(57)【要約】  本発明は、デジタルホログラフィック顕微鏡（ＤＨＭ）と少なくとも１つの流体システムとを含む、液体試料中の物体を観察、分析及び／又は分離するフローサイトメトリーシステム及びフローサイトメトリー方法であって、該ＤＨＭは照明手段と、干渉システムと、デジタル記録手段とを含み、該流体システムは上記物体を上記ＤＨＭの該照明手段の照明ビームを通るように導くことが可能であり、該流体システムは該流体システムを通して液体試料ストリームを誘導する機構を備え、好ましくは、該流体システムは、該流体システム内の液体試料ストリームの横断寸法を制御する流径制御デバイスを備え、好ましくは、該流径制御デバイスは、該液体試料ストリーム中に物体を１つずつ又は複数の物体を一度に並べることが可能である、フローサイトメトリーシステム及びフローサイトメトリー方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
デジタルホログラフィック顕微鏡（ＤＨＭ）と少なくとも１つの流体システムとを含む、液体試料中の物体を観察、分析及び／又は分離するフローサイトメトリーシステムであって、該ＤＨＭは照明手段と、干渉システムと、デジタル記録手段とを含み、該流体システムは前記物体を前記ＤＨＭの該照明手段の照明ビームを通るように導くことが可能であり、該流体システムは該流体システムを通して液体試料ストリームを誘導する機構を備え、又は、該流体システムは、該流体システム内の液体試料ストリームの横断寸法を制御する流径制御デバイスを備え、又は、該流体システムは、該流体システム内の液体試料ストリームの横断寸法を制御する流径制御デバイスを備え、該流径制御デバイスは、該液体試料ストリーム中に前記物体を１つずつ又は複数の物体を一度に並べることが可能である、フローサイトメトリーシステム。
【請求項２】
前記物体が、生物有機体、細胞、細胞色素、ＤＮＡ鎖及びＲＮＡ鎖、染色体、タンパク質、微生物、細菌、ウイルス、酵母、線虫、酵素、細胞質、膜組織、原生生物等、並びに非生物体、不純物、汚染物質、又はそれらの任意の組合せの一覧のいずれかである、請求項１に記載のフローサイトメトリーシステム。
【請求項３】
前記液体試料ストリームを誘導する機構がポンプを含む、請求項１又は２に記載のフローサイトメトリーシステム。
【請求項４】
前記ＤＨＭの照明手段が部分コヒーレント光源を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のフローサイトメトリーシステム。
【請求項５】
前記ＤＨＭが微分ＤＨＭ又はカラーＤＨＭである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のフローサイトメトリーシステム。
【請求項６】
前記流体システムがキャピラリー−フローサイトメトリー用の毛細管を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のフローサイトメトリーシステム。
【請求項７】
前記流体システムが、物体を含む前記液体試料を流すことができるシースフローによる狭いトンネルをもたらす流体力学的集束システムを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のフローサイトメトリーシステム。
【請求項８】
前記流体システムが、前記液体試料ストリーム中に流れる物体を音響学的に集結させる音響学的集束システムを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のフローサイトメトリーシステム。
【請求項９】
前記ＤＨＭの照明手段に対する前記物体の蛍光応答を測定する蛍光測定システムを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のフローサイトメトリーシステム。
【請求項１０】
前記物体の蛍光応答を誘導する蛍光照明手段を含む、請求項９に記載のフローサイトメトリーシステム。
【請求項１１】
前記フローサイトメトリーシステムにより測定可能な特性に従って物体を分離する物体選別システムを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のフローサイトメトリーシステム。
【請求項１２】
液体試料中の物体を観察、分析及び／又は分離するフローサイトメトリー方法であって、
照明手段と、干渉システムと、デジタル記録手段とを含むＤＨＭを準備する工程と、
流体システムを通して前記液体試料の液体試料ストリームを誘導する機構を備える流体システムを準備する工程と、
前記流体システムを通して液体試料ストリームを誘導する工程と、
前記物体を１つずつ又は複数の物体を一度に並べて、前記ＤＨＭの照明手段の照明ビームを通るように導く工程と、
前記ＤＨＭを用いて前記物体を観察及び／又は分析する工程と、
を含む、方法。
【請求項１３】
前記物体の観察された特性に従って前記液体試料ストリームから該物体を分離する工程を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記物体が、生物有機体、細胞、細胞色素、ＤＮＡ鎖及びＲＮＡ鎖、染色体、タンパク質、微生物、細菌、ウイルス、酵母、線虫、酵素、細胞質、膜組織、原生生物、非生物体、不純物、汚染物質、又はそれらの任意の組合せである、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
物体が、毛細管現象、キャピラリーフロー、音響学的集束及び／又は流体力学的集束によって並べられる、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デジタルホログラフィック顕微鏡（ＤＨＭ：Digital Holographic Microscope）を用いた、液体試料中での細胞、細菌、酵母、微生物、線虫等の生物有機体、及び非生物体、不純物、汚染物質、又はそれらの任意の組合せを含む物体の観察、測定、分析及び／又は分離の技術分野に関する。より詳細には、物体がフローサイトメトリー構成においてＤＨＭリアクタの照明ビームを通って流れ、ＤＨＭにより観察されるそれらの特徴に応じて物体を観察、測定、分析、分類及び場合によって分離することができるシステムが開示される。
【背景技術】
【０００２】
フローサイトメトリーは、細胞及び染色体等の微細粒子を、流体のストリーム中に懸濁させて、電子検出装置に通すことによってカウント及び検査する技法である。これによって、１秒に付き最大数千もの粒子の物理的及び／又は化学的な特徴の同時多重パラメータ分析が可能となる。フローサイトメトリーは、健康障害、特に血液がんの診断に日常的に使用されているが、研究及び診療の両方において多くの他の用途がある。一般的な変法は対象となる集団を精製するために、粒子をそれらの特性に基づき選別することである。
【０００３】
蛍光活性化細胞選別は特殊なタイプのフローサイトメトリーである。蛍光活性化細胞選別は、各細胞の特定の光散乱特徴及び蛍光特徴に基づき、生物細胞の異種混合物を２つ以上のコンテナに１細胞ずつ選別する方法を提供する。蛍光活性化細胞選別は、個々の細胞からの蛍光シグナルの客観的かつ定量的な記録、及び特に対象となる細胞の物理的分離をもたらすことから、有用な科学機器である。細胞懸濁液は狭く急速に流れる液体ストリームの中心に取り込まれる。フローはその直径に対して細胞間を大きく分離するように配置される。振動機構によって、細胞のストリームが個々の小滴へと分割（break）される。このシステムは小滴１つ当たりの細胞が２つ以上となる可能性が低くなるように調整される。ストリームが小滴へと分割される直前、フローは蛍光測定ステーションを通り、そこで各細胞の対象となる蛍光特徴が測定される。帯電リングをちょうどストリームが小滴へと分割される場所に置く。直前の蛍光強度測定に基づき電荷がリング上に置かれ、ストリームから小滴が分割されるときに、逆の電荷が小滴上に捕獲される。次いで帯電した小滴がその電荷に応じて小滴の進路をコンテナへと変える静電偏向システムを通って落下する。システムによっては、電荷をストリームに直接印加して、小滴への分割によってストリームと同じ符号の電荷が保持される。次いでストリームは小滴への分割後に中性へと戻る。
【０００４】
このようにしてフローサイトメトリーを用いて、液体試料において物体を分析して、物体を他のものと分離することができる。そのために物体を液体中に懸濁させ、典型的に物体の低密度懸濁液と物体の液体を狭流又は小滴で下方に落下させる小滴状のノズルとを使用することによって１つずつ並べる。挟流が照明手段、典型的にはレーザービーム又は蛍光活性化光の前を通る。レーザービームを物体から散乱させることができるか、又は物体が蛍光マーカーで標識されている場合に照明手段が物体中に蛍光を誘導することができる。観察される散乱光及び／又は蛍光応答光に基づき、個々にスキャンされる物体に関する情報を得ることができる。更にこの情報を用いて、この物体をビームと分離することができる。それに、物体又は物体が懸濁している液滴上に電荷を誘導することができ、次いで静電場を印加することによってストリームから物体を取り出すことができる。既存のフローサイトメトリーに重要なのは、測定装置は通常、物体に関する情報を１つずつ得ることが可能であることから、物体等の微細粒子が測定装置を通る際に液体フロー中に１つずつ並べられることである。
【０００５】
特許文献１には、三次元顕微鏡法を用いて試料、とりわけ厚みのある生物試料及び試料から発せられる蛍光場を得る方法及びデバイスが開示されている。一実施の形態は、被検査物の干渉シグナルを得ることと、被検査物から生じる蛍光シグナルを得ることと、これらのシグナルを記録することと、所与の時点で被検査物及び被検査物から発せられる蛍光場の三次元画像を再構成するようにこれらのシグナルを処理することとを含む。別の実施の形態は、デジタルホログラフィ顕微鏡と、被検査物を照明する蛍光励起源と（ここでは顕微鏡と蛍光励起源とは被検査物の干渉シグナル及び被検査物から生じる蛍光シグナルを得るように協働する）、干渉シグナル及び蛍光シグナルを記録する手段と、所与の時点で被検査物及び被検査物から発せられる蛍光場の三次元画像を再構成するように干渉シグナル及び蛍光シグナルを処理する手段とを含む。
【０００６】
特許文献２には、蛍光試料及び生物試料等の比較的厚みのある試料を含む試料の高品質３Ｄ画像を得るのにデジタルホログラフィにおいて機能することが可能な小型顕微鏡であって、該顕微鏡が研究対象の試料を照明するための少なくとも一部が空間的にコヒーレントな照明手段と、電子画像化デバイスのセンサー上に上記試料から干渉ビームを発生させる微分干渉計とを備え、該微分干渉計が或る干渉ビームを他の干渉ビームに対して規定の角度傾けるためのすなわち傾動手段を含み、上記傾動により電子画像化デバイスのセンサー上に上記干渉ビームの規定シフトが生じ、該シフトは各ビームの空間コヒーレント幅よりも小さく、上記顕微鏡は試料の信頼性のある３Ｄ画像を得るのに最小限の追加の調整しか要求されないように、試料とは独立して或る程度全体的に（quasi totally）予め調整することが可能である、小型顕微鏡が開示されている。
【０００７】
流体力学的集束は、例えば微生物学者らによって、例えば細菌又は細胞のサイズを決定するためにフローサイトメータ又はコールターカウンタからより正確な結果をもたらすのに用いられる技法である。細胞を小トンネルに通し、レーザー光線又は電流の断絶（disruptions）を引き起こすことで細胞をカウントする。これらの断絶は機器によって分析される。直径がマイクロメートル程度でなければならず、トンネルの長さは数ミリメートルを超えるとされることから、通例の製造プロセスを用いてこの目的に十分なほど狭いトンネルを作製することは難しい。流体力学的集束は、流体力学の効果を用いて、流体からトンネルの壁を構築することによってこの問題を解決する。ガラス又はプラスチック製の幅広（直径数百マイクロメートル）のチューブが使用され、それを通してシースフローと呼ばれる流体の「壁」が送り出される。試料をシースフローの中心に注入する。２つの流体の速度又は密度が十分に異なっていれば、それらは混合せず、二層の安定したフローを形成する。安定性は懸濁物体のより質の良い測定に必要とされる。
【０００８】
特許文献３には、試料流路を有する毛管と、該毛管と連結した少なくとも１つの振動生成トランスデューサであって、試料流路内で音響放射圧を誘導する音響シグナルを生成し、試料流路中の流体試料ストリーム内を流れる粒子を音響的に集結させるように構成されている、少なくとも１つの振動生成トランスデューサと、音響的に集結させた粒子の少なくとも一部と相互作用して出力シグナルを生成するように構成されている紫色レーザー及び青色レーザーを有するインテロゲーション光源とを備えるフローサイトメータが開示されている。特許文献３と同様のシステムは、音響学的集束を用いたフローサイトメータ、より具体的には音響学的集束を用いたキャピラリー−フローサイトメータの一例である。
【０００９】
特許文献４には、微粒子にタグ付けされた蛍光物質を検出する方法及び装置が開示されている。このデバイスは、微粒子を選択位置へと（past）移動させる単一キャピラリーフロー輸送システムと、微粒子にタグ付けされた物質に放射線を当てるための電磁放射線源と、選択位置において物質から放出された蛍光を測定する検出システムとを備える。この方法は微粒子を選択位置へと移動させることと、微粒子にタグ付けされた蛍光物質に放射線を当てることと、選択位置で蛍光物質から放出される蛍光を測定することとを含む。特許文献４又は特許文献３と同様のシステムはキャピラリー−フローサイトメータの一例である。
【００１０】
従来技術のフローサイトメータには多くの不利点がある。不利点の一つは、散乱光から得られる物質に関する情報は限定されているということである。フローサイトメトリー分析から得られるデータは集団レベルであることから、個々の物質の挙動を観察し測定することは容易ではない。従来技術のフローサイトメータによる別の主な不利点はその低い物体押出量である。高速のフローサイトメータ及び選別機であっても、物体押出量は依然として１秒当たり数千の物体数に満たない。押出量は流速に関連し、測定装置によって制限され、また移動粒子において適切な質の測定をもたらすことが可能である必要がある。典型的には、流速が増大すると測定の質は低減し、逆もまた同様である。そのためより高速の測定技法、すなわちより短期間で適切な質の測定を行う技法により、押出量の増大が可能となる。多くの実験では、非常に大量の物体が必要となる。このことは従来技術において利用可能な高速のフローサイトメータ及び選別機であっても、長期間に亘って稼働させる必要があることを示唆しており、これには多大な費用がかかるだけでなく、このような長期の稼働により選別される物体は科学実験には有用ではなくなっている場合があることから、質の問題も抱えている。この問題は選別する物体を滅菌する必要がある場合に更に深刻化し得る。
【００１１】
高速フローサイトメータに滅菌物体を用いることができるが、これによってこの操作が複雑になり、押出量が更に低減される。ほとんどの既存のフローサイトメトリーシステムでは、例えば後の検査又は画像データベースの更新に望まれ得る物体の画像は得られない。細胞、細菌、酵母、微生物、線虫等の生物有機体、及び非生物体、不純物、汚染物質、又はそれらの任意の組合せを含む物体の画像を得るシステムにおいて、画像は物体を顕微鏡の焦点に並べる必要がある、従来型の顕微鏡、例えば蛍光顕微鏡又は射影顕微鏡を用いて撮影される。焦点を外れて並べられた物体の測定結果は通常排除され、これにより有効性及び情報の多大な喪失が起こる。
【００１２】
さらに、フローサイトメトリーは非常に高性能の機器を要し、熟練した高度な訓練を積んだオペレータでなければ、フローサイトメトリーを行い、このような装置から任意の許容可能な性能レベルを引き出すことはできない。
【００１３】
また、フローサイトメータは購入及び維持に多大な費用がかかる機器である。分析だけなく選別することもできるレーザーフローサイトメータは、特に小さな研究所にとっては非常に高価であり、アーク灯型サイトメータでも僅かに安価なだけである。更なる選別能を有するフローサイトメータはそのより安価なもののほぼ２倍のコストがかかり得る。さらに、高速選別機の稼働は、通常１回の操作毎にかなりの量のコストがかかる別の経常的な出費である。
【００１４】
従来技術のフローサイトメータの分析又は測定装置を用いて取得したデータは十分に正確なものではない場合があり、このデータが十分に迅速に得られない場合があり、この装置は費用がかかりすぎる場合があり、またこの装置では二次元及び／又はアナログの画像しか得られない場合がある。従来技術のフローサイトメータは従来の光学技法を用いて、物体の画像を得ることができるが、物体を光学システムの焦点に合わせる必要がある。これには２つの主な不利点がある：（ｉ）特に物体がフローサイトメータの場合のように移動する物体である場合、物体を焦点に配置するのに物体が直線状（straightforward）にならないことから、物体から良好な画像を得ることが不可能であり、（ｉｉ）一度に１つの物体しか焦点に配置することができないことから、１つずつしか物体の画像を得ることができない。さらに、集めた試料を分析前に処理する必要があり、これは時間のかかる労働集約的な手順であり得る。異なる試料をモニタリング又は分析するのに同じ装置を使用する場合、汚染が問題になり得る。
【００１５】
ＤＨＭは、他の画像化又は分析技法によって得られる画像及び情報よりも優れた試料に関する画像、及び／又は直接デジタル化情報を提供することができる。フローサイトメトリーシステムの測定装置として又はフローサイトメータに加えてＤＨＭを用いることで、ユーザーは液体中に懸濁させた物体の三次元写真を得ることが可能となる。この写真はＤＨＭにより記録された記録干渉情報に基づくものである。ＤＨＭは顕微鏡の焦点に物体を１つずつ並べる必要なくこの情報を得ることができる。実際、ＤＨＭにより記録された干渉パターンが取得後フォーカシング（post-acquisition focusing：取得後焦点調節）を可能にし、これにより好ましくは分析コンピュータ上での取得後ソフトウェアによって、デジタル化干渉パターンから物体の鮮明な３Ｄ画像を抽出することが可能となり、またこれには物体を顕微鏡の焦点に位置付けるか、又は顕微鏡の焦点を物体の位置に合わせる必要はない。その上、記録された干渉パターンには多くの物体の３Ｄ情報が含まれ得ることから、物体を一列に並べる必要がない。これにより、ＤＨＭをフローサイトメトリーシステムに又はフローサイトメトリーシステムと併せて使用する場合、押出量の増大がもたらされる。さらに、ＤＨＭも蛍光色素又はマーカーと併せて使用することができ、この組合せが１回の稼働で多くの懸濁物体及び大量の観察可能な広範のパラメータ群をもたらす。
【００１６】
当該技術分野において依然として測定特性、観察特性、分析特性及び／又は分離特性が改善されたフローサイトメータが必要とされている。フローサイトメータの測定装置としてデジタルホログラフィック顕微鏡を用いることで、特に画像化過程においてフォーカシング装置又はフォーカシング工程の必要性を排除するその取得後フォーカシング能に起因して、スキャンする物体に関して従来技術のフローサイトメータより良好な情報を得ることが可能となる。さらにＤＨＭは、物体の干渉画像又はホログラフィ画像を作成するのにほとんど時間を必要としないことから、移動する物体に関して高品質な情報を得るのに十分に適している。ホログラフィ画像には、典型的に散乱光及び蛍光に基づくものであるフローサイトメトリーシステムにおける従来技術の測定が送達することができる情報よりも物体に関する情報がかなり多く含有されている。
【００１７】
当該技術分野において押出量が改善されたフローサイトメータが必要とされている。ＤＨＭの迅速な取得時間が、従来技術のフローサイトメータ、特にスキャンする物体に関する同程度の量及び質の情報をもたらす従来技術のサイトメータよりも高い押出量を可能にする。ＤＨＭは、特にその取得後フォーカシング能に起因して、１回の記録工程で多くの物体の情報を集めることも可能である。そのため、顕微鏡の焦点に１つずつ物体を提示する必要なく、多くの物体のホログラムを得ることができる。
【００１８】
当該技術分野においてスキャンする物体に対して非侵襲的なフローサイトメータが必要とされている。これには、細胞、細菌、酵母、微生物、線虫等の生物有機体、及び非生物体、不純物、汚染物質、又はそれらの任意の組合せを含む、スキャンする物体に蛍光又は他のマーカーを導入する必要があるフローサイトメータが含まれる。このような標識は高価で、時間がかかり、かつ物体に対して侵襲的である場合があり、この場合物体を更なる実験には使用することができない。ＤＨＭが物体に関する高品質の情報を得る非侵襲的でコスト及び時間効率の良い方法をもたらすことから、フローサイトメータをＤＨＭとともに用いることでこの問題が解決される。これには又は測定の質の改善には色素又はマーカーは必要とされない。また、当該技術分野において、１回の稼働でＤＨＭ及び蛍光技法によって得られるような、懸濁物体に関する複合情報を得ることが可能なフローサイトメータも必要とされている。
【００１９】
当該技術分野において操作が容易なフローサイトメータが更に必要とされている。ＤＨＭは、操作を容易にすることができ、さらに更なる使用のために電子的に記憶し及び／又は容易に転送することができるデジタル化情報が与えられることから、自動化に十分有用である。
【００２０】
当該技術分野においてより安価に製造及び操作されるフローサイトメータも必要とされている。ＤＨＭを備えるフローサイトメータには、色素又はマーカーは必要ではなく、そのため操作コストが低くなる。さらに、ＤＨＭはレーザー等の高コヒーレント光源の代わりにＬＥＤ、ＯＬＥＤ、ＯＬＥＴ等の部分コヒーレント光源を含むことができ、そのため製造コストが劇的に抑えられる。
【００２１】
したがって本発明は、液体フロー中の物体の観察のためにデジタルホログラフィック顕微鏡を備えるフローサイトメータを提供することを目的とする。
【００２２】
ＤＨＭは他の画像化又は分析技法よりも優れた試料に関する画像、及び／又は直接デジタル化情報を提供することができる。ＤＨＭは、記録された干渉パターンに関する取得後フォーカシング技法を行うことができることから、フォーカシングシステムは必要ではない。そのため、フォーカシングの必要なく物体の高品質画像を得ることができ、これらの画像を取得後工程において取得することができることから、一度に２つ以上の物体の画像を得ることができる。さらに、従来技術の技法を用いると、集めた試料を分析前に処理する必要があり、これは時間のかかる労働集約的な手順であり得る。異なるリアクタ、又は異なる時点で同じリアクタをモニタリング又は分析するのに同じ装置を使用する場合、汚染が問題になり得る。従来技術の技法では常に、リアクタ若しくは別のリアクタへと試料を戻すことができるわけではなく、又はリアクタの環境パラメータを適合するのにリアルタイムにモニタリングして適時にフィードバックを与えることができるわけではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２３】
【特許文献１】米国特許第７４６３３６６号
【特許文献２】国際公開第２００４１０２１１１号
【特許文献３】国際公開第２０１１／０６８７６４号
【特許文献４】国際公開第１９９８／０５７１５２号
【発明の概要】
【００２４】
本発明は、デジタルホログラフィック顕微鏡（ＤＨＭ）と少なくとも１つの流体システムとを備える、液体試料中の物体を観察、分析及び／又は分離するフローサイトメトリーシステムであって、
上記ＤＨＭは照明手段と、干渉システムと、デジタル記録手段とを含み、
上記流体システムは上記物体を上記ＤＨＭの照明手段の照明ビームを通るように導くことが可能であり、
好ましくは、上記物体は、生物有機体、細胞、細胞色素、ＤＮＡ鎖及びＲＮＡ鎖、染色体、タンパク質、微生物、細菌、ウイルス、酵母、線虫、酵素、細胞質、膜組織、原生生物等、並びに非生物体、不純物、汚染物質、又はそれらの任意の組合せの一覧のいずれかであり、
好ましくは、上記流体システムは、該流体システムを通して液体試料ストリームを誘導する機構を備え、好ましくは、該機構はポンプを含み、
好ましくは、上記流体システムは該流体システム内の液体試料ストリームの横断寸法を制御する流径制御デバイスを備え、好ましくは、該流径制御デバイスは該液体試料ストリーム中に物体を１つずつ又は複数の物体を一度に並べることが可能である、
フローサイトメトリーシステムを提供するが、これに限定されない。
【００２５】
好ましい実施の形態では、ＤＨＭの照明手段は部分コヒーレント光源を含む。
【００２６】
好ましい実施の形態では、ＤＨＭは微分ＤＨＭ、カラー若しくは感色（color-sensitive）ＤＨＭ、又はそれらの組合せである。
【００２７】
好ましい実施の形態では、上記システムは物体の蛍光を観察する１つ又は複数の蛍光検出器を含む。
【００２８】
好ましい実施の形態では、流体システムはキャピラリー−フローサイトメトリー用の毛細管を含む。
【００２９】
好ましい実施の形態では、流体システムは、物体を含む液体試料を流すことができるシースフローによる狭いトンネルをもたらす流体力学的集束システムを含む。
【００３０】
好ましい実施の形態では、流体システムは、上記液体試料ストリーム中に流れる物体を音響学的に集結させる音響学的集束システムを含む。
【００３１】
好ましい実施の形態では、フローサイトメトリーシステムは、上記ＤＨＭにより測定可能な特性に従って物体を分離する物体選別システムを含む。
【００３２】
好ましい実施の形態では、上記物体は細胞である。より好ましい実施の形態では、該細胞が異常である、例えばヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に感染していることを示す特性に従って該細胞を分離することができる。
【００３３】
好ましい実施の形態では、本発明は上記１つ又は複数の流体システムと接続され、該流体システムにおいて液体フローを誘導することが可能な少なくとも１つのポンプシステムを備える、上記フローサイトメトリーシステムを提供する。
【００３４】
好ましい実施の形態では、本発明は少なくとも１つの流体システムが試料リザーバと上記ＤＨＭとの間に該リザーバ及び／又は１つ若しくは複数の他のリザーバへと戻る回路を形成する、上記フローサイトメトリーシステムを提供する。
【００３５】
好ましい実施の形態では、本発明は少なくとも１つの流体システムがリザーバに対して該流体システムを容易に着脱するためのリザーバ取付けシステムを備え、これにより流体の漏出が抑えられる、上記フローサイトメトリーシステムを提供する。
【００３６】
好ましい実施の形態では、本発明は少なくとも１つの流体システムが、圧縮、引抜及び／又は押出すると該流体システムにおいて流体フローが生じる、流体密封された可撓、可動及び／又は可曲（bendable）部分を含む、上記フローサイトメトリーシステムを提供する。
【００３７】
好ましい実施の形態では、本発明は上記流体密封された可撓、可動及び／又は可曲部分を圧縮、引抜及び／又は押出することで、上記流体システムにおいて流体フローを誘導することが可能な、上記流体システムに接続されたポンプを含むポンプシステムを備える、上記フローサイトメトリーシステムを提供する。
【００３８】
好ましい実施の形態では、本発明は少なくとも１つのポンプシステムが、上記ポンプが接続された流体システムに流体フロー、好ましくは連続した流体フローを誘導することが可能な、蠕動ポンプ等のポンプ、好ましくは連続ポンプを含む、上記フローサイトメトリーシステムを提供する。
【００３９】
更なる態様では、本発明は上記フローサイトメトリーシステムの流体システム用のチューブを提供する。
【００４０】
好ましい実施の形態では、上記チューブがオートクレーブ処理可能である。
【００４１】
好ましい実施の形態では、本発明は上記部分が上記チューブを通すことで液体試料ストリームを狭めるキャピラリー部分を含む、上記チューブを提供する。
【００４２】
更なる態様では、本発明は少なくとも部分的に透明なチューブ、リザーバ、シース流体又は透明な遮断部（interruptions）若しくは開口部、例えば管類等の上記フローサイトメトリーシステムのＤＨＭの照明手段に対して少なくとも部分的に透明な１つ又は複数の部分を含む、上記フローサイトメトリーシステム用の流体システムを提供する。
【００４３】
異なる態様では、本発明は液体試料中の物体を観察、分析及び／又は分離するフローサイトメトリー方法であって、
照明手段と、干渉システムと、デジタル記録手段とを含むＤＨＭを準備する工程と、
好ましくは流体システムを通して液体試料の液体試料ストリームを誘導する機構を備える流体システムを準備する工程と、
流体システムを通して液体試料ストリームを誘導する工程と、
上記物体を１つずつ又は複数の物体を一度に並べて、上記ＤＨＭの照明手段の照明ビームを通るように導く工程と、
上記ＤＨＭを用いて上記物体を観察及び／又は分析する工程と、
好ましくは上記物体の観察される特性に従って上記液体試料ストリームから該物体を分離する工程と、
を含む、方法を提供し、好ましくは、上記物体は、細胞、細菌、酵母、微生物、線虫等の生物有機体、及び非生物体、不純物、汚染物質、又はそれらの任意の組合せであり、好ましくは、上記物体は毛細管現象、キャピラリーフロー、音響学的集束及び／又は流体力学的集束によって並べられる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明によるフローサイトメトリーシステムを説明するフロー図である。
【図２】液体試料がリザーバフロー２０２から従来技術で既知のフローサイトメータ２１２へ、続いてＤＨＭへとどのようにして流れるかを示す図である。
【図３】液体試料ストリームがＤＨＭへ、続いて従来技術のフローサイトメータへと至る、本発明によるフローサイトメトリーシステムの一実施形態を示す図である。
【図４】液体試料ストリーム中の物体がＤＨＭによって取得された情報に従って選別され、続いて物体の亜集団が更なる情報を得るために従来技術のフローサイトメータへと至る、本発明によるフローサイトメトリーシステムの一実施形態を示す図である。
【図５】液体試料ストリーム中の物体が、従来技術のフローサイトメータとＤＨＭとによって取得された複合情報に従って選別される、本発明によるフローサイトメトリーシステムの一実施形態を示す図である。
【図６】液体試料ストリーム中の物体が従来技術のフローサイトメータによって取得された情報に従って選別され、続いて物体の選別された亜集団が更なる情報を得るためにＤＨＭへと至る、本発明によるフローサイトメトリーシステムの一実施形態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本発明は液体試料中の物体を観察、分析及び／又は分離するフローサイトメトリーシステム及び方法に関する。本発明はこのようなフローサイトメトリーシステムの流体システム及びこのような流体システム用のチューブにも関する。
【００４６】
別途定義されない限り、本発明の開示において使用される技術用語及び科学用語を含む全ての用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解される意味を有する。更なる説明（guidance）による本発明の教示をよりよく理解するための用語の定義が含まれる。
【００４７】
本明細書で使用される場合、以下の用語は以下の意味を有する。
【００４８】
本明細書で使用される数量を特定していない単数形（"A","an", and "the"）は、別途文脈により明確に指示されない限り、単数及び複数の両方の指示物を指す。例えば、「コンパートメント（a compartment）」は１つ又は２つ以上のコンパートメントを指す。
【００４９】
本明細書においてパラメータ、量、期間等の計測可能な値に対する言及で使用される「約（About）」は、規定値より±２０％以下、好ましくは±１０％以下、より好ましくは±５％以下、更により好ましくは±１％以下、そして更により好ましくは±０．１％以下の変動を包含することを意味し、そのような変動であれば開示される本発明において実施するのに適切である。しかしながら、修飾語「約」が言及する値自体も具体的に開示されていることを理解されたい。
【００５０】
本明細書で使用される「含む（"Comprise," "comprising," and"comprises"）」及び「で構成される（"comprisedof"）」は、「含む（"include","including", "includes"）」又は「含有する（"contain","containing", "contains"）」と同義であり、その前にある（follows）例えば構成要素の存在を明示する包括的な又はオープンエンド型の用語であり、当該技術分野において既知又はそこで開示される追加の言及されていない構成要素、特徴、要素、部材、工程の存在を排除又は除外するものではない。
【００５１】
端点による数値範囲の記述は、記述された端点だけでなく、その範囲内に含まれる数及び分数を全て含む。
【００５２】
「重量％」（重量パーセント）の表現は、別途定義されない限り本明細書及び明細書全体において、配合物の全重量をベースとする各構成要素の相対重量を表す。
【００５３】
第１の態様では、本発明は、デジタルホログラフィック顕微鏡（ＤＨＭ）と少なくとも１つの流体システムとを備える、液体試料中の物体を観察、分析及び／又は分離するフローサイトメトリーシステムであって、
上記ＤＨＭは照明手段と、干渉システムと、デジタル記録手段とを含み、
上記流体システムは上記物体を上記ＤＨＭの照明手段の照明ビームを通るように導くことが可能であり、
好ましくは、上記物体は、生物有機体、細胞、細胞色素、ＤＮＡ鎖及びＲＮＡ鎖、染色体、タンパク質、微生物、細菌、ウイルス、酵母、線虫、酵素、細胞質、膜組織、原生生物等、並びに非生物体、不純物、汚染物質、又はそれらの任意の組合せの一覧のいずれかであり、
好ましくは、上記流体システムは該流体システムを通して液体試料ストリームを誘導する機構を備え、好ましくは、該機構はポンプを含み、
好ましくは、上記流体システムは、該流体システム内の液体試料ストリームの横断寸法を制御する流径制御デバイスを備え、好ましくは、該流径制御デバイスは、該液体試料ストリーム中に物体を１つずつ又は複数の物体を一度に並べることが可能である、
フローサイトメトリーシステムを提供する。
【００５４】
生物有機体、細胞、細胞色素、ＤＮＡ鎖及びＲＮＡ鎖、染色体、タンパク質、微生物、細菌、ウイルス、酵母、線虫、酵素、細胞質、膜組織、原生生物等、並びに非生物体、不純物、汚染物質、又はそれらの任意の組合せ等の物体を測定及び／又は分析するためのＤＨＭの使用には、他の技法、特に他の顕微鏡技法を上回る多くの有利点があり、ＤＨＭの使用が本明細書に亘って説明されている。この有利点には、光学的フォーカシング工程を用いずに複数の物体の情報を得ることができる取得後フォーカシングの可能性が含まれる。ＤＨＭを、物体がＤＨＭによって測定又は観察される場合に該物体が一列に並んでいる又は２つ以上の物体が一度に提示されている液体中の物体のストリーム又はフローと組み合わせることで、試料中の個々の物体の詳細な分析を得ることが可能となり、この分析は従来技術のフローサイトメトリーシステムと比較して質が改善している。さらにこれにより、従来技術のＤＨＭにおいて同数の物体を分析するよりも速い、ＤＨＭによる多くの物体の高速の詳細な個別化したスキャニング又は分析が可能となる。
【００５５】
フローサイトメトリーシステムにおけるＤＨＭの使用は、他の分析／モニタリング技法と比較して以下のような多くの有利点をもたらす：
特定の時点で及び特定のリアクタから試料を回収又は手動で回収して、その後従来の顕微鏡、位相差顕微鏡又は共焦点顕微鏡等の（２Ｄ／３Ｄ）顕微鏡システムにおいて分析する労働集約的な方法とは異なりインライン３Ｄ／４Ｄモニタリングが可能であること、
他の顕微鏡技法と比較してより短い期間で試料に関する情報がより大量に集められること、
試料の自動デジタル化、更には自動定性化（qualification）及び定量化が可能であること等。
【００５６】
ＤＨＭにより、３Ｄ画像化を可能にする直接デジタル化位相情報が得られる。これは初めに大量の２Ｄ画像群を得て、そこから場合によって追加のデジタル化工程後に３Ｄ画像を再構成するＣＴスキャン等の他の３Ｄ画像化技法よりも速い。そのため本発明は、観察、分析及び／又はモニタリングの装置又は機構としてＤＨＭを使用することによって、リアクタのより速く、より正確でかつより信頼性の高い分析及び／又はモニタリングをもたらす。またＤＨＭは、例えばＣＴ技法よりも速くかつ正確であることから、流体試料、より好ましくは液体試料を分析するのに、特に３Ｄ情報を得るのに他の顕微鏡システムよりも適している。
【００５７】
デジタルホログラフィック顕微鏡法（ＤＨＭ）は、試料の層単位のスキャンを必要とすることなく、３Ｄ試料又は物体の記録を可能にする技法である。この点で、ＤＨＭは、共焦点顕微鏡法よりも優れた技法である。ＤＨＭでは、ＣＣＤカメラ又はＣＭＯＳカメラ等のデジタルカメラによってホログラフィ表現が記録され、その後、その表現をコンピュータ上で記憶するか、又は処理することができる。
【００５８】
ホログラフィ表現、すなわちホログラムを作成するのに、従来、試料を照明するのにレーザー光等の高コヒーレント光源が用いられている。最も基本的な設定では、光源からの（from）光は２つのビーム、すなわち物体ビームと参照ビームとに分割される。物体ビームは光学システムを介して試料に送信され、試料と相互作用し、それにより、物体の光学的特性及び３Ｄ形状に応じて、光の位相及び振幅を変更する。次いで試料から反射されるか又は試料を透過した物体ビームが、（例えば、ミラー及び／又はビームスプリッターのセットによって）参照ビームと干渉して、結果として干渉パターンが生じ、その干渉パターンがデジタル形式で記録される。物体ビーム及び参照ビームが同等の振幅を有するとき、ホログラムはより正確になることから、参照ビーム内に吸収要素を導入することができる。その吸収要素は参照ビームの振幅を物体ビームのレベルまで減少させるが、参照ビームの位相を変更しないか、又は変更するにしても、位相を全体的に、すなわち、参照ビームが吸収要素をどこで、どのように通り抜けるかに左右されることなく変更する。記録された干渉パターンには、物体の光学的特性及び３Ｄ形状によって決まる位相変化及び振幅変化に関する情報が含有される。
【００５９】
ホログラムを形成する代替の方法は、インラインホログラフィ技法を用いることによる。インラインＤＨＭはより従来的なＤＨＭに類似のものであるが、ビームを分割せず、少なくともビームスプリッター又は他の外部光学要素によって分割しない。インラインＤＨＭは、流体中の粒子、例えば細胞の密度がそれほど高くない溶液を見るのに使用されるのが最も好ましい。それにより、少なくとも部分的にコヒーレントな光の或る部分が粒子と相互作用することなく試料を通り抜け（参照ビーム）、粒子と相互作用した光（物体ビーム）と干渉し、干渉パターンを生成し、その干渉パターンはデジタル形式で記録されるとともに、処理される。インラインＤＨＭは透過モードで用いられ、相対的に大きなコヒーレンス長を有する光を必要とし、試料が厚すぎるか、又はその密度が高すぎる場合には使用することができない。
【００６０】
微分デジタルホログラフィック顕微鏡法（ＤＤＨＭ：Differential Digital HolographicMicroscopy）と呼ばれる別のＤＨＭ技法が、例えば欧州特許第１６３１７８８号において開示されている。ＤＤＨＭは、参照ビーム及び物体ビームを実際には使用しないという点で他の技法とは異なる。ＤＤＨＭの好ましい設定では、試料に反射モード又は透過モードで少なくとも部分的にコヒーレントな光からなる照明手段によって照明する。反射又は透過した試料ビームを対物レンズを通して送り、その後ビームスプリッターによって２つに分割して、例えばマイケルソン型又はマッハツェンダー型の微分干渉計において異なる経路で送ることができる。経路の一つでは、ビーム曲げ要素又は傾斜手段、例えば透明なウェッジが挿入される。次いで２つのビームが集束レンズの焦点面において互いに干渉して、この焦点面での干渉パターンがデジタル形式で記録され、例えばコンピュータに接続されたＣＣＤカメラによって記憶される。これにより、ビーム曲げ要素に起因して、２つのビームは制御された方法で僅かにシフトし、干渉パターンはそのシフト量に応じたものとなる。その後ビーム曲げ要素が回転することにより、シフト量が変化する。さらに新たな干渉パターンが記録される。これをＮ回行うことができ、これらのＮ個の干渉パターンから、集束レンズの焦点面での位相の勾配（すなわち空間導関数）をコンピュータで概算することができる。これは位相ステッピング法と呼ばれるものであるが、フーリエ変換データ処理技法等の位相勾配を得る他の方法も知られている。位相の勾配を積分して、位相を位置関数として得ることができる。場合によって、必ずしもそうである必要はないが、Ｎ個の記録された干渉パターンの振幅の加重平均から、光の振幅を位置関数としてコンピュータで計算することができる。このようにして位相及び振幅を確認した後、同じ情報を直接ホログラフィ法（参照ビーム及び物体ビームを用いる）の場合のように得て、続いて物体の３Ｄ再構成を行うことができる。微分ＤＨＭには他のタイプのＤＨＭを上回る或る特定の有利点があり、その有利点の一つは製造コスト及び操作コストの低減である。さらに微分ＤＨＭでは、干渉成分の間に試料を導入する必要がなく、それにより得られるホログラムの質が良くなり、ＤＨＭがより強固にかつより耐衝撃性となる。このことから好ましい実施形態では、ＤＨＭは微分ＤＨＭである。
【００６１】
診断状況におけるＤＨＭの使用には多くの有利点があり、そのためＤＨＭは本発明のような状況において実施するのに理想的な技法になる。明視野画像に加えて、位相シフト画像も作成される。位相シフト画像はＤＨＭの場合に特有のものであり、光学的距離についての定量化可能な情報を与える。反射ＤＨＭでは、位相シフト画像は物体の断層画像を形成する。
【００６２】
生きている生物細胞のような透明な物体は、従来、位相差顕微鏡又は微分干渉コントラスト顕微鏡において視認される。これらの方法は、位相シフト情報を用いて明視野画像を歪ませることによって、位相をシフトする透明物体を可視化する。明視野画像を歪ませる代わりに、透過ＤＨＭは、物体の光学的な厚みを示す別の位相シフト画像を作成する。このようにして、デジタルホログラフィック顕微鏡法が、透明物体を可視化するとともに定量化することを可能にし、それゆえ定量的位相差顕微鏡法とも呼ばれる。さらにはＤＨＭは細胞内構造の三次元での画像化を可能にする。
【００６３】
物体の画像を所与の焦点距離で算出する。しかしながら、記録されるホログラムには必要な物体の波面情報が全て含有されているため、再構成アルゴリズムにおいて焦点距離パラメータを変更することにより、あらゆる焦点面で物体を算出することが可能である。実際、ホログラムには完全な画像層を算出するのに必要な情報が全て含有されている。ＤＨＭシステムにおいて、物体の波面が複数の角度から記録される場合、物体の光学的特徴を完全に特性化して、物体の断層画像を作成することが可能である。
【００６４】
さらに、ＤＨＭシステムは像形成用のレンズを有しないことから、従来の光学収差はそれらのＤＨＭには当てはまらない。光学収差は、再構成アルゴリズムの設計によって「補正される」。光学的設定を正確にモデル化する再構成アルゴリズムは光学収差の影響を受けない。光学顕微鏡システムにおいて、光学収差は従来、レンズを組み合わせて、複雑で、コストがかかる像形成用顕微鏡対物レンズとすることによって補正される。さらに、高倍率における狭い焦点深度は高精度の機構を必要とする。最後に、ＤＨＭシステムに必要とされる部品は、レーザーダイオード及び画像センサーのような安価な光学素子及び半導体部品である。低い部品コストを、ＤＨＭの自動フォーカシング能と組み合わせると、コストが非常に低いＤＨＭシステムを製造することが可能になる。
【００６５】
好ましい実施形態では、ＤＨＭは微分ＤＨＭ、カラー若しくは感色ＤＨＭ、又はそれらの組合せである。典型的には、フローサイトメトリーシステムのコストを低く抑えるべき場合に微分ＤＨＭを使用することができる。異なる波長の又はその付近の２つ以上、例えば３つの照明手段を含むカラー又は感色ＤＨＭにより、物体のより詳細な及び／又はカラー画像を得ることが可能である。
【００６６】
好ましい実施形態では、上記システムは、物体の蛍光を観察する１つ若しくは複数の蛍光検出器又は物体のインピーダンスを測定するインピーダンス検出器を含む。本発明のフローサイトメトリーシステムは、インピーダンス（すなわち導電率）の測定システム等の従来技術のフローサイトメトリーシステムで使用される測定構成要素と、光学システム−ランプ（水銀、キセノン）；高出力水冷レーザー（アルゴン、クリプトン、色素レーザー）；低出力空冷レーザー（アルゴン（４８８ｎｍ）、赤色−ＨｅＮｅ（６３３ｎｍ）、緑色−ＨｅＮｅ、ＨｅＣｄ（ＵＶ））；光シグナルを生じるダイオードレーザー（青色、緑色、赤色、紫色）とを備え得る。このため、ＤＨＭを既存のフローサイトメトリーシステムに連結させることができ、それによりＤＨＭを有しない既存のシステムと比較して１回の稼働で得られる情報が増大する。
【００６７】
好ましい実施形態では、流体システムはキャピラリー−フローサイトメトリー用の毛細管を含む。このようにして、例えばシース流体又は他の機構を必要とせずに液体試料中の物体、例えば細胞を毛細管内に一列に又は複数の物体を一度に並べることができる。毛細管の幅を選ぶことにより、ＤＨＭの照明手段へと同時に曝される物体の数を制御することも可能である。
【００６８】
好ましい実施形態では、流体システムは、物体を含む液体試料を流すことができるシースフローによる狭いトンネルをもたらす流体力学的集束システムを含む。流体力学的集束は、分析のために粒子を位置付けるのに非常に有効なアプローチである。
【００６９】
好ましい実施形態では、流体システムは上記液体試料ストリーム中に流れる物体を音響的に集結させる音響学的集束システムを含む。音響学的集束システムを備えるフローサイトメータは、試料粒子を検査域へと集束及び集結させるのに、例えば毛細管の構造全体に亘って発生する音響励振を利用する。音響学的方法が粒子を集束及び集結させることから、音響学的集束システムを有しないフローサイトメータの出力及び消耗品のほんの一部を用いて、従来の粒子分析速度と長い通過時間との両方を維持することが可能である。より長い積分時間により、依然として高感度の測定を行いながらも、より安価で、小さく、かつ求められる出力が小さいデータ取得システムを用いた従来の粒子分析が可能になる。また、音響学的集束フローサイトメトリーの利得はシース流体の排除が可能であることのみに限定されない。さらに音響学的集結により、水モニタリング用途で見られるように、十分な分析速度で１リットル当たり数個の細胞又は粒子の程度という極めて希薄な試料の分析が可能となる。シースがないことから、稀有な事象の高信頼性分析のために対象となる粒子を繰り返し再分析することも可能である。
【００７０】
好ましい実施形態では、フローサイトメトリーシステムは上記ＤＨＭにより測定可能な特性に従って物体を分離する物体選別システムを含む。より好ましい実施形態では、上記選別システムは物体のストリームを個々の小滴へと分割する振動機構を備える。このシステムは、１つの小滴に付き物体が２つ以上になる可能性が低くなるように調整される。ストリームが小滴に分割する直前に、フローをＤＨＭの照明手段へと通し、そこで既定の物体特性を測定又は観察することができる。帯電リングをちょうどストリームが小滴へと分割される場所に置く。直前のＤＨＭ測定に基づき電荷がリング上に置かれ、ストリームから小滴が分割されるときに、逆の電荷が小滴上に捕獲される。次いで帯電した小滴がその電荷に応じて小滴の進路をコンテナへと変える静電偏向システムを通って落下する。別の実施形態では、電荷をストリームに直接印加して、小滴への分割によってストリームと同じ符号の電荷が保持される。次いでストリームは小滴への分割後に中性へと戻る。
【００７１】
好ましい実施形態では、上記物体の少なくとも幾つかは細胞である。細胞はＤＨＭによってかなり詳細に研究することができる物体である。
【００７２】
好ましい実施形態では、上記物体の少なくとも幾つかは、好ましくはサイズがＤＨＭの検出限度よりも大きいものを含む不純物又は汚染物質である。ＤＨＭの検出限度は典型的に、おおよそ照明ビームの波長であるが、例えば暗視野顕微鏡技法を用いることで、この波長の約半分まで更に低減することができる。
【００７３】
好ましい実施形態では、上記フローサイトメトリーシステムは、上記ＤＨＭの照明手段に対する物体の蛍光応答を測定する蛍光測定システムを含む。このため、フローサイトメトリーシステムはＤＨＭと蛍光分析とから複合情報を得ることができる。蛍光分析には、試料又は試料中の物体を少なくとも１つのマーカー及び／又は色素で処理する必要があり得る。ＤＨＭと蛍光測定システムとによる複合データから、例えばＤＨＭにより得られる細胞特徴と、ウイルス、タンパク質、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列等の存在を示すマーカーの蛍光シグナルとの間の相関関係を見ることもできる。
【００７４】
試料中の物体の蛍光応答は自発的なものであっても又はＤＨＭの照明手段により誘導されるものであってもよく、及び／又は好ましい実施形態では、フローサイトメトリーシステムは上記物体の蛍光応答を誘導する蛍光照明手段を含む。これらの照明手段には、スペクトル、強度及び／又は物体の蛍光を誘導することが可能な他の特性を有する光源が含まれ得て、この物体はマーカー及び／又は色素で処理することができる。
【００７５】
より好ましい実施形態では、１つ又は複数の特性、好ましくは細胞が異常である、例えばヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に感染していることを示す特性に従って該細胞を分離することができる。これらの特性には、上記ＤＨＭによって測定可能な特性、例えば細胞のサイズ、細胞の高さ、細胞の光学的高さ、細胞型、核のサイズ、核の高さ、核の光学的高さ、レンズ効果等又はそれらの任意の組合せが含まれ得る。これらの特性は照明手段に対する物体の蛍光応答によっても測定可能であり、そこでは物体を例えばＨＰＶ等の異常の存在を標識する少なくとも１つのマーカー及び／又は色素で処理することが好ましい。レンズ効果の特性は物体の湾曲、並びに細胞構成成分及び細胞流体、例えば細胞質の屈折率に応じた、細胞のフォーカシング特性又はデフォーカシング（defocussing）特性を指す。このような特性を用いて、細胞が生きているのか又は死んでいるのかを判断することができる。
【００７６】
更なる態様では、本発明は液体試料中の物体を観察、分析及び／又は分離するフローサイトメトリー方法であって、
照明手段と、干渉システムと、デジタル記録手段とを含むＤＨＭを準備する工程と、
好ましくは流体システムを通して液体試料の液体試料ストリームを誘導する機構を備える流体システムを準備する工程と、
流体システムを通して液体試料ストリームを誘導する工程と、
上記物体を１つずつ又は複数の物体を一度に並べて、上記ＤＨＭの照明手段の照明ビームを通るように導く工程と、
上記ＤＨＭを用いて上記物体を観察及び／又は分析する工程と、
好ましくは上記物体の観察される特性に従って上記液体試料ストリームから該物体を分離する工程と、
を含む、方法を提供し、好ましくは上記物体は、細胞、細菌、酵母、微生物、線虫等の生物有機体、及び非生物体、不純物、汚染物質、又はそれらの任意の組合せであり、好ましくは上記物体は毛細管現象、キャピラリーフロー、音響学的集束及び／又は流体力学的集束によって並べられる。
【００７７】
本明細書に記載のフローサイトメトリーシステムにおいてデジタルホログラフィック顕微鏡法以外の顕微鏡技法では、リアクタ及び回路システムにおけるプロセスのモニタリングに十分なほど速く又は正確にすることができない。このような他の顕微鏡技法はインラインでは適用することができず、試料を採取して、場合によっては色素（dye）又は着色剤を適用して、試料をスライドに塗布し、スライド上の試料を観察するのに顕微鏡を使用する必要がある。このプロセスは時間がかかり、労働集約的であるため、自動化に適していない。他の顕微鏡技法ではアナログ画像を得ることでき、その後アナログ画像を、例えば追加のスキャン工程によってデジタル形式で記憶することができる。ＤＨＭでは、情報はデジタル形式で得られ、直接デジタル処理することができる、すなわち追加のデジタル化手順は必要ない。さらにＤＨＭは、所望に応じて試料をリアクタに戻すことができることから、試料の喪失は起こらない。他の顕微鏡技法は、例えば着色剤、スライド、追加の必要なマーカー等の使用のためにこのような有利点を有し得ない。ただし、蛍光マーカー及び色素又は他の従来技術の技法をＤＨＭとともに使用することは依然として可能であり、それにより１回の稼働で懸濁物体から得ることができる情報量が増大する。
【００７８】
一般的にＤＨＭは、ＬＡＳＥＲ又はＬＥＤ等のコヒーレント光源又は少なくとも部分的にコヒーレントな光源を含む照明手段と、ミラー及び／又はビームスプリッターのセットを含み得る干渉計と、ＣＣＤカメラ又はＣＭＯＳカメラ等のデジタル記録手段と、例えばフラッシュメモリカード又は長期記憶のために接続された磁気記録デバイスとを備える。ＤＨＭは、レンズ、ミラー、プリズム、アッテネーター等の更なる光学部品も備え得る。場合によっては、ＤＨＭはメインフレーム、ＰＣ、ＰＬＣ等の論理デバイス等の処理手段を含むか又は処理手段に接続され得る。ＤＨＭは、好ましくは観察される試料の性質に応じて透過モード及び／又は反射モードで機能させることができる。本発明のシステムに使用されるＤＨＭは、従来のＤＨＭ、インラインＤＨＭ、微分ＤＨＭ、カラー若しくは感色ＤＨＭ、又は別の種類のＤＨＭであってもよい。したがって好ましい実施形態では、上記フローサイトメトリーシステムのＤＨＭの照明手段は部分コヒーレント光源を含む。部分コヒーレント光源は概して、コヒーレント光源よりも安価である。
【００７９】
上記フローサイトメトリーシステムの実施形態では、少なくとも１つの流体システムは、上記リアクタからの流体に直接接触し得る１つ又は複数のチューブを含む。好ましくは上記チューブは、起こり得る捻れにも耐性がある可曲材料を含む。流体を導くのに流体システムにおいてチューブを使用することの有利点は、チューブは安価に作製することができ、手動で適用に十分なほど長くすることができるか、又は長い導流路と組み合わせることができることである。より好ましい実施形態では、チューブ、より好ましくは容易に交換可能なチューブのみをリアクタの流体に直接接触させることができる。それにより、流体システムの他の構成成分を、費用のかかり得るクリーニング手順又は汚染物質除去手順を必要とすることなく再使用することができる。
【００８０】
好ましい実施形態では、上記少なくとも１つの流体システムは、上記流体試料の位相情報を得るための上記ＤＨＭの照明手段に対して少なくとも部分的に透明な部分を含む。
【００８１】
本発明によるフローサイトメトリーシステムを用いて液体試料リザーバの内容物をインラインでモニタリング及び／又は分析するには、好ましくはリザーバから試料を断定的に取り出す必要はなく、ＤＨＭと少なくともリザーバの内容物の試料との光学的接触が必要となる。そのため、上記流体システムは、少なくともＤＨＭとの光学的接触をもたらす部分を含むことができ、上記部分の特性はＤＨＭの規格に対して最適化されているのが好ましい。さらに好ましい実施形態では、流体システムは試料をリザーバからＤＨＭへ、更にそのリザーバへと戻るように、及び／又は１つ若しくは複数の他のリザーバへと導く、１つ又は複数のチューブを含む。このような実施形態では、流体システムは、場合によってＤＨＭによって得られる情報に応じて、流体を或るリザーバからＤＨＭへと、更に同じリザーバへと戻るように又は別のリザーバへと導くことができる。ＤＨＭが液体試料に関する情報を迅速かつ正確に取得することが可能であることから、ＤＨＭは観察される試料の内容物を処理するのに何が必要であるかを決定するのにこの情報をリアルタイムで使用することができる。それに加えて好ましい実施形態では、流体システムは１つ又は複数のバルブ、好ましくは電子操作されたバルブと、バルブ及びＤＨＭと操作可能に接続され、ＤＨＭによって取得された情報に基づき、どの時点でどのバルブを開閉するかを決定する意思決定ユニットとを含むことができる。
【００８２】
或るリザーバから取られた試料の、例えば別のリザーバからの残部（remains）による汚染を回避するために、リザーバからの流体に直接接触し得る流体システム回路の部分は容易に交換可能であるものとする。このようにして、リザーバからの流体に接触しない部分を再使用することができる。これには多くの有利点がある：交換可能な部分を少なくとも部分的に安価な材料から作製することができ、ＤＨＭ又は流径制御デバイス、例えば落下する液体ストリームをマイクロメートルサイズへと狭めるノズルとの最適な光学的接触をもたらす部分だけを高価なものにすればよく、再使用が可能な部分はより長期間持たせる必要があることから、より高価でかつより良い質のものであり得る。再使用が可能な部分の製造コストが安くとも問題はない。より詳細には、本発明のシステムの製造者は、システムの特定の用途に従って最適化することのできる再使用が可能な部分を作製する方法を選ぶことができる。システムの交換可能な部分は汚染物質除去若しくは滅菌させる必要はなく、又は特に多くの異なるタイプの試料を同じフローサイトメトリーシステムによって分析する必要がある場合、流体システムに接続する前に滅菌、例えばオートクレーブ処理することができ、これにより時間及びコストが節約される（gaining time and saving costs）。このような交換可能な部分は大量に作製することができ、コストが削減される。そのため好ましい実施形態では、流体システムは容易に交換可能であり及び／又は製造コストが安いチューブを含む。
【００８３】
好ましい実施形態では、本発明のシステムは、ＤＨＭ、特にＤＨＭの運転パラメータを調整することが可能な、ＤＨＭ又はＤＨＭの一部に接続された中央ユニットを含む。
【００８４】
流体フローは、例えばリアクタで行う反応若しくは熱勾配によって誘導される密度差又は圧力差による、例えば高低差等によって誘導されるような重力による、対流、伝導又は放射等の自然現象により存在し得る。流体フローが望まれるが、自発的に発生しない場合、又はフローを制御する必要がある場合、上記システムにおいてフローを誘導するために１つ又は複数のポンプシステムを流体システムに接続することができる。そのため好ましい実施形態では、本発明のフローサイトメトリーシステムは、流体システムに接続され、該流体システムにおいて流体フローを誘導することが可能な少なくとも１つのポンプシステムを含む。
【００８５】
好ましい実施形態では、本発明によるフローサイトメトリーシステムは、リザーバに対して流体システムを容易に着脱するためのリザーバ取付けシステムを備える少なくとも１つの流体システムを含み、これにより流体の漏出が抑えられる。より好ましい実施形態では、上記リザーバ取付けシステムは、上記リザーバの側面又は蓋の開口部において対応するねじ山を締緩することができる、外面に取り付けられたねじ山を備え、それにより該開口部が封止される、すなわち流体が上記リザーバと上記流体システムとで構成される容量から漏れるのが抑えられる。上記リザーバ取付けシステムは流体内向き流束及び流体外向き流束用の少なくとも２つの流路を備え、それにより上記流体システムを介した上記リザーバから上記ＤＨＭへの、場合によってはその逆の輸送が可能となる。リザーバ取付けシステムは、流体システムをリザーバへと上面、側面、底面又はそれらの組合せから接続することができるようなものとすることができる。
【００８６】
好ましい実施形態では、少なくとも１つの流体システムは、圧縮、引抜及び／又は押出すると該流体システムにおいて流体フローが生じる、流体密封された可撓、可動及び／又は可曲部分を含む。このため、高リスクの漏出を伴わず、フローのアクチュエータを汚染させることなく、流体フローを流体システムにおいて誘導することができる。より好ましい実施形態では、本発明の流体顕微鏡システムは、上記流体密封された可撓、可動及び／又は可曲部分を圧縮、引抜及び／又は押出することが可能な、上記流体システムに接続されたポンプシステムを備え、それにより該流体システムにおいて流体フローが誘導される。
【００８７】
更に別の態様では、本発明は流体システムを介して１つ又は複数のリザーバに接続された、本明細書に開示されるフローサイトメトリーシステムの集合体を提供する。このリザーバは液体中に懸濁する物体の試料を含むことができ、その物体を上記フローサイトメトリーシステムによって観察、測定、分析、分類及び／又は選別することができる。
【００８８】
本発明は、本発明を更に解説する以下の非限定的な実施例により更に説明され、これは本発明の範囲の限定を意図するものではなく、またそのように解釈されるべきでもない。
【実施例】
【００８９】
図１は本発明によるフローサイトメトリーシステムを示すフロー図である。液体試料、すなわち懸濁液中の物体の試料をリザーバ２０６から流体システムへと導入する。ポンプシステム２０１によって液体試料でストリームを誘導し、液体試料を流体システムのチューブ２０２を介して流体システムの流径制御デバイス２０３へと導く。液体試料のストリームはこのデバイス２０３によって狭められ（２０４）、フローサイトメトリーシステムのＤＨＭ２０５へと送られる。これは本明細書に記載されるような任意の技法：流体力学的集束、音響学的集束、毛細管現象等によって行うことができ、液体試料はＤＨＭの照明手段の照明ビームを通して単純に落下させても、又は透明な毛細管等の透明なチューブ内で照明ビームを通るように導いてもよい。挟流２０４の直径又は断面積を予め設定しても、又は分析される特定の液体試料若しくはフローサイトメトリーシステムのオペレータの仕様書（specifications）に従って調整してもよい。高押出には、一度に大量の物体が照明ビームに与えられ、ＤＨＭによって観察されるように、大きい直径を選ぶことができる。物体を測定される特性に従って選別する場合、物体が１つずつ並ぶ小さい直径が好まれ得る。液体試料ストリーム中の物体に関する情報はＤＨＭ２０５によって記録され、好ましくはリンク２０８を介してコンピュータ制御式データベースシステム２０７へと送られる。このシステム２０７はＤＨＭによって得られる情報を解釈することができ、例えば個々の物体上で拡大表示するために取得後フォーカシングを行い、画像化ソフトウェア又は画像解釈ソフトウェアを用いてこれらの物体に関する情報を取得することができる。制御システム２０７は更に、物体に関して得られた情報を記憶又は選択的に記憶することが可能であり、一連の既定基準に応じてストリーム中の物体を選別するようにリンク２１１を介して選別装置２１０を操作することができる。次いで選別された物体を１つ又は複数のリザーバ２０９へと導くことができる。
【００９０】
選別の場合、フローサイトメトリーシステムは、液体試料ストリームを個々の小滴に分割する振動機構も備え得る。次いでこのシステムは小滴１つ当たりの物体が２つ以上となる可能性が低くなるように調整することができる。帯電リングをちょうどストリームが小滴へと分割される場所に置く。ストリームが小滴に分割する直前に、フローをＤＨＭ２０５へと通し、そこで各物体の対象となる特性を測定する。帯電リングをちょうどストリームが小滴へと分割される場所に置く。直前の測定された特性に基づき電荷がリング上に置かれ、ストリームから小滴が分割されるときに、逆の電荷が小滴に捕獲される。次いで帯電した小滴がその電荷に応じて小滴の進路をコンテナへと変える静電偏向システムを通って落下する。システムによっては、電荷をストリームに直接印加して、小滴への分割によってストリームと同じ符号の電荷が保持される。次いでストリームは小滴への分割後に中性へと戻る。
【００９１】
図２〜図６に、従来のフローサイトメータをＤＨＭと組み合わせた、本発明によるフローサイトメトリーシステムの他の実施形態を示す。
【００９２】
図２では、リザーバ２０６から液体試料が従来技術において知られているフローサイトメータ２１２、例えば蛍光又は散乱レーザー光に基づいたフローサイトメータへと流れる（２０２）。図２の従来技術のフローサイトメータ２１２は、試料中の物体を１つずつ並べる流径制御デバイスを備え、従来技術のフローサイトメータ２１２から外に出る液体試料ストリームは物体が１つずつ並んでいる狭められた試料ストリーム２０４とすることができ、上記ストリームはＤＨＭ２０５の照明ビームを通るように導かれる又は落下する。代替的には、ストリームはＤＨＭ２０５の照明ビームに与えられる前に拡張されてもよい。ＤＨＭによって、例えば２Ｄ、３Ｄ又は４Ｄ画像を含む物体に関する更なる情報を得ることができる。その後、液体試料ストリームをリザーバに戻すことができる。
【００９３】
図３に、液体試料ストリームがＤＨＭへ、続いて従来技術のフローサイトメータへと至る、本発明によるフローサイトメトリーシステムの一実施形態を示す。液体試料をリザーバ２０６から取り、流体システム２０２を介してＤＨＭ２０５へと導き、そこでＤＨＭ２０５によって複数の物体を一度に観察する。次いで液体試料ストリームを流体システムによって従来技術のフローサイトメータ２１２へと導き、そこでストリーム中の物体が１つずつ並ぶように液体試料ストリームを狭める。挟流２０４を回収して、流体システムによってリザーバ２０９へと導く。例えばこのような構成では、例えば自動制御システム２１４を介して従来技術のフローサイトメータ２１２の設定をリアルタイムに適合させるのに、ＤＨＭ２０５によって取得された情報を使用することができる。
【００９４】
図４に、液体試料ストリーム中の物体がＤＨＭによって取得された情報に従って選別され、続いて物体の亜集団が更なる情報を得るために従来技術のフローサイトメータへと至る、本発明によるフローサイトメトリーシステムの一実施形態を示す。図４に示されるシステムは、液体試料ストリーム２１５の内の１つのフローに沿って従来技術のフローサイトメータ２１２が追加されていること以外は図１に示されるものと同様のものである。この構成では、従来技術のフローサイトメータ２１２は、選別された液体試料ストリーム２１５には既に対象となる物体しか含有されていないことから、制御システム２０７とは独立して機能することができる。代替的にはフローサイトメータ２１２は、集中制御、コンピュータ及び／又はデータシステムとしての機能を果たすことができるこの制御システム２０７に接続していてもよい。
【００９５】
図５に、液体試料ストリーム中の物体が、従来技術のフローサイトメータとＤＨＭとによって取得された複合情報に従って選別される、本発明によるフローサイトメトリーシステムの一実施形態を示す。図５に示されるシステムは、液体試料ストリーム２０２中の流径制御デバイスを備えた従来技術のフローサイトメータ２１２が追加されていること以外は図１に示されるものと同様のものである。従来技術のサイトメータ２１２は、レーザー光の散乱の観察によって得られた物体の情報、例えば蛍光強度又は寸法を、リンク２１３を介して制御システム２０７に供給する。従来技術のフローサイトメータ２１２から出るストリームは狭いままである（２０４）、すなわち物体は依然として１つずつ並び得る。次いで物体をＤＨＭの照明手段の照明ビームを通るように導き、物体に関する情報を得て、リンク２０８を介して制御システム２０７を通して送る。次いで制御システム２０７は選別装置２１０を操作するために、従来技術のフローサイトメータとＤＨＭとからの情報をリアルタイムに組み合わせて、選別装置２１０において物体をそれらの測定される特性に従って選別することができる。選別された液体試料ストリームを１つ又は複数のリザーバ２０９へと戻すことができる。
【００９６】
図６に、液体試料ストリーム中の物体が従来技術のフローサイトメータによって取得された情報に従って選別され、続いて物体の選別された亜集団が更なる情報を得るためにＤＨＭへと至る、本発明によるフローサイトメトリーシステムの一実施形態を示す。液体試料ストリーム中に懸濁する物体をリザーバ２０６から取り、物体を１つずつ並べる流体システム２０２を介して従来技術のフローサイトメータ２１２へと導く。従来技術のフローサイトメータ２１２によって得られた情報を用いて、例えば従来技術の制御システム２２０を介して物体を選別する（２１０）。依然として狭いままであり得る、すなわち物体が１つずつ並んだままであり得る選別された液体試料ストリーム２０４の１つを、ＤＨＭの照明ビームを通るように導き、ＤＨＭによって、選別された物体に関する更なる情報が得られる。その情報を分析し及び／又は制御システム２０７にリンク２０８を介して記憶することができる。選別された液体試料ストリームを１つ又は複数のリザーバ２０９へと導くことができる。
【００９７】
本発明は、上述のあらゆる具現化された形態に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲の再評価を要することなく提示された製作例に幾らかの変更を加えることができることが示唆される。
【符号の説明】
【００９８】
２０１：ポンプシステム
２０２：チューブ
２０３：流径制御デバイス
２０４：挟流
２０５：フローサイトメトリーシステムのＤＨＭ
２０６：リザーバ
２０８：リンク
２０９：リザーバ
２０７：コンピュータ制御式データベースシステム
２０８：リンク
２１０：選別装置
２１１：リンク
２１２：フローサイトメータ
２１３：リンク
２１５：液体試料ストリーム
２２０：従来技術の制御システム
【図１】
2015510592.tif 000003
【図２】
2015510592.tif 000004
【図３】
2015510592.tif 000005
【図４】
2015510592.tif 000006
【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年12月13日(2013.12.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デジタルホログラフィック顕微鏡（ＤＨＭ）と少なくとも１つの流体システムとを含む、液体試料中の物体を観察、分析及び／又は分離するフローサイトメトリーシステムであって、該ＤＨＭは照明手段と、干渉システムと、デジタル記録手段とを含み、該流体システムは前記物体を前記ＤＨＭの該照明手段の照明ビームを通るように導くことが可能であり、該流体システムは該流体システムを通して液体試料ストリームを誘導する機構を備え、該流体システムは、該流体システム内の液体試料ストリームの横断寸法を制御する流径制御デバイスを備え、該流径制御デバイスは、該液体試料ストリーム中に前記物体を１つずつ又は複数の物体を一度に並べることが可能である、フローサイトメトリーシステムであって、
前記ＤＨＭの照明手段が部分コヒーレント光源を含む、フローサイトメトリーシステム。
【請求項２】
前記物体が、生物有機体、細胞、細胞色素、ＤＮＡ鎖及びＲＮＡ鎖、染色体、タンパク質、微生物、細菌、ウイルス、酵母、線虫、酵素、細胞質、膜組織、原生生物等、並びに非生物体、不純物、汚染物質、又はそれらの任意の組合せの一覧のいずれかである、請求項１に記載のフローサイトメトリーシステム。
【請求項３】
前記液体試料ストリームを誘導する機構がポンプを含む、請求項１又は２に記載のフローサイトメトリーシステム。
【請求項４】
流径制御デバイスは、事前設定され又は可変式であり、液体試料ストリームの直径又は横断寸法を制御する、請求項１〜３のいずれか一に記載のフローサイトメトリーシステム。
【請求項５】
前記ＤＨＭが微分ＤＨＭ又はカラーＤＨＭである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のフローサイトメトリーシステム。
【請求項６】
前記流体システムがキャピラリー−フローサイトメトリー用の毛細管を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のフローサイトメトリーシステム。
【請求項７】
前記流体システムが、物体を含む前記液体試料を流すことができるシースフローによる狭いトンネルをもたらす流体力学的集束システムを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のフローサイトメトリーシステム。
【請求項８】
前記流体システムが、前記液体試料ストリーム中に流れる物体を音響学的に集結させる音響学的集束システムを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のフローサイトメトリーシステム。
【請求項９】
前記ＤＨＭの照明手段に対する前記物体の蛍光応答を測定する蛍光測定システムを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のフローサイトメトリーシステム。
【請求項１０】
前記物体の蛍光応答を誘導する蛍光照明手段を含む、請求項９に記載のフローサイトメトリーシステム。
【請求項１１】
前記フローサイトメトリーシステムにより測定可能な特性に従って物体を分離する物体選別システムを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のフローサイトメトリーシステム。
【請求項１２】
液体試料中の物体を観察、分析及び／又は分離するフローサイトメトリー方法であって、
照明手段と、干渉システムと、デジタル記録手段とを含むＤＨＭを準備する工程と、
流体システムを通して前記液体試料の液体試料ストリームを誘導する機構を備える流体システムを準備する工程であって、該流体システムは該流体システム内の液体試料ストリームの横断寸法を制御する流径制御デバイスを備え、
前記流体システムを通して液体試料ストリームを誘導する工程と、
該流体システム内の液体試料ストリームの横断寸法を制御することによって、前記物体を１つずつ又は複数の物体を一度に並べて、前記ＤＨＭの照明手段の照明ビームを通るように導く工程と、
前記ＤＨＭを用いて前記物体を観察及び／又は分析する工程と、
を含む、方法であって、
前記ＤＨＭの照明手段が部分コヒーレント光源を含む、方法。
【請求項１３】
前記物体の観察された特性に従って前記液体試料ストリームから該物体を分離する工程を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記物体が、生物有機体、細胞、細胞色素、ＤＮＡ鎖及びＲＮＡ鎖、染色体、タンパク質、微生物、細菌、ウイルス、酵母、線虫、酵素、細胞質、膜組織、原生生物、非生物体、不純物、汚染物質、又はそれらの任意の組合せである、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
物体が、毛細管現象、キャピラリーフロー、音響学的集束及び／又は流体力学的集束によって並べられる、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【国際調査報告】
2015510592.tif 000009
2015510592.tif 000010
2015510592.tif 000011
2015510592.tif 000012