(57)【要約】本発明は、５−フルオロウラシルの結合体、５−フルオロウラシル免疫原、５−ＦＵおよび／または別の分子に結合体化している５−ＦＵを結合する抗体に関し、ならびに試料中、例えば血漿中、の５−フルオロウラシルの量を検出、定量およびモニターするためのアッセイに関する。一局面において、５−ＦＵに結合し、かつ競合アッセイにおいてウラシルとの２．４％もしくはそれより小さい交差反応性を有する抗体が提供される。別の局面において、５−ＦＵに結合する上記抗体が、競合アッセイにおいてチミンとの３％未満の交差反応性を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
５−ＦＵに結合し、かつ競合アッセイにおいてウラシルとの２．４％もしくはそれより小さい交差反応性を有する抗体。
【請求項２】
５−ＦＵに結合する前記抗体が、競合アッセイにおいてチミンとの３％未満の交差反応性を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
５−ＦＵに結合し、かつ競合アッセイにおいてチミンとの３％未満の交差反応性を有する抗体。
【請求項４】
競合アッセイにおいてテガフールとの１５％より高い交差反応性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
カペシタビン、ウラシル、ウリジン、チミン、チミジン、フォリン酸、オキサリプラチン、イリノテカン、メトトレキサートおよびシスプラチンからなる群より選択される１つ以上の化合物との１％未満の交差反応性を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
５，６−ジヒドロ−５−フルオロウラシルとの３％未満の交差反応性を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
５−ＦＵを結合する単離された抗体またはその断片であって、前記抗体が重鎖および軽鎖を含み、ここで前記重鎖のアミノ酸配列が、配列番号３、４および５を含み、かつ前記軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号７、８および９を含むものである、抗体またはその断片。
【請求項８】
前記重鎖アミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸２０−４７７を含む、請求項７に記載の抗体またはその断片。
【請求項９】
前記軽鎖アミノ酸配列が、配列番号６のアミノ酸２１−２３４を含む、請求項７または８に記載の抗体またはその断片。
【請求項１０】
前記抗体が、モノクローナル抗体；ヒト化抗体；キメラ抗体；一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）；Ｆａｂ断片；Ｆ（ａｂ’）断片；および合成抗体からなる群より選択される、請求項７〜９のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項１１】
式（１）：
【化２１】
2015502356.tif 000028
の化合物であって、式中、
Ｒは、タンパク質、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、検出標識であるか、またはＲに結合している酸素原子と一緒になって反応性エステルを形成し、かつ
ｍは、１、２、３または４である、
化合物。
【請求項１２】
前記式が、
【化２２】
2015502356.tif 000029
である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒが、反応性エステルを形成する、請求項１１または１２に記載の化合物。
【請求項１４】
形成される前記エステルが、低級アルキルエステル、イミドエステルまたはアミドエステルである、請求項１１または１２に記載の化合物。
【請求項１５】
前記タンパク質が、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）および血清アルブミンからなる群より選択される、請求項１１または１２に記載の化合物。
【請求項１６】
前記標識が、電気化学発光標識、酵素標識、フルオロフォア、ラテックス粒子、磁性粒子、放射性元素、リン光色素、色素結晶子、金粒子、銀コロイド粒子、セレンコロイド粒子、金属キレート、補酵素、電気活性基、オリゴヌクレオチドおよび安定なラジカルからなる群より選択される、請求項１１または１２に記載の化合物。
【請求項１７】
前記金属キレートが、ルテニウムまたはオスミウム金属キレートである、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
前記化合物が、
【化２３】
2015502356.tif 000030
である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１９】
前記化合物が、
【化２４】
2015502356.tif 000031
である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項２０】
５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）に選択的に結合する抗体を生産する方法であって、前記方法は：
ａ）動物を式（１）：
【化２５】
2015502356.tif 000032
の少なくとも１つの化合物で免疫化する工程であって、式中、
Ｒは、タンパク質、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、タンパク質、検出標識であるか、またはＲに結合している酸素原子と一緒になって反応性エステルを形成し、かつ
ｍは１、２、３または４である、工程と、
ｂ）前記抗体を単離する工程と
を含む、方法。
【請求項２１】
前記哺乳動物を、式：
【化２６】
2015502356.tif 000033
の化合物で免疫化する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記哺乳動物を、式：
【化２７】
2015502356.tif 000034
の化合物で免疫化する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗体が、５−ＦＵに結合し、かつ競合アッセイにおいてウラシルとの２．４％もしくはそれより小さい交差反応性を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗体が、５−ＦＵに結合し、かつ競合アッセイにおいてチミンとの３％未満の交差反応性を有する、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体が、５−ＦＵに結合し、かつ競合アッセイにおいてテガフールとの１５％より高い交差反応性を有する、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体が、カペシタビン、ウラシル、ウリジン、チミン、チミジン、フォリン酸、オキサリプラチン、イリノテカン、メトトレキサートおよびシスプラチンからなる群より選択される１つ以上の化合物との１％未満の交差反応性を有する、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体が、５，６−ジヒドロ−５−フルオロウラシルとの３％未満の交差反応性を有する、請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗体が、マウスＩｇＧ２ｂ抗体である、請求項２２〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
請求項２０〜２９に記載の方法のいずれか１つによって生産される抗体。
【請求項３１】
試料中の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を検出する方法であって、前記方法は：少なくとも前記試料と第一の結合分子およびディテクター分子を溶液中で併せる工程であって、ここで、前記第一の結合分子は、前記ディテクター分子を結合でき、かつ５−ＦＵは、前記第一の結合分子の前記ディテクター分子への結合を競合的に阻害する、工程と、前記第一の結合分子の前記ディテクター分子への結合を検出する工程とを含む、方法。
【請求項３２】
前記試料が、哺乳動物からの血清試料である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記第一の結合分子が、抗体またはその断片である、請求項３１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗体またはその断片が、５−ＦＵに結合し、かつ競合アッセイにおいてウラシルとの２．４％もしくはそれより小さい交差反応性を有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗体が、５−ＦＵに結合し、かつ競合アッセイにおいてチミンとの３％未満の交差反応性を有する、請求項３３〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記抗体が、競合アッセイにおいてテガフールとの１５％より高い交差反応性を有する、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記抗体が、カペシタビン、ウラシル、ウリジン、チミン、チミジン、フォリン酸、オキサリプラチン、イリノテカン、メトトレキサートおよびシスプラチンからなる群より選択される１つ以上の化合物との１％未満の交差反応性を有する、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗体が、５，６−ジヒドロ−５−フルオロウラシルとの３％未満の交差反応性を有する、請求項３３〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記試料を前記第一の結合分子と併せる前に希釈する、請求項３１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記試料を前記第一の結合分子と併せる前に希釈しない、請求項３１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記試料が、血漿である、請求項３１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
少なくとも前記第一の結合分子または前記ディテクター分子が、前記試料で再水和される凍結乾燥組成物からのものである、請求項３１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記第一の結合分子が、凍結乾燥組成物からのものである、請求項３１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記ディテクター分子が、凍結乾燥組成物からのものである、請求項３１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記第一の結合分子および前記ディテクター分子を別々の組成物中で凍結乾燥させる、請求項３１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記別々の凍結乾燥組成物を前記試料で再水和させる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
＜５．０ｎｇ／ｍＬの検出下限を有する、請求項３１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
１０〜３０，０００ｎｇ／ｍＬのダイナミックレンジを有する、請求項３１〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
３、５、７、１０、１２または１５分未満で完了する、請求項３１〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記試料が患者からのものであり、前記方法が、前記試料において検出される５−ＦＵの量に基づいて患者の５−ＦＵ用量を調整する工程をさらに含む、請求項３１〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記溶液が、ＧＰＲＰ−ＮＨ２（配列番号１）を含む、請求項３１〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記第一の結合分子が表面に結合される、請求項３１〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記溶液を一定の期間インキュベートした後に、前記第一の結合分子が表面に結合される、請求項３１〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記第一の結合分子および前記表面各々が、結合ペアの対応するメンバーから成る、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記結合ペアが、ストレプトアビジンおよびビオチンである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記第一の結合分子が、ビオチンを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記表面が、ビーズである、請求項５２〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記ビーズが、常磁性ビーズである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
少なくとも１つの検出標識が、電気化学発光標識、酵素標識、フルオロフォア、ラテックス粒子、磁性粒子、放射性元素、リン光色素、色素結晶子、金粒子、銀コロイド粒子、セレンコロイド粒子、金属キレート、補酵素、電気活性基、オリゴヌクレオチドおよび安定なラジカルから選択される、請求項３１から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記金属キレートが、ルテニウムまたはオスミウム金属キレートである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項３１から６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
試料中の５−ＦＵを検出するためのＥＣＬ検出キットであって、前記キットは：
（ｉ）必要に応じて表面に固定化または結合される結合分子と、
（ｉｉ）標識されたディテクター分子と
を含み、前記結合分子が、前記ディテクター分子に結合でき、かつ５−ＦＵが、前記結合分子の前記ディテクター分子への結合を競合的に阻害するものである、キット。
【請求項６３】
可搬型ＥＣＬ分析器の使用をさらに含む、請求項６２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１１年１１月３０日に出願された米国仮出願第６１／５６５，２８１号および２０１２年６月２８日に出願された同第６１／６６５，６８６号（これらの各々は、それらの全体が参考として本明細書に援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
分野
本開示は、生体試料中の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）の存在を検出する、該５−ＦＵを定量する、または該５−ＦＵの量をモニターするためのアッセイに関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）は、癌患者において結腸直腸、頭頚部、胃および乳癌腫をはじめとする（しかしこれらに限定されない）腫瘍を処置するために広範に使用されている。５−ＦＵは、殆どの場合、全身投与されるが、一部の形態の前癌性および癌性皮膚障害を処置するために局所適用もされる。５−ＦＵのプロドラッグも癌処置に使用される。
【０００４】
５−ＦＵ薬物動態が広い患者間および患者内変動性を有することが示されている。患者間の調整用量間の差を含めて、個体間の５−ＦＵの代謝率をめぐる幾つかの不確定要素がまだ存在する。例えば、個体ごとに算出された体表面積に基づいて調製された同等の用量の５−ＦＵを異なる患者に投与したとき、全身曝露に顕著な差が生ずる。（Ｂｅｒｔｉｎｏら、Ｃｌｉｎ．Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ、６：４０７−４２６、（２００７））。これは、一部の患者では過剰投薬の結果として毒性をもたらすことがあり、または他の患者では過少投薬に起因して効力低減をもたらすことがある。加えて、一部の患者は、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ（ＤＰＤ）欠損症を有し、この欠損症は、５−ＦＵ曝露から非常に重篤な、ことによると致死性の、毒性副作用の原因になり得る。実際、一部の患者、特に老人患者は、低下した５−ＦＵ血漿クリアランスを有し、これは、より高い毒性リスクにつながる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂｅｒｔｉｎｏら、Ｃｌｉｎ．Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ（２００７）６：４０７〜４２６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、５−ＦＵの投与および体内の５−ＦＵレベルのモニタリングのための有効な常用治療薬管理システムを、患者における一切の望ましくない副作用を制限および回避するために時宜に応じて毒性用量または有効でない用量を調整することができるように設計することは、重要である。例えば、目標血漿レベルへの５−ＦＵの用量調整を個別化する能力は、体表面積に基づく投薬方法より正確であろうし、好ましいであろう。個別化された投薬は、毒性の発生の減少、生存率改善、および５−ＦＵ処置に対する患者の全体的な応答増大にもつながるであろう。５−ＦＵ用量を調整して最適な血漿濃度を達成することができるように５−ＦＵレベルをモニターするための改善された抗体、イムノアッセイおよび方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、５−ウラシルの結合体、５−フルオロウラシル免疫原、５−ＦＵを結合する抗体、および／または別の分子に結合体化している５−ＦＵを結合する抗体、ならびに試料中、例えば血漿中、の５−フルオロウラシルの量を検出、定量およびモニターするためのアッセイに、一般に関する。
【０００８】
本開示は、５−ＦＵに結合し、かつ競合アッセイにおいてウラシルとの２．４％もしくはそれより小さい交差反応性を有する抗体に、一般に関する。
【０００９】
一部の実施形態において、本開示は、５−ＦＵに結合し、かつ競合アッセイにおいてウラシルとの２．４％もしくはそれより小さい交差反応性を有する抗体であって、５−ＦＵに結合し、かつ競合アッセイにおいてチミンとの３％未満の交差反応性を有するものである抗体に、一般に関する。
【００１０】
本開示は、５−ＦＵに結合し、かつ競合アッセイにおいてチミンとの３％未満の交差反応性を有する抗体に、一般に関する。
【００１１】
一部の実施形態において、本開示は、本開示の抗体であって、競合アッセイにおいてテガフール（ｔｅｇａｆｕｒ）との１５％より高い交差反応性を有するものである抗体に、一般に関する。
【００１２】
一部の実施形態において、本開示は、本開示の抗体であって、カペシタビン、ウラシル、ウリジン、チミン、チミジン、フォリン酸、オキサリプラチン、イリノテカン、メトトレキサートおよびシスプラチンからなる群より選択される１つ以上の化合物との１％未満の交差反応性を有するものである抗体に、一般に関する。
【００１３】
一部の実施形態において、本開示は、本開示の抗体であって、５，６−ジヒドロ−５−フルオロウラシルとの３％未満の交差反応性を有するものである抗体に、一般に関する。
【００１４】
本開示は、５−ＦＵを結合する単離された抗体またはその断片であって、該抗体が重および軽鎖を含み、その重鎖アミノ酸配列が、配列番号３、４および５を含み、ならびにその軽鎖アミノ酸配列が、配列番号７、８および９を含むものである、抗体またはその断片に、一般に関する。
【００１５】
一部の実施形態において、本開示は、５−ＦＵを結合する単離された抗体またはその断片であって、その重鎖アミノ酸配列が配列番号２のアミノ酸２０−４７７を含むものである、単離された抗体またはその断片に、一般に関する。
【００１６】
一部の実施形態において、本開示は、５−ＦＵを結合する単離された抗体またはその断片であって、その軽鎖アミノ酸配列が配列番号６のアミノ酸２１−２３４を含むものである、単離された抗体またはその断片に、一般に関する。
【００１７】
一部の実施形態において、本開示は、５−ＦＵを結合する単離された抗体またはその断片であって、該抗体が、モノクローナル抗体；ヒト化抗体；キメラ抗体；一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）；Ｆａｂ断片；Ｆ（ａｂ’）断片；および合成抗体からなる群より選択されるものである、単離された抗体またはその断片に、一般に関する。
【００１８】
本開示は、式（１）の化合物：
【００１９】
【化１】
2015502356.tif 000002
（式中、Ｒは、タンパク質、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、検出標識であるか、またはＲに結合している酸素原子と一緒になって反応性エステルを形成し、およびｍ＝１、２、３または４である）
に、一般に関する。
【００２０】
一部の実施形態において、本開示は、式（１）の化合物であって、該式が、
【００２１】
【化２】
2015502356.tif 000003
である化合物に、一般に関する。
【００２２】
一部の実施形態において、本開示は、Ｒが反応性エステルを形成する、式（１）の化合物に、一般に関する。
【００２３】
一部の実施形態において、本開示は、形成されるエステルが、低級アルキルエステル、イミドエステルまたはアミドエステルである、式（１）の化合物に、一般に関する。
【００２４】
一部の実施形態において、本開示は、前記タンパク質が、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）および血清アルブミンからなる群より選択される、式（１）の化合物に、一般に関する。
【００２５】
一部の実施形態において、本開示は、前記標識が、電気化学発光標識、酵素標識、フルオロフォア、ラテックス粒子、磁性粒子、放射性元素、リン光色素、色素結晶子（ｄｙｅ  ｃｒｙｓｔａｌｉｔｅ）、金粒子、銀コロイド粒子、セレンコロイド粒子、金属キレート、補酵素、電気活性基、オリゴヌクレオチドおよび安定なラジカルからなる群より選択される、式（１）の化合物に、一般に関する。
【００２６】
一部の実施形態において、本開示は、前記金属キレートが、ルテニウムまたはオスミウム金属キレートである、式（１）の化合物に、一般に関する。
【００２７】
一部の実施形態において、本開示は、
【００２８】
【化３】
2015502356.tif 000004
である、式（１）の化合物に、一般に関する。
【００２９】
一部の実施形態において、本開示は、
【００３０】
【化４】
2015502356.tif 000005
である、式（１）の化合物に、一般に関する。
【００３１】
本開示は、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）に選択的に結合する抗体を生産する方法であって、
ａ）動物を式（１）：
【００３２】
【化５】
2015502356.tif 000006
の少なくとも１つの化合物で免疫化する工程であって、式中、Ｒは、タンパク質、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、タンパク質、検出標識であるか、またはＲに結合している酸素原子と一緒になって反応性エステルを形成し、およびｍ＝１、２、３または４である、工程と、
ｂ）前記抗体を単離する工程と
を含む方法に、一般に関する。
【００３３】
一部の実施形態において、本開示は、哺乳動物を式：
【００３４】
【化６】
2015502356.tif 000007
の化合物で免疫化する、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）に選択的に結合する抗体を生産する方法に、一般に関する。
【００３５】
一部の実施形態において、本開示は、哺乳動物を式：
【００３６】
【化７】
2015502356.tif 000008
の化合物で免疫化する、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）に選択的に結合する抗体を生産する方法に、一般に関する。
【００３７】
一部の実施形態において、本開示は、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）に選択的に結合する抗体を生産する方法であって、前記抗体がモノクローナル抗体である方法に、一般に関する。
【００３８】
一部の実施形態において、本開示は、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）に選択的に結合する抗体を生産する方法であって、前記抗体が、５−ＦＵに結合し、かつ競合アッセイにおいてウラシルとの２．４％もしくはそれより小さい交差反応性を有するものである方法に、一般に関する。
【００３９】
一部の実施形態において、本開示は、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）に選択的に結合する抗体を生産する方法であって、前記抗体が、５−ＦＵに結合し、かつ競合アッセイにおいてチミンとの３％未満の交差反応性を有するものである方法に、一般に関する。
【００４０】
一部の実施形態において、本開示は、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）に選択的に結合する抗体を生産する方法であって、前記抗体が、５−ＦＵに結合し、かつ競合アッセイにおいてテガフールとの１５％より高い交差反応性を有するものである方法に、一般に関する。
【００４１】
一部の実施形態において、本開示は、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）に選択的に結合する抗体を生産する方法であって、前記抗体が、カペシタビン、ウラシル、ウリジン、チミン、チミジン、フォリン酸、オキサリプラチン、イリノテカン、メトトレキサートおよびシスプラチンからなる群より選択される１つ以上の化合物との１％未満の交差反応性を有するものである方法に、一般に関する。
【００４２】
一部の実施形態において、本開示は、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）に選択的に結合する抗体を生産する方法であって、前記抗体が、５，６−ジヒドロ−５−フルオロウラシルとの３％未満の交差反応性を有するものである方法に、一般に関する。
【００４３】
一部の実施形態において、本開示は、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）に選択的に結合する抗体を生産する方法であって、前記抗体がマウスＩｇＧ２ｂ抗体である方法に、一般に関する。
【００４４】
本開示は、本開示の方法のいずれか１つによって生産される抗体に、一般に関する。
【００４５】
本開示は、試料中の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を検出する方法であって、少なくとも前記試料と第一の結合分子およびディテクター分子を溶液中で併せる工程（ここで、前記第一の結合分子は、前記ディテクター分子を結合でき、および５−ＦＵは、前記第一の結合分子の前記ディテクター分子への結合を競合的に阻害する）と、前記第一の結合分子の前記ディテクター分子への結合を検出する工程とを含む方法に、一般に関する。
【００４６】
一部の実施形態において、本開示は、試料中の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を検出する方法であって、前記試料が、哺乳動物からの血清試料である方法に、一般に関する。
【００４７】
一部の実施形態において、本開示は、試料中の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を検出する方法であって、前記第一の結合分子が、抗体またはその断片である方法に、一般に関する。
【００４８】
一部の実施形態において、本開示は、試料中の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を検出する方法であって、前記抗体またはその断片が、５−ＦＵに結合し、かつ競合アッセイにおいてウラシルとの２．４％もしくはそれより小さい交差反応性を有するものである方法に、一般に関する。
【００４９】
一部の実施形態において、本開示は、試料中の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を検出する方法であって、前記抗体が、５−ＦＵに結合し、かつ競合アッセイにおいてチミンとの３％未満の交差反応性を有するものである方法に、一般に関する。
【００５０】
一部の実施形態において、本開示は、試料中の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を検出する方法であって、前記抗体が、競合アッセイにおいてテガフールとの１５％より高い交差反応性を有するものである方法に、一般に関する。
【００５１】
一部の実施形態において、本開示は、試料中の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を検出する方法であって、前記抗体が、カペシタビン、ウラシル、ウリジン、チミン、チミジン、フォリン酸、オキサリプラチン、イリノテカン、メトトレキサートおよびシスプラチンからなる群より選択される１つ以上の化合物との１％未満の交差反応性を有するものである方法に、一般に関する。
【００５２】
一部の実施形態において、本開示は、試料中の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を検出する方法であって、前記抗体が、５，６−ジヒドロ−５−フルオロウラシルとの３％未満の交差反応性を有するものである方法に、一般に関する。
【００５３】
一部の実施形態において、本開示は、試料中の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を検出する方法に概して関し、ここで前記試料を第一の結合分子と併せる前に希釈する。
【００５４】
一部の実施形態において、本開示は、試料中の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を検出する方法に概して関し、ここで前記試料を第一の結合分子と併せる前に希釈しない。
【００５５】
一部の実施形態において、本開示は、試料中の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を検出する方法であって、前記試料が血漿である方法に、一般に関する。
【００５６】
一部の実施形態において、本開示は、試料中の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を検出する方法であって、少なくとも前記第一の結合分子または前記ディテクター分子が、前記試料で再水和される凍結乾燥組成物からのものである方法に、一般に関する。
【００５７】
一部の実施形態において、本開示は、試料中の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を検出する方法であって、前記第一の結合分子が、凍結乾燥組成物からのものである方法に、一般に関する。
一部の実施形態において、本開示は、試料中の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を検出する方法であって、前記ディテクター分子が、凍結乾燥組成物からのものである方法に、一般に関する。
【００５８】
一部の実施形態において、本開示は、試料中の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を検出する方法であって、前記第一の結合分子および前記ディテクター分子を別々の組成物中で凍結乾燥させるものである方法に、一般に関する。
【００５９】
一部の実施形態において、本開示は、試料中の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を検出する方法であって、前記別々の凍結乾燥組成物を前記試料で再水和させるものである方法に、一般に関する。
【００６０】
一部の実施形態において、本開示は、試料中の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を検出する方法であって、＜５．０ｎｇ／ｍＬの検出下限を有する方法に、一般に関する。
【００６１】
一部の実施形態において、本開示は、試料中の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を検出する方法であって、１０〜３０，０００ｎｇ／ｍＬのダイナミックレンジを有する方法に、一般に関する。
【００６２】
一部の実施形態において、本開示は、試料中の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を検出する方法であって、３、５、７、１０、１２または１５分未満で完了する方法に、一般に関する。
【００６３】
一部の実施形態において、本開示は、試料中の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を検出する方法に概して関し、前記試料が患者からのものであり、この方法は、その試料において検出される５−ＦＵの量に基づいて患者の５−ＦＵ用量を調整する工程をさらに含む。
【００６４】
一部の実施形態において、本開示は、試料中の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を検出する方法であって、前記溶液が、ＧＰＲＰ−ＮＨ２（配列番号１）を含むものである方法に、一般に関する。
【００６５】
一部の実施形態において、本開示は、試料中の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を検出する方法であって、前記第一の結合分子が表面に結合されるものである方法に、一般に関する。
【００６６】
一部の実施形態において、本開示は、試料中の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を検出する方法であって、前記溶液を一定の期間インキュベートした後、前記第一の結合分子が表面に結合されるものである方法に、一般に関する。
【００６７】
一部の実施形態において、本開示は、試料中の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を検出する方法であって、前記第一の結合分子および前記表面各々が、結合ペアの対応するメンバーから成るものである方法に、一般に関する。
【００６８】
一部の実施形態において、本開示は、試料中の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を検出する方法であって、前記結合ペアが、ストレプトアビジンおよびビオチンである方法に、一般に関する。
【００６９】
一部の実施形態において、本開示は、試料中の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を検出する方法であって、前記第一の結合分子がビオチンを含むものである方法に、一般に関する。
【００７０】
一部の実施形態において、本開示は、試料中の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を検出する方法であって、前記表面がビーズである方法に、一般に関する。
【００７１】
一部の実施形態において、本開示は、試料中の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を検出する方法であって、前記ビーズが常磁性ビーズである方法に、一般に関する。
【００７２】
一部の実施形態において、本開示は、試料中の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を検出する方法であって、前記少なくとも１つの検出標識が、電気化学発光標識、酵素標識、フルオロフォア、ラテックス粒子、磁性粒子、放射性元素、リン光色素、色素結晶子、金粒子、銀コロイド粒子、セレンコロイド粒子、金属キレート、補酵素、電気活性基、オリゴヌクレオチドおよび安定なラジカルから選択されるものである方法に、一般に関する。
【００７３】
一部の実施形態において、本開示は、試料中の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を検出する方法であって、前記金属キレートが、ルテニウムまたはオスミウム金属キレートである方法に、一般に関する。
【００７４】
一部の実施形態において、本開示は、試料中の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を検出する方法であって、前記哺乳動物がヒトである方法に、一般に関する。
【００７５】
本開示は、試料中の５−ＦＵを検出するためのＥＣＬ検出キットであって、表面に任意に固定化または結合される結合分子と、標識されたディテクター分子とを含み、前記結合分子が、前記ディテクター分子に結合でき、および５−ＦＵが、前記結合分子の前記ディテクター分子への結合を競合的に阻害するものであるキットに、一般に関する。前記キットは、可搬型ＥＣＬ分析器の使用も含み得る。
【００７６】
本開示は、試料中の５−ＦＵを検出するためのアッセイに、一般に関する。一部の実施形態において、本開示のアッセイは、試料（例えば、血漿）中の５−ＦＵを正確にモニターして、広いダイナミックレンジにわたり結果を提供することができる。本開示のアッセイは、５−ＦＵプロドラッグの注入中および／または経口投与後の５−ＦＵのモニタリングを可能にする。ＤＰＤ欠損症または他のクリアランス問題のために５−ＦＵに過剰曝露された患者の同定にこのアッセイを用いることができる。加えて、効力の改善および副作用の減少をもたらし得る個別化５−ＦＵ処置に本開示のアッセイを用いることができる。
【００７７】
配列の簡単な説明
配列番号１は、アミノ酸配列ＧＰＲＰである。
【００７８】
配列番号２は、モノクローナル抗体６１Ｃ６（ｍａｂ  ６１Ｃ６）の重鎖のアミノ酸配列である。
【００７９】
配列番号３、４および５は、ｍａｂ  ６１Ｃ６の重鎖の、それぞれ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
【００８０】
配列番号６は、ｍａｂ  ６１Ｃ６の軽鎖のアミノ酸配列である。
【００８１】
配列番号７、８および９は、ｍａｂ  ６１Ｃ６の軽鎖の、それぞれ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
【００８２】
配列番号１０は、ｍａｂ  ６１Ｃ６の重鎖をコードしているヌクレオチド配列である。
【００８３】
配列番号１１は、ｍａｂ  ６１Ｃ６の軽鎖をコードしているヌクレオチド配列である。
【発明を実施するための形態】
【００８４】
本開示は、５−ＦＵに選択的に結合する様々な抗体を提供する。これらの抗体は、下に示す式（１）の化合物または免疫原に由来する。前記抗体は、生体試料中の５−ＦＵの量を有利に検出、定量およびモニターすることができるイムノアッセイにおいて使用する。生体試料中の５−ＦＵを測定するための前記イムノアッセイは、迅速であり、感度がよく、および正確であり、それによって処置中に５−ＦＵの投薬を最適化する。
【００８５】
免疫原
本開示は、式（１）：
【００８６】
【化８】
2015502356.tif 000009
の化合物に概して関し、式中、Ｒは、タンパク質、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、検出標識であるか、またはＲに結合している酸素原子と一緒になって反応性エステルを形成し、ここでｍ＝１、２、３または４である。式（１）の化合物は、本開示の抗体上の結合部位について試料中の５−ＦＵと競合するように設計されている、５−ＦＵの結合体である。今般開示する免疫原化合物は、式（１）の化合物の１置換５−ＦＵ誘導体である。
【００８７】
本開示の一定の実施形態において、式（１）の化合物は、以下：
【００８８】
【化９】
2015502356.tif 000010
のうちのいずれか１つであり得、これらの式中、Ｒは、タンパク質、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、検出標識であるか、またはＲに結合している酸素原子と一緒になって反応性エステルを形成する。一定の実施形態において、形成されるエステルは、低級アルキルエステル、イミドエステルまたはアミドエステルであり得る。さらなる他の実施形態において、タンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）および／または血清アルブミン、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などであり得る。タンパク質および／または検出標識を、ＮＨＳとの反応によるものをはじめとする任意の手段によって化合物に連結させることができる。前記検出標識をタンパク質に、例えばＢＳＡまたはＫＬＨに、付着または結合させることができることを企図している。前記タンパク質への結合または付着は、２、３、４または５炭素鎖、および直鎖、分岐、飽和または不飽和炭素鎖をはじめとする（しかしこれらに限定されない）様々な長さおよび配置の炭素リンカーを用いて果たすことができる。炭素に加えて他の原子をこれらのリンカーに含めることもでき、それらの原子としては、例えば、酸素、窒素および硫黄が挙げられる。
【００８９】
一部の実施形態において、検出標識は、電気化学発光標識、酵素標識、フルオロフォア、ラテックス粒子、磁性粒子、放射性元素、リン光色素、色素結晶子、金粒子、銀コロイド粒子、セレンコロイド粒子、金属キレート、補酵素、電気活性基、オリゴヌクレオチドおよび安定なラジカルからなる群より選択される。適する金属キレートの例としては、ルテニウムまたはオスミウム金属キレートが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９０】
抗５−Ｆｕ抗体の生産
５−ＦＵに選択的に結合する本開示の抗体は、式（１）：  
【００９１】
【化１０】
2015502356.tif 000011
（式中、Ｒはタンパク質であり、およびｍ＝１、２、３または４である）
の少なくとも１つの化合物で動物を免疫化し、その後、その抗体を単離することによって生産することができる。ＮＨＳとの反応によるものをはじめとする任意の手段によって、タンパク質を前記化合物に連結させることができる。本発明の抗体を、より短いリンカーを有する５−ＦＵの１位修飾結合体から産生させる（例えば、実施例４および６を参照のこと）。一部の実施形態では、動物を式：
【００９２】
【化１１】
2015502356.tif 000012
の少なくとも一方の化合物で免疫化する。
【００９３】
一定の実施形態では上記化合物両方を使用して動物を免疫化することができることを企図している。他の実施形態ではこれら２つの上記化合物の一方のみを使用して動物を免疫化することをさらに企図している。
【００９４】
本開示の抗体を生産する方法は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を作製するためのものを含む。免疫化される動物は、鳥類または哺乳類であり得、該哺乳類は、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジおよびブタからなる群より選択されるものを含む。
【００９５】
一定の実施形態において、本開示の抗体を生産する方法は、本開示の化合物、例えば、タンパク質に連結した５−ＦＵを用いて適切な免疫化スケジュールに従って動物を免疫化する工程を含む。一部の実施形態では、５−ＦＵを、担体分子、例えば、ＢＳＡ、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＫＬＨ、オボアルブミン（ＯＶＡ）、サイログロブリン（ＴＧ）、破傷風毒素、または合成担体、例えば多抗原性ペプチド（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ）（ＭＡＰＳ）にカップリングさせる。適切な期間の後、抗体をその動物から抽出および／または単離する。例えば、抗体を腹水、血液または血清から得ることができ、モノクローナル抗体を脾細胞とパートナー細胞系の融合から得ることができる。抗体は、カップリング反応に使用され得る多くのアミノ基、カルボキシル基およびスルフヒドリル基を有する。実施例セクションにより、本開示の抗体の一部を産生させるための例示的、非限定的方法を提供する。
【００９６】
一定の他の実施形態では、本開示の抗体を、配列番号１０および１１によりコードされている重および軽鎖アミノ酸配列をそれぞれ発現させることによって生産することができる。
【００９７】
抗体
本開示の一部の実施形態において、第一の結合分子は、５−ＦＵをおよび／または別の分子（単数もしくは複数）に結合体化している５−ＦＵを結合する抗体またはその断片であり得る。例えば、前記抗体は、５−ＦＵへの結合体化を伴わない同じ分子と比較して、５−ＦＵに結合体化している分子に選択的に結合する。抗体を、５−ＦＵに結合していると記載するとき、これは、５−ＦＵへの結合体化を伴わない同じ分子と比較して、５−ＦＵに結合体化している分子を選択的に結合する抗体も含むと解する。
【００９８】
本開示の抗体は、モノクローナル抗体であってもよいし、またはポリクローナル抗体であってもよい。調製方法に依存して、一定の実施形態における本開示の抗体は、凍結乾燥状態であり得る。本質的に任意のタイプの抗体を、本開示の実施形態に従って結合分子として使用することができる。かかる抗体の適する例としては、合成抗体、モノクローナル抗体、組換え生産された抗体、細胞内抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）、多重特異性抗体、二重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、合成抗体、前述のもののいずれかの一本鎖ＦＶ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）およびエピトープ結合断片が挙げられるが、これらに限定されない。本開示において使用する抗体は、所望の結合部位を結合できる免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の部分を含み得る。本開示の免疫グロブリン分子は、本質的に、免疫グロブリン分子の任意のクラスまたはアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）であってよい。天然に軽鎖を欠くラクダ科動物（ｃａｍｅｌｉｄ）抗体も使用することができる。加えて、同族結合部位を結合することが公知の抗体の単一または複数のＣＤＲを含むポリペプチドを含めて、ナノボディーおよびドメイン抗体として公知の構造を使用することができるが、但し、有効量の結合能力を保持することを条件とする。
【００９９】
一定の実施形態において、本開示の抗体は、５−ＦＵおよび／または別の分子に結合体化している５−ＦＵを選択的に結合し、ならびに次の特性のうちの１つ以上を有する：（ｉ）競合アッセイにおけるウラシルとの３％もしくはそれより小さい交差反応性；（ｉｉ）競合アッセイにおけるチミンとの３％未満の交差反応性；（ｉｉｉ）競合アッセイにおけるテガフールとの１５％より高い交差反応性；（ｉｖ）カペシタビン、ウラシル、ウリジン、チミン、チミジン、フォリン酸、オキサリプラチン、イリノテカン、メトトレキサートおよびシスプラチンからなる群より選択される１つ以上の化合物との１％未満の交差反応性；または（ｖ）５，６−ジヒドロ−５−フルオロウラシルとの３％未満の交差反応性。
【０１００】
一定の他の実施形態において、抗体は、５−ＦＵおよび／または別の分子に結合体化している５−ＦＵを選択的に結合し、ならびに（ｉ）〜（ｖ）の特性のすべてを有する。さらに他の実施形態において、抗体は、５−ＦＵおよび／または別の分子に結合体化している５−ＦＵを選択的に結合し、ならびに競合アッセイにおけるウラシルとの３％もしくはそれより小さい交差反応性および競合アッセイにおけるチミンとの３％未満の交差反応性、両方を有する。
【０１０１】
本開示の一部の抗体は、競合アッセイにおいてウラシルとの＜２．５％、＜２％、＜１．５％または＜１％交差反応性を有し得る。詳細には、一部の抗体は、競合アッセイにおいてウラシルとの０．８１％以下、１．４％以下、または２．４％もしくはそれより小さい交差反応性を有し得る。他の抗体は、競合アッセイにおいてチミンとの＜２．５％、＜２％、＜１．５％または＜１％交差反応性を有し得る。本開示のさらに他の抗体は、競合アッセイにおいて５，６−ジヒドロ−５−フルオロウラシルとの＜２．５％、＜２％、＜１．５％または＜１％交差反応性を有し得る。一定の抗体は、競合アッセイにおいてテガフールとの＞１２％、＞１３％、＞１５％、＞１７．５％、＞２０％、＞２５％、または＞３０％交差反応性を有し得る。
【０１０２】
本開示は、５−ＦＵおよび／または別の分子に結合体化している５−ＦＵを結合する単離された抗体またはその断片であって、前記抗体が、重鎖および軽鎖を含み、その重鎖アミノ酸配列が配列番号３、４および５を含み、ならびにその軽鎖アミノ酸配列が配列番号７、８および９を含むものである、抗体またはその断片を提供する。一定の実施形態において、重鎖アミノ酸配列は、配列番号２を含み、および／または軽鎖アミノ酸配列は、配列番号６を含む。一部の実施形態において、重鎖アミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸２０−４７７を含み、および／または軽鎖アミノ酸配列は、配列番号６のアミノ酸２１−２３４を含む。さらに他の実施形態において、抗体またはその断片は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、および合成抗体からなる群より選択される。
【０１０３】
本開示の一部の実施形態において、抗体は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つまたは少なくとも６つの、本明細書に開示するＣＤＲ、例えば、配列番号３〜５および７〜９を有することがある。本開示の一定の実施形態は、５−ＦＵおよび／または別の分子に結合体化している５−ＦＵに特異的に結合する抗体であって、本明細書に記載される可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲおよび／または可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲの誘導体を含むものである抗体を含む。当業者に公知の標準的技法を用いて、本発明の抗体をコードしているヌクレオチド配列に突然変異（例えば、付加、欠失および／または置換）を導入することができ、前記標準的技法には、アミノ酸置換を生じさせるために慣例的に用いられる部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発が含まれる。一定の実施形態において、前記ＶＨおよび／またはＶＬ  ＣＤＲ誘導体は、元のＶＨおよび／またはＶＬ  ＣＤＲと比較して２５未満のアミノ酸置換、２０未満のアミノ酸置換、１５未満のアミノ酸置換、１０未満のアミノ酸置換、５未満のアミノ酸置換、４未満のアミノ酸置換、３未満のアミノ酸置換、または２未満のアミノ酸置換を含み得る。あるいは、突然変異をＶＨおよび／またはＶＬ  ＣＤＲコーディング配列のすべてまたは一部に沿ってランダムに、例えば飽和突然変異誘発によって、導入することができ、結果として生ずる突然変異体を生物学的活性についてスクリーニングして、活性を保持する突然変異体を同定することができる。突然変異誘発後、コードされている抗体を発現させることができ、その抗体の活性を決定することができる。
【０１０４】
本開示の抗体は、適切な免疫化スケジュール（例えば、下の実施例において説明するもの）に従ってＢａｌｂ／ｃマウスを免疫化し、その後、腹腔内（ｉｐ）または静脈内（ｉｖ）注射によりおおよそ１００μＬから２００μＬの免疫原をそのマウスに注射することによって、生産することもできる。当業者に周知の他のプロトコルも利用できることを企図している。本明細書に記載する免疫化方法は、５−ＦＵ抗体に対する所望の血清抗体応答を生じさせることができる。
【０１０５】
その後、マウスＢ細胞ハイブリドーマを生成するための標準的な融合プロトコルに従って融合を行うことができる。本開示の所望のモノクローナル抗体を産生できるハイブリドーマは、Ｂ細胞リンパ球を骨髄腫細胞などの不死細胞系と融合させることによって得る。例えば、マウス骨髄腫細胞を、上で説明したものなどの免疫原で免疫化したマウスからの脾細胞と融合させることができる。それらの細胞を、ハイブリドーマが出現するまで、播種することができる。そのハイブリドーマの上清を、クローニングに使用することとなる所望の陽性細胞の免疫グロブリン生産について、公知の技法を用いてモニターすることができる。その後、公知の手順に従って、所望のクローンを増幅させることができ、モノクローナル抗体を採取することができる。
【０１０６】
５−ＦＵ抗体の細胞系を生産できる３つの例示的ハイブリドーマが、３６Ｈ１１、２７Ｆ９および７２Ｂ９と呼ばれる細胞系で、２０１２年１１月１２日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．、アメリカ合衆国２０１１０−２２０９、バージニア州マナッサス、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．１０８０１）に寄託された。３６Ｈ１１のＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号は、＿＿＿＿＿であり、２７Ｆ９のＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号は、＿＿＿＿＿であり、および７２Ｂ９のＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号は、＿＿＿＿＿である。これら３つの寄託ハイブリドーマの各々は、マウス骨髄腫細胞系Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ）と融合しているＢａｌｂ／ｃマウス脾細胞に由来した。これらの寄託物は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項に従って管理されることになる。
【０１０７】
５−ＦＵアッセイ
上で詳細に説明した抗体を本開示のアッセイにおいて使用することができる。一定の例示的実施形態において、本開示は、試料（例えば、血漿または血清）中の５−ＦＵを検出および測定でき、かつ広いダイナミックレンジにわたり結果を提供できるアッセイを提供する。本開示のアッセイは、融合中および／または５−ＦＵプロドラッグの経口投与後の５−ＦＵのモニタリングを可能にすることができる。本開示は、ＤＰＤ欠損症または他のクリアランス問題のために５−ＦＵに過剰曝露された患者の同定に用いることができるアッセイも提供する。加えて、効力の改善および副作用の減少をもたらし得る個別化５−ＦＵ処置に本開示のアッセイを用いることができる。一部の実施形態では、式（１）の化合物および本開示の抗体を、本明細書に提供するアッセイにおいて使用することができる。
【０１０８】
本開示の一部の実施形態は、試料中の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を検出する方法であって、（ｉ）少なくとも前記試料と第一の結合分子およびディテクター分子を溶液中で併せる工程を含む方法も提供し、ここで、前記第一の結合分子は、前記ディテクター分子を結合し、５−ＦＵは、前記第一の結合分子の前記ディテクター分子への結合を競合的に阻害する、および／または前記第一の結合分子の前記ディテクター分子への結合と競合する。前記方法は、（ｉｉ）前記第一の結合分子の前記ディテクター分子への結合を検出する工程も含む。一部の実施形態において、前記方法は、試料をＤＰＤ阻害剤と接触させる工程をさらに含む。前記試料を結合分子とインキュベートする前におよび／もしくはインキュベートする間に、または前記アッセイ中の任意の時点で、その試料をＤＰＤ阻害剤と接触させることができる。
【０１０９】
一部の実施形態において、前記試料は、ヒトなどの哺乳動物からの血清試料であり得る。
【０１１０】
一定の実施形態において、前記結合分子は、上で説明したものなどの抗体であり得る。本開示の他の実施形態において、結合分子（例えば、第一の結合分子）は、凍結乾燥組成物からのものであり得、および／またはディテクター分子は、凍結乾燥組成物からのものであり得る。さらに他の実施形態において、結合分子およびディテクター分子を、別々の組成物中で凍結乾燥させることができる。例えば、一部のアッセイ形式は、前記試料と結合分子をディテクター分子の添加前に併せる、または３つすべてを本質的に同時に併せる場合により良好に作用することができる。一定の実施形態において、ディテクター分子および結合分子は、前記試料が存在しない限り、同じ溶液中にはない。一部の状況では、ディテクター分子と結合分子を試料の添加前に溶液中で併せないほうがよい。他の実施形態では、（第一の）結合分子と試料をディテクター分子の添加前に併せる。例えば、試料と第一の結合分子とを含む溶液をディテクター分子の添加前に一定期間インキュベートしてもよい。
【０１１１】
前記アッセイの一部の実施形態では、結合分子もしくはディテクター分子または両方を含有する凍結乾燥組成物を前記試料で再水和する。この実施形態は、前記試料がそのアッセイ中に本質的に希釈されず、その結果、希釈された試料と比較して、同じ体積の未希釈試料中により多くの５−ＦＵが存在するため、より高レベルの感度をもたらすことができる点で有利である。一部の実施形態では、試料を結合分子と併せる前に希釈する。一部の実施形態では、試料を結合分子と併せる前に希釈しない。
【０１１２】
本開示のアッセイの例示的実施形態において使用する成分／試薬を、標準的な凍結乾燥方法を用いて凍結乾燥させることができる。例えば、前記成分および試薬を、所望の成分（単数または複数）、例えばディテクター分子または結合成分、を含有する溶液を作ることによって凍結乾燥させることができる。その後、その溶液を使用して液滴を形成することができ、それらの液滴を凍結媒体（例えば、液体窒素）に落下させ、典型的には凍結した球体を形成させ、その後、それらの凍結した球体またはペレットを凍結乾燥させる。
【０１１３】
他の例示的実施形態では、第一の結合分子を本開示のアッセイまたは方法中に表面に結合させる。この結合は、第一の結合分子を試料と接触させる前または接触させた後に行うことができる。前記第一の結合分子を表面に直接（例えば、共有結合で）または間接的に（例えば、結合ペアを使用して）結合させることができる。適する結合パートナーの例としては、ビオチン／ストレプトアビジン；抗体／抗原；抗体／Ｆｃ受容体；第一の種の抗体と、第一の種の抗体に対する第二の種の抗体；Ｆｃ／Ｆｃ受容体；ポリＡ／オリゴｄＴ；６−Ｈｉｓ／Ｎｉ２＋；６−Ｈｉｓ／コバルト；６−Ｈｉｓ／二価カチオン樹脂；相補的ＤＮＡ鎖；リンホトキシン−アルファ（ＬＴ−アルファ）／ＬＴ−アルファ受容体；リンホトキシン−ベータ（ＬＴ−ベータ）／ＬＴ−ベータ受容体；Ｔ細胞抗原ｇｐ３９（ＣＤ４０Ｌ）／ＣＤ４０；ＣＤ３０Ｌ／ＣＤ３０；ＦＡＳＬ／ＦＡＳ；４−１ＢＢＬ／４−１ＢＢＬ受容体；ＯＸ４０Ｌ／ＯＸ４０Ｌ受容体；およびＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）／ＴＲＡＩＬ受容体が挙げられるが、これらに限定されない。一定の例示的実施形態において、結合パートナーを結合する結合ペアは、ストレプトアビジンおよびビオチン、または互いに結合する２つの抗体、例えば、別の抗体のＦｃ部分を結合する抗体であり得る。他の実施形態では、第一の結合分子を多数の結合ペアの相互作用によって表面に結合させることができる。さらに他の実施形態では、結合分子および表面は、各々、結合ペアの対応するメンバーであり得る。例えば、直接または間接的に表面に結合している結合分子をもたらす本質的に任意の方法を使用できることを企図している。一部の実施形態では、第一の結合分子がビオチンを含み、表面がストレプトアビジンを含む、または第一の結合分子がストレプトアビジンを含み、表面がビオチンを含む。
【０１１４】
一定の例示的実施形態では、第一の結合分子および試料を一定期間インキュベートし、その後、その第一の結合分子を表面に結合させる、本発明のアッセイまたは方法を行うことができる。他の実施形態では、第一の結合分子を試料と接触させる前に表面に結合させる。本開示の一部の例示的実施形態は、表面（例えば、ビーズ）に結合させた第一の結合分子を凍結乾燥状態で提供する。
【０１１５】
本開示のアッセイおよび方法において使用する試料は、例えば、患者からの血漿または血清であり得る。
【０１１６】
本開示の適する表面の例としては、ビーズ、プレート、ガラス表面（例えば、スライドガラスもしくはガラスビーズ）、プラスチック表面、金属表面、ポリスチレン表面（例えば、ビーズもしくはプレート）、ニトロセルロース表面、またはナノ粒子表面が挙げられるが、これらに限定されない。例示的実施形態において、前記ビーズは、常磁性ビーズ、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手できるもの、例えばＭ２７０およびＭ２８０関連ビーズであり得る。
【０１１７】
本開示のディテクター分子は、第一の結合分子を結合する、および５−ＦＵが第一の結合分子へのディテクター分子の結合を競合的に阻害するものであり得る。したがって、一定の例示的実施形態において、ディテクター分子は、検出可能な標識を有する場合があり、その標識を本明細書では検出標識とも呼ぶ。一部の実施形態において、本開示のアッセイまたは方法は、非標識ディテクター分子と、検出標識を有する第二の結合分子とを使用し、ここで、前記第二の結合分子は、前記ディテクター分子を結合するが、前記ディテクター分子の第一の結合分子への結合を実質的に阻害しない、または前記ディテクター分子の第一の結合分子への結合と実質的に競合しない。例えば、前記ディテクター分子を直接標識せず、検出標識を有する第二の結合分子への結合の結果として間接的に標識する。
【０１１８】
本開示の一定の例示的実施形態において、ディテクター分子は、式：
【０１１９】
【化１２】
2015502356.tif 000013
を有し、この式中のＲは、タンパク質および／または検出標識を含む。一部の実施形態において、Ｒは、１つ以上の検出標識に結合されるタンパク質であり得る。一部の例示的実施形態において、ディテクター分子は、以下：
【０１２０】
【化１３】
2015502356.tif 000014
のうちの１つであり得る。
【０１２１】
本開示の例示的実施形態では、１つ以上の検出標識をディテクター分子に付着させる、例えば、ＢＳＡまたはＫＬＨタンパク質に付着させることができる。本開示のディテクター分子の適する例は、下の実施例１５において説明するものも含む。
【０１２２】
有利には、本開示の抗体および／またはアッセイは、非常に低濃度の５−ＦＵの検出を可能にすることができる。例えば、前記アッセイは、５−ＦＵについて、血清または血漿などの試料中、＜５．０ｎｇ／ｍＬ；＜１０．０ｎｇ／ｍＬ；＜２５．０ｎｇ／ｍＬ；＜３５ｎｇ／ｍＬ；＜５０ｎｇ／ｍＬ；＜１００ｎｇ／ｍＬ；＜１５０ｎｇ／ｍＬ；または＜２００ｎｇ／ｍＬの検出下限を有することができる。本開示の一部のアッセイは、１０〜３０，０００ｎｇ／ｍＬのダイナミックレンジを有する。
【０１２３】
本開示は、試料中の５−ＦＵの検出に比較的短い期間しか要しない方法も提供する。例えば、本開示の一部のアッセイまたは方法は、試料中の５−ＦＵを検出することができ、結合分子が試料に接触する時から始まって３、５、７、１０、１２、１５、２０、３０、４５または６０分未満で完了することができる。
【０１２４】
本開示において使用する検出標識は、アッセイ形式と適合性であるものであり得、電気化学発光標識、酵素標識、フルオロフォア、ラテックス粒子、磁性粒子、放射性元素、リン光色素、色素結晶子、金粒子、銀コロイド粒子、セレンコロイド粒子、金属キレート、補酵素、電気活性基、オリゴヌクレオチドおよび安定なラジカルを含むが、これらに限定されない。適する金属キレートの例としては、ルテニウムまたはオスミウム金属キレート（例えば、米国特許第５，３１０，６８７号を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。適する酵素標識としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載する一部のアッセイ形式では、「ＴＡＧ」または「ＴＡＧ  Ｐｌｕｓ」を例示的なタイプの検出標識として使用する。しかし、任意の適合性標識タイプがこれらのアッセイにおいて使用され得ることを企図している。
【０１２５】
本開示のアッセイ形式と適合性である任意のアッセイタイプ、例えば、電気化学発光（ＥＣＬ）アッセイまたは酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）アッセイを用いて、本開示のアッセイを行うことができることをさらに企図している。ＥＣＬアッセイは、より安定したアッセイ技法であり、それらはより高い感度を生じ、より広いダイナミックレンジ（低〜高）を有するので有利である。
【０１２６】
ＥＣＬアッセイの概説は、Ｍａｔｈｅｗら（Ｋａｔｈｍａｎｄｕ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２００５、３：９１−９３）およびＦｏｒｓｔｅｒら（Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．２００９、２：３５９−８５）に提供されている。ＥＣＬを検出に用いることができる。ＥＣＬまたは電気発生化学発光は、電気化学反応が、光を放出する化学発光反応に先行する形態の化学発光である。
【０１２７】
本発明の一部のＥＣＬベースのアッセイは、組み込まれた電極を有する表面に結合もしくは付着しているまたは結合もしくは付着させることができる結合分子（捕捉剤）の使用を含む捕捉工程と、ＥＣＬ標識に直接的にまたは間接的にカップリングさせた検出分子を使用する検出工程とを含み得る。ＥＣＬ標識は、電気化学反応によって刺激された化学発光反応から発生される発光を提供する、例えば、米国特許第５，０６８，０８８号、同第５，０９３，２６８号、同第５，０６１，４４５号、同第５，２３８，８０８号、同第５，１４７，８０６号、同第５，２４７，２４３号、同第５，２９６，１９１号、同第５，３１０，６８７号、同第５，２２１，６０５号および同第６，６７３，５３３号を参照のこと。ＥＣＬ標識は、一般に、ＴＡＧとも呼ばれる。通常使用されるＥＣＬ標識としては、Ｒｕ含有およびＯｓ含有有機金属化合物、例えば、Ｒｕ（２，２’−ビピリジン）３２＋部分（「Ｒｕｂｐｙ」または「ＴＡＧ１」とも呼ばれる；例えば米国特許５，２３８，８０８号を参照のこと）を含む、金属が例えば第ＶＩＩＩ属貴金属からのものである有機金属化合物が挙げられるが、これらに限定されない。また、ＴＡＧ１およびＲｕｂｐｙの誘導体をＥＣＬ標識として使用することができる。ＥＣＬベースの検出システムは、電気的ポテンシャルを利用して、ＥＣＬ標識を励起させて、光を放出する。一部の実施形態では、検出方法中にシュウ酸塩またはトリプロピルアミンなどの分子を添加し、それにより化学反応が促進され、その結果、ＥＣＬ標識から測定可能な光が放出される。
【０１２８】
ＥＣＬを使用する一定の例示的実施形態では、ビオチンおよび／またはルテニウム（例えば、ＢＶ−ＴＡＧ  ＰｌｕｓまたはＢＶ  ＴＡＧ）修飾タンパク質（例えば、抗体）結合体の調製物を使用し、例えば、ＮＨＳ−エステルビオチンおよびＢＶ−ＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  ＮＨＳエステルまたはＢＶ  ＴＡＧ  ＮＨＳエステルを使用する第一級アミン基（−ＮＨ２）の修飾によってその調製物を得ることができる。一部のＥＣＬ分析器は、電圧を印加したときに（例えば、フローセル内の）その白金電極上のルテニウムにカップリングされた常磁性ビーズから放出される光を検出する。光ダイオード検出器を使用して光を検出し、その強度は、ビーズ表面のルテニウム標識の量に比例する。
【０１２９】
本開示の一部の実施形態において、検出方法（例えば、ＥＣＬベースの方法）は、洗浄工程を、例えば、結合分子の添加後、試料の添加後、またはディテクター分子の添加後に含むことがある。一部の実施形態では、洗浄工程を前記検出方法の各工程後に行う。他の実施形態では、洗浄工程を検出前に最終工程として行い、さらに他の実施形態では、それが唯一の洗浄工程である。洗浄工程を用いて、あらゆる未結合分子／成分、例えば、捕捉結合分子、試料の成分／分子、または標識された検出分子を除去するまたは洗い流すことができる。洗浄工程は、典型的には洗浄緩衝液を使用して行う。一部の実施形態において、洗浄緩衝液としては、界面活性剤、酸、塩基性塩溶液、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０１３０】
加えて、アッセイ試薬、例えば、緩衝液（例えば、試料緩衝液）および／または洗浄緩衝液は、例えば、１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．１）；１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）；０．０３％Ｔｗｅｅｎ−２０；０．０５％  Ｐｒｏｃｌｉｎ  ３００；０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；０．０２５ｍｇ／ｍＬ  ＨＲＢ１；０．５％ウシＩｇＧ（ＢＧＧ）；０．０５ｍｇ／ｍＬ  ＭＡＫ−３３  ＩｇＧ  Ｐｏｌｙ；１５％トレハロース；および２％ＰＥＧを含有する試料緩衝液中に、さらなる分子を含有することがある。
【０１３１】
本開示の方法において使用する試料は、患者からのものであり得、前記方法は、その試料中で検出された５−ＦＵの量に基づいて患者の５−ＦＵ用量を調整する工程をさらに含み得る。例えば、最良の処置転帰（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｕｔｃｏｍｅ）をもたらす結果となる患者の血清／血液中の５−ＦＵの範囲は公知であるか、または決定することができるので、処置を最適化するように患者に与える用量を調整することができる。
【０１３２】
一部の実施形態において、前記アッセイまたは方法は、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏアミド（ＧＰＲＰ−ＮＨ２；配列番号１）の使用を含む。他の実施形態では、ビーズを使用するものなどの特定のアッセイタイプまたは形式に干渉し得るフィブリンネットワークの形成を阻止するために、ＧＰＲＰ−ＮＨ２（配列番号１）を使用する。
【０１３３】
本開示の方法またはアッセイの一定の例示的実施形態は、小体積の試薬を使用して、ならびに一部のケースでは凍結乾燥された第一の結合分子および／もしくはディテクター分子または両方を使用して、小さい試料体積で５−ＦＵを有利に検出することができる。これらの特徴が、前記方法またはアッセイのポイント・オブ・ケア設定での使用を可能にし得る。
【０１３４】
本開示の結合分子は、所望の部位に結合することができる分子であり、抗体、ペプチド、レクチン、アプタマーおよびモノボディー（ＡＤＮＥＣＴＩＮＳ（商標）としても公知）を含むが、これらに限定されない。
【０１３５】
キット
本開示は、様々なキットに一般に関する。前記キットは、前記アッセイまたは方法において使用することができる化合物または試薬、例えば結合分子およびディテクター分子を含み、前記結合分子は抗体であり得る。前記抗体は、本開示に記載するものを含み得る。前記ディテクター分子は、検出標識、例えばＥＣＬ標識を含み得る。一部の実施形態において、前記結合分子および／または前記ディテクター分子は、凍結乾燥状態である。他の実施形態において、前記結合分子およびディテクター分子は、別々に凍結乾燥された組成物に含有される。
【０１３６】
本開示は、試料中の５−ＦＵを検出するためのＥＣＬ検出キットにも、一般に関する。一部の実施形態において、キットは、（ｉ）表面（例えば、ビーズ）に必要に応じて固定化または結合されている結合分子（例えば、抗体）と、（ｉｉ）標識されたディテクター分子とを含み、前記結合分子は、前記ディテクター分子に結合することができ、および５−ＦＵは、前記結合分子の前記ディテクター分子への結合を競合的に阻害する。一部の実施形態では、前記キットを可搬型ＥＣＬ分析器と併用することができる。使用することができるＥＣＬ分析器の例としては、Ｍ−ＳＥＲＩＥＳ（登録商標）ＭＩＭ分析器（ＢｉｏＶｅｒｉｓ、メリーランド州ゲーサーズバーグ）およびＭｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  ＤｉｓｃｏｖｅｒｙのＳｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００、Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ２４００、Ｓｅｃｔｏｒ  ＰＲ  ４００およびＳｅｃｔｏｒ  ＰＲ  １００が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３７】
本明細書に記載する任意の方法または組成物を本明細書に記載する任意の他の方法または組成物について実行できることを企図している。特許請求の範囲および／または本明細書において用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」に関連して用いるときの語「ａ」および「ａｎ」の使用は、「１つの」を意味し得るが、「１つ以上の」、「少なくとも１つの」および「１つまたは１つより多くの」とも一致する。リストに伴って用いるときの用語／句「および／または」の使用は、リストされている用語の１つ以上を利用できることを意味する、例えば、それはそれらの要素の１つまたはすべてに限定されない。
【０１３８】
本明細書において用いる場合、移行句「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、非限定的である。この用語を用いている請求項は、かかる請求項の中で列挙されているものに加えて要素を含有し得る。したがって、例えば、特許請求の範囲は、列挙されている要素またはそれらの等価物が存在する限り、そこに具体的に列挙されていない他の段階も含む方法を包含し得る。
【０１３９】
本明細書中の参考文献の引用または論述は、そのようなものが本発明の先行技術であるという承認と解釈してはならない。本明細書において言及するすべての出版物、特許および特許出願は、本願では、各々の個々の出版物、特許または特許出願が参照により本明細書に援用されていると具体的にかつ個々に示されているのと同程度にそれら全体が参照により本明細書に援用されている。上述の出版物、特許および特許出願のいずれかと共に発表された任意の補足情報も参照により援用されている。例えば、一部の雑誌論文は、概してオンラインで入手できる補足情報とともに発表される。
【実施例】
【０１４０】
以下の実施例は、非限定的でありかつ単に説明のためであることを意図したものである。
【０１４１】
本発明の特定の実施形態を、説明を目的として本明細書に記載してきたが、添付の特許請求の範囲に記載の本発明から逸脱することなく、それらの詳細の非常に多くの変形が可能であることは当業者には理解されるであろう。
【０１４２】
ここに記載する実施例の一部またはすべてを通して、以下の材料および装置を使用した：
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）；Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（Ｓｉｇｍａ）；２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン塩酸塩（ＭＩＴ）（Ｓｉｇｍａ）；Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ３０Ｋフィルタ（１５ｍＬ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）；Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（登録商標）透析カセット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；フロイントアジュバント、不完全および完全（Ｓｉｇｍａ）；ＢＶ−ＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  ＮＨＳエステル（ＢｉｏＶｅｒｉｓ）；ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ２８０−ＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；Ｍｅｇａｔｈｕｒａ  ｃｒｅｎｕｌａｔａ（キーホールリンペット）からのヘモシアニン  ＫＬＨ（Ｓｉｇｍａ）；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｐｌｕｓ  Ａｇａｒｏｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）；５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）およびウラシル（Ｓｉｇｍａ）；５−フルオロジヒドロピリミジン−２，４−ジオン（ＤＨ−５−ＦＵ）（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｓｏｔｏｐｅｓ）；フトラフール（テガフール）（Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ）；ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（１×）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；ＵｌｔｒａＤＯＭＡ無血清ハイブリドーマ培地（Ｌｏｎｚａ）；Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標）Ｒａｐｉｄ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔｓ−Ｍｏｕｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）；ＯＰＩ培地サプリメント−Ｈｙｂｒｉ−Ｍａｘ（商標）（Ｓｉｇｍａ）；ペニシリン−ストレプトマイシン溶液Ｈｙｂｒｉ−Ｍａｘ（商標）（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）（Ｓｉｇｍａ）；ＩＬ−６組換えマウス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；ウシ胎仔血清、超低ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；ウシ胎仔血清（ＡＴＣＣ）；規定された（ｄｅｆｉｎｅｄ）ウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）；Ｌ−グルタミン２００ｍＭ（Ｌｏｎｚａ）；Ｌ−グルタミン−２００ｍＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；ＨＴサプリメント（１００×）、液体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；ＨＡＴサプリメント（５０×）、液体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；ハイブリドーマ・クローニング・サプリメント（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ）；ジメチルスルホキシド−Ｈｙｂｒｉ−Ｍａｘ（商標）（Ｓｉｇｍａ）；ポリエチレングリコール１５００（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）；トリパンブルー溶液−０．４％（Ｓｉｇｍａ）；Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ）；赤血球溶解緩衝液Ｈｙｂｒｉ−Ｍａｘ（商標）（Ｓｉｇｍａ）；Ｍ３８４分析器（ＢｉｏＶｅｒｉｓ）；およびＭ１ＭＲ分析器（ＢｉｏＶｅｒｉｓ）。
【０１４３】
実施例１  ５−ＦＵに基づく免疫原の合成
【０１４４】
【化１４】
2015502356.tif 000015
上に提示したスキームを用いて、本開示の例示的な５−ＦＵに基づく免疫原の１つを合成した。このスキームについての工程は、次のとおりである：
［２ａ］１６ｍＬのジメチルホルムアミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ＃２２７０５６−１００ｍＬ）中の５−フルオロウラシル（［１］、１．８ｇ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ．＃８５８４７１−５Ｇ）の溶液をトリエチルアミン（２．８ｇ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ＃Ｔ０８８６−１Ｌ）と混合し、３０℃で撹拌した。上の混合物にエチル−３−ブロモプロピオナート（２．９５ｇ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ＃１２８１６３−２５Ｇ）を滴下した。得られた混合物を４８時間、室温で撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。残留物を水で取りあげ、酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出した。併せた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。その生成物を、フラッシュカラムによりジクロロメタン中の１〜３％メタノールを利用して精製した。所望の生成物をジクロロメタン／ヘキサンから再結晶させて、２．３ｇの化合物を得た。
【０１４５】
［３ａ］４ｍＬのメタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ＃３２２４１５−２Ｌ）中の［２ａ］（２２０ｍｇ）の溶液に、２０％水酸化カリウム（ＥＭＤ、Ｃａｔ＃ＰＸ１４８０−１１）水溶液（０．４ｍＬ）を添加した。得られた混合物を室温で１２時間撹拌し、濃縮した。残留物を１０ｍＬの水で取りあげ、２Ｎ  ＨＣｌ溶液でｐＨ２〜３に調整した。その混合物を酢酸エチル（３×２０ｍＬ）で抽出した。有機相を併せ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して１９８ｍｇの化合物を得た。
【０１４６】
［４ａ］２０ｍＬのジクロロメタン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ＃２７０９９７−１Ｌ）中の［３ａ］（１９８ｍｇ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（２６０ｍｇ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ＃２２００５１−５Ｇ）との混合物に、  の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ）プロピルカルボジイミド（９００ｍｇ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ．＃Ｅ７７５０−２５Ｇ）を添加した。得られた混合物を１．５時間、室温、アルゴン下で撹拌した。得られた混合物を０．０５Ｎ  ＨＣｌ（２０ｍＬ）、水（２×２０ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して６７ｍｇの化合物を得た。
【０１４７】
［５ａ］キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）の１−３Ｃ−５−ＦＵ−ＮＨＳエステルでの修飾。ＫＬＨを先ず１５ｍＬ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ３０Ｋフィルタで濃縮し、緩衝液を、１０．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４と１３９．５ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４と１５０．６ｍＭ  ＮａＣｌとを含有するリン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．７〜７．９（典型的にはｐＨ７．８）に交換した。その後、ＫＬＨを、ＤＭＳＯに新しく溶解した１−３Ｃ−５−ＦＵ−ＮＨＳを１００：１の負荷比（１−３Ｃ−５−ＦＵ−ＮＨＳのＫＬＨに対するモル比、ＦＷ＝１５０ｋＤ）で用いて修飾した。修飾後、１−３Ｃ−５−ＦＵ−ＫＬＨを透析カセットで緩衝液交換し、１×ＰＢＳ中、−８０℃で保存した。
【０１４８】
実施例２  Ｂａｌｂ／ｃマウスの免疫化（１−３Ｃ−５−ＦＵ−ＫＬＨ結合体を使用するマウスにおける５−ＦＵ抗体の生産）
初回免疫化および追加免疫化のためにそれぞれ完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）に１−３Ｃ−５−ＦＵ−ＫＬＨを乳化させることによって、５−ＦＵ免疫原を調製した。ボルテックスミキサーをその最高速度で用いて１５分間、抗原とアジュバントを混合することによって、エマルジョンを調製した。
【０１４９】
Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫化するために、８匹のマウス各々に、その初回免疫化については２００μＬ中に５０μｇタンパク質とＣＦＡとを含有する２００μＬの免疫原を腹腔内（ＩＰ）注射によって与え、そして追加免疫化については２５μｇタンパク質とＩＦＡを２００μＬで背部の複数の位置への皮下接種によって与えた。初回免疫化に関しては第１日に腹腔内（ＩＰ）注射として１−３Ｃ−５−ＦＵ−ＫＬＨ（フロイントアジュバント、完全）を用いてマウスを免疫化した。第１回から第４回の追加抗原量をそれぞれ第１５、２９、５６および８３日に皮下投与し、この時、１−３Ｃ−５−ＦＵ−ＫＬＨ（フロイントアジュバント、不完全）でマウスを免疫化した。
【０１５０】
実施例３  マウスにおける抗５−ＦＵ抗体応答の分析
この実施例は、５−ＦＵおよび関連化学物質に対する血清５−ＦＵ抗体応答および抗体特異性の分析を記載する。
【０１５１】
血清試料を第２回の追加免疫化後に採取し、１×ＰＢＳと０．５％のＢＳＡと０．３％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０と０．１％  ＭＩＴとを含有する抗体アッセイ緩衝液または５−ＦＵ抗体スクリーン緩衝液の様々な希釈度で分析した。血清試料を「架橋アッセイ（ｂｒｉｄｇｉｎｇ  ａｓｓａｙ）」によって分析し、このアッセイでは抗５ＦＵ抗体の存在が免疫複合体を生じさせ、この免疫複合体は、Ｂｉ−１−３Ｃ−５−ＦＵ−ＢＳＡ、５−ＦＵ抗体およびＴＡＧ  Ｐｌｕｓ−１−３Ｃ−５−ＦＵ−ＢＳＡを含有し、前記抗５−ＦＵ抗体の一方の結合部位へのＢｉ−３Ｃ−５−ＦＵ−ＢＳＡの結合および前記抗体の他方の結合部位へのＴＡＧ  Ｐｌｕｓ−１−３Ｃ−５−ＦＵ−ＢＳＡの結合によって形成される。この免疫複合体を、前記Ｂｉ−１−３Ｃ−５−ＦＵ−ＢＳＡに結合しているＭ２８０−ＳＡビーズにより捕捉することができ、それによってそのＭ２８０−ＳＡビーズにＴＡＧ  Ｐｌｕｓ標識を連結させることができる。
【０１５２】
２００μｇ／ｍＬのＭ２８０−ＳＡビーズ中の１００ｎｇ／ｍＬのＢｉ−１−３Ｃ−５−ＦＵ−ＢＳＡと１００ｎｇ／ｍＬのＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  １−３Ｃ−５−ＦＵとを含有する５−ＦＵ抗体アッセイ試薬マスターミックスを用いて希釈試料を試験した。典型的な実験では、血清試料を先ず前記アッセイ緩衝液で所望の希釈度に希釈し、２５μＬの希釈血清試料を５０μＬの抗体検出マスターミックスと混合し、３０分間、９６ウェルプレートにおいて振盪しながらインキュベートした。そのインキュベーション後、＞２分間にわたりそのプレートにプレート磁石（ＬｉｆｅＳｅｐ（商標）９６Ｆ、Ｄｅｘｔｅｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、６０００７イリノイ州エルク・グローブ・ビレッジ）を付着させ、プレートを素早く反転させて反応マトリックスを除去することにより、Ｍ２８０−ＳＡビーズを回収した。回収したＭ２８０−ＳＡビーズを１５０μＬ希釈液に再懸濁させた。この希釈液は、１．８ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４と、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４と、１２０ｍＭ  ＮａＣｌと、２．７ｍＭ  ＫＣｌと、０．０３３％Ｔｗｅｅｎ２０と、０．１０％ＫＡＴＨＯＮ（登録商標）ＣＧ／ＩＣＰ  ＩＩ（Ｃａｔ：４８１７８−Ｕ、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）とを含有するＰＢＳ系緩衝溶液である。Ｍ１ＭＲまたはＭ３８４  ＥＣＬ分析器のいずれかにおいて９６ウェル標準プロトコルを用いて１００μＬ吸引体積で前記試料のＥＣＬシグナル（ＥＣＬカウント）を読取った。
【０１５３】
競合抗体アッセイ形式を用いて抗体特異性をさらに分析した。これらのアッセイを５−ＦＵおよび５−ＦＵと構造的に関連する他の化学物質の存在下で行った。
【０１５４】
二匹のマウスを、それらの抗５−ＦＵ血清力価、５−ＦＵに対する特異性、ならびにウラシルおよび５−フルオロジヒドロピリミジン−２，４−ジオン（ＤＨ−５−ＦＵ）に対する交差反応性に基づいて、ハイブリドーマ融合のために選択した。
【０１５５】
実施例４  Ｂａｌｂ／ｃマウスの免疫化（１−３Ｃ−５−ＦＵ−ＫＬＨおよび１−５Ｃ−５−ＦＵ−ＫＬＨ結合体を使用するマウスにおける５−ＦＵ抗体の生産）
初回免疫化および追加免疫化のためにそれぞれ完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中で５−ＦＵ−ＫＬＨ結合体１−３Ｃ−５−ＦＵ−ＫＬＨおよび１−５Ｃ−５−ＦＵ−ＫＬＨを乳化させることによって、５−ＦＵ免疫原を調製した。ボルテックスミキサーをその最高速度で１５分間、抗原とアジュバントを混合することによって、またはその混合物を乳化針（ｅｍｕｌｓｉｆｙｉｎｇ  ｎｅｅｄｌｅ）に５０回より多く通過させることによって、エマルジョンを調製した。
【０１５６】
５〜６週齢メスＢａｌｂ／ｃマウスに、典型的には、１回の初回免疫化については２００μＬ中に５０μｇのタンパク質とＣＦＡとを含有する２００μＬの免疫原を腹腔内（ＩＰ）注射によって与え、そして複数の追加免疫化については２５μｇタンパク質とＩＦＡを２００μＬで背部の複数の位置への皮下接種によって与えた。追加免疫化を典型的には初回免疫化の約２週間後に行い、２〜６周間隔で複数回投与した。
【０１５７】
それらのマウスにおけるポリクローナル５−ＦＵ抗体を分析するために、第２回の追加免疫化後に複数の血清試料を採取し、１×ＰＢＳと、０．５％のＢＳＡと、０．３％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０と、０．１％  ＭＩＴとを含有する抗体アッセイ緩衝液での様々な希釈度で分析した。５−ＦＵに対して最高の感度を有する抗体応答を発生させたマウスを選択するために、捕捉された５−ＦＵ特異的抗体を標識抗マウス抗体で検出する典型的な間接的抗体アッセイを含む様々な抗体検出アッセイを用いて、ならびにＥＬＩＳＡおよびＥＣＬ技術、ならびにＥＣＬベースの「架橋アッセイ」を用いて、血清試料を分析した。
【０１５８】
ＥＣＬ技術での間接的抗体検出アッセイについては、２５μＬの希釈血清試料を、先ず、競合化学物質を有するまたは有さない２５μＬのアッセイ緩衝液と混合し、そして次に、５ｎｇの捕捉試薬（これは、前記捕捉試薬は、５μｇの常磁性Ｍ２８０−ストレプトアビジンビーズ（Ｍ２８０−ＳＡビーズ）に事前結合された、３炭素リンカーを有するビオチン化１位修飾５−ＦＵ  ＢＳＡ結合体（Ｂｉ  １−３Ｃ−５−ＦＵ  ＢＳＡ）または５炭素リンカーを有するビオチン化１位修飾５−ＦＵ  ＢＳＡ結合体（Ｂｉ−１−５Ｃ−５−ＦＵ  ＢＳＡ）であった）を含有する２５μＬのアッセイ緩衝液と振盪しながら１０分間インキュベートした。そのインキュベーション後、Ｍ２８０−ＳＡビーズを１５０μＬのアッセイ緩衝液で２回洗浄した。各洗浄中にプレート磁石（ＬｉｆｅＳｅｐ（商標）９６Ｆ、Ｄｅｘｔｅｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、６０００７イリノイ州エルク・グローブ・ビレッジ）を付着させることによってビーズを回収した。Ｍ２８０−ＳＡビーズに結合した５−ＦＵ特異的抗体を、さらに１０分間インキュベートしたアッセイ緩衝液中の１００μＬの０．５μｇ／ｍＬ  ＴＡＧ  Ｐｌｕｓ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ．Ｃａｔ：１１５−００５−０７１）（ＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  ＧＡＭ）で検出した。そのインキュベーション後、ビーズを１回洗浄し、１５０μＬ希釈液に再懸濁させた。この希釈液は、１．８ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４と、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４と、１２０ｍＭ  ＮａＣｌと、２．７ｍＭ  ＫＣｌと、０．０３３％  Ｔｗｅｅｎ２０と、０．１０％  ＫＡＴＨＯＮ（登録商標）ＣＧ／ＩＣＰ  ＩＩ（Ｃａｔ：４８１７８−Ｕ、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）とを含有するＰＢＳ系緩衝液である。Ｍ１ＭＲまたはＭ３８４  ＥＣＬ分析器のいずれかにおいて９６ウェル標準プロトコルを用いて１００μＬ吸引体積で前記試料のＥＣＬシグナル（ＥＣＬカウント）を読取った。
【０１５９】
各試料におけるＥＣＬシグナルは、捕捉試薬結合ビーズに結合した５−ＦＵ抗体に比例し、５−ＦＵおよび５−ＦＵと構造的に関連する化学物質の量に、該抗体が該化学物質に交差反応性である場合、反比例した。５−ＦＵの５０％阻害濃度（５−ＦＵ  ＩＣ５０）を、ＥＣＬアッセイの５０％減少をもたらす濃度と定義した。曲線フィッティングプログラム（ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ  ＧｘＰ  ｖ５．２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｉｎｃ．）において連続希釈５−ＦＵ曲線において抗体反応性を分析することにより、ＩＣ５０値を計算した。より低い５−ＦＵ  ＩＣ５０は、より高い５−ＦＵ抗体感度を反映する。５−ＦＵと構造的に関連する化学物質の抗体交差反応性を、５−ＦＵのＩＣ５０と競合化学物質のＩＣ５０との百分率比と定義した。表１は、５−ＦＵとの５−ＦＵポリクローナル抗体反応性およびテガフールとの交差反応性を要約するものである。
【０１６０】
各群における５匹のマウスからの血清試料の同等の部分から成る、２つのプールされた５−ＦＵポリクローナル抗体を、この間接的ＥＣＬ抗体アッセイでの５−ＦＵに対するそれらの特異性（５−ＦＵ  ＩＣ５０）およびテガフールとの交差反応性のために選択した。３炭素リンカー５−ＦＵ結合体で免疫化したマウスにおいて生じた５−ＦＵ抗体は、１２．４μｇ／ｍＬの５−ＦＵ  ＩＣ５０を有し、これは、５炭素５−ＦＵ結合体でのマウスにおける抗体の５−ＦＵ  ４２０μｇ／ｍＬより実質的に低かった。３炭素リンカー５−ＦＵ結合体で免疫化されたマウスは、テガフールとのはるかに低い交差反応性（１６４％対２９７２％）も有し、したがって、５−ＦＵ抗体応答を惹起するための好ましい免疫原であった。
【０１６１】
【表１】
2015502356.tif 000016
抗体検出用のより迅速かつ簡便なアッセイである「架橋アッセイ」でも抗体応答を分析した。典型的には、２００μｇ／ｍＬのＭ２８０−ＳＡビーズ中の１００ｎｇ／ｍＬのＢｉ−１−３Ｃ−５−ＦＵ−ＢＳＡと１００ｎｇ／ｍＬのＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  １−３Ｃ−５−ＦＵとを含有する５−ＦＵ抗体アッセイ用試薬マスターミックスを用いて、希釈試料を試験した。典型的な実験では、血清試料を、先ず、アッセイ緩衝液で所望の希釈度に希釈し、２５μＬの希釈血清試料を５０μＬの抗体検出マスターミックスと混合し、３０分間、９６ウェルプレートで振盪しながらインキュベートした。そのインキュベーション後、プレート磁石（ＬｉｆｅＳｅｐ（商標）９６Ｆ、Ｄｅｘｔｅｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、６０００７イリノイ州エルク・グローブ・ビレッジ）をプレートに２分未満、付着させ、そのプレートを素早く反転させて反応マトリックスを除去することによって、Ｍ２８０−ＳＡビーズを回収した。回収したＭ２８０−ＳＡビーズを１５０μＬ希釈液に再懸濁させた。
【０１６２】
実施例５  ５−ＦＵ抗体産生ハイブリドーマの生成、スクリーニングおよびアイソタイプ決定
組織培養培地、ＯＰＩ培地サプリメント−Ｈｙｂｒｉ−Ｍａｘ（商標）、を調製するために、１リットルのＤＭＥＭに対して１０ｍＬ滅菌水（０．２ｕｍ濾過Ｈ２Ｏ）でバイアルの内容物を再構成した。マウスＩＬ−６（ｍＩＬ−６）の調製のために、希釈ストックをＤＭＥＭで１００ｎｇ／ｍＬの濃度に調製し、８０℃で保持した。ｍＩＬ−６の最終濃度は、１０ｐｇ／ｍＬであった。５００ｍＬの「基本組織培養培地」を作るために、３９０ｍＬ  ＤＭＥＭ、５ｍＬ  ＯＰＩ、５ｍＬ  Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、５０μＬ  ｍＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍＬ）および５０ｍＬ  ＦＢＳを混合し、０．２μｍフィルタに通して濾過した。ＨＴ培地は、１×ＨＴを補足した基本組織培養培地であった。ＨＡＴ培地は、２×ＨＡＴと２０％のハイブリドーマ・クローニング・サプリメントとを補足した基本組織培養培地であった。細胞凍結培地は、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を補足したＦＢＳから調製した。
【０１６３】
融合パートナーの調製では、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞を＜１×１０６細胞／ｍＬに増殖させて、約１億個の細胞を得た。細胞を複数の５０ｍＬチューブの中で、２００ｇでの３分間の遠心分離によってペレットにした。細胞を５０ｍＬコニカルチューブの中で２０ｍＬの予め温めたＤＭＥＭ培地で３回洗浄した。
【０１６４】
選択されたマウス脾臓を採取し、１０ｍＬの氷冷ＤＭＥＭ中で保存した。１〜２ｍＬの氷冷ＤＭＥＭが入っている１００ｍｍペトリ皿の中で、滅菌シリンジプランジャの平坦な端部を用いてその脾臓組織を裂いて開き、粉砕した。脾細胞懸濁物を含むＤＭＥＭを７０μｍセルストレーナに通して濾過した。脾細胞を４００ｇで５分間の遠心分離によってペレットにした。それらのペレットをほぐし、赤血球（ＲＢＣ）を１ｍＬのＲＢＣ溶解緩衝液で１分間、溶解した。１４ｍＬの氷冷ＤＭＥＭを添加した。細胞を４００ｇで５分間、採取した。１０ｍＬのＤＭＥＭを各チューブに、約１０×１０６細胞／ｍＬの濃度を目標とするように添加した。３０μＬのＤＭＥＭおよび１５μＬの０．４％トリパンブルー（最終希釈度＝１：４）中で１５μＬの細胞懸濁物を混合し、顕微鏡でカウントすることにより、細胞を顕微鏡でカウントした。
【０１６５】
脾細胞およびＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞を５０ｍＬコニカルチューブにおいてＤＭＥＭ培地中１：３から３：１の比で混合し、４００ｇで５分間、遠心分離した。細胞ペレットを乱さないように上清を除去した。そのチューブを穏やかにタッピングし、回旋させることによって、細胞ペレットをほぐした。１．０ｍＬの３７℃  ＰＥＧ  １５００を、ピペットで穏やかに撹拌しながら１．０分にわたって滴下した。ＰＥＧを添加した後、チューブ（ｔｕｂ）にキャップをかぶせ、１．０分間、穏やかに回旋させた。１５ｍＬのＤＭＥＭをそのチューブに、５分にわたっての穏やかな滴下で、一滴ずつゆっくりと添加し、その後、３７℃水浴内で５分間、細胞をインキュベートした。３０ｍＬの温かい基本組織培養培地を穏やかな滴下でゆっくりとそのチューブに添加し、その後、３７℃水浴内で１５分間インキュベートした。その細胞融合懸濁物を４００ｇで５分間、遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットを５０ｍＬ基本組織培養培地に穏やかに再懸濁させた。５０μＬの細胞懸濁物を９６ウェルプレートの各ウェルに移し、その後、一晩、３７℃、５％ＣＯ２組織培養インキュベーターの中に置いた。翌日、５０μＬの２×ＨＡＴ培地を各ウェルに添加し、その後、それらのプレートを組織培養インキュベーターに戻した。各ウェルに５０μＬの１×ＨＡＴ培地を第３および７日に添加し、１００μＬの１ｘＨＴ培地を第９から１１日に添加した。必要な場合には、新たな培地を添加する前に各ウェル内の一定の体積の培地を除去した。
【０１６６】
ハイブリドーマを第１０〜１４日の間、上で説明した５−ＦＵ抗体アッセイ（架橋アッセイ）によって５−ＦＵ抗体の分泌についてスクリーニングした。２５μＬの培養上清をアッセイプレートに移し、２００μｇ／ｍＬのＭ２８０−ＳＡビーズ中の１００ｎｇ／ｍＬの各Ｂｉ−１−３Ｃ−５−ＦＵ−ＢＳＡおよびＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  １−３Ｃ−５−ＦＵ−ＢＳＡを含有する５０μＬの５−ＦＵ抗体アッセイ・マスター・ミックスと混合した。試料を３０分間、振盪しながらインキュベートした。ビーズを回収し、１５０μＬの希釈液に再懸濁させ、Ｍ３８４分析器において１００μＬ吸引体積で読取った。２０％より多い増殖ウェルを有するプレートから同定されたハイブリドーマを、９６ウェルプレートにおいて０．３および１．０細胞／ウェルで制限希釈することによって再クローニングした。
【０１６７】
５−ＦＵ結合について陽性と同定されたハイブリドーマに関して５−ＦＵ抗体特異性および交差反応性を試験した。ハイブリドーマ培養上清を、抗体特異性および交差反応性について、５−ＦＵおよび他の構造的に類似した化学物質（ウラシル、ＤＨ−５−ＦＵおよびテガフールを含む）の存在下での競合アッセイによって試験した。一部の実験では、ハイブリドーマ培養上清を１：５の連続希釈で試験して、後続の競合試験のための最適濃度を決定した。
【０１６８】
典型的には、２５μＬの培養上清を、競合化学物質を有するまたは有さない２００μｇ／ｍＬのＭ２８０−ＳＡビーズ中の１００ｎｇ／ｍＬの各Ｂｉ−１−３Ｃ−５−ＦＵ−ＢＳＡおよびＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  １−３Ｃ−５−ＦＵ−ＢＳＡを含有する５０μＬの５−ＦＵアッセイ・マスター・ミックスと混合した。試料を３０分間インキュベートした。ビーズを回収し、１５０μＬの希釈液に再懸濁させ、Ｍ３８４分析器において１００μＬ吸引体積で読取った。
【０１６９】
Ｘ＿ＲＣＴ＝交差反応（算出５−ＦＵ濃度／１０μｇ／ｍＬ）。ハイブリドーマ２６Ｈ７、２７Ｆ４、２７Ｆ９、３６Ｈ１１、４９Ｄ８、６１Ｃ６および７２Ｂ９は、５−ＦＵに対するより良好な特異性を示し（シグナルが低レベルの５−ＦＵの存在下で減少し）、それらを増幅、および制限希釈によるクローニングのために選択した。
【０１７０】
抗体アイソタイプをＰｉｅｒｃｅ  Ｒａｐｉｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｐｌｕｓ  Ｋａｐｐａ  ａｎｄ  Ｌａｍｂｄａ−Ｍｏｕｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で決定した。ハイブリドーマ細胞系２６Ｈ７および２７Ｆ４についてのアイソタイプおよび軽鎖は、決定できなかった。２７Ｆ９、３６Ｈ１１、４９Ｄ８および７２Ｂ９ハイブリドーマについてのアイソタイプは、ＩｇＧ１であると決定され、すべて、κ軽鎖を有した。６１Ｃ６についてのアイソタイプは、ＩｇＧ２ｂであり、κ軽鎖を有した。
【０１７１】
実施例６  ５−ＦＵ抗体産生ハイブリドーマの生成およびスクリーニング
マウスＢ細胞ハイブリドーマの生成についての一般的な融合プロトコルに従って融合を行った。選択されたレスポンダーからマウス脾臓を採取し、１０ｍＬの氷冷ＤＭＥＭ中で保存した。単離された脾細胞とＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞とをプレーンＤＭＥＭ培地中１：３から３：１の比で混合することによって融合マウスＢ細胞を調製し、１％ＯＰＩ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１０ｐｇ／ｍＬのマウスｒＩＬ−６および１０％ＦＢＳを１ｘのＨＡＴと共に含有するＤＭＥＭ培地中で７〜１０日間、培養した。１ｘＨＴを伴う同じＤＭＥＭ培地をそれらの培養物に供給した。ハイブリドーマを、通常、第１０〜１４日の間、５−ＦＵ抗体の分泌について、前に説明した５−ＦＵ抗体アッセイ（架橋アッセイ）によってスクリーニングした。陽性ハイブリドーマを、典型的には、前記抗体アッセイで１０より大きいシグナルバックグラウンドで同定し、特徴付けし、その後、０．３および１．０細胞／ウェルの制限希釈プレートのうちの、２０％より多い増殖ウェルを有するプレートから単離した。陽性増殖ウェルを増幅させ、培養上清を抗体の特徴付けのために採取した。
【０１７２】
実施例７  ５炭素リンカーに対して３炭素リンカーを有する５−ＦＵ結合体で免疫化したマウスに由来するモノクローナル５−ＦＵ抗体の間接的ＥＬＩＳＡアッセイでの分析
この実験における抗体捕捉試薬は、５−ＦＵの１位が３炭素または５炭素リンカーで修飾されている５−ＦＵ  ＢＳＡ結合体であった。１０．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４と、１３９．５ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４と、１５０．６ｍＭ  ＮａＣｌとを含有するリン酸緩衝食塩水を含有するリン酸緩衝液、＝ｐＨ７．７〜７．９（典型的にはｐＨ７．８）中で１−５Ｃ−５−ＦＵ−ＮＨＳエステルとＢＳＡとを１２：１の負荷比（１−５Ｃ−５−ＦＵ−ＮＨＳ  対  ＢＳＡのモル比）で混合し、室温で１時間以上にわたりインキュベーション（典型的には室温で１時間インキュベーション）することによって、５−ＦＵをＢＳＡに結合体化させた。そのインキュベーション後、未結合１−５Ｃ−５−ＦＵ−ＮＨＳエステルを、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ４−３０Ｋフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃａｔ＃ＵＦＣ８０３０２４）での３回の緩衝液交換によって除去した。５−ＦＵと結合体化しているＢＳＡ（５−ＦＵ−ＢＳＡ）を濃縮し、同じリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）中で保存した。
【０１７３】
１−３Ｃ−５−ＦＵ−ＢＳＡまたは１−５Ｃ−５−ＦＵ−ＢＳＡのいずれかを抗体捕捉試薬として、およびホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体化ヤギ抗マウス抗体を抗体ディテクター試薬として使用して、この間接的抗体ＥＬＩＳＡアッセイ５−ＦＵアッセイを構築した。３，３，５，５−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）をＨＲＰ酵素基質として用いて、５−ＦＵ抗体の結合を検出した。５−ＦＵ  ＥＬＩＳＡアッセイシグナル（ＯＤ４５０）は、５−ＦＵの漸増濃度に比例して減少した。５−ＦＵ  ＩＣ５０およびテガフール交差反応性を、前のセクションにおけるように決定した。
【０１７４】
３炭素リンカー結合体を伴う５−ＦＵ結合体、および５炭素リンカー結合体を伴う５−ＦＵ結合体それぞれで免疫化したマウスから、モノクローナル５−ＦＵ抗体を得た。モノクローナル抗体をそれらの最高の５−ＦＵ感度（例えば、最低の５−ＦＵ  ＩＣ５０）についてスクリーニングした。３炭素および５炭素リンカー結合体で免疫化したマウスにおける５−ＦＵとの選択したモノクローナルの抗体特異性およびテガフールとの交差反応性を表２に要約した。
【０１７５】
３−炭素５−ＦＵ結合体で免疫化したマウスからのモノクローナル抗体は、実質的により低い５−ＦＵ  ＩＣ５０を示した。注目に値することとして、抗体クローン３６Ｈ１１および６１Ｃ６は、約５６〜５７ｎｇ／ｍＬで並外れて低い５−ＦＵ  ＩＣ５０を有し、それぞれ、７．６％および２８％のテガフール交差反応性で検出された。
【０１７６】
表１および表２に提示する結果は、５炭素リンカーではなく、より短いリンカーである３炭素リンカーを有する１位修飾５−ＦＵ結合体が、５−ＦＵに特異的なアッセイ抗体を生産するために好ましい免疫原であることを実証した。この５−ＦＵ結合体は、５−ＦＵに対して感度がよくかつテガフールに対して低い（１２％以下の）交差反応性を有する抗体を生産した。
【０１７７】
【表２】
2015502356.tif 000017
テガフールに加えて、幾つかの５−ＦＵと構造的に関連する化学物質も、３炭素リンカーを有する５−ＦＵ結合体を用いて産生された抗体に対するそれらの交差反応性について評価し、下の表３に要約した。殆どの抗体は、テガフールを除き、ＤＨ−５−ＦＵ、ウラシル、シトシンおよびチミンと有意に交差反応性ではなかった（例えば、＜１０％交差反応性を有した）。しかし、抗体３６Ｈ１１は、５−ＦＵに対して特異性が高く、テガフールとの約１２％もしくはそれより小さい交差反応性が検出された。
【０１７８】
【表３】
2015502356.tif 000018
実施例８  ５−ＦＵ結合体のリンカー長を選択することによる５−ＦＵアッセイ感度およびダイナミックレンジの調整
ある５−ＦＵ結合体を用いて産生された５−ＦＵ抗体は、典型的に、異なるリンカーを有する異なる５−ＦＵ結合体と様々な程度に反応性である。ある５−ＦＵ抗体は、異なる５−ＦＵ結合体に対してより高い感度を有することもあり、またはより低い感度を有することもある。５−ＦＵ抗体は、通常、より短いリンカーを有する５−ＦＵ結合体を用いるとより高いアッセイ感度を有し、およびより希釈された試料の検出により望ましいだろう。逆に、例えば未希釈試料に関しては、より長いリンカーを有する５−ＦＵ結合体は、より高い５−ＦＵ濃度の検出により適しているだろう。５−ＦＵ抗体のパネルの様々な５−ＦＵ反応性を間接的ＥＬＩＳＡによって決定し、表４に要約した。
【０１７９】
【表４】
2015502356.tif 000019
すべてのモノクローナル抗体は、５炭素リンカーでより低いＩＣ５０を有したクローン４９Ｄ８を除き、より長いリンカー（５炭素）で１．７から４．８倍増加にわたるより高い５−ＦＵ  ＩＣ５０を呈示した。それにもかかわらず、５−ＦＵアッセイ感度およびダイナミックレンジを、様々な長さを有するリンカーを選択することによって調整することができる。
【０１８０】
実施例９  ＥＣＬアッセイによる５−ＦＵ検出のための抗体６１Ｃ６の試験
５−ＦＵ抗体スクリーン緩衝液およびヒトヘパリンリチウム血漿中で作成した５−ＦＵ曲線の性能に基づき、ＥＣＬアッセイにおいて５−ＦＵ抗体をアッセイ捕捉試薬およびアッセイディテクター試薬として評価した。キャリブレーター曲線は、ヘパリンＬｉ中のチャコール処理ヒト血漿を使用して作成した。すべての精製抗体をＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  ＮＨＳエステルと１５：１の負荷比でおよびＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンと１０：１の負荷比で結合体化させた。
【０１８１】
ビオチン化５−ＦＵ  ＢＳＡ事前結合Ｍ２８０−ＳＡビーズを用いて捕捉試薬を評価することに加えて、この実験により、Ｍ２７０−アミンビーズに共有結合で結合体化させた５−ＦＵも捕捉試薬として評価した。
【０１８２】
別段の具体的な言及がない限り、同体積の試料を先ずは捕捉試薬と、そしてその後、ディテクター試薬と９６ウェルプレートにおいて混合することによって、５−ＦＵイムノアッセイを構成した。試薬を添加した後、試料を５分間、室温で振盪しながら混合した。そのインキュベーション後、プレート磁石を２分間、アッセイプレートに付着させ、１５０μＬの希釈液に再懸濁させることによって、ビーズを回収した。試料を、９６標準ラウンド・プレート・プロトコルに従って１００μＬ吸引体積で、Ｍ３８４分析器において読取るか、Ｍ１ＭＲ分析器において読取った。
【０１８３】
アッセイディテクター試薬としてのＴＡＧ  Ｐｌｕｓ結合体化抗体６１Ｃ６の性能を研究した。アッセイ性能を５−ＦＵ抗体スクリーニング緩衝液中で、５−ＦＵキャリブレーター（試料）として１５０μｇ／ｍＬから９．６ｎｇ／ｍＬの５倍５−ＦＵ連続希釈曲線を用いて評価した。
【０１８４】
合計５つの捕捉試薬をこの実験で評価した。３つの捕捉試薬は、１ｍｇのビーズ（２００μｇ／ｍＬ）につき１．０μｇの捕捉試薬の比でＭ２８０−ＳＡビーズに事前結合させたＢｉ−１−３Ｃ−５−ＦＵ−ＢＳＡ、Ｂｉ−１−５Ｃ−５−ＦＵ−ＢＳＡおよびＢｉ−３−５Ｃ−５−ＦＵ−ＨＳＡを含む、ビオチン化ＢＳＡを介してＭ２８０−ＳＡビーズに結合されている５−ＦＵであった。他の２つの捕捉試薬は、２００μｇ／ｍＬの最終濃度になるように緩衝液中のＭ２７０アミンビーズに５−ＦＵを直接結合体化させた、１−５Ｃ−５−ＦＵ−Ｍ２７０および１−３Ｃ−５−ＦＵ−Ｍ２７０であった。
【０１８５】
使用したアッセイディテクター試薬は、２．０μｇ／ｍＬの濃度でのＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  ５−ＦＵ  ｍＡｂ  ６１Ｃ６であった。アッセイを次のように行った：２５μＬの捕捉試薬を各ウェルに添加した。２５μＬの５−ＦＵキャリブレーター（試料）を各ウェルに添加し、捕捉試薬とともに短時間混合した。混合された試料および捕捉試薬に２５μＬのディテクター試薬を添加した。そのプレートを５分間、ＭｉｃｒｏＭｉｘ  ５シェーカーにおいてＦｏｒｍ８およびＡｍｐ６で振盪しながらインキュベートした。ビーズを回収し、１５０μＬ希釈液に再懸濁させた。そのプレートをＭ３８４  ＥＣＬ分析器において１００μＬの吸引体積で９６標準プレートプロトコルに従って読取った。
【０１８６】
同じ５−ＦＵキャリブレーター曲線を、ＴＡＧ  Ｐｌｕｓ結合体化抗体とペアにした各捕捉試薬を捕捉試薬として用いて試験した。ディテクター抗体としてのＴＡＧ  Ｐｌｕｓ結合体化６１Ｃ６抗体と各５−ＦＵアッセイ捕捉試薬のために２つのアッセイプレートを設定した。
【０１８７】
各キャリブレーター曲線（例えば、事前結合ビーズまたは結合体化Ｍ２７０ビーズのいずれかを伴うもの）の平均シグナルおよび％ＴＢ（全結合の百分率＝５−ＦＵ濃度によるシグナル／緩衝液中でのシグナル）を評価した。抗体ｍＡｂ  ６１Ｃ６と、捕捉試薬としてのＢｉ−１−５Ｃ−５−ＦＵ−ＢＳＡ事前結合Ｍ２８０−ＳＡビーズを用いて、９．６および４８ｎｇ／ｍＬの５−ＦＵで高い％ＴＢを示した結果は、ＥＣＬ分析器Ｍ３８４の限界を超える、より高いシグナルを生じさせた、過剰量のディテクター抗体に起因する可能性が高かった。
【０１８８】
実験の１つは、１位ではなく３位が修飾されている５−ＦＵ誘導体である３−５Ｃ−５−ＦＵ−ＨＳＡを捕捉抗体として使用した。しかし、６１Ｃ６抗体は、この３位修飾５−ＦＵに対して反応性であった。実施例５において選択した他の抗体も３−５Ｃ−５−ＦＵ−ＨＳＡと様々なレベルに反応性であった。
【０１８９】
一部のキャリブレーターは、１−５Ｃ−５−ＦＵ−Ｍ２７０を用いる実験においてｍＡｂ  ６１Ｃ６により％ＴＢ増大を呈示した。これは、その最適濃度を超える抗体濃度に起因する可能性が高い。
【０１９０】
抗体６１Ｃ６は、アッセイ捕捉試薬としての１位修飾５−ＦＵ誘導体と３位修飾５−ＦＵ誘導体の両方に関して十分なアッセイ感度を一貫して実証した。
【０１９１】
実施例１０  ｍＡｂ  ６１Ｃ６のアッセイ性能
この実施例は、ｍＡｂ  ６１Ｃ６でのアッセイ性能の評価を説明するものである。前記アッセイ性能を、プールされたヒトヘパリンリチウム血漿（血漿）において評価した。ヘパリンＬｉ中のチャコール処理ヒト血漿を使用して、キャリブレーター曲線を作成した。５−ＦＵキャリブレーター曲線は、１５０μｇ／ｍＬから９．６ｎｇ／ｍＬの血漿中の５倍５−ＦＵ連続希釈曲線であった。試験する化学物質をその血漿にスパイクして１０μｇ／ｍＬの最終濃度にした。捕捉試薬は、２００μｇ／ｍＬ（２５μＬ／ウェル）の最終濃度になるように５ＦＵ抗体スクリーン緩衝液に再懸濁させた１−５Ｃ−５ＦＵ−Ｍ２７０ビーズであった。ディテクター試薬は、５−ＦＵ抗体スクリーン緩衝液中のＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  ｍＡｂ  ６１Ｃ６（０．５μｇ／ｍＬ）であった。
【０１９２】
２５μＬの捕捉試薬を各ウェルに添加した。２５μＬの試料、５−ＦＵキャリブレーターまたは競合化学物質、を各ウェルに添加し、捕捉試薬とともに短時間混合した。その混合された試料および捕捉試薬に２５μＬのディテクター試薬を添加した。そのプレートを５分間、ＭｉｃｒｏＭｉｘ５シェーカーで振盪しながらインキュベートした。そのプレートをＭ１ＭＲ分析器において１００μＬの吸引体積で９６標準プレートプロトコルに従って読取った。
【０１９３】
データを、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏデータ解析ソフトウェアパッケージの内蔵５パラメータ曲線フィッティング・アルゴリズム・プログラムで解析した。キャリブレーター％ＴＢは、Ｃａｌ１（０．０ｎｇ／ｍＬ  ５−ＦＵ）シグナル（アッセイバックグラウンド）で割ったキャリブレーターシグナルの比であった。検出下限（ＬＤＬ）は、２４のＣａｌ１反復物の２×標準偏差を引いた２４のＣａｌ１反復物の平均シグナルの５−ＦＵ濃度であった。ＬＤＬは、２．７ｎｇ／ｍＬであると決定した。
【０１９４】
実施例１１  ５−ＦＵの存在および不在下での５−ＦＵに構造的に類似した化学物質に対するおよび選択化学療法薬に対する抗体６１Ｃ６の交差反応性
化学物質および化学療法薬に対するｍＡｂ  ６１Ｃ１の交差反応をヒト血漿において５−ＦＵ不在下および目標４００ｎｇ／ｍＬの５−ＦＵ存在下で試験した。構造的に類似した化学物質および化学療法薬に対する交差反応性をそれぞれ１０μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬで試験した。
【０１９５】
臨床および実験室の標準機関（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）は、「干渉物質の交差反応性を、治療範囲の上限付近の濃度の分析物の不在下および存在下両方で試験すべきである」と推奨している（ＥＰ０７Ａ２の７２頁）。
【０１９６】
交差反応性の計算は、次の方程式で示される：
％交差反応性＝１００×（測定値−真の値）÷（干渉物質の濃度）  。
【０１９７】
次のものは、実施例の一部で使用したアッセイ試薬である。捕捉試薬：１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）と、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）と、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と、０．５％ウシＩｇＧ（ＢＧＧ）と、０．１％２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン塩酸塩（ＭＩＴ）と、０．３３％  Ｂｒｉｊ−３５と、０．０５ｍｇ／ｍＬ  ＭＡＫ−３３  ＩｇＧ  Ｐｏｌｙ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）と、０．０２５ｍｇ／ｍＬ  ヘテロ親和性ブロッキング試薬−１（ＨＲＢ−１、Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｉｎｃ．、９２０７１カリフォルニア州サンティー）とを含有する抗体希釈液中の２５０μｇ／ｍＬの１−５Ｃ−５−ＦＵ−Ｍ２７０（３０μＬ／ウェル）。ディテクター試薬：抗体希釈液中の１．５μｇ／ｍＬ  ＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  ｍＡｂ６１Ｃ６（３０μＬ／ウェル）。５−ＦＵキャリブレーター曲線は、９．６ｎｇ／ｍＬから１５０μｇ／ｍＬにわたるヘパリンリチウム中のチャコール処理ヒト血漿での５−ＦＵの１：５連続希釈であった。
【０１９８】
それぞれ１０および１００μｇ／ｍＬの化学物質および化学療法薬のアッセイ試料を、５−ＦＵなし、および５−ＦＵあり（４００ｎｇ／ｍＬ  目標濃度）の同じヒト血漿にスパイクした。
【０１９９】
交差反応性について試験した化学物質および化学療法薬は、次のものを含んだ：ＤＭＳＯ中の１．０ｍｇ／ｍＬ  テガフール（Ｔｅｇ）；ＤＭＳＯ中の１．０ｍｇ／ｍＬ  カペシタビン（Ｃａｐ）；１．０ｍｇ／ｍＬ  ウラシル（Ｕｒｃ）ＤＭＳＯ；ＤＭＳＯ中の１．０ｍｇ／ｍＬ  ＤＨ５ＦＵ；１．０ｍｇ／ｍＬ  ウリジン（Ｕｒｄ）Ｈ２Ｏ；Ｈ２Ｏ中の１．０ｍｇ／ｍＬ  チミン；１．０ｍｇ／ｍＬ  チミジン（Ｔｈｙｍｄ）Ｈ２Ｏ；１０ｍｇ／ｍＬ  フォリン酸（ＦｏｌＡ）Ｈ２Ｏ；１０ｍｇ／ｍＬ  オキサリプラチン（Ｏｘｐ）Ｈ２Ｏ；１０ｍｇ／ｍＬ  イリノテカン（Ｉｒｔ）ＤＭＳＯ；１０ｍｇ／ｍＬ  メトトレキサート（Ｍｔｘ）ＤＭＳＯ；および１０ｍｇ／ｍＬ  シスプラチン（Ｃｓｐ）ＤＭＳＯ。
【０２００】
３０μＬのアッセイ試料および５−ＦＵキャリブレーターをプレートに添加し、続いて３０μＬの捕捉試薬を添加した。ＭｉｃｒｏＭｉｘ  ５シェーカーをＦｏｒｍ  ８およびＡｍｐ  ６で用いて振盪しながら６０秒間そのプレートをインキュベートし、その後、３０μＬのディテクター試薬を添加した。ＭｉｃｒｏＭｉｘ  ５シェーカーをＦｏｒｍ  ８およびＡｍｐ  ６で用いて振盪しながら６分間そのプレートをインキュベートした。ビーズを回収し、１５０μＬ希釈液に再懸濁させた。そのプレートを、Ｍ１ＭＲ分析器において１００μＬの吸引体積で９６標準プレートのためのプロトコルに従って読取った。
【０２０１】
【表５】
2015502356.tif 000020
５−ＦＵあり、およびなしでこの実験において決定したテガフール、ウラシル、ＤＨ−５−ＦＵおよびカペシタビンに対する交差反応性は、実施例５における結果に匹敵した。ウリジン、チミンおよびチミジンに対する交差反応性は、５−ＦＵあり、およびなしで１．０％未満であった。フォリン酸、オキサリプラチン、イリノテカン、メトトレキサートおよびシスプラチンを含む１００μｇ／ｍＬの化学療法薬に対する交差反応性は、５−ＦＵあり、およびなしで本質的に検出不能であった。テガフールに対する交差反応性は、このアッセイが、主として、テガフールを含有しない試料において５−ＦＵを検出するために用いられる場合、重要ではない。例えば、このアッセイは、テガフールの投与を受けなかった患者からの試料中の５−ＦＵについて試験するために用いられる。
【０２０２】
試験した化学物質および化学療法薬に対する抗体６１Ｃ６についての交差反応性プロフィールは、５−ＦＵ検出アッセイに許容され得る。
【０２０３】
実施例１２  ５−ＦＵアッセイ形式、試料混合順序、アッセイインキュベーション時間設定およびアッセイ試薬濃度の評価
この実施例では、２５、３０、４０および５０μＬを含む様々なアッセイ試料、捕捉およびディテクター試薬体積で５−ＦＵアッセイを構成したが、試料、捕捉およびディテクター試薬体積を１実験内で同一に保った。アッセイインキュベーション後、プレート磁石を２分間、アッセイプレートに付着させ、１５０μＬの希釈液に再懸濁させることによって、ビーズを回収した。試料を、９６標準ラウンドプレートプロトコルの１００μＬ吸引体積で、Ｍ３８４分析器において読取るか、Ｍ１ＭＲ分析器において読取った。
【０２０４】
アッセイディテクター試薬としてＴＡＧ  Ｐｌｕｓ結合体化５−ＦＵ−ＢＳＡおよびＴＡＧ−Ｐｌｕｓ−５−ＦＵ、ならびにアッセイ捕捉試薬としてｍＡｂ  ６１Ｃ６での、５−ＦＵアッセイ性能を、次のように評価した：５−ＦＵキャリブレーター曲線は、１５０μｇ／ｍＬから９．６ｎｇ／ｍＬのヒトヘパリンリチウム血漿中で作成した５倍連続希釈曲線であった。ヘパリンＬｉ中のチャコール処理ヒト血漿を使用して、キャリブレーター曲線を作成した。捕捉試薬は、１２５μｇ／ｍＬの最終濃度になるように５−ＦＵ抗体スクリーン緩衝液に再懸濁させた、Ｂｉ−ｍＡｂ  ６１Ｃ６事前結合Ｍ２８０−ＳＡビーズ（Ｍ２８０−ＳＡビーズ１ｍｇにつき５．０μｇの抗体）（３０μＬ／ウェル）であった。試験したディテクター試薬は、ＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  １−５Ｃ−５−ＦＵ、ＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  １−５Ｃ−５−ＦＵ−ＢＳＡおよびＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  １−３Ｃ−５−ＦＵ−ＢＳＡであった。
【０２０５】
３０μＬの試料を各ウェルに添加し、短時間、３０μＬの捕捉試薬と混合した。その混合された試料および捕捉試薬に３０μＬのディテクター試薬を添加した。そのプレートを、ＭｉｃｒｏＭｉｘ  ５シェーカーにおいてＦｏｒｍ  ８およびＡｍｐ  ６で振盪しながら５分間インキュベートした。ビーズを回収し、１５０μＬ希釈液に再懸濁させた。そのプレートをＭ３８４  ＥＣＬ分析器において１００μＬの吸引体積で９６標準プレートのためのプロトコルに従って読取った。
【０２０６】
３炭素および５炭素エチル鎖リンカーを有する漸増濃度のＴＡＧ  Ｐｌｕｓ結合体化５−ＦＵ−ＢＳＡを用いてアッセイを行った。
【０２０７】
ディテクター試薬としてＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  １−３Ｃ−５−ＦＵ  ＢＳＡを使用する有効な５−ＦＵの検出範囲は、おおよそ９．６から３０，０００ｎｇ／ｍＬであった。９．６ｎｇ／ｍＬの５−ＦＵでの％ＴＢは、０．５、０．７５および１．０μｇ／ｍＬのＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  １−３Ｃ−５−ＦＵ−ＢＳＡでそれぞれ７０％、７５％および７８％であった。これは、低いディテクター濃度ほど高い感度を有することを示唆する。
【０２０８】
ＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  １−５Ｃ−５−ＦＵ  ＢＳＡでの全体的なアッセイ性能は、ＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  １−３Ｃ−５−ＦＵ  ＢＳＡのものに類似していた。９．６ｎｇ／ｍＬの５−ＦＵでの％ＴＢは、０．５、０．７５および１．０μｇ／ｍＬのＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  １−５Ｃ−５−ＦＵ−ＢＳＡでそれぞれ８２％、８７％および８８％であった。これは、低いディテクター濃度ほど高いアッセイ感度を有することを示唆する。
【０２０９】
ＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  １−５Ｃ−５−ＦＵ（直接５炭素リンカーを介してＴＡＧ  Ｐｌｕｓに結合体化している５−ＦＵ誘導体）での全体的なアッセイ感度は、ＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  １−５Ｃ−５−ＦＵ  ＢＳＡおよびＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  １−３Ｃ−５−ＦＵ  ＢＳＡでのアッセイより低かった。０．０５０および０．１０μｇ／ｍＬでのより低い濃度のＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  １−５Ｃ−５−ＦＵが、５−ＦＵを検出する上でより感度が良かった。このアッセイディテクター試薬は、４８ｎｇ／ｍＬで５−ＦＵを検出することができた。他の点では、ＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  １−３Ｃ−５−ＦＵ  ＢＳＡは、低いディテクター濃度ほど高いアッセイ感度を有するという、より好適な結果を示した。
【０２１０】
ｍＡｂ  ６１Ｃ６をアッセイ捕捉試薬として使用し、およびＴＡＧ  Ｐｌｕｓと直接結合体化しているか担体タンパク質を介して結合体化している５−ＦＵをディテクター試薬として使用して、５−ＦＵを検出することは、有効であった。抗体６１Ｃ６を捕捉試薬として使用し、およびｍＡｂ  ６１Ｃ６をディテクター試薬として使用して、同様のアッセイ性能を得た。
【０２１１】
実施例１３  ５−ＦＵアッセイ・ディテクター・インキュベーション時間設定
アッセイシグナルは、第一のアッセイインキュベーション時間設定を１分から４分に延長したときにわずかに減少することが明らかになった。この実験により、３分から１５分の第二のアッセイインキュベーション時間設定を評価した。
【０２１２】
５−ＦＵキャリブレーターは、プールされたヒトヘパリンリチウム血漿（４０μＬ／ウェル）にスパイクされた５−ＦＵを含んだ。ヘパリンＬｉ中のチャコール処理ヒト血漿を使用してキャリブレーター曲線を作成した。使用した捕捉試薬は、１２５μｇ／ｍＬの最終濃度になるように抗体希釈液に再懸濁させた、事前結合されたＢｉ  １−５Ｃ−５−ＦＵ  ＢＳＡ（Ｍ２８０−ＳＡビーズ１ｍｇにつき２．０μｇのＢｉ  １−５Ｃ−５−ＦＵ  ＢＳＡ）（４０μＬ／ウェル）であった。使用したディテクター試薬は、抗体希釈液中の０．５μｇ／ｍＬのＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  ６１Ｃ６（４０μＬ／ウェル）であった。
【０２１３】
捕捉試薬を、先ず、５−ＦＵキャリブレーターと混合し、３０秒間、振盪しながらインキュベートした（第一のインキュベーション）。その第一のインキュベーション後、ディテクター試薬をその混合物に添加し、３から１５分の追加のインキュベーションのためにインキュベートした（第二のインキュベーション）。そのインキュベーション後、ビーズを１２０μＬの希釈液で２回洗浄し、１２０μＬの希釈液に再懸濁させた。そのプレートを、Ｍ１ＭＲ分析器において７０μＬの吸引体積で９６標準プレートのためのプロトコルに従って読取った。
【０２１４】
それらの結果により、１つのキャリブレーター（１５０，０００  ５−ＦＵ  ｎｇ／ｍＬでのＣａｌ８）を除き、第二のインキュベーション時間が延びるにつれてアッセイシグナルが増加することが明らかになった。５−ＦＵなしの緩衝液中の全結合のパーセント（％ＴＢ）は、より長いインキュベーション時間による影響を受けないようであった。これは、５−ＦＵアッセイには３分のインキュベーションで十分であることを示す。
【０２１５】
実施例１４  ５−ＦＵアッセイの様々なパラメータの試験の要約
アッセイシグナルは、０．５〜１．２μｇ／ｍＬへのディテクター抗体濃度に比例して増加した。それらの結果は、５−ＦＵ分析物が、少なくとも４時間、氷上の抗体スクリーン緩衝液中およびヒトヘパリンＬｉ血漿中で安定していること、ならびに５−ＦＵディテクターＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  ｍＡｂ  ６１Ｃ６が、少なくとも４日間、２〜８℃で、抗体希釈液中で安定していることを実証した。
【０２１６】
捕捉試薬１−５Ｃ−５−ＦＵ−Ｍ２７０ビーズは、２〜８℃で少なくとも４０時間、安定しているように見えた。抗体６１Ｃ６での５−ＦＵアッセイ性能の研究からの結果は、７分未満で得られ、抗体６１Ｃ６での５−ＦＵアッセイが１０〜３０，０００ｎｇ／ｍＬのダイナミックレンジ、およびＬＤＬ＜５．０ｎｇ／ｍＬを有することを示した。その機能性感度は、おおよそ１０ｎｇ／ｍＬ（これは、キャリブレーター曲線に基づく機能性感度の推定値である）であると決定された。抗体６１Ｃ６での５−ＦＵアッセイは、ウラシル、ＤＨ−５−ＦＵ、カペシタビン、ウリジン、チミン、チミジン、フォリン酸、オキサリプラチン、イリノテカン、メトトレキサート、シスプラチンおよび５−エチニルウラシルに対して３．０％未満の交差反応性、ならびにテガフールに対して１２％未満の交差反応性を有した。
【０２１７】
実施例１５  様々な５−ＦＵアッセイのための試薬の合成および調製
１−５Ｃ−５−ＦＵ−ＢＳＡの調製
１０．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４と、１３９．５ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４と、１５０．６ｍＭ  ＮａＣｌとを含有するリン酸緩衝食塩水を含有するリン酸緩衝液、＝ｐＨ７．７〜７．９（典型的にはｐＨ７．８）中で１−５Ｃ−５−ＦＵ−ＮＨＳエステルとＢＳＡを１２：１の負荷比（１−５Ｃ−５−ＦＵ−ＮＨＳ  対  ＢＳＡのモル比）で混合し、室温で１時間以上にわたりインキュベーション（典型的には室温で１時間インキュベーション）することによって、５−ＦＵを先ずＢＳＡに結合体化させた。そのインキュベーション後、未結合１−５Ｃ−５−ＦＵ−ＮＨＳエステルを、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ４−３０Ｋフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃａｔ＃  ＵＦＣ８０３０２４）での３回の緩衝液交換によって除去した。５−ＦＵと結合体化しているＢＳＡ（５−ＦＵ−ＢＳＡ）を濃縮し、同じリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）中で保存した。
【０２１８】
ビオチン１−５Ｃ−５−ＦＵ−ＢＳＡ（Ｂｉ−５Ｃ−５−ＦＵ−ＢＳＡ）を調製するために、５−ＦＵ−ＢＳＡを、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン、Ｎｏ−Ｗｅｉｇｈｔ  Ｆｏｒｍａｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ＃２１３２７）とともに１０：１の負荷比（ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン  対  １−５Ｃ−５−ＦＵ−ＢＳＡのモル比）で、ｐＨ７．８リン酸緩衝液中で１時間より長く、室温でインキュベートした。そのインキュベーション後、未結合ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンを、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ４−３０Ｋフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃａｔ＃  ＵＦＣ８０３０２４）での、３７．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４と、１１２．５ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４と、１５０．６ｍＭ  ＮａＣｌと、０．１０％  ２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン塩酸塩（ＭＩＴ）とを含有するｐＨ７．２リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）への３回の緩衝液交換によって除去した。
【０２１９】
ＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  １−５Ｃ−５−ＦＵ−ＢＳＡを調製するために、５−ＦＵ−ＢＳＡを、ＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  ＮＨＳエステルとともに１２：１の負荷比（ＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  ＮＨＳエステル  対  １−５Ｃ−５−ＦＵ−ＢＳＡのモル比）で、ｐＨ７．８リン酸緩衝液中で典型的には１時間、室温でインキュベートした。そのインキュベーション後、未結合ＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  ＮＨＳエステルを、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ４−３０Ｋフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃａｔ＃  ＵＦＣ８０３０２４）での、３７．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４と、１１２．５ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４と、１５０．６ｍＭ  ＮａＣｌと、０．１０％  ２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン塩酸塩（ＭＩＴ）とを含有するｐＨ７．２リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）への３回の緩衝液交換によって除去した。
【０２２０】
ＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  １−３Ｃ−５−ＦＵ−ＢＳＡおよびビオチン  １−３Ｃ−５−ＦＵ−ＢＳＡ（Ｂｉ−１−３Ｃ−５−ＦＵ−ＢＳＡ）の調製は、ＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  １−５Ｃ−５−ＦＵ−ＢＳＡおよびビオチン１−５Ｃ−５−ＦＵ−ＢＳＡの調製に類似していた。１−３Ｃ−５−ＦＵ−ＮＨＳエステルをＢＳＡとともにインキュベートすることによって、３炭素リンカーを有する５−ＦＵを、先ず、ＢＳＡに結合体化させた。次に、その１−３Ｃ−５−ＦＵ−ＢＳＡをＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  ＮＨＳエステルと、およびＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンと、それぞれ１２：１および１０：１の負荷比で結合体化させた。
【０２２１】
ＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  ３−５Ｃ−５−ＦＵ−ＨＳＡおよびビオチン３−５Ｃ−５−ＦＵ−ＨＡＳ（Ｂｉ−３−５Ｃ−５−ＦＵ−ＨＡＳ）の調製は、ＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  １−５Ｃ−５−ＦＵ−ＢＳＡおよびビオチン１−５Ｃ−５−ＦＵ−ＢＳＡについて説明したのと本質的に同じであった。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を先ず５−ＦＵ  ３位修飾ＮＨＳエステル（３−５Ｃ−５−ＦＵ  ＮＨＳエステル）と結合体化させたこと、および３−５Ｃ−５−ＦＵ−ＢＳＡをＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンおよびＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  ＮＨＳエステルでさらに修飾したことを除く。
【０２２２】
Ｂｉ−１−３Ｃ−５−ＦＵ−ＢＳＡ、Ｂｉ−１−５Ｃ−５−ＦＵ−ＢＳＡおよびＢｉ−３−５Ｃ−５−ＦＵ−ＨＳＡ（ビオチン化５−ＦＵ結合体化血清アルブミンまたはビオチン化タンパク質）事前結合ビーズを調製するために、１．０ｍｇ  Ｍ２８０−ＳＡビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を５−ＦＵ抗体スクリーン緩衝液または抗体希釈剤中で２．０μｇ  ビオチン化タンパク質とともに１時間を超えて室温でインキュベートした。そのインキュベーション後、Ｍ２８０−ＳＡビーズを１．０ｍｇ／ｍＬのビーズ濃度で再懸濁させ、同じ緩衝液で３回洗浄した。
【０２２３】
【化１５】
2015502356.tif 000021
１−５Ｃ−５−ＦＵ−Ｍ２７０ビーズおよび１−３Ｃ−５−ＦＵ−Ｍ２７０ビーズを調製するために、次のスキームに従った。［６ｃ］Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２７０  Ａｍｉｎｅ（１５ｍｇ、５００ｕＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ＃１４３０７Ｄ）を１．５ｍＬマイクロチューブにピペットで移し、３×１０００μＬの０．２Ｎ炭酸−重炭酸（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ＃２８３８２）緩衝液（ｐＨ９．４）で洗浄し、０．７５ｍＬの炭酸−重炭酸緩衝液に懸濁させた。［４］（０．２５ｍＬの無水Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド中１２ｍｇ）の溶液を前処理したビーズに添加し、得られた混合物を室温で４時間、振盪した。磁石下で上清を除去し、１×１０００μＬのＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドおよび２×１０００μＬのＰＢＳＴ緩衝液で洗浄した。得られたビーズを５００μＬのＰＢＳＴ緩衝液で再構成した。［６ｄ］［６ｃ］に関して説明したのと同じ手順を［６ｄ］の調製に用いた。
【０２２４】
ＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  １−３Ｃ−５−ＦＵの調製のためのスキームは、次のとおりであった：
【０２２５】
【化１６】
2015502356.tif 000022
［４ｂ］６０ｍＬのジクロロメタン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ＃２７０９９７−１Ｌ）中の［３ａ］（３５０ｍｇ）の混合物に、アルゴン下でＮ−Ｂｏｃ−２，２’−（エチレンジオキシ）ジエチルアミン（３７６ｍｇ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ＃８９７６１−１Ｇ）を添加した。ジシクロヘキシルカルボジイミド（３１５ｍｇ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ＃Ｄ８０００２−２５Ｇ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１８６ｍｇ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ＃３６２４４１−５０Ｇ）を上記混合物に添加した。得られた混合物を室温、アルゴン下で一晩撹拌した。完了したら、その混合物を濃縮し、ジクロロメタン中の０〜３％メタノールを溶離液として利用してフラッシュカラムで精製して、６００ｍｇの生成物を得た。
【０２２６】
［５ｂ］ジクロロメタン（２ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ＃２７０９９７−１Ｌ）中の［４ｂ］（５６ｍｇ）に、２ｍＬのトリエチルアミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ＃Ｔ０８８６−１Ｌ）を添加した。得られた混合物を室温で３時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。２×３０ｍＬのジクロロメタン（１％トリエチルアミンを含有）を添加し、溶媒を減圧下で除去して５０ｍｇの生成物を得た。
【０２２７】
［６ｂ］４ｍＬのジクロロメタン／水（１／１）中の５０ｍｇの［５ｂ］の混合物に、５５ｍｇのＲｕＰｌｕｓ酸（ＢｉｏＶｅｒｉｓ）を添加した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ）プロピルカルボジイミド（２５ｍｇ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ．＃Ｅ７７５０−２５Ｇ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、１５ｍｇ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ＃３６２４４１−５０Ｇ）を添加し、得られた混合物を室温、アルゴン下で１６時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。その反応混合物を水に再溶解し、１）１．０Ｍトリエチルアンモニウム緩衝液（ＴＥＡＢ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ＃Ｔ７４０８）（ｐＨ７．６、５０ｍＬ）、２）１．０Ｍ重炭酸ナトリウム（２５ｍＬ）および３）０．１Ｍ  ＴＥＡＢ（ｐＨ７．６、５０ｍＬ）で平衡させたＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ＃Ａ２５１２０−１００Ｇ）イオン交換カラム（２．５ｃｍ×１０ｃｍ）に適用した。そのカラムを０．１Ｍ（ｐＨ７．６）から０．４ＭのＴＥＡＢ（ｐＨ７．６）の勾配で溶離して、所望の生成物を得た。
【０２２８】
モノクローナル６１Ｃ６を精製するために、モノクローナル抗体６１Ｃ６の培養上清（約１００ｍＬ）を採取し、５０ｍＬコニカルチューブの中で保存した。その上清を卓上遠心分離機における３，５００ｇでの１０分間の遠心分離によって清澄化し、０．２μｍフィルタユニットに通して濾過し、１００ｍＬのＩｇＧプロテインＡ結合緩衝液で希釈した。その希釈された上清を、１５ｍＬコニカルチューブの中で５．０ｍＬのプロテインＡ結合緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて１回洗浄した２．０ｍＬのプロテインＡ樹脂スラリー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）と、一晩、２〜８℃で混合した。そのインキュベーション後に、プロテインＡ樹脂を１５ｍＬコニカルチューブに移し、５ｍＬプロテインＡＩｇＧ結合緩衝液で４回洗浄し、２ｍＬスピンカラムに移した。抗体をそのカラムからＩｇＧ溶離緩衝液中に溶出させ、溶出液を直ちに１．０Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８（１．０ｍＬの溶出に対して０．１５ｍＬ）で中和した。溶出させた抗体は、リン酸緩衝液ｐＨ７．８へ緩衝液交換した。
【０２２９】
Ｂｉ  ｍＡｂ  ６１Ｃ６を調製するために、精製ｍＡｂ  ６１Ｃ６をＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン、Ｎｏ−Ｗｅｉｇｈ  Ｆｏｒｍａｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ＃２１３２７）とともに８：１の負荷比（ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン  対  ｍＡｂ  ６１Ｃ６のモル比）で、ｐＨ７．８リン酸緩衝液中、典型的には１時間、室温でインキュベートした。そのインキュベーション後、未結合ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンを、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ４−３０Ｋフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃａｔ＃  ＵＦＣ８０３０２４）での、３７．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４と、１１２．５ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４と、１５０．６ｍＭ  ＮａＣｌと、０．１０％  ２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン塩酸塩（ＭＩＴ）とを含有するｐＨ７．２リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）への３回の緩衝液交換によって除去した。
【０２３０】
ＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  ｍＡｂ  ６１Ｃ６を調製するために、精製ｍＡｂ  ６１Ｃ６をＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  ＮＨＳエステルとともに１５：１の負荷比（ＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  ＮＨＳエステル  対  ｍＡｂ  ６１Ｃ６のモル比）で、ｐＨ７．８リン酸緩衝液中、典型的には１時間、室温でインキュベートした。そのインキュベーション後、未結合ＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  ＮＨＳエステルを、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ４−３０Ｋフィルタ（Ｃａｔ：ＵＦＣ８０３０２４。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州ビルリカ）での、３７．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４と、１１２．５ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４と、１５０．６ｍＭ  ＮａＣｌと、０．１０％  ２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン塩酸塩（ＭＩＴ）とを含有するｐＨ７．２リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）への３回の緩衝液交換によって除去した。
【０２３１】
Ｍ２８０−ストレプトアビジンビーズ（Ｍ２８０−ＳＡ）に事前結合されたビオチン抗５−ＦＵ  ６１Ｃ６モノクローナル抗体を調製するために、１．０ｍｇ  Ｍ２８０−ＳＡビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ＃１１２−０５Ｄ）を８．０μｇ  Ｂｉ抗５−ＦＵ  ６１Ｃ６モノクローナル抗体とともに試料緩衝液（下で説明）中で１時間、室温でインキュベートした。１時間のインキュベーション後、そのビオチン抗５−ＦＵ  ６１Ｃ６モノクローナル抗体−Ｍ２８０−ＳＡビーズ複合体を試料緩衝液で３回洗浄し、試料緩衝液に１．０ｍｇ／ｍＬで再懸濁させた。その事前結合Ｂｉ抗５−ＦＵ  ６１Ｃ６モノクローナル抗体−Ｍ２８０−ストレプトアビジンビーズを２〜８℃で保存した。
【０２３２】
実施例１６  ５−ＦＵ  ＥＣＬアッセイにおける５−ＦＵ試薬濃度の最適化
捕捉試薬（ｃａｐｔｕｒｅ）としてのビオチン化抗５−ＦＵ  ６１Ｃ６モノクローナル抗体−ストレプトアビジンビーズ（Ｂｉ−ｍＡｂ−ビーズ）、およびディテクターとしてのＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  １−５Ｃ−５−ＦＵ−ＢＳＡというアッセイ形式を用いてこの実験を行って、５−ＦＵ試薬の濃度を最適化した。
【０２３３】
８点キャリブレーター曲線と、０．２μｇ／ｍＬのディテクター試薬（ＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  １−５Ｃ−５−ＦＵ−ＢＳＡ）濃度ならびに０．１、０．１５、０．２および０．２５ｍｇ／ｍＬの捕捉試薬（Ｂｉ−ｍＡｂ−ビーズ）濃度での交差力価測定（ｃｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）とを用いて、前記最適化を行った。
【０２３４】
次のプロトコルを用いてアッセイを調製した。５−ＦＵ捕捉試薬は、Ｂｉ−ｍＡｂ−ビーズであり、それを試料緩衝液中０．１、０．１５、０．２および０．２５ｍｇ／ｍＬという様々な濃度で試験した。ディテクター試薬は、ＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  １−５Ｃ−５−ＦＵ−ＢＳＡであり、それを試料緩衝液中０．２μｇ／ｍＬの濃度で試験した。５−ＦＵ試薬（捕捉およびディテクター）をこの実験では水性形態として使用した。
【０２３５】
試料緩衝液を次の成分濃度で調合した：０．０３％Ｔｗｅｅｎ−２０を伴う１００ｍＭリン酸ナトリウム；０．０５％  Ｐｒｏｃｌｉｎ  ３００を伴う１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）；０．０２５ｍｇ／ｍＬ  ＨＲＢ１を伴う０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；０．０５  ｍｇ／ｍＬ  ＭＡＫ−３３  ＩｇＧ  Ｐｏｌｙを伴う０．５％ウシＩｇＧ（ＢＧＧ）；２％ＰＥＧを伴う１５％トレハロース；および１０μｇ／ｍＬ  ヤギ抗マウスＩｇＧを伴う２．５ｍｇ／ｍＬ  サリチル酸。
【０２３６】
次の材料をアッセイ調製に使用した：Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水（ＭｉｌｌｉＱ）；リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）（Ｓｉｇｍａ）；リン酸水素ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）（Ｓｉｇｍａ）；塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）（Ｓｉｇｍａ）；トレハロース（Ｆｉｓｈｅｒ）；ＰＥＧ（Ｓｉｇｍａ）；ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；ＭＡＫ３３−ＩｇＧ  Ｐｏｌｙ（Ｒｏｃｈｅ）；ＨＢＲ−１（Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）；Ｐｒｏｃｌｉｎ  ３００（Ｓｉｇｍａ）；０．２μｍ使い捨てフィルタユニット（ＶＷＲ）；ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｅｒａ  Ｃａｒｅ）；ウシＩｇＧ（ＢＧＧ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）；Ｔｗｅｅｎ−２０（ＢｉｏＣｈｅｍ）；サリチル酸（Ｓｉｇｍａ）；１．０Ｎ  ＮａＯＨ（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ）；ｐＨ４緩衝液（ＶＷＲ）；ｐＨ７緩衝液（ＶＷＲ）。
【０２３７】
清浄な１０００ｍＬ使い捨てビーカーにおおよそ３００ｍＬ（３００ｇ）のＤＩ水を満たした。撹拌棒をビーカーに加え、そのビーカーを撹拌プレートに載せて中速で混合した。
【０２３８】
以下の材料をそのビーカーに添加し、すべての固形物が見かけ上、溶解されるまで混合した：ＮａＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮａＣｌ、トレハロース、ＰＥＧ。次に、以下の材料をそのビーカーに添加して、見かけ上、溶解されるまで混合し続けた：ＢＳＡ、ＢＧＧ、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｐｒｏｃｌｉｎ３００、サリチル酸、マウスＩｇＧ、ＭＡＫ３３−ＩｇＧ  ｐｏｌｙ、ＨＢＲ−１。４〜７範囲に較正されたｐＨメータを使用することにより、１．０Ｎ  ＮａＯＨを使用してその溶液のｐＨを７．１±０．１に調整した。メスシリンダーを使用してその溶液を５００ｍＬの最終体積にし、最低１０分間混合した。アスピレータポンプを使用して、その溶液を０．２μｍ滅菌フィルタユニットに通して濾過した。
【０２３９】
チャコール処理ヘパリンリチウムヒト血漿（ＢｉｏＲｅｃｌａｍａｔｉｏｎ、Ｃａｔ＃  ＨＭＰＬＬＩＨＰ−ＳＴＲＰＤ）中、０．０、５０、１００、２５０、６２５、２５００、１００００および２００００ｎｇ／ｍＬの濃度での５−ＦＵ抗原（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ＃８５８４７１）を用いて定式化されたキャリブレーター曲線を調製した。４．１％リン酸二水素カリウム；２．１４％トリプロピルアミン（ＴＰＡ）；０．８８％塩化ナトリウム；０．０２％ポリドカノール［Ｔｈｅｓｉｔ］；および０．１％オキサバン−Ａ（保存薬）を用いて、ＧＬＯ溶液を調製した。０．０２％ポリドカノール［Ｔｈｅｓｉｔ］および０．１２％Ｋａｔｈｏｎ  ＣＧ−ＩＣＰを用いて、ＳＴＯＲＥ溶液を調製した。
【０２４０】
次の装置をアッセイ手順の中で使用した：ＬｉｆｅＳｅｐ  ９６Ｆプレート磁石（Ｄｅｘｔｅｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；Ｖｏｒｔｅｘ  Ｇｅｎｉｅ（ＶＷＲ）；Ｐｉｃｏｆｕｇｅ遠心分離機（ＶＷＲ）；タイマー（ＶＷＲ）；９６ウェル丸底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ（Ｃａｔ＃  ６５０２０１））；デジタル・ヒート・ブロック（ＶＷＲ）；Ｍｉｃｒｏｍｉｘプレートシェーカー（Ｓｅｉｍｅｎｓ／ＤＰＣ）。
【０２４１】
電気化学発光（ＥＣＬ）ベースの検出分析器、ＢｉｏＶｅｒｉｓ  Ｍ１Ｍ（Ｃａｔ＃３１０８０６）を試料体積について変更して用いて、下記のアッセイを実行した。変更は、次のとおりである。該当する場合には管系の長さを短縮した。フローセル入口孔直径ならびに測定面積および体積を低減させる。前記分析器で使用したソフトウェアは、パラメータが調節可能である研究バージョンのソフトウェアである。この研究用ソフトウェアで試料体積についての動作パラメータのシーケンスも変更した。これらの変更を伴う計器をＭｅＭ１と呼んだ。
【０２４２】
下記のアッセイは、競合形式アッセイであり、例えば、検出される分析物の濃度が増加するにつれてこのアッセイからのシグナルは減少する。アッセイ手順は次のとおりであった。３７±２℃に設定したデジタル・ヒート・ブロックの金属プレートホルダー上で、５０μＬの各キャリブレーター、続いて２６μＬの捕捉試薬および２６μＬのディテクター試薬を二連でプレートウェルに直接添加した。Ｆｏｒｍ  ８およびＡｍｐ  ６に設定したＭｉｃｒｏｍｉｘシェーカーに３０秒間それらのプレートを載せて混合した。その後、プレートを、３７±２℃に設定したデジタル・ヒート・ブロックの金属プレートホルダー内に配置した。プレートをプレートカバーで覆い、５±０．５分間インキュベートした。そのアッセイインキュベーション後、アッセイプレートを１５０μＬ／ウェルのＧＬＯ溶液で２回洗浄した。各プレートウェル内の磁性ビーズ複合体をプレート磁石で２±０．５分間ペレットにした。各ウェルからの液体内容物を適切な廃棄物容器へデカントし、プレートをペーパータオルの束に素早く打ちつけることによって残留する液体を除去した。１５０μＬのＧＬＯ溶液を各ウェルに添加した。プレートを再懸濁させ、Ｆｏｒｍ  ８およびＡｍｐ６に設定したＭｉｃｒｏｍｉｘシェーカーで２±０．５分間洗浄した。上記の工程の各々をもう１回繰り返した。その２回目の洗浄後、洗浄されたビーズ複合体を１００μＬ／ウェルのＧＬＯ溶液に再懸濁させた。そのプレートを、Ｆｏｒｍ８および振幅６に設定したＭｉｃｒｏｍｉｘシェーカーに２±０．５分間載せて、ビーズを完全に再懸濁させた。単一緩衝液系（ＧＬＯ溶液）を使用してＭｅＭ１分析器でそれらのプレートを評価した。Ｗａｓａｂｉバージョン２．０２．００３９を使用してプレートを評価した。
【０２４３】
０．２μｇ／ｍＬ  ＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  １−５Ｃ−５−ＦＵ−ＢＳＡ研究についての結果は、０．２５ｍｇ／ｍＬ  捕捉試薬および０．２μｇ／ｍＬ  ディテクター試薬の抗体構成が、他の試験した条件（例えば、０．１５ｍｇ／ｍＬ  捕捉試薬、０．１ｍｇ／ｍＬ  捕捉試薬）と比較して、最高平均ＥＣＬカウント、およびＥＣＬについての％ＣＶ、および６％未満の定量に関してより良好なデータを生じさせることを示した。この抗体構成は、５−ＦＵイムノアッセイに許容され得ることが見出された。５−ＦＵイムノアッセイについての非ゼロキャリブレーター（ＣＡＬ２〜ＣＡＬ８）は、５０ｎｇ／ｍＬから２０，０００ｎｇ／ｍＬ（具体的には、５０、１００、２５０、６２５、２５００、１００００、２００００ｎｇ／ｍＬ）の範囲にわたった。
【０２４４】
実施例１７  交差反応性評価
この実験は、５−ＦＵ類似体、プロドラッグおよび干渉試薬に対するモノクローナル抗体６１Ｃ６の特異性を試験するために行った。５−ＦＵアッセイの成分（捕捉試薬、ディテクター）を水性形態で評価し、実施例１６でも使用した。この実施例では、５−ＦＵアッセイの成分（捕捉試薬、ディテクター試薬）を凍結乾燥させ、試料（キャリブレーター、対照、およびスパイクした血漿試料）を凍結乾燥試薬ペレットに直接添加した。
【０２４５】
前記化学物質、プロドラッグおよび干渉試薬ならびにそれらの試験濃度は、次のとおりであった：各々１０μｇ／ｍＬのウラシル、ウリジン、チミン、チミジン、ＤＨ５ＦＵ、テガフール、カペシタビンおよびヘモグロビン；各々１００μｇ／ｍＬのフォリン酸、オキサリプラチン、イリノテカン、メトトレキサートおよびシスプラチン；０．６ｍｇ／ｍＬのビリルビン；ならびに３０ｍｇ／ｍＬのイントラリピッド。
【０２４６】
次のプロトコルを用いてアッセイを調製した。５ＦＵ捕捉試薬は、試料緩衝液中０．３２５ｍｇ／ｍＬの濃度のＢｉ−ｍＡｂ−ビーズを有した（実施例１６）。ディテクター試薬は、試料緩衝液中０．２６μｇ／ｍＬの濃度のＴＡＧ  Ｐｌｕｓ  １−５Ｃ−５−ＦＵ−ＢＳＡを有した（実施例１６）。捕捉溶液およびディテクター溶液を分注（２０μＬ）し、凍結乾燥した。チャコール処理ヘパリンリチウムヒト血漿中、０．０、２５、１００、２５０、６２５、２５００、１００００および２００００ｎｇ／ｍＬの濃度での５−ＦＵ抗原を用いて定式化されたキャリブレーター曲線を作成した。チャコール処理ヘパリンリチウムヒト血漿において５−ＦＵ抗原を用いて調合した３つのレベル（高、中および低）の対照試料（１５０００、１５００および７５ｎｇ／ｍＬ）を調製した。アッセイ抗体との交差反応性を有し得る可能性がある１５の化合物を試験して、その反応性の程度および性質を確認した。化合物を（内因性については１０，０００ｎｇ／ｍＬ、外因性については１００，０００ｎｇ／ｍＬの濃度で）５−ＦＵを含まない試料、７５ｎｇ／ｍＬ  スパイクした５−ＦＵ試料および１，０００ｎｇ／ｍＬ  スパイクした５−ＦＵ試料にスパイクした。
【０２４７】
次の化合物をアッセイに使用した：ウラシル（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、＃０１９Ｋ００３３）；ウリジン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、＃０３０Ｍ５３０９Ｖ）；チミン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、＃０００１４３８２４２）；ＤＨ５ＦＵ（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｓｏｔｏｐｅｓ、＃１０３１０）；テガフール（Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ、＃Ａ００１５４３５０１）；カペシタビン（Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．、＃ＴＲＣ−０４０３０６）；フォリン酸（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、＃ＢＣＢＣ４１７６Ｖ）；オキサリプラチン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｏ９５１２）；イリノテカン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、＃０５０Ｍ１５８０Ｖ）；メトトレキサート（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、ＬＬＣ、＃Ｒ２７２０４）；シスプラチン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、＃４７９３０６）；ビリルビン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、＃１０６Ｋ１５６２）；ヘモグロビン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、＃０６９Ｋ７５４５）；イントラリピッド（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、＃０２８Ｋ０７４０）。
【０２４８】
次の装置をアッセイ手順の中で使用した：ＬｉｆｅＳｅｐ  ９６Ｆプレート磁石（Ｄｅｘｔｅｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；Ｖｏｒｔｅｘ  Ｇｅｎｉｅ（ＶＷＲ）；Ｐｉｃｏｆｕｇｅ遠心分離機（ＶＷＲ）；タイマー（ＶＷＲ）；９６ウェル丸底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ（Ｃａｔ＃  ６５０２０１））；デジタル・ヒート・ブロック（ＶＷＲ）；Ｍｉｃｒｏｍｉｘプレートシェーカー（Ｓｅｉｍｅｎｓ／ＤＰＣ）。
【０２４９】
アッセイ手順は、次のとおりであった。使用前にマイクロプレートの表面の静電気を、Ｚｅｒｏｓｔａｔ静電気除去デバイスを使用して低下させた。そのデバイスをマイクロプレートの表面に向け、数回、引金を引いてそのマイクロプレートを横断して引金を放した。真空ピックアップシステム（Ｖａｃｕｕｍ  Ｐｉｃｋ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して、各捕捉試薬およびディテクター試薬について１つの凍結乾燥ペレットをプレートウェルに移した。中空針先端をピックアップペンに取り付け、フィンガー制御真空をペレットのピックアップ（人差し指を穴の上に置いて、針に真空を引いた）および解放（その穴から人差し指を上げる）に用いた。３７±２℃に設定したデジタル・ヒート・ブロックの金属プレートホルダー上で、５０μＬの各キャリブレーター、対照および試料（この場合は交差反応性パネル）を、２個の凍結乾燥ペレットが入っているプレートウェルに二連で直接添加した。Ｆｏｒｍ  ８およびＡｍｐ  ６に設定したＭｉｃｒｏｍｉｘシェーカーに３０秒間プレートを載せて混合した。その後、３７±２℃に設定したデジタル・ヒート・ブロックの金属プレートホルダー内にそのプレートを配置した。プレートをプレートカバーで覆い、５±０．５分間インキュベートした。そのアッセイインキュベーション後、実施例１６に関して説明したようにアッセイプレートを洗浄して評価した。
【０２５０】
【表６】
2015502356.tif 000023
結果は、凍結乾燥５−ＦＵ試薬がよく作用すること、およびニート血漿（１００％マトリックス）を凍結乾燥５−ＦＵ試薬で試験できることを明示した。
【０２５１】
実施例１８  ５−ＦＵ凍結乾燥試薬の精度の評価
この実験により、２つの異なるＭｅＭ１分析器での５回の試行にわたり５−ＦＵ凍結試薬の精度を評価した。使用した材料および装置は、実施例１７に関して説明したものと同じであった。用いたプロトコルは、実施例１７に関して説明したものと同じであった。
【０２５２】
全体として、キャリブレーターおよび対照試料は、予想許容基準：ＣＶ％＜１０％；％ＡＲ＝目標値の±２０％を満たし、過剰定量（１５１％）された１つの高い対照の例外が存在したが、３つの対照のうちの２つは公称値の２０％以内で仕様を満たした。５−ＦＵキャリブレーターおよび品質管理（ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ）についての５回の試行からの結果は、次のものを含んだ：ＥＣＬについての平均％ＣＶ（キャリブレーターおよび対照）＝３．５％；および定量についての平均％ＣＶ（キャリブレーターおよび対照）＝４．６％。５回の試行からの一貫した結果は、前記５−ＦＵイムノアッセイが低い％ＣＶによって示される申し分のない精度を有することを示した。
【０２５３】
実施例１９  アッセイ検出下限（ＬＤＬ）評価
この実験を行って、２回の試行にわたってのＣＡＬ１（ゼロキャリブレーター）の８０点から検出下限（ＬＤＬ）を評価することにより５−ＦＵアッセイ感度を評価した。この評価は、８点キャリブレーター曲線およびトリレベル対照に基づいた。使用した材料および装置は、実施例１６に関して説明したものと同じであった。用いたプロトコルは、実施例１７に関して説明したものと同じであった。
【０２５４】
２回の試行からの平均ＬＤＬ値は、２．５４ｎｇ／ｍＬであると決定され、ＥＣＬについての平均％ＣＶ＝３．３９％であった。
【０２５５】
実施例２０  アッセイ時間設定の評価
この実験を行って、５−ＦＵイムノアッセイインキュベーション時間設定を評価した。３７℃で５、１０および１５分のアッセイインキュベーション時間を試験し、該アッセイインキュベーション時間は、８点キャリブレーター曲線およびトリレベル対照に基づいた。使用した材料および装置は、実施例１７に関して説明したものと同じであった。用いたプロトコルは、各アッセイプレートを５±０．５分、１０±１分、および１５±１．５分で逐次的にインキュベートしたことを除き、実施例１７に関して説明したものと同じであった。１台のＭｅＭ１と、調製し、凍結させた１ロットのキャリブレーターおよび対照とをこの研究に用いた。
【０２５６】
ＥＣＬシグナルは、３７℃でアッセイインキュベーション時間が５から１５分に延びるにつれて漸進的に増加した。１５分のインキュベーションで、ＥＣＬカウントは約１００万カウントであった。シグナルが計器の飽和範囲に達してしまうので、このインキュベーションは推奨しない。
【０２５７】
アッセイ感度は、３７℃でアッセイインキュベーション時間が５から１５分に延びるにつれて顕著に減少した（ＣＡＬ１（０．０ｇｍ／ｍＬ  ５−ＦＵ、ゼロキャリブレーター）と比較した各キャリブレーターのシグナルの％差）。５分のインキュベーションで、ＥＣＬシグナルは、２５ｎｇ／ｍＬの５−ＦＵをチャコール処理血漿にスパイクしたとき（ＣＡＬ２、２５ｎｇ／ｍＬ  ５−ＦＵ）、ＣＡＬ１と比較して６１％に降下したが、同レベルのスパイクした５−ＦＵを用いて、ＥＣＬシグナルは、他のインキュベーション時間設定ではＣＡＬ１と比較して７８％にしか降下しなかった。これは、この５−ＦＵイムノアッセイが、より短いインキュベーション時間がより良好な感度を達成することを示す。結果は、３７℃で５分が５−ＦＵイムノアッセイの最適なアッセイ時間設定であることを実証した。
【０２５８】
実施例２１  ５−ＦＵ試料緩衝液の評価
これらの実験を行って、５−ＦＵ試料緩衝液へのサリチル酸および／またはヤギ抗マウスの添加が、例えば、一部の正常血漿試料における高い５−ＦＵカウントの検出の低減を助長するために、必要であるかどうかを評価した。これらの実験は、５−ＦＵ試料緩衝液の４つの異なる調合物を使用し、２人の異なるオペレーターがこれらの実験を評価した。
【０２５９】
５−ＦＵ試料緩衝液の前記４つの異なる調合物は、成分およびそれらの濃度については実施例１６の試料緩衝液を参照して次のとおりであった：調合物Ｉ−サリチル酸なし（他の点では実施例１６における試料緩衝液と同じ）；調合物ＩＩ−ヤギ抗マウスＩｇＧなし（他の点では実施例１６における試料緩衝液と同じ）；調合物ＩＩＩ−サリチル酸なし、かつヤギ抗マウスＩｇＧなし（他の点では実施例１６における試料緩衝液と同じ）；および調合物ＩＶ−実施例１６における試料緩衝液と同じ、すなわち、サリチル酸とヤギ抗マウスＩｇＧの両方を含有する。使用した材料および装置は、実施例１６に関して説明したものと同じであった。用いたプロトコルは、実施例１６に関して説明したものと同じであった。
【０２６０】
５−ＦＵ試料緩衝液の評価のために結果を収集し、二人のオペレーターが行うアッセイで分析して、キャリブレーターおよびスパイクしたヒト血漿試料についての平均ＥＣＬカウントおよび平均濃度を調べた。それらの結果のすべては、キャリブレーターおよび対照については２つのウェルの平均、ならびに正常血漿試料およびスパイクした血漿試料については３つのウェルの平均を表す。
【０２６１】
スパイクした試料の定量は、８点キャリブレーター曲線およびトリレベル対照試料に基づいた。合計３２のアッセイプレートを２人のオペレーター（オペレーター１人あたり１６のアッセイプレート）が２台の異なるＭｅＭ１分析器で評価した。各アッセイプレートは、８点キャリブレーター曲線、トリレベル対照、およびスパイクした正常ヒト血漿試料から成った。正常ヒト血漿試料（合計１５）を３レベル（０、５００および５０００ｎｇ／ｍＬ）の５−ＦＵ分析物で各々スパイクした。試験中、前記１５の試料を、３または４試料の群で、各々緩衝液調合物を用いて試行した。１５のスパイクした正常ヒト血漿試料を評価するために、各緩衝液調合物に４つのプレートが必要であった。
【０２６２】
すべてのプレート（２人のオペレーター間で３２プレート）からのキャリブレーター曲線は、５−ＦＵイムノアッセイについての次の例示的許容基準を満たした：７つのキャリブレーター、Ｃａｌ２〜Ｃａｌ８（それぞれ、２５、１００、２５０、５００、１０００、２５００、１００００ｎｇ／ｍＬ）のうちの６つは、カウントおよび定量について許容可能な％変動係数（％ＣＶ）を有する。Ｃａｌ２およびＣａｌ８については、カウントおよび定量について％ＣＶ≦２０％が許容可能である。Ｃａｌ３〜Ｃａｌ７（それぞれ、１００、２５０、５００、１０００、２５００ｎｇ／ｍＬ）については、カウントおよび定量について％ＣＶ≦１５％が許容可能である。Ｃａｌ３〜Ｃａｌ７は、目標濃度の±１５％以内にバックフィット（ｂａｃｋｆｉｔ）する。Ｃａｌ２およびＣｌａ８は、目標濃度の±２０％以内にバックフィットする。これらの制限により、キャリブレーター曲線フィットの質は、試料および対照の正確な定量が実行可能であるようなものであることが保証される。バックフィットまたは％ＣＶが前記許容可能基準外である場合には、Ｃａｌ２〜Ｃａｌ８間の１つのキャリブレーターの最大値を除去して、６つのキャリブレーターの最小値を残して４パラメータロジスティック曲線フィットを生成することができる。
【０２６３】
３つの対照のうちの２つは、目標値の±２０％以内で定量された。すべてのプレートからのカウントおよび定量についてのキャリブレーター％ＣＶは、≦１５％であった。キャリブレーターバックフィットもまた、キャリブレーター３〜７については±２０％、ならびにＣａｌ２およびＣａｌ８については±１５％のバックフィットの例示的許容基準を満たした。すべてのプレートからのカウントおよび定量についての対照％ＣＶは、≦２０％であった。対照バックフィットもまた、目標の２０％以内のバックフィットの許容基準を満たした。
【０２６４】
５−ＦＵ試料緩衝液の異なる調合物を使用するキャリブレーターおよび対照試料についてのＥＣＬシグナルは、ＥＣＬおよび定量についての％ＣＶの点で同等であった。オペレーター＃２の実験から得たＥＣＬシグナルは、オペレーター＃１の実験からのものと比較して１０〜１５％低かった。理論により拘束されることを望まないが、ＥＣＬシグナルのこの低減は、（１）オペレーター＃２が試験を完了したときは３週間経っていた液体形態の捕捉試薬および／または（２）分析器間の差に起因する可能性が高かった。この低減されたＥＣＬシグナルは、スパイクした血漿試料の定量に影響を及ぼさなかった。
【０２６５】
５−ＦＵ試料緩衝液の異なる調合物を使用してスパイクしたヒト血漿試料から定量した５−ＦＵ値もまた、互いに同様の結果を有した。
【０２６６】
この研究からの結果全体は、５−ＦＵ試料緩衝液へのサリチル酸およびヤギ抗マウスＩｇＧの添加が、正常ヒト血漿試料における５−ＦＵのバックグラウンド定量を有意に低下させないことを明示した。
【０２６７】
本明細書に開示する５−ＦＵイムノアッセイの大部分は、検出方法としてＥＣＬ技術を用いてＭｅＭ１分析器計器で試行した。インキュベーション時間は、３７℃で約５分であった。試料は、５０μＬの試料体積で抗凝固処置された、ヒト血漿、ヘパリンリチウムと、次の対照を含有した：７５ｎｇ／ｍＬ、１５００ｎｇ／ｍＬ、１５０００ｎｇ／ｍＬ  ５−ＦＵ。０．０〜２０，０００ｎｇ／ｍＬ  ５−ＦＵのキャリブレーター範囲を５パラメータロジスティック、１／（シグナル）２の重み付け、キャリブレーター曲線で使用した。
【０２６８】
実施例２２  ｍＡｂ  ６１Ｃ６のアミノ酸およびヌクレオチド配列
ｍａｂ  ６１Ｃ６の重鎖
ｍａｂ  ６１Ｃ６の重鎖をコードしているヌクレオチド配列を、配列番号１０であると決定した。
【０２６９】
ｍａｂ  ６１Ｃ６の重鎖のアミノ酸配列を、次のものであると決定した：
【０２７０】
【化１７】
2015502356.tif 000024
ｍａｂ  ６１Ｃ６の重鎖のアミノ酸配列（配列番号２）は、推定シグナルペプチド（１−１９）、ＣＨ１（１４２−２３８）およびＣＨ２（２６１−３７０）領域（下線を引いた）を含有する。ヒンジ領域（２３９−３７０）は、斜体である。ＣＤＲ−Ｈ１（４５−５４）（配列番号３）、ＣＤＲ−Ｈ２（６９−８５）（配列番号４）およびＣＤＲ−Ｈ３（１１８−１３０）（配列番号５）領域にも下線を引いた。
【０２７１】
ｍａｂ  ６１Ｃ６の軽鎖をコードしているヌクレオチド配列を、配列番号１１におけるとおりであると決定した。
【０２７２】
ｍａｂ  ６１Ｃ６の軽鎖のアミノ酸配列を、次のものであると決定した：
【０２７３】
【化１８】
2015502356.tif 000025
ｍａｂ  ６１Ｃ６の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号６）は、推定シグナルペプチド（１−２０）、ＣＤＲ−Ｌ１（４４−５４）（配列番号７）、ＣＤＲ−Ｌ２（７０−７６）（配列番号８）およびＣＤＲ−Ｌ３（１０９−１１７）（配列番号９）を含有し、これらのすべてに下線を引いた。
【０２７４】
【化１９】
2015502356.tif 000026
【０２７５】
【化２０】
2015502356.tif 000027
【配列表】
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【国際調査報告】
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2015502356.tif 000038
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