(57)【要約】  本発明は、試料における特定のRNA分子を増幅するための方法であって、前記方法が、(a)試料におけるRNA分子にポリ(リボヌクレオチド)配列を付加する工程;(b)前記ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列を含むリバースプライマーを用いて、ポリアデニル化RNA分子を逆転写する工程;ならびに(c)同じリバースプライマー、および検出されるべきRNA分子に特異的なフォワードプライマーを用いて、cDNA分子を増幅および検出する工程を含み、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの少なくとも1つがヘアピンプライマーを含む、方法を提供する。本発明はまた、この方法を実施するのに有用なキットを提供する。
2015530113.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料における特定のRNA分子を増幅するための方法であって、前記方法が、
(a)試料におけるRNA分子にポリ(リボヌクレオチド)配列を付加する工程;
(b)前記ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列を含むリバースプライマーを用いて、ポリ(リボヌクレオチド)-RNA分子を逆転写する工程;ならびに
(c)同じリバースプライマー、および検出されるべきRNA分子に特異的なフォワードプライマーを用いて、cDNA分子を増幅および検出する工程
を含み、
フォワードプライマーおよびリバースプライマーの少なくとも1つが、
(i)検出されるべきRNA分子に特異的な第1のヌクレオチド配列および/または前記ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列;
(ii)第1の配列の5'末端における第2のヌクレオチド配列;
(iii)第2の配列の5'末端における第3のヌクレオチド配列またはスペーサー;
(iv)第3の配列の5'末端における第4のヌクレオチド配列であって、二本鎖のデュプレックスを形成するように第2の配列に相補的である第4の配列;ならびに
(v)デュプレックスの鎖が分離した時、検出可能なシグナルを放出するための手段
を含むヘアピンプライマーを含み、
リバースプライマーがヘアピンプライマーを含む場合、前記ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列が、前記ヘアピンプライマーの第1のヌクレオチド配列内に存在する、方法。
【請求項２】
前記ポリ(リボヌクレオチド)配列の付加がポリアデニル化を含み、前記ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列がオリゴ(dT)配列を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記ポリ(リボヌクレオチド)配列の付加がポリウリジニル化を含み、前記ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列がオリゴ(dA)配列を含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
リバースプライマーが、前記ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列の3'末端において、検出されるべきRNA分子に特異的なヌクレオチド配列を追加として含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
フォワードプライマーがヘアピンプライマーを含み、リバースプライマーがヘアピンプライマーを含まない、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
リバースプライマーがヘアピンプライマーを含み、フォワードプライマーがヘアピンプライマーを含まない、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも2個の特定のRNA分子に対応するcDNA分子が、検出されるべき1個のRNA分子にいずれも特異的である2つの異なるプライマー対を用いる多重増幅反応において増幅および検出される、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも1つのプライマー対がヘアピンプライマーを含む、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、または10個の特定のRNA分子に対応するcDNA分子が、単一の多重反応において増幅および検出される、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
方法に用いられる各プライマー対が、ヘアピンプライマーを含み、かつ検出されるべき各RNA分子に特異的である、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
特定のRNA分子が非コードRNAを含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
非コードRNAが、核内低分子RNA(snRNA)、核小体低分子RNA(snoRNA)、一時的低分子RNA(stRNA)、アンチジーンRNA(agRNA)、マイクロRNA(miRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、およびPiwi相互作用RNA(piRNA)からなる群から選択される、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
非コードRNAがmiRNAを含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
非コードRNAが、miR-31、CTL23、miR-126、miR-1、miR-335、miR-139-5p、miR-210、miR-143、miR-10b、miR-181a、miR-28-5p、miR-127-5p、miR-125b、miR-222、miR-29a*、miR-381、let7d、miR-93、miR-200-5p、miR-221、およびmiR-107のうちの1つまたは複数から選択される、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
多重反応において、非コードRNAと共に、1個または複数のmRNA分子を増幅および検出する工程を含む、請求項11から13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記1個または複数のmRNA分子が、ヘアピンプライマーを含むプライマー対を用いて増幅および検出される、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記1個または複数のmRNA分子が、ヘアピンプライマーを含まないプライマー対を用いて増幅される、請求項15に記載の方法。
【請求項１８】
前記1個または複数のmRNA分子が、プローブを用いて検出される、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
プローブがmRNA分子に特異的である、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
シグナル放出手段がエネルギー供与体部分およびエネルギー受容体部分を含み、それぞれがヘアピンプライマーに結合しており、かつデュプレックスの鎖が分離した時のみシグナルが検出可能であるように間隔を置いて配置されている、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
エネルギー供与体部分とエネルギー受容体部分が、約10〜40ヌクレオチドの範囲内での距離を置いて配置されている、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
受容体部分が、供与体部分によって放出された波長とは異なる波長で蛍光を放出するフルオロフォアである、請求項20に記載の方法。
【請求項２３】
エネルギー供与体部分がフルオロフォアであり、エネルギー受容体部分がフルオロフォアクエンチャーである、請求項20に記載の方法。
【請求項２４】
供与体部分が、フルオレセイン、5-カルボキシフルオレセイン(FAM)、ローダミン、5-(2'-アミノエチル)アミノナフタレン-1-スルホン酸(EDANS)、アントラニルアミド、クマリン、テルビウムキレート誘導体、およびReactive Red 4からなる群から選択され、受容体部分が、DABCYL、ローダミン、テトラメチルローダミン、酪酸ピレン、エオシンニトロチロシン、エチジウム、フルオレセイン、マラカイトグリーン、およびテキサスレッドからなる群から選択される、請求項20に記載の方法。
【請求項２５】
供与体部分がフルオレセインまたはその誘導体であり、受容体部分がDABCYLである、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
エネルギー供与体部分とエネルギー受容体部分が、デュプレックスにおいて、5ヌクレオチドまたはそれ未満だけ離れている逆鎖ヌクレオチド上に位置している、請求項20に記載の方法。
【請求項２７】
エネルギー供与体部分とエネルギー受容体部分が、デュプレックスにおいて互いに反対側にある相補ヌクレオチド上に位置している、請求項20に記載の方法。
【請求項２８】
前記ポリ(リボヌクレオチド)配列の付加および逆転写工程が単一の反応混合物において実行される、請求項1から27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記増幅および検出工程が、前記ポリ(リボヌクレオチド)配列の付加および逆転写工程とは別の反応混合物において実行される、請求項1から28のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ポリ(リボヌクレオチド)配列の付加、逆転写工程、ならびに増幅および検出工程が全て、単一の反応混合物において実行される、請求項1から28のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
単一の反応混合物が、ポリ(A)ポリメラーゼ、および逆転写および増幅のための単一酵素を含む、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
単一の反応混合物が、逆転写および増幅のための単一酵素、ならびにポリ(U)配列をRNA分子に付加する酵素であって、ウリジリルトランスフェラーゼまたはポリ(U)ポリメラーゼからなる群から選択される酵素を含む、請求項30に記載の方法。
【請求項３３】
前記増幅および検出工程が定量的リアルタイムPCRを含む、請求項1から32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
(a)フォワードプライマーおよびリバースプライマーであって、フォワードプライマーが、検出されるべきRNA分子に特異的であり、リバースプライマーが、ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列を含み、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの少なくとも1つが、
(i)検出されるべきRNA分子に特異的な第1のヌクレオチド配列、および/または前記ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列;
(ii)第1の配列の5'末端における第2のヌクレオチド配列;
(iii)第2の配列の5'末端における第3のヌクレオチド配列またはスペーサー;
(iv)第3の配列の5'末端における第4のヌクレオチド配列であって、二本鎖のデュプレックスを形成するように第2の配列に相補的である第4の配列;ならびに
(v)デュプレックスの鎖が分離した時、検出可能なシグナルを放出するための手段
を含むヘアピンプライマーを含み、
リバースプライマーがヘアピンプライマーを含む場合、前記ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列が、前記ヘアピンプライマーの第1のヌクレオチド配列内に存在する、フォワードプライマーおよびリバースプライマー;ならびに
(b)前記ポリ(リボヌクレオチド)配列をRNA分子に付加する能力がある酵素
を含むキット。
【請求項３５】
フォワードプライマーおよびリバースプライマーであって、フォワードプライマーが、検出されるべきRNA分子に特異的であり、リバースプライマーが、ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列を含み、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの少なくとも1つが、
(i)検出されるべきRNA分子に特異的な第1のヌクレオチド配列、および/または前記ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列;
(ii)第1の配列の5'末端における第2のヌクレオチド配列;
(iii)第2の配列の5'末端における第3のヌクレオチド配列またはスペーサー;
(iv)第3の配列の5'末端における第4のヌクレオチド配列であって、二本鎖のデュプレックスを形成するように第2の配列に相補的である第4の配列;ならびに
(v)デュプレックスの鎖が分離した時、検出可能なシグナルを放出するための手段
を含むヘアピンプライマーを含み、
リバースプライマーがヘアピンプライマーを含む場合、前記ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列が、前記ヘアピンプライマーの第1のヌクレオチド配列内に存在する、フォワードプライマーおよびリバースプライマー
を含むキットであって、
前記1個または複数の特定のRNA分子に対応するcDNA分子を増幅および検出するための追加のプライマーまたはプローブを含まないキット。
【請求項３６】
リバースプライマーが、前記ポリ(リボヌクレオチド)配列の3'末端において、検出されるべきRNA分子に特異的なヌクレオチド配列を追加として含む、請求項34または35に記載のキット。
【請求項３７】
前記ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列が、オリゴ(dT)配列を含む、請求項34から36のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３８】
前記ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列が、オリゴ(dA)配列を含む、請求項34から36のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３９】
フォワードプライマーがヘアピンプライマーを含み、リバースプライマーがヘアピンプライマーを含まない、請求項34から38のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４０】
リバースプライマーがヘアピンプライマーを含み、フォワードプライマーがヘアピンプライマーを含まない、請求項34から38のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４１】
前記ポリ(リボヌクレオチド)配列をRNA分子に付加する能力がある酵素を含む、請求項35に記載のキット。
【請求項４２】
前記ポリ(リボヌクレオチド)配列をRNA分子に付加する能力がある酵素が、ポリ(A)ポリメラーゼを含む、請求項34または請求項41に記載のキット。
【請求項４３】
前記ポリ(リボヌクレオチド)配列をRNA分子に付加する能力がある酵素が、ウリジリルトランスフェラーゼまたはポリ(U)ポリメラーゼからなる群から選択される酵素を含む、請求項34または請求項41に記載のキット。
【請求項４４】
逆転写酵素を含む、請求項34から41のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４５】
前記ポリ(リボヌクレオチド)配列をRNA分子に付加する能力がある酵素、および逆転写酵素が1つの容器で提供される、請求項44に記載のキット。
【請求項４６】
DNAポリメラーゼを含む、請求項34から44のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４７】
逆転写酵素とDNAポリメラーゼを単一酵素の形として含む、請求項46に記載のキット。
【請求項４８】
前記ポリ(リボヌクレオチド)配列をRNA分子に付加する能力がある酵素を、単一酵素の形をとる逆転写酵素とDNAポリメラーゼと一緒に含む、請求項47に記載のキット。
【請求項４９】
前記ポリ(リボヌクレオチド)配列をRNA分子に付加する能力がある酵素が、単一酵素の形をとる逆転写酵素とDNAポリメラーゼと一緒に、1つの容器で提供される、請求項48に記載のキット。
【請求項５０】
検出されるべき1個のRNA分子にいずれも特異的である少なくとも2つの異なるプライマー対を含む、請求項34から46のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５１】
少なくとも1つのプライマー対がヘアピンプライマーを含む、請求項50に記載のキット。
【請求項５２】
検出されるべき1個のRNA分子にいずれも特異的である少なくとも3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、または10個の異なるプライマー対を含む、請求項34から50のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５３】
キットにおける各ヘアピンプライマーが異なる検出可能なシグナルを生じる、請求項50から52のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５４】
特定のRNA分子が非コードRNAを含む、請求項34から53のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５５】
非コードRNAが、核内低分子RNA(snRNA)、核小体低分子RNA(snoRNA)、一時的低分子RNA(stRNA)、アンチジーンRNA(agRNA)、マイクロRNA(miRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、およびPiwi相互作用RNA(piRNA)からなる群から選択される、請求項34から54のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５６】
非コードRNAがmiRNAを含む、請求項34から55のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５７】
非コードRNAが、miR-31、CTL23、miR-126、miR-1、miR-335、miR-139-5p、miR-210、miR-143、miR-10b、miR-181a、miR-28-5p、miR-127-5p、miR-125b、miR-222、miR-29a*、miR-381、let7d、miR-93、miR-200-5p、miR-221、およびmiR-107のうちの1つまたは複数から選択される、請求項56に記載のキット。
【請求項５８】
多重反応において、非コードRNAと共に、1個または複数のmRNA分子を増幅するための1つまたは複数のプライマー対を追加として含む、請求項54から56のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５９】
前記1個または複数のmRNA分子を増幅するための1つまたは複数のプライマー対がヘアピンプライマーを含まない、請求項58に記載のキット。
【請求項６０】
mRNA分子を検出するための1つまたは複数のプローブを追加として含む、請求項59に記載のキット。
【請求項６１】
プローブがmRNA分子に特異的である、請求項60に記載のキット。
【請求項６２】
シグナル放出手段がエネルギー供与体部分およびエネルギー受容体部分を含み、それぞれがヘアピンプライマーに結合しており、かつデュプレックスの鎖が分離した時のみシグナルが検出可能であるように間隔を置いて配置されている、請求項34から56のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６３】
エネルギー供与体部分とエネルギー受容体部分が、約10〜40ヌクレオチドの範囲内での距離を置いて配置されている、請求項62に記載のキット。
【請求項６４】
受容体部分が、供与体部分によって放出された波長とは異なる波長で蛍光を放出するフルオロフォアである、請求項62に記載のキット。
【請求項６５】
エネルギー供与体部分がフルオロフォアであり、エネルギー受容体部分がフルオロフォアクエンチャーである、請求項62に記載のキット。
【請求項６６】
供与体部分が、フルオレセイン、5-カルボキシフルオレセイン(FAM)、ローダミン、5-(2'-アミノエチル)アミノナフタレン-1-スルホン酸(EDANS)、アントラニルアミド、クマリン、テルビウムキレート誘導体、およびReactive Red 4からなる群から選択され、受容体部分が、DABCYL、ローダミン、テトラメチルローダミン、酪酸ピレン、エオシンニトロチロシン、エチジウム、フルオレセイン、マラカイトグリーン、およびテキサスレッドからなる群から選択される、請求項62に記載のキット。
【請求項６７】
供与体部分がフルオレセインまたはその誘導体であり、受容体部分がDABCYLである、請求項66に記載のキット。
【請求項６８】
エネルギー供与体部分とエネルギー受容体部分が、デュプレックスにおいて、5ヌクレオチドまたはそれ未満だけ離れている逆鎖ヌクレオチド上に位置している、請求項62から67のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６９】
エネルギー供与体部分とエネルギー受容体部分が、デュプレックスにおいて互いに反対側にある相補ヌクレオチド上に位置している、請求項62から67のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、全体として参照により本明細書に組み入れられている、2012年9月28日に出願された米国仮特許出願第61/707,670号の恩典を主張する。
【０００２】
連邦政府支援の研究および開発の下でなされた発明への権利に関する言明
適用なし。
【０００３】
本発明は、一般的に、RNA分子の検出および定量化の領域に関する。特に、本発明は、マイクロRNAの検出および定量化のための方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００４】
マイクロRNAは、およそ22ヌクレオチド非コードRNAの大量のクラスであり、動物、植物、およびウイルスの発生において重要な制御的役割を果たしている。マイクロRNAの認識は、約15年前にlin-4の発見から始まり、そのlin-4は、C.エレガンス(C. elegans)の生活環および幼虫の発生における線虫のタイミングおよび発育に関与する低分子RNAをコードするが(Leeら1993 Cell 75:843〜854頁、Wightmanら1993 Cell 75:855362)、マイクロRNAが、動物において幅広い制御的機能を有するリボ制御因子の主要なクラスを形成することは、つい最近になって認識されたばかりであった(Lagos-Quintanaら2001 Science 294:853858、Lauら2001 Science 294:858〜862頁、LeeおよびAmbros. 2001 Science 294:862〜864頁)。
【０００５】
マイクロRNAは、メッセンジャーRNA標的の翻訳を分解または遮断することにより、転写後レベルにおける遺伝子発現の制御に関与し、ヒトゲノムのおよそ30%がマイクロRNAによって制御され得ることが推測されている。マイクロRNAは、発生、成長および増殖、アポトーシス、分化、ならびに癌および糖尿病などの様々なヒト疾患(http://www.mir2disease.org/)を含む様々な細胞プロセスにおいて役割を果たす。癌におけるマイクロRNAの重要性は、最近の論文(Barbarottoら2008 Int. J. Cancer. 122:969〜977頁)において脚光を浴びており、その論文は以下のことを指摘している:(i)miRNAは、分析されたヒト癌のあらゆる型において変化している;(ii)miRNAは、癌遺伝子および腫瘍抑制因子として働く;(iii)miRNA変化は、癌素因の原因となる可能性がある;(iv)miRNAプロファイリングは、新しい癌診断ツールを表す;ならびに(v)miRNAプロファイリングは癌における診断ツールを表す。
【０００６】
qRT-PCR手順によるマイクロRNAの定量化は、マイクロRNAの小さなサイズ(すなわち、PCRに通常、用いられるプライマーのサイズである、わずか約21〜25ヌクレオチド)のために非常に困難である。この問題の解決は、RaymondらRNA. 2005 Nov;ll(ll): 1737〜44頁; GiladらPLoS ONE. 2008 Sep 5;3(9):e3148; Sharbati-TehraniらBMC Molecular Biology. 2008、9:34に発表されている。Raymondらは、遺伝子特異的逆転写工程、続いて、ロックド核酸(LNA)分子を含有する遺伝子特異的フォワードプライマーおよびユニバーサルリバースプライマーを用いるSYBR green qPCR工程を記載する。Giladらは、ポリアデニル化工程、非特異的逆転写工程、および遺伝子特異的フォワードプライマー、遺伝子特異的TaqManプライマー、およびユニバーサルリバースプライマーを含むqPCR工程を含むqRT-PCRアッセイを報告している。Sharbati-Tehraniらは、遺伝子特異的逆転写工程、続いて、遺伝子特異的フォワードプライマーおよび2つのユニバーサルプライマーを用いるSYBR green qPCR工程を含むqRT-PCRアッセイを開発した。
【０００７】
診断マイクロRNAアッセイは、Applied Biosystems, Inc.およびExiqonによって開発されている。ABI TaqmanマイクロRNAアッセイ設計は、多重化できる可能性があるが、複雑であり、かつ低い非効率的な温度での逆転写を必要とする。そのテクノロジーは、ステムループ逆転写(RT)プライマー、ならびに個々のマイクロRNAプローブおよびプライマーセットを用いる。標的あたり以下の合計4つのオリゴヌクレオチドがある:ループ化RTプライマー、フォワードPCRプライマー、リバースPCRプライマー、およびTAQMAN(登録商標)プローブ。ExiqonマイクロRNAアッセイは、ユニバーサルタグ、およびファーストストランド合成、および検出のためのSYBR(登録商標)Greenを利用する。このシステムは、多重化することができず、少なくとも3つのオリゴヌクレオチド(ユニバーサルタグを有する縮重RTプライマー、フォワードプライマー、およびリバースプライマー)を利用する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第6,794,499号
【特許文献２】米国特許第6,670,461号
【特許文献３】米国特許第6,262,490号
【特許文献４】米国特許第6,770,748号
【特許文献５】米国特許第6,027,998号
【特許文献６】米国特許第6,605,451号
【特許文献７】PCT公開第WO 97/31256号
【特許文献８】PCT公開第WO 01/92579号
【特許文献９】米国特許第5,830,711号
【特許文献１０】米国特許第6,027,889号
【特許文献１１】米国特許第5,686,243号
【特許文献１２】PCT公開第WO0056927A3号
【特許文献１３】PCT公開第WO9803673A1号
【特許文献１４】PCT公開第WO 2010/985966号
【特許文献１５】PCT公開第WO 2010/085966号
【特許文献１６】米国特許第5,866,336号
【特許文献１７】米国特許第5,958,349号
【特許文献１８】米国特許第6,403,037号
【特許文献１９】米国特許第6,440,725号
【特許文献２０】米国特許第6,783,736号
【特許文献２１】米国特許第6,818,185号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Leeら1993 Cell 75:843〜854頁
【非特許文献２】Wightmanら1993 Cell 75:855362
【非特許文献３】Lagos-Quintanaら2001 Science 294:853858
【非特許文献４】Lauら2001 Science 294:858〜862頁
【非特許文献５】LeeおよびAmbros、2001 Science 294:862〜864頁
【非特許文献６】Barbarottoら2008 Int. J. Cancer. 122:969〜977頁
【非特許文献７】RaymondらRNA. 2005 Nov;ll(ll);1737〜44頁
【非特許文献８】GiladらPLoS ONE. 2008 Sep 5;3(9):e3148
【非特許文献９】Sharbati-TehraniらBMC Molecular Biology. 2008、9:34
【非特許文献１０】BergerおよびKimmel (1987) METHODS IN ENZYMOLOGY、152巻: GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES、San Diego: Academic Press, Inc.
【非特許文献１１】Sambrookら(1989) MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL、第2版、1〜3巻、Cold Spring Harbor Laboratory
【非特許文献１２】AndersonおよびYoung、Quantitative Filter Hybridization in NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (1985)
【非特許文献１３】「A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics」John SantaLucia, Jr.、PNAS 1998年2月17日95巻4号1460〜1465頁
【非特許文献１４】Ausbelら; PCR Primer: A Laboratory Manual、Diffenbach編、Cold Spring Harbor Press (1995)
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【非特許文献２６】Barany、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 188〜93頁(1991)
【非特許文献２７】BiおよびSambrook、Nucl. Acids Res. 25:2924〜2951頁(1997)
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【非特許文献２９】Deanら、Proc Natl Acad Sci USA 99:5261〜66頁(2002)
【非特許文献３０】BaranyおよびGelfand、Gene 109: 1〜11頁(1991)
【非特許文献３１】Walkerら、Nucl. Acid Res. 20: 1691〜96頁(1992)
【非特許文献３２】Polstraら、BMC Inf. Dis. 2:18頁〜(2002)
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【非特許文献３６】Cookら、J Microbiol Methods. 2003年5月;53(2): 165〜74頁
【非特許文献３７】Schweitzerら、Curr Opin Biotechnol. 2001年2月;12(l):21〜7頁
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【非特許文献４０】Sarinら、1988、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 :7448〜7451頁
【非特許文献４１】Juら、1995、Proc. Natl. Acad. Sci., USA 92:4347〜4351頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一つの態様は、試料における特定のRNA分子を増幅するための方法である。いくつかの実施形態において、方法は、
(a)試料におけるRNA分子にポリ(リボヌクレオチド)配列を付加する工程;
(b)前記ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列を含むリバースプライマーを用いて、ポリ(リボヌクレオチド)-RNA分子を逆転写する工程;および
(c)同じリバースプライマー、および検出されるべきRNA分子に特異的なフォワードプライマーを用いて、cDNA分子を増幅および検出する工程
を必要とする。フォワードプライマーおよびリバースプライマーの少なくとも1つは、
(i)検出されるべきRNA分子に特異的な第1のヌクレオチド配列および/または前記ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列;
(ii)第1の配列の5'末端における第2のヌクレオチド配列;
(iii)第2の配列の5'末端における第3のヌクレオチド配列またはスペーサー;
(iv)第3の配列の5'末端における第4のヌクレオチド配列であって、二本鎖のデュプレックスを形成するように第2の配列に相補的である第4の配列;ならびに
(v)デュプレックスの鎖が分離した時、検出可能なシグナルを放出するための手段
を含むヘアピンプライマーを含み、リバースプライマーがヘアピンプライマーを含む場合、前記ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列が、前記ヘアピンプライマーの第1のヌクレオチド配列内に存在する。いくつかの実施形態において、ポリ(リボヌクレオチド)配列の付加は、ポリアデニル化を含み、前記ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列は、オリゴ(dT)配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ(リボヌクレオチド)配列の付加はポリウリジニル化を含み、前記ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列は、オリゴ(dA)配列を含む。いくつかの実施形態において、リバースプライマーは、前記ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列の3'末端において、検出されるべきRNA分子に特異的なヌクレオチド配列を追加として含む。いくつかの実施形態において、フォワードプライマーはヘアピンプライマーを含み、リバースプライマーはヘアピンプライマーを含まない。いくつかの実施形態において、リバースプライマーはヘアピンプライマーを含み、フォワードプライマーはヘアピンプライマーを含まない。
【００１１】
いくつかの実施形態において、少なくとも2個の特定のRNA分子に対応するDNA分子は、2つの異なるプライマー対を用いる多重増幅反応において増幅および検出され、その2つの異なるプライマー対のそれぞれは、検出されるべき1個のRNA分子に特異的である。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのプライマー対はヘアピンプライマーを含む。いくつかの実施形態において、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、または10個の特定のRNA分子に対応するcDNA分子は、単一の多重反応において増幅および検出される。いくつかの多重の実施形態において、方法に用いられる各プライマー対は、ヘアピンプライマーを含み、かつ検出されるべき各RNA分子に特異的である。
【００１２】
いくつかの実施形態において、方法は、多重反応において、非コードRNAと共に、1個または複数のmRNA分子を増幅および検出する工程を必要とする。いくつかの実施形態において、1個または複数のmRNA分子は、ヘアピンプライマーを含むプライマー対を用いて増幅および検出される。いくつかの実施形態において、1個または複数のmRNA分子は、ヘアピンプライマーを含まないプライマー対を用いて増幅される。いくつかの実施形態において、1個または複数のmRNA分子は、プローブを用いて検出される。いくつかの実施形態において、プローブはmRNA分子に特異的である。
【００１３】
いくつかの実施形態において、ポリ(リボヌクレオチド)配列の付加および逆転写工程は、単一の反応混合物において実行される。いくつかの実施形態において、増幅および検出工程は、ポリ(リボヌクレオチド)配列の付加および逆転写工程とは別の反応混合物において実行される。いくつかの実施形態において、ポリ(リボヌクレオチド)配列の付加、逆転写工程、ならびに増幅および検出工程は全て、単一の反応混合物において実行される。いくつかの実施形態において、単一の反応混合物は、ポリ(A)ポリメラーゼ、ならびに逆転写および増幅のための単一の酵素を含む。いくつかの実施形態において、単一の反応混合物は、逆転写および増幅のための単一の酵素、ならびにポリ(U)配列をRNA分子に付加する酵素を含み、その付加する酵素がウリジリルトランスフェラーゼまたはポリ(U)ポリメラーゼから選択される。いくつかの実施形態において、増幅および検出工程は、定量的リアルタイムPCRを含む。
【００１４】
本発明の他の態様は、キットを含む。いくつかの実施形態において、キットは、
(a)フォワードプライマーおよびリバースプライマーであって、フォワードプライマーが、検出されるべきRNA分子に特異的であり、リバースプライマーが、ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列を含み、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの少なくとも1つが、
(i)検出されるべきRNA分子に特異的な第1のヌクレオチド配列、および/または前記ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列;
(ii)第1の配列の5'末端における第2のヌクレオチド配列;
(iii)第2の配列の5'末端における第3のヌクレオチド配列またはスペーサー;
(iv)第3の配列の5'末端における第4のヌクレオチド配列であって、二本鎖のデュプレックスを形成するように第2の配列に相補的である第4の配列;ならびに
(v)デュプレックスの鎖が分離した時、検出可能なシグナルを放出するための手段
を含むヘアピンプライマーを含み、リバースプライマーがヘアピンプライマーを含む場合、前記ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列が、前記ヘアピンプライマーの第1のヌクレオチド配列内に存在する、フォワードプライマーおよびリバースプライマー;ならびに
(b)前記ポリ(リボヌクレオチド)配列をRNA分子に付加する能力がある酵素
を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態において、キットは、
フォワードプライマーおよびリバースプライマーであって、フォワードプライマーが、検出されるべきRNA分子に特異的であり、リバースプライマーが、ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列を含み、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの少なくとも1つが、
(i)検出されるべきRNA分子に特異的な第1のヌクレオチド配列、および/または前記ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列;
(ii)第1の配列の5'末端における第2のヌクレオチド配列;
(iii)第2の配列の5'末端における第3のヌクレオチド配列またはスペーサー;
(iv)第3の配列の5'末端における第4のヌクレオチド配列であって、二本鎖のデュプレックスを形成するように第2の配列に相補的である第4の配列;ならびに
(v)デュプレックスの鎖が分離した時、検出可能なシグナルを放出するための手段
を含むヘアピンプライマーを含み、リバースプライマーがヘアピンプライマーを含む場合、前記ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列が、前記ヘアピンプライマーの第1のヌクレオチド配列内に存在する、フォワードプライマーおよびリバースプライマー
を含み、かつキットは、前記1個または複数の特定のRNA分子に対応するcDNA分子を増幅および検出するための追加のプライマーまたはプローブを含まない。いくつかの実施形態において、このキットは前記ポリ(リボヌクレオチド)配列をRNA分子に付加する能力がある酵素を追加として含むことができる。
【００１６】
キットのいくつかの実施形態において、リバースプライマーは、前記ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列の3'末端において、検出されるべきRNA分子に特異的なヌクレオチド配列を追加として含む。キットのいくつかの実施形態において、前記ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列は、オリゴ(dT)配列を含む。キットのいくつかの実施形態において、前記ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列は、オリゴ(dA)配列を含む。キットのいくつかの実施形態において、フォワードプライマーはヘアピンプライマーを含み、リバースプライマーはヘアピンプライマーを含まない。キットのいくつかの実施形態において、リバースプライマーはヘアピンプライマーを含み、フォワードプライマーはヘアピンプライマーを含まない。
【００１７】
キットのいくつかの実施形態において、前記ポリ(リボヌクレオチド)配列をRNA分子に付加する能力がある酵素は、ポリ(A)ポリメラーゼを含む。キットのいくつかの実施形態において、前記ポリ(リボヌクレオチド)配列をRNA分子に付加する能力がある酵素は、ウリジリルトランスフェラーゼまたはポリ(U)ポリメラーゼからなる群から選択される酵素を含む。いくつかの実施形態において、キットは逆転写酵素を含む。いくつかの実施形態において、前記ポリ(リボヌクレオチド)配列をRNA分子に付加する能力がある酵素、および逆転写酵素は、1つの容器内で提供される。いくつかの実施形態において、キットはDNAポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態において、キットは、逆転写酵素とDNAポリメラーゼとを単一酵素の形として含む。いくつかの実施形態において、キットは、前記ポリ(リボヌクレオチド)配列をRNA分子に付加する能力がある酵素を、単一酵素の形をとる逆転写酵素とDNAポリメラーゼと一緒に含む。いくつかの実施形態において、前記ポリ(リボヌクレオチド)配列をRNA分子に付加する能力がある酵素は、単一酵素の形をとる逆転写酵素とDNAポリメラーゼと一緒に、1つの容器内で提供される。
【００１８】
いくつかの実施形態において、キットは、検出されるべき1個のRNA分子にいずれも特異的である少なくとも2つの異なるプライマー対を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのプライマー対はヘアピンプライマーを含む。いくつかの実施形態において、キットは、検出されるべき1個のRNA分子にいずれも特異的である少なくとも3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、または10個の異なるプライマー対を含む。いくつかの実施形態において、キットにおける各ヘアピンプライマーは、異なる検出可能なシグナルを生じる。
【００１９】
いくつかの実施形態において、キットは、多重反応において、非コードRNAと共に、1個または複数のmRNA分子を増幅するための1つまたは複数のプライマー対を追加として含む。いくつかの実施形態において、1個または複数のmRNA分子を増幅するための1つまたは複数のプライマー対は、ヘアピンプライマーを含まない。いくつかの実施形態において、キットは、mRNA分子を検出するための1つまたは複数のプローブを追加として含む。いくつかの実施形態において、プローブは、mRNA分子に特異的である。
【００２０】
方法およびキットのいくつかの実施形態において、特定のRNA分子は非コードRNAを含む。いくつかの実施形態において、非コードRNAは、以下から選択される:核内低分子RNA(snRNA)、核小体低分子RNA(snoRNA)、一時的低分子RNA(small temporal RNA)(stRNA)、アンチジーンRNA(agRNA)、マイクロRNA(miRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、およびPiwi相互作用RNA(piRNA)。いくつかの実施形態において、非コードRNAは、以下のうちの1つまたは複数から選択される: miR-31、CTL23、miR-126、miR-1、miR-335、miR-139-5p、miR-210、miR-143、miR-10b、miR-181a、miR-28-5p、miR-127-5p、miR-125b、miR-222、miR-29a*、miR-381、let7d、miR-93、miR-200-5p、miR-221、およびmiR-107。
【００２１】
方法およびキットのいくつかの実施形態において、シグナル放出手段は、エネルギー供与体部分およびエネルギー受容体部分を含み、それぞれがヘアピンプライマーに結合しており、かつデュプレックスの鎖が分離した時のみ、シグナルが検出可能であるように間隔をおいて配置されている。いくつかの実施形態において、エネルギー供与体部分および受容体部分は、約10〜40ヌクレオチドの範囲内での距離を置いて配置されている。いくつかの実施形態において、受容体部分は、供与体部分によって放出された波長と異なる波長で蛍光を放出するフルオロフォアである。いくつかの実施形態において、エネルギー供与体部分はフルオロフォアであり、エネルギー受容体部分はフルオロフォアクエンチャーである。いくつかの実施形態において、供与体部分は、フルオレセイン、5-カルボキシフルオレセイン(FAM)、ローダミン、5-(2'-アミノエチル)アミノナフタレン-1-スルホン酸(EDANS)、アントラニルアミド、クマリン、テルビウムキレート誘導体、およびReactive Red 4から選択され、受容体部分は、DABCYL、ローダミン、テトラメチルローダミン、酪酸ピレン、エオシンニトロチロシン、エチジウム、フルオレセイン、マラカイトグリーン、およびテキサスレッドから選択される。いくつかの実施形態において、供与体部分はフルオレセインまたはその誘導体であり、受容体部分がDABCYLである。いくつかの実施形態において、エネルギー供与体部分とエネルギー受容体部分は、デュプレックスにおいて5ヌクレオチドまたはそれ未満だけ離れている逆鎖ヌクレオチド上に位置している。いくつかの実施形態において、エネルギー供与体部分とエネルギー受容体部分は、デュプレックスにおいて互いに反対側にある相補ヌクレオチド上に位置している。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】リバースプライマーがヘアピンプライマーである、本明細書に記載された方法の実施形態を示す図である。
【図２】フォワードプライマーがヘアピンプライマーである、本明細書に記載された方法の実施形態を示す図である。
【図３】標的の希釈系列に関して一重で、本明細書に記載された方法に従って行った定量的リアルタイムPCRマイクロRNAアッセイの結果を示す図である。蛍光はPCRサイクル数に対してプロットされている。
【図４Ａ】多重定量的リアルタイムPCRマイクロRNAアッセイの結果を示す図である。蛍光はPCRサイクル数に対してプロットされている。miR31。
【図４Ｂ】多重定量的リアルタイムPCRマイクロRNAアッセイの結果を示す図である。蛍光はPCRサイクル数に対してプロットされている。CTL23。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、多重マイクロRNAアッセイにおける複数の標的に特異的に作製することができる、各標的についての2つのオリゴヌクレオチド(RT/リバースプライマー/プローブとフォワードプライマーの組み合わせ、またはRT/リバースプライマーとフォワードプライマー/プローブの組み合わせ)を用いる、遺伝的状態のRNA(例えば、miRNA)マーカーの測定に関する。
【００２４】
定義
特許請求の範囲および明細書に用いられる用語は、他に規定がない限り、下に示されたように定義される。
【００２５】
用語「核酸」は、ヌクレオチドポリマーを指し、他に限定がない限り、天然に存在するヌクレオチドに類似した様式で機能する(例えば、ハイブリダイズする)ことができる天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む。
【００２６】
核酸という用語は、任意の型のDNAまたはRNAを含み、それには、例えば、ゲノムDNA;相補DNA(cDNA)(通常、メッセンジャーRNA(mRNA)の逆転写により、または増幅により得られる、mRNAのDNA表現);合成的に、または増幅により産生されたDNA分子;mRNA;および非コードRNAが挙げられる。
【００２７】
核酸という用語は、一本鎖分子に加えて、二本鎖または三本鎖核酸複合体を包含する。二本鎖または三本鎖核酸複合体において、核酸鎖は、同一の広がりをもつ必要はない(すなわち、二本鎖核酸は、両方の鎖の全長に沿って二本鎖である必要はない)。
【００２８】
核酸という用語はまた、メチル化による、および/またはキャッピングによるなどのその任意の化学修飾体も包含する。核酸修飾には、追加の電荷、分極率、水素結合、静電気的相互作用を組み入れる化学基の付加、および個々の核酸塩基への、または全体としての核酸への機能性の付加を挙げることができる。そのような修飾には、2'位糖修飾、5位ピリミジン修飾、8位プリン修飾、シトシン環外アミンにおける修飾などの塩基修飾、5-ブロモ-ウラシルの置換、糖-リン酸バックボーンの修飾、イソ塩基(isobase)、イソシチジン、およびイソグアニジンなどの異常な塩基対形成組み合わせが挙げられ得る。
【００２９】
より具体的には、いくつかの実施形態において、核酸には、(2-デオキシ-D-リボースを含有する)ポリデオキシリボヌクレオチド、(D-リボースを含有する)ポリリボヌクレオチド、およびプリンまたはピリミジン塩基のN-またはC-グリコシドである任意の他の型の核酸、加えて、非ヌクレオチドのバックボーンを含有する他のポリマー、例えば、ポリアミド(例えば、ペプチド核酸(PNA))およびポリモルホリノポリマー(Neugeneとして、Anti-Virals, Inc.社、Corvallis社、Oregon社から市販されている)、ならびに、ポリマーが、DNAおよびRNAに見出されるような塩基対形成および塩基スタッキングを可能にする立体配置で核酸塩基を含有するとの条件での、他の合成配列特異的核酸ポリマーを挙げることができる。核酸という用語はまた、ロックド核酸(LNA)を包含し、そのロックド核酸は、LNAの開示として全体として参照により本明細書に組み入れられている、米国特許第6,794,499号、第6,670,461号、第6,262,490号、および第6,770,748号に記載されている。
【００３０】
核酸は、固相媒介型化学合成などの完全化学合成プロセスに、核酸を産生する任意の種からの単離を通してなどの生物学的供給源に、もしくはDNA複製、PCR増幅、逆転写などの分子生物学ツールによる核酸の操作を含むプロセスに、またはそれらのプロセスの組み合わせに由来することができる。
【００３１】
非コードRNAは、必ずしもタンパク質へ翻訳されないRNA種を含む。これらには、トランスファーRNA(tRNA)およびリボソームRNA(rRNA)、加えて、核内低分子RNA(snRNA)、核小体低分子RNA(snoRNA;例えば、メチル化またはシュードウリジル化に関連づけられるもの)、一時的低分子RNA(stRNA)、アンチジーンRNA(agRNA)、マイクロRNA(miRNA;遺伝子発現を制御する)、低分子干渉RNA(siRNA;RNA干渉(RNAi)経路に関与し、それらは特定の遺伝子の発現に干渉するが、抗ウイルス剤として、およびゲノムの染色質構造を形作ることにおいて働くことも示されている)、およびPiwi相互作用RNA(piRNA;Piwiタンパク質との相互作用を通してRNA-タンパク質複合体を形成する;これらのpiRNA複合体は、レトロトランスポゾン、および生殖系列細胞、特に精子形成における生殖系列細胞における他の遺伝因子の転写性遺伝子サイレンシングに結びつけられている)、および長鎖非コードRNA(長鎖ncRNA;典型的には約200ヌクレオチドより長い非コード転写物である)が挙げられるが、それらに限定されない。
【００３２】
用語「マイクロRNA」、「miRNA」、および「miR」は、同意語として用いられ、動物および植物などの生きている生物体の内因性遺伝子に由来する非コードRNAを指す。「成熟」型において、これらのmiRNAは、典型的には、長さが21〜25ヌクレオチドであり、生物活性がある。それらは、一般的に、およそ75ヌクレオチドの長さを有するpre-miRNA(pre-miR)と名付けられたより長いヘアピン様前駆体からプロセシングされる。pre-miRNAの前駆体は、約500〜3000ヌクレオチドの長さを有するpri-miRNA(pri-miR)である。miRNAは、miRNPと名付けられた複合体に集合し、メッセンジャーRNAに結合して、翻訳効率に干渉することにより、重要な生物学的過程への主要な制御因子として働く。本明細書に記載された方法の標的マイクロRNAは、科学文献、およびmiRBaseデータベース(microrna.sanger.ac.uk/)(Sanger Institute、UKにより運営されたウェブ上のマイクロRNAデータのホームである)などの公開データベースから知られたマイクロRNAなどの全ての既知のマイクロRNAを指す。miRBaseリリース19は、そこに開示された全ての成熟miRNAおよび未熟miRNA配列を含め、参照により本明細書に組み入れられている。
【００３３】
「ポリアデニル化」は、RNA分子の3'末端におけるポリ(A)テール(全ての塩基がアデニンである、ひと続きのRNA)の付加を指す。ポリアデニル化は、生きている生物体において自然の生物学的過程であるが、市販の大腸菌(E.coli)ポリ(A)ポリメラーゼI(E-PAP)などの様々なポリメラーゼを用いてインビトロでも実行させることができる。
【００３４】
「ポリウリジニル化」は、RNA分子の3'末端におけるポリ(U)テール(全ての塩基がウリジンである、ひと続きのRNA)の付加を指す。ポリウリジニル化は、生きている生物体において自然の生物学的過程であるが、ウリジリルトランスフェラーゼまたはポリ(U)ポリメラーゼ(その後者はNew England Biolabsから市販されている)などの様々な酵素を用いてインビトロでも実行させることができる。
【００３５】
本明細書で用いられる場合、用語「相補的な」は、2つのヌクレオチド間の正確な対形成のための能力を指す;すなわち、核酸の所定の位置におけるヌクレオチドが、別の核酸のヌクレオチドと水素結合して正準の塩基対を形成する能力があるなら、その2つの核酸は、その位置において互いに相補的であるとみなされる。2つの一本鎖核酸分子間の相補性は、ヌクレオチドの一部のみが結合する「部分的」であってもよく、または全部の相補性が一本鎖分子間に存在する場合、それは完全であり得る。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強さに有意な効果を生じる。
【００３６】
「特異的ハイブリダイゼーション」は、規定されたストリンジェンシー条件下で、ハイブリダイゼーション混合物中に存在する他のヌクレオチド配列への実質的結合がない場合の核酸の標的ヌクレオチド配列への結合を指す。当業者は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを緩和することが、配列ミスマッチの許容を可能にすることを認識している。
【００３７】
いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で実行される。句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、一般的に、規定されたイオン強度およびpHにおいて特定の配列についての融解温度(Tm)より低い約5℃から約20℃または25℃までの範囲内での温度を指す。本明細書で用いられる場合、Tmは、二本鎖核酸分子の集団が、一本鎖へ半数が解離するようになる時点の温度である。核酸のTmを計算するための方法は、当技術分野において周知である(例えば、BergerおよびKimmel (1987) METHODS IN ENZYMOLOGY、152巻: GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES、San Diego: Academic Press, Inc.ならびにSambrookら(1989) MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL、第2版、1〜3巻、Cold Spring Harbor Laboratory参照、どちらも、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の説明として参照により本明細書に組み入れられている)。標準的な参考文献によって示されているように、Tm値の簡単な推定は、核酸が1M NaClでの水溶液中にある場合、方程式: Tm=81.5+0.41(% G+C)によって計算されてもよい(例えば、AndersonおよびYoung、Quantitative Filter Hybridization in NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (1985)参照)。ハイブリッドの融解温度(および、したがって、ストリンジェントなハイブリダイゼーションについての条件)は、プライマーまたはプローブの長さおよび性質(DNA、RNA、塩基組成)、ならびに標的核酸の性質(DNA、RNA、塩基組成、溶液中に存在する、または固定化されているなど)、加えて塩および他の成分の濃度(例えば、ホルムアミド、デキストラン硫酸、ポリエチレングリコールの存在または非存在)などの様々な因子によって影響される。これらの因子の効果は周知であり、当技術分野における標準的な参考文献において論じられている。たいていの配列の特異的ハイブリダイゼーションを達成するのに適した例証的なストリンジェントな条件は、少なくとも約60℃の温度、およびpH7における約0.2モル濃度の塩濃度である。最近接熱力学に基づいたオリゴヌクレオチド配列についてのTm計算は、「A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics」John SantaLucia, Jr.、PNAS 1998年2月17日95巻4号1460〜1465頁(この説明として参照により本明細書に組み入れられている)に記載されているように、行うことができる。
【００３８】
用語「オリゴヌクレオチド」は、比較的短い、一般的には200ヌクレオチド未満、より具体的には100ヌクレオチド未満、最も具体的には50ヌクレオチド未満である核酸を指すために用いられる。典型的には、オリゴヌクレオチドは一本鎖DNA分子である。
【００３９】
用語「プライマー」は、核酸とハイブリダイズする(「アニールする」とも呼ばれる)能力があり、かつ適切な緩衝液中、適した温度での適切な条件下(すなわち、4つの異なるヌクレオシド三リン酸、およびDNAポリメラーゼもしくはRNAポリメラーゼまたは逆転写酵素などの重合のための作用物質の存在下)で、ヌクレオチド(RNAまたはDNA)重合のための開始部位としての役割を果たすオリゴヌクレオチドを指す。プライマーの適切な長さは、そのプライマーの意図される使用に依存するが、プライマーは典型的には、少なくとも7ヌクレオチド長であり、いくつかの実施形態において、長さが、10ヌクレオチドから30ヌクレオチドまで、またはいくつかの実施形態において、15ヌクレオチドから30ヌクレオチドまでの範囲である。いくつかの実施形態において、プライマーは、若干より長く、例えば、30〜50ヌクレオチド長であり得る。この関連において、「プライマー長」は、相補的な「標的」配列にハイブリダイズし、かつヌクレオチド合成をプライムする、オリゴヌクレオチドまたは核酸の部分を指す。短いプライマー分子は、一般的に、鋳型と十分安定なハイブリッド複合体を形成するためにより冷たい温度を必要とする。プライマーは、鋳型の正確な配列を反映する必要はないが、鋳型とハイブリダイズするのに十分相補的でなければならない。
【００４０】
プライマーは、そのプライマーまたはその一部が核酸内のヌクレオチド配列にハイブリダイズする場合には、別の核酸にアニールすると言われる。プライマーが特定のヌクレオチド配列にハイブリダイズするという言明は、プライマーが、そのヌクレオチド配列と完全に、または排他的にハイブリダイズすることを意味するものではない。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書に用いられる増幅プライマーは、ヌクレオチド配列に「アニールする」、または「特異的である」と言われる。この記載は、ヌクレオチド配列へ全体的にアニールするプライマー、加えて、ヌクレオチド配列へ部分的にアニールするプライマーを包含する。
【００４１】
用語「プライマー対」は、増幅されるべきDNA配列の5'末端の相補体とハイブリダイズする5'「上流プライマー」または「フォワードプライマー」、および増幅されるべき配列の3'末端とハイブリダイズする3'「下流プライマー」または「リバースプライマー」を含む1セットのプライマーを指す。当業者によって認識されているように、用語「上流」および「下流」、または「フォワード」および「リバース」は、限定的であることを意図するものではなく、むしろ、いくつかの実施形態において、例証的な配向を提供する。
【００４２】
「プローブ」は、1つまたは複数の型の化学結合を通して、一般的には相補的塩基対形成を通して、通常には水素結合形成を通して、相補的配列の標的核酸に結合し、それにしたがって、デュプレックス構造を形成する能力がある核酸である。プローブは、特にプローブがそれの相補的標的にハイブリダイズした時点で、プローブの容易な検出を可能にするために検出可能な標識で標識することができる。しかしながら、代替として、プローブは標識されてなくてもよく、直接的かまたは間接的にかのいずれかで、標識されているリガンドとの特異的結合により、検出可能であり得る。プローブは、サイズがかなり異なり得る。一般的に、プローブは、長さが少なくとも7〜15ヌクレオチドである。他のプローブは、少なくとも20、30、または40ヌクレオチド長である。さらに他のプローブは、若干より長く、少なくとも50、60、70、80、または90ヌクレオチド長である。まだなお他のプローブは、さらにより長く、少なくとも100、150、200ヌクレオチド長、またはそれ以上である。プローブはまた、上記の値のいずれかによって境界される任意の範囲(例えば、長さが15〜20ヌクレオチド)内にある任意の長さであり得る。
【００４３】
プライマーまたはプローブは、標的核酸配列に完全に相補的であり得、または完全な相補性には満たないことがあり得る。いくつかの実施形態において、プライマーは、少なくとも7ヌクレオチドの配列に関して、より典型的には10〜30ヌクレオチドの範囲内での配列に関して、いくつかの実施形態において少なくとも14〜25ヌクレオチドの配列に関して、標的核酸配列の相補体と少なくとも65%同一性を有し、いくつかの実施形態において、少なくとも75%同一性、少なくとも85%同一性、少なくとも90%同一性、または少なくとも95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一性を有する。ある特定の塩基(例えば、プライマーの3'塩基)は、一般的に、望ましくは、標的核酸配列の対応する塩基に完全に相補的であることを理解されたい。プライマーおよびプローブは、典型的には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にアニールする。
【００４４】
本明細書で用いられる場合、プライマーの一部、またはプライマー内のヌクレオチド配列に関して、「検出されるべきRNA分子」などの核酸に「特異的な」という用語は、適切なアニーリング条件下で標的核酸へ特異的にアニールすることができるプライマーまたはヌクレオチド配列を指す。
【００４５】
本教示による増幅は、核酸配列を直線的にかまたは指数関数的にかのいずれかで増幅するための幅広い技術を非限定的に含む、典型的には鋳型依存性様式で、少なくとも1つの標的核酸の少なくとも一部が再生される任意の手段を包含する。増幅工程を実施するための例証的手段には、リガーゼ連鎖反応(LCR)、リガーゼ検出反応(LDR)、ライゲーション、それに続いてのQ-レプリカーゼ増幅、PCR、プライマー伸長、鎖置換増幅(SDA)(strand displacement amplification)、超分岐鎖置換増幅(hyperbranched strand displacement amplification)、多置換増幅(MDA)(multiple displacement amplification)、核酸鎖に基づいた増幅(NASBA)(nucleic acid strand-based amplification)、2ステップ多重化増幅、ローリングサークル増幅(RCA)などが、それらの多重バージョンおよび組み合わせ、例えば、限定されるわけではないが、OLA/PCR、PCR/OLA、LDR/PCR、PCR/PCR/LDR、PCR/LDR、LCR/PCR、PCR/LCR(組み合わせ型連鎖反応  -  CCRとしても公知である)などを含めて、挙げられる。そのような技術の説明は、とりわけ、Ausbelら; PCR Primer: A Laboratory Manual、Diffenbach編、Cold Spring Harbor Press (1995); The Electronic Protocol Book、Chang Bioscience (2002); Msuihら、J. Clin. Micro. 34:501〜07頁(1996); The Nucleic Acid Protocols Handbook、R. Rapley編、Humana Press、Totowa、N.J. (2002); Abramsonら、Curr Opin Biotechnol. 1993年2月;4(l):41〜7頁、米国特許第6,027,998号;米国特許第6,605,451号、Baranyら、PCT公開第WO 97/31256号; Wenzら、PCT公開第WO 01/92579号; Dayら、Genomics、29(1): 152〜162頁(1995)、Ehrlichら、Science 252:1643〜50頁(1991); Innisら、PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications、Academic Press (1990); Favisら、Nature Biotechnology 18:561〜64頁(2000);ならびにRabenauら、Infection 28:97〜102頁(2000); Belgrader、Barany、およびLubin、Development of a Multiplex Ligation Detection Reaction DNA Typing Assay、Sixth International Symposium on Human Identification、1995(ワールドワイドウェブ: promega.com/geneticidproc/ussymp6proc/blegrad.html-で入手可能); LCR Kit Instruction Manual、カタログ#200520、参照#050002、Stratagene、2002; Barany、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 188〜93頁(1991); BiおよびSambrook、Nucl. Acids Res. 25:2924〜2951頁(1997); Zirviら、Nucl. Acid Res. 27:e40i〜viii (1999); Deanら、Proc Natl Acad Sci USA 99:5261〜66頁(2002); BaranyおよびGelfand、Gene 109: 1〜11頁(1991); Walkerら、Nucl. Acid Res. 20: 1691〜96頁(1992); Polstraら、BMC Inf. Dis. 2:18頁〜(2002); Lageら、Genome Res. 2003年2月;13(2):294〜307頁、ならびにLandegrenら、Science 241 : 1077〜80頁(1988)、Demidov, V.、Expert Rev Mol Diagn. 2002年11月;2(6):542〜8頁、Cookら、J Microbiol Methods. 2003年5月;53(2): 165〜74頁、Schweitzerら、Curr Opin Biotechnol. 2001年2月;12(l):21〜7頁、米国特許第5,830,711号、米国特許第6,027,889号、米国特許第5,686,243号、PCT公開第WO0056927A3号、ならびにPCT公開第WO9803673A1号に見出すことができる。
【００４６】
いくつかの実施形態において、増幅は、以下の逐次手順の少なくとも1サイクルを含む:少なくとも1つの標的核酸における相補的な、または実質的に相補的な配列と少なくとも1つのプライマーをアニールさせる工程;ポリメラーゼを用いて、鋳型依存性様式で少なくとも1つのヌクレオチド鎖を合成する工程;および新しく形成された核酸デュプレックスを変性して鎖を分離する工程。サイクルは繰り返される場合もあるし、繰り返されない場合もある。増幅は、温度サイクリング工程を含むことができ、または等温で実施することができる。
【００４７】
「多重増幅反応」は、2つの核酸が同時に増幅され、識別可能な標識を用いて検出される反応である。
【００４８】
用語「qPCR」は、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を指すために本明細書で用いられ、それはまた、「リアルタイムPCR」または「動態学的ポリメラーゼ連鎖反応」としても公知である;全ての用語は、リアルタイムシグナル検出を含むPCRを指す。
【００４９】
「試薬」は、広くには、分析物(例えば、分析されることになっている核酸)以外の、反応において用いられる任意の作用物質を指す。核酸増幅反応のための例証的な試薬には、緩衝液、金属イオン、ポリメラーゼ、逆転写酵素、プライマー、鋳型核酸、ヌクレオチド、標識、色素、ヌクレアーゼ、dNTPなどが挙げられるが、それらに限定されない。酵素反応のための試薬には、例えば、基質、補助因子、緩衝液、金属イオン、阻害剤、および活性化剤が挙げられる。
【００５０】
本明細書で用いられる場合、用語「標識」は、検出可能な、および/または定量化可能なシグナルを提供するために用いることができる任意の原子または分子を指す。特に、標識は、核酸またはタンパク質へ直接的に、または間接的に付着することができる。プローブに付着することができる適切な標識には、放射性同位元素、フルオロフォア、発色団、質量標識(mass labels)、高電子密度粒子、磁気粒子、スピン標識、化学発光を放出する分子、電気化学的活性分子、酵素、補助因子、および酵素基質が挙げられるが、それらに限定されない。
【００５１】
本明細書で用いられる場合、用語「色素」は、一般的に、300nm以上の波長での電磁放射線を吸収する任意の有機または無機分子を指す。
【００５２】
本明細書で用いられる場合、用語「蛍光色素」は、一般的に、ランプ、フォトダイオード、もしくはレーザー、または別の蛍光色素などの電磁放射線の供給源による照射での蛍光機構により、より長い波長の電磁放射線を放出する任意の色素を指す。
【００５３】
特定のRNA分子を増幅するための方法
本発明の一つの態様は、試料における特定のRNA分子、典型的には、ポリ(A)テールを有しないRNA分子を増幅するための方法を含む。方法は、試料におけるRNA分子にポリ(リボヌクレオチド)配列を付加する工程、および結果として生じたRNA分子を、ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列を含むリバースプライマーを用いて逆転写して、標的RNA分子が試料中に存在する場合には、少なくとも1つのcDNA分子を生じる工程を必要とする。cDNA分子は、そのcDNA分子を生成するために用いられたのと同じリバースプライマー、および検出されるべきRNA分子に特異的なフォワードプライマーを用いて、増幅および検出される。フォワードプライマーおよびリバースプライマーの少なくとも1つは、
(i)検出されるべきRNA分子に特異的な第1のヌクレオチド配列、および/またはポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列;
(ii)第1の配列の5'末端における第2のヌクレオチド配列;
(iii)第2の配列の5'末端における第3のヌクレオチド配列またはスペーサー;
(iv)第3の配列の5'末端における第4のヌクレオチド配列であって、二本鎖のデュプレックスを形成するように第2の配列に相補的である第4の配列;ならびに
(v)デュプレックスの鎖が分離した時、検出可能なシグナルを放出するための手段
を有するヘアピンプライマーを含み、
リバースプライマーがヘアピンプライマーである場合、ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列が、ヘアピンプライマーの第1のヌクレオチド配列内に存在する。いくつかの実施形態において、リバースプライマーは、ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列の3'末端において、検出されるべきRNA分子に特異的なヌクレオチド配列を追加として含む。
【００５４】
いくつかの実施形態において、方法は、少なくとも2個の特定のRNA分子に対応するcDNA分子が、検出されるべき1個のRNA分子にいずれも特異的である2つの異なるプライマー対を用いる多重増幅反応において増幅および検出される多重形式で実行される。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのプライマー対がヘアピンプライマーを含み、1つより多いプライマー対がヘアピンプライマーを含み、または反応における全てのプライマー対がヘアピンプライマーを含む。単一の多重反応における各ヘアピンプライマーは、一般的に、デュプレックスの鎖が分離した時、反応における他のもの全てから識別できる検出可能なシグナルを放出するための手段を含む。単一の多重反応において増幅および検出することができるcDNAの数は、一つには、1反応において互いに識別され得るシグナルの数に依存する。いくつかの実施形態において、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、または10個の特定のRNA分子に対応するcDNA分子は、単一の多重反応において増幅および検出される。
【００５５】
いくつかの実施形態において、方法は、多重反応において、非コードRNAと共に、1個または複数のmRNA分子を増幅および検出する工程を含む。mRNAは、ヘアピンプライマーを含むプライマー対を用いて増幅および検出することができるが、必ずしも必要ではない。例えば、mRNA分子は、非標識プライマーにより増幅され、標識されている、またはアッセイ中に標識されるようになるプローブを用いて検出され得る。いくつかの実施形態において、プローブは、mRNA分子に特異的である。いくつかの実施形態において、mRNA分子は、非標識プライマーを用いて増幅され、DNA結合性色素を用いて検出され得る。mRNA分子を増幅するための適切なプライマーには、標的特異的プライマー、1つのプライマーがオリゴ(dT)配列または縮重配列を含むプライマー対が挙げられる。
【００５６】
いくつかの実施形態において、ポリ(リボヌクレオチド)配列はポリ(A)配列を含み、ポリ(A)配列にアニールする配列は、オリゴ(dT)配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ(A)ポリメラーゼは、RNA分子をポリアデニル化するために用いられる。RNA分子をポリアデニル化および逆転写するための方法は周知であり、例えば、Sambrook, J.、Fritsch, E.F.、およびManiatis, T.、Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press、NY、1巻、2巻、3巻(1989)に記載されている。いくつかの実施形態において、標的RNA分子は、単一の反応混合物においてポリアデニル化および逆転写される。適切な手順は、この説明のために参照により本明細書に組み入れられている、2010年8月5日に公開されたPCT公開第WO2010/985966号に記載されている。簡単に述べれば、ポリ(A)ポリメラーゼ、逆転写酵素、フォワードプライマーおよびリバースプライマー、dNTP、ATP、ならびにRNA試料が、ポリアデニル化および逆転写を可能にする適切な条件下で、適切な緩衝液(例えば、ポリ(A)ポリメラーゼ緩衝液)中、一緒にインキュベートされ、標的RNA分子に対応するcDNA分子を生じる。実施例1参照。
【００５７】
いくつかの実施形態において、ポリ(リボヌクレオチド)配列はポリ(U)配列を含み、ポリ(U)配列にアニールする配列は、オリゴ(dA)配列を含む。ポリウリジニル化の能力がある酵素には、ウリジリルトランスフェラーゼまたはポリ(U)ポリメラーゼが挙げられる。これらの酵素およびそれらの活性は、RNA特異的リボヌクレオチジルトランスフェラーゼの説明のために参照により組み入れられている、MartinおよびKeller (2007)「RNA-specific ribonucleotidyl transferases」RNA 13:1834〜1849頁に記載されている。いくつかの実施形態において、ポリ(リボヌクレオチド)配列は、リガーゼを用いて付加される。
【００５８】
いくつかの実施形態において、cDNA分子の増幅および検出は、別個の反応混合物において、すなわち、ポリ(リボヌクレオチド)配列の付加および逆転写とは別に、実行することができる。いくつかの実施形態において、増幅および検出は、定量的リアルタイムPCRにより行われる。リアルタイムPCRを実施するための方法は周知である。いくつかの実施形態において、リアルタイムPCR反応は、ポリメラーゼ(例えば、Taqポリメラーゼ)、フォワードプライマーおよびリバースプライマー、dNTP、鋳型核酸、ならびに適切な緩衝液を含み、それらは、温度サイクリングに供されて、各プライマー対に対して単位複製配列を産生する。リアルタイムPCRは、当技術分野において入手可能な任意のPCR装置を用いて実施することができる。本明細書に記載された方法において、ポリ(リボヌクレオチド)配列の付加/逆転写のために用いられるのと同じフォワードプライマーおよびリバースプライマーが増幅/検出に用いられる。そのプライマーのうちの1つは、プローブとしての役割も果たすヘアピンプライマーであるため(下記参照)、2つのオリゴヌクレオチドだけ(すなわち、フォワードプライマーとリバースプライマーであり、別個のプローブはなし)が、標的RNA分子が単一の反応において検出され得るのに必要とされる。典型的には、リアルタイムPCRデータ収集および解析に用いられる装置は、サーマルサイクラー、蛍光励起および発光収集のための光学器械、ならびに任意で、コンピュータおよびデータ取得解析ソフトウェアを含む。
【００５９】
いくつかの実施形態において、ポリ(リボヌクレオチド)配列の付加、逆転写、および増幅/検出は、単一の反応混合物において実行される。いくつかの実施形態において、単一の反応混合物は、ポリ(A)ポリメラーゼ、ならびに逆転写および増幅のための単一酵素、例えば、逆転写-PCR(RT-PCR)手順に用いることができる単一の熱安定性DNAポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態において、単一酵素は、Roche社から市販されている、HAWKZ05 FAST DNAポリメラーゼである。いくつかの実施形態において、単一の反応混合物は、逆転写および増幅のための単一の酵素、およびウリジリルトランスフェラーゼまたはポリ(U)ポリメラーゼなどのポリ(U)配列をRNA分子に付加する酵素を含む。
【００６０】
試料
核酸含有試料の調製物は、生物学的供給源から得ることができ、当技術分野において公知の通常の方法を用いて調製することができる。特に、本明細書に記載された方法において有用なRNAは、ヒトに加えて、単細胞生物、ならびに植物または非ヒト動物、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、霊長類、および他の非ヒト哺乳類などの高等生物を含む、任意の供給源から得ることができる。核酸は、様々な標準技術のいずれかにより、細胞、体液(例えば、血液、血液画分、尿など)、または組織試料から得ることができる。いくつかの実施形態において、方法は、血漿、血清、髄液、リンパ液、腹水、胸水、口腔液、および皮膚の外切片(external sections)の試料;気道、腸管、生殖管、および尿路からの試料;涙、唾液、血液細胞、幹細胞、または腫瘍の試料を用いる。試料は、生きている、もしくは死んだ生物体から、またはインビトロ培養物から得ることができる。例証的な試料には、単細胞、パラフィン包埋組織試料、および針生検を挙げることができる。
【００６１】
対象の核酸は、当技術分野において周知の方法を用いて単離することができ、供給源、核酸の性質、および類似した因子に応じて、特定の方法を選択する。試料核酸は純粋な形をとる必要はなく、典型的には、実施される本発明の方法の工程を可能にするのに十分、純粋である。
【００６２】
標的RNA分子
ポリアデニル化および増幅することができる任意の標的RNA分子は、本明細書に記載された方法を用いて検出することができる。いくつかの実施形態において、標的RNA分子についての少なくともいくつかのヌクレオチド配列情報が公知であろう。例えば、増幅のために少なくとも適切なフォワードプライマーの設計を可能にするのに十分な配列情報が、一般的には、所定の標的RNA分子について入手できる。いくつかの実施形態において、標的RNA分子の3'末端における十分な配列が公知であり、この公知の配列へ部分的にアニールし、かつ方法の第1の工程において生じたポリ(A)テールへ部分的にアニールするプライマーの設計を可能にする。いくつかの実施形態において、標的には、過剰発現または過小発現が疾患を示しているRNA、組織特異的もしくは発生特異的様式で発現するRNA、または特定の刺激により誘導されるRNAを挙げることができる。
【００６３】
いくつかの実施形態において、少なくとも1個の標的RNA分子は、非コードRNAである。いくつかの実施形態において、適切な非コードRNA標的には、snRNA、snoRNA、stRNA、agRNA、miRNA、siRNA、piRNA、および長鎖ncRNAが挙げられる。いくつかの実施形態において、標的RNA分子には、科学文献およびmiRBaseデータベースリリース19 (microrna.sanger.ac.uk/)などの公開データベースから公知のマイクロRNAなど、そこに開示された全ての成熟miRNAおよび未熟miRNA配列を含め、任意の公知の、または未発見のマイクロRNAが挙げられる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載された方法において検出および定量化することができるマイクロRNA標的には、乳癌において調節が解除されている、以下の表に示されたものが挙げられる。
【００６４】
【表Ａ】
2015530113.tif 000003
【００６５】
実施例1において、2つの標的miRNA分子、miR31およびCTL23が多重アッセイにおいて検出されている。
【００６６】
フォワードプライマー
いくつかの実施形態において、フォワードプライマーは、ヘアピンプライマーではなく、10〜30もしくは12〜25、または13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、もしくは25ヌクレオチドなどの10ヌクレオチドから100ヌクレオチドまでの範囲内での長さを有する。いくつかの実施形態において、フォワードプライマーの長さは、これらの値のいずれかによって境界される範囲内、例えば、20〜23ヌクレオチドの範囲内に入る。本明細書に記載された方法に用いられるのに適した非ヘアピンフォワードプライマーを設計するための検討事項は、この説明のために参照により本明細書に組み入れられている、PCT公開第WO2010/085966号に示されている。
【００６７】
リバースプライマー
いくつかの実施形態において、方法に用いられるリバースプライマーは、ヘアピンプライマーではなく、15〜50もしくは20〜45、または21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、もしくは44ヌクレオチドの範囲内での長さなどの10ヌクレオチドから100ヌクレオチドまでの範囲内での長さを有する。いくつかの実施形態において、リバースプライマーの長さは、これらの値のいずれかによって境界される範囲内、例えば、30〜45ヌクレオチドの範囲内に入る。本明細書に記載された方法に用いられるのに適した非ヘアピンリバースプライマーを設計するための検討事項は、この説明のために参照により本明細書に組み入れられている、PCT公開第WO2010/085966号に示されている(「伸長プライマー」の説明を参照)。
【００６８】
ヘアピンプライマー
上記の方法において、特定のRNA分子を検出するためのプライマー対におけるプライマーのうちの少なくとも1つは、ヘアピンプライマーである。ヘアピンプライマーは、エネルギー供与体部分とエネルギー受容体部分との間のMETの原理を利用する。いくつかの実施形態において、METは、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)であり、プライマーが供与体部分および受容体部分で標識されており、供与体部分によって放出される蛍光エネルギーが受容体部分によって吸収されるように、供与体部分がフルオロフォアであり、受容体部分がフルオロフォアであってもよい。いくつかの実施形態において、受容体部分は、供与体から吸収されたエネルギーを異なる波長で放出するフルオロフォアであり;その後、受容体の発光は、増幅反応の進行を評価するために測定されてもよい。いくつかの実施形態において、ヘアピンプライマーは、供与体-クエンチャーFRETペアで標識される。いくつかの実施形態において、ヘアピンプライマーは、受容体部分が、供与体の蛍光をクエンチするように構成される。プライマーが増幅産物の中へ取り込まれる場合、それの立体配置は変化し、クエンチングは排除され(すなわち、プライマーは直線化され)、供与体部分の蛍光が検出され得る。
【００６９】
ヘアピンプライマーは任意の適切なサイズであり得、いくつかの実施形態において、20〜100もしくは30〜80もしくは35〜60、または36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、もしくは59ヌクレオチドの範囲内である。いくつかの実施形態において、ヘアピンプライマーの長さは、これらの値のいずれかによって境界される範囲内、例えば、45〜55ヌクレオチドの範囲内に入る。本明細書に記載された方法に用いられるのに適したヘアピンリバースプライマーを設計するための検討事項は、米国特許第5,866,336号(1999年2月2日発行)に示されている。
【００７０】
いくつかの実施形態において、ヘアピンプライマーは、以下の連続した配列を含み、または代わりに、それらからなる:(a)前記プライマーの3'末端における、前記標的配列を含む核酸鎖に相補的なヌクレオチド配列の核酸ポリメラーゼによる合成をプライムすることができるように1つまたは複数の標的配列に十分相補的な配列を3'末端に含む8〜40ヌクレオチドの第1の一本鎖ヌクレオチド配列;(b)第1の配列の5'末端における、6〜30ヌクレオチドの第2のヌクレオチド配列であって、前記第1のヌクレオチド配列内のヌクレオチドが、分子エネルギー移動対の供与体部分および受容体部分からなる群から選択される第1の部分で標識されており、供与体部分が、励起された時、1つまたは複数の特定の波長のエネルギーを放出し、かつ受容体部分が、供与体部分によって放出された1つまたは複数の特定の波長でのエネルギーを吸収する、第2のヌクレオチド配列;(c)前記第2の配列の5'末端における、3〜20ヌクレオチドの第3の一本鎖ヌクレオチド配列;(d)第3の配列の5'末端における、6〜30ヌクレオチドの第4のヌクレオチド配列であって、前記第4のヌクレオチド配列内のヌクレオチドが、前記供与体部分および前記受容体部分からなる群から選択される第2の部分で標識されており、前記第2の部分が、前記第1のヌクレオチド配列を標識していない前記群のメンバーであり、前記第4のヌクレオチド配列が、デュプレックスが前記第4のヌクレオチド配列と前記第2のヌクレオチド配列との間で形成するように、前記第2のヌクレオチド配列に逆の順番で十分相補的であり、その結果、前記第1の部分と第2の部分が十分近接し、その結果、供与体部分が励起されてエネルギーを放出した時、受容体部分が、供与体部分によって放出されたエネルギーを吸収し、前記デュプレックスが形成されない場合、前記第1の部分と前記第2の部分が、前記第1の部分と第2の部分との間での分子エネルギー移動を妨げる距離で隔てられる、第4のヌクレオチド配列。ヌクレオチド配列の代わりに非ヌクレオチドスペーサーが用いられる実施形態において、スペーサーは、第2のヌクレオチド配列と第3のヌクレオチド配列との間に3〜20ヌクレオチドと等価のスペーシングを提供し、かつヘアピンプライマーが、本明細書に記載されているように機能することを可能に
する任意の連結部分または1連の連結部分であり得る。適切なスペーサーは、当業者に公知である。例えば、Glen Research社は、本明細書に記載されたヘアピンプライマーにおいてスペーサーとして用いることができる、9-O-ジメトキシトリチル-トリエチレングリコール、l-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホルアミダイト(C36H49N2O7P)を販売している。
【００７１】
本明細書に記載された方法においてヘアピンプライマーがフォワードプライマーとして用いられる場合、1つまたは複数の標的配列に十分相補的である第1のヌクレオチド配列の部分は、検出されるべきRNA分子に特異的な配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載された方法においてヘアピンプライマーがリバースプライマーとして用いられる場合、1つまたは複数の標的配列に十分相補的である第1のヌクレオチド配列の部分は、検出されるべきRNA分子に特異的な配列を含む。いくつかの実施形態において、方法においてヘアピンプライマーがリバースプライマーとして用いられる場合、1つまたは複数の標的配列に十分相補的である第1のヌクレオチド配列の部分は、ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列(例えば、オリゴ(dT)配列またはオリゴ(dA)配列)を含む。いくつかの実施形態において、ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列は、長さが7〜20、または7〜15、または8、9、10、11、12、13、もしくは14ヌクレオチドの範囲である(または、これらの値のいずれかによって境界される範囲内の長さを有する)。いくつかの実施形態において、本明細書に記載された方法においてヘアピンプライマーがリバースプライマーとして用いられる場合、ヘアピンプライマーは、ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列、およびこの配列の3'末端において(すなわち、プライマーの3'末端において)、検出されるべきRNA分子に特異的な配列を含む。いくつかの実施形態において、この標的特異的配列は、長さが、2〜10、または3、4、5、6、7、8、もしくは9ヌクレオチドの範囲である(またはこれらの値のいずれかによって境界される範囲内の長さを有する)。
【００７２】
供与体部分および受容体部分は、ヘアピンステム(デュプレックス領域)のいずれかの末端ヌクレオチド上に位置することができ、または内部に位置することができる。いくつかの実施形態において、供与体部分および受容体部分は、ステムの相補鎖に付着しており、一方の部分が5'末端に、他方の部分が相補鎖上で5bp離れて付着している。例えば、2つの部分は、ステムの2つの相補鎖によって形成される二重ヘリックスの5bp(180度)ターンによって相殺することができ、したがって、立体的に最も近接し、供与体の放出が受容体へ移動されるだろう(および、例えば、受容体によってクエンチされるだろう)。いくつかの実施形態において、2つの部分は、ヘアピンが閉じられた立体配置にある場合、1ヌクレオチド(3.4オングストローム)未満の距離だけ隔てられたステムの相補鎖上にあることができる。いくつかの実施形態において、2つの部分は、ヘアピンが閉じられた立体配置にある場合、ステムの相補ヌクレオチド上に、互いに正反対にある。
【００７３】
ヘアピンプライマーが直線化された場合、供与体部分は、METを実質的に妨げるのに十分長い介在配列によって受容体(例えば、クエンチャー)部分から隔てられなければならない。供与体フルオロフォアおよび受容体フルオロフォアからなるFRET対が用いられる場合、2つのFRET部分は、(a)第1のステム配列の少なくとも一部、(b)ループ、および(c)第2のステム配列の少なくとも一部を含む介在配列によって隔てられる。いくつかの実施形態において、介在配列は、長さが15〜25ヌクレオチドであり、いくつかの実施形態において、長さが20ヌクレオチドである。
【００７４】
いくつかの実施形態において、受容体部分は、供与体によって提供されたエネルギーを異なる波長で再放出するフルオロフォアである;すなわち、プライマーが閉じられた状態にある場合、受容体からの放出は検出されるだろうが、供与体からの放出は検出されないだろう。いくつかの実施形態において、受容体部分はクエンチャーであり、供与体によって放出されたエネルギーを、蛍光を発することなく吸収する。いずれの場合においても、供与体の蛍光は、プライマーが直線化された開口状態にある、すなわち、二本鎖増幅産物の中へ取り込まれた場合のみ、検出され得る。この状態におけるエネルギー移動は、最小であり、供与体からの強い放出シグナルが検出されるだろう。
【００７５】
プライマーは、当技術分野において公知の標準方法により、例えば、自動DNAシンセサイザー(例えば、Biosearch社、Applied Biosystems社などから市販されているもの)の使用により、合成されてもよい。例として、ホスホロチオエートプライマーは、Steinら(1988、Nucl. Acids Res. 16:3209頁)の方法により合成されてもよく、メチルホスホネートプライマーは、多孔性ガラスポリマー支持体の使用により調製することができる(Sarinら、1988、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 :7448〜7451頁)など。
【００７６】
プライマーは、化学合成中に供与体部分および受容体部分で標識されてもよく、または標識を、当技術分野において公知の方法により、合成後に付着されてもよい。いくつかの実施形態において、供与体部分はフルオロフォアである。いくつかの実施形態において、供与体部分および受容体部分の両方がフルオロフォアである。
【００７７】
当業者は、分光光度法の技術分野公知の技術を用いて、どのフルオロフォアが、適切な供与体-受容体FRET対にさせるかを容易に決定することができる。例えば、FAM(520nmの発光極大を有する)は、FRET対においてTAMRA、ROX、およびR6G(全て、514nmの発光極大を有する)についての適切な供与体である。プライマーは、好ましくは、合成中に修飾され、Juら(1995、Proc. Natl. Acad. Sci., USA 92:4347〜4351頁)によって記載されているように、修飾されたdT塩基がAmino-Modifier C6 dT (Glen Research)の使用により指定された位置へ導入され、修飾されたdT塩基上の第1級アミノ基が、取り込まれる。これらの修飾は、プライマーの指定された位置への蛍光色素のその後の取り込みに用いられてもよい。
【００７８】
例示的な自動化およびシステム
いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、自動試料ハンドリングおよび/または分析プラットフォームを用いて検出される。いくつかの実施形態において、市販の自動分析プラットフォームが利用される。例えば、いくつかの実施形態において、GeneXpert(登録商標)システム(Cepheid、Sunnyvale、CA)が利用される。
【００７９】
本明細書に記載された方法は、GeneXpertシステムと共に用いるために例証されている。例示的な試料調製および分析方法は、下に記載されている。しかしながら、本発明は、特定の検出方法または分析プラットフォームに限定されない。当業者は、プラットフォームおよび方法のいくつでも利用され得ることを認識している。
【００８０】
GeneXpert(登録商標)は、自己完結型の使い捨てカートリッジを利用する。試料抽出、増幅、および検出は全て、この自己完結型の「カートリッジ内実験室」内で行われてもよい(例えば、米国特許第5,958,349号、第6,403,037号、第6,440,725号、第6,783,736号、第6,818,185号参照;それぞれは、この説明のために全体として参照により本明細書に組み入れられている)。
【００８１】
カートリッジの構成要素には、試薬を含有する処理チャンバー、フィルター、ならびに標的核酸を抽出し、精製し、および増幅するのに有用な捕獲テクノロジーが挙げられるが、それらに限定されない。バルブは、チャンバーからチャンバーへの液体移動を可能にし、核酸溶解構成要素および濾過構成要素を含有する。光学ウィンドウはリアルタイムの光学的検出を可能にする。反応チューブは、非常に迅速な温度サイクリングを可能にする。
【００８２】
いくつかの実施形態において、GeneXpert(登録商標)システムは、拡張性のために複数のモジュールを含む。各モジュールは、試料ハンドリング構成要素および分析構成要素と共に複数のカートリッジを含む。
【００８３】
試料がカートリッジに加えられた後、試料は、溶解緩衝液に接触し、遊離した核酸は、シリカまたはガラス基質などの核酸結合性基質に結合する。その後、試料上清は除去され、核酸は、Tris/EDTA緩衝液などの溶出緩衝液中に溶出される。その後、溶出物は、カートリッジ内で処理され、本明細書に記載されているように標的遺伝子を検出されてもよい。いくつかの実施形態において、溶出物は、凍結乾燥粒子としてカートリッジ内に存在する試薬の少なくとも一部を再構成するために用いられる。
【００８４】
いくつかの実施形態において、PCRが、1個または複数のRNA分子の存在を増幅および検出するために用いられる。いくつかの実施形態において、PCRは、AptaTaq (Roche)などのホットスタート機能をもつTaqポリメラーゼを用いる。
【００８５】
いくつかの実施形態において、オフライン遠心分離が、細胞含有量が少ない試料に関してアッセイ結果を向上させるために用いられる。緩衝液が加えられた、または加えられていない試料が遠心分離され、上清が除去される。その後、ペレットは、より少ない体積の上清、緩衝液、または他の液体中に再懸濁される。その後、再懸濁されたペレットは、前に記載されているように、GeneXpert(登録商標)カートリッジへ加えられる。
【００８６】
キット
本発明はまた、本明細書に記載された方法を実行するためのキットを提供する。そのようなキットは、これらの方法のいずれかを実施するために有用な1つまたは複数の試薬を含む。キットは、一般的に、試薬を、1つもしくは複数の別個の組成物として、または任意で、試薬の適合性が許容される場合、混合物として保持する1つまたは複数の容器を含むパッケージを含む。キットはまた、試料処理、洗浄、またはアッセイの任意の他の工程を行うのに有用な緩衝液、希釈液、標準液、および/または任意の他の材料などのユーザーの観点から望ましい可能性がある他の材料も含むことができる。
【００８７】
キットは、好ましくは、本明細書に記載されたスクリーニング方法のうちの1つまたは複数を実行するための使用説明書を含む。本発明のキットに含まれる使用説明書は、包装材料に貼ることができ、またはパッケージ挿入物として含むことができる。使用説明書は、典型的には、文書または印刷物であるが、それらはそのようなものに限定されない。そのような使用説明書を記憶し、かつそれらをエンドユーザーへ伝達する能力がある任意の媒体が、本発明によって企図される。そのような媒体には、電子記憶媒体(例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ)、光学媒体(例えば、CD ROM)などが挙げられるが、それらに限定されない。本明細書で用いられる場合、用語「使用説明書」は、使用説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含むことができる。
【００８８】
いくつかの実施形態において、キットは以下を含む:(a)上記のようなフォワードプライマーおよびリバースプライマーであって、フォワードプライマーが、検出されるべきRNA分子に特異的であり、リバースプライマーがポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列を含み、上記のように、フォワードプライマーおよびリバースプライマーのうちの少なくとも1つがヘアピンプライマーを含む、フォワードプライマーおよびリバースプライマー;ならびに(b)ポリ(リボヌクレオチド)配列をRNA分子に付加する能力がある酵素。
【００８９】
いくつかの実施形態において、キットは、上記のようなフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、フォワードプライマーが、検出されるべきRNA分子に特異的であり、リバースプライマーがポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列を含み、上記のように、フォワードプライマーおよびリバースプライマーのうちの少なくとも1つがヘアピンプライマーを含み、キットが、前記1個または複数の特定のRNA分子に対応するcDNA分子を増幅および検出するための追加のプライマーまたはプローブを含まない。いくつかの実施形態において、このキットは、ポリ(リボヌクレオチド)配列をRNA分子に付加する能力がある酵素を含む。
【００９０】
これらのキットのいくつかの実施形態において、リバースプライマーは、ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列の3'末端において、検出されるべきRNA分子に特異的なヌクレオチド配列を追加として含む。
【００９１】
これらのキットのいくつかの実施形態において、ポリ(リボヌクレオチド)配列はポリ(A)配列であり、このポリ(A)配列にアニールする配列は、オリゴ(dT)配列を含む。いくつかの実施形態において、そのようなキットは、ポリ(A)配列をRNA分子に付加するためのポリ(A)ポリメラーゼを含む。
【００９２】
これらのキットのいくつかの実施形態において、ポリ(リボヌクレオチド)配列はポリ(U)配列であり、このポリ(U)配列にアニールする配列は、オリゴ(dA)配列を含む。いくつかの実施形態において、そのようなキットは、ポリ(U)配列をRNA分子に付加するためのウリジリルトランスフェラーゼまたはポリ(U)ポリメラーゼを含む。
【００９３】
いくつかの実施形態において、フォワードプライマーはヘアピンプライマーを含み、リバースプライマーはヘアピンプライマーを含まない。いくつかの実施形態において、リバースプライマーはヘアピンプライマーを含み、フォワードプライマーはヘアピンプライマーを含まない。
【００９４】
いくつかの実施形態において、キットは逆転写酵素を含む。いくつかの実施形態において、逆転写酵素は、ポリ(リボヌクレオチド)配列をRNA分子に付加する能力がある酵素と同じ容器で提供される。いくつかの実施形態において、キットはDNAポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態において、単一酵素が、逆転写酵素とDNAポリメラーゼとして働く。いくつかの実施形態において、キットは、ポリ(リボヌクレオチド)配列をRNA分子に付加する能力がある酵素を、単一酵素の形をとる逆転写酵素とDNAポリメラーゼと共に含む。いくつかの実施形態において、これらの2つの酵素は1つの容器で提供される。
【００９５】
多重方法に有用ないくつかの実施形態において、キットは、検出されるべき1個のRNA分子にいずれも特異的である少なくとも2つの異なるプライマー対を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのプライマー対がヘアピンプライマーを含み、1つより多いプライマー対がヘアピンプライマーを含み、または反応における全てのプライマー対がヘアピンプライマーを含む。いくつかの実施形態において、各ヘアピンプライマーは、デュプレックスの鎖が分離した時、反応における全ての他のものから識別できる、検出可能なシグナルを放出するための手段を含む。いくつかの実施形態において、キットは、検出されるべき1つのRNA分子にいずれも特異的である少なくとも3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、または10個の異なるプライマー対を含む。
【００９６】
いくつかの実施形態において、キットは、上記のように、非コードRNAを検出するための1つまたは複数のプライマー対を含む。いくつかの実施形態において、キットは、多重反応において、非コードRNAと共に、1個または複数のmRNA分子を増幅するための1つまたは複数のプライマー対を追加として含む。いくつかの実施形態において、1個または複数のmRNA分子を増幅するためのプライマー対は、ヘアピンプライマーを含む。いくつかの実施形態において、1個または複数のmRNA分子を増幅するためのプライマー対は、ヘアピンプライマーを含まない。ヘアピンプライマーがmRNA分子の検出に用いられない場合、キットは、mRNA分子を検出するための1つまたは複数のプローブを追加として含むことができる。いくつかの実施形態において、プローブはmRNA分子に特異的である。
【００９７】
本明細書に記載された実施例および実施形態は、例証することをのみ目的とすること、ならびにそれらを鑑みれば、様々な改変または変化が当業者に示唆されるだろうし、この出願の精神と視野、および添付された特許請求の範囲の範囲内に含まれるはずであることは、理解されている。
【００９８】
加えて、本明細書に引用された全ての他の刊行物、特許、および特許出願は、全ての目的のために全体として参照により本明細書に組み入れられている。
【実施例】
【００９９】
(実施例1)
多重miRNAアッセイ
多重miRNAアッセイを、リバースプライマーがヘアピンプライマーである2つのプライマー対を用いて、上記のように行った。各リバースプライマーは、オリゴ(dT)配列、およびオリゴ(dT)配列の3'側に5塩基の標的特異的配列を含む。標的は、miR31およびCTL23であった。用いられたプライマーはTable 1(表1)に示されている。
【０１００】
【表１】
2015530113.tif 000004
【０１０１】
ポリアデニル化および逆転写を以下のように行った:
【０１０２】
【表２】
2015530113.tif 000005
【０１０３】
定量的リアルタイムPCRを以下のように行った:
【０１０４】
【表３】
2015530113.tif 000006
【０１０５】
結果は図3および図4に示されている。これらのグラフにおいて、蛍光は、PCRサイクル数に対してプロットされている。図3は、標的の希釈系列に関して一重で行った定量的リアルタイムPCRマイクロRNAアッセイの結果を示す。図4A〜Bは、多重定量的リアルタイムPCRマイクロRNAアッセイの結果を示す。これらの結果は、miR31(A)およびCTL23(B)が多重で測定できることを実証している。
【図１】
2015530113.tif 000007
【図２】
2015530113.tif 000008
【図３】
2015530113.tif 000009
【図４Ａ】
2015530113.tif 000010
【図４Ｂ】
2015530113.tif 000011
【配列表】
2015530113000001.app
【国際調査報告】
2015530113.tif 000012
2015530113.tif 000013
2015530113.tif 000014
2015530113.tif 000015