(57)【要約】  本発明は、無放射減衰により発生されたエネルギーを電気信号に変換することができる、焦電または圧電要素および電極（４、５）を有する変換器（３）を設置する工程と、変換器をサンプルと接触させる工程と、光源（６）から電磁放射線の一連のパルスでサンプルを照射する工程と、検出器（７）で変換器３により発生された電気シグナルを検出する工程とを含み、サンプルは、熱または衝撃波など、無放射減衰によりエネルギーを発生するために放射線源（６）により発生された電磁放射線を吸収することができる、赤血球（２）など、粒子（２）を含み、電磁放射線の波長は、粒子（２）による放射線の吸収が無放射減衰によりエネルギーを発生するようなものである、血液製剤のサンプル中の凝固を測定する方法に関する。装置（１）も提供する。
2015500496.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液製剤のサンプル中の凝固を測定する方法であって、
非放射性減衰により発生されたエネルギーを電気シグナルへ変換することができる、焦電または圧電素子および電極を有する変換器を設置する工程と、前記変換器を前記サンプルと接触する工程と、
前記サンプルを電磁放射線の一連のパルスで照射する工程と、
前記変換器により発生された前記電気シグナルを検出する工程とを含み、
前記サンプルは、非放射性減衰によりエネルギーを発生するために放射線源により発生された前記電磁放射線を吸収することができる粒子を含み、前記電磁放射線の波長は、粒子による前記放射線の前記吸収が非放射性減衰によりエネルギーを発生するようなものである、方法。
【請求項２】
前記血液製剤は、全血または血漿である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記粒子は、炭素粒子、着色ポリマー粒子、染料粒子、金属粒子、赤血球、磁気粒子、非導電コア材料および少なくとも１つの金属殻層を有するナノ粒子、ポリピロールまたはその誘導体で構成された粒子、並びにこれらの組み合わせから選択される請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記粒子は、赤血球または炭素粒子である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプルは、全血であり、非放射性減衰によりエネルギーを発生するために前記放射線源により発生された前記電磁放射線を吸収することができる、唯一の存在する粒子は、赤血球である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記変換器は、前記サンプルを前記変換器と接触している状態に保持するチャンバー内に位置する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記チャンバーは、上面と下面とを有し、前記変換器は、前記上面を形成する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
サンプルは、抗凝固剤および／または凝血促進剤を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
非放射性減衰によりエネルギーを発生するために電磁放射線を吸収することができる粒子を含む血液製剤のサンプル中の凝固を測定する装置であって、前記装置は、
前記粒子による前記放射線の前記吸収が非放射性減衰によりエネルギーを発生するような波長にて電磁放射線の一連のパルスを発生するようになっている放射線源と、
非放射性減衰により発生されたエネルギーを電気シグナルに変換することができる、焦電または圧電要素及び電極とを有する変換器を含むサンプルチャンバーと、
前記変換器により発生された前記電気シグナルを検出することができる検出器とを備え、前記装置は、更に、凝血促進剤、および、任意に抗凝固剤を含んでなる、装置。
【請求項１０】
前記チャンバーは、上面と下面とを有し、前記変換器は、前記上面を形成する、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
前記装置は、リーダーおよびカートリッジで形成され、前記カートリッジは、前記リーダーと解放可能に係合可能であり、前記リーダーは、前記放射線源および前記検出器を組み込み、前記カートリッジは、前記変換器および前記チャンバーを組み込む、請求項９または１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記装置は、更に、開放端を有し、かつ、毛細管作用により前記流体を引き込むように配設された細長いサンプル回収通路を含み、前記通路は、回収端部と送出端部とを有し、前記送出端部は、前記サンプルチャンバーと流体連通しており、前記通路は、長さの第１の部分に沿って、抗凝固剤で被覆された領域が、かつ、長さの第２の部分に沿って、凝血促進剤で被覆された領域が設けられ、前記サンプルが前記第２の部分の前に前記第１の部分と接触するようになってなる、請求項９〜請求項１１のいずれか一項に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液測定方法に関し、特に、凝固状態の測定に関する。
【背景技術】
【０００２】
凝固は、血が凝固するプロセスであり、損傷した血管からの失血の停止（止血）に極めて重要な役割を果たす。したがって、凝固の測定は、臨床的に重要である。凝固は、複雑なメカニズムを介して発生し、フィブリン形成に至る２つの経路を有している。これらの２つの経路は、（内因性経路の別名でも知られる）接触活性化経路、および、（外因性経路の別名でも知られる）組織因子経路である。凝固率を判断するいくつかの異なる方法が、現在、利用可能である。これらの方法としては、内因性凝固経路の目安である活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）、外因性凝固経路の目安であるプロトロンビン時間（ＰＴ）、高用量ヘパリン療法中の患者を対象とする活性化凝固時間（ＡＣＴ）、ＩＮＲ（通常のサンプルに対する患者サンプルのＰＴの比率）、およびトロンビン発生時間がある。これらの手法のそれぞれが異なる状態下で機能するが、実際の物理的測定結果、即ち、血液サンプルが物理的に凝固する時間は、各々の方法において同じである。
【０００３】
凝固の速度を測定するために使用される多くの方法があり、その大半は、サンプルに関係する物理パラメータの測定を重点的に取り扱う。これらとしては、以下がある。
−目視検査。血液のサンプルは、ガラス容器に入れられて観察される。凝血塊の外観を目視検査により調べることができる。
−光散乱。血漿が、赤血球から分離されてトロンボプラスチンで処理される。フィブリン鎖形成によってサンプルが濁り、これを光散乱により測定することができる。
−電気機械的な方法。１つの例は、プランジャを活性化された血液サンプルから出入りさせる機械的なプランジャによる方法である。凝血塊形成によってサンプルの粘度が変わり、その後、これが検出される。別の例は、マイクロカンチレバーの使用である。
−血栓弾性描写器。ピンをワイヤから吊り下げてキュベット内の血液サンプルに入れる。キュベットを前後に回転させる。ピンの動きによって、凝血塊形成に関係するいくつかの有用なパラメータが得られる。
−磁気による方法。サンプルを磁石を含む小さいチューブに入れて、チューブを水平方位に回転させる。サンプルが凝固していなかった場合、磁石は、自由に回ってチューブの底に留まる。一旦サンプルが凝固し始めると、磁石は、凝血塊で動かなくなり、チューブを動き回り、これを検出することができる。
−電気化学的な方法。Ｒｏｃｈｅ  ＣｏａｇｕＣｈｅｋ（登録商標）は、電気化学的方法で作業する臨床現場即時装置である。トロンビン（因子ｌｌａ）は、ペプチド基質を裂き、電気化学シグナルが発生される。
−粘度測定。血液を前後にポンプ圧送して毛細管に通して、動きの速度を光学的にモニタリングする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、当技術分野において、凝固を測定する単純、正確、かつ応用自在の手法に対する必要性が存在している。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
したがって、本発明は、
非放射性減衰により発生されたエネルギーを電気シグナルへ変換することができる、焦電または圧電素子および電極を有する変換器を設置する工程と、変換器をサンプルと接触させる工程と、
サンプルを電磁放射線の一連のパルスで照射する工程と、
変換器により発生された電気シグナルを検出する工程とを含み、
サンプルは、無放射減衰によりエネルギーを発生するために放射線源により発生された電磁放射線を吸収することができる粒子を含み、電磁放射線の波長は、粒子による放射線の吸収が無放射減衰によりエネルギーを発生するようなものである、血液製剤のサンプル中の凝固を測定する方法を提供する。
【０００６】
したがって、本発明は、変換器に向うかまたは変換器から離れるサンプル内の粒子の動きが凝固事象により摂動され、経時的な粒子の動きの摂動が凝固速度の目安をもたらす方法を提示する。ここで図面を参照して本発明を説明する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】本発明と共に使用されるＷＯ２００４／０９０５１２号公報の化学検出装置の概略図を示す。
【図２】本発明によるカートリッジを示す。
【図３ａ】血液は、凝固せず（上は生データ／真中はサイクル１を基準／下はサイクル数に対する典型的なピーク最大値）、サイクル数は、３０秒間の期間にわたって収集され、その後平均化されたデータを指し、矢印は、実験の時間にわたるシグナルの変化を示すヘパリンが有る凝固実験を示す。
【図３ｂ】血液は、凝固せず（上は生データ／真中はサイクル１を基準／下はサイクル数に対する典型的なピーク最大値）、サイクル数は、３０秒間の期間にわたって収集され、その後平均化されたデータを指し、矢印は、実験の時間にわたるシグナルの変化を示すヘパリンが有る凝固実験を示す。
【図３ｃ】血液は、凝固せず（上は生データ／真中はサイクル１を基準／下はサイクル数に対する典型的なピーク最大値）、サイクル数は、３０秒間の期間にわたって収集され、その後平均化されたデータを指し、矢印は、実験の時間にわたるシグナルの変化を示すヘパリンが有る凝固実験を示す。
【図４ａ】血液は、凝固し（上は生データ／真中はサイクル１を基準／下はサイクル数に対する典型的なピーク最大値）、矢印は、実験の時間にわたるシグナルの変化を示すヘパリンがない凝固実験を示す。
【図４ｂ】血液は、凝固し（上は生データ／真中はサイクル１を基準／下はサイクル数に対する典型的なピーク最大値）、矢印は、実験の時間にわたるシグナルの変化を示すヘパリンがない凝固実験を示す。
【図４ｃ】血液は、凝固し（上は生データ／真中はサイクル１を基準／下はサイクル数に対する典型的なピーク最大値）、矢印は、実験の時間にわたるシグナルの変化を示すヘパリンがない凝固実験を示す。
【図５】変動するトロンボプラスチン比率に関するサイクル数に対する平均ピーク高さを示す。
【図６ａ】トロンボプラスチンの比率の各々の未加工の痕跡を示し、矢印は、実験の時間にわたるシグナルの変化を示す。
【図６ｂ】トロンボプラスチンの比率の各々の未加工の痕跡を示し、矢印は、実験の時間にわたるシグナルの変化を示す。
【図６ｃ】トロンボプラスチンの比率の各々の未加工の痕跡を示し、矢印は、実験の時間にわたるシグナルの変化を示す。
【図６ｄ】トロンボプラスチンの比率の各々の未加工の痕跡を示し、矢印は、実験の時間にわたるシグナルの変化を示す。
【図６ｅ】トロンボプラスチンの比率の各々の未加工の痕跡を示し、矢印は、実験の時間にわたるシグナルの変化を示す。
【図６ｆ】トロンボプラスチンの比率の各々の未加工の痕跡を示し、矢印は、実験の時間にわたるシグナルの変化を示す。
【図６ｇ】トロンボプラスチンの比率の各々の未加工の痕跡を示し、矢印は、実験の時間にわたるシグナルの変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、電磁放射線の一連のパルスを発生するようになっている放射線源と、無放射減衰により発生されたエネルギーを電気シグナルに変換することができる、焦電または圧電要素および電極を有する変換器と、変換器により発生された電気シグナルを検出することができる検出器とを含んでなる装置を採用する。本発明の装置は、ＷＯ２００４／０９０５１２号公報で説明されている装置に本質的に基づく。
【０００９】
図１は、電磁放射線での粒子２の照射時の粒子２における熱発生を拠り所とする本発明により使用される装置１を示す。（粒子は、変換器面より上方に示されている）。簡潔さを期すために、粒子のみが、図１に示されている（装置の残りの構成部品は、本明細書において、以下で更に詳細に説明する）。図１は、粒子２が存在する場合のデバイス１を示す。装置１は、焦電または電極コーティング４、５を有する圧電変換器３を含んでなる。変換器３は、好ましくは分極ポリフッ化ビニリデン膜である。電極コーティング４、５は、好ましくは透明であり、最も好ましくは酸化インジウムスズで形成されている。電極は、好ましくは、約３５ｎｍの厚さを有するが、ほとんど任意の厚さが、下回ると導電率が低すぎる１ｎｍの下限値、および、上回ると光の透過が低すぎる（８０％Ｔ未満であるべきではない）１００ｎｍの上限値から可能である。特に好適な実施形態において、変換器は、酸化インジウムスズ被覆ポリフッ化ビニリデン膜である。その表面に細胞または粒子が結合するのを防止するために、パリレンポリマー層または不活性蛋白質層、例えば、ポリストレプトアビジン層など、更なる層を変換器３に塗布することができる。
【００１０】
粒子２は、変換器３の近位にあると示されている。本発明の重要な特徴は、電磁放射線（通常は「光」という）６、好ましくは可視光により照射されたときに粒子２が熱を発生するということである。光源は、例えば、ＬＥＤとすることができる。光源６は、適切な波長の光で粒子２を照射する。理論に束縛されるものではないが、粒子２は励起状態を発生するために光を吸収し、その後、無放射減衰が発生し、その結果、図１で曲線により示すエネルギーが発生されると考えられている。このエネルギーは、主として熱（即ち、環境内の熱運動）の形であるが、他の形のエネルギー（主として衝撃波）が発生される場合もある。しかしながら、エネルギーは変換器により検出されて、電気シグナルに変換される。装置は、測定される特定の粒子に向けて較正され、したがって、無放射減衰により発生されたエネルギーの正確な形態を判断する必要はない。特記がない限り、「熱」という用語は、無放射減衰により発生されたエネルギーを意味するために本明細書で使用される。光源６は、粒子２を照射するように位置付けられる。好ましくは、光源６は変換器３および電極４、５の反対側に位置付けられ、粒子２は、変換器３および電極４、５を介して照射される。光源は、光源が導波システムである変換器内の内部光源とすることができる。導波路は、変換器自体でもよいか、または、導波路は、変換器に取り付けられた追加的な層でもよい。照射の波長は、使用される粒子に左右される。
【００１１】
粒子２により発生されたエネルギーは、変換器３により検出されて、電気シグナルに変換される。電気シグナルは、検出器７により検出される。光源６および検出器７は、両方は、制御器８の制御下にある。光源６は、「断続光（chopped light）」と称される光の一連のパルスを発生する。原則的に、単一の閃光、即ち、電磁放射線の１つのパルスであれば、変換器３からシグナルを発生するのに十分であろう。しかしながら、再現性のあるシグナルを取得するためには、複数の閃光が使用され、実際には、これには断続光が必要である。電磁放射線のパルスが適用される周波数は、変えることができる。下限値では、パルスの間の時間遅延は、各々のパルスと電気シグナルの発生との間の時間遅延を判断するのに十分でなければならない。上限値では、それぞれのパルスの間の時間遅延は、データを記録するために掛かる期間が不当に延長されるほど大きくてはならない。好ましくは、パルスの周波数は、１〜５０Ｈｚから、更に好ましくは、１〜１０Ｈｚ、最も好ましくは２Ｈｚである。これは、それぞれ、２０〜１，０００ｍｓ、１００〜１，０００ｍｓ、および５００ｍｓのパルス間の時間遅延に相当する。更に、いわゆる「マークスペース」比、すなわち、オンシグナル対オフシグナルの比は、好ましくは１であるが、他の比率は、悪影響なしで使用することができる。次のパルスがシステムを摂動させる前に、システムが熱平衡に近づくことを可能にするために、より短いオンパルスと、より長いオフシグナルとを用いるのにはいくつかの利点がある。異なるチョッピングの頻度または異なるマークスペース比で断続光を発生する電磁放射線源が、当技術分野で公知である。検出器７は、光源６からの光の各々のパルスと変換器３から検出器７により検出される対応する電気シグナルとの間の時間遅延を判断する。この時間遅延は、距離ｄの関数である。粒子が表面に直接に結合されたとき、シグナルは、好ましくは、２〜７ｍｓから測定される。チャンバーの深さを通る粒子の測定については、より長い時間遅延、例えば、１０〜５０ｍｓが使用される。システムは、時間遅延が測定プロセスを通して変わる可能性があるシグナルにおけるピーク最大値を測定するように構成することもできる。
【００１２】
光の各々のパルスと再現性のある結果をもたらす対応する電気シグナルとの間の時間遅延を判断する任意の方法を使用することができる。好ましくは、時間遅延は、光の各々のパルスの開始から、粒子からの熱の吸収に対応する電気シグナルの最大値が検出器７によりのように検出される時点まで測定される。
【００１３】
粒子２は変換器の表面から分離される場合があり、シグナルはそれでも検出することができることに注意するべきである。更に、シグナルが、介在する媒質を介して検出可能であるばかりでなく、異なる距離ｄを区別することができ、（これは、「深さプロファイリング」と称してきた）受信されるシグナルの強度は、変換器３の表面からの特定の距離ｄでの粒子２の濃度に比例する。更に、媒質自体の性質が時間遅延および所与の時間遅延でのシグナルの大きさに影響を与えることがわかった。
【００１４】
本発明において、粒子は、赤血球（赤血球）または別の粒子とすることができる。粒子の目的は、無放射減衰によりエネルギーを発生するために放射線源により発生された電磁放射線を吸収することである。その後、放射減衰は、変換器により電気シグナルに変換される。電磁放射線の波長は、粒子による放射線の吸収が無放射減衰によりエネルギーを発生するようなものである。例えば、赤血球が凝固挙動をモニタリングするために使用される場合、放射線の波長は、好ましくは５２０ｎｍである。
【００１５】
赤血球は、血液、即ち、（分離されてない）全血のサンプル内に存在する。これらの血球は、血球が分散している周囲の血漿より濃いことから、試験チューブまたは容器などの静的システムにおいて時間と共に沈降する傾向がある。ＷＯ２００４／０９０５１２号公報で説明されているシステムは、通常、赤血球からのシグナルが最小限となる光の波長（約６９０ｎｍ）を使用することにより、及びまた、光パルスの２、３ミリ秒後にシグナルを測定することにより赤血球からのシグナルを最小限に抑えるように設定され、よって出力が変換器の付近で発生される熱に制限される。しかしながら、適切な波長にて、および、パルスの後のその後の時間周期にて電気シグナルを測定することにより、表面から更に離れた粒子に関するより多くの情報を取得することが可能である。したがって、上記のシステムを使用して、経時的な粒子の動き（例えば赤血球の沈降）をモニタリングすることが可能である。
【００１６】
沈殿する赤血球から取得されたシグナルは、赤血球が沈殿するときに初めは下がり、凝固が発生すると、再び上がり始めることがわかった。この予想外の発見事項は、完全には理解されていない。しかしながら、理論に束縛されるものではないが、これは、２つの現象の結果でありうる。第１に、赤血球は、初めに落ち始めるが、凝血塊が形成されると、その後、再び上方に押し上げられるという点である。これは、凝血塊退縮として知られているプロセスに関係すると考えられる。第２に、熱伝達プロセスが凝固したサンプルにおいて異なり、その結果、より多くの熱が、凝固したサンプルを介して変換器に伝達されるという点である。しかしながら、このプロセスを測定する長所は、凝固プロセスにより特徴的である、固有の最小値（粒子が初めに変換器の方へ移動している場合、例えば、変換器がチャンバーの底を形成した場合には最大値にもなり得る）を有するシグナルが得られるという点である。この特徴的なシグナルによって、変換器により発生された電気シグナルのより効果的な分析が可能である。これによって、今度は、サンプル内の凝固の速度の臨床的に有用な目安が得られる。
【００１７】
凝固プロセスは、凝固が発生することができる任意の血液製剤内で測定することもできる。このような血液製剤は、フィブリノゲンおよび凝固因子を含んでなる。好ましくは、血液製剤は、（分離されてない）全血または血漿である。
【００１８】
測定を実行するために使用される粒子は、使用される電磁放射線の波長にて無放射減衰によりエネルギーを発生するために放射線源により発生された電磁放射線を吸収することができなければならない。粒子は、多かれ少なかれサンプルの媒質より高密度になる（主として水、但し、血液製剤は、溶解蛋白質、グルコース、凝固因子、無機イオン、ホルモン、および溶解ガス（主として二酸化炭素）も含んでなる）。通常は、粒子は、媒質より高密度になり、したがって、重力下で沈殿する。しかしながら、粒子は、媒質ほど高密度ではないことがあり得、粒子の動きは上向きになり、媒質内の粒子の浮揚性により制御される。どちらにしても、変換器に向うかまたは変換器から離れる粒子の動きは、動きが凝血塊の形成の影響を受けると変わる。
【００１９】
粒子の沈殿速度（または浮揚性）は、粒子のサイズおよび密度の関数である。沈殿（または浮揚性）は、通常は数秒から数分の凝固プロセスの時間尺度で測定可能であるような速度にて発生しなければならない。したがって、非常に大きい、より高密度な粒子は、凝固プロセスが行われる前にチャンバーの底に沈殿する場合があり、一方、血漿と類似の密度の非常に小さい粒子は、プロセスが測定可能であるほどの速さでは沈殿しない場合がある。したがって、所与の分析のために、サイズと密度との間の好適なバランスがもたらされなければならない。
【００２０】
好ましくは、本発明では、２０ｎｍ〜１０μｍの粒度を有する粒子を使用する。粒度とは、最も広い地点での粒子の直径を意味する。粒子は、好ましくは０．８〜２０ｇ／ｍＬの密度を有している。一例として、赤血球は、約７ミクロンの直径およびほぼ１．１ｇ／ｍＬの密度を有している。
【００２１】
粒子が赤血球である場合、測定は、赤血球の沈殿により行われる。他の粒子については、粒子は通常は、周囲の媒質よりも高密度になり、したがって、測定は、沈殿により行われるが、他の粒子の方が密度が小さいこともあり得る。粒子は、粒子（媒質より密度が低いか高いか）の性質および変換器の場所（サンプルより上方かまたは下方か）によって変換器から離れるか、または、変換器へ移動することになる。
【００２２】
分離されてない全血の場合、赤血球は、本明細書で定義するように粒子の役目を果たすことができる。しかしながら、他の粒子を追加して更なるまたは他の吸収／無放射減衰源をもたらすことができる。血漿または赤血球が除去された他の血液製剤の場合、沈殿（または浮揚性）が測定されるためには、粒子を追加しなければならない。
【００２３】
したがって、粒子は、説明する方法で電磁放射線と相互作用することができる任意の物質で構成することができる。好ましくは、粒子は、炭素粒子（例えば、密度２ｇ／ｍＬおよびサイズ２００ｎｍ）、着色ポリマー粒子（好ましくは着色ラテックス（例えば２０〜２，０００ｎｍ））、染料粒子、金属（好ましくは金色）粒子（約１５〜２０ｇ／ｍＬの密度および約２０〜１００ｎｍのサイズの）、赤血球、磁気粒子、非導電コア材料および少なくとも１つの金属シェル層を有するナノ粒子、ポリピロールまたはその誘導体で構成された粒子、および、その組み合わせから選択されるが、これらに限定されない。
【００２４】
磁気粒子の場合、電磁放射線は、高周波放射線である。本明細書で上述した他の粒子の全ては、ＩＲまたは紫外線を含むことができる光を採用する。金粒子は、市販されているか、または、公知の方法（例えば、Ｇ．Ｆｒｅｎｓ、Ｎａｔｕｒｅ、２４１、２０〜２２（１９７３）を参照）を使用して調製することができる。ナノ粒子の更に詳細な説明については、米国特許第６，３４４，２７２号公報およびＷＯ２００７／１４１５８１号公報を参照のこと。
【００２５】
好ましくは、粒子は、赤血球、炭素粒子または金粒子であり、特に好適な実施形態において、サンプルは、全血であり、非放射性減衰によりエネルギーを発生するために放射線源により発生された電磁放射線を吸収することができる唯一の存在する粒子は、赤血球である。
【００２６】
サンプルは、通常、マイクロリットルの規模である（例えば、１〜１００μＬ、好ましくは１〜３０μＬ）。流体サンプルを保持するために、変換器は、好ましくは、１つまたはそれ以上の側壁と、上面と、下面とを有するチャンバー内に位置する。したがって、変換器は、好ましくは、サンプルを変換器と接触している状態に保持するチャンバー内に位置する。好ましくは、変換器は、チャンバーと一体型である、即ち、チャンバーを画定する側壁または上面もしくは下面の１つを形成する。好適な実施形態において、チャンバーは、上面と下面とを有し、変換器は、上面を形成する。サンプルは、単に、例えば、毛管路の内側の表面張力により保持される場合がある。チャンバーの深さは、通常は５０ｐｍ〜１ｃｍ、好ましくは、１５０〜２５０μＬである。
【００２７】
サンプルおよび測定自体の取り扱いを容易にするために、サンプルは、好ましくは抗凝固剤および／または凝血促進剤を含んでなる。
【００２８】
１つまたはそれ以上の抗凝固剤が、凝固の始まりを遅延させるためにサンプルに追加してもよい。抗凝固剤は、サンプルが採取された後に任意の段階にて追加してよい。一般的な抗凝固剤は、ヘパリン、クエン酸塩またはＥＤＴＡである。
【００２９】
全血が内因性経路により凝固に引き起こすために必要な因子の全てを含むが、１つまたはそれ以上の凝血促進剤もサンプルに追加してもよい。凝血促進剤は、凝固カスケードの内因性か、外因性か、または共通の経路を活性化するために選択してもよい。
【００３０】
内因性経路を介した活性化は、エラグ酸、コラーゲンまたはシリカなど、接触活性剤を追加することにより達成してもよい。シリカは、カオリン、微粒状にされたシリカまたはコロイド状シリカであってもよい。接触活性剤は、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）など、コーティングを使用するチャンバーの内面に適用してもよい。あるいは、因子Ｘｌｌａ、因子Ｘｌａ、または因子ＩＸａ、並びに、プロトロンビン、因子Ｖｌｌｌ／因子Ｖｌｌｌａ、および因子Ｘを使用してもよい。
【００３１】
外因性経路を介した活性化は、因子Ｖｌｌ／因子Ｖｌｌａの追加の有無を問わず、組織因子を追加することにより達成してもよい。あるいは、活性化は、因子Ｖｌｌａにより、任意によりプロトロンビン、因子Ｖ／Ｖａ、第ＩＸ因子または因子Ｘで達成してもよい。
【００３２】
共通の経路を介した活性化は、外因性因子Ｘａの追加により、または、ヘビ毒酵素（例えばラッセルクサリヘビからのヘビ毒酵素）など、因子Ｘの外因性活性剤と組み合わせた外因性因子Ｘの追加により達成してもよい。あるいは、因子Ｘの外因性活性剤は、内在性因子Ｘの活性化のために追加してもよい。任意に、プロトロンビンおよび／または因子Ｖ／Ｖａを追加してもよい。
【００３３】
上記の凝血促進剤と同様に、リン脂質またはシリコーン界面活性剤など、界面活性剤を追加してもよい。
【００３４】
抗凝固剤および／または凝血促進剤は、好ましくは本発明の装置に組み込まれたチャンバー内に貯蔵される。抗凝固剤および／または凝血促進剤は、変換器の表面の上へ付着してもよい。
【００３５】
本発明は、以下を含む、無放射減衰によりエネルギーを発生するために電磁放射線を吸収することができる粒子を含む血液製剤のサンプル中の凝固を測定する装置も提供する：
粒子による放射線の吸収が非放射性減衰によりエネルギーを発生するような波長にて電磁放射線の一連のパルスを発生するようになっている放射線源と、
無放射減衰により発生されたエネルギーを電気シグナルに変換することができる、焦電または圧電要素および電極を有する変換器を含むサンプルチャンバーと、変換器により発生された電気シグナルを検出することができる検出器とを含み、装置は、更に、凝血促進剤、および、任意に抗凝固剤を含んでなる。
【００３６】
本発明の装置は、好ましくは流体連通している複数のチャンバーを含むことができる。装置は、好ましくは更に、装置の外側と接触しているサンプル回収端部と、図２のコア部２１に示すように、サンプルチャンバーと流体連通しているサンプル送出端部とを有する細長いサンプル回収通路を含んでなる。更なる詳細については、ＷＯ２０１１／０２７１４７号公報を参照のこと。異なる凝固測定を異なるチャンバー内で行うことができ、実際、他のチャンバーは、例えば、免疫アッセイに向けて他のアッセイ構成部品を含むことができる。
【００３７】
好適な実施形態において、装置は、更に、開放端を有し、かつ、毛細管作用により通路に流体を引き込むように配設された細長いサンプル回収通路を含み、通路は、回収端部と送出端部とを有し、送出端部は、サンプルチャンバーと流体連通しており、通路は、長さの第１の部分に沿って、抗凝固剤で被覆された領域が、かつ、長さの第２の部分に沿って、凝血促進剤で被覆された領域が設けられ、サンプルが第２の部分の前に第１の部分と接触するようになってなる。この構成によって、サンプルは、回収通路内の凝固を防止するために抗凝固剤に接触し、次に、測定を容易にするために凝血促進剤と接触することができる。
【００３８】
装置は、別々のリーダーおよびカートリッジまたは一体型装置の形を取ることができる。前者において、装置は、リーダーおよびカートリッジで形成され、カートリッジは、リーダーと解放可能に係合可能であり、リーダーは、放射線源および検出器を組み込み、カートリッジは、変換器およびチャンバーを組み込む。リーダーは、好ましくは携帯型リーダーである。カートリッジは、好ましくは使い捨てのカートリッジである。
【００３９】
制限的でないことを意図する以下の実施例を参照して本発明をここで説明する。
【実施例】
【００４０】
（実施例１）
ＰＶＤＦ膜
酸化インジウムスズで被覆された分極圧電／焦電ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）バイモルフ膜を以下の実施例において検出装置として使用した。酸化インジウムスズ面を気相ガス蒸着法により（およその厚さ１ミクロンの）パリレンの層で被覆した。この方法は、パラシクロファン前駆体の昇華およびその後の熱分解、次に、表面上のフリーラジカル重合を伴った。更なる詳細についてはＷＯ  ２００９／１４１６３７号公報を参照のこと。その後、結果的に得られた膜を、一晩、室温にてインキュベーションによりポリストレプトアビジン溶液（２．７ｍｍｏｌ／ｌＫＣＩ、１３７ｍｍｏｌ／ｌＮａＣＩおよび０．０５％のＴｗｅｅｎを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌ燐酸緩衝液−ＰＢＳ中２００μｇ／ｍＬ）で被覆した。ポリストレプトアピジンをＴｉｓｃｈｅｒらにより説明されているように（米国特許第５，０６１，６４０号公報）調製した。ポリストレプトアビジンは、単に、センサの表面を覆う不活性蛋白質層である。
【００４１】
（実施例２）
カートリッジの作製
図２に示すように、測定を行うためにカートリッジ１４を作製した。カートリッジ１４を補強材１６上で支持されたピアゾ／ピロ膜１５で作製した。３つのサンプルチャンバー１８を形成するために型抜きされた感圧接着剤被覆ポリエステルフィルム１７を表面に適用した。発生された電荷を検出するためにピアゾ／ピロ膜１５の上面および下面との電気的接続を可能にするように施した。その後、先の構成部品を標識２０が適用された上蓋１９と、コア部２１、シール２２及び底蓋２３との間に挟持することによりカートリッジ１４を形成した。
【００４２】
サンプルでサンプルチャンバーを帯電させることにより測定を行った。ピアゾ／ピロ膜１５にＬＥＤで連続して断続ＬＥＤ光を上蓋１９の穴を介して照射した。ＬＥＤパルス毎に、増幅器およびアナログ／デジタル（ＡＤＣ）変換器を使用してピアゾ／ピロ膜１５全体にわたって電圧を測定する。時間分解ＡＤＣシグナルを経時的にプロットする。
【００４３】
（実施例３）
凝固１：ヘパリン有り、及び無し
静脈血サンプルをヘパリン採血管に引き込んだ。更に、同じ供血者から、指穿刺による約５００μＬの血液をエッペンドルフチューブに（抗凝固剤なしで）採血した。約３０秒間ボルテクサーで混合することにより、両サンプルに酸素添加した。ボルテクス処理（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）後、両方のサンプルをピペット採取によりカートリッジのセンサーウェル内に取り込んで測定を実行する器具に挿入した。この実施例において、カートリッジ内のサンプル採取管を使用しなかった。
【００４４】
サンプルのデータが、それぞれ、図３および４に示されている。
図３は、シグナルの通常の変化を示しており、即ち、シグナルは、血液サンプルがセンサ面から離れて沈殿するにつれて経時的に弱まる。ピーク最大値対サイクル番号も、この関係を示しており、実行の終了に向って徐々に小さくなる比較的急な低下を強調している。これとは対照的に、図４は、抗凝固剤なしのサンプルの著しく異なるプロファイルを示す。サンプルは、それほど低下しないが、より重要なこととして、実行を通してほぼ半分で最小値となり、その後、再び、増加し始める。カートリッジの全てが、この行動を示した。（一旦サンプルが凝固すれば血球が動きを停止し、したがって、一定のシグナル／ピーク高さを有するはずと予想されるので、これは驚くべき発見事項である。）
【００４５】
これらのデータは、凝固していない血液サンプルと凝固した血液サンプルの沈殿プロファイルとの間に区別可能な差異があることを示した。
【００４６】
（実施例４）
凝固２：トロンボプラスチン試薬
実施例３とは異なり、サンプルに特定の凝固剤を追加することにより凝固を制御した。
【００４７】
商用プロトロンビン時間凝固剤（ＴＥＣＩｏｔＰＴ−Ｓ）を使用した。この市販の試薬は、主としてトロンボプラスチンとカルシウムとを含んでなる。標準的なプロトロンビン時間試験において、サンプルをクエン酸塩採取管に採取する。その後、２：１のＰＴ試薬：サンプル比で試薬をこれに追加する。通常は、血液または血漿は、約１０〜２０秒で凝固する。したがって、反応を遅らせるために（測定を容易にするために）、器具で観察するのに適切と思われる時間尺度での凝固を引き起こすレベルを判断するために試薬を滴定した。（代案として、器具が１０〜２０秒の時間スケールを測定するように構成することができることに注意するべきである）この器具構成が実験に利用可能だったのでより長い時間が使用された。
【００４８】
静脈血サンプルを供血者からクエン酸塩チューブに採取した。その後、血液：試薬の１０：１〜２０：１の範囲のＰＴの異なる比でこれを混合した。これは、５％〜１０容量％の範囲のＰＴ容積に対応する。混合後、サンプルは直ちにカートリッジに取り込んで、測定を行う器具に挿入した。
【００４９】
ピーク高さをサイクル数に対してプロットしたが、これらのデータが、各比率について以下で図５に示されている。
【００５０】
２０：１〜１４：１の比率について、サンプルは、有意に凝固していないことを示す通常の低下を示す。１２：１および１０：１の両方は、凝固した物質について図４で観察された一般的なプロファイルを示す、すなわち、ピーク高さは、最小値へと低下してから増大し、凝固を示す。これは、最も高い濃度において、シグナルがより素早く最小値に到達することを示し、シグナルが増加し始めるまでシグナルの形状および時間をモニタリングすることにより凝固の差異を区別することができることを示す。
【００５１】
完全性を期すために、生データは、以下で図６でサンプルの各々について示されている。
【００５２】
臨床測定に向けて、システムは、サンプルが通常凝固するのに掛かる時間を特定するために通常のヒトの血液サンプル（および既存の凝固方法）に即して較正される。
【００５３】
特定の形式の凝固試験の状態下でその後、較正されたシステムは、患者血液サンプルの凝固の時間を測定するために使用される。凝固までの時間の変化が、血液サンプルが凝固するのが普通のサンプルよりも早いか、又は遅いかを特定するために使用される。その後、これは、臨床診断を行うか、または、凝固時間を正常範囲に戻すために既存の療法を調整するために使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図６ｅ】
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【図６ｆ】
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【図６ｇ】
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【国際調査報告】
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