピロラクトン開環の連鎖を起こして、着色、蛍光セミナフトフルオレセインを生成する（例えば、図3参照）。いくつかの態様において、プローブはHcyおよびGSHとも反応するが、これははるかに低い程度で、反応によって蛍光はほとんど生じず、明らかな変色は見られない（図2〜3）。したがって、プローブ5を時間依存的検定において用い、CysとHcy/GSHを区別することができる。いくつかの態様において、プローブ5は、Cysに対する選択的「裸眼」計量器としての使用にも適している。
2015516470.tif 000034
【００７４】
非蛍光化合物であるプローブ8は、スキーム3に示すとおり、類似の反応の連鎖を起こして、強い蛍光のレゾルフィン7を放出する。いくつかの溶液中で、プローブ8はCysを選択的に検出し、より低い程度でHcyを検出する。
2015516470.tif 000035
【００７５】
CysおよびHcyに対してGSHを選択的に検出するために、7員環または8員環（3aおよび3bのような）よりも大きい環（GSHの場合には12員環）の生成を支持する手ごわい問題を克服しなければならない。特定の界面活性剤を含むことにより、プローブ8の本来の選択性が劇的に変化することが判明した。
【００７６】
臭化セチルトリメチルアンモニウム（CTAB）はカチオン性界面活性剤で、いくつかの環の分子内環化を触媒しうるミセルを形成し、それにより、大きい環が小さい環よりも速く閉環しうるように、環のサイズに基づいて予想される動力学を逆転させる（Wei et al., Langmuir, 1991, 7, 1336-1339）。GSHはカチオン性CTABミセルの表面に結合することが可能であると判明している（Huang et al., Langmuir, 2005, 23, 1518-1522）。
【００７７】
プローブ8は小さく、実質的に平面状であるため、CTABミセルと相互作用して大きい環の閉環およびGSHの選択的検出を促進することが可能である。操作のいかなる特定の理論にも縛られたくはないが、作用メカニズムはGSHが非蛍光プローブ8に共役付加して化合物9を生成することを含み、これは次いでCTABによって触媒される分子内環化/脱離反応連鎖を起こして、12員環10および遊離レゾルフィン色素7を放出し、蛍光を回復することになる（スキーム4）。高分解能質量分析により、12員環10（図1）およびレゾルフィン7の生成が示された。CysおよびHcyなどの他のチオールは、CTAB存在下でプローブ8との有意な反応は示さなかった。
2015516470.tif 000036
【００７８】
別のカチオン性界面活性剤である塩化ベンジル-ジメチル-トリデシル-アザニウム（BC）も、プローブ8によりGSHを選択的に検出した。BCを溶液に含めると、Cysも検出されたが、GSHはより強い蛍光を生じた。
【００７９】
開示するプローブの態様は、チオール基およびアミノ基を含む化合物を選択的に検出するために適切である。例示的化合物には、生体チオールCys、Hcy、およびGSHが含まれる。チオール基およびアミノ基を含む少なくとも1つのチオール含有化合物を含む可能性がある試料を、一般式Iのプローブを含む溶液と合わせる。試料は、血液（例えば、全血または血液生成物もしくは血漿などの成分）または尿（または尿生成物もしくは成分）などの生物体液であってもよい。反応を有効な期間進行させる。有効な期間は、チオール含有化合物が試料中に存在する場合に、縮合、環化、および脱離反応が起こり、それにより反応混合物の吸光スペクトル、蛍光発光スペクトル、または両方における変化を生じるのに十分な時間である。いくつかの態様において、有効な期間は、10秒〜30分、1〜30分、1〜25分、1〜20分、または1〜10分などの、≦60分、≦30分、≦20分、≦10分、または≦5分である。チオール含有化合物の存在を、（i）反応前の反応混合物の色を化合物との反応後の反応混合物の色と比較すること、（ii）反応が有効な期間進行した後、1つまたは複数の波長で反応混合物の吸光度の変化を検出すること、（iii）試料およびプローブを合わせた後の第一の時点での反応混合物の吸光スペクトルを、反応が有効な期間進行した後の反応混合物の吸光スペクトルと比較すること、（iv）反応が有効な期間進行した後、1つまたは複数の波長で反応混合物の発光の変化を検出すること、（v）試料および化合物を合わせた後の第一の時点での反応混合物の発光スペクトルを、反応が有効な期間進行した後の反応混合物の発光スペクトルと比較すること、（vi）またはその任意の組み合わせによって検出する。チオール含有化合物非存在下では、変化は検出されない。
【００８０】
プローブの吸光スペクトルの変化は、吸光スペクトルを得ること、適切な波長で吸光度を測定すること、または実質的に変色を検出すること（すなわち、裸眼により）によって検出してもよい。プローブの蛍光スペクトルの変化は、蛍光発光スペクトルを得ること、または適切な波長で蛍光強度を測定することによって検出してもよい。経時的な吸光度および/または蛍光変化を測定してもよい。
【００８１】
特定の態様において、試料中のチオール含有化合物の濃度を判定してもよい。例えば、CysまたはGSHの濃度を判定してもよい。標準曲線を、式Iのプローブを既知の量のチオール含有化合物を含む溶液と合わせることによって調製する。有効な期間の後、吸光度および/または蛍光を適切な波長で測定する。いくつかの例において、プローブ8を用いた場合、有効な期間は1分、2分、8分、10分、20分、または60分未満であり、蛍光発光は585〜590nm（λex＝565nm）で測定し；最大吸光度は585〜590nmで見られた。特定の例において、プローブ5を用いた場合、有効な期間は25分であり、最大蛍光は615〜620nm（λex＝550nm）で見られた。次いで、チオールを含む可能性がある試料をプローブと、同じ条件（溶液組成、pH、時間、温度）下で合わせ、次いで吸光度および/または蛍光を測定し、較正曲線と比較して試料中のチオール濃度を判定する。
【００８２】
いくつかの態様において、試料を6.0〜7.5のpHなどの、5.5〜8.0のpHに緩衝化する。蛍光はpHが高いほど速く発生しうるが、選択性はより低いpHで増強されうる。特定の態様において、GSHを生物体液中で検出する場合、試料をpH6に緩衝化した。
【００８３】
いくつかの例において、試料はCys、Hcy、および/またはGSH以外のスルフヒドリル含有化合物を含み、かつ/または可視波長領域で有意な吸光度、蛍光、および/もしくは散乱を示す。特定の態様において、試料は、血液、血液生成物もしくは成分（例えば、血漿）、尿、または尿生成物もしくは成分などの、生物体液である。
【００８４】
1つの態様において、試料は血漿を含み、方法は、血漿を還元剤（例えば、トリフェニルホスフィンまたはTCEP（トリス-(2-カルボキシエチル)-ホスフィン））と合わせる段階、および血漿からタンパク質を除去する段階をさらに含む。タンパク質は、例えば、沈澱によって除去してもよい。血漿は緩衝液で希釈（例えば、10％などの、5〜20％の濃度まで）してもよい。1つの例において、50mMリン酸緩衝液、pH6.0を用いた。一般式Iのプローブを還元し、除タンパクした血漿と合わせる。チオールの存在を、反応混合物の吸光スペクトル、発光スペクトル、または両方の変化を検出することによって判定する。
【００８５】
別の態様において、試料は全血を含む。全血を吸収紙上にスポッティングし、乾燥させる。チオールを乾燥血液スポットから抽出する。1つの例において、リン酸緩衝液（100mM、pH6.0）を用いて抽出を行う。抽出物を、例えば、TCEPまたはトリフェニルホスフィンで還元する。還元抽出物を、ゲルろ過などにより分画してタンパク質および他の高分子量分子を除去することにより、還元チオールを単離する。1つの例において、1000〜5000ダルトンの分子量を有する球状タンパク質を分画することが可能な、架橋デキストランゲルを含む脱塩カラム（Sephadex(登録商標)G-25、GE Healthcare）を、溶離剤としての100mMリン酸緩衝液と共に用いた。単離した分画を一般式Iのプローブと合わせる。チオールの存在を、反応混合物の吸光スペクトル、発光スペクトル、または両方の変化を検出することによって判定する。
【００８６】
いくつかの態様において、Cysを含む可能性がある試料を式IAのプローブと、カチオン性界面活性剤非存在下で合わせることにより、Cysを選択的に検出する。特定の態様において、Cysをプローブ8により選択的に検出する。反応は6〜7.5のpHで1〜60分間行ってもよい。試料および/またはプローブを、アニオン性または非イオン性界面活性剤を含む溶液中で提供してもよい。例えば、トリトン(登録商標)X-100（ポリエチレングリコールtert-オクチルフェニルエーテル）はプローブのCysに対する選択性を高め、かつ/または反応が起こる速度を高めることがあり、例えば、10〜15分でありうる。Cysを、反応混合物の吸光スペクトル、発光スペクトル、または両方の変化を検出することによって検出する。プローブ8を用いる場合、蛍光は565nmの励起波長で生じうる。蛍光を、580〜590nmの発光波長で蛍光強度を測定することにより、または蛍光発光スペクトルを得ることにより検出する。いくつかの例において、Cysを、反応混合物中の桃色の発生を観察することにより、視覚的に検出することができる。
【００８７】
または、Cysを含む可能性がある試料を式IIのプローブと合わせることにより、Cysを選択的に検出することができる。特定の態様において、プローブ5を用いてCysを選択的に検出する。反応は6〜7.5のpHで1〜30分間行ってもよい。試料および/またはプローブを、界面活性剤、例えば、CTABなどのカチオン性界面活性剤を含む溶液中で提供してもよい。Cysを、反応混合物の吸光スペクトル、発光スペクトル、または両方の変化を検出することによって検出する。プローブ5を用いる場合、蛍光は550nmの励起波長で生じうる。蛍光を、615〜635nmの波長で蛍光強度を測定することにより、または蛍光発光スペクトルを得ることにより検出する。いくつかの例において、Cysを、反応混合物中の桃色の発生を観察することにより、視覚的に検出することができる。
【００８８】
GSHを含む可能性がある試料を式IAのプローブと、カチオン性界面活性剤存在下で合わせることにより、GSHを選択的に検出することができる。いくつかの態様において、GSHをプローブ8により選択的に検出する。適切なカチオン性界面活性剤にはCTABおよびBCが含まれる。反応は6〜7.5のpHで0〜30分間行ってもよい。GSHは、極性非プロトン性溶媒などの特定の溶媒中で、プローブ8により選択的に検出してもよい。例えば、プローブ8はGSHを、DMSO：H2O 1：1の溶液（pH7.4）中で選択的に検出する。GSHを、反応混合物の吸光スペクトル、発光スペクトル、または両方の変化を検出することによって検出する。プローブ8を用いる場合、蛍光は565nmの励起波長で生じうる。蛍光を、580〜590nmの発光波長で蛍光強度を測定することにより、または蛍光発光スペクトルを得ることにより検出する。いくつかの態様において、GSHを、溶液中の桃色の発生を観察することにより、視覚的に検出することができる。
【００８９】
VI. プローブ合成
いくつかの態様において、一般式IAの構造を有するプローブを、以下のスキーム5に示す1段階反応で合成する。レゾルフィン、またはレゾルフィン類縁体を、塩化アクリロイルなどのアクリロイル塩と、ジクロロメタンおよびトリエチルアミン存在下で合わせて、アクリラートレゾルフィン類縁体を生成する。R1およびR3〜R8は前に規定したとおりである。
2015516470.tif 000037
【００９０】
特定の態様において、一般式IIの構造を有するプローブを、以下のスキーム6に示すとおりに合成する。ヒドロキシベンゾフェノン誘導体を、1,3-ジヒドロキシフェニル誘導体を2-ベンゾフラン-1,3-ジオン誘導体と、塩化アルミニウム存在下で反応させることにより調製する。ヒドロキシベンゾフェノン誘導体および1,8-ナフタレン誘導体を、メタンスルホン酸を用いての反応によって縮合し、セミナフトフルオレセイン（SNF）誘導体を生成する。次いで、SNF誘導体をアクリロイル塩と、トリエチルアミンおよびジクロロメタン存在下で反応させて、アクリラートSNF誘導体を生成する。R1、R3〜R6、R10、およびR12〜R17は前に規定したとおりである。
2015516470.tif 000038
【００９１】
VII. キット
キットも本開示の特徴である。キットの態様は本明細書において開示する少なくとも1つのプローブを含み、ここでプローブは1つまたは複数のチオール含有化合物、特にチオール基およびアミノ基を含む1つまたは複数の化合物（例えば、システイン、ホモシステイン、グルタチオン）を選択的に検出するのに適している。いくつかの態様において、キットは生理的pHの緩衝溶液をさらに含む。特定の態様において、緩衝液は、pH7.4の20〜50mMリン酸もしくはHEPES緩衝液、またはpH6.0の50〜100mMリン酸緩衝液などの、pH6〜7.5のリン酸緩衝液である。プローブを緩衝液に溶解してもよく、またはプローブは乾燥型で含まれてもよく、ユーザーがプローブおよび緩衝溶液を使用時もしくは使用前に合わせることができる。いくつかの態様において、緩衝溶液は界面活性剤をさらに含む。キットは、その中で検出を行うことができる、使い捨て試験管またはキュベットなどの、1つまたは複数の容器を含んでいてもよい。いくつかの態様において、少なくとも1つの化合物と反応した場合に、検出可能な変色および/または検出可能な蛍光発光スペクトルの変化を起こすのに有効な量のプローブを、使い捨て容器中にあらかじめ秤量する。キットは、検出を行うための説明書をさらに含んでいてもよい。いくつかの態様において、キットはチオール含有化合物、例えば、システイン、ホモシステイン、および/またはグルタチオンの対照試料を含む。典型的には、対照試料は固体型で提供する。
【実施例】
【００９２】
VIII. 実施例
材料および機器：すべての化学物質はSigma-AldrichまたはAcrosから購入し、それ以上精製せずに用いた。すべての実験において、Hcy以外は鏡像異性的に純粋な天然アミノ酸を用い、Hcyはラセミ体で用いた。1H-NMRおよび13C-NMRスペクトルは、Bruker AMX-400 NMR分光器で、内部標準としてTMSを用いて記録した。ESI-HRMS（高分解能質量分析）スペクトルは、Thermo Electron LTQ Orbitrapハイブリッド質量分析計で得た。UV-可視スペクトルは、Cary 50 UV-Vis分光光度計で収集した。蛍光スペクトルは、励起および発光両方に対してスリット幅を5nmに設定した、Cary Eclipse（Varian, Inc.）蛍光分光光度計で収集した。蛍光分光光度計の高電圧はプローブ8に対して500Vに設定した。pH測定はOrion 410A pH計で行った。
【００９３】
実施例1
プローブ5の合成
2015516470.tif 000039
SNFを発表された方法（Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004, 101, 1129-1134）に従って2段階で合成した。
2015516470.tif 000040
。
【００９４】
無水CH2Cl2（10mL）中のSNF（120mg、0.30mmol）およびトリエチルアミン（2当量）の溶液に、塩化アクリロイル（2.5当量、5mLのCH2Cl2と混合）を0℃で滴加した。この温度で90分間撹拌した後、得られた混合物を室温まで加温し、終夜撹拌した。次いで、混合物をCH2Cl2（25mL）で希釈し、水（12mL×3）で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥した。溶媒を蒸発により除去して、粗生成物を黄色固体で得、次いでこれをフラッシュカラムクロマトグラフィ（シリカゲル、CHCl3/EtAC 100：6）で精製して、4を淡黄色固体で得た（99mg、収率65％）。
2015516470.tif 000041
。
【００９５】
実施例2
プローブ5によるシステインの選択的検出
プローブ5（10μM）を1当量のCys、Hcy、GSH、ロイシン、プロリン、アルギニン、ヒスチジン、バリン、メチオニン、スレオニン、グルタミン、アラニン、アスパラギン酸、ノルロイシン、イソロイシン、リジン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、システイン、またはホモシステインと、pH7.4（HEPES緩衝液、20mM）で緩衝化した1.0mM CTAB中で25分間合わせた。蛍光スペクトルを550nmの励起波長で得た。図2Aに示すとおり、Cysだけが有意な蛍光を生じた。少量の蛍光が、HcyおよびGSHとの反応後に得られた（図2B）が、他の評価した化合物からは有意な蛍光は得られなかった。図3は、プローブ5がCysと反応した際に得られた可視変色を示す写真である。HcyまたはGSHでは変色は観察されなかった。
【００９６】
実施例3
プローブ8の合成
2015516470.tif 000042
プローブ8を、レゾルフィン7の塩化アクリロイルとの1段階反応で合成した（スキーム6）。無水CH2Cl2（15mL）中のレゾルフィン（7、220mg）およびトリエチルアミン（1.5当量）の溶液に、塩化アクリロイル（5mLのCH2Cl2中2.0当量）を0℃で滴加した。この温度で60分間撹拌した後、得られた混合物を室温まで冷却し、終夜撹拌した。混合物をCH2Cl2（20mL）で希釈し、H2O（10mL×3）で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥した。溶媒を蒸発により除去して、橙色固体を得た（172mg、収率70％）。
2015516470.tif 000043
。
【００９７】
実施例4
プローブ8によるシステインの選択的検出
プローブ8（2.5μM）をチオール（2当量）と、リン酸緩衝液（pH7.4、50mM）中で合わせた。20分後、吸光スペクトルおよび蛍光（λex＝565nm）スペクトルを得た。経時的な蛍光変化（λem＝587nm）もモニターした。
【００９８】
リン酸緩衝液中で、プローブ8は、動力学的に有利な7員環形成により、Cysに対して優れた選択性を示した。Cysをプローブ8と混合した後、共役付加生成物8aが生成し、これは速やかな環化反応を起こして3aを生成する一方、遊離レゾルフィンを放出する（前述のスキーム3）。Cysに応答して有意な変色および蛍光増強が観察された（図4、5）。Hcyの場合、その側鎖に追加のメチレン基を有するため、動力学的に不利な8員環が生成する。GSHでは、プローブ8のα,β-不飽和カルボニル部分へのチオールの1,4-付加が容易に起こりうるが、あとに続くCysと同様の分子内環化は、リン酸緩衝液中では進行しない。HcyまたはGSHの場合には、これらの条件下で有意な発色または蛍光反応は見られなかった（図4、5）。
【００９９】
蛍光検定の時間経過を図5（挿入図）に示す。Cysとの反応後の蛍光は時間と共に増大し、約90分後にプラトーに達したが、HcyおよびGSHでは、反応は有意に遅かったことが明らかである。
【０１００】
プローブ8のCysに対する応答の選択性および直線性も調査した。様々な濃度（0〜3μM）のCysをプローブ8（2.5μM）と、pH7.4（リン酸緩衝液、50mM）で合わせ、反応を60分間進行させた。図6は、Cysおよびプローブ8を合わせた後60分で得られた蛍光スペクトル（λex＝565nm）を示す。図7は、Cys濃度の関数としての、593nmでの蛍光強度における直線的増大（相関係数0.995）を示すグラフである。感受性がマイクロモル濃度よりも低い線形応答が観察され、0.2μMという低い濃度のCysを検出しうることが示された。
【０１０１】
高分解能質量分析により、プローブ8（20μM）をCys（20μM）とMeOH:H2O 1：1中で合わせた場合、化合物3a（3-カルボキシ-5-オキソペルヒドロ-1,4-チアゼピン）の生成およびレゾルフィン7の放出が示された（図8）。反応時間は3時間であった。同様に、プローブ8（20μM）をHcy（20μM）とMeOH:H2O 1：1中で合わせた（反応時間＝3時間）場合、化合物3bが生成し、レゾルフィンが放出された（図9）。
【０１０２】
遊離NH2基の必要性を示すために、N-アセチルシステイン（NAC）を用いての実験を行った。CysおよびNAC（リン酸緩衝液（50mM、pH＝7.4）中12.5μM）を、プローブ8（2.5μM）を含む溶液に加えた。吸光スペクトルおよび発光スペクトルを90分間の時間経過を通して得た。NACを含む反応からは、有意な吸光または発光は得られなかった。結果から、分子内環化および付加/脱離反応が起こるには遊離NH2基が必要であることが判明した。
【０１０３】
実施例5
プローブ8の選択性に対するCTABの影響
Cys、Hcy、またはGSH（2当量）を、4mLのリン酸緩衝液（pH7.4、50mM）中のプローブ8（10μM）に加えた。次いで、CTABを加えて、2mM CTABを含む溶液を生成した。CTAB添加直後、GSHを含む溶液で強い桃色が発生した。図10は、チオールと合わせたプローブ8の吸光スペクトルを示す。挿入図は、GSHの選択的検出を示すカラー写真であり；写真はCTAB添加直後に撮影した。GSH存在下で、CTAB添加直後に強い桃色が得られた（挿入図）。HcyおよびCysは同じ条件下で有意な変化を示さなかった。これらの結果は，プローブ8-CTAB系はGSHの選択的な目視検査計量器として役立ちうることを示している。
【０１０４】
蛍光スペクトル（λex＝565nm；λem＝587nm）も、CTAB添加直後に得た（図11）。GSHでのみ有意な蛍光が得られた。高分解能質量分析により、CTAB媒質中の12員環の生成が確認された。環に対応する主ピークはm/z 360.08で見られた（図1）。
【０１０５】
pH7.4で緩衝化した2.0mM CTAB中のプローブ8（2.5μM）の2当量のCys、Hcy、またはGSHとの反応を、蛍光分光法-λex ＝565nm；λem＝587nmで経時的にモニターした。図11の挿入図に示すとおり、GSHでは即時蛍光が見られ、蛍光は急速に増大して、2分未満でプラトーに達した。これに対して、CysおよびHcyは、最初は蛍光をほとんど生じず；時間と共に蛍光は徐々に増大したが、GSHで得られた蛍光よりはるかに低いままであった。
【０１０６】
実施例6
プローブ8の選択性に対する界面活性剤および溶媒の影響
様々な界面活性剤存在下で、プローブ8のチオール選択性を評価した。プローブ8（2.5μM）を、以下の界面活性剤を含むリン酸緩衝化媒質（50mM、pH＝7.4）中で2当量のCys、Hcy、またはGSHと合わせた：（a ）ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、10mM；（b）トリトン(登録商標)X-100、0.3mM；（c）塩化ベンジル-ジメチル-トリデシル-アザニウム（塩化ベンザルコニウム、BC）、0.05mM、または（d）CTAB、2mM。
2015516470.tif 000044
時間依存的蛍光変化（λex/λem＝565/590nm）をモニターした。結果を図12〜15に示す。図12および13に示すとおり、Cysは、SDSおよびトリトンX-100存在下で、プローブ8によって優先的に検出された。SDS存在下で（図12）、蛍光は50分間の測定時間枠を通してゆっくり増大した。トリトン(登録商標)X-100存在下では（図13）、蛍光ははるかに速く増大し、Cysに対するより高い選択性が観察された。BCおよびCTABを用いた場合、最大蛍光が1〜2分以内に達成された。図14に見られるとおり、CysおよびGSHはいずれもBC存在下で検出され、GSHはより強い蛍光を生じた。CTAB存在下で（図15）、GSHに対するはるに高い選択性が観察された。図16および17は、CTAB（図16）およびトリトンX-100（図17）存在下でのプローブ8の蛍光スペクトルで、ここでもプローブ8はカチオン性界面活性剤CTAB存在下ではGSHに対して選択的であるが、トリトンX-100存在下ではCysに対して選択的であることを示している。
【０１０７】
結果は、プローブ8がBCおよびCTABなどのカチオン性界面活性剤存在下でGSHの指示薬であることを示している。いかなる特定の理論にも縛られたくはないが、カチオン性ミセルとGSHとの間の有利なクーロン引力が、カチオン性界面活性剤存在下でのプローブ8のGSHに対する選択性において役割を果たしている可能性がある。負に荷電したSDSは、プローブ8の3つのチオールすべてに対する応答を抑制したが；非イオン性界面活性剤トリトンX-100は、Cysへの選択性を増強し、HcyまたはGSHに対するゼロ応答を引き起こした。GSHでの結果を図18にまとめており、これは界面活性剤添加直後に得た蛍光スペクトルを示す。挿入図は、同じ系の時間依存的蛍光変化（λem＝587nm）を示すグラフである。
【０１０８】
別の検定において、プローブ8（2.5μM）を2当量のCys、Hcy、GSH、ロイシン、プロリン、アルギニン、ヒスチジン、バリン、メチオニン、スレオニン、グルタミン、アラニン、アスパラギン酸、ノルロイシン、イソロイシン、リジン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、システイン、またはホモシステインと、pH7.4（リン酸緩衝液、50mM）で緩衝化した2.0mM CTAB中で合わせた。蛍光発光スペクトル（λex＝565nm）をチオールおよび他のアミノ酸の添加直後に得た。図19に示すとおり、GSHだけが有意な蛍光を生じた。プローブ8のGSHに対する選択性をさらに試験するために、GSHに過剰の他のアミノ酸を加えて競合実験を行い、GSHだけを含む溶液に比べて、有意な蛍光強度の相違は認められなかった。
【０１０９】
界面活性剤は有機環境を模倣することができるため、DMSO：H2O（1：1、pH7.4で緩衝化）中の選択性を試験した。Cys、Hcy、およびGSH（2当量）をDMSO：H2O（1：1、pH7.4で緩衝化）中のプローブ8（2.5μM）に加え、蛍光を経時的に測定した。プローブ8のGSHに対する選択性が示された（図20）。
【０１１０】
Cys存在下でのプローブ8のGSHに対するCTAB仲介性応答を評価した。Cys（2μM）および漸増濃度のGSH（0〜2μM）のpH7.4（リン酸緩衝液、50mM）での混合物をプローブ8（1.5μM）に加え、蛍光スペクトル（λex＝565nm）を2分後に得た。図21に示すとおり、Cysが存在する場合、プローブ8の蛍光スペクトルに有意な相違はなかった。しかし、GSHまたはGSH＋Cysをプローブ8と反応させると、蛍光は大幅に増大した。したがって、プローブ8はCys存在下でもGSHに対して選択的である。図22は、蛍光強度とGSH濃度との間の相関係数0.990の直線関係を示し、また、GSHおよびCysの混合物でも相関係数0.9894を有する直線関係を示している。
【０１１１】
pH7.4（リン酸緩衝液、50mM）で緩衝化した2.0mM CTAB媒質中、様々な濃度（0〜6μM）のGSHをプローブ8（2.5μM）と合わせることによって、GSH濃度の影響を評価した。GSH濃度はヒト血漿中のGSHの範囲内であった。図23は、CTAB添加直後に得た蛍光スペクトル（λex＝565nm）を示す。図23の挿入図は、マイクロモル濃度よりも低い感受性および蛍光強度（λex＝565nm、λem＝587nm）とGSH濃度との間の直線関係（相関係数0.998）を示すグラフである。測定はCTAB添加直後に行った。これらの結果は、プローブ8-CTAB系がヒト血漿中の典型的なGSH濃度の範囲内で良好に機能することを示している。
【０１１２】
実施例7
プローブ8によるGSH検出に対するpHの影響
プローブ8-CTAB-GSHシグナルはpH7.4では高かった（例えば、実施例6参照）が、アクリル酸エステルは高いpHで加水分解を受けやすく、GSHも同じ条件下で比較的不安定であることが知られている（半減期はpH7.4では9時間であるのに比べ、pH6.5では16時間；Stevens et al., Biochem. Educ., 1983, 11, 70）。
【０１１３】
プローブ8-CTAB系のスペクトル挙動を、広範囲のpH値（pH5.5〜pH8）で調査し、様々なチオ−ルに対するその応答を低いpH値で試験した。プローブ8（2.5μM）をpH5.5〜8で緩衝化したCTAB媒質（2mM）に加え、580nmの波長で吸光度を経時的にモニターした（図24）。プローブ8は、試験したpH値が高いほど背景シグナルが大きかった。プローブ8-CTAB系は低いpH値で最も安定であった。1分後および10分後のpH6.0、7.0、および8.0のCTAB媒質中のプローブ8の吸光スペクトルを、それぞれ図25および26に示す。
【０１１４】
pH6でのチオールとの反応を評価した。pH6（リン酸緩衝液、50mM）で緩衝化した2.0mM CTAB媒質中のチオール（2当量）添加後のプローブ8（2.5μM）の吸光スペクトルを20分後に得た（図27）。蛍光スペクトル（λex＝565nm）も得た（図28）。図28の挿入図は、時間依存的蛍光変化（λem＝587nm）を示し；蛍光の増大はpH7.4（例えば、図15参照）に比べて速度がわずかに遅かったが、GSHに対する選択性は、いかなる残存CysおよびHcy応答も完全に除去することで、さらに増強された。したがって、pH6を血漿中でのさらなる適用試験のために選択した。
【０１１５】
実施例8
プローブ5および8による血漿中のGSHの検出
ヒト血漿（0.5mL）を、触媒としてのトリフェニルホスフィン（0.1M、80μL）存在下、HCl（0.2M、40μL）を用いて、室温で15分間還元した。還元後の試料中に存在するタンパク質を、アセトニトリル（0.5mL）を加え、続いて試料を20分間遠心沈降（4000rpm）することによって沈澱させた。次いで、上清の液体を、1.0mM CTAB存在下、pH7.4 HEPES緩衝溶液（0.1M、5mL）中のプローブ5（10μM）の溶液に加えた。蛍光スペクトル（λex＝550nm）を25分後に得た。
【０１１６】
図29に示すとおり、蛍光発光は還元血漿の添加により有意な増大を示した。しかし、プローブ5を含む溶液の蛍光発光は、トリフェニルホスフィン単独または除タンパク血漿（還元剤なし）のいずれかの対照を加えた場合、明白な蛍光増大は示さず、蛍光増大はプローブ5のCysとの反応が原因であったことを示している。血漿試料中のCysの量は、標準の添加法によって、172.8±8.7μM（n＝3）と判定され、これは十分に健常個人からのヒト血漿試料で報告されたCys濃度範囲（135.8〜266.5μM）内である。結果は、プローブ5が生体試料中のCysの定量的検出のために有用でありうることを示している。
【０１１７】
血漿タンパク質を、MeCN（再構成量の3分の2）を用いて沈澱させ、4,000rpmで30分間遠心沈降することにより除去した。上清の液体を希釈して10％除タンパク血漿とし、2.0mM CTAB存在下、リン酸緩衝液（pH6、50mM）中のプローブ8（1〜1.5μM）の溶液に加えた。いくつかの試料にGSH（0〜2.0μM）またはGSH（2μM）およびCys（2μM）の混合物を加えた。
【０１１８】
重複測定（n＝3）試料およびGSH添加試料の蛍光応答を前述のとおりにモニターし、血漿試料中のGSH含有量を標準較正曲線の回帰式からもとめた（図30、プローブ8＝1μM）。測定は混合の8分後に行った。蛍光発光スペクトル（λex＝565nm）も混合の8分後に得た（図31、プローブ8＝1μM）。較正曲線を用いて、血漿試料のGSH含有量を3.24±0.14μMと判定し、これは十分に健常個人からのヒト血漿試料で報告されたGSH濃度範囲内である。既知のGSH添加量の回収は、99.2％から102.3％の間で、満足できる精度であった（表1）。表1に示すとおり、3つの重複測定試料の相対標準偏差は6％未満であった。これらの結果から、ヒト血漿中のGSHの定量的検出においてプローブ8を使用することは、適用可能であり、信頼性がある可能性が明らかとなった。
【０１１９】
感受性および選択性を、血漿単独、血漿＋0.5μM GSH、血漿＋2μM GSH、ならびに血漿＋2μM GSHおよび2μM Cys（プローブ8＝1.5μM）の蛍光スペクトルを得ることにより評価した。測定は混合の8分後に行った。結果を図32に示す。特に、Cysの添加はGSH定量に有意な干渉を示さなかった。
【０１２０】
（表１）10％除タンパクヒト血漿試料中のGSH含有量の定量
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【０１２１】
実施例9
プローブ8による乾燥血液スポット中のGSHの選択的検出
ブタ血液（10、20、および40μL）をWhatman 903(商標)ろ紙上にスポッティングし、室温で3〜4時間乾燥させた。酸化グルタチオンを乾燥血液スポット（DBS）から2.5mLリン酸緩衝液（100mM、pH7.4）により抽出した。抽出物をTCEP（トリス-(2-カルボキシエチル)-ホスフィン）（35mM）で還元して、ジスルフィドを還元した。還元抽出物をPD-10脱塩カラム（Sephadex(登録商標)G-25（架橋デキストランゲル）、GE Healthcare）で、溶離剤としてリン酸緩衝液（100mM、pH7.4）を用いてゲルろ過することにより、還元GSHを単離した。約1.5〜2.5mLの分画を4mLバイアルに回収した。CTAB（2.0mM）およびプローブ8（2.5μM）をバイアルに加えた。溶液をpH6.0（リン酸緩衝液、50mM）で緩衝化した。
【０１２２】
CTABおよびプローブ8の添加後の桃色発色により、GSHを4番目および5番目に溶離した分画中で検出した。5番目の分画から吸光スペクトルおよび蛍光スペクトル（λex＝565nm）を得た（それぞれ図33および34）。測定は混合直後に行った。図33は、プローブ8が10μL乾燥ブタ血から得た抽出物中のGSHを検出したことを示す蛍光スペクトルである。
【０１２３】
開示する発明の原理を適用しうる多くの可能な態様を考慮して、例示する態様は本発明の好ましい例にすぎないことが理解されるべきで、本発明の範囲を限定すると考えられるべきではない。それよりも、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって規定される。したがって、本発明者らは、本発明者らの発明として、これらの特許請求の範囲の主旨および範囲内に入るすべてを主張する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【国際調査報告】
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