(57)【要約】遺伝子操作された微生物細胞、例えば、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞が、食品添加剤並びに再生可能燃料及び工業化学品の供給源として有用な微生物油を提供する。例えば、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質生合成タンパク質をコードするコード配列を含む組換え核酸であって、但し前記タンパク質は、ケトアシルアシルキャリアータンパク質シンターゼＩＩ、ステアロイルアシルキャリアータンパク質デサチュラーゼ、又はデルタ１２脂肪酸デサチュラーゼではないものとする、組換え核酸が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質生合成タンパク質をコードするコード配列を含む組換え核酸であって、但し前記タンパク質は、ケトアシルアシルキャリアータンパク質シンターゼＩＩ、ステアロイルアシルキャリアータンパク質デサチュラーゼ、又はデルタ１２脂肪酸デサチュラーゼではないものとする、組換え核酸。
【請求項２】
前記脂質生合成タンパク質が表１にあるタンパク質から選択される、請求項１に記載の組換え核酸。
【請求項３】
前記タンパク質が、表１にあるタンパク質と比較して少なくとも１つの点突然変異を有する、請求項２に記載の組換え核酸。
【請求項４】
前記タンパク質が、表１にあるタンパク質と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％又は９５％の配列同一性を有する、請求項１に記載の組換え核酸。
【請求項５】
前記コード配列が、プロモーターと動作可能に連結した状態にある、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換え核酸。
【請求項６】
前記コード配列が、非翻訳制御エレメントと動作可能に連結した状態にある、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換え核酸。
【請求項７】
前記コード配列が、標的配列と動作可能に連結した状態にある、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換え核酸。
【請求項８】
前記標的配列が、プラスチド標的配列及びミトコンドリア標的配列の群から選択されるトランジットペプチドである、請求項７に記載の組換え核酸。
【請求項９】
前記核酸がＤＮＡ分子である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組換え核酸。
【請求項１０】
機能性Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質生合成タンパク質をコードする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換え核酸。
【請求項１１】
前記タンパク質が、少なくとも１つの点突然変異を有するジアシルグリセロールジアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）である、請求項３に記載の組換え核酸。
【請求項１２】
ショ糖インベルターゼをさらにコードする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組換え核酸。
【請求項１３】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質生合成遺伝子の発現を抑制する阻害性ＲＮＡをさらにコードする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組換え核酸。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組換え核酸を含む発現カセット。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組換え核酸で形質転換された遺伝子操作された微生物細胞。
【請求項１６】
前記細胞がＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属又はＣｈｌｏｒｅｌｌａ属の細胞である、請求項１５に記載の遺伝子操作された微生物細胞。
【請求項１７】
前記細胞がＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の細胞である、請求項１６に記載の遺伝子操作された微生物細胞。
【請求項１８】
前記細胞が、表１に列挙される遺伝子から選択される内在性脂質生合成遺伝子と、１つ以上の外来性のＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質生合成遺伝子との両方を含む、請求項１７に記載の細胞。
【請求項１９】
前記外来遺伝子が脂質生合成タンパク質をコードし、前記脂質生合成タンパク質のアミノ酸配列が、前記内在性脂質生合成タンパク質と同一である、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２０】
前記外来遺伝子が、前記脂質生合成タンパク質のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列のコドンが変化しているヌクレオチド配列を含む、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２１】
前記外来遺伝子が、天然のＰｒｏｔｏｔｈｅｃａタンパク質と少なくとも５０％のアミノ酸同一性を有するタンパク質をコードする、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２２】
前記外来遺伝子が、天然のＰｒｏｔｏｔｈｅｃａプロモーターではないプロモーターエレメントと動作可能に連結した状態にある、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２３】
前記外来遺伝子が、天然のＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ非翻訳制御エレメントではない非翻訳制御エレメントと動作可能に連結した状態にある、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２４】
前記外来遺伝子が、天然のＰｒｏｔｏｔｈｅｃａトランジットペプチドではないトランジットペプチドをコードするヌクレオチド配列と動作可能に連結した状態にある、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２５】
前記トランジットペプチドがプラスチド標的配列又はミトコンドリア標的配列である、請求項２４に記載の細胞。
【請求項２６】
前記細胞が、配列番号５と少なくとも７５％のヌクレオチド同一性を有する２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する、請求項１５〜２５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２７】
前記細胞が、少なくとも１０％のＣ８〜Ｃ１４である脂肪酸プロフィールを有する、請求項１５〜２６のいずれか一項に記載のＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞。
【請求項２８】
前記細胞が、少なくとも５０％のＣ１２である脂肪酸プロフィールを有する、請求項１５〜２６のいずれか一項に記載のＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞。
【請求項２９】
前記細胞が、少なくとも７０％のＣ１８：１である脂肪酸プロフィールを有する、請求項１５〜２６のいずれか一項に記載のＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞。
【請求項３０】
請求項１５〜２９のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞を、油が産生されるような条件下で培養する工程を含む、微生物油を得る方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法により生成される微生物油。
【請求項３２】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の遺伝子操作された細胞であって、表１に列挙される遺伝子から選択される１つ以上の内在性脂質生合成遺伝子の活性が減弱されている、細胞。
【請求項３３】
前記内在性遺伝子の前記活性が、染色体遺伝子欠失、染色体遺伝子挿入、フレームシフト突然変異、点突然変異、又は阻害性ＲＮＡによって減弱されている、請求項３２に記載の細胞。
【請求項３４】
表１に列挙される遺伝子から選択される外来のＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質生合成経路遺伝子をさらに含む、請求項３２又は３３に記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項３５】
内在性脂質生合成遺伝子の１つ以上の対立遺伝子が減弱される、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項３６】
前記内在性脂質生合成遺伝子の１つの対立遺伝子が、表１から選択される外来のＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質生合成経路遺伝子及び選択可能なマーカーにより置換される、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項３７】
前記内在性脂質生合成遺伝子の２つ以上の対立遺伝子が、表１から選択される外来のＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質生合成経路遺伝子及び選択可能なマーカーにより置換される、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項３８】
前記細胞が、配列番号５と少なくとも７５％のヌクレオチド同一性を有する２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する、請求項１５〜３７のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項３９】
前記細胞が、少なくとも１０％のＣ８〜Ｃ１４である脂肪酸プロフィールを有する、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載のＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞。
【請求項４０】
請求項３２〜３９のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞を、油が産生されるような条件下で培養する工程を含む、微生物油を得る方法。
【請求項４１】
請求項４０に記載の方法により生成される微生物油。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）により、２０１１年１１月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／５６４，２４７号明細書、２０１１年１２月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／５８１，５３８号明細書、及び２０１２年７月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／６７４，２５１号明細書の利益を主張する。これらの出願の各々は、あらゆる目的から全体として参照により本明細書に援用される。
配列表の参照
本願は配列表を含む。
【０００２】
特定の実施形態において、油生成の向上を示し、そのため化学、食品製造、燃料及び工業化学品生産、微生物学、及び分子生物学の分野に用途が見出される遺伝子操作された微生物、例えばＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ株が提供される。
【背景技術】
【０００３】
微細藻類は、遺伝子操作された微細藻類を含め、食品及び燃料に使用される油の重要な新規供給源であると特定されている。国際公開第２００８／１５１１４９号パンフレット、国際公開第２００９／１２６８４３号パンフレット、及び国際公開第２０１０／０４５３６８号パンフレット（各々があらゆる目的から全体として参照により本明細書に援用される）を参照のこと。微生物油生成方法の開発においては、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ株に重点的に多大な労力が注がれてきたが、最近になってＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の株もまた、特定の用途に適合するよう作られた油を含め、微生物油の新規供給源として有望であると特定されている。国際公開第２０１０／０６３０３１号パンフレット、国際公開第２０１０／０６３０３２号パンフレット、及び国際公開第２０１１／１５０４１０号パンフレット及び国際公開第２０１２／１０６５６０号パンフレット（各々があらゆる目的から全体として参照により本明細書に援用される）を参照のこと。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００８／１５１１４９号
【特許文献２】国際公開第２００９／１２６８４３号
【特許文献３】国際公開第２０１０／０４５３６８号
【特許文献４】国際公開第２０１０／０６３０３１号
【特許文献５】国際公開第２０１０／０６３０３２号
【特許文献６】国際公開第２０１１／１５０４１０号
【特許文献７】国際公開第２０１２／１０６５６０号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
特定の実施形態において、本発明は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質生合成タンパク質又はその一部をコードするコード配列を含む組換え（例えば単離）核酸を提供する。一部の実施形態では、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質生合成タンパク質をコードするコード配列を含む組換え核酸が提供され、但し、そのタンパク質は、ケトアシルアシルキャリアータンパク質シンターゼＩＩ、ステアロイルアシルキャリアータンパク質デサチュラーゼ、又はデルタ１２脂肪酸デサチュラーゼでないものとする。一部の実施形態では、タンパク質は、配列番号２７０のケトアシルアシルキャリアータンパク質シンターゼＩＩタンパク質、配列番号２７１のステアロイル（ｓｔｅａｒｏｌ）アシルキャリアータンパク質デサチュラーゼ、又は配列番号２７２若しくは２７３のデルタ１２脂肪酸デサチュラーゼではない。一部の実施形態では、コード配列は、プロモーター、非翻訳制御エレメント、及び／又はプラスチド標的配列及びミトコンドリア標的配列などの標的配列と動作可能に連結した状態にある。組換え核酸は、例えばＤＮＡ分子であってもよい。特定の実施形態において、組換え核酸は発現ベクターである。組換え核酸は、例えば、機能性Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質生合成酵素をコードするｍＲＮＡをコードする発現カセットを含み得る。或いは、又は加えて、組換え核酸は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質生合成遺伝子の発現を抑制する阻害性ＲＮＡをコードする発現カセットを含み得る。一部の実施形態では、脂質生合成タンパク質は、表１にあるタンパク質である。一部の実施形態では、タンパク質は、本明細書に提供されるタンパク質又は本明細書に提供される遺伝子によりコードされるタンパク質と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％又は９５％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、タンパク質又はタンパク質をコードする遺伝子は、表１に列挙される。
【０００６】
一部の実施形態では、核酸におけるコード配列によりコードされるタンパク質は、１つ以上の点突然変異、欠失、置換、又はそれらの組み合わせを含む。他の実施形態では、タンパク質は、表１にあるタンパク質と比較して少なくとも１つの点突然変異を有する。一部の実施形態では、コード配列によりコードされるタンパク質は機能タンパク質である。一部の実施形態では、タンパク質は、少なくとも１つの点突然変異を有するジアシルグリセロールジアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）である。他の実施形態では、組換え核酸はショ糖インベルターゼをさらにコードする。
【０００７】
特定の実施形態において、本明細書に提供される組換え核酸で形質転換された遺伝子操作された微生物細胞もまた提供される。一部の実施形態では、この細胞は、微生物細胞、植物細胞、又は酵母細胞である。詳細な実施形態では、１つ以上の外来遺伝子を含む細胞が提供され、ここで外来遺伝子は、表１に列挙される遺伝子から選択されるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質生合成遺伝子である。遺伝子操作された微生物細胞は、例えば、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ属又はＣｈｌｏｒｅｌｌａ属の細胞であってもよい。詳細な実施形態では、細胞は、表１に列挙される遺伝子から選択される内在性脂質生合成遺伝子及び１つ以上の外来性Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質生合成遺伝子の両方を含む。特定の実施形態において、外来遺伝子は脂質生合成タンパク質をコードすることができ、ここで脂質生合成タンパク質のアミノ酸配列は、内在性脂質生合成タンパク質と同一である。例えば、外来遺伝子は、天然の核酸におけるコドンと比較したとき、脂質生合成タンパク質のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列のコドンが変化しているヌクレオチド配列を含み得る。種々の実施形態において、外来遺伝子は、天然のＰｒｏｔｏｔｈｅｃａタンパク質と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸同一性を有するタンパク質をコードすることができる。外来遺伝子は、一部の実施形態では、天然のＰｒｏｔｏｔｈｅｃａプロモーターではないプロモーターエレメント、天然のＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ非翻訳制御エレメントではない非翻訳制御エレメント、及び／又は天然のＰｒｏｔｏｔｈｅｃａトランジットペプチドではないトランジットペプチドをコードするヌクレオチド配列と動作可能に連結した状態にあってよい。トランジットペプチドは、例えば、プラスチド標的配列又はミトコンドリア標的配列であってもよい。特定の実施形態において、細胞は、配列番号５と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のヌクレオチド同一性を有する２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する。詳細な実施形態では、細胞はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞であり、ここで細胞は、少なくとも１０％のＣ８〜Ｃ１４である脂肪酸プロフィールを有する。
【０００８】
特定の実施形態において、本発明の別の態様は、上述のような遺伝子操作された細胞、例えばＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞を、油が産生されるような条件下で培養する工程を含む、微生物油を得る方法である。特定の実施形態において、このように産生された微生物油は、少なくとも１０％のＣ８〜Ｃ１４である脂肪酸プロフィールを有する。本発明はまた、この方法によって生成された微生物油も含む。
【０００９】
詳細な実施形態では、本発明は、例えばＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の、遺伝子操作された細胞を提供し、ここで１つ以上の内在性脂質生合成遺伝子（表１に列挙される遺伝子から選択される）の活性は、減弱されている。種々の実施形態において、内在する遺伝子の活性は、染色体遺伝子欠失、染色体遺伝子挿入、フレームシフト突然変異、点突然変異、及び／又は阻害性ＲＮＡによって減弱されている。遺伝子操作された細胞は、特定の実施形態において、表１に列挙される遺伝子から選択される外来のＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質生合成経路遺伝子をさらに含み得る。詳細な実施形態では、遺伝子操作された細胞における内在性脂質生合成遺伝子の１つ以上の対立遺伝子が減弱される。
【００１０】
特定の実施形態では、内在性脂質生合成遺伝子の１つの対立遺伝子が、遺伝子操作された細胞において、例えば、表１から選択される外来のＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質生合成経路遺伝子をコードするポリヌクレオチド及び選択可能なマーカーにより置換される。この実施形態の変形例では、内在性脂質生合成遺伝子の２つ以上の対立遺伝子が、各々、表１から選択される外来のＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質生合成経路遺伝子をコードするポリヌクレオチド及び選択可能なマーカーにより置換される。特定の実施形態において、遺伝子操作された細胞は、配列番号５と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のヌクレオチド同一性を有する２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する。詳細な実施形態では、遺伝子操作された細胞はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞であり、ここで細胞は、少なくとも１０％のＣ８〜Ｃ１４である脂肪酸プロフィールを有する。一部の実施形態では、細胞は、少なくとも、少なくとも５０％、６０％、又は７０％のＣ１２：０である脂肪酸プロフィールを有する。一部の実施形態では、細胞は、少なくとも、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％のＣ１８：１である脂肪酸プロフィールを有する。特定の実施形態において、本発明はまた、微生物油を得る方法も提供し、これは、例えばＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞であってもよいこの遺伝子操作された細胞を、油が産生されるような条件下で培養する工程を含む。特定の実施形態において、このように産生された微生物油は、少なくとも１０％のＣ８〜Ｃ１４である脂肪酸プロフィールを有する。本発明はまた、この方法によって産生された微生物油も含む。
【００１１】
別の態様において、本発明は、脂肪酸プロフィールが遺伝子操作株とそれが由来した株とで異なるように、１つ以上の脂質生合成遺伝子において、そのような１つ以上の遺伝子の発現が増加又は減少するように改変された、遺伝子操作された微生物細胞、例えばＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞を提供する。一実施形態において、少なくとも２つの遺伝子が改変されている。種々の実施形態において、遺伝子改変は以下の改変の１つ以上を含む：（ｉ）遺伝子又はその酵素生成物の減弱；及び（ｉｉ）遺伝子又はその酵素生成物の発現上昇；（ｉｉｉ）遺伝子又はその酵素生成物の活性の変化。
【００１２】
種々の実施形態において、遺伝子操作された細胞は１つ以上の減弱遺伝子を有し、ここで減弱された遺伝子は、相同組換え事象及び干渉性ＲＮＡをコードする外来遺伝子の導入からなる群から選択される手段によって減弱されている。種々の実施形態において、遺伝子の１つ以上の対立遺伝子が減弱される。
【００１３】
種々の実施形態において、遺伝子操作された細胞は１つ以上の過剰発現遺伝子を有し、ここで過剰発現した遺伝子は、前記細胞への前記遺伝子のさらなるコピーの導入；前記遺伝子の新しい発現制御エレメントの導入；及び遺伝子のタンパク質コード配列の変更からなる群から選択される手段によって上方調節されている。種々の実施形態において、遺伝子の１つ以上の対立遺伝子を過剰発現させる。
【００１４】
種々の実施形態において、遺伝子操作される細胞の改変遺伝子は、表１に提供されるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質生合成遺伝子からなる群から選択される。種々の実施形態において、遺伝子操作された細胞は、表１に提供されるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質生合成遺伝子からなる群から選択される外来遺伝子を含む。種々の実施形態において、遺伝子操作された細胞は、ある遺伝子の１つ以上の過剰発現した対立遺伝子を含み、その遺伝子は、表１に提供されるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質生合成遺伝子からなる群から選択される。種々の実施形態において、遺伝子操作された細胞は、表１に提供されるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質生合成遺伝子からなる群から選択される減弱遺伝子を有する。種々の実施形態において、遺伝子操作された細胞は、ある遺伝子の１つ以上の減弱した対立遺伝子を有し、その遺伝子は、表１に提供されるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質生合成遺伝子からなる群から選択される。
【００１５】
種々の実施形態において、遺伝子操作された細胞は、３％〜６０％のＣ８：０、３％〜６０％のＣ１０：０、３％〜７０％のＣ１２：０、３％〜９５％のＣ１４：０、３％〜９５％のＣ１６：０、３％〜９５％のＣ１８：０、３％〜９５％のＣ１８：１、０％〜６０％のＣ１８：２、０％〜６０％のＣ１８：３又はそれらの組み合わせからなる群から選択される脂肪酸プロフィールを有する。種々の実施形態において、Ｃ１０：０とＣ１２：０との比が少なくとも３：１である。ある場合には、Ｃ１０：０とＣ１４：０との比が少なくとも１０：１である。種々の実施形態において、Ｃ１２：０とＣ１４：０との比が少なくとも３：１である。種々の実施形態において、遺伝子操作された細胞は、少なくとも４０％飽和脂肪酸、少なくとも６０％飽和脂肪酸、又は少なくとも８５％飽和脂肪酸の脂肪酸プロフィールを有する。
【００１６】
別の態様において、本発明は、油が産生されるような条件下で本発明の遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞を培養する工程を含む、微生物油を得る方法を提供する。種々の実施形態において、微生物油は、３％〜４０％のＣ８：０、３％〜６０％のＣ１０：０、３％〜７０％のＣ１２：０、３％〜９５％のＣ１４：０、３％〜９５％のＣ１６：０、３％〜９５％のＣ１８：０、３％〜９５％のＣ１８：１、０％〜６０％のＣ１８：２、０％〜６０％のＣ１８：３又はそれらの組み合わせからなる群から選択される脂肪酸プロフィールを有する。種々の実施形態において、Ｃ１０：０とＣ１２：０との比が少なくとも３：１である。ある場合には、Ｃ１０：０とＣ１４：０との比が少なくとも１０：１である。種々の実施形態において、Ｃ１２：０とＣ１４：０との比が少なくとも３：１である。種々の実施形態において、遺伝子操作された細胞は、少なくとも４０％飽和脂肪酸、少なくとも６０％飽和脂肪酸、又は少なくとも８５％飽和脂肪酸の脂肪酸プロフィールを有する。
【００１７】
さらなる態様において、本発明は、微生物油並びに前記油を含有する食品、燃料、及び化学品又はそれに由来する化学品を提供する。
【００１８】
別の態様において、本発明は、遺伝子改変されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞及び他の細胞の作製方法において有用な組換え核酸を提供する。本発明の核酸は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質生合成遺伝子の全て又はある一部を含む。
【００１９】
種々の実施形態において、これらの核酸は発現カセットを含み、発現カセットは、コード配列と、コード配列の発現を調節する制御配列とからなり、コード配列は、脂質生合成タンパク質、酵素をコードするｍＲＮＡ、又は脂質生合成遺伝子の発現を抑制する働きをするＲＮＡｉをコードし得る。
【００２０】
他の実施形態では、これらの核酸は、１つ以上の発現カセットを含む発現ベクターであって、宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれることによるか、或いは自由に複製するベクターとして、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ又は他の宿主細胞において安定的に複製する発現ベクターである。
【００２１】
他の実施形態では、これらの核酸は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質生合成遺伝子の一部分のみを含み、この一部分は、コード配列、エクソン、又は制御エレメントの一部分であってもよい。このような核酸は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ及び非Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ宿主細胞用の発現カセットの構築、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ宿主細胞への外来ＤＮＡの組み込み、及び相同組換えによりＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質生合成遺伝子を減弱させるのに有用な核酸の構築に有用である。
【００２２】
一部の実施形態では、脂質生合成遺伝子を過剰発現させるための配列、組成物、宿主細胞、及び方法が提供される。一部の態様において、過剰発現させる脂質生合成遺伝子は、ＬＥＣ２、ＤＧＡＴ、ＡＴＰ：クエン酸リアーゼ（ＡＣＬ）、リンゴ酸酵素、リパーゼ、脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素、アシル−ＣｏＡ結合タンパク質（ＡＣＢＰ）、又はリポ酸シンターゼ（ＬＳ１）の１つ以上である。
【００２３】
本発明のこれらの及び他の態様及び実施形態は添付の図面（その簡単な説明はこのすぐ後に続く）、以下の本発明の詳細な説明に示され、以下の例に例示される。上記及び本願全体を通じて考察される特徴のいずれも、本発明の種々の実施形態において組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】実施例３７に記載されるとおり、標的遺伝子破壊を伴う及び伴わないＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＦＡＤｃ対立遺伝子のＰｓｔＩ制限酵素地図を示す。
【図２】実施例３７に記載されるサザンブロットの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
読者の便宜を図り、本発明のこの詳細な説明をいくつかの章に分ける。第Ｉ章は、本明細書で用いる用語の定義を提供する。第ＩＩ章は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質生合成経路の概要を提供する。第ＩＩＩ章は、本発明のＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞の培養方法を記載する。第ＩＶ章は、本発明のＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ及び遺伝子操作細胞の遺伝子操作方法を記載する。第Ｖ章は、本発明により提供される微生物油を記載する。第ＶＩ章は、本発明の核酸を記載する。
【００２６】
第Ｉ章．定義
他の意味であると定義されていない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語及び化学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解している意味を有する。以下の参考文献は、本発明で用いられる多くの用語に関する一般的な定義に関する知識を与えるものである。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（第２版、１９９４）；Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ編集、１９８８）；Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第５版、Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（編集）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；Ｈａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ、Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書で使用される場合、他の意味であると明記されていない限り、以下の用語は、それらに属する以下の意味を有する。
【００２７】
「微細藻類内で活性な」核酸は、微細藻類内で機能を発揮する核酸を指す。例えば、トランスジェニック微細藻類に抗生物質耐性を付与するために、抗生物質耐性遺伝子を動かすために用いられるプロモーターは、微細藻類内で活性である。
【００２８】
「アシルキャリアータンパク質」又は「ＡＣＰ」は、脂肪酸合成中に成長していくアシル鎖に、４’−ホスホパンテテイン部分の末端チオールにおいてチオールエステルとして結合するタンパク質であり、脂肪酸シンターゼ複合体の成分を含む。
【００２９】
「アシル−ＣｏＡ分子」又は「アシル−ＣｏＡ」は、補酵素Ａの４’−ホスホパンテテイン部分の末端チオールの位置で、チオールエステル結合によって補酵素Ａに共有結合したアシル部分を含む分子である。
【００３０】
「対立遺伝子」は、１つ又は２つ以上の形態の遺伝子又は遺伝子座を指す。ある遺伝子の対立遺伝子は、１００％以下のヌクレオチド配列同一性を共有し得る。ある遺伝子の対立遺伝子によりコードされる遺伝子産物は、１００％以下のアミノ酸配列同一性を共有し得る。ある遺伝子の異なる対立遺伝子及び／又はそこでコードされる遺伝子産物を過剰発現させると、遺伝子操作された生物に異なる表現型が付与され得る。ある遺伝子の異なる対立遺伝子及び／又はそこでコードされる遺伝子産物を減弱させると、遺伝子操作された生物に異なる表現型が付与され得る。
【００３１】
「遺伝子の減弱」は、（ｉ）野生型遺伝子と比べて、遺伝子産物（ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ、阻害性ＲＮＡ分子、及び他のＲＮＡ、ポリペプチド）の量の減少をもたらす異なる制御配列を有するように遺伝子を遺伝子操作すること；（ｉｉ）野生型細胞と比べて、検出可能な遺伝子コピーが少ないか又は全くなく、且つ対応する遺伝子産物の量が減少するように細胞を遺伝子操作すること；及び／又は（ｉｉｉ）遺伝子産物の安定性及び／又は活性が低下するように（すなわち、増加がＲＮＡ遺伝子産物の安定性である場合、ｍＲＮＡ遺伝子産物の翻訳が増加するように、及び／又はｍＲＮＡ遺伝子産物によりコードされるタンパク質の酵素活性レベルが減少する、すなわちタンパク質の安定性又は活性が低下することにより減少するように（これはまた、「酵素生成物の減弱」とも称される）、遺伝子のコード配列を遺伝子操作することを指す。「減弱遺伝子産物」は、前述の方法のいずれかによる遺伝子の減弱の遺伝子産物である。「減弱遺伝子」は、遺伝子産物の量の減少をもたらす本明細書に記載される方法の１つ以上により遺伝子操作されている遺伝子である。従って遺伝子の減弱は、「遺伝子発現の低下」、「遺伝子の下方調節」、又は「遺伝子の不活性化」をもたらす。
【００３２】
「純培養」は、他の生物による汚染を実質的に含まない生物の培養である。
【００３３】
「バイオマス」は、細胞の成長及び／又は増殖によって生成する物質である。バイオマスは、細胞及び／又は細胞内成分、並びに、限定されないが、細胞によって分泌された化合物のような細胞外物質を含有していてもよい。
【００３４】
「触媒」は、生成物の一部分とならずに、反応剤の化学反応を容易にするか、又は促進することができる、分子又は高分子複合体のような薬剤である。触媒は、反応速度を高め、その後で、同じ触媒が、生成物を得るための別の反応剤として作用してもよい。触媒は、一般的に、反応に必要な合計活性化エネルギーを小さくするため、反応がすばやく進行するか、又は低い温度で進行する。従って、反応の平衡状態にすばやく達し得る。触媒の例としては、生体触媒である酵素；生体触媒ではない熱；石油精製プロセスで用いる金属が挙げられる。
【００３５】
「共生培養」、及び「共生生育」及び「共生発酵」などのこの用語の変形は、同じバイオリアクター内に２種類以上の細胞が存在することを指す。２種類以上の細胞は、全てが微細藻類のような微生物であってもよく、異なる細胞種と共に培養された微細藻類細胞であってもよい。培養条件は、２種類以上の細胞の成長及び／又は増殖を進めるような条件であってもよく、又は、２種類以上の細胞のうち１種類、又は部分的な集合の成長及び／又は繁殖を容易にしつつ、残りの細胞の成長を維持する条件であってもよい。
【００３６】
「コード配列」は、遺伝子又は発現カセットのうち、細胞において当該の遺伝子又は発現カセットから転写されるＲＮＡをコードする一部分、特に、ｍＲＮＡのうち、当該のｍＲＮＡによりコードされるタンパク質に翻訳される一部分を指す。翻訳部分の間にある遺伝子の任意の非翻訳部分は、「イントロン」と称される。
【００３７】
「補因子（ｃｏｆａｃｔｏｒ）」又は「補因子（ｃｏ−ｆａｃｔｏｒ）」は、基質以外の、酵素がその酵素活性を達成するのに必要な任意の分子である。
【００３８】
「相補的ＤＮＡ」又は「ｃＤＮＡ」は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の逆転写又は増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）を介する）によって通常得られるｍＲＮＡのＤＮＡ複写物である。
【００３９】
「制御配列」は、遺伝子又は発現カセットにおけるコード配列の転写を調節する核酸配列であって、従ってプロモーター、エンハンサー、転写終結配列、及び翻訳開始配列が含まれる核酸配列を指す。
【００４０】
「育てられた」、及びこの語句の別の言い方である「培養された」、「発酵された」は、選択した条件及び／又は制御された条件を利用することによって、１つ以上の細胞の成長（細胞の大きさ、細胞成分が増え、及び／又は細胞活性が高まる）及び／又は増殖（有糸分裂によって細胞の数が増える）を意図的に進めることを指す。成長と増殖を組み合わせて、繁殖と呼ぶ場合もある。選択した条件及び／又は制御された条件の例としては、十分に定義されている培地（ｐＨ、イオン強度、炭素源のような既知の特徴を有する）、特定の温度、酸素圧、二酸化炭素濃度、バイオリアクター内の成長を用いることが挙げられる。育てることは、微生物の成長又は増殖が自然に起こること、又は人の介入なしに起こることを指さず、例えば、微生物が地中で最終的に化石化し、未精製油を生成するような天然の成長は、育てられたとは言わない。
【００４１】
「細胞溶解」は、低張な環境における細胞の溶解である。細胞溶解は、細胞内側への過剰な浸透作用、又は水の移動によって生じる（水分過剰）。細胞は、内部の水の浸透圧に耐えられず、爆発する。
【００４２】
「脱脂した食料」及び「脱脂した微生物バイオマス」は、機械的な力を使って（すなわち、連続圧搾機で圧縮して）、又は溶媒抽出を利用して、又は両者を使って油（脂質を含む）を抽出するか、又は単離した後の微生物バイオマスである。脱脂した食料は、微生物バイオマスから油／脂質を抽出又は単離する前と比較して、油／脂質の量が減っているが、油／脂質はいくらか残っている。
【００４３】
「デサチュラーゼ」は、脂質合成経路において脂肪酸分子又はトリアシルグリセリド分子の脂肪酸鎖への二重結合（不飽和）の導入に関与する酵素である。例としては、限定はされないが、ステアロイルアシルキャリアータンパク質デサチュラーゼ（ＳＡＤ）及び脂肪酸アシルデサチュラーゼとしても知られる脂肪酸デサチュラーゼ（ＦＡＤ）が挙げられる。
【００４４】
「発現カセット」は、場合により１つ以上の制御配列との組み合わせでの、コード配列及びプロモーターを指す。酵素用の発現カセットは、例えば、及び限定なしに、翻訳開始制御配列を含む。
【００４５】
「発現ベクター」、「発現構築物」、「プラスミド」又は「組み換えＤＮＡ構築物」は、例えば、組み換え手段又は直接的な化学合成によって、人の介入によって発生した核酸を指し、一連の特定の核酸エレメントは、宿主細胞内で特定の核酸を転写及び／又は翻訳することができる。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス又は核酸フラグメントの一部分であり得る。典型的には、発現ベクターは、プロモーターに動作可能に連結した、転写されるべき核酸を含む。一部の発現カセットは発現ベクターであるが、発現ベクターは、多くの場合に２つ以上の発現カセットを含み、例えば、宿主細胞に外来遺伝子を導入するため、発現ベクターに選択可能なマーカー用の発現カセットが含まれることがある。当業者は、特定の遺伝子、又はその一部をコードする「組換え核酸」が、それが天然に存在する特定のコンテクストから単離されることを理解する。
【００４６】
「外来遺伝子」は、細胞に導入された（「形質転換された」）ＲＮＡ及び／又はタンパク質を発現するようなコードを有する核酸であり、「導入遺伝子」とも呼ばれる。形質転換された細胞は、組み換え細胞と呼ばれることもあり、この細胞に、さらなる外来遺伝子が導入されてもよい。外来遺伝子は、形質転換される細胞と異なる種に由来していてもよく（つまり、異種）、同じ種に由来していてもよい（つまり、同種）。従って、外来遺伝子は、この細胞のゲノムでは異なる位置にあるような同種遺伝子を含んでいてもよく、内在する遺伝子複製物と比較して、異なる制御下にある同種遺伝子を含んでいてもよい。外来遺伝子は、この細胞の２種類以上の複製物中に存在していてもよい。外来遺伝子は、ゲノムへの挿入物として細胞（核又はプラスミド（ｐｌａｓｔｉｄ））中に維持されてもよく、又はエピソーム分子として細胞中に維持されてもよい。
【００４７】
「外部から与えられた」は、細胞培養物の培地に与えられた分子を指す。
【００４８】
「連続圧搾機で圧縮する」は、大豆や菜種のような原材料から油を抽出する機械的な方法である。連続圧搾機は、スクリュー型の機械であり、ケージで覆われた円筒形の空洞を通すことによって材料を圧縮する。原材料は、圧搾機の片側から入り、ケーキが他方から出ていく間に、ケージ内にあるバーの間から油がしみ出て、集められる。この機械は、スクリューからの摩擦及び連続的な圧力を利用し、原材料を動かし、圧縮する。油は、固形物が通過することができない小さな開口部からしみ出る。原材料が圧縮されていくと、典型的には、摩擦によって熱が発生する。
【００４９】
「脂肪酸」は、遊離脂肪酸、脂肪酸塩、又はグリセロ脂質中の脂肪酸アシル部分を意味するものとする。
【００５０】
「脂肪酸修飾酵素（ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ）」又は「脂肪酸修飾酵素（ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）」は、脂肪酸の共有構造を変化させる酵素を指す。脂肪酸修飾酵素の例としては、リパーゼ、脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素、脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素、脂肪アルデヒド還元酵素、脂肪アルデヒドデカルボニラーゼが挙げられる。
【００５１】
「脂肪酸プロフィール」は、鎖長及び／又は飽和パターンの点で見た、細胞又は細胞に由来する油における脂肪酸の分布を指す。これに関連して、飽和パターンは、不飽和酸に対する飽和酸の尺度又は細胞の様々な脂肪酸における二重結合の位置の分布のより詳細な分析を含み得る。脂肪酸プロフィールは、例えばガスクロマトグラフィーを用いることにより、容易に決定される。一つの方法では、トリアシルグリセロールの脂肪酸が周知の方法を用いて脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）に変換される。次にガスクロマトグラフィーによってＦＡＭＥ分子が検出される。例えば、不飽和のない１４炭素原子の脂肪酸（Ｃ１４：０）では、Ｃ１４：１などの任意の他の脂肪酸と比較して別個のピークが観察される。ＧＣ−ＦＩＤを用いて決定される各ＦＡＭＥクラスのピーク面積は、脂肪酸の重量百分率に比例する。特に指定のない限り、脂肪酸プロフィールは、全脂肪酸含有量の重量パーセントとして表される。脂肪酸プロフィールに言及する場合、「少なくとも４％のＣ８〜Ｃ１４」は、細胞又は抽出されたグリセロ脂質組成物における全脂肪酸の少なくとも４重量％が８、１０、１２又は１４炭素原子を含む鎖長を有することを意味する。
【００５２】
「脂肪酸合成酵素」は、脂肪酸の鎖長、飽和、又は官能基修飾を変化させるか、又は他の場合には、細胞における脂肪酸プロフィールの変化をもたらし得る酵素を指す。脂肪酸合成酵素の例としては、脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、ステアロイルアシルキャリアータンパク質デサチュラーゼ（ＳＡＤ）及び脂肪酸アシルデサチュラーゼ（ｄｅｓｔａｕｒａｓｅ）（ＦＡＤ）を含むデサチュラーゼ、脂肪酸アシルヒドロキシラーゼ、及びβ−ケト−アシル−ＡＣＰシンターゼが挙げられる。
【００５３】
「脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ」は、脂肪酸合成中に、アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）から脂肪酸が開裂するのを触媒する酵素である。
【００５４】
「脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素」は、アシル−ＣｏＡ分子から一級アルコールへの還元を触媒する酵素である。
【００５５】
「脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素」は、アシル−ＣｏＡ分子からアルデヒドへの還元を触媒する。
【００５６】
「脂肪族アルデヒドデカルボニラーゼ」は、脂肪族アルデヒドからアルカンへの変換を触媒する酵素である。
【００５７】
「脂肪族アルデヒド還元酵素」は、アルデヒドから一級アルコールへの還元を触媒する酵素である。
【００５８】
「固定炭素源」は、培地中で、周囲温度及び周囲圧力で固体又は液体の形態として存在し、培地で培養されている微生物が利用してもよい、炭素を含有する分子、典型的には有機分子である。
【００５９】
「機能タンパク質」は、減弱されたとしてもその活性が維持されているタンパク質を指す。
【００６０】
「遺伝子操作された」、「〜を遺伝子操作する」、及び「遺伝子操作している」は、人の介入による生細胞のＤＮＡ及び／又はＲＮＡの変化を指す。典型的には、この変化は、１つ以上の発現ベクターの導入によって媒介されるが、ある場合には、突然変異生成のみによって、機能的に同等の変化が達成され得る。
【００６１】
「グリセロ脂質」は、グリセロールのｓｎ−１位、ｓｎ−２位又はｓｎ−３位で１つ以上のリン酸塩、脂肪酸、ホスホセリン、ホスホコリン、ホスホイノシトール、又はホスホエタノールアミン、又はグリセロール骨格に共有結合した他の部分とエステル化したグリセロール分子を指す。グリセロ脂質の例としては、トリアシルグリセリド（トリグリセリド）、ジアシルグリセリド（ジグリセリド）、モノアシルグリセリド（モノグリセリド）、グリセロール−３−リン酸、リゾホスファチジン酸、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、及びホスファチジルエタノールアミンが挙げられる。
【００６２】
「グリセロ脂質合成酵素」は、グリセロ脂質の合成に関与する酵素を指す。グリセロ脂質合成酵素は、例えば、アシル基を置換グリセロールと共有結合させる働きをする。グリセロ脂質合成酵素の例としては、グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、リン脂質ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、及びホスファチジン酸ホスファターゼが挙げられる。
【００６３】
「グリセロリン脂質」は、グリセロール骨格のｓｎ−１位、ｓｎ−２位又はｓｎ−３位に、少なくとも１つ又はそれ以上の共有結合したリン酸塩又は共有結合したリン酸塩含有部分、例えば、ホスホコリン、ホスホセリン、ホスホイノシトール、及びホスホエタノールアミンを有するグリセロ脂質である。グリセロリン脂質としては、ホスホグリセロール、リゾホスファチジン酸、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、及びホスファチジルエタノールアミンが挙げられる。
【００６４】
「従属栄養」は、それが培養条件に関連するとき、実質的に光が存在しないなかで固定炭素源を利用又は代謝しながら培養することである。
【００６５】
「ホモジネート」は、物理的に破壊されたバイオマスである。
【００６６】
「水素：炭素比」は、原子単位であらわした、分子中の水素原子と炭素原子との比率である。この比率は、炭化水素分子中の炭素原子及び水素原子の数を述べるときに用いられ得る。例えば、最も大きな比率を有する炭化水素は、メタンＣＨ４である（４：１）。
【００６７】
「疎水性画分」は、水系相への溶解度よりも、疎水性相への溶解性が高いような、物質の一部分又は画分である。疎水性画分は、実質的に水には溶解せず、通常は非極性である。
【００６８】
「脂質収量の増加」は、例えば、培養物１リットルあたりの細胞乾燥重量が増加すること、脂質を構築する細胞の割合が増えること、又は、単位時間あたりの培養容積１リットルあたり、脂質の合計量が増えることのような、微生物培養物の生産性の増加を指す。
【００６９】
「誘発性プロモーター」は、特定の刺激に応答し、動作可能に連結した遺伝子の転写に介在するプロモーターである。そのようなプロモーターの例は、ｐＨ又は窒素レベルが変化する条件下で誘導されるプロモーター配列であり得る。
【００７０】
「動作可能に連結した状態で」は、制御配列（典型的には、プロモーター）、連結した配列（典型的には、タンパク質をコードする配列、コード配列とも呼ばれる）のような、２個の核酸配列間の機能的な連結である。プロモーターは、遺伝子の転写に介在することができる場合、外来遺伝子と動作可能に連結した状態である。
【００７１】
「ｉｎ  ｓｉｔｕ」は、「その場で」又は「その元々の位置で」という意味である。
【００７２】
「栄養物の制限濃度」は、培養している微生物の増殖を制限するような、培養物中の化合物の濃度である。「栄養物の非制限濃度」は、所与の培養期間中に、最大限の増殖を支援するような濃度である。従って、所与の培養期間中に生成する細胞の数は、栄養物が非制限濃度である場合よりも、制限濃度存在する場合には少なくなる。最大限の増殖を支援する濃度よりも多く栄養物が存在する場合には、培養物中に栄養物が「過剰で」あると言われる。
【００７３】
「リパーゼ」は、水に不溶性の脂質基質内のエステル結合を加水分解するのを触媒する水溶性酵素である。リパーゼは、脂質がグリセロール及び脂肪酸に加水分解されるのを触媒する。
【００７４】
「脂質」は、非極性溶媒（例えば、エーテル及びクロロホルム）に可溶性であり、水には比較的溶けないか、完全に不溶性の分子種である。脂質分子は、主に、疎水性の性質を有する長い炭化水素鎖かららなるため、これらの性質を有している。脂質の例としては、脂肪酸（飽和及び不飽和）；グリセリド又はグリセロ脂質（例えば、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド又は天然の脂肪、ホスホグリセリド、グリセロリン脂質）；グリセリド以外のもの（スフィンゴ脂質、コレステロール及びステロイドホルモンを含むステロール脂質、テルペノイド、脂肪族アルコール、ワックス、ポリケツドを含むプレノール脂質）；複雑な脂質誘導体（糖に連結した脂質、又は糖脂質、タンパク質に連結した脂質）が挙げられる。本明細書で使用されるとき、用語「トリアシルグリセリド」と「トリグリセリド」とは同義的である。「脂肪」及び「油」は、「トリアシルグリセリド」と呼ばれる脂質のサブグループである。「油」は、「脂肪」と区別されるとき、常温常圧で概して液体であるトリアシルグリセリドを指す。脂肪酸は、慣習的に、炭素原子の数と二重結合の数とをコロンで区切って列挙する表記法により命名される。例えばオレイン酸はＣ１８：１と表すことができ、及びカプリン酸はＣ１０：０と表すことができる。
【００７５】
「脂質生合成経路（ｌｉｐｉｄ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｐａｔｈｗａｙ）」又は「脂質生合成経路（ｌｉｐｉｄ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ）」又は「脂質代謝経路」又は「脂質経路」は、脂質の合成又は分解を指す。従って脂質生合成経路の酵素（例えば脂質経路酵素）には、脂肪酸合成酵素、脂肪酸修飾酵素、及びグリセロ脂質合成酵素、並びに脂質代謝、すなわち脂質修飾又は分解のいずれかに影響を及ぼすタンパク質（例えば脂質経路タンパク質）、及び脂質を化学修飾する任意のタンパク質、並びにキャリアータンパク質が含まれる。脂質生合成タンパク質にはまた、脂質代謝に関与する転写因子及びキナーゼも含まれる。
【００７６】
「脂質生合成遺伝子」は、脂質代謝、脂質の合成か、修飾か、又は分解かのいずれかに関与するタンパク質、及びキャリアータンパク質を含めた、脂質を化学修飾する任意のタンパク質をコードする任意の遺伝子である。
【００７７】
「脂質経路酵素」は、脂質代謝、すなわち、脂質の合成、修飾、又は分解のいずれかにおいて役割を果たす任意の酵素、及び脂質を化学修飾する任意のタンパク質、並びにキャリアータンパク質である。
【００７８】
「溶解物」は、溶解した細胞の内容物を含む溶液である。
【００７９】
「溶解」は、多くの場合に完全性を低下させる機械的機構、ウイルス機構又は浸透圧機構による、細胞内成分を少なくともいくらか放出させるのに十分な生物学的有機体の細胞膜及び場合により細胞壁の破壊である。
【００８０】
「溶解すること」は、細胞内成分を少なくともいくらか放出させるのに十分なまで生物学的有機体又は細胞の細胞膜及び場合により細胞壁を破壊することである。
【００８１】
「微細藻類」は、葉緑体又はプラスチドを含み、場合により、光合成を行うことができる真核性微生物であるか、又は、光合成を行うことができる原核性微生物である。微細藻類には、固定炭素源をエネルギーとして代謝することができない偏性光合成独立栄養生物と、単に固定炭素源がないと生存することができない従属栄養生物とが存在する。微細藻類には、細胞分裂の直後に、妹細胞から分離するＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのような単細胞有機体、２種類の別個の細胞型を有する単純な多細胞光合成細菌である、例えば、Ｖｏｌｖｏｘのような細菌が含まれる。微細藻類は、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａのような細胞を含む。また、微細藻類には、Ａｇｍｅｎｅｌｌｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ｐｙｒｏｂｏｔｒｙｓのような、細胞−細胞接着性を示す他の細菌の有機体も含まれる。また、微細藻類は、特定のｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅ  ａｌｇａｅ種、及びＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の種のような、光合成を行う能力が失われている偏性従属栄養微生物も含む。
【００８２】
「微生物」及び「細菌」は、微細な単細胞有機体である。
【００８３】
「自然に共発現する」は、２種類のタンパク質あるいは遺伝子に関する際、例えば、２種類のタンパク質をコードする遺伝子が、共通の制御配列の制御下にあるため、又は、上述の２種類のタンパク質をコードする遺伝子が、同じ刺激に応答して発現するため、そのタンパク質又は遺伝子が、これらが誘導される組織又は有機体で自然に共発現することを意味する。
【００８４】
「遺伝子の過剰発現」は、（ｉ）野生型遺伝子と比べて、細胞における遺伝子産物（ＲＮＡ、及びＲＮＡがｍＲＮＡである場合、ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質）の量の増加をもたらす異なる制御配列を有するように遺伝子を遺伝子操作すること；（ｉｉ）野生型細胞と比べて、遺伝子コピー数がより多く、且つ対応する遺伝子産物の量が増加するように細胞を遺伝子操作すること；及び／又は（ｉｉｉ）遺伝子産物の安定性及び／又は活性が増加するように（すなわち、その増加がＲＮＡ遺伝子産物の安定性である場合、ｍＲＮＡ遺伝子産物の翻訳が増加するように、及び／又はｍＲＮＡ遺伝子産物によりコードされるタンパク質の酵素活性レベルが増加する、すなわちタンパク質の安定性又は活性が高まることにより増加するように（これはまた、「酵素生成物の過剰発現」とも称される）、遺伝子のコード配列を遺伝子操作することを指す。「過剰発現遺伝子」は、前述の方法のいずれかによる遺伝子の過剰発現の産物である。従って、遺伝子の過剰発現は「遺伝子発現の増加」をもたらす。
【００８５】
「プロモーター」は、核酸の転写に関連する核酸制御配列である。本明細書で使用される場合、プロモーターは、転写開始部位の近くに、必要な核酸配列を含み、例えば、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合には、ＴＡＴＡエレメントを含む。また、プロモーターは、場合により、遠位エンハンサーエレメント又はリプレッサーエレメントを含み、これらは、転写開始部位から数千塩基対離れた位置にあり得る。
【００８６】
「Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞」は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の微細藻類の任意の細胞、株、及び種を指す。例示的なＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞及び株としては、限定なしに、以下の種のいずれかが挙げられる：Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｐｏｒｔｏｒｉｃｅｎｓｉｓ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ、及びＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉ。一つの重要な実施形態において、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの細胞又は株である。より一般的には、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの２３ｓ  ｒＲＮＡと７５％超の配列同一性を共有する、又は配列番号５に列挙される微細藻類の細胞、株、及び種。
【００８７】
「組換え」は、外来の核酸の導入又は天然の核酸の変化に起因して改変された細胞、核酸、タンパク質又はベクターである。従って、例えば、組換え細胞は、天然の（非組換え）形態の細胞中には見られない遺伝子を発現するか、又は天然遺伝子を、それらの遺伝子が非組換え細胞により発現される場合と異なる形で発現する。「組換え核酸」は、当初はインビトロで、概して核酸の操作により、例えば、ポリメラーゼ及びエンドヌクレアーゼを使用して形成された核酸であるか、又は他の場合には、単離形態（すなわち、ここでは核酸は、天然の形態の核酸が天然ではそれと共に存在する少なくとも１つの他の成分から分離されている）を含め、自然中には通常見られない形態の核酸である。組み換え核酸は、例えば、動作可能に連結した状態にある２種類以上の核酸を配置することによって生成させてもよい。従って、天然では通常は接続していないＤＮＡ分子を結合させることによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成した核酸又は発現ベクターの単離物は、両方とも組み換えであると本発明の目的上考える。組み換え核酸が作られ、宿主細胞又は有機体に導入されると、宿主細胞の細胞機構を用いてｉｎ  ｖｉｖｏで複製し得るが、このような核酸は、いったん組み換え状態で産生すると、その後に細胞内で複製されたものであっても、本発明の目的上組み換えと考える。同様に、「組み換えタンパク質」は、組み換え技術によって、すなわち、組み換え核酸の発現によって作られるタンパク質である。
【００８８】
用語「置換」又は「〜を置換する」又は「置換された」は、ある遺伝子配列の、別の遺伝子配列による改変に関連して使用されるとき、好適なフランキング領域を含む外来遺伝子配列との相同組換えによる、内在する遺伝子の除去又はノックアウトを指す。
【００８９】
「阻害性ＲＮＡ」は、遺伝子発現を阻害するＲＮＡを指す。阻害性ＲＮＡは二本鎖干渉性ＲＮＡを含む。阻害性ＲＮＡはロングＲＮＡヘアピンを含み、これは、一部の実施形態では約２００〜７５０ヌクレオチド長であり、５０〜６５０ヌクレオチドの標的遺伝子のコード配列及び十分に長い配列（典型的には２５〜２００ヌクレオチド）によって分離されたその相補配列を含んで、コード配列及びその相補体が二本鎖配列を形成することを可能にする。ＲＮＡｉはまたマイクロＲＮＡも含み、これはロングＲＮＡヘアピンより短く、典型的には僅か１９〜２２ヌクレオチドの標的遺伝子のコード配列及びその相補体をフランキング配列と共に含んで、細胞中の、ＲＮＡｉによる遺伝子発現の干渉を媒介する酵素を結合する。
【００９０】
「音波処理」は、音波エネルギーを使用することによる、細胞などの生物学的材料を破壊するプロセスである。
【００９１】
「ショ糖利用遺伝子」は、発現すると、ショ糖をエネルギー源として利用する能力を補助する遺伝子である。ショ糖利用遺伝子によってコードされるタンパク質は、本明細書では「ショ糖利用酵素」と呼ばれ、ショ糖トランスポーター、ショ糖インベルターゼ、グルコキナーゼやフルクトキナーゼのようなヘキソキナーゼを含む。
【００９２】
「外来遺伝子の上方調節」は、（ｉ）野生型遺伝子と比べて、細胞において遺伝子産物（ＲＮＡ、及びＲＮＡがｍＲＮＡである場合、ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質）の量の増加をもたらす異なる制御配列を有するように遺伝子を遺伝子操作すること；（ｉｉ）野生型細胞と比べて、遺伝子コピー数がより多く、且つ対応する遺伝子産物の量が増加するように細胞を遺伝子操作すること；及び／又は（ｉｉｉ）遺伝子産物の安定性及び／又は活性が増加するように（すなわち、その増加がＲＮＡ遺伝子産物の安定性である場合、ｍＲＮＡ遺伝子産物の翻訳が増加するように、及び／又はｍＲＮＡ遺伝子産物によりコードされるタンパク質の酵素活性レベルが増加する、すなわちタンパク質の安定性又は活性が高まることにより増加するように（これはまた、「酵素生成物の上方調節」とも称される）、遺伝子のコード配列を遺伝子操作することを指す。「上方調節遺伝子」は、前述の方法のいずれかによる増加した遺伝子発現の産物である。従って、遺伝子の上方調節は「遺伝子発現の増加」をもたらす。
【００９３】
第ＩＩ章  Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質生合成経路
特定の実施形態において、本発明は、生成される脂質又は脂肪酸の特性及び／又は比率が変化するように改変された組換えＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞を提供する。さらに、又は或いは、脂質生合成経路は、脂質生合成経路における脂質及び中間物の酵素処理によって、生成される様々な脂質分子の特性及び／又は比率が変化するように改変され得る。種々の実施形態において、本発明の組換えＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞は、形質転換されていない対応する細胞と比較して、単位体積あたり及び／又は単位時間あたりの脂質収量、炭素鎖長が（例えば、再生可能ディーゼルの生産に対して、又は脂質原料を必要とする工業化学品の用途に対して）最適化され、二重結合又は三重結合の数が場合によりゼロまで減らされ、且つ特定の脂質種又は個別的な脂質の集合の水素：炭素比が高くなっている。他の実施形態では、脂質は二重結合の数が増えている。
【００９４】
詳細な実施形態では、脂肪酸及びグリセロ脂質の代謝の分岐点を制御する１つ以上の鍵となる酵素が、脂質生成を向上させるため上方調節又は下方調節されている。遺伝子の上方調節、又は過剰発現は、例えば、例えば転写を増やす強力なプロモーター及び／又はエンハンサーエレメントを用いて、目的の酵素をコードする遺伝子が発現する発現構築物で細胞を形質転換することにより達成し得る。このような構築物は、形質転換体を選択に供し得るように選択可能なマーカーを含んでもよく、選択は、構築物の増幅及びコードされた酵素の発現量の増加をもたらし得る。遺伝子の下方調節、又は減弱は、例えば、染色体にコードされた対応する遺伝子の全て又は一部を相同組換えによって除去する発現カセットで細胞を形質転換することにより達成し得る。脂質経路酵素の発現量はまた、場合により、阻害性ＲＮＡ構築物を使用して低下させることもできる。場合により、内在する脂質経路遺伝子を、個々に又は組み合わせでその酵素特異性、発現量、又は細胞局在が変化するように改変してもよい。上方調節又は下方調節において使用される発現カセットは、宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれることによるか、又は自由に複製するベクターとして複製することができる。
【００９５】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）脂質生合成経路の遺伝子及び遺伝子産物を表１に列挙し、以下の第Ａ〜Ｋ節に詳述する。記載される場合、遺伝子の異なる対立遺伝子が提供される。典型的には、２つのタンパク質間には中程度のアミノ酸変化が認められ、対立遺伝子は典型的には、エクソンにおいて０〜２％多型であり、イントロンにおいて４〜７％多型である。
【００９６】
【表１】
2015500009.tif 000002
【００９７】
【表２】
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【００９８】
【表３】
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【００９９】
【表４】
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【０１００】
【表５】
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【０１０１】
Ａ．アセチル−ＣｏＡ−マロニル（ｍａｌｏｎｙ）−ＣｏＡからアシル−ＡＣＰへ
脂肪酸合成の初期段階には、固定炭素（例えば、グルコース、ショ糖等）又は他の炭素源からピルビン酸塩への変換が関わる。次に、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ、及びジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼを含むピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＰＤＨ）が、３炭素代謝物ピルビン酸塩を２炭素代謝物アセチル−ＣｏＡに変換する。重炭酸塩を基質として利用するアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）複合体が、３炭素化合物マロニル−ＣｏＡを生成する。次にマロニル−ＣｏＡ：ＡＣＰアシルトランスフェラーゼ（ＭＡＴ）がマロニル−ＣｏＡからアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）へのマロニル基の転移を触媒し、それによりマロニル−ＡＣＰが生成される。ＡＣＰは、脂肪酸生合成における様々な中間反応のアシルキャリアーとして使用される。このように、代謝物アセチル−ＣｏＡ及びマロニル−ＣｏＡ並びにＡＣＰタンパク質は、脂肪酸生合成の重要な出発点である。
【０１０２】
脂肪酸及び脂質の産生が増加するように微生物を遺伝子操作するため、アセチル−ＣｏＡ／マロニル−ＣｏＡ／ＡＣＰ産生の増加が得られる組換え改変を、個別に、或いは組み合わせで作製し得る。例えば、マロニル−ＣｏＡ産生を増加させるため、発現カセットを作成し、それを使用して微生物を形質転換することにより、構成的又は調節性プロモーターの制御下でＡＣＣ酵素複合体の１つ以上の成分をコードするポリヌクレオチドを過剰発現させてもよい。本発明の実施形態に係る上方調節に好適な酵素のさらなる例としては、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の酵素が挙げられる（例としては、微細藻類由来のいくつかを含め、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＰ＿４１５３９２；ＡＡＡ５３０４７；Ｑ１ＸＤＭ１；及びＣＡＦ０５５８７が挙げられる）。ピルビン酸デヒドロゲナーゼの上方調節によりアセチル−ＣｏＡの産生が増加し、それにより脂肪酸合成が増加し得る。
【０１０３】
アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ複合体は、脂肪酸合成の最初の段階を触媒する。従って、この複合体を含む１つ以上の酵素を上方調節することにより、脂肪酸の産生が増加し得る（例としては、微細藻類由来のいくつかを含め、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＢＡＡ９４７５２；ＡＡＡ７５５２８；ＡＡＡ８１４７１；ＹＰ＿５３７０５２；ＹＰ＿５３６８７９；ＮＰ＿０４５８３３；及びＢＡＡ５７９０８が挙げられる）。ＡＣＣアーゼ複合体の酵素には、ヘテロマーＡＣＣアーゼＢＣサブユニット１、ヘテロマーＡＣＣアーゼＢＣＣサブユニット、ヘテロマーＡＣＣアーゼａ−ＣＴサブユニット、及びヘテロマーＡＣＣアーゼｂ−ＣＴサブユニット１が含まれ得る。
【０１０４】
ＡＣＣは２つの形態、細胞質のホモマー（単一のサブユニット）の形態及びプラスチドにおけるヘテロマー（多数のサブユニット）の形態で存在する。両タイプのＡＣＣとも、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ（ＵＴＥＸ  １４３５株）に見られる。プラスチドトランジットペプチドがホモマーＡＣＣアーゼで同定されたことから、それがプラスチド及び細胞質の両方に局在し得ることが示される。一部の実施形態では、プラスチド標的化ホモマーＡＣＣサブユニットの１つ以上を発現させるための配列並びに関連する組成物及び方法が提供される。プラスチド標的化は、本明細書に提供されるもののいずれかから選択されるリーダープラスチドトランジットペプチドを結合させることによるか、目的の遺伝子それ自体にある、若しくはプラスチドトランジットペプチドを含有するＰｒｏｔｏｔｈｅｃａの任意の内在性プラスチド標的化遺伝子から得られる内在性のプラスチドトランジットペプチドを使用することによるか、又は異種プラスチドトランジットペプチドを使用することにより達成することができる。他の実施形態では、１つ以上のプラスチド標的化ヘテロマーＡＣＣサブユニットを過剰発現させるための配列並びに関連する組成物及び方法が提供される。一部の実施形態では、ＡＣＣ過剰発現により、Ｃ１８：２及びＣ１８：３脂肪酸の比が少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、又は５０％低下する。
【０１０５】
一部の実施形態では、ＡＣＣ及び１つ以上の下流の脂質生合成遺伝子を同時に過剰発現させる。一実施形態において、ＡＣＣ及びＤＧＡＴを同時過剰発現させるための配列、組成物、及び方法が提供される。ＡＣＣを過剰発現させることにより、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａでは概して低いデンプン量をさらに低減して脂質生合成に有利にすることができる。一部の実施形態では、１つ以上の下流の脂質生合成遺伝子の過剰発現に合わせてデンプン生成が減弱される。
【０１０６】
他の実施形態では、アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）（これは脂肪酸合成の間に成長するアシル鎖を運ぶ）をコードするポリヌクレオチドを上方調節することによる脂肪酸産生のための配列、組成物、及び方法が提供される。ＡＣＰの例としては、微細藻類由来のいくつかを含め、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ａ０Ｔ０Ｆ８；Ｐ５１２８０；ＮＰ＿８４９０４１；ＹＰ＿８７４４３３並びに配列番号２０７が挙げられる。アシルキャリアータンパク質は細胞内局在性が異なり得る（配列番号６３〜６５、配列番号１９５、及び配列番号２０７）。配列番号１９４及び配列番号２０６に列挙される配列は、それぞれ配列番号１９５及び配列番号２０７に示されるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓアミノ酸配列のコード配列を提供する。本発明の一実施形態において、第１の外来ＡＣＰを過剰発現させ、同時に異なるＡＣＰを下方調節することが有利である。
【０１０７】
組換え改変を行うことにより、脂質生合成経路における他の中間物の産生を増加させてもよい。例えば、マロニル−ＡＣＰ産生を増加させるため、発現カセットを作成し、それを使用して微生物を形質転換することにより、マロニル基をマロニル−ＣｏＡからアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）に転移させる活性を有するＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓマロニル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスアシラーゼ（ＭＡＴ）（配列番号１７５）をコードする配列番号１７４に示されるポリヌクレオチドを過剰発現させてもよい。この発現カセットは、ＭＡＴの発現を駆動する活性を有する構成的又は誘発性プロモーターを含み得る。
【０１０８】
一部の実施形態では、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の負の調節因子であるピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（ＰＤＨＫ）を下方調節させるための配列及び方法が提供される。
【０１０９】
脂肪酸以外の代謝物を合成するためにピルビン酸塩又はアセチル−ＣｏＡのプールを枯渇させる酵素は、前駆体代謝物について脂質生合成経路酵素と競合し得る。このような競合酵素の減弱は、脂肪酸又は脂質の産生を増加させ得る。脂肪酸及び脂質の産生が増加するように微生物を遺伝子操作するため、代謝物前駆体について競合する酵素を減弱する組換え改変を、個別に、或いは組み合わせで作製し得る。例えば、酢酸塩を産生するためのアセチル−ＣｏＡの使用を減少させるため、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）酢酸キナーゼ酵素（配列番号１０７〜１１２）をコードする１つ又は複数の遺伝子を除去する発現カセットを作成してもよい。酢酸キナーゼの減弱はまた、構成的又は調節性プロモーターの制御下にあるアンチセンスＲＮＡを含む発現カセットの構築及び使用によっても達成することができる。本発明の実施形態に係る下方調節に好適な酵素のさらなる例としては、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）乳酸デヒドロゲナーゼ（配列番号１１７、ヌクレオチド、配列番号１１８、タンパク質）（これはピルビン酸塩から乳酸塩を合成する）又はＰ．ｍｏｒｉｆｏｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ＰＴＡ、配列番号１１３〜１１６）（これは、酢酸塩の代謝における一工程の、アセチル−ＣｏＡからアセチルリン酸への変換を触媒する）が挙げられる。
【０１１０】
Ｂ．アシル−ＡＣＰから脂肪酸へ
成長するアシル−ＡＣＰ鎖は、縮合、第１の還元反応、脱水、及び第２の還元反応が関わる一連の４つの酵素反応を通じて２炭素ずつ増えて伸長する。これらの反応は、縮合酵素（β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ、ＫＡＳ）、第１の還元酵素酵素（β−ケトアシル−ＡＣＰ還元酵素、ＫＡＲ）、デヒドラーゼ（β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラーゼ、ＨＲ）及び第２の還元酵素（エノイル−ＡＣＰ還元酵素、ＥＮＲ）により触媒される。
【０１１１】
４炭素化合物を生成するマロニル−ＡＣＰとアセチル−ＣｏＡとの間の最初の縮合反応は、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ（ＫＡＳ）ＩＩＩにより触媒される。Ｃ１６：０を介した、伸長するアシル−ＡＣＰ鎖に対する連続的な２炭素付加は、ＫＡＳ  Ｉにより触媒される。酵素ＫＡＳＩＩは、Ｃ１６：０−ＡＣＰからＣ１８：０−ＡＣＰへの２炭素の延長を行う。生成する脂肪酸の所望の特性に応じて、１つ以上のＫＡＳ酵素を微生物において減弱又は過剰発現させてもよい。例えば、１８個以上の炭素原子を有する脂肪酸の産生が増加するように微生物を操作するため、発現カセットを作成し、それを使用して微生物を形質転換することにより、構成的又は誘発性プロモーターの制御下でＫＡＳＩＩ酵素をコードするポリヌクレオチドを過剰発現させてもよい。本発明の実施形態での使用に好適なＫＡＳＩＩ酵素の例は、配列番号１０６（実施例６を参照）及び配列番号２１１に提供されるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＫＡＳＩＩ酵素である。これらの酵素のタンパク質コード配列は、配列番号１０５及び配列番号２１０に提供される。短鎖又は中鎖脂肪酸の産生が増加するように微生物を遺伝子操作するため、発現カセットを作成し、それを使用して微生物を形質転換することにより、標的化したノックダウンによるか、又は阻害性ＲＮＡの使用によるなどして、ＫＡＳＩＩの発現を低下させてもよい。場合により、ＫＡＳＩＩのノックアウト又はノックダウンをポリヌクレオチドの使用と組み合わせて微生物を形質転換することにより、ＫＡＳＩ又はＫＡＳＩＩＩのいずれかの酵素をコードするポリヌクレオチドを過剰発現させてもよい。本発明の実施形態での使用に好適なＫＡＳＩＩＩ酵素の例は、配列番号２１４に示されるポリヌクレオチド配列によりコードされるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＫＡＳＩＩＩ酵素（配列番号２１５に提供される）である。本発明の実施形態での使用に好適なＫＡＳＩ酵素の例は、それぞれ配列番号７０及び６８に提供されるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＫＡＳＩ酵素対立遺伝子１及び２である。これらの酵素のタンパク質コード配列は、それぞれ配列番号６９及び配列番号６７に提供される。
【０１１２】
さらなる実施形態において、組換え細胞は、ＫＡＳＩＩ酵素活性が減弱されていない遺伝的背景においてＫＡＳＩ及び／又はＫＡＳＩＩＩ酵素を過剰発現するように操作される。さらに別の実施形態において、組換えポリヌクレオチドが作成され、それを使用して微生物を形質転換することによりＫＡＳＩ酵素が除去又は下方調節され、それにより１６炭素より多い脂肪酸の産生が増加する。場合により、ＫＡＳＩのノックアウト又はノックダウンをポリヌクレオチドの使用と組み合わせて微生物を形質転換することにより、ＫＡＳＩＩをコードするポリヌクレオチドを過剰発現させてもよい。
【０１１３】
特定の脂肪酸及び脂質の産生が増加するように微生物を遺伝子操作するため、脂肪酸伸長に関与する酵素を減弱又は過剰発現させる組換え改変を、個別に、或いは組み合わせで作製し得る。そのような酵素としては、β−ケトアシル−ＡＣＰ還元酵素（ＫＡＲ）、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラーゼ（ＨＤ）、及びエノイル−ＡＣＰ還元酵素（ＥＲ）が挙げられる。例えば、発現カセットを作成し、それを使用して微生物を形質転換することにより、構成的又は誘発性プロモーターの制御下でＫＡＲ酵素、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラーゼ、又はエノイル−ＡＣＰ還元酵素をコードするポリヌクレオチドを過剰発現させてもよい。或いは、発現カセットを作成し、それを使用して微生物を形質転換することにより、ＫＡＲ酵素、ＨＤ酵素、又はＥＲ酵素の発現をノックアウト又は減弱する働きをするポリヌクレオチドを過剰発現させてもよい。本発明の実施形態での使用に好適なＫＡＲ酵素の例は、配列番号１８４に示されるポリヌクレオチド配列によりコードされるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＫＡＲ酵素（配列番号１８５に提供される）である。本発明の実施形態での使用に好適なＨＤ酵素の例は、配列番号２０８に示されるポリヌクレオチド配列によりコードされるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＨＤ酵素（配列番号２０９に提供される）である。本発明の実施形態での使用に好適なＥＲ酵素の例は、配列番号２００に示されるポリヌクレオチド配列によりコードされるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＥＲ（配列番号２０１に提供される）、及びＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）ｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡ還元酵素（配列番号１９７、配列番号１９６に示されるポリヌクレオチド配列によりコードされる）である。本発明の実施形態に応じて、特定の培養条件下で、例えば脂質産生中に、及び／又はさらなる脂質生合成遺伝子又は遺伝子産物が変化するように操作されている微生物の遺伝的背景において、ＫＡＲ、ＨＤ、又はＥＲ酵素を上方調節又は下方調節することが有利であり得る。
【０１１４】
脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（ＴＥ）酵素は、アシル−ＡＣＰを遊離脂肪酸及びＡＣＰに加水分解することにより伸長を終了させる。ＴＥは、特定の炭素長及び飽和度のアシル−ＡＣＰに対して特異性を示し得るか、又は広域のＴＥであって、様々な長さ及び飽和度のアシル−ＡＣＰ鎖を切断することが可能であり得る。ＴＥの基質特異性は、脂肪酸の鎖長及び飽和度の確立に寄与する重要な因子である。生成する脂肪酸の所望の長さ又は飽和度に応じて、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする１つ以上の遺伝子を微生物において減弱又は過剰発現させてもよい。例えば、Ｃ１８：１−ＡＣＰに対して選択性を示す内在性の脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の発現をノックアウトし又は低下させると同時に、飽和Ｃ１２及びＣ１４−ＡＣＰに対して特異性を示す異なるＴＥを微生物において過剰発現させてもよく、それにより微生物における脂肪酸の集合が変化し得る。本発明の実施形態における使用に好適なアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの例としては、配列番号７１に示されるポリヌクレオチド配列によりコードされるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓアシル−ＡＣＰチオエステラーゼＦＡＴＡ１（配列番号７２に提供される）が挙げられる。実施例５、実施例３４、及び実施例３６に、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの減弱を記載する。
【０１１５】
Ｃ．不飽和脂肪酸及び脂肪酸アシル鎖
脂肪酸鎖、脂肪酸アシル−ＣｏＡ鎖、又は脂肪酸アシル−ＡＣＰ鎖への炭素−炭素二重結合の導入は、デサチュラーゼの活性に頼る。デサチュラーゼ酵素は、その基質の炭素鎖長及び飽和度に対して特異性を示し得る。特定のデサチュラーゼは、飽和脂肪酸又は飽和脂肪酸アシル−ＡＣＰを不飽和脂肪酸又は不飽和脂肪酸アシル−ＡＣＰに変換することができる。他のデサチュラーゼ酵素は、不飽和脂肪酸の炭素−炭素二重結合の数を増加させ得る。
【０１１６】
ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＦ１５３０８；ＡＢＭ４５９１１；ＡＡＹ８６０８６、及び配列番号５９〜６２を参照のこと）は、例えば、ステアロイル−ＡＣＰからオレオイル−ＡＣＰへの変換を触媒する。この遺伝子を上方調節すると、細胞により産生される一価不飽和脂肪酸の比率を増加させることができる；一方、下方調節すると、一不飽和の比率を低下させることができる。例示を目的として、ＳＡＤは、Ｃ１８：０前駆体からのＣ１８：１脂肪酸の合成に関与する。
【０１１７】
追加的なデサチュラーゼは、ホスファチジルグリセロールデサチュラーゼ（ＦＡＤ４）、プラスチドオレイン酸デサチュラーゼ（ＦＡＤ６）、プラスチドリノール酸デサチュラーゼ（ＦＡＤ７／ＦＡＤ８）、小胞体オレイン酸デサチュラーゼ（ＦＡＤ２）、小胞体リノール酸（ｌｉｎｏｌａｔｅ）デサチュラーゼ（ＦＡＤ３）、デルタ１２脂肪酸デサチュラーゼ（Δ１２  ＦＡＤ）及びデルタ１５脂肪酸デサチュラーゼ（Δ１５  ＦＡＤ）を含む脂肪酸アシルデサチュラーゼ（ＦＡＤ）である。これらのデサチュラーゼはまた、脂質飽和に関する改変も提供する。例示を目的として、Δ１２脂肪酸デサチュラーゼは、Ｃ１８：１前駆体からのＣ１８：２脂肪酸の合成に関与し、Δ１５脂肪酸デサチュラーゼは、Ｃ１８：２前駆体からのＣ１８：３脂肪酸の合成に関与する。
【０１１８】
さらに追加的なデサチュラーゼは、パルミチン酸塩特異的モノガラクトシルジアシルグリセロールデサチュラーゼ（ＦＡＤ５）、リノレオイルデサチュラーゼ、ω−６脂肪酸デサチュラーゼ、ω−３脂肪酸デサチュラーゼ、及びω−６−オレイン酸デサチュラーゼを含めて、脂質飽和に関する改変を提供する。ω−６脂肪酸デサチュラーゼ、ω−３脂肪酸デサチュラーゼ、又はω−６−オレイン酸デサチュラーゼなどの１つ以上のデサチュラーゼの発現を、不飽和脂肪酸と飽和脂肪酸との比が変化するように制御してもよい。
【０１１９】
本出願者らは、非常にコンパクトなプロモーター領域及び双方向性プロモーターの広範な使用により、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａが極めてコンパクトなゲノムを有することを見出した。例えば、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａは、複数の局在化が可能なＦＡＤ２及びＦＡＤ３の単一コピーを有する。ＦＡＤ３は２つの代替的な開始位置をコードし、その一方はプラスチドトランジットペプチドをコードし、その他方はそれをコードしない。加えてＦＡＤ３はその３’ＵＴＲにＥＲ保留シグナルを含み、ＥＲ保留シグナルは、プラスチド標的化形態ではＣＯＯＨカルボキシ末端から離れるようにシフトし、ＥＲ結合形態では戻る。これにより、生物体の必要に応じて同じ遺伝子が異なる細胞内位置に行くことが可能となる。
【０１２０】
プラスチドにおいて合成されるアシル−ＡＣＰは、当該の細胞小器官内においてグリセロ脂質を含む脂質の形成に直接使用されるか、又はリン脂質、トリアシルグリセロール（ｔｒｉａｃｙｇｙｌｃｅｒｏｌ）、若しくはワックスを含む脂質の合成のため、プラスチドの外部に運び出される。脂質生合成遺伝子は、特定の細胞内位置における活性に対して特異性を示し得る。
【０１２１】
Ｄ．脂肪酸から脂肪酸アシル−ＣｏＡへ
脂肪酸はプラスチドから運び出されると、アシル−ＣｏＡシンテターゼの触媒作用によってＣｏＡと再エステル化され、アシル−ＣｏＡを形成し得る。異なるアシル−ＣｏＡシンテターゼ酵素は細胞内局在性が異なり、異なる鎖長の脂肪酸に対する特異性を示し得る。アシル−ＣｏＡシンテターゼの例は、酵素の長鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡシンテターゼである。生成するトリアシルグリセロールの所望の特性に応じて、アシル−ＣｏＡシンテターゼをコードする１つ以上の遺伝子を微生物において減弱又は過剰発現させてもよい。
【０１２２】
Ｅ．脂肪酸アシル−ＣｏＡからトリアシルグリセロールへ
トリアシルグリセリドは、ｓｎ−グリセロール−３−リン酸分子の３つの連続的なアシル−ＣｏＡ−依存性アシル化により形成され得る。グリセロ脂質合成の律速段階である第１のアシル化は、グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）により触媒され、リゾホスファチジン酸を生成する。第２のアシル化段階は、酵素アシル−ＣｏＡ：リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）により触媒される。第３のアシル化段階の前に、酵素ホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）（又はリピン）がホスファチジン酸からのリン酸基の除去を行い、ｓｎ−１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を生成する。最後のアシル−ＣｏＡ依存性アシル化は、アシル−ＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）により触媒される。
【０１２３】
微生物は、脂質の産生が増加するように遺伝子操作され得る。例えば、ＴＡＧの産生を増加させるため、発現カセットを作成し、それを使用して微生物を、ＧＰＡＴの発現を増加させる働きをするポリヌクレオチドに対して形質転換してもよい。この発現カセットは、ＧＰＡＴの発現を駆動する活性を有する構成的又は誘発性プロモーターを含むことができ、内在するＧＰＡＴ活性が減弱されている株の遺伝的背景で利用され得る。本発明の実施形態における使用に好適なＧＰＡＴの例は、本明細書において配列番号１８７として示されるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＧＰＡＴ（本明細書において配列番号１８６に示される配列によりコードされる）である。
【０１２４】
微生物は、所望の特性を有するトリアシルグリセロール分子の産生が増加するように遺伝子操作され得る。特定のアシルトランスフェラーゼ酵素は、ＧＰＡＴ、ＬＰＡＡＴ、及びＤＧＡＴを含め、細胞内局在性に対する特異性又はそれらが置換グリセロール骨格に転移させるアシル−ＣｏＡ鎖の長さ及び飽和度に対する基質特異性を示し得る。加えて、ＬＰＡＡＴ及びＤＧＡＴ酵素は、それらがアシル−ＣｏＡを転移させる置換グリセロールの形態に対する基質特異性を示し得る。生成するトリアシルグリセリドの所望の特性に応じて、ＧＰＡＴ、ＬＰＡＡＴ、ＤＧＡＴ、又は他のアシルトランスフェラーゼ（ａｃｙｌｔｒａｎｆｅｒａｓｅ）をコードする１つ以上の遺伝子を微生物において減弱又は過剰発現させてもよい。例えば、ｓｎ−２位でエステル化された中鎖脂肪酸を有するＴＡＧの産生を増加させるため、発現カセットを作成し、それを使用して微生物を形質転換することにより、中鎖の転移に特異性を有するＬＰＡＡＴを過剰発現させてもよい。この発現カセットは、ＬＰＡＡＴの発現を駆動する活性を有する構成的又は誘発性プロモーターを含むことができ、内在するＬＰＡＡＴ活性が減弱されている株の遺伝的背景で利用され得る。本発明の実施形態における使用に好適なＬＰＡＡＴの例としては、配列番号８２及び配列番号８３に示されるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＬＰＡＡＴ  Ｅ及びＬＰＡＡＴ  Ａ（それぞれ配列番号８１及び配列番号８４に示される配列によりコードされる）が挙げられる。
【０１２５】
同様に、ＴＡＧの産生を増加させるため、発現カセットを作成し、それを使用して微生物を形質転換することにより、アシル−ＣｏＡをＤＡＧ分子に転移させる活性を有するＤＧＡＴをコードするポリヌクレオチドを過剰発現させてもよい。この発現カセットは、ＤＧＡＴ２の発現を駆動する活性を有する構成的又は誘発性プロモーターを含み得る。本発明における使用に好適なＤＧＡＴの例は、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２型（ＤＧＡＴ２）（配列番号１８３、配列番号１８２に示される配列によりコードされる）である。組換え微生物により生成する脂肪酸又は脂質の所望の特性により、基質特異性により特徴付けられるＴＥの上方調節を、同じ基質特異性を示す１つ以上のＧＰＡＴ、ＬＰＡＡＴ、又はＤＧＡＴ酵素と組み合わせることが有利であり得る。
【０１２６】
本発明の実施形態における使用に好適なさらなるアシルトランスフェラーゼ（ａｃｙｌｔｒａｎｆｅｒａｓｅ）としては、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ膜結合Ｏ−アシルトランスフェラーゼドメイン含有タンパク質（配列番号２０３、配列番号２０２に提供されるヌクレオチド配列によりコードされる）、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ推定１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（配列番号１７９、配列番号１７８に提供されるヌクレオチド配列によりコードされる）、及びＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓアシルトランスフェラーゼ（配列番号２１７、配列番号２１６に提供されるヌクレオチド配列によりコードされる）が挙げられる。モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＭＧＡＴ）遺伝子は、ジアシルグリセロール（ｄｉａｃｙｇｌｙｃｅｒｏｌ）の合成を触媒し、概して、トリアシルグリセロール生合成の最後の工程もまた触媒することができる。ひいては、この発明において提供されるＭＧＡＴ遺伝子の上方調節は望ましいといえる。
【０１２７】
代替的な脂質経路酵素が、上記の経路と別の経路を経てトリアシルグリセリド分子を生成することができる。脂肪酸アシル−ＣｏＡ非依存性トリアシルグリセロール経路の酵素は、選択的基質特異性を呈し得るアシルリゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼを用いてホスファチジルコリン（ＰＣ）部分の間で脂肪酸アシル基を転移させ、最終的にそれらをジアシルグリセロールに転移させる。
【０１２８】
Ｆ．さらなる脂質分子
脂肪酸又は脂肪酸アシル分子は、そのＤＡＧ及びＴＡＧへの取り込みに加えて、限定はされないが、リン脂質、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、スフィンゴ脂質（ＳＬ）、モノガラクトシルジアシルグリセロール、ジガラクトシルジアシルグリセロール、リポヌクレオチド、及びワックスエステルを含め、様々な脂質分子に取り込まれ得る。ＰＣ、ＰＳ、ＰＩ、ＳＬ、ワックスエステル、リポヌクレオチド、又はガラクトリピド、モノガラクトシルジアシルグリセロール（ＭＧＤＧ）若しくは又はジガラクトシルジアシルグリセロール（ＤＧＤＧ）の分子を合成する酵素は、脂肪酸又は脂肪酸アシル分子を含む基質に関して、ＤＡＧ及びＴＡＧをもたらし又は最終的にそれを合成する酵素と競合し得る。ＰＣ、ＰＳ、ＰＩ、ＳＬ、モノガラクトシルジアシルグリセロール、ジガラクトシルジアシルグリセロール、又はワックスエステルの合成、利用、又は分解に関与するタンパク質をコードする遺伝子としては、ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＤＡＧ−ＣＰＴ）、シチジン二リン酸ジアシルグリセロールシンターゼ（ＣＴＰ−ＤＡＧシンターゼ）、ホスファチジルイノシトールシンターゼ（ＰＩシンターゼ）、コリンキナーゼ（ＣＫ）、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼ）、ホスファチジルイノシトール−４−キナーゼ（ＰＩ４−キナーゼ）、ジアシルグリセロール（ｄｉａｃｙｅｒｏｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）キナーゼ（ＤＧＫ）、ホスファチジルグリセロール−３−リン酸ホスファターゼ（ＰＧＰＰ）、コリンリン酸シチジルトランスフェラーゼ（ＣＰＣＴ）、ホスファチジン酸シチジリルトランスフェラーゼ、ホスファチジルセリンデカルボキシラーゼ（ＰＳＤ）、ホスホリパーゼＣ（ＰｌｉＣ）、ホスホリパーゼＤ（ＰｌｉＤ）、スフィンゴ脂質デサチュラーゼ（ＳＤ）、モノガラクトシルジアシルグリセロールシンターゼ（ＭＧＤＧシンターゼ）、ジガラクトシルジアシルグリセロールシンターゼ（ＤＧＤＧシンターゼ）、ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ（ＫＣＳ）、３−ケトアシル還元酵素（ＫＲ）、及びワックスシンターゼ（ＷＳ）を挙げることができる。生成する脂肪酸又は脂質分子の所望の特性に応じて、脂質分子を生成する基質として脂肪酸又は脂肪酸アシル分子を利用する酵素をコードする１つ以上の遺伝子を、微生物において減弱又は過剰発現させてもよい。
【０１２９】
一実施形態において、ＤＡＧをＰＡに変換するＤＧＫを阻害する配列、組成物、及び方法が提供される。例えば、ＤＧＫは、ＲＮＡｉ、ヘアピン構築物、又は二重若しくは単一のノックアウトを使用して阻害することができる。他の実施形態では、εサブタイプ（ＤＧＫｅ）を過剰発現させる配列、組成物、及び方法が提供される。一部の態様において、ＤＧＫｅの過剰発現は、Ｃ２０：４などの特定のアシル基を有するＤＡＧの選択的な除去をもたらす。
【０１３０】
トリグリセリドの産生が増加するように微生物を操作するには、リン脂質合成を支援する酵素を減弱させることが有利であり得る。例えば、リン脂質シチジン二リン酸（ＣＤＰ）−ジアシルグリセロールの産生を減少させるため、発現カセットを作成し、それを使用して微生物を形質転換することにより、ホスファチジン酸及びシチジン三リン酸の縮合を触媒してＣＤＰ−ジアシルグリセロールを産生させるホスファチジン酸シチジリルトランスフェラーゼを減弱させてもよい。本発明の実施形態における使用に好適なホスファチジン酸シチジリルトランスフェラーゼの例は、配列番号１７６に示されるポリヌクレオチド配列によりコードされるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓホスファチジン酸シチジリルトランスフェラーゼ（配列番号１７７）である。この発現カセットは、ホスファチジン酸シチジリルトランスフェラーゼの発現を駆動して下方調節する活性を有する構成的又は誘発性プロモーターを含み得る。
【０１３１】
さらに、トリアシルグリセリド以外のさらなる脂質部分が、リン酸化グリセロールの誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ）を骨格として利用し得る。リン脂質（ｐｈｏｐｈｏｌｉｐｉｄ）の合成に関与するホスファチジルグリセロリン酸シンターゼ（ＰＧＰシンターゼ）などの酵素は、リン酸化形態のグリセロールを含む基質に関して、トリアシルグリセロールを提供する酵素と競合し得る。生成する脂質分子の所望の特性に応じて、ホスファチジルグリセロリン酸シンターゼをコードする１つ以上の遺伝子を微生物において減弱又は過剰発現させてもよい。リポイルシンターゼ又はリポ酸シンターゼ（Ｌｉｐｏｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ）とも称されるリポ酸シンターゼ（Ｌｉｐｏａｔｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ：ＬＳ）は、概してミトコンドリアに局在し、リポ酸の合成に利用される。リポ酸は、重要な補因子及び抗酸化剤である。
【０１３２】
Ｇ．脂肪酸分解
特定の脂肪酸及び脂質の産生が増加するように微生物を遺伝子操作するため、脂肪酸及び脂質の分解を低下させる組換え改変を、個別に、或いは組み合わせで作製し得る。脂肪酸の分解にはアシル−ＣｏＡオキシダーゼ、３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、グリオキシソーム脂肪酸β酸化多機能タンパク質、及びエノイル−ＣｏＡヒドラターゼなどのタンパク質が関与するため、これらの及び他のタンパク質を微生物において減弱させることにより、脂肪酸分解を遅らせ、又は阻止してもよい。例えば、脂肪酸分解が低下するように微生物を操作するため、発現カセットを作成し、それを使用して微生物を形質転換することにより、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ、及びグリオキシソーム脂肪酸β酸化多機能タンパク質の１つ以上を、ノックアウト又はノックダウンのいずれかの手法によって下方調節してもよい。本発明の実施形態での使用に好適なアシル−ＣｏＡオキシダーゼ酵素の例は、配列番号１９０に示されるポリヌクレオチド配列によりコードされる）Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓアシル−ＣｏＡオキシダーゼ（配列番号１９１に提供される）である。本発明の実施形態での使用に好適なエノイル−ＣｏＡヒドラターゼの例は、配列番号１９２に示されるポリヌクレオチド配列によりコードされるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（配列番号１９３に提供される）である。本発明の実施形態における使用に好適なグリオキシソーム脂肪酸β酸化多機能タンパク質の例は、配列番号１６６に示されるポリヌクレオチド配列によりコードされるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）グリオキシソーム脂肪酸β酸化多機能タンパク質（配列番号１６７に提示される）である。組換え微生物により生成する脂肪酸の所望の鎖長及び飽和度により、さらなる脂質経路遺伝子又は遺伝子産物が変化するように操作されている微生物の遺伝的背景において脂肪酸又は脂質分解酵素を下方調節することが有利であり得る。
【０１３３】
長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼ（当該技術分野において長鎖アシル−ＣｏＡリガーゼとしても知られる）は、遊離脂肪酸をアシル−ＣｏＡチオエステルに変換する。これらのアシル−ＣｏＡチオエステルは、次に、脂肪β−酸化に関与する酵素によって分解され得る。脂肪酸分解が低下するように微生物を操作するため、発現カセットを作成し、それを使用して微生物を形質転換することにより、長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼをノックアウト又はノックダウンのいずれかの手法によって下方調節してもよい。本発明の実施形態における使用に好適な長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼの例は、配列番号１９９に提示されるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼ（配列番号１９８に示されるポリヌクレオチド配列によりコードされる）である。組換え微生物により生成する脂肪酸の所望の鎖長及び飽和度により、さらなる脂質経路遺伝子又は遺伝子産物が変化するように操作されている微生物の遺伝的背景において長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼを下方調節することが有利であり得る。
【０１３４】
Ｈ．モノグリセリド、トリグリセリド、及び脂質分解
トリグリセリドの組換え微生物産生を増加させる戦略は、これらの分子の酵素分解を阻止し又は低下させることである。モノグリセリドリパーゼ及びトリアシルグリセロールリパーゼなど、トリグリセリドを脂肪酸及びグリセロールに加水分解する酵素は、微生物において減弱させるとトリグリセリドの分解を遅らせ又は妨げ得るタンパク質の例である。例えば、トリグリセリド分解が低下するように微生物を操作するため、発現カセットを作成し、それを使用して微生物を形質転換することにより、モノグリセリドリパーゼ又はトリアシルグリセロールリパーゼをノックアウト又はノックダウンのいずれかの手法によって下方調節してもよい。本発明の実施形態における使用に好適なモノグリセリドリパーゼの例は、配列番号１８９に提示されるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）モノグリセリドリパーゼ（配列番号１８８に示されるポリヌクレオチド配列によりコードされる）である。本発明の実施形態における使用に好適なトリアシルグリセロールリパーゼの例は、配列番号１６９に提示されるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）トリアシルグリセロールリパーゼ（配列番号１６８に示されるポリヌクレオチド配列によりコードされる）である。本発明の実施形態に応じて、特定の培養条件下で、例えば脂質産生中、１つ以上のリパーゼを減弱させることが有利であり得る。
【０１３５】
Ｉ．全般的調節因子
さらに、遺伝子の上方調節及び／又は下方調節を、脂質生合成経路の遺伝子の発現を制御する全般的調節因子に適用し得る。従って、必要に応じて、複数の脂肪酸合成遺伝子の発現が阻害され又は増進し、最終的に脂質産生が増加するように、脂質合成の１つ以上の全般的調節因子がそれぞれ上方調節又は下方調節され得る。例としては、ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）、例えばＳＲＥＢＰ−１ａ及びＳＲＥＢＰ−１ｃが挙げられる（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＰ＿０３５６１０及びＱ９ＷＴＮ３を参照）。一実施形態において、内在するＬＥＣ２相同体などの全般的調節因子を上方調節することにより、脂質産生を増加させてもよい。脂質生合成プロセスから窒素感受性を切り離し又は変化させることもまた、有用であり得る（Ｂｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２０１２年５月４日）。また、本発明には、Ｓｑｕａｍｏｓａ結合タンパク質である窒素応答調節因子ＮＲＲ１も提供される。場合によっては、例えば、ＮＲＲ１の発現を亢進させて窒素飢餓に対する応答を増加させることが望ましいこともある。
【０１３６】
Ｊ．脂肪滴タンパク質
真核細胞は、脂肪滴と呼ばれることの多いトリアシルグリセロール分子を種々の細胞小器官に貯蔵する。脂肪滴タンパク質１（ＬＤＰ１、配列番号１１９〜１２０）などの脂肪滴タンパク質に関連するタンパク質は、脂肪滴の構造、形成、サイズ、及び数にとって重要である。ある場合には、脂肪滴タンパク質の減弱が脂肪滴サイズの増加をもたらす。他の場合には、脂肪滴タンパク質の突然変異配列の過剰発現が、脂肪滴のサイズ及び数の増加をもたらす。脂肪酸及び脂質を産生するように微生物を遺伝子操作するため、脂肪滴タンパク質の発現を変化させる組換え改変を、個別に、或いは組み合わせで作製し得る。例えば、脂肪滴タンパク質（配列番号１１９〜１２０）をコードする遺伝子又は遺伝子産物を減弱又は除去する発現カセットを作成してもよい。ＲＮＡｉ、ＲＮＡヘアピン、又は他のアンチセンス媒介戦略を使用した遺伝子産物の減弱を、誘発性又は構成的プロモーターと組み合わせてもよい。さらなる実施形態において、１つ以上の脂肪滴タンパク質を過剰発現する発現カセットを作成してもよい。脂肪滴タンパク質の過剰発現は、構成的又は誘発性プロモーターにより駆動され得る。Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）は、藻類脂肪滴タンパク質（ＬＤＰ）の植物相当物であるオレオシンを含まない。代わりに、本明細書に提供されるＬＤＰ１などの藻類脂肪滴タンパク質が、脂肪滴形態を変化させるため過剰発現させるのに好適である。
【０１３７】
Ｋ．炭素環代謝の改変
糖類及び代謝物が脂肪酸若しくは脂質合成における使用又は他の細胞経路に好適な中間物に代謝される際には、多数の酵素経路が関与する。本発明の一実施形態において、脂質合成に関わる代謝物の産生に寄与する酵素又は脂肪酸及び脂質経路以外の経路に脂質合成の中間物若しくは代謝物を利用する酵素の調節又は活性を変化させることが有利である。クレブスサイクルはそのような代謝経路であり、アセチル−ＣｏＡを消費して最終的に二酸化炭素を生じる。クレブスサイクルの関与酵素には、フマル酸ヒドラターゼ（当該技術分野においてフマラーゼとしても知られる）が含まれる。特定の脂肪酸又は脂質の産生が増加するように微生物を操作するため、発現カセットを作成し、それを使用して微生物を形質転換することにより、フマル酸ヒドラターゼをノックアウト又はノックダウンのいずれかの手法によって減弱させてもよい。本発明の実施形態における使用に好適なフマル酸ヒドラターゼの例は、配列番号１７１に提示されるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）フマル酸ヒドラターゼ（配列番号１７０に示されるポリヌクレオチド配列によりコードされる）である。本発明の実施形態により、特定の培養条件下で、例えば脂質産生中、フマル酸ヒドラターゼを減弱させることが有利であり得る。
【０１３８】
炭素代謝が関与する酵素のさらなる例は、ｓｎ−グリセロール３−リン酸をジヒドロキシアセトンリン酸（ｄｉｈｙｄｒｏｈｙｘａｃｅｔｏｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、（当該技術分野においてグリセロンリン酸としても知られる）に可逆的に変換するＮＡＤ依存性グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼである。トリアシルグリセロール骨格前躯体分子であるｓｎ−グリセロール３−リン酸代謝物の量を増加させるため、発現カセットを作成し、それを使用して微生物を形質転換することにより、ＮＡＤ依存性グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼの発現を増進してもよい。本発明の実施形態における使用に好適なＮＡＤ依存性グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼの例は、配列番号２０５に提示されるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）ＮＡＤ依存性グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（配列番号２０４に示されるポリヌクレオチド配列によりコードされる）である。本発明の実施形態により、特定の培養条件下で、例えば脂質産生中、ＮＡＤ依存性グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼを減弱させることが有利であり得る。一部の実施形態では、例えばＰＡＰ、Ｇ３ＰＤＨ、ＧＰＡＴ、ＬＰＰＡＴ、及びＤＧＡＴの組み合わせなど、いくつかのトリアシルグリセロール産生経路酵素の発現を組み合わせることが有利であり得る。
【０１３９】
グリセロホスホジエステルホスホジエステラーゼなどの他のタンパク質が、脂質経路の中間物を合成する。グリセロホスホジエステルホスホジエステラーゼはグリセロホスホジエステルを加水分解することにより、脂質合成に用いられ得るｓｎ−グリセロール３−リン酸を形成する。脂質の産生が増加するように微生物を操作するため、発現カセットを作成し、それを使用して微生物を形質転換することにより、グリセロホスホジエステルホスホジエステラーゼをコードするポリヌクレオチドを過剰発現させてもよい。本発明の実施形態における使用に好適なグリセロホスホジエステルホスホジエステラーゼの例は、配列番号１８０に示されるポリヌクレオチド配列によりコードされるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）グリセロホスホジエステルホスホジエステラーゼ（配列番号１８１）である。エンドグルカナーゼなどのセルラーゼ（ｃｅｌｌｕａｓｅ）が、細胞が利用できるようにセルロース化合物を分解するのに有用である。セルロース系材料を分解する分泌において、又は脂肪滴形成が増進し得るように細胞壁を崩す機構として、潜在的な利用が見出される内在性のエンドグルカナーゼが提供される。
【０１４０】
第ＩＩＩ章．培養
特定の実施形態において、本発明は、概して、微生物油（脂質）を生成するための、微生物、例えば、油産生微生物、例えば、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ及びＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ種及び株を含む微細藻類、並びに酵母、真菌、植物、及び細菌の種及び株の培養に関する。詳細な実施形態では、微生物は組換え微生物である。以下の考察は、例示的な種としてＰｒｏｔｏｔｈｅｃａに焦点を置く。読者の便宜を図り、この章をいくつかの節に分ける。第１節は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ種及び株と、新規Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ種及び株並びに関連する微細藻類のゲノムＤＮＡ比較による同定方法について記載する。第２節は、培養に有用なバイオリアクターについて記載する。第３節は、培養培地について記載する。第４節は、本発明の例示的な培養方法に従う油の生成について記載する。
【０１４１】
１．Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ種及び株
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａは高濃度の脂質、特に燃料の生産に好適な脂質を産生することができるため、脂質の生成に使用される注目すべき微生物である。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａが産生する脂質は、他の微細藻類が産生する脂質と比べて鎖長が短く且つ飽和度が高い炭化水素鎖を有する。さらに、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質は概して色素を含まず（クロロフィル及び特定のカロチノイドが低い乃至検出不能なレベル）、いずれにしても、他の微細藻類による脂質と比べて色素の含有量がはるかに低い。さらに、本発明により提供される組換えＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞を使用すると、他の微生物による脂質の生成と比べて高収率及び高効率、且つ低コストで脂質を生成し得る。本発明の方法において用いられる例示的なＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ株としては、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ（ＵＴＥＸ  ３２７を含む）、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｐｏｒｔｏｒｉｃｅｎｓｉｓ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ株１４４１、１４３５を含む）、及びＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉが挙げられる。加えて、この微細藻類は従属栄養成長し、遺伝子操作することができる。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の種は、偏性従属栄養生物である。
【０１４２】
本発明で使用するＰｒｏｔｏｔｈｅｃａの種は、ゲノムの特定標的領域を増幅させることによって同定することができる。例えば、特定のＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ種又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ株の同定は、プライマーと、任意のゲノム領域を用いた方法とを用い、例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｏｔ．Ｂｕｌｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｎ．（２００１）４２：１１５−１２１  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓに記載されている方法を用いて、核及び／又は葉緑体のＤＮＡを増幅させ、塩基配列を決定することによって行ってもよい。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａだけではなく、同様の脂質プロフィール及び産生能を有する他の炭化水素及び脂質を産生する有機体の種を同定するために、リポソームの内部に転写されたスペーサー（ＩＴＳ１及びＩＴＳ２  ｒＤＮＡ）、２３Ｓ  ｒＲＮＡ、１８Ｓ  ｒＲＮＡ、及び他の保存されたゲノム領域を増幅させ、塩基配列を決定する、当業者によって十分に確率された系統発生解析の方法を用い得。例えば、藻類を同定し、分類する方法は、例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００５年８月；１７０（４）：１６０１−１０及びＲＮＡ、２００５年４月；１１（４）：３６１−４を参照。
【０１４３】
従って、ゲノムＤＮＡ比較を用い、本発明で使用すべき微細藻類の適切な種を同定してもよい。保存されたゲノムＤＮＡ領域、例えば、限定されないが、２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡを、微細藻類の種から増幅させ、本発明で使用する好ましい微細藻類に分類学的に関連する微細藻類の種をスクリーニングするために、コンセンサス配列を比較することができる。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ属に含まれる種に対し、このようなＤＮＡ配列比較を行った例を以下に示す。ゲノムＤＮＡ比較は、株の収集中にうまく同定できなかった微細藻類の種を同定するのにも有用であり得る。株の収集では、表現型及び形態学的特徴に基づいて、微細藻類の種を同定することが多いだろう。これらの特徴を使用すると、微細藻類の種又は属を間違ってカテゴリー分けしてしまうことがある。ゲノムＤＮＡ比較を用いることは、系統発生的関係に基づいて微細藻類種をカテゴリー分けする良好な方法であろう。
【０１４４】
本発明において使用する微細藻類は、典型的には、配列番号１〜９に列挙されている少なくとも１つの配列に対するヌクレオチド同一性が少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、又は少なくとも８５％の２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするゲノムＤＮＡ配列を有する。
【０１４５】
ヌクレオチド同一性又はアミノ酸同一性の割合を決定するために配列を比較する場合、典型的には、ある配列を参照配列として作用させ、これと試験配列とを比較する。配列比較アルゴリズムを用いた場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、部分配列の座標を指定し、必要な場合、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムが、指定したプログラムパラメータに基づいて、試験配列を参照配列と比較して配列同一性の割合を算出する。
【０１４６】
比較のために、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）による局地的ホモロジーアルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）によるホモロジーアラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）と同様の方法で検索することによって、これらのアルゴリズムをコンピュータ制御によって実施することによって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩの、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ）、又は、視覚的な観察（一般的に、前出のＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．を参照）によって、配列の最適アラインメントを行ってもよい。
【０１４７】
配列同一性の割合及び配列類似性を決定するのに適した他の例示的アルゴリズムは、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ウェブアドレスはｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に公開されている。このアルゴリズムは、検索配列の中で、データベース配列中の同じ長さの文字列と整列させたときに、ある正の値である閾値Ｔとマッチするか、又は閾値Ｔを満足するような長さＷの短い文字列を特定することによって、スコアが最も大きくなる配列対（ＨＳＰ）をまず特定することを含む。Ｔは、近隣の文字列スコアの閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．、前出）。これらの初期の近隣の文字列ヒットが、これらの配列に含まれるもっと長いＨＳＰを見つけるための初期検索の出発点として作用する。この文字列のヒットを、累積アラインメントスコアが増加得る限りは、それぞれの配列に沿って両方向に拡張していく。累積スコアは、ヌクレオチド配列の場合、パラメータＭ（マッチングした残基対に対するリワードスコア；常に０より大きい）及びパラメータＮ（マッチングしない残基に対するペナルティースコア；常に０より小さい）を用いて算出される。アミノ酸配列の場合、スコアの行列を用いて累積スコアを算出する。それぞれの方向への文字列ヒットの拡張は、累積アラインメントスコアが、到達した最大値からＸの大きさだけ下がった場合、１つ以上のマイナス値のスコアをもつ残基のアラインメントの累積のため、累積スコアが０又は０未満になった場合、又は、いずれかの配列が末端まできた場合に中止される。核酸又はポリペプチドが本発明の範囲内にあるかどうかを特定するためには、ＢＬＡＳＴプログラムのデフォルトパラメータが適している。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）は、文字列長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４をデフォルトとして用い、両鎖を比較する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプロフラムを、文字列長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、ＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列をデフォルトとして用いる。ＴＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列のタンパク質配列を用いる）は、文字列長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、ＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列をデフォルトとして用いる（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（１９８９）を参照）。
【０１４８】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、配列同一性の割合を算出することに加え、２つの配列間の類似性の統計分析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７（１９９３）を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって与えられる類似性の測定値は、ひとつには最小合計確率（Ｐ（Ｎ））があり、この値は、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列が偶然マッチする確率の指標を与える。例えば、試験核酸と参照核酸とを比較したときの最小合計確率が、０．１未満、より好ましくは、約０．０１未満、最も好ましくは、約０．００１未満であるときに、この核酸は、参照配列と類似していると考える。
【０１４９】
本明細書に提供されるペプチド及びタンパク質配列は、ペプチドの機能に対して実質的な効果を有しない保存的又は非必須アミノ酸置換を有し得ることが理解される。保存的アミノ酸置換は、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンなどの脂肪族アミノ酸を別の脂肪族アミノ酸に置き換えること；セリンをスレオニンに置き換えること；スレオニンをセリンに置き換えること；アスパラギン酸及びグルタミン酸などの酸性残基を別の酸性残基に置き換えること；アスパラギン及びグルタミンなどのアミド基を有する残基を、別のアミド基を有する残基に置き換えること；リジン及びアルギニンなどの塩基性残基を別の塩基性残基と交換すること；及びフェニルアラニン及びチロシンなどの芳香族残基を別の芳香族残基に置き換えることを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００又はそれ以上のアミノ酸置換、付加、挿入、又は欠失を有する。
【０１５０】
本発明において使用される微生物の選択に影響を及ぼす他の考慮事項としては、油、燃料、及び油脂化学品の生産に好適な脂質又は炭化水素の産生に加えて：（１）細胞重量に対する割合として高い脂質含有量；（２）成長の容易さ；（３）遺伝子操作の容易さ；及び（４）バイオマス処理の容易さが挙げられる。詳細な実施形態では、野生型又は遺伝子操作された微生物は、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、又は少なくとも７０％又はそれ以上が脂質である細胞を生じる。好ましい生物体は（糖類上で光なしに）従属栄養成長する。
【０１５１】
本発明の実施に用いられ得る藻類の例としては、限定はされないが、以下の藻類が挙げられる：Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｐｏｒｔｏｒｉｃｅｎｓｉｓ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉ。
【０１５２】
２．バイオリアクター
微生物は、遺伝子操作を行うためと、炭化水素（例えば、脂質、脂肪酸、アルデヒド、アルコール、及びアルカン）を生成するためとの両方の目的で培養される。前者のタイプの培養は、小規模に、少なくとも初めは出発微生物が成長できる条件下で行われる。炭化水素生成を目的とする培養は、通常、バイオリアクターで大規模に行われる（例えば、１０，０００Ｌ、４０，０００Ｌ、１００，０００Ｌ又はそれ以上のバイオリアクター）。微細藻類は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ種を含め、本発明の方法では、典型的にはバイオリアクター内の液体培地で培養される。典型的には、バイオリアクターは光を侵入をさせない。
【０１５３】
バイオリアクター又は発酵槽は、微細藻類細胞を、その生理学的周期の様々な段階を通じて培養するために用いられる。バイオリアクターは、従属栄養成長及び増殖方法における使用に多くの利点を提供する。食品に使用するバイオマスを生成するには、好ましくは微細藻類を、例として浮遊培養下など、液体中で大量に発酵させる。スチール製発酵槽などのバイオリアクターが、極めて多い培養量を収容することができる（本発明の種々の実施形態において４０，０００リットル以上の容積のバイオリアクターが使用される）。また、バイオリアクターによって、典型的には、温度、ｐＨ、酸素圧、二酸化炭素濃度のような培養条件を制御することができる。例えば、バイオリアクターは、典型的には、例えば、酸素又は窒素のような気体成分を液体培養物にバブリングすることが可能な配管に接続したポートを用いて構築することができる。また、培地のｐＨ、微量元素が何であるか及びその濃度、他の培地構成要素のような他の培養パラメータは、バイオリアクターを用いて簡単に操作することができる。
【０１５４】
バイオリアクターは、微細藻類が繁殖され、数が増える間、培地がバイオリアクターを流れるような構成であることもある。ある実施形態では、例えば、播種した後であるが、細胞が所望の密度になる前に、培地をバイオリアクターに注入することができる。別の状況では、培養開始時にバイオリアクターを培地で満たし、培養物を播種した後は、培地を注入しない。言い換えると、微細藻類のバイオマスを、微細藻類が繁殖され、数が増える間、水性媒体中で培養する。しかし、水性培地の量は、この期間全体でバイオリアクターを流れていない。従って、ある実施形態では、水性培地は、播種した後に、バイオリアクターを流れない。
【０１５５】
スピニングブレード、インペラー、揺動機構、撹拌棒、又は加圧気体を注入する手段のようなデバイスを備えるバイオリアクターを用い、微細藻類の培養物を混合してもよい。混合は、連続的であってもよく、断続的であってもよい。例えば、ある実施形態では、微細藻類が望ましい数に増えるまで微細藻類を繁殖させるために、気体及び培地を入れるのに乱流を用いる形態は維持されない。
【０１５６】
気体、固体、半固体、液体を、微細藻類を含むバイオリアクターチャンバーに入れるため、又は抽出するために、バイオリアクターポートを用することができる。多くのバイオリアクターは、２個以上のポートを備えているが（例えば、１つは培地を入れるため、他方はサンプリングのため）、１種類の基質だけを１個のポートから入れたり、出したりする必要はない。例えば、バイオリアクターに培地を流し、その後で、サンプリングしたり、ガスを入れたり、ガスを出したり、又は他の目的のために１個のポートを使用することができる。好ましくは、培養物の純培養性を損なうことなく、サンプリングポートを繰り返し用いてもよい。サンプリングポートは、サンプルの流れを止めるか、開始させるか、又は連続的なサンプリング手段を与えるようなバルブ又は他のデバイスを備えるような構成とすることができる。バイオリアクターは、典型的には、培養物を播種することができるような少なくとも１個のポートを備えており、このようなポートを、培地又は気体を入れるような他の目的で用いることもできる。
【０１５７】
バイオリアクターポートによって、微細藻類の培養物の気体内容物を操作することができる。説明のために、バイオリアクターの容積の一部分は、液体ではなく気体としてもよく、バイオリアクターの気体注入口から、ポンプによって気体をバイオリアクターに入れることができる。ポンプによってバイオリアクターへと有益に入れることができる気体としては、空気、空気／ＣＯ２混合物、アルゴンのような希ガス、他の気体が挙げられる。バイオリアクターは、典型的には、バイオリアクターにガスを入れる速度をユーザーが制御することができるように取り付けられている。上述のように、バイオリアクターへの気体の流れを増やすことによって、培養物の混合性を高めてもよい。
【０１５８】
気体の流れを増やすことは、培地の濁度にも影響を及ぼす。乱流は、バイオリアクターに入った気体が培地表面でバブリングするように、水性培地の液量より低いところに気体注入ポートを配置することによって起こしてもよい。１種類以上の気体がポートを出て行き、気体が外に逃げ、それにより、バイオリアクター中に圧力が蓄積されるのを防ぐ。好ましくは、気体流出ポートは、バイオリアクターに微生物が入り込んで汚染されることを防ぐような「一方向」バルブにつながっている。
【０１５９】
３．培地
微細藻類培地は、典型的には、固定窒素源、固定炭素源、微量元素、場合により、ｐＨを維持するためのバッファー、ホスフェート（典型的には、リン酸塩として与えられる）のような成分を含有する。他の成分は、特に、海水微細藻類の場合には、塩化ナトリウムのような塩を含んでいてもよい。窒素源としては、有機窒素源及び無機窒素源が挙げられ、例えば、限定されないが、分子状窒素、硝酸エステル、硝酸塩、アンモニア（純水なもの、又は塩形態、例えば、（ＮＨ４）２ＳＯ４及びＮＨ４ＯＨ）、タンパク質、大豆ミール、コーンスティープリカー、酵母抽出物が挙げられる。微量元素の例としては、例えば、それぞれＺｎＣｌ２、Ｈ３ＢＯ３、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏのような形態の亜鉛、ホウ素、コバルト、銅、マンガン、モリブデンが挙げられる。
【０１６０】
本発明の方法で有用な微生物は、世界中の種々の場所及び環境で発見されている。他の種からの単離、及び得られる進化多様性の結果として、最適な成長、及び脂質及び／又は炭化水素構成要素の最適な発生のための特定の成長培地は、予測することが困難となることがある。ある場合では、特定の微生物株は、ある種の阻害成分が存在するか、又は、特定の微生物株が必要とするある種の必須栄養分が必要量存在しないために、特定の成長培地上で成長することができない場合がある。
【０１６１】
固体及び液体の成長培地は、一般的に、さまざまな供給源から入手可能であり、さまざまな微生物株に適した特定の培地を調製する方法の説明は、例えば、オンラインでは、藻類の培養物を収集するためのＡｕｓｔｉｎ、１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ａ６７００、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ、７８７１２−０１８３のテキサス大学によって運営されているサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｔｅｘ．ｏｒｇ／で見つけ得る（ＵＴＥＸ）。例えば、種々の淡水培地及び塩水培地としては、ＰＣＴ公開番号第２００８／１５１１４９号に記載されているものが挙げられ、この文献は、参照により組み込まれる。
【０１６２】
特定の例では、プロテオース培地は、純培養の培地に適しており、培地１リットル（ｐＨ約６．８）は、プロテオースペプトン１ｇを、Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  １リットルに加えることによって調製してもよい。Ｂｒｉｓｔｏｌ  ｍｅｄｉｕｍは、水溶液中に、２．９４ｍＭのＮａＮＯ３、０．１７ｍＭのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．３ｍＭのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．４３ｍＭ、１．２９ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１．４３ｍＭのＮａＣｌを含む。１．５％寒天培地の場合、寒天１５ｇを上述の溶液１リットルに加えてもよい。この溶液に蓋をし、オートクレーブにかけ、次いで、使用するまで冷蔵温度で保存する。別の例は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ単離培地（ＰＩＭ）であり、１０ｇ／Ｌのフタル酸水素カリウム（ＫＨＰ）、０．９ｇ／Ｌの水酸化ナトリウム、０．１ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、０．２ｇ／Ｌのリン酸水素カリウム、０．３ｇ／Ｌの塩化アンモニウム、１０ｇ／Ｌのグルコース、０．００１ｇ／Ｌの塩酸チアミン、２０ｇ／Ｌの寒天、０．２５ｇ／Ｌの５−フルオロシトシンを含み、ｐＨ範囲が５．０〜５．２である（Ｐｏｒｅ、１９７３、Ａｐｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２６：６４８−６４９を参照）。本発明の方法と共に用いるのに適した他の培地は、上に特定したＵＲＬを閲覧することによって、又はＳＡＧ、ＣＣＡＰ又はＣＣＡＬＡのような、微生物の培地を保有している他の機関に助言を求めることによって、簡単に特定し得る。ＳＡＧは、ゲッティンゲン大学（ドイツ、ゲッティンゲン）のＣｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅを指し、ＣＣＡＰは、Ｓｃｏｔｔｉｓｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（英国、スコットランド）によって管理されている藻及び原生動物の培養株保存機関を指し、ＣＣＡＬＡは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ（トシェボニュ、チェコ共和国）の藻研究所の培養株保存機関を指す。さらに、米国特許第５，９００，３７０号は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ種の従属栄養性発酵に適した培地の処方及び条件について記載している。
【０１６３】
固定炭素源のコストは油の作製が経済的とするのに十分に低いものでなければならないため、油の生成には固定炭素源の選択が重要である。従って、好適な炭素源として、例えば、酢酸塩、フロリドシド、フルクトース、ガラクトース、グルクロン酸、グルコース、グリセロール、ラクトース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、ラムノース、ショ糖、及び／又はキシロースが挙げられるが、それらの化合物を含有する供給原料の選択が、本発明の方法の重要な態様である。本発明の方法において有用な好適な供給原料としては、例えば、黒液、コーンスターチ、解重合セルロース系材料、乳清、糖蜜、ジャガイモ、モロコシ、ショ糖、サトウダイコン、サトウキビ、コメ、及びコムギが挙げられる。炭素源はまた、ショ糖と解重合サトウダイコンパルプとの混合物など、混合物としても提供され得る。１つ以上の炭素源が、１つ以上の外部から提供される固定炭素源の少なくとも約５０μＭ、少なくとも約１００μＭ、少なくとも約５００μＭ、少なくとも約５ｍＭ、少なくとも約５０ｍＭ、及び少なくとも約５００ｍＭの濃度で供給され得る。発酵用供給原料として高濃縮炭素源が好ましい。例えば、一部の実施形態では、細胞が成長して脂質を蓄積する間ずっと、高濃縮の固定炭素源が細胞に供給される流加回分式で育てる際、培養工程前の供給原料のグルコース濃度の少なくとも３００ｇ／Ｌ、少なくとも４００ｇ／Ｌ、少なくとも５００ｇ／Ｌ、又は少なくとも６００ｇ／Ｌ又はそれ以上のグルコース濃度が加えられる。他の実施形態では、細胞が成長して脂質を蓄積する間ずっと、高濃縮の固定炭素源が細胞に供給される流加回分式で育てる際、培養前のショ糖の少なくとも５００ｇ／Ｌ、少なくとも６００ｇ／Ｌ、少なくとも７００ｇ／Ｌ、少なくとも８００ｇ／Ｌ又はそれ以上のショ糖濃度が加えられる。ショ糖などの高濃縮の固定炭素源の非限定的な例としては、濃いサトウキビ汁、サトウキビ汁、テンサイ汁及び糖蜜が挙げられる。本発明の目的にとって特に興味深い炭素源としては、セルロース（解重合形態）、グリセロール、ショ糖、及びモロコシが挙げられ、その各々を以下でより詳細に考察する。
【０１６４】
本発明によれば、原材料として解重合されたセルロース系バイオマスを用い、微生物を培養することができる。セルロース系バイオマス（例えば、トウモロコシ茎葉のような茎葉）は安価であり、入手が容易であるが、この物質を酵母のための原材料として使用する試みは長年失敗している。特定的には、このような原材料は、酵母の成長を阻害することがわかっており、酵母は、セルロース系材料から生成した五炭糖（例えば、ヘミセルロースから生成したキシロース）を用いることができない。対照的に、微細藻類は、処理したセルロース系材料を用いて成長することができる。セルロース系材料は、一般的に、約４０〜６０％のセルロースと；約２０〜４０％のヘミセルロースと；１０〜３０％のリグニンとを含む。
【０１６５】
適切なセルロース系材料としては、草及び木のエネルギー作物、及び農業用作物から得られた残渣、すなわち、主要な食品又は繊維製品の分野から除去されなかった植物の一部、主に茎及び葉が挙げられる。例としては、農業廃棄物、例えば、サトウキビの絞りかす、モミ殻、トウモロコシ繊維（茎、葉、皮及び穂軸を含む）、麦わら、稲わら、テンサイパルプ、シトラスパルプ、柑橘類の皮；森林の廃棄物、例えば、硬材及び軟材の間伐、伐採作業から得られる硬材及び軟材の残渣；木材廃棄物、例えば、製材工場の廃棄物（木片、おがくず）、パルプ工場の廃棄物；都市廃棄物、例えば、都市固形廃棄物の紙片、都会の廃材、都市の伐採した草のような、都市の緑廃棄物；木材製造の廃棄物が挙げられる。さらなるセルロース含有材料としては、スイッチグラス、ハイブリッドポプラ材、ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ、テンサイ繊維、ソルガム繊維のような専用のセルロース含有作物が挙げられる。このような材料から生成する五炭糖としては、キシロースが挙げられる。
【０１６６】
細菌が上述の材料を含む糖類を利用することができる効率を高めるために、セルロース系材料を処理する。本発明は、材料が微生物（例えば、微細藻類及び油産生酵母）の従属栄養性培養物で用いるのに適するように酸爆発させた後、セルロース系材料を処理するための新規方法を提供する。上述のように、リグノセルロース系バイオマスは、セルロース、β１，４結合したグルコース（六炭糖）の結晶性ポリマー、ヘミセルロース、主にキシロース（五炭糖）で構成され、少量のマンノース、ガラクトース、アラビノース、リグニンで構成されている、ゆるく会合したポリマー、シナピルアルコール及びその誘導体で構成される複雑な芳香族ポリマー、α１，４結合したポリガラクツロン酸の直鎖であるペクチンのような、種々の画分で構成されている。セルロース及びヘミセルロースがポリマー構造であるため、これらの中に含まれる糖類（例えば、単糖類のグルコース及びキシロース）は、多くの細菌によって有効に使用（代謝）し得る形態ではない。このような細菌の場合、セルロース系バイオマスをさらに処理し、このポリマーを構成している単糖類を作成することは、セルロース系材料を原材料（炭素源）として有効に利用するのに非常に役立ち得る。
【０１６７】
本発明の方法の別の実施形態では、炭素源は、バイオディーゼルのトランスエステル化から得られる、酸性化されたグリセロール及び酸性化されていないグリセロールを含むグリセロールである。一実施形態では、炭素源は、グリセロールと、少なくとも１つの他の炭素源とを含んでいる。ある場合では、グリセロール及び少なくとも１つの他の固定炭素源の全てが、発酵開始時に微生物に与えられる。ある場合では、グリセロール及び少なくとも１つの他の固定炭素源が、微生物に対して所定の比率で同時に与えられる。ある場合では、グリセロール及び少なくとも１つの他の固定炭素源が、発酵している間、所定の速度で細菌に供給される。
【０１６８】
ある種の微細藻類は、グルコースの存在下と比べて、グリセロールの存在下でより速い細胞分裂を受ける（ＰＣＴ／ＵＳ２００８／１５１１４９号明細書を参照）。そうした場合、初めに細胞にグリセロールを供給して細胞密度を急速に上昇させて、次にグルコースを供給して脂質を蓄積させる二段階成長プロセスにより、脂質の産生効率を高めることができる。トランスエステル化プロセスのグリセロール副産物を使用すると、生成プロセスに戻す場合に経済的に顕著な利点がもたらされる。グリセロールとグルコースとの混合物など、他の供給方法も同様に提供される。また、このような混合物を供給することによって、同じ経済的な利点が得られる。それに加え、本発明は、ショ糖のような代わりとなる糖をグリセロールとの種々の組み合わせで微細藻類に供給する方法を提供する。
【０１６９】
本発明の方法の別の実施形態では、炭素源は転化糖である。転化糖は、ショ糖をその単糖成分フルクトースとグルコースとに分割することにより生成される。転化糖の生成は、当該技術分野において公知のいくつかの方法により達成することができる。そのような方法の一つは、ショ糖の水溶液を加熱することである。多くの場合に、ショ糖の転化糖への変換を加速させるため、触媒が用いられる。この触媒は生物学的な触媒であり、例えば、インベルターゼ及びスクラーゼのような酵素をショ糖に添加して、転化糖を生成する加水分解反応を加速させてもよい。酸は非生物学的触媒の例であり、熱と組み合わせると加水分解反応が加速し得る。転化糖は、ショ糖と比べて作製後に結晶化しにくく、従って保存上の利点を提供し、及び微細藻類を含めた微生物の従属栄養培養の場合における流加回分発酵では、濃縮炭素源が必要となる。一実施形態では、炭素源は、好ましくは培養工程（これは場合により流加回分培養である）の前に少なくとも８００ｇ／リットル、少なくとも９００ｇ／リットル、少なくとも１０００ｇ／リットル又は少なくとも１１００ｇ／リットルの、好ましくは濃縮された形態の転化糖である。好ましくは濃縮された形態の転化糖は、細胞が成長して脂質を蓄積する間ずっと細胞に供給される。
【０１７０】
本発明の方法の別の実施形態では、炭素源は、ショ糖であり、ショ糖を含む複雑な原材料、例えば、サトウキビの処理から得られる濃いサトウキビ汁を含む。従属栄養で油を生成するための培養物の密度は高いため、固定炭素源（例えば、ショ糖、グルコース等）は、好ましくは濃縮された形態の、育てる工程の前に好ましくは少なくとも５００ｇ／リットル、少なくとも６００ｇ／リットル、少なくとも７００ｇ／リットル又は少なくとも８００ｇ／リットルである固定炭素源であり、育てる工程は、場合により、細胞が成長して脂質を蓄積する間ずっと材料が細胞に供給される流加回分式で育てる。ある場合では、炭素源は、好ましくは濃縮された形態の、好ましくは、場合により流加回分培養である育てる工程の前に少なくとも固形分６０％又は約７７０ｇ／リットル糖、少なくとも固形分７０％又は約９２５ｇ／リットル糖、又は少なくとも固形分８０％又は約１１２５ｇ／リットル糖である、濃いサトウキビ汁の形態のショ糖である。濃縮された濃いサトウキビ汁は、細胞が成長して脂質を蓄積する間ずっと細胞に供給される。
【０１７１】
一実施形態では、培地は、少なくとも１つのショ糖利用酵素をさらに含む。ある場合では、培地は、ショ糖インベルターゼを含む。一実施形態では、ショ糖インベルターゼ酵素は、微生物の集合が発現する外来のショ糖インベルターゼ遺伝子によってコードされる分泌可能なショ糖インベルターゼ酵素である。従って、いくつかの状況では、以下の第ＩＶ章にさらに詳細に記載されるように、微細藻類は、ショ糖トランスポーター、ショ糖インベルターゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼ、又はフルクトキナーゼのようなショ糖利用酵素を発現するように遺伝子操作されている。
【０１７２】
ショ糖を含有する複雑な原材料としては、サトウキビの処理から得られる廃棄糖液が挙げられ、サトウキビ処理の価値の低い上述の廃棄生成物によって、炭化水素及び他の油の生成において、顕著に費用を節約することができる。本発明の方法で有用な、ショ糖を含有する別の複雑な原材料は、ソルガムであり、ソルガムシロップ及び純粋なソルガムを含む。ソルガムシロップは、甘いソルガムの茎の汁から生成する。ソルガムシロップの糖プロフィールは、主に、グルコース（デキストロース）、フルクトース、ショ糖からなる。
【０１７３】
第ＩＶ−Ｉ章．遺伝子操作方法及び材料
本発明は、限定はされないが、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞を遺伝子改変するための方法及び材料並びに組換えＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｋｒｕｇａｎｉ、及びＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ宿主細胞を含めた、本発明の方法において有用な組換え宿主細胞を提供する。これらの方法及び材料の説明は、読者の便宜を図り、いくつかの節に分ける。第１節では、形質転換方法について記載する。第２節では、相同組換えを用いた遺伝子操作方法について記載する。第３節では、発現ベクター及び構成成分について記載する。第４節では、選択可能なマーカー及び構成成分について記載する。
【０１７４】
１．操作方法−形質転換
細胞は、例えば、遺伝子銃、エレクトロポレーション（Ｍａｒｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００４），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ８：８２１−８２６を参照）、ガラスビーズによる形質転換及び炭化ケイ素ウィスカーによる形質転換を含め、任意の好適な技法で形質転換し得る。用い得る別の方法は、プロトプラストの形成及びＣａＣｌ２及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用することによる微細藻類細胞への組換えＤＮＡの導入を含む（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：６３−７３を参照、これは、この方法をＣｈｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａの形質転換に用いることを報告している）。微細藻類の共形質転換を用いて２つの異なるベクター分子を細胞に同時に導入してもよい（例えば、Ｊａｋｏｂｉａｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｔｉｓｔ；１５５（４）：３８１−９３を参照）。
【０１７５】
遺伝子銃による方法（例えば、Ｓａｎｆｏｒｄ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９８８）６：２９９−３０２、米国特許第４，９４５，０５０号明細書を参照；エレクトロポレーション（Ｆｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）（１９８５）８２：５８２４−５８２８）；レーザービーム、マイクロインジェクション、又はＤＮＡを微細藻類に導入することが可能な任意の他の方法の使用を、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞の形質転換に用いることができる。
【０１７６】
２．操作方法−相同組換え
相同組み換えは、相補的ＤＮＡ配列が相同性領域と整列して入れ替わる能力である。標的とするゲノム配列（「テンプレート」）と相同な配列を含むトランスジェニックＤＮＡ（「ドナー」）が生物に導入され、次いで、対応するゲノム相同配列の部位においてゲノムへの組み換えが行われる。このプロセスの機構的な工程には、ほとんどの場合に以下が含まれる：（１）相同ＤＮＡセグメントの対形成；（２）ドナーＤＮＡ分子への二本鎖切断の導入；（３）遊離ドナーＤＮＡ末端によるテンプレートＤＮＡ分子への侵入と、それに続くＤＮＡ合成；及び（４）最終的な組み換え産物をもたらす二本鎖切断修復イベントの解消。
【０１７７】
宿主生物において相同組み換えを行う能力は、分子遺伝子レベルで行われ得ることにとって多くの実用的意義があり、用途に応じた油を産生することができる油産生微生物の生成に有用である。相同組み換えは、それ自体の本来の性質により、正確な遺伝子標的事象であり、従って同じ標的配列を用いて作られたほとんどのトランスジェニック系は表現型の点で本質的に同一であり、スクリーニングが必要な形質転換事象はかなり少ない。また相同組み換えは、遺伝子が宿主染色体に挿入される事象を標的としており、ひいては、遺伝子の選択が存在しない状態であっても、優れた遺伝子安定性が得られる。染色体上の遺伝子座が異なれば、異種プロモーター／ＵＴＲに由来するものであっても、遺伝子発現に影響が及び得るため、相同組み換えは、よく知られていないゲノム環境にある遺伝子座を検索し、それらの環境が遺伝子発現に与える影響を評価する方法であり得る。
【０１７８】
相同組み換えを用いる特に有用な遺伝子操作適用は、プロモーター／ＵＴＲなどの特異的な宿主制御エレメントを選び出し、高度に特異的な方法で異種遺伝子発現を駆動することである。例えば、選択マーカーをコードする異種遺伝子によりデサチュラーゼ遺伝子／遺伝子ファミリーを除去又はノックアウトすると、宿主細胞で生成される飽和脂肪酸の全体的な割合が増加することが予想され得る。実施例３は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓで生じさせるそのようなデサチュラーゼ遺伝子除去又はノックアウトの相同組み換え標的構築物及び実施例について記載している。内因性遺伝子の発現を低下させる別のアプローチは、限定されないが、ＲＮＡｉ又はアンチセンスアプローチ、並びにｄｓＲＮＡアプローチを含め、ＲＮＡによって誘導する遺伝子発現の下方調節又はサイレンシングを用いることである。アンチセンス、ＲＮＡｉ、ヘアピンＲＮＡ、及びｄｓＲＮＡアプローチは、当該技術分野において周知されており、ｍＲＮＡとして発現するとヘアピンＲＮＡの形成をもたらし得る発現構築物又はアンチセンス方向に転写され得る標的遺伝子の一部分を含む発現構築物の導入を含む。これらの４つのアプローチは全て、標的遺伝子の発現の低下をもたらし得る。実施例３及び４は、ＲＮＡヘアピンアプローチによる内在性Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ脂質生合成遺伝子の減弱又は下方調節の発現構築物及び実施例について記載している。
【０１７９】
相同組み換えは正確な遺伝子標的事象であるため、十分なフランキング領域が同定されている限り、目的の遺伝子又は領域内の任意のヌクレオチドを正確に改変するのに用いることができる。従って、相同組み換えを、ＲＮＡ及び／又はタンパク質の遺伝子発現に影響を及ぼす制御配列を改変する手段として用い得る。相同組み換えはまた、基質特異性、親和性、及びＫｍのような酵素活性を改変する目的でタンパク質コード領域を改変し、そのようにして宿主細胞の代謝に望ましい変化を生じさせるためにも用いることができる。相同組み換えは、遺伝子ターゲッティング、遺伝子変換、遺伝子欠失、遺伝子重複、及び遺伝子反転を生じさせ、且つプロモーター、エンハンサー及び３’ＵＴＲのような遺伝子発現調節エレメントを交換する強力なゴーストゲノム（ｇｏｓｔ  ｇｅｎｏｍｅ）操作手段である。
【０１８０】
相同組み換えは、内在する配列の一部を含む標的構築物を用いて内在性宿主細胞ゲノム内の目的の遺伝子又は領域を「標的とする」ことにより達成し得る。このような標的配列は、目的の遺伝子又は領域の５’に位置していてもよく、目的の遺伝子／領域の３’に位置していてもよく、或いはさらには目的の遺伝子／領域に隣接していてもよい。このような標的構築物は、さらなるベクター骨格を有する超らせん構造のプラスミドＤＮＡとして、ベクター骨格を有しないＰＣＲ産物として、又は線状分子として宿主細胞に形質転換され得る。ある場合には、初めに制限酵素を用いてトランスジェニックＤＮＡ（ドナーＤＮＡ）内の相同配列を露出させることが有利な場合がある。この工程により、組み換え効率が増し、望ましくない事象の発生を減らすことができる。組み換え効率を高める他の方法としては、ＰＣＲを用いることにより、標的とするゲノム配列と相同な線状末端を含む形質転換用トランスジェニックＤＮＡを作成することが挙げられる。
【０１８１】
非限定的な例示として、相同組み換えに有用なドナーＤＮＡ配列の領域としては、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおけるＤＮＡのＫＥ８５８領域が挙げられる。ＫＥ８５８は、タンパク質のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）ファミリーと相同性を共有するタンパク質のコード領域の一部を包含する１．３ｋｂのゲノム断片である。サザンブロットから、ＫＥ８５８配列がＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）ゲノムの単一コピーに存在することが示されている。この領域及び相同組み換え標的化にこの領域を用いる実施例が、国際公開第２０１０／０６３０３２号パンフレットに記載されている。ドナーＤＮＡの別の有用な領域は６Ｓゲノム配列の一部である。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｍｉｓでの相同組換えにおけるこの配列の使用は、以下の実施例に記載する。
【０１８２】
３．ベクター及びベクター成分
本発明の実施形態における微生物の形質転換用ベクターは、本明細書の開示を考慮して、当業者に周知されている技術によって調製することができる。ベクターは、典型的には１つ以上の遺伝子を含有し、それぞれの遺伝子が所望の産物（遺伝子産物）の発現をコードし、且つ１つ以上の制御配列に動作可能に連結されており、これらの制御配列が遺伝子発現を調整し、又は遺伝子産物を組み換え細胞の特定の位置に標的化する。読者の助けとなるように、この節をいくつかの節に分ける。第Ａ節は、典型的にベクターに含まれる制御配列並びに本発明により提供される新規制御配列について記載する。第Ｂ節は、典型的にベクターに含まれる遺伝子並びに新規コドン最適化方法及びそれを使用して調製される本発明により提供される遺伝子について記載する。第Ｃ節は、ベクターに含まれる、且つ本発明により提供される選択可能なマーカーについて記載する。第Ｄ節は、遺伝子の同定に用いられる方法及び手順について記載する。
【０１８３】
Ａ．制御配列
制御配列は、コード配列の発現を調節するか、又は遺伝子産物を、細胞内又は細胞外の特定の位置に向かわせる核酸である。発現を調節する制御配列としては、例えば、コード配列の転写を調節するプロモーター、コード配列の転写を終結させるターミネーターが挙げられる。別の制御配列は、コード配列の末端に位置する３’非翻訳配列であり、ポリアデニル化シグナルをコードする。遺伝子産物を特定の位置に向かわせる制御配列としては、シグナルペプチドをコードする配列が挙げられ、この配列は、それが結合しているタンパク質を細胞内又は細胞外の特定の位置に向かわせる。
【０１８４】
従って、微細藻類において外来遺伝子を発現させるための例示的なベクターの設計は、望ましい遺伝子産物（例えば、選択可能なマーカー、脂質経路酵素、又はショ糖利用酵素）のコード配列を、微細藻類において活性なプロモーターと動作可能に連結した状態で含む。或いは、ベクターが、目的のコード配列と動作可能に連結したプロモーターを含まない場合、ベクターの組み込み位置で内在性プロモーターに動作可能に連結するように、コード配列を細胞に形質転換してもよい。このプロモーターを使用しない形質転換方法は、微細藻類でうまく機能することが分かっている（例えば、Ｌｕｍｂｒｅｒａｓ，ｅｔ．ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ（１９８８），１４（４），ｐｐ．４４１−４４７を参照）。
【０１８５】
多くのプロモーターが、形質転換される藻類に内在するプロモーター、並びに形質転換される藻類に内在しないプロモーター（すなわち、他の藻類に由来するプロモーター、高等植物に由来するプロモーター、植物ウイルス又は藻類ウイルスに由来するプロモーター）を含め、微細藻類において活性である。微細藻類において活性な例示的外来性プロモーター及び／又は内在性プロモーター（並びに微細藻類で機能する抗生物質耐性遺伝子）は、ＰＣＴ公開番号第２００８／１５１１４９号明細書及びこの明細書に引用されている参考文献に記載されている。
【０１８６】
外来遺伝子を発現させるために用いられるプロモーターは、その外来遺伝子に天然で連結しているプロモーターであってもよく、又は異種遺伝子であってもよい。ある種のプロモーターは、２つ以上微細藻類において活性である。他のプロモーターは、種に特異的である。例示的なプロモーターとしては、以下の実施例で用いられるＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉに由来するβ−チューブリンなどのプロモーター、並びにカリフラワーモザイクウイルス（ＣＭＶ）及びクロレラウイルスなどのウイルスプロモーターが挙げられ、これらは複数の微細藻類種で活性であることが示されている（例えば、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２００５  Ｍａｒ；２３（１０−１１）：７２７−３５；Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００５  Ａｕｇ；４３（４）：３６１−５；Ｍａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（ＮＹ）．２００２  Ｊａｎ；４（１）：６３−７３）。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａにおける外来遺伝子の発現に用いるのに適切な別のプロモーターは、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａグルタミン酸脱水素酵素プロモーター／５’ＵＴＲである。場合により、これらの配列のうち、プロモーターを含有する少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、又は６０ヌクレオチド、又はそれ以上が使用される。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａで外来遺伝子を発現させるのに有用な例示的なプロモーターは、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ＨＵＰ１遺伝子のプロモーター（配列番号１０）、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ硝酸還元酵素プロモーター（配列番号１１）など、本願の配列表に列挙される。米国特許第６，３９５，９６５号明細書の配列番号１〜７など、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａウイルスプロモーターもまた、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａで遺伝子を発現させるために用いることができる。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａで活性なさらなるプロモーターは、例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９９４  Ｏｃｔ  １４；２０４（１）：１８７−９４；Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９４  Ｏｃｔ；２６（１）：８５−９３；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００４  Ａｕｇ  １５；３２６（１）：１５０−９；及び、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００４  Ｊａｎ  ５；３１８（１）：２１４−２３に見い出すことができる。他の有用なプロモーターは、以下の実施例に詳細に記載する。
【０１８７】
プロモーターは、一般に、構成的又は誘発性と特徴付けることができる。構成的プロモーターは、一般に、常に（又は、細胞周期の特定の時期に）同じレベルで活性であるか、又は発現を駆動する働きをする。逆に誘発性プロモーターは、刺激に応答したときのみ活性である（又は不活性化する）か、又は顕著に上方調節若しくは下方調節される。いずれの種類のプロモーターも、本発明の実施形態において利用が見出される。本発明の実施形態において有用な誘発性プロモーターとしては、例えば、外から与えられる低分子（例えば、配列番号１０の場合には、グルコース）、温度（熱又は冷却）、培養培地中の窒素不足、ｐＨなどの刺激に応答して、動作可能に連結した遺伝子の転写を媒介するプロモーターが挙げられる。好適なプロモーターは、本質的にサイレントな遺伝子の転写を活性化させるか、又は低レベルで転写される動作可能に連結した遺伝子の転写を、好ましくは実質的に上方調節することができる。以下の実施例に、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞において有用なさらなる誘発性プロモーターを記載する。
【０１８８】
３’非翻訳領域とも称される終結領域は、転写開始領域（プロモーター）にとって天然であってもよく、目的のＤＮＡ配列にとって天然であってもよく、又は別の供給源から得られるものであってもよい。例えば、Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｏｒｏｚｃｏ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８８），１６：８４１１を参照のこと。
【０１８９】
本発明の実施形態では、外来の酵素又はタンパク質の区画化した発現を提供する制御配列を利用して、その外来の酵素又はタンパク質を１つ以上の細胞内小器官（ｏｇｒａｎｅｌｌｅ）に誘導する。標的化する細胞小器官は、葉緑体、プラスチド、ミトコンドリア、及び小胞体である。本発明のさらなる実施形態は、タンパク質の細胞外分泌を可能にする組換えポリヌクレオチドを提供する。
【０１９０】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａの核ゲノムでコードされるタンパク質は、プラスチド標的シグナルを用いてプラスチドを標的とし得る。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａに内在するプラスチド標的配列は、例えば、プラスチドを標的とするタンパク質をコードするＣｈｌｏｒｅｌｌａ核ゲノムの遺伝子など、知られており（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＹ６４６１９７及びＡＦ４９９６８４を参照のこと）、一実施形態では、本発明のベクターでこのような制御配列を使用して、タンパク質の発現がＰｒｏｔｏｔｈｅｃａプラスチドに標的化される。
【０１９１】
以下の実施例は、藻類プラスチド標的配列を使用して外来の酵素及びタンパク質を宿主細胞の正しい区画に標的化させることを記載する。藻類プラスチド標的配列は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｄｉｅｓ細胞を使用して作製されたｃＤＮＡライブラリから得られており、国際公開第２０１０／０６３０３２号パンフレットに記載される。
【０１９２】
別の実施形態において、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａにおける外来の酵素又はタンパク質の発現は、小胞体に標的化される。適切な保留又は選別シグナルを発現ベクターに含めることにより、タンパク質が小胞体（ＥＲ）に保留されてゴルジへと下流に行かないことが確実になる。例えば、Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ  ＵＲ−Ｐｌａｎｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌのＩＭＰＡＣＴＶＥＣＴＯＲ１．３ベクターは、周知のＫＤＥＬ保留又は選別シグナルを含む。このベクターにより、発現量が５倍以上に高まることが報告されている点で、ＥＲ保留は実際的な利点を有する。この主な理由は、発現したタンパク質の翻訳後分解に関与するプロテアーゼが、細胞質に存在するものと比べてＥＲが含むものは濃度が低い及び／又は異なるためと思われる。緑色微細藻類で機能するＥＲ保留シグナルが知られている。例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００５  Ａｐｒ  ２６；１０２（１７）：６２２５−３０を参照。
【０１９３】
本発明の別の実施形態では、ポリペプチドは培養培地への細胞外分泌を標的とする。本発明の方法に従い、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａにおいて用い得るＣｈｌｏｒｅｌｌａで活性な分泌シグナルの例について、Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．３８（１９９９），ｐｐ．３３５−３４１を参照のこと。
【０１９４】
Ｂ．遺伝子及びコドン最適化
典型的には、遺伝子は、プロモーターと、コード配列と、終止制御配列とを含む。組み換えＤＮＡ技術によって構築される場合、遺伝子は発現カセットと呼ばれることもあり、組み換え遺伝子を宿主細胞に導入するために使用されるベクターへの挿入に好都合となるように、制限配列が隣接していてもよい。発現カセットにはゲノム由来のＤＮＡ配列又は他の核酸標的が隣接してもよく、相同組み換えによるゲノムへの発現カセットの安定的な組み込みを促進し得る。或いは、ベクター及びその発現カセットは組み込まれないままであってもよく、この場合、ベクターは典型的には、異種ベクターＤＮＡの複製をもたらすことが可能な複製起点を含み得る。
【０１９５】
ベクター上に存在する共通の遺伝子は、タンパク質をコードする遺伝子であり、その発現により、このタンパク質を含む組み換え細胞を、このタンパク質を発現しない細胞と区別することができる。そのような遺伝子、及びその対応する遺伝子産物は、選択可能なマーカーと呼ばれる。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａの形質転換に有用なトランス遺伝子構築物には、さまざまな選択可能なマーカーのいずれを用いてもよい。適切な選択可能マーカーの例としては、Ｇ４１８耐性遺伝子、硝酸還元酵素遺伝子（Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３５：３５６−３６２を参照）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＨＰＴ；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）、Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：６３−７３を参照）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、フレオマイシン対する耐性を付与するｂｌｅ遺伝子（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７２：１９７−２０５）が挙げられる。微細藻類の抗生物質に対する感度を決定する方法は、公知である。例えば、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．１９９６  Ｏｃｔ  １６；２５２（５）：５７２−９。
【０１９６】
抗生物質ベースでない他の選択可能なマーカーもまた、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ種を含め、一般に微細藻類の形質転換に有用なトランス遺伝子構築物に用いることができる。これまで微細藻類が利用できなかった特定の炭素源の利用能を付与する遺伝子もまた、選択可能なマーカーとして使用することができる。例示として、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株はショ糖上では、たとえ成長したとしても、典型的には生育が悪い。ショ糖インベルターゼ遺伝子を含む構築物を使用すると、陽性形質転換体が炭素基質としてショ糖上で成長する能力を付与することができる。ショ糖利用を選択可能なマーカーとして他の選択可能なマーカー共に使用することに関するさらなる詳細は、以下で考察する。
【０１９７】
本発明の目的上、本発明の組み換え宿主細胞を調製するために用いられる発現ベクターは、遺伝子のうちの１つが選択可能なマーカーである場合に、少なくとも２つの遺伝子、多くの場合に３つの遺伝子を含み得る。例えば、本発明の遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａは、選択可能なマーカーに加え、１つ以上の外来遺伝子、例えば、ショ糖インベルターゼ遺伝子又はアシルＡＣＰ−チオエステラーゼ遺伝子などを含む本発明のベクターで形質転換することにより作製することができる。一方又は両方の遺伝子を、誘発性プロモーターを用いて発現させてもよく、それにより、これらの遺伝子が発現する相対的なタイミングを制御し、脂質収量及び脂肪酸エステルへの変換を高めることができる。２種以上の外来遺伝子の発現が同じ誘発性プロモーターの制御下にあってもよく、又は異なる誘発性（又は構成的）プロモーターの制御下にあってもよい。後者の状況では、第１の外来遺伝子の発現が第１の期間に誘発されてもよく（この間、第２の外来遺伝子の発現は誘発されても、又は誘発されなくてもよい）、且つ第２の外来遺伝子の発現が第２の期間に誘発されてもよい（この間、第１の外来遺伝子の発現は誘発されても、又は誘発されなくてもよい）。
【０１９８】
他の実施形態では、２種以上の外来遺伝子は（任意の選択可能なマーカーに加えて）脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ及び脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素であり、これらの複合作用によりアルコール産物が生じる。
【０１９９】
２種以上の外来遺伝子を発現する本発明の実施形態の他の例示的なベクターとしては、ショ糖トランスポーターとショ糖インベルターゼ酵素との両方をコードするベクター、及び選択可能なマーカーと分泌型ショ糖インベルターゼとの両方をコードするベクターが挙げられる。いずれの種類のベクターで形質転換された組み換えＰｒｏｔｏｔｈｅｃａも、サトウキビ（及びサトウキビ由来の糖）を炭素源として利用可能であるように操作されているため、低い製造コストで脂質を生成する。上述の２種類の外来遺伝子の挿入は、定方向変異誘発法及び／又はランダム変異誘発法による多糖生合成の破壊と組み合わせることができ、脂質産生に流れる炭素フラックスがさらに大きくなるよう誘導される。個々に、及び組み合わせて、栄養転換、脂質産生を変化させる操作、及び外来の酵素による処理により、微生物が産生する脂質の組成が変化する。この変化は、脂質の産生量、他の脂質種に対する１つ以上の炭化水素種の産生量、及び／又は微生物において産生される脂質種の種類の変化であり得る。例えば、より多量の及び／又はより高い割合のＴＡＧを産生するように微細藻類を操作することができる。
【０２００】
組み換えタンパク質の最適な発現のために、形質転換される宿主細胞で優先的に用いられるコドンを用いてｍＲＮＡを生成するコード配列を利用することが有益である。従って、トランス遺伝子の適切な発現には、トランス遺伝子のコドンの使用が、トランス遺伝子を発現する生物体の特定のコドンバイアスと適合していることが必要とされ得る。この効果の根底にある正確な機構は多くあるが、利用可能なアミノアシル化ｔＲＮＡプールが細胞内で合成されるタンパク質と適切にバランスしていることと、併せて、必要性が満たされる場合に、トランスジェニックメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のより効率的な翻訳が含まれる。トランス遺伝子内のコドンの使用が最適化されていない場合、利用可能なｔＲＮＡプールが異種ｍＲＮＡの効率的な翻訳を可能にするのに不十分であるため、リボソームが失速して停止し、トランスジェニックｍＲＮＡが不安定になる場合がある。
【０２０１】
本発明は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａにおける組み換えタンパク質の発現の成功に有用な、コドンが最適化された核酸を提供する。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ種のコドン使用を、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓから単離したｃＤＮＡ配列を調べることにより分析した。この分析は２４，０００を超えるコドンの調査に相当し、以下の表２に結果を示す。
【０２０２】
【表６】
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【０２０３】
他の実施形態では、組み換えベクター中の遺伝子が、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ株以外の微細藻類株に対してコドン最適化されている。例えば、微細藻類での発現について遺伝子を記録する方法が、米国特許第７，１３５，２９０号明細書に記載されている。コドン最適化のさらなる情報が、例えばＧｅｎＢａｎｋのコドン使用データベースで利用可能である。
【０２０４】
本発明の方法及び材料により、任意の外来遺伝子をＰｒｏｔｏｔｈｅｃａに導入することが可能になるが、以下の章で考察するように、ショ糖利用及び脂質経路の改変に関係する遺伝子は特に興味深い。
【０２０５】
Ｃ．選択可能なマーカー
ショ糖利用
一実施形態では、本発明の組み換えＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞は、１つ以上の外来性のショ糖利用遺伝子をさらに含む。種々の実施形態では、１つ以上の遺伝子は、フルクトキナーゼ、グルコキナーゼ、ヘキソキナーゼ、ショ糖インベルターゼ、ショ糖トランスポーターからなる群から選択される１つ以上のタンパク質をコードする。例えば、ショ糖トランスポーター及びショ糖インベルターゼが発現することにより、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａが培地からショ糖を細胞に運び込み、ショ糖を加水分解してグルコース及びフルクトースを産生することが可能になる。場合により、フルクトースのリン酸化を最大にするのに内在性ヘキソキナーゼ活性では不十分な場合、フルクトキナーゼもまた発現させてよい。適したショ糖トランスポーターの例は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＣＡＤ９１３３４、ＣＡＢ９２３０７、及びＣＡＡ５３３９０である。適したフルクトキナーゼの例は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｐ２６９８４、Ｐ２６４２０及びＣＡＡ４３３２２である。
【０２０６】
一実施形態では、本発明は、ショ糖インベルターゼを分泌するＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ宿主細胞を提供する。ショ糖インベルターゼの分泌により、ショ糖を細胞に運び込むことができるトランスポーターの発現が不要になる。これは、分泌されたインベルターゼがショ糖分子からグルコース分子及びフルクトース分子への変換を触媒し、いずれの分子も、本発明により提供される微生物によって輸送及び利用され得るためである。例えば、分泌シグナル（例えば、配列番号１２（酵母に由来する）、配列番号１３（高等植物に由来する）、配列番号１４（真核性コンセンサス分泌シグナル）、及び配列番号１５（高等植物及び真核性コンセンサスに由来するシグナル配列の組み合わせ）を用いたショ糖インベルターゼの発現によって、インベルターゼ活性が細胞外で発生する。このようなタンパク質の発現は、本明細書に開示される遺伝子操作方法により可能となるもので、これにより、細胞外グルコースをエネルギー源としてすでに利用可能な細胞が、ショ糖を細胞外エネルギー源として利用することが可能となる。
【０２０７】
ショ糖を含有する培地においてインベルターゼを発現するＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ種は、油の生成に好ましい微細藻類種である。この完全に活性なタンパク質の発現及び細胞外標的化により、得られた宿主細胞がショ糖で成長することが可能となる一方、対応する非形質転換細胞は成長できない。従って、本発明は、インベルターゼ活性及びショ糖の加水分解によって評価される場合にインベルターゼ遺伝子が発現するようにゲノムに組み込まれた、限定されないが酵母インベルターゼ遺伝子を含む、コドンが最適化されたインベルターゼ遺伝子（配列番号１６）を有するＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ組み換え細胞を提供する。
【０２０８】
適切なショ糖インベルターゼの例としては、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＣＡＢ９５０１０、ＮＰ＿０１２１０４（配列番号１７）、及びＣＡＡ０６８３９で特定されるものが挙げられる。適切なインベルターゼの非限定的な例としては、参照により本明細書に援用される国際公開第２０１０／０６３０３２号パンフレットに記載されるものが挙げられる。
【０２０９】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａがインベルターゼを培地に分泌すると、細胞は、純粋な試薬グレードのグルコースで成長させるときと同様に、サトウキビ加工から得た廃棄糖液でも成長することができる；サトウキビ加工のこの価値の低い廃棄物を用いることで、脂質及び他の油の生成において費用を大幅に節約することができる。従って、本発明は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ微生物の集合と、（ｉ）ショ糖及び（ｉｉ）ショ糖インベルターゼ酵素を含む培養培地とを含む微生物培養物を提供する。種々の実施形態では、培養物中のショ糖は、モロコシ、テンサイ、サトウキビ、糖液、又は解重合セルロース系材料（場合によりリグニンを含有し得る）に由来する。別の態様では、本発明の方法及び試薬は、組換えＰｒｏｔｏｔｈｅｃａが利用し得る供給原料の数及びタイプを大幅に増加させる。ここに例示される微生物を、ショ糖を利用できるように変える一方、本発明の方法及び試薬を適用することにより、セルラーゼ、ペクチナーゼ、イソメラーゼなどを分泌する能力を有する本発明の操作された宿主微生物がセルロース系などの原材料を利用することができるようにしてもよく、その結果、宿主は酵素反応の分解産物に単に耐えるだけでなく、それを炭素源として利用するようになる。
【０２１０】
Ｄ．配列決定
脂質生合成経路遺伝子及び酵素の遺伝子配列及びアミノ酸配列の同定には、様々な方法を用い得る。ポリヌクレオチド（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＣＲ増幅ヌクレオチド）の配列は、限定はされないが、サンガー配列決定法、パイロシーケンシング、合成による配列決定、オリゴヌクレオチドプローブライゲーションによる配列決定、及びリアルタイムシーケンシングを含む配列決定法によって決定することができる。当業者は、ヌクレオチド配列を、公開されているゲノム配列データベース又は発現した配列と比較してもよい。ＤＮＡ配列が決定又は開示されている場合、当業者は公開されているエクソン配列からのセグメントを比較してもよく、又はエクソン配列から、イントロン配列を含まない再構成配列を構築してもよい。ポリヌクレオチドの配列はまた、限定はされないが、手動の翻訳又は当該技術分野において一般的に知られるバイオインフォマティクスソフトウェアによるコンピュータ自動化翻訳を含む様々な方法によって、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に翻訳されてもよい。配列決定されたＤＮＡ、ＲＮＡ、アミノ酸、ペプチド、又はタンパク質の比較方法としては、限定はされないが、配列の手動評価又はコンピュータ自動化配列比較及びＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  ５５  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｅ，ｅｔ  ａｌ，（１９９３）／．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／  ＢＬＡＳＴ／もまた参照のこと）などのアルゴリズムを用いた同定を挙げることができる。
【０２１１】
本明細書は、１つ以上の特定の微生物遺伝子及びタンパク質をコードする部分的又は完全なアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を教示する。これにより当業者は、本明細書に報告されるとおりの配列を利用して、当業者に公知の目的のため開示される配列の全て又は一部を使用し得る。
【０２１２】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑを使用してＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）のゲノム配列決定を実施し、ペアエンドリードを得た（１００ｂｐリード、約４５０ｂｐ断片サイズ）。ゲノムＤＮＡは標準的なプロトコルを使用して調製し、流体力学的せん断によって断片化する。Ｒｏｃｈｅ  ４５４技法を用いたゲノムデータ（４００ｂｐ断片サイズ）もまた、８ｋｂメイトペアライブラリと同じく得た。トランスクリプトームデータはＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑペアエンドデータ（１００ｂｐリード、約４５０ｂｐ断片サイズ）からなった。シーケンスリードはクオリティトリミングし、ｆａｓｔｘツールを使用してフィルタリングした。ゲノムデータはＶｅｌｖｅｔを用いて（Ｚｅｒｂｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｖｅｌｖｅｔ：ｄｅ  Ｂｒｕｉｊｎグラフを用いたデノボショートリードアセンブリのためのアルゴリズム（ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ｆｏｒ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｓｈｏｒｔ  ｒｅａｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｕｓｉｎｇ  ｄｅ  Ｂｒｕｉｊｎ  ｇｒａｐｈｓ），Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００８年５月）、最適化したｋｍｅｒ及び他のデフォルトパラメータを使用し、且つＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＬＬＯＲＡアセンブラを使用してアセンブルした。ＭＡＫＥＲ  ｐｉｐｅｌｉｎｅを使用してアノテーションを実施し、ｎｒデータベース（ＮＣＢＩ）に対してＢＬＡＳＴにより遺伝子を同定した。加えて、ｃＤＮＡライブラリを構築し、このライブラリからの約１２００個のｃＤＮＡを、サンガー配列決定法を用いて配列決定した。次に、これらのｃＤＮＡをアノテートして、Ｉｌｌｕｍｉｎａトランスクリプトームから転写物を見つけ出し、且つＩｌｌｕｍｉｎａトランスクリプトーム及びゲノム配列データの精度の検証を助けるための初期入口点として使用した。Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ技術を利用して、ゲノムサンプルからロングリードも得た。所与の塩基位置は、以下の表に示されるとおりのコードにより指示される。場合によっては、２つの代表的な配列を構築し、それぞれが２つの可能な塩基、並びに２つの代替配列についての対応するタンパク質翻訳を有した。かかる配列は、「バージョン１」及び「バージョン２」と称される。
【０２１３】
【表７】
2015500009.tif 000008
【０２１４】
第ＩＶ−ＩＩ章．遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞
第１の態様において、本発明は、遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞を提供し、ここでは、遺伝子操作株の脂肪酸プロフィールが、それが由来した株の脂肪酸プロフィールと異なるように、１つ以上の脂質生合成遺伝子が、そのような１つ以上の遺伝子の発現が増加又は減少するように改変されている。一実施形態において、少なくとも２つの遺伝子が改変されている。種々の実施形態において、遺伝子改変には、以下の改変の１つ以上が含まれる：（ｉ）遺伝子又はその酵素生成物の減弱；及び（ｉｉ）遺伝子又はその酵素生成物の発現上昇；（ｉｉｉ）遺伝子又はその酵素生成物の活性の変化。
【０２１５】
種々の実施形態において、遺伝子操作された細胞は１つ以上の減弱遺伝子を有し、ここで減弱された遺伝子は、相同組換え事象及び干渉性ＲＮＡをコードする外来遺伝子の導入からなる群から選択される手段によって減弱されている。種々の実施形態において、遺伝子の１つ以上の対立遺伝子が減弱される。
【０２１６】
種々の実施形態において、遺伝子操作された細胞は１つ以上の過剰発現遺伝子を有し、ここで過剰発現した遺伝子は、前記細胞への前記遺伝子のさらなるコピーの導入；前記遺伝子の新しい発現制御エレメントの導入；及び遺伝子のタンパク質コード配列の変更からなる群から選択される手段によって上方調節されている。種々の実施形態において、遺伝子の１つ以上の対立遺伝子を過剰発現させる。
【０２１７】
種々の実施形態において、遺伝子操作された細胞の改変遺伝子は、表１に提供されるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質生合成遺伝子からなる群から選択される。種々の実施形態において、遺伝子操作された細胞は、表１に提供されるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質生合成遺伝子からなる群から選択される外来遺伝子を含む。種々の実施形態において、遺伝子操作された細胞は、表１に提供されるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質生合成遺伝子からなる群から選択される遺伝子である遺伝子のもう一つの過剰発現した対立遺伝子を含む。種々の実施形態において、遺伝子操作された細胞は、表１に提供されるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質生合成遺伝子からなる群から選択される減弱遺伝子を有する。種々の実施形態において、遺伝子操作された細胞は、表１に提供されるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質生合成遺伝子からなる群から選択される遺伝子である遺伝子の１つ以上の減弱した対立遺伝子を有する。
【０２１８】
種々の実施形態において、遺伝子操作された細胞は１つ以上の過剰発現遺伝子を有し、ここで遺伝子の発現は、前記細胞への前記遺伝子のさらなるコピーの導入；及び前記遺伝子に対する新規発現制御エレメントの導入からなる群から選択される手段によって増加している。種々の実施形態において、過剰発現遺伝子は外来遺伝子である。
【０２１９】
種々の実施形態において、遺伝子操作された細胞の改変遺伝子は、表１に提供されるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質生合成遺伝子からなる群から選択される。
【０２２０】
種々の実施形態において、遺伝子操作された細胞は、表１に提供されるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質生合成遺伝子からなる群から選択される上方調節遺伝子を有する。種々の実施形態において、遺伝子操作された細胞は、表１に提供されるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質生合成遺伝子からなる群から選択される減弱遺伝子を有する。種々の実施形態において、遺伝子操作された細胞は、３％〜６０％のＣ８：０、３％〜６０％のＣ１０：０、３％〜７０％のＣ１２：０、３％〜９５％のＣ１４：０、３％〜９５％のＣ１６：０、３％〜９５％のＣ１８：０、３％〜９５％のＣ１８：１、３％〜６０％のＣ１８：２、１％〜６０％のＣ１８：３又はそれらの組み合わせからなる群から選択される脂肪酸プロフィールを有する。種々の実施形態において、Ｃ１０：０とＣ１２：０との比は少なくとも３：１である。種々の実施形態において、Ｃ１２：０とＣ１４：０との比は少なくとも３：１である。ある場合には、Ｃ１０：０とＣ１４：０との比は少なくとも１０：１である。種々の実施形態において、遺伝子操作された細胞は、少なくとも４０％飽和脂肪酸、少なくとも６０％飽和脂肪酸、又は少なくとも８５％飽和脂肪酸の脂肪酸プロフィールを有する。種々の実施形態において、遺伝子操作された細胞は、少なくとも８５％不飽和脂肪酸、少なくとも９０％不飽和脂肪酸、少なくとも９５％不飽和脂肪酸、又は少なくとも９７％不飽和脂肪酸の脂肪酸プロフィールを有する。
【０２２１】
本発明の実施形態はまた、例えば、脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（実施例５を参照）又はケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ（実施例６を参照）などの脂質生合成（ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｉｓ）酵素をコードする１つ以上の外来遺伝子を含むように改変された組換えＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞も提供する。一部の実施形態では、脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ及び天然で共発現するアシルキャリアータンパク質をコードする遺伝子が、場合により他の脂質生合成遺伝子をコードする１つ以上の遺伝子を伴い、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞に形質転換される。他の実施形態では、ＡＣＰと脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼとが互いにに対する親和性を有してもよく、この親和性は、この２つが本発明の微生物及び方法で一緒に使用されるとき、それらが特定の組織又は生物体において天然で共発現するか否かに関わらず利点を付与する。従って、本発明の実施形態は、これらの酵素の天然で共発現するペア、並びに互いに相互作用してＡＣＰからの長さ特異的な炭素鎖の切断を促進する親和性を共有するペアの両方を企図する。
【０２２２】
さらに他の実施形態では、デサチュラーゼをコードする外来遺伝子が、他の脂質生合成遺伝子をコードする１つ以上の遺伝子と共にＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞に形質転換され、脂質飽和に関する改変を提供する。他の実施形態では、内在性デサチュラーゼ遺伝子をＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞において（例えば、遺伝子のさらなるコピーの導入によって）過剰発現させる。一部の実施形態では、デサチュラーゼは所望の炭素鎖長を基準に選択されてもよく、それによりデサチュラーゼが、特定の炭素長の基質、又は特定の炭素長範囲内の基質内での位置特異的な改変を作製する能力を有するようになる。別の実施形態において、所望の脂肪酸プロフィールが一不飽和物（Ｃ１６：１及び／又はＣ１８：１など）の増加である場合、ＳＡＤの過剰発現又は異種ＳＡＤの発現を、脂肪酸アシルデサチュラーゼ（ＦＡＤ）又は別のデサチュラーゼ遺伝子のサイレンシング又は不活性化と（例えば、突然変異、ＲＮＡｉ、アンチセンス、又は内在性デサチュラーゼ遺伝子のノックアウト等によって）組み合わせてもよい。
【０２２３】
他の実施形態では、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞は、減弱された内在性デサチュラーゼ遺伝子を有するように改変されており、ここで減弱は、遺伝子又はデサチュラーゼ酵素を不活性化する。ある場合には、突然変異させる内在性デサチュラーゼ遺伝子は脂肪酸デサチュラーゼ（ＦＡＤ）である。他の場合には、突然変異させる内在性デサチュラーゼ遺伝子はステアロイルアシルキャリアータンパク質デサチュラーゼ（ＳＡＤ）である。実施例４は、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ及びデルタ１２脂肪酸デサチュラーゼの標的化した除去について記載する。実施例４はまた、ＲＮＡアンチセンス構築物を使用した内在性デサチュラーゼ遺伝子の発現の低下についても記載する。実施例
【０２２４】
ある場合には、所望の脂肪酸プロフィールを産生するトランスジェニック細胞（ｔｒａｎｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌ）を実現するため、遺伝子操作技術の１つ以上を組み合わせることが有利であり得る。一実施形態において、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞は、減弱した内在性チオエステラーゼ（ｔｈｉｏｅｓｔｅａｓｅ）遺伝子と、１つ以上の外来遺伝子とを含む。非限定的な例では、減弱した内在性チオエステラーゼ遺伝子を有するＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞は、外来性の脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子及び／又はショ糖インベルターゼ遺伝子もまた発現することができる。以下の実施例５は、内在性チオエステラーゼの標的化した除去又はノックアウトを含み、且つチオエステラーゼ及びショ糖インベルターゼを選好するＣｕｐｈｅａ  ｗｒｉｇｈｔｉｉ  ＦａｔＢ２  Ｃ１０：０−Ｃ１４：０も発現するトランスジェニックＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞について記載する。
【０２２５】
他の実施形態では、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質生合成（ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｉｓ）遺伝子の１つの対立遺伝子が減弱されている。さらなる実施形態において、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質生合成（ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｉｓ）遺伝子の２つ以上の対立遺伝子が減弱されている。さらなる実施形態において、異なるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質生合成（ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｉｓ）遺伝子の１つ以上の対立遺伝子が減弱されている。以下の実施例３７は、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼの複数の対立遺伝子の標的化したノックアウトについて記載する。以下の実施例３４は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの複数の対立遺伝子の標的化したノックアウトについて記載する。以下の実施例８は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ及び脂肪酸デサチュラーゼの標的化したノックアウトについて記載する。ある場合には、遺伝子の異なる対立遺伝子の標的化したノックアウトは、脂肪酸プロフィールに異なる効果をもたらし得る。
【０２２６】
第Ｖ章．微生物油
本発明の方法に従い油を生成するには、例えば、光が培養物にあたらないような、きわめて大きな（４０，０００リットル以上の）発酵槽を使用する場合のように、細胞を暗い場所で培養することが好ましい。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ種は、固定炭素源を含有する培地において光が存在しない状態で油を生成するように成長し、増殖する；このような成長は、従属栄養成長として知られている。
【０２２７】
一例として、脂質を生成する微細藻類細胞の播種物質が培地に入れられ、細胞が増殖し始めるまでに遅延期間（遅延期）が存在する。遅延期間の後、増殖速度は徐々に上がっていき、対数期すなわち指数増殖期に入る。次いで、指数増殖期の後、窒素のような栄養物が少なくなったり、毒性基質が増えたり、菌体数感知機構のために増殖が遅くなる。このように増殖が遅くなった後、増殖が止まり、細胞は、細胞に与えられている特定の環境に依存して、静止期又は安定成長状態に入る。脂質を豊富に含むバイオマスを得るために、培養物は、典型的には、その後指数増殖期が終わった後に良好に収穫され、指数増殖期は、窒素又は別の鍵となる栄養物（炭素以外のもの）を枯渇させることによって初期に終わらせてもよく、細胞は、過剰に存在する炭素源を脂質に変換する。培養条件のパラメータを操作することにより、油の総生成量、生成する脂質種の組み合わせ、及び／又は特定の油の生成を最適化し得る。
【０２２８】
上記に考察したとおり、バイオリアクター又は発酵槽を用いると、細胞はその成長周期の種々の期間を経ることができる。一例として、脂質を生成する細胞の接種材料が培地に入れられ、細胞が増殖し始めるまでに遅延期間（遅延期）が存在する。遅延期間の後、増殖速度は徐々に上昇し、対数期すなわち指数増殖期に入る。次いで、指数増殖期の後、栄養物が減り、及び／又は毒性基質が増えるため、増殖が遅くなる。増殖はこのように遅くなった後止まり、細胞は、細胞に与えられている特定の環境に依存して、静止期又は安定成長状態に入る。本明細書に開示されている細胞による脂質の生成は、対数期の間に行われてもよく、又は静止期を含め、その後に行われてもよく、静止期では栄養物が供給されるか、又はいまだ利用可能であるため、細胞分裂なしに脂質を生成し続けることが可能である。
【０２２９】
好ましくは、本明細書に記載されている条件及び当該技術分野で既知の条件を用いて成長させた微生物は、脂質を少なくとも約２０重量％、好ましくは、少なくとも約４０重量％、より好ましくは、少なくとも約５０重量％、最も好ましくは、少なくとも約６０重量％含む。プロセスの条件は、特定の用途に適した脂質の収量を高めるように、及び／又は、生成費用を減らすように調節してもよい。例えば、特定の実施形態では、微細藻類を、グルコースのような固定炭素エネルギーを過剰量与えつつ、制限濃度の１つ以上の栄養物、例えば、窒素、リン又は硫黄が存在する状態で培養する。窒素による制限は、窒素が過剰に与えられている培地における微生物脂質収量よりも、微生物脂質収量を増やす傾向がある。特定の実施形態では、脂質収量の増加は、少なくとも約１０％、約５０％、約１００％、約２００％、又は約５００％である。全培養期間の一部又は全期間にわたって、制限量の栄養物が存在する状態で細菌を培養する場合もある。特定の実施形態では、栄養物の濃度は、全培養期間の間に、制限濃度及び非制限濃度を少なくとも２回繰り返す。過剰量の炭素を与えつつ、窒素量を制限するか、又はまったく窒素を含まない状態で、時間を延長させて培養を続けることによって、細胞の脂質含有量を増やしてもよい。
【０２３０】
別の実施形態では、脂質経路に関連する酵素（例えば、脂肪酸合成酵素）のための１つ以上の補因子が存在する状態で、脂質を産生する細菌（例えば、微細藻類）を培養することによって、脂質収量を増やす。一般的に、補因子の濃度は、補因子が存在しない状態での微生物油脂収量よりも、微生物油脂（例えば、脂肪酸）の量を増やすのに十分な濃度である。特定の実施形態では、補因子をコードする外来遺伝子を含む細菌（例えば、微細藻類）を培養物に含むことによって、培養物に補因子を与える。又は、補因子の合成に関与するタンパク質をコードする外来遺伝子を含有する細菌（例えば、微細藻類）を含むことによって、培養物に補因子を与えてもよい。特定の実施形態では、適切な補因子としては、例えばビオチン、パントテン酸化合物などの、脂質経路酵素に必要な任意のビタミンが挙げられる。本発明で使用するのに適した補因子をコードする遺伝子、又はそのような補因子の合成に関与する遺伝子は公知であり、上述のような構築物及び技術を用いて微生物（例えば、微細藻類）に導入することができる。
【０２３１】
本明細書に記載されているバイオリアクター、培養条件、並びに従属栄養成長及び増殖方法の特定の例を任意の適切な形で組み合わせ、微生物成長及び脂質及び／又はタンパク質生成の効率を高めることができる。
【０２３２】
当該技術分野において公知の種々の培養方法を用いて、乾燥重量で高い割合の油／脂質が蓄積した微細藻類バイオマスが作成されている（ＰＣＴ公開番号第２００８／１５１１４９号明細書を参照）。本明細書に記載されている培養方法で作成され、本発明において有用な微細藻類バイオマスは、乾燥重量で少なくとも２％の微細藻類の油を含む。ある実施形態では、微細藻類バイオマスは、微細藻類の油を乾燥重量で少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、又は少なくとも６０％含む。ある実施形態では、微細藻類バイオマスは、微細藻類の油を１０〜９０％、２５〜７５％含む。
【０２３３】
本明細書に記載されているバイオマスの微細藻類の油、又は本発明の方法及び組成物で使用するためにバイオマスから抽出された微細藻類の油は、１つ以上の別個の脂肪酸エステル側鎖を有するグリセロ脂質を含み得る。グリセロ脂質は、１個、２個又は３個の脂肪酸分子にエステル化されたグリセロール分子からなり、脂肪酸分子は長さが様々で、種々の飽和度を有し得る。脂肪酸分子（及び微細藻類の油）の長さ及び飽和特性は、以下の第ＩＶ章にさらに詳細に記載するように、培養条件又は脂質経路の操作によって、本発明の微細藻類の油中の脂肪酸分子の性質又は比率を改変するように操作することができる。従って、藻類油の特定のブレンドは、２種以上の微細藻類に由来するバイオマス又は藻油を混合することによって、単一の藻種中で調製されてもよく、又は、本発明の藻類油と、大豆、菜種、キャノーラ、パーム、パーム核、ココナツ、トウモロコシ、野菜くず、ナンキンハゼ、オリーブ、ヒマワリ、綿実、鶏脂、牛脂、豚脂、微細藻類、大型藻類、微生物、クフェア、亜麻、ピーナッツ、上質のホワイトグリース、ラード、カメリナ・サティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ）、カラシの種子、カシューナッツ、オーツ麦、ハウチワマメ、ケナフ、キンセンカ、麻、コーヒー、亜麻仁（亜麻）、ヘーゼルナッツ、ユーホルビア、カボチャの種、コリアンダー、ツバキ、ゴマ、ベニバナ、イネ、アブラギリ、ココア、コプラ、ケシ、トウゴマの実、ピーカン、ホホバ、マカダミア、ブラジルナッツ、アボカド、石油、又は上述のいずれかの油の留分などの他の供給源に由来する油とをブレンドすることによって調製されてもよい。
【０２３４】
油組成物、すなわちグリセロ脂質の脂肪酸構成要素の特性及び比率は、少なくとも２つ別個の微細藻類種に由来するバイオマス又は油を組み合わせることによって操作することもできる。ある実施形態では、別個の微細藻類種のうちの少なくとも２つが、異なるグリセロ脂質プロフィールを有する。別個の微細藻類種は、好ましくは従属栄養条件下で、本明細書に記載されるように共に又は別々に培養してもよく、それによりそれぞれの油が産生され得る。異なる微細藻類種は、細胞のグリセロ脂質中、異なる割合の別個の脂肪酸構成要素を含有し得る。
【０２３５】
一般的に、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ株は、鎖長がＣ８〜Ｃ１４の脂肪酸をほとんど又は全く含まない。例えば、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｋｒｕｇａｎｉ（ＵＴＥＸ  ３２９）、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ（ＵＴＥＸ  １４４２）及びＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉ（ＵＴＥＸ  １４３８）は、Ｃ８脂肪酸を全く含まず（又は検出可能な量を含まず）、Ｃ１０脂肪酸を０〜０．０１％、Ｃ１２脂肪酸を０．０３〜２．１％、Ｃ１４脂肪酸を１．０〜１．７％含む。
【０２３６】
また、微細藻類油は、微細藻類によって産生されるか、又は培地から微細藻類の油に取り込まれる他の構成要素を含み得る。これらの他の構成要素は、微細藻類の培養に用いられる培養条件、微細藻類の種、バイオマスから微細藻類油を回収するために用いられる抽出方法及び微細藻類油の組成に影響を与え得る他の要因に応じてさまざまな量で存在し得る。このような構成要素の非限定的な例としては、０．０２５〜０．３ｍｃｇ／油ｇ、好ましくは０．０５〜０．２４４マイクログラム／油グラム存在するカロチノイド；０．０２５〜０．３ｍｃｇ／油ｇ、好ましくは０．０４５〜０．２６８マイクログラム／油グラム存在するクロロフィルａ；０．０３ｍｃｇ／油ｇ未満、好ましくは０．０２５マイクログラム／油グラム未満の総クロロフィル；３５〜１７５ｍｃｇ／油ｇ、好ましくは３８．３〜１６４マイクログラム／油グラム存在するγトコフェロール；５０〜３００ｍｃｇ／油ｇ、好ましくは６０．８〜２６１．７マイクログラム／油グラム存在する総トコフェロール；０．５％未満、好ましくは０．２５％未満のブラシカステロール、カンペステロール、スチグマステロール、又はβ−シトステロール；３００マイクログラム／油グラム未満の総トコトリエノール；及び２２５〜３５０ｍｃｇ／油ｇ、好ましくは２４９．６〜３２５．３マイクログラム／油グラム存在する総トコトリエノールが挙げられる。
【０２３７】
他の構成要素としては、限定されないが、リン脂質、トコフェロール、トコトリエノール、カロチノイド（例えば、α−カロチン、β−カロチン、リコピンなど）、キサントフィル（例えば、ルテイン、ゼアキサンチン、α−クリプトキサンチン、β−クリプトキサンチン）、及び種々の有機化合物又は無機化合物が挙げられる。ある場合には、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ種から抽出した油は、０．００１〜０．０５、好ましくは０．００３〜０．０３９のマイクログラムルテイン／油グラム、０．００５未満、好ましくは０．００３未満のマイクログラムリコピン／油グラム；及び０．００５未満、好ましくは０．００３未満のマイクログラムβカロチン／油グラムを含む。
【０２３８】
安定炭素同位体値δ１３Ｃは、標準（例えばＰＤＢ、サウスカロライナ州のＰｅｅｄｅｅ層からのＢｅｌｅｍｎｉｔｅ  ａｍｅｒｉｃａｎａの化石骨格のカーボナイト）に対する１３Ｃ／１２Ｃの比の表現である。油の安定炭素同位体値δ１３Ｃ（０／００）は、使用される供給原料のδ１３Ｃ値に関連し得る。一部の実施形態では、油は、トウモロコシ又はサトウキビなどのＣ４植物に由来する糖上で従属栄養成長させた油性生物から得られる。一部の実施形態では、油のδ１３Ｃ（０／００）は、−１０〜−１７０／００又は−１３〜−１６０／００である。
【０２３９】
第２の態様において、本発明は、油が産生されるような条件下で本発明の遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞を培養する工程を含む、微生物油を得る方法を提供する。種々の実施形態において、微生物油は、０．１％〜６０％のＣ８：０、０．１％〜６０％のＣ１０：０、０．１％〜６０％のＣ１２：０、０．１％〜９５％のＣ１４：０、１％〜９５％のＣ１６：０、０．１％〜９５％のＣ１８：０、０．１％〜９５％のＣ１８：１、０．１％〜６０％のＣ１８：２、０．１％〜６０％のＣ１８：３又はそれらの組み合わせからなる群から選択される脂肪酸プロフィールを有する。種々の実施形態において、Ｃ１０：０とＣ１２：０との比は少なくとも３：１である。ある場合には、Ｃ１０：０とＣ１４：０との比は少なくとも１０：１である。ある場合には、Ｃ１０：０とＣ１４：０との比は少なくとも２：１である。ある場合には、Ｃ１２：０とＣ１４：０との比は少なくとも２：１である。ある場合には、Ｃ１２：０とＣ１４：０との比は少なくとも３：１である。種々の実施形態において、遺伝子操作された細胞は、少なくとも４０％飽和脂肪酸、少なくとも６０％飽和脂肪酸、又は少なくとも８５％飽和脂肪酸の脂肪酸プロフィールを有する。種々の実施形態において、遺伝子操作された細胞は、少なくとも８５％不飽和脂肪酸、少なくとも９０％不飽和脂肪酸、少なくとも９５％不飽和脂肪酸、又は少なくとも９７％不飽和脂肪酸の脂肪酸プロフィールを有する。
【０２４０】
第３の態様において、本発明は、微生物油並びに前記油を含有する食品、燃料、及び化学品又はそれに由来する化学品を提供する。
【０２４１】
第ＶＩ章．核酸
第５の態様において、本発明は、遺伝子改変されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞及び他の細胞の作製方法において有用な組換え核酸を提供する。本発明の実施形態は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質生合成遺伝子のコード配列のある一部をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【０２４２】
種々の実施形態において、これらの核酸は発現カセットを含み、この発現カセットは、コード配列と、コード配列の発現を調節する制御配列とからなり、コード配列は、脂質生合成酵素をコードするｍＲＮＡ又は脂肪酸生合成遺伝子の発現を抑制する働きをするＲＮＡｉをコードし得る。
【０２４３】
他の実施形態では、これらの核酸は、１つ以上の発現カセットを含む発現ベクターであって、宿主細胞の染色体ＤＮＡへの組み込みによるか、或いは自由に複製するプラスミドとして、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ又は他の宿主細胞において安定的に複製する発現ベクターである。
【０２４４】
他の実施形態では、これらの核酸はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質生合成遺伝子の一部分を含み、この一部分は、コード配列、エクソン、又は制御エレメントの一部分であってもよい。このような核酸は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ及び非Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ宿主細胞用の発現カセットの構築、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ宿主細胞への外来ＤＮＡの組み込み、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ及び非Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ宿主細胞で発現する外来遺伝子の発現の調節、及びＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質合成遺伝子を相同組換え又はアンチセンスＲＮＡ媒介性ノックダウンによるなどして不活性化するのに有用な核酸の構築に有用である。
【実施例】
【０２４５】
実施例１：Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａの培養方法
細胞乾燥重量で高い割合の油を得るようにＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ株を育てた。凍結保存した細胞を室温で解凍し、細胞５００μｌを、２％グルコースを含む培地４．５ｍｌ（４．２ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、３．１ｇ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．２４ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２５ｇ／Ｌ  クエン酸一水和物、０．０２５ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２  ２Ｈ２Ｏ、２ｇ／Ｌ  酵母抽出物）に入れ、６ウェルプレートで撹拌しつつ（２００ｒｐｍ）、２８℃で７日間成長させた。細胞乾燥重量は、あらかじめ秤量しておいたエッペンドルフ管中、培養物１ｍｌを１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって決定した。培養物の上澄みを棄て、得られた細胞ペレットを脱イオン水１ｍｌで洗浄した。培養物を再び遠心分離処理し、上澄みを棄て、細胞ペレットを凍結するまで−８０℃に置いた。次いで、サンプルを２４時間凍結乾燥し、細胞乾燥重量を算出した。培養物中の総脂質を決定するために、培養物３ｍｌを取り出し、Ａｎｋｏｍシステム（Ａｎｋｏｍ  Ｉｎｃ．、Ｍａｃｅｄｏｎ、ＮＹ）を用い、製造業者のプロトコルに従って分析した。サンプルを、Ａｍｋｏｍ  ＸＴ１０抽出機を用い、製造業者のプロトコルに従って、溶媒抽出した。酸によって加水分解して乾燥させたサンプルと、溶媒抽出して乾燥させたサンプルとの質量差として、総脂質を決定した。細胞乾燥重量での油の割合を測定した値を表３に示す。
【０２４６】
【表８】
2015500009.tif 000009
【０２４７】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の複数の株に由来する微細藻類サンプルの遺伝子型を解析した。藻類のバイオマスからゲノムＤＮＡを以下のように単離した。液体培養物から、細胞（約２００ｍｇ）を１４，０００×ｇで５分間遠心分離処理した。次いで、細胞を滅菌蒸留水に再び懸濁させ、１４，０００×ｇで５分間遠心分離処理し、上澄みを棄てた。このバイオマスに、直径約２ｍｍの１個のガラスビーズを加え、この管を−８０℃で少なくとも１５分間置いた。サンプルを取り出し、研磨バッファー（１％  Ｓａｒｋｏｓｙｌ、０．２５Ｍ  ショ糖、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０、ＲＮａｓｅ  Ａ  ０．５ｕｇ／μｌ）１５０μｌを加えた。ペレットを短時間ボルテックスすることによって再び懸濁させた後、５Ｍ  ＮａＣｌ  ４０μｌを加えた。サンプルを簡単にボルテックスした後、５％  ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）６６μｌを加え、最後に短時間ボルテックスした。次いで、サンプルを６５℃で１０分間インキュベートした後、１４，０００×ｇで１０分間遠心分離処理した。新しい管に上澄みを移し、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール  １２：１２：１  ３００μｌで１回抽出し、次いで、１４，０００×ｇで５分間遠心分離処理した。０．７体積部のイソプロパノール（約１９０μｌ）を含む新たな管に、得られた水相を移し、ひっくり返すことによって混合し、室温で３０分間インキュベートするか、又は４℃で一晩インキュベートした。１４，０００×ｇで１０分間遠心分離処理することによってＤＮＡを回収した。次いで、得られたペレットを７０％エタノールで２回洗浄した後、１００％エタノールで最後に洗浄した。ペレットを室温で２０〜３０分風乾した後、１０ｍＭ  ＴｒｉｓＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）５０μｌで再び懸濁させた。
【０２４８】
上述のように調製した藻の全ＤＮＡ５μｌを、これを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０で１：５０に希釈した。最終容積が２０μｌのＰＣＲ反応を以下のように設定した。２×ｉＰｒｏｏｆ  ＨＦマスターミックス（ＢＩＯ−ＲＡＤ）１０μｌを、０．４μｌのプライマーＳＺ０２６１３（１０ｍＭストック濃度の５’−ＴＧＴＴＧＡＡＧＡＡＴＧＡＧＣＣＧＧＣＧＡＣ−３’）に加えた。このプライマー配列は、Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ寄託番号Ｌ４３３５７の位置５６７〜５８８であり、高等植物及び藻のプラスチドゲノムにおいて高度に保存されている。次いで、これに０．４μｌのプライマーＳＺ０２６１５（１０ｍＭストック濃度の５’−ＣＡＧＴＧＡＧＣＴＡＴＴＡＣＧＣＡＣＴＣ−３’）を加えた。このプライマー配列は、Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ寄託番号Ｌ４３３５７の位置１１１２〜１０９３と相補性であり、高等植物及び藻のプラスチドゲノムにおいて高度に保存されている。次いで、希釈した全ＤＮＡ５μｌ及びｄＨ２Ｏ  ３．２μｌを加えた。ＰＣＲ反応を以下のように行った。９８℃、４５秒；９８℃、８秒；５３℃、１２秒；７２℃、２０秒を３５サイクル繰り返した後、７２℃で１分、２５℃で保持。ＰＣＲ産物を精製するために、核反応物に１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０  ２０μｌを加えた後、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール  １２：１２：１  ４０μｌで抽出し、ボルテックスし、１４，０００×ｇで５分間遠心分離処理した。ＰＣＲ反応物をＳ−４００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に入れ、３，０００×ｇで２分間遠心分離処理した。次いで、精製したＰＣＲ産物を、ＰＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯへとＴＯＰＯクローン化し、ＬＢ／Ｓｐｅｃプレートで陽性クローンを選択した。精製したプラスミドＤＮＡについて、Ｍ１３の順プライマー及び逆プライマーを用い、両方向で配列を決定した。２３Ｓ  ｒＲＮＡ  ＤＮＡの配列が決定された全部で１２種類のＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ株を選択し、これらの配列を、配列表に列挙している。株及び配列表の番号のまとめは、以下にある。ＵＴＥＸ  １４３５（配列番号５）配列との全体的な違いについて、配列を分析した。最も違う配列として、２対があらわれた（ＵＴＥＸ  ３２９／ＵＴＥＸ  １５３３及びＵＴＥＸ  ３２９／ＵＴＥＸ  １４４０）。これら両者の場合で、ペアワイズアラインメントから、一対の配列同一性が７５．０％であった。ＵＴＥＸ  １４３５とのパーセント配列同一性もまた、以下に掲載する：
【０２４９】
【表９】
2015500009.tif 000010
【０２５０】
上に列挙した株の一部から得られた脂質サンプルについてＨＰＬＣを用いて脂肪酸プロフィールを分析した。結果を以下の表４に示す。
【０２５１】
【表１０】
2015500009.tif 000011
【０２５２】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５から抽出した油（溶媒抽出によるか、又は連続圧搾機を用いる）について、カロチノイド、クロロフィル、トコフェロール、他のステロール及びトコトリエノールを分析した。結果を以下の表５にまとめる。
【０２５３】
【表１１】
2015500009.tif 000012
【０２５４】
４つの別個のロットからの、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓから抽出した油を、標準的な植物油の処理方法を用いて精製し、漂白した。簡潔に言えば、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓから抽出した未精製油を水平デカンターで透明にし、そこで油から固形分を分離した。次いで透明にした油をクエン酸及び水とともにタンクに移し、約２４時間静置しておいた。２４時間後、タンク内の混合物が２つの別個の層を形成した。下層は水及びガムから構成され、次いでガムをデカンテーションにより除去してから、その脱ガム油を漂白タンクに移した。次いで油を別の一添加量のクエン酸とともに加熱した。次いで漂白クレイを漂白タンクに加え、混合物を真空下でさらに加熱することで、存在した水を全て蒸発させた。次いで混合物を葉状濾過器でポンピングして、漂白クレイを除去した。次いで濾過した油を最終的な５μｍ仕上げフィルターに通し、次いで、回収して、使用時まで保存した。次いで精製及び漂白した（ＲＢ）油について、カロチノイド、クロロフィル、ステロール、トコトリエノール及びトコフェロールを分析した。これらの分析の結果を以下の表６にまとめる。「ｎｄ」は、検出されなかったことを示し、検出感度は以下に掲載する：
検出感度
カロチノイド（ｍｃｇ／ｇ）ｎｄ＝＜０．００３ｍｃｇ／ｇ
クロロフィルＩＩ（ｍｃｇ／ｇ）ｎｄ＝＜０．０３ｍｃｇ／ｇ
ステロール（％）ｎｄ＝０．２５％
トコフェロール（ｍｃｇ／ｇ）；ｎｄ＝３ｍｃｇ／ｇ
【０２５５】
【表１２】
2015500009.tif 000013
【０２５６】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ油の同じ４つのロットを、微量元素についても分析した。結果を以下の表７にまとめる。
【０２５７】
【表１３】
2015500009.tif 000014
【０２５８】
実施例２：Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａの遺伝子銃による一般的形質転換方法
Ｓｅａｓｈｅｌｌ製の金マイクロキャリア５５０ナノメートルを製造業者のプロトコルに従って調製した。プラスミド（２０μｇ）を、結合バッファー５０μｌ及びＳ５５０ｄ金担体６０μｌ（３０ｍｇ）と混合し、氷中、１分間インキュベートした。沈殿バッファー（１００μｌ）を加え、この混合物を氷中でさらに１分間インキュベートした。ボルテックスした後、ＤＮＡでコーティングされた粒子を、エッペンドルフ５４１５Ｃ微量遠心器で１０，０００ｒｐｍで１０秒間回転させることによって、ペレット状にした。この金ペレットを冷たい１００％エタノール５００μｌで１回洗浄し、微量遠心器で軽く回転させることによってペレット状にし、氷冷したエタノール５０μｌで再び懸濁させた。軽く（１〜２秒）音波処理した後、１０μｌのＤＮＡコーティングされた粒子を、すぐにキャリア膜に移した。
【０２５９】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ株を、２％グルコースを含むプロテオース培地（２ｇ／Ｌ  酵母エキス、２．９４ｍＭ  ＮａＮＯ３、０．１７ｍＭ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．３ｍＭ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．４ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１．２８ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、０．４３ｍＭ  ＮａＣｌ）中、旋回シェーカー上で、細胞密度が２×１０６細胞／ｍｌになるまで成長させた。この細胞を収穫し、滅菌蒸留水で１回洗浄し、培地５０μｌに再び懸濁させた。非選択的なプロテオース培地プレートの中央の１／３に１×１０７細胞を広げた。この細胞を、ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ  Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で撃った。破裂ディスク（１３５０ｐｓｉ）を用い、プレートはスクリーン／マクロキャリアの集合体から６ｃｍ下に置く。細胞を２５℃で１２〜２４時間回復させた。回復したら、ゴム製スパチュラで細胞をプレートから掻き取り、培地１００μｌと混合し、適切に選別した抗生物質を含むプレートに広げた。２５℃でインキュベーションして７〜１０日経過後、プレート上に形質転換された細胞を示すコロニーが目視で確認された。コロニーを取り出し、２回目の選択ラウンドのために選択的な（抗生物質あるいは炭素源のいずれか）寒天プレートにスポットとして乗せた。
【０２６０】
実施例３：脂肪酸メチルエステル検出による脂肪酸分析
乾燥バイオマスから脂質サンプルを調製した。２０〜４０ｍｇの乾燥バイオマスを２ｍＬのＭｅＯＨ中５％Ｈ２ＳＯ４に再懸濁し、適量の好適な内部標準（Ｃ１９：０）を含有する２００ｕｌのトルエンを添加した。この混合物を短時間超音波処理してバイオマスを分散させ、次に７０〜７５℃で３．５時間加熱した。２ｍＬのヘプタンを添加して脂肪酸メチルエステルを抽出し、続いて２ｍＬの６％Ｋ２ＣＯ３（水溶液）を添加して酸を中和した。混合物を激しく撹拌し、標準ＦＡＭＥを使用するガスクロマトグラフィー分析のため、上層の一部を、Ｎａ２ＳＯ４（無水）が入ったバイアルに移した。
【０２６１】
実施例４：微細藻類Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおける飽和脂肪酸濃度の改変
Ａ．遺伝子ノックアウトアプローチによるステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ及びデルタ１２脂肪酸デサチュラーゼ発現の低減
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）に由来するゲノムＤＮＡのｃＤＮＡ、Ｉｌｌｕｍｉａトランスクリプトーム及びＲｏｃｈｅ  ４５４シーケンシングに基づくバイオインフォマティクスベースのアプローチを用いたゲノムスクリーンの一部として、脂肪酸不飽和化に関わる２つの特定の遺伝子群を同定した：ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ（ＳＡＤ）及びデルタ１２脂肪酸デサチュラーゼ（Δ１２  ＦＡＤ）。ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ酵素は脂質合成経路の一部であり、脂肪酸アシル鎖に二重結合を導入する働きをし、例えば、Ｃ１８：０脂肪酸からＣ１８：１脂肪酸を合成する。デルタ１２脂肪酸デサチュラーゼもまた脂質合成経路の一部であり、既に不飽和の脂肪酸に二重結合を導入する働きをし、例えば、Ｃ１８：１脂肪酸からＣ１８：２脂肪酸を合成する。ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼをコードする遺伝子は、２つの別個のファミリーに分類された。これらの結果に基づき、デサチュラーゼ酵素の各ファミリー内でより高度に保存されたコード領域を標的とすることにより複数の遺伝子ファミリーメンバーを潜在的に破壊し得る３つの遺伝子破壊構築物を設計した。
【０２６２】
３つの相同組み換え標的構築物は、以下を用いて設計した：（１）デルタ１２脂肪酸デサチュラーゼ（ｄ１２ＦＡＤ）又はＦＡＤ２ファミリーメンバーのコード配列の高度に保存された部分及び（２）２つの別個のＳＡＤファミリー（ＳＡＤ１及びＳＡＤ２）の各々を標的化する２つの構築物、各々が各ファミリーからのコード配列の保存領域を有する。この戦略は、相同組み換えにより標的遺伝子のフランキング領域を標的とし得る古典的な遺伝子置換戦略ではなく、選択可能なマーカー遺伝子をこれらの高度に保存されたコード領域に（複数のファミリーメンバーを標的として）埋め込み得る。
【０２６３】
全ての構築物は、上述の方法を用いた遺伝子銃形質転換により細胞に導入し、構築物は線状化してから細胞に撃ち込んだ。形質転換体はショ糖含有プレート／培地で選択し、脂質プロフィールの変化は上述の方法を用いて分析した。３つの標的構築物の各々からの関連する配列を以下に列挙する。
【０２６４】
【表１４】
2015500009.tif 000015
【０２６５】
構築物の各々による形質転換から代表的な陽性クローンを取り出し、それらのクローンの脂肪酸プロフィールを決定した。脂質サンプルを各形質転換体由来の乾燥バイオマスから調製し、それらのサンプルの脂肪酸プロフィールを、実施例３に記載されるとおりの標準的な脂肪酸メチルエステルガスクロマトグラフィー水素炎イオン化（ＦＡＭＥ  ＧＣ／ＦＩＤ）検出法を用いて分析した。形質転換により生じるトランスジェニック系の脂肪酸プロフィール（全脂肪酸に対する面積％で表される）を表８に示す。
【０２６６】
【表１５】
2015500009.tif 000016
【０２６７】
各構築物は、望ましい脂肪酸クラスに対して計測可能な影響を有し、３つのケース全てにおいて、特に２つのＳＡＤノックアウトで、Ｃ１８：０濃度が著しく上昇した。ＳＡＤノックアウトからの複数のクローンをさらに比較すると、ＳＡＤ２Ｂノックアウト系統が、ＳＡＤ２Ａノックアウト系統で観察されるＣ１８：１脂肪酸濃度と比べて、Ｃ１８：１脂肪酸の著しく大きい低下を有したことが示された。
【０２６８】
上述の方法を用いてＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの背景にさらなるΔ１２  ＦＡＤノックアウトを作成した。Δ１２ＦＡＤの潜在的な相同性を同定するため、以下のプライマーを使用して、推定ＦＡＤをコードするゲノム領域を増幅した：
プライマー１  ５’−ＴＣＡＣＴＴＣＡＴＧＣＣＧＧＣＧＧＴＣＣ−３’配列番号２７
プライマー２  ５’−ＧＣＧＣＴＣＣＴＧＣＴＴＧＧＣＴＣＧＡＡ−３’配列番号２８
上記プライマーを用いたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓゲノムＤＮＡのゲノム増幅から得られた配列は、高度な類似性を示したが、ＰｒｏｔｏｔｈｅｃａにΔ１２ＦＡＤの複数の遺伝子又は対立遺伝子が存在することが示された。
【０２６９】
この結果に基づき、１つ以上のΔ１２ＦＡＤ遺伝子の不活性化を目指す２つの遺伝子破壊構築物を設計した。この戦略は、古典的な遺伝子置換戦略を用いるのではなく、ショ糖インベルターゼ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するｓｕｃ２）カセット（配列番号２９）を高度に保存されたコード領域に埋め込み、ひいては選択可能なマーカーとしてショ糖の加水分解能を付与するものであり得る。ｐＳＺ１１２４と命名された第１の構築物は、５’及び３’ゲノム標的配列を含み、それに、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２遺伝子（配列番号３１）の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター（配列番号３０）と、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲ（配列番号３２）とが隣接した。ｐＳＺ１１２５と命名された第２の構築物は、５’及び３’ゲノム標的配列を含み、それに、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２遺伝子の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーターと、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲとが隣接した。構築物の関連配列は、配列表に列挙する：
Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２カセット  配列番号２９
ｐＳＺ１１２４  （ＦＡＤ２Ｂ）  ５’ゲノム標的配列  配列番号３３
ｐＳＺ１１２４  （ＦＡＤ２Ｂ）  ３’ゲノム標的配列  配列番号３４
ｐＳＺ１１２５  （ＦＡＤ２Ｃ）  ５’ゲノム標的配列  配列番号３５
ｐＳＺ１１２５  （ＦＡＤ２Ｃ）  ３’ゲノム標的配列  配列番号３６
【０２７０】
ｐＳＺ１１２４及びｐＳＺ１１２５を、それぞれＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの背景に導入した。ショ糖を加水分解する能力に基づき陽性クローンを選択した。表９は、ｐＳＺ１１２４及びｐＳＺ１１２５標的ベクターを利用した２つのトランスジェニック系で得られた脂肪酸プロフィール（面積％、上述の方法を用いて作成）をまとめている。
【０２７１】
【表１６】
2015500009.tif 000017
【０２７２】
ＦＡＤ２Ｂ（ｐＳＺ１１２４）構築物を含むトランスジェニックから、脂肪酸プロフィールに関して極めて興味深い、予想外の結果がもたらされ、すなわち低下することを予想し得たＣ１８：２濃度が、約１面積％しか低下しなかった。しかしながら、Ｃ１８：１脂肪酸濃度は著しく増加し、ほぼ例外なくＣ１６：０濃度がその代償となり、Ｃ１６：０濃度は著しく低下した。ＦＡＤ２Ｃ（ｐＳＺ１１２５）構築物を含むトランスジェニックからも、脂質プロフィールの変化がもたらされた：Ｃ１８：２の濃度が著しく低下し、これに対応してＣ１８：１濃度が増加する。
【０２７３】
Ｂ．Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞においてデルタ１２デサチュラーゼ（ＦＡＤｃ）を下方調節するＲＮＡヘアピンアプローチ
長いヘアピンＲＮＡによりＦＡＤｃ（デルタ１２デサチュラーゼ遺伝子）の遺伝子発現を下方調節するように構築されたベクターを、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５の遺伝的背景に導入した。唯一の炭素源としてショ糖で成長する能力を陽性クローンに付与するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼ遺伝子を選択可能なマーカーとして利用し、２つのタイプの構築物を使用した。第１のタイプの構築物は、ＦＡＤｃコード領域の第１エクソンがシスでその第１のイントロンに連結し、その後に逆方向の第１エクソンの反復単位が続く部分を利用した。このタイプの構築物は、ｍＲＮＡとして発現したときにヘアピンを形成するように設計された。この第１のタイプの構築物を２つ作製し、１つはＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  Ａｍｔ０３プロモーター（配列番号３７）により駆動されるもので、ｐＳＺ１４６８と命名され、２つ目は、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｍａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター（配列番号３０）により駆動されるもので、ｐＳＺ１４６９と命名された。第２のタイプの構築物は、アンチセンス方向の大きいＦＡＤｃエクソン２を利用し、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  Ａｍｔ０３プロモーター（配列番号３７）により駆動されるか（ｐＳＺ１４７０と命名された）、又はＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｍａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター（ｐｒｏｍｔｅｒ）（配列番号３０）により駆動された（ｐＳＺ１４７１と命名された）。４つの構築物はいずれも、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼカセット（配列番号２９）と、核ゲノムに組み込むための、６Ｓゲノム領域に対する５’（配列番号３８）及び３’（配列番号３９）相同組み換え標的配列（構築物に隣接する）とを有した。各ロングヘアピンＲＮＡ構築物のＦＡＤｃ部分の配列を、各構築物の関連する部分とともに、以下のとおり配列表に列挙する：
【０２７４】
【表１７】
2015500009.tif 000018
【０２７５】
４つの構築物のそれぞれを、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ１４３５）の背景に形質転換し、ショ糖を唯一の炭素源として含むプレートを使用して陽性クローンをスクリーニングした。各形質転換から陽性クローンを取り出し、一部を選択して、脂肪酸プロフィールに対するｐＳＺ１４６８、ｐＳＺ１４６９、ｐＳＺ１４７０及びｐＳＺ１４７１に含まれたヘアピン及びアンチセンスカセットの影響を決定した。各形質転換から選択されたクローンを脂質生成条件下で成長させ、上述のような直接的なトランスエステル化法を用いて脂肪酸プロフィールを決定した。形質転換のそれぞれからの代表的な脂肪酸プロフィールを、以下の表１０にまとめている。野生型１及び２細胞は、陰性対照として形質転換体のそれぞれと共に実行した非形質転換Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ１４３５）細胞であった。
【０２７６】
【表１８】
2015500009.tif 000019
【０２７７】
上記の結果は、ヘアピン構築物ｐＳＺ１４６８及びｐＳＺ１４６９が予想された表現型：それぞれ野生型１及び野生型２と比較したときのＣ１８：２脂肪酸濃度の低下及びＣ１８：１脂肪酸濃度の増加を示したことを示している。アンチセンス構築物ｐＳＺ１４７０及びｐＳＺ１４７１は、Ｃ１８：２脂肪酸濃度の低下はもたらさず、それぞれ野生型１及び野生型２と比較したときには僅かな増加を示し、及びＣ１６：０脂肪酸濃度の僅かな低下を示した。
【０２７８】
実施例５：改変された脂肪酸プロフィールを有する操作された微細藻類
上述のように、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ種において特定の内在性脂質経路遺伝子をノックアウト又はノックダウンにより減弱させる異種遺伝子の組み込みにより、脂肪酸プロフィールを変えることができる。内在性脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子ＦＡＴＡ１をノックアウトする結果として、宿主細胞の脂肪酸プロフィールが影響を受け得るかどうかを評価するため、プラスミド構築物（表１１に列挙される）を作製した。
【０２７９】
Ｐｒｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５、株Ｊの古典的に変異を誘発した誘導体を、実施例２の方法を用いて、以下の表１１のプラスミド構築物のうちの１つで形質転換した。各構築物は、内在するＦＡＴＡ１遺伝子を分断するように核ゲノムに組み込むための領域と、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号３０）及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲ（配列番号３２）の制御下にあるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼコード領域とを含んだ。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２発現カセットは配列番号２９として列挙され、選択マーカーとして機能した。全てのタンパク質コード領域は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５（表２を参照）の核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにコドンを最適化した。核ゲノムの組み込みに使用したＦＡＴＡ１遺伝子の標的領域に関連する配列を、以下に示す。
【０２８０】
【表１９】
2015500009.tif 000020
【０２８１】
【表２０】
2015500009.tif 000021
【０２８２】
Ｃｕｐｈｅａ  ｗｒｉｇｈｔｉｉ  ＡＣＰ−チオエステラーゼ２（ＣｗＦａｔＢ２）遺伝子（寄託番号Ｕ５６１０４）を株ＪのＦＡＴＡ１−１遺伝子座に導入するため、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号３７）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲ（配列番号３２）の制御下でＣｗＦａｔＢ２遺伝子のタンパク質コード領域を発現するように構築物を作成した。この構築物の関連する部分は、配列表に配列番号５１として提供される。Ｃｕｐｈｅａ  ｗｒｉｇｈｔｉｉ  ＦａｔＢ２チオエステラーゼのコドンが最適化されたｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を、配列表にそれぞれ配列番号５２及び配列番号５３として列挙する。
【０２８３】
ＦＡＴＡ１−ＣｒｂＴｕｂ＿ｙＩｎｖ＿ｎｒ−ＦＡＴＡ１を株Ｊに形質転換した後、一次形質転換体をクローン精製し、実施例１に開示される条件と同様のｐＨ５．０の標準的な脂質産生条件下で成長させた。脂質サンプルを各形質転換体由来の乾燥バイオマスから調製し、それらのサンプルの脂肪酸プロフィールを、実施例３に記載されるとおりの標準的な脂肪酸メチルエステルガスクロマトグラフィー水素炎イオン化（ＦＡＭＥ  ＧＣ／ＦＩＤ）検出法を用いて分析した。ｐＳＺ１８８３により株Ｊを形質転換することにより生じるトランスジェニック系の脂肪酸プロフィール（全脂肪酸に対する面積％で表される）を、表１２に示す。
【０２８４】
【表２１】
2015500009.tif 000022
【０２８５】
これらの結果は、宿主の内在するＦＡＴＡ１−１対立遺伝子を除去することにより、操作された微細藻類の脂肪酸プロフィールが変わることを示している。選択可能なマーカーを内在するＦＡＴＡ１対立遺伝子に標的化させる影響は、Ｃ１６：０脂肪酸産生の明らかな減少と、それに伴うＣ１８：１脂肪酸産生の増加である。
【０２８６】
ＦＡＴＡ１−ＣｒｂＴｕｂ＿ｙＩｎｖ＿ｎｒ：：ａｍｔ０３＿ＣｗＴＥ２＿ｎｒ−ＦＡＴＡ１を株Ｊに形質転換した後、一次形質転換体をクローン精製し、４０ｇ／Ｌの総濃度となるように提供される種々の炭素源でｐＨ７．０の標準的な脂質生成条件下で成長させた。ショ糖濃度は４０ｇ／Ｌであった。グルコースのみを炭素源として使用した場合、グルコースは４０ｇ／Ｌで提供した。グルコース及びフルクトースを炭素源として使用した場合、グルコース（ｇｌｕｃｅｓ）は２０ｇ／Ｌで提供し、及びフルクトースは２０ｇ／Ｌで提供した。脂質サンプルを各形質転換体由来の乾燥バイオマスから調製し、それらのサンプルの脂肪酸プロフィールを、実施例３に記載されるとおりの標準的な脂肪酸メチルエステルガスクロマトグラフィー水素炎イオン化（ＦＡＭＥ  ＧＣ／ＦＩＤ）検出法を用いて分析した。ｐＳＺ１９２５により株Ｊを形質転換することにより生じるトランスジェニック系の脂肪酸プロフィール（全脂肪酸に対する面積％で表される）を、表１３に示す。
【０２８７】
得られる脂肪酸プロフィールを表１３に列挙する。
【０２８８】
【表２２】
2015500009.tif 000023
【０２８９】
選択可能なマーカーが単独で宿主のＦＡＴＡ１−１対立遺伝子を標的化することと一致して、選択可能なマーカーを外来性チオエステラーゼと共に組み込むと、操作された微細藻類の脂肪酸プロフィールが変化する。上記のように、外来遺伝子をＦＡＴＡ１−１対立遺伝子に標的化させると、Ｃ１６：０脂肪酸産生の明らかな減少が生じる。ＦＡＴＡ１遺伝子座におけるＣｗＴＥ２チオエステラーゼのさらなる発現はまた、中鎖脂肪酸及びＣ１８：１脂肪酸産生にも影響を与え、影響の程度は、分析される形質転換体に存在する外来性チオエステラーゼ活性のレベルに依存する。ＦＡＴＡ１−ＣｒｂＴｕｂ＿ｙＩｎｖ＿ｎｒ：：ａｍｔ０３＿ＣｗＴＥ２＿ｎｒ−ＦＡＴＡ１のような構築物中でＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲのように反復単位が隣接する遺伝子は、宿主ゲノムに組み込むと、増幅し得る。標的組み込み部位で増幅されるトランス遺伝子の複製物の数とチオエステラーゼ濃度との間には、脂肪酸プロフィール又はウエスタンブロッティングにより評価されるときの組み換えタンパク質蓄積のいずれに対する影響によっても明らかなように、良好な一致がある。
【０２９０】
ＣｗＴＥ２遺伝子が増幅を起こしたトランスジェニック系は、中鎖（Ｃ１０：０〜Ｃ１４：０）脂肪酸の著しい増加及び同時に起こるＣ１８：１脂肪酸の減少を示す。対照的に、ＣｗＴＥ２が増幅をほとんど又は全く起こさなかった形質転換体（おそらく１〜２個の複製物）は、外来性チオエステラーゼのより低い発現と一致し、中鎖脂肪酸の僅かな増加及びＣ１８：１脂肪酸の増加に対するはるかに大きい影響をもたらす。
【０２９１】
まとめて、これらのデータは、宿主の内在するＦＡＴＡ１−１対立遺伝子を除去すると、操作された微細藻類の脂質プロフィールが変化することを示している。
【０２９２】
実施例６：Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質生合成遺伝子の過剰発現による微細藻類の脂肪酸プロフィールの改変
上述のように、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ（ＫＡＳＩＩ）は、脂肪酸生合成においてＣ１６：０−ＡＣＰからＣ１８：０−ＡＣＰへの２炭素伸長を触媒する。これは、宿主生物の脂肪酸プロフィールの確立において重要な脂質生合成酵素であり、ステアリン酸塩及びオレイン酸塩の産生にとって決定的な意味を持つ。プラスミド構築物を作成して、ＫＡＳＩＩ遺伝子が発現した結果として宿主細胞の脂肪酸プロフィールが影響を受け得るかどうかを評価した。ＫＡＳＩＩ遺伝子配列の供給源は、Ｐｒｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５又は高等植物（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｓ、又はＲｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）から選択した。
【０２９３】
Ｐｒｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５、株Ｊの古典的に変異を誘発した誘導体を、実施例２の方法を用いて、以下の表１４のプラスミド構築物のうちの１つで形質転換した。各構築物は、６Ｓ遺伝子座で核ゲノムに組み込むための領域と、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼコード領域とを含んだ。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２発現カセットは配列番号２９として列挙され、選択マーカーとして機能した。各構築物について、ＫＡＳＩＩコード領域は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号３７）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲ（配列番号３２）の制御下にあった。各ＫＡＳＩＩ酵素の天然のトランジットペプチドは、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチド（配列番号５４）により置換した。全てのタンパク質コード領域は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５の核遺伝子（表２を参照）に固有のコドンバイアスを反映するようにコドンを最適化した。
【０２９４】
核ゲノム組み込み用の６Ｓ遺伝子座標的化領域に関連する配列を、以下に示す。
【０２９５】
【表２３】
2015500009.tif 000024
【０２９６】
【表２４】
2015500009.tif 000025
【０２９７】
構築物６Ｓ：：β−ｔｕｂ：ｓｕｃ２：ｎｒ：：Ａｍｔ０３：Ｓ１０６ＳＡＤ：ＰｍＫＡＳＩＩ：ｎｒ：：６Ｓの関連するヌクレオチド配列は、配列表に配列番号５８として提供される。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ  Ｓ１０６ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチドを含むＰｍＫＡＳＩＩのコドン最適化配列は、配列表に配列番号１０５として提供される。配列番号１０６は、配列番号１０５のタンパク質翻訳を提供する。
【０２９８】
各プラスミド構築物を株Ｊに個々に形質転換した後、ショ糖を単一炭素源として含むプレート上で陽性クローンをスクリーニングした。先述の例と同じく、一次形質転換体をクローン精製し、標準的な脂質産生条件下で成長させた。ここで、上述のように、形質転換体はｐＨ７で培養し、脂質サンプルは各形質転換体由来の乾燥バイオマスから調製した。野生型陰性対照と比較したときのいくつかの陽性形質転換体の脂肪酸プロフィール（面積％で表される）を、以下の表１５に各プラスミド構築物について要約する。
【０２９９】
【表２５】
2015500009.tif 000026
【０３００】
表１５に提供するデータは、高等植物ＫＡＳＩＩ遺伝子がどれも形質転換した微細藻類細胞の脂肪酸プロフィールに変化をもたらさなかったことを示している。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  Ａｍｔ０３プロモーター以外のプロモーターにより駆動される高等植物由来のＫＡＳＩＩ遺伝子を発現するさらなるプラスミド構築物もまた、形質転換細胞において脂肪酸プロフィールを変化させることはできなかった。全く対照的に、表２に示すコドン頻度を用いてコドン最適化されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＫＡＳＩＩ遺伝子を過剰発現させると、Ｃ１６：０鎖長の明らかな減少と、同時に起こるＣ１８：１長さの脂肪酸の増加が観察された。同様の脂肪酸プロフィール変化が、β−チューブリンプロモーターにより駆動されるＰｍＫＡＳＩＩ遺伝子を発現する構築物を形質転換したときに観察された。
【０３０１】
これらの結果は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質生合成遺伝子の外因的な発現が、遺伝子操作された微細藻類の脂肪酸プロフィールを変化させ得ることを示している。
【０３０２】
実施例７：操作された微生物から生成された加工油の特徴
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）を形質転換ベクターｐＳＺ１５００（配列番号１３７）で形質転換する方法及び効果については、ＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に既に記載されている。
【０３０３】
Ｐｒｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）の古典的に変異を誘発した（より高い油生成のため）誘導体、株Ａを、本明細書及びＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおりの遺伝子銃による形質転換方法により、ｐＳＺ１５００で形質転換した。ｐＳＺ１５００は、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５における発現にコドン最適化されたＣａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓオレイル−チオエステラーゼ（ＣｔＯＴＥ）遺伝子のヌクレオチド配列を含んだ。ｐＳＺ１５００発現構築物は、核ゲノムへの組み込み用のＦＡＤｃゲノム領域に対する５’（配列番号１３８）及び３’（配列番号１３９）相同組換え標的配列（構築物に隣接する）、並びにＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号５）及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲ（配列番号１２６）の制御下にあるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼコード領域を含む。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２発現カセットは配列番号１２７として列挙され、選択マーカーとして働いた。ＣｔＯＴＥコード領域は、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号１２８）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあり、天然のトランジットペプチドは、Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチド（配列番号１２９）により置換した。ＣｔＯＴＥ及びｓｕｃ２のタンパク質コード領域は、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおり、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようコドン最適化した。
【０３０４】
株Ａの一次ｐＳＺ１５００形質転換体を、ショ糖を単一炭素源として含有する寒天プレート上で選択してクローン精製し、単一の操作された系統、株Ｄを分析用に選択した。株Ｄは、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおり成長させた。次に、生成されたバイオマスからの油のヘキサン抽出を、標準方法を用いて実施し、得られたトリグリセリド油が残留ヘキサンを含まないことを決定した。連続圧搾機での圧縮を用いて微細藻類から油を抽出する他の方法が、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３１１０８号明細書に記載され、本明細書により参照によって援用される。
【０３０５】
株Ｄのバイオマスから抽出した油の種々のロットを、標準的な植物油加工処理方法を用いて精製、漂白、脱臭した。これらの手順により油サンプルＲＢＤ４３７、ＲＢＤ４６９、ＲＢＤ５０１、ＲＢＤ５０２、ＲＢＤ５０３、及びＲＢＤ５２９を生成し、これらを、米国油脂化学協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’Ｓｏｃｉｅｔｙ）、米国材料試験協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）、及び国際標準化機構（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ）が定義する方法に従い分析的試験プロトコルに供した。これらの分析の結果は、以下の表１６〜表２１に要約する。
【０３０６】
【表２６】
2015500009.tif 000027
【０３０７】
ＲＢＤ４６９油を、ＡＯＣＳ方法に従い微量元素含有量、固形脂肪含有量、及びロビボンド色について分析した。これらの分析の結果を、以下の表１７、表１８、及び表１９に提供する。
【０３０８】
【表２７】
2015500009.tif 000028
【０３０９】
【表２８】
2015500009.tif 000029
【０３１０】
【表２９】
2015500009.tif 000030
【０３１１】
【表３０】
2015500009.tif 000031
【０３１２】
ＲＢＤ４６９油をエステル転移反応に供して脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を生成した。ＲＢＤ４６９の得られたＦＡＭＥプロフィールを表２０に示す。
【０３１３】
【表３１】
2015500009.tif 000032
【０３１４】
抗酸化剤を補足しない６つのＲＢＤ油サンプル及び抗酸化剤を補足した３つのＲＢＤ油サンプルの油安定性指数（ＯＳＩ）を、油安定性指数ＡＯＣＳ方法Ｃｄ  １２ｂ−９２に従い分析した。表２１には、Ｍｅｔｒｏｈｍ  ８７３  Ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ  Ｒａｎｃｉｍａｔを使用して実施した、１１０℃で行ったＯＳＩ  ＡＯＣＳ  Ｃｄ  １２ｂ−９２試験の結果を示す。結果は、星印（ａｓｔｅｒｉｃｋｓ）（＊）で示した場合を除き、複数のＯＳＩランの平均値である。分析していないサンプルは、（ＮＡ）で示す。
【０３１５】
【表３２】
2015500009.tif 000033
【０３１６】
形質転換されていないＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）酸プロフィールは、６０％未満のＣ１８：１脂肪酸及び７％超のＣ１８：２脂肪酸を含む。対照的に、株Ｄ（ｐＳＺ１５００を含む）は、Ｃ１８：１脂肪酸の組成が増加（８５％を上回るまで）し且つＣ１８：２脂肪酸が減少（０．０６％未満まで）した脂肪酸プロフィールを呈した。精製、漂白、及び脱ガム後、株Ｅで作製した油から調製したＲＢＤ油サンプルは、ＯＳＩ値＞２６時間を呈した。抗酸化剤を添加すると、株Ｄの油から調製したＲＢＤ油のＯＳＩは、４８．６０時間から２４２時間超に増加した。
【０３１７】
実施例８：脂肪酸デサチュラーゼ及びアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの対立遺伝子破壊による操作された微生物のオレイン酸濃度の改善
この例では、形質転換ベクターを使用することによる、高いオレイン酸及び低いリノール酸を産生するように先に操作したＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株のＦＡＴＡ遺伝子座の破壊を記載する。この例で使用した形質転換カセットは、微生物を操作するため選択可能なマーカー及びＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＫＡＳＩＩ酵素をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで形質転換微生物の脂肪酸プロフィールは、さらにオレイン酸濃度が増加し、且つパルミチン酸濃度が低下するように改変されていた。
【０３１８】
実施例７及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載される株Ｄは、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）の古典的に変異を誘発した（より高い油生成のため）誘導体であり、続いて、実施例２における及びＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおりの遺伝子銃による形質転換方法に従い形質転換構築物ｐＳＺ１５００（配列番号１３７）で形質転換した。この株を、構築物ｐＳＺ２２７６による形質転換用の宿主として使用して、ＫＡＳＩＩ酵素の発現を増加させると同時に、内在性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子座を除去して株Ｅを作成した。ｐＳＺ２２７６形質転換構築物は、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ核ゲノムへの組み込み用のＦＡＴＡ１ゲノム領域に対する５’（配列番号１４０）及び３’（配列番号１４１）相同組換え標的配列（構築物に隣接する）、Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓアクチンプロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号１４２）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲ（配列番号１２６）の制御下にあるＡ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＴＨＩＣタンパク質コード領域を含んだ。このＡｔＴＨＩＣ発現カセットは配列番号１４３として列挙され、選択マーカーとして働いた。Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＫＡＳＩＩタンパク質コード領域は、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号１２８）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあり、ＫＡＳＩＩ酵素の天然のトランジットペプチドは、Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチド（配列番号１２９）により置換した。Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ  Ｓ１０６ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチドを含むＰｍＫＡＳＩＩのコドン最適化配列は、配列表に配列番号１４４として提供される。配列番号１４５は、配列番号１４４のタンパク質翻訳を提供する。ＰｍＫＡＳＩＩ及びｓｕｃ２のタンパク質コード領域は、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおり、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようコドン最適化した。
【０３１９】
株Ｄの一次ｐＳＺ２２７６形質転換体を、チアミン不含の寒天プレート上で選択してクローン精製し、単一の操作された系統、株Ｅを分析用に選択した。株Ｅは、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおりの、ｐＨ５．０及びｐＨ７．０の従属栄養脂質産生条件下で培養した。脂質サンプルを各形質転換体由来の乾燥バイオマスから調製し、それらのサンプルの脂肪酸プロフィールを、実施例３に記載されるとおりの標準的な脂肪酸メチルエステルガスクロマトグラフィー水素炎イオン化（ＦＡＭＥ  ＧＣ／ＦＩＤ）検出法を用いて分析した。ｐＳＺ２２７６を株Ｄに形質転換することによって生じるトランスジェニック系の脂肪酸プロフィール（全脂肪酸に対する面積％で表される）を、表２２に示す。
【０３２０】
【表３３】
2015500009.tif 000034
【０３２１】
表２２に示されるとおり、ＣｔＯＴＥ発現カセットによりＦＡＤｃ対立遺伝子を標的化して破壊すると、形質転換微生物の脂肪酸プロフィールが影響を受けた。株Ｄ（ｐＳＺ１５００形質転換ベクターを含む）の脂肪酸プロフィールは、株Ａと比べてＣ１８：１脂肪酸の組成の増加と、同時にＣ１６：０及びＣ１８：２脂肪酸の低下を示した。続くｐＳＺ２２７６による株Ｄの形質転換によりＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）ＫＡＳＩＩタンパク質を過剰発現させると同時にＦＡＴＡ遺伝子座を除去すると（それにより株Ｅを作成する）、形質転換微生物の脂肪酸プロフィールになおもさらなる影響がもたらされた。株Ｅの脂肪酸プロフィールは、株Ａ及びＤと比べてＣ１８：１脂肪酸の組成の増加と、Ｃ１６：０脂肪酸のさらなる低下を示した。Ａｍｔ０３プロモーターからの発現を誘導するための、ｐＨ７の培養条件における株Ｅの増殖は、ｐＨ５で培養した同じ株と比べてＣ１８：０及びＣ１８：１脂肪酸が多く、且つＣ１６：０脂肪酸が少ない脂肪酸プロフィールをもたらした。
【０３２２】
これらのデータは、オレイン酸の濃度を増加させると同時にリノール酸及びパルミチン酸の濃度を低下させるための、宿主生物の脂肪酸プロフィールに影響を与える複数の遺伝子改変の有用性を実証している。さらに、この例は、宿主微生物の脂肪酸プロフィールを変化させるための、外来性ＫＡＳＩＩタンパク質コード領域の発現を制御するｐＨ調節可能なプロモーターを含むカセットによる、組換えポリヌクレオチドを使用した内在性ＦＡＴＡ対立遺伝子の標的遺伝子破壊を例示する。
【０３２３】
実施例９：脂肪酸デサチュラーゼの条件的発現
この例では、形質転換ベクターを使用することによる、シード及び脂質生産性の両方の増殖段階で高いオレイン酸及び極めて低いリノール酸を産生するように先に操作したＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株におけるデルタ１２脂肪酸デサチュラーゼ（ＦＡＤ）の条件的発現を記載する。天然の油における極めて低いリノール酸濃度は、特定の用途において使用が求められる。しかしながら、宿主微生物の細胞分裂期（「シード段階」）にリノール酸が存在しないことは不利である。リノール酸をシード培地に補足して細胞分裂を促進し、且つ脂質産生中は添加しないことでもよいが、しかしながらこの追加により不要なコストがかかる。この問題を解消するため、細胞分裂に十分なリノール酸の濃度が達成され得るとともに、微生物培養の油生成段階において極めて低濃度のリノール酸を有する油が産生され得るように、ＦＡＤ２酵素を制御して発現させるための形質転換カセットを構築した。この例で用いられる形質転換カセットは、微生物を操作するため選択可能なマーカー、ｐＨ調節可能なプロモーター、及びＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＦＡＤ２酵素をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで形質転換微生物の脂肪酸プロフィールは、オレイン酸産生が増加し、且つリノール酸産生が調節可能となるように改変されていた。
【０３２４】
実施例７及び８並びにＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載される株Ｄは、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）の古典的に変異を誘発した（より高い油生成のため）誘導体であり、続いて、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおりの遺伝子銃による形質転換方法により形質転換構築物ｐＳＺ１５００（配列番号１３７）で形質転換した。この株を、構築物ｐＳＺ２４１３による形質転換用の宿主として使用して、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＦＡＤ２酵素を調節するためのｐＨ駆動性プロモーターを導入した。ｐＳＺ２４１３形質転換構築物は、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ核ゲノムへの組み込み用の６Ｓゲノム領域に対する５’（配列番号１２１）及び３’（配列番号１２２）相同組換え標的配列（構築物に隣接する）、Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓアクチンプロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号１４２）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲ（配列番号１２６）の制御下にあるＡ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＴＨＩＣタンパク質コード領域を含んだ。このＡｔＴＨＩＣ発現カセットは配列番号１４３として列挙され、選択マーカーとして働いた。Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＦＡＤ２タンパク質コード領域は、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号１２８）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあった。ＰｍＦＡＤ２のコドン最適化配列は、配列表に配列番号１４６として提供される。配列番号１４７は、配列番号１４６のタンパク質翻訳を提供する。ＰｍＦＡＤ２及びｓｕｃ２のタンパク質コード領域は、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおり、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようコドン最適化した。
【０３２５】
株Ｄの一次ｐＳＺ２４１３形質転換体を、チアミン不含の寒天プレート上で選択してクローン精製し、操作された系統、株Ｆの単離物を分析用に選択した。これらの単離物を、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおり、従属栄養脂質産生条件下にｐＨ７．０で培養し（それによりＰｍＡｍｔ０３プロモーターからのＦＡＤ２の発現を活性化した）、及びｐＨ５．０で培養した。脂質サンプルを各形質転換体由来の乾燥バイオマスから調製し、それらのサンプルの脂肪酸プロフィールを、実施例３に記載されるとおりの標準的な脂肪酸メチルエステルガスクロマトグラフィー水素炎イオン化（ＦＡＭＥ  ＧＣ／ＦＩＤ）検出法を用いて分析した。ｐＳＺ２４１３で株Ｄに形質転換することにより生じるトランスジェニック株Ｆの９つの代表的な単離物（Ｆ−１〜Ｆ−９）の得られたＣ１８：２脂肪酸プロフィール（面積％で表される）を、表２３に示す。
【０３２６】
【表３４】
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【０３２７】
表２３に示されるとおり、異なるｐＨ値で株を培養したことにより生じた、ＰｍＦＡＤ２酵素の制御された発現の影響は、形質転換微生物におけるＣ１８：２脂肪酸の組成の明らかな増加である。リノール酸は、株Ａの脂肪酸の約６％〜約７．３％を含む。対照的に、株Ｄ（両方のＦＡＤ２対立遺伝子を除去するｐＳＺ１５００形質転換ベクターを含む）は、０．０１％リノール酸の脂肪酸プロフィールにより特徴付けられる。ｐＳＺ２４１３で株Ｄを形質転換することによる株Ｆの作成は、リノール酸の産生がＡｍｔ０３プロモーターにより調節される組換え微生物をもたらす。Ａｍｔ０３プロモーターからのＦＡＤ２発現を誘導するため、ｐＨ７の培養条件で株Ｆ単離物を増殖させると、約４．５％〜約７．５％リノール酸により特徴付けられる脂肪酸プロフィールとなった。対照的に、ｐＨ５の培養条件で株Ｆ単離物を増殖させると、約０．３３〜約０．７７％リノール酸により特徴付けられる脂肪酸プロフィールとなった。
【０３２８】
これらのデータは、ＦＡＤ２酵素の条件的発現を可能にする組換えポリヌクレオチドが、操作された微生物の脂肪酸プロフィールの改変に、及び詳細には、微生物細胞におけるＣ１８：２脂肪酸産生の調節において、有用且つ有効であることを実証している。
【０３２９】
実施例１０〜３３：序論及び表
以下の実施例１０〜３３は、本発明における様々な微生物の操作を記載する。微生物の脂肪酸プロフィールを変化させるため、微生物が遺伝子改変されてもよく、ここでは内在性又は外来性の脂質生合成経路酵素を発現させるか、過剰発現させるか、又は減弱させる。脂肪酸不飽和度に関して脂肪酸プロフィールが変化し、脂肪酸鎖長が減少又は増加するように微生物を遺伝子操作する工程は、形質転換ベクター（例えば、プラスミド）の設計及び構築、１つ以上のベクターによる微生物の形質転換、形質転換微生物（形質転換体）の選択、形質転換微生物の成長、及び操作された微生物により産生された脂質の脂肪酸プロフィールの分析を含む。
【０３３０】
宿主生物の脂肪酸プロフィールを変化させる導入遺伝子は、数多くの真核微生物で発現させることができる。真核微生物における導入遺伝子の発現の例は、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓａｃｃａｒｏｐｈｉｌａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ、Ｇｏｎｉｕｍ  ｐｅｃｔｏｒａｌｅ、Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａ、Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ、Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａ、Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍ、Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ、及びＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを含め、科学文献に見出すことができる。これらの発現技法を本発明の教示と組み合わせて、変化した脂肪酸プロフィールを有する操作された微生物を生成してもよい。
【０３３１】
宿主生物の脂肪酸プロフィールを変化させるか、又は宿主生物により産生されるグリセロ脂質（ｇｌｙｃｅｒｏｌｉｐｄ）の位置特異的分布を変化させる導入遺伝子はまた、数多くの原核微生物で発現させることができる。油産生微生物における導入遺伝子の発現の例は、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓを含め、文献に見出すことができる。これらの発現技法を本発明の教示と組み合わせて、変化した脂肪酸プロフィールを有する操作された微生物を生成してもよい。
【０３３２】
【表３５】
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【０３３３】
【表３６】
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【０３３４】
【表３７】
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【０３３５】
【表３８】
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【０３３６】
【表３９】
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【０３３７】
【表４０】
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【０３３８】
【表４１】
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【０３３９】
【表４２】
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【０３４０】
【表４３】
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【０３４１】
【表４４】
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【０３４２】
【表４５】
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【０３４３】
【表４６】
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【０３４４】
【表４７】
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【０３４５】
【表４８】
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【０３４６】
【表４９】
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【０３４７】
実施例１０：Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａの操作
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＤａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成し得る。簡潔に言えば、Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．３５（１９９７）ｐｐ．３５６−３６２は、プラスミドＤＮＡによるＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａの安定な核形質転換を報告した。Ｄａｗｓｏｎは、微粒子銃の形質転換方法を用いて、完全なＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素遺伝子（ＮＲ、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｕ３９９３１）をコードするプラスミドｐＳＶ７２−ＮＲｇを、突然変異体Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａに導入した（ＮＲ突然変異体）。このＮＲ突然変異体は、窒素源として硝酸塩を利用することなしには成長することができない。硝酸還元酵素は硝酸塩から亜硝酸塩への変換を触媒する。形質転換前、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ  ＮＲ突然変異体は、唯一の窒素源として硝酸塩（ＮＯ３−）を含む培養培地上で微小コロニー段階より先に成長することはできなかった。ＮＲ突然変異体Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａにおけるＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ＮＲ遺伝子産物の発現を選択可能なマーカーとして使用して、硝酸塩代謝の欠損を取り戻した。ｐＳＶ７２−ＮＲｇプラスミドによる形質転換後、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ＮＲ遺伝子産物を安定的に発現するＮＲ突然変異体Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａが得られ、これは単一炭素源として硝酸塩を含む寒天プレート上で微小コロニー段階より先に成長することができた。安定な形質転換体のＤＮＡの評価はサザン解析により実施し、安定な形質転換体のＲＮＡの評価はＲＮアーゼ保護により実施した。形質転換したＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ（ＮＲ突然変異体）の選択及び維持は、０．２ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４、０．６７ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、３．５ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、１．０ｇ／Ｌ  Ｎａ３Ｃ６Ｈ５Ｏ７・Ｈ２Ｏ及び１６．０ｇ／Ｌ寒天、適切な窒素源（例えば、ＮＯ３−）、微量栄養素、及び炭素源を含む寒天プレート（ｐＨ７．４）上で実施した。Ｄａｗｓｏｎはまた、液体培養培地におけるＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ  ＮＲ突然変異体の増殖も報告した。Ｄａｗｓｏｎは、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素遺伝子のプラスミドｐＳＶ７２−ＮＲｇ並びにプロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ  ＮＲ突然変異体における異種遺伝子発現を可能にするのに好適であったことを報告した。Ｄａｗｓｏｎはまた、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素遺伝子産物の発現が、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ  ＮＲ突然変異体における選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことも報告した。
【０３４８】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素（ＣｖＮＲ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＳＶ７２−ＮＲｇが構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２５から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表２４Ａ〜Ｄに従いＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａにおける発現にコドン最適化されている。表２５の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＣｖＮＲプロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、ＣｖＮＲ  ３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａの安定な形質転換は、微粒子銃又は他の公知の方法を含めた周知されている形質転換技法によって実現される。ＣｖＮＲ遺伝子産物の活性を選択可能なマーカーとして用いることにより、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ  ＮＲ突然変異株の窒素同化（ａｓｓｉｍｉｌｉａｔｉｏｎ）の欠損を取り戻し、形質転換ベクターを安定的に発現するＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ  ＮＲ突然変異体を選択し得る。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、微量栄養素並びに適切な窒素源及び炭素源を補足した、０．５ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、０．２５ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏが挙げられる（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｌｉｐｉｄｓ  Ｖｏｌ．５：７（１９７０），ｐｐ．５９７−６００）。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
【０３４９】
実施例１１：Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓの操作
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＣｈｏｗ  ａｎｄ  Ｔｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成し得る。簡潔に言えば、Ｃｈｏｗ  ａｎｄ  Ｔｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  １８（１９９９），ｐｐ．７７８−７８０は、プラスミドＤＮＡによるＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓの安定な核形質転換を報告した。Ｃｈｏｗ  ａｎｄ  Ｔｕｎｇは、エレクトロポレーションの形質転換方法を用いて、プラスミドｐＩＧ１２１−Ｈｍ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＢ４８９１４２）をＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓに導入した。ｐＩＧ１２１−Ｈｍのヌクレオチド配列は、ＧＵＳタンパク質コード配列の上流でＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターに動作可能に連結され、且つＧＵＳタンパク質コード配列の下流でノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子の３’ＵＴＲ／ターミネーターにさらに動作可能に連結されたβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）レポーター遺伝子産物をコードする配列を含んだ。プラスミドｐＩＧ１２１−Ｈｍの配列は、ハイグロマイシンＢ抗生物質耐性カセットをさらに含んだ。このハイグロマイシンＢ抗生物質耐性カセットは、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＢＡＨ２４２５９）遺伝子産物をコードする配列に動作可能に連結されたＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターを含んだ。形質転換前、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓは、５０ｕｇ／ｍｌハイグロマイシンＢを含む培養培地で増殖することができなかった。ｐＩＧ１２１−Ｈｍプラスミドによる形質転換後、５０ｕｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ（ｈｙｒｇｒｏｍｙｃｉｎ  Ｂ）を含む培養培地で増殖するＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓの形質転換体が得られた。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓにおけるｈｐｔ遺伝子産物の発現により、５０ｕｇ／ｍＬハイグロマイシンＢ（ｈｙｒｇｒｏｍｙｃｉｎ  Ｂ）の存在下における形質転換したＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓの増殖が可能となり、従ってＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのハイグロマイシンＢ耐性カセットの有用性が確立された。ＧＵＳレポーター遺伝子の検出可能な活性から、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター及びｎｏｓ  ３’ＵＴＲが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓにおける異種遺伝子発現を可能にするのに好適であることが示された。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。形質転換したＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓの選択及び維持は、ＹＡ培地（寒天及び４ｇ／Ｌ酵母エキス）を含む寒天プレート上で行った。液体培養培地におけるＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓの増殖は、Ｃｈｏｗ  ａｎｄ  Ｔｕｎｇにより考察されるとおり実施した。ＹＡ培地以外の培地におけるＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓの増殖については記載されている（例えば、Ｃｈａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｖｕｅ  ｄｅｓ  Ｅｎｅｒｇｉｅｓ  Ｒｅｎｏｕｖｅｌａｂｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  １４（２０１１），ｐｐ．２１−２６及びＩｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２７（２０００），ｐｐ．６３１−６３５を参照）。Ｃｈｏｗ  ａｎｄ  Ｔｕｎｇは、プラスミドｐＩＧ１２１−Ｈｍ、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター、及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓにおける異種遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ｃｈｏｗ  ａｎｄ  Ｔｕｎｇは、ハイグロマイシンＢ（ｈｙｒｏｍｙｃｉｎ  Ｂ）耐性カセットが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓにおける選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓにおける異種遺伝子発現を可能にするのに好適なさらなるプラスミド、プロモーター、３’ＵＴＲ／ターミネーター、及び選択可能なマーカーは、Ｃｈａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｖｕｅ  ｄｅｓ  Ｅｎｅｒｇｉｅｓ  Ｒｅｎｏｕｖｅｌａｂｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  １４（２０１１），ｐｐ．２１−２６において考察されている。
【０３５０】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるハイグロマイシンＢ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むｐＩＧ１２１−Ｈｍが構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２５から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表２４Ａ〜Ｄに従いＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓにおける発現にコドン最適化されている。表２５の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓの安定な形質転換は、エレクトロポレーション又は他の公知の方法を含む周知されている形質転換技法によって実現される。ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓを、限定はされないが、ハイグロマイシンを含む寒天培地上で選択し得る。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、微量金属と、場合により１．５ｇ／Ｌ  ＮａＮＯ３を補足したＢＧ１１培地（０．０４ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、０．０７５ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２、０．０３６ｇ／Ｌ  クエン酸、０．００６ｇ／Ｌ  クエン酸鉄アンモニウム、１ｍｇ／Ｌ  ＥＤＴＡ、及び０．０２ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＣＯ３）が挙げられる。脂質産生のためのＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓの培養に好適なさらなる培地としては、例えば、Ｗａｔａｎａｂｅ培地（１．５ｇ／Ｌ  ＫＮＯ３、１．２５ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、１．２５ｇｌ−１  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２０ｍｇｌ−１  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏを微量栄養素と共に含む）及びＩｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２７（２０００），ｐｐ．６３１−６３５により報告されるとおりの低窒素培地（２０３ｍｇ／ｌ（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、２．２３６ｇ／ｌ  ＫＣｌ、２．４６５ｇ／ｌ  ＭｇＳＯ４、１．３６１ｇ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４及び１０ｍｇ／ｌ  ＦｅＳＯ４を含む）が挙げられる。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
【０３５１】
実施例１２：Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａの操作
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成し得る。簡潔に言えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．３９：５（２００１），ｐｐ．３６５−３７０は、プラスミドＤＮＡによるＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａの安定な形質転換を報告した。Ｃｈｅｎは、エレクトロポレーションの形質転換方法を用いて、プラスミドｐＢｉｎＵΩＮＰ−１をＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａに導入した。ｐＢｉｎＵΩＮＰ−１のヌクレオチド配列は、ＮＰ−１タンパク質コード領域の上流でＺｅａ  ｍａｙｓユビキチン（ｕｂｉ１）遺伝子プロモーターに動作可能に連結され、且つＮＰ−１タンパク質コード領域の下流でノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子の３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、好中球ペプチド−１（ＮＰ−１）ウサギ遺伝子産物をコードする配列を含んだ。プラスミドｐＢｉｎＵΩＮＰ−１の配列は、Ｇ４１８抗生物質耐性カセットをさらに含んだ。このＧ４１８抗生物質耐性カセットは、アミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ａｐｈ  ３’）遺伝子産物をコードする配列を含んだ。ａｐｈ  ３’遺伝子産物は、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を付与する。形質転換前、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａは、３０ｕｇ／ｍＬ  Ｇ４１８を含む培養培地で増殖することができなかった。ｐＢｉｎＵΩＮＰ−１プラスミドによる形質転換後、３０ｕｇ／ｍＬ  Ｇ４１８を含む選択的培養培地で増殖するＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａの形質転換体が得られた。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａにおけるａｐｈ  ３’遺伝子産物の発現により、３０ｕｇ／ｍＬ  Ｇ４１８の存在下における形質転換したＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａの増殖が可能となり、従ってＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのＧ４１８抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。ＮＰ−１遺伝子産物の検出可能な活性から、ｕｂｉ１プロモーター及びｎｏｓ  ３’ＵＴＲが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａにおける異種遺伝子発現を可能にするのに好適であることが示された。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。形質転換したＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａの選択及び維持は、１５ｕｇ／ｍＬ  Ｇ４１８（液体培養用）を含むか又は３０ｕｇ／ｍＬ  Ｇ４１８（１．８％寒天を含む固体培養用）を含むＫｎｏｐ培地（０．２ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、０．２ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１２ｇ／Ｌ  ＫＣｌ、及び１０ｍｇ／Ｌ  ＦｅＣｌ３を含む、ｐＨ６．０〜８．０、０．１％酵母エキス及び０．２％グルコースを補足）上で行った。Ｋｎｏｐ培地以外の培地におけるＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａの増殖が報告されている（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．７３：５（２００７），ｐｐ．１０５０−１０５６、Ｊａｒｖｉｓ  ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎ���ｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１９（１９９１），ｐｐ．３１７−３２１及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４（２００２），ｐｐ．６３−７３を参照）。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａにおける異種遺伝子発現を可能にするのに好適なさらなるプラスミド、プロモーター、３’ＵＴＲ／ターミネーター、及び選択可能なマーカーが報告されている（Ｊａｒｖｉｓ  ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４（２００２），ｐｐ．６３−７３を参照）。Ｃｈｅｎは、プラスミドｐＢｉｎＵΩＮＰ−１、ｕｂｉ１プロモーター、及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａにおける外来遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ｃｈｅｎは、ｐＢｉｎＵΩＮＰ−１でコードされるＧ４１８耐性カセットが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａにおける選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。
【０３５２】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるＧ４１８に対する耐性を付与するａｐｈ  ３’遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＢｉｎＵΩＮＰ−１が構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２５から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表２４Ａ〜Ｄに従いＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａにおける発現にコドン最適化されている。表２５の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＺｅａ  ｍａｙｓ  ｕｂｉ１プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａの安定な形質転換は、エレクトロポレーション又は他の公知の方法を含む周知されている形質転換技法によって実現される。ａｐｈ  ３’遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａを、限定はされないが、Ｇ４１８を含むＫｎｏｐ寒天培地上で選択し得る。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、Ｋｎｏｐ培地並びにＪａｒｖｉｓ  ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．により報告される培養培地が挙げられる。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
【０３５３】
実施例１３：Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉの操作
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＥｌ−Ｓｈｅｅｋｈ  ｅｔ  ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成し得る。簡潔に言えば、Ｅｌ−Ｓｈｅｅｋｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉａ  Ｐｌａｎｔａｒｉｕｍ，Ｖｏｌ．４２：２（１９９９），ｐｐ．２０９−２１６は、プラスミドＤＮＡによるＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉの安定な形質転換を報告した。Ｅｌ−Ｓｈｅｅｋｈは、微粒子銃の形質転換方法を用いて、プラスミドｐＢＩ１２１（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ４８５７８３）をＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉに導入した。プラスミドｐＢＩ１２１は、カナマイシン／ネオマイシン抗生物質耐性カセットを含んだ。このカナマイシン／ネオマイシン抗生物質耐性カセットは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子プロモーター、カナマイシン及びＧ４１８に対する耐性用の、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子産物（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＬ９２０３９）をコードする配列、及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子の３’ＵＴＲ／ターミネーターを含んだ。ｐＢＩ１２１はさらに、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターに動作可能に連結され、且つｎｏｓ遺伝子の３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）レポーター遺伝子産物をコードする配列を含んだ。形質転換前、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉは、１５ｕｇ／Ｌカナマイシンを含む培養培地で増殖することができなかった。ｐＢＩ１２１プラスミドによる形質転換後、１５ｍｇ／Ｌカナマイシンを含む選択的培養培地で増殖するＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉの形質転換体が得られた。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉにおけるｎｐｔＩＩ遺伝子産物の発現により、１５ｍｇ／Ｌカナマイシンの存在下における増殖が可能となり、従ってＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのカナマイシン／ネオマイシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。ＧＵＳ遺伝子産物の検出可能な活性から、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター及びｎｏｓ  ３’ＵＴＲが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉにおける異種遺伝子発現を可能にするのに好適であることが示された。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。Ｅｌ−Ｓｈｅｅｋｈにより報告されるとおり、形質転換したＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉの選択及び維持は、ＹＥＧ培地（１％酵母エキス、１％グルコース）及び１５ｍｇ／Ｌカナマイシンを含む半流動寒天プレート上で実施した。Ｅｌ−Ｓｈｅｅｋｈはまた、ＹＥＧ液体培養培地におけるＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉの増殖も報告した。脂質産生のためのＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉの培養に好適なさらなる培地が、Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＢＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｖｏｌ．１６３３（２００３），ｐｐ．２７−３４に開示されている。Ｅｌ−Ｓｈｅｅｋｈは、プラスミドｐＢＩ１２１、ＣａＭＶプロモーター、及びノパリンシンターゼ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉにおける異種遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ｅｌ−Ｓｈｅｅｋｈは、ｐＢＩ１２１でコードされるカナマイシン／ネオマイシン耐性カセットが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉにおける選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。
【０３５４】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるカナマイシン／ネオマイシン耐性遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＢＩ１２１が構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２５から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表２４Ａ〜Ｄに従いＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉにおける発現にコドン最適化されている。表２５の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉの安定な形質転換は、微粒子銃又は他の公知の方法を含めた周知されている形質転換技法によって実現される。ｎｐｔＩＩ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉを、限定はされないが、カナマイシン又はネオマイシンを含むＹＥＧ寒天培地上で選択し得る。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、ＹＥＧ培地、及びＳａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．により報告される培養培地が挙げられる。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
【０３５５】
実施例１４：Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａの操作
Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＷａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成し得る。簡潔に言えば、Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１７（２００５），ｐｐ．３６３−３６８は、プラスミドＤＮＡによるＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａの安定な核形質転換を報告した。Ｗａｌｋｅｒは、エレクトロポレーションの形質転換方法を用いて、プラスミドｐＤｂｌｅＦＬＡＧ１．２をＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａに導入した。ｐＤｂｌｅＦＬＡＧ１．２は、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａリブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ小サブユニット遺伝子（ｒｂｃＳ１、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＹ５３０１５５）のプロモーター及び３’ＵＴＲに動作可能に連結された、抗生物質フレオマイシンに対する耐性用の、Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ  ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓブレオマイシン結合タンパク質（ｂｌｅ）をコードする配列を含むブレオマイシン抗生物質耐性カセットをコードする配列を含んだ。形質転換前、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａは、１ｍｇ／Ｌフレオマイシンを含む培養培地で増殖することができなかった。ｐＤｂｌｅＦＬＡＧ１．２プラスミドによる形質転換後、１ｍｇ／Ｌフレオマイシンを含む選択的培養培地で増殖するＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａの形質転換体が得られた。Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａにおけるｂｌｅ遺伝子産物の発現により、１ｍｇ／Ｌフレオマイシンの存在下における増殖が可能となり、従ってＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのブレオマイシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。Ｗａｌｋｅｒにより報告されるとおり、形質転換したＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａの選択及び維持は、４．５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ及び１ｍｇ／Ｌフレオマイシン（ｐｈｅｏｍｙｃｉｎ）をさらに含むＤｕｎａｌｉｅｌｌａ培地（ＤＭ、Ｐｒｏｖａｓｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈｉｖ  ｆｕｒ  Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ，Ｖｏｌ．２５（１９５７），ｐｐ．３９２−４２８により記載されるとおり）において実施した。脂質産生のためのＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａの培養に好適なさらなる培地は、Ｔａｋａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．１０１：３（２００６），ｐｐ．２２３−２２６及びＭａｓｓａｒｔ  ａｎｄ  Ｈａｎｓｔｏｎ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  Ｖｅｎｉｃｅ  ２０１０，Ｔｈｉｒｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｅｎｅｒｇｙ  ｆｒｏｍ  Ｂｉｏｍａｓｓ  ａｎｄ  Ｗａｓｔｅにおいて考察される。Ｗａｌｋｅｒは、プラスミドｐＤｂｌｅＦＬＡＧ１．２並びにＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａリブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ小サブユニット遺伝子のプロモーター及び３’ＵＴＲが、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａにおける異種発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ｗａｌｋｅｒは、ｐＤｂｌｅＦＬＡＧ１．２でコードされるブレオマイシン耐性カセットが、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａにおける選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。
【０３５６】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｂｌｅ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＤｂｌｅＦＬＡＧ１．２が構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２５から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表２４Ａ〜Ｄに従いＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａにおける発現にコドン最適化されている。表２５の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でｒｂｃＳ１プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、ｒｂｃＳ１  ３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａの安定な形質転換は、エレクトロポレーション又は他の公知の方法を含む周知されている形質転換技法によって実現される。ｂｌｅ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａを、限定はされないが、フレオマイシン（ｐｈｅｏｍｙｃｉｎ）を含むＤＭ培地上で選択し得る。Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、ＤＭ培地並びにＴａｋａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．及びＭａｓｓａｒｔ  ａｎｄ  Ｈａｎｓｔｏｎにより記載される培養培地が挙げられる。Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
【０３５７】
実施例１５：Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉの操作
Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＨａｌｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｒａｐｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成し得る。簡潔に言えば、Ｈａｌｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｒａｐｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌｕｍｅ  １７（１９９９），ｐｐ．９９−１０９は、プラスミドＤＮＡによるＶｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉの安定な核形質転換を報告した。Ｈａｌｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｒａｐｐｅｌは、微粒子銃の形質転換方法を用いて、ｐｚｅｏＥプラスミドをＶｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉに導入した。ｐｚｅｏＥプラスミドは、Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ  β−チューブリン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｌ２４５４７）のプロモーター及び３’ＵＴＲに動作可能に連結された、抗生物質ゼオシンに対する耐性用の、Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ  ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓブレオマイシン結合タンパク質（ｂｌｅ）をコードする配列を含むブレオマイシン抗生物質耐性カセットをコードする配列を含んだ。形質転換前、Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉは、１．５ｕｇ／ｍｌゼオシンを含む培養培地で増殖することができなかった。ｐｚｅｏＥプラスミドによる形質転換後、２０ｕｇ／ｍｌ超のゼオシンを含む選択的培養培地で増殖するＶｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉの形質転換体が得られた。Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉにおけるｂｌｅ遺伝子産物の発現により、２０ｕｇ／ｍｌゼオシンの存在下における増殖が可能となり、従ってＶｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのブレオマイシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。Ｈａｌｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｒａｐｐｅｌにより報告されるとおり、形質転換したＶｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉの選択及び維持は、１ｍｇ／Ｌフレオマイシン（ｐｈｅｏｍｙｃｉｎ）を含むＶｏｌｖｏｘ培地（ＶＭ、Ｐｒｏｖａｓｏｌｉ  ａｎｄ  Ｐｉｎｔｎｅｒ，Ｔｈｅ  Ｅｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ，Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２（１９５９），Ｔｙｒｏｎ，Ｃ．Ａ．ａｎｄ  Ｈａｒｔｍａｎ，Ｒ．Ｔ．，ｅｄｓ．，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ：Ｕｎｉｖｅｒｉｓｔｙ  ｏｆ  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ｐｐ．８８−９６により記載されるとおり）において実施した。脂質産生のためのＶｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉの培養に好適な培地はまた、ＳｔａｒｒによりＳｔａｒｒ  Ｒ，Ｃ，．Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ｓｕｐｐｌ．，Ｖｏｌ．４（１９７０），ｐｐ．５９−１００においても考察される。Ｈａｌｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｒａｐｐｅｌは、プラスミドｐｚｅｏＥ並びにＶｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ  β−チューブリン遺伝子のプロモーター及び３’ＵＴＲが、Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉにおける異種発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ｈａｌｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｒａｐｐｅｌは、ｐｚｅｏＥでコードされるブレオマイシン耐性カセットが、Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉにおける選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉにおける異種遺伝子発現を可能にするのに好適で、及びＶｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉにおける選択的マーカーとして使用するのに好適なさらなるプラスミド、プロモーター、３’ＵＴＲ／ターミネーター、及び選択可能なマーカーが報告されている（例えば、Ｈａｌｌａｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｓｕｍｐｅｒ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．９１（１９９４），ｐｐ  １１５６２−１１５６６及びＨａｌｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｏｄｎｉｏｋ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２５（２００６），ｐｐ．５８２−５８１を参照）。
【０３５８】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｂｌｅ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐｚｅｏＥが構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２５から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表２４Ａ〜Ｄに従いＶｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＶｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉにおける発現にコドン最適化されている。表２５の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＶｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ  β−チューブリンプロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ  β−チューブリン３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。当業者は、Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉゲノムの配列内のそのような相同性領域を同定することができる（Ｐｒｏｃｈｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．３２９：５９８８（２０１０），ｐｐ２２３−２２６による文献において参照される）。形質転換ベクターによるＶｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉの安定な形質転換は、微粒子銃又は他の公知の方法を含めた周知されている形質転換技法によって実現される。ｂｌｅ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＶｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉを、限定はされないが、ゼオシンを含むＶＭ培地上で選択し得る。Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、ＶＭ培地及びＳｔａｒｒにより考察される培養培地が挙げられる。Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
【０３５９】
実施例１６：Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓの操作
Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＳｔｅｉｎｂｒｅｎｎｅｒ  ａｎｄ  Ｓａｎｄｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成し得る。簡潔に言えば、Ｓｔｅｉｎｂｒｅｎｎｅｒ  ａｎｄ  Ｓａｎｄｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７２：１２（２００６），ｐｐ．７４７７−７４８４は、プラスミドＤＮＡによるＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓの安定な核形質転換を報告した。Ｓｔｅｉｎｂｒｅｎｎｅｒは、微粒子銃の形質転換方法を用いて、プラスミドｐＰｌａｔ−ｐｄｓ−Ｌ５０４ＲをＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓに導入した。プラスミドｐＰｌａｔ−ｐｄｓ−Ｌ５０４Ｒはノルフルラゾン耐性カセットを含み、このカセットは、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓフィトエンデサチュラーゼ遺伝子（Ｐｄｓ、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＹ７８１１７０）のプロモーター、タンパク質コード配列、及び３’ＵＴＲを含み、ここでＰｄｓのタンパク質コード配列は、除草剤ノルフルラゾンに対する耐性を付与する遺伝子産物（Ｐｄｓ−Ｌ５０４Ｒ）をコードするように５０４位で改変された（それによりロイシンがアルギニンに変更された）。ｐＰｌａｔ−ｐｄｓ−Ｌ５０４Ｒによる形質転換前、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓは、５ｕＭノルフルラゾンを含む培地上で増殖することができなかった。ｐＰｌａｔ−ｐｄｓ−Ｌ５０４Ｒプラスミドによる形質転換後、５ｕＭノルフルラゾンを含む選択的培養培地で増殖するＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓの形質転換体が得られた。Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓにおけるＰｄｓ−Ｌ５０４Ｒ遺伝子産物の発現により、５ｕＭノルフルラゾンの存在下における増殖が可能となり、従ってＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのノルフルラゾン除草剤耐性カセットの有用性が確立された。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。Ｓｔｅｉｎｂｒｅｎｎｅｒにより報告されるとおり、形質転換したＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓの選択及び維持は、２．４２ｇ／Ｌトリス酢酸塩、及び５ｍＭノルフルラゾンを補足したＯＨＡ培地（ＯＨＭ（０．４１ｇ／Ｌ  ＫＮＯ３、０．０３ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．２４６ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１１ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、２．６２ｍｇ／Ｌ  Ｆｅ（ＩＩＩ）クエン酸塩×Ｈ２Ｏ、０．０１１ｍｇ／Ｌ  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１２ｍｇ／Ｌ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０７５ｍｇ／Ｌ  Ｃｒ２Ｏ３、０．９８ｍｇ／Ｌ  ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．１２ｍｇ／Ｌ  Ｎａ２ＭｏＯ４×２Ｈ２０、０．００５ｍｇ／Ｌ  ＳｅＯ２及び２５ｍｇ／Ｌビオチン、１７．５ｍｇ／Ｌチアミン、及び１５ｍｇ／ＬビタミンＢ１２）を含む寒天プレート上で実施した。液体培地におけるＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓの増殖は、Ｓｔｅｉｎｂｒｅｎｎｅｒ  ａｎｄ  Ｓａｎｄｍａｎｎにより、基本培地（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５９（１９９３），ｐｐ．８６７−８７３により記載されるとおりの基本培地）を使用して行った。Ｓｔｅｉｎｂｒｅｎｎｅｒ  ａｎｄ  Ｓａｎｄｍａｎｎは、ｐＰｌａｔ−ｐｄｓ−Ｌ５０４Ｒプラスミド並びにＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓフィトエンデサチュラーゼ遺伝子のプロモーター及び３’ＵＴＲが、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓにおける異種発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ｓｔｅｉｎｂｒｅｎｎｅｒ  ａｎｄ  Ｓａｎｄｍａｎｎは、ｐＰｌａｔ−ｐｄｓ−Ｌ５０４Ｒでコードされるノルフルラゾン耐性カセットが、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓにおける選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓにおける異種遺伝子発現を可能にするのに好適なさらなるプラスミド、プロモーター、３’ＵＴＲ／ターミネーター、及び選択可能なマーカーが報告されている（Ｋａｔｈｉｒｅｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４５（２００９），ｐｐ  ６４２−６４９を参照）。
【０３６０】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるＰｄｓ−Ｌ５０４Ｒ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＰｌａｔ−ｐｄｓ−Ｌ５０４Ｒが構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２５から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表２４Ａ〜Ｄに従いＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓにおける発現にコドン最適化されている。表２５の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ  ｐｄｓ遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ  ｐｄｓ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓの安定な形質転換は、微粒子銃又は他の公知の方法を含めた周知されている形質転換技法によって実現される。Ｐｄｓ−Ｌ５０４Ｒ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓを、限定はされないが、ノルフルラゾンを含むＯＨＡ培地上で選択し得る。Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、基本培地並びにＫｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｋａｔｈｉｒｅｓａｎ  ｅｔ  ａｌ、及びＧｏｎｇ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．９：５（１９９７），ｐｐ．４３７−４４４により記載される培養培地が挙げられる。Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
【０３６１】
実施例１７：Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体の操作
Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体における本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＡｂｅ  ｅｔ  ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成し得る。簡潔に言えば、Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５２：９（２０１１），ｐｐ．１６７６−１６８５は、プラスミドＤＮＡによるＣｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体の安定な核形質転換を報告した。Ａｂｅは、微粒子銃の形質転換方法を用いて、プラスミドｐＳＡ１０６をＣｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体に導入した。プラスミドｐＳＡ１０６は、Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体クロロフィルａ／ｂ−結合タンパク質遺伝子（ＣＡＢ、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＢ３６３４０３）のプロモーター及び３’ＵＴＲに動作可能に連結された、Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ  ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓブレオマイシン結合タンパク質遺伝子（ｂｌｅ、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＣＡＡ３７０５０）をコードする配列を含むブレオマイシン耐性カセットを含んだ。ｐＳＡ１０６による形質転換前、Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体は、３ｕｇ／ｍｌフレオマイシンを含む培地上で増殖することができなかった。ｐＳＡ１０６による形質転換後、３ｕｇ／ｍｌフレオマイシンを含む選択的培養培地で増殖するＣｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体の形質転換体が得られた。Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体におけるｂｌｅ遺伝子産物の発現により、３ｕｇ／ｍｌフレオマイシンの存在下における増殖が可能となり、従ってＣｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体において使用される選択可能なマーカーとしてのブレオマイシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。Ａｂｅにより報告されるとおり、形質転換したＣｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体の選択及び維持は、初めにＣ培地（０．１ｇ／Ｌ  ＫＮＯ３、０．０１５ｇ／Ｌ  Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ、０．０５ｇ／Ｌグリセロリン酸塩−Ｎａ２、０．０４ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｇ／Ｌトリス（ヒドロキシルメチル）アミノメタン、微量ミネラル、ビオチン、ビタミンＢ１及びＢ１２）を含む上層寒天において実施した後、続いてフレオマイシンを補足したＣ培地を含む寒天プレートに単離した。Ａｂｅにより報告されるとおり、液体培地におけるＣｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体の増殖は、Ｃ培地で行った。Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体の増殖に好適なさらなる液体培養培地は、Ｓｅｋｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０：４（２００３），ｐｐ．１４７−１５３により考察される。Ａｂｅは、ｐＳＡ１０６プラスミド並びにＣｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体ＣＡＢ遺伝子のプロモーター及び３’ＵＴＲが、Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体における異種遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ａｂｅは、ｐＳＡ１０６でコードされるブレオマイシン耐性カセットが、Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体における選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体における異種遺伝子発現を可能にするのに好適なさらなるプラスミド、プロモーター、３’ＵＴＲ／ターミネーター、及び選択可能なマーカーが報告されている（Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４９（２００８），ｐｐ．６２５−６３２を参照）。
【０３６２】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｂｌｅ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＳＡ１０６が構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２５から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表２４Ａ〜Ｄに従いＣｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体の核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＣｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体における発現にコドン最適化されている。表２５の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＣｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体ＣＡＢ遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体ＣＡＢ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体ゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＣｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体の安定な形質転換は、微粒子銃又は他の公知の方法を含めた周知されている形質転換技法によって実現される。ｂｌｅ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＣｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体を、限定はされないが、フレオマイシンを含むＣ培地上で選択し得る。Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、Ｃ培地並びにＡｂｅ  ｅｔ  ａｌ．及びＳｅｋｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．により報告される培養培地が挙げられる。Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
【０３６３】
実施例１８：Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓの操作
Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＳｕｎ  ｅｔ  ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成し得る。簡潔に言えば、Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．３７７（２００６），ｐｐ．１４０−１４９は、プラスミドＤＮＡによるＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓの安定な形質転換を報告した。Ｓｕｎは、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｏｐｏｒａｔｉｏｎ）の形質転換方法を用いて、完全なＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ硝酸還元酵素遺伝子をコードするプラスミドｐＤＶＮＲを、突然変異体Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ  ＮＲ突然変異体）に導入した。このＮＲ突然変異体は、窒素源として硝酸塩を使用しない限り成長できない。硝酸還元酵素は硝酸塩から亜硝酸塩への変換を触媒する。形質転換前、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ  ＮＲ突然変異体は、唯一の窒素源として硝酸塩（ＮＯ３−）を含む培養培地において増殖することができなかった。ＮＲ突然変異体Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓにおけるＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ  ＮＲ遺伝子産物の発現を選択可能なマーカーとして使用して、硝酸塩代謝の欠損を取り戻した。ｐＤＶＮＲプラスミドによる形質転換後、単一炭素源として硝酸塩を含む寒天プレート上で成長可能な、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ  ＮＲ遺伝子産物を安定的に発現するＮＲ突然変異体Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓが得られた。サザン解析により、安定な形質転換体のＤＮＡの評価を行った。形質転換したＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ（ＮＲ突然変異体）の選択及び維持は、５ｍＭ  ＫＮＯ３を含む寒天プレート上で行った。Ｓｕｎはまた、液体培養培地におけるＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ及びＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ  ＮＲ突然変異体の増殖も報告した。Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓの増殖に好適なさらなる培地は、Ｇｏｒｄｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１０：２（１９９８），ｐｐ．１３５−１４４及びＭｏｕｌｔｏｎ  ａｎｄ  Ｂｕｒｆｏｒｄ，Ｈｙｄｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ，Ｖｏｌｓ．２０４−２０５：１（１９９０），ｐｐ．４０１−４０８により報告される。Ｓｕｎは、プラスミドｐＤＶＮＲ並びにＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ硝酸還元酵素遺伝子のプロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ  ＮＲ突然変異体における異種発現を可能にするのに好適であったことを報告した。Ｓｕｎはまた、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ硝酸還元酵素遺伝子産物の発現が、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ  ＮＲ突然変異体における選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことも報告した。
【０３６４】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ硝酸還元酵素（ＤｖＮＲ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＤＶＮＲが構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２５から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表２４Ａ〜Ｄに従いＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓにおける発現にコドン最適化されている。表２５の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＤｖＮＲプロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、ＤｖＮＲ  ３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ  ＮＲ突然変異体の安定な形質転換は、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）又は他の公知の方法を含む周知されている形質転換技法によって実現される。ＤｖＮＲ遺伝子産物の活性を選択可能なマーカーとして用いることにより、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ  ＮＲ突然変異株の窒素同化（ａｓｓｉｍｉｌｉａｔｉｏｎ）の欠損を取り戻し、形質転換ベクターを安定的に発現するＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ  ＮＲ突然変異体を選択し得る。Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｕｌｔｏｎ  ａｎｄ  Ｂｕｒｆｏｒｄ、及びＧｏｒｄｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．により考察される培地が挙げられる。Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
【０３６５】
実施例１９：Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａの操作
Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＧｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成し得る。簡潔に言えば、Ｇｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５（２００３），ｐｐ．４５１−４５６は、プラスミドＤＮＡによるＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａの安定な形質転換を報告した。Ｇｅｎｇは、エレクトロポレーションの形質転換方法を用いて、ｐＵΩＨＢｓＡｇ−ＣＡＴプラスミドをＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａに導入した。ｐＵΩＨＢｓＡｇ−ＣＡＴは、ＨＢｓＡＧタンパク質コード領域の上流でＺｅａ  ｍａｙｓ  ｕｂｉ１プロモーターに動作可能に連結され、且つＨＢｓＡＧタンパク質コード領域の下流で、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ遺伝子（ｎｏｓ）の３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、Ｂ型肝炎表面抗原をコードする配列を含むＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡＧ）発現カセットを含む。ｐＵΩＨＢｓＡｇ−ＣＡＴは、シミアンウイルス４０プロモーター及びエンハンサーに動作可能に連結された、抗生物質クロラムフェニコールに対する耐性を付与するクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子産物をコードする配列を含むクロラムフェニコール耐性カセットをさらに含んだ。ｐＵΩＨＢｓＡｇ−ＣＡＴによる形質転換前、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａは、６０ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールを含む培地上で増殖することができなかった。ｐＵΩＨＢｓＡｇ−ＣＡＴプラスミドによる形質転換後、６０ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールを含む選択的培養培地で増殖するＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａの形質転換体が得られた。Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａにおけるＣＡＴ遺伝子産物の発現により、６０ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールの存在下における増殖が可能となり、従ってＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのクロラムフェニコール耐性カセットの有用性が確立された。ＨＢｓＡｇ遺伝子産物の検出可能な活性から、ｕｂｉ１プロモーター及びｎｏｓ  ３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａにおける遺伝子発現を可能にするのに好適であることが示された。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。Ｇｅｎｇは、形質転換したＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａの選択及び維持を、６０ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールを含むＪｏｈｎｓｏｎ培地（Ｊ１、Ｂｏｒｏｗｉｔｚｋａ  ａｎｄ  Ｂｏｒｏｗｉｔｚｋａ（ｅｄｓ），Ｍｉｃｒｏ−ａｌｇａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ｐｐ．４６０−４６１により記載される）を含む寒天プレート上で行ったことを報告した。Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａの液体増殖は、Ｇｅｎｇにより、６０ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールを含むＪ１培地において行われた。Ｊ１培地以外の培地におけるＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａの増殖が考察されている（Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏ���．Ｂｉｏ．Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｖｏｌ．３６（２００９），ｐｐ．１４３３−１４３９及びＢｏｒｏｗｉｔｚｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｄｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ，Ｖｏｌｓ．１１６−１１７：１（１９８４），ｐｐ．１１５−１２１を参照）。Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａにおける異種遺伝子発現を可能にするのに好適なさらなるプラスミド、プロモーター、３’ＵＴＲ／ターミネーター、及び選択可能なマーカーが、Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．により報告されている。Ｇｅｎｇは、プラスミドｐＵΩＨＢｓＡｇ−ＣＡＴ、ｕｂｉ１プロモーター、及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａにおける外来遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ｇｅｎｇは、ｐＵΩＨＢｓＡｇ−ＣＡＴでコードされるＣＡＴ耐性カセットが、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａにおける選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告する。
【０３６６】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるＣＡＴ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＵΩＨＢｓＡｇ−ＣＡＴが構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２５から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表２４Ａ〜Ｄに従いＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａにおける発現にコドン最適化されている。表２５の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でｕｂｉ１プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａの安定な形質転換は、エレクトロポレーション又は他の公知の方法を含む周知されている形質転換技法によって実現される。ＣＡＴ遺伝子産物の活性を選択可能なマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａを、限定はされないが、クロラムフェニコール（ｃｈｒｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）を含むＪ１培地において選択し得る。Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、Ｊ１培地並びにＦｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．及びＢｏｒｏｗｉｔｚｋａ  ｅｔ  ａｌ．により記載される培養培地が挙げられる。Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
【０３６７】
実施例２０：Ｇｏｎｉｕｍ  ｐｅｃｔｏｒａｌの操作
Ｇｏｎｉｕｍ  ｐｅｃｔｏｒａｌにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＬｅｒｃｈｅ  ａｎｄ  Ｈａｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成し得る。簡潔に言えば、Ｌｅｒｃｈｅ  ａｎｄ  Ｈａｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ９：６４，２００９は、プラスミドＤＮＡによるＧｏｎｉｕｍ  ｐｅｃｔｏｒａｌｅの安定な核形質転換を報告した。Ｌｅｒｃｈｅは、微粒子銃の形質転換方法を用いて、プラスミドｐＰｍｒ３をＧｏｎｉｕｍ  ｐｅｃｔｏｒａｌｅに導入した。プラスミドｐＰｍｒ３は、ａｐｈＶＩＩＩタンパク質コード領域の上流でＶｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ  ｈｓｐ７０Ａ−ｒｂｃＳ３ハイブリッドプロモーターに動作可能に連結され、且つａｐｈＶＩＩＩタンパク質コード領域の下流でＶｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ  ｒｂｃＳ３遺伝子の３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、抗生物質パロモマイシンに対する耐性用の、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｉｍｏｓｕｓのアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ａｐｈＶＩＩＩ）遺伝子産物（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＢ０３８５６）をコードする配列を含むパロモマイシン耐性カセットを含んだ。ｐＰｍｒ３による形質転換前、Ｇｏｎｉｕｍ  ｐｅｃｔｏｒａｌｅは、０．０６ｕｇ／ｍｌパロモマイシンを含む培地上で増殖することができなかった。ｐＰｍｒ３による形質転換後、０．７５ｕｇ／ｍｌ以上のパロモマイシンを含む選択的培養培地で増殖するＧｏｎｉｕｍ  ｐｅｃｔｏｒａｌｅの形質転換体が得られた。Ｇｏｎｉｕｍ  ｐｅｃｔｏｒａｌｅにおけるａｐｈＶＩＩＩ遺伝子産物の発現により、０．７５ｕｇ／ｍｌ以上のパロモマイシンの存在下における増殖が可能となり、従ってＧｏｎｉｕｍ  ｐｅｃｔｏｒａｌｅにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのパロモマイシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。Ｌｅｒｃｈｅ  ａｎｄ  Ｈａｌｌｍａｎは、形質転換したＧｏｎｉｕｍ  ｐｅｃｔｏｒａｌｅの選択及び維持を、１．０ｕｇ／ｍｌパロモマイシンを含む液体Ｊａｗｏｒｓｋｉ培地（２０ｍｇ／Ｌ  Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ、１２．４ｍｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、５０ｍｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１５．９ｍｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３、２．２５ｍｇ／Ｌ  ＥＤＴＡ−ＦｅＮａ、２．２５ｍｇ／Ｌ  ＥＤＴＡ  Ｎａ２、２．４８ｇ／Ｌ  Ｈ３ＢＯ３、１．３９ｇ／Ｌ  ＭｎＣｌ２．４Ｈ２Ｏ、１ｍｇ／Ｌ（ＮＨ４）６ＭＯ７Ｏ２４．４Ｈ２Ｏ、０．０４ｍｇ／ＬビタミンＢ１２、０．０４ｍｇ／Ｌチアミン−ＨＣｌ、０．０４ｍｇ／Ｌビオチン、８０ｍｇ／Ｌ  ＮａＮＯ３、３６ｍｇ／Ｌ  Ｎａ４ＨＰＯ４．１２Ｈ２Ｏ）において行ったことを報告した。Ｇｏｎｉｕｍ  ｐｅｃｔｏｒａｌｅにおける異種遺伝子発現を可能にするのに好適なさらなるプラスミド、プロモーター、３’ＵＴＲ／ターミネーター、及び選択可能なマーカーが、Ｌｅｒｃｈｅ  ａｎｄ  Ｈａｌｌｍａｎによりさらに考察される。Ｌｅｒｃｈｅ  ａｎｄ  Ｈａｌｌｍａｎは、プラスミドｐＰｍｒ３、Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ  ｈｓ���７０Ａ−ｒｂｃＳ３ハイブリッドプロモーター、及びＶｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ  ｒｂｃＳ３遺伝子の３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｇｏｎｉｕｍ  ｐｅｃｔｏｒａｌｅにおける外来遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ｌｅｒｃｈｅ  ａｎｄ  Ｈａｌｌｍａｎは、ｐＰｍｒ３でコードされるパロモマイシン耐性カセットが、Ｇｏｎｉｕｍ  ｐｅｃｔｏｒａｌｅにおける選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。
【０３６８】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるａｐｈＶＩＩＩ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＰｍｒ３が構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２５から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表２４Ａ〜Ｄに従いＧｏｎｉｕｍ  ｐｅｃｔｏｒａｌｅの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＧｏｎｉｕｍ  ｐｅｃｔｏｒａｌｅにおける発現にコドン最適化されている。表２５の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＶｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ  ｈｓｐ７０Ａ−ｒｂｃＳ３ハイブリッドプロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ  ｒｂｃＳ３遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｇｏｎｉｕｍ  ｐｅｃｔｏｒａｌｅゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＧｏｎｉｕｍ  ｐｅｃｔｏｒａｌｅの安定な形質転換は、微粒子銃又は他の公知の方法を含む周知されている形質転換技法によって実現し得る。ａｐｈＶＩＩＩ遺伝子産物の活性を選択可能なマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＧｏｎｉｕｍ  ｐｅｃｔｏｒａｌｅを、限定はされないが、パロモマイシンを含むＪａｗｏｒｓｋｉ培地において選択し得る。Ｇｏｎｉｕｍ  ｐｅｃｔｏｒａｌｅ脂質産生に好適な成長培地としては、Ｊａｗａｏｒｓｋｉ培地及びＳｔｅｉｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ，Ｖｏｌ．４５：９（１９５８），ｐｐ．６６４−６７２により報告される培地が挙げられる。Ｇｏｎｉｕｍ  ｐｅｃｔｏｒａｌｅ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
【０３６９】
実施例２１：Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの操作
Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＡｐｔ  ｅｔ  ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成し得る。簡潔に言えば、Ａｐｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．２５２（１９９６），ｐｐ．５７２−５７９は、ベクターＤＮＡによるＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの安定な核形質転換を報告した。Ａｐｔは、微粒子銃の形質転換技法を用いて、プラスミドｐｆｃｐＡをＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍに導入した。プラスミドｐｆｃｐＡは、ｂｌｅタンパク質コード領域の上流でＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍフコキサンチンクロロフィルａ結合タンパク質遺伝子（ｆｃｐＡ）のプロモーターに動作可能に連結され、且つｂｌｅタンパク質コード領域の３’領域において、又は下流で、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ  ｆｃｐＡ遺伝子の３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、抗生物質フレオマイシン及びゼオシンに対する耐性用の、Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ  ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓブレオマイシン結合タンパク質（ｂｌｅ）をコードする配列を含むブレオマイシン耐性カセットを含んだ。ｐｆｃｐＡによる形質転換前、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍは、５０ｕｇ／ｍｌゼオシンを含む培地上で増殖することができなかった。ｐｆｃｐＡによる形質転換後、５０ｕｇ／ｍｌゼオシンを含む選択的培養培地で増殖するＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの形質転換体が得られた。Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍにおけるｂｌｅ遺伝子産物の発現により、５０ｕｇ／ｍｌゼオシンの存在下における増殖が可能となり、従ってＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのブレオマイシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。Ａｐｔは、形質転換したＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの選択及び維持を、５０ｍｇ／Ｌゼオシンを含むＬＤＭ培地（Ｓｔａｒｒ  ａｎｄ  Ｚｅｉｋｕｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２９，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，（１９９３）により報告されるとおり）を含む寒天プレート上で行ったことを報告した。Ａｐｔは、５０ｍｇ／Ｌゼオシンを含むＬＤＭ培地におけるＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ形質転換体の液体増殖を報告した。ＬＤＭ培地以外の培地におけるＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの増殖が（Ｚａｓｌａｖｓｋａｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２９２（２００１），ｐｐ．２０７３−２０７５により、及びＲａｄｏｋｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．１３（２０１１），ｐｐ．８９−９５により）考察されている。Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍにおける異種遺伝子発現を可能にするのに好適なさらなるプラス���ド、プロモーター、３’ＵＴＲ／ターミネーター、及び選択可能なマーカーが、Ａｐｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｚａｓｌａｖｓｋａｉａ  ｅｔ  ａｌ．、及びＲａｄｏｋｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．による同じ報告に報告されている。Ａｐｔは、プラスミドｐｆｃｐＡ、並びにＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ  ｆｃｐＡプロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍにおける外来遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ａｐｔは、ｐｆｃｐＡでコードされるブレオマイシン耐性カセットが、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍにおける選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。
【０３７０】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｂｌｅ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐｆｃｐＡが構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２５から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表２４Ａ〜Ｄに従いＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍにおける発現にコドン最適化されている。表２５の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ  ｆｃｐＡ遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ  ｆｃｐＡ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。当業者は、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍゲノムの配列内のそのような相同性領域を同定することができる（Ｂｏｗｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．４５６（２００８），ｐｐ．２３９−２４４による文献において参照される）。形質転換ベクターによるＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの安定な形質転換は、微粒子銃又は他の公知の方法を含めた周知されている形質転換技法によって実現される。ｂｌｅ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍを、限定はされないが、パロモマイシンを含むＬＤＭ培地において選択し得る。Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、Ｒａｄｏｋｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．により報告されるとおりのｆ／２培地が挙げられる。Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
【０３７１】
実施例２２：Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．の操作
Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．における本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＹａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成し得る。簡潔に言えば、Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．５９：２（２０１１），ｐｐ．１１３−１１９は、プラスミドＤＮＡによるＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．の安定な核形質転換を報告した。Ｙａｍａｇｕｃｈｉは、微粒子銃の形質転換方法を用いて、プラスミドｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔをＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．に導入した。ｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔは、ｎａｔタンパク質コード領域の上流でＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａフコキサンチンクロロフィルａ／ｃ結合タンパク質遺伝子（ｆｃｐ）プロモーターに動作可能に連結され、且つ３’領域（ｎａｔタンパク質コード配列の下流）でＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ  ｆｃｐ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、ヌルセオトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｎａｔ）遺伝子産物（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＣ６０４３９）をコードする配列を含むヌルセオトリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）耐性カセットを含んだ。ｎａｔ遺伝子産物は、抗生物質ヌルセオトリシンに対する耐性を付与する。ｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔによる形質転換前、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．は、５００ｕｇ／ｍｌヌルセオトリシンを含む培地上で増殖することができなかった。ｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔによる形質転換後、５００ｕｇ／ｍｌヌルセオトリシンを含む選択的培養培地で増殖するＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．の形質転換体が得られた。Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．におけるｎａｔ遺伝子産物の発現により、５００ｕｇ／ｍｌヌルセオトリシンの存在下における増殖が可能となり、従ってＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．において使用される選択可能なマーカーとしてのヌルセオトリシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。Ｙａｍａｇｕｃｈｉは、形質転換したＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．の選択及び維持を、５００ｕｇ／ｍｌヌルセオトリシンを含むｆ／２培地（Ｇｕｉｌａｒｄ，Ｒ．Ｒ．，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｐｈｙｔｏｐｌａｎｋｔｏｎ  ｆｏｒ  ｆｅｅｄｉｎｇ  ｍａｒｉｎｅ  ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ，Ｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  Ａｎｉｍａｌｓ，Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｃｈａｎｌｅｙ（ｅｄｓ）１９７５，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６−６０により報告されるとおり）を含む寒天プレート上で行ったことを報告した。Ｙａｍａｇｕｃｈｉにより実施されたとおりの、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．形質転換体の液体増殖を、５００ｍｇ／Ｌヌルセオトリシンを含むｆ／２培地で行った。さらなる培養培地におけるＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．の増殖が（例えば、Ｎａｐｏｌｉｔａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｖｏｌ．２１：２（１９９０），ｐｐ．１２２−１３０において���及びＶｏｌｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１２８：３（１９８９），ｐｐ．２１９−２４０により）報告されている。Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．における異種遺伝子発現を可能にするのに好適なさらなるプラスミド、プロモーター、３’ＵＴＲ／ターミネーター、及び選択可能なマーカーが、Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．による同じ報告に報告されている。Ｙａｍａｇｕｃｈｉは、プラスミドｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔ、並びにＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ  ｆｃｐプロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．における外来遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ｙａｍａｇｕｃｈｉは、ｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔでコードされるヌルセオトリシン耐性カセットが、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．における選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。
【０３７２】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｎａｔ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔが構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２５から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表２４Ａ〜Ｄに従いＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｃｏｍｐｒｅｓｓｕｍの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するように近縁のＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｃｏｍｐｒｅｓｓｕｍにおける発現にコドン最適化されている。表２５の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ  ｆｃｐ遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ  ｆｃｐ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．ゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．の安定な形質転換は、微粒子銃又は他の公知の方法を含む周知されている形質転換によって実現される。ｎａｔ遺伝子産物の活性を選択可能なマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．を、限定はされないが、ヌルセオトリシンを含むｆ／２寒天培地において選択し得る。Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、ｆ／２培地、並びにＮａｐｏｌｉｔａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．及びＶｏｌｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．により考察される培養培地が挙げられる。Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
【０３７３】
実施例２３：Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓの操作
Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＰｏｕｌｓｅｎ  ａｎｄ  Ｋｒｏｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成し得る。簡潔に言えば、Ｐｏｕｌｓｅｎ  ａｎｄ  Ｋｒｏｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．２７２（２００５），ｐｐ．３４１３−３４２３は、プラスミドＤＮＡによるＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓの形質転換を報告した。Ｐｏｕｌｓｅｎ  ａｎｄ  Ｋｒｏｇｅｒは、微粒子銃の形質転換方法を用いて、ｐＣＦ−ｂｌｅプラスミドをＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓに導入した。プラスミドｐＣＦ−ｂｌｅは、ｂｌｅタンパク質コード領域の上流でＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓフコキサンチン（ｆｕｃｏｚａｎｔｈｉｎ）クロロフィルａ／ｃ結合タンパク質遺伝子（ｆｃｐＡ、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＹ１２５５８０）プロモーターに動作可能に連結され、且つ３’領域（ｂｌｅタンパク質コード領域の下流）でＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ  ｆｃｐＡ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、抗生物質ゼオシン及びフレオマイシンに対する耐性用の、Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ  ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓブレオマイシン結合タンパク質（ｂｌｅ）をコードする配列を含むブレオマイシン耐性カセットを含んだ。ｐＣＦ−ｂｌｅによる形質転換前、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓは、１ｍｇ／ｍｌゼオシンを含む培地上で増殖することができなかった。ｐＣＦ−ｂｌｅによる形質転換後、１ｍｇ／ｍｌゼオシンを含む選択的培養培地で増殖するＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓの形質転換体が得られた。Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓにおけるｂｌｅ遺伝子産物の発現により、１ｍｇ／ｍｌゼオシンの存在下における増殖が可能となり、従ってＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのブレオマイシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。Ｐｏｕｌｓｅｎ  ａｎｄ  Ｋｒｏｇｅｒは、形質転換したＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓの選択及び維持を、１ｍｇ／ｍｌゼオシン含有の人工海水培地を含む寒天プレート上で行ったことを報告した。Ｐｏｕｌｓｅｎ  ａｎｄ  Ｋｒｏｇｅｒは、１ｍｇ／ｍｌゼオシンを含む人工海水培地におけるＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ形質転換体の液体増殖を報告した。さらなる培養培地におけるＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓの増殖が（例えば、Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１７：１（２００５），ｐｐ．６１−６５において、及びＯｒｃｕｔｔ  ａｎｄ  Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｌｉｐｉｄｓ，Ｖｏｌ．９：１２（１９７４），ｐｐ．１０００−１００３により）考察されている。Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．における異種遺伝子発現を可能にするためのさらなるプラスミド、プロモーター、及び３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｐｏｕｌｓｅｎ  ａｎｄ  Ｋｒｏｇｅｒによる同じ報告に報告されている。Ｐｏｕｌｓｅｎ  ａｎｄ  Ｋｒｏｇｅｒは、プラスミドｐＣＦ−ｂｌｅ並びにＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ  ｆｃｐプロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓにおける外来遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ｐｏｕｌｓｅｎ  ａｎｄ  Ｋｒｏｇｅｒは、ｐＣＦ−ｂｌｅでコードされるブレオマイシン耐性カセットが、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓにおける選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。
【０３７４】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｂｌｅ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＣＦ−ｂｌｅが構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２５から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表２４Ａ〜Ｄに従いＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓにおける発現にコドン最適化されている。表２５の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ  ｆｃｐ遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ  ｆｃｐ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓの安定な形質転換は、微粒子銃又は他の公知の方法を含めた周知されている形質転換技法によって実現される。ｂｌｅ遺伝子産物の活性を選択可能なマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓを、限定はされないが、ゼオシンを含む人工海水寒天培地において選択し得る。Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、人工海水並びにＬｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．及びＯｒｃｕｔｔ  ａｎｄ  Ｐａｔｔｅｒｓｏｎにより報告される培地が挙げられる。Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
【０３７５】
実施例２４：Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．の操作
Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．における本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりｔｅｎ  Ｌｏｈｕｉｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成し得る。簡潔に言えば、ｔｅｎ  Ｌｏｈｕｉｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．１３：３（１９９８），ｐｐ．４２７−４３５は、プラスミドＤＮＡによるＡｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．の安定な形質転換を報告した。ｔｅｎ  Ｌｏｈｕｉｓは、炭化ケイ素ウィスカーの存在下における撹拌の形質転換技法を用いて、プラスミドｐＭＴ  ＮＰＴ／ＧＵＳをＡｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．に導入した。ｐＭＴ  ＮＰＴ／ＧＵＳは、ｎｐｔＩＩタンパク質コード領域の上流、又は５’でＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子プロモーターに動作可能に連結され、且つ３’領域（ｎｐｔＩＩタンパク質コード領域の下流）でｎｏｓ遺伝子の３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子産物（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＬ９２０３９）をコードする配列を含むネオマイシン耐性カセットを含んだ。ｎｐｔＩＩ遺伝子産物は、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を付与する。ｐＭＴ  ＮＰＴ／ＧＵＳプラスミドは、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターに動作可能に連結され、且つＣａＭＶ  ３５Ｓ  ３’ＵＴＲ／ターミネーターにさらに動作可能に連結された、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）レポーター遺伝子産物をコードする配列をさらに含んだ。ｐＭＴ  ＮＰＴ／ＧＵＳによる形質転換前、Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．は、３ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を含む培地で増殖することができなかった。ｐＭＴ  ＮＰＴ／ＧＵＳによる形質転換後、３ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を含む選択的培養培地で増殖するＡｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．の形質転換体が得られた。Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．におけるｎｐｔＩＩ遺伝子産物の発現により、３ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８の存在下における増殖が可能となり、従ってＡｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．において使用される選択可能なマーカーとしてのネオマイシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。ＧＵＳレポーター遺伝子の検出可能な活性から、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター及び３’ＵＴＲが、Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．における遺伝子発現を可能にするのに好適であることが示された。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。ｔｅｎ  Ｌｏｈｕｉｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒは、Ｆ／２濃縮溶液（供給業者Ｓｉｇｍａにより提供される）及び３ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を補足した海水を含む培地におけるＡｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ形質転換体の液体増殖並びにＦ／２濃縮溶液及び３ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を補足した海水を含む寒天培地でのＡｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．形質転換体の選択及び維持を報告した。さらなる培養培地におけるＡｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．の増殖が（例えば、Ｍａｎｓｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１７：４（２００５）ｐｐ．２８７−ｖ３００において）報告されている。Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．における異種遺伝子発現を可能にするための、さらなるプロモーター、３’ＵＴＲ／ターミネーター、及び選択可能なマーカーを含む、さらなるプラスミドが、ｔｅｎ  Ｌｏｈｕｉｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒによる同じ報告に報告されている。ｔｅｎ  Ｌｏｈｕｉｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒは、プラスミドｐＭＴ  ＮＰＴ／ＧＵＳ並びにｎｏｓ及びＣａＭＶ  ３５Ｓ遺伝子のプロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．における外来遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、ｔｅｎ  Ｌｏｈｕｉｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒは、ｐＭＴ  ＮＰＴ／ＧＵＳでコードされるネオマイシン耐性カセットが、Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．における選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。
【０３７６】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｎｐｔＩＩ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＭＴ  ＮＰＴ／ＧＵＳが構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２５から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表２４Ａ〜Ｄに従い近縁種Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｃａｒｔｅｒａｅの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＡｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．における発現にコドン最適化されている。表２５の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、ｎｏｓ  ３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．ゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＡｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．の安定な形質転換は、シリコン繊維媒介マイクロインジェクション又は他の公知の方法を含む周知されている形質転換技法によって実現される。ｎｐｔＩＩ遺伝子産物の活性を選択可能なマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＡｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．を、限定はされないが、Ｇ４１８を含む海水寒天培地において選択し得る。Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、人工海水並びにＭａｎｓｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．及びｔｅｎ  Ｌｏｈｕｉｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒにより報告される培地が挙げられる。Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
【０３７７】
実施例２５：Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍの操作
Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりｔｅｎ  Ｌｏｈｕｉｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成し得る。簡潔に言えば、ｔｅｎ  Ｌｏｈｕｉｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．１３：３（１９９８），ｐｐ．４２７−４３５は、プラスミドＤＮＡによるＳｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍの安定な形質転換を報告した。ｔｅｎ  Ｌｏｈｕｉｓは、シリコン繊維媒介マイクロインジェクションの形質転換技法を用いて、プラスミドｐＭＴ  ＮＰＴ／ＧＵＳをＳｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍに導入した。ｐＭＴ  ＮＰＴ／ＧＵＳは、ｎｐｔＩＩタンパク質コード領域の上流、又は５’でＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子プロモーターに動作可能に連結され、且つ３’領域（ｎｐｔＩＩタンパク質コード領域の下流）でｎｏｓ遺伝子の３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子産物（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＬ９２０３９）をコードする配列を含むネオマイシン耐性カセットを含んだ。ｎｐｔＩＩ遺伝子産物は、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を付与する。ｐＭＴ  ＮＰＴ／ＧＵＳプラスミドは、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターに動作可能に連結され、且つＣａＭＶ  ３５Ｓ  ３’ＵＴＲ／ターミネーターにさらに動作可能に連結された、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）レポーター遺伝子産物をコードする配列をさらに含んだ。ｐＭＴ  ＮＰＴ／ＧＵＳによる形質転換前、Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍは、３ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を含む培地で増殖することができなかった。ｐＭＴ  ＮＰＴ／ＧＵＳによる形質転換後、３ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を含む選択的培養培地で増殖するＳｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍの形質転換体が得られた。Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍにおけるｎｐｔＩＩ遺伝子産物の発現により、３ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８の存在下における増殖が可能となり、従ってＳｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのネオマイシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。ＧＵＳレポーター遺伝子の検出可能な活性から、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター及び３’ＵＴＲが、Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍにおける遺伝子発現を可能にするのに好適であることが示された。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。ｔｅｎ  Ｌｏｈｕｉｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒは、Ｆ／２濃縮溶液（供給業者Ｓｉｇｍａにより提供される）及び３ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を補足した海水を含む培地におけるＳｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍ形質転換体の液体増殖並びにＦ／２濃縮溶液及び３ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を補足した海水を含む寒天培地でのＳｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍ形質転換体の選択及び維持を報告した。さらなる培養培地におけるＳｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍの増殖が（例えば、Ｉｇｌｅｓｉａｓ−Ｐｒｉｅｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．８９：２１（１９９２）ｐｐ．１０３０２−１０３０５において）考察されている。Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍにおける異種遺伝子発現を可能にするための、さらなるプロモーター、３’ＵＴＲ／ターミネーター、及び選択可能なマーカーを含む、さらなるプラスミドが、ｔｅｎ  Ｌｏｈｕｉｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒによる同じ報告において考察されている。ｔｅｎ  Ｌｏｈｕｉｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒは、プラスミドｐＭＴ  ＮＰＴ／ＧＵＳ並びにｎｏｓ及びＣａＭＶ  ３５Ｓ遺伝子のプロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍにおける外来遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、ｔｅｎ  Ｌｏｈｕｉｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒは、ｐＭＴ  ＮＰＴ／ＧＵＳでコードされるネオマイシン耐性カセットが、Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍにおける選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。
【０３７８】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｎｐｔＩＩ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＭＴ  ＮＰＴ／ＧＵＳが構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２５から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表２４Ａ〜Ｄに従いＳｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＳｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍにおける発現にコドン最適化されている。表２５の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、ｎｏｓ  ３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＳｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍの安定な形質転換は、シリコン繊維媒介マイクロインジェクション又は他の公知の方法を含む周知されている形質転換技法によって実現される。ｎｐｔＩＩ遺伝子産物の活性を選択可能なマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＳｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍを、限定はされないが、Ｇ４１８を含む海水寒天培地において選択し得る。Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、人工海水並びにＩｇｌｅｓｉａｓ−Ｐｒｉｅｔｏ  ｅｔ  ａｌ．及びｔｅｎ  Ｌｏｈｕｉｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒにより報告される培地が挙げられる。Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
【０３７９】
実施例２６：Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．の操作
Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＫｉｌｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成し得る。簡潔に言えば、Ｋｉｌｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．１０８：５２（２０１１）ｐｐ．２１２６５−２１２６９は、形質転換構築物によるＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓの安定な核形質転換を報告した。Ｋｉｌｉａｎは、エレクトロポレーションの形質転換方法を用いて、形質転換構築物Ｃ２をＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂに導入した。Ｃ２形質転換構築物は、ｂｌｅタンパク質コード領域の上流でＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子ＶＣＰ２のプロモーターに動作可能に連結され、且つｂｌｅタンパク質コード領域の下流でＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂビオラキサンチン／クロロフィルａ結合遺伝子ＶＣＰ１の３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、抗生物質フレオマイシン及びゼオシンに対する耐性用の、Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ  ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓブレオマイシン結合タンパク質（ｂｌｅ）のコード配列を含むブレオマイシン耐性カセットを含んだ。Ｃ２による形質転換前、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂは、２ｕｇ／ｍｌゼオシンを含む培地上で増殖することができなかった。Ｃ２による形質転換後、２ｕｇ／ｍｌゼオシンを含む選択的培養培地で増殖するＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂの形質転換体が得られた。Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂにおけるｂｌｅ遺伝子産物の発現により、２ｕｇ／ｍｌゼオシンの存在下における増殖が可能となり、従ってＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのブレオマイシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。ＰＣＲにより、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。Ｋｉｌｉａｎは、５倍レベルの微量金属、ビタミン、及びリン酸塩溶液を含み、さらに２ｕｇ／ｍｌゼオシンを含むＦ／２培地（Ｇｕｉｌａｒｄ  ａｎｄ  Ｒｙｔｈｅｒ，Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．８（１９６２），ｐｐ．２２９−２３９により報告される）におけるＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂ形質転換体の液体増殖を報告した。Ｋｉｌｉａｎはまた、人工海水２ｍｇ／ｍｌゼオシンを含む寒天Ｆ／２培地上でのＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂ形質転換体の選択及び維持も報告した。さらなる培養培地におけるＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓの増殖が（例えば、Ｃｈｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１００：２（２００９），ｐｐ．８３３−８３８及びＰａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．９０：４（２０１１），ｐｐ．１４２９−１４４１において）考察されている。Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂにおける異種遺伝子発現を可能にするための、さらなるプロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミネーターを含むさらなる形質転換構築物、及び形質転換体選択用の選択可能なマーカーが、Ｋｉｌｉａｎによる同じ報告において考察されている。Ｋｉｌｉａｎは、形質転換構築物Ｃ２並びにＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子ＶＣＰ２のプロモーター及びＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子ＶＣＰ１の３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂにおける外来遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ｋｉｌｉａｎは、Ｃ２でコードされるブレオマイシン耐性カセットが、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂにおける選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。
【０３８０】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｂｌｅ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む形質転換構築物Ｃ２が構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２５から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表２４Ａ〜Ｄに従いＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．の核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂにおける発現にコドン最適化されている。表２５の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂ  ＶＣＰ２遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂ  ＶＣＰ１遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂの安定な形質転換は、エレクトロポレーション又は他の公知の方法を含む周知されている形質転換技法によって実現される。ｂｌｅ遺伝子産物の活性を選択可能なマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂを、限定はされないが、ゼオシンを含むＦ／２培地において選択し得る。Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、Ｆ／２培地並びにＣｈｉｕ  ｅｔ  ａｌ．及びＰａｌ  ｅｔ  ａｌ．により報告される培地が挙げられる。Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
【０３８１】
実施例２７：Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａ操作
Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＤｕｎａｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成し得る。簡潔に言えば、Ｄｕｎａｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３１（１９９５），ｐｐ．１００４−１０１２は、プラスミドＤＮＡによるＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａの安定な形質転換を報告した。Ｄｕｎａｈａｙは、微粒子銃の形質転換方法を用いて、プラスミドｐＡＣＣＮＰＴ５．１をＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａに導入した。プラスミドｐＡＣＣＮＰＴ５．１は、ｎｐｔＩＩコード領域の上流でＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｌ２０７８４）のプロモーターに動作可能に連結され、且つ３’領域（ｎｐｔＩＩコード領域の下流）でＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａ  ＡＣＣアーゼ遺伝子の３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子産物のコード配列を含むネオマイシン耐性カセットを含んだ。ｎｐｔＩＩ遺伝子産物は、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を付与する。ｐＡＣＣＮＰＴ５．１による形質転換前、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａは、１００ｕｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を含む５０％人工海水培地で増殖することができなかった。ｐＡＣＣＮＰＴ５．１による形質転換後、１００ｕｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を含む選択的５０％人工海水培地において増殖するＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａの形質転換体が得られた。Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａにおけるｎｐｔＩＩ遺伝子産物の発現により、１００ｕｇ／ｍｌ  Ｇ４１８の存在下における増殖が可能となり、従ってＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのネオマイシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。Ｄｕｎａｈａｙは、１．０７ｍＭケイ酸ナトリウム及び１００ｕｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を補足した人工海水培地（ＡＳＷ、Ｂｒｏｗｎ，Ｌ．，Ｐｈｙｃｏｌｏｇｉａ，Ｖｏｌ．２１（１９８２），ｐｐ．４０８−４１０により考察されるとおり）におけるＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａの液体増殖を報告した。Ｄｕｎａｈａｙはまた、１００ｕｇ／ｍｌ  Ｇ４１８含有のＡＳＷ培地を含む寒天プレート上でのＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａ形質転換体の選択及び維持も報告した。さらなる培養培地におけるＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａの増殖が（例えば、Ｓｒｉｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２８−２９：１（１９９１），ｐｐ．３１７−３２６及びＰａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．１０９：３（２０１０），ｐｐ．２３５−２３９において）考察されている。Ｄｕｎａｈａｙは、プラスミドｐＡＣＣＮＰＴ５．１及びＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）遺伝子のプロモーターが、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａにおける外来遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ｄｕｎａｈａｙは、ｐＡＣＣＮＰＴ５．１でコードされるネオマイシン耐性カセットが、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａにおける選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。
【０３８２】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｎｐｔＩＩ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＡＣＣＮＰＴ５．１が構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２５から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表２４Ａ〜Ｄに従いＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａにおける発現にコドン最適化されている。表２５の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａ  ＡＣＣアーゼプロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａ  ＡＣＣアーゼ３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａの安定な形質転換は、微粒子銃又は他の公知の方法を含めた周知されている形質転換技法によって実現される。ｎｐｔＩＩ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａを、限定はされないが、Ｇ４１８を含む寒天ＡＳＷ培地において選択し得る。Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、ＡＳＷ培地並びにＳｒｉｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１及びＰａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．により報告される培地が挙げられる。Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
【０３８３】
実施例２８：Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａの操作
Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＤｕｎａｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成し得る。簡潔に言えば、Ｄｕｎａｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３１（１９９５），ｐｐ．１００４−１０１２は、プラスミドＤＮＡによるＮａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａの安定な形質転換を報告した。Ｄｕｎａｈａｙは、微粒子銃の形質転換方法を用いて、プラスミドｐＡＣＣＮＰＴ５．１をＮａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａに導入した。プラスミドｐＡＣＣＮＰＴ５．１は、ｎｐｔＩＩコード領域の上流でＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｌ２０７８４）のプロモーターに動作可能に連結され、且つ３’領域（ｎｐｔＩＩコード領域の下流）でＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａ  ＡＣＣアーゼ遺伝子の３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子産物のコード配列を含むネオマイシン耐性カセットを含んだ。ｎｐｔＩＩ遺伝子産物は、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を付与する。ｐＡＣＣＮＰＴ５．１による形質転換前、Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａは、１００ｕｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を含む人工海水培地で増殖することができなかった。ｐＡＣＣＮＰＴ５．１による形質転換後、１００ｕｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を含む選択的人工海水培地において増殖するＮａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａの形質転換体が得られた。Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａにおけるｎｐｔＩＩ遺伝子産物の発現により、Ｇ４１８の存在下における増殖が可能となり、従ってＮａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのネオマイシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。Ｄｕｎａｈａｙは、１．０７ｍＭ  ケイ酸ナトリウム及び１００ｕｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を補足した人工海水培地（ＡＳＷ、Ｂｒｏｗｎ，Ｌ．，Ｐｈｙｃｏｌｏｇｉａ，Ｖｏｌ．２１（１９８２），ｐｐ．４０８−４１０により考察されるとおり）におけるＮａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａの液体増殖を報告した。Ｄｕｎａｈａｙはまた、１００ｕｇ／ｍｌ  Ｇ４１８含有のＡＳＷ培地を含む寒天プレート上でのＮａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａ形質転換体の選択及び維持も報告した。さらなる培養培地におけるＮａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａの増殖が（例えば、Ｔａｄｒｏｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈａｎｓｅｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４：４（１９８８），ｐｐ．４４５−４５２及びＳｒｉｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２０−２１：１（１９８９），ｐｐ．２８１−２９１において）考察されている。Ｄｕｎａｈａｙは、プラスミドｐＡＣＣＮＰＴ５．１及びＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（Ａ���Ｃアーゼ）遺伝子のプロモーターが、Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａにおける外来遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ｄｕｎａｈａｙは、ｐＡＣＣＮＰＴ５．１でコードされるネオマイシン耐性カセットが、Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａにおける選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。
【０３８４】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｎｐｔＩＩ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＡＣＣＮＰＴ５．１が構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２５から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表２４Ａ〜Ｄに従い近縁のＮａｖｉｃｕｌａ  ｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＮａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａにおける発現にコドン最適化されている。表２５の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａ  ＡＣＣアーゼ遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａ  ＡＣＣアーゼ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＮａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａの安定な形質転換は、微粒子銃又は他の公知の方法を含めた周知されている形質転換技法によって実現される。ｎｐｔＩＩ遺伝子産物の活性を選択可能なマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＮａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａを、限定はされないが、Ｇ４１８を含む寒天ＡＳＷ培地において選択し得る。Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、ＡＳＷ培地並びにＳｒｉｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８９及びＴａｄｒｏｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈａｎｓｅｎにより報告される培地が挙げられる。Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
【０３８５】
実施例２９：Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの操作
Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＰｏｕｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成し得る。簡潔に言えば、Ｐｏｕｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４２（２００６），ｐｐ．１０５９−１０６５は、プラスミドＤＮＡによるＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの安定な形質転換を報告した。Ｐｏｕｌｓｅｎは、微粒子銃の形質転換方法を用いて、プラスミドｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔをＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａに導入した。ｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔは、ｎａｔタンパク質コード領域の上流でＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａフコキサンチンクロロフィルａ／ｃ結合タンパク質遺伝子（ｆｃｐ）プロモーターに動作可能に連結され、且つ３’領域（ｎａｔタンパク質コード配列の下流）でＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ  ｆｃｐ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、ヌルセオトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｎａｔ）遺伝子産物（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＣ６０４３９）をコードする配列を含むヌルセオトリシン耐性カセットを含んだ。ｎａｔ遺伝子産物は、抗生物質ヌルセオトリシンに対する耐性を付与する。ｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔによる形質転換前、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａは、１０ｕｇ／ｍｌヌルセオトリシンを含む培地で増殖することができなかった。ｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔによる形質転換後、１００ｕｇ／ｍｌヌルセオトリシンを含む選択的培養培地で増殖するＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの形質転換体が得られた。Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａにおけるｎａｔ遺伝子産物の発現により、１００ｕｇ／ｍｌヌルセオトリシンの存在下における増殖が可能となり、従ってＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのヌルセオトリシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。Ｐｏｕｌｓｅｎは、形質転換したＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの選択及び維持を、１００ｕｇ／ｍｌヌルセオトリシンを含む変法ＥＳＡＷ培地（Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１６（１９８０），ｐｐ．２８−３５により考察されるとおり）を含む液体培地において行ったことを報告した。さらなる培養培地におけるＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの増殖が（例えば、Ｖｏｌｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１２８：３（１９８９），ｐｐ．２１９−２４０において）考察されている。Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａにおける使用に好適なさらなる選択可能なマーカーを含む、さらなるプラスミドが、Ｐｏｕｌｓｅｎによる同じ報告において考察されている。Ｐｏｕｌｓｅｎは、プラスミドｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔ、���びにＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ  ｆｃｐプロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａにおける外来遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ｐｏｕｌｓｅｎは、ｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔでコードされるヌルセオトリシン耐性カセットが、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａにおける選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。
【０３８６】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｎａｔ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔが構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２５から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表２４Ａ〜Ｄに従いＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａにおける発現にコドン最適化されている。表２５の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ  ｆｃｐ遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ  ｆｃｐ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。当業者は、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａゲノムの配列内のそのような相同性領域を同定することができる（Ａｒｍｂｒｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．３０６：５６９３（２００４）：ｐｐ．７９−８６による文献において参照される）。形質転換ベクターによるＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの安定な形質転換は、微粒子銃又は他の公知の方法を含めた周知されている形質転換技法によって実現される。ｎａｔ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａを、限定はされないが、ヌルセオトリシンを含むＥＳＡＷ寒天培地において選択し得る。Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、ＥＳＡＷ培地、並びにＶｏｌｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．及びＨａｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．により考察される培養培地が挙げられる。Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
【０３８７】
実施例３０：Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの操作
Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＣｅｒｕｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成し得る。簡潔に言えば、Ｃｅｒｕｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１４５：１（１９９７），ｐｐ．９７−１１０は、形質転換ベクターによるＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの安定な核形質転換を報告した。Ｃｅｒｕｔｔｉは、微粒子銃の形質転換方法を用いて、形質転換構築物Ｐ［１０３０］をＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉに導入した。構築物Ｐ［１０３０］は、ａａｄＡタンパク質コード領域の上流でＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉリブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ小サブユニット遺伝子（ＲｂｃＳ２、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ０４４７２）プロモーターに動作可能に連結され、且つ３’領域（ａａｄＡタンパク質コード配列の下流）でＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  ＲｂｃＳ２遺伝子３”ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、アミノグルコシド３’−アデニルトランスフェラーゼ（ａａｄＡ）遺伝子産物をコードする配列を含むスペクチノマイシン耐性カセットを含んだ。ａａｄＡ遺伝子産物は、抗生物質スペクチノマイシンに対する耐性を付与する。Ｐ［１０３０］による形質転換前、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉは、９０ｕｇ／ｍｌスペクチノマイシンを含む培地で増殖することができなかった。Ｐ［１０３０］による形質転換後、９０ｕｇ／ｍｌスペクチノマイシンを含む選択的培養培地で増殖するＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの形質転換体が得られ、従ってＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのスペクチノマイシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。Ｃｅｒｕｔｔｉは、形質転換したＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの選択及び維持を、９０ｕｇ／ｍｌスペクチノマイシンを含むトリス酢酸塩リン酸塩培地（ＴＡＰ、Ｈａｒｒｉｓ，Ｔｈｅ  Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９８９により記載されるとおり）を含む寒天プレート上で行ったことを報告した。Ｃｅｒｕｔｔｉはさらに、９０ｕｇ／ｍｌスペクチノマイシンを含むＴＡＰ液体培地におけるＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの増殖を報告した。代替的な培養培地におけるＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの増殖が（例えば、Ｄｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｆｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．５：３（２０１１），ｐｐ．２６０−２７０及びＹａｎｔａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．１０７：２（２０１０），ｐｐ．２５８−２６８において）考察されている。Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒ���ｔｉｉにおける使用に好適なさらなる選択可能なマーカーを含む、さらなる構築物、並びにＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおける異種遺伝子発現を促進するのに好適なプロトマー及び３’ＵＴＲを含む数多くの調節配列は、当該技術分野において公知であり、考察されている（レビューは、Ｒａｄａｋｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．９：４（２０１０），ｐｐ．４８６−５０１を参照）。Ｃｅｒｕｔｔｉは、形質転換ベクターＰ［１０３０］並びにＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉプロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおける外来遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ｃｅｒｕｔｔｉは、Ｐ［１０３０］でコードされるスペクチノマイシン耐性カセットが、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおける選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。
【０３８８】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるａａｄＡ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターＰ［１０３０］が構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２５から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表２４Ａ〜Ｄに従いＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおける発現にコドン最適化されている。表２５の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  ＲｂｃＳ２プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  ＲｂｃＳ２  ３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。当業者は、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉゲノムの配列内のそのような相同性領域を同定することができる（Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．３１８：５８４８（２００７），ｐｐ．２４５−２５０による文献において参照される）。形質転換ベクターによるＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの安定な形質転換は、微粒子銃又は他の公知の方法を含めた周知されている形質転換技法によって実現される。ａａｄＡ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉを、限定はされないが、スペクチノマイシンを含むＴＡＰ寒天培地上で選択し得る。Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、ＥＳＡＷ培地、並びにＹａｎｔａｏ  ｅｔ  ａｌ．及びＤｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．により考察される培養培地が挙げられる。Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
【０３８９】
実施例３１：Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの操作
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＦｉｃｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成し得る。簡潔に言えば、Ｆｉｃｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．５５（２００３），ｐｐ．７２７−７３７は、プラスミドＤＮＡによるＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの安定な核形質転換を報告した。Ｆｉｃｋｅｒｓは、酢酸リチウム形質転換方法を用いて、プラスミドＪＭＰ１２３をＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａに導入した。プラスミドＪＭＰ１２３は、ｈｐｈタンパク質コード領域の上流でＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＬＩＰ２遺伝子プロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＪ０１２６３２）に動作可能に連結され、且つｈｐｈタンパク質コード領域の下流でＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＬＩＰ２遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子産物（ｈｐｈ）をコードする配列を含むハイグロマイシンＢ耐性カセットを含んだ。ＪＭＰ１２３による形質転換前、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａは、１００ｕｇ／ｍｌハイグロマイシンを含む培地上で増殖することができなかった。ＪＭＰ１２３による形質転換後、１００ｕｇ／ｍｌハイグロマイシンを含む培地で増殖することが可能な形質転換Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが得られ、従ってＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのハイグロマイシンＢ抗生物質耐性カセットが確立された。Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＬＩＰ２遺伝子のプロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミネーターのＪＭＰ１２３に提供されたヌクレオチド配列は、ＬＩＰ２遺伝子座へのｈｐｈコード配列の相同組換え用ドナー配列として働いた。サザン法により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。Ｆｉｃｋｅｒｓは、形質転換したＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの選択及び維持を、１００ｕｇ／ｍｌハイグロマイシン含有の標準ＹＰＤ培地（酵母エキスペプトンデキストロース）を含む寒天プレート上で行ったことを報告した。形質転換したＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの液体培養は、ハイグロマイシン含有のＹＰＤ培地において行った。Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの培養に用いられる他の培地及び技法が報告されており、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおいて使用される数多くの他のプラスミド、プロモーター、３’ＵＴＲ、及び選択可能なマーカーが報告されている（例えば、Ｐｉｇｎｅｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６：８（２０００），ｐｐ．３２８３−３２８９，Ｃｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２７：４（２０１０），ｐｐ．２７７−２８２、及びＢａｒｔｈ  ａｎｄ  Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎ，（１９９６），Ｉｎ：Ｋ，Ｗ．（Ｅｄ．），Ｎｏｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｙｅａｓｔｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙ．Ｓｐｒｉｎｔｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ−Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒ，ｐｐ．３１３−３８８を参照）。Ｆｉｃｋｅｒｓは、形質転換ベクターＪＭＰ１２３並びにＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＬＩＰ２遺伝子プロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける異種遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ｆｉｃｋｅｒｓは、ＪＭＰ１２３でコードされるハイグロマイシン耐性カセットが、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。
【０３９０】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｈｐｈ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターＪＭＰ１２３が構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２５から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表２４Ａ〜Ｄに従いＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける発現にコドン最適化されている。表２５の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＬＩＰ２遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＬＩＰ２遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。当業者は、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａゲノムの配列内のそのような相同性領域を同定することができる（Ｄｕｊｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．４３０（２００４），ｐｐ．３５−４４による文献において参照される）。形質転換ベクターによるＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの安定な形質転換は、酢酸リチウム形質転換又は他の公知方法を含む周知されている形質転換技法によって実現される。ｈｐｈ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを、限定はされないが、ハイグロマイシンを含むＹＰＤ培地上で選択し得る。Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、ＹＰＤ培地、並びにＣｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．により記載される培養培地が挙げられる。Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
【０３９１】
実施例３２：Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎｅの操作
Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎｅにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＭａｃｋｅｎｚｉｅ  ｅｔ  ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成し得る。簡潔に言えば、Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６（２０００），ｐｐ．４６５５−４６６１は、プラスミドＤＮＡによるＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａの安定な核形質転換を報告した。ＭａｃＫｅｎｚｉｅは、プロトプラスト形質転換方法を用いて、プラスミドｐＤ４をＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａに導入した。プラスミドｐＤ４は、ｈｐｔタンパク質コード領域の上流でＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａヒストンＨ４．１遺伝子プロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＪ２４９８１２）に動作可能に連結され、且つｈｐｔタンパク質コード領域の下流でＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ  Ｎ−（５’−ホスホリボシル（ｐｈｏｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ））アントラニル酸イソメラーゼ（ｔｒｐＣ）遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子産物（ｈｐｔ）をコードする配列を含むハイグロマイシンＢ耐性カセットを含んだ。ｐＤ４による形質転換前、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａは、３００ｕｇ／ｍｌハイグロマイシンを含む培地上で増殖することができなかった。ｐＤ４による形質転換後、３００ｕｇ／ｍｌハイグロマイシンを含む培地上で増殖する形質転換Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａが得られ、従ってＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのハイグロマイシンＢ抗生物質耐性カセットが確立された。サザン法により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。Ｍａｃｋｅｎｚｉｅは、形質転換したＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａの選択及び維持を、ハイグロマイシンを含むＰＤＡ（ポテトデキストロース寒天）培地上で行ったことを報告した。Ｍａｃｋｅｎｚｉｅによる形質転換したＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａの液体培養は、ハイグロマイシン含有の、ＰＤＡ培地又はＳ２ＧＹＥ培地（５％グルコース、０．５％酵母エキス、０．１８％  ＮＨ４ＳＯ４、０．０２％  ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、０．０００１％  ＦｅＣｌ３−６Ｈ２Ｏ、０．１％微量元素、１０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４を含む）において行われた。Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａの培養に用いられる他の培地及び技法が報告されており、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａにおいて使用される他のプラスミド、プロモーター、３’ＵＴＲ、及び選択可能なマーカーが報告されている（例えば、Ａｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７５：１７（２００９）ｐｐ．５５２９−３５及びＬｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１６４：７（２００１），ｐｐ．９７９−９０を参照）。Ｍａｃｋｅｎｚｉｅは、形質転換ベクターｐＤ４並びにＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐ��ｎａヒストンＨ４．１プロモーター及びＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ  ｔｒｐＣ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａにおける異種遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ｍａｃｋｅｎｚｉｅは、ｐＤ４でコードされるハイグロマイシン耐性カセットが、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａにおける選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。
【０３９２】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｈｐｔ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＤ４が構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２５から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表２４Ａ〜Ｄに従いＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａにおける発現にコドン最適化されている。表２５の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａヒストンＨ４．１遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ  ｔｒｐＣ  ３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。当業者は、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａゲノムの配列内のそのような相同性領域を同定することができる（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ，Ｖｏｌ．６：１２（２０１１）による文献において参照される）。形質転換ベクターによるＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａの安定な形質転換は、プロトプラスト形質転換又は他の公知の方法を含む周知されている形質転換技法によって実現される。ｈｐｔ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａを、限定はされないが、ハイグロマイシンを含むＰＤＡ培地で選択し得る。Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、Ｓ２ＧＹＥ培地、並びにＬｕ  ｅｔ  ａｌ．及びＡｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．により記載される培養培地が挙げられる。Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
【０３９３】
実施例３３：Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０の操作
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０における本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＫａｌｓｃｈｅｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成し得る。簡潔に言えば、Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５２（１９９９），ｐｐ．５０８−５１５は、プラスミドＤＮＡによるＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓの安定な形質転換を報告した。Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒは、エレクトロポレーションの形質転換方法を用いて、プラスミドｐＮＣ９５０１をＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０に導入した。プラスミドｐＮＣ９５０１は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｚｕｒｅｕｓ  ２３Ｓ  ｒＲＮＡ  Ａ１０６７メチルトランスフェラーゼ遺伝子の完全ヌクレオチド配列を含む（この遺伝子のプロモーター及び３’ターミネーター配列を含む）チオストレプトン耐性（ｔｈｉｏｒ）カセットを含んだ。ｐＮＣ９５０１による形質転換前、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓは、１ｍｇ／ｍｌチオストレプトンを含む培地上で増殖することができなかった。ｐＮＣ９５０１によるＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０の形質転換後、１ｍｇ／ｍｌチオストレプトンを含む培養培地上で増殖する形質転換体が得られ、従ってＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０における選択可能なマーカーとしてのチオストレプトン耐性カセットの使用が確立された。Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒにより記載される第２のプラスミド、ｐＡＫ６８は、耐性ｔｈｉｏｒカセット並びにｌａｃＺプロモーターにより駆動される、ポリヒドロキシアルカノエート生合成用のＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  β−ケトチオラーゼ（ｐｈａＢ）、アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素（ｐｈａＡ）、及びポリ３−ヒドロキシアルカン酸シンターゼ（ｐｈａＣ）遺伝子の遺伝子配列を含んだ。ポリヒドロキシアルカノエート生合成が欠損しているＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０株のｐＡＫ６８形質転換後、非形質転換株と比べてより多量のポリヒドロキシアルカノエートを産生する形質転換Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０が得られた。導入されたＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ｐｈａＢ、ｐｈａＡ、及びｐｈａＣ酵素の検出可能な活性から、ｐＡＫ６８プラスミドでコードされる調節エレメントがＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０における異種遺伝子発現に好適であったことが示された。Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒは、形質転換したＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０の選択及び維持を、チオストレプトンを含む標準的なルリアブロス（ＬＢ）培地、栄養ブイヨン（ＮＢ）、又は無機塩類培地（ＭＳＭ）上で行ったことを報告した。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０の培養に用いられる他の培地及び技法が記載されている（例えば、Ｋｕｒｏｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１４７：３−４（２０１０），ｐｐ．２１２−２１８及びＡｌｖｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂ���ａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５４：２（２０００），ｐｐ．２１８−２２３を参照）。Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒは、形質転換ベクターｐＮＣ９５０１及びｐＡＫ６８、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｚｕｒｅｕｓ  ２３Ｓ  ｒＲＮＡ  Ａ１０６７メチルトランスフェラーゼ遺伝子及びｌａｃＺ遺伝子のプロモーターが、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０における異種遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒは、ｐＮＣ９５０１及びｐＡＫ６８でコードされるｔｈｉｏｒカセットが、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０における選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。
【０３９４】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｔｈｉｏｒ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＮＣ９５０１が構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２５から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表２４Ａ〜Ｄに従いＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０における発現にコドン最適化されている。表２５の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でｌａｃＺ遺伝子プロモーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０ゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。当業者は、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０ゲノムの配列内のそのような相同性領域を同定することができる（Ｈｏｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬＯＳ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．７：９（２０１１）による文献において参照される。形質転換ベクターによるＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０の形質転換は、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｏｐｏｒａｔｉｏｎ）又は他の公知の方法を含む周知されている形質転換技法によって実現される。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｚｕｒｅｕｓ  ２３Ｓ  ｒＲＮＡ  Ａ１０６７メチルトランスフェラーゼ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０を、限定はされないが、チオストレプトンを含むＬＢ培地上で選択し得る。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、Ｋｕｒｏｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．及びＡｌｖａｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．により考察される培養培地が挙げられる。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
【０３９５】
実施例３４：脂肪酸栄養要求性のための微細藻類の操作
Ｃｕｐｈｅａ  ｗｒｉｇｈｔｉｉチオエステラーゼ（ＣｗＴＥ２）を発現するように操作したＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）を、両方の内在性チオエステラーゼ対立遺伝子ＦＡＴＡ１−１及びＦＡＴＡ１−２をノックアウトするさらなる遺伝子改変用の宿主生物として使用した。ここで、第１の形質転換構築物は、ＦＡＴＡ１−１遺伝子座にネオマイシン発現カセットを組み込むように作成した。この構築物、ｐＳＺ２２２６は、核ゲノムのＦＡＴＡ１−１遺伝子座に対する５’（配列番号１５０）及び３’（配列番号１５１）相同組換え標的配列（構築物に隣接する）並びにＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号５）及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲ（配列番号１２６）の制御下にあるネオマイシン耐性タンパク質コード配列を含んだ。このＮｅｏＲ発現カセットは配列番号１３５として列挙され、選択可能なマーカーとして働いた。
【０３９６】
ｐＳＺ２２２６の形質転換後、個々の形質転換体を、ショ糖及びＧ４１８を含む寒天プレート上で選択した。単一の単離物、株Ｈを、さらなる遺伝子改変用に選択した。第２の形質転換構築物、ｐＳＺ２２３６は、チアミン選択可能マーカーの発現を可能にするポリヌクレオチドをＦＡＴＡ１−２遺伝子座で株Ｈに組み込むように作成した。ｐＳＺ２２３６は、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ核ゲノムへの組み込み用のＦＡＴＡ１−２ゲノム領域に対する５’（配列番号１５２）及び３’（配列番号１５３）相同組換え標的配列（構築物に隣接する）並びにＣ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓアクチンプロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号１４２）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲ（配列番号１２６）の制御下にあるＡ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＴＨＩＣタンパク質コード領域を含んだ。このＡｔＴＨＩＣ発現カセットは配列番号１４３として列挙され、選択可能なマーカーとして働いた。ｐＳＺ２２３６による株Ｈの形質転換によって株Ｉを作成した後、個々の形質転換体を、遊離脂肪酸を含む寒天プレート上で選択した。株Ｉは、寒天プレート上で、及びチアミン不含且つ遊離脂肪酸を補足した培地において増殖することができた。
【０３９７】
実施例３５：ステアリン酸の産生を増加させるための微生物の操作
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）の古典的に変異を誘発した株、株Ｊを、本明細書並びにＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおりの遺伝子銃による形質転換方法によりプラスミド構築物ｐＳＺ２２８１で形質転換した。ｐＳＺ２２８１は、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼの発現を下方調節するＲＮＡヘアピン（ＳＡＤ２ｈｐＣ、配列番号１５４）をコードするポリヌクレオチド、核ゲノムへの組み込み用の６Ｓゲノム領域に対する５’（配列番号１２１）及び３’（配列番号１２２）相同組換え標的配列（構築物に隣接する）、並びに配列番号１２３に示されるタンパク質配列を発現する、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号１２５）及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲ（配列番号１２６）の制御下にあるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼコード領域（配列番号１２４）を含んだ。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２発現カセットは配列番号１２７として列挙され、選択可能なマーカーとして働いた。ＳＡＤ２ｈｐＣ  ＲＮＡヘアピンをコードするポリヌクレオチド配列は、Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓアクチンプロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号１４２）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲ（配列番号１２６）の制御下にあった。
【０３９８】
構築物ｐＳＺ２２８１による株Ｊの形質転換によって株Ｋを作成した後、陽性クローンを、ショ糖を単一炭素源として含有する寒天プレート上で選択した。個々の形質転換体をクローン精製し、本明細書並びにＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に詳述されるとおりの脂質産生に好適な従属栄養条件下で増殖させた。乾燥バイオマスから脂質サンプルを調製し、実施例３に記載されるとおりの（ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書も参照のこと）標準的な脂肪酸メチルエステルガスクロマトグラフィー水素炎イオン化検出法を用いて分析した。単一炭素源としてグルコース上で増殖させたＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ株Ｊ及び単一炭素源としてショ糖上で増殖させた株Ｋの３つの代表的な単離物の脂肪酸プロフィール（全脂肪酸に対する面積％で表される）を、表２６に提供する。
【０３９９】
【表５０】
2015500009.tif 000051
【０４００】
表２６に提供されるデータは、形質転換生物のＣ１８：０及びＣ１８：１脂肪酸プロフィールに対するＳＡＤ２ヘアピンＲＮＡ構築物の発現の明らかな影響を示している。ＳＡＤ２ヘアピンＲＮＡ構築物を含む株Ｋ形質転換体の脂肪酸プロフィールは、飽和Ｃ１８：０脂肪酸の割合の増加と、同時の不飽和Ｃ１８：１脂肪酸の減少を実証した。非形質転換株の脂肪酸プロフィールは、約３％のＣ１８：０を含む。形質転換株の脂肪酸プロフィールは、約３７％のＣ１８：０を含む。これらのデータは、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおけるＳＡＤ  ＲＮＡヘアピン構築物の発現を可能にするポリヌクレオチドの発現及び使用の成功による、操作された宿主微生物における飽和脂肪酸の割合の改変、詳細には微生物細胞におけるＣ１８：０脂肪酸の濃度の増加及びＣ１８：１脂肪酸の減少を示す。
【０４０１】
実施例３６：内在性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼのノックダウンによるオレイン酸の産生を増加させるための微生物の操作
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）の古典的に変異を誘発した株、株Ｊを、本明細書並びにＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおりの遺伝子銃による形質転換方法により、構築物ｐＳＺ２４０２〜ｐＳＺ２４０７の各々で独立して形質転換した。構築物ｐＳＺ２４０２〜ｐＳＺ２４０７の各々は、脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの発現を下方調節するようにＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＦＡＴＡ１  ｍＲＮＡ転写物に対して標的化されたヘアピンＲＮＡをコードする異なるポリヌクレオチド、核ゲノムへの組み込み用の６Ｓゲノム領域に対する５’（配列番号１２１）及び３’（配列番号１２２）相同組換え標的配列（構築物に隣接する）、並びにＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号１２５）及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲ（配列番号１２６）の制御下にある、配列番号１２３に示されるタンパク質配列を発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼコード領域（配列番号１２４）を含んだ。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２発現カセットは配列番号１２７として列挙され、選択可能なマーカーとして働いた。各ヘアピンに対応するポリヌクレオチドの配列表識別情報を表２７に列挙する。各ＲＮＡヘアピンをコードするポリヌクレオチド配列は、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号１２５）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲ（配列番号１２６）の制御下にあった。
【０４０２】
【表５１】
2015500009.tif 000052
【０４０３】
表２７に列挙される構築物の各々で株Ｊを独立して形質転換した後、ショ糖を単一炭素源として含有する寒天プレート上で陽性クローンを選択した。個々の形質転換体をクローン精製し、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に詳述されるとおりの脂質産生に好適な従属栄養条件下で増殖させた。乾燥バイオマスから脂質サンプルを調製し、実施例３に記載されるとおりの標準的な脂肪酸メチルエステルガスクロマトグラフィー水素炎イオン化検出法を用いて分析した。単一炭素源としてグルコース上で増殖させたＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ株Ｊ及び単一炭素源としてショ糖上で増殖させた株Ｊの各形質転換の代表的な単離物の脂肪酸プロフィール（全脂肪酸に対する面積％で表される）を、表２８に提供する。
【０４０４】
【表５２】
2015500009.tif 000053
【０４０５】
表２８に提供されるデータは、形質転換生物のＣ１８：０及びＣ１８：１脂肪酸プロフィールに対するＦＡＴＡヘアピンＲＮＡ構築物の発現の明らかな影響を示している。ＦＡＴＡヘアピンＲＮＡ構築物を含む株Ｊ形質転換体の脂肪酸プロフィールは、Ｃ１８：１脂肪酸の割合の増加と、同時のＣ１６：０及びＣ１８：０脂肪酸の減少を実証した。非形質転換株Ｊの脂肪酸プロフィールは、約２６．６６％のＣ１６：０、３％のＣ１８：０、及び約５９％のＣ１８：１脂肪酸である。対照的に、形質転換株の脂肪酸プロフィールは、８．６％もの低さのＣ１６：０及び１．５４％のＣ１８：０及び７８％より高いＣ１８：１脂肪酸を含む。これらのデータは、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）のＦＡＴＡ１酵素が長さＣ１８の脂肪酸の加水分解に対して選択的特異性を示すことを示している。
【０４０６】
これらのデータは、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおけるポリヌクレオチド  ＦＡＴＡ  ＲＮＡヘアピン構築物の有用性及び使用の成功による、操作された微生物の脂肪酸プロフィールの改変、詳細には微生物細胞におけるＣ１８：１脂肪酸の濃度の増加及びＣ１８：０及びＣ１６：０脂肪酸の減少を示す。
【０４０７】
実施例３７：脂肪酸デサチュラーゼの複数の対立遺伝子破壊による操作された微生物の脂肪酸レベルの改変
この例では、形質転換ベクターを使用して、選択可能なマーカー及び外来性ＳＡＤ酵素をコードする配列を含む形質転換カセットによりＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓのＦＡＤｃ遺伝子座を破壊することによる微生物の操作を記載し、ここでは形質転換微生物の脂肪酸プロフィールが改変されている。
【０４０８】
Ｐｒｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）の古典的に変異を誘発した（より高い油生成のため）誘導体、株Ａを、実施例２に詳述する遺伝子銃による形質転換方法により形質転換構築物ｐＳＺ１４９９（配列番号２４６）で形質転換した。ｐＳＺ１４９９は、Ｐｒｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５における発現にコドン最適化されたＯｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を含んだ。ｐＳＺ１４９９発現構築物は、核ゲノムへの組み込み用のＦＡＤｃゲノム領域に対する５’（配列番号２４７）及び３’（配列番号２４８）相同組換え標的配列（構築物に隣接する）並びにＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼコード領域を含んだ。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２発現カセットは配列番号１５９として列挙され、選択マーカーとして働いた。Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼコード領域は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号８９）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあり、天然のトランジットペプチドは、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチド（配列番号４９）により置換された。Ｏ．ｅｕｒｏｐａｅａ  ＳＡＤ発現カセット全体をｐＳＺ１４９９と命名したとともに、ＦＡＤｃ５’＿ｂｔｕｂ−Ｓｕｃ２−ｎｒ＿ａｍｔ０３−Ｓ１０６ＳＡＤ−ＯｅＳＡＤ−ｎｒ−ＦＡＤｃ３’と記載し得る。
【０４０９】
単一炭素源としてショ糖を含有するプレート上で一次形質転換体を選択した。個々の形質転換体をクローン精製し、実施例１に開示されるとおりの条件と同様の、ｐＨ７．０の標準的な脂質産生条件下で成長させた。実施例３に記載されるとおりの標準的な脂肪酸メチルエステルガスクロマトグラフィー水素炎イオン化（ＦＡＭＥ  ＧＣ／ＦＩＤ）検出法を用いて脂肪酸プロフィールを分析した。形質転換ベクターの形質転換により生じる一組の代表的なクローンから得られた脂肪酸プロフィールを、表２９に示す。グルコースを単一炭素源としてを含む（ｐＨ５．０）脂質産生条件下で成長させた非形質転換株Ｃ株から得られた脂質の脂肪酸プロフィールを、さらに表２９に提供する。
【０４１０】
【表５３】
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【０４１１】
表２９に示されるとおり、ｐＳＺ１４９９による株Ｃの形質転換は、形質転換微生物の脂肪酸プロフィールに影響を及ぼす。形質転換されていないＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）株のＣ株は、６０％未満のＣ１８：１脂肪酸及び７％超のＣ１８：２脂肪酸を含む脂肪酸プロフィールを呈する。対照的に、ｐＳＺ１４９９で形質転換された株である株Ｃは、Ｃ１８：１脂肪酸の組成の増加及びそれと同時のＣ１８：０及びＣ１８：２脂肪酸の減少を有する脂肪酸プロフィールを呈した。Ｃ１８：２脂肪酸は、ｐＳＺ１４９９で形質転換された株Ｃの脂肪酸プロフィールには検出されなかった。ｐＳＺ１４９９形質転換体において検出可能なＣ１８：２脂肪酸が存在しないことから、複数のＦＡＤｃゲノム遺伝子座に組み込むための相同組換え標的配列を含むｐＳＺ１４９９による形質転換がＦＡＤ活性を消失させたことが示された。
【０４１２】
サザンブロット解析を実施して、複数のＦＡＤｃ対立遺伝子がｐＳＺ１４９９形質転換ベクターにより破壊されたことを確かめた。標準的な分子生物学的方法を用いて株Ｃ及びｐＳＺ１４９９形質転換体からゲノムＤＮＡを抽出した。各サンプルからのＤＮＡを、制限酵素ＰｓｔＩで消化した後、０．８％アガロースゲル上で泳動させた。このゲルからのＤＮＡをナイロン＋膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移し、次にこれをＦＡＤｃ  ３’領域に対応するＰ３２標識ポリヌクレオチドプローブと共にハイブリダイズした。図１は、ｐＳＺ１４９９形質転換カセットのマップ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）の２つの配列決定したＦＡＤｃ対立遺伝子、及びｐＳＺ１４９９形質転換ベクターにより破壊された対立遺伝子の予測サイズを示す。ＦＡＤｃ対立遺伝子１はＰｓｔＩ制限部位を含むが、ＦＡＤｃ対立遺伝子２は含まない。ＳＡＤカセットを組み込むと、破壊されたＦＡＤｃ対立遺伝子にＰｓｔＩ制限部位が導入され、いずれの対立遺伝子が破壊されたかに関わらず、約６ｋｂの断片がサザン法で解析され得る。図２は、サザンブロット解析の結果を示す。両方の形質転換体とも、約６ｋｂにおけるハイブリダイゼーションバンドが検出される。対立遺伝子が破壊されていないことを示し得るそれより小さいハイブリダイゼーションバンドは検出されなかった。これらの結果は、両方のＦＡＤｃ対立遺伝子がｐＳＺ１４９９により破壊されたことを示している。
【０４１３】
ＳＡＤ発現カセットでＦＡＤｃ脂肪酸デサチュラーゼの両方の対立遺伝子を除去すると、約７４％のＣ１８：１を含む脂肪酸プロフィールがもたらされる。まとめると、これらのデータは、ＦＡＤ対立遺伝子のノックアウト及びそれと同時のステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ酵素の外因性発現により操作された微生物の脂肪酸プロフィールの改変を可能にするポリヌクレオチドの有用性及び有効性を実証している。
【０４１４】
本明細書に引用されている全ての参考文献は、特許、特許明細書、刊行物を含め、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号も含め、その内容がすでに具体的に組み込まれているか否かにかかわらず、その全体が本明細書によって参照により組み込まれる。本明細書で述べられている刊行物は、本発明と組み合わせて使用することが可能な試薬、方法及び概念を記載し、開示する目的で引用されている。本明細書におけるいかなる記載も、これらの引用文献が本明細書に記載した本発明との関連で従来技術であることを認めたものと解釈されるべきではない。詳細には、以下の特許出願が、本明細書によってあらゆる目的から全体として参照により援用される：２００８年６月２日に出願された「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｉｌ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ」と題されるＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６５５６３号明細書、２０１０年４月１４日に出願された「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｏｉｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ」と題されるＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／３１１０８号明細書、２００９年１１月３０日に出願された「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔａｉｌｏｒｅｄ  Ｏｉｌｓ  ｉｎ  Ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ」と題される国際公開第２０１０／０６３０３２号パンフレット、２０１１年５月２７日に出願された「Ｔａｉｌｏｒｅｄ  Ｏｉｌｓ  Ｐｒｏｄｕｃｅｄ  Ｆｒｏｍ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ」と題されるＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、及び２０１２年２月２日に出願された「Ｔａｉｌｏｒｅｄ  Ｏｉｌｓ  Ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ」と題されるＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ／２０１２／０２３６９６号明細書。
【化１】
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【化２７５】
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【化２７６】
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【化２７７】
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【化２７８】
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【化２７９】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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