(57)【要約】  本発明は、抗体及び抗体断片であって、その天然の鎖間ジスルフィド架橋の1つ以上が特定の架橋部分で置き換えられたものに関する。架橋部分は、抗体又は抗体断片内の鎖間ジスルフィド結合を選択的に標的化でき、これにより、より均一に修飾された生成物（例えば抗体-薬物コンジュゲートなど）の構築が可能となる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学修飾抗体ABであって、
（i）抗原AGに特異的に結合することができ；
（ii）4つの鎖であって、そのうち2つが重鎖であり、そのうち2つが軽鎖である鎖を含み；且つ
（iii）式（IA）の鎖間架橋部分を少なくとも1つ、又は式（IB）の鎖間架橋部分を少なくとも1つ
【化１】
2015510877.tif 000067
（式中、SA及びSBは、該化学修飾抗体の異なる鎖に結合する硫黄原子である）
含む、
化学修飾抗体AB。
【請求項２】
IgG1抗体である、請求項１に記載の化学修飾抗体。
【請求項３】
式（IA）の鎖間架橋部分を1つ又は式（IB）の鎖間架橋部分を1つ有し、且つ鎖は、それ以外ジスルフィド架橋-S-S-により架橋される、請求項２に記載の化学修飾抗体。
【請求項４】
式（IA）の鎖間架橋部分を2つ又は式（IB）の鎖間架橋部分を2つ有し、且つ鎖は、それ以外ジスルフィド架橋-S-S-により架橋される、請求項２に記載の化学修飾抗体。
【請求項５】
式（IA）の鎖間架橋部分2つの各々、又は式（IB）の鎖間架橋部分2つの各々が、2つの重鎖のうちの1つを、2つの軽鎖のうちの1つと架橋する、請求項４に記載の化学修飾抗体。
【請求項６】
式（IA）の鎖間架橋部分を3つ又は式（IB）の鎖間架橋部分を3つ有し、且つ鎖は、それ以外ジスルフィド架橋-S-S-により架橋される、請求項２に記載の化学修飾抗体。
【請求項７】
式（IA）の鎖間架橋部分を4つ又は式（IB）の鎖間架橋部分を4つ有し、且つ鎖は、ジスルフィド架橋-S-S-により架橋されない、請求項２に記載の化学修飾抗体。
【請求項８】
前記式（IA）の鎖間架橋部分の少なくとも1つがそれぞれ、同一又は異なって、式（IA’）部分であり、前記式（IB）の鎖間架橋部分の少なくとも1つがそれぞれ、同一又は異なって、式（IB’）部分である：
【化２】
2015510877.tif 000068
（式中、
-  Rは、（i）水素原子、（ii）カーゴ部分又は（iii）リンカー部分であって、該リンカー部分は、任意選択で、少なくとも1つのカーゴ部分と連結されてよく；且つ
-  RA及びRBは、互いに独立して、（i）化学的不活性基、（ii）カーゴ部分又は（iii）リンカー部分であって、該リンカー部分は、任意選択で、少なくとも1つのカーゴ部分と連結されてよく；且つ
-  SA及びSBは、前記化学修飾抗体の異なる鎖に結合する硫黄原子である）、
、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化学修飾抗体。
【請求項９】
前記化学修飾抗体が、薬物部分であるカーゴ部分を少なくとも1つ含む、請求項８に記載の化学修飾抗体。
【請求項１０】
前記薬物部分が細胞毒性剤である、請求項９に記載の化学修飾抗体。
【請求項１１】
前記抗原が、MY9、B4、EpCAM、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD11、CD19、CD20、CD22、CD25、CD26、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD44、CD56、CD64、CD70、CD74、CD79、CD105、CD138、CD205、CD227、EphAレセプター、EphBレセプター、EGFR、EGFRvIII、HER2、HER3、BCMA、PSMA、ルイスY、メソテリン、cripto、α（v）β3、α（v）β5、α（v）β6インテグリン、C242、CA125、GPNMB、ED-B、TMEFF2、FAP、TAG-72、GD2、CAIX及び5T4から選択される、請求項１０に記載の化学修飾抗体。
【請求項１２】
前記化学修飾抗体が、前記式（IB’）の鎖間架橋部分（式中、RAが前記薬物部分を含み、RBがイメージング剤を含む）を少なくとも1つ含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の化学修飾抗体。
【請求項１３】
前記リンカー部分（iii）が、式-L（CM）m（Z）n-m
（式中、
-  Lは連結部分を表し；
-  各CMは、同一又は異なって、カーゴ部分を表し；
-  各Zは、同一又は異なって、Lと結合する反応性基であって、カーゴ部分がLと連結するように該カーゴ部分と反応することができるものを表し；
-  nは、1、2又は3であり；且つ
-  mは、0〜nの整数である）
部分である、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の化学修飾抗体。
【請求項１４】
前記リンカー部分（iii）が、酵素触媒作用、酸性触媒作用、塩基性触媒作用、酸化触媒作用又は還元触媒作用により化学的断片化を受けることができる、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の化学修飾抗体。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の化学修飾抗体を選択的に製造するための方法であって、
-  還元剤の存在下、抗体の少なくとも1つの鎖間ジスルフィド架橋を還元する工程；及び
-  式（IIA）の鎖間架橋試薬の少なくとも1つ、又は式（IIB）の鎖間架橋部分の少なくとも1つ
【化３】
2015510877.tif 000069
（式中、X及びYは、それぞれ独立して、求電子性脱離基を表す）
と該抗体とを反応させる工程を含み、
それにより、該抗体の所望の位置に、式（IA）又は（IB）の鎖間架橋部分を所望の数導入し、該化学修飾抗体を製造する、方法。
【請求項１６】
前記還元剤が、2-メルカプトエタノール、トリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン、ジチオスレイトール及びベンゼンセレノールから選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
化学修飾抗体ABであって、
（i）抗原AGに特異的に結合することができ；
（ii）4つの鎖であって、そのうち2つが重鎖であり、そのうち2つが軽鎖である鎖を含み；且つ
（iii）式（III）の鎖間架橋部分の少なくとも1つ
【化４】
2015510877.tif 000070
（式中、SA及びSBは、該化学修飾抗体の異なる鎖に結合する硫黄原子である）
を含む、
化学修飾抗体AB。
【請求項１８】
化学修飾抗体断片ABFであって、
（i）抗原AGに特異的に結合することができ；
（ii）少なくとも2つの鎖を含み；且つ
（iii）式（IAF）の鎖間架橋部分を少なくとも1つ、又は式（IBF）の鎖間架橋部分を少なくとも1つ
【化５】
2015510877.tif 000071
（式中、SAF及びSBFは、該化学修飾抗体断片の異なる鎖に結合する硫黄原子である）
含む、
化学修飾抗体断片ABF。
【請求項１９】
前記式（IAF）の鎖間架橋部分の少なくとも1つ又は式（IBF）の鎖間架橋部分の少なくとも1つを介して重鎖が軽鎖と架橋されるscFv抗体断片である、請求項１８に記載の化学修飾抗体断片ABF。
【請求項２０】
前記式（IAF）の鎖間架橋部分の少なくとも1つ又は式（IBF）の鎖間架橋部分の少なくとも1つを介して重鎖が軽鎖と架橋されるFab抗体断片である、請求項１８に記載の化学修飾抗体断片ABF。
【請求項２１】
前記化学修飾抗体断片が、1位の窒素原子を介して薬物又はイメージング剤と連結され且つ2位の窒素原子を介して半減期延長剤と連結される前記式（IBF）の鎖間架橋部分を少なくとも1つを含む、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の化学修飾抗体断片ABF。
【請求項２２】
請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の化学修飾抗体断片を製造するための方法であって、
-  還元剤の存在下、抗体断片の少なくとも1つの鎖間ジスルフィド架橋を還元する工程；及び
-  式（IIA）部分を含む鎖間架橋試薬の少なくとも1つ、又は式（IIB）部分を含む鎖間架橋試薬の少なくとも1つ
【化６】
2015510877.tif 000072
（式中、X及びYは、それぞれ独立して、求電子性脱離基を表す）
と該抗体断片とを反応させる工程を含み、
それにより、該抗体断片の所望の位置に、式（IAF）又は（IBF）の鎖間架橋部分を所望の数導入し、該化学修飾抗体断片を製造する、方法。
【請求項２３】
化学修飾抗体断片ABFであって、
（i）抗原AGに特異的に結合することができ；
（ii）少なくとも2つの鎖を含み；且つ
（iii）式（IIIF）の鎖間架橋部分の少なくとも1つ
【化７】
2015510877.tif 000073
（式中、SAF及びSBFは、該化学修飾抗体断片の異なる鎖に結合する硫黄原子である）
を含む、
化学修飾抗体断片ABF。
【請求項２４】
請求項１〜１４のいずれか一項で定義するとおりの1つ以上の化学修飾抗体であって、そのそれぞれが抗原AGに結合できる抗体を含む組成物であって、ここで、該1つ以上の化学修飾抗体のうち特定の化学修飾抗体が、
（i）該1つ以上の化学修飾抗体のその他いずれかよりも多い重量で存在し；且つ
（ii）該1つ以上の化学修飾抗体全体量の少なくとも30重量％の量で存在する、
組成物。
【請求項２５】
前記1つ以上の化学修飾抗体のうち前記特定の化学修飾抗体が、該1つ以上の化学修飾抗体全体量の少なくとも50重量％の量で存在する、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記特定の化学修飾抗体が、請求項３〜７から選択されるいずれか一項で定義したとおりの化学修飾抗体である、請求項２４又は２５に記載の組成物。
【請求項２７】
式（IA）又は（IB）
【化８】
2015510877.tif 000074
（式中、SA及びSBは、結果として生じる化学修飾抗体の異なる鎖に結合する硫黄原子である）
の鎖間架橋部分によって、抗体の鎖間ジスルフィド結合の1つ以上を選択的に置き換えることを介して抗体の選択的な化学修飾を達成するための、式（IIA）又は式（IIB）
【化９】
2015510877.tif 000075
（式中、X及びYは、それぞれ独立して、求電子性脱離基を表す）
の鎖間架橋試薬の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体及び抗体断片の化学修飾に関する。特に、本発明は、抗体及び抗体断片の、その天然（native）の1つ以上の鎖間ジスルフィド架橋にわたり選択的修飾を達成するための方法、並びにかかる選択的方法を介して得ることができる関連生成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体（mAb）は、最も急速に成長している治療クラスを表し、腫瘍学、感染性疾患、炎症性疾患及び心臓血管内科を含む様々な臨床領域にわたって、効果的な治療を提供する可能性がある。現在、抗体の世界市場はおよそ500億ドルと推定される。
【０００３】
当該領域において、抗体の化学修飾は、抗体のin vivo特性の最適化（例えば、改善された薬物動態）を可能にする又は抗体に新たな機能及び活性を付与（例えば、薬物又はイメージング剤の結合）する、「カーゴ（cargo）」（又は「機能的」）部分の結合を可能にすることから、キーとなる技術的チャレンジである。
【０００４】
しかし、現在、抗体の化学修飾における従来技術は理想から程遠い。それは、以下の方法に依存する：
a）天然リジン残基への非選択的コンジュゲーション（不均一混合物、及び高頻度での活性の喪失がもたらされる）；
b）結合部位として単一のシステインを組み込むための突然変異（合成的に不便であり、問題のあるタンパク質発現並びにジスルフィド交換及び凝集が引き起こされ得る）；又は
c）コンジュゲーションのために2つのシステイン残基を提供するための、天然ジスルフィド結合の還元（キーとなる架橋モチーフが失われることによる抗体安定性の低下、及びこの場合にも、形成される生成物の不均一混合物がもたらされ得る）。
【０００５】
抗体薬物コンジュゲート（「ADC」）（世界的抗体市場のキーとなる、急速に成長している分野）を提供するに際し、抗体修飾において高度な均一性を達成することの利点には、治療指数及び薬物動態の改善が含まれ得る。従って、より均一なコンジュゲートを提供するため、抗体の選択的修飾についての新たな方法が現在熱心に探索されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
結果として、選択的に抗体を修飾するための新規方法に対する必要性、及び従来の方法を用いて通常得られる均一性よりも高い均一性を有する化学修飾抗体の提供に対する必要性が当該分野に存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本特許出願は、抗体及び抗体断片であって、その天然の1つ以上の鎖間ジスルフィド架橋が、特定の合成架橋部分で置き換えられているものを記載する。架橋部分は、鎖内（intra-chain）よりむしろ鎖間（inter-chain）ジスルフィド結合を、さらには特定の鎖間ジスルフィド結合を選択的に標的化することができ、より均一に化学修飾された抗体（例えば、架橋部分が1つ以上のカーゴ部分も有する（carries）場合には、ADCなどのより均一なバイオコンジュゲート）の構築を可能にする。
【０００８】
要約
本発明者らは、マレイミド及び3,6-ジオキソピリダジン化合物の特定のクラスを用いて、適切な反応条件下、それを抗体及び抗体断片の鎖間ジスルフィド架橋と反応させた場合に、該鎖間ジスルフィド架橋を選択的に標的化し、置き換えることができることを確認した。化学修飾は、鎖内ジスルフィド架橋よりもむしろ鎖間ジスルフィド架橋で優先的に生じ、抗体又は抗体断片に存在する他の鎖間ジスルフィド架橋に優先して、選択した鎖間ジスルフィド架橋で生じるように調節することもできる。
【０００９】
従って、これらの鎖間架橋部分を組み込んだ化学修飾抗体及び抗体断片は、従来法におけるものよりも不均一性が低い。さらに、後に化学修飾の基礎として役立ち得る人工的な残基を導入するための突然変異誘発合成工程を達成することを通常必要としない。さらに、本明細書に記載の鎖間架橋部分は、それらが置き換わる天然の鎖間ジスルフィド架橋の構造を模倣できるので、天然抗体又は抗体断片の構造的完全性及び機能性を保持することを保証する。
【００１０】
結果として、本発明者らは、特徴的な鎖間架橋部分を有する、選択的に修飾された抗体及び抗体断片を得た。該架橋部分は、それ自体がさらに1つ以上のカーゴ部分を有してよく、従って、その抗体（又は抗体断片）成分が選択的に機能化されているコンジュゲートの提供がもたらされる。3,6-ジオキソピリダジン修飾の場合には、単一の鎖間架橋部分スキャフォールド上に複数のカーゴ部分、例えば、薬物又はイメージング剤と半減期延長剤（half-life extending agent）との両方を組み込むことが特に容易である。本明細書においてより詳細に記載するように、関連する合成方法、生成物及び使用も提供する。
【００１１】
従って、本発明は、化学修飾抗体ABであって、
（i）抗原AGに特異的に結合することができ；
（ii）4つの鎖であって、そのうち2つが重鎖であり、そのうち2つが軽鎖である鎖を含み；且つ
（iii）式（IA）の鎖間架橋部分を少なくとも1つ、又は式（IB）の鎖間架橋部分を少なくとも1つ
【００１２】
【化１】
2015510877.tif 000002
【００１３】
（式中、SA及びSBは、該化学修飾抗体の異なる鎖に結合する硫黄原子である）
含む、
化学修飾抗体ABを提供する。
【００１４】
また、本発明の化学修飾抗体を選択的に製造するための方法であって、
-  還元剤の存在下、抗体の少なくとも1つの鎖間ジスルフィド架橋を還元する工程；及び
-  式（IIA）の鎖間架橋試薬の少なくとも1つ、又は式（IIB）の鎖間架橋部分の少なくとも1つ
【００１５】
【化２】
2015510877.tif 000003
【００１６】
（式中、X及びYは、それぞれ独立して、求電子性脱離基を表す）
と該抗体とを反応させる工程を含み、
それにより、該抗体の所望の位置に、式（IA）又は（IB）の鎖間架橋部分を所望の数導入し、該化学修飾抗体を製造する、方法も提供する。
【００１７】
本発明はさらに、化学修飾抗体ABであって、
（i）抗原AGに特異的に結合することができ；
（ii）4つの鎖であって、そのうち2つが重鎖であり、そのうち2つが軽鎖である鎖を含み；且つ
（iii）式（III）の鎖間架橋部分の少なくとも1つ
【００１８】
【化３】
2015510877.tif 000004
【００１９】
（式中、SA及びSBは、該化学修飾抗体の異なる鎖に結合する硫黄原子である）
を含む、
化学修飾抗体ABを提供する。
【００２０】
本発明はまた、化学修飾抗体断片ABFであって、
（i）抗原AGに特異的に結合することができ；
（ii）少なくとも2つの鎖を含み；且つ
（iii）式（IAF）の鎖間架橋部分を少なくとも1つ、又は式（IBF）の鎖間架橋部分を少なくとも1つ
【００２１】
【化４】
2015510877.tif 000005
【００２２】
（式中、SAF及びSBFは、該化学修飾抗体断片の異なる鎖に結合する硫黄原子である）
含む、
化学修飾抗体断片ABFも提供する。
【００２３】
さらに、本発明は、本発明の化学修飾抗体断片を製造するための方法であって、
-  還元剤の存在下、抗体断片の少なくとも1つの鎖間ジスルフィド架橋を還元する工程；及び
-  式（IIA）部分を含む鎖間架橋試薬の少なくとも1つ、又は式（IIB）部分を含む鎖間架橋試薬の少なくとも1つ
【００２４】
【化５】
2015510877.tif 000006
【００２５】
（式中、X及びYは、それぞれ独立して、求電子性脱離基を表す）
と該抗体断片とを反応させる工程を含み、
それにより、該抗体断片の所望の位置に、式（IAF）又は（IBF）の鎖間架橋部分を所望の数導入し、該化学修飾抗体断片を製造する、方法を提供する。
【００２６】
本発明はさらに、化学修飾抗体断片ABFであって、
（i）抗原AGに特異的に結合することができ；
（ii）少なくとも2つの鎖を含み；且つ
（iii）式（IIIF）の鎖間架橋部分の少なくとも1つ
【００２７】
【化６】
2015510877.tif 000007
【００２８】
（式中、SAF及びSBFは、該化学修飾抗体断片の異なる鎖に結合する硫黄原子である）
を含む、
化学修飾抗体断片ABFを提供する。
【００２９】
さらに、本発明は、本発明の1つ以上の化学修飾抗体であって、そのそれぞれが抗原AGに結合できる抗体を含む組成物であって、ここで、該1つ以上の化学修飾抗体のうち特定の化学修飾抗体が、
（i）該1つ以上の化学修飾抗体のその他いずれかよりも多い重量で存在し；且つ
（ii）該1つ以上の化学修飾抗体全体量の少なくとも30重量％の量で存在する、
組成物を提供する。
【００３０】
さらに、本発明は、式（IA）又は（IB）
【００３１】
【化７】
2015510877.tif 000008
【００３２】
（式中、SA及びSBは、結果として生じる化学修飾抗体の異なる鎖に結合する硫黄原子である）
の鎖間架橋部分によって、抗体の鎖間ジスルフィド結合の1つ以上を選択的に置き換えることを介して抗体の選択的な化学修飾を達成するための、式（IIA）又は式（IIB）
【００３３】
【化８】
2015510877.tif 000009
【００３４】
（式中、X及びYは、それぞれ独立して、求電子性脱離基を表す）
の鎖間架橋試薬の使用を提供する。
【００３５】
さらに好ましい特徴及び実施態様は、付随する説明及び添付の特許請求の範囲に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１Ａ】図1は、実施例2.3に示すように、抗CEAを還元した場合に得られたLCMSスペクトルを示す：Aは、非修飾抗CEAに相当する。
【図１Ｂ】図1は、実施例2.3に示すように、抗CEAを還元した場合に得られたLCMSスペクトルを示す：Bは、TCEPでの還元に相当する。
【図１Ｃ】図1は、実施例2.3に示すように、抗CEAを還元した場合に得られたLCMSスペクトルを示す：Cは、2-メルカプトエタノールでの還元に相当する。
【図１Ｄ】図1は、実施例2.3に示すように、抗CEAを還元した場合に得られたLCMSスペクトルを示す：Dは、DTTでの還元に相当する。
【図２】図2は、実施例2.4に記載するように、抗CEAにDTTを添加し、混合物を経時的にインキュベートし、LCMSによってモニタリングした結果を示す：黒丸は、低塩条件下、10当量のDTTに相当する；黒三角は、高塩条件下、10当量のDTTに相当する；白丸は、低塩条件下、20当量のDTTに相当する；白三角は、高塩条件下、20当量のDTTに相当する。
【図３Ａ】図3は、実施例2.5に従って、抗CEAを架橋した場合に得られたLCMSスペクトルを示す：Aは、非修飾抗CEAに相当する。
【図３Ｂ】図3は、実施例2.5に従って、抗CEAを架橋した場合に得られたLCMSスペクトルを示す：Bは、5分間反応後のサンプルに相当する。
【図４Ａ】図4は、様々な量の還元剤及び架橋試薬を用いて、実施例2.6に従って、抗CEAを架橋した結果を示す：Aは、様々なサンプル混合物のパフォーマンスを示す。
【図４Ｂ】図4は、様々な量の還元剤及び架橋試薬を用いて、実施例2.6に従って、抗CEAを架橋した結果を示す：Bは、非修飾抗CEAのLCMSスペクトルである。
【図４Ｃ】図4は、様々な量の還元剤及び架橋試薬を用いて、実施例2.6に従って、抗CEAを架橋した結果を示す：Cは、15当量の還元剤及び架橋試薬をともに用いて架橋した場合に得られたLCMSスペクトルである。
【図５】図5は、実施例2.7に従って、LCMSによりモニタリングされるとおり、抗CEAを架橋した結果を示す。
【図６Ａ】図6は、実施例2.8に従って、抗CEAを修飾及び機能化した結果を示す：Aは、非修飾抗CEAのLCMSスペクトルである。
【図６Ｂ】図6は、実施例2.8に従って、抗CEAを修飾及び機能化した結果を示す：Bは、ビオチン化（biotinylated）抗CEAのLCMSスペクトルである。
【図６Ｃ】図6は、実施例2.8に従って、抗CEAを修飾及び機能化した結果を示す：Cは、抗CEA-フルオレセインのLCMSスペクトルである。
【図６Ｄ】図6は、実施例2.8に従って、抗CEAを修飾及び機能化した結果を示す：Dは、アルキル化抗CEAのLCMSスペクトルである。
【図６Ｅ】図6は、実施例2.8に従って、抗CEAを修飾及び機能化した結果を示す：Eは、非修飾抗CEAのUVトレースである。
【図６Ｆ】図6は、実施例2.8に従って、抗CEAを修飾及び機能化した結果を示す：Fは、PEG化抗CEAのUVトレースである。
【図６Ｇ】図6は、実施例2.8に従って、抗CEAを修飾及び機能化した結果を示す：Gは、ペグ化抗CEAのSDS-PAGE分析である。
【図６Ｈ】図6は、実施例2.8に従って、抗CEAを修飾及び機能化した結果を示す：Hは、ペグ化抗CEAのMALDI-TOF分析である（左のピークは、レーザー衝撃によって生じた脱ペグ化タンパク質である）。
【図７】図7は、実施例2.9に従って、LCMSによりモニタリングされるとおり、抗CEAのin situ機能化の結果を示す。
【図８】図8は、実施例2.10に従って、LCMSによりモニタリングされるとおり、抗CEAのin situ機能化の結果を示す：黒丸は、2当量の架橋試薬を用いて得られた結果であり、白四角は、5当量の架橋試薬を用いて得られた結果である。
【図９】図9は、実施例2.11に従って、LCMSによりモニタリングされるとおり、2当量の架橋試薬と様々な量の還元剤とを用いたツーステッププロトコルにおける、抗CEAのin situ架橋の結果を示す。また、1.5当量又は1.2当量の架橋試薬を用いた場合（それぞれ、白色カラム及び黒色カラム）、全体で20当量の還元剤を用いて得られる結果も示す。
【図１０】図10は、実施例2.12に従って、UV/Vis分光法によりモニタリングした抗CEA-フルオレセインの蛍光を示す：点線は、非修飾抗CEAである；実線（filled line）は、5 μg/mlの抗CEA-フルオレセインであり、横長の点線（hashed line）は、25 μg/mlの抗CEA-フルオレセインである。
【図１１】図11は、実施例2.13に従って、抗CEA-HRPコンジュゲート合成のSDS-PAGE分析を示す：（1）ビオチン化抗CEA；（2）非修飾抗CEA；（3）非修飾抗CEAとHRP/STREPコンジュゲートとの混合；（4）HRP/STREPコンジュゲート；（5）15 μl；（6）12 μl；（7）10 μl；（8）8 μl；（9）6 μl；（10）4 μl；（11）2 μl；及び（12）1 μl。
【図１２Ａ】図12は、実施例2.14に従って、抗CEA-HRPコンジュゲートを用いたワンステップELISAの結果を示す：Aは、精製コンジュゲートのSDS-PAGE分析を示し、ここで、1は非修飾抗CEAであり、2はビオチン化抗CEAであり、3はHRP/STREPコンジュゲートであり、4は抗CEAとHRP/STREPコンジュゲートとの混合であり、5は精製抗CEA-HRPコンジュゲートである。
【図１２Ｂ】図12は、実施例2.14に従って、抗CEA-HRPコンジュゲートを用いたワンステップELISAの結果を示す：Bは、抗CEA-HRPコンジュゲートの活性試験を示す。
【図１２Ｃ】図12は、実施例2.14に従って、抗CEA-HRPコンジュゲートを用いたワンステップELISAの結果を示す：Cは、増加量の抗原に対するワンステップELISAの結果を示す。
【図１２Ｄ】図12は、実施例2.14に従って、抗CEA-HRPコンジュゲートを用いたワンステップELISAの結果を示す：Dは、減少量の抗CEA-HRPコンジュゲートを用いたワンステップELISAの結果を示す。
【図１３】図13は、実施例2.15に従って、抗CEA-HRPを用いたツーステップELISAの結果を示す：白丸は、一次及び二次抗体ミックスを用いた抗CEA-ビオチンである；白三角は、1：460希釈のHRP/STREPコンジュゲートを用いた結果である；黒丸は、1：4600希釈のHRP/STREPコンジュゲートを用いた結果である。
【図１４−１】図14は、実施例2.16に記載するように、機能的に架橋した抗CEAのELISA研究を示す：左側グラフにおいて、白丸は抗CEAであり、白三角は「処理した（processed）」抗CEAであり、黒丸は連続的に架橋した抗CEAであり、黒三角はin situ架橋した抗CEAである。
【図１４−２】図14は、実施例2.16に記載するように、機能的に架橋した抗CEAのELISA研究を示す：右側のグラフにおいて、白丸は「処理した（processed）」抗CEAであり、白三角は抗CEA-ビオチンであり、黒丸は抗CEA-フルオレセインであり、黒三角は抗CEA-PEG5000である。
【図１５】図15は、実施例2.17に記載するように、機能的に架橋した抗CEAに対するELISA結果を示す：白丸は「古い」架橋抗CEAであり、白三角は「新しい」架橋抗CEAであり、黒丸は「古い」抗CEA-PEG5000であり、黒三角は「新しい」抗CEA-PEG5000である。
【図１６】図16は、実施例2.18に記載するように、蛍光に基づく細胞ELISAの結果を示し、ここで、黒色カラムはCAPAN-1細胞に関し、灰色カラムはコントロールA375細胞に関する。
【図１７】図17は、実施例2.20に記載するように、様々な還元剤に対する、架橋抗CEAの安定性試験のLCMS結果を示す：黒丸は2-メルカプトエタノールに関し、白四角はジチオスレイトールに関し、黒三角はグルタチオンに関する。
【図１８Ａ】図18は、実施例2.21に記載するように、架橋抗CEAの血漿安定性に対する試験結果を示す：Aは、ヒト血漿において短時間インキュベート後のSDS-PAGEを示し、ここで、1+2+3は非修飾抗CEA（それぞれ、1、3、5 μg）を用いたローディングコントロールであり、4はニッケルビーズ精製バックグラウンドを示し、5は1 hでの結果を、6は4 hでの結果を、7は24 hでの結果を示す。
【図１８Ｂ】図18は、実施例2.21に記載するように、架橋抗CEAの血漿安定性に対する試験結果を示す：Bは、ヒト血漿において長時間インキュベート後のSDS-PAGEを示し、ここで、1+2+3は非修飾抗CEA（それぞれ、1、3、5 μg）を用いたローディングコントロールであり、4は3 dでの結果を、5は5 dでの結果を、6は7 dでの結果を、7は非修飾抗CEAを用いた7 dでの結果を、8はアルキル化抗CEAを用いた7 dでの結果を示す。
【図１８Ｃ】図18は、実施例2.21に記載するように、架橋抗CEAの血漿安定性に対する試験結果を示す：Cは、ニッケルビーズパフォーマンスコントロールのSDS-PAGEを示し、ここで、1は非修飾抗CEAであり、2は架橋抗CEAであり、3はアルキル化抗CEAであり、4は、PBSから精製された混合物であり、5はヒト血漿から精製された混合物である。
【図１８Ｄ】図18は、実施例2.21に記載するように、架橋抗CEAの血漿安定性に対する試験結果を示す：Dは、ヒト血漿中、1 h後のMSを示す。
【図１８Ｅ】図18は、実施例2.21に記載するように、架橋抗CEAの血漿安定性に対する試験結果を示す：Eは、ヒト血漿中、3 d後のMSを示す。
【図１８Ｆ】図18は、実施例2.21に記載するように、架橋抗CEAの血漿安定性に対する試験結果を示す：Fは、ヒト血漿中、7 d後のMSを示す。
【図１８Ｇ】図18は、実施例2.21に記載するように、架橋抗CEAの血漿安定性に対する試験結果を示す：Gは、ヒト血漿中、7 d後の非修飾抗CEAのMSを示す。
【図１８Ｈ】図18は、実施例2.21に記載するように、架橋抗CEAの血漿安定性に対する試験結果を示す：Hは、ヒト血漿中、7 d後のアルキル化抗CEAのMSを示す。
【図１９】図19は、実施例2.22に記載するように、ヒト血漿中でインキュベート後、抗CEAアナログ活性のELISA測定結果を示す：白丸は「処理した（processed）」sscFvであり、白三角は架橋sscFvであり、黒丸はアルキル化sscFvであり、黒四角はPEG-sscFvである。
【図２０Ａ】図20は、実施例3.2に従って、リツキシマブ（Rituximab）の還元結果を示す：Aは、TCEPを用いた還元を示すSDS-PAGE分析であり、ここで、1は非修飾抗体であり、2は抗体+DMFであり、3は5当量であり、4は10当量であり、5は20当量であり、6は40当量であり、7は60当量であり、8は80当量であり、9は100当量である。
【図２０Ｂ】図20は、実施例3.2に従って、リツキシマブの還元結果を示す：Bは、インタクト抗体のMSを示す。
【図２０Ｃ】図20は、実施例3.2に従って、リツキシマブの還元結果を示す：Cは、還元抗体のMSを示す。
【図２１】図21は、実施例3.3に記載するin situ抗体架橋のSDS-PAGE分析を示す：1）非修飾抗体、2）抗体+DMF、3）3当量、4）5当量、5）10当量、6）20当量、7）5当量、8）20当量、9）40当量及び10）80当量。
【図２２】図22は、実施例3.4に記載するように、抗体のin situ PEG化のSDS-PAGE分析を示す：1）非修飾抗体、2）抗体+DMF、3）3当量、4）5当量、5）10当量、6）20当量、7）5当量、8）20当量、9）40当量及び10）80当量。
【図２３Ａ】図23は、実施例3.5に記載するように、リツキシマブのPEG化の結果を示す：Aは、以下のとおり、様々な還元剤を用いたin situ PEG化のSDS-PAGE分析を示す：1）非修飾抗体；2）抗体+80当量のPEG；3）10当量のTCEP/20当量のPEG；4）10当量のTCEP；5）40当量のTCEP/80当量のPEG；6）40当量のTCEP；7）10当量のSe/20当量のPEG；8）10当量のSe；9）40当量のSe/80当量のPEG；及び10）40当量のSe。
【図２３Ｂ】図23は、実施例3.5に記載するように、リツキシマブのPEG化の結果を示す：Bは、非修飾抗体のMSを示す。
【図２３Ｃ】図23は、実施例3.5に記載するように、リツキシマブのPEG化の結果を示す：Cは、サンプル3のMSを示す。
【図２３Ｄ】図23は、実施例3.5に記載するように、リツキシマブのPEG化の結果を示す：；Dは、サンプル5のMSを示す。
【図２３Ｅ】図23は、実施例3.5に記載するように、リツキシマブのPEG化の結果を示す：Eは、サンプル7のMSを示す。
【図２３Ｆ】図23は、実施例3.5に記載するように、リツキシマブのPEG化の結果を示す：Fは、サンプル9のMSを示す。
【図２４】図24は、実施例3.6に記載するように、リツキシマブの連続的架橋のSDS-PAGE分析を示す：1）非修飾抗体、2）抗体+80当量+DMF、3）抗体+TCEP、4）5当量、5）10当量、6）20当量、7）30当量、8）40当量、9）60当量及び10）80当量。
【図２５】図25は、実施例3.6に記載するように、リツキシマブの段階的in situ PEG化のSDS-PAGE分析を示す：1）非修飾抗体、2）抗体+80当量、3）抗体+TCEP、4）5当量、5）10当量、6）20当量、7）30当量、8）40当量、9）60当量、10）80当量、11）抗体+25当量、12）5当量、13）10当量、14）20当量及び15）25当量。
【図２６】図26は、実施例3.7に記載するように、リツキシマブの「代替的（alternative）」還元のSDS-PAGE分析を示す：1）非修飾抗体、2）5当量のDTT、3）10当量のDTT、4）20当量のDTT、5）50当量のDTT、6）5当量のbME、7）10当量のbME、8）20当量のbME、及び9）50当量のbME。
【図２７】図27は、実施例3.8に記載するように、リツキシマブの「代替的（alternative）」PEG化のSDS-PAGE分析を示す：1）非修飾抗体、2）15当量、3）20当量、4）25当量、5）30当量及び6）抗体+30当量。
【図２８】図28は、実施例3.9に記載するように、リツキシマブの混合還元のSDS-PAGE分析を示す：1）非修飾抗体、2）抗体+TCEP、3）10当量、4）20当量及び5）50当量。
【図２９】図29は、実施例3.10に記載するように、リツキシマブの混合PEG化のSDS-PAGE分析を示す：1）非修飾抗体、2）抗体+10当量、3）抗体+TCEP+DTT、4）3当量、5）5当量、6）10当量、7）抗体+30当量、8）15当量、9）20当量、10）25当量及び11）30当量。
【図３０Ａ】図30は、実施例3.11に記載するように、リツキシマブPEG化に対する「in situ」条件と「連続的」条件との比較結果を示す：Aは、SDS-PAGE分析を示し、ここで、1は非修飾抗体であり、2は抗体+DMF+60当量のPEGであり、3は40当量のSeであり、4は40当量のSe+10当量のPEGであり、5は30当量のSeであり、6は30当量のSe+60当量のPEGであり、7は20当量のSeであり、8は20当量のSe+40当量のPEGであり、9は抗体+25当量のPEGであり、10は5当量のTCEP/10当量のDTTであり、11は5当量のTCEP/10当量のDTT/20当量のPEGであり、12は20当量のDTTであり、13は20当量のDTT/25当量のPEGであり、14は10当量のTCEPであり、15は10当量のTCEP/20当量のPEGである。
【図３０Ｂ】図30は、実施例3.11に記載するように、リツキシマブPEG化に対する「in situ」条件と「連続的」条件との比較結果を示す：Bは、プロダクトレーン4のMSを示す。
【図３０Ｃ】図30は、実施例3.11に記載するように、リツキシマブPEG化に対する「in situ」条件と「連続的」条件との比較結果を示す：Cは、プロダクトレーン6のMSを示す。
【図３０Ｄ】図30は、実施例3.11に記載するように、リツキシマブPEG化に対する「in situ」条件と「連続的」条件との比較結果を示す：Dは、プロダクトレーン8のMSを示す。
【図３０Ｅ】図30は、実施例3.11に記載するように、リツキシマブPEG化に対する「in situ」条件と「連続的」条件との比較結果を示す：Eは、プロダクトレーン11のMSを示す。
【図３０Ｆ】図30は、実施例3.11に記載するように、リツキシマブPEG化に対する「in situ」条件と「連続的」条件との比較結果を示す：Fは、プロダクトレーン13のMSを示す。
【図３０Ｇ】図30は、実施例3.11に記載するように、リツキシマブPEG化に対する「in situ」条件と「連続的」条件との比較結果を示す：Gは、プロダクトレーン15のMSを示す。
【図３１】図31は、実施例3.12に記載のリツキシマブのin situ蛍光標識のSDS-PAGE分析を示す：1）非修飾抗体、2）抗体+DMF+60当量のジチオフェノールマレイミド、3）20当量のDTT、4）フルオレセイン標識抗体、5）30当量のSe及び6）架橋抗体。
【図３２Ａ】図32は、実施例3.14に記載の部位選択的PEG化の結果を示す：Aは、以下のとおり、消化物（digest）のSDS-PAGEを示す：1）非修飾抗体、2+6）非修飾抗体の消化物、3+7）in situ PEG化抗体の消化物-Fab収率＝25.0％、4+8）連続的PEG化抗体（TCEP）の消化物-Fab収率＝14.3％、5+9）連続的PEG化抗体（DTT）の消化物-Fab収率＝7.9％。
【図３２Ｂ】図32は、実施例3.14に記載の部位選択的PEG化の結果を示す：Bは、非修飾抗体のFc領域のMSを示す。
【図３２Ｃ】図32は、実施例3.14に記載の部位選択的PEG化の結果を示す：Cは、in situ PEG化抗体のFc領域のMSを示す。
【図３２Ｄ】図32は、実施例3.14に記載の部位選択的PEG化の結果を示す：Dは、連続的PEG化抗体（TCEP）のFc領域のMSを示す。
【図３２Ｅ】図32は、実施例3.14に記載の部位選択的PEG化の結果を示す：Eは、連続的PEG化抗体（DTT）のFc領域のMSを示す。
【図３２Ｆ】図32は、実施例3.14に記載の部位選択的PEG化の結果を示す：Fは、非修飾抗体のFab領域のMSを示す。
【図３２Ｇ】図32は、実施例3.14に記載の部位選択的PEG化の結果を示す：Gは、in situ PEG化抗体のFab領域のMSを示す。
【図３２Ｈ】図32は、実施例3.14に記載の部位選択的PEG化の結果を示す：Hは、連続的PEG化抗体（TCEP）のFab領域のMSを示す。
【図３２Ｉ】図32は、実施例3.14に記載の部位選択的PEG化の結果を示す：Iは、連続的PEG化抗体（DTT）のFab領域のMSを示す。
【図３３Ａ】図33は、実施例3.15に記載するように、リツキシマブの段階的PEG化の結果を示す：Aは、反応物（reaction）のSDS-PAGEを示し、ここで、1は非修飾抗体であり、2は非修飾抗体+10当量であり、3は還元抗体であり、4は5当量であり、5は8当量であり、6は10当量である。
【図３３Ｂ】図33は、実施例3.15に記載するように、リツキシマブの段階的PEG化の結果を示す：Bは、サンプルレーン4（LMW種は、PEG化HHL断片である）のMSである。
【図３３Ｃ】図33は、実施例3.15に記載するように、リツキシマブの段階的PEG化の結果を示す：Cは、サンプルレーン6のMSである。
【図３４】図34は、実施例3.16に記載するように、リツキシマブの再酸化研究の結果を示す（括弧内の数字は、両方のヒンジ領域システインが形成されるという仮定の下で存在するジスルフィド結合の推定量を示す）：1）還元抗体、2）5 min（4％）、3）20 min（3％）、4）40 min（3％）、5）60 min（3％）、6）2 h（2％）、7）4 h（2％）、8）20 h（1％）、9）30 h（1％）、10）40 h（1％）。
【図３５Ａ】図35は、実施例3.17に従って、リツキシマブの段階的修飾の結果を示す：Aは、反応物のSDS-PAGEを示す（ゲル上部のバンド（ウェル底部）は凝集を示す）：1）還元抗体、2）還元抗体+20％v/v DMF、3）4当量のPEG、4）8当量のPEG、5）12当量のPEG、6）16当量のPEG、7）4当量のdiTPMM、8）8当量のdiTPMM、9）12当量のdiTPMM、10）16当量のdiTPMM。
【図３５Ｂ】図35は、実施例3.17に従って、リツキシマブの段階的修飾の結果を示す：Bは、サンプルレーン6（LMW種は、PEG化HHL断片である）のMSである。
【図３５Ｃ】図35は、実施例3.17に従って、リツキシマブの段階的修飾の結果を示す：Cは、サンプルレーン10（LMW種は、潜在的に架橋されたHHL断片である）のMSである。
【図３６Ａ】図36は、実施例3.18に記載するように、機能化リツキシマブ活性のフローサイトメトリー分析を示す：Aは、細胞生存率及び染色効率を示し、ここで、サンプルIDは以下のとおりである：1）アイソタイプコントロール、2）非修飾/非処理の抗体、3）「処理した（processed）」抗体、4）in situ PEG化抗体（40当量のベンゼンセレノール+10当量のPEG）、5）in situ PEG化抗体（30当量のベンゼンセレノール+60当量のPEG）、6）in situ PEG化抗体（20当量のベンゼンセレノール+40当量のPEG）、7）連続的PEG化抗体（TCEP+DTT）、8）連続的PEG化抗体（TCEP）、9）連続的PEG化抗体（DTT）、10）連続的機能化抗体（フルオレセイン標識）、11）in situ機能化抗体（架橋）、12）in situ機能化抗体（n.a.）。
【図３６Ｂ】図36は、実施例3.18に記載するように、機能化リツキシマブ活性のフローサイトメトリー分析を示す：Bは、相対的染色効率を示し、ここで、サンプルIDはAと同様である。
【図３６Ｃ】図36は、実施例3.18に記載するように、機能化リツキシマブ活性のフローサイトメトリー分析を示す：C〜Gは、ヒストグラム（サンプルIDはAと同様）を示し、塗りつぶした濃い灰色＝ネガティブコントロールであり、塗りつぶした薄い灰色＝ポジティブコントロールであり、ここで、Cは、抗体処理の影響を示す（黒色＝非修飾抗体、灰色＝「処理した（processed）」抗体）。
【図３６Ｄ】図36は、実施例3.18に記載するように、機能化リツキシマブ活性のフローサイトメトリー分析を示す：C〜Gは、ヒストグラム（サンプルIDはAと同様）を示し、塗りつぶした濃い灰色＝ネガティブコントロールであり、塗りつぶした薄い灰色＝ポジティブコントロールであり、ここで、Dは、希釈系列を示す（黒色＝10 μg/ml、灰色＝5 μg/ml、薄い灰色＝1 μg/ml）。
【図３６Ｅ】図36は、実施例3.18に記載するように、機能化リツキシマブ活性のフローサイトメトリー分析を示す：C〜Gは、ヒストグラム（サンプルIDはAと同様）を示し、塗りつぶした濃い灰色＝ネガティブコントロールであり、塗りつぶした薄い灰色＝ポジティブコントロールであり、ここで、Eは、in situ PEG化を示す（黒色＝4、灰色＝5、薄い灰色＝6）。
【図３６Ｆ】図36は、実施例3.18に記載するように、機能化リツキシマブ活性のフローサイトメトリー分析を示す：C〜Gは、ヒストグラム（サンプルIDはAと同様）を示し、塗りつぶした濃い灰色＝ネガティブコントロールであり、塗りつぶした薄い灰色＝ポジティブコントロールであり、ここで、Fは、連続的PEG化を示す（黒色＝7、灰色＝8、薄い灰色＝9）。
【図３６Ｇ】図36は、実施例3.18に記載するように、機能化リツキシマブ活性のフローサイトメトリー分析を示す：C〜Gは、ヒストグラム（サンプルIDはAと同様）を示し、塗りつぶした濃い灰色＝ネガティブコントロールであり、塗りつぶした薄い灰色＝ポジティブコントロールであり、ここで、Gは、機能化を示す（黒色＝10、灰色＝11、薄い灰色＝12）。
【図３７】図37は、実施例3.19に記載するように、各種修飾リツキシマブの安定性試験についてのサンプルを示す：M）分子量マーカー；レーンは上から250、150、100、100、80、60、40、30、25、20及び15 kDaであり、AB）非修飾抗体、1）ジブロモマレイミド連続的架橋抗体とともに、2）N-フェニルジブロモマレイミド架橋及び加水分解抗体とともに、3）部分的還元及びアルキル化抗体。
【図３８Ａ】図38は、実施例3.19のリツキシマブアナログを用いた熱安定性アッセイを示す。示した融解温度は、算出した平均である。（A）in situ PEG化抗体。括弧内の数字は、ベンゼンセレノール：N-PEG5000-ジチオフェノール-マレイミドの使用した当量である。
【図３８Ｂ】図38は、実施例3.19のリツキシマブアナログを用いた熱安定性アッセイを示す。示した融解温度は、算出した平均である。（B）連続的PEG化抗体。
【図３８Ｃ】図38は、実施例3.19のリツキシマブアナログを用いた熱安定性アッセイを示す。示した融解温度は、算出した平均である。（C）コントロール及びin situ架橋抗体。
【図３８Ｄ】図38は、実施例3.19のリツキシマブアナログを用いた熱安定性アッセイを示す。示した融解温度は、算出した平均である。（D）様々なシステイン修飾を有するサンプル。
【図３９】図39は、実施例3.20に記載するように、リツキシマブ断片のPEG化を示す。M）分子量マーカー；レーンは上から250、150、100、100、80、60、40、30、25、20及び15 kDaである。1+7）40当量のベンゼンセレノールを用いた還元コントロール。2+8）ベンゼンセレノール：N-PEG5000-ジチオフェノールマレイミドを40：10の比率で用いたin situ PEG化。3+9）10当量のTCEP（1 h）を用いた還元コントロール。4+10）10当量のTCEP（1 h）で還元後、20当量のPEG化試薬を用いた連続的PEG化。5+11）20当量のDTT（4 h）を用いた還元コントロール。6+12）20当量のDTT（4 h）で還元後、25当量のN-PEG5000-ジチオフェノールマレイミドを用いた連続的PEG化。
【図４０】図40は、実施例3.21に記載するように、リツキシマブFab及びFc断片混合物の連続的PEG化を示す。サンプルをTCEPで1時間処理した後、20当量のN-PEG5000-ジチオフェノールマレイミドを添加した。M）分子量マーカー；レーンは上から250、150、100、100、80、60、40、30、25、20及び15 kDaである。1）10当量のTCEP及びPEG化試薬で処理したFab断片。2）10当量のTCEP及びPEG化試薬で処理したFc断片。PEG化試薬を添加する前に、以下のTCEPで処理したFab及びFcの2：1混合物：3）2当量、4）4当量、5）6当量、6）8当量、7）10当量及び8）15当量。
【図４１】図41は、実施例3.21に記載するように、リツキシマブFab及びFc断片混合物のin situ PEG化を示す。サンプルは、以下の比率のベンゼンセレノール：N-PEG5000-ジチオフェノールマレイミドで処理した。M）分子量マーカー；レーンは上から250、150、100、100、80、60、40、30、25、20及び15 kDaである。1）30：5で処理したFab断片。2）30：5で処理したFc断片。以下で処理したFab及びFcの2：1混合物：3）30：2、4）60：2、5）30：5、6）60：5、7）30：10及び8）60：10。
【図４２】図42は、実施例4.2に記載するように、至適条件下、TCEPを用いたトラスツズマブ（Trastuzumab）の還元研究を示す。M）分子量マーカー；レーンは上から250、150、100、100、80、60、40、30、25、20及び15 kDaである。AB）非修飾抗体。以下のTCEP：1）1当量、2）2当量、3）3当量、4）4当量、5）5当量、6）6当量及び7）7当量。
【図４３】図43は、実施例4.4に記載するように、トラスツズマブのin situ架橋及びドキソルビシンでのその後の機能化を示す。M）分子量マーカー；レーンは上から250、150、100、100、80、60、40、30、25、20及び15 kDaである。AB）非修飾抗体。1）サンプルA（DAR 1.1）。2）サンプルB（DAR 2.0）。3）サンプルC（DAR 3.1）。4）サンプルD（DAR 4.0）。フラグメンテーションパターンを可視化するためにゲルをオーバーロードした。
【図４４】図44は、実施例4.6に従って、TCEPを用いたトラスツズマブ-DOXの処理を示す。M）分子量マーカー；レーンは上から250、150、100、100、80、60、40、30、25、20及び15 kDaである。1）非処理材料。2）3当量のTCEP。3）5当量のTCEP。4）7当量のTCEP。
【図４５】図45は、実施例4.7に記載するように、in situ架橋及び機能化トラスツズマブの消化物を示す。M）分子量マーカー；レーンは上から250、150、100、100、80、60、40、30、25、20及び15 kDaである。AB）非修飾抗体。1）架橋抗体。2）機能化抗体。3）機能化抗体のペプシン消化物（Fab2断片を産生）。4）機能化抗体Fab2断片のパパイン消化物（Fab断片を産生）。5）非修飾抗体のペプシン消化物（Fab2断片を産生）。6）修飾抗体Fab2断片のパパイン消化物（Fab断片を産生）。
【図４６】図46は、実施例4.8.1に記載するように、トラスツズマブ修飾のための段階的プロトコルを示す。M）分子量マーカー；レーンは上から250、150、100、100、80、60、40、30、25、20及び15 kDaである。AB）非修飾抗体。R）分割（aliquoting）及び架橋試薬の添加前の還元トラスツズマブサンプル。1-4）異なる架橋試薬5当量との反応；1）DTL-1-DOX；2）DTL-2-DOX；3）DTL-3-DOX；4）いずれの架橋試薬も添加せず、DMFのみ添加した。
【図４７】図47は、実施例4.8.2.1に記載するように、トラスツズマブ修飾のための連続的プロトコルを示す。M）分子量マーカー；レーンは上から250、150、100、100、80、60、40、30、25、20及び15 kDaである。AB）非修飾抗体。R）分割及び橋試薬の添加前の還元トラスツズマブサンプル。1-5）異なる架橋試薬5当量との反応；1）DTL-1-DOX；2）DTL-2-DOX；4）いずれの架橋試薬も添加せず、DMFのみを添加した（4℃での反応）。5）いずれの架橋試薬も添加せず、DMFのみ添加した。
【図４８】図48は、実施例4.8.2.2に記載するように、DTL-3-DOXを用いたハーセプチン（Herceptin）修飾のための連続的プロトコルを示す。M）分子量マーカー；レーンは上から250、150、100、100、80、60、40、30、25、20及び15 kDaである。AB）非修飾抗体。R）架橋試薬添加前の還元ハーセプチンサンプル。1）バッファー系中のDMFを10％（v/v）に補正するためにDMFを添加して、400 rpmで振盪しながら、25℃にてDTL-3-DOX（20当量）と反応。
【図４９】図49は、実施例4.8.3に記載するように、トラスツズマブ修飾のためのin situプロトコルを示す。M）分子量マーカー；レーンは上から250、150、100、100、80、60、40、30、25、20及び15 kDaである。AB）非修飾抗体。R）架橋試薬もDMFも添加しない還元トラスツズマブサンプル。1-7）異なる架橋試薬5当量との反応；1）DTL-1-DOX；2）DTL-2-DOX；3）DTL-3-DOX；7）いずれの架橋試薬も添加せず、DMFのみ添加した。全ての反応物は、400 rpmで振盪しながら、37℃でインキュベートした。
【図５０】図50は、実施例4.8.4に記載するように、トラスツズマブFab修飾のための段階的プロトコルを示す。M）分子量マーカー；レーンは上から250、150、100、100、80、60、40、30、25、20及び15 kDaである。Fab）非修飾Fab。R）分割及び架橋試薬の添加前の還元Fabサンプル。1-3）異なる架橋試薬5当量との反応；1）DTL-1-DOX；2）DTL-2-DOX；3）DTL-3-DOX；4）いずれの架橋試薬も添加せず、DMFのみ添加した。全ての反応物は、400 rpmで振盪しながら、25℃でインキュベートした。
【図５１Ａ】図51は、実施例4.8.4に従って得られた典型的なES-LCMSスペクトルを示し、A）1.16のDARを有するDTL-1-DOXを用いた段階的プロトロコルのためのコンジュゲーション後にサンプル中に存在するトラスツズマブFab ADCを示す。
【図５１Ｂ】図51は、実施例4.8.4に従って得られた典型的なES-LCMSスペクトルを示し、B）0.51のDARを有するDTL-2-DOXを用いた段階的プロトロコルのためのコンジュゲーション後にサンプル中に存在するトラスツズマブFab ADCを示す。
【図５１Ｃ】図51は、実施例4.8.4に従って得られた典型的なES-LCMSスペクトルを示し、C）0.63のDARを有するDTL-3-DOXを用いた段階的プロトロコルのためのコンジュゲーション後にサンプル中に存在するトラスツズマブFab ADCを示す。
【図５２】図52は、実施例4.8.5に記載するように、トラスツズマブFab修飾のための連続的プロトコルを示す。M）分子量マーカー；レーンは上から250、150、100、100、80、60、40、30、25、20及び15 kDaである。Fab）非修飾Fab。R）分割及び架橋試薬の添加前の還元Fabサンプル。1-5）異なる架橋試薬5当量との反応；1）DTL-1-DOX；2）DTL-2-DOX；3）DTL-3-DOX；4）いずれの架橋試薬も添加せず、DMFのみ添加した；5）1）と同様の条件下、DTL-1-DOXで処理した非還元Fab。全ての反応物は、400 rpmで振盪しながら、25℃でインキュベートした。
【図５３Ａ】図53は、実施例4.8.5に従って得られた典型的なES-LCMSスペクトルを示し、A）1.21のDARを有するDTL-1-DOXを用いた連続的プロトコルのためのコンジュゲーション後にサンプル中に存在するトラスツズマブFab ADCを示す。
【図５３Ｂ】図53は、実施例4.8.5に従って得られた典型的なES-LCMSスペクトルを示し、B）0.64のDARを有するDTL-2-DOXを用いた連続的プロトコルのためのコンジュゲーション後にサンプル中に存在するトラスツズマブFab ADCを示す。
【図５３Ｃ】図53は、実施例4.8.5に従って得られた典型的なES-LCMSスペクトルを示し、C）0.94のDARを有するDTL-3-DOXを用いた連続的プロトコルのためのコンジュゲーション後にサンプル中に存在するトラスツズマブFab ADCを示す。
【図５４】図54は、実施例4.8.6に記載するように、トラスツズマブFab修飾のためのin situプロトコルを示す。M）分子量マーカー；レーンは上から250、150、100、100、80、60、40、30、25、20及び15 kDaである。Fab）非修飾Fab。1-4）異なる架橋試薬5当量との反応；1）DTL-1-DOX；2）DTL-2-DOX；3）DTL-3-DOX；4）いずれの架橋試薬も添加せず、DMFのみ添加した。全ての反応物は、400 rpmで振盪しながら、37℃でインキュベートした。フラグメンテーションパターンを可視化するためにゲルをオーバーロードした。SDS-PAGEゲル分析前にサンプルを煮沸しなかった。
【図５５Ａ】図55は、実施例4.8.6に従って得られた典型的ES-LCMSスペクトルを示し、A）1.43のDARを有するDTL-1-DOXを用いたin situプロトコルのためのコンジュゲーション後にサンプル中に存在するトラスツズマブFab ADCを示す。
【図５５Ｂ】図55は、実施例4.8.6に従って得られた典型的ES-LCMSスペクトルを示し、B）0.74のDARを有するDTL-2-DOXを用いたin situプロトコルのためのコンジュゲーション後にサンプル中に存在するトラスツズマブFab ADCを示す。
【図５５Ｃ】図55は、実施例4.8.6に従って得られた典型的ES-LCMSスペクトルを示し、C）1.12のDARを有するDTL-3-DOXを用いたin situプロトコルのためのコンジュゲーション後にサンプル中に存在するトラスツズマブFab ADCを示す。
【図５６】図56は、実施例4.9に記載するように、段階的プロトコルを介して、DTL-1-DOX、DTL-2-DOX及びDTL-3-DOXでコンジュゲート化されたトラスツズマブADCに対するELISAアッセイによる結合親和性を示す。
【図５７】図57は、実施例4.9に記載するように、連続的プロトコルを介して、DTL-1-DOX、DTL-2-DOX及びDTL-3-DOXでコンジュゲート化されたトラスツズマブADCに対するELISAアッセイによる結合親和性を示す。
【図５８】図58は、実施例4.9に記載するように、in situプロトコルを介して、DTL-1-DOX、DTL-2-DOX及びDTL-3-DOXでコンジュゲート化されたトラスツズマブADCに対するELISAアッセイによる結合親和性を示す。
【図５９】図59は、実施例4.5に詳細を記載するように、キャピラリーゲル電気泳動を用いたADC分析を示す。
【図６０】図60は、実施例4.9に記載するように、段階的プロトコルを介して、DTL-1-DOX、DTL-2-DOX及びDTL-3-DOXでコンジュゲート化されたトラスツズマブFab ADCに対するELISAアッセイによる結合親和性を示す。
【図６１】図61は、実施例4.9に記載するように、連続的プロトコルを介して、DTL-1-DOX、DTL-2-DOX及びDTL-3-DOXでコンジュゲート化されたトラスツズマブFab ADCに対するELISAアッセイによる結合親和性を示す。
【図６２】図62は、実施例4.9に記載するように、in situプロトコルを介して、DTL-1-DOX、DTL-2-DOX及びDTL-3-DOXでコンジュゲート化されたトラスツズマブFab ADCに対するELISAアッセイによる結合親和性を示す。
【図６３】図63は、実施例5.5.2に記載するように、トラスツズマブ修飾を示す。M）分子量マーカー；レーンは上から250、150、100、100、80、60、40、30、25、20及び15 kDaである。AB）非修飾抗体。1）in situ、6当量のDiSH-Diet；2）段階的、6当量のDiBr-Diet、3）段階的、6当量のDiSH-Diet；4）in situ、50当量のDiSH-Diet；5）段階的、50当量のDiBr-Diet；6）段階的、50当量のDiSH-Diet。全ての反応物は、37℃でインキュベートした。
【図６４】図64は、実施例5.5.2に記載するように、Astra-PEGを用いてコンジュゲート化された、ピリダジン修飾トラスツズマブ-Fabに対するELISAアッセイによる結合親和性を示す。
【００３７】
詳細な説明
本明細書で使用する場合、「抗体」は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性抗体及び多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を含む。「抗体断片」は、所望の生物学的活性（例えば、その対応する「インタクト」抗体の活性又は実質的な活性）を示すような抗体（例えば、「インタクト」抗体が特異的に結合することができる抗原への特異的結合能力を保持する）の断片である。
【００３８】
本明細書で使用する場合、抗体（及び抗体断片）は、抗体（及び抗体断片）の融合タンパク質であって、タンパク質が抗体（又は抗体断片）に共有結合を介して融合されるものを含む。また、抗体又は抗体断片が、その標的抗原に特異的に結合する能力を維持するならば、抗体及び抗体断片の化学的アナログ及び誘導体も含まれる。従って、例えば、特異的結合能が保持されるならば、化学修飾が可能である（例えば、グリコシル化、アセチル化、PEG化、及び限定されることなく、その他の修飾）。かかる可能な「化学修飾」が、本明細書に詳細に記載するような架橋部分を介した特定の化学修飾に追加されることが強調される。
【００３９】
抗体は、標的抗原に特異的に結合できる可変領域と、定常領域とを含む。本明細書で定義するような抗体は、任意のタイプ又はクラス（例えば、IgG、IgE、IgM、IgD及びIgA）又はサブクラス（例えば、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl及びIgA2）のものであり得る。抗体は、任意の適した種に由来し得る。いくつかの実施態様において、抗体は、ヒト又はマウス起源のものである。抗体は、例えば、ヒト、ヒト化又はキメラであり得る。
【００４０】
本明細書で使用する場合、「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体であり、すなわち、集団に含まれる個々の抗体は、潜在的な自然発生変異が若干存在するかもしれないことを除いて、同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一抗原部位に向けられている。
【００４１】
本明細書で定義するような「モノクローナル抗体」は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種から誘導された又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であるが、鎖の残りが、他の種から誘導された又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同である、キメラ抗体であってよく、且つそれらが所望の生物学的活性を示す限り、かかる抗体の断片であってよい。
【００４２】
「インタクト抗体」は、抗原結合可変領域、並びに軽鎖定常ドメイン（CL）及び重鎖定常ドメインCHI、CH2、CR3及びCH4を抗体クラスに応じて含むものである。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン、例えば、ヒト天然配列定常ドメイン、又はそのアミノ酸配列変異体であってよい。
【００４３】
インタクト抗体は、1つ以上の「エフェクター機能」を有してよく、これは、抗体のFc領域（例えば、天然配列Fc領域又はアミノ酸配列変異体Fc領域）に起因するその生物学的活性を意味する。抗体エフェクター機能の例として、補体依存性細胞傷害、抗体依存性細胞傷害（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity）（ADCC）及び抗体依存性細胞食作用（antibody-dependent cell-mediated phagocytosis）が挙げられる。
【００４４】
「抗体断片」は、インタクト抗体の一部を含み、好ましくはその抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例としては、Fab、Fab'、F（ab'）2及びFv断片、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、線状抗体（linear antibody）、一本鎖抗体分子、scFv、scFv-Fc、抗体断片から形成される多重特異性抗体断片、Fab発現ライブラリーにより産生される断片、又は標的抗原（例えば、癌細胞抗原）に免疫特異的に結合する、上記いずれかのエピトープ結合断片が挙げられる。
【００４５】
非ヒト（例えば、げっ歯類）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。
【００４６】
用語「抗原AGに特異的に結合することができる」とは、特定の所定の標的抗原AGに抗体（又は抗体断片）が結合することを意味する。
【００４７】
典型的には、抗体（又は抗体断片）は、少なくとも約1×107 M-1の親和性で結合し、且つ／又は所定の標的抗原に対しては、該所定の標的抗原又は近縁の標的抗原以外の非特異的コントロール物質（例えば、BSA、カゼイン）に対するその結合親和性よりも少なくとも2倍高い親和性で結合する。疑義を回避するため、本明細書において、本発明の化学修飾抗体又は抗体断片を複数含む物質組成物への言及は、典型的には、同一抗原AGに各々特異的に結合することができる、複数の化学修飾抗体又は抗体断片を意味する（例えば、同一の天然抗体又は抗体断片に各々由来するが、化学修飾の数又は位置については異なる、複数の化学修飾抗体を含む組成物）。
【００４８】
本明細書で使用する場合、抗体又は抗体断片の「鎖」は、当分野における通常の意味を有し、すなわち「抗体鎖」、つまり（天然）抗体の構成部分の1つを形成又は含むポリペプチド配列を含む存在を意味する。疑義を回避するため、scFv抗体断片は、例えば、2つのこのような鎖（すなわち、抗体の重鎖可変領域と抗体の軽鎖可変領域；scFv抗体断片においては、前記鎖はペプチドリンカーを介して結合されるが、本明細書においてはそれでも別個の鎖を含むものとする）を含むことが強調される。
【００４９】
鎖は、重鎖又は軽鎖であってよい。軽鎖は、κ（「カッパ」）軽鎖又はλ（「ラムダ」）軽鎖のいずれかであってよい。
【００５０】
鎖間ジスルフィド結合は、抗体又は抗体断片において、別個の鎖を一緒につなげるジスルフィド結合（-S-S-）である。鎖間ジスルフィド結合は、単一鎖の別個のセクションを一緒につなげる鎖内ジスルフィド結合と対比され得る。用語「鎖間ジスルフィド結合」は、本明細書において、用語「鎖間ジスルフィド架橋」と交換可能に使用される。鎖間ジスルフィド結合は、抗体又は抗体断片において、別個の鎖を「架橋する」ことが理解されよう。
【００５１】
当分野で周知なとおり、異なるクラス及びサブクラスの抗体は、異なる数の鎖間ジスルフィド結合を含む。例えば、IgG1抗体では、4つの鎖間ジスルフィド結合が存在しており：1つは、第一の軽鎖を第一の重鎖と連結し、1つは、第二の軽鎖を第二の重鎖と連結し、2つは、第一の重鎖を第二の重鎖と連結する。
【００５２】
従って、本明細書において、化学修飾抗体又は抗体断片における「鎖間架橋部分」への言及は、典型的には、その文脈で定義される部分が、対応する非修飾（すなわち、天然）抗体又は抗体断片にそうでなければ存在していたであろう鎖間ジスルフィド結合に置き換わって（すなわち、その代わりに）存在することを意味する。従って、典型的には、化学修飾抗体又は抗体断片に存在する各鎖間架橋部分のために、対応する非修飾（すなわち、天然）抗体又は抗体断片に存在するであろう鎖間ジスルフィド結合は1つ少なく存在する。例えば、2つの鎖間架橋部分を有する化学修飾IgG1抗体については、典型的には、残りは全体で（わずか）2つの鎖間ジスルフィド架橋が存在するだろう。本明細書において、一定数の鎖間架橋部分を「有する」（又は「有している」）抗体又は抗体断片への言及は、典型的には、抗体又は抗体断片が、かかる鎖間架橋部分を具体的にその数で有する（かかる鎖間架橋部分を、明確に特定するのではなく潜在的に多く有するというよりも）ことを意味することに留意されたい。
【００５３】
本明細書で使用する場合、用語「天然（native）」とは、本発明の化学修飾抗体又は抗体断片へと組み込まれる前の、その環境形態（ambient form）にある物質（例えば、抗体、抗体断片、カーゴ部分）を意味する。例えば、「天然」抗体への言及は、典型的には、本明細書で定義するような鎖間架橋部分を1つ以上導入するために本発明に従ってもたらされる化学修飾の非存在下において存在する抗体を意味する。「天然」抗体断片への言及は、典型的には、本明細書で定義するような鎖間架橋部分を1つ以上導入するために本発明に従ってもたらされる化学修飾の非存在下において存在する抗体断片を意味する。同様に、「天然」カーゴ部分への言及は、本発明の化学修飾抗体又は抗体断片へと組み込まれる前のカーゴ部分を意味する。
【００５４】
本明細書で使用する場合、「カーゴ部分」は、特定の抗体又は抗体断片の企図する用途を考慮して望ましい方法にて抗体又は抗体断片の特性を修飾するために、抗体又は抗体断片に結合されてよい任意の部分を構成する。当業者ならば、抗体及び抗体断片の化学修飾という概念を熟知しており、それゆえ、適切なカーゴ部分を選択して、化学修飾抗体又は抗体断片をその企図する実用的な目的に適合させることができるだろう。
【００５５】
例示的なカーゴ部分としては以下が挙げられる：検出可能部分（例えば、イメージング剤）、酵素活性部分、アフィニティタグ、ハプテン、免疫原性担体、抗原、リガンド、生物学的活性部分、リポソーム、ポリマー部分、半減期延長剤、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、細胞、炭水化物、DNA、RNA及び固体基材。
【００５６】
当業者に容易に理解されるように、化合物内（例えば、化学修飾抗体又は抗体断片内）に含まれるカーゴ部分は、対応する天然「カーゴ物質」（例えば、カーゴ分子）をそこに結合することにより得ることが可能である。カーゴ物質を二次的化合物に結合させる場合、新たな結合が二次的化合物に生じることができるように、そのカーゴ物質のどこかの結合を崩壊させることが必要である。かかるプロセスの例としては、カーゴ物質が二次的分子に結合するカーゴ部分となる場合には、カーゴ物質からの脱離基の喪失、カーゴ物質が-OH又は-SH基などの水素原子含有求核基を介して反応する場合には、プロトンの喪失、或いはカーゴ物質が求電子又は求核付加反応を介して二次的化合物と反応する場合には、カーゴ物質における二重結合の単結合への変換が挙げられる。従って、当業者ならば、例えば「薬物」であるカーゴ部分とは、天然薬物の二次的分子への組み込みにより形成される部分であって、対応する天然薬物化合物と比較して内部結合の喪失を伴う（例えば、かかる部分が二次的分子への結合を形成する場合には、-OH、-SH又は-NH2部分からのプロトンの喪失）ものを意味することが理解されよう。
【００５７】
カーゴ部分は、その天然型（すなわち、それが化学修飾抗体又は抗体断片の一部でない場合）における別個の生物学的意義を有する部分であってよい。好ましくは、本発明で使用されるカーゴ部分はいずれも、少なくとも200ダルトン、より好ましくは少なくとも500ダルトン、最も好ましくは少なくとも1000ダルトンの分子量を有する。本明細書で記載するようなカーゴ部分は、生体分子部分であってよい。
【００５８】
本明細書で使用する場合、用語「検出可能部分」とは、試験サンプルにおいて検出可能なシグナルを生成することができる部分を意味する。明らかに、検出可能部分は、対応する「検出可能化合物」に由来する部分であって、本明細書に記載の方法で抗体又は抗体断片に連結された場合に検出可能なシグナルを生成する能力を保持する部分であることが理解され得る。検出可能部分はまた、当分野において、「タグ」、「プローブ」及び「標識」としても一般に公知である。検出可能部分の例としては、発色性部分、蛍光性部分、放射性部分及び電気化学的に活性な部分が挙げられる。本発明において、好ましい検出可能部分は、発色性部分及び蛍光性部分である。蛍光性部分が最も好ましい。
【００５９】
発色性部分は着色する部分であり、本発明の化学修飾抗体又は抗体断片中に組み込まれた場合に着色するか、或いは本発明の化学修飾抗体又は抗体断片中に組み込まれ、該化学修飾抗体又は抗体断片が次に二次的標的種と相互作用した場合（例えば、化学修飾抗体又は抗体断片が、その対応する抗原AGに特異的に結合する場合）に着色するものである。
【００６０】
典型的には、用語「発色性部分」とは、少なくとも2つのエネルギー状態（比較的低いエネルギーの基底状態と、放射線スペクトルの特定の領域からの光エネルギーの吸収によって上昇し得る励起状態）で存在し得る、会合した（associated）原子の基をいう。しばしば、会合した原子の基は、非局在化電子を含む。本発明での使用に適した発色性部分には、π系及び金属錯体を含むコンジュゲート化部分が挙げられる。例としては、ポルフィリン、ポリエン、ポリイン及びポリアリールが挙げられる。好ましい発色性部分は以下である：
【００６１】
【化９】
2015510877.tif 000010
【００６２】
蛍光性部分は、蛍光性の化学的部分であるフルオロフォアを含む部分である。本発明の化学修飾抗体及び抗体断片などの二次的分子中に蛍光性部分として一般に組み込まれる蛍光性化合物の例には、以下が挙げられる：
-  Invitrogenから入手可能なAlexa Fluor（登録商標）色素ファミリー；
-  シアニン及びメロシアニン；
-  Invitrogenから入手可能なBODIPY（ホウ素-ジピロメテン）色素ファミリー；
-  ATTO-TEC GmbHが製造するATTO色素ファミリー；
-  フルオレセイン及びその誘導体；
-  ローダミン及びその誘導体；
-  ナフタレン誘導体（例えば、そのダンシル誘導体及びプロダン誘導体）；
-  ピリジルオキサゾール、ニトロベンゾオキサジアゾール及びベンゾオキサジアゾール誘導体；
-  クマリン及びその誘導体；
-  ピレン誘導体；並びに
-  Invitrogenから入手可能な、オレゴングリーン、エオシン、テキサスレッド、カスケードブルー及びナイルレッド。
【００６３】
本発明での使用に好ましい蛍光性部分としては、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、スルホローダミン101酸塩化物（テキサスレッド）及びダンシルが挙げられる。フルオレセイン及びダンシルが特に好ましい。
【００６４】
放射性部分は、放射性核種を含む部分である。放射性核種の例としては、ヨウ素-131、ヨウ素-125、ビスマス-212、イットリウム-90、イットリウム-88、テクネチウム-99m、銅-67、レニウム-188、レニウム-186、ガリウム-66、ガリウム-67、インジウム-111、インジウム-114m、インジウム-114、ホウ素-10、トリチウム（水素-3）、炭素-14、硫黄-35、フッ素-18及び炭素-11が挙げられる。フッ素-18及び炭素-11は、例えば、陽電子放出断層撮影で頻繁に使用される。
【００６５】
一実施態様において、放射性部分は、放射性核種単独からなってよい。別の実施態様において、放射性核種は、例えば、リンカー基（例えば、チオール基含有リンカー）に直接共有結合することにより、又はキレート剤と配位錯体を形成することにより、より大きな放射性部分に組み込まれてよい。当分野で公知の適したキレート剤としては、DTPA（ジエチレントリアミン-五酢酸無水物）、NOTA（1,4,7-トリアザシクロノナン-N,N’,N’’-三酢酸）、DOTA（1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N’,N’’,N’’’-四酢酸）、TETA（1,4,8,11-テトラアザシクロテトラ-デカン-N,N’,N’’,N’’’-四酢酸）、DTTA（N1-（p-イソチオシアナトベンジル）-ジエチレン-トリアミン-N1,N2,N3-四酢酸）及びDFA（N’-［5-［［5-［［5-アセチルヒドロキシアミノ）ペンチル］アミノ］-1,4-ジオキソブチル］ヒドロキシアミノ］ペンチル］-N-（5-アミノペンチル）-N-ヒドロキシブタンジアミド）が挙げられる。
【００６６】
電気化学的に活性な部分は、電流測定法又はボルタメトリ法などの電気化学的方法において、電気化学的シグナルを生成することができる基を含む部分である。典型的には、電気化学的に活性な部分は、少なくとも2つの別個の酸化還元状態で存在することができる。
【００６７】
当業者ならば、慣用的に入手可能な非常に多数の検出可能化合物から、本発明に従う使用に適するであろう検出可能化合物を容易に選択できることは当然である。従って、本発明の方法論は、検出可能部分を含む化学修飾抗体又は抗体断片を産生するために使用され得、これは次いで、かかる種の検出を伴う任意の慣用の生化学的技術で使用され得る。
【００６８】
検出可能部分の特に有用なクラスの1つはイメージング剤である。イメージング剤（本明細書で定義する場合、コントラスト剤を含む）は、医学分野、例えば診断や、進行中の治療的介入効率をモニタリングするために広範に使用されている。多数のイメージング剤が、ヒト及び動物対象において、in vivoで使用されている。例えば、数百ものかかるイメージング剤の詳細なリストが、Molecular Imaging and Contrast Agent Database（Molecular Imaging and Contrast Agent Database（MICAD）にてオンラインでアクセス可能[インターネット]。Bethesda（MD）：National Center for Biotechnology Information（US）；2004-2013. 以下から入手可能：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK5330/）から入手可能である。
【００６９】
従って、当業者ならば容易に、慣用的に入手可能な非常に多数のイメージング剤から、本発明に従う使用に適するであろうイメージング剤を選択し、次いで、選択したイメージング剤をカーゴ部分として本発明の生成物内に組み込むことができるだろう。従って、本発明の方法論は、イメージング剤を含む化学修飾抗体又は抗体断片を産生するために使用され得、これは次いで、イメージング剤の使用を伴う任意の慣用の技術で使用され得る。
【００７０】
特に好ましいイメージング剤の例としては、放射性核種プローブ（テクネチウム-99m、インジウム-111、ヨウ素-123、ヨウ素-124、ヨウ素-125、ガリウム-67、ガリウム-68、ルテチウム-177、フッ素-18（18F）、ジルコニウム-89、銅-64、テクネチウム（Techetium）-94m、及び臭素-76を含む）、蛍光光学（optical）プローブ（Alexa Fluor色素ファミリー、シアニン色素ファミリー、BODIPY（ホウ素-ジピロメテン）色素ファミリー、ATTO色素ファイリー由来の化合物；フルオレセイン及びその誘導体；ローダミン及びその誘導体；ナフタレン誘導体（例えば、そのダンシル誘導体及びプロダン誘導体）；ピリジルオキサゾール、ニトロベンゾオキサジアゾール及びベンゾオキサジアゾール誘導体；クマリン及びその誘導体；ピレン誘導体；並びに、オレゴングリーン、エオシン、テキサスレッド、カスケードブルー及びナイルレッドを含む）からなる群から選択されるイメージング剤が挙げられる。
【００７１】
本明細書で使用する場合、用語「酵素活性部分」とは、酵素、酵素基質、又は酵素の補因子を意味する。好ましくは、酵素活性部分は酵素である。
【００７２】
本明細書で使用する場合、用語「アフィニティタグ」とは、アフィニティタグとアフィニティパートナーの両方が単一のサンプル中に存在する場合に、第二の化学的部分である「アフィニティパートナー」と相互作用することができる化学的部分を意味する。典型的には、アフィニティタグは、アフィニティパートナーとの特異的結合相互作用を形成することができる。特異的結合相互作用は、サンプル中に存在するアフィニティパートナーと任意の他の化学物質との間で生じ得る任意の結合相互作用よりも強い結合相互作用である。
【００７３】
生化学で特に広く使用されるアフィニティタグ／アフィニティパートナー対の1つは、ビオチン／（ストレプト）アビジン対である。アビジン及びストレプトアビジンは、ビオチン（5-［（3aS,4S,6aR）-2-オキソヘキサヒドロ-1H-チエノ［3,4-d］イミダゾール-4-イル］ペンタン酸）由来のアフィニティタグに対し高い親和性及び特異性で結合するアフィニティパートナーとして使用され得るタンパク質である。当分野で一般に使用される他のアフィニティタグ／アフィニティパートナー対としては、アミラーゼ／マルトース結合タンパク質、グルタチオン／グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、及び金属（例えば、ニッケル又はコバルト）／ポリ（His）が挙げられる。当業者に理解されるように、対のどちらか一方のメンバーが「アフィニティタグ」として機能し得、対のもう一方のメンバーが「アフィニティパートナー」として機能し得る。従って、用語「アフィニティタグ」及び「アフィニティパートナー」は交換可能である。
【００７４】
当業者は、生化学、及び特にバイオコンジュゲート技術との関連において、アフィニティタグ／アフィニティパートナー相互作用の慣用的な使用を認識しているであろう。従って、当業者には、本発明に従う使用のためにアフィニティタグを選択するにあたり何らの困難もないであろう。従って、本発明の方法論は、アフィニティタグ／アフィニティパートナー相互作用を使用する慣用的な生化学的技術での使用に適合させた化学修飾抗体及び抗体断片を産生するために使用され得る。
【００７５】
本発明に従う好ましいアフィニティタグは、ビオチン、アミラーゼ、グルタチオン及びポリ（His）である。特に好ましいアフィニティタグはビオチンである。
【００７６】
本明細書で使用する場合、用語「ハプテン」とは、その天然形態ではin vivoの免疫応答を刺激できないが、免疫原性担体分子に連結されるとin vivoの免疫応答を刺激できる、エピトープを含む部分を意味する。典型的には、ハプテンは、比較的低い分子量（例えば1000未満の分子量）の非タンパク質性部分である。エピトープは、免疫系によって認識され、免疫応答を刺激する、分子又は部分の一部である。
【００７７】
本明細書で使用する場合、用語「免疫原性担体」とは、in vivoで投与されたときに免疫応答を促進できる、ハプテンにカップリングされることができる抗原を意味する。免疫原性担体の例としては、タンパク質、リポソーム、合成又は天然のポリマー部分（例えば、デキストラン、アガロース、ポリリジン及びポリグルタミン酸部分）、及び合成により設計された有機部分が挙げられる。一般に使用されるタンパク質免疫原性担体としては、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、アミノエチル化又はカチオン化されたウシ血清アルブミン、サイログロブリン、オボアルブミン及び種々のトキソイドタンパク質（例えば、破傷風トキソイド及びジフテリアトキソイド）が挙げられる。合成により設計された周知の有機分子担体としては、多抗原性ペプチド（MAP）が挙げられる。
【００７８】
本明細書で使用する場合、用語「抗原」とは、in vivoで投与されたときに免疫応答を引き起こすことができ、その免疫応答の間に産生される抗体に結合することができる物質を意味する。
【００７９】
本明細書で使用する場合、用語「リガンド」とは、生体分子の機能的特性を修飾するような方法で生体分子（例えばタンパク質）と相互作用できる部分を意味する。典型的には、リガンドは、標的タンパク質上の部位に結合する部分である。リガンドと生体分子との間の相互作用は、典型的には非共有結合である。例えば、相互作用は、イオン結合、水素結合又はファンデルワールス相互作用を介したものであってよい。しかしながら、ある種のリガンドについては生体分子と共有結合を形成する可能性もある。典型的には、リガンドは、相互作用したときに生体分子の化学的コンフォメーションを変更することができる。
【００８０】
タンパク質と相互作用することができるリガンドの例としては、基質（例えば、酵素により触媒される化学反応に参加することにより、結合に際し酵素によって作用される）、阻害剤（結合に際しタンパク質活性を阻害する）、活性化因子（結合に際しタンパク質の活性を増加させる）及び神経伝達物質が挙げられる。
【００８１】
本明細書で使用する場合、用語「生物学的活性部分」とは、in vivoで投与されたときに生化学的応答を誘導することができる部分を意味する。
【００８２】
生物学的活性部分は薬物（本明細書においては、それ以外に「薬物部分」とも称する）であり得る。薬物には、細胞毒性剤（例えば、ドキソルビシン、メトトレキサート及びそれらの誘導体）、in vivoで代謝されて細胞毒性剤を生じ得る細胞毒素前駆体、抗悪性腫瘍剤、降圧薬、心保護剤、抗不整脈薬、ACE阻害剤、抗炎症薬、利尿薬、筋弛緩薬、局所麻酔薬、ホルモン、コレステロール降下薬、抗凝固薬、抗うつ薬、精神安定薬、神経遮断薬、鎮痛薬（例えば、麻薬性鎮痛薬又は解熱鎮痛薬）、抗ウイルス薬、抗菌薬、抗真菌薬、静菌薬（bacteriostat）、CNS活性剤、抗痙攣薬、抗不安薬、制酸薬、麻薬、抗生物質、呼吸器薬（respiratory agent）、抗ヒスタミン剤、免疫抑制剤、免疫活性化剤（immunoactivating agent）、栄養添加物、鎮咳薬、診断剤、催吐薬及び制吐薬、炭水化物、グリコサミノグリカン、糖タンパク質及び多糖、脂質、例えば、ホスファチジル-エタノールアミン、ホスファチジルセリン（phosphtidylserine）及びその誘導体、スフィンゴシン、ステロイド、ビタミン、抗生物質（ランチビオティック剤、静菌（bacteristatic）剤及び殺菌剤を含む）、抗真菌薬、駆虫剤、及び単細胞病原体を含む感染性因子に対して有効な他の薬剤、低分子エフェクター分子（small effector molecule）、例えば、ノルアドレナリン、αアドレナリンレセプターリガンド、ドパミンレセプターリガンド、ヒスタミンレセプターリガンド、GABA／ベンゾジアゼピンレセプターリガンド、セロトニンレセプターリガンド、ロイコトリエン及びトリヨードサイロニン（triodothyronine）、並びにそれらの誘導体が含まれる。
【００８３】
生物学的活性部分はまた、生体膜を容易に通過でき、且つ二次的な機能的部分とコンジュゲート分子を形成する場合にはその二次的な機能的部分が生体膜を通過する能力を増強できる化合物に由来する、部分であり得る。例えば、生物学的活性部分は、WO 2009/027679（その内容は、その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）に記載されるものなどの、「タンパク質形質導入ドメイン」（PTD）又は低分子担体（small molecule carrier）（「SMC」又は「分子タグ（tug）」）であってよい。
【００８４】
本発明の好ましい実施態様において、生物活性部分は薬物であり、例えば、本明細書においてさらに定義する特定の薬物クラスの一つである。
【００８５】
本明細書で使用する場合、用語「リポソーム」とは、両親媒性の特性を有するリン脂質二重層からなる構造を意味する。本発明に従う使用に適したリポソームとしては、単層小胞及び多重層小胞が挙げられる。
【００８６】
本明細書で使用する場合、用語「ポリマー部分」とは、対応する単一のポリマー分子から誘導される、単一のポリマー鎖（分枝又は非分枝）を意味する。ポリマー部分は、天然ポリマーでも合成ポリマーでもよい。しかし典型的には、ポリマー分子はポリヌクレオチドではない。
【００８７】
生化学の分野で周知のとおり、ポリマー部分を含むコンジュゲートの創出は、多くのin vivo及びin vitroの適用において有用である。例えば、タンパク質（抗体及び抗体断片を含む）などの高分子の種々の特性（溶解度特性、表面特徴、及び溶液中又は冷凍時の安定性を含む）は、ポリマー部分をそれに結合させることによって修飾され得る。
【００８８】
従って、当業者であれば、ポリマー部分を含む化学修飾抗体又は抗体断片を調製するために本発明の方法論が使用できることを認識するであろう。当業者であれば、当分野で慣用的に使用されるポリマー部分に基づいて、本発明に従う使用に適したポリマー部分を容易に選択できるであろう。
【００８９】
従って、ポリマー部分の性質は、化学修飾抗体又は抗体断片の使用目的に依存するであろう。本発明に従う使用のための例示的なポリマー部分としては、多糖、ポリエーテル、ポリアミノ酸（例えばポリリジン）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ（メタ）アクリル酸及びその誘導体、ポリウレタン並びにポリホスファゼンが挙げられる。典型的には、かかるポリマーは、少なくとも10個のモノマー単位を含む。従って、例えば、多糖は、少なくとも10個の単糖単位を典型的に含む。
【００９０】
2つの特に好ましいポリマー分子は、デキストラン及びポリエチレングリコール（「PEG」）、並びにこれらの分子の誘導体（例えば、モノメトキシポリエチレングリコール、「mPEG」）である。好ましくは、PEG又はその誘導体は、20,000未満の分子量を有する。好ましくは、デキストラン又はその誘導体は、10,000〜500,000の分子量を有する。
【００９１】
上記ポリマーは、in vivoにおいて、本発明の化学修飾抗体及び抗体断片の半減期を延長する（すなわち、例えば細胞などの生理的条件下、その安定性を増加させる）のに特に有用であってよい。従って、カーゴ部分の特定のタイプは、「半減期延長剤」であり、すなわち、化学修飾抗体又は抗体断片の半減期を（例えば、生理的条件（例えばヒトの）下）、このカーゴ部分を欠いたそれ以外の対応する化学修飾抗体又は抗体断片の半減期と比較して、増加させることができるカーゴ部分である。半減期延長剤は、ポリマー部分（例えば、上記のものなど）であってよく、或いは非ポリマー部分であってもよい。典型的には、半減期延長剤は、比較的高分子量の物質であり、例えば、少なくとも500ダルトン、好ましくは少なくとも1000ダルトン、例えば少なくとも2000ダルトンの分子量を有してよい。
【００９２】
例示的な半減期延長剤としては、ポリアルキレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリオキサゾリン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、HPMAコポリマー、ポリエステル、ポリアセタール、ポリ（オルトエステル）、ポリカーボネート、ポリ（イミノカーボネート）、ポリアミド、ジビニルエーテル-無水マレイン酸及びスチレン-無水マレイン酸のコポリマー、多糖、ポリグルタミン酸からなる群から選択される半減期延長剤が挙げられる。
【００９３】
本明細書で使用する場合、用語「アミノ酸」とは、アミン官能基及びカルボキシル官能基の両方を含む部分を意味する。しかしながら、好ましくは、アミノ酸はα-アミノ酸である。好ましくは、アミノ酸は、タンパク新生アミノ酸、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、ピロリジン、セレノシステイン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンから選択されるアミノ酸である。しかしながら、アミノ酸は、非タンパク新生アミノ酸でもあり得る。非タンパク新生アミノ酸の例としては、ランチオニン、2-アミノイソ酪酸、デヒドロアラニン、γ-アミノ酪酸、オルニチン、シトルリン、カナバニン及びミモシンが挙げられる。本発明に従う特に好ましいアミノ酸は、システインである。
【００９４】
本明細書で使用する場合、用語「ペプチド」及び「タンパク質」とは、アミノ酸残基からなるポリマー部分を意味する。当業者が認識するように、用語「ペプチド」は典型的に、比較的短い長さのポリマーを示すために当分野で使用され、用語「タンパク質」は典型的に、比較的長い長さのポリマーを示すために当分野で使用される。本明細書で使用する場合、ペプチドは最大50アミノ酸残基を含み、対してタンパク質は50アミノ酸より多くを含むことが慣用である。しかしながら、本出願で同定されるカーゴ部分は、ペプチド又はタンパク質のいずれかを典型的に示し得るので、この区別は重要ではないことが理解されよう。
【００９５】
本明細書で使用する場合、用語「ポリペプチド」は、「タンパク質」と交換可能に使用される。さらに、タンパク質は、抗体、抗体断片及び酵素を含む。
【００９６】
本明細書で使用する場合、ペプチド又はタンパク質は、任意の天然又は非天然のアミノ酸を含み得る。例えば、ペプチド又はタンパク質は、例えば天然のα-アミノ酸に対応する、α-アミノ酸残基のみを含んでよい。或いは、ペプチド又はタンパク質はさらに、1以上の化学修飾を含んでよい。例えば、化学修飾は、その翻訳後にタンパク質にin vivoで生じる修飾である翻訳後修飾に対応してよく、例えば、アシル化（例えば、アセチル化）、アルキル化（例えば、メチル化）、アミド化、ビオチン化、ホルミル化、グリコシル化、糖化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、酸化、硫酸化又はリン酸化である。当業者は当然、かかる翻訳後修飾されたペプチド又はタンパク質が、依然として本発明の意味の範囲内の「ペプチド」又は「タンパク質」を構成することを認識するであろう。例えば、糖タンパク質（1以上のオリゴ糖側鎖を有するタンパク質）がタンパク質の一種であることは当分野で十分確立されている。
【００９７】
本明細書で使用する場合、用語「細胞」とは、生きた生物の単一の細胞を意味する。
【００９８】
本明細書で使用する場合、用語「炭水化物」には、単糖類及びオリゴ糖類が含まれる。典型的には、オリゴ糖は、2〜9個の単糖単位を含む。従って、本明細書で使用する場合、多糖は、炭水化物としてよりもむしろ「ポリマー部分」として分類される。しかしながら、本発明に従って使用されるカーゴ部分は、「炭水化物」及び「多糖」のいずれかを典型的に構成し得るので、当業者はこの区別が重要ではないことを理解するであろう。
【００９９】
本明細書で使用する場合、用語「DNA」とは、1以上のヌクレオチドから構成されるデオキシリボ核酸を意味する。DNAは、一本鎖でも二本鎖でもよい。好ましくは、DNAは1より多いヌクレオチドを含む。
【０１００】
本明細書で使用する場合、用語「RNA」とは、1以上のヌクレオチドを含むリボ核酸を意味する。好ましくは、RNAは1より多いヌクレオチドを含む。
【０１０１】
本明細書で使用する場合、用語「固体基材」とは、標準的条件（約20℃の温度及び約100 kPaの圧力）下で固体であり、本明細書に記載の鎖間架橋部分と相互作用して、固体基材と抗体又は抗体断片とを共に含むコンジュゲートを形成することができる物体を意味する。本発明で使用する固体基材は、微視的寸法でも巨視的寸法でもよいが、典型的には、0.001 μm（好ましくは0.1 μm、最も好ましくは1 μm）以上である少なくとも1つの寸法を有する。本発明で使用する固体基材は、少なくとも1つの実質的に平らな表面を有する基材（例えば、「スライド」状、「メンブレン」状又は「チップ」状の基材）、及び曲面を有する基材（例えば、ビーズ状の基材及びチューブ状の基材）を含む、任意の形状を有し得る。
【０１０２】
当業者ならば、当分野で慣用的に使用される固体基材の様々な材料、形状及びサイズを熟知しているだろう。典型的には、本発明で使用される固体基材は、生体分子（例えば、抗体及び抗体断片）、又は生物学的対象（interest）の他の分子を固定化するのに適した固体基材であり、従って、それらには、かかる目的に適していることが当分野で公知の任意の固体基材が含まれる。かかる材料の供給業者には、Pierce、Invitrogen及びSigma Aldrichが含まれる。
【０１０３】
本発明での使用に適した固体基材には、ナノチューブ、金属基材、金属酸化物基材、ガラス基材、シリコン基材、シリカ基材、マイカ基材及びポリマー基材が含まれる。好ましい金属基材には、金、銀、銅、プラチナ、鉄及び／又はニッケル基材が含まれるが、金基材が特に好ましい。
【０１０４】
ポリマー基材には、天然ポリマー及び合成ポリマーが含まれる。明らかに、「ポリマー基材」は、複数のポリマー分子を含む基材である。好ましいポリマー基材には、ポリスチレン基材、ポリプロピレン基材、ポリカーボネート基材、シクロ-オレフィンポリマー基材、架橋ポリエチレングリコール基材、多糖基材、例えばアガロース基材、並びにアクリルアミド系樹脂基材、例えばポリアクリルアミド基材及びポリアクリルアミン／アズラクトンコポリマー基材が含まれる。好ましい基材には、金基材、ガラス基材、シリコン基材、シリカ基材及びポリマー基材、特に本明細書で特定するそれらのポリマー基材が含まれる。特に好ましい基材は、ガラス基材、シリコン基材、シリカ基材、ポリスチレン基材、架橋ポリエチレングリコール基材、多糖基材（例えば、アガロース基材）及びアクリルアミド系樹脂基材である。別の好ましい実施態様において、固体基材はナノチューブ、特にカーボンナノチューブである。
【０１０５】
本明細書で使用する場合、用語「ナノチューブ」とは、チューブ状の構造であって、そのチューブの幅がナノメーターオーダー（典型的には、最大で10ナノメートル）のものを意味する。ナノチューブは、カーボンナノチューブ又は無機ナノチューブであり得る。カーボンナノチューブは、単層ナノチューブ（SWNT）又は多層ナノチューブ（MWNT）であり得る。無機ナノチューブは、炭素以外の元素、例えば、シリコン、銅、ビスマス、金属酸化物（例えば、二酸化チタン、二酸化バナジウム及び二酸化マンガン）、硫化物（例えば、二硫化タングステン及び二硫化モリブデン）、窒化物（例えば、窒化ホウ素及び窒化ガリウム）及びセレン化物（例えば、セレン化タングステン及びセレン化モリブデン）などからなるナノチューブである。好ましくは、ナノチューブはカーボンナノチューブである。
【０１０６】
本明細書で使用する場合、「コンジュゲート」とは、抗体又は抗体断片と少なくとも1つのカーゴ部分とを含む分子を意味する。抗体又は抗体断片と少なくとも1つのカーゴ部分とは、本明細書に記載されるように、抗体又は抗体断片に結合される鎖間架橋部分を介して互いに共有結合される。
【０１０７】
本明細書で使用する場合、用語「基」及び「部分」は交換可能に使用される。
【０１０８】
本明細書で使用する場合、「反応性基」とは、第一の分子と第二の分子との間に共有結合が形成するように第二の分子上の官能基との化学反応に参加することができる、第一の分子上の官能基を意味する。反応性基には、脱離基、求核基及び本明細書に記載される他の反応性基が含まれる。
【０１０９】
本明細書で使用する場合、用語「求電子性脱離基」とは、その炭素原子における求核攻撃後に求核剤により置き換えられ得る、飽和又は不飽和の炭素原子に結合した置換基を意味する。当業者ならば、特定の化合物上に位置付けるため及び特定の求核剤と反応するために適した求電子性脱離基を慣用的に選択できる。
【０１１０】
本明細書で使用する場合、用語「求核剤」とは、電子対を提供することによって化学結合を形成することができる官能基又は化合物を意味する。
【０１１１】
本明細書で使用する場合、用語「リンカー基」、「リンカー部分」、「連結基（linking group）」又は「連結部分」（本明細書では便宜上「リンカー部分」と称するが、これらの用語は完全に交換可能であることに留意されたい）とは全て、ある化学的部分を別の化学的部分に連結することができる部分を意味する。本発明に従って使用されるリンカー部分の性質は、当然、得られる化学修飾抗体及び抗体断片がその本来の目的を満たすことができる限り、重要ではない。当業者であれば、リンカー部分がコンジュゲート分子の構築に慣用的に使用されることを認識するであろうし、本発明の特定の実施態様とともに使用するために適切なリンカー部分を容易に選択できるだろう。
【０１１２】
典型的には、本発明で使用するためのリンカー部分は有機基である。典型的には、かかるリンカー部分は、50〜1000、好ましくは100〜500の分子量を有する。本発明に従う使用に適切なリンカー部分の例は、当分野の共通の一般的知識であり、「Bioconjugate Techniques」（Greg T. Hermanson, Academic Press Inc., 1996）（その内容は本明細書中で参照によりその全体が組み込まれる）などの標準的な参考教科書に記載されている。
【０１１３】
本明細書で使用する場合、用語「アルキル」には、直鎖及び分枝鎖の両方の飽和アルキル基が含まれる。好ましくは、アルキル基は、C1-20アルキル基、より好ましくはC1-15、なおより好ましくはC1-12アルキル基、なおより好ましくはC1-6アルキル基であり、最も好ましくはC1-4アルキル基である。特に好ましいアルキル基としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、tert-ブチル、ペンチル及びヘキシルが挙げられる。用語「アルキレン」は、しかるべく解釈されるべきである。
【０１１４】
本明細書で使用する場合、用語「アルケニル」とは、分枝鎖でも非分枝鎖でもよい、1つ以上の炭素-炭素二重結合を含む基をいう。好ましくは、アルケニル基は、C2-20アルケニル基、より好ましくはC2-15アルケニル基、なおより好ましくはC2-12アルケニル基、又は好ましくはC2-6アルケニル基であり、最も好ましくはC2-4アルケニル基である。用語「アルケニレン」は、しかるべく解釈されるべきである。
【０１１５】
本明細書で使用する場合、用語「アルキニル」とは、分枝鎖でも非分枝鎖でもよい、1つ以上の三重結合を含む炭素鎖をいう。好ましくは、アルキニル基は、C2-20アルキニル基、より好ましくはC2-15アルキニル基、なおより好ましくはC2-12アルキニル基、又は好ましくはC2-6アルキニル基であり、最も好ましくはC2-4アルキニル基である。用語「アルキニレン」は、しかるべく解釈されるべきである。
【０１１６】
特記のない限り、アルキル、アルケニル又はアルキニル基は、典型的には非置換である。しかしながら、かかる基が非置換又は置換であると示されている場合、1個以上の水素原子が、任意選択で、ハロゲン原子又は-NH2若しくはスルホン酸基で置き換えられていてよい。好ましくは、置換されたアルキル、アルケニル又はアルキニル基は、1〜10個の置換基、より好ましくは1〜5個の置換基、なおより好ましくは1、2又は3個の置換基、最も好ましくは1又は2個の置換基、例えば1個の置換基を有する。好ましくは、置換されたアルキル、アルケニル又はアルキニル基は、2個以下のスルホン酸置換基を有する。ハロゲン原子が好ましい置換基である。しかし好ましくは、アルキル、アルケニル又はアルキニル基は非置換である。
【０１１７】
アルキル、アルケニル若しくはアルキニル基、又はアルキレン、アルケニレン若しくはアルキニレン基である部分において、（a）0、1又は2個の炭素原子は、C6-10アリーレン、5〜10員のヘテロアリーレン、C3-7カルボシクリレン及び5〜10員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置き換えられていてもよく、且つ（b）0〜6個の-CH2-基は、-O-、-S-、-S-S-、-C（O）-、-C（O）-O-、-O-C（O）-、-NH-、-N（C1-6アルキル）-、-NH-C（O）-、-C（O）-NH-、-O-C（O）-NH-及び-NH-C（O）-O-基から選択される基によって置き換えられていてもよく、合計で0〜6個の該炭素原子及び-CH2-基が置き換えられていることが好ましく、合計で0〜4個がより好ましく、合計で0、1又は2個がなおより好ましい。最も好ましくは、炭素原子又は-CH2-基のいずれも置き換えられていない。
【０１１８】
-CH2-基を置き換えるための好ましい基は、O-、-S-、-C（O）-、-C（O）-O-、-O-C（O）-、-NH-、-NH-C（O）-及び-C（O）-NH-基である。炭素原子を置き換えるための好ましい基は、フェニレン、5〜6員のヘテロアリーレン、C5-6カルボシクリレン及び5〜6員のヘテロシクリレン基である。本明細書で使用する場合、「0、1又は2個の炭素原子」への言及は、アルキル、アルケニル又はアルキニル鎖中の任意の末端又は非末端炭素原子（その炭素原子に結合した任意の水素原子を含む）を意味する。本明細書で使用する場合、「0〜6個の-CH2-基」への言及は、0、1、2、3、4、5又は6個の-CH2-基を意味し、該-CH2-基はそれぞれ、アルキル、アルケニル又はアルキニル鎖中の末端炭素原子、又は残りの水素原子が保持されている末端炭素原子（例えば、-CH3が-O-に置き換えられ、その結果が-OH基である）に対応しない基をいう。
【０１１９】
本明細書で使用する場合、C6-10アリール基は、6〜10個の炭素原子を有する、単環式又は多環式の6〜10員の芳香族炭化水素環系である。フェニルが好ましい。用語「アリーレン」は、しかるべく解釈されるべきである。
【０１２０】
本明細書で使用する場合、5〜10員のヘテロアリール基は、O、S及びNから選択される少なくとも1個のヘテロ原子、例えば、1、2、3又は4個のヘテロ原子を含む、単環式又は多環式の5〜10員の芳香族環系（例えば、5又は6員環）である。環が4個のヘテロ原子を含む場合、これらは好ましくは全てが窒素原子である。用語「ヘテロアリーレン」は、しかるべく解釈されるべきである。
【０１２１】
単環式ヘテロアリール基の例としては、チエニル、フリル、ピロリル、イミダゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル及びテトラゾリル基が挙げられる。
【０１２２】
多環式ヘテロアリール基の例としては、ベンゾチエニル、ベンゾフリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾトリアゾリル、インドリル、イソインドリル及びインダゾリル基が挙げられる。好ましい多環式基としては、インドリル、イソインドリル、ベンズイミダゾリル、インダゾリル、ベンゾフリル、ベンゾチエニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾチアゾリル及びベンゾイソチアゾリル基が挙げられ、より好ましくはベンズイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル及びベンゾチアゾリルであり、最も好ましくはベンゾチアゾリルである。しかしながら、単環式ヘテロアリール基が好ましい。
【０１２３】
好ましくは、ヘテロアリール基は、5〜6員のヘテロアリール基である。特に好ましいヘテロアリール基は、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、トリアゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル及びピラジニル基である。より好ましい基は、チエニル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピロリル及びトリアジニルであり、最も好ましくはピリジニルである。
【０１２４】
本明細書で使用する場合、5〜10員のヘテロシクリル基は、1個以上の炭素原子、例えば1、2、3又は4個の炭素原子が、N、O、S、S（O）及びS（O）2から選択される部分で置き換えられている、非芳香族の、飽和又は不飽和の、単環式又は多環式のC5-10炭素環式環系である。好ましくは、5〜10員のヘテロシクリル基は5〜6員環である。用語「ヘテロシクリエン（heterocyclyene）」は、しかるべく解釈されるべきである。
【０１２５】
ヘテロシクリル基の例としては、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル（thietanyl）、ピロリジニル、イミダゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ジチオラニル（dithiolanyl）、ジオキソラニル、ピラゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ヘキサヒドロピリミジニル、メチレンジオキシフェニル、エチレンジオキシフェニル、チオモルホリニル、S-オキソ-チオモルホリニル、S,S-ジオキソ-チオモルホリニル、モルホリニル、1,3-ジオキソラニル、1,4-ジオキソラニル、トリオキソラニル（trioxolanyl）、トリチアニル（trithianyl）、イミダゾリニル、ピラニル、ピラゾリニル、チオキソラニル（thioxolanyl）、チオキソチアゾリジニル、1H-ピラゾール-5-（4H）-オニル、1,3,4-チアジアゾール-2（3H）-チオニル、オキソピロリジニル、オキソチアゾリジニル、オキソピラゾリジニル、スクシンイミド（succinimido）及びマレイミド基及び部分が挙げられる。好ましいヘテロシクリル基は、ピロリジニル、イミダゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ジチオラニル、ジオキソラニル、ピラゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ヘキサヒドロピリミジニル、チオモルホリニル及びモルホリニル基及び部分である。より好ましいヘテロシクリル基は、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、チオモルホリニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ピペリジニル、モルホリニル及びピロリジニル基である。
【０１２６】
疑義を回避するため、ヘテロアリール基及びヘテロシクリル基の上記定義は、環中に存在し得る「N」部分をいうが、熟練の化学者に明らかなように、N原子は、単結合を介して隣接する環原子のそれぞれに結合した場合、プロトン化される（又は以下に規定する置換基を有する）であろう。
【０１２７】
本明細書で使用する場合、C3-7カルボシクリル基は、3〜7個の炭素原子を有する、非芳香族の、飽和又は不飽和の炭化水素環である。好ましくは、C3-7カルボシクリル基は、3〜7個の炭素原子、より好ましくは5〜6個の炭素原子を有する、飽和又はモノ不飽和の炭化水素環（すなわち、シクロアルキル部分又はシクロアルケニル部分）である。例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル及びシクロヘキシル、並びにそれらのモノ不飽和バリアントが挙げられる。特に好ましい炭素環式基は、シクロペンチル及びシクロヘキシルである。用語「カルボシクリレン」は、しかるべく解釈されるべきである。
【０１２８】
具体的には、カルボシクリル又はヘテロシクリル基中の0、1又は2個の炭素原子は、-C（O）-基で置き換えられてよい。本明細書で使用する場合、置き換えられる「炭素原子」は、それらが結合する水素原子を含むことが理解される。1又は2個の炭素原子が置き換えられる場合、2個のかかる炭素原子が置き換えられることが好ましい。好ましいかかるカルボシクリル基としてはベンゾキノン基が挙げられ、好ましいかかるヘテロシクリル基としてはスクシンイミド及びマレイミド基が挙げられる。
【０１２９】
特記のない限り、アリール、ヘテロアリール、カルボシクリル又はヘテロシクリル基は、典型的には非置換である。しかしながら、かかる基が非置換又は置換であると示されている場合、1個以上の水素原子が、任意選択で、ハロゲン原子又はニトロ、カルボキシル、シアノ、アシル、アシルアミノ、カルボキサミド、スルホンアミド、トリフルオロメチル、ホスフェート、C1-6アルキル、C6-10アリール、5〜10員のヘテロアリール、C3-7カルボシクリル、5〜10員のヘテロシクリル、-ORx、-SRx、-N（Rx）（Ry）及び-SO2-Rx基（式中、Rx及びRyは、独立して、水素原子並びにC1-6アルキル及びC6-10アリール基から選択される）に置き換えられていてもよい。
【０１３０】
好ましくは、置換されたアリール、ヘテロアリール、カルボシクリル又はヘテロシクリル基は、1〜4個の置換基、より好ましくは1〜2個の置換基、最も好ましくは1個の置換基を有する。好ましくは、置換されたアリール、ヘテロアリール、カルボシクリル又はヘテロシクリル基は、2個以下のニトロ置換基及び2個以下のスルホン酸置換基を有する。好ましい置換基は、C1-6アルキル、-O（C1-6アルキル）、カルボキミド及びアシルを含む。しかし好ましくは、アリール、ヘテロアリール、カルボシクリル又はヘテロシクリル基は非置換である。
【０１３１】
本明細書で使用する場合、ハロゲン原子は、典型的にはF、Cl、Br又はI原子であり、好ましくはBr又はCl原子であり、より好ましくはBr原子である。
【０１３２】
本明細書で使用する場合、C1-6アルコキシ基は、酸素原子に結合したC1-6アルキル（例えば、C1-4アルキル）基である。
【０１３３】
本明細書で使用する場合、C1-6アルキルチオール基は、硫黄原子に結合したC1-6アルキル（例えば、C1-4アルキル）基である。
【０１３４】
本明細書で使用する場合、5〜10員のヘテロシクリルチオールは、硫黄原子に結合した5〜10員の（例えば、5〜6員の）ヘテロシクリル基である。
【０１３５】
本明細書で使用する場合、C6-10アリールチオールは、硫黄原子に結合したC6-10アリール（例えば、フェニル）基である。
【０１３６】
本明細書で使用する場合、C3-7カルボシクリルチオールは、硫黄原子に結合したC3-7カルボシクリル（例えば、C5-6カルボシクリル）基である。
【０１３７】
抗体ABの化学修飾の数及び位置
本発明の化学修飾抗体ABの式（IA）又は（IB）
【０１３８】
【化１０】
2015510877.tif 000011
【０１３９】
の鎖間架橋部分において、SA及びSBは、該化学修飾抗体の異なる鎖に結合する硫黄原子である。本明細書の他の箇所で説明するように、本発明の化学修飾抗体ABにおいて、前記少なくとも1つの鎖間架橋部分はそれぞれ、典型的には、対応する非修飾抗体に存在する1つの鎖間ジスルフィド結合を置き換える。さらに、硫黄原子SA及びSBは、対応する非修飾抗体に存在する前記鎖間ジスルフィドの硫黄原子に対応する。従って、鎖間ジスルフィド架橋は、架橋単位-SA-C=C-SB-を含む鎖間架橋部分によって置き換えられていることが理解できる。本発明者らは、この架橋単位が、抗体の構造的完全性及び特異的結合能を保持することを助け、場合によってはそれらを高めることさえ助けることを発見した。
【０１４０】
本発明の化学修飾抗体ABは好ましくはIgG1抗体である。従って、典型的には、前記式（IA）又は（IB）の鎖間架橋部分はそれぞれ、対応する非修飾IgG1抗体に存在する4つの鎖間ジスルフィド結合の1つを置き換える。
【０１４１】
本発明者らは、化学修飾抗体ABをその対応する抗体から産生するために使用する反応条件を適切に調節することによって、特定の位置に特定の数の鎖間架橋部分を有する（すなわち、特定の鎖を架橋する）化学修飾抗体を得ることができることを発見した。従って、本発明の化学修飾抗体ABは、IgG1抗体であって、
（i）式（IA）又は（IB）の鎖間架橋部分を1つ有し、且つ鎖は、それ以外ジスルフィド架橋-S-S-によって架橋されているか（すなわち、3つの鎖間ジスルフィド結合を保持する）；
（ii）式（IA）又は（IB）の鎖間架橋部分を2つ有し、且つ鎖は、それ以外ジスルフィド架橋-S-S-によって架橋されているか（すなわち、2つの鎖間ジスルフィド結合を保持する）；
（iii）式（IA）又は（IB）の鎖間架橋部分を3つ有し、且つ鎖は、それ以外ジスルフィド架橋-S-S-によって架橋されているか（すなわち、1つの鎖間ジスルフィド結合を保持する）；又は
（iv）式（IA）又は（IB）の鎖間架橋部分を4つ有する（すなわち、いずれの鎖間ジスルフィド結合も保持しない）
ものであってよい。
【０１４２】
（i）において、前記式（IA）又は（IB）の鎖間架橋部分は、2つの重鎖を架橋してよく、或いはまた軽鎖を重鎖と架橋してもよい。
【０１４３】
（ii）において、式（IA）又は（IB）の鎖間架橋部分2つの各々は、2つの重鎖のうちの1つを2つの軽鎖のうちの1つと架橋してよい（すなわち、鎖間架橋部分は、抗体のFab領域に限定されてよい）。或いは、式（IA）又は（IB）の鎖間架橋部分2つの各々は、2つの重鎖を架橋してよい（すなわち、鎖間架橋部分は、抗体のFc領域に限定されてよい）。さらにまた、式（IA）又は（IB）の鎖間架橋部分の1つが2つの重鎖を架橋してよく、且つ式（IA）又は（IB）の他の鎖間架橋部分が、軽鎖を重鎖と架橋してよい。
【０１４４】
（iii）において、化学修飾抗体は、2つの重鎖間にて1つの鎖間ジスルフィド結合を保持してよく（すなわち、Fc領域において）、或いはまた重鎖と軽鎖との間にて1つの鎖間ジスルフィド結合を保持してもよい（すなわち、Fab領域において）。
【０１４５】
疑義を回避するため、（ii）、（iii）、（iv）において、典型的には、化学修飾抗体AB上に存在する鎖間架橋部分は全て、以下のいずれかである：（A）式（IA）の鎖間架橋部分；又は（B）式（IB）の鎖間架橋部分。当業者には明らかなとおり、典型的には、化学修飾抗体は、式（IA）部分又は式（IB）部分のいずれか（両方の混合物というよりも）を導入する試薬を用いて製造される。とはいえ、式（IA）部分及び式（IB）部分の両方を含む化学修飾抗体の構築も、すなわち複数の試薬を用いることによって理解されるだろう。
【０１４６】
本発明はまた、本発明の1つ以上の化学修飾抗体を含む組成物も提供する。
【０１４７】
本発明の一例となる組成物は、特定の抗原AGに特異的に結合することができる本発明の特定の化学修飾抗体ABを含み、且つ該抗原AGに特異的に結合することができる本発明のかかる化学修飾抗体AB以外のものを実質的に含まない。「実質的に〜ない」とは、10重量％未満、例えば5重量％未満又は1重量％未満を意味する。言い換えれば、前記組成物は、特定の位置に特定の数の鎖間架橋部分を含む化学修飾抗体を含み、同じ対応する抗体に基づくが（従って、同一抗原AGに特異的に結合できる）鎖間架橋部分の数及び／又は位置が異なる化学修飾抗体を実質的に含まないものであってよい。この組成物において、本発明の前記特定の化学修飾抗体ABは、好ましくは、上記（i）、（ii）、（iii）又は（iv）で定義されるとおりである。前記組成物は、他の抗体又は化学修飾抗体（例えば、抗原AG以外の抗原に特異的に結合することができる抗体又は化学修飾抗体）を含む他の構成要素を当然含んでもよい。
【０１４８】
従って、この例示的組成物は、実質的に均一な化学修飾抗体組成物と考えることができる。「実質的に均一」とは、前記特定の化学修飾抗体以外に、抗原AGに特異的に結合することができる本発明の化学修飾抗体ABが組成物中に実質的に存在しないことを意味する。
【０１４９】
より一般的には、本発明の例示的組成物は、本発明の化学修飾抗体を複数含んでよいが（ここで複数とは、特定の抗原AGに結合することができる（すなわち、特定の天然抗体に基づく）2以上の化学修飾抗体を意味する）、とはいえ、本発明の特定の化学修飾抗体を統計量よりも多く含む。かかる組成物は、必ずではないが、上記で定義したように実質的に均一であってよい。しかし、とはいえ、それらは、特定の数及び位置の鎖間架橋部分を有する本発明の化学修飾抗体の「過密（over-population）」を導くという点で、本発明の合成方法の選択性を反映する。
【０１５０】
従って、本発明の例示的組成物は、本発明の1つ以上の化学修飾抗体を含み、これは特定の抗原AGに特異的に結合することができる。さらに、前記1つ以上の化学修飾抗体のうち特定の化学修飾抗体は、該1つ以上の化学修飾抗体全体量の少なくとも30重量％の量で存在する。典型的には、かかる組成物において、前記特定の化学修飾抗体は、1つ以上の化学修飾抗体のその他いずれかよりも多い重量で存在する。
【０１５１】
「特定の化学修飾抗体」とは、特定の位置に特定の数の（特定の）鎖間架橋部分を有する化学修飾抗体を意味する。特に、前記特定の化学修飾抗体は、好ましくは、上記（i）、（ii）、（iii）又は（iv）で定義したとおりであり、すなわち、それは、好ましくは、1、2、3、又は4つの鎖間架橋部分を含むIgG1抗体である。
【０１５２】
好ましくは、前記特定の化学修飾抗体の量は、前記化学修飾抗体全体量の少なくとも40重量％、より好ましくは少なくとも50重量％、最も好ましくは少なくとも60重量％である。上記で定義したような「実質的に均一」な組成物において、前記特定の化学修飾抗体の量は、前記化学修飾抗体全体量の少なくとも90重量％であることが理解されよう。それは、本発明の特に好ましい実施態様を構成する。
【０１５３】
再度、疑義を回避するために、組成物は、任意の相対量で他の構成要素を含んでよいことを強調する。例えば、AGとは異なる抗原に特異的に結合することができる異なる抗体又は化学修飾抗体が、任意量で存在してよい。
【０１５４】
式（IA）又は（IB）の鎖間架橋部分の構造
式（IA）又は（IB）
【０１５５】
【化１１】
2015510877.tif 000012
【０１５６】
の鎖間架橋部分において、記号
【０１５７】
【化１２】
2015510877.tif 000013
【０１５８】
は、別の基への結合点を意味する。該基の正体は本発明において重要ではなく、特定のマレイミド及び3,6-ジオキソピリダジン架橋試薬が、抗体及び抗体断片を選択的に機能化するために使用できるとの発見に基づく。とはいえ、かかる基の例を、本明細書においてさらに詳細に述べる。
【０１５９】
好ましくは、本発明の化学修飾抗体において、前記式（IA）の鎖間架橋部分の少なくとも1つはそれぞれ、同一又は異なって、式（IA’）：
【０１６０】
【化１３】
2015510877.tif 000014
【０１６１】
（式中、
-  Rは、（i）水素原子、（ii）カーゴ部分又は（iii）リンカー部分であって、該リンカー部分は、任意選択で、カーゴ部分と連結されてよく；且つ
-  SA及びSBは、該化学修飾抗体の異なる鎖に結合する硫黄原子である）
部分である。
【０１６２】
通常、前記式（IA）の鎖間架橋部分の少なくとも1つはそれぞれ同一である。前記式（IA）の鎖間架橋部分の少なくとも1つがそれぞれ同一である化学修飾抗体は、合成が容易である。しかし、式（IA）の鎖間架橋部分が異なるものも可能である。これは例えば、その対応する抗体から化学修飾抗体を合成する間に、複数の異なる試薬を用いることによって達成できる。
【０１６３】
式（IA’）の鎖間架橋部分は、以下のいずれかを構成してよいことが理解されるだろう：（a）化学修飾抗体のさらなる機能化をもたらすのに適した化学反応性（chemically reactive）部分、又は（b）カーゴ部分を有し、それにより、化学修飾抗体をバイオコンジュゲート構築物とする部分。具体的には、Rが水素原子、又はカーゴ部分と連結されないリンカー部分である場合には、式（IA’）の鎖間架橋部分は、部分（a）を構成する。さらに、Rがカーゴ部分、又は少なくとも1つのカーゴ部分と連結されたリンカー部分である場合には、式（IA’）の鎖間架橋部分は、部分（b）を構成する。
【０１６４】
式（IA’）の鎖間架橋部分に関連して使用される場合、用語「カーゴ部分」及び「リンカー部分」は、本明細書で定義するとおりである。当業者ならば、カーゴ部分及びリンカー部分はともに、化学修飾抗体の意図する機能に従い、慣用的に選択できることを容易に理解するだろう。
【０１６５】
好ましい実施態様において、本発明の化学修飾抗体は、少なくとも1つのカーゴ部分、例えば、式（IA）の鎖間架橋部分それぞれに結合される少なくとも1つ（例えば、1つ）のカーゴ部分を含む。特に好ましい実施態様において、式（IA）の鎖間架橋部分はそれぞれ、少なくとも1つ（例えば、1つ）のカーゴ部分を含む式（IA’）の鎖間架橋部分である。この実施態様において、化学修飾抗体は、抗体と少なくとも1つのカーゴ部分とを共に含むため、コンジュゲートを構成する。
【０１６６】
代替的な好ましい実施態様において、本発明の化学修飾抗体はいずれのカーゴ部分も含まない。例えば、この化学修飾抗体において、式（IA）の鎖間架橋部分はそれぞれ、いずれのカーゴ部分も含まない式（IA’）の鎖間架橋部分（すなわち、Rが水素原子、又はカーゴ部分と連結されないリンカー部分である）であってよい。この実施態様において、化学修飾抗体は、コンジュゲートではないが、所定の用途のために関心のあるカーゴ部分を導入するために、さらなる化学的機能化の影響を受けやすい。
【０１６７】
現在特に好ましい一実施態様において、式（IA）の鎖間架橋部分を含む化学修飾抗体にカーゴ部分、又はカーゴ部分のそれぞれ（好ましくはそれぞれ）が存在する場合、これは薬物部分である。この実施態様において、化学修飾抗体は、「抗体-薬物コンジュゲート」又は「ADC」であることが理解されよう。ADCは、低分子薬物（small drug）の治療活性と、抗体選択性の能力とを組み合わせており、現在、癌療法の分野において、重要な研究及び臨床的関心のあるものである。
【０１６８】
従って、特に好ましい薬物部分は、細胞毒性剤である。好ましい細胞毒性剤には、アントラサイクリン、オーリスタチン、メイタンシノイド、カリケアマイシン、タキサン、ベンゾジアゼピン及びデュオカルマイシンが含まれる。他の好ましい薬物部分には、放射性核種薬物及び光増感剤が含まれる。
【０１６９】
当業者ならば、細胞毒性剤を有する化学修飾抗体に関連して、例示的適用は癌療法の分野にあり、ここでは、抗体がin vivoにて癌細胞を特異的に標的化し、それにより、その場所への細胞毒性剤の選択的デリバリーが導かれることを理解するだろう。
【０１７０】
典型的には、癌細胞などの細胞をADCが標的とすることを意図する場合、抗体は、その抗原AGが、その細胞により、非癌細胞での発現に対して過剰発現される抗原（例えば、特定タイプの癌細胞の表面上に過剰発現する抗原）、又はそうでなければ癌細胞と関連する抗原AGであるように選択されるだろう。これにより、ADCは、治療効果（例えば、細胞毒性剤を介して達成される細胞毒性効果）が望まれる細胞を特異的に標的化することが可能となる。結果として、好ましい実施態様において、化学修飾抗体は、少なくとも1つの細胞毒性剤を含み、抗原AGは、癌細胞により過剰発現されるか、そうでなければ癌細胞と関連する抗原である（例えば、本明細書に記載の例示的なかかる抗原など）。
【０１７１】
多数のADCが既に開発されており、ここでは、抗体断片が、公知のリンカーを介して薬物部分とコンジュゲート化されている。本発明の化学修飾抗体には、これらの以前に公知の抗体と薬物部分との「ペア」のいずれかを含む化合物が含まれるが、これは、本発明の鎖間架橋部分を介して選択的な様式でコンジュゲート化されるよう修飾されている。
【０１７２】
癌細胞抗原に対し免疫特異性である抗体は、商業的に得ることができ、又は当業者に公知の任意の方法、例えば、組み換え発現技術などによって製造できる。癌細胞抗原に対し免疫特異性である抗体をコードするヌクレオチド配列は、例えば、GenBankデータベース又は類似のデータベース、文献出版物、又は慣用的なクローニング及びシーケンシングによって得ることができる
【０１７３】
本発明で使用するための抗体の非限定的な例として、以下の抗原に特異的に結合することができる抗体が挙げられる（非限定的な例となる対応疾患状態を括弧に記載する）：CA125（卵巣）、CA15-3（癌腫）、CA19-9（癌腫）、CA 242（結腸直腸）、L6（癌腫）、CD2（ホジキン病又は非ホジキンリンパ腫）、CD3、CD4、CD5、CD6、CD11、CD25、CD26、CD37、CD44、CD64、CD74、CD205、CD227、CD79、CD 105、CD138、CD20（非ホジキンリンパ腫）、CD52（白血病）、CD33（白血病）、CD22（リンパ腫）、CD38（多発性骨髄腫）、CD40（リンパ腫）、CD19（非ホジキンリンパ腫）、CD30（CD30+ 悪性腫瘍）、CD70、CD56（小細胞肺癌、卵巣癌、多発性骨髄腫、固形腫瘍）、ルイスY（癌腫）、ルイスX（癌腫）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（癌腫）、αフェトプロテイン（癌腫）、胎盤型アルカリフォスファターゼ（癌腫）、前立腺特異抗原（前立腺）、前立腺特異的膜抗原（前立腺）、前立腺酸性フォスファターゼ（前立腺）、上皮成長因子（癌腫）、MAGE-1（癌腫）、MAGE-2（癌腫）、MAGE-3（癌腫）、MAGE-4（癌腫）、抗トランスフェリンレセプター（癌腫）、p97（メラノーマ）、MUC1（乳癌）、CEA（結腸直腸）、gp100（メラノーマ）、MARTl（メラノーマ）、IL-2レセプター（T細胞白血病及びリンパ腫）、ムチン（癌腫）、P21（癌腫）、MPG（メラノーマ）、Neu癌遺伝子産物（癌腫）、BCMA、グリピカン-3、Liv-1又はルイスY（上皮性腫瘍）、HER2（乳癌）、GPNMB（乳癌）、CanAg（固形腫瘍）、DS-6（乳癌、卵巣癌、固形腫瘍）、HLA-Dr10（非ホジキンリンパ腫）、VEGF（肺及び結腸直腸癌）、MY9、B4、EpCAM、EphAレセプター、EphBレセプター、EGFR、EGFRvIII、HER2、HER3、BCMA、PSMA、メソテリン、cripto、α（v）β3、α（v）β5、α（v）β6インテグリン、C242、EDB、TMEFF2、FAP、TAG-72、GD2、CAIX及び5T4。
【０１７４】
現在特に好ましい抗体として、以下の抗原に特異的に結合することができるものが挙げられる：MY9、B4、EpCAM、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD11、CD19、CD20、CD22、CD25、CD26、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD44、CD56、CD64、CD70、CD74、CD79、CD105、CD138、CD205、CD227、EphAレセプター、EphBレセプター、EGFR、EGFRvIII、HER2、HER3、BCMA、PSMA、ルイスY、メソテリン、cripto、α（v）β3、α（v）β5、α（v）β6インテグリン、C242、CA125、GPNMB、ED-B、TMEFF2、FAP、TAG-72、GD2、CAIX及び5T4。
【０１７５】
癌治療に使用するために公知の抗体の例としては、以下が挙げられる：非ホジキンリンパ腫患者を治療するためのキメラ抗CD20モノクローナル抗体であるRITUXAN（登録商標）（リツキシマブ；Genentech）；卵巣癌を治療するためのマウス抗体であるOVAREX；結腸直腸癌を治療するためのマウスIgG2a抗体であるPANOREX（Glaxo Wellcome, NC）；頭頸部癌などの上皮成長因子陽性癌を治療するための抗EGFR IgGキメラ抗体であるセツキシマブERBITUX（Imclone Systems Inc., NY）；肉腫を治療するためのヒト化抗体であるビタキシン（Medlmmune, Inc., MD）；慢性リンパ性白血病（CLL）を治療するためのヒト化IgG1抗体であるCAMPATH I/H（Leukosite, MA）；急性骨髄性白血病（AML）を治療するためのヒト化抗CD33 IgG抗体であるSMART MI95（Protein Design Labs, Inc., CA）及びSGN-33（Seattle Genetics, Inc., WA）；非ホジキンリンパ腫を治療するためのヒト化抗CD22 IgG抗体であるLYMPHOCIDE（Immunomedics, Inc., NJ）；非ホジキンリンパ腫を治療するためのヒト化抗HLA-DR抗体であるSMART ID10（Protein Design Labs, Inc., CA）；非ホジキンリンパ腫を治療するための放射性標識マウス抗HLA-Dr10抗体であるONCOLYM（Techniclone, Inc., CA）；ホジキン病又は非ホジキンリンパ腫を治療するためのヒト化抗CD2 mAbであるALLOMUNE（BioTransplant, CA）；肺及び結腸直腸癌を治療するための抗VEGFヒト化抗体であるAVASTIN（Genentech, Inc., CA）；非ホジキンリンパ腫を治療するための抗CD22抗体であるエプラツズマブ（Epratuzamab）（Immunomedics, Inc., NJ and Amgen, CA）；結腸直腸癌を治療するためのヒト化抗CEA抗体であるCEACIDE（Immunoniedics, NJ）；並びに乳癌を治療するための抗HER2/neuレセプターモノクローナル抗体であるハーセプチン（TRASTUZUMAB）。
【０１７６】
好ましくは、Rがリンカー部分である場合、該リンカー部分は、酵素触媒作用、酸性触媒作用、塩基性触媒作用、酸化触媒作用及び還元触媒作用により化学的断片化（chemical fragmentation）を受けることができる。化学的断片化の影響を受けやすいリンカー部分の使用は、バイオコンジュゲート技術、特に例えばADC技術において十分に確立されている。当業者に理解されるように、化学的断片化が可能なリンカー部分の使用は、その後の断片化によって1つ以上のカーゴ部分の放出が生じる、限定的な寿命を有するコンジュゲートが意図される適用において有利である。
【０１７７】
化学的断片化を受けることができるリンカー部分が使用される、特に十分に確立された分野は、ADC技術の分野である。ここでは、抗体を用いて、in vivoにおいて、カーゴ部分（典型的には薬物部分）を関心のある領域に（例えば、細胞表面に発現する抗原に抗体を結合させることを介して標的化される標的細胞に）向ける。次いで、コンジュゲートが関心のある領域に達すると、リンカーの化学的断片化によりカーゴ部分が放出される。疑義を回避するため、かかる技術で典型的に使用されるリンカー部分の全てのタイプが、本発明で容易に使用され得る。ADCと同様に、カーゴ部分に抗体を一緒に連結するために適したリンカー部分であって、本発明で使用し得るリンカー部分の代表的レビューの1つが、Ducry及びStumpによりBioconjugate Chem. 2010 21 5-13（その内容は、その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）において提供される。
【０１７８】
リンカー部分が、酵素触媒作用、酸性触媒作用、塩基性触媒作用、酸化触媒作用及び還元触媒作用により化学的断片化を受けることができる実施態様において、リンカー部分の化学構造は、それを所望の化学的断片化メカニズムの影響を受けやすい状態にするという観点で選択される。当業者ならば、所望の化学的断片化メカニズムを達成するのに適した化学的モチーフについて十分に理解しているだろう。
【０１７９】
例えば、酸性触媒作用を介した化学的断片化を所望する場合、リンカー部分は、その全体の構造内に酸不安定性モチーフ（かかる酸不安定性モチーフの例はカルバメート及びヒドラゾンモチーフである）を含まなければならない。かかる酸不安定性モチーフの具体例の一つは、
【０１８０】
【化１４】
2015510877.tif 000015
【０１８１】
である。
【０１８２】
同様に、還元触媒作用を所望する場合、リンカー部分は、還元的切断（reductive cleavage）の影響を受けやすいモチーフ（例えば、ジスルフィド結合）を含まなければならない。
【０１８３】
酵素触媒作用により化学的断片化を受けることができるリンカー部分の例は、プロテアーゼ切断可能なペプチドモチーフを含むリンカーである。かかるプロテアーゼ切断可能なペプチドモチーフの具体例の一つは、
【０１８４】
【化１５】
2015510877.tif 000016
【０１８５】
である。
【０１８６】
このモチーフは、例えば、市販のADC製品ブレンツキシマブ ベドチン（ある種の癌の治療に使用するためのCD30標的抗体-薬物コンジュゲート）で使用される。
【０１８７】
Rがリンカー部分である場合、該リンカー部分の構造の一例は、
式-L（CM）m（Z）n-m
（式中、
-  Lは連結部分を表し；
-  各CMは、同一又は異なって、カーゴ部分を表し；
-  各Zは、同一又は異なって、Lと結合する反応性基であって、カーゴ部分がLと連結するように該カーゴ部分と反応することができるものを表し；
-  nは、1、2又は3であり；且つ
-  mは、0〜nの整数である）
部分である。
【０１８８】
疑義を回避するため、式L（CM）m（Z）n-mにおいて、連結部分Lは、m個のカーゴ部分CMと、n-m個の反応性基Zを有する。前記カーゴ部分CM及び反応性基Zのそれぞれは、連結部分L上の任意の位置にて結合されてよい。
【０１８９】
Rが、式-L（CM）m（Z）n-mのリンカー部分である場合、Lは、好ましくは、非置換であるか、又はハロゲン原子並びに-NH2及びスルホン酸基から選択される1つ以上の置換基で置換されている、C1-20アルキレン基、C2-20アルケニレン基又はC2-20アルキニレン基である部分であり、式中、（a）0、1又は2個の炭素原子は、C6-10アリーレン、5〜10員のヘテロアリーレン、C3-7カルボシクリレン及び5〜10員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置き換えられており、且つ（b）0〜6個の-CH2-基は、-O-、-S-、-S-S-、-C（O）-、-C（O）-O-、-O-C（O）-、-NH-、-N（C1-6アルキル）-、-NH-C（O）-、-C（O）-NH-、-O-C（O）-NH-及び-NH-C（O）-O-基から選択される基によって置き換えられており、式中、
（i）該アリーレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか、又はハロゲン原子並びにニトロ、カルボキシル、シアノ、アシル、アシルアミノ、カルボキサミド、スルホンアミド、トリフルオロメチル、ホスフェート、C1-6アルキル、C6-10アリール、5〜10員のヘテロアリール、C3-7カルボシクリル、5〜10員のヘテロシクリル、-ORx、-SRx、-N（Rx）（Ry）及び-SO2-Rx基（式中、Rx及びRyは、独立して、水素原子並びにC1-6アルキル及びC6-10アリール基から選択される）から選択される1つ以上の置換基によって置換されており；
（ii）該カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基中の0、1又は2個の炭素原子は、-C（O）-基によって置き換えられている。
【０１９０】
疑義を回避するため、Lのこの定義が、C1-20アルキレン基、C2-20アルケニレン基又はC2-20アルキニレン基（すなわち、化学修飾抗体に基CM又はZを連結する二価の部分）をいうとしても、nが1より大きい実施態様においては、追加のCM及び／又はZはそれぞれ、対応する二価の連結部分Lにおいて水素原子を置き換えることが理解されるべきであることを強調する。従って、例えば、nが2である場合、Lは3価の部分（架橋部分を2つのCM、2つのZ、又は1つのCMと1つのZに結合する）であり、nが3である場合、Lは4価の部分（架橋部分を、任意の3つのCM及び／又はZに結合する）である。
【０１９１】
好ましくは、任意のアリーレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、最大で2つの置換基により置換されており、より好ましくは、それらは非置換である。好ましい置換基として、C1-6アルキル、-O（C1-6アルキル）、カルボキサミド及びアシルが挙げられる。
【０１９２】
一側面において、Lは、非置換のC1-12アルキレン基である部分を表し、式中、（a）0又は1個の炭素原子は、フェニレン基によって置き換えられており、且つ（b）0、1又は2個の-CH2-基は、-O-、-S-、-S-S-、-C（O）-、-C（O）-O-、-O-C（O）-、-NH-、-N（C1-6アルキル）-、-NH-C（O）-、-C（O）-NH-、-O-C（O）-NH-及び-NH-C（O）-O-基から選択される基によって置き換えられており、ここで、該フェニレン基は、非置換であるか、又はハロゲン原子並びにニトロ、カルボキシル、シアノ、アシル、アシルアミノ、カルボキサミド、スルホンアミド、トリフルオロメチル、ホスフェート、C1-6アルキル、C6-10アリール、5〜10員のヘテロアリール、C3-7カルボシクリル、5〜10員のヘテロシクリル、-ORx、-SRx、-N（Rx）（Ry）及び-SO2-Rx基（式中、Rx及びRyは、独立して、水素原子並びにC1-6アルキル及びC6-10アリール基から選択される）から選択される1つ以上の置換基によって置換されている。
【０１９３】
例えば、Lは、非置換のC1-4アルキレン基である部分であってよく、式中、0又は1個の炭素原子は、非置換のフェニレン基により置き換えられており、0又は1個の-CH2-基は、-S-S-、-O-C（O）-NH-及び-NH-C（O）-O-基から選択される基によって置き換えられている。
【０１９４】
Zは、カーゴ部分が式Lの基と連結するように、該カーゴ部分と反応することができる、式Lの基と結合する反応性基を表す。当業者が理解するように、反応性基自体の性質は重要ではない。非常に広範な反応性基が、バイオコンジュゲートにおいてカーゴ部分をリンカーに接続するために、当分野で現在慣用的に使用されている。かかる反応性基は、例えば、アミン化合物、チオール化合物、カルボキシル化合物、ヒドロキシル化合物、カルボニル化合物、又は反応性水素を含む化合物をリンカーに結合することが可能であってよい。当業者であれば当然、任意のかかる反応性基が、本発明に従う使用に適するだろうことを即座に認識するだろう。当業者は、「Bioconjugate Techniques」（Greg T. Hermanson, Academic Press Inc., 1996）（その内容は、その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）などの標準的教科書を参照して、共通の一般知識から、適切な反応性基を選択することができるだろう。
【０１９５】
Zは好ましくは以下である：
（a）式-LG、-C（O）-LG、-C（S）-LG又は-C（NH）-LGの基（式中、LGは求電子性脱離基である）；
（b）-OH、-SH、-NH2、-NH（C1-6アルキル）及び-C（O）NHNH2基から選択される求核剤Nu’；
（c）求核剤と開環求電子反応し得る環式部分Cyc；
（d）式-S（O2）（Hal）の基（式中、Halはハロゲン原子である）；
（e）式-N＝C＝O又は-N＝C＝Sの基；
（f）式-S-S（IG’）の基（式中、IG’は、本明細書で定義したとおりの式IGの基を表す）；
（g）1つ以上のハロゲン原子によって置換されたC6-10アリール基である、基AH；
（h）紫外線光への曝露によって活性化され得る光反応性基；
（i）式-C（O）H又は-C（O）（C1-6アルキル）の基；
（j）マレイミド基；
（k）式-C（O）CHCH2の基；
（l）式-C（O）C（N2）H又は-PhN2+の基（式中、Phはフェニル基を示す）；
（m）エポキシド基；
（n）アジド基-N3；及び
（o）アルキン基-C≡CH。
【０１９６】
最も好ましくは、Zは以下から選択される：
（a）式-LG、-C（O）-LG及び-C（S）-LGの基（式中、LGは、ハロゲン原子並びに-O（C1-6アルキル）、-SH、-S（C1-6アルキル）、トリフレート、トシレート、メシレート、N-ヒドロキシスクシンイミジル及びN-ヒドロキシスルホスクシンイミジル基から選択される）；
（b）式-OH、-SH及び-NH2の基；
（c）式
【０１９７】
【化１６】
2015510877.tif 000017
【０１９８】
又は
【０１９９】
【化１７】
2015510877.tif 000018
【０２００】
の基；及び
（d）マレイミド基。
【０２０１】
本明細書で使用する場合、「マレイミド基」は、非置換のマレイミド基（典型的には、その窒素原子を介してLに結合する）であってよく、或いはまた、置換されたマレイミド基（典型的にはやはり、その窒素原子を介してLに結合する）であってよく、該置換基は、二重結合環炭素原子（すなわち、窒素原子からβ位の炭素原子）の1つ又は両方に位置する求電子性脱離基（例えば、本明細書で定義したとおりの基X及びY）である。
【０２０２】
LGは好ましくは、ハロゲン原子並びに-O（IG’）、-SH、-S（IG’）、-NH2、NH（IG’）、-N（IG’）（IG’’）、-N3、トリフレート、トシレート、メシレート、N-ヒドロキシスクシンイミジル、N-ヒドロキシスルホスクシンイミジル、イミダゾリル及びアジド基から選択され、式中、IG’及びIG’’は、同一又は異なって、それぞれ式IGの基を表す。
【０２０３】
Nu’は好ましくは、-OH、-SH及び-NH2基から選択される。
【０２０４】
Cycは好ましくは、基
【０２０５】
【化１８】
2015510877.tif 000019
【０２０６】
及び
【０２０７】
【化１９】
2015510877.tif 000020
【０２０８】
から選択される。
【０２０９】
Halは好ましくは塩素原子である。
【０２１０】
AHは好ましくは、少なくとも1個のフッ素原子で置換されたフェニル基である。
【０２１１】
光反応性基は、好ましくは以下から選択される：
（a）少なくとも1個の式-N3の基によって置換されており、1個以上のハロゲン原子によって任意選択で更に置換されていてもよい、C6-10アリール基；
（b）ベンゾフェノン基；
（c）式-C（O）C（N2）CF3の基；及び
（d）式-PhC（N2）CF3の基（式中、Phはフェニル基を示す）。
【０２１２】
nは好ましくは1又は2であり、最も好ましくは1である。
【０２１３】
本明細書で使用する場合、基IGは化学的不活性基（chemically inert group）である。典型的には、IGは、非置換であるか、又はハロゲン原子及びスルホン酸基から選択される1つ以上の置換基で置換されている、C1-20アルキル基、C2-20アルケニル基又はC2-20アルキニル基である部分を表し、式中、（a）0、1又は2個の炭素原子は、C6-10アリーレン、5〜10員のヘテロアリーレン、C3-7カルボシクリレン及び5〜10員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置き換えられており、且つ（b）0、1又は2個の-CH2-基は、-O-、-S-、-S-S-、-C（O）-及び-N（C1-6アルキル）-基から選択される基によって置き換えられており、式中、
（i）該アリーレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか、又はハロゲン原子並びにC1-6アルキル、C1-6アルコキシ、C1-6アルキルチオール、-N（C1-6アルキル）（C1-6アルキル）、ニトロ及びスルホン酸基から選択される1つ以上の置換基によって置換されており；且つ
（ii）該カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基中の0、1又は2個の炭素原子は、-C（O）-基によって置き換えられている。
【０２１４】
IGは好ましくは、非置換のC1-6アルキル基、C2-6アルケニル基又はC2-6アルキニル基である部分を表し、式中、（a）0又は1個の炭素原子は、フェニレン、5〜6員のヘテロアリーレン、C5-6カルボシクリレン及び5〜6員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置き換えられており、該フェニレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか、又はハロゲン原子並びにC1-4アルキル及びC1-4アルコキシ基から選択される1又は2つの置換基によって置換されており、且つ（b）0、1又は2個の-CH2-基は、-O-、-S-及び-C（O）-基から選択される基によって置き換えられている。
【０２１５】
より好ましくは、IGは、非置換のC1-6アルキル基である部分を表し、式中、（a）0又は1個の炭素原子は、非置換のフェニレン、5〜6員のヘテロアリーレン、C5-6カルボシクリレン及び5〜6員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置き換えられている。
【０２１６】
最も好ましくは、IGは、非置換のC1-6アルキル基を表す。
【０２１７】
好ましくは、nは1又は2であり、最も好ましくは、nは1である。好ましい一実施態様において、n及びmは、共に1に等しい（すなわち、リンカー部分は、単一のカーゴ部分を有し、いずれの反応性基Zも有さず、従って、化学修飾抗体がコンジュゲートを構成することを意味する）。別の好ましい実施態様において、nは1であり、mは0である（すなわち、リンカー部分は、いずれのカーゴ部分も有さないが、化学修飾抗体をカーゴ部分での機能化に適したものとする反応性基Zを有する）。
【０２１８】
本発明の別の好ましい側面において、反応性基Zは、カーゴ部分を導入するためのその後の機能化が、周知（且つ科学文献で広く報告されている）の「クリック」ケミストリーに従って進むよう選択される。「クリック」ケミストリーは、実施が簡単で、高い収率を有し、精製を全く必要としないか又は最低限の精製のみを必要とし、且つ保護工程を必要とすることなく多様な構造をつなぐのに万能である、強力な連結反応の基を包含する。本発明で利用できるクリック反応を記載した代表的な論文の一つは、「C.D Hein, X.-M. Liu and D. Wang, Pharm Res 2008 25（10）2216-2230」である（その内容は、その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【０２１９】
「クリック」反応は、例えば、アルキンのアジドに対するヒュスゲン1,3-双極子環化付加反応を介して起こる。従って、特に好ましい反応性基Zには、アジド基-N3及びアルキン基-C≡CHも含まれる。当業者ならば容易に理解するように、かかる反応性基は、クリック反応を実施するために理想的に適している。特に好ましい実施態様において、化学修飾抗体は、2つの反応性基Zを含み、そのうち1つがアジド基N3であり、他方がアルキン基-C≡CHである。これにより、任意の2つの所望のカーゴ部分を導入するために2つのオルトゴナルなクリック反応を用いて、化学修飾抗体の二重機能化が容易に可能となる。
【０２２０】
好ましくは、本発明の化学修飾抗体において、前記式（IB）の鎖間架橋部分の少なくとも1つはそれぞれ、同一又は異なって、式（IB’）：
【０２２１】
【化２０】
2015510877.tif 000021
【０２２２】
（式中、
-  RA及びRBは、互いに独立して、（i）化学的不活性基、（ii）カーゴ部分又は（iii）リンカー部分であって、該リンカー部分は、任意選択で、少なくとも1つのカーゴ部分と連結されてよく；且つ
-  SA及びSBは、前記化学修飾抗体の異なる鎖に結合する硫黄原子である）
部分である。
【０２２３】
通常、前記式（IB）の鎖間架橋部分の少なくとも1つはそれぞれ同一である。前記式（IB）の鎖間架橋部分の少なくとも1つがそれぞれ同一である化学修飾抗体は合成が容易である。しかし、式（IB）の鎖間架橋部分が異なるものも可能である。これは例えば、その対応する抗体から化学修飾抗体を合成する間に、複数の異なる試薬を用いることによって達成できる。
【０２２４】
「化学的不活性基」RA及び／又はRBは、典型的には水素ではない。さらに、「化学的不活性基」とは、本発明の化学修飾抗体が製造される反応条件下、反応しない（すなわち、反応に影響されやすくない）基を意味する。例えば、化学的不活性基は、対応する鎖間架橋試薬が抗体と反応して所望のジスルフィド架橋を達成する場合、それ自体は反応に影響されやすい（崩壊に影響されやすいことも含む）ものでない。さらに、化学的不活性基は、典型的には、化学不活性基ではない基RA又はRB上に含まれるリンカー部分で反応が達成される場合にも、それ自体は反応に影響されやすいものでない。
【０２２５】
典型的には、基RA及びRBのうち多くて1つが化学的不活性基である。好ましくは、RAとRBのいずれも化学的不活性基ではなく、すなわち、RA及びRBは、互いに独立して、（ii）カーゴ部分又は（iii）リンカー部分（該リンカー部分は、任意選択で、少なくとも1つのカーゴ部分と連結されてよい）のいずれかである。RA及び／又はRBが化学的不活性基である場合、化学的不活性基は、好ましくは、本明細書で定義したとおりの基IGである。
【０２２６】
式（IB’）の鎖間架橋部分は、以下のいずれかを構成してよいことが理解されるだろう：（a）化学修飾抗体のさらなる機能化をもたらすのに適した化学反応性部分、又は（b）カーゴ部分を有し、それにより、化学修飾抗体をバイオコンジュゲート構築物とする部分。具体的には、RA及びRBが、化学的不活性基、又はカーゴ部分と連結されないリンカー部分である場合（典型的には、RA及びRBのうち多くて1つが化学的不活性基である）には、式（IB’）の鎖間架橋部分は、部分（a）を構成する。さらに、RA及びRBの少なくとも1つが、カーゴ部分、又は少なくとも1つのカーゴ部分と連結されたリンカー部分である場合には、式（IB’）の鎖間架橋部分は、部分（b）を構成する。
【０２２７】
式（IB’）の鎖間架橋部分に関連して使用される場合、用語「カーゴ部分」及び「リンカー部分」は、本明細書の他の箇所で定義したとおりである（例えば、基Rを参照）。当業者ならば、カーゴ部分及びリンカー部分はともに、化学修飾抗体の意図する機能に従い、慣用的に選択できることを容易に理解するだろう。
【０２２８】
好ましい実施態様において、本発明の化学修飾抗体は、少なくとも1つのカーゴ部分、例えば、式（IB）の鎖間架橋部分それぞれに結合される少なくとも1つのカーゴ部分（例えば、1つ又は2つ、好ましくは2つのカーゴ部分）を含む。特に好ましい実施態様において、式（IB）の鎖間架橋部分はそれぞれ、少なくとも1つのカーゴ部分（例えば、2つのカーゴ部分）を含む式（IB’）の鎖間架橋部分である。この実施態様において、化学修飾抗体は、抗体と少なくとも1つのカーゴ部分とを共に含むため、コンジュゲートを構成する。
【０２２９】
現在特に好ましい一実施態様において、式（IB）の鎖間架橋部分を含む化学修飾抗体における少なくとも1つ（例えば、1つ）のカーゴ部分は薬物部分である。この実施態様において、化学修飾抗体は、「抗体-薬物コンジュゲート」又は「ADC」であることが理解されよう。好ましい薬物部分には、本明細書の他の箇所にすでに記載したもの（例えば、本明細書に記載の細胞毒性剤）が含まれる。
【０２３０】
特に好ましい実施態様において、式（IB’）の鎖間架橋部分は、少なくとも2つ（例えば、2つ）のカーゴ部分を含む。例えば、式（IB’）の鎖間架橋部分は、薬物部分とイメージング剤の両方を含んでよい。この実施態様において、好ましくは、式RAが前記薬物部分を含み、RBが前記イメージング剤を含む。
【０２３１】
代替的な実施態様において、本発明の化学修飾抗体は、いずれのカーゴ部分も含まない。例えば、この化学修飾抗体において、式（IB）の鎖間架橋部分はそれぞれ、いずれのカーゴ部分も含まない式（IB’）の鎖間架橋部分であってよい。この実施態様において、化学修飾抗体は、コンジュゲートではないが、所定の用途のために関心のあるカーゴ部分を導入するために、さらなる化学的機能化の影響を受けやすい。
【０２３２】
合成方法
本発明者らは、抗体の選択的な化学修飾が、鎖間架橋試薬を抗体と反応させる反応条件を適切に調節することにより達成できることを発見した。
【０２３３】
「選択的」化学修飾（化学修飾抗体を「選択的に」製造するためのプロセスにおいても同様）とは、所望の位置に所望の数の鎖間架橋部分を導入するような方法で抗体の化学修飾を達成することを意味する。鎖間架橋部分の所望の数は、鎖間架橋部分により置き換えられるべき、抗体に存在する鎖間ジスルフィド架橋の数に相当する。所望の位置は、置き換えられるべき前記鎖間ジスルフィド架橋の位置に相当する（例えば、2つの重鎖の架橋、又は重鎖と軽鎖の架橋）。
【０２３４】
「選択的」化学修飾は、「非選択的」化学修飾（抗体上に導入される鎖間架橋部分の数及び位置がコントロールされておらず、従って、異なる数及び／又は位置の鎖間架橋部分を有する抗体を含む、生成物の不均一混合物がもたらされる）と対比され得る。
【０２３５】
「選択的」化学修飾は、所望の位置に所望の数の鎖間架橋部分のみを含む、純粋な化学修飾抗体が得られることを意味するものでないことが強調されるべきである。合成プロセスは、それにより、所望の特定の数及び位置の鎖間架橋部分を有する本発明の化学修飾抗体が過密にもたらされる限り、「選択的」である。言い換えれば、「選択的」化学修飾は、本明細書で定義するような本発明の例示的組成物、例えば、本発明の1つ以上の化学修飾抗体AB（特定の抗原AGに特異的に結合することができる）を含む組成物であって、該1つ以上の化学修飾抗体のうち特定の化学修飾抗体が、該1つ以上の化学修飾抗体全体量の少なくとも30重量％（例えば、該化学修飾抗体全体量の少なくとも40重量％、より好ましくは少なくとも50重量％、最も好ましくは少なくとも60重量％、例えば少なくとも90重量％）の量で存在する組成物を提供するプロセスを構成する。
【０２３６】
一般に、本発明のプロセスは、化学修飾抗体を選択的に製造するためのプロセスであり、還元剤の存在下、抗体の少なくとも1つの鎖間ジスルフィド架橋を還元する工程と、式（IIA）又は（IIB）
【０２３７】
【化２１】
2015510877.tif 000022
【０２３８】
（式中、X及びYは、それぞれ独立して、求電子性脱離基を表す）
の鎖間架橋試薬の少なくとも1つと該抗体とを反応させる工程の両方を含む。
【０２３９】
好ましくは、X及びYは、それぞれ独立して、ハロゲン原子又は基-SR1、-OR1、-NR1R2、-SeR1、-SO2R1、-SO2OR1、-SO2NR1R2、-SOR1、-CN、-C（H）（COOR1）（COOR2）若しくは-P（O）OR1R2R3（式中、R1、R2及びR3は、独立して、水素原子並びにC1-6アルキル、5〜10員のヘテロシクリル、C6-10アリール及びC3-7カルボシクリル基から選択される）を表す。
【０２４０】
より好ましくは、X及びYは、それぞれ独立して、ハロゲン原子又はC1-6アルキルチオール、5〜10員のヘテロシクリルチオール、C6-10アリールチオール若しくはC3-7カルボシクリルチオール基を表す。
【０２４１】
最も好ましくは、X及びYは、それぞれ独立して、ハロゲン原子を表し、例えば、X及びYはそれぞれ塩素又は臭素原子である。
【０２４２】
「抗体の少なくとも1つの鎖間ジスルフィド架橋を還元する」ことへの言及は、鎖間架橋部分と置き換えることが所望される鎖間ジスルフィド架橋のそれぞれを還元することを意味することが理解されよう。例えば、所望の生成物が2つの鎖間架橋部分を含む場合、プロセスは、2つの鎖間ジスルフィド架橋を還元する工程を含む。
【０２４３】
現在好ましい還元剤としては、2-メルカプトエタノール、トリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン、ジチオスレイトール及びベンゼンセレノールが挙げられる。しかし、ジスルフィド結合を還元することができる他の還元剤、例えば、他のホスフィン、セレノール又はチオール試薬なども使用してよい。
【０２４４】
いくつかの実施態様において、還元剤の存在下、抗体の少なくとも1つの鎖間ジスルフィド架橋を還元する工程、及び式（IIA）又は（IIB）の鎖間架橋試薬の少なくとも1つと該抗体を反応させる工程は、単一の合成工程で実施される。「単一の合成工程」により、還元剤の存在下、抗体の少なくとも1つの鎖間ジスルフィド架橋を還元することにより形成される任意の中間生成物を単離することなく、還元剤と、式（IIA）又は（IIB）の鎖間架橋試薬とが、反応混合物に添加される。
【０２４５】
還元剤の存在下、抗体の少なくとも1つの鎖間ジスルフィド架橋を還元する工程と、式（IIA）又は（IIB）の鎖間架橋試薬の少なくとも1つと該抗体を反応させる工程とを単一の合成工程で実施する場合、還元剤、及び式（IIA）又は（IIB）の鎖間架橋試薬は、反応混合物に同時に添加されてよい。或いは、還元剤を最初に添加し、式（IIA）又は（IIB）の鎖間架橋試薬をその後（例えば、0.5〜5時間後）添加してもよい。
【０２４６】
別の実施態様において、還元剤の存在下、抗体の少なくとも1つの鎖間ジスルフィド架橋を還元する工程、及び式（IIA）又は（IIB）の鎖間架橋試薬の少なくとも1つと該抗体を反応させる工程は、別々の合成工程で実施される。「別々の合成工程」とは、第一の工程にて、抗体の少なくとも1つの鎖間ジスルフィド架橋の還元を達成するために還元剤を添加した後、過剰な還元剤を除去し、その後、第二の工程において、中間生成物を少なくとも1つの鎖間架橋試薬と反応させることを意味する。好ましくは、第二の工程の直前に、中間生成物を1〜48時間（例えば12〜36時間、例えば約24時間）の期間、インキュベートする；本発明者らは、かかる「平衡（equilibration）」期間が、特定の所望の数の鎖間架橋部分を生産するよう、最終生成物の分布にバイアスをかける助けとなり得ることを発見した。
【０２４７】
還元剤と、式（IIA）又は（IIB）の鎖間架橋試薬との相対的比率は、所望の化学修飾抗体の収率を増加させるために調節することもできる。還元剤と式（IIA）又は（IIB）の鎖間架橋試薬との典型的な比率（モルによる）は、1：5〜5：1（例えば、1：3〜3：1、例えば、1：2〜2：1）である。
【０２４８】
同様に、抗体に対する、還元剤、及び式（IIA）又は（IIB）の鎖間架橋試薬のモル当量数は、所望の化学修飾抗体の収率を増加させるために調節することができる。抗体に対する還元剤の典型的なモル当量は、2〜100、例えば5〜50である。抗体に対する式（IIA）又は（IIB）の鎖間架橋試薬の典型的なモル当量は、2〜100、例えば5〜50である。
【０２４９】
さらに、2以上の還元剤を使用して本発明のプロセスを実施することが可能である。例えば、還元剤の存在下、抗体の少なくとも1つの鎖間ジスルフィド架橋を還元する工程と、式（IIA）又は（IIB）の鎖間架橋試薬の少なくとも1つと該抗体を反応させる工程とを単一の合成工程で実施する場合、複数の還元剤を、式（IIA）又は（IIB）の鎖間架橋試薬とともに同時に添加してよく、或いは複数の還元剤を段階的に添加した後、式（IIA）又は（IIB）の鎖間架橋試薬を添加してもよい。同様に、還元剤の存在下、抗体の少なくとも1つの鎖間ジスルフィド架橋を還元する工程と、式（IIA）又は（IIB）の鎖間架橋試薬の少なくとも1つと該抗体を反応させる工程とを別々の合成工程で実施する場合、過剰な還元剤を除去する工程の前に、複数の還元剤を同時に添加してよく、或いは異なる還元剤を段階的に添加してよい。
【０２５０】
本明細書で提供する実施例により、本発明の合成方法が、所望の数及び位置の鎖間架橋部分を有する本発明の化学修飾抗体を製造する能力をさらに実証する。
【０２５１】
式（IIA）又は（IIB）
【０２５２】
【化２２】
2015510877.tif 000023
【０２５３】
の鎖間架橋試薬は、本発明の化学修飾抗体に存在する式（IA）又は（IB）部分の（対応する）鎖間架橋部分と構造が近似することが理解されるだろう。還元された鎖間ジスルフィド架橋を有し、それゆえ2つの遊離チオール基を含む抗体は、鎖間架橋試薬の3位及び4位での各チオール基の攻撃により鎖間架橋試薬と反応でき、同時に求電子性脱離基X及びYを失うと考えられる。これにより、元の抗体に存在する対応する鎖間ジスルフィド架橋の代わりとして式（IA）又は（IB）の鎖間架橋部分を介して、抗体が「再架橋」することができる。
【０２５４】
好ましくは、式（IIA）の鎖間架橋試薬は、1位の窒素原子に結合する基R（本明細書で定義するとおり）を有する（すなわち、式（I’）の架橋部分と同様）。言い換えれば、式（IIA）の鎖間架橋試薬は、好ましくは、式（IIA’）：
【０２５５】
【化２３】
2015510877.tif 000024
【０２５６】
を有する。
【０２５７】
好ましくは、式（IIB）の鎖間架橋試薬は、それぞれ、2位及び1位の窒素原子に結合する基RA及びRB（本明細書で定義するとおり）を有する（すなわち、式（IB’）の架橋部分と同様）。言い換えれば、式（IIB）の鎖間架橋試薬は、好ましくは、式（IIB’）：
【０２５８】
【化２４】
2015510877.tif 000025
【０２５９】
を有する。
【０２６０】
本発明者らは、抗体の鎖間ジスルフィド結合と、式（IIB）の架橋試薬内のX-=-Y部分との間の架橋反応が、2位及び1位の窒素原子が単に水素原子と結合するのではない場合（例えば、それらが、式（IIB’）と同様に、基RA及びRBと代わりに結合する場合）に、非常に効率的に進行することを発見した。これは、1位及び2位にて非機能化又は一機能化のいずれかである場合、ピリダジンジオン環の擬芳香族特性と、それによる求核攻撃への相対的な不応性に起因し得ると考えられる。これは、1位のN原子に結合する非水素基の存在を、良好な架橋反応性を達成するために必要としないマイレイミド系架橋試薬の反応性挙動と対照的である。
【０２６１】
本発明の製造プロセスにおいて、標的生成物の均一性（すなわち純度）は、所望する場合、さらなる工程、すなわち、前記化学修飾抗体（又は、プロセスが化学修飾抗体断片の製造に関する場合には抗体断片）をその後精製する工程を実施することにより、さらに増加させることができる。好ましくは、前記化学修飾抗体（又は抗体断片）をその後精製する工程は、化学修飾抗体（又は抗体断片）のクロマトグラフィー精製を達成すること、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、イムノアフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー又は疎水性相互作用クロマトグラフィーを達成することを含む。この任意の精製工程により、典型的には、元の生成物混合物中に存在し得る任意の他の化学修飾抗体（又は抗体断片）に対して、前記化学修飾抗体（又は抗体断片）の相対量が増加する。
【０２６２】
本発明はまた、式（IA）又は（IB）の鎖間架橋部分により抗体の1つ以上の鎖間ジスルフィド結合を選択的に置き換えることを介して、抗体の選択的化学修飾を達成するための、式（IIA）又は（IIB）の鎖間架橋試薬の使用も提供する。
【０２６３】
「選択的な置き換え」とは、抗体の所望の位置に存在する所望の数の鎖間ジスルフィド結合を置き換えることを意味する。前記鎖間ジスルフィド結合（単数又は複数）は、式（IA）又は（IB）の鎖間架橋部分によって置き換えられる。前記使用は、化学修飾抗体を製造するための本発明のプロセスを実施することを含んでよい。
【０２６４】
式（IA）の鎖間架橋部分の開環
本発明はさらに、式（III）
【０２６５】
【化２５】
2015510877.tif 000026
【０２６６】
の鎖間架橋部分を少なくとも1つ含む化学修飾抗体を提供する。
【０２６７】
式（III）の鎖間架橋部分は、式（IA）の鎖間架橋部分と近似した化学構造をことが理解されるだろう。具体的には、これは、式（IA）の鎖間架橋部分の加水分解生成物である。
【０２６８】
従って、式（III）の鎖間架橋部分を少なくとも1つ含む化学修飾抗体は、式（IA）の鎖間架橋部分を少なくとも1つ含む化学修飾抗体の加水分解、ひいては開環を達成することにより容易に製造することができる。前記加水分解は、マレイミド化合物をマレアミド酸（maleaimic acid）化合物に加水分解するための公知技術（例えば、Machida et al., Chem. Pharm. Bull. 1977 24 2739、及びRyan et al. Chem. Commun. 2011 47 5452を参照）を用いて容易に達成することができる。適した1つの方法は、式（IA）の鎖間架橋部分を少なくとも1つ含む対応する化学修飾抗体を、0〜50℃（例えば、20〜40℃）の温度にて、穏やかな塩基性水性条件（例えば、pH=7.1以上、例えば、7.2〜10）に供することである。任意の塩基又は塩基性バッファー溶液を用い得る。LiOHは適した一例である。pH=7.4のPBSバッファー溶液も有効である。
【０２６９】
疑義を回避するため、本明細書において教示する、式（IA）の鎖間架橋部分を少なくとも1つ含む化学修飾抗体の好ましい側面は、式（III）の鎖間架橋部分を少なくとも1つ含む化学修飾抗体の好ましい側面として理想的に適合することを強調する。言い換えれば、式（IA）の鎖間架橋部分を少なくとも1つ含む化学修飾抗体に関して説明するような、抗体の架橋部分の好ましい数及び位置、好ましい抗体、並びに好ましい追加のカーゴ部分及びリンカー部分は、式（III）の鎖間架橋部分を少なくとも1つ含む化学修飾抗体の好ましい側面として理想的に適合する。
【０２７０】
さらに、式（III）の架橋部分の1位の窒素は、式（IA）の架橋部分の1位の窒素と対応することが理解されるだろう。結果として、式（IA）の架橋部分の1位に結合されてよい基Rは、式（III）の架橋部分の1位に理想的に結合されてよく、本明細書に記載するような該基Rの好ましい実施態様が、式（III）の架橋部分との関連でそのまま適用できる。言い換えれば、式（III）の好ましい架橋部分は、式（III’）：
【０２７１】
【化２６】
2015510877.tif 000027
【０２７２】
（式中、Rは、本明細書で定義したとおりである）
を有する。
【０２７３】
式（III）の鎖間架橋部分を少なくとも1つ含む化学修飾抗体を得るために開環を達成することの利点の1つは、式（III）の鎖間架橋部分は、式（IA）の鎖間架橋部分よりも、抗体からさほど容易に切断可能でないことである。
【０２７４】
抗体断片への原理の適用
本発明の原理は、抗体断片の選択的化学修飾を達成するためにも容易に適用可能である。
【０２７５】
従って、一側面において、本発明は、化学修飾抗体断片ABFに関する。式（IAF）又は（IBF）の鎖間架橋部分は、その硫黄原子SAF及びSBFが化学修飾抗体断片の異なる鎖に結合する（化学修飾（完全（full））抗体の異なる鎖とは対照的に）ことを除き、式（IA）又は（IB）の鎖間架橋部分と同一である。その結果、式（IA）又は（IB）の鎖間架橋部分の好ましい構造的特徴（例えば、式（IA）の1位の窒素に結合されてよい基Rの正体、並びに式（IB）の2位及び1位の窒素に結合される基RA及びRBの正体など）は全て、式（IAF）又は（IBF）の鎖間架橋部分の好ましい構造的特徴でもある。特に、式（IAF）の好ましい鎖間架橋部分は、式（IAF’）：
【０２７６】
【化２７】
2015510877.tif 000028
【０２７７】
（式中、Rは本明細書で定義したとおりである）
を有する。
【０２７８】
さらに、式（IBF）の好ましい鎖間架橋部分は、式（IBF’）：
【０２７９】
【化２８】
2015510877.tif 000029
【０２８０】
（式中、RA及びRBは、本明細書で定義したとおりである）
を有する。
【０２８１】
化学修飾抗体断片ABFは、前記式（IAF）又は（IBF）の鎖間架橋部分の少なくとも1つを介して重鎖が軽鎖に架橋されるscFv抗体断片であってよい。
【０２８２】
或いは、化学修飾抗体断片ABFは、前記式（IAF）又は（IBF）の鎖間架橋部分の少なくとも1つを介して重鎖が軽鎖に架橋されるFAB抗体断片であってよい。
【０２８３】
式（IBF）の鎖間架橋部分を少なくとも1つ含む化学修飾抗体断片ABFを提供することの重要な利点の一つは、それが、（a）該化学修飾抗体断片の異なる鎖に結合される硫黄原子SAF及びSBFの架橋と、（b）少なくとも2つ（例えば2つ）のカーゴ部分を用いた該抗体断片の機能化とを同時に行う特に容易な手段を提供することである。具体的には、前記式（IBF）の鎖間架橋部分は、式（IBF）の架橋部分の1位の窒素原子を介して第一のカーゴ部分と連結され、2位の窒素原子を介して第二のカーゴ部分と連結されてよい。
【０２８４】
特に好ましい実施態様において、前記第一のカーゴ部分は薬物又はイメージング剤であり、前記第二のカーゴ部分は半減期延長剤である（これらのカーゴ部分及びその好ましい実施態様は、本明細書の他の箇所で定義するとおりである）。より具体的には、式（IBF’）において、RAが前記半減期延長剤を含み、RBが前記薬物又はイメージング剤を含む。かかる化学修飾抗体断片は、薬物／イメージング剤構成要素の存在のためにADCと考えることができ、これは、潜在的に、特に高い商業的価値がある。これは、抗体断片（例えば、scFV又はFab断片）が、細菌宿主（完全抗体と同様に、哺乳動物細胞において発現されるべきものよりも）において非常に高い産生量で発現可能だからである。しかしながら、治療及び診断的適用において、抗体断片の使用に伴う進行中の問題の一つは、それらが血流において急速に排除される傾向にあることである。従って、この特に好ましい本発明の化学修飾抗体断片では、その根底にある断片を細菌宿主において容易に産生するという利点にアクセス可能である一方、半減期延長剤の存在を介して、その根底にある断片のin vivoクリアランスの問題を緩和することができる。
【０２８５】
本発明の化学修飾抗体断片は、化学修飾抗体を製造するために適用される合成方法と同一の方法を用いて製造してよいが、抗体試薬を適切な抗体断片試薬に置き換えるよう適合される。改めて、化学修飾抗体を製造するためのプロセスの好ましい側面は、化学修飾抗体断片を製造するためのプロセスの好ましい側面でもある。本発明者らは、本発明の合成方法により、抗体断片中の鎖内ジスルフィド架橋と、存在し得る任意の他の（非標的）鎖間ジスルフィド架橋との両方に対して、標的鎖間ジスルフィド架橋を選択的に置き換えることができることを発見した。
【０２８６】
典型的には、化学修飾scFv抗体断片が製造されるべき場合、scFv抗体断片試薬は、抗体断片の重鎖と軽鎖との間にジスルフィド結合（例えば、人為的に導入されたジスルフィド結合）を含むものである。
【０２８７】
同様に、式（IAF）の鎖間架橋部分の少なくとも1つは、式（IIIF）の鎖間架橋部分の少なくとも1つを生成するために開環され得る。マレイミドの開環を達成するための方法は、本明細書の他の箇所で述べたとおりである。式（IIIF）の好ましい鎖間架橋部分は、式（IIIF’）：
【０２８８】
【化２９】
2015510877.tif 000030
【０２８９】
（式中、Rは本明細書で定義したとおりである）
を有する。
【０２９０】
適用
当業者に明らかなとおり、本発明の方法論、並びに化学修飾抗体及び抗体断片は、抗体及び抗体断片の化学修飾に依存する、全ての実用的な適用に広く適用可能である。典型的には、機能化抗体を伴う従来のプロセス及び方法は、本発明で利用される鎖間架橋部分を組み込むことにより、直接に修正され得る。有利には、これらの鎖間架橋部分を組み込んだ化学修飾抗体及び抗体断片は、従来法におけるものよりも不均一性が低い。さらに、後に化学修飾の基礎として役立ち得る人工残基を導入するための突然変異誘発合成工程を達成することを通常必要としない。その上、本明細書に記載の鎖間架橋部分は、天然抗体又は抗体断片の構造的完全性及び機能性を保持することを保証する。
【０２９１】
慣用的プロセスの例として、抗原AGを検出するためのプロセス、生物学的精製プロセス、及び物質がかかる化合物と相互作用するか否かを同定するためのアッセイプロセスが挙げられる。かかるプロセスとして、ELISA（「酵素結合免疫吸着検定法」）プロセス、LAB（「標識アビジン−ビオチン」）アッセイプロセス、BRAB（「架橋アビジン−ビオチン」）アッセイプロセス、ABC（「アビジン−ビオチンコンプレックス」）アッセイプロセス、及びFRET（「フェルスター共鳴エネルギー移動」）アッセイが挙げられる。
【０２９２】
しかしながら、本発明の生成物に対する特に好ましい適用の一つは、治療及び診断である。本明細書の他の箇所で説明するように、抗体及び抗体断片は、標的抗原AGに特異的に結合する能力を有する。この能力は、具体的には、関心のある標的抗原（例えば、癌細胞などの関心のある細胞表面上に発現する標的抗原）に特異的に結合する抗体又は抗体断片に診断又は治療的有用性のあるカーゴ部分をコンジュゲートすることによって、該カーゴ部分をin vivoで所望の位置に向かわせるために活用できる。特に好ましい一実施態様において、化学修飾抗体又は抗体断片は、臨床的意義のある抗原（例えば、癌細胞上に発現する抗原）に特異的に結合することができ、該化学修飾抗体又は抗体断片は、検出可能な部分又は薬物（例えば、細胞毒性薬）である少なくとも1つのカーゴ部分をさらに有する。
【０２９３】
従って、本発明は、以下を含む医薬組成物も提供する：（i）薬物又は診断剤（好ましくは薬物、より好ましくは細胞毒性剤）である少なくとも1つのカーゴ部分を含む、本発明の化学修飾抗体（又は抗体断片）；及び（ii）医薬上許容可能な希釈剤又は担体。好ましくは、前記構成要素（i）はADC、すなわち抗体-薬物コンジュゲート（ここで、本明細書で定義する「ADC」は、抗体又は抗体断片のいずれかを含んでよい）である。
【０２９４】
特定の一側面において、本発明は、対象における癌の発生を改善又は低下させる方法であって、細胞毒性剤である少なくとも1つのカーゴ部分を含む本発明の化学修飾抗体（又は抗体断片）の有効量を前記対象に投与する工程を含み、ここで、化学修飾抗体（又は抗体断片）が癌と関連する抗原AG（例えば、癌細胞の表面上に発現し、且つ／又は本明細書の他の箇所に記載の特定の抗原の一つに特異的に結合できる、抗原）に特異的に結合できる、方法を提供する。
【０２９５】
本発明はまた、治療によりヒト若しくは動物の身体を治療する方法において使用するため、又はヒト若しくは動物の身体に対して実施される診断方法で使用するための、薬物又は診断剤（好ましくは薬物、より好ましくは細胞毒性剤）である少なくとも1つのカーゴ部分を含む本発明の化学修飾抗体（又は抗体断片）を提供する。
【０２９６】
さらに、本発明は、癌の治療方法において使用するための、細胞毒性剤である少なくとも1つのカーゴ部分を含む本発明の化学修飾抗体（又は抗体断片）であって、該化学修飾抗体（又は抗体断片）が癌と関連する抗原AG（例えば、癌細胞の表面上に発現し、且つ／又は本明細書の他の箇所に記載の特定の抗原の一つに特異的に結合できる、抗原）に特異的に結合できるものを提供する。
【０２９７】
本発明の医薬組成物は、獣医用又はヒト用投与に適している。
【０２９８】
本発明の医薬組成物は、組成物が患者に投与されることを可能とする任意の形態であり得る。組成物は、例えば、固体又は液体の形態であってよい。典型的な投与経路としては、非経口、眼内、腫瘍内が挙げられるが、これらに限定されない。非経口投与としては、皮下注射、静脈内、筋内又は胸骨内（intrasternal）注射又は注入技術が挙げられる。一側面において、組成物は非経口投与される。特定の実施態様において、組成物は静脈内投与される。
【０２９９】
組成物は、1つ以上の投薬単位の形態（例えば、錠剤は単回投薬単位であり得る）をとり得、液体形態において本発明の化合物の容器は、複数回の投薬単位を保持し得る。
【０３００】
医薬組成物の調製時に使用される材料は、好ましくは、使用される量で非毒性である。当業者には、医薬組成物中の活性成分の最適な用量は、様々な因子によって決まることが明らかであろう。関連する因子としては、動物タイプ（例えば、ヒト）、本発明の化合物の特定の形態、投与様式及び用いられる組成物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３０１】
医薬上許容される希釈剤又は担体は、該組成物が、例えば、錠剤又は粉末形態であるように、固体又は粒子状物質であり得る。担体は液体であり得る。さらに、担体は粒子状物質であり得る。
【０３０２】
医薬組成物は、液体形態、例えば、溶液、エマルジョン又は懸濁液の形態であり得る。注射により投与するための組成物において、1つ以上の界面活性剤、保存料、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、バッファー、安定剤及び等張剤も含まれ得る。
【０３０３】
液体医薬組成物は、それらが溶液、懸濁液又は他の類似の形態であるかに関わらず、以下の1つ以上も含み得る；滅菌希釈剤、例えば、注射用水、食塩水、好ましくは生理食塩水、リンガー液、等張性塩化ナトリウム、溶媒或いは懸濁化媒質として役立ち得る合成モノグリセリド又はジグリセリドなどの固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、シクロデキストリン、プロピレングリコール又は他の溶媒；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコール又はメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸；バッファー、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩又はアミノ酸、及び塩化ナトリウム又はデキストロースなどの張性を調整するための物質。非経口組成物は、ガラス、プラスチック又は他の材料で作製されたアンプル、使い捨てシリンジ又は複数回用量のバイアルに封入され得る。生理食塩水は例示的アジュバントである。注射可能な組成物は好ましくは滅菌である。
【０３０４】
特定の障害又は状態の治療に効果的な化学修飾抗体又は抗体断片の量は、該障害又は状態の性質によって決まり、標準的臨床技術によって決定され得る。さらに、in vitro又はin vivoアッセイは、最適な用量範囲の同定を助けるために任意選択で用いられ得る。組成物で用いられる正確な用量は、投与経路、及び疾患又は障害の重篤度にも依存し、医師の判断及び各患者の環境に応じて決定されるべきである。
【０３０５】
組成物は、適切な用量が得られるように、有効量の化学修飾抗体又は抗体断片を含む。典型的には、この量は、組成物の少なくとも約0.01重量％の化合物化学修飾抗体又は抗体断片である。例示的実施態様において、医薬組成物は、非経口用量単位が、約0.01重量％〜約2重量％の化学修飾抗体又は抗体断片を含むように調製される。
【０３０６】
静脈内投与のために、組成物は、患者の体重1 kg当たり、約0.01〜約100 mgの化学修飾抗体又は抗体断片を含み得る。一側面において、組成物は、患者の体重1 kg当たり、約1〜約100 mgの化学修飾抗体又は抗体断片を含み得る。別の側面において、投与量は、体重1 kg当たり、約0.1〜約25 mgの化学修飾抗体又は抗体断片の範囲である。
【０３０７】
通常、患者に投与される化学修飾抗体又は抗体断片の用量は、典型的には、患者の体重1 kg当たり、約0.01 mg〜約20 mgである。一側面において、患者に投与される用量は、患者の体重1 kg当たり、約0.01 mgと約10 mgとの間である。別の側面において、患者に投与される用量は、患者の体重1 kg当たり、約0.1 mgと約10 mgとの間である。さらに別の側面において、患者に投与される用量は、患者の体重1 kg当たり、約0.1 mgと約5 mgとの間である。さらに別の側面において、投与される用量は、患者の体重1 kg当たり、約0.1 mgと約3 mgとの間である。さらに別の側面において、投与される用量は、患者の体重1 kg当たり、約1 mgと約3 mgとの間である。
【０３０８】
化学修飾抗体又は抗体断片は、任意の簡便な経路、例えば、注入又はボーラス注射により投与され得る。投与は、全身又は局所であり得る。様々なデリバリーシステム、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、カプセルなどへのカプセル化が公知であり、これを用いて、化学修飾抗体又は抗体断片を投与することができる。ある実施態様において、2以上の化学修飾抗体又は抗体断片が患者に投与される。
【０３０９】
特定の実施態様において、1つ以上の化学修飾抗体又は抗体断片を、治療の必要がある領域に局所的に投与することが所望され得る。これは、例えば、以下により達成され得るが、これらに限定されない：手術の間の局所注入によって；局所適用、例えば、手術後の創傷包帯と共に；注射によって；カテーテルによって；又はインプラントによって（該インプラントは、シアラスティック膜のような膜、又は繊維を含む、多孔性、無孔性又はゼラチン状の材料である）。一実施態様において、投与は、癌、腫瘍、又は新生物若しくは前新生物組織の部位（又はもとの部位）への直接注射によってなされ得、別の実施態様において、投与は、自己免疫疾患の兆候の部位（又はもとの部位）への直接注射によってなされ得る。
【０３１０】
化学修飾抗体又は抗体断片は、制御放出システムでデリバリーすることができ、例えば、ポンプ又は様々なポリマー材料を用いることができる（これらに限定されない）。さらに、制御放出システムは、化学修飾抗体又は抗体断片の標的の近くに、例えば肝臓などに位置付けることができ、それゆえ全身用量の一部しか必要としない（例えば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138（1984）を参照）。Langer（Science 249：1527-1533（1990））による総説において論じられている他の制御放出システムも使用し得る。
【０３１１】
用語「担体又は希釈剤」とは、化学修飾抗体又は抗体断片と共に投与される希釈剤、アジュバント又は賦形剤をいう。かかる医薬担体は液体、例えば、水及びオイル（石油、動物、植物又は合成起源のものを含む）であり得る。担体は食塩水などであり得る。加えて、補助剤、安定化剤及び他の薬剤も使用できる。好ましくは、患者に投与される場合、化学修飾抗体又は抗体断片、及び医薬上許容される担体は、滅菌である。化学修飾抗体又は抗体断片が静脈内投与される場合、水が例示的な担体である。食塩水、並びにデキストロース及びグリセロール水溶液は、液体担体、特に注射液として用いることもできる。本発明の組成物は、所望する場合には、少量の湿潤若しくは乳化剤、又はpH緩衝剤も含み得る。
【０３１２】
本発明の組成物は、溶液、ペレット、粉末、持続放出製剤の形態、又は使用に適した任意の他の形態をとり得る。適した医薬担体の他の例は、E. W. Martinにより「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載される。
【０３１３】
化学修飾抗体又は抗体断片は、慣用的な手順に従って、動物、特にヒトへの静脈内投与に適合した医薬組成物として製剤化されてよい。典型的には、静脈内投与のための担体又はビヒクルは、滅菌等張水性緩衝液である。必要に応じて、組成物は可溶化剤も含み得る。静脈内投与のための組成物は、任意選択で、注射部位の痛みを緩和するために、リドカインなどの局所麻酔薬を含み得る。一般に、成分は、例えば、活性成分の量を示したアンプル又はサシェなどの密封コンテナ中に、凍結乾燥粉末、又は水を含まない濃縮物として単位投薬形態で別個に、又は共に混合されて提供される。化学修飾抗体又は抗体断片が注入により投与される場合、例えば、滅菌医薬品グレードの水又は食塩水を含む輸液ボトルを使用して投薬することができる。化学修飾抗体又は抗体断片が注射によって投与される場合、投与前に成分を混合することができるように、注射用滅菌水又は食塩水のアンプルが提供され得る。
【０３１４】
組成物は、固体又は液体用量単位の物理的形態を改変する様々な材料を含み得る。例えば、組成物は、活性成分の周囲にコーティングシェルを形成する材料を含み得る。該コーティングシェルを形成する材料は、典型的には不活性であり、例えば、糖、シェラック、及び他の腸溶性コーティング剤から選択され得る。或いは、活性成分は、ゼラチンカプセル中に入れることができる。
【０３１５】
固体又は液体形態であるかに関わらず、本発明の組成物は、癌の治療に使用される薬理作用のある物質を含み得る。
【０３１６】
化学修飾抗体又は抗体断片は、癌を治療するのに特に有用である（すなわち、抗体／抗体断片及びカーゴ部分（単数又は複数）のアイデンティティが、例えば、本明細書の他の箇所に記載するように、適切に選択される場合）。具体的には、化学修飾抗体又は抗体断片は、腫瘍細胞若しくは癌細胞の増殖を阻害するため、腫瘍若しくは癌細胞においてアポトーシスを引き起こすため、又は患者において癌を治療するために有用である。化学修飾抗体又は抗体断片は、動物の癌を治療するための様々な場でそれに応じて使用され得る。
【０３１７】
化学修飾抗体又は抗体断片は、腫瘍細胞又は癌細胞に治療的活性剤をデリバリーするために使用することができる。化学修飾抗体又は抗体断片で治療することができる癌のタイプの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
-  固形腫瘍（線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、結腸直腸癌、腎臓癌、膵臓癌、骨癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、口腔癌、鼻腔癌、咽頭癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、子宮癌、精巣癌、小細胞肺癌、膀胱癌、肺癌、上皮癌、神経膠腫、多形性膠芽腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、皮膚癌、黒色腫、神経芽細胞腫及び網膜芽細胞腫を含むが、これらに限定されない）；
-  血液-骨癌（急性リンパ芽球性白血病（「ALL」）、急性リンパ芽球性B細胞白血病、急性リンパ芽球性T細胞白血病、急性骨髄芽球性白血病（「AML」）、急性前骨髄球性白血病（「APL」）、急性単芽球性白血病、急性赤白血病性白血病、急性巨核芽球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性非リンパ球性白血病、急性未分化白血病、慢性骨髄性白血病（「CML」）、慢性リンパ球性白血病（「CLL」）、ヘアリーセル白血病及び多発性骨髄腫を含むが、これらに限定されない）；
-  急性及び慢性白血病、例えば、リンパ芽球性、骨髄性、リンパ球性及び骨髄球性白血病；並びに
-  リンパ腫、例えば、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンストローム型マクログロブリン血症、重鎖病及び真性赤血球増加症。
【０３１８】
本発明に従った治療の影響を受けやすい癌の更なる例は、本明細書で開示するように、本明細書において特定の抗体又は抗体断片と併せて括弧内に開示するものである。
【０３１９】
以下の実施例は本発明の範囲を限定することなく、本発明の原理をさらに説明する。
【実施例】
【０３２０】
実施例
1. 概要
1.1 方法
LCMSは、Waters Acquity Single Quad Detectorに接続したWaters Acquity UPLC［カラム、Acquity UPLC BEH C18 1.7 μm 2.1×50 mm；波長、254 nm；移動相、95：5の水（0.1％ギ酸）：MeCN（0.1％ギ酸）、4分間にわたる勾配（5：95の水（0.1％ギ酸）：MeCN（0.1％ギ酸）まで）；流速、0.6 mL/min；MSモード、ES+/-；スキャン範囲、m/z＝95 - 2000；スキャン時間、0.25 s］を用いてタンパク質サンプルに対して実施した。データは連続体モードで得た。サンプル量は30 μlであり、注入量は、パーシャルループフィル（partial loop fill）を用いて3〜9 μlであった。MSのエレクトロスプレー供給源は、3.5 kVのキャピラリー電圧及び20〜200 Vのコーン電圧で操作した。窒素を総流量600 L／hで、ネブライザー及び脱溶媒和ガスとして使用した。MassLynxソフトウェアにプレインストールされたMaxEnt 1アルゴリズムを使用して、総質量スペクトルをイオンシリーズから再構築した。
【０３２１】
MALDI-TOF分析は、MALDI micro MX（Micromass）で実施した。データは、337 nmのレーザー波長にて、12 kVの電源電圧及び5 kVのリフレクトロン電圧（該当する場合）で得た。サンプルは、以下で概要を述べるように記録した。緩衝塩は、Slide-A-Lyzer MINI透析ユニット（Thermo Scientific、2又は10 kDa MWCO）を用いて、脱イオン水に対して24時間、4℃で透析することにより分析前に除去した。全てのタンパク質は、マトリックスとの1：1混合物後、MALDIプレート上にスポットした（1：1のH2O：MeCN中、10 mg/ml）。必要に応じて、トリフルオロ酢酸（TFA、10 mg/ml）を予めスポットした。
【０３２２】
MSデータの相対的定量化は、同定可能なペプチド又はタンパク質シグナル（出発材料、生成物、副産物及び分解産物）を全て、その非修飾シグナル強度（相対的イオンカウント）に従って、100％に正規化することにより実施した。
【０３２３】
吸光度測定は、クオーツキュベット（1 cmの経路長、容量75 μl）中、温度制御された12xサンプルホルダーを備えたCarry Bio 100（Varian）UV/Vis分光光度計にて、25℃で実施した。サンプルをベースライン補正し、スリットを5 nmに設定した。タンパク質溶液を450〜250 nmでスキャンし、ランベルト・ベールの法則で、公開又は計算された（ExPASyデータべースのProtParamツールを介したアミノ酸配列に基づく；http://expasy.org/sprot/）モル吸光係数を用いて濃度を計算した。完全抗体を含む溶液の濃度は、NanoDrop装置（Thermo Scientific）にてIgGセッティングで測定（4連）し、バッファーの吸光度に対して補正した。
【０３２４】
蛍光データは、クオーツキュベット中、温度制御された4xサンプルホルダーを備えたCarry Eclipse（Varian）マシンにて、25℃で得た。ブランクバッファーをゼロ蛍光として使用した；スリットを5 nmに設定し、スキャンスピードは平均であった。吸光度スキャンを用いて、理想的な励起波長を決定し、1000 AU未満の最大蛍光シグナルを得るためにサンプル濃度を希釈した。
【０３２５】
非還元グリシン-SDS-PAGEは、標準的な実験室手順に従って実施した。20 kDa〜80 kDaのタンパク質は16％ゲルで分離し；80 kDa超のタンパク質は12％ゲルで分離した。両方のケースにおいて、4％のスタッキングゲルを使用し、ブロードレンジMWマーカー（10 kDa〜250 kDa、BioLabs）を同時に流して、タンパク質量（protein weights）を推定した。ゲルは全て、改変した文献プロトコル（Candiano et al., 2004）（0.12％のクマシーG-250及びクマシーR-250色素を、G-250色素のみの代わりに、染色溶液に添加する）に従って染色した。
【０３２６】
緩衝液は全て、2回脱イオン化した水で調製し、フィルター滅菌した。超高純度DMFはSigma-Aldrichから購入し、乾燥条件下で保存した。栓のないベンゼンセレノールのボトルはアルゴン下で保存し、溶液がオレンジ色に変化した場合に交換した。
【０３２７】
用語「処理した（processed）」抗体断片又は完全抗体とは、通常、還元剤以外の他の全ての実験条件（例えば、精製工程）を受けた、非修飾材料サンプルをいう。
【０３２８】
1.2 MALDIプロトコル
MALDI-TOF MSにより個々のタンパク質及びコンジュゲートを可視化するために適したプロトコルを開発した。
【０３２９】
表3.1：MALDI-TOF MSプロトコル。CHCA＝α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸。SA＝シナピン酸。ref+＝リフレクトロンポジティブ、ref-＝リフレクトロンネガティブ、lin-＝リニアネガティブ、lin+＝リニアポジティブ。
【０３３０】
【表１】
2015510877.tif 000031
【０３３１】
1.3 化合物ストック溶液
化学化合物及び還元試薬のストック溶液は、1〜10当量をタンパク質に添加する場合には100x濃度（標的抗体又は断片に対して）で、10当量超を添加する場合には400x又は1000x濃度とした。ベンゼンセレノール溶液は、実験の直前に調製し、再使用しなかった。ストック溶液は、24時間（4℃）より長くは保存しなかった。全てのストックは、以下を除いて、乾燥DMF中で調製し、以下はバッファーのみで調製した：N-PEG5000-ジブロモマレイミド、N-PEG5000-ジチオフェノールマレイミド、2-メルカプトエタノール、TCEP及びDTT。
【０３３２】
2. 抗CEA scFv断片の修飾
2.1 材料
抗CEAは、ヒトCEAの大部分のN末端（細胞外）Igドメインに対する単鎖抗体断片であり、低nM親和性で結合する。もとのscFvは、ファージディスプレイから単離されたマウス抗体であり、細菌（E. coli）中で大量に生産される。本研究で使用する構築物（研究内での呼称shMFELL2Cys）は、それぞれ、重鎖及び軽鎖の可変ドメインを含むヒト化バージョン（28アミノ酸置換）であり、それらはペプチドリンカーによって結合され、26.7 kDa（246アミノ酸）のMWを有する。精製を容易にするためにHis6-タグをC末端に付加し、タンパク質を安定化させるために、人為的ジスルフィド結合を抗原結合部位に正反対に導入した（G44C及びA239C）。親抗体の結晶構造が利用可能である（PDBコード：1QOK）。Dr Berend Tolner（UCL Cancer Institute）により提供された材料は、SDS-PAGE分析から推定されるとおり、90％純粋であった。
【０３３３】
2.2 抗CEA溶液の調製
抗CEAは、種々の濃度でPBS（pH 7.4）中で供給し、アリコートで-20℃にて保存した。抗体断片は、実験の前に、PBS（pH 7.4）及びDMF（最終量10％v/v、特記のない限り）中で希釈して、70.0 μM（1.87 mg/ml）の濃度とした。吸光係数ε280＝48,735 M-1cm-1を用いてタンパク質濃度を計算した。
【０３３４】
2.3 抗CEAの還元研究
抗CEAに50当量のTCEP、2-メルカプトエタノール又はDTTを2、4又は6時間添加した。反応を周囲温度で維持し、インキュベーション時間後、還元の間に生成される遊離システインをキャップするため、100当量のモノブロモマレイミドを20分間添加した。全てのサンプルをLCMSにより分析した。DTTが、この系に対する理想的還元剤であることが示された。
【０３３５】
2.4 DTTを用いた抗CEA還元の最適化
抗CEAに10又は20当量のDTTを添加し、反応物（reaction）を周囲温度で10、30、60又は90分間インキュベートした。DTTに対して2x過剰なジブロモマレイミドを20分間添加し、サンプルをLCMSにより分析した。抗体断片を、増加濃度のNaClを含むPBSバッファー中で希釈し、最終塩濃度を500 mM（137 mMの代わりに）とした高塩条件下で、同じ実験を実施した。
【０３３６】
2.5 還元剤とマレイミドを連続的に添加することによる抗CEAの架橋（連続的プロトコル）
抗CEAを20当量のDTTで周囲温度にて1時間処理した。次いで、30当量のジブロモマレイミドを添加し、5、10及び15分後にサンプルを取り出し、LCMSにより分析した。定量的ジスルフィド架橋を観察した。
【０３３７】
2.6 還元剤とマレイミドを同時に添加することによる抗CEAの架橋（in situプロトコル）
抗CEAに、以下の組み合わせとなるように様々な量のジチオフェノールマレイミド及び様々な量のベンゼンセレノールを添加した（架橋剤：還元剤）：5：2、5：5、10：10、15：15、20：10及び20：20。反応を周囲温度で1時間保持し、LCMSにより分析した。定量的な機能的ジスルフィド架橋が達成された。
【０３３８】
2.7 抗CEAのin situ架橋の経時変化
抗CEAに15当量のジチオフェノールマレイミド及び15当量のベンゼンセレノールを添加した。5、10、20、30、45及び60分後にアリコートを取り出し、LCMSに供した。
【０３３９】
2.8 抗CEAの連続的修飾及び機能化
抗CEAを、20当量のDTTを用いて周囲温度で1時間還元した。次いで、30当量のN-フルオレセイン-ジブロモマレイミド、N-ビオチン-ジブロモマレイミド又はN-PEG5000-ジブロモマレイミド、或いはまた50当量のマレイミドを添加して、10分後に反応物をLCMSにより分析した。抗CEA PEG化の場合、変換は、非修飾抗体のUVシグナルが、反応していないコントロールと比較して完全に喪失することにより示された。生成物のアイデンティティは、MALDI-TOF MS及びSDS-PAGEにより確認した。定量的且つ選択的な機能的ジスルフィド架橋が、様々な機能性で達成された。
【０３４０】
2.9 抗CEAのin situ機能化
抗CEAに15当量のN-PEG5000-ジチオフェノールマレイミド及び15当量のベンゼンセレノールを添加した。反応を周囲温度で60分間維持し、5、10、20、30、45及び60分後に、LCMSによる分析のためにアリコートを取り出した。抗CEA PEG化の変換は、連続的プロトコルで記載するようにモニタリングした。
【０３４１】
2.10 in situプロトコルの最適化
抗CEAに2又は5当量のジチオフェノールマレイミド、及び様々な量のベンゼンセレノールを添加した。反応を周囲温度で20分間維持し、LCMSにより分析した。
【０３４２】
2.11 ツーステッププロトコルとしてのin situ架橋の最適化
抗CEAに2当量のジチオフェノールマレイミドを添加した。可変量のベンゼンセレノールを周囲温度で15分間添加し、それに続いて、同量のベンゼンセレノールをさらに15分間添加した。サンプルをLCMSにより分析した。また、還元剤の最良の組み合わせも、1.2及び1.5当量のジチオフェノールマレイミドに対して試験した。
【０３４３】
2.12 抗CEA-フルオレセインの蛍光
抗CEA-フルオレセインを連続的プロトコルを介して合成し、製造者に指示に従って、PD MiniTrap G-25脱塩カラム（GE Healthcare）で精製することにより過剰なN-フルオレセイン-ジブロモマレイミドを除去した。タンパク質溶液の濃度をUV/Vis分光法により測定し、抗CEAアナログを25又は5 μg/mlに希釈し、非修飾抗CEA（350 μg/ml）とともに、発光波長518 nm（励起488 nm）で蛍光を記録した。
【０３４４】
2.13 抗CEA-HRPコンジュゲートの合成
抗CEA-ビオチンを連続的プロトコルを介して合成し、PD G-25脱塩カラムで精製することにより過剰なN-ビオチン-ジブロモマレイミドを除去した。タンパク質溶液の濃度をUV/Visにより測定し、20 μMに調整した。15 μlの抗体溶液を増加量のHRP-ストレプトアビジンコンジュゲート（Invitrogen、1.25 mg/ml）と混合し、サンプル量を30 μlに調整し、周囲温度で1時間インキュベートした。SDS-PAGEによりサンプルを分析した。
【０３４５】
2.14 抗CEA-HRPコンジュゲートでの「ワンステップ」ELISA
抗CEA-ビオチンを連続的プロトコルを介して合成し、PD G-25脱塩カラムで精製することにより過剰なN-ビオチン-ジブロモマレイミドを除去した。タンパク質溶液の濃度をUV/Vis分光法により測定した。
【０３４６】
ビオチン化抗体を3x過剰（質量）なHRP/STREPコンジュゲートとともに周囲温度で1時間インキュベートし、抗CEA-HRPコンジュゲートを、製造者の指示に従って、ニッケル磁気ビーズ（Millipore）で精製した。生成物をSDS-PAGEにより分析し、そのOD280により定量化した。PBSにて段階希釈した抗CEA-HRPコンジュゲート（1：101〜1：105）10 μlを、96ウェルプレート中、90 μlのELISA基質溶液と混合し、反応停止後、490 nmで吸光度を読んだ。比較のために、HRP/STREPコンジュゲートの段階希釈物（1：102〜1：106）、及び使用したELISA用の二次抗体の段階希釈物（1：104〜1：108）も共に試験した。OD280＝0.4であるHRP-抗CEAコンジュゲート溶液の1：500希釈物が、使用したELISA混合物と比較可能な良好なシグナルを生じることが分かった。
【０３４７】
96ウェルプレートを様々な量の完全長CEA（PBS中、0.125 mg/ml〜4 mg/ml）でコーティングし、記載するようにブロッキング及び洗浄し、OD280＝0.4である抗CEA-HRPコンジュゲート溶液の1：500希釈物100 μl（1ウェル当たり）とともに、周囲温度で1時間インキュベートした。プレートの読み取りは記載するように実施した。
【０３４８】
或いは、通常の抗体溶液に代えて、OD280＝0.4である抗CEA-HRPコンジュゲート溶液の希釈物を用いて標準的ELISAを実施した。
【０３４９】
2.15 抗CEA-HRPのプレート上（on-plate）での形成を用いた「ツーステップ」ELISA
ELISAプレートを記載するように調製し、ビオチン化抗CEAの通常の希釈物で処理した。一方のサンプルは、記載した一次抗体及び二次抗体の混合物と反応させた。他方のサンプルは、HRP/STREPコンジュゲートの1：460希釈物（PBS中、1％（w/v）Marvel、抗体に対して20x推定質量過剰）で処理し、三番目のサンプルは、HRP/STREPコンジュゲートの1：4600希釈物（PBS中、1％（w/v）Marvel、抗体に対して2x推定質量過剰）で処理した。インキュベーション時間は、いずれのサンプルについても周囲温度で1時間を超えないように調整（staggered）した。可視化及び読み取りは、記載するように実施した。
【０３５０】
2.16 機能的に架橋された抗CEAはCEAとの結合を保持する
抗CEA及びそのアナログの全てのELISAサンプルを修飾後にPD G-25脱塩カラムで精製し、UV/Vis分光法により濃度を測定した。
【０３５１】
ELISAプレートを、PBS中の最終濃度が1 μg/mlとなるように希釈した完全長ヒトCEAで周囲温度にて1時間コーティングし、洗浄し、PBS中5％（w/v）のMarvelミルク粉末（Premier Foods）溶液で4℃、一晩ブロッキングした。プレートを洗浄し、抗CEA及びそのアナログを指示濃度（典型的には、5.0、1.0、0.5、0.1、0.05及び0.01 μg/ml）にPBSで希釈後、添加した。アッセイを周囲温度で1時間インキュベートし、洗浄し、一次抗体（抗テトラHisマウスIgG1、Quiagen、1％（w/v）Marvel溶液中1：1000）を添加した。周囲温度にて1時間後、ELISAプレートを洗浄し、二次抗体（ECL抗マウス-ヒツジIgG1 HRP連結、GE Healthcare、1％（w/v）Marvel溶液中1：1000）を周囲温度で1時間添加した。プレートを洗浄し、新たに調製した基質溶液（25 mlの50 μMリン酸塩-クエン酸塩（phosphate citrate）バッファー中、1錠のo-フェニレンジアミン、Sigma-Aldrich）を各ウェルに添加した。強いオレンジ色が生じた際に、4 MのHClを添加して反応を停止し、490 nmの波長でプレートを読んだ。コントロールは、全てのELISAに含まれており、ここでは、CEAの代わりに、又は抗体断片の代わりに、いくつかのウェルにPBSを添加していた。
【０３５２】
各サンプルは3連で試験し、誤差は平均の標準偏差として示す。
【０３５３】
2.17 機能的に架橋した抗CEAの安定性研究
架橋抗CEA及び抗CEA-PEG5000をin situプロトコルを介して調製し、PD G-25脱塩カラムで精製し、4℃で4日間保存した。この期間の後、両方の化合物を再度調製し、記載するように精製し、UV/Vis分光法により濃度を測定し、保存した化合物とともに、ELISAを介して結合活性を試験した。機能的に架橋した抗CEAは、これらの条件下、安定であった。
【０３５４】
2.18 蛍光に基づく細胞ELISA
抗CEA-フルオレセインを段階的プロトコルを介して合成し、PD G-25脱塩カラムで精製することにより過剰なN-フルオレセイン-ジブロモマレイミドを除去した。タンパク質溶液の濃度をUV/Vis分光法により測定した。
【０３５５】
96ウェルプレート中、CAPAN-1（CEA発現細胞）（DMEM、20％FCS、1％グルタミン酸塩、1％ストレプトマイシン中で培養）及びA375（ネガティブコントロール）（DMEM、10％FCS、1％グルタミン酸塩、1％ストレプトマイシン中で培養）細胞株の対数期培養物を非酵素的に剥離し、カウントし、希釈（1ウェル当たり3x103〜1x105）した。細胞（それぞれの培地中）を、インキュベーター中（湿潤大気中37℃、5％CO2大気）、24時間接着させ、PBSで穏やかに2回洗浄し、500 ngの蛍光抗体（PBS中、5 μg/ml）で周囲温度にて1時間処理した。全てのサンプルをPBSで穏やかに2回洗浄し、ウェルをPBSで満たし、蛍光を518 nm（励起488 nm、暴露時間100 ms、スリット12 nm）で読んだ。非蛍光抗CEAで処理した細胞、未処理の細胞、及びPBS単独を用いて、バックグランドを測定した。フルオレセイン（Fluoroscein）標識抗CEAは、CEA発現細胞に対し選択的である。
【０３５６】
2.19 Biacoreアッセイを用いた、機能化抗CEAのKd測定
架橋抗CEA及び抗CEA-PEG5000をin situプロトコルを介して調製し、PD G-25脱塩カラムで精製し、UV/Vis分光法により濃度を測定した。
【０３５７】
次いで、Biacore T100での表面プラズモン共鳴を介して、非修飾（「処理した（processed）」）抗CEAとともに結合活性を試験した。簡単に述べると、SAチップ（ストレプトアビジンでコーティング）に、566 AUのビオチン化（biotynilated）NA1をロードし、抗CEA断片及びそのアナログの段階希釈物を注入した（400、200、100、50、25、12.5及び0 nM）。接触時間は、20 μl/minの流速で120秒間であり、それに続いて、解離時間は600秒間であった。チップは、10 mMのグリシン溶液を用いて、60秒間、30 μl/minの流速で再生した。サンプルランは全て25℃で実施し、結合パラメーターは、提供されるソフトウェアパッケージ（Biacore T100 Evaluation Software V 2.0.3）を用いて計算した。
Kd：非修飾抗CEA：20.8 ± 2.9 nM
架橋抗CEA：6.4 ± 0.3 nM
ペグ化抗CEA：8.7 ± 0.3 nM
【０３５８】
2.20 還元剤に対するマレイミド架橋の安定性
ジブロモマレイミド架橋抗CEAをin situプロトコルを介して調製し、PD G-25脱塩カラムで精製し、UV/Vis分光法により濃度を測定した。
【０３５９】
修飾抗体断片を100当量の2-メルカプトエタノール、DTT又はGSHで、周囲温度にて48時間処理した。異なる時点でアリコートを取り出し、LCMSにより分析した。48時間後、全てのサンプルを200当量のマレイミドと反応させ、再度、LCMSに供した。
【０３６０】
2.21 ヒト血漿におけるマレイミド架橋の安定性
ジブロモマレイミド架橋抗CEAをin situプロトコルを介して調製し、PD G-25脱塩カラムで精製し、UV/Vis分光法により濃度を測定した。
【０３６１】
70 μgの架橋抗CEAを500 μlのヒト血漿（Sigma-Aldrich）に添加し、37℃で1時間、4時間、24時間、3日間、5日間及び7日間インキュベートした。PureProteome Nickel Magnetic Beads（Millipore）を用いて、以下のいくつかを除き製造者の指示に従って、血漿から抗体断片を精製した：イミダゾールを含まない洗浄バッファー中でビーズを4回洗浄し、500 mMのイミダゾール中で5分間、2回タンパク質を溶出した。イミダゾールを除去し、限外濾過スピンカラム中、PBSで洗浄を繰り返すことにより溶出液を濃縮した。タンパク質溶液をLCMSにより分析した。
【０３６２】
コントロールとして、マレイミドでアルキル化した抗CEAを、架橋抗CEAについて記載するように、連続的プロトコルを介して調製し、25 μgのこの材料を25 μgの非修飾及び25 μgの架橋抗CEAと混合した。混合物を500 μlのPBS又はヒト血漿に添加し、37℃で1時間インキュベートし、上記で概要を述べるように、ニッケル磁気ビーズで精製した。精製した混合物をSDS-PAGEにより分析した。或いは、アルキル化及び非修飾抗CEAを、ヒト血漿中、37℃で7日間インキュベートし、上記のように単離し、分析した。ジブロモマレイミド架橋抗CEAは、ヒト血漿中、37℃で7日間、実質的に安定であった。
【０３６３】
2.22 ヒト血漿中でのインキュベーション後の抗CEAアナログの活性
架橋抗CEA及び抗CEA-PEG5000はin situプロトコルを介して合成し、アルキル化抗CEAは連続的プロトコルを介して合成した。アナログは全てPD G-25脱塩カラムで精製し、UV/Vis分光法により濃度を測定した。
【０３６４】
37.5 μgの抗体アナログ又は非修飾抗体を500 μlのヒト血漿に添加し、37℃でインキュベートした。1時間、4時間、24時間、3日間、5日間及び7日間後、各サンプルから12 μlを取り出し、788 μlのPBSで希釈（1.1 μg/mlの想定濃度を得るため）し、液体窒素中で急速凍結し、-20℃で保存した。全てのサンプルを回収した後、記載するようにELISAアッセイを実施した。コントロールとして、PBS中12 μlのヒト血漿の希釈物を同時に流した。
【０３６５】
3. キメラIgG1全長抗体：リツキシマブの修飾
3.1 材料及び準備
リツキシマブは、CD20に対するキメラIgG1全長抗体である。抗体は、その臨床製剤（clinical formulation）（9 mg/ml NaCl、7.35 mg/mlクエン酸Na二水和物（dehydrate）、0.7 mg/mlポリソルベート80）で10 mg/mlの濃度で得た。この溶液をPBSに溶解し、超遠心分離（MWCO 50 kDa, Sartorius）を介して、バッファーをPBSに完全に交換した。交換後の濃度をNanoDropで測定し、3.44 mg/ml（22.9 μM）とし、タンパク質溶液を急速凍結アリコート中、-20℃で保存した。特記のない限り、実験前に、DMFを最終濃度20％（v/v）まで添加した。
【０３６６】
3.2 リツキシマブの還元
抗体を様々な量のTCEPで周囲温度にて1時間処理し、SDS-PAGEでサンプルを分析した。インタクト及び還元サンプルを透析し、記載するように、MALDI-TOFにより可視化した。
【０３６７】
3.3 リツキシマブを用いたin situ架橋研究
抗体に様々な量のジチオフェノールマレイミドを添加し、それに続いて、10又は40当量のTCEPを添加した。サンプルを周囲温度で1時間インキュベートし、SDS-PAGEにより分析した。完全抗体、重鎖及び軽鎖について予測されるバンドを検証することにより、架橋の成功又はリツキシマブを推定した。
【０３６８】
3.4 リツキシマブの予備的in situ PEG化研究
抗体に様々な量のN-PEG5000-ジチオフェノールマレイミドを添加し、それに続いて、10又は40当量のTCEPを添加した。サンプルを周囲温度で1時間インキュベートし、SDS-PAGEにより分析した。完全抗体、重鎖及び軽鎖について予測されるバンドを検証することにより、架橋の成功又はリツキシマブを推定した。
【０３６９】
3.5 リツキシマブを用いた詳細なPEG化研究
抗体に様々な量のN-PEG5000-ジチオフェノールマレイミドを添加し、それに続いて、様々な量のTCEP又はベンゼンセレノールのいずれかを添加した。反応物を周囲温度で1時間インキュベートし、SDS-PAGEにより分析した。プロテインA磁気ビーズを用いて、以下のいくつかを除き製造者の指示に従って、PEG化サンプルを精製した：結合反応物を周囲温度で1時間インキュベートし、溶出物（elution）は全て、周囲温度で5分間インキュベートした。精製サンプルを調製し、記載するように、MALDI-TOFにより分析した。
【０３７０】
図23に示すように、10当量のTCEP/20当量のPEGとの反応は、主に、0及び1つの修飾をもたらし（図23C）、40当量のTCEP/80当量のPEGとの反応は、主に、0、1及び2つの修飾をもたらし（図23D）、10当量のSe/20当量のPEGとの反応は、主に、1つの修飾をもたらし（図23E）、40当量のSe/80当量のPEGとの反応は、主に、2つの修飾をもたらした（図23F）。従って、化学修飾抗体生成物は、適切な反応条件を選択することにより調節し得た。
【０３７１】
3.6 リツキシマブの連続的架橋
リツキシマブを40当量のTCEPで周囲温度にて1時間処理した。次いで、様々な量のジチオフェノールマレイミドを周囲温度で30分間添加し、SDS-PAGEによりサンプルを分析した。
【０３７２】
リツキシマブ（DMFなしで調製）を40当量のTCEPで周囲温度にて1時間処理した。次いで、様々な量のN-PEG5000-ジチオフェノールマレイミドを周囲温度で30分間添加し、SDS-PAGEによりサンプルを分析した。10当量のTCEPを用いて実験を繰り返した。
【０３７３】
還元工程の間、及びマレイミド添加前のDMFの存在は、準最適（sub-optimal）であることが示された。
【０３７４】
3.7 リツキシマブの代替的還元
抗体（DMFなし）を様々な量のDTT又は2-メルカプトエタノール（bME）のいずれかで周囲温度にて1時間処理した。SDS-PAGEにより全てのサンプルを分析した。同じ量のDTTを用いて、4時間、実験を繰り返した。
【０３７５】
3.8 リツキシマブの代替的還元連続的PEG化
リツキシマブ（DMFなし）を20当量のDTTで周囲温度にて1時間還元し、それに続いて、様々な量のN-PEG5000-ジブロモマレイミドを添加した。SDS-PAGEによりサンプルを分析した。完全抗体、重鎖及び軽鎖について予測されるバンドを検証することにより、架橋の成功又はリツキシマブを推定した。
【０３７６】
3.9 リツキシマブの混合還元
抗体（DMFなし）を3又は5当量のTCEPで周囲温度にて1時間処理した。次いで、様々な量のDTTを周囲温度で3時間添加し、SDS-PAGEにより全ての反応物を分析した。
【０３７７】
3.10 リツキシマブの混合還元連続的PEG化
抗体（DMFなし）を5当量のTCEPで周囲温度にて1時間処理した。次いで、10当量のDTTを周囲温度で3時間添加し、それに続いて、様々な量のN-PEG5000-ジブロモマレイミドを添加した。SDS-PAGEにより反応物を分析した。完全抗体、重鎖及び軽鎖について予測されるバンドを検証することにより、架橋の成功又はリツキシマブを推定した。
【０３７８】
3.11 リツキシマブPEG化のためのin situ対連続的条件
リツキシマブPEG化のために最適化された確立された条件を、比較のために並べて使用した。抗体は周囲温度にて、40+10、30+60及び20+40当量のベンゼンセレノール+N-PEG5000-ジチオフェノールマレイミドの組み合わせを用いて各1時間、in situ修飾するか、或いは5当量のTCEP（1時間）+10当量のDTT（3時間）+20当量のN-PEG5000-ジブロモマレイミド、20当量のDTT（4時間）+25当量のN-PEG5000-ジブロモマレイミド、又は10当量のTCEP（1時間）+20当量のN-PEG5000-ジチオフェノールマレイミドを用いて各30分間、連続的に修飾した。サンプルは全てプロテインA磁気ビーズで精製し、SDS-PAGE及びMALDI-TOFにより分析した。
【０３７９】
図30に示すように、40当量のSe+10当量のPEGとの反応は、主に、2つの修飾をもたらし（図30B）、30当量のSe+60当量のPEGとの反応は、主に、2つの修飾をもたらし（図30C）、20当量のSe+40当量のPEGとの反応は、主に、1及び2つの修飾をもたらし（図30D）、5当量のTCEP/10当量のDTT/20当量のPEGとの反応は、1、2、3及び4つの修飾の混合物をもたらし（図30E）、20当量のDTT/25当量のPEGとの反応は、主に、2、3及び4つの修飾をもたらし（図30F）、10当量のTCEP/20当量のPEGとの反応は、主に、2及び3つの修飾をもたらした（図30G）。従って、化学修飾抗体生成物は、適切な反応条件を選択することにより調節し得た。
【０３８０】
3.12 リツキシマブのin situ蛍光標識
マレイミド架橋リツキシマブをin situ方法（30当量のベンゼンセレノール+60当量のジチオフェノールマレイミド、1時間）を用いて調製し、蛍光リツキシマブを連続的方法（20当量のDTTで1時間、次いで、抗体溶液中20％v/vの最終濃度となるDMF体積中、25当量のN-フルオレセイン-ジブロモマレイミドで30分間）により生成した。プロテインA磁気ビーズで両方のサンプルを精製し、SDS-PAGEにより分析した。リツキシマブ-フルオレセインの蛍光は、518 nmの波長（励起488 nm）及び50 ng/mlの濃度で記録した。N-フルオレセイン-マレイミド標識ソマトスタチンとの比較により、抗体1分子当たり2.02モルのフルオレセインが得られた。
【０３８１】
3.13 リツキシマブのパパイン消化
リツキシマブは、Pierce Fab Preparation Kit（ThermoScientific）の構成要素を用いて消化したが、チオールフリー・プロトコルを確立した：固定化パパインを、アルゴン雰囲気下及び一定振盪（constant shacking）（1,100 rpm）下、10 mMのDTT（消化バッファー中：50 mM リン酸塩、1 mM EDTA、pH 6.8）で暗所にて25℃、1時間活性化した。樹脂を消化バッファー（DTT不含）で4回洗浄し、限外濾過（5 kDa MWCO）を介して消化バッファーへと移した0.5 mlの抗体溶液を添加した。暗所にて振盪（1,100 rpm）させながら、混合物を37℃で18時間インキュベートした。フィルターカラムを用いて消化物から樹脂を分離し、PBS（pH 7.4）で3回洗浄し、消化物を洗浄物と合わせた。限外濾過カラム（5 kDa MWCO）を用いてバッファーをPBSに完全に交換し、体積を2 mlに調整し、サンプルをNAbプロテインAカラムに適用し、一定混合下、周囲温度で1時間インキュベートした。製造者のプロトコルに従ってFab画分を溶出し、カラムをPBSで3回洗浄し、0.2 Mのグリシン-HCl（pH 2.5）でFc画分を4回溶出し、これを1 MのTris（pH 8.5）溶液で中和した。Fab画分を洗浄物と合わせ、Fab溶液及びFc溶液の両方を、限外濾過カラム（10 kDa MWCO, Sartorius）を用いてPBSにバッファー交換した。
【０３８２】
消化物は全てSDS-PAGEにより分析した。Fab断片の濃度は、ε280=82,905 M-1cm-1のモル吸光係数を用いて、UV/Visにより測定した。
【０３８３】
3.14 in situ及び連続的リツキシマブPEG化の両方の部位選択性
PEG化リツキシマブをin situ（40当量のベンゼンセレノール+10当量のN-PEG5000-ジチオマレイミド、1時間）で調製するか、又は連続的（20当量のDTT又は10当量のTCEPと、N-PEG5000-ジブロモ-及びジチオフェノールマレイミド）に調製した。NAbプロテインAカラム（ThermoScientific）で材料を精製し、記載するように、固定化パパインで消化した。消化の前後にSDS-PAGE及びMALDI-TOFにより全てのサンプルを分析した。PEG化の選択性は、プロトコルに依存する。in situプロトコル（ベンゼンセレノール）では、FcジスルフィドよりもFABジスルフィドに対する選択性が生じる。
【０３８４】
3.15 リツキシマブの段階的PEG化（マレイミド添加前の過剰な還元剤の除去）
抗体（DMFなし）を60当量のTCEPで周囲温度にて1時間還元した。PD G-25脱塩カラムでの精製により還元剤を除去し、5、8又は10当量のN-PEG5000-ジチオマレイミドを溶液に1時間、急速に添加した。サンプルを濃縮し、SDS-PAGE及びMALDI-TOFにより分析した。急速な添加によって、修飾された完全抗体と修飾された重/重/軽（heavy/heavy/light：HHL）種との混合物が生じた。
【０３８５】
図33に示すように、5当量のN-PEG5000-ジチオマレイミドとの反応は、2、3及び4つの修飾の混合物をもたらした一方（図33B）、10当量のN-PEG5000-ジチオマレイミドとの反応は、主に、3及び4つの修飾をもたらした（図33C）。従って、化学修飾抗体生成物は、適切な反応条件を選択することにより調節し得た。
【０３８６】
3.16 再酸化研究
リツキシマブ（DMFなし）を60当量のTCEPで周囲温度にて1時間還元した。PD G-25脱塩カラムにサンプルを通して還元剤を除去し、バッファーを50 mMリン酸塩、1 mM EDTA、pH 6.8に交換した。溶液中、アルゴンをすぐにバブリングし、反応をシールし、周囲温度で40時間、暗所にてインキュベートした。アルゴン流下、様々な時間でアリコートを取り出し、40当量のマレイミド（最終濃度20％v/vとなるDMF中）と30分間反応させた。SDS-PAGEを介して、標準物（1、2及び4 μgの非修飾抗体）とともにサンプルを分析し、ゲルの濃度測定（densiometric）分析によりジスルフィド結合の再形成を定量化した。還元ジスルフィドは、延長された期間、安定であった。
【０３８７】
3.17 リツキシマブのさらなる段階的修飾（マレイミド添加前の過剰な還元剤の除去）
還元抗体を、再酸化研究で確立されたように調製し、アルゴン下、周囲温度にて暗所で24時間インキュベートした。還元抗体及び再形成された抗体のアリコートに、4、8、12又は16当量のN-PEG5000-ジチオフェノールマレイミド（PBS中）又はジチオフェノールマレイミド（DMF、最終20％v/v中）のいずれかを周囲温度にて30分間添加した。SDS-PAGE及びMALDI-TOFによりサンプルを分析した。脱塩後であってマレイミドの添加前に、還元抗体が「再構築（re-assemble）」する時間を認めることにより、HHL不純物がほとんどない4重標識された抗体への優れた変換が生じる。
【０３８８】
図35に示すように、16当量のN-PEG5000-ジチオマレイミドとの反応は、ほぼ、4つの修飾をもたらした。
【０３８９】
3.18 機能化リツキシマブは活性を保持する
PEG化リツキシマブを「リツキシマブの最適化されたPEG化」で概要を示すように合成し、機能化抗体を「リツキシマブの機能化」で記載するように合成した。「処理した（processed）」抗体は、ベンゼンセレノールを添加することなく、確立されたin situ架橋条件にリツキシマブを供することにより調製した。抗体サンプルは全て、プロテインA磁気ビーズで精製し、濃縮し、濃度を測定した（0.22 mg/ml〜0.39 mg/ml）。
【０３９０】
Raji細胞（B細胞株）の対数期培養物を増殖し（RPMI 1640+GlutarMAX、25 mM HEPES中、37℃、湿潤雰囲気、5％CO2）、回収し、遠心分離によりバッファー（PBS、4％FCS、0.02％アジ化ナトリウム）へと移し、96ウェルプレート中、1ウェル当たり50,000細胞を入れた。バッファー中、10、5又は1 μg/mlの一次抗体（リツキシマブサンプル）50 μlで細胞を4℃、1時間処理した。コントロールとして、非修飾/「非処理（unprocessed）」リツキシマブ（ポジティブコントロール）、アイソタイプコントロール（マウスキメラIgG1 κ、1 μg/ml、ネガティブコントロール）、二次抗体のみ（ヤギFITC結合抗ヒトIgG F（ab）2, Jackson ImmunoResearch、ネガティブコントロール、一次抗体インキュベーションの間は50 μlのバッファー）、及びバッファーのみ（両方の工程において、ライブゲート（live gate）コントロール）でもRaji細胞を処理した。プレートを洗浄し、二次抗体を添加した（1ウェル当たり、50 μlのバッファー中1 μlの溶液）。この工程において、予めバッファーのみで処理した細胞に蛍光標識したリツキシマブを添加した。サンプルを暗所にて4℃、1時間インキュベートし、洗浄し、2％ホルムアルデヒド（PBS中）で周囲温度にて10分間固定した。細胞を再度洗浄し、200 μlのバッファーに再懸濁し、プレートをフローサイトメーター（Guava easyCyte 8HT, Millipore）にロードした。
【０３９１】
データを取得し（5,000イベント）、インストールされたソフトウェア（guaraSoft, InCyte 2.2.2）を用いて分析した。非染色細胞、ポジティブ及びネガティブコントロール並びにサンプル（それに応じて読まれた、2連で調製したもの）を用いて設定を調整した。生細胞についてゲーティング（前方散乱光vs側方散乱光）後、蛍光染色を分析した。抗体希釈物にわたる、蛍光細胞集団における小さなシフトにより、飽和に達しなかったことが確認された。
【０３９２】
3.19 リツキシマブアナログの熱安定性
PEG化アナログに加えて、3つの異なるリツキシマブアナログを、熱安定性試験に備えて合成した：マレイミド架橋リツキシマブは、抗体を20当量のDTTで周囲温度にて4時間還元し、25当量のジブロモマレイミド（最終濃度20％となるDMF中）を30分間添加することにより調製した。同様に、架橋及び加水分解抗体を、ジブロマレイミドの代わりにN-フェニル-ジブロモマレイミドを添加し、該材料を37℃で16時間インキュベートすることにより合成した。部分的アルキル化リツキシマブは、文献（Sun et al. 2005）に記載されるように調製した。簡単に述べると、抗体を25 mM NaCl、25 mM ホウ酸ナトリウム、1 mM EDTA、pH 8.0バッファーへと移し、2.75当量のTCEPで37℃、2時間処理し、4℃まで冷却し、4.4当量のマレイミドと30分間反応させた。
【０３９３】
リツキシマブアナログは全て、反応後に、PD G-25脱塩カラム（PBS中に）で精製し、NanoDropにより濃度を測定した。
【０３９４】
蛍光抗体を除いて、フローサイトメトリー活性試験のために調製したリツキシマブアナログ全ての熱安定性を、特別に合成したサンプル（図37参照）とともに、サーマルシフトアッセイにて分析した（図38参照）。非修飾及び「処理した（processed）」リツキシマブをコントロールとした。抗体アナログの濃度を600 nM又は150 nMに調整し、予め希釈（PBS中、1：100）した疎水性蛍光色素（Sypro Orange, Sigma-Aldrich）と色素：抗体溶液の比＝1：10で混合した。40 μlを96ウェルプレートへと移し、簡単に遠心分離（1,000 rpm）し、シールした。サーマルシフトアッセイは、Mx 3005P qPCRマシン（Stratagene）にて、サンプルを25℃から95℃まで1分当たり1℃の速度で加熱することにより実施した。インストールされたMxProソフトウェアで蛍光の増加を記録し（励起波長472 nm、発光波長570 nm）、データをエクスポートし、シグモイド曲線の形状にフィットさせ、ここから、単純な融解温度Tmを計算した。リツキシマブの熱安定性は、ジスルフィド架橋後、維持された。
【０３９５】
3.20 リツキシマブ断片のPEG化
精製したリツキシマブFab及びFc断片を、「リツキシマブの最適化されたPEG化」で概要を示すように、それぞれ37.3 μM及び18.7 μMで、最適化されたin situ及び連続的PEG化手順に供した。図39に示すように、SDS-PAGEにより、還元コントロールとともに断片のPEG化を可視化した。
【０３９６】
3.21 リツキシマブFc及びFab断片混合物のPEG化
精製したリツキシマブFab及びFc断片を、2：1の比率で混合し、「完全抗体」の最終濃度を18.7 μMとした。混合物は、2、5又は10当量のN-PEG5000-ジチオフェノールマレイミド及び30又は60当量のベンゼンセレノールを用いてin situでPEG化するか、或いは2、4、6、8、10又は15当量のTCEPと、それに続いて、1時間後に20当量のPEG化試薬を用いるTCEPに基づく連続的プロトコルを介してPEG化した。SDS-PAGEにより、還元コントロール及び単一断片反応物とともに、全てのサンプルを分析した。結果（図40及び41参照）は、TCEPが重-重鎖ジスルフィドの選択的マレイミド架橋を可能にする一方、ベンゼンセレノールは重-軽鎖ジスルフィドの選択的マレイミド架橋を可能にすることを示す。
【０３９７】
4. IgG1全長抗体：トラスツズマブの修飾
4.1 材料及び準備
トラスツズマブは、HER2に対するキメラIgG1全長抗体である。抗体は、その臨床製剤（凍結乾燥）で得た。粉末を10 mlの滅菌水に溶解し、限外濾過（MWCO 50 kDa, Sartorius）を介して、バッファーを消化バッファー（50 mMリン酸塩、1 mM EDTA、pH 6.8）に完全に交換した。交換後の濃度をNanoDropにより測定し、3.38 mg/ml（22.9 μM）に調整し、タンパク質溶液を急速凍結アリコート中、-20℃で保存した。特記のない限り、実験前に、DMFを最終濃度10％（v/v）まで添加した。
【０３９８】
4.2 トラスツズマブの還元研究
連続的に調製するサンプル中の還元剤の量を低下させるため、トラスツズマブでの還元研究を増加pHにて実施した。限外濾過（MWCO 10 kDa）により、トラスツズマブをホウ酸塩バッファー（25 mMホウ酸ナトリウム、25 mM NaCl、1 mM EDTA、pH 8.0）へと移し、NanoDrop装置で濃度を測定し、穏やかな撹拌下、抗体を様々な量のTCEPで37℃、2時間処理した。20当量のマレイミド（DMF中）を添加することにより反応を停止し、SDS-PAGEにより分析した（図42参照）。
【０３９９】
4.3 架橋試薬の合成
4.3.1 概論
全ての反応は、特記のない限り、室温で撹拌しながら大気圧で実施した。試薬及び溶媒は、商業的供給源から購入し、提供されるとおりに、又は常法により精製して使用した。ガラス製品は、アルゴン下で実施する反応のために、予め加熱乾燥（flame dried）した。反応は、VWRから購入したアルミニウムプレート上にコーティングされたシリカゲルSIL G/UV254にて実施するTLC分析によりモニタリングした。可視化は、254 nmの波長で操作するUVランプ下、5％の水酸化ナトリウム水溶液（5 mL）及び水（200 mL）中、過マンガン酸カリウム（3 g）及び炭酸カリウム（20 g）の溶液で染色し、それに続いて加熱することにより実施した。フラッシュカラムクロマトグラフィーは、Merckから購入したシリカゲル60（0.04〜0.063 mm、230〜400メッシュ）を用いて実施した。核磁気共鳴スペクトルは、周囲の室温プローブで操作するBrucker NMRスペクトロメーターにてCDCl3（別の溶媒が記載されていない限り）中で記録した。内部標準として残留溶媒を使用して、1Hスペクトルは400、500又は600 MHzで記録し、13Cスペクトルは125又は150 MHzで記録した。必要に応じて、DEPT135、COSY、HMQC、HMBC及びNOESYスペクトルを用いて、構造を確認した。データは、以下のとおり提示する：1Hについて、化学シフト（ppm）（多重度、Jカップリング定数（Hz）、Hの数、構造の割当（assignment on structure））；及び13Cに対して、化学シフト（ppm）（構造の割当）。多重度は以下のとおり報告する：s（シングレット）、d（ダブレット）、t（トリプレット）、q（カルテット）、quint.（クインテット）、sext.（セクステット）、oct.（オクテット）、m（マルチプレット）、br（ブロード）、dd（ダブレットオブダブレット）、dt（ダブレットオブトリプレット）、ABq（ABカルテット）。赤外スペクトルは、ATRモードで操作するPerkin Elmer Spectrum 100 FTIRスペクトロメーターで記録した。融点はGallenkamp装置で測定したが、補正していない。単離した化合物全てについての実験手順を示す。引用した収率は全て、特記のない限り、単離収率であり、複数の生成物が得られた場合、データは、単離した順序で示す。反応のための一般的方法を報告する。
【０４００】
4.3.2 2,3-ジブロモ-マレイミド-N-ヘキサン酸 1
DBL-1
【０４０１】
【化３０】
2015510877.tif 000032
【０４０２】
10 mLの丸底フラスコ中、2,3-ジブロモマレイン酸無水物（256 mg、1 mmol）及び6-アミノカプロン酸（131 mg、1 mmol、1当量）を添加した。次に、AcOH（2 mL）を添加し、混合物を撹拌しながら120℃で3時間加熱した。次いで、混合物を室温まで冷却させた。80℃、減圧下（under vacuo）で濃縮することによりAcOHを除去し、トルエン（10 mL）を添加してもう一度濃縮することにより、AcOHの痕跡を除去して黄白色固体を生成し、これを石油エーテル：EtOAc（1：1 v/v）を用いたシリカでのフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、白色固体として1を得た（311 mg、0.84 mmol、84％）。1に関するデータ：mp = 123-124 ℃. IR (ペレット) νmax 2936, 2868, 1721, 1695, 1589, 1396, 1046, 946, 842, 733. 1H NMR (500 MHz, MeOD-d4) 1.34 (quint., J = 7.5 Hz, 2H, C5), 1.63 (overlapped quint., J = 7.5 Hz, 4H, C4 and C6), 2.29 (t, J = 7.5 Hz, 2H, C7), 3.58 (t, J = 7.5 Hz, 2H, C3); 13C NMR (125 MHz, MeOD-d4) 25.5 (C5), 27.2 (C4), 29.0 (C6), 34.6 (C7), 40.3 (C3), 130.3 (C2), 165.5 (C1), 177.4 (C8). ESI-MS [M]+ 365.9, [M+2]+ 367.9, [M+4]+ 369.9（それぞれ1:2:1の強度比）. HRMS (ESI) [M]+ found 365.8986, C10H10NO4Br2 requires 365.8977.
【０４０３】
4.3.3 2,3-ジチオフェノール-マレイミド-N-ヘキサン酸 2
DTL-1
【０４０４】
【化３１】
2015510877.tif 000033
【０４０５】
アルゴン下、25 mLの丸底フラスコ中、2,3-ジブロモ-マレイミド-N-ヘキサン酸 1（369 mg、1 mmol）をMeOH（4 mL）に溶解した。次いで、NaOAc（172 mg、2.1 mmol、2.1 当量）を添加した。次に、アルゴン下、チオフェノール（225 μL、2.2 mmol、2.2当量）のMeOH（2 mL）溶液を反応混合物に5分間にわたって滴下し、オレンジ色溶液を得た。混合物を室温で20分間撹拌した。次いで、20 mM HCl（10 mL、0.2 mmol、0.2当量）でクエンチし、EtOAc（2×20 mL）で抽出した。合わせた有機層を乾燥（MgSO4）し、濾過し、減圧下で濃縮して、黄色固体を生成し、これを石油エーテル：EtOAc（2：5 v/v）を用いたシリカでのフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、黄色固体として2を得た（371 mg、0.87 mmol、87％）。2に関するデータ：IR (ペレット) νmax 3058, 2940, 2870, 1766, 1697, 1541, 1395, 1176, 1049, 915, 842, 747, 687. 1H NMR (600 MHz, MeOD-d4) 1.31 (quint., J = 7.2 Hz, 2H, C5), 1.57-1.63 (overlapped quint., J = 7.2 Hz, 4H, C4 and C6), 2.27 (t, J = 7.2 Hz, 2H, C7), 3.51 (t, J = 7.2 Hz, 2H, C3), 7.17-7.18 (overlapped m, 4H, Ph), 7.24-7.29 (overlapped m, 6H, Ph); 13C NMR (150 MHz, MeOD-d4) 25.5 (C5), 27.3 (C4), 29.1 (C6), 34.8 (C7), 39.5 (C3), 129.2 (Ph), 130.1 (Ph), 130.7 (Ph), 132.4 (Ph), 137.0 (C2), 168.4 (C1), 177.5 (C8). HRMS (ESI) [M]+ found 427.09131, C22H21NO4S2 requires 427.09065.
【０４０６】
4.3.4 2,3-ジチオフェノール-マレイミド-N-（N-ドキソルビシンヘキサンアミド） 3
DTL-1-DOX
【０４０７】
【化３２】
2015510877.tif 000034
【０４０８】
アルゴン下、10 mLの丸底フラスコ中、2,3-ジチオフェノール-マレイミド-N-ヘキサン酸 2（7.63 mg、0.0178 mmol、1.03当量）、HOBt（0.25 mg、0.00178 mmol、0.1当量）及びHBTU（6.7 mg、0.0178 mmol、1.03当量）をDMF（0.5 mL）に溶解して、黄色溶液を得た。次に、DIPEAのDMF（50 μL、0.0189 mmol、1.1当量）溶液（0.378 M）を添加し、混合物を3分間撹拌した。次いで、塩酸ドキソルビシン（10 mg、0.0172 mmol、1当量）のDIPEA（3.27 μL、1.1当量）とのDMF（0.7 mL）溶液を添加した。添加時に溶液は赤色に変化した。溶液を室温で6時間撹拌した。次いで、減圧下で濃縮し、DCM（20 mL）を添加し、飽和LiCl水溶液（3×10 mL）、15％K2CO3（10 mL）、15％クエン酸溶液（10 mL）及び水（10 mL）で洗浄した。有機層を乾燥（MgSO4）し、濾過し、減圧下で濃縮して赤色固体を生成し、これをDCM：EtOAc：MeOH（10：10：1 v/v）を用いたシリカでのフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、赤色固体として3を得た（15.1 mg、0.016 mmol、92％）。3に関するデータ：IR (ペレット) νmax 3469, 2435, 1702, 1617, 1580, 1398, 1207, 1077, 980, 735, 690. 1H NMR (600 MHz, MeOD-d4 + drops of CDCl3) 1.20 (quint., J = 7.2 Hz, 2H, C31), 1.27 (d, J = 6.6 Hz, 3H, C27), 1.47-1.59 (overlapped quint., J = 7.2 Hz, 4H, C30 and C32), 1.74 (dd, J = 13.2, 4.8 Hz, 1H, C4), 1.99 (dt, J = 13.2, 3.6 Hz, 1H C4), 2.11 (m, J = 4.8 Hz, 1H, C7 overlapped with C29), 2.15 (t, J = 7.2 Hz, 2H, C29), 2.33 (d, J = 14.4, 1H, C7), 2.85 (d, J = 18.6, 1H, C9), 3.01 (d, J = 18.6, 1H, C9), 3.38 (t, J = 7.2, 2H, C33), 3.61 (s, 1H, C2), 3.95 (s, 3H, C24), 4.14 (dq, J = 13.2, 2.4, 1H, C3), 4.25 (q, J = 6.6, 1H, C1), 4.74 (ABq, J = 19.8, νAB = 17.5, 2H, C26), 5.07 (dt, J = 2.4, 1.8, 1H, C6), 5.41 (d, J = 3.6, 1H, C5), 7.06-7.07 (overlapped m, 4H, Ph), 7.16-7.23 (overlapped m, 6H, Ph), 7.43 (d, J = 8.4, 1H, C17), 7.72 (t, J = 8.4, 1H, C18), 7.78 (d, J = 7.8, 1H, C19); 13C NMR (150 MHz, MeOD-d4 + drops of CDCl3) 17.4 (C27), 26.4 (C31), 27.2 (C32), 29.1 (C30), 30.5 (C4), 34.1 (C9), 36.7 (C29), 37.3 (C7), 39.5 (C33), 47.0 (C3), 57.1 (C24), 65.8 (C26), 68.6 (C1), 69.9 (C2), 71.2 (C6), 77.4 (C8), 102.2 (C5), 112.2 (C22), 112.4 (C13), 120.2 (C17), 120.5 (C19), 121.5 (C15), 129.2 (Ph), 130.1 (Ph), 130.6 (Ph), 132.5 (Ph), 135.1 (C11), 135.7 (C10), 136.3 (C20), 136.9 (C35), 137.1 (C18), 156.2 (C23), 157.3 (C12), 162.3 (C16), 168.2 (C34), 175.4 (C28), 187.6 (C21), 188.0 (C14), 214.7 (C25). HRMS (ESI) [M+Na]+ found 975.2427, C49H48N2O14S2Na requires 975.2445.
【０４０９】
4.3.5 2,3-ジブロモ-マレイミド-N-（p-安息香酸） 4
DBL-2
【０４１０】
【化３３】
2015510877.tif 000035
【０４１１】
25 mLの丸底フラスコ中、2,3-ジブロモマレイン酸無水物（1.024 g、4 mmol）及びp-アミノ安息香酸（0.549 g、4 mmol、1当量）を添加した。次に、AcOH（12 mL）を添加し、混合物を撹拌しながら120℃で40分間加熱した。そのうちに生成物が溶液から析出（crashes out）する。次いで、混合物を室温まで冷却させ、濾過した。濾過ケーキを冷MeOH（2 mL）及びDCMで洗浄し、減圧下で乾燥して、オフイエロー色固体として4を得た（1.181 g、3.15 mmol、79％）。4に関するデータ：IR (ペレット) νmax 2828, 2544, 1778, 1728, 1689, 1591, 1376, 1286, 1100, 826, 723. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) 7.51 (d, J = 8.4 Hz, 2H, C4), 8.06 (d, J = 8.4 Hz, 2H, C5), 13.2 (br, 1H, COOH); 13C NMR (150 MHz, DMSO-d6) 126.6 (C4), 129.8 (C3), 130.1 (C5), 130.3 (C6), 135.3 (C2), 163.1 (C1) 166.7 (C7). ESI-MS [M]+ 373, [M+2]+ 375, [M+4]+ 377（それぞれ1:2:1の強度比）. HRMS (ESI) [M]+found 372.85833, C11H5NO4Br2 requires 372.85798.
【０４１２】
4.3.6 2,3-ジチオフェノール-マレイミド-N-（p-安息香酸） 5
DTL-2
【０４１３】
【化３４】
2015510877.tif 000036
【０４１４】
25 mLの丸底フラスコ中、2,3-ジブロモ-マレイミド-N-（p-安息香酸）4（375 mg、1 mmol）をTHF（12 mL）に溶解した。次いで、NaOAc（172 mg、2.1 mmol、2.1当量）を添加した。次に、チオフェノール（225 μL、2.2 mmol、2.2当量）のTHF（2 mL）溶液を、アルゴン下、反応混合物に5分間にわたって滴下した。混合物を室温で90分間撹拌し、時間とともに徐々に黄色に変化した。次いで、減圧下で濃縮し、DCM（80 mL）に再溶解し、3分間超音波処理した。次いで、固体を除去するために濾過し、濾液を濃縮して、黄色固体を得、これをDCM：MeOH（2：5 v/v）を用いたシリカでのフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、黄色固体として5を得た（189 mg、0.44 mmol、44％）。5に関するデータ：IR (ペレット) νmax3120, 2163, 1708, 1431, 1053, 967, 733. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 7.30 (overlapped m, 10H, Ph), 7.51 (d, J = 8.4 Hz, 2H, C4), 8.04 (d, J = 8.4 Hz, 2H, C5); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) 126.1 (C4), 128.0 (C3), 128.9 (Ph), 129.0 (Ph), 129.9 (C5), 130.7 (overlapped, Ph, C6), 135.8 (C2), 165.2 (C1) 166.7 (C7). HRMS (ESI) [M-H+]- found 432.0360, C23H14NO4S2 requires 432.0364.
【０４１５】
4.3.7 2,3-ジチオフェノール-マレイミド-N-（N-ドキソルビシン-p-ベンズアミド） 6
DTL-2-DOX
【０４１６】
【化３５】
2015510877.tif 000037
【０４１７】
アルゴン下、10 mLの丸底フラスコ中、2,3-ジチオフェノール-マレイミド-N-（p-安息香酸）5（7.46 mg、0.0172 mmol、1当量）、HOBt（0.25 mg、0.00178 mmol、0.1当量）及びHBTU（6.7 mg、0.0178 mmol、1.03当量）をDMF（0.5 mL）に溶解して、黄色溶液を得た。次に、DIPEAのDMF（50 μL、0.0189 mmol、1.1当量）溶液（0.378 M）を添加し、混合物を3分間撹拌した。次いで、塩酸ドキソルビシン（10 mg、0.0172 mmol、1当量）のDIPEA（3.27 μL、1.1当量）とのDMF（0.7 mL）溶液を添加した。添加の際に溶液は赤色に変化した。溶液を室温で6時間撹拌した。次いで、DCM（10 mL）を添加し、0.68 M AcOH：AcONaバッファーpH 5（10 mL）及び飽和LiCl水溶液（3×10 mL）で洗浄した。有機層を乾燥（MgSO4）し、濾過し、減圧下で濃縮して、赤色固体を生成し、これをDCM：EtOAc：MeOH（20：20：1 v/v）を用いたシリカでのフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、赤色固体として6を得た（14.9 mg、0.0155 mmol、90％）。6に関するデータ：IR (ペレット) νmax 3516, 3407, 2926, 1714, 1615, 1578, 1374, 1284, 1207, 984, 732. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) 1.16 (d, J = 6.6 Hz, 3H, C27), 1.54 (dd, J = 13.2, 4.2 Hz, 1H, C4), 2.08 (dt, J = 13.2, 3.6 Hz, 1H C4), 2.12-2.25 (ABq, J = 12.6, νAB = 61, 2H, C7), 3.00 (q, J = 18.6, 2H, C9), 3.56 (br, 1H, C2), 3.97 (s, 3H, C24), 4.20 (m, 1H, C3 overlapped with C1), 4.25 (q, J = 6.6, 1H, C1 overlapped with C3), 4.59 (d, J = 5.4 Hz, 2H, C26), 4.88 (d, J = 5.4 Hz, 1H, C2-OH overlapped with C26-OH), 4.90 (t, J = 6.0 Hz, 1H, C26-OH overlapped with C2-OH), 4.97 (t, J = 4.2 Hz, 1H, C6), 5.28 (d, J = 2.4 Hz, 1H, C5), 5.52 (s, 1H, C8-OH), 7.21-7.35 (overlapped m, 10H, Ph), 7.43 (d, J = 8.4, 2H, C17 overlapped with NH), 7.65 (t, J = 4.8, 1H, C18), 7.90-7.91 (overlapped d, J = 7.2 Hz, 4H, C30 and C31), 7.78 (d, J = 7.8, 1H, C19), 13.29 (s, 1H, C12-OH), 14.05 (s, 1H, C23-OH); 13C NMR (150 MHz, DMSO-d6) 17.1 (C27), 29.5 (C4), 32.1 (C9), 36.8 (C7), 46.2 (C3), 56.6 (C24), 63.7 (C26), 66.7 (C1), 67.9 (C2), 70.1 (C6), 75.0 (C8), 100.5 (C5), 110.7 (C22), 110.9 (C13), 119.0 (C17), 119.8 (C19), 120.1 (C15), 126.1 (C31), 127.9 (C30 overlapped with Ph) 128.0 (Ph overlapped with C30), 128.9 (Ph), 129.0 (Ph overlapped with C29), 133.9 (C29 overlapped with C32), 130.6 (Ph), 134.2 (C11), 134.7 (C10), 135.6 (C35 overlapped with C20) , 136.3 (C18), 154.5 (C23), 156.2 (C12), 160.8 (C16), 165.2 (C28), 165.4 (C34), 186.5 (C21), 186.6 (C14), 213.9 (C25). HRMS (ESI) [M+Na]+ found 981.1976, C50H42N2O14S2Na requires 981.1975.
【０４１８】
4.3.8 Fmoc-バリン-シトルリン（citruline） 7
【０４１９】
【化３６】
2015510877.tif 000038
【０４２０】
アルゴン下、100 mLの丸底フラスコ中、Fmoc-バリン（2.5 g、7.37 mmol）及びN-ヒドロキシ-スクシンイミド（0.86 g、7.37 mmol、1当量）をTHF（10 mL）に溶解した。次いで、0℃まで冷却し、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC、1.54 g、7.37 mmol、1当量）を添加した。5分間撹拌し、次いで氷浴を取り除き、室温で5時間撹拌させた。次いで、濾過し、濾過ケーキをTHF（30 mL）でさらに洗浄した。合わせた濾液を濃縮し、減圧化で乾燥して、白色固体としてFmoc-バリン-OSuを生成した。次に、シトルリン（1.36 g、7.74 mmol、1.05当量）を水（10 mL）に溶解し、これにNaHCO3（0.65 g、7.74 mmol、1.05当量）を添加した。次いで、Fmoc-バリン-OSuをジメトキシエタン（DME、20 mL）及びTHF（10 mL）に懸濁し、シトルリン溶液上に5分間にわたって添加した。時間とともに沈殿が徐々に形成された。懸濁液を室温で16時間撹拌した。次に、15％クエン酸溶液（35 mL）を添加し、10：1 EtOAc：iPrOH（2×50 mL）で抽出した。合わせた有機層を水（2×75 mL）で洗浄し、次いで乾燥（MgSO4）し、濾過し、濃縮し、減圧下で乾燥して、汚れた白色固体を生成した。次に、Et2O（40 mL）を添加し、10分間超音波処理し、濾過し、集めた固体をEt2Oで洗浄した。減圧下で乾燥して、白色固体として7を生成した（1.53 g、3.1 mmol、42％）。7に関するデータ：IR (ペレット) νmax 3290, 2960, 1689, 1643, 1535, 1448, 1233, 1031, 738. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) 0.85-0.89 (overlapped d, J = 6.6 Hz, 6H, C6), 1.38 (m, 2H, C8), 1.48-1.71 (m, 2H, C7), 1.98 (oct., J = 6.6 Hz, 1H, C5), 2.95 (q, J = 6.6 Hz, 2H, C9), 3.92 (ABq, J = 7.2, νAB = 5.4, 1H, C1), 4.14 (m, 1H, Fmoc), 4.21 (m, 2H, Fmoc), 4.28 (m, 1H, C3), 5.40 (br, 2H, C10NH2), 5.95, (t, J = 5.4 Hz, 1H, C9NH), 7.32 (m, 2H, Fmoc), 7.42 (m, 2H, Fmoc), 7.32 (m, 3H, Fmoc overlapped with C1NH), 7.75 (t, J = 7.8 Hz, 2H, Fmoc), 7.89 (d, J = 7.8 Hz, 2H, Fmoc), 8.20 (d, J = 7.2 Hz, 1H, C2NH), 12.55 (br, 1H, COOH); 13C NMR (150 MHz, DMSO-d6) 18.3 (C6), 19.2 (C6), 26.7 (C7), 28.4 (C8), 30.6 (C5), 38.8 (C9), 46.7 (Fmoc), 51.9 (C3), 59.8 (C1), 64.9 (Fmoc), 65.7 (Fmoc), 125.4 (Fmoc), 127.1 (Fmoc), 127.7 (Fmoc), 140.7 (Fmoc), 143.8 (Fmoc), 143.9 (Fmoc), 156.1 (Fmoc), 158.8 (C10), 171.4, (C4), 173.5 (C2). HRMS (ESI) [M-H+]- found 495.2261, C26H31N4O6 requires 495.2244.
【０４２１】
4.3.9 Fmoc-バリン-シトルリン-PABOH 8
【０４２２】
【化３７】
2015510877.tif 000039
【０４２３】
100 mLの丸底フラスコ中、Fmoc-バリン-シトルリン 7（0.994 g、2 mmol）及びp-アミノベンゾイックアルコール（aminobenzoic alcohol）（PABOH、0.493 g、4 mmol、2当量）を2：1のDCM：MeOH（36 mL）に溶解した。次に、2-エトキシ-1-エトキシカルボニル-1,2-ジヒドロキノリン（EEDQ、0.989 g、4 mmol、2当量）を添加し、16時間撹拌させたままとした。次いで、減圧下で濃縮（40℃）し、Et2O（75 mL）上に懸濁し、5分間超音波処理し、濾過し、集めた固体をEt2Oで洗浄した。減圧下で濃縮して、白色固体として8を生成した（0.958 g、1.59 mmol、80％）。8に関するデータ：IR (ペレット) νmax3275, 2961, 1687, 1640, 1532, 1249, 1032, 739, 521. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) 0.84-0.88 (overlapped d, J = 6.6 Hz, 6H, C6), 1.33-1.45 (2m, 2H, C8), 1.56-1.71 (2m, 2H, C7), 1.98 (oct., J = 6.6 Hz, 1H, C5), 2.90-3.03 (2m, J = 6.6 Hz, 2H, C9), 3.92 (ABq, J = 7.5, νAB = 4.9, 1H, C1), 4.22 (m, 2H, Fmoc), 4.30 (m, 1H, Fmoc), 4.42 (d, J = 4.0 Hz, 3H, C15 overlapped with C1), 5.09 (t, J = 5.5 Hz, 1H, C15OH), 5.40 (br, 2H, C10NH2), 5.95, (t, J = 5.5 Hz, 1H, C9NH), 7.22 (d, J = 8.5 Hz, 2H, C13), 7.31 (t, J = 7.0 Hz, 2H, Fmoc), 7.40 (m, 3H, Fmoc overlapped with C1NH), 7.53 (d, J = 8.0 Hz, 2H, C12), 7.73 (t, J = 7.5 Hz, 2H, Fmoc), 7.88 (d, J = 7.5 Hz, 2H, Fmoc), 8.10 (d, J = 7.5 Hz, 1H, C2NH), 9.97 (br, 1H, C11NH); 13C NMR (150 MHz, DMSO-d6) 18.3 (C6), 19.2 (C6), 26.8 (C7), 29.5 (C8), 30.4 (C5), 38.8 (C9), 46.7 (Fmoc), 53.0 (C3), 60.1 (C1), 62.6 (C15), 65.7 (Fmoc), 118.8 (C12), 120.1 (Fmoc), 125.4 (Fmoc), 126.9 (C13), 127.6 (Fmoc), 137.4 (C11), 137.5 (C14), 140.7 (Fmoc), 143.8 (Fmoc), 143.9 (Fmoc), 156.1 (Fmoc), 158.8 (C10), 170.4, (C4), 171.2 (C2). HRMS (ESI) [M+Na]+ found 624.2788, C33H39N5O6Na requires 624.2798.
【０４２４】
4.3.10 バリン-シトルリン-PABOH 9
【０４２５】
【化３８】
2015510877.tif 000040
【０４２６】
50 mLの丸底フラスコ中、Fmoc-バリン-シトルリン-PABOH 8（1.178 g、1.59 mmol）をDMF（16 mL）に溶解した。次に、ジエチルアミン（3.12 mL、30 mmol、19当量）を添加し、暗所にて16時間撹拌させたままとした。次いで、減圧下で濃縮（40℃）し、DCM（75 mL）上に懸濁し、5分間超音波処理し、濾過して、ガム様固体材料を集め、これをフィルター中、DCMで洗浄した。注記：2回以上の超音波処理サイクルが必要とされ得る。集めた材料をMeOHに溶解して、フィルターから取り出し、減圧下で濃縮して、淡褐色に汚れた（smuged）白色固体として9を生成した（0.477 g、1.25 mmol、79％）。9に関するデータ：IR (ペレット) νmax 3282, 2960, 2871, 1644, 1603, 1538, 1513, 1413, 1310, 1008, 823. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) 0.78-0.88 (2d, J = 6.6 Hz, 6H, C6), 1.32-1.43 (2m, 2H, C8), 1.55-1.70 (2m, 2H, C7), 1.93 (oct., J = 6.6 Hz, 1H, C5), 2.92-3.01 (2m, J = 6.6 Hz, 2H, C9), 3.92 (m, J = 4.8, 1H, C1), 4.42 (d, J = 4.8 Hz, 2H, C15), 4.47 (q, J = 7.2 Hz, 1H, C3), 5.11 (t, J = 5.5 Hz, 1H, C15OH), 5.42 (br, 2H, C10NH2), 5.98, (t, J = 5.5 Hz, 1H, C9NH), 7.23 (d, J = 8.4 Hz, 2H, C13), 7.54 (d, J = 8.4 Hz, 2H, C12), 8.15 (d, J = 7.8 Hz, 1H, C2NH), 10.05 (br, 1H, C11NH); 13C NMR (150 MHz, DMSO-d6) 16.9 (C6), 19.6 (C6), 26.7 (C7), 30.2 (C8), 31.3 (C5), 38.6 (C9), 52.5 (C3), 59.6 (C1), 62.6 (C15), 118.9 (C12), 126.9 (C13), 137.4 (C11), 137.5 (C14), 158.8 (C10), 170.5, (C4), 174.3 (C2). HRMS (ESI) [M+Na]+ found 402.2106, C18H29N5O4Na requires 402.2117.
【０４２７】
4.3.11 DTL-1-バリン-シトルリン-PABOH 10
【０４２８】
【化３９】
2015510877.tif 000041
【０４２９】
アルゴン下、5 mLの丸底フラスコ中、DTL-1（85.7 mg、0.2 mmol）、HOBt（2.6 mg、0.02 mmol、0.1当量）及びHBTU（75 mg、0.2 mmol、1当量）をDMF（0.5 mL）に溶解して、黄色溶液を得た。次に、DIPEA（37.7 μL、0.22 mmol、1.1当量）を添加し、混合物を3分間撹拌した。次いで、バリン-シトルリン-PABOH（76.1 mg、0.2 mmol、1当量）を添加し、暗所にて室温で5時間撹拌した。次いで、減圧下で濃縮し、8：1のDCM：MeOH（90 mL）に再溶解し、濾過した。減圧下で再度濃縮して、黄色固体を生成し、これをDCM：MeOH（9：1 v/v）を用いたシリカでのフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、黄色固体として10を得た（126.8 mg、0.16 mmol、80％）。10に関するデータ：IR (ペレット) νmax 3274, 2933, 2867, 1701, 1633, 1529, 1395, 1213, 1044, 1023, 736, 686. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) 0.82-0.86 (2d, J = 6.6 Hz, 6H, C6), 1.20 (quint., J = 7.2 Hz, 2H, C19), 1.33-1.44 (2m, 2H, C8), 1.49 (overlapped m., 4H, C18 and C20), 1.55-1.70 (2m, 2H, C7), 1.95 (oct., J = 6.6 Hz, 1H, C5), 2.09-2.21 (2m, J = 7.2 Hz, 2H, C17), 2.92-3.01 (2m, J = 6.6 Hz, 2H, C9), 3.38 (t, J = 7.2 Hz, 2H, C21), 4.12 (ABq, J = 7.2, νAB = 4.3, 1H, C1), 4.19 (ABq, J = 8.4, νAB = 10.8, 1H, C3), 4.42 (d, J = 5.4 Hz, 2H, C15), 5.11 (t, J = 5.4 Hz, 1H, C15OH), 5.42 (br, 2H, C10NH2), 5.98, (t, J = 5.4 Hz, 1H, C9NH), 7.21-7.30 (overlapped m, 12H, Ph and C13), 7.54 (d, J = 8.4 Hz, 2H, C12), 7.83 (d, J = 8.4 Hz, 1H, C1NH), 8.08 (d, J = 7.2 Hz, 1H, C2NH), 9.91 (br, 1H, C11NH); 13C NMR (150 MHz, DMSO-d6) 18.2 (C6), 19.3 (C6), 24.9 (C20), 25.3 (C19), 25.8 (C18), 26.9 (C8), 27.6 (C17), 29.4 (C7), 30.4 (C5), 34.9 (C21), 38.4 (C9), 53.1 (C3), 57.6 (C1), 62.6 (C15), 118.9 (C12), 126.9 (C13), 127.9 (Ph), 129.1 (Ph), 129.2 (Ph), 130.7 (Ph), 135.4 (C23), 137.4 (C11), 137.5 (C14), 158.9 (C10), 166.5 (C22), 170.4, (C4), 172.3 (C16), 172.8 (C2). HRMS (ESI) [M+Na]+ found 811.2917, C40H48N6O7S2Na requires 811.2924.
【０４３０】
4.3.12 DTL-1-バリン-シトルリン-PABC-DOX 11
DTL-3-DOX 11
【０４３１】
【化４０】
2015510877.tif 000042
【０４３２】
アルゴン下、10 mLの丸底フラスコ中、DTL-1-バリン-シトルリン-PABOH 10（64.1 mg、0.08 mmol）をピリジン（1.2 mL）に溶解して、黄色溶液を得た。溶液を0℃まで冷却し、DCM（0.8 mL）中、p-ニトロフェニル-クロロホルメート（48.5 mg、0.25 mmol、3当量）を添加した。0℃で10分間撹拌し、次いで室温まで温めて、さらに2時間撹拌した。次いで、EtOAc（20 mL）を添加し、15％クエン酸（3×25 mL）で洗浄した。有機層を乾燥（MgSO4）し、減圧下で濃縮し、DCM：MeOH＝20：1〜15：1（v/v）のグラジエントを用いたシリカゲル60でのカラムクロマトグラフィーにより精製した。得られた中間体DTL-1-バリン-シトルリン-PABC生成物（23.99 mg、0.025 mmol、30％）は、アルゴン下でDMF（1.4 mL）に溶解し、これに塩酸ドキソルビシン（16 mg、0.027 mmol、1.08当量）を添加し、続いてDIPEA（4.8 μL、0.0276 mmol、1.1当量）を添加することにより、次の工程ですぐに使用した。赤色混合物を16時間撹拌した。次いで、減圧下で濃縮（40℃）して、赤色固体を得、これをDCM：MeOH（10：1 v/v）にてシリカゲル60でのカラムクロマトグラフィーにより精製して、赤色固体として11を得た（33 mg、0.24 mmol、97％）。11に関するデータ：IR (ペレット) νmax3324, 2935, 2411, 1704, 1620, 1579, 1519, 1440, 1400, 1284, 1208, 1017, 984, 736, 686. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) 0.80-0.84 (2d, J = 6.6 Hz, 6H, C42), 1.11 (d, J = 6.6 Hz, 2H, C51), 1.20 (quint., J = 7.2 Hz, 2H, C46), 1.32-1.42 (2m, 2H, C36), 1.47 (overlapped m., 4H, C45 and C47), 1.55-1.68 (2m, 2H, C35), 1.83 (dt, J = 13.2, 3.6 Hz, 1H, C4), 1.94 (oct., J = 6.6 Hz, 1H, C41), 2.08-2.12 (m, 2H, C7), 2.09-2.21 (m, J = 7.8 Hz, 2H, C44), 2.92-3.01 (2m, J = 6.6 Hz, 2H, C37), 2.98 (d, J = 18 Hz, 1H, C9), 3.37 (m, 2H, C48 under water peak), 3.43 (m, 1H, C2), 3.71 (m, J = 4.8 Hz, 1H, C3), 3.99 (s, 3H, C24), 4.14 (q, J = 6.6 Hz, 1H, C1), 4.18 (t, J = 7.8 Hz, 1H, C40), 4.34 (q, J = 7.2 Hz, 1H, C34), 4.57 (d, J = 6.0 Hz, 2H, C26), 4.72 (d, J = 5.4 Hz, 1H, C2OH), 4.88 (m, 3 H, C28 overlapped with C26OH), 4.94 (t, J = 4.2 Hz, 1H, C6), 5.22 (d, J = 2.4 Hz, 1H, C5), 5.42 (br, 2H, C38NH2), 5.49 (s, 1H, C8OH), 5.97, (t, J = 5.4 Hz, 1H, C37NH), 6.86 (d, J = 8.4 Hz, 1H, C3NH), 7.21-7.29 (overlapped m, 12H, Ph overlapped with C30), 7.54 (d, J = 8.4 Hz, 2H, C31), 7.67 (dd, J = 6.0, 3.0 Hz, 1H, C17), 7.82 (d, J = 8.4 Hz, 1H, C40NH), 7.92 (m, 2H, overlapped C18 and C19), 8.09 (d, J = 7.2 Hz, 1H, C39NH), 9.97 (br, 1H, C33NH), 13.30 (br, 1H, C12OH), 14.05 (br, 1H, C23OH); 13C NMR (150 MHz, DMSO-d6) 17.1 (C51), 18.2 (C42), 19.3 (C42), 24.9 (C47), 25.8 (C46), 26.8 (C36), 27.6 (C45), 29.3 (C35), 29.8 (C4), 30.4 (C41), 32.1 (C9), 34.9 (C44 close to C7), 36.7 (C48), 38.2 (C37), 47.1 (C3), 53.1 (C34), 56.6 (C24), 57.5 (C40), 63.7 (C26), 64.9 (C28), 66.4 (C1), 67.9 (C2), 69.9 (C6), 74.9 (C8), 100.3 (C5), 110.7 (C22), 110.9 (C13), 118.9 (C31), 119.1 (C17), 119.8 (C19), 120.1 (C15), 128.0 (Ph), 128.6 (C30), 129.0 (Ph), 129.2 (Ph), 130.7 (Ph), 131.8 (C32), 134.2 (C11), 134.7 (C10), 135.4 (C50), 135.6 (C20), 136.3 (C18), 154.5 (C23), 155.3 (C12), 156.1 (C29), 158.9 (C38), 160.8 (C16), 166.5 (C49), 170.6, (C33), 171.3 (C39 close to C43), 172.3 (C27), 168.6 (C21), 168.7 (C14), 213.9 (C25). HRMS (ESI) [M+Na]+ found 1380.4388, C68H75N7O19S2Na requires 1380.4457.
【０４３３】
4.3.13 N-プロパルギル-3,4-ジチオフェノールマレイミド（N-アルキン ジチオフェノールマレイミド）
【０４３４】
【化４１】
2015510877.tif 000043
【０４３５】
プロパルギルアミン（0.009 mL、0.135 mmol）を、N-メトキシカルボニル-3,4-ジチオフェノールマレイミド（50 mg、0.135 mmol）のジクロロメタン（6 mL）撹拌溶液に添加した。2時間後、シリカを添加し、得られた混合物を一晩撹拌した。次いで、これを濾過し、濃縮し、粗残留物（crude residue）をカラムクロマトグラフィーにより精製して、黄色オイルとして標題化合物を生成した（46.5 mg、0.132 mmol、98％）。dH (CDCl3, 600MHz) 7.30 (2H, t, J = 7.2 Hz, ArH), 7.26 (4H, t, J = 7.2 Hz, ArH), 7.22 (4H, d, J = 7.2 Hz, ArH), 4.26 (2H, d, J = 2.3 Hz, CH2), 2.21 (1H, t, J = 2.3 Hz, CH); dC (CDCl3, 150 MHz) 165.6 (s), 136.0 (s), 131.9 (d), 129.1 (d), 128.8 (s), 128.7 (d), 76.9 (s), 71.9 (d), 27.7 (t); HRMS: Mass calculated for C19H13O2NS2: 351.03822, observed: 351.03865.
【０４３６】
4.3.14 14-アジド-N-（（2S,3S,4S,6R）-3-ヒドロキシ-2-メチル-6-（（（1S,3S）-3,5,12-トリヒドロキシ-3-（2-ヒドロキシアセチル）-10-メトキシ-6,11-ジオキソ-1,2,3,4,6,11-ヘキサヒドロテトラセン-1-イル）オキシ）テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル）-3,6,9,12-テトラオキサテトラデカン-1-アミド（アジド-PEG4-DOX）
【０４３７】
【化４２】
2015510877.tif 000044
【０４３８】
14-アジド-3,6,9,12-テトラオキサテトラデカン-1-酸（4.4 mg、16 μmol）及びDIPEA（6.2 μL、35 μmol）のDMF（1 mL）溶液にHBTU（6.7 mg、18 μmol）を添加し、反応混合物を21℃で5分間撹拌した。この時間の後、ドキソルビシン（9.3 mg、16 μmol）を添加し、反応混合物を21℃で3時間撹拌した。次いで、反応混合物をH2O（10 mL）及びDCM（10 mL）で希釈し、DCM（3×15 mL）で抽出し、合わせた有機層を飽和LiCl水溶液（2×10 mL）及び酢酸塩バッファーpH 5で洗浄し、乾燥（MgSO4）し、減圧下（in vacuo）で濃縮した。粗残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（5％MeOH/EtOAc）により精製して、赤色固体として14-アジド-N-（（2S,3S,4S,6R）-3-ヒドロキシ-2-メチル-6-（（（1S,3S）-3,5,12-トリヒドロキシ-3-（2-ヒドロキシアセチル）-10-メトキシ-6,11-ジオキソ-1,2,3,4,6,11-ヘキサヒドロテトラセン-1-イル）オキシ）テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル）-3,6,9,12-テトラオキサテトラデカン-1-アミドを得た（9 mg、11 μmol、70％）。1H NMR (600 MHz, MeOD) d 13.84 (1H, s), 13.05 (1H, s), 7.79 (1H, d, J = 7.5 Hz), 7.75 (1H, apt. t, J = 7.9 Hz), 7.48 (1H, d, J = 8.3 Hz), 5.38 - 5.42 (1H, m), 5.03 - 5.07 (1H, m), 4.74 (2H, d, J = 5.3 Hz), 4.29 (1H, q, J = 6.4 Hz), 4.18 - 4.23 (1H, m), 3.99 (3H, s), 3.58 - 3.70 (17H, m), 3.35 (2H, t, J = 5.3 Hz), 3.01 (1H, d, J = 18.4 Hz), 2.84 (1H, d, J = 18.4 Hz), 2.35 (1H, d, J = 14.3 Hz), 2.11 - 2.17 (1H, m), 2.00 (1H, m), 1.77 (1H, dd, J = 13.2, 4.5 Hz), 1.26 (3H, d, J = 6.8 Hz); 13C NMR (150 MHz, MeOD) d 214.8 (C), 187.9 (C), 187.6 (C), 172.0 (C), 162.4 (C), 157.3 (C), 156.1 (C), 137.2 (CH), 136.2 (C), 135.7 (C), 135.1 (C), 121.4 (C), 120.5 (CH), 120.2 (CH), 112.3 (C), 112.1 (C), 102.1 (CH), 77.3 (C), 71.9 (CH2), 71.6 (CH2), 71.5 (CH2), 71.5 (CH2), 71.3 (CH2), 71.2 (CH2), 71.1 (CH), 71.0 (CH2), 69.8 (CH), 68.6 (CH), 65.7 (CH2), 57.1 (CH3), 51.7 (CH2), 46.7 (CH), 37.3 (CH2), 34.0 (CH2), 30.7 (CH2), 17.3 (CH3)
【０４３９】
4.4 in situ架橋及びドキソルビシンでの機能化
トラスツズマブを限外濾過（MWCO 10 kDa）によりホウ酸塩バッファー（25 mMホウ酸ナトリウム、25 mM NaCl、1 mM EDTA、pH 8.0）へと移し、以下のin situプロトコルで処理した。A）15％DMF中、20当量のN-アルキン-ジチオフェノールマレイミド+10当量のベンゼンセレノールで周囲温度にて1時間。B）15％DMF中、20当量のN-アルキン-ジチオフェノールマレイミド+10当量のベンゼンセレノールで周囲温度にて30分間、次いで10当量のベンゼンセレノールでさらに30分間。C）15％DMF中、10当量のN-アルキン-ジチオフェノールマレイミド+7当量のTCEPで37℃にて2時間。D）15％DMF中、15当量のN-アルキン-ジチオフェノールマレイミド+10当量のTCEPで37℃にて2時間。反応は、全てのサンプルにおいて、20当量のマレイミド（DMF中）で停止し、限外濾過（MWCO 10 kDa）によりPBS（pH 7.4）へと精製した。UV/Vis（ε280＝210,000 cm-1M-1）により濃度を測定し、抗体を30 μMに希釈した後、サンプルは全て、150 μM CuSO4、750 μM THPTA、5 mM 塩酸アミノグアニジン及び5 mMアスコルビン酸ナトリウムの存在下、30当量のアジド-PEG4-DOXで処理した。A）を90分間のみ反応させた以外は、反応物を22℃で18時間インキュベートした。サンプルは全て、サイズ排除クロマトグラフィー（HiLoad Sephadex 75 16/60カラム（GE Healthcare）、PBSで平衡化）により精製し、下記式：
【０４４０】
【化４３】
2015510877.tif 000045
【０４４１】
を介して、薬物抗体比（DAR）をUV/Visにより計算した。
【０４４２】
【表２】
2015510877.tif 000046
【０４４３】
結果を図43に示す。
【０４４４】
4.5 キャピラリーゲル電気泳動によるADC分析
キャピラリーゲル電気泳動を用いて、ジスルフィド結合に基づく機能化により誘導される断片化を定量した。0、1、2、3及び4のDAR（ドキソルビシンのもの）を有する抗体サンプルを、「in situ架橋及びドキソルビシンでの機能化」で概要を示すように調製した。さらに、ハーセプチンの還元シリーズを、該抗体（25 mMホウ酸ナトリウム、25 mM NaCl、1 mM EDTA、pH 8.0中）を0、1、2、3、4、5、6又は7当量のTCEPで37℃、2時間処理することにより調製した。反応後、全てのサンプルを20当量のマレイミド（DMF中）でアルキル化し、限外濾過（MWCO 10 kDa）によりPBS（pH 7.4）へと移した。
【０４４５】
PEREGRINE Iマシン（deltaDOT）でCGE分析を実施した。SDS-MWサンプルバッファー（Proteome Lab）中、サンプルを1 mg/mlに希釈し、65℃まで20分間加熱した。簡単に遠心分離した後、50 μlをサンプルバイアルへと移し、マシンへロードした。
【０４４６】
分離は、直径50 μmのフューズドシリカキャピラリーにて22℃で実施した。分離長は20.2 cmであり、ランタイムは45分間であり、抗体断片は214 nmの波長で検出した。サンプルをロードする前に、5 psi/16 kVにて、キャピラリーを0.1 M HCl、水及びランバッファーで流した。ランバッファーからノイズを3分間記録した。比較に基づく断片の同定を検証するために、タンパク質サイズ標準（protein sizing standard）（Beckman Coulter）を使用した。
【０４４７】
データ分析は、EVAソフトウェア（version 3.1.7, deltaDOT）を用いて実施した。ランファイルをロードし、GSTアルゴリズムを用いて、頻度＝40、感度＝1で分析した。GSTピークサーチは、質量によるピークの同定と、非修飾、部分的及び完全還元抗体サンプル間での比較とに基づき、13分と32分の間（8,000〜20,000スキャン）で実施した。HHLL、HHL、HH、HL、H及びL抗体種に対応するピークは、必要に応じて手動で追加し、全てのシグナルについてピーク面積の境界を調整した。ピーク面積（吸光度）は、抗体断片のサイズに応じて変わるので、正規化プロセスを確立した。
【０４４８】
完全抗体の吸光度と完全に分解された抗体（H及びL断片のみ）の吸光度との間の補正因子を計算した。この因子は、ジスルフィド結合の状態に応じて、残りの断片（HHL、HH、HL）の面積を補正するために調整し、例えば、75％のジスルフィド結合がインタクトであると想定される場合には、補正因子の25％のみをHHL断片のピーク面積に適用した。還元シリーズのサンプルに基づき正規化を確立し、様々なDARを有するサンプルに移した。さらに、観察された非修飾抗体の断片化もバックグラウンドとして減算して、誘導された断片化を計算し、これは、ADC合成間の抗体ジスルフィド結合の機能化のみに基づく。分析により、全てのADCが、＞67％の完全に再架橋された抗体を含むことが示された（図59参照）。
【０４４９】
4.6 トラスツズマブのベンゼンセレノール系in situ機能化の部位特異性
2.0（サンプルB）及び3.1（サンプルC）のDARを有するトラスツズマブ-DOXコンジュゲートを、「in situ架橋及びドキソルビシンでの機能化」で概要を示すように調製した。限外濾過（MWCO 5 kDa）によりホウ酸塩バッファー（pH 8.0）にバッファー交換した後、これらを、非修飾抗体とともに、3、5又は7当量のTCEPで37℃、2時間処理した。図44に示すように、得られた断片化をSDS-PAGEにより可視化した。ゲルにより、重-軽（heavy-light）相互作用は、ベンゼンセレノールにより媒介されるマレイミド架橋の後、還元条件に対して安定化されることが示される。これは、ベンゼンセレノールにより媒介される、トラスツズマブのマレイミド架橋が、重-軽鎖間ジスルフィド結合を標的とすることを示す。
【０４５０】
4.7 トラスツズマブ-DOXコンジュゲートの消化
2.0のDARを有するトラスツズマブ-DOXコンジュゲート（サンプルB）を、「in situ架橋及びドキソルビシンでの機能化」で概要を示すように調製した。限外濾過（MWCO 10 kDa）によるバッファー交換（20 mM酢酸ナトリウム、pH 3.1へ）を介して、サンプルのpHを低下させた。固定化ペプシン（0.15 mL）を同じバッファーで4回洗浄し、トラスツズマブ-DOX（0.45 mL、3.19 mg/mL）を添加した。一定撹拌下（1,100 rpm）、混合物を37℃、5時間インキュベートした。フィルターカラムを用いて、消化物から樹脂を分離し、消化バッファー（50 mMリン酸ナトリウム、150 mM NaCl、1 mM EDTA、pH 6.8）で3回洗浄した。消化物を洗浄物と合わせ、体積を0.5 mLに調整した。
【０４５１】
次に、固定化パパイン（0.5 mL, 0.25 mg/mL）を、アルゴン雰囲気下及び一定撹拌（1,100 rpm）下、10 mMのDTT（消化バッファー中）で暗所にて25℃、1時間活性化した。樹脂を消化バッファー（DTT不含）で4回洗浄し、0.5 mLのトラスツズマブ-DOX-Fab2溶液を添加した。混合物を、一定撹拌（1,100 rpm）下、暗所にて37℃、16時間インキュベートした。フィルターカラムを用いて消化物から樹脂を分離し、PBS（pH 7.0）で3回洗浄し、消化物を洗浄物と合わせた。限外濾過（MWCO 10 kDa）によりバッファーをPBSに完全に交換し、体積を0.3 mLに調整した。並行して、非修飾トラスツズマブサンプルをコントロールとして「処理した（processed）」。
【０４５２】
SDS-PAGEによりサンプル及びコントロールを分析した（図45参照）。HER-Fab-DOXの薬物ローディングは、UV/Vis（ε280＝68,560 cm-1M-1）により評価した。消化前のインタクト材料は、2.06のDARを有した。単離したFab-DOXは0.79のDARを有したことから、薬物のおよそ77％が、抗体Fab領域を標的化したことが示唆される。
【０４５３】
4.8ドキソルビシン化合物での直接的架橋及び機能化
トラスツズマブ（平均MW 147000）及びトラスツズマブFab（ES-MSによるMW 47662）の機能化は、システインコンジュゲーションを介して即時にジスルフィド架橋できる試薬を含むドキソルビシンを用いた、3つの異なるプロトコルを介して実施した。前記試薬の構造は、以下を含む：2重コンジュゲーションに利用可能な2,3-ジチオ-マレイミドコンジュゲーション部位；N、Oなどのヘテロ原子も含めたC6とC25との間のN-機能化スペーサーユニットであって、直鎖又は分枝鎖ファクション（faction）に配置される、アルキル、アリール、アミド、尿素及びカルバミドの範囲に及ぶ構造要素から選択され、加水分解安定性、及び／又は薬物放出のための自壊的（self-immolative）スペーサーを提供するよう調節されたもの；安定構造のスペーサー又は薬剤放出のための自壊的スペーサーに結合されるドキソルビシン。トラスツズマブ又はトラスツズマブFabへのコンジュゲーションのために、それぞれ、DMF中、9.16 mM又は0.916 mM溶液として調製した架橋試薬DTL-1DOX、DTL-2-DOX及びDTL-3-DOXを用いて例証する。化合物の特徴を含むそれらの合成の詳細を以下に示す。
【０４５４】
3つのプロトコルは以下のとおり称する：
段階的：ここでは、抗体又は抗体断片は、そのアクセス可能なジスルフィド結合を還元され、次いで、還元剤の除去を受け、それに続いて、選択した架橋試薬が添加される。
連続的：ここでは、抗体又は抗体断片は、そのアクセス可能なジスルフィド結合を還元され、それに続いて、予め還元剤を除去することなく、架橋試薬がすぐに添加される。
in situ：ここでは、抗体又は抗体断片は、還元と架橋を同時に提供するため、開始から還元剤と架橋試薬の両方が存在する間に還元される。
【０４５５】
4.8.1 トラスツズマブmAbの段階的修飾
限外濾過（MWCO 10 kDa）により、トラスツズマブをホウ酸塩バッファー（25 mMホウ酸ナトリウム、25 mM NaCl、1 mM EDTA、pH 8.0）へと移し、濃度を22.9 μMに補正した。この溶液を400 rpmで振盪させながら、37℃、2時間TCEP（7当量）で処理した。次いで、過剰なTCEPと分離するために、製造者のプロトコルに従って、上記ホウ酸塩バッファーで平衡化したPD-G25バッファースワッピングカラムを介してこの溶液を溶出した。UV/Vis（ε280＝210,000 cm-1M-1）により濃度を評価し、濃縮して22.9 μMに戻した。次に、溶液を200 μL（0.00397 μmol）ポーションに分割（aliquoted）し、これに以下の溶液（9.16 mM）を2.17 μL添加した：A）DMF（20 μL）に希釈したDTL-1-DOX（5当量）（4℃で保持）；B）DMF（20 μL）に希釈したDTL-2-DOX（5当量）（400 rpmで振盪させながら37℃で保持）；C）DMF（20 μL）に希釈したDTL-3-DOX（5当量）（400 rpmで振盪させながら37℃で保持）。D）架橋試薬を添加せずDMF（22.17 μL）のみ（400 rpmで振盪させながら37℃で保持）。架橋試薬とのDMFの添加は、バッファー系について10％DMF（v/v）組成を保証した。添加30分後に、各反応物からサンプル（5 μL）を取り出し、マレイミド（20当量）でクエンチし、SDS-PAGEゲル分析のために取っておいた。限外濾過と希釈による少なくとも6サイクルの濃縮を用いた限外濾過（MWCO 10 kDa）により、反応混合物をすぐにリン酸塩バッファー（70 mMリン酸塩、1 mM EDTA、pH 6.8）にバッファー交換した。回収した抗体の収率とDAR（上記式に従う）を測定する目的で、精製した材料をUV/Visにより分析した。SDS-PAGEゲルによる分析も実施した（図46参照）。
【０４５６】
【表３】
2015510877.tif 000047
【０４５７】
4.8.2 トラスツズマブmAbの連続的修飾
4.8.2.1 DTL1-DOX及びDTL2-DOXでのトラスツズマブの連続的修飾
限外濾過（MWCO 10 kDa）により、トラスツズマブをホウ酸塩バッファー（25 mMホウ酸ナトリウム、25 mM NaCl、1 mM EDTA、pH 8.0）へと移し、濃度を22.9 μMに補正した。この溶液を400 rpmで振盪させながら、37℃、2時間TCEP（7当量）で処理した。次に、溶液を200 μL（0.004576 μmol）ポーションに分割し、これに以下の溶液（9.16 mM）を2.50 μL添加した：A）DMF（19.7 μL）に希釈したDTL-1-DOX（5当量）（4℃で保持）；B）DMF（19.7 μL）に希釈したDTL-2-DOX（5当量）（400 rpmで振盪させながら37℃で保持）；C）架橋試薬を添加せずDMF（22.17 μL）のみ（4℃で反応）；D）架橋試薬を添加せずDMF（22.17 μL）のみ（37℃で反応）。架橋試薬とのDMFの添加は、バッファー系について10％DMF（v/v）組成を保証した。添加30分後に、各反応物からサンプル（5 μL）を取り出し、マレイミド（20当量）でクエンチし、SDS-PAGEゲル分析のために取っておいた。限外濾過と希釈による少なくとも6サイクルの濃縮を用いた限外濾過（MWCO 10 kDa）により、反応混合物をすぐにリン酸塩バッファー（70 mMリン酸塩、1 mM EDTA、pH 6.8）にバッファー交換した。回収した抗体の収率とDAR（上記式に従う）を測定する目的で、精製した材料をUV/Visにより分析した。SDS-PAGEゲルによる分析も実施した（図47参照）。
【０４５８】
4.8.2.2 DTL3-DOXでのトラスツズマブの連続的修飾
還元トラスツズマブのアリコート（200 μL、0.004576 μmol）をセクション4.7.2.1に記載するように調製した。DMF（19.7 μL）に希釈したDTL-3-DOX（20当量）を添加し、混合物を400 rpmで振盪させながら25℃で保持した。添加30分後に、反応物からサンプル（5 μL）を取り出し、マレイミド（20当量）でクエンチし、SDS-PAGEゲル分析のために取っておいた。限外濾過と希釈による少なくとも6サイクルの濃縮を用いた限外濾過（MWCO 10 kDa）により、反応混合物をすぐにリン酸塩バッファー（70 mMリン酸塩、1 mM EDTA、pH 6.8）にバッファー交換した。回収した抗体の収率とDAR（上記式に従う）を測定する目的で、精製した材料をUV/Visにより分析した。SDS-PAGEゲルによる分析も実施した（図48参照）。
【０４５９】
【表４】
2015510877.tif 000048
【０４６０】
4.8.3 トラスツズマブmAbのin situ修飾
限外濾過（MWCO 10 kDa）により、トラスツズマブをホウ酸塩バッファー（25 mMホウ酸ナトリウム、25 mM NaCl、1 mM EDTA、pH 8.0）へと移し、濃度を22.9 μMに補正した。この溶液を、以下の架橋試薬及びDMF（バッファー系の10％DMF（v/v）組成を保証するため）の存在下、400 rpmで振盪させながら、37℃、2時間TCEP（7当量）で処理した：A）DTL-1-DOX（10当量）（400 rpmで振盪させながら37℃で保持）；B）DTL-2-DOX（10当量）（400 rpmで振盪させながら37℃で保持）；C）DTL-3-DOX（10当量）（400 rpmで振盪させながら37℃で保持）。D）架橋試薬を添加せずDMFのみ（37℃で反応）。2時間後、各反応物からサンプル（5 μL）を取り出し、マレイミド（20当量）でクエンチし、SDS-PAGEゲル分析のために取っておいた。限外濾過と希釈による少なくとも6サイクルの濃縮を用いた限外濾過（MWCO 10 kDa）により、反応混合物をすぐにリン酸塩バッファー（70 mMリン酸塩、1 mM EDTA、pH 6.8）にバッファー交換した。回収した抗体の収率とDAR（上記式に従う）を測定する目的で、精製した材料をUV/Visにより分析した。選択したケースについて、MALDI-TOFによる分析も実施した。SDS-PAGEゲルによる分析も実施した（図49参照）。
【０４６１】
【表５】
2015510877.tif 000049
【０４６２】
4.8.4 トラスツズマブFabの段階的修飾
限外濾過（MWCO 10 kDa）により、トラスツズマブFabをホウ酸塩バッファー（25 mMホウ酸ナトリウム、25 mM NaCl、1 mM EDTA、pH 8.0）へと移し、濃度を22.9 μMに補正した。この溶液を400 rpmで振盪させながら、37℃、2時間TCEP（3当量）で処理した。次いで、過剰なTCEPと分離するために、製造者のプロトコルに従って、上記ホウ酸塩バッファーで平衡化したPD-G25バッファースワッピングカラムを介してこの溶液を溶出した。UV/Vis（ε280＝68590 cm-1M-1）により濃度を評価し、濃縮して22.9 μMに戻した。次に、溶液を100 μL（0.00229 μmol）ポーションに分割し、これに以下の溶液（0.916 mM）を12.5 μL添加した：A）DTL-1-DOX（5当量）（400 rpmで振盪させながら25℃で保持）；B）DTL-2-DOX（5当量）（400 rpmで振盪させながら25℃で保持）；C）DTL-3-DOX（5当量）（400 rpmで振盪させながら25℃で保持）。D）架橋試薬を添加せずDMF（12.5 μL）のみ（400 rpmで振盪させながら25℃で保持）。E）バッファー系について10％DMF（v/v）組成を保証するDMF中、架橋試薬を添加。添加30分後に、各反応物からサンプル（5 μL）を取り出し、マレイミド（20当量）でクエンチし、SDS-PAGEゲル分析のために取っておいた。反応混合物をすぐにPBSで400 μLに希釈し、EtOAc（2×200 μL）で抽出して、過剰な架橋試薬を除去した。限外濾過と希釈による少なくとも4サイクルの濃縮を用いた限外濾過（MWCO 10 kDa）により、Fab ADCを有する水層をリン酸塩バッファー（70 mMリン酸塩、1 mM EDTA、pH 6.8）にバッファー交換した。回収した抗体の収率とDAR（上記式に従う）を測定する目的で、精製した材料をUV/Visにより分析した（先の完全トラスツズマブε280を上記トラスツズマブFabの値に交換する）。LCMSによる分析も実施した（図51参照）。SDS-PAGEゲルによる分析も実施した（図50参照）。
【０４６３】
【表６】
2015510877.tif 000050
【０４６４】
4.8.5 トラスツズマブFabの連続的修飾
限外濾過（MWCO 10 kDa）により、トラスツズマブFabをホウ酸塩バッファー（25 mMホウ酸ナトリウム、25 mM NaCl、1 mM EDTA、pH 8.0）へと移し、濃度を22.9 μMに補正した。この溶液を400 rpmで振盪させながら、37℃、2時間TCEP（3当量）で処理した。次に、溶液を100 μL（0.00229 μmol）ポーションに分割し、これに以下の溶液（0.916 mM）を12.5 μL添加した：A）DTL-1-DOX（5当量）（400 rpmで振盪させながら25℃で保持）；B）DTL-2-DOX（5当量）（400 rpmで振盪させながら25℃で保持）；C）DTL-3-DOX（5当量）（400 rpmで振盪させながら25℃で保持）。D）架橋試薬を添加せずDMF（12.5 μL）のみ（400 rpmで振盪させながら25℃で保持）。E）TCEPの不在下、400 rpmで振盪させながら25℃で2時間、ホウ酸塩バッファー中でインキュベートしたFabを、25℃、400 rpmで振盪させながら、DTL-1-DOX（5当量）、10％（v/v）DMFで処理した。DMF中の架橋試薬の添加は、バッファー系について10％DMF（v/v）組成を保証した。添加30分後に、各反応物からサンプル（5 μL）を取り出し、マレイミド（20当量）でクエンチし、SDS-PAGEゲル分析のために取っておいた。反応混合物をすぐにPBSで400 μLに希釈し、EtOAc（2×200 μL）で抽出して、過剰な架橋試薬を除去した。限外濾過と希釈による少なくとも4サイクルの濃縮を用いた限外濾過（MWCO 10 kDa）により、Fab ADCを有する水層をリン酸塩バッファー（70 mMリン酸塩、1 mM EDTA、pH 6.8）にバッファー交換した。回収した抗体の収率とDAR（上記式に従う）を測定する目的で、精製した材料をUV/Visにより分析した（先の完全トラスツズマブε280を上記トラスツズマブFabの値に交換する）。LCMSによる分析も実施した（図53参照）。SDS-PAGEゲルによる分析も実施した（図52参照）。
【０４６５】
コントロール実験D）及びE）から明らかなとおり、架橋試薬は、Fabを再形成するために必要であり（SDS-PAGEゲル参照）、Fabがコンジュゲーション前に還元されない限り、架橋試薬の付加は生じない（SDS-PAGEゲル及びDARテーブル参照）。
【０４６６】
【表７】
2015510877.tif 000051
【０４６７】
4.8.6 トラスツズマブFabのin situ修飾
限外濾過（MWCO 10 kDa）により、トラスツズマブFabをホウ酸塩バッファー（25 mMホウ酸ナトリウム、25 mM NaCl、1 mM EDTA、pH 8.0）へと移し、濃度を22.9 μMに補正した。この溶液を、以下の架橋試薬及びDMF（バッファー系の10％DMF（v/v）組成を保証するため）の存在下、400 rpmで振盪させながら、37℃、2時間TCEP（3当量）で処理した：A）DTL-1-DOX（5当量）；B）DTL-2-DOX（5当量）；C）DTL-3-DOX（5当量）。D）架橋試薬を添加せずDMFのみ添加した。2時間後、各反応物からサンプル（5 μL）を取り出し、マレイミド（20当量）でクエンチし、SDS-PAGEゲル分析のために取っておいた。反応混合物をすぐにPBSで400 μLに希釈し、EtOAc（2×200 μL）で抽出して、過剰な架橋試薬を除去した。限外濾過と希釈による少なくとも4サイクルの濃縮を用いた限外濾過（MWCO 10 kDa）により、Fab ADCを有する水層をリン酸塩バッファー（70 mMリン酸塩、1 mM EDTA、pH 6.8）にバッファー交換した。回収した抗体の収率とDAR（上記式に従う）を測定する目的で、精製した材料をUV/Visにより分析した（先の完全トラスツズマブε280を上記トラスツズマブFabの値に交換する）。LCMSによる分析も実施した（図55参照）。SDS-PAGEゲルによる分析も実施した（図54参照）。
【０４６８】
【表８】
2015510877.tif 000052
【０４６９】
4.9 トラスツズマブADCについてのELISAアッセイ
3つ全てのプロトコルによりコンジュゲート化した、DTL-1-DOX、DTL-2-DOX及びDTL-3-DOXとのトラスツズマブADC及びトラスツズマブFab ADCについてELISAアッセイを実施した；結果を図56〜58に示す。ELISAアッセイのための典型的プロトコル：96ウェルプレートを0.25 μg/mLのHer2（100 μL）でコーティングした（ネガティブPBSコントロールのための列を含む）。コーティングを室温で2時間放置した後、200 μLの1％BSA溶液で4℃、一晩ブロッキングした。翌日、試験サンプルの希釈系列（30 nM、10 nM、3.33 nM、1.11 nM、0.37 nM、0.12 nM）とともに室温にて1時間インキュベーションした。次いで、PBS中に希釈した検出抗体（抗ヒトIgG, Fab特異的-HRP）とともに1時間インキュベートし、最後に、過ホウ酸ナトリウムを有するリン酸塩-クエン酸塩バッファー中のo-フェニレンジアミン塩酸塩（10 mg/20 mL）を100 μL添加した。4 M HCl（50 μL）で酸性化することにより反応を停止した。490 nmで吸光度を測定した。マレイミド架橋トラスツズマブADCの結合は、標的Her2抗原に対して維持された。
【０４７０】
5. ピリダジンジオンでの抗体修飾
5.1 ピリダジンジオン試薬合成
5.1.1 1-アジド-4-メチルベンゼン
【０４７１】
【化４４】
2015510877.tif 000053
【０４７２】
p-トルイジン（2.0 g、18.4 mmol）の2N HCl（28 mL）溶液に、亜硝酸ナトリウム（1.5 g、22.4 mmol）のH2O（5 mL）溶液を-5℃にて5分間にわたり徐々に添加し、内部温度が0℃を超えないことを確認した。添加完了後、反応混合物を-5℃で5分間撹拌して、ジアゾニウム塩を形成した。次いで、尿素（130 mg、2.2 mmol）を添加して、ジアゾニウム塩溶液を中和した。この後、ジアゾニウム塩溶液を、アジ化ナトリウム（2.4 g、37.2 mmol）及び酢酸ナトリウム（4.6 g、56 mmol）のH2O（30 mL）溶液に、0℃にて5分間にわたり添加した。混合物を0℃で2時間撹拌した。混合物をEt2O（2×60 mL）へ抽出し、合わせた有機層を乾燥（MgSO4）し、減圧下で濃縮して、黄色オイルとして1-アジド-4-メチルベンゼンを得た（2.3 g、17.3 mmol、94％）：1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.15 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.92 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 2.33 (s, 3H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 137.2 (CH), 134.7 (CH), 130.4 (CH), 118.9 (CH), 21.0 (CH3).
【０４７３】
5.1.2 1-アジド-4-（ブロモメチル）ベンゼン
【０４７４】
【化４５】
2015510877.tif 000054
【０４７５】
1-アジド-4-メチルベンゼン（0.85 g、6.4 mmol）、N-ブロモスクシンイミド（1.5 g、8.3 mmol）及びアゾビス（イソブチロニトリル）（0.31 g、1.9 mmol）の乾燥ベンゼン（20 mL）溶液を、アルゴン下、暗所にて8時間加熱還流した。この時間の後、混合物をH2O（20 mL）へ注ぎ、Et2O（2×20 mL）へ抽出し、合わせた有機層を乾燥（MgSO4）し、減圧下で濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（ニートペトロール（neat petrol））による精製により、淡褐色固体として1-アジド-4-（ブロモメチル）ベンゼンを生成した（1.1 g、5.1 mmol、80％）：1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.38 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.00 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 4.48 (s, 2H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 140.3 (CH), 134.6 (CH), 130.7 (CH), 119.5 (CH), 33.0 (CH2); HRMS (ES+) calcd for C7H6N3Br [M79Br+H]+  211.9740, observed 211.9743.
【０４７６】
5.1.3 ジ-tert-ブチル 1-（プロプ-2-イン-1-イル）ヒドラジン-1,2-ジカルボキシレート
【０４７７】
【化４６】
2015510877.tif 000055
【０４７８】
トルエン（2 mL）及び5％NaOH水溶液（2 mL）の混合物中、ジ-tert-ブチル ヒドラジン-1,2-ジカルボキシレート（300 mg、1.29 mmol）の溶液に、テトラ-n-ブチルアンモニウム ブロミド（13 mg、0.03 mmol）及びプロパルギルブロミド（461 mg、3.87 mmol）を添加した。反応混合物を21℃で16時間撹拌した。この時間の後、H2O（20 mL）を添加し、混合物を酢酸エチル（3×15 mL）で抽出した。合わせた有機層をブライン（15 mL）で洗浄し、乾燥（MgSO4）し、減圧下で濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（20％EtOAc/ペトロール）による精製により、白色固体としてジ-tert-ブチル 1-（プロプ-2-イン-1-イル）ヒドラジン-1,2-ジカルボキシレートを生成した（435 mg、1.61 mmol、85％）：m.p. 103-104 ℃ (lit. m.p. 103.1-103.4 ℃)エラー! ブックマークが定義されていません。 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.47 (br s, 0.78H), 6.18 (br s, 0.22H,), 4.27 (s, 2H), 2.24 (t, J = 2.4 Hz, 1H), 1.48 (s, 18H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 155.0 (C), 82.2 (C), 81.7 (C), 79.0 (C), 77.7 (C), 72.5 (CH), 39.5 (CH2), 28.5 (CH3), 28.5 (CH3).
【０４７９】
5.1.4 ジ-tert-ブチル 1-（4-アジドベンジル）-2-（プロプ-2-イン-1-イル）ヒドラジン-1,2-ジカルボキシレート
【０４８０】
【化４７】
2015510877.tif 000056
【０４８１】
ジ-tert-ブチル 1-（プロプ-2-イン-1-イル）ヒドラジン-1,2-ジカルボキシレート（200 mg、0.70 mmol）のDMF（10 mL）溶液に、炭酸セシウム（480 mg、1.50 mmol）及び1-アジド-4-（ブロモメチル）ベンゼン（230 mg、1.10 mmol）を添加した。反応混合物を21℃で16時間撹拌した。この時間の後、反応混合物をH2O（20 mL）で希釈し、EtOAc（3×20 mL）で抽出した。合わせた有機層をブライン（15 mL）で洗浄し、乾燥（MgSO4）し、減圧下で濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（20％Et2O/ペトロール）による精製により、粘性の暗黄色液体としてジ-tert-ブチル 1-（4-アジドベンジル）-2-（プロプ-2-イン-1-イル）ヒドラジン-1,2-ジカルボキシレートを得た（261 mg、0.65 mmol、93％）：1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.38 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.97 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.63-3.98 (m, 4H), 2.19 (t, J = 2.4 Hz, 1H), 1.47 (s, 11H), 1.30 (s, 9H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) d 154.6 (C), 154.3 (C), 139.5 (C), 133.6 (C), 131.4 (CH), 118.9 (CH), 81.7 (C), 81.6 (C), 78.5 (C), 72.9 (CH), 52.6 (CH2), 39.3 (CH2), 28.3 (CH3), 28.1 (CH3); HRMS (CI) calcd for C20H27N5O4Na [M+Na]+424.1961, observed 424.1965.
【０４８２】
5.1.5 1-（4-アジドベンジル）-4,5-ジブロモ-2-（プロプ-2-イン-1-イル）-1,2-ジヒドロピリダジン-3,6-ジオン
【０４８３】
【化４８】
2015510877.tif 000057
【０４８４】
ジ-tert-ブチル 1-（4-アジドベンジル）-2-（プロプ-2-イン-1-イル）ヒドラジン-1,2-ジカルボキシレート（1.8 g, 4.5 mmol）のCH2Cl2（55 mL）溶液に、TFA（18 mL）を添加し、反応混合物を21℃で30分間撹拌した。この時間の後、揮発性材料を全て、減圧下で除去した。粗残留物を、2,3-ジブロモマレイン酸無水物（1.4 g、5.4 mmol、1.2当量）の氷AcOH（125 mL）溶液に添加し、反応混合物を130℃で16時間加熱した。次いで、反応混合物を減圧下で濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（15％〜50％Et2O/ペトロール）による精製により、黄色固体として1-（4-アジドベンジル）-4,5-ジブロモ-2-（プロプ-2-イン-1-イル）-1,2-ジヒドロピリダジン-3,6-ジオンを生成した（560 mg、1.30 mmol、28％）：1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.25 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.02 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 5.46 (s, 2H), 4.75 (d, J = 2.5 Hz, 2H), 2.45 (t, J = 2.4 Hz, 1H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 153.5 (C), 153.0 (C), 140.8 (C), 136.7 (C), 135.8 (C), 130.9 (C), 128.5 (CH), 120.0 (CH), 75.7 (C), 75.2 (CH), 50.3 (CH2), 37.1 (CH2).
【０４８５】
5.1.6 メチル 3,4-ジブロモ-2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-カルボキシレート
【０４８６】
【化４９】
2015510877.tif 000058
【０４８７】
ジブロモマレイミド（1.0 g、3.9 mmol）及びN-メチルモルホリン（0.43 mL、3.9 mmol）のTHF（35 mL）溶液に、メチルクロロホルメート（0.31 mL、3.9 mmol）を添加し、反応混合物を21℃で20分間撹拌した。この時間の後、CH2Cl2（40 mL）を添加し、反応混合物をH2O（50 mL）で洗浄し、乾燥（MgSO4）し、減圧下で濃縮して、ピンク色粉末としてメチル 3,4-ジブロモ-2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-カルボキシレートを得た（1.18 g、3.80 mmol、97％）：m.p. 115-118 ℃; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 4.00 (s, 3H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 159.3 (C), 147.0 (C), 131.5 (C), 54.9 (CH3); HRMS (EI) calcd for C6H3O4N79Br2 [M]+・  310.8423, observed 310.8427.
【０４８８】
5.1.7 tert-ブチル 14-アジド-3-（tert-ブトキシカルボニル）-2-（プロプ-2-イン-1-イル）-6,9,12-トリオキサ-2,3-ジアザテトラデカン-1-オエート
【０４８９】
【化５０】
2015510877.tif 000059
【０４９０】
ジ-tert-ブチル 1-（プロプ-2-イン-1-イル）ヒドラジン-1,2-ジカルボキシレート（108 mg、0.40 mmol）のDMF（3 mL）溶液に、炭酸セシウム（156 mg、0.48 mmol）及び2-（2-（2-（2-アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル メタンスルホネート（130 mg、0.44 mmol）を添加し、反応混合物を21℃で16時間撹拌した。この時間の後、反応混合物をH2O（10 mL）で希釈し、Et2O（5×10 mL）で抽出し、合わせた有機層を飽和LiCl水溶液（2×10 mL）で洗浄し、乾燥（MgSO4）し、減圧下で濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（30％EtOAc/ペトロール）による精製により、黄色オイルとしてtert-ブチル 14-アジド-3-（tert-ブトキシカルボニル）-2-（プロプ-2-イン-1-イル）-6,9,12-トリオキサ-2,3-ジアザテトラデカン-1-オエートを生成した（177 mg、0.38 mmol、94％）：1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 4.61-3.41 (m, 16H) 3.38 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 2.27-2.21 (m, 1H) 1.51-1.42 (m, 18H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) d 155.3 (C), 155.3 (C), 154.8 (C), 154.7 (C), 154.5 (C), 154.3 (C), 153.9 (C), 82.2 (C), 82.0 (C), 81.7 (C), 81.7 (C), 81.4 (C), 81.3 (C), 79.3 (C), 79.3 (C), 78.9 (C), 72.5 (CH), 72.3 (CH), 72.1 (CH), 70.8 (CH2), 70.8 (CH2), 70.7 (CH2), 70.5 (CH2), 70.4 (CH2), 70.3 (CH2), 70.1 (CH2), 68.6 (CH2), 68.5 (CH2), 68.4 (CH2), 50.8 (CH2), 50.7 (CH2), 50.7 (CH2), 49.8 (CH2), 49.8 (CH2), 41.3 (CH2), 41.2 (CH2), 39.7 (CH2), 39.6 (CH2), 28.3 (CH3), 28.3 (CH3), 28.3 (CH3), 28.2 (CH3), 28.1 (CH3), 28.0 (CH3), 28.0 (CH3), 27.8 (CH3); HRMS (CI) calcd for [M+Na]+494.2591, observed 494.2582.
【０４９１】
5.1.8 1-（2-（2-（2-（2-アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）-4,5-ジブロモ-2-（プロプ-2-イン-1-イル）-1,2-ジヒドロピリダジン-3,6-ジオン
【０４９２】
【化５１】
2015510877.tif 000060
【０４９３】
tert-ブチル 14-アジド-3-（tert-ブトキシカルボニル）-2-（プロプ-2-イン-1-イル）-6,9,12-トリオキサ-2,3-ジアザテトラデカン-1-オエート（100 mg、0.21 mmol）のCH2Cl2（2 mL）溶液に、TFA（1 mL）を添加し、反応混合物を21℃で30分間撹拌した。この時間の後、揮発性材料を全て、減圧下で除去した。粗残留物を、N-メトキシカルボニル-ジブロモマレイミド（73 mg、0.23 mmol）及びNEt3（47 mg、0.47 mmol）のCH2Cl2（5 mL）溶液に添加し、反応混合物を21℃で16時間撹拌した。次いで、反応混合物を減圧下で濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（0.2％MeOH/CH2Cl2）による精製により、黄色オイルとして1-（2-（2-（2-（2-アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）-4,5-ジブロモ-2-（プロプ-2-イン-1-イル）-1,2-ジヒドロピリダジン-3,6-ジオンを生成した（25 mg、0.05 mmol、23％）：1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 5.15 (d, J = 2.3 Hz, 2H), 4.45 (t, J = 4.7 Hz, 2H), 3.77 (t, J = 4.7 Hz, 2H), 3.67-3.64 (m, 2H), 3.63-3.54 (m, 8H), 3.39 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 2.38 (t, J = 2.4 Hz, 1H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 152.9 (C), 152.5 (C), 136.4 (C), 135.8 (C), 76.6 (C), 74.5 (CH), 70.8 (CH2), 70.8 (CH2), 70.7 (CH2), 70.6 (CH2), 70.2 (CH2), 68.3 (CH2), 50.7 (CH2), 48.4 (CH2), 37.3 (CH2); HRMS (ES+) calcd for C15H20O5N579Br2[M+H]+ 507.9831, observed 507.9835.
【０４９４】
5.1.9 2,2'-（（1-（4-アジドベンジル）-3,6-ジオキソ-2-（プロプ-2-イン-1-イル）-1,2,3,6-テトラヒドロピリダジン-4,5-ジイル）ビス（スルファンジイル））二安息香酸
【０４９５】
【化５２】
2015510877.tif 000061
【０４９６】
1-（4-アジドベンジル）-4,5-ジブロモ-2-（プロプ-2-イン-1-イル）-1,2-ジヒドロピリダジン-3,6-ジオン（89 mg、0.20 mmol）のCH2Cl2（5 mL）溶液に、NEt3（0.11 mL、0.80 mmol）及びチオサリチル酸（63 mg、0.40 mmol）を添加し、混合物を21℃で30分間撹拌した。次いで、反応混合物を減圧下で濃縮した。粗残留物にH2O（10 mL）を添加し、混合物をEtOAc（2×10 mL）で洗浄した。1N aq. HClを添加することにより水層をpH=2に酸性化し、EtOAc（4×10 mL）で抽出し、合わせた有機層を乾燥（MgSO4）し、減圧下で濃縮して、黄色固体として2,2'-（（1-（4-アジドベンジル）-3,6-ジオキソ-2-（プロプ-2-イン-1-イル）-1,2,3,6-テトラヒドロピリダジン-4,5-ジイル）ビス（スルファンジイル））二安息香酸を得た（113 mg、0.19 mmol、97％）：1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.01-7.93 (m, 2H), 7.47-7.30 (m, 6H), 7.17 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.96 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 5.33 (s, 2H), 4.64 (s, 2H), 2.41 (t, J = 2.4 Hz, 1H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 170.3 (C), 170.2 (C), 156.0 (C), 155.6 (C), 144.2 (C), 143.7 (C), 140.5 (C), 134.6 (C), 134.5 (C), 132.9 (CH), 132.7 (CH), 132.5 (CH), 132.1 (CH), 132.0 (CH), 131.1 (C), 128.6 (CH), 128.1 (CH), 119.8 (CH), 75.9 (C), 74.9 (CH), 49.7 (CH2), 36.5 (CH2); HRMS (ES-) calcd for C28H18O6N5S2[M-H]-584.0699, observed 584.0710.
【０４９７】
5.1.10 N,N'-（（（オキシビス（エタン-2,1-ジイル））ビス（オキシ））ビス（エタン-2,1-ジイル））ビス（1-フルオロシクロオクト-2-インカルボキサミド）
【０４９８】
【化５３】
2015510877.tif 000062
【０４９９】
1-フルオロシクロオクト-2-インカルボン酸（230 mg、1.35 mmol）及びDIPEA（0.482 mL、2.7 mmol）のDMF（10 mL）溶液にHBTU（616 mg、1.62 mmol）を添加し、反応混合物を21℃で5分間撹拌した。この時間の後、1,11-ジアミノ-3,6,9-トリオキサウンデカン（130 mg、0.68 mmol）を添加し、反応混合物を21℃で4時間撹拌した。次いで、反応混合物をH2O（30 mL）で希釈し、EtOAc（3×15 mL）で抽出し、合わせた有機層を乾燥（MgSO4）し、減圧下で濃縮した。粗残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（50％EtOAc/Et2O）により精製して、黄色オイルとしてN,N'-（（（オキシビス（エタン-2,1-ジイル））ビス（オキシ））ビス（エタン-2,1-ジイル））ビス（1-フルオロシクロオクト-2-インカルボキサミド）を得た（340 mg、0.05 mmol、99％）。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm 7.21 (br s, 2H), 3.62-3.50 (m, 12H), 3.50-3.35 (m, 4H), 2.35-2.15 (m, 8H), 2.05-1.74 (m, 8H), 1.64-1.55 (m, 2H), 1.42-1.30 (m, 2H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 169.4 (C), 109.6 (C), 93.6 (C), 86.9 (C), 70.1 (CH2), 70.0 (CH2), 69.8 (CH2), 46.6 (CH2), 46.4 (CH2), 39.3 (CH2), 33.8 (CH2), 28.9 (CH2), 25.6 (CH2), 20.5 (CH2); HRMS (ES-) calcd for C26H37O5N2F2[M-H]- 495.2671, observed 495.2668.
【０５００】
5.1.11 1-（4-（（4,5-ジブロモ-3,6-ジオキソ-2-（プロプ-2-イン-1-イル）-2,3-ジヒドロピリダジン-1（6H）-イル）メチル）フェニル）-4-フルオロ-N-（1-（1-フルオロシクロオクト-2-イン-1-イル）-1-オキソ-5,8,11-トリオキサ-2-アザトリデカン-13-イル）-4,5,6,7,8,9-ヘキサヒドロ-1H-シクロオクタ[d][1,2,3]トリアゾール-4-カルボキサミド
【０５０１】
【化５４】
2015510877.tif 000063
【０５０２】
N,N'-（（（オキシビス（エタン-2,1-ジイル））ビス（オキシ））ビス（エタン-2,1-ジイル））ビス（1-フルオロシクロオクト-2-インカルボキサミド）（136 mg、0.28 mmol）のCH2Cl2（5 mL）溶液に、1-（4-アジドベンジル）-4,5-ジブロモ-2-（プロプ-2-イン-1-イル）-1,2-ジヒドロピリダジン-3,6-ジオン（50 mg, 0.11 mmol）のCH2Cl2（3 mL）溶液を徐々に添加し、反応混合物を21℃で16時間撹拌した。この時間の後、反応混合物を減圧下で濃縮し、粗残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（1％MeOH/EtOAc）により精製して、黄色オイルとして、1-（4-（（4,5-ジブロモ-3,6-ジオキソ-2-（プロプ-2-イン-1-イル）-2,3-ジヒドロピリダジン-1（6H）-イル）メチル）フェニル）-4-フルオロ-N-（1-（1-フルオロシクロオクト-2-イン-1-イル）-1-オキソ-5,8,11-トリオキサ-2-アザトリデカン-13-イル）-4,5,6,7,8,9-ヘキサヒドロ-1H-シクロオクタ[d][1,2,3]トリアゾール-4-カルボキサミドを、ジアステレオ-及びレジオ-アイソマーの非分離混合物として得た（33 mg、0.04 mmol、32％）：1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.44 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.42 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.32 (br s, 1H), 6.88 (br s, 1H), 5.57 (t, J = 17.7 Hz, 2H), 4.77 (s, 2H), 3.71-3.51 (m, 14 H), 3.48 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.02-2.92 (m, 1H), 2.92-2.84 (m, 1H), 2.73-2.58 (m, 1H), 2.48 (t, J = 2.4 Hz, 1H), 2.44-2.22 (m, 5H), 2.02-1.39 (m, 12H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 171.0, 170.8, 168.7, 168.5, 153.5, 153.0, 143.2, 143.0, 136.7, 136.4, 136.2, 136.1, 135.4, 135.4, 128.2, 127.0, 126.9, 109.4, 109.3, 95.2, 95.2, 94.6, 93.9, 93.9, 93.4, 87.5, 87.3, 75.6, 75.5, 70.7, 70.6, 70.6, 70.5, 70.4, 70.4, 69.7, 69.5, 50.2, 46.6, 46.4, 39.4, 39.3, 37.4, 34.0, 33.3, 33.1, 29.0, 26.5, 25.8, 24.0, 22.3, 22.3, 21.8, 21.2, 20.7, 20.7; HRMS (ES+) calcd for C40H48O7N7Br2F2[M79Br79Br+H]+ 934.1989, observed 934.1950.
【０５０３】
5.2ピリダジンジオン系架橋試薬を用いた抗体コンジュゲーションの一般的手順
5.2.1 Her-Fab-ピリダジンジオンコンジュゲート（Her-Fab-PD）を調製するための一般的手順
Her-Fab（50 μL、30 μM、1.4 mg/mL、1当量）のホウ酸塩バッファー（25 mMホウ酸ナトリウム、25 mM NaCl、1 mM EDTA、pH 8.0）溶液にTCEP（最終濃度90 μM、3当量）を添加し、反応混合物を37℃で90分間インキュベートした。この時間の後、ピリダジンジオンのDMF（最終濃度3 mM、10当量）溶液を添加し、反応混合物を37℃で1時間インキュベートした。この後、LCMSによる分析により、99％のコンジュゲートへの変換が明らかとなった。次いで、VivaSpinサンプルコンセントレーター（GE Healthcare, 10,000 MWCO）を用いて、新たなバッファーへと透析濾過を繰り返すことにより、過剰な試薬を除去した。
【０５０４】
5.2.2 アジド-アルキン ヒュスゲン環化付加（CuAAC）の一般的手順
「クリック性（clickable）」-Her-Fab-ピリダジンジオン（50 μL、21 μM、1 mg/mL）のPBS（pH 7.4）溶液（トリス（3-ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン（THPTA）（500 μM）、CuSO4（100 μM）、アミノグアニジン（5 mM）を含む）に、カーゴ分子（アジド又はアルキン）（最終濃度420 μM、20当量）及びアスコルビン酸ナトリウム（最終濃度5 mM）を添加し、反応混合物を25℃で1時間インキュベートした。この後、LCMSによる分析により、99％のコンジュゲートへの変換が明らかとなった。次いで、VivaSpinサンプルコンセントレーター（GE Healthcare, 10,000 MWCO）を用いて、新たなバッファーへと透析濾過を繰り返すことにより、過剰な試薬を除去した。
【０５０５】
5.2.3 歪み促進（Strain-Promoted）アジド-アルキン環化付加（SPAAC）の一般的手順
クリック性-Her-Fab-ピリダジンジオン（50 μL、21 μM、1 mg/mL）のPBS（pH 7.4）溶液にカーゴ分子（アジド）を添加し、反応混合物を25℃で4時間インキュベートした。この後、LCMSによる分析により、99％のコンジュゲートへの変換が明らかとなった。次いで、VivaSpinサンプルコンセントレーター（GE Healthcare, 10,000 MWCO）を用いて、新たなバッファーへと透析濾過を繰り返すことにより、過剰な試薬を除去した。
【０５０６】
5.3 抗体FAB断片のピリダジンジオンコンジュゲーション
5.3.1 Her-Fab-アジドアルキン-ピリダジンジオンコンジュゲート（Her-Fab-Azal-PD）の調製
架橋試薬として2,2'-（（1-（4-アジドベンジル）-3,6-ジオキソ-2-（プロプ-2-イン-1-イル）-1,2,3,6-テトラヒドロピリダジン-4,5-ジイル）ビス（スルファンジイル））二安息香酸を用いて、Her-Fab-ピリダジンジオンコンジュゲートの調製の一般的手順に従った。
実測値（Observed mass）：47925。理論値（Expected mass）：47924。
【０５０７】
5.3.2 Her-Fab-PEGアジドアルキン-ピリダジンジオンコンジュゲート（Her-Fab-Pazal-PD）の調製
架橋試薬として1-（2-（2-（2-（2-アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）-4,5-ジブロモ-2-（プロプ-2-イン-1-イル）-1,2-ジヒドロピリダジン-3,6-ジオンを用いて、Her-Fab-ピリダジンジオンコンジュゲートの調製の一般的手順に従った。
実測値：47994。理論値：47994。
【０５０８】
5.3.3 Her-Fab-アルキン歪みアルキン（StrainedAlkyne）-ピリダジンジオンコンジュゲート（Her-Fab-Astra-PD）の調製
架橋試薬として1-（4-（（4,5-ジブロモ-3,6-ジオキソ-2-（プロプ-2-イン-1-イル）-2,3-ジヒドロピリダジン-1（6H）-イル）メチル）フェニル）-4-フルオロ-N-（1-（1-フルオロシクロオクト-2-イン-1-イル）-1-オキソ-5,8,11-トリオキサ-2-アザトリデカン-13-イル）-4,5,6,7,8,9-ヘキサヒドロ-1H-シクロオクタ[d][1,2,3]トリアゾール-4-カルボキサミドを用いて、Her-Fab-ピリダジンジオンコンジュゲートの調製の一般的手順に従った。
実測値：48418。理論値：48420。
【０５０９】
5.4 Fab-ピリダジンジオンコンジュゲートの機能化
5.4.1 Her-Fab-Azal-PD-PEG4コンジュゲートの調製
カーゴ分子として2-（2-（2-（2-アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エタノール（PEG4-N3）を、「クリック性」-Her-Fab-ピリダジンジオンとしてHer-Fab-Azal-PDを用いて、CuAACの一般的手順に従った。
実測値：48148。理論値：48143。
【０５１０】
5.4.2 Her-Fab-Azal-PD-ローダミンコンジュゲートの調製
カーゴ分子としてジベンジルシクロオクチン-PEG4-テトラメチルローダミン（DBCO-PEG4-TAMRA）を、「クリック性」-Her-Fab-ピリダジンジオンとしてHer-Fab-Azal-PDを用いて、SPAACの一般的手順に従った。
実測値：48864。理論値：48861。
【０５１１】
5.4.3 Her-Fab-Azal-PD-ローダミン-フルオレセインコンジュゲートの調製
カーゴ分子として1-（2-（2-（2-（2-アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）-3-（3',6'-ジヒドロキシ-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9'-キサンテン]-5-イル）チオウレア（フルオレセイン-PEG4-N3）を、「クリック性」-Her-Fab-ピリダジンジオンとしてHer-Fab-Azal-PD-ローダミンを用いて、CuAACの一般的手順に従った。
実測値：49474。理論値：49468。
【０５１２】
5.4.4 Her-Fab-Astra-PD-PEG4コンジュゲートの調製
カーゴ分子としてPEG4-N3を、「クリック性」-Her-Fab-ピリダジンジオンとしてHer-Fab-Astra-PDを用いて、SPAACの一般的手順に従った。
実測値：48640。理論値：48639。
【０５１３】
5.4.5 Her-Fab-Astra-PD-PEG4-PEG4コンジュゲートの調製
カーゴ分子としてPEG4-N3を、「クリック性」-Her-Fab-ピリダジンジオンとしてHer-Fab-Astra-PD-PEG4を用いて、CuAACの一般的手順に従った。
実測値：48880。理論値：48882。
【０５１４】
5.4.6 Her-Fab-Astra-PD-フルオレセインコンジュゲートの調製
カーゴ分子としてフルオレセイン-PEG4-N3を、「クリック性」-Her-Fab-ピリダジンジオンとしてHer-Fab-Astra-PDを用いて、SPAACの一般的手順に従った。
実測値：49032。理論値：49025。
【０５１５】
5.4.7 Her-Fab-Astra-PD-フルオレセイン-PEG4コンジュゲートの調製
カーゴ分子としてPEG4-N3を、「クリック性」-Her-Fab-ピリダジンジオンとしてHer-Fab-Astra-PD-フルオレセインを用いて、CuAACの一般的手順に従った。
実測値：49252。理論値：49251。
【０５１６】
5.4.8 Her-Fab-Astra-PD-His6コンジュゲートの調製
カーゴ分子としてヒスチジン6-PEG4-N3を、「クリック性」-Her-Fab-ピリダジンジオンとしてHer-Fab-Astra-PDを用いて、SPAACの一般的手順に従った。
実測値：49518。理論値：49518。
【０５１７】
5.4.9 Her-Fab-Astra-PD-PEG DOXの調製
カーゴ分子としてDOX-PEG4-N3を、「クリック性」-Her-Fab-ピリダジンジオンとしてHer-Fab-Astra-PDを用いて、SPAACの一般的手順に従った。
実測値：49253。理論値：49257。
【０５１８】
5.5 完全抗体のピリダジンジオン修飾
5.5.1 トラスツズマブmAbの段階的修飾
限外濾過（MWCO 10 kDa）により、トラスツズマブをホウ酸塩バッファー（25 mMホウ酸ナトリウム、25 mM NaCl、1 mM EDTA、pH 8.0）へと移し、濃度を20.6 μMに補正した。この溶液を400 rpmで振盪させながら、37℃、2時間TCEP（10当量）で処理した。次いで、過剰なTCEPと分離するために、製造者のプロトコルに従って、上記ホウ酸塩バッファーで平衡化したPD-G25バッファースワッピングカラムを介してこの溶液を溶出した。UV/Vis（ε280＝215,000 cm-1M-1）により濃度を評価し、濃縮して20.6 μMに戻した。次に、溶液を40 μL（0.826 nmol）ポーションに分割し、これに、以下の溶液（10.3 mM）を4 μL添加し：A）DMF（20 μL）に希釈した4,5-ジブロモ-1,2-ジエチル-1,2-ジヒドロピリダジン-3,6-ジオン（DiBr-Diet）（50当量）（37℃で保持）；B）DMF（20 μL）に希釈した1,2-ジエチル-4,5-ビス（フェニルチオ）-1,2-ジヒドロピリダジン-3,6-ジオン（DiSH-Diet）（50当量）（37℃で保持）；以下の溶液（1.3 mM）を4 μL添加した：C）DMF（20 μL）に希釈した4,5-ジブロモ-1,2-ジエチル-1,2-ジヒドロピリダジン-3,6-ジオン（DiBr-Diet）（6当量）（37℃で保持）；D）DMF（20 μL）に希釈した1,2-ジエチル-4,5-ビス（フェニルチオ）-1,2-ジヒドロピリダジン-3,6-ジオン（DiSH-Diet）（5当量）（37℃で保持）。架橋試薬とのDMFの添加は、バッファー系について10％DMF（v/v）組成を保証した。添加2時間後に、各反応物からサンプル（5 μL）を取り出し、マレイミド（20当量）でクエンチし、SDS-PAGEゲル分析のために取っておいた。限外濾過と希釈による少なくとも6サイクルの濃縮を用いた限外濾過（MWCO 10 kDa）により、反応混合物をホウ酸塩バッファー（25 mMホウ酸ナトリウム、25 mM NaCl、1 mM EDTA、pH 8.0）にバッファー交換した。回収した抗体の収率と、ピリダジンジオン抗体比（PAR）（下記式に従う）を測定する目的で、精製した材料をUV/Visにより分析した。ジチオピリダジンジオンは、339 nmで強い吸光度を有する。SDS-PAGEゲルによる分析も実施した。
【０５１９】
【化５５】
2015510877.tif 000064
【０５２０】
【表９】
2015510877.tif 000065
【０５２１】
5.5.2 トラスツズマブmAbのin situ修飾
限外濾過（MWCO 10 kDa）により、トラスツズマブをホウ酸塩バッファー（25 mMホウ酸ナトリウム、25 mM NaCl、1 mM EDTA、pH 8.0）へと移し、濃度を22.9 μMに補正した。この溶液を、以下の架橋試薬及びDMF（バッファー系の10％DMF（v/v）組成を保証するため）の存在下、400 rpmで振盪させながら、37℃、2時間TCEP（7当量）で処理した：A）DMF（20 μL）に希釈した1,2-ジエチル-4,5-ビス（フェニルチオ）-1,2-ジヒドロピリダジン-3,6-ジオン（DiSH-Diet）（50当量）（37℃で保持）；B）DMF（20 μL）に希釈した1,2-ジエチル-4,5-ビス（フェニルチオ）-1,2-ジヒドロピリダジン-3,6-ジオン（DiSH-Diet）（6当量）（37℃で保持）。C）架橋試薬を添加せずDMFのみ（37℃で反応）。2時間後、各反応物からサンプル（5 μL）を取り出し、マレイミド（20当量）でクエンチし、SDS-PAGEゲル分析のために取っておいた。限外濾過と希釈による少なくとも6サイクルの濃縮を用いた限外濾過（MWCO 10 kDa）により、反応混合物をホウ酸塩バッファー（25 mMホウ酸ナトリウム、25 mM NaCl、1 mM EDTA、pH 8.0）にバッファー交換した。回収した抗体の収率とPAR（上記式に従う）を測定する目的で、精製した材料をUV/Visにより分析した。SDS-PAGEゲルによる分析も実施した（図63参照）。
【０５２２】
【表１０】
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【０５２３】
連続的プロトコルによりコンジュゲート化したHer-Fab-Astra-PD-PEG4とともに、トラスツズマブFabに対してELISAアッセイを実施した（図64を参照）。ELISAアッセイのための典型的プロトコル：96ウェルプレートを0.25 μg/mLのHer2（100 μL）でコーティングした（ネガティブPBSコントロールのための列を含む）。コーティングを室温で2時間放置した後、200 μLの1％BSA溶液で4℃、一晩ブロッキングした。翌日、試験サンプルの希釈系列（24 nM、8.1 nM、2.7 nM、0.89 nM、0.30 nM、0.10 nM）とともに室温にて1時間インキュベーションした。次いで、PBS中に希釈した検出抗体（抗ヒトIgG, Fab特異的-HRP）とともに1時間インキュベートし、最後に、過ホウ酸ナトリウムを有するリン酸塩-クエン酸塩バッファー中のo-フェニレンジアミン塩酸塩（10 mg/20 mL）を100 μL添加した。4 M HCl（50 μL）で酸性化することにより反応を停止した。490 nmで吸光度を測定した。ピリダジンジオン架橋トラスツズマブFabの結合は、標的Her2抗原に対して維持された。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｈ】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１８Ｆ】
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【図１８Ｇ】
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【図１８Ｈ】
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【図１９】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２３Ｆ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３０Ｄ】
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【図３０Ｇ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３２Ｄ】
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【図３２Ｅ】
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【図３２Ｆ】
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【図３２Ｇ】
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【図３２Ｈ】
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【図３２Ｉ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３８Ｄ】
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【図５１Ａ】
2015510877.tif 000136
【図５１Ｂ】
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【図５１Ｃ】
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【図５３Ａ】
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【図５３Ｂ】
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【図５３Ｃ】
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【図５５Ａ】
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【図５５Ｂ】
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【図５５Ｃ】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図６０】
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【図６１】
2015510877.tif 000149
【図６２】
2015510877.tif 000150
【図６４】
2015510877.tif 000151
【図４Ａ】
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【図６Ｇ】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１６】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図２０Ａ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
2015510877.tif 000172
【図３０Ｅ】
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【図３０Ｆ】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３３Ａ】
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【図３４】
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【図３５Ａ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
2015510877.tif 000181
【図３６Ｃ】
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【図３６Ｄ】
2015510877.tif 000183
【図３６Ｅ】
2015510877.tif 000184
【図３６Ｆ】
2015510877.tif 000185
【図３６Ｇ】
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【図３７】
2015510877.tif 000187
【図３９】
2015510877.tif 000188
【図４０】
2015510877.tif 000189
【図４１】
2015510877.tif 000190
【図４２】
2015510877.tif 000191
【図４３】
2015510877.tif 000192
【図４４】
2015510877.tif 000193
【図４５】
2015510877.tif 000194
【図４６】
2015510877.tif 000195
【図４７】
2015510877.tif 000196
【図４８】
2015510877.tif 000197
【図４９】
2015510877.tif 000198
【図５０】
2015510877.tif 000199
【図５２】
2015510877.tif 000200
【図５４】
2015510877.tif 000201
【図５９】
2015510877.tif 000202
【図６３】
2015510877.tif 000203
【国際調査報告】
2015510877.tif 000204
2015510877.tif 000205
2015510877.tif 000206