(57)【要約】  免疫応答を抑制する処置の方法を提供する。本方法は、処置が必要な対象に、該対象のｉＮＫＴ細胞機能を抑制するのに有効な量で、ｉＮＫＴ細胞に選択的に結合する裸の遮断抗体を投与することを含む。ｉＮＫＴ細胞に選択的に結合する、単離されたヒト化抗体を含む組成物もまた提供する。
2015502340.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫応答を抑制するための処置の方法であって、処置の必要がある対象に、ｉＮＫＴ細胞に選択的に結合する裸の遮断抗体を、前記対象のｉＮＫＴ細胞機能を抑制するのに有効な量で、投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
遮断抗体が、枯渇抗体であり、量が、ｉＮＫＴ細胞を枯渇させるのに有効である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗原に対する対象の免疫応答が抑制される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
抗原が、アレルゲンである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
対象が、喘息を患い、処置が、対象において１つまたは２つ以上の喘息の症状を抑制する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
喘息が、アレルギー性喘息である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
対象が、ＣＯＰＤを患い、処置が、前記対象において１つまたは２つ以上のＣＯＰＤの症状を抑制する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
対象が、気道過敏性障害を患い、かつ処置が、前記対象において１つまたは２つ以上の前記障害の症状を抑制する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
対象が、ヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
対象が、ヒトである、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
抗体が、完全ヒト抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
抗体が、３つの軽鎖および３つの重鎖ＣＤＲ領域をもち、前記の３つの軽鎖および３つの重鎖のＣＤＲ領域の夫々が、ヒト配列の複合体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
抗体が、組み換えの可溶性ヒトｉＴＣＲへの結合において１．０μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０で、ｉＮＫＴ細胞に結合する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
抗体が、配列番号２４、２５および２６と、８５位にロイシンとを含む軽鎖可変領域をもつ、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
抗体が、配列番号２１、２２および２３と、２３位にバリンおよび／または９９位にスレオニンとを含む重鎖可変領域をもつ、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
抗体が、配列番号１によって定義されるエピトープに結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
抗体が、配列番号１および２によって定義されるエピトープに結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
抗体が、配列番号１５、１６、１７、１８、１９または２０から選択される軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
抗体が配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４から選択される重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
抗体が、ＮＫＴＴ１２０を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
抗体が、対象への投与後、１つまたは２つ以上の血清サイトカインレベルにおいて、有意な変化を引き起こさない、請求項２に記載の方法。
【請求項２２】
ｉＮＫＴ細胞に選択的に結合する、単離されたヒト化抗体を含む組成物であって、前記抗体が、組み換えの可溶性ヒトｉＴＣＲへの結合において０．９μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０をもつ、前記組成物。
【請求項２３】
重鎖可変領域および軽鎖可変領域が、ヒト配列からなる、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
ＩＣ５０が、０．５μｇ／ｍｌ未満である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
ＩＣ５０が、０．３μｇ／ｍｌ未満である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２６】
ＩＣ５０が、０．１μｇ／ｍｌと０．５μｇ／ｍｌとの間である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２７】
抗体が、配列番号１によって定義されるエピトープに結合する、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
抗体が、３つの軽ＣＤＲ領域および３つの重ＣＤＲ領域をもち、前記の３つの軽ＣＤＲ領域および３つの重ＣＤＲ領域の夫々が、ヒト配列の複合体である、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
抗体が、配列番号２４、２５および２６と、８５位でロイシンとを含む軽鎖可変領域をもつ、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
抗体が、配列番号２１、２２および２３と、２３位でバリンおよび／または９９位でスレオニンとを含む重鎖可変領域をもつ、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
抗体が、配列番号２４、２５および２６と、８５位でロイシンとを含む配列をもつ軽鎖可変領域、ならびに、配列番号２１、２２および２３と、２３位でバリンおよび／または９９位でスレオニンとを含む重鎖可変領域をもつ、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３２】
抗体が、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４から選択される配列をもつ重鎖可変領域を含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３３】
抗体が、配列番号１５、１６、１７、１８、１９または２０から選択される配列をもつ軽鎖可変領域を含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３４】
抗体が、配列番号１７または１８から選択される配列をもつ軽鎖可変領域を含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３５】
抗体が、配列番号７、８、９、１０または１４から選択される配列をもつ重鎖可変領域、および配列番号１７または１８から選択される配列をもつ軽鎖可変領域を含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３６】
抗体が、配列番号１７または１８から選択される配列を有する軽鎖可変領域、および配列番号９または１０から選択される配列を有する重鎖可変領域をもつ、請求項２２の組成物。
【請求項３７】
抗体が、配列番号２７の配列を有する重鎖可変領域、および配列番号２９の配列を有する軽鎖可変領域をもつ、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３８】
抗体が、配列番号２８の配列を有する重鎖可変領域、および配列番号２９の配列を有する軽鎖可変領域をもつ、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３９】
抗体が、枯渇抗体である、請求項２２〜３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
抗体が、対象への投与後、１つまたは２つ以上の血清サイトカインレベルにおいて、有意な変化を引き起こさない、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
抗体が、活性化抗体である、請求項２２〜３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４２】
対象においてｉＮＫＴ細胞を枯渇させることによって該対象を処置するための方法であって、かかる処置が必要なヒト対象に、該ヒト対象においてｉＮＫＴ細胞を枯渇させるのに有効な請求項３８に記載の組成物の量を投与することを含む、前記方法。
【請求項４３】
対象が、気道過敏状態、アレルギー、自己免疫疾患、アレルギーを除く炎症状態、虚血再灌流傷害、血管炎性疾患もしくは鎌状赤血球貧血を患うか、または移植の予定があるか、もしくは移植を行った、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
抗体が、対象に投与後、１つまたは２つ以上の血清サイトカインレベルにおいて、有意な変化を引き起こさない、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
対象においてｉＮＫＴ細胞を活性化させることによって該対象を処置するための方法であって、かかる処置が必要なヒト対象に、該ヒト対象においてｉＮＫＴ細胞を活性化させるのに有効な請求項３９に記載の組成物の量を投与することを含む、前記方法。
【請求項４５】
対象が、感染性疾患を患うか、または癌を患う、請求項４４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１１年１０月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／５５２，３３７号の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づいて利益を主張するものであり、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
喘息は世界的に見て比較的一般的な病気である。２００９年に、疾患管理センターは、米国における喘息の普及率が人口の８．２％、すなわち２４．６百万人であることを推定した。世界的に見て喘息の重荷は大きく、３億を超えるケースの普及が推定され、この数字は２０２５年までに１億ケースを上回って増加することが予想される。
【０００３】
喘息は我が国の最も高コストな病気の１つである。年間の米国の喘息のための健康への支出および生産性減少は２００億＄を超えると推定される。２００６年および２００７年において、米国では、１年あたり約３５００名が喘息関連で死亡し、世界的に見ると２５０，０００名超が死亡した。
【０００４】
喘息の重症度は症状の頻度および重症度、または「発作」、肺機能試験の結果、ならびに症状を管理するために必要な薬剤のレベルによって区別される（NIH, “Guidelines for the Diagnosis and Management of Asthma, 2007”）。喘息患者の約３０％が、通常の肺機能試験で穏やかで断続的な喘息の症状を示す。他の喘息患者の３０％が、通常の肺機能試験で穏やかで継続的な症状（１週間あたり２または３以上の発症）を示す。喘息患者の４０パーセントは、変則的な肺機能試験で、中等度から軽重度で継続的かつ日常的な、または持続的な喘息の症状を示す。喘息関連健康ケアコストの８０％超は、中等度から軽重度の継続的および／またはより軽度な、処置困難な喘息を有する個体の２０％が原因であると推定される。したがって、処置困難な喘息は医学的なニーズを著しく満たさないままである。
【０００５】
免疫システムを調節することは、自己免疫疾患、感染、アレルギー、炎症状態、自然流産、妊娠、移植片対宿主疾患および癌を含むが、これらに限定されない様々な他の疾患および障害と同様に、喘息を処置するための望ましいアプローチとして追及されている。Ｔ細胞は、かかる調節の標的である。Ｔ細胞は多数の免疫システム機能に関与するリンパ球である。ヘルパーＴ細胞、細胞毒性Ｔ細胞およびサプレッサーＴ細胞などのＴ細胞サブセットは、異なる免疫機能を仲介する。ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞は、従来のＴ細胞とナチュラルキラー（ＮＫ）細胞との両者が有する、表面マーカーおよび機能的な特性を共有するＴリンパ球サブセットである。Ｔ細胞と違って、それらはペプチド抗原よりむしろ糖脂質抗原を認識する。
【０００６】
ＮＫＴ細胞は３つのサブセットに区分することができる：非変異のＴ細胞受容体を発現し、かつＣＤ１ｄにより制限されるタイプ１（ｉＮＫＴ）、変異のＴ細胞受容体を発現するが、ＣＤ１ｄにより制限されるタイプ２（ＮＫＴ）、および、変異のＴ細胞受容体を発現し、かつＣＤ１ｄにより制限されないタイプ３（ＮＫＴ様）である。タイプ１のｉＮＫＴ細胞は、特定のＴＣＲ−β鎖（ヒトにおけるＶβ１１、マウスにおけるＶβ８．２、Ｖβ７およびＶβ２）と好んで対となる、独自に再構成され、高度に保存された半非変異のＴＣＲ−α鎖（ヒトにおけるＶα２４−Ｊα１８およびマウスにおけるＶα１４−Ｊα１８）を発現する。それらは動物の系統発生を通じて高度に保存されている。これは、それらのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の多様な配列をもつ大半のＴ細胞の部分母集団とは対照的である。ｉＮＫＴ細胞の非変異のＴＣＲは、抗原提示細胞の表面上のＭＨＣ−Ｉ様タンパク質ＣＤ１ｄに提示された糖脂質の抗原と反応する。ｉＮＫＴ細胞の顕著な特徴は、特徴的なサイトカインであるが、そうでなければＴヘルパータイプＩ（Ｔｈ１）細胞およびＴｈ２細胞夫々により産生される、ＩＬ−４およびＩＦＮγを含むサイトカインの混合物を素早く産生するそれらの能力である。非変異のＮＫＴ細胞は、「古典的なＮＫＴ細胞」を指すこともある。
【０００７】
ｉＮＫＴ細胞の独自な特徴は、それらが海洋性海綿動物に由来する糖脂質である、ＣＤ１ｄに提示されるα−ガラクトシル−セラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）を認識することである。これは、α−ＧａｌＣｅｒ融合ＣＤ１ｄ四量体を使用することによって、フローサイトメトリーにより、マウス、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）、およびヒトのｉＮＫＴ細胞をモニターすることに利用されている。ヒト−ｉＴＣＲの非変異のループに結合する、マウスのモノクローナル抗体６Ｂ１１もまた、ヒトおよびＮＨＰのｉＮＫＴ細胞をモニターするために使用されている。
【０００８】
ｉＮＫＴ細胞は、ヒトおよび非ヒトの末梢血中の全Ｔ細胞集団のうち極めて小さなサブセットを表す。それらの相対数は、健常者間で１００倍超変わることがあり、ヒトにおけるＣＤ３＋細胞の０．０１％〜１％超のいずれかを表す。ここで該範囲の下位は大多数のヒトを表す。
【０００９】
従来のＴ細胞は成熟して記憶表現型を獲得するために、外的な抗原に暴露させる必要がある。病理学的事象を通じて、または薬理学的介入によって枯渇する従来の記憶Ｔ細胞のクローン増殖した集団は、新しい胸腺の移入物が、同一的に再構成されたＴＣＲとともに、最初の発作として、同様のまたは同一の外的または病原性抗原に暴露された場合にのみ回復することができる。かかるＴ細胞の枯渇によって一定の個体の免疫レパートリー内で「穴」が生じることがある。従来のＴ細胞とは異なり、ｉＮＫＴ細胞は、持続的な再生能をもつ。ヒトにおいて、ｉＮＫＴ細胞の再生は、骨髄移植の次に検討された。ｉＮＫＴ細胞数のベースラインへの完全な回復を、切除治療のための末梢血幹細胞移植救助の１月後に観察した。したがって、ｉＮＫＴ細胞枯渇治療は、他のＴ細胞を枯渇させるよりもリスクが少ないかもしれない。
【００１０】
ｉＮＫＴ細胞は他のＴ細胞と同様に胸腺において発達する。マウスにおける研究によって、ｉＮＫＴ細胞は従来のＴ細胞と異なり、外的な抗原または病原性抗原に前もって暴露する必要なく、ＣＤ１ｄ分子に提示された今まで未知な内因性抗原を認識することによって、自然な発達の間に記憶表現型を獲得したことが示されている。それらの記憶表現型のために、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって提示される外的または内因性の糖脂質抗原への暴露に応答して、末梢免疫コンパートメント内において、それらは急速に活性化し増殖することができる。
【００１１】
ｉＮＫＴ細胞は、自然免疫システムおよび適応免疫システムを両腕とする特性を共有し、よってＴおよびＢ細胞応答ならびに自然免疫を調節することによって独自の役割を果たす（１）。ｉＮＫＴ細胞は即効的であり、これは自然免疫システムの特徴である。それらが抗原特異的な応答などの他のＴ細胞の特質を共有するため、それらはまた適応免疫システムの特徴も示す。それら自体は、夫々免疫応答の発達を増強または緩和するために、前炎症性および免疫調節性の役割を果たすことができる、２つのシステム間をつなぐ橋として働く（２）。
【００１２】
ｉＮＫＴ細胞の特質によって、疾患のための処置としてのｉＮＫＴ細胞機能の操作に向けて、検討が促進した（３、４、５、６）。多数の研究によって、ｉＮＫＴ細胞は、Ｔｈ１およびＴｈ２応答間のバランスを調節できることが示された。これらの細胞は病原体に対する応答、癌における免疫監視機構、および自己免疫の調節において役割を果たすと仮定づけられた。これらの状態の大半について、ｉＮＫＴ細胞の欠損については部分的に特徴づけられるのみであり、いくつかの場合において対立する研究によって論争された。特にヒトの研究は、２つの重要な制限によって制約されている。第一に、大半のヒトの研究は、ｉＮＫＴ細胞の同定に準最適法を用いている。第二に、大半のヒトの研究は、定量的であるのみであり、ｉＮＫＴ細胞数、比率、または機能の調整という機能的な結果に関してはヒトのデータはほとんど存在しない。
【００１３】
ｉＮＫＴ細胞機能は、喘息における潜在的な役割に関して有意な注目を集めた。ｉＮＫＴ細胞の遺伝学的な除去、または薬理学的な遮断のいずれか一方による、ｉＮＫＴ細胞機能の阻害は、マウスにおける気道過敏症（ＡＨＲ）の発達を妨げる（７、８）。これは卵白アルブミンおよびオゾン誘発性ＡＨＲの両方に見られる（９）。卵白アルブミンまたはオゾンに対する暴露の後、野生型マウスの肺においてｉＮＫＴ細胞は増加する。非変異のＴ細胞受容体の一部をコードする遺伝子のノックアウトによってｉＮＫＴ細胞機能が遺伝学的に欠損したマウスにおいて、ｉＮＫＴ細胞の養子移植によって、アレルゲンに対してＡＨＲを引き起こす能力が回復する（９）。逆に、有効なｉＮＫＴ細胞のアゴニストであるα−ＧａｌＣｅｒを有する気道において、ｉＮＫＴ細胞の活性化によって、マウスおよび非ヒト霊長類の両方においてＡＨＲとは見分けのつかない応答を引き起こす（１０、１１）。ｉＮＫＴ細胞が遺伝学的に欠損したマウスもまた、慢性的なセンダイウイルスモデルのＣＯＰＤの気道において病理的な変化の発達に耐性をもつ（１２）。マウスモデルからの発見と同様に、ヒトにおいて、ｉＮＫＴ細胞は健康な人の肺において存在しないが、中等度から軽度な喘息を有する患者の肺において存在し、アレルゲンまたはウイルスの負荷の後にさらに増加する（３、１３、１４）。ＢＡＬ流動体および喘息患者の末梢血におけるｉＮＫＴ細胞レベル間において関係性はほとんどまたは全くないように見える。既存技術は、ｉＮＫＴ細胞が喘息と必然的に関連するか、または喘息の結果であるか、またはｉＮＫＴ細胞機能を妨げることを目指した治療が喘息の処置になり得るかを確定づけていない。
【００１４】
ヒト非変異Ｔ細胞受容体を認識する、マウスのモノクローナル抗体６Ｂ１１は、米国の公開された出願第2007/0160600の対象である。この抗体はヒトｉＮＫＴ細胞に選択的に結合し、ｉＮＫＴ細胞を、他のリンパ球および他のヒト組織型と区別することが可能である。前記出願は、６Ｂ１１抗体が免疫応答を増強するか、または抑制するかについて対立する声明を提供している。前記出願は、ある点では、抗体がｉＮＫＴ細胞の増殖を刺激することを示し、抗体がｉＮＫＴ細胞のアゴニストであることを示唆している。前記出願は、別の点では、ｉＮＫＴ活性の増大が、免疫応答の抑制をもたらすことがあると示唆している。また別の点では、前記出願はｉＮＫＴ活性への干渉が免疫応答を抑制するだろうということを示している。特に前記出願は、免疫応答を抑制するために、トキシンに抗体がカップリングしてｉＮＫＴ細胞を枯渇させるはずであると示唆している。したがって、この出願は、６Ｂ１１抗体の使用が望ましいであろう医療事情を明確にするものではない。
【００１５】
本発明の概要
驚くべきことに、ｉＮＫＴに選択的に結合するある裸の抗体が、低用量でin vivoで一過的にｉＮＫＴ細胞を枯渇させるだろうということが見出された。さらに、ｉＮＫＴに選択的に結合するある抗体が、ｉＮＫＴ細胞を活性化させるだろうということが見出された。予想外に高い親和性でヒトｉＮＫＴ細胞に選択的に結合するヒト抗体も見出された。これらの発見に基づき、気道過敏症状態を処置することができると考えられる（例えば、喘息（アレルギー性喘息を含むが、これに限定しない）および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））。さらに、ｉＮＫＴ細胞が仲介する様々な他の状態、例えば、アレルギー、自己免疫疾患、アレルギーを除く炎症状態、虚血再灌流傷害、鎌状赤血球貧血、血管炎性疾患、移植拒絶、感染性疾患および癌などを処置することができると考えられる。
【００１６】
本発明の一側面により、ｉＮＫＴ細胞機能を抑制する処置の方法を提供する。本発明の一側面により、免疫応答を抑制する処置の方法を提供する。夫々の方法は、処置の必要がある対象に対して、ｉＮＫＴ細胞機能を抑制するために効果的な量においてｉＮＫＴ細胞に選択的に結合する裸の抗体を投与することに関連する。いくつかの態様において、抗体は枯渇抗体(depleting antibody)であり、量はｉＮＫＴ細胞を枯渇させるために効果的である。
【００１７】
前記の方法を様々な障害を処置するために使用することができる。一側面において、抗原に対する対象の免疫応答は抑制される。例えば、抗原は、アレルゲン、自己抗原または移植抗原であってもよい。本発明の一側面において、対象は喘息を患い、対象において処置は１つまたは２つ以上の喘息の症状を抑制する。いくつかの態様において、喘息はアレルギー性の喘息である。いくつかの態様において、対象は、（ｉ）通常の肺機能試験で、穏やかで継続的な喘息の症状（１週間あたり２または３以上の発症）、（ｉｉ）変則的な肺機能試験で、中等度から軽重度で継続的かつ日常的な、または持続的な喘息の症状、または（ｉｉｉ）処置不応性の喘息を患う。一側面において、方法は対象において気道の再構成を抑制する。本発明の別の側面において、対象はＣＯＰＤを患い、処置は対象において１つまたは２つ以上のＣＯＰＤの症状を抑制する。一側面において、処置はＣＯＰＤを患う対象において気道の再構成を抑制する。一側面において、処置は対象における疾患の進行を遅らせる。別の側面において、対象はアレルギー、自己免疫疾患、アレルギーを除く炎症状態、虚血再灌流傷害、鎌状赤血球貧血、または血管炎性疾患を患い、処置は対象において１つまたは２つ以上の疾患の症状を抑制する。別の側面において、対象は移植を受けているか、または移植を受ける候補者であり、処置は１つまたは２つ以上の移植拒絶の症状を抑制する。別の側面において、対象は感染を患い、処置は感染の成長を遅め、感染の成長を止め、または関連した感染性因子を除去し、または対象において１つまたは２つ以上の感染の症状を抑制する。別の側面において、対象は癌を患い、処置は癌の成長を遅め、癌の成長を止め、または癌を除去し、または対象において１つまたは２つ以上の癌の症状を抑制する。前記のいかなる側面および態様において、対象はヒトであってよく、抗体はヒト化抗体であってよい。前記のいかなる側面および態様において、対象はヒトであってよく、抗体は完全ヒト化抗体であってよい。完全ヒト抗体はヒトのアミノ酸配列のみからなる抗体である。いくつかの態様において、完全ヒト抗体は、種々のヒト抗体からのヒトのアミノ酸配列セグメントの複合体である。
【００１８】
本発明は、抗体の使用に関するものであり、その性質は下記に詳述されている。いくつかの態様において、抗体はヒト化抗体である。いくつかの態様において、抗体は全て完全ヒト抗体である。いくつかの態様において、抗体は全て完全ヒト、複合抗体であってもよい。いくつかの態様において、抗体は３つの軽鎖ＣＤＲ領域および３つの重鎖ＣＤＲ領域をもってもよく、ここで３つの軽鎖ＣＤＲ領域および３つの重鎖ＣＤＲ領域の夫々はヒト配列の複合体である。
【００１９】
別の側面において本発明は、ｉＮＫＴ細胞に少なくともある親和性で結合するヒト化抗体に関する。いくつかの態様において、抗体が、組み換えの可溶性ヒトｉＴＣＲへの結合において１．０μｇ／ｍｌ未満であるＩＣ５０でｉＮＫＴ細胞に結合する。いくつかの態様において、ヒト化抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域はヒト配列からなる。
【００２０】
いくつかの態様において、抗体は、配列番号１によって定義されるエピトープに結合する。いくつかの態様において、抗体は、配列番号２によって定義されるエピトープに結合する。いくつかの態様において、抗体は、配列番号２４、２５および２６を含む軽鎖可変領域をもつ。いくつかの態様において、抗体は、配列番号２４、２５および２６を含む軽鎖可変領域をもち、かつ８５位にロイシンももつ。いくつかの態様において、抗体は、配列番号２１、２２および２３を含む重鎖可変領域をもつ。いくつかの態様において、抗体は、配列番号２１、２２および２３を含む重鎖可変領域をもち、かつ２３位にバリンを、かつ／または９３位にスレオニンももつ。いくつかの態様において、抗体は、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４から選択した重鎖可変領域を含む。いくつかの態様において、抗体は、配列番号１５、１６、１７、１８、１９または２０から選択した軽鎖可変領域を含む。いくつかの態様において、抗体は、配列番号１５、１６、１７、１８、１９または２０から選択した軽鎖可変領域、かつ配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４から選択した重鎖可変領域を含む。いくつかの態様において、抗体は配列番号１０および１８を含む。いくつかの態様において、抗体は配列番号２７を含む。いくつかの態様において、抗体は配列番号２８を含む。いくつかの態様において、抗体は配列番号２９を含む。いくつかの態様において、抗体は配列番号２７および２９を含む。いくつかの態様において、抗体は配列番号２８および２９を含む。
【００２１】
本発明の別の側面より、単離したヒト化抗体を提供する。抗体はｉＮＫＴ細胞に選択的に結合し、ここで該抗体は組み換えの可溶性ヒトｉＴＣＲに対する結合において０．９μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０をもつ。いくつかの態様において、ＩＣ５０は０．８μｇ／ｍｌ未満、０．５μｇ／ｍｌ未満および０．３μｇ／ｍｌ未満でもある。いくつかの態様において、ＩＣ５０は０．１と０．９μｇ／ｍｌの間である。いくつかの態様において、ＩＣ５０は０．１と０．５μｇ／ｍｌの間である。
【００２２】
いくつかの態様において、抗体は配列番号１によって定義されるエピトープに結合する。他の態様において、抗体は配列番号２によって定義されるエピトープに結合する。いくつかの態様において、抗体は３つの軽鎖ＣＤＲ領域および３つの重鎖ＣＤＲ領域をもち、ここで３つの軽鎖ＣＤＲ領域および３つの重鎖ＣＤＲ領域の夫々はヒト配列の複合体である。
【００２３】
いくつかの態様において、抗体は配列番号２４、２５および２６を含む軽鎖可変領域をもつ。いくつかの態様において、抗体は配列番号２４、２５および２６を含む軽鎖可変領域をもち、かつ８５位にロイシンをもつ。いくつかの態様において、抗体は配列番号２１、２２および２３を含む重鎖可変領域をもつ。いくつかの態様において、抗体は配列番号２１、２２および２３を含む重鎖可変領域をもち、かつ２３位にバリン、かつ／または９９位にスレオニンをもつ。いくつかの態様において、抗体は配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４から選択した重鎖可変領域を含む。いくつかの態様において、抗体は配列番号１５、１６、１７、１８、１９または２０から選択した軽鎖可変領域を含む。いくつかの態様において、抗体は配列番号１５、１６、１７、１８、１９または２０から選択した軽鎖可変領域、および配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４から選択した重鎖可変領域を含む。いくつかの態様において、抗体は配列番号１０および１８を含む。いくつかの態様において、抗体は配列番号２７を含む。いくつかの態様において、抗体は配列番号２８を含む。いくつかの態様において、抗体は配列番号２９を含む。いくつかの態様において、抗体は配列番号２７および２９を含む。いくつかの態様において、抗体は配列番号２８および２９を含む。
【００２４】
いくつかの態様において、抗体の結合領域は全てのヒトのハプロタイプのヒト末梢血単球に無反応的(non-reactive)である。
【００２５】
前記のいかなる態様において、ヒト化抗体は枯渇抗体であってもよい。前期のいかなる態様において、ヒト化抗体は活性化抗体であってもよい。前記のいかなる態様において、抗体は、対象に投与後、１または２以上の血清サイトカインレベルにおいて有意な変化を誘導しない特質をもってもよい［誘導しない］。
【００２６】
別の側面における本発明は方法である。方法は、ｉＮＫＴ細胞の活性を妨げるために、またはｉＮＫＴ細胞を枯渇させるために効果的な量において、ｉＮＫＴ細胞に選択的に結合する、単離したヒト化抗体と対象のｉＮＫＴ細胞との接触に関する。一態様において、細胞をin vitroで接触させる。一態様において、細胞をin vivoで接触させ、その量は対象における免疫応答を抑制するために十分な量である。一態様において、抗体は枯渇抗体であり、その量は対象においてｉＮＫＴ細胞を枯渇させるために十分な量である。これらの態様において、抗体は、活性化抗体を除く、上記の任意のヒト化抗体である。
【００２７】
別の側面における本発明は方法である。方法は、ｉＮＫＴ細胞を活性化させるために効果的な量において、ｉＮＫＴ細胞に選択的に結合し、活性化させる、単離したヒト化抗体と対象のｉＮＫＴ細胞との接触に関する。一態様において、細胞をin vitroで接触させる。一態様において、細胞をin vivoで接触させ、その量は対象における免疫応答を増強するために十分な量である。これらの態様において、抗体は、ｉＮＫＴ細胞の機能を妨げるか、またはｉＮＫＴ細胞を枯渇させる抗体を除く、上記の任意のヒト化抗体である。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、ヒト末梢血ｉＮＫＴ細胞に結合するＮＫＴＴ１２０を示す。３人のドナー（２６０２７、２６０２８、２６０３１）からのヒト全血を、抗ＣＤ３および抗Ｖα２４ ｍＡｂと合わせて、α−ＧａｌＣｅｒ融合ＣＤ１ｄ四量体、６Ｂ１１−ＦＩＴＣまたはＮＫＴＴ１２０−ＦＩＴＣで染色した。続いて赤血球を溶解し、細胞をフローサイトメトリーによって分析した。示した細胞はＣＤ３＋リンパ球についてゲーティングした。
【００２９】
【図２】図２は、ＮＫＴＴ１２０によるｉＮＫＴ細胞に対するＣＤ１ｄ四量体の結合の遮断を示す。Ａ）ヒトＰＢＭＣを３０μｇ／ｍｌのＮＫＴＴ１２０の存在または非存在下において３０分間インキュベートし、次に、洗浄することなく、ＣＤ３およびα−ＧａｌＣｅｒ融合ＣＤ１ｄ四量体で染色した。抗体の存在は四量体の染色を妨げる。Ｂ）ヒトｉＴＣＲトランスフェクタント（ヒトｉＴＣＲのＶα２４−Ｊα１８およびＶβ１１鎖の両方を発現する）を３０μｇ／ｍｌのＮＫＴＴ１２０の存在または非存在下において３０分間インキュベートし、次に、洗浄することなく、α−ＧａｌＣｅｒ融合ＣＤ１ｄ四量体で染色した。ＮＫＴＴ１２０の存在はα−ＧａｌＣｅｒ融合ＣＤ１ｄ四量体の結合を妨げる。
【００３０】
【図３】図３は、血液、脾臓およびリンパ節における、ＮＫＴＴ１２０によるｉＮＫＴ細胞の枯渇を示す。Ｖα２４トランスジェニックＪα１８欠損マウスの腹腔内にＮＫＴＴ１２０（１投薬につきｎ＝２）を投薬し、４８時間後に屠殺した。続いて、血液、脾臓、および単離したリンパ節リンパ球ならびにｉＮＫＴ細胞数をフローサイトメトリーによって決定した。
【００３１】
【図４】図４は、Ｖａ２４トランスジェニックマウスにおけるＮＫＴＴ１２０によるｉＮＫＴ細胞の枯渇の時間経過を示す。Ａ）Ｖαトランスジェニックマウス（１グループにつきｎ＝２）の腹腔内に１００μｇのＮＫＴＴ１２０を注射し、示した時間ポイントで屠殺した。脾臓のＣＤ３＋ＮＫ１．１＋ｉＮＫＴ細胞をゲーティングし、６Ｂ１１結合細胞のパーセンテージを評価した。Ｂ）Ｖα２４トランスジェニックマウス（１グループにつきｎ＝２）に１００μｇのＮＫＴＴ１２０を注射した。対照グループにはＮＫＴＴ１２０を与えなかった。４８時間後、別々のＮＫＴＴ１２０処置マウスおよび対照マウスに２μｇのα−ＧａｌＣｅｒを注射した。α−ＧａｌＣｅｒ注射の２時間後、マウスを屠殺し、脾臓のＣＤ３＋ＮＫ１．１＋ｉＮＫＴ細胞をフローサイトメトリーによって細胞内のＩＦＮγについてアッセイした。
【００３２】
【図５】図５は、Ｖａ２４トランスジェニックマウスにおけるｉＮＫＴ細胞の薬理学的な枯渇が、α−ＧａｌＣｅｒ仲介ｉＮＫＴ細胞依存的ＡＨＲを抑止することを示す。ＢＡＬＢ／ｃ ｎ＝６（１グループにつきｎ＝３）に戻し交配したＶα２４トランスジェニックマウスの腹腔内に１００μｇのＮＫＴＴ１０３またはリツキシマブを注射した。４８時間後、マウスに１μｇのα−ＧａｌＣｅｒを負荷した。追加の２４時間後、マウスにメタコリンを負荷し、肺耐性（ＲＬ）および動的コンプライアンス（Ｃｄｙｎ、非表示）を評価した。リツキシマブを陰性アイソタイプ対照として使用した。
【００３３】
【図６】図６は、ヒトおよびカニクイザルのｉＮＫＴ細胞の頻度の比較を示す。カニクイザルのｉＮＫＴ細胞の頻度の範囲は、ＣＤ３、抗Ｖα２４（クローンＣ１５）および６Ｂ１１の結合によって決定されるように、末梢血においてヒトの対象において発見されるそれと著しく同等である。
【００３４】
【図７】図７は、ヒトおよびカニクイザルのｉＮＫＴ細胞への飽和結合の比較を示す。カニクイザル（ＮＨＰ）およびヒトのｉＮＫＴ細胞は直接競合結合アッセイにおいて、同様なＮＫＴＴ１２０の飽和結合を示す。カニクイザルまたはヒトの全血を、示したＮＫＴＴ１２０の濃度でインキュベートし、次にｉＮＫＴ細胞の飽和結合を評価するために、蛍光色素で標識した６Ｂ１１で染色した。ヒト試料はResearch Blood Components, Inc.から購入した。
【００３５】
【図８】図８は、投薬から２４時間後のＮＫＴＴ１２０によるｉＮＫＴ細胞の枯渇を示す。動物にＮＫＴＴ１２０の単回用量を処置し、７日間モニターした。データは、処置（１投薬につきｎ＝１）から２４時間後のｉＮＫＴ細胞における用量依存的な減少を示す。動物のこのコホートにおける前処置ベースラインのｉＮＫＴレベルは、ＣＤ３＋細胞の０．１２％〜１．１３％の範囲におよぶ。ｉＮＫＴ細胞の完全な枯渇を、０．０３ｍｇ／ｋｇの用量での投薬から２４時間後に観察した。
【００３６】
【図９】図９は、カニクイザルにおけるＮＫＴＴ１２０によるｉＮＫＴ細胞枯渇を示す。カニクイザルにおけるｉＮＫＴ細胞枯渇のＮＫＴＴ１２０用量反応。
【００３７】
【図１０】図１０は、ＮＫＴＴ１２０のｉＮＫＴ細胞、Ｂ細胞およびＴ細胞への効果を示す。ＮＫＴＴ１２０（０．０３ｍｇ／ｋｇ）の処置はＢ細胞および他のＴ細胞への有意な効果を示さない。
【００３８】
【図１１】図１１は、ヒト全血におけるサイトカインレベルに対するＮＫＴＴ１２０の効果を示す。未処置、ＮＫＴＴ１２０および抗ＣＤ３処置をした、健康なドナー（ｎ＝４）からの全血試料におけるサイトカインレベル。対照レベルと異なった結果のみを示す。健康なドナーからの血液試料はResearch Blood Components, Inc.から購入した。
【００３９】
【図１２】図１２は、Ｆｃエフェクター機能が減少した抗ｉＮＫＴ ｍＡｂによるｉＮＫＴ細胞の活性化を示す。
【００４０】
詳細な説明
以下の詳細な記述は、本発明のある側面の実例として作成されている。他の側面を熟慮し、本開示の範囲または精神から外れることなく達成してもよいと解釈すべきである。したがって、以下の詳細な記述は、限られた意味で用いられるべきではない。本明細書で使用される科学的および技術的な用語は、特に指定がない限り、当該分野おいて一般的に使用される意味をもつ。本明細書において提供される定義は、本明細書で頻繁に使用されるある用語の理解を助けるものであり、本開示の範囲を制限する意図はない。単数形は「ａ」、「ａｎ」を形成し、「ｔｈｅ」は、その内容が明確に指示しない限り、複数形を含む。用語「ｏｒ」は、その内容が明確に指示しない限り、「および／または」を含む意味において一般的に用いられる。
【００４１】
一側面における本発明は、様々な目的に有用である、本明細書に記載の抗体である。抗体は生物学的試料におけるｉＮＫＴ細胞の存在を同定するために使用することができる。それらは、抗体に結合した剤をｉＮＫＴ細胞に対してin vitroまたはin vivoで輸送するために使用できる。かかる剤は共有結合的に、または非共有結合的に取り付けてもよく、例えば標識、トキシン、共刺激分子などを含んでもよい。抗体はｉＮＫＴ細胞に干渉させるか、またはその活性を妨げるために使用することができる。枯渇抗体はin vitroまたはin vivoで細胞集団からｉＮＫＴ細胞を枯渇させるために使用することができる。活性化抗体はin vitroまたはin vivoでｉＮＫＴ細胞を活性化するために使用できる。抗体は様々な病状、特にヒトにおける病状を処置するために使用することもできる。遮断抗体または枯渇抗体の場合において、抗体は喘息、ＣＯＰＤ、アレルギー、アレルギーを除く炎症状態、移植拒絶、虚血再灌流傷害、鎌状赤血球貧血および自己免疫疾患を処置するために使用できると考えられる。活性化抗体の場合において、例えば癌および感染性疾患を処置するために抗体を使用できると考えられる。
【００４２】
「活性化抗体」は、それがin vivoでｉＮＫＴ細胞に結合する場合、ｉＮＫＴ細胞の活性の遮断またはｉＮＫＴ細胞の枯渇と対比して、ｉＮＫＴ細胞を刺激し、インターフェロンガンマ、ＩＬ４、ＩＬ１０またはＩＬ１３を産生させる抗体である。活性化抗体は、典型的に、Ｆｃ部分をもたないか、またはＦｃγＲＩおよびＣｌｑに結合しないＦｃ部分をもつ。一態様において、活性化抗体のＦｃ部分はＦｃγＲＩ、ＣｌｑまたはＦｃγＲＩＩＩに結合しない。かかる機能性を有する抗体が一般的に知られている。ＩｇＧ４のＦｃ領域を有する抗体などの、かかるネイティブ抗体が存在する。抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）の機能性を除去するために遺伝学的にまたは化学的に改変したＦｃ部分を有する抗体も存在する。
【００４３】
「アレルギー」は物質（アレルゲンまたは環境性抗原）に対する異常な免疫応答を指す。アレルギーは、典型的には、アレルゲンに対する免疫グロブリン、ＩｇＥの特定のクラスからの抗体の産生に関連する、突発的な状態である。アレルギー反応の症状は、ＩｇＥが抗原と反応する体内の場所に依存して変化する。反応が呼吸上皮に沿って起こる場合、一般的に症状はくしゃみ、咳および喘息の反応である。
【００４４】
「アレルゲン」は感受性のある対象において、アレルギーの、または喘息の反応を引き起こすこともある物質を意味する。アレルゲンのリストは多数あり、花粉、植物、昆虫（毒液を含む）、動物（動物のフケを含む）、真菌胞子および薬剤、ならびに環境性の抗原または刺激物（例えば、煙、スモッグ、オゾン、ハイドロカーボン、ダスト、寒気）を含んでもよい。
【００４５】
「喘息」は気道の炎症および狭窄、ならびに吸い込んだ剤に対する気道の増大した反応性によって特徴づけられる呼吸器系の障害である。喘息は頻繁にアトピー性またはアレルギー性の状態と関連づけられるが、独占的に関連づけられることはない。喘息の症状は、気流閉塞からもたらされる喘鳴、呼吸困難、胸の圧迫感および咳の再発を含む。喘息と関連づけられる気道の炎症は、気道上皮の裸出、基底膜下におけるコラーゲン堆積、浮腫、肥満細胞の活性化、好中球、好酸球およびリンパ球を含む炎症細胞浸潤などの多くの生理学的な変化の観察を通じて検出できる。気道炎症の結果、喘息患者は気道過敏性（ＡＨＲ）、気流制限、呼吸器症状、および疾患慢性化を経験することが多い。気流制限は、気管支閉塞に至ることが多い、急性気管支収縮、気道浮腫、粘液栓形成、および気道再構成などの特徴を含む。
【００４６】
「遮断抗体」は、それがin vivoでｉＮＫＴ細胞に結合する場合、インターフェロンガンマ、ＩＬ４、ＩＬ１０、およびＩＬ１３を産生するｉＮＫＴ細胞の能力の阻止または減少をもたらす抗体である。遮断抗体は枯渇抗体を含む。
【００４７】
「複合抗体」は、種々の抗体からの配列セグメントを包含する抗体である。
【００４８】
「枯渇抗体」は、それがin vivoでｉＮＫＴ細胞に結合する場合、ｉＮＫＴ細胞の死滅をもたらす抗体である。死滅は完全な死滅である必要はない。代わりに、死滅はｉＮＫＴ細胞の検出可能な減少を含める。減少は、例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、またはそれ以上のｉＮＫＴ細胞における減少であってもよい。枯渇抗体は典型的には、ＦｃγＲＩおよび／またはＣ１ｑに結合するＦｃ部分をもつ。一態様において、枯渇抗体のＦｃ部分はＦｃγＲＩ、Ｃ１ｑ、およびＦｃγＲＩＩＩに結合する。かかる機能性を有する抗体は一般的に知られている。ＩｇＧ１のＦｃ領域を有する抗体などの、かかるネイティブ抗体が存在する。ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣの機能性を増強するために遺伝学的または化学的に改変されたＦｃ部分を有する抗体も存在する。
【００４９】
「免疫応答を増強する」は、一般的に、ｉＮＫＴ細胞によるインターフェロンガンマ、ＩＬ４、ＩＬ１０、またはＩＬ１３の産生を増加させること、ケモカイン受容体の表面発現を増加させること、またはｉＮＫＴ細胞を増殖させることを意味する。特定の疾患または状態に関連して、「免疫応答を増強させる」は、１つまたは２つ以上の疾患または状態、例えば、１つまたは２つ以上の癌または感染性疾患の症状の発達を止めるか、進行を阻害するか、発達を逆戻りさせるか、あるいは緩和させるか、寛解させることを意味する。
【００５０】
「単離した」は、抗体（または抗体をコードする核酸分子）という面において、抗体（または核酸）をその自然環境から除くこと、またはその自然状態から改変することを意味する。したがって、「単離した」は、抗体または核酸分子をその自然環境から除去した程度、またはその自然状態から改変した程度を、必ずしも反映するとは限らない。しかし、ある程度精製した抗体または核酸分子は「単離した」であると解釈されるだろう。
【００５１】
「対象」はヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、またはヤギなどの哺乳動物を意味する。ある重要な態様において、哺乳動物はヒトである。
【００５２】
「ｉＮＫＴ細胞機能を抑える」は、一般的に、ｉＮＫＴ細胞の活性を阻害するか、またはｉＮＫＴ細胞を枯渇させることによって、ｉＮＫＴ細胞の活性を減少させることを意味する。特定の疾患または状態に関連して、「ｉＮＫＴ細胞機能を抑える」は、１つまたは２つ以上の疾患または症状、例えば、喘息（アレルギー性喘息を含む）、ＣＯＰＤ、アレルギー、アレルギーを除く炎症性疾患、移植片対宿主病、移植片拒絶、虚血再灌流傷害および自己免疫疾患の１つまたは２つ以上の症状の発達を止めるか、進行を阻害するか、発達を逆戻りさせるか、あるいは緩和させるか、寛解させることを意味する。
【００５３】
本明細書の方法は抗体を用いる。抗体は選択的にｉＮＫＴ細胞に結合する。ｉＮＫＴ細胞に選択的に結合する抗体は、ある種のｉＮＫＴ細胞に結合し、生理学的な条件下のような抗体が使用される条件下で、他のＮＫＴ型、他のリンパ球型、および全ての他の組織型を含む、該種の他の組織型から該種のｉＮＫＴ細胞を判別するために、in vitroまたはin vivoで使用される能力をもつことを意味する。一態様において、抗体は、選択的にヒトｉＮＫＴ細胞に結合する。一態様において、抗体は、ｉＮＫＴ細胞のＣＤＲ３ループに結合する。一態様において、抗体は配列番号１によって定義されるエピトープに選択的に結合する。他の態様において、抗体は配列番号１および２の両方によって定義されるエピトープに選択的に結合する。
【００５４】
いくつかの態様において、抗体は裸の抗体である。「裸の抗体(naked antibody)」は、抗原結合フラグメントを含むが、トキシンなどの分離したエフェクター分子に結合していない抗体を意味する。いくつかの態様における裸の抗体は、全てモノクローナル抗体である。いくつかの態様における裸の抗体はヒト化モノクローナル抗体である。いくつかの態様における、裸の抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。裸の抗体のＦｃ領域は、例えば、抗体が、改善された半減期またはＡＤＣＣを仲介する改善された能力をもつように、改変されてもよい。いくつかの態様において、裸の抗体のＦｃ領域は、例えば、抗体が、減少した、ＡＤＣＣを仲介する能力をもつように、改変されてもよい。裸の抗体は哺乳動物または非哺乳動物の細胞において生産してもよく、したがって、様々な糖化パターンをもってもよい。
【００５５】
「抗体」という用語は広義において使用され、具体的には、例えば、単一のモノクローナル抗体、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、単鎖抗体、および抗体の抗原結合フラグメントを含む。抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭなどのいかなる免疫グロブリンからの免疫グロブリンの定常ドメインを含んでもよい。いくつかの態様において、定常ドメインは、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を仲介するものである。
【００５６】
本明細書に使用されているように、「抗原結合フラグメント」は抗原に結合する無傷の抗体の一部分を意味する。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；二重特異性抗体；線型抗体（Zapata et al., Protein Eng. 8 (10): 1057-1062 [1995]）；および単鎖抗体分子を含む。
【００５７】
「Ｆｖ」は完全な抗原認識結合部位を包含する、最小な抗体フラグメントである。本領域は、強い非共有結合性の会合における、１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この立体配置において、夫々の可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用し、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面における抗原結合部位を定義する。まとめると、６つのＣＤＲは、抗体に対して抗原結合特異性を与える。
【００５８】
Ｆａｂフラグメントは軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）も包含する。Ｆａｂフラグメントは、抗体のヒンジ領域から１つまたは２つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での少数の残基の追加において、Ｆａｂ’フラグメントとは異なる。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、それらの間においてヒンジのシステインをもつＦａｂ’フラグメントの対として当初産生された。抗体フラグメントの他の化学的なカップリングも知られている。
【００５９】
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパおよびラムダと呼ばれる、２つの明らかに離れた異なるタイプの１つに帰属することができる。
【００６０】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、ここで、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖において存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドはさらに、ｓＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成することを可能にさせる、ＶＨおよびＶＬドメイン間のポリペプチドリンカーを含む。ｓＦｖの総説は、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994) を参照。
【００６１】
ハイブリドーマという用語は、ハイブリドーマ細胞を永久なモノクローナル抗体産生工場の一種にする、特定の抗原を認識できるＢ細胞、および永続的に生きる骨髄腫細胞の組み合わせを説明する。かかる抗体は動物細胞、典型的にはマウスから生成する。もしマウスのモノクローナル抗体を、ヒトなどの異なる種に処置するために使用する場合、ヒトの免疫システムはマウス抗体を「異物」として認識し、それらに対して免疫応答を開始するだろう。この免疫応答を回避するために、ヒト免疫システムによって認識されるマウス抗体の一部を遺伝学的にヒト抗体の部分と置き換えることができる。このマウス−ヒト抗体遺伝子の産物を「ヒト化」モノクローナル抗体と呼ぶ。この産物は、患者自身の免疫システムによって認識され破壊されることを回避する、通常のヒト抗体と十分によく似ている。これによって、もし抗体をヒトにおいて治療上使用する場合、潜在的に有害な免疫応答を誘発することを回避する。
【００６２】
いくつかの態様において、抗体はヒトに投与したときに免疫応答を誘発しない。このように、後に続く投与に干渉するであろう好ましくない免疫応答を生み出すことなく、１回より多く、いくつかの態様においては、年間で数回またはより多くの回数で投与することができる。ヒト化抗体に関連して本明細書において使用されるように、「免疫応答を誘発しない」は、ヒトハプロタイプの多様性を表すヒトＰＢＭＣの一団と接触した場合に、バックグラウンド超のサイトカイン応答を生成しないことを意味する。かかる試験は以下の例において詳しく述べられている。
【００６３】
次に、ヒト化形態の非ヒト（例えばマウス）抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を包含する、キメラの免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそのフラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、または抗体の他の抗原結合部分配列など）である。ヒト化抗体は典型的に、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、望ましい特異性、親和性、および容量をもつ、マウス、ラット、またはウサギなどの非ヒトの種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基と置き換わったヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は対応する非ヒト残基と置き換えられている。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体、持ち込まれた(imported)ＣＤＲ配列、持ち込まれたフレームワーク配列のいずれにおいても見つからない残基をも含んでもよい。一般的に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのそれらに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のそれらである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。ヒト化抗体は最適には、少なくとも免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれの部分も含むであろう（Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)）。
【００６４】
非ヒト抗体をヒト化する方法は当該分野においてよく知られている。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒトであるソースからそれに導入される１つまたは２つ以上のアミノ酸残基をもつ。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「持ち込み(import)」可変ドメインから典型的に取られる「持ち込み」残基を指すことが多い。ヒト化はWinterおよび共同研究者の方法（Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)））に従って、げっ歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することによって行うことができる。したがって、かかる「ヒト化」抗体はキメラ抗体（米国特許第4,816,567号）である、ここで無傷のヒト可変ドメインは、非ヒトの種からの対応する配列に置換されているため、実質的に存在しない。実際には、ヒト化抗体は典型的に、いくつかのＣＤＲ残基およびおそらくいくつかのＦＲ残基が、げっ歯類の抗体における類似した部位からの残基によって置換される、ヒト抗体である。
【００６５】
ヒト化抗体の作製において使用されるヒト可変ドメイン、軽および重の両方の選択によって抗原性を減少できる。「ベストフィット」方法により、げっ歯類の抗体の可変ドメインの配列を、知られたヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングする。ヒト配列またはげっ歯類のそれに最も近い配列の組み合わせは次にヒト化抗体のヒトフレームワーク（ＦＲ）として許容される（Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)）。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークはいくつかの種々のヒト化抗体に使用してもよい（Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)）。
【００６６】
一態様において、以下の例において示されるように、ＣＤＲ領域は、１つのヒト配列において見出されるＣＤＲの１つのセグメント、および別のヒト配列において見出される同じＣＤＲの別のセグメント、セグメントが交わる重複領域で共通配列をもつ２つの配列の夫々を有する、重複するヒト配列の複合体から作製される。一態様において、ヒト配列の複合体は、知られたＴ細胞エピトープをもたない。一態様において、以下の例に示されるように、ヒト配列の複合体はヒトにおいて免疫応答を誘発しない。
【００６７】
抗原を高い親和性で保持し、かつ他の好ましい生理学的特性を有するように抗体をヒト化することはさらに重要である。この点において、ＣＤＲの外部にアミノ酸があってもよく、これは抗体の親和性に寄与する。またこれらの残基を含むことは、許容可能な親和性の抗体をもつために重要になることもある。本明細書に使用されるように、可変領域のコンセンサス配列はＣＤＲおよび、抗原結合特異性を与えるために重要であると考えられ、かつヒト化抗体において含まれるべきである、ある他の「フレームワーク」残基を含む、可変領域のその一部である。コンセンサス配列において含まれない残基は、ｉＮＫＴ細胞の抗体に対する親和性の実質的な減少なしに、代替できる可能性がより高い。コンセンサス配列は、例えば、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを使用することによって選択する。選択した候補免疫グロブリン配列の確からしい三次元立体構造を説明し表示する、コンピュータープログラムも入手可能である。これらの表示の精査によって、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の潜在的な役割の分析、つまり、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響する残基の分析が可能となる。
【００６８】
免疫化において、内因性免疫グロブリン産生の存在しない条件下においてヒト抗体の完全なレパートリーを産生することが可能である、トランスジェニック動物（例えばマウス）を同様に用いることができる。例えば、キメラマウスおよび生殖細胞系変異マウスにおいて、抗体の重鎖結合領域（Ｊ（Ｈ））遺伝子のホモ接合欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらす。かかる生殖細胞系変異マウスにおいて、ヒト生殖細胞系の免疫グロブリン遺伝子アレイのトランスファーは、抗原負荷に際し、ヒト抗体の産生をもたらすであろう（例えば、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-255 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol., 7:33 (1993)）。ヒト抗体はファージディスプレイライブラリーにおいても産生することができる（Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)）。ヒトモノクローナル抗体の調製について、CoteらおよびBoernerらの技術を入手することも可能である（Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)0; Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)）。
【００６９】
本発明がいかなる理論にも拘泥されないことを望んでいるが、本発明の裸のブロック抗体は、投与された場合にｉＮＫＴ細胞の活性に干渉するだけでなく、ｉＮＫＴ細胞の枯渇をもたらすと考えられる。この枯渇は、規定時間を超えて保存されたｉＮＫＴ細胞集団について一過的であるとも考えられる。ｉＮＫＴ細胞の枯渇はＡＤＣＣによって仲介されると考えられる。このようにして、驚くべきことに、裸の抗体はｉＮＫＴ細胞によって仲介される免疫応答を抑えるために使用することができる。かかる免疫応答は、喘息（アレルギー性喘息を含む）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー、自己免疫疾患、アレルギーを除く炎症状態、虚血再灌流傷害、血管炎性疾患、および移植拒絶を含む。
【００７０】
一態様において、抗体はＣＨＯ細胞において産生される。ＣＨＯ細胞において産生される裸の抗体は、ＣＨＯ細胞は最適なＡＤＣＣのための糖化パターンをもつと考えられないにも関わらず、ｉＮＫＴ細胞を枯渇させる場合において有効であることが見出された。これらの抗体もまた、ＡＤＣＣによって仲介される枯渇を増加させるためのＦｃ領域へのいかなる増強の不足にもかかわらず、ｉＮＫＴ細胞を枯渇させる場合において有効である。これら抗体がかかる増強なしに極めて有効であることは驚くべきことである。
【００７１】
いくつかの態様において、枯渇抗体は、対象への投与後、１または２以上の血清サイトカインレベルにおいて有意な変化を誘導しない。「有意な変化がない」は、対象における１または２以上の血清サイトカインレベルにおける変化が、枯渇抗体の投与後に、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満であることを意味する。いくつかの態様において、血清サイトカインレベルは、枯渇抗体の投与から２時間、４時間、８時間、１６時間、または２４時間後までに有意な変化を示さない。血清サイトカインの例は、表８に示されるものを含むが、これらに限定されることはない。いくつかの態様において、枯渇抗体は、図８において示される１または２以上の血清サイトカインレベルにおいて有意な変化を誘導しない。いくつかの態様において、枯渇抗体は、図８において示される全ての血清サイトカインレベルにおいて有意な変化を誘導しない。いくつかの態様において、枯渇抗体は、表８において示される２、３、４、５、または６のいかなる血清サイトカインレベルにおいて有意な変化を誘導しない。いくつかの態様において、枯渇抗体は、いかなる１または２以上（全てを含む）の血清ＩＦＮγ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１ ＲＡおよびＭＩＰ−１βのレベルにおいて有意な変化を誘導しない。
【００７２】
上記のように、抗体の有効性を増強させるための戦略はよく知られている。これらの変化のいくつかは、Ｆｃ領域に対する変化を経る。いくつかは可変領域に対する変化に関連する。後者の例において、フレームワーク領域に対する変化によって、抗体がその標的に結合する能力を増強することができる。さらに、可変領域に対する変化は抗体の半減期を延ばすことが可能であることが示された。例えば、“Reduced elimination of IgG antibodies by engineering the variable region”, Hattori et al., Protein Engineering, Design and Selection, vol 23 no. 5, pp. 385-392, 2010を参照。
【００７３】
一般的に、ＩｇＧ１は、抗体依存性細胞仲介性細胞障害および補体活性化によって細胞死を仲介するであろう抗体のよく知られた選択である。ＩｇＧ３は、おそらく、そのいくぶんか短い半減期および広範囲なアロタイプの多型のため、より控えめに使用されている。ＩｇＧ１は、その細胞死エフェクター機能を増強させるために改変されている。例えば、米国公開出願第2008/008018344号を参照。かかる改変に対するある特定なアプローチは“Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function”, Dahiyat et al, PNAS, vol.103, No 11, 4005-4010, March 14, 2006に記載されている。ＩｇＧ４は、他方、ＦｃγＲＩに対して低い親和性をもつため、活性化抗体として用いられている。ＩｇＧ４はそのＦｃエフェクター機能を減少させるために改変され、活性化抗体としてさらにより適したものになっている。例えば、２つの単一な残基の置換によって改変されたＦｃ領域は“Elimination of Fc Receptor-dependent Effector Function of a Modified IgG Monoclonal Antibody to Human CD4”, Truneh et al., The Journal of Immunology, 1925-1933, 2000に記載されている。Ｆｃ領域の糖化に対する変化も、抗体に基づく治療を改善するために作製されている。例えば、Glycosylation as a strategy to improve antibody-based therapeutics”, Jefferis, R., Nature Reviews, Vol 8, March 2009, 226-234を参照。上記の全てのかかる改変は本発明の範囲内である。
【００７４】
一般的に、宿主細胞はヒト化抗体の産生のために、クローニングベクターまたは発現ベクターでトランスフェクションまたは形質転換を行ってもよく、プロモーター誘導、形質転換体の選択、または望ましい配列をコードする遺伝子の増幅に適するように改変された従来の栄養培地において培養してもよい。培地、気温、ｐＨなどの培養条件は、過度な実験をすることなく、当業者が選択することができる。一般的に、細胞培養の生産性を最大化させるための原理、プロトコルおよび実践的な技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) and Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition, vols. 1-3, eds. Sambrook and Russel (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Pressにおいて見つけることができる。
【００７５】
真核細胞のトランスフェクションおよび原核細胞の形質転換の方法は、当該分野における当業者に知られており、例えばＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム仲介およびエレクトロポレーションを含む。形質転換は、使用する宿主細胞に依存して、かかる細胞に適切な標準的な技術を使用して行う。例えば、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition, vols. 1-3, eds. Sambrook and Russel (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載があるような、塩化カルシウムを用いるカルシウム処置、またはエレクトロポレーションを原核生物に使用してもよい。細胞壁を包含しない哺乳動物細胞には、Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈殿法を用いてもよい。哺乳動物細胞ホストシステムのトランスフェクションの一般的な側面は、例えば、米国特許第４，３９９，２１６号において記載されている。酵母への形質転換は、典型的にはVan Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977)またはHsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979)の方法によって行う。しかし、核のマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞との微生物プロトプラスト融合、またはポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン、などの細胞へのＤＮＡ導入のための他の方法を用いてもよい。哺乳動物細胞を形質転換するための様々な技術は、Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)およびMansour et al., Nature, 336:348-352 (1988)を参照。
【００７６】
本記載のベクターにおけるＤＮＡのクローニングに適した宿主細胞は、原核生物、酵母、高等真核細胞を含む。適した原核生物は、グラム陰性生物またはグラム陽性生物などの真正細菌、例えば大腸菌などのEnterobacteriaceaeを含む。大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ATCC 31,446）；大腸菌Ｘ１７７６（ATCC 31,537）；大腸菌株Ｗ３１１０（ATCC 27,325）およびＫ５ ７７２（ATCC 53,635）のような様々な大腸菌株は公的に入手可能である。他の適した原核生物の宿主細胞は、Escherichia、例えば大腸菌、Enterobacter、Erwinia、Klebsiella、Proteus、Salmonella、例えばSalmonella typhimurium、Serratia、例えばSerratia marcescans、Shigella、B. subtilisおよびB. licheniformisなどのBacilli（例えば１９８９年4月１２日に公開されたＤＤ ２６６，７１０において開示されたB. licheniformis 41P）、P. aeruginosaなどのPseudomonas、およびStreptomycesを含む。代わりに、または加えて、クローニングのin vitroの方法、例えばＰＣＲまたは他の核酸ポリメラーゼ反応が適している。
【００７７】
糖化したヒト化抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物に由来するそれらを含む。無脊椎動物の細胞の例は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９などの昆虫細胞、ならびに植物細胞を含む。有用な哺乳動物の宿主細胞株の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）およびＣＯＳ細胞を含む。より具体的な例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ATCC CRL 1651）で形質転換したサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（懸濁培養における増殖のためにサブクローニングした２９３または２９３細胞、Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＰ（ＣＨＯ、Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ATCC CCL 75）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；およびマウス乳癌（ＭＭＴ ０６０５６２、ATCC CCL51）を含む。適した宿主細胞の選択は、当該分野において日常的な技能の範囲内である。
【００７８】
ヒト化抗体（またはその一部）をコードする核酸（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）は、クローニング（ＤＮＡの複製）または発現のための複製可能なベクターに挿入されてもよい。様々なベクターは公的に入手可能である。例えば、ベクターは、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、またはファージの形態であってもよい。適した核酸配列は、様々な方法によってベクターに挿入することができる。一般的に、ＤＮＡは、当該分野において知られた技術を使用して、適した制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。ベクターの構成要素は一般的に、１つまたは２つ以上のシグナル配列、複製開始点、１つまたは２つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終了配列を含むが、これらに限定することはない。これら構成要素の１つまたは２つ以上を含む、適したベクターの構築には、当該分野において当業者によく知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
【００７９】
ヒト化抗体（またはその一部）は、直接的のみならず、異種ポリペプチドを有する融合ペプチドとしてもまた、組み換えで産生されてもよく、該異種ポリペプチドは、成熟したタンパク質またはポリペプチドのＮ末端にある特定の切断部位をもつ、シグナル配列であっても、他のポリペプチドであってもよい。一般的に、シグナル配列は、ベクターの構成要素であっても、ベクター内に挿入された、ヒト化抗体（またはその一部）をコードするＤＮＡの一部であってもよい。
【００８０】
発現ベクターまたはクローニングベクターは、ベクターが１つまたは２つ以上の選択した宿主細胞において複製することを可能にする核酸配列を含んでもよい。かかる配列は様々な微生物、酵母、およびウイルスでよく知られている。ｐＢＲ３２２プラスミドからの複製開始点は、大半のグラム陰性細菌に適しており、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルスの開始点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、またはＢＰＶ）は哺乳動物細胞においてクローニングベクターに有用である。
【００８１】
発現およびクローニングベクターは、選択可能マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を包含してもよい。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他のトキシン、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリンに対する耐性を与えるタンパク質、（ｂ）栄養要求性欠乏を補うタンパク質、または（ｃ）複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードし、例えばBacilliのＤ−アラニンラセミ化酵素をコードする遺伝子がある。
【００８２】
発現およびクローニングベクターはたいてい、ｍＲＮＡ合成を方向づける核酸配列をコードするヒト化抗体（またはその部分）に、操作可能に連結したプロモーターを包含する。様々な潜在的な宿主細胞によって認識されるプロモーターがよく知られている。原核生物の宿主に使用する際に適したプロモーターは、ベータ−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーターシステム[Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)]、アルカリフォスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム[Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776]、およびｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーター [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)] を含む。細菌システムでの使用のためのプロモーターは、ＨＣＮまたはＫｉｒ２．１チャンネルをコードするＤＮＡに操作可能に連結したシャイン−ダルガノ（Ｓ．Ｄ．）配列もまた包含するであろう。
【００８３】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのヒト化抗体（またはその一部）の転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（UK 2,211,504 published Jul. 5, 1989）、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、サルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られたプロモーター、異種哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから得られたプロモーター、およびヒートショックプロモーターから得られたプロモーターによって制御し、かかる提供されるプロモーターは宿主細胞システムに適合性がある。
【００８４】
高等真核生物によるヒト化抗体をコードするＤＮＡの転写は、ベクターへのエンハンサー配列の挿入によって増加することがある。エンハンサーは、その転写を増加させるプロモーターに働く、たいてい約１０から３００ｂｐのＤＮＡのシス作用エレメントである。多くのエンハンサー配列は哺乳動物の遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ−フェトタンパク質、およびインシュリン）から現在知られている。しかし、典型的には、真核生物細胞のウイルスからのエンハンサーが用いられるであろう。例は、複製開始点の後期側（１００−２７０ｂｐ）のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを含む。エンハンサーは、ヒト化抗体（またはその部分）をコードする配列に対して５’または３’の位置で、ベクター内につなぎ合わされてもよいが、好ましくはプロモーターから５’の部位に位置付られる。
【００８５】
真核生物の宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物からの有核細胞）において使用される発現ベクターは、転写を終了させるため、およびｍＲＮＡを安定化させるために必要な配列も含むであろう。かかる配列は、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’非翻訳領域、およびときどき３’非翻訳領域から一般的に獲得できる。これらの領域は、ヒト化抗体（またはその一部）をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分において、ポリアデニル化フラグメントとして翻訳されるヌクレオチドセグメントを包含する。
【００８６】
例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターは、対照エレメントの構成成分に操作可能に連結してもよい。例えば、典型的なベクターは、転写開始領域、発現されるタンパク質のヌクレオチド配列、および転写終了領域を含む。典型的には、かかる操作可能に連結したコンストラクトは、ウイルスのシスエレメントであり、ＡＡＶ ＩＴＲ配列を有する、その５および３の領域に隣接するであろう。対照配列は、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびサルウイルス４０などのウイルスに由来するプロモーターから提供可能であることが多い。ウイルスの調節配列は、様々な細胞において高いレベルの発現を達成するために選ぶことができる。代わりに、初期サイトメガロウイルスプロモーターのような普遍的に発現するプロモーターは、いかなる細胞型においても発現を達成するために利用することができる。第三の代替案は、組織特異的な発現を駆動するプロモーターの使用である。このアプローチは、非標的組織において、望ましいタンパク質の発現が枯渇効果をもつかもしれない場合に、特に有用である。したがって、様々な態様により、ベクターは、心臓特異的なプロモーターとして機能する、ヒト脳性ナトリウム利尿ペプチド（ｈＢＮＰ）のプロモーターの近位を包含する。かかるベクターの構築についての詳細は、LaPointe et al., "Left Ventricular Targeting of Reporter Gene Expression In Vivo by Human BNP Promoter in an Adenoviral Vector," Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 283:H1439-45 (2002)を参照。
【００８７】
様々な態様において、ヒト化抗体はコンセンサス配列をもつ重鎖可変領域を含む。コンセンサス配列は６Ｂ１１に基づいて開発し、６Ｂ１１重鎖のＣＤＲ領域の全て、１つまたは２つ以上のフレームワーク残基を含み、残るアミノ酸には、一態様において、抗体はいかなる配列またはヒト抗体からの配列の複合体をも含む。一態様において、軽鎖コンセンサス配列は、配列番号２４、２５、および２６、かつ８５位にロイシンを含む。いくつかの態様において、重鎖コンセンサス配列は配列番号２１、２２、および２３、かつ２３位にバリン、かつ／または９９位にスレオニンをもつ。追加的な望ましいフレームワーク残基は、表１において強調表示されている。
【００８８】
様々な態様において、ヒト化抗体は配列番号：７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４のアミノ酸配列、または配列番号：７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４に９０％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上相同だが、常に配列番号２４、２５、および２６のコンセンサス配列、かつ８５位にロイシンを含むアミノ酸配列をもつ重鎖可変領域を含む。抗体が、配列番号：７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４に９０％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上相同なアミノ酸配列をもつ重鎖可変領域を含む、いくつかの態様において、１つまたは２つ以上、または全てのアミノ酸の違いは保存的な置換である。いくつかの態様において、置換はヒト抗体において存在するそれらのみである。ヒト化抗体はさらに、配列番号：１５、１６、１７、１８、１９、または２０のアミノ酸配列、または配列番号１５、１６、１７、１８、１９、または２０に９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の相同性をもつが、常に配列番号２１、２２、および２３のコンセンサス配列、かつ２３位にバリン、かつ／または９９位にスレオニンを含むアミノ酸配列をもつ軽鎖可変領域を含んでもよい。抗体が、配列番号：１５、１６、１７、１８、１９、または２０に９０％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上の相同なアミノ酸配列をもつ軽鎖可変領域を含む、いくつかの態様において、１つまたは２つ以上または全てのアミノ酸配列の違いは保存的な置換であるが、常に配列番号２１、２２、および２３のコンセンサス配列、かつ２３位にバリン、かつ／または９９位にスレオニンを含む。かかる重鎖アミノ酸配列および軽鎖アミノ酸配列のいかなる組み合わせも考慮する。いくつかの態様において、ヒト化抗体は、（ｉ）配列番号：７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４のいかなるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、（ｉｉ）配列番号：１５、１６、１７、１８、１９、または２０のいかなるアミノ酸配列をもつ軽鎖可変領域を含む。
【００８９】
様々な態様において、ヒト化抗体は（ｉ）配列番号：２７または２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および（ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００９０】
「保存的なアミノ酸置換」は、ポリペプチドのアミノ酸を機能的に相同な別のアミノ酸に置換することを指す。かかる保存的なアミノ酸は、よく知られた技術によって、ポリペプチドの構造または機能に対する最小の妨害で、ポリペプチドにおいて互いに置換してもよい。以下の５グループは夫々互いに保存的に置換してもよいアミノ酸を含む：脂肪族：グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｊ）；芳香族：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）；含硫黄：メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）；基本：アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）；酸性：アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）。
【００９１】
モノクローナル抗体（関連するベクターおよび細胞株を含む）の作製、クローニング、発現の方法は当該分野における当業者によく知られている（例えば、その全開示は参照により本明細書に組み込まれる、米国公開番号第２００９／０１７５９２３号を参照。）
【００９２】
ヒト化抗体は医薬組成物の形態において様々な障害の処置のために投与することができる。かかる組成物は抗体および１つまたは２つ以上の他の薬学的に許容される構成成分を含む。Remington's Pharmaceutical Science (15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1980)) を参照。好ましい形態は、投与および治療応用の意図した様式に依存する。組成物は、望ましい製剤に依存して、薬学的に許容される、動物またはヒトの投与のための医薬組成物の製剤のために一般的に使用される溶媒として定義される、無毒性担体または希釈剤も含むことがある。希釈剤は、抗体の生物学的活性に不利に影響しないように選択する。かかる希釈剤の例は、蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、ブドウ糖溶液、およびハンクス溶液である。さらに、医薬組成物または製剤は、他の担体または無毒性、非治療性、非免疫原性の安定剤などを含んでもよい。
【００９３】
医薬組成物は、タンパク質、キトサンなどの多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、および（ラテックス機能化SEPHAROSE.TM.（GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.）、アガロース、セルロースなどの）共重合体、高分子アミノ酸、アミノ酸共重合体、および（油滴、またはリポソームなどの）脂質凝集体のような、大きく、遅く代謝される高分子も含んでもよい。
【００９４】
医薬組成物は注射可能な組成物であってもよい。注射可能な組成物は溶液、懸濁液、分散液などを含む。注射可能な溶液、懸濁液、分散液などは、オレイン酸を含む合成モノグリセリドまたはジグリセリドおよび脂肪酸を含む滅菌油などの、適した分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用する、当該分野においてよく知られた技術によって製剤してもよい（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Chapter 43, 14th Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa.を参照）。
【００９５】
本発明の抗体を含む、注射可能な組成物は水、食塩水、等張食塩水、リン酸緩衝食塩水、クエン酸緩衝食塩水などにおいて調製してもよく、無毒な界面活性剤と任意に混ぜてもよい。分散液はグリセロール、液体ポリエチレン、グリコール、ＤＮＡ、野菜油、トリアセチンなど、およびその混合物において調製してもよい。通常の保存および使用条件下では、これらの調剤は細菌の成長を抑えるために保存剤を含んでもよい。注射または点滴に適した製剤投薬形態は、滅菌した水溶液または分散液、または、注射可能なまたは点滴可能な滅菌溶液または滅菌分散液の即時調製に粉末が適応している、有効成分を含む滅菌粉末を含む。好ましくは、究極的な投薬形態は、滅菌流動物であって、製造および保存条件下で安定である。液体担体または溶液の溶媒、懸濁液または分散液は、例えば、水、エタノール、およびグリセロール、プロピレングリコール、または液体ポリエチレングリコールなどのポリオール、野菜油、無毒性グリセリルエステル、およびその適した溶液を含む溶媒または液体分散媒であってもよい。溶液、懸濁液または分散液の適度な流動性は、例えば、リポソームの形成によって、分散液の場合においては望ましい粒径の維持によって、または無毒性の界面活性剤の使用によって維持することができる。細菌の動きの抑制は、様々な抗生剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって達成できる。糖、緩衝液、または塩化ナトリウムなどの等張剤を含んでもよい。注射可能な組成物の長期の吸収は、吸収を遅延させる剤の組成物における含有物、例えばモノステアリン酸アルミニウムハイドロゲルおよびゼラチンによって生じさせることができる。溶解度向上剤を加えてもよい。
【００９６】
滅菌した注射可能な組成物は、望ましい量において、例えば上に挙げたような様々な他の成分を有する適切な溶媒において、抗体を組み込むことによって調製してもよく、次に望ましくは例えば濾過滅菌によって、滅菌を行ってもよい。注射可能な滅菌溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の方法は、活性成分、および前に濾過滅菌した溶液において存在する、いかなる追加的な望ましい成分の粉末を生み出す、真空乾燥およびフリーズドライ技術を含む。濾過滅菌、例えば０．２２ミクロンのフィルターまたはナノ濾過、ガンマまたは電子線滅菌、またはパルス白色光などの、いかなる適した滅菌プロセスを用いてもよい。他の適した滅菌プロセスは、UtiSter (Pegasus Biologics, Irvine Calif.)および例えば米国特許第6,946,098号および米国特許第5,730,933号において記載されるそれらを含む。
【００９７】
様々な態様において、最終的な溶液は、約４と約９の間、約５と約７の間、約５．５と約６．５または約６の間のｐＨをもつように調整する。組成物のｐＨは、薬学的に許容される酸、塩基、または緩衝液で調整してもよい。塩酸は適した酸の例であり、水酸化ナトリウムは適した塩基の例である。塩酸または水酸化ナトリウムは、１Ｎ溶液などの、いかなる適した形態において存在してもよい。
【００９８】
生成した注射可能な溶液は、好ましくは、疾患を処置するために有効な１つまたは２つ以上の抗体の量を包含する。様々な態様において、約０．０００１ｍｇ／ｍｌと約５０ｍｇ／ｍｌの間の濃度で、抗体は注射可能な組成物において存在する。様々な態様において、約０．０１ｍｇ／ｍｌと約１０ｍｇ／ｍｌの間の濃度で、抗体は注射可能な組成物において存在する。
【００９９】
抗体は、抗体の投与に際し当該分野において知られる他の投与様式によって投与することもできる。かかる投与様式は、吸入、摂取、局所塗布を含む。
【０１００】
例
例１．６Ｂ１１マウス抗体からの複合ヒト化抗体の生成
簡潔に説明すると、抗ｉＮＫＴ受容体抗体クローン６Ｂ１１の重鎖Ｖ領域および軽鎖Ｖ領域（ＶＨおよびＶκ）配列を決定した（１５）。これらの配列に基づき、Composite Human Antibodies（商標）(Antitope Ltd, Cambridge, UK)を産生した。Composite Human Antibodies（商標）は、可変領域がマウス抗体クローン６Ｂ１１に同一な配列であるＣＤＲをもつ、ヒト配列のセグメントからなる可変領域をもつ。Composite Human Antibodies（商標）を構築するためのヒトＶ領域配列のセグメントを関係のないヒト抗体配列データベースから得た。夫々の選択した配列セグメント、ならびに接合したセグメントによって形成される接合点を、ＭＨＣクラスＩＩに結合する可能性について、iTOPE（商標）分析を使用して試験し、全ての最終的なComposite Human Antibodies（商標）配列変異体をＴ細胞エピトープを避けるために設計した。Composite Human Antibodies（商標）Ｖ領域遺伝子をヒト配列セグメントの組み合わせをコードする合成オリゴヌクレオチドを使用して生成した。これらは次にヒト定常領域を包含するベクターにクローン化し、抗体を産生し、キメラ参照モノクローナルと比較して、競合ＥＬＩＳＡによって標的抗原に対する結合について試験した。
【０１０１】
より具体的には、マウスＣＤＲ内に包含される残基は（KabatおよびChothiaの定義を使用して）、多数のマウスのフレームワーク残基と合わせてComposite Human Antibodies（商標）において維持した。重要なフレームワーク残基を選択するために、マウス６Ｂ１１抗体Ｖ領域の構造モデルをSwiss PDBを使用して作製し、抗体の結合特質に潜在的に重要である、Ｖ領域における制限アミノ酸を同定するために分析した。
【０１０２】
上記の分析から、いくつかの種々のヒト抗体からのヒト配列セグメントの複合体は、ＣＤＲを維持し、６Ｂ１１マウス配列のフレームワーク残基を選択した抗体を形成するために組み合わせることができるかもしれない。ＣＤＲ外の代替のヒトセグメントには広範な許容範囲が存在するかもしれないが、ＣＤＲ内の可能性のあるヒトセグメントには極めて狭い内容しか存在しないかもしれない。Composite Human Antibodies（商標）変異体における全てのＣＤＲ領域は、（ヒト配列データベースから得た）２つ以上の関係のないヒト配列セグメントを含んだ。
【０１０３】
６Ｂ１１複合ヒト抗体変異体を作製するために使用できるかもしれない、配列セグメントの大きな初歩的なセットを選択し、ヒトＭＨＣクラスＩＩアレルに対して結合するペプチドのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ分析のために、iTope（商標）（アンチトープ）技術を使用して分析し、かつ既知の抗体配列に関係するＴ細胞エピトープのデータベースであるTCED（商標）（アンチトープ）を使用して分析した。ヒトＭＨＣクラスＩＩに対する有意な非ヒトの生殖細胞系の結合体（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｂｉｎｄｅｒ）として同定した、または、TCED（商標）に対して有意なヒットを得た配列セグメントを棄却した。これにより配列セグメントの減少したセットをもたらし、セグメント間の接合点は潜在的なＴ細胞のエピトープを包含しないことを確認するために、これらの組み合わせを再度分析した。次に選択したセグメントを、合成のための重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を産生するために組み合わせた。５つの重鎖および４つの軽鎖を初期に設計し構築した。さらに、フレームワークのセグメント選択において多様性が全体の親和性に影響を与えることができる、従来の観察に基づいた、その標的抗原に対するヒト化抗体の親和性を増加させることを意図して、さらなる鎖を設計した。初期のＶＨの設計では、大部分の配列セグメントはヒトサブグループ３の抗体フレームワークに関係し、追加の設計では、サブグループ１、２および４に関係したセグメントを優先的に含めた。初期のＶκの設計では、大部分の配列セグメントはヒトサブグループ４抗体フレームワーク関連し、追加の設計では、サブグループ１および２に関連したセグメントを優先的に含めた。全体において、８つのＶＨ鎖および６つのＶκ鎖を表１に詳述される配列で構築した。全てのＶＨ鎖を全てのＶκ鎖との組み合わせにおいて試験し、全部で４８種の抗体を得た。
【表１−１】
2015502340.tif 000003
【表１−２】
2015502340.tif 000004
【０１０４】
６Ｂ１１の全ての変異体Composite Human Antibodies（商標）ＶＨおよびＶκ領域遺伝子を、アニール、ライゲーション、およびＰＣＲ増幅を行った一連の重複オリゴヌクレオチドを使用して合成し、全長合成Ｖ領域を得た。組み立てた変異体を次にAntitopeのｐＡＮＴ発現ベクターシステムに直接クローン化した。２つの重鎖ベクターを使用した：ＩｇＧ４ＰＥ（Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ）をＶＨ１〜ＶＨ５のコンストラクトに使用し、ＩｇＧ１を全てのコンストラクト（ＶＨ１〜ＶＨ８）に使用した、つまり、ＶＨ１〜ＶＨ５をＩｇＧ４ＰＥおよびＩｇＧ１の両方として作製した。
【０１０５】
初期に、複合重鎖および軽鎖（Ｖκ１〜Ｖκ４と組み合わせたＶＨ１〜ＶＨ５）の全ての組み合わせを、ＩｇＧ４ＰＥおよびＩｇＧ１の両方の定常領域（つまり、全部で４０の抗体）で作製した。４０の抗体をコードするベクターをエレクトロポレーションを経てＮ５０細胞に安定的にトランスフェクションし、２００ｎＭメトトレキサート（Sigma Cat. No. M8407）を使用して選択した。夫々のコンストラクトのためのいくつかのメトトレキサート耐性コロニーを、ＩｇＧ１発現レベルについて、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４のＥＬＩＳＡを使用して試験し、最も良い発現株を選び、液体窒素で凍結した。ＩｇＧ１発現細胞株を抗体生産および試験のために拡大した。次に、３つの追加のＶＨ領域（ＶＨ６〜ＶＨ８）および２つの追加のＶκ領域（Ｖκ５およびＶκ６）をＩｇＧ１定常領域のみで構築した。安定的な細胞株を上記のように、追加のＶ領域の全ての組み合わせについて、および初期のＶ領域との組み合わせ（つまり、２８の追加抗体）において作製した。極めて遅い成長および低い発現レベルのために、１つの変異体ＶＨ６／Ｖκ２を、合理的な時間スケール内でタンパク質精製過程に取ることはできなかったが、成功したトランスフェクションおよびクローン選択を全ての変異体について達成した。
【０１０６】
６Ｂ１１の４７のＩｇＧ１変異体をProtein A sepharose column  （GE Healthcare Cat. No. 110034-93）でＮＳＯ細胞培養液上清から精製し、予測されたアミノ酸配列に基づいて吸光係数ε（０．１％）を使用してＯＤ２８０ｎｍによって定量した。ＶＨ６変異体重鎖またはＶＨ８変異体重鎖のいずれかを包含する変異体のε（０．１％）は１．５８である。全ての他の変異体について、ε（０．１％）は１．６０である。約１ｍｇの夫々の抗体変異体を精製し、リード抗体（下記参照）を還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。重鎖および軽鎖の予測されたサイズに対応するバンドを、いかなるコンタミネーションの証拠なしに観察した。
【０１０７】
組み換えのＴＣＲヘテロ二量体（Precision Antibody（商標））に対する４７のＮＳＯ由来６Ｂ１１のComposite Human Antibody（商標）変異体の結合を、競合ＥＬＩＳＡによって評価した。簡潔に説明すると、HIS-Select（商標）High Sensitivity (HS) Nickel Coated Plate 96-well clear strip-well plates（Sigma Cat. No. 55688）を、ＰＢＳ中の５μｇ／ｍｌの精製したＴＣＲヘテロ二量体で、４℃で1時間コーティングした。抗ｉＮＫＴ受容体Composite Human Antibody（商標）変異体の夫々の希釈系列（５０〜０．３９μｇ／ｍｌ）を、一定濃度の０．０５％のＢＳＡ／ＰＢＳ中のビオチン化した抗ｉＮＫＴ受容体キメラ参照抗体（３μｇ／ｍｌ）と事前に混合した。コーティングされたＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、および夫々のウェルに添加した１００μｌの事前に混合した抗体で洗浄した。プレートを室温で１時間インキュベートした。精製したＴＣＲヘテロ二量体に対するビオチン化抗ｉＮＫＴ受容体キメラ抗体の結合は、streptavidin-HRP （Sigma Cat. No. 00S5512）およびTMB single solution substrate （Invitrogen Cat. No. 00-2323）を使用して検出した。３Ｍ ＨＣｌで反応を停止させた後、４５０ｎｍでの吸光度をDynex Technologies MRX TC II plate readerで測定し、試験抗体の結合曲線を、夫々のプレートに含まれる抗ｉＮＫＴ受容体キメラ参照抗体標準と比較した。実験内および実験間の比較を可能にするために、変異体のＩＣ５０値を、夫々のプレートに含まれた参照抗体に対して標準化した。
【０１０８】
キメラ参照抗体標準（６Ｂ１１ ＩｇＧ１）と比較して、全ての試験したComposite Human Antibody（商標）変異体の相対的なＩＣ５０値を表２に示す。
【表２】
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【０１０９】
さらに直接的な比較を可能にするために、最も低い相対的なＩＣ５０値を有する８の変異体を競合ＥＬＩＳＡにおいてさらに試験した（表３）。これにより、６Ｂ１１キメラ参照抗体と比較して、選択した変異体が結合プロファイルを改善し、相対的なＩＣ５０値は、最初の実験からのものと同等であることを確認した。
【表３】
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【０１１０】
対照抗体に対する結合への軽度の改善が変異体のいくつかにおいて予想されるかもしれないが、観察された程度まで結合が改善されたことは完全に予想外であったことに留意すべきである。特に、対照抗体に対して結合は２倍より大きく、３倍より大きく、４倍より大きく、および、さらに５倍よりも大きく改善した。
【０１１１】
Composite Human Antibody（商標）変異体がタンパク質凝集体を形成する傾向をＳＥＣによって評価した。簡潔に説明すると、最も低い相対的なＩＣ５０値を有する４つの変異体、すなわちＶＨ２／Ｖκ４、ＶＨ４／Ｖκ３、ＶＨ４／Ｖκ４およびＶ８／Ｖκ４を分析のために選択した。５０μｌの夫々の変異体をSuperdex（商標）200 5/150 GL gel filtration column（GE Healthcare #28-9065-61）に充填し、ＡＫＴＡ清浄器を使用してカラムを通してポンプで送った。ＳＥＣトレースを捕捉した。ＶＨ２／Ｖκ４、ＶＨ４／Ｖκ３およびＶＨ４／Ｖκ４のComposite Human Antibody（商標）変異体は、タンパク質凝集体を形成する証拠を示さなかった。しかし、ＶＨ８／Ｖκ４変異体のトレースは、１Ａ３画分において少量な凝集体を示すように見えた。
【０１１２】
結合データ、Composite Human Antibody（商標）のＶ領域配列およびＳＥＣの分析に基づいて、以下の抗体をさらに試験した：ＮＫＴＴ１０３（６Ｂ１１キメラＩｇＧ１対照抗体−配列番号３０および３１）、ＮＫＴＴ１２０（配列番号２７および２９）、ＮＫＴＴ２１９（配列番号２７および１７）、およびＮＫＴＴ３２０（配列番号２８および２９）。ＮＫＴＴ１２０はＶＫ４軽鎖およびＶＨ４重鎖の軽配列および重配列を含む。ＮＫＴＴ２１９はＶκ３およびＶＨ４の軽配列および重配列を含む。ＮＫＴＴ２１９はＮＫＴＴ１２０と同じＩｇＧ１定常ドメインをもつ。しかし、フコシルトランスフェラーゼを欠損した細胞株において発現するため、ＮＫＴＴ２１９の定常ドメイン領域は、設計によってＮＫＴＴ１２０と比較して異なる糖化パターンをもつ。これにより、その分子のＦｃ部分における非フコシル化した（またはアフコシル化した）炭水化物パターンをもたらし、ＦｃγＲＩＩＩに対して結合するその能力を増強し、したがって、そのＡＤＣＣ能力を増強する（５×〜１０×）。（参考文献１８〜２２を参照）。これは、in vitro結合実験（１００×まで改善）、およびトランスジェニックマウスおよびサルにおけるin vivoのＮＫＴ細胞枯渇実験（５×−１０×の改善）において実証されている。
【０１１３】
例２．ＮＫＴＴ１２０のキャラクタリゼーション
ＮＫＴＴ１２０の結合親和性および機能的なキャラクタリゼーションの測定を、組み換えのヒト非変異体ＴＣＲおよび細胞を使用して行い、in vivo機能をトランスジェニックマウスおよびカニクイザルにおいて試験した。データはＮＫＴＴ１２０が、精製した可溶な形態において、またはｉＮＫＴ細胞上の膜タンパク質として、ヒト非変異体のＴ細胞受容体（ｉＴＣＲ）に対して高い選択性および特異性をもつことを示す。細胞上のｉＴＣＲに結合した場合、ＮＫＴＴ１２０は、それらの細胞の枯渇を仲介する。Ｆｃの機能の観点において、他の研究では、ＮＫＴＴ１２０がヒトＦｃγＲＩ、Ｃ１ｑ、およびＦｃγＲＩＩＩに結合することが示されている。最終的に、ＮＫＴＴ１２０仲介ｉＮＫＴ細胞枯渇は、in vitroのヒト全血試料、またはカニクイザルにおけるin vivoにおいてサイトカイン応答を誘導しない。
【０１１４】
ＮＫＴＴ１２０はＨｕ-ｓｉＴＣＲ（ヒト可溶性ｉＴＣＲ）に結合する
ＮＫＴＴ１２０および他の抗ｉＮＫＴ ＴＣＲ ｍＡｂの結合を、組み換えの可溶性ヒトｉＴＣＲ（Ｈｕ-ｓｉＴＣＲ）を使用してＥＬＩＳＡおよびＳＰＲによって評価した。Ｈｕ-ｓｉＴＣＲを使用したＥＬＩＳＡにおいて、１．０μｇ／ｍｌのＩＣ５０を有するキメラ６Ｂ１１ ｍＡｂと比べて、ＮＫＴＴ１２０は０．２ｇ／ｍｌのＩＣ５０値を示した。引き続いて、ＳＰＲ（BIAcore（商標））による分析によって、ＮＫＴＴ１２０はＨｕ-ｓｉＴＣＲに対して〜６０ｎＭのＫＤをもつことが示された。
【０１１５】
ヒトｉＮＫＴ細胞に対するＮＫＴＴ１２０の結合
α−ＧａｌＣｅｒ融合ＣＤ１ｄ四量体およびマウス抗ヒトｉＴＣＲ ｍＡｂ ６Ｂ１１のように、ヒト化ＮＫＴＴ１２０はヒトｉＮＫＴ細胞に特異的に結合する。ヒトｉＮＫＴ細胞に対するα−ＧａｌＣｅｒ融合ＣＤ１ｄ四量体、６Ｂ１１およびＮＫＴＴ１２０の結合を比較するために、健康なドナーからの全血（Research Blood Componentsから購入）を、ＣＤ３および抗Ｖα２４ ｍＡｂと合わせて、夫々の剤で夫々染色した。６Ｂ１１およびα−ＧａｌＣｅｒ融合ＣＤ１ｄ四量体と同様に、明らかにＮＫＴＴ１２０はｉＮＫＴ細胞に対して特異的に結合する。（図１）
【０１１６】
ＮＫＴＴ１２０はｉＮＫＴ−ＴＣＲおよびα−ＧａｌＣｅｒ結合部位上の重複エピトープを認識する
ＮＫＴＴ１２０エピトープ、非変異体ＣＤＲ３ループは、ＣＤ１ｄに結合するｉＴＣＲの領域に存在する。ＮＫＴＴ１２０エピトープを調べるために、ヒトＰＢＭＣまたはヒトｉＴＣＲを発現するトランスフェクタントをＮＫＴＴ１２０の存在または非存在下でインキュベートし、次にα−ＧａｌＣｅｒ融合ＣＤ１ｄ四量体によって染色した。ＮＫＴＴ１２０の存在は完全に四量体の結合を抑止した。（図２）
【０１１７】
他のヒト細胞株に対する無反応性
ヒトｉＮＫＴ細胞に対するＮＫＴＴ１２０の特異性を実証するために、in vitroで拡大したヒトｉＮＫＴ細胞に対するＮＫＴＴ１２０の結合を、リンパ系および非リンパ系の選択したヒト細胞株の一団に対する結合と比較した（表４）。
【表４】
2015502340.tif 000007
【０１１８】
ＭＨＣＩ染色を陽性対照とし、一方、精製したヒトＩｇＧを陰性対照とした。ＮＫＴＴ１２０はいかなる試験した細胞株とも交差反応せず、一方、in vitroで拡大したヒトｉＮＫＴ細胞に対して結合した。９つの試験した細胞株のうち７つは、抗ＭＨＣクラスＩ陽性対照ｍＡｂを認識した。前述のように、ＭＨＣクラスIの発現はＫ５６２およびＦＯ−１細胞に存在せず、予想されるように、抗ＭＨＣクラスＩ対照ｍＡｂは、現在の研究において、これらの細胞に結合しなかった。
【０１１９】
ＮＫＴＴ１２０のＦｃ機能の解析
ＮＫＴＴ１２０はヒト化ＩｇＧ１ ｍＡｂであり、したがって、ヒトＦｃγＲＩおよびＣｌｑに結合することが予想される。そのＩｇＧ−Ｆｃの特性のキャラクタリゼーションの部分として、ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩ、および補体の構成成分Ｃｌｑとの反応性についてＥＬＩＳＡにおいて評価した。３つの対照抗体をＮＫＴＴ１２０のキャラクタリゼーションの研究において使用した：（ｉ）ＮＫＴＴ１０３、ＮＫＴＴ１２０と同じＩｇＧ−Ｆｃドメインを共有するが、親マウスＶドメイン領域をもつキメラ６Ｂ１１ ｍＡｂ；（ｉｉ）ＮＫＴＴ２１９、ＮＫＴＴ１２０と同じ可変領域を有するが、抗体依存性細胞仲介性障害（ＡＤＣＣ）が増強されたヒト化ＩｇＧ１をもつヒト化ｍＡｂ；およびＮＫＴＴ３２０、ＮＫＴＴ１２０と同じ可変領域を有するが、改変されたＩｇＧ４アイソタイプをもつヒト化ｍＡｂ。すべての３つの抗体（ＮＫＴＴ１２０、ＮＫＴＴ２１９およびＮＫＴＴ３２０）は同様な特異性および親和性を有する、同じｉＴＣＲエピトープに結合する。
【０１２０】
ＮＫＴＴ１２０はＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩに結合する。ＮＫ細胞上に発現するＦｃγＲＩは、治療的なＩｇＧ１ ｍＡｂがin vivoでＡＤＣＣを仲介する一次的な機構である。ＮＫＴＴ１２０は、ＩｇＧの重鎖を認識し結合する、膜侵襲複合体(complement membrane attack complex)の第1副構成成分であるＣｌｑとも結合し、古典的な補体経路を開始し、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をもたらす。キメラ６Ｂ１１ ｍＡｂはＮＫＴＴ１２０と同様のＦｃ結合特性を示す。続くBIAcore（商標）分析において、ＮＫＴＴ１２０はＦｃγＲＩならびにＦｃγＲＩＩＩ、およびＣｌｑに結合することが見出された。増強したＦｃエフェクター機能を有するように設計されたＮＫＴＴ２１９は、ＦｃγＲＩならびにＦｃγＲＩＩＩの両方、およびＣｌｑに結合し、したがって、ｉＮＫＴ細胞を枯渇させる改良された能力をもつことが予想される。対照的に、Ｆｃエフェクター機能が除去されたＮＫＴＴ３２０は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩまたはＣｌｑを認識せず、したがってｉＮＫＴ細胞の枯渇を引き起こすことは予想されない。
【０１２１】
Ｖα２４トランスジェニックマウスにおけるｉＮＫＴ細胞の枯渇
ヒト（Ｖα２４−Ｊα１８）非変異体ＴＣＲα鎖の導入遺伝子を発現するマウスを使用した。これらのマウスは、マウスＪα１８領域を欠き、したがって、Ｖα１４−Ｊα１８＋マウス非変異体ＮＫＴ細胞を産生できない。マウスにおいて存在する全てのｉＮＫＴ細胞は、トランスジェニックヒト非変異体ＴＣＲα鎖を発現することのみ可能であり、したがって、全てがＮＫＴＴ１２０エピトープをもつ。これらのＣＤ３＋ＮＫ１．１＋標準ｉＮＫＴ細胞の割合は、野生型マウスのそれに極めて同等である（全てのＣＤ３＋Ｔ細胞の〜２％）。しかし、全てのｉＮＫＴ細胞が、ＮＫＴＴ１２０エピトープを包含するヒト非変異体ＴＣＲαドメインを発現する一方、ランダムに組み込まれる導入遺伝子の性質のために、標準的な（非ｉＮＫＴ）Ｔ細胞の大部分が同様にそれを発現する。さらに、ヒトＶα２４α鎖は、様々な内因性マウスＴＣＲβ鎖と対になる。これらのＶα２４α鎖−マウスβ鎖の対のいくつかは、６Ｂ１１とは対を形成しないようであり、全てではないが大多数のＶα２４を発現するＴ細胞もまた６Ｂ１１（およびＮＫＴＴ１２０）に結合する。これはＮＫＴＴ１２０に対して「落ち込み(sink)」を効果的に生み出し、研究結果の解釈に影響を与えることがある。したがって、これらのトランスジェニックマウスはｉＮＫＴ細胞の枯渇を研究するために非常に有用であるが、それらはＮＫＴＴ１２０の生理学的効果を研究するためのモデルとして限定されている。
【０１２２】
まとめると、これらのマウスにおいてＣＤ３＋Ｔ細胞（〜６５％）の大部分は、トランスジェニックヒトＶα２４α鎖を発現し、市販の抗Ｖα２４ｍＡｂ（Ｃ１５）を使用して染色することができる。ＣＤ３＋Ｔ細胞の約３０％が６Ｂ１１およびＮＫＴＴ１２０に結合する。ＣＤ３＋Ｔ細胞のわずか２％が（標準的なｉＮＫＴ細胞としてそれらを識別する）ＮＫマーカーＮＫ１．１を共発現し、６Ｂ１１（およびＮＫＴＴ１２０）に結合する。これらのマウスにおいて、６Ｂ１１結合ＣＤ３＋Ｔ細胞のほんの少数が実際にｉＮＫＴ細胞であることを考慮することが重要である。それでも、全てのｉＮＫＴ細胞がヒトｉＴＣＲα鎖を発現し、したがって、６Ｂ１１およびＮＫＴＴ１２０に結合するといえる。以下に記載される枯渇実験では、ＣＤ３＋ＮＫ１．１＋標準ｉＮＫＴ細胞集団に主眼が置かれている。
【０１２３】
ＮＫＴＴ１２０は急速に、選択的かつ効率的にＶα２４トランスジェニックマウスにおいてｉＮＫＴを枯渇させる
末梢血、脾臓およびリンパ節において、ＮＫＴＴ１２０によるｉＮＫＴ細胞の枯渇の用量反応を確立するために、Ｖα２４トランスジェニックＪα１８欠損マウスにＮＫＴＴ１２０の示された用量を腹腔内投薬した（図３）。投薬から４８時間後で、マウスを屠殺し、血液、脾臓およびリンパ節リンパ球を単離した。ｉＮＫＴ細胞数をフローサイトメトリーによって決定した（ＣＤ３＋ＮＫ１．１＋６Ｂ１１＋細胞）。ｉＮＫＴ細胞の枯渇は、末梢血中において最も効率的であり、続いて脾臓およびリンパ節であった。リンパ節において、血液に対して１０倍多い用量が、リンパ節における同等な枯渇のためには必要であった：血液中３μｇの用量によって達成されるレベルに対して、リンパ節では枯渇したｉＮＫＴ細胞が３０μｇであり、リンパ節における血液と同程度の枯渇は、１００μｇおよび１０μｇの用量を夫々比較した場合に見られた。
【０１２４】
さらに、ＮＫＴＴ１２０仲介ｉＮＫＴ細胞枯渇のカイネティクスの時間経過を確立するために、Ｖα２４トランスジェニックＪα１８欠損マウスに、１００μｇのＮＫＴＴ１２０（１投薬当たりｎ＝２）を腹腔内投薬した。示された時点でマウスを屠殺し、脾細胞を単離し、ｉＮＫＴ細胞数をフローサイトメトリーによって決定した。ｉＮＫＴ細胞数は実質的に、投与から２時間後で大幅に減少し、投薬から６時間後でほぼ完全に枯渇した。（図４、パネルＡ）。さらに、機能的なｉＮＫＴ細胞がＮＫＴＴ１２０の投薬によって完全に枯渇することの確証を得るために、Ｖα２４トランスジェニックＪα１８欠損マウスに、１００μｇのＮＫＴＴ１２０を腹腔内投与した。４８時間後、マウスに２μｇのｉＮＫＴ細胞スーパーアゴニストαＧａｌＣｅｒを静脈内注射した。このαＧａｌＣｅｒ負荷の２時間後、マウスを屠殺し、脾細胞を採取し、フローサイトメトリーによって細胞内ＩＦＮγを分析した（ＣＤ３＋ＮＫ１．１＋細胞をゲーティング）。データを、ＮＫＴＴ１２０を注射しなかった対照マウスからのものと比較した。未処置のマウスにおいて強いＩＦＮγ応答を検出したが、ＮＫＴＴ１２０による前処置は、αＧａｌＣｅｒに対するいかなる応答をも抑止した（図４、パネルＢ）。
【０１２５】
ｉＮＫＴ細胞の薬理学的枯渇はαＧａｌＣｅｒ刺激ＡＨＲを抑止する
鼻腔内のαＧａｌＣｅｒ負荷によって肺にリクルートされるｉＮＫＴ細胞は、マウスおよびサルにおいてＡＨＲを誘導するために十分であることが実証されている（１０、１１）。６Ｂ１１キメラ抗体（ＮＫＴＴ１０３）およびＢＡＬＢ／ｃバックグラウンドに６世代戻し交配したＶα２４トランスジェニックマウス（ＢＡＬＢ／ｃマウスは、一般的にＴｈ２傾向喘息モデルの影響をより受けやすい）を使用した予備実験において、ｉＮＫＴ細胞の薬理学的枯渇が、鼻腔内αＧａｌＣｅｒ負荷の効果を大幅に寛解できることが示された。
【０１２６】
図４：Ｖａ２４トランスジェニックマウスにおけるＮＫＴＴ１２０によるｉＮＫＴ細胞枯渇の時間経過
Ａ．Ｖα２４トランスジェニックマウス（１グループあたりｎ＝２）に１００μｇのＮＫＴＴ１２０を腹腔内注射し、示した時点で屠殺した。脾臓のＣＤ３＋ＮＫ１．１＋ｉＮＫＴ細胞でゲーティングを行い、６Ｂ１１結合細胞の割合を評価した。
Ｂ．Ｖα２４トランスジェニックマウス（１グループあたりｎ＝２）に１００μｇのＮＫＴＴ１２０を注射した。対照グループはＮＫＴＴ１２０を受けとらなかった。４８時間後、別々のＮＫＴＴ１２０処置マウスおよび対照マウスに、２μｇのαＧａｌＣｅｒを注射した。αＧａｌＣｅｒ注射から２時間後、マウスを屠殺し、脾臓のＣＤ３＋ＮＫ１．１＋ｉＮＫＴ細胞をフローサイトメトリーによって細胞内ＩＦＮについてアッセイした。
【０１２７】
図５はｉＮＫＴ細胞の薬理学的な枯渇が鼻腔内投与したαＧａｌＣｅｒによって誘導されたＡＨＲを抑止することを実証する。
データは、ｉＮＫＴ細胞枯渇のメカニズムが辺縁趨向ではなく、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを経るものであることを示唆している。
【０１２８】
カニクイザルにおけるＮＫＴＴ１２０の予備的な非ＧＬＰ ＰＫ／ＰＤ試験
ＮＫＴＴ１２０を、カニクイザルを使用して、２つの非ＧＬＰ試験において試験した。最初の試験では、ＮＫＴＴ１２０がｉＮＫＴ細胞を枯渇させる用量を定義するため、および、より広範なＰＫ／ＰＤ試験のための用量選択の案内を助けるために、ＮＫＴＴ１２０のｉＮＫＴ細胞枯渇の用量反応を調べた。カニクイザルをこれらの予備的な非ＧＬＰ薬理学試験およびＰＫ／ＰＤ試験のために、以下の理由で選択した：（ｉ）ヒトおよびカニクイザル間におけるＮＫＴＴ１２０結合エピトープ（ｉＴＣＲのＣＤＲ３αループ）の配列相同性のため;（ｉｉ）カニクイザルおよびヒトのｉＮＫＴ細胞に対するＮＫＴＴ１２０の陽性および同等な結合を示すが、げっ歯類および他種のｉＮＫＴ細胞に対するＮＫＴＴ１２０の有意な結合を示さないin vitroのデータのため;（ｉｉｉ）カニクイザルｉＮＫＴ細胞に対するＮＫＴＴ１２０の示された反応性および特異性のため;（ｉｖ）ヒトおよびカニクイザルの末梢血間のｉＮＫＴ細胞数分布における相同性のため。
【０１２９】
ヒトＮＫＴＴ１２０抗原エピトープに対する種の配列相同性
ヒトおよびカニクイザル間のｉＴＣＲアミノ酸配列は、1つのアミノ酸のみが異なる標的ＮＫＴＴ１２０結合領域と同様である（表５）。全体的なＶα２４−Ｊ１８領域は霊長類および非霊長類種間で高度に保存されているが、げっ歯類およびヒトにおける関連したＮＫＴＴ１２０結合エピトープ領域は３つのアミノ酸で異なり、これは抗体の結合を抑止するために十分である。したがって、ＮＫＴＴ１２０はヒトおよびカニクイザルおよびアカゲザルからのｉＮＫＴ細胞に結合するが、リスザルやげっ歯類の細胞には結合しない。それはヒトＶα２４−Ｊα１８ ｉＴＣＲ−α鎖の導入遺伝子を発現するマウスに対しても結合する。
【表５】
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【０１３０】
ヒトおよびカニクイザルにおけるｉＮＫＴ細胞の頻度
ヒトおよびカニクイザルにおけるｉＮＫＴ細胞の頻度を比較するために、ヒトの健康なドナー（血液サンプルはResearch Blood Components, Inc.から購入した）およびカニクイザルの全血におけるｉＮＫＴ細胞数をフローサイトメトリーによって評価した。データは、ヒトおよびカニクイザルにおけるｉＮＫＴ細胞の同等な頻度を示す。（図６）。
【０１３１】
ＮＫＴＴ１２０は、ヒトおよびカニクイザルのｉＮＫＴ細胞において同様な飽和結合プロフィールを示す
ｉＮＫＴ細胞に対するＮＫＴＴ１２０の飽和結合を測定するために、ヒト全血試料（Research Blood Components, Inc.から購入）またはカニクイザルの全血を、氷上で３０分間ＮＫＴＴ１２０の種々の濃度でインキュベートし、続いて、蛍光色素標識６Ｂ１１で染色した。滴定曲線は、ヒトおよびカニクイザルのｉＮＫＴ細胞について（６Ｂ１１染色の遮断によって決定されるように）同様な飽和結合を示す。累積的に、データは、カニクイザルがＮＫＴＴ１２０の非臨床毒性試験のための最も関連性のある動物であることを確認している。（図７）
【０１３２】
カニクイザルにおける、用量範囲を見出すｉＮＫＴ細胞枯渇試験
用量範囲を見出す薬力学的試験において、６回の投薬を試験した：０．０００５、０．００１、０．００２、０．００３、０．０１および０．０３ｍｇ／ｋｇ（１投与当たりｎ＝１）。動物は次に、投薬から７日間、ｉＮＫＴ細胞をフローサイトメトリーによって測定した；データは、全Ｔ細胞のパーセントとして表した。ＴおよびＢリンパ球、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞もフローサイトメトリーによってモニターした。臨床化学および血液学的評価を行った；急性期タンパク質、Ｃ反応性タンパク質およびハプトグロビンを測定し、選択したサイトカインＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＴＮＦαおよびＩＦＮγを測定した。
【０１３３】
ＮＫＴＴ１２０は末梢血ｉＮＫＴ細胞の用量依存的な減少を示し（図８）、０．０３ｍｇ／ｋｇの用量で２４時間以内に完全な枯渇が観察され、７日間のモニター期間持続した。部分的な枯渇を低用量で観察し、可逆的であるように見えた。ｉＮＫＴ細胞への影響は０．００３ｍｇ／ｋｇ以下の用量で観察されなかった。明白な毒性は、投薬後認められなかった。ｉＮＫＴ細胞への予想される効果は別として、試験物関連と考えられる本試験における認められる他の効果はなかった。
【０１３４】
カニクイザルにおけるＰＫ／ＰＤ試験
用量範囲を見出す試験の結果に基づいて、ＮＫＴＴ１２０の３つの用量（０．００３、０．０３、および０．３ｍｇ／ｋｇ；１投薬当たりｎ＝３）を、以前の試験のそれに対して相対的に延長した時間において（すなわち、７日に対する２８日）、リンパ球をモニターした薬力学的／薬物動態（ＰＫ／ＰＤ）試験において使用することを選択した。フローサイトメトリーによって全Ｔ細胞のパーセントとしてｉＮＫＴ細胞を測定し、Ｔリンパ球およびＢリンパ球、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を測定するためにも使用した。用量範囲を見出す試験において測定したそれらのパラメーターに加えて、血清も抗ＮＫＴＴ１２０抗体の存在について試験した。
【０１３５】
明白な毒性は、投薬後認められなかった。２つの最高用量によって試験期間中完全にｉＮＫＴ細胞は枯渇したが、一方、低用量によって約５０％のベースラインまでｉＮＫＴ細胞は減少し、４日目までに〜８０％のベースラインまで戻った（図９）。Ｔ細胞およびＢ細胞において他の試験物関連の変化は認められなかった（図１０）。抗ＮＫＴＴ１２０抗体は検出されなかった。
【０１３６】
用量範囲を見出す試験は、ｉＮＫＴ細胞が急速に枯渇し、結果として血清サイトカインレベルが増加しなかったことを示したが、それらの枯渇の前にサイトカインがｉＮＫＴ細胞に対するＮＫＴＴ１２０の結合の結果として放出されるかもしれないという理論的な可能性が存在する。したがって、前の結果を確認するために、選択したサイトカイン（ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＴＮＦαおよびＩＦＮγ）を測定した。サイトカインへの影響はなかった。
【０１３７】
全体として、ＮＫＴＴ１２０の投与によって、他の血液学的、生化学的または免疫学的パラメーターに対する有意な効果の非存在下で、可逆的および用量依存的に末梢ｉＮＫＴ細胞の特異的な枯渇をもたらすことが結論である。
【０１３８】
カニクイザルにおけるＮＫＴＴ１２０の薬物動態分析
ＮＫＴＴ１２０のＰＫを評価した。ＰＫ分析によって、ＮＫＴＴ１２０が、約１１日間の半減期を含む、モノクローナル抗体治療薬にかなり特有なパラメーターとともに、全ての用量にわたって一貫したＰＫプロフィールをもつことを示された。一回の静脈内投薬後、カニクイザルに投与したＮＫＴＴ１２０の薬物動態パラメーターを表６および表７に示す。     
【表６】
2015502340.tif 000009
【表７】
2015502340.tif 000010
【０１３９】
ＡＤＣＣ増強ＩｇＧ−Ｆｃエフェクター機能をもつｉＮＫＴ細胞抗体を有するカニクイザルにおけるＰＫ／ＰＤ試験
ｉＮＫＴ細胞枯渇に対するＮＫＴＴ１２０の効果を、ＡＤＣＣ増強ＩｇＧ−Ｆｃエフェクター機能（ＮＫＴＴ２１９）を有するが、同じ抗原特異性および親和性を有する抗体と比較した。ＮＫＴＴ１２０およびＮＫＴＴ２１９を０．００３ｍｇ／ｋｇでカニクイザルに静脈内投薬し、夫々およびｉＮＫＴ細胞を、２８日間にわたる時点で測定した。データは、同じ用量でＮＫＴＴ１２０によって仲介される部分的な枯渇と比較して、０．００３ｍｇ／ｋｇの用量のＮＫＴＴ２１９で、ｉＮＫＴ細胞の完全な枯渇を確立する。これらのデータは、本試験においてＮＫＴＴ２１９で１０倍に増強された活性が予想され観察されたように、ｉＮＫＴ細胞の枯渇がＡＤＣＣによって仲介されることを確認する。データは、また、低用量の０．００３ｍｇ／ｋｇのＮＫＴＴ１２０で観察されたｉＮＫＴ細胞における一過的な減少が、完全な枯渇が増強されたＡＤＣＣ活性をもつＮＫＴＴ２１９の同じ用量で達成されるように、部分的な枯渇によるものであるという概念を裏付ける。
【０１４０】
枯渇ｍＡｂ（ＮＫＴＴ１２０およびＮＫＴＴ２１９）の陰性対照として、Ｆｃエフェクター機能を欠いているＮＫＴＴ３２０を、ＮＫＴＴ１２０のそれよりも３０倍高いまでの用量で試験し、ｉＮＫＴ細胞は枯渇しなかった。両方の対照抗体（増強された枯渇抗体、ＮＫＴＴ２１９、および非枯渇抗体、ＮＫＴＴ３２０）からのデータは、ｉＴＣＲエピトープをマスクするか、またはｉＮＫＴ細胞を隔離することとは対照的に、ＮＫＴＴ１２０がｉＮＫＴ細胞を枯渇することを確認する。
【０１４１】
ＮＫＴＴ１２０はin vitroでヒト全血中のサイトカイン応答を誘導しない
ヒトにおいてＮＫＴＴ１２０による処置を受けてサイトカインを放出する可能性を検討するために、我々はヒト全血実験においてＮＫＴＴ１２０の効果を評価した。フローサイトメトリーによってｉＮＫＴ細胞数を測定した後、全血を、２０μｇ／ｍｌ（この濃度は１ｍｇ／ｋｇの投薬後に予測される血しょうの曝露よりも高い）のＮＫＴＴ１２０の存在下または非存在下で２４時間TruCulture（商標）チューブにおいてインキュベートした。陽性対照として、全血を、抗ＣＤ３ ｍＡｂを包含するチューブ中においてインキュベートした。２４時間後、上清を回収、冷凍し、マルチプレックスサイトカイン分析のためにRules-Based Medicine（ＴＸ）に送った。試験した分析物を表８に一覧で示す。
【表８】
2015502340.tif 000011
【０１４２】
マルチプレックスサイトカイン分析の結果を図１１に示す（未処置の対照レベルからの変化を示したサイトカインのデータのみを示す）。いくつかのサイトカイン（ＩＦＮγ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１ ＲＡおよびＭＩＰ−１β）の大幅な上昇が、４人の試験したドナーのうち少なくとも２人において、抗ＣＤ３陽性対照によって誘導された。しかし、ＮＫＴＴ１２０は、４つのドナー試料のいずれにおいても、いかなるサイトカイン応答も誘導しなかった。データは、ＮＫＴＴ１２０仲介ｉＮＫＴ細胞枯渇が、in vitroのヒト全血セット(whole blood setting)において測定可能なサイトカイン誘導効果がないことを示す。
【０１４３】
減少したＦｃエフェクター機能で設計されたヒト化抗ｉＮＫＴ ｍＡｂによるｉＮＫＴ細胞の活性化の実証
ＮＫＴＴ３２０は、ヒトｉＴＣＲを特異的に認識するヒト化ｍＡｂである。それはヒンジ領域において導入された２つのアミノ酸の変化を有する改変されたＩｇＧ４ ｍＡｂであり、１つはＩｇＧ４重鎖二量体形成を安定化させるように、２つ目は残存のＦｃγＲ結合能力を低下させるように設計されている（Newman et al., Clin Immunol 98, 164-174）。以下の試験は、ＮＫＴＴ３２０が、健康なドナーのヒト全血中のヒトｉＮＫＴ細胞を活性化できることを示している。
【０１４４】
ヒト全血をＲＰＭＩ中に希釈し、２０μｇ／ｍｌの対照ＩｇＧまたは２０μｇ／ｍｌのＮＫＴＴ３２０と共に、３７℃、５％のＣＯ２で一晩インキュベートした。次に、試料の表面を抗ＣＤ３、ＣＤ４、Ｖａ２４、Ｖｂ１１、ＣＤ２５およびＣＤ６９で染色した。ＲＢＣを溶解し、細胞を固定し、透過処理し、細胞内ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４を染色し、BD LSR Fortessaでフローサイトメトリー分析を行った。ｉＮＫＴ細胞を、ＣＤ３、Ｖａ２４およびＶｂ１１染色によって同定した。
【０１４５】
結果はＮＫＴＴ３２０が健康なボランティアのヒト全血において細胞内ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の発現を誘導することを示す（図１２）。活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５のアップレギュレーションも観察した（データは示されていない）。
【０１４６】
【表９−１】
2015502340.tif 000012
【表９−２】
2015502340.tif 000013
【表９−３】
2015502340.tif 000014
【図１】
2015502340.tif 000015
【図２】
2015502340.tif 000016
【図３】
2015502340.tif 000017
【図４】
2015502340.tif 000018
【図５】
2015502340.tif 000019
【図６】
2015502340.tif 000020
【図７】
2015502340.tif 000021
【図８】
2015502340.tif 000022
【図９】
2015502340.tif 000023
【図１０】
2015502340.tif 000024
【図１１】
2015502340.tif 000025
【図１２】
2015502340.tif 000026
【配列表】
2015502340000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年3月27日(2013.3.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫応答を抑制するための処置の方法であって、処置の必要がある対象に、ｉＮＫＴ細胞に選択的に結合する裸の遮断抗体を、前記対象のｉＮＫＴ細胞機能を抑制するのに有効な量で、投与することを含む、ここで前記遮断抗体が、枯渇抗体であり、かつ前記量が、ｉＮＫＴ細胞を枯渇させるのに有効である、前記方法。
【請求項２】
抗原に対する対象の免疫応答が抑制される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗原が、アレルゲンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
対象が、喘息を患い、処置が、対象において１つまたは２つ以上の喘息の症状を抑制する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
喘息が、アレルギー性喘息である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
対象が、ＣＯＰＤを患い、処置が、前記対象において１つまたは２つ以上のＣＯＰＤの症状を抑制する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
対象が、気道過敏性障害を患い、かつ処置が、前記対象において１つまたは２つ以上の前記障害の症状を抑制する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
対象が、ヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
対象が、ヒトである、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
抗体が、完全ヒト抗体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
抗体が、３つの軽鎖および３つの重鎖ＣＤＲ領域をもち、前記の３つの軽鎖および３つの重鎖のＣＤＲ領域の夫々が、ヒト配列の複合体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
抗体が、組み換えの可溶性ヒトｉＴＣＲへの結合において１．０μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０で、ｉＮＫＴ細胞に結合する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
抗体が、配列番号２４、２５および２６と、８５位にロイシンとを含む軽鎖可変領域をもつ、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
抗体が、配列番号２１、２２および２３と、２３位にバリンおよび／または９９位にスレオニンとを含む重鎖可変領域をもつ、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
抗体が、配列番号１によって定義されるエピトープに結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
抗体が、配列番号１および２によって定義されるエピトープに結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
抗体が、配列番号１５、１６、１７、１８、１９または２０から選択される軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
抗体が配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４から選択される重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
抗体が、ＮＫＴＴ１２０を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
抗体が、対象への投与後、１つまたは２つ以上の血清サイトカインレベルにおいて、有意な変化を引き起こさない、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ｉＮＫＴ細胞に選択的に結合する、単離されたヒト化抗体を含む組成物であって、前記抗体が、組み換えの可溶性ヒトｉＴＣＲへの結合において０．９μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０をもつ、前記組成物。
【請求項２２】
重鎖可変領域および軽鎖可変領域が、ヒト配列からなる、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
ＩＣ５０が、０．５μｇ／ｍｌ未満である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
ＩＣ５０が、０．３μｇ／ｍｌ未満である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２５】
ＩＣ５０が、０．１μｇ／ｍｌと０．５μｇ／ｍｌとの間である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２６】
抗体が、配列番号１によって定義されるエピトープに結合する、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
抗体が、３つの軽ＣＤＲ領域および３つの重ＣＤＲ領域をもち、前記の３つの軽ＣＤＲ領域および３つの重ＣＤＲ領域の夫々が、ヒト配列の複合体である、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
抗体が、配列番号２４、２５および２６と、８５位でロイシンとを含む軽鎖可変領域をもつ、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
抗体が、配列番号２１、２２および２３と、２３位でバリンおよび／または９９位でスレオニンとを含む重鎖可変領域をもつ、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
抗体が、配列番号２４、２５および２６と、８５位でロイシンとを含む配列をもつ軽鎖可変領域、ならびに、配列番号２１、２２および２３と、２３位でバリンおよび／または９９位でスレオニンとを含む重鎖可変領域をもつ、請求項２１に記載の組成物。
【請求項３１】
抗体が、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４から選択される配列をもつ重鎖可変領域を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項３２】
抗体が、配列番号１５、１６、１７、１８、１９または２０から選択される配列をもつ軽鎖可変領域を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項３３】
抗体が、配列番号１７または１８から選択される配列をもつ軽鎖可変領域を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項３４】
抗体が、配列番号７、８、９、１０または１４から選択される配列をもつ重鎖可変領域、および配列番号１７または１８から選択される配列をもつ軽鎖可変領域を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項３５】
抗体が、配列番号１７または１８から選択される配列を有する軽鎖可変領域、および配列番号９または１０から選択される配列を有する重鎖可変領域をもつ、請求項２１の組成物。
【請求項３６】
抗体が、配列番号２７の配列を有する重鎖可変領域、および配列番号２９の配列を有する軽鎖可変領域をもつ、請求項２１に記載の組成物。
【請求項３７】
抗体が、配列番号２８の配列を有する重鎖可変領域、および配列番号２９の配列を有する軽鎖可変領域をもつ、請求項２１に記載の組成物。
【請求項３８】
抗体が、枯渇抗体である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項３９】
抗体が、対象への投与後、１つまたは２つ以上の血清サイトカインレベルにおいて、有意な変化を引き起こさない、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
抗体が、活性化抗体である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項４１】
対象においてｉＮＫＴ細胞を枯渇させることによって該対象を処置するための方法であって、かかる処置が必要なヒト対象に、該ヒト対象においてｉＮＫＴ細胞を枯渇させるのに有効な請求項３７に記載の組成物の量を投与することを含む、前記方法。
【請求項４２】
対象が、気道過敏状態、アレルギー、自己免疫疾患、アレルギーを除く炎症状態、虚血再灌流傷害、血管炎性疾患もしくは鎌状赤血球貧血を患うか、または移植の予定があるか、もしくは移植を行った、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
抗体が、対象に投与後、１つまたは２つ以上の血清サイトカインレベルにおいて、有意な変化を引き起こさない、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
対象においてｉＮＫＴ細胞を活性化させることによって該対象を処置するための方法であって、かかる処置が必要なヒト対象に、該ヒト対象においてｉＮＫＴ細胞を活性化させるのに有効な請求項４０に記載の組成物の量を投与することを含む、前記方法。
【請求項４５】
対象が、感染性疾患を患うか、または癌を患う、請求項４４に記載の方法。
【国際調査報告】
2015502340.tif 000027
2015502340.tif 000028