(57)【要約】ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、アルミニウム塩アジュバント、およびＴＬＲ４アゴニストを含む免疫原性組成物。好ましくは、ＴＬＲ４アゴニスト、および／またはトキソイドのうちの少なくとも１種が、アルミニウム塩アジュバント上に吸着されている。一局面において、この免疫原性組成物は、０．４ｍｇ／ｍｌ未満のＡｌ＋＋＋濃度を有する。別の局面において、この免疫原性組成物は、各々低用量のジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および百日咳トキソイドを有する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、アルミニウム塩アジュバント、およびＴＬＲ４アゴニストを含む免疫原性組成物。
【請求項２】
前記ＴＬＲ４アゴニスト、および／または前記トキソイドのうちの少なくとも１種が、前記アルミニウム塩アジュバントに吸着されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記免疫原性組成物が、０．４ｍｇ／ｍｌ未満のＡｌ＋＋＋濃度を有する、上記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４】
各々低用量のジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および百日咳トキソイドを有する、上記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および百日咳トキソイドに加えて抗原を含む、上記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
結合体化Ｈｉｂ莢膜糖、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、三価の不活化ポリオウイルス、および／または結合体化髄膜炎菌莢膜糖を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
≦８Ｌｆ／ｍｌのジフテリアトキソイドを有する、上記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
≦３．５Ｌｆ／ｍｌの破傷風トキソイドを有する、上記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
≦５μｇ／ｍｌの百日咳トキソイドを有する、上記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
≦５μｇ／ｍｌのＨｉｂ糖を有する、上記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
≦５μｇ／ｍｌのＨＢｓＡｇを有する、上記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
（ｉ）≦２０ＤＵ／ｍｌの１型ポリオウイルスおよび／または（ｉｉ）≦４ＤＵ／ｍｌの２型ポリオウイルスおよび／または（ｉｉｉ）≦１６ＤＵ／ｍｌの３型ポリオウイルスを有する、上記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記アルミニウム塩アジュバントが、（ｉ）水酸化アルミニウムアジュバントまたは（ｉｉ）リン酸アルミニウムアジュバントまたは（ｉｉｉ）水酸化アルミニウムアジュバントとリン酸アルミニウムアジュバントとの混合物である、上記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
髄膜炎菌血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５および／またはＹのうちの１種または複数に由来する結合体化莢膜糖を含む、上記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
肺炎球菌血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび／または３３Ｆのうちの１種または複数に由来する結合体化莢膜糖を含む、上記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
（ｉ）髄膜炎菌Ｈ因子結合タンパク質抗原および／または（ｉｉ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌのヘパリン結合抗原および／または（ｉｉｉ）髄膜炎菌ＮｈｈＡ抗原および／または（ｉｖ）髄膜炎菌外膜小胞を含む、上記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ＴＬＲ４アゴニストが３ｄ−ＭＰＬである、上記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
患者において免疫応答を上昇させる方法であって、上記請求項のいずれか一項に記載の組成物を前記患者に投与するステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、米国仮出願第６１／６０８，４０９号（２０１２年３月８日出願）および同第６１／６９７，７４５号（２０１２年９月６日出願）の利益を主張する。これら出願の両方の完全な内容は、全ての目的のために参考として本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、混合ワクチン、すなわち、ワクチンの投与により、１種超の病原体に対して被験体を同時に免疫化することができるよう、１種超の病原体に由来する混合免疫原を含有するワクチンの分野にある。
【背景技術】
【０００３】
単一用量内に１種超の病原生物に由来する抗原を含有するワクチンが、「多価」ワクチンまたは「混合」ワクチンとして公知である。ジフテリア、破傷風および百日咳（「ＤＴＰ」ワクチン）、またははしか、おたふく風邪および風疹（「ＭＭＲ」ワクチン）に対して防御するための三価ワクチンを含めた、様々な混合ワクチンがヒトへの使用に対して認可されてきた。これらのワクチンは、受ける注射の回数が減るという利点を患者に提供し、これが、特に小児の患者において、コンプライアンスの増大という臨床的利点につながる可能性がある（例えば、参考文献１の第２９章を参照されたい。）。
【０００４】
現行の混合ワクチンは、経験的な安全性の研究にもかかわらず、一部の患者の圧力団体に懸念を与えているアルミニウム塩の比較的高い量をアジュバントとして含む可能性がある［２，３］。例えば、公知の混合ワクチンにおけるレベルは以下の通りである（以下の表Ａも参照されたい）：
【０００５】
【表１】
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【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ＰｌｏｔｋｉｎおよびＯｒｅｎｓｔｅｉｎ編、Ｖａｃｃｉｎｅｓ．（２００４）第４版、ＩＳＢＮ：０−７２１６−９６８８−０
【非特許文献２】Ｆｒａｎｃｏｉｓら、Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  Ｊ（２００５）２４：９５３〜６１
【非特許文献３】Ｂａｙｌｏｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００１）２０（補遺３）：Ｓ１８〜Ｓ２３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
より低レベルのアルミニウムを有するワクチンは、一部の患者群に対して有用であり、本発明の目的は、このようなワクチンを、理想的にはワクチンの効力を損失することなく提供することである。
【０００８】
現行のワクチンに伴う別の弱点は、様々な文献では、保護効果がより少ない量の抗原で達成し得ることが示されているものの、それらのワクチンが比較的高い量の抗原を必要とすることであり、例えば、参考文献４では、Ｄ−Ｔ−Ｐｗ−Ｈｉｂワクチンにおいて、免疫学的応答を損失することなく、Ｈｉｂ抗原の量を半減できることが示され、参考文献５では、ポリオに対する十分なレベルの防御を維持しながら、低減したＩＰＶ用量を使用することができることが主張されている。本発明の目的は、理想的には免疫保護効果を損失することなく、低減された量の抗原を有するさらなるワクチンを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一般に、本発明は、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、アルミニウム塩アジュバント、およびＴＬＲ４アゴニストを含む免疫原性組成物を提供する。好ましくは、ＴＬＲ４アゴニストおよび／または少なくとも１種のトキソイドは、アルミニウム塩アジュバントに吸着されている。
【００１０】
したがって、本発明は、様々な混合ワクチン組成物ならびにこれらの製造のための方法を提供する。ＴＬＲ４アゴニストを含むことによって、組成物が比較的低い量の抗原および／または比較的低い量のアルミニウムを有することが可能になるが、それにもかかわらず比較的高い量の抗原および／または比較的高い量のアルミニウムを有する混合ワクチンと同等の免疫原性を有する。
【００１１】
したがって、第１の実施形態では、免疫原性組成物は、０．４ｍｇ／ｍｌ未満のＡｌ＋＋＋濃度を有する。免疫原性組成物が患者への投与のための単位用量形態である場合、単位用量中のＡｌ＋＋＋の量は０．２ｍｇ未満とすることができる。
【００１２】
第２の実施形態では、組成物は、各々低用量のジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および百日咳トキソイドを有する。
【００１３】
第３の実施形態では、組成物は、（ａ）各々低用量のジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および百日咳トキソイドならびに（ｂ）０．４ｍｇ／ｍｌ未満の濃度のＡｌ＋＋＋を有する。組成物が患者への投与のための単位用量形態である場合、それは、１単位用量当たり０．２ｍｇ未満のＡｌ＋＋＋を含むことができる。
【００１４】
本発明の組成物は、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および百日咳トキソイドに加えて抗原を含むことができ、例えば、Ｈｉｂ莢膜糖（理想的には、結合体化されている）、ＨＢｓＡｇ、ＩＰＶ、髄膜炎菌莢膜糖（理想的には、結合体化されている）などを含むことができる。
【００１５】
本発明のさらなる態様は、１または２つのみの本発明のＤＴａＰ含有組成物が投与される、乳児のための免疫化スケジュールである。したがって本発明は、少なくともジフテリア、破傷風および百日咳（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）（百日咳（ｗｈｏｏｐｉｎｇ  ｃｏｕｇｈ））に対して乳児を免疫化するための方法を提供し、この方法は、本発明の混合ワクチンの２用量以下を乳児に投与することを含む。
【００１６】
ジフテリアトキソイド
ジフテリアは、グラム陽性の無芽胞性好気性細菌であるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅにより引き起こされる。この生物はプロファージコードＡＤＰ−リボシル化外毒素（「ジフテリア毒素」）を発現し、その毒素は、（例えばホルムアルデヒドを使用して）処理することによって、もはや毒性はないが、抗原性のままであり、注射後に特異的な抗毒素抗体の生成を刺激することができるトキソイドが得られる。ジフテリアトキソイドは、参考文献１の第１３章により詳細に開示されている。好ましいジフテリアトキソイドは、ホルムアルデヒド処理によって調製されるものである。そのジフテリアトキソイドは、Ｃ．  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅを増殖培地（例えばＦｅｎｔｏｎ培地、またはＬｉｎｇｇｏｕｄ＆Ｆｅｎｔｏｎ培地）（これらにウシ抽出物を補充してもよい）中で増殖させ、続いてホルムアルデヒド処理、限外濾過および沈殿を行うことによって得ることができる。次いで、トキソイド化した材料を滅菌濾過および／または透析を含むプロセスにより処理してもよい。
【００１７】
ジフテリアトキソイドの量は、国際単位（ＩＵ）で表現することができる。例えば、ＮＩＢＳＣ［６］は、「Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  Ｔｏｘｏｉｄ  Ａｄｓｏｒｂｅｄ  Ｔｈｉｒｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  １９９９」［７、８］を供給し、それは、１アンプルあたり１６０ＩＵを含有する。ＩＵ系の代替として、「Ｌｆ」単位（「凝集単位」、「限界凝集用量」、または「凝集の限界」）が、１国際単位の抗毒素と混合した場合に、最適に凝集する混合物を生成するトキソイドの量として定義される［９］。例えば、ＮＩＢＳＣは、１アンプルあたり３００Ｌｆを含有する「Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  Ｔｏｘｏｉｄ，Ｐｌａｉｎ」［１０］および１アンプルあたり９００Ｌｆを含有する「Ｔｈｅ  １ｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｆｏｒ  Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  Ｔｏｘｏｉｄ  Ｆｏｒ  Ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ」［１１］を供給する。組成物中のジフテリア毒素の濃度は、このような基準試薬に対して較正された基準物質との比較によって、凝集アッセイを使用して容易に決定することができる。ＩＵ系とＬｆ系との間の変換は、特定のトキソイド調製物に依存する。
【００１８】
本発明の一部の実施形態では、組成物は「低用量」のジフテリアトキソイドを含む。これは、組成物中のジフテリアトキソイドの濃度が≦８Ｌｆ／ｍｌ、例えば＜７、＜６、＜５、＜４、＜３、＜２、＜１Ｌｆ／ｍｌなどであることを意味する。したがって、典型的な０．５ｍｌの単位用量の体積では、ジフテリアトキソイドの量は４Ｌｆ未満、例えば＜３、＜２、＜１、＜１／２Ｌｆなどである。
【００１９】
組成物中のジフテリアトキソイドは、好ましくはアルミニウム塩上に、好ましくは水酸化アルミニウムアジュバント上に吸着されている（より好ましくは完全に吸着されている）。
【００２０】
破傷風トキソイド
破傷風は、グラム陽性、芽胞形成性桿菌属である、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉにより引き起こされる。この生物は、エンドペプチダーゼ（「破傷風毒素」）を発現し、これを処理することによって、もはや毒性はないが、抗原性のままであり、注射後に特異的な抗毒素抗体の生成を刺激することができるトキソイドが得られる。破傷風トキソイドは、参考文献１の第２７章でより詳細に開示されている。好ましい破傷風トキソイドは、ホルムアルデヒド処理により調製されたものである。破傷風トキソイドは、Ｃ．ｔｅｔａｎｉを増殖培地（例えば、ウシカゼイン由来のＬａｔｈａｍ培地）中で増殖させ、続いてホルムアルデヒド処理、限外濾過法および沈殿を行うことによって得ることができる。次いで、材料は、滅菌濾過および／または透析を含むプロセスによって処理することができる。
【００２１】
破傷風トキソイドの量は、国際単位（ＩＵ）で表現することができる。例えば、ＮＩＢＳＣは、「Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｔｏｘｏｉｄ  Ａｄｓｏｒｂｅｄ  Ｔｈｉｒｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ２０００」［１２、１３］を供給し、それは、１アンプルあたり４６９ＩＵを含有する。ジフテリアトキソイドと同様に、「Ｌｆ」単位はＩＵ系の代替である。ＮＩＢＳＣは、「Ｔｈｅ  １ｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｔｏｘｏｉｄ  Ｆｏｒ  Ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ」［１４］を供給し、それは、１アンプルあたり１０００ＬＦを含有する。組成物中のジフテリア毒素の濃度は、このような基準試薬に対して較正された基準物質との比較によって、凝集アッセイを使用して容易に決定することができる。
【００２２】
本発明の一部の実施形態では、組成物は「低用量」の破傷風トキソイドを含む。これは、組成物中の破傷風トキソイドの濃度が≦３．５Ｌｆ／ｍｌ、例えば＜３、＜２．５、＜２、＜１．５＜１、＜１／２Ｌｆ／ｍｌなどであることを意味する。したがって、典型的な０．５ｍｌの単位用量の体積では、破傷風トキソイドの量は、１．７５Ｌｆ未満、例えば＜１．５、＜１、＜１／２、＜１／４Ｌｆなどである。
【００２３】
組成物中の破傷風トキソイドは、好ましくは、アルミニウム塩上に、好ましくは水酸化アルミニウムアジュバント上に吸着されている（時には完全に吸着されている）。
【００２４】
百日咳トキソイド
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓは百日咳を引き起こす。ワクチン中の百日咳抗原は、細胞性（全細胞、不活化Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ細胞の形態；「ｗＰ」）または無細胞性（「ａＰ」）のいずれかである。細胞性百日咳抗原の調製は、十分に記録されており（例えば、参考文献１の第２１章を参照されたい）、例えばそれは、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの第Ｉ相培養物の熱不活化により得ることができる。無細胞性抗原を使用する場合、以下の抗原のうちの１種、２種または（好ましくは）３種が含まれる：（１）無毒化百日咳毒素（百日咳トキソイド、または「ＰＴ」）；（２）線維状赤血球凝集素（「ＦＨＡ」）；（３）ペルタクチン（「６９キロダルトン外膜タンパク質」としても公知）。これら３種の抗原は、改変Ｓｔａｉｎｅｒ−Ｓｃｈｏｌｔｅ液体培地中で増殖させたＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ培養物からの単離により調製することができる。ＰＴおよびＦＨＡは、発酵ブロスから（例えば、ヒドロキシアパタイトゲル上への吸着により）単離することができるのに対して、ペルタクチンは、細胞から加熱処理および凝集（例えば塩化バリウムを使用して）により抽出することができる。抗原は、次に続くクロマトグラフィーおよび／または沈殿ステップにおいて精製することができる。ＰＴおよびＦＨＡは、疎水性クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーにより精製することができる。ペルタクチンは、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー、またはＩＭＡＣにより精製することができる。ＦＨＡおよびペルタクチンは、本発明による使用の前に、ホルムアルデヒドで処理することができる。ＰＴは、好ましくは、ホルムアルデヒドおよび／またはグルタルアルデヒドの処理により無毒化される。この化学的解毒作用手順の代替として、ＰＴは、酵素活性が変異誘発によって低減した変異体ＰＴ［１５］（例えば９Ｋ／１２９Ｇ二重変異体［１６］）であってよいが、化学処理による無毒化が好ましい。
【００２５】
本発明は、ＰＴ含有ｗＰ抗原または好ましくはＰＴ含有ａＰ抗原を使用する。ａＰ抗原を使用する場合、本発明の組成物は典型的に、ＰＴに加えて、ＦＨＡおよび、場合によって、ペルタクチンを含むことになる。それはまた場合によって、線毛タイプ２および３も含むことができる。
【００２６】
無細胞性百日咳抗原の量は、典型的にはマイクログラムで表現される。本発明の一部の実施形態では、組成物は、「低用量」の百日咳トキソイドを含む。これは、組成物中の百日咳トキソイドの濃度は≦５μｇ／ｍｌ、例えば＜４、＜３、＜２．５、＜２、＜１μｇ／ｍｌなどであることを意味する。したがって、典型的な０．５ｍｌの単位用量の体積では、百日咳トキソイドの量は２．５μｇ未満、例えば＜２、＜１．５、＜１、＜０．５μｇなどである。
【００２７】
百日咳トキソイド、ＦＨＡおよびペルタクチンのそれぞれが本発明の組成物中に存在することは通常である。それらは、様々な比（質量で）、例えば、ＰＴ：ＦＨＡ：ｐ６９比が１６：１６：５または５：１０：６または２０：２０：３または２５：２５：８または１０：５：３で存在し得る。これら３種の抗原のそれぞれは一般に、＜６０μｇ／ｍｌ、例えば、それぞれが４〜５０μｇ／ｍｌの範囲で存在することになる。百日咳抗原の総濃度＜１２０μｇ／ｍｌは典型的である。両方が存在する場合、ペルタクチンと比べて過剰の質量のＦＨＡを有することは通常である。
【００２８】
組成物中の百日咳トキソイドは、好ましくはアルミニウム塩上に、好ましくは水酸化アルミニウムアジュバント上に吸着されている（時には完全に吸着されている）。いずれのＦＨＡも水酸化アルミニウムアジュバント上に吸着されていることができる。いずれのペルタクチンもリン酸アルミニウムアジュバント上に吸着されていることができる。
【００２９】
Ｈｉｂ結合体
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ型（「Ｈｉｂ」）は、細菌性髄膜炎を引き起こす。Ｈｉｂワクチンは典型的には、莢膜糖抗原（例えば、参考文献１の第１４章）に基づき、その調製は、十分に記録されている（例えば参考文献１７〜２６）。Ｈｉｂ糖は、キャリアタンパク質に結合体化することによって、その免疫原性を、特に小児において増強する。典型的なキャリアタンパク質は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ジフテリアトキソイドのＣＲＭ１９７誘導体、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅタンパク質Ｄ、および血清群Ｂ髄膜炎菌に由来する外膜タンパク質複合体である。破傷風トキソイドは、「ＰＲＰ−Ｔ」と一般に呼ばれる製品に使用される場合、好ましいキャリアである。ＰＲＰ−Ｔは、Ｈｉｂ莢膜多糖を、臭化シアンを使用して活性化し、活性化した糖を、アジピン酸リンカー（例えば、（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）など、典型的には塩酸塩）にカップリングし、次いでリンカー−糖実体と破傷風トキソイドキャリアタンパク質とを反応させることによって作製することができる。結合体の糖部分は、Ｈｉｂ細菌から調製される場合の全長ポリリボシルリビトールホスフェート（ＰＲＰ）、および／または全長ＰＲＰのフラグメントを含み得る。糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）が１：５（すなわち過剰なタンパク質）から５：１（すなわち過剰な糖）、例えば１：２から５：１の比、および１：１．２５から１：２．５の比である結合体を使用することができる。しかし、好ましいワクチンにおいて、糖とキャリアタンパク質の重量比は、１：２．５から１：３．５である。破傷風トキソイドが抗原としても、キャリアタンパク質としても存在するワクチンにおいて、結合体内の糖とキャリアタンパク質の重量比は、１：０．３から１：２であってよい［２７］。Ｈｉｂ結合体の投与は、好ましくは、≧０．１５μｇ／ｍｌ、より好ましくは、≧１μｇ／ｍｌの抗ＰＲＰ抗体濃度を生じ、これらは標準的な応答閾値である。
【００３０】
Ｈｉｂ抗原の量は、典型的にマイクログラムで表現される。結合体抗原については、その数字は結合体の糖含有量に基づく。本発明の一部の実施形態では、組成物は、「低用量」のＨｉｂ結合体を含む。これは、組成物中のＨｉｂ糖の濃度が≦５μｇ／ｍｌ、例えば＜４、＜３、＜２．５、＜２、＜１などであることを意味する。したがって、典型的な０．５ｍｌの単位用量の体積において、Ｈｉｂの量は２．５μｇ未満、例えば＜２、＜１．５、＜１、＜０．５などである。
【００３１】
Ｈｉｂ結合体は、アルミニウム塩上に吸着されていてもよいし、または吸着されてなくてもよい。
【００３２】
Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、ウイルス性肝炎を引き起こす公知の因子の１つである。ＨＢＶビリオンは、外側タンパク質外被またはカプシドに取り囲まれた内部コアからなり、ウイルスコアは、ウイルスＤＮＡゲノムを含有する。カプシドの主成分は、ＨＢＶ表面抗原または、より一般的には、「ＨＢｓＡｇ」として公知のタンパク質であり、それは、典型的には、分子量約２４ｋＤａを有する２２６アミノ酸ポリペプチドである。すべての現存するＢ型肝炎ワクチンはＨＢｓＡｇを含有し、この抗原が正常なワクチン被接種者に投与された場合、それは、ＨＢＶ感染に対して防御する抗ＨＢｓＡｇ抗体の生成を刺激する。
【００３３】
ワクチン製造に関して、ＨＢｓＡｇは、２つの方式で作製することができる。第１の方法は、慢性Ｂ型肝炎キャリアの血漿から粒子状形態で抗原を精製することを含む。これは、ＨＢＶ感染中に多量のＨＢｓＡｇが肝臓で合成され、血流中に放出されるからである。第２の方式は、組換えＤＮＡ法によりタンパク質を発現させることを含む。本発明の方法で使用するためのＨＢｓＡｇは、酵母細胞において組換え発現される。適切な酵母として、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなど）またはＨａｎｅｎｓｕｌａ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａなど）宿主が挙げられる。
【００３４】
天然のＨＢｓＡｇ（すなわち、血漿精製した製品の場合のような）とは異なり、酵母で発現されたＨＢｓＡｇは、一般にグリコシル化されておらず、これは、本発明で使用するためのＨＢｓＡｇの最も好ましい形態である。酵母で発現されたＨＢｓＡｇは、高度に免疫原性であり、血液製剤汚染のリスクなしに調製することができる。
【００３５】
ＨＢｓＡｇは一般に、リン脂質を含む脂質マトリクスを含めて、実質的に球状の粒子（平均直径約２０ｎｍ）の形態となる。酵母で発現されたＨＢｓＡｇ粒子は、ホスファチジルイノシトールを含むことができ、これは、天然のＨＢＶビリオンでは見出されない。粒子はまた、免疫系を刺激するために、非毒性量のＬＰＳを含み得る［２８］。粒子は、酵母の破壊中に使用される場合、非イオン性界面活性剤（例えばポリソルベート２０）を保持し得る［２９］。
【００３６】
ＨＢｓＡｇ精製のための好ましい方法は、細胞破壊の後に以下を含む：限外濾過法；サイズ排除クロマトグラフィー；陰イオン交換クロマトグラフィー；超遠心分離；脱塩；および滅菌濾過。溶解物は、細胞破壊後に（例えばポリエチレングリコールを使用して）沈殿させてもよく、これによってＨＢｓＡｇは溶液中に残り、これで限外濾過にかける準備ができる。
【００３７】
精製後、ＨＢｓＡｇを透析に供してもよく（例えば、システインと共に）、この透析を使用して、ＨＢｓＡｇ調製中に使用された可能性があるチメロサールなどのあらゆる水銀防腐剤を除去することができる［３０］。チメロサールを含まない調製物が好ましい。
【００３８】
ＨＢｓＡｇは、好ましくは、ＨＢＶサブタイプａｄｗ２に由来する。
【００３９】
ＨＢｓＡｇの量は、典型的にマイクログラムで表現される。本発明の一部の実施形態では、組成物は「低用量」のＨＢｓＡｇを含む。これは、組成物中のＨＢｓＡｇの濃度が、≦５μｇ／ｍｌ、例えば＜４、＜３、＜２．５、＜２、＜１などであることを意味する。したがって、典型的な０．５ｍｌの単位用量の体積では、ＨＢｓＡｇの量は２．５μｇ未満、例えば＜２、＜１．５、＜１、＜０．５などである。
【００４０】
ＨＢｓＡｇは、アルミニウム塩上に吸着されていてもよい（好ましくはリン酸アルミニウムアジュバント上に吸着されている）。
【００４１】
不活化ポリオウイルス抗原（ＩＰＶ）
灰白髄炎は、３つの型のポリオウイルスのうちの１つによって引き起こされ得る。その３つの型は類似しており、同一の症状を引き起こすが、それらは抗原的には極めて異なり、１つの型による感染は、その他による感染を防御しない。したがって、参考文献１の第２４章で説明されているとおり、本発明と共に３つのポリオウイルス抗原、すなわちポリオウイルス１型（例えばＭａｈｏｎｅｙ菌株）、ポリオウイルス２型（例えばＭＥＦ−１菌株）、およびポリオウイルス３型（例えばＳａｕｋｅｔｔ菌株）を使用することが好ましい。これらの菌株（「Ｓａｌｋ」菌株）の代替として、例えば、参考文献３１および３２に考察されているとおり、１型〜３型のうちのＳａｂｉｎ菌株を使用することができる。これらの菌株は通常のＳａｌｋ菌株より強力であることができる。
【００４２】
ポリオウイルスは細胞培養物中で増殖してもよい。好ましい培養物は、Ｖｅｒｏ細胞株を使用し、このＶｅｒｏ細胞株は、サル腎臓由来の継続細胞株である。Ｖｅｒｏ細胞は、好都合には、培養されたマイクロキャリアであることができる。ウイルス感染前および感染中のＶｅｒｏ細胞の培養物は、ウシ由来の材料、例えば、子牛血清、およびラクトアルブミン加水分解物（例えば、ラクトアルブミンの酵素分解により得られる）の使用を含み得る。このようなウシ由来の材料は、ＢＳＥも他のＴＳＥも含まない供給源から得られるべきである。
【００４３】
増殖後、ビリオンは、限外濾過法、ダイアフィルトレーション、およびクロマトグラフィーなどの技術を使用して精製することができる。患者への投与の前に、ポリオウイルスを不活化させなければならず、これは、ウイルスが本発明のプロセスで使用される前に、ホルムアルデヒドでの処理により達成することができる。
【００４４】
ウイルスは、好ましくは、個々に増殖、精製および不活化され、次いで組み合わせることによって、本発明での使用のためのバルク混合物が得られる。
【００４５】
不活化ポリオウイルス（ＩＰＶ）の量は、典型的に「ＤＵ」単位（「Ｄ抗原単位」［３３］）で表現される。本発明の一部の実施形態では、組成物は「低用量」のポリオウイルスを含む。１型ポリオウイルスに対しては、これは、組成物中のウイルスの濃度が、≦２０ＤＵ／ｍｌ、例えば＜１８、＜１６、＜１４、＜１２、＜１０などであることを意味する。２型ポリオウイルスに対しては、これは、組成物中のウイルスの濃度が、≦４ＤＵ／ｍｌ、例えば＜３、＜２、＜１、＜０．５などであることを意味する。３型ポリオウイルスに対しては、これは、組成物中のウイルスの濃度が、≦１６ＤＵ／ｍｌ、例えば＜１４、＜１２、＜１０、＜８、＜６などであることを意味する。１、２および３型の３つのすべてのポリオウイルスが存在する場合、その３つの抗原は、それぞれ５：１：４のＤＵ比で存在することができ、または任意の他の適切な比、例えば、Ｓａｂｉｎ菌株を使用する場合には、１５：３２：４５の比で存在することができる［３１］。Ｓａｂｉｎ菌株に由来する低用量の抗原は、特に有用であり、（１単位用量当たり）１型は≦１０ＤＵ、２型は≦２０ＤＵ、および３型は≦３０ＤＵである。
【００４６】
ポリオウイルスは、好ましくは、これらが処方される前にはいかなるアジュバントにも吸着されていないが、これらは処方後に、組成物中のアルミニウム塩（複数可）に吸着させることができる。
【００４７】
さらなる抗原
Ｄ、Ｔ、Ｐａ、ＨＢｓＡｇ、Ｈｉｂおよび／またはポリオウイルス抗原を含むのと同様に、本発明の免疫原性組成物は、さらなる病原体に由来する抗原を含み得る。例えば、これらの抗原は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（血清群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５および／またはＹのうちの１種または複数）またはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来し得る。
【００４８】
髄膜炎菌糖
組成物がＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ莢膜糖結合体を含む場合、１種または１種超のこのような結合体が存在し得る。血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹのうちの２、３、または４種を含めること、例えばＡ＋Ｃ、Ａ＋Ｗ１３５、Ａ＋Ｙ、Ｃ＋Ｗ１３５、Ｃ＋Ｙ、Ｗ１３５＋Ｙ、Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５、Ａ＋Ｃ＋Ｙ、Ａ＋Ｗ１３５＋Ｙ、Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙなどは典型的である。血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹの４種すべてに由来する糖を含む成分は、ＭＥＮＡＣＴＲＡ（商標）およびＭＥＮＶＥＯ（商標）製品の場合のように有用である。１種超の血清群に由来する結合体が含まれる場合、それらは実質的に等しい質量で存在してもよく、例えば各血清群の糖の質量は互いに±１０％以内にある。１血清群当たりの典型的な量は、１μｇ〜２０μｇ、例えば１血清群当たり２〜１０μｇ、または約４μｇまたは約５μｇまたは約１０μｇである。実質的に等しい比の代替として、血清群Ａ糖の２倍の質量を使用することもできる。
【００４９】
結合体の投与は、好ましくは、少なくとも４倍、および好ましくは少なくとも８倍という関連する血清群についての血清殺菌アッセイ（ＳＢＡ）力価の増大をもたらす。ＳＢＡ力価は、新生仔ウサギ補体またはヒト補体を使用して測定することができる［３４］。
【００５０】
血清群Ａ髄膜炎菌の莢膜糖は、Ｃ３位およびＣ４位において部分的Ｏ−アセチル化を有する、（α１→６）連結Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−１−ホスフェートのホモポリマーである。Ｃ−３位でのアセチル化は、７０〜９５％であることができる。糖を精製するために使用される条件は（例えば、塩基性条件下）、脱Ｏ−アセチル化を生じる可能性があるが、このＣ−３位においてＯＡｃを保持することは有用である。一部の実施形態では、血清群Ａ糖中のマンノサミン残渣のうちの少なくとも５０％（例えば少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれより高い）は、Ｃ−３位においてＯ−アセチル化している。アセチル基は、加水分解を阻止するためにブロック基で置き換えることができ［３５］、このような修飾糖は、本発明の意味の範囲内で依然として血清群Ａ糖である。
【００５１】
血清群Ｃ莢膜糖は、（α２→９）連結シアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸、または「ＮｅｕＮＡｃ」）のホモポリマーである。糖構造は、→９）−Ｎｅｕ  ｐ  ＮＡｃ  ７／８  ＯＡｃ−（α２→と記載される。大部分の血清群Ｃ株は、シアル酸残渣のＣ−７および／またはＣ−８においてＯ−アセチル基を有するが、臨床分離株のうちの約１５％は、これらのＯ−アセチル基を欠いている［３６、３７］。ＯＡｃ基の存在または不在は、独自のエピトープを生成し、糖への抗体結合の特異性は、Ｏ−アセチル化（ＯＡｃ−）株および脱Ｏ−アセチル化（ＯＡｃ＋）株に対するその殺菌活性に影響を及ぼし得る［３８〜４０］。本発明で使用される血清群Ｃ糖は、ＯＡｃ＋株またはＯＡｃ−株のいずれかから調製することができる。認可されたＭｅｎＣ結合体ワクチンは、ＯＡｃ−（ＮＥＩＳＶＡＣ−Ｃ（商標））糖とＯＡｃ＋（ＭＥＮＪＵＧＡＴＥ（商標）＆ＭＥＮＩＮＧＩＴＥＣ（商標））糖の両方を含む。一部の実施形態では、血清群Ｃ結合体の生成のための株は、ＯＡｃ＋株、例えば血清型１６、血清亜型Ｐ１．７ａ，１などのＯＡｃ＋株である。したがってＣ：１６：Ｐ１．７ａ，１ＯＡｃ＋株を使用することができる。血清亜型Ｐ１．１のＯＡｃ＋株、例えば、Ｃ１１株などもまた有用である。好ましいＭｅｎＣ糖は、ＯＡｃ＋株、例えば、株Ｃ１１などから採取される。
【００５２】
血清群Ｗ１３５糖は、シアル酸−ガラクトース二糖単位のポリマーである。それは、血清群Ｃ糖のように、ただし、シアル酸の７および９位に、可変のＯ−アセチル化を有する［４１］。構造は、→４）−Ｄ−Ｎｅｕｐ５Ａｃ（７／９ＯＡｃ）−α−（２→６）−Ｄ−Ｇａｌ−α−（１→と記載される。
【００５３】
血清群Ｙ糖は、二糖繰返し単位が、ガラクトースの代わりにグルコースを含むことを除いて、血清群Ｗ１３５糖に類似している。それは、血清群Ｗ１３５のように、シアル酸７および９位に可変のＯ−アセチル化を有する［４１］。血清群のＹ構造は、→４）−Ｄ−Ｎｅｕｐ５Ａｃ（７／９ＯＡｃ）−α−（２→６）−Ｄ−Ｇｌｃ−α−（１→と記載される。
【００５４】
本発明に従い使用される糖は、上記に記載されている通り、Ｏ−アセチル化されていてもよい（例えば、天然の莢膜糖において見られるものと同じＯ−アセチル化パターンを有する）か、またはそれらは、糖環の１つもしくは複数の位置において、部分的にもしくは完全に脱Ｏ−アセチル化されていてもよく、またはそれらは天然の莢膜糖と比較して過剰Ｏ−アセチル化されていてもよい。例えば、参考文献４２は、８０％超が脱Ｏ−アセチル化されている血清群Ｙ糖の使用について報告している。
【００５５】
髄膜炎菌結合体中の糖部分は、髄膜炎菌から調製される通りの全長糖を含んでもよいし、および／または全長糖のフラグメントを含んでもよい、すなわち、糖は、細菌に見られる天然莢膜糖よりも短くてもよい。したがって、糖は、解重合されていてもよく、解重合は、糖精製中または精製後であるが、結合体化の前に生じる。解重合は、糖の鎖長を低減させる。１つの解重合法は、過酸化水素の使用を含む［４３］。過酸化水素は、糖に加えられ（例えば、１％の最終Ｈ２Ｏ２濃度を得るため）、次いで、所望の鎖長の低減が達成されるまで、混合物をインキュベートする（例えば、約５５℃で）。別の解重合方法は、酸加水分解を含む［４４］。他の解重合方法は当技術分野で公知である。本発明による使用のための結合体を調製するために使用される糖は、これらの解重合方法のうちのいずれかにより入手可能であり得る。解重合は、免疫原性に対して最適な鎖長を得るために、および／または糖を物理的な扱いやすさのために鎖長を低減させるために使用することができる。一部の実施形態では、糖は、以下の範囲の平均重合度（Ｄｐ）を有する：Ａ＝１０〜２０；Ｃ＝１２〜２２；Ｗ１３５＝１５〜２５；Ｙ＝１５〜２５。Ｄｐではなく分子量に関して、有用な範囲は、すべての血清群に対して以下の通りである：＜１００ｋＤａ；５ｋＤａ〜７５ｋＤａ；７ｋＤａ〜５０ｋＤａ；８ｋＤａ〜３５ｋＤａ；１２ｋＤａ〜２５ｋＤａ；１５ｋＤａ〜２２ｋＤａ。他の実施形態では、髄膜炎菌血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹのそれぞれに由来する糖に対する平均分子量は、特にＭＡＬＬＳにより決定される場合、５０ｋＤａより大きくてもよく、例えば≧７５ｋＤａ、≧１００ｋＤａ、≧１１０ｋＤａ、≧１２０ｋＤａ、≧１３０ｋＤａなどであり［４５］、さらに１５００ｋＤａまでであってもよい。例えば：ＭｅｎＡ糖は、５０〜５００ｋＤａの範囲、例えば６０〜８０ｋＤａであってよく；ＭｅｎＣ糖は、１００〜２１０ｋＤａの範囲であってよく；ＭｅｎＷ１３５糖は６０〜１９０ｋＤａの範囲、例えば１２０〜１４０ｋＤａであってよく；および／またはＭｅｎＹ糖は、６０〜１９０ｋＤａの範囲、例えば１５０〜１６０ｋＤａであってよい。
【００５６】
成分または組成物がＨｉｂ結合体と髄膜炎菌結合体の両方を含む場合、一部の実施形態では、Ｈｉｂ糖の質量は、ある特定の髄膜炎菌血清群糖の質量と実質的に同じであることができる。一部の実施形態では、Ｈｉｂ糖の質量は、ある特定の髄膜炎菌血清群糖の質量より大きい（例えば少なくとも１．５×）。一部の実施形態では、Ｈｉｂ糖の質量は、ある特定の髄膜炎菌血清群糖の質量より小さい（例えば少なくとも３分の２）。
【００５７】
組成物が１種超の髄膜炎菌血清群に由来する糖を含む場合、１血清群当たりの平均糖質量が存在する。各血清群の実質的に等しい質量が使用される場合、平均質量はそれぞれ個々の質量と同じであり；等しくない質量が使用される場合、平均は異なり、例えば、ＭｅｎＡＣＷＹ混合物に対して１０：５：５：５μｇの量であるとすると、平均質量は、１血清群当たり６．２５μｇである。一部の実施形態では、Ｈｉｂ糖の質量は、１血清群当たりの髄膜炎菌糖の平均質量と実質的に同じである。一部の実施形態では、Ｈｉｂ糖の質量は、１血清群当たりの髄膜炎菌糖の平均質量より大きい（例えば少なくとも１．５×）。一部の実施形態では、Ｈｉｂ糖の質量は、１血清群当たりの髄膜炎菌糖の平均質量より少ない（例えば少なくとも３分の２）［４６］。
【００５８】
髄膜炎菌ポリペプチド
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂの莢膜糖は、有用なワクチン免疫原ではないので、ポリペプチド抗原を代わりに使用することができる。例えば、参考文献４７においてＮｏｖａｒｔｉｓ  Ｖａｃｃｉｎｅｓにより報告された「血清群Ｂ髄膜炎菌のユニバーサルワクチン」、または参考文献４８で考察されているＢＥＸＳＥＲＯ製品を本発明で使用することができる。
【００５９】
本発明の組成物は、Ｈ因子結合タンパク質（ｆＨＢＰ）抗原を含むことができる。ｆＨＢＰ抗原は詳細に特徴づけられている。ｆＨＢＰ抗原はまた、タンパク質「７４１」［参考文献４９中、配列番号２５３５および２５３６］、「ＮＭＢ１８７０」、「ＧＮＡ１８７０」［参考文献５０〜５２］、「Ｐ２０８６」、「ＬＰ２０８６」または「ＯＲＦ２０８６」［５３〜５５］としても公知である。それは、天然にはリポタンパク質であり、すべての髄膜炎菌血清群にわたり発現する。ｆＨＢＰ抗原は、３つの異なる改変体に分けられ［４３］、すべての改変体に対する抗原を含むのが好ましい。
【００６０】
本発明の組成物は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌのヘパリン結合抗原（ＮＨＢＡ）を含み得る［５７］。この抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８の公開ゲノム配列［５８］に、遺伝子ＮＭＢ２１３２として含まれていた。
【００６１】
本発明の組成物は、ＮａｄＡ抗原を含み得る。ＮａｄＡ抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８の公開ゲノム配列［５８］に遺伝子ＮＭＢ１９９４として含まれていた。
【００６２】
本発明の組成物は、ＮｓｐＡ抗原を含み得る。ＮｓｐＡ抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８の公開ゲノム配列［５８］に遺伝子ＮＭＢ０６６３として含まれていた。
【００６３】
本発明の組成物は、ＮｈｈＡ抗原を含み得る。ＮｈｈＡ抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８の公開ゲノム配列［５８］に遺伝子ＮＭＢ０９９２として含まれていた。
【００６４】
本発明の組成物は、Ａｐｐ抗原を含み得る。Ａｐｐ抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８の公開ゲノム配列［５８］に遺伝子ＮＭＢ１９８５として含まれていた。
【００６５】
本発明の組成物は、Ｏｍｐ８５抗原を含み得る。Ｏｍｐ８５は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８の公開ゲノム配列［５８］に遺伝子ＮＭＢ０１８２として含まれていた。
【００６６】
本発明の組成物は、髄膜炎菌外膜小胞を含み得る。
【００６７】
肺炎球菌糖
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、細菌性髄膜炎を引き起こし、現存するワクチンは莢膜糖に基づく。したがって本発明の組成物は、キャリアタンパク質に結合体化した少なくとも１種の肺炎球菌莢膜糖を含むことができる。
【００６８】
本発明は、１つまたは複数の異なる肺炎球菌血清型に由来する莢膜糖を含むことができる。組成物が１種超の血清型に由来する糖抗原を含む場合、これらを、好ましくは、別個に調製し、別個に結合体化し、次いで組み合わせる。肺炎球菌莢膜糖を精製するための方法は当技術分野で公知であり（例えば、参考文献５９を参照されたい）、２３種の異なる血清型に由来する精製糖に基づくワクチンは、長年の間公知であった。これらの方法に対する改善もまた記載されており、例えば、血清型３については参考文献６０に、または血清型１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆおよび１９Ａについては、参考文献６１に記載されている通りである。
【００６９】
肺炎球菌莢膜糖（複数可）は、典型的に以下の血清型から選択されることになる：１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび／または３３Ｆ。したがって、全部で、組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３またはそれより多い異なる血清型に由来する莢膜糖を含み得る。少なくとも血清型６Ｂ糖を含む組成物が有用である。
【００７０】
血清型の有用な組合せは、７価の組合せ、例えば、血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆのそれぞれに由来する莢膜糖を含む。別の有用な組合せは、９価の組合せ、例えば、血清型１、４、５、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆのそれぞれに由来する莢膜糖を含む。別の有用な組合せは、１０価の組合せ、例えば、血清型１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆのそれぞれに由来する莢膜糖を含む。１１価の組合せは、血清型３に由来する糖をさらに含み得る。１２価の組合せは、１０価の混合物に以下を加えてもよい：血清型６Ａおよび１９Ａ；６Ａおよび２２Ｆ；１９Ａおよび２２Ｆ；６Ａおよび１５Ｂ；１９Ａおよび１５Ｂ；または２２Ｆおよび１５Ｂ。１３価の組合せは、１１価の混合物に以下を加えてもよい：血清型１９Ａおよび２２Ｆ；８および１２Ｆ；８および１５Ｂ；８および１９Ａ；８および２２Ｆ；１２Ｆおよび１５Ｂ；１２Ｆおよび１９Ａ；１２Ｆおよび２２Ｆ；１５Ｂおよび１９Ａ；１５Ｂおよび２２Ｆ；６Ａおよび１９Ａなど。
【００７１】
したがって、有用な１３価の組合せは、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９（または１９Ａ）、１９Ｆおよび２３Ｆに由来する莢膜糖を含み、例えば、参考文献６２〜６５で開示されている通りに調製される。１つのこのような組合せは、約８μｇ／ｍｌにおいて血清型６Ｂ糖および約４μｇ／ｍｌの濃度において他の１２種の糖をそれぞれ含む。別のこのような組合せは、約８μｇ／ｍｌにおいてそれぞれ血清型６Ａおよび６Ｂ糖、ならびに約４μｇ／ｍｌにおいてそれぞれ他の１１種の糖を含む。
【００７２】
結合体に対して適切なキャリアタンパク質として、細菌性毒素、例えば、ジフテリアまたは破傷風の毒素、またはそのトキソイドもしくは変異体などが挙げられる。これらは結合体ワクチンに一般に使用される。例えば、ＣＲＭ１９７ジフテリア毒素変異体は有用である［６６］。他の適切なキャリアタンパク質として、合成ペプチド［６７、６８］、熱ショックタンパク質［６９、７０］、百日咳タンパク質［７１、７２］、サイトカイン［７３］、リンフォカイン［７３］、ホルモン［７３］、増殖因子［７３］、人工タンパク質、例えば、様々な病原体由来の抗原に由来する複数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ［７４］、例えば、Ｎ１９［７５］、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに由来するタンパク質Ｄ［７６〜７８］、ニューモリシン（ｐｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎ）［７９］もしくはその無毒性誘導体［８０］、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ［８１］、鉄取り込みタンパク質［８２］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに由来する毒素ＡまたはＢ［８３］、組換え型Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａエキソタンパク質Ａ（ｒＥＰＡ）［８４］などを含むものが挙げられる。
【００７３】
肺炎球菌結合体ワクチンに対して、特に有用なキャリアタンパク質は、ＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイドおよびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅタンパク質Ｄである。ＣＲＭ１９７は、ＰＲＥＶＮＡＲ（商標）に使用されている。１３価の混合物は、ＣＲＭ１９７を、１３種の結合体のそれぞれに対してキャリアタンパク質として使用してもよく、ＣＲＭ１９７は、約５５〜６０μｇ／ｍｌで存在し得る。
【００７４】
組成物が１種超の肺炎球菌血清型に由来する結合体を含む場合、それぞれ別個の結合体に対して同じキャリアタンパク質を使用すること、または異なるキャリアタンパク質を使用することが可能である。しかし、どちらの場合も、異なる結合体の混合物は通常、各血清型の結合体を別個に調製し、次いでそれらを混合して別個の結合体の混合物を形成することによって形成されることになる。参考文献８５は、多価肺炎球菌結合体ワクチンにおいて異なるキャリアタンパク質を使用する場合の潜在的利点について記載しているが、ＰＲＥＶＮＡＲ（商標）製品は、７種の異なる血清型のそれぞれに対して同じキャリアを成功裏に使用している。
【００７５】
キャリアタンパク質は、肺炎球菌糖に対して直接またはリンカーを介して共有結合的に結合体化し得る。様々なリンカーが公知である。例えば、付着はカルボニルを介してもよく、これは、修飾糖の遊離ヒドロキシル基とＣＤＩとの反応［８６、８７］、続いてタンパク質との反応によりカルバメート連結を形成することによって形成され得る。カルボジイミド縮合を使用することができる［８８］。アジピン酸リンカーを使用することができ、これは、遊離−ＮＨ２基（例えば、アミノ化によって糖に導入される）とアジピン酸とを（例えば、ジイミド活性化を使用して）カップリングし、次いでタンパク質を、生成した糖−アジピン酸中間体にカップリングする［８９、９０］ことによって形成され得る。他のリンカーとして、β−プロピオンアミド［９１］、ニトロフェニル−エチルアミン［９２］、ハロアシルハライド［９３］、グリコシド連結［９４］、６−アミノカプロン酸［９５］、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ＳＰＤＰ）［９６］、アジピン酸ジヒドラジドＡＤＨ［９７］、Ｃ４〜Ｃ１２部分［９８］などが挙げられる。
【００７６】
還元的アミノ化を介して結合体化を使用することができる。糖は、最初に過ヨウ素酸塩で酸化することによって、アルデヒド基を導入してもよく、次いでこのアルデヒド基を、還元的アミノ化を介して、キャリアタンパク質への（例えばリシンのε−アミノ基への）直接共有結合を形成できる。糖が、１分子当たり複数のアルデヒド基を含む場合、この連結技法は、架橋生成物をもたらすことができ、この場合、複数のアルデヒドが、複数のキャリアアミンと反応する。この架橋結合体化技法は、特に、少なくとも肺炎球菌血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆに対して有用である。
【００７７】
肺炎球菌糖は、肺炎球菌から調製した通りの全長のインタクトな糖を含んでもよいし、および／または全長糖のフラグメントを含んでもよい、すなわち糖は、細菌中に見られる天然の莢膜糖よりも短くてもよい。したがって、糖は解重合されていてもよく、解重合は糖精製中または精製後だが、結合体化前に生じる。解重合は糖の鎖長を低減させる。解重合は、免疫原性に対して最適鎖長を提供するため、および／または糖の物理的な扱いやすさのために鎖長を低減させるために使用することができる。１種超の肺炎球菌血清型が使用される場合、各血清型に対してインタクトな糖を使用し、各血清型に対してフラグメントを使用すること、またはいくつかの血清型に対してインタクトな糖を使用し、他の血清型に対してフラグメントを使用することが可能である。
【００７８】
組成物が、血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１９Ｆおよび２３Ｆのうちのいずれかに由来する糖を含む場合、これらの糖は、好ましくはインタクトである。対照的に、組成物が血清型１８Ｃに由来する糖を含む場合、この糖は好ましくは解重合される。
【００７９】
血清型３の糖は、解重合されてもよく、例えば、血清型３の糖は、例えば酢酸を使用して、解重合のために酸加水分解に供してもよい［６２］。次いで、生成したフラグメントを活性化のために酸化させてもよく（例えば過ヨウ素酸塩酸化、おそらく二価カチオンの存在下、例えばＭｇＣｌ２で）、還元条件下（例えばシアノ水素化ホウ素ナトリウムを使用して）でキャリアに結合体化（例えばＣＲＭ１９７）してもよく、次いで（場合によって）糖中の任意の未反応のアルデヒドを（例えば、水素化ホウ素ナトリウムを使用して）キャッピングすることができる［６２］。結合体化は、例えば、活性化した糖およびキャリアを同時に凍結乾燥した後で、凍結乾燥させた材料に対して実施してもよい。
【００８０】
血清型１の糖は少なくとも部分的に脱Ｏ−アセチル化してもよく、これは、例えば、重炭酸塩／炭酸塩緩衝液などを使用して、例えば、アルカリ性ｐＨ緩衝液処理により達成し得る［６３］。このような（部分的に）脱Ｏ−アセチル化された糖は、活性化（例えば過ヨウ素酸塩酸化）のために酸化してもよく、キャリア（例えばＣＲＭ１９７）に還元条件下で（例えばシアノ水素化ホウ素ナトリウムを使用して）結合体化し、次いで（場合によって）糖中の任意の未反応のアルデヒドを、（例えば水素化ホウ素ナトリウムを使用して）キャッピングすることができる［６３］。結合体化は、例えば、活性化した糖およびキャリアを同時に凍結乾燥した後で、凍結乾燥させた材料に対して実施してもよい。
【００８１】
血清型１９Ａの糖は、活性化（例えば過ヨウ素酸塩酸化）のために酸化されてもよく、ＤＭＳＯ中のキャリア（例えばＣＲＭ１９７）に還元条件下で結合体化し、次いで（場合によって）糖中の任意の未反応のアルデヒドを、（例えば水素化ホウ素ナトリウムを使用して）キャッピングすることができる［９９］。結合体化は、例えば、活性化した糖およびキャリアを同時に凍結乾燥した後で、凍結乾燥させた材料に対して実施してもよい。
【００８２】
１つまたは複数の肺炎球菌莢膜糖結合体は、凍結乾燥形態で存在し得る。
【００８３】
肺炎球菌結合体は、理想的には、関連する糖類に結合する抗莢膜抗体を誘発でき、例えば、抗糖抗体レベル≧０．２０μｇ／ｍＬを誘発し得る［１００］。抗体は、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）および／またはオプソニン作用活性（ｏｐｓｏｎｏｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）（ＯＰＡ）の測定により評価することができる。ＥＩＡ法は、十分に検証されてきており、抗体濃度とワクチン効力との間に関連性がある。
【００８４】
アルミニウム塩アジュバント
本発明の組成物はアルミニウム塩アジュバントを含む。現在使用されているアルミニウム塩アジュバントは典型的に、「水酸化アルミニウム」または「リン酸アルミニウム」アジュバントのいずれかと言及される。これらは便利な名称ではあるが、どちらも、存在する実際の化学化合物の正確な記載ではない（例えば、参考文献１０１の第９章および参考文献１０２の第４章を参照されたい）。本発明は、アジュバントとして有用な「水酸化物」または「ホスフェート」塩のいずれも使用することができる。ヒドロキシドイオンを含むアルミニウム塩は、これらのヒドロキシドイオンが、抗原および／またはＴＬＲアゴニストの吸着のために容易にリガンド交換できることから、本発明で使用するのに好ましい不溶性塩である。したがって、ＴＬＲ４アゴニストの吸着に好ましい塩は、水酸化アルミニウムおよび／またはヒドロキシリン酸アルミニウムである。これらは、リン含有基（例えばホスフェート、ホスホネート）と容易にリガンド交換して、安定的な吸着をもたらし得る表面ヒドロキシル部分を有する。水酸化アルミニウムアジュバントが最も好ましい。
【００８５】
「水酸化アルミニウム」として公知のアジュバントは典型的には、通常は少なくとも部分的に結晶質であるオキシ水酸化アルミニウム塩である。式ＡｌＯ（ＯＨ）によって表すことができるオキシ水酸化アルミニウムは、赤外（ＩＲ）分光法によって、詳細には１０７０ｃｍ−１での吸着バンドおよび３０９０〜３１００ｃｍ−１での強いショルダーの存在によって、水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）３などの他のアルミニウム化合物から識別することができる（参考文献１０１の第９章）。水酸化アルミニウムアジュバントの結晶化度は、ハーフハイトでの回折バンド幅（ｔｈｅ  ｗｉｄｔｈ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  ｂａｎｄ  ａｔ  ｈａｌｆ  ｈｅｉｇｈｔ）（ＷＨＨ）に反映され、その際、結晶性が乏しい粒子は、結晶子のより小さなサイズのため、より大きな線の広がりを示す。ＷＨＨが大きくなるほど、表面積は大きくなり、かつより高いＷＨＨ値を有するアジュバントが、抗原吸着についてより高い能力を有することが判明している。繊維状形態（例えば透過電子顕微鏡写真において見られるとおりの）が、例えば直径約２ｎｍを有する針様粒子を伴う水酸化アルミニウムアジュバントでは典型的である。水酸化アルミニウムアジュバントのＰＺＣは、典型的には、約１１であり、即ちそのアジュバント自体が、生理学的ｐＨで正の表面電荷を有する。ｐＨ７．４でＡｌ＋＋＋１ｍｇ当たりタンパク質１．８〜２．６ｍｇの吸着能が、水酸化アルミニウムアジュバントでは報告されている。
【００８６】
「リン酸アルミニウム」として公知のアジュバントは典型的には、ヒドロキシリン酸アルミニウムであり、多くの場合に少量の硫酸塩も含む。それらは沈殿によって得ることができ、沈殿の間の反応条件および濃度が、その塩中のヒドロキシルに対するホスフェートの置換の程度に影響する。ヒドロキシリン酸塩は一般に、０．３から０．９９のＰＯ４／Ａｌモル比を有する。ヒドロキシリン酸塩は、ヒドロキシル基の存在によって厳密なＡｌＰＯ４からは区別することができる。例えば３１６４ｃｍ−１でのＩＲスペクトルバンド（例えば、２００℃に加熱した場合）が、構造的ヒドロキシルの存在を示す（参考文献１０１の第９章）。
【００８７】
リン酸アルミニウムアジュバントのＰＯ４／Ａｌ＋＋＋モル比は、一般に０．３から１．２、好ましくは０．８から１．２、より好ましくは０．９５±０．１である。リン酸アルミニウムは一般に、特にヒドロキシリン酸塩では非晶質である。典型的なアジュバントは、０．８４から０．９２のＰＯ４／Ａｌモル比を有する非晶質のヒドロキシリン酸アルミニウムであり、０．６ｍｇ  Ａｌ＋＋＋／ｍｌで含まれる。そのリン酸アルミニウムは一般に、粒子状である。その粒子の典型的な直径は、任意の抗原の吸着後に、０．５〜２０μｍの範囲（例えば約５〜１０μｍ）である。ｐＨ７．４でＡｌ＋＋＋１ｍｇあたりタンパク質０．７〜１．５ｍｇの吸着能が、リン酸アルミニウムアジュバントで報告されている。
【００８８】
リン酸アルミニウムのＰＺＣは、ヒドロキシルに対するホスフェートの置換の度合いに逆比例し、この置換度は、沈殿によって塩を調製するために使用される反応条件および反応物の濃度に応じて変えることができる。他にも、溶液中の遊離ホスフェートイオンの濃度を変化させることによって（より多くのリン酸塩＝より酸性のＰＺＣ）、またはヒスチジン緩衝液などの緩衝液を添加する（ＰＺＣをより塩基性にする）ことによって、ＰＺＣを変える。本発明によって使用されるリン酸アルミニウムは一般に、４．０から７．０、より好ましくは、５．０から６．５、例えば約５．７のＰＺＣを有するであろう。
【００８９】
溶液であると、リン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムアジュバントの両方ともが、直径１〜１０μｍの安定的な多孔性凝集体を形成する傾向がある［１０３］。
【００９０】
組成物は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの両方の混合物を含むことができ、かつ成分は、これらの塩の一方または両方に吸着されていてよい。
【００９１】
本発明の組成物を調製するために使用されるリン酸アルミニウム溶液は、緩衝液（例えば、リン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液またはトリス緩衝液）を含有し得るが、これは常に必要とは限らない。リン酸アルミニウム溶液は、好ましくは無菌であり、発熱物質を含まない。リン酸アルミニウム溶液は、例えば、１．０〜２０ｍＭ、好ましくは５〜１５ｍＭ、より好ましくは約１０ｍＭの濃度で存在する、遊離の水性ホスフェートイオンを含み得る。リン酸アルミニウム溶液はまた塩化ナトリウムも含む。塩化ナトリウムの濃度は、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｍｌ（例えば０．５〜５０ｍｇ／ｍｌ、１〜２０ｍｇ／ｍｌ、２〜１０ｍｇ／ｍｌ）の範囲であり、より好ましくは約３±１ｍｇ／ｍｌである。ＮａＣｌの存在は抗原の吸着の前に、ｐＨの正確な測定を容易にする。
【００９２】
本発明の組成物は、理想的には、１単位用量当たり０．８５ｍｇ未満のＡｌ＋＋＋を含む。本発明の一部の実施形態では、組成物は、１単位用量当たり０．５ｍｇ未満のＡｌ＋＋＋を含む。Ａｌ＋＋＋の量はこれより少ない、例えば＜２５０μｇ、＜２００μｇ、＜１５０μｇ、＜１００μｇ、＜７５μｇ、＜５０μｇ、＜２５μｇ、＜１０μｇなどであってもよい。
【００９３】
本発明の一部の実施形態では、組成物は、１．７ｍｇ／ｍｌ未満のＡｌ＋＋＋濃度を有する。Ａｌ＋＋＋の濃度は、これより少ない、例えば＜１ｍｇ／ｍｌ、＜８００μｇ／ｍｌ、＜６００μｇ／ｍｌ、＜５００μｇ／ｍｌ、＜４００μｇ／ｍｌ、＜３００μｇ／ｍｌ、＜２５０μｇ／ｍｌ、＜２００μｇ／ｍｌ、＜１５０μｇ／ｍｌ、＜１００μｇ／ｍｌ、＜７５μｇ／ｍｌ、＜５０μｇ／ｍｌ、＜２０μｇ／ｍｌなどであってもよい。
【００９４】
本発明の組成物がアルミニウムベースのアジュバントを含む場合、成分の沈降が貯蔵中に生じ得る。したがって、組成物は、患者への投与前に振盪させるべきである。振盪させた組成物は濁った白色の懸濁物となる。
【００９５】
トール様受容体４アゴニスト
本発明の組成物はＴＬＲ４アゴニストを含み、最も好ましくはヒトＴＬＲ４アゴニストである。ＴＬＲ４は従来の樹状細胞およびマクロファージを含めた先天免疫系の細胞によって発現される［１０４］。ＴＬＲ４を介したトリガー（ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ）により、ＭｙＤ８８依存性経路およびＴＲＩＦ依存性経路の両方を利用するシグナル伝達カスケードが誘発され、それぞれＮＦ−κＢおよびＩＲＦ３／７活性化をもたらす。ＴＬＲ４の活性化は、典型的に確固としたＩＬ−１２ｐ７０の生成を誘発し、Ｔｈ１−タイプ細胞免疫応答および液性免疫応答を強く強化する。
【００９６】
様々な有用なＴＬＲ４アゴニストが当技術分野で公知であり、このうちの多くは内毒素またはリポ多糖類（ＬＰＳ）の類似体である。例えば、ＴＬＲ４アゴニストは以下であってよい：
（ｉ）３ｄ−ＭＰＬ（すなわち３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ；３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａまたは３−Ｏ−デスアシル−４’−モノホスホリル脂質Ａとしても公知）。内毒素のモノホスホリル脂質Ａ部分のこの誘導体は、グルコサミンの還元末端の脱アシル化した３位を有する。それは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔａのヘプトース欠損変異体から調製され、脂質Ａと化学的に同様であるが、酸に不安定なホスホリル基および塩基に不安定なアシル基が欠如している。３ｄ−ＭＰＬの調製は、参考文献１０５にもともと記載されており、製品は、Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより製造および販売されている。それはＧＳＫの「ＡＳ０４」アジュバント中に存在する。さらなる詳細は参考文献１０６〜１０９において見出すことができる。
【００９７】
（ｉｉ）グルコピラノシル脂質Ａ（ＧＬＡ）［１１０］またはそのアンモニウム塩、例えば：
【００９８】
【化１】
2015509963.tif 000004
（ｉｉｉ）アミノアルキルグルコサミニドホスフェート、例えば、ＲＣ−５２９またはＣＲＸ−５２４［１１１〜１１３］など。ＲＣ−５２９およびＣＲＸ−５２４は、これらのＲ２基が異なる以下の構造：
【００９９】
【化２】
2015509963.tif 000005
【０１００】
を有する。
【０１０１】
（ｉｖ）ホスフェート含有非環式骨格に連結している脂質を含有する化合物、例えば、ＴＬＲ４アンタゴニストＥ５５６４など［１１４、１１５］：
【０１０２】
【化３】
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【０１０３】
（ｖ）参考文献１１６に定義されているとおりの式Ｉ、ＩＩもしくはＩＩＩの化合物、またはその塩、例えば、化合物「ＥＲ８０３０５８」、「ＥＲ８０３７３２」、「ＥＲ８０４０５３」、「ＥＲ８０４０５８」、「ＥＲ８０４０５９」、「ＥＲ８０４４４２」、「ＥＲ８０４６８０」、「ＥＲ８０３０２２」、「ＥＲ８０４７６４」または「ＥＲ８０４０５７」など。ＥＲ８０４０５７はまた、Ｅ６０２０としても公知であり、以下の構造：
【０１０４】
【化４】
2015509963.tif 000007
【０１０５】
を有し、一方で、ＥＲ８０３０２２は以下の構造：
【０１０６】
【化５】
2015509963.tif 000008
【０１０７】
を有する。
【０１０８】
（ｖｉ）参考文献１１７に開示されているポリペプチドリガンドのうちの１種。
【０１０９】
これらのＴＬＲ４アゴニストのいずれも本発明で使用することができる。
【０１１０】
ＴＬＲアゴニストがアルミニウム塩に吸着し、これにより、アジュバントの免疫増強効果を改善することが可能である［１１８］。これは、より良い（より強い、またはより迅速に達成される）免疫応答をもたらすことができ、および／または等価なアジュバント効果を維持しつつ、組成物中のアルミニウムの量の低減を可能にする。したがって、本発明の組成物は、ＴＬＲ４アゴニストが吸着されているアルミニウム塩を含むことができる。アゴニストおよび塩は、抗原を吸着する塩の能力（少なくともある程度）を保持する安定したアジュバント複合体を形成することができる。
【０１１１】
吸着性の特性を有するＴＬＲ４アゴニストは典型的に、アルミニウム塩の表面基、特に表面ヒドロキシル基を有する塩とリガンド交換され得るリン含有部分を含む。したがって有用なＴＬＲ４アゴニストは、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、ホスホニト、ホスフィニト、ホスフェートなどを含み得る。好ましいＴＬＲ４アゴニストは、少なくとも１個のホスフェート基［１１８］、例えば上記に列挙したアゴニスト（ｉ）〜（ｖ）を含む。
【０１１２】
単位用量中のＴＬＲ４アゴニストの量は、比較的広範囲にあり、これは、慣用的な治験を介して決定することができる。１〜１０００μｇ／用量の量、例えば１用量当たり５〜１００μｇまたは１用量当たり１０〜１００μｇ、理想的には１用量当たり≦３００μｇ、例えば、１用量当たり約５μｇ、１０μｇ、２０μｇ、２５μｇ、５０μｇまたは１００μｇを使用することができる。したがって、本発明の組成物中のＴＬＲアゴニストの濃度は、２〜２０００μｇ／ｍｌ、例えば１０〜２００μｇ／ｍｌ、または約５、１０、２０、４０、５０、１００または２００μｇ／ｍｌ、および理想的には≦６００μｇ／ｍｌであってよい。
【０１１３】
一般に、組成物中のＴＬＲ４アゴニストとＡｌ＋＋＋との重量比は、５：１未満、例えば、４：１未満、３：１未満、２：１未満、または１：１未満となる。したがって、例えば、Ａｌ＋＋＋濃度０．５ｍｇ／ｍｌでは、ＴＬＲ４アゴニストの最大濃度は２．５ｍｇ／ｍｌとなる。しかし、より高いまたはより低いレベルを使用することができる。Ａｌ＋＋＋より少ない質量のＴＬＲ４アゴニストが最も典型的となり得、例えば、１用量当たり、１００μｇのＴＬＲアゴニストに対し０．２ｍｇのＡｌ＋＋＋などである。例えば、Ｆｅｎｄｒｉｘ製品は、１用量当たり５０μｇの３ｄ−ＭＰＬおよび０．５ｍｇのＡｌ＋＋＋を含む。
【０１１４】
組成物中の少なくとも５０％（質量で）のＴＬＲ４アゴニスト、例えば≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧８５％、≧９０％、≧９２％，≧９４％、≧９５％、≧９６％，≧９７％、≧９８％，≧９９％、またはさらに１００％のＴＬＲ４アゴニストがアルミニウム塩に吸着されていることが好ましい。
【０１１５】
本発明の組成物が、金属塩に吸着されているＴＬＲ４アゴニストを含み、さらに緩衝液も含む場合、緩衝液中の任意のホスフェートイオンの濃度は、高濃度のホスフェートイオンは脱離を引き起こす可能性があるので、５０ｍＭ未満（例えば、１〜１５ｍＭ）とすべきであることが好ましい。ヒスチジン緩衝液の使用が好ましい。
【０１１６】
３ｄ−ＭＰＬ
本発明での使用のための好ましいＴＬＲ４アゴニストは３ｄ−ＭＰＬである。それは、リン酸アルミニウムアジュバントに、水酸化アルミニウムアジュバントに、または両方の混合物に吸着され得る［１１９］。
【０１１７】
３ｄ−ＭＰＬは、それらのアシル化（例えば、３、４、５または６個のアシル鎖を有し、その鎖の長さは異なってもよい）により異なる、関連する分子の混合物の形態をとることができる。２種のグルコサミン（また２−デオキシ−２−アミノ−グルコースとしても公知）単糖は、これらの２位の炭素（すなわち、２および２’位）においてＮ−アシル化しており、３’位にもまたＯ−アシル化が存在する。炭素２に付加している基は、式−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ１Ｒ１’を有する。炭素２’に付加している基は式−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ２Ｒ２’を有する。炭素３’に付加している基は式−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ３Ｒ３’を有する。代表的な構造は：
【０１１８】
【化６】
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【０１１９】
である。基Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立に、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３である。ｎの値は、好ましくは８から１６、より好ましくは９から１２、最も好ましくは１０である。
【０１２０】
基Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’は、それぞれ独立に：（ａ）−Ｈ；（ｂ）−ＯＨ；または（ｃ）−Ｏ−ＣＯ−Ｒ４（式中、Ｒ４は、−Ｈまたは−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３のいずれかであり、ｍの値は好ましくは８から１６であり、より好ましくは１０、１２または１４である）であることができる。２位において、ｍは好ましくは１４である。２’位において、ｍは好ましくは１０である。３’位において、ｍは好ましくは１２である。したがって、基Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’は、好ましくは、ドデカン酸、テトラデカン酸またはヘキサデカン酸からの−Ｏ−アシル基である。
【０１２１】
Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のすべてが−Ｈである場合、３ｄ−ＭＰＬは３個のアシル鎖しか有さない（２、２’および３’位のそれぞれの上に１個）。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のうちの２個だけが−Ｈである場合、３ｄ−ＭＰＬは４個のアシル鎖を有することができる。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のうちの１個だけが−Ｈである場合、３ｄ−ＭＰＬは５個のアシル鎖を有することができる。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のいずれも−Ｈでない場合、３ｄ−ＭＰＬは６個のアシル鎖を有することができる。本発明に従い使用される３ｄ−ＭＰＬは、３〜６個のアシル鎖を有するそれらの形態の混合物であってよいが、混合物中に６個のアシル鎖を有する３ｄ−ＭＰＬを含むこと、特に６個のアシル鎖形態が３ｄ−ＭＰＬ全体の少なくとも１０重量％、例えば≧２０％、≧３０％、≧４０％、≧５０％またはこれ以上を占めることを確実にすることが好ましい。６個のアシル鎖を有する３ｄ−ＭＰＬが最もアジュバント活性のある形態であることが判明している。
【０１２２】
したがって、本発明での使用に対して最も好ましい形態の３ｄ−ＭＰＬは：
【０１２３】
【化７】
2015509963.tif 000010
【０１２４】
である。３ｄ−ＭＰＬが混合物の形態で使用される場合、本発明の組成物において、３ｄ−ＭＰＬの量または濃度に関する言及は、混合物中で組み合わせた３ｄ−ＭＰＬ種を指す。
【０１２５】
典型的な組成物は、２５μｇ／ｍｌから２００μｇ／ｍｌ、例えば５０〜１５０μｇ／ｍｌ、７５〜１２５μｇ／ｍｌ、９０〜１１０μｇ／ｍｌの範囲、または約１００μｇ／ｍｌの濃度で３ｄ−ＭＰＬを含む。１用量あたり２５〜７５μｇの３ｄ−ＭＰＬ、例えば１用量あたり４５〜５５μｇ、または約５０μｇの３ｄ−ＭＰＬを投与することが通常である。
【０１２６】
水性条件では、３ｄ−ＭＰＬは、異なるサイズ、例えば、直径＜１５０ｎｍまたは＞５００ｎｍを有するミセル凝集体または粒子を形成することができる。それらのうちのいずれかまたは両方を本発明に使用することができ、より良い粒子は、慣用的なアッセイにより選択することができる。それらの優れた活性のため、より小さな粒子（例えば、３ｄ−ＭＰＬの透明な水性懸濁物を得るために十分に小さい）が本発明による使用に対して好ましい［１２０］。好ましい粒子は、１５０ｎｍ未満、より好ましくは１２０ｎｍ未満の平均直径を有し、１００ｎｍ未満の平均直径さえも有することができる。しかし、ほとんどの場合には、平均直径は、５０ｎｍ以上である。３ｄ−ＭＰＬがアルミニウム塩に吸着されている場合、３Ｄ−ＭＰＬの粒径を直接測定することができないこともあるが、粒径は吸着が行われる前に測定することができる。粒子直径は、動的光散乱の慣用的な技法で評価することができ、これによって平均粒子直径が明らかとなる。粒子がｘｎｍの直径を有するということであれば、一般に、この平均の周囲に粒子の分布が存在することになり、少なくとも５０％の数（例えば≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧９０％、またはそれ以上）の粒子がｘ±２５％の範囲内の直径を有することになる。
【０１２７】
免疫原性組成物
本発明の組成物は、以下を含み得る：（ａ）抗原性成分；および（ｂ）非抗原性成分。抗原性成分は、上記で考察された抗原を含むことができる、または上記抗原からなる。非抗原性成分は、アルミニウム塩およびＴＬＲ４アゴニストを含めた、キャリア、アジュバント、賦形剤、緩衝液などを含むことができる。これらの非抗原性成分は様々な供給源を有し得る。例えば、それらは、製造中に使用される上記抗原またはアジュバント材料のうちの１つに存在していてもよいし、またはそれら成分とは別個に加えられてもよい。
【０１２８】
本発明の好ましい組成物は、１つまたは複数の薬学的キャリアおよび／または賦形剤を含む。
【０１２９】
張度を制御するためには、生理学的塩、例えば、ナトリウム塩などを含めることが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、これは、１〜２０ｍｇ／ｍｌで存在し得る。
【０１３０】
組成物は一般に、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、好ましくは２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの質量オスモル濃度を有し、より好ましくは２８０〜３２０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内に入ることになる。質量オスモル濃度は、ワクチン接種によって引き起こされる疼痛に対して影響を及ぼさないことが以前に報告されているが［１２１］、それにもかかわらず、質量オスモル濃度をこの範囲内に保つことが好ましい。
【０１３１】
本発明の組成物は、１つまたは複数の緩衝液を含み得る。典型的な緩衝液としては以下が挙げられる：リン酸緩衝液；トリス緩衝液；ホウ酸緩衝液；コハク酸緩衝剤；ヒスチジン緩衝液；またはクエン酸緩衝剤。緩衝液は、典型的に、５〜２０ｍＭの範囲に含まれることになる。
【０１３２】
本発明の組成物は、（いかなるエマルジョンアジュバントと混合する前に）界面活性剤を実質的に含まないことができる。特に、本発明の組成物は、ポリソルベート８０を実質的に含まないことができ、例えば組成物は、０．１μｇ／ｍｌ未満のポリソルベート８０を含有し、好ましくは検出可能なポリソルベート８０を含有しない。しかし、組成物がＨＢｓＡｇを含む場合、組成物は通常、例えばそれが酵母破壊中に使用された場合、ポリソルベート２０を含む［２９］。
【０１３３】
本発明の組成物のｐＨは、一般に６．０から７．５である。したがって、製造プロセスは、包装前に組成物のｐＨを調整するステップを含むことができる。患者に投与する水性組成物は、最適な安定性のため、５．０から７．５、より典型的には５．０から６．０のｐＨを有することができる；ジフテリアトキソイドおよび／または破傷風トキソイドが存在する場合、ｐＨは理想的には６．０から７．０である。
【０１３４】
本発明の組成物は好ましくは無菌である。
【０１３５】
本発明の組成物は好ましくは非発熱性であり、例えば、１用量あたり＜１ＥＵ（内毒素単位、標準的な尺度；１ＥＵは、１用量あたり０．２ｎｇのＦＤＡ参照標準内毒素ＥＣ−２「ＲＳＥ」と等しい）、好ましくは１用量あたり＜０．１ＥＵを含有する。
【０１３６】
本発明の組成物は好ましくはグルテンを含まない。
【０１３７】
抗原の吸着される性質に起因して、ワクチン製品は、濁った外観をもつ懸濁物であってよい。この外観は、微生物の混入が容易に目に見えないことを意味するので、ワクチンは好ましくは抗菌剤を含有する。ワクチンが複数回用量容器に包装されている場合、これは特に重要である。包含するのに好ましい抗菌剤は、２−フェノキシエタノールおよびチメロサールである。しかし、本発明のプロセスの間に水銀防腐剤（例えばチメロサール）を使用しないことが好ましい。したがって、このプロセスで使用する成分のうちの１種からすべてが、水銀防腐剤を実質的に含まなくてもよい。しかし、微量の存在は、本発明において使用される前にある成分がこのような防腐剤で処理されていた場合、不可避となり得る。しかし安全性のため、最終組成物が約２５ｎｇ／ｍｌ未満の水銀を含有することが好ましい。より好ましくは、最終ワクチン製品は、検出可能なチメロサールを含有しない。これは、一般に水銀防腐剤を、本発明のプロセスにおいて抗原を添加する前に抗原調製物から除去することによって、または組成物を作製するために使用される成分の調製中にチメロサールの使用を回避することによって達成される。水銀を含まない組成物が好ましい。
【０１３８】
本発明の組成物は一般に水性形態である。
【０１３９】
製造中に、所望の最終濃度を得るための成分の希釈は、通常ＷＦＩ（注射用蒸留水（ｗａｔｅｒ  ｆｏｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ））を用いて実施されることになる。
【０１４０】
本発明は、個々の用量への包装に対して適したバルク材料を提供することができ、次いでこれらを患者への投与のために分配することができる。上記で考察された濃度は、典型的には、最終の包装された用量における濃度であり、よって、バルクワクチン中の濃度はより高くてもよい（例えば、希釈により最終濃度へ低減されるものとする）。
【０１４１】
本発明の組成物は、好ましくは、０．５ｍｌ単位用量で患者に投与される。０．５ｍｌ用量についての言及は、通常の分散、例えば０．５ｍｌ±０．０５ｍｌを含むと理解されるはずである。複数回用量の状況に対しては、複数回用量の量を単一容器内に、例えば、１０回用量の複数回用量容器には５ｍｌ（または１０％の過剰充填を入れて５．５ｍｌ）を一緒に抽出および包装することになる。
【０１４２】
個々の抗原性成分に由来する残留材料もまた、本発明のプロセスによって生成される最終ワクチンにおいて微量で存在し得る。例えば、ホルムアルデヒドがジフテリア、破傷風および百日咳のトキソイドを調製するために使用された場合、最終ワクチン製品は、微量のホルムアルデヒド（例えば、１０μｇ／ｍｌ未満、好ましくは＜５μｇ／ｍｌ）を保持し得る。媒体または安定剤がポリオウイルス調製中に使用された可能性があり（例えばＭｅｄｉｕｍ１９９）、これらは最終ワクチンへと持ち越されることもある。同様に、遊離アミノ酸（例えばアラニン、アルギニン、アスパルテート、システインおよび／もしくはシスチン、グルタメート、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、プロリンおよび／もしくはヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンならびに／またはバリン）、ビタミン（例えば、コリン、アスコルベートなど）、リン酸水素二ナトリウム、リン酸一カリウム、カルシウム、グルコース、硫酸アデニン、フェノールレッド、酢酸ナトリウム、塩化カリウムなどは、最終ワクチン中にそれぞれ≦１００μｇ／ｍｌ、好ましくは＜１０μｇ／ｍｌで保持され得る。抗原調製物に由来する他の成分、例えば、ネオマイシンなど（例えば硫酸ネオマイシン、特にポリオウイルス成分に由来するもの）、ポリミキシンＢ（例えば、硫酸ポリミキシンＢ、特にポリオウイルス成分に由来するもの）などもまた、１用量当たりナノグラム以下（ｓｕｂ−ｎａｎｏｇｒａｍ）の量で存在し得る。抗原調製物を起源とする最終ワクチンのさらなる可能な成分は、抗原の完全未満の精製から生じる。したがって、少量のＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのタンパク質および／またはゲノムＤＮＡが存在し得る。これらの残留成分の量を最小限に抑えるため、抗原調製物は、好ましくは、抗原が本発明で使用される前に、残留成分を除去するために除去される。
【０１４３】
ポリオウイルス成分が使用される場合、ポリオウイルスは一般に、Ｖｅｒｏ細胞上で増殖されている。最終ワクチンは、好ましくは、１０ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは≦１ｎｇ／ｍｌ、例えば≦５００ｐｇ／ｍｌまたは≦５０ｐｇ／ｍｌのＶｅｒｏ細胞ＤＮＡ、例えば１０ｎｇ／ｍｌ未満のＶｅｒｏ細胞ＤＮＡ（≧５０塩基対長である）を含有する。
【０１４４】
本発明の組成物は、使用のため容器で提示される。適切な容器として、バイアルおよび使い捨てシリンジ（好ましくは無菌のもの）が挙げられる。本発明のプロセスは、使用のために、ワクチンを容器に包装するステップを含み得る。適切な容器として、バイアルおよび使い捨てシリンジ（好ましくは無菌のもの）が挙げられる。
【０１４５】
本発明はまた、本発明の薬学的組成物を含有する、例えば単位用量を含有する送達デバイス（例えばシリンジ、ネブライザー、噴霧器、吸入器、皮膚パッチなど）を提供する。このデバイスは、組成物を脊椎動物被験体に投与するために使用することができる。
【０１４６】
本発明はまた、本発明の薬学的組成物を含有する、例えば単位用量を含有する滅菌容器（例えばバイアル）を提供する。
【０１４７】
本発明はまた、本発明の薬学的組成物の単位用量を提供する。
【０１４８】
本発明はまた、本発明の薬学的組成物を含有する気密密閉容器を提供する。適切な容器には例えば、バイアルが含まれる。
【０１４９】
本発明の組成物がバイアルで提示される場合、バイアルは好ましくはガラスまたはプラスチック材料から作製される。バイアルは好ましくは、組成物がこれに加えられる前に滅菌されている。ラテックス感受性患者に伴う問題を回避するため、バイアルは、ラテックスを含まないストッパーで密封し得る。バイアルは単一用量のワクチンを含んでもよいし、または１回超の用量（「複数回用量」バイアル）例えば１０用量を含んでもよい。複数回用量バイアルを使用する場合、各用量は、バイアル内容物の汚染を回避するように注意を払いながら、滅菌針およびシリンジで、厳重な無菌条件下で取り出すべきである。好ましいバイアルは、無色のガラスで作製される。
【０１５０】
バイアルは、予備充填されたシリンジがキャップに挿入され、シリンジの内容物がバイアル中へ排出され（例えば、その中の凍結乾燥材料を再構成するために）、バイアルの内容物がシリンジへ戻されることが可能となるように、適合したキャップ（例えば、ルアーロック）を有することができる。バイアルからシリンジを外した後、針を取り付けることができ、組成物を患者に投与することができる。キャップは、好ましくは、シールまたはカバーの内側に位置し、これによって、シールまたはカバーは、キャップがアクセスされ得る前に外さなければならない。
【０１５１】
組成物がシリンジへと包装される場合、シリンジは通常、これに針が取り付けられてはいないが、別個の針が組立ておよび使用のためにシリンジと共に供給されてもよい。安全針が好ましい。１−インチ２３−ゲージ、１−インチ２５−ゲージおよび５／８−インチ２５−ゲージの針が典型的である。シリンジは、記録保持を促進するために、内容物のロット番号および使用期限が印刷されていてもよい剥離式ラベルと共に提供され得る。シリンジ内のプランジャーは好ましくは、プランジャーが吸引中に偶発的に外れることを防止するためにストッパーを有する。シリンジは、ラテックスゴムキャップおよび／またはプランジャーを有していてもよい。使い捨てシリンジは、単一用量のワクチンを含有する。シリンジは一般に、針を取り付ける前に先端を密封する先端キャップを有し、先端キャップは好ましくは、ブチルゴムで作製される。シリンジおよび針が別個に包装される場合、針は好ましくは、ブチルゴムシールドにはめ込まれている。灰色のブチルゴムが好ましい。好ましいシリンジは、商標名「Ｔｉｐ−Ｌｏｋ」（商標）で市販されているものである。
【０１５２】
ガラス容器（例えばシリンジまたはバイアル）が使用される場合、ソーダ石灰ガラスではなく、ホウケイ酸ガラスから作製された容器を使用することが好ましい。
【０１５３】
組成物が容器に包装された後、容器は、分配のために箱の中、例えば厚紙の箱の中に封入することができ、箱には、ワクチンの詳細、例えばその商標名、ワクチン中の抗原のリスト（例えば「Ｂ型肝炎組換え型」など）、提示容器（例えば「使い捨て充填済みＴｉｐ−Ｌｏｋシリンジ」または「１０×０．５ｍｌ単一用量バイアル」）、その用量（例えば「それぞれ０．５ｍｌの１用量を含有する」）、注意事項（例えば「成人のみの使用」または「小児のみの使用」）、使用期限、適応症、特許番号などがラベル付けされている。各箱は、１種超の包装されたワクチン、例えば５または１０個の包装されたワクチン（特にバイアルに対する）を含有し得る。
【０１５４】
ワクチンは、ワクチンの詳細、例えば投与のための使用説明書、ワクチン内の抗原の詳細などを含むリーフレットと一緒に（例えば、同じ箱の中に）包装されることになる。使用説明書はまた、注意事項、例えば、ワクチン接種後のアナフィラキシー反応の場合にすぐに利用可能なアドレナリンの溶液を保持することなどを含有し得る。
【０１５５】
包装されたワクチンは、好ましくは２℃から８℃で保存する。ワクチンを、凍結してはいけない。
【０１５６】
ワクチンは、製造後に、完全な液体形態で（すなわち、すべての抗原性成分が水溶液または懸濁物中にある）で提供することができるか、またはワクチンは、２つの成分を一緒に混合することによって、ワクチンを使用するとき／使用する場所で即時調製することができる形態で調製することができる。このような２成分の実施形態は、例えば、水性材料と凍結乾燥材料とを混合することによる、液体／液体混合および液体／固体混合を含む。例えば、一実施形態では、ワクチンは、以下を混合することによって作製することができる：（ａ）水性抗原および／またはアジュバントを含む第１成分；ならびに（ｂ）凍結乾燥抗原を含む第２成分。別の実施形態では、ワクチンは、以下を混合することによって作製することができる：（ａ）水性抗原および／またはアジュバントを含む第１成分；ならびに（ｂ）水性抗原を含む第２成分。別の実施形態ではワクチンは、以下を混合することによって作製することができる：（ａ）水性抗原を含む第１成分；および（ｂ）水性アジュバントを含む第２成分。この２つの成分は好ましくは別個の容器（例えば、バイアルおよび／またはシリンジ）の中にあり、本発明は、成分（ａ）および（ｂ）を含むキットを提供する。
【０１５７】
別の有用な液体／凍結乾燥フォーマットは、（ａ）アルミニウム塩およびＴＬＲ４アゴニストの水性複合体ならびに（ｂ）１つまたは複数の抗原を含む凍結乾燥成分を含む。患者への投与に対して適切なワクチン組成物は、成分（ａ）および（ｂ）を混合することによって得られる。一部の実施形態では、成分（ａ）は抗原を含まず、これによって、最終ワクチン中のすべての抗原性成分は成分（ｂ）に由来する；他の実施形態では、成分（ａ）は１つまたは複数の抗原を含み、これによって、最終ワクチン中の抗原性成分は、成分（ａ）および（ｂ）の両方に由来する。
【０１５８】
したがって、本発明は、混合ワクチンを調製するためのキットを提供し、このキットは、上述の通りの成分（ａ）および（ｂ）を含む。キットの構成要素は、典型的にバイアルまたはシリンジであり、単一のキットが、バイアルおよびシリンジの両方を含有し得る。本発明はまた、このようなキットを調製するためのプロセスを提供し、このプロセスは以下のステップを含む：（ｉ）上記に記載通りの水性成分ワクチンを調製するステップ；（ｉｉ）前記水性混合ワクチンを第１の容器、例えばシリンジ内に包装するステップ；（ｉｉｉ）抗原含有成分を凍結乾燥形態で調製するステップ；（ｉｖ）前記凍結乾燥抗原を第２の容器、例えばバイアル内に包装するステップ；ならびに（ｖ）第１の容器および第２の容器を一緒にキットの中に包装するステップ。次いで、キットは医師へ分配することができる。
【０１５９】
液体／凍結乾燥フォーマットは、結合体成分、特にＨｉｂおよび／または髄膜炎菌および／または肺炎球菌の結合体を含むワクチンに対して特に有用である。なぜならこれらは凍結乾燥形態でより安定であり得るからである。したがって結合体は、本発明でのこれらの使用の前に凍結乾燥されていてもよい。
【０１６０】
成分が凍結乾燥される場合、それは一般に、凍結乾燥の前に、例えば安定剤として加えられる非活性成分を含む。包含するのに好ましい安定剤は、ラクトース、スクロースおよびマンニトール、ならびにこれらの混合物、例えばラクトース／スクロース混合物、スクロース／マンニトール混合物などである。したがって、凍結乾燥材料の水性の再構成により得た最終のワクチンは、ラクトースおよび／またはスクロースを含有し得る。凍結乾燥ワクチンを調製する際に、非晶質賦形剤および／または非晶質緩衝剤を使用するのが好ましい［１２２］。
【０１６１】
本発明の組成物は、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイドおよび百日咳トキソイドを含む。一部の実施形態では、組成物は、破傷風トキソイドと比較して、過剰のジフテリアトキソイドを含む（Ｌｆ単位で測定した場合）。この過剰分は理想的には少なくとも１．５：１、例えば５Ｌｆのジフテリアトキソイドが、破傷風トキソイド２Ｌｆごとにある（すなわち５：２比）。これらの実施形態は乳児および小児において最も有用である。青年および成人に（追加免疫（ｂｏｏｓｔｅｒ）として）最も有用な他の実施形態では、組成物は、ジフテリアトキソイドと比較して、過剰の破傷風トキソイドを含む（Ｌｆ単位で測定した場合）。この過剰分は理想的には少なくとも１．５：１、例えば、２Ｌｆの破傷風トキソイドが、ジフテリアトキソイド１Ｌｆごとにある（すなわち２：１比）。他の実施形態では、等しい量のジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドが使用される（Ｌｆ単位）。ジフテリアまたは破傷風のうちの一方が過剰に存在する場合、過剰分は、理想的には少なくとも１．５倍、例えば２倍、または２．５倍であるべきだが、過剰分は５倍を超えないものとする。
【０１６２】
本発明の一部の組成物は、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイドおよび百日咳トキソイド、１型、２型および３型に対する不活化ポリオウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原ならびにＨｉｂ結合体を含む。これらの組成物の抗原性部分は、このリストの中の抗原からなってもよく、または追加の病原体（例えば髄膜炎菌）に由来する抗原をさらに含んでもよい。したがって組成物はそれ自体ワクチンとして使用することができ、またはさらなる混合ワクチンの成分として使用することもできる。
【０１６３】
処置方法およびワクチンの投与方法
本発明の組成物は、ヒト患者への投与に適しており、本発明は、本発明の組成物を患者に投与するステップを含む、患者において免疫応答を上昇させる方法を提供する。
【０１６４】
本発明はまた、医療における使用のための本発明の組成物を提供する。組成物は、本明細書中に様々に記載されているように、例えば一部の実施形態では、２用量以下の混合ワクチンを乳児に与えることによって、投与することができる。
【０１６５】
本発明はまた、患者において免疫応答を上昇させるための医薬の製造における、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、アルミニウム塩アジュバント、およびＴＬＲ４アゴニストの使用を提供する。医薬品は、理想的には、本明細書中の他の箇所で様々に記載されている組成物であり、医薬品は、本明細書で様々に記載されている通り投与することができる。
【０１６６】
これらの方法、使用および組成物で上昇させる免疫応答は、理想的には保護的であり、本発明の免疫原性組成物は好ましくは、少なくともジフテリア、破傷風、および百日咳の予防に使用するためのワクチンである。これらの抗原成分に応じて、ワクチンはまた細菌性髄膜炎、ポリオ、肝炎などに対して防御することもできる。
【０１６７】
完全な効力を有するために、典型的な一次免疫化スケジュール（特に小児用）は、１回超の用量を投与するステップを含み得る。例えば、用量は以下であってよい：０カ月および６カ月（時間０は最初の用量である）において；０カ月、１カ月、２カ月および６カ月において；０日目、２１日目において、次いで第３の用量を、６カ月から１２カ月の間に；２カ月、４カ月および６カ月において；３カ月、４カ月および５カ月において；６週、１０週および１４週において；２カ月、３カ月および４カ月において；または０カ月、１カ月、２カ月、６カ月および１２カ月において。
【０１６８】
組成物はまた、追加免疫用量として、例えば、１歳から２歳までの小児に対して、青年に対して、または成人に対して、使用することができる。
【０１６９】
本発明の組成物は、例えば、腕または脚への筋肉注射によって投与することができる。
【０１７０】
上述されているように、本発明のさらなる態様は、１つまたは２つのみのＤＴＰ含有組成物が投与される、乳児（すなわち、誕生から１歳の間の小児）のための免疫化スケジュールである。したがって、一部の実施形態では、本発明は、現行の通常の３回用量スケジュールと比較してより少ない用量を送達するが、免疫保護効果の損失はない。この態様に従い、ワクチンの２回以下の用量が乳児に与えられる、すなわち乳児には、単回用量または２回用量のワクチンが与えられるが、３回（またはそれより多い）用量は与えられない。しかし、乳児には、後年、すなわち乳児の第１回目の誕生日の後または第２回目の誕生日の後、第３の用量（さらなる用量であり得る）が与えられてもよい。１回または２回の用量は、好ましくは、（ｉ）１カ月から５カ月の間の月齢（ｉｉ）２カ月から４カ月の間の月齢（ｉｉｉ）３カ月から５カ月の間の月齢（ｉｖ）６週から１６週の間の週齢、または（ｖ）０カ月から３カ月の間の月齢の乳児に与えられる。例えば、２回の用量が（ｉ）１カ月および２カ月の月齢（ｉｉ）２カ月および４カ月の月齢（ｉｉｉ）３カ月および４カ月の月齢（ｉｖ）２カ月および３カ月の月齢（ｖ）０カ月から１カ月の月齢などにおいて与えられ得る。
【０１７１】
一般
「含むこと」という用語は、「含むこと」および「からなること」を内包し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、Ｘから専らなることも、または追加の何か、例えば、Ｘ＋Ｙを含むこともある。
【０１７２】
「実質的に」という語は、「完全に」を排除するものではない。例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まないこともある。必要に応じて、「実質的に」という言葉は、本発明の定義から省かれていることもある。
【０１７３】
数値ｘに関連して、「約」という用語は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１７４】
特に述べられていない限り、２つ以上の成分を混合するステップを含む方法は、特定の順序での混合を何ら必要としない。したがって成分を、任意の順序で混合することができる。３つの成分が存在する場合は、２つの成分を互いに組み合わせることができ、次いで、その組合せを、第３の成分などと組み合わせ得る。
【０１７５】
抗原がアジュバントに「吸着されている」と記載されている場合、その抗原の少なくとも５０％（重量による）、例えば５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％またはそれより多くが吸着されていることが好ましい。ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドは両方とも完全に吸着されている、すなわち上清中に何も検出できないことが好ましい。ＨＢｓＡｇの完全吸着を使用することができる。
【０１７６】
結合体の量は一般に、キャリアの選択による変動を回避するために、糖の質量（すなわち、全体としての結合体の用量（キャリア＋糖）は述べられている用量より高い）に関して与えられる。
【０１７７】
組成物がアルミニウム塩アジュバントを含む場合、この組成物はまた、好ましくは水中油型エマルジョンアジュバントを含まない。逆に、組成物が水中油型エマルジョンアジュバントを含む場合、この組成物はまた、好ましくはアルミニウム塩アジュバントを含まない。
【０１７８】
本発明で使用されるリン含有基は、周辺環境のｐＨ、例えばそれらが溶解している溶媒のｐＨに応じていくつかのプロトン化および脱プロトン化形態で存在することがある。したがって、本明細書において特定の形態を例示することはできるが、別段に述べられていない限り、これらの例示は、単なる代表であり、具体的なプロトン化または脱プロトン化形態に限定するものではないことが意図されている。例えば、ホスフェート基の場合には、これは、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２として例示されているが、定義には、酸性条件で存在し得るプロトン化形態−［ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ２）（ＯＨ）］＋および−［ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ２）２］２＋ならびに塩基性条件で存在し得る脱プロトン化形態−［ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）（Ｏ）］−および［ＯＰ（Ｏ）（Ｏ）２］２−が含まれる。本発明は、全てのそのような形態を包含する。
【０１７９】
ＴＬＲ４アゴニストは、薬学的に許容される塩として存在してよい。したがって、化合物は、その薬学的に許容される塩、すなわち生理学的または毒物学的に容認できる塩（適切には、薬学的に許容される塩基付加塩および薬学的に許容される酸付加塩が含まれる）の形態で使用され得る。
【０１８０】
互変異性体形態で存在し得る本明細書に示されているＴＬＲアゴニストの場合、化合物は、すべてのこのような互変異性体形態で使用することができる。
【０１８１】
化合物が組成物の一部として身体に投与された場合、その化合物は、適切なプロドラッグで代わりに置き換えられてもよい。
【０１８２】
動物（および特にウシ）材料が細胞の培養に使用される場合、それらは、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）を含まず、かつ特に牛海綿状脳症（ＢＳＥ）を含まない供給源から得られるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１８３】
【図１】図１は、示された処置群に対するＦＨＡ特異的記憶Ｂ細胞の％を示している。
【発明を実施するための形態】
【０１８４】
ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、ペルタクチン（ｐ６９）、および線維状赤血球凝集素を従来の方法で調製する。これらを、以下の最終濃度（１ｍｌ当たり）で、緩衝液中で合わせることによって、バルクワクチン「＃１」および「＃２」を作製する：
【０１８５】
【表２】
2015509963.tif 000011
【０１８６】
ワクチン＃１は、小児での使用のために意図されているのに対して、ワクチン＃２は、青年での使用のために意図されている。
【０１８７】
さらなるバルクワクチン＃３および＃４を同じように得るが、これらはまた、ポリオウイルス１型、２型および３型を、１６０、３２および１２８ＤＵ／ｍｌで含む。
【０１８８】
ＨＢｓＡｇをワクチン＃３に加える（４０μｇ／ｍｌ）ことによって、さらなるバルクワクチン＃５を得る。
【０１８９】
抗原の比を維持しながら、例えば用量を低減させるための希釈により、これら４種のワクチンから他のワクチンを調製することができる。したがって２倍、２．５倍、３倍などの希釈物を作製できる。
【０１９０】
ワクチン＃１、＃２、＃３、＃４、および＃５、またはこれらの希釈物を、モノホスホリル脂質の類似体を、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムのいずれかの上に吸着させることによって得たアジュバント複合体と合わせる。この組合せは１：１の体積比で行われ、これによって、上記抗原濃度は、最終ワクチンで半減されるようになる。混合後の最終Ａｌ＋＋＋濃度は１ｍｇ／ｍｌである。
【０１９１】
成分を合わせた後、容量オスモル濃度およびｐＨを測定する（および、必要に応じて、調整する）ことによって、生理学的な受諾可能性を確実にする。
【０１９２】
合わせた抗原の完全性および免疫原性を試験することによって、抗原のいずれもが、組み合わせ物として処方された後、分析用プロファイルの変化を示していないか、すなわち抗原およびアジュバントがともに物理的に適合性であるかチェックする。
【０１９３】
次いでワクチンを使用して、試験動物を免疫化し、免疫応答を評価する。マウスにおける典型的な投薬体積は０．１ｍｌである（ヒト投薬体積の１／５）。
【０１９４】
追加免疫強度のワクチン
それぞれ（０．５ｍｌ当たり）が２Ｌｆのジフテリアトキソイド、５Ｌｆの破傷風トキソイド、および１６μｇの無細胞性百日咳抗原（精製したＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇ、ＦＨＡおよびｐ６９ペルタクチンの混合物）を含有する３種のワクチンを試験した。Ｄｔと比較して、過剰のＴｔが、青年および成人において最も有用な投薬を提供する。
【０１９５】
ワクチンは、（Ａ）アジュバント添加していない（ｕｎａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）（Ｂ）２ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムでアジュバント添加した（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）（「Ａｌ−Ｈ」）または（Ｃ）２ｍｇ／ｍｌのＡｌ−Ｈおよび１００μｇ／ｍｌのＴＬＲ−４アゴニストでアジュバント添加した。ＴＬＲ−４アゴニストは合成モノホスホリル脂質Ａであり、Ａｌ−Ｈに吸着されていた。すべての抗原は、処方物（Ｂ）および（Ｃ）中でＡｌ−Ｈに吸着されていた。
【０１９６】
比較のため、ＢＯＯＳＴＲＩＸ（商標）製品もまた試験した。これは、（０．５ｍｌ当たり）２．５Ｌｆのジフテリアトキソイド、５Ｌｆの破傷風トキソイド、および１８．５μｇの無細胞性百日咳抗原（精製したＰＴ、ＦＨＡおよびｐ６９ペルタクチンの混合物）を含有し、リン酸アルミニウムおよび水酸化物塩の混合物でアジュバント添加している。緩衝液とＡｌ−Ｈの混合物を陰性対照として使用した。
【０１９７】
４種のワクチンは、１００μｌの筋肉内用量で、メスのＢａｌｂ／Ｃマウス（６週齢）に、第０、２１および３５日目に投与した。各用量から２週間後、血清を試験した。
【０１９８】
血清の全ＩｇＧ力価を各抗原について測定すると、以下の通りであった（幾何平均）：
【０１９９】
【表３】
2015509963.tif 000012
【０２００】
したがって、すべての場合において、かつすべての時点で（第３５日でのｐ６９を除いて）、これらの５つの群の中で最も高い力価は、吸着されているＴＬＲ４アゴニストでアジュバント添加した抗原を与えたマウスに見られた。重要なことに、認可されたＢＯＯＳＴＲＩＸワクチンと比較してもこの改善が見られた。さらに、Ａｌ−Ｈ単独またはＢＯＯＳＴＲＩＸ（商標）とは異なり、吸着されているＴＬＲ４アゴニストは、アジュバント添加していない群と比較して、抗ＰＴ力価を改善することができた。
【０２０１】
ＴＬＲ４アゴニストもまたより迅速な応答をもたらす。第２の用量は、すべての抗原についてＩｇＧ応答の明白な増大を示したが、第３の用量後の改善はあまり有意ではなかった。
【０２０２】
ＦＨＡ特異的記憶Ｂ細胞
第３の用量から４〜５カ月後、ＦＨＡ特異的記憶Ｂ細胞を、免疫化されたマウスにおいて測定した。マウスを屠殺し、それらの脾臓細胞を、５日間、ＩＬ−２およびＣｐＧの存在下で培養することによって、すべての記憶Ｂ細胞を増殖させた。次いで脾臓細胞を収集し、事前にＦＨＡ抗原（１０ｍｇ／ｍｌ）または抗マウスＩｇのいずれかでコーティングされた９６−ウェルＥＬＩＳＰＯＴプレートに播種した。一晩のインキュベーション後、プレートを洗浄することによって、付着していない脾臓細胞を除去し、ＦＨＡ特異的記憶Ｂ細胞および全記憶Ｂ細胞の両方をビオチン化した抗マウスＩｇおよびＨＲＰ−ストレプトアビジンで検出した。個々の記憶Ｂ細胞を表す有色のスポットをＥＬＩＳＰＯＴリーダー装置でカウントした。次いで、全Ｂ細胞と比較した、ＦＨＡ特異的なＢ細胞のパーセンテージを各試料に対して計算した。図１は、各群に対する結果を示す。これら５つの群の中で、最も高い割合は、ＴＬＲ４アゴニストを有する群（Ｃ）で見られる。
【０２０３】
本発明は単なる例で説明されており、本発明の範囲および意図の範囲内にとどまりながら改変がなされ得ることが理解されるはずである。
【０２０４】
【表４】
2015509963.tif 000013
【０２０５】
【化８】
2015509963.tif 000014
【０２０６】
【化９】
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【０２０７】
【化１０】
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【図１】
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【国際調査報告】
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