(57)【要約】植物成長および収量を増加させるための組成物および方法を提供する。組成物は高収量遺伝子ＴＥＬ、プロモーター、および目的の植物におけるＴＥＬ遺伝子の発現を増加させるエンハンサーを含む。植物における少なくとも１つのＴＥＬ遺伝子の発現を増大させることにより、植物成長および収量は向上が達成され、こうした植物を栽培する畑における作物収量は増加する。目的の植物は、ＴＥＬ遺伝子のコード配列と操作可能に連結した植物における発現を駆動することができるプロモーターを含む、ＤＮＡ構築物で形質転換することができる。ＤＮＡ構築物は、ＴＥＬコード配列の発現を増加させるように作用する少なくとも１つのエンハンサーを含むことができる。プロモーターまたはエンハンサーは、目的の植物のゲノム中、植物における内因性ＴＥＬコード配列の発現を増加させる部位に挿入することができる。
2015500651.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の植物における植物成長および／または収量の増加方法であって、前記方法がＴＥＬ配列と操作可能に連結した植物における発現を駆動するプロモーターを含むＤＮＡ構築物で前記植物を形質転換するステップを含み、前記ＴＥＬ配列が以下の特性の少なくとも１つを有するアミノ酸配列を含むタンパク質をエンコードする、方法：
ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４と少なくとも５８％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列；
ｉｉ）４つの残基Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅの少なくとも３つが前記植物に保存されるＴＥＬ  ＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ３）を有するアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列；
ｉｉｉ）ＲＲＭ３ドメインのＣ末端外にＴＥＬ特異的保存モチーフを含むアミノ酸配列を有し、以下のペプチド中の１０個の残基の少なくとも７個が保存される、前記アミノ酸配列：
Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ／Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ／Ｇｌｕ−Ｎ−Ａｓｐ／Ｇｌｕ−Ｎ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ／Ｖａｌ（Ｎはいずれかの残基を表す）；および
ｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも５８％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列。
【請求項２】
前記ＤＮＡ構築物が、前記プロモーターおよびＴＥＬ配列と操作可能に連結した植物における遺伝子の発現を増大させる少なくとも１つのエンハンサーをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つのエンハンサーが、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）からの３５Ｓエンハンサーである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＴＥＬ配列が、合成配列である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記プロモーターが、ＴＥＬプロモーターである、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＴＥＬ配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４と少なくとも５８％の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をエンコードし、少なくとも１つのＴＥＬモチーフを含む、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
目的の植物における植物成長および／または収量の増加方法であって、前記方法が、前記少なくとも１つのエンハンサーのゲノムをＴＥＬ遺伝子の約３０ｋｂ以内に組み入れるステップを含む方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つのエンハンサーが、ＣａＭＶからの３５Ｓエンハンサーである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
対照植物と比較して増加したＴＥＬ配列の発現を示す形質転換植物であって、前記植物がそのゲノム中にＴＥＬ配列と操作可能に連結した植物における発現を駆動するプロモーターを含むＤＮＡ構築物を安定に組み入れ、前記ＴＥＬ配列が以下の特性の少なくとも１つを有するアミノ酸配列を含むタンパク質をエンコードする、形質転換植物：
ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４と少なくとも５８％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列；
ｉｉ）４つの残基Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅの少なくとも３つが前記植物に保存されるＴＥＬ  ＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ３）を有するアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列；
ｉｉｉ）ＲＲＭ３ドメインのＣ末端外にＴＥＬ特異的保存モチーフを含むアミノ酸配列を有し、以下のペプチド中の１０個の残基の少なくとも７個が保存される、前記アミノ酸配列：
Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ／Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ／Ｇｌｕ−Ｎ−Ａｓｐ／Ｇｌｕ−Ｎ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ／Ｖａｌ（Ｎはいずれかの残基を表す）；および
ｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも５８％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列。
【請求項１０】
前記ＤＮＡ構築物が、前記ＴＥＬ配列と操作可能に連結した植物における遺伝子の発現を増大させる少なくとも１つのエンハンサーをさらに含む、請求項９に記載の形質転換植物。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのエンハンサーが、ＣａＭＶからの３５Ｓエンハンサーである、請求項１０に記載の形質転換植物。
【請求項１２】
前記ＴＥＬ配列が、合成配列である、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の形質転換植物。
【請求項１３】
前記プロモーターが、ＴＥＬプロモーターである、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の形質転換植物。
【請求項１４】
前記ＴＥＬプロモーターが、前記ＴＥＬ配列と相同である、請求項１３に記載の形質転換植物。
【請求項１５】
前記ＴＥＬ配列が、内因性配列である、請求項１４に記載の形質転換植物。
【請求項１６】
対照植物と比較して増加したＴＥＬ配列の発現を示す形質転換植物であって、前記植物が、そのゲノム中に少なくとも１つのエンハンサーを前記ＴＥＬ遺伝子の約３０ｋｂ以内で組み入れられた、形質転換植物。
【請求項１７】
前記少なくとも１つのエンハンサーが、ＣａＭＶからの３５Ｓエンハンサーである、請求項１６に記載の形質転換植物。
【請求項１８】
請求項９〜１７のいずれか１項に記載の植物からの形質転換種子。
【請求項１９】
前記植物が、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、アブラナ科植物、ワタ、イネ、ダイズ、オオムギ、ヒマワリ、サトウキビ、針葉樹、ススキ、スイッチグラス、およびナタネからなる群から選択される、請求項９〜１７のいずれか１項に記載の形質転換植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は分子生物学の分野に関する。植物成長および収量の増大方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
世界人口の増加により作物収量の向上は農業の重要な目標となった。作物および園芸改良の従来の手段は、望ましい特性を有する株を識別する選抜育種技術を用いる。しかしながら、こうした選抜育種技術はいくつかの欠点を有する。すなわち、これらの技術は一般的には労働集約的であり、植物は親株から受け継がれている望ましい形質を常にもたらすとは限らない異種の遺伝成分をしばしば含むことがある。収量は何十年間も多遺伝子性形質であると考えられている。伝統的な植物育種のいくらかの進歩により収量は向上した。こうした方法は、近縁または遠縁の個体を交配させ、所望の特性を有する新規作物品種または株を作製することを含む。植物バイオテクノロジーは、病気および害虫に強い植物を開発することにより、作物収量を向上させるのに役立っている。加えて、トランスジェニック除草剤耐性植物が作物の収量を増加させるのに役立っている。
【０００３】
多くの植物の栽培化は収量の劇的な増加と相関してきた。自然集団において起こるほとんどの表現型変異は連続的であり、同義遺伝子の影響により引き起こされる。栽培化植物における収量に劇的な差をもたらす特定の遺伝子の同定は、農業研究の重要な焦点となった。多くの植物の種子は人間および動物の栄養にとって重要であるので、種子収量はとくに重要な形質である。トウモロコシ、コメ、コムギ、キャノーラおよびダイズのような作物は、種子自体の直接消費によって、または加工された種子で育てられた肉製品の消費によって人間のカロリー摂取量合計の半分を超える量を占める。それらは糖、油および産業プロセスに用いられる多くの種類の代謝産物の供給源でもある。種子は胚（新梢および根の供給源）および胚乳（発芽中および幼苗の初期成長中の胚成長のための栄養の供給源）を含む。種子の発育には多くの遺伝子が関わり、根、葉および幹からの代謝産物の成長中の種子への輸送を要する。胚乳は、とくに、炭水化物、油およびタンパク質の代謝前駆体を吸収し、それらを貯蔵高分子に合成し、穀実を太らせる。植物収量を増加させる能力は、観賞植物の生産を含む農業、樹芸、園芸および林業のような分野において多くの用途を有するだろう。収量の増加は、（医薬品、抗体もしくはワクチンのような物質のバイオテクノロジーを用いた製造のための、または有機廃棄物の生物変換のための）バイオリアクターに用いられる藻類の生産、および他のこうした分野において用いることもできる。
【０００４】
Ｍｅｉ２はシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）の減数分裂を促進するのに重要な遺伝子である。植物におけるＭｅｉ２様遺伝子の存在は最初にアラビドプシスＭｅｉ２様１（ＡＭＬ１）の同定および特性解明により明らかとなった。ＡＭＬ１は葉、根、花、および長角果を含む多数の組織において発現する。Ｍｅｉ２様遺伝子はトウモロコシから単離され、ＴＥＲＭＩＮＡＬ  ＥＡＲ１（ＴＥ１）遺伝子と称された。特性解明の際、トウモロコシ遺伝子は葉間期および分裂組織での葉の分化において葉の分化部位の数および位置を下方調節することにより示された。研究は、Ｍｅｉ２様遺伝子が多種多様な群からなる植物において広く存在していることを明らかにした。Ｍｅｉ２は３つのＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）を含有するタンパク質であり、ＲＮＡに結合することができる。Ｍｅｉ２のホモログも植物において同定された。
【０００５】
作物の収量の増加は農業にとって非常に重要である。収量が向上した品種の開発は、各種作物の品種開発のもっとも重要な目標の１つである。伝統的な育種の進歩により作物収量は向上したが、各種作物の収量をさらに向上させる新規の作物収量の向上方法は依然として大いに望まれている。従って、収量の増加方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
植物成長および収量を増加させるための組成物および方法を提供する。組成物は高収量遺伝子（Ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅａｒ１様（ＴＥＬ）遺伝子）、プロモーター、および目的の植物におけるＴＥＬ遺伝子の発現を増加させるエンハンサーを含む。本発明は、植物における少なくとも１つのＴＥＬ遺伝子の発現を増大させることにより、植物成長および収量は向上し、こうした植物を栽培する畑における作物収量は増加することを認識する。植物におけるＴＥＬ遺伝子の発現を増加させるためのいずれの方法も本発明に含まれる。目的の植物は、ＴＥＬ遺伝子のコード配列と操作可能に連結した植物における発現を駆動することができるプロモーターを含む、ＤＮＡ構築物で形質転換することができる。任意で、ＤＮＡ構築物は、ＴＥＬコード配列の発現を増加させるように作用する少なくとも１つのエンハンサーを含むことができる。別の実施形態では、プロモーターまたはエンハンサーは、目的の植物のゲノム中、植物における内因性ＴＥＬコード配列の発現を増加させる部位に挿入することができる。
【０００７】
本発明の組成物は、ＴＥＬポリペプチドの配列、プロモーターの配列、および／またはエンハンサーの配列をエンコードする核酸分子、それらの核酸分子を含むベクター、ならびにベクターを含む宿主細胞を含む。組成物はＴＥＬポリペプチド配列およびそれらのポリペプチドに対する抗体も含む。ヌクレオチド配列は、目的の植物における形質転換および発現のため、ＤＮＡ構築物または発現カセットに用いることができる。ヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、特定の植物における発現のために設計された合成配列であってもよい。組成物は形質転換植物、植物細胞、組織、および種子も含む。
【０００８】
よって、本発明は一般的には分子生物学の分野に関し、対照植物と比較して植物収量を増加させるための方法に関する。より具体的には、本発明は、ＴＥＬ遺伝子またはそのホモログをエンコードする核酸の植物における発現を調節するステップを含む、植物収量の増加方法に関する。本発明はまた、ＴＥＬ遺伝子、またはそのホモログをエンコードする核酸の発現を増加させた植物に関し、その植物は対照植物と比較して増加した収量を有する。本発明は、本発明の方法において有用な構築物も提供する。
【０００９】
とくに、目的の植物におけるＴＥＬコード配列の発現を増大させるための方法を提供する。こうした発現の増大は植物の成長の増加、種子生産の増加、および収量の増加をもたらす。試料中のＴＥＬ核酸およびポリペプチドを検出するための方法およびキットも含まれる。
【００１０】
本発明は以下の実施形態を含む：
【００１１】
１．目的の植物における植物成長および／または収量の増加方法であって、前記方法が前記植物におけるＴＥＬ配列の発現を増加させるステップを含む、方法。
【００１２】
２．前記方法が、ＴＥＬヌクレオチド配列と操作可能に連結した植物における発現を駆動するプロモーターを含むＤＮＡ構築物で前記植物を形質転換するステップにおいて、前記ＴＥＬ配列が以下の特性の少なくとも１つを有するアミノ酸を含むタンパク質をエンコードする、ステップを含む、実施形態１の方法：
ｉ）前記アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４と少なくとも５８％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む；
ｉｉ）前記アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４と少なくとも７０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む；
ｉｉｉ）前記アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４と少なくとも８０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む；
ｉｖ）前記アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４と少なくとも９０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む；
ｖ）前記アミノ酸配列は４つの残基Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅの少なくとも３つが前記植物に保存されるＴＥＬ  ＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ３）を有するアミノ酸配列を含む；
ｖｉ）前記アミノ酸配列はＲＲＭ３ドメインのＣ末端外にＴＥＬ特異的保存モチーフを有し、以下のペプチド中の１０個の残基の少なくとも７個が保存されるアミノ酸配列を含む：
Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ／Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ／Ｇｌｕ−Ｎ−Ａｓｐ／Ｇｌｕ−Ｎ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ／Ｖａｌ（Ｎはいずれかの残基を表す）； 
ｖｉｉ）前記アミノ酸配列はイネＴＥＬタンパク質と少なくとも約６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む；
ｖｉｉｉ）前記アミノ酸配列はイネＴＥＬタンパク質と少なくとも約７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む；および
ｉｘ）前記アミノ酸配列はイネＴＥＬタンパク質と少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１３】
３．前記ＤＮＡ構築物が前記プロモーターと操作可能に連結した植物における遺伝子の発現を増大させる少なくとも１つのエンハンサーおよびＴＥＬ配列をさらに含む、実施形態２の方法。
【００１４】
４．前記少なくとも１つのエンハンサーがカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）からの３５Ｓエンハンサーである、実施形態３の方法。
【００１５】
５．前記ＴＥＬ配列が合成配列である、実施形態１〜４いずれか１つの方法。
【００１６】
６．前記プロモーターがＴＥＬプロモーターである、実施形態２〜５のいずれか１つの方法。
【００１７】
７．前記ＴＥＬ配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４と少なくとも５８％の同一性を有し、少なくとも１つのＴＥＬモチーフを含む、実施形態２〜６のいずれか１つの方法。
【００１８】
８．ＴＥＬ配列の発現が少なくとも２倍〜少なくとも５０倍増加される、実施形態１〜７のいずれか１つの方法。
【００１９】
９．ＤＮＡ構築物であって、前記構築物がＴＥＬヌクレオチド配列と操作可能に連結し、さらに植物における発現を増大させる少なくとも１つのエンハンサーと操作可能に連結した植物における発現を駆動するプロモーターを含む、ＤＮＡ構築物を含む発現カセットにおいて、前記ＴＥＬ配列が以下の特性の少なくとも１つを有するアミノ酸を含むタンパク質をエンコードする、発現カセット：
ｉ）前記アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４と少なくとも５８％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む；
ｉｉ）前記アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４と少なくとも７０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む；
ｉｉｉ）前記アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４と少なくとも８０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む；
ｉｖ）前記アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４と少なくとも９０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む；
ｖ）前記アミノ酸配列は４つの残基Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅの少なくとも３つが前記植物に保存されるＴＥＬ  ＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ３）を有するアミノ酸配列を含む；
ｖｉ）前記アミノ酸配列はＲＲＭ３ドメインのＣ末端外にＴＥＬ特異的保存モチーフを有し、以下のペプチド中の１０個の残基の少なくとも７個が保存されるアミノ酸配列を含む：
Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ／Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ／Ｇｌｕ−Ｎ−Ａｓｐ／Ｇｌｕ−Ｎ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ／Ｖａｌ（Ｎはいずれかの残基を表す）；
ｖｉｉ）前記アミノ酸配列はイネＴＥＬタンパク質と少なくとも約６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む；
ｖｉｉｉ）前記アミノ酸配列はイネＴＥＬタンパク質と少なくとも約７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む；および
ｉｘ）前記アミノ酸配列はイネＴＥＬタンパク質と少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２０】
１０．前記エンハンサーがＣａＭＶからの３５Ｓエンハンサーである、実施形態９の発現カセット。
【００２１】
１１．前記ＴＥＬ配列が合成配列である、実施形態９〜１０いずれか１つの発現カセット。
【００２２】
１２．前記プロモーターがＴＥＬプロモーターである、実施形態９〜１１のいずれか１つの発現カセット。
【００２３】
１３．実施形態９〜１２のいずれか１つの発現カセットで形質転換された植物。
【００２４】
１４．実施形態１３の植物の形質転換種子。
【００２５】
１５．前記ＴＥＬ配列が内因性配列である、実施形態１の方法。
【００２６】
１６．前記目的の植物がそのゲノム中に前記ＴＥＬ遺伝子の約３０ｋｂ以内で組み入れられた少なくとも１つのエンハンサーを有する、実施形態１５の方法。
【００２７】
１７．前記少なくとも１つのエンハンサーがＣａＭＶからの３５Ｓエンハンサーである、実施形態１６の方法。
【００２８】
１８．ＴＥＬ配列の発現が少なくとも２倍〜少なくとも５０倍増大される、実施形態１５〜１７のいずれか１つの方法。
【００２９】
１９．対照植物と比較して増加したＴＥＬ配列の発現を示す形質転換植物。
【００３０】
２０．前記植物がそのゲノム中にＴＥＬヌクレオチド配列と操作可能に連結した植物における発現を駆動するプロモーターを含むＤＮＡ構築物を安定に組み入れた、実施形態１９の形質転換植物において、前記ＴＥＬ配列が以下の特性の少なくとも１つを有するアミノ酸配列を含むタンパク質をエンコードする、形質転換植物：
ｉ）前記アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４と少なくとも５８％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む；
ｉｉ）前記アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４と少なくとも７０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む；
ｉｉｉ）前記アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４と少なくとも８０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む；
ｉｖ）前記アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４と少なくとも９０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む；
ｖ）前記アミノ酸配列は４つの残基Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅの少なくとも３つが前記植物に保存されるＴＥＬ  ＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ３）を有するアミノ酸配列を含む；
ｖｉ）前記アミノ酸配列はＲＲＭ３ドメインのＣ末端外にＴＥＬ特異的保存モチーフを有し、以下のペプチド中の１０個の残基の少なくとも７個が保存されるアミノ酸配列を含む：
Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ／Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ／Ｇｌｕ−Ｎ−Ａｓｐ／Ｇｌｕ−Ｎ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ／Ｖａｌ（Ｎはいずれかの残基を表す）；
ｖｉｉ）前記アミノ酸配列はイネＴＥＬタンパク質と少なくとも約６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む；
ｖｉｉｉ）前記アミノ酸配列はイネＴＥＬタンパク質と少なくとも約７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む；および
ｉｘ）前記アミノ酸配列はイネＴＥＬタンパク質と少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００３１】
２１．前記ＤＮＡ構築物が前記ＴＥＬ配列と操作可能に連結した植物における遺伝子の発現を増大させる少なくとも１つのエンハンサーをさらに含む、実施形態２０の形質転換植物。
【００３２】
２２．前記少なくとも１つのエンハンサーがＣａＭＶからの３５Ｓエンハンサーである、実施形態２１の形質転換植物。
【００３３】
２３．前記ＴＥＬ配列が合成配列である、実施形態２０〜２２のいずれか１つの形質転換植物。
【００３４】
２４．前記プロモーターがＴＥＬプロモーターである、実施形態２０〜２３のいずれか１つの形質転換植物。
【００３５】
２５．前記ＴＥＬプロモーターが前記ＴＥＬ配列と同種である、実施形態２４の形質転換植物。
【００３６】
２６．ＴＥＬ配列の発現が少なくとも２倍〜少なくとも５０倍増加される、実施形態１９〜２５のいずれか１つの形質転換植物。
【００３７】
２７．前記ＴＥＬ配列が内因性配列である、実施形態１９の形質転換植物。
【００３８】
２８．前記目的の植物がそのゲノム中に前記ＴＥＬ遺伝子の約３０ｋｂ以内で組み入れられた少なくとも１つのエンハンサーを有する、実施形態２７の形質転換植物。
【００３９】
２９．前記少なくとも１つのエンハンサーがＣａＭＶからの３５Ｓエンハンサーである、実施形態２８の形質転換植物。
【００４０】
３０．ＴＥＬ配列の発現が少なくとも２倍〜少なくとも５０倍増加される、実施形態２７〜２９のいずれか１つの形質転換植物。
【００４１】
３１．実施形態１９〜３０のいずれか１つの植物からの形質転換種子。
【００４２】
３２．前記植物がトウモロコシ、モロコシ、コムギ、アブラナ科植物、ワタ、イネ、ダイズ、オオムギ、ヒマワリ、サトウキビ、針葉樹、ススキ、スイッチグラス、およびナタネからなる群から選択される、実施形態１９〜３０のいずれか１つの形質転換植物。
【００４３】
３３．前記植物が単子葉植物である、実施形態１３、１４、および２０〜３２のいずれか１つの植物。
【００４４】
３４．前記植物が双子葉植物である、実施形態１３、１４、および２０〜３２のいずれかの１つの植物。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】植物Ｍｅｉ２様タンパク質の系統樹である。配列アラインメントおよび系統樹構築をＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩよりもたらされるプログラムを用いて行った。単細胞緑藻オストレオコッカス・タウリ（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｔａｕｒｉ）からのＭｅｉ２様タンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）をルート配列として用いた。ＡｔＭＬ−２およびＡｔＭＬ−４はシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）からのＡＭＬタンパク質である；ＧｍＭＬ−２、ＧｍＭＬ−４、ＧｍＭＬ−５、ＧｍＭＬ−６、およびＧｍＭＬ−７はダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）からのＡＭＣタンパク質である；ＯｓＭＬ−２、ＯｓＭＬ−３およびＯｓＭＬ−５（ＧｅｎＰｅｐｔ  ＡＰ００５６５１．３）はイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）からのＡＭＬタンパク質である；フィスコミトレラＴＥ１およびフィスコミトレラＴＥ２はヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）からのＴＥＬタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）である；グリシンＴＥ１およびグリシンＴＥ２はダイズからの２つのＴＥＬタンパク質（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）である；リシナスＴＥはトウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）からのＴＥＬタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）である；ポプルスＴＥ１はヒロハハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）からのＴＥＬタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）である；ポプルスＴＥ２はポプルス・カネスケンス（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｃａｎｅｓｃｅｎｓ）からのＴＥＬタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）である；ブラッシカＴＥ１はブラッシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ）からのＴＥＬ遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）である；アラビドプシスＴＥ１およびアラビドプシスＴＥ２はシロイヌナズナからの２つのＴＥＬタンパク質（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）である；セラギネラＴＥ１およびセラギネラＴＥ２はイヌカタヒバ（Ｓｅｌａｇｉｎｅｌｌａ  ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉ）からのＴＥＬタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）である；ソルガムＴＥはモロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌａｒ）からのＴＥＬ（ＥＥＳ０１９３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）である；ゼアＴＥはトウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）からのＴＥＬタンパク質（ＡＦ０４７８５２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）である；オリザＴＥはイネからのＴＥＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）である；ヴィティスＴＥ１はヨーロッパブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）からのＴＥＬタンパク質（ＸＰ００２２７１３８６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）である；ブラキポディウムＴＥはブラキポディウム（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ）からのＴＥＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）である；トリチカムＴＥはコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．）からのＴＥＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）である；ゴッシピウムＴＥはアプランドワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）からのＴＥＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）である。
【図２】植物Ｍｅｉ−２様タンパク質の保存モチーフのアラインメントである。ＯｓＴＥ：イネからのＴＥＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）；ＧｍＴＥＬ１：ダイズからのＴＥＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）；ＧｍＴＥＬ２：ダイズからのＴＥＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）；ＡｔＴＥＬ１：シロイヌナズナからのＴＥＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）；ＡｔＴＥＬ２：シロイヌナズナからのＴＥＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）；ＰｔａＴＥＬ１：ヨーロッパヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌａ）×ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）からのＴＥＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）；ＰｔａＴＥＬ２：ヨーロッパヤマナラシ×ウラジロハコヤナギからのＴＥＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）；ＶｖＴＥＬ１：ヨーロッパブドウからのＴＥＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）；ＶｖＴＥＬ２：ヨーロッパブドウからのＴＥＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）；ＺｍＴＥＬ：トウモロコシからのＴＥＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）；ＳｂＴＥＬ：モロコシからのＴＥＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）；ＳｍＴＥＬ：イヌカタヒバからのＴＥＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）；ＲｃＴＥ：トウゴマからのＴＥＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）；ＯｔＭｅｉ２Ｌ：オストレオコッカス・タウリからのＭｅｉ２様遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）； ＡｌＴＥＬ１：セイヨウミヤマハタザオ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｌｙｒａｔａ）からのＴＥＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）；ＢｒＴＥＬ：ブラッシカ・ラパからのＴＥＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）；ＧｈＴＥＬ１：アプランドワタからのＴＥＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）。
【図３】イベントＨＡＳ−２０のＴ−ＤＮＡ挿入周辺のゲノム構造の図である。Ｔ−ＤＮＡ挿入はＯｓＴＥＬ遺伝子の約５ｋｂ下流に位置する。
【図４】植物形質転換に用いられるＴ−ＤＮＡの図である。天然ＯｓＴＥＬ遺伝子発現カセットはプロモーター（ｐＯｓＴＥＬ）、タンパク質コード配列およびターミネーター（ＯｓＴＥＬ−ｔｅｒ）を含み、その全ポリヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１として示される。具体的には、ｐ３５ＳはＣａＭＶの３５Ｓプロモーターを表し；ｐＵｂｉはトウモロコシユビキチンプロモーターを表し；ＥＰＳＰＳ−ｔｅｒは除草剤耐性遺伝子Ｇ１０ｅｖｏ（ＥＰＳＰＳ）およびそのターミネーターを表す。（Ａ）：ｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０−ＯｓＴＥＬ；（Ｂ）：ｐＣａｍｂｉａ１３００−Ｇ１０−ＯｓＴＥＬ；（Ｃ）：ｐＣａｍｂｉａ１３００−Ｇ１０−ｐ３５Ｓ−ＯｓＴＥＬ。ベクターｐＣａｍｂｉａ１３００−３５ｓ−Ｇ１０およびｐＣａｍｂｉａ１３００−Ｇ１０のポリヌクレオチド配列はそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９として示される。
【図５】トウモロコシ形質転換のためのベクターｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０−ＺｍＴＥＬのＴ−ＤＮＡの図である。トウモロコシＺｍＴＥＬ遺伝子はプロモーター（ｐＺｍＴＥＬ）、タンパク質コード配列およびターミネーター（ＺｍＴＥＬ−ｔｅｒ）を含み、その全ポリヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５として示される。
【図６】ワタ形質転換のためのＴ−ＤＮＡ構造の図である。Ａ：ｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０−ＧｈＴＥＬ１；Ｂ：ｐＣａｍｂｉａ１３００−Ｇ１０−ＧｈＴＥＬ２。ＧｈＴＥＬ１およびＧｈＴＥＬ２遺伝子はともにプロモーター（ｐＧｈＴＥＬ１およびｐＧｈＴＥＬ２）、タンパク質コード配列およびターミネーター（ＧｈＴＥＬ１−ｔｅｒおよびＧｈＴＥＬ２−ｔｅｒ）を含む。２つの発現カセットの全ポリヌクレオチド配列はそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９として示される。
【図７】キャノーラ形質転換のためのベクターｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０−ＡｔＴＥＬ１（Ａ）およびｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０−ＡｔＴＥＬ２（Ｂ）のＴ−ＤＮＡ構造の図である。シロイヌナズナＡｔＴＥＬ１およびＡｔＴＥＬ２遺伝子はともにプロモーター（ｐＡｔＴＥＬ１およびｐＡｔＴＥＬ２）、タンパク質コード配列およびターミネーター（ＡｔＴＥＬ１−ｔｅｒおよびＡｔＴＥＬ２−ｔｅｒ）を含み、それらの全ポリヌクレオチド配列はそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３として示される。
【図８】キャノーラ形質転換のためのベクターｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０−ＢｒＴＥＬのＴ−ＤＮＡ構造である。ＢｒＴＥＬ遺伝子はプロモーター（ｐＢｒＴＥＬ）、タンパク質コード配列およびターミネーター（ＢｒＴＥＬ−ｔｅｒ）を含み、その全ポリヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５として示される。
【図９】コムギ形質転換ベクターｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０−ＴａＴＥＬのＴ−ＤＮＡ構造である。コムギＴａＴＥＬ遺伝子はプロモーター（ｐＴａＴＥＬ）、タンパク質コード配列およびターミネーター（ＴａＴＥＬ−ｔｅｒ）を含み、その全ポリヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９として示される。
【図１０】ダイズ形質転換ベクターｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０−ＧｍＴＥＬ１（Ａ）およびｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０−ＧｍＴＥＬ２（Ｂ）のＴ−ＤＮＡ構造である。ダイズＧｍＴＥＬ１およびＧｍＴＥＬ２遺伝子はともにプロモーター（ｐＧｍＴＥＬ１およびｐＧｍＴＥＬ２）、タンパク質コード配列およびターミネーター（ＧｍＴＥＬ１−ｔｅｒおよびＧｍＴＥＬ２−ｔｅｒ）を含み、それらの全ポリヌクレオチド配列はそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５として示される。
【図１１】ＯｓＴＥＬ−１遺伝子での形質転換イネ（Ｔ）および非形質転換親株「Ｘｉｕｓｈｕｉ１３４」（ＣＫ）の表現型の比較である。対照植物（ＣＫ）と比較して、形質転換株（Ｔ）は顕著な草丈の増加（Ａ参照）、ならびに種子の増大（Ｂ参照）および穂の増大（Ｃ参照）を示した。
【図１２】実施例５におけるＺｍＴＥＬ遺伝子での形質転換トウモロコシ（Ｔ）および非形質転換親株の表現型の比較である。対照植物（ＣＫ）と比較して、形質転換株（Ｔ）は顕著な草丈の増加（Ｂ参照）、ならびに種子および穂軸の増大（Ａ参照）を示した。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明は、植物または植物細胞におけるＴＥＬ遺伝子またはコード配列の発現を増加させるための方法に関する。植物におけるＴＥＬ配列の発現を増加または増大させることにより、植物は植物成長およびひいては作物収量の向上を示す。「ＴＥＬ配列」とは、以下の特性の少なくとも１つを有する核酸分子を指す：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４と少なくとも５８％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含むタンパク質をエンコードする；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４と少なくとも７０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含むタンパク質をエンコードする; ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４と少なくとも８０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含むタンパク質をエンコードする；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４と少なくとも９０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含むタンパク質をエンコードする；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４を含むアミノ酸配列を含むタンパク質をエンコードする；４つの残基Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅの少なくとも３つが植物に保存されるＴＥＬ  ＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ３）を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をエンコードする；ＲＲＭ３ドメインのＣ末端外にＴＥＬ特異的保存モチーフを有し、以下のペプチド中の１０個の残基の少なくとも７個が保存されるアミノ酸配列を含むタンパク質をエンコードする：
Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ／Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ／Ｇｌｕ−Ｎ−Ａｓｐ／Ｇｌｕ−Ｎ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ／Ｖａｌ（Ｎはいずれかの残基を表す）；イネＴＥＬタンパク質と少なくとも約６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をエンコードする；イネＴＥＬタンパク質と少なくとも約７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をエンコードする；およびイネＴＥＬタンパク質と少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をエンコードする。
【００４７】
すなわち、本発明のＴＥＬ配列は少なくともＲＲＭ３モチーフ、および全長ＴＥＬ配列まで、少なくとも約１５個の追加のアミノ酸、少なくとも約２０個の追加のアミノ酸、少なくとも約２５個の追加のアミノ酸、少なくとも約３０個の追加のアミノ酸、少なくとも約４０個の追加のアミノ酸、少なくとも約５０個の追加アミノ酸を含む。１つの実施形態では、ＴＥＬ配列はアミノ酸配列：
ｄｔｒｔｔｖｍｉｒｎｉｐｎｋｙｓｑｋｌｌｌｎｍｌｄｎｈｃｉｌｓｎｑｑｉｅａｓｃｅｄｅａｑｐｆｓｓｙｄｆｌｙｌｐｉｄｆｎｎｋｃｎｖｇｙｇｆｖｎｌｔｓｐｅａａｖｒｌｙｋａｆｈｋｑｐｗｅｖｆｎｓｒｋｉｃｑｖｔｙａｒｖｑｇｌｄａｌｋｅｈｆｋｎｓｋｆｐｃｄｓｄｅｙｌｐｖｖｆｓｐｐｒｄｇｋｌｌｔｅｐｖｐｌ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２
を含むアミノ酸配列をエンコードする。他の実施形態では、ＴＥＬ配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２と少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれより高い配列同一性を有するアミノ酸配列をエンコードする配列を含む。
【００４８】
Ｃ末端ＲＲＭ（ＲＲＭ３）はＭｅｉ２様タンパク質に特有であり、３つのＲＲＭのうちもっとも高度に保存される。ＲＲＭ３はまた、他のＲＲＭドメインでは見られない保存配列要素をそのＣ末端に含有する。Ｊｅｆｆａｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｄｅｖ  Ｇｅｎｅｓ  Ｅｖｏｌ．２１４（３）：１４９−５８を参照されたい。
【００４９】
ＴＥＬ配列の発現の増加は、収穫指数を低減することなく、植物成長、強度、活力、および収量を増加させる。形質転換植物は丈が高く、幹または茎が大きく、成長が早く、成長活力を示し、大きなバイオマスを生産し、増加した種子生産を有する。植物は大きく強い根を有する。本発明の形質転換植物を栽培すれば作物収量が増加するだろう。「作物収量」とは、土地面積の単位当たりに収穫される作物の量を指す。作物収量は穀物、または豆に用いられることが多い評価方法であり、通常ヘクタール当たりのメトリックトン（またはヘクタール当たりのキログラム）で測定される。作物収量は植物からの種子生産量も指す。「植物成長」とは、植物の大きさ、高さ、周径、強度、質量、種子生産数、等を指す。
【００５０】
本方法は目的の植物におけるＴＥＬ遺伝子の発現の増加または増大を含む。植物におけるＴＥＬ遺伝子の発現を増加させるためのいずれの方法も本発明に含まれる。目的の植物は、ＴＥＬ遺伝子またはその変異体もしくはトランケーション体のコード配列と操作可能に連結した植物における発現を駆動することができるプロモーターを含む、ＤＮＡ構築物で形質転換することができる。任意で、ＤＮＡ構築物は、コード配列の発現を増加させるように作用する、少なくとも１つの操作可能に連結したエンハンサーを含むことができる。別の実施形態では、プロモーターまたはエンハンサーは目的の植物のゲノム中、植物における天然ＴＥＬコード配列の発現を増加させる部位に挿入することができる。
【００５１】
植物におけるＴＥＬ配列の発現を増大または増加させることにより、植物成長、種子生産、および一般的な収量の増加が見られる。「ＴＥＬ遺伝子の発現の増大または増加」とは、目的の植物において、対照植物と比較して、ｍＲＮＡまたはＴＥＬタンパク質の産生により測定される発現が少なくとも約２倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍、約６０倍、約７０倍、約８０倍またはそれより大きく増加されることを指す。「対照植物」とは、ＴＥＬ配列の発現を変化もしくは増大させていない、または追加のＴＥＬ配列で形質転換していない植物、すなわち、当該植物または植物細胞と遺伝子的には同一であるが、ＴＥＬ遺伝子の発現を誘発する条件または刺激に曝露されていない植物または植物細胞を指す。すなわち、本発明の変異植物はＴＥＬｍＲＮＡ、ＴＥＬタンパク質、または両方の発現の増大を示す。
【００５２】
いずれの理論にも縛られないが、ＴＥＬタンパク質の極度の過剰産生は望ましくない表現型を有する植物をもたらし得ると考えられる。従って、形質転換植物におけるＴＥＬ配列の発現を駆動するのに用いられるプロモーターの選択により、発現を制御することができる。ＴＥＬプロモーターは所望のレベルでの組換え遺伝子の発現において良好な結果をもたらす。後述するように、強い構成的プロモーターを含む、いずれのプロモーターを用いてもよい。しかしながら、強いプロモーターが用いられる場合、得られる植物を所望の表現型に基づき選択することができる。よって、本発明の方法は形質転換植物の所望の表現型の選択を含む。こうした所望の植物は、成長および活力の増加、大きな幹および根による強度の増加、または穀実もしくはバイオマス収量の増加を示すだろう。所望の形質転換植物は表現型に基づき選択することができるが、こうした植物は少なくとも２倍〜６０倍のＴＥＬ発現の増加、少なくとも１０倍〜５０倍の発現の増加、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、または少なくとも４０倍の発現の増加を示すだろうと考えられる。
【００５３】
こうした所望の植物を栽培し、適切な植物と交配し、所望の表現型を有する種子を作製することができる。すなわち、少なくとも１つのエンハンサーの挿入によりその発現が増加された組換えＴＥＬ遺伝子または内因性ＴＥＬ遺伝子を目的の植物に導入することができる。こうした植物は増大した割合で成長し、作物を生産するだろう。
【００５４】
「ＴＥＬ遺伝子」または「ＴＥＬ配列」とは、ＴＥＬタンパク質またはＴＥＬタンパク質の変異体もしくはトランケーション体の全アミノ酸配列をエンコードする配列を指す。こうしたトランケーション体は上述したＲＲＭ３保存領域を含む。目的の植物を形質転換するのに用いられるＴＥＬ遺伝子はその植物と同種または異種であってもよい。多くのＴＥＬ遺伝子が当技術分野において知られているが、本発明の実施では、フラグメントおよび変異体が植物成長を促進し、収量を増加させる所望の活性を保持する限り、既知のＴＥＬ遺伝子のフラグメントおよび変異体を含む、いずれを用いることもできる。ＴＥＬ遺伝子は、酵母のＭｅｉ２とアミノ酸配列類似性を共有する植物および菌類からの遺伝子のグループである（Ｗａｔａｎａｂｅ  ａｎｄ  Ｙａｍａｍｏｔｏ  １９９４，Ｃｅｌｌ  ７８：４８７−４９８）。すべての植物は多数のＭｅｉ２様遺伝子を有し、それらの配列類似性に基づき２つのグループに分けることができる（Ｊｅｆｆａｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅｓ．Ｅｖｏｌ  ２１４：１４９−１５８）。１つは、もとはシロイヌナズナから同定されたＡＭＬタンパク質と類似する、ＡＭＬグループである（Ｈｉｒａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４１３：１６−２０）。
【００５５】
Ｍｅｉ２様遺伝子の２つめのグループは、トウモロコシからのＴｅｒｍｉｎａｌ  Ｅａｒ１（ＴＥ１）遺伝子と類似する、ＴＥＬグループである（Ｖｅｉｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：１６６−１６８）。植物Ｍｅｉ２様遺伝子がＴＥＬまたはＡＭＬ遺伝子であるかどうかは、エンコードされたアミノ酸配列の分析により決定することができる。例えば、図１はＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩにより構築されたさまざまな植物Ｍｅｉ２様遺伝子の系統樹を示す。この系統樹では、植物Ｍｅｉ２様遺伝子は２つの異なるグループ、ＡＭＬグループおよびＴＥＬグループを明確に形成した。ＴＥＬ様タンパク質は通常、Ｎ末端領域に２つのＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）、およびそのＣ末端領域に１つのＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ３）を含有する。Ｃ末端のＲＲＭ３は植物に高度に保存され、ＴＥＬタンパク質の機能にとって重要な役割を果たす。ＡＭＬタンパク質と比較して、ＴＥＬタンパク質に特有の特性は、ＲＲＭ３モチーフ内に挿入されたＴＥＬ特異的ペプチドである（図２）。すべてのＡＭＬタンパク質はこのモチーフを有さない。ＴＥＬタンパク質に特有の別の特性は、ＲＲＭ３のＣ末端外の保存領域である（図２）。これはすべてのＡＭＬタンパク質に含まれない。本発明のＴＥＬアミノ酸配列は、この保存領域内で少なくとも約６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれより高い配列同一性を共有する。
【００５６】
よって、本発明のＴＥＬまたはＴＥＬ様タンパク質としては、ＴＥＬモチーフの少なくとも１つを有するものが挙げられる。本発明のＴＥＬまたはＴＥＬ様タンパク質としては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、保存領域と少なくとも約６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれより高い配列同一性を有するものが挙げられる。保存領域を有するＴＥＬ配列を同定するため、イネ保存モチーフを用い、ＮＣＢＩ配列データベースを後述するデフォルトパラメーターを用いて検索することができる。イネ配列が用いられ、ＴＥＬ配列がアラインされる場合、配列は約６０％またはそれより高い配列同一性を共有する。同様に、ＴＥＬまたはＴＥＬ様タンパク質としては、ＴＥＬモチーフの少なくとも１つを有し、本発明のＴＥＬタンパク質と少なくとも５０％、少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するものが挙げられる。ＴＥＬまたはＴＥＬ様タンパク質としては、保存領域内で少なくとも６０％の配列同一性を有し、本発明のＴＥＬタンパク質と少なくとも５０％、少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するものが挙げられる。
【００５７】
多くのＴＥＬ遺伝子が本明細書において開示され、当技術分野において知られているが、これらのＴＥＬ配列のいずれか、ならびにその変異体およびトランケーション体はいずれの目的の植物にも用いることができる。後述するように、本明細書における配列は、本発明の実施において有用な他のＴＥＬ遺伝子を単離するのに用いることができる。本発明のＴＥＬタンパク質をエンコードするヌクレオチド配列としては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、３１、３３、３７、３９、４１、４３、４５に記載される配列、ならびにその変異体、フラグメント、および補体が挙げられる。当技術分野において知られ、本発明の実施において有用な他の配列としては、シロイヌナズナ（例えば、ＮＰ＿１８９２４２．１、ＢＡＢ０１４３８．１、ＮＰ＿１７６９４３．１、ＢＡＡ２２３７４．１、ＮＰ＿５６８９４６．１、ＮＰ＿１７４９０２．１、ＮＰ＿１９６３４６．１、ＡＢＥ６５６８９．１、ＢＡＦ０２１０７．１、ＡＡＧ５１７４２．１）；トウモロコシ（例えば、ＮＰ＿００１１０４９０３．１、ＤＡＡ５６２５３．１、ＮＰ＿００１１５１４１９．１、ＤＡＡ４０６１４．１、ＮＰ＿００１１３２２４６．１、ＡＦＷ５８１１８．１、ＡＣＮ２６４７６．１、ＡＦＷ８６２５２．１、ＮＰ＿００１１６９５４３．１、ＡＦＷ７５１９３．１）；ヨーロッパブドウ（例えば、ＸＰ＿００２２８２１１７．１、ＸＰ＿００２２７１３８６．１、ＣＢＩ１７７１６．３、ＣＢＩ１６８２９．３、ＸＰ＿００３６３４４１０．１、ＣＢＩ１９０７５．３、ＣＢＩ３１７５２．３、ＣＢＩ３８０１２．３、ＸＰ＿００２２７９７９２．２）；ダイズ（例えば、ＸＰ＿００３５５２８００．１、ＸＰ＿００３５３７５５５．１、ＸＰ＿００３５３２０９６．１、ＸＰ＿００３５５１９１８．１、ＸＰ＿００３５２２４５０．１、ＸＰ＿００３５４６５７５．１）；タルウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）（例えば、ＸＰ＿００３６０１８７８．１、ＸＰ＿００３５９５５８２．１、ＸＰ＿００３５９５５８１．１、ＡＡＴ３８９９８．１、ＸＰ＿００３６０２７５０．１、ＸＰ＿００３６３０５９５．１）；ヒロハハコヤナギ（例えば、ＸＰ＿００２３１１７４９．１、ＸＰ＿００２３１４５７９．１、ＸＰ＿００２３０１０１４．１、ＸＰ＿００２３２８９５９．１、ＸＰ＿００２３３４１３０．１、ＸＰ＿００２２９７８７５．１）；ヒメツリガネゴケ（例えば、ＸＰ＿００１７７８４２３．１、ＡＥＮ７１５４７．１、ＸＰ＿００１７６４１７６．１、ＡＥＮ７１５４８．１、ＸＰ＿００１７８００８２．１、ＸＰ＿００１７６５６２７．１）；セイヨウミヤマハタザオ（例えば、ＸＰ＿００２８７５３１０．１、ＸＰ＿００２８８７１４４．１、ＸＰ＿００２８６６４６３．１、ＸＰ＿００２８７１２６２．１、ＸＰ＿００２８９３９２５．１）；トウゴマ（例えば、ＸＰ＿００２５１５０４５．１、ＸＰ＿００２５１２９７４．１、ＸＰ＿００２５１３８２３．１、ＸＰ＿００２５３４７４３．１、ＸＰ＿００２５１１０９１．１）；イヌカタヒバ（例えば、ＸＰ＿００２９６０５５２．１、ＸＰ＿００２９６９１９５．１、ＸＰ＿００２９６９６０７．１、ＸＰ＿００２９６５３１７．１、ＸＰ＿００２９８２７９９．１）；モロコシ（例えば、ＸＰ＿００２４５６８１０．１、ＸＰ＿００２４６２７１４．１、ＸＰ＿００２４３７６６１．１、ＸＰ＿００２４５２１６９．１）；セイヨウヤマカモジ（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ  ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）（例えば、ＸＰ＿００３５６７３７４．１、ＸＰ＿００３５７６７６２．１、ＸＰ＿００３５７９６４５．１、ＸＰ＿００３５６９１５０．１）；イネ、ジャポニカ種（例えば、ＮＰ＿００１０４５１３９．１、ＥＡＺ１４５５２．１、ＮＰ＿００１０６３７５４．１、ＮＰ＿００１１７２９８８．１）；ヨーロッパヤマナラシ×ウラジロハコヤナギ（例えば、ＡＢＲ１９８１８．１、ＡＢＲ１９８１７．１）；オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ  ｓｕｂｓｐ．ｖｕｌｇａｒｅ）（例えば、ＢＡＪ８５８７５．１、ＡＡＬ８５７０１．１）；イネ、インディカ種（例えば、Ａ２ＷＹ４６．１、ＥＥＣ８４９３２．１)；トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）（例えば、ＮＰ＿００１２３４５４７．１）；パンコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）（例えば、ＡＡＴ３９００３．１）；クサビコムギ（Ａｅｇｉｌｏｐｓ  ｓｐｅｌｔｏｉｄｅｓ）（例えば、ＡＡＴ３９０００．１）；ヨツヒメゾウリムシ（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ  ｔｅｔｒａｕｒｅｌｉａ）ｄ４−２株（例えば、ＸＰ＿００１４３２６２０．１、ＸＰ＿００１４３６４７８．１）；ウンシュウミカン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ）（例えば、ＡＡＴ３９００４．１）；テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ）（例えば、ＡＡＴ３８９９６．１）；ボルボックス（Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ  ｆ．ｎａｇａｒｉｅｎｓｉｓ）（例えば、ＸＰ＿００２９５７６６４．１）；クラミドモナス・ラインハーディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）（例えば、ＸＰ＿００１７０００７８．１）；オストレオコッカス・タウリ（例えば、ＸＰ＿００３０７９２６４．１）；オストレオコッカス・ルシマリヌス（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｃｉｍａｒｉｎｕｓ）ＣＣＥ９９０１（例えば、ＸＰ＿００１４１７９７０．１）；クロレラ・バリアビリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）（例えば、ＥＦＮ５２０８８．１）；シトカトウヒ（Ｐｉｃｅａ  ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ）（例えば、ＡＢＲ１６１４９．１）；ネグレリア・グルベリ（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ  ｇｒｕｂｅｒｉ）（例えば、ＸＰ＿００２６７０２９２．１）；テトラヒメナ・サーモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）（例えば、ＸＰ＿００１０３２０１８．１）；およびアルブゴ・ライバキ（Ａｌｂｕｇｏ  ｌａｉｂａｃｈｉｉ）（例えば、ＣＣＡ２１７７１．１）が挙げられる。こうした配列はすべて本明細書に参照により組み入れられる。「補完」とは、所定のヌクレオチド配列とハイブリダイズし、これにより安定な二本鎖を形成することができるように、所定のヌクレオチド配列と十分に相補的なヌクレオチド配列を指す。
【００５８】
ＴＥＬタンパク質をエンコードするこれらのヌクレオチド配列のフラグメントである核酸分子も本発明に含まれる。「フラグメント」とは、ＴＥＬタンパク質をエンコードするヌクレオチド配列の一部分を指す。ヌクレオチド配列のフラグメントはＴＥＬタンパク質の生物学的に活性な部分をエンコードすることができ、または他のＴＥＬ様配列を単離するのに有用なハイブリダイゼーションプローブもしくはＰＣＲプライマーとして用いることができるフラグメントであってもよい。一般的には、本発明のヌクレオチド配列のトランケーションフラグメントは、ＲＲＭ３保存領域を含み、ＴＥＬタンパク質の生物学的活性を保持し、ひいてはＴＥＬ活性を保持するタンパク質フラグメントをエンコードする。「活性を保持する」とは、フラグメントがＴＥＬタンパク質のＴＥＬ活性の少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％またはそれより高い割合を有することを指す。「ＴＥＬ活性」とは植物成長または収量の増加を指す。ＴＥＬ活性の測定方法は、タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルを測定するステップ、および成長表現型の増加について変異植物を成長させるステップを含む。
【００５９】
ＴＥＬ核酸分子の変異体はさまざまな方法により作製することができる。これらの変異は、本発明のＴＥＬタンパク質によりエンコードされるものとは異なるアミノ酸配列を有するタンパク質をエンコードするＤＮＡ配列をもたらすことができる。よって、タンパク質は、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、トランケーション、および挿入を含むさまざまな方法で変性させることができる。こうした操作の方法は一般的には当技術分野において知られている。例えば、ＴＥＬタンパク質のアミノ酸配列変異体はＤＮＡの変異により調製することができる。これは変異誘発および／または指向性進化におけるいくつかの形態の１つにより達成することもできる。いくつかの態様では、アミノ酸配列においてエンコードされる変化はタンパク質の機能に実質的には影響を及ぼさない。方法としては、ＤＮＡ複製中の塩基の誤取り込み、例えばＸＬ−１  Ｒｅｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ）；ＤＮＡシャッフリング（Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１０７４７−１０７５１；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９−３９１；Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：４３６−４３８；Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７２：３３６−３４７；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：４５０４−４５０９；Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：２８８−２９１；ならびに米国特許第５，６０５，７９３号および第５，８３７，４５８号）；等が挙げられる。タンパク質配列に対する変異は、ＰＣＲ、変異誘発、組換え、等のような分子方法により導入される挿入、欠失、または変異により行うことができる。こうした変異体は所望のＴＥＬ活性を有する。しかしながら、ＴＥＬタンパク質のＴＥＬ活性を与える能力は、本発明の組成物にこうした技術を用いることにより向上させることができることが理解される。
【００６０】
本発明の好適なＴＥＬタンパク質は、本明細書に挙げられる、または配列表に含まれるＴＥＬ配列のいずれかのヌクレオチド配列と同一の、または配列同一性を有するヌクレオチド配列によりエンコードされる。標準的なパラメーターを用いて本明細書に記載されるアラインメントプログラムの１つを用い、参照ＴＥＬ配列と比較して、少なくとも約５０％、約６０％または６５％の配列同一性、約７０％または７５％の配列同一性、約８０％または８５％の配列同一性、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い配列同一性を有する変異体アミノ酸またはヌクレオチド配列は本発明に含まれる。当業者であれば、コドンの縮退、アミノ酸の類似性、リーディングフレームの位置、等を考慮することにより、これらの値を適切に調節し、２つのヌクレオチド配列によりエンコードされるタンパク質の対応する同一性を決定することができることを認識するだろう。
【００６１】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸の同一性パーセントを決定するため、配列は最適な比較を目的としてアラインされる。２つの配列間の同一性パーセントは、配列により共有される同一位置の数の関数である（すなわち、同一性パーセント＝同一位置の数／位置の総数（例えば、重複位置）×１００）。１つの実施形態では、２つの配列は同じ長さである。別の実施形態では、同一性パーセントは参照配列の全体にわたって計算される。２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップを許容して、または許容せずに、後述するものと同様の技術を用いて決定することができる。同一性パーセントを計算する際には、一般的には完全マッチが数えられる。
【００６２】
２つの配列間の同一性パーセントの決定は数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。２つの配列の比較に用いられる数学的アルゴリズムの非限定的な例としては、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７において修正された、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４のアルゴリズムがある。こうしたアルゴリズムはＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３のＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸプログラムに組み入れられる。本発明のＴＥＬ様核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るには、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索をＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、語長＝１２で行うことができる。本発明のＴＥＬタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るには、ＢＬＡＳＴタンパク質検索をＢＬＡＳＴＮＸプログラム、スコア＝５０、語長＝３で行うことができる。比較を目的としてギャップを有するアラインメントを得るには、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９に記載されるように、ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２．０）を用いることができる。あるいは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用い、分子間の距離関係を検出する反復検索を行うことができる。Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）同上を参照されたい。ＢＬＡＳＴ、ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合、各プログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＸおよびＢＬＡＳＴＮ）のデフォルトパラメーターを用いることができる。アラインメントは精査により手動で行うこともできる。
【００６３】
配列の比較にはＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０）を含む他の数学的アルゴリズムを用いてもよい。ＣｌｕｓｔａｌＷは配列を比較し、アミノ酸またはＤＮＡ配列の全体をアラインし、よって全アミノ酸配列の配列保存についてのデータを提供することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムはいくつかの市販のＤＮＡ／アミノ酸分析ソフトウェアパッケージ、例えばＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩプログラムスイート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールスバッド）のＡＬＩＧＮＸモジュールに用いられている。ＣｌｕｓｔａｌＷでのアミノ酸配列のアラインメント後、アミノ酸同一性パーセントを評価することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントの分析に有用なソフトウェアプログラムの非限定的な例としてはＧＥＮＥＤＯＣ（商標）がある。ＧＥＮＥＤＯＣ（商標）（Ｋａｒｌ  Ｎｉｃｈｏｌａｓ）は複数のタンパク質間のアミノ酸（またはＤＮＡ）類似性および同一性の評価を可能にする。配列の比較に用いられる数学的アルゴリズムの別の非限定的な例としては、Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７のアルゴリズムがある。こうしたアルゴリズムは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓソフトウェアパッケージ、バージョン１０（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，  Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州サンディエゴ、スクラントン・ロード９６８５から市販）の一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み入れられている。アミノ酸配列の比較にＡＬＩＧＮプログラムを用いる場合、ＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長ペナルティ１２、ギャップペナルティ４を用いることができる。
【００６４】
他に記載のない限り、配列同一性または類似性を決定するには、以下のパラメーターを用い、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８（３）：４４３−４５３のアルゴリズムを用いるＧＡＰバージョン１０が用いられる：ヌクレオチド配列の同一性％および類似性％にはギャップ重量５０および長さ重量３、ならびにｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックス；アミノ酸配列の同一性％または類似性％にはギャップ重量８および長さ重量２、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングプログラム。同等のプログラムを用いることもできる。「同等のプログラム」とは、いずれかの問題の２つの配列について、ＧＡＰバージョン１０により生成された対応するアラインメントと比較した場合、同一のヌクレオチド残基マッチおよび同一の配列同一性パーセントを有するアラインメントを生成する、いずれかの配列比較プログラムを指す。
【００６５】
示したように、本発明の実施では変異体ＴＥＬ核酸分子を用いてもよい。ヌクレオチド配列をエンコードするＴＥＬタンパク質の「変異体」は、本明細書に開示されるＴＥＬタンパク質をエンコードするが、遺伝コードの縮退のためわずかに異なる配列、および上述したように十分に同一である配列を含む。天然発生対立変異体は周知の分子生物学技術、例えばポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）および後述するハイブリダイゼーション技術を用いて同定することができる。変異体ヌクレオチド配列は、例えば、部位特異的変異誘発を用いることにより生成されたが、後述するように依然として本発明に開示されるＴＥＬタンパク質をエンコードする、合成誘導ヌクレオチド配列も含む。本発明に含まれる変異体タンパク質は生物学的に活性であり、すなわち、それらは天然タンパク質の所望の生物学的活性、すなわち、ＴＥＬ活性を有し続ける。
【００６６】
当業者であれば、本発明のヌクレオチド配列の変異により変化を導入し、これにより、タンパク質の生物学的活性を変えることなく、エンコードされたＴＥＬタンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらすことができることをさらに理解するだろう。よって、変異体単離核酸分子は、１つ以上のアミノ酸置換、付加または欠失がエンコードされたタンパク質に導入されるように、１つ以上のヌクレオチド置換、付加、または欠失を本明細書に開示される対応するヌクレオチド配列に導入することにより作製することができる。変異は標準的な技術、例えば部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発により導入することができる。こうした変異体ヌクレオチド配列も本発明に含まれる。
【００６７】
例えば、保存アミノ酸置換は、１つ以上の予測された非必須アミノ酸残基で行うことができる。「必須」アミノ酸残基は生物学的活性に必要であるが、「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を変えることなく、ＴＥＬタンパク質の野生型配列から変異させることができる残基である。「保存アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野において定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リシン、アラギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。
【００６８】
アミノ酸置換は機能を保持する非保存領域において行ってもよい。一般的には、こうした置換は保存アミノ酸残基、またはこうした残基がタンパク質活性に必須である、保存モチーフ内に存在するアミノ酸残基については行われない。保存され、タンパク質活性に必須であり得る残基の例としては、例えば、本発明の配列と類似または関連したタンパク質のアラインメントに含まれるすべてのタンパク質間で同一である残基（例えば、相同タンパク質のアラインメントにおいて同一である残基）が挙げられる。保存されるが、保存アミノ酸置換が可能であり得、依然として活性を保持し得る残基の例としては、例えば、本発明の配列と類似または関連した高収量タンパク質のアラインメントに含まれるすべてのタンパク質間に保存置換のみを有する残基（例えば、相同タンパク質のアラインメントに含まれるすべてのタンパク質間に保存置換のみを有する残基）が挙げられる。しかしながら、当業者であれば、機能的変異体が保存残基において小さな保存または非保存変異を有し得ることを理解するだろう。１つの実施形態では、アミノ酸配列における変化は、図２に記載される保存モチーフまたはそのモチーフの周りの領域では行われない。
【００６９】
あるいは、変異体ヌクレオチド配列は、変異をコード配列の全部または一部に沿ってランダムに導入することにより、例えば飽和変異誘発により生成することができ、得られた変異体はＴＥＬ活性を与える能力についてスクリーニングし、活性を保持する変異体を同定することができる。変異誘発後、エンコードされたタンパク質は組換え発現することができ、タンパク質の活性は標準的なアッセイ技術を用いて決定することができる。
【００７０】
本発明のポリペプチド、またはその変異体もしくはフラグメントに対する抗体も含まれる。抗体の作製方法は当技術分野において周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；米国特許第４，１９６，２６５号参照）。
【００７１】
本明細書において挙げられるＴＥＬタンパク質に加えて、本発明は、植物、コケ、および菌類を含む他の生物において新規ＴＥＬ遺伝子をクローニングおよび使用する方法も提供する。例えば、本明細書において提供される配列を用いることにより、新規ＴＥＬ遺伝子をＰＣＲおよび核酸ハイブリダイゼーションのような方法でクローニングすることができる。ＰＣＲプライマーはＴＥＬ遺伝子のＤＮＡ配列の保存領域に応じて設計することができる。また、保存アミノ酸配列を用い、ＰＣＲの縮重プライマーを設計することができる。ＰＣＲから部分的に知られる遺伝子を用い、Ｔａｉｌ−ＰＣＲ、５’ＲＡＣＥ、３’ＲＡＣＥ、等のようなさまざまな既知の方法を用いて全長遺伝子をクローニングすることができる。例えば、Ｓｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂｕｒｋｅ（２００３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２３６：２４１−２７２；および市販のキットを参照されたい。後述するように、本発明および他の文献において提供される遺伝子を用い、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーをハイブリダイズするプローブを調製し、ＴＥＬ遺伝子をクローニングすることができる。ＴＥＬ様遺伝子がクローニングされると、そのエンコードされたアミノ酸配列を用い、これが図１に例示されるようなＴＥＬ遺伝子のオルソログであるかを決定することができる。
【００７２】
さまざまな配列決定プロジェクトの急速な進歩に伴い、新規ＴＥＬ遺伝子は、本発明により提供されるＴＥＬアミノ酸配列および／または核酸配列を用いてさまざまなデータベースを検索することにより同定することができる。こうしたデータベースとしては、これらに限定されないが、ゲノム配列、ＥＴＳ、およびｃＤＮＡ配列のデータベースが挙げられる。ＢＬＡＳＴ法（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９０  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３-４１０）が広く用いられている。例えば、Ｊｅｆｆａｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．は検索によりデータベースから１５個のＭｅｉ２様遺伝子を同定し、そのいくつかはさらにＴＥＬグループのメンバーと同定された（Ｊｅｆｆａｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅｓ．Ｅｖｏｌ．２１４：１４９−１５８）。
【００７３】
Ｍｅｉ２様タンパク質がＴＥＬグループのタンパク質であるかを決定するため、そのアミノ酸配列を調査することができる。本発明のＴＥＬタンパク質は収量増大に有用となる以下の特性の少なくとも１つを有する：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４と少なくとも５８％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４と少なくとも７０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４と少なくとも８０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４と少なくとも９０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む；４つの残基Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅの少なくとも３つが植物に保存されるＴＥＬ  ＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ３）を有するアミノ酸配列を含む；ＲＲＭ３ドメインのＣ末端外にＴＥＬ特異的保存モチーフを有し、以下のペプチド中の１０個の残基の少なくとも７個が保存されるアミノ酸配列を含む：
Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ／Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ／Ｇｌｕ−Ｎ−Ａｓｐ／Ｇｌｕ−Ｎ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ／Ｖａｌ（Ｎはいずれかの残基を表す）；イネＴＥＬタンパク質と少なくとも約６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む；イネＴＥＬタンパク質と少なくとも約７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む；イネＴＥＬタンパク質と少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７４】
よって、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、等のような方法を用い、対応するＴＥＬ配列、本発明の配列と実質的な同一性を有する配列を同定することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａtｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）およびＩｎｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）を参照されたい。
【００７５】
ハイブリダイゼーション方法では、本明細書において開示されるＴＥＬヌクレオチド配列のすべてまたは一部を用い、本発明に用いられる追加のＴＥＬ配列についてｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。こうしたｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーの構築方法は当技術分野において一般的に知られ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１，同上において開示されている。いわゆるハイブリダイゼーションプローブは、ゲノムＤＮＡフラグメント、ｃＤＮＡフラグメント、ＲＮＡフラグメント、または他のオリゴヌクレチドであってもよく、３２Ｐ、またはその他の検出可能なマーカー、例えば他の放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子のような検出可能な基で標識することができる。ハイブリダイゼーションのプローブは、合成オリゴヌクレオチドを本明細書において開示される既知のＴＥＬタンパク質をエンコードするヌクレオチド配列に基づき標識することにより作製することができる。ヌクレオチド配列またはエンコードされたアミノ酸配列中の保存ヌクレオチドまたはアミノ酸残基に基づき設計された縮重プライマーをさらに用いることができる。プローブは一般的には、ストリンジェントな条件下で本発明のＴＥＬタンパク質またはそのフラグメントもしくは変異体をエンコードするヌクレオチド配列の少なくとも約１２個、少なくとも約２５個、少なくとも約５０個、７５個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、または２００個の連続ヌクレオチドとハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。ハイブリダイゼーションのためのプローブの調製方法は一般的には当技術分野において知られ、本明細書に参照により組み入れられるＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１，同上において開示されている。
【００７６】
例えば、本明細書において開示される全ＴＥＬ核酸配列、またはその一部分以上は、対応するＴＥＬ様配列およびメッセンジャーＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるプローブとして用いることができる。さまざまな条件下で特異的ハイブリダイゼーションを達成するため、こうしたプローブは特有の、好適には少なくとも約１０個のヌクレオチドの長さ、または少なくとも約２０個のヌクレオチドの長さの配列を含む。こうしたプローブを用い、ＰＣＲにより選択された生物からの対応するＴＥＬ配列を増幅することができる。所望の生物からの追加のコード配列を単離するため、または生物中のコード配列の存在を決定する診断アッセイとしてこの技術を用いることができる。ハイブリダイゼーション技術としては、導入されたＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングが挙げられる（プラークまたはコロニー；例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）参照）。
【００７７】
こうした配列のハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件下で行うことができる。「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、その下でプローブがその標的配列と、他の配列より検出可能に大きい程度（例えば、バックグラウンドの少なくとも２倍）までハイブリダイズする条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、異なる状況では異なる。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、プローブと１００％相補的な標的配列を同定することができる（相同プロ―ビング）。あるいは、ストリンジェンシー条件は、低い程度の類似性が検出されるように、配列中のいくらかのミスマッチを許容するよう調節することができる（非相同プロ―ビング）。一般的には、プローブは約１０００個未満のヌクレオチドの長さ、好適には５００個未満のヌクレオチドの長さである。
【００７８】
一般的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度がｐＨ７．０〜８．３で約１．５Ｍ未満のＮａイオン、一般的には約０．０１〜１０ＭのＮａイオン（または他の塩）であり、温度が短いプローブ（例えば、１０〜５０個のヌクレオチド）について少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば、５０個より多いヌクレオチド）について少なくとも約６０℃であるものである。ストリンジェントな条件はホルムアミドのような脱安定化剤の添加で達成することもできる。例となる低ストリンジェンシー条件は、３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、３７℃のバッファー溶液でのハイブリダイゼーション、および５０〜５５℃の１倍〜２倍ＳＳＣ（２０倍ＳＳＣ＝３．０Ｍ  ＮａＣｌ／０．３Ｍ  クエン酸三ナトリウム）での洗浄を含む。例となる中ストリンジェンシー条件は、４０〜４５％ホルムアミド、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、３７℃でのハイブリダイゼーション、および５５〜６０℃の０．５倍〜１倍ＳＳＣでの洗浄を含む。例となる高ストリンジェンシー条件は、５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、３７℃でのハイブリダイゼーション、および６０〜６５℃の０．１倍ＳＳＣでの洗浄を含む。任意で、洗浄バッファーは約０．１％〜約１％のＳＤＳを含むことができる。ハイブリダイゼーション時間は一般的には約２４時間未満、通常は約４時間〜約１２時間である。
【００７９】
特異性は一般的にはポストハイブリダイゼーション洗浄の機能であり、重要な因子は最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについて、ＴｍはＭｅｉｎｋｏｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｈｌ（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４の式：Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−  ０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌから概算することができ；式中、Ｍは一価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシンおよびサイトシンヌクレオチドの割合であり、％ｆｏｒｍはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの割合であり、Ｌは塩基対中のハイブリッドの長さである。Ｔｍは、相補的標的配列の５０％が完全マッチプローブとハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度およびｐＨ下）である。Ｔｍはミスマッチ１％毎に約１℃低下し；よって、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション、および／または洗浄条件は、所望の同一性の配列とハイブリダイズするよう調節することができる。例えば、≧９０％同一性を有する配列が求められる場合、Ｔｍを１０℃低下させることができる。一般的には、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度およびｐＨで特定の配列およびその補体について熱融点（Ｔｍ）より約５℃低くなるよう選択される。しかしながら、激しくストリンジェントな条件は熱融点（Ｔｍ）より１、２、３、または４℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を用いることができ；中程度にストリンジェントな条件は熱融点（Ｔｍ）より６、７、８、９、または１０℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を用いることができ；低ストリンジェンシー条件は熱融点（Ｔｍ）より１１、１２、１３、１４、１５、または２０℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を用いることができる。式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物、ならびに所望のＴｍを用い、当業者であれば、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液のストリンジェンシーにおける多様性が本質的に説明されていることを理解するだろう。所望のミスマッチの程度が４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）未満のＴｍをもたらす場合、より高い温度を用いることができるように、ＳＳＣ濃度を増加させることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションについてのさらなる説明は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ-Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎd  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）において見られる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａ���ｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照されたい。
【００８０】
上述したように、植物におけるＴＥＬ遺伝子の発現を増加させるための１つ方法は、本発明のＴＥＬ配列をエンコードする核酸分子を含むＤＮＡ構築物で目的の植物を形質転換することである。植物およびよって作物においてＴＥＬ遺伝子を導入および発現する一般的な方法が現在利用可能である。一般的には、目的の植物の形質転換は以下のステップを含む：１）ＴＥＬ遺伝子の発現カセットを構築するステップ（構築物に用いられるポリヌクレオチドはコード配列を含有するゲノムフラグメント、または全長ｃＤＮＡ、もしくは人工的に合成されたａＤＮＡフラグメントとすることができる。プロモーター、エンハンサーおよびターミネーターのような制御配列はコードＤＮＡと操作可能に連結し、機能的発現カセットを作製することができる。通常、プロモーターはコードＤＮＡの５’端と連結し、ターミネーターはコードＤＮＡの３’端と連結している。発現カセットは、天然プロモーター、コード配列およびターミネーターを含むゲノムＴＥＬ  ＤＮＡフラグメントを含むことができる。）；２）ＴＥＬ発現カセットを有する形質転換ベクターを構築するステップ（例えば、ｐＣａｍｂｉａ１３００またはその修飾バージョンを用い、アグロバクテリウム媒介形質転換のＴＥＬ発現カセットをクローニングすることができる。）；および３）標的作物を形質転換し、形質転換イベントを選択するステップ（ウエスタン分析法を用い、ＴＥＬ導入遺伝子の発現を検出することができる。）。
【００８１】
本発明の実施では天然または内因性ＴＥＬ遺伝子の発現カセットを用いることができる。こうした発現カセットはプロモーター、コード配列およびターミネーターを、すべてゲノムＤＮＡの１つのフラグメント中に含有する。ＴＥＬ遺伝子のプロモーターは通常、コード配列の５’端に位置し、開始コドンの最大２〜３ｋｂ上流である。ターミネーターは通常、コード配列の３’端に約１．０ｋｂ以内で位置する。ＡＡＴＡＡＡのようなポリＡシグナル配列はターミネーターの端で用いることができる。
【００８２】
さらに、本発明はさまざまな植物ゲノムからの多くの天然ＴＥＬ発現カセットも提供する。これらのカセットの核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、７、９、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２７、２９、および４５に挙げられる。形質転換植物におけるこれらのＴＥＬの発現を増大させるため、エンハンサーをこれらの発現カセットの上流または下流に挿入することができる。１つのよく用いられるエンハンサーはカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓエンハンサーである（Ｂｅｎｆｅｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９０，ＥＭＢＯ  Ｊ．９：１６８５−１６９６）。
【００８３】
示したように、本発明のＴＥＬ配列は、目的の植物における発現のためのＤＮＡ構築物または発現カセットにおいて提供することができる。「植物発現カセット」とは、植物細胞においてオープンリーディングフレームからのタンパク質の発現をもたらすことができるＤＮＡ構築物を指す。一般的にはこれらはプロモーターおよびコード配列を含有する。こうした構築物は３’非翻訳領域も含有することが多い。こうした構築物は、植物におけるＴＥＬコード配列の発現を増大または増加させるエンハンサーを含有することができる。
【００８４】
「植物形質転換ベクター」とは、植物細胞の効率的な形質転換に必要なＤＮＡ分子を指す。こうした分子は１つ以上の植物発現カセットで構成することができ、２つ以上の「ベクター」ＤＮＡ分子に組織化することができる。例えば、バイナリーベクターは、植物細胞の形質転換に必要なすべてのシス作用性およびトランス作用性機能をエンコードするのに２つの隣接しないＤＮＡベクターを用いる植物形質転換ベクターである（Ｈｅｌｌｅｎｓ  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｉｎｅａｕｘ（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５：４４６−４５１）。「ベクター」とは、異なる宿主細胞間での導入のために設計された核酸構築物を指す。「発現ベクター」とは、外来細胞において異種ＤＮＡ配列またはフラグメントを導入、挿入および発現する能力を有するベクターを指す。カセットは本発明の配列と操作可能に連結した５’および３’制御配列を含む。「操作可能に連結した」とは、プロモーターと第２配列との間の機能的連結を指し、そこではプロモーター配列が第２配列に対応するＤＮＡ配列の転写を開始および媒介する。一般的には、操作可能に連結しているとは、連結した核酸配列が隣接し、２つのタンパク質コード領域を結合する必要がある場合は隣接し、かつ同じリーディングフレーム内にあることを意味する。カセットは、生物に共形質転換する少なくとも１つの追加の遺伝子をさらに含有することができる。あるいは、追加の遺伝子は複数の発現カセット上に提供することができる。
【００８５】
「プロモーター」とは、下流コード配列の転写を指示するように機能する核酸配列を指す。プロモーターは、他の転写および翻訳制御核酸配列（別名「コントロール配列」）とともに、目的のＤＮＡ配列の発現に必要である。本発明の実施では構成的または組織特異的プロモーターを用いることができる。コアＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０−８１２）；イネアクチン（ＭｃＥｌｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１６３−１７１）；ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：６１９−６３２およびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８９）；ｐＥＭＵ（Ｌａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１：５８１−５８８）；ＭＡＳ（Ｖｅｌｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：２７２３−２７３０）；ＡＬＳプロモーター（米国特許第５，６５９，０２６号）、ルビスコスモールサブユニットからのプロモーター、オクトピンシンターゼおよびノパリンシンターゼのようなアグロバクテリウム・ツメファシエンスＴ−ＤＮＡから誘導されるプロモーター、等を含む、多くのプロモーターが知られ、これらを用いることができる。組織特異的プロモーターとしては、分裂組織特異的プロモーター（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２４：８６３−８７８；Ｖｅｒｍａ  ａｎｄ  Ｋｕｍａｒ（２００５）Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：５１６−５２１；Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ（２００９）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １４９：８４１−８５０）；トウモロコシホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼのような緑色組織特異的プロモーター（米国特許第５，８５６，１７７号)；等が挙げられる。これらの参照文献のすべては本明細書に参照により組み入れられる。
【００８６】
ＴＥＬ遺伝子のプロモーターを用い、目的の植物における他のＴＥＬ遺伝子のコード配列の発現を駆動することができる。例えば、トウモロコシＴＥＬ遺伝子プロモーターを用い、イネ、コムギ、モロコシ、トウモロコシ、等におけるイネＴＥＬ遺伝子発現を駆動することができる。さまざまな植物からのプロモーターはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２〜５５に提供される。クローニングされたいずれかの遺伝子からプロモーター領域を単離することは周知の技術である。
【００８７】
遺伝子発現の制御に用いられるプロモーターについてはよく研究されている。例えば、Ｐｏｔｅｎｚａ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ｉｎ．Ｖｉｔｒｏ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ−Ｐｌａｎｔ．４０：１−２を参照されたい。構造的発現および組織特異的発現のためのすべてのプロモーターは、収量増大のため植物におけるＴＥＬ遺伝子の発現を駆動するのに用いることができる。本発明においてＴＥＬ遺伝子の発現を指示するのに用いられるプロモーターは、組織特異的プロモーター（米国特許第５８８０３３０号）、ＡＲＳＫ１根特異的プロモーター、ＡＰ１開花プロモーター（Ｂａｉ  ｅｔ  ａｌ．２００８，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．１７：１０３５−１０４３）のような、さまざまな異種プロモーターとすることができる。これらのプロモーターは組織特異的発現増大をもたらすことができ、これは組織特異的成長増大をもたらすことができる。
【００８８】
ＤＮＡ構築物または発現カセットはＴＥＬ配列の挿入を制御領域の転写制御下とするため複数の制限部位を備える。
【００８９】
示したように、ＤＮＡ構築物にはＴＥＬコード配列の発現を増加させるエンハンサーを用いることができる。こうしたエンハンサーとしては、３５Ｓエンハンサー、トランケーテッド３５Ｓエンハンサー、および他の転写アクチベーターが挙げられる。構築物には１つ以上のエンハンサーエレメントを用いることができ、多くの場合少なくとも２つのエレメントが用いられ得る。エンハンサーはＴＥＬ配列の発現を駆動するプロモーターに対して５’または３’であり、発現カセットにおけるエレメントと操作可能に連結することができる。
【００９０】
発現カセットは、５’−３’の転写方向で、転写および翻訳開始領域（すなわち、プロモーター）、本発明のＤＮＡ配列、ならびに植物において機能的な翻訳および転写終止領域（すなわち、終止領域）を含む。プロモーターはネイティブもしくはアナログ、または植物宿主および／もしくは本発明のＤＮＡ配列に対して外来もしくは異種であってもよい。加えて、プロモーターは天然配列またはあるいは合成配列であってもよい。プロモーターが植物宿主に対して「ネイティブ」または「同種」であるとは、プロモーターが、プロモーターが導入される天然植物に見られることを意味する。プロモーターが本発明のＤＮＡ配列に対して「外来」または「異種」であるとは、プロモーターが、操作可能に連結した本発明のＤＮＡ配列に対してネイティブまたは天然に発生するプロモーターではないことを意味する。
【００９１】
終止領域は転写開始領域にネイティブであってもよく、操作可能に連結した目的のＤＮＡ配列にネイティブであってもよく、植物宿主にネイティブであってもよく、または別の供給源由来（すなわち、プロモーター、目的のＤＮＡ配列、植物宿主、またはこれらのいずれかの組み合わせに対して外来または異種）であってもよい。ＴＥＬ発現カセットに用いられるターミネーターはＴＥＬのネイティブターミネーターとすることができるが、他のターミネーターとすることもできる。よく用いられるターミネーターとしては、ＣａＭＶの３５Ｓターミネーターが挙げられる。他のターミネーターとしては、Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６２：１４１−１４４；  Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６４：６７１−６７４；Ｓａｎｆａｃｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ５：１４１−１４９；Ｍｏｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１２６１−１２７２；Ｍｕｎｒｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅ  ９１：１５１−１５８；Ｂａｌｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７：７８９１−７９０３；およびＪｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１５：９６２７−９６４０において開示されるものが挙げられる。オクトピンシンターゼおよびノパリンシンターゼ終止領域のような便利な終止領域はＡ．ツメファシエンスのＴｉプラスミドから入手可能である。
【００９２】
適切な場合、遺伝子は形質転換宿主細胞における発現の増加のため最適化することができる。すなわち、遺伝子は発現増大のための特定の植物特異的コドンを用いて合成することができる。当技術分野では植物特異的遺伝子の合成方法が利用可能である。例えば、本明細書に参照により組み入れられる、米国特許第５，３８０，８３１号および第５，４３６，３９１号、ならびにＭｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：４７７−４９８を参照されたい。発現を増大させるため、導入遺伝子として用いるＴＥＬ遺伝子を修飾することができる。例えば、コドン使用を最適化することができ、イントロンを削除することができ、未成熟なポリＡシグナルを除去することができる。
【００９３】
本発明の方法は、ヌクレオチド構築物を植物に導入するステップを含む。「導入する」とは、ヌクレオチド構築物を植物に、構築物が植物の細胞の内部へのアクセスを得るような方法でもたらすことを指す。本発明の方法は、ヌクレオチド構築物が植物の少なくとも１つの細胞の内部へのアクセスを得ることのみを必要とし、ヌクレオチド構築物を植物に導入するための特定の方法が用いられることを必要としない。これらに限定されないが、安定形質転換方法、一過性形質転換方法、およびウイルス媒介方法を含む植物へのヌクレオチド構築物の導入方法が当技術分野において知られている。
【００９４】
「植物」とは、全植物、植物器官（例えば、葉、幹、根、等）、種子、植物細胞、珠芽、胚およびその子孫を指す。植物細胞は分化または未分化（例えば、カルス、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉細胞、根細胞、師管細胞、花粉）であり得る。
【００９５】
「形質転換植物」または「安定に形質転換された」植物、細胞もしくは組織とは、植物細胞に外因性核酸配列またはＤＮＡフラグメントを導入または挿入した植物を指す。これらの核酸配列としては、外因性であり、または未形質転換植物細胞中に存在しないもの、および内因性であり、または未形質転換植物細胞中に存在し得るものが挙げられる。「異種」とは一般的には、細胞に内因性またはそれらが存在する天然ゲノムの一部ではなく、インフェクション、トランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、マイクロプロジェクション、等により細胞に付加された核酸配列を指す。
【００９６】
植物細胞の形質転換は、当技術分野において知られるいくつかの技術の１つにより達成することができる。本発明のＴＥＬ遺伝子を修飾し、植物細胞において発現を得る、または増大させることができる。一般的には、こうしたタンパク質を発現する構築物は、遺伝子の転写を駆動するプロモーター、ならびに転写終止およびポリアデニレーションを可能にする３’非翻訳領域を含有する。
【００９７】
一般的には、この「植物発現カセット」は「植物形質転換ベクター」に挿入される。この植物形質転換ベクターは、植物形質転換を達成するのに必要な１つ以上のＤＮＡベクターで構成することができる。例えば、バイナリーベクターおよびヘルパープラスミドを有するベクターは、効率的な形質転換を達成するのに必要なＤＮＡセグメントがかなり大きく複雑であり、別のＤＮＡ上に機能を分けることが有利なアグロバクテリウム媒介形質転換にもっともよく用いられる。バイナリーベクターは一般的には、Ｔ−ＤＮＡ導入に必要なシス作用性配列（例えば左境界および右境界）、植物細胞における発現が可能となるよう構成される選択性マーカー、および「目的の遺伝子」（形質転換植物の作製が望まれる植物細胞における発現が可能となるよう構成される遺伝子）を有するプラスミドベクターを含む。このプラスミドベクター上には細菌複製に必要な配列も存在する。シス作用性配列は、植物細胞への効率的な導入およびそこでの発現を可能にするよう配置される。例えば、選択性マーカー遺伝子およびＴＥＬ遺伝子は左右境界間に位置することができる。多くの場合、第２プラスミドベクターはアグロバクテリウムから植物細胞へのＴ−ＤＮＡ導入を媒介するトランス作用性因子を含有する。このプラスミドは、当技術分野において理解されるように、アグロバクテリウムによる植物細胞の感染、境界配列での開裂によるＤＮＡの導入およびｖｉｒ媒介ＤＮＡ導入を可能にする毒性機能（ｖｉｒ遺伝子）を有することが多い（Ｈｅｌｌｅｎｓ  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｉｎｅａｕｘ  （２０００）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５：４４６−４５１）。植物形質転換にはいくつかのタイプのアグロバクテリウム株（例えば、ＬＢＡ４４０４、ＧＶ３１０１、ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５、等）を用いることができる。第２プラスミドベクターはマイクロプロジェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ポリエチレングリコール、等のような他の方法により植物を形質転換するには必要ない。
【００９８】
一般的には、植物形質転換方法は、異種ＤＮＡを標的植物細胞（例えば、未成熟または成熟胚、懸濁培養物、非分化カルス、プロトプラスト、等）に導入するステップ、およびその後（選択性マーカー遺伝子に従って）適切な選択を行い、未形質転換細胞集団の群から形質転換植物細胞を回収するステップを含む。外植片は一般的には新たに供給される同じ培地に移し、定期的に培養する。その後、形質転換細胞は最大閾値レベルの選択剤を補充した再生培地に入れ、シュートに分化する。シュートは次に発根したシュートまたは小植物を回収するため選択的発根培地に移す。形質転換小植物はその後成熟植物に成長し、稔性種子を生産する（例えば、Ｈｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６：２７１−２８２；Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：７４５−７５０）。外植片は一般的には新たに供給される同じ培地に移し、定期的に培養する。形質転換植物を作製するための技術および方法についての一般的な説明は、Ａｙｒｅｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋ（１９９４）Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １３：２１９−２３９およびＢｏｍｍｉｎｅｎｉ  ａｎｄ  Ｊａｕｈａｒ（１９９７）Ｍａｙｄｉｃａ  ４２：１０７−１２０において見られる。形質転換物質は多くの細胞を含有するため、対象標的カルスのいずれの片、組織、または細胞集団にも形質転換および非形質転換細胞の両方が存在する。非形質転換細胞を殺滅し、形質転換細胞を増殖させる能力は形質転換植物培養物をもたらす。多くの場合、非形質転換細胞を除去する能力は形質転換植物細胞の急速回収および形質転換植物の作製成功を制限している。
【００９９】
形質転換プロトコルおよびヌクレオチド配列を植物に導入するためのプロトコルは、形質転換の標的とされる植物または植物細胞のタイプ、すなわち、単子葉植物または双子葉植物に応じて異なり得る。形質転換植物の作製は、これらに限定されないが、マイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：３２０  ３３４）、エレクトロポレーション（Ｒｉｇｇｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：５６０２  ５６０６）、アグロバクテリウム媒介形質転換（米国特許第５，５６３，０５５号および米国特許第５，９８１，８４０号）、直接遺伝子導入（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：２７１７  ２７２２）、弾道粒子加速（例えば、米国特許第４，９４５，０５０号；米国特許第５，８７９，９１８号；米国特許第５，８８６，２４４号；および米国特許第５，９３２，７８２号；Ｔｏｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｅｄ．Ｇａｍｂｏｒｇ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）；ＭｃＣａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：９２３  ９２６参照）；およびＬｅｃ１形質転換（国際公開第ＷＯ００／２８０５８号）を含むいくつかの方法の１つにより行うことができる。また、Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１  ４７７；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８７：６７１  ６７４；Ｄａｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：７３６  ７４０（イネ）；Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：４３０５  ４３０９；Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：５５９  ５６３を参照されたい。また、米国特許第５，２４０，８５５号；第５，３２２，７８３号；第４，９４５，０５０号；第５，３２４，６４６号；米国特許出願公開第２００１００２６９４１号；第２００２０１５０６６号；および国際公開第ＷＯ９１／００９１５号を参照されたい。
【０１００】
形質転換させた細胞は従来の方法に従って植物中で成長させることができる。例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ５：８１−８４を参照されたい。これらの植物を次に成長させ、同じ形質転換株または異なる株で受粉させることができ、所望の表現型特性の構造的発現を有する得られたハイブリッドを同定することができる。所望の表現型特性の発現が達成されるように、所望の表現型特性の発現が安定に維持され、受け継がれるように２世代以上栽培した後、種子を収穫することができる。このようにして、本発明は、本発明のヌクレオチド構築物、例えば、本発明の発現カセットをそれらのゲノム中に安定に組み入れた形質転換種子（別名「トランスジェニック種子」）を提供する。
【０１０１】
異種外来ＤＮＡを植物細胞に導入後、植物ゲノムにおける異種遺伝子の形質転換または挿入は、挿入遺伝子に関連する核酸およびタンパク質の分析のようなさまざまな方法により確認される。分子技術としては、ＰＣＲ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）、ゲノムＤＮＡのサザンブロット分析、ノーザンブロット分析およびウエスタンブロット（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１，同上）が挙げられる。
【０１０２】
クロラムフェニコール耐性、アミノグリコシドＧ４１８、ヒグロマイシン、等のような、植物細胞に用いられる多数の選択性マーカーが開発された。クロロプラスト代謝に関与する産物をエンコードする他の遺伝子を選択性マーカーとして用いてもよい。例えば、グリホサート、ブロモキシニル、またはイミダゾリノンのような除草剤に対する耐性をもたらす遺伝子は特定の用途を有し得る。こうした遺伝子は報告されている（Ｓｔａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：６３１０−６３１４（ブロモキシニル耐性ニトリラーゼ遺伝子）；およびＳａｔｈａｓｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：２１８８（ＡＨＡＳイミダゾリノン耐性遺伝子）。植物、植物器官（例えば、葉、幹、根、等）、種子、植物細胞、珠芽、胚またはその子孫における導入遺伝子の存在を検出するための方法は当技術分野において周知である。
【０１０３】
ＴＥＬタンパク質を発現する稔性植物をＴＥＬ活性について試験し、最適な活性を示す植物をさらなる育種のために選択することができる。コード配列の発現の増大についてアッセイする方法が当技術分野において利用可能である。このようにして、植物をスクリーニングし、ＴＥＬ配列の発現のレベルに基づき選択することができる。さらに、形質転換種子を栽培し、好ましい表現型に基づき選択することができる。
【０１０４】
論じたように、植物におけるＴＥＬ配列の発現を増大させるためのいずれの方法も本発明に含まれる。作物収量を向上させる別の方法は、他の植物遺伝子工学技術により作物における内因性ＴＥＬ遺伝子またはコード配列の発現を増大させることである。すなわち、発現カセットを用いて第２ＴＥＬコード配列を導入する代わりに、目的の植物における内因性ＴＥＬ遺伝子の発現を増加させることができる。この方法では、エンハンサー（例えばＣａＭＶの３５Ｓエンハンサー）を植物における内因性ＴＥＬ遺伝子の近くに挿入し、内因性配列の発現を増加させることができる。３５Ｓエンハンサーは、遺伝子の上流または下流の領域に挿入された場合、目的の遺伝子から２０ｋｂ、３０ｋｂ、またはそれより離れて挿入された場合であっても、遺伝子発現を増大させることができることが見出されている（Ｊｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００６，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．４５：１２３−１３２）。よって、エンハンサーはＴＥＬ遺伝子のすぐ上流および／または下流のＴＥＬ配列の領域に挿入することができる。他の実施形態では、エンハンサーはＴＥＬ遺伝子のゲノム上流および／または下流の領域にＴＥＬ遺伝子の約１ｋｂ、約５ｋｂ、約１０ｋｂ、約１５ｋｂ、約２０ｋｂ、約３０ｋｂ以内で、またはこれより離れて挿入することができる。当業者であれば、いずれの場合にエンハンサーがＴＥＬ配列から離れすぎ、増大効果を有さないかを判断することができる。１つの例では、少なくとも１つの３５Ｓエンハンサーを含有するＴ−ＤＮＡはＴＥＬ遺伝子の約５ｋｂ下流に挿入され、ＴＥＬ配列の発現を顕著に増大させ、結果として収量を実質的に増加させた。
【０１０５】
ゲノム中へのヌクレオチド分子の部位特異的標的化の方法は知られ、ＴＡＬＥＮに基づく挿入（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ３０：３９０−３９２、Ｃｅｒｍａｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  Ｅｐｕｂ  １４  Ａｐｒｉｌ  ２０１１；ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｒ２１８、Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ  ａｎｄ  Ｖｏｙｔａｓ（２０１１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３３：１８４３−１８４６、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２９：１４３−１５０、Ｓｃｈｏｌｚｅ  ａｎｄ  Ｂｏｃｈ（２０１１）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １４４７−５３）；Ｃｒｅ−ｌｏｘ部位特異的組換え（Ｄａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ７：６４９−６５９、Ｌｙｚｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｐｌａｎｔ  Ｊ  １：１−９）；ＦＬＰ−ＦＲＴ組換え（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １５１：１０８７−１０９５）；Ｂｘｂ１媒介挿入（Ｙａｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｊ（２０１１）７０１：１４７−１６６）；ジンクフィンガー媒介挿入（Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ４４：６９３−７０５、Ｃａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ６９：６９９−７０９）；同種組換え（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ−Ｌａｚａｒｏｖｉｃｈ  ａｎｄ  Ｌｅｖｙ（２０１１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ７０１：５１−６５、Ｐｕｃｈｔａ，Ｈ．（２００２）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４８：１７３−１８２）；等を含む。これらの参照文献のすべては本明細書に参照により組み入れられる。
【０１０６】
ＴＡＬＥＮ技術は遺伝子工学における配列特異的標的化のために開発された。ＴＡＬ（転写アクチベーター様）エフェクターは、予測可能な特異性を有する新規クラスのＤＮＡ結合タンパク質を構成する。植物細胞内では、ＴＡＬは核に局在化し、標的プロモーターに結合し、植物遺伝子の発現を誘発する。ＴＡＬのＤＮＡ結合特異性はタンデムリピートの中央ドメインにより決定される。Ｓｃｈｏｌｚｅ  ａｎｄ  Ｂｏｃｈ  同上。ＴＡＬＥＮ技術を用い、エンハンサー配列をＴＥＬ遺伝子の近くに特異的に挿入することができる。従って、ＴＡＬＥＮ技術を用い、少なくとも１つのエンハンサーエレメントをＴＥＬ遺伝子の下流または上流のゲノム中の所望の場所に挿入することができる。例えば、ＴＡＬ技術を用い、ＣａＭＶの３５ＳエンハンサーをイネＴＥＬ遺伝子の下流の５ｋｂ以内に挿入することができる。
【０１０７】
ＴＥＬ発現はデノボ設計転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）を用いることにより増大させることもできる。キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）からのＴＡＬＥは、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含有する調節タンパク質である（Ｂｏｃｈ  ａｎｄ  Ｂｏｎａｓ（２０１０）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ  ４８：４１９−４３６）。ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインは、それらが特定のＤＮＡ配列に結合するようにデノボ設計することができる。こうしたデノボ設計ＴＡＬＥを用い、その特定の配列の下流遺伝子を活性化することができる。この遺伝子発現増大方法は、植物において成功裏に実施された（Ｍｏｒｂｉｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０７：２１６１７−２１６２２）。イネ、トウモロコシ、コムギ、およびダイズのＴＥＬ遺伝子のプロモーター領域はすべて知られており、本明細書において提供される。ＴＡＬＥは、転写開始部位の近くの上流の部位に特異的に結合するように修飾することができる。これらの植物におけるこうしたデノボ設計ＴＡＬＥの形質転換は、それらのＴＥＬ遺伝子の発現を増大させ、ひいては作物収量を増大させるだろう。このようにして、ＴＡＬＥ媒介挿入はいずれかの目的の植物におけるＴＥＬ遺伝子について設計することができる。ＴＥＬ遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列を用い、コード配列から上流または下流のＤＮＡ領域を配列することができる。こうした配列を用い、ＴＡＬＥ技術を用いる挿入のためにエンハンサーを標的化することができる。
【０１０８】
配列特異的挿入技術はジンクフィンガータンパク質を用いて開発された（Ｕｒｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１１：６３６−６４６；Ｄａｖｉｓ  ＆  Ｓｔｏｋｏｅ（２０１０）ＢＭＣ  Ｍｅｄ．８：４２；Ｃａｍｅｎｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｉｎｉ  Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８：６６９−６７６）。従って、ジンクフィンガー法を転写エンハンサーの配列特異的挿入に用い、植物におけるＴＥＬ遺伝子の発現およびよって収量を増大させることができる。
【０１０９】
本発明の方法は、これらに限定されないが、単子葉植物および双子葉植物を含むいずれの植物種に用いてもよい。目的の植物の例としては、これらに限定されないが、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科植物、トウガラシ、ジャガイモ、ワタ、コメ、ダイズ、サトウダイコン、サトウキビ、タバコ、オオムギ、ナタネ、アブラナ属、ムラサキウマゴヤシ、ライムギ、キビ、ベニバナ、ピーナッツ、サツマイモ、キャッサバ、コーヒー、ココナッツ、パイナップル、柑橘類、ココア、茶、バナナ、アボカド、イチジク、グアバ、マンゴー、オリーブ、パパイヤ、カシュー、マカダミア、アーモンド、カラスムギ、野菜、観葉植物、および針葉樹が挙げられる。
【０１１０】
野菜としては、これらに限定されないが、トマト、レタス、サヤインゲン、アオイマメ、エンドウマメ、キュウリ属のメンバー、例えばキュウリ、カンタループ、およびマスクメロンが挙げられる。観葉植物としては、これらに限定されないが、アザレア、アジサイ、ハイビスカス、バラ、チューリップ、スイセン、ペチュニア、カーネーション、ポインセチア、およびキクが挙げられる。好適には、本発明の植物は作物植物（例えば、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科植物、トウガラシ、ジャガイモ、ワタ、イネ、ダイズ、サトウダイコン、サトウキビ、タバコ、オオムギ、ナタネ、ススキ、スイッチグラス、ジャトロファ、等）および針葉樹である。
【０１１１】
植物収量の増加方法を提供する。本方法は植物におけるＴＥＬコード配列の発現を増加または増大させ、植物成長、活力、および収量の増加をもたらすステップを含む。本明細書において定義されるように、植物の「収量」とは、植物により生産されるバイオマスおよび／または種子の質および／または量を指す。「バイオマス」とはいずれかの測定された植物産物である。バイオマス生産の増加は測定された植物産物の収量のいずれかの向上である。収量の増加は、ＴＥＬ配列を発現しない植物と比較して、これらに限定されないが、収量の少なくとも１％の増加、少なくとも３％の増加、少なくとも５％の増加、少なくとも１０％の増加、少なくとも１５％の増加、少なくとも１８％の増加、少なくとも２０％の増加、少なくとも３０％の増加、少なくとも５０％の増加、少なくとも７０％の増加、少なくとも１００％の増加またはこれより大きな増加を含む、いずれかの統計的に有意な増加を含むことができる。目的の植物における種子生産は、対照植物と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも１００％、またはこれより大きく増加させることができる。
【０１１２】
以下の実施例は限定としてではなく例示として提供する。
【実施例】
【０１１３】
（実施例１）収量増大遺伝子としてのイネＴＥＬ遺伝子の同定
（１）高収量を有するイネのＴ−ＤＮＡ挿入変異体の分子特性解析
形質転換イネ株、ＨＳＡ−２０は、予想外だが大いに望ましい、高収量という農業形質を有すると同定した。非形質転換親株「ＷＹＧ−７」の植物と比較して、ＨＳＡ−２０株のもっとも驚くべき表現型はそれらの劇的に増大した種子である。形質転換に用いた親株の千粒重は２６．１ｇだったが、ＨＳＡ−２０株の千粒重は３６．５ｇであり、３９．８％高かった。ＨＳＡ−２０種子は対照植物の種子より約２０％長く、７％幅広だった。ＨＳＡ−２０植物は丈も顕著に高く、稈径も顕著に大きかった。ＨＳＡ−２０成熟植物の平均草丈は、非形質転換植物の９７ｃｍに対して１０７ｃｍだった。主穂当たりの種子数はＨＳＡ−２０と対照植物との間で統計的に同じだった。主穂の平均重量は非形質転換親株の３．６ｇに対して４．８ｇである。ＨＳＡ−２０と非形質転換対照との間で出穂期には有意な差はなかった。
【０１１４】
ＨＳＡ−２０のＴ−ＤＮＡ挿入のサザンブロット分析は、これがシングルコピーのみのＴ−ＤＮＡ挿入による形質転換イベントであることを示した。ＰＣＲ検出による２００株のＨＳＡ−２０の隔離されたＴ１集団の試験は、種子増大の表現型を有する植物の１００％がＴ−ＤＮＡ挿入に陽性であり、普通の大きさの種子を有する植物がすべてＰＣＲ陰性であることを示し、Ｔ−ＤＮＡの挿入が高収量の表現型の理由であることを示した。
【０１１５】
（２）Ｔ−ＤＮＡ挿入部位の特性解析
ＨＳＡ−２０におけるＴ−ＤＮＡ挿入部位の特性を解析するため、イネゲノム中のＴ−ＤＮＡの境界配列をＴＡＩＬ−ＰＣＲ法により決定した（Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，２００７，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４３：６４９−６５６）。Ｔ−ＤＮＡが染色体１の長腕に挿入され、両側のその境界配列はそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１であることが見出された。
【０１１６】
この挿入はいずれの既知のまたは理論上の遺伝子内にあるとも考えられなかった。これはｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅａｒ１様遺伝子（ＯｓＴＥＬ）とＲａｂＧＡＰ／ＴＢＣドメインタンパク質をエンコードする推定遺伝子との間の領域に挿入された。挿入はＯｓＴＥＬ遺伝子の約４．５ｋｂ下流およびＲａｂＧＡＰ／ＴＢＣドメインをエンコードする推定遺伝子の５．４ｋｂ上流である（図３）。
【０１１７】
（３）ＨＳＡ−２０植物におけるＯｓＴＥＬ遺伝子の発現増大
ＯｓＴＥＬおよびＲａｂＧＡＰ／ＴＢＣドメインをエンコードする推定遺伝子のｍＲＮＡレベルを、ＲＴ−ＰＣＲ分析を用い、１か月の幼苗のＨＳＡ−２０株と非形質転換親株との間で比較した。ＯｓＴＥＬｍＲＮＡは非形質転換対照植物よりＨＳＡ−２０植物において顕著に高いが、ＲａｂＧＡＰ／ＴＢＣドメインタンパク質をエンコードする推定遺伝子のｍＲＮＡはほぼ同じであることが見出された。ＨＳＡ−２０植物におけるＯｓＴＥＬの発現増大は、ＯｓＴＥＬ遺伝子から４．９ｋｂ下流に挿入されたＴ−ＤＮＡ内のＣａＭＶ３５Ｓエンハンサーのためであると考えられた。
【０１１８】
（実施例２）イネ形質転換のためのＯｓＴＥＬ発現ベクターの構築
形質転換ベクターｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０はｐＣａｍｂｉａ１３００の修飾形態である。具体的には、ハイグロマイシン耐性遺伝子ｈｔｐＩＩをＸｈｏＩ酵素によりｐＣａｍｂｉａ１３００から消化した後、グリホサート耐性遺伝子Ｇ１０ｅｖｏ（ＥＰＳＰシンターゼ）の発現カセットで置換した。Ｇ１０ｅｖｏ発現カセットはトウモロコシユビキチンプロモーター、ｐＵｂｉ、グリホサート耐性遺伝子Ｇ１０ｅｖｏ（ＥＰＳＰＳ）およびその下流ターミネーターで構成される。ベクターｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０およびＥＰＳＰＳのポリヌクレオチド配列はそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８として示される。ベクターｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０中のプロモーターｐ３５Ｓは、イネＯｓＴＥＬ遺伝子の発現を増大させるエンハンサーを提供する。
【０１１９】
ＯｓＴＥＬの全長遺伝子は、推定プロモーター領域、コード配列および推定ターミネーターで構成される（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される）。これはＰＣＲ増幅により得られた。１．８ｋｂの推定プロモーターおよびコード領域は、約４．０ｋｂのターミネーターを含め、ＰＣＲによりイネ（ジャポニカ種）から単離されたゲノムＤＮＡから別々に得られた。
ＰＣＲに用いたプライマーを表１に挙げる。
【０１２０】
【表１】
2015500651.tif 000003
【０１２１】
プロモーター内のＢａｍＨＩ部位を削除するため、プロモーターの２つのフラグメントを、それぞれプライマーｐＯｓＴＥＬ−Ｆ／ｐＯｓＴＥＬ−ＭＲおよびｐＯｓＴＥＬ−Ｒ／ｐＯｓＴＥＬ−ＭＦにより増幅させた。これらの２つのフラグメントを次に、プライマーｐＯｓＴＥＬ−ＦおよびｐＯｓＴＥＬ−Ｒを用い、ＯｓＴＥＬの全長プロモーターを得るため、次回のＰＣＲのテンプレートとして組み合わせた。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ部位をそれぞれその５’および３’端に導入した。１．８ｋｂ長のこのプロモーター領域ＤＮＡをＰ−Ｅａｓｙベクター（Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．、北京）にクローニングし、配列により確認し、ｐＯｓＴＥＬと名付けた。
【０１２２】
コード配列および推定ターミネーターを含むフラグメントを、プライマーＯｓＴＥＬｃｏｄ−ＦおよびＯｓＴＥＬｔｅｒ−Ｒを用いるＰＣＲにより得た。ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩ部位をそれぞれその５’および３’端に導入した。４．０ｋｂのＰＣＲ産物をＰ−Ｅａｓｙベクター（Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．、北京）にクローニングし、配列により確認し、ＯｓＴＥＬ−ＴＥＲと名付けた。
【０１２３】
タカラ（宝生物工程有限公司、中国大連）からの高忠実度ＤＮＡポリメラーゼＰｒｉｍｅｒ  ｓｔａｒおよびそのコンパニオン試薬を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応条件および手順は以下のとおりである：
【０１２４】
【表２】
2015500651.tif 000004
【０１２５】
天然ＯｓＴＥＬ遺伝子および３５Ｓエンハンサーを含むＴ−ＤＮＡを有するベクターの構築：
Ｔ−Ｅａｓｙベクターにおいてクローニングした２つのＰＣＲ産物を、二重酵素消化、それぞれＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩおよびＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩによりベクターから消化した。２つの得られたフラグメントを、そのＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩ部位の間で、同時にｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０にクローニングし、ベクターｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０−ＯｓＴＥＬ（図４Ａに示す）を作製し、これはＯｓＴＥＬ遺伝子の下流に３５Ｓプロモーター（ｐ３５Ｓ）を有する。クローンイネＯｓＴＥＬ遺伝子の全長ポリヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示す。
【０１２６】
天然ＯｓＴＥＬ遺伝子を含むが３５Ｓエンハンサーを含まないＴ−ＤＮＡを有するベクターの構築：
３５ＳプロモーターおよびｈｐｔＩＩ遺伝子の両方を、ＥｃｏＲ１およびＸｈｏＩでの消化によりプラスミドｐＣａｍｂｉａ１３００から除去した。次に、適切な端のＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩの消化部位で固定された、グリホサート耐性発現カセットｐＵｂｉ−ＥＰＳＰＳを上述したように消化したｐＣａｍｂｉａ１３００ＤＮＡにライゲーションした。得られたベクターｐＣａｍｂｉａ１３００−Ｇ１０（配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９として示される）は、ベクターｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０（実施例２の第１段落に記載）と比較して、ｐ３５Ｓプロモーターを含まない。ｐＣａｍｂｉａ１３００−Ｇ１０をＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩで消化した後、ｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０−ＯｓＴＥＬを同様にＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩで消化することにより得られたＯｓＴＥＬ遺伝子のフラグメントにライゲーションした。得られたベクターはｐＣａｍｂｉａ１３００−Ｇ１０−ＯｓＴＥＬである。このベクターのＴ−ＤＮＡ構造は図４Ｂに示す。
【０１２７】
ＯｓＴＥＬの発現を駆動するｐ３５Ｓを用いるベクターの構築：
ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターを、それぞれその５’および３’端にＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ部位を有するようにＰＣＲにより修飾した。このプロモーターをＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩで消化したＯｓＴＥＬ−ＴＥＲフラグメントにライゲーションした。３５ＳプロモーターおよびＯｓＴＥＬ−ＴＥＲを次にＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩで予め消化したｐＣａｍｂｉａ１３００−Ｇ１０にライゲーションし、形質転換ベクターｐＣａｍｂｉａ１３００−Ｇ１０−ｐ３５Ｓ−ＯｓＴＥＬ（図４Ｃ）を作製した。
【０１２８】
トウモロコシＺｍＴＥＬの形質転換ベクター構築物：
そのプロモーターおよびターミネーターを含む、トウモロコシ天然ＺｍＴＥＬ遺伝子をＰＣＲ増幅により得た。用いたＰＣＲプライマーの配列を表３に示す。
【０１２９】
【表３】
2015500651.tif 000005
【０１３０】
まず、トウモロコシＺｍＴＥＬ遺伝子の３つのＤＮＡフラグメント、ＺｍＴＥＬ−Ａ、ＺｍＴＥＬ−ＢおよびＺｍＴＥＬ−Ｃを、それぞれプライマー対、ＺｍＴＥ−Ａ−ＦとＺｍＴＥ−Ａ−Ｒ、ＺｍＴＥ１−Ｂ−ＦとＺｍＴＥ−Ｂ−ＲおよびＺｍＴＥ１−Ｃ−ＦとＺｍＴＥ−Ｃ−Ｒを用いるＰＣＲによりトウモロコシゲノムから増幅させた。次に、ＺｍＴＥＬ−ＢおよびＺｍＴＥＬ−Ｃの複合フラグメントを、１回目の複合ＰＣＲ産物ＺｍＴＥＬ−ＢおよびＺｍＴＥＬ−Ｃをテンプレートとして、ＺｍＴＥ−Ｂ−ＦおよびＺｍＴＥ−Ｃ−Ｒをプライマーとして用いるＰＣＲにより作製した。この複合フラグメントをＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩにより消化し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化したフラグメントＺｍＴＥＬ−Ａとともに、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩで予め消化したプラスミドｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０にライゲーションした。ＺｍＴＥＬ−Ａがベクターと正しい配向性で連結したクローンを選択し、ｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０−ＺｍＴＥＬ（図５）と名付けた。トウモロコシＺｍＴＥＬ遺伝子のポリヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５として示される。
【０１３１】
（実施例３）イネ形質転換
アグロバクテリウム媒介方法によるイネ形質転換は当技術分野において周知である。例えば、そのすべてを本明細書に参照により組み入れる、Ｈｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３５：２０５−２１８；Ｈｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ６：２７１−２８２；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １：２７９６−２８０２を参照されたい。
【０１３２】
実施例２に記載したように構築された４つのベクターを、アグロバクテリウム媒介形質転換方法（Ｌｕ  ＆  Ｇｏｎｇ（１９９８）Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０：１２５−１３１  ａｎｄ  Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  １：１０８−１１５）を用いて「Ｘｉｕｓｈｕｉ１３４」に形質転換した。手順はグリホサート耐性遺伝子を選択マーカーとして含めるよう少し変更した。「Ｘｉｕｓｈｕｉ１３４」の成熟種子から誘導したカルスをレシピエントとして用いた。それぞれｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０−ＯｓＴＥＬ、ｐＣａｍｂｉａ１３００−Ｇ１０−ＯｓＴＥＬ、ｐＣａｍｂｉａ１３００−Ｇ１０−ｐ３５Ｓ−ＯｓＴＥＬおよびｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０−ＺｍＴＥＬ１のバイナリーベクターを含有するＥＨＡ４４０４の単クローンを、カルスを感染させるため別々に培養した。用意したカルスを１００μＭのアセトシリンゴンを含有する細菌細胞懸濁液（ＯＤ５９５で０．４）に浸漬し、３０分間（ときどき振盪しながら）共培養した。次に、カルスを共培養培地に移し、暗室で２〜３日間２８℃でインキュベートした。共培養後、カルスを無菌水ですすぎ、次に適切な濃度のハイグロマイシンを有する選択的培地において２か月間２８℃で暗培養した（中期に入ったら連続的に培養した）。選択後、勢いよく成長する形質転換カルスを予備分化培地に移し、約１０日間インキュベートした。次に、予備分化したカルスを分化培地に移し、分化および発芽のため３０℃、１６時間の光周期でインキュベートした。２〜３週間後、耐性のある再生中の小植物を、生育、活性化および発根のため０．１ｍｇ／Ｌのグリホサートを含有する発根培地に移した。よく成長した再生小植物を洗浄し、寒天を除去し、同定のため温室において水中に移植した。このパートに記載した培地の特定の成分は付録１に示す。
【０１３３】
（実施例４）収量増大についての形質転換イネの分析
Ｔ−ＤＮＡベクターｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０−ＯｓＴＥＬ、ｐＣａｍｂｉａ１３００−Ｇ１０−ＯｓＴＥＬ、ｐＣａｍｂｉａ１３００−Ｇ１０−ｐ３５Ｓ−ＯｓＴＥＬ、およびｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０−ＺｍＴＥＬを、アグロバクテリウム媒介形質転換を用いる形質転換イネＸＳ１３４（ジャポニカ種）に用いた。各構築物について少なくとも１００個の独立した形質転換イベントが得られた。各構築物について次の表現型の１つ以上を示すイベントがあった：高い草丈、大きい種子、少ない分げつ数、および大きい稈径。多くのイベントが種子を生産し、その平均重量は対照植物からの種子の平均重量より３０％、４０％、５０％、および６０％大きかった。表４は異なる構築物に見られた表現型をまとめる。
【０１３４】
【表４】
2015500651.tif 000006
【０１３５】
結果は、その発現が各種プロモーターの制御下にある場合、ＯｓＴＥＬが収量を増大させることができることを示した。天然プロモーターおよび構成的プロモーターの両方が作用した。さらに、ＯｓＴＥＬまたはＺｍＴＥＬ遺伝子の下流のＣａＭＶ３５Ｓエンハンサーは形質転換イベントにおける表現型の頻度を増加させる。また、イネにおけるトウモロコシからの異種ＴＥＬ遺伝子の発現は、イネからの内因性プロモーターと同様にイネ収量を増大させることができる。
【０１３６】
ｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０−ＯｓＴＥＬで形質転換したイベントＯｓＸ−２は、同じ播種条件および播種密度下で非形質転換対照植物と比較して１８．６％の収量増加を示した。
【０１３７】
（実施例５）トウモロコシ形質転換および形質転換トウモロコシの分析
１）トウモロコシ形質転換
アグロバクテリウム媒介方法によるトウモロコシ形質転換はよく構築されている（Ｆｒａｍｅ  ｅｔ  ａｌ．２００２，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２９：１３−２２）。この実験では選択剤としてグリホサートを用いた。簡潔に、それぞれＴ−ＤＮＡ構築物ｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０−ＺｍＴＥＬおよびｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０−ＯｓＴＥＬを含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株を調製し、トウモロコシ胚を受粉の８〜１０日後に形質転換した（長さ１．０〜１．５ｍｍ）。胚を２〜３日間２２℃でアグロバクテリウムとインキュベートした後、２００ｍｇ／Ｌのチメンチンを含有するカルス誘導培地へ移した。１０〜１４日間２８℃での暗培養後、２ｍＭのグリホサートを含有する選択培地へカルスを移し、２〜３週間２８℃で培養を続けた。新しくしたグリホサート選択培地でさらに２〜３週間培養後、生き残ったカルスを再生培地へ移し、１０〜１４日間培養した後、新鮮な再生培地へ移し、さらに１０日〜１４日間培養した。発生したシュートを、次は０．１ｍＭのグリホサートを含有する発根培地へ移した。生き残った小植物を生育および種子生産のため温室へ移した。
【０１３８】
２）形質転換トウモロコシの分析
ｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０−ＺｍＴＥＬおよびｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０−ＯｓＴＥＬのそれぞれについて約１２０個のイベントが得られた。両構築物からの約８０個のイベントは次の表現型の１つ以上を示した：早く力強い成長；高い草丈；大きな穂；および大きな粒（図１２）。
【０１３９】
ｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０−ＺｍＴＥＬで形質転換されたイベントＴＥ１３およびＴＥ３１は、対照トウモロコシ植物より２５．５％および２１．９％大きな、穂当たりの重量を示した。ＺｍＴＥＬ遺伝子発現のリアルタイムＰＣＲ分析は、ＺｍＴＥＬの発現がＴＥ１３およびＴＥ３１の両方において顕著に増大したことを示した。ＴＥ１３およびＴＥ３１両方におけるＺｍＴＥＬのｍＲＮＡの量は、開花期に対照植物の葉に見られるレベルの約４０倍だった。
【０１４０】
（実施例６）異なる植物種からのＴＥＬ遺伝子のクローニングおよびベクター構築
異なる植物の遺伝子のデータベースを検索して見つけたＴＥＬと相同な遺伝子の分析に基づき、ＴＥＬ遺伝子ホモログのクローニングのためのＰＣＲプライマーを設計した（表５に示される）。テンプレートおよび適切なプライマーとして異なる植物のゲノムを用い、プロモーター領域、コード配列、およびターミネーターを含む全長ＴＥＬ遺伝子を、さま各種植物からのＰＣＲによって別々に増幅させた。植物ゲノム抽出の技術は前に説明されている（Ａｌｌｅｎ  ＧＣ  ｅｔ  ａｌ．２００６，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１：２３２０−２３２５）。ＰＣＲ反応は、本質的には実施例１に記載したような、標準的な手順に従って行った。
【０１４１】
【表５】
2015500651.tif 000007
【０１４２】
ワタからのＴＥＬ相同遺伝子のクローニング：
配列アラインメントによってオンラインで公開されているゴシピウム・レモンディ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｒａｉｍｏｎｄｉｉ）のゲノムからＴＥＬの２つの相同遺伝子を見出した。２対のプライマーＧｈＴＥＬ１−Ｆ／ＧｈＴＥＬ１−ＲおよびＧｈＴＥＬ２−Ｆ／ＧｈＴＥＬ２−Ｒ（表５参照）を、これらの２つ遺伝子の配列に基づき設計した。地方産のワタ種ゴシピウム・ヒルスツム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）のゲノムＤＮＡをテンプレートとして用い、それぞれプライマー対ＧｈＴＥＬ１−Ｆ／ＧｈＴＥＬ１−ＲおよびＧｈＴＥＬ２−Ｆ／ＧｈＴＥＬ２−ＲでのＰＣＲによってＧｈＴＥＬ１およびＧｈＴＥＬ２の２つのＴＥＬ  ＤＮＡフラグメントを増幅させた。プロモーター、コード領域、およびターミネーターを含む得られたＤＮＡフラグメントをそれぞれｐＧｈＴＥＬ１−ＧｈＴＥＬ１−ｔｅｒおよびｐＧｈＴＥＬ２−ＧｈＴＥＬ２−ｔｅｒとした（配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９に示される）。
【０１４３】
ｐＧｈＴＥＬ１−ＧｈＴＥＬ１−ｔｅｒの端をＰＣＲによってＰｓｔＩおよびＫｐｎＩ部位に別々に固定した。同様にＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩ部位をｐＧｈＴＥＬ２−ＧｈＴＥＬ２−ｔｅｒの端に付加した。ｐＧｈＴＥＬ１−ＧｈＴＥＬ１−ｔｅｒフラグメントをＰｓｔＩおよびＫｐｎＩの二重酵素消化により切断した後、そのＰｓｔＩおよびＫｐｎＩの間でプラスミドｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０にクローニングし、新たなプラスミドｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０−ＧｈＴＥＬ１を作製し、そのＴ−ＤＮＡ構造は図６（Ａ）に示した。同様に、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩを用い、ｐＧｈＴＥＬ２−ＧｈＴＥＬ２−ｔｅｒフラグメントを二重消化した後、ｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０のＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩ部位にクローニングし、ベクターｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０−ＧｈＴＥＬ２を作製し、そのＴ−ＤＮＡ構造は図６（Ｂ）に示した。
【０１４４】
シロイヌナズナからのＴＥＬ遺伝子のクローニング：
配列アラインメントによってＴＥＬの２つの相同遺伝子をシロイヌナズナのゲノム（オンライン公開）から見出した。２対のプライマーＡｔＴＥＬ１−ＦとＡｔＴＥＬ１−ＲおよびＡｔＴＥＬ２−ＦとＡｔＴＥＬ２−Ｒ（表５参照）をこの２つの遺伝子の配列に基づき設計した。シロイヌナズナのゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いた。ＡｔＴＥＬ１およびＡｔＴＥＬ２の２つのＴＥＬ−１様遺伝子を、それぞれＡｔＴＥＬ１−ＦとＡｔＴＥＬ１−ＲおよびＡｔＴＥＬ２−ＦとＡｔＴＥＬ２−Ｒのプライマー対でのＰＣＲによって増幅させた。プロモーター、コード領域、およびターミネーターを含む得られたＤＮＡフラグメントをそれぞれｐＡｔＴＥＬ１−ＡｔＴＥＬ１−ｔｅｒおよびｐＡｔＴＥＬ２−ＡｔＴＥＬ２−ｔｅｒとし、その配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３に示した。
【０１４５】
ｐＡｔＴＥＬ１−ＡｔＴＥＬ１−ｔｅｒの両端をＰＣＲによってＫｐｎＩ部位で固定した。ｐＡｔＴＥＬ１−ＡｔＴＥＬ１−ｔｅｒフラグメントをＫｐｎＩにより消化した後、ｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０のプラスミドにそのＫｐｎＩ部位で挿入した。新たなプラスミドｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０−ＡｔＴＥＬ１を作製し、そのＴ−ＤＮＡ構造は図７（Ａ）に示す。同様にＨｉｎｄＩＩＩ部位をｐＡｔＴＥＬ２−ＡｔＴＥＬ２−ｔｅｒの両端に付加した。ＨｉｎｄＩＩＩが消化したフラグメントｐＡｔＴＥＬ２−ＡｔＴＥＬ２−ｔｅｒをプラスミドｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０にそのＨｉｎｄＩＩＩ部位で挿入した。得られたベクターはｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０−ＡｔＴＥＬ２であり、そのＴ−ＤＮＡ構造は図７（Ｂ）に示した。
【０１４６】
ブラッシカからのＴＥＬ遺伝子のクローニング：
配列のブラスト検索によって１つのＴＥＬ遺伝子をブラッシカ・ラパのゲノムから見出した。ＢｒＴＥＬ遺伝子をＰＣＲクローニングのため２つの部分に分け、１つ（ＢｒＴＥＬ−Ａ）はプロモーターおよびコード領域の一部を含み、もう１つ（ＢｒＴＥＬ−Ｂ）はコード領域の残りの部分およびターミネーターを含む。２対のプライマー、ＢｒＴＥＬ−Ｆ／ＢｒＴＥＬ−ＭＲおよびＢｒＴＥＬ−ＭＦ／ＢｒＴＥＬ−Ｒ（表５）をＢｒＴＥＬ遺伝子に基づき設計した。ブラッシカ・ラパのゲノムＤＮＡからＢｒＴＥＬ−ＡおよびＢｒＴＥＬ−ＢをそれぞれＢｒＴＥＬ−Ｆ／ＢｒＴＥＬ−ＭＲおよびＢｒＴＥＬ−ＭＦ／ＢｒＴＥＬ−Ｒのプライマー対で別々に増幅させた。
【０１４７】
ＰＣＲにより、ＢｒＴＥＬ−Ａの端をそれぞれＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ部位で固定した。同時に、ＢｒＴＥＬ−Ｂの端をそれぞれＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩ部位で固定した。ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ二重消化ＢｒＴＥＬ−ＡおよびＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ二重消化ＢｒＴＥＬ−Ｂを次に、３重ライゲーションでｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０のプラスミドにＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩの間でクローニングした。ベクターｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０−ＢｒＴＥＬを構築し、そのＴ−ＤＮＡ構造を図８に示した。クローンＢｒＴＥＬ遺伝子の全ヌクレオチド配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５として示した。
【０１４８】
コムギからのＴＥＬ遺伝子のクローニング：
コムギにおけるＴＥＬ遺伝子の検索およびＰＣＲプライマー設計の方法は上述したものと同じだった。コムギＴａＴＥＬ遺伝子をＰＣＲ増幅のため２つの部分に分け、１つ（ＴａＴＥＬ−Ａ）はプロモーターおよびコード領域の一部を含み、もう１つ（ＴａＴＥＬ−Ｂ）はコード領域の残りの部分およびターミネーターを含む。２対のプライマー、ＴａＴＥＬ−Ｆ／ＴａＴＥＬ−ＭＲおよびＴａＴＥＬ−ＭＦ／ＴａＴＥＬ−Ｒ（表５）を設計し、それぞれＴａＴＥＬ−Ｆ／ＴａＴＥＬ−ＭＲおよびＴａＴＥＬ−ＭＦ／ＴａＴＥＬ−Ｒのプライマー対でコムギのゲノムからＴａＴＥＬ−ＡおよびＴａＴＥＬ−Ｂを別々に増幅させた。
【０１４９】
ＰＣＲを用い、ＴａＴＥＬ−Ａの端をそれぞれＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｐａＬＩ部位で固定した。同時に、ＴａＴＥＬ−Ｂの端をそれぞれＡｐａＬＩおよびＫｐｎＩ部位で固定した。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｐａＬＩにより二重消化されたＴａＴＥＬ−ＡならびにＡｐａＬＩおよびＫｐｎＩにより二重消化されたＴａＴＥＬ−Ｂを次に、３重ライゲーションでｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０のプラスミドにＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩ部位の間でクローニングした。得られたベクターｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０−ＴａＴＥＬを構築し、そのＴ−ＤＮＡ構造を図９に示した。クローンＴａＴＥＬ遺伝子の全ヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９として示す。
【０１５０】
ダイズからのＴＥＬ遺伝子のクローニング：
ダイズゲノムには２つのＴＥＬ遺伝子がある。２つの遺伝子を、それぞれＧｍＴＥＬ１−Ｆ／ＧｍＴＥＬ１−ＲおよびＧｍＴＥＬ２−Ｆ／ＧｍＴＥＬ２−Ｒ（表５参照)のプライマー対でＰＣＲを用い、ダイズのゲノムＤＮＡから増幅させた。それらのプロモーター領域、コード領域、およびターミネーターを含む得られたＤＮＡフラグメントを、それぞれｐＧｍＴＥＬ１−ＧｍＴＥＬ１−ｔｅｒおよびｐＧｍＴＥＬ２−ＧｍＴＥＬ２−ｔｅｒとし、それらの全ヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示す。
【０１５１】
両フラグメントの端をＰＣＲによってＳａｌＩ部位で固定した。フラグメントｐＧｍＴＥＬ１−ＧｍＴＥＬ１−ｔｅｒをＳａｌＩで消化した後、プラスミドｐＣａｍｂｉａ  １３００−３５Ｓ−Ｇ１０にそのＳａｌＩ部位で挿入した。結果、植物形質転換ベクターｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０−ＧｍＴＥＬ１が構築され、そのＴ−ＤＮＡ構造を図１０（Ａ）に示す。同様に、ＨｉｎｄＩＩＩ  ｓｉｔｅおよびＳａｌＩ部位をそれぞれｐＧｍＴＥＬ２−ＧｍＴＥＬ２−ｔｅｒの端に付加した。ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ二重消化フラグメントｐＧｍＴＥＬ２−ＧｍＴＥＬ２−ｔｅｒをプラスミドｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０にそのＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩ部位の間で挿入した。得られたベクターはｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０−ＧｍＴＥＬ２であり、そのＴ−ＤＮＡ構造は図１０（Ｂ）に示す。
【０１５２】
上で概説した技術的手順または当技術分野において知られる同等の手順を用い、ＴＥＬ遺伝子ホモログは、これらに限定されないが、単子葉植物、双子葉植物、被子植物、および裸子植物を含むいずれかの植物種から単離および特性解析することができる。目的の植物の例としては、これらに限定されないが、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科植物、トウガラシ、ジャガイモ、ワタ、イネ、ダイズ、サトウダイコン、サトウキビ、タバコ、オオムギ、ナタネ、アブラナ属、アルファルファ、ライムギ、キビ、ベニバナ、ピーナッツ、サツマイモ、キャッサバ、コーヒー、ココナッツ、パイナップル、柑橘類、ココア、茶、バナナ、リンゴ、ナシ、モモ、アボカド、イチジク、グアバ、マンゴー、オリーブ、パパイヤ、カシュー、マカダミア、アーモンド、カラスムギ、野菜、観葉植物、および針葉樹が挙げられる。
【０１５３】
野菜としては、これらに限定されないが、トマト、レタス、サヤインゲン、アオイマメ、エンドウマメ、キュウリ属のメンバー、例えばキュウリ、カンタループ、およびマスクメロンが挙げられる。観葉植物としては、これらに限定されないが、アザレア、アジサイ、ハイビスカス、バラ、チューリップ、スイセン、ペチュニア、カーネーション、ポインセチア、およびキクが挙げられる。好適には、本発明の植物は作物植物（例えば、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科植物、トウガラシ、ジャガイモ、ワタ、イネ、ダイズ、サトウダイコン、サトウキビ、タバコ、オオムギ、ナタネ、等）、ならびにエネルギー作物、例えば、これらに限定されないが、スイッチグラス、アルンド、カメリア、ジャトロファ、およびススキである。
【０１５４】
（実施例７）植物からのＴＥＬ遺伝子の配列分析
データベースを検索し、ＰＣＲベースのクローニングを用いることにより、さまざまな植物種から推定Ｍｅｉ２様遺伝子を得た。これらのＴＥＬ遺伝子のエンコードされたアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、および４６に挙げている。上で挙げたように、データベースにおいて同定することができる各種植物からのＡＭＬ遺伝子はたくさんある。選択されたＡＭＬタンパク質およびＴＥＬタンパク質のアミノ酸配列アラインメントに基づきＶｅｃｔｏｒＮＴにより系統樹を構築した（図１）。系統樹には２つの異なるグループ、ＡＭＬグループおよびＴＥＬグループがある。従って、植物からのＴＥＬ遺伝子およびＡＭＬ遺伝子は、それらのアミノ酸配列に基づく系統樹分析により区別することができる。
【０１５５】
さまざまな植物種から発見されたＴＥＬタンパク質は互いに顕著な類似性を共有する。しかしながら、植物からのＴＥＬタンパク質のもっとも保存される部分はＲＲＭ３領域（図２）である。ＡＭＬタンパク質と比較して、ＴＥＬタンパク質のもっとも驚くべき特性の２つは、ＲＲＭ３ドメイン内のＴＥＬ特異的モチーフの追加の領域（図２）およびＲＲＭ３のＣ末端外の保存要素（図２）である。ＡＭＬタンパク質および酵母Ｍｅｉ２タンパク質はこれらの２つの特性のいずれも有さない。興味深いことに、Ｏ・タウリからのＭｅｉ２様タンパク質は保存Ｃ末端ＴＥＬ配列モチーフを含有するが、ＲＲＭ３ドメイン内にＴＥＬ特異的モチーフは有さない。Ｏ・タウリは海洋緑藻の単細胞種であり、プラシノ藻綱に属し、緑色植物系列のなかでも早くに分化した種類である。同様に、Ｏ・タウリからのＭｅｉ２様タンパク質は、近代植物のＴＥＬおよびＡＭＬタンパク質両方の共通の祖先を代表している。
【０１５６】
ＲＲＭ３および保存領域外のそのＣ末端の一部からなるモチーフ（イネＴＥＬにおけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）は異なる植物ＴＥＬタンパク質間でも高度に保存される。異なる植物種からの異なるＴＥＬタンパク質間でのこのモチーフの配列同一性は６８％以上である。イネＴＥＬからのこのモチーフはＯ・タウリＭｅｉ２様タンパク質からのモチーフと５９％の同一性を共有する。しかしながら、このモチーフはいずれかの植物ＡＭＬタンパク質からのいずれのモチーフとも５８％未満のアミノ酸配列同一性を共有する。
【０１５７】
酵母Ｍｅｉ２タンパク質のＲＲＭ３ドメインは機能にとって重要なドメインである。よって、植物ＴＥＬタンパク質のＲＲＭ３は収量向上においても重要な役割を果たし得る。しかしながら、ＲＲＭ３のみが形質転換イネ研究においてＴＥＬ機能を保持していない。よって、ＲＲＭ３ドメインに加えて、ＲＲＭ３のＣ末端外の保存領域もその生物学的機能にとって重要であり得る。
【０１５８】
（実施例８）植物ＴＥＬタンパク質に対する抗体の作製およびＴＥＬタンパク質検出におけるそれらの使用
ＯｓＴＥＬタンパク質の全長をエンコードするｃＤＮＡを、プライマーＯｓＴＥＬ−ｆ （５’ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＧＧＡＡＧＧＡＧＧＴＧＧＧＡＧＴＧＧＣ）およびＯｓＴＥＬ−ｒ（５’ＣＴＣＧＡＧＣＴＡＧＴＣＡＧＴＧＴＡＧＣＣＴＡＧＧＣＧＣＴＧＴＡＧＣ）を用いるＰＴ−ＰＣＲにより得た。ＰＣＲ産物を、制限酵素部位ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩを用いてｐＥＴ３２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングし、発現ベクターｐＥＴ３２ｂ−ＯｓＴＥＬを得た。ｃＤＮＡ配列を完全に決定し（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６）、大腸菌における発現に用いた。発現したタンパク質はその後精製し、杭州市にある抗体作製会社がウサギ免疫するのに用いた。
【０１５９】
得られた抗血清を用い、追加のＯｓＴＥＬ遺伝子を発現する形質転換イネおよび内因性ＯｓＴＥＬ発現のみを有する非形質転換イネの両方においてＯｓＴＥＬタンパク質を検出した。意義深いことに、形質転換イネ株ではより多くのＯｓＴＥＬタンパク質が検出された。
【０１６０】
（実施例９）キャノーラの遺伝子形質転換
アブラナ形質転換の技術は当技術分野において周知である。アブラナの子葉、胚軸および茎はすべて、さまざまな研究者により形質転換の標的組織として用いられてきた。例えば、Ｍｏｌｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）は、子葉ペチオールの切断端はアグロバクテリウムバイナリーベクターを用いて容易に形質転換されることを見出した。Ｐｕａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）は、最大１０％の形質転換率の茎部の再生系を開発した。Ｍｏｌｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）は、標的組織としてペチオールを用い、形質転換率を５５％まで上げた。
【０１６１】
本明細書において用いたアブラナ形質転換の詳細な手順は以下のとおりである。アブラナの種子を０．５％の塩化第二水銀を用いて１０分間殺菌した後、無菌水で３〜４回洗浄し、ＭＳ培地（３０ｇ／Ｌスクロースおよび６ｇ／Ｌ寒天）でインキュベートした。暗室で２日間インキュベート後、種子を明１６時間：暗８時間の光周期のインキュベーターへ移した。６〜８日後、無菌幼苗の胚軸を遺伝子形質転換のレシピエントとして切り落とした。胚軸を予備インキュベーション固体ＭＳ培地（１．０ｍｇ／Ｌ２．４−Ｄ、１．０ｍｇ／Ｌ６ＢＡ、３０ｇ／Ｌスクロース、および６ｇ／Ｌ寒天）へ移し、７２時間暗室でインキュベートした。予備インキュベートした胚軸を、ｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０−ＢｒＴＥＬのプラスミドを含有するアグロバクテリウムの細胞懸濁液に８〜１０分間浸漬した後、固体ＭＳ培地（１．０ｍｇ／Ｌ２．４−Ｄ、１．０ｍｇ／６ＢＡ、１００ＭＡ、３０ｇ／Ｌスクロース、および６ｇ／Ｌ寒天）（過剰なアグロバクテリウム懸濁液を、無菌吸収紙を用いて吸収後）へ移し、その後４８時間暗室で培養した。
【０１６２】
５００ｍｇ／Ｌのセファログリシンを含有する無菌水で洗浄後、共インキュベートした胚軸を選択的固体ＭＳ培地（１．０ｍｇ／Ｌ２．４−Ｄ、１．０ｍｇ／Ｌ６ＢＡ、１２ｍＭグリホサート、５００ｍｇ／Ｌセファログリシン、３０ｇ／Ｌスクロース、および８ｇ／Ｌｃａｎａｋｅｏ）上に移し、少なくとも１４日間光に当てながら培養後、分化固体ＭＳ培地（２．０ｍｇ／ＬＺＴ、４．０ｍｇ／Ｌ６ＢＡ、５ｍｇ／ＬＡｇＮＯ３、１２ｍＭグリホサート、５００ｍｇ／Ｌセファログリシン、３０ｇ／Ｌスクロース、および８ｇ／Ｌｃａｎａｋｅｏ）上で、耐性苗が育つまで２週間毎に培地を替えながら連続的に二次明培養した。耐性苗を茎分化固体ＭＳ培地（２．０ｍｇ／ＬＺＴ、３．０ｍｇ／Ｌ６ＢＡ、５ｍｇ／ＬＡｇＮＯ３、２ｍＭグリホサート、５００ｍｇ／Ｌセファログリシン、３０ｇ／Ｌスクロース、および８ｇ／Ｌｃａｎａｋｅｏ）へ移し、光に当てながらキュベートした。茎が１ｃｍまで伸びたら切り、発根固体ＭＳ培地（０．２ｍｇ／ＬＩＢＡ、３０ｇ／Ｌスクロース、および８ｇ／Ｌｃａｎａｋｅｏ）で茎から根が出るまで７日間インキュベートした。
【０１６３】
（実施例１０）ダイズ形質転換
本明細書において用いた形質転換ダイズを得る手順は現行の技術（Ｄｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ３４：３８１−３８７；Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｓｃｉｅｎｔｉａ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａ  Ｓｉｎｉｃａ  ４１：６６１−６６８；Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ３２：３１３−３１９）である。健康で丸々と成熟したダイズを選択し、８０％エタノールで２分間殺菌し、無菌水で洗浄し、塩素（５０ｍｌのＮａＣｌＯおよび２ｍＬの濃ＨＣｌの化学反応で生成）で満たした乾燥機で４〜６時間殺菌した。殺菌したダイズをＢ５培地に播き、２５℃で５日間９０〜１５０μｍｏｌの光子ｍ−２ｓ−１の光強度でインキュベートした。子葉が緑色になり種子の殻が割れたら、無菌の発芽豆を取り出した。上胚軸および胚軸を取った発芽豆を縦半分に切り、２つの外植片と上胚軸および胚軸を得た。外植片に上胚軸および胚軸の節で７〜８回傷をつけ、インフェクションの標的組織として用いた。
【０１６４】
ベクターｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０−ＧｍＴＥＬ１およびｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０−ＧｍＴＥＬ２を含有するアグロバクテリウムの単一コロニーを別々に培養して用いた。用意した外植片をアグロバクテリウム細胞懸濁液に３０分間浸漬した。次に感染した組織を、過剰な細胞懸濁液をきれいな無菌ろ紙で除去した後の１／１０Ｂ５共培養培地に移し、２５℃で３〜５日間暗室でインキュベートした。
【０１６５】
共培養した組織をＢ５液媒で洗浄し、アグロバクテリウムを除去した後、固体Ｂ５培地に入れ、発芽のため５日間２５℃でインキュベートした。発芽した組織を０．１〜０．５ｍＭのグリホサートを含有する選択的Ｂ５培地へ移し、２５℃で光に当てながら４週間、２週間毎に培地を替えてインキュベートした。選択された幼芽組織を光に当てながら２５℃での生育培養のため固体ＭＳ培地に移した。次に、形質転換幼苗は発根培養のため１／２Ｂ５培地へ移した。最後に、作製された小植物を洗浄して寒天を除去し、さらなる特性解析のため温室に植えた。
【０１６６】
（実施例１１）内因性遺伝子の近くへのエンハンサーの挿入によるＴＥＬ遺伝子発現の増大
遺伝子学では、エンハンサーは、遺伝子集団における遺伝子の転写レベルを（その名のとおり）向上させるための、タンパク質と結合することができるＤＮＡの短い領域（すなわち、転写因子にかなり近い、トランス作用性因子）である。エンハンサーは通常シス作用性であるが、作用する遺伝子にとくに近づく必要はなく、場合によっては同じ染色体上にある必要もない（Ｓｐｉｌｉａｎａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  ４３５（７０４２）：６３７-４５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０３５７４．ＰＭＩＤ１５８８０１０１）。エンハンサーは制御する遺伝子の上流または下流に位置していてもよい。さらに、エンハンサーは、出発部位の塩基対数十万個分も上流または下流に位置するものがいくつか見出されているように、転写に影響を与えるために転写開始部位の近くに位置する必要はない。エンハンサーはプロモーター領域自体には作用しないが、アクチベータータンパク質に結合される。これらのアクチベータータンパク質は、ポリメラーゼＩＩおよび一般的な転写因子をリクルートし、遺伝子の転写を開始するメディエーター複合体と相互作用する。エンハンサーはイントロン内で見ることもできる。エンハンサーの配向性はその機能に影響することなく逆でさえあり得る。加えて、エンハンサーは染色体のどこで消費および挿入してもよく、遺伝子転写に依然として影響を及ぼす。
【０１６７】
ＴＡＬＥＮ法により、トウモロコシのＴＥＬ遺伝子の下流の領域を選択し、二重３５Ｓエンハンサーを含有する発現カセットを挿入した。標的領域は：Ｃｔｇｔｔｔａｔａｃａａｇａｇｃｃｃｔａｔｃａａｔｇａｔｇｇｃｃｔａａａｔａｃｇｇａｇａｃｔａｃｔａｇａｔｃａａｃｔａａｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８）とした。他の近くの領域もエンハンサー挿入には十分である。Ｇ１０ｅｖｏ遺伝子（ＥＰＳＰＳ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）の発現カセットは、２つの３５Ｓエンハンサーを含有する二重３５Ｓプロモーターを有する。Ｇ１０ｅｖｏＥＰＳＰシンターゼは形質転換の選択性マーカーとしてグリホサート耐性をもたらすが、３５Ｓプロモーターは隣接する領域に位置するＴＥＬ遺伝子の発現を増大させるエンハンサーエレメントをもたらす。
【０１６８】
形質転換ベクターを構築するため、Ｇ１０ｅｖｏ発現カセットおよびトウモロコシにおける標的配列のどちらの側にも隣接する配列を含むＤＮＡフラグメントを構築した（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）。このフラグメントはその端にＸｈＩ部位およびＫｐｎＩ部位を有し、同じ２つの酵素、ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩで予め消化したｐＣａｍｂｉａ１３００にクローニングした。得られたベクターはｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０−Ｒｅｃとした。
【０１６９】
トウモロコシゲノムにおいて標的化された配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８）はＴＥＬ遺伝子の約３ｋｂ下流である。この標的配列に基づき、１対のデザイナーＴＡＬＥＮ、ＴＡＬＥＮ−ＦおよびＴＡＬＥＮ−Ｒを設計および合成する。ＴＡＬＥＮ−ＦおよびＴＡＬＥＮ−Ｒの発現カセットをそれぞれＣａＭＶ３５Ｓプロモーターおよびイネアクチンプロモーターを用いて構築する。ＴＡＬＥＮ−ＬおよびＴＡＬＥＮ−Ｒを含有する発現カセットのＤＮＡ配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１に示す。その端にＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を有するＴＡＬＥＮ−ＦカセットのＤＮＡフラグメント、ならびにその端にＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩ制限部位を有するＴＡＬＥＮ−ＲカセットのＤＮＡフラグメントは３重ライゲーションでＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩにより予め消化したｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０−Ｒｅｃにライゲーションする。得られたベクターｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０−Ｒｅｃ−ＴＡＬＥＮ−ＦＲは、ＴＡＬＥＮ−ＦおよびＴＡＬＥＮ−Ｒの両方の発現カセットを含有する（図１０）。
【０１７０】
ｐＣａｍｂｉａ１３００−３５Ｓ−Ｇ１０−Ｒｅｃ−ＴＡＬＥＮ−ＦＲをアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４に形質転換し、トウモロコシを形質転換するのに用いる。２ｍＭのグリホサートを含有する選択培地をカルス培養選択に用いる。得られた形質転換トウモロコシ植物をＰＣＲ法により標的領域に正しく挿入されたイベントについてスクリーニングする。
【０１７１】
当技術分野において知られる標的化遺伝子挿入の他の方法を用い、転写エンハンサーを所望の植物種のＴＥＬ遺伝子の近くの領域に導入することができる。このようにして、内因性遺伝子の発現を通常の内因性のレベルを超えて増加させ、植物活力の増大および収量の増加をもたらすことができる。収量を増大させるこの方法は単独で、または活力および／または収量が増加した植物を作製するように異種遺伝子と組み合わせて用いることができる。
【０１７２】
以下の配列を配列表に含める。
【０１７３】
【表６】
2015500651.tif 000008
【０１７４】
本発明は分子生物学、生物化学および組織培養学における多くの技術を用いた。これらの技術は当技術分野において利用可能である。技術の詳細な方法についてはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄ．ｂｙ  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  Ｐｒｅｓ）およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ＥＤ（ｅｄ．ｂｙ  Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）を参照することができる。
【０１７５】
本明細書に記載したすべての文献および特許文献は当業者のレベルを示すものである。すべての文献および特許文献は本明細書に参照により、各個別の文献または特許文献が具体的にかつ個別に本明細書に参照により組み入れられるのと同じ程度に組み入れられる。
【０１７６】
前述の発明は明確な理解を目的として例示のためいくらか詳細に記載したが、添付の特許請求の範囲内で特定の変更および修正を行うことができることは明らかである。
【図３】
2015500651.tif 000009
【図４（Ａ）】
2015500651.tif 000010
【図４（Ｂ）】
2015500651.tif 000011
【図４（Ｃ）】
2015500651.tif 000012
【図５】
2015500651.tif 000013
【図６（Ａ）】
2015500651.tif 000014
【図６（Ｂ）】
2015500651.tif 000015
【図７（Ａ）】
2015500651.tif 000016
【図７（Ｂ）】
2015500651.tif 000017
【図８】
2015500651.tif 000018
【図９】
2015500651.tif 000019
【図１０（Ａ）】
2015500651.tif 000020
【図１０（Ｂ）】
2015500651.tif 000021
【図１１Ａ】
2015500651.tif 000022
【図１１Ｂ】
2015500651.tif 000023
【図１１Ｃ】
2015500651.tif 000024
【図１２Ａ】
2015500651.tif 000025
【図１２Ｂ】
2015500651.tif 000026
【図１】
2015500651.tif 000027
【図２】
2015500651.tif 000028
【手続補正書】
【提出日】平成26年8月26日(2014.8.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の植物における植物成長および／または収量の増加方法であって、前記方法がＴＥＬ配列と操作可能に連結した植物における発現を駆動するプロモーターを含むＤＮＡ構築物で前記植物を形質転換するステップを含み、前記ＴＥＬ配列が以下の特性の少なくとも１つを有するアミノ酸配列を含むタンパク質をエンコードする、方法：
ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４と少なくとも５８％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列；
ｉｉ）４つの残基Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅの少なくとも３つが前記植物に保存されるＴＥＬ  ＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ３）を有するアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列；
ｉｉｉ）ＲＲＭ３ドメインのＣ末端外にＴＥＬ特異的保存モチーフを含むアミノ酸配列を有し、以下のペプチド中の１０個の残基の少なくとも７個が保存される、前記アミノ酸配列：
Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ／Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ／Ｇｌｕ−Ｎ−Ａｓｐ／Ｇｌｕ−Ｎ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ／Ｖａｌ（Ｎはいずれかの残基を表す）；および
ｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも５８％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列。
【請求項２】
前記ＤＮＡ構築物が、前記プロモーターおよびＴＥＬ配列と操作可能に連結した植物における遺伝子の発現を増大させる少なくとも１つのエンハンサーをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つのエンハンサーが、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）からの３５Ｓエンハンサーである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記プロモーターが、ＴＥＬプロモーターである、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
目的の植物における植物成長および／または収量の増加方法であって、前記方法が、前記少なくとも１つのエンハンサーのゲノムをＴＥＬ遺伝子の約３０ｋｂ以内に組み入れるステップを含む方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つのエンハンサーが、ＣａＭＶからの３５Ｓエンハンサーである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
対照植物と比較して増加したＴＥＬ配列の発現を示す形質転換植物であって、前記植物がそのゲノム中にＴＥＬ配列と操作可能に連結した植物における発現を駆動するプロモーターを含むＤＮＡ構築物を安定に組み入れ、前記ＴＥＬ配列が以下の特性の少なくとも１つを有するアミノ酸配列を含むタンパク質をエンコードする、形質転換植物：
ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４と少なくとも５８％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列；
ｉｉ）４つの残基Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅの少なくとも３つが前記植物に保存されるＴＥＬ  ＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ３）を有するアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列；
ｉｉｉ）ＲＲＭ３ドメインのＣ末端外にＴＥＬ特異的保存モチーフを含むアミノ酸配列を有し、以下のペプチド中の１０個の残基の少なくとも７個が保存される、前記アミノ酸配列：
Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ／Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ／Ｇｌｕ−Ｎ−Ａｓｐ／Ｇｌｕ−Ｎ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ／Ｖａｌ（Ｎはいずれかの残基を表す）；および
ｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも５８％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列。
【請求項８】
前記ＤＮＡ構築物が、前記ＴＥＬ配列と操作可能に連結した植物における遺伝子の発現を増大させる少なくとも１つのエンハンサーをさらに含む、請求項７に記載の形質転換植物。
【請求項９】
前記少なくとも１つのエンハンサーが、ＣａＭＶからの３５Ｓエンハンサーである、請求項８に記載の形質転換植物。
【請求項１０】
前記プロモーターが、ＴＥＬプロモーターである、請求項７〜９のいずれか１項に記載の形質転換植物。
【請求項１１】
対照植物と比較して増加したＴＥＬ配列の発現を示す形質転換植物であって、前記植物が、そのゲノム中に少なくとも１つのエンハンサーを前記ＴＥＬ遺伝子の約３０ｋｂ以内で組み入れられた、形質転換植物。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのエンハンサーが、ＣａＭＶからの３５Ｓエンハンサーである、請求項１１に記載の形質転換植物。
【請求項１３】
請求項７〜１０のいずれか１項に記載の植物からの形質転換種子。
【請求項１４】
請求項１１又は１２に記載の植物からの形質転換種子。
【国際調査報告】
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