(57)【要約】細菌膜標的ドメインなどの少なくとも１つの異種細胞内局在化ドメインに融合されたジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）ポリペプチドの融合タンパク質、このような融合タンパク質を含む改変光合成微生物、ならびにトリグリセリド、脂肪酸、およびワックスエステルなどの脂質を含む、光合成微生物による脂質の生成を向上させるための関連する方法が提供される。本発明の実施形態は、一般に、異種細胞内局在化ドメインに融合されたＤＧＡＴポリペプチドを含むジアシルグリセロールトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）融合ポリペプチドに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種細胞内局在化ドメインに融合されたＤＧＡＴポリペプチドを含むジアシルグリセロールトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）融合ポリペプチド。
【請求項２】
前記細胞内局在化ドメインが前記ＤＧＡＴポリペプチドのＮ末端に融合している、請求項１に記載のＤＧＡＴ融合ポリペプチド。
【請求項３】
前記細胞内局在化ドメインが前記ＤＧＡＴポリペプチドの内部領域に融合している、請求項１に記載のＤＧＡＴ融合ポリペプチド。
【請求項４】
前記内部領域が、前記ＤＧＡＴポリペプチドのＮ末端の約２〜１００個のアミノ酸内に存在する、請求項３に記載のＤＧＡＴ融合ポリペプチド。
【請求項５】
前記内部領域が、前記ＤＧＡＴポリペプチドのＮ末端の約２〜５個のアミノ酸内に存在する、請求項４に記載のＤＧＡＴ融合ポリペプチド。
【請求項６】
前記細胞内局在化ドメインが、チラコイド、小胞、脂肪体、グリコーゲン顆粒、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）体、カルボキシソーム、および／またはシアノフィシン顆粒を標的化するドメインである、請求項１に記載のＤＧＡＴ融合ポリペプチド。
【請求項７】
前記細胞内局在化ドメインが、チラコイド、小胞、脂肪体、グリコーゲン顆粒、ＰＨＢ体、カルボキシソーム、および／またはシアノフィシン顆粒の細胞質側にＤＧＡＴを選択的に局在化する、請求項６に記載のＤＧＡＴ融合ポリペプチド。
【請求項８】
前記細胞内局在化ドメインが、細菌の膜標的ドメインまたは細菌の原形質膜（ＰＭ）標的ドメインである、請求項１に記載のＤＧＡＴ融合ポリペプチド。
【請求項９】
前記膜標的ドメインまたはＰＭ標的ドメインが、前記膜の細胞質側にＤＧＡＴを選択的に局在化する、請求項８に記載のＤＧＡＴ融合ポリペプチド。
【請求項１０】
前記細菌ＰＭ標的ドメインが、細菌原形質膜タンパク質の少なくとも１つのＮ末端シグナル配列のアミン酸配列を含む、請求項８に記載のＤＧＡＴ融合ポリペプチド。
【請求項１１】
前記細菌ＰＭ標的ドメインが、細菌原形質膜タンパク質の少なくとも１つの膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）のアミン酸配列を含む、請求項８に記載のＤＧＡＴ融合ポリペプチド。
【請求項１２】
前記細菌ＰＭ標的ドメインが、細菌原形質膜タンパク質の少なくとも１つのシグナル配列および少なくとも１つの膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）のアミン酸配列を含み、必要に応じて、前記Ｎ末端シグナル配列および前記ＴＭＤが同じ細菌原形質膜タンパク質に由来する、請求項８に記載のＤＧＡＴ融合ポリペプチド。
【請求項１３】
前記細菌原形質膜タンパク質が、細菌原形質膜の細胞質側に局在する少なくとも１つのＣ末端ドメインを有することを特徴とする、請求項１０に記載のＤＧＡＴ融合ポリペプチド。
【請求項１４】
前記細菌膜タンパク質が膜内在性タンパク質（ＩＭＰ）である、請求項１０に記載のＤＧＡＴ融合ポリペプチド。
【請求項１５】
前記ＩＭＰが膜貫通タンパク質（ＴＰ）である、請求項１４に記載のＤＧＡＴ融合ポリペプチド。
【請求項１６】
前記ＩＭＰが膜内在性化学受容体である、請求項１４に記載のＤＧＡＴ融合ポリペプチド。
【請求項１７】
前記膜内在性化学受容体がメチル受容走化性タンパク質（ＭＣＰ）である、請求項１６に記載のＤＧＡＴ融合ポリペプチド。
【請求項１８】
前記ＭＣＰが、シネココッカス・エロンガタスのＰＣＣ７９４２−０８５８またはＰＣＣ７９４２−１０１５によってコードされている、請求項１７に記載のＤＧＡＴ融合ポリペプチド。
【請求項１９】
前記細菌ＰＭ標的ドメインが、本質的にＰＣＣ７９４２−０８５８によってコードされる前記ＭＣＰの前記Ｎ末端シグナル配列および２つの前記Ｎ末端近接ＴＭＤからなる、請求項１８に記載のＤＧＡＴ融合ポリペプチド。
【請求項２０】
前記細菌ＰＭ標的ドメインが、本質的にＰＣＣ７９４２−０８５８によってコードされる前記ＭＣＰのＮ末端の４３〜５３個のアミノ酸からなる、請求項１８に記載のＤＧＡＴ融合ポリペプチド。
【請求項２１】
前記ＤＧＡＴポリペプチドが、アシネトバクター属のＤＧＡＴ、ストレプトマイセス属のＤＧＡＴ、またはアルカニボラクス属のＤＧＡＴである、請求項１に記載のＤＧＡＴ融合ポリペプチド。
【請求項２２】
前記ＤＧＡＴポリペプチドおよび前記細胞内局在化ドメインを分離するペプチドリンカーを含む、請求項１に記載のＤＧＡＴ融合ポリペプチド。
【請求項２３】
前記ペプチドリンカーが生理学的に安定である、請求項２２に記載のＤＧＡＴ融合ポリペプチド。
【請求項２４】
前記ペプチドリンカーが、約１〜２００個のアミノ酸、１〜１５０個のアミノ酸、１〜１００個のアミノ酸、１〜９０個のアミノ酸、１〜８０個のアミノ酸、１〜７０個のアミノ酸、１〜６０個のアミノ酸である、１〜５０個のアミノ酸、１〜４０個のアミノ酸、１〜３０個のアミノ酸、１〜２０個のアミノ酸、１〜１０個のアミノ酸、または１〜５個のアミノ酸長である、請求項２２に記載のＤＧＡＴ融合ポリペプチド。
【請求項２５】
前記ペプチドリンカーが、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、または１００個のアミノ酸長である、請求項２２に記載のＤＧＡＴ融合ポリペプチド。
【請求項２６】
請求項１に記載の前記ＤＧＡＴ融合ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項２７】
前記ポリヌクレオチドが１以上の調節エレメントに作動可能に連結している、請求項２６に記載の単離ポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２８】
前記１以上の調節エレメントが誘導性プロモーターを含む、請求項２７に記載のベクター。
【請求項２９】
請求項１に記載のＤＧＡＴ融合ポリペプチドをコードする１以上の導入ポリヌクレオチドを含む改変光合成微生物。
【請求項３０】
トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）、ワックスエステル（ＷＥ）、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、またはそれらの任意の組み合わせを生成する、請求項２９に記載の改変光合成微生物。
【請求項３１】
さらに、１以上の過剰発現したアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）、アシル−ＡＣＰ合成酵素（Ａａｓ）、またはその両方を含む、請求項２９に記載の改変光合成微生物。
【請求項３２】
さらに、１以上の過剰発現したアシル−アシルキャリアータンパク質（アシル−ＡＣＰ）還元酵素および１以上の過剰発現したアルコール脱水素酵素を含み、トリアシルグリセロールに対して、ワックスエステル、遊離脂肪酸、またはその両方を選択的に生成する、請求項２９に記載の改変光合成微生物。
【請求項３３】
前記過剰発現したアシル−ＡＣＰ還元酵素が、シネココッカス・エロンガタスのＰＣＣ７９４２（ｏｒｆ１５９４）またはシネコシスティス種ＰＣＣ６８０３（ｏｒｆｓｌｌ０２０９）によってコードされる、請求項３２に記載の改変光合成微生物。
【請求項３４】
前記過剰発現したアルコール脱水素酵素が、シネコシスティスのｓｌｒ１１９２またはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｙｌｙｉｉのＡＣＩＡＤ３６１２によってコードされる、請求項３２に記載の改変光合成微生物。
【請求項３５】
内因性アルデヒド脱水素酵素、内因性アルデヒドデカルボニラーゼ、もしくはその両方をコードする１以上の遺伝子の発現および／または活性を低下させることを含む、請求項２９に記載の改変光合成微生物。
【請求項３６】
前記光合成微生物が、シネココッカス・エロンガタスのＰＣＣ７９４２であり、前記アルデヒド脱水素酵素がｏｒｆ０４８９によってコードされ、前記アルデヒドデカルボニラーゼがｏｒｆ１５９３によってコードされている、請求項３５に記載の改変光合成微生物。
【請求項３７】
前記ＤＧＡＴ融合ポリペプチドをコードする導入ポリヌクレオチドが、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている、請求項２９に記載の改変光合成微生物。
【請求項３８】
前記改変光合成微生物がシアノバクテリアである、請求項２９に記載の改変光合成微生物。
【請求項３９】
前記シアノバクテリアがシネココッカス・エロンガタスである、請求項３８に記載の改変光合成微生物。
【請求項４０】
前記改変されたシアノバクテリアは、異なる方法で改変されたシアノバクテリアと比較して成長が増加しているか、かつ／または細胞毒性が低下しており、前記異なる方法で改変されたシアノバクテリアは、対応するＤＧＡＴを発現するが、異種の細胞内局在化ドメインに融合されたＤＧＡＴは発現しない、請求項３８に記載の改変光合成微生物。
【請求項４１】
前記異なる方法で改変されたシアノバクテリアが野生型ＤＧＡＴを発現する、請求項４０に記載の改変光合成微生物。
【請求項４２】
請求項１に記載のＤＧＡＴ融合ポリペプチドをコードする単離したポリヌクレオチドを前記光合成微生物に導入することを含む、光合成微生物を改変するための方法。
【請求項４３】
請求項２９に記載の改変光合成微生物を培養することを含む、脂質生成の方法。
【請求項４４】
前記培養が、前記ＤＧＡＴ融合ポリペプチドの発現を誘導することを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
トリアシルグリセロール、ワックスエステル、遊離脂肪酸、またはそれらの任意の組み合わせの生成を含む、請求項４３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１２年３月９日出願の、「修飾されたジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼタンパク質およびその使用方法（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ  Ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ）」と題する米国仮特許出願第６１／６０９，０６３号の優先権を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０００２】
配列表
本願に関連する配列表を紙に代えてテキスト形式で提供し、同配列表は参照により本明細書に援用される。配列表を含むテキストファイルの名前は、Ｍ０７７−０００９ＰＣＴＳｅｑ  Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔである。このテキストファイルは、約６３８キロバイトであり、２０１３年２月１５日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で電子的に提出されている。
【０００３】
本発明は、細菌膜標的ドメインなどの少なくとも１つの異種細胞内局在化ドメインに融合されたジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）ポリペプチドの融合タンパク質、このような融合タンパク質を含む改変光合成微生物、ならびにトリグリセリド、脂肪酸、およびワックスエステルなどの脂質を含む光合成微生物による脂質の生成を向上させるための関連する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
脂肪酸は、非分枝脂肪族の末端または鎖を有するカルボン酸であり、後者の長さは、約４〜約２８炭素原子である。トリグリセリドは、３つの脂肪酸分子でエステル化されたグリセロールからなる中性極性分子である。ワックスエステルは、脂肪酸および長鎖アルコールとのエステルである。トリグリセリドおよび脂肪酸は、植物および藻類を含むほとんどの真核生物、ならびに放線菌の特定の種およびアシネトバクター属のメンバーを含む特定の原核生物による炭素分子およびエネルギー貯蔵分子として利用することができる。
【０００５】
また、トリグリセリド、脂肪酸、およびワックスエステルは、バイオ燃料および／または様々な特殊化学薬品の生成における供給原料としても利用することもできる。例えば、トリグリセリドおよび遊離脂肪酸は、アルコールが植物油、動物性脂肪、リサイクルグリースに含まれるものなどのトリグリセリド油または脂肪酸分子と反応して、脂肪酸アルキルエステルなどのバイオディーゼルを生成するエステル交換反応に供してもよい。トリグリセリドが出発材料に含まれる場合は、このような反応は副生成物としてグリセリンも生成し、これは医薬および化粧品産業で使用するために精製され得る。
【０００６】
特定の生物は、バイオ燃料の生成におけるトリグリセリドまたは遊離脂肪酸の供給源として利用することができる。例えば、藻類は、自然界でエネルギー貯蔵分子としてトリグリセリドを生成し、特定のバイオ関連技術が、現在、バイオ燃料の原料として藻類を使用することに着目している。藻類は光合成生物であり、藻類などのトリグリセリド生成生物を使用すると、太陽光、水、ＣＯ２、主要栄養素、および微量栄養素からバイオディーゼルを生成することができる。しかし、藻類は、容易に遺伝子操作することができず、自然界以外の培養条件下では油（すなわち、トリグリセリド、脂肪酸）を生成することができない。
【０００７】
藻類と同様に、シアノバクテリアは光合成からエネルギーを得、クロロフィルＡおよび水を利用して、ＣＯ２を削減する。特定のシアノバクテリアは、太陽光、水、ＣＯ２、水、および無機塩のみから炭水化物、タンパク質、および脂肪酸などの代謝産物を生成することができる。藻類とは異なり、シアノバクテリアは遺伝子操作することができる。例えば、シネココッカスは、低レベルの栄養条件下で成長し、自然界では脂質膜の形態で乾燥重量約１０％の脂肪酸を蓄積する遺伝子操作可能な貧栄養シアノバクテリアである。しかし、シアノバクテリアは、典型的には、トリグリセリド合成に関与する必須酵素を欠いているので、シネココッカスなどのシアノバクテリアは、トリグリセリドエネルギー貯蔵分子を生成しない。その代わりに、野生のシネココッカスは、典型的には、その主たる炭素貯蔵形態としてグリコーゲンを蓄積する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、例えば、バイオ燃料および／または様々な特殊化学品の生成において供給原料として使用するために、トリグリセリドおよび脂肪酸などの脂質を生成することができるシアノバクテリアを含む改変光合成微生物に対するニーズが当技術分野に明白に存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の実施形態は、一般に、異種細胞内局在化ドメインに融合されたＤＧＡＴポリペプチドを含むジアシルグリセロールトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）融合ポリペプチドに関する。
【００１０】
特定の実施形態において、細胞内局在化ドメインは、ＤＧＡＴポリペプチドのＮ末端に融合される。特定の実施形態において、細胞内局在化ドメインは、ＤＧＡＴポリペプチドの内部領域に融合される。一部の実施形態において、この内部領域は、ＤＧＡＴポリペプチドのＮ末端の約２〜１００個のアミノ酸内に存在する。具体的な実施形態において、この内部領域は、ＤＧＡＴポリペプチドのＮ末端の約２〜５個のアミノ酸内に存在する。
【００１１】
特定の実施形態において、細胞内局在化ドメインは、チラコイド、小胞、脂肪体、グリコーゲン顆粒、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）体、カルボキシソーム、および／またはシアノフィシン顆粒を標的化するドメインである。場合により、細胞内局在化ドメインは、チラコイド、小胞体、脂肪体、グリコーゲン顆粒、ＰＨＢ体、カルボキシソーム、および／またはシアノフィシン顆粒の細胞質側にＤＧＡＴを選択的に局在化する。
【００１２】
特定の実施形態において、細胞内局在化ドメインは細菌膜標的ドメインである。特定の実施形態において、細胞内局在化ドメインは、細菌原形質膜（ＰＭ）標的ドメインである。特定の態様において、膜標的ドメインまたはＰＭ標的ドメインは、膜の細胞質側にＤＧＡＴを選択的に局在化する。
【００１３】
特定の実施形態において、細菌ＰＭ標的ドメインは、細菌の原形質膜タンパク質の少なくとも１つのＮ末端シグナル配列のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、細菌ＰＭ標的ドメインは、細菌の原形質膜タンパク質の少なくとも１つの膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、細菌ＰＭ標的ドメインは、細菌の原形質膜タンパク質の少なくとも１つのシグナル配列および少なくとも１つの膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）のアミノ酸配列を含み、必要に応じて、Ｎ末端シグナル配列およびＴＭＤは、同じ細菌の原形質膜タンパク質に由来する。
【００１４】
一部の実施形態において、細菌の原形質膜タンパク質は、細菌の原形質膜の細胞質側に局在化される少なくとも１つのＣ末端ドメインを有することを特徴とする。特定の実施形態において、細菌の膜タンパク質は、膜内在性タンパク質（ＩＭＰ）である。一部の実施形態において、ＩＭＰは、膜貫通タンパク質（ＴＰ）である。特定の実施形態において、ＩＭＰは膜内在性化学受容体である。
【００１５】
特定の実施形態において、膜内在性化学受容体は、メチル受容走化性タンパク質（ＭＣＰ）である。ＭＣＰは、シネココッカス・エロンガタスのＰＣＣ７９４２−０８５８またはＰＣＣ７９４２−１０１５によってコードされている。一部の実施形態において、細菌ＰＭ標的ドメインは、本質的に、ＰＣＣ７９４２−０８５８によってコードされているＭＣＰのＮ末端シグナル配列および２つのＮ末端近接ＴＭＤからなる。具体的な実施形態において、細菌ＰＭ標的ドメインは、本質的に、ＰＣＣ７９４２−０８５８によってコードされているＭＣＰのＮ末端の約４３〜５３個のアミノ酸からなる。さらなる他の実施形態において、細菌ＰＭ標的ドメインは、本質的に、ＰＣＣ７９４２−０８５８によってコードされているＭＣＰのＮ末端の１３６〜１４１個のアミノ酸からなる。
【００１６】
一部の実施形態において、ＤＧＡＴポリペプチドは、アシネトバクター属のＤＧＡＴ、ストレプトマイセス属のＤＧＡＴ、またはアルカニボラクス属のＤＧＡＴである。
【００１７】
特定のＤＧＡＴ融合ポリペプチドは、ＤＧＡＴポリペプチドおよび細胞内局在化ドメインを分離するペプチドリンカーを含む。一部の実施形態において、ペプチドリンカーは、生理学的に安定である。特定の実施形態において、ペプチドリンカーは、約１〜２００個のアミノ酸、１〜１５０個のアミノ酸、１〜１００個のアミノ酸、１〜９０個のアミノ酸、１〜８０個のアミノ酸、１〜７０個のアミノ酸、１〜６０個のアミノ酸である、１〜５０個のアミノ酸、１〜４０個のアミノ酸、１〜３０個のアミノ酸、１〜２０個のアミノ酸、１〜１０個のアミノ酸、または１〜５個のアミノ酸長である。具体的な実施形態において、ペプチドリンカーは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、または１００個のアミノ酸長である。
【００１８】
また、例えば、ポリヌクレオチドが１以上の調節エレメントに作動可能に連結されている場合に、本明細書に記載のＤＧＡＴ融合ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド、およびこのようなポリヌクレオチドを含むベクターも含まれる。一部の実施形態において、前記１以上の調節エレメントは誘導性プロモーターを含む。
【００１９】
また、本明細書に記載のＤＧＡＴ融合ポリペプチドをコードする１以上の導入されたポリヌクレオチドを含む改変光合成微生物も含まれる。一部の実施形態において、この改変光合成微生物は、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）、ワックスエステル（ＷＥ）、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、またはそれらの任意の組み合わせを生成する。
【００２０】
特定の実施形態において、この改変光合成微生物は、さらに１以上の過剰発現したアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）、アシル−ＡＣＰ合成酵素（Ａａｓ）、またはその両方を含む。
【００２１】
特定の実施形態において、この改変光合成微生物は、さらに、１以上の過剰発現したアシル−アシルキャリアータンパク質（アシル−ＡＣＰ）還元酵素および１以上の過剰発現したアルコール脱水素酵素を含み、トリアシルグリセロールと比較して、ワックスエステル、遊離脂肪酸、またはその両方を選択的に生成する。具体的な実施形態において、過剰発現したアシル−ＡＣＰ還元酵素は、シネココッカス・エロンガタスのＰＣＣ７９４２（ｏｒｆ１５９４）またはシネコシスティス種のＰＣＣ６８０３（ｏｒｆｓｌｌ０２０９）によってコードされている。特定の実施形態において、過剰発現したアルコール脱水素酵素は、シネコシスティスのｓｌｒ１１９２またはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｙｌｙｉｉのＡＣＩＡＤ３６１２によってコードされている。
【００２２】
特定の改変光合成微生物は、内因性アルデヒド脱水素酵素、内因性アルデヒドデカルボニラーゼ、またはその両方をコードする１以上の遺伝子の低下した発現および／または活性をさらに含む。具体的な実施形態において、この光合成微生物は、シネココッカス・エロンガタスのＰＣＣ７９４２であり、アルデヒド脱水素酵素はｏｒｆ０４８９によってコードされ、アルデヒドデカルボニラーゼはｏｒｆ１５９３によってコードされている。
【００２３】
本明細書に記載のいくつかの改変光合成微生物において、ＤＧＡＴ融合ポリペプチドをコードする導入ポリヌクレオチドは、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている。
【００２４】
特定の実施形態において、この光合成微生物はシアノバクテリアである。具体的な実施形態において、このシアノバクテリアは、シネココッカス・エロンガタスである。一部の態様において、改変されたシアノバクテリアは、異なる方法で改変されたシアノバクテリアと比較して成長が増加しているか、かつ／または細胞毒性が低下しており、この異なる方法で改変されたシアノバクテリアは、対応するＤＧＡＴを発現するが、異種の細胞内局在化ドメインに融合されたＤＧＡＴを発現しない。特定の場合において、異なる方法で改変されたシアノバクテリアは、野生型ＤＧＡＴを発現し、ＤＧＡＴの他の型を発現しない。
【００２５】
また、本明細書に記載のＤＧＡＴ融合ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを光合成微生物に導入することを含む光合成微生物を改変するための方法も含まれる。
【００２６】
特定の実施形態は、本明細書に記載の改変光合成微生物を培養することを含む脂質生成のための方法を含む。一部の実施形態において、前記培養には、ＤＧＡＴ融合ポリペプチドの発現を誘導することが含まれる。これらのおよび関連する特定の方法は、トリアシルグリセロール、ワックスエステル、遊離脂肪酸、またはそれらの任意の組み合わせの生成を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】シネココッカス・エロンガタスのメチル受容走化性タンパク質ＰＣＣ７９４２＿０８５８のドメイン配向を示す図である。ＳＳは、ＰＣＣ７９４２＿０８５８のＮ末端シグナル配列を表す。
【図２】Ｎ末端に膜標的ドメインまたは原形質膜（ＰＭ）標的ドメインを有する３つの異なるＤＧＡＴ−ＧＦＰ融合タンパク質（ＳＳ−ＤＧＡＴ−ＧＦＰ）のドメイン配向を示す図である。これらの構築物中の膜標的ドメインは、メチル受容走化性タンパク質ＰＣＣ７９４２＿０８５８のＮ末端シグナル配列（ＳＳ）から取得される。
【図３】全てのＤＧＡＴ−ＧＦＰおよびＳＳ−ＤＧＡＴ−ＧＦＰ融合タンパク質の発現は、フローサイトメトリーによって検出することができることを示すグラフである。
【図４】ＳＳ−ＤＧＡＴ−ＧＦＰ発現シアノバクテリアの成長表現型が、ＤＧＡＴ−ＧＦＰ発現シアノバクテリアの成長表現型と比較して顕著に改善されることを示すグラフである。
【図５】ＰＣＣ７９４２＿０８５８のＮ末端シグナル配列を含むように改変されたＤＧＡＴが、シアノバクテリアにおいてトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）を生成する能力を保持していることを示す写真である。１ＯＤの細胞を各レーンにロードし、非極性溶媒中で泳動した。ＴＡＧは、全ての試料において検出された。ＦＦＡは、ＤＧＡＴ−ＧＦＰ試料（Ｎｏ  ＳＳ）でのみ検出された。（−）はＩＰＴＧ誘導の無い場合、（＋）はＩＰＴＧで誘導した場合を示す。
【図６】アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）を過剰発現するシネココッカス・エロンガタスにおいて、ＤＧＡＴ−ＧＦＰにＳＳ３０配列を融合すると、ＤＧＡＴ誘導に関連する成長表現型を顕著に改善することを示すグラフである。
【図７】誘導性プロモーター（Ｐｔｒｃ）の制御下で、ＳＳ３０−ＤＧＡＴ−ＧＦＰおよびＡＣＰの遺伝子で形質転換したシネココッカス・エロンガタスによる高レベルのトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）生成を示す写真である。
【図８】Ｎ末端の膜標的ドメインまたは原形質膜（ＰＭ）標的ドメインを有する３つの異なるＡＤＧＡＴ融合タンパク質（ＳＳ３０−ＡＤＧＡＴ、ＳＳ４８−ＴＭＤ−ＡＤＧＡＴ、ＴＭＤ−ＡＤＧＡＴ）のドメイン配向を示す図である。これらの構築中の膜標的ドメインは、メチル受容走化性タンパク質ＰＣＣ７９４２＿０８５８のＮ末端シグナル含有配列（ＳＳ）および／または膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）含有配列から取得される。
【図９】ＡＤＧＡＴへのＮ末端シグナル（ＳＳ）含有配列および／または膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）含有配列の融合が、アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）を過剰発現するシネココッカス・エロンガタスにおいて、ＤＧＡＴ誘導に関連する成長表現型を顕著に改善することを示すグラフである。（−）はＩＰＴＧ誘導の無い場合、（＋）はＩＰＴＧで誘導した場合を示す。
【図１０】ＳＳ３０−ＡＤＧＡＴ、ＳＳ４８−ＴＭＤ−ＡＤＧＡＴ、およびＴＭＤ−ＡＤＧＡＴ融合タンパク質を発現するシアノバクテリアが、シアノバクテリア中でトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）を生成する能力を保持することを示すグラフである。０．５ＯＤの細胞を各レーンにロードし、非極性溶媒中で泳動した。ＴＡＧは、全ての試料において検出された。誘導から４８時間後の、（−）はＩＰＴＧ誘導の無い場合、（＋）はＩＰＴＧで誘導した場合を示す。
【図１１】ＳＳ３０−ＡＤＧＡＴ、ＳＳ４８−ＴＭＤ−ＡＤＧＡＴ、およびＴＭＤ−ＡＤＧＡＴ融合タンパク質を発現するシアノバクテリアが、シアノバクテリア中でトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）を生成する能力を保持することを示すグラフである。０．５ＯＤの細胞を各レーンにロードし、非極性溶媒中で泳動した。ＴＡＧは、全ての試料において検出された。誘導から７２時間後の、（−）はＩＰＴＧ誘導の無い場合、（＋）はＩＰＴＧで誘導した場合を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、メチル基受容走化性タンパク質ＰＣＣ７９４２＿０８５８の膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）配列および／またはＮ末端シグナル配列を、組換え発現させたジアシルグリセロールトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）のＮ末端に融合すると、シアノバクテリアなどのＤＧＡＴを発現する光合成微生物の細胞成長特性を改善するという驚くべき発見に部分的に基づいている。この発見は、脂質、特にトリグリセリドおよびワックスエステルの生成におけるこのような微生物の有用性を著しく向上させる。
【００２９】
限定するものではないが１つの理論によると、野生型ＤＧＡＴの組換え発現は、例えば、他の可能なメカニズムのうち、光合成プロセスを破壊することにより、かつ／または反応性酸素種の生成を介して酸化ストレスを起こすことにより、特定のシアノバクテリアなどの特定光合成微生物の成長表現型を低下させる。限定するものではないが１つの可能性として、野生型ＤＧＡＴは、その基質特異性に悪影響を及ぼすように細胞質全体にランダムに分散させることができる。限定するものではないが他の可能性によると、野生型ＤＧＡＴは、光合成微生物のチラコイド膜、すなわち、光合成の部位に選択的に局在するか、かつ／またはその基質特異性に悪影響を及ぼすようにチラコイド膜もしくは他の細胞膜と会合することができる。いずれにしても、細胞質中でＤＧＡＴの酵素的部分が脂質生成基質と相互作用することを可能にする方法で、少なくとも１つの細胞内領域（例えば、膜）にＤＧＡＴを選択的に局所化する異種の細胞内局在化ドメインにＤＧＡＴを融合すると、細胞成長に対するこれらの潜在的な悪影響を低下させるだけでなく、トリグリセリドおよびワックスエステルなどの脂質を生成するＤＧＡＴの能力も保持する。したがって、膜標的ドメインなどの、この結果を達成する本質的に任意の細胞内局在化ドメインに、本明細書に記載のＤＧＡＴポリペプチドを融合させることができる。特定の場合において、膜標的ドメインは、細菌膜タンパク質の少なくとも１つのシグナル配列（例えば、Ｎ末端シグナル配列）、膜貫通ドメイン、および／または膜内在性ドメインから構成されている。
【００３０】
したがって、本発明の実施形態は、チラコイド、小胞、脂肪体、グリコーゲン顆粒、ＰＨＢ体、カルボキシソーム、および／もしくはシアノフィシン顆粒などの原形質膜、１以上の細胞内膜、ならびに／または１以上の細胞内領域にＤＧＡＴを選択的に局在化するドメインなどの異種細胞内局在化ドメインに融合されたＤＧＡＴポリペプチドを含む、単離したジアシルグリセロールトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）融合ポリペプチドを含む。特定の態様において、細胞内局在化ドメインは、細菌の原形質膜（ＰＭ）標的ドメインなどの細菌膜標的ドメインである。また、本明細書に記載のＤＧＡＴ融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、かかるポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含む改変光合成微生物、かかる改変光合成微生物を生成する関連する方法、ならびにそれらから脂質を生成する関連する方法も含まれる。
【００３１】
また、本発明の実施形態は、脂質生合成に関与する特定の遺伝子の過剰発現がより高レベルの脂質生合成をもたらすという発見と組み合わせてもよい。したがって、特定の実施形態において、本発明に従って使用される改変光合成微生物、例えば、シアノバクテリアは、さらに、本明細書に記載のものの全てを含むがこれらに限定されない脂質生合成タンパク質、例えば、トリグリセリド生合成または脂肪酸生合成と関連する活性を有するポリペプチドをコードする１以上の外因性（すなわち、導入された）または過剰発現させる核酸を含む。脂質生合成タンパク質の具体例としては、とりわけ本明細書に記載のアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）、アシル−ＡＣＰ合成酵素（Ａａｓ）、アシル−ＡＣＰ還元酵素、チオエステラーゼまたはＴｅｓＡもしくはＦａｔＢなどのアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（ＴＥＳ）、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）、ホスファチジン酸ホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（ＰＡＰまたはホスファチジン酸ホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ））、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）ヒドロラーゼまたはリパーゼ、脂肪酸アシルＣｏＡ合成酵素、リパーゼ、ならびにホスホリパーゼＡ、Ｂ、もしくはＣなどのホスホリパーゼ（ＰＬ）が挙げられる。
【００３２】
一例として、本発明の実施形態は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６５９３８号に記載されるように、アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）、アシル−ＡＣＰ合成酵素（Ａａｓ）、またはその両方を過剰発現するように改変された光合成微生物、例えば、シアノバクテリアが、必要に応じて、チオエステラーゼなどの１以上の追加の脂質生合成タンパク質と組み合わせて、増加した量の脂質、例えば、トリグリセリド、遊離脂肪酸、および／またはワックスエステルを生成し、全細胞脂質含量の増加を示す場合が多いという発見と組み合わせることができる。別の例として、導入されるかまたは過剰発現させる１以上のＰＡＰポリペプチドの組み込みは、本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいてトリグリセリドの生成を増加させることができる。ここで、ＰＡＰは、トリグリセリドの直接前駆体であるジアシルグリセロール分子の生成を触媒し、したがって、本明細書に記載のＤＧＡＴ融合タンパク質の前駆体の可用性を増加させ、その後、ジアシルグリセロール前駆体をトリグリセリドに変換することにより、トリグリセリド合成の最終工程を触媒する。
【００３３】
また、本発明の態様は、例えば、脂肪酸の生成を増加させるために、シアノバクテリアなどの光合成微生物が、より多くの特定の方法で遺伝子組換えすることができるという発見と組み合わせることもできる。脂肪酸はトリグリセリドの出発材料を提供するので、本明細書および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６１９３６号ならびに米国特許出願第１２／６０５２０４号（参照により援用される）に記載のように、遺伝子組換えした光合成微生物における脂肪酸生成の増加を利用して、トリグリセリドの生成を増加させることができる。本発明の光合成微生物は、脂肪酸合成に関連する１以上の酵素をコードする１以上の外因性ポリヌクレオチド配列を導入することによって、脂肪酸の生成を増加させるように改変することができる。かかる酵素の例としては、とりわけ本明細書に記載のアシル−ＡＣＰ還元酵素およびＡＣＣａｓｅが挙げられる。
【００３４】
また、本発明の実施形態は、アシル−ＡＣＰ還元酵素、アルコール脱水素酵素、およびワックスエステル合成酵素の共発現が、アシル−ＡＣＰから脂肪族アルデヒド経路を介してワックスエステル形成を提供するという発見と組み合わせることもできる。例えば、アシル−ＡＣＰ還元酵素（例えば、ｏｒｆ１５９４）、長鎖アルコール脱水素酵素、および二官能性ＤＧＡＴ酵素（例えば、ａＤＧＡＴ）を過剰発現するシアノバクテリアは、国際特許出願第ＰＣＴ／２０１１／０６５８９６号に記載のように、トリグリセリド生成が少ないだけでなく、ワックスエステルも生成する。これらの改変されたシアノバクテリアは遊離脂肪酸を生成し、したがって、ｏｒｆ０４８９によってコードされる内因性アルデヒド脱水素酵素は、アシルアルデヒド基質に対してアルコール脱水素酵素と競合することが示唆されるので、ｏｒｆ０４８９の発現減少（例えば、欠失）は、さらに、ｏｒｆ０４８９の発現減少がない改変微生物に対して、これらのおよび関連する微生物においてワックスエステル合成を増加させることができる。さらに、ｏｒｆ１５９３によってコードされるアルデヒドデカルボニラーゼもまた、アシルアルデヒド基質に対してアルコール脱水素酵素と競合することができるので、ｏｒｆ１５９３の発現減少（例えば、欠失）は、独立して、ワックスエステル合成を増加させ、ｏｒｆ０４８９の発現減少と組み合わせると、さらにワックスエステル合成を増加させることができる。ワックスエステル形成の増加はまた、例えば、ＡＣＰ、Ａａｓ、またはその両方を含む脂肪族アルデヒド合成に関連する他の遺伝子の過剰発現と、これらのまたは関連する実施形態のいずれか１つとを組み合わせることによって達成することもできる。
【００３５】
また、本発明の態様は、変異（例えば、完全欠失または部分欠失）などによるグリコーゲン合成に関与する特定の遺伝子の機能的な除去が、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６９２８５号および米国特許出願第１２／６４５２２８号に記載のように、シアノバクテリアなどの光合成微生物においてグリコーゲン蓄積および／または貯蔵を低下させるという発見と組み合わせることもできる。例えば、グルコース−１−リン酸アデニリルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｌｇＣ）、ホスホグルコムターゼ遺伝子（ｐｇｍ）、および／またはグリコーゲン合成酵素遺伝子（ｇｌｇＡ）の欠失を含むシネココッカスなどのシアノバクテリアは、野生型シアノバクテリアと比較して、個別にまたは様々な組み合わせで、著しく減少したレベルのグリコーゲンを生成および蓄積することができる。グリコーゲン蓄積の減少は、窒素の減少を含むストレス条件下で特に顕著にすることができる。
【００３６】
また、本発明の態様は、シアノバクテリアなどの光合成微生物におけるグリコーゲン分解に関与する遺伝子またはタンパク質の過剰発現が、同様に、減少したグリコーゲンおよび／または貯蔵をもたらすという発見と組み合わせることもできる。典型的なグリコーゲン分解タンパク質には、グリコーゲンホスホリラ−ゼ（ＧｌｇＰ）、グリコーゲンイソアミラーゼ（ＧｌｇＸ）、グルカノトランスフェラーゼ（ＭａｌＱ）、ホスホグルコムターゼ（Ｐｇｍ）、グルコキナーゼ（Ｇｌｋ）、およびホスホグルコースイソメラ−ゼ（Ｐｇｉ）が含まれる。
【００３７】
本明細書に提供する説明に基づく他の組み合わせは、当業者には明らかであろう。
【００３８】
Ａ．定義
特段の規定のない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、一般に、本発明が属する当業界の通常の知識を有する者によって理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料について記載する。本発明の目的のために、次の用語を以下に定義する。
【００３９】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願は、参照によりその全体が援用される。
【００４０】
冠詞「１つ（ａ）」および「１つ（ａｎ）」は、冠詞の文法上の目的語の１つまたは２つ以上（すなわち少なくとも１つ）を表すために本明細書で使用する。一例として、「１つの要素」は、１つの要素または２つ以上の要素を意味する。
【００４１】
「約」とは、参照の量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量または長さに対して３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１％ほど変化する数量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量または長さを意味する。
【００４２】
参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の断片および変異型に適用される用語「生物活性のある断片」および「生物活性のある変異型」は、参照配列の活性の少なくとも約０．１、０．５、１、２、５、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００％またはそれ以上を有する断片および／または変異型を意味する。代表的な生物活性のある断片および変異型は、一般的に、相互作用、例えば、分子内相互作用または分子間相互作用に関与する。分子間相互作用は、本明細書の他の箇所に記載の特異的結合相互作用または酵素的相互作用で有り得る。特定の実施形態において、本明細書の他の箇所に記載され、当技術分野で公知の生物活性のある断片または変異型は、保存された酵素的配列、ドメインまたはモチーフを含む。適切には、生物活性のある断片は、それが由来する野生型ポリペプチドの活性の約１％、１０％、２５％、５０％以上を有する。
【００４３】
「コード配列」とは、遺伝子のポリペプチド生成物のコードに寄与する任意の核酸配列を意味する。これに対し、用語「非コード配列」は、遺伝子のポリペプチド生成物のコードに寄与しない任意の核酸配列を表す。
【００４４】
文脈が特に必要としない限り、本明細書を通して、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、記載の段階もしくは要素、または複数の段階もしくは要素のグループを包含するが、任意の他の段階もしくは要素、または複数の段階もしくは要素のグループを排除しないことを意味すると理解されるであろう。
【００４５】
「からなる」とは、文言「からなる」の前に記載されている要素を含み、かつそれに限定されることを意味する。したがって、文言「からなる」は、記載された要素が必要または必須であり、他の要素が存在し得ないことを示す。
【００４６】
「から本質的になる」とは、その文言の前に記載されている任意の要素を含み、記載の要素の開示で指定される活性または作用と干渉しないか、または寄与しない他の要素に限定されることを意味する。したがって、文言「から本質的になる」は、記載の要素が必要とされるかまたは必須であるが、他の要素は任意であり、それらが記載の要素の活性または作用に影響を及ぼすか否かに応じて存在してもしなくてもよい。
【００４７】
用語「相補的」および「相補性」は、塩基対合則によって関連するポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を表す。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」と相補的である。相補性は「部分的」であってもよく、その際、核酸塩基の一部のみが塩基対合則に従ってマッチする。または、核酸間で「完全（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）」または「完全（ｔｏｔａｌ）」相補性があってもよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に著しく影響を及ぼす。
【００４８】
「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓ  ｔｏ）」または「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｔｏ）」とは、（ａ）参照ポリヌクレオチド配列の全部もしくは一部と実質的に同一または相補的であるか、またはペプチドもしくはタンパク質中のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド；あるいは（ｂ）参照ペプチドもしくはタンパク質中のアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するペプチドもしくはポリペプチドを意味する。
【００４９】
「誘導体」とは、当技術分野で理解されるような修飾、例えば、コンジュゲーションもしくは他の化学的部分との複合体形成（例えば、ペグ化）、または翻訳後修飾技術によって基本配列から誘導されたポリペプチドを意味する。用語「誘導体」はまた、機能的に同等な分子を提供する付加または欠失を含む親配列に行われた変更もその範囲内に含む。
【００５０】
「酵素反応条件」とは、任意の必要な条件が、酵素が機能することを可能にする環境（すなわち、温度、ｐＨ、阻害物質の欠如などの要因）で利用可能なことを意味する。酵素反応条件は、試験管内などのインビトロ、または細胞内などのインビボのいずれかで有り得る。
【００５１】
本明細書で使用する用語「機能」および「機能的」などは、生物学的、酵素的、または治療的な機能を表す。
【００５２】
「融合タンパク質」または「融合ポリペプチド」とは、もともとそれらの別々のポリペプチドまたはドメインをコードする２つ以上のコード配列の結合を介して作成されているポリペプチドを表し、結合されたコード配列の翻訳により、典型的には、別々のポリペプチドまたはドメインのそれぞれに由来する官能特性を有する単一の融合ポリペプチドが生じる。
【００５３】
「遺伝子」とは、染色体上の特定座位を占め、転写調節配列および／もしくは翻訳調節配列ならびに／または翻訳領域の配列および／もしくは非翻訳配列（すなわち、イントロン、５’非翻訳配列および３’非翻訳配列）からなる遺伝の単位を意味する。
【００５４】
用語「宿主細胞」には、本発明の任意の組換えベクターもしくは単離ポリヌクレオチドのレシピエントであり得るかまたはレシピエントであった個々の細胞もしくは細胞培養物を含む。宿主細胞は単一の宿主細胞の子孫を含み、その子孫は、天然、偶発的、または意図的な変異および／もしくは変化によって、（形態または全ＤＮＡ相補体において）元の親細胞と完全に同一でなくてもよい。宿主細胞には、インビボまたはインビトロで、本発明の組換えベクターまたはポリヌクレオチドを用いてトランスフェクトするかまたは感染させた細胞が含まれる。本発明の組換えベクターを含む宿主細胞は組換え宿主細胞である。
【００５５】
「相同性」は、同一であるか、または保存的置換を構成するアミノ酸の数の割合を表す。相同性は、ＧＡＰなどの配列比較プログラムを用いて決定することができる（Ｄｅｖｅｒａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１２，３８７−３９５，１９８４、参照により援用される）。このようにして、本明細書に引用されるものと類似または実質的に異なる長さの配列は、アライメントへのギャップの挿入によって比較することができ、このようなギャップは、例えば、ＧＡＰによって用いられる比較アルゴリズムによって決定される。
【００５６】
「単離」とは、通常、その天然の状態で付随する成分を実質的にまたは本質的に含まない材料を意味する。例えば、本明細書で使用する「単離ポリヌクレオチド」は、天然状態でそれに隣接する配列から精製されたポリヌクレオチド、例えば、通常、断片に隣接する配列から除去されたＤＮＡ断片を表す。あるいは、本明細書で使用する「単離ペプチド」または「単離ポリペプチド」などは、その天然の細胞環境からの、および細胞の他の成分との会合からのペプチドもしくはポリペプチド分子のインビトロ単離ならびに／または精製を表す。
【００５７】
用語「調節」および「変更」は、典型的には、対照に比べて、統計的に有意なまたは生理学的に有意な量もしくは程度の「増加」および「増強」ならびに「減少」もしくは「低下」を含む。「増加（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」または「増加（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ）」には、典型的には、非改変光合成微生物または異なる方法で改変された光合成微生物などの同じ種の対照光合成微生物と比較して、１以上の改変光合成微生物（例えば、シアノバクテリア）の成長もしくは増殖する能力および／または脂肪酸、ワックスエステル、もしくはトリグリセリドなどの多量の所与の脂質を生成もしくは貯蔵する能力が含まれる。
【００５８】
特定の実施形態において、異なる方法で改変された光合成微生物には、生物活性のあるＤＧＡＴポリペプチドを発現するが、定義された細胞内領域に選択的に局在するＤＧＡＴは発現しない微生物が含まれる。例えば、異なる方法で改変された微生物は、１以上の細胞内領域（例えば、細胞内膜、チラコイド、小胞、脂肪体、グリコーゲン顆粒、ＰＨＢ体、カルボキシソーム、シアノフィシン顆粒、原形質膜の細胞質側）における選択的局在化と比較して、細胞質全体に分散する活性型のＤＧＡＴを発現することはできるが、ＤＧＡＴの他の型は発現することができない。一部の実施形態において、異なる方法で改変された光合成微生物には、他の細胞内領域と比較して、１以上の細胞内領域に選択的に局在する生物活性のあるＤＧＡＴポリペプチドを発現する微生物が含まれる。例えば、異なる方法で改変された光合成微生物は、原形質膜または他の膜と比較して、チラコイド膜に選択的に局在するＤＧＡＴを発現することができるが、ＤＧＡＴの他の型を発現することはできない。具体的な実施形態において、異なる方法で改変された光合成微生物は、膜標的ドメインなどの異種の細胞内局在化ドメインを含まないＤＧＡＴ（例えば、野生型ＤＧＡＴ）を発現するが、ＤＧＡＴの他の型を発現しない。
【００５９】
特定の態様には、別々にまたは一緒に、総トリグリセリド、総ワックスエステル、および総脂肪酸を含む総脂質の増加が含まれる。一部の態様には、別々にまたは一緒に、総遊離脂肪酸、細胞内の総脂肪酸、および／または分泌された総脂肪酸の増加が含まれる。特定の実施形態において、総脂質は、全種類の脂質の対応する増加、または１以上の特定の種類の脂質（例えば、脂肪酸、遊離脂肪酸、分泌脂肪酸、トリグリセリド、ワックスエステル）のみの相対的な増加のいずれかで増加し得る。特定の実施形態において、総脂質は、同じ状態のまま（例えば、総脂質が、同じ種類の非改変微生物と比較して著しく増加しない）か、または減少してもよく、１以上の特定の脂質の生成もしくは貯蔵は、他の脂質（例えば、脂肪酸、遊離脂肪酸、分泌脂肪酸、トリグリセリド、ワックスエステル）と比較して増加し得る。
【００６０】
一部の実施形態において、トリグリセリドの生成または貯蔵が、脂肪酸および／またはワックスエステルなどの他の脂質と比較して増加する。特定の実施形態において、ワックスエステルの生成または貯蔵は、トリグリセリドおよび／または脂肪酸などの他の脂質と比較して増加する。特定の実施形態において、１以上の選択された種類の脂肪酸の生成または貯蔵は、（例えば、分泌脂肪酸、遊離脂肪酸、細胞内の脂肪酸、Ｃ１４：０、Ｃ１４：１、Ｃ１６：０、Ｃ１６：１ｎ９、およびＣ１８：０の脂肪酸などの特定の脂肪酸）は、他の種類の脂肪酸（例えば、分泌脂肪酸、遊離脂肪酸、細胞内の脂肪酸、Ｃ１４：０、Ｃ１４：１、Ｃ１６：０、Ｃ１６：１ｎ９、およびＣ１８：０の脂肪酸などの特定の脂肪酸）または脂質と比較して増加し得る。
【００６１】
「増加した」または「増強した」量は、典型的には、「統計的に有意な」量であり、典型的には同じ種の細胞成長および／または非改変微生物もしくは異なる方法で改変された微生物によって生成される脂質の量の（全ての整数ならびに１以内の小数点および１を超える小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８などを含む）１．１、１．２、１．５、１．７、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０倍またはそれ以上（例えば、１００、５００、１０００倍）の増加を含み得る。一部の実施形態において、本明細書に記載の非改変もしくは異なる方法で改変された微生物と比較して、細胞成長ならびに／または総脂質、総トリグリセリド、総脂肪酸、全遊離脂肪酸、選択された脂肪酸、細胞内の総脂肪酸、分泌された総脂肪酸、および／もしくは総ワックスエステルの生成または貯蔵は、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％増加する。特定の実施形態において、細胞成長ならびに／または総脂質、総トリグリセリド、総脂肪酸、総遊離脂肪酸、細胞内の総脂肪酸、分泌された総脂肪酸、および／もしくは総ワックスエステルの生成または貯蔵は、約５０％〜２００％増加する。このような増加は、例えば、ＤＧＡＴ発現の誘導後約２４、３６、４８、６０、７２、９６、１０８、１２０、１３２、１４４、１５６、１６８、１８０、１９２またはそれ以上の時間の時点で、（例えば、膜標的ドメイン−ＤＧＡＴ融合タンパク質を発現するシアノバクテリアと、野生型ＤＧＡＴまたは膜標的ドメインを含まないＤＧＡＴのみを発現するシアノバクテリアと比較して）経時的に観察または測定することができる。
【００６２】
脂肪酸などの脂質の生成は、ナイルレッド染色、薄層クロマトグラフィー、およびガスクロマトグラフィーなどの当技術分野で公知の技術に従って測定することができる。トリグリセリドの生成は、例えば、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼを用いた酵素的比色試験を含む市販の酵素試験を用いて測定することができる。遊離脂肪酸の生成は、ＦＡＭＥＳの全体的な蓄積などの絶対単位（例えば、ＯＤ／ｍｌ、μｇ／ｍｌ）または経時的なＦＡＭＥＳの生成を反映する単位、すなわち、ＦＡＭＥＳの生成速度（例えば、ＯＤ／ｍｌ／日、μｇ／ｍｌ／日）で測定することができる。例えば、本明細書に記載の特定の改変された微生物は、少なくとも約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０μｇ／ｍＬ／日；および／または少なくとも約２０〜３０、２０〜３５、２０〜４０、２０〜４５、２０〜５０、２５〜３０、２５〜３５、２５〜４０、２５〜４５、２５〜５０、３０〜３５、３０〜４０、３０〜４５、３０〜５０、３５〜４０、３５〜４５、３５〜５０、４０〜４５、もしくは４０〜５０μｇ／ｍＬ／日の範囲で生成することができる。ＴＡＧの生成も同様に測定することができる。
【００６３】
特定の場合において、「減少」または「低下」には、改変されていないシアノバクテリアまたは異なる方法で改変されたシアノバクテリアなどの対照光合成微生物と比較して、グリコーゲンなどのより少ない量（例えば、統計学的に有意な量）の所与の炭素系生成物を生成または蓄積する１以上の改変光合成微生物、例えば、シアノバクテリアの能力が含まれる。本明細書に例示するように、グリコーゲンおよび関連分子の生成は、当技術分野で公知の技術に従って測定することができる（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １７７０：７６３−７７３，２００７参照）。特定の場合において、「減少」または「低下」には、改変されていないシアノバクテリアまたは異なる方法で改変されたシアノバクテリアなどの対照光合成微生物における発現レベルと比較して、改変光合成微生物、例えば、シアノバクテリアによる１以上の興味の遺伝子もしくはタンパク質（例えば、グリコーゲンの生合成経路または貯蔵経路、アルデヒドデカルボニラーゼ、アルデヒド脱水素酵素、Ａａｓと関連するタンパク質）のより少ないレベルの発現を意味する。特定の実施形態において、炭素系生成物の生成もしくは蓄積、または１以上の興味の遺伝子もしくはタンパク質の発現は、「統計学的に有意な」量で、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％低下する。特定の実施形態において、炭素系生成物の生成もしくは蓄積、または１以上のタンパク質もしくは遺伝子の発現は、約５０％〜１００％低下する。
【００６４】
特定の態様において、標的遺伝子は、改変ポリペプチドを発現するが、当業者に明らかなそのポリペプチドの活性部位、その細胞内局在、その安定性、または他の機能的特徴を変更するか否かに関わらず、グリコーゲンの生合成または貯蔵に関して機能または活性を低下させるようにコードポリペプチドのアミノ酸配列を変更するヌクレオチドレベルでの変化または変異によって「非機能的」にすることができる。ポリペプチドのコード配列に対するこのような修飾は、所与の光合成微生物のゲノムレベルおよび／または自然淘汰（例えば、指向進化）における部位特異的変異誘発などの当技術分野で公知の技術に従って行うことができる。
【００６５】
「から取得される」とは、例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの試料が、所望の生物もしくは所望の生物内の特定の組織などの特定の供給源から単離されるか、またはそれに由来することを意味する。「から取得される」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列情報が、所望の生物由来の特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列から単離されるか、またはそれに由来する状況も表すことができる。例えば、とりわけ本明細書に記載の原形質膜標的ドメイン、ＤＧＡＴポリペプチド、アシル−ＡＣＰ還元酵素、ＡＣＰ、Ａａｓ、アシルＣｏＡ合成酵素、グリコーゲン分解タンパク質、アルデヒド脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、および／またはアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの酵素をコードするポリヌクレオチド配列は、様々な原核生物もしくは真核生物、または特定の真核生物内の特定の組織もしくは細胞から単離または取得することができる。
【００６６】
本明細書で使用する用語「作動可能に連結される」は、プロモーターの調節制御下に遺伝子を配置し、次いで、その遺伝子の転写および必要に応じて翻訳を制御することを意味する。異種プロモーター／構造遺伝子の組み合わせの構築において、一般的に、遺伝子配列またはプロモーターと、その自然環境でそれが制御する遺伝子（すなわち、遺伝子配列またはプロモーターが由来する遺伝子）との間の距離とほぼ同じくらいである遺伝子転写開始部位からの距離に遺伝子配列もしくはプロモーターを配置することが好ましい。当技術分野で公知のとおり、この距離にあるいくつかの変化は機能を喪失することなく適合することができる。同様に、その制御下に置かれるべき異種遺伝子に対する調節配列エレメントの好ましい位置は、その自然環境における要素（すなわち、それが由来する遺伝子）の配置によって定義される。「構成的プロモーター」は、典型的には活性がある、すなわち、ほとんどの条件下で転写を促進する。「誘導性プロモーター」は、典型的には、所与の分子因子（例えば、ＩＰＴＧ）または所与の環境条件（例えば、特定のＣＯ２濃度、栄養レベル、光、熱）の存在下などの特定の条件下でのみ活性がある。その条件が存在しない場合には、誘導性プロモーターは、典型的には、著しいレベルまたは測定可能なレベルの転写活性を可能にしない。例えば、誘導性プロモーターは、温度、ｐＨ、ホルモン、代謝産物（例えば、ラクトース、マンニトール、アミノ酸）、（例えば、波長特異的な）光、（例えば、塩誘導される）浸透ポテンシャル、重金属、または抗生物質に応じて誘導することができる。多数の標準的な誘導性プロモーターは、当業者に公知であろう。
【００６７】
本明細書で使用する記述「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはＤＮＡを指す。この用語は、典型的には、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドのいずれかの長さが少なくとも１０塩基のヌクレオチドのポリマー形態、またはいずれかの種類のヌクレオチドの改変型を指す。この用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡの一本鎖ならびに二本鎖の形態を含む。
【００６８】
ポリヌクレオチドに関して、用語「外因性」は、野生型細胞または生物中で天然に存在しないが、典型的には、分子生物学的技術によって細胞に導入されたポリヌクレオチド配列を指す。外因性ポリヌクレオチドの例としては、ベクター、プラスミド、および／または所望のタンパク質をコードする人工核酸構築物が挙げられる。また、内因性ポリヌクレオチド配列の発現を調節するために使用され得る外因性プロモーターを含む外因性調節エレメントも含まれる。
【００６９】
ポリヌクレオチドに関して、用語「内因性」または「天然の」は、所与の野生型細胞または生物に見られ得る天然に存在するポリヌクレオチド配列を表す。例えば、特定のシアノバクテリア種は、典型的には、ＤＧＡＴ遺伝子を含まず、したがって、ＤＧＡＴポリペプチドをコードする「内因性」ポリヌクレオチド配列を含まない。また、分子生物学的技術によって、第１の生物から単離され、第２の生物に移される特定のポリヌクレオチド配列は、典型的には、第２の生物に対して「外因性」ポリヌクレオチドと見なされる。特定の実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、例えば、コード配列または調節エレメントなどの天然に存在する別のポリヌクレオチド配列の１以上の追加コピーを作製するために、このようなポリヌクレオチド配列をすでに含んでいる微生物に分子生物学的技術によって「導入」され、それによって、コードされたポリペプチドの過剰発現を促進することができる。
【００７０】
「ポリペプチド」、「ポリペプチド断片」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーならびにその変異型および合成類似体を表すために本明細書において互換的に使用される。したがって、これらの用語は、１以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体などの天然に存在しない合成アミノ酸であるアミノ酸ポリマー、および天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される。特定の態様において、ポリペプチドは、典型的には、様々な化学反応を触媒する（すなわち、その速度を増加させる）酵素ポリペプチド、または「酵素」を含むことができる。
【００７１】
「ホスホグリセリド」（またはグリセロリン脂質）は、生体膜の主要な脂質成分であり、例えば、グリセロール部分に結合した少なくとも１つのＯ−アシルもしくはＯ−アルキルまたはＯ−アルク−１’−エニル残基、および窒素を含む塩基、グリセロール、もしくはイノシトール単位で作られた極性頭部を含むｓｎ−グリセロ−３−リン酸の任意の誘導体を含む。ホスホグリセリドはまた、リン酸と別のヒドロキシル化化合物とのアシルグリセロールエステルによって形成された両親媒性脂質として特徴づけることもできる。
【００７２】
「減少した窒素条件」または「窒素制限」の条件は、一般的に、標準的な窒素濃度の特定の分数または割合が培地中に存在する培養条件を表す。このような分数には、典型的には、標準的な窒素条件の約１／５０、１／４０、１／３０、１／１０、１／５、１／４、または約１／２が含まれるが、これらに限定されない。このような割合には、典型的には、標準的な窒素条件の約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、または５０％未満が含まれるが、これに限定されない。「標準的な」窒素条件は、本明細書で例示され、当技術分野で公知であるとおり、例えば、ＢＧ１１培地中に存在する窒素の量によって推定することができる。例えば、ＢＧ１１培地は、通常、約１．５グラム／リットルの濃度でＮａＮＯ３の形態の窒素を含む（例えば、Ｒｉｐｐｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１１：１−６１，１９７９を参照されたい）。
【００７３】
用語「参照配列」は、別の配列と比較される核酸コード配列、またはアミノ酸配列を表す。本明細書に記載の全てのポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列は、名前（例えば、ｏｒｆ１５９３、ｏｒｆ０４８９、ｏｒｆ１５９４、ＴｅｓＡ、ＡＣＰ、ａＤＧＡＴ、ＭＣＰ）によって記載されるものおよび配列表に記載されているものを含む参照配列として含まれる。
【００７４】
本明細書で使用する記述「配列同一性」または、「配列５０％同一性」とは、配列が、比較ウィンドウ上でヌクレオチドベースまたはアミノ酸ベースで同一である程度を表す。したがって、「配列同一性の割合」は、比較ウィンドウ上の２つの最適に整列させた配列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、  Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＭｅｔ）が両方の配列中に生じる位置の数を決定し、一致した位置の数を得、その一致した位置の数を比較ウィンドウ（すなわち、ウィンドウサイズ）中の位置の総数で割り、その結果に１００を乗じることによって計算し、配列同一性の割合を得ることができる。典型的には、ポリペプチド変異体が、参照ポリペプチドの少なくとも１つの生物活性を維持する場合に、本明細書に記載の参照配列（例えば、配列表を参照されたい）のいずれかに対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチドおよびポリペプチドが含まれる。
【００７５】
２種類以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列関係を説明するために使用される用語には、「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性の割合」および「実質的同一性」が含まれる。「参照配列」は、ヌクレオチドおよびアミノ酸残基を含めて、長さが少なくとも１２個、しばしば、１５〜１８個、多くの場合少なくとも２５個のモノマー単位である。２つのポリヌクレオチドは、それぞれ、（１）２つのポリヌクレオチド間で類似性がある配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部のみ）、および（２）２つのポリヌクレオチド間で多様性がある配列を含み得るので、２つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、配列類似性の局所領域を同定および比較するために、「比較ウィンドウ」上の２つのポリヌクレオチドの配列を比較することによって行われる。「比較ウィンドウ」は、２つの配列を最適に整列させた後に、配列が同数の連続した位置の参照配列と比較される少なくとも６個の連続した位置、一般的には約５０〜約１００個、より一般的には約１００〜約１５０個の概念的部分を表す。比較ウィンドウは、２つの配列の最適なアライメントのために、（付加または欠失を含まない）参照配列と比較して約２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。比較ウィンドウを整列させるための配列の最適なアライメントは、アルゴリズム（ウィスコンシンジェネティクスソフトウェアパッケージ  リリース７．０、ジェネティクスコンピューターグループ、５７５サイエンスドライブ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ）、米国ウィスコンシン州マディソンのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピューター実装によって、または検査および選択された様々な方法のいずれかによって生成された最良のアライメント（すなわち、比較ウィンドウ上で最も高い割合の相同性を生じること）によって行うことができる。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９によって開示されるようなプログラムのＢＬＡＳＴファミリーも参照することができる。配列解析の詳細な議論は、Ａｕｓｕｂｅｌらの「分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ，１９９４−１９９８、第１５章のユニット１９．３に見出すことができる。
【００７６】
用語「シグナル配列」は、タンパク質のＮ末端に存在し、そのタンパク質を細胞内の特定の位置、例えば、分泌経路、チラコイド膜、または原形質膜に標的化するアミノ酸配列を表す。シグナル配列は、タンパク質の残りの部分からそれを放出する切断部位を有しても有さなくてもよい。
【００７７】
「統計学的に有意な」とは、結果が偶然起こった可能性は低かったことを意味する。統計的有意性は、当技術分野で公知の任意の方法によって決定することができる。一般的に使用される有意性の基準には、帰無仮説が真実であれば、観測されるイベントが発生する頻度または確率であるｐ値が含まれる。得られたｐ値が有意水準よりも小さい場合には、帰無仮説は拒絶される。単純な場合において、有意水準は０．０５以下のｐ値で定義される。
【００７８】
「実質的に」または「本質的に」とは、ある所与の量のほぼ全部または完全、例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上を意味する。
【００７９】
「ストレス条件」は、環境による物理的ストレスおよび／または遺伝的ストレスの両方を含むストレスをシアノバクテリアに課し、バイオマス蓄積、細胞分裂、もしくはその両方を低下させる任意の条件またはそれらの組み合わせを表す。ストレス条件下で、光合成微生物のバイオマス蓄積および／または細胞分裂を、非ストレス条件下での対応する光合成微生物と比較して少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％低下させることができる。
【００８０】
ストレスの例としては、標準と比較して低下または上昇した温度；栄養欠乏、例えば、窒素、硫黄、リン、および／またはリン酸などの１以上の必須栄養素のレベルの低下または不在；標準と比較してＣＯ２レベルの低下または増加；標準と比較して、露光量、例えば、強度もしくは持続時間の減少または増加；標準と比較して減少または増加した窒素、鉄、硫黄、リン、および／もしくは銅への暴露；標準と比較して変更されたｐＨ、例えば、より高いもしくはより低い酸性またはより高いもしくはより低い塩基性；標準と比較して変更された塩条件；ＤＮＡ合成阻害またはタンパク質合成阻害を引き起こす薬剤への暴露；標準と比較して、培養密度の増加または減少；野生型光合成微生物と比較して、バイオマス蓄積、細胞分裂、または分裂の減少に関連する１以上のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの導入または過剰発現；野生型光合成微生物と比較してバイオマス蓄積、細胞分裂、または分裂の低下に関連する１以上のポリペプチドの発現の変化が含まれるが、これらに限定されない。様々なシアノバクテリアのための標準的な成長および培養条件（例えば、非ストレス条件）が、当技術分野で公知である。
【００８１】
本明細書で使用する用語「トリグリセリド」（トリアシルグリセロールまたは中性脂肪）は、グリセロールの脂肪酸トリエステルを指す。トリグリセリドは、典型的には、非極性および水不溶性である。
【００８２】
「形質転換」は、宿主細胞ゲノムへの外来ＤＮＡの取り込みおよび組み込み、一方の生物から他方の生物のゲノムへの外来遺伝子の転移による細胞中の永久的な、遺伝性変化を表す。
【００８３】
「ベクター」とは、ポリヌクレオチドを挿入またはクローニングすることができるポリヌクレオチド分子、好ましくは、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、酵母またはウイルスに由来するＤＮＡ分子を意味する。ベクターは、好ましくは、１以上の固有の制限部位を含み、標的細胞もしくは組織または前駆細胞もしくはその組織を含む規定の宿主細胞において自己複製が可能であり得るか、またはクローニング配列が再現できるように規定の宿主のゲノムと統合可能であり得る。したがって、ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、その複製が染色体複製から独立している染色体外実体として存在するベクター、例えば、直鎖状または閉環状プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体であり得る。ベクターは、自己複製を保証する任意の手段を含み得る。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されたときに、ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体と共に複製されるものであり得る。そのようなベクターは、宿主染色体の特定の、所望の部位への組換えを可能にする特異的配列を含み得る。ベクター系は、宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡを共に含む単一のベクターもしくはプラスミド、２種類以上のベクターもしくはプラスミド、またはトランスポゾンを含み得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞とのベクターの適合性に依存するであろう。この場合、ベクターは、好ましくは、シアノバクテリア細胞などの光合成微生物細胞において作動可能に機能的であるベクターである。ベクターは、コードされたポリペプチドの１以上にインフレームで融合されるか、または別々に発現させることができる緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などのレポーター遺伝子を含むことができる。ベクターはまた、適切な形質転換体の選択のために使用することができる抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカーも含むことができる。
【００８４】
用語「野生型」は、天然に存在する供給源から単離された場合、その遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する遺伝子または遺伝子産物を表す。野生型遺伝子または遺伝子産物（例えば、ポリペプチド）は、集団において最も高頻度に観察され、したがって、任意に設計される遺伝子の「正常」または「野生型」形態である。
【００８５】
Ｂ．ポリペプチド
本発明の実施形態は、細菌膜標的ドメインなどの少なくとも１つの異種細胞内局在化ドメインに融合された少なくとも１つのＤＧＡＴポリペプチドを含む、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）融合タンパク質を含む。このような融合タンパク質は、他の細胞成分から部分的にまたは完全に単離されるか、または例えば、改変光合成微生物などの無細胞系または宿主細胞において発現させることができる。
【００８６】
本明細書に記載のＤＧＡＴ融合タンパク質を含むことに加えて、本明細書に記載の改変光合成微生物は、必要に応じて、過剰発現もしくは導入する１以上の脂質生合成タンパク質および／またはグリコーゲン分解に関連し、過剰発現もしくは導入する１以上のタンパク質の任意の組合せを含むことができる。脂質生合成タンパク質の例としては、本明細書に記載のアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）、アシル−ＡＣＰ合成酵素（Ａａｓ）、アシル−ＡＣＰ還元酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アルデヒドデカルボニラーゼ、チオエステラーゼ（ＴＥＳ）、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）、ホスファチジン酸ホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（ＰＡＰ；またはホスファチジン酸ホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ））、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）ヒドロラーゼ、脂肪酸アシルＣｏＡ合成酵素、およびリパーゼ／ホスホリパーゼが挙げられる。グリコーゲン分解に関連する代表的なタンパク質を以下に記載する。
【００８７】
特定の場合において、この光合成微生物は、必要に応じて、１以上の内因性脂質生合成タンパク質の発現の低下、発現の除去、または非機能的発現（例えば、活性が低下したかまたは機能しない欠失変異体の発現）を含んでもよい。特定の態様において、例えば、ワックスエステルの生成において、シネココッカスなどの改変光合成微生物は、必要に応じて、１以上のアルデヒドデカルボニラーゼ（例えば、ｏｒｆ１５９３）、アルデヒド脱水素酵素（例えば、ｏｒｆ０４８９）、またはその両方の発現の低下、発現の除去、または非機能的発現を含んでもよい。特定の態様において、この改変光合成微生物は、必要に応じて、Ａａｓポリペプチドの発現の低下、発現の除去、または非機能的発現を含んでもよい。
【００８８】
これらの改変光合成微生物のいずれかは、必要に応じて、単独で、または過剰発現させた脂質生合成タンパク質および／もしくは過剰発現させたグリコーゲン分解タンパク質と組み合わせて、または本明細書に記載の任意の他のポリペプチド関連修飾と組み合わせて、グリコーゲン生合成に関連する１以上のタンパク質の発現の低下、発現の除去、または非機能的発現を含んでもよい。
【００８９】
明らかなように、本発明の改変光合成微生物は、典型的には、それらが少なくとも１つの細胞内局在化ドメイン−ＤＧＡＴ融合タンパク質を発現するかぎり、本明細書に記載の追加の改変のうちの１以上の任意の組み合わせを含んでもよい。さらに、本発明の組成物および方法は、本明細書に記載のポリペプチドのいずれかの生物活性のある変異型および／または断片を使用して実施され得ることが理解される。
【００９０】
（ｉ）細胞内局在化ドメイン−ＤＧＡＴ融合タンパク質
上記のように、本発明の実施形態は、細菌膜標的ドメインなどの少なくとも１種類の異種細胞内局在化ドメインに融合された少なくとも１つのＤＧＡＴポリペプチドを含む細胞内局在化ドメイン−ＤＧＡＴ「融合タンパク質」を含む。
【００９１】
融合タンパク質を作製する方法もそうであるように、「融合タンパク質」は、本明細書の他の箇所で定義され、当技術分野で公知である。融合タンパク質は、標準的な技術を用いて調製することができる。例えば、所望の融合物のポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列を別々に構築し、適切な発現ベクターにライゲーションすることができる。一方のポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の３’末端を、（後述の）ペプチドリンカーの有無にかかわらず、配列のリーディングフレームが一致するように、第２（または第３、第４など）のポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の５’末端に連結することができる。これにより、両方の成分ポリペプチドの生物活性を保持する単一の融合タンパク質への翻訳が可能になる。
【００９２】
ライゲーションしたＤＮＡ配列は、適切な転写または翻訳調節エレメントに作動可能に連結することができる。ＤＮＡの発現に関与する調節エレメントは、典型的には、第１のポリペプチド（例えば、膜標的ドメイン）をコードするＤＮＡ配列の５’側に位置している。同様に、翻訳を終了するために必要な停止コドンおよび転写終結シグナルは、典型的には、第２（または第３、第４など）のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の３’側に存在する。
【００９３】
本明細書に記載のＤＧＡＴ融合タンパク質において、細胞内局在化ドメインまたは標的ドメインは、ＤＧＡＴポリペプチドのＮ末端、ＤＧＡＴポリペプチドのＣ末端、ＤＧＡＴポリペプチドの内部に、またはそれらの任意の組み合わせに融合することができる。内部融合のために、細胞内局在化ドメインまたは標的ドメインは、Ｎ末端領域内（例えば、最初の約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００程度のアミノ酸）、内部領域（Ｎ末端領域とＣ末端領域の間）、および／またはＣ末端領域内（例えば、最後の約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００程度のアミノ酸）でＤＧＡＴポリペプチドに融合することができる。好ましくは、細胞内局在化ドメインもしくは標的ドメインは、ＤＧＡＴポリペプチドのＮ末端、または、例えば、約１〜１００個のアミノ酸内のＮ末端付近に融合される。特定の実施形態において、細胞内局在化ドメインまたは標的ドメインをＤＧＡＴポリペプチドの第２のアミノ酸に融合すると、最初の残基（ＡＵＧコドンのメチオニン残基）が除去される。
【００９４】
本明細書に記載の細胞内局在化ドメインは、それらが融合されるＤＧＡＴのタンパク質の細胞内局在化を変更する。したがって、このような変更は、対応する野生型ＤＧＡＴタンパク質の局在化と比較して測定することができる。ほとんどの一般的な態様において、ＤＧＡＴ融合タンパク質は、光合成微生物の１以上の定義された細胞内領域に「標的化」されるか、または「選択的に局在」し、その際、ＤＧＡＴ融合タンパク質の少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、またはほぼ１００％が、微生物の細胞質または可溶性画分と比較して、定義された細胞内領域に付随して見出され得る。特定の態様において、細胞内領域は、原形質膜、チラコイド、小胞、脂肪体、グリコーゲン顆粒、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）体、カルボキシソーム、シアノフィシン顆粒、ならびに／またはチラコイド、小胞、脂肪体、グリコーゲン顆粒、ＰＨＢ体、カルボキシソーム、および／もしくはシアノフィシン顆粒に付随する細胞内膜などの細胞内膜のうちの１以上である。特定の実施形態において、ＤＧＡＴ融合タンパク質の酵素ドメインは、細胞内領域または付随膜の細胞質側に選択的に局在する。
【００９５】
より特定の実施形態において、ＤＧＡＴ融合タンパク質は、光合成微生物の１以上の膜に「標的化」されるか、または「選択的に局在」し、その際、細胞の細胞質または可溶性画分などの他の細胞空間と比較して、融合タンパク質の少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、またはほぼ１００％は、所与の光合成微生物（例えば、シアノバクテリア）における発現の際に、少なくとも１つの膜（例えば、膜画分）に付随して見出され得る。膜の例としては、原形質膜、ならびにチラコイド、小胞、脂肪体、グリコーゲン顆粒、ＰＨＢ体、カルボキシソーム、および／またはシアノフィシン顆粒に付随する細胞内膜などの任意の細胞内膜が挙げられる。一部の実施形態において、ＤＧＡＴ融合タンパク質の酵素ドメインは、膜の細胞質側に選択的に局在する。
【００９６】
より具体的な実施形態において、ＤＧＡＴ融合タンパク質は、光合成微生物の原形質膜に「標的化」されるか、または「選択的に局在」し、その際、細胞質、小胞、脂肪体、チラコイド、グリコーゲン顆粒、ＰＨＢ体、カルボキシソーム、シアノフィシン顆粒、他の細胞内膜（例えば、チラコイド膜、脂肪体膜、小胞膜）、またはそれらの任意の組み合わせなどの他の細胞空間と比較して、融合タンパク質の少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、またはほぼ１００％は、所与の光合成微生物（例えば、シアノバクテリア）における発現の際に、原形質膜で見出され得る（または原形質膜に付随し得る）。チラコイドは、チラコイド内腔を取り巻くチラコイド膜からなり、光合成の場所である。これらのおよび関連する特定の実施形態において、ＤＧＡＴ融合タンパク質の酵素ドメインは、原形質膜の細胞質側に選択的に局在する。
【００９７】
特定の態様において、異種の細胞内局在化ドメインへの融合は、ＤＧＡＴによって媒介される光化学系破壊、活性酸素種の生成、および細胞生存率の損失の可能性を制限し、それによってＤＧＡＴ発現光合成微生物および脂質生成光合成微生物の細胞成長表現型を改善する。
【００９８】
細胞内局在化ドメイン
一般的に、本明細書に記載のＤＧＡＴ融合タンパク質の細胞内局在化ドメイン配列は、原形質膜、チラコイド、小胞、脂肪体、グリコーゲン顆粒、ＰＨＢ体、カルボキシソーム、シアノフィシン顆粒、または細胞内膜などの（例えば、細胞質全体への分散に関して）定義された細胞内領域に所与のタンパク質を選択的に局在化する任意の１以上のシグナル配列または他の配列から取得することができる。したがって、特定例としては、これらの細胞内領域に付随する膜にＤＧＡＴを標的化するドメインを含む膜標的ドメイン、チラコイド標的ドメイン、小胞標的ドメイン、脂質体標的ドメイン、グリコーゲン顆粒標的ドメイン、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）体標的ドメイン、カルボキシソーム標的ドメイン、およびシアノフィシン顆粒標的ドメインが挙げられる。具体的な場合において、ＤＧＡＴが細胞質中の脂質生成基質と相互作用することができるように、細胞内局在化ドメインは、ＤＧＡＴの活性ドメインを細胞内領域の細胞質側に選択的に局在化する。
【００９９】
細胞内局在化ドメインは、原形質膜などの膜の細胞内領域にＤＧＡＴ融合タンパク質を選択的に局在化し、かつ／または他の細胞膜もしくは基質との関係を変更し、ＤＧＡＴポリペプチドの酵素的部分が細胞質中の脂質生成基質と相互作用するのを可能にするのに十分な任意の長さであり得る。例えば、特定の実施形態において、細胞内局在化ドメインは、長さが約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００またはそれ以上のアミノ酸を含み、それらの間の全ての整数および範囲（例えば、長さが２０〜１００、３０〜１００、４０〜１００、５０〜１００、２０〜２００、３０〜２００、４０〜２００、５０〜２００個のアミノ酸）を含む、長さが約１０〜１０００個のアミノ酸であり得る。
【０１００】
特定の実施形態において、細胞内局在化ドメインは、膜標的ドメインまたは原形質膜（ＰＭ）標的ドメインである。このような膜標的配列は、Ｎ末端シグナル配列、膜貫通ドメイン配列、および／または細菌の原形質膜タンパク質などの細菌膜タンパク質の膜内在性配列の任意の組み合わせから取得されるかまたはそれらに由来し得る。特定の場合において、このような細菌の（それらの内因性状態の）原形質膜タンパク質は、原形質膜に選択的に局在し、細菌の原形質膜の細胞質側および／または（グラム陰性細菌由来の原形質膜タンパク質については）外膜のペリプラズム側に局在化される少なくとも１つのＣ末端領域を有することを特徴とする。
【０１０１】
細菌の原形質膜タンパク質は原形質膜に「選択的に局在」し、その際、このタンパク質の少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、またはほぼ１００％は、特定の光合成細菌については細胞質、細胞壁、他の細胞の「小器官」もしくはチラコイド膜などの膜、またはこれらの組み合わせなどの他の細胞空間と比較して、それが由来する細菌（例えば、グラム陽性菌、グラム陰性菌、光合成細菌、シアノバクテリア）における（好ましくは、内因性の）発現の際に原形質膜で見出され得る。
【０１０２】
特定の実施形態において、膜標的ドメインまたはＰＭ標的ドメインは、Ｎ末端シグナル配列のアミノ酸、１以上の膜貫通ドメイン（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の膜貫通ドメイン）のアミノ酸配列、１以上の膜内在性ドメインのアミノ酸配列、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。組み合わせた場合には、Ｎ末端シグナル配列、膜貫通ドメイン、および／または膜内在性ドメインは、同じまたは異なる細菌の原形質膜タンパク質に由来し得る。
【０１０３】
膜標的ドメインまたはＰＭ標的ドメインの配列は、シグナル配列、膜貫通ドメイン、または任意の様々な細菌膜タンパク質の膜内在性ドメインから取得（または由来）し得る。例えば、細菌膜タンパク質は、膜貫通タンパク質（ＴＰ）などの膜内在性タンパク質（ＩＭＰ）であり得る。場合によって、膜標的ドメインは、原形質膜の脂質二重層にまたがる唯一のドメインを有する１回のみ貫通した膜貫通タンパク質、または原形質膜の脂質二重層にまたがる約２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のドメインを有する複数回貫通した膜貫通タンパク質から取得される。後者の場合、膜標的ドメインは、複数の膜貫通ドメインのうちの任意の１以上を含むことができる。特定の態様において、膜標的ドメインまたは膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）は、αヘリックス膜貫通構造、またはβバレル膜貫通構造を含み、後者は、典型的には、グラム陰性外膜タンパク質に由来し得る。
【０１０４】
一部の実施形態において、膜標的ドメインまたはＰＭ標的ドメインは、全脂質二重層にはまたがらないが、原形質膜などの膜の細胞質側に挿入または付着している。例としては、両親媒性ヘリックス（例えば、膜平面と並行）によって膜と相互作用する膜標的ドメイン、疎水性ループによって膜と相互作用する膜標的ドメイン、および、例えば、カルシウムイオンを介した静電的またはイオン性相互作用によって膜と相互作用する膜標的ドメインが挙げられる。
【０１０５】
一部の実施形態において、膜標的ドメイン配列は、１以上のグラム陰性菌、グラム陽性菌、もしくはシアノバクテリアなどの他の細菌の膜タンパク質または原形質膜タンパク質から取得される。典型的な細菌については本明細書の他の箇所に記載されており、当技術分野で公知である。
【０１０６】
特定の実施形態において、膜標的ドメインまたはＰＭ標的ドメイン配列は、Ａｐｈａｎｏｃａｐｓａ、Ａｐｈａｎｏｔｈｅｃｅ、Ｃｈａｍａｅｓｉｐｈｏｎ、Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｈｒｏｏｇｌｏｅｏｃｙｓｔｉｓ、Ｃｏｅｌｏｓｐｈａｅｒｉｕｍ、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｙａｎｏｂｉｕｍ、Ｃｙａｎｏｄｉｃｔｙｏｎ、Ｃｙａｎｏｓａｒｃｉｎａ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ、Ｄａｃｔｙｌｏｃｏｃｃｏｐｓｉｓ、Ｇｌｏｅｃａｐｓａ、Ｇｌｏｅｏｔｈｅｃｅ、Ｍｅｒｉｓｍｏｐｅｄｉａ、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ、Ｒａｄｉｏｃｙｓｔｉｓ、Ｒｈａｂｄｏｄｅｒｍａ、Ｓｎｏｗｅｌｌａ、Ｓｙｎｙｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、ＴｈｅｒｍｏｓｅｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓおよびＷｏｒｏｎｉｃｈｉｎｉａの属のシアノバクテリア；Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｎａｂａｅｎｏｐｓｉｓ、Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ、Ａｕｌｏｓｉｒａ、Ｃａｌｏｔｈｒｉｘ、Ｃｏｌｅｏｄｅｓｍｉｕｍ、Ｃｙａｎｏｓｐｉｒａ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｏｓｉｓ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｕｍ、Ｆｒｅｍｙｅｌｌａ、Ｇｌｅｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｍｉｃｒｏｃｈａｅｔｅ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ、Ｎｏｓｔｏｃ、Ｒｅｘｉａ、Ｒｉｃｈｅｌｉａ、Ｓｃｙｔｏｎｅｍａ、Ｓｐｒｉｒｅｓｔｉｓ、Ｔｏｙｐｏｔｈｒｉｘ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａｌｅｓの属のネンジュモ目、シアノバクテリア；Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ、Ｇｅｉｔｌｅｒｉｎｅｍａ、Ｈａｌｏｍｉｃｒｏｎｅｍａ、Ｈａｌｏｓｐｉｒｕｌｉｎａ、Ｋａｔａｇｎｙｍｅｎｅ、Ｌｅｐｔｏｌｙｎｇｂｙａ、Ｌｉｍｎｏｔｈｒｉｘ、Ｌｙｎｇｂｙａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ、Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ、Ｐｌａｎｋｔｏｔｈｒｉｃｏｉｄｅｓ、Ｐｌａｎｋｔｏｔｈｒｉｘ、Ｐｌｅｃｔｏｎｅｍａ、Ｐｓｅｕｄｏａｎａｂａｅｎａ／Ｌｉｍｎｏｔｈｒｉｘ、Ｓｃｈｉｚｏｔｈｒｉｘ、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ、Ｓｙｍｐｌｏｃａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ、Ｔｙｃｈｏｎｅｍａの属のシアノバクテリア；Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｉｄｉｏｐｓｉｓ、Ｄｅｒｍｏｃａｒｐａ、Ｄｅｒｍｏｃａｒｐｅｌｌａ、Ｍｙｘｏｓａｒｃｉｎａ、Ｐｌｅｕｒｏｃａｐｓａ、Ｓｔａｎｉｅｒｉａ、Ｘｅｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔｅｓの属のプレウロカプサ目、シアノバクテリア；Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｎ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｔｈｒｉｘの属のシアノバクテリア；ならびにＣａｐｓｏｓｉｒａ、Ｃｈｌｏｒｏｇｅｏｅｐｓｉｓ、Ｆｉｓｃｈｅｒｅｌｌａ、Ｈａｐａｌｏｓｉｐｈｏｎ、Ｍａｓｔｉｇｏｃｌａｄｏｐｓｉｓ、Ｎｏｓｔｏｃｈｏｐｓｉｓ、Ｓｔｉｇｏｎｅｍａ、Ｓｙｍｐｈｙｏｎｅｍａ、Ｓｙｍｐｈｏｎｅｍｏｐｓｉｓ、Ｕｍｅｚａｋｉａ、ａｎｄ  Ｗｅｓｔｉｅｌｌｏｐｓｉｓの属のスティゴネマ目、シアノバクテリアなどの光合成細菌の膜タンパク質または血漿膜タンパク質から取得される。特定の実施形態において、このシアノバクテリアは、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｉｇｒａｎｕｌａｔｕｓ、シネココッカス・エロンガタス、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｅｏｐｏｌｉｅｎｓｉｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｖｉｄｕｓ、Ｓｙ���ｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、およびＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｕｂｅｓｃｅｎｓを含むが、これらに限定されないシネココッカス属由来である。具体的な実施形態において、膜標的ドメイン配列は、シネココッカス・エロンガタス種のＰＣＣ７９４２株またはシネココッカス種のＰＣＣ７００２（もとは、Ａｇｍｅｎｅｌｌｕｍ  ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｕｍとして知られる）の原形質膜タンパク質に由来する。
【０１０７】
一部の実施形態において、膜タンパク質は、化学受容体または走化性タンパク質などの原形質膜受容体タンパク質である。特定例としては、膜内在性化学受容体、例えば、膜貫通化学受容体が挙げられる。化学受容体または走化性タンパク質の例としては、メチル受容走化性タンパク質およびセリン走化性受容体（例えば、大腸菌のＴｓｒ受容体）およびアスパラギン酸走化性受容体などのアミノ酸走化性受容体が挙げられる。したがって、膜標的ドメインは、このような細菌の原形質膜受容体の任意の１以上のシグナル配列および／または膜貫通ドメインから取得できる。
【０１０８】
特定の実施形態において、膜標的ドメインは、メチル受容走化性タンパク質（ＭＣＰ）から取得される（または由来する）。ＭＣＰは、トポロジーの種類（Ｚｈｕｌｉｎ，Ａｄｖ  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．４５：１５７−１９８，２００１参照）およびシグナル伝達ドメインクラス（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｚｈｕｌｉｎ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ．１０４：２８８５−２８９０，２００７参照）によって分類することができる。トポロジーＩ型のＭＣＰは、大きなペリプラズムリガンド結合ドメインならびにＨＡＭＰドメイン（すなわち、ヒスチジンキナーゼ、アデニリルシクラーゼ、メチル結合タンパク質、およびホスファターゼ）からなる細長い細胞質領域、続いて、順に、「メチル化」、「柔軟な束」および「シグナル伝達」のサブドメインで構成されているシグナル伝達ドメインを有する（上述のＡｌｅｘａｎｄｅｒ  ａｎｄ  ＺｈｕｌｉｎおよびＨａｚｅｌｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ．３３：９−１９，２００８参照）。ＭＣＰは、細胞極で大規模アレイ内の他の走化性タンパク質と共にクラスターを形成する。
【０１０９】
例えば、大腸菌、Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｒｉｍｉｔｉａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｈｅｐａｔｉｃｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ａｃｅｔｏｎｅｍａ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｈａｌｏｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎｕｓ、およびＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉを含む様々な細菌のＭＣＰアレイが十分に特徴付けられている（Ｂｒｉｅｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ．１０６：１７１８１−１７１８６，２００９参照）。したがって、膜標的ドメインは、これらの細菌の任意の１以上のＭＣＰ、または本明細書に記載の、もしくは当技術分野で公知の任意の他の細菌のＭＣＰのシグナル配列および／または膜貫通ドメインに由来し得る。
【０１１０】
具体的な実施形態において、ＭＣＰは、シネココッカス・エロンガタスのＰＣＣ７９４２−０８５８またはＰＣＣ７９４２−１０１５によってコードされている。シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２−０８５８ＭＣＰのポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１９９および２００に記載されており、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２−１０１５のＭＣＰのポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号２０１および２０２に記載されている。
【０１１１】
一部の実施形態において、膜標的ドメインは、Ｎ末端シグナル配列、第１の（Ｎ末端）膜貫通ドメイン、および／またはＰＣＣ７９４２−０８５８の第２の貫通ドメインを単独または共に組み合わせて含むか、または本質的にそれらからなる。特定の場合において、細菌膜標的ドメインは、ＰＣＣ７９４２−０８５８によってコードされるＭＣＰのＮ末端の約４３〜５３個のアミノ酸、例えば、配列番号１９９の約１〜４３、１〜４４、１〜４５、１〜４６、１〜４７、１〜４８、１〜４９、１〜５０、１〜５１、１〜５２、１〜５３、１〜５４、１〜５５、１〜５６、１〜５７、１〜５８、１〜５９、１〜６０残基を含むか、または本質的にそれらからなる。特定の場合において、細菌膜標的ドメインは、配列番号２１１〜２１５を含むか、または本質的にそれらからなる。特定の場合において、細菌膜標的ドメインは、ＰＣＣ７９４２−０８５８によってコードされるＭＣＰのＮ末端シグナル配列および２つのＮ末端に近接するＴＭＤ、例えば、配列番号１９９の約１〜１４１個の残基を含むか、または本質的にそれらからなる。
【０１１２】
ＤＧＡＴポリペプチド
本明細書で使用する「ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ」（ＤＧＡＴ）ポリペプチドは、任意の細胞源から取得される任意のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを含み、これは、このような能力を有するジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ配列の天然に存在する（例えば、対立遺伝子変異体、オルソログ）または天然に存在しない任意の変異型に加えて、酵素反応条件下で１，２−ジアシルグリセロールおよび脂肪酸アシル基質からトリアシルグリセロールの生成を触媒する能力を実証する。多くのＴＡＧ生成菌でしばしば見られるように、本発明のＤＧＡＴポリペプチドには、ＤＧＡＴ活性およびＣｏＡ：脂肪族アルコールアシルトランスフェラーゼ活性、例えば、ワックスエステル合成（ＷＥＳ）活性を示す二機能性タンパク質などの二機能性タンパク質も含まれる。
【０１１３】
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）は、オレオイル−ＣｏＡ依存的にステロールまたはジアシルグリセロールのいずれかをエステル化するＯ−アシルトランスフェラーゼスーパーファミリーのメンバーである。特に、ＤＧＡＴはジアシルグリセロールをエステル化し、この反応は、植物、真菌および哺乳類におけるトリアシルグリセロールの生成の最後の酵素段階を表す。具体的には、ＤＧＡＴは、１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）のｓｎ−３位にアシル補酵素Ａからのアシル基を転移させ、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）を形成することに関与する。ＤＧＡＴは、Ｈａｒｗｏｏｄ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ．Ａｃｔａ，１３０１：７−５６，１９９６）、Ｄａｕｍら（Ｙｅａｓｔ  １６：１４７１−１５１０，１９９８）、およびＣｏｌｅｍａｎら（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．２０：７７−１０３，２０００）（これらの各々は参照により本明細書に援用される）に概略されている膜内在性タンパク質である。
【０１１４】
植物および真菌では、ＤＧＡＴは、膜および脂肪体の画分と付随する。ＴＡＧを触媒する際に、ＤＧＡＴは、主にエネルギー貯蔵として使用される炭素の貯蔵に寄与する。しかし動物では、ＤＧＡＴの役割はより複雑である。ＤＧＡＴは、リポタンパク質のアセンブリおよび血漿トリアシルグリセロール濃度の調節（Ｂｅｌｌ，Ｒ．Ｍ．ら）だけでなく、ジアシルグリセロールレベルの調節の役割も担っている（Ｂｒｉｎｄｌｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，Ｖａｎｃｅ，Ｄ．Ｅ．＆Ｖａｎｃｅ，Ｊ．Ｅ．（編）（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ），１７１−２０３；およびＮｉｓｈｉｚｕｋａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：６０７−６１４，１９９２、これらの各々は参照により援用される）。
【０１１５】
真核生物では、ＴＡＧを形成する能力を有するタンパク質をコードする少なくとも３つの独立したＤＧＡＴ遺伝子ファミリー（ＤＧＡＴ１、ＤＧＡＴ２、およびＰＤＡＴ）について説明されている。酵母は、ＤＧＡＴ１、ＤＧＡＴ２、およびＰＤＡＴの３つ全てを含んでいるが、これらの遺伝子ファミリーの発現レベルは、ライフサイクルの異なる段階中に変化する（Ｄａｈｌｑｖｓｔ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：６４８７−６４９２，２０００、参照により援用される）。
【０１１６】
原核生物では、アシネトバクターカルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）ＡＤＰ１由来のＷＳ／ＤＧＡＴは、広範なクラスの細菌性ワックスエステルおよびＴＡＧ生合成酵素の最初に同定されたメンバーを表する。この酵素は、推定膜貫通領域を含むが、真核生物のＤＧＡＴ１およびＤＧＡＴ２ファミリーに配列相同性を示さない。インビトロ条件下では、ＷＳ／ＤＧＡＴは、多種多様の脂肪族アルコール、さらにチオールを様々なアシルＣｏＡチオエステルのアシル部分のアクセプターとして利用する幅広い能力を示す。ＷＳ／ＤＧＡＴアシル基トランスフェラーゼ酵素は、非常に広い基質特異性を示す。相同なアシルトランスフェラーゼの遺伝子は、例えば、約１５種類の機能的相同体が存在するＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｙｌｉｉ、Ａ．ｂａｕｍａｎｉｉ、およびＭ．ａｖｉｕｍ、ならびにＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＣＤＣ１５５１を含む中性脂質を蓄積することが可能なほとんど全ての細菌中に見出されている（例えば、Ｄａｎｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６：５０１７−５０３０，２００４；およびＫａｌｓｃｈｅｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７：８０７５−８０８２．２００３参照）。
【０１１７】
ＤＧＡＴタンパク質は、脂肪酸アシルＣｏＡおよび脂肪酸アシル−ＡＣＰ分子を含む宿主細胞中で様々なアシル基質を利用することができる。さらに、ＤＧＡＴは特定の分子に関して優先的な活性を示すことができるが、ＤＧＡＴ酵素によって影響を受けるアシル基質は、様々な炭素鎖長および飽和度を有していてもよい。
【０１１８】
真核生物のＯ−アシルトランスフェラーゼスーパーファミリーの他のメンバーと同様に、真核生物のＤＧＡＴポリペプチドは、典型的には、Ｚｈｏｎｇｍｉｎら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４２：１２８２−１２９１，２００１）（参照により本明細書に援用される）に記載されるようなＦＹｘＤＷＷＮ（配列番号１５）ヘプタペプチド保持モチーフおよびヒスチジン（またはチロシン）−セリン−フェニルアラニン（Ｈ／ＹＳＦ）トリペプチドモチーフを含む。高度に保存されたＦＹｘＤＷＷＮ（配列番号１５）は、脂肪酸アシルＣｏＡ結合に関与すると考えられている。したがって、特定の場合において、本明細書に記載の融合タンパク質のＤＧＡＴポリペプチド部分は、これらのモチーフの１つ以上を含んでもよい。
【０１１９】
本明細書に記載の融合タンパク質に従って利用されるＤＧＡＴポリペプチドは、真核生物および原核生物を含む任意の生物から単離することができる。ＤＧＡＴ遺伝子を有する真核生物は、当技術分野で公知であり、様々な動物（例えば、哺乳類、ショウジョウバエ、線虫）、植物、寄生虫、および真菌（例えば、出芽酵母および分裂酵母などの酵母）を含む。原核生物の例としては、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｒａｎｋｉａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｏｃｒｉｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの代表的な属のものなどの特定の放線菌類、高いＧ＋Ｃ比を有するグラム陽性菌のグループが挙げられる。ＤＧＡＴ活性をコードする１以上の遺伝子を有する放線菌の具体例としては、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ、Ｒ．ｒｕｂｅｒ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓが挙げられる。
【０１２０】
ＤＧＡＴ活性を有する１種類以上の酵素をコードする原核生物のさらなる例としては、Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ａ．ｂａｕｍａｎｉｉ、Ａ．ｂａｙｌｉｉなどのアシネトバクター属のメンバー、およびＡｌｃａｎｉｖｏｒａｘ属のメンバーが挙げられる。特定の実施形態において、ＤＧＡＴポリペプチドは、十分に特徴付けられたＤＧＡＴ（ＡｔｆＡ）を含むトリグリセリド形成グラム陰性原核生物であるＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｙｌｉｉ種のＡＤＰ１である。
【０１２１】
特定の実施形態において、ＤＧＡＴポリペプチドは、アシネトバクターのＤＧＡＴ（ＡＤＧＡＴ）、ストレプトマイセスのＤＧＡＴ、またはアルカニボラクスのＤＧＡＴである。特定の実施形態において、ＤＧＡＴポリペプチドは、配列番号５８、５９、６０、もしくは６１、またはそれらの断片もしくは変異型のいずれか１つに記載のポリペプチド配列を含むか、またはそれらからなる。配列番号５８は、ＤＧＡＴｎの配列であり、配列番号５９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのＤＧＡＴ（ＳｃｏＤＧＡＴまたはＳＤＧＡＴ）の配列であり、配列番号６０は、Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓのＤＧＡＴ（ＡｂｏＤＧＡＴ）の配列であり、配列番号６１はＤＧＡＴｄの配列である。
【０１２２】
特定の実施形態において、本発明の改変光合成微生物は、２種類以上の細胞内局在化ドメイン−ＤＧＡＴ融合タンパク質を発現することができる。ＤＧＡＴポリペプチドは、同一でもまたは異なっていてもよい。特定の実施形態において、以下の細胞内局在化ドメイン−ＤＧＡＴ融合物は、改変光合成微生物、例えば、シアノバクテリアにおいて、ＡＤＧＡＴｄ：：ＳｃｏＤＧＡＴ；ＡＤＧＡＴｄ（ＮＳ１）：：ＡＤＧＡＴｄ（ＮＳ２）；ＡＤＧＡＴｎ（ＮＳ１）：：ＡＤＧＡＴｎ（ＮＳ２）；ＡＤＧＡＴｎ（ＮＳ１）：：ＳＤＧＡＴ（ＮＳ２）；ＳＤＧＡＴ（ＮＳ１）：：ＡＤＧＡＴｎ（ＮＳ２）；ＳＤＧＡＴ（ＮＳ１）：：ＳＤＧＡＴ（ＮＳ２）、の二重のＤＧＡＴ株の１種類を使用して共発現される。ＮＳ１ベクターのｐＡＭ２２９１については、ＥｃｏＲＩはＡＴＧに続き、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の一部である。ＮＳ２ベクターのｐＡＭ１５７９については、ＥｃｏＲＩはＡＴＧに続き、ＯＲＦの一部である。ＡＴＧ後のＥｃｏＲＩヌクレオチドを有するＤＧＡＴは、ｐＡＭ２２９１またはｐＡＭ１５７９のいずれかにクローニングすることができ、このようなＤＧＡＴはＡＤＧＡＴｄと呼ばれている。他の実施形態は、Ｎｄｅ／ＢｇｌＩＩ部位を有するＮＳ１ベクターであるベクターｐＡＭ２３１４ＦＴｒｃ３、またはＮｄｅ／ＢｇｌＩＩ部位を有するＮＳ２ベクターであるベクターｐＡＭ１５７９ＦＴｒｃ３を利用する。ＥｃｏＲＩヌクレオチドを含まないＤＧＡＴは、これらの最後の２つのベクターのいずれかにクローニングすることができる。このようなＤＧＡＴはＡＤＧＡＴｎと呼ばれている。異なるＤＧＡＴを発現する改変光合成微生物は、異なる脂肪酸組成を有するＴＡＧを発現する。したがって、特定の実施形態は、多様な脂肪酸組成を有するＴＡＧを生成するために、２種類以上の異なる細胞内局在化ドメイン−ＤＧＡＴ融合物を発現させることを企図する。
【０１２３】
ペプチドリンカー
特定の実施形態において、ペプチドリンカー配列は、各ポリペプチドがその所望の２次および３次構造に折り畳まれることを保証するのに十分な距離だけ、ＤＧＡＴポリペプチドおよび異種の細胞内局在化ドメインを分離するために用いることができる。このようなペプチドリンカー配列は、当技術分野で公知の標準的な技術を用いて融合タンパク質に組み込むことができる。
【０１２４】
特定のペプチドリンカー配列は、（１）可動性のある伸長した立体構造をとることができること；（２）第１および第２のポリペプチド上の機能的エピトープと相互作用することができる２次構造をとることができないこと；（３）それらの生理学的安定性；および（４）ポリペプチドの機能的エピトープまたは他の特徴と反応し得る疎水性残基または荷電残基の欠如、の代表的な要因に基づいて選択することができる。例えば、Ｇｅｏｒｇｅ  ａｎｄ  Ｈｅｒｉｎｇａ，Ｊ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１５：８７１−８７９，２００２を参照されたい。
【０１２５】
リンカー配列は、本質的に任意の長さであり得るが、一般的に、約１〜約３００個のアミノ酸長である。特定のリンカーは、約１〜３００個のアミノ酸、１〜２５０個、１〜２００個のアミノ酸、１〜１５０個のアミノ酸、１〜１００個のアミノ酸、１〜９０個のアミノ酸、１〜８０個のアミノ酸、１〜７０個のアミノ酸、１〜６０個のアミノ酸、１〜５０個のアミノ酸、１〜４０個のアミノ酸、１〜３０アミノ酸、１〜２０個のアミノ酸、１〜１０個のアミノ酸、１〜５個のアミノ酸、１〜４個のアミノ酸、１〜３個のアミノ酸、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４  、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００個もしくはそれ以上のアミノ酸長の全体的なアミノ酸長を有することができる。
【０１２６】
リンカーとして有用に用いることができる特定のアミノ酸配列には、Ｍａｒａｔｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ４０：３９−４６，１９８５；Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ．８３：８２５８−８２６２，１９８６；米国特許第４，９３５，２３３号および同第４，７５１，１８０号に開示されるものが含まれる。特定のペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒおよび／またはＡｓｎ残基を含む。必要に応じて、ＴｈｒおよびＡｌａなどの他の中性に近いアミノ酸も、ペプチドリンカー配列に使用することができる。
【０１２７】
特定の代表的なリンカーには、［Ｇ］Ｘ、［Ｓ］Ｘ、［Ｎ］Ｘ、［ＧＳ］Ｘ、［ＧＧＳ］Ｘ、［ＧＳＳ］Ｘ、［ＧＳＧＳ］Ｘ（配列番号２０３）、［ＧＧＳＧ］Ｘ（配列番号２０４）、［ＧＧＧＳ］Ｘ（配列番号２０５）、［ＧＧＧＧＳ］Ｘ（配列番号２０６）、［ＧＮ］Ｘ、［ＧＧＮ］Ｘ、［ＧＮ］Ｘ、［ＧＮＧＮ］Ｘ（配列番号２０７）、［ＧＧＮＧ］Ｘ（配列番号２０８）、［ＧＧＧＮ］Ｘ（配列番号２０９）、［ＧＧＧＧＮ］Ｘ（配列番号２０９）リンカーなどのＧｌｙ、Ｓｅｒおよび／またはＡｓｎ含有リンカーが含まれ、Ｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０またはそれ以上である。これらのおよび関連するアミノ酸の他の組み合わせは、当業者には明らかであろう。
【０１２８】
しかし、特定の実施形態において、ペプチドリンカーの任意の１以上は任意選択である。例えば、（膜またはＰＭ標的ドメインが由来する）細菌膜タンパク質およびＤＧＡＴポリペプチドが、機能的ドメインを分離して、立体的干渉を防止するために使用することができる非必須領域（例えば、Ｎ末端および／もしくはＣ末端アミノ酸、または原形質膜タンパク質については、シグナル配列および／または膜貫通ドメインのすぐ下流の領域）を有する場合には、リンカー配列は必要とされない可能性がある。
【０１２９】
（ｉｉ）脂質生合成タンパク質
様々な実施形態において、本発明の改変光合成微生物は、さらに、脂質生合成タンパク質、例えば、本明細書に記載のもののいずれかを含むがこれらに限定されないトリグリセリド生合成または脂肪酸生合成に関連する活性を有するポリペプチドをコードする１以上の外因性（例えば、導入されるか）または過剰発現させる核酸を含む。特定の場合において、この改変光合成微生物は、１以上の選択された脂質生合成タンパク質の発現および／または活性の低下を含み得る。これらのタンパク質のいくつかは、以下により詳細に記載されている。
【０１３０】
特定の実施形態において、外因性核酸は、微生物のゲノムに対して天然に存在する核酸配列を含まない。一部の実施形態において、外因性核酸は、微生物のゲノムに対して天然に存在する核酸配列を含むが、例えば、微生物において核酸および／またはそれによってコードされているポリペプチドの発現を増加させるために、例えば、ベクターまたは分子生物学技術によって微生物に導入されている。特定の実施形態において、天然または内因性の核酸およびその対応するタンパク質の発現は、天然の遺伝子の上流に異種プロモーターを導入することによって増加させることができる。上述のように、脂質生合成タンパク質は、トリグリセリド生合成、脂肪酸合成、ワックスエステル合成、またはそれらの任意の組合せに関与し得る。
【０１３１】
トリグリセリド生合成
トリグリセリドまたはトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）は、主に３つの脂肪酸でエステル化されたグリセロールからなり、炭水化物またはタンパクのいずれかよりも酸化により多くのエネルギーを与える。トリグリセリドは、ほとんどの真核生物のエネルギー貯蔵の重要なメカニズムを提供する。哺乳類では、ＴＡＧは、脂肪細胞および肝細胞を含むいくつかの細胞型で合成ならびに貯蔵されている（Ｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４９：４５９−４８７，１９８０）（参照により援用される）。植物では、ＴＡＧ生成は、主に種子油の生成に重要である。
【０１３２】
真核生物とは対照的に、原核生物におけるトリグリセリド生成の観察は、アシネトバクター属の特定のメンバーに加えて、マイコバクテリウム属、ノカルディア属、ロドコッカス属およびストレプトマイセス属のメンバーなどの特定の放線菌に限定される。特定の放線菌種では、トリグリセリドは、乾燥細胞重量のほぼ８０％まで蓄積することができるが、アシネトバクターではわずか乾燥細胞重量の約１５％までしか蓄積しない。一般的に、トリグリセリドは、それぞれの種、成長段階、および培養条件に依存する量ならびに直径で、球状の脂肪体に貯蔵される。例えば、炭素および窒素の含有量が高い複合培地で培養すると、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓの細胞は、ほんのわずかのＴＡＧを含むが、これらの細胞を窒素対炭素比が低い無機塩培地で培養すると、ＴＡＧ体の脂質含量量および数が著しく増加し、後期定常増殖期に最大量に達する。この段階では、細胞は、ほとんど完全に、５０〜４００ｎｍの範囲の直径を呈する脂肪体で満たされ得る。一例として、脂質が、全細胞乾燥重量の７０％を超える量に達することができるＲ．ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０が挙げられる。
【０１３３】
細菌では、ＴＡＧ形成は、典型的には、原形質膜へのジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ酵素のドッキングから始まり、小さな脂肪滴（ＳＬＤ）の形成が続く。これらのＳＬＤは、直径がわずか数ナノメートルしかなく、膜にドッキングした酵素と会合した状態である。この脂質蓄積段階では、ＳＬＤは、典型的には、原形質膜で乳状の油性（ｏｌｅｏｇｅｎｏｕｓ）層を形成する。長期の脂質合成中に、ＳＬＤは、膜と会合したアシルトランスフェラーゼから離れ、膜と結合した脂質前駆体に集塊する。これらの脂質前駆体は、異なるサイズ、例えば、Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓでは約２００ｎｍであり、Ｒ．ｏｐａｃｕｓでは約３００ｎｍに達した後、膜との接触を失い、細胞質中に放出される。遊離のおよび膜結合した脂質前駆体は、蛍光顕微鏡検査中にＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓで観察され、Ｒ．ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０およびＡ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ  ＡＤＰ１でも確認されるように、細胞質および細胞壁で生じる脂質ドメインに対応する（例えば、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３１：１５６１−１５７２，１９９９、およびＷａｌｔｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５５：７５０−７６３，２００５参照）。脂質前駆体中では、ＳＬＤは、互いに合体して、電子顕微鏡検査中に不透明に見える場合が多い成熟脂肪体中に見られる均質な脂質コアを形成する。
【０１３４】
細菌ＴＡＧの組成および構造は、微生物および炭素源によって大きく変動する。さらに、フェニルデカン酸および４，８，１２−トリメチルトリデカン酸などのまれなアシル部分も、細菌ＴＡＧの構造的多様性に寄与し得る（例えば、Ａｌｖａｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６０：３６７−７６，２００２参照）。
【０１３５】
真核生物と同様に、原核生物におけるＴＡＧの主な機能は、エネルギーおよび炭素の貯蔵化合物として機能することである。しかし、ＴＡＧは、原核生物において他の機能を提供することができる。例えば、脂肪体は、原形質膜およびリン脂質（ＰＬ）生合成から除外されなければならない扱いにくい炭素源上で成長中に形成される毒性または無用な脂肪酸のための貯蔵所として機能する可能性がある。さらに、多くのＴＡＧ蓄積細菌は、土壌に遍在しており、この生息地において、脱水を引き起こす水欠乏が頻繁に生じる環境ストレスである。蒸発耐性脂質の貯蔵は、脱水条件下で脂質の炭化水素鎖の酸化が多量の水を生成するので、基本的な水の供給を維持するための戦略であるかもしれない。しかし、これらの生物は、トリグリセリドの生合成に必要な酵素を欠いているので、シネココッカスなどのシアノバクテリアはトリグリセリドを生成しない。
【０１３６】
トリグリセリドは、脂肪酸およびグリセロールから合成される。トリグリセリド（ＴＡＧ）合成の１機構として、「ケネディ経路」を介したグリセロール−３−リン酸の逐次アシル化により、ホスファチジン酸を生成させる。次に、ホスファチジン酸は、酵素ホスファチジン酸ホスファターゼによって脱リン酸化され、１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を生成する。基質としてＤＡＧを使用することで、少なくとも３種類の異なるクラスの酵素は、ＴＡＧ形成を媒介することができる。一例として、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）活性を有する酵素は、基質としてアシルＣｏＡを使用してＤＡＧのアシル化を触媒する。基本的に、ＤＧＡＴ酵素は、アシルＣｏＡと１，２−ジアシルグリセロール分子を結合させて、ＴＡＧを形成する。別の方法として、アシルＣｏＡ非依存的なＴＡＧ合成は、ＤＡＧエステル化のアシル供与体としてリン脂質を使用する、酵母および植物に見られるリン脂質：ＤＡＧアシルトランスフェラーゼによって媒介され得る。第３に、動植物のＴＡＧ合成は、アシル供与体および受容体の両方としてＤＡＧを使用し、ＴＡＧおよびモノアシルグリセロールを生成するＤＡＧ−ＤＡＧ−トランスアシラーゼによって媒介され得る。
【０１３７】
本発明の改変光合成微生物、例えば、シアノバクテリアは、本明細書に記載のポリペプチドおよび酵素の１以上を含むポリペプチドをコードする１以上の外因性ポリヌクレオチドを含んでもよい。
【０１３８】
野生型シアノバクテリアは、典型的には、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素などのトリグリセリド合成に必要な酵素をコードしていないので、本発明の実施形態は、必要に応じて、脂肪酸アシルＣｏＡ合成酵素活性を有する１以上の酵素と組み合わせて、１以上のＤＧＡＴ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子組換えシアノバクテリアを含む。特定の実施形態において、１以上の外因性ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のＤＧＡＴ融合タンパク質および脂肪酸アシルＣｏＡ合成酵素、またはその機能的変異体もしくは断片をコードする。
【０１３９】
さらに、トリグリセリドは、典型的には、脂肪酸から形成されるので、細胞内の脂肪酸生合成のレベルは、トリグリセリドの生成を制限することができる。したがって、脂肪酸生合成のレベルの増加は、トリグリセリドの生成の増加を可能にし得る。以下に説明するように、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、脂肪酸生合成へのコミットメント段階を触媒する。したがって、本発明の特定の実施形態は、１以上のＤＧＡＴ融合タンパク質に加えて、脂肪酸生合成および脂質生成を増加させるためのアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有する１以上の酵素、および必要に応じて、トリグリセリド生成を触媒するための脂肪酸アシルＣｏＡ合成酵素活性を有する１以上の酵素をコードするポリヌクレオチドを含むシアノバクテリア、ならびにその使用法を含む。これらのおよび関連する実施形態を以下に詳述する。
【０１４０】
脂肪酸生合成
脂肪酸は、負に荷電した、様々な長さで様々な程度の酸化状態の直鎖状炭化水素鎖のグループである。負電荷は、カルボキシル末端基に位置し、典型的には、生理学的ｐＨ値（ｐＫ約２〜３）で脱プロトン化される。脂肪酸「尾部」の長さは、その水溶性（またはある程度不溶性）および両親媒性特性を決定する。脂肪酸は、成体膜の一部を形成するリン脂質およびスフィンゴ脂質、ならびに主に細胞内でエネルギー貯蔵分子として使用されるトリグリセリドの構成要素である。
【０１４１】
脂肪酸は、アセチルＣｏＡおよびマロニルＣｏＡ前駆体から形成される。マロニルＣｏＡは、アセチルＣｏＡのカルボキシル化型であり、補酵素Ａに結合した３個の炭素のジカルボン酸のマロン酸塩を含む。アセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、アセチルＣｏＡがカルボキシル化されて、マロニルＣｏＡを形成する２段階反応を触媒する。特に、マロン酸は、酵素アセチルＣｏＡカルボキシラーゼのビオチン補因子を使用して、ＣＯ２の添加によってアセチルＣｏＡから形成される。
【０１４２】
脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）は、脂肪酸生合成の鎖伸長段階を実行する。ＦＡＳは、巨大多酵素複合体である。哺乳類では、ＦＡＳは、それぞれが複数の酵素活性を含む２つのサブユニットを含む。細菌および植物において、巨大複合体に結合する個々のタンパク質は、合成スキームの各段階を触媒する。例えば、細菌および植物において、アシルキャリアータンパク質は、より小さい独立したタンパク質である。
【０１４３】
脂肪酸合成は、アセチルＣｏＡから始まり、鎖は、完全な脂肪酸の炭素１およびα−炭素が最後に付加されるように、「末端」から成長する。最初の反応は、大型哺乳類の脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）タンパク質の領域であるアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）のパントテン酸基へのアセチル基の転移である。この反応では、アセチルＣｏＡはアセチルＣｏＡ＋ＣＥ−ｃｙｓ−ＳＨ→アセチル−ｃｙｓ−ＣＥ＋ＣｏＡＳＨに示すように、縮合酵素（ＣＥ）ドメインのシステイン−ＳＨ基に付加される。機構的には、これは２段階プロセスであり、この基は、最初にＡＣＰ（アシルキャリアーペプチド）に転移され、その後、縮合酵素ドメインのシステイン−ＳＨ基に転移される。
【０１４４】
第２の反応において、マロニルＣｏＡは、マロニルＣｏＡ＋ＡＣＰ−ＳＨ→マロニルＡＣＰ＋ＣｏＡＳＨに示すように、ＡＣＰスルフヒドリル基に付加される。このＳＨ基は、ＡＣＰのホスホパントテン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｎｉｃ）補欠分子族の一部である。
【０１４５】
第３の反応において、アセチル基は、マロニルＡＣＰ＋アセチル−ｃｙｓ−ＣＥ→ベータ−ケトブチリル−ＡＣＰ＋ＣＯ２に示すように、二酸化炭素の放出によりマロニル基に転送される。
【０１４６】
第４の反応において、ケト基は、ベータ−ケトブチリル−ＡＣＰ＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋→ベータ−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰ＋ＮＡＤ＋に示すように、ベータ−ケトアシル還元酵素活性によってヒドロキシル基に還元される。
【０１４７】
第５の反応において、ベータ−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰは、ベータ−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰ→２−ブテノイル−ＡＣＰ＋Ｈ２Ｏに示すように、脱水され、ベータ−ヒドロキシアシルデヒドラターゼ活性によってトランス−単不飽和脂肪酸アシル基を形成する。
【０１４８】
第６の反応において、二重結合は、２−ブテノイル−ＡＣＰ＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋→ブチリル−ＡＣＰ＋ＮＡＤＰ＋に示すように、ＮＡＤＰＨによって還元され、最初のものよりも炭素が２個長い飽和脂肪酸アシル基が得られる（この場合、アセチル基はブチリル基に変換されている）。その後、ブチリル基は、ブチリル−ＡＣＰ＋ＣＥ−ｃｙｓ−ＳＨ→ＡＣＰ−ＳＨ＋ブチリル−ｃｙｓ−ＣＥに示すように、ＡＣＰスルフヒドリル基からＣＥスルフヒドリルへ転送される。この段階は、元のアセチル基に対して前に利用されたのと同じトランスフェラーゼ活性によって触媒される。ここでブチリル基は、このプロセスを繰り返すために、すぐに新しいマロニル基（上記第三反応）と縮合することができる。脂肪酸アシル基が１６個の炭素長になると、パルミトイル−ＡＣＰ＋Ｈ２Ｏ→パルミチン酸＋ＡＣＰ−ＳＨに示すように、チオエステラーゼ活性が脂肪酸アシル基を加水分解し、遊離パルミチン酸を形成する。脂肪酸分子は、伸長および／または不飽和化などのさらなる修飾を受けることができる。
【０１４９】
改変光合成微生物、例えば、シアノバクテリアは、脂肪酸合成に関与する上記ポリペプチドまたは酵素のいずれかをコードする１以上の外因性ポリヌクレオチドを含んでもよい。特定の実施形態において、この酵素は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼまたはその変異体もしくはその機能的断片である。
【０１５０】
ワックスエステル合成
ワックスエステルは、脂肪酸と長鎖アルコールとのエステルである。これらの中性脂質は、脂肪族アルコールおよび酸から構成され、両方の部分は通常、長鎖（例えば、Ｃ１６およびＣ１８）または超長鎖（Ｃ２０以上）の炭素構造であるが、中鎖含有ワックスエステル（例えば、Ｃ１０、Ｃ１２およびＣ１４）が含まれる。ワックスエステルは、細菌、昆虫、哺乳類、および陸生植物において多様な生物学的機能を有し、また様々な工業的用途にとって重要な基質である。様々な種類のワックスエステルが、化粧品、ろうそく、印刷インキ、潤滑剤、コーティング材料、およびその他などのファインケミカルの生成に広く使用されている。
【０１５１】
アシネトバクターなどの特定の生物において、アシネトバクター種のワックスエステル合成経路は、アシル保酵素Ａ（アシルＣｏＡ）から開始し、その後、アシルＣｏＡ還元酵素およびアルデヒド還元酵素を介して対応するアルコールに還元されると考えられている。他の生物において、例えば、ワックスエステル生合成は、２４〜３４個の炭素長の超長鎖脂肪酸ワックス前駆体への飽和Ｃ１６およびＣ１８脂肪酸アシルＣｏＡの伸長、ならびにアルカン形成（脱カルボニル）またはアルコール形成（アシル還元）経路のいずれかによるその後の修飾を伴う（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １４８：９７−１０７，２００８参照）。
【０１５２】
特定の態様において、ワックスエステル合成は、アシル−ＡＣＰ→アシルアルデヒド経路を介して生じ得る。この経路において、アシル−ＡＣＰ還元酵素の過剰発現は、アシルアルデヒドへのアシル−ＡＣＰの変換を増加させ、次いで、アルコール脱水素酵素の過剰発現は、脂肪族アルコールへのアシルアルデヒドの変換を増加させ、ＤＧＡＴの過剰発現は、それらの対応するワックスエステルへの脂肪族アルコールの変換を共同的に増加させる。したがって、改変光合成微生物、例えば、シアノバクテリアは、ワックスエステルの合成に関与する上記ポリペプチドまたは酵素のいずれかをコードする１以上の外因性ポリヌクレオチドを含んでもよい。
【０１５３】
アシルキャリアータンパク質
本発明の実施形態は、必要に応じて、１以上の外因性（例えば、組換えにより導入された）または過剰発現させたＡＣＰタンパク質を含む。これらのタンパク質は、脂肪酸合成に重要な役割を果たしている。シアノバクテリアを含む細菌における脂肪酸合成は、調節された逐次的方法で、ＩＩ型脂肪酸合成酵素システム（約１９個の遺伝子からなるＦＡＳ  ＩＩ）の高度に保存された酵素により行われる。アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）は、その４’−ホスホパントテン酸補欠分子族（ＡＣＰ−チオエステル）の末端に結合したチオエステルとして全ての中間体を保有することによって、このプロセスにおいて中心的な役割を果たしている。ａｃｐ遺伝子産物であるＡｐｏ−ＡＣＰは、典型的には、枯草菌で特徴付けられているとおり、大腸菌またはＳｆｐ（サーファクチンタイプ）のＰＴＴで見られるアシルキャリアータンパク質合成酵素（ＡｃｐＳ）型などのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ＰＴＴ）により活性化される。シアノバクテリアは、１次代謝および２次代謝の両方で作用すると理解されているＳｆｐ様ＰＰＴを保有する。したがって、本発明の実施形態は、ＡＣＰなどの同族ＡＣＰコード遺伝子の過剰発現と組み合わせて、ＡｃｐＳおよび／またはＳｆｐ型のＰＰＴなどのＰＰＴの過剰発現を含む。
【０１５４】
ＡＣＰ−チオエステルは、ＦＡＳ  ＩＩシステムの全ての酵素の基質である。脂肪酸合成の最終生成物は、典型的には、チオエステル結合によりＡＣＰに結合した約１４〜１８個の炭素からなる長いアシル鎖である。
【０１５５】
他の細菌のＦＡＳ  ＩＩシステムの少なくとも３種類の酵素は、アシル−ＡＣＰによるフィードバック阻害を受けることができる：１）ＡＣＣａｓｅ複合体−この経路の最初のステップであるマロニルＣｏＡの生成を触媒するＡｃｃＡＢＣＤ遺伝子のヘテロ四量体；２）アセチルＣｏＡとマロニル−ＡＣＰの縮合を触媒するＦａｂＨ遺伝子（β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ＩＩＩ）の生成物；および３）各伸長ラウンドでの最終伸長段階を触媒するＦａｂＩ遺伝子（エノイル−ＡＣＰ還元酵素）の生成物。アシル−ＡＣＰ還元酵素などの特定のタンパク質は、シアノバクテリアなどの光合成細菌における脂肪酸生成を増加させることが可能であり、このタンパク質と組み合わせたＡＣＰの過剰発現およびおそらく他の生合成タンパク質はさらに、そのような株における脂肪酸生成を増加させると考えられる。
【０１５６】
ＡＣＰは、様々な真核生物、微生物（例えば、細菌、真菌）、または植物に由来し得る。特定の実施形態において、ＡＣＰポリヌクレオチド配列およびその対応するポリペプチド配列は、シネココッカスなどのシアノバクテリアに由来する。特定の実施形態において、ＡＣＰは、ホウレンソウなどの植物に由来し得る。配列番号５〜１２は、シネココッカスおよびアシネトバクター由来の代表的な細菌ＡＣＰのヌクレオチド配列およびポリペプチド配列を提供し、配列番号１３〜１４は、Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ（ホウレンソウ）由来の代表的な植物ＡＣＰのヌクレオチド配列およびポリペプチド配列を提供する。配列番号５および６は、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２に由来し、配列番号７〜１２は、アシネトバクター種のＡＤＰ１に由来する。
【０１５７】
ＡＣＰを有する原核生物の例としては、代表的な属のＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｒａｎｋｉａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｏｃｒｉｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓなどの高いＧ＋Ｃ比を有するグラム陽性菌のグループである特定の放線菌が挙げられる。ＡＣＰ活性をコードする１種類以上の遺伝子を有する放線菌の特定例としては、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ、Ｒ．ｒｕｂｅｒ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓが挙げられる。ＡＣＰ活性を有する１種類以上の酵素をコードする原核生物のさらなる例としては、Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ａ．ｂａｕｍａｎｉｉ、Ａ．ｂａｙｌｉｉなどのアシネトバクター属のメンバー、およびＡｌｃａｎｉｖｏｒａｘ属のメンバーが挙げられる。特定の実施形態において、ＡＣＰ遺伝子または酵素は、トリグリセリドを形成するグラム陰性原核生物であるＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｙｌｉｉ種のＡＤＰ１から単離される。
【０１５８】
アシル−ＡＣＰ合成酵素（Ａａｓ）
アシル−ＡＣＰ合成酵素（Ａａｓ）は、約Ｃ４〜Ｃ１８の鎖長を有する脂肪酸を含む脂肪酸によるアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）のチオールのＡＴＰ依存的アシル化を触媒する。シアノバクテリアの他の機能の中で、Ａａｓ酵素は、培地から他の脂質に外因性脂肪酸を直接取り込むだけでなく、脂質膜からのアシル鎖のリサイクルにおいて役割を果たす。シアノバクテリアにおけるＡａｓの欠失は、培地への遊離脂肪酸の分泌を引き起こし得る。例えば、Ｋａｃｚｍａｒｚｙｋ  ａｎｄ  Ｆｕｌｄａ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １５２：１５９８−１６１０，２０１０を参照されたい。
【０１５９】
特定の実施形態は、本明細書に記載の、および当技術分野で公知の１以上のＡａｓポリペプチドを過剰発現させることができる。１つの非限定的な理論によれば、ＡＣＰの過剰発現と組み合わせたＡａｓの過剰発現は、例えば、アシル−ＡＣＰレベルを高めることによってＤＧＡＴ発現株におけるＴＡＧ生成を増加させる。例えば、１以上のアルコール脱水素酵素および二機能性ＤＧＡＴなどのワックスエステル合成酵素の過剰発現と組み合わせた場合、必要に応じてＡＣＰの過剰発現と組み合わせたＡａｓの過剰発現は、同様に、ワックスエステルの形成を増加させることができる。したがって、特定の実施形態は、必要に応じてＡＣＰポリペプチドの過剰発現と組み合わせて、特に、アルコール脱水素酵素、アシル−ＡＣＰ還元酵素（例えば、ｏｒｆ１５９４）、およびワックスエステル合成酵素（例えば、ＤＧＡＴ）の過剰発現と組み合わせた場合には、過剰発現させたＡａｓポリペプチドを含む改変光合成微生物を含む。
【０１６０】
細菌Ａａｓ酵素の例としては、大腸菌、アシネトバクター種、およびＶ．ｈａｒｖｅｙｉなどのビブリオ種に由来するものが挙げられる（例えば、Ｓｈａｎｋｌｉｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．１８：３５５−３６０，２０００；Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．４５：１０００８−１００１９，２００６参照）。配列番号４３および４４は、それぞれ、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２（０９１８）由来の代表的なＡａｓのヌクレオチド配列およびポリペプチド配列を提供する。
【０１６１】
特定の実施形態において、これらのポリペプチドのいずれか１つをＡａｓと組み合わせて使用する場合に、Ａａｓは、過剰発現したＡＣＰ、ＤＧＡＴ、および／またはＴＥＳと同じ生物に由来する。したがって、特定の実施形態は、例えば、様々な動物（例えば、哺乳類、ショウジョウバエ、線虫）、植物、寄生虫、および真菌（例えば、出芽酵母および分裂酵母などの酵母）を含む、ＤＧＡＴまたはＴＥＳが由来する本明細書に記載の生物のいずれかのＡａｓの配列を含む。原核生物の例としては、代表的な属のＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｒａｎｋｉａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｏｃｒｉｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓなどの高いＧ＋Ｃ比を有するグラム陽性菌のグループの特定の放線菌が挙げられる。Ａａｓ活性をコードする１以上の遺伝子を有する放線菌の具体例としては、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ、Ｒ．ｒｕｂｅｒ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓが挙げられる。Ａａｓ活性を有する１以上の酵素をコードする原核生物のさらなる例としては、Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ａ．ｂａｕｍａｎｉｉ、Ａ．ｂａｙｌｉｉなどのアシネトバクター属のメンバー、およびＡｌｃａｎｉｖｏｒａｘ属のメンバーが挙げられる。特定の実施形態において、Ａａｓ遺伝子または酵素は、トリグリセリドを形成するグラム陰性原核生物であるＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｙｌｉｉ種のＡＤＰ１から単離される。
【０１６２】
１つの非限定的な理論によれば、内因性アルデヒド脱水素酵素は、過剰発現したｏｒｆ１５９４によって生成された過剰のアシル−アルデヒドに作用し、それらを遊離脂肪酸に変換することができる。このような脱水素酵素の正常な役割は、ダメージを受けた脂質を除去するか、または他の方法で処理することが伴う可能性がある。このシナリオでは、その後、Ａａｓ遺伝子産物は、ＡＣＰにそれらを連結することにより、これらの遊離脂肪酸をリサイクルする可能性がある。したがって、Ａａｓ遺伝子産物の発現の低下または排除が、最終的にＡＣＰへの脂肪酸の転移を低下または防止することによって、脂肪酸の生成を増加させる可能性がある。したがって、特定の態様は、１以上の内因性アシル−ＡＣＰ合成酵素（または合成酵素）の酵素活性を低下または排除する点変異もしくは挿入などの変異（例えば、ゲノム変異）を含む。またＡａｓタンパク質をコードする内因性遺伝子の完全欠失または部分欠失も含まれる。
【０１６３】
アシル−ＡＣＰ還元酵素
アシル−ＡＣＰ還元酵素（またはアシル−ＡＣＰ脱水素酵素）は、還元酵素または短鎖脱水素酵素ファミリーのメンバーであり、ＩＩ型脂肪酸合成（ＦＡＳ）システムの重要な酵素である。他の潜在的な触媒活性の中でも、本明細書で使用する「アシル−ＡＣＰ還元酵素」または「アシル−ＡＣＰ脱水素酵素」は、アシルアルデヒドへのアシル−ＡＣＰの変換（還元）、およびそれに付随するＮＡＤＰ＋へのＮＡＤ（Ｐ）Ｈの酸化を触媒することが可能である。一部の実施形態において、アシル−ＡＣＰ還元酵素は、優先的にアシル−ＡＣＰと相互作用し、かつアシルＣｏＡと有意に相互作用しない、すなわち、アシルアルデヒドへのアシルＣｏＡの変換を著しく触媒しない。
【０１６４】
アシル−ＡＣＰ還元酵素は、シアノバクテリアなどの光合成微生物を含む様々な植物および細菌に由来し得る。１つの代表的なアシル−ＡＣＰ還元酵素は、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２のｏｒｆ１５９４によりコードされる（ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列については、それぞれ、配列番号１および２を参照されたい）。別の代表的なアシル−ＡＣＰ還元酵素は、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ種のＰＣＣ６８０３のｏｒｆｓｌｌ０２０９によりコードされる（ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列については、それぞれ、配列番号３および４を参照されたい）。
【０１６５】
アルコール脱水素酵素
本発明の実施形態は、必要に応じて、１以上のアルコール脱水素酵素ポリペプチドを含む。アルコール脱水素酵素の例としては、アシルまたは脂肪酸アルデヒド（例えば、ノニルアルデヒド、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８、Ｃ２０の脂肪酸アルデヒドのうちの１以上）を基質として使用し、それらを脂肪族アルコールに変換することができるものが挙げられる。具体例としては、長鎖アルデヒド（例えば、Ｃ１６、Ｃ１８、Ｃ２０）を基質として使用できる長鎖アルコール脱水素酵素が挙げられる。特定の実施形態において、アルコール脱水素酵素は、天然に存在するかまたは改変微生物に対して内因性であり、（アシル−ＡＣＰ還元酵素によって生成される）増加したアシルアルデヒドを脂肪族アルコールに変換するのに十分であり、それによってワックスエステル生成の増加および全体的に十分な成長特性に貢献する。特定の実施形態において、アルコール脱水素酵素は、改変されたものとは異なる微生物に由来する。
【０１６６】
これらのおよび関連する実施形態において、アルコール脱水素酵素の発現または過剰発現は、脂肪族アルコールの生成に向かい、アルカン、脂肪酸、またはトリグリセリドなどの他の生成物の生成から離れるアシルアルデヒドのシャントを増加させることができる。ワックスエステル合成酵素活性（例えば、脂肪族アルコールをワックスエステルに変換する能力）を有するＤＧＡＴまたは他の酵素などの１以上のワックスエステル合成酵素と組み合わせた場合に、アルコール脱水素酵素は、ワックスエステルの生成に寄与し得る。アルコール脱水素酵素は、潜在的に毒性のあるアシルアルデヒドの蓄積を低下させ、それによって改変された微生物の成長特性を改善することもできる。
【０１６７】
アルコール脱水素酵素の非限定的な例としては、シネコシスティス種のＰＣＣ６８０３のｓｌｒ１１９２（配列番号１０４〜１０５）およびＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｙｌｙｉのＡＣＩＡＤ３６１２（配列番号１０６〜１０７）によってコードされているものが挙げられる。また、そのホモログまたはパラログ、その機能的等価物、およびその断片またはその変異体も含まれる。機能的等価物は、脂肪族アルコールにアシルアルデヒド（例えば、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８、Ｃ２０アルデヒド）を効率的に変換する能力を有するアルコール脱水素酵素を含むことができる。機能的等価物の具体例としては、長鎖アルデヒド（例えば、Ｃ１６、Ｃ１８、Ｃ２０）を基質として利用する能力を有する長鎖アルコール脱水素酵素が挙げられる。
【０１６８】
特定の実施形態において、アルコール脱水素酵素は、（配列番号１０４のポリヌクレオチド配列によってコードされている）配列番号１０５のアミノ酸配列、またはこの配列の活性断片もしくは変異型を有する。一部の実施形態において、アルコール脱水素酵素は、（配列番号１０６のポリヌクレオチド配列によってコードされている）配列番号１０７のアミノ酸配列、またはこの配列の活性断片もしくは変異型を有する。
【０１６９】
アルデヒド脱水素酵素
本発明の実施形態は、必要に応じて１以上の過剰発現または導入されるアルデヒド脱水素酵素を含む。アルデヒド脱水素酵素の例としては、基質としてアシルアルデヒド類（例えば、ノニルアルデヒド、Ｃ１６脂肪族アルデヒド）を用いて、それらを脂肪酸に変換することができる酵素が挙げられる。特定の実施形態において、アルデヒド脱水素酵素は、天然に存在するかまたは改変微生物に対して内因性であり、（アシル−ＡＣＰ還元酵素によって生成される）増加したアシルアルデヒドを脂肪酸に変換するのに十分であり、それによって脂肪酸生成の増加および全体的に十分な成長特性に寄与する。
【０１７０】
特定の実施形態において、アルデヒド脱水素酵素は、例えば、酵素をコードするポリヌクレオチドの遺伝子組換えによる導入、内因性酵素の発現の増加、またはその両方によって過剰発現させることができる。アルデヒド脱水素酵素は、例えば、内因性アルデヒド脱水素酵素のみを発現するアシル−ＡＣＰ還元酵素過剰発現株と比較して、アシル−ＡＣＰ還元酵素過剰発現株の脂肪酸生成をさらに増加させ、かつ／またはその成長特性を改善するために、天然に存在するかまたは内因性の酵素を既に発現している株において過剰発現させることができる。アルデヒド脱水素酵素はまた、その種類の天然に存在するアルデヒド脱水素酵素を有していない株、例えば、ノニルアルデヒドなどのアシルアルデヒドを効率的に脂肪酸に変換することができる酵素を自然に発現しない株において発現または過剰発現させることもできる。
【０１７１】
これらのおよび関連する実施形態において、アルデヒド脱水素酵素の発現または過剰発現は、脂肪酸の生成に向かい、アルカンなどの他の生成物の生成から離れるアシルアルデヒドのシャントを増加させることができる。アルコール脱水素酵素は、潜在的に毒性のあるアシルアルデヒドの蓄積を低下させ、それによって改変微生物の成長特性を改善することもできる。
【０１７２】
１つの代表的なアルデヒド脱水素酵素は、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２のｏｒｆ０４８９によってコードされている。また、そのホモログまたはパラログ、その機能的等価物、およびその断片もしくは変異型も含まれる。機能的等価物は、脂肪酸にアシルアルデヒド類（例えば、ノニルアルデヒド）を効率的に変換する能力を有するアルデヒド脱水素酵素を含むことができる。具体的な実施形態において、アルデヒド脱水素酵素は、（配列番号１０２のポリヌクレオチド配列によってコードされている）配列番号１０３のアミノ酸配列を有する。
【０１７３】
特定の実施形態は、例えば、ワックスエステルの生成において、１以上のアルデヒド脱水素酵素の発現および／または活性が低下した光合成微生物を含む。点変異、挿入、または完全欠失もしくは部分欠失の変異などの、１以上の内因性アルデヒド脱水素酵素の酵素活性を低下または排除する変異（例えば、ゲノム変異）が含まれる。具体的な実施形態は、ｏｒｆ０４８９の完全欠失または部分欠失を有する改変されたシネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２を含む。
【０１７４】
アルデヒドデカルボニラーゼ
特定の実施形態は、１以上のアルデヒドデカルボニラーゼの発現および／または活性が低下した光合成微生物を含む。本明細書で使用する「アルデヒドデカルボニラーゼ」は、アルカンまたはアルケンへのアシルアルデヒド（または脂肪族アルデヒド）の変換を触媒することができる。非ヘム二鉄酵素のフェリチン様またはリボヌクレオチド還元酵素様ファミリーメンバーが含まれる（例えば、Ｓｔｕｂｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ．２３：４３８−４３，１９９８参照）。
【０１７５】
１つの非限定的な理論によると、ＰＣＣ７９４２＿ｏｒｆ１５９３（シネココッカス由来）またはＰＣＣ６８０３＿ｏｒｆｓｌｌ０２０８（Ｓｙｎｅｃｈｏｓｔｉｓ種のＰＣＣ６８０３由来）によってコードされるアルデヒドデカルボニラーゼは、アルカンまたはアルケン生成のための基質としてアシルアルデヒドを利用するので、このタンパク質の発現が低下させると、アルカン生成経路から離れて、脂肪酸生成経路に向かう（アシル−ＡＣＰ還元酵素によって生成される）アシルアルデヒドをシャントすることにより、遊離脂肪酸の収量をさらに増加させることができる。ＰＣＣ７９４２＿ｏｒｆ１５９３およびＰＣＣ６８０３＿ｏｒｆｓｌｌ０２０８オルソログは、例えば、Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  ＰＣＣ７３１０２、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ−１、シネココッカス種のＪａ−３−３ＡＢ、Ｐ．ｍａｒｉｎｕｓ  ＭＩＴ９３１３、Ｐ．ｍａｒｉｎｕｓ  ＮＡＴＬ２Ａ、およびシネココッカス種のＲＳ  ９１１７に見られ得、後者は、少なくとも２種類のパラログ（ＲＳ９１１７−１およびＲＳ９１１７−２）を有する。
【０１７６】
特定の実施形態は、必要に応じて、１以上の内因性アルデヒド脱水素酵素の発現低下と組み合わせて、例えば、脂肪酸またはワックスエステルの生成において、１以上の内因性アルデヒドデカルボニラーゼの酵素活性を低下または排除する変異（例えば、ゲノム変異）を含む。また、アルデヒドデカルボニラーゼをコードする内因性遺伝子の点変異、挿入、完全欠失または部分欠失も含まれる。具体的な実施形態は、ｏｒｆ１５９３の完全欠失または部分欠失を有する改変されたシネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２を含む。
【０１７７】
チオエステラーゼ
特定の実施形態は、必要に応じて、導入されるＡＣＰ酵素、導入されるＡａｓ酵素、またはその両方のうちの少なくとも１つと組み合わせて、１以上の外因性または過剰発現させたチオエステラーゼ酵素を含む。例えば、一実施形態は、ＴｅｓＡ株もしくはＦａｔＢ株などの遊離脂肪酸を生成するＴＥＳ株（すなわち、導入されるＴｅｓＡもしくはＦａｔＢを有する株）の成長および／または脂肪酸生成を増加させるために、導入されるＡＣＰおよび／またはＡａｓを使用することに関する。本明細書で言及するチオエステラーゼは、特にチオール基でエステラーゼ活性を呈する（水の存在下で、エステルを酸およびアルコールに分解する）。脂肪酸は、新規の脂肪酸合成のプロセス中にチオエステル結合により、補酵素Ａ（ＣｏＡ）およびアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）などの補因子分子に付着する場合が多い。特定の実施形態は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性、アシルＣｏＡチオエステラーゼ活性、またはその両方の活性を有するチオエステラーゼを使用する。両方の活性（すなわち、アシル−ＡＣＰ／アシルＣｏＡチオエステラーゼ）を有するチオエステラーゼの例としては、ＴｅｓＡおよび関連する実施形態が挙げられる。特定の実施形態において、選択されたチオエステラーゼは、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するが、アシルＣｏＡチオエステラーゼ活性は有していない。アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性のみを有するチオエステラーゼの例としては、ＦａｔＢチオエステラーゼおよび関連する実施形態が挙げられる。
【０１７８】
特定のチオエステラーゼは、チオエステラーゼ活性とリゾホスホリパーゼ活性の両方を有している。チオエステラーゼの具体例としては、ＴｅｓＡ、ＴｅｓＢ、および関連する実施形態が挙げられる。特定の実施形態は、大腸菌のＴｅｓＡまたは大腸菌のＴｅｓＢなどのチオエステラーゼ活性を有するペリプラズム局在性または細胞質局在性の酵素を使用することができる。通常、例えば、ペリプラズムに局在している野生型ＴｅｓＡを使用して、環境から除去される脂肪酸−ＡＣＰ（アシル−ＡＣＰ）または脂肪酸−ＣｏＡ（アシルＣｏＡ）の化合物のチオエステル結合を加水分解する。変異体チオエステラーゼ、（互換的にＰｌｄＣ／＊ＴｅｓＡまたは＊ＴｅｓＡと呼ばれる）ＰｌｄＣは、細胞質からペリプラズムへのＴｅｓＡの適切な輸送に必要なＮ末端アミノ酸配列の欠失により、ペリプラズムに排出されない。この欠失は、内因性アシル−ＡＣＰおよびアシルＣｏＡ中間体につながる細胞質局在性ＰｌｄＣ（＊ＴｅｓＡ）を生じる。ＴｅｓＡのＮ末端領域における他の変異または欠失を用いて、同じ結果、すなわち、細胞質ＴｅｓＡを得ることができる。
【０１７９】
過剰発現させたＰｌｄＣ（＊ＴｅｓＡ）は、内因性アシル−ＡＣＰおよびアシルＣｏＡ分子からのアシル基の加水分解を引き起こす。ＰｌｄＣ（＊ＴｅｓＡ）を発現する細胞は、膜脂質合成に必要であるアシル−ＡＣＰおよびアシルＣｏＡ分子の生成を維持するために、追加の細胞の炭素源およびエネルギーを導かねばならない。したがって、ＰｌｄＣ（＊ＴｅｓＡ）発現は、全細胞脂質含量の正味の増加を生じる。例えば、ＰｌｄＣ（＊ＴｅｓＡ）は、シネココッカスでのみ、バイオマスの１０％からバイオマスの２０％の２倍の総脂質含量を発現させ、その結果、＊ＴｅｓＡまたは関連する分子を導入ＡＣＰおよび／または導入Ａａｓと組み合わせることによってさらに増加させることができる。したがって、特定の実施形態は、外因性もしくは過剰発現させたＡＣＰ、外因性もしくは過剰発現させたＡａｓ、またはその両方と組み合わせて、外因性もしくは過剰発現させた（＊ＴｅｓＡなどの）細胞質ＴｅｓＡを使用する。
【０１８０】
特定の実施形態において、チオエステラーゼ（ＴＥＳ）は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼおよび／またはアシルＣｏＡチオエステラーゼである。特定の実施形態において、ＴＥＳは、配列番号１２１に記載の配列、またはその断片もしくは変異型を有する大腸菌由来のＴｅｓＡもしくはＴｅｓＢ、または細胞質ＴｅｓＡ変異体（＊ＴｅｓＡ）である。
【０１８１】
特定のチオエステラーゼは、チオエステラーゼ活性のみを有し、すなわち、それらはほとんどまたは全くリゾホスホリパーゼ活性を有していない。これらのチオエステラーゼの例としては、ＦａｔＢファミリーの酵素が挙げられる。ＦａｔＢによってコードされている酵素は、典型的には、Ｃ１４〜Ｃ１８の飽和ＡＣＰ、優先的には１６：０のＡＣＰを加水分解するが、１８：１のＡＣＰも加水分解することができる。Ｃｕｐｈｅａ種のものなどの植物または種子中の中鎖（Ｃ８−Ｃ１２）脂肪酸の生成は、中鎖脂肪酸アシル−ＡＣＰに対して鎖長特異性を有するＦａｔＢ酵素により生じる場合が多い。これらの中鎖ＦａｔＢチオエステラーゼは、例えば、とりわけ、カリフォルニアベイエリアの月桂樹、ココナッツ、およびニレを含む油中の中鎖脂肪酸を有する多くの種に存在する。したがって、ＦａｔＢ配列は、これらのおよび他の生物に由来してもよい。特定例としては、Ｃ８、Ｃ１２、Ｃ１４、およびＣ１６のＦａｔＢチオエステラーゼなどの植物ＦａｔＢアシル−ＡＣＰチオエステラーゼが挙げられる。したがって、特定の実施形態において、ＴＥＳは、Ｃ８、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、またはＣ１８のＦａｔＢなどのＦａｔＢポリペプチドである。
【０１８２】
ＦａｔＢチオエステラーゼの具体例としては、Ｃｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａのＣ８／Ｃ１０ＦａｔＢチオエステラーゼ、Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  Ｃ１２  ＦａｔＢ１チオエステラーゼ、Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｍｐｈｏｒａ  Ｃ１４  ＦａｔＢ１チオエステラーゼ、およびＣｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ  Ｃ１６  ＦａｔＢ１チオエステラーゼが挙げられる。具体的な実施形態において、このチオエステラーゼは、配列番号１０８（完全長タンパク質）または配列番号１０９（シグナル配列を含まない成熟タンパク質）のアミノ酸配列を含むＣｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ  Ｃ８／Ｃ１０  ＦａｔＢである。特定の実施形態において、このチオエステラーゼは、配列番号１１０（完全長タンパク質）または配列番号１１１（シグナル配列を含まない成熟タンパク質）のアミノ酸配列を含むＵｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  Ｃ１２  ＦａｔＢ１である。特定の実施形態において、このチオエステラーゼは、配列番号１１２（完全長タンパク質）または配列番号１１３（シグナル配列を含まない成熟タンパク質）のアミノ酸配列を含むＣｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｍｐｈｏｒａ  Ｃ１４  ＦａｔＢ１である。特定の実施形態において、このチオエステラーゼは、配列番号１１４（完全長タンパク質）または配列番号１１５（シグナル配列を含まない成熟タンパク質）のアミノ酸配列を含むＣｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ  Ｃ１６  ＦａｔＢ１である。
【０１８３】
アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）
本発明の実施形態は、必要に応じて１以上の外因性（例えば、組換えにより導入されるか）または過剰発現させたＡＣＣａｓｅタンパク質を含む。本明細書で使用する「アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ」遺伝子は、酵素反応条件下でマロニルＣｏＡを生成するために、アセチルＣｏＡのカルボキシル化を触媒する能力を示す任意の細胞源から取得できるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドなどのアミノ酸をコードする任意のポリヌクレオチド配列を含み、さらに、そのような能力を有するアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ配列の任意の天然に存在するかまたは天然に存在しない変異型を含む。
【０１８４】
アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）は、その２つの触媒活性であるビオチンカルボキシラーゼ（ＢＣ）およびカルボキシルトランスフェラーゼ（ＣＴ）を介してマロニルＣｏＡを生成するために、アセチルＣｏＡの不可逆的カルボキシル化を触媒するビオチン依存性酵素である。ビオチンカルボキシラーゼ（ＢＣ）ドメインは、反応の第１段階：ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質（ＢＣＣＰ）ドメインに共有結合したビオチン補欠分子族のカルボキシル化を触媒する。反応の第２段階では、カルボキシルトランスフェラーゼ（ＣＴ）ドメインは、（カルボキシ）ビオチンからアセチルＣｏＡへのカルボキシル基の転移を触媒する。マロニルＣｏＡは、脂肪酸への前駆体としての機能以外の代謝的役割を持たないので、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）によるマロニルＣｏＡの形成は脂肪酸合成のコミットメントステップを示す。この理由のために、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、脂肪酸合成における中心的酵素を表す。
【０１８５】
ほとんどの原核生物では、ＡＣＣａｓｅはマルチサブユニット酵素であるが、ほとんどの真核生物では、巨大なマルチドメイン酵素である。酵母では、酵母ＡＣＣａｓｅのＣＴドメインの結晶構造は、２．７Ａの解像度で決定された（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９９：２０６４−２０６７（２００３））。この構造は、同じ骨格の折り畳みを共有する２つのドメインを含む。この折り畳みは、ｂ−ｂ−ａ超らせんを有するタンパク質のクロトナーゼ／ＣｌｐＰファミリーに属する。ＣＴドメインはその表面に多数の挿入を含んでおり、これらはＡＣＣａｓｅの二量体化に重要である。酵素の活性部位は、二量体界面に位置している。
【０１８６】
シネココッカスなどのシアノバクテリアは、天然のＡＣＣａｓｅ酵素を発現するが、これらの細菌は、典型的には、著しい量の脂肪酸を生成または蓄積しない。例えば、自然界のシネココッカスは、脂質膜の形態の脂肪酸を乾燥重量で合計約４％まで蓄積する。
【０１８７】
脂肪酸生合成のコミットメント段階におけるＡＣＣａｓｅの役割を考慮すると、本発明の実施形態は、シアノバクテリアの天然ゲノムに対して外因性であるＡＣＣａｓｅ酵素をコードする１以上のポリヌクレオチドを導入することによって、シアノバクテリアにおける脂肪酸生合成の生成、ひいては脂質生成を増加させる方法を含む。本発明の実施形態には、シアノバクテリアの天然ゲノムに対して外因性であるＡＣＣａｓｅ酵素をコードする１以上ポリヌクレオチドを含む、改変されたシアノバクテリアおよび前記シアノバクテリアを含む組成物も含まれる。
【０１８８】
ＡＣＣａｓｅ酵素をコードするポリヌクレオチドは、内因性のＡＣＣａｓｅ遺伝子を含む任意の原核生物または真核生物などの任意の生物から単離または取得することができる。ＡＣＣａｓｅ遺伝子を有する真核生物の例は、当技術分野で公知であり、様々な動物（例えば、哺乳類、ショウジョウバエ、線虫）、植物、寄生虫、および真菌（例えば、出芽酵母および分裂酵母などの酵母）を含む。特定の実施形態において、ＡＣＣａｓｅをコードするポリヌクレオチド配列は、シネココッカス種のＰＣＣ７００２から取得される。
【０１８９】
ＡＣＣａｓｅ活性を有する酵素をコードするポリヌクレオチドを取得するために利用され得る原核生物の例としては、とりわけ、大腸菌、レジオネラ・ニューモフィラ、リステリア・モノサイトゲネス、肺炎連鎖球菌、枯草菌、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｂｅｕｍ  ＡＴＣＣ  ２９１７４、ｍａｒｉｎｅ  ｇａｍｍａ  ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＨＴＣＣ２０８０、Ｒｏｓｅｏｖａｒｉｕｓ種のＨＴＣＣ２６０１、Ｏｃｅａｎｉｃｏｌａ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ  ＨＴＣＣ２５１６、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃａｃｃａｅ  ＡＴＣＣ  ４３１８５、Ｖｉｂｒｉｏ  ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ  １２Ｇ０１、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｔｕｎｉｃａｔａ  Ｄ２、マリノバクター属のＥＬＢ１７、ｍａｒｉｎｅ  ｇａｍｍａ  ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＨＴＣＣ２１４３、ロゼオバクター属のＳＫ２０９−２−６、Ｏｃｅａｎｉｃｏｌａ  ｂａｔｓｅｎｓｉｓ  ＨＴＣＣ２５９７、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ  ｂｖ．ｔｒｉｆｏｌｉｉ  ＷＳＭ１３２５、硝酸菌属のＮｂ−３１１Ａ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｇｇｒｅｇａｎｓ  ＤＳＭ  ９４８５、Ｃｈｌｏｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、Ｃｈｌｏｒｏｈｅｒｐｅｔｏｎ  ｔｈａｌａｓｓｉｕｍ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、ゲオバチルス属、およびＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａが含まれるが、これらに限定されない。
【０１９０】
特定の代表的なアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）は、配列番号５５、４５、４６、４７、４８もしくは４９、またはその断片もしくは変異型のいずれかに記載のポリペプチド配列を含むか、またはそれらから成る。配列番号５５は、出芽酵母のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ｙＡｃｃｌ）の配列であり、配列番号４５は、シネココッカス種ＰＣＣ  ７００２  ＡＣＣＡであり、配列番号４６は、シネココッカス種ＰＣＣ  ７００２  ＡｃｃＢの配列であり、配列番号４７は、シネココッカス種ＰＣＣ  ７００２  ＡｃｃＣの配列であり、配列番号４８は、シネココッカス種ＰＣＣ  ７００２  ＡｃｃＤの配列であり、配列番号４９は、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍのＡＣＣａｓｅの配列である。特定の実施形態において、導入されるＡＣＣａｓｅは、改変光合成微生物のゲノムに対して天然のものではない。
【０１９１】
ホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）
本明細書で使用する「ホスファチジン酸ホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）」または「ホスファチジン酸ホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）」の遺伝子は、酵素反応条件下で、ホスファチジン酸の脱リン酸化（ＰｔｄＯＨ）を触媒し、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）および無機リン酸を生じる能力を示す任意の細胞源から取得されるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドなどのアミノ酸をコードする任意のポリヌクレオチド配列を含み、さらに、このような能力を有するホスファチジン酸ホスファターゼ配列の任意の天然に存在するかまたは天然に存在しない変異型を含む。
【０１９２】
ホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ、３−ｓｎ−ホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼ）は、ホスファチジン酸の脱リン酸化（ＰｔｄＯＨ）を触媒し、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）および無機リン酸を生じる。この酵素は、ヒドロラーゼのファミリー、特にリン酸モノエステル結合に作用するものに属する。この酵素クラスの系統名は、３−ｓｎ−ホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼである。一般的に使用されている他の名称には、リン酸ホスファターゼ、酸ホスファチジルホスファターゼ、およびホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼが含まれる。この酵素は、グリセロ脂質代謝、グリセロリン脂質代謝、エーテル脂質代謝、およびスフィンゴ脂質代謝の少なくとも４つの代謝経路に関与している。
【０１９３】
ＰＡＰ酵素は、その生成物のジアシルグリセロールを介してリン脂質およびトリアシルグリセロールの合成の両方、ならびに真核細胞内の脂質シグナル伝達分子の生成または分解においても役割を果たす。ＰＡＰ酵素は、典型的には、触媒活性に必要なそれらの補因子に関して、Ｍｇ２＋依存性（ＰＡＰ１酵素と呼ばれる）またはＭｇ２＋非依存性（ＰＡＰ２または脂質リン酸ホスファターゼ（ＬＰＰ）酵素）のいずれかに分類される。酵母系および哺乳類系の両方において、ＰＡＰ２酵素は、脂質シグナル伝達に関与していることが公知である。これに対し、出芽酵母中に見られるものなどのＰＡＰ１酵素は、新規脂質合成に関与し（Ｈａｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８１：９２１０−９２１８，２００６）、それによって、２種類のＰＡＰが異なる生理的機能を担っていることが明らかとなっている。
【０１９４】
酵母および高等真核細胞の両方において、ＰＡＰ反応は、ＰｔｄＯＨから中間体ＤＡＧを介して形成される貯蔵脂質トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の合成におけるコミットメント段階である。また、反応生成物ＤＡＧは、膜リン脂質ホスファチジルコリン（ＰｔｄＣｈｏ）およびホスファチジルエタノールアミンの合成にも使用される。基質ＰｔｄＯＨは、中間体ＣＤＰ−ＤＡＧを介した全ての膜リン脂質（および誘導体イノシトール含有スフィンゴ脂質）の合成に使用される。したがって、ＰＡＰ活性の調節は、細胞がＤＡＧを介して貯蔵脂質およびリン脂質を作るか、またはＣＤＰ−ＤＡＧを介してリン脂質を作るかを否かに影響を与えている。さらに、ＰＡＰは、リン脂質合成の転写調節に関与している。
【０１９５】
ＰＡＰ１酵素は、出芽酵母中でＰＡＰ１酵素をコードすると同定された遺伝子（Ｐａｈ１、以前はＳｍｐ２として知られていた）を含む酵母の膜および細胞画分から精製され、特徴づけられている。Ｐａｈ１にコードされているＰＡＰ１酵素は、細胞のサイトゾルおよび膜画分中に見られ、実際に、膜とのその会合は周辺に見られる。酵母から精製された複数の形態のＰＡＰ１から予測されるように、ｐａｈ１Δ変異体は、依然としてＰＡＰ１活性を含有しており、ＰＡＰ１活性を有する酵素をコードするさらなる遺伝子または複数の遺伝子の存在が示唆される。
【０１９６】
Ｐａｈ１にコードされるＰＡＰ１を欠く変異体の分析により、この酵素が脂質合成に使用されるＤＡＧを生成するという証拠が提供されている。ｐａｈ１Δ変異を含有する細胞は、ＰｔｄＯＨを蓄積し、ＤＡＧおよびそのアシル化誘導体ＴＡＧの量が低下している。指数関数的に成長している酵母においてリン脂質合成はＴＡＧの合成よりも優位であるが、成長の静止期ではＴＡＧ合成がリン脂質合成よりも優位である。ＴＡＧ含有率に対するｐａｈ１Δ変異の効果は、静止期で最も明白である。例えば、Ｐａｈ１遺伝子を欠く静止期の細胞は、ＴＡＧ含有率において＞９０％の低下を示す。同様に、ｐａｈ１Δ変異は、成長の対数期でリン脂質組成（例えば、その結果としてのＰｔｄＣｈｏ含有率の低下）に対して最も顕著な効果を示す。リン脂質合成の転写調節におけるその役割のために、Ｐａｈ１にコードされるＰＡＰ１酵素の細胞生理学に対する重要性がさらに強調される。
【０１９７】
ＰＡＰ酵素の補因子としてのＭｇ２＋イオンの必要性は、これらの酵素のホスファターゼ反応を支配する触媒モチーフと相関している。例えば、Ｐａｈ１にコードされるＰＡＰ１酵素は、ハロ酸脱ハロゲン酵素（ＨＡＤ）様ドメイン内にＤｘＤｘＴ（「ｘ」は任意のアミノ酸である）（配列番号１９８）触媒モチーフを有する。このモチーフは、Ｍｇ２＋依存性ホスファターゼ酵素のスーパーファミリーに見られ、その最初のアスパラギン酸残基は、ホスファターゼ反応におけるホスフェート部分との結合に関与する。これに対し、ＤＰＰ１およびＬＰＰ１にコードされるＰＡＰ２酵素は、膜の親水性表面に局在する３個のドメインの脂質ホスファターゼモチーフを含有する。コンセンサス配列ＫｘｘｘｘｘｘＲＰ（ドメイン１）（配列番号１１６）、ＰＳＧＨ（ドメイン２）（配列番号１１７）、およびＳＲｘｘｘｘｘＨｘｘｘＤ（ドメイン３）（配列番号１１８）を含むこの触媒モチーフは、活性にＭｇ２＋イオンを必要としない脂質ホスファターゼのスーパーファミリーに共通である。ドメイン１中の保存されたアルギニン残基ならびにドメイン２およびドメイン３中の保存されたヒスチジン残基は、ＰＡＰ２酵素の触媒活性に重要であり得る。したがって、ホスファチドホスファターゼポリペプチドは、上述の触媒モチーフのうちの１以上を含み得る。
【０１９８】
ホスファチジン酸ホスファターゼ酵素活性を有するポリペプチドは、適切な内在性ホスファチジン酸ホスファターゼ遺伝子を有する任意の生物から取得できる。ホスファチジン酸ホスファターゼをコードするポリヌクレオチド配列を取得するために使用できる生物の例としては、とりわけ、ヒト、マウス、ラット、ウシ、キイロショウジョウバエ、シロイヌナズナ、イネいもち病菌、出芽酵母、分裂酵母、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、およびバチルス・プミルスが挙げられるが、これらに限定されない。ＰＡＰ酵素の特定例としては、出芽酵母由来のＰａｈ１、大腸菌由来のＰｇｐＢ、およびＰＣＣ６８０３由来のＰＡＰが挙げられる。
【０１９９】
特定の実施形態において、ホスファチジン酸ホスファターゼポリペプチドは、配列番号１３１に記載のポリペプチド配列、またはその断片もしくは変異型を含むか、またはそれらからなる。配列番号１３１は、出芽酵母のホスファチジン酸ホスファターゼ（ｙＰａｈｌ）の配列である。特定の実施形態において、ＰＡＰのポリペプチド配列は、大腸菌のＰｇｐＢ遺伝子、および／またはシネコシスティス種ＰＣＣ６８０３のＰＡＰ遺伝子によってコードされている。
【０２００】
トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）ヒドロラーゼ
特定の実施形態は、ＴＡＧ生成株におけるＴＡＧの生成を増加させるための、外因性または過剰発現させたＴＡＧヒドロラーゼ（またはＴＡＧリパーゼ）の使用に関する。例えば、具体的な実施形態は、ＤＧＡＴ、および必要に応じてＴＥＳと組み合わせて、ＴＡＧヒドロラーゼを利用することができる。その後、これらの実施形態は、ＡＣＰ、Ａａｓ、もしくはその両方、本明細書に記載の脂質生合成タンパク質のいずれか、ならびに／または本明細書に記載のグリコーゲン生成および貯蔵への修飾のいずれかを利用することができる。したがって、上述のとおり、ＴＡＧヒドロラーゼは、ＡＣＰまたはＡａｓの有無に関わらず、ＴＡＧ生成株（例えば、ＤＧＡＴ発現株）で使用することができる。
【０２０１】
ＴＡＧヒドロラーゼは、典型的には、不溶性の、長鎖脂肪酸ＴＡＧに特異的なカルボキシルエステラーゼである。カルボキシルエステラーゼは、以下の化学反応を触媒する。
カルボン酸エステル＋Ｈ２Ｏ⇔アルコール＋カルボン酸塩
【０２０２】
したがって、この酵素の２種類の基質は、カルボン酸エステルおよびＨ２Ｏであり、その２つの生成物は、アルコールおよびカルボン酸塩である。１つの非限定的な理論によれば、ＴＡＧ生成株（例えば、ＤＧＡＴ／ＡＣＰ、ＤＧＡＴ／Ａａｓ、ＤＧＡＴ／ＡＣＰ／Ａａｓ）におけるＴＡＧヒドロラーゼの発現（または過剰発現）は、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の蓄積を増加させるだけでなく、遊離１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の量を増加させるためにアシル鎖を解放する。その後、この遊離ＤＡＧは、ＤＧＡＴの基質として機能し、それによって、特に過剰発現させたＡＣＰ、Ａａｓ、または両方の存在下でＴＡＧ生成の増加を可能にする。したがって、ＴＡＧヒドロラーゼを用いる特定の実施形態は、例えば、ＤＧＡＴのみを発現する微生物に対して、増加した量のＴＡＧを生成する。具体的な実施形態において、ＴＡＧヒドロラーゼは、ＤＡＧではなくＴＡＧに特異的であり、すなわち、ＤＡＧと比較してＴＡＧに対して優先的に作用する。
【０２０３】
ＴＡＧヒドロラーゼの非限定的な例としては、シロイヌナズナのＳＤＰ１（ＳＵＧＡＲ−ＤＥＰＥＮＤＥＮＴ１）トリアシルグリセロールリパーゼ（配列番号１７０）、アシネトバクター種ＡＤＰ１のＡＣＩＡＤ１３３５（配列番号１７１）、出芽酵母のＴＧ１４Ｐ（配列番号１７２）、およびロドコッカス属のＲＨＡ１＿ｒｏ０４７２２（ＹＰ＿７０４６６５）ＴＡＧリパーゼ（配列番号１７３）が挙げられる。ロドコッカス属の追加の推定リパーゼ／エステラーゼには、ＲＨＡ１＿ｒｏ０１６０２リパーゼ／エステラーゼ（ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列については、それぞれ配列番号１５６および１７４を参照されたい）、およびＲＨＡ１＿ｒｏ０６８５６リパーゼ／エステラーゼ（ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列については、それぞれ配列番号１１９および１２０を参照されたい）が含まれる。
【０２０４】
脂肪酸アシルＣｏＡ合成酵素
特定の実施形態は、脂肪酸の活性化を増加させ、それによって、ＴＡＧ生成株（例えば、ＤＧＡＴ発現株）におけるＴＡＧ生成を増加させるために、過剰発現させた脂肪酸アシルＣｏＡ合成酵素の使用に関する。例えば、特定の実施形態は、脂肪酸アシルＣｏＡ合成酵素およびＤＧＡＴと組み合わせて、アシル−ＡＣＰ還元酵素を利用することができる。その後、これらの実施形態は、ＡＣＰ、ＡＣＣａｓｅ、もしくはその両方、ならびに／または本明細書に記載のグリコーゲンの生成および貯蔵もしくはグリコーゲンの分解への修飾のいずれかをさらに利用することができる。
【０２０５】
脂肪酸アシルＣｏＡ合成酵素は、脂肪酸アシルＣｏＡチオエステルの形成を触媒することにより、代謝のために脂肪酸を活性化する。その後、脂肪酸アシルＣｏＡチオエステルは、少なくとも唯一の炭素源として脂肪酸上で成長できる細菌（例えば、大腸菌、サルモネラ菌）において、β酸化の基質としてだけでなく、リン脂質生合成のアシル供与体として機能することができる。多くの脂肪酸アシルＣｏＡ合成酵素は、アデニル化中間体を形成する酵素に共通のＡＴＰ／ＡＭＰ結合モチーフ、および脂肪酸結合モチーフの２つの高度に保存された配列要素によって特徴付けられる。
【０２０６】
１つの非限定的な理論によれば、特定の実施形態は、遊離脂肪酸の活性化を増加させるために、脂肪酸アシルＣｏＡ合成酵素を使用することができ、これはその後、主に、本明細書に記載のＤＧＡＴ発現（したがって、ＴＡＧを生成する）光合成微生物によって、ＴＡＧに組み込むことができる。したがって、脂肪酸アシルＣｏＡ合成酵素は、増加したレベルの遊離脂肪酸を生成するものなどの、本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいて使用することができ、その際、遊離脂肪酸をＴＡＧに変換することが望ましい。上述したように、その後、これらの遊離脂肪酸は、脂肪酸アシルＣｏＡ合成酵素によって活性化されて、アシルＣｏＡチオエステルを生成することができ、これは、その後、増加したレベルのＴＡＧを生成するためにＤＧＡＴによって基質として機能し得る。
【０２０７】
１つの代表的な脂肪酸アシルＣｏＡ合成酵素には、中鎖および長鎖脂肪酸に対して基質特異性を有する脂肪酸アシルＣｏＡ合成酵素をコードする大腸菌由来のＦａｄＤ遺伝子（ヌクレオチドおよびポリペプチド配列については、それぞれ配列番号１６および１７を参照されたい）が含まれる。他の代表的な脂肪酸アシルＣｏＡ合成酵素には、出芽酵母由来のものが含まれる。Ｆａａ１ｐは、インビトロでＣ１２〜Ｃ１６のアシル鎖を使用することができ（ヌクレオチドおよびポリペプチド配列については、それぞれ配列番号１８および１９を参照されたい）、Ｆａａ２Ｐは、Ｃ７〜Ｃ１７の範囲の制限の少ない特異性を示し（ヌクレオチドおよびポリペプチド配列については、それぞれ配列番号２０および２１を参照されたい）、Ｆａａ３Ｐは、ＤＧＡＴ１のものと共に、外因性脂肪酸の存在下で、出芽酵母における脂質蓄積を増強する（ヌクレオチドおよびポリペプチド配列については、それぞれ配列番号２２および２３を参照されたい）。配列番号２２は、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２における発現のためにコドン最適化されている。
【０２０８】
リパーゼ／ホスホリパーゼ
様々な実施形態において、本発明の改変光合成微生物、例えば、シアノバクテリアは、さらに、リパーゼもしくはホスホリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１以上の外因性もしくは導入される核酸、またはその断片もしくは変異型を含む。ホスホリパーゼ、リゾホスホリパーゼ、チオエステラーゼ、およびこれらの活性のうちの１つ、２つもしくは全３つを有する酵素を含むリパーゼは、典型的には、脂質基質中のエステル化学結合の加水分解を触媒する。いずれか１つの理論に束縛されるものではないが、特定の代表的な実施形態において、１種類以上のホスホリパーゼの発現は、膜脂質から脂肪酸を生成することができ、これはその後、アシル−ＡＣＰを作るためにＡＣＰおよび／またはＡａｓによって使用され得る。その後、これらのアシル−ＡＣＰは、例えば、トリグリセリド合成経路に供給され、それによってトリグリセリド（ＴＡＧ）生成を増加させることができる。
【０２０９】
ホスホリパーゼは、リン脂質を脂肪酸および他の親油性物質に加水分解する酵素である。それらが触媒する反応の種類によって区別される、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤと命名された４つの主要クラスがある。ホスホリパーゼＡｌはＳＮ−１アシル鎖を切断するが、ホスホリパーゼＡ２はＳＮ−２アシル鎖を切断し、アラキドン酸を放出する。ホスホリパーゼＢは、ＳＮ−１およびＳＮ−２の両方のアシル鎖を切断し、リゾホスホリパーゼとしても知られている。ホスホリパーゼＣは、ジアシルグリセロールおよびリン酸含有頭部基を放出する前にリン酸塩を切断する。ホスホリパーゼＣは、シグナル伝達において中心的な役割を果たし、セカンドメッセンジャーのイノシトール３リン酸を放出する。ホスホリパーゼＤは、リン酸塩を切断した後に、ホスファチジン酸およびアルコールを放出する。タイプＣおよびＤは、ホスホジエステラーゼと考えられている。様々な実施形態において、これらのクラスの任意の１つからの１以上のホスホリパーゼは、単独でまたは任意の組み合わせで使用することができる。
【０２１０】
上述したように、ホスホリパーゼ（ＰＬＡ１、ＰＬＡ２）は、アシル鎖をｓｎ１またはｓｎ２の位置（グリセロール骨格上の炭素１または炭素２）で切断することによって、シアノバクテリアの主要なリン脂質であるホスファチジルグリセロールを含む様々な種類のリン脂質に作用する。いくつかはｓｎ１またはｓｎ２に選択的であり、他のものはその両方に作用する。リゾホスホリパーゼは、ホスホリパーゼの生成物であり得るリゾリン脂質、または新規ホスファチジン酸合成経路の通常の中間体、例えば、１−アシル−ＤＡＧ−３−リン酸塩であるリゾホスファチジン酸に作用する。
【０２１１】
限定するものではないが、単なる理論により、特定の実施形態において、ホスホリパーゼおよび／またはリゾホスホリパーゼは、リン脂質またはリゾリン脂質のアシル鎖を切断し、細胞膜およびチラコイド膜の両方を含む脂質膜の正常なリサイクルの調節解除をすることができ、その後、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）を蓄積させると理解されている。特定の実施形態（例えば、ＴｅｓＡ株）において、これらのＦＦＡは、細胞外に蓄積することができる。他の実施形態（例えば、ＡＣＰおよび／またはＡａｓが過剰発現する微生物）において、ＦＦＡは、ＡＣＰも過剰発現する株の中でアシル−ＡＣＰ合成酵素（Ａａｓ）によってアシル−ＡＣＰに変換することができる。具体的な実施形態（例えば、ＤＧＡＴ含有微生物）において、その後、これらのアシル−ＡＣＰはＴＡＧを作るために、ＤＧＡＴの基質として機能し得る。
【０２１２】
他の実施形態において、ホスホリパーゼは、リゾリン脂質およびアシル鎖を生成するために過剰発現することができる。その後、リゾリン脂質は、残りのアシル鎖を切断するリゾホスホリパーゼの基質として機能し得る。一部の実施形態において、これらのアシル鎖は、ＦＦＡとして蓄積することができるか、または他の実施形態において、アシル−ＡＣＰを生成するためのアシル−ＡＣＰ合成酵素（Ａａｓ）の基質として機能し得、これはその後、ＴＡＧを作るためにＤＧＡＴによって使用され得る。
【０２１３】
ホスホリパーゼＣ酵素の特定例としては、細菌由来のものに加えて、哺乳類および寄生生物などの真核生物に由来するものが挙げられる。例としては、真核生物、特に哺乳類に見られる主要形態のホスホイノシチドホスホリパーゼＣ（ＥＣ３．１．４．１１）、アルファ毒素を含む細菌酵素の亜鉛依存性ホスホリパーゼＣファミリー（ＥＣ３．１．４．３）、関連する細菌酵素のホスファチジルイノシトールジアシルグリセロールリアーゼ（ＥＣ４．６．１．１３）、およびトリパノソーマ酵素のグリコシルホスファチジルイノシトールジアシルグリセロールリアーゼ（ＥＣ４．６．１．１４）が挙げられる。
【０２１４】
特定の実施形態において、本発明は、リゾホスホリパーゼを使用することを企図する。リゾホスホリパーゼは、以下の化学反応を触媒する酵素である。
２−リゾホスファチジン酸＋Ｈ２Ｏ⇔グリセロール−３−リン酸＋カルボン酸塩
【０２１５】
したがって、この酵素の２種類の基質は、２−リゾホスファチジルコリンおよびＨ２Ｏであるが、その２つの生成物はグリセロホスホコリンおよびカルボン酸塩である。
【０２１６】
リゾホスホリパーゼは、ヒドロラーゼファミリーのメンバーであり、それらはカルボン酸エステル結合に特異的に作用する。リゾホスホリパーゼは、グリセロリン脂質代謝に関与する。リゾホスホリパーゼの例としては、２−リゾホスファチジルコリンアシルヒドロラーゼ、レシチナーゼＢ、リゾレシチナーゼ、ホスホリパーゼＢ、リゾホスファチダーゼ（Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄａｓｅ）、レシートリパーゼ（Ｌｅｃｉｔｈｏｌｉｐａｓｅ）、ホスファチダーゼＢ、リゾホスファチジルコリンヒドロラーゼ、リゾホスホリパーゼＡ１、リゾホスホリパーゼＬ１（ＴｅｓＡ）、リゾホスホリパーゼＬ２、ＴｅｓＢ、リゾホスホリパーゼトランスアシラーゼ、神経障害標的エステラーゼ、ＮＴＥ、ＮＴＥ−ＬｙｓｏＰＬＡ、ＮＴＥ−リゾホスホリパーゼ、およびＶｕ  パタチン（Ｐａｔａｔｉｎ）１タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本発明に従って利用されるリゾホスホリパーゼは、細菌、例えば、大腸菌、または植物から誘導される。これらのリゾホスホリパーゼのいずれも、本発明の様々な実施形態に従って使用することができる。
【０２１７】
リゾホスホリパーゼＬ１（ＰｌｄＣまたはＴｅｓＡとも呼ばれる）などの特定のリゾホスホリパーゼは、上記のリゾホスホリパーゼおよびチオエステラーゼ活性の両方を有するペリプラズム局在性酵素または細胞質局在性酵素である。したがって、ＴｅｓＡなどの特定のチオエステラーゼは、リゾホスホリパーゼとして特徴付けることもできる。本明細書に記載の変異型リゾホスホリパーゼ、ＰｌｄＣ（＊ＴｅｓＡ）は、細胞質からペリプラズムにＴｅｓＡの適切な輸送に必要なＮ末端アミノ酸配列の欠失によりペリプラズムに排出されない。これは、内因性アシル−ＡＣＰおよびアシルＣｏＡ中間体につながる細胞質局在性ＰｌｄＣ（＊ＴｅｓＡ）タンパク質を生じる。ＰｌｄＣ（＊ＴｅｓＡ）の過剰発現により、内因性アシル−ＡＣＰおよびアシルＣｏＡ分子のアシル基が加水分解される。ＰｌｄＣ（＊ＴｅｓＡ）を発現する細胞は、膜脂質合成に必要であるアシル−ＡＣＰおよびアシルＣｏＡ分子の生成を維持するために、さらなる細胞の炭素およびエネルギーを導かねばならない。したがって、ＰｌｄＣ（＊ＴｅｓＡ）の発現により、細胞内脂質含有量の正味の増加が引き起こされる。本明細書に記載のとおり、シネココッカスにおけるＰｌｄＣ（＊ＴｅｓＡ）の発現は、バイオマスの１０％〜バイオマスの２０％まで脂質含有量を２倍にする。
【０２１８】
特定の実施形態において、本発明に従って利用されるリゾホスホリパーゼは、ホスホリパーゼおよびチオエステラーゼ活性の両方を有している。両方の活性を有するリゾホスホリパーゼの例としては、上記の段落に記載のものを含む、例えば、大腸菌のリゾホスホリパーゼＬ１などのリゾホスホリパーゼＬ１（ＴｅｓＡ）、ならびにその断片および変異体が挙げられる。ホスホリパーゼのように、特定の実施形態は、チオエステラーゼ活性が低下しているかまたは全くない変異体を含む、唯一のリゾホスホリパーゼ活性を有するＴｅｓＡ変異体を使用することができる。
【０２１９】
特定の実施形態において、ホスホリパーゼは、細菌のホスホリパーゼ、例えば、リゾホスホリパーゼ、またはその断片もしくは変異型、例えば、大腸菌、出芽酵母、ロドコッカス属、ストレプトマイセス属またはアシネトバクター属に由来するホスホリパーゼである。
【０２２０】
ホスホリパーゼのさらなる非限定的な例としては、アシネトバクター種ＡＤＰ１のホスホリパーゼＡｌ（ＰｌｄＡ）、大腸菌のホスホリパーゼＡ（ＰｌｄＡ）、ストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）のホスホリパーゼ、シロイヌナズナのホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２−α）、シロイヌナズナのホスホリパーゼＡｌ／トリアシルグリセロールリパーゼ（ＤＡＤ１；Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  Ａｎｔｈｅｒ  Ｄｅｈｉｓｃｅｎｃｅ）、シロイヌナズナの葉緑体ＤＯＮＧＬＥ、シロイヌナズナのパタチン様タンパク質、アナベナ・バリアビリスＡＴＣＣ  ２９４１３のパタチンが挙げられる。リゾホスホリパーゼのさらなる非限定的な例としては、出芽酵母Ｓ２８８ｃのホスホリパーゼＢ（Ｐｌｂ１ｐ）、出芽酵母Ｓ２８８ｃのホスホリパーゼＢ（Ｐｌｂ２ｐ）、アシネトバクターＡＤＰ１のＡＣＩＡＤ１０５７（ｔｅｓＡホモログ）、アシネトバクターＡＤＰ１のＡＣＩＡＤ１９４３リゾホスホリパーゼ、およびロドコッカスのリゾホスホリパーゼ（ＹＰ＿７０２３２０；ＲＨＡ１＿ｒｏ０２３５７）が挙げられる。
【０２２１】
特定の実施形態において、コードされるホスホリパーゼは、リゾホスホリパーゼＬ１（ＴｅｓＡ）、リゾホスホリパーゼＬ２、ＴｅｓＢ、もしくはＶｕ  パタチン１タンパク質、またはそれらのホモログ、断片もしくは変異型を含むか、またはそれらからなる。特定の実施形態において、リゾホスホリパーゼＬ１（ＴｅｓＡ）、リゾホスホリパーゼＬ２、またはＴｅｓＢは、配列番号１３３に記載の野生型配列を有する大腸菌のリゾホスホリパーゼＬ１、配列番号１３７に記載の野生型配列を有する大腸菌のリゾホスホリパーゼＬ２、または配列番号１３４に記載の野生型配列を有する大腸菌のＴｅｓＢなどの細菌のリゾホスホリパーゼＬ１（ＴｅｓＡ）、リゾホスホリパーゼＬ２、またはＴｅｓＢである。特定の実施形態において、Ｖｕパタチン１タンパク質は、配列番号１３８に記載の野生型配列を有する。
【０２２２】
特定の実施形態において、ホスホリパーゼは、ペリプラズムの代わりに主に細胞質に局在するように改変される。例えば、ホスホリパーゼは、ペリプラズム局在性に関連した領域内に欠失または変異を有し得る。特定の実施形態において、ホスホリパーゼ変異体は、リゾホスホリパーゼＬ１（ＴｅｓＡ）、またはＴｅｓＢから誘導される。特定の実施形態において、リゾホスホリパーゼＬ１（ＴｅｓＡ）またはＴｅｓＢの変異体は、配列番号１２１に記載の配列を有する細胞質大腸菌リゾホスホリパーゼＬ１（ＰｌｄＣ（＊ＴｅｓＡ））変異体などの細菌のリゾホスホリパーゼＬ１（ＴｅｓＡ）またはＴｅｓＢの変異体である。
【０２２３】
ホスホリパーゼポリペプチド配列のさらなる例としては、アシネトバクター種ＡＤＰ１のホスホリパーゼＡ１（ＰｌｄＡ）（配列番号１５７）、大腸菌のホスホリパーゼＡ１（ＰｌｄＡ）（配列番号１５８）、ストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）のホスホリパーゼ（配列番号１５９）、シロイヌナズナのホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２−α）（配列番号１６０）、シロイヌナズナのホスホリパーゼＡ１／トリアシルグリセロールリパーゼ（ＤＡＤ１；Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  Ａｎｔｈｅｒ  Ｄｅｈｉｓｃｅｎｃｅ  １）（配列番号１６１）、シロイヌナズナの葉緑体ＤＯＮＧＬＥ（配列番号１６２）、シロイヌナズナのパタチン様タンパク質（配列番号１６３）、およびアナベナ・バリアビリスＡＴＣＣ  ２９４１３のパタチン（配列番号１６４）が挙げられる。リゾホスホリパーゼポリペプチド配列のさらなる非限定的な例としては、出芽酵母Ｓ２８８ｃのホリパーゼＢ（Ｐｌｂ１ｐ）（配列番号１６５）、出芽酵母Ｓ２８８ｃのホリパーゼＢ（Ｐｌｂ２ｐ）（配列番号１６６）、アシネトバクターＡＤＰ１のＡＣＩＡＤ１０５７（ＴｅｓＡホモログ）（配列番号１６７）、アシネトバクターＡＤＰ１のＡＣＩＡＤ１９４３リゾホスホリパーゼ（配列番号１６８）、およびロドコッカスのリゾホスホリパーゼ（ＹＰ＿７０２３２０；ＲＨＡ１＿ｒｏ０２３５７）（配列番号１６９）が挙げられる。
【０２２４】
（ｉｉｉ）グリコーゲンの合成、貯蔵、および分解
特定の実施形態において、この改変光合成微生物は、さらに、グリコーゲン合成または貯蔵の経路と関連する１以上の遺伝子の発現が低下するか、かつ／またはグリコーゲン分解経路と関連するタンパク質をコードする１以上のポリヌクレオチド、もしくはその機能的断片の変異型の発現が増加するようなさらなる修飾を含む。
【０２２５】
様々な実施形態において、本発明の改変光合成微生物、例えば、シアノバクテリアは、グリコーゲン合成および／または貯蔵に関連する１以上の遺伝子の発現が低下している。特定の実施形態において、これらの改変光合成微生物は、グリコーゲン合成および／または貯蔵と関連する変異もしくは欠損した遺伝子を有する。特定の実施形態において、これらの改変光合成微生物は、変異もしくは欠損した遺伝子の一部を含むベクター、例えば、変異もしくは欠損した遺伝子の１以上の対立遺伝子のノックアウトまたはノックダウンを生成するために使用される標的ベクターを含む。特定の実施形態において、これらの改変光合成微生物は、グリコーゲン合成および／もしく貯蔵に関連する遺伝子によって発現されるｍＲＮＡに結合するアンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを含む。
【０２２６】
特定の実施形態において、本発明の改変光合成微生物、例えば、シアノバクテリアは、本明細書に記載のもののいずれかを含むが、これらの限定されないグリコーゲン分解またはトリグリセリドもしくは脂肪酸生合成に関連する活性を有するポリペプチドをコードする１以上の外因性または導入される核酸を含む。特定の実施形態において、外因性核酸は、微生物ゲノムに対して天然である核酸配列を含まない。特定の実施形態において、外因性核酸は、微生物ゲノムに対して天然である核酸配列を含むが、例えば、微生物におけるその核酸および／またはその核酸がコードするポリペプチドの発現を増加させるために、例えば、ベクターまたは分子生物学技術によって、微生物にすでに導入されている。
【０２２７】
グリコーゲンの生合成および貯蔵
グリコーゲンは、動物および細菌細胞を含むほとんどの細胞中の炭素ならびにエネルギー貯蔵の手段として機能するグルコースの多糖類である。より具体的には、グリコーゲンは、α−１，４−グルコシド結合を約９０％、およびα−１，６結合を約１０％含む巨大な分岐状グルコースホモポリマーである。特に細菌では、α−１，４−ポリグルカンの形態でのグリコーゲンの生合成および貯蔵は、環境内の過渡的な飢餓状態に対処するための重要な戦略を表す。
【０２２８】
グリコーゲン生合成は、いくつかの酵素の作用を伴う。例えば、細菌のグリコーゲン生合成は、一般に、（１）ホスホグルコムターゼ（Ｐｇｍ）によって触媒されるグルコース−１−リン酸の形成、続いて、（２）グルコース−１−リン酸アデニルトランスフェラーゼ（ＧｌｇＣ）によって触媒されるＡＴＰおよびグルコース−１−リン酸からのＡＤＰ−グルコース合成、続いて（３）グリコーゲン合成酵素（ＧｌｇＡ）によって触媒される、ＡＤＰ−グルコースから既存のα−１，４−グルカンプライマーへのグリコシル部分の転位、の一般的な段階を経る。このグリコーゲン合成の後者の段階は、典型的には、α−１，４−グルコシド鎖の伸長のためのグルコシル供与体としてＡＤＰ−グルコースを利用することによって起こる。
【０２２９】
細菌では、グリコーゲン合成における主な調節段階は、ＡＤＰ−グルコース合成のレベル、または上記のステップ（２）で生じ、この反応は、ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼとしても知られるグルコース−１−リン酸アデニルトランスフェラーゼ（ＧｌｇＣ）によって触媒される（例えば、Ｂａｌｌｉｃｏｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ６：２１３−２２５，２００３参照）。これに対し、哺乳類のグリコーゲン合成の主な調節段階は、グリコーゲン合成酵素のレベルで行われる。本明細書に示すとおり、シアノバクテリアなどの光合成微生物のグリコーゲン合成経路の調節および／または他の有効成分を変更し、それによりグリコーゲンの生合成および貯蔵を低下させることによって、そうでなければグリコーゲンとして貯蔵されていた炭素を、前記光合成微生物が利用して、脂質、脂肪酸、およびトリグリセリドなどの他の炭素系貯蔵分子を合成することができる。
【０２３０】
したがって、本発明の特定の改変光合成微生物、例えば、シアノバクテリアは、これらの段階の１以上を破壊する（すなわち、グリコーゲンの生合成および／または貯蔵に関して１以上の段階を「非機能的」にさせる）か、またはこれらの段階に直接関与する酵素もしくはそれらをコードする遺伝子の任意の１以上を変更する変異、欠失、または任意の他の変更を含んでもよい。上記のように、このような改変光合成微生物、例えば、シアノバクテリアは、典型的には、野生型光合成微生物と比較して、脂肪酸などの増加した量の脂質の生成および／または蓄積を可能にする。特定の代表的なグリコーゲン生合成遺伝子を、以下に記載する。
【０２３１】
ホスホグルコムターゼ遺伝子（ｐｇｍ）
一実施形態において、改変光合成微生物、例えば、シアノバクテリアは、減少した量のホスホグルコムターゼ遺伝子を発現する。特定の実施形態において、この改変光合成微生物は、その調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、転写因子、正または負の調節タンパク質など）のいずれかを含むホスホグルコムターゼ遺伝子の変異または欠失を含んでもよい。遺伝子ｐｇｍによってコードされるホスホグルコムターゼ（ｐｇｍ）は、典型的には、酵素結合中間体であるグルコース−１，６−二リン酸を経由して、グルコース−１−リン酸のグルコース−６−リン酸への可逆的変換を触媒する（例えば、Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７６：５８４７−５８５１，１９９４参照）。この反応は可逆的であるが、グルコース−６−リン酸の形成が著しく促進される。
【０２３２】
しかし、典型的には、多量のグルコース−６−リン酸が存在する場合には、Ｐｇｍは、１−炭素のリン酸化およびｃ−炭素の脱リン酸化を触媒し、グルコース−１−リン酸を生じる。その後、得られたグルコース−１−リン酸は、ＧｌｇＣの触媒活性を含むいくつかの中間段階によってＵＤＰ−グルコースに変換され、これはその後、以下に記載のグリコーゲン合成酵素の活性によるグリコーゲン貯蔵分子に付加することができる。したがって、特定の条件下で、Ｐｇｍ酵素は、グリコーゲンの生合成および貯蔵に仲介的な役割を果たしている。
【０２３３】
ｐｇｍ遺伝子は、全てではないがほとんどのシアノバクテリアを含む多種多様な生物で発現している。ｐｇｍ遺伝子も、シアノバクテリア由来の様々なｐｇｍ遺伝子のポリヌクレオチド配列を提供する配列番号２４（ネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２）、配列番号２５（シネコシスティス種ＰＣＣ６８０３）、および配列番号２６（シネココッカス種ＷＨ８１０２）、配列番号７９（シネココッカスＲＣＣ３０７）、および配列番号８０（シネココッカス７００２）の比較の際に理解できるように、シアノバクテリア間で高度に保存されている。
【０２３４】
シネココッカスなどのシアノバクテリアでのｐｇｍ遺伝子の欠失が、前記シアノバクテリアにおけるグリコーゲンの蓄積を減少させ、脂質および脂肪酸などの他の炭素系の生成物の生成も増加させることを本明細書において初めて実証した。
【０２３５】
グルコース−１−リン酸アデニルトランスフェラーゼ（ｇｌｇＣ）
一実施形態において、改変光合成微生物、例えば、シアノバクテリアは、減少した量のグルコース−１−リン酸アデニルトランスフェラーゼ（ｇｌｇＣ）遺伝子を発現している。特定の実施形態において、この改変光合成微生物は、その調節エレメントのいずれかを含むｇｌｇＣ遺伝子の変異または欠失を含んでもよい。ｇｌｇＣ遺伝子によってコードされている酵素（例えば、ＥＣ２．７．７．２７）は、一般的に、以下の化学反応を触媒することによって、デンプン、グリコーゲン、およびショ糖の代謝に関与する。
ＡＴＰ＋α−Ｄ−グルコース−１−リン酸⇔二リン酸＋ＡＤＰ−グルコース
【０２３６】
したがって、この酵素の２種類の基質は、ＡＴＰおよびα−Ｄ−グルコース−１−リン酸であるが、その２種類の生成物は二リン酸およびＡＤＰ−グルコースである。ｇｌｇＣによってコードされている酵素は、植物におけるデンプン生合成および細菌におけるグリコーゲン生合成の最初のコミットメントされた律速段階を触媒する。この酵素は、植物および細菌における貯蔵多糖の蓄積を調節するための酵素部位であり、アロステリックに活性化されるか、またはエネルギーフラックスの代謝物によって阻害される。
【０２３７】
ｇｌｇＣ遺伝子によってコードされる酵素は、トランスフェラーゼファミリー、特に、リン含有ヌクレオチド基を転移させるトランスフェラーゼ（すなわち、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ）に属する。この酵素クラスの系統名は、典型的には、ＡＴＰ：α−Ｄ−グルコース−１−リン酸アデニリルトランスフェラーゼと呼ばれている。一般的に使用されている他の名称には、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ、グルコース−１−リン酸アデニルトランスフェラーゼ、アデノシン二リン酸グルコースピロホスホリラーゼ、アデノシン二リン酸グルコースピロホスホリラーゼ、ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ、ＡＤＰ−グルコース合成酵素（ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＡＤＰ−グルコース合成酵素（ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、ＡＤＰＧピロホスホリラーゼ、およびＡＤＰ：α−Ｄ−グルコース−１−リン酸アデニリルトランスフェラーゼが含まれる。
【０２３８】
ｇｌｇＣ遺伝子は、全てではないが、ほとんどのシアノバクテリアを含む多種多様な植物および細菌で発現している。ｇｌｇＣ遺伝子は、シアノバクテリア由来の様々なｇｌｇＣ遺伝子のポリヌクレオチド配列を記載している配列番号２７（シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２）、配列番号２８（シネコシスティス種ＰＣＣ６８０３）、配列番号２９（シネココッカス種ＰＣＣ７００２）、配列番号３０（シネココッカス種ＷＨ８１０２）、配列番号３１（シネココッカス種ＲＣＣ３０７）、配列番号３２（トリコデスミウム・エリスラエウム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ  ｅｒｙｔｈｒａｅｕｍ）ＩＭＳ１０１）、配列番号３３（アナベナ・バリアビリス）、および配列番号３４（ノストック種ＰＣＣ７１２０）の比較の際に理解できるように、シアノバクテリアの間で高度に保存されている。
【０２３９】
シネココッカスなどのシアノバクテリアにおけるｇｌｇＣ遺伝子の欠失は、前記シアノバクテリアにおけるグリコーゲンの蓄積を減少させ、脂質および脂肪酸などの他の炭素系生成物の生成を増加させる。
【０２４０】
グリコーゲン合成酵素（ｇｌｇＡ）
一実施形態において、改変光合成微生物、例えば、シアノバクテリアは、減少した量のグリコーゲン合成酵素遺伝子を発現する。特定の実施形態において、この改変光合成微生物は、調節エレメントのいずれかを含むグリコーゲン合成酵素遺伝子に欠失または変異を含むことができる。ＵＤＰ−グルコース−グリコーゲングルコシルトランスフェラーゼとしても知られているグリコーゲン合成酵素（ＧｌｇＡ）は、ＵＤＰ−グルコースおよび（１，４−α−Ｄ−グルコシル）ｎの反応を触媒し、ＵＤＰおよび（１，４−α−Ｄ−グルコシル）ｎ＋１を生じる糖転移酵素である。グリコーゲン合成酵素は、成長中のグリコーゲンポリマー上に追加のグルコースモノマーを組み込むためにＡＤＰ−グルコースを使用するα−保持グルコシルトランスフェラーゼである。基本的に、ＧｌｇＡは、グリコーゲンとして貯蔵するためのポリマー鎖に過剰なグルコース残基を１つずつ変換する最終段階を触媒する。
【０２４１】
古典的には、グリコーゲン合成酵素、またはα−１，４−グルカン合成酵素は、配列、糖供与体特異性および調節機構の違いにより、動物／真菌グリコーゲン合成酵素および細菌／植物のデンプン合成酵素の２つのファミリーに分けられている。しかし、詳細な配列分析、予想される２次構造比較、および解析スレッドが、これらの２つのファミリーが構造的に関連していること、および動物／真菌合成酵素のいくつかのドメインがこれらの細胞型の特定の調節要件を満たすために取得されたことを示す。
【０２４２】
特定の細菌グリコーゲン合成酵素の結晶構造が証明されている（例えば、Ｂｕｓｃｈｉａｚｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２３，３１９６−３２０５，２００４参照）。これらの構造は、報告されたグリコーゲン合成酵素が、グリコーゲンホスホリラーゼおよび糖転移酵素スーパーファミリーの他の糖転移酵素中のように構築された２つのロスマンフォールドドメイン内に折り畳まれ、両方のドメイン間の深い裂溝は触媒中心を含むことを示す。このグリコーゲン合成酵素のＮ末端ドメインのコアは、両側に７つのαヘリックスが隣接する主に平行で中央の９つの鎖のβシートからなる。Ｃ末端ドメイン（残基２７１〜４５６）は、６つの鎖の平行なβシートおよび９つのαヘリックスを有する同様の折り畳みを示す。このドメインの最後のαヘリックスは、位置４５７〜４６０でねじれており、このタンパク質の最後の１７残基（４６１〜４７７）は、Ｎ末端ドメインを越えてαヘリックスとして続き、糖転移酵素の典型的な特徴をしている。
【０２４３】
これらの構造は、全体的な折り畳みおよびグリコーゲン合成酵素の活性部位の構造が、グリコーゲンホスホリラーゼのものと著しく類似しているおり、後者は炭水化物蓄積の可動化において中心的な役割を果たしており、これらは共通の触媒機構および同等の基質結合特性を示すことも明らかにする。しかし、グリコーゲンホスホリラーゼとは対照的に、グリコーゲン合成酵素は、触媒サイクル中に重要なドメイン間の「閉環」の動きを受けることが予測されるはるかに広い触媒クレフトを有している。
【０２４４】
特定のＧｌｇＡ酵素の結晶構造が証明されている（例えば、参照により援用されるＪｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ  ２４：６９４−７０４，２００５を参照されたい）。これらの研究は、ＧｌｇＡのＮ末端触媒ドメインがジヌクレオチド結合ロスマンフォールドに似ており、Ｃ末端ドメインは協同的なアロステリック調節および独特なオリゴマー化に関与する左巻きの平行βヘリックスを採用していることを示す。また、レギュレータ結合部位と活性部位との間の伝達は、Ｎ末端、グルコース−１−リン酸結合部位、およびＡＴＰ結合部位を含む酵素のいくつかの明確な領域が関与する。
【０２４５】
ｇｌｇＡ遺伝子は、動物、植物、真菌、および細菌の細胞を含み、全てではないがほとんどのシアノバクテリアを含む多種多様な細胞で発現している。ｇｌｇＡ遺伝子も、シアノバクテリア由来の様々なｇｌｇＡ遺伝子のポリヌクレオチド配列を記載している配列番号３５（シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２）、配列番号３６（シネコシスティス種ＰＣＣ６８０３）、配列番号３７（シネココッカス種ＰＣＣ７００２）、配列番号３８（シネココッカス種ＷＨ８１０２）、配列番号３９（シネココッカス種ＲＣＣ３０７）、配列番号４０（トリコデスミウム・エリスラエウムＩＭＳ１０１）、配列番号４１（アナベナ・バリアビリス）、および配列番号４２（ノストック種ＰＣＣ７１２０）の比較の際に理解できるように、シアノバクテリア間で高度に保存されている。
【０２４６】
グリコーゲン分解
特定の実施形態において、本発明の改変光合成微生物は、グリコーゲン分解経路に関連する増加した量の１以上のポリペプチドを発現している。特定の実施形態において、前記１以上のポリペプチドは、例えば、配列番号６８、７０、７２、７３、８３または８５に提供されているものを含む、グリコーゲンホスホリラーゼ（ＧｌｇＰ）、グリコーゲンイソアミラーゼ（ＧｌｇＸ）、グルカノトランスフェラーゼ（ＭａｌＱ）、ホスホグルコムターゼ（Ｐｇｍ）、グルコキナーゼ（Ｇｌｋ）、および／またはホスホグルコースイソメラーゼ（Ｐｇｉ）、またはその機能的断片もしくは変異型を含む。本発明に有用な追加のＰｇｍポリペプチド配列の例を、配列番号７４、７６、７７、７９、および８１に提供する。Ｐｇｍ、Ｇｌｋ、およびＰｇｉは、条件に依存して、グリコーゲン合成または分解を促進することができる双方向性酵素である。
【０２４７】
（ｉｖ）ポリペプチド変異型および断片
上記のように、本発明の実施形態は、本明細書に記載の参照ポリペプチドおよびポリヌクレオチドのいずれかの変異型および断片を含む（例えば、配列表参照）。変異型ポリペプチドは、生物活性があり、すなわち、参照ポリペプチドの酵素活性を保有し続ける。このような変異型は、例えば、遺伝子多型および／または人為操作から生じ得る。
【０２４８】
参照ポリペプチドの生物活性のある変異型は、デフォルトパラメーターを用いる本明細書の他の箇所に記載の配列アライメントプログラムにより決定されるとおり、参照タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、一般的に少なくとも７５％、８０％、８５％、通常約９０％〜９５％またはそれ以上、典型的には約９７％もしくは９８％またはそれ以上の配列類似性または配列同一性を有する。参照ポリペプチドの生物活性のある変異型は、一般的にそのタンパク質と２００、１００、５０または２０個のアミノ酸残基または適切には、約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、またはさらに１個のアミノ酸残基を含む６〜１０個のアミン酸残基などの１〜１５個ほどのアミン酸残基、１〜１０個ほどのアミノ酸残基が異なり得る。一部の実施形態において、変異型ポリペプチドは、１５、１０または５個未満であるが少なくとも１個のアミノ酸残基が本明細書で言及する参照配列（例えば、配列表参照）と異なる。他の実施形態において、変異型ポリペプチドは、残基の２０％、１５％、１０％または５％未満であるが少なくとも１個の残基が参照配列と異なる。
【０２４９】
生物活性のある断片は、参照ポリペプチド配列の、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４５０、５００、６００個またはそれ以上で、それらの間の全ての整数を含む連続するアミノ酸であるポリペプチド断片であり得る。
【０２５０】
参照ポリペプチドは、アミノ酸置換、欠失、トランケーション、および挿入を含む様々な方法で変更することができる。このような操作のための方法は当技術分野で一般に知られている。例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、ＤＮＡ中の変異によって調製することができる。変異誘発およびヌクレオチド配列変更のための方法は、当技術分野で公知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ．８２：４８８−４９２，１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌら（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２，１９８７）、米国特許第４，８７３，１９２号、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら（“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，”第４版、Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．，１９８７）およびその中で引用された文献を参照されたい。目的のタンパク質の生物活性に影響を与えない適切なアミノ酸置換に関するガイダンスは、Ｄａｙｈｏｆｆら（（１９７８）、タンパク質の配列および構造のアトラス（Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）、米国立生物医学研究財団、ワシントンＤ．Ｃ．）に見出すことができるに見出すことができる。
【０２５１】
点変異またはトランケーションによって作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための方法、および選択された特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための方法は当技術分野で公知である。このような方法は、参照ポリペプチドのコンビナトリアル変異誘発により生成された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適用可能である。ライブラリー中の機能的変異体の頻度を高める技術である再帰的アンサンブル変異誘発（Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（ＲＥＭ））は、ポリペプチド変異体を同定するためのスクリーニングアッセイと組み合わせて使用することができる（Ａｒｋｉｎ  ａｎｄ  Ｙｏｕｒｖａｎ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８９：７８１１−７８１５，１９９２；Ｄｅｌｇｒａｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．６：３２７−３３１，１９９３）。以下でより詳細に論じるとおり、１つのアミノ酸を同様の特性を有する別のアミノ酸と交換するような保存的置換が望ましい場合がある。
【０２５２】
ポリペプチド変異体は、参照アミノ酸配列と比較して、それらの配列に沿った様々な位置での保存的アミノ酸置換を含むことができる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されており、一般的に以下のように下位分類することができる。
【０２５３】
酸性：残基が生理的ｐＨでのＨイオンの喪失により負の電荷を有し、ペプチドが生理学的ｐＨの水性媒体中に存在する場合に残基が含まれるペプチドの高次構造における表面位置を探求するために水溶液によって誘引される。酸性側鎖を有するアミノ酸には、グルタミン酸およびアスパラギン酸が含まれる。
【０２５４】
塩基性：残基が、生理学的ｐＨでまたはその１つまたは２つのｐＨ単位内でＨイオンと会合することにより正の電荷を有し（例えば、ヒスチジン）、ペプチドが生理学的ｐＨの水性媒体中に存在する場合に残基が含まれるペプチドの高次構造における表面位置を探求するために水溶液によって誘引される。塩基性側鎖を有するアミノ酸には、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが含まれる。
【０２５５】
電荷：残基が、生理的ｐＨで荷電しており、そのため、酸性または塩基性側鎖を有するアミノ酸（すなわち、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、リジンおよびヒスチジン）を含む。
【０２５６】
疎水性：残基が、生理的ｐＨで荷電しておらず、ペプチドが水性媒体中に存在する場合に残基が含まれるペプチドの高次構造における内部位置を探求するために水溶液によって反発される。疎水性側鎖を有するアミノ酸には、チロシン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニンおよびトリプトファンが含まれる。
【０２５７】
中性／極性：残基は、生理的ｐＨで荷電していないが、ペプチドが水性媒体中に存在する場合に残基が含まれるペプチドの高次構造における内部位置を探求するように、残基は水溶液によって十分に反発されない。中性／極性側鎖を有するアミノ酸には、アスパラギン、グルタミン、システイン、ヒスチジン、セリンおよびスレオニンが含まれる。
【０２５８】
この説明はまた、特定のアミノ酸の側鎖が、極性基を欠いていても、疎水性を付与するほど十分に大きくないので、特定のアミノ酸を「小」と特徴付ける。プロリンを除いて、「小さい」アミノ酸は、少なくとも１つの極性基が側鎖上にある場合には４個以下の炭素を有するアミノ酸であり、少なくとも１つの極性基が側鎖上に無い場合には、３個以下の炭素を有するアミノ酸である。小さな側鎖を有するアミノ酸には、グリシン、セリン、アラニンおよびスレオニンが含まれる。遺伝子にコードされる２級アミノ酸のプロリンは、ペプチド鎖の２次立体構造に対するその公知の効果により特殊な場合である。プロリンの構造は、その側鎖がα−アミノ基の窒素およびα−炭素に結合している点で、天然に存在する他の全てのアミノ酸とは異なる。しかし、いくつかのアミノ酸類似性行列（例えば、Ｄａｙｈｏｆｆら（（１９７８）、タンパク質の進化的変化のモデル（Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、距離関係を決定するための行列（Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ）Ｉｎ  Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（編）、タンパク質の配列および構造のアトラス（Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）、第５巻、ｐｐ．３４５〜３５８、米国立生物医学研究財団、ワシントンＤ．Ｃ．）；およびＧｏｎｎｅｔら（Ｓｃｉｅｎｃｅ．２５６：１４４３０−１４４５，１９９２）によって開示されるような、例えば、ＰＡＭ１２０行列およびＰＡＭ２５０行列）は、グリシン、セリン、アラニンおよびスレオニンと同じグループにプロリンを含む。したがって、本発明の目的では、プロリンは「小さい」アミノ酸として分類される。
【０２５９】
極性または非極性としての分類に必要な誘引または反発の程度は任意であり、したがって、具体的には、本発明によって企図されるアミノ酸は、いずれか一方として分類されてきた。具体的に名前が付けられていないほとんどのアミノ酸は、公知の挙動に基づいて分類することができる。
【０２６０】
アミノ酸残基はさらに、環状または非環状、および芳香族または非芳香族、残基の側鎖置換基に対する自明の分類、ならびに大小として下位分類することができる。追加の極性置換基が存在する場合には、カルボキシル炭素を含めて合計４個以下の炭素原子を含み、追加の極性置換基が存在しない場合には３個以下炭素原子を含む場合に、残基は小さいと考えられる。小さな残基はもちろん、常に非芳香族である。それらの構造特性に依存して、アミノ酸残基は、２つ以上のクラスに入ることができる。天然に存在するタンパク質アミノ酸について、この方式による下位分類を表Ａに提示する。
【０２６１】
【表Ａ】
2015509533.tif 000002
【０２６２】
保存的アミノ酸置換は、側鎖に基づくグループ分けも含む。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり、脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループはセリンおよびスレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループはアスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループは、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループは、リジン、アルギニン、およびヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸のグループはシステインおよびメチオニンである。例えば、イソロイシンまたはバリンによるロイシンの置換、グルタミンによるアスパラギンの置換、セリンによるスレオニンの置換、または構造的に関連するアミノ酸によるアミノ酸の類似の置換は、生じた変異型ポリペプチドの特性に対して深刻な影響を及ぼさない。本明細書に記載のように、アミノ酸の変化が、機能的な切断型ポリペプチドおよび／または変異型ポリペプチドをもたらすか否かは、その酵素活性をアッセイすることによって容易に決定することができる。表Ｂの代表的な置換基の項目下に保存的置換を示す。本発明の範囲内に入るアミノ酸置換は、一般に、置換の領域におけるペプチド骨格の（ａ）構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のバルクの維持に対するそれらの効果において有意に異ならない置換を選択することによって行われる。置換が導入された後、変異体は生物活性についてスクリーニングされる。
【０２６３】
【表Ｂ】
2015509533.tif 000003
【０２６４】
もう１つの方法として、保存的置換を行うための類似のアミノ酸は、側鎖の同一性に基づいて、３つのカテゴリーに分類することができる。Ｚｕｂａｙ，Ｇ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３版、Ｗｍ．Ｃ．Ｂｒｏｗｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９３）に記載されているように、第１のグループは、全てが荷電している側鎖を有するグルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジンを含み、第２のグループは、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、グルタミン、アスパラギンを含み、第３のグループは、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニンを含む。
【０２６５】
したがって、参照ポリペプチド中の予測される非必須アミノ酸残基は、典型的には、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置換される。あるいは、変異は、飽和変異誘発などによって、コード配列の全てまたは一部に沿って無作為に導入することができ、得られた変異型を、親ポリペプチドの活性についてスクリーニングし、その活性を保持する変異型を同定することができる。コード配列の変異誘発後、コードペプチドを組換え発現させることができ、そのペプチドの活性を決定することができる。「非必須」アミノ酸残基は、その活性の１以上を消失させるかまたは実質的に変更することなく、実施形態のポリペプチドの野生型配列から変更することができる残基である。適切には、変更は、これらの活性の１つを実質的に消失させず、例えば、その活性は、野生型の少なくとも２０％、４０％、６０％、７０％、８０％、１００％、５００％、１０００％またはそれ以上である。「必須」アミノ酸残基は、参照ポリペプチドの野生型配列から変更された場合に、野生型活性の２０％未満しか存在しないように親分子の活性を消失させる残基である。例えば、このような必須アミノ酸残基は、様々な供給源からの参照ポリペプチドの酵素部位に保存されている配列を含む、異なる種間の参照ポリペプチドに保存されているものを含み得る。
【０２６６】
したがって、本発明はまた、天然に存在する参照ポリペプチド配列またはその生物活性のある断片の変異体も企図し、それらの変異体は、１以上のアミノ酸残基の付加、欠失、または置換によって天然に存在する配列から区別される。上述したように、一般的に、変異体は、参照ポリペプチド配列に対して少なくとも約３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の類似性または配列同一性を示す。さらに、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００個もしくはそれ以上のアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換により天然配列または親配列から異なるが、親配列もしくは参照ポリペプチド配列の特性または活性を保持する配列が企図される。
【０２６７】
一部の実施形態において、変異型ポリペプチドは、少なくとも１つであるが、５０、４０、３０、２０、１５、１０、８、６、５、４、３または２個未満のアミノ酸残基によって参照配列とは異なる。他の実施形態において、変異型ポリペプチドは、残基の少なくとも１％であるが、２０％、１５％、１０％または５％未満が参照配列と異なる。（この比較がアライメントを必要とする場合は、配列は、最大の類似性について整列されるべきである。欠失もしくは挿入、またはミスマッチから「グループからはずれる」配列は異なるものと考えられる。）
【０２６８】
配列間の配列類似性または配列同一性の計算（これらの用語は本明細書において互換的に使用される）は、以下のように行われる。２つのアミノ酸配列、または２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するために、配列を最適な比較目的のために整列させる（例えば、ギャップは、最適なアライメントの第１および第２のアミノ酸配列もしくは第１および第２の核酸配列の一方または両方に導入することができ、非相同配列は比較目的のために無視することができる）。特定の実施形態において、比較目的のために整列させた参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。その後、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列における位置が第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められる場合に、それらの分子はその位置で同一である。
【０２６９】
２つの配列間のパーセント同一性は、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮して、２つの配列の最適なアライメントのために導入する必要がある配列によって共有される同一の位置の数の関数である。
【０２７０】
２つの配列間の配列の比較およびパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。好ましい実施形態において、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３，１９７０）アルゴリズムを使用し、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２行列またはＰＡＭ２５０行列のいずれか、および１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップの重み、ならびに１、２、３、４、５、または６の長さの重みを使用して決定される。さらに別の好ましい実施形態において、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを用いて、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列、および４０、５０、６０、７０、または８０のギャップの重み、ならびに１、２、３、４、５、または６の長さの重みを用いて決定される。特に好ましいパラメーターセット（および特に明記しない限り使用すべきもの）は、ギャップペナルティが１２、ギャップ延長ペナルティが４、フレームシフトギャップペナルティが５のＢｌｏｓｓｕｍ  ６２スコア行列である。
【０２７１】
２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃａｂｉｏｓ．４：１１−１７，１９８９）のアルゴリズムを用い、ＰＡＭ１２０重み残基表（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を用いて決定することができる。
【０２７２】
本明細書に記載の核酸およびタンパク質配列は、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定するために、「クエリー配列」として使用して、公的データベースに対する検索を実行することができる。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２１５：４０３−１０）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて実行することができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行うことができる。比較の目的でギャップ付きアライメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）に記載のＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを用いることができる。
【０２７３】
上述したように、一実施形態において、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドは、ＢＬＡＳＴアライメントツールを用いて評価することができる。ローカルアライメントは、単に、比較される配列のそれぞれからのペアである配列セグメントのペアからなる。Ｓｍｉｔｈ−ＷａｔｅｒｍａｎまたはＳｅｌｌｅｒｓアルゴリズムの変更は、スコアが延長またはトリミングによって改善することができない、高スコアリングセグメントペア（ＨＳＰ）と呼ばれる全てのセグメントペアを見つける。ＢＬＡＳＴアライメントの結果は、ＢＬＡＳＴスコアが偶然期待できる可能性を示すための統計的尺度を含む。
【０２７４】
ロースコアＳは、各整列配列に関連したギャップおよび置換の数から計算され、その際、高い類似度スコアがより重要なアライメントを示す。置換スコアは、ルックアップテーブル（ＰＡＭ、ＢＬＯＳＵＭ参照）によって与えられる。
【０２７５】
ギャップスコアは、典型的には、ギャップオープニングペナルティＧおよびギャップ伸長ペナルティＬの合計として計算される。長さｎのギャップについては、ギャップコストはＧ＋Ｌｎである。ギャップコストＧおよびＬの選択は経験的であるが、Ｇの高い値（１０〜１５）、例えば１１、およびＬの低い値（１〜２）、例えば１を選択することが通例である。
【０２７６】
ビットスコアＳ’は、使用されるスコアリングシステムの統計的特性が考慮されているアライメントロースコアＳに由来する。ビットスコアはスコアリングシステムに関して正規化され、したがって、それらを用いて、異なる検索からアライメントスコアを比較することができる。用語「ビットスコア」および「類似度スコア」は互換的に使用される。ビットスコアは、アライメントの良好さの指標を与え、スコアが高いほど、アライメントは良好である。
【０２７７】
Ｅ値、または期待値は、同様のスコアを有する配列が偶然にデータベースで発生する可能性を説明する。偶然にデータベース検索で発生すると予想されるＳと同等またはより良好なスコアを有する異なるアライメントの数の予測である。Ｅ値が小さいほど、アライメントはより重要である。例えば、ｅ−１１７のＥ値を有するアライメントは、同様のスコアを有する配列が単に偶然に生じる可能性が低いことを意味する。さらに、アミノ酸のランダムペアを整列させるための期待されるスコアが負であることが必要であり、そうでなければ、長いアライメントは、整列セグメントが関連していたか否かに関わらず、高いスコアを有する傾向がある。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、適切な置換行列、ヌクレオチドまたはアミノ酸を使用し、ギャップ付きアライメントのためにギャップ生成および伸長ペナルティを使用する。例えば、ＢＬＡＳＴアライメントおよびポリペプチド配列の比較は、典型的には、ＢＬＯＳＵＭ６２行列、ギャップ存在ペナルティ（ｇａｐ  ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ  ｐｅｎａｌｔｙ）１１、およびギャップ伸長ペナルティ１を使用して行われる。
【０２７８】
一実施形態において、配列類似性スコアは、ＢＬＯＳＵＭ６２行列、ギャップ存在ペナルティ１１、およびギャップ伸長ペナルティ１を使用して行われるＢＬＡＳＴ解析から報告される。
【０２７９】
特定の実施形態において、本明細書に提供する配列同一性／類似性スコアは、ＧＡＰバージョン１０（ＧＣＧ、Ａｃｃｅｌｒｙｓ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）を使用して、ギャップの重み５０および長さの重み３、ならびにｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリング行列を用いたヌクレオチド配列の％同一性および％類似性、ギャップの重み８および長さの重み２、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列を用いたアミノ酸配列の％同一性および％類似性（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ．８９：１０９１５−１０９１９，１９９２）のパラメーターを用いて得られた値を指す。ＧＡＰは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３，１９７０）のアルゴリズムを使用して、一致の数を最大にし、ギャップの数を最小にする２つの完全配列のアライメントを見出す。
【０２８０】
特定の一実施形態において、変異型ポリペプチドは、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００、もしくはそれ以上で、それらの間の全ての整数および範囲を含むＢＬＡＳＴビットスコアまたは配列類似性スコアを生成するために、参照ポリペプチド配列（例えば、配列表参照）と最適に整列させることができるアミノ酸配列を含み、その際、ＢＬＡＳＴアライメントは、ＢＬＯＳＵＭ６２行列、ギャップ存在ペナルティ１１、およびギャップ伸長ペナルティ１を使用した。
【０２８１】
参照ポリペプチドの変異型は、参照ポリペプチドの変異型のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。ライブラリーまたはタンパク質コード配列の断片、例えば、Ｎ末端、Ｃ末端、もしくは内部断片を用いて、参照ポリペプチドの変異型のスクリーニングおよびその後の選択のための変化に富んだ断片集団を生成することができる。
【０２８２】
点変異またはトランケーションによって作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための方法、および選択された特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための方法は当技術分野で公知である。このような方法は、ポリペプチドのコンビナトリアル変異誘発により生成される遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適用可能である。
【０２８３】
本発明はまた、本明細書に記載の参照ポリペプチドのキメラタンパク質または融合タンパク質の使用も企図する。本明細書で使用する「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、参照ポリペプチド、または（例えば、複数の断片を作成するための）別の参照ポリペプチド、非参照ポリペプチド、もしくはその両方に連結されたポリペプチド断片を含む。特定の実施形態において、参照ポリペプチドは、異種ポリペプチド配列に融合させることができる。「異種ポリペプチド」は、典型的には、参照タンパク質配列とは異なり、同じまたは異なる生物に由来し得るタンパク質に対応するアミノ酸配列を有する。融合タンパク質の参照ポリペプチドは、生物活性のあるアミノ酸配列の全てまたは一部に対応することができる。
【０２８４】
特定の実施形態において、融合タンパク質は、参照タンパク質の少なくとも１つまたは２つの生物活性のある部分を含む。融合タンパク質を形成するポリペプチドは、典型的には、Ｃ末端からＮ末端に連結されているが、それらはまた、Ｃ末端からＣ末端、Ｎ末端からＮ末端、またはＮ末端からＣ末端に連結することができる。融合タンパク質のポリペプチドは任意の順序で有り得る。
【０２８５】
融合パートナーは、それらがポリペプチドの酵素活性に悪影響を及ぼさない条件で、本質的に任意の所望の目的のために設計および含有されてもよい。例えば、一実施形態において、融合パートナーは、天然の組換えタンパク質よりも高い収率でタンパク質を発現するのを助ける配列（発現エンハンサー）を含んでもよい。タンパク質の溶解性もしくは安定性を増大させるか、またはタンパク質が所望の細胞内区画に標的化されるのを可能にするために、他の融合パートナーを選択してもよい。
【０２８６】
融合タンパク質は、リガンドに対して高い親和性を有する部分を含むことができる。例えば、融合タンパク質は、参照ポリペプチド配列がＧＳＴ配列のＣ末端に融合されたＧＳＴ融合タンパク質であり得る。このような融合タンパク質は、得られたポリペプチドの精製および／または同定を容易にすることができる。あるいは、この融合タンパク質は、そのＮ末端に異種シグナル配列を含む参照ポリペプチドであり得る。特定の宿主細胞では、このようなタンパク質の発現および／または分泌は、異種シグナル配列の使用を通して増加させることができる。
【０２８７】
融合タンパク質は、一般的に、本明細書の他の箇所に記載の標準的な技術を用いて調製することができる。ペプチドリンカー配列は、必要に応じて、各ポリペプチドがその２次および３次構造に折り畳まれることを保証するのに十分な距離で、第１および第２のポリペプチド成分を分離するために用いることができる。代表的なペプチドリンカーは、本明細書中の他の箇所に記載されている。
【０２８８】
Ｃ．ポリヌクレオチドおよびベクター
本発明の実施形態は、本明細書に記載のジアシルグリセロールトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、この融合タンパク質は、細菌膜または細菌の原形質膜（ＰＭ）標的ドメインなどの少なくとも１つの細胞内局在化ドメインに融合された少なくとも１つのＤＧＡＴポリペプチドを含む。このようなポリヌクレオチドは、ベクター内の他の細胞成分、例えば、このようなベクターを含む（例えば、試験管もしくはキット中の）組成物、または改変光合成微生物などの宿主細胞内の他の細胞成分から部分的にまたは完全に単離することができる。
【０２８９】
これらのポリヌクレオチドおよびそれらを含む改変光合成微生物は、必要に応じて、脂質生合成タンパク質をコードする１以上の（導入される）ポリヌクレオチド、および／またはグリコーゲン分解に関連するポリペプチドをコードする１以上の（導入される）ポリヌクレオチドを含んでもよい。
【０２９０】
また、天然に存在する任意の機能的変異型もしくは断片（例えば、対立遺伝子変異型、オルソログ、スプライスバリアント）、またはこれらの天然のポリヌクレオチドの天然に存在しない（すなわち、遺伝子工学により最適化された）変異型もしくは断片をコードするヌクレオチド配列、ならびにこのようなポリヌクレオチドを含み、例えば、クローニングベクターおよび発現ベクターを含む組成物も含まれる。
【０２９１】
また、本明細書に記載の改変光合成微生物は、必要に応じて、単独で、または脂質生合成タンパク質および／もしくはグリコーゲン分解に関連する過剰発現させたタンパク質の存在と組み合わせて、グリコーゲン生合成もしくは貯蔵に関連する１以上の遺伝子における変異または欠失を含んでもよい。例えば、ワックスエステルの産生のための特定の改変光合成微生物は、必要に応じて、単独で、または脂質生合成タンパク質および／もしくはグリコーゲン分解に関連する過剰発現させたタンパク質の存在と組み合わせて、アルデヒドデカルボニラーゼ、アルデヒド脱水素酵素、またはその両方をコードする１以上の遺伝子における変異または欠失を含んでもよい。
【０２９２】
この文脈における記述「変異」または「欠失」は、一般的に、遺伝子産物を全く機能させないかまたはその機能を低下させた光合成微生物、例えば、シアノバクテリアにおけるそれらの変化または変更を指す。そのような変化または変更の例としては、全部または一部の標的遺伝子（例えば、ｇｌｇＡ、ｇｌｇＣ、ｐｇｍ、アルデヒドデカルボニラーゼ、アルデヒド脱水素酵素）のコード配列または調節配列へのヌクレオチド置換、欠失、または付加／挿入が挙げられ、これらは、転写、翻訳、翻訳後修飾、またはタンパク質安定性のレベルに関わらず、その遺伝子によってコードされているポリペプチドの発現を混乱、排除、下方制御するかまたは著しく低下させる。このような変更はまた、発現低下の有無に関わらず、タンパク質の酵素活性または他の機能特性（例えば、局在）を低下させることもできる。
【０２９３】
選択可能なマーカーを有するベクターとの組換えなどによるこのような変化または変更を引き起こすための技術は、本明細書に例示され、分子生物学技術分野で公知である。特定の実施形態において、遺伝子の１以上の対立遺伝子、例えば、２つまたは全ての対立遺伝子は、光合成微生物内で変異または除去されてもよい。特定の実施形態において、本発明の改変光合成微生物、例えば、シアノバクテリアは、部分二倍体すなわち部分的な二倍体である。
【０２９４】
標的遺伝子またはポリペプチドの「欠失」はまた、当技術分野で公知の様々なアンチセンス技術（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡ）などを用いて、その遺伝子のｍＲＮＡを標的にすることによって達成することもできる。したがって、その遺伝子によってコードされているポリペプチドまたは酵素は改変光合成微生物によって発現しないか、または無視できる量で発現される場合に、標的遺伝子は「非機能的」と考えることができる。
【０２９５】
本明細書で使用する用語「ＤＮＡ」および「ポリヌクレオチド」ならびに「核酸」は、特定の種の全ゲノムＤＮＡを含まない単離されたＤＮＡ分子を含む。したがって、ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、ＤＮＡセグメントが得られる種の全ゲノムＤＮＡから実質的に単離されるか、またはそれから精製された１以上のコード配列を含むＤＮＡセグメントを指す。ＤＮＡセグメントおよびこのようなセグメントのより小さな断片、ならびに、例えば、プラスミド、コスミド、ファージミド、ファージ、およびウイルスなどを含む組換えベクターも、用語「ＤＮＡセグメント」および「ポリヌクレオチド」に含まれる。
【０２９６】
当業者が理解するとおり、本発明のポリヌクレオチド配列は、タンパク質、ポリペプチド、およびペプチドなどを発現するか、または発現するように適合させることができるゲノム配列、ゲノム外にコードされた配列およびプラスミドにコードされた配列、ならびに遺伝子操作されたより小さい遺伝子セグメントを含み得る。このようなセグメントは、人の手によって当然単離されるか、または合成的に変更することができる。
【０２９７】
ポリヌクレオチドは、一本鎖（翻訳領域もしくはアンチセンス）または二本鎖であってよく、（ゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成の）ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であってよい。追加の翻訳領域または非翻訳領域の配列は、そうである必要はないが、本発明のポリヌクレオチド内に存在してもよいし、ポリヌクレオチドは、そうである必要はないが、他の分子および／または支持材料に連結されていてもよい。
【０２９８】
ポリヌクレオチドは、天然配列（例えば、本明細書に記載のタンパク質をコードする内因性配列）を含むか、またはそのような配列の変異型もしくは断片、または生物学的に機能する等価物を含んでもよい。ポリヌクレオチド変異型は、好ましくは、本明細書でさらに説明するように、コードされたポリペプチドの酵素活性が非修飾ポリペプチドまたは参照ポリペプチドと比較して実質的に減少しないような１以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含んでもよい。コードされたポリペプチドの酵素活性に対する効果は、一般的に、本明細書に記載され、当技術分野で公知のとおりに評価することができる。
【０２９９】
（ｉ）細胞内局在化ドメイン−ＤＧＡＴ融合ポリヌクレオチド
本発明の実施形態は、膜標的ドメイン−ＤＧＡＴ融合タンパク質などの、本明細書に記載の細胞内局在化ドメイン−ＤＧＡＴ融合タンパク質のいずれかをコードするポリヌクレオチド（例えば、単離ポリヌクレオチド）を含む。これらのポリヌクレオチドは、ＤＧＡＴポリペプチド、またはその活性断片もしくは変異型をコードする少なくとも１つの配列とインフレームで融合された、本明細書に記載の異種細胞内局在化ドメインをコードする少なくとも１つの配列を含む。
【０３００】
したがって、特定の実施形態は、本明細書に記載の細胞内局在化ドメインの任意の１以上をコードするポリヌクレオチドを含み、このようなポリヌクレオチドは、ＤＧＡＴをコードするポリヌクレオチドにインフレームで融合される。膜標的ドメインをコードする代表的な配列は、配列番号２００または２０２の中に見られ、それぞれのＰＣＣ７９４２−０８５８およびＰＣＣ７９４２−１０１５は、シネココッカス・エロンガタス由来の２つのメチル受容走化性（ＭＣＰ）タンパク質の配列をコードする。例えば、特定の実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、配列番号２００（ＰＣＣ７９４２−０８５８）、ＰＣＣ７９４２−０８５８遺伝子のＮ末端シグナル配列をコードする配列番号２１３のＮ末端の約１２９個のヌクレオチドを含み、追加配列は、例えば、配列番号２００（ＰＣＣ７９４２−０８５８）のＮ末端の約１３２、１３５、１３８、１４１、１４４、１４７、１５０、１５３、１５６、１５９、１６２、１６５、１６８、１７１、１７４、１７７、１８０個またはそれ以上のヌクレオチドを含むこともできる。
【０３０１】
本明細書に記載ＤＧＡＴポリペプチドの任意の１以上をコードするポリヌクレオチドも含まれ、このようなポリヌクレオチドは、異種細胞内局在化ドメインをコードするポリヌクレオチドにインフレームで融合している。特定の実施形態において、融合タンパク質のＤＧＡＴコード部分は、配列番号５８、５９、６０もしくは６１のいずれか１つに記載のポリペプチド配列、またはその断片もしくは変異型を含むか、またはそれらからなるＤＧＡＴをコードする。配列番号５８はＤＧＡＴｎの配列であり、配列番号５９は、ストレプトマイセス・セリカラーのＤＧＡＴ配列（ＳｃｏＤＧＡＴまたはＳＤＧＡＴ）であり、配列番号６０は、Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓのＤＧＡＴ配列（ＡｂｏＤＧＡＴ）であり、配列番号６１は、ＤＧＡＴｄの配列（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｙｌｉｉ種）である。
【０３０２】
特定の実施形態において、融合タンパク質のＤＧＡＴをコードする部分は、配列番号６２、６３、６４、６５、または６６のいずれか１つに記載のポリペプチド配列、またはその断片もしくは変異型を含むか、またはそれらからなる。配列番号６２は、ＤＧＡＴｎをコードするシアノバクテリア配列の発現のためにコドン最適化されており、配列番号６３は、配列番号６２に対して相同性があり、配列番号６４は、ＳｃｏＤＧＡＴをコードするシアノバクテリア配列の発現のためにコドン最適化されており、配列番号６５は、ＡｂｏＤＧＡＴをコードするシアノバクテリア配列の発現のためにコドン最適化されており、配列番号６６は、ＤＧＡＴｄをコードするシアノバクテリア配列の発現のためにコドン最適化されている。ＤＧＡＴｎおよびＤＧＡＴｄは、開始メチオニンの直後に２つの追加のアミノ酸残基を含むＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｙｌｉｉのＤＧＡＴおよびその改変体に相当する。
【０３０３】
（ｉｉ）脂質生合成遺伝子
特定の実施形態において、この改変光合成微生物は、１以上の脂質生合成タンパク質をコードする導入ポリヌクレオチドを含む。場合によって、改変光合成微生物は、脂質生合成遺伝子をコードする内因性ポリヌクレオチドを含み、プロモーターなどの調節エレメントが、そのコードタンパク質の発現を調節または変更するために、そのポリヌクレオチドの上流に導入されている。
【０３０４】
特定の実施形態において、この改変光合成微生物は、脂質生合成ポリペプチドの発現もしくは活性が低下または排除されている。そのコードポリペプチドの発現および／もしくは活性を低下または排除する内因性脂質生合成遺伝子の完全欠失もしくは部分欠失、および点変異または挿入が含まれる。
【０３０５】
代表的な脂質生合成遺伝子は、本明細書に記載のアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）、アシル−ＡＣＰ合成酵素（Ａａｓ）、アシル−ＡＣＰ還元酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アルデヒドデカルボニラーゼ、チオエステラーゼ（ＴＥＳ）、アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）、ホスファチジン酸ホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（ＰＡＰ；またはホスファチジン酸ホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ））、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）ヒドロラーゼ、脂肪酸アシルＣｏＡ合成酵素、およびリパーゼ／ホスホリパーゼなどのポリペプチドをコードする。
【０３０６】
アシルキャリアータンパク質
特定の実施形態において、この改変光合成微生物は、１以上のアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）をコードする１以上のポリヌクレオチドを含む。代表的なＡＣＰヌクレオチド配列は、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２由来の配列番号５、アシネトバクター種ＡＤＰ１由来の配列番号７、９、および１１、ならびにホウレンソウ由来の配列番号１３を含む。
【０３０７】
アシル−ＡＣＰ合成酵素（Ａａｓ）
特定の実施形態において、この改変光合成微生物は、１以上のアシル−ＡＣＰ合成酵素（Ａａｓ）をコードする１以上のポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、Ａａｓのヌクレオチド配列は、シネココッカス・エロンガタスのＳｅ９１８遺伝子に由来する。１つの代表的なＡａｓ配列のヌクレオチド配列は、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ  ７９４２由来の配列番号４３である。
【０３０８】
特定の実施形態において、本発明の改変光合成微生物は、コードされたＡａｓポリペプチドの発現および／もしくは活性を低下または排除するために、１以上の内因性Ａａｓ遺伝子、例えば、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２のＳｅ９１８遺伝子の点変異、挿入、または完全欠失もしくは部分欠失などの変異を有する。
【０３０９】
アシル−ＡＣＰ還元酵素
特定の実施形態において、この改変光合成微生物は、１以上のアシル−ＡＣＰ還元酵素ポリペプチドをコードする１以上のポリヌクレオチドを含む。代表的なアシル−ＡＣＰ還元酵素のヌクレオチド配列は、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２（配列番号１）由来のｏｒｆ１５９４およびシネコシスティス種ＰＣＣ６８０３（配列番号３）由来のｏｒｆｓｌｌ０２０９を含む。
【０３１０】
アルコール脱水素酵素
特定の実施形態は、アルコール脱水素酵素をコードする１以上のポリヌクレオチド配列を使用することができる。代表的なアルコール脱水素酵素は、シネコシスティス種のＰＣＣ６８０３のｓｌｒ１１９２（配列番号１０４）およびＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｙｌｉｉ由来のＡＣＩＡＤ３６１２（配列番号１０６）を含む。
【０３１１】
アルデヒド脱水素酵素
特定の実施形態は、アルデヒド脱水素酵素をコードする１以上のポリヌクレオチド配列を使用することができる。例えば、トリグリセリドまたはワックスエステルの生成のための特定の実施形態は、１以上の内因性アルデヒド脱水素酵素遺伝子の点変異、挿入、または完全欠失もしくは部分欠失などの変異を含んでもよい。１つの代表的なアルデヒド脱水素酵素は、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２（配列番号１０２）のｏｒｆ０４８９である。
【０３１２】
アルデヒドデカルボニラーゼ
例えば、トリグリセリドまたはワックスエステルの生成のための特定の実施形態は、１以上の内因性アルデヒドデカルボニラーゼ遺伝子の点変異、挿入、または完全欠失もしくは部分欠失などの変異を含んでもよい。アルデヒドデカルボニラーゼの一例は、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２のｏｒｆ１５９３によってコードされている。別の例としては、シネコシスティス種ＰＣＣ６８０３のｏｒｆｓｌｌ０２０８によってコードされているアルデヒドデカルボニラーゼが挙げられる。
【０３１３】
チオエステラーゼ（ＴＥＳ）
特定の実施形態において、この改変光合成微生物は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼおよび／またはアシルＣｏＡチオエステラーゼを含む１以上のチオエステラーゼ（ＴＥＳ）をコードする１以上のポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、ＴＥＳのポリヌクレオチド配列は、大腸菌由来のＴｅｓＡまたはＴｅｓＢポリペプチドをコードしており、細胞質ＴｅｓＡ変異体（＊ＴｅｓＡ）は配列番号１２１に記載の配列を有する。
【０３１４】
特定の実施形態において、ＴＥＳのポリヌクレオチド配列は、Ｃ８、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、またはＣ１８  ＦａｔＢ酵素などのＦａｔＢ酵素をコードするＦａｔＢ遺伝子の配列を含む。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、リゾホスホリパーゼ活性がほとんどないかまたは全くなく、チオエステラーゼ活性のみを有するチオエステラーゼ（例えば、ＦａｔＢチオエステラーゼ）をコードする。具体的な実施形態において、チオエステラーゼは、アシルＣｏＡではなく、アシル−ＡＣＰを加水分解することができるＦａｔＢアシル−ＡＣＰチオエステラーゼである。配列番号１９７は、Ｃｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ由来のＣ８／Ｃ１０  ＦａｔＢ２チオエステラーゼの代表的なヌクレオチド配列であり、配列番号１２２は、シアノバクテリアにおける発現のためにコドン最適化されている。配列番号１２３は、Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ由来のＣ１２  ＦａｔＢ１  アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの代表的なヌクレオチド配列であり、配列番号１２４は、シアノバクテリアにおける最適な発現のためにコドン最適化された配列番号１２３のバージョンである。配列番号１２６は、Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｍｐｈｏｒａ由来のＣ１４  ＦａｔＢ１チオエステラーゼの代表的なヌクレオチド配列であり、配列番号１２５は、配列番号１２６のコドン最適化されたバージョンである。配列番号１２７は、Ｃｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ由来のＣ１６  ＦａｔＢ１チオエステラーゼの代表的なヌクレオチド配列であり、配列番号１２８は、配列番号１２７のコドン最適化されたバージョンである。特定の実施形態において、１以上のＦａｔＢ配列は、Ｐｔｒｃプロモーターなどの強力なプロモーターに作動可能に連結されている。他の実施形態において、１以上のＦａｔＢ配列は、アラビノースプロモーターなどの比較的弱いプロモーターに作動可能に連結されている。
【０３１５】
アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号５５、４５、４６、４７、４８、もしくは４９のいずれかに記載のポリペプチド配列、またはその断片もしくは変異型を含むか、またはそれらからなるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）をコードする。特定の実施形態においては、ＡＣＣａｓｅポリヌクレオチドは、配列番号５６、５７、５０、５１、５２、５３もしくは５４のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異型を含むか、またはそれらからなる。配列番号５５は、出芽酵母のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ｙＡｃｃｌ）の配列であり、配列番号５６は、ｙＡｃｃｌをコードするシアノバクテリア配列の発現のためにコドン最適化されている。配列番号４５は、シネココッカス種ＰＣＣ７００２のＡｃｃＡであり、配列番号４６は、シネココッカス種ＰＣＣ７００２のＡｃｃＢであり、配列番号４７は、シネココッカス種ＰＣＣ７００２のＡｃｃＣであり、配列番号４８は、シネココッカス種ＰＣＣ７００２のＡｃｃＤである。配列番号５０は、シネココッカス種ＰＣＣ７００２のＡｃｃＡであり、配列番号５１は、シネココッカス種ＰＣＣ７００２のＡｃｃＢであり、配列番号５２は、シネココッカス種ＰＣＣ７００２のＡｃｃＣであり、配列番号５３は、シネココッカス種ＰＣＣ７００２のＡｃｃＤである。配列番号４９はコムギのＡＣＣａｓｅであり、配列番号５４は、このコムギのＡＣＣａｓｅをコードする。
【０３１６】
ホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１３１に記載のポリペプチド配列またはその断片もしくは変異型を含むか、またはそれらからなるホスファチジン酸ホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（ホスファチジン酸ホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）とも呼ばれる；ＰＡＰ）をコードする。特定の実施形態において、ホスファチジン酸ホスファターゼポリヌクレオチドは、配列番号１２９もしくは配列番号１３０に記載のポリヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異型を含むか、またはそれらからなる。配列番号１３１は、出芽酵母のホスファチジン酸ホスファターゼ（ｙＰＡＨｌ）の配列であり、配列番号１２９は、ｙＰＡＨｌをコードするシアノバクテリア配列の発現のためにコドン最適化されている。特定の実施形態において、ＰＡＰのヌクレオチド配列は、大腸菌のＰｇｐＢ遺伝子、および／またはシネコシスティス種ＰＣＣ６８０３のＰＡＰ遺伝子に由来する。
【０３１７】
トリグリセロール（ＴＡＧ）ヒドロラーゼ
特定の実施形態は、ＴＡＧヒドロラーゼをコードする１以上のポリヌクレオチド配列を使用する。ＴＡＧヒドロラーゼポリヌクレオチド配列の非限定的な例としては、シロイヌナズナ由来のＳＤＰ１（ＳＵＧＡＲ−ＤＥＰＥＮＤＥＮＴ  １）トリアシルグリセロールリパーゼ（配列番号１５３）、アシネトバクター種ＡＤＰ１由来のＡＣＩＡＤ１３３５（配列番号１５４）、出芽酵母のＴＧ１４Ｐ（配列番号１７５）、ロドコッカス由来のＲＨＡ１＿ｒｏ０４７２２（ＹＰ＿７０４６６５）ＴＡＧリパーゼ（配列番号１５５）が挙げられる。代表的なリパーゼ／エステラーゼの追加のポリヌクレオチド配列には、ロドコッカス種由来のＲＨＡｌ＿ｒｏ０１６０２リパーゼ／エステラーゼ（配列番号１５６）、およびロドコッカス種由来のＲＨＡ１＿ｒｏ０６８５６リパーゼ／エステラーゼ（配列番号１１９参照）が含まれる。
【０３１８】
脂肪酸アシルＣｏＡ合成酵素
特定の実施形態は、脂肪酸アシルＣｏＡ合成酵素をコードする１以上のポリヌクレオチド配列を使用する。１つの代表的な脂肪酸アシルＣｏＡ合成酵素は、中鎖および長鎖脂肪酸に対して基質特異性を有する脂肪酸アシルＣｏＡ合成酵素をコードする大腸菌由来のＦａｄＤ遺伝子（配列番号１６）を含む。他の代表的な脂肪酸アシルＣｏＡ合成酵素は、出芽酵母由来のものを含み、例えば、Ｆａａ１ｐコード配列は、配列番号１８に記載されており、Ｆａａ２ｐコード配列は、配列番号２０に記載されており、Ｆａａ３ｐは、配列番号２２に記載されている。配列番号２２は、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２における発現のためにコドン最適化されている。
【０３１９】
リパーゼ／ホスホリパーゼ
特定の実施形態において、この改変光合成微生物は、リゾホスホリパーゼを含む１以上のリパーゼまたはホスホリパーゼをコードする１以上のポリヌクレオチド、またはその断片もしくは変異型を含む。特定の実施形態において、コードされたリゾホスホリパーゼは、リゾホスホリパーゼＬ１（ＴｅｓＡ）、リゾホスホリパーゼＬ２、ＴｅｓＢ、Ｖｕパタチン１タンパク質、またはそのホモログである。
【０３２０】
特定の実施形態において、コードされたホスホリパーゼ、例えば、リゾホスホリパーゼは、細菌のホスホリパーゼ、またはその断片もしくは変異型であり、ポリヌクレオチドは、細菌のホスホリパーゼポリヌクレオチド配列、例えば、大腸菌、エンテロコッカス・フェカリス、またはラクトバチルス・プランタラム由来の配列を含む。特定の実施形態において、コードされるホスホリパーゼは、リゾホスホリパーゼＬ１（ＴｅｓＡ）、リゾホスホリパーゼＬ２、ＴｅｓＢ、Ｖｕパタチン１タンパク質、またはその機能的断片である。
【０３２１】
特定の実施形態において、リゾホスホリパーゼは、配列番号１９６に記載の野生型配列を有するポリヌクレオチド（ｐｌｄＣ）によってコードされる大腸菌リゾホスホリパーゼＬ１、または配列番号１３２に記載の野生型配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる大腸菌ＴｅｓＢなどの細菌のリゾホスホリパーゼＬ１（ＴｅｓＡ）またはＴｅｓＢである。大腸菌のリゾホスホリパーゼＬ１のポリペプチド配列は、配列番号１３３に提供され、大腸菌ＴｅｓＢのポリペプチド配列は配列番号１３４に提供される。他の実施形態において、リゾホスホリパーゼは、配列番号１３５に記載の野生型配列を有するポリヌクレオチド（ｐｌｄＢ）によってコードされる大腸菌リゾホスホリパーゼＬ２などのリゾホスホリパーゼＬ２、または配列番号１３６に記載の野生型配列を有するポリヌクレオチドによってコードされるＶｕパタチン１タンパク質である。大腸菌リゾホスホリパーゼＬ２のポリペプチド配列は配列番号１３７に提供され、Ｖｕパタチン１タンパク質のポリペプチド配列は配列番号１３８に提供される。
【０３２２】
特定の実施形態において、ホスホリパーゼ変異型をコードするポリヌクレオチドは、ペリプラズムの代わりに細胞質に主に局在するホスホリパーゼをコードするように改変される。例えば、そのポリヌクレオチドは、ペリプラズム局在と関連する領域内の欠失または変異を有するホスホリパーゼをコードしてもよい。特定の実施形態において、コードされるホスホリパーゼ変異型は、リゾホスホリパーゼＬ１（ＴｅｓＡ）から誘導される。特定の実施形態において、リゾホスホリパーゼＬ１（ＴｅｓＡ）変異型は、配列番号１３９に記載の配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる大腸菌リゾホスホリパーゼ（ＴｅｓＡ）変異型などの細菌のＴｅｓＡである。リゾホスホリパーゼＬ１変異型のポリペプチド配列は、配列番号１２１（ＰｌｄＣ（＊ＴｅｓＡ））に提供される。
【０３２３】
ホスホリパーゼをコードするポリヌクレオチド配列のさらなる例としては、アシネトバクター種ＡＤＰ１由来のホスホリパーゼＡｌ（ＰｌｄＡ）（配列番号１４０）、大腸菌由来のホスホリパーゼＡ（ＰｌｄＡ）（配列番号１４１）、ストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）由来のホスホリパーゼ（配列番号１４２）、シロイヌナズナ由来のホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２−α）（配列番号１４３）、シロイヌナズナ由来のホスホリパーゼＡ１／トリアシルグリセロールリパーゼ（ＤＡＤ１、Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  Ａｎｔｈｅｒ  Ｄｅｈｉｓｃｅｎｃｅ  １）（配列番号１４４）、シロイヌナズナ由来の葉緑体ＤＯＮＧＬＥ（配列番号１４５）、シロイヌナズナ由来のパタチン様タンパク質（配列番号１４６）、およびアナベナ・バリアビリスＡＴＣＣ２９４１３由来のパタチン（配列番号１４７）が挙げられる。リゾホスホリパーゼをコードするポリヌクレオチド配列のさらなる非限定的な例としては、出芽酵母Ｓ２８８ｃ由来のホスホリパーゼＢ（Ｐｌｂ１ｐ）（配列番号１４８）、出芽酵母Ｓ２８８ｃ由来のホスホリパーゼＢ（Ｐｌｂ２ｐ）（配列番号１４９）、アシネトバクター種ＡＤＰ１由来のＡＣＩＡＤ１０５７（ＴｅｓＡホモログ）（配列番号１５０）、アシネトバクター種ＡＤＰ１由来のＡＣＩＡＤ１９４３リゾホスホリパーゼ（配列番号１５１）、およびロドコッカス属由来のリゾホスホリパーゼ（ＹＰ＿７０２３２０；ＲＨＡ１＿ｒｏ０２３５７）（配列番号１５２）が挙げられる。
【０３２４】
（ｉｉｉ）グリコーゲンの生合成、貯蔵、および分解遺伝子
グリコーゲンの生合成遺伝子および貯蔵遺伝子
上述のように、特定の実施形態は、グリコーゲン生合成および／もしくは貯蔵に関連する１以上ポリペプチドの発現ならびに／または活性の、例えば、そのようなポリペプチドをコードする１以上の遺伝子の変異による低下または除去を含む。コードタンパク質の発現および／もしくは生物活性を低下または除去する１以上のグリコーゲン生合成／貯蔵遺伝子の完全欠失もしくは部分欠失、および点変異または挿入が含まれる。グリコーゲン合成および／または貯蔵に関連する代表的な遺伝子には、ｇｌｇＣ、ｐｇｍ、およびｇｌｇＡが含まれる。
【０３２５】
このようなｇｌｇＣポリヌクレオチド配列の例は、配列番号２８（シネコシスティス種ＰＣＣ６８０３）、配列番号３４（ネンジュモ種ＰＣＣ７１２０）、配列番号３３（アナベナ・バリアビリス）、配列番号３２（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ  ｅｒｙｔｈｒａｅｕｍ  ＩＭＳ  １０１）、配列番号２７（シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２）、配列番号３０（シネココッカス種ＷＨ８１０２）、配列番号３１（シネココッカス種ＲＣＣ３０７）、および配列番号２９（シネココッカス種ＰＣＣ７００２）に提供され、それぞれ、配列番号８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、および９３に記載の配列を有するＧｌｇＣポリペプチドをコードする。
【０３２６】
このようなｐｇｍポリヌクレオチド配列の例は、配列番号２５（シネコシスティス種ＰＣＣ６８０３）、配列番号７５（シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２）、配列番号２６（シネココッカス種ＷＨ８１０２）、配列番号７８（シネココッカスＲＣＣ３０７）、および配列番号８０（シネココッカス７００２）に提供され、それぞれ、配列番号７４、７６、７７、７９および８１に記載の配列を有するＰｇｍポリペプチドをコードする。
【０３２７】
このようなｇｌｇＡポリヌクレオチド配列の例は、配列番号３６（シネコシスティス種ＰＣＣ６８０３）、配列番号４２（ネンジュモ種ＰＣＣ７１２０）、配列番号４１（アナベナ・バリアビリス）、配列番号４０（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ  ｅｒｙｔｈｒａｅｕｍ  ＩＭＳ  １０１）、配列番号３５（シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２）、配列番号３８（シネココッカス種ＷＨ８１０２）、配列番号３９（シネココッカス種ＲＣＣ３０７）、および配列番号３７（シネココッカス種ＰＣＣ７００２）に提供され、それぞれ、配列番号９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００および１０１に記載の配列を有するｇｌｇＡポリペプチドをコードする。
【０３２８】
グリコーゲン分解遺伝子
特定の実施形態において、この改変光合成微生物は、グリコーゲン分解と関連する１以上ポリペプチドをコードする１以上のポリヌクレオチド、またはその断片もしくは変異型を含む。特定の実施形態において、１以上ポリペプチドは、グリコーゲンホスホリラーゼ（ＧｌｇＰ）、グリコーゲンイソアミラーゼ（ＧｌｇＸ）、グルカノトランスフェラーゼ（ＭａｌＱ）、ホスホグルコムターゼ（Ｐｇｍ）、グルコキナーゼ（Ｇｌｋ）、および／またはホスホグルコースイソメラーゼ（Ｐｇｉ）、またはその機能的断片もしくは変異型である。
【０３２９】
代表的なｇｌｇＰポリヌクレオチド配列を配列番号６７に提供し、代表的なＧｌｇＰポリペプチド配列を配列番号６８に提供する。代表的なｇｌｇＸポリヌクレオチド配列を配列番号６９に提供し、代表的なＧｌｇＸポリペプチド配列を配列番号７０に提供する。代表的なｍａｌＱポリヌクレオチド配列を配列番号７１に提供し、代表的なＭａｌＱポリペプチド配列を配列番号７２に提供する。代表的なホスホグルコムターゼ（ｐｇｍ）ポリヌクレオチド配列を配列番号２４に提供し、代表的なホスホグルコムターゼ（Ｐｇｍ）ポリペプチド配列を配列番号７３に提供し、他のものを以下に提供する（配列番号２５、２６、７４〜８１）。代表的なｇｌｋポリヌクレオチド配列を配列番号８２に提供し、代表的なＧｌｋポリペプチド配列を配列番号８３に提供する。代表的なｐｇｉポリヌクレオチド配列を配列番号８４に提供し、代表的なＰｇｉポリペプチド配列を配列番号８５に提供する。
【０３３０】
（ｉｖ）ポリヌクレオチド変異体、断片、ベクター、および発現系
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、これらのポリヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異型のうちの１つを含むか、あるいはこれらのポリペプチド配列、またはその断片もしくは変異型のうちの１つをコードする。
【０３３１】
本出願のタンパク質および酵素をコードする代表的ヌクレオチド配列は、完全長の参照ポリヌクレオチド、およびこれらの遺伝子、それらの転写物もしくはこれらの転写物のＤＮＡコピーの完全長または実質的に完全長のヌクレオチド配列の部分を包含する。ヌクレオチド配列の部分は、参照ポリペプチドの生物活性を保持するポリペプチド部分またはセグメントをコードしてもよい。本明細書に提供される酵素の生物活性のある断片をコードするヌクレオチド配列の部分は、少なくとも約２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１５０、２００、３００、４００、５００、６００個またはそれ以上の連続するアミノ酸残基、完全長の酵素に存在するアミノ酸のほぼ総数までをコードしてもよい。この文脈および本明細書で使用する全ての他の文脈中の「中間の長さ」は、１０１、１０２、１０３など、１５１、１５２、１５３など、２０１、２０２、２０３などの引用される値の間の任意の長さを意味することが容易に理解されるであろう。
【０３３２】
本明細書に記載のポリヌクレオチドは、コード配列自体の長さに関係なく、それらの全長がかなり変化できるように、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、マルチクローニング部位、および他のコードセグメントなどの他のＤＮＡ配列と組み合わせてもよい。したがって、ほとんどの任意の長さのポリヌクレオチド断片が使用でき、全長は、好ましくは、所望の組換えＤＮＡプロトコルにおける調製および使用の容易さによって制限されることが企図される。
【０３３３】
本発明はまた、本明細書に記載の参照ポリヌクレオチド配列（例えば、配列表参照）の変異型も企図する。核酸変異型は、対立遺伝子変異型（同じ遺伝子座）、ホモログ（異なる遺伝子座）、およびオルソログ（異なる生物）などの天然に存在するものであるか、または天然に存在しないものであり得る。これらの天然に存在する変異型は、例えば、当技術分野で公知の様々なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびハイブリダイゼーションベースの技術を含む公知の分子生物学技術を用いて同定および単離することができる。天然に存在する変異型は、参照ポリペプチドの活性を有する１以上の遺伝子をコードする任意の生物から単離することができる。したがって、本発明の実施形態は、このような天然に存在するポリヌクレオチド変異型を含むシアノバクテリアを包含する。
【０３３４】
天然に存在しない変異型は変異誘発技術によって作製され、ポリヌクレオチド、細胞、または生物に適用されるものを含むことができる。これらの変異型は、ヌクレオチドの置換、欠失、逆位および挿入を含むことができる。翻訳領域もしくは非翻訳領域のいずれか、またはその両方にバリエーションが生じ得る。特定の態様において、天然に存在しない変異型は、活性、安定性、または任意の他の望ましい特徴が増加した酵素の遺伝子工学処理およびスクリーニングなどにより、シアノバクテリアにおける使用のために最適化されていてもよい。
【０３３５】
（本来コード産物と比較して）、保存的および非保存的アミノ酸置換の両方を変化させることができる。ヌクレオチド配列については、保存的変異型は、遺伝コードの縮重のため、参照ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする配列を含む。変異型ヌクレオチド配列はまた、本明細書の他の箇所に記載されるように、例えば、部位特異的変異誘発を用いることによって生成されるが、依然として生物活性のある参照ポリペプチドをコードするものなどの合成的に誘導されたポリヌクレオチド配列も含む。一般に、デフォルトパラメーターを用いて本明細書の他の箇所に記載の配列アライメントプログラムによって決定する場合に、特定のポリヌクレオチド配列の変異型は、参照ポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、一般的に少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９８％またはそれ以上の配列同一性を有する。
【０３３６】
（例えば、本明細書に記載の）既知の参照ポリヌクレオチド配列を用いて、他の生物、特に他の微生物由来の対応する配列および対立遺伝子を単離することができる。核酸配列のハイブリダイゼーションのための方法は、当技術分野で容易に利用可能である。他の生物由来のコード配列は、本明細書に記載のコード配列との配列同一性に基づいて、公知の技術に従って単離することができる。これらの技術では、既知のコード配列の全てまたは一部は、選択された生物からクローニングされたゲノムＤＮＡ断片またはｃＤＮＡ断片（すなわち、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリー）の集団に存在する他の参照コード配列に選択的にハイブリダイズするプローブとして使用される。
【０３３７】
したがって、本発明はまた、以下に記載のストリンジェンシー条件下で、参照ヌクレオチド配列、またはそれらの相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドも企図する。本明細書で使用する用語「低ストリンジェンシー、中ストリンジェンシー、高ストリンジェンシー、または非常に高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を説明している。ハイブリダイゼーション反応を実施するためのガイダンスは、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９８、前出）のセクション６．３．１−６．３．６に見出すことができる。水性および非水性の方法がその参考文献に記載されており、いずれも使用することができる。
【０３３８】
本明細書での「低ストリンジェンシー」条件への言及は、４２℃でのハイブリダイゼーションについては少なくとも約１％ｖ／ｖ〜少なくとも約１５％ｖ／ｖのホルムアミドおよび少なくとも約１Ｍ〜少なくとも約２Ｍの塩、ならびに４２℃での洗浄については少なくとも約１Ｍ〜少なくとも約２Ｍの塩を含有および包含する。低ストリンジェンシー条件はまた、６５℃でのハイブリダイゼーションについては１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ、および室温での洗浄については（ｉ）２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳまたは（ｉｉ）０．５％ＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、５％ＳＤＳも含んでよい。低ストリンジェンシー条件の一実施形態は、約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のハイブリダイゼーション、その後、少なくとも５０℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中の２回の洗浄を含む（低ストリンジェンシー条件の洗浄の温度は、５５℃まで上昇させることができる）。
【０３３９】
「中ストリンジェンシー」条件は、４２℃でのハイブリダイゼーションについては少なくとも約１６％ｖ／ｖ〜少なくとも約３０％ｖ／ｖのホルムアミドおよび少なくとも約０．５Ｍ〜少なくとも約０．９Ｍの塩、ならびに５５℃での洗浄については少なくとも約０．１Ｍ〜少なくとも約０．２Ｍの塩を含有および包含する。中程度のストリンジェンシー条件はまた、６５℃でのハイブリダイゼーションについては１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ、ならびに６０〜６５℃での洗浄については（ｉ）２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳまたは（ｉｉ）０．５％ＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、５％ＳＤＳも含んでよい。中程度のストリンジェンシー条件の一実施形態は、約４５℃での６×ＳＳＣ中のハイブリダイゼーション、その後、６０℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中の１回以上の洗浄を含む。
【０３４０】
「高ストリンジェンシー」条件は、４２℃でのハイブリダイゼーションについては少なくとも約３１％ｖ／ｖ〜少なくとも約５０％ｖ／ｖのホルムアミドおよび少なくとも約０．０１Ｍ〜約０．１５Ｍの塩、ならびに５５℃での洗浄については約０．０１Ｍ〜約０．０２Ｍの塩を含有および包含する。高ストリンジェンシー条件はまた、６５℃でのハイブリダイゼーションについては１％ＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ、ならびに６５℃を上回る温度での洗浄については（ｉ）０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳまたは（ｉｉ）０．５％ＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、１％ＳＤＳも含む。高ストリンジェンシー条件の一実施形態は、約４５℃での６×ＳＳＣ中のハイブリダイゼーション、その後、６５℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中の１回以上の洗浄を含む。
【０３４１】
特定の実施形態において、本明細書に記載の参照ポリペプチドまたは酵素は、非常に高いストリンジェンシー条件下で開示されたヌクレオチド配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる。非常に高いストリンジェンシー条件の一実施形態は、６５℃での０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳ中のハイブリダイゼーション、その後、６５℃での０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ中の１回以上の洗浄を含む。
【０３４２】
他のストリンジェンシー条件は、当技術分野で公知であり、当業者は、ハイブリダイゼーションの特異性を最適化するために、様々な要素を操作できることを認識するであろう。最終洗浄のストリンジェンシーの最適化は、高度のハイブリダイゼーションを保証するために役立ち得る。詳細な例については、前出のＡｕｓｕｂｅｌらのページ２．１０．１〜２．１０．１６およびＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９、前出）のセクション１．１０１〜１．１０４を参照されたい。
【０３４３】
ストリンジェントな洗浄は、典型的には、約４２℃〜６８℃の温度で実施されるが、当業者は、他の温度がストリンジェントな条件に適切であり得ることを理解するであろう。ハイブリダイゼーションの最大速度は、典型的には、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成のためのＴｍ以下の約２０℃〜２５℃で生じる。Ｔｍが融点、すなわち、２つの相補的ポリヌクレオチド配列が解離する温度であることは当技術分野で公知である。Ｔｍを推定するための方法は当技術分野で公知である（前出のＡｕｓｕｂｅｌらのページ２．１０．８参照）。
【０３４４】
一般的には、完全に一致した２本鎖ＤＮＡのＴｍは、以下の式によって近似値として予測することができる。
【０３４５】
【数１】
2015509533.tif 000004
式中、Ｍは、好ましくは０．０１モル〜０．４モルの範囲のＮａ＋の濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、３０％〜７５％Ｇ＋Ｃの範囲である、塩基の総数の割合としてのグアノシンおよびシトシン塩基の合計であり、％ホルムアミドは、容積によるパーセントホルムアミド濃度であり、長さは、ＤＮＡ２本鎖における塩基対の数である。２本鎖ＤＮＡのＴｍは、ランダムにミスマッチした塩基対の数が１％増加するごとに約１℃低下する。洗浄は、一般的に、高ストリンジェンシーではＴｍ−１５℃、中ストリンジェンシーではＴｍ−３０℃で実施される。
【０３４６】
ハイブリダイゼーション手順の一例において、固定化されたＤＮＡを含む膜（例えば、ニトロセルロース膜またはナイロン膜）を、４２℃で一晩、標識プローブを含むハイブリダイゼーション緩衝液（５０％脱イオン化ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×ラインハルト溶液（０．１％の糞便（ｆｅｃａｌ）、０．１％のポリビニルピロリドンおよび０．１％ウシ血清アルブミン）、０．１％ＳＤＳおよび２００ｍｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡ）中でハイブリダイズさせる。次いで、この膜を、２回の連続する中ストリンジェンシー洗浄（すなわち、１５分間４５℃での２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、その後、１５分間５０℃での２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）に供し、その後、２回の連続する高ストリンジェンシー洗浄（すなわち、１２分間５５℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、その後、１２分間６５〜６８℃での０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ溶液）に供する。
【０３４７】
ポリヌクレオチドおよびその融合体は、当技術分野で公知の利用可能な十分に確立された様々な技術のいずれかを用いて調製し、操作し、かつ／または発現させることができる。例えば、本発明のポリペプチド、またはその融合タンパク質もしくは機能的等価物をコードするポリヌクレオチド配列は、適切な宿主細胞中のトリグリセリドまたは脂質生合成酵素の発現を指示するための組換えＤＮＡ分子において使用できる。遺伝暗号の固有の縮重のために、実質的に同一または機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列が生成されてもよく、これらの配列を用いて、所定のポリペプチドをクローニングし、発現させることができる。
【０３４８】
当業者によって理解されるように、場合によって、天然に存在しないコドンを有するポリペプチドコードヌクレオチド配列を生成することが有利であり得る。例えば、特定の原核生物または真核生物宿主によって好まれるコドンは、タンパク質発現の速度を増加させるか、または天然に存在する配列から生成された転写物の半減期よりも長い半減期などの望ましい特性を有する組換えＲＮＡ転写物を生成するように選択することができる。このようなヌクレオチドは、典型的には、「コドン最適化された」ヌクレオチドと呼ばれる。
【０３４９】
さらに、本明細書に記載のポリヌクレオチド配列は、様々な理由でポリペプチドコード配列を変更するために、遺伝子産物のクローニング、プロセシング、発現および／または活性を修飾する変更を含むがこれらに限定されない当技術分野で公知の方法を用いて操作することができる。
【０３５０】
所望のポリペプチドを発現させるために、ポリペプチド、またはその機能的等価物をコードするヌクレオチド配列は、適切な発現ベクター、すなわち、挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要な要素を含むベクターに挿入することができる。当業者に公知の方法を用いて、目的のポリペプチドならびに適切な転写制御エレメントおよび翻訳制御エレメントをコードする配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えが含まれる。このような技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９）、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８９）に記載されている。
【０３５１】
様々な発現ベクター／宿主系が公知であり、ポリヌクレオチド配列を含有および発現させるために利用することができる。特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、シアノバクテリア系に導入して、発現させることができる。このように、本発明は、様々なシアノバクテリアにおいて使用するのに適する調節配列（例えば、プロモーターおよびエンハンサー）を有するベクターならびにプラスミドシステムの使用を企図する（例えば、Ｋｏｋｓｈａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ５８：１２３−３７，２００２参照）。例えば、無差別（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）ＲＳＦ１０１０プラスミドは、シネコシスティス属およびシネココッカス属のいくつかのシアノバクテリアにおける自己複製を提供する（例えば、Ｍｅｒｍｅｔ−Ｂｏｕｖｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２６：３２３−３２７，１９９３参照）。別の例として、ｐＦＣ１発現ベクターは、無差別プラスミドＲＳＦ１０１０に基づいている。ｐＦＣ１は、ラムダｃＩ８５７リプレッサーコード遺伝子およびｐＲプロモーターを保有し、その後に、ラムダｃｒｏリボソーム結合部位およびＡＴＧ翻訳開始コドンが続く（例えば、Ｍｅｒｍｅｔ−Ｂｏｕｖｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２８：１４５−１４８，１９９４参照）。後者は、ｐＦＣ１の特有のＮｄｅＩ制限部位（ＣＡＴＡＴＧ）内に位置しており、発現させるタンパク質コード配列とインフレームで融合させるために、この酵素で切断した後に露出させることができる。
【０３５２】
発現ベクターに存在する（または別々に用いられる）「制御エレメント」または「調節配列」は、転写および翻訳を行うために宿主細胞タンパク質と相互作用するベクターの非翻訳領域−エンハンサー、プロモーター、５’および３’非翻訳領域である。このようなエレメントは、その強度および特異性が変化してもよい。利用されるベクター系および宿主に応じて、構成的および誘導性プロモーターを含む任意の数の適切な転写および翻訳エレメントを用いてもよい。一般的に、強力な大腸菌プロモーターは、シアノバクテリアにおいて十分機能することはよく知られている。シアノバクテリア系にクローニングする場合にも、ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、カリフォルニア州ラホーヤ）、またはｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社、メリーランド州ゲイザースバーグ）などのハイブリッドｌａｃＺプロモーターなどの誘導性プロモーターも使用することができる。ｐＡＭ１５７９およびｐＡＭ２９９１ｔｒｃなどのＩＰＴＧ誘導性プロモーターを含む他のベクターを、本発明に従って利用してもよい。
【０３５３】
特定の実施形態は、温度誘導系または温度誘導性調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リプレッサー）を使用してもよい。一例として、バクテリオファージ左側（ｌｅｆｔ−ｗａｒｄ）プロモーター（ＰＬ）を有するオペロンおよび温度感受性リプレッサー遺伝子ＣＩ８５７を用いて、シアノバクテリアにおいて脂肪酸および／またはトリグリセリドを生成するための温度誘導系を生成することができる（例えば、参照により本明細書に援用される米国特許第６，３０６，６３９号参照）。非許容温度（低温、３０℃）で、リプレッサーがオペレーター配列に結合することにより、ＲＮＡポリメラーゼがＰＬプロモーターで転写を開始するのを妨げると考えられている。したがって、コード遺伝子の発現が抑制される。細胞培養物を許容温度（３７〜４２℃）に移すと、リプレッサーはオペレーターに結合することができない。これらの条件下で、ＲＮＡポリメラーゼは、コード遺伝子の転写を開始することができる。
【０３５４】
シアノバクテリア系では、いくつかの発現ベクターまたは調節配列を、発現ポリペプチドについて意図される用途に応じて選択することができる。大量を必要とする場合には、コードタンパク質の高レベル発現を指示するベクターまたは調節配列を使用することができる。例えば、ＡＣＣａｓｅ酵素の過剰発現は、脂肪酸生合成を増加させるために利用することができる。このようなベクターには、ハイブリッドタンパク質が産生されるように、目的のポリペプチドをコードする配列を、アミノ末端のＭｅｔおよびそれに続くβ−ガラクトシダーゼの７残基の配列を有するベクターにインフレームでライゲーションすることができるＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）などの大腸菌用の多機能性クローニングおよび発現ベクター、ならびにｐＩＮベクター（Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５５０３−５５０９（１９８９））などが含まれるが、これらに限定されない。ｐＧＥＸベクター（プロメガ社、ウィスコンシン州マディソン）を用いて、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させることもできる。
【０３５５】
特定の実施形態は、シアノバクテリアプロモーターまたは調節オペロンを使用してもよい。特定の実施形態において、プロモーターは、例えば、Ｒｏｎｅｎ−Ｔａｒａｚｉら（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １８：１４６１−１４６９，１９９５）に記載のシネココッカス属のｒｂｃＬＳオペロン、または例えば、Ｉｍａｓｈｉｍｉｚｕら（Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８５：６４７７−８０，２００３）に記載のシネコシスティス種ＰＣＣ６７１４株のｃｐｃオペロンを含んでもよい。特定の実施形態において、Ｃｈｕｎｇｊａｔｕｐｏｒｎｃｈａｉら（Ｃｕｒｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３８：２１０−２１６，１９９９）に記載のシネココッカス属由来のｔＲＮＡｐｒｏ遺伝子もプロモーターとして利用することができる。特定の実施形態は、アンモニウムによって抑制され、亜硝酸塩で誘導される、シネココッカス種ＰＣＣ７９４２株由来のｎｉｒＡプロモーターを使用してもよい（例えば、Ｍａｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：４０８０−４０８８，１９９８；およびＱｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７１：５６７８−５６８４，２００５参照）。発現の効率は、文献に記載されたものなどの、使用される特定のシアノバクテリアの細胞系に適切なエンハンサーの包含によって高めることができる。
【０３５６】
特定の実施形態において、外因性または内因性の参照ポリペプチド、またはその断片もしくは変異型を過剰発現させるために利用される発現ベクターまたは導入プロモーターは、例えば、これらのポリペプチドのいずれかの長期過剰発現の毒性効果を回避するために、非誘導条件下の弱いプロモーターを含む。シアノバクテリアにおける使用のためのこのようなベクターの一例は、ｐＢＡＤベクター系である。任意の所与のプロモーターからの発現レベルは、例えば、誘導前後にプロモーターによって生成される転写産物またはｍＲＮＡの量を決定するために、例えば、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を行うことにより決定することができる。特定の場合において、弱いプロモーターは、誘導物質の非存在下での目的の遺伝子または転写産物の基礎レベルの発現が、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２においてｒｎｐＢ遺伝子のプロモーターにより生成される発現レベルの２．０％以下であるプロモーターとして定義される。他の実施形態において、弱いプロモーターは、誘導因子の非存在下での目的の遺伝子または転写産物の基礎レベルの発現が、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２においてｒｎｐＢ遺伝子のプロモーターにより生成される発現レベルの５．０％以下であるプロモーターとして定義される。
【０３５７】
さらに、ベクター中で使用するために、本明細書に記載の調節エレメントのいずれか（例えば、プロモーター、エンハンサー、リプレッサー、リボソーム結合部位、転写終結部位）は、その遺伝子の発現を調節する（例えば、過剰発現を促進する）ために、光合成微生物（例えば、シアノバクテリア）のゲノムに、典型的には、本明細書に記載の内因性または天然に存在する参照遺伝子／ポリヌクレオチド配列（例えば、上流もしくは下流）を囲む領域に直接導入してもよい。
【０３５８】
特定の開始シグナルも用いて、目的のポリペプチドをコードする配列のより効率的な翻訳を達成することもできる。このようなシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。ポリペプチドをコードする配列、その開始コドン、および上流配列が適切な発現ベクターに挿入される場合には、追加の転写または翻訳制御シグナルは必要ではない。しかし、コード配列またはその一部のみが挿入された場合には、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルが提供されるべきである。さらに、開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするために正しいリーディングフレームであるべきである。外因性翻訳エレメントおよび開始コドンは、天然および合成の両方の様々な起源のものであってよい。
【０３５９】
生成物に特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを使用して、ポリヌクレオチドにコードされる生成物の発現を検出および測定するための様々なプロトコルが当技術分野で公知である。例としては、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）が挙げられる。これらおよび他のアッセイは、Ｈａｍｐｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９０）およびＭａｄｄｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：１２１１−１２１６（１９８３）に記載されている。所望のポリヌクレオチドの存在または発現レベルは、ＰＣＲによって確認することもできる。
【０３６０】
多種多様な標識および結合技術が当業者に知られており、様々な核酸およびアミノ酸アッセイにおいて使用することができる。ポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブを生成するための手段には、標識ヌクレオチドを用いたオリゴ標識、ニックトランスレーション、末端標識またはＰＣＲ増幅が含まれる。あるいは、ｍＲＮＡプローブの生成のために、これらの配列またはその任意の部分をベクターにクローニングすることができる。このようなベクターは、当技術分野で公知であり、市販されており、これを用いて、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６などの適切なＲＮＡポリメラーゼおよび標識ヌクレオチドの添加によりインビトロでＲＮＡプローブを合成することができる。これらの手順は、様々な市販のキットを用いて行うことができる。使用できる適切なレポーター分子または標識には、放射性核種、酵素、蛍光、化学発光、または発色剤、ならびに基質、補因子、阻害剤、および磁性粒子などが含まれる。
【０３６１】
目的のポリヌクレオチド配列で形質転換されたシアノバクテリア宿主細胞は、細胞培養物からのタンパク質の発現および回収に適した条件下で培養することができる。組換え細胞により産生されたタンパク質は、使用される配列および／またはベクターに依存して分泌されるか、または細胞内に含まれ得る。当業者によって理解されるように、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、細胞内の所望の部位へのコードポリペプチドの局在化を指示するシグナル配列を含むように設計することができる。他の組換え構築物を用いて、コードタンパク質の分泌を指示するポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に、目的のポリペプチドをコードする配列を結合することができる。
【０３６２】
Ｄ．改変光合成微生物
特定の実施形態は、シアノバクテリアを含む改変光合成微生物、およびその使用法に関し、この改変光合成微生物は、１以上の過剰発現させた、外因性または導入された細胞内局在化ドメイン−ＤＧＡＴ融合タンパク質、およびそれをコードする対応するポリヌクレオチドを含み、このＤＧＡＴ融合タンパク質は、異種細胞内局在化ドメインおよびＤＧＡＴポリペプチド、またはその変異型もしくは断片を含む。特定の実施形態において、このＤＧＡＴ融合タンパク質は、膜標的ドメイン−ＤＧＡＴ融合タンパク質または原形質膜（ＰＭ）標的ドメイン−ＤＧＡＴ融合タンパク質である。一部の実施形態において、このＤＧＡＴポリペプチド変異型または断片は、野生型ＤＧＡＴポリペプチドの１以上の活性の少なくとも５０％を保持する。
【０３６３】
特定の態様において、本明細書に記載のＤＧＡＴ−融合タンパク質を発現する光合成微生物は、さらに、１以上の導入されたまたは過剰発現させた脂質生合成タンパク質を含み得る。脂質生合成タンパク質の例としては、限定されないが、アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）、アシル−ＡＣＰ合成酵素（Ａａｓ）、アシル−ＡＣＰ還元酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アルデヒドデカルボニラーゼ、チオエステラーゼ（ＴＥＳ）、アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）、ホスファチジン酸ホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（ＰＡＰ；またはホスファチジン酸ホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ））、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）ヒドロラーゼ、脂肪酸アシルＣｏＡ合成酵素、およびリパーゼ／ホスホリパーゼ、ならびにそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０３６４】
特定の好ましい組み合わせは、外因性または過剰発現させたＡＣＰと組み合わせた、本明細書に記載の外因性または過剰発現させたＤＧＡＴ融合タンパク質、Ａａｓと組み合わせたＤＧＡＴ融合タンパク質、ＡＣＰおよびＡａｓと組み合わせたＤＧＡＴ融合タンパク質、＊ＴｅｓＡもしくはＦａｔＢなどのＡＣＰおよびＴＥＳと組み合わせたＤＧＡＴ融合タンパク質、＊ＴｅｓＡもしくはＦａｔＢなどのＡａｓおよびＴＥＳと組み合わせたＤＧＡＴ融合タンパク質、ならびに／またはＡＣＰ、ＡａｓおよびＴＥＳと組み合わせたＤＧＡＴ融合タンパク質を有する改変光合成微生物を含む。
【０３６５】
また、ＴＡＧ産生株に１以上のＴＡＧヒドロラーゼを組み込む組み合わせも含まれる。例えば、特定の実施形態には、外因性または過剰発現させたＴＡＧヒドロラーゼ、および必要に応じてＴＥＳと組み合わせて、本明細書に記載のＤＧＡＴ融合タンパク質、外因性もしくは過剰発現させたＡＣＰ、Ａａｓ、またはその両方を有する改変光合成微生物が含まれる。しかし、特定の実施形態は、ＡＣＰまたはＡａｓの有無にかかわらず、ＤＧＡＴ融合タンパク質および過剰発現させたまたは外因性のＴＡＧヒドロラーゼ、ならびに必要に応じて、ＴｅｓＡ（または＊ＴｅｓＡ）などのＴＥＳもしくはＦＡＴＢ配列の任意の１以上を使用することができる。したがって、これらのおよび関連する実施形態は、ＡＣＰ、Ａａｓに、またはその両方を必要とするものとは別に使用することができる。例えば、特定の実施形態は、ＤＧＡＴ融合タンパク質およびＴＡＧヒドロラーゼ、ならびに必要に応じてＴＥＳを含むことができる。これらの実施形態のいずれか１つは、さらに、ＡＣＣａｓｅ、ＰＡＰ、脂肪酸アシルＣｏＡ合成酵素、および／またはＰＬＣなどのＰＬなどの１以上の追加の脂質生合成タンパク質と組み合わせることができる。
【０３６６】
特定の組み合わせは、ＤＧＡＴ融合タンパク質を発現する光合成微生物に１以上の脂肪酸アシルＣｏＡ合成酵素（例えば、ＦａｄＤ）を組み込む。例えば、特定の実施形態は、ＤＧＡＴ融合タンパク質および脂肪酸アシルＣｏＡ合成酵素、ならびに必要に応じてＴＥＳおよび／またはＴＡＧヒドロラーゼと組み合わせて、外因性または過剰発現させたＡＣＰ、Ａａｓまたはその両方を有する改変光合成微生物が含まれる。しかし、特定の実施形態は、ＡＣＰもしくはＡａｓの有無にかかわらず、ＤＧＡＴ融合タンパク質および過剰発現させたもしくは外因性の脂肪酸アシルＣｏＡ合成酵素、必要に応じてＴｅｓＡ（もしく＊ＴｅｓＡ）などのＴＥＳまたはＦａｔＢ配列の任意の１以上を使用してもよい。したがって、これらのおよび関連する実施形態は、ＡＣＰ、Ａａｓに、またはその両方を必要とするものとは別に使用することができる。例えば、特定の実施形態は、ＤＧＡＴの融合タンパク質および脂肪酸アシルＣｏＡ合成酵素、ならびに必要に応じてＴＥＳ（例えば、ＴｅｓＡ、ＦａｔＢ）を含んでもよい。これらの実施形態のいずれか１つは、さらに、ＡＣＣａｓｅ、ＰＡＰ、ＴＡＧヒドロラーゼ、および／またはＰＬＣなどのＰＬなどの１以上の追加の脂質生合成タンパク質と組み合わせることができる。
【０３６７】
これらの実施形態のいずれか１つは、グリコーゲン分解経路に関与するタンパク質をコードする１以上の導入されたもしくは過剰発現させたポリヌクレオチド、ならびに／またはグリコーゲン生合成もしくは貯蔵経路（例えば、グルコース−１−リン酸アデニルトランスフェラーゼ（ｇｌｇＣ）遺伝子および／もしくはホスホグルコムターゼ（ｐｇｍ）遺伝子の完全欠失または部分欠失）の発現が低下した株と組み合わせることもできる。例えば、特定の改変光合成微生物は、ｇｌｇＣ遺伝子および／またはｐｇｍ遺伝子の完全欠失または部分欠失と組み合わせた、本明細書に記載のＤＧＡＴ融合タンパク質、外因性または過剰発現させたＡＣＰ、Ａａｓ、ＤＧＡＴおよびＰＡＰを含むことができる。
【０３６８】
本発明の光合成微生物はまた、脂肪酸合成に関連する１以上の酵素をコードする１以上の外因性ポリヌクレオチド配列を導入することによって、脂肪酸の生成を増加させるために改変することもできる。特定の態様において、外因性のポリヌクレオチド配列は、アシルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）活性を含み、典型的には、ＡＣＣａｓｅ発現を増加させ、それによって、細胞内のＡＣＣａｓｅ活性を増加させることが可能である酵素をコードする。この酵素は、脂肪酸合成の「コミットメントステップ」を触媒するので、細胞内のＡＣＣａｓｅ活性の増加は、脂肪酸生成の増加に寄与する。同様に、一部の態様において、この改変光合成微生物は、例えば、トリグリセリドの出発物質である脂肪酸の生成を増加させ、それによってトリグリセリドの生成を増加させるために、アシル−ＡＣＰ還元酵素と組み合わせて本明細書に記載のＤＧＡＴ融合タンパク質を含んでもよい。
【０３６９】
他の組み合わせには、例えば、本明細書に記載のＤＧＡＴ融合タンパク質、ならびに、外因性または過剰発現させたＡＣＣａｓｅと組み合わせた外因性または過剰発現させたＡＣＰ；ＡＣＣａｓｅと組み合わせたＡａｓ；ＡＣＣａｓｅと組み合わせたＡＣＰおよびＡａｓ；ＰＡＰと組み合わせたＡＣＰ；ＰＡＰと組み合わせたＡａｓ；ＰＡＰと組み合わせたＡＣＰおよびＡａｓ；ＰＬＡ、ＰＬＢ、またはＰＬＣなどのＰＬと組み合わせたＡＣＰ；ＰＬと組み合わせたＡａｓ；ＰＬと組み合わせたＡＣＰおよびＡａｓのうちの１つを含む改変光合成微生物が含まれる。これらの実施形態のいずれか１つは、互い（例えば、ＡＣＰ、Ａａｓ、ＡＣＣａｓｅ、およびＰＡＰ）に結合することができ、かつ／または、外因性または過剰発現させたＴＥＳと組み合わせることができる。これらの実施形態のいずれか１つは、グリコーゲン分解経路に関与するタンパク質をコードする１以上の導入されたポリヌクレオチド、ならびに／またはグリコーゲンの生合成経路もしくは貯蔵経路の発現が低下した株（例えば、グルコース−１−リン酸アデニルトランスフェラーゼ（ｇｌｇＣ）遺伝子および／もしくはホスホグルコムターゼ（ｐｇｍ）遺伝子の完全欠失または部分欠失）とさらに組み合わせることもできる。
【０３７０】
上記実施形態のいずれか１つは、アルデヒドデカルボニラーゼの発現が低下した株と組み合わせることもできる。特定の実施形態において、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２を含むシアノバクテリアなどのｏｒｆ１５９３は、ｏｒｆ１５９４（アシル−ＡＣＰ還元酵素コード領域）のすぐ上流に存在し、アルデヒドデカルボニをコードする。１つの非限定的な理論によれば、ｏｒｆ１５９３によってコードされているアルデヒドデカルボニラーゼは、アルカン生成の基質としてアシルアルデヒドを利用しているため、このタンパク質の発現低下は、さらに、アルカン生成経路から離れて、脂肪酸の生成経路および貯蔵経路に向かわせるように（アシル−ＡＣＰ還元酵素によって生成される）アシルアルデヒドをシャントすることにより遊離脂肪酸の収率を増加させることができる。ＰＣＣ７９４２＿ｏｒｆ１５９３オルソログは、例えば、（ｏｒｆｓｌｌ０２０８によってコードされている）シネコシスティス種ＰＣＣ６８０３、Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  ＰＣＣ  ７３１０２、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ−１、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ種Ｊａ−３−３ＡＢ、Ｐ．ｍａｒｉｎｕＳ  ＭＩＴ９３１３、Ｐ．ｍａｒｉｎｕｓ  ＮＡＴＬ２Ａ、およびＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ種ＲＳ９１１７に見られ得、後者は少なくとも２つのパラログ（ＲＳ９１１７−１およびＲＳ９１１７−２）有する。ｏｒｆ１５９３の完全欠失もしくは部分欠失を有するシネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２、およびｏｒｆｓｌｌ０２０８の完全欠失もしくは部分欠失を有するシネコシスティス種ＰＣＣ６８０３などの、これらおよび他のアルデヒドデカルボニラーゼをコードする１以上の遺伝子の変異または完全欠失もしく部分欠失を有する株が含まれる。例えば、特定の改変光合成微生物は、ｇｌｇＣ遺伝子および／またはｐｇｍ遺伝子の完全欠失もしくは部分欠失と組み合わせて、必要に応じて、過剰発現させたＡＣＰ、ＡＣＣａｓｅ、ＤＧＡＴ／アシルＣｏＡ合成酵素、または以下のものの全てと組み合わせて、ならびに必要に応じて、アルデヒドデカルボニラーゼ（例えば、ＰＣＣ７９４２＿ｏｒｆ１５９３、ＰＣＣ６８０３＿ｏｒｆｓｌｌ０２０８）をコードする遺伝子の完全欠失もしくは部分欠失と組み合わせて、過剰発現させたアシル−ＡＣＰ還元酵素を含むことができる。
【０３７１】
これらの実施形態のいずれか１つはまた、アシル−ＡＣＰ合成酵素（Ａａｓ）の発現が低下した株と組み合わせることもできる。いずれか１つの理論に縛られることなく、内因性アルデヒド脱水素酵素は、ｏｒｆ１５９４によって生成されたアシルアルデヒドに作用して、それらを遊離脂肪酸に変換する。このような脱水素酵素の正常な役割は、損傷した脂質の除去またはそうでなければ他の方法での処理を含む可能性がある。このシナリオでは、その後、Ａａｓの遺伝子産物は、ＡＣＰにそれらを連結することにより、これらの遊離脂肪酸をリサイクルする可能性がある。したがって、Ａａｓ遺伝子産物の発現を低下または排除すると、最終的にＡＣＰへの移動を低下または防止することによって、脂肪酸の産生を増加させる可能性がある。シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２のＡａｓ遺伝子などの１以上のＡａｓ遺伝子の変異および完全欠失または部分欠失が含まれる。一例として、特定の改変光合成微生物は、ｇｌｇＣ遺伝子および／またはｐｇｍ遺伝子の完全欠失または部分欠失と組み合わせて、必要に応じてＡＣＰ、ＡＣＣａｓｅ、ＤＧＡＴ／アシルＣｏＡ合成酵素、または以下のものの全てと組み合わせ、必要に応じてアルデヒドデカルボニラーゼをコードする遺伝子の完全欠失または部分欠失（例えば、ＰＣＣ７９４２＿ｏｒｆ１５９３、ＰＣＣ６８０３＿ｏｒｆｓｌｌ０２０８）と組み合わせて、ならびに必要に応じてアシル−ＡＣＰ合成酵素をコードするＡａｓ遺伝子の完全欠失または部分欠失と組み合わせて、過剰発現させたアシル−ＡＣＰ還元酵素を含むことができる。
【０３７２】
これらの実施形態のいずれか１以上はまた、アルデヒド脱水素酵素の発現が増加した株と組み合わせることもできる。１つの代表的なアルデヒド脱水素酵素は、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２のｏｒｆ０４８９によってコードされている。また、そのホモログまたはパラログ、その機能的等価物、およびその断片もしくは変異型も含まれる。機能的等価物は、脂肪酸にアシルアルデヒド（例えば、ノニルアルデヒド）に変換する能力を有するアルデヒド脱水素酵素を含むことができる。特定の実施形態において、アルデヒド脱水素酵素は、（配列番号１０２のポリヌクレオチド配列によってコードされている）配列番号１０３のアミノ酸配列、またはこの配列の活性断片もしく変異型を有する。
【０３７３】
いくつかの改変光合成微生物は、トリグリセリド生成を増加させるために、さらに必要に応じて、例えば、他の脂質に対してワックスエステルを生成するために、導入されたまたは過剰発現させたアルコール脱水素酵素と組み合わせて、本明細書に記載のＤＧＡＴ融合タンパク質および導入されたまたは過剰発現させたアシル−ＡＣＰ還元酵素を含んでもよい。これらのおよび関連する特定の実施形態は、少なくとも１つの内因性アルデヒドデカルボニラーゼ、内因性アルデヒド脱水素酵素、またはその両方の発現および／または活性の減少と組み合わせることができる。
【０３７４】
例えば、特定の改変光合成微生物は、過剰発現させたまたは導入されたアシル−ＡＣＰ還元酵素および過剰発現させたまたは導入されたアルコール脱水素酵素と組み合わせて、さらに、内因性アルデヒドデカルボニラーゼの発現および／または活性を低下させる少なくとも１つの変異（例えば、点変異、挿入、完全欠失もしくは部分欠失）と組み合わせて本明細書に記載のＤＧＡＴ融合タンパク質を含み得る。特定の改変光合成微生物は、過剰発現させたまたは導入されたアシル−ＡＣＰ還元酵素および過剰発現させたまたは導入されたアルコール脱水素酵素と組み合わせて、さらに、内因性アルデヒド脱水素酵素の発現および／または活性を低下させる少なくとも１つの変異（例えば、点変異、挿入、完全欠失もしくは部分欠失）と組み合わせてＤＧＡＴ融合タンパク質を含んでもよい。一部の実施形態は、過剰発現させたまたは導入されたアシル−ＡＣＰ還元酵素および過剰発現させたまたは導入されたアルコール脱水素酵素と組み合わせて、さらに内因性アルデヒド脱水素酵素の発現および／または活性を低下させる少なくとも１つの変異ならびに内因性アルデヒドデカルボニラーゼの発現および／または活性を低下させる少なくとも１つの変異と組み合わせて、ＤＧＡＴ融合タンパク質を含む改変光合成微生物を含んでもよい。特定の実施形態において、例えば、改変光合成微生物が、シネココッカス・エロンガタスである場合には、アルデヒド脱水素酵素はｏｒｆ０４８９によってコードされ、アルデヒドデカルボニラーゼはシネココッカス・エロンガタスのｏｒｆ１５９３によってコードされている。
【０３７５】
例えば、他の組み合わせには、過剰発現させたＡＣＰ、過剰発現させたＡＣＰと組み合わせた過剰発現させたアシル−ＡＣＰ還元酵素、ＡＣＣａｓｅと組み合わせたアシル−ＡＣＰ還元酵素、ＡＣＰおよびＡＣＣａｓｅと組み合わせたアシル−ＡＣＰ還元酵素、過剰発現させたアシルＣｏＡ合成酵素と組み合わせた過剰発現させたアシル−ＡＣＰ還元酵素（例えば、膜標的ドメイン−ＤＧＡＴ融合／アシルＣｏＡ合成酵素の組み合わせ）、過剰発現させたＡＣＣａｓｅと組み合わせ、必要に応じて過剰発現させたアシルＣｏＡ合成酵素と組み合わせた過剰発現させたアシル−ＡＣＰ還元酵素、過剰発現させたＡＣＰおよびＡＣＣａｓｅと組み合わせ、必要に応じて過剰発現させたアシルＣｏＡ合成酵素と組み合わせた過剰発現させたアシル−ＡＣＰ還元酵素のうちの１以上と組み合わせて、本明細書に記載のＤＧＡＴ融合タンパク質を含み、グリコーゲン蓄積が低下した改変光合成微生物が含まれる。アシル−ＡＣＰ還元酵素およびＤＧＡＴ過剰発現株は、必要に応じて、過剰発現させたアシルＣｏＡ合成酵素と組み合わせて、典型的には、ＤＧＡＴのみを過剰発現する株と比較してトリグリセリド生成が増加している。これらの実施形態のいずれか１つは、グリコーゲン分解経路に関与するタンパク質をコードする１以上の導入されたポリヌクレオチド、および／またはグリコーゲンの生合成経路もしくは貯蔵経路の発現が低下した株（例えば、グルコース−１−リン酸アデニルトランスフェラーゼ（ｇｌｇＣ）遺伝子および／もしくはホスホグルコムターゼ（ｐｇｍ）遺伝子の完全欠失または部分欠失を有する株）と組み合わせることができる。本発明は、改変光合成微生物が、（例えば、ストレス条件下で）野生型光合成微生物と比較してグリコーゲン蓄積量が減少している間は、グリコーゲンの分解、除去、および／または排除と関連したタンパク質または酵素をコードする任意の種類のポリヌクレオチドの使用を企図する。
【０３７６】
様々な方法、例えば、微生物にポリヌクレオチドを導入して、そのポリペプチドを過剰発現させるために内在性遺伝子を改変することによって（例えば、プロモーターなどの外因性調節エレメントを導入することによって）、発現増加または過剰発現を行うことができる。例えば、他の内因性ポリヌクレオチド配列の１以上のコピーは、発現を増加させるために、すなわち、他の内因性ポリヌクレオチド配列の追加コピーを作製するために組換え技術によって導入することができる。目的の遺伝子のコード配列および／もしくは調節配列の変異、ならびに／またはＲＡＮ阻害を含む、本明細書の他の箇所で記載され、当技術分野で公知の様々な方法で、発現および／または活性を低下させることもできる。
【０３７７】
本発明の改変光合成微生物は、任意の種類の光合成微生物を用いて作製することができる。これらには、光合成細菌、緑藻類、およびシアノバクテリアが含まれるが、これらに限定されない。光合成微生物は、例えば、シアノバクテリアなどの天然に存在する光合成微生物、または人工的な光合成細菌などの遺伝子操作された光合成微生物であり得る。天然に存在する光合成微生物、または光合成微生物になるように遺伝子操作することができる代表的な微生物には、細菌、真菌、古細菌、原生生物、緑藻類などの真核生物、プランクトン、プラナリアおよびアメーバなどの動物が含まれるが、これらに限定されない。天然に存在する光合成微生物の例としては、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｍａｘｉｍｕｍ、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａ、Ｂｏｔｒｙｃｏｃｃｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ、Ｓｅｒｅｎａｓｔｒｕｍ  ｃａｐｒｉｃｏｍｕｔｕｍ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ａｕａｄｒｉｃａｕｄａ、Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｃｒｕｅｎｔｕｍ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ａｃｕｔｕｓ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ種、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｏｂｌｉｑｕｕｓ、Ａｎａｂａｅｎｏｐｓｉｓ、Ａｕｌｏｓｉｒａ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｕｍ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ種、および／またはＴｏｌｙｐｏｔｈｒｉｘが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３７８】
本発明の改変されたシアノバクテリアは、遺伝的に操作可能である、すなわち、外因性遺伝物質の導入および発現に許容される任意の属または種のシアノバクテリア由来であり得る。本発明の方法に従って遺伝子操作することができるシアノバクテリアの例としては、シネコシスティス属、シネココッカス属、サーモシネココッカス属、ネンジュモ属、プロクロロコッカス属、ミクロキスティス属、アナベナ属、スピルリナ属、およびグロエオバクター属（Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３７９】
青緑藻、青緑色細菌、または藍色植物門としても知られているシアノバクテリアは、光合成を介してエネルギーを得る細菌の門である。シアノバクテリアは、炭水化物、タンパク質、脂質および核酸などの代謝物をＣＯ２、水、無機塩および光から生成することができる。全てのシアノバクテリアは、本発明に従って使用することができる。
【０３８０】
シアノバクテリアには、単細胞およびコロニー形成種の両方が含まれる。コロニーは、線維、シートあるいは中空の球を形成することができる。いくつかの糸状コロニーは、良好な成長条件下で形成される栄養細胞、正常細胞、光合成細胞、環境条件が過酷になると形成し得る気候耐性胞子であるアキネート、および窒素固定に不可欠な酵素ニトロゲナーゼを含む厚壁の異質細胞などのいくつかの異なる細胞型に分化する能力を示す。
【０３８１】
異質細胞はまた、窒素が必要なときはいつでも、適切な環境条件（例えば、嫌気性）下で形成することもできる。異質細胞形成種は、窒素固定に特化しており、植物が使用できない窒素ガスを、植物が吸収し、タンパク質および核酸に変換できるアンモニア（ＮＨ３）、亜硝酸塩（ＮＯ２−）、または硝酸塩（ＮＯ３−）に固定することができる。
【０３８２】
多くのシアノバクテリアはまた、連鎖体と呼ばれ、主要バイオマスから移動して離れ、他の場所で出芽し、新たなコロニーを形成する運動型繊維も形成する。連鎖体中の細胞は植物状態にある時よりも薄く、運動型の鎖のいずれかの端部上の細胞が先細りになっている場合が多い。親コロニーから離脱するためには、連鎖体は、ネクリジウム（ｎｅｃｒｉｄｉｕｍ）と呼ばれる繊維中のより弱い細胞を引き裂く必要があります。
【０３８３】
各個々のシアノバクテリア細胞は、典型的には、厚いゼラチン状の細胞壁を有する。シアノバクテリアは、クオラムセンシング分子の自己誘導物質−２およびアシル−ホモセリンラクトンが存在しない点で、他のグラム陰性細菌とは異なる。これらは鞭毛を欠いているが、連鎖体および一部の単細胞種は、表面に沿って滑ることによって移動することができる。水柱においては、一部のシアノバクテリア、古細菌のようにガス胞を形成することにより浮く。
【０３８４】
シアノバクテリアは、光合成で機能する緻密で高度に組織化された内膜系を有している。シアノバクテリアにおける光合成は、一般的に、電子供与体として水を使用し、副産物として酸素を生成するが、一部のシアノバクテリアは、他の光合成細菌と同様に硫化水素も使用できる。二酸化炭素は、カルビン回路を介して還元され、炭水化物を形成する。ほとんどの形態では、光合成機構は、チラコイドと呼ばれる細胞膜のひだ内に埋め込まれている。好気的条件下で窒素を固定する能力により、シアノバクテリアは、とりわけ真菌（例えば、地衣類）、サンゴ、シダ植物（例えば、アカウキクサ）、および被子植物（例えば、グンネラ）などのいくつかの他の生物群との共生生物として見られる場合が多い。
【０３８５】
シアノバクテリアは、好気性条件下で窒素および炭素を還元することができる唯一の生物群である。水を酸化する光合成は、光化学系（ＰＳ）ＩＩおよびＩ（Ｚ−スキーム）の活性を結合することによって達成される。嫌気性条件下では、シアノバクテリアは、紅色光合成細菌と同様に、水以外の電子供与体（例えば、硫化水素、チオ硫酸塩、または分子状水素）を用いて、ＰＳ  Ｉ（すなわち、環状光リン酸化）のみを使用することもできる。さらに、シアノバクテリアは、古細菌の特性である、暗所で嫌気性呼吸によって元素硫黄を還元する能力を共有する。シアノバクテリアの光合成電子伝達系は、呼吸電子伝達の構成要素と同じ区画を共有する。典型的には、原形質膜は呼吸鎖の構成要素のみを含有するが、チラコイド膜では呼吸および光合成電子伝達の両方が行われている。
【０３８６】
チラコイド膜に付着したフィコビリソームは、シアノバクテリアの光化学系のための集光アンテナとして機能する。フィコビリソーム構成要素（フィコビリタンパク質）は、ほとんどのシアノバクテリアの青緑色の色素沈着の原因である。色の変動は、主にカロテノイドおよびフィコエリトリンによるものであり、赤茶色がかった着色を細胞に提供することができる。いくつかのシアノバクテリアでは、光の色が、フィコビリソームの組成に影響を与えている。緑色光では、細胞は、より多くのフィコエリトリンを蓄積するが、赤色光では、より多くのフィコシアニンを生成する。したがって、細菌は、赤色光では緑色に見え、緑色光では赤色に見える。このプロセスは、補色適応として知られており、細胞の光合成に利用可能な光の使用を最大化する方法を表す。
【０３８７】
特定の実施形態において、このシアノバクテリアは、例えば、海洋形態のシアノバクテリアまたは淡水形態のシアノバクテリアであり得る。海洋形態のシアノバクテリアの例としては、シネココッカスＷＨ８１０２、シネココッカスＲＣＣ３０７、シネココッカスＮＫＢＧ１５０４１ｃ、およびトリコデスミウムが挙げられるが、これらに限定されない。淡水形態のシアノバクテリアの例としては、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２、シネコシスティスＰＣＣ６８０３、Ｐｌｅｃｔｏｎｅｍａ  ｂｏｒｙａｎｕｍ、およびアナベナ種が挙げられるが、これらに限定されない。所望の酵素またはポリペプチドをコードする外因性遺伝物質は、特定の自己複製ベクター中などで一過的であるか、または組込み（例えば、組換え）などによってシアノバクテリアの天然ゲノム内に安定的に導入することができる。
【０３８８】
他の実施形態において、本発明の遺伝子改変されたシアノバクテリアは、汽水または塩水中で成長することが可能であり得る。淡水形態のシアノバクテリアを使用する場合には、トリグリセリド産生の全体的な純費用は、培養物を成長させるために必要な栄養素および淡水の値段の両方に依存する。淡水は将来的には限られた資源であることが予測され、その場合には、淡水に代わるものを見つけるため、費用効果が高くなる。２つのかかる代替方法には、（１）処理施設からの廃水の使用、および（２）塩水または汽水の使用が含まれる。
【０３８９】
海洋の塩水は、３．１％〜３．８％の塩分濃度の範囲であり、平均３．５％であり得るが、これは、完全ではないが、大部分が、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）イオンで構成されている。一方、汽水は、淡水よりも塩分濃度が高いが、海水ほどではない。汽水は、約０．５％〜３％の塩分を含有し、したがって、広範囲の塩分レジームを含み、したがって、正確に定義されていない。廃水は、人間の影響を受けている任意の水である。廃水は、家庭用および商業用の施設、産業、および／または農業から放出された液体廃棄物からなり、様々な濃度で広範囲の潜在的な汚染物質を包含し得る。
【０３９０】
海洋中には幅広いシアノバクテリアの分布が存在し、シネココッカス属は単に１つの生物的地位を占めるにすぎない。具体的には、（以前はＡｇｍｅｎｅｌｌｕｍ  ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｕｍ株ＰＲ−６として知られていた）シネココッカス種ＰＣＣ７００２は、汽水中で成長し、単細胞性であり、３８℃の最適成長温度を有する。この株は高塩条件での成長に十分に適するが、淡水中では非常にゆっくり成長する。特定の実施形態では、本発明は、廃水または塩水／汽水のいずれかで成長が可能となるように変更されたシアノバクテリアのシネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２の使用を企図する。塩化ナトリウムストレスに耐性のあるシネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２変異体について説明されており（Ｂａｇｃｈｉ，Ｓ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈ  Ｒｅｓ．２００７，９２：８７−１０１）、塩水中での成長に耐性がある遺伝子改変されたシネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２について説明されている（Ｗａｄｉｔｅｅ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ．２００２，９９：４１０９−４１１４）。本発明によれば、塩水耐性株は、０．５％〜４．０％の塩分範囲の塩分を有する水または培地中で成長することができるが、この範囲に包含される全ての塩分中で必ずしも成長できるとは限らない。一実施形態において、塩耐性株は、１．０％〜２．０％の塩分範囲の塩分を有する水または培地中で成長することができる。別の実施形態において、塩水耐性株は、２．０％〜３．０％の塩分範囲の塩分を有する水または培地中で成長することができる。
【０３９１】
本明細書中に記載の方法に従って利用および／または遺伝子改変できるシアノバクテリアの例としては、Ａｐｈａｎｏｃａｐｓａ、Ａｐｈａｎｏｔｈｅｃｅ、Ｃｈａｍａｅｓｉｐｈｏｎ、Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｈｒｏｏｇｌｏｅｏｃｙｓｔｉｓ、Ｃｏｅｌｏｓｐｈａｅｒｉｕｍ、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｙａｎｏｂｉｕｍ、Ｃｙａｎｏｄｉｃｔｙｏｎ、Ｃｙａｎｏｓａｒｃｉｎａ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ、Ｄａｃｔｙｌｏｃｏｃｃｏｐｓｉｓ、Ｇｌｏｅｃａｐｓａ、Ｇｌｏｅｏｔｈｅｃｅ、Ｍｅｒｉｓｍｏｐｅｄｉａ、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ、Ｒａｄｉｏｃｙｓｔｉｓ、Ｒｈａｂｄｏｄｅｒｍａ、Ｓｎｏｗｅｌｌａ、Ｓｙｎｙｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、およびＷｏｒｏｎｉｃｈｉｎｉａの属からのクロオコックス目のシアノバクテリア、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｎａｂａｅｎｏｐｓｉｓ、Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ、Ａｕｌｏｓｉｒａ、Ｃａｌｏｔｈｒｉｘ、Ｃｏｌｅｏｄｅｓｍｉｕｍ、Ｃｙａｎｏｓｐｉｒａ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｏｓｉｓ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｕｍ、Ｆｒｅｍｙｅｌｌａ、Ｇｌｅｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｍｉｃｒｏｃｈａｅｔｅ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ、Ｎｏｓｔｏｃ、Ｒｅｘｉａ、Ｒｉｃｈｅｌｉａ、Ｓｃｙｔｏｎｅｍａ、Ｓｐｒｉｒｅｓｔｉｓ、およびＴｏｙｐｏｔｈｒｉｘの属からのＮｏｓｔａｃａｌｅｓシアノバクテリア、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ、Ｇｅｉｔｌｅｒｉｎｅｍａ、Ｈａｌｏｍｉｃｒｏｎｅｍａ、Ｈａｌｏｓｐｉｒｕｌｉｎａ、Ｋａｔａｇｎｙｍｅｎｅ、Ｌｅｐｔｏｌｙｎｇｂｙａ、Ｌｉｍｎｏｔｈｒｉｘ、Ｌｙｎｇｂｙａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ、Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ、Ｐｌａｎｋｔｏｔｈｒｉｃｏｉｄｅｓ、Ｐｌａｎｋｔｏｔｈｒｉｘ、Ｐｌｅｃｔｏｎｅｍａ、Ｐｓｅｕｄｏａｎａｂａｅｎａ／Ｌｉｍｎｏｔｈｒｉｘ、Ｓｃｈｉｚｏｔｈｒｉｘ、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ、Ｓｙｍｐｌｏｃａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ、Ｔｙｃｈｏｎｅｍａの属からのＯｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａｌｅｓシアノバクテリア、Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｉｄｉｏｐｓｉｓ、Ｄｅｒｍｏｃａｒｐａ、Ｄｅｒｍｏｃａｒｐｅｌｌａ、Ｍｙｘｏｓａｒｃｉｎａ、Ｐｌｅｕｒｏｃａｐｓａ、Ｓｔａｎｉｅｒｉａ、Ｘｅｎｏｃｏｃｃｕｓの属からのＰｌｅｕｒｏｃａｐｓａｌｅｓシアノバクテリア、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｎ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｔｈｒｉｘの属からのＰｒｏｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔｅｓシアノバクテリア、ならびにＣａｐｓｏｓｉｒａ、Ｃｈｌｏｒｏｇｅｏｅｐｓｉｓ、Ｆｉｓｃｈｅｒｅｌｌａ、Ｈａｐａｌｏｓｉｐｈｏｎ、Ｍａｓｔｉｇｏｃｌａｄｏｐｓｉｓ、Ｎｏｓｔｏｃｈｏｐｓｉｓ、Ｓｔｉｇｏｎｅｍａ、Ｓｙｍｐｈｙｏｎｅｍａ、Ｓｙｍｐｈｏｎｅｍｏｐｓｉｓ、Ｕｍｅｚａｋｉａ、およびＷｅｓｔｉｅｌｌｏｐｓｉｓの属からのＳｔｉｇｏｎｅｍａｔａｌｅｓシアノバクテリアが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、シアノバクテリアは、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｉｇｒａｎｕｌａｔｕｓ、シネココッカス・エロンガタス、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｅｏｐｏｌ��ｅｎｓｉｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｖｉｄｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、およびＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｕｂｅｓｃｅｎｓを含むが、これらに限定されないシネココッカス属からのものである。
【０３９２】
特定の実施形態において、このシアノバクテリアは、Ａｎａｂａｅｎａ種の株ＰＣＣ７１２０、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ種の株ＰＣＣ６８０３、Ｎｏｓｔｏｃ  ｍｕｓｃｏｒｕｍ、Ｎｏｓｔｏｃ  ｅｌｌｉｐｓｏｓｐｏｒｕｍ、またはＮｏｓｔｏｃ種の株ＰＣＣ７１２０である。特定の好ましい実施形態において、このシアノバクテリアは、シネココッカス・エロンガタス種の株ＰＣＣ７９４２である。
【０３９３】
本明細書に提供される方法で利用できるシアノバクテリアのさらなる例としては、シネココッカス種の株ＷＨ７８０３、ＷＨ８１０２、ＷＨ８１０３（典型的にはコンジュゲーションによって遺伝子改変されたもの）、Ｂａｅｏｃｙｔｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｉｄｉｏｐｓｉｓ種（典型的にはコンジュゲーション／電気穿孔によって改変されたもの）、異質細胞非形成糸状株Ｐｌａｎｋｔｏｔｈｒｉｘ種、Ｐｌｅｃｔｏｎｅｍａ  ｂｏｒｙａｎｕｍ  Ｍ１０１（典型的には電気穿孔によって改変されたもの）、および異質細胞形成株Ａｎａｂａｅｎａ種の株ＡＴＣＣ２９４１３（典型的にはコンジュゲーションによって改変されたもの）、Ｔｏｌｙｐｏｔｈｒｉｘ種の株ＰＣＣ７６０１（典型的にはコンジュゲーション／電気穿孔によって改変されたもの）、ならびにＮｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ株ＡＴＣＣ２９１３３（典型的にはコンジュゲーション／電気穿孔によって改変されたもの）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３９４】
特定の好ましい実施形態において、このシアノバクテリアは、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２株または（元はＡｇｍｅｎｅｌｌｕｍ  ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｕｍとして知られていた）シネココッカス種のＰＣＣ７００２であり得る。
【０３９５】
特定の実施形態において、本発明の遺伝子改変光合成微生物、例えば、シアノバクテリアを用いて、任意の合理的な所望の規模の日常的な培養技術を用いて、太陽光、水、空気、および最小限の栄養素のみからトリグリセリドおよび／または他の炭素系の生成物を生成することができる。具体的な実施形態において、本発明は、定義された成長条件下で成長利点を示す光合成微生物の自発性変異体の使用を企図する。他の利点の中で、最小限のエネルギーおよび栄養素の投入から大量のトリグリセリドを生成する能力により、本発明の改変光合成微生物、例えば、シアノバクテリアは、バイオディーゼルなどの生物燃料およびグリセリンなどの特殊化学製品の両方のその後の生成における管理が容易で、効率的な原料源となる。
【０３９６】
Ｅ．改変光合成微生物の生成法
本発明の実施形態には、本明細書に記載の改変光合成微生物（例えば、シアノバクテリア）の生成法も含まれる。
【０３９７】
特定の実施形態において、本発明は、対応する野生型光合成微生物または異なる方法で改変された光合成微生物（例えば、ＤＧＡＴを発現するが、原形質膜を含む膜などの細胞内領域に選択的に局在する形態ではないもの）と比較して、大量の脂質、例えば、トリグリセリドを生成する改変光合成微生物を生成するために光合成微生物を改変する方法であって、本明細書に記載の細胞内局在化ドメイン−ＤＧＡＴ融合タンパク質（その活性断片または変異体を含む）をコードする１以上のポリヌクレオチドを微生物に導入することを含む方法を含む。
【０３９８】
ＤＧＡＴが、異種の細胞内局在化ドメイン（例えば、野生型ＤＧＡＴ）を含まない、ＤＧＡＴを発現する対応する改変光合成微生物と比較して、細胞成長特性が改善した、改変光合成微生物を生成する光合成微生物を改変する方法であって、本明細書に記載の細胞内局在化ドメイン−ＤＧＡＴ融合タンパク質（その活性断片または変異体を含む）をコードする１以上のポリヌクレオチドを、前記微生物に導入することを含む方法も含まれる。
【０３９９】
方法はさらに、ポリヌクレオチドが、例えば、抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカーを発現するベクターに存在する場合に、１以上の所望のポリヌクレオチドが正常に導入された光合成微生物を選択するステップを含み得る。一例として、選択および単離は、当技術分野で公知の抗生物質耐性マーカー（例えば、カナマイシン、スペクチノマイシンおよびストレプトマイシン）の使用を含み得る。
【０４００】
特定の態様において、このような光合成微生物はさらに、１以上の脂質生合成タンパク質の発現を増加させることにより、例えば、脂質生合成タンパク質をコードするポリヌクレオチドの外因性コピーを導入することにより、内因性脂質生合成タンパク質の発現を増加させることにより、またはその両方により改変することができる。一部の態様において、このような光合成微生物は、さらに、グリコーゲン分解に関連する１以上のタンパク質の発現を増加させることにより、例えば、グリコーゲン分解タンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドのコピーを導入することにより、内因性グリコーゲン分解タンパク質の発現を増加させることにより、またはその両方により改変することができる。
【０４０１】
したがって、特定の実施形態において、本発明は、（１）１以上の細胞内局在化ドメイン−ＤＧＡＴ融合タンパク質をコードする１以上のポリヌクレオチドを前記光合成微生物に導入すること、および（２）内因性脂質生合成タンパク質をコードする配列の上流に、１以上の作動可能に連結されたプロモーター（例えば、誘導性プロモーターもしくは調節性プロモーター）を導入すること、かつ／または脂質生合成タンパク質、またはその断片もしくは変異型をコードする１以上のポリヌクレオチドを導入すること、を含む改変光合成微生物、例えば、シアノバクテリアの生成法を含む。代表的な脂質生合成タンパク質には、アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）、アシル−ＡＣＰ合成酵素（Ａａｓ）、アシル−ＡＣＰ還元酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アルデヒドデカルボニラーゼ、チオエステラーゼ（ＴＥＳ）、アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）、ホスファチジン酸ホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ）（ＰＡＰ；またはホスファチジン酸ホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ））、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）ヒドロラーゼ、脂肪酸アシルＣｏＡ合成酵素、およびリパーゼ／ホスホリパーゼ、ならびにそれらの任意の組み合わせのうちの任意の１以上が含まれる。
【０４０２】
特定の実施形態は、（１）１以上の細胞内局在化ドメイン−ＤＧＡＴ融合タンパク質をコードする１以上のポリヌクレオチドを前記光合成微生物に導入すること、および（２）内因性グリコーゲン分解タンパク質をコードする配列の上流領域に１以上の作動可能に連結されたプロモーター（例えば、誘導性プロモーターもしくは調節性プロモーター）を前記光合成微生物に導入すること、ならびに／またはグリコーゲン分解タンパク質、またはその断片もしくは変異型をコードする１以上のポリヌクレオチドを導入すること、を含む改変光合成微生物、例えば、シアノバクテリアの生成法を含む。代表的なグリコーゲン分解タンパク質には、グリコーゲンホスホリラーゼ（ＧｌｇＰ）、グリコーゲンイソアミラーゼ（ＧｌｇＸ）、グルカノトランスフェラーゼ（ＭａｌＱ）、ホスホグルコムタ−ゼ（Ｐｇｍ）、グルコキナーゼ（Ｇｌｋ）、および／またはホスホグルコースイソメラーゼ（Ｐｇｉ）、ならびにそれらの任意の組み合わせのうちの任意の１以上が含まれる。
【０４０３】
特定の実施形態は、（１）１以上の細胞内局在化ドメイン−ＤＧＡＴ融合タンパク質をコードする１以上のポリヌクレオチドを前記光合成微生物に導入すること、（２）内因性脂質生合成タンパク質をコードする配列の上流領域に１以上の作動可能に連結されたプロモーター（例えば、誘導性プロモーターもしくは調節性プロモーター）を前記光合成微生物に導入すること、および／または脂質生合成タンパク質またはその断片もしくは変異型をコードする１以上のポリヌクレオチドを導入すること、ならびに（３）内因性グリコーゲン分解タンパク質をコードする配列の上流領域に１以上の作動可能に連結されたプロモーター（例えば、誘導性プロモーターもしくは調節性プロモーター）を前記光合成微生物に導入すること、ならびに／またはグリコーゲン分解タンパク質、またはその断片もしくは変異型をコードする１以上のポリヌクレオチドを導入すること、を含む改変光合成微生物、例えば、シアノバクテリアの生成法を含む。
【０４０４】
特定の実施形態において、脂質生合成タンパク質は、アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）、アシル−ＡＣＰ合成酵素（Ａａｓ）、またはその両方である。例えば、特定の実施形態は、（１）１以上の細胞内局在化ドメイン−ＤＧＡＴ融合タンパク質をコードする１以上のポリヌクレオチドを前記光合成微生物に導入すること、（２）内因性ＡＣＰコード配列の上流領域に１以上の作動可能に連結されたプロモーター（例えば、誘導性プロモーターもしくは調節性プロモーター）を前記光合成微生物に導入すること、ならびに／またはＡＣＰ、またはその断片もしくは変異型をコードする１以上のポリヌクレオチドを導入すること、を含む改変光合成微生物、例えば、シアノバクテリアの生成法を含む。これらのおよび関連する方法は、さらに（３）内因性ＴＥＳ、ＡＣＣａｓｅ、ＴＡＧヒドロラーゼ、脂肪酸アシルＣｏＡ合成酵素、ＰＡＰ、および／もしくはホスホリパーゼをコードする配列の上流領域に１以上の作動可能に連結されたプロモーター（例えば、誘導性プロモーターもしくは調節性プロモーター）を前記光合成微生物に導入すること、ならびに／またはＴＥＳ、ＡＣＣａｓｅ、ＴＡＧヒドロラーゼ、脂肪酸アシルＣｏＡ合成酵素、ＰＡＰ、および／もしくはホスホリパーゼ、またはその断片もしくは変異型をコードする１以上のポリヌクレオチドを導入すること、を含むことができる。
【０４０５】
一部の実施形態は、（１）１以上の細胞内局在化ドメイン−ＤＧＡＴ融合タンパク質をコードする１以上のポリヌクレオチドを前記光合成微生物に導入すること、（２）内因性Ａａｓコード配列の上流領域に１以上の作動可能に連結されたプロモーター（例えば、誘導性プロモーターもしくは調節性プロモーター）を前記光合成微生物に導入すること、ならびに／またはＡａｓポリペプチド、またはその断片もしくは変異型をコードする１以上のポリヌクレオチドを導入すること、を含む改変光合成微生物、例えば、シアノバクテリアの生成法を含む。これらのおよび関連する方法は、さらに、（３）内因性ＴＥＳ、ＡＣＣａｓｅ、ＴＡＧヒドロラーゼ、脂肪酸アシルＣｏＡ合成酵素、ＰＡＰ、および／もしくはホスホリパーゼをコードする配列の上流領域に１以上の作動可能に連結されたプロモーター（例えば、誘導性プロモーターもしくは調節性プロモーター）を前記光合成微生物に導入すること、ならびに／またはＴＥＳ、ＡＣＣａｓｅ、ＴＡＧヒドロラーゼ、脂肪酸アシルＣｏＡ合成酵素、ＰＡＰ、および／もしくはホスホリパーゼ、またはその断片もしくは変異型をコードする１以上のポリヌクレオチドを導入すること、を含むことができる。
【０４０６】
具体的な実施形態は、（１）１以上の細胞内局在化ドメイン−ＤＧＡＴ融合タンパク質をコードする１以上のポリヌクレオチドを前記光合成微生物に導入すること、（２）内因性ＡＣＰコード配列の上流領域に１以上の作動可能に連結されたプロモーター（例えば、誘導性プロモーターもしくは調節性プロモーター）を前記光合成微生物に導入すること、ならびに／またはＡＣＰ、またはその断片もしくは変異型をコードする１以上のポリヌクレオチドを導入すること、（３）内因性Ａａｓコード配列の上流領域に１以上の作動可能に連結されたプロモーター（例えば、誘導性プロモーターもしくは調節性プロモーター）を前記光合成微生物に導入すること、ならびに／またはＡａｓポリペプチド、またはその断片もしくは変異型をコードする１以上のポリヌクレオチドを導入すること、を含む改変光合成微生物、例えば、シアノバクテリアの生成法を含む。これらのおよび関連する方法は、さらに、（４）内因性ＴＥＳ、ＡＣＣａｓｅ、ＴＡＧヒドロラーゼ、脂肪酸アシルＣｏＡ合成酵素、ＰＡＰ、および／もしくはホスホリパーゼのコード配列の上流領域に１以上の作動可能に連結されたプロモーター（例えば、誘導性プロモーターもしくは調節性プロモーター）を前記光合成微生物に導入すること、ならびに／またはＴＥＳ、ＡＣＣａｓｅ、ＴＡＧヒドロラーゼ、脂肪酸アシルＣｏＡ合成酵素、ＰＡＰ、および／もしくはホスホリパーゼ、またはその断片もしくは変異型をコードする１以上のポリヌクレオチドを導入すること、を含むことができる。
【０４０７】
一部の実施形態において、脂質生合成タンパク質は、例えば、トリグリセリドの生成を増加させるか、かつ／またはワックスエステルを生成するために、必要に応じて過剰発現させたアルコール脱水素酵素と組み合わせたアシル−ＡＣＰ還元酵素である。したがって、特定の実施形態は、（１）１以上の細胞内局在化ドメイン−ＤＧＡＴ融合タンパク質をコードする１以上のポリヌクレオチドを前記光合成微生物に導入すること、（２）内因性アシルＡＣＰ還元酵素をコードする配列の上流領域に１以上の作動可能に連結されたプロモーター（例えば、誘導性プロモーターもしくは調節性プロモーター）を前記光合成微生物に導入すること、ならびに／またはアシル−ＡＣＰ還元酵素、またはその断片もしくは変異型をコードする１以上のポリヌクレオチドを導入すること、を含む、改変光合成微生物、例えば、シアノバクテリアの生成法を含む。
【０４０８】
ワックスエステル生成については、（１）１以上の細胞内局在化ドメイン−ＤＧＡＴ融合タンパク質をコードする１以上のポリヌクレオチドを前記光合成微生物に導入すること、（２）内因性アシルＡＣＰ還元酵素をコードする配列の上流領域に１以上の作動可能に連結されたプロモーター（例えば、誘導性プロモーターもしくは調節性プロモーター）を前記光合成微生物に導入すること、ならびに／またはアシルＡＣＰ還元酵素、またはその断片もしくは変異型をコードする１以上のポリヌクレオチドを導入すること、（３）内因性アルコール脱水素酵素をコードする配列の上流領域に１以上の作動可能に連結されたプロモーター（例えば、誘導性プロモーターもしくは調節性プロモーター）を前記光合成微生物に導入すること、ならびに／またはアルコール脱水素酵素、またはその断片もしくは変異型をコードする１以上のポリヌクレオチドを導入すること、を含む改変光合成微生物、例えば、シアノバクテリアの生成法も含まれる。
【０４０９】
本明細書に記載の光合成微生物のいずれかは、さらに、グリコーゲン合成および／もしくは貯蔵に関連する１以上の内因性遺伝子／タンパク質、１以上の内因性アルデヒド脱水素酵素、１以上の内因性アルデヒドデカルボニラーゼ、および／もしくは１以上の内因性Ａａｓのポリペプチドの発現ならびに／または活性を低下させることによって変更することができる。グリコーゲン合成および／または貯蔵に関連する代表的な遺伝子／タンパク質には、ｇｌｇＡ、ｇｌｇＣ、およびｐｇｍが含まれる。
【０４１０】
特定の実施形態において、発現または活性は、前記１以上の遺伝子の１以上の対立遺伝子をノックアウトまたはノックダウンすることによって低下する。特定の実施形態において、１以上の遺伝子の発現または活性は、前記１以上の遺伝子を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは干渉ＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡと光合成微生物とを接触させることによって低下する。特定の実施形態において、前記１以上の遺伝子、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡにハイブリダイズするポリヌクレオチドを発現するベクターが前記光合成微生物に導入される。目的のタンパク質の発現および／または活性を低下させるために、目的の遺伝子および／もしくはその調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー）のうちの１以上の点変異、挿入、または完全欠失もしくは部分欠失などの変異体の作製も含まれる。自然選択または定方向選択を用いて、目的のタンパク質の発現低下および／または活性が低下した天然変異体を同定することもできる。
【０４１１】
例えば、特定の実施形態は、アルデヒド脱水素酵素、アルデヒドデカルボニラーゼ、またはその両方の発現および／または活性が減少している改変光合成微生物の生成法を含む。これらのおよび関連する実施形態は、（１）１以上細胞内局在化ドメイン−ＤＧＡＴ融合タンパク質をコードする１以上のポリヌクレオチドを前記光合成微生物に導入すること、（２）本明細書に記載のように、アルデヒド脱水素酵素の発現および／または活性を低下させる、例えば、アルデヒド脱水素酵素を「非機能的」にさせる点変異、挿入、または完全欠失もしくは部分欠失などのアルデヒド脱水素酵素をコードする内因性遺伝子に１以上の変異を導入することを含んでもよい。また、（１）１以上の細胞内局在化ドメイン−ＤＧＡＴ融合タンパク質をコードする１以上のポリヌクレオチドを前記光合成微生物に導入すること、（２）アルデヒドデカルボニラーゼの発現および／または活性を低下させる点変異、挿入、または完全欠失もしくは部分欠失などの１以上の変異を、アルデヒドデカルボニラーゼをコードする内因性遺伝子内に導入すること、を含む改変光合成微生物の生成法も含まれる。
【０４１２】
一部の実施形態は、（１）１以上の細胞内局在化ドメイン−ＤＧＡＴ融合タンパク質をコードする１以上のポリヌクレオチドを前記光合成微生物に導入すること、（２）アルデヒド脱水素酵素の発現および／または活性を低下させる点変異、挿入、または完全欠失もしくは部分欠失などの１以上の変異を、アルデヒド脱水素酵素をコードする内因性遺伝子に導入すること、（３）アルデヒドデカルボニラーゼの発現および／または活性を低下させる点変異、挿入、または完全欠失もしくは部分欠失などの１以上の変異を、アルデヒドデカルボニラーゼをコードする内因性遺伝子内に導入すること、を含む改変光合成微生物の生成法を含む。
【０４１３】
特定の方法は、アルデヒド脱水素酵素の発現および／もしくは活性の低下、アルデヒドデカルボニラーゼの発現および／もしくは活性の低下、またはその両方と組み合わせて、アシル−ＡＣＰ還元酵素およびアルコール脱水素酵素の発現が増加した改変光合成微生物を産生することを含む。本明細書に記載のように、これらのおよび関連する実施形態は、ワックスエステルの生成に有用であり得る。したがって、一部の実施形態は、（１）１以上の細胞内局在化ドメイン−ＤＧＡＴ融合タンパク質をコードする１以上のポリヌクレオチドを前記改変光合成微生物に導入すること、（２）内因性アシル−ＡＣＰ還元酵素コード配列の上流領域に１以上の作動可能に連結されたプロモーター（例えば、誘導性プロモーターもしくは調節性プロモーター）を前記改変光合成微生物に導入すること、ならびに／またはアシル−ＡＣＰ還元酵素、またはその断片もしくは変異型をコードする１以上のポリヌクレオチドを導入すること、（３）内因性のアルコール脱水素酵素をコードする配列の上流領域に作動可能に連結された１以上のプロモーター（例えば、誘導性プロモーターもしくは調節性プロモーター）を前記光合成微生物に導入すること、ならびに／またはアルコール脱水素酵素、またはその断片もしくは変異型をコードする１以上のポリヌクレオチドを導入すること、ならびに（４）アルデヒド脱水素酵素の発現および／または活性を低下させる点変異、挿入、または完全欠失もしくは部分欠失などのアルデヒド脱水素酵素をコードする内因性遺伝子の中に１以上の変異を導入すること、（５）アルデヒドデカルボニラーゼの発現および／または活性を低下させる点変異、挿入、または完全欠失もしくは部分欠失などの１以上の変異を、アルデヒドデカルボニラーゼをコードする内因性遺伝子に導入すること、を含む改変光合成微生物の生成法を含む。具体的な実施形態において、例えば、光合成微生物が、ストレプトコッカス・エロンガタスである場合に、アルデヒド脱水素酵素はｏｒｆ０４８９によってコードされ、アルデヒドデカルボニラーゼはｏｒｆ１５９３によってコードされている。
【０４１４】
光合成微生物、例えば、シアノバクテリアは、例えば、機能的ポリペプチドを発現する遺伝子の一部または全てを除去するか、または機能的ポリペプチドを発現するポリヌクレオチドを導入するために、当技術分野で公知の技術に従って遺伝子改変することができる。特定の態様において、上記のように、光合成微生物、例えば、シアノバクテリアにおける遺伝的操作は、天然の光合成微生物配列、目的の外因性遺伝子、および選択マーカーまたは薬剤耐性遺伝子を含む非複製ベクターを導入することによって行うことができる。光合成微生物への導入に際して、ベクターは、相同組換えを介して光合成微生物のゲノムに組み込まれ得る。この方法では、目的の外因性遺伝子および薬剤耐性遺伝子は、光合成微生物のゲノムに安定的に組み込まれる。その後、このような組換え細胞は、薬物選択によって非組換え細胞から単離することができる。シアノバクテリアのための細胞の形質転換法および選択マーカーも当技術分野で公知である（シアノバクテリアへの遺伝子導入およびシアノバクテリアの他の情報の説明については、例えば、Ｗｉｒｔｈ，Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２１６：１７５−７，１９８９；およびＫｏｋｓｈａｒｏｖａ，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ５８：１２３−３７，２００２；ならびにシアノバクテリア：分子生物学、遺伝学、および進化（Ａｎｔｏｎｉｏ  ＨｅｒｒｅｒａおよびＥｎｒｉｑｕｅ  Ｆｌｏｒｅｓ編）Ｃａｉｓｔｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，２００８を参照されたく、これらの各々は参照により援用される）。
【０４１５】
特定の実施形態において、タンパク質の内因性バージョン（例えば、ＡＣＰ、Ａａｓ、ＴＥＳ、ＡＣＣａｓｅ、ＴＡＧヒドロラーゼ、脂肪酸アシルＣｏＡ合成酵素、ＰＡＰ、ＰＬ）は、存在する場合に、そのタンパク質をコードする内因性遺伝子、すなわち、その遺伝子の天然に存在するバージョンの上流に異種または他のプロモーターを導入することにより過剰発現させることができる。このようなプロモーターは、構成的または誘導性であり得る。
【０４１６】
グリコーゲンの生合成または貯蔵に関連する１以上の遺伝子のいずれかの欠失または変異の発生は、所与の遺伝子（例えば、ｇｌｇＣ、ｐｇｍ）の上流および下流の隣接領域を標的とし、内因性コード配列をベクター配列と置換するために、それらの隣接領域においてシアノバクテリアのゲノムと組み換える複製しない選択可能なベクター系の使用を含む、当技術分野で公知の様々な方法に従って達成することができる。薬物選択マーカーなどの選択マーカーがベクター配列に存在することを前提として、遺伝子欠失を含有するシアノバクテリア細胞を、容易に単離し、同定し、特徴付けることができる。このような選択可能なベクターをベースとした組換え方法は、標的となる上流および下流の隣接領域に限定される必要はないが、本明細書に記載のように、その遺伝子が「非機能的」な状態である限り、所与の遺伝子内の内部配列を標的としてもよい。
【０４１７】
欠失または変異の生成はまた、アンチセンスベースの技術を用いて達成することができる。例えば、シアノバクテリアは、鉄調節転写物の中央部に対してアンチセンスに転写され、広範囲に及ぶ塩基対形成を介してその蓄積を阻止する１７７−ｎｔ  ｎｃＲＮＡ、およびｆｕｒＡ転写物の翻訳を妨害するアンチセンスＲＮＡ（α−ｆｕｒＡ  ＲＮＡ）として機能する完全なｆｕｒＡ遺伝子と重複し、相補性のあるａｌｒ１６９０  ｍＲＮＡ（例えば、Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３５５：３２５−３３４，２００６参照）などのアンチセンス調節に依存する天然の調節事象を含むことが示されている（例えば、Ｄｕｈｒｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０３：７０５４−７０５８，２００６参照）。したがって、グリコーゲンの生合成または貯蔵に関与する遺伝子を標的とするアンチセンス分子の取り込みは、本明細書に記載のように、これらの遺伝子の発現を負に調節し、それらを「非機能的」にさせることが同様に予想される。
【０４１８】
本明細書で使用する場合、アンチセンス分子は、遺伝子またはｍＲＮＡの標的コード鎖に相補的な配列を有する鎖を含む１本鎖および２本鎖ポリヌクレオチドの両方を包含する。したがって、アンチセンス分子は、１本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび２本鎖ｓｉＲＮＡ分子の両方を含む。
【０４１９】
本明細書に記載の他の修飾は、標準的な手順および試薬、例えば、当技術分野で利用可能なベクターを使用して生成することができる。関連する方法は、ＰＣＴ出願ＷＯ２０１０／０７５４４０に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０４２０】
Ｆ．脂質の産生法
本発明の改変光合成微生物および方法を用いて、脂肪酸、トリグリセリド、および／またはワックスエステルなどの脂質を生成することができる。したがって、本発明は、（本明細書の他の箇所に記載の）本発明の改変光合成微生物のいずれかを培養することを含む、脂質を生成する方法を提供する。
【０４２１】
一実施形態において、この改変光合成微生物は、同じ種の改変されていないすなわち野生型のシアノバクテリア、または同じ種の異なる方法で改変されたシアノバクテリアと比較して、増加した脂質を生成または蓄積するシアノバクテリアである。特定の実施形態において、この改変光合成微生物は、同じ種の改変されていないすなわち野生型のシアノバクテリア、または同じ種の異なる方法で改変されたシアノバクテリアと比較して、増加したトリグリセリドを生成または蓄積するシアノバクテリアである。具体的な場合において、この異なる方法で改変されたシアノバクテリアは、野生型ＤＧＡＴを発現し、他の形態ののＤＧＡＴを発現しない。異なる方法で改変されたシアノバクテリアの他の例については、本明細書に記載されている。特定の態様において、増加したトリグリセリド生成は、異なる方法で改変されたシアノバクテリアと比較して、改善された細胞成長特性、例えば、経時的に増加した細胞生存と関連し、したがって、経時的、例えば、培養後またはＤＧＡＴの発現誘導後２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日目、もしくはそれ以後に、または連続培養システムにおいて測定される。
【０４２２】
一実施形態において、この改変光合成微生物は、同じ種の改変されていないすなわち野生型のシアノバクテリア、または同じ種の異なる方法で改変されたシアノバクテリアと比較して、増加したワックスエステルを生成または蓄積するシアノバクテリアである。これらのおよび関連する実施形態において、このシアノバクテリアは、細胞内局在化ドメイン−ＤＧＡＴ融合タンパク質と組み合わせて、アシル−ＡＣＰ還元酵素およびアルコール脱水素酵素を過剰発現する。一部の実施形態において、異なる方法で改変されたシアノバクテリアは、アシル−ＡＣＰ還元酵素およびアルコール脱水素酵素と組み合わせてＤＧＡＴを発現するものであるため、ワックスエステルが生成されるが、野生型ＤＧＡＴが発現し、他の形態のＤＧＡＴは発現しない。一部の態様において、増加したワックスエステルの生成は、異なる方法で改変されたシアノバクテリアと比較して改善された細胞成長特性、例えば、経時的に増加した細胞生存と関連し、したがって、経時的、例えば、培養後またはＤＧＡＴの発現誘導後２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日目、もしくはそれ以後に、または連続培養システムにおいて測定される。
【０４２３】
特定の実施形態において、１以上の導入されたポリヌクレオチドは、１以上の発現構築物中に存在する。特定の実施形態において、１以上の発現構築物は、１以上の誘導性プロモーターを含む。特定の実施形態において、１以上の発現構築物は、前記改変光合成微生物のゲノムに安定的に組み込まれている。
【０４２４】
特定の実施形態において、導入されたタンパク質をコードする導入されたポリヌクレオチドは、非誘導条件下の弱いプロモーターを含む発現構築物中に存在する。特定の実施形態において、導入されたポリヌクレオチドの１以上は、シアノバクテリア、例えば、シネココッカス・エロンガタスにおける発現のためにコドン最適化されている。
【０４２５】
特定の実施形態において、この光合成微生物は、シネココッカス・エロンガタス株ＰＣＣ７９４２またはシネココッカス・エロンガタス株ＰＣＣ７９４２の耐塩性変異型などのシネココッカス・エロンガタスである。特定の実施形態において、この光合成微生物は、シネココッカス種ＰＣＣ７００２またはシネコシスティス種ＰＣＣ６８０３である。
【０４２６】
光合成微生物は、当技術分野で公知の技術に従って培養することができる。例えば、シアノバクテリアは、Ｎｅｄｂａｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．１００：９０２−１０，２００８）に記載のものなどの光バイオリアクターベースの技術に加えて、Ａｃｒｅｍａｎら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：１９３−１９４，１９９４）に記載のものなどの、当技術分野で公知の技術に従って培養（ｃｕｌｔｕｒｅ）または培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｅ）することができる。シアノバクテリアの典型的な実験室の培養条件の一例は、一定の撹拌、３０〜１００μモル光子／ｍ２／秒の一定照度、３０℃、通気培養フラスコ中のＢＧ−１１培地（ＡＴＣＣ培地６１６）中で成長させることである。
【０４２７】
シアノバクテリアを培養するために多種多様な培地が利用可能であり、例えば、とりわけ、ＡｉｂａおよびＯｇａｗａ（ＡＯ）培地、ＡｌｌｅｎおよびＡｒｎｏｎ培地＋硝酸塩（ＡＴＣＣ培地１１４２）、Ａｎｔｉａ（ＡＮＴ）培地、Ａｑｕｉｌ培地、Ａｓｈｂｅｙ無窒素寒天、ＡＳＮ−ＩＩＩ培地、ＡＳＰ２培地、ＡＳＷ培地（人工海水および誘導体）、ＡＴＣＣ培地６１７（海洋性シアノバクテリア用のＢＧ−１１、改変ＡＴＣＣ培地６１６［ＢＧ−１１培地］）、ＡＴＣＣ培地８１９（青緑色窒素固定培地、ＡＴＣＣ培地６１６［ＢＧ−１１培地］、ＮＯ３を含まない）、ＡＴＣＣ培地８５４（ＡＴＣＣ培地６１６［ＢＧ−１１培地］、ビタミンＢ１２を含む）、ＡＴＣＣ培地１０４７（ＡＴＣＣ培地９５７［ＭＮ海洋性培地］、ビタミンＢ１２を含む）、ＡＴＣＣ培地１０７７（窒素固定海洋性培地、ＡＴＣＣ培地９５７［ＭＮ海洋性培地］、ＮＯ３を含まない）、ＡＴＣＣ培地１２３４（ＢＧ−１１ウラシル培地、ＡＴＣＣ培地６１６［ＢＧ−１１培地］、ウラシルを含む）、Ｂｅｇｇｉａｔｏａ培地（ＡＴＣＣ培地１３８）、Ｂｅｇｇｉａｔｏａ培地２（ＡＴＣＣ培地１１９３）、シアノバクテリア用ＢＧ−１１培地（ＡＴＣＣ培地６１６）、青緑色（ＢＧ）培地、Ｂｏｌｄ基本（ＢＢ）培地、Ｃａｓｔｅｎｈｏｌｔｚ  Ｄ培地、改変Ｃａｓｔｅｎｈｏｌｔｚ  Ｄ培地（好塩性シアノバクテリア）、Ｃａｓｔｅｎｈｏｌｔｚ  ＤＧ培地、Ｃａｓｔｅｎｈｏｌｔｚ  ＤＧＮ培地、Ｃａｓｔｅｎｈｏｌｔｚ  ＮＤ培地、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓブロス、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ培地（ＡＴＣＣ培地９２０）、Ｃｈｕ＃１０培地（ＡＴＣＣ培地３４１）、改変Ｃｈｕ＃１０培地、改変Ｃｈｕ＃１１培地、ＤＣＭ培地、ＤＹＩＶ培地、Ｅ２７培地、Ｅ３１培地および誘導体、ｆ／２培地、ｆ／２培地誘導体、Ｆｒａｑｕｉｌ培地（淡水微量金属緩衝培地）、藻類用Ｇｏｒｈａｍ培地（ＡＴＣＣ培地６２５）、ｈ／２培地、Ｊａｗｏｒｓｋｉ（ＪＭ）培地、Ｋ培地、Ｌ１培地および誘導体、ＭＮ海洋性培地（ＡＴＣＣ培地９５７）、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｅｒｄｓｃｈｒｅｉｂｅｒ（ＰＥ）培地、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ＰＣ培地、プロテオースペプトン（ＰＰ）培地、Ｐｒｏｖ培地、Ｐｒｏｖ培地誘導体、Ｓ７７＋ビタミン培地、Ｓ８８＋ビタミン培地、塩水栄養素寒天（ＳＮＡ）培地および誘導体、ＳＥＳ培地、ＳＮ培地、改変ＳＮ培地、ＳＮＡＸ培地、土壌／水二相（Ｓ／Ｗ）培地および誘導体、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ用ＳＯＴ培地：ＡＴＣＣ培地１６７９、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ（ＳＰ）培地、ｖａｎ  ＲｉｊｎおよびＣｏｈｅｎ（ＲＣ）培地、Ｗａｌｓｂｙ培地、Ｙｏｐｐ培地、ならびにＺ８培地が含まれる。
【０４２８】
特定の実施形態において、この改変光合成微生物は、例えば、導入されたポリヌクレオチドが誘導性プロモーターを含む場合に、導入されたポリヌクレオチドの発現を誘導するのに適した条件下で培養される。誘導性プロモーターを誘導するのに適した条件および試薬は、当技術分野で公知であり、利用可能である。また、例えば、代謝産物が導入されたポリヌクレオチドの発現を抑制し、経時的に微生物によるその代謝産物の使用によりその濃度およびその抑制活性が低下し、それによってポリヌクレオチド配列の発現増加が可能になる自己誘導システムの使用も含まれる。
【０４２９】
特定の実施形態において、改変光合成微生物、例えば、シアノバクテリアは、脂質、トリグリセリドおよび／または脂肪酸を生成するために有利な条件下で成長する。特定の実施形態において、光強度は、１００〜２０００ｕＥ／ｍ２／ｓまたは２００〜１０００ｕＥ／ｍ２／ｓである。特定の実施形態において、培地のｐＨ範囲は、７．０〜１０．０である。特定の実施形態において、ＣＯ２は、１％〜１０％の範囲のレベルまで培養装置に注入される。特定の実施形態において、ＣＯ２の範囲は、２．５％〜５％である。特定の実施形態において、栄養補給は成長の線形位相中に行われる。これらの条件のそれぞれは、トリグリセリド生成に望ましい。
【０４３０】
特定の実施形態において、この改変光合成微生物は、振盪条件とは対照的に、静的な成長条件下で、少なくともしばらくの間培養される。例えば、この改変光合成微生物は、静的な条件下で培養した後、導入されたポリヌクレオチド（例えば、細胞内局在化ドメイン−ＤＧＡＴ融合、アシル−ＡＣＰ還元酵素、ＡＣＰ、Ａａｓ、ＡＣＰ／Ａａｓ、グリコーゲン分解タンパク質、ＡＣＣａｓｅ、ＤＧＡＴ、脂肪酸アシルＣｏＡ合成酵素、アルデヒド脱水素酵素、アルコール脱水素酵素）の発現を誘導することができるか、かつ／またはこの改変光合成微生物は、導入されたポリヌクレオチドの発現が誘発される静的な条件下、もしくは導入されたポリヌクレオチドの発現が誘導されている期間の一部の間に培養することができる。静的な成長条件は、例えば、振盪なしでの成長または細胞が３０ｒｐｍ以下もしくは５０ｒｐｍ以下で振盪される成長として定義され得る。
【０４３１】
特定の実施形態において、この改変光合成微生物は、少なくともしばらくの間、様々な量の炭酸水素塩を補充した培地中で培養される。例えば、この改変光合成微生物は、５、１０、２０、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｍＭの炭酸水素塩と共に培養した後、導入されたポリヌクレオチド（例えば、膜標的ドメイン−ＤＧＡＴ融合タンパク質、アシル−ＡＣＰ還元酵素、アルデヒド脱水素酵素、ＡＣＰ、Ａａｓ、ＡＣＰ／Ａａｓ、グリコーゲン分解タンパク質、ＡＣＣａｓｅ、ＤＧＡＴ、脂肪酸アシルＣｏＡ合成酵素、アルコール脱水素酵素）の発現が誘導することができるか、かつ／または導入されたポリヌクレオチドの発現が誘導されている間に、もしくは導入されたポリヌクレオチドの発現が誘導されている期間の一部の間に、前述の炭酸水素塩の濃度で培養することができる。
【０４３２】
関連する実施形態において、本発明の改変された光合成生物および方法は、グリセリンもしくはワックスエステルなどのバイオ燃料および／または特殊化学品の生成に使用することができる。したがって、特定の実施形態において、バイオ燃料を生成する方法は、改変光合成微生物が、対応する野生型光合成微生物と比較して増加した量の全細胞脂質、脂肪酸、ワックスエステルおよび／またはトリグリセリドを蓄積する条件下で、本発明の改変光合成微生物のいずれかを培養すること、細胞の脂質、脂肪酸、ワックスエステル、および／またはトリグリセリドを得ること、ならびにバイオ燃料を生成するために得られた細胞脂質、脂肪酸、ワックスエステル、および／またはトリグリセリドを処理することを含む。別の実施形態において、バイオ燃料を生成する方法は、本発明の改変光合成微生物によって生成される脂質、脂肪酸、ワックスエステル、および／またはトリグリセリドを加工することを含む。さらなる実施形態において、バイオ燃料の生成方法は、本発明の改変光合成微生物によって生成される脂質、脂肪酸、ワックスエステル、および／またはトリグリセリドを得ること、ならびにバイオ燃料を生成するために、得られた細胞の脂質、脂肪酸、ワックスエステル、および／またはトリグリセリドを加工することを含む。特定の実施形態において、この改変光合成生物は、成長が低下するが、光合成を維持する条件下で成長する。
【０４３３】
バイオ燃料または特殊化学品、例えば、バイオディーゼルを生成するために微生物から脂質を加工する方法は、当技術分野で公知であり、利用可能である。例えば、トリグリセリドは、バイオディーゼルを生成するためにエステル交換されてもよい。エステル交換は、アルカリ触媒作用、酸触媒作用、またはリパーゼ触媒作用などの当技術分野で公知の方法のいずれか１つによって行うことができる（例えば、Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８，２（２）：１３０−１４３参照）。エステル交換の様々な方法は、例えば、バッチ反応器、超臨界アルコール、超音波反応器、またはマイクロ波照射の使用を利用する（このような方法は、例えば、Ｊｅｏｎｇ  ａｎｄ  Ｐａｒｋ，Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６，１３１（１−３）：６６８−６７９；Ｆｕｋｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．２００１，９２（５）：４０５−４１６；Ｓｈａｈ  ａｎｄ  Ｇｕｐｔａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ．２００８，２（１）：１−９；およびＣａｒｒｉｌｌｏ−Ｍｕｎｏｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ．１９９６，６１（２２）：７７４６−７７４９に記載されている）。このバイオディーゼルは、さらに、例えば、蒸留により、加工または精製することができるか、かつ／または米国特許出願公開第２００８／０２８２６０６号に記載されるように、バイオディーゼル安定剤をバイオディーゼルに添加することができる。
【０４３４】
本発明の特定の実施形態を以下の実施例により説明する。しかし、本発明は、多くの異なる形態で実施することができ、本明細書に記載された実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、本開示が網羅的かつ完全となり、当業者に本発明の範囲を十分に伝えるように、これらの実施形態が提供される。
【実施例】
【０４３５】
実施例１
異種細胞内標的ドメインに融合されるＤＧＡＴの発現および活性
いくつかの融合タンパク質は、シアノバクテリアにおける細胞成長および脂質生成にアシネトバクター属のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＡＤＧＡＴ）のＮ末端に融合される定義された異種細胞内標的ドメイン配列の影響を試験するために作製した。最初に、ＳＳ−ＡＤＧＡＴ融合は、シネココッカス・エロンガタス由来のメチル受容走化性タンパク質ＰＣＣ７９４２＿０８５８（ＰＣＣ７９４２＿０８５８のドメイン配向については図１を参照されたい）から誘導されたＮ末端シグナル配列にＡＤＧＡＴのＮ末端を付加することによって行った。
【０４３６】
ＡＤＧＡＴのＡＴＧ開始コドンを除去し、ＰＣＣ７９４２＿０８５８のＮ末端シグナル（ＳＳ）含有配列を、（ｉ）Ｎ末端の１２９個のヌクレオチド（ＳＳ、配列番号２１３）、（ｉｉ）Ｎ末端の１４４個のヌクレオチド（ＳＳ１５、配列番号２１４）、または（ｉｉｉ）ＰＣＣ７９４２＿０８５８のＮ末端の１５９個のヌクレオチド（ＳＳ３０、配列番号２１５）（膜標的ドメイン−ＤＧＡＴ融合タンパク質のドメイン配向については図２参照）、のＡＤＧＡＴのＮ末端に融合した。ＳＳ１５およびＳＳ３０の配列は、必要に応じて、膜でＤＧＡＴによる高い柔軟性を提供するために、ＰＣＣ７９４２＿０８５８からの余分なヌクレオチドを含む。これらの研究で使用されるＤＧＡＴは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とインフレームで融合されるＡＤＧＡＴのＣ末端修飾形態である。
【０４３７】
ＳＳ−ＡＤＧＡＴ−ＧＦＰ融合タンパク質のそれぞれを、ＩＰＴＧ誘導性のＰｔｒｃ  ＮＳ１ベクターにクローニングした。各融合タンパク質のシネココッカス・エロンガタスの形質転換体および対照を単離し、液体培養で成長させた後、ＩＰＴＧで誘導し、その後、ＧＦＰ発現、細胞成長、およびトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）生成について分析した。
【０４３８】
図３に示すように、ＳＳ−ＡＤＧＡＴ−ＧＦＰのＧＦＰ蛍光のレベルは、ＡＤＧＡＴ−ＧＦＰについて観察されたものよりわずかに低かったものの、ＡＤＧＡＴの誘導は、融合タンパク質の発現を示すＧＦＰ蛍光を増加させた。図４に示すように、ＳＳ−ＤＧＡＴ融合タンパク質（ＳＳ−ＡＤＧＡＴ−ＧＦＰ、ＳＳ１５−ＡＤＧＡＴ−ＧＦＰ、ＳＳ３０−ＡＤＧＡＴ−ＧＦＰ）の発現は、少なくとも１６８時間にわたって、ＡＤＧＡＴ（ＡＤＧＡＴ−ＧＦＰ）の発現と比較してシネココッカス・エロンガタス形質転換体の成長表現型を顕著に改善した。図５に示すように、全てのＳＳ−ＡＤＧＡＴ発現株は、ＴＡＧを生成する能力を保持する。
【０４３９】
次いで、ＳＳ−ＡＤＧＡＴ−ＧＦＰ融合タンパク質構築物および対照を、アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）を過剰発現するように改変したシネココッカス・エロンガタスに形質転換した（参照により援用される米国特許出願第６１／４２５，１７９号および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６５９３８号参照）。上記のように、各融合タンパク質および対照の形質転換体を単離し、液体培養で成長させた後、ＩＰＴＧで誘導し、その後、ＧＦＰ発現、細胞成長、およびトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）について分析した。上記と同様に、図６は、ＳＳ３０−ＡＤＧＡＴ−ＧＦＰ融合タンパク質（ＳＳ３０−ＡＤＧＡＴ−ＧＦＰ）が、少なくとも１６８時間にわたって、ＡＤＧＡＴ（ＡＤＧＡＴ−ＧＦＰ）の発現と比較して、ＡＣＰを過剰発現するシネココッカス・エロンガタス形質転換体の成長表現型を顕著に改善したことを示している。図７は、ＳＳ３０−ＡＤＧＡＴ−ＧＦＰを発現している株が、ＡＣＰの過剰発現と組み合わせた場合に、高レベルのＴＡＧを生成する能力を保持することを示している。
【０４４０】
第２に、シアノバクテリアにおける細胞成長および脂質生成へのＮ末端シグナル配列および膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）配列の寄与を比較するために、ｉｖ）Ｎ末端シグナル含有配列（ＳＳ３０、配列番号２１５）をＡＤＧＡＴ（ＳＳ３０−ＡＤＧＡＴ）に融合するか、ｖ）Ｎ末端シグナル含有配列（ＳＳ４８）＋２つの膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）含有配列をＡＤＧＡＴ（ＳＳ４８−ＴＭＤ−ＡＤＧＡＴ）に融合するか、またはｖｉ）ＴＭＤ含有配列をＡＤＧＡＴ（ＴＭＤ−ＡＤＧＡＴ）に融合し、３種の追加のＡＤＧＡＴ融合タンパク質を作製した。ＳＳ含有配列およびＴＭＤ含有配列は、シネココッカス・エロンガタスのメチル受容走化性タンパク質ＰＣＣ７９４２＿０８５８由来である（ＰＣＣ７９４２＿０８５８のドメイン配向については図１を参照されたい）。
【０４４１】
ＳＳ３０−ＡＤＧＡＴは、ＧＦＰがＡＤＧＡＴのＣ末端に融合されていないこと以外は上記のとおりであった。ＳＳ４８−ＴＭＤ−ＡＤＧＡＴについては、ＡＤＧＡＴのＡＴＧ開始コドンを除去し、ＰＣＣ７９４２＿０８５８のＮ末端シグナル含有配列（ＳＳ４８）＋２つのＴＭＤ含有配列（配列番号２１１）をＡＤＧＡＴのＮ末端に融合した。ＳＳ４８−ＴＭＤ配列は、配列番号１９９のアミノ酸１〜１３６を含有する。ＴＭＤ−ＡＤＧＡＴについては、ＡＤＧＡＴのＡＴＧ開始コドンを除去し、ＰＣＣ７９４２＿０８５８の開始メチオニンに続く２つのＴＭＤ含有配列（配列番号２１２）をＡＤＧＡＴのＮ末端に融合した。ＴＭＤ配列は、アミノ酸の１の位置にメチオニンを含有し、その後、配列番号１９９のアミノ酸６０〜１４２が続く。膜標的ドメイン−ＤＧＡＴ融合タンパク質のドメイン配向については図８を参照されたい。
【０４４２】
ＳＳ３０−ＡＤＧＡＴ、ＳＳ４８−ＴＭＤ−ＡＤＧＡＴおよびＴＭＤ−ＡＤＧＡＴ融合タンパク質のそれぞれを、ＩＰＴＧ誘導性Ｐｔｒｃ  ＮＳ１ベクターにクローニングした。ＳＳ３０−ＡＤＧＡＴ、ＳＳ４８−ＴＭＤ−ＡＤＧＡＴおよびＴＭＤ−ＤＧＡＴ融合タンパク質構築物を、対照と共に、アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）を過剰発現するように改変したシネココッカス・エロンガタスに形質転換した（参照により援用される米国特許出願第６１／４２５，１７９号および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６５９３８号参照）。各融合タンパク質および対照の形質転換体を単離し、液体培養で成長させた後、ＩＰＴＧで誘導して、その後、細胞成長およびトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）生成について分析した。
【０４４３】
図９は、全てのＡＤＧＡＴ融合タンパク質（ＳＳ３０−ＡＤＧＡＴ、ＳＳ４８−ＴＭＤ−ＡＤＧＡＴ、ＴＭＤ−ＡＤＧＡＴ）が、少なくとも８９時間にわたって、ＡＤＧＡＴの発現と比較して、ＡＣＰを過剰発現しているシネココッカス・エロンガタス形質転換体の成長表現型を顕著に改善したことを示す。図１０および図１１は、ＡＣＰの過剰発現と組み合わせた場合に、ＳＳ３０−ＡＤＧＡＴ−ＧＦＰについて上記で見られたものと同様に、誘導後４８時間および７２時間のそれぞれ時点で、ＳＳ３０−ＡＤＧＡＴ−発現株が、高レベルのＴＡＧを生成する能力を保持していることを示す。ＳＳ４８−ＴＭＤ−ＡＤＧＡＴおよびＴＭＤ−ＡＤＧＡＴ発現株は、ＡＣＰの過剰発現と組み合わせた場合に、ＴＡＧを生成したが、ＴＡＧレベルはＳＳ３０−ＡＤＧＡＴ融合株で見られるほど高くはなかった。
【０４４４】
全体として、これらのデータは、細菌のＮ末端シグナル含有配列、細菌のＮ末端シグナル含有配列と膜貫通ドメイン含有配列、または膜貫通ドメインのみを含む配列を有するＤＧＡＴのＮ末端修飾が、シアノバクテリアにおけるＤＧＡＴ発現と時々関連する不都合な成長表現型を減少させるが、ＴＡＧおよびワックスエステル（ＷＥ）生成に必要な酵素活性を保持していることを示す。本明細書に記載の他の可能性の中で、これらの観察は、膜へのＤＧＡＴの標的を可能にする細菌膜タンパク質由来の任意の膜標的配列が、光合成細菌などの光合成微生物（例えば、シアノバクテリア）の成長特性を改善するのに十分であることを示唆している。改善された成長特性および堅牢な脂質生成との組み合わせは、ＤＧＡＴのＮ末端に融合された細菌のＮ末端シグナル配列を用いて行われる。
【図１】
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【図２】
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【図７】
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【図８】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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