(57)【要約】本発明は医薬分野に関し、具体的にはフルオキセチンの色素脱失疾患を治療する用途に関する。薬理学研究により、フルオキセチンは色素脱失疾患を治療する効果、特に白毛症、白斑を治療する効果を有することが判明する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
色素脱失疾患の治療及び／又は予防のための薬物を調製するフルオキセチンの用途。
【請求項２】
色素脱失疾患は白斑である、請求項１に記載の用途。
【請求項３】
色素脱失疾患は白毛症である、請求項１に記載の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬分野に関し、具体的にはフルオキセチンの色素脱失疾患を治療する用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
色素脱失性皮膚病は、皮膚のメラニン細胞欠乏又はメラニン合成機能の低下、損傷に起因するよく見られる後天性の色素沈着減少性皮膚病である。例えば、白毛症はよく見られる色素脱失疾患であり、幅広い人達に及んでいる。また、皮膚難病である白斑のような皮膚病は世界各地において発生しており、すべての民族が巻き添えにされる可能性があり、患者の通常の生活に深刻な影響を与えている。現在、色素脱失性皮膚病の治療は未だに困難であり、且つ再発率が高い。既存の色素向上薬物そのものは色素合成促進作用が明らかではなく、臨床でよく用いられる局所外用色素向上薬（例えば、ソラレン（訳注：Ｐｓｏｒａｌｅｎ））は、常に効果的に機能しにくくて、光感受性を有する。そのため、治療効果の確実な治療薬物を開発する必要が益々差し迫っている。
【０００３】
フルオキセチン（ｆｌｕｏｘｅｔｉｎｅ）の化学名はＮ−メチル−γ−［４−（トリフルオロメチル）フェノキシ］フェニルプロピルアミンであり、臨床で用いられているのはフルオキセチンの塩酸塩である。その商品名はプロザック（Ｐｒｏｚａｃ（登録商標））であり、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙにより開発され、１９８７年にアメリカで初めて発売され、引き続いてイギリス、フランス、ドイツ、日本等の国で応用され、１９９６年にわが国で登録された（Ｘ９６０４４５）。その分子式はＣ１７Ｈ１８Ｆ３ＮＯ・ＨＣｌであり、分子量は３４５．７９であり、塩酸塩は白い結晶であり、融点は１７９〜１８２℃である（溶解）。
【０００４】
フルオキセチンの主な薬理効果は、中枢神経系シナプス前膜の５−ヒドロキシトリプタミンに対する再取り込みを選択的に抑制することにあるので、選択的５−ヒドロキシトリプタミン再取り込み阻害薬とも呼ばれる。フルオキセチンは経口吸収が良く、吸収は食べ物に影響されない。血中濃度は６〜８時間でピークに達し、その活性代謝産物である脱メチル化フルオキセチンの半減期は７〜１０ｄである。腎排泄は主な排出ルートであり、約８０％の薬物は尿液として排泄され、１５％の薬物は大便として排泄される。フルオキセチンは基本的に肝臓で代謝され、肝臓病はその代謝に影響することが可能である。臨床で成人の欝病、強迫神経症と神経性過食症の治療に使用され、さらに広場恐怖症を有する又は有しないパニック障害の治療に使用される。フルオキセチンは、主として選択的にセロトニン作動系に作用し、コリン作動系、アドレナリン作動系及びヒスタミン系に対する作用が弱いので、従来の三環系、ヘテロ環系抗鬱薬、モノアミン酸化酵素阻害薬類と比べて、治療効果が良く、有害反応が軽くて少なく、安全性が高く、耐性が良いという特徴を持つ。そのよく見られる有害反応には胃腸障害、神経失調、例えば食欲不振、吐き気、頭痛、不眠、発汗等がある。フルオキセチンは臨床で広く応用され、副作用が少ないが、皮膚色素合成に対する影響については、今までまだ研究されたことはない。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、フルオキセチンの治療用途、即ち、フルオキセチンの色素脱失性疾患を治療する用途、特に白毛症、白斑を治療する用途に用いられることを開示している。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１はフルオキセチンのＢ１６Ｆ１０細胞の成長に対する影響を表す図である。
【図２】図２はフルオキセチンのＢ１６Ｆ１０細胞のチロシナーゼ活性に対する影響を表す図である。
【図３】図３はフルオキセチンのＢ１６Ｆ１０細胞のメラニン含有量に対する影響を表す図である。
【図４】図４はフルオキセチンのＢ１６Ｆ１０細胞のメラニン合成に重要な蛋白質ＭＩＴＦ、ＴＹＲ、ＴＲＰ−１及びＴＲＰ−２の蛋白質表現に対する影響を表す図である。
【図５】図５はフルオキセチンのＢ１６Ｆ１０細胞のメラニン合成に重要な蛋白質ＭＩＴＦ、ＴＹＲ、ＴＲＰ−１及びＴＲＰ−２に対するバンドのグレイスケールを走査した結果である。
【図６】図６はフルオキセチンのヒト初代メラニン細胞の増殖に対する影響を表す図である。
【図７】図７はフルオキセチンのヒト初代メラニン細胞のチロシナーゼ活性に対する影響を表す図である。
【図８】図８はフルオキセチンのヒト初代メラニン細胞のメラニン含有量に対する影響を表す図である。
【図９】図９はフルオキセチンのヒト初代メラニン細胞のメラニン合成に重要な蛋白質ＭＩＴＦ、ＴＹＲ、ＴＲＰ−１及びＴＲＰ−２の蛋白質表現に対する影響を表す図である。
【図１０】図１０はフルオキセチンのヒト初代メラニン細胞のメラニン合成に重要な蛋白質ＭＩＴＦ、ＴＹＲ、ＴＲＰ−１及びＴＲＰ−２に対するバンドのグレイスケールを走査した結果である。
【図１１】図１１はフルオキセチン投与第１２日目の同時に脱毛したＣ５７ＢＬ／６マウスの背中の皮膚の色の具合を表す図である。
【図１２】図１２はフルオキセチンのＣ５７ＢＬ／６マウスの毛包メラノサイトのＭＩＴＦ、ＴＹＲ、ＴＲＰ−１及びＴＲＰ−２の蛋白質表現に対する影響を表す図である。
【図１３】図１３はフルオキセチンのＣ５７ＢＬ／６マウスの毛包メラノサイトのＭＩＴＦ、ＴＹＲ、ＴＲＰ−１及びＴＲＰ−２に対するバンドのグレイスケールを走査した結果である。
【図１４】図１４はＣ５７ＢＬ／６マウスの毛包メラニン合成に重要な蛋白質の免疫組織化学結果である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
以下に本発明の一部の薬効学試験及び結果を示す。
【０００８】
第一部分：フルオキセチンのＢ１６Ｆ１０マウスのメラノーマ細胞系メラニン合成に対する影響
一、フルオキセチンのＢ１６Ｆ１０細胞の増殖に対する影響
ＭＴＴ法により、細胞増殖率を測定：
指数増殖期にあり、状態の良いＢ１６Ｆ１０細胞を採取して、消化させて、カウントし、１０％ウシ胎児血清含有高グルコースＤＭＥＭ培養液にて細胞を再懸濁させ、細胞を９６ウェルカルチャープレートに接種し、接種密度は２．２×１０４個／ｍｌであり、接種量は１８０μｌ／ウェルであり、３７℃、５％ＣＯ２の培養器に置いて２４時間培養した。異なる濃度の塩酸フルオキセチンを加えて、２０μｌ／ウェルで、７２時間培養した。１ウェル当たりにＭＴＴを２０μｌ加え、３７℃の培養器に４時間反応させた。上澄み液を取り除いて、１ウェル当たりにＤＭＳＯを１５０μｌ加え、シェーカーに置いて１０分間振とうした。マイクロウェルプレート計測器を用いて、波長５７０ｎｍにおいて１ウェル当たりの吸光度を測定し、細胞増殖率を計算した。その結果を図１に示す。
【０００９】
実験の結果：ブランク対照群と比べた結果、フルオキセチン投与群（０．１−１０μＭ）は、Ｂ１６Ｆ１０細胞の成長に顕著な影響がない（Ｐ＞０．０５）。
【００１０】
実験の結論：フルオキセチン（０．１−１０μＭ）は、Ｂ１６Ｆ１０のメラノーマ細胞に低い毒性及び低い発癌作用を示している。
【００１１】
二、フルオキセチンのＢ１６Ｆ１０細胞のチロシナーゼ活性に対する影響
Ｌ−ＤＯＰＡ酸化法により、チロシナーゼ活性を測定：
指数増殖期にあり、状態の良いＢ１６Ｆ１０細胞を採取して、消化させて、カウントし、細胞を６ウェルプレートに接種し、接種濃度は約１×１０５個／ｍｌであり、接種量は２ｍｌ／ウェルであり、３７℃、５％ＣＯ２の培養器に置いて２４時間培養した。１．８ｍｌ／ウェルで、２．５％ウシ胎児血清含有高グルコースＤＭＥＭ培地に交換し、０．２ｍｌ／ウェルで異なる濃度の塩酸フルオキセチンを加えて、７２時間培養した。ＰＢＳにて２回洗浄し、細胞をｄｏｆｆチューブに集めて、１本当たりのチューブに非変性溶解バッファー（１ｎＭ  ＰＭＳＦを含む）を１００μｌ加え、４℃で２０分間溶解させて、４℃、１２０００ｒ／ｍｉｎで１０分間遠心分離させ、上澄み液を取って蛋白質定量法（ＢＣＡ法）で蛋白質濃度を計算した。３０μｇの蛋白質を含む量を取って、９６ウェルプレートに加えて、ＰＢＳ（０．１Ｍ、ｐＨ６．８）で１００μｌに定量して、０．０１％Ｌ−ＤＯＰＡを１００μｌ加え、濃度ごとに３つのマルチウェルを設け、３７℃で遮光で６０分間培養して、波長４７５ｎｍにおいてＯＤ値を測定した。１μｇ当たりの蛋白質の吸光度を計算し、結果は％で表され、その結果を図２に示す。図２において、対照群と比べて、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１となる。ＰＳＯはソラレンである。
実験の結果：ブランク対照群と比べた結果、フルオキセチンはＢ１６Ｆ１０細胞のチロシナーゼ活性を明らかに促進する。フルオキセチンが１μＭ、５μＭの場合、Ｐ＜０．０５である。フルオキセチンが１０μＭの場合、Ｐ＜０．０１である。最高濃度の場合、酵素活性向上率は陽性対照薬剤のソラレンに近い。
【００１２】
実験の結論：フルオキセチンは、Ｂ１６Ｆ１０のメラノーマ細胞メラニン合成の律速酵素（訳注：ｒａｔｅ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）であるチロシナーゼの活性を明らかに促進する効果を有する。
【００１３】
三、フルオキセチンのＢ１６Ｆ１０細胞のメラニン含有量に対する影響
ＮａＯＨ溶解法により、メラニン含有量を測定：
指数増殖期にあり、状態の良いＢ１６Ｆ１０細胞を採取して、消化させて、カウントし、細胞を直径１０ｃｍの培養皿に接種し、接種量は３×１０５個／枚であり、３７℃、５％ＣＯ２の培養器に置いて２４時間培養した。培地を２．５％ウシ胎児血清含有高グルコースＤＭＥＭ培地に交換し、異なる濃度の塩酸フルオキセチンを加え、７２時間培養した。ＰＢＳにて２回洗浄し、細胞を集めて、非変性溶解バッファー（１ｎＭ  ＰＭＳＦを含む）を３００ｕｌ加え、４℃で２０分間溶解させた。４℃、１２０００ｒ／ｍｉｎで１０分間遠心分離させ、上澄み液を取って蛋白質定量法（ＢＣＡ法）で総蛋白質含有量を計算した。下層のメラニン沈澱にＮａＯＨ（１０％ＤＭＳＯを含む）を２００μｌ加え、８０℃のウォーターバス中に置いて２時間溶解させた。メラニン標準品により標準メラニン含有量のグラフを作成した。完全に溶解したメラニンを２００μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに加え、４０５ｎｍにおいて吸光度を測定し、１ｍｇ当たりの蛋白質のメラニン含有量を計算し、その結果を図３に示す。図３において、対照群と比べて、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１となる。ＰＳＯはソラレンである。
【００１４】
実験の結果：ブランク対照群と比べた結果、フルオキセチン（１−１０μＭ）はＢ１６Ｆ１０細胞のメラニン含有量を明らかに増加させた。フルオキセチンが１μＭの場合、Ｐ＜０．０５である。フルオキセチンが５μＭ、１０μＭの場合、Ｐ＜０．０１であり、且つ向上率は陽性対照薬剤のソラレンを超えている。
【００１５】
実験の結論：フルオキセチンはＢ１６Ｆ１０細胞のメラニン含有量を明らかに向上させることができる。
【００１６】
四、フルオキセチンのＢ１６Ｆ１０細胞のメラニン合成に重要な蛋白質ＴＹＲ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２及びＭＩＴＦの表現に対する影響
Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ法により、メラニン合成に重要な蛋白質の表現を検出：
指数増殖期にあり、状態の良いＢ１６Ｆ１０細胞を採取して、消化させて、カウントし、細胞を６ウェルプレートに接種し、前記のようにグループに分けて薬物処理を行い、７２時間後細胞を集めて、細胞溶解液を加え、遠心分離させて上澄み液を取ってＢＣＡ法により、蛋白質濃度を測定した後、蛋白質溶解液を同じ濃度まで調整して、同体積の２倍のローディングバッファー（訳注：ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）と均一に混合させて、沸かして５分後ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を行った。電気泳動完了後、１００Ｖの電圧で１時間かけて蛋白質をニトロセルロース膜に転写して、５％スキムミルク含有ＴＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で１時間ブロッキングした。それぞれに、フィルムと、ブロッキング液に溶解しているＴＹＲ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＩＴＦ及びβ−ａｃｔｉｎ一次抗体（１：２００）とを４℃で徹夜で培養し、ＴＢＳＴにて５分／回で３回洗浄した。その後、対応する二次抗体（１：４０００）を加えて１時間培養し、ＴＢＳＴにて５分／回で３回洗浄した。フィルムを配合された超高光感度の持つＥＣＬ検出試薬混合液に５分間浸漬させ、暗室でＸ線フィルムに感光させた。現像及び定着により結果を得、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社のＱｕａｎｔｉｔｙ  ｏｎｅソフトを用いて結果を分析した。その結果を図４、図５に示す。図面においては、対照群と比べて、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１となる。ＦＬＵはフルオキセチンを表す。
【００１７】
実験の結果：ブランク対照群と比べた結果、フルオキセチンは、Ｂ１６Ｆ１０細胞のＭＩＴＦ、チロシナーゼ（ＴＹＲ）及びチロシナーゼ関連蛋白質１（ＴＲＰ−１）の蛋白質表現を明らかに向上させることができ、有意差があるが、チロシナーゼ関連蛋白質２（ＴＲＰ−２）の蛋白質レベルには明らかな影響がない。
【００１８】
実験の結論：フルオキセチンは、Ｂ１６Ｆ１０細胞のメラニン合成に重要な蛋白質（ＭＩＴＦ、ＴＹＲ、ＴＲＰ１）の表現を向上させることにより、メラニン含有量を増加させることができる。
【００１９】
第二部分：フルオキセチンの正常ヒト初代メラニン細胞のメラニン合成に対する影響
一、フルオキセチンのヒト初代メラニン細胞の増殖に対する影響
ＭＴＴ法により、細胞増殖率を測定：
指数増殖期にあり、状態の良い正常ヒト初代メラニン細胞を採取して、消化させて、カウントし、細胞を９６ウェルカルチャープレートに接種し、接種密度は５×１０４個／ｍｌであり、接種量は１８０μｌ／ウェルであり、３７℃、５％ＣＯ２の培養器に置いて２４時間培養した。異なる濃度の塩酸フルオキセチンを加えて、７２時間培養した。１ウェル当たりにＭＴＴを２０μｌ加え、３７℃の培養器に４時間反応させた。上澄み液を取り除いて、１ウェル当たりにＤＭＳＯを１５０μｌ加え、シェーカーに置いて１０分間振とうした。マイクロウェルプレート計測器を用いて、波長５７０ｎｍにおいて１ウェル当たりの吸光度を測定し、細胞増殖率を計算した。その結果を図６に示す。
【００２０】
実験の結果：ブランク対照群と比べた結果、フルオキセチン投与群は、正常ヒト初代メラニン細胞の成長には顕著な影響がない（Ｐ＞０．０５）。
【００２１】
実験の結論：フルオキセチンはヒト初代メラニン細胞の増殖には明らかな影響がなく、且つ低い毒性を示している。
【００２２】
二、フルオキセチンのヒト初代メラニン細胞のチロシナーゼ活性に対する影響
Ｌ−ＤＯＰＡ酸化法により、チロシナーゼ活性を測定：
指数増殖期にあり、状態の良いヒト初代メラニン細胞を採取して、消化させて、カウントし、細胞を６ウェルプレートに接種し、接種濃度は約１×１０５個／ｍｌであり、接種量は２ｍｌ／ウェルであり、３７℃、５％ＣＯ２の培養器に置いて２４時間培養した。異なる濃度の塩酸フルオキセチンを加え、７２時間培養した。ＰＢＳにて２回洗浄し、細胞をｄｏｆｆチューブに集めて、１本当たりのチューブに非変性溶解液（１ｎＭ  ＰＭＳＦを含む）を８０μｌ加え、４℃で２０分間溶解させ、４℃、１２０００ｒ／ｍｉｎで１０分間遠心分離させ、上澄み液を取って蛋白質定量法（ＢＣＡ法）で蛋白質濃度を計算した。１０μｇの蛋白質を含む量を取って、９６ウェルプレートに加えて、ＰＢＳ（０．１Ｍ、ｐＨ６．８）で１００μｌに定量して、０．０１％Ｌ−ＤＯＰＡを１００μｌ加え、濃度ごとに３つのマルチウェルを設け、３７℃で遮光で６０分間培養して、波長４７５ｎｍにおいてＯＤ値を測定した。１μｇ当たりの蛋白質の吸光度を計算し、結果は％で表され、その結果を図７に示す。図面においては、対照群と比べて、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１となる。ＰＳＯはソラレンを表す。
【００２３】
実験の結果：ブランク対照群と比べた結果、フルオキセチンはヒト初代メラニン細胞のチロシナーゼ活性を明らかに促進した（Ｐ＜０．０１）。それに、フルオキセチンが５μＭ、１０μＭの場合、酵素活性向上率は陽性対照薬剤のソラレンを超えている。
【００２４】
実験の結論：テストの濃度以内に、フルオキセチンは、ヒト初代メラニン細胞のメラニン合成の律速酵素であるチロシナーゼの活性を明らかに促進する効果を有する。
【００２５】
三、フルオキセチンのヒト初代メラニン細胞のメラニン含有量に対する影響
ＮａＯＨ溶解法により、メラニン含有量を測定：
指数増殖期にあり、状態の良いヒト初代メラニン細胞を採取して、消化させて、カウントし、細胞を６ウェルプレートに接種し、接種濃度は約１×１０５個／ｍｌであり、接種量は２ｍｌ／ウェルであり、３７℃、５％ＣＯ２の培養器に置いて２４時間培養した。異なる濃度の塩酸フルオキセチンを加え、７２時間培養した。ＰＢＳにて２回洗浄し、細胞を集めて、非変性溶解液（１ｎＭ  ＰＭＳＦを含む）を８０μｌ加え、４℃で２０分間溶解させた。４℃、１２０００ｒ／ｍｉｎで１０分間遠心分離させ、上澄み液を取って蛋白質定量法（ＢＣＡ法）で総蛋白質含有量を計算した。下層のメラニン沈澱にＮａＯＨ（１０％ＤＭＳＯを含む）を１００μｌ加え、８０℃のウォーターバス中に置いて２時間溶解させた。メラニン標準品で標準メラニン含有量のグラフを作成した。１００μｌ／ウェルで、完全に溶解したメラニンを９６ウェルプレート中に加えて、４０５ｎｍにおいて吸光度を測定し、１ｍｇ当たりの蛋白質のメラニン含有量を計算し、その結果を図８に示す。図面においては、対照群と比べて、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１となる。ＰＳＯはソラレンである。
【００２６】
実験の結果：ブランク対照群と比べた結果、フルオキセチンはヒト初代メラニン細胞のメラニン含有量を明らかに向上させた（Ｐ＜０．０１）。それに、向上率は陽性対照薬剤のソラレンに近く、又はそれを超えている。
【００２７】
実験の結論：フルオキセチンはヒト初代メラニン細胞のメラニン含有量を明らかに促進することができる。
【００２８】
四、フルオキセチンのヒト初代メラニン細胞のメラニン合成に重要な蛋白質ＴＹＲ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２及びＭＩＴＦの表現に対する影響
Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ法により、メラニン合成に重要な蛋白質の表現を検出：
指数増殖期にあり、状態の良いヒト初代メラニン細胞を採取して、消化させて、カウントし、細胞を６ウェルプレートに接種し、前記のようにグループに分けて薬物処理を行い、７２時間後細胞を集めて、細胞溶解液を加え、遠心分離させて上澄み液を取ってＢＣＡ法により、蛋白質濃度を測定した後、蛋白質溶解液を同じ濃度まで調整して、同体積の２倍のローディングバッファーと均一に混合させて、沸かして５分後ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を行った。電気泳動完了後、１００Ｖの電圧で１時間かけて蛋白質をニトロセルロース膜に転写して、５％スキムミルク含有ＴＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で１時間ブロッキングした。それぞれに、フィルムと、ブロッキング液に溶解しているＴＹＲ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＩＴＦ及びβ−ａｃｔｉｎ一次抗体（１：２００）とを４℃で徹夜で培養し、ＴＢＳＴに５分／回で３回洗浄した。その後、対応する二次抗体（１：４０００）を加えて１時間培養し、ＴＢＳＴにて５分／回で３回洗浄した。フィルムを配合された超高光感度の持つＥＣＬ検出試薬混合液に５分間浸漬させ、暗室でＸ線フィルムに感光させた。現像及び定着により結果を得、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社のＱｕａｎｔｉｔｙ  ｏｎｅソフトを用いて結果を分析した。その結果を図９、図１０に示す。図面においては、対照群と比べて、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１となる。ＦＬＵはフルオキセチンを表す。
【００２９】
実験の結果：ブランク対照群と比べた結果、フルオキセチンは、ヒト初代メラニン細胞のＭＩＴＦ、チロシナーゼ（ＴＹＲ）及びチロシナーゼ関連蛋白質１（ＴＲＰ−１）の蛋白質表現を明らかに向上させることができ、有意差があるが、チロシナーゼ関連蛋白質２（ＴＲＰ−２）の蛋白質レベルには明らかな影響がない。
【００３０】
実験の結論：フルオキセチンは、ヒト初代メラニン細胞のメラニン合成に重要な蛋白質（ＭＩＴＦ、ＴＹＲ、ＴＲＰ−１）の表現を向上させることにより、メラニン含有量を増加させることができる。
【００３１】
第三部分：フルオキセチンの同時に脱毛したＣ５７ＢＬ／６マウスの毛包メラニン及びメラニン合成蛋白質表現に対する影響。
【００３２】
一、フルオキセチンのＣ５７ＢＬ／６マウスの皮膚毛包メラニン合成に対する影響
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを順化させて飼育した後、同時の毛包生長周期を誘導するように、実験する前の日に、ロジン・パラフィン混合物を用いて動物の背中の毛を抜き取った。１０匹／群で動物をランダムに溶媒対照群（生理食塩水）とフルオキセチン投与群（２０ｍｇ／ｋｇ）とに分けた。臨床投与方法を参照して、日に１回強制経口投与して、１２日間連続投与した。投与第１２日目に撮影してマウス背中の皮膚の色の具合を記録した。その結果を図１１に示す。
【００３３】
実験の結果：マウスの背中の皮膚の写真から示すように、投与第１２日目の場合、溶媒対照群と比べた結果、フルオキセチン投与群のマウスの脱毛エリアの皮膚の色が明らかに濃くなった。
【００３４】
実験の結論：フルオキセチンを１２日間強制経口投与して、同時に脱毛したＣ５７ＢＬ／６マウスの皮膚のメラニン合成を明らかに促進することができる。
【００３５】
二、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ法により、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの毛包メラニン合成に重要な蛋白質表現を検出
第１２日目に投与した後、前記動物を殺して、皮膚試料を採集してＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ実験を行った。所定量のＣ５７ＢＬ／６マウスの皮膚組織を取って、細かく切って、組織溶解液とプロテアーゼ阻害薬を加え、ホモジネートにして蛋白質を抽出した。ＢＣＡ法により、蛋白質濃度を測定した後、蛋白質溶解液を同じ濃度まで調整して、同体積の２倍のローディングバッファーと均一に混合させて、沸かして５分後ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を行った。電気泳動完了後、１００Ｖの電圧で１時間かけて蛋白質をニトロセルロース膜に転写して、５％スキムミルク含有ＴＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で１時間ブロッキングした。それぞれに、フィルムと、ブロッキング液に溶解しているＴＹＲ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＩＴＦ及びβ−ａｃｔｉｎ一次抗体（１：２００）とを４℃で徹夜で培養し、ＴＢＳＴにて５分／回で３回洗浄した。その後、対応する二次抗体（１：４０００）を加えて１時間培養し、ＴＢＳＴにて５分／回で３回洗浄した。フィルムを配合された超高光感度の持つＥＣＬ検出試薬混合液に５分間浸漬させ、暗室でＸ線フィルムに感光させた。現像及び定着により結果を得、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社のＱｕａｎｔｉｔｙ  ｏｎｅソフトを用いて結果を分析した。その結果を図１２、図１３に示す。図面においては、対照群と比べて、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１となる。ＦＬＵはフルオキセチン群を表す。
【００３６】
実験の結果：ブランク対照群と比べた結果、フルオキセチンは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの同時に脱毛した皮膚毛包のＭＩＴＦ、チロシナーゼ（ＴＹＲ）、チロシナーゼ関連蛋白質１（ＴＲＰ−１）及びチロシナーゼ関連蛋白質２（ＴＲＰ−２）の蛋白質表現を明らかに向上させることができ、有意差がある。
【００３７】
実験の結論：フルオキセチンは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの同時に脱毛した皮膚毛包のメラノサイトにおけるメラニン合成に重要な蛋白質表現を向上させることにより、毛包におけるメラニン含有量を増加させることができる。
【００３８】
三、免疫組織化学手法により、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの毛包メラニン合成の重要蛋白質表現を検出
第１２日目に投与した後、前記動物を殺して、脊椎線と平行して皮膚試料を採集する。皮膚組織を１０％ホルムアルデヒドに４８時間固定させ、パラフィンに埋め込み、毛包に沿って縦方向でスライスして（４μｍ）、それぞれにＨＥ染色、免疫組織化学染色を行った。ＨＥ染色：定常のヘマトキシリン−エオシン染色を行った。免疫組織化学染色：切片を脱ろう、水和して、３％過酸化水素で室温にて１０分間培養して、ＰＢＳにて５分間リンスし、３回繰り返した。熱による抗原賦活処理を行った後、ヤギ血清ブロッキング液を滴下して２０分間ブロッキングし、ウサギ由来のＴＹＲ、ＴＲＰ−１及びＴＲＰ−２抗体を加えて、４℃で徹夜で培養した。ＰＢＳで３回リンスしてから、ＴＲＩＴＣ（訳注：ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌ  ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）標識のヤギ抗ウサギＩｇＧを加え、３７℃で３０分間培養し、ＰＢＳにて５分／回で３回リンスした。蛍光消光抑制剤を加えて、切片の封入を行った。陰性対照実験として、一次抗体の代わりに、一次抗体希釈液を用いて前記手順を繰り返した。１匹の動物から２枚の皮膚の切片を選んで、１枚あたりにランダムに５つの視野を選んで、蛍光顕微鏡により撮影して記録した。その結果を図１４に示す。図面におけるスケール：２０μｍ；ｄｐ（訳注：ｄｅｒｍａｌ  ｐａｐｉｌｌａ）：毛乳頭。
【００３９】
実験の結果：ブランク対照群と比べた結果、フルオキセチンは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの同時に脱毛した皮膚のエリアにおいて、毛乳頭の上方に位置する毛包のメラノサイトチロシナーゼ（ＴＹＲ）、チロシナーゼ関連蛋白質１（ＴＲＰ−１）及びチロシナーゼ関連蛋白質２（ＴＲＰ−２）の蛋白質表現を明らかに向上させることができる。
【００４０】
実験の結論：Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇの結果と一致しており、フルオキセチンは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの同時に脱毛した皮膚毛包のメラノサイトにおけるメラニン合成に重要な蛋白質の表現を向上させることにより、毛包におけるメラニン含有量を増加させることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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