(57)【要約】  本発明は、ガラクトースエピメラーゼ活性を欠如し、発現カセットを有する１コピー以上の組換えＤＮＡ分子を有するサルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）の弱毒変異株を増殖させる新規方法に関する。当該方法は、当該サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）株を、発酵の過程で培地中にグルコースが追加されず、開始時点でのグルコースの量が、定常期に達する前に枯渇する量である培地中で培養する工程を含む。更に、本発明は、上記方法により取得できるサルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）弱毒変異株、及びＶＥＧＦ受容体タンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子を保有する、ワクチンとして使用される、サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）弱毒変異株に関する。【選択図】図２
2015502162.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガラクトースエピメラーゼ活性を欠如し、発現カセットを有する１コピー以上の組換えＤＮＡ分子を有するサルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）の弱毒変異株を増殖させる方法であって、当該株を、発酵スケールで、ほぼ中性の当初ｐＨ値の、ペプトンを含有する緩衝培地中で培養する工程を含み、当該発酵の過程での培地中のグルコースの量が、定常期に達する前に当該グルコースの量が０にまで減少するように調整される、当該方法。
【請求項２】
発酵の過程で培地中にグルコースが追加されず、開始時点でのグルコースの量が、定常期に達する前に枯渇する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）の弱毒変異株が、サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａである、請求項１又は２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記発現カセットが、真核細胞発現カセットであり、好ましくはＶＥＧＦ受容体タンパク質をコードし、好ましくは、当該ＶＥＧＦ受容体タンパク質が、ヒトＶＥＧＦＲ−２及びそれと約８０％以上の同一性を有する類似体からなる群から選択され、特に当該ヒトＶＥＧＦＲ−２は、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記緩衝培地が、非動物起源のペプトンを含有し、好ましくは、非動物起源のＴｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ  （ＴＳＢ）である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記培地の体積が約１０ｌ、好ましくは約１０〜１０，０００ｌ、より好ましくは約３０〜１，０００ｌ、最も好ましくは約１００〜５００ｌである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記当初グルコース濃度が、細菌の最少培地のグルコース濃度以下であり、好ましくは前記当初グルコース濃度が、約０〜４ｇ／ｌである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記当初ｐＨ値が約５〜９、好ましくは約６〜８、より好ましくは約６．５〜７．５である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ｐＨ値が、前記培養の過程で、約約６〜８、好ましくは約６．５〜７．５に調整される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
増殖の進行が、（ｉ）光学密度（ＯＤ）の測定、好ましくは（ｉａ）培養物の光学密度のｉｎ−ｓｉｔｕでのモニタリングによる測定、又は（ｉｂ）試料の取得及び当該試料の光学密度の測定、又は（ｉｉ）細胞密度の測定、好ましくは（ｉｉａ）顕微鏡下での細胞密度測定、又は（ｉｉｂ）電気抵抗による細胞密度の測定、又は（ｉｉｃ）フローサイトメトリーによる細胞密度の測定、又は（ｉｉｉ）試料の取得及び寒天培地への播種による、コロニー形成単位（ＣＦＵ）の測定、により判定される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が、光学密度が約６、好ましくは光学密度が約５〜６に達する前に回収される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）の弱毒変異株が、サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａであり、前記組換えＤＮＡ分子が、カナマイシン耐性遺伝子、ｐＭＢ１ｏｒｉ、及びＣＭＶプロモーターの制御下にあるヒトＶＥＧＦＲ−２をコードする真核細胞発現カセットを有し、特に、ヒトＶＥＧＦＲ−２をコードする発現カセットの核酸配列が、配列番号２に記載されたものである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ガラクトースエピメラーゼ活性を欠如し、発現カセットを有する１コピー以上の組換えＤＮＡ分子を有するサルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）の弱毒変異株であって、当該株を、発酵スケールで、ほぼ中性の当初ｐＨ値の、ペプトンを含有する緩衝培地中で培養する工程を含む増殖方法であって、当該発酵の過程での培地中のグルコースの量が、定常期に達する前に当該グルコースの量が０にまで減少するように調整され、好ましくは発酵の過程で培地中にグルコースが追加されず、開始時点でのグルコースの量が、定常期に達する前に枯渇する、当該増殖方法により取得が可能な、当該弱毒変異株。
【請求項１４】
前記発現カセットが、真核細胞発現カセットであり、好ましくはＶＥＧＦ受容体タンパク質をコードし、好ましくは、当該ＶＥＧＦ受容体タンパク質が、ヒトＶＥＧＦＲ−２及びそれと約８０％以上の同一性を有する類似体からなる群から選択され、特に当該ヒトＶＥＧＦＲ−２は、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する、請求項１３に記載の弱毒変異株。
【請求項１５】
サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａであり、前記組換えＤＮＡ分子が、カナマイシン耐性遺伝子、ｐＭＢ１ｏｒｉ、及びＣＭＶプロモーターの制御下にあるヒトＶＥＧＦＲ−２をコードする真核細胞発現カセットを有し、特に、ヒトＶＥＧＦＲ−２をコードする発現カセットの核酸配列が、配列番号２に記載されたものである、請求項１４に記載の弱毒変異株。
【請求項１６】
サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａの弱毒変異株であって、ＶＥＧＦ受容体タンパク質をコードする真核細胞発現カセットを有する、１コピー以上の組換えＤＮＡ分子を有し、好ましくは、当該ＶＥＧＦ受容体タンパク質が、ヒトＶＥＧＦＲ−２及びそれと約８０％以上の同一性を有する類似体からなる群から選択され、特に当該ヒトＶＥＧＦＲ−２は、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する、ワクチンとして使用される、当該弱毒変異株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガラクトースエピメラーゼ活性を欠如し、発現カセットを有する１コピー以上の組換えＤＮＡ分子を有するサルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）の弱毒変異株を増殖させる新規方法に関する。当該方法は、当該サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）株を、発酵の過程で培地中にグルコースが追加されず、開始時点でのグルコースの量が、定常期に達する前に枯渇する量である培地中で培養する工程を含む。更に、本発明は、上記方法により取得できるサルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）弱毒変異株、及びＶＥＧＦ受容体タンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子を保有する、ワクチンとして使用される、サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）弱毒変異株に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチン開発の様々なアプローチの中でも、多くの病原体の導入経路を模倣し、全身的及び粘膜区画の両方のレベルで、体液性及び細胞性免疫応答を有効に誘導出来る生細菌ワクチンは、最も有望なものの一つである。生細菌ワクチンは、経口又は経鼻投与が可能であるため、非経口投与と比較して単純で安全に投与が可能である。バッチ調製のコストは相対的に低く、生細菌ワクチンの製剤は安定性が高い。弱毒化は、毒性遺伝子、制御遺伝子及び代謝遺伝子等の様々な遺伝子の消去により達成され得る。
【０００３】
弱毒細菌ワクチンは、対応する病原性株に対する免疫性を誘導するのに使用されるだけでなく、１つ以上の異種抗原を送達するように改変されることも出来る。
【０００４】
サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）の弱毒派生物は、潜在的に免疫化の粘膜経路を通じて送達され、宿主組織に侵入して定着しつつ、異種抗原を生産し続ける能力を有するため、哺乳類の免疫系に対して異種抗原を送達するためのビヒクルとして有用である。更に、サルモネラ株は、全身的及び粘膜区画の両方のレベルで、体液性及び細胞性免疫応答を強力に誘導する。
【０００５】
ａｒｏ突然変異により弱毒化された幾つかのサルモネラ・タイフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株は、動物モデルにおいて、異種抗原のための安全かつ効果的な送達ビヒクルとなることが示されている。
【０００６】
異種抗原、特に特定のＶＥＧＦ受容体タンパク質をコードするＤＮＡ構築物を、生きた弱毒化サルモネラ・タイフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株を介してマウス標的細胞に送達するアプローチは、ＷＯ  ０３／０７３９９５に記載されている。Ｎｉｅｔｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００２，  ８（１２），  １３６９）は、腫瘍の血管新生に必須のマウス血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ−２又はＦＬＫ−１）をコードする発現ベクターを保有する弱毒化Ｓ．  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ａｒｏＡ株ＳＬ７２０７が、癌ワクチンとして機能することを実証している。
【０００７】
しかしながら、弱毒化サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型株である、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型タイフィ（ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａ（Ｓ．  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａと略す）が、ヒトにおける使用が許容された唯一のものである。
【０００８】
この耐容性良好な生きた抗腸チフス経口ワクチンは、野生型毒性細菌単離物Ｓ．  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２の化学的突然変異に由来し、ｇａｌＥ遺伝子における機能欠失突然変異及び他の未同定の突然変異を保有するものである。それは、実地試験における有効性及び安全性が示された後、多くの国で腸チフスワクチンとして承認されている。
【０００９】
ヒトに安全に使用できる異種抗原、特に癌抗原の送達ビヒクルとしての生きた弱毒化細菌ベクターの根強い需要が存在する。ＤＮＡワクチンとしてのそのような弱毒ウイルスベクターの提供も、前記異種抗原ＤＮＡで形質転換された弱毒化細菌株の効果的かつ高収量な培養を要求している。組換えＤＮＡ構築物による細菌株の形質転換は、しばしば細胞増殖の減少をもたらす。従って、通常は、機能的に活性の生きた細胞を高収量で取得するためには、好ましくは大スケールの培養プロセスを改善する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）の弱毒突然変異株を増殖させるための従来の方法を改善することである。具体的には、本発明の目的は、異種抗原をコードする組換えＤＮＡ分子を保有する生きた細菌細胞を高収量で取得するための効率的な培養方法を開発することである。そのような方法、及びそのような方法により取得できるサルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）の弱毒突然変異株は、ヒトに使用されるＤＮＡワクチンとして安全な弱毒化サルモネラ株の多大な需要を満足させるものである。そのような方法は、弱毒化サルモネラ株を基礎としたＤＮＡワクチンの大スケールの商業生産に特に適したものであってもよい。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
驚くべきことに、ガラクトースエピメラーゼ活性を欠失したサルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）弱毒化株の細胞収量は、定常期に達する前に培地中のグルコース量がゼロにまで減少するとき、顕著に増大することが見出された。本発明者らは、発酵の過程での培地へのグルコースの追加が、より高い細胞密度／より高いＯＤ値をもたらさないことを示した。対照的に、弱毒化サルモネラ株の培養の過程でグルコースの追加を省略すると、収量が、光学密度で、定常期の開始時点で約６〜８になり、一方、同一の培養条件でグルコースレベルを約１〜４ｇ／ｌ、好ましくは約２〜３ｇ／ｌとした場合（例えば培地にグルコースを連続して追加することにより達成される）、光学密度は約３〜３．５に留まる。
【００１２】
本発明のサルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）弱毒突然変異株を増殖させる方法は、グルコースの存在下で培養した細胞と比較して形態の異なる細胞を生産する。グルコース非存在下で増殖させたサルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）細胞は、グルコース存在下で培養した細胞よりも小型で短い。しかしながら、これらの形態的に異なる細胞は、グルコース存在下で増殖させた細胞と同様に、生物的に完全に活性で、細胞溶解においてどのような傾向も示さない。
【００１３】
本発明の方法における培養の過程でグルコースの追加を省略することにより取得された細胞の収量の増大は、選択されたサルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）の弱毒変異株が、異種抗原をコードする組換えＤＮＡ分子（例えばｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＫ１、又はｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１等のそのプラスミド）を保有していてもいなくても（空の弱毒化株）観察される。
【００１４】
従って、一つの態様において、本発明は、ガラクトースエピメラーゼ活性を欠如し、発現カセットを有する１コピー以上の組換えＤＮＡ分子を有するサルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）の弱毒変異株を増殖させる方法であって、当該株を、発酵スケールで、ほぼ中性の当初ｐＨ値の、ペプトンを含有する緩衝培地中で培養する工程を含み、当該発酵の過程での培地中のグルコースの量が、定常期に達する前に当該グルコースの量が０にまで減少するように調整される、当該方法に関する。
【００１５】
特定の態様において、発酵の過程で培地中にグルコースが追加されず、開始時点でのグルコースの量が、定常期に達する前に枯渇する。
【００１６】
特定の態様において、前記サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）の弱毒変異株が、サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａである。
【００１７】
特定の態様において、前記発現カセットが、真核細胞発現カセットであり、好ましくはＶＥＧＦ受容体タンパク質をコードし、好ましくは、当該ＶＥＧＦ受容体タンパク質が、ヒトＶＥＧＦＲ−２及びそれと約８０％以上の同一性を有する類似体からなる群から選択され、特に当該ヒトＶＥＧＦＲ−２は、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する。
【００１８】
特定の態様において、前記緩衝培地が、非動物起源のペプトンを含有し、好ましくは、非動物起源のＴｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ  （ＴＳＢ）である。
【００１９】
特定の態様において、前記培地の体積が少なくとも約１０ｌ、より好ましくは約１０〜１０，０００ｌ、より具体的には約３０〜１，０００ｌ、最も具体的には約１００〜５００ｌである。
【００２０】
特定の態様において、前記当初グルコース濃度が、細菌の最少培地のグルコース濃度以下であり、特に前記当初グルコース濃度が、約０〜４ｇ／ｌである。
【００２１】
特定の態様において、前記当初ｐＨ値が約５〜９、具体的には約６〜８、より具体的には約６．５〜７．５である。
【００２２】
特定の態様において、前記ｐＨ値が、前記培養の過程で、約約６〜８、好ましくは約６．５〜７．５に調整される。
【００２３】
特定の態様において、増殖の進行が、光学密度（ＯＤ）の測定、好ましくは培養物の光学密度のｉｎ−ｓｉｔｕでのモニタリングによる測定、又は試料の取得及び当該試料の光学密度の測定により判定される。
【００２４】
他の態様において、増殖の進行が、細胞密度の測定、好ましくは顕微鏡下での細胞密度測定、又は電気抵抗による細胞密度の測定、又はフローサイトメトリーによる細胞密度の測定、により判定される。
【００２５】
他の態様において、増殖の進行が、試料の取得及び寒天培地への播種による、コロニー形成単位（ＣＦＵ）の測定により判定される。
【００２６】
特定の態様において、前記細胞が、光学密度が約６、好ましくは光学密度が約５〜６に達する前に回収される。
【００２７】
特定の態様において、前記サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）の弱毒変異株が、サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａであり、前記組換えＤＮＡ分子が、カナマイシン耐性遺伝子、ｐＭＢ１ｏｒｉ、及びＣＭＶプロモーターの制御下にあるヒトＶＥＧＦＲ−２をコードする真核細胞発現カセットを有し、特に、ヒトＶＥＧＦＲ−２をコードする発現カセットの核酸配列が、配列番号２に記載されたものである。
【００２８】
他の態様において、本発明は、ガラクトースエピメラーゼ活性を欠如し、発現カセットを有する１コピー以上の組換えＤＮＡ分子を有するサルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）の弱毒変異株であって、当該株を、発酵スケールで、ほぼ中性の当初ｐＨ値の、ペプトンを含有する緩衝培地中で培養する工程を含む増殖方法であって、当該発酵の過程での培地中のグルコースの量が、定常期に達する前に当該グルコースの量が０にまで減少するように調整される、当該増殖方法により取得が可能な、当該弱毒変異株に関する。
【００２９】
特定の態様において、発酵の過程で培地中にグルコースが追加されず、開始時点でのグルコースの量が、定常期に達する前に枯渇する。
【００３０】
特定の態様において、前記発現カセットが、真核細胞発現カセットであり、好ましくはＶＥＧＦ受容体タンパク質をコードする。特定の態様において、当該ＶＥＧＦ受容体タンパク質が、ヒトＶＥＧＦＲ−２及びそれと約８０％以上の同一性を有する類似体からなる群から選択される。特に当該ヒトＶＥＧＦＲ−２は、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する。
【００３１】
特定の態様において、前記弱毒変異株が、サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａであり、前記組換えＤＮＡ分子が、カナマイシン耐性遺伝子、ｐＭＢ１ｏｒｉ、及びＣＭＶプロモーターの制御下にあるヒトＶＥＧＦＲ−２をコードする真核細胞発現カセットを有する。特定の態様において、ヒトＶＥＧＦＲ−２をコードする発現カセットの核酸配列が、配列番号２に記載されたものである。
【００３２】
尚も他の側面において、本発明は、サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａの弱毒変異株であって、ＶＥＧＦ受容体タンパク質をコードする真核細胞発現カセットを有する、１コピー以上の組換えＤＮＡ分子を有する、ワクチンとして使用される、当該弱毒変異株に関する。
【００３３】
幾つかの態様において、当該ＶＥＧＦ受容体タンパク質が、ヒトＶＥＧＦＲ−２及びそれと約８０％以上の同一性を有する類似体からなる群から選択される。
【００３４】
好ましい態様において、当該ヒトＶＥＧＦＲ−２は、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する。
【００３５】
本発明の方法によりサルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）弱毒変異株を高収量で取得できるという事実は、認可されたサルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａ株等の弱毒化サルモネラ株を基礎とした商業用ＤＮＡワクチンを安全かつ経済的に製造するのに重要である。発現プラスミドｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１等の、異種抗原をコードする組換えＤＮＡ分子を担持するサルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａは、より高収量で培養できるため、ヒトに使用するＤＮＡワクチンをより高収量で取得できる。また、上記方法は、サルモネラを生産及び培養するとき、それが弱毒化株であっても適用される厳格な安全ルールに適合するものである。
【００３６】
本発明は、本明細書中に含まれる、下記詳細な説明及び実施例を参照することにより、より容易に理解され得る。
（１）野生型サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）及び弱毒化サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａを含むサルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）
【００３７】
本発明において、任意の弱毒化サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）が使用され得る。弱毒化サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａは、Ｔｙｐｈｏｒａｌ  Ｌ（登録商標）、又はＶｉｖｏｔｉｆ（登録商標）（Ｂｅｒｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｌｔｄ．，  ａ  Ｃｒｕｃｅｌｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の有効成分である。現在のところ、腸チフスに対する生きた経口ワクチンとして認可を受けた唯一のものである。当該ワクチンは、４０か国以上で承認されている。１９９６年１２月１６日付で、Ｔｙｐｈｏｒａｌ  Ｌ（登録商標）の販売承認番号は、ＰＬ  １５７４７／０００１である。ワクチンの用量あたり、２ｘ１０９個以上のＳ．  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａコロニー形成単位を含有し、そして５ｘ１０９以上の非生存Ｓ．  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ細胞を含有する。当該ワクチン株は、酵母抽出物の消化物、カゼインの酸消化物、グルコース及びがラクトースを含有する培地中、調整された条件下での発酵槽中で増殖する。
【００３８】
サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａ細菌株は、本発明において使用される場合、がラクトースを代謝することが出来ないという生化学的特徴を有する。当該組換え弱毒化細菌株は、硫酸塩をスルフィドに還元することが出来ない点でも、野生型サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２株と相違する。サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａ株の血清学的特徴に関しては、当該細菌の外側の膜の多糖類である０９−抗原を含み、サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２の特徴的な成分である０５−抗原を欠いている。斯かる血清学的特徴は、バッチ出荷のための一群の同定試験の好ましい試験を含む根拠を支持する。
【００３９】
特定の態様において、本発明の方法で増殖するサルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）の弱毒変異株は、ヒト血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ−２）の真核細胞発現カセットをコードする１コピー以上のプラスミドＤＮＡｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１を担持する、サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａである。斯かる弱毒化変異株はＶＸＭ０１と表記され、経口癌ワクチンとして使用出来る。
【００４０】
本発明において、サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａ株は、異種抗原血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ−２）をコードするプラスミドＤＮＡの細菌担体として機能し、ＤＮＡワクチンＶＸＭ０１を経口送達する。
【００４１】
プラスミドＤＮＡ技術を基礎とするワクチンの送達は、様々な粘膜及び全身免疫応答をもたらす。生きた複製ベクターは、リポ多糖類（ＬＰＳ）等のそれら自体の免疫調節因子を生産し、それらは、微小カプセル等の他の投与形態よりも有利となり得る。更に、天然の導入経路の使用は、サルモネラ等の多くの細菌が、腸管内腔から、ＰｅｙｅｒパッチのＭ細胞を通じて脱出し、やがてリンパ節や脾臓に移動することにより、免疫系の誘導部位にワクチンを標的化することを可能とするので、有益であることが示されている。ワクチン株サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａは、優秀な安全プロフィールを有することが実証されている。Ｍ細胞を通じて腸管内腔から脱出した後、当該細菌は、マクロファージや樹状細胞等の食細胞に取り込まれる。これらの細胞は病原体により活性化されて分化を開始し、そしてリンパ節や脾臓内に移動する。Ｓ．  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１株の細菌は弱毒変異なので、食細胞中で生存出来ず、その時点で死滅する。Ｓ．  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａが全身の血液中に侵入できることを示唆するデータは、現在のところ存在しない。斯かる生きた弱毒化サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａワクチン株は、優秀な安全プロフィールを呈しつつ、特異的な免疫系の標的化を可能とする。
【００４２】
標的抗原をコードするＤＮＡを担持する生きた弱毒化細菌担体は、これらの抗原を経口送達するためのビヒクルとして使用され得る。生きた複製ベクターは、リポ多糖類（ＬＰＳ）等のそれら自体の免疫調節因子を生産し、それらは、微小カプセル等の他の投与形態よりも有利となり得る。
【００４３】
遺伝的免疫化は、従来のワクチンより有利であり得る。標的ＤＮＡは、長期間に渡り検出され、抗原の補給所（ｄｅｐｏｔ）として振る舞う。ＧｐＣアイランド等の幾つかのプラスミド中の配列モチーフは免疫誘導性であり、それらは、ＬＰＳ及び他の細菌成分による免疫刺激と共に、アジュバントとして機能し得る。
【００４４】
上記のように、組換えサルモネラ細菌は、Ｍ細胞を通じて腸管内腔から脱出し、食細胞に取り込まれる。これらの食細胞は、病原体により活性化されて分化を開始し、そしてリンパ節や脾臓内に移動する。その過程で、当該細菌は弱毒変異体なので死滅し、プラスミドを基礎とする真核細胞発現ベクターが放出され、プラスミドが、特異的な輸送系を通じて、又はエンドソーム漏出（ｅｎｄｏｓｏｍａｌ  ｌｅａｋａｇｅ）により、細胞質内に移動する。最後に、当該ベクターは核内に移行し、転写され、宿主細胞の細胞質中に抗原を発現させる。前記異種抗原、好ましくはヒトＶＥＧＦＲ−２に対する特異的細胞傷害性Ｔ細胞は、活性化された抗原提示細胞（ＡＰＣ）により誘導される。
【００４５】
特定の態様において、サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａ株により担持される組換えＤＮＡ分子は、宿主細胞内でのＶＥＧＦＲ−２タンパク質の効率的な転写を確保する真核細胞ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、及び細菌宿主内での複製を確保する原核細胞複製起点（ｏｒｉ）を含有する、プラスミドＤＮＡｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１  （７．５８  ｋｂ）である。ベクターｐｃＤＮＡ３は市販されており（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｅ．ｃｏｌｉ中での複製に、又は哺乳類細胞中で組換えタンパク質を発現するのに必要でない配列を除去して、ＤＮＡ配列をヒトゲノムに対して可能な同一性を有するように限定し、染色体への組み込みの確率を最小にすることにより、規制上の要件を充足するように改変された。更に、カナマイシン耐性遺伝子をアンピシリン耐性遺伝子に置き換えた。本発明の方法に従い弱毒化変異サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）株ＶＸＭ０１を生産するために、ｐＶＡＸ１−Ｆｌｋ−１プラスミドの高コピーｐＵＣ起点を、ｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１ちゅうのｐＢＲ３２２の複製の低コピー起点で置き換えた。低コピー改変は、代謝負担を減少させ、構築物をより安定にするために行われた。プラスミドｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１構築の詳細を図２に示す。
【００４６】
（２）血管内皮増殖因子受容体：
血管内皮増殖因子ＶＥＧＦ（Ｋｄ７５−７６０ｐＭ）は、脈管系、特に血管及びリンパ管の様々な構成要素の増殖及び分化を制御する、６つの構造的に関連するタンパク質（ＶＥＧＦ−Ａ  ［ＶＥＧＦとしても知られる］、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅ及びＰＬＧＦ  ［胎盤増殖因子、ＰＧＦ又はＰＩＧＦ−２としても知られる］）のファミリーのメンバーである。血管新生におけるＶＥＧＦの役割は、ＶＥＧＦＲ−２とこのタンパク質との相互作用を通じて媒介される。キナーゼ挿入ドメイン含有受容体（ＫＤＲ）としても知られるＶＥＧＦＲ−２は、アミノ酸長１３５６、分子量２００〜２３０ｋＤａで、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｃ及びＶＥＧＦ−Ｄに対する高親和性の受容体である。内皮細胞のｃＤＮＡのスクリーニングを通じてヒトにおいて同定されたチロシンキナーゼ受容体の内、ＶＥＧＦ−Ｒ２は、既に発見されていた、胎児肝臓キナーゼ１（Ｆｌｋ−１）としても知られるマウスＶＥＧＦＲ−２と８５％の配列同一性を有する。ＶＥＧＦＲ−２は、内皮及び造血前駆体、そして内皮細胞、発生期の造血幹細胞、及び臍帯ストローマにおいて、通常発現している。しかしながら、休止期の成体の血管系において、ＶＥＧＦＲ−２ｍＲＮＡは下方制御されているように見える。
【００４７】
ＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインは、１８個の潜在的なＮ連結グリコシル化部位を有する。ＶＥＧＦＲ−２は、最初に１５０ｋＤａのタンパク質として合成され、直ちにグリコシル化されて２００ｋＤａの中間体になり、そして更に緩慢にグリコシル化されて成熟した２３０ｋＤａのタンパク質となって、これが細胞表面に提示される。
【００４８】
ｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１プラスミド内にクローニングされたｃＤＮＡの配列がコードするヒトＶＥＧＦＲ−２のアミノ酸配列を、図１に示す。
【００４９】
（３）空の及び操作されたサルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａの製造
本発明に従い実施されるサルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）の弱毒変異株の製造プロセスは、アミノ酸及びペプチドの供給源としてペプトンを含有する培地中でサルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）の弱毒変異株を培養することを含む。本発明の方法に適した培地は、限定されないが、標準的なＴＳＢ培地や非動物起源のＴＳＢ培地を含む。標準的なＴＳＢ培地及び非動物起源のＴＳＢ培地のいずれも、２．５ｇ／ｌのグルコースを含有する。通常、ＴＳＢ又はＴＳＢ様培地中の当初グルコース量は、弱毒化サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）株の培養の３〜５時間後に完全に消費され、培地中の一定のグルコースレベルを維持するために、３〜５時間ごとに新鮮なグルコースで置換されなければならない。異種抗原をコードする組換えＤＮＡ分子を任意で保有するサルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）の弱毒変異株の培養の過程でのグルコースの追加を省略することが、グルコースを追加する培養と比較して細胞増殖の増大をもたらすという知見は大変に驚異的なものであり、細菌細胞における特定の代謝経路がグルコースの非存在がきっかけとなることを示唆する。そのような効果は、ＴＳＢ又はＴＳＢ様培地が培養プロセスの開始時点でグルコースを全く含有しない場合にも観察される。従って、本発明の方法は、より高い細胞収量及び最終的なＤＮＡワクチンの収量と別に、発酵過程でのグルコース供給が不要となることにより、コストが安くなり、プロセスが単純になるという更なる利点が存在する。
【００５０】
本発明に従い実施されるサルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａの弱毒変異株の製造プロセスは、下記表１に例示的に記載される。
【表１】
2015502162.tif 000003
【００５１】
より詳細には：培養物（ＴＳＢ培地プラス２５ μｇ／ｍｌカナマイシン）は、それぞれ異なるサルモネラ株（空のＴｙ２１ａ及び組換えＴｙ２１ａ（ｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１））の試料が播種される。細胞試料の生産において、２．５〜３．０ｇ／ｌのグルコース、好ましくは２．５ｇ／ｌのグルコースを含有するＴＳＢ培地が使用される。更に、当該培地は、カナマイシンを、好ましくは２５μｇ／ｍｌ含有する。当該培養物は３０℃±２℃で撹拌しながら、光学密度がＯＤ６００ｎｍ＞０．１となるまで続行される。更なる詳細は、実施例の項に記載される。
【００５２】
培養時間の完遂時点で、第一及び第二のプレカルチャー工程における工程内管理は、ＯＤ６００ｎｍ、ｐＨ及びＣＦＵ／ｍｌを測定することにより、あるいは、プラスミド安定性（ＰＳＴ）及び細菌実験の判定による、細菌増殖の解析を含む。後者の解析は、気難しい病原性微生物の溶血反応を判定するための血液寒天アッセイに基づく。クロスフロー濾過（ＣＦＦ）の前後に、ＣＦＵ値が評価される。最終的な細菌濃縮物を製剤化した後、ＣＦＵ及び屈折率は、当該製剤上で、最低の細菌濃度を用いて測定される。
【００５３】
グルコース補給が省略される本発明の方法は、労働集約的でなく、より効率的で、高い細胞収率をもたらす。
【００５４】
（４）細胞培養中のグルコース補給の影響
空の、及び操作されたサルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａの細胞の増殖を、ＴＳＢ又はＴＳＢ様培地中、０〜３０時間、２５〜３５℃、好ましくは３０℃、ｐＨ６．５〜７．５、好ましくは７．０での培養により試験した。増殖は、ＯＤ又はＣＦＵ／ｍｌ（コロニー形成単位）で測定された。
【００５５】
これらの実験の結果は、グルコースの追加が、グルコースの消費にもかかわらず、野生型の株のＯＤ値／細胞量の増大をもたらさないことを示す。対照的に、グルコースの追加をしないフラスコは、より高いＯＤ値を達成した（プレカルチャー１で６、プレカルチャー２で８）。グルコース添加の約１時間後、ＯＤは定常化した（又は僅かに減少した）。グルコース添加を反復するごとにグルコース消費は低下してゆき、増殖に対する追加の効果は観察されなかった。発酵の過程でｐＨ値も測定され、幾つかの実験でｐＨのシフトが観察された場合、当初ｐＨ値に調整された。
【００５６】
グルコースの追加無しで、グルコースの枯渇後にｐＨのアルカリへのシフトが観察されたが、グルコースを補給している場合、ｐＨ値は低下した（図８のプレカルチャー１と図９のプレカルチャー２の比較）。そのような現象は全てのプレカルチャーで観察され、世代番号の影響は無いことが示唆された。グルコース補給は、最大３０時間の平均培養時間の間に、１〜５回（好ましくは１〜３回）行われた。通常、細胞培養の出発条件に依存して、約５〜１５時間後、細胞増殖が対数期から定常期に進行する。グルコースを補給して培養したプレカルチャーが新鮮な培地に播種された場合、同様の増殖特性（グルコース添加無しでより高いＯＤ値／ｐＨのアルカリへのシフト）が観察された。
【００５７】
増殖期又は当初培地中にグルコースを添加しないことにより、培地系が緩衝されていたにも関わらず、ｐＨ値のアルカリへのシフト（約７から約８）が観察された。細胞増殖の過程で、ｐＨ値を当初ｐＨである約７に調整するのが望ましいであろう。
【００５８】
それらの結果は、比較的低いレベルのグルコース濃度が、（グルコース）代謝の可逆的変化を引き起こすことを示唆する。何らかの理論に拘束されないが、グルコース減少が一定のレベルを再び下回ったとしても、培地中に分泌された何らかの物質が、更なる増殖を阻害すると予想される。新しい培地中に播種された後、その物質の濃度は希釈されて有効量を下回る。同様の結果は、当初培地がグルコースを含有しない場合にも得られる。
【００５９】
興味深いことに、同一の結果が、空のサルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａだけでなく、操作したサルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａ  −  ｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１  （ＶＸＭ０１）を用いた場合も観察され、これは、斯かる驚異的な効果が、人工的に操作された細菌構築物によって影響されないことを示唆する。しかしながら、図１２に見られるように、グルコース補給の無い操作された細菌の細胞増殖は、予想通り、野生型よりも遅いが、最終的には、野生型株と同等の高い光学密度（ＯＤ７〜８）を達成した。一方、グルコースを補給してグルコースの存在下で培養された操作されたサルモネラ株は、そのような高い光学密度を達成することは無く、ＯＤ３以下で増殖を停止した。
【００６０】
空の、及び操作されたＳ．ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ株のいずれも、グルコースを追加した、及び追加しない場合において、同等の増殖特性を示す。
【００６１】
要するに、上記及び下記の本発明の結果は、いずれの株においても、グルコースの追加が、より高いＯＤ値／細胞収量をもたらさないことを示す。対照的に、グルコース追加を行わないフラスコは、より高いＯＤ値に達する。グルコースを追加しない場合のｐＨのアルカリへのシフトはグルコースの枯渇後に観察されるが、グルコースを追加すると、ｐＨ値は低下する。サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａの培養過程でのグルコース濃度依存的代謝変化の効果の一つは、現在のところ未知の阻害物質が増殖培地中に放出されることにあると推定される。
【００６２】
一つの態様において、本発明は、ガラクトースエピメラーゼ活性を欠如し、発現カセットを有する１コピー以上の組換えＤＮＡ分子を有するサルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）の弱毒変異株を増殖させる方法であって、当該株を、発酵スケールで、ほぼ中性の当初ｐＨ値の、ペプトンを含有する緩衝培地中で培養する工程を含み、当該発酵の過程での培地中のグルコースの量が、定常期に達する前に当該グルコースの量が０にまで減少するように調整される。
【００６３】
本発明の文脈において、「含む」又は「含有する」は、「含むがそれに限定されない」を意味する。これらの用語は非限定的であることを意図し、言及される特徴、要素、数字、工程又は構成を特定するが、１つ以上の他の特徴、要素、数字、工程、構成又はそれらの群の存在、又は追加を排除しない。「含む」は、従って、より限定的な「からなる」及び「本質的に〜からなる」を包含する。
【００６４】
本発明の文脈において、「約」又は「およそ」は、所定の数値又は範囲の２０％以内、あるいは１０％以内、５％以内を含む。あるいは、特に生物学的系において、「約」は、Ｌｏｇ（即ち一桁）以内を含み、所定の数値の２倍以内を含む。
【００６５】
本発明の文脈において、「増殖」及び「培養」は同意語として用いられ、微生物の増殖をうながす培地中で微生物を増殖させることを意味する。
【００６６】
本発明の文脈において、「発酵」は、典型的には発酵槽、即ち微生物増殖に最適の条件を維持する装置中で、代謝産物や微生物自体を含む所望の微生物産物の高収量の生産のため、大スケールで微生物を培養することを意味する。
【００６７】
本発明の文脈において、「弱毒化」は、弱毒化突然変異を保有しない親細菌株と比較して病原性が減少している細菌株を意味する。弱毒細菌株は、好ましくは病原性を欠損しているが、免疫応答を誘導する能力を保持している。弱毒化細菌は、天然に見出されてもよく、又はそれらは、例えば新しい培地又は細胞培養に適応させることにより実験室中で生産されてもよく、又はそれらは組換えＤＮＡ技術により生産されてもよい。
【００６８】
本発明の文脈において、「変異株」は、ゲノム中に変異を有する細菌株を意味する。この文脈において、「変異」は、点突然変異、挿入、欠失、転位及び逆位を含む、核酸配列の変化を意味する。
【００６９】
本発明の文脈において、「組換えＤＮＡ分子」は、操作されたＤＮＡ構築物、好ましくは異なる起源のＤＮＡ断片を組み合わせたものを意味する。組換えＤＮＡ分子は直鎖核酸であってもよく、又は好ましくは、発現ベクタープラスミドに関心のあるオープンリーディングフレームを導入することにより生産される環状組換えＤＮＡプラスミドであってもよい。オープンリーディングフレームは、好ましくは、異種抗原である。異種抗原は、好ましくは癌抗原である。癌抗原は、好ましくはＶＥＧＦ受容体タンパク質である。本発明の文脈において、「異種抗原」は、サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）以外の種に由来する抗原を意味する。
【００７０】
本発明の文脈において、「発現カセット」は、発現をコントロールする制御配列のコントロール下にある１つ以上の遺伝子を有する核酸の単位を意味する。サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）の弱毒変異株に含まれる発現カセットは、好ましくは、標的細胞中のオープンリーディングフレームの転写を媒介する。発現カセットは、典型的には、プロモーター、１つ以上のオープンリーディングフレーム及び転写終結シグナルを有する。
【００７１】
本発明の文脈において、「ペプトン」は、例えば元のタンパク質混合物の部分的酸又は酵素加水分解等による、タンパク質を含有する材料の加水分解により生産されるアミノ酸及びペプチドを含有する、切断生産物の混合物を意味する。
【００７２】
本発明の文脈において、「ほぼ中性のｐＨ値」は、約５〜９、好ましくは約６〜８、より好ましくは約６．５〜７．５、最も好ましくは約７のｐＨ値を意味する。
【００７３】
本発明の方法に適した培地は、限定されないが、標準的なＴＳＢ培地、及び非動物起源のＴＳＢ培地を含む。当該技術分野で知られる標準的なＴＳＢ培地は、膵臓カゼインペプトン、大豆ミールペプトン、リン酸水素二カリウム（緩衝剤）、塩化ナトリウム、及びエネルギー源として当初濃度２．５ｇ／ｌのグルコース（＝デキストロース）を含有する。非動物起源の適切なＴＳＢ培地の例は、非動物由来ペプトン、リン酸水素二カリウム（緩衝剤）、塩化ナトリウム、及びエネルギー源として当初濃度２．５ｇ／ｌのグルコースを含有する、ＣＡＳＯ  Ｂｏｕｉｌｌｏｎである。
【００７４】
本発明の文脈において、「定常期」は、指数又は対数期の後の細菌の増殖段階を意味し、当該段階で、増殖培地中の細胞密度は概ね一定に維持される。従って、「定常期に達する前」とは、定常期の前の任意の時点を意味し、ラグ期（即ち細菌が増殖条件に適応する間の最初の細菌増殖の相）及び対数期を含む。驚くべきことに、本発明の方法に係るサルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）の弱毒変異株の培養は、対数増殖期を延長させることが見出された。発酵の過程でグルコースを追加しない場合に対数期の途中で枯渇する当初グルコース量でサルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａを培養した場合、定常期に達するまでに培養開始後９時間以上、好ましくは９〜２０時間、より好ましくは９〜１５時間、最も好ましくは９〜１２時間を要する。
【００７５】
特定の態様において、発酵の過程でグルコースが追加されず、当初グルコース量は、定常期に達する前に枯渇する。しかしながら、定常期に達する前にグルコースの量が０になる限り、グルコースが追加される場合も、サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）の弱毒化突然変異株の培養方法に包含される。
【００７６】
本発明の文脈において、「グルコースが枯渇する」とは、細菌により培地中の当初グルコース量が消費される（即ち取り込まれ代謝される）ことを意味する。
【００７７】
特定の態様において、サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）弱毒変異株は、サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａである。
【００７８】
特定の態様において、前記発現カセットは、真核細胞の発現カセットである。適切な免疫応答を誘導するのに必要な異種抗原の量は、細菌にとって有害であり、細胞死、過剰な弱毒化又は異種抗原の発現の喪失をもたらすものであってもよい。細菌ベクター中で発現しないが標的細胞中でのみ発現する真核細胞発現カセットの使用が、このような毒性の問題を克服する。
【００７９】
本発明の文脈において、「真核細胞発現カセット」は、真核細胞中でオープンリーディングフレームの発現を許容する発現カセットを意味する。真核細胞発現カセットは、真核細胞中でオープンリーディングフレームの発現をコントロールできる制御配列、好ましくはプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む。本発明のワクチンとして使用されるサルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）株が含有する組換えＤＮＡ分子中に含有されるプロモーター及びポリアデニル化シグナルは、好ましくは、免疫化される対象の細胞内で機能するものが選択される。本発明の方法における弱毒変異サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）株、特に特にヒトのＤＮＡワクチンの製造に有用プロモーターの例として、限定されないが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス胸部腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、例えばＨＩＶロングターミナルリピート（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、例えばＣＭＶ前初期プロモーター、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）、ラウスサルコーマウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター、あるいはヒト遺伝子由来のプロモーター、例えばヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、及びヒトメタロチオネインのプロモーター等が挙げられる。特定の態様において、真核細胞発現カセットは、ＣＭＶプロモーターを含有する。本発明の文脈において、「ＣＭＶプロモーター」は、前初期サイトメガロウイルスプロモーターを意味する。
【００８０】
適切な、特にヒトＤＮＡワクチンの生産に適したポリアデニル化シグナルは、限定されないが、ＢＧＨポリアデニル化部位、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、及びＬＴＲポリアデニル化シグナルを含む。特定の態様において、本発明の弱毒変異サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）株が含有する組換えＤＮＡ分子に含まれる真核細胞発現カセットは、ＢＧＨポリアデニル化シグナルを含有する。
【００８１】
異種遺伝子、例えば異種抗原の発現に必要な制御エレメント、例えばプロモーター及びポリアデニル化シグナルに加えて、組換えＤＮＡ分子中に、他のエレメントが組み込まれてもよい。そのような追加のエレメントとして、エンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、例えば、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチンのエンハンサー、及びＣＭＶ、ＲＳＶ及びＥＢＶ等のウイルスのエンハンサーが挙げられる。
【００８２】
制御配列及びコドンは一般に種に依存するものであるから、それらは好ましくは１、免疫化される種においてタンパク質の生産効率が最大になるように選択される。当業者は、対象の種の中で機能する組換えＤＮＡ分子を生産することが出来る。
【００８３】
特定の態様において、前記発現カセットは、ＶＥＧＦ受容体タンパク質をコードする。
【００８４】
ＶＥＧＦ受容体タンパク質は、リガンドである血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に結合する内皮細胞特異的受容体チロシンキナーゼであり、ＶＥＧＦの結合により二量体化され、リン酸転位により活性となる。ＶＥＧＦＲには、ＶＥＧＦＲ−１（ＦＬＴ１）、  ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ、ＦＬＫ１）及びＶＥＧＦＲ−３（ＦＬＴ４）の３つのサブタイプが存在する。ＶＥＧＦ−２は、公知の殆ど全てのＶＥＧＦに対する細胞応答を媒介する。膜結合ＶＥＧＦ受容体は、７つのイムノグロブリン様ドメイン、１つの膜貫通領域、及び分割されたチロシンキナーゼドメインを有する細胞内部分を有する。また、ＶＥＧＦＲ転写産物は、可溶性ＶＥＧＦ受容体タンパク質をコードするオルタナティブスプライスバリアントを生じる。ＶＥＧＦ増殖因子のファミリーは、ＶＥＧＦ−Ａから−Ｅ、及びＰＧＦの６つのメンバーを含む。好ましい態様において、真核細胞発現カセットは、ヒトＶＥＧＦＲ−２及びそれと８０％以上の同一性を有する類似体からなる群から選択される、ＶＥＧＦ受容体タンパク質をコードする。
【００８５】
本発明の文脈において、ヒトＶＥＧＦＲ−２の「類似体」は、ＶＥＧＦＲ−２のアミノ酸配列及び／又はアミノ酸配列をコードする核酸配列が相違するＶＥＧＦ受容体タンパク質を意味する。ヒトＶＥＧＦＲ−２のホモログは、例えば他の生物種のＶＥＧＦＲ−２の類似体等の天然に存在するものであっても、又は操作されたＶＥＧＦＲ−２類似体であってもよい。コドンの使用方法は、種の間で異なることが知られている。従って、標的細胞内で異種タンパク質を発現させる場合、標的細胞のコドンの使用方法に核酸配列を適応させることが必須、又は少なくとも有用である。ＶＥＧＦ受容体タンパク質の類似体を設計及び構築する方法は、当業者にとって周知である。
【００８６】
ＶＥＧＦＲ−２類似体は、１つ以上のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換を有する１つ以上の突然変異を含んでもよい。本発明の教示において、アミノ酸の付加、欠失及び／又は置換は、機能的ＶＥＧＦＲ−２類似体のアミノ酸配列中の、連続したアミノ酸であっても、又は散在するアミノ酸であってもよい。本発明の教示において、前記類似体及びヒトＶＥＧＦＲ−２が約８０％以上の同一性を有する限り、アミノ酸の付加、欠失及び／又は置換が幾つあってもよい。特定の態様において、ヒトＶＥＧＦＲ−２の類似体は、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、又は最も好ましくは約９５％以上の配列類似性、及び約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、又は最も好ましくは約７５％以上の配列同一性を有する。欠失、付加及び／又は置換を有する類似体と親配列との比較を含む同一性及び／又は類似性を判定する方法及びアルゴリズムは、当業者に周知である。ＤＮＡレベルでは、ヒトＶＥＧＦＲ−２の類似体をコードする核酸配列は、遺伝的コードの縮重により、様々なものがあってもよい。
【００８７】
尚も他の好ましい態様において、前記真核細胞発現カセットは、配列番号１に見られるアミノ酸配列を有するヒトＶＥＧＦＲ−２をコードする。
【００８８】
幾つかの態様において、前記緩衝培地は、非動物起源のペプトンを含有する。好ましい態様において、当該緩衝培地は、非動物起源のＴｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ  （ＴＳＢ）である。
【００８９】
本発明の文脈において、「非動物起源のペプトン」は、動物起源ではない天然のタンパク質を部分的酸又は酵素加水分解して生産した切断産物の混合物を意味する。好ましくは、当該天然のタンパク質は、植物起源である。非動物起源のペプトンは、真核動物に直接由来しない成分を含有する。
【００９０】
幾つかの態様において、培地の体積は１０Ｌ以上である。
【００９１】
幾つかの態様において、培地の体積は、最小で約１０Ｌ、又は３０Ｌ、又は５０Ｌ、又は１００Ｌ、最大で約１００００Ｌ、又は１０００Ｌ、又は８００Ｌ又は５００Ｌである。
【００９２】
特定の態様において、培地の体積は、約１００〜５００Ｌ、より好ましくは約１００Ｌ、約１５０Ｌ、約２００Ｌ、約２５０Ｌ、約３００Ｌ、約４００Ｌ、又は約５００Ｌである。
【００９３】
幾つかの態様において、当初グルコース濃度は、細菌最小培地のグルコース濃度又はそれ以下に相当する。
【００９４】
幾つかの態様において、当初グルコース濃度は、約０〜４ｇ／ｌである。
【００９５】
特定の態様において、当初グルコース濃度は約０ｇ／ｌ、約０．５ｇ／ｌ、約１ｇ／ｌ、約１．５ｇ／ｌ、約２ｇ／ｌ、約２．５ｇ／ｌ、約３ｇ／ｌ、約３．５ｇ／ｌ、又は約４ｇ／ｌである。
【００９６】
幾つかの態様において、当初ｐＨ値は、最小で約５、約６又は約６．５、最大で約９、約８又は約７．５である。
【００９７】
特定の態様において、当初ｐＨ値は、約６．５〜７．５、より好ましくは約７．０である。
【００９８】
特定の態様において、ｐＨ値は、培養の過程で、約６〜８、特に６．５〜７．５に調整される。
【００９９】
特定の態様において、ｐＨ値は、発酵の過程で、最小で約６又は６．５、最大で約８又は７．５に調整される。
【０１００】
特定の態様において、前記ｐＨ値は、発酵の過程で、約６．５〜７．５、より好ましくは約７．０に調整される。
【０１０１】
特定の態様において、前記増殖の進行は、光学密度（ＯＤ）を測定することにより判定される。
【０１０２】
本発明の文脈において、ある物体の「光学密度」又は「濁度」は、所定の波長の光における、当該物体に照射された光の量と、当該物体を透過した光の量との間の対数比を意味する。光学密度は、好ましくは、分光光度計を使用して測定される。好ましくは、光学密度は、懸濁物中の細胞、好ましくは細菌の濃度を測定するのに使用出来る。細胞懸濁物を可視光が透過するとき、当該光は散乱する。散乱が大きい程、懸濁物中に細胞が多く存在することが示唆される。典型的には、６００ｎｍの波長における光学密度（ＯＤ６００）が測定される。培養時間に対してプロットされた細菌培養物の特定の波長における光学密度は、細菌増殖の様々な相を描出し、細菌培養物のダブリングタイムを判定するのに使用出来る、増殖曲線を提供する。当該増殖曲線は、所定の培地中、所定の条件下で培養された細菌の種類において特徴的である。従って、細胞懸濁物の光学密度の測定は、細菌増殖の段階をモニタリングするのに使用出来る。光学密度の測定は、培養手順の終点、即ち細胞を回収すべき細菌増殖の段階、典型的には増殖の中対数（ｍｉｄ−ｌｏｇ）相を判定するのに使用出来る。
【０１０３】
好ましい態様において、増殖の進行は、培養物の光学密度をｉｎ−ｓｉｔｕでモニタリングすることにより、又は試料を取得して当該試料の光学密度を測定することにより決定される。ｏｎ−ｌｉｎｅ又はｉｎ−ｓｉｔｕデバイスを使用する細菌培養物の光学密度のｉｎ−ｓｉｔｕモニタリングは、定常的、持続的、非侵襲的な細胞増殖のモニタリングを可能とし、コンタミネーションのリスクを最小化し、そして、煩わしい労働集約的な試料の抽出を排除することを可能とする。
【０１０４】
驚くべきことに、本発明の方法によるサルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）の弱毒変異株の増殖は、定常期に達するまでに光学密度の値が約６．０〜８．０に及ぶことが見出された。これに対し、同様の発酵プロセスであるがグルコースレベルが約１〜４ｇ／Ｌで概ね一定になるように発酵の過程でグルコースが追加された培養条件では、光学密度の値は約３〜５．５に留まった。従って、驚くべきことに、サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）弱毒変異株を、発酵の過程で培地中にグルコースが追加されず、開始時点でのグルコースの量が、定常期に達する前に枯渇する量である培地中で増殖させることにより、グルコースが追加される発酵プロセスと比較して、定常期に達するまでの光学密度が増大することが見出された。
【０１０５】
他の態様において、増殖の進行は、細胞密度を測定することにより判定される。
【０１０６】
好ましい態様において、細胞密度は顕微鏡下での細胞密度測定、又は電気抵抗による細胞密度の測定、又はフローサイトメトリーによる細胞密度の測定により判定される、細胞密度は、顕微鏡下で、計数チャンバーや血球計算板等を使用して細胞数を手作業で計数することにより判定できる。電気抵抗に基づく細胞密度の測定は、好ましくは、Ｃｏｕｌｔｅｒカウンターを使用して実施される。フローサイトメトリーによる細胞密度の測定は、細流中を通る細胞に一つずつレーザーを当てることにより達成される。光検出器が、細胞が反射した光を検出する。
【０１０７】
驚くべきことに、本発明の方法によるサルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）の弱毒変異株の増殖は、定常期に達するまでに細胞密度が約５ｘ１０１４〜８ｘ１０１４に及ぶことが見出された。これに対し、同様の発酵プロセスであるがグルコースレベルが約１〜４ｇ／Ｌで概ね一定になるように発酵の過程でグルコースが追加された培養条件では、細胞密度は約５ｘ１０１３〜１ｘ１０１４に留まった。従って、驚くべきことに、サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）弱毒変異株を、発酵の過程で培地中にグルコースが追加されず、開始時点でのグルコースの量が、定常期に達する前に枯渇する量である培地中で増殖させることにより、グルコースが追加される発酵プロセスと比較して、定常期に達するまでの細胞密度が増大することが見出された。
【０１０８】
光学密度が約０．４を下回る場合、光学密度の値は細胞密度に比例する。従って、校正曲線は、細胞密度に対する光学密度をプロッティングすることにより作成できる。そのような校正曲線は、光学密度を測定することにより懸濁物中の細胞密度を推定するのに使用出来る。
【０１０９】
他の態様において、増殖の進行は、試料を採取して寒天プレートに播種することによりコロニー形成単位（ＣＦＵ）を測定することにより測定される。この方法により、寒天プレート上にコロニーを形成出来る生存細胞のみがカウントされる。
【０１１０】
驚くべきことに、本発明の方法によるサルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）の弱毒変異株の増殖は、定常期に達するまでにＣＦＵ値が約６ｘ１０９〜約８ｘ１０９に及ぶことが見出された。これに対し、同様の発酵プロセスであるがグルコースレベルが約１〜４ｇ／Ｌで概ね一定になるように発酵の過程でグルコースが追加された培養条件では、ＣＦＵ値は約２ｘ１０９〜５ｘ１０９に留まった。従って、驚くべきことに、サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）弱毒変異株を、発酵の過程で培地中にグルコースが追加されず、開始時点でのグルコースの量が、定常期に達する前に枯渇する量である培地中で増殖させることにより、グルコースが追加される発酵プロセスと比較して、定常期に達するまでの細胞密度が増大するだけでなく、生存細胞の数も増大することが見出された。
【０１１１】
特定の態様において、前記細胞は、光学密度が約６に達する前に回収される。
【０１１２】
好ましい態様において、前記細胞は、光学密度が約５〜６となったときに回収される。
【０１１３】
好ましい態様において、サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）の弱毒変異株はサルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａであり、組換えＤＮＡ分子は、カナマイシン耐性遺伝子、ｐＭＢ１ｏｒｉ、及びＣＭＶプロモーターの制御下にあるヒトＶＥＧＦＲ−２をコードする真核細胞発現カセットを有する。
【０１１４】
好ましい態様において、ヒトＶＥＧＦＲ−２の核酸配列は、配列番号２に示すものである。
【０１１５】
尚も他の側面において、本発明は、ガラクトースエピメラーゼ活性を欠如し、発現カセットを有する１コピー以上の組換えＤＮＡ分子を有するサルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）の弱毒変異株であって、当該株を、発酵スケールで、ほぼ中性の当初ｐＨ値の、ペプトンを含有する緩衝培地中で培養する工程を含む増殖方法であって、当該発酵の過程での培地中のグルコースの量が、定常期に達する前に当該グルコースの量が０にまで減少するように調整され、好ましくは発酵の過程で培地中にグルコースが追加されず、開始時点でのグルコースの量が、定常期に達する前に枯渇する、当該増殖方法により取得が可能な、当該弱毒変異株に関する。
【０１１６】
特定の態様において、発酵の過程で培地中にグルコースが追加されず、開始時点でのグルコースの量が、定常期に達する前に枯渇する。
【０１１７】
特定の態様において、前記発現カセットが、真核細胞発現カセットである。
【０１１８】
特定の態様において、前記発現カセットが、ＶＥＧＦ受容体タンパク質をコードする。
【０１１９】
好ましい態様において、前記真核細胞発現カセットが、ヒトＶＥＧＦＲ−２及びそれと約８０％以上の同一性を有する類似体からなる群から選択される、ＶＥＧＦ受容体タンパク質をコードする。
【０１２０】
尚も他の態様において、前記真核細胞発現カセットが、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するヒトＶＥＧＦＲ−２をコードする。
【０１２１】
特定の態様において、前記サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）の弱毒変異株が、サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａであり、前記組換えＤＮＡ分子が、カナマイシン耐性遺伝子、ｐＭＢ１ｏｒｉ、及びＣＭＶプロモーターの制御下にあるヒトＶＥＧＦＲ−２をコードする真核細胞発現カセットを有する。
【０１２２】
好ましい態様において、ヒトＶＥＧＦＲ−２の核酸配列は、配列番号２に示すものである。
【０１２３】
他の側面において、本発明は、サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａの弱毒変異株であって、ＶＥＧＦ受容体タンパク質をコードする真核生物の発現カセットを有する、１コピー以上の組換えＤＮＡ分子を有する、ワクチンとして使用される当該弱毒変異株に関する。
【０１２４】
本発明の文脈において、「ワクチン」は、投与後に対象中に免疫応答を誘導できる薬剤を意味する。ワクチンは、好ましくは、疾患を予防し、緩和し、又は治療する。好ましくは、そのようなワクチンは、サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）の弱毒変異株、好ましくはＳ．ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａを含有する。好ましくは、前記ワクチンは、更に、好ましくは異種抗原をコードする発現カセットを有する１コピー以上の組換えＤＮＡ分子を有する。そのような、異種抗原をコードするＤＮＡの送達ビヒクルとなる、ベクターを有する、例えば弱毒化細菌株等のワクチンは、ＤＮＡワクチンと呼ばれる。
【０１２５】
特定の態様において、真核細胞発現カセットは、ヒトＶＥＧＦＲ−２及びこれと約８０％以上の同一性を有する類似体からなる群から選択されるＶＥＧＦ受容体タンパク質をコードする。
【０１２６】
好ましい態様において、前記真核細胞発現カセットは、配列番号１に示すヒトＶＥＧＦＲ−２をコードする。
【０１２７】
他の態様において、本発明は、ガラクトースエピメラーゼ活性を欠如したサルモネラの弱毒変異株の細胞増殖を増大させる方法であって、当該株を、カゼイン及び大豆ミールの酵素消化物を本質的に含有し、当初グルコース量が２．５〜３．０ｇ／Ｌ以下、当初ｐＨが６．５〜７．５である緩衝培地中で培養することによる当該方法であって、当該培養は、細胞増殖の定常期まで発酵部ロス中に追加のグルコースを補給しないで実施することにより、当該ブロス中の当初のグルコースレベルが維持されず、発酵の過程でのグルコースの完全な枯渇によってのみ達成される細胞増殖の増大が、最終的に取得出来る定常期（好ましくは１８＝２０時間後に取得される）の光学密度が、発酵の過程でグルコースが追加されて発酵ブロス中のグルコースレベルが２．０〜３．０ｇ／ｌに維持される以外は同一の発酵プロセスで培養した場合に５．０〜５．５であるのに対し、７．５〜８．０に達する、当該方法。
【０１２８】
特定の態様において、最大の細胞増殖は、培養開始から２０時間で得られる。
【０１２９】
好ましい態様において、培養過程でグルコースを追加した場合に細胞密度は５ｘ１０１３〜１ｘ１０１４であるのに対し、発酵過程でグルコース補給を行わない場合、細胞密度は５ｘ１０１４〜８ｘ１０１４に達する。
【０１３０】
特定の態様において、培養過程でグルコースを追加した場合にコロニー形成単位（ＣＦＵ）は２ｘ１０９〜５ｘ１０９であるのに対し、発酵過程でグルコース補給を行わない場合、コロニー形成単位（ＣＦＵ）は、６ｘ１０９〜８ｘ１０９／ｍｌに達する。
【０１３１】
特定の態様において、発酵の過程でｐＨ値が７．０に調整される。増殖相において、又は出発時の培地に最初から、グルコースを添加しないことにより、当該培地系が緩衝されているにもかかわらず、ｐＨ値のアルカリへのシフト（約７から約８）が観察される。細胞の増殖の過程で、ｐＨ値を出発時の約７．０に調整するのが好ましいであろう。
【０１３２】
本発明の特定の態様において、前記培地は、Ｔｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ  （ＴＳＢ）又はこれと同一又は類似の栄養分を提供する培地である。
【０１３３】
本発明の更に好ましい態様において、サルモネラの弱毒変異ワクチン株は、サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａである。
【０１３４】
他の側面において、本発明は、サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａの弱毒変異癌ワクチン株を生産する方法に関し、当該株は、ヒト血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ−２又はＦＬＫ−１）の真核細胞発現カセットをコードする複数のコピーのプラスミドＤＮＡを担持し、当該方法は、本発明のサルモネラ弱毒変異ワクチン株の細胞増殖を増大させる方法を含む。
【０１３５】
特定の態様において、前記プラスミドＤＮＡは、ＣＭＶプロモーターの制御下にあるＶＥＧＦＲ−２のｃＤＮＡ、カナマイシン耐性遺伝子、及びｐＭＢ１ｏｒｉを含み、ｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１と表記される、７５８０ｂｐのプラスミドＤＮＡである。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】図１は、ｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１プラスミド中にクローニングされたｃＤＮＡがコードするＶＥＧＦＲ−２のアミノ酸配列を示す。
【図２】図２は、ｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１のプラスミドマップを示す。
【図３】図３は、サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２ａ（ｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１）の製造プロセスを示す。
【図４】図４は、Ｓ．ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａの単離のフローチャートを示す。
【図５】図５は、カナマイシン存在下／非存在下のサルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａのプレカルチャー１及び２の増殖を示す。
【図６】図６は、サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａ（空）の、グルコースを追加した場合（最終グルコース濃度２．５ｇ／ｌ）としない場合の培養（プレカルチャー１）の増殖を示す。細胞増殖は、６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６００）により判定された。矢印はグルコースの追加（パルシング）を示す。Ｘ軸は、培養時間（ｈ）を表し；ｙ軸は、ＯＤで測定された細胞密度及びグルコース（ｇｌｃ）濃度ｇ／ｌを表す。
【図７】図７は、サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａ（空）の、グルコースを追加した場合（最終グルコース濃度２．５ｇ／ｌ）としない場合の培養（プレカルチャー１）の増殖を示す。細胞増殖は、６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６００）により判定された。矢印はグルコースの追加（パルシング）を示す。Ｘ軸は、培養時間（ｈ）を表し；ｙ軸は、ＯＤで測定された細胞密度及びｐＨ値のシフトを表す。
【図８】図８は、サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａ（空）の、グルコースを追加した場合（最終グルコース濃度２．５ｇ／ｌ）としない場合の培養（プレカルチャー２）の増殖を示す。細胞増殖は、６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６００）により判定された。矢印はグルコースの追加（パルシング）を示す。Ｘ軸は、培養時間（ｈ）を表し；ｙ軸は、ＯＤで測定された細胞密度及びグルコース（ｇｌｃ）濃度ｇ／ｌを表す。
【図９】図９は、サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａ（空）の、グルコースを追加した場合（最終グルコース濃度２．５ｇ／ｌ）としない場合の培養（プレカルチャー２）の増殖を示す。細胞増殖は、６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６００）により判定された。矢印はグルコースの追加（パルシング）を示す。Ｘ軸は、培養時間（ｈ）を表し；ｙ軸は、ＯＤで測定された細胞密度及びｐＨ値のシフトを表す。
【図１０】図１０は、サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａ（空）の、グルコースを追加した場合（最終グルコース濃度２．５ｇ／ｌ）としない場合の培養（プレカルチャー３、プレカルチャー１のグルコースプライム接種（ｐｒｉｍｅｄ  ｉｎｏｃｕｌｕｍ））の増殖を示す。細胞増殖は、６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６００）により判定された。矢印はグルコースの追加（パルシング）を示す。Ｘ軸は、培養時間（ｈ）を表し；ｙ軸は、ＯＤで測定された細胞密度及びグルコース（ｇｌｃ）濃度ｇ／ｌを表す。
【図１１】図１１は、サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａ（空）の、グルコースを追加した場合（最終グルコース濃度２．５ｇ／ｌ）としない場合の培養（プレカルチャー３、プレカルチャー１のグルコースプライム接種（ｐｒｉｍｅｄ  ｉｎｏｃｕｌｕｍ））の増殖を示す。細胞増殖は、６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６００）により判定された。矢印はグルコースの追加（パルシング）を示す。Ｘ軸は、培養時間（ｈ）を表し；ｙ軸は、ＯＤで測定された細胞密度及びｐＨ値のシフトを表す。
【図１２】図１２は、サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａと、操作された癌ワクチン生産株（サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａ：ｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１，  ＶＸＭ０１）の、グルコースを追加した場合（最終グルコース濃度２．５ｇ／ｌ）としない場合の培養（プレカルチャー１）の増殖を示す。細胞増殖は、６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６００）により判定された。矢印はグルコースの追加（パルシング）を示す。Ｘ軸は、培養時間（ｈ）を表し；ｙ軸は、ＯＤで測定された細胞密度を表す。
【図１３】図１３は、サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａと、操作された癌ワクチン生産株（サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａ：ｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１，  ＶＸＭ０１）の、グルコースを追加した場合（最終グルコース濃度２．５ｇ／ｌ）としない場合の培養（プレカルチャー１）の増殖を示す。細胞増殖は、６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６００）により判定された。矢印はグルコースの追加（パルシング）を示す。Ｘ軸は、培養時間（ｈ）を表し；ｙ軸は、ＯＤで測定された細胞密度を表す。
【実施例】
【０１３７】
実施例１：Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｅｄ  Ｌｏｔ  （ＲＳＬ）を調製するためのサルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａ株の単離
ＲＳＬの調製の第一の段階は、Ｔｙｐｈｏｒａｌ  Ｌ（登録商標）カプセルから弱毒化サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａ株を単離し、続いて当該弱毒化細菌を、プラスミドＤＮＡ  （ｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１）で形質転換することである。弱毒化サルモネラ・エンテリカ・セロヴァー・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａ株を含有する市販のＴｙｐｈｏｒａｌ  Ｌ（登録商標）カプセルを、下記の組換え実験に使用されるＳ．ｔｙｐｈｉのストックの調製に使用した。当該プロセスは、前記カプセルの内容物を液体培養培地に播種し、更に当該液体培地を寒天培地にプレーティングして、単一の細菌コロニーを単離することからなる。単一のコロニーは単離され、液体培養培地中で増殖させられる。ＶＡＸ．Ｔｙ２１−１及びＶＡＸ．Ｔｙ２１−２の２つの培養物がグリセロールで製剤化され、分注され（１ｍＬ）、そして−７５±５℃で保存された。２つの培養物のそれぞれの同一性が、更に確認された。
【０１３８】
実施例２：プラスミド構築
プラスミド構築の原則は、以下の工程を有する二重鎖インビトロ遺伝子合成に基づく。
−７．５８ｋＢの全長ｐＶＡＸ１０−ＶＲ２．１プラスミドを、最大１・５ｋＢの５つの断片に分割した（ソフトウエア解析による）。各断片を、それぞれが両鎖のオリゴヌクレオチドの間で重複する領域を有する４０〜５０ｂｐのオリゴヌクレオチドに分割した。
−インビトロ合成されたオリゴヌクレオチドは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼとインキュベーションしてリン酸化された。
−適切な条件下で重複したオリゴヌクレオチドをアニールさせた後、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ酵素が、並列したオリゴヌクレオチドを接続した。
−ライゲーション工程の終了後、ライゲーションしたプラスミド断片（〜１．５ｋＢ）の収量が増大するように、外側の位置にアニールするプライマーを使用して、ＰＣＲを実施した。
−アガロースゲル電気泳動を実施して、ＰＣＲ産物を単離した。
−単離したＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｋ＃４５７５−４０）にクローニングし、育種用のＴＯＰ１０  Ｅ．  ｃｏｌｉに形質転換した。
−ＴＯＰＯプラスミドの単離後、制限及び配列の評価を実施した。
−単離された並列した断片を、オーバーラップＰＣＲを通じて組立てた。当該プロセスの後、ｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１プラスミドを線形的に組立てた。
−ＸｈｏＩ制限消化（ｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１プラスミド中に制限酵素部位が１つ存在する。図２．１．Ｓ．１．２．２−１）し、Ｔ４リガーゼを通じて共有結合させ、当該環状プラスミドを、育種用のＥ．ｃｏｌｉに形質転換した。
−最終的なプラスミド配列の評価の後、ｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１プラスミドを、Ｓ．  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ細菌株に形質転換した。
【０１３９】
当該プラスミドｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１の合成は成功であった（参照配列通りのものであった）。当該プラスミドを、更に、Ｓ．  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ細菌株単離物（Ｖａｘ．Ｔｙ２１−１及びＶａｘ．Ｔｙ２１−２）を形質転換するのに使用した。
【０１４０】
実施例３：製造プロセス
下記表２は、発酵の過程でグルコースを供給する／しない製造プロセスをまとめたものである。
【表２】
2015502162.tif 000004
【０１４１】
細菌増殖プロセスは、２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する２ｘ３５０ｍｌのＴＳＢ培地中で実施された。バッフルを有する２本の２−Ｌ−Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコに、サルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａ及びＴｙ２１ａ  （ｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１）のアリコート（１ｍｌ）をそれぞれ播種した。当該培養物を、光学密度がＯＤ６００ｎｍ＞０．１となるまで、撹拌（１４０ｒｐｍ）しながら３０℃±２℃でインキュベーションした。当該第一の細菌培養物（５０ｍｌ）を、カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を含有する６ｘ５５０ｍｌのＴＳＢ培地を充填したバッフルを有する３−ｌ−Ｆｅｒｎｂａｃｈフラスコに播種し、第二の培養（プレカルチャー２）を行った。当該培養物を、光学密度がＯＤ６００ｎｍ≧０．３となるまで、撹拌（１８０ｒｐｍ）しながら３０℃±２℃でインキュベーションした。当該インキュベーションの終了後、動作体積２７ｌの制御されたステンレス鋼発酵槽中に調製されたメインカルチャー（０．００１％ガラクトースを含有するＴＳＢ培地）に前記プレカルチャー２（プールされた細菌培養物の５本のフラスコ）を播種し、以下の設定の下、３０℃でインキュベーションした。通気２ｌ／ｍｉｎ、圧力１ｂａｒ、ｐＨ７．０、ｐＯ２≧４０％。
【０１４２】
培養試料中の半分には、当初培養培地中に最終濃度２．０〜３．０ｇ／ｌとなる量のグルコースを補給した。グルコース補給は、発酵開始の３〜５時間後に実施され、３〜５時間ごとに複数回反復された。
【０１４３】
もう半分の培養試料は、サルモネラ細胞の培養の過程でグルコースを全く補給しない点以外は、上記と同一である。対照として、培養当初からグルコースを添加していない培養培地（グルコース不含ＴＳＢ培地）についても試験した。
【０１４４】
前記細菌培養物は、１５％スクロース溶液に対するクロスフロー濾過（ＣＦＦ）／透析濾過により濃縮された。当該最終的な細菌濃縮物の５種類の希釈物が調製された。最終的な細菌製品は、２Ｒバイアルに分注され（１ｍｌ）、当該バイアルは閉口され、ラベルが付され、キャップが付され、−７５℃±５℃で保存された。
【０１４５】
第一及び第二のプレカルチャー工程における、インキュベーション時間の終了時点での工程内管理は、ＯＤ６００ｎｍ、ｐＨ及びＣＦＵ／ｍＬの測定、及びプラスミド安定性（ＰＳＴ）の判定、及び細菌試験による、細菌増殖の解析を含む。後者の解析は、病原性微生物の溶血反応を判定するための血液寒天アッセイに基づく。ＣＦＵ値は、ＣＦＦの前及び後に評価された。最終的な細菌濃縮物の製剤化後、ＣＦＵ及び屈折率を、細菌濃度が最低の製剤に対して測定された。
【０１４６】
実施例４：カナマイシン存在下及び非存在下でのサルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａ（ｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１）の増殖
生細菌癌ワクチンの生産は、弱毒化サルモネラ・エンテリカ・セロヴァー・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａ株（ｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１プラスミド含有）の発酵を基礎とする。増殖後、細胞懸濁物は、クロスフロー濾過で濃縮され、透析濾過により洗浄された。洗浄された細胞懸濁物の５種類の希釈物を、２Ｒガラスバイアルに充填した。
【０１４７】
これらのフラスコ増殖試験は、以下を目的とする。
−生産プロセスのタイムテーブルを計画するためのプレカルチャー１及び２の増殖速度の評価
−高い細胞密度（ＯＤ６００値）を達成するためのグルコース補給の影響の調査
【０１４８】
実験の実施は、サルモネラ・エンテリカ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｔｙｐｈｉ）ＴＹ２１ａ及びサルモネラ・エンテリカ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｔｙｐｈｉ）ＴＹ２１ａ（ｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１）（＝ＶＭＸ０１株）のマスター細胞バンクから出発した。発酵の元種は、２段階のプレカルチャー（ＶＫ）により調製された。プレカルチャー１は、ＭＣＢから直接播種された。プレカルチャー２は、プレカルチャー１からより大きい体積で播種された。２ｌ    Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ（プレカルチャー１）及び３ｌ  Ｆｅｒｎｂａｃｈ  Ｃｏｒｎｉｎｇフラスコ（プレカルチャー２）増殖試験におけるプレカルチャーのタイムコースを評価するために、増殖試験が実施された。プレカルチャーは、カナマイシン存在下／非存在下の両方の条件において、増殖／対数増殖相についての情報を得るために、両条件について実施された。
【０１４９】
これらの５つのフラスコの増殖は図５に示すように比較される。
−ＶＫ１ａ：５００ｍｌ  ＴＳＢ培地、３ｌ  Ｃｏｒｎｉｎｇフラスコ＋０．５ｍｌ  ＭＣＢ，３０℃、１２０ｒｐｍ
−ＶＫ１ｂ：５００ｍｌ  ＴＳＢ培地、３ｌ  Ｃｏｒｎｉｎｇフラスコ＋０．５ｍｌ  ＭＣＢ，３０℃、１２０ｒｐｍ
−ＶＫ２：１０００ｍｌ  ＴＳＢ培地、３ｌ  Ｃｏｒｎｉｎｇフラスコ＋７５ｍｌ  ＶＫ１ｂ（ＯＤ１．６），３０℃、１２０ｒｐｍ
−ＶＫ１ａｋ：５００ｍｌ  ＴＳＢ培地＋２５ｍｇ／ｌ硫酸カナマイシン、２ｌ  Ｃｏｒｎｉｎｇフラスコ＋０．５ｍｌ  ＭＣＢ，３０℃、１２０ｒｐｍ
−ＶＫ１ｂｋ：５００ｍｌ  ＴＳＢ培地＋２５ｍｇ／ｌ硫酸カナマイシン、３ｌ  Ｃｏｒｎｉｎｇフラスコ＋０．５ｍｌＭＣＢ，３０℃、１２０ｒｐｍ
−ＶＫ２ａｋ：１０００ｍｌ  ＴＳＢ培地＋２５ｍｇ／ｌ硫酸カナマイシン、３ｌ  Ｃｏｒｎｉｎｇフラスコ＋７５ｍｌ  ＶＫ１ａｋ（ＯＤ１，８），３０℃、１２０ｒｐｍ
−ＶＫ２ｂｋ：１０００ｍｌ  ＴＳＢ培地＋２５ｍｇ／ｌ硫酸カナマイシン、３ｌ  Ｃｏｒｎｉｎｇフラスコ＋７５ｍｌ  ＶＫ１ａｋ（ＯＤ１，８），３０℃、１２０ｒｐｍ
【０１５０】
図５の結果は、カナマイシンの有無、及びＣｏｒｎｉｎｇフラスコが２ｌか３ｌかは、顕著に増殖に影響しないことを示す。プレカルチャー１の３０℃での培養時間は、対数期の細胞をプレカルチャー２に播種するために、約１５〜２３時間とするべきである（ＯＤ６００は最大で１〜４）。プレカルチャー２の最少のＯＤ６００（＞０．５）は、２〜３時間後に達成され；対数増殖期はＯＤ６００値が０．５〜３．０として特徴付けられる。
【０１５１】
実施例５：グルコースを補給した場合としない場合のサルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａ（空）の増殖
３つのプレカルチャー（１、２、３）の増殖試験が、２ｌ  Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ中で、及び生産株と同様に２段階の培養で、実施された。
【０１５２】
プレカルチャー１は、ＲＣＢから直接播種され；プレカルチャー２は、プレカルチャー１からより大きい体積で播種された。カナマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドを欠いているため、抗生物質による選択は省略された。プレカルチャー工程の影響（世代数）を評価するため、反復的なグルコース追加を、プレカルチャー１及び２において行い、それらをグルコース追加を行わない培養物と比較した。更に、グルコース追加を行ったプレカルチャー１を、プレカルチャー２の元種として使用して、グルコース濃度が媒介する代謝への影響の可逆性を追跡した。プレカルチャー３は、グルコース追加を行い、新鮮なＴＳＢ培地（グルコース含有又は不含）に播種したものを表す。
【０１５３】
図６〜１１において使用される試料の表記を以下に示す。
−ＶＫ１ａ：５００ｍｌ  ＴＳＢ培地、２ｌ  Ｃｏｒｎｉｎｇフラスコ＋０．５ｍｌ  ＲＣＢ、３０℃、１２０ｒｐｍ
−ＶＫ１ｂ：５００ｍｌ  ＴＳＢ培地、２ｌ  Ｃｏｒｎｉｎｇフラスコ＋０．５ｍｌ  ＲＣＢ、３０℃、１２０ｒｐｍ＋グルコース追加
−ＶＫ２ａ：５００ｍｌ  ＴＳＢ培地、２ｌ  Ｃｏｒｎｉｎｇフラスコ＋３８ｍｌ  ＶＫ１ａ（ＯＤ５．４）、３０℃、１２０ｒｐｍ
−ＶＫ２ｂ：５００ｍｌ  ＴＳＢ培地、２ｌ  Ｃｏｒｎｉｎｇフラスコ＋３８ｍｌ  ＶＫ１ａ（ＯＤ５．４）、３０℃、１２０ｒｐｍ＋グルコース追加
−ＶＫ３ａ：５００ｍｌ  ＴＳＢ培地、２Ｌ  Ｃｏｒｎｉｎｇフラスコ＋３８ｍｌ  ＶＫ１ｂ（ＯＤ５．１；５時間後最初のグルコース追加）、３０℃、１２０ｒｐｍ
−ＶＫ３ｂ：５００ｍｌ  ＴＳＢ培地、２Ｌ  Ｃｏｒｎｉｎｇフラスコ＋３８ｍｌ  ＶＫ１ｂ（ＯＤ５．１；５時間後最初のグルコース追加）、３０℃、１２０ｒｐｍ＋グルコース追加
【０１５４】
これらの実験の結果は、グルコースの追加が、グルコースが消費されるにも拘らず、野生型株のＯＤ値／細胞収量の増大をもたらさないことを示す。対照的に、グルコースを追加しないフラスコのＯＤは、より高い値に達した（プレカルチャー１では６、プレカルチャー２では８）。グルコースを添加して約１時間後、グルコースを追加しない場合と比較して、ＯＤは一定となった（又は僅かに低下した）。グルコースの追加を繰り返すとグルコース消費は減少し、増殖に対する追加の効果は見られなくなった。
【０１５５】
ｐＨのアルカリへのシフトは、グルコースの追加を行わず、グルコースが枯渇した後に観察された。一方、グルコースを追加した場合、ｐＨ値は低下した（図８のプレカルチャー１と図９のプレカルチャー２を比較）。この減少は両方のプレカルチャー（ＶＫ１、ＶＫ２）で観察され、世代数は影響しないことが示唆される。
【０１５６】
グルコースを追加して増殖させたプレカルチャーを新鮮な培地（１：１４希釈；図１０、図１１）、同一の増殖特性（グルコース追加を行わない場合のより高いＯＤ値／ｐＨのアルカリへのシフト）が観察された。
【０１５７】
以上の結果は、グルコースの濃度が下限（約２．５ｇ／ｌ）を上回る場合に、（グルコースの）代謝の可逆的な変化が引き起こされることを示唆する。恐らく、グルコースが再びトリガーレベルを下回っても、細胞の増殖を阻害する物質が培地中に分泌される。新しい培地に播種した後（ＶＫ３）、この物質は、有効量を下回るまで希釈される。
【０１５８】
実施例６：グルコースを追加する、又はしないサルモネラ・タイフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａの操作された癌ワクチン生産株（ｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１）  （＝ＶＸＭ０１）の増殖
実施例５に示す癌ワクチン生産株ＶＸＭ０１において実施されたものと同一の実験アプローチが使用された。実施例５との唯一の違いは、当該株がプラスミドｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１で形質転換されている点である。これらの調査は、生産株Ｓ．  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ：ｐＶＡＸ１０−ＶＲ２．１  （ｐ）のグルコース代謝に関連する増殖特性が、プラスミドに影響されず空の株の特性に影響されるという仮説を検証するために行われた。両株の増殖及びグルコース追加を、図１１及び１２に記載する。
【０１５９】
当該結果は、両株（Ｓ．  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａの空及び操作された生産株）の増殖特性が同等であることを示す。プラスミの影響を示唆するものは見受けられなかった。更に、グルコースを追加しない細胞は、グルコース存在下で増殖させた細胞と比較して異なる形態を示すが、それらは、グルコースの存在下で増殖させた細胞と比較して、細胞の溶解を増大させるものではなく、プラスミドの安定性を低下させる（操作された細胞の場合）ものではない。
【表３】
2015502162.tif 000005
【表４】
2015502162.tif 000006
【表５】
2015502162.tif 000007
【図１−１】
2015502162.tif 000008
【図１−２】
2015502162.tif 000009
【図２】
2015502162.tif 000010
【図３】
2015502162.tif 000011
【図４】
2015502162.tif 000012
【図５】
2015502162.tif 000013
【図６】
2015502162.tif 000014
【図７】
2015502162.tif 000015
【図８】
2015502162.tif 000016
【図９】
2015502162.tif 000017
【図１０】
2015502162.tif 000018
【図１１】
2015502162.tif 000019
【図１２】
2015502162.tif 000020
【図１３】
2015502162.tif 000021
【配列表】
2015502162000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年10月16日(2014.10.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１−１】
2015502162.tif 000022
【図１−２】
2015502162.tif 000023
【図２】
2015502162.tif 000024
【図３】
2015502162.tif 000025
【図４】
2015502162.tif 000026
【図５】
2015502162.tif 000027
【図６】
2015502162.tif 000028
【図７】
2015502162.tif 000029
【図８】
2015502162.tif 000030
【図９】
2015502162.tif 000031
【図１０】
2015502162.tif 000032
【図１１】
2015502162.tif 000033
【図１２】
2015502162.tif 000034
【図１３】
2015502162.tif 000035
【国際調査報告】
2015502162.tif 000036
2015502162.tif 000037
2015502162.tif 000038