(57)【要約】  本発明は、細胞を凍結乾燥させて細胞及び細胞が含んでいる有用物質を常温で安定して保存する方法に関するものである。本発明の凍結乾燥保護剤を使用して細胞を凍結乾燥すれば、凍結時に発生し得る細胞構造の損傷を防ぐことができ、前記凍結乾燥された細胞は常温で保管することができて、細胞内に含まれている有用物質は常温でその機能を維持することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）動物細胞を培養する段階、（２）前記培養された動物細胞を凍結乾燥保護剤で処理する段階、及び（３）前記凍結乾燥保護剤で処理された動物細胞を凍結乾燥させる段階を含む、凍結乾燥した細胞を常温で安定して保存する方法。
【請求項２】
前記動物細胞は、ヒト来由の細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の凍結乾燥された細胞を常温で安定して保存する方法。
【請求項３】
前記細胞は、ケラチノサイトまたは繊維芽細胞であることを特徴とする、請求項２に記載の凍結乾燥された細胞を常温で安定して保存する方法。
【請求項４】
前記凍結乾燥保護剤は、糖、タンパク質、水溶性高分子物質を含むことを特徴とする、請求項１に記載の凍結乾燥された細胞を常温で安定して保存する方法。
【請求項５】
前記糖は、デキストロース（ｄｅｘｔｒｏｓｅ）、マルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）、グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）、ラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、トレハロース（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）、マンノース（ｍａｎｎｏｓｅ）、ラフィノース（ｒａｆｆｉｎｏｓｅ）、セロビオース（ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ）、ゲンチオビオース（ｇｅｎｔｉｏｂｉｏｓｅ）、イソマルトース（ｉｓｏｍａｌｔｏｓｅ）、アラビノース（ａｒａｂｉｎｏｓｅ）、果糖（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）、メレジトース（ｍｅｌｅｚｉｔｏｓｅ）、メリビオース（ｍｅｌｉｂｉｏｓｅ）、ソルビトール（ｓｏｒｂｉｔｏｌ）、トリオース（ｔｒｉｏｓｅ）から選択されることを特徴とする、請求項４に記載の凍結乾燥された細胞を常温で安定して保存する方法。
【請求項６】
前記タンパク質は、アルブミンまたは血清であることを特徴とする、請求項４に記載の凍結乾燥された細胞を常温で安定して保存する方法。
【請求項７】
前記水溶性高分子物質は、ポリエチレングリコールまたはプロピレングリコール、ＨＥＳ（ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ  ｓｔａｒｃｈ）、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリエチレンアミン、ポリエチレンオキシド（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ）、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）から選択されることを特徴とする、請求項４に記載の凍結乾燥された細胞を常温で安定して保存する方法。
【請求項８】
請求項１ないし請求項７のいずれか一項の方法で製造された安定した凍結乾燥製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を凍結乾燥させて細胞及び細胞が含んでいる有用物質を常温で安定して保存する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
凍結乾燥は、溶液状態等にある試料を凍結してそのままの状態で減圧下に放置することにより、試料中の水分を昇華させて除去する乾燥法であり、生体試料をはじめとして水を含む試料の乾燥に広く使用されている。
しかし、細胞のような水を含む試料は、凍結すると、凍結中に水の分子どうしが溶質や混入物の媒質を排除しながら結晶化して水の分子のみからなる氷結晶を形成するため、含水物中で溶質や混入物の媒質が不均一に拡散し、凍結濃縮が発生するものと知られている。
【０００３】
また、細胞の損傷は、室温の乾燥状態でもおき得る。
前記のような問題点を解決するため、凍結乾燥時に、細胞構造の損傷なしに保存するために凍結保存溶液が使用される。凍結乾燥前に細胞保護のために前もって使用する凍結保存溶液は、溶液のイオン強度と浸透圧を維持する緩衝溶液と、凍結及び乾燥させる際の組織の物理、化学的損傷を防止し、組織の構造変化を防止する凍結乾燥保護剤で構成される。この際、凍結乾燥保護剤は、遊離転移温度を高めて、凍結乾燥過程で氷粒子の再結晶に起因する組織瓦解を防止し組織の安定性を高める。すなわち、乾燥中に組織の温度が遊離転移温度より高ければ、氷粒子の再結晶がなされ、再結晶した氷粒子が大きくなって組織が損傷するため、凍結乾燥保護剤を用して遊離転移温度を高めれば、組織内に六角形の氷より安定せず、氷結晶の大きさが小さな遊離質氷または正方形の氷の比重が高くなるため、組織の損傷を減らし乾燥速度を高めることができる。
【０００４】
現在、一般的に使用されている凍結乾燥保護剤は、ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）、デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）、ショ糖（ｓｕｃｒｏｓｅ）、グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）、マンニトール（ｍａｎｎｉｔｏｌ）、ソルビトール（ｓｏｒｂｉｔｏｌ）、果糖（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）、トレハロース（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）、ラフィノ−ス（ｒａｆｆｉｎｏｓｅ）、血清アルブミン（ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）等を目的に応じて組み合わせたものであるが、これらの生体安全性はすでに検証されているが、目的による混合条件が難しいので、製造方法が複雑で、製造時に多くの費用が所要されるという短所がある。
【０００５】
前記凍結乾燥保護剤を使用して細菌、ウイルス、血清、ワクチン等を凍結乾燥させれば、常温で長期間保存することができる長所がある。
【０００６】
しかし、真核細胞の場合、前記凍結乾燥保護剤を使用しても凍結乾燥時に細胞膜等の細胞構造の損傷なしに細胞を安定して保存するのが難しく、その結果、細胞内の有用物質の機能を維持することができない問題点がある。
【０００７】
また、前記凍結乾燥保護剤を使用しても凍結乾燥された細胞を冷凍及び低温で保管しなければならず、常温で細胞及び細胞内に含有された有用物質を安定して保存することができないという短所がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、細胞を凍結乾燥させて細胞及び細胞が含んでいる有用物質を常温で安定して保存する方法、及び前記方法で製造された安定した凍結乾燥製剤を提供しようとする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は（１）動物細胞を培養する段階、（２）前記培養された動物細胞を凍結乾燥保護剤で処理する段階、及び（３）前記凍結乾燥保護剤で処理された動物細胞を凍結乾燥させる段階を含む、凍結乾燥された細胞を常温で安定して保存する方法を提供する。
【００１０】
また、本発明は、前記方法で製造された安定した凍結乾燥製剤を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の凍結乾燥保護剤を使用して細胞を凍結乾燥すれば、凍結時に発生し得る細胞構造の損傷を防ぐことができ、前記凍結乾燥された細胞は常温で１年以上保管することができて、細胞内に含まれている有用物質は常温でその機能を維持することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ヒトに由来したケラチン細胞のシート形態を位相差倒立顕微鏡を使用して観察した結果を示したものである。
【図２】ヒトに由来したケラチン細胞のペレット形態を位相差倒立顕微鏡を使用して観察した結果を示したものである。
【図３】ヒトに由来した繊維芽細胞の形態を位相差倒立顕微鏡を使用して観察した結果を示したものである。
【図４】シート形態のケラチン細胞をＰＥＴフィルムに付着した形態を示したものである。
【図５】Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ状態の細胞で上層液を除去し、残ったｐｅｌｌｅｔ形態の細胞を示したものである。
【図６】シート形態のケラチン細胞で発現するタンパク質と創傷治癒因子を測定した結果を示したものである。
【図７】ペレット形態のケラチン細胞で発現するタンパク質と創傷治癒因子を測定した結果を示したものである。
【図８】ペレット形態の繊維芽細胞で発現するタンパク質と創傷治癒因子を測定した結果を示したものである。
【図９】凍結乾燥前の細胞と凍結乾燥後の細胞を対照群と比較して創傷治癒効果を確認した結果を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は（１）動物細胞を培養する段階、（２）前記培養された動物細胞を凍結乾燥保護剤で処理する段階、及び（３）前記凍結乾燥保護剤で処理された動物細胞を凍結乾燥させる段階を含む、凍結乾燥された細胞を常温で安定して保存する方法を提供する。
【００１４】
本発明に使用された用語「安定して」は、常温で細胞の機能が維持されることを意味する。常温の温度は１５ないし２０℃の温度を意味し、これは一般的に安定性を維持しやすい冷蔵（０〜１０℃）保管条件を含むことができる。
【００１５】
本発明の動物細胞は、哺乳動物またはヒトに由来したものを使用することができる。
【００１６】
前記細胞は、ケラチノサイトまたは繊維芽細胞であることができ、細胞の形態はシート形態またはペレット形態であることができる。前記ペレット形態の細胞は、ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ細胞を遠心分離して上層液をとり除いた後に残った細胞であるところ、ペレット形態の細胞はｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ細胞を含むことができる。
【００１７】
前記ケラチノサイトの起源組織としては、分化した皮膚、皮膚付属器官または胚芽肝細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）が適している。起源組織が皮膚の場合には、包皮（ｆｏｒｅｓｋｉｎ）、わき、尻、乳房、頭皮、恥骨部または陰嚢に来由したものを使用することが好ましい。起源組織が皮膚付属器官の場合には、毛嚢、汗腺、皮脂腺または毛細管に来由したものを使用するのが適している。毛嚢は成熟期（ａｎａｇｅｎ）の毛嚢に来由し毛嚢のケラチノサイトが付いている髪の毛を使用することが好ましい。
【００１８】
前記繊維芽細胞は、分化した皮膚組織を分解（ｄｉｓａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）するか胚芽肝細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）を分化して収得することができる。分解は、当業界に公知となった方法を利用することができ、そのような方法としては、物理的分解及び／または消化酵素及び／または隣合う細胞との連結を弱くするキレーティング剤の処理等が含まれる。このような方法を利用して細胞を破壊せず、組織を単一細胞に分散することができる。特に、酵素による分離は、先に組織を粉砕（ｍｉｎｃｉｎｇ）した後、多数の消化酵素のうちいずれか一つを単独でまたは混合して処理することにより、容易に達成されることができる。適した酵素の例には、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、ＤＮａｓｅ、プロナーゼ及びディスパーゼ等が含まれるが、これに制限されるものではない。物理的な分解方法は、グラインダー（ｇｒｉｎｄｅｒ）、ブレンダー（ｂｌｅｎｄｅｒ）、篩（ｓｉｅｖｅ）、ホモジナイザー（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）またはソニケーター（ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を利用する方法がある。
【００１９】
本発明の細胞は、通常の動物細胞培養用の培地で培養することにより増殖することができる。このような培地は、当業界に公知となった成分及び造成によって製造したり商業的に入手することができる。本発明で利用することができる培地としては、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）；  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）；  Ｍ１９９；  ＲＰＭＩ  １６４０；  Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＤＭＥＭ）、ＭＣＤＢ、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１０、ＮＣＴＣ  １０９、ＮＣＴＣ  １３５、Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−Ｓｅｒｕｍ  Ｆｒｅｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ）、Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＫＧＭ）等が含まれるが、これに制限されるものではない。
【００２０】
前記培地は、ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、ウシ血清（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、トリヨードサイロニン（ｔｒｉｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ、Ｔ３）、インシュリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）、ヒドロコルゾン（ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、アデニン（ａｄｅｎｉｎ）、トランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）、ゲンタマイシン（Ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ）及びペニシリン−ストレプトマイシン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）のような抗生剤等を追加で含むことができるが、これに制限されるものではない。
【００２１】
本発明の動物細胞は、凍結乾燥される前に凍結乾燥保護剤で処理される。
【００２２】
本発明の凍結乾燥保護剤は、糖、タンパク質、水溶性高分子物質を含んで製造されることができる。
【００２３】
本発明に使用される糖は、単糖類、二糖類、多糖類を全て含み、デキストロース（ｄｅｘｔｒｏｓｅ）、マルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）、グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）、ラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、トレハロース（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）、マンノース（ｍａｎｎｏｓｅ）、ラフィノース（ｒａｆｆｉｎｏｓｅ）、セロビオース（ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ）、ゲンチオビオース（ｇｅｎｔｉｏｂｉｏｓｅ）、イソマルトース（ｉｓｏｍａｌｔｏｓｅ）、アラビノース（ａｒａｂｉｎｏｓｅ）、果糖（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）、メレジトース（ｍｅｌｅｚｉｔｏｓｅ）、メリビオース（ｍｅｌｉｂｉｏｓｅ）、ソルビトール（ｓｏｒｂｉｔｏｌ）、トリオース（ｔｒｉｏｓｅ）であることができるが、これに限定されるものではない。
【００２４】
本発明の糖は、細胞膜と細胞膜タンパク質を、凍結時に現われる氷結晶から保護し安定化させる役割をする。したがって、本発明によって製造された凍結乾燥製剤の安定性が向上することができ、細胞構造が損傷なしに維持されることができる。
【００２５】
本発明で使用される糖は、細胞の種類等に応じて任意に適するように選択されることができ、凍結乾燥保護剤全体の組成物中に０．１ないし２０％で含まれることができる。糖が０．１％未満なら凍結乾燥時に効果が低下し、２０％を超過するようになると凍結乾燥保護剤の粘性が高くて扱いやすくなくなる。
【００２６】
また、本発明の凍結乾燥保護剤は、タンパク質を含むことができる。本発明のタンパク質は、凍結から細胞が破損されることを防ぐ。適切なタンパク質はアルブミン、血清等が含まれるが、これらに制限されない。添加されるタンパク質は、細胞の種類等に応じて任意に適するように選択されることができ、凍結乾燥保護剤全体の組成物の中に１ないし１５％で含まれることができる。タンパク質が１％未満なら凍結乾燥時に効果が低下し、１５％を超過するようになると細胞が含む有用物質の測定実験に影響を及ぼし得る。
【００２７】
また、本発明の凍結乾燥保護剤は、水溶性高分子物質を含む。本発明の高分子物質は、細胞を保護してその大きさ及び形態が乾燥工程の間一定に維持されるようにし、乾燥及び保存に耐える能力を向上させるため、保護剤として機能することができる。適切な高分子物質は、ポリエチレングリコールまたはプロピレングリコール、ＨＥＳ（ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ  ｓｔａｒｃｈ）、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリエチレンアミン、ポリエチレンオキシド（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ）、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）等が含まれるが、これらに制限されない。添加される高分子物質の濃度は、凍結乾燥保護剤全体の組成物中に０．５ないし５％で含まれることができる。水溶性高分子物質が０．５％未満なら凍結乾燥時に効果が低下し、５％を超過するようになると凍結乾燥保護剤の粘性が高くて扱いやすくなくなる。
【００２８】
本発明で細胞に凍結乾燥保護剤を処理することは、当業界に公知となった多様な方法によってなされることができる。処理時間は細胞の種類等に応じて多様であり得て、例えば常温（１５℃〜２５℃）で５分ないし１０分の間処理することができる。
【００２９】
本発明で凍結乾燥保護剤が処理された細胞は、市販の凍結乾燥器を利用して当業界に公知となった凍結乾燥方法によって凍結乾燥することができる。このような方法は、例えばＪａｎｏｆｆ等のアメリカ特許第４，８８０，８３５号に開示されている。
【００３０】
本発明の一具体例で、本発明細胞の凍結乾燥方法は次の手順のとおりである。（１）適した容器に細胞を入れ、緩衝溶液で浮遊した後、超低温冷凍庫に入れて−１５℃以下で約１２時間以上凍結させる。（２）凍結乾燥器のサンプルチャンバを−１５℃まで下げた後、（１）の凍結したサンプルを入れて３０分以上安定化させる。（３）凍結乾燥器の水分トラップ（ｔｒａｐ）温度は−７０℃ないし−８０℃を維持し、真空圧力を１０ないし１００ｍｔｏｒｒに調節した後、凍結乾燥器チャンバの温度を常温２５℃まで上昇させながら乾燥を完了する。（４）凍結乾燥器から容器を取り出した後、栓で密封して常温で保存する。
【００３１】
以下、製造例及び実験例によって本発明をさらに詳しく説明することにする。これらの実施例は、ただ本発明をより具体的に説明するためのもので、本発明の要旨によって、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないということは、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者において自明なことである。
【００３２】
実施例１：ヒト来由のケラチノサイト及び繊維芽細胞の培養
ａ）シート形態のケラチン細胞培養
ヒト来由のケラチン細胞は、ガンマ線照査された３Ｔ３フィーダー（ｆｅｅｄｅｒ）と、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍとＨａｍ−Ｆ１２を３：１で混合して作った培地を使用して、３７℃、１０％Ｃ０２の条件でコンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）に培養した。細胞の形態を位相差倒立顕微鏡を使用して１００倍の倍率で観察した結果、図１に示したようにシート（Ｓｈｅｅｔ）形態を確認した（図１参照）。
【００３３】
ｂ）ペレット形態のケラチン細胞培養
ヒト来由のケラチン細胞をＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−Ｓｅｒｕｍ  Ｆｒｅｅ  Ｍｅｄｉｕｍを土台とする培養液を使用して３７℃、１０％Ｃ０２の条件でプレコンフルエント（Ｐｒｅ−ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）に培養した。細胞の形態を位相差倒立顕微鏡を使用して１００倍の倍率で観察した（図２参照）。
【００３４】
ｃ）ペレット形態の繊維芽細胞培養
ヒト来由の繊維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）をＨａｍ−Ｆ１２を土台とする培養液を使用して、３７℃、１０％Ｃ０２の条件でプレコンフルエント（Ｐｒｅ−ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）に培養した。細胞の形態を位相差倒立顕微鏡を使用して１００倍の倍率で観察した（図３参照）。
【００３５】
ｄ）ケラチン細胞が塗布されたペットフィルム製作
ａ）で培養されたシート形態を成したケラチン細胞は、ペットフィルム（ＰＥＴ  ｆｉｌｍ、Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ  ｆｉｌｍ）に付着して支持した（図４参照）。
【００３６】
ｅ）上層液が除去されたペレット形態細胞製作
ｂ）及びｃ）で培養されたケラチン細胞及び繊維芽細胞を、プレコンフルエントな培養状態で細胞のペレットのみ残して上層液を除去した（図５参照）。
【００３７】
実施例２：凍結乾燥保護剤の製造及び処理方法
ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）培地に、ｇｌｕｃｏｓｅ０．１〜５％、ｓｕｃｒｏｓｅ０．１〜５％、ｄｅｘｔｒａｎ０．１〜  ５％、ｒａｆｆｉｎｏｓｅ０．１〜  ５％等の糖類と、アルブミン０．１〜５％、血清１〜１０％を添加した凍結保存液に、高分子物質であるポリエチレングリコール（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ、ＰＥＧ、分子量６，０００〜３５，０００）を０．５％〜５％間の濃度で添加して凍結乾燥保存液を製造した。
【００３８】
シート形態の細胞は、培養液を除去した後、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）を浸る程度に添加して残っている培養液を洗滌（ｗａｓｈｉｎｇ）してしまった後、凍結乾燥保存液が浸るように添加して５分〜１０分処理した。ペレット形態の細胞は、５０ｍＬ  ｔｕｂｅに入れられたペレットにＰＢＳ４０ｍＬを添加してパイペッティング（ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ）後、遠心分離して残っている培養液を洗滌（ｗａｓｈｉｎｇ）した。総３回繰り返し、５０ｍＬ  ｔｕｂｅに残ったペレットに凍結乾燥保存液を浸る程度に添加して、パイペッティング（ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ）して５〜１０分間処理後、遠心分離して上層液を除去した。
【００３９】
実施例３：ケラチノサイト及び繊維芽細胞の凍結乾燥
実施例２で凍結乾燥保存液が処理された細胞を−１５℃以下に１２ｈｒ時間以上凍結した。シート形態細胞の乾燥は、温度を−１５℃から常温２５℃まで上昇させながら３０分〜９０分の間実施した。水分トラップ（ｔｒａｐ）の温度は−７０℃〜−８０℃、真空圧力は１０〜１００ｍｔｏｒｒを維持した。乾燥後には密封して常温で保管した。ペレット形態細胞の乾燥は、温度を常温２５℃まで上昇させながら６時間以上実施した。水分トラップ（ｔｒａｐ）の温度は−７０℃〜−８０℃、真空圧力は１０〜１００ｍｔｏｒｒを維持した。乾燥の完了した細胞は密封して常温で保管した。
【００４０】
実験例１：凍結乾燥細胞の水分除去率
凍結乾燥前と凍結乾燥後の細胞の重さを測定して、凍結乾燥後に除去された水分の比率を計算した。Ｓｈｅｅｔ形態の細胞とペレット形態の細胞すべて「実施例３」の方法で凍結乾燥時、９８％以上の水分除去率を示した。
【００４１】
実験例２：凍結乾燥前と凍結乾燥後の細胞の安定性測定
ペレット形態とｓｈｅｅｔ形態の細胞を凍結乾燥して主要因子の安定性を測定した。常温で保管して０週（乾燥後即時）、１週、２週、３週、１ないし５ヶ月、１２ヶ月目を測定し、ケラチン細胞は、総タンパク質量とＩＬ−α、ｂ−ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＰＤＧＦの含有量を測定、繊維芽細胞はｂ−ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＰＤＧＦの含有量を下記の方法で測定した。
【００４２】
ＰＢＳ４ｍｌを、ｓｈｅｅｔ形態の凍結乾燥細胞にはｓｈｅｅｔが浸るように添加し、ペレット形態の凍結乾燥細胞には添加後ｐｉｐｅｔｔｉｎｇして水化させた後、総タンパク質は、染色試薬（ｄｙｅ）を処理後にＥＬＩＳＡを利用して吸光度を測定し、ＩＬ−α、ｂ−ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＰＤＢＦは、Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍのＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｋｉｔを利用して測定した。
【００４３】
測定結果、各因子は細胞の種類と形態に関係なく安定して維持された（図６、７、８参照）。
【００４４】
実験例３：凍結乾燥細胞の創傷治癒効果測定
Ｍｏｕｓｅ（Ｂａｌｂ／ｃ）の背に直径１．５ｃｍの大きさの傷を４個部位につけた後、実験群として１）凍結保存液を処理後ワセリンガーゼに支持した凍結乾燥前の細胞と、２）凍結乾燥保存液を処理後ペットフィルムに支持した凍結乾燥後の細胞を適用し、対照群として１）ワセリンガーゼと、２）ペットフィルムを適用して、それぞれ７日、１０日、１４日、２１日後の傷の治癒程度を測定した。測定結果、図９に示したように凍結乾燥前の細胞と凍結乾燥後の細胞群のどちらも対照群に比べて創傷治癒が早く進展した。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明の凍結乾燥保護剤を使用して細胞を凍結乾燥すれば、凍結時に発生し得る細胞構造の損傷を防ぐことができ、細胞内に含まれている有用物質は常温でその機能を維持することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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