(57)【要約】  ブタ生殖器呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）に対するペプチドベースのマーカーワクチンならびにブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）の予防、モニタリング及び制御のための一組の免疫診断テストが開示される。本発明の種々の態様によるワクチン製剤は、ＰＲＲＳＶ  ＧＰ２、ＧＰ３、ＧＰ４、又はＧＰ５タンパク質に由来するペプチドの混合物を有し；それぞれのペプチドは個々に、それぞれのペプチドの免疫原性を増強するために人工Ｔヘルパーエピトープに個々に結合された、Ｂ細胞ＰＲＲＳＶ中和／レセプター結合エピトープを有し；これにＰＲＲＳＶ  ＧＰ４、ＧＰ５、Ｍ及びヌクレオカプシドタンパク質に由来するＴヘルパーエピトープを提示するペプチドの混合物を補充して、細胞性免疫を付与することができる。このようなウイルスペプチド組成物は、ワクチン製剤として許容可能な送達系に調製され、ＰＲＲＳＶ負荷時にＰＲＲＳＶ抗体を持たないブタに感染からの交差防御を与えることができる。
2015509086.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド抗原及び獣医学的に許容可能な送達ビヒクル又はアジュバントを有する、ブタ生殖器呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）ワクチン組成物であって、該ペプチド抗原が、
ａ）配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、及びこれらの任意の組合せ；
ｂ）（ａ）のホモログ；及び
ｃ）（ａ）又は（ｂ）の任意の組合せ
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、ＰＲＲＳワクチン組成物。
【請求項２】
前記ペプチド抗原が、配列番号９のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のＰＲＲＳワクチン。
【請求項３】
前記ペプチド抗原が、配列番号１０のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のＰＲＲＳワクチン。
【請求項４】
前記ペプチド抗原が、配列番号１１のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のＰＲＲＳワクチン。
【請求項５】
前記ペプチド抗原が、配列番号１２のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のＰＲＲＳワクチン。
【請求項６】
前記ペプチド抗原が、１〜５個のアミノ酸を付加するか又は欠失させることによって変更される、請求項１に記載のＰＲＲＳワクチン。
【請求項７】
前記ペプチド抗原のアミノ末端又はカルボキシル末端に共有結合したＴヘルパーエピトープをさらに有する、請求項１に記載のＰＲＲＳワクチン。
【請求項８】
前記Ｔヘルパーエピトープが配列番号３５である、請求項７に記載のＰＲＲＳワクチン。
【請求項９】
前記Ｔヘルパーエピトープが、ε−リジン残基を有するスペーサーを介してペプチド抗原に共有結合する、請求項７に記載のＰＲＲＳワクチン。
【請求項１０】
前記スペーサーが配列番号３６である、請求項９に記載のＰＲＲＳワクチン。
【請求項１１】
前記抗原ペプチドに結合されていないＴヘルパーエピトープをさらに有し、該Ｔヘルパーエピトープが配列番号４７〜９０からなる群から選択される、請求項１に記載のＰＲＲＳワクチン。
【請求項１２】
前記ペプチド抗原の総量が約１０μｇ〜約１ｍｇである、請求項１のいずれかに記載のＰＲＲＳワクチン。
【請求項１３】
前記送達ビヒクル及びアジュバントが、モンタニド（Montanide）ISA 50V、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート、及びＣｐＧオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１に記載のＰＲＲＳワクチン。
【請求項１４】
請求項１に記載のワクチンを投与する工程を有する、ＰＲＲＳ感染に対して子ブタを防御する方法。
【請求項１５】
ａ）ペプチド抗原及び獣医学的に許容可能な送達ビヒクル又はアジュバント、
ｂ）配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号３１、及びそれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド抗原、及び
ｃ）配列番号８０〜９０及びそれらの組合せからなる群から選択されるＰＲＲＳＶ  Ｔｈペプチド、を有する、ＰＲＲＳワクチン組成物。
【請求項１６】
ａ）ペプチド抗原及び獣医学的に許容可能な送達ビヒクル又はアジュバント、
ｂ）配列番号４２、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、及びそれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド抗原、及び
ｃ）配列番号８０〜９０及びそれらの組合せからなる群から選択されるＰＲＲＳＶ  Ｔｈペプチド、を有する、ＰＲＲＳワクチン組成物。
【請求項１７】
ａ）配列番号１及び配列番号２の混合物を固体支持体に付着させる工程、
ｂ）前記固体支持体に付着した前記ペプチドを、該ペプチドに抗体が結合するのを促す条件下で、前記抗体を含むブタの血液、血清又は血漿サンプルに曝露する工程、及び
ｃ）前記固体支持体に付着した前記ペプチドに結合した抗体の存在を検出する工程、を有する、ＰＲＲＳ感染を診断する方法。
【請求項１８】
抗ＰＲＲＳＶ抗体の存在をテストするためのＥＬＩＳＡイムノアッセイであって、
ａ）配列番号７及び配列番号８の混合物を固体支持体に付着させる工程、
ｂ）前記固体支持体に付着した前記ペプチドを、該ペプチドに抗体が結合するのを促す条件下で、前記抗体を有するブタの血液、血清又は血漿サンプルに曝露する工程、及び
ｃ）前記支持体に付着した前記ペプチドに結合した抗体の存在を検出する工程
を有する、上記ＥＬＩＳＡイムノアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ブタ生殖器呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）に対するペプチドベースのマーカーワクチンならびにブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）のモニタリング及び制御のための一組の免疫診断テストに関する。
【背景技術】
【０００２】
ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）は、成熟雌ブタ及び若雌ブタにおける重度の繁殖障害の原因として１９８０年代後半に発見され、ブタ産業における最も重要な病原体の１つである。成熟雌ブタ及び若雌ブタが感染することにより、後期流産、早期分娩及び病弱な子ブタの出産を引き起こし得る一方、感染雄ブタは、精子の質の低下及び精液中のウイルス排出を示す。
【０００３】
また、ＰＲＲＳＶは、幼若ブタのブタ呼吸器病症候群に関与することも見出され、ウイルス及び細菌の二次感染を伴って呼吸障害を引き起こす。このウイルスは、限られたインビボでの細胞指向性を示し、肺胞マクロファージが主要な標的細胞である。
【０００４】
ＰＲＲＳＶは、アルテリウイルス科ニドウイルス目に属する、エンベロープを有する一本鎖ＲＮＡウイルスであり（１）、約１５ｋｂの長さで、９つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からなる。ビリオンは、ウイルスＲＮＡと結合したヌクレオカプシドタンパク質（オープンリーディングフレーム７、ＯＲＦ７によってコードされる）で構成されるヌクレオカプシドコアからなる。ヌクレオカプシドは脂質エンベロープに囲まれ、そのエンベロープ中に６つの構造タンパク質：糖タンパク質ＧＰ２（ＯＲＦ２ａ）、ＧＰ３（ＯＲＦ３）、ＧＰ４（ＯＲＦ４）及びＧＰ５（ＯＲＦ５）、ならびに非グリコシル化タンパク質Ｍ（ＯＲＦ６）及びＥ（ＯＲＦ２ｂ）が埋め込まれている。ＧＰ５及びＭは、エンベロープ内で最も豊富なタンパク質であると考えられる一方、その他のエンベロープタンパク質の存在量はより少ない。ゲノムの５’末端に位置するＯＲＦ１ａ及びＯＲＦ１ｂは、非構造タンパク質をコードする。
【０００５】
他の多くのＲＮＡウイルスと同様に、ＰＲＲＳＶは高い遺伝的変異性を示し、病原性の変異、免疫系との相互作用、及びウイルスタンパク質の抗原特性に反映される。遺伝子型間に高い変異性は存在するが、ウイルス株は通常、ＯＲＦ５及び／又はＯＲＦ７配列に基づき、欧州（ＥＵ）及び北米（ＮＡ）遺伝子型に分類される。
【０００６】
ＰＲＲＳＶは、宿主の防御免疫を回避し得る多数の特性を獲得している。これらの特性は、感染から１〜２週間後にウイルス特異的抗体が遅れて産生されることであり；このような抗体は、初代ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）におけるインビトロでのウイルス複製を減少させることができず；本当に必要なウイルス中和抗体は、感染からおよそ３〜４週間後に低レベルで出現するため、急性期のウイルス血症に影響を及ぼすには遅すぎる（１、２）。
【０００７】
この弱いウイルス中和抗体反応にもかかわらず、感染の開始時にこのようなウイルス中和抗体が十分量存在すれば、肺におけるウイルス複製、ウイルス血症及びウイルスの経胎盤伝播に対しての防御を提供でき、ＰＲＲＳＶ特異的中和抗体が、防御免疫に一部貢献できることを示している（２、３）。
【０００８】
ＰＲＲＳウイルス血症は、感染ブタの血中において中和抗体と一緒に見つかり、このことから、体液性免疫反応のみではしっかりとした防御を付与しなかったことが示される。細胞性免疫（ＣＭＩ）は、ＰＲＲＳＶの排除に重要な役割を果たすことが示されている（４）。リンパ球芽球化及び適応サイトカイン産生（例えば、インターフェロンγ；ＩＦＮ−γ）によって判定されるように、感染ブタにおけるＣＭＩ応答の進行は遅れることが見出され、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）のインビトロの再現応答（recall response）では、感染後およそ４〜８週目に検出可能になり、これは中和抗体の発生と相関していた（５〜７）。ＩＦＮ−γは、動物における様々な細胞変性ウイルス感染に対する細胞性免疫反応に重要な役割を果たす。ＰＲＲＳＶ感染したブタにおいて、ＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡは、リンパ節、肺及び末梢血単核球で検出された（７）。
【０００９】
ウイルス中和抗体を誘導するＢ細胞エピトープ及びＩＦＮ−γを誘発するＴ細胞エピトープを提示する抗原性領域を、ＰＲＲＳＶ構造プロテオーム全体にわたって探索することは、獣医ウイルス免疫学において、過去２０年間にわたって最もやりがいのあるトピックスの１つである。世界的なＰＲＲＳＶ研究団体によって蓄積された成果として、このようなエピトープマッピング結果を示す代表的な論文を、本明細書に参考として提供する（８〜１０）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
改変生ワクチン（ＭＬＶ）及び不活化ＰＲＲＳＶウイルス溶解物ワクチンが市販されているにもかかわらず、ＰＲＲＳＶ関連疾患の制御は、依然として問題をはらんでいる。１つの主要な問題は、ＰＲＲＳＶワクチンが、同種の攻撃に対しては有効であるが、異種の攻撃に対しては有効でないという点についての有効性である。また、ＭＬＶについての安全性の問題が本分野で報告されている。改変生ワクチンは、妊娠成熟雌ブタ、若雌ブタにおける使用に適さず、及びワクチン接種により精液中にワクチンウイルスの排出を引き起こす場合があるので雄ブタにおける使用に適さない。改変生ウイルスワクチンは、ワクチン接種動物中で存続できる。ワクチン未接種動物への感染、及びその後のワクチン−ウイルス誘導疾患が報告されている。なお、感染ブタとワクチン接種ブタとを識別でき、それによりＰＲＲＳＶ感染の追跡管理及び制御が容易になる、マーカーワクチンの開発が緊急に必要とされている。
【００１１】
要約すると、防御抗体及び細胞性免疫反応を誘導可能な、異なる機能性Ｂ細胞エピトープ及びＴ細胞エピトープを有する免疫原性ＰＲＲＳＶペプチドを設計すること、ならびにブタにおけるＰＲＲＳＶ株の交差防御を可能にするこれらのデザイナーペプチドを有するワクチン製剤を設計することが、依然として緊急に必要とされている。これらの合理的に設計され且つ分子的に特徴付けられた免疫原性ペプチドの利用可能性と共に、感染ブタ由来の抗体によって認識され得る抗原性ペプチドを同定する必要性もあり、且つこれらのデザイナーペプチドを用いて、感染動物とワクチン接種動物とを血清学的に識別するための一組の診断テスト（したがって、診断システム）を開発し、ＰＲＲＳＶ感染の有効な制御を可能にする必要性もある。最終的に、このようなペプチドベースのマーカーワクチンの低価格製造及び品質管理のための手段、ならびにＰＲＲＳ疾患を効果的にモニタリング及び制御するための広い用途の診断システムを開発することが必要である。
【００１２】
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【００１３】
発明の簡単な説明
本開示は、ブタ生殖器呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）に対するペプチドベースのマーカーワクチンならびにブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）の予防、モニタリング及び制御のための一組の免疫診断テストに関する。
【００１４】
構造的ＰＲＲＳＶプロテオーム全体にわたる抗原性領域に関する科学的情報を利用できるにもかかわらず、研究団体が数十年も努力しても、感染性因子に対する成功したペプチドベースのワクチンを全く開発できないために、大部分の病原体について合成ペプチドワクチンはこの先生産されそうもないという意見がある。本発明者は、第一世代の生物学的ワクチンから多くを学び、ここでは選択的なＰＲＲＳＶのＢ細胞エピトープ及びＴ細胞エピトープを含む合理的設計アプローチにより、所望のウイルス株に対する合成ペプチドベースのＰＲＲＳＶワクチンならびに疾患のモニタリング及び制御のためのコンパニオン診断テストの検証及び開発が可能なはずである。Ｂ細胞中和エピトープはほとんどが立体構造であり、それらのＢ細胞エピトープ関連ペプチド免疫原を設計する場合にはそれを考慮しなければならないと認識することが重要である。関連するＢ抗原性エピトープの同定及び設計には、標的分子の構造とその機能との間の関係を理解することが必要になる。免疫原設計に供する標的分子の構造及び機能の理解におけるこのような学問分野を、本発明者は「機能的抗原学（functional antigenic）」と呼ぶ。また、免疫反応は複雑かつ多面的である。疑似種集団として存在する、急速に進化するＲＮＡウイルスに対するワクチンは、宿主免疫系を回避するウイルス変異体が出現するリスクを最小限にするために、できる限り多くの異なる防御免疫メカニズムを刺激することを常に目標とすべきである。
【００１５】
成功した合成ペプチドベースのワクチンは、適応免疫及び先天免疫を含む免疫系の適切な要素を刺激する成分を有するであろう。エピトープベースのペプチドワクチンの開発における別の主要な障害は、一部に、これらのエピトープを提示する短鎖ペプチドが非免疫原性であるという性質に起因している。また、病原体の遺伝的変異及び宿主の遺伝的変異性から生じる広範な交差防御のためのワクチンの普遍性が可能になるように、幅広いレパートリーのＢエピトープ及びＴエピトープを含むことが必要である。さまざまな疾患に対する合成ペプチドベースのワクチン及び診断テストの膨大な努力及び実験検証により、本発明者は、所望の免疫原性の増強に適したＴ細胞エピトープを補充した、インビボ及びインビトロの血清学的及び機能的研究のための抗体を誘発する天然標的分子上の抗原部位に擬態したペプチド免疫原の合理的な設計に重点を置いている。これにより、臨床的及び商業的応用のためのそれぞれの標的疾患における最適化抗原、免疫原、及びワクチン製剤につながっている（１１〜２０）。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の種々の態様によるワクチン製剤は、ＰＲＲＳＶ  ＧＰ２、ＧＰ３、ＧＰ４、又はＧＰ５タンパク質に由来するペプチドの混合物を含み；それぞれのペプチドは個々にＢ細胞ＰＲＲＳＶ中和／レセプター結合エピトープを有し、該エピトープは個々に、各ペプチドの免疫原性を増強するために、人工Ｔヘルパーエピトープに結合し；ペプチドの混合物にＰＲＲＳＶ  ＧＰ４、ＧＰ５、Ｍ及びヌクレオカプシドタンパク質に由来するＴヘルパーエピトープを提示するペプチドの混合物を補充して、細胞性免疫を付与することができる。このようなウイルスペプチド組成物は、ワクチン製剤として許容可能な送達系に調製され、ＰＲＲＳＶ負荷時にＰＲＲＳＶ抗体を持たないブタに感染からの交差防御を与えることができる。
【００１７】
本発明の種々の態様による診断システムは一組の診断テストを含み、あるテストは、ＰＲＲＳＶ感染動物から最適抗体認識のために、ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ７をコードする２つの重複する抗原ペプチドをＥＬＩＳＡイムノアッセイ形式で提供し、且つその他のテストは、ＰＲＲＳＶペプチドワクチン免疫化動物から最適抗体認識のために、ＧＰ２、ＧＰ３、ＧＰ４及びＧＰ５由来ワクチン標的ペプチドを、ＥＬＩＳＡイムノアッセイ形式で提供する。これらの診断テストを組合せて、感染動物とワクチン接種動物との識別（ＤＩＶＡ）、ひいては疾患の効果的なモニタリング及び制御のための診断システムを構成する。
【００１８】
ＰＲＲＳＶ感染からブタを防御するこのようなワクチンの製造方法、及びＤＩＶＡのための一組の免疫診断テストの製造方法、ひいては疾患の効果的な制御を可能にする方法にも関する。
【００１９】
本発明のペプチド又はペプチド組成物は、天然のウイルスとの交差反応性により、ＰＲＲＳＶ負荷時に感染からＰＲＲＳＶ抗体を持たない子ブタを交差防御するためのマーカーワクチンの開発、及び感染動物とワクチン接種動物とを識別するための一組のペプチドベースのＥＬＩＳＡの開発のために、標的種における膨大な血清学的検証のプロセスによって設計され、かつ最適化される。
【００２０】
本開示はＰＲＲＳＶワクチンに関し、詳細には、ＰＲＲＳＶ  ＧＰ２、ＧＰ３、ＧＰ４又はＧＰ５タンパク質のＢエピトープに由来するペプチド及びペプチド組成物を有するＰＲＲＳＶワクチンに関し、各ペプチドは任意にＴヘルパーエピトープと結合してもよく、ＰＲＲＳＶとの交差反応性を有する高力価の抗体を含めた液性免疫を免疫化宿主に誘導するように、ペプチドの免疫原性を増強してもよい。
【００２１】
本ペプチド又はペプチド組成物は、細胞性免疫反応を開始するために、ワクチン製剤中にＰＲＲＳＶ  ＧＰ４、ＧＰ５、Ｍ及びヌクレオカプシドタンパク質のＴ細胞エピトープを提示する追加のペプチドをさらに補充される。
【００２２】
本発明の種々の態様が提供される。ある一組の態様として、感染動物由来のヌクレオカプシド（ＮＣ）タンパク質に対する抗体の検出用抗原として有効なペプチド及びペプチド組成物に関する。第２の一組の態様として、ワクチン接種動物由来のＧＰ２、ＧＰ３、ＧＰ４及びＧＰ５エピトープを標的とするマーカーワクチンに対する抗体の検出用に有効なペプチド及びペプチド組成物に関する。これらの診断テストはＤＩＶＡの診断システムを構成し、ひいては疾患の効果的な制御を構成する。
【００２３】
ＰＲＲＳＶタンパク質のＢ細胞エピトープ及びＴ細胞エピトープの両方に由来する、ペプチド（類）、そのホモログ及びアナログに関する、他の一組の態様がある。このようなＰＲＲＳＶペプチドは、優先的にではあるが任意に、それらの個々の免疫原性を増強するために人工コンビナトリアルＴヘルパーエピトープに結合してもよい。
【００２４】
また、他の一組の態様において、ＰＲＲＳＶ感染に対してブタを防御するために、天然のＰＲＲＳＶタンパク質抗原と交差反応性を示す抗体反応及び細胞性免疫反応の両方を一緒に誘発するように、ＰＲＲＳＶ  Ｂ細胞エピトープ及びＴ細胞エピトープ由来のペプチド免疫原に由来するペプチド及びペプチド組成物を有する、ワクチン製剤に関する。
【００２５】
このような設計されたペプチドの各々は、産業上の利用のためにミリグラムからキログラムのスケールで化学合成することができ、かつ品質管理することができる。
ワクチン製剤に通常含まれる送達ビヒクル及び他の成分もまた、本発明の種々の態様によって提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１Ａは、コトランスフェクトされたＨＴＫ細胞株細胞の細胞質内のＰＲＲＳＶ  ＧＰ５タンパク質に対する抗体を、本発明の態様による免疫蛍光法により検出するメカニズムを示す図である。  図１Ｂは、図１Ａに記載のメカニズムによって実施される免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）である。細胞質内のＧＰ５に結合したＰＲＲＳＶ  ＧＰ５タンパク質に対する抗体を有するコトランスフェクトされたＨＴＫ細胞株細胞が検出される。
【図２Ａ】ＰＲＲＳＶ  ＭＤ００１株（受託番号ＡＦ１２１１３１）のヌクレオカプシド（ＮＣ）タンパク質上の抗原部位の局在及び感染動物におけるＮＣタンパク質に対する抗体を検出するためのＵＢＩ  ＰＲＲＳＶ  ＮＣ  ＥＬＩＳＡに用いる抗原ペプチド（配列番号１）の同定。
【図２Ｂ】ＰＲＲＳＶ  ＭＤ００１株（受託番号ＡＦ１２１１３１）のヌクレオカプシド（ＮＣ）タンパク質上の抗原部位の局在及び感染動物におけるＮＣタンパク質に対する抗体を検出するためのＵＢＩ  ＰＲＲＳＶ  ＮＣ  ＥＬＩＳＡに用いる抗原ペプチド（配列番号２）の同定。
【図３】ＰＲＲＳＶ株ＭＤ００１（配列番号３）、ＪＸＡ１（配列番号４）、ＮＡ（配列番号５）及びＥＵ（配列番号６）由来の相同ヌクレオカプシドタンパク質配列のアラインメント。
【図４】マーカーワクチン設計に適したＰＲＲＳＶ  ＪＸＡ１株（受託番号ＡＹ２Ｇ２３５２）のＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ２〜ＯＲＦ７タンパク質における選択されたＢ細胞エピトープ及びＴ細胞エピトープの局在。
【図５】ＵＢＩ  ＰＲＲＳＶ  ＮＣ  ＮＡ  ＥＬＩＳＡでテストされた異なる起源由来のブタ血清の血清反応性。
【図６Ａ】ＵＢＩの診断システム（即ち、ＰＲＲＳＶ感染ブタを検出するためのテスト、ならびにＧＰ２、ＧＰ３、及びＧＰ４タンパク質由来のデザイナーペプチド免疫原を含むワクチン製剤を接種された動物を検出するためのテスト）によって検出及び識別されるように、ＰＲＲＳＶ感染ブタにおける標的ペプチド免疫原に対する特異的な高力価抗体を誘発するＵＢＩ  ＰＲＲＳＶマーカーワクチン製剤。
【図６Ｂ】ＵＢＩの診断システム（即ち、ＰＲＲＳＶ感染ブタを検出するためのテスト、ならびにＧＰ３、ＧＰ４、及びＧＰ５タンパク質由来のデザイナーペプチド免疫原を含むワクチン製剤を接種された動物を検出するためのテスト）によって検出及び識別されるように、ＰＲＲＳＶ感染ブタにおける標的ペプチド免疫原に対する特異的な高力価抗体を誘発するＵＢＩ  ＰＲＲＳＶマーカーワクチン製剤。
【図７】図７Ａは、ＰＲＲＳウイルス負荷後の病理組織学的病変を示す写真。間質性肺炎を発症したコントロール群の動物は、肺にリンパ球細胞による肺胞壁の肥厚が現れた。  図７Ｂは、ＰＲＲＳウイルス負荷後の病理組織学的病変を示す写真。ＵＢＩ  ＰＲＲＳ  ＧＰ５ペプチドワクチン製剤によって免疫化された動物。肺は正常な肺胞壁を維持する。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
ペプチド抗原は、免疫反応を検出することができ、あるペプチド抗原は、免疫反応を刺激することもできる。多くのペプチド抗原は、免疫反応の高感度かつ特異的な検出に用いられ得るが、ほとんどの場合、それら自体では免疫原として作用しない。ペプチド免疫原は、免疫反応の刺激及びそれらの検出に用いることができる、特殊な分類のペプチド抗原である。本発明のある態様によれば、ＰＲＲＳＶワクチン中のペプチド抗原は、防御免疫反応の発生を刺激するように共に作用するＢ細胞（Ｂ）エピトープ及びＴヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープの両方を有するペプチド免疫原であり、ＰＲＲＳＶ感染に対する免疫反応を検出することができる別の一組のペプチド抗原も存在する。
【００２８】
Ｂ細胞エピトープの同定のある方法は、多様な長さ、典型的には、２０〜６０残基又はこれ以上の長さ、のネステッドペプチド（nested peptide）であり且つ重複するペプチドの一組を利用する。これらのより長いペプチドは、面倒な一連の独立した固相ペプチド合成によって合成される。その後、得られたネステッドペプチドでありかつ重複するペプチドの一組を、抗体結合研究に用いることにより、非連続の立体構造Ｂ細胞エピトープを含む免疫優性決定基を最もうまく提示するペプチドを同定することができる。本発明の１つの態様は、２つの重複するＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ７がコードするヌクレオカプシドペプチドを提供し、その１方は７０アミノ酸配列（配列番号１、図２Ａにも示す）を有し、他方は７３アミノ酸配列（配列番号２、図２Ｂにも示す）を有し、かつ各々が独自に、最適な抗体認識のためのＢ細胞エピトープのクラスターを有している。これらの抗原ペプチドは、経験的に同定され、ＰＲＲＳＶ感染子ブタ由来の血清サンプル及びＥＬＩＳＡイムノアッセイ形式を用いて最適化された。ペプチド抗原を含む抗体捕捉相に適合できる任意のイムノアッセイ形式（例えば、ＥＬＩＳＡ）を用いることにより、ＰＲＲＳＶ感染ブタ由来の血液、血清、又は血漿サンプル中のＰＲＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質の特定のフラグメントに結合する抗体を検出し、かつ定量することができる。
【００２９】
ある特定の態様において、完全長ＰＲＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質のアミノ酸残基２〜７１に対応する、約７０アミノ酸の最適化ＰＲＲＳＶ抗原ペプチド（配列番号１）、及び完全長ＰＲＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質のアミノ酸残基５１〜１２３に対応する、約７３アミノ酸の別の最適化ＰＲＲＳＶ抗原ペプチド（配列番号２）が同定された。これらの２つのペプチドを混合物中に等比で混合して、感染ブタにおけるＥＬＩＳＡによるＰＲＲＳＶに対する抗体の検出に最適な抗体捕捉相を構成した。これらの２つの高抗原性ペプチドは共に、免疫優性Ｂ細胞エピトープのクラスターを有することが見出され、ＰＲＲＳＶ陽性血清パネルに対して最も顕著で一貫した抗原性を有した。ＰＲＲＳＶヌクレオカプシドペプチド（例えば、配列番号１及び２）を含む診断テストキットの製造及び使用は、本発明の種々の例示的態様の範囲内である。
【００３０】
本発明のＰＲＲＳＶ抗原ペプチドの特定の態様は、さらに配列番号１及び２の免疫学的に機能的なホモログであると定義され、これらは、ＰＲＲＳＶの突然変異株及び変異株由来の対応する配列及び立体構造要素を有する。相同ＰＲＲＳＶ抗原ペプチドは、起源となる変異体ＰＲＲＳＶ北米株のヌクレオカプシドタンパク質の２〜７１位及び５１〜１２３位とほぼ相関するアミノ酸残基を有する。このようなホモログは、ＣｌｕｓｔａｌＷ（Julie D. Thompson, Toby Gibson of European Molecular Biology Laboratory, Germany and Desmond Higgins of European Bioinformatics Institute, Cambridge, UK. Algorithmicにより作成）などの配列アラインメントプログラムによって容易に実証される。図３は、ＰＲＲＳＶ  ＭＤ００１  Ｔａｉｗａｎ／９９Ｙ／ＡＦ１２１１３１（配列番号３）、ＪＸＡ１  Ｂｅｉｊｉｎｇ／０６Ｙ／ＥＦ１１２４４５（配列番号４）、ＮＡ／ＮＪ−ａ／０４Ｙ／ＡＹ３７２８２（配列番号５）、ＥＵ／Ｌｅｎａ／０８Ｙ／ＥＵ９０９６９１（配列番号６）の多様な株から得た４つの抗原配列のＣｌｕｓｔａｌＷによるアラインメントを示す。図３にアラインメントされたヌクレオカプシドホモログの起源となるＰＲＲＳＶ株は、欧州株のウイルスを含む。表１はまた、起源となるＰＲＲＳＶ株であるＥＵ（欧州株／０８Ｖ２０４／Ｂｅｌｇｉｕｍ／ＥＵ／ＧＵ７３７２６６）を用いて、抗原ペプチド配列番号１及び配列番号２（北米株／ＭＤ００１／ＴＷ／ＡＡＣ９８５３６）のホモログ（配列番号７及び配列番号８）を例示する。ある態様において、配列番号１に対するホモログ（配列番号７）は、ＥＵ株由来のＰＲＲＳＶ  ＮＣタンパク質のアミノ酸約２位〜アミノ酸約７２位のアミノ酸配列を有する。別の態様において、ホモログ（配列番号８）は、ＥＵ株由来のＰＲＲＳＶ  ＮＣタンパク質のアミノ酸約５２位〜アミノ酸約１２８位のアミノ酸配列を有する。これらの２つの相同ペプチドも同様に、混合物中に等比で混合して、感染ブタにおけるＥＬＩＳＡによるＰＲＲＳＶ（好ましくは欧州株）に対する抗体の検出に最適な抗体捕捉相を構成できる。
【００３１】
本発明のホモログはさらに、配列番号１及び配列番号２と少なくとも５０％の同一性を有すると定義される。ある態様において、変異株ホモログ（配列番号７）は、配列番号１と約５０％の同一性を有する。別の態様において、変異株ホモログ（配列番号８）は、配列番号２と約６４％の同一性を有する。
【００３２】
感染動物の血清サンプル由来の抗体を検出するのに有用な、ＰＲＲＳＶ  ＮＣタンパク質から同定される抗原ペプチドに加えて、中和及び／又はレセプター結合機能部位に対応する、ＰＲＲＳＶ  ＧＰ２、ＧＰ３、ＧＰ４及びＧＰ５タンパク質上に存在する抗原領域がある。種々のペプチド免疫原は、標的ペプチドベースのＥＬＩＳＡによってそれぞれの免疫原性を評価するために、そしてさらに重要なことには、本発明の態様による免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）によって天然のＰＲＲＳＶタンパク質に対する誘発抗体の交差反応性のために、これらのエピトープ領域の周辺で設計された。また、ＰＲＲＳＶ  ＧＰ４、ＧＰ５、Ｍ及びＮＣタンパク質上に存在する、十分に実証された免疫優性Ｔ細胞エピトープがある。これらのＴヘルパー部位由来のペプチドは、ブタにおけるリンパ球増殖応答を引き起こし、動物における様々な細胞変性ウイルス感染に対する細胞性免疫反応に重要な役割を果たす、ＩＦＮ−γを含むサイトカイン産生をもたらす。
【００３３】
図４に示すような態様は、ＰＲＲＳＶ  ＪＸＡ１（受託番号ＡＹ２Ｇ２３５２）の配列に基づくＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ２〜ＯＲＦ７がコードする（ＧＰ２、ＧＰ３、ＧＰ４、ＧＰ５、Ｍ、及びＮ）タンパク質における、本発明の選択されたＢ細胞エピトープ及びＴ細胞エピトープの分布及び位置を説明する。
【００３４】
本発明の別の態様は、４つの最適化されかつ選択されたＰＲＲＳＶ  Ｂ細胞エピトープクラスターペプチドの配列、即ちＧＰ５．３（Ｖ２１−Ｅ６５）（配列番号９）、ＧＰ２Ｂ（Ｖ１１１−Ｌ１３６）（配列番号１０）、ＧＰ３Ｂ（Ｃ５７−Ｃ７５）（配列番号１１）、及びＧＰ４Ｂ（Ｃ５２−Ｃ６９）（配列番号１２）を提供する。これらのＢ細胞エピトープクラスターは、中和特性及びレセプター結合特性を有する部位の周辺に位置する。
【００３５】
本発明の他の態様は、これらの４つのＰＲＲＳＶ  Ｂ細胞エピトープクラスターペプチドの免疫学的に機能的なアナログを提供する。表３は、起源となる株であるＭＤ００１、ＪＸＡ１、ＮＡ及びＥＵを用いて、相同ＧＰ５（配列番号１３〜１５）、ＧＰ２（配列番号１７〜１９）、ＧＰ３（配列番号２１〜２３）、及びＧＰ４（配列番号２５〜２７）由来のＢエピトープクラスターペプチド配列のアラインメントを示す。Ｂ細胞エピトープクラスターペプチドの各々のコンセンサス配列（配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２８）も示され、可変位置に割り当てられたアミノ酸は、それらの位置に最も頻繁に適用されるアミノ酸である。
【００３６】
Ｂ細胞エピトープクラスターペプチドの免疫学的に機能的なアナログは、本来の抗原ペプチドと実質的に同じ免疫学的性質を保持する、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２及びホモログの変異体を含む。例えば、配列番号９の機能的なアナログ又はホモログである変異体は、１つのアミノ酸位置における保存的置換；総電荷の変化；別の部分への共有結合；あるいは小さい付加、挿入、欠失もしくは保存的置換及び／又はそれらの任意の組合せを有することができる。したがって、ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５．３  Ｂエピトープ（Ｖ２１−Ｅ６５）抗原ペプチド（例えば、配列番号９）に結合する抗体は、そのＰＲＲＳＶ  ＧＰ５．３  Ｂエピトープ抗原ペプチドの免疫学的に機能的なアナログにも実質的に類似の効力で結合することになるであろう。ある態様において、機能的なアナログは、配列番号９又はホモログに対して少なくとも４０％の同一性を有する。別の態様において、機能的なアナログは、配列番号１１又はホモログに対して少なくとも５６％の同一性を有する。さらに別の態様において、機能的なアナログは、配列番号１２又はホモログに対して少なくとも７２％の同一性を有する。さらに別の態様において、機能的なアナログは、配列番号１０又はホモログに対して少なくとも８０％の同一性を有する。なお別の態様において、機能的なアナログは、配列番号１２又はホモログに対して少なくとも９４％の同一性を有する。
【００３７】
ある態様において、表３に示すように、ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５．３  Ｂエピトープクラスターペプチド（Ｖ２１−Ｅ６５）の免疫学的に機能的なアナログは、保存的置換によるか、及び挿入又は欠失によって、改変されているＰＲＲＳＶ  ＧＰ５．３  Ｂエピトープクラスターペプチドのバージョンを包含する。この態様において、免疫学的に機能的なアナログは、配列番号９からか又は配列番号９のホモログから、保存的な置換によって改変することができる。
【００３８】
保存的置換は、１つのアミノ酸残基が、類似の化学的性質を有する別のアミノ酸残基に置き換えられる場合の置換である。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸として、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが挙げられ；極性中性アミノ酸として、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが挙げられ；正電荷（塩基性）アミノ酸として、アルギニン、リジン及びヒスチジンが挙げられ；負電荷（酸性）アミノ酸として、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。
【００３９】
別の態様において、表３及び表４に示すように、免疫学的に機能的なアナログは、Ｎ末端、Ｃ末端へのアミノ酸付加によって、及び／又はペプチドの中間部への挿入によって改変することができる。本発明の種々の態様において、付加は、ペプチドのＮ末端又はＣ末端への付加である。付加は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１アミノ酸残基の付加とすることができる（配列番号９及び３０）。このような付加は、ＰＲＲＳＶタンパク質に存在せず、かつＰＲＲＳＶ  Ｂエピトープクラスターペプチドの免疫原性を変更しない、アミノ酸配列を構成してもよい。ＰＲＲＳＶ  Ｂエピトープクラスターペプチドに存在しない付加として、小さい荷電配列（例えば、リジン?リジン?リジン）、分岐鎖構造の形成が可能なアミノ酸（例えば、εＮ?リジン）又は環化構造の形成が可能なアミノ酸（例えば、システイン）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のある態様において、ＰＲＲＳＶに存在しないアミノ酸配列の付加は、５アミノ酸以下の付加である。アミノ酸の付加は、古典的又は非古典的なアミノ酸のいずれか、もしくはそれらの混合物とすることができる。
【００４０】
別の特定の態様において、免疫学的に機能的なアナログは、ペプチドのＮ末端、Ｃ末端、及び／又は中間部に対するアミノ酸欠失によって改変することができる。種々の態様において、欠失は、ペプチドのＮ末端又はＣ末端に対する欠失である。欠失は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１アミノ酸残基の欠失とすることができる。表４に示すような特定の態様において、アミノ酸配列の欠失は、９アミノ酸以下の欠失である（配列番号３３及び３４）。
【００４１】
別の態様において、表７に示すように、ＰＲＲＳＶ  Ｂエピトープクラスターペプチドの免疫学的に機能的なアナログは、電荷の変更によって改変されているＰＲＲＳＶ  Ｂエピトープクラスター抗原ペプチドを包含する。このような電荷の変更は、アミノ酸の置換、付加、もしくは欠失、又は荷電分子の共有結合の結果であってもよい。電荷の変更により、そのペプチドが、未改変のペプチドと比較してより塩基性に、より酸性に、又はより中性になるという結果を生じてもよい。ある特定の態様において、そのペプチドは、１〜５個のリジン残基をＮ末端又はＣ末端に付加することによってより塩基性となる。より特定の態様において、そのペプチドは、３個のリジン残基をＮ末端に付加することによってより塩基性となる。
【００４２】
限定されない例として、本発明のペプチドの免疫学的に機能的なアナログは、末端のアミノ酸に付加された１〜約５個の追加のアミノ酸（古典的及び非古典的）を有することができる。例えば、電荷を変更するために、配列Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓを、このＰＲＲＳＶ  Ｂ細胞エピトープクラスターペプチドのアミノ末端に付加することができる。
【００４３】
上記ペプチドは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成法及びそのプロセスに対する無数の利用可能な改良法などの標準的な手法を用いて容易に合成することができる。上記ペプチドは、組換えＤＮＡ技術を用いて作製することもできる。このように、ＰＲＲＳＶ  Ｂ細胞エピトープクラスター抗原ペプチド及びＰＲＲＳＶ  Ｂ細胞エピトープクラスター抗原ペプチドの免疫学的に機能的なアナログをコードする核酸分子、ならびにその補体（compliments）は、本発明の種々の例示的な態様に包含される。ＰＲＲＳＶ  Ｂ細胞エピトープクラスター抗原ペプチド及び免疫学的に機能的なアナログをコードする核酸分子を含むベクター、特に発現ベクターもまた、本発明の種々の例示的な態様に包含される。それらのベクターを含有する宿主細胞も、本発明の種々の例示的な態様に包含される。
【００４４】
本発明の種々の例示的な態様はまた、ＰＲＲＳＶ抗原ペプチド及びＰＲＲＳＶ  Ｂ細胞抗原ペプチドの免疫学的に機能的なアナログを産生する方法も包含する。例えば、その方法は、ＰＲＲＳＶ抗原ペプチド及び／又はＰＲＲＳＶ抗原ペプチドの免疫学的に機能的なアナログをコードする核酸分子を含む発現ベクターを含む宿主細胞を、そのＰＲＲＳＶペプチド及び／又はＰＲＲＳＶペプチドの免疫学的に機能的なアナログが発現されるような条件下でインキュベートする工程を有することができる。
【００４５】
本発明のある態様により、固相合成によって産生されるペプチド組成物が提供される。この態様は、感染細胞の溶解物又は分泌物に由来する、管理されかつ十分に定義された免疫原を使用することができる。この態様の化学的プロセスによって産生される抗原の質は、管理されかつ定義されるので、結果として、抗原性、免疫原性及び収率の再現性を保証することができる。また、生体有害材料がペプチド抗原の製造に用いられないので、リスクを低下させ、費用のかかる生物学的封じ込めの必要性がなくなる。部位特異的免疫原は、高モル濃度の選択されたエピトープを提示するので、ＰＲＲＳＶ抗原ペプチド組成物を用いたワクチンの安全性及び免疫有効性の両方が保証される。
【００４６】
ある態様において、本発明のペプチドは合成される。定義されたＰＲＲＳＶ抗原合成ペプチドを用いることにより、子ブタにおける抗体検出及び診断のための抗原として用いられる場合、偽陽性の結果が最小限になる。公知のＢ細胞エピトープ及びＴｈエピトープを有する定義された合成ペプチドを免疫原として用いることにより、ワクチンの免疫原性成分として用いられる場合、ＰＲＲＳＶに感染したか又は組換えウイルスに感染した宿主細胞由来の、ならびに組換えタンパク質発現系由来の、ＰＲＲＳウイルス及び／又は組換えタンパク質と同時精製される可能性がある抗原性材料の存在によって引き起こされる、望ましくない非ＰＲＲＳＶ特異的免疫反応が排除される。例えば、ブタ由来の血清は、宿主細胞に対する、又は組換えEscherichia coli、酵母もしくはバキュロウイルスに対する抗体を有する可能性があり、それらは後に、生物学的に得られた抗原に基づく診断テストに用いられる抗原性材料と交差反応性となり、これらの外来性の免疫原を成分として含むワクチンによって生じるこのような免疫反応は、防御的ではない。対照的に、本発明のＰＲＲＳＶペプチドワクチンを接種されたブタは、宿主細胞又は発現ベクター由来のタンパク質、例えば、生物学的に誘導されたＰＲＲＳＶ抗原と同時精製される組換えEscherichia coli、酵母又はバキュロウイルス由来のタンパク質に対する不都合な抗体及び他の免疫反応がない、焦点を絞った免疫反応を生じるであろう。
【００４７】
合成ペプチドのこの態様はまた、産生中に生じる不純物による干渉も最小限にする。長い合成の場合、カップリング効率の厳密な制御にもかかわらず、アミノ酸の挿入、欠失、置換、及び早期終結を含む、伸長サイクル中の事象に起因してペプチドアナログも生成され、そのため、標的とするペプチド合成物とともに複数のペプチドアナログが生成する。それにもかかわらず、このようなペプチドアナログは、免疫診断用の固相抗原としてか又はワクチン接種用の免疫原としてのいずれかで、免疫学的用途に用いられる場合、抗原性及び免疫原性に寄与するものとしてペプチド調製物においてなおも適している。
【００４８】
合成ペプチドの免疫学的用途における２５年間の経験において、本発明者らは、意図した免疫学的活性の保持を可能にする構造的可変性の範囲が、低分子薬物による特定の薬物活性、又は生物学的に誘導される薬物と同時に生成される高分子に見られる所望の活性及び望ましくない毒性の保持を可能にする構造的可変性の範囲よりもはるかに融通が利くものであることを見出した。これは、意図的に設計されたか、又は意図したペプチドと類似のクロマトグラフィー特性及び免疫学的特性を有する欠失配列副産物の混合物として合成プロセスの誤りによって不可避的に生成されたかのいずれかのペプチドアナログが、所望のペプチドの精製された調製物と同程度に有効であることが多い理由である。これらのペプチドを使用して最終生成物の再現性及び有効性を保証するように、製造プロセス及び生成物評価プロセスの両方をモニタリングする識別力のあるＱＣ手順が開発される限り、設計されたアナログ及び意図しないアナログ混合物は、有効である。
【００４９】
本発明の他の態様において、内在性ＰＲＲＳＶ  Ｔｈペプチド及びそれらのホモログ（配列番号４７〜７９）をワクチン組成物中に含めることができる。Ｔｈペプチドが存在することにより、ＰＲＲＳＶペプチドワクチンの免疫原性を改善することができる。ＰＲＲＳＶ  Ｂエピトープに由来する免疫原性ペプチド（上述のホモログ及びアナログを包含する）は、内在性ＰＲＲＳＶ  Ｔｈエピトープと混合することができる。
【００５０】
本発明の他の態様において、内在性ＰＲＲＳＶ  Ｔｈペプチドはコンビナトリアル配列として提示されることができ、そこで、アミノ酸残基の組合せは、ＰＲＲＳＶ  Ｔｈペプチドに対するホモログの配列に基づいて、フレームワーク内の特定の位置に表される。コンビナトリアルペプチドの集合体は、合成プロセス中、特定の位置に、１つの特定のアミノ酸の代わりに設計された保護アミノ酸の混合物を付加することによって、１つの合成プロセスで合成することができる。このようなコンビナトリアルＰＲＲＳＶ  Ｔｈペプチド集合体により、多様な遺伝的背景の動物に対する広範なＴヘルパーエピトープ適用範囲が可能になる。ＰＲＲＳＶ  Ｔｈペプチドの代表的なコンビナトリアル配列を、ＰＲＲＳＶ  Ｔｈエピトープの各々について、表６の配列番号４７〜７９に由来するように、表７の配列番号８０〜９０に示す。
【００５１】
ある態様において、ＪＸＡ１配列に基づいて配列番号４７、５１、５５、５９、６１、６３、６７、７０、７４、７６と記載され（表６にも示す）、かつＰＲＲＳＶ  Ｂペプチド免疫原に結合していない、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６及びＯＲＦ７由来の免疫優性ＰＲＲＳＶ  Ｔｈエピトープのクラスターを有するＴｈペプチドを用いてＰＲＲＳＶ  Ｂエピトープペプチド免疫原の免疫原性を補い、実施例５に記載するように、ペプチドベースのＰＲＲＳＶワクチン製剤の免疫原性を増強することができる。Ｂエピトープペプチド免疫原に共有結合することなく、配列番号４７、５１、５５、５９、６１、６３、６７、７０、７４、７６を遊離ペプチドとして含むことにより、それらのワクチン製剤の免疫原性を改善することができる。実施例１０に記載されるような別の態様において、Ｂエピトープペプチド免疫原に共有結合することなく、群２について配列番号４７、５１、５５、５９、６１、６３、６７、７０、７４、７６を、ならびに群１、群３、及び群４について配列番号８０〜９０を遊離ペプチドとして含むことにより、それらのワクチン製剤の免疫原性を改善することができる。
【００５２】
別の態様において、ＰＲＲＳＶペプチド（上述のホモログ及びアナログを含む）は、スペーサーを介して又はスペーサーを介さずに、Ｔｈエピトープを含むことが知られている配列を含むペプチドに共有結合することができる。この態様により、Ｔｈエピトープに共有結合していない同等の免疫原よりも増強された免疫原性を提供することができる。ある特定の態様において、Ｔｈエピトープを含むペプチドは、ＰＲＲＳＶペプチドのＮ末端（配列番号３８）及び／又はＣ末端（配列番号３９）に共有結合する。別の特定の態様において、スペーサーは、配列Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−εＮＬｙｓ（配列番号３６）、又は単一アミノ酸εＮＬｙｓを有し、表５にも示す（それぞれ、配列番号４３及び４２）。ある態様において、Ｔｈエピトープを含むペプチドは、ＰＲＲＳＶペプチドのアミノ末端に共有結合する。ある特定の態様において、Ｔｈエピトープを含む表５に示すようなペプチド（配列番号４０）は、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−εＮＬｙｓスペーサー（配列番号３６）を介してアミノ末端に結合した人工コンビナトリアルＴｈペプチド配列番号３５（表５に示す）であり、配列番号４０として示す。
【００５３】
本発明の種々の態様は、ＰＲＲＳＶに対してブタを防御するためのワクチン組成物に関する。例示的な態様において、ワクチンは、免疫原性ペプチド抗原又はペプチド免疫原組成物及び許容可能な送達ビヒクル又はアジュバントを有する。種々の態様において、ＰＲＲＳＶワクチン組成物は、ペプチド抗原又はペプチド抗原組成物及び獣医学的に許容可能な送達ビヒクル又はアジュバントを有し、そのペプチド抗原は、
ａ）ＰＲＲＳＶ  Ｂ細胞エピトープクラスターペプチド抗原ＧＰ５．３（Ｖ２１−Ｅ６５）（配列番号９）、ＧＰ２Ｂ（Ｖ１１１−Ｌ１３６）（配列番号１０）、ＧＰ３Ｂ（Ｃ５７−Ｃ７５）（配列番号１１）及びＧＰ４Ｂ（Ｃ５２−Ｃ６９）（配列番号１２）のいずれか１つ；
ｂ）（ａ）のホモログ；
ｃ）（ａ）又は（ｂ）の抗原的にかつ免疫学的に機能的なアナログ；
ｄ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換、アミノ酸付加、及び／又はアミノ酸欠失を有する、（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）；ならびに
ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組合せ
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００５４】
ＰＲＲＳＶワクチンの態様において、ペプチド抗原の電荷は、１〜５個のアミノ酸を付加するか又は欠失させることによって変更される。ＰＲＲＳＶクチンの別の態様において、抗原的にかつ免疫学的に機能的なホモログ又はアナログは、ＧＰ２、ＧＰ３、ＧＰ４及びＧＰ５に由来する、ＰＲＲＳＶ  Ｂ細胞エピトープクラスターペプチド抗原ＧＰ５．３（Ｖ２１−Ｅ６５）（配列番号９）、ＧＰ２Ｂ（Ｖ１１１−Ｌ１３６）（配列番号１０）、ＧＰ３Ｂ（Ｃ５７−Ｃ７５）（配列番号１１）及びＧＰ４Ｂ（Ｃ５２−Ｃ６９）（配列番号１２）のいずれか１つに由来するアミノ酸配列の抗原と少なくとも５０％の同一性を有する。ある特定の態様において、ペプチド抗原は、配列番号９、１０、１１、１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００５５】
ＰＲＲＳＶワクチンの別の態様において、ペプチド抗原は、該ペプチド抗原のＮ末端又はＣ末端に共有結合したＴヘルパーエピトープをさらに有する。ある特定の態様において、Ｔヘルパーエピトープは、ペプチド抗原のアミノ末端に共有結合する。別の特定の態様において、Ｔヘルパーエピトープは、少なくとも１つのアミノ酸を有するスペーサーを介して、ペプチド抗原に共有結合する。ある特定の態様において、Ｔヘルパーエピトープは配列番号３５である。さらに別の特定の態様において、スペーサーはＬｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−εＮＬｙｓ（配列番号３６）である。さらに別の特定の態様において、スペーサーはεＮＬｙｓである。ある特定の態様において、ペプチド抗原は、配列番号４２、４３、４４、４５又は４６である。
【００５６】
種々の例示的な態様において、任意の量の免疫原性ペプチド抗原を用いて、動物における免疫反応を誘発することができる。ある特定の態様において、ペプチド抗原の量は、約０．１μｇ〜約１００ｍｇである。別の特定の態様において、ペプチド抗原の量は、約１μｇ〜約１０ｍｇである。さらに別の態様において、ペプチド抗原の量は、約１０μｇ〜約１ｍｇである。
【００５７】
ＰＲＲＳＶワクチン組成物の種々の態様において、この組成物は、配列番号４７、５１、５２、５５、５９、６１、６３、６７、７０、７４、及び７６の１１個のＰＲＲＳＶＴヘルパーエピトープペプチドの等モル混合物をさらに有する。ある特定の態様において、配列番号４７、５１、５２、５５、５９、６１、６３、６７、７０、７４、及び７６の等モル混合物の量は、約０．１μｇ〜約１ｍｇである。より特定の態様において、配列番号４７、５１、５２、５５、５９、６１、６３、６７、７０、７４、及び７６の等モル混合物の量は、約１μｇ〜約１００μｇである。
【００５８】
種々の例示的な態様において、任意のタイプ又は任意の量の送達ビヒクル又はアジュバントを用いることができる。ある特定の態様において、送達ビヒクル及びアジュバントは、モンタニド（Montanide）（商標）ISA 50V（油中水型エマルションを生成するための、植物油及びオレイン酸マンニド（mannide oleate）からなる油性ワクチンアジュバント組成物）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０（ポリソルベート８０又はポリオキシエチレン（２０）モノオレイン酸ソルビタンとしても公知）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、及び／又はそれらの任意の組合せである。
【００５９】
ある特定の態様において、ＰＲＲＳＶワクチン組成物は、配列番号３３のペプチド抗原及び獣医学的に許容可能な送達ビヒクル又はアジュバントを有し、ペプチド抗原の量は約１０μｇ〜約１ｍｇである
【００６０】
本発明の別の態様は、ＰＲＲＳＶ母性由来抗体（ＭＤＡ）陽性であるか又は陽性でない子ブタをＰＲＲＳＶ感染に対して防御する方法に関し、この方法は、上述の例示的な態様のいずれかに包含されるワクチンを投与する工程を有する。
【００６１】
本開示に従って調製した配列番号１及び配列番号２の２つのＰＲＲＳＶ  ＮＣペプチドの混合物を用いて、このペプチドをイムノアッセイの捕捉相に、例えばＥＬＩＳＡテストキットの固相免疫吸着剤に、抗原的有効量で使用することにより、ＰＲＲＳＶ抗体を検出することもできる。本発明のある態様によると、任意の適合性のイムノアッセイ形式を、対象のペプチドと共に用いることができる。このような形式は、当業者に周知であり、多くの標準的な免疫学マニュアル及びテキストに記載されている。例えばHarlowら、1988（２４）を参照のこと。これらには、他の周知のイムノアッセイ形式の中でも、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素イムノドットアッセイ、凝集アッセイ、抗体−ペプチド−抗体サンドイッチアッセイ、ペプチド−抗体−ペプチドサンドイッチアッセイが含まれる。ある態様において、イムノアッセイは、２つのＰＲＲＳＶ  ＮＣ抗原ペプチド（配列番号１及び配列番号２）を含むペプチド組成物でコーティングされた固相を用いるＥＬＩＳＡである。
【００６２】
本発明のある態様によると、このペプチドにより、成熟雌ブタ及び若雌ブタ、成熟雄ブタ及び去勢ブタ、ならびに子ブタ由来の血清を、ＰＲＲＳＶ感染についてスクリーニングＥＬＩＳＡによってテストすることができ、ワクチン接種前の子ブタ由来の血清を、母体由来の抗ＰＲＲＳＶ抗体のレベルについて評価することができ、かつ、ＰＲＲＳＶ抗原ペプチドを用いたワクチンに対する、ワクチン接種を受けた子ブタにおける免疫反応のレベルを測定することができる。
【００６３】
ある特定の態様において、ＥＬＩＳＡイムノアッセイを用いて、ブタの血液、血清又は血漿サンプルを、抗ＰＲＲＳＶ抗体の存在についてテストすることができ、このイムノアッセイは、
ｉ．２つのＰＲＲＳＶ  ＮＣペプチド（配列番号１及び配列番号２）の混合物を固体支持体に付着する工程、
ｉｉ．前記固体支持体に付着した前記ペプチドを、そのペプチドに抗体が結合するのを促す条件下で、抗体を含むブタの血液、血清又は血漿サンプルに曝露する工程、及び
ｉｉｉ．前記固体支持体に付着した前記ペプチドに結合した抗体の存在を検出する工程、
を有する。
【００６４】
別の特定の態様において、ＥＬＩＳＡイムノアッセイを用いて、ブタの血液、血清又は血漿サンプルを、抗ＰＲＲＳＶ抗体の存在についてテストすることができ、このアッセイは、
ｉ．２つのＰＲＲＳＶ  ＮＣペプチド（配列番号７及び配列番号８）の混合物を、欧州株配列に由来する配列番号１及び配列番号２のホモログとして、固体支持体に付着する工程、
ｉｉ．前記固体支持体に付着した前記ペプチドを、そのペプチドに抗体が結合するのを促す条件下で、抗体を含むブタの血液、血清又は血漿サンプルに曝露する工程、及び
ｉｉｉ．前記固体支持体に付着した前記ペプチドに結合した抗体の存在を検出する工程、
を有する。
【００６５】
対象のＥＬＩＳＡキットの例示使用において、テストすべきブタ血清サンプルを、サンプル希釈剤で希釈した後、１つ以上の上述のＰＲＲＳＶペプチドと、ある期間、存在する場合には任意の抗体が、ペプチド感作固相に結合する条件下で接触させる。未結合の材料を除去した後（例えば、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄することによって）、二次複合体を、ブタ特異的ＩｇＧに対する標識抗体又は標識プロテインＡ、標識プロテインＧ、もしくは標識プロテインＡ／Ｇと接触させる。これらの抗体又はプロテインＡ、ＧもしくはＡ／Ｇは、この二次複合体に結合して三次複合体を形成し、これらの二次抗体又はプロテインＡもしくはＧもしくはＡ／Ｇがレポーター分子で標識されているので、その三次複合体は、検出手段に供されると検出される。レポーター分子は、酵素、放射性同位体、フルオロフォア、生物発光分子、化学発光分子、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンなどとすることができる。ＥＬＩＳＡの場合、レポーター分子は、好ましくは酵素である。
【００６６】
本発明の特定の態様として、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
（１）ペプチド抗原及び獣医学的に許容可能な送達ビヒクル又はアジュバントを有する、ブタ生殖器呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）ワクチン組成物であって、該ペプチド抗原が、ａ）配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、及びこれらの任意の組合せ；ｂ）（ａ）のホモログ；及びｃ）（ａ）又は（ｂ）の任意の組合せ；からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、ＰＲＲＳワクチン組成物。
（２）ペプチド抗原が配列番号９のアミノ酸配列を有する、（１）に記載のＰＲＲＳワクチン。
（３）ペプチド抗原が配列番号１０のアミノ酸配列を有する、（１）に記載のＰＲＲＳワクチン。
（４）ペプチド抗原が配列番号１１のアミノ酸配列を有する、（１）に記載のＰＲＲＳワクチン。
（５）ペプチド抗原が配列番号１２のアミノ酸配列を有する、（１）に記載のＰＲＲＳワクチン。
（６）ペプチド抗原が、１〜５個のアミノ酸を付加するか又は欠失させることによって変更される、（１）に記載のＰＲＲＳワクチン。
（７）ペプチド抗原のアミノ末端又はカルボキシル末端に共有結合したＴヘルパーエピトープをさらに有する、（１）に記載のＰＲＲＳワクチン。
（８）Ｔヘルパーエピトープが配列番号３５である、（７）に記載のＰＲＲＳワクチン。
（９）Ｔヘルパーエピトープが、ε−リジン残基を有するスペーサーを介してペプチド抗原に共有結合する、（７）に記載のＰＲＲＳワクチン。
（１０）スペーサーが配列番号３６である、（９）に記載のＰＲＲＳワクチン。
（１１）抗原ペプチドに結合されていないＴヘルパーエピトープをさらに有し、該Ｔヘルパーエピトープが配列番号４７〜９０からなる群から選択される、（１）に記載のＰＲＲＳワクチン。
（１２）ペプチド抗原の総量が約１０μｇ〜約１ｍｇである、（１）に記載のＰＲＲＳワクチン。
（１３）送達ビヒクル及びアジュバントが、モンタニド（Montanide）ISA 50V、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート、及びＣｐＧオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、（１）に記載のＰＲＲＳワクチン。
（１４）（１）に記載のワクチンを投与する工程を有する、ＰＲＲＳ感染に対して子ブタを防御する方法。
（１５）  ａ）ペプチド抗原及び獣医学的に許容可能な送達ビヒクル又はアジュバント、ｂ）配列番号１０、１１、１２、３１、及びそれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド抗原、及びｃ）配列番号８０〜９０及びそれらの組合せからなる群から選択されるＰＲＲＳＶ  Ｔｈペプチド、を有する、ＰＲＲＳワクチン組成物。
（１６）  ａ）ペプチド抗原及び獣医学的に許容可能な送達ビヒクル又はアジュバント、ｂ）配列番号４２、４４、４５、４６、及びそれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド抗原、及びｃ）配列番号８０〜９０及びそれらの組合せからなる群から選択されるＰＲＲＳＶ  Ｔｈペプチド、を有する、ＰＲＲＳワクチン組成物。
（１７）  ａ）配列番号１及び配列番号２の混合物を固体支持体に付着させる工程、ｂ）前記固体支持体に付着した前記ペプチドを、該ペプチドに抗体が結合するのを促す条件下で、抗体を含むブタの血液、血清又は血漿サンプルに曝露する工程、及びｃ）前記固体支持体に付着した前記ペプチドに結合した抗体の存在を検出する工程、を有する、ＰＲＲＳ感染を診断する方法。
（１８）  ａ）配列番号７及び配列番号８の混合物を固体支持体に付着させる工程、ｂ）前記固体支持体に付着した前記ペプチドを、該ペプチドに抗体が結合するのを促す条件下で、抗体を含むブタの血液、血清又は血漿サンプルに曝露する工程、及びｃ）前記支持体に付着した前記ペプチドに結合した抗体の存在を検出する工程、を有する、抗ＰＲＲＳＶ抗体の存在をテストするためのＥＬＩＳＡイムノアッセイ。
【００６７】
以下の実施例は、本発明を説明するために役立つものであり、本発明の範囲を限定するために用いられるべきでない。
【実施例１】
【００６８】
ＰＲＲＳＶでコトランスフェクトされたＨＴＫ細胞を用いた免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）による標的ＰＲＲＳＶ  Ｂ細胞エピトープクラスターペプチド抗原と天然ＰＲＲＳＶタンパク質抗原との間の交差反応性についての免疫血清力価の評価のための血清学的アッセイ
【００６９】
ＰＲＲＳＶサブユニットタンパク質、ＧＰ３、ＧＰ４及びＧＰ５、に対する抗体は、組換えワクシニアウイルスｒＶＶＴ７（Ｔ７ポリメラーゼ組換えワクシニアウイルス）とＴ７プロモーターの下流にＰＲＲＳＶ  ｏｒｆ３、ｏｒｆ４及びｏｒｆ５をそれぞれコードするプラスミドでコトランスフェクトされたＨＴＫ細胞を用いる免疫蛍光法によって検出することができる。この方法は、哺乳類細胞において、その本来のウイルス複製と共に高忠実度でこれらのＰＲＲＳＶタンパク質の一過性の発現をもたらす。ＰＲＲＳＶ  ＧＰ３、ＧＰ４及びＧＰ５が膜貫通ドメイン及び側鎖修飾からなるので、最良のＰＲＲＳＶタンパク質構造は、デノボでしか生成できない。各々のＰＲＲＳＶサブユニットタンパク質、ＧＰ２、ＧＰ３、ＧＰ４又はＧＰ５、をデノボ合成し、コトランスフェクトされたＨＴＫ細胞を、ＰＲＲＳＶに対する特異的抗体の存在についての免疫アッセイにおける評価用免疫血清によって細胞内染色を行うための標的細胞として用いた。この免疫蛍光アッセイシステムにより、高い特異性及び感度で天然ＰＲＲＳＶ抗原に対する抗体の検出に最良の条件が可能になる。
【００７０】
図１Ａに図示するメカニズムに従って、ＨＴＫ細胞株細胞を、Ｔ７ポリメラーゼ組換えワクシニアウイルス（ｒＶＶＴ７）に感染させ（２１）、リポフェクトアミン（lipofectamine）（商標）（Invitrogen）によってＰＲＲＳＶ−ｏｒｆ３、ｏｒｆ４及びｏｒｆ５プラスミドでコトランスフェクトした（２２）。詳細には、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターによって媒介される天然のＰＲＲＳＶタンパク質の発現のためのｐＲＲＳＶプラスミドの構築を、以下のとおり行った：完全長のｐＲＲＳＶ遺伝子（台湾ＰＲＲＳＶ  ＭＤ００１株（受託番号ＡＦ０３５４０９）由来）を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅し、ｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏ（登録商標）プラスミドベクター（Invitrogen）にクローニングした。ｐＲＲＳＶプラスミドの発現能力を、ＰＲＲＳＶ株ＭＤ００１由来のｏｒｆ３、ｏｒｆ４及びｏｒｆ５に対する完全なヌクレオチド配列を示す配列決定によって確認した。
【００７１】
ＨＴＫ細胞を、９６ウェルプレートにおいて集密度（confuluency）８０％になるまで増殖させ、ｒＶＶＴ７に感染させ（２２）、次いで、リポフェクトアミン（商標）（Invitrogen）によってｐＲＲＳＶ  ｏｒｆ３、ｏｒｆ４及びｏｒｆ５プラスミドで個々にコトランスフェクトした。コトランスフェクションの２４時間後、細胞を８０％アセトンで固定し、このプレートを免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）によるＰＲＲＳＶタンパク質に対する抗体の検出のために−８０℃で保存した。
【００７２】
図１Ａの図は、Ｔ７ポリメラーゼ組換えワクシニアウイルス（Ｔ７／ｖａｃ）に感染させ（２１）、リポフェクトアミン（商標）（Invitrogen）によってｐＣＲ−ｏｒｆ５プラスミドでコトランスフェクトされたＨＴＫ細胞株細胞を示す。組換えＧＰ５タンパク質は、翻訳後に細胞質に輸送される（２２）。抗ＧＰ５抗体は、本発明のある態様によれば、トランスフェクトされたＨＴＫ宿主細胞の細胞質に結合し、標識二次抗体の免疫蛍光法によって検出される。この方法により、原核生物Ｔ７プロモーターを介した完全長ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５タンパク質のＨＴＫ細胞における一過性の真核生物発現によって、真正ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５タンパク質に対する抗体が高い特異性で検出される。ｐＣＲ−完全長ＰＲＲＳＶゲノムでの類似のトランスフェクションも、原核生物Ｔ７プロモーターを介した完全長ＰＲＲＳＶゲノムのＨＴＫ細胞における一過性の真核生物発現によるＰＲＲＳＶ  ＧＰ２、ＧＰ３、ＧＰ４、Ｍ及びＮタンパク質の高い特異性での検出に用いることができる。
【００７３】
免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）によるＰＲＲＳＶ抗体の力価測定
初めに血清サンプルをＰＢＳで１０倍希釈し、次に２倍の段階希釈を行った。各テストランのために、ＰＲＲＳＶ感染ＳＰＦブタ由来の陽性コントロール血清及び未感染ＳＰＦブタ由来の陰性コントロール血清の両方を含めて、ｐＲＲＳＶ  ｏｒｆ−７プラスミドによるＰＲＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質の発現を検証した。１：１０よりも高い希釈度で細胞質に局在した蛍光シグナルを生じる血清サンプル（図１Ｂに示す）を、＞１０のＩＦＡ力価を有するとスコア化した；これらの力価から、ＰＲＲＳＶに感染した動物が示された。ワクチン接種の結果として「標的ペプチド」特異的抗体を含む、動物ワクチン由来の血清について、特異的標的タンパク質又は完全ＰＲＲＳＶゲノムに対するそれらの抗体の交差反応性を、対応する標的天然ＰＲＲＳＶタンパク質（例えば、ＧＰ２、３、４又は５）を用いた免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）によって評価することができる。自然感染したブタから、又はＰＲＲＳＶペプチドベースのワクチンを接種したブタから採取した血清サンプルのすべてのテストを、コード下で行った。
【実施例２】
【００７４】
ＰＲＲＳＶの中和／レセプター結合部位を提示するデザイナーペプチドの免疫原性評価のためのＰＲＲＳＶ  Ｂ細胞エピトープクラスターペプチド抗原ベースのＥＬＩＳＡ
９６ウェルプレートのウェルを、特記しない限り１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ９．５）中の特記しない限り２μｇ／ｍＬでの個々の標的ペプチド１００μＬを用いて、３７℃で１時間、個々にコーティングした。
【００７５】
ペプチドでコーティングしたウェルを、３重量％ゼラチンのＰＢＳ溶液２５０μＬと共に３７℃で１時間インキュベートして、非特異的タンパク質結合部位をブロッキングした後、０．０５容量％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、乾燥させた。ＰＲＲＳＶ抗体についてＩＦＡで陽性のブタ血清及び陰性コントロール血清を、特記しない限り、２０容量％正常ヤギ血清、１重量％ゼラチン及び０．０５容量％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含むＰＢＳで１：２０に希釈した。この希釈した検体１００μＬを各ウェルに添加し、３７℃で６０分間反応させた。
【００７６】
次に、ウェルを０．０５容量％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０のＰＢＳ溶液で６回洗浄して、未結合抗体を除去した。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ブタＩｇＧを標識トレーサーとして用いて、陽性ウェル中で形成された抗体／ペプチド抗原複合体に結合させた。０．０５容量％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含む１容量％正常ヤギ血清のＰＢＳ溶液中の予め力価測定した最適希釈度のペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ブタＩｇＧ  １００μＬを各ウェルに添加して、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。０．０５容量％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０のＰＢＳ溶液でウェルを６回洗浄して未結合抗体を除去し、クエン酸ナトリウム緩衝液中に０．０４重量％３’，３’，５’，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）及び０．１２容量％過酸化水素を含む１００μＬの基質混合物とさらに１５分間反応させた。この基質混合物を用いて、有色生成物を形成させることによりペルオキシダーゼ標識を検出した。１．０Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を１００μＬ添加することにより反応を停止し、４５０ｎｍでの吸光度（Ａ４５０）を測定した。
【００７７】
動物血清中のＰＲＲＳＶ抗体を検出する目的に従って、血清希釈を行った。すなわち（ａ）潜在的な自然感染を識別するために、１：２０の希釈度を用い、Ａ４５０測定値を記録し、カットオフ計算用の固有の内在性の陰性コントロールを用いた；又は（ｂ）ペプチドベースのＰＲＲＳＶワクチン製剤を接種したブタの抗体価を測定するために、１：１０〜１：１０，０００の１０倍段階希釈の血清をテストし、テストした血清の力価（Ｌｏｇ１０として表される）をＡ４５０の線形回帰分析によって算出した。
【実施例３】
【００７８】
感染動物とワクチン接種動物を識別するための診断用途に最適なＰＲＲＳＶ抗原ペプチドの同定
ＰＲＲＳＶ分離体ＪＸＡ１、ＬＶ、ＥＵ、ＮＡの既に公開された配列由来、及び台湾株ＭＤ００１由来のＰＲＲＳＶのゲノム配列を用いて、オープンリーディングフレームからタンパク質配列を推定し、ＯＲＦ２、３、４、５、６及び７がコードするタンパク質配列から得られたデータを用いて、ＰＲＲＳＶ感染した動物由来の血清中の抗体を検出するためのＢ細胞エピトープクラスター抗原ペプチド、及びマーカーワクチン製剤を投与した動物において誘発される特異的抗体を検出するためにマーカーワクチン製剤に用いられる機能的中和／レセプター結合部位を提示する抗原ペプチドをデザインした。
【００７９】
本発明者らは、生物情報学の情報及び古典的な免疫化実験を用いて、診断用途及びワクチン用途に最適なＢ及びＴ細胞エピトープクラスター化ペプチドを同定するためにスクリーニングされるペプチドの数を限定する戦略を用いた。
感染動物とワクチン接種動物の識別のために緊急に必要とされるツール（「ＤＩＶＡ」システムと呼ばれる）の開発は、マーカーワクチン設計プロセスを補完するものである。
【００８０】
ブタにおいてＰＲＲＳＶ感染中に生成される大部分の抗体は、ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ７がコードするヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）タンパク質（これに対する主要な抗原決定基が同じ大陸由来の株間で比較的よく保存されている）に対して特異的であるので、このＮＣタンパク質を、ウイルス特異的抗体の検出ならびに感染及び疾患の診断に適した候補として標的化した。抗体捕捉のために合成ペプチドベースの抗原を用いる利点としては、偽陽性を引き起こす、ＰＲＲＳＶとは無関係の細胞成分が存在しないことに起因する特異性の改善、及びエピトープクラスターペプチドの固有の性質に起因する感受性の改善が挙げられることがよく知られている。
【００８１】
公知のＰＲＲＳＶ感染を有する動物由来の陽性血清を用いて、抗体検出に役立つ可能性のある強力かつ一貫した抗原性のための重複するＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ７がコードするＮＣペプチドをスクリーニングした。陰性血清は、正常なブタ及びＰＲＲＳＶ感染のないことが知られているＳＰＦブタから採取した。北米ＭＤ００１株のＮＣタンパク質のエピトープマッピングに関するデータを、図２に要約した。デザイナーペプチドを、２μｇ／ｍＬにて１ウェル当たり０．１ｍＬでプレートコーティングに用いた間接的ＥＬＩＳＡを行った。ＭＤ００１  ＮＣタンパク質由来の配列を徐々に長くした２つの系列（ａ〜ｅ）のペプチドを合成した。４１７１系列のペプチド（図２Ａに示す）は、残基７１で始まるＣ末端で合成し、４１７２系列のペプチド（図２Ｂに示す）は、残基１２３で始まるＣ末端で合成した。これらのペプチドを個々にプレートコーティングに用い、１２個の確証されたＰＲＲＳＶ陰性血清のパネルと共に３つのプールされたＰＲＲＳＶ陽性血清で、各ペプチドに対する感受性及び特異性についてテストした。
【００８２】
図２Ａに示すように、ペプチド４１７１ｅのＮ末端に位置する配列「ＰＮＮＮＧＫＱＱＫＫＫ」（配列番号９１）を有する１１ｍｅｒの抗原エピトープでテストしたこの４１７１系列由来のペプチドの中で、ペプチド４１７１ｅ（配列番号１）が最も抗原性が高いことが分かった。
【００８３】
図２Ｂに示すように、Ｎ末端に位置する配列「ＥＫＰＨＦＰＬＡＴＥＤＤＶＲＨＨＦＴ」（配列番号９２）を有する１８ｍｅｒの抗原エピトープでテストしたこの４１７２系列由来のペプチドの中で、ペプチド４１７２ｅ（配列番号２）が最も抗原性が高いことが分かった。
【００８４】
１８ｍｅｒの抗原エピトープ「ＥＫＰＨＦＰＬＡＴＥＤＤＶＲＨＨＦＴ」（配列番号９２）は、ペプチド４１７１ａ〜ｄ内で提示した場合、抗原性はなかった。しかし、この１８ｍｅｒのペプチドエピトープは、それ自体を完全長４１７１ｅ分子（配列番号１）内で提示して、配列番号１上の１１ｍｅｒの抗原エピトープ「ＰＮＮＮＧＫＱＱＫＫＫ」と組合せると、大きな立体構造エピトープを形成する。さらに、７０ｍｅｒ及び７３ｍｅｒの２つのペプチド（それぞれ、配列番号１及び２）の予想外の免疫優性抗原性は、長い連続エピトープ及び非連続エピトープの列を提示する、ＮＣタンパク質上の大きな露出面を提示する長鎖ペプチドと一致する。
【００８５】
抗原ペプチド４１７１ｅ（配列番号１）及び４１７２ｅ（配列番号２）を２：１の混合比で、３μｇ／ｍＬにて１ウェル当たり０．１ｍＬでプレートコーティングに用い、これはＰＲＲＳＶ北米株に対する抗体の捕捉／検出のためのＵＢＩ  ＰＲＲＳＶ  ＮＣ  ＥＬＩＳＡの一部を成した。
【００８６】
種々のＰＲＲＳＶ株（ＭＤ００１、ＪＸＡ１、ＮＡ及びＥＵ）由来の相同ＮＣタンパク質配列を、図３に示すようにアラインメントした。親ＭＤ００１配列と比較して、起源となるＥＵ配列にはアミノ酸残基の重大な置換、挿入及び欠失があるにもかかわらず、起源となる欧州株のＰＲＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質のアミノ酸配列に基づく表１に示すような置換ペプチドホモログ（配列番号３及び配列番号４）は、ＰＲＲＳＶ欧州株に対する抗体の捕捉／検出のためのＵＢＩ  ＰＲＲＳＶ  ＮＣ  ＥＵ  ＥＬＩＳＡにおいて抗原として同様に用いられる。
【００８７】
ＩＦＡテストによって抗ＰＲＲＳＶ  ＮＣタンパク質の反応性について予め特徴付けられた３０個の血清のパネルを陽性血清パネルとして用いて、ＵＢＩ  ＰＲＲＳＶ  ＮＣ  ＥＬＩＳＡの感受性及び特異性をさらに検証した。表２に示すように、ＵＢＩ  ＰＲＲＳＶ  ＮＣ  ＥＬＩＳＡは、ＩＦＡによる検出限界が約１：１６希釈であった場合、ＮＣタンパク質についてＩＦＡテストとだいたい同レベルの感受性を有する。ＵＢＩ  ＰＲＲＳＶ  ＮＣ  ＥＬＩＳＡテストを補助的な血清学ツールとして用いて、他の実施例に記載されるように、野外サンプルを評価し、感染動物とワクチン接種動物を識別し、ＰＲＲＳＶマーカーペプチドベースのワクチンを評価した。
【実施例４】
【００８８】
ＰＲＲＳＶマーカーワクチンに用いる抗原ペプチドを同定するための血清学的検証用ペプチドの設計及び合成
約１０〜約７０アミノ酸長の配列を有するＰＲＲＳＶ  ＧＰ２、ＧＰ３、ＧＰ４、ＧＰ５、Ｍ及びＮＣタンパク質由来のＰＲＲＳＶ  Ｂ細胞及びＴ細胞の両方のエピトープクラスター部位を提示する、幅広いレパートリーのＰＲＲＳＶ抗原ペプチドを設計した。いくつかのペプチドについて、適切な部位でアミノ酸置換を行うことにより、対応する天然タンパク質との交差反応を最大にするように局所構造維持に制約を与える環状ペプチドの形成が可能になった。他の抗原ペプチドについて、それらの各々の免疫原性を高めるために、人工コンビナトリアルＴｈペプチド（例えば、ＵＢＩＴｈ３、配列番号１５）と結合させた。すべてのペプチドを、ペプチド合成の反復サイクル、ワクチン形成、動物免疫化、及び血清学的テストを含む、大きな労力を要しかつ時間的制約のある「血清学的検証」プロセスに供し、各診断及びワクチンのための本発明者らの最初の適用を受けた標的動物における、さらなるテストのための候補ペプチドを得た。
【００８９】
免疫原性テストに用いられるすべてのペプチドを、Ｆｍｏｃ化学を用いて、Applied BioSystems Peptide Synthesizer Models 430A, 431及び433を用いて合成した。Ｎ末端のＦｍｏｃ保護及び三官能性アミノ酸の側鎖保護基を用いて、固相支持体上での独立した合成によって、各ペプチドを作製した。完成したペプチドを固体支持体から切り離し、９０％トリフルオロ酢酸によって側鎖保護基を除去した。合成ペプチド調製物を、正確な組成についてマトリックス支援レーザー脱離飛行時間型（ＭＡＬＤＴＯＦ）質量分析によって、且つ合成プロファイル及び濃度を含む内容について逆相ＨＰＬＣによって、特徴付けした。長い合成の場合、カップリング効率の厳密な制御にもかかわらず、伸長サイクル中の事象（アミノ酸の挿入、欠失、置換、及び早期終結を含む）に起因してペプチドアナログも生成されたため、標的とするペプチドとともに複数のペプチドアナログが生成した。それにもかかわらず、このようなペプチドアナログは、免疫診断用の抗体捕捉抗原として、又はワクチン接種用の免疫原としてのいずれかで免疫学的用途に用いられる場合、抗原性及び免疫原性に寄与するものとしてペプチド調製物においてなおも適していた。これらのペプチドを使用して最終生成物の再現性及び有効性を保証するように、製造プロセス及び生成物評価プロセスの両方をモニタリングする識別力のあるＱＣ手順が開発される限り、意図的に設計したか又は合成プロセスの間に副産物の混合物として生成したこのようなペプチドアナログは、典型的には、所望のペプチドの精製調製物と同程度に有効であることが多い。
【００９０】
図４は、後のワクチン製剤用途に用いるために本発明者らの最初の調査及び検証を経た、ＰＲＲＳＶ２〜ＯＲＦ７がコードするタンパク質（ＧＰ２、ＧＰ３、ＧＰ４、ＧＰ５、Ｍ及びＮＣタンパク質）上における選択されたＢ細胞エピトープ及びＴ細胞エピトープの分布／局在を示す。Ｂ細胞エピトープクラスターペプチド免疫原の設計目標は、中和抗体を誘導することができるか、又は標的細胞に結合するＰＲＲＳＶレセプターに関連する、選択された機能部位を模倣する抗原ペプチドを作り出すことである。特異的なＧＰ５  Ｂ細胞エピトープクラスターペプチドを、単一のＰＲＲＳＶ株配列に基づくか、又はいくつかのＰＲＲＳＶ株配列に由来する場合は、広範なウイルス適用範囲のためのコンビナトリアル配列として、天然のＰＲＲＳＶ  ＧＰ５タンパク質抗原に対するそれらの相対的な免疫原性及び交差反応性をテストするために、表４に示すようにレセプター結合／中和部位の周辺の４つのアミノ酸フレームＧＰ５．１、５．２、５．３及び５．４（配列番号９〜１４）にわたって設計した。
【００９１】
ＧＰ２  Ｂエピトープ（Ｖ１１１−Ｌ１３６）、ＧＰ３  Ｂエピトープ（Ｃ５７−Ｃ７５）及びＧＰ４  Ｂエピトープ（Ｃ５２−Ｃ６９）の呼称で、ＰＲＲＳＶ  ＪＸＡ１配列に基づき構造タンパク質ＧＰ２〜ＧＰ４由来の中和部位の周辺で設計された、さらなるＢ細胞クラスター抗原ペプチドを、表３に示す。ＧＰ２  Ｂ（Ｖ１１１−Ｌ１３６）は直鎖ペプチド（配列番号６）として提示され、一方、ＧＰ３  Ｂエピトープ（Ｃ５７−Ｃ７５）及びＧＰ４  Ｂエピトープ（Ｃ５２−Ｃ６９）は環状ペプチド（配列番号７及び８）として提示されることにより、立体構造維持のための局所的制約が可能になる。これらの抗原ペプチドはまた、これらのペプチド抗原の長さが短い性質に起因する免疫原性を増強するために、表５に示すようにＧＰ５．１及びＧＰ５．２フレームについてＣ末端で（配列番号２９及び３０）、又はＮ末端で（配列番号３９〜４６）のいずれかで、人工コンビナトリアルＴｈペプチド（配列番号１５）に個々に結合した。これらのＢ細胞エピトープクラスターペプチド免疫原をワクチン製剤に組み込み、十分に設計されたプロトコルに従ってモルモット又はブタを免疫化し、広範な血清学的評価のために免疫血清を適時に採取した。これらの免疫血清を、それぞれの標的ペプチド抗原に対する抗体力価についてそれぞれの標的ペプチド抗原ベースのＥＬＩＳＡでテストすることにより、免疫原性についてテストした。
【００９２】
免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）によるＰＲＲＳＶ天然タンパク質抗原に対する交差反応の検出は、実施例１に記述したように行った。これは、設計したペプチド免疫原が最終的なワクチン製剤での使用に適していることを評価するためのものである。ペプチド免疫原として認められたこれらのペプチド抗原について、表３に示すような起源となるＰＲＲＳＶ株（例えば、ＭＤ００１、ＪＸＡ１、ＮＡ及びＥＵ株）由来の配列、又はコンセンサス（ｃｏｎｓ）配列、あるいはそれらに由来する、配列番号３２、３３及び３４として表４に示すようなコンビナトリアル配列を有するペプチドホモログを、異なる株のＰＲＲＳＶとの広範な交差反応性のために免疫化宿主において抗体を誘発できるペプチド免疫原としてさらに設計した。
【００９３】
Ｔ細胞エピトープクラスターペプチド免疫原の設計は、はるかに簡単である。免疫化宿主における細胞性免疫反応の幅を広げるために、ＰＲＲＳＶで免疫化された後にウイルス負荷されたブタから得られた末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の培養においてＩＦＮ−γ応答を誘導する能力に基づいて十分に特徴付けされた免疫優性Ｔ細胞エピトープを、ワクチン製剤に組み込むために選択した。ＧＰ４、ＧＰ５、Ｍ及びＮＣタンパク質由来の、ＰＲＲＳＶ  ＪＸＡ１株に基づくＴ細胞エピトープクラスターペプチドの配列、ならびに種々のＰＲＲＳＶ株（ＭＤ００１、ＮＡ  及びＥＵ）の相同ＰＲＲＳＶ  Ｔヘルパーエピトープ配列のアラインメントを、配列番号４７〜７９として表６に示す。これらのやや疎水性のペプチド抗原の溶解性を改善するために、それらに対する個々のＴヘルパーペプチドのＮ末端に３つのリジン残基（ＫＫＫ）を付加して、ペプチド免疫原として作用するようにした。全ての同定されたＴｈペプチド免疫原（配列番号４７〜７９）を、ＰＲＲＳＶ  Ｂ細胞クラスターペプチド免疫原の免疫原性をさらに増強するための補充（Ｔ細胞エピトープ１）として、かつそれら自体で細胞性免疫のためのＰＲＲＳＶ  Ｔ細胞ペプチド免疫原として、ワクチン製剤中に等比で混合することによって、これらのＴ細胞クラスターペプチドのプールを作製した。  
【００９４】
Ｔ細胞エピトープ適用範囲を動物の多様な遺伝的背景にわたってさらに広げるために、特異的エピトープのコンビナトリアルペプチド（４つの相同Ｔエピトープ配列に基づく）を、各々のＴ細胞エピトープについて調製する。同様に、表７に示すように、３つのリジン残基（ＫＫＫ）を、それぞれのコンビトリアルＴエピトープクラスターペプチド免疫原（配列番号８０〜９０）のＮ末端に付加した。これらのＴエピトープクラスターコンビトリアルペプチド免疫原のプール（プール２）を、ＰＲＲＳＶ  Ｂ細胞クラスターペプチド免疫原の免疫原性をさらに増強するためのワクチン製剤中の補充として、かつそれら自体で細胞性免疫のためのＰＲＲＳＶ  Ｔ細胞ペプチド免疫原として用いた。
【実施例５】
【００９５】
免疫原性及び天然ＰＲＲＳＶタンパク質との交差反応性を評価するための、ＧＰ５、ＧＰ２、ＧＰ３及びＧＰ４タンパク質由来のＰＲＲＳＶ  Ｂエピトープクラスターペプチド抗原を含むワクチン製剤を用いたモルモット又はブタの免疫化
外部ドメインは、細胞外空間（細胞の外側の空間）へと伸びる膜タンパク質のドメインである。外部ドメインは、通常、標的細胞表面との接触を開始し、感染の間、細胞への付着及び細胞内への侵入の原因となる、ウイルスタンパク質の部分である。中和抗体はウイルスとその細胞レセプターとの相互作用を阻止するので、ウイルス侵入関連ドメインは、中和抗体の誘導にとって重要である。したがって、次世代の有効なＰＲＲＳＶワクチンを開発する場合、ＰＲＲＳＶのウイルス侵入関連ドメインの機能性を評価することが重要である。マクロファージ特異的レクチンであるシアロアドヘシン（ＣＤ１６３）は、マクロファージ上の極めて重要なウイルスレセプターである。可溶型のシアロアドヘシンを用いて、ＰＲＲＳＶのＧＰ５及びＭの複合体のジスルフィド結合ヘテロダイマーが、シアロアドヘシンに対するリガンドであることを見出した。このリガンド−レセプター相互作用は、シアロアドヘシンのレクチン活性、及びＧＰ５糖タンパク質上のシアル酸に依存する。したがって、ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５タンパク質の外部ドメイン及びＧＰ５の免疫原性に対するＭの影響を調査して、ウイルスＭ／ＧＰ５と宿主細胞レセプターシアロアドヘシンとの間の相互作用を阻止する免疫を誘導する目的で、ＰＲＲＳＶマーカーワクチン製剤に用いるのに最適なＧＰ５ペプチド免疫原を同定した。
【００９６】
ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５タンパク質の外部ドメインのレセプター結合／中和部位の周辺で４５個を超えるペプチド抗原を設計し、免疫原性評価のために４つのアミノ酸配列フレームに分類した。
【００９７】
第１のフレームは、ＰＲＲＳＶ株ＭＤ００１の配列に基づいて、ＧＰ５外部ドメインのＣ末端残基「Ｅ」（グルタミン酸）で始まり、ＧＰ５タンパク質のシグナル配列中に５つの追加のアミノ酸残基を含んで、外部ドメインのＮ末端まで伸長することにより、ＧＰ５．１  ＭＤ００１（Ａ２６−Ｅ６５）ペプチド抗原（配列番号２９）として表４に示すような４０ｍｅｒのペプチド抗原を作製した。この設計は、必要であれば、ＧＰ５ペプチド抗原の中心部のＣｙｓ残基がＭペプチドの外部ドメインとジスルフィド結合を形成することができる。
【００９８】
第２のドメインは、ＧＰ５．１  ＭＤ００１（Ａ２６−Ｅ６５）ペプチド抗原のシグナル配列中への別の５つのアミノ酸残基による、Ｎ末端での伸長で得られた、４５ｍｅｒのペプチドＧＰ５．２  ＭＤ００１（Ｖ２１−Ｅ６５）（配列番号３０）であり、Ｃ２４とＣ４８の間の分子内ジスルフィド結合により、ＧＰ５の外部ドメインの局所立体構造の維持が可能になった。この設計により、Ｍタンパク質の非存在下で、ＧＰ５の外部ドメインの大部分に対する特異的抗体の誘導が可能になった。
【００９９】
第３のフレームは、外部ドメインの１１ｍｅｒのＧＰ５  ＨＶ２領域を除外したことを別として、第２フレームペプチド抗原ＧＰ５．２  ＭＤ００１（Ｖ２１−Ｅ６５）をモデルにして、３４ｍｅｒのペプチド抗原ＧＰ５．３（Ｖ２１−Ｄ５４）（配列番号９）を得た。この設計により、ＧＰ５の外部ドメインの高度に保存された中心領域のＢ細胞認識が可能になる。
【０１００】
第４のフレーム（ＧＰ５．４）は、ＧＰ５タンパク質の外部ドメインの中央に位置するループ構造を対象とし、ＰＲＲＳＶ株ＭＤ００１配列に基づく２５ｍｅｒの環状ペプチドＧＰ５．４（Ｃ２４−Ｃ４８）になった。株間の変異に適応させるために、北米型のＪＸＡ１／ＭＤ００１及びＪＸＡ１／ＮＪ−ａのＰＲＲＳＶ株配列に従って第３及び第４アミノ酸フレームのペプチド抗原をモデルにしたコンビナトリアルペプチドを、ＧＰ５．３  ＪＸＡ１／ＭＤ００１（Ｖ２１−Ｄ５４）（配列番号３２）、ＧＰ５．３  ＪＸＡ１／ＮＪ−ａ（Ｖ２１−Ｄ５４）（配列番号３３）及びＧＰ５．４  ＮＪ−ａ／ＪＸＡ１／ＭＤ００１  （Ｃ２４−Ｃ４８）（配列番号３４）として設計した。ＧＰ５外部ドメインペプチド免疫原性に対するＭタンパク質の外部ドメインの影響を評価するために、ＭＤ００１配列に基づいて以下の配列：「ＭＧＳＳＬＤＤＲＣＨＤＳＴＡＰＱＫＶＬＬＡＦＳＩＴＹ」（配列番号９３）を有する２６ｍｅｒの外部ドメインペプチドを、評価用に設計した（Ｍ１−Ｙ２６）。
【０１０１】
ＰＲＲＳＶの構造は、ウイルスＲＮＡと結合したヌクレオカプシドタンパク質からなる。この核タンパク質は、脂質エンベロープに囲まれ、そのエンベロープ中に以下の６つの構造タンパク質が埋め込まれている：ＧＰ２、ＧＰ３、ＧＰ４、ＧＰ５ならびに非グリコシル化タンパク質Ｍ及びＥ（ＯＲＦ２ｂ）。ＧＰ５及びＭは、エンベロープ内で最も豊富なタンパク質であり、その他のエンベロープタンパク質の存在量はより少ない。ＧＰ５は、ＰＲＲＳＶ防御免疫のための主要な標的であり続けてきたが、ＰＲＲＳＶの変異性、ならびにＧＰ２及びＧＰ３も臨床学的及びウイルス学的防御にいくらか関わっている一方、ＧＰ２、ＧＰ３及びＧＰ４由来の抗原ペプチドに結合する実証されたポリクローナル抗体もＰＲＲＳＶに対する中和活性を示すという最新の知見を考慮して、ＧＰ２、ＧＰ３及びＧＰ４由来の選択された抗原ペプチドも、ＰＲＲＳＶワクチン製剤中に組み込むために設計し、スクリーニングし、同定した。具体的には、表３に示すような抗原ペプチドＧＰ２Ｂエピトープ（Ｖ１１１−Ｌ１３６）（配列番号１０）、ＧＰ３  Ｂエピトープ（Ｃ５７−Ｃ７５）（配列番号１１）、ＧＰ４  Ｂエピトープ（Ｃ５２−Ｃ６９）（配列番号１２）を、免疫原性及び交差反応性評価のために、ＰＲＲＳＶ  ＪＸＡ１株配列に基づき設計した。種々のＰＲＲＳＶ株の相同ＧＰ５、ＧＰ２、ＧＰ４及びＧＰ４由来のＢエピトープ配列も、ペプチド抗原設計の参照のために例として表３にリスト化する。
【０１０２】
ＧＰ５、ＧＰ２、ＧＰ３、及びＧＰ４由来のこれらのＢエピトープクラスターペプチド抗原はまた、表５に示すように、ＧＰ５．１及びＧＰ５．２フレームについてＣ末端（配列番号３７及び３８）又はＮ末端（配列番号３９〜４６）でのいずれかで、人工コンビナトリアルＴｈペプチド（配列番号３５）に個々に結合し、それらの長さが短い性質を克服してこれらのペプチド抗原の免疫原性を増強させた。
【０１０３】
ワクチン製剤
本発明のペプチドベースＰＲＲＳＶワクチンの例示される使用において、アミノ末端又はカルボキシル末端でＬｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−εＮＬｙｓ（配列番号３６）又はεＮＬｙｓスペーサーを介して、人工コンビナトリアルＴｈ配列ＵＢＩＴｈ（登録商標）３（配列番号３５）などの外来性のＴｈエピトープに結合するか又は結合しない、表３〜７に配列番号９〜９０としてリスト化されるようなレセプター結合／中和部位又はＴヘルパーエピトープクラスター部位を有する免疫原ペプチドとして含むワクチン製剤を、市販の油性ワクチン送達ビヒクルであるモンタニド（Montanide）ISA 50V2を用いて供給業者の推奨手順に基づいて、油中水型エマルションに製剤化した。オレイン酸マンニド（mannide oleate）の油性アジュバント組成物であるモンタニド（Montanide）（登録商標）ISA 50V2（Ｓｅｐｐｉｃ、パリ、フランス）及びブタワクチンに通常用いられるミネラルオイルを、等容量の水相ペプチドＰＢＳ溶液で乳化した。ペプチド免疫原を、特定のプロトコル（例えば、エマルション中のペプチド比及び総ペプチド濃度）に従って、約２５〜７５μｇ／ｍＬでそれぞれのエマルションに製剤化した。これらのエマルションベースのワクチン製剤を、他に特記しない限り、１部位当たり０．２５ｍＬ〜０．５ｍＬでモルモットに、又は１部位当たり１ｍＬで子ブタに筋肉注射した。
【０１０４】
デザイナーペプチドワクチン製剤でのモルモット及び子ブタの免疫化
モルモットにおいて行った免疫原性研究について、成熟した無感作の雄及び雌Duncan-Hartleyモルモット（体重３００〜３５０ｇ）を、１群当たり３匹で用いた。２回用量として０ｗｐｉ及び３ｗｐｉに筋肉内（ＩＭ）に特定のワクチン製剤を投与して動物を免疫化した。これらのワクチン製剤は、免疫化の前に約３０分間室温に放置し、約１０〜１５秒間攪拌しなければならない。初回免疫化後０週目、３週目及び５週目（ｗｐｉ）に、血清サンプル用に血液を採取した。ペプチド免疫原及びワクチン製剤の免疫原性評価のために、実施例１及び２に記載されるように、直接結合力価について標的ペプチドベースのＥＬＩＳＡによって、ならびに交差反応性力価についてＰＲＲＳＶによりコトランスフェクトされた細胞ベースのＩＦＡによって、これらのサンプルをテストした。
【０１０５】
特定病原体不在（ＳＰＦ）農場由来の約４週齢の子ブタを、免疫原性研究のために耳標を付け、研究プロトコルに従ってグループ化した（子ブタ３〜５頭／群）。これらの群を、０週目及び４週目に筋肉内にワクチン製剤を投与して免疫化した。１つの研究において、以前にＰＲＲＳＶ感染があった通常の農場由来の子ブタを用いて、感染ブタと本発明のマーカーワクチン製剤をワクチン接種したブタとを区別するために、診断ＥＬＩＳＡテストの組合せを用いることにより、抗ＰＲＲＳＶ抗体の存在下でのデザイナーＰＲＲＳＶペプチド抗原の別個の免疫原性を評価し、ＰＲＲＳＶマーカーワクチン製剤に対するこれらのブタの応答を測定した。
【０１０６】
初回免疫時、３〜４週目の第１回追加免疫時、及び５〜６週目の追加免疫から２週間後に血液サンプルを採取し、血清サンプルを調製し、実施例１及び２に詳述するように免疫原性及び交差反応性の評価のための複数の血清学的テストに供した。
【０１０７】
ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５タンパク質外部ドメイン配列から設計したペプチド免疫原の最適化及びランク付け
調製した多数のＧＰ５外部ドメインペプチド免疫原の中から９個をエマルション製剤に製剤化して、初回及び追加免疫の免疫化スケジュール後のそれらの相対的な免疫原性を、図示及びランク付けした。表８から分かるように、ＰＲＲＳＶ  ＭＤ００１配列に基づくペプチド免疫原４０２０Ｋｃ（配列番号３８）は、標的ペプチドＥＬＩＳＡ（＞１  ｌｏｇ１０）及びＩＦＡ力価の両方に基づいて、ペプチド免疫原４０２０Ｋｂ（配列番号３７）よりも免疫原性が高い。したがって、アミノ酸配列フレーム２（ＧＰ５．２）設計は、フレーム１（ＧＰ５．１）よりも優れている。ペプチド免疫原４０２０Ｋｃを、実施例６に詳述するように、ＰＲＲＳＶ  ＭＤ００１によるＰＲＲＳＶ負荷研究の大部分に用いた。表８に示すように、ＰＲＲＳＶ  ＭＤ００１由来の配列を有するフレーム３（ＧＰ５．３）で設計されたペプチド免疫原４０４８Ｋｂ（配列番号３９）は、ペプチド４０２０Ｋｃとほぼ同じ免疫原性を有することが見出されたが、そのＩＦＡ力価は、ペプチド免疫原４０２０ＫｃのＩＦＡ力価よりも高かった。ペプチド免疫原４０４８Ｋｂと比較した場合に、ＥＬＩＳＡ及びＩＦＡの両方によって実証されるような類似の免疫原性が、第３フレーム（ＧＰ５．３）に基づいて設計された別のペプチド免疫原４０５０Ｋｂ（配列番号４０）で見出された。したがって、フレーム３は、ＧＰ５  Ｂ細胞エピトープクラスター抗原提示のためのより有利な設計フレームとみなされた。
【０１０８】
ウイルス株の適用範囲を広げるために、本発明者らは、アミノ酸配列フレーム３に基づいて、例えばペプチド免疫原４０５２Ｋｂ（配列番号４１）及びペプチド４１２４  Ｋｂ（配列番号４２）のような、いくつかの関連するコンビナトリアルペプチド抗原の設計に進み、単一配列ＧＰ５ペプチド４０４８ａ（配列番号９）及び４０５０ａ（配列番号３１）と比較した場合の抗体反応性の幅についてテストした。ＭＤ００１及びＪＸＡ１由来のＧＰ５．３フレーム配列との二重反応性が、ペプチド４０５２Ｋｂ（配列番号４１）を用いた免疫化により得られた免疫血清について見出されたことから、ＭＤ００１及びＪＸＡ１の両方の適用範囲の幅が実証された。ＧＰ５．３ペプチド抗原４１２４ａ（配列番号３０）及び４１２４Ｋｂ（配列番号４２）を、ペプチド免疫原のコンビナトリアル性をさらに拡大するために設計し、それらの各々の免疫原性について比較した。表８に示すように、ＥＬＩＳＡ及びＩＦＡの両方によって示されるような免疫原性の著しい増強が、ペプチド抗原４１２４ａと比較した場合にペプチド４１２４Ｋｂで見出され、ペプチド抗原４１２４ａに結合した場合の人工コンビナトリアルＴｈペプチド（配列番号３５）の免疫原性増強効果がわかった。ＧＰ５のループ構造を維持するようにＮ末端及びＣ末端の両方でアミノ酸を減らすことにより、ペプチド抗原４０９４ａ（配列番号３５）及びそのより高い免疫原性型のペプチド抗原４０９４Ｋｂ（配列番号４３）の設計を得た。両方のペプチド抗原が、このような配列トリミングの後に、低下した免疫原性を示したので、人工的に構築したループ構造（Ｃ２４−Ｃ４８）は、ＧＰ５外部ドメインの重大な意味を持つ部分を残しており、それにより増強される免疫原性は、ペプチド抗原４１２４ａ及び４１２４Ｋｂの構造中にＮ末端及びＣ末端の両方から伸長することによって、最適に組み込まれることができる。
【０１０９】
すべての評価において、人工コンビナトリアルＴｈペプチド（配列番号３５）の、ペプチド抗原４０２０ｂ及び４０２０ｃの場合に見られるようなＣ末端への付着（結果として、４０２０Ｋｂ及び４０２０Ｋｃが生じる）、又は４１２４ａのようなＮ末端への付着（結果として、４１２４Ｋｂが生じる）はすべて、各々のペプチド抗原が、より優れたペプチド免疫原になることを促進した。ペプチド４０９４及び４１２４系列のペプチド抗原を、実施例７に記載されるようにＰＲＲＳＶ  ＪＸＡ１株によるＰＲＲＳＶ  ＧＰ５ベースの負荷研究を追跡するために、エマルションワクチン製剤に調製した。ペプチド免疫原４１２４Ｋｂは、エマルションの単回投与にもかかわらず、高病原性ＰＲＲＳＶ  ＪＸＡ１株による感染からの無感作子ブタの完全な（２０頭／２０頭＝１００％）防御の成功が実証された（群５）一方、ペプチド免疫原４０９４系列は、２回用量の免疫化の後に最適以下の防御（４頭／５頭＝８０％）をもたらした。
【０１１０】
ＧＰ５  Ｂエピトープクラスターペプチド抗原の免疫原性へのＰＲＲＳＶ外部ドメインＭペプチドの効果
ＧＰ５及びＭは、ＰＲＲＳＶエンベロープ内で最も豊富なタンパク質であり、これらの２つのタンパク質は、それらの外部ドメイン中にジスルフィド結合ヘテロダイマーを形成して、マクロファージの細胞表面上のシアロアドヘシンレセプター（ＣＤ１６３）に対するリガンドとして作用する。完全長Ｍ外部ドメインペプチド抗原（２６ｍｅｒの長さ）を調製し、１：１及び１：１０の比で完全長ＧＰ５外部ドメインペプチド免疫原４０２０Ｋｂ又は４０２０Ｋｃと混合して、ＧＰ５外部ドメインペプチド抗原４０２０Ｋｂ及び４０２０Ｋｃの両方の免疫原性に対するこの外部ドメインＭペプチドの影響を評価した。
【０１１１】
表９に示すように、２６ｍｅｒの外部ドメインＭペプチドは、ＧＰ５ペプチド免疫原４０２０Ｋｂ及び４０２０Ｋｃと等比で混合した場合、驚くほどの免疫原性であることが見出され、ＧＰ５ペプチド免疫原４０２０Ｋｂ及び４０２０Ｋｃに対するＭの相対免疫原性は、ペプチドベースのＥＬＩＳＡによって測定されるように、それぞれ約１０００倍及び１００倍にランク付けされた（群１及び群２の比較；群３、群４及び群５の比較）。ＧＰ５ペプチド免疫原４０２０Ｋｃに対するＩＦＡ力価はまた、用量依存的に著しく抑制された（群３、群４及び群５の比較）。リガンド−レセプター相互作用は、マクロファージ上のシアロアドヘシンのレクチン活性及びＧＰ５糖タンパク質上のシアル酸に依存するので、ＰＲＲＳＶエンベロープ中のこの主要タンパク質に結合するための抗体の誘発を可能にする、ＧＰ５の免疫原性を保存することが重要である。したがって、Ｍペプチドは、エンベロープ上でのＧＰ５との共有結合が示唆され、リガンドとしてのＧＰ５／Ｍ複合体の一部であるにもかかわらず、Ｂ細胞エピトープクラスターペプチド抗原ベースの構成成分における本発明者らの追跡ＰＲＲＳＶワクチン設計において除外された。
【０１１２】
ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５  Ｂ細胞エピトープクラスターペプチド抗原のＩＦＡ力価に対する様々な用量のＰＲＲＳＶ  Ｔｈプールの効果
最適以下の免疫原性を有するＧＰ５外部ドメインの中央ループ構造を提示するＧＰ５ペプチド抗原４０９４ａ（Ｃ２４−Ｃ４８）を、子ブタにおける本研究に用いて、Ｂ細胞エピトープクラスターペプチド抗原の免疫原性に対する様々な用量のＰＲＲＳＶ  Ｔｈペプチドの効果を調査した。ＰＲＲＳＶ  Ｔｈエピトープクラスターペプチドの等比での混合物を、５％、１０％、２０％〜５０％で４０９４ａペプチド抗原（配列番号３１）にさらに補充した。Ｂ細胞エピトープクラスター抗原ペプチド及びＴ細胞エピトープクラスターペプチド抗原の両方を含むワクチン製剤を、３０μｇ／ｍＬの最適以下用量での初回及び追加免疫プロトコルを含む標準免疫化プロトコルによって子ブタに投与して、ペプチド抗原４０９４ａの免疫原性に対するこのようなＰＲＲＳＶ  Ｔｈペプチドの効果をモニタリングした（群１〜群４）。ＥＬＩＳＡによって測定される免疫原性は、これらのモニタリングした群についてそれほど変化しなかったが、ＩＦＡ力価により、天然ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５タンパク質に対するこれらの子ブタにおいて誘発された抗ペプチド抗体の交差反応性の用量依存的な改善が実証された。比較のために、コンビナトリアルＴｈエピトープを４０９４ａ（配列番号３１）（群５）に共有結合させて含む、ＧＰ５  Ｂ細胞エピトープクラスターペプチド免疫原４０９４Ｋｂ（配列番号４３）が、ペプチド抗原４０９４ａ単独と比較して改善された免疫原性を有することも示した。これらの短いＰＲＲＳＶ  Ｔｈペプチド（配列番号４７〜７９）は、免疫化宿主を刺激後にＰＲＲＳＶに曝露すると再現応答（recall response）によってＰＲＲＳＶに対する細胞性免疫を開始することが知られているが、Ｂ細胞エピトープクラスターペプチド抗原に共有結合しなかった。改善されたＩＦＡ力価によって示される抗体反応性の質の改善により、このようなＴ細胞性免疫反応の利点が示唆された。ＰＲＲＳＶへの曝露時にＰＲＲＳＶに対するサイトカイン産生を含む広範な細胞性免疫を開始するために、これらの厳選されたＰＲＲＳＶ  Ｔｈペプチドを、すべての追跡負荷研究において、２０％（重量／重量）でＰＲＲＳＶ  Ｂ細胞エピトープクラスターペプチド免疫原と共にワクチン製剤中に含めた。
【０１１３】
中和活性を有する抗原部位周辺の高い免疫原性を示すＧＰ２、ＧＰ３及びＧＰ４  Ｂ細胞クラスターペプチドの同定及び設計
ＧＰ２、ＧＰ３及びＧＰ４タンパク質由来の抗原ペプチドに結合するポリクローナル抗体も、ＰＲＲＳＶに対する中和活性を示し、これらのＰＲＲＳＶエンベロープの微量タンパク質も、ＰＲＲＳＶに対する臨床学的及びウイルス学的防御にいくらか関わっているという最新の知見を考慮して、表３に示すような特異的抗原ペプチドＧＰ２Ｂエピトープ（Ｖ１１１−Ｌ１３６）（配列番号６）、ＧＰ３  Ｂエピトープ（Ｃ５７−Ｃ７５）（配列番号１１）、ＧＰ４  Ｂエピトープ（Ｃ５２−Ｃ６９）（配列番号１２）を、免疫原性及び交差反応性評価のために、ＰＲＲＳＶ  ＪＸＡ１株配列に基づき設計し、候補ペプチド抗原として同定した。これらのＢエピトープクラスターペプチド抗原を、そのＮ末端で人工コンビナトリアルＴｈペプチド（配列番号３５）に個々に結合し、モルモットにおける免疫原性評価のためのＧＰ２、３、及び４  Ｂ細胞エピトープクラスター抗原ペプチド（配列番号４４〜４６）とした。
【０１１４】
人工コンビナトリアルＴｈ配列に結合されているか又は結合されていない、中和活性を有する抗原部位の周辺で特異的に設計されたＧＰ２、ＧＰ３及びＧＰ４  Ｂ細胞クラスターペプチドを個々に含むワクチン製剤を、それらの各々の免疫原性の評価のために、モルモットにおいてテストした。設計した多数のペプチド免疫原の中で、それらのＮ末端で人工コンビナトリアルＴｈペプチドに結合した３つのペプチド（配列番号４４、４５、及び４６）は、表１１に示すように、３０μｇ用量での単回投与でも、驚くほど高い免疫原性を示した。したがって、これらの高い免疫原性を示すペプチドは、ＰＲＲＳＶワクチンのための最終製剤に組み込むための傑出した候補である。
【０１１５】
モルモットにおける複合ＧＰ２、ＧＰ３、ＧＰ４及びＧＰ５エピトープクラスターペプチド免疫原についての免疫原性評価
ＰＲＲＳＶ  ＧＰ２、３、４及び５タンパク質由来のＢ細胞エピトープクラスターペプチド抗原の各々について設計を改良した後、初回刺激については総ペプチド濃度３０μｇ／ｍＬで、及び追跡追加免疫については３ｗｐｉに１５μｇ／ｍＬで、標準エマルションベースワクチン製剤中に等比で混合したこれらのペプチドの組合せを、他のペプチド抗原と混合した（admixed）場合には個々のペプチド抗原の免疫原性についてテストし、且つ混合物中の１つ以上の抗原の免疫原性のいかなる意図されない抑制も評価及び回避するために、ペプチド抗原混合物の全体の免疫原性も評価した。この評価を行って、ＧＰ５／Ｍペプチド抗原混合物に対するＭペプチドによる負の影響を回避した。
【０１１６】
表１２に示すように、ＧＰ４  Ｂエピトープクラスターペプチド抗原（配列番号４６）を、ＧＰ３／４組合せ製剤としてＧＰ３  Ｂエピトープクラスターペプチド抗原（配列番号４５）と、ならびに、ＧＰ３／４／５組合せ製剤としてＧＰ３（配列番号４５）及びＧＰ５（配列番号４２）と、又は、ＧＰ２／３／４組合せ製剤としてＧＰ２（配列番号４４）及びＧＰ３（配列番号４５）と混合した場合、標的ペプチドベースのＥＬＩＳＡによって判断したＧＰ４ペプチド抗原の免疫原性は、ＧＰ３標的ペプチドと混合した場合には強いままであったが、３種のペプチド抗原混合物中にある場合には、著しく弱まった。ＧＰ２及びＧＰ３エピトープクラスターペプチド抗原の免疫原性は、ＧＰ４ペプチド抗原と比較して、単一のペプチド抗原と同じ免疫原性を維持した。したがって、ＧＰ２及びＧＰ３エピトープクラスターペプチド抗原は、免疫反応適用範囲の幅を広げるために、任意のＰＲＲＳＶペプチド抗原混合物にさらに確実に用いることができる。ＧＰ２、ＧＰ３及びＧＰ４が、ウイルスエンベロープ上の微量成分であるという事実にかかわらず、対応する天然ＰＲＲＳＶタンパク質抗原との交差反応性を示す妥当なＩＦＡ力価が、ＧＰ５抗原ペプチドの非存在下でペプチド抗原混合物によって得られた（例えば、群１、２及び４）。
【実施例６】
【０１１７】
ＰＲＲＳＶ  Ｔｈエピトープクラスターペプチド抗原を補充したＧＰ５由来のペプチドベースのＰＲＲＳＶワクチンは、ＰＲＲＳＶ  ＭＤ００１株による負荷から子ブタを防御した
ＰＲＲＳＶ感染からのブタの防御において、ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５  Ｂ細胞エピトープクラスターペプチド抗原の有効性を証明するために、３つの連続した免疫化及び負荷研究が台湾動物技術研究所（ＡＴＩＴ）によって行われた。ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５  Ｂエピトープクラスターペプチド抗原によって生成されたワクチン製剤を客観的に評価するために、すべての製剤をコード化した。ブタコレラ、仮性狂犬病、萎縮性鼻炎、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ、口蹄疫、ブタ赤痢、疥癬、及びアクチノバチルス・プルロニューモニアを含めた病原体がないことを保証するために、ＳＰＦブタを定期的にモニタリングした。ＰＲＲＳ  １００１Ｓ、１００２Ｓ及び１００３Ｓ研究のすべての群で、ＧＰ５  Ｂエピトープクラスターペプチド免疫原４０２０Ｋｃ（配列番号３８）及び４０５２Ｋｂ（配列番号４１）を使用し、いくつかの製剤パラメータにわずかな変動があった。これらの製剤は、４０２０Ｋｃ抗原ペプチドとして群１及び２で、ならびに４０５２Ｋｂ抗原ペプチド由来ワクチン製剤として群３及び４で等価であるとみなされた。プールされた等比のＰＲＲＳＶ  Ｔｈエピトープペプチド混合物（ＪＸＡ１配列に基づく配列番号４７、５１、５２、５５、５９、６１、６３、６７、７０、７４、７６）を１０重量％でそれぞれのワクチン製剤に補充して、細胞性免疫を付与することによって、ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５ペプチド抗原の免疫原性をさらに増強した。
【０１１８】
トランスジェニックＳＰＦ農場を汚染しないために、これらの研究を２つの場所で行った。すなわち、免疫化の部分のみを、これらの免疫化／負荷研究への参加のために４週齢のＳＰＦブタを提供したトランスジェニックＳＰＦ農場で行った。この農場はＡＴＩＴによって運営され、台湾北部のHsian Shan、Hsin Chuの隔離された区域にある。４週間の初回及び追加免疫の免疫化プロトコルの完了後、これらのＳＰＦブタを、負荷研究のために台湾南部にある十分に管理された別の農場に移動した。ＰＲＲＳＶの米国株は台湾に蔓延しているので、２つの米国株ＭＤ−００１及びＡＭＥＲＶＡＣ−ＰＲＲＳを、これらの負荷研究に採用した。ウイルス負荷後、ＩＦＡ及びウイルス血症テストのために、血清サンプルを採取した。最終的に、これらの動物を安楽死させ、肉眼検査及び病理学検査に供した。ＳＰＦ子ブタは、１群当たり５頭で、研究設計に基づいてグループ化した。表１３に示すように、血液サンプルを採取した。採取した全ての血清サンプルをＰＲＲＳＶ−ＯＲＦ５  ＩＦＡテスト（ｒＶＶ−ＰＲＲＳ  ＯＲＦ５発現法による）によってテストした。
【０１１９】
注射後の臨床的観察
各々のワクチン投与の前及び後の全ての子ブタを、局所の（反応源性及びアレルギー反応を含む）反応及び全身性の（呼吸困難、食欲、下痢、咳、ＣＮＳ／ＳＳ、及びアレルギー反応を含む）反応についての臨床的観察に供した。研究の間、局所反応源性に関連した腫脹が時折見出されたが、わずか３〜４日間しか持続せず、それ以上の差は観察されずに正常な状態に戻った。研究対象の全ての動物について、全身性の有害反応は観察されなかった。
【０１２０】
ウイルス負荷後の臨床的観察
全ての免疫化ブタは、ウイルス負荷を受けた後のモニタリングの期間中、ＰＲＲＳに特有の臨床徴候を示さなかった。
【０１２１】
免疫化及び負荷後のＩＦＡ検出及び肺病変
ＰＲＲＳＶに対する特異的抗体は、免疫化後に生成し、表１４に示すように、４及び６ｗｐｉ（免疫化後の週数）にＩＦＡによって検出されたように、高力価に達した。表１４に示すように、コントロール群の動物はいずれも、負荷ウイルスストックで表される場合にＰＲＲＳＶ  ＧＰ５タンパク質の免疫原性が弱いという性質に大部分起因して、ＰＲＲＳＶ負荷研究の後でもＰＲＲＳＶ  ＧＰ５タンパク質に対する抗体を誘発しなかった。ワクチン接種群は、ウイルス負荷後２ｗｐｃ（負荷後の週数）に、高いＩＦＡ力価を維持した。ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５  Ｂエピトープクラスターペプチド抗原ワクチン製剤（群１及び２について４０２０ＫＣならびに群３及び４について４０５２Ｋｂ）で免疫化した２０頭の子ブタのうち１８頭は、１つの病変も検出されることなく、完全に防御された（防御率９０％）。群３及び４の子ブタのうち２頭には、軽微な病変が検出された。対照的に、図７Ａ及び７Ｂに示すように、８０％（４頭／５頭）のブタには、間質性肺炎の重度の病変が認められた。ＡＴＩＴのＰＲＲＳＶ研究室で行われた広範な負荷テストに基づいて、ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５タンパク質のより高いＩＦＡ力価は、ＰＲＲＳＶ負荷に対する完全防御とよく相関した。
【０１２２】
ウイルス血症検出
ＰＲＲＳＶウイルス量検出のためにＰＲ−ＰＣＲ法を用いたところ、全てのワクチン接種ブタにおいて、検出可能なウイルス量は認められなかった。これは、肺における防御有効性の結果と一致している。これらの２つのウイルス株は、感染後に重篤な症状を引き起こさないが、２０頭中１８頭のワクチン接種ブタにおいて、ウイルス血症が認められず、かつ病理学的結果がまったく認められなかったことから、ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５ベースのワクチン製剤によって付与される防御有効性の証明概念が実証された。
【実施例７】
【０１２３】
ＰＲＲＳＶ  Ｔｈエピトープクラスターペプチド抗原を補充したＧＰ５由来のペプチドベースのＰＲＲＳＶワクチンは、単回の免疫化スケジュールならびに初回及び追加免疫の免疫化スケジュールの両方の後で、高病原性ＰＲＲＳＶ（ＮＶＤＣ−ＪＸＡ１株）による負荷から子ブタを防御した
【０１２４】
中国ＰＲＲＳＶ  ＪＸＡ１負荷モデルの背景：
２００６年、中国において、当初は知られていなかった、ＰＲＲＳの症状を伴ういわゆる「高熱」病の未曾有の大規模流行があり、これは１０を超える省（自治都市又は自治区）に蔓延して、２，０００，０００頭を超えるブタに発症し、約４００，０００頭の致死例を出した。典型的なＰＲＲＳとは異なり、多数の成熟雌ブタも「高熱」病に感染した。この非定型ＰＲＲＳの大流行は、当初、神経症状（例えば、震え）、高熱（４０〜４２℃）、紅斑性白化皮疹などを示すブタコレラ様疾患として同定された。免疫学的分析と共に行われた剖検により、複数の臓器が高病原性ＰＲＲＳＶに感染していることが明確に示され、重度の病理学的変化が観察された。「Emergence of Fatal PRRSV Variants: Unparalleled Outbreaks of Atypical PRRS in China and Molecular Dissection of the Unique Hallmark」におけるKegong Tianら（2007 PLosOne doi: 10.1371/ journal.pone.0000526）による協力で、ブタ感染モデルが中国において確立され、１２頭のＳＰＦブタ（１群当たり４頭の子ブタ）の負荷のために、異なる起源を有する３つの代表的なＰＲＲＳＶ分離体（ＪＸＡ１、ＨＥＢ１、及びＨＵＢ２）を用いて、分離ＰＲＲＳＶの高病原性を再現した。
【０１２５】
各群において、２頭の子ブタに静脈内注射し、両方とも６〜８日以内に死亡したことから、テストしたＰＲＲＳＶ株の高い病原性が暗示された。同様に、各群の他の２頭の子ブタに鼻腔内接種すると、それらは３〜６日以内に「高熱」病の顕著な徴候（例えば、高熱、血斑、点状出血、震え、及びランピング（lamping）など）を示し、両方とも注射後１０日目に死亡した。その後、ウイルス分離体を感染ブタからうまく回収し、ＰＣＲ検出及びＥＭによって確認した。剖検を行って、免疫学的効果及び病理学的病変を評価した。ほぼ同じ病理学的変化（肺、心臓、脳、腎臓、肝臓などにおいて）が、「高熱」流行中に屠殺されたブタにおいて観察されたので、中国における「高熱」病の２００６年の大流行は、ブタ集団における高病原性ＰＲＲＡＶ感染によって引き起こされたことが確認された。ＰＲＲＳＶ単離体の１つであるＪＸＡ１は現在、中華人民共和国（ＰＲＣ）ガイドラインの通り、子ブタにおけるＰＲＲＳＶワクチンの防御有効性を検証するための標準化負荷研究における標準ウイルスとして用いられている。
【０１２６】
ＰＲＣ政府ワクチン製品ガイドラインによる妥当なＰＲＲＡＶ負荷及びワクチンの有効性の定義
４週齢の子ブタを、ペプチドベースのＰＲＲＳＶワクチン製剤で１回又は２回、２週間の間隔でワクチン接種した一方、１群はワクチン未接種コントロールとして保持した。それらの全ての子ブタを、ＰＲＲＳＶ  ＮＶＤＣ−ＪＸＡ１高抗原性ウイルス３ｍＬ（１０Ｅ５  ＴＣＩＤ５０を含む）を用いて耳の後ろに筋肉注射で負荷した。体温を２１日間毎日観察した。この負荷研究は、５頭中５頭の動物が負荷時に発熱を伴う病気になり、かつ５頭中少なくとも２頭の動物が死亡する場合に、妥当とみなす。ワクチンが防御的であるとみなされるためには、免疫化したブタの５頭中少なくとも４頭が健康を維持していることが必要である。
【０１２７】
南京の動物衛生ワクチン社（Animal Health Vaccine company）と共同でＵＢＩにより行われた負荷研究、ＰＲＣ２０１１年概要報告：
上述のようにＰＲＣの農業部刊行のガイドラインに従って、合計３５頭のブタを血清陰性についてスクリーニングし、そのうち３０頭をこの負荷研究のために選択した。詳細な動物の選択、ランダム化、グループ化、免疫化及び負荷研究、温度観察及び記録、ならびに死亡数を以下に記載する。
【０１２８】
中国江蘇省無錫市の農場由来の２８日齢の健康な子ブタを選択した。南京のワクチン効力／ウイルス負荷テストセンターに本拠地を置く動物衛生ワクチン社で治験を行った。ＰＲＲＳ抗体テストキット（ＬＳＩ社、フランス）、ロット番号２−ＶＥＲＰＲＡ−００１，Ｅｘｐ．２０１２−０１及びＰＲＲＳ抗原テストキット：ＰＲＲＳ  ＲＴ−ＰＣＲインビトロ診断キット（ＮＳＰ２  １５９４−１６８０変異体株）を用いて、ＰＲＲＳＶ不在の動物を選択した。ＰＲＲＳ病原性株（ＮＶＣＤ−ＪＸＡ１）は、ストックの１０倍希釈物を作製して負荷テストに用い、動物１頭当たり３ｍｌで動物に投与した。
【０１２９】
農場由来の合計３５頭の健康な子ブタを、スクリーニングのために選択し、３０頭を本研究に登録した。選択された全ての子ブタは、血清中のＰＲＲＳ抗原及び抗体について陰性との結果が出た。登録された全ての子ブタを、１群当たり５頭で、群１〜６の６群に無作為に割り当てた。ブタの頸筋の脇にある耳の真後ろに位置する部位に、筋肉内注射を行った。免疫化投与量及び群を表１５にリスト化する（客観的になるためにコード下で行った）。
【０１３０】
群１は、ＰＲＲＳＶ内在性Ｔヘルパーエピトープペプチド（ＪＸＡ１配列に基づく配列番号４７、５１、５２、５５、５９、６１、６３、６７、７０、７４、７６）の等比のプールを２０重量％で補充した、ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５ペプチド（ＧＰ５  Ｂエピトープクラスターペプチド抗原４０９４系列、配列番号４３）に基づくワクチンで免疫化した。
【０１３１】
群２〜５については、ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５ペプチド（ＧＰ５  Ｂエピトープクラスターペプチド抗原４１２４、配列番号４２）を免疫原として用いた。ワクチン製剤中の最終ペプチド濃度は、３０μｇ／ｍＬであった。この製剤はまた、ＰＲＲＳＶ内在性Ｔヘルパーエピトープペプチド（ＪＸＡ１配列に基づく配列番号４７、５１、５２、５５、５９、６１、６３、６７、７０、７４、７６）が等比で混合されたプールを、群２、３、及び４についてそれぞれ１０重量％（すなわち、２７．５μｇのＢ：２．５μｇのＴのプール）、２０重量％（すなわち、２５μｇのＢ：５μｇのＴのプール）及び５０重量％（すなわち、２０μｇのＢ：１０μｇのＴのプール）で、ＰＲＲＳＶ  Ｂエピトープ免疫原（配列番号４２）に補充して含んだ。群５の動物は、単回投与しか受けなかったことを除いて、群４と同じワクチン製剤を受けた。
【０１３２】
群６は、いずれのペプチドでの免疫化も受けなかった、陰性コントロール群であった。
【０１３３】
本研究に最初に登録された３０頭全ての子ブタについての抗体スクリーニング結果を、表１６に示す。免疫化前にＲＴ−ＰＣＲによりＰＲＲＳＶ抗原についてテストしたブタ由来の全てのサンプルの結果から、３０頭中３０頭が陰性であることがわかった一方、テストキットの陽性コントロールは１８５塩基対の増幅バンドが認められたことから、このテストシステムの有効性を確証した。無作為化後の全ての動物番号を表１７に示す。ＰＲＲＳＶ抗体のＯＤ値の結果を、初回免疫化後０日目及び２８日目について表１８に示す。ＰＲＲＳＶ  ＪＸＡ１負荷後の体温及び死亡数を、表１９に示される温度（℃）で観察した。
【０１３４】
要約すると、表１９に示すように、コントロール群（群６）の全ての子ブタが、ウイルス負荷後の最初の数日中に病気になり、表２０に示すように、２頭が死亡した（５頭中２頭＝死亡率４０％）。この負荷研究下でワクチン接種を受けなかったコントロール群の結果は、ＰＲＣの農業部によって制定された負荷研究の妥当性判断基準及びガイドラインに適合した。コントロール群と対照的に、群１の動物は、８０％の生存率（５頭中４頭）及びわずか２０％の死亡率で防御された。なお、群２〜５の全ての動物（２０頭中２０頭）が防御され、したがって１００％の防御がもたらされた。
【０１３５】
１つの主要な研究としてＧＰ５  Ｂエピトープクラスターペプチド抗原ベースのワクチン製剤を受けた２５頭全ての動物を合わせると（すなわち、群１〜５）、２５頭中２４頭の動物が、わずか４％の死亡率で高病原性ＰＲＲＳＶウイルス株ＪＸＡ１による負荷を生き残った。この結果は、負荷を受けて数日中に４０％のブタが死亡し、５頭全ての子ブタが病気になった後に１００％の死亡率をもたらしたコントロール群と比較すると、驚くべきことである。
【実施例８】
【０１３６】
ＰＲＲＳＶに対する広く防御的な抗体を誘発するための多成分ＰＲＲＳＶペプチドワクチン
ＰＲＲＳＶは、主要な糖タンパク質であるＧＰ５と、３つの他の微量な糖タンパク質、すなわち、ＧＰ２ａ、ＧＰ３、及びＧＰ４を、ビリオンエンベロープ上に含み、これらの全てが感染性ビリオンの生成に必要である。ＧＰ４とＧＰ５タンパク質との間に強い相互作用が存在することが見出されたが、他の微量なエンベロープ糖タンパク質（ＧＰ２及びＧＰ３）とＧＰ５との間の弱い相互作用も検出されており、その結果、多タンパク質複合体の形成を生じる。全体として、ＧＰ４タンパク質は、糖タンパク質間の相互作用を媒介するために重要であり、感受性宿主細胞へのウイルス侵入のためにＣＤ１６３との相互作用を媒介する原因となるＧＰ５に加えて、ＧＰ２ａと共に、ウイルス付着タンパク質としての役割を果たすという結論に達した。
【０１３７】
ＰＲＲＳＶの変異性が高いために、広く有効なＰＲＲＳＶワクチンの開発には、複数のウイルス株の防御が必要である。ＰＲＲＳＶマーカーワクチン成分の基礎として、内在性ＰＲＲＳＶ  Ｔｈペプチド（プール１について、ＪＸＡ１配列に基づく配列番号４７、５１、５２、５５、５９、６１、６３、６７、７０、７４、７６、及びプール２について、配列番号８０〜９０）のプールを補充した、既に防御有効性が実証された４つのＧＰ５ベースのＰＲＲＳＶワクチン製剤（配列番号３８のＧＰ５  Ｂエピトープペプチド抗原４０２０Ｋｃ、配列番号４１のペプチド抗原４０５２Ｋｂ、配列番号４３の４０９４Ｋｂ及び配列番号４２の４１２４Ｋｂ）を用い、多タンパク質レセプター複合体でポリクローナル抗体を誘発するために、このペプチド混合物中に、実証された機能的中和／レセプター結合部位を提示する抗原ペプチドを組み込むことにより、ウイルス適用範囲の広い強力な多成分ＰＲＲＳＶワクチンの開発を可能にすることが非常に望ましい。
【０１３８】
ＰＲＲＳＶに対する著しい中和特性を示すＧＰ２、ＧＰ３、及びＧＰ４抗原ペプチド結合抗体を用いて（８）、これらの選択領域の周辺でペプチド抗原を設計し、実施例５に示すように各々のタンパク質から最も強力なペプチド免疫原をスクリーニングした。これらのペプチド免疫原を、ウイルス株の広範な適用範囲を目的とする多成分ＰＲＲＳＶペプチドワクチンとして、様々なワクチン製剤に組み込んだ。精巧な分析ツールであるＬＣ／ＭＳ／ＭＳツール及び十分に管理されたＧＭＰペプチド製造プロセスが利用できるので、地域利用（例えば、北米  対  欧州）のためにカスタマイズされた再現性のあるワクチン製剤を合理的に開発できる。
【実施例９】
【０１３９】
ＰＲＲＳＶ感染動物、ワクチン接種されたＰＲＲＳＶ不在動物、又はワクチン接種されたＰＲＲＳＶ感染動物を同定するためのＵＢＩ  ＤＩＶＡシステム及びエピトープベースのマーカーワクチンの適用
実施例１に示すように、プレートコーティングのための混合物としてＰＲＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質由来の２つの抗原ペプチド（４１７１ｅ、配列番号１及び４１７２ｅ、配列番号２）を組合せた後、ＰＲＲＳＶ感染動物を検出するためのトレーサーとしてタンパク質−ＨＲＰコンジュゲートを用いることにより、ＵＢＩ  ＰＲＲＳＶ  ＮＣ  ＥＬＩＳＡテストキットを確立した。このテストを、効果的なＰＲＲＳＶマーカーペプチドワクチンの免疫原性をモニタリングするためにカスタマイズされた標的ペプチドベースのＥＬＩＳＡと併用して、感染動物とワクチン接種動物の識別のためのＰＲＲＳＶ  ＤＩＶＡシステムを形成することができる。
【０１４０】
図５に示すように、ＰＲＲＳＶワクチン免疫原性研究に入る前にＰＲＲＳＶ陰性であることが事前のスクリーニングにより分かっている、正常な子ブタ（ｎ＝１０９）由来の血清は、ＵＢＩ  ＰＲＲＳＶ  ＮＣ  ＥＬＩＳＡテストで高い特異性（１０９−１／１０９＝９９％）を示した。この群の次に、天然ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５タンパク質に対する交差反応性を有し、標的ペプチドベースのＥＬＩＳＡによって示されるようにＧＰ５に対する高力価の抗体を含むことが分かっている（Ｌｏｇ１０力価＞＝３）、ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５マーカーワクチン製剤を受けたブタ（ｎ＝４５）由来の血清は、ＰＲＲＳＶ  ＮＣ  ＥＬＩＳＡテストによって陰性とスコア化され、このテストの特異性がさらに実証された。中央に示される３つの血清群についてのＥＬＩＳＡ測定値は、感染動物由来の純種のＩＦＡ陽性血清のものである。これらのサンプルは、ＩＦＡ力価と並行して増加するＥＬＳＩＡ  ＯＤ４５０ｎｍ測定値を示した。右端の血清は、ＰＲＲＳＶ感染を有することが分かっている米国の農場から採取したサンプル（ｎ＝１００）であった。ＵＢＩ  ＰＲＲＳＶ  ＮＣ  ＥＬＩＳＡで＞５６％の血清陽性率が見出され、この農場におけるＰＲＲＳＶ感染の高い有病率を示している。
【０１４１】
ＵＢＩ  ＰＲＲＳＶ  ＮＣ  ＥＬＩＳＡ及びＵＢＩ  ＰＲＲＳＶ  Ｂエピトープマーカーワクチン標的ペプチドベースのＥＬＩＳＡを併用して、ＰＲＲＳＶ感染を有することが分かっている台湾の農場においてＰＲＲＳＶマーカーワクチン製剤の免疫原性をモニタリングしたところ、いくつかの洞察に満ちた情報が観察された。
【０１４２】
第一に、図６Ａ及び６Ｂに示すように、ＰＲＲＳＶワクチン免疫原性研究に登録された全てのブタは、ＰＲＲＳＶ  ＮＳ  ＥＬＩＳＡで、カットオフ値よりもずっと高いｓ／ｃ比を示し、陽性であることが分かった。このような感染はグレーの背景で強調表示した図に示され、テストした全ての動物が感染していた。第二に、これらの子ブタには高レベルのＰＲＲＳＶ  ＮＣ反応性抗体（大部分は母性由来（ＭＤＡ））が存在するにもかかわらず、全てのペプチドベースのＰＲＲＳＶワクチン製剤が、それぞれの標的ペプチドベースのＥＬＩＳＡによって検出されたように著しい免疫原性を実証した。図６Ａ及び６Ｂに示すように、全ての動物を、初回免疫化後０週間、４週間及び６週間を通して受けたワクチン製剤中に含まれる成分ペプチド抗原に対するそのペプチド特異的抗体力価について、モニタリングした。その各々が初回ならびに０及び４週目の追加免疫スケジュールでの１回用量当たり、合計３０μｇ／ｍＬでこれらのペプチド抗原を含むワクチン製剤（ＧＰ２＋ＧＰ３、ＧＰ３、ＧＰ３＋ＧＰ４、ＧＰ４、又はＧＰ５ペプチド抗原）の中で、独立した高い免疫原性は、ほとんど全てのＰＲＲＳＶ  ＧＰ２及びＧＰ３中和部位由来のペプチドワクチン製剤と関連し、「ＧＰ５ペプチド単独」ワクチン製剤と関連していることが見出され、ＧＰ４中和部位由来のペプチド抗原は、他のＰＲＲＳＶ（ＧＰ３）ペプチド抗原と組合せると、免疫原性が若干損なわれた。
【０１４３】
中和抗体を誘発するために、ＧＰ２、ＧＰ３、ＧＰ４及びＧＰ５タンパク質由来の中和及びレセプター結合部位の周辺で設計されたＰＲＲＳＶ  Ｂエピトープクラスターペプチド免疫原を組み込み、細胞性免疫を促進するために内在性ＰＲＲＳＶ  Ｔヘルパーペプチドの混合物を補充した、コンビナトリアルペプチドベースのＰＲＲＳＶワクチンが、ＰＲＲＳＶ  ＭＤ００１及びＪＸＡ１株（共に北米型の株）による負荷研究のために計画されている。
【実施例１０】
【０１４４】
ＳＰＦ農場におけるＰＲＲＳＶ感染の根絶のためのＵＢＩのＰＲＲＳＶペプチドベースのマーカーワクチン及びその診断ＤＩＶＡシステムの採用
マーカーワクチン製剤に用いられるＰＲＲＳＶ  Ｂエピトープクラスターペプチド抗原は、ＰＲＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質由来の抗原ペプチドを含まない一方、感染ブタは通常、この主要な構造タンパク質に対する早期抗体を発現しているので、感染動物とワクチン接種動物を識別するための診断システム、従って診断ＤＩＶＡシステムに、ＰＲＲＳＶ  ＮＣ  ＥＬＩＳＡ及びＰＲＲＳＶ  Ｂエピトープマーカーワクチン標的ペプチドベースのＥＬＩＳＡを組み込むことは論理的である。
【０１４５】
ＵＢＩのＰＲＲＳＶペプチドベースのマーカーワクチンは、ＰＲＲＳＶタンパク質上の中和及びレセプター結合部位に対する高力価のＩＦＡ陽性交差反応性抗体を誘発することができる。このようなマーカーワクチン製剤は、ＭＬＶ又はウイルス溶解物ベースのＰＲＲＳＶワクチンよりも効果的に、ＰＲＲＳＶ感染を予防することができる。なぜなら、これらのタンパク質の免疫原性が、現行の生物学的ワクチンフォーマットで提示される場合に非常に弱いという性質のせいである。
【０１４６】
ＵＢＩの診断ＤＩＶＡシステムとそのＰＲＲＳＶマーカーワクチンの併用は、ＰＲＲＳＶ感染による長期的問題を克服するために、以下の戦略に基づいて台湾のＳＰＦ農場で実行される。このＳＰＦ農場は、全ての病原体に対する厳密なモニタリング記録を継続しており、ＰＲＲＳＶ感染のみを有する。この農場は、その現在のＰＲＲＳＶ感染を、従来の生物学的ワクチンでは、重大なバイオセキュリティリスクを負うことなく排除できない。ＵＢＩのＰＲＲＳＶペプチドベースのマーカーワクチンを用いると、ワクチンの化学的性質に起因するこのようないかなるバイオセキュリティリスクも示さない。
【０１４７】
ＰＲＲＳＶ感染したＳＰＦ農場におけるＰＲＲＳＶ根絶のための戦略
この農場は、少なくとも２年間、ＵＢＩのＰＲＲＳＶペプチドベースのマーカーワクチンを用いたワクチン接種プログラムを継続する。農場内の全てのブタを、０週間、４週間及び８週間、免疫化スケジュールを用いてワクチン接種し、少なくとも６ヶ月間モニタリングする。ＮＣ及びマーカーワクチン標的ペプチドに対する血清抗体力価を、ＰＲＲＳＶウイルス血症レベルと共に、ＰＲＲＳＶ  ＮＣ  ＥＬＩＳＡ、ＩＦＡ及び定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を含めたアッセイによってモニタリングする。ワクチン接種プログラム開始６ヶ月後、ワクチン接種を受けた母親から生まれた子ブタはワクチン接種を受けずに、これらの子ブタにおける感染率についてＵＢＩ  ＰＲＲＳＶ  ＮＣによって１〜３ヶ月間モニタリングする。全ての子ブタがＵＢＩ  ＰＲＲＳＶ  ＮＣ  ＥＬＩＳＡでの陰性反応性を示せば、この農場は、ＰＲＲＳＶ感染に対して制御下にあるとみなすことができる。この農場はその後、先にＰＲＲＳＶ感染していた全てのブタを退去させる。このような退去までは、農場内の全てのブタは、ＰＲＲＳＶペプチドベースのマーカーワクチンで継続的にワクチン接種する。
【０１４８】
この農場は、ＰＲＲＳＶに対するブタの免疫を増強するために、ＰＲＲＳＶペプチドベースのマーカーワクチンを用いて全てのブタのワクチン接種を継続する。
【０１４９】
新たに導入した子ブタ及び成熟雌ブタが、ＰＲＲＳＶ  ＮＣ  ＥＬＩＳＡでの血清陰性反応性に基づきＰＲＲＳＶ不在であることが見出された場合、この農場はＰＲＲＳＶ不在であることを宣言することができ、従って、ＰＲＲＳＶ根絶プログラムの成功を宣言することができる。
【０１５０】
モニタリングに用いる指標
ＵＢＩのＰＲＲＳＶ  ＮＣ  ＥＬＩＳＡ及びＰＲＲＳＶマーカーワクチン標的ペプチドベースのＥＬＩＳＡ、したがってＤＩＶＡは、この農場の全ての動物由来の血清を、反応性一貫性についてモニタリングするのに用いることができる。ＰＲＲＳＶ  ＮＣ  ＥＬＩＳＡから導き出される陽性率（％）及び平均ＯＤ値は、ワクチン接種及びモニタリングの期間中記録される。
【０１５１】
ＰＲＲＳＶ  ＮＣタンパク質に対する移行抗体を有する場合がある（したがって、ＰＲＲＳＶ  ＮＣ  ＥＬＩＳＡで陽性を示す）１ヶ月齢未満の子ブタは、時間と共に減少する。環境中に循環しているＰＲＲＳＶが存在しない、すなわち、新たな感染がない場合、これらの子ブタもまたＰＲＲＳＶ不在になる。その農場は、ＰＲＲＳＶ感染した成熟雌ブタを急いで退去させる。ＰＲＲＳＶマーカーペプチドワクチンで処置することにより、先に感染していた成熟雌ブタから環境へのＰＲＲＳＶの放出についての残余リスクはさらに低下し、したがって、農場全体がＰＲＲＳＶ不在状態に到達することが可能になる。表２１は、このようなテストのためのサンプルサイズ必要量を、１頭のＰＲＲＳＶ陽性ブタを検出する確率について、９５％の信頼度で設定する。
【０１５２】
ＤＩＶＡ及び多成分ＰＲＲＳＶペプチド免疫原ベースのワクチン製剤を用いたパイロットＰＲＲＳＶ排除研究
ＤＩＶＡによる血清学的手段によってモニタリングされる、パイロットＰＲＲＳＶ排除研究は、通常のＰＲＲＳＶ感染農場において、多成分ＰＲＲＳＶペプチド免疫原を含む油中水型（ＩＳＡ５０）エマルションベースのワクチン製剤を用いることによって行われ、このような多成分ＰＲＲＳＶペプチド免疫原ベースのワクチン製剤を受けた動物による、ＰＲＲＳＶ  ＮＣ抗体陰性化の潜在力を評価した。
【０１５３】
より具体的には、ＰＲＲＳＶ  ＮＣ  ＥＬＩＳＡによって陽性と出た４週齢の合計１５頭の子ブタを、本研究のために５つの実験群に分類した。これらの子ブタを、０週間、４週間、８週間、免疫化及び採血（bleeding）スケジュールに基づいて免疫化し、初回免疫化の日から１３週間モニタリングした。ＧＰ５（配列番号４２）、ＧＰ２（配列番号４４）、ＧＰ３（配列番号４５）及びＧＰ４（配列番号４６）由来のＰＲＲＳＶ  Ｂペプチド免疫原を、種々の組合せ（例えば、群１及び２についてはＧＰ５、ＧＰ２、ＧＰ３、及びＧＰ４；群３についてはＧＰ５、ＧＰ３及びＧＰ４；群４についてはＧＰ３及びＧＰ４）で、等比で、ＰＲＲＳＶ  Ｂペプチド免疫原について１回用量当たり合計２５μｇ／ｍＬで混合した。これらの製剤には、群２についてはＰＲＲＳＶ  Ｔｈペプチド（同じく等比で混合した、配列番号４７、５１、５２、５５、５９、６１、６３、６７、７０、７４、及び７６）を、群１、３及び４についてはＰＲＲＳＶ  Ｔｈコンビナトリアルペプチド（配列番号８０〜９０）を、２０重量％（すなわち、１回用量当たり５μｇ／ｍＬ）でさらに補充した。ＰＲＲＳＶ感染を特定するために、ＮＣに対する血清抗体反応性をＰＲＲＳＶ  ＮＣ  ＥＬＩＳＡによってモニタリングする一方、種々のワクチン製剤によってもたらされる免疫原性について、ＰＲＲＳＶマーカーペプチドワクチンＢエピトープ成分に対する血清抗体力価を、対応するＰＲＲＳＶ  ＧＰ２、ＧＰ３、ＧＰ４及びＧＰ５ペプチドベースのＥＬＩＳＡによってモニタリングした。群５の動物は、ＰＲＲＳＶペプチドベースのワクチン製剤を受けず、陰性コントロール群としての役割を果たした。
【０１５４】
群１〜４の全てのブタが、それぞれのマーカーワクチン標的ＰＲＲＳＶ  Ｂ  ＧＰ２、ＧＰ３、ＧＰ４及びＧＰ５ペプチドに対する抗体を発現したことが、それぞれのＰＲＲＳＶペプチドベースのＥＬＩＳＡによって検出され、特異的抗体力価は、初回免疫化から４週目の第２回免疫化の後に３Ｌｏｇ１０よりも高く、モニタリングされた１３週間の間ずっと高いままであった。しかし、ＰＲＲＳＶ  ＮＣタンパク質に対する抗体反応性は、表２２に示すように、初回免疫化後およそ６〜８週目で最大反応性まで増大した後、初回免疫化後１０週目までにベースライン付近まで低下し、モニタリング期間中の初回免疫化後１３週目でベースラインのままであった。
【０１５５】
対照的に、ＰＲＲＳＶペプチドベースの免疫原を含むワクチン製剤を受けていない、群５の動物由来の血清は全て、ＰＲＲＳＶ  ＮＣタンパク質に対する高い反応性を維持した。ＰＲＲＳＶ  ＮＣタンパク質に対する抗体は、感染ブタに存在することが知られているので、多成分ＰＲＲＳＶペプチド免疫原ベースのワクチン製剤でワクチン接種されたブタにおける、ＰＲＲＳＶ  ＮＣに対するこのような陰性化の驚くべき知見により、これらの多成分ＰＲＲＳＶペプチドベースのワクチン製剤の有効性がさらに確証された。したがって、ＤＩＶＡの適用及びこれらの多成分ＰＲＲＳＶペプチド免疫原ベースのワクチン製剤は、広い用途を有し、ＰＲＲＳＶ感染のモニタリング、予防、排除及び根絶のための緊急の必要性を満たす。
【０１５６】
【表１】
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【０１５７】
【表２】
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【０１５８】
【表３】
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【０１５９】
【表４】
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【０１６０】
【表５】
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【０１６１】
【表６】
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【０１６２】
【表７】
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【０１６３】
【表８】
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【０１６４】
【表９】
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【０１６５】
【表１０】
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【０１６６】
【表１１】
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【０１６７】
【表１２】
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【０１６８】
【表１３】
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【０１６９】
【表１４】
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【０１７０】
【表１５】
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【０１７１】
【表１６】
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【０１７２】
【表１７】
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【０１７３】
【表１８】
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【０１７４】
【表１９】
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【０１７５】
【表２０】
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【０１７６】
【表２１】
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【０１７７】
【表２２】
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【０１７８】
【表２３】
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【０１７９】
【表２４】
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【０１８０】
【表２５】
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【０１８１】
【表２６】
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【０１８２】
【表２７】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年12月26日(2014.12.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド抗原及び獣医学的に許容可能な送達ビヒクル又はアジュバントを有する、ブタ生殖器呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）ワクチン組成物であって、該ペプチド抗原が、
ａ）配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、及びこれらの任意の組合せ；
ｂ）（ａ）のホモログ；及び
ｃ）（ａ）又は（ｂ）の任意の組合せ
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、ＰＲＲＳワクチン組成物。
【請求項２】
前記ペプチド抗原が、配列番号９のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のＰＲＲＳワクチン組成物。
【請求項３】
前記ペプチド抗原が、配列番号１０のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のＰＲＲＳワクチン組成物。
【請求項４】
前記ペプチド抗原が、配列番号１１のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のＰＲＲＳワクチン組成物。
【請求項５】
前記ペプチド抗原が、配列番号１２のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のＰＲＲＳワクチン組成物。
【請求項６】
前記ペプチド抗原が、１〜５個のアミノ酸を付加するか又は欠失させることによって変更される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＰＲＲＳワクチン組成物。
【請求項７】
前記ペプチド抗原のアミノ末端又はカルボキシル末端に共有結合したＴヘルパーエピトープをさらに有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＰＲＲＳワクチン組成物。
【請求項８】
前記Ｔヘルパーエピトープが配列番号３５である、請求項７に記載のＰＲＲＳワクチン組成物。
【請求項９】
前記Ｔヘルパーエピトープが、ε−リジン残基を有するスペーサーを介してペプチド抗原に共有結合する、請求項７に記載のＰＲＲＳワクチン組成物。
【請求項１０】
前記スペーサーが配列番号３６である、請求項９に記載のＰＲＲＳワクチン組成物。
【請求項１１】
前記抗原ペプチドに結合されていないＴヘルパーエピトープをさらに有し、該Ｔヘルパーエピトープが配列番号４７〜９０からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＰＲＲＳワクチン組成物。
【請求項１２】
前記ペプチド抗原の総量が約１０μｇ〜約１ｍｇである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のＰＲＲＳワクチン組成物。
【請求項１３】
前記送達ビヒクル及びアジュバントが、モンタニド（Montanide）ISA 50V、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート、及びＣｐＧオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＰＲＲＳワクチン組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＰＲＲＳワクチン組成物を投与する工程を有する、ＰＲＲＳ感染に対して子ブタを防御する方法。
【請求項１５】
ａ）ペプチド抗原及び獣医学的に許容可能な送達ビヒクル又はアジュバント、
ｂ）配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号３１、及びそれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド抗原、及び
ｃ）配列番号８０〜９０及びそれらの組合せからなる群から選択されるＰＲＲＳＶ  Ｔｈペプチド、を有する、ＰＲＲＳワクチン組成物。
【請求項１６】
ａ）ペプチド抗原及び獣医学的に許容可能な送達ビヒクル又はアジュバント、
ｂ）配列番号４２、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、及びそれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド抗原、及び
ｃ）配列番号８０〜９０及びそれらの組合せからなる群から選択されるＰＲＲＳＶ  Ｔｈペプチド、を有する、ＰＲＲＳワクチン組成物。
【請求項１７】
ａ）配列番号１及び配列番号２の混合物を固体支持体に付着させる工程、
ｂ）前記固体支持体に付着した前記ペプチドを、該ペプチドに抗体が結合するのを促す条件下で、前記抗体を含むブタの血液、血清又は血漿サンプルに曝露する工程、及び
ｃ）前記固体支持体に付着した前記ペプチドに結合した抗体の存在を検出する工程、を有する、ＰＲＲＳ感染を診断する方法。
【請求項１８】
抗ＰＲＲＳＶ抗体の存在をテストするためのＥＬＩＳＡイムノアッセイであって、
ａ）配列番号７及び配列番号８の混合物を固体支持体に付着させる工程、
ｂ）前記固体支持体に付着した前記ペプチドを、該ペプチドに抗体が結合するのを促す条件下で、前記抗体を有するブタの血液、血清又は血漿サンプルに曝露する工程、及び
ｃ）前記支持体に付着した前記ペプチドに結合した抗体の存在を検出する工程
を有する、上記ＥＬＩＳＡイムノアッセイ。
【国際調査報告】
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