(57)【要約】  神経幹細胞を調製するための培養培地およびその使用を提供する。神経幹細胞を調製するための培養培地は、幹細胞の増殖のために適している基礎培養培地と、ＧＳＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤およびＢＭＰ阻害剤の少なくとも１つから選択される細胞シグナル経路阻害剤とを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞を培養するための基礎培地と、
ＧＳＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤およびＢＭＰ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つである阻害剤と、
を含む、神経幹細胞を調製するための培地。
【請求項２】
前記基礎培地は、ｍＴｅＳＲ１である、請求項１に記載の培地。
【請求項３】
前記阻害剤は、ＧＳＫ阻害剤  ＣＨＩＲ９９０２１、ＭＥＫ阻害剤  ＰＤ０３２５９０１、ＴＧＦ−β阻害剤  Ａ８３−０１、ＲＯＣＫ阻害剤  チアゾビビン、および、ＢＭＰ阻害剤  ＤＭＨ１を含む、請求項１に記載の培地。
【請求項４】
前記阻害剤は、約０．３μＭから約３０μＭのＧＳＫ阻害剤  ＣＨＩＲ９９０２１、約１０ｎｍから約１０μＭのＭＥＫ阻害剤  ＰＤ０３２５９０１、約５０ｎｍから約５μＭのＴＧＦ−β阻害剤  Ａ８３−０１、約５０ｎｍから約５μＭのＲＯＣＫ阻害剤  チアゾビビン、および、約２０ｎｍから約２μＭのＢＭＰ阻害剤  ＤＭＨ１を含む、請求項３に記載の培地。
【請求項５】
前記阻害剤は、約３μＭのＧＳＫ阻害剤  ＣＨＩＲ９９０２１、約１μＭのＭＥＫ阻害剤  ＰＤ０３２５９０１、約０．５μＭのＴＧＦ−β阻害剤  Ａ８３−０１、約０．５μＭのＲＯＣＫ阻害剤  チアゾビビン、および、約０．２μＭのＢＭＰ阻害剤  ＤＭＨ１を含む、請求項３に記載の培地。
【請求項６】
ＧＳＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤およびＢＭＰ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つである阻害剤を含む、神経幹細胞を調製するためのキット。
【請求項７】
前記阻害剤は、ＧＳＫ阻害剤  ＣＨＩＲ９９０２１、ＭＥＫ阻害剤  ＰＤ０３２５９０１、ＴＧＦ−β阻害剤  Ａ８３−０１、ＲＯＣＫ阻害剤  チアゾビビン、および、ＢＭＰ阻害剤  ＤＭＨ１を含む、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
前記ＧＳＫ阻害剤  ＣＨＩＲ９９０２１、前記ＭＥＫ阻害剤  ＰＤ０３２５９０１、前記ＴＧＦ−β阻害剤  Ａ８３−０１、前記ＲＯＣＫ阻害剤  チアゾビビン、および、前記ＢＭＰ阻害剤  ＤＭＨ１は、それぞれ異なる容器に収容されている、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
さらに、基礎培地であるｍＴｅＳＲ１を含む、請求項６に記載のキット。
【請求項１０】
前記阻害剤は前記基礎培地中に溶解されている、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
前記阻害剤は、約３μＭの濃度を有するＧＳＫ阻害剤  ＣＨＩＲ９９０２１、約１μＭの濃度を有するＭＥＫ阻害剤  ＰＤ０３２５９０１、約０．５μＭの濃度を有するＴＧＦ−β阻害剤  Ａ８３−０１、約０．５μＭの濃度を有するＲＯＣＫ阻害剤  チアゾビビン、および、約０．２μＭの濃度を有するＢＭＰ阻害剤  ＤＭＨ１を含む、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載の培地を含む、神経幹細胞を調製するためのキット。
【請求項１３】
神経幹細胞の調製における、請求項６ないし１２のいずれか１項に記載のキットの使用。
【請求項１４】
神経幹細胞の調製における、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の培地の使用。
【請求項１５】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載の培地を使用して体細胞を培養することを含む神経幹細胞を調製する方法であって、
前記体細胞は、当該体細胞から前記神経幹細胞への分化転換を誘導するための、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｍｉＲ３０２からなる群から選択される少なくとも１つである多能性幹細胞因子をコードする核酸配列を含む、方法。
【請求項１６】
前記体細胞は、ヒト尿中脱落細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記体細胞が、
ヒトの尿を遠心分離し、沈殿物を得ることと、
尿培養のための培地を使用して前記沈殿物を培養し、一次ヒト尿中脱落細胞を得ることと、
Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｍｉＲ３０２からなる群から選択される少なくとも１つである多能性幹細胞因子をコードする核酸配列を担持するベクターを使用して、前記一次ヒト尿中脱落細胞を形質転換して、当該体細胞を得ることと、
によって得られる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ベクターは、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｍｉＲ３０２をコードする前記核酸配列を担持する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ベクターは、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｍｉＲ３０２のそれぞれをコードする前記核酸配列を担持するプラスミドを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記一次ヒト尿中脱落細胞は、電気的形質導入の手段によって形質転換される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
付着神経幹細胞を得るために基礎培地を使用して前記神経幹細胞を前培養し、
約１％のＮ２サプリメント、約１％の非必須アミノ酸、約０．１％のヘパリン、約２０ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞増殖因子および約２０ｎｇ／ｍｌの上皮成長因子が添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を含む、神経幹細胞のための培地において、前記付着神経幹細胞を培養することをさらに含む、
請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１５ないし２１のいずれか１項に記載の方法によって得られる神経幹細胞、またはその分裂物・分化物。
【請求項２３】
神経細胞損傷によって誘発される疾患を治療するための薬剤の調製における、請求項２２に記載の神経幹細胞またはその分裂物・分化物の使用。
【請求項２４】
請求項２２に記載の神経幹細胞またはその分裂物・分化物を患者に導入することを含む、神経細胞損傷によって誘発される疾患を治療する方法。
【請求項２５】
請求項２２に記載の神経幹細胞またはその分裂物・分化物を、分化のために適切な条件下において培養することを含む、神経細胞を調製する方法。
【請求項２６】
異なる種類のニューロンおよび神経膠細胞を得るために、前記神経幹細胞を、約１％のＮ２サプリメント、約１％の非必須アミノ酸、約０．１％のヘパリンおよびニューロトロフィンが添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地において培養することをさらに含み、
前記ニューロトロフィンは、約１０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、約１０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、約１０ｎｇ／ｍＬのＣＮＴＣおよび約１０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦで構成されている、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ヒトの尿からヒト尿中脱落細胞を分離するための分離装置と、
前記分離装置と接続されており、ヒト尿中脱落細胞を形質転換するためのＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｍｉＲ３０２からなる群から選択される少なくとも１つである多能性幹細胞因子をコードする核酸配列のベクターを具備している形質転換装置と、
前記形質転換装置と接続されており、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の培地を具備しており、体細胞から神経幹細胞へと分化転換を誘導するために、形質転換されたヒト尿中脱落細胞に分化転換を受けさせるための分化転換装置と、
を備える、神経幹細胞を調製するためのシステム。
【請求項２８】
請求項２２に記載の神経幹細胞を候補化合物と接触させる工程と、
前記神経幹細胞を前記候補化合物と接触させる工程の前および後のそれぞれにおける神経幹細胞の多能性を判定する工程であって、前記神経幹細胞を前記候補化合物と接触させた後における多能性の減少を、前記候補化合物が神経幹細胞の分化誘導能を有する指標とする、工程と、を含む、
神経幹細胞の分化を誘導するための化合物をスクリーニングする方法。
【請求項２９】
患者から体細胞を分離する工程と、
請求項１５ないし２１のいずれか１項に記載の方法によって、前記体細胞を基盤とした神経幹細胞を調製する工程と、
前記患者に前記神経幹細胞を導入する工程とを含む、
神経変性疾患または神経細胞損傷によって誘発される疾患を治療する方法。
【請求項３０】
前記薬剤を請求項２２に記載の神経幹細胞と接触させる工程と、
前記薬剤を前記神経幹細胞と接触させる工程の前および後における前記神経幹細胞を判定する工程と、
前記神経幹細胞の変化に基づき前記薬剤が神経系に影響を及ぼすかどうかを判定する工程と、を含む、
薬剤が神経系に影響を及ぼしているかどうかを判定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施の形態は、一般的に生物医学の分野に関し、さらに特には神経幹細胞を調製するための培地およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、ヒトならびに種々の組織およびそれらの細胞の最初の元となるものであり、その最も顕著な生物学的特性は、自己再生および増殖の能力を有するだけでなく、多分化能性をも有することである。幹細胞は、異なる元によって、体性幹細胞および胚性幹（ＥＳ）細胞に分類される。体性幹細胞は、神経幹細胞、間葉系幹細胞および造血幹細胞等を含む。現在、造血幹細胞および間葉系幹細胞における多くの研究の以外にも、神経幹細胞における研究も相対的に深くなされている。
【０００３】
１９９２年に、ＲｅｙｎｏｌｄおよびＷｅｉｓｓらが、成体マウスの線条体から、自己再生、分裂および増殖の能力を有するだけでなく、損傷および疾患に応答し得る神経系の細胞のほとんどの種類に分化をもすることができる、神経幹細胞を初めて分離した。１９９８年には、日本の岡野およびＣｏｒｎｅｌｌ大学のＧｏｌｄｍａｎが、ヒトの成人の脳組織における神経幹細胞の存在を共同で実証した。現在、段階的な実験を通して神経系における多能性幹細胞の存在が実証されており、そこからの分離にも成功している。これは、神経系の損傷の修復および神経変性障害の細胞置換療法のための新たな希望となっている。非再生および非自己修復であるニューロンの特性は医療科学において克服しがたい障害であり、中枢神経系の組織構造の脆弱性およびそれらの知的活動の上での重要性のため、さらなる中枢神経系障害およびその後遺症はヒトの健康および生活の質に影響を及ぼす最も慢性的な疾患の１つであるので、その神経幹細胞における研究は最も熱い議題となっており、幹細胞研究の分野において焦点が当てられている部分であり、臨床適用において明るい前途を有している。しかし、現在では、神経幹細胞に関する研究はまだ改善の必要がある。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の実施の形態は、少なくともある程度関連する分野において存在する問題の、少なくとも１つを解決することを求めるものである。従って、本発明の１つの目的は、効果的に神経幹細胞を調製するための手段を提供することである。
【０００５】
本発明の第１の態様の実施の形態は、神経幹細胞を調製するための培地を提供する。本発明の実施の形態によると、当該培地は、幹細胞を培養するための基礎培地、および、ＧＳＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤およびＢＭＰ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つである阻害剤を含んでもよい。本発明の発明者らは、体細胞、特に転写調節因子を発現する体細胞を培養するための当該培地の使用は、体細胞を神経幹細胞へと効果的に分化転換し（ここでは“人工神経幹細胞”としても知られている）、分化転換の時間を大いに短縮し得るということを見出した。
【０００６】
本発明の第２の態様の実施の形態は、神経幹細胞を調製するためのキットを提供する。本発明の実施の形態によると、キットは、ＧＳＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤およびＢＭＰ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つである阻害剤を含んでもよい。本発明の発明者らは、体細胞、特に転写調節因子を発現する体細胞、を培養するための当該キットの使用は、体細胞を神経幹細胞へと効果的に分化転換し、分化転換の時間を大いに短縮し得るということを見出した。
【０００７】
本発明の第３の態様の実施の形態は、神経幹細胞を調製するためのキットを提供し、当該キットは上述した培地を含み得る。本発明の発明者らは、体細胞、特に転写調節因子を発現する体細胞を培養するための当該キットの使用は、体細胞を神経幹細胞へと効果的に分化転換し、分化転換の時間を大いに短縮し得るということを見出した。
【０００８】
本発明の第４の態様の実施の形態は、神経幹細胞の調製における上述したキットの使用を提供する。本発明の実施の形態による当該キットの使用は、体細胞、特に転写調節因子を発現する体細胞を効果的に培養し、大いに短縮した時間で体細胞を神経幹細胞へとさらに効果的に分化転換し得る。
【０００９】
本発明の第５の態様の実施の形態は、神経幹細胞の調製における上述した培地の使用を提供する。これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの体細胞、特に転写調節因子を発現する体細胞の培養の手段によって、大いに短縮した時間で体細胞を神経幹細胞へと効果的に分化転換し得る。
【００１０】
本発明の第６の態様の実施の形態は、神経幹細胞を調製する方法を提供する。本発明の実施の形態によると、当該方法は、上述した培地を使用して体細胞を培養することを含み、当該体細胞は、体細胞から神経幹細胞への分化転換を誘導するための、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｍｉＲ３０２からなる群から選択される少なくとも１つである多能性幹細胞因子をコードする核酸配列を含んでいる。本発明の発明者らは、特定の転写因子によってコードされた多能性幹細胞因子の核酸配列を運んでいる体細胞を培養するための、本発明の実施の形態による培地の使用は、大いに短縮した時間で体細胞を神経幹細胞へと効果的に分化転換し得るということを見出した。
【００１１】
本発明の第７の態様の実施の形態は、神経幹細胞またはその分裂物・分化物（派生物、ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）を提供する。本発明の実施の形態によると、上述の方法によって当該神経幹細胞が得られる。さらに、本発明の実施の形態による神経幹細胞またはその分裂物・分化物は、適切な条件下において神経細胞へと効果的に分化し得る。
【００１２】
本発明の第８の態様の実施の形態は、神経細胞損傷によって誘発される疾患を治療するための薬剤の調製における、上述した神経幹細胞またはその分裂物・分化物の使用を提供する。本発明の実施の形態による神経幹細胞およびその分裂物・分化物は適切な条件下において神経細胞へと効果的に分化し得るので、従って、当該神経幹細胞およびその分裂物・分化物はさらに薬剤へと調製され、神経細胞損傷によって誘発される疾患を治療するために使用され得る。
【００１３】
本発明の第９の態様の実施の形態は、神経細胞損傷によって誘発される疾患を治療する方法を提供する。本発明の実施の形態によると、当該方法は、上述した神経幹細胞またはその分裂物・分化物を患者へと導入することを含み得る。上述した神経幹細胞またはその分裂物・分化物を患者へと導入することによって、神経幹細胞を神経細胞へと効果的に分化させることができ、神経細胞損傷によって誘発される身体損傷をさらに治療し得る。
【００１４】
本発明の第１０の態様の実施の形態は、神経幹細胞を調製する方法を提供する。本発明の実施の形態によると、当該方法は、分化に適した条件下において上述の神経幹細胞を培養することを含み得る。本発明の実施の形態による当該方法の使用は、神経幹細胞を神経細胞へと効果的に分化させることができ、神経細胞を効果的に調製し得る。
【００１５】
本発明の第１１の態様の実施の形態は、神経幹細胞を調製するためのシステムを提供する。本発明の実施の形態によると、当該システムは、ヒトの尿からヒト尿中脱落細胞（ａ  ｈｕｍａｎ  ｕｒｉｎｅ  ｅｘｆｏｌｉａｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ）を分離する分離装置と、当該分離装置と接続されており、ヒト尿中脱落細胞を形質転換するＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｍｉＲ３０２からなる群から選択される少なくとも１つである多能性幹細胞因子をコードする核酸配列のベクターを具備している形質転換装置と、当該形質転換装置と接続されており、形質転換されたヒト尿中脱落細胞の神経幹細胞への分化転換を誘導するために、形質転換されたヒト尿中脱落細胞に分化転換を受けさせるための上述した培地を具備している分化転換装置と、を備え得る。当該システムの使用は、上述した神経細胞を調製する方法を効果的に実行することができ、神経幹細胞を効果的に調製し得る。
【００１６】
本発明の第１２の態様の実施の形態は、神経幹細胞の分化を誘導するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。本発明の実施の形態によると、当該方法は、上述の神経幹細胞を候補化合物と接触させること、および、神経幹細胞を候補化合物と接触させる工程の前および後のそれぞれにおける神経幹細胞の多能性を判定することを含み得る。神経幹細胞を候補化合物と接触させた後における多能性の減少は、候補化合物が神経幹細胞の分化誘導能を有する指標となる。当該方法の使用は、神経幹細胞の分化を誘導する化合物を得るために、効果的にスクリーニングすることができる。
【００１７】
本発明の第１３の態様の実施の形態は、神経変性疾患または神経細胞損傷によって誘発される疾患を治療する方法を提供する。本発明の実施の形態によると、当該方法は、患者から体細胞を分離すること、上述の方法に従って当該体細胞を基盤とした神経幹細胞を調製すること、および、患者に当該神経幹細胞を導入することを含み得る。神経変性疾患または神経細胞損傷によって誘発される疾患を治療する方法の使用は、得られた神経幹細胞を患者へと効果的に導入することができ、さらに効果的に患者体内で神経細胞へと分化し、神経変性または神経細胞損傷によって誘発される身体損傷を治療し、神経変性疾患および神経細胞損傷によって誘発された疾患を治療することも可能となり得る。
【００１８】
本発明の第１４の態様の実施の形態は、薬剤が神経系に影響を及ぼしているかどうかを判定する方法を提供する。本発明の実施の形態によると、当該方法は、薬剤を本発明の実施の形態による神経幹細胞と接触させること、および、薬剤を神経幹細胞と接触させる工程の前および後の神経幹細胞を判定し、神経幹細胞の変化に基づき薬剤が神経系に影響を及ぼすかどうかを判定することを含み得る。当該方法の使用は、薬剤が神経系に影響を及ぼすかどうかを効果的に判定することができる。
【００１９】
本発明の実施の形態の追加の態様および利点は、以下の記述において部分的に与えられているか、以下の記述から部分的に明らかとなるか、または本発明の実施の形態の実行から習得されるだろう。
【００２０】
本発明の実施の形態におけるこれらおよび他の態様および利点は、添付の図面を参照とする以下の記述から明らかとなり、より容易に理解されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の実施の形態による、神経幹細胞を調製する方法を示すフローチャートの図である。
【図２】本発明の実施の形態による、神経幹細胞を調製するシステムを示す概略図である。
【図３】本発明の実施の形態による、神経変性疾患または神経細胞損傷によって誘発される疾患を治療する方法を示すフローチャートの図である。
【図４】本発明の実施の形態による、人工神経幹細胞を誘導している間における異なる位相の細胞形態を示す撮影図である。
【図５】本発明の実施の形態による、免疫蛍光法およびリアルタイムＰＣＲによって判定された人工神経幹細胞内における神経幹細胞のマーカー遺伝子の発現レベルを示す撮影図である。
【図６】本発明の実施の形態による、免疫蛍光法によって判定された人工神経幹細胞由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化産物間における、異なる種類のニューロンおよび神経膠細胞に固有の異なるマーカーの発現を示す撮影図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の実施の形態について、詳細において言及がなされるだろう。図面を参照としてここに記載されている実施の形態は、説明的、例示的であり、本発明を一般的に理解するために使用されるものである。実施の形態は、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。同様または類似の要素、および、同様または類似の機能を有している要素は、記載を通して同様の符号を付している。
【００２３】
本発明の第１の態様の実施の形態は、神経幹細胞を調製するための培地を提供する。本発明の実施の形態によると、当該培地は、幹細胞を培養するための基礎培地、および、ＧＳＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤およびＢＭＰ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つである阻害剤を含んでもよい。本発明の発明者らは、体細胞、特に転写調節因子を発現する体細胞、を培養するための当該培地の使用は、体細胞を神経幹細胞へと効果的に分化転換し、分化転換の時間を大いに短縮し得るということを見出した。
【００２４】
本発明の実施の形態によると、基礎培地の種類は特に限定されない。本発明のある実施の形態によると、基礎培地は、ｍＴｅＳＲ１である（ステムセル社から購入され得る）。本発明の実施の形態によると、阻害剤の種類も、特に限定されず、細胞シグナル経路阻害剤の様々な種類であり得る。本発明のある実施の形態によると、阻害剤は、ＧＳＫ阻害剤  ＣＨＩＲ９９０２１、ＭＥＫ阻害剤  ＰＤ０３２５９０１、ＴＧＦ−β阻害剤  Ａ８３−０１、ＲＯＣＫ阻害剤  チアゾビビン（ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ）、および、ＢＭＰ阻害剤  ＤＭＨ１を含み得る。これらの阻害剤は全て市販されており、体細胞を神経幹細胞へ分化転換する効率をさらに改善することができる。神経幹細胞を調製するための培地における阻害剤のそれぞれの濃度は、特に限定されない。本発明のある実施の形態によると、阻害剤は、約０．３μＭから約３０μＭのＧＳＫ阻害剤  ＣＨＩＲ９９０２１、約１０ｎＭから約１０μＭのＭＥＫ阻害剤  ＰＤ０３２５９０１、約５０ｎｍから約５μＭのＴＧＦ−β阻害剤  Ａ８３−０１、約５０ｎｍから約５μＭのＲＯＣＫ阻害剤  チアゾビビン、約２０ｎｍから約２μＭのＢＭＰ阻害剤  ＤＭＨ１を含み得る。好ましくは、本発明のある実施の形態によると、阻害剤は、約３μＭのＧＳＫ阻害剤  ＣＨＩＲ９９０２１、約１μＭのＭＥＫ阻害剤  ＰＤ０３２５９０１、約０．５μＭのＴＧＦ−β阻害剤  Ａ８３−０１、約０．５μＭのＲＯＣＫ阻害剤  チアゾビビン、および、約０．２μＭのＢＭＰ阻害剤  ＤＭＨ１を含み得る。これによって、体細胞の神経幹細胞への分化転換の効率をさらに改善することができる。
【００２５】
本発明の第２の態様の実施の形態は、神経幹細胞を調製するためのキットを提供する。本発明の実施の形態によると、当該キットは、ＧＳＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤およびＢＭＰ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つである阻害剤を含んでもよい。本発明の発明者らは、体細胞、特に転写調節因子を発現する体細胞を培養するための当該キットの使用は、体細胞を神経幹細胞へと効果的に分化転換し、分化転換の時間を大いに短縮し得るということを見出した。本発明の実施の形態によると、阻害剤の種類は特に限定されない。本発明のある実施の形態によると、阻害剤は、ＧＳＫ阻害剤  ＣＨＩＲ９９０２１、ＭＥＫ阻害剤  ＰＤ０３２５９０１、ＴＧＦ−β阻害剤  Ａ８３−０１、ＲＯＣＫ阻害剤  チアゾビビン、および、ＢＭＰ阻害剤  ＤＭＨ１を含み得る。これらの阻害剤は全て市販されており、体細胞の神経幹細胞への分化転換の効率を、さらに改善することができる。神経幹細胞を調製するための培地における、阻害剤のそれぞれの濃度は、特に限定されない。本発明のある実施の形態によると、ＧＳＫ阻害剤  ＣＨＩＲ９９０２１、ＭＥＫ阻害剤  ＰＤ０３２５９０１、ＴＧＦ−β阻害剤  Ａ８３−０１、ＲＯＣＫ阻害剤  チアゾビビン、および、ＢＭＰ阻害剤  ＤＭＨ１は、それぞれ異なる容器において収容される。従って、キットは、体細胞の神経幹細胞への分化転換において、便利に使用され得る。本発明のある実施の形態によると、キットは、基礎培地をさらに含み得る。当該基礎培地は、ｍＴｅＳＲ１である（ステムセル社から購入され得る）。
【００２６】
本発明の実施の形態によると、阻害剤の存在は特に限定されない。本発明のある実施の形態によると、キットにおいて、阻害剤が基礎培地中に溶解されている。従って、当該キットは、体細胞の神経幹細胞への分化転換において、便利に使用され得る。本発明のある実施の形態によると、キットにおいて、基礎培地中に溶解された阻害剤は、約３μＭの濃度を有するＧＳＫ阻害剤  ＣＨＩＲ９９０２１、約１μＭの濃度を有するＭＥＫ阻害剤  ＰＤ０３２５９０１、約０．５μＭの濃度を有するＴＧＦ−β阻害剤  Ａ８３−０１、約０．５μＭの濃度を有するＲＯＣＫ阻害剤  チアゾビビン、および、約０．２μＭの濃度を有するＢＭＰ阻害剤  ＤＭＨ１を含み得る。従って、上述のキットを使用する体細胞の神経幹細胞への分化転換の効果は、さらに改善され得る。
【００２７】
本発明の第３の態様の実施の形態は、神経幹細胞を調製するためのキットを提供し、当該キットは当該培地を含み得る。本発明の発明者らは、体細胞、特に転写調節因子を発現する体細胞、を培養するための当該キットの使用は、体細胞を神経幹細胞へと効果的に分化転換し、分化転換の時間を大いに短縮し得るということを見出した。神経幹細胞を調製するための当該培地は、詳細に上述したものであり、簡潔とするため省略する。本発明の第４の態様の実施の形態は、神経幹細胞の調製における上述したキットの使用を提供する。本発明の実施の形態による当該キットの使用は、体細胞、特に転写調節因子を発現する体細胞、を効果的に培養し、大いに短縮した時間で体細胞を神経幹細胞へとさらに効果的に分化転換し得る。当該キットは、詳細に上述したものであり、簡潔とするため省略する。本発明の第５の態様の実施の形態は、神経幹細胞の調製における上述した培地の使用を提供する。これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの体細胞、特に転写調節因子を発現する体細胞、の培養の手段によって、大いに短縮した時間で体細胞を神経幹細胞へと効果的に分化転換し得る。神経幹細胞を調製するための当該培地は、詳細に上述したものであり、簡潔とするため省略する。
【００２８】
本発明の第６の態様の実施の形態は、神経幹細胞を調製する方法を提供する。本発明の実施の形態によると、当該方法は、上述した培地を使用して体細胞を培養することを含み、当該体細胞は、体細胞から神経幹細胞への分化転換を誘導するための、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｍｉＲ３０２からなる群から選択される少なくとも１つである多能性幹細胞因子をコードする核酸配列を含んでいる。本発明の発明者らは、特定の転写因子によってコードされた多能性幹細胞因子の核酸配列を担持する体細胞を培養するための本発明の実施の形態による当該培地の使用は、大いに短縮した時間で体細胞を神経幹細胞へと効果的に分化転換し得るということを見出した。本発明の実施の形態によると、体細胞の種類は特に限定されない。本発明のある実施の形態によると、体細胞は、ヒト尿中脱落細胞である。従って、始原細胞を容易に得ることができ、神経幹細胞の調製の効果をさらに改善し、神経幹細胞を調製するための費用を減少させ、侵襲性手術を使用して始原細胞を取得するための労力および材料費を抑えることができる。
【００２９】
さらに、本発明の実施の形態によると、体細胞は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｍｉＲ３０２からなる群から選択される少なくとも１つである多能性幹細胞因子をコードする核酸配列を含み、また、このような体細胞は、当該多能性幹細胞因子のない体細胞へ生物学的処置を受けさせることによっても得ることができる。具体的には、本発明の実施の形態によると、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｍｉＲ３０２からなる群から選択される少なくとも１つの多能性幹細胞因子をコードする核酸配列を含む体細胞は、次の工程によって得ることができる。
まず、ヒトの尿を遠心分離し、沈殿物を得て、
次に、尿を培養するための培地を使用して沈殿物を培養し、一次ヒト尿中脱落細胞を得て、
最後に、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｍｉＲ３０２からなる群から選択される少なくとも１つである多能性幹細胞因子をコードする核酸配列を担持するベクターを使用して、一次ヒト尿中脱落細胞を形質転換し、体細胞を得る。本発明のある実施の形態によると、当該ベクターは、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｍｉＲ３０２をコードする核酸配列を担持する。本発明のある実施の形態によると、当該ベクターは、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｍｉＲ３０２のそれぞれをコードする核酸配列を担持するプラスミドを含む。本発明のある実施の形態によると、一次ヒト尿中脱落細胞は、電気的形質導入の手段によって形質転換される。
【００３０】
神経幹細胞を得た後、当該神経幹細胞に、さらに増殖培養を受けさせてもよい。本発明の実施の形態によると、神経幹細胞に増殖培養に受けさせる方法は特に限定されず、本発明のある実施の形態によると、神経幹細胞を調製する方法が、神経幹細胞に増殖培養を受けさせるための以下の工程をさらに含んでもよい。
まず、ｍＴｅＳＲ１のような基礎培地を使用して神経幹細胞を前培養し、付着神経幹細胞を得て、
次に、約１％のＮ２サプリメント、約１％の非必須アミノ酸、約０．１％のヘパリン、約２０ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞増殖因子および約２０ｎｇ／ｍｌの上皮成長因子が添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を含む、神経幹細胞のための培地において当該付着神経幹細胞を培養する。
【００３１】
本発明の第７の態様の実施の形態は、神経幹細胞またはその分裂物・分化物を提供する。本発明の実施の形態によると、上述の方法によって神経幹細胞が得られる。さらに、本発明の実施の形態による、神経幹細胞またはその分裂物・分化物は、適切な条件下において神経細胞へと効果的に分化し得る。本発明の第８の態様の実施の形態は、神経細胞損傷によって誘発される疾患を治療するための薬剤の調製における、上述した神経幹細胞またはその分裂物・分化物の使用を提供する。本発明の実施の形態による神経幹細胞およびその分裂物・分化物は適切な条件下において神経細胞へと効果的に分化し得るので、神経幹細胞およびその分裂物・分化物はさらに薬剤へと調製され、神経細胞損傷によって誘発される疾患を治療するために使用され得る。本発明の第９の態様の実施の形態は、神経細胞損傷によって誘発される疾患を治療する方法を提供する。本発明の実施の形態によると、当該方法は、上述した神経幹細胞またはその分裂物・分化物を患者へと導入することを含み得る。上述した神経幹細胞またはその分裂物・分化物を患者へと導入することによって、神経幹細胞が神経細胞へと効果的に分化し、神経細胞損傷によって誘発される身体損傷をさらに治療し得る。
【００３２】
本発明の第１０の態様の実施の形態は、神経幹細胞を調製する方法を提供する。本発明の実施の形態によると、当該方法は、分化に適した条件下において上述の神経幹細胞を培養することを含み得る。本発明の実施の形態による当該方法の使用は、神経幹細胞を神経細胞へと効果的に分化させることができ、神経細胞を効果的に調製し得る。本発明の実施の形態によると、神経幹細胞に分化培養を受けさせる方法は特に限定されない。本発明のある実施の形態によると、異なる種類のニューロンおよび神経膠細胞を得るために、神経幹細胞は、約１％のＮ２サプリメント、約１％の非必須アミノ酸、約０．１％のヘパリンおよびニューロトロフィンが添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地において培養される。ニューロトロフィンは、約１０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、約１０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、約１０ｎｇ／ｍＬのＣＮＴＣおよび約１０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦで構成されている。
【００３３】
本発明の第１１の態様の実施の形態は、神経幹細胞を調製するためのシステムを提供する。本発明の実施の形態によると、図２に示すように、システム１０００は、分離装置１００と、形質転換装置２００と、分化転換装置３００とを含み得る。ここで、分離装置１００は、ヒトの尿からヒト尿中脱落細胞を分離するために使用される。形質転換装置２００は、分離装置１００と接続されており、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｍｉＲ３０２からなる群から選択される少なくとも１つである多能性幹細胞因子をコードする核酸配列を担持するベクターを具備しており、分離装置１００から受け取ったヒト尿中脱落細胞を形質転換するために使用される。分化転換装置３００は、形質転換装置と接続されており、形質転換されたヒト尿中脱落細胞の神経幹細胞への分化転換を誘導するように、形質転換装置２００から受け取った形質転換されたヒト尿中脱落細胞に分化転換を受けさせるための上記の培地を具備している。当該システムの使用は、上述した神経細胞を調製する方法を効果的に実行することができ、神経幹細胞を効果的に調製し得る。
【００３４】
本発明の第１２の態様の実施の形態は、神経幹細胞の分化を誘導するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。本発明の実施の形態によると、当該方法は、上述の神経幹細胞を候補化合物と接触させること、および、神経幹細胞を候補化合物と接触させる工程の前および後のそれぞれにおける神経幹細胞の多能性を判定することを含み得る。神経幹細胞を候補化合物と接触させた後における多能性の減少は、候補化合物が神経幹細胞の分化誘導能を有する指標となる。当該方法の使用は、神経幹細胞の分化を誘導する化合物を得るために、効果的にスクリーニングすることができる。本発明の第１３の態様の実施の形態は、神経変性疾患または神経細胞損傷によって誘発される疾患を治療する方法を提供する。本発明の実施の形態によると、図３に示すように、方法は以下の工程を含み得る。
まず、患者から体細胞を分離し、
次に、上述の方法に従って当該体細胞を基盤とした神経幹細胞を調製し、
および、当該患者に当該神経幹細胞を導入する。
【００３５】
神経変性疾患または神経細胞損傷によって誘発される疾患を治療する方法の使用は、得られた神経幹細胞を患者へと効果的に導入することができ、さらに効果的に患者体内で神経細胞へと分化し、神経変性または神経細胞損傷によって誘発される身体損傷を治療し、神経変性疾患および神経細胞損傷によって誘発された疾患を治療できる可能性があるということである。
【００３６】
本発明の第１４の態様の実施の形態は、薬剤が神経系に影響を及ぼしているかどうかを判定する方法を提供する。本発明の実施の形態によると、当該方法は、薬剤を本発明の実施の形態による神経幹細胞と接触させること、および、薬剤を神経幹細胞と接触させる工程の前および後の神経幹細胞を判定し、神経幹細胞の変化に基づき薬剤が神経系に影響を及ぼすかどうかを判定することを含み得る。当該方法の使用は、薬剤が神経系に影響を及ぼすかどうかを効果的に判定することができる。
【００３７】
神経幹細胞を調製するための培地およびその使用が、本発明の発明者らによる厳然たる創造的労力および最適な言及を通して達成されていることは認識されるべきである。さらに、本発明のそれぞれの態様において記載されている特徴は、互いにそれぞれの他のものを参照し得るものであり、これは、簡潔とするためここでは省略する。
【実施例】
【００３８】
本発明の実施例について、詳細において言及がなされるだろう。以下の実施例は説明的であり、本発明の範囲を限定するように解釈することはできないということは、当業者によって理解されるだろう。特定の技術または条件が実施例において特定されていない場合、当該分野の文献に記載されている技術もしくは条件、または製品説明書に従って、工程は行われる。試薬または機器の製造者が特定されていない場合、試薬または機器は市販されている。
【００３９】
実施例１：神経幹細胞の調製
１．ヒト尿中脱落細胞の分離（尿中細胞（Ｕｒｉｎｅ  ｃｅｌｌｓ、ＵＣ））
以下の工程による尿中脱落細胞の分離。
（１）ペニシリン／ストレプトマイシンを添加した滅菌容器に、尿の中流の１５０−２００ｍＬを収集する。
（２）尿を５０ｍＬ遠心チューブの中に移し、４００ｇで１０分間遠心分離を行う。
（３）尿の約５ｍＬを維持するように、上清を捨てる。
（４）ペニシリン／ストレプトマイシンを含む約１０から３０ｍＬのＰＢＳを、工程（３）において得た尿に加え、穏やかに混ぜた後、４００ｇで１０分間遠心分離を行う。
（５）残った液体が０．５ｍＬ未満となるまで、上清を捨てる。
（６）尿培養のための培地１ｍＬを残った尿の液体に加え、得られた沈殿物を再懸濁し、細胞を収集する。
【００４０】
（７）尿培養のための培地１ｍＬを追加した０．１％ゼラチンを塗布した６０ｍｍ培養皿（または６−ウェルプレート）内に、収集した細胞を播種する。当該尿培養のための培地は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＰＡＡ）およびペニシリン／ストレプトマイシンを添加した高グルコースＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ、ＨｙＣｌｏｎｅ）を、ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔ  Ｋｉｔ  ＣＣ−４１２７  ＲＥＧＭ培地（Ｌｏｎｚａ）を用いて均一に混合することによって得た。
（８）細胞を播種した培養皿を、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに３日間置いた。
（９）細胞が皿の底へ付着するかどうかを観察し、追加の尿培養のための培地１ｍＬを穏やかに加え、細胞を播種した培養皿を、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに置いて連続培養した。
（１０）播種の日から５日目から７日目において培養皿内の培地を捨て、ＰＢＳで一度洗浄した後に新鮮な尿培養のための培地（抗生物質なし）を培養皿に加える。これにより、付着細胞の増殖を観察することができた。
（１１）細胞増殖状況に応じて培地を添加または交換し、０．２５％トリプシンを用いた継代培養ができた。
（１２）第二世代から一次ヒト尿中脱落細胞を採取し、使用のために凍結液（９０％ＦＢＳ＋１０％ＤＭＳＯ）を用いて液体窒素中において凍結し保存する。
【００４１】
２．人工神経幹細胞（ｉＮＳＣ）の誘導
人工神経幹細胞の誘導の実験は、細胞調製、プラスミドの電気的形質導入、細胞播種誘導、細胞クローン選択、ｉＮＳＣ増幅等を含む。詳細には、
（１）凍結した一次ヒト尿中脱落細胞を解凍し、１０ｃｍ皿（または６−ウェルプレート）内に播種する。
（２）付着一次ヒト尿中脱落細胞の培養集密度が１０ｃｍ皿において約９０％になった時、０．２５％トリプシンを使用して付着細胞を消化し、そして消化された細胞を採取し、計数する。
（３）適当な細胞数（電気的形質導入機構毎において５００，０００から１，５００，０００までの範囲の細胞数）を有する消化された細胞を、１．５ｍＬのＥＰチューブに移し、その後２００ｇで５分間遠心分離する。
（４）工程（３）において得られた上清を捨てて、得られた細胞沈殿物を電気的形質導入のカップ中に回収する。
（５）プラスミドの形質転換系を調製する：哺乳類上皮細胞およびシーケンスのサプリメント１（Ｌｏｎｚａ）１８μＬに、Ｂａｓｉｃ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）溶液８２μＬを加え、続けて穏やかに混合し、その後十分に混合しながらプラスミド５μｇを加え、プラスミド形質転換系を得る。当該プラスミドは、ｐＣＥＰ４−Ｏ２ＳＥＴ２Ｋ（３μｇ）およびｐＣＥＰ４−ｍｉＲ−３０２（２μｇ）を含んでいる。
（６）工程（４）において上述したカップをＡｍａｘａエレクトロポレーター（Ｌｏｎｚａ）上に配置し、Ｔ−０１３（またはＴ−０２０）の手順を選択することにより電気的形質導入を実行する。
【００４２】
（７）電気的に形質導入された細胞を、マトリゲルでコーティングされた６−ウェルプレート（または１０ｃｍ皿）の中に、ウェル毎に１００，０００から３００，０００細胞の播種密度において、播種密度が細胞の状態に応じて調整され得るように移し、その後尿中細胞を培養するための培地を添加する。
（８）尿中細胞を培養するための培地を、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、１μＭのＰＤ０３２５９０１、０．５μＭのＡ８３−０１（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、０．５μＭのチアゾビビン、および、０．２μＭのＤＭＨ１（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含むｍＴｅＳＲ１培地によって、工程（７）において播種した日から２日目に（またはトランスフェクション後２日目に）交換する。当該ｍＴｅＳＲ１培地は、本発明の神経幹細胞を調整するための培地であり、細胞培養のために使用され、２日おきに交換される。
（９）細胞クローンを選択し、機械的方法によって小片に分割し、その後、マトリゲルでコーティングされた６−ウェルプレート（または１２−ウェルプレート）の中に選択した細胞を播種し、播種した細胞を通常のｍＴｅＳＲ１培地を用いて培養する。当該細胞クローンは、電気的形質導入から１２から１５日後に得られ、当該細胞クローンは適切な大きさ、明瞭なエッジ、および、電気的に形質導入された細胞から展開されるコンパクトな配列形状となっている。
【００４３】
（１０）付着細胞が観察された時に新鮮な培地に交換し、さらに３から５日間付着細胞を培養し、培地は１日おきに交換する。これによって、ロゼット様神経構造またはポラリティー形状において配列している、多数の神経幹細胞様細胞クラスターが観察される。
（１１）機械的方法によって神経幹細胞様細胞クラスターを選択し、当該神経幹細胞様細胞クラスターを、１ｍＬピペットを用いて吸い取り、当該神経幹細胞様細胞クラスターが小片または単一細胞へとなるように、穏やかにピペッティングする。その後、得られた単一の細胞を、神経幹細胞を培養するための培地を含むＴ２５フラスコに移す。当該神経幹細胞を培養するための培地は、１％Ｎ２サプリメント（Ｇｉｂｃｏ）、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、Ｇｉｂｃｏ）、０．１％ヘパリン（Ｓｉｇｍａ）、２０ｎｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および、２０ｎｇ／ｍｌ上皮成長因子（ＥＧＦ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）が添加されているＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を含んでいる。
（１２）１週間Ｔ２５フラスコにおいて培養された単一細胞の懸濁物から明瞭な境界で、神経球を得る（ここでの神経球は、Ｐ１の代の神経球として規定される）。培養物の培地は、元の培地と比較して半分の量が２または３日おきに交換されていた。
【００４４】
（１３）単一細胞が７から１４日間培養されある大きさの神経球を有した時、すなわち、単一細胞がＴ２５フラスコに移され神経幹細胞を培養するための培地で培養された日から７日目から１４日目の時、神経球に継代している。３００μｍより大きい直径を有するこれらの神経球を選択し、１５ｍＬの遠心チューブ内に移し、神経球を沈降させるか、または５０ｇで１分から２分間遠心分離し、得られた上清を捨てた後、１ｍＬのＡｃｃｕｔａｓｅ（アキュターゼ）を用いて３７℃で３分から５分間消化する。
（１４）神経幹細胞を培養するための培地（当該神経幹細胞を培養するための培地は、１％Ｎ２サプリメント（Ｇｉｂｃｏ）、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、Ｇｉｂｃｏ）、０．１％ヘパリン（Ｓｉｇｍａ）、２０ｎｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および、２０ｎｇ／ｍｌ上皮成長因子（ＥＧＦ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）が添加されているＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を含んでいる）を、上述した遠心チューブに、その中の反応系が１０ｍＬの容量を有するまで加え、その後、２００ｇで５分間遠心分離を行う。
（１５）工程（１４）において得られたものの上清を捨てた後、幹細胞を培養するための少量の培地（約５００μＬ）を加え、続けて穏やかに混合し、１ｍＬピペットを使用して小片となるように細胞クラスターを穏やかにピペッティングし、神経幹細胞を培養するための培地１ｍＬを遠心チューブの中へ加え、新しいフラスコの中で均一に混合された後に得られた細胞を播種し、神経球の第二世代を得る。
【００４５】
任意において、一次ヒト尿中脱落細胞からの誘導による神経幹細胞の調製の間の、異なる細胞の段階における細胞形態を観察および撮影するために、倒立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＢＸ５１）を使用した。その結果を図４に示す。図４は、本発明の実施の形態による、人工神経幹細胞を誘導している間における異なる段階の細胞形態を示す画像である。
【００４６】
図４において示すように、Ａは一次ヒト尿中脱落細胞を示しており、Ｂは細胞に電気的形質導入を受けさせることによって誘導された細胞クローンを示しており、Ｃは選択された付着細胞クローンの形態であり、ＤはｉＮＳＣの神経球である。ズーム倍率は１００である。
【００４７】
実施例２：人工神経幹細胞（ｉＮＳＣ）の表現型判定
１．免疫蛍光法によるｉＮＳＣにおけるＮＳＣマーカーの発現判定
（１）２４−ウェルプレートにおいてマトリゲルでコーティングしたスライドを置き、スライドに対し実施例１において調製した小さい体積を有するｉＮＳＣ神経球を５から１０付着させ、その後、その上に神経幹細胞を培養するための培地１００μＬを加え、そして、翌日に、２４−ウェルプレートのそれぞれのウェルの中に神経幹細胞を培養するための培地５００μＬを加える。その後、１から２日間培養する。
（２）工程（１）において得られた培養細胞を、４％パラホルムアルデヒド中において室温下で２０分間固定する。
（３）ＰＢＳを用いて１回あたり５分間に３回固定した細胞を洗浄する。
（４）工程（３）において得られた細胞を、一次抗体（Ｐａｘ６、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｓｏｘ１またはＳｏｘ２）、１％ＢＳＡ、１０％正常ヤギ血清、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを添加したＰＢＳ中において、４℃で一晩インキュベートする。
（５）工程（４）において得られた細胞を、ＰＢＳを用いて１回あたり５分間に３回洗浄する。
（６）工程（５）において得られた細胞を、Ａｌｅｘａ５６８または４８８で標される二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｉｇｅｎ）を用いて、暗所において室温下で１時間インキュベートする。
（７）工程（６）において得られた細胞を、ＰＢＳを用いて１回あたり５分間に３回洗浄する。
（８）工程（７）において得られた細胞を、ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）を用いて暗所において室温下で３分間インキュベートする。
（９）工程（８）において得られた細胞を、ＰＢＳを用いて１回あたり５分間に３回洗浄する。
（１０）工程（９）において得られた細胞を有するスライドを設置し、撮影によってサンプルを観察する。その結果を図５に示す。
【００４８】
２．リアルタイムＰＣＲによる人工神経幹細胞（ｉＮＳＣ）における神経幹細胞マーカー遺伝子の発現判定
まず、製造者の使用書に従って、実施例１において調製された人工神経幹細胞のトータルＲＮＡを抽出するために、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｔａｋａｒａ）を使用した。その後、抽出したトータルＲＮＡに逆転写を受けさせ、ｃＤＮＡを得るために、Ｍ−ＭＬＶ  ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を使用した。さらに、得たｃＤＮＡにリアルタイムＰＣＲを受けさせ、神経幹細胞マーカー遺伝子の発現を判定するために、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（商標）ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）およびＡＢＩ  ７３００蛍光定量ＰＣＲ装置を使用した。その結果を図５に示す。ここで、リアルタイムＰＣＲにおけるプライマーの配列は以下の通りである。
【００４９】
【表１】
2015509719.tif 000002
【００５０】
図５は、本発明の実施の形態による、免疫蛍光法およびリアルタイムＰＣＲによって判定された人工神経幹細胞内における神経幹細胞のマーカー遺伝子の発現レベルを示す画像である。図５において示されるように、ＡおよびＢは免疫蛍光法の染色結果であり、ＡはＰａｘ６およびＮｅｓｔｉｎの両方の発現がｉＮＳＣにおいて陽性であることを示しており、ＢはＳｏｘ１（Ｂ）の発現がｉＮＳＣにおいて陽性であることを示している。ＣはリアルタイムＰＣＲ検出の結果であり、それぞれ、ｉＮＳＣにおけるＳｏｘ２、Ｐａｘ６、Ｓｏｘ１およびＮｅｓｔｉｎの発現レベルを示している。ＵＣは尿中細胞を示しており、ｉＰＳは一次ヒト尿中脱落細胞から誘導された多能性幹細胞である。
【００５１】
３．ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｉＮＳＣの分化能力の判定
マトリゲルでコーティングしたスライドを２４−ウェルプレートに置き、実施例１において調製したｉＮＳＣ神経球（人工神経幹細胞）を２４−ウェルプレートのそれぞれのウェルにおいて置かれたスライド上に付着させ、その上に神経幹細胞を培養するための培地１００μＬを加えた。そして、翌日に、２４−ウェルプレートのそれぞれのウェルの中に神経分化用の培地１ｍＬを加え、その後、細胞を１から２日間培養した。当該神経分化用の培地は、１％Ｎ２サプリメント（Ｇｉｂｃｏ）、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、Ｇｉｂｃｏ）、０．１％ヘパリン（Ｓｉｇｍａ）およびニューロトロフィン（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）が添加されているＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を含んでおり、当該ニューロトロフィンは１０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、１０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、１０ｎｇ／ｍＬのＣＮＴＣおよび１０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦから構成されている。当該神経分化培養のための培地は、元の神経分化培養のための培地の量と比較して半分の量が、２日おきに交換された。上述の培養の２週間後、人工神経幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化産物が得られた。その後、Ｔｕｊ、Ｍａｐ２、Ｄｃｘ、ＴＨ、ＧＡＢＡ、グルタミンおよびＧＦＡＰタンパク質のような、人工神経幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏで得られる分化産物の発現を、免疫蛍光法によって検出した。その結果を図６に示す。詳細には、ＴＨ、ＧＡＢＡ、グルタミンおよびＧＦＡＰタンパク質は、異なる種類のニューロンおよび神経膠細胞に固有のマーカーである。これにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化を介して人工神経幹細胞から得られた異なる種類のニューロンおよび神経膠細胞について、人工神経幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化産物におけるそれぞれのＴｕｊ、Ｍａｐ２、Ｄｃｘ、ＴＨ、ＧＡＢＡ、グルタミンおよびＧＦＡＰタンパク質それぞれの発現を検出することにより、判定することができる。これは、さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの人工神経幹細胞の分化能力を判定し得るものである。
【００５２】
図６は、本発明の実施の形態による、免疫蛍光法によって判定された人工神経幹細胞由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化産物間における、異なる種類のニューロンおよび神経膠細胞に固有の異なるマーカーの発現を示す画像である。図６に示すように、ＡはｉＮＳＣが自発的に大量のニューロンおよび神経膠細胞を形成していることを示しており、Ｂは人工神経幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化産物においてＭａｐ２およびＧＡＢＡの発現が陽性であることを示しており、Ｃは人工神経幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化産物においてＭａｐ２およびグルタミンの発現が陽性であることを示しており、Ｄは人工神経幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化産物においてＴＨの発現が陽性であることを示しており、Ｅは人工神経幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化産物においてＴｕｊおよびＧＦＡＰ（アストロサイトマーカー）の発現が陽性であることを示しており、Ｆは人工神経幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化産物においてＤｃｘおよびＴｕｊの発現が陽性であることを示している。
【００５３】
本明細書を通した“ある実施の形態”、“いくつかの実施の形態”、“１つの実施の形態”、“別の実施の形態”、“実施例”、“特定の実施例”または“いくつかの実施例”との言及は、当該実施の形態または実施例に関連して記載されている特定の要素、構造、材料または特徴が、本発明の少なくとも１つの実施の形態または実施例において含まれているということを意図している。従って、本明細書を通した種々の箇所における、“いくつかの実施の形態において”、“ある実施の形態において”、“実施の形態において”、“別の実施例において”、“実施例において”、“特定の実施例において”または“いくつかの実施例において”のようなフレーズの出現は、本発明の同様の実施の形態または実施例を必ずしも示しているわけではない。さらに、当該特定の要素、構造、材料または特徴は、１以上の実施の形態または実施例における任意の適した方法で、組み合わせてもよい。
【００５４】
説明上における実施の形態は示され記載されているが、上記の実施の形態は本開示に限定して解釈されるべきものではなく、本発明の精神、原理および範囲から逸脱することがなければ、変更、代替および変形が実施の形態においてなされ得るということは、当業者によって理解されるだろう。
【００５５】
（関連する出願）
本出願は、２０１２年２月２９日に中華人民共和国国家知識産権局に提出された、中国特許出願第２０１２１００５１０９５．０の優先権および利益を主張しており、その全体の内容は参照によりここに組み込まれる。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明の神経幹細胞を調製するための培地は、神経幹細胞を効果的に調製することに適用することができる。体細胞、特に転写調節因子を発現する体細胞、を培養するための当該培地の使用は、大いに短縮された時間で、体細胞を神経幹細胞へと効果的に分化転換することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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