(57)【要約】  本発明は、核酸増殖及び検出に関連する生物学的用途のためのＲＮアーゼＨ切断を用いるアッセイに対する改善を提供し、前記ＲＮアーゼＨは可逆的に不活性化されている。
2015510776.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）サンプルをポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシドトリホスフェート、緩衝液、可逆的に不活性であるＲＮアーゼＨ酵素、第１プライマーを含む反応混合物中で処理するステップ；
ｂ）温度を上昇させて、前記ＲＮアーゼＨ酵素を活性化するステップ；
ｃ）前記第１プライマーを適切な温度で標的ＲＮＡとハイブリダイズするステップ；
ｄ）二本鎖産物を前記ＲＮアーゼＨで処理して保護基を除去するステップ；
ｅ）前記第１プライマーを重合して、標的ＲＮＡに対して相補的なｃＤＮＡを形成するステップ；
を含むサンプル中の標的ＲＮＡ分子をコピーしてｃＤＮＡを産生させる方法であって、前記第１プライマーはその３’末端またはその近くでＲＮアーゼＨ酵素で除去され得る保護基で保護されており、前記第１プライマーはハイブリダイズし、二本鎖産物を形成するように標的ＲＮＡに対して相補的である前記方法。
【請求項２】
前記反応混合物は更にｃＤＮＡに対して相補的な第２プライマーを含み、前記方法は更に前記第２プライマーをｃＤＮＡに対してハイブリダイズし、前記第２プライマーを重合してｃＤＮＡに対して相補的な伸長産物を形成する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＲＮアーゼＨ酵素はＲＮアーゼＨ２酵素である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＲＮアーゼＨ２酵素はパイロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）ＲＮアーゼＨ２酵素である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリメラーゼはホットスタートポリメラーゼでない請求項１に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つの構造Ｉ：
【化１】
2015510776.tif 000019
（式中、Ｒ１及びＲ２は独立して低級アルキル、低級シクロアルキル、低級アルケニル、低級アリール、低級アリールアルキル、低級アルコキシ、アシルまたはカルボアルコキシ基からなる群から選択され、或いは一緒に低級炭素環または低級ヘテロ環を規定し、Ｒ１及びＲ２の各々は独立して場合によりハロゲン、アルコキシ、アミノ、アシル、カルボキシ、カルボアルコキシまたはカルバミルで置換されている）
の修飾リシン残基を含む修飾パイロコッカス・アビシＲＮアーゼＨ２タンパク質。
【請求項７】
Ｒ１及びＲ２の一方はＨであり、Ｒ１及びＲ２の他方はＣＨ３である請求項６に記載の修飾パイロコッカス・アビシＲＮアーゼＨ２タンパク質。
【請求項８】
Ｒ１及びＲ２の一方はＨであり、Ｒ１及びＲ２の他方はＣＨ２ＣＯ２Ｈである請求項６に記載の修飾パイロコッカス・アビシＲＮアーゼＨ２タンパク質。
【請求項９】
Ｒ１及びＲ２はＣＨ３である請求項６に記載の修飾パイロコッカス・アビシＲＮアーゼＨ２タンパク質。
【請求項１０】
Ｒ１及びＲ２は一緒にブタン−１，４−ジイルである請求項６に記載の修飾パイロコッカス・アビシＲＮアーゼＨ２タンパク質。
【請求項１１】
前記リシン残基は保存リシン残基である請求項６に記載の修飾パイロコッカス・アビシＲＮアーゼＨ２タンパク質。
【請求項１２】
約２５個のリシン残基が修飾されている請求項６に記載の修飾パイロコッカス・アビシＲＮアーゼＨ２タンパク質。
【請求項１３】
約２２〜約２８個のリシン残基が修飾されている請求項６に記載の修飾パイロコッカス・アビシＲＮアーゼＨ２タンパク質。
【請求項１４】
（ｔｅｍｐ）での活性が約（低温活性）未満である請求項６に記載の修飾パイロコッカス・アビシＲＮアーゼＨ２タンパク質。
【請求項１５】
少なくとも１つの構造Ｉ：
【化２】
2015510776.tif 000020
（式中、Ｒ１及びＲ２は独立して低級アルキル、低級シクロアルキル、低級アルケニル、低級アリール、低級アリールアルキル、低級アルコキシ、アシルまたはカルボアルコキシ基からなる群から選択され、或いは一緒に低級炭素環またはヘテロ環を規定し、Ｒ１及びＲ２の各々は独立して場合によりハロゲン、アルコキシ、アミノ、アシル、カルボキシ、カルボアルコキシまたはカルバミルで置換されている）
の修飾リシン残基を含む修飾パイロコッカス・アビシＲＮアーゼＨ２タンパク質；及び
少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡリガーゼ
を含むキット。
【請求項１６】
更に、ＲＮアーゼＨ２切断ドメインを含むオリゴヌクレオチドを含む請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
パイロコッカス・アビシＲＮアーゼＨ２タンパク質を式ＩＩ：
【化３】
2015510776.tif 000021
（式中、Ｒ１及びＲ２は独立して低級アルキル、低級シクロアルキル、低級アルケニル、低級アリール、低級アリールアルキル、低級アルコキシ、アシルまたはカルボアルコキシ基からなる群から選択され、或いは一緒に低級炭素環または低級ヘテロ環を規定し、Ｒ１及びＲ２の各々は独立して場合によりハロゲン、アルコキシ、アミノ、アシル、カルボキシ、カルボアルコキシまたはカルバミルで置換されている）
の化合物と接触させることを含むパイロコッカス・アビシＲＮアーゼＨ２タンパク質の修飾方法。
【請求項１８】
更に、前記パイロコッカス・アビシＲＮアーゼＨ２タンパク質の式ＩＩの化合物との接触を反復させることを含む請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記反復接触は少なくとも合計３回の接触を含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記反復接触は少なくとも合計５回の接触を含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記反復接触は少なくとも合計１０回の接触を含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
式ＩＩの化合物との接触は無水マレイン酸、無水シトラコン酸(ｃｉｔｒｉｃｏｎｙｌ)、無水シス−アコチニン酸及び無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸からなる群から選択される化合物との接触を含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも１つの構造Ｉ：
【化４】
2015510776.tif 000022
（式中、Ｒ１及びＲ２は独立して低級アルキル、低級シクロアルキル、低級アルケニル、低級アリール、低級アリールアルキル、低級アルコキシ、アシルまたはカルボアルコキシ基からなる群から選択され、或いは一緒に低級炭素環または低級ヘテロ環を規定し、Ｒ１及びＲ２の各々は独立して場合によりハロゲン、アルコキシ、アミノ、アシル、カルボキシ、カルボアルコキシまたはカルバミルで置換されている）
の修飾リシン残基を含む修飾パイロコッカス・アビシＲＮアーゼＨ２タンパク質を再活性化する方法であって、前記修飾パイロコッカス・アビシＲＮアーゼＨ２タンパク質を加熱することを含む前記方法。
【請求項２４】
前記加熱は少なくとも約９５℃の温度に加熱することを含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
オリゴヌクレオチドをＲＮアーゼＨ２切断ドメインで切断する方法であって、
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインを含むオリゴヌクレオチドを少なくとも１つの構造Ｉ：
【化５】
2015510776.tif 000023
（式中、Ｒ１及びＲ２は独立して低級アルキル、低級シクロアルキル、低級アルケニル、低級アリール、低級アリールアルキル、低級アルコキシ、アシルまたはカルボアルコキシ基からなる群から選択され、或いは一緒に低級炭素環または低級ヘテロ環を規定し、Ｒ１及びＲ２の各々は独立して場合によりハロゲン、アルコキシ、アミノ、アシル、カルボキシ、カルボアルコキシまたはカルバミルで置換されている）
の修飾リシン残基を含む修飾パイロコッカス・アビシＲＮアーゼＨ２タンパク質と修飾パイロコッカス・アビシＲＮアーゼＨ２タンパク質を再活性化させるのに十分な温度で接触させ、これにより前記オリゴヌクレオチドを切断することを含む方法。
【請求項２６】
前記方法はホットスタート法である請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記方法はシングルチューブ方法である請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記方法は核酸増殖アッセイ、核酸検出アッセイ、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）、プライマープローブアッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、多項式増殖方法、ＤＮＡ配列決定方法、またはプライマー伸長を含む方法の少なくとも１つにおけるステップである請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインを含むオリゴヌクレオチドの接触は、単一ＲＮＡ残基、または少なくとも１つの代替ヌクレオシドで置換されているＲＮＡ塩基を含むオリゴヌクレオチドの接触を含む請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
オリゴヌクレオチドの接触は二重鎖オリゴヌクレオチドの接触を含む請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
オリゴヌクレオチドの接触はＤＮＡ複製のためのプライマーの接触を含む請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
第１及び第２プライマーが判別プライマーであるＤＮＡ分子中の一塩基多型（ＳＮＰ）を判別する際に使用するための請求項２に記載の方法。
【請求項３３】
更に第３プライマーを含み、前記第３プライマーはその後の増殖反応に関与しないように修飾されている請求項２に記載の方法。
【請求項３４】
前記修飾は切断可能なリンケージを形成する請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記の切断可能なリンケージは化学的切断または制限酵素を受けやすい請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記修飾は保護基を含む請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記保護基は２’−修飾ＲＮＡ残基、脱塩基残基、非天然塩基、または非ヌクレオチドナフチル−アゾ修飾因子を含む請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮアーゼＨ）酵素を熱可逆的不活性化のために酸無水物で化学的に修飾する方法及び前記修飾酵素を用いる用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＤＮＡの単コピーまたは少数コピーを指数的に増幅させるユビキタスな方法である。この技術は３０年経っているが、その使用は増え続けており、現在配列決定、機能ゲノム学、診断、法医学及び遺伝子発現の方法に組み込まれている。
【０００３】
現在多数のＰＣＲの変法が存在しており、多くは幾つかの基本的ステップ：相補的塩基間の水素結合を切断するために高温で変性して、一本鎖標的ＤＮＡを形成するステップ；低温でプライマーをアニールするステップ；及び６０℃以上で最適活性を有する耐熱性ポリメラーゼ酵素を用いてプライマーを伸長させるステップ；を共有しており、これにより標的ＤＮＡを増幅させている。ＰＣＲは完璧なシステムでなく、典型的には耐熱性酵素がなお僅かな活性を有している低温で非特異的増幅が起こる。この欠点によりＰＣＲの多くの用途が妨げられており、非特異的増殖を減少または解消するために「ホットスタートＰＣＲ」方法が考案された。
【０００４】
「ホットスタートＰＣＲ」は、反応物を高温、通常９５℃またはその前後に加熱し、プライマーアニーリング温度、通常６０℃またはその前後に冷却するまでポリメラーゼ連鎖反応の開始を防止する方法の使用を指す。最初のホットスタートＰＣＲ方法は、反応成分間の物理的バリアを除去すべく加熱することにより壊され得る物理的バリアを使用した。このアプローチの初期実施形態の１つでは、核酸（標的ＤＮＡ、プライマー、デオキシヌクレオチド及び緩衝液）をワックスシールによりＤＮＡポリメラーゼから分離する。反応物を９５℃に加熱するとワックスが溶融してＤＮＡポリメラーゼと他の反応成分が混合し得、プライマー結合を生じさせるために反応物を十分に冷却したらＰＣＲが開始する。現在、ホットスタートＰＣＲは通常、加熱により逆転され得るＤＮＡポリメラーゼを幾つかの方法により不活性化する均質な反応ミックスを用いて実施することを含む。例には、化学的修飾（例えば、本発明においてＲＮアーゼＨ２を可逆的に不活性化するために使用されている無水物修飾スキーム）、ＤＮＡポリメラーゼに結合する抗体、またはＤＮＡポリメラーゼに結合するアプタマーが含まれる。いずれの場合も、ＤＮＡポリメラーゼ活性を制限する物質を加熱により変性または分解させる。
【０００５】
可逆的に不活性化されるホットスタートＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、典型的には修飾されていない天然Ｔａｑ  ポリメラーゼに比して５〜１０倍高価である。コストが高いにも関わらず、ホットスタートＰＣＲは現在ＰＣＲ用途においてほぼ独占的に使用されている。ホットスタート法を用いると、ＰＣＲの結果が２つの方向で改善される：
１）向上した特異性。ホットスタート法がない場合、プライマーは低温で不完全な配列マッチを有する複雑な核酸サンプル中の部位に結合し、ＤＮＡ合成を開始し得、こうすると望ましくない産物が増殖され得る。ホットスタート法はこのタイプのミスプライミングを抑制または防止し得る。
２）ＰＣＲサイクリングが始まる前に反応物を室温で不活性に維持できる。高スループットスクリーニング方法の場合、後にロボットラボ機器によりＰＣＲサーモサイクラーに充填するために室温で保持されている多数のＰＣＲプレート（数千の個々の反応物を含む）をセットアップすることが一般的である。ホットスタート法がない場合、いったん最終的にＰＣＲが開始すると試薬を消費し、ＰＣＲの品質を低下させるＤＮＡポリメラーゼ及びプライマーに依存する副反応が生ずる。
【０００６】
低温で本質的に不活性であり、よって望ましくない非特異的増殖を制限する他の酵素を利用するＰＣＲの変法が開発されている。Ｗａｌｄｅｒら（米国特許出願２００９／０３２５１６９）に記載されている１つの例は、３’末端またはその近くに保護基を含有しているプライマーを使用している。このプライマーは、保護基が低温では全くまたは殆ど活性を持たないＲＮアーゼＨ酵素により切断されるまで伸長し得ない。
【０００７】
ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖の一部のときＲＮＡ鎖中のホスホジエステル結合を切断するエンドリボヌクレアーゼである。この酵素はＤＮＡまたはハイブリダイズされていない一本鎖ＲＮＡを切断しない。この特徴により、所望の相補的ＤＮＡが逆転写により合成されたらＲＮＡ鋳型を分解するｃＤＮＡ合成のような生物学的用途においてＲＮアーゼＨが有用となる。
【０００８】
無水物修飾は、最も一般的にはテルムス・アクウァーティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）由来の一般的なＤＮＡポリメラーゼのような耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに適用するときに熱可逆的不活性化のためにタンパク質を修飾するために広く使用されている（Ｂｉｒｃｈら，米国特許Ｎｏ．５，７７３，２５８を参照されたい）。これらの無水物は、式１
【０００９】
【化１】
2015510776.tif 000003
（式中、Ｒ１及びＲ２は水素、または置換もしくは未置換のアルキルまたはアリール基であり、或いはＲ１及びＲ２は環状基を形成する）
に示す一般構造を有している。
【００１０】
好ましい無水物の例には、無水シトラコン酸及び無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸が含まれるが、これらに限定されない。これらの試薬をＲＮアーゼＨ２タンパク質と反応させると、可逆的不活性化が生じた。無水物はリシンの末端アミン及びタンパク質のＮ末端を修飾して、電荷を変化させ、多分タンパク質のコンホメーションに影響を与える（図１）。使用する無水物の種類に応じて除去カイネテックスが異なるが（Ｗａｌｄｅｒら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１９７７，１３（３）：４０７−４１４を参照されたい）、これらのタンパク質修飾が高温及び低ｐＨに対して高感受性であることは公知である（Ｄｉｘｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｈａｍ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ，１９６８，１０９（２）：３１２−３１４を参照されたい）。
【００１１】
本発明は、核酸増殖及び検出に関連する生物学的用途のためにＲＮアーゼＨ切断を使用するアッセイに対して改善をも与え、前記ＲＮアーゼＨは可逆的に不活性化されている。本発明のこれらの作用効果及び他の作用効果、並びに追加の本発明の特徴は本明細書中に与えられている本発明の記載から明らかであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００９／０３２５１６９号明細書
【特許文献２】米国特許第５，７７３，２５８号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｄｉｘｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｈａｍ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ，１９６８，１０９（２）：３１２−３１４
【非特許文献２】Ｗａｌｄｅｒら，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１９７７，１３（３）：４０７−４１４
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、核酸増殖及び検出に関連する生物学的用途のためにＲＮアーゼＨ切断を使用するアッセイに対して改善をも与え、前記ＲＮアーゼＨは可逆的に不活性化される。
【００１５】
ＲＮアーゼＨ、特に好熱性ＲＮアーゼＨ酵素の使用は多数の他の生物学的アッセイ（全文を参照により本明細書に組み入れるＷａｌｄｅｒら，米国特許出願番号２００９／０３２５１６９を参照されたい）にも敷衍される。好熱性ＲＮアーゼＨ酵素は核酸増殖及び検出アッセイでのホットスタートプロトコルを可能にし、前記アッセイにはホットスタート成分が反応において使用される高温で活性を獲得する耐熱性ＲＮアーゼＨまたは他のニッキング酵素であるＰＣＲ、ＯＬＡ（オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ）、ＬＣＲ（ライゲーション連鎖反応）、多項式増殖及びＤＮＡシーケンシングが含まれるが、これらに限定されない。前記アッセイは、相補的核酸配列に対してハイブリダイズし、機能性５’または３’末端を生ずるように切断されるまで反応に関与できない本発明の修飾オリゴヌクレオチドを使用している。標準の無修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用する対応のアッセイと比較して、特異性が大きく高まる。更に、可逆的に不活性化されるＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡリガーゼに対する要件が取り除かれる。
【００１６】
ホットスタートＲＮアーゼＨの幾つかの代替物が存在している：１）バイロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｉｉ）ＲＮアーゼＨ２の場合のように低温で本質的に全くまたは殆ど活性を有していない耐熱性ＲＮアーゼＨ酵素；２）化学的修飾により可逆的に不活性化される耐熱性ＲＮアーゼＨ；及び３）遮断抗体により可逆的に不活性化される耐熱性ＲＮアーゼＨ。加えて、ランダム変異誘発のような当業界で公知の手段により、本発明のアッセイにおいて望ましいＲＮアーゼＨの形質を更に改善し得るＲＮアーゼＨの突然変異バージョンが合成され得る。或いは、本発明にとって望ましい特性を有している他の酵素の突然変異株を使用し得る。本発明の方法は主に第２の選択に向けられている。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】タンパク質修飾のために有用な各種無水物化合物の構造を含む。無水シス−アコチニン酸、無水シトラコン酸及び無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸の化学構造を示す。
【図２】リシン残基の無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸との反応及び加熱処理による前記無水物の除去のスキームを示す。リシン残基に対して無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸をカップリングして、修飾酵素の不活性化をもたらす反応スキームを示す（上部）。この構造を加熱または低ｐＨで処理すると（下部）、反応が逆転し、この時点で無修飾の酵素は再活性化される。
【図３】ＲＮアーゼＨ２活性についてのＦＱレポーターオリゴヌクレオチドアッセイを示す。ＲＮアーゼＨ２活性についての蛍光クエンチしたヘアピンプローブアッセイを示す。ＤＮＡ塩基は大文字であり、ＲＮＡ塩基は小文字であり、ＦＡＭは６−カルボキシフルオレセインであり、ＦＱはアイオワブラック（登録商標）ＦＱダーククエンチャーである。インタクト状態では、プローブはＦＡＭレポーター染料がアイオワブラックダーククエンチャーと整列しているヘアピンを形成する。この配置で、プローブは「ダーク」である。プローブのＲＮアーゼＨ２による切断はリボ−Ｃ残基の５’側で起こる。高い反応温度で、切断断片が解離して、レポーター染料がクエンチャーから分離する。この状態では、プローブは「プライト」であり、ポジティブシグナルは５２０ｎｍ  ＦＡＭ励起で検出される。
【図４】２．６ｍＵ  酵素を用いる無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸修飾Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２の不活性化及び加熱再活性化のアッセイを示す。無修飾及び無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸修飾Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２の相対活性をＦＱレポーターオリゴヌクレオチドアッセイを用いて特性評価した。アッセイは６０℃で０．９ｎＭ  酵素（無修飾酵素の場合２．６ｍＵ）を用いて１０μＬの反応物中で行った。蛍光測定値を１０分間のインキュベーション中１１秒毎に集めた。酵素を反応物に直接（上部パネル）か、または無水物修飾を逆転させ、酵素活性を再活性化するために９５℃で１０分間インキュベートした後（下部パネル）添加する。ＲＦＵは相対蛍光単位である。
【図５】２００ｍＵ  酵素を用いる無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸修飾Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２の不活性化及び加熱再活性化のアッセイを示す。無修飾及び無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸修飾Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２の相対活性をＦＱレポーターオリゴヌクレオチドアッセイを用いて特性評価した。アッセイは６０℃で６７ｎＭ  酵素（無修飾酵素の場合２００ｍＵ）を用いて１０μＬの反応物中で行った。蛍光測定値を１０分間のインキュベーション中１１秒毎に集めた。酵素を反応物に直接（上部パネル）か、または無水物修飾を逆転させ、酵素活性を再活性化するために９５℃で１０分間インキュベートした後（下部パネル）添加する。ＲＦＵは相対蛍光単位である。
【図６】２．６ｍＵ  酵素を用いる無水シス−アコチニン酸修飾Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２の不活性化及び加熱再活性化のアッセイを示す。無修飾及び無水シス−アコチニン酸修飾Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２の相対活性をＦＱレポーターオリゴヌクレオチドアッセイを用いて特性評価した。アッセイは６０℃で０．９ｎＭ  酵素（無修飾酵素の場合２．６ｍＵ）を用いて１０μＬの反応物中で行った。蛍光測定値を１０分間のインキュベーション中１１秒毎に集めた。酵素を反応物に直接（上部パネル）か、または無水物修飾を逆転させ、酵素活性を再活性化するために９５℃で１０分間インキュベートした後（下部パネル）添加する。ＲＦＵは相対蛍光単位である。
【図７】２００ｍＵ  酵素を用いる無水シス−アコチニン酸修飾Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２の不活性化及び加熱再活性化のアッセイを示す。無修飾及び無水シス−アコチニン酸修飾Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２の相対活性をＦＱレポーターオリゴヌクレオチドアッセイを用いて特性評価した。アッセイは６０℃で６７ｎＭ  酵素（無修飾酵素の場合２００ｍＵ）を用いて１０μＬの反応物中で行った。蛍光測定値を１０分間のインキュベーション中１１秒毎に集めた。酵素を反応物に直接（上部パネル）か、または無水物修飾を逆転させ、酵素活性を再活性化するために９５℃で１０分間インキュベートした後（下部パネル）添加する。ＲＦＵは相対蛍光単位である。
【図８】２．６ｍＵ  酵素を用いる無水シス−アコチニン酸修飾Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２の不活性化及び加熱再活性化のアッセイを示す。無修飾及び無水シス−アコチニン酸修飾Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２の相対活性をＦＱレポーターオリゴヌクレオチドアッセイを用いて特性評価した。アッセイは６０℃で０．９ｎＭ  酵素（無修飾酵素の場合２．６ｍＵ）を用いて１０μＬの反応物中で行った。蛍光測定値を１０分間のインキュベーション中１１秒毎に集めた。酵素を反応物に直接（上部パネル）か、または無水物修飾を逆転させ、酵素活性を再活性化するために９５℃で１０分間インキュベートした後（下部パネル）添加する。ＲＦＵは相対蛍光単位である。
【図９】２００ｍＵ  酵素を用いる無水シトラコン酸修飾Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２の不活性化及び加熱再活性化のアッセイを示す。無修飾及び無水シトラコン酸修飾Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２の相対活性をＦＱレポーターオリゴヌクレオチドアッセイを用いて特性評価した。アッセイは６０℃で６７ｎＭ  酵素（無修飾酵素の場合２００ｍＵｍＵ）を用いて１０μＬの反応物中で行った。蛍光測定値を１０分間のインキュベーション中１１秒毎に集めた。酵素を反応物に直接（上部パネル）か、または無水物修飾を逆転させ、酵素活性を再活性化するために９５℃で１０分間インキュベートした後（下部パネル）添加する。ＲＦＵは相対蛍光単位である。
【図１０】無修飾組換えパイロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）ＲＮアーゼＨ２のＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示す。Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２をエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）により試験した。デコンボリューショントレースのスペクトルの質量を示し、主要ピークの分子量（ダルトン）を示す。
【図１１】無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸で修飾した組換えパイロコッカス・アビシＲＮアーゼＨ２のＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示す。Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２を合計で３倍モル過剰の無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸と反応させ、修飾タンパク質をエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）により試験した。質量スペクトルのデコンボリューショントレースを示し、主要ピークの分子量（ダルトン）を示す。
【図１２】無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸で修飾した後、加熱処理した組換えパイロコッカス・アビシＲＮアーゼＨ２のＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示す。Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２を合計で３倍モル過剰の無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸と反応させ、修飾タンパク質を９５℃で１０分間加熱して、修飾反応を逆転させた。最終産物をエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）により試験した。質量スペクトルのデコンボリューショントレースを示し、主要ピークの分子量（ダルトン）を示す。
【図１３】ホットスタートＤＮＡポリメラーゼを用いて室温で一晩インキュベートした後に行ったｑＰＣＲの増殖プロットを示す。増殖反応をホットスタートＤＮＡポリメラーゼ（ｉＴａｑ）を用いて実施した。全ての反応成分を一緒に混合し、反応プレートを室温で一晩インキュベートした。無修飾プライマー（左パネル）を使用すると、効率的な増殖反応が生じ、天然Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２（左上）と無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸修飾ホットスタートＰ．ａ．ＲＮアーゼＨ２（左下）の添加の間に差は見られなかった。保護されている切断可能なプライマー（右パネル）を使用すると、効率的な増殖反応が生じ、天然Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２（右上）と無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸修飾ホットスタートＰ．ａ．ＲＮアーゼＨ２（右下）の添加の間に差は見られなかった。
【図１４】天然（非ホットスタート）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて室温で一晩インキュベートした後に行ったｑＰＣＲの増殖プロットを示す。増殖反応を天然Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（非ホットスタート）を用いて実施した。全ての反応成分を一緒に混合し、反応プレートを室温で一晩インキュベートした。無修飾プライマー（左パネル）を使用すると、標的核酸配列の検出可能な増殖は生じなかった；反応を天然Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２（左上）と無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸修飾ホットスタートＰ．ａ．ＲＮアーゼＨ２を用いて行った（左下）。保護されている切断可能なプライマー（右パネル）を使用すると、無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸修飾ホットスタートＰ．ａ．ＲＮアーゼＨを使用したときには標的核酸の効率的な増殖が生じた（右下）が、天然Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２を使用したときには増殖は生じなかった（右上）。
【図１５】無修飾プライマー及び天然Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２を用いる高温ＲＴを用いてヒトＳＦＲＳ９遺伝子を検出するＲＴ−ｑＰＣＲの増殖プロットを示す。反応を無修飾順方向及び逆方向ＰＣＲプライマーを用いるシングルチューブフォーマットでＨａｗｋＺ０５（商標）ファストワンステップＲＴ−ＰＣＲマスターミックスを用いて実施した。逆方向ＰＣＲプライマーはＲＴプライマーとしても機能する。逆転写（ＲＴ）反応を２０ｎｇのヒーラ細胞ＲＮＡを用いて行い、５５℃で５分間、６０℃で５分間及び６５℃で５分間のインキュベーションを段階的に進めた後、９５℃で１０分間の変性ステップ、その後ＰＣＲの４５サイクルを実施した。反応をＲＮアーゼＨ２なしで、または指示したように２．６ｍＵ、２５ｍＵまたは２００ｍＵの天然Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２を用いて行った。
【図１６】無修飾プライマー及び無水物修飾ＨＳ−Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２を用いる高温ＲＴを用いてヒトＳＦＲＳ９遺伝子を検出するＲＴ−ｑＰＣＲの増殖プロットを示す。反応を無修飾順方向及び逆方向ＰＣＲプライマーを用いるシングルチューブフォーマットでＨａｗｋＺ０５（商標）ファストワンステップＲＴ−ＰＣＲマスターミックスを用いて実施した。逆方向ＰＣＲプライマーはＲＴプライマーとしても機能する。逆転写（ＲＴ）反応を２０ｎｇのヒーラ細胞ＲＮＡを用いて行い、５５℃で５分間、６０℃で５分間及び６５℃で５分間のインキュベーションを段階的に進めた後、９５℃で１０分間の変性／ＲＮアーゼＨ２活性化ステップ、その後ＰＣＲの４５サイクルを実施した。反応をＲＮアーゼＨ２なしで、または指示したように２．６ｍＵ、２５ｍＵまたは２００ｍＵの無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸修飾Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２を用いて行った。
【図１７】保護されている切断可能なＦｏｒ  ＰＣＲプライマー及び無水物修飾ＨＳ−Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２を用いる高温ＲＴを用いてヒトＳＦＲＳ９遺伝子を検出するＲＴ−ｑＰＣＲの増殖プロットを示す。反応を保護されている切断可能な順方向ＰＣＲプライマー及び無修飾逆方向ＰＣＲプライマーを用いるシングルチューブフォーマットでＨａｗｋＺ０５（商標）ファストワンステップＲＴ−ＰＣＲマスターミックスを用いて実施した。逆方向ＰＣＲプライマーはＲＴプライマーとしても機能する。逆転写（ＲＴ）反応を２０ｎｇのヒーラ細胞ＲＮＡを用いて行い、５５℃で５分間、６０℃で５分間及び６５℃で５分間のインキュベーションを段階的に進めた後、９５℃で１０分間の変性／ＲＮアーゼＨ２活性化ステップ、その後ＰＣＲの４５サイクルを実施した。反応をＲＮアーゼＨ２なしで、または指示したように２．６ｍＵ、２５ｍＵまたは２００ｍＵの無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸修飾Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２を用いて行った。
【図１８】無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸修飾Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ及び無修飾の外部ＲＴプライマーを用いる高温ＲＴ−ｑＰＣＲからのＳＦＲＳ９遺伝子の増殖産物を示す。反応を無修飾（Ｕ）Ｆｏｒ及びＲｅｖ  ＰＣＲプライマーまたは保護されている切断可能な（Ｂ）Ｆｏｒ及びＲｅｖ  ｒｈＰＣＲプライマーを用いるシングルチューブフォーマットでＨａｗｋＺ０５（商標）ファストワンステップＲＴ−ＰＣＲマスターミックスを用いて実施した。逆転写（ＲＴ）反応を１０ｎｇのヒーラ細胞ＲＮＡを用いて行い、５５℃で５分間、６０℃で５分間及び６５℃で５分間のインキュベーションを段階的に進めた後、９５℃で１０分間の変性／ＲＮアーゼＨ２活性化ステップ、その後ＰＣＲの４５サイクルを実施した。反応を１０ｍＵの無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸修飾Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２を用いて行った。無修飾の外部ＲＴプライマーを指示した濃度で使用した。（Ｆｏｒ及びＲｅｖ  ＰＣＲプライマーから作成した）所望の１４５ｂｐアンプリコンの位置を示す。（Ｆｏｒ  ＰＣＲプライマー及びＲＴプライマーから作成した）望ましくない１７０ｂｐアンプリコンの位置を示す。
【図１９】無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸修飾Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ及び中心ｒＣ  ＲＮＡ残基を含有している修飾外部ＲＴプライマーを用いる高温ＲＴ−ｑＰＣＲからのＳＦＲＳ９遺伝子の増殖産物を示す。反応を無修飾（Ｕ）Ｆｏｒ及びＲｅｖ  ＰＣＲプライマーまたは保護されている切断可能な（Ｂ）Ｆｏｒ及びＲｅｖ  ｒｈＰＣＲプライマーを用いるシングルチューブフォーマットでＨａｗｋＺ０５（商標）ファストワンステップＲＴ−ＰＣＲマスターミックスを用いて実施した。逆転写（ＲＴ）反応を１０ｎｇのヒーラ細胞ＲＮＡを用いて行い、５５℃で５分間、６０℃で５分間及び６５℃で５分間のインキュベーションを段階的に進行させた後、９５℃で１０分間の変性／ＲＮアーゼＨ２活性化ステップ、その後ＰＣＲの４５サイクルを実施した。反応を１０ｍＵの無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸修飾Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２を用いて行った。１個の中央に位置するｒｃ  ＲＮＡ残基を含有している修飾外部ＲＴプライマーを指示した濃度で使用した。（Ｆｏｒ及びＲｅｖ  ＰＣＲプライマーから作成した）所望の１４５ｂｐアンプリコンの位置を示す。（Ｆｏｒ  ＰＣＲプライマー及びＲＴプライマーから作成した）望ましくない１７０ｂｐアンプリコンの位置を示す。外部ＲＴプライマーの非存在下（０ｎＭ）で対照反応を行った。
【図２０】無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸修飾Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ及び中心脱塩基ナフチル−アゾ修飾因子を含有している修飾外部ＲＴプライマーを用いる高温ＲＴ−ｑＰＣＲからのＳＦＲＳ９遺伝子の増殖産物を示す。反応を無修飾（Ｕ）Ｆｏｒ及びＲｅｖ  ＰＣＲプライマーまたは保護されている切断可能な（Ｂ）Ｆｏｒ及びＲｅｖ  ｒｈＰＣＲプライマーを用いるシングルチューブフォーマットでＨａｗｋＺ０５（商標）ファストワンステップＲＴ−ＰＣＲマスターミックスを用いて実施した。逆転写（ＲＴ）反応を１０ｎｇのヒーラ細胞ＲＮＡを用いて行い、５５℃で５分間、６０℃で５分間及び６５℃で５分間のインキュベーションを段階的に進めた後、９５℃で１０分間の変性／ＲＮアーゼＨ２活性化ステップ、その後ＰＣＲの４５サイクルを実施した。反応を１０ｍＵの無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸修飾Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２を用いて行った。１つの中心に位置する脱塩基ナフチル−アゾ修飾因子を含有している修飾外部ＲＴプライマーを指示した濃度で使用した。（Ｆｏｒ及びＲｅｖ  ＰＣＲプライマーから作成した）所望の１４５ｂｐアンプリコンの位置を示す。（Ｆｏｒ  ＰＣＲプライマー及びＲＴプライマーから作成した）望ましくない１７０ｂｐアンプリコンの位置を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
１つの実施形態では、本発明の組成物及び方法は、ＲＮアーゼＨ２酵素を可逆的に不活性化し、加熱すると再活性化されるようにするための該酵素の修飾を含む。ＲＮアーゼＨ２は、化学的に修飾されたホットスタートＲＮアーゼＨ２酵素（ＨＳ−ＲＮアーゼＨ２）を生成するように酸無水物で修飾される。更なる実施形態では、ＲＮアーゼＨ２酵素は微生物パイロコッカス・アビシ（Ｐ．ａ．）由来である。本明細書中に記載されている方法はＰＣＲ及び逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイにおけるＨＳ−ＲＮアーゼＨ２の改善された有用性をも記載している。
【００１９】
保護されている切断可能なプライマーとＲＮアーゼＨ２の併用はＰＣＲ（ｒｈＰＣＲ）の特異性を向上させる。更に、プライマーに依存するＤＮＡ合成反応は、プライマーがＲＮアーゼＨ２切断により活性化されるまで保護されている切断可能なプライマーを用いて起こり得ない；Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２のようなあるＲＮアーゼＨ２酵素は室温で最小の活性を有している。従って、ｒｈＰＣＲは高価な市販のホットスタートＤＮＡポリメラーゼを使用する必要なく、天然Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて十分に実施し得る；すなわち、ｒｈＰＣＲは本質的にホットスタート挙動を示し得る。本明細書中、特に明記しない限り、ＨＳ−ＲＮアーゼＨ２への言及は非天然ＲＮアーゼＨ２を指す。
【００２０】
１つの実施形態では、ＨＳ−ＲＮアーゼＨ２は高温ＲＴ反応でも使用され得る。ＲＮＡから逆転写（ＲＴ）により作成されるｃＤＮＡ中の標的遺伝子レベルを定量するために高特異性ｒｈＰＣＲ（保護されている切断可能なプライマー及びＲＮアーゼＨ２を使用する）を使用することが有利であり得る。ＲＴ反応はＲＮＡ鋳型からのｃＤＮＡの合成をプライミングするためにＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用する。プライミング複合体はＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二重鎖を形成して、ＲＴ反応におけるＲＮアーゼＨ２活性の存在は標的ＲＮＡを分解し、反応の効率を低下させるおそれがある。ＲＴ−ｑＰＣＲはしばしば、まずＲＴ反応を例えばトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）ＲＴ酵素またはモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）ＲＴ酵素を用いて低温（典型的には、３７〜４２℃）で行う２ステッププロセスとして行われている。ｃＤＮＡ合成反応の完了後、ＰＣＲを高温（典型的には、６０〜７２℃）で実施する。これらの反応を別々のチューブで実施する場合、ＲＮアーゼＨ２酵素はｃＤＮＡ合成が完了した後に添加し得る。ＲＴ及びＰＣＲステップを１つのチューブで関連させる場合、ＲＮアーゼＨ２はＲＴ中に存在していなければならず、ＲＮＡ標的を分解し得る。実施例５は、ＲＮＡ配列中のＳＮＰをＨＳ−ＲＮアーゼＨ２及びｒｈＰＣＲを用いて同定し得るという本発明の別の作用効果を立証している。これは、ＲＮＡを配列変化について分析しなければならない各種分野で使用され得る。
【００２１】
ワンチューブＲＴ−ＰＣＲを保護されているプライマー及びＨＳ−ＲＮアーゼＨ２酵素を用いて実施できることは実施例４において立証されている。この実施例では、１つの保護されているプライマーをその後のＰＣＲにおいてＲＴプライマー及び逆方向プライマーの両方として作用する保護されていない逆方向プライマーと共に使用している。
【００２２】
ＨＳ−ＲＮアーゼＨ２がＲＴ−ｑＰＣＲ一塩基多型（ＳＮＰ）アッセイにおいて機能できることは実施例５において立証されている。この実施例では、２つの異なるＲＮＡサンプル間の１つのヌクレオチドの違いをワンチューブＲＴ−ＰＣＲシステム及びＲＮＡ塩基の反対側にある可能性あるＳＮＰを有する１つの保護されているプライマーを用いて検出している。
【００２３】
ＨＳ−ＲＮアーゼＨ２が２つの保護されているプライマー及び外部の保護されていない逆転写プライマーを含有しているＲＴ−ｑＰＣＲアッセイにおいて機能できることは以下の実施例１１において立証されている。
【００２４】
ＨＳ−ＲＮアーゼＨ２は、ＲＮＡが逆転写される前に天然酵素の活性がＲＮＡを分解する高温ＲＴ反応においても使用され得る。この作用効果は実施例９及び１０において示されている。実施例９はＲＮＡ配列中のＳＮＰをＨＳ−ＲＮアーゼＨ２及びｒｈＰＣＲを用いて同定され得るという本発明の追加の作用効果を立証している。これは、ＲＮＡを配列変化について分析しなければならない多くの各種分野で使用され得る。
【００２５】
Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２は２５℃で低活性を有しているが、ｒｈＰＣＲを実施する前に長いプレインキュベーション時間があるとき（すなわち、多数の反応をロボットを用いてバッチで実施する場合）にはこれは十分でないことがある。ＨＳ−ＲＮアーゼＨ２により酵素の可逆的不活性化が生じ得、必要なときには機能性を完全に戻すことができる。この作用効果の例を実施例１１に示す。
【００２６】
定義
本発明の理解を助けるために、幾つかの用語を以下に定義する。
【００２７】
本明細書中で使用されている用語「核酸」及び「オリゴヌクレオチド」は、（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有している）ポリデオキシリボヌクレオチド、（Ｄ−リボースを含有している）ポリリボヌクレオチド、及びプリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドである他のタイプのポリヌクレオチドを指す。用語「核酸」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」を長さの点で区別する意図はなく、これらの用語は互換可能に使用されている。これらの用語は、分子の主要構造のみを指す。よって、これらの用語には、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ、並びに二本鎖及び一本鎖ＲＮＡが含まれる。本明細書中で使用する場合、オリゴヌクレオチドは塩基、糖またはホスフェート骨格が修飾されているヌクレオチドアナログ、並びに非プリンまたは非ピリミジンヌクレオチドアナログを含み得る。
【００２８】
オリゴヌクレオチドは適当な方法により作成され得、これらの方法には各々が参照により本明細書に組み入れるＮａｒａｎｇら，１９７９，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６８：９０−９９のホスホトリエステル方法；Ｂｒｏｗｎら，１９７９，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６８：１０９−１５１のホスホジエステル方法；Ｂｅａｕｃａｇｅら，１９８１，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９−１８６２のジエチルホスホラミダイト方法；及び米国特許Ｎｏ．４，４５８，０６６の固体補助体方法のような方法による直接化学的合成が含まれる。オリゴヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドのコンジュゲートの合成方法の概説は参照により本明細書に組み入れるＧｏｏｄｃｈｉｌｄ、１９９０，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１（３）：１６５−１８７に記載されている。
【００２９】
本明細書中で使用されている用語「ハイブリダイゼーション」は、相補的塩基対合のために２つの一本鎖核酸による二重構造の形成を指す。ハイブリダイゼーションは、完全相補的核酸鎖間またはミスマッチのマイナー領域を含有している「実質的に相補的な」核酸鎖間で起こり得る。完全相補的核酸鎖のハイブリダイゼーションが非常に好ましい条件を「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「配列特異的ハイブリダイゼーション条件」と称する。実質的に相補的な配列の安定な二重鎖は余りストリンジェントでないハイブリダイゼーション条件下で形成され得る；許容されるミスマッチの程度はハイブリダイゼーション条件を適当に調節することによりコントロールされ得る。核酸テクノロジーの当業者は、例えばオリゴヌクレオチドの長さ及び塩基対組成、イオン強度及びミスマッチな塩基対の頻度を含めた多数の変数を考慮して、業界により提供されているガイドライン（例えば、参照により本明細書に組み入れるＳａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｗｅｔｍｕｒ，１９９１，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６（３／４）：２２７−２５９；及びＯｗｅｚａｒｚｙら，２００８，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４７：５３３６−５３５３を参照されたい）に従って二重鎖安定性を経験的に調べることができる。
【００３０】
本明細書中で使用されている用語「標的」、「標的配列」、「標的領域」及び「標的核酸」は同義語であり、増幅、配列決定または検出しようとする核酸の領域または配列を指す。
【００３１】
本明細書中で使用されている用語「プライマー」は、適当な条件下でのＤＮＡ合成の開始ポイントとして作用し得るオリゴヌクレオチドを指す。前記条件には、核酸鎖に対して相補的なプライマー伸長産物の合成を４つの異なるヌクレオシドトリホスフェート及び伸長剤（例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）の存在下、適切な緩衝液中、適当な温度で誘発させる条件が含まれる。プライマー伸長は１つ以上のヌクレオチドトリホスフェートの非存在下でも実施され得、この場合限定された長さの伸長産物が産生される。本明細書中で使用されている用語「プライマー」は、１つのオリゴヌクレオチドが隣接位置でハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドへのライゲーションにより「伸長」されるライゲーション媒介反応において使用されるオリゴヌクレオチドを包含すると意図される。よって、本明細書中で使用されている用語「プライマー伸長」は、ＤＮＡ合成の開始ポイントとしてプライマーを用いる個々のヌクレオシドトリホスフェートの重合、及び伸長産物を形成するための２つのオリゴヌクレオチドのライゲーションの両方を指す。
【００３２】
プライマーは好ましくは一本鎖ＤＮＡである。プライマーの適当な長さはプライマーの意図する使用に依存するが、典型的には６〜５０ヌクレオチド、好ましくは１５〜３５ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子は通常鋳型と十分に安定なハイブリッド複合体を形成するためにより低い温度を必要とする。プライマーは鋳型核酸の正確な配列を反映させる必要はないが、鋳型とハイブリダイズするために十分に相補的でなければならない。所与の標的配列の増殖のために適当なプライマーの設計は当業界で公知であり、本明細書中で引用されている文献に記載されている。
【００３３】
プライマーは、プライマーの検出または固定化を可能にするが、ＤＮＡ合成の開始ポイントとして作用するプライマーの基本的特性を変化させない追加の特徴を取り込み得る。例えば、プライマーは、標的核酸に対してハイブリダイズしないが、増幅産物のクローニングまたは検出を容易にする追加の核酸配列を５’末端に含み得る。ハイブリダイズする鋳型に対して十分相補的であるプライマーの領域を本明細書中ではハイブリダイジング領域と称する。
【００３４】
用語「増幅反応」は、鋳型核酸配列のより多いコピーをもたらす、または鋳型核酸の転写をもたらす酵素反応を含めた化学反応を指す。増殖反応には、逆転写、リアルタイムＰＣＲ（米国特許Ｎｏｓ．４，６８３，１９５及び４，６８３，２０２を参照されたい；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編，１９９０）を参照されたい）を含めたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、及びリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｂａｒａｎｙら，米国特許Ｎｏ．５，４９４，８１０を参照されたい）が含まれる。例示的な「増幅反応条件」または「増幅条件」は典型的には２または３ステップサイクルを含む。２ステップサイクルは高温変性ステップ、その後にハイブリダイゼーション／伸長（または、ライゲーション）ステップを含む。３ステップサイクルは、変性ステップ、ハイブリダイゼーションステップ、及び別の伸長またはライゲーションステップを順次含む。
【００３５】
本明細書中で使用されている「ポリメラーゼ」は、ヌクレオチドの重合を触媒する酵素を指す。通常、この酵素は核酸鋳型配列にアニールしたプライマーの３’末端で合成を開始させる。「ＤＮＡポリメラーゼ」はデオキシリボヌクレオチドの重合を触媒する。公知のＤＮＡポリメラーゼには、パイロコッカス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｎｄｂｅｒｇら，１９９１，Ｇｅｎｅ，１０８：１）、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｌｅｃｏｍｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｕｂｌｅｄａｙ，１９８３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１１：７５０５）、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍら，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５６：３１１２）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｇｅｌｆａｎｄ，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：７６６１）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｅｎｅｓｈ  ａｎｄ  ＭｃＧｏｗａｎ，１９７７，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，４７５：３２）、超好熱性古細菌（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）（Ｔｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼとも称される、Ｃａｒｉｅｌｌｏら，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９：４１９３）、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄｉａｚ  ａｎｄ  Ｓａｂｉｎｏ，１９９８，Ｂｒａｚ  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．，３１：１２３９）、テルムス・アクウォーティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｈｉｅｎら，１９７６，Ｊ．Ｂａｃｔｅｏｒｉｏｌ．，１２７：１５５０）、超好熱始原菌（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓ）ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｇｉら，１９９７，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６３：４５０４）、ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼ（特許出願ＷＯ  ０１３２８８７）及びパイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）ＧＢ−Ｄ（ＰＧＢ−Ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｊｕｎｃｏｓａ−Ｇｉｎｅｓｔａら，１９９４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１６：８２０）が含まれる。上記酵素のポリメラーゼ活性は当業界で公知の手段により測定され得る。
【００３６】
本明細書中で使用されている場合、十分にストリンジェントな条件下での増殖反応において使用するときにプライマーが主に標的核酸に対してハイブリダイズするならば、このプライマーは標的配列に対して「特異的」である。典型的には、プライマー−標的二重鎖安定性がプライマーとサンプル中に存在している他の配列の間で形成される二重鎖の安定性よりも高いならば、プライマーは標的配列に対して特異的である。当業者は、塩条件、及びプライマーの基本組成及びミスマッチの位置のような各種要因がプライマーの特異性に影響を与えること、及びプライマー特異性のルーチンの実験確認が多くの場合必要であることを認識している。プライマーが標的配列のみと安定な二重鎖を形成し得るハイブリダイゼーション条件を選択し得る。よって、標的特異的プライマーを適当にストリンジェントな増殖条件で使用すると、標的プライマー結合部位を含有している前記標的配列を選択的に増殖させ得る。
【００３７】
本明細書中で使用されている用語「非特異的増殖」は、プライマーが標的配列以外の配列に対してハイブリダイズし、プライマー伸長のための基質として働く結果として標的配列以外の核酸配列が増殖することを指す。プライマーの非標的配列に対するハイブリダイゼーションは「非特異的ハイブリダイゼーション」と称され、特により低い温度、より低いストリンジェンシー、前増殖条件の間、またはサンプル中に単ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の場合のように真の標的に対して非常に密接に関連している配列を有している変異型対立遺伝子がサンプル中にある場合には起こりがちである。
【００３８】
本明細書中で使用されている用語「反応混合物」は、所与の反応を実施するのに必要な試薬を含有している溶液を指す。増殖反応を実施するのに必要な試薬を含有している溶液を指す「増幅反応混合物」は、典型的には適当な緩衝液中にオリゴヌクレオチドプライマー及びＤＮＡポリメラーゼまたはリガーゼを含有している。「ＰＣＲ反応混合物」は、典型的には適当な緩衝液中にオリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ（最も典型的には、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ）、ｄＮＴＰ及び二価金属カチオンを含有している。反応混合物は、反応を可能にするのに必要な試薬を全て含有しているならば完全と称され、必要な試薬の部分集合しか含有していないならば不完全と称される。当業者は、反応成分は便宜性、貯蔵安定性の理由、または成分濃度を用途に応じて調節できるように各々が全成分の部分集合を含有している別々の溶液として日常的に保存されていること、及び反応前に完全反応混合物を作成するために反応成分を組み合わせることを理解している。更に、当業者は、反応成分は市販化のために別々に包装されていること、及び有用な市販キットは本発明の保護されているプライマーを含めた反応成分の部分集合を含有していてもよいことを理解している。
【００３９】
本明細書中で使用されている用語「切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）ドメイン」または「切断（ｃｌｅａｖｉｎｇ）ドメイン」は同義語であり、プライマーまたは他のオリゴヌクレオチドを切断する切断化合物、例えば切断酵素により認識されるプライマーまたは他のオリゴヌクレオチドの５’及び３’末端の間に位置している領域を指す。本発明の目的では、切断ドメインは、プライマーまたは他のオリゴヌクレオチドが相補的核酸配列に対してハイブリダイズするときだけ切断されるが、一本鎖のときには切断されないように設計されている。切断ドメインまたはそれに隣接する配列は、ａ）プライマーまたは他のオリゴヌクレオチドのポリメラーゼまたはリガーゼによる伸長またはライゲーションを防止または抑制する、ｂ）変異型対立遺伝子を検出するために判別を強化する、またはｃ）望ましくない切断反応を抑える部分を含み得る。前記部分の１つ以上を切断ドメインまたはそれに隣接する配列中に含めてもよい。
【００４０】
本明細書中で使用されている用語「ＲＮアーゼＨ切断ドメイン」は、ＲＮアーゼＨに対する基質を与えるリボ核酸残基または別のアナログを１つ以上含有している切断ドメインのタイプである。ＲＮアーゼＨ切断ドメインはプライマーまたはオリゴヌクレオチド内のどこにでも配置され得、好ましくは分子の３’末端または５’末端またはその近くに配置されている。
【００４１】
「ＲＮアーゼＨ１切断ドメイン」は通常少なくとも３個の残基を含有している。「ＲＮアーゼＨ２切断ドメイン」は１個のＲＮＡ残基、連続して連結しているＲＮＡ残基、またはＤＮＡ残基または他の化学基により分離されているＲＮＡ残基を含有していてもよい。１つの実施形態では、ＲＮアーゼＨ２切断ドメインは２’−フルオロヌクレオシド残基である。より好ましい実施形態では、ＲＮアーゼＨ２切断可能ドメインは２個の隣接する２’−フルオロ残基である。
【００４２】
本明細書中で使用されている用語「切断化合物」または「切断剤」は、プライマーまたは他のオリゴヌクレオチド内の切断ドメインを認識し、切断ドメインの存在に基づいてオリゴヌクレオチドを選択的に切断し得る化合物を指す。本発明において使用される切断化合物は、実質的に相補的な核酸配列に対してハイブリダイズするときのみ切断ドメインを含むプライマーまたは他のオリゴヌクレオチドを選択的に切断するが、一本鎖のときにはプライマーまたは他のオリゴヌクレオチドを切断しない。切断化合物は切断ドメイン内またはそれに隣接するプライマーまたは他のオリゴヌクレオチドを切断する。本明細書中で使用されている用語「隣接する」は、切断化合物が切断ドメインの５’末端または３’末端のいずれかでプライマーまたは他のオリゴヌクレオチドを切断することを意味する。本発明において好ましい切断反応により、５’−ホスフェート基及び３’−ＯＨ基が生ずる。
【００４３】
好ましい実施形態では、切断化合物は「切断酵素」である。切断酵素は、プライマーまたは他のヌクレオチドが実質的に相補的な核酸配列に対してハイブリダイズするときに切断ドメインを認識し得るが、相補的核酸配列を切断しない（すなわち、二重鎖中の一本鎖を切断する）タンパク質またはリボザイムである。切断酵素は、一本鎖のときには切断ドメインを含むプライマーまたは他のオリゴヌクレオチドを切断しない。切断酵素の例はＲＮアーゼＨ酵素及び他のニッキング酵素である。
【００４４】
本明細書中で使用されている用語「保護基」は、増殖反応が起こらないようにプライマーまたは他のオリゴヌクレオチドに結合している化学部分を指す。例えば、プライマー伸長及び／またはＤＮＡライゲーションは起こらない。保護基がプライマーまたは他のオリゴヌクレオチドから除去されたら、オリゴヌクレオチドは設計されたアッセイ（ＰＣＲ、ライゲーション、配列決定等）に関与し得る。よって、「保護基」はポリメラーゼまたはＤＮＡリガーゼによる認識を妨げる化学部分であり得る。保護基は切断ドメインに取り込まれ得るが、通常切断ドメインの５’または３’側に配置されている。保護基は２個以上の化学部分を含み得る。本発明では、「保護基」は典型的にはオリゴヌクレオチドをその標的配列に対してハイブリダイズした後除去される。
【００４５】
用語「蛍光発生プローブ」は、ａ）結合している蛍光基及びクエンチャー、場合によりマイナーグルーブバインダーを有しているオリゴヌクレオチド、またはｂ）ＤＮＡ結合試薬、例えばＳＹＢＲ（登録商標）緑色染料のいずれかを指す。
【００４６】
用語「蛍光標識」または「蛍光基」は、約３５０〜９００ｎｍの最大蛍光発光を有する化合物を指す。広範囲の蛍光基が使用され得、この中には５−ＦＡＭ（５−カルボキシフルオレセインとも称される；Ｓｐｉｒｏ（イソベンゾフラン−ｌ（３Ｈ），９’−（９Ｈ）キサンテン）−５−カルボン酸，３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−６−カルボキシフルオレセイン）とも称される）；５−ヘキサクロロ−フルオレセイン；（［４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロ−（３’，６’−ピバロイル−フルオレセイニル）−６−カルボン酸］）；６−ヘキサクロロ−フルオレセイン；（［４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロ−（３’，６’−ジピバロイルフルオレセイニル）−５−カルボン酸］）；５−テトラクロロ−フルオレセイン；（［４，７，２’，７’−テトラクロロ−（３’，６’−ジピバロイルフルオレセイニル）−５−カルボン酸］）；６−テトラクロロ−フルオレセイン；（［４，７，２’，７’−テトラクロロ−（３’，６’−ジピバロイルフルオレセイニル）−６−カルボン酸］）；５−ＴＡＭＲＡ（５−カルボキシテトラメチルローダミン）；キサンチリウム，９−（２，４−ジカルボキシフェニル）−３，６−ビス（ジメチル−アミノ）；６−ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチルローダミン）；９−（２，５−ジカルボキシフェニル）−３，６−ビス（ジメチルアミノ）；ＥＤＡＮＳ（５−（（２−アミノエチル）アミノ）ナフタレン−ｌ−スルホン酸）；１，５−ＩＡＥＤＡＮＳ（５−（（（（２−ヨードアセチル）アミノ）エチル）アミノ）ナフタレン−ｌ−スルホン酸）；Ｃｙ５（インドジカルボシアニン−５）；Ｃｙ３（インド−ジカルボシアニン−３）；及びＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ（２，６−ジブロモ−４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸）；クアーサー（登録商標）−６７０染料（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；カルフロー（登録商標）オレンジ染料（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；ロックス染料；マックス染料（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、並びにその適当な誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
【００４７】
本明細書中で使用されている用語「クエンチャー」は、蛍光ドナーまたはその近くに結合したときにそのドナーからの発光を減ずることができる化合物の分子または一部を指す。消光は、蛍光共鳴エネルギー移動、光誘導電子移動、項間交差の常磁性強化、デクスター交換カップリング、及び暗色複合体の形成のような励起子カップリングを含めた幾つかのメカニズムのいずれかにより生じ得る。蛍光は、蛍光基より発生した蛍光がクエンチャーの非存在下での蛍光に比して少なくとも１０％、例えば１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．９％またはそれ以上減少したときに「消光」されている。多数の市販クエンチャーが当業界で公知であり、ＤＡＢＣＹＬ、Ｂｌａｃｋ  ＨｏｌｅＴＭクエンチャー（ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２及びＢＨＱ−３）、アイオワブラック（登録商標）ＦＱ及びアイオワブラック（登録商標）ＲＱが含まれるが、これらに限定されない。これらは所謂ダーククエンチャーである。これらは天然蛍光を持たず、本質的に蛍光性である他のクエンチャー、例えばＴＡＭＲＡでみられるようなバックグラウンドの問題が殆ど解消される。
【００４８】
以下の実施例により本発明を更に説明するが、これらの実施例は勿論本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【００４９】
［実施例１］
本実施例は、各種無水物との反応によるパイロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｉｉ）（Ｐ．ａ．）ＲＮアーゼＨ２の可逆的修飾／不活性化を立証する。
【００５０】
Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２を無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸、無水シトラコン酸または無水シス−アコチニン酸を用いて化学的に修飾し、化学的修飾を加熱処理により除去した。本研究で使用した３つの無水物の化学構造を図１に示す。無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸がポリペプチド上の第１級アミンを修飾する化学反応及び加熱により触媒される可逆反応を図２に示す。無修飾酵素の相対的酵素活を化学的に修飾した酵素の加熱処理前後と比較した。
【００５１】
方法：
Ｐ．ａ．ｒｎｂ遺伝子を既報（Ｄｏｂｏｓｙら，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１１，ｌｌ：ｅ８０；Ｗａｌｄｅｒら，ＵＳ  ２００９／０３２５１６９Ａ１）のように大腸菌における発現のためにコドン最適化し、発現ベクターにクローン化した。組換えＰ．ａ．ＲＮ２発現プラスミドを有している大腸菌を１０Ｌ発酵リアクター中でＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏｗａ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ（米国イリノイ州コーラルヴィル）により増殖させた。生じた細胞ペーストを−８０℃で保存した。細胞ペーストの一部（〜５０グラム）を溶解し、組換えＰ．ａ．ＲＮアーゼＨ２酵素をＥｎｚｙｍａｔｉｃｓ（米国マサチューセッツ州ビバリー）によりほぼ均質まで精製した。酵素のストック溶液を緩衝液Ｆ（２０ｍＭ  トリス（ｐＨ８．４），０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１００ｍＭ  ＫＣｌ，０．１％  トリトンＸ−１００及び５０％  グリセロール）中−２０℃で保存した。
【００５２】
野生型Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２の配列を配列番号１として以下に示す。リシン残基（Ｋ）を太字で示し、下線を引いている。
【００５３】
配列番号１：天然Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２，２２４アミノ酸，２５３９４．１８ダルトン
【００５４】
【化２】
2015510776.tif 000004
【００５５】
組換えタンパク質は発現ベクターにより導入された幾つかの追加アミノ酸を含み、天然酵素から縦線（｜）により分離されている。組換えＰ．ａ．ＲＮアーゼＨ２酵素の配列を以下に示す。
【００５６】
配列番号２：組換えＰ．ａ．ＲＮアーゼＨ２，２４６アミノ酸，２７５７３．７０ダルトン
【００５７】
【化３】
2015510776.tif 000005
【００５８】
組換えＰ．ａ．ＲＮアーゼＨ２タンパク質は２８個のリシン残基を含有している。従って、アミノ末端を含めて全部で２９個の遊離アミン基が３つの無水物のいずれかでの化学反応により修飾するために利用可能である。従って、Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２の無水物を用いる化学的処理のために、２９：１という無水物：タンパク質のモル比は全反応性アミンに対する無水物の比１：１に相当する。わかりやすくするために、今後Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２の無水物での「１：１処理」は２９：１の無水物：タンパク質のモル比の使用を示し、１００％  効率と仮定して全ての遊離アミン基と反応させるために十分な試薬を使用したことを示す。
【００５９】
Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２の無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸、無水シトラコン酸または無水シス−アコチニン酸での修飾：
３８μΜの最終濃度となるように７４μＬの１５０ｍＭ  Ｎａボレート（ｐＨ９．０）及び０．１％  トリトンＸ−１００を含む緩衝液に７７μｇ（８６４単位）の濃縮ストック組換え酵素を添加することにより３つの同一のＰ．ａ．ＲＮアーゼＨ２溶液を調製した。無水物がトリス中で遊離アミンと反応して反応をクエンチする恐れがあるので、反応をトリス含有溶液を避けてボレート緩衝液中で実施したことに注目されたい。新鮮な無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸、無水シトラコン酸または無水シス−アコチニン酸をＤＭＦ中に４０ｍＭで溶解させた。１．０μＬの無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸を第１ＲＮアーゼＨ２アリコートに添加し、１．０μＬの無水シトラコン酸を第２ＲＮアーゼＨ２アリコートに添加し、１．０μＬの無水シス−アコチニン酸を第３ＲＮアーゼＨ２アリコートに添加した。３つの処理は１４．５：１  無水物：酵素、すなわちタンパク質中に存在する全アミンに対する無水物のモル比０．５：１の添加に相当する。サンプルを渦流撹拌し、氷上で３０分間インキュベートした。インキュベートした後、１μＬアリコートを各反応ミックスから取り出し、個々に５７μＬの緩衝液Ｄ（２０ｍＭ  トリスＨＣｌ，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１００ｍＭ  ＫＣｌ，０．１％  トリトンＸ−１００，１０％  グリセロール，ｐＨ８．４）で希釈し、その後の分析（最終濃度０．６７μΜ）のために氷上で保存した。無水物毎に上記手順をもう５回繰り返して、最終産物は、０．５の無水物：第１級アミンのモル比で６×反応させて、第１級アミンに対する無水物のモル比３の蓄積処理を生じさせたＰ．ａ．ＲＮアーゼＨ２の３サンプルであった。第６回の無水物処理サイクル後、反応物をクエンチし、更なる化学的修飾が生ずるのを妨げるために修飾ＲＮアーゼＨ２タンパク質の３つのサンプルに１８．５μＬの１００ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ８．４）を添加した（２０ｍＭ  トリスの最終濃度を生ずる）。
【００６０】
バルクの無水物処理サンプルを２０ｍＭ  トリス（ｐＨ８．４）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１００ｍＭ  ＫＣｌを含有している緩衝液に対して６〜８ｋＤａの分画分子量を有するＤ−Ｔｕｂｅ（商標）Ｄｉａｌｙｚｅｒ  Ｍｉｎｉ’ｓ（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，カリフォルニア州サンジェゴ）を用いて透析した。透析は４℃で、２時間毎に３×２００ｍＬ、次いで一晩１×２００ｍＬで、毎回新鮮な緩衝液と交換しながら実施した。透析後、タンパク質濃度をクーマシーブリリアントブルーで染色した４〜２０％  ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルを用いて可視化し、１００〜６００ｎｇの範囲のＢＳＡ標準に対する修飾ＲＮアーゼＨ２のバンド強度と比較することにより確認した。ゲル画像をＩｍａｇｅＪバンドデンシトメトリーを用いて定量した。修飾酵素を−２０℃で保存した。
【００６１】
修飾ＲＮアーゼＨ２酵素活性の分析：
修飾されていない及び化学的に修飾したＰ．ａ．ＲＮアーゼＨ２の酵素活性を合成蛍光クエンチしたオリゴヌクレオチドレポーターアッセイ（ＦＱレポーターアッセイ）を用いて調べた。合成レポーターの配列を以下に示す。
【００６２】
配列番号３：ＲＮＨ２  ｒＣ  ＦＡＭレポーター
【００６３】
【化４】
2015510776.tif 000006
【００６４】
配列番号４：ＲＮＨ２  ｒＣコンペティター
【００６５】
【化５】
2015510776.tif 000007
【００６６】
ＤＮＡ塩基は大文字であり、ＲＮＡ塩基は小文字であり、ＦＡＭは６−カルボキシフルオレセインであり、ＦＱはアイオワブラック（登録商標）ＦＱダーククエンチャーである。
【００６７】
レポーターは、１９塩基ステムドメイン及び４塩基ループドメインを有するヘアピン／ループ構造を形成する自己相補的配列である。この分子は、染料及びクエンチャーがヘアピン形成時に接触するように５’末端にＦＡＭ蛍光染料、３’末端にダーククエンチャーを含有している。この配置で、蛍光染料はクエンチされ、レポーターは「ダーク」である。１つのリボヌクレオチド（ｒＣ）残基はＲＮアーゼＨ２切断部位を含む分子の５’末端から１１位に位置している。レポーター分子のＲＮアーゼＨ２による切断後、分子の１０塩基５’末端断片が解離し、蛍光染料がクエンチャーから分離される。この配置では、染料はクエンチされず、レポーターは「ブライト」である。ＲＮアーゼＨ２活性アッセイの概略図を図３に示す。
【００６８】
ＦＱレポーターアッセイを使用して、無修飾Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２の活性を上のバルク酵素修飾反応から採取した既に「後の分析のために取り出した」アリコートと比較した。無水物修飾したＰ．ａ．ＲＮアーゼＨ２アリコートの再活性化を同様に試験した。無水物修飾の各サイクル後、１μｌの各反応物を６６７ｎＭの酵素の最終濃度（無修飾酵素の場合２００ｍＵ／μＬ活性に等しい）となるように緩衝液Ｄで希釈した。これらのストックをこの濃度で使用するか、または更に緩衝液Ｄで９ｎＭ濃度（無修飾酵素の場合２．６ｍＵ／μＬ活性に等しい）に希釈した。（６６７ｎＭ及び９ｎＭ濃度で）無修飾酵素及び修飾酵素のアリコートを追加処理することなく研究し、または活性試験の前に９５℃で１０分間加熱した。反応を次のようにセットアップした：ＦＱレポーターアッセイは１μＬの無修飾及び修飾酵素希釈物を用いて１０μＬの最終容量で行った；無修飾酵素の場合、使用した酵素の量はそれぞれ２００ｍＵまたは２．６ｍＵの酵素に相当する。ＦＱレポーターアッセイの成分を表１に下記する。
【００６９】
【表１】
2015510776.tif 000008
【００７０】
１０μＬの反応物をＲｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，米国インディアナ州インディアナポリス）を用いて３８４ウェルプレート中６０℃で１０分間インキュベートし、蛍光測定は１１秒毎に１回行った。アッセイは無修飾Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２を用いて、３つの無水物毎に全ての無水物処理サンプル（０．５×，ｌ．０×，１．５×，２．０×，２．５×及び３×修飾）について修飾を逆転させるべく９５℃で１０分間の加熱処理の前後に行った。無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸修飾したＰ．ａ．ＲＮアーゼＨ２の２．６ｍＵアッセイの結果を図４に示す。第１処理（０．５×修飾）後に活性の有意な損失が見られたが、１．０×〜３．０×処理の場合には活性は検出されなかった。最も高度に修飾したサンプル（３．０×修飾）の場合でも、９５℃で１０分間の加熱処理後に酵素活性の完全回復が見られた。無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸修飾したＰ．ａ．ＲＮアーゼＨ２の２００ｍＵアッセイの結果を図５に示す。この非常に高濃度の酵素を用いると、０．５×、ｌ．０×及び１．５×処理サンプルで残留活性が見られたが、２．０×、２．５×または３．０×処理サンプルでは活性は検出されなかった。２．６ｍＵの酵素を用いて得た結果と同様に、最も高度に修飾したサンプル（３．０×修飾）の場合でも、９５℃で１０分間で加熱処理後酵素活性の完全回復が見られた。
【００７１】
無水シス−アコチニン酸修飾したＰ．ａ．ＲＮアーゼＨ２の２．６ｍＵアッセイの結果を図６に示す。第１処理（０．５×修飾）後に活性の損失が見られたが、２．０×レベルの修飾まで酵素の完全不活性化は生じなかった。無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸を用いて得た結果とは異なり、０．５×処理サンプルの場合でも９５℃で１０分間の加熱処理後完全活性は回復しなかった。加熱処理を１５分間まで延長しても結果は改善しなかった。無水シス−アコチニン酸修飾したＰ．ａ．ＲＮアーゼＨ２の２００ｍＵアッセイの結果を図７に示す。この非常に高濃度の酵素を用いると、処理サンプルの全てにおいて酵素活性が見られ、この処理プロトコルを用いると酵素の完全不活性化が達成されなかったことを示している。２．６ｍＵアッセイの場合で見られたように、２００ｍＵアッセイサンプルのいずれも加熱処理後完全活性に回復しなかった。
【００７２】
無水シトラコン酸修飾したＰ．ａ．ＲＮアーゼＨ２の２．６ｍＵアッセイの結果を図８に示す。第１処理（０．５×修飾）後に活性の損失が見られ、酵素の完全不活性化がｌ．０×レベルの修飾により達成された。無水シス−アコチニン酸を用いて得た結果と同様に、０．５×処理サンプルの場合でも９５℃で１０分間の加熱処理後に完全活性が回復しなかった。加熱処理を１５分間延長させても結果は改善しなかった。無水シトラコン酸修飾したＰ．ａ．ＲＮアーゼＨ２の２００ｍＵアッセイの結果を図９に示す。この非常に高濃度の酵素を用いると、酵素活性が０．５×、ｌ．０×及び１．５×処理サンプルで検出されたが、２．０×〜３．０×処理サンプルの場合完全不活性化が観察された。２００ｍＵアッセイサンプルの場合、酵素活性は加熱処理後ほぼ完全に回復したが、反応の開始時にわずかに遅い基質切断が見られた。
【００７３】
無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸、無水シトラコン酸または無水シス−アコチニン酸を用いるＰ．ａ．ＲＮアーゼＨ２の処理は酵素活性を低下させ、活性の部分的または完全回復は９５℃での短期間インキュベーションで達成され得る。この酵素は非常に耐熱性であり、活性を有意に損失させることなく３０分間インキュベートされ得、無水物に基づく不活性化／再活性化方法はホットスタートＲＮアーゼＨ２酵素を作成するための適当なアプローチを提供する。試験した各種処理の中で、無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸が最も好ましい特性を示し、タンパク質中の遊離第１級アミンに対して２倍モル過剰の無水物を用いる酵素の処理は酵素活性を全体的に不活性化した。更に、化学的修飾は９５℃で１０分間の加熱処理で可逆的であった。
【００７４】
［実施例２］
本実施例は化学的に修飾したパイロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｉｉ）ＲＮアーゼＨ２の分光測定分析を示す。
【００７５】
上の実施例１からのＰ．ａ．ＲＮアーゼＨ２サンプルを化学的修飾（不活性化）の効率及び修飾基を加熱処理により除去する能力（再活性化）を調べるべく分子量を測定するためにエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）を用いて研究した。０．５×モル比の無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸で６回修飾した（最終３×モル比）酵素サンプルのみを研究した。
【００７６】
修飾Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２の質量分析評価：
組換えＰ．ａ．ＲＮアーゼＨ２の３つのサンプルを透析緩衝液、２０ｍＭ  トリス（ｐＨ８．４）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１００ｍＭ  ＫＣｌ中で質量分析のために作成した：
１．無修飾Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２（対照）
２．修飾（３×無水物処理）Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２（不活性）
３．９５℃で１０分間インキュベートした修飾（３×無水物処理）Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２（活性）。
【００７７】
３つのサンプルをＮｏｖａｔｉａ，ＬＬＣ（米国ニュージャージー州プリンストン）でエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）を用いて試験した。タンパク質中の各第１級アミン基を無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸と反応させると、分子量が１５２ダルトン増加し、Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２中の２９個のアミン基の全てが反応すると質量は４４０８ダルトン増加する筈である。天然及び修飾酵素の予想される分子量を下表２に示す。
【００７８】
【表２】
2015510776.tif 000009
【００７９】
無修飾組換えＰ．ａ．ＲＮアーゼＨ２について得たデコンボリューション処理したＥＳＩ−ＭＳスペクトルを図１０に、３×無水物処理Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２については図１１に、加熱処理した（逆転させた）３×無水物処理Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２については図１２に示す。同定された主要スペクトルピークの質量値を下表３に要約する。無修飾酵素は２７，５７１Ｄａの一次質量を示した。３×修飾酵素は、無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸で修飾した１９〜２８個の第１級アミンを有するタンパク質種に相当する１０個の質量ピークを示し、最も優勢な種は２２個の修飾アミンを有している。加熱処理した３×修飾酵素は、無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸で修飾した０〜５個の第１級アミンを有するタンパク質種に相当する６個の質量ピークを示し、最も優勢な種は３個の修飾アミンを有している。
【００８０】
【表３】
2015510776.tif 000010
【００８１】
加熱処理した無水物修飾Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２は、無修飾酵素と比較してＦＱレポーターオリゴヌクレオチド基質の切断率の約５０％の低減を示し、これはこのサンプルの質量スベクトルでアミン上の０〜５個の修飾基の保持に関連している。
【００８２】
無修飾ＲＮアーゼＨ２サンプルは予想される質量を呈した。無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸で最終３×モル比まで修飾したＲＮアーゼＨ２サンプルは活性の１０００倍低減を示し、これは酵素の第１級アミン基の大部分の修飾に相関している。加熱処理は酵素を効果的に再活性化し、９５℃で１０分間インキュベーション後ほぼ完全な活性が見られた。この処理は修飾アミン基の全てを完全に除去しなかった。しかしながら、再活性化した酵素は実施した全ての生化学的パフォーマンステストにおいて効果的に機能した。
【００８３】
［実施例３］
本実施例は、サイクリングを始める前に反応物を室温で一晩放置しても、本発明の無水物修飾ホットスタートＰ．ａ．ＲＮアーゼＨ２を用いるｒｈＰＣＲが天然Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（非ホットスタートＤＮＡポリメラーゼ）を用いて十分に機能し、高価なホットスタートＤＮＡポリメラーゼを使用しなくて済むことを立証する。本アッセイは、無修飾対保護されている切断可能なプライマー、天然対ホットスタートＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、及び天然対ホットスタートＰ．ａ．ＲＮアーゼＨ２を用いるＰＣＲを比較する。
【００８４】
方法：
定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を、ヒトＳＭＡＤ７遺伝子（ｒｓ４９３９８２７，ＮＭ ００５９０４）中の部位に対して特異的なプローブ及びプライマーを用いて２ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（ＧＭ１８５６２，Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，米国ニュージャージー州カムデン）で実施した。反応を０．４ＵのホットスタートＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ｉＴａｑ（商標），Ｂｉｏ−Ｒａｄ，米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）または天然Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｎｚｙｍｅｓ，Ｉｎｃ．，米国マサチューセッツ州ビバリー）のいずれかを使用した。反応物は３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００ｎＭの各プライマー、２００ｎＭの５’−ヌクレアーゼアッセイプローブ（配列番号９）、２ＵのＳＵＰＥＲａｓｅｌｎ（商標）ＲＮアーゼインヒビター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，米国カリフォルニア州カールスバッド）及び５ｆｍｏｌｅｓのＰ．ａ．ＲＮアーゼＨ２（１０μＬの反応物中０．５ｎＭの最終濃度、または２．６ｍＵの無修飾酵素）を含むｉＴａｑ（商標）緩衝液を含んでいた。保護されている切断可能なプライマー（保護されているＳＭＡＤ７  Ｆｏｒ  ｒＣ，配列番号８及び保護されているＳＭＡＤ７  Ｒｅｖ  ｒＧ，配列番号６）または無修飾プライマー（ＳＭＡＤ７  Ｆｏｒ、配列番号７及びＳＭＡＤ７  Ｒｅｖ，配列番号５）を使用した。本研究で使用した全てのオリゴヌクレオチドを表４に下記する。反応物をセットアップし、直ちに流すか、またはセットアップし、ＰＣＲサイクリングの開始前に室温で一晩インキュベートした。サイクリングをＲｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，米国インディアナ州インディアナポリス）を用いて次のように実施した：９５℃で１０分間の後、９５℃で１０秒間及び６０℃で３０秒間の４５サイクル。反応は全て３回実施した。サーモサイクリングを開始する前に最初に９５℃で１０分間インキュベートすると、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼ（ｉＴａｑ）及びホットスタート（無水物処理）Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２酵素が再活性化できる。天然Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ及び無修飾Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２酵素はこの活性化ステップを必要としないが、にもかかわらず全ての反応を同一サイクリングプログラムを用いて行った。
【００８５】
【表４】
2015510776.tif 000011
【００８６】
結果：
ＰＣＲをホットスタートＤＮＡポリメラーゼを用いて実施した場合、反応物をセットアップした後直ちに行っても（示さず）、反応物をサーモサイクリング前に室温で一晩インキュベートしても増殖反応を同一の効率で進行した。図１３は、室温で一晩インキュベートした後にホットスタートＤＮＡポリメラーゼｉＴａｑを用いて得た増殖プロットを示す。無修飾プライマー（左パネル）を使用すると効率的な増殖反応が生じ、天然Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２（左上）と無水物修飾ホットスタートＰ．ａ．ＲＮアーゼＨ２（左下）の添加の間に差異は見られなかった。保護されている切断可能なプライマー（右パネル）を使用しても効率的な増殖反応が生じ、天然Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２（右上）と無水物修飾ホットスタートＰ．ａ．ＲＮアーゼＨ２（右下）の添加の間に差異は見られなかった。ＲＮアーゼＨ２を反応物に添加しないならば、保護されている切断可能なプライマーを使用しても増殖は生じなかった（示さず）。
【００８７】
図１４は、天然Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて得た増殖プロットを示す。全ての反応成分を混合した後直ちに反応を行った場合、増殖は予想した効率で生じ、得られたプロットはホットスタートＤＮＡポリメラーゼを用いて得たものと類似していた（図示せず）。対照的に、サーモサイクリング前に反応プレートを室温で一晩インキュベートしたときには、無修飾プライマー（左パネル）を使用すると標的核酸配列の検出できない増殖が生じた。この場合、活性ＤＮＡポリメラーゼが保護されていないプライマーと一緒に存在し、望ましくない副反応が室温で生じて、試薬が消費され、その後の所望する増殖反応の質が落ちる。保護されている切断可能なプライマー（右パネル）を使用すると、プライマー活性化のために無水物修飾ホットスタートＰ．ａ．ＲＮアーゼＨ２を使用したときには標的核酸の効率的な増殖が生じた（右下）が、天然Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２を使用したときにはそうではなかった（右上）。よって、Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２が室温で殆ど活性を有していなくても、十分な活性がｒｈＰＣＲをこれらの条件下で実施するときには酵素の修飾ホットスタートバージョンが必要であることを維持されている。
【００８８】
室温での増殖反応において反応中の活性ＤＮＡポリメラーゼ及びプライマーの存在に依存する望ましくない反応が生ずる。これらの反応は反応成分を消費し、所望する増殖反応の効率及び質を低下させる。高価なホットスタートＤＮＡポリメラーゼを使用するとこれらの人為産物を解消し得る。或いは、ｒｈＰＣＲと保護されている切断可能なプライマー及び無水物修飾ホットスタートＲＮアーゼＨ２酵素の使用は効率的で特異的な増殖反応が生じ得る。
【００８９】
［実施例４］
以下の実施例は、シングルチューブ高温ＲＴ−ｑＰＣＲ反応における無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸修飾ホットスタートＰ．ａ．ＲＮアーゼＨ２の使用を説明する。
【００９０】
Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２は低温（例えば、２５〜４５℃）で最小の活性を有し、低温ＲＴ反応で使用した条件での酵素活性の低下はこの酵素をＲＴ中存在させるのに十分であり得る。２ステップ低温ＲＴ反応を内部遺伝子特異的プライマー、ランダムヘキサマープライマーまたはオリゴｄＴプライマーを使用し、Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２を存在させるかまたは存在させずに行った。ｃＤＮＡ合成後、ｑＰＣＲをヒト腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１Ａ（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ，ＮＭ ００１０６５）内の１５７ｂｐ領域を増幅させるために実施した。使用したプライマー、プローブ及び標的核酸の配列を表５に下記する。ＰＣＲアッセイはこの遺伝子のポリＡ鎖部位に対して５’に１５０９塩基を配置していることに注目されたい。
【００９１】
【表５】
2015510776.tif 000012
【００９２】
ＴＮＦＲＳＦ１Ａ標的核酸配列中のＦｏｒ（順方向）及びＲｅｖ（逆方向）プライミング部位の部位に下線が付けられている。遺伝子特異的ＲＴプライマーに対するプライマー結合部位をイタリックで示し、下線も付けられている。ＦＡＭ＝６−カルボキシフルオレセイン及びＩＢＦＱ＝アイオワブラック（登録商標）ＦＱ蛍光クエンチャー。
【００９３】
逆転写は、ｌ×ファーストストランド緩衝液（５０ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ８．３）室温で；７５ｍＭ  ＫＣｌ；３ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、０．０１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ｄＮＴＰ、３０Ｕ  Ｓｕｐｅｒｃｒｉｐｔ−ＩＩ  ＲＴ、５Ｕ  ＳＵＰＥＲａｓｅ−Ｉｎ（商標）ＲＮアーゼインヒビター、及び１．３μΜのＴＮＦＲＳＦ１Ａ特異的ＲＴプライマー（配列番号１４）、２５０ｎｇのオリゴｄＴプライマー（配列番号１６）または２５０ｎｇのランダムヘキサマープライマー（配列番号１５）を含む１５μＬの反応物中で１５０ｎｇのヒーラ細胞全ＲＮＡを用いて実施した。反応を２．６ｍＵの無修飾組換えＰ．ａ．ＲＮアーゼＨ２を添加するかまたは添加せずに４２℃で６０分間行った後、７０℃で１５分間のＲＴ酵素不活性化ステップを行った。
【００９４】
増幅反応を上記ＲＴ反応物（例えば、２０ｎｇの全細胞ＲＮＡから作成したｃＤＮＡ）の各々を２μＬ用いて行った。反応物は最終１０μＬ反応容量でｌ×イモレース反応緩衝液（１６ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４，１００ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ８．３）及び０．０１％  トゥィーン−２０）、０．４Ｕ  イモレースＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ，米国マサチューセッツ州トーントン）、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、８００μΜ  ｄＮＴＰ、２００ｎＭ  順方向及び逆方向プライマー（配列番号１１及び１２）及び２００ｎＭ  プローブ（配列番号１３）を含んでいた。使用したＰＣＲサイクリング条件は９５℃で５分間の後、９５℃で１５秒間及び６０℃で６０秒間の２ステップＰＣＲの４５サイクルであった。反応をＲｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，米国インディアナ州インディアナポリス）サーモサイクラーを用いて行った。反応は全て３回行った。定量サイクル値（Ｃｑ）を絶対定量／二次導関数法を用いて求めた。
【００９５】
低温ＲＴでＰ．ａ．ＲＮアーゼＨ２を用いるかまたは用いずに作成したｃＤＮＡからのＴＮＦＲＳＦ１Ａ遺伝子のＰＣＲ増殖の結果を下表６に示す。ＲＮアーゼＨ２の非存在下では、３つのＲＴ−プライマーバリエーションの全てが２５〜２６サイクル範囲のＣｑ値を有する類似の結果を生じた。ＲＮアーゼＨ２の存在下では、遺伝子特異的プライマーまたはランダムヘキサマーを用いてプライミングしたＲＴ反応で検出された標的レベルは「ＲＮアーゼＨ２なしの」対照反応とほぼ同一であった；しかしながら、オリゴｄＴを用いてプライミングしたＲＴ反応は２サイクル遅延を示し、これはこのＲＴ反応には僅かに低いレベルの標的しか存在していなかったことを示している。よって、４２℃で実施したＲＴ反応中にＰ．ａ．ＲＮアーゼＨ２が存在しても、ＲＴプライマーをＰＣＲアッセイ部位（遺伝子特異的プライマー及びランダムヘキサマー）の近くに配置したときに作成された標的ｃＤＮＡのレベルに悪影響を与えなかったが、ＲＴプライマーをＰＣＲアッセイの部位（オリゴｄＴ）から１５０９塩基に配置したときには余り効率的でないＲＴ反応が生じた。多分、これは、長ｃＤＮＡ伸長を必要としたときには反応の感受性に影響を及ぼしたｃＤＮＡ合成中に存在するＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二重鎖中のＲＮＡが部分的に分解するためである。反応をＰ．ａ．ＲＮアーゼＨ２がより高い活性を有しているより高い温度（例えば、５５〜６５℃）で実施したならば、ＲＮＡ鋳型の分解が増えるであろう。
【００９６】
【表６】
2015510776.tif 000013
【００９７】
ＲＴは耐熱性逆転写酵素を用いて高温で実施し得る。高温ＲＴ方法により、低温ではＤＮＡポリメラーゼの処理能力を妨げる複雑な安定な二次構造を有しているＲＮＡ鋳型からのより忠実なｃＤＮＡ合成が可能である。このアプローチの一例はＨａｗｋＺ０５（商標）ＲＴ酵素（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，米国インディアナ州インディアナポリス）を使用する。二価カチオンとしてマグネシウムの代わりにマンガンを使用すると、この酵素はＲＴ−ｑＰＣＲの両ステップを補助し得る耐熱性逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼの両方として機能する。Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２はＭｎ＋＋またはＭｇ＋＋カチオンのいずれかの存在下で十分に機能し、本実施例で使用した反応条件において良好な触媒活性を有していることに注目されたい。反応を、典型的にはＲＴ及びＰＣＲステップの両方をシングルチューブにおいて順次実施する密閉チューブフォーマットで行う。このアプローチは反応チューブが産物を移動させるために開かれているときに必然的に起こる反応産物の空気伝染を制限し、これにより分子診断用途にとって特に重要な特徴である交差汚染及び偽陽性反応が低減する。
【００９８】
ヒトＳＦＲＳ９遺伝子（ＮＭ ００３７６９）中の部位での増幅効率を、ＲＮアーゼＨ２を添加せずに、或いは天然Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２または無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸修飾Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２（上の実施例１を参照されたい）を添加して高温ＲＴ−ｑＰＣＲを用いて研究した。無水物修飾Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２を「ホットスタートＲＮアーゼＨ２」または「ＨＳ−ＲＮアーゼＨ２」とも称する。シングルチューブ高温ＲＴ−ｑＰＣＲの標準方法は無修飾プライマー及び蛍光クエンチした５’−ヌクレアーゼレポータープローブを使用する；ＲＴ反応を逆ＰＣＲプライマーによりプライミングする。この実験は、無修飾プライマー（ＳＦＲＳ９  Ｆｏｒ及びＲｅｖ，配列番号１７及び１８）、または無修飾Ｒｅｖプライマー（配列番号１８）と保護されている切断可能な順方向プライマー（保護されているＳＦＲＳ９  Ｆｏｒ，配列番号１９）の対を用いて行った。保護されている切断可能なＦｏｒプライマーはＰＣＲにおいて機能させるためにはＲＮアーゼＨ２による活性化を必要とすることに注目されたい。無修飾Ｆｏｒプライマーの代わりに保護されている切断可能な順方向プライマーを使用すると、反応特異性が増加し、ＳＮＰ判別が所望されるならば１つの対立遺伝子を選択的に増幅させるために使用し得る（実施例５を参照されたい）。順方向プライマーは反応のＲＴ相中に機能せず、反応のＰＣＲ相が始まるまでＲＮアーゼＨ２により切断（活性化）させる必要がないことに注目されたい。オリゴヌクレオチド配列を下表７に示す。
【００９９】
【表７】
2015510776.tif 000014
【０１００】
ＲＴ−ｑＰＣＲを、ＨａｗｋＺ０５（商標）ファストワンステップＲＴ−ＰＣＲマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，米国インディァナ州インディアナポリス）、１．５ｍＭ  Ｍｎ（ＯＡｃ）２、２００ｎＭ  プライマー及び２００ｎＭ  プローブを含む反応物１０μＬあたり２０ｎｇのヒーラ細胞ＲＮＡを用いて実施した。各反応物に２．６、２５または２００ｍＵの無修飾Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２または新規のＨＳ−Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２を添加した；ＲＮアーゼＨ２なしの対照反応も実施した。反応を５’−ヌクレアーゼアッセイフォーマットで無修飾プライマー（ＳＦＲＳ９  Ｆｏｒ及びＳＦＲＳ９  Ｒｅｖ，配列番号１７及び１８）、または保護されている順方向プライマーと無修飾逆方向プライマー（保護されているＳＦＲＳ９  Ｆｏｒ及びＳＦＲＳ９  Ｒｅｖ，配列番号１９及び１８）をＳＦＲＳ９プローブ（配列番号２０）と共に使用した。
【０１０１】
反応のＲＴ相は、５５℃で５分間、６０℃で５分間及び６５℃で５分間段階的に行ったインキュベーションの最初の１５分間の間に進行した。次いで、９５℃で１０分間インキュベートして標的核酸を変性させた後、ＰＣＲを９２℃で５秒間、６０℃で４０秒間及び７２℃で１秒間の４５サイクルを行った。反応をＲｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，米国インディアナ州インディアナポリス）サーモサイクラーを用いて行った。反応は全て３回実施した。９５℃のインキュベーションもＨＳ−Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２酵素を活性化させることに注目されたい。
【０１０２】
結果を図１５〜１７に示す。無修飾プライマーを用いて行った反応の場合、ＲＮアーゼＨ２を存在させずにシングルチューブ高温ＲＴ−ｑＰＣＲ反応が十分に実施した。しかしながら、少量でも天然Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２の添加は反応に対して有害な影響を有する（図１５）。２．６ｍＵの酵素の添加はＣｑ値を〜１０サイクル変化させ、２５ｍＵの酵素の添加はＣｑ値を〜１４サイクル変化させ、２００ｍＵの酵素を用いて行った反応は明らかな増殖を示さなかった。ＲＴ反応のために使用した反応温度（５５〜６５℃）で、Ｐ．ａ．は非常に活性であり、ｃＤＮＡ合成の初期相の間に多分ＲＮＡ鋳型を分解する。対照的に、無水物修飾ＨＳ−Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２を用いて実施した反応はＲＮアーゼＨ２の非存在下で行った反応と同様の効率でＳＦＲＳ９標的の増殖を示した（図１６）。この場合、ＲＮアーゼＨ２なしで行った反応と２．６〜２００ｍＵのＲＮアーゼＨ２を用いて行った反応の間で差は見られず、修飾ＲＮアーゼ酵素が５５〜６５℃で実施したときでも十分に不活性化され、ｃＤＮＡ合成の間にＲＮＡ標的を分解しなかったことが確認された。保護されている切断可能なＦｏｒ  ＰＣＲプライマー及び無修飾Ｒｅｖ  ＰＣＲプライマーと共に用いて実施した反応の結果を図１７に示す。保護されているプライマーの切断／活性化の必要性と一致して、ＲＮアーゼＨ２の非存在下では増殖は見られなかった。無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸修飾ＨＳ−Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２を使用すると、２５ｍＵまたは２００ｍＵの酵素との反応は無修飾プライマーを用いて見られたものと同一の増殖効率を示した。２．６ｍＵの酵素を用いて行った反応はほぼ４サイクル遅延を示し、これは反応条件が完全プライマー切断を生じなかったことを示している。
【０１０３】
高温ＲＴ−ｑＰＣＲ反応において天然Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２を存在させても、ｃＤＮＡ合成中ＲＮＡが分解し、増殖が防止される。本発明の新規な無水物修飾Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２を使用すると、ＲＴ反応中酵素を不活性状態で存在させることができ、よってｃＤＮＡ合成は正常に進む。ｃＤＮＡ合成後に行った熱変性ステップは修飾ＲＮアーゼＨ２を活性化し、その後ｒｈＰＣＲを保護されている切断可能なプライマーを用いて実施し得る。従って、ｒｈＰＣＲのより高い特異性は高温シングルチューブＲＴ−ｑＰＣＲに適応させ得る。
【０１０４】
［実施例５］
以下の実施例は、ＲＴ−ｑＰＣＲ一塩基多型（ＳＮＰ）アッセイにおける無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸修飾Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２の有用性を説明する。本実施例のアッセイはＫＲＡＳ  ＳＮＰのシングルチューブＲＴ−ｒｈＰＣＲによる判別を立証する。
【０１０５】
ヒトＫＲＡＳ遺伝子（ＮＭ ００４９８５）中のＧ／Ｔ  ＳＮＰ部位を、ｒｈＰＣＲ及び高温シングルチューブＲＴ−ｑＰＣＲ  ＨａｗｋＺ０５（商標）ファストワンステップＲＴ−ＰＣＲマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，米国インディアナ州インディアナポリス）を用いて上記実施例４に記載されている方法に類似の方法を用いて研究した。
【０１０６】
ＲＴ−ｑＰＣＲを、ＨａｗｋＺ０５（商標）ファストワンステップＲＴ−ＰＣＲマスターミックス、１ｍＭ  Ｍｎ（ＯＡｃ）２、２００ｎＭ  プライマー及び２００ｎＭ  プローブを含む反応物１０μＬあたり５０ｎｇのＨＣＴ−１５（Ｇ／Ｇ）またはＳＷ４８０（Ｔ／Ｔ）全細胞ＲＮＡを用いて実施した。ＲＴ及びＰＣＲを実施する前に各反応物に２００ｍＵのＨＳ−ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２を添加した。全ての反応で、ＲＴプライマー及び逆ＰＣＲプライマーの両方として役立つ同一の無修飾ＫＲＡＳ  Ｒｅｖプライマー（配列番号２１）を使用した。幾つかの反応ではＫＲＡＳ  Ｒｅｖプライマーを無修飾の無判別ＫＲＡＳ  Ｆｏｒプライマー（配列番号２２）と対とした。他の反応ではＫＲＡＳ  ＲｅｖプライマーをＧ−ＳＮＰ無判別ＫＲＡＳ  ｒＧ  Ｆｏｒ保護されている切断可能なプライマー（配列番号２３）またはＴ−ＳＮＰ無判別ＫＲＡＳ  ｒＵ  Ｆｏｒ保護されている切断可能なプライマー（配列番号２４）と対とした。全てのアッセイで５’−ヌクレアーゼアッセイレポーターとして同一の蛍光クエンチしたプローブ（配列番号２５）を使用した。実施例５で使用したプライマー及びプローブを下表８に示す。
【０１０７】
【表８】
2015510776.tif 000015
【０１０８】
反応のＲＴ相は、５５℃で５分間、６０℃で５分間及び６５℃で５分間段階的に行った最初の１５分間のインキュベーションの間に進行した。次いで、９５℃で１０分間インキュベートして標的核酸を変性した後、ＰＣＲを９２℃で５秒間、６０℃で４０秒間及び７２℃で１秒間の４５サイクルを行った。反応をＲｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，米国インディアナ州インディアナポリス）サーモサイクラーを用いて行った。反応は全て３回実施した。９５℃のインキュベーションもＨＳ−Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２酵素を活性化することに注目されたい。
【０１０９】
結果を下表９に示す。無修飾の無判別ＫＲＡＳ  Ｆｏｒプライマーを用いて実施した反応は両方の細胞株に対して類似のＣｑ値を示した。保護されている切断可能なＫＲＡＳ  ｒＧプライマーはＨＣＴ−１５  ＤＮＡ（Ｇ／Ｇ）を用いて２５．９のＣｑを示したが、ＳＷ４８０  ＤＮＡ（Ｔ／Ｔ）を用いると１２．３サイクルが３８．２に遅延した。逆に、保護されている切断可能なＫＲＡＳ  ｒＵプライマーはＨＣＴ−１５  ＤＮＡ（Ｇ／Ｇ）を用いると３６．８の遅延Ｃｑ、ＳＷ４８０  ＤＮＡ（Ｔ／Ｔ）を用いると２５．９のＣｑを示した。
【０１１０】
【表９】
2015510776.tif 000016
【０１１１】
無水物修飾ＨＳ−Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２を用いると、非常に正確なＳＮＰ  ｒｈＰＣＲアッセイをシングルチューブ高温ＲＴ−ｑＰＣＲフォーマットで実施でき、本発明の方法で使用される修飾酵素の有用性が立証される。
【０１１２】
［実施例６］
本実施例は、ワンチューブＲＴ−ｑＰＣＲにおいて２つの保護されているＰＣＲプライマーを外部ＲＴプライマーと共に使用する方法を立証する。増殖産物がＲＴプライマーから派生する可能性を無くすために、ＲＴプライマーはｃＤＮＡ合成をプライミングする能力を保持しているが、ＰＣＲを補助しないように修飾されている。
【０１１３】
実施例４及び５は、無水物修飾ＨＳ−Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２は高温ＲＴ反応中に存在し得ること及び不活性化酵素がｃＤＮＡ合成中にＲＮＡ鋳型を分解しないことを立証している。本実施例は更に、酵素は９５℃で１０分間のインキュベーションで再活性化され、その後ｒｈＰＣＲは保護されている切断可能なプライマーを用いて実施され得ることを立証している。これらの実施例では、逆ＰＣＲプライマーは修飾されておらず、遺伝子特異的ＲＴプライマーとしても機能した。（無修飾逆方向プライマーの代わりに）保護されている切断可能な逆方向プライマーを使用して追加の特異性を所望するならば、ＰＣＲ逆方向プライマーがこの時点で保護されているのでＲＴプライマーとして機能させるために第３プライマーオリゴヌクレオチドを反応物に添加することが必要となる。新規のＲＴプライマーをＰＣＲ逆方向プライマーに対して３’に配置する。しかしながら、修飾されていないので、このプライマーはＰＣＲ反応に関与し得、保護されている切断可能な逆方向プライマーの使用により獲得される特異性の改善がなくなる。従って、ＲＴ反応においてｃＤＮＡ合成をプライミングし得るが、その後の増殖反応に関与しないようにＲＴプライマーを修飾することが望ましい。１つのアプローチは、ＲＴ反応は例えば６０℃で進行し得るが、増殖反応が７０℃で進行するようにＰＣＲプライマーよりも低い融点（Ｔｍ）を有するＲＴプライマーを作成することである。すなわち、ＰＣＲをＲＴプライマーのＴｍを十分に上回る温度で行い、このプライマーはもはや鋳型に対してアニールしない。しかしながら、商業的な高温ＲＴ方法において使用する高温ＲＴプロトコルは典型的にはＲＮＡ二次構造を破壊するために最高６５℃でのインキュベーションを含み、プライマーアニーリングが６０℃またはその前後で生ずるように多くのＰＣＲ反応が設計されている。異なるＴｍをＲＴ対ＰＣＲプライマーに対して使用し得るが。この方法はＰＣＲプライマー及び反応を高温で運転するように再設計しなければならない。本実施例は、標準反応温度で修飾ＲＴプライマーを使用する方法を立証し、この場合ＲＴプライマーはｃＤＮＡ合成をプライミングする能力はあるが、その後の増殖反応に関与しない。
【０１１４】
同一の目的を達成する２つの修飾戦略が記載されている。第１は、切断可能なリンケージがＲＴプライマー内の内部に含まれている。ＲＴ反応（ｃＤＮＡ合成）をプライマーインタクトで実施し、その後化学的または酵素的事象が切断しやすいリンケージでＲＴプライマーを切断させる。残りのプライマー断片はもはやＰＣＲにおいて通常使用されている反応温度で更なるＤＮＡ合成反応をプライミングするために十分な結合親和性を有していない。プライマー中に切断部位を導入するために当業者に公知の各種アプローチ、例えば化学切断を受けやすいリンケージ、制限酵素部位等を使用し得る。本実施例では、シングルＲＮＡ塩基をＲＴプライマーの中央またはその周りに配置する。無水物修飾ＨＳ−Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２を使用すると、ＲＮアーゼＨ２はｃＤＮＡ合成中不活性であり、プライマーは正常に機能する。ｃＤＮＡ合成後、反応物を９５℃で約１０分間加熱し、ＨＳ−Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２を再活性化させる。反応物をＰＣＲ中５０〜７０℃に戻すと、ＲＴプライマーそれ自体はＲＮアーゼＨ２アタッチに対する基質となる。ＲＴプライマーを切断し、生じた短断片はこの時点で低いＴｍを有し、５０〜７０℃の範囲で増殖反応に関与し得ない。よって、ＲＴプライマーはｃＤＮＡ合成をプライミングするのに役立つが、ＰＣＲに関与しない。
【０１１５】
第２は、オリゴヌクレオチドのＤＮＡ合成をプライミングする能力に影響を与えないが、ＤＮＡ合成のための鋳型として機能する能力に影響を与えるＲＴプライマーの中心またはその近くに修飾基を配置する。よって、線形プライマー伸長反応（例えば、ｃＤＮＡ合成）は補助されるが、指数的増殖反応は防止される；その後の増殖サイクル中、伸長産物がプライマー保護基の部位で時期尚早に停止し、その結果最終増殖産物は短くなり、ＲＴプライマーが５０〜７０℃の範囲の反応温度で結合するのに十分な長さのプライマー結合部位を含有していない。この目的に役立ち得る各種保護基、例えば２’−修飾ＲＮＡ残基（例えば、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ）、脱塩基残基（脂肪族スペーサー、ｄ−スペーサー）、非天然塩基（例えば、５−ニトロインドール）等（Ｂｅｈｌｋｅら，米国特許Ｎｏｓ．７，１１２，４０６及び７，６２９，１５２を参照されたい）が当業者に公知である。本実施例は、保護基として、鋳型機能を阻止する（すなわち、連鎖停止反応を誘導する）が、標的核酸に対する修飾プライマーのハイブリダイゼーションを脱安定化し得ない利点を有する非ヌクレオチドナフチル−アゾ修飾因子（Ｌａｉｋｈｔｅｒら，米国特許Ｎｏ．８，０８４，５８８及びＲｏｓｅら，米国特許出願２０１１／０２３６８９８を参照されたい）を使用している。鋳型機能を壊す修飾基の多く、例えば脂肪族スペーサー、ｄ−スペーサー等は二重鎖形成（例えば、プライマーのより低いＴｍ）にも影響を与える。
【０１１６】
方法：
ＲＴ−ｑＰＣＲを、ＨａｗｋＺ０５（商標）ファストワンステップＲＴ−ＰＣＲマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，米国インディアナ州インディアナポリス）、１．５ｍＭ  Ｍｎ（ＯＡｃ）２、２００ｎＭ  ＰＣＲプライマー及び２００ｎＭ  プローブ（ＳＦＲＳ９プローブ，配列番号２０）を含む反応物１０μＬあたり１０ｎｇのヒーラ細胞全ＲＮＡを用いて実施した。外部ＲＴプライマーを２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭまたは０ｎＭで使用した。各反応物にＲＮアーゼＨ２を添加しないかまたは１０ｍＵの無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸修飾ＨＳ−Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２を添加した。増殖を無修飾ＰＣＲプライマー（ＳＦＲＳ９  Ｆｏｒ及びＲｅｖ，配列番号１７及び１８）または保護されている切断可能なｒｈＰＣＲプライマー（ＳＦＲＳ９  Ｆｏｒ  ｒＧ及びＳＦＲＳ９  Ｒｅｖ  ｒＡ，配列番号２７及び２８）のいずれかを用いて実施した。反応のＲＴ相を外部ＲＴプライマーなしで、または無修飾プライマー（ＳＦＲＳ９−ＲＴ，配列番号３１）、内部ｌＲＮＡ残基を有する修飾プライマー（ＳＦＲＳ９−ＲＴ−ｒＣ，配列番号３０）、または内部非ヌクレオチドナフチル−アゾ修飾因子を有する修飾プライマー（ＳＦＲＳ９−ＲＴ−ＺＥＮ，配列番号２９）を用いて実施した。配列を下表１０に示す。
【０１１７】
【表１０】
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【０１１８】
反応のＲＴ相は、５５℃で５分間、６０℃で５分間及び６５℃で５分間段階的に行ったインキュベーションの最初の１５分間の間に進行した。次いで、標的核酸を９５℃で１０分間インキュベートして変性させた後、ＰＣＲを９２℃で５秒間、６０℃で４０秒間及び７２℃で１秒間の４５サイクルを行った。反応をＲｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、米国インディアナ州インディアナポリス）サーモサイクラーを用いて行った。反応は全て３回実施した。９５℃のインキュベーションもＨＳ−Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２酵素を活性化することに注目されたい。増殖後、サンプルを取り出し、８％  非変性ゲルでのポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分離し、ｌ×ＧｅｌＳｔａｒ（登録商標）核酸ステイン（Ｌｏｎｚａ，米国メイン州ロックランド）を用いて１０分間染色した。生成物をＵＶ励起での蛍光により可視化した。
【０１１９】
ｑＰＣＲ  ５’−ヌクレアーゼアッセイのサイクル閾値を下表１１に示す。予想されたように、保護されているプライマーを用いて行った反応はＲＮアーゼＨ２の非存在下では増幅しなかった。他の増殖反応はすべて比較的類似のＣｑ値を示したが、増幅産物は図１８〜２０のゲル画像に明示され得るように使用したＲＴプライマーに応じて反応間で大きく変化した。
【０１２０】
【表１１】
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【０１２１】
増殖反応を、Ｆｏｒ及びＲｅｖ  ＰＣＲプライマー（配列番号１７及び１８、または２７及び２８）から作成した所望の１４５ｂｐアンプリコン、またはＦｏｒ  ＰＣＲプライマー（配列番号１７及び２７）及びＲＴプライマー（配列番号２９、３０または３１）から作成した所望しない１７０ｂｐアンプリコンを産生した。外部ＲＴプライマーなしでＦｏｒ及びＲｅｖ  ＰＣＲプライマーを使用すると、予想される１４５ｂｐアンプリコンのみが産生された（図１９，「０ｎＭ  ＲＴプライマー」レーン）。
【０１２２】
無修飾ＲＴプライマー（配列番号３１）はＰＣＲ反応に関与して、異なる量の望ましくない１７０ｂｐ産物が形成された（図１８）。この産物の量は低濃度のＲＴプライマーを使用すると低減した；しかしながら、１０ｎＭの無修飾ＲＴプライマーのみを使用したときでも大量の産物が残った。対照的に、中心ｒＣＲＮＡ残基を有する修飾ＲＴプライマー（配列番号３０）を使用すると所望の１４５ｂｐアンプリコンが専ら作成された（図１９）。このオリゴヌクレオチドはＲＴ反応をプライミングするが、加熱再活性化後Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２により分解し、よってＰＣＲ増殖に関与し得ない。低ＲＴ濃度（５０ｎＭ及び１０ｎＭ）の使用は全ての外部プライマー設計で所望産物の最もロバストな収率を与えた。中心脱塩基ナフチル−アゾ修飾因子を含有している修飾ＲＴプライマー（配列番号２９）（図２０）を使用しても、大部分所望の１４５ｂｐアンプリコンを産生した。このオリゴヌクレオチドはＲＴ反応をプライミングし、ＰＣＲ中ＤＮＡ合成をプライミングするために有能なままであるが、鋳型機能に欠陥があり、最終増殖産物は完全プライマー結合部位を含有していないので、線形増殖を維持し得、指数的増殖を補助し得ない。このプライマーを低濃度で使用しても（５０ｎＭ及び１０ｎＭ）最もロバストな反応を示した。
【０１２３】
無水３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸修飾ＨＳ−Ｐ．ａ．ＲＮアーゼＨ２により、ｒｈＰＣＲをシングルチューブ高温ＲＴ−ｑＰＣＲフォーマットで保護されているＦｏｒ及びＲｅｖプライマーを用いて実施できる。無修飾ＲＴプライマーを使用すると望ましくないより長い増殖産物が生ずるが、ＲＴをプライミングし得るが、ＰＣＲに関与できない修飾ＲＴプライマーを使用すると所望のアンプリコンが高い特異性で産生される。
【０１２４】
本明細書中で引用されている出願公開、特許出願及び特許明細書を含めた全ての参考文献は、各参考文献が個々に、具体的に参照により組み入れると明記されており、全文が本明細書中に記載されているのと同程度に参照により組み入れられる。
【０１２５】
（特に、以下の特許請求の範囲の関係で）本発明を記載している内容中の用語“ａ”、“ａｎ”、“ｔｈｅ”及び類似の使用は、明細書中に別段の指示がないかまたは前後関係から明らかに否定されていない限り、単数形及び複数形の両方を含むと解釈されるべきである。用語“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”、“ｈａｖｉｎｇ”、“ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ”及び“ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ”は、別段の記載がない限り、制約のない用語（すなわち、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味するが、これらに限定されない）である。本明細書中の値の範囲の記載は単に本明細書中に別段の指示がない限り、範囲内に入るそれぞれ別々の値を個別に言及する簡略標記法として使用すると意図され、それぞれ別々の値は本明細書中に個別に記述されているように明細書中に組み込まれる。本明細書中に記載されている方法は全て、本明細書中に別段の指示がないかまた前後関係により明らかに否定されていない限り、適当な順序で実施され得る。本明細書中に記載されている任意及び全ての例、または例示的用語（例えば、「例えば（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）は本発明をより明らかにするためだけであり、別段の主張がない限り本発明の範囲に限定を加えない。明細書中の用語は特許請求されていない要素を本発明の実施のために必須であると解釈されるべきでない。
【０１２６】
本発明を実施するために本発明者らに公知の最良モードを含めた本発明の好ましい実施形態が本明細書中に記載されている。これらの好ましい実施形態の改変は上の記載を読めば当業者にとって自明となるであろう。本発明者らは必要に応じて当業者が前記改変を使用することを期待し、本発明者らは本発明が本明細書中に具体的に記載されている以外の別の方法で実施されると意図している。従って、本発明は施行される法律により許容される本明細書に添付されている特許請求の範囲の主題の全ての修飾及び均等物を包含する。更に、上記した要素の全ての可能な変更での組合せは本明細書中に別段の指示がないかまたは前後関係により明らかに否定されていない限り、本発明により包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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