(57)【要約】  本開示内容は、アジュバントポリペプチドに架橋結合した抗原に対する免疫応答を亢進する際に有効なアジュバントポリペプチドに関する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アジュバントポリペプチドを含有してなるワクチン組成物であって、該アジュバントポリペプチドが、免疫応答が望まれる抗原性分子と架橋結合または会合した細菌性αタンパク質を含むものであるワクチン組成物。
【請求項２】
前記αタンパク質が、アミノ酸残基EAERXAAELAXX(K/Q)を含む少なくとも一のアミノ酸モチーフを含むポリペプチドを含み、このときＸは任意の親水性アミノ酸残基である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記抗原性分子がポリペプチド抗原である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記抗原性分子が多糖抗原である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項５】
前記抗原性分子がリポ多糖抗原である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項６】
α-タンパク質および抗原ポリペプチドが、インフレームの翻訳融合タンパク質である、請求項１から３のいずれか一に記載の組成物。
【請求項７】
前記抗原ポリペプチドが細菌性病原体から単離される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、
ｉ）配列番号：１〜２６からなる群から選択されるアミノ酸配列、
ｉｉ）上記ｉ）に定義されるアミノ酸配列であって、一または複数のアミノ酸残基の付加、欠失または置換によって変更され、かつ、亢進したヘム結合活性および／または低減した溶血性活性を維持するかまたは有しているアミノ酸配列
からなる群から選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、
ｉ）配列番号：２７〜４２からなる群から選択されるアミノ酸配列、
ｉｉ）上記ｉ）に定義されるアミノ酸配列であって、一または複数のアミノ酸残基の付加、欠失または置換によって変更され、かつ、亢進したヘム結合活性および／または低減した溶血性活性を維持するかまたは有しているアミノ酸配列
からなる群から選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、
ｉ）配列番号：４３、４４、４５、４６、４７、４８、５１、５２、５３、５４、５５または５６からなる群から選択されるアミノ酸配列、
ｉｉ）上記ｉ）に定義されるアミノ酸配列であって、一または複数のアミノ酸残基の付加、欠失または置換によって変更されているアミノ酸配列
からなる群から選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが、配列番号：６４のアミノ酸配列、または、一または複数のアミノ酸残基の付加、欠失または置換によって変更されているアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項７に記載の組成物。
【請求項１２】
病原性細菌種に対してヒトを予防接種する方法であって、
ｉ）有効量の請求項７、８、１０および１１のいずれか一に記載のワクチン組成物の一回量をヒト被検体に投与し、保護的免疫を誘導すること、場合によって、
ｉｉ）保護的免疫を誘導するために十分な、一または複数の更なる用量のワクチンを前記被検体に投与すること
を含む方法。
【請求項１３】
ヒト被検体において細菌病原性感染の治療に使用するための、請求項７、８、１０および１１のいずれか一に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
ヒト細菌性病原体から単離された抗原に対するオプソニンの産生のための方法であって、
ｉ）請求項８に記載のワクチン組成物を提供すること、
ｉｉ）オプソニン産生を誘導するために十分な有効量の前記組成物をヒト被検体に投与すること
を含む方法。
【請求項１５】
前記抗原性ポリペプチドがウイルス病原体から単離される、請求項２または３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記抗原性ポリペプチドが、配列番号：４９、５０、６０または６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記抗原性ポリペプチドは、パピローマウイルス遺伝子、好ましくはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）遺伝子によってコードされる、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ウイルス遺伝子がＥ６またはＥ７である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ウイルス遺伝子が、配列番号：６２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ウイルス遺伝子が、配列番号：６３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
前記抗原性ポリペプチドが単離された癌抗原である、請求項２または３に記載の組成物。
【請求項２２】
前記癌抗原が癌遺伝子によってコードされる、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記癌抗原が、Ｈｅｒ２、ＥｐＣＡＭまたはＣＤ１９の群から選択される癌遺伝子に由来する、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記癌抗原が、配列番号：５８に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２５】
前記癌抗原が、配列番号：５９に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２６】
前記ワクチン組成物が、少なくとも１種のさらなるアジュバントおよび/または担体を含む、請求項１から１１および１５から２５のいずれか一に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示内容は、アジュバントポリペプチドに架橋した抗原または抗原−ポリペプチドアジュバントのポリペプチド融合物ないしはポリペプチド−抗原融合タンパク質として製造された抗原に対する免疫応答を高めるのに有効なアジュバントポリペプチド、当該アジュバントを含むワクチン組成物、および当該組成物を用いるワクチン接種の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アジュバント（免疫増強剤または免疫調節剤）は、ワクチン抗原に対する免疫応答を改善するために数十年間使用されている。ワクチン製剤へのアジュバントの混合は、ワクチン抗原に対する特定の免疫応答を高め、加速し、延長するためのものである。アジュバントの利点には、弱い抗原の免疫原性の改善、有効な免疫化に必要な抗原量の減少、必要となる追加免疫化の頻度の減少、および高齢者および免疫障害があるワクチン受診者における免疫応答の改善が含まれる。
【０００３】
また、アジュバントは、例えば免疫グロブリン各種クラスによる所望の免疫応答、および細胞障害性ないしはヘルパーＴリンパ球の応答の誘導を最適化するためにも用いられうる。加えて、特定のアジュバントを用いて粘膜表面での抗体応答を促進することができる。水酸化アルミニウムまたはリン酸カルシウムまたはアルミニウムはヒトワクチンにおいて日常的に使用されている。さらに最近では、ＩＲＩＶ（免疫賦活化再構成インフルエンザビロソーム）に混合した抗原およびエマルジョンベースのアジュバントＭＦ５９を含有するワクチンが特定の地域で認可されている。アジュバントは、その起源、作用機構および物理的または化学的性質に応じて分類することができる。最も一般的に類型化されるアジュバントクラスは、ゲルタイプ、微生物、油乳剤および乳化剤ベース、微粒子、合成およびサイトカインである。
【０００４】
最終ワクチン製品に２以上のアジュバントが存在してもよい。これらアジュバントはワクチンに存在する単一抗原ないしはすべての抗原と組み合わされても、各アジュバントが一つの抗原と組み合わされていてもよい。現在用いられているかまたは開発されているアジュバントの起源および性質は非常に多様である。例えば、アルミニウムベースのアジュバントは単一の無機化合物からなり、ＰＬＧはポリマー炭水化物であり、ビロソームは異種のウイルス粒子に由来し得、ＭＤＰは細菌細胞壁に由来し、サポニンは植物起源のものであり、スクアレンはサメ肝油に由来し、そして、組換え内因性免疫調節剤は組換え細菌、酵母または哺乳動物細胞に由来する。ヒトへの使用のためには余りに反応性が強い鉱物油乳剤など、獣医用のワクチンにはいくつかのアジュバントが認可されている。同様に、完全フロイントアジュバントは、公知の最も強力なアジュバントの一つであるが、ヒトへの使用には適していない。免疫応答を起こさせるのが典型的に困難である抗原に対する免疫応答を促進するための、毒性が低いが有効性が増強したアジュバントを同定することが求められ続けている。
【０００５】
ワクチンは多種多様な感染症から保護する。多くのワクチンは、被検体に注入される不活化または弱毒化した病原体によって製造される。免疫した被検体は、液性（例えば抗体）および細胞性（例えば細胞溶解性T細胞）応答の両方を生成することによって応答する。例えば、インフルエンザワクチンの中には、ホルムアルデヒドによる化学的処理によりウイルスを不活性化することにより製造されるものもある。多くの病原体の化学的または熱不活性化のために、防御免疫を授けるワクチン免疫原を生じさせる一方で、発熱や注射部位反応などの副作用も引き起こしうる。細菌の場合には、不活性化された生物は非常に毒性が高い傾向があり、副作用により粗ワクチン免疫原（例えば細胞性百日咳ワクチン）の適用が制限されているため、ワクチン開発は薬物開発に後れをとっている。さらに、細胞全体の不活性化生物を用いる有効なワクチン開発では、エピトープのマスキング、免疫優性、低抗原濃度および抗原の重複性（リダンダンシー）の問題を抱えている。現在の抗生物質治療は薬剤耐性菌の出現によって現在好まれていないので、残念である。
【０００６】
したがって、近年の多くのワクチンは、分子クローニングによって単離し、副作用を引き起こす材料から精製した病原体の防御抗原から製造されている。これらのワクチンは「サブユニットワクチン」として知られている。ここ数年でサブユニットワクチンの開発は多くの研究を集めている。新しい病原体の出現および抗生物質耐性の拡がりにより、新たなワクチンの開発とサブユニットワクチンの開発に有用な他の候補分子の同定の必要性が生じている。同様に、ゲノムおよびプロテオミクス研究から新たなワクチン抗原が発見されると、特に細菌性病原体に対する新たなサブユニットワクチン候補の開発が可能となる。しかしながら、サブユニットワクチンは、死滅または弱毒化病原体ワクチンの副作用を回避する傾向があるが、その「純粋な」状態は、サブユニットワクチンが防御を付与するのに十分な免疫原性を常に持つわけではないことを意味する。
【０００７】
本開示内容は、免疫応答が所望される抗原と架橋または会合した場合に、アジュバント活性を有する細菌性ポリペプチドのファミリーの同定に関する。ファミリーは「α-タンパク質」と呼ばれる。α-タンパク質は複雑性が低いポリペプチドであり、そのように呼ばれるのは配列のαへリックス性質が予測されるからである。大規模に研究されている同時に分泌されるＩｇＡ１プロテアーゼと共に宿主に曝される細菌のαタンパク質については比較的あまり知られていない。α-タンパク質は、細胞膜および細胞質を通過する哺乳動物細胞に侵入することが示されている。それが最終的に核に移行するが、この興味深い観察結果にもかかわらず、α-タンパク質の機能に関してはあまり取り上げられていない。プロテアーゼは、最初に、リーダーペプチド、ラージプロテアーゼドメイン、可変長αタンパク質およびβコアとして知られるＣ末端βバレルドメインからなるラージプレタンパク質として合成される。周辺質に移動した後、βドメインは外膜へ挿入し、プロテアーゼとαタンパク質の自己分泌を促す。外膜を通して細胞外の環境へ移動すると、プロテアーゼドメインは、プロリンリッチ認識部位で膜に包埋されたβコアから自身を切断する。さらに切断部位がプロセシングされ外部環境へ遊離αタンパク質が遊離され、この外部環境で生物に感染したものの分泌物中で容易に検出される。成熟プロテアーゼとβコアとの間の物理的リンカーとして働く以外、αタンパク質の生物学的役割は知られていない。
【０００８】
発明者等は、免疫応答が望まれる抗原とαタンパク質との物理学的会合（結合）により抗原に対する免疫応答が亢進されることを発見した。
【発明の概要】
【０００９】
本発明の態様によれば、アジュバントポリペプチドを含むワクチン組成物であって、該アジュバントポリペプチドが、免疫応答が望まれる抗原性分子と架橋結合または会合した細菌性αタンパク質を含むものであるワクチン組成物が提供される。
【００１０】
本発明の好適な実施形態では、前記αタンパク質は、アミノ酸残基EAERXAAELAXX(K/Q)を含む少なくとも一のアミノ酸モチーフを含むポリペプチドを含み、このときＸは任意の親水性アミノ酸残基である。
【００１１】
本発明の好適な実施形態では、前記αタンパク質は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２００コピーのアミノ酸モチーフを含む。
【００１２】
本発明の好適な実施形態では、抗原性分子はポリペプチド抗原である。
【００１３】
本発明の他の好適な実施形態では、抗原性分子は多糖抗原である。
【００１４】
本発明の好適な実施形態では、抗原性分子はリポ多糖抗原である。
【００１５】
本発明の他の好適な実施形態では、α-タンパク質および抗原性分子はリポソーム調製物で会合している。
【００１６】
本発明の好適な実施形態では、α-タンパク質および抗原ポリペプチドは、インフレームの翻訳融合タンパク質である。 
【００１７】
本発明の好適な実施形態では、前記抗原ポリペプチドは細菌性病原体から単離されている。 
【００１８】
本発明の他の好適な実施形態では、細菌病原体はグラム陰性細菌性病原体である。
【００１９】
本発明の好適な方法では、前記グラム陰性細菌は、ナイセリア属、モラクセラ属、エシェリキア属、サルモネラ属、シゲラ属、シュードモナス属、ヘリコバクター属、レジオネラ属、ヘモフィルス属、クレブシエラ属、エンテロバクター属、クロノバクター属、スタフィロコッカス属およびセラチア属からなる属群から選択される。
【００２０】
他の種には、シュードモナス・エルジノーサや他のシュードモナス種、ステノトロホモナス・マルトフィリア、バークホルデリア・セパシアや他のバークホルデリア属、アルカリゲネス・キシロソキシダンス、アシネトバクター、腸内細菌科、ヘモフィルス属、モラクセラ属、バクテロイド属、フランシセラ属、シゲラ属、プロテウス属、ビブリオ属、サルモネラ属、ボルデテラ属、ヘリコバクター属、レジオネラ属、シトロバクター属、カンピロバクター属、エルシニア属およびナイセリア属の種が含まれる。本発明の他の実施形態では、グラム陰性細菌には、グラム陰性細菌には、セラチア属、プロテウス属、クレブシエラ属、エンテロバクター属、シトロバクター属、クロノバクター属、サルモネラ属、プロビデンシア属、モルガネラ属、セデセア属および大腸菌などの生物からなる群から選択される腸内細菌科が含まれる。
【００２１】
本発明の好適な実施形態では、前記のヒトの細菌病原体は髄膜炎菌である。 
【００２２】
本発明の好適な実施形態では、前記のヒトの細菌病原体は淋菌である。 
【００２３】
本発明の好適な実施形態では、前記のヒトの細菌性病原体は、ストレプトコッカス菌種、例えば肺炎連鎖球菌である。
【００２４】
発明者等の同時継続中の出願ＧＢ１１０２０９０．６（未公開）において、ヒト細菌性病原体を標的とするオプソニンの産生を有利に誘導する保護的抗原クラスを開示している。Ｇｌｙ１抗原は、分泌されるタンパク質であり、鉄供給源としてヘムまたはヘモグロビンを含む限定培地で生育した髄膜炎菌などの生育に必須であることを示している。Ｇｌｙ１の欠失変異体の表現型はこれら条件下で成長することができないため、Ｇｌｙ１は鉄代謝に関与し、本質的な機能を提供している。Ｇｌｙ１タンパク質は、ヘムの隔離に関与する多くの病原性細菌種に見られるタンパク質クラスの一例であり、細菌の増殖維持や感染の確立に関与している可能性が高い。
【００２５】
本発明の好適な実施形態では、前記ポリペプチドは、
ｉ）配列番号：１〜２６からなる群から選択されるアミノ酸配列、
ｉｉ）上記ｉ）に定義されるアミノ酸配列であって、一または複数のアミノ酸残基の付加、欠失または置換によって変更され、かつ、亢進したヘム結合活性および／または低減した溶血性活性を維持するかまたは有しているアミノ酸配列
からなる群から選択される。
【００２６】
本明細書に開示される修飾されたポリペプチドは、一または複数の置換、付加、欠失、切断の任意の組み合わせによりアミノ酸配列が異なっていてもよい。好適な変異体には、保存的アミノ酸置換によって参照ポリペプチドと異なるものがある。この置換とは、類似の特性の別のアミノ酸によって所与のアミノ酸を置換するものである。限定するものではないが以下のアミノ酸リストが保存的置換（類似）とみなされる。ａ）アラニン、セリンおよびスレオニン；ｂ）グルタミン酸およびアスパラギン酸；ｃ）アスパラギンおよびグルタミン；ｄ）アルギニンおよびリジン；ｅ）イソロイシン、ロイシン、メチオニンおよびバリン、ならびにｆ）フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン。変化する前の参照ポリペプチドと同じ生物学的機能および活性を維持するかまたは亢進する変異体が最も好ましい。
【００２７】
ある実施形態では、変異体ポリペプチドは、本明細書中に示す完全長アミノ酸配列と、少なくとも３５％の同一性、より好ましくは少なくとも４０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも４５％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の同一性、最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【００２８】
発明者等の同時継続中の出願ＧＢ１１０２０９１．４（未公開）において、細菌性動物病原体、特に農業上重要な動物種や伴侶動物の細菌性病原体、人畜共通感染のグラム陰性細菌種に対して保護性があるワクチンにおいて抗原性ポリペプチドを開示している。ＧＢ１１０２０９１．４の開示内容は、動物（すなわちヒト以外の）細菌性病原体、例えばウシ／ヒツジの病原体であるマンヘミア・ヘモリチカおよびヘモフィルス・ソムナスを標的とするオプソニンの産生を誘導する保護的抗原のクラスに関する。
【００２９】
本発明の他の好適な実施形態では、前記ポリペプチドは、グラム陰性、非ヒト細菌性病原体から単離される。 
【００３０】
本発明の好適な実施形態では、前記ポリペプチドは、グラム陰性細菌の人畜共通動物病原体から単離される。 
【００３１】
本発明の好適な実施形態では、前記の非ヒト細菌性動物病原体は、マンヘミア属、アクチノバチルス属、パスツレラ属、ヘモフィルス属またはエドワード属からなる属群から選択される。 
【００３２】
他の細菌性病原体には、ブルセラ属、カンピロバクター属、ビブリオ属、エルシニア属およびサルモネラ属から選択される人畜共通種が含まれる。
【００３３】
本発明の好適な実施形態では、前記ポリペプチドは、
ｉ）配列番号：２７〜４２からなる群から選択されるアミノ酸配列、
ｉｉ）上記ｉ）に定義されるアミノ酸配列であって、一または複数のアミノ酸残基の付加、欠失または置換によって変更され、かつ、亢進したヘム結合活性および／または低減した溶血性活性を維持するかまたは有しているアミノ酸配列
からなる群から選択される。
【００３４】
本発明の他の好適な実施形態では、前記ポリペプチドは、
ｉ）配列番号：４３、４４、４５、４６、４７、４８、５１、５２、５３、５４、５５または５６からなる群から選択されるアミノ酸配列、
ｉｉ）上記ｉ）に定義されるアミノ酸配列であって、一または複数のアミノ酸残基の付加、欠失または置換によって変更されているアミノ酸配列
からなる群から選択される。
【００３５】
本発明の態様によると、病原性細菌種に対してヒトを予防接種する方法であって、
ｉ）有効量の本発明に係るワクチン組成物の一回量をヒト被検体に投与し、保護的免疫を誘導すること、場合によって、
ｉｉ）保護的免疫を誘導するために十分な、一または複数の更なる用量のワクチンを前記被検体に投与すること
を含む方法が提供される。
【００３６】
本発明の他の態様によると、ヒト被検体において細菌病原性感染の治療に使用するための本発明に係るワクチン組成物が提供される。
【００３７】
本発明の他の態様によると、ヒト細菌性病原体から単離された抗原に対するオプソニンの生産のための方法であって、
ｉ）本発明に係るワクチン組成物を提供すること、
ｉｉ）オプソニン産生を誘導するために十分な有効量の前記組成物をヒト被検体に投与すること
を含む方法が提供される。
【００３８】
本発明の他の好適な実施形態では、前記抗原性ポリペプチドはウイルス病原体から単離される。
【００３９】
本発明の好適な実施形態では、前記抗原性ポリペプチドは、ヒト免疫不全ウイルス；ヒトＴ細胞白血病ウイルス；ヒトパピローマウイルス；パポバウイルス；ライノウイルス；ポリオウイルス；ヘルペスウイルス；アデノウイルス；エプスタイン・バーウイルス；インフルエンザウイルス、Ｂ型およびＣ型肝炎ウイルスからなる群から選択されるウイルスに由来する。
【００４０】
本発明の好適な実施形態では、前記抗原性ポリペプチドは、配列番号：４９、５０、６０または６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４１】
本発明の好適な実施形態では、前記抗原性ポリペプチドは、パピローマウイルス遺伝子、好ましくはヒトパピローマウイルス遺伝子によってコードされる。
【００４２】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）はその病理学的作用が変化する。例えば、ヒトでは、いわゆる低リスクＨＰＶであるＨＰＶ−６およびＨＰＶ−１１などは性器疣贅（尖圭コンジローマとも呼ばれる）などの良性過形成を引き起こす一方で、高リスクのＨＰＶ、例えばＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−５２、ＨＰＶ−５４およびＨＰＶ−５６は子宮頚癌や陰茎癌などの癌を引き起こしうる。ＨＰＶ−１は尋常性疣贅の原因となる。ＨＰＶ−５およびＨＰＶ−８は皮膚の悪性扁平上皮癌を引き起こす。ＨＰＶ−２は、皮膚および扁平（経口）上皮の悪性および非悪性の病変に見出される。ＨＰＶ−１６は再発性呼吸器乳頭腫症に関連して発見された。
【００４３】
本発明の好適な実施形態では、前記ヒトパピローマウイルスは、ＨＰＶ−２；ＨＰＶ−６；ＨＰＶ−１１；ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−５２、ＨＰＶ−５４；ＨＰＶ−５６；ＨＰＶ−５およびＨＰＶ−８からなる群から選択される。
【００４４】
本発明の好適な実施形態では、前記ＨＰＶはＨＰＶ−１６である。
【００４５】
本発明の好適な実施形態では、前記ウイルス遺伝子はＥ６またはＥ７である。
【００４６】
本発明の好適な実施形態では、前記ウイルス遺伝子は、配列番号：６２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。 
【００４７】
本発明の好適な実施形態では、前記ウイルス遺伝子は、配列番号：６３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。 
【００４８】
本発明のさらに他の好適な実施形態では、前記抗原性ポリペプチドは単離された癌抗原である。
【００４９】
本明細書中で用いるように、「癌」なる用語は、自己増殖の能力を有する細胞、つまり細胞増殖が急増するという特徴を有する異常な状態または様子を有する細胞を指す。この用語は、組織病理学的タイプまたは侵襲性のステージに関わりなく、癌性増殖または腫瘍形成性過程、転移組織または悪性形質転換細胞、組織または臓器のすべての種を含むとされる。「癌」なる用語には、様々な臓器系の悪性腫瘍、例えば肺、乳房、甲状腺、リンパ、胃腸および尿生殖路に影響するもの、ならびに、ほとんどの結腸癌、腎細胞癌、前立腺癌および／または精巣腫瘍などの悪性腫瘍、肺の非小細胞癌、小腸の癌および食道の癌を含む腺癌が含まれる。「上皮性悪性腫瘍」なる用語は、呼吸器系癌、胃腸系癌、泌尿生殖器系癌、睾丸癌、乳癌、前立腺癌、内分泌系の癌および黒色腫を含む上皮性または内分泌性組織の悪性腫瘍と認識されており、それらを指す。例示的な上皮性悪性腫瘍には、子宮頸部、肺、前立腺、乳房、頭頸部、結腸および卵巣の組織から形成されるものが含まれる。「上皮性悪性腫瘍」なる用語には、例えば、癌性および肉腫性の組織を含んでなる悪性腫瘍を含む癌肉腫も含まれる。「腺癌」は、腺組織に由来する癌、または腫瘍細胞が認識可能な腺構造を形成している癌を指す。「肉腫」なる用語は間葉由来の悪性腫瘍と認識されており、それを指す。他には、肺癌、例えば小細胞肺癌または非小細胞肺癌などがある。他のクラスの肺癌には、神経内分泌性癌、肉腫および異なる組織起源の転移性癌が含まれる。
【００５０】
本発明の好適な実施形態では、前記癌抗原は癌遺伝子によってコードされる。 
【００５１】
本発明の好適な実施形態では、前記癌抗原は、Ｈｅｒ２、ＥｐＣＡＭまたはＣＤ１９の群から選択される癌遺伝子に由来する。 
【００５２】
本発明の好適な実施形態では、前記癌抗原は、配列番号：５８に示されるアミノ酸配列を含む。 
【００５３】
本発明の好適な実施形態では、前記癌抗原は、配列番号：５９に示されるアミノ酸配列を含む。 
【００５４】
本発明の好適な実施形態では、前記ワクチン組成物は、少なくとも１種のさらなるアジュバントおよび／または担体を含む。 
【００５５】
本発明の好適な実施形態では、前記のさらなるアジュバントは、水酸化アルミニウム、アルミニウムまたはリン酸カルシウムからなる群から選択される。
【００５６】
本発明の好適な実施形態では、前記のさらなるアジュバントは、ＧＭＣＳＦ、インターフェロンγ、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターロイキン１２、インターロイキン２３、インターロイキン１７、インターロイキン２、インターロイキン１、ＴＧＦ、ＴＮＦαおよびＴＮＦβからなる群から選択されるサイトカインからなる群から選択される。
【００５７】
本発明のさらなる他の実施形態では、前記さらなるアジュバントは、ＴＬＲアゴニスト、例えばＣｐＧオリゴヌクレオチド、フラジェリン、モノホスホリルリピドＡ、ポリＩ：Ｃおよびその誘導体である。
【００５８】
本発明の好適な実施形態では、前記さらなるアジュバントは、細菌性細胞壁誘導体、例えばムラミルジペプチド（ＭＤＰ）および／またはトレハロースジコリノミコレート（ＴＤＭ）である。
【００５９】
本発明のワクチン組成物は、注入、例えばエアロゾルや点鼻薬などの吸入による鼻腔スプレーを含め任意の従来の経路によって投与されうる。投与は、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、皮下、または皮内であってよい。本発明のワクチン組成物は有効量で投与される。「有効量」とは、単独でまたは更なる投薬で所望の応答を生成するワクチン組成物の量である。特定の細菌性疾患を治療する場合には、感染性作用物質によって刺激されると所望の応答は防御を提供する。
【００６０】
ワクチンの量は、当然のことながら、年齢、身体状態、体積および体重、治療期間、併用療法の性質（もしあれば）、特定の投与経路および保健従事者の知識と専門性の範囲内の因子を含む、個々の患者パラメータに依存するであろう。これらの因子は当業者によく知られており、所定の実験を超えない範囲内で対処することができる。概して、個々の成分またはそれらの組み合わせの最大用量が免疫を誘発するために十分に用いられることが好ましい。この量はつまり正当な医学的判断による安全性の高い用量である。しかしながら、患者は、医学的な理由、心理学的理由または実質的な他の理由によりより低用量または耐容量を主張することは当業者が容易に理解できるであろう。
【００６１】
被検体に投与されるワクチンの用量は、異なるパラメーターに従って、特に用いる投与様式および被検体の状態に従って選択されうる。被検体の応答が用いた初期用量では不十分である場合には、より高用量（または異なるより局在的な運搬経路による効果的な高用量）が患者の許容範囲内で用いられてよい。
【００６２】
一般に、複数用量のワクチンが製剤化され、当分野で標準的な手順に従って有効な免疫化用量で投与される。ワクチン組成物の投与のための他のプロトコールは当業者に知られており、その場合、投薬量、注入計画、注入部位、投与様式などは前述から変更されうる。ヒト以外の哺乳動物へのワクチン組成物の（例えば試験目的または獣医治療目的のための）投与は、前述と実質的に同じ条件で行われる。
【００６３】
本発明の好適な実施形態では、少なくとも一のさらなる抗細菌剤を含む本発明に係るワクチン組成物が提供される。 
【００６４】
本発明の他の好適な実施形態では、少なくとも一のさらなる抗ウイルス剤を含む本発明に係るワクチン組成物が提供される。 
【００６５】
本発明の他の好適な実施形態では、少なくとも一のさらなる抗癌剤を含む本発明に係るワクチン組成物が提供される。
【００６６】
本明細書の記載および特許請求の範囲全体を通して、「含む」および「含有する」なる語句およびこれら語句の変形、例えば「含んでいる」および「含み」は、「含むがこれらに限定しない」ことを意味し、他の部分、付加物、成分、整数または工程を除くことを意図するものではなく、除かない。
【００６７】
本明細書の記載および特許請求の範囲全体を通して、文脈上別段の必要性がない限り、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞が用いられる場合、明細書は、文脈上別段の必要性がない限り、複数形および単数形を考慮しているものと理解される。
【００６８】
本発明の特定の態様、実施形態または実施例に関連して記載される特性、整数、特徴、化合物、化学的部分、または基は、本明細書において記載されている任意の他の態様、実施形態または実施例と、矛盾しない限り、それらに適用可能であると理解される。
【００６９】
本発明の実施形態は、以下の図を参照して例示としてのみ記載する。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】α−タンパク質およびγ−α−タンパク質の発現、およびα−タンパク質の精製を示す。クマシーブルーにて染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥは以下を示す；左パネル：α−タンパク質（レーンＡ）またはγ−α−タンパク質（レーンＧＡ）のいずれかを発現するＭ７２（γ）細胞の全細胞溶解物。右パネル：レーン１、ＳＤＳで溶解した非誘導細胞ペレット；レーン２、誘導細胞ペレット；レーン３、ＰＥＩ上清にて処理した後の可溶性タンパク質；レーン４、硫酸アンモニウム沈殿、再懸濁およびＱカラムにアプライした透析後のレーン３からのタンパク質；レーン５、Ｑカラムフロースルー；レーン６および７、ＳＰカラムから溶出したα−タンパク質を含有する画分；レーン８、１０ｋＤａのタンパク質サイズマーカー。
【図２】αタンパク質の沈降速度分析を示す。αタンパク質の超遠心分離法による分析結果をグラフで示す。扁長モデル、テーラー法、水和ａ／ｂ＝２０．０２６；２ａ＝３１．６３３ｎｍ；２ｂ＝１．５８０ｎｍ；水和膨張＝１９．８８。このモデルは１８．８ｋＤａのタンパク質について算出した形状をグラフで表し、本実験の条件下で１．０７３Ｓの沈降係数が観察された。速度：５００００ｒｐｍ。温度：２２℃。検出：レイリー干渉およびＡ２４４。水和推定値は、アミノ酸組成物および溶液ｐＨに基づいて１ｇのタンパク質当たり０．５５２ｇの水である。算出した摩擦比（ｆ／ｆ０）は２．５６３であり、球形物についての算出したｆ／ｆ０は１．０である。
【図３】α-タンパク質の円偏光二色性を示す。観察された曲線は、すべてのα-ヘリックス構造の特徴である。
【図４】１回の免疫化後のストレプトアビジンおよびαタンパク質に対する１３日目の血清抗体力価を表す。ストレプトアビジンコート９６ウェルプレートを用いて、ＰＢＳ、α−タンパク質またはストレプトアビジンまたはα−タンパク質−ストレプトアビジン複合体と共に播種したマウス血清中のマウス抗ストレプトアビジン免疫グロブリンの存在を測定した。α−タンパク質−ストレプトアビジンコンジュゲートのストレプトアビジンに対するコンジュゲート群の血清抗体力価は、ストレプトアビジン群またはコントロール群のものより高かった。
【図５】α−タンパク質融合体の生じうる構成を示す配置図である。（Ａ）アミノ末端およびカルボキシ末端は図上に示す。灰色の長方形は対象タンパク質、抗原または免疫原であり、α−タンパク質は黒の長方形で示す。（Ｂ）および（Ｃ）はそれぞれＮ末端またはＣ末端での融合を示す。（Ｄ）および（Ｅ）では、タンパク質は、例えばＧＧＧＳやその複数コピーからなる短いフレキシブルリンカーによって連結される。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
材料および方法
α−タンパク質のクローニングおよび発現
髄膜炎菌ＩｇＡプロテアーゼのα−タンパク質領域をコードするＤＮＡ（ＮＭＢ  ＩｇＡ１プロテアーゼ完全読み取り枠寄託番号ＡＡＫ１５０２３の残基１００３−１１７１）は、リボソーム結合部位および開始コドン（下線）およびＥｃｏＲＩ部位（斜体）を含むＡｌｐｈａｆ１： 5'-AAATGAATTCATCGAGGATTTAATTATGAGCCCGCAGGCAAATCAA-3'と、ＨｉｎｄＩＩＩ認識部位（斜体）および終止コドン（下線）を含むリバースプライマーr1: 5'-ATGACAGAAGCTTTGGTATCTACCTGCGGTTACGACGTTT-3'といったプライマーを用いた標準的な技術によりＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物は、発現ベクターｐＪＯＮＥＸ４（Sayers & Eckstein F (1991) Nucleic Acids Res 19: 4127-4132に記載される）にクローニングし、大腸菌Ｍ７２（λ）に形質転換した。完全に配列決定した個々のクローンを同定し、α−タンパク質をコードするｐＪＯＮＥＸ＿αと名付けた。
【００７２】
γ−α−タンパク質のクローニングおよび発現
髄膜炎菌ＩｇＡプロテアーゼの領域（ＮＭＢ  ＩｇＡ１プロテアーゼＡＡＫ１５０２３の残基９７７−１１７１）は、フォワードプライマーＦ１: 5’-AAATGAATTCATCGAGGATTTAATTATGAGTCCTGCCACAAACACGGC-3’と共に、ＨｉｎｄＩＩＩ認識部位（斜体）および終止コドン（下線）を含むリバースプライマーＲ１：5’-AAATGAATTCATCGAGGATTTAATTATGAGTCCTGCCACAAACACGGC-3’といったプライマーを用いた標準的な技術によりＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物は、発現ベクターｐＪＯＮＥＸ４（Sayers & Eckstein F (1991) Nucleic Acids Res 19: 4127-4132に記載される）にクローニングし、大腸菌Ｍ７２（λ）に形質転換した。完全に配列決定した個々のクローンを同定し、γ−α−タンパク質をコードするｐＪＯＮＥＸ＿γ−αと名付けた。
【００７３】
α−タンパク質の精製
大腸菌Ｍ７２（λ）細胞のｐＨＰＮＭＢａプラスミドからタンパク質を発現させ、可溶性タンパク質を得、標準的な方法を用いてイオン交換クロマトグラフィにかけた。簡単にいうと、粗タンパク質抽出物を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ  ｐＨ８、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール（ｖ／ｖ）中のアニオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｑ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にアプライした。α−タンパク質は空隙と共に現れ、２０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４  ｐＨ６．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール（ｖ／ｖ）へ透析し、続いてＨｉＴｒａｐヘパリンおよびＳＰカチオン交換カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にアプライし、同じバッファ中の直線勾配のＮａＣｌ（１００ｍｌ中０〜１Ｍ  ＮａＣｌ）にて溶出した。５ｍｌの分画を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析した。精製したタンパク質は５０％グリセロールに−８０℃で保存した。
【００７４】
γ−α−タンパク質の精製
大腸菌Ｍ７２（λ）細胞のｐＪＯＮＥＸ＿γ−αプラスミドからタンパク質を発現させ、可溶性タンパク質を得、標準的な方法を用いてイオン交換クロマトグラフィにかけた。簡単にいうと、粗タンパク質抽出物を、２０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４  ｐＨ５．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、５％グリセロール（ｖ／ｖ）中のカチオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐヘパリン、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にアプライし、同じバッファ中の直線勾配のＮａＣｌ（１００ｍｌ中０〜１Ｍ  ＮａＣｌ）にて溶出した。これを、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ  ｐＨ８、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、５％グリセロールに透析し、ＨｉＴｒａｐ  Ｑアニオン交換カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にアプライし、その後タンパク質は空隙と共に現れ、２０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４  ｐＨ５．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、５％グリセロール（ｖ／ｖ）へ透析し、次いで２０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４  ｐＨ５．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、５％グリセロール（ｖ／ｖ）中のカチオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐヘパリン、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にアプライした。これを同じバッファ中の直線勾配のＮａＣｌ（１００ｍｌ中０〜１Ｍ  ＮａＣｌ）にて溶出した。５ｍｌの分画を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析した。精製したタンパク質は５０％グリセロールに−２０℃で保存した。
【００７５】
合成γペプチド
マウス免疫化に用いる合成γペプチドはケンブリッジペプチド社から注文し、タンパク質エクスポート中はαペプチドから切断したＮＭＢγペプチドの配列に基づいた。合成ペプチドのアミノ酸配列は以下のものであった。SPATNTASQAQTDSAQIAKPQNIVVAPP （配列番号：６４）。
【００７６】
免疫化および抗血清の生成
６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに、１０μｇのα−タンパク質単独、合成γ−タンパク質単独、γ−α−タンパク質単独、α−タンパク質とストレプトアビジン、α−タンパク質と合成γ−タンパク質、ストレプトアビジン単独、またはストレプトアビジン−α−タンパク質−ビオチンコンジュゲートのいずれかを含む２００μｌのリン酸緩衝生理食塩水を腹腔内注入した。血液試料は接種の１３日後に尾静脈から得た。血液は４℃で終夜保存し、１３０００×ｇで５分間遠心分離した。α−タンパク質および／またはストレプトアビジンをＰＢＳにて１０μｇ／ｍｌに希釈し、ＥＬＩＳＡプレート（ＣｏＳｔａｒ（登録商標））を１００μｌ／ウェルにてコートした。プレートは４℃で終夜保存した。ウェルを吸引し、洗浄バッファ（ＰＢＳ＋０．０５％ＴＷＥＥＮ２０）にて洗浄した。１００μｌのブロッキングバッファ（ＰＢＳ＋５％粉末ミルク）を添加してウェルの反応を止め、室温で１時間インキュベートした。次いで、マウス血清の段階希釈液をウェルに添加した。インキュベート後、ウェルを洗浄バッファにて洗浄し、１／２０００希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗マウスＩｇＧ（ＢＤ  ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎＴＭ）  １００μｌを各ウェルに添加し、その後室温で１時間インキュベートした。ウェルを吸引し、洗浄バッファにて洗浄した。次いで、酵素イムノアッセイにおいてペルオキシダーゼ活性を検出するための基質（ＳＩＧＭＡＦＡＳＴＴＭ  ＯＰＤ錠）を２０ｍｌの水に溶解し、１００μｌを各ウェルに添加した。Ｇｅｎ５ソフトウエアを搭載したＴｅｃａｎプレート読み取り機を用いて４５０ｎｍ波長の吸光度を測定した。
【００７７】
α−タンパク質およびγ−α−タンパク質を直ちに発現させ、α−タンパク質を図１に示すような標準的なクロマトグラフィの手順によってすぐに精製した。分析用超遠心分離法の結果から、非常に伸長した構造を有していたことが示唆された（３０ｎｍ超の長さ、図２）。タンパク質は、円偏光二色性によって測定したところ予測されるαへリックス構造を有していた（図３）。
【００７８】
α−タンパク質はモデル抗原に対して免疫応答を刺激する
モデル抗原（ストレプトアビジン）は、図４に示されるようなα−タンパク質にコンジュゲートした場合に見られる免疫応答と比較して、弱い免疫応答を起こすことがわかった。
【００７９】
α−タンパク質との架橋結合
精製したα−タンパク質を、リン酸カリウムバッファ中のＮ−ヒドロキシサクシンイミド−ビオチンエステル（ＮＨＳ−ビオチン）にてｐＨ７〜８で活性化した。ＮＨＳビオチンエステルは使用直前にＤＭＳＯに溶解して１ｍｇ／ｍｌとし、７５μｌ（１ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌのタンパク質に添加した（１ｍｇ／ｍｌ）。この反応物を室温で４時間インキュベートし、ｐＨ８の０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌに対して終夜透析した。ストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ）は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解して１ｍｇ／ｍｌとし、次いで１８５μｌのストレプトアビジンを５００μｌのビオチン化α−タンパク質と反応させ、氷上で１時間インキュベートした。
【００８０】
α−タンパク質との架橋結合の一般的な手順
免疫化のためにタンパク質と他の分子を架橋結合するための方法は文献において周知であり、多くは免疫化および予防接種のためにα−タンパク質を分子へ結合するために適している。例えば、遊離システイン残基を含むペプチドおよびタンパク質は、中性ｐＨ条件下で、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）などのヘテロ二官能性アミン対チオール架橋剤を用いてα−タンパク質へコンジュゲートすることができる。まず、標準的な条件下でα−タンパク質をスルホ−ＳＭＣＣと反応させ、その後、修飾したα−タンパク質内のマレイミド基と反応するチオール含有タンパク質ないしはペプチドと混合する。遊離チオールを欠くペプチドおよびタンパク質抗原は、適当な水溶性ビス（スルホスクシンイミジル）スベリン酸塩（スルホ−ＤＳＳ）、アミン対アミン架橋剤を用いて、アミノ末端に存在する遊離アミノ基またはリジン側鎖のγアミノ基を用いてα−タンパク質へ結合することができる。
【００８１】
α−タンパク質融合体の一般的な構築
α−タンパク質融合体は、対象タンパク質とのアミノないしはカルボキシ末端結合α−タンパク質融合体として、全遺伝子合成を含む標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作製することができる。α−タンパク質とパートナーとの間の連結は、短く、組換え遺伝子内にコードされるフレキシブルリンカーを含んでも含んでなくてもよい。図５参照。
【００８２】
ＮＭＢ  ＩｇＡ１プロテアーゼの残基９７７−１１７１からなるタンパク質、γ−α−タンパク質の融合体。
配列番号：４３
MSPATNTASQAQTDSAQIAKPQNIVVAPPSPQANQAEEAKRQQAKAEQVKRQQAEAERKSAELAKQKAEAEREARELATRQKAEQERSSAELARRHEKEREAAELSAKQKVEAEREAQALAVRRKAEAEEAKRQAAELARQQEEARKAAELAAKQKAETERKAAEIAEQKAEAEREAAELAKQKAEEEGRQAAQSQ
【００８３】
Ｃ末端にα−タンパク質を有するＧｌｙ１タンパク質（寄託番号：ＮＰ＿２７３８１８）の融合体。
配列番号：４４
MKKMFLSAVLLLSAAAQTVWADTVFSCKTDNNKYIEVQKINRNLYEYSFGSAAKKEIAIRNSKADLLGRSDRWQGMGSGRWATMKFQNGEFMYTIWTGFDSVTHTESSGVVVERRGKEVARVGCTPKTAQANFNDDDFSSPQANQAEEAKRQQAKAEQVKRQQAEAERKSAELAKQKAEAEREARELATRQKAEQERSSAELARRHEKEREAAELSAKQKVEAEREAQALAVRRKAEAEEAKRQAAELARQQEEARKAAELAAKQKAETERKAAEIAEQKAEAEREAAELAKQKAEEEGRQAAQSQ
【００８４】
またはα−タンパク質のＣ末端に融合したＮＰ＿２７３８１８の成熟領域。
配列番号：４５
MSPQANQAEEAKRQQAKAEQVKRQQAEAERKSAELAKQKAEAEREARELATRQKAEQERSSAELARRHEKEREAAELSAKQKVEAEREAQALAVRRKAEAEEAKRQAAELARQQEEARKAAELAAKQKAETERKAAEIAEQKAEAEREAAELAKQKAEEEGRQAAQSQAQTVWADTVFSCKTDNNKYIEVQKINRNLYEYSFGSAAKKEIAIRNSKADLLGRSDRWQGMGSGRWATMKFQNGEFMYTIWTGFDSVTHTESSGVVVERRGKEVARVGCTPKTAQANFNDDDFS
【００８５】
融合体はGGGSやGGGSGGGSなどの小さなフレキシブルリンカー領域を含みうる。
【実施例】
【００８６】
実施例：フレキシブルリンカー（GGGS）を有するナイセリアのＧｌｙ１タンパク質（寄託番号：ＮＰ＿２７３８１８）とＣ末端のα−タンパク質との融合体。
配列番号：４６
MKKMFLSAVLLLSAAAQTVWADTVFSCKTDNNKYIEVQKINRNLYEYSFGSAAKKEIAIRNSKADLLGRSDRWQGMGSGRWATMKFQNGEFMYTIWTGFDSVTHTESSGVVVERRGKEVARVGCTPKTAQANFNDDDFSGGGSSPQANQAEEAKRQQAKAEQVKRQQAEAERKSAELAKQKAEAEREARELATRQKAEQERSSAELARRHEKEREAAELSAKQKVEAEREAQALAVRRKAEAEEAKRQAAELARQQEEARKAAELAAKQKAETERKAAEIAEQKAEAEREAAELAKQKAEEEGRQAAQSQ
【００８７】
実施例：α−タンパク質のＮ末端とマンヘミアタンパク質寄託番号：ＮＰ＿２７３８１８の融合体。
配列番号：４７
MRKLLVITALTLCTTPVFAADKNVIFSCTSTEGKPLTVKRVGNDYEYSYDKTTFKNPIKKAVTNDGSIIARGSGFTTYALELENDGLKYLVGFVQPNGNAKEFIEPGATISQRKEQPSIGSVDCDTRKKSHYKFDVHLMNTLSPQANQAEEAKRQQAKAEQVKRQQAEAERKSAELAKQKAEAEREARELATRQKAEQERSSAELARRHEKEREAAELSAKQKVEAEREAQALAVRRKAEAEEAKRQAAELARQQEEARKAAELAAKQKAETERKAAEIAEQKAEAEREAAELAKQKAEEEGRQAAQSQ
【００８８】
太字で示すＮ末端シグナルペプチド配列（MRKLLVITALTLCTTPVFA）は大腸菌内での発現の間に除かれる。
【００８９】
実施例：α−タンパク質のＮ末端とヘモフィルス・インフルエンザエタンパク質寄託番号：Ｅ１Ｘ８Ｚ７の融合体。
配列番号：４８
MKKLLTIGAVAMFATPAFAANNIFSCTAENGSPVSVTKNGSDYEFTYGQVSFKNPVKQVFANQDSYVATGSGFITSSLEMRNNGTSYTIQFVQPHNSNSIEEPMLYITNGSKMDTVSCKAGSATQNFERRSMKASSPQANQAEEAKRQQAKAEQVKRQQAEAERKSAELAKQKAEAEREARELATRQKAEQERSSAELARRHEKEREAAELSAKQKVEAEREAQALAVRRKAEAEEAKRQAAELARQQEEARKAAELAAKQKAETERKAAEIAEQKAEAEREAAELAKQKAEEEGRQAAQSQ
【００９０】
実施例：α−タンパク質Ｃ末端に融合したＢ型肝炎ウイルス。
配列番号：４９
MSPQANQAEEAKRQQAKAEQVKRQQAEAERKSAELAKQKAEAEREARELATRQKAEQERSSAELARRHEKEREAAELSAKQKVEAEREAQALAVRRKAEAEEAKRQAAELARQQEEARKAAELAAKQKAETERKAAEIAEQKAEAEREAAELAKQKAEEEGRQAAQSQENITSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPTCPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTTSAGPCRTCTTTAQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSWLSLLVPFVQWFAGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYRILS
PFLPLLPIFFCLWVYI
【００９１】
実施例：α−タンパク質Ｃ末端に融合した大きな表面抗原（Ｂ型肝炎ウイルス）。
配列番号：５０
MSPQANQAEEAKRQQAKAEQVKRQQAEAERKSAELAKQKAEAEREARELATRQKAEQERSSAELARRHEKEREAAELSAKQKVEAEREAQALAVRRKAEAEEAKRQAAELARQQEEARKAAELAAKQKAETERKAAEIAEQKAEAEREAAELAKQKAEEEGRQAAQSQGQNLSTSNPLGFFPDHQLDPAFRANTANPDWDFNPNKDTWPDANKVGAGAFGLGFTPPHGGLLGWSPQAQGILQTLPANPPPASTNRQTGRQPTPLSPPLRNTHPQAMQWNSTTFHQTLQDPRVRGLYFPAGGSSSGTNPVPTTASPLSSIFSRIGDPALNMENITSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPTCPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCRTCMTTAQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYSILSPFLPLLPIFFCLWVYI
【００９２】
α−タンパク質Ｎ末端に融合した分泌されたフィブロネクチン結合タンパク質抗原ｆｂｐＡ［結核菌］寄託番号．ＺＰ＿０６４４５２８１。
配列番号：５１
MREARMQLVDRVRGAVTGMSRRLVVGAVGAALVSGLVGAVGGTATAGAFSRPGLPVEYLQVPSPSMGRDIKVQFQSGGANSPALYLLDGLRAQDDFSGWDINTPAFEWYDQSGLSVVMPVGGQSSFYSDWYQPACGKAGCQTYKWETFLTSELPGWLQANRHVKPTGSAVVGLSMAASSALTLAIYHPQQFVYAGAMSGLLDPSQAMGPTLIGLAMGDAGGYKASDMWGPKEDPAWQRNDPLLNVGKLIANNTRVWVYCGNGKPSDLGGNNLPAKFLEGFVRTSNIKFQDAYNAGGGHNGVFDFPDSGTHSWEYWGAQLNAMKPDLQRALGATPNTGPAPQGASPQANQAEEAKRQQAKAEQVKRQQAEAERKSAELAKQKAEAEREARELATRQKAEQERSSAELARRHEKEREAAELSAKQKVEAEREAQALAVRRKAEAEEAKRQAAELARQQEEARKAAELAAKQKAETERKAAEIAEQKAEAEREAAELAKQKAEEEGRQAAQSQ
【００９３】
α−タンパク質のＣ末端に融合した髄膜炎菌由来のＧＮＡ１８７０タンパク質に基づく。
配列番号：５２
SPQANQAEEAKRQQAKAEQVKRQQAEAERKSAELAKQKAEAEREARELATRQKAEQERSSAELARRHEKEREAAELSAKQKVEAEREAQALAVRRKAEAEEAKRQAAELARQQEEARKAAELAAKQKAETERKAAEIAEQKAEAEREAAELAKQKAEEEGRQAAQSQSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
【００９４】
以下のタンパク質は、α−タンパク質との化学的な架橋結合形態で用いられるか、または、全遺伝子合成によってＮないしはＣ末端融合体として構築され、適切な宿主、好ましくは大腸菌内で発現されうる。
【００９５】
配列番号：５３  
エステラーゼ，抗原８５−Ｂ［マイコバクテリウム・ツベルクローシス  ＣＤＣ１５５１］
MSPLSTLALSAAVTDTEMRRLCARIDIWPPHTVCSGPSTRRHTGQRGTGMTDVSRKIRAWGRRLMIGTAAAVVLPGLVGLAGGAATAGAFSRPGLPVEYLQVPSPSMGRDIKVQFQSGGNNSPAVYLLDGLRAQDDYNGWDINTPAFEWYYQSGLSIVMPVGGQSSFYSDWYSPACGKAGCQTYKWETFLTSELPQWLSANRAVKPTGSAAIGLSMAGSSAMILAAYHPQQFIYAGSLSALLDPSQGMGPSLIGLAMGDAGGYKAADMWGPSSDPAWERNDPTQQIPKLVANNTRLWVYCGNGTPNELGGANIPAEFLENFVRSSNLKFQDAYNAAGGHNAVFNFPPNGTHSWEYWGAQLNAMKGDLQSSLGAG
【００９６】
配列番号：５４
エステラーゼ，［マイコバクテリウム・ツベルクローシス  ＣＤＣ１５５１］
MHTALHDGGGHMKGRSALLRALWIAALSFGLGGVAVAAEPTAKAAPYENLMVPSPSMGRDIPVAFLAGGPHAVYLLDAFNAGPDVSNWVTAGNAMNTLAGKGISVVAPAGGAYSMYTNWEQDGSKQWDTFLSAELPDWLAANRGLAPGGHAAVGAAQGGYGAMALAAFHPDRFGFAGSMSGFLYPSNTTTNGAIAAGMQQFGGVDTNGMWGAPQLGRWKWHDPWVHASLLAQNNTRVWVWSPTNPGASDPAAMIGQAAEAMGNSRMFYNQYRSVGGHNGHFDFPASGDNGWGSWAPQLGAMSGDIVGAIR
【００９７】
配列番号：５５
シャペロニン  ＧｒｏＥＬ［マイコバクテリウム・ツベルクローシス  Ｈ３７Ｒｖ］
MSKLIEYDETARRAMEVGMDKLADTVRVTLGPRGRHVVLAKAFGGPTVTNDGVTVAREIELEDPFEDLGAQLVKSVATKTNDVAGDGTTTATILAQALIKGGLRLVAAGVNPIALGVGIGKAADAVSEALLASATPVSGKTGIAQVATVSSRDEQIGDLVGEAMSKVGHDGVVSVEESSTLGTELEFTEGIGFDKGFLSAYFVTDFDNQQAVLEDALILLHQDKISSLPDLLPLLEKVAGTGKPLLIVAEDVEGEALATLVVNAIRKTLKAVAVKGPYFGDRRKAFLEDLAVVTGGQVVNPDAGMVLREVGLEVLGSARRVVVSKDDTVIVDGGGTAEAVANRAKHLRAEIDKSDSDWDREKLGERLAKLAGGVAVIKVGAATETALKERKESVEDAVAAAKAAVEEGIVPGGGASLIHQARKALTELRASLTGDEVLGVDVFSEALAAPLFWIAANAGLDGSVVVNKVSELPAGHGLNVNTLSYGDLAADGVIDPVKVTRSAVLNASSVARMVLTTETVVVDKPAKAEDHDHHHGHAH
【００９８】
配列番号：５６
コ−シャペロニン  ＧｒｏＥＳ［マイコバクテリウム・ツベルクローシス  Ｈ３７Ｒｖ］
MAKVNIKPLEDKILVQANEAETTTASGLVIPDTAKEKPQEGTVVAVGPGRWDEDGEKRIPLDVAEGDTVIYSKYGGTEIKYNGEEYLILSARDVLAVVSK
【００９９】
配列番号：５７
早期分泌抗原標的，６ｋＤａ［マイコバクテリウム・ツベルクローシス  ＣＤＣ１５５１］
MTEQQWNFAGIEAAASAIQGNVTSIHSLLDEGKQSLTKLAAAWGGSGSEAYQGVQQKWDATATELNNALQNLARTISEAGQAMASTEGNVTGMFA
【０１００】
配列番号：５８  
ヒトＨｅｒ２レセプター残基２３−６５２
TQVCTGTDMKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQVVQGNLELTYLPTNASLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGASPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRSRACHPCSPMCKGSRCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCARCKGPLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLACLHFNHSG
【０１０１】
配列番号：５９  
ヒトＰＳＡ  寄託番号：Ｐ０７２８８  残基２５−２６１
IVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHDLMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERPSLYTKVVHYRKWIKDTIVANP
【０１０２】
配列番号：６０
ＨＩＶ  ｇｐ１２０  残基３３−５１１
KLWVTVYYGVPVWKEATTTLFCASDAKAYDTEVHNVWATHACVPTDPNPQEVVLVNVTENFNMWKNDMVEQMHEDIISLWDQSLKPCVKLTPLCVSLKCTDLKNDTNTNSSSGRMIMEKGEIKNCSFNISTSIRGKVQKEYAFFYKLDIIPIDNDTTSYKLTSCNTSVITQACPKVSFEPIPIHYCAPAGFAILKCNNKTFNGTGPCTNVSTVQCTHGIRPVVSTQLLLNGSLAEEEVVIRSVNFTDNAKTIIVQLNTSVEINCTRPNNNTRKRIRIQRGPGRAFVTIGKIGNMRQAHCNISRAKWNNTLKQIASKLREQFGNNKTIIFKQSSGGDPEIVTHSFNCGGEFFYCNSTQLFNSTWFNSTWSTEGSNNTEGSDTITLPCRIKQIINMWQKVGKAMYAPPISGQIRCSSNITGLLLTRDGGNSNNESEIFRPGGGDMRDNWRSELYKYKVVKIEPLGVAPTKAKRRVVQREKR
【０１０３】
ＨＩＶ  ＧＡＧタンパク質
配列番号：６１
MGARASVLSGGELDKWEKIRLRPGGKKKYKLKHIVWASRELERFAVNPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLYCVHQRIDVKDTKEALEKIEEEQNKSKKKAQQAAAAAGTGNSSQVSQNYPIVQNLQGQMVHQAISPRTLNAWVKVVEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAGPIAPGQMREPRGSDIAGTTSTLQEQIGWMTNNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDIRQGPKEPFRDYVDRFYKTLRAEQASQDVKNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPANIMMQRGNFRNQRKTVKCFNCGKEGHIAKNCRAPRKKGCWRCGREGHQMKDCTERQANFLGKIWPSYKGRPGNFLQSRPEPTAPPEESFRFGEEKTTPSQKQEPIDKELYPLTSLRSLFGNDPSSQ
【０１０４】
Ｅ６［ヒトパピローマウイルスタイプ１６］
配列番号：６２
MHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSVYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL
【０１０５】
Ｅ７［ヒトパピローマウイルスタイプ１６］
配列番号：６３
MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP
【０１０６】
髄膜炎菌γ  ペプチド融合タンパク質
配列番号：６４
SPATNTASQAQTDSAQIAKPQNIVVAPP
【０１０７】
実施例１：α−およびγ−ペプチドに対する血清抗体力価
マウスを、α−またはγ−ペプチド、またはα−とγ−ペプチド併用、またはそれらの融合型のいずれかで免疫化し、抗血清を生成させた。表１および表２に示すように、α−タンパク質は単独で接種した場合に高い免疫原性タンパク質である（表１）。このことから、αペプチドは、他の免疫原性の低いタンパク質に対して免疫応答を増加するキャリアタンパク質として作用することができることが示唆される。γ−ペプチド単独では免疫応答を起こさなかったが、α−ペプチドとの併用または融合型で接種した場合には検出可能な免疫応答が測定された（表２）。
【０１０８】
表１：αペプチドに対するマウス各群の血清抗体力価。血清抗体価は、血清抗体価がＰＢＳ単独を接種したマウスから得られるベースライン値よりも大きい場合に最大の希釈係数として算出した。α単独を接種したマウスは多くの数の抗α抗体を持つ。α＋γ混合を接種したマウスは、α単独群と比較しておよそ２０％低い力価である。α−γ融合体では抗体力価が１００分の１であるのに対して、γ単独ではα−ペプチドに対して検出可能なレベルの抗体を産生しなかった。
【表１】
2015500226.tif 000003
【０１０９】
表２：γペプチドに対するマウス各群の血清抗体力価。血清抗体力価は、血清抗体価がPBS単独を接種したマウスから得られるベースライン値よりも大きい場合に最大の希釈係数として算出した。示されるように、α＋γ混合またはγ−α融合体を接種したマウスはいずれもγ−タンパク質に対して高いレベルの抗体を産生したが、その他の群は検出可能なレベルの抗γ抗体を産生しなかった。
【表２】
2015500226.tif 000004
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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