(57)【要約】  本発明は、骨治癒または再生を促進する必要のある患者に、インスリン疑似剤を局所投与することによって骨治癒または再生を促進方法を提供し、骨治癒プロセスを加速するためのインスリン−疑似剤の新応用が開示された。また、骨損傷を治療する必要のある患者に、インスリン−疑似剤またはその組成物を局所投与するのに適した骨損傷の治療および空隙充填装置、製品およびキットも開示された。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療上有効量のインスリン−疑似剤（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｍｉｍｅｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）を骨疾患を患った患者に局所投与することを有する、骨疾患を患った患者における骨の治癒または再生を促進する方法。
【請求項２】
前記インスリン−疑似剤が、インスリン経路−刺激（ｉｎｓｕｌｉｎ  ｐａｔｈｗａｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ）亜鉛、バナジウム、タングステン、モリブデン、ニオブ、セレン、またはマンガン化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記インスリン−疑似剤が、亜鉛、バナジウムまたはマンガン化合物である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記インスリン−疑似剤が、骨の損傷部位に投与される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記骨疾患が、骨折、骨の外傷、脊椎の関節固定および四肢の関節固定などの関節固定、ならびに外傷後の骨の手術（ｐｏｓｔ−ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｏｎｅ  ｓｕｒｇｅｒｙ）、補綴後の関節の手術（ｐｏｓｔ−ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ  ｊｏｉｎｔ  ｓｕｒｇｅｒｙ）、整形後の骨の手術（ｐｏｓｔ−ｐｌａｓｔｉｃ  ｂｏｎｅ  ｓｕｒｇｅｒｙ）、ポストデンタル手術（ｐｏｓｔ−ｄｅｎｔａｌ  ｓｕｒｇｅｒｙ）、骨の化学療法処置（ｂｏｎｅ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）、先天性骨欠損、外傷後の骨欠損（ｐｏｓｔ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｏｎｅ  ｌｏｓｓ）、手術後の骨欠損（ｐｏｓｔ  ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｂｏｎｅ  ｌｏｓｓ）、感染後の骨欠損（ｐｏｓｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｂｏｎｅ  ｌｏｓｓ）、同種移植片の埋め込み（ａｌｌｏｇｒａｆｔ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）または骨の放射線療法処置（ｂｏｎｅ  ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記骨疾患が、骨折、骨の欠陥、ならびに骨欠損（ｏｓｓｅｏｕｓ  ｄｅｆｅｃｔｓ）、ならびに癒合遷延（ｄｅｌａｙｅｄ  ｕｎｉｏｎｓ）および癒合不全（ｎｏｎ−ｕｎｉｏｎｓ）から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記方法が、骨自家移植片法、骨同種移植片法、自家幹細胞治療法、自家移植成長因子濃縮法、同種幹細胞治療法、化学的刺激法、電気的刺激法、低強度パルス超音波（ＬＩＰＵＳ）法、内固定法および外固定法から選択される骨の再生を促進する第二の方法と組み合わせて使用される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記方法が、同種移植片法、自家移植片法、異種移植片法、人工移植法または整形外科バイオ複合材料法と組み合わせて使用される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記方法が、細胞毒性薬、サイトカインまたは成長阻害剤を前記インスリン−疑似剤と一緒に投与することを有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法が、外来骨成長刺激剤（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｂｏｎｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）と組み合わせて使用される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法が、生物活性骨剤（ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｂｏｎｅ  ａｇｅｎｔ）を前記インスリン−疑似剤と一緒に投与することを有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記生物活性骨剤が、ペプチド成長因子、抗炎症因子、炎症促進因子、アポトーシスの阻害剤、ＭＭＰ阻害剤、および骨異化アンタゴニストからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ペプチド成長因子が、ＩＧＦ（１，２）、ＰＤＧＦ（ＡＡ、ＡＢ、ＢＢ）、ＢＭＰｓ、ＦＧＦ（１−２０）、ＴＧＦ−β（１−３）、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、および副甲状腺ホルモン関連ペプチド（ＰＴＨｒＰ）からなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗炎症因子が、抗ＴＮＦα、可溶性ＴＮＦレセプター、ＩＬｌｒａ、可溶性ＩＬ１レセプター、ＩＬ４、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３からなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記骨異化アンタゴニストが、ビスホスホネート、オステオプロテゲリン、およびスタチンからなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
局所投与を特徴とする骨の治癒または再生を加速する必要のある患者における骨の治癒または再生を加速するための薬剤の製造のためのインスリン−疑似剤の使用。
【請求項１７】
治療上有効量の、治癒または骨の再生を必要とする骨状態に苦しめられている患者へのインスリン−疑似剤の局所投与用に処方されるインスリン−疑似剤を含む骨損傷治療キット。
【請求項１８】
骨誘導担体（ｏｓｔｅｏｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｃａｒｒｉｅｒ）およびインスリン−疑似剤を含む、骨の癒着または空隙充填のための骨再生材料。
【請求項１９】
前記インスリン−疑似剤が、インスリン経路−刺激亜鉛、バナジウム、タングステン、モリブデン、ニオブ、セレン、またはマンガン化合物である、請求項１８に記載の材料。
【請求項２０】
前記インスリン−疑似剤が、バナジウムまたは亜鉛化合物である、請求項１９に記載の材料。
【請求項２１】
前記骨誘導担体が、自家移植片物質、同種移植片物質、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、異種移植片物質、人工移植生体材料、および整形外科バイオ複合材料からなる群より選択される、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の材料。
【請求項２２】
インスリン−疑似剤化合物またはその組成物を包含する、少なくとも一つの骨接触表面（ｂｏｎｅ−ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ  ｓｕｒｆａｃｅ）を含む、整形外科または脊椎のインプラント。
【請求項２３】
前記整形外科インプラントが、スクリュー、プレート、ロッド、Ｋ−ワイヤ、ピン、フック、いかり、髄内装置、椎弓根スクリュー（ｐｅｄｉｃｌｅ  ｓｃｒｅｗｓ）、椎弓根フック、脊椎固定ケージ（ｓｐｉｎａｌ  ｆｕｓｉｏｎ  ｃａｇｅｓ）、脊椎固定プレート、プロテーゼ、および多孔質金属インプラント（例えば、柱金属インプラント）からなる群より選択される、請求項２２に記載の整形外科または脊椎のインプラント。
【請求項２４】
チタン、チタンの合金、タンタル、タンタルの合金、コバルトクロム合金、合金鋼、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される金属から形成される、請求項２２または２３に記載の整形外科または脊椎のインプラント。
【請求項２５】
前記合金鋼が、ステンレス鋼である、請求項２４に記載の整形外科または脊椎のインプラント。
【請求項２６】
ポリマー材料から形成される、請求項２２または２３に記載の整形外科または脊椎のインプラント。
【請求項２７】
前記ポリマー材料が、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸−グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリ（オルトエステル）（ＰＯＥｓ）、およびこれらの組み合わせから選択されるポリマーを含む、請求項２６に記載の整形外科または脊椎のインプラント。
【請求項２８】
前記インスリン−疑似剤化合物が、インスリン経路−刺激亜鉛、バナジウム、タングステン、モリブデン、ニオブ、セレン、およびマンガン化合物、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載の整形外科または脊椎のインプラント。
【請求項２９】
前記インスリン−疑似剤化合物が、亜鉛、バナジウム、またはマンガン化合物である、請求項２８に記載の整形外科または脊椎のインプラント。
【請求項３０】
脊椎融合外科手技（ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）における脊椎融合を増進する方法であって、
隣接する脊椎のそれぞれの一部分を露出させ；ならびに
前記隣接する脊椎の前記露出部分の間および両方の脊椎の前記露出部分と接触している領域内に、補助的な骨組織材料およびインスリン−疑似剤化合物を配置する、
ステップを含み、
前記インスリン−疑似剤化合物が、骨組織材料と共に前記二つの脊椎の融合（ｆｕｓｉｏｎ）速度を増加させるための有効量で提供される、方法。
【請求項３１】
前記インスリン−疑似剤化合物が、インスリン経路−刺激亜鉛、バナジウム、タングステン、モリブデン、ニオブ、セレン、またはマンガン化合物である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記インスリン−疑似剤化合物が、亜鉛またはバナジウムである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記インスリン−疑似剤化合物を、前記融合部位（ｆｕｓｉｏｎ  ｓｉｔｅ）に添加する、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記インスリン−疑似剤化合物を、移植に適するために処方骨組織材料形態で添加する、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記インスリン−疑似剤化合物を、外科的に許容可能な担体をさらに含む組成物として添加する、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記組成物が、前記インスリン−疑似剤化合物を含む硫酸カルシウムペレットである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
自家骨移植、同種骨移植、異種骨移植、整形外科バイオ複合材料、または合成骨空隙フィラーの移植方法との組み合わせである、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記合成骨空隙フィラーが、セラミック骨移植代用品である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記方法が、準備領域を形成するためのラミナまたは外側塊の天然ホスト骨の剥皮、および部分的融合（ｓｅｇｍｅｎｔａｌ  ｆｕｓｉｏｎ）を誘導するための前記準備領域へのインスリン−疑似剤化合物を含む骨移植混合物のパーキングを含む後方融合（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｆｕｓｉｏｎ）である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記方法が、面関節の側面の剥皮、準備領域を形成するための一以上の横突起、および部分的融合を誘導するための前記準備領域へのインスリン−疑似剤化合物を含む骨移植混合物のパーキングを含む後側方融合（ｐｏｓｔｅｒｏｌａｔｅｒａｌ  ｆｕｓｉｏｎ）である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
椎体間装置の移植との組み合わせである、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
脊椎の前柱の椎体間の融合（椎体前方融合）を高めるための、椎体間装置（ｉｎｔｅｒｂｏｄｙ  ｄｅｖｉｃｅ）の中央チャンバ内における、自家移植、同種移植、または合成的な（例えばセラミック）骨空隙充填剤との組み合わせである、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
椎体が減圧のために除去される場合または椎体に干渉する外傷、腫瘍または感染を処理する場合に、前方椎体切除と同様に前方椎間板切除術および圧迫解除後に実行される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
脊椎融合外科手技における脊椎の増増進のためのキットであって、
インスリン−疑似剤および製薬上許容可能な担体を含む組成物を含む脊椎融合手技において、容易な適用のための製剤組成物を含む、キット。
【請求項４５】
同種移植骨組織材料および／またはセラミック骨移植代用品をさらに含む、請求項４４に記載の骨組織キット。
【請求項４６】
前記インスリン−疑似剤および前記同種移植骨組織材料またはセラミック骨移植代用品が、混合物として提供される、請求項４５に記載の骨組織キット。
【請求項４７】
前記インスリン−疑似剤および前記同種移植骨組織材料またはセラミック骨移植代用品が、その後の混合のために提供される、請求項４５に記載の骨組織キット。
【請求項４８】
前記インスリン−疑似剤が、インスリン経路−刺激亜鉛、バナジウム、タングステン、モリブデン、ニオブ、セレン、およびマンガン化合物、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項４４に記載の骨組織キット。
【請求項４９】
インスリン−疑似剤および製薬上許容可能な担体を含む、脊椎融合外科手技における脊椎の融合の速度を増進するための組成物。
【請求項５０】
前記インスリン−疑似剤は、インスリン経路刺激亜鉛、バナジウム、タングステン、モリブデン、ニオブ、セレン、およびマンガン化合物、並びにこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５１】
二つの隣接する脊椎の融合を安定させ、促進するように構成された補綴インプラントを含み、前記補綴インプラントの表面に接触する骨組織がインスリン−疑似剤を含む組成物で被覆される、脊椎融合を増進するための埋め込み型装置。
【請求項５２】
前記インスリン−疑似剤が、インスリン経路−刺激亜鉛、バナジウム、タングステン、モリブデン、ニオブ、セレン、およびマンガン化合物、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項５１に記載の埋め込み型装置。
【請求項５３】
前記インスリン−疑似剤が、亜鉛、バナジウム、またはマンガン化合物である、請求項５２に記載の埋め込み型装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年１１月２９日付で提出の、米国仮特許出願第６１／５６４，８２２号、２０１２年１０月２５日付で提出の、米国仮特許出願第６１／７１８，６４６号、２０１１年１２月９日付で提出の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／６４２４０号、２０１０年１２月１０日付で提出の、米国仮特許出願第６１／４２１，９２１号、２０１０年１２月３０日付で提出の、米国仮特許出願第６１／４２８，３４２号、および２０１１年３月１８日で提出の、米国仮特許出願第６１／４５４，０６１号に対して３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．  §１１９（ｅ）に基づく優先権を主張し、これらはすべて参考で本明細書中に引用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、骨再生のための治療補助薬としてのインスリン−疑似剤（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｍｉｍｅｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ）の使用、さらにインスリン−疑似剤の局所投与による患者の骨の治癒または再生の方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
約６００，０００件の癒着不能を含む、約６００万件の骨折が毎年米国であり、そのうち約１０％が治癒に至らない。骨折治癒は、細胞の連続的な採用および骨の修復に不可欠な要素の具体的な時間的発現を伴う複雑なプロセスである。骨折治癒のプロセスは、骨折部位における血塊の初期形成から始まる。血栓内の血小板および炎症細胞は、走化性、増殖、血管新生および骨芽細胞や軟骨芽細胞への間葉系細胞の分化のために重要ないくつかの因子を放出する。
【０００４】
実施される整形外科手術において、毎年約１００万件で同種移植または自家移植が必要である。骨の治癒を促進する一つの解決法として、骨芽細胞、線維芽細胞、軟骨芽細胞等の、細胞を、適当な環境で、生物活性のあるシグナル伝達分子、例えば、インスリンまたはインスリン−疑似剤（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｍｉｍｅｔｉｃ）、またはβ−ＴＣＰ（ＣａＰＯ４）等の担体ありもしくはなしで、およびコーラーゲンで処理する、組織工学（ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）によるものがある。骨折の現状の治療方法としては、（ａ）電気刺激装置（ＰＥＭＦ、エキソゲン（Ｅｘｏｇｅｎ）など）および（ｂ）骨形成タンパク質（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＢＭＰ）、例えば、ｒｈＢＭＰ−２／ＡＣＳ（ＩＮＦＵＳＥ（登録商標）  Ｂｏｎｅ  Ｇｒａｆｔ）等の、生物剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）がある。後者は、特定の体間ケイジ（ｉｎｔｅｒｂｏｄｙ  ｃａｇｅｓ）による脊椎固定時の自家移植片置換（ａｕｔｏｇｒａｆｔ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｓｐｉｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ）（ＡＬＩＦ）（２００２）として、ＩＭ釘による脛骨骨折の修復（２００４）ための、および頭蓋上顎骨手術（ｃｒａｎｉｏｆａｃｉａｌ  ｍａｘｉｌｌａｒｙ  ｓｕｒｇｅｒｙ）（２００６）のためのアジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）として、ＦＤＡによって認可されたが、この方法は、高価であり、１申請あたり約５，０００ドルかかる（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，  Ｊ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．  Ａｍ．，  ２００２，  ８４：  １０３２-１０４４；  Ｔｒｉｐｐｅｌ，  Ｓ．Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．  Ａｍ．，  １９９６，  ７８：  １２７２−８６）。
【０００５】
初期の血腫形成に続いて起こる骨折治癒プロセスは、第一次または第二次骨折治癒として分類されうる。第一次骨折治癒は、骨フラグメント間の歪（ｉｎｔｅｒｆｒａｇｍｅｎｔａｒｙ  ｓｔｒａｉｎ）がほとんどないまたは全くない堅固な骨内固定（ｒｉｇｉｄ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｆｉｘａｔｉｏｎ）の存在下で生じ、これにより骨折ギャップにわたって直接骨が形成する。第二次骨折治癒は、固定せずにまたは堅くない固定（ｎｏｎ−ｒｉｇｉｄ  ｆｉｘａｔｉｏｎ）により骨フラグメント間の歪に応答して生じ、これにより骨膜及び外軟組織（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｓｏｆｔ  ｔｉｓｓｕｅ）からの応答による特徴を有する膜内及び軟骨内骨化により骨が形成する。
【０００６】
膜内骨形成は骨膜で始まる。この領域内に位置する骨芽細胞は、骨マトリックスを生成し、成長因子を合成し、この部位にさらに細胞を補充する。膜内骨化が開始してからすぐに、骨折部位に直接隣接する肉芽組織が軟骨に置換されて、軟骨内骨形成を引き起こす。骨折ギャップを一時的に橋渡しする軟骨は、間葉細胞の軟骨細胞への分化によって生成する。軟骨性仮骨は、増殖性軟骨細胞から始まり、最終的には肥大軟骨細胞で支配される。肥大軟骨細胞は、血管形成を開始し、得られた血管系は骨芽前駆細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）さらには軟骨吸収細胞及び破骨細胞の補充（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）のためのルートを提供し、石灰化組織を再吸収する。この骨芽前駆細胞は骨芽細胞に分化して、線維性骨を生成し、これにより骨折を癒合させる（ｆｏｒｍｉｎｇ  ａ  ｕｎｉｔｅｄ  ｆｒａｃｔｕｒｅ）。骨折治癒の最終段階は、線維性骨の再構成による構造体の形成という特徴があり、この構造体は元の組織と似ており、骨折前の骨の機械的完全性を有する。
【０００７】
しかしながら、骨代謝のプロセスは、骨修復とはかなり異なる。骨の代謝は、骨形成と骨吸収との相互作用である。前記したような、骨修復は、連続的な補充（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）および間葉細胞の適当な骨芽細胞／軟骨形成細胞系への分化による骨折／欠損部位の修復を含む複雑なプロセスである。
【０００８】
脊椎融合は、脊椎症、ディスク障害、および脊柱管狭窄症を含む種々の条件のために実行される共通の手順である。単独レベルの脊椎融合後の偽関節（ｐｓｅｕｄｏａｒｔｈｒｏｓｉｓ）率は、３５％までと報告されていた。脊椎関節固定後の骨形成の過程は、骨折治癒および異所性骨化の間に起こるものと同様であり、融合速度を増大させるための薬剤は、以下の脊椎融合後の偽関節を減少させるのに重要な役割を担っている。我々の知る限りでは、本発明より前に、例えば亜鉛またはバナジウム化合物のようなインスリン−疑似剤の局所当初による脊椎融合における治療のｉｎ  ｖｉｖｏ評価は、実行されていない。
【０００９】
脊椎融合を増進するための新方法と共に、骨再生を増進することによって骨折を修復するための新方法を開発する必要性は明確に存在する。
【発明の概要】
【００１０】
発明の要約
本発明は、インスリン経路−刺激亜鉛、バナジウム、タングステン、モリブデン、ニオブ、セレン、またはマンガン化合物を含むがこれらに限定されないインスリン−疑似剤の局所投与による、骨再生のための独特なストラテジーを提供する。
【００１１】
本発明の一態様では、治療上有効量のインスリン−疑似剤（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｍｉｍｅｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）を患者に局所投与することを有する、骨再生の必要のある患者の骨の疾患の治療方法が提供される。
【００１２】
本発明の他の態様では、局所投与の骨の治癒または再生を必要とする患者における骨の治癒または再生を促進するための薬剤の製造のためのインスリン疑似剤化合物の使用が提供される。
【００１３】
本発明の他の態様では、適用の必要のある患者にインスリン−疑似剤化合物および制約上許容できる単体を含む、薬剤デリバリー装置またはキットが提供される。
【００１４】
本発明の他の態様は、骨自家移植法は、骨同種移植法、自己幹細胞治療法、自家成長因子濃縮物を利用する方法、同種幹細胞治療法、化学的刺激法、電気刺激法、低強度パルス超音波（ＬＩＰＵＳ）法、内固定法、および外部の固定から選択される骨再生を促進するための第二の方法、またはインスリン−疑似剤またはその組成物の局所投与することを含む。
【００１５】
本発明はまた、脊椎融合（ｓｐｉｎａｌ  ｆｕｓｉｏｎ）手法における脊椎融合を促進する独特なストラテジーを提供する。
【００１６】
本発明の一態様は、骨誘導担体（ｏｓｔｅｏｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｃａｒｒｉｅｒ）およびインスリン−疑似剤を含む骨癒着（ｂｏｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ）または空隙充填（ｖｏｉｄ  ｆｉｌｌｉｎｇ）のための骨再生材料を提供する。一実施形態では、前記骨再生材料は、自家骨組織（ａｌｌｏｇｒａｆｔ  ｂｏｎｅ  ｔｉｓｓｕｅ）を含む。他の実施形態では、前記骨再生材料は、異種移植骨組織（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｂｏｎｅ  ｔｉｓｓｕｅ）を含む。
【００１７】
本発明の他の態様では、以下の工程を含む脊椎骨（ｓｐｉｎｅ）における脊椎（ｖｅｒｔｅｂｒａｅ）を安定化するための外科手技（ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）が提供される：
隣接する脊椎のそれぞれの一部を露出させること；および
前記隣接する脊椎の前記露出部分の間および両方の脊椎の前記露出部分と接触している領域内に、補助的な骨組織材料およびインスリン−疑似剤を配置すること；
この際、前記インスリン−疑似剤は、骨組織材料とともに前記二つの脊椎の融合（ｆｕｓｉｏｎ）速度を増加させるための有効量で提供される。
【００１８】
一実施形態では、前記脊椎は、腰椎（ｌｕｍｂａｒ  ｖｅｒｔｅｂｒａｅ）である。他の実施形態では、前記脊椎は、頚椎（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｖｅｒｔｅｂｒａｅ）である。一実施形態では、前記骨組織材料は、自家移植骨組織を含む。他の実施態様では、前記骨組織材料は、同種移植骨材料である。一実施態様では、前記インスリン−疑似剤は、骨組織材料と混合される。特別な実施態様では、前記骨組織材料は、自家移植骨組織であり、前記インスリン−疑似剤は、前記二つの脊椎の前記露出部分の間に配置される前に、採取後の前記骨組織材料と混合される。
【００１９】
他の実施形態では、当該方法は、当該二つの脊椎を安定させ、当該骨組織材料と前記二つの脊椎との融合を促進するように構成された補綴インプラント（ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ  ｉｍｐｌａｎｔ）で当該２つの脊椎をサポートする工程をさらに含む。
【００２０】
一実施形態では、当該補綴インプラントの骨組織接触面は、当該インスリン−疑似剤で被覆されている。
【００２１】
他の態様では、本発明は、脊椎融合外科手技における脊椎の融合速度を増進するための骨組織キットを提供し、当該骨組織キットは、インスリン−疑似剤および製薬上許容可能な担体を含む組成物を含む。一実施形態では、当該キットはまた同種移植骨組織材料を含む。一実施形態では、当該インスリン−疑似剤および当該同種移植骨組織材料は、混合物として提供される。他の実施形態では、当該インスリン−疑似剤および同種移植骨組織材料は、その後の混合のために提供される。他の態様では、本発明は、脊椎融合外科手技における脊椎の融合の速度を増進するための組成物を提供し、当該組成物は、インスリン−疑似剤および製薬上許容可能な担体を含む。一実施形態では、当該組成物は、同種移植骨材料を含む。
【００２２】
他の態様では、本発明は、脊椎融合を増進するための埋め込み型装置をお提供する。この際、補綴インプラントは、二つの隣接する脊椎の融合を安定させ促進するように構成され、前記補綴インプラントの表面に接触する骨組織は、インスリン−疑似剤を含む組成物で被覆される。
【００２３】
本発明に用いられるインスリン疑似剤の例として、インスリン経路−刺激（ｉｎｓｕｌｉｎ  ｐａｔｈｗａｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ）亜鉛、バナジウム、タングステン、モリブデン、ニオブ、セレン、およびマンガン化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
ゆえに、本発明は、糖尿病であるまたは糖尿病ではない、患者、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトでの骨の治癒の促進および脊椎融合の増進のための特有な方法を提供する。本発明のインスリン−疑似剤による治療の開発によって、成長因子（例えばインスリン）などの複合分子をデリバリーする特殊な方法の開発の必要性を取り除き、これにより、治療に関連するコストを低減し、特殊な貯蔵を排除し、使用しやすさを促進するであろう。本発明の上記および他の形態は、下記図面および詳細な説明を参照してより良好に理解できるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、術後のＸ線写真を示す。（Ａ）アインホルン（Ｅｉｎｈｏｒｎ）モデル、（Ｂ）本研究で使用したモデルの、術後すぐに撮影した代表的なＸ線写真である。（（Ｂ）では、キルシュナー鋼線が転子を通り抜けており、これにより骨折部位が安定化され、キルシュナー鋼線の移動を防止する）。
【図２】図２は、機械的試験セットアップ（Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｓｅｔｕｐ）：フィールド金属（Ｆｉｅｌｄ’ｓ  ｍｅｔａｌ）で３／４平方インチナットに埋め込まれる前の無傷の大腿骨を示し、この際、（Ａ）ＺＩＮＣ  １０（３．０ｍｇ／ｋｇ  ＺｎＣｌ２）および（Ｂ）ＺＩＮＣ  ８（１．０ｍｇ／ｋｇ  ＺｎＣｌ２）は、２セットの亜鉛で処理した４週間整形後に採取された大腿骨であり、らせん骨折の治癒を示し、（Ｃ）ＺＩＮＣ  ３（コントロール）は、癒合不全（Ｎｏｎ−ｕｎｉｏｎｓ）の非らせん骨折を示す（左：無傷の大腿骨、右：骨折した大腿骨）。
【図３】図３は、生理食塩水コントロールと比較して、局所ＺｎＣｌ２（１．０および３．０ｍｇ／Ｋｇ）で処理した骨折の大腿骨の代表的サンプルの４週間レントゲン写真（ＡＰおよび内側面図（Ｍｅｄｉａｌ−Ｌａｔｅｒａｌ  ｖｉｅｗｓ））を示す図である。
【図４】図４は、生理食塩水コントロールと比較して、ＺｎＣｌ２で処理した骨折の組織形態計測を示す図である。
【図５】図５は、ＣａＳＯ４コントロールと比較して、１．０ｍｇ／Ｋｇ  ＺｎＣｌ２＋ＣａＳＯ４担体で処理した各群の骨折した大腿骨の代表的サンプルの４週間レントゲン写真（ＡＰおよび内側面図（Ｍｅｄｉａｌ−Ｌａｔｅｒａｌ  ｖｉｅｗｓ））を示す図である。
【図６】図６は、既存療法（ＢＭＰ２）でのＺｎＣｌ２の使用の比較を示す図である：（１）硫酸カルシウム（ＣａＳＯ４）ビヒクルに伴うＺｎＣｌ２の単独髄内投与（１ｍｇ／ｋｇ）（紫色）；（２）ビヒクルなしのＺｎＣｌ２の単独髄内投与（３ｍｇ／ｋｇ）（緑色）；（３）バッファビヒクルに伴うＢＭＰ−２の単独経皮投与（８０ｇ）を用いたＢＭＰ−２研究（赤色）；および（４）超音波処理の毎日露出期間（２０分／日）を用いたエクソジェン（Ｅｘｏｇｅｎ）研究。当該平均値（２５日間の継続）が、青色で示される。
【図７】図７は、生理食塩水コントロールと比較して、局所塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）の４週間骨折後のレントゲン写真を示す図である。
【図８】図８は、局所ＶＡＣレベルの定量化を示す図である。骨折したおよび反対側の（無傷の）大腿骨のための手術後の１、４、７、および１４日間における大腿骨のバナジウム濃度（μｇバナジウム／骨質量のグラム）。
【図９】図９は、ＶＡＣおよび生理食塩水コントロールで処理したラットにおける組織学の比較を示す図である：生理食塩水の代表的な部分、１．５ｍｇ／ｋｇ  ＶＡＣおよび３ｍｇ／ｋｇ  ＶＡＣ群が立体顕微鏡で可視化された１．６７Ｘの１０〜２１日間からの治癒の進行を示す。
【図１０】図１０は、骨折した大腿骨の各群における３つ代表的なサンプルの４週間レントゲン写真：（Ａ）生理食塩水コントロール、（Ｂ）１．５ｍｇ／ｋｇ  ＶＡＣ、（Ｃ）３．０ｍｇ／ｋｇ  ＶＡＣを示す図である。
【図１１】図１１は、ＶＡＣ処理または未滅菌（無傷の大腿骨に対して正規化）処理の４週間機械的試験を示す図である。データは、平均値±標準偏差を示す。＊は、コントロールよりも統計学的に高い値を示し、ｐ＜０．０５対生理食塩水コントロール。
【図１２】図１２は、放射線分析により測定し、正常（非糖尿病）ラットにおける大腿骨骨折の長期治癒に対する局所バナジウム治療の効果を示す図である。
【図１３】図１３は、進行中のＢＭＰ２およびエクソジェンの治療法の局所ＶＡＣ処理の比較を示す図である。
【図１４】図１４は、Ｌ４−Ｌ５の横突起が軟らかい組織を除去し、高速バリで剥皮されたことを示している図である。
【図１５】図１５は、破砕された自家移植が、適切なレベル（Ｌ４−Ｌ５）で何度横突起の間で広がっていたことを示す図である。インプラントまたはブランクの相当額は、自家移植床に組み込んだ。
【図１６】図１６は、コントロール群と比較してラットモデルにおけるバナジウム処理した脊椎のＸ線写真を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
発明の詳細な説明
本発明は、インスリン−疑似剤が、骨折部位でのインスリンシグナル伝達経路を刺激することにより、骨再生を促進するために使用することができるという発見に基づいている。特に、本発明は、骨に対するインスリン−疑似剤の生物学的影響として、骨の治癒において重要な役割を果たすために利用できるという発見に基づくものである。担当ありまたは担体なしで局所的にデリバリーされる、例えばインスリン経路−刺激亜鉛、バナジウム−疑似剤は、ねじり強度及び再生骨の骨密度を改善することができる。骨の再生を促進するための、バナジウム、亜鉛、または類似の金属塩療法の開発は、治療的に有益であり、
プロテイン成長因子（例えばインスリン）などの複合分子をデリバリーする特殊な方法の開発の必要性を取り除き、特殊な貯蔵を排除し、使用しやすさを促進し、対費用効果が高い。
【００２７】
従って、本発明は、骨折のような種々の骨疾患を治療するために、及び脊椎融合を増進するために、例えば脊椎関節固定の治療において、インスリン−疑似剤を用いる。本発明に好適に用いられるインスリン−疑似剤は、インスリン経路−刺激亜鉛、バナジウム、タングステン、モリブデン、ニオブ、セレン、マンガン金属または化合物を含むが、これらに限定されない。例えば、我々は、ＺｎＣｌ２を単独でまたは整形外科用担体（例えばＣａＳＯ４）付の製剤の一部として使用し、手術後の骨折部位に直接適用するときに、骨折治癒の加速を示した。
【００２８】
好ましくは、前記骨の治癒の必要のある患者は、骨折、骨の外傷、脊椎固定術、四肢の関節固定術などを含む関節固定、および外傷後の骨の手術（ｐｏｓｔ−ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｏｎｅ  ｓｕｒｇｅｒｙ）、補綴後の関節の手術（ｐｏｓｔ−ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ  ｊｏｉｎｔ  ｓｕｒｇｅｒｙ）、整形後の骨の手術（ｐｏｓｔ−ｐｌａｓｔｉｃ  ｂｏｎｅ  ｓｕｒｇｅｒｙ）、ポストデンタル手術（ｐｏｓｔ−ｄｅｎｔａｌ  ｓｕｒｇｅｒｙ）、骨の化学療法処置（ｂｏｎｅ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）、先天性骨欠損、外傷後の骨欠損（ｐｏｓｔ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｏｎｅ  ｌｏｓｓ）、手術後の骨欠損（ｐｏｓｔ  ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｂｏｎｅ  ｌｏｓｓ）、感染後の骨欠損（ｐｏｓｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｂｏｎｅ  ｌｏｓｓ）、同種移植片の埋め込み（ａｌｌｏｇｒａｆｔ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）または骨の放射線療法処置（ｂｏｎｅ  ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）に関連する骨欠損疾患（ｂｏｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｔ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）から選択される骨の疾患に苦しむ。
【００２９】
上記態様の他の実施形態では、前記骨の疾患は、骨折、骨欠損、ならびに癒合遷延（ｄｅｌａｙｅｄ  ｕｎｉｏｎ）および癒合不全（ｎｏｎ−ｕｎｉｏｎ）から選択される。
【００３０】
したがって、一態様では、本発明は、治療上有効量のインスリン経路−刺激インスリン−疑似剤を、骨疾患を患った患者に局所投与することを有する、骨疾患を患った患者における骨の治癒または再生を促進する方法を提供する。
【００３１】
上記態様の一実施形態では、前記インスリン−疑似剤は、インスリン経路−刺激（ｉｎｓｕｌｉｎ  ｐａｔｈｗａｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ）亜鉛、バナジウム、タングステン、モリブデン、ニオブ、セレン、またはマンガン化合物である。
【００３２】
上記態様の他の実施形態では、前記インスリン−疑似剤は、亜鉛、バナジウムまたはマンガン化合物である。
【００３３】
上記態様の他の実施形態では、前記インスリン−疑似剤は、骨の損傷部位に投与される。
【００３４】
上記態様の他の実施形態では、本発明の方法は、同種移植片法、自家移植片法、異種移植片法、人工移植法または整形外科バイオ複合材料法と組み合わせて使用される。
【００３５】
上記態様の他の実施形態では、前記方法は、細胞毒性薬、サイトカインまたは成長阻害剤を前記インスリン−疑似剤と一緒に投与することを有する。
【００３６】
上記態様の他の実施形態では、前記方法は、外来骨成長刺激剤（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｂｏｎｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）と組み合わせて使用される。
【００３７】
上記態様の他の実施形態では、前記方法は、生物活性骨剤（ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｂｏｎｅ  ａｇｅｎｔ）を前記インスリン−疑似剤と一緒に投与することを有する。
【００３８】
上記態様の他の実施形態では、前記生物活性骨剤は、ペプチド成長因子、抗炎症因子、炎症促進因子、アポトーシスの阻害剤、ＭＭＰ阻害剤、および骨異化アンタゴニストからなる群より選択される。
【００３９】
上記態様の他の実施形態では、前記ペプチド成長因子は、ＩＧＦ（１，２）、ＰＤＧＦ（ＡＡ、ＡＢ、ＢＢ）、ＢＭＰｓ、ＦＧＦ（１−２０）、ＴＧＦ−β（１−３）、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、および副甲状腺ホルモン関連ペプチド（ＰＴＨｒＰ）からなる群より選択される。
【００４０】
上記態様の他の実施形態では、前記抗炎症因子は、抗ＴＮＦα、可溶性ＴＮＦレセプター、ＩＬｌｒａ、可溶性ＩＬ１レセプター、ＩＬ４、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３からなる群より選択される。
【００４１】
上記態様の他の実施形態では、前記骨異化アンタゴニストは、ビスホスホネート、オステオプロテゲリン、およびスタチンからなる群より選択される。
【００４２】
上記態様の他の実施形態では、前記患者は、哺乳動物である。
【００４３】
上記態様の他の実施形態では、前記患者は、ヒトである。
【００４４】
上記態様の他の実施形態では、前記患者は、非糖尿病のヒトである。
【００４５】
他の態様では、本発明は、局所投与を特徴とする骨の治癒または再生を加速する必要のある患者における骨の治癒または再生を加速するための薬剤の製造のためのインスリン−疑似剤の使用を提供する。
【００４６】
他の態様では、本発明は、本発明のインスリン−疑似剤化合物またはその組成物を包含する、少なくとも一つの骨接触表面（ｂｏｎｅ−ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ  ｓｕｒｆａｃｅ）を含む、整形外科または脊椎のインプラントを提供する。
【００４７】
整形外科装置の例として、スクリュー、プレート、ロッド、Ｋ−ワイヤ、ピン、フック、いかり、髄内装置、椎弓根スクリュー（ｐｅｄｉｃｌｅ  ｓｃｒｅｗｓ）、椎弓根フック、脊椎固定ケージ（ｓｐｉｎａｌ  ｆｕｓｉｏｎ  ｃａｇｅｓ）、脊椎固定プレート、プロテーゼ、および多孔質金属インプラント（例えば、柱金属インプラント）などを含む。本発明に用いられるインプラントとしては、チタン、チタンの合金、タンタル、タンタルの合金、コバルトクロム合金、ステンレス鋼などの合金などから形成される金属インプラントを含む。本発明に用いられるポリマーインプラントとしては、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸−グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリ（オルトエステル）（ＰＯＥｓ）などを含む。
【００４８】
前記インスリン疑似剤は、従来の手段により、インプラントの骨接触表面に被覆されうる。代替用のインプラントは、製剤化することができ、インスリン−疑似剤がインプラントの骨接触面に組み込まれるように製造することができる。これの達成できる手段は、当業者にとって容易で明らかである。
【００４９】
他の態様では、本発明は、治癒または骨再生を必要とする骨疾患を患った患者へ局所投与するための製剤化されたインスリン−疑似剤の治療有効量を含む骨損傷治療キットを提供する。かようなキットは、例えば皮下注射器（ｈｙｐｏｄｅｒｍｉｃ  ｓｙｒｉｎｇｅ）のような局所投与のための装置を含みうる。
【００５０】
他の態様では、本発明は、骨再生または骨融合を促進するために、骨組織材料、セラミック骨移植代用品、またはこれらの組み合わせを提供する。本発明に好適に用いられる骨組織材料は、自家移植、同種移植、および異種移植材料を含む。
【００５１】
上記態様の一実施形態では、前記骨組織材料は、インスリン経路−刺激亜鉛、バナジウム、タングステン、モリブデン、ニオブ、セレン、およびマンガン化合物から選択されるインスリン−疑似剤を含む。
【００５２】
上記態様の他の実施形態では、前記骨組織材料は、バナジウム、マンガン、および亜鉛化合物から選択されるインスリン−疑似剤を含む。
【００５３】
上記態様の他の実施形態では、前記骨組織材料は、製薬上許容可能な担体をさらに含む。
【００５４】
上記態様の他の実施形態では、前記製薬上許容可能な担体は、無機塩である。
【００５５】
上記態様の他の実施形態では、前記製薬上許容可能な担体は、硫酸塩またはリン酸塩から選択される無機塩である。
【００５６】
上記態様の他の実施形態では、前記製薬上許容可能な担体は、カルシウム塩である。
【００５７】
他の態様では、本発明は、脊椎融合を増進するためのインスリン疑似剤を利用する脊椎融合手技（手法）を提供する。一実施態様では、脊椎骨（ｓｐｉｎｅ）における脊椎（ｖｅｒｔｅｂｒａｅ）を安定化するための外科手技は、提供され、隣接する脊椎のそれぞれの一部分を露出させ；ならびに前記隣接する脊椎の前記露出部分の間および両方の脊椎の前記露出部分と接触している領域内に、補助的な骨組織材料、セラミック骨移植代用品（ｃｅｒａｍｉｃ  ｂｏｎｅ−ｇｒａｆｔ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ）またはこれらの組み合わせ、およびインスリン−疑似剤化合物を配置する、ステップを含み、この際前記インスリン−疑似剤化合物が、骨組織材料と共に前記二つの脊椎の融合（ｆｕｓｉｏｎ）速度を増加させるための有効量で提供される。
【００５８】
上記態様の他の実施形態では、前記インスリン−疑似剤は、亜鉛、バナジウム、タングステン、モリブデン、ニオブ、セレン、またはマンガン化合物をである。
【００５９】
上記態様の他の実施形態では、前記インスリン−疑似剤は、亜鉛またはバナジウム化合物である。
【００６０】
上記態様の他の実施形態では、前記インスリン−疑似剤は、補助的な骨組織材料および／またはセラミック骨移植代用品に添加され、インスリン−疑似剤を含む補助的な骨組織材料を提供する。
【００６１】
上記態様の他の実施形態では、前記インスリン−疑似剤は、製薬上許容可能な担体をさらに含む組成物として、前記補助的な骨組織材料および／またはセラミック骨移植代用品とは別に添加される。一実施形態によれば、前記組成物は、インスリン−疑似剤硫酸カルシウムペレットである。
【００６２】
上記態様の他の実施形態では、前記方法は、自家骨移植、同種骨移植、異種骨移植、セラミック骨移植代用品、整形外科バイオ複合材料などの移植方法との組み合わせである。一実施形態よれば、インスリン−疑似剤は、自家移植、同種移植、異種移植、セラミック骨移植代用品、整形外科バイオ複合材料などと混合されている。
【００６３】
患者の関心好適部位は、骨治癒を必要とする部位およびこれらの部位に隣接および／または連結する領域を含む。また、本発明の治療方法は、骨自家移植片法、骨同種移植片法、自家移植成長因子濃縮法、自家幹細胞治療法、同種幹細胞治療法、化学的刺激法、電気的刺激法、低強度パルス超音波（ＬＩＰＵＳ）法、内固定法および外固定法から選択される少なくとも一つの手順との任意の組み合わせであり、この際、脊椎融合の場合には、融合された脊椎を安定化し、または二つの隣接する脊椎融合における速度を増加させるであろう。
【００６４】
本発明に用いられるインスリン−疑似剤亜鉛化合物は、例えば鉱酸亜鉛塩などの無機亜鉛化合物を含む。無機亜鉛化合物の例として、塩化亜鉛、硫酸亜鉛、リン酸亜鉛、炭酸亜鉛、および硝酸亜鉛、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
インスリン−疑似剤亜鉛化合物はまた、有機酸の亜鉛塩を含める。有機酸亜鉛塩の例としては、酢酸亜鉛、ギ酸亜鉛、プロピオン酸亜鉛、グルコン酸亜鉛、ビス（マルトラト）亜鉛、アセキサム酸亜鉛、アスパラギン酸亜鉛、ビス（マルトラト）亜鉛（ＩＩ）［Ｚｎ（ｍａ）２］、ビス（２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキシド）亜鉛（ＩＩ）［Ｚｎ（ｈｐｏ）２］、ビス（アリキシナト）Ｚｎ（ＩＩ）［Ｚｎ（ａｌｘ）２］、ビス（６−メチルピコリナト）Ｚｎ（ＩＩ）［Ｚｎ（６ｍｐａ）２］、ビス（アスピリナト）亜鉛（ＩＩ）、ビス（ピロール−２−カルボキシラト）亜鉛［Ｚｎ（ｐｃ）２］、ビス（アルファ−フロン酸）亜鉛［Ｚｎ（ｆａ）２］、ビス（チオフェン−２−カルボキシラト）亜鉛［Ｚｎ（ｔｃ）２］、ビス（チオフェン−２−アセタト）亜鉛［Ｚｎ（ｔａ）２］、（Ｎ−アセチル−Ｌ−システイナト）Ｚｎ（ＩＩ）［Ｚｎ（ｎａｃ）］、亜鉛（ＩＩ）／ポリ（γ−グルタミン酸）［Ｚｎ（γ−ｐｇａ）］、ビス（ピロリジン−Ｎ−ジチオカルバメート）亜鉛（ＩＩ）［Ｚｎ（ｐｄｃ）２］、亜鉛（ＩＩ）Ｌ−ラクテート［Ｚｎ（ｌａｃ）２］、亜鉛（ＩＩ）Ｄ−（２）−キナ酸［Ｚｎ（ｑｕｉ）２］、ビス（１，６−ジメチル−３−ヒドロキシ−５−メトキシ−２−ペンチル−１，４−ジヒドロピリジン−４−チオナト）亜鉛（ＩＩ）［Ｚｎ（ｔａｎｍ）２］、β−アラニル−Ｌ−ヒスチジナト亜鉛（ＩＩ）（ＡＨＺ）など、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態において、亜鉛塩の有機酸は、天然に存在する脂肪酸である。
【００６６】
適切な有機バナジウム系インスリン−疑似剤は、バナジウムアセチルアセトネート（ＶＡＣ）、バナジウムスルフェート（ＶＳ）、バナジウム３−エチル−アセチルアセトネート（ＶＥＴ），及びビス（マルトラト）オキソバナジウム（ＢＭＯＶ）などを含むが、これらに限定されない。好ましい態様において、前記有機バナジウム化合物は、バナジウムアセチルアセトネート（ＶＡＣ）である。有機バナジウム化合物であるバナジウムアセチルアセトネート（ＶＡＣ）は、１型および２型糖尿病の動物と人間の研究ではインスリン−疑似効果を示し、および動物実験で糖尿病のいくつか合併症を妨げてきた。研究されているＶＡＣの追加の薬理活性は、糖新生の阻害、グルタミン酸脱水素酵素活性の低下、および抗脂肪分解を含む。骨治癒または再生を加速するための、または軟骨損傷および修復の治療補助剤としてのこれらのバナジウム系インスリン−疑似剤は、本発明者らによって、関連する米国仮出願第６１／２９５，２３４及び６１／５０４，７７７、並びにＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／２１２９６およびＰＣＴ／ＵＳ１２／４５７７１に開示され、その全体が本明細書中で参考として採用されうる。本発明に好適に用いられるインスリン−疑似バナジウム化合物は、米国特許第５，３００，４９６；５，５２７，７９０；５，６８８，７８４；５，８６６，５６３；５，８８８，８９３；６，２６８，３５７および６，２８７，５８６号を含み、その全体が本明細書中で参考として採用されうる。
【００６７】
本発明により、骨治癒または再生のためのインスリン疑似剤としての好適なタングステン、セレン、モリブデン、ニオブ、またはマンガン化合物も提供され、そしてそれらの形態および投与様式は、当業者の把握内である。
【００６８】
タングステン化合物の例として、タングステン酸ナトリウム［Ｎａ２ＷＯ４・ｘＨ２Ｏ］、タングストリン酸［Ｈ３［Ｐ（Ｗ３Ｏ１０）４］・ｘＨ２Ｏ］、タングストリン酸のアラニン錯体（ＷＰＡ−Ａ）［Ｈ３［Ｐ（Ｗ３Ｏ１０）４］［ＣＨ３ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨ］・ｘＨ２Ｏ］、ホモ−ポリオキソタングステン酸塩およびバナジウムポリオキソタングステン酸塩、タングステン（ＶＩ）過酸化錯体（例えば（ｇｕ）２［ＷＯ２（Ｏ２）２］および（ｇｕ）［ＷＯ（Ｏ２）２（ｑｕｉｎ−２−ｃ）］、この際、「ｇｕ」はグアニジウムであり、「ｑｕｉｎ−２−ｃ」はキンリン２−カルボキシレートである）、およびタングステンの過金属酸化物（ｐＷ）が挙げられるが、これらに限定されない。モリブデン化合物は、例えばモリブデンの過金属酸化物を含む。
【００６９】
ニオブ化合物は、例えばの（ｇｕ）３［Ｎｂ（Ｏ２）４］および（ｇｕ）２［Ｎｂ（Ｏ２）３（ｑｕｉｎ−２−ｃ）（この際、「ｇｕ」はグアニジウムであり、「ｑｕｉｎ−２−ｃ」はキンリン２−カルボキシレートである）ような過酸化錯体を含むが、これらに限定されない。
【００７０】
セレン化合物は、セレン酸ナトリウム［Ｎａ２ＳｅＯ４・ｘＨ２Ｏ］および亜セレン酸ナトリウム［Ｎａ２ＳｅＯ３・ｘＨ２Ｏ］を含むが、これらに限定されない。
【００７１】
マンガン化合物は、３−Ｏ−メチル−Ｄ−キロ−イノシトール＋塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、Ｄ−キロ−イノシトール＋塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、硫酸マンガン［ＭｎＳＯ４］、Ｄ−キロ−イノシトール２ａ（ピニトールとして）およびガラクトサミンを含むイノシトールグリカンシュード−ジサッカライドＭｎ（２＋）キレート、経口マンガン（ｏｒａｌ  ｍａｎｇａｎｅｓｅ）、例えばＭｎＯ２、ＭｎＯＡｌ２Ｏ３、およびＭｎ３Ｏ４などのマンガン酸化物を含むが、これらに限定されない。
【００７２】
本発明に用いられる、特にバナジウム、亜鉛、マンガン、およびタングステン化合物などの他のインスリン−疑似金属化合物は、例えば、Ｗｏｎｇ，Ｖ．Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００４，４５（３）：１０７−１５；およびＮｏｍｉｖａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００１，８６（４）：  ６５７−６６７などに開示され、その全体が本明細書中で参考として採用されうる。
【００７３】
低分子（例えば、亜鉛、バナジウム、タングステン、モリブデン、ニオブ、セレン、またはマンガン）インスリン−疑似剤の利点として以下を含むが、これらに限定されない：（ａ）低分子インスリン疑似剤の開発は、骨折患者にとって非常に重要となり得る；（ｂ）担体を必要とインスリン複合体は、デュアル剤（ｄｕａｌ  ａｇｅｎｔ）製品としてＦＤＡの要件を満たすことは困難であり得る；および（ｃ）小分子インスリン疑似剤は、長い半減期を有し、一般にタンパク質と見られるストレージの問題を回避することができる。
【００７４】
具体的な治癒メカニズムとしては、以下に制限されないが、（ａ）骨内の石化成分を保持する、（ｂ）骨からの石化成分の放出を阻害する、（ｃ）骨芽細胞活性を刺激する、（ｄ）破骨細胞活性を低減する、または（ｅ）骨の再構築（ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）を刺激することが挙げられる。
【００７５】
本明細書中で使用される、「治療上有効な量」ということばは、剤の投与が生理学的に有意である量を意味する。その存在によって患者の骨の治癒プロセスに検出可能な変化がある場合には、その剤の投与は生理学的に有意である。
【００７６】
本明細書中で使用される、「骨損傷（ｂｏｎｅ  ｉｎｊｕｒｙ）」、「損傷を受けた骨（ｉｎｊｕｒｅｄ  ｂｏｎｅ）」などのことばは、骨折、骨の外傷、関節固定、および外傷後の骨の手術（ｐｏｓｔ−ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｏｎｅ  ｓｕｒｇｅｒｙ）、補綴後の関節の手術（ｐｏｓｔ−ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ  ｊｏｉｎｔ  ｓｕｒｇｅｒｙ）、整形後の骨の手術（ｐｏｓｔ−ｐｌａｓｔｉｃ  ｂｏｎｅ  ｓｕｒｇｅｒｙ）、ポストデンタル手術（ｐｏｓｔ−ｄｅｎｔａｌ  ｓｕｒｇｅｒｙ）、骨の化学療法処置（ｂｏｎｅ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）、先天性骨欠損、外傷後の骨欠損（ｐｏｓｔ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｏｎｅ  ｌｏｓｓ）、手術後骨欠損（ｐｏｓｔ  ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｂｏｎｅ  ｌｏｓｓ）、感染後骨欠損（ｐｏｓｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｂｏｎｅ  ｌｏｓｓ）、同種移植片の埋め込み（ａｌｌｏｇｒａｆｔ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）または骨の放射線療法処置（ｂｏｎｅ  ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）に関連する骨欠損疾患（ｂｏｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｔ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）からなる群より選択される骨の疾患を意味する。
【００７７】
上記態様の他の実施形態では、前記方法は、脊椎融合手技に使用される。本発明のインスリン−疑似剤組成物は、脊椎融合手技のための特に有用な補助剤である。前記組成物は、脊椎融合および脊椎骨安定化を促進し、また脊椎安定化装置の機能を改善するために使用することができる。
【００７８】
一実施形態によれば、二つの隣接する脊椎を安定化し、前記二つの脊椎の融合を促進するように構成された補綴インプラントである椎体間装置（ｉｎｔｅｒｂｏｄｙ  ｄｅｖｉｃｅ）が提供され、この際、前記補綴インプラントの表面に接触する骨組織は、インスリン−疑似剤を含む組成物で被覆されている。前記装置はまた、自家移植骨、同種移植骨、異種移植骨、セラミック骨移植代用品、整形外科バイオ複合材料などを、前記二つの隣接する脊椎の露出表面に供給するように構成されてもよく、この際、骨または骨移植代用品は、インスリン−疑似剤と混合されてもよく、混合されなくてもよい。
【００７９】
他の態様では、本発明は、脊椎融合外科手技における脊椎の融合速度を増進するための骨組織キットを提供し、当該骨組織キットは、インスリン−疑似剤および製薬上許容可能な担体を含む組成物を含む。一実施形態では、当該キットはまた、同種移植骨組織材料、異種移植骨組織材料、および／またはセラミック骨移植代用品を含む。一実施形態では、前記インスリン−疑似剤と同種移植骨組織材料、異種移植骨組織材料、および／またはセラミック骨移植代用品とは、混合物として提供される。他の実施形態では、前記インスリン−疑似剤と同種移植骨組織材料、異種移植骨組織材料、および／またはセラミック骨移植代用品とは、その後の混合のために提供される。
【００８０】
上記態様の他の実施形態では、前記インスリン−疑似剤は、インスリン経路−刺激亜鉛、バナジウム、タングステン、モリブデン、ニオブ、セレン、およびマンガン化合物、ならびにこれらの混合物から選択される。前記インスリン−疑似剤は、、脊椎融合手技において使用するのに適した当技術分野で公知の任意の形態であってもよい。
【００８１】
他の態様では、本発明は、脊椎融合外科手技における脊椎融合を増進するためのインスリン−疑似剤を含む組成物を提供し、当該組成物は、インスリン−疑似剤および製薬上許容可能な担体を含む。
【００８２】
一実施形態では、前記組成物は、自家移植骨材料および／またはセラミック骨移植代用品を含む。
【００８３】
上記態様の他の実施形態では、前記インスリン−疑似剤は、インスリン経路−刺激亜鉛、バナジウム、タングステン、モリブデン、ニオブ、セレン、およびマンガン化合物、並びにこれらの組み合わせから選択される。
【００８４】
上記態様の他の実施形態では、前記埋め込み型装置（ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ  ｄｅｖｉｃｅ）は、頸椎、胸椎、または腰椎の後部または後外側の融合を増進するために自家移植、同種移植、または合成的骨空隙充填剤（例えば、セラミック）と組み合わせられる。これは、ラミナまたは外側塊（ｌａｔｅｒａｌ  ｍａｓｓｅｓ）（後方融合）もしくは椎間関節および横突起の側（後側方融合（ｐｏｓｔｅｒｏｌａｔｅｒａｌ  ｆｕｓｉｏｎ））の天然ホスト骨の剥皮（ｄｅｃｏｒｔｉｃａｔｉｏｎ）を伴う。前記骨移植混合物（インスリン−疑似剤を含む）は、その後、部分的融合を誘導するために、これらの準備領域に充填された（ｐａｃｋｅｄ  ｏｖｅｒ）。
【００８５】
上記態様の他の実施形態では、前記埋め込み型装置は、脊椎の前柱の椎体間の融合（椎体前方融合）を増進するために、椎体間装置（ｉｎｔｅｒｂｏｄｙ  ｄｅｖｉｃｅ）の中央チャンバ内における、自家移植、同種移植、または合成的骨空隙充填剤（例えば、セラミック）と組み合わせられる。これは、椎体が減圧のために除去される場合または椎体に干渉する外傷、腫瘍または感染を処理する場合に、前方椎体切除と同様に前方椎間板切除術および圧迫解除後に実行される。
【００８６】
上記態様の他の実施形態では、インスリン−疑似剤は、前方椎体間融合を果たすために、脊椎骨の前柱の椎体間に挿入された椎体間装置（ケージ）の表面修飾として使用される。かようなケージは、椎間板切除又は椎体切除後の脊椎の前柱を再構築するために使用される（上記参照）。前記表面修飾必要の領域は、頭側（上）および尾側（下）部分の対応する脊椎端板（ｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｅｎｄｐｌａｔｅｓ）と同格の表面でありうる。
【００８７】
上記態様の他の実施形態では、インスリン−疑似剤は、開放または経皮の後方アプローチによって挿入され、椎弓根スクリューのような脊椎固定装置への表面修飾として使用される。かようなスクリューは、椎弓根を通って後方への前方方向の椎体内に下方に延びるパイロットホールを穿孔することにより配置される。各椎体の前記スクリューは、その後、スパン運動部分を安定化させるためにロッドによって相互に接続されている。
【００８８】
上記態様の他の実施形態では、インスリン−疑似剤は、開放または最小限侵入する前方（ｍｉｎｉｍａｌｌｙ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ａｎｔｅｒｉｏｒ）もしくは前外側のアプローチによって挿入され、プレートと組み合わせて使用する椎弓根スクリューのような脊椎固定装置への表面修飾として使用される。かような前方椎体スクリューは、通常、頸部と下位腰椎での前方から後方方向に配置される。上側の腰椎と胸椎では、それらは多くの場合、前外側の出発点から椎体に配置される。
【００８９】
上記態様の任意の実施形態では、前記インスリン−疑似剤は、亜鉛、バナジウム、タングステン、モリブデン、ニオブ、セレン、またはマンガン化合物、およびこれらの組み合わせから選択され、好ましくは、例えば、ＶＡＣ、塩化マンガン、または塩化亜鉛などの、バナジウム、マンガン、または亜鉛化合物である。
【００９０】
脊椎融合を必要とする患者を作る病気または疾患は、関節固定術、椎間板変性症、椎間板ヘルニア、椎間板の痛み、脊髄腫瘍、脊椎骨折、脊柱側弯症、脊柱後（すなわち、ショイエルマン病）、脊椎すべり症、脊椎症、後室ラミ症候群、他の変性脊椎条件、および脊椎の不安定を引き起こす他の任意疾患を含むが、これらに限定されない。
【００９１】
所定の治療に使用される薬剤組成物の実際の好ましい量は、使用される特定の形態、処方される特定の組成、用法、投与される特定の部位、および主治医または獣医などの当業者によって認識される他の飲位によってとこなるであろう。所定の投与プロトコルでの最適な投与速度は、公知の投与量決定試験を用いて、当業者によって容易に決定できる。
【００９２】
本発明で使用されうるインスリン−疑似剤の投与量は、想定される特定の用途によって異なりうる。適当な投与量または投与経路の決定は、通常の医師の技量内によく含まれる。本発明のインスリン疑似剤のための投与計画は、例えば、特定の薬剤の薬力学的特性ならびにその投与様式および投与経路；受容者の、種、年齢、性別、健康、医学的状態、および体重；症状の性質および程度;などの既知の因子に依存する。例えば、例えば亜鉛、バナジウム、またはマンガン化合物のような特殊なインスリン−疑似剤の局所投与量は、患者の体重によりも骨の状態の詳細に依存することができる。局所投与の投与量は、全身投与の投与量とは異なる場合があり、溶液中での投与の投与量は、埋め込み型装置上に表面の被覆を介する投与の場合の投与量とも異なりうる。いかなる特定の理論に縛られることなく、本発明に係るインスリン−疑似剤の投与量は、患者におけるインスリン経路が骨の治癒または再生プロセスを促進するために刺激されるようなレベルであるべきである。
【００９３】
示された効果のために使用される場合、一般的な方針として、各活性成分の投与量は、患者の体重に基づいて、０．００１から約２００ｍｇ／ｋｇの間の範囲であることができ、好ましくは、０．０１から約１００ｍｇ／ｋｇの間の範囲であり、特に好ましくは、０．１から約５０ｍｇ／ｋｇの間の範囲である。投与量は、必要なときにいつでも繰り返されることができ、または医師によって決定されるように骨の治癒および再生プロセスに有益であると考えることができ、例えば、一日一回、週一回、一回隔週、毎月一回、または特定の患者にほとんど利益を提供できる任意の他の期間であってもよい。
【００９４】
「インスリン疑似デリバリーシステム」を介する「局所亜鉛」の投与経路は、例えば即時放出（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｒｅｌｅａｓｅ）、制御放出（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅ）、持続放出（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅ）、および徐放（ｅｘｔｅｎｄｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅ）方法などの公知の方法に準拠する。インスリン−疑似デリバリーシステムのための好ましい投与方式は、損傷骨または融合部位およびこれらの部位に隣接および／または連結する領域への直接注射、または融合部位およびこれらの部位に隣接および／または連結する領域へのインスリン−疑似剤の外科的移植を含む。このタイプのシステムは、上述した放出場所と同様に放出の時間的制御をすることができる。
【００９５】
本明細書で使用される製剤はまた、治療される特定の兆候に必要な一以上の活性化合物を含み、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補進活性を有する活性化合物を含む。代わりに、またはそれに加えて、前記製剤は、細胞毒性薬、サイトカイン又は成長阻害剤を含んでもよい。このような分子は、意図する目的に有効な組み合わせと量で存在する。
【００９６】
生体内に＋４（バナジル）および＋５（バナデート）として存在するバナジウムは、胃腸（ＧＩ）管および、下痢または嘔吐などの胃腸の副作用において、乏しい吸収率を示している。結果として、追加の有機バナジウム化合物、すなわち、バナジル３−エチルアセチルアセトネート（ＶＥＴ）、ビス（マルトラート）オキソバナジウム（ＢＭＯＶ）、及びＶＡＣは、吸収および安全性を改善するために合成されている。有機配位子を有するＶＡＣは、ＢＭＯＶ、ＶＳ、およびＶＥＴを含む他のバナジウム化合物と比較して、抗糖尿病関数においてより効果的であることが証明されている。
【００９７】
本発明の方法で使用できるバナジウムデリバリーシステムにおけるバナジウム化合物の治療用製剤は、所望の純度を有するバナジウム化合物を、必要であれば製薬上許容できる担体、賦形剤または安定化剤と混合することによって、貯蔵を目的として調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））。このような治療用製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態でありうる。許容できる生体適合性担体、賦形剤または安定化剤は、使用される投与量及び濃度で受容者にとって無毒であり、バッファー、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸；アスコルビン酸やメチオニン等の抗酸化剤；防腐剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンズトニウム；フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルパラベンまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール：３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン；グルコース、マンノース、デキストリン、またはヒアルロン等の、単糖類、二糖類、および他の炭水化物；キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩を形成する対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）：ならびに／あるいは、非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を包含しうる。
【００９８】
製剤をｉｎ  ｖｉｖｏでの投与に使用するためには、滅菌済である必要がある。このような製剤は、凍結乾燥または再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）の前または後に、滅菌用濾過膜で濾過することによって容易に滅菌されうる。本明細書における治療用製剤は、好ましくは、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、静脈注射用の溶液バックまたは皮下注射針で穿刺可能なストッパーを有するバイアル瓶に入れられる。
【００９９】
また、バナジウムは、例えば、コアセルベーション技術によってまたは界面重合によって、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルによって調製された、マイクロカプセルに封入されてもよい。このような調製物は、コロイド状薬剤デリバリーシステム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）でまたはマクロエマルジョンで投与されてもよい。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（または１７版以降），Ｏｓｏｌ  Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示される。
【０１００】
必要であれば、バナジウムデリバリーシステムにおける有機バナジウム試薬は、多孔質リン酸カルシウム、非多孔質リン酸カルシウム、ヒドロキシアパタイト、リン酸３カルシウム、リン酸４カルシウム、硫酸カルシウム、自然骨、無機骨、有機骨から得られるカルシウム鉱物、またはこれらの組み合わせを含む。
【０１０１】
バナジウムデリバリーシステムにおけるバナジウムの徐放（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）または持続徐放（ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）投与が望ましい場合には、マイクロカプセル化が包含される。徐放用の組換タンパク質のマイクロカプセル化は、ヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）、インターフェロン−α、−β、−γ（ｒｈＩＦＮ−α、−β、−γ）、インターロイキン−２、およびＭＮ  ｒｇｐ１２０で、実施に成功している。（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１９９６，２：７９５−７９９；Ｙａｓｕｄａ，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｔｈｅｒ．，１９９３，２７：１２２１−１２２３；Ｈｏｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９０，８：７５５−７５８；Ｃｌｅｌａｎｄ，「Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｄｅ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｐｏｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｎｅｗｍａｎ，  ｅｄｓ．，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９５，ｐｐ．４３９−４６２；ＷＯ９７／０３６９２、ＷＯ９６／４００７２、ＷＯ９６／０７３９９及び米国特許第５，６５４，０１０号）。
【０１０２】
徐放製剤の適当な例としては、バナジウムデリバリーシステムにおけるバナジウムを含む固体疎水性ポリマーの半透マトリックスがあり、このマトリックスは、成形物、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態である。徐放マトリックスの例としては、１以上のポリアンヒドライド（例えば、米国特許第４，８９１，２２５号及び同第４，７６７，６２８号）、ポリエステル、例えば、ポリグリコリド、ポリラクチド及びポリラクチド−ｃｏ−グリコリド（例えば、米国特許第３，７７３，９１９号；同第４，７６７，６２８号；および同第４，５３０，８４０号；Ｋｕｌｋａｒｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｓｕｒｇ．，１９９６，９３：８３９）、ポリアミノ酸、例えば、ポリリシン、ポリエチレンオキシドの重合体及び共重合体、ポリエチレンオキシドアクリレート、ポリアクリレート、エチレン−酢酸ビニル、ポリアミド、ポリウレタン、ポリオルトエステル、ポリアセチルニトリル、ポリホスファゼン、ならびにポリエステルヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、セルロース、アシル置換セルロースアセテート、非分解性ポリウレタン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニル、ポリ（ビニルイミダゾール）、クロロスルホネート化ポリオレフィン、ポリエチレンオキシド、Ｌ−グルタミン酸及びγ−エチル−Ｌ−グルタメートの共重合体、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸共重合体、例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸共重合体及び酢酸ロイプロリドから構成される注射用マイクロスフェア）、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸等の重合体は１００日にわたって放出が可能であるが、特定のヒドロゲルはより短期間でタンパク質を放出する。使用されてもよい追加の非生分解性ポリマーとしては、ポリエチレン、ポリビニルピロリドン、エチレン酢酸ビニル、ポリエチレングリコール、セルロースアセテートブチレート及びセルロースアセテートプロピオネートがある。
【０１０３】
または、徐放製剤は、分解性生物材料、例えば、コラーゲンおよびその誘導体、生体内分解性脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸など）から構成されてもよい。生分解性重合体は、生体適合性、特定の分解に対する高い応答性、及び生物学的マトリックスへの活性薬剤の取り込み易さにより、魅力的な製剤である。例えば、ヒアルロン酸（ＨＡ）は、架橋されてもよく、生物学的材料用の膨潤性ポリマーデリバリーベヒクルとして使用されうる。（米国特許第４，９５７，７４４号；Ｖａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｌｙｍ．Ｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｅｎｇ．，１９９１，６２：７３１−７３５）。また、ポリエチレングリコールでグラフトされたＨＡポリマーは、望ましくない薬剤漏れおよび生理学的条件での長期間貯蔵に関連する変性を低減する改善されたデリバリーマトリックスとして調製された。（Ｋａｚｕｔｅｒｕ，Ｍ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１９９９，５９：７７−８６）。使用されてもよいさらなる生分解性ポリマーとしては、ポリ（カプロラクトン）、ポリアンヒドライド、ポリアミノ酸、ポリオルトエステル、ポリシアノアクリレート、ポリ（ホスファジン）、ポリ（ホスホジエステル）、ポリエステルアミド、ポリジオキサノン、ポリアセタール、ポリケタール、ポリカーボネート、ポリオルトカーボネート、分解性無毒性ポリウレタン、ポリヒドロキシブチレート、ポリヒドロキシバレレート、ポリアルキレンオキザレート、ポリアルキレンスクシネート、ポリ（リンゴ酸）、キチン及びキトサンがある。
【０１０４】
または、生分解性ヒドロゲルを、バナジウムデリバリーシステムにおけるバナジウム化合物の放出制御材料（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅ  ｍａｔｅｒｉａｌ）として使用してもよい。マクロマーの適切な選択により、バナジウムデリバリーシステムにおける様々なタイプのバナジウム化合物に適した透過性、細孔径及び分解速度の範囲を有する膜を製造してもよい。
【０１０５】
または、バナジウムデリバリーシステムにおけるバナジウム用の徐放デリバリーシステムは分散液から構成されてもよい。分散液は、さらに懸濁液またはエマルジョンのいずれかとして分類されうる。バナジウム化合物用のデリバリーベヒクルにおいて、懸濁液は、液体媒質に（より均一にまたはより低い均一性で）分散する非常に小さい固体粒子の混合物である。懸濁液の固体粒子は、数ナノメートル〜数百ミクロンのサイズであってもよく、マイクロスフェア、マイクロカプセル及びナノスフェアがありうる。これに対して、エマルジョンは、少量の乳化剤によって懸濁液中に保持される２以上の非混合液体の混合物である。乳化剤は、非混合液体間で界面膜を形成し、界面活性剤または洗浄剤としても知られている。エマルジョン製剤は、油または脂肪を分散させながら水が連続相中にある水中油型（ｏ／ｗ）、さらには水をさせながら油が連続相中にある油中水型（ｗ／ｏ）双方でありうる。適当な徐放製剤の一例は、ＷＯ  ９７／２５５６３に開示される。さらに、本発明においてバナジウム化合物と共に使用されるエマルジョンとしては、多重エマルジョン、マイクロエマルジョン、微液滴及びリポソームがある。微液滴は、内部に油相がある球状液層から構成される単層のリン脂質ベヒクルである（例えば、米国特許第４，６２２，２１９号及び米国特許第４，７２５，４４２号）。リポソームは、水不溶性極性液体を水溶液と混合することによって調製されるリン脂質ベヒクルである。
【０１０６】
または、バナジウムデリバリーシステムにおけるバナジウムの徐放製剤は、強い生体適合性及び広範な生分解特性を発揮するポリマーである、ポリ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）を用いて開発してもよい。ＰＬＧＡの分解産物である、乳酸及びグリコール酸は、ヒトの体から素早く取り除かれる。さらに、このポリマーの分解性は、分子量及び組成に応じて数か月から数年まで調節できる。さらなる情報については、Ｌｅｗｉｓ，「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ａｇｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  Ｌａｃｔｉｄｅ／Ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｅｒ，」ｉｎ  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍ．Ｃｈａｓｉｎ  ａｎｄ  Ｒ．Ｌａｎｇｅｅｒ，ｅｄｓ．（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９０），  ｐｐ．  １−４１を参照。
【０１０７】
具体的な例として、インスリン−疑似剤は、デリバリーポンプを介してある部位に連続的に局所投与されてもよい。一実施形態においては、ポンプを、外側で（ポケットの中またはベルトの上に）装着し、針または柔らかいカニューレ（薄いプラスチックチューブ）を有する長い、薄い、柔軟なプラスチック管類を用いて体に取り付け、カニューレまたは針を挿入した後、皮膚の下の適所に留置する。この針またはカニューレ及び管類は、例えば、４８〜７２時間毎に交換してもよい。ポンプは、カートリッジ内にインスリン−疑似剤を溜め、最適なデリバリー速度に基づいてインスリン−疑似剤を放出しうる。必要であれば、ポンプのプログラムを作成して、四六時中連続して少量の薬剤を投与してもよく、これは特定の場合に好ましい。
【０１０８】
本発明の様々な応用は表１に示される。
【０１０９】
【表１】
2015502938.tif 000002
【０１１０】
本発明の化合物および組成物は、インスリンなどの生物製剤に関連する問題のない効果的なインスリン疑似剤である。彼らは生物製剤上の様々な注目すべき利点は、例えば、製造工程に、彼らの高い耐性と条件（例えば、上昇した温度）を有している。ＺｎＣｌ２の場合には、一般的な医療製品に使用される既知の、安定性の高い化合物であり、長い貯蔵寿命を有していて、ストレージおよび汚染／殺菌に関連する問題はない。
【０１１１】
本発明の化合物および組成物はまた多用途であり、それらは、直接的にまたは担体付の製剤の一部として骨折部位に適用し、骨折治癒を加速するのに用いられる。記載された発明を使用するために特別な技術を開発する必要はない。例えば、亜鉛化合物は、手術や骨髄内の一部として直接的に骨折部位に適用されうる。
【０１１２】
同様に、バナジウム系インスリン疑似剤は、骨折の治癒過程を加速させることができ（４〜５週で解決された骨折治癒）、回復する時間を短縮することができ（正常および糖尿病患者の両方において）、非治癒骨折を解決することができ（年間全体で１０％）、糖尿病（障害のホストモデル）骨折を解決することができ、加えて整形外科用装置のいくつかの分野における幅広い適用に用いることができる。バナジウム表面修飾アプローチの場合、バナジウムは、バナジウムは、骨治癒を増強するために、既存のインプラント（プレート、釘、スクリュー、Ｋワイヤなど）を修飾するために使用することができる。
【０１１３】
亜鉛化合物においても同様であり、バナジウム化合物はまた、例えばインスリンなどの生物製剤に関連する問題を伴わない効果的なインスリン疑似剤である。それらは、生物製剤に対して以下の利点を有し、例えば、製造プロセス（例えば、高温）を耐える機能、高い安定性および長い貯蔵寿命を有し、貯蔵、および汚染/滅菌の問題を有さない。更に、開示されたバナジウムの化合物は多用途であり、それらは、直接的にまたは担体付の製剤の一部として骨折部位に適用し、骨折治癒を加速するのに用いられる。一般的に整形外科用インプラントに用いられる材料の表面は、バナジウムで修飾することができ、かような修飾された材料はまた、骨折治癒を促進するのに有効であることが示された。記載された発明を使用するために特別な技術を開発する必要はない。バナジウム化合物の場合、当該材料は外科手術の一部として直接的に骨折部位に適用することができまたは経皮的に注射することができる。表面修飾されたインプラントの場合、インプラントに関連付けられている標準的な外科技術を使用することができる。開示された本研究では、骨形成の質は、トルク、剛性、剪断弾性率及び剪断応力のような機械的パラメータを測定することと共に、Ｘ−線、マイクロ−ＣＴスキャンを用いて特徴付けられ、すべての場合において、骨治癒の質は、同じ動物における正常な骨と比較した。
【０１１４】
本発明のインスリン疑似剤化合物を含む表面被覆組成物によって被覆された埋め込め型装置が使用される場合、前記被覆は、例えば関連技術分野で公知の任意の方法（例えば、Ｐｅｔｒｏｖａ，Ｒ．およびＳｕｗａｔｔａｎａｎｏｎｔ，Ｎ．，Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒ．Ｍａｔ．，３４（５）：８  （２００５）に開示された方法が挙げられるが、これに限定されない）によって達成することができる。例えば、適当な方法は、化学蒸着（ＣＶＤ）、物理蒸着（ＰＶＤ）、熱化学処理、酸化、およびプラズマ溶射（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｒ．Ｃ．，Ｍｅｔ．Ｐｒｏｇｒ．（１９８６）；Ｈａｂｉｇ，Ｋ．Ｈ．，Ｔｒｉｂｏｌ．Ｉｎｔ．，２２：６５  （１９８９））等を含む。本発明の適切な被覆はまた、ＣＶＤによって第一ボロン拡散被覆を形成すること（Ｚ．Ｚａｋｈａｒｉｅｖ，Ｚ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｒｆ．Ｃｏａｔｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，３１：２６５  （１９８７））によって得られた複数、好ましくは２または３の層の組み合わせを含むことができる。熱化学的処理技術は、よく研究され産業界で広く用いられている。これは、非金属または金属が化学反応に続き熱拡散によって当該表面に浸透される方法である。熱化学処理によって、表面層の組成、構造、および性質が変更される。
【０１１５】
その他の適当な被覆技術は、浸炭、窒化、浸炭窒化、クロマイジング、およびアルミナイジングを含むことができるが、これらに限定されない。これらの被覆技術において、ホウ素化（ｂｏｒｏｎｉｚｉｎｇ）は、熱化学プロセスであり、表面を硬く耐摩耗性に生産するのに使用される。当業者は理解できるように、異なるコーティング技術は、特定の目的に適した所望の特性を有するためにバナジウム系コーティングおよび本発明の被覆されたデバイスを作製するために使用されてもよい。
【０１１６】
本発明は、以下に制限されないが、ウマ、イヌ、ネコ、または他の家畜若しくは野生の哺乳動物等の、哺乳動物での様々な骨折を治療するためまたは脊椎融合を増進するための獣医薬において広範な用途がある可能性がある。特定の有用な用途は、例えば、傷ついた競走馬の治療で見出されうる。
【０１１７】
本発明を限定するものではないが、下記実施例によって、本発明の特定の態様を詳細に説明する。
【実施例】
【０１１８】
実施例１
骨折治癒のための亜鉛化合物の使用
材料および方法
ＢＢウィスターラットモデル
動物源および由来
本研究で使用した糖尿病耐性（ＤＲ）ＢＢウィスターラットは、ＵＭＤＮＪ−Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ（ＮＪＭＳ）の繁殖コロニーから得た。これらのラットは、制御された環境条件で飼育され、不断給餌された。全ての研究プロトコールは、ユニバーシティ  オブ  メディスン  アンド  デンティストリー  オブ  ニュー  ジャージーの施設内にある動物実験委員会によって承認された。
【０１１９】
糖尿病耐性（ＤＲ）ＢＢウィスターラット
全２４匹のＤＲ  ＢＢウィスターラットを本研究に使用した。機械的試験の間の不安定な固着により、３つのサンプルを除去した。別のサンプルは手術後の伝染に関連した伏在な要因により削除されました。残りの１７匹の動物は、機械的試験に使用され、コントロール食塩水（ｎ＝６）、０．１ｍｇ／ｋｇの塩化亜鉛（ｎ＝２）、１．０ｍｇ／ｋｇの塩化亜鉛（ｎ＝３）、３．０ｍｇ／ｋｇの塩化亜鉛（ｎ＝３）、６．０ｍｇ／ｋｇの塩化亜鉛（ｎ＝４）および１０．０ｍｇ／ｋｇの塩化亜鉛（ｎ＝３）の群に分けた。
【０１２０】
閉鎖大腿骨骨折モデル
前記したのと同様にして右大腿骨に、閉鎖中−骨幹骨折モデル（ｃｌｏｓｅｄ  ｍｉｄ−ｄｉａｐｈｙｓｅａｌ  ｆｒａｃｔｕｒｅ  ｍｏｄｅｌ）を用いて、９３〜９９日齢のＤＲ動物で、外科手術を行った。
【０１２１】
ケタミン（６０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（８ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内（ＩＰ）注射することにより、通常の麻酔を投与した。各ラットの右脚を毛を剃り、ベタジン（Ｂｅｔａｄｉｎｅ）及び７０％アルコールで切開部位を洗浄した。膝蓋骨に、約１ｃｍの内側傍膝蓋骨皮膚切開（ｍｅｄｉａｌ，  ｐａｒａｐａｔｅｌｌａｒ  ｓｋｉｎ  ｉｎｃｉｓｉｏｎ）を行った。膝蓋骨の位置を横に変え、大腿遠位の顆間窩（ｉｎｔｅｒｃｈｏｎｄｙｌａｒ  ｎｏｔｃｈ）を露出させた。１８ゲージの針で侵入孔を作り、１８ゲージの針を用いて大腿骨の穴を広げた。キルシュナー鋼線（Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒ  ｗｉｒｅ）（３１６ＬＶＭ  ステンレス鋼、０．０４インチ直径、Ｓｍａｌｌ  Ｐａｒｔｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｍｉａｍｉ  Ｌａｋｅｓ，  ＦＬ）を髄腔（ｍｅｄｕｌｌａｒｙ  ｃａｎａｌ）の長さ分挿入し、大腿骨の転子に穴を開けた（ｄｒｉｌｌ）。キルシュナー鋼線を大腿顆と同一平面で切断した。洗浄後、４−０のバイクリル吸収性縫合糸で傷を閉じた。次に、中軸閉鎖骨折（ｃｌｏｓｅｄ  ｍｉｄｓｈａｆｔ  ｆｒａｃｔｕｒｅ）を、３点屈折骨折機（ｔｈｒｅｅ−ｐｏｉｎｔ  ｂｅｎｄｉｎｇ  ｆｒａｃｔｕｒｅ  ｍａｃｈｉｎｅ）を用いて一方向に（ｕｎｉｌａｔｅｒａｌｌｙ）作製した。Ｘ線で撮影して、骨折が許容できる形状かどうかを決定した。適切な骨折は、だいたい中−骨幹の、低エネルギーの、横骨折（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ  ｍｉｄ−ｄｉａｐｈｙｓｅａｌ，  ｌｏｗ  ｅｎｅｒｇｙ，  ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ  ｆｒａｃｔｕｒｅ）である（図１）。ラットは、骨折後すぐに自由に歩きまわらせた。この閉鎖骨折モデルは、骨の外傷治癒（ｏｓｓｅｏｕｓ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ）装置及び薬剤の有効性を評価するのに一般的に使用される。
【０１２２】
局所的な亜鉛デリバリー
バッファと混合した塩化亜鉛［（ＺｎＣｌ２）、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ］を、骨折させる前に、髄腔内（ｉｎｔｒａｍｅｄｕｌｌａｒｙ  ｃａｎａｌ）に注射した。前記バッファは、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムヒドロキシ安息香酸メチル、及び塩化亜鉛からなる。１．０ｍｇ／ｋｇで、および３．０ｍｇ／ｋｇの塩化亜鉛の用量を０．１ｍＬの体積で試験し、投与した。
【０１２３】
機械的試験
骨折した外側大腿骨（ｆｒａｃｔｕｒｅｄ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌ  ｆｅｍｏｒａ）を骨折してから３〜４週間後に切除した。大腿骨から軟組織を除去して、髄腔内の髄内釘を除去した。サンプルを生理食塩水（０．９％  ＮａＣｌ）を浸したガーゼに包み、−２０℃で貯蔵した。試験前に、すべての大腿骨を冷凍庫から取り出し、３〜４時間かけて室温にまで解凍した。骨折した外側大腿骨の近位端及び遠位端を、フィールド金属（Ｆｉｅｌｄ’ｓ  ｍｅｔａｌ）で３／４平方インチ  ナットに埋め込み、約１８ｍｍのガーゼ長さを残した（図２）。仮骨、ゲージ長及び大腿骨の寸法を測定した後、２０Ｎｍｍの反応トルクセル（ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｔｏｒｑｕｅ  ｃｅｌｌ）（Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ，  Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ，  ＡＺ）を有するサーボ油圧機（ｓｅｒｖｏｈｙｄｒａｕｌｉｃｓ  ｍａｃｈｉｎｅ）（ＭＴＳ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｏｒｐ．，  Ｅｄｅｎ  Ｐｒａｉｒｉｅ，  ＭＮ）を用いてねじり試験を行い、２．０ｄｅｇ／秒の速度で破損（ｆａｉｌｕｒｅ）を試験した。破損に対する最大トルク及び破損に対する角度を、角変位データから測定した。
【０１２４】
破損に対する最大トルク、最大ねじれ剛性、剛性率、及び最大剪断応力を標準式から算出した（Ｅｋｅｌａｎｄ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｏｒｔｈｏｐ．Ｓｃａｎｄ．，１９８１，５２（６）：６０５−１３；Ｅｎｇｅｓａｅｔｅｒ，Ｌ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｏｒｔｈｏｐ．Ｓｃａｎｄ．，１９７８，４９（６）：５１２−８）。最大トルク及び最大ねじれ剛性はエクソジェンの特性であると考えられ、その一方、剛性立及び最大剪断応力は内因性の特性であると考えられる。破損に対する最大トルクは、角変位の増加がトルクのさらなる増加をもたらさなくなった時点として規定される。最大ねじれ剛性は、破損に対するトルク、ガーゼ長さ（埋め込まれた近位端及び遠位端間の露出された大腿骨の距離）および角変位の関数である。最大剪断応力は、破損に対する最大トルク、中−骨幹領域内の最大半径及び極慣性モーメントの関数である。極慣性モーメントは、大腿骨を中空楕円（ｈｏｌｌｏｗ  ｅｌｌｉｐｓｅ）として形作ることによって算出した。Ｅｎｇｅｓａｅｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７８）は、中空楕円モデルを用いて算出された極慣性モーメントはわずか２％しか実測の極慣性モーメントと相違しないことを示した（Ｅｎｇｅｓａｅｔｅｒ，Ｌ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｏｒｔｈｏｐ．Ｓｃａｎｄ．，１９７８，４９（６）：５１２−８）。
【０１２５】
異なる処理群間の生体力学的パラメーターを比較するために、相当する無傷の（ｉｎｔａｃｔ）反対側大腿骨（ｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌ  ｆｅｍｕｒ）値で各骨折した大腿骨値を割ることによって標準化した（図２）。標準化を用いて、ラット間の年齢及び体重の相違による生物学的な変動を最小限にした。
【０１２６】
ねじり試験によって測定される生体力学的パラメーターに加えて、破損（ｆａｉｌｕｒｅ）の様式によって、多くの情報が提供されうる。肉眼による試験によって測定される際のねじりによる破損（ｔｏｒｓｉｏｎａｌ  ｆａｉｌｕｒｅ）の様式により、治癒の範囲に関する指標が提供された。中−骨幹領域でのねじれ破損は完全な癒合（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｕｎｉｏｎ）を示し、その一方、骨折部位での横方向の破損は癒合不全を示した。ねじれ／横方向破損の組み合わせは一部癒合を示した（図２）。
【０１２７】
データおよび統計学的分析
分散分析（ＡＮＯＶＡ）をＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃ試験に従って行い、２よりグループサイズ大きいＺｎＣｌ２群での処理の差異を測定した（ＳｉｇｍａＳｔａｔ  ３．０，ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）。ＺｎＣｌ２研究における２つの処理群の間の差異を確認するために、スチューデントのｔ−テスト（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）が行われた。Ｐ値が０．０５未満であると、統計学的に有意差があると考えた。
【０１２８】
動物手術の一般的な説明
閉鎖中間骨幹骨折手術は、前述のように各ラットの右大腿骨上で行った。（Ｂｅａｍ，  Ｈ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．２００２，２０（６）：１２１０−１２１６；Ｇａｎｄｈｉ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｎｅ  ２００６，３８（４）：５４０−５４６．）全身麻酔はケタミン（６０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（８ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射によって投与した。その後、閉鎖の中軸骨折は、３−ポイント曲げ破壊器具（ＢＣＣ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ａｕｔｏｍｏｔｉｖｅ、Ｌｉｎｄｅｎ  ＮＪ）を用いることによって作製され、骨折後直ちにＸ−線によって確認した。
【０１２９】
ＺｎＣｌ２溶液の準備
硫酸カルシウム担体の有無にかかわらず、様々な用量で、滅菌水に混合された塩化亜鉛（ＺｎＣｌ２）、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯを、骨折させる前に、髄腔内（ｉｎｔｒａｍｅｄｕｌｌａｒｙ  ｃａｎａｌ）に注射した。塩化亜鉛の投与量は、各動物の体重に基づかないで、２９０グラムのＢＢウィスターラットのためのより低い理論的に許容用量に基づき、重金属中毒または行動の変化を引き起こさない。この重量は、５０グラム以上であり、約９０日齢（本研究における調査の年齢）の非糖尿病ＢＢウィスターラットの平均体重より低い。０．１ｍｌ体積の塩化亜鉛溶液を検討された各投与量で骨髄空間に一回の注射によって局所投与した。
【０１３０】
ＺｎＣｌ２／ＣａＳＯ４製剤の準備
ＺｎＣｌ２／ＣａＳＯ４混合物を準備するために、ＣａＳＯ４（２ｇ）をガラスバイアルに入れた。当該バイアルをオートクレーブに置き、ドライサイクル中で２時間滅菌した。ＣａＳＯ４パウダー（０．８ｇ）を、４００μｌの生理食塩水または４００μｌのＺｎＣｌ２溶液（１．０ｍｇ／ｋｇ）と室温で１分間混合した。得られた混合物を、１ｃｃの滅菌シリンジのバレルに充填し、シリンジプランジャーの挿入によってシリンジバレルのオープン口に押し下げた。シリンジバレルに１８−ゲージの滅菌針を取り付けた後、０．１ｍｌ体積の該混合物を、キルシュナー鋼線の挿入および骨折の前に、直接ラット大腿管（非糖尿病ＢＢウィスターラット）に注入した。
【０１３１】
マイクロラジオグラフィー評価
連続したマイクロレントゲン写真を、外科手術してから２週毎にすべての動物から得た。前記したのと同様の麻酔下で、ラットを側腹臥位にし（ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｐｒｏｎｅ  ｓｏ  ｌａｔｅｒａｌ）、大腿骨の前後（ＡＰ）像を得た。Ｐａｃｋａｒｄ  Ｆａｘｉｔｒｏｎ  （ＭＸ２０−Ｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）及びＫｏｄａｋ  ＭｉｎＲ−２０００マンモグラフィーフィルムを用いて、レントゲン写真を撮影した。５５ｋＶｐで３０秒間、暴露した。さらに、剖検後の動物から大腿骨を除いた後、拡大レントゲン写真を得た。すべてのレントゲン写真サンプルについて、骨折後４週で、定性分析を行った。２人の別の観察者が、それぞれ、大腿骨の側面及びＡＰ方向双方の骨内及び皮質架橋（ｅｎｄｏｓｔｅａｌ  ａｎｄ  ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｂｒｉｄｇｉｎｇ）に基づいてレントゲン写真を評価した。同じ群のサンプルでの平均値を算出して、４週での骨内及び皮質治癒の全体割合（％）を測定した。全ての分析を、以下の５点のレントゲン写真による評価システムを用いて盲検で行った：０＝明白な骨ブリッジ（ｂｏｎｙ  ｂｒｉｄｇｉｎｇ）はかった、１＝１つ皮質の骨ブリッジ、２＝２つ皮質の骨ブリッジ、３＝３つ皮質の骨ブリッジ、および４＝４つ全ての皮質の骨ブリッジ（Ｂｅｒｇｅｎｓｔｏｃｋ，Ｍ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｔｒａｕｍａ  ２００５，１９（１０）：７１７−７２３参照）。
【０１３２】
ねじれ機械的試験
ねじり試験は、２０Ｎｍの反応トルク細胞（インターフェース、スコッツデール、ＡＺ）と共に油圧サーボ（ｓｅｒｖｏｈｙｄｒａｕｌｉｃｓ）機（ＭＴＳ  Ｓｙｓ．Ｃｏｒｐ．，Ｅｄｅｎ  Ｐｒａｉｒｉｅ，ＭＮ）を用いて、４週間実施した。大腿骨は、骨折後４〜６週の時点に２．０ｄｅｇ／ｓｅｃの速度で破断する試験した。トルクピーク、ねじれ剛性、有効バルク率、および有効最大剪断応力（σ）は、中空の楕円として、各大腿骨をモデルにするための標準式を用いて決定した（Ｅｋｅｌａｎｄ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｏｒｔｈｏｐ．Ｓｃａｎｄ．１９８１，５２（６）：６０５−６１３；Ｅｎｇｅｓａｅｔｅｒ，Ｌ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｔａ  Ｏｒｔｈｏｐ．Ｓｃａｎｄ．１９７８，４９（６）：５１２−５１８）。異なる群間の生体力学的パラメータを比較するために、データは、対応する無傷の反対側大腿骨の値で各大腿骨骨折の値を割ることによって正規化した。ねじれ機械的試験は、フィールド金属の骨ポッティング時のゲージの長さの違いによって制限される。骨折間隙の配置および寸法は、標準偏差に寄与できる。最後に、大腿骨の自然な構造と対称的に、大腿骨が中空の楕円であると仮定する数学的モデルに依存するため、当該試験は制限される。（Ｌｅｖｅｎｓｔｏｎ，Ｍ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１９９４，９（９）：１４５９−１４６５．）
組織形態計測による早期治癒分析
骨折した大腿骨を、骨折後７日に切除し、脱灰し、脱水し、パラフィン包埋し、および標準的な組織学の技術を用いて切開した。切片は、オリンパスＢＨ２−ＲＦＣＡ顕微鏡（オリンパス光学工業株式会社、新宿区、東京、日本）を用いて、マッソントリクローム（Ａｃｃｕｓｔａｉｎ（商標）トリクローム染色キット、Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）で染色した。デジタル画像は、ニコンのデジタルカメラＤＸＭ１２００Ｆ（ニコン、東京、日本）を用いて収集した。軟骨、新骨、および総仮骨面積は、イメージ・プロプラスソフトウェア（バージョン５、Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤ）を用いてデジタル画像から測定した。総軟骨および新骨の面積は、総仮骨面積に対して標準化され、面積百分率として表した。二つの独立したレビューは、不整合を最小化するために使用された。
【０１３３】
組織形態計測による後期治癒分析
骨折治癒の後期段階におけるＶＡＣの効果を調べるために、大腿骨は、上述した群において、２１日で、動物から切除し、標準的な組織学技術を用いて、包埋および切断した。これは、キシレンに浸漬し、最後にポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）の層に予め埋め込む脱水を含む。純ＰＭＭＡに埋め込み、ホット水浴中で凝固させた後、スライドをＰＭＭＡブロックから切断し、磨き、そしてＳｔｅｖｅｎｅｌの青とワンギーソンピクロフクシン（ＳＶＧ）の組み合わせで染色した。骨折カルスの組織学的画像は、パーソナルコンピュータにＣＣＤカメラ（Ｏｐｔｒｏｎｉｃｓ、Ｇｏｌｅｔａ、カリフォルニア）を介して接続されたオリンパスＳＺＸ１２正立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏ，ＬＴＤ、日本）を用いて入手し、バイオカントソフトウェアパッケージ（Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｉｎｃ，Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮ）を用いて分析した。比較されたパラメータは、ａ）カルス領域、ｂ）パーセント石灰化組織領域、およびｃ）パーセント軟骨領域を含む。この手順の限界は、ＰＭＭＡの区画に関連した困難性のため、高い厚さでのスライドの生産を含む。これは、細胞の重なり合う層に起因して、細胞形態学の分析に加えて、染色のために切断することができるセクションの数を制限する。
【０１３４】
動物の一般的な健康状態
骨折手術時にＢＢウィスターラットの日齢を７５〜１３７日の間で変化させた。但し、治療群中の動物の日齢および雌雄の別は、それぞれの実験と一致させた。屠殺の日に、手術後のパーセント重量変化は、治療群間で同様であった。
【０１３５】
結果
一般的な健康状態
本実験では、ラットは、骨折時において、９３〜１１７日齢であった。骨折時から安楽死するまでの処理群の間に、パーセント体重増加における有意差はなかった（表２）。血中グルコースレベルは、塩化亜鉛で処理したラットにおいて高かったが、血糖値は、すべての処理群において、正常範囲内であった（表２）。
【０１３６】
【表２】
2015502938.tif 000003
【０１３７】
マイクロラジオグラフィー評価
骨折後４週間において、塩化亜鉛で処理したラットからの大腿骨は、コントロール大腿骨に比べて有意に高いレントゲン写真のスコアを示した。
【０１３８】
機械的試験結果
局所ＺｎＣｌ２（担体なし）
大腿骨骨折の治癒に対する局所亜鉛療法の効果は、ねじり機械的試験によって測定した。骨折後４週間において、局所ＺｎＣｌ２で処理したラットは、未処置群と比較して、骨折した大腿骨の改良された機械的特性を示した。骨折後４週間のレントゲン写真は、当該知見を支持する（図３）。表３は、２つの異なる用量でのレントゲン写真スコア値を示す。
【０１３９】
【表３】
2015502938.tif 000004
【０１４０】
表４は、治癒４週間後、骨折した骨のための骨の機械的試験の結果をまとめたものである。有効剪断応力は、それぞれ１．０ｍｇ／ｋｇおよび３．０ｍｇ／ｋｇの投与量において、ＺｎＣｌ２で処理した動物からの治癒の大腿骨に対して骨折後４週間で１．６倍および２．２倍高かった。これらの無傷の反対側の大腿骨に対して標準化したら、コントロール群（ｐ＜０．０５）に対して、３ｍｇ／ｋｇＺｎＣｌ２の投与量において、骨折した大腿骨の、破損に対するパーセント最大トルク、パーセントねじれ剛性、およびパーセント有効剛性率は、それぞれ２．０倍、３．８倍、および８．０倍高かった。
【０１４１】
正常（非糖尿病）ラットにおける大腿骨骨折の治癒に対する局所亜鉛療法の効果は、ねじり機械的試験によって測定した。骨折後４週間において、塩化亜鉛で処理してラットからの骨折した大腿骨は、コントロール群からの骨折した大腿骨に比べて、より向上された機械的な特性を示した。１０ｍｇ／ｋｇＺｎＣｌ２の場合、最大ねじれ剛性は、未処理群より有意に高かった（表４）。無傷のものに対して骨折した大腿骨の機械的パラメータを標準化したら、局所亜鉛処理で処理群における、パーセント破損に対する最大トルク（生理食塩水群対３ｍｇ／ｋｇＺｎＣｌ２群、ｐ＜０．０５）、ねじれ剛性（生理食塩水群対３ｍｇ／ｋｇＺｎＣｌ２群、ｐ＜０．０５）、および剛性率（生理食塩水群対３ｍｇ／ｋｇＺｎＣｌ２群、ｐ＜０．０５；生理食塩水群対１０ｍｇ／ｋｇＺｎＣｌ２群、ｐ＜０．０５、）は、生理食塩水群に比べて、有意的高かった（表４）。
【０１４２】
治癒は放射線検査により評価し、機械的試験により定量した。局所ＺｎＣｌ２処理は、放射線の外観を改善し、有意に骨折した大腿骨の機械的強度を増加させた。骨折後４週間において、３．０ｍｇ／ｋｇＺｎＣｌ２の場合の骨折した大腿骨の平均のパーセント破損に対する最大トルクは、未処理の生理食塩水群に比べて、有意的（２．０４倍）高かった（８２．０％の反対側のもの対２７．０％）。３．０ｍｇ／ｋｇＺｎＣｌ２の場合のパーセント最大ねじれ剛性値は、未処理の生理食塩水群に比べて、有意的（３．８５倍）高かった（９７．０％の反対側のもの対２０．０％）。低い（３．０ｍｇ／ｋｇＺｎＣｌ２）および高い（１０．０ｍｇ／ｋｇＺｎＣｌ２）投与量の両方の場合のパーセント剛性率は、有意に向上し、未処理の生理食塩水群に比べて、高い投与量が８．８倍（３６．０％の反対側のもの対４．０％）向上し、および低い投与量が９．０倍（３９．０％の反対側のもの対４．０％）向上した。このデータは、局所ＺｎＣｌ２処理は骨折治癒中の骨再生を増進し、亜鉛および潜在的に類似した金属は骨形成薬剤として治療的に使用できることを示す。
【０１４３】
【表４】
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【０１４４】
塩化亜鉛処理した骨折の組織形態計測（Ｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ）
７、１０、および２１日間後の塩化亜鉛処理した骨折の組織形態計測は、表５にリストされ、図４に示される。
【０１４５】
【表５】
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【０１４６】
局所ＺｎＣｌ２／ＣａＳＯ４製剤
我々は、ＺｎＣｌ２／ＣａＳＯ４製剤を当該骨折部位に適用し、上記実験を繰り返した。骨折後４週間のレントゲン写真は、有意に骨が形成される知見を支持する（図５）。
【０１４７】
【表６】
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【０１４８】
図６は、当該製剤を使用して４週間の治癒後、骨折した骨のための骨の機械的試験の結果をまとめたものである。有効剪断応力は、１．０ｍｇ／ｋｇの投与量において生理食塩水およびＣａＳＯ４コントロールに対して、ＺｎＣｌ２／ＣａＳＯ４で処理した動物からの治癒の大腿骨に対して、それぞれ４週間後で２．７倍および１．７倍高かった。これらの無傷の反対側の大腿骨に対して標準化したら、生理食塩水コントロール群（ｐ＜０．０５）に対して、１ｍｇ／ｋｇＺｎＣｌ２  ＣａＳＯ４の投与量において、骨折した大腿骨の、破損に対するパーセント最大トルク、パーセントねじれ剛性、およびパーセント有効剛性率は、それぞれ２．８倍、４．０倍、および４．５倍高かった。
【０１４９】
既存療法でのＺｎＣｌ２の使用の比較（ＢＭＰ２）
インスリン−疑似補助剤（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｍｉｍｅｔｉｃ  ａｄｊｕｎｃｔ）として、亜鉛化合物は、骨折部位でのインスリンシグナル伝達を刺激することにより、骨再生を促進するために使用することができる。骨折部位に直接適用されたＺｎＣｌ２の処理は、コントロールと比較して、４週間後に処置した動物において、骨の機械的パラメータを有意に増加させた。それは、骨折治癒過程を加速させた（標準ラット大腿骨骨折モデルにおける平均８から１０週間の代わりに、４から５週間で骨折治癒できた）。
【０１５０】
現在、米国ではＦＤＡの使用が承認された他の治癒補助剤は、骨形成タンパク質（ＢＭＰの）およびエクソジェン／パルス電磁フィールド（ＰＥＭＦ）などを含む。しかし、ＢＭＰは、異所性骨の成長を引き起こし、および毎回塗布するのにコストが高いなどの欠点に関連し得る；また、エクソジェン／ＰＥＭＦ療法は、骨折治癒における唯一の限定された実績の有用性を示し、患者が毎日の使用に守ることが必要である。
【０１５１】
図６のチャートは、骨折治癒のために現在承認されている製品（ＢＭＰ−２およびエクソジェン）と塩化亜鉛（単独で、またはＣａＳＯ４と組み合わせて）の使用を比較するものである。これらの研究はそれぞれ、４週間の時点での破損に対する最大トルクを測定することによって、大腿骨骨折治癒に対する治療補助剤の有効性を調べた。具体的には、以下のものがそれらのそれぞれの未処理のコントロール群と比較した：
（１）硫酸カルシウム（ＣａＳＯ４）ビヒクルに伴うＺｎＣｌ２の単独髄内投与（１ｍｇ／ｋｇ）（紫色）；（２）ビヒクルなしのＺｎＣｌ２の単独髄内投与（３ｍｇ／ｋｇ）（緑色）；（３）バッファビヒクルに伴うＢＭＰ−２の単独経皮投与（８０ｇ）を用いたＢＭＰ−２研究（赤色）（Ｅｉｎｈｏｒｎ，Ｔ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．Ａｍ．２００３，８５−Ａ（８）：１４２５−１４３５を参照）；および（４）超音波処理の毎日露出期間（２０分／日）を用いたエクソジェン研究。当該平均値（２５日間の継続）が、青色で示される（Ａｚｕｍａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．２００１，１６（４）：６７１−６８０を参照）。
【０１５２】
図で示されるように、塩化亜鉛のようなインスリン−疑似剤の単独使用は、結果として、ＢｏｎｎａｒｒｅｎｓとＥｉｎｈｏｒｎのラット大腿骨骨折モデルのねじり機械的試験を用いて、ＬＩＰＵＳおよびＢＭＰ２の既存のゴールドスタンダードに比べて、破損に対するトルクおよび骨折仮骨のその他の機械的性質の改善を有意に増加させたにつながる。
【０１５３】
要するに、我々は、人工骨折に先立って直ちに投与された局所ＺｎＣｌ２処理は、（単独で、または担体を含む製剤として）、非糖尿病ラットにおける治癒を促進することを見出した。４週間の時点で、治癒した骨の機械的パラメータは、コントロール群の場合よりも実質的に高かった。これは、骨折部位に適用する場合、骨の成長を促進するインスリンの能力に関する我々の以前の知見と一致する。これはまた、バナジルアセチルアセトネート（ＶＡＣ）のようなインスリン−疑似化合物がインスリンのように骨折治癒を促進するという我々の知見と一致する。しかし、インスリン−疑似剤、ＺｎＣｌ２は、ＶＡＣとは違って、多くの市販の医療製品に使用される化合物であり、したがって潜在的な規制障壁は最小限となる。これは、骨折に局所的に適用したインスリン−疑似剤は、骨折治癒の補助剤として治療上に使用することができ、局所ＺｎＣｌ２処理は、費用対効果の良い骨折治癒の補助剤であり、他の可能な整形外科用途における可能性を有することを示唆している。
【０１５４】
上記の準備データは、亜鉛などのインスリン−疑似剤を用いた局所治療は、骨の再生を向上させる有効な方法であることを示している。機械的パラメータおよびＸ線検査から、骨は、生理食塩水処理したコントロールと比較して、亜鉛で処理したラットでは骨折後４週で骨がブリッジされたことが明らかになった。機械的試験中に発生したらせん骨折は、放射線の観察を支持し、試験された用量で局所ＺｎＣｌ２の塗布は、未処理のコントロールと比較して、骨折治癒を促進することを示唆している。これらのデータは、骨再生を加速または増進する治療薬として、塩化亜鉛の追加的試験を支持している。
【０１５５】
実施例２
骨折治癒のためのマンガン化合物の使用
材料および方法
ラットモデル
本研究で使用した動物モデルは、糖尿病耐性（ＤＲ）ＢＢウィスターラットである。これは、制御された環境条件および不断給餌下で維持されている、ＵＭＤＮＪ−Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ（ＮＪＭＳ）の繁殖コロニーから得られる。
【０１５６】
前記ＢＢウィスターコロニーは、元々バイオブリーディング（トロント、カナダ）から入手した糖尿病を起こしやすいＢＢウィスターラットから作られた。人間のＩ型糖尿病と同様に、自然発症糖尿病のＢＢウィスターラットは、膵臓β細胞の選択的かつ完全な破壊を受けた後の血漿インスリンの減少と関連して、発症日内に著しい高血糖、糖尿、および体重減少を示す。放置すれば、糖尿病のＢＢウィスターラットは、数日以内にケトアシドーシスになり、結果として死に至る。ＢＢウィスターラットラットの遺伝子解析は、糖尿病が、さらなる感受性およびリンパ球減少の進行に関連した少なくとも４つの他の遺伝子座と共に、第４染色体の座位におけるｉｄｄｍ４糖尿病誘発感受性の存在と強く関連することの進行を示す（Ｍａｒｔｉｎ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  １９９９，４８（１１）：２１３８−４４）。
【０１５７】
ＤＲ−ＢＢウィスターコロニーはまた、元々バイオブリーディング（ＢｉｏＢｒｅｅｄｉｎｇ）から購入し、糖尿病のＢＢウィスターラットに関連する研究のための効果的なコントロール群として作られている。制御された環境条件下で、ＤＲ−ＢＢウィスターラットは、自発的Ｉ型糖尿病を発症することなく、非リンパ球減少であり、かつかつ免疫応答性でありうる。それ以来「通常の」ラットモデルのモデルとして、我々の研究室で使用されている。我々の研究において、市販のラットを購入するよりも、ＢＢウィスターラットを利用することが選択された。なぜなら、同様のプロトコルで何年間で利用されたラットとの親しみやすさだけではなく、どんな時にも必要に応じて様々なプロトコルでの飼育によってコロニーを拡大する能力があるからである。我々の様々なプロトコル間でデータを比較する際に、ＢＢウィスターとＤＲ−ＢＢウィスターラットモデルの一貫性のある使用は、信頼性の向上を可能にさせうる。
【０１５８】
動物の一般的な健康状態
骨折手術時にＢＢウィスターラットの日齢を９５〜１３７日の間で変化させた。但し、治療群中の動物の日齢および雌雄の別は、それぞれの実験と一致させた。屠殺の日に、手術後のパーセント重量変化は、治療群間で同様であった。
【０１５９】
外科テクニック
手術は、右大腿骨内の閉鎖中−骨幹骨折モデルを生成するために実行される。ケタミン（６０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（８ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内（ＩＰ）注射によって手術前に全身麻酔を投与する。各ラットの右脚を剃毛し、ベタジンおよび７０％アルコールで切開部位を準備する。１センチメートルの内側パラ膝蓋骨（ｐａｒａｐａｔｅｌｌａｒ）皮膚切開を行い、次いで大腿四頭筋腱のすぐ近く大腿四頭筋を通って小さい縦切開を行う。膝蓋骨の位置を横に変え、大腿遠位の顆間窩（ｉｎｔｅｒｃｈｏｎｄｙｌａｒ  ｎｏｔｃｈ）を露出させる。１８ゲージの針で侵入孔を作り、続いて大腿骨髄内の穴を広げる。実験群に対して、（異なる投与量の）０．１ｍＬのＭｎＣｌ２溶液を、大腿骨の髄腔に注入する。コントロール群に対して、０．１ｍＬの生理食塩水を注入する。キルシュナー鋼線（Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒ  ｗｉｒｅ）（３１６ＬＶＭ  ステンレス鋼、０．０４インチ直径、Ｓｍａｌｌ  Ｐａｒｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉａｍｉ  Ｌａｋｅｓ，ＦＬ）を髄腔内に挿入する。キルシュナー鋼線を大腿顆と同一平面で切断する。洗浄後、４〜０のバイクリル吸収性縫合糸で傷を閉じる。次に、中軸閉鎖骨折（ｃｌｏｓｅｄ  ｍｉｄｓｈａｆｔ  ｆｒａｃｔｕｒｅ）を、３点屈折骨折機（ｔｈｒｅｅ−ｐｏｉｎｔ  ｂｅｎｄｉｎｇ  ｆｒａｃｔｕｒｅ  ｍａｃｈｉｎｅ）を用いて一方向に（ｕｎｉｌａｔｅｒａｌｌｙ）作製する。Ｘ線で撮影して、骨折が許容できる形状かどうかを決定する。横のみの、中−骨幹骨折を容認する。ラットは、骨折後すぐに自由に歩きまわらせる。
【０１６０】
手術後手順
Ｘ線は、安楽死の日まで２週間間隔で撮る。安楽死後、Ｘ線も同様に撮る。Ｘ線写真を撮るために、動物に麻酔の半分の用量を与える。すべての群は、感染症の手術後および自由に歩き回る能力後４日間、厳密に監視される。
【０１６１】
ねじれ機械的試験
ねじり試験は、２０Ｎｍの反応トルク細胞（インターフェース、スコッツデール、ＡＺ）と共に油圧サーボ（ｓｅｒｖｏｈｙｄｒａｕｌｉｃｓ）機（ＭＴＳ  Ｓｙｓ．Ｃｏｒｐ．，Ｅｄｅｎ  Ｐｒａｉｒｉｅ，ＭＮ）を用いて、骨折後４週間に実施した。大腿骨は、骨折後４週に２．０ｄｅｇ／ｓｅｃの速度で破断する試験した。トルクピーク、ねじれ剛性、有効バルク率、および有効最大剪断応力（σ）は、中空の楕円として、各大腿骨をモデルにするための標準式を用いて決定した（Ｅｋｅｌａｎｄ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｏｒｔｈｏｐ．Ｓｃａｎｄ．１９８１，５２（６）：６０５−６１３；Ｅｎｇｅｓａｅｔｅｒ，Ｌ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｔａ  Ｏｒｔｈｏｐ．Ｓｃａｎｄ．１９７８，４９（６）：５１２−５１８）。異なる群間の生体力学的パラメータを比較するために、データは、対応する無傷の反対側大腿骨の値で各大腿骨骨折の値を割ることによって正規化した。ねじれ機械的試験は、フィールド金属の骨ポッティング時のゲージの長さの違いによって制限される。骨折間隙の配置および寸法は、標準偏差に寄与できる。最後に、大腿骨の自然な構造と対称的に、大腿骨が中空の楕円であると仮定する数学的モデルに依存するため、当該試験は制限される（Ｌｅｖｅｎｓｔｏｎ，Ｍ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１９９４，９（９）：１４５９−１４６５．）。
【０１６２】
組織形態計測による早期治癒分析
骨折した大腿骨を、骨折後７日および１０日に切除し、脱灰し、脱水し、パラフィン包埋し、および標準的な組織学の技術を用いて切開した。切片は、オリンパスＢＨ２−ＲＦＣＡ顕微鏡（オリンパス光学工業株式会社、新宿区、東京、日本）を用いて、マッソントリクローム（Ａｃｃｕｓｔａｉｎ（商標）トリクローム染色キット、Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）で染色した。デジタル画像は、ニコンのデジタルカメラＤＸＭ１２００Ｆ（ニコン、東京、日本）を用いて収集した。軟骨、新骨、および総仮骨面積は、イメージ・プロプラスソフトウェア（バージョン５、Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤ）を用いてデジタル画像から測定した。総軟骨および新骨の面積は、総仮骨面積に対して標準化され、面積百分率として表した。二つの独立したレビューは、不整合を最小化するために使用された。
【０１６３】
データおよび統計学分析
分散分析（ＡＮＯＶＡ）をＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃ試験に従って行い、２より大きいグループサイズＭｎＣｌ２群での処理の差異を決定した。ＭｎＣｌ２研究における２つの処理群の間の差異を確認するために、学生のｔ−テストが行われた。Ｐ値が０．０５未満であると、統計学的に有意差があると考えた。
【０１６４】
結果
機械的試験
担体なしの局所ＭｎＣｌ２
大腿骨骨折の治癒に対する局所ＭｎＣｌ２療法の効果は、ねじり機械的試験によって測定した。骨折後４週間において、局所ＭｎＣｌ２で処理したラットは、生理食塩水コントロール群と比較して、骨折した大腿骨の改良された機械的特性を示した。破損に対する最大トルクは、生理食塩水コントロール群に比べて有意に向上した（ｐ＜０．０５：０．１２５ｍｇ／ｋｇ  ＭｎＣｌ２、ｐ＜０．０５：０．２５ｍｇ／ｋｇ  ＭｎＣｌ２、ｐ＜０．０５：０．３ｍｇ／ｋｇ  ＭｎＣｌ２）（表７）。無傷の反対側の大腿骨に他強いて標準化したら、パーセントねじれ剛性は、生理食塩水コントロール群に比べて有意に向上した（ｐ＜０．０５：０．１２５ｍｇ／ｋｇ  ＭｎＣｌ２、ｐ＜０．０５：０．２５ｍｇ／ｋｇ  ＭｎＣｌ２）（表７）。
【０１６５】
【表７】
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【０１６６】
レントゲン写真分析
骨折後４週間に撮影されたレントゲン写真は、これらの機械的試験の結果を支持している（図７）。４週間で、投与量０．２５ｍｇ／ｋｇのＭｎＣｌ２で処理した骨折は、生理食塩水コントロールよりも増加した石灰化した組織を示した。また、レントゲン写真の分析は、ＭｎＣｌ２群が骨膜下骨部位（ｓｕｂｐｅｒｉｏｓｔｅａｌ  ｂｏｎｙ  ａｒｅａ）およびカルスにおいて融合体を示した、これに対して生理食塩水コントロールのレントゲン写真は、融合体の証拠を示さなかった。
【０１６７】
組織形態計測分析
ＭｎＣｌ２で処理した動物において、組織形態計測分析は、７日で、コントロールに比べて、０．３ｍｇ／ｋｇのＭｎＣｌ２で処理した大腿骨において、統計学的により低い（ｐ＜０．０５）パーセント軟骨を示した（表８）。１０日で、生理食塩水コントロールに比べて、０．３ｍｇ／ｋｇのＭｎＣｌ２で処理した大腿骨において、パーセント石灰化組織は、統計学的に増加した（ｐ＜０．０５：０．３ｍｇ／ｋｇ  ＭｎＣｌ２）（表８）。
【０１６８】
【表８】
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【０１６９】
実施例３
骨折治癒のためのバナジウム化合物の使用
方法
動物手術の一般的な説明
閉鎖中間骨幹骨折手術は、前述のように各ラットの右大腿骨上で行った。全身麻酔はケタミン（６０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（８ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射によって投与した。その後、閉鎖の中軸骨折は、３−ポイント曲げ破壊器具（ＢＣＣ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ａｕｔｏｍｏｔｉｖｅ、Ｌｉｎｄｅｎ  ＮＪ）を用いることによって作製され、骨折後直ちにＸ−線によって確認した。
【０１７０】
ＶＡＣ溶液の準備
硫酸カルシウム担体の有無にかかわらず、様々用量で、滅菌水滅菌水に混合されたバナジルアセチルアセトナート（ＶＡＣ）、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯは、骨折させる前に、髄腔内（ｉｎｔｒａｍｅｄｕｌｌａｒｙ  ｃａｎａｌ）に注射した。ＢＭＯＶおよびＶＳなどの他の有機バナジウム化合物よりＶＡＣが選択され、これは、ＶＡＣの、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３ベータ（ＧＳＫ−３β）、およびプロテインチロシンリン酸化（ＰＴＰ）の刺激における優れた有効性が認められているからである。また、Ｍｅｈｄｉらは、ＢＭＯＶおよびＶＳに比べて、ＶＡＣに対してより多くのプロテインインスリンレセプターベータサブユニット（ＩＲβ）、およびインスリンレセプター基質１（ＩＲＳ−１）チロシンリン酸化を報告した。ＶＡＣの投与量は、各動物の体重に基づかないで、２９０グラムのＢＢウィスターラットのためのより低い理論的に許容用量に基づき、重金属中毒または行動の変化を引き起こさない。この重量は、５０グラム以上であり、約９０日齢（本研究における調査の年齢）の非糖尿病ＢＢウィスターラットの平均体重より低い。Ｚｈａｎｇらによって注入された毎日皮下投与量は、０．２９ｋｇのこの平均重量で乗じた。０．１ｍｌ体積のＶＡＣ溶液を検討された各投与量で骨髄空間に一回の注射によって局所投与した。１．５ｍｇ／ｋｇ投与量は、Ｚｈａｎｇによって投与された用量の５０％であって、これは、Ｚｈａｎｇらと同じ濃度の高用量の投与されたＶＡＣの絶対的濃度を低減した。その後、０．５ｍｇ／ｋｇの投与量（低用量の３３．３％）および０．２５ｍｇ／ｋｇの投与量（低用量の１６．６％）で、ＶＡＣの最適投与量を決定し、ＶＡＣの有効性の範囲を調べるために評価した。
【０１７１】
ＶＡＣ／ＣａＳＯ４製剤の準備
ＶＡＣ／ＣａＳＯ４混合物を準備するために、２ｇのＣａＳＯ４をガラスバイアルに入れた。当該バイアルをオートクレーブに置き、ドライサイクル中で２時間滅菌した。ＣａＳＯ４パウダー（０．８ｇ）を、４００μｌの生理食塩水または４００μｌのＶＡＣ溶液（０．２５ｍｇ／ｋｇおよび１．５ｍｇ／ｋｇ）と室温で１分間混合した。得られた混合物を、１ｃｃの滅菌シリンジのバレルに充填し、シリンジプランジャーの挿入によってシリンジバレルのオープン口に押し下げた。シリンジバレルに１８−ゲージの滅菌針を取り付けた後、０．１ｍｌ体積の該混合物を、キルシュナー鋼線の挿入および骨折の前に、直接ラット大腿管（非糖尿病ＢＢウィスターラット）に注入した。
【０１７２】
パックホウ素化（バナジウム−ボロン及びボロンコントロール）ステンレス鋼ロッド製造：
スチール鋼ならびに他の金属及び合金表面のホウ素化中、ホウ素原子は、材料中に拡散して、様々なタイプの金属ホウ素化物を形成する。
【０１７３】
１．６ｍｍのキルシュナー鋼線を、アニールし、洗浄し、５ｍｍ厚の耐熱性スチールボックス内に含まれるホウ素化粉末混合物中に充填した。これにより、表面が１０〜２０μｍの厚みの層でホウ素化されうる。炭化ホウ素、ＶＡＣ、炭化ケイ素、及びホウ素化活性化剤からなる混合物を調製した。内容物をこれらが充填された容器になじませた後、蓋でカバーし、容器内で放置した。この容器を鉄の小塊で秤量し、製造中にホウ素化剤を均一に含浸させた。この容器を被覆した加熱コイルによる電気加熱されたボックス中で記載されるようにホウ素化温度にまで加熱した。被覆されたロッドを室温まで冷却し、外科手術前に滅菌のために９５％エチルアルールで拭いた。
【０１７４】
動物モデルにおけるバナジウムの定量
ＢＢウィスターラットを麻酔し、外科的処置を開始する前に、外部刺激に対する非応答性であることが確認した。麻酔したラットは、胸骨のすぐ横の浅い穿刺後に肋間を通して２２ゲージの針付の１０ｍｌのシリンジを用いて、心臓穿刺により放血した。真皮と心臓壁を穿刺した後、わずかな背圧をプランジャーの上に置き、心室から血液を撤回した。採取した血液は、血漿（ヘパリン処理）または血清（非ヘパリン処理した）のコレクションのために使用される適切な容器に移した。心臓穿刺後、ラットを頸椎脱臼を経由して安楽死させた。
【０１７５】
切除した大腿骨は、脱イオン水で骨を３回リンスした後、付着した筋肉、腱および他の組織を取り除き、その後乾燥グラシン紙に置き、空気乾燥した。ピンは、一度すすぎ、清浄なコニカルチューブに保存した。収集した肝臓、腎臓、脳、および左上腕骨（ｈｕｍｅｒｏｕｓ）は３回すすぎ、空気乾燥させた。「乾燥」の目的は、水すすぎ後の水滴を付着除去し、真の組織重量はできる限り正確に記録されることを可能にすることであった。グラシン紙上の組織の位置は、空気曝露の１または２分後に変更した。空気乾燥は、５分以上持続しない。乾燥骨は、乾燥の、酸浸漬／脱イオン水リンスする前に、プレ秤量した７ｍｌのプラスチックライナーキャップ付きの密閉可能なシンチレーションバイアルに置いた。他の臓器も、それぞれに適切なサイズのプレすすぎ、乾燥前の重量を測定プラスチックバイアル中に保存した。バイアルは、採取日、右または左大腿骨、ラットＩＤコード、調査官および研究ＩＤを示すように消えないマーカーでラベルした。臓器は、その後、将来の分析（定量化が現在計画されていない）まで、低温（−８０℃）保存用の冷凍庫に入れた。
【０１７６】
骨は、慎重に空気乾燥し、骨重量の異常性を避けるために、骨内膜空間に任意の混入された水分を取り出し、または振って落とした。その後、コレクションのビーカーを再度洗浄し、大腿骨を、試験片の二次汚染を避けるために、慎重に取り扱った。骨は、正常ラット大腿骨における標準レベルと比較し、骨中のバナジウムのレベルを決定するために原子吸光分析法により分析した。分析は、組織中のバナジウム濃度を定量するために、標準の公開したテクニック１４に基づいた。
【０１７７】
組織形態計測による早期治癒分析
骨折した大腿骨を、骨折後２、４、７、および１０日に切除し、脱灰し、脱水し、パラフィン包埋し、および標準的な組織学の技術を用いて切開した。切片は、オリンパスＢＨ２−ＲＦＣＡ顕微鏡（オリンパス光学工業株式会社、新宿区、東京、日本）を用いて、マッソントリクローム（Ａｃｃｕｓｔａｉｎ（商標）トリクローム染色キット、Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）で染色した。デジタル画像は、ニコンのデジタルカメラＤＸＭ１２００Ｆ（ニコン、東京、日本）を用いて収集した。軟骨、新骨、および総仮骨面積は、イメージ・プロプラスソフトウェア（バージョン５、Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤ）を用いてデジタル画像から測定した。総軟骨および新骨の面積は、総仮骨面積に対して標準化され、面積百分率として表した。二つの独立したレビューは、不整合を最小化するために使用された。
【０１７８】
組織形態計測による後期治癒分析
骨折治癒の後期段階におけるＶＡＣの効果を調べるために、大腿骨は、上述した群において、１０、１４、および２１日で、動物から切除し、標準的な組織学技術を用いて、包埋および切断した。これは、キシレンに浸漬し、最後にポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）の層に予め埋め込む脱水を含む。純ＰＭＭＡに埋め込み、ホット水浴中で凝固させた後、スライドをＰＭＭＡブロックから切断し、磨き、そしてＳｔｅｖｅｎｅｌの青とワンギーソンピクロフクシン（ＳＶＧ）の組み合わせで染色した。骨折カルスの組織学的画像は、パーソナルコンピュータにＣＣＤカメラ（Ｏｐｔｒｏｎｉｃｓ、Ｇｏｌｅｔａ、カリフォルニア）を介して接続されたオリンパスＳＺＸ１２正立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏ，ＬＴＤ、日本）を用いて入手し、バイオカントソフトウェアパッケージ（Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｉｎｃ，Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮ）を用いて分析した。比較されたパラメータは、ａ）カルス領域、ｂ）パーセント石灰化組織領域、およびｃ）パーセント軟骨領域を含む。この手順の限界は、ＰＭＭＡの区画に関連した困難性のため、高い厚さでのスライドの生産を含む。これは、細胞の重なり合う層に起因して、細胞形態学の分析に加えて、染色のために切断することができるセクションの数を制限する。
【０１７９】
早期免疫組織化学
２、４、７、および１０日で、細胞増殖の指標として、細胞を複製するラベルのための１時間前に５−２’ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ、、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と共に動物の腹腔内に注入した。骨折した大腿骨を切除し、ホルマリン中で固定し、脱灰し（Ｉｍｍｕｎｏｃａｌ，Ｄｅｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｔａｌｌｍａｎ，ＮＹ）、パラフィンに埋め込み、そして縦方向に切断した（厚さ５μｍ）。ＢｒｄＵ取り込むための陽性の細胞は、市販の試薬（ＤＡＫＯ社、カーペンタリア、カリフォルニア州）を用いて、免疫組織化学によって検出した。各骨折のデジタル画像は、ニコンＤＸＭ１２００ｆカメラを備えたＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＨ２−ＲＦＣＡ顕微鏡を用いて収集した。各試料について、カルス面積を測定し、骨膜カルス領域におけるＢｒｄＵ陽性細胞は、イメージプロプラスソフトウェアを用いて計数した。
骨折部位の近位および遠位の最大１ｃｍに対する外仮骨並びに大腿骨の外表面から３ｍｍにおける全てのＢｒｄＵ陽性細胞を計数した。ＢｒｄＵ陽性細胞の数は、カルスの単位面積あたりに標準化し、ラットあたり１つのデータム（ｍｍ２あたりのＢｒｄＵ陽性細胞）を、統計分析のために使用した。
【０１８０】
ねじれ機械的試験
ねじり試験は、２０Ｎｍの反応トルク細胞（インターフェース、スコッツデール、ＡＺ）と共に油圧サーボ（ｓｅｒｖｏｈｙｄｒａｕｌｉｃｓ）機（ＭＴＳ  Ｓｙｓ．Ｃｏｒｐ．，Ｅｄｅｎ  Ｐｒａｉｒｉｅ，ＭＮ）を用いて、４週および５週で実施した。大腿骨は、骨折後４〜６週の時点に２．０ｄｅｇ／ｓｅｃの速度で破断する試験した。トルクピーク、ねじれ剛性、有効バルク率、および有効最大剪断応力（σ）は、中空の楕円として、各大腿骨をモデルにするための標準式を用いて決定した。異なる群間の生体力学的パラメータを比較するために、データは、対応する無傷の反対側大腿骨の値で各大腿骨骨折の値を割ることによって正規化した。ねじれ機械的試験は、フィールド金属の骨ポッティング時のゲージの長さの違いによって制限される。骨折間隙の配置および寸法は、標準偏差に寄与できる。最後に、大腿骨の自然な構造と対称的に、大腿骨が中空の楕円であると仮定する数学的モデルに依存するため、当該試験は制限される。
【０１８１】
データおよび統計学分析
分散分析（ＡＮＯＶＡ）をＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃ試験に従って行い、２よりグループサイズ大きいＶＡＣ群での処理の差異を測定した（ＳｉｇｍａＳｔａｔ  ３．０，ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）。ＶＡＣ研究における２つの処理群の間の差異を確認するために、スチューデントのｔ−テスト（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）が行われた。Ｐ値が０．０５未満であると、統計学的に有意差があると考えた。
【０１８２】
動物の一般的な健康状態
骨折手術時にＢＢウィスターラットの日齢を７５〜１３７日の間で変化させた。但し、治療群中の動物の日齢および雌雄の別は、それぞれの実験と一致させた。屠殺の日に、手術後のパーセント重量変化は、治療群間で同様であった。
【０１８３】
結果
動物モデルにおけるバナジウムの定量
局部的に注入されたＶＡＣは、約２週間の局所注射の後、骨折した大腿骨内において引き続き結合される。これらの結果は、以下の実験から決定した。骨折直前に、０．１ｍＬの生理食塩水または４．３５ｍｇ／ｍＬのＶＡＣ溶液（４．３５ｍｇ／ｍＬのＶＡＣ溶液；約１．５ｍｇＶＡＣ／ラットの体重ｋｇ；約４３５μｍのＶＡＣ粉末；約８４μｍのバナジウム）を各ラットの大腿骨管に注入した。骨折部位から如何に迅速にバナジウムが分散するのを評価するために、ラットを手術後１、４、４および１４日で屠殺し、骨折カルス中におけるバナジウムレベルを測定した。原子吸光光度法は、局所バナジウムレベルを定量するために使用し、通常のラット大腿骨におけるレベルと比較して標準化した。局所バナジウムレベルの有意差（Ｐ＜０．０５）は、全ての時点で調べた際に、局所バナジウム処理されたラットの、右の骨折大腿骨および左の非破断試験の大腿骨の間で検出された（図８）。ＶＡＣの半減期は、Ｚｈａｎｇらによれば比較的に短く（６日）、骨折大腿骨においてその量は、反対側の大腿骨に比べて、４、７、および１４日で有意に減少した。１４日では、バナジウムの局所レベルは、１、４、および７日に比べて有意に減少した（ｐ＜０．０５）。
【０１８４】
組織形態計測分析
ＶＡＣで処理した動物において、組織形態計測分析は、７および１０日の両方で、コントロールに比べて、１．５ｍｇ／ｋｇのＶＡＣで処理した大腿骨において、統計学的により高い（ｐ＜０．０５）パーセント軟骨を示した（表９）。１４日で、生理食塩水コントロールに比べて、１．５ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇ両方のＶＡＣで処理した大腿骨におけるパーセント石灰化組織は、有意に増加した（ｐ＜０．０５：１．５ｍｇ／ｋｇ  ＶＡＣ、ｐ＜０．０５：３ｍｇ／ｋｇ  ＶＡＣ）。２１日後、パーセント石灰化組織は、１．５ｍｇ／ｋｇのＶＡＣで処理した大腿骨において、有意に増加した（ｐ＜０．０５）。このＶＡＣ−介在した治癒の加速は、１０〜２１日で、組織切片を経由して観察できる（表９；図９）。
【０１８５】
【表９】
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【０１８６】
早期免疫組織化学
ＶＡＣで処理した動物において、骨折後２または４日で細胞増殖における有意差はなかったが、骨折後７および１０日で、骨膜において、単位面積あたり（ｐ＜０．０５）より多くの増殖細胞が有意に観察された。
【０１８７】
機械的試験
担体なしの局所ＶＡＣ
大腿骨骨折の治癒に対する局所バナジウム療法の効果は、ねじり機械的試験によって測定した。骨折後４週間において、バナジウムで処理したラットは、未処理群と比較して、骨折した大腿骨の改良された機械的特性を示した。破損に対する最大トルク、ねじれ剛性、最大有効剪断応力、および有効剛性率は、すべて未処理群に比べて有意に増加した（ｐ＜０．０５：１．５ｍｇ／ｋｇ  ＶＡＣ、ｐ＜０．０５：３ｍｇ／ｋｇ  ＶＡＣ）（表１０）。
【０１８８】
骨折後４週に撮ったレントゲン写真は、これらの機械的試験の結果を支持する（図１０）。無傷の反対側の大腿骨に対して骨折した大腿骨の機械的パラメータを標準化したら、局所バナジウムで処理した群におけるパーセント破損に対する最大トルク、パーセントねじれ剛性、およびパーセント有効剛性率は、依然として、生理食塩水コントロール群に比べて、有意に向上した（ｐ＜０．０５：１．５ｍｇ／ｋｇＶＡＣ、ｐ＜０．０５：３ｍｇ／ｋｇ  ＶＡＣ）。骨折後５週で、１．５ｍｇ／ｋｇＶＡＣで処理した群における破損に対する最大トルクおよびねじれ剛性は、コントロールおよび３ｍｇ／ｋｇＶＡＣで処理した群の両方に比べて、有意に向上した（ｐ＜０．０５）（表１１）。
【０１８９】
【表１０】
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【０１９０】
【表１１】
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【０１９１】
糖尿病モデルにおける担体なしの局所ＶＡＣ
糖尿病の大腿骨骨折の治癒に対する局所バナジウム療法の効果は、ねじり機械的試験によって測定した。Ｉ型糖尿病のＢＢウィスターラットに対して、血中グルコースは、隔週でモニターし、全身グルコースレベルを維持するために、全ての糖尿病動物に対して、おおよそ２週間毎に皮下Ｌｉｎｐｌａｎｔｓ  ＴＭ（Ｌｉｎｓｈｉｎ、Ｃａｎａｄａ）を投与した。骨折後６週で、バナジウムで処理した糖尿病ラットは、未処理の糖尿病群に比べて、骨折した大腿骨の改良された機械的特性を示した。破損に対する最大トルク、ねじれ剛性、最大有効剪断応力、および有効剛性率は、すべて未処理の糖尿病群に比べて有意に増加した（ｐ＜０．０５：１．５ｍｇ／ｋｇ  ＶＡＣ）（表１２）。無傷の反対側の大腿骨に対して骨折した大腿骨の機械的パラメータを標準化したら、局所バナジウムで処理した糖尿病群におけるパーセント破損に対する最大トルク、パーセントねじれ剛性、パーセント有効剛性率、およびパーセント有効有効剛性率は、依然として、処理の糖尿病群に比べて、有意に向上した（ｐ＜０．０５：１．５ｍｇ／ｋｇ  ＶＡＣ）。６週で、ＶＡＣで処理した糖尿病動物のねじれ機械的試験は、非糖尿病動物の場合と比較した。
【０１９２】
【表１２】
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【０１９３】
局所ＶＡＣ／ＣａＳＯ４製剤
硫酸カルシウム担体付の局所バナジウムねじり試験をしたときに、結果は、硫酸カルシウムバッファおよび硫酸カルシウム担体付の１．５ｍｇ／ｋｇＶＡＣの両方の群に比べて、硫酸カルシウム担体付の０．２５ｍｇ／ｋｇＶＡＣの場合の有効剪断応力（ｐ＜０．０５）は、有意に高いことを示した。無傷の反対側の大腿骨に対して骨折した大腿骨の機械的パラメータを標準化したら、硫酸カルシウム担体付の０．２５ｍｇ／ｋｇＶＡＣにおける破損に対する最大トルクおよびパーセント有効ねじれ剛性は、硫酸カルシウムバッファ群に比べて有意に向上した（ｐ＜０．０５）（表１３）。
【０１９４】
【表１３】
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【０１９５】
表面修飾ＶＡＣ被覆したインプラント
骨折後４週での表面修飾されたロッドのねじり機械的試験では、未処理の３１６Ｌステンレス鋼（ＳＳ）コントロールロッドに比べて、バナジウム−ボロン表面修飾したロッドの動物の破損に対する最大トルクが有意に向上したことを示した（Ｐ＜０．０５）。無傷の反対側の大腿骨に対して骨折した大腿骨の機械的パラメータを標準化したら、未処理の３１６Ｌステンレス鋼（ＳＳ）コントロールロッドに比べて、バナジウム−ボロン表面修飾したロッドの動物のパーセント破損に対する最大トルクが有意に向上した（Ｐ＜０．０５）。ボロン表面修飾したコントロールロッドに比べてバナジウム−ボロン表面修飾したロッドにおけるねじり機械的パラメータは高かったが、これらの群の間では、有意差は見られなかった（表１４および１５）。
【０１９６】
【表１４】
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【０１９７】
【表１５】
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【０１９８】
高齢ラットに対するＶＡＣの影響
正常（非糖尿病）ラットにおける大腿骨骨折の治癒に対する局所バナジウム療法の効果は、ねじり機械的試験によって測定した。骨折後４週で、ＶＡＣで処理した高齢のラット（生後１９０〜１９５日）からの骨折した大腿骨は、コントロール群からの骨折した大腿骨よりも高い高い機械的特性を示した。無傷の反対側の大腿骨に対して骨折した大腿骨の機械的パラメータを標準化したら、局所バナジウムで処理した群におけるパーセント破損に対する最大トルク（生理食塩水群対１．５ｍｇ／ｋｇ  ＶＡＣ群ｐ＜０．０５）は、生理食塩水群に比べると、有意に向上した（表１６）。
【０１９９】
治癒は放射線検査により評価し、機械的試験により定量した。局所ＶＡＣ治療は、レントゲンの外観を改善し、骨折した大腿骨の機械的強度を有意に増加させた。骨折後４週で、１．５ｍｇ／ｋｇのＶＡＣで処理した骨折した大腿骨の平均パーセント破損に対する最大トルクは、未処理の生理食塩水群に比べて、有意に７６％向上した（表１６）。このデータは、局所ＶＡＣ治療は、高齢の骨折治癒において、骨再生を増進したことを示している。
【０２００】
【表１６】
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【０２０１】
正常（非糖尿病）ラットにおける大腿骨骨折の治癒に対する局所バナジウム療法の効果は、ねじり機械的試験によって測定した。骨折後４週で、ＶＡＣで処理したラットからの骨折した大腿骨の機械的強度は、投与前にＶＡＣ溶液はオートクレーブ処理やガンマ照射を行った場合であっても、コントロール群からの骨折した大腿骨の場合より向上した（図１１、表１７）。滅菌せずの１．５ｍｇ／ｋｇＶＡＣ群において、破損に対する最大トルク（生理食塩水群対滅菌せずの１．５ｍｇ／ｋｇＶＡＣ群、ｐ＜０．０５）およびねじれ剛性（生理食塩水群対滅菌せずの１．５ｍｇ／ｋｇＶＡＣ群、ｐ＜０．０５）は、生理食塩水コントロール群より有意に向上した。１．５ｍｇ／ｋｇＶＡＣのオートクレーブしたＶＡＣ群において、ねじれ剛性（生理食塩水群対１．５ｍｇ／ｋｇオートクレーブしたＶＡＣ群、ｐ＜０．０５）は、生理食塩水コントロール群より有意に向上した（表１７）。無傷の反対側の大腿骨に対して骨折した大腿骨の機械的パラメータを標準化したら、局所バナジウム処理した群におけるパーセントねじれ剛性（生理食塩水群対滅菌せずの１．５ｍｇ／ｋｇＶＡＣ群、ｐ＜０．０５、生理食塩水群対１．５ｍｇ／ｋｇオートクレーブしたＶＡＣ群、ｐ＜０．０５）、および剛性率（生理食塩水群対滅菌せずの１．５ｍｇ／ｋｇＶＡＣ群、ｐ＜０．０５）は、生理食塩水群と比べると、有意に向上した（表１７）。
【０２０２】
【表１７】
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【０２０３】
治癒は放射線検査により評価し、機械的試験により定量した。局所ＶＡＣ治療は、放射線の外観を改善し、有意に骨折した大腿骨の機械的強度を増加させた。骨折後４週で、滅菌せずの１．５ｍｇ／ｋｇＶＡＣおよび後述のオートクレーブプロセスにおける平均パーセント最大ねじれ剛性は、有意に向上し、生理食塩水コントロール群に比べて、滅菌せずのＶＡＣでは、２．８倍向上し（反対側の７６．０％対２０．０％）、およびオートクレーブしたＶＡＣでは、２．５倍向上した（反対側の７０．０％対２０．０％）。滅菌せずの１．５ｍｇ／ｋｇＶＡＣにおけるパーセント剛性率の値は、有意に向上し、生理食塩水コントロール群に比べて、４．８倍向上した（反対側の２３．０％対４．０％）。このデータは、局所ＶＡＣ治療は、骨折治癒中の骨再生を増進し、タンパク質の安定性および生物活性に影響を及ぼし得る効果的な滅菌技術はＶＡＣの生物活性を有意に変化させないことを示している。
【０２０４】
正常（非糖尿病）ラットにおける大腿骨骨折の治癒に対する局所バナジウム療法の効果は、放射線分析によって測定した。骨折後１２週で、低（１．５ｍｇ／ｋｇ）および高（３．０ｍｇ／ｋｇ）のＶＡＣの両方で処理したラットからの骨折大腿骨は、誘導された骨折の解明（図１２）を受けて、異所性骨形成の証拠を示さなかった。局所ＶＡＣで処理大腿骨は、骨折治癒を通して、ＶＡＣの毒性／発がん性の証拠を示唆していない正常なリモデリングを実証した。上記のデータは、効果的なＶＡＣ治療用量範囲０．５〜３．０ｍｇ／ｋｇを証明し、これは、ねじれの機械的パラメータにおいて２から３倍増加する結果に繋ぐ。
【０２０５】
既存療法との比較
図１３のチャートは、バナジウム技術と骨折治癒のための現在承認された製品（ＢＭＰ−２およびエクソジェン）とを比較する。これらの研究のそれぞれは、同じ時点（４週）での破損に対する最大トルクを測定することにより、大腿骨の骨折治癒に対する治療補助剤の有効性を検討した。具体的には、以下を比較した：（１）硫酸カルシウム（ＣａＳＯ４）ビヒクルに伴うＶＡＣの単独経皮投与（０．２５ｍｇ／ｋｇ）（赤色）；（２）ビヒクルなしのＶＡＣ単独経皮投与（１．５ｍｇ／ｋｇ）（青色）；（３）大腿骨の髄腔内に埋め込まれた、バナジウムで表面修飾された（バナジウムパック−ホウ素化と呼ばれるプロセス）３１６Ｌステンレス鋼ｋ−ワイヤ（緑色）；（４）バッファビヒクルに伴うＢＭＰ−２の単独経皮投与（８０ｇ）を用いたＢＭＰ−２研究（オレンジ色）；および（５）超音波処理の毎日露出期間（２０分／日）を用いたエクソジェン（Ｅｘｏｇｅｎ）研究。当該平均値（２５日間の継続）は、ダークブルーで示される。
【０２０６】
従って、これらの結果は以下のことを証明した、中でも、（ａ）バナジウム化合物（例えば、ＶＡＣ）単独でまたは整形外科用担体（例えば、ＣａＳＯ４）付の製剤の一部としての使用は、骨折部位へ直接に適用すること；および（ｂ）表面に既知の熱加工技術によってバナジウムで修飾された整形外科インプラント（椎弓根スクリュー、皿、ロッド、ワイヤ、等）の使用。インスリン−疑似剤として、バナジウム化合物は、骨折部位でのインスリンシグナル伝達を刺激することにより、骨再生を促進するために使用することができる。局所ＶＡＣは、インスリンシグナル伝達受容体のベータサブユニットを標的とする。インスリン−疑似剤存在はまた、軟骨および石灰化した組織形成を強化します。我々の研究室のデータは、ＶＡＣ治療が骨折カルス（骨折後７および１０日）の骨膜下領域内の細胞増殖を有意に増加させることを証明した。これは、骨折カルス内において、有意に高いパーセント軟骨に変換される（骨折後７および１０日）。局所ＶＡＣで処理したラット動物モデルのパーセント石灰化組織は、２１日後、コントロールより有意に高かった。これは骨治癒プロセスの進行を加速し、４および５週後のＶＡＣ処理した動物における機械的試験パラメータをコントロールに比べて、有意に強化した。
【０２０７】
実施例４
インスリン−疑似剤は脊椎融合（Ｓｐｉｎａｌ  Ｆｕｓｉｏｎ）を増進すること
コントロールに比べて、増加した融合速度は、持続放出型のインスリンインプラントで処理したとき、ラットの後側部の腰部脊椎融合モデル中で観察された。インスリン−疑似剤の効果は、ラットの後外側腰椎融合モデルにおける脊椎融合術の補助として分析された。バナジルアセチルアセトナート（ＶＡＣ）又は亜鉛を、硫酸カルシウムでペレット化し、ラット後外側腰椎融合において、自家移植片付の融合床に適用した。これらの結果は、自家移植片およびパルミチン酸ペレットで処理したコントロール群と比較した。
【０２０８】
研究デザイン
プロトコルは、ＵＭＤＮＪ−ニュージャージー医科大学の動物施設ケア使用委員会によって承認された。重さ約５００グラム毎の５０匹骨格的に成熟したＳＤラットは、ウィルツ型（Ｗｉｌｔｓｅ−ｔｙｐｅ）のアプローチを利用して、Ｌ４−Ｌ５からの腸骨稜自家移植片と共に後外側横突間の腰椎融合を受けた。横突起および高速バリ剥皮の曝露後、低用量バナジウム硫酸カルシウムペレット（０．７５ｍｇ／ｋｇ）、高用量バナジウム硫酸カルシウムペレット（１．５ｍｇ／ｋｇ）、低用量亜鉛硫酸カルシウムペレット（０．５ｍｇ／ｋｇ）、高用量亜鉛硫酸カルシウムペレット（１．０ｍｇ／ｋｇ）、およびマイクロ再結晶パルミチン酸ペレットのコントロールの５つのペレットの中のいずれかを融合サイトに加えた。腸骨稜の自家移植（片側約０．３グラム）を同量を採取し、各ペレットを移植した。ラットは８週間で屠殺し、脊椎を採取し、軟組織を除去し、マニュアル触診、レントゲン写真およびマイクロＣＴにより試験した。すべての評価項目のパラメータは、盲検で二人の別々の個人によって独立して審査され、不一致があった時により低いグレードの融合を採用した。
【０２０９】
外科手技
腹腔内のケタミン（４０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）で全身麻酔を得た後、ラットの腰部を剃毛し、ポビドンヨード浸したガーゼで消毒した。背側正中切開は、Ｌ３から仙骨までで行った。二つの正中切開を正中線から腰部筋膜５ｍｍを介して実施した。解剖は、腸骨稜まで行い、約０．３グラムの骨は、小さな骨鉗子を用いて採取した。採取された自家移植片は、片面あたり０．３グラムを得るために、無菌のスケールで秤量した。鈍的切開は、各側の面関節に側面の背髄近傍の筋肉を反映して、後外側方に実施した。反射した傍脊柱筋は開創器で固定された。Ｌ４−Ｌ５の横突起は、軟組織を除去し、高速バリで剥皮した（図１４）。破砕された自家移植は、適切なレベル（Ｌ４−Ｌ５）で横突起の間で広げた。インプラント、またはブランクの当量は、自家移植床に組み込んだ（図１５）。開創器を除去し、傍脊柱筋を融合床を覆うようにさせた。背側腰筋膜を連続の４〜０再吸収可能な縫合糸を用いて閉じ、そして皮膚を結節の４〜０再吸収可能な縫合糸を用いて閉じた。手術部位を抗生物質軟膏で処理し、ラットにエンロフロキサシンの抗生物質（１０ｍｇ／ｋｇ）の用量を与えた。レントゲン写真は、手術直後に撮影した。血中グルコースレベルは、手術前、並びに手術後１２および２４時間で採取した。表１８参照。
【０２１０】
【表１８】
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【０２１１】
ペレットの準備
ペレットを準備するために、１ｍＬのシリンジ内に０．２ｍＬの各貯蔵液０．４ｇのＣａＳＯ４と混合し、担体の適切な整合性を得る。その後、直径２ｍｍの透明なＴｙｇｏｎ実験室用チュービングに注入し、一晩硬化させる。
【０２１２】
一度、ペレットは、移植前に、7ｍｍの部分に区分され、オートクレーブされる（滅菌するため）。
【０２１３】
【表１８−１】
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【０２１４】
貯蔵液を準備するために、各ペレット中の溶液の体積は、混合物に対する溶液の体積の割合で算出される。
【０２１５】
【表１８−２】
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【０２１６】
【表１８−３】
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【０２１７】
レントゲン写真分析
９０秒間３５ｋＶでの後前方向（Ｐｏｓｔｅｒｏａｎｔｅｒｉｏｒ）のレントゲン写真は、屠殺および採取後８週目で撮った。レントゲン試験前に全ての軟組織を除去した。二人の独立した盲検観察者は、従来公表された放射線のスケールに基づき、両側での固体融合塊（ｆｕｓｉｏｎ  ｍａｓｓ）（Ａ）、片側だけの融合塊（Ｂ）、両側での小さい融合塊（Ｃ）、および移植片吸収（Ｄ）で、レントゲン写真を等級付けた。表１９参照。
【０２１８】
【表１９】
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【０２１９】
レントゲン写真（図１６）に基づき、高用量のバナジウム群において、５／１０は両側での固体融合塊を有し、３／１０は片側だけの融合塊を有し、１／１０は両側での小さい融合塊を有し、および１／１０は移植片吸収を有していた。低用量のバナジウム群において、３／１０は両側での固体融合塊を有し、３／１０は片側だけの融合塊を有し、０／１０は両側での小さい融合塊を有し、および４／１０は移植片吸収を有していた。高用量の亜鉛群において、７／１０は両側での固体融合塊を有し、３／１０は片側だけの融合塊を有し、０／１０は両側での小さい融合塊を有し、および０／１０は移植片吸収を有していた。低用量の亜鉛群において、７／１０は両側での固体融合塊を有し、１／１０は片側だけの融合塊を有し、２／１０は両側での小さい融合塊を有し、および０／１０は移植片吸収を有していた。コントロール群において、２／９は両側での固体融合塊を有し、３／９は片側だけの融合塊を有し、１は両側での小さい融合塊を有し、および３／９は移植片吸収を有していた。
【０２２０】
マニュアル触診
すべての軟組織を除去した後、二人の独立した盲検観察者は、マニュアル触診を行い、融合部位（Ｌ４−Ｌ５）を強調した。融合した（Ａ）、部分的に融合した（Ｂ）、および融合しなかった（Ｃ）で試料を分級した。表２０参照。
【０２２１】
【表２０】
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【０２２２】
マニュアル触診に基づき、高用量のバナジウム群において、６／１０は固体融合を有し、２／１０は部分的に融合され、および２／１０は融合されなかった。低用量のバナジウム群において、１／１０は固体融合を有し、４／１０は部分的に融合され、および５／１０は融合されなかった。高用量の亜鉛群において、４／１０は固体融合を有し、１／１０は部分的に融合され、および５／１０は融合されなかった。低用量の亜鉛群において、３／１０は固体融合を有し、４／１０は部分的に融合され、および３／１０は融合されなかった。コントロール群において、０／９は固体融合を有し、１／９は部分的に融合され、および８／９は融合されなかった。
【０２２３】
マイクロＣＴ分析
【０２２４】
【表２１】
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【０２２５】
マイクロＣＴ分析に基づき、Ｌ４／Ｌ４横突起および融合塊の平均骨体積（ｍｅａｎ  ｂｏｎｅ  ｖｏｌｕｍｅ）は、コントロールにおいて１２６．７ｍｍ３であった。高用量バナジウム群において１７０．８ｍｍ３であり、低用量バナジウム群において１６７．４ｍｍ３であった。高用量亜鉛群において１７２．７ｍｍ３であり、低用量亜鉛群において１７２．９ｍｍ３であった。コントロールに対する各実験群間の差は、有意であった（表２１を参照）。
【０２２６】
統計分析
マンホイットニーランクテスト（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｒａｎｋ  Ｔｅｓｔ）は、レントゲン写真およびマニュアル触診の分析のために実施した。カッパ（Ｋａｐｐａ）値は、評価者間の合意のために計算した。ＡＮＯＶＡはＨｏｌｍ  Ｓｉｄａｋ試験を用いて二次試験でマイクロＣＴに従って、新しい骨形成のａｔｍを行った。統計分析は、ＳｉｇｍａＳｔａｔを用いて行った。
【０２２７】
５０匹の動物の内、１匹のコントロールラットは、おそらく麻酔の原因で、術後初日に死亡した。残りの４９匹のラットには合併症がなく、計画通りに屠殺した（０．０２％の周術期死亡率）。
【０２２８】
前記実施例および好ましい実施形態の説明は詳細な説明であり、本発明を限定するものでなく、本発明は特許請求の範囲によって規定されると受け止められるべきである。容易に認識されるように、上記の態様の多くの変更および組み合わせが、特許請求の範囲に記載される本発明から逸脱しない限り利用できる。このような変更は本発明の範囲および概念から逸脱しないものとみなされ、すべてのこのような変更は下記特許請求の範囲の範囲に含まれると解される。引用されるすべての参考文献は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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