(57)【要約】マイクロ流体デバイス（９）内の非特異的蛍光を減衰させる方法であって、マイクロ流体デバイス（９）が、各々が標的検体（５５；５５’）に特異的な蛍光検出分子（５２：５２’）によって生成される信号を用いて体液内の複数の標的検体を分析するためのマイクロ流体アッセイチャンバ（１０）と、光学的に透明な面（１４ｆ）以外のチャンバ（１０）の面（１４ｄ）に特異的に結合された蛍光検出分子（５２；５２’）によって放射された信号を減衰させる減衰色素と（６０）、を含む、方法、並びに複数の検体（５５；５５’）の各々によって生成される信号を確定する方法。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一フルオロフォアを用いて複数の標的検体の存在を検出するためにマイクロ流体デバイスにおいて非特異的蛍光を減衰させる方法であって、
（ｉ）少なくとも一部が光学的に透明な第１壁と、第１壁の内腔面と、前記光学的に透明な壁とは反対側の壁であって、反対側の壁の内腔面を含む反対側の壁と、を含むアッセイチャンバを有するマイクロ流体デバイスを提供するステップであって、前記光学的に透明な第１壁の前記内腔面が、生物学的サンプルにおける第１標的検体に対して特異的な第１結合パートナーでコーティングされ、前記反対側の壁の前記内腔面が、前記サンプルにおける第２標的検体に対して特異的な第２結合パートナーでコーティングされる、ステップと、
（ｉｉ）単一フルオロフォアから構成された、前記第１標的検体に対する第３結合パートナーと、前記単一フルオロフォアで標識された、前記第２標的検体に対する第４結合パートナーと、を前記チャンバ内に導入するステップと、
（ｉｉｉ）結合事象が発生し得るようにインキュベートするステップと、
（ｉｖ）前記チャンバの内容物を除去するステップと、
（ｖ）前記チャンバ内の前記単一フルオロフォアの蛍光を光学的に測定するステップであって、前記単一フルオロフォアの光学的測定値が前記第１標的検体及び前記第２標的検体の濃度に関連する、ステップと、
（ｖｉ）前記チャンバ内に色素を含む溶液を、前記単一フルオロフォアに対する励起波長範囲又は放射波長範囲に近い波長範囲の光を吸収するのに十分な濃度で導入するステップと、
（ｖｉｉ）前記色素を含む前記溶液が前記チャンバ内に導入された後に、前記チャンバ内の前記単一フルオロフォアの蛍光を２度目に光学的に測定するステップであって、第２の光学的測定値が前記第１標的検体の濃度に関連する、ステップと、
（ｖｉｉｉ）ステップ（ｖ）における前記光学的測定値からステップ（ｖｉｉ）における前記光学的測定値を減算することにより、前記第２標的検体の濃度を計算するステップと、を含む方法。
【請求項２】
前記チャンバ壁の前記内腔面にコーティングされた前記結合パートナーが中間結合パートナーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記光学的に透明な壁及び前記反対側の壁以外の前記チャンバの前記内腔面が結合剤又はブロッキング剤でコーティングされていない、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１壁が完全に光学的に透明である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｉｖ）とステップ（ｖ）との間に前記チャンバを洗浄するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｖ）とステップ(ｖｉ）との間に前記チャンバを洗浄するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記チャンバの内腔が、少なくとも、前記光学的に透明な壁とは反対側の壁と前記光学的に透明な壁とによって完全に密閉される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第１結合パートナーが、前記第１標的検体に特異的な第１抗体を含み、前記フルオロフォアで標識された前記第３結合パートナーが、前記第１標的検体に特異的な第２抗体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第２結合パートナーが、前記第２標的検体に特異的な第１抗体を含み、前記フルトロフォアで標識された前記第４結合パートナーが、前記第２標的検体に特異的な第２抗体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記光学的に測定するステップが、前記単一フルオロフォアで標識されかつチャンバの壁の前記内腔面に結合された前記第１標的検体又は前記第２標的検体から発生する光信号を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記光学的に透明な壁の前記内腔面と前記反対側の壁の前記内腔面との間の距離が約１０ミクロン〜５．０ミリメートルの範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記光学的に透明な壁の前記内腔面と前記反対側の壁の前記内腔面との間の距離が約７５ミクロンの範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記光学的に透明な壁の前記内腔面と前記反対側の壁の前記内腔面との間の距離が約５０ミクロン〜２００ミクロンの範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記光学的に透明な壁の前記内腔面と前記反対側の壁の前記内腔面との間の距離が約７５ミクロン〜１００ミクロンの範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記色素が、アマランス、エリオグラウシン及びブリリアントグリーン並びにそれらの組合せから構成される群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
標的検体を検出するためのアッセイチャンバを含むマイクロ流体デバイスであって、前記アッセイチャンバが、少なくとも一部が光学的に透明な第１壁と、第１壁内腔面と、前記光学的に透明な壁とは反対側の壁であって、反対側の壁の内腔面を含む反対側の壁と、を含み、前記光学的に透明な第１壁の前記内腔面が、生物学的サンプルにおける第１標的検体に対して特異的な第１結合パートナーでコーティングされ、前記反対側の壁の前記内腔面が、前記サンプルにおける第２標的検体に対して特異的な第２結合パートナーでコーティングされる、マイクロ流体デバイスと、
単一フルオロフォアから構成された前記第１標的検体に対する第３結合パートナー、及び、前記第３結合パートナーを標識する際に使用された前記単一フルオロフォアで標識された前記第２標的検体に対する第４結合パートナーと、
色素を含む溶液であって、前記色素が、前記チャンバの前記内腔面に結合された前記単一フルオロフォアに対する励起波長範囲又は放射波長範囲の近くの波長範囲の光を吸収可能である、溶液と、を含む組成物。
【請求項１７】
前記第１結合パートナーが、前記第１標的検体に特異的な第１抗体を含み、前記単一フルオロフォアで標識された前記第３結合パートナーが、前記第１標的検体に特異的な第２抗体を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記第２結合パートナーが、前記第２標的検体に特異的な第１抗体を含み、前記単一フルトロフォアで標識された前記第４結合パートナーが、前記第２標的検体に特異的な第２抗体を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
前記光学的に透明な壁の前記内腔面と前記反対側の壁の前記内腔面との間の距離が約１０ミクロン〜５．０ミリメートルの範囲である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２０】
前記光学的に透明な壁の前記内腔面と前記反対側の壁の前記内腔面との間の距離が約７５ミクロンの範囲である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２１】
前記光学的に透明な壁の前記内腔面と前記反対側の壁の前記内腔面との間の距離が約５０ミクロン〜２００ミクロンの範囲である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２２】
前記光学的に透明な壁の前記内腔面と前記反対側の壁の前記内腔面との間の距離が約７５ミクロン〜１００ミクロンの範囲である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２３】
前記色素が、アマランス、エリオグラウシン及びブリリアントグリーン並びにそれらの組合せから構成される群から選択される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２４】
蛍光信号を検出する光検出器と、前記蛍光信号から前記第１標的検体及び前記第２標的検体の量を求めることができるマイクロプロセッサとをさらに含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２５】
前記第１壁が完全に光学的に透明である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２６】
アッセイチャンバ内の複数の標的検体の存在を検出する方法であって、
（ｉ）少なくとも一部が光学的に透明な第１壁と、第１壁内腔面と、前記光学的に透明な壁とは反対側の壁であって、反対側の壁の内腔面を含む反対側の壁と、を含むアッセイチャンバを有するマイクロ流体デバイスを提供するステップであって、前記光学的に透明な第１壁の内腔面が、生物学的サンプルにおける第１標的検体に対して特異的な第１結合パートナーでコーティングされ、前記反対側の壁の前記内腔面が、前記生物学的サンプルにおける第２標的検体に対して特異的な第２結合パートナーでコーティングされる、ステップと、
（ｉｉ）前記チャンバ内に前記生物学的サンプルを導入するステップと、
（ｉｉｉ）単一フルオロフォアから構成された、前記第１標的検体に対する第３結合パートナーと、前記単一フルオロフォアで標識された、前記第２標的検体に対する第４結合パートナーと、を前記チャンバ内に導入するステップと、
（ｉｖ）結合事象が発生し得るようにインキュベートするステップと、
（ｖ）前記チャンバの内容物を除去するステップと、
（ｖｉ）前記チャンバ内の前記単一フルオロフォアの蛍光を光学的に測定するステップであって、光学的測定値が前記第１標的検体及び前記第２標的検体の濃度に関連する、ステップと、
（ｖｉｉ）前記チャンバ内に色素を含む溶液を、前記単一フルオロフォアに対する励起波長範囲又は放射波長範囲に近い波長範囲の光を吸収するのに十分な濃度で導入するステップと、
（ｖｉｉｉ）前記色素を含む前記溶液が前記チャンバ内に導入された後に、前記チャンバ内の前記単一フルオロフォアの蛍光を２度目に光学的に測定するステップであって、第２の光学的測定値が前記第１標的検体の濃度に関連する、ステップと、
（ｉｘ）ステップ（ｖ）における前記光学的測定値からステップ（ｖｉｉ）における前記光学的測定値を減算することにより、前記第２標的検体の濃度を計算するステップと、を含む方法。
【請求項２７】
前記波長範囲が、放射波長範囲、励起波長範囲及びそれらの組合せから構成される群から選択される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、患者の体液等、生物学的サンプルにおけるタイプの蛍光標識された標的生物学的検体の定量的光学的分析に関する。本発明は、より詳細には、サンプルにおける検体の濃度を反映する複数の標的検体から発生する真のかつ特異的な光信号を得る装置及び方法に関する。サンプルは、マイクロ流体デバイスのアッセイチャンバ内で、アッセイチャンバの２つの活性の最適に平行な面が２以上の検体の有無について調べることを可能にするように、減衰色素を使用することによって試験される。
【背景技術】
【０００２】
生物医学的アッセイにおける単一標的検体の蛍光測定はアッセイチャンバで行われてよく、アッセイチャンバでは、チャンバの一部に光学的に透明な面があり、その面が、内腔面にサンプルにおいて対象の標的検体に特異的な結合パートナーをコーティングすることによって活性化される。光学的に透明な活性面の結合パートナーは、標的検体を特異的に「捕捉」し、その標的検体は、標的検体に対する特異性を有する蛍光標識された検出分子を使用することによってその後に検出される。
【０００３】
マイクロ流体デバイスのアッセイチャンバにおける複数の面において、単一標的検体とは対照的に複数の検体を検出する場合、いくつかの問題に直面する。例えば、１つの検体に対して特異的なフルオレセイン標識抗体を、別の検体に特異的なローダミン標識抗体から定量的に識別することができる。しかしながら、この方法には、適切な波長のエネルギーで各フルオロフォアを特異的に励起し、各フルオロフォアからの放射光を特異的に測定するために、たいていは複数のバンドパスフィルタから構成される複雑かつ費用のかかる光学系が必要である。
【０００４】
チャンバ内の複数の面上で複数の検体を検出する別の方法は、チャンバの１以上の面において結合パートナーを空間的に分離することである。単一フルオロフォアの使用を可能にするこの方法では、表面（複数可）に対して光学部品を移動させる（すなわち、光学系を移動させるか又はデバイスを移動させる）必要があり、それは、費用がかかり、複雑であり、かつ経時的に信頼性が低い可能性がある。この方法ではまた、表面上に結合パートナーを厳密に位置決めする必要があり、それは技術的に困難である可能性がありかつ交差汚染の危険がある。
【０００５】
複数の検体検出のさらに別の解決法は、光学部品の焦点を定め直すことにより各面からの蛍光が識別されるのを可能にするのに十分離れている、チャンバの平行な面の使用か、又は２つの光学系あるいは２つの光学的に透明な面の使用である。しかしながら、この方法では深いチャンバが必要であり、それは、流体工学の問題（例えば、チャンバを充填し空にすることが困難であること）、拡散距離が長く（又は混合が必要である）、及び従って、アッセイ時間が長いことによる不十分な結合効率、費用がかかる大きい試薬の体積、及び非効率的な空間の使用をもたらす可能性がある。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、従来技術による装置及び方法の欠点を克服し、単一のフルオロフォア、単一の焦点経路及び平面を備えた固定光学部品、並びに最適な流体特性を有する浅いアッセイチャンバを使用して複数の検体を検出する、自動化された、費用効率の高い、高スループットな解決法に関する。アッセイは、極めて迅速な試験結果及び費用のかかる試薬の効率的な使用を可能にしながら、同時にアッセイ感度及び精度を向上させる、マイクロ流体デバイスで行われる。
【０００７】
一態様では、本発明は、アッセイチャンバ内のサンプルにおける検体の濃度を反映する複数の標的検体から発生する真のかつ特異的な光信号を得る装置、キット又は組成物に関する。一実施形態では、本発明は、少なくとも光学的に透明な部分を含む第１壁と、第１壁とは反対側の壁と、内腔と、を備えるアッセイチャンバを有するマイクロ流体デバイスを含む。任意選択的に、第１壁は完全に光学的に透明である。第１壁の光学的に透明な部分の内腔面は、サンプルにおける第１標的検体に対して特異的な第１結合パートナーでコーティングされ、反対側の壁の内腔面は、サンプルにおける第２標的検体に対して特異的な第２結合パートナーでコーティングされる。第１標的検体に対して特異的な第３結合パートナーは、フルオロフォア検出分子によって標識され、第２標的検体に対して特異的な第４結合パートナーは、同じフルオロフォア検出分子によって標識される。
【０００８】
本装置、キット又は組成物は、色素を含む溶液を含む。色素は、前記チャンバの内腔面に結合される蛍光検出標識のいずれかの放射波長範囲、励起波長範囲又はそれらの組合せから構成される群から選択された波長範囲の光を吸収することができる。
【０００９】
本発明の一実施形態では、第１結合パートナーは、第１標的検体に対して特異的な第１抗体であり、フルオロフォアで標識された第３結合パートナーは、第１標的検体に対して特異的な第２抗体である。第２結合パートナーは、第２標的検体に対して特異的な第１抗体であり、同じフルオロフォアで標識された第４結合パートナーは、第２標的検体に対して特異的な第２抗体である。
【００１０】
別の実施形態では、アッセイチャンバの光学的に透明な壁の内腔面と前記反対側の壁の内腔面との間の距離は、約５０ミクロン〜約２００ミクロン、約７５ミクロン〜約１００ミクロン、又は１０ミクロン〜５．０ミリメートルの範囲である。
【００１１】
色素は、アマランス、エリオグラウシン、ブリリアントグリーン及びそれらの組合せから構成される群から選択される。
【００１２】
特定の実施形態では、本装置、キット又は組成物は、蛍光信号を検出する光検出器と、蛍光信号から第１標的検体及び第２標的検体の量を求めることができるマイクロプロセッサと、を含む。
【００１３】
別の態様では、本発明は、上述したアッセイチャンバを有するマイクロ流体デバイスにおいて複数の検体を検出する方法に関する。本方法の一実施形態によれば、対象の標的検体を有していると考えられるサンプルが、アッセイチャンバ内に導入される。結合及び洗浄により未結合検体及び他の使用成分の除去を可能にするインキュベーションの後、チャンバ内に、第１標的検体及び第２標的検体にそれぞれ特異的でありかつ各々同じフルオロフォアで標識された第３結合パートナー及び第４結合パートナーが導入される。結合が発生するのを可能にするのに十分なインキュベーションに続いて、チャンバの中身が除去され、過剰な洗浄剤で洗浄される。第１標的検体及び第２標的検体の濃度に関連する、チャンバ内の蛍光の光学測定値が測定される。そして、１以上の色素を含む溶液がチャンバ内に導入され、１以上の色素は、選択されたフルオロフォアの放射波長範囲、励起波長範囲及びそれらの組合せから構成される群から選択された波長範囲の光を吸収する。従って、チャンバの反対側の壁の内腔面に結合されるあらゆる蛍光検出分子が、色素を含む溶液によってマスクされる。チャンバの第２蛍光測定が光学的に行われる。第１標的検体及び第２標的検体の濃度は、２つの光学測定値から計算される。任意選択的に、サンプルをチャンバに導入する前に、サンプル及び２つのフルオロフォア標識結合パートナー（１つが各標的検体に対して特異的）を合わせて混合することができる。チャンバの洗浄を、標識された第３結合パートナー及び第４標識結合パートナーを追加する前、インキュベーションの後、又はチャンバ内に色素が導入される前に行うことができる。
【００１４】
本発明のこれらの実施形態及び他の態様は、本発明を限定するのではなく例示するように意図されている、以下の詳細な説明及び添付図面から容易に明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】本発明の一実施形態に係るマイクロ流体デバイスを含む例示的な計測システムの平面図である。
【図１Ｂ】本発明の一実施形態に係る例示的なアッセイチャンバの上面切取図を示す。
【図１Ｃ】図１Ｂに示す例示的なアッセイチャンバの底面切取図を示す。
【図１Ｄ】本発明の一実施形態に係る別の例示的な円柱状アッセイチャンバの上面切取図を示す。
【図１Ｅ】図１Ｄに示す例示的な円柱状アッセイチャンバの底面切取図を示す。
【図１Ｆ】本発明の一実施形態に係る例示的なアッセイチャンバ及び作製方法の上面図を示す。
【図２】減衰色素を追加しないアッセイチャンバの概略断面図である。
【図３】本発明の一実施形態に係る減衰色素を含む例示的なアッセイチャンバの概略断面図である。
【図４】本発明の一実施形態に係る壁の光信号部を含む例示的なアッセイチャンバの斜視図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、添付図面とともに読まれるべき以下の説明を通してより完全に理解されるであろう。この説明では、本発明のさまざまな実施形態の範囲において同様の数字は同様の要素を指す。本説明の範囲において、請求項に係る発明を、実施形態に関して説明する。当業者は、本明細書に記載する方法及びシステムが単に例示的なものであることと、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく変更を行うことができることとを容易に理解するであろう。
【００１７】
本明細書で使用するマイクロ流体デバイスは、およそピコリットルからマイクロリットルの流体体積を利用する生物学的アッセイ用のデバイスを意味する。それらデバイスは、ミリメートルからマイクロメートルの範囲の寸法のチャネル及び／又はチャンバを有している。
【００１８】
本明細書で使用する標的生物学的検体は、限定されないが、病原体、タンパク質、核酸、脂質、抗体、抗原及び酵素等、生物学的試料における対象となる検体又は検体群を意味する。例えば、検体群は、複数のタンパク質、例えばミオグロビン、ＢＮＰ及びＣＫ−ＭＢ、心不全を検出するための共有する有用性によって注目される関連するタンパク質であってよい。
【００１９】
本明細書で使用する蛍光検出分子は、別の分子又は物質と直接的又は間接的に複合体を形成することができ、かつ適切な蛍光光学系を使用して検出され得る、あらゆる分子、結合パートナー、又は実体を意味するものとし、そうした蛍光光学系では、分子、結合パートナー又は実体は、適切な波長の光によって励起され、（波長の異なる）放射光が測定される。分子、結合パートナー又は実体は、固有に蛍光性であってよく、又は適切なフルオロフォアの付着によって蛍光性になってよい。
【００２０】
本明細書で使用する減衰色素は、あらゆる蛍光検出分子の放射波長範囲、励起波長範囲又は放射波長範囲及び励起波長範囲の組合せを含む波長範囲の光を吸収する色素を意味する。
【００２１】
本明細書で使用する結合パートナーは、分子、例えば、標的生物学的検体に特異的に結合する抗体、又は、結合カスケードにおける中間体（例えば中間結合パートナーとして表面にストレプトアビジンがコーティングされ、その後、ストレプトアビジンが、標的生物学的検体に対して特異的な結合パートナーである抗体に共役したビオチンに結合する場合）を意味する。
【００２２】
本明細書で使用する背景蛍光とは、対象となる標的検体に結合された蛍光検出分子から発生していない蛍光を意味するものとする。
【００２３】
一態様では、本発明は、限定されないが、身体組織又は患者の体液、例えば血液、血清、血漿、尿、唾液、髄液、関節滑液、消化液、組織吸引物、滲出液及び浸出物等の生物学的試料における複数の標的生物学的検体の光学的測定用の使い捨てマイクロ流体デバイスに関する。
【００２４】
本発明の実施形態は、マイクロ流体デバイスのアッセイチャンバの異なる内腔面に結合した複数の標的検体の検出用の装置、キット、組成物又は方法、例えば免疫学的検定（イムノアッセイ）法に関する。
【００２５】
図１Ａ〜図１Ｆは、対象となる複数の標的検体の高感度の、正確な、費用効率の高いかつ自動化された診断試験に対して開発された、本発明に係る使い捨てマイクロ流体デバイス及び計測システムの例示的な実施形態である。一実施形態では、図１Ａを参照すると、計測システムは、アッセイチャンバ１０及び流体導管２を有するマイクロ流体デバイス９と、マイクロ流体デバイスホルダ４と、マイクロプロセッサ６と、電子回路８と、光源９０、及びアッセイチャンバ内の標的検体に結合された蛍光検出分子によって生成される光信号等の光信号を測定する光検出器１００を含む光学系９２と、を含む。
【００２６】
図１Ｂを参照すると、一実施形態では、マイクロ流体デバイスは、チャンバ内腔１６を包囲する６つの壁１２ｎ、具体的には１２ａ、１２ｂ、１２ｃ、１２ｄ、１２ｅ及び１２ｆを有する矩形アッセイチャンバ１０を含む。アッセイチャンバ１０は、いずれかの壁が引力源に最も近い壁である時に流体を保持することができる。言い換えれば、組立後、チャンバ１０は、任意選択的なポート、例えば入口ポート２０及び出口ポート２２を除くすべての面が完全に密閉される。一実施形態では、チャンバ１０は例えば円柱又はチャネルであってよい。マイクロ流体デバイスのチャンバの形状は、図に示す形状によって限定されない。
【００２７】
チャンバ１０の各壁１２ａ〜１２ｆは、内腔１６に隣接する内腔面１４を有している。本発明による一実施形態では、チャンバ１０は入口ポート２０及び出口ポート２２を有している。
【００２８】
壁１２ｆ内に、活性の光学的に透明な壁部分が配置され、又は任意選択的に、図１Ｂに示すように、壁１２ｆ全体が光学的に透明である。壁１２ｆの内腔面１４ｆ又は任意選択的に壁１２ｆの光学的に透明な部分のみが、その面を、対象となる第１標的検体又は第１標的検体群に特異的な結合パートナーでコーティングすることによって活性化される。壁１２ｄは壁１２ｆの反対側である。壁１２ｄ及び１２ｆは平面であってもよく、又は１以上の曲線部を有していてもよい。一実施形態では、光学的に透明な壁１２ｆとは反対側のチャンバ壁１２ｄは、光学的に透明な壁１２ｆの平面に対して、例えば実質的に平行であるか、０度〜４５度であるか、０度〜１０度であるか、又は１０度〜４５度である。代替的に、チャンバ壁１２ｄの内腔面は、光学的に透明な壁１２ｆの内腔面の平面に対して、例えば実質的に平行であるか、０度〜４５度であるか、０度〜１０度であるか又は１０度〜４５度である。
【００２９】
反対側のチャンバ壁１２ｄの内腔面１４ｄの領域は、壁１２ｆの内腔面１４ｆにおける活性化領域に比較して同様にサイズが決められかつ位置決めされている。内腔面１４ｄは、その面を、対象となる第２標的検体又は検体群に対して特異的な結合パートナーでコーティングすることによって活性化される。一実施形態では、光学的に透明な壁１２ｆの内腔面１４ｆ及び反対側の壁１２ｄの内腔面１４ｄ以外のチャンバ壁１２ａ〜１２ｃ及び１２ｅの内腔面１４は、結合パートナーで、かつアッセイの開始前に、本来これらの壁の内腔面に対して非特異的な結合をブロックするブロッキング剤又は他の何らかの薬剤でコーティングされていない。
【００３０】
アッセイチャンバ１０は、ポリマー、例えば限定されないがポリスチレンから形成されてよい。
【００３１】
図１Ｂ〜図１Ｃを参照すると、本発明による特定の実施形態では、アッセイチャンバ１０は実質的に矩形であり、光学的に透明な壁１２ｆ（又はその一部）と光学的に透明な壁１２ｆの反対側の壁１２ｄとを備えている。光学的に透明な壁１２ｆ（又はその一部）の内腔面１４ｆと、光学的に透明な壁１２ｆとは反対側の壁１２ｄの内腔面１４ｄとの間の距離８０は、約１０ミクロン〜５ミリメートル、１０ミクロン〜２ミリメートル、１０ミクロン〜１ミリメートル、５０ミクロン〜２００ミクロン、５０ミクロン〜１２５ミクロン、７０ミクロン〜１００ミクロン、７５ミクロン〜１５０ミクロン、好ましくは５０ミクロン〜１００ミクロン、より好ましくは７５ミクロンの範囲である。チャンバ内腔１６は、チャンバ１０の光学的に透明な壁１２ｆと、光学的に透明な壁とは反対側の壁１２ｄと、を含む壁１２ａ〜１２ｆによって境界が決められかつ密閉されている。光学的に透明な壁以外の壁は、光遮断材料、例えば黒色プラスチックから形成されてよい。代替的に、それらの壁は光学的に透明であってよい。
【００３２】
図１Ｄ〜図１Ｅを参照すると、本発明の別の実施形態では、アッセイチャンバ１０は実質的に円柱状であり、円柱状チャンバ１０の両端の壁１２ｆ及び１２ｄと、壁１２ｆ及び１２ｄを接合する壁１２ｂと、を備えている。チャンバ１０の壁１２ｆは光学的に透明であり、又は任意選択的に、壁１２ｆの一部が光学的に透明である。光学的に透明な壁１２ｆの反対側のチャンバ壁１２ｄは、光学的に透明な壁１２ｆの平面に対して、実質的に平行であるか、０度〜４５度であるか、０度〜１０度であるか、又は１０度〜４５度である。代替的に、チャンバ壁１２ｄの内腔面は、光学的に透明な壁１２ｆの内腔面の平面に対して、例えば実質的に平行であるか、０度〜４５度であるか、０度〜１０度であるか又は１０度〜４５度である。
【００３３】
さらに図１Ｄ〜図１Ｅを参照すると、円柱状チャンバ１０の光学的に透明な壁１２ｆの内腔面１４ｆ又は内腔面１４ｆの一部は、当業者には既知である標準的な方法によって対象となる第１標的検体に対して特異的な結合パートナーで面１４ｆをコーティングすることによって活性化される。反対側のチャンバ壁１２ｄの内腔面１４ｄの同様にサイズが決められかつ位置決めされた領域は、第２標的検体に対して特異的な結合パートナーでコーティングすることによって活性化される。
【００３４】
例えば、一実施形態では、１２ｄ及び１２ｆのサイズは異なるが依然として平行であってよい。従って、１２ｄ及び１２ｆの表面全体のコーティングは、被覆面積が異なることになる。矩形形状又は円柱形状に適用される際、各コーティングされた内腔面の部分は、光学測定が行われる、ｚ次元において分離されたｘ次元及びｙ次元で少なくとも「オーバラップする」必要がある。円柱形状は、例えば、１２ｄ及び１２ｆのサイズが異なる場合、より円錐形状であってよい。
【００３５】
一実施形態では、チャンバ壁１２ｂの内腔面１４ｂは、結合パートナーで、かつアッセイの開始前に、本来この壁の内腔面に対して非特定結合をブロックするブロッキング剤又は何らかの他の薬剤でコーティングされていない。光学的に透明な壁１２ｆの内腔面１４ｆと壁１２ｄの内腔面１４ｄとの間の距離８０は、約１０ミクロン〜５ミリメートル、１０ミクロン〜２ミリメートル、１０ミクロン〜１ミリメートル、５０ミクロン〜２００ミクロン、５０ミクロン〜１２５ミクロン、７０ミクロン〜１００ミクロン、７５ミクロン〜１５０ミクロン、好ましくは５０ミクロン〜１０ミクロン、より好ましくは７５ミクロンの範囲である。
【００３６】
チャンバは、他の形状（例えば、直交する縁とは対照的に湾曲する側部を含む形状は、チャンバに溶液を導入してチャンバから溶液を除去する時に最適な流体特性を促進することができる）、例えばチャネルであってもよく、図示する矩形形状又は円柱形状に限定されない。光学的に透明な壁以外の壁は、光遮断材料、例えば黒色プラスチックから形成されてよい。代替的に、壁は光学的に透明であってよい。
【００３７】
図１Ｆを参照すると、本発明に係る生物学的試料において標的検体を検出するマイクロ流体デバイスの一実施形態では、チャンバ１０は、複数の部品から単一の一体型チャンバ１０に組み立てられる。例えば、一実施形態では、第１チャンバ部品は、ポリマー材料製の浅いウェル４０であり、浅いウェル４０は、浅いウェル４０の底部の壁１２ｄと、浅いウェルの頂部の開放面４２と、ウェル側壁１２ａ、１２ｂ、１２ｃ及び１２ｅと、を有している。ウェルの形状は、矩形に限定されないが、例えば楕円形、円形又は他の形状であってよい。
【００３８】
浅いウェル４０の深さは、約１０ミクロン〜５ミリメートル、１０ミクロン〜２ミリメートル、１０ミクロン〜１ミリメートル、５０ミクロン〜２００ミクロン、５０ミクロン〜１２５ミクロン、７０ミクロン〜１００ミクロン、７５ミクロン〜１５０ミクロン、好ましくは５０ミクロン〜１００ミクロン、より好ましくは７５ミクロンの範囲である。寸法が浅いウェル４０の開放面４２に実質的に対応する、光学的に透明な平面の壁１２ｆ又は光学的に透明な部分を含む壁は、浅いウェル４０に接合されてアッセイチャンバ１０を形成する第２チャンバ部品を形成している。アッセイチャンバ１０の光学的に透明な壁１２、又は任意選択的に壁１２ｆの一部は、壁の一方の側の面を、対象となる標的検体に対して上に定義した結合パートナーでコーティングすることによって、活性化される（例えば、図２を参照）。浅いウェル４０の底面壁１２ｄの内腔（内側）面１４ｄは、第２標的検体に結合パートナーを施すことによって活性化される。チャンバ壁の内腔面にコーティングされる結合パートナーは、限定されないが、例えば、標的検体に対して特異的なポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体及びそのフラグメント、他のタンパク質、レクチン、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質バイオマーカー、アプタマー、レセプター、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、ビオチン又はストレプトアビジンであってよい。光学的に透明な壁１２ｆのコーティングされた面１４ｆは、新たに形成されたチャンバ１０の内腔側にあるように、浅いポリマーウェル４０の開放面４２に下向きに配置される。
【００３９】
代替的に、別の実施形態では、浅いウェル４０は光学的に透明であってよく、平面壁１２ｆ「蓋」は不透明であってよい。この場合、光学部品は浅いウェル４０側にある。
【００４０】
アッセイチャンバの光学的に透明な壁１２ｆは、浅いポリマーウェル４０の壁の頂部に、接着剤、熱結合、超音波溶接又は他の永久取付方法によって取り付けられる。一実施形態では、浅いウェル４０の基部の壁１２ｄの内腔面１４ｄ以外のチャンバ１０の浅いウェル部分４０の内腔面１４は、アッセイの開始前に、ブロッキング剤、例えば限定されないが、ブロッキング剤カゼイン、ウシ血清アルブミン及び新生仔牛血清等、いかなる薬剤によっても処理されていない。
【００４１】
図２を参照すると、一実施形態では、図１Ｂに関して上述したような、対象となる第１標的検体用の特異的な結合パートナーでコーティングされたチャンバの光学的に透明な部分１２ｆの内腔面１４ｆと、対象となる第２標的検体用の別の特異的な結合パートナーでコーティングされた反対側の壁１２ｄの内腔面１４ｄと、を有するチャンバ１０が、アッセイのために用意される。対象となる標的検体を有すると思われる生物学的試料がチャンバ内腔内に導入される。標的検体の、内腔面１４ｄ及び１４ｆ上の結合パートナーへの結合が可能とするのに適切なインキュベーション期間の後、チャンバ内腔の容積を超えるか又はそれに等しい体積の溶液を、入口ポートを介して導入することにより、チャンバ内腔は洗浄されて、未結合の又は過剰な検体とともに生物学的試料の他の望ましくない成分が除去される。洗浄液は、出口ポート２２を介して除去されてよい。各々同じフルオロフォアを使用する、第１の標的検体に対する結合親和性を有する蛍光検出分子と、第２標的検体に対する結合親和性を有する蛍光検出分子とが、チャンバ１０の内腔１６内に同時に導入される（例えば、１つの試薬において混合される）。検出分子の同じフルオロフォアは、色素キサンテン（例えば、フルオレセイン（Fluorescein）、Texas Red）、シアニン、ナフタレン、クマリン、オキサジアゾール、ピレン、オキサジン、アクリジン、アリールメチン（arylmethine）、テトラピロール、及びTOTO-1、YOYO-1、Alexa Fluor、Cy系（Cy2、Cy5、Cy7）及び他の多くのものを含む市販の色素に由来する一般的な色素系からの標準蛍光分子とともに、ランタニド、ユーロピウム、サマリウム及びテルビウム等、時間分解蛍光で有用な蛍光分子である。
【００４２】
チャンバは、再び、光学的検出の前に洗浄されて未結合の蛍光検出分子が除去される。任意選択的に、対象となる標的検体に対する結合親和性を有する蛍光検出分子は、サンプルと事前に混合されてよい。そして、混合物がチャンバ内に導入され、その後チャンバ内腔が洗浄され、その後、光学的検出が行われる。
【００４３】
本発明に係る一実施形態では、いずれの標的検体に対しても、蛍光検出分子と一体化した結合パートナーは、内腔面にコーティングされる結合パートナーとは異なる。別法として、蛍光検出分子と一体化した結合パートナーと内腔面にコーティングされる標的検体に対する結合パートナーとは、例えば、標的検体が多価である場合、同じであってよい。さらに、結合パートナーは、例えばストレプトアビジンが中間結合パートナーとして内腔面にコーティングされる場合、結合カスケードにおける中間体であってよい。そして、ストレプトアビジンは、対象となる標的に対して特異的な抗体に共役したビオチンに結合する。流体サンプルにおける標的検体の各々は、標的検体及び結合パートナーが溶液内で接触する時、蛍光検出分子のその特異的な結合パートナーに結合し、それにより、蛍光標識された第１標的検体及び第２標的検体を形成する。
【００４４】
多検体検出では、各検体に対してそのそれぞれの面に対する特異性を維持することが重要である。表面処理中、ストレプトアビジンを中間体として使用することができる。各面における他の結合パートナーは、特異性を確保する必要がある。
【００４５】
本発明における単一フルオロフォアは、２つの標的検体又は２つの標的検体群を識別することができる。より大きい多様な能力が望まれる場合、さらなるシステム複雑性、例えば複数のフルオロフォア又は空間的分離を導入する必要があり、それらはともに適切な光学部品が必要である。
【００４６】
図２を参照すると、光学的検出に対して、光学系９２の光源９０からの励起光は、アッセイチャンバ１０の光学的に透明な壁１２ｆを通るように向けられる。励起光は、光学的に透明な壁１２ｆの内腔面１４ｆの結合パートナー５７に結合される第１標的検体５５に結合された蛍光検出分子５２の蛍光５６を励起する。同様に、蛍光５６’が、反対側の壁１２ｄの内腔面１４ｄの結合パートナー５７’に結合される第２標的検体５５’の蛍光検出分子５２’から放出される。蛍光検出分子５２及び５２’に対して同じフルオロフォアが使用される。
【００４７】
図２に示すように、第１標的検体及び第２標的検体から放射された総蛍光の第１光学読取値は、光検出器１００によって測定される。背景蛍光のみが測定される場合、サンプルに第１標的検体及び第２標的検体のいずれも存在しないと結論づけることができる。検出可能な蛍光は、第１標的検体及び第２標的検体の一方又は他方又は両方の存在を示す。
【００４８】
第１光学読取値が取得された後、ここで図３を参照すると、検出分子５２及び５２’で使用されるフルオロフォアに対して励起波長範囲又は放射波長範囲に近い波長範囲の光を強力に吸収するのに十分な濃度の減衰色素６０が、チャンバの内腔内に導入される。減衰色素６０は、アマランス、エリオグラウシン、ブリリアントグリーン又はさまざまな色素の組合せ等の標準的な非蛍光色素を含む。光学的に透明な壁１２ｆ（又はその一部）とは反対側の壁１２ｄの内腔面１４ｄに特異的に結合される第２標的検体５５’からの蛍光５６’は、チャンバ内腔内に導入される１つ又は複数の色素６０によって「マスク」される。光学的に透明な壁１２ｆの面１４ｆの結合パートナー５７に結合された蛍光標識された第１標的検体５５の特異的な蛍光５６はマスクされない。こここでまた蛍光が測定される。減衰色素が存在する場合に検出可能な蛍光は、本質的に、光学的に透明な壁１２ｆの内腔面１４ｆからのみ発生し、それは、反対側の壁面からの蛍光は減衰色素によってマスクされているためである。
【００４９】
本明細書に記載するような色素が存在しない場合の蛍光測定の定量的結果に対する、色素が存在する場合の蛍光測定の定量的結果により、色素が存在しない場合の総蛍光信号の計算によって、第１標的検体及び第２標的検体の量を求めることができる。マイクロプロセッサを使用して、以下のような蛍光信号の解析により、第１標的検体及び第２標的検体の量を求めることができる。光検出器によって測定された蛍光信号が背景を上回り、色素ある場合もない場合も等価である場合、第１標的検体５５（又はその検体群）のみが存在し、蛍光の大きさはサンプルにおける第１標的検体５５の量に比例する、と結論づけることができる。色素がない場合に背景を上回る蛍光が検出されるが、色素がある場合に背景蛍光のみが測定される場合、第２標的検体５５’（又はその検体群）のみが存在し、色素のない場合の蛍光の大きさは、サンプルにおける第２標的検体５５’の大きさに比例する、と結論づけることができる。色素がある場合に背景を上回る蛍光が検出されるが、その量が色素なしで測定された蛍光を下回る場合、試料内に第１標的検体５５及び第２標的検体５５’（又はそれぞれの検体群）がともに存在すると結論づけることができる。この場合、色素がある場合の蛍光の量は、サンプルにおける第１標的検体５５の量に比例し、色素がない場合及びある場合の蛍光の差は、サンプルにおける第２標的検体５５’の量に比例する。チャンバ内で減衰色素を使用する場合と使用しない場合との検体の組合せ及び蛍光信号を、以下の表１に要約する。
【００５０】
【表１】
2015500499.tif 000003
【００５１】
複数の標的検体を識別するように多重出力を増大させるために、本明細書に開示する二面及び減衰色素の発明を、多検体検出用の他の一般的な実施と組み合わせることができる。例えば、２つのフルオロフォアを使用して、１つの内腔面、例えば壁１２ｆの内腔面１４ｆ上の２つの検体を検出し識別することができ、任意選択的に、同じ２つのフルオロフォアを使用して、別の内腔面、例えば壁１２ｄの内腔面１４ｄ上の２つのさらなる検体を検出し識別することができる。これにより、４つの検体又は検体群の特異的な検出及び定量化が可能であるが、２つのフルオロフォアを励起し測定するためにさらに複雑な光学部品が必要である。同様に、さらに別の実施形態では、１つの壁に１つのフルオロフォアによる４つの空間的に別個の活性化された内腔面を、反対側の内腔面上で複製して、単一のフルオロフォアで合計８つの標的検体を検出することも可能であるが、空間的に分離した活性領域を特異的に測定するために複雑な光学部品が必要である。
【００５２】
図４を参照すると、本発明による一実施形態では、機器の光学部品は、光学的に透明な壁１２ｆ又はその一部の内腔面１４ｆからかつ光学的に透明な壁１２ｆとは反対側の壁１２ｄの内腔面１４ｄからのみの蛍光を検出し、チャンバ１０の側壁又は他の壁部分から放射される可能性がある蛍光を検出しないように配置されている。
【００５３】
例えば、さらに図４を参照すると、一実施形態では、チャンバ深さが０．１ｍｍであり外側寸法が６ｍｍ×２ｍｍである、本発明による矩形アッセイチャンバ１０において、チャンバの光学的に透明な壁１２ｆは６ｍｍ×２ｍｍである。さらに図４を参照すると、この実施形態では、光信号に対して、６ｍｍ×２ｍｍの光学的に透明な壁１２ｆの例えば中心の１ｍｍ×１ｍｍ光信号部分１２０、例えば中心のみが利用される。従って、光学的に透明な壁及び反対側の壁面の作動面以外のチャンバの側面等の壁面の蛍光検出分子の非特異的結合による信号は、実質的に除去される。
【００５４】
本発明により、競合結合アッセイもまた考慮される。競合フォーマットでは、蛍光標識された標的検体が、試料における非標識標的検体と競合するように、反応に追加される。試料に検体が存在する場合に増大した蛍光を見つける代わりに、競合フォーマットでは、低減した蛍光を見つける。競合フォーマットに対して、表１に類似する表を構成することができる。現表のおよそ反対である。例えば、いずれかの検体が存在しない場合、内腔面１４ｄ及び内腔面１４ｆの両方から強力な蛍光が予期される。
【００５５】
実施例
ミオグロビン及びＢＮＰが、上述した本発明によるマイクロ流体デバイスで検出することができる生物学的試料における例示的な第１標的検体及び第２標的検体である。
【００５６】
まず図２を参照すると、例示的なチャンバは、浅く、深さ８０が例えば約７５ミクロンである。ミオグロビンの特異的なエピトープに向けられた結合パートナー、例えばモノクローナル抗体を、光学的に透明な壁１２ｆの内腔面１４ｆに施される結合パートナーとして使用することができる。ＢＮＰの特異的なエピトープに向けられた別の結合パートナー、例えば第２モノクローナル抗体を、反対側の壁１２ｄの内腔面１４ｄに施される第２結合パートナーとして使用することができる。それぞれの面に結合されたモノクローナル抗体への標的検体の結合を可能にするように、チャンバ内腔内に生物学的試料が導入される。標的検体のそれらの関連する結合パートナーへの結合が発生し得るために十分な時間の後、チャンバ内腔が洗浄されて、未結合ミオグロビン及びＢＮＰとともに生物学的試料における他の成分が除去される。そして、ともに同じフルオロフォアを使用する、ミオグロビンの異なるエピトープに向けられた蛍光標識の異なる抗体と、ＢＮＰの異なるエピトープに向けられた蛍光標識モノクローナル抗体とが、チャンバ内腔内に同時に（単一混合試薬として）導入される。十分なインキュベーション時間の後、蛍光標識モノクローナル抗体はそれらのそれぞれの標的検体に結合して、蛍光標識標的検体を形成する。そして、色素なしにチャンバが洗浄され、未結合蛍光標識抗体が除去される。システムにアマランス等の減衰色素が存在しない状態で、ミオグロビンが結合する光学的に透明な壁の面から発生するユーロピウムからの蛍光と、ＢＮＰが結合する反対側の壁から発生する蛍光とが、結合信号として光学的に検出される。
【００５７】
反対側の壁の内腔面と光学的に透明な壁の内腔面とから発生する総蛍光が測定された後、図３を参照すると、アマランス等の減衰色素がチャンバ内腔内に導入される。減衰色素は、反対側の壁１２ｄの内腔面１４ｄから発生する蛍光を遮断する。減衰色素が存在する場合に測定された光信号は、光学的に透明な壁１２ｆの内腔面１４ｆからのみ発生する蛍光５６に関連する。上述したように、減衰色素が存在する場合及び存在しない場合に測定された蛍光を利用することにより、ミオグロビンから発生する特異的な蛍光信号とＢＮＰから発生する特異的な蛍光信号とを計算することができ、これらの信号を適切な標準曲線に適用することにより、単一のフルオロフォア及び固定光学部品を使用しながら、ミオグロビン及びＢＮＰの濃度を求めることができる。
【００５８】
当業者は、多重検体検出を達成するために複数の面とともに減衰色素を用いる実施態様における変形を理解するであろう。こうした変形としては、競合フォーマット等の代替アッセイフォーマットが挙げられる。さらに、チャンバを、最初に色素ありで洗浄して、未結合蛍光標識抗体を除去し、蛍光を測定することができ、その後、チャンバは再度、色素なしで洗浄剤により洗浄され、第２蛍光測定が行われる。
【００５９】
生物学的サンプルにおける複数の標的検体を測定する本発明の方法の一実施形態によれば、アッセイチャンバを有するマイクロ流体デバイスが提供される。アッセイチャンバは、壁によって密閉された内腔と任意選択的な入口ポート及び出口ポートとを有する。１つのチャンバ壁又はその一部は、チャンバ内から放射された蛍光光を、チャンバ内の蛍光の量を測定するチャンバの外側の光検出器に伝達するために、光学的に透明である。別のチャンバ壁は、光学的に透明な壁の反対側である。
【００６０】
光学的に透明な壁又はその一部の面は、生物学的試料における対象となる第１標的検体に対する特異的な結合パートナーでコーティングされ、反対側の壁の面又はその同様に位置決めされた部分は、対象となる第２標的検体に対する特異的な結合パートナーでコーティングされる。
【００６１】
１ステップアッセイでは、生物学的試料は、各々単一フルオロフォアで標識された少なくとも２つの結合パートナーと混合され、各結合パートナーは、標的検体のうちの１つに対して特異性を有している。結合パートナーとともに試料及び蛍光検出分子は、アッセイチャンバの内腔内に導入される。
【００６２】
代替的に、２ステップアッセイでは、チャンバ内腔にサンプルのみが追加され、結合が発生するのに十分な時間が与えられ、その後、蛍光検出分子が追加される。典型的には、蛍光検出分子がアッセイチャンバの内腔内に導入される前に、チャンバは洗浄される。
【００６３】
光学的に透明な壁の内腔面又は反対側の壁の内腔面のいずれかに特異的な蛍光標識とともに検体又は検体群の捕捉を確実にする結合事象が発生し得るようにするインキュベーションの後、生物学的サンプル及び未結合蛍光検出分子を含む溶液が、チャンバから除去され、チャンバは、チャンバの容積を超えるかそれに等しい体積の洗浄剤で洗浄される。
【００６４】
蛍光が測定される。測定された蛍光は、光学的に透明な壁及び反対側の壁の内腔面からの蛍光の合計である。背景蛍光のみが測定される場合、サンプルにいずれの標的検体も存在しないと結論づけることができる。検出可能な蛍光は、生物学的試料に、両標的検体又は２つの標的検体のうちのいずれかが存在することを示す。
【００６５】
次に、上述したように、チャンバ内腔は、１以上の減衰色素を含むある体積の溶液で充填される。色素溶液体積は、チャンバの容積におよそ等しい。二度目に蛍光が測定される。色素が存在する場合の検出可能な蛍光は、光学的に透明な内面からのみ発生し、それは、反対側の壁の内腔面からの蛍光は、チャンバ内腔内の減衰色素によって「マスク」されるためである。検出可能な蛍光は、生物学的試料における第１標的検体の量に関連する。
【００６６】
本発明の方法によれば、蛍光信号が背景を上回り色素がある場合及びない場合に等価である時に、第１標的検体の量を求めることができ、蛍光信号が背景を上回るが、色素がある場合に背景蛍光のみが測定される場合、第２標的検体の量を求めることができる。色素が存在する場合に背景を超える蛍光が測定可能であるが、蛍光の量が、色素がない場合に測定された蛍光を下回る場合、第１標的検体の量及び第２標的検体の量を求めることができ、それにより、第１標的検体の量が、色素が存在する場合の蛍光に関連し、色素が存在しない場合及び存在する場合の蛍光の差が、サンプルにおける第２標的検体の量に比例する。生物学的試料における標的検体の量を求めるために、測定された検出可能信号は、各検体に対する校正曲線と比較される。
【００６７】
上述したデバイス及び方法を使用して、いかなる他の検出分子もなしで単一フルオロフォア、単一焦点面及び経路を有する固定光学部品並びに最適な流体特性を備えた浅いチャンバを有するマイクロ流体デバイスを用いて、複数の標的検体の有無を検出することができる。従って、本発明の上述した装置及び方法は、蛍光に基づくインビトロ医療診断試験の精度を向上させ、それにより患者治療の向上につながる。
【００６８】
本明細書に記載したものの変形、変更及び他の実施態様は、特許請求の範囲に記載されている本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく当業者に想到するであろう。従って、本発明は、上記の例示的な説明によってではなく、以下の特許請求の範囲の趣旨及び範囲によって定義されるべきである。
【図１Ａ】
2015500499.tif 000004
【図１Ｂ】
2015500499.tif 000005
【図１Ｃ】
2015500499.tif 000006
【図１Ｄ】
2015500499.tif 000007
【図１Ｅ】
2015500499.tif 000008
【図１Ｆ】
2015500499.tif 000009
【図２】
2015500499.tif 000010
【図３】
2015500499.tif 000011
【図４】
2015500499.tif 000012
【国際調査報告】
2015500499.tif 000013
2015500499.tif 000014
2015500499.tif 000015
2015500499.tif 000016