(57)【要約】  核内因子ｋＢ必須修飾因子結合（ＮＥＭＯ）ドメイン又はその断片とＭＣｏＴＩ−Ｉ／ＩＩ又はその断片とを含む新規の融合タンパク質、並びに炎症性疾患及び他の医学的状態を治療するためのそれらの使用。
2015509949.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＢＤ又はその断片とＭＣｏＴＩ−Ｉ／ＩＩ又はその断片とを含む融合タンパク質。
【請求項２】
融合タンパク質がＭＣｏＴＩ−Ｉ／ＩＩのループ６をＮＢＤ又はその断片と置換することにより形成される、請求項１の融合タンパク質。
【請求項３】
ＮＢＤが配列番号４により表される、請求項２の融合タンパク質。
【請求項４】
融合タンパク質が直鎖状分子である、請求項２の融合タンパク質。
【請求項５】
融合タンパク質が配列番号１０により表される配列を有する、請求項４の融合タンパク質。
【請求項６】
融合タンパク質が環状ペプチドである、請求項２の融合タンパク質。
【請求項７】
融合タンパク質が配列番号９により表される、請求項２の融合タンパク質。
【請求項８】
ＮＢＤの断片が配列番号２２により表される、請求項２の融合タンパク質。
【請求項９】
ＮＢＤの断片が配列番号２３により表される、請求項２の融合タンパク質。
【請求項１０】
ＮＢＤ又はその断片が融合タンパク質のＮ末端にある、請求項２の融合タンパク質。
【請求項１１】
ＮＢＤ又はその断片が融合タンパク質のＮ末端の直ぐにはない、請求項２の融合タンパク質。
【請求項１２】
融合タンパク質が配列番号１３〜２１から成る群から選択される配列により表される、請求項１０の融合タンパク質。
【請求項１３】
融合タンパク質が１つ以上のリンカーを含む、請求項１の融合タンパク質。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載の融合タンパク質と薬学的に許容可能な担体を含有する薬学的組成物。
【請求項１５】
被験者における炎症性疾患を治療するための請求項１〜１３のいずれかに記載の融合タンパク質の使用。
【請求項１６】
被験者の医学的状態を治療するための請求項１〜１３のいずれかに記載の融合タンパク質の使用であって、医学的状態が少なくとも一部は核内因子ｋＢ（ＮＦ−κβ）の活性化に起因する、使用。
【請求項１７】
医学的状態が、移植片対宿主疾患、敗血症、筋ジストロフィー、悪液質、心臓肥大、心臓虚血、再灌流傷害、脊髄損傷、及び癌から成る群から選択される、請求項１６の融合タンパク質の使用。
【請求項１８】
被験者の炎症性疾患を治療する方法において、請求項１〜１３のいずれかの融合タンパク質を含有する薬学的組成物の治療的有効量を前記被験者に投与することを含む、方法。
【請求項１９】
哺乳動物におけるＮＦ−κβ経路の活性化を阻害する方法において、請求項１４に記載の薬学的組成物の治療的有効量を哺乳動物に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年２月２３日に出願され、「ＮＥＭＯ  ＢＩＮＤＩＮＧ  ＤＯＭＡＩＮ  ＦＵＳＩＯＮ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ」と題された米国特許出願第６１／６０２２６４号に基づく優先権の利益を主張するものである。上記出願の開示全体は、出典明示によりその全体が本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
核内因子ｋＢ（ＮＦ−κβ）必須調節因子（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）結合ドメイン（ＮＥＭＯ結合ドメイン又はＮＢＤ）は、ＩｋＢキナーゼ（ＩＫＫ）複合体の活性化をブロックする。ＮＢＤは、細胞に導入された場合、炎症に誘導されるＮＦ−κＢの活性化を選択的にブロックすることが示された。この点から、ＮＢＤは治療薬として研究されている。
【０００３】
しかし、ＮＢＤが有効であるためには、それが細胞に送達される必要がある。したがって、細胞へのＮＢＤの導入を促進するための送達ビヒクルとして細胞透過性ペプチドが使用されている。しかし、そのようなペプチドは治療域が極めて狭い（すなわち、中毒量と治療量との差がほとんどない）ことが見出されており、治療薬としてのペプチドの適用を大幅に制限している。抗炎症動物モデルにおいて、既知のＮＢＤペプチドは１〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で有効性を示し始めるが、毒性がマウスにおいて５０ｍｇ／ｋｇを超える用量で観察されている。この毒性は、同様の毒性が不活性変異体ＮＢＤペプチドで、又は細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）単独が送達される場合に観察されることから、そのようなＮＢＤペプチドを送達するのに使用される高濃度のＣＰＰによって生じるようである。したがって、より大きい治療域を有する強力な抗炎症分子が必要である。
【発明の概要】
【０００４】
開示された融合タンパク質は、ＮＢＤ又はその断片とＭＣｏＴＩ−Ｉ／ＩＩ又はその断片とを含む。好ましくは、融合タンパク質は、ＭＣｏＴＩ−Ｉ／ＩＩのループ６をＮＢＤ又はその断片と置換して形成される。ＮＢＤは例えば配列番号４、２２、又は２３により表され得る一方、融合タンパク質は配列番号９、１０、又は１３〜２１により表され得る。好ましくは、ＮＢＤ又はその断片は、融合タンパク質のＮ末端であり、ＭＣｏＴＩ−Ｉ／ＩＩのループ６に取って代わる。融合タンパク質は、環状又は直鎖状であってもよく、１つ以上のリンカーをさらに含んでもよい。融合タンパク質はまた薬学的に許容可能な担体中の薬学的組成物として処方（製剤化）することもできる。
【０００５】
ここに開示された融合タンパク質は、被験者の炎症性疾患および他の医学的状態を治療するのに使用することができる。１つの実施態様において、ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−Ｉ／ＩＩ融合タンパク質を含む薬学的組成物は、それを必要とする被験者に治療的有効量で投与することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】ＭＣｏＴＩ−Ｉ及びＭＣｏＴＩ−ＩＩの構造の実例を示す図である。
【図２】ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩが、ＮＢＤペプチドより大きな効力でＮＦ−κβシグナル伝達を阻害することを示すグラフである。
【図３】細胞ベースのアッセイにおけるＮＦ−κβシグナル伝達のＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩ（グラフＡ）及びＮＢＤペプチド（グラフＢ）阻害に関する用量依存的関係を示す２つのグラフを含む。ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩは、このアッセイではＮＢＤペプチドより１０６倍強力である。
【図４】ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩがマウスＣＰＥモデルにおいて炎症を低減することを示すグラフである。
【図５】ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩがマウスＣＰＥモデルにおいて炎症を低減することを示す別のグラフである。ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩは、ＮＢＤペプチドより５０００倍強力である。
【図６】ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩがマウスＣＩＡモデルにおいて関節炎スコアを低下させることを示すグラフである。
【図７】ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩが、マウスＣＩＡモデルにおいてバックグラウンドレベルに対し足腫脹を低減することを示すグラフである。
【図８】ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩが、マウスＣＩＡモデルにおいて関節の関節炎損傷を防ぐことを示すグラフである。
【図９】ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩが、既存の抗関節炎薬と比較して組織病理学的総合スコアの著しい減少を示すことを示すグラフである。
【図１０】ＮＢＤ配列に下線が付された、ＮＢＤ及びＭＣｏＴＩ−ＩＩを含むヌクレオチド及びポリペプチドの配列を記載する図である。
【図１１】ＮＢＤ配列に下線が付された、ＮＢＤ及びＭＣｏＴＩ−ＩＩを含むヌクレオチド及びポリペプチドのより多くの配列を記載する図である。
【図１２】ＮＢＤ配列に下線が付され、リンカー残基が太字にされた、ＮＢＤ及びＭＣｏＴＩ−ＩＩを含むヌクレオチド及びポリペプチドのより多くの配列を記載する図である。
【図１３】ＮＢＤ配列に下線が付された、ＮＢＤ及びＭＣｏＴＩ−ＩＩを含むヌクレオチド及びポリペプチドのさらなる配列を記載する図である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
定義
本明細書で使用されるとき、次の用語及びその変形形態は、そのような用語が使用される文脈が、異なる意味を明らかに意図しない限り以下に示された意味を有する。
【０００８】
数値に関して使用される場合の「約」は、示された量のプラスマイナス１０パーセントを意味する。例えば、限定するものではないが、「約１０」は９から１１を意味し、「約１０％」は９％から１１％を意味する。
【０００９】
「アミノ酸」は、天然のアミノ酸及びアミノ酸類似体（すなわち、Ｄ及びＬ光学異性体を含む非天然、合成、及び修飾アミノ酸）を指す。
【００１０】
「生物活性ペプチド」は、ＮＢＤなどの薬学的効果を有するペプチドを指す。生物活性ペプチドは、ペプチド模倣体であってもよい。生物活性ペプチドは、プレプロペプチドの形態で細胞において合成されたタンパク質であってもよく、活性な生成物を得るために次いで切断及び修飾される。生物活性ペプチドは、標的細胞上の特定の受容体に対する結合相互作用を通じて生理的機能を最終的に調節し、生理的応答の誘導をもたらす、ホルモン様又は薬物様活性を有するペプチドであってもよい。その機能特性に従って生物活性ペプチドは、抗菌性、抗血栓性、降圧性、オピオイド性、免疫調節性、無機物結合性、及び抗酸化性などに分類することができる。
【００１１】
「細胞透過性ペプチド」（ＣＰＰ）は、他の部分と一緒に細胞の形質膜を越えて移行することができるポリペプチドを指す。細胞透過性ペプチドは、他の分子の細胞取り込みを促す特に治療目的のための一般的に短いペプチドである。ＣＰＰは、共有結合を介した化学結合又は非共有相互作用のどちらかを通じて送達される分子と結合することができる。
【００１２】
「環状ペプチド」は、アミノ末端及びカルボキシル末端自体が、環状鎖を形成するペプチド結合により連結されているポリペプチド鎖である。
【００１３】
「断片」は、親又は野生型分子に関して切断、欠失、及び／又は修飾を有する分子、特にアミノ酸分子を指す。アミノ酸残基／タンパク質の修飾は当分野でよく知られており、例えば、アシル化、メチル化、リン酸化、硫酸化などが含まれる。
【００１４】
ポリペプチドに関して「融合された」及び「融合」は、２つ以上の前駆体ポリペプチドをつなげて形成されたポリペプチドを指す。これらのポリペプチドは直接つなぎ合わされてもよく、又は他のアミノ酸残基（すなわち、リンカー）がそれらの間にあってもよい。そのため、共に融合されるポリペプチドは、直接又は間接的に（すなわち、リンカーなどを介して）接続され得る。本明細書で使用されるとき、「融合タンパク質」は、ＮＢＤ又はその断片及びＭＣｏＴＩ−Ｉ／ＩＩ又はその断片の組み合わせを主として指す。本融合タンパク質は、細菌合成又は自動合成などの任意の手段により作製できることが理解されるべきである。
【００１５】
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、及び「ヌクレオチド配列」は互換的に使用され、任意の長さのＤＮＡ（すなわち、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミド、ベクター、ウイルスゲノム、単離ＤＮＡ、プローブ、プライマーなど）、ＲＮＡ（すなわち、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）、又はＤＮＡ及びＲＮＡの混合物のポリマーを指す。核酸は、一本鎖もしくは二本鎖、直鎖状もしくは環状、及び／又は天然又は合成ポリヌクレオチドであってもよい。さらに、核酸は、メチル化ヌクレオチド及び／又はヌクレオチド類似体などの非自然発生のヌクレオチドを含み得る。
【００１６】
ポリペプチドに関して「直鎖状」は、共に結合されたアミノ酸の単一の直鎖状ポリマー鎖を含むポリペプチドを指す。直鎖状ポリペプチドは、例えば、自動合成装置を用いて又は組換え方法を通じて形成することができる。直鎖状ポリペプチドは、ジスルフィド結合を含んでもよい。
【００１７】
「ループ６」は、ＭＣｏＴＩ−Ｉ／ＩＩタンパク質のループ６を指す（配列番号２７）。
【００１８】
「医学的状態（Medical condition）」は、疾患及び疾患の症状の両方を指す。
【００１９】
「ＭＣｏＴＩ−Ｉ／ＩＩ」は、配列番号２５又はその部分を含む分子又はその断片を指す。この配列中のアミノ酸１５は、リジン又はグルタミンのどちらかであってもよく、アミノ酸１６は、リジン又はアルギニンのどちらかであってもよい。野生型ＭＣｏＴＩ−Ｉにおいて、アミノ酸１５及び１６はそれぞれグルタミン及びアルギニンであるが、野生型ＭＣｏＴＩ−ＩＩにおいてアミノ酸１５及び１６は、それぞれリジン及びリジンである。ＭＣｏＴＩ−Ｉ／ＩＩの断片は、例えば、ループ６が欠失されている断片を含み得る。
【００２０】
「ＮＢＤ」又は「ＮＥＭＯ結合ドメイン」は、核内因子κβ（ＮＦ−κβ）必須調節因子結合ドメインペプチド配列を指す。「ＮＢＤ」は、末端グルタミン残基を有する又は有さない、配列番号４により表されるＮＢＤの完全長配列を指す。「ＮＢＤ又はその断片」は、配列番号４により表される完全長ＮＢＤペプチド配列、又は本明細書に開示された融合タンパク質を作製するのに使用することができるＮＢＤペプチド配列の薬学的に有効な断片、例えば、配列番号２２及び配列番号２３により表されるＮＢＤ断片のどちらかを指す。ＮＢＤの断片は、好ましくは、完全長ＮＢＤ配列の約４個のアミノ酸から約１０個のアミノ酸を含み、ＮＢＤの切断、アミノ酸欠失、及び／又はアミノ酸修飾を含み得る。
【００２１】
「ＮＢＤペプチド」は、ＮＢＤ及びＣＰＰ（ＭＣｏＴＩ−Ｉ／ＩＩ又はその断片以外の）を含む分子を指す。ＮＢＤペプチドは、ＮＥＭＯとＩＫＫα及びβとの相互作用を妨げることによりｉｋＢキナーゼ（ＩＫＫ）キナーゼ複合体の活性化をブロックすることが知られている。
【００２２】
「薬学的」は、被験者における疾患の治癒、緩和、治療又は予防を含む、被験者の生理的機能を回復、修復又は修正する上での効果を指す。「薬学的組成物」及び「医薬」は、薬学的効果を有する組成物である。
【００２３】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は互換的に使用され得、ペプチド結合を介して結合された４個以上のアミノ酸を含むアミノ酸のポリマーを指す。タンパク質は、直鎖状、分枝状、又は環状であり得、自然発生のアミノ酸及び／又はアミノ酸類似体を含み得る。
【００２４】
「被験者」は、本明細書に記載されたような薬学的組成物で治療される個体を指す。被験者は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。
【００２５】
「治療的有効量」は、被験者に投与される場合、疾患又は他の医学的状態の治療を含む、被験者の生理的機能の回復、修復又は修正に効果を有するのに十分な組成物の量を指す。
【００２６】
「治療域」は、中毒量と治療量との投与量差を指す。
【００２７】
「治療」には、予防的治療、並びに被験者が炎症及び／又は炎症性疾患もしくは状態などの疾患又は他の医学的状態を経験した後の治療の両方が含まれる。例えば、炎症の予防的治療には、被験者が炎症及び／又は炎症性疾患もしくは状態を経験する前の組成物の投与が含まれる。疾患又は状態の「治療」には、低減、改善、除去、ブロック、阻害などが含まれる。
【００２８】
「含む（comprise）」並びに「含む（comprising）」及び「含む（comprises）」などのこの用語の変形形態は、他の追加物、構成要素、整数又はステップを排除することを意図しない。本明細書で使用される用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」並びに類似の指示対象は、文脈におけるそれらの使用の別段の指示がない限り、単数形及び複数形の両方を含むと解釈されるべきである。「本質的に〜から成る（consisting essentially of）」及び該用語の変形形態は、本質的に重要な他の構成要素又はステップの除外を意味するものとする。故に、列挙された構成要素から本質的に成る組成物は、微量汚染物質及び薬学的に許容可能な担体を除外しないことになる。「〜から成る（consisting of）」は、微量を上回る他の構成要素又はステップの除外を意味するものとする。例えば、ポリペプチドが任意の他のアミノ酸は含有しないが列挙されたアミノ酸配列を含有する場合、ポリペプチドはアミノ酸配列「から成る」。そのようなアミノ酸配列が、ほんの数個の追加のアミノ酸残基、すなわち、約１から約１０個の追加の残基、より好ましくは１〜５個と一緒に存在する場合、ポリペプチドはアミノ酸配列から「本質的に成る」。アミノ酸配列がポリペプチドの最終アミノ酸配列の少なくとも一部である場合、ポリペプチドはアミノ酸配列を「含む」。
【００２９】
融合タンパク質
図１〜１３に示されているように、本発明は、ＭＣｏＴＩ−Ｉ／ＩＩ又はその断片に融合されたＮＢＤ又はその断片を含む融合タンパク質に関する。ＮＢＤは、ＮＦ−κβシグナル伝達経路においてＩκβ複合体の活性化をブロックしてＮＦ−κβの活性化をブロックすることが知られている。Ｉκβの活性化のブロックはＮＦ−κβの活性化を妨げ、これによりＮＦ−κβが細胞の細胞質に進入し転写因子として作用するのを妨げる。１つのそのような融合タンパク質がＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩであり、炎症性疾患及び他の医学的状態を治療する方法において医薬として使用することができる。
【００３０】
ＮＢＤ
本融合分子において使用されるＮＢＤは、好ましくは、配列番号４により表された１１アミノ酸配列である。しかし、この１１アミノ酸配列の治療的に活性な断片もまた、本融合タンパク質を形成するのに使用することができる。例えば、配列番号２２により表された６アミノ酸ＮＢＤ配列（１〜３位の最初の３つのアミノ酸の欠失及びＮＢＤの１０〜１１位の最後の２つのアミノ酸の欠失）が、本発明の分子を形成するのにＭＣｏＴＩ−Ｉ／ＩＩ又はその断片に融合されてもよい。あるいは、配列番号２３により表された９アミノ酸配列（ＮＢＤの１０〜１１位のアミノ酸の欠失）がＭＣｏＴＩ−Ｉ／ＩＩ又はその断片に融合されてもよい。
【００３１】
ＭＣｏＴＩ−Ｉ／ＩＩ
ＭＣｏＴＩ−Ｉ（配列番号２４）及びＭＣｏＴＩ−ＩＩ（配列番号３）は、システインノット微小タンパク質（ＣＫＭ）である。その天然形態において、これらのポリペプチド（図１に示された１）は、ループ１（１１）、ループ２（１２）、ループ３（１３）、ループ５（１５）、及びループ６（１６）、及びジスルフィド結合（２０）を含む複数のループを含む。ＭＣｏＴＩ−Ｉ及びＭＣｏＴＩ−ＩＩは、環状ペプチドとして見出されもしくは作製されてもよく（参照番号３０により示されたペプチド結合により）、又は直鎖状構築物として作製されてもよい。
【００３２】
ＣＫＭは、典型的には５０個未満のアミノ酸から成る小さいペプチドである。ＣＫＭは、一般的に分子内ジスルフィド結合及び小さい三重らせんβシートに基づき定義された構造を有する薬理活性物質である［（例えば、Ｃｒａｉｋ  ＤＪ（２００１）Ｐｌａｎｔ  ｃｙｃｌｏｔｉｄｅｓ：ｃｉｒｃｕｌａｒ、ｋｎｏｔｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｏｘｉｎｓ．Ｔｏｘｉｃｏｎ  ３９：１８０９〜１３頁、この内容は全体が参照により本明細書に組み込まれている）参照］。その独特の構造は、信じられないほど高い熱的、化学的及び酵素的安定性に関与している。ＣＫＭは６５℃で数週間煮沸され、インキュベートされ得、又はさらには構造的及び機能的完全性を失うことなく１Ｎ  ＨＣｌ又は１Ｎ  ＮａＯＨ中に置かれ得る［（例えば、Ａｕｓｔｉｎ  Ｊ（２００９）Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｃｙｃｌｏｔｉｄｅ  ＭＣｏＴＩ−Ｉ．Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ  １０：２６６３〜７０頁；Ｆｒｉｄｍａｎ  ＪＳら、（２０１０）Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＪＡＫ１  ａｎｄ  ＪＡＫ２  ｉｓ  ｅｆｆｉｃａｃｉｏｕｓ  ｉｎ  ｒｏｄｅｎｔ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＮＣＢ０２８０５０．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８４：５２９８〜３０７；Ｋｈａｊａ  Ｋら、（２０１０）Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎｓ  Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＮＥＭＯ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ３：１１０〜１２４頁；Ｋｉｍｕｒａ  ＲＨら、（２００９）Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｋｎｏｔｔｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ａ  ｎｅｗ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６９：２４３５〜４２頁；及びＰｅｔｅｒｓｏｎ  Ｓら、（２０１１）Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｐｏｒｔａｂｅｌｌａ  ｍｕｓｈｒｏｏｍｓ  ｏｎ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ、ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ、ａｎｄ  ｂｏｄｙ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｉｌｕｔｅ  ｂｒｏｗｎ  ｎｏｎ−ａｇｏｕｔｉ（ＤＢＡ１）ｍｉｃｅ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｏｄｓ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ  １：２７９〜２９６頁）参照］。ＣＫＭは、髄腔内投与される鎮痛薬、ジコノチド（例えば、Ｄｏｇｇｒｅｌｌ  ＳＡ（２００４）Ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ  ｚｉｃｏｎｏｔｉｄｅ  ｆｏｒ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｐａｉｎ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ  １３：８７５〜７頁参照）を含む。
【００３３】
ＭＣｏＴＩ−Ｉ又はＭＣｏＴＩ−ＩＩは、本明細書に開示された融合タンパク質の骨格を形成する。ＭＣｏＴＩ−Ｉの配列は配列番号２５（図１３）により示され、一方、ＭＣｏＴＩ−ＩＩの配列は配列番号３（図１０）により示される。ＭＣｏＴＩ−Ｉ及びＭＣｏＴＩ−ＩＩは、トリプシン阻害剤ＣＫＭサブファミリーのメンバーである。
【００３４】
ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩ
本明細書に開示されたＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−Ｉ／ＩＩは、（１）ＮＢＤ（配列番号４により表された）、又はその断片、及び（２）ＭＣｏＴＩ−Ｉ／ＩＩ（配列番号２５により表された）、又はその断片の融合により形成される。１つの例において、直鎖形態のＭＣｏＴＩ−ＩＩが本ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩ融合タンパク質を形成するのに使用されてもよく、配列番号１０により表され得る。好ましくは、融合タンパク質は、ＭＣｏＴＩ−Ｉ／ＩＩのループ６（図１に示された）をＮＢＤ又はその断片と置換して形成される。ＭＣｏＴＩ−ＩＩのループ６は、配列番号２７により表される。そのため、最終融合タンパク質において、上述のアミノ酸配列は好ましくは存在しない。融合は直接、すなわちペプチド単位間にいずれのアミノ酸残基もない状態であってもよく、又は１つ以上のリンカーを介していてもよい。他の実施態様において、本発明の融合タンパク質は環状であってもよく、並びに／又は直鎖状及び環状の両方であってもよい。さらに他の実施態様において、ＮＢＤ又はその断片は、ＭＣｏＴＩ−ＩＩタンパク質配列の他の位置に挿入されてもよい。例えば、本明細書に開示された本発明の融合タンパク質は、ループ６及びＭＣｏＴＩ−ＩＩの１つ以上の他のループの少なくとも一部を置換して形成されてもよく、並びに／又は本明細書に開示された本発明の融合タンパク質は、ループ６の少なくとも一部を置換して形成されてもよく、並びに／又は本明細書に開示された本発明の融合タンパク質は、ＭＣｏＴＩ−ＩＩのループ６以外のループの少なくとも一部を置換して形成されてもよい。
【００３５】
１つの実施態様において、ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩは配列番号１１により表すことができる。この融合タンパク質において、ＮＢＤは、１〜３位に３つのアミノ酸欠失、及び１０及び１１位に２つのアミノ酸欠失を有する。このＮＢＤ断片は、配列番号２２により表される。このＮＢＤ断片は、好ましくは融合タンパク質のＮ末端に位置する。他の実施態様において、上記ＮＢＤ断片は、例えば配列番号１４により表されるように、融合タンパク質のＮ末端に位置しなくてもよい。例えば、ＮＢＤ断片は、融合タンパク質のＮ末端のすぐ側にある１つ以上のリンカーに続いてもよい。
【００３６】
あるいは、ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩは、配列番号１２により表すことができる。この融合タンパク質において、ＮＢＤは１０及び１１位に２つのアミノ酸欠失を有する。このＮＢＤ断片は、配列番号２３により表される。該ＮＢＤ断片は、融合タンパク質のＮ末端に位置する。他の実施態様において、上記ＮＢＤ断片は、例えば配列番号１５により表されるように、融合タンパク質のＮ末端に位置しなくてもよい。例えば、このＮＢＤ断片は、融合タンパク質のＮ末端のすぐ側にある１つ以上のリンカーに続いてもよい。
【００３７】
別の実施態様において、ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩは配列番号１３により表すことができる。この融合タンパク質において、ＮＢＤはＭＣｏＴＩ−Ｉ／ＩＩ骨格のＮ末端のすぐ側になくてもよい。ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩは、ＮＢＤ（又はその断片）が１つ以上のリンカーにより隣接された配列番号１６〜２１により表すこともできる。リンカーは、融合タンパク質のＮ末端もしくはＮ末端付近、及び／又はＣ末端もしくはＣ末端付近に位置してもよい。リンカーは、ＭＣｏＴＩ−Ｉ／ＩＩのフレームワーク内でのＮＢＤ（又はその断片）の柔軟性を向上させるために使用することができる。好ましくは、リンカーはＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒである。リンカーはよく知られている。任意のタイプ及び数のリンカーが使用され得る。例えば、３つを超えるアミノ酸リンカーが使用されてもよく、及び／又はより長いリンカーが使用されてもよい。他の実施態様において、リンカーは取り除かれてもよい。
【００３８】
代替の実施態様において、ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−Ｉ／ＩＩペプチドは、ＮＢＤ配列のサブセット（配列番号１１、配列番号１２）、又はＮＢＤ配列がＮ末端のすぐ側にないサブセット（配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５）を含有してもよい。あるいは、ＮＢＤ配列は、ＭＣｏＴＩ−ＩＩ骨格のフレームワーク内でのＮＢＤの柔軟性を向上させるために、１つ（配列番号１６、配列番号１９）、２つ（配列番号１７、配列番号２０）又は３つ（配列番号１８、配列番号２１）のリンカー（Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ）もＮＢＤのＮ及びＣ末端に含有することができる。
【００３９】
直鎖状ＭＣｏＴＩ−Ｉ／ＩＩ
代替の実施態様において、本発明は、インビボで生物活性ペプチドを送達するための直鎖状ＭＣｏＴＩ−Ｉ／ＩＩ分子の使用を含み得る。好ましくは、生物活性ペプチドは、ＭＣｏＴＩ−Ｉ／ＩＩ分子のＮ末端に融合される（又はさもなければ共有結合される）。ＭＣｏＴＩ−Ｉ／ＩＩ部分もまた、好ましくはＭＣｏＴＩ−Ｉ／ＩＩ分子のループ６を欠き、生物活性ペプチドがループ６の代わりに付加される。
【００４０】
製造方法
本融合タンパク質は、当分野に知られている方法により製造することができる。例えば、Ｆｍｏｃベースの固相ペプチド合成などの自動化ポリペプチド合成が、本タンパク質を作製するのに行われてもよい。あるいは、本融合タンパク質は、細菌、酵母、昆虫、又は哺乳動物細胞を用いるなど組換え方法により作製することができる。ＨＥＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、及び当分野に知られている他の細胞などの様々な細胞系が、本タンパク質を組換え的に作製するのに使用され得る。
【００４１】
組換え的に本融合タンパク質を作製する場合、適切なポリヌクレオチド及びベクターが選択される。例えば、配列番号８により表された単離ポリ核酸分子が、細菌合成に使用されてもよい。好ましくは、ポリ核酸はＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。好ましくは、ベクターは、タンパク質の効率的なトランスフェクション及び効率的な発現に必要な調節エレメントの全てを含む。そのようなベクターは当分野でよく知られており、任意の適切なベクターがこの目的のために選択され得る。組換え細胞のトランスフェクション及び培養は、同様に当分野でよく知られている。好ましくは、そのような組換え細胞及びその任意の子孫細胞は、本融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを含む。そのような細胞系は、本明細書に記載された融合タンパク質（例えば、ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩ）を連続的に、又はベクターに応じて誘導／活性化時に発現することができる。
【００４２】
本融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、代替の実施態様において、融合タンパク質を被験者に送達するために被験者に直接投与することができる。そのような送達は、当分野に知られている遺伝子療法ベクター及びプロトコルを手段とするであろう。
【００４３】
本融合タンパク質の製造後、そのようなタンパク質は、本明細書に記載された融合タンパク質を含む、すなわち、ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−Ｉ／ＩＩ、及び薬学的に許容可能な賦形剤を含む薬学的組成物として処方することができる。薬学的組成物は、例えば、乳化剤、緩衝液、不活性（ｉｎｅｒｔ）／不活性（ｉｎａｃｔｉｖｅ）成分、糖、塩などを含むことができる。好ましくは、薬学的組成物は経口投与される。しかし、薬学的組成物は、注射、経口、経皮、及び／又は局所などの（ただし、これらに限定されない）いずれの方法での投与にも適し得る。例えば、経口形態で提供される場合、薬学的組成物は次の特性、すなわち、酵素抵抗性、胃液中での安定性及びＧＩ膜透過性を有するように処方されてもよい。
【００４４】
治療
ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−Ｉ／ＩＩは、ＮＦ−κβの活性化を伴う多くの異なる医学的状態、特に炎症性状態又は疾患を、ＮＦ−ｋＢ経路のＴＮＦα媒介活性化を阻害して治療する方法において医薬として使用することができる。本明細書に記載された本発明のタンパク質、ポリ核酸、及び／又はベクターは、炎症性疾患又は状態を治療するための医薬として使用することができる。この点で、本発明は、ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩ、本明細書に記載された単離ポリ核酸分子及び／又はベクター、及び／又は本発明による薬学的組成物が患者に投与される、炎症性疾患又は状態を治療するための方法に関する。本発明の融合タンパク質、ポリ核酸、及び／又はベクターは単独で、又は炎症性疾患もしくは状態並びに／又は他の疾患及び状態を治療する他の医薬に加えて投与することができる。例えば、本発明の融合タンパク質、ポリ核酸、及び／又はベクターは、他の既知の医薬と共に治療計画の一環として投与することができる。他の実施態様において、本明細書に記載された本発明のタンパク質、ポリ核酸、及び／又はベクターは医薬として使用されて、該医薬を投与すると改善するように思われるいずれかの他の疾患又は状態を治療することができる。
【００４５】
本明細書に記載された本発明のタンパク質、ポリ核酸、及び／又はベクターは、ＮＦ−κβ経路の活性化を阻害及び／又はブロックするのに使用することができる。ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、及びＩＬ−１などの炎症性メディエーターは炎症性疾患の発症機序において重要であり、ＮＦ−κＢの活性化により制御されており、そのためこの分子をブロックすることはそのような状態を治療し得る。ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−Ｉ／ＩＩは、既知の細胞透過性ＮＢＤペプチドより１０６倍強力であることが発見された。効力におけるこの改善は、インビボでの炎症性損傷（例えば、カラゲニン足浮腫（ＣＰＥ）マウスモデルで示されるような）を改善するのに必要とされる投与量の５０００倍の減少になった。したがって、ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−Ｉ／ＩＩは、炎症性疾患を治療するための強力な経口投与可能な薬剤である。
【００４６】
本明細書に記載された方法を用いて治療することができる炎症性疾患及び／又は状態には、アルツハイマー病、強直性脊椎炎、関節炎（すなわち、変形性関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎）、癌、浮腫、腫脹、喘息、アテローム性動脈硬化、クローン病、大腸炎、皮膚炎、憩室炎、線維筋痛、肝炎、過敏性腸症候群、全身性エリテマトーデス、腎炎、パーキンソン病、潰瘍性大腸炎、呑酸／胸焼け、座瘡、喘息、アテローム性動脈硬化、気管支炎、癌、心臓炎、セリアック病、慢性パン（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｐａｎ）、肝硬変、認知症、糖尿病、ドライアイ、浮腫、気腫、湿疹、胃腸炎、歯肉炎、心臓疾患、高血圧、インスリン耐性、間質性膀胱炎、関節痛／関節炎／関節リウマチ、メタボリック症候群（症候群Ｘ）、筋炎、腎炎、肥満、骨減少、骨粗鬆症、歯周病、多発性軟骨炎、乾癬、副鼻腔炎、痙攣性結腸、シェーグレン症候群、全身性カンジダ症、腱炎、ＵＴＩ、膣炎、呼吸器アレルギー性疾患、過敏性肺疾患、アナフィラキシー又は過敏性反応、薬剤アレルギー、昆虫刺傷アレルギー、炎症性腸疾患、限定されないが自己免疫性血液疾患、自己免疫性甲状腺炎、ベーチェット病、グレーブス病、移植片拒絶、移植片対宿主疾患などの自己免疫疾患などの慢性もしくは急性疾患又は状態が含まれるが、これらに限定されない。さらなる状態及び疾患には、虚血再灌流傷害、サイトカイン誘導毒性などが含まれる。好ましくは、関節炎及び腫脹などの状態が治療される。
【００４７】
本明細書に開示された本発明の融合タンパク質、ポリ核酸、及び／又はベクターは、特定の炎症性疾患又は状態などの特定の疾患又は状態を防ぐのに使用することができる。例えば、本明細書に開示された本発明の融合タンパク質、ポリ核酸、及び／又はベクターは、関節炎性関節損傷を防ぐのに使用することができる。
【００４８】
核内因子κＢ（ＮＦ−κＢ）の活性化が、ヒトデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）におけるジストロフィン欠損から生じる筋肉変性に寄与する、筋ジストロフィー及び悪液質などの筋骨格疾患など、ＮＦ−κＢが病理において役割を果たす他の状態も本発明で治療することができる。また、心臓肥大、虚血、及び再灌流傷害などの心臓状態；脊髄損傷；敗血症；並びに癌も含まれる。例えば、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫において、恒常的ＮＦ−κＢ活性はＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−Ｉ／ＩＩにより抑制することができる。
【実施例】
【００４９】
ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩの合成
ＮＢＤ配列（配列番号４）を、図１に示されているようにループ６を置換してＭＣｏＴＩ−ＩＩ（配列番号３）に移植した。合成は、２つの方法で達成した：１）細菌での発現［（例えば、Ａｕｓｔｉｎ  Ｊら、（２００９）Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｃｙｃｌｏｔｉｄｅ  ＭＣｏＴＩ−Ｉ．Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ  １０：２６６３〜７０頁、及びＳｃｈｍｏｌｄｔ  ＨＵら、（２００５）Ａ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄ  ｒｉｃｈ  ｃｙｓｔｉｎｅ  ｋｎｏｔ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｂａｒｎａｓｅ  ａｓ  ａ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｈａｎｄｌｅ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ  ３９：８２〜９頁参照）；これら各々の内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれている］、並びに２）自動ペプチド合成装置での合成［（例えば、Ａｖｒｕｔｉｎａ  Ｏら、（２００４）Ｆｍｏｃ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ２９−Ｒｅｓｉｄｕｅ  Ｃｙｓｔｉｎｅ−Ｋｎｏｔ  Ｔｒｙｐｓｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  Ｇｕａｎｉｎｙｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｐ１−Ｐｏｓｉｔｉｏｎ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００４：４９３１〜４９３５頁、及びＣａｍａｒｅｒｏ  ＪＡ  ら（２００４）Ｆｍｏｃ−ｂａｓｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｌｐｈａ−ｔｈｉｏｅｓｔｅｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ａｒｙｌ  ｈｙｄｒａｚｉｎｅ  ｓｕｐｐｏｒｔ．Ｊ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ  ６９：４１４５〜５１頁参照）］。
【００５０】
ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩは、細菌合成及び自動合成アプローチの両方を用いて合成した。細菌合成は、環状の天然の折り畳まれたＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩをもたらした。自動合成に対して本発明者らは、直鎖状バージョンのＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩを生成した。両方のアプローチを以下により詳細に記載する。
【００５１】
ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩの細菌合成。ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩ構築物の生成
相補的センス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて生成したＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩをコードする遺伝子を、細菌におけるタンパク質発現のための適切なプラスミドにサブクローニングした。細菌において発現する場合、ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩはその天然の折り畳まれたコンフォメーションで精製した。しかし、ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩは、複数のカラム／ＨＰＬＣを用いて細菌タンパク質から離して精製しなければならなかった。野生型ＭＣｏＴＩ−ＩＩ−インテイン−キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）融合タンパク質は、次のように生成した。ＭＣｏＴＩ−ＩＩのタンパク質配列（配列番号３）をコードするセンス（配列番号１）及びアンチセンス（配列番号２）オリゴヌクレオチドをアニーリングして二本鎖カセットを生成した。ベクターｐＴＸＢ１（インテイン−ＣＢＤコード領域を含有する）に該カセットをサブクローニングするために、５’Ｎｄｅ  Ｉ及び３’Ｓａｐ  Ｉ部位を含めた。Ａ  Ｂｇｌ  ＩＩ制限酵素認識部位もループ６の後に含めて、ＮＥＭＯ結合ドメイン配列（ＮＢＤ）（配列番号４）をコードするｃＤＮＡ配列へのサブクローニングを可能にした。ＭＣｏＴＩ−ＩＩのｃＤＮＡ配列は、インテイン−ＣＢＤコード領域をコードするｃＤＮＡ領域のすぐ上流、及び該領域とインフレームになるようにｐＴＸＢ１にサブクローニングした。
【００５２】
ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩカセットは、ＮＢＤ配列及びＭＣｏＴＩ−ＩＩペプチド（配列番号７）の一部をコードするセンス（配列番号５）及びアンチセンス（配列番号６）オリゴヌクレオチドをアニーリングして生成した。ＮＢＤコード配列を野生型ＭＣｏＴＩ−ＩＩ−インテイン−ＣＢＤ：ｐＴＸＢ１にサブクローニングするために、５’Ｎｄｅ  Ｉ及び３’Ｂｇｌ  ＩＩ部位を含めた。ＭＣｏＴＩ−ＩＩ：ｐＴＸＢ１のＮｄｅ  Ｉ／Ｂｇｌ  ＩＩ部位へのＮＢＤコード領域のサブクローニングは、野生型ループ６コード領域をＮＢＤコード領域と置換し、構築物ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩ：ｐＴＸＢ１をもたらした。細菌においてＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩを発現するためのヌクレオチド及びタンパク質配列は、それぞれ配列番号８及び配列番号９に示されている。
【００５３】
ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩの発現及び精製
野生型及びＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩの細菌発現は、大腸菌Ｏｒｉｇａｍｉ（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）で行った。野生型ＭＣｏＴＩ−ＩＩ：ｐＴＸＢ１又はＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩ：ｐＴＸＢ１のどちらかをトランスフェクトした大腸菌を、対数期増殖に達するまでアンピシリンの存在下、ＬＢ培地で３７℃で増殖させた。対数期増殖に達した後、細胞を３０℃に馴化させ、ＩＰＴＧを添加し（０．３μＭの最終濃度で）、３０℃で２時間増殖させた。細胞を遠心分離により回収し、−８０℃で貯蔵した。
【００５４】
野生型又はＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩを発現する大腸菌を、プロテアーゼ阻害剤及びベンゾナーゼを含有するＢｕｇｂｕｓｔｅｒ溶液（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）に室温で２０分間溶解した。遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、１時間）により得られた清澄化溶解物を、キチンビーズ（ＮＥＢ，Ｉｎｃ．から入手可能）（３０倍容量のＨＥＰＥＳ緩衝液：２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ及び５００ＭｇＣｌ２で洗浄した）に添加し、１時間混合しながら４℃でインキュベートした。カラムを流し、０．１％トリトン−Ｘ−１００を含む５０倍容積のＨＥＰＥＳ緩衝液と、これに続く５０倍容積のＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄した。カラムをＨＥＰＥＳ緩衝液中、３０ｍＭ  ＤＴＴで一晩処理し、環化され折り畳まれた野生型又はＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩの溶出液を得た。溶出液を凍結乾燥し、滅菌水に再懸濁し、溶媒Ａ（０．１％水性ＴＦＡ）に対し０〜６０％溶媒Ｂ（９０％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）の直線勾配を用いて、流速１．０ｍｌ／分でＣ１８カラムの逆相ＨＰＬＣにより野生型又はＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩを精製した。活性ピークを回収し、ＡＣＮを回転蒸発により除去し、凍結乾燥した。処理後の最終ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩタンパク質配列は、配列番号１０により表すことができる（ただし、上述の処理の産物は環状タンパク質であると理解されるべきであり、配列番号１０におけるＮ末端及びＣ末端の指定は任意である）。
【００５５】
ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩの自動合成
ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩをＦｍｏｃベースの固相ペプチド合成と、これに続く任意選択の頭尾環化により化学的に合成した。自動合成を用いる場合、ペプチドは天然のコンフォメーションに折り畳まれなければならないことがある［（例えば、Ａｂｏｙｅ  ＴＬら、（２０１１）Ｉｎｔｅｒｌｏｃｋｉｎｇ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅｓ  ｉｎ  ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｔｏｗａｒｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ｏｆ  ｃｙｃｌｏｔｉｄｅｓ．Ａｎｔｉｏｘｉｄ  Ｒｅｄｏｘ  Ｓｉｇｎａｌ  １４：７７〜８６頁；Ｃｅｍａｚａｒ  Ｍら、（２００６）Ｋｎｏｔｓ  ｉｎ  ｒｉｎｇｓ．Ｔｈｅ  ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｋｎｏｔｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｏｃｈｉｎｃｈｉｎｅｎｓｉｓ  ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−ＩＩ  ｆｏｌｄｓ  ｖｉａ  ａ  ｓｔａｂｌｅ  ｔｗｏ−ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１：８２２４〜３２頁；及びＣｅｍａｚａｒ  Ｍら、（２００８）Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｔｗｏ−ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ａｓｓｉｓｔｓ  ｉｎ  ｅｌｕｃｉｄａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  ａ  ｃｙｃｌｉｃ  ｃｙｓｔｉｎｅ  ｋｎｏｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １６：８４２〜５１０頁参照）；これらの内容は全体が参照により本明細書に組み込まれている］。これを達成するために、ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩを還元及び酸化グルタチオンを含有する緩衝液に入れた。適正な折り畳みは、１Ｈ−１Ｈ  ＴＯＣＳＹ  ＮＭＲにより決定した（例えば、Ａｕｓｔｉｎ  Ｊら、（２００９）Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｃｙｃｌｏｔｉｄｅ  ＭＣｏＴＩ−Ｉ．Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ  １０：２６６３〜７０頁参照、この内容は全体が参照により本明細書に組み込まれている）。
【００５６】
本発明者らは、ループ６がＮＢＤ配列（配列番号４）と置換されるＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩの直鎖バージョン（配列番号１０）をデザインした。本発明者らは、直鎖状ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩを生成するために上記のような自動化学合成を利用した。
【００５７】
ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩによるＮＦ−κＢ経路の阻害
細胞透過性ＮＢＤペプチドは、インビトロ結合アッセイ及び細胞ベースのアッセイ、並びにインビボ齧歯類モデルにおいて、ＮＦ−κＢシグナル伝達及び炎症反応を阻害することが実証されている［（例えば、Ｄａｉ  Ｓら、（２００４）Ｔｈｅ  ＩｋａｐｐａＢ  ｋｉｎａｓｅ（ＩＫＫ）ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＮＥＭＯ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ，ｂｌｏｃｋｓ  ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｂｏｎｅ  ｅｒｏｓｉｏｎ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９：３７２１９〜２２頁；Ｄａｒｗｅｃｈ  Ｉら、（２００９）Ｉｍｐｅｄｉｍｅｎｔ  ｏｆ  ＮＥＭＯ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｏｓｔｅｏｌｙｓｉｓ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １０８：１３３７〜４５頁；ｄｉ  Ｍｅｇｌｉｏ  Ｐら、（２００５）Ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｅｌｌ−ｐｅｒｍｅａｂｌｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ＮＦ−ｋａｐｐａＢ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ５２：９５１〜８頁；Ｋｈａｊａ  Ｋら、（２０１０）Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎｓ  Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＮＥＭＯ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ３：１１０〜１２４頁；Ｍａｙ  ＭＪ、Ｍａｒｉｅｎｆｅｌｄ  ＲＢ、及びＧｈｏｓｈ  Ｓ（２００２）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｋａｐｐａ  Ｂ−ｋｉｎａｓｅ  ＮＥＭＯ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：４５９９２〜６０００頁；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ＪＭら、（２０１１）Ｐｅｐｔｉｄｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＦ−ｋａｐｐａＢ  ｒｅｓｃｕｅｓ  ｄｉａｐｈｒａｇｍ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｍｏｌ  Ｍｅｄ；Ｔｉｌｓｔｒａ  Ｊら、（２００７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ  ３５：８１１〜５頁参照）、これらの内容は全体が参照により本明細書に組み込まれている］。
【００５８】
ＭＣｏＴＩ−ＩＩに移植されたＮＢＤ配列がＮＦ−κＢシグナル伝達を阻害する能力を依然として示すことを実証するために、本発明者らは細胞ベースのアッセイを利用した。ＨＥＫ２９３細胞に、分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）（発現が、５つのＮＦ−κＢ部位を含有するＥＬＡＭ−１複合プロモーターの制御下にある）をコードするプラスミドｐＮｉＦｔｙ−ＳＥＡＰをトランスフェクトした。ＴＮＦαによる細胞の処理は、ＩｋＢキナーゼ複合体の活性化を引き起こし、今度は、ＮＦ−κＢがＳＥＡＰ発現をもたらす。本発明者らは、ＮＢＤペプチドで処理したｐＮｉＦｔｙ−ＳＥＡＰトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞（図２；図３、パネルＢ）が、ＴＮＦα媒介ＳＥＡＰ発現の発現を約６０μＭのＩＣ５０で濃度依存的にブロックすることを確認した。対照としてのＮＢＤペプチドの変異不活性形態は、ＴＮＦα媒介ＳＥＡＰ発現をブロックしなかった（図２）。細菌において生成された環状化ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩ（データ不図示）又は自動合成により生成された直鎖状ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩ（図２；図３パネルＡ）による細胞の処理は、ＴＮＦα媒介ＳＥＡＰ発現をブロックしたが、ＷＴ  ＭＣｏＴＩ−ＩＩはブロックしなかった（図２）。この結果は、ＭＣｏＴＩ−ＩＩの骨格に移植されたＮＢＤ配列が、細胞に進入し細胞質におけるＮＦ−κＢシグナル伝達を阻害する能力を保持することを示している。最も重要には、直鎖状ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩは、ＮＢＤペプチドより１０６倍強力な６０ｐＭのＩＣ５０でＴＮＦα媒介ＳＥＡＰ発現をブロックした。最終的に、ＷＴ及びＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩは、最大１μＭの濃度で明らかな細胞毒性は引き起こさなかった。
【００５９】
ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩはインビボで炎症反応を減少させる
直鎖状ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩの抗炎症活性は、マウスＣＰＥモデルにおいて２つの用量（５及び２５μｇ／ｋｇ）でテストした。マウスに、左後足の足底下部領域にカラゲニン注射して浮腫を誘導する１時間前に、ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩ、デキサメタゾン（１０ｍｇ／ｋｇ）又は生理食塩水のどちらかを投与（腹腔内）した。次いで腫脹を、カラゲニン注射２、４、６及び１２時間後に水置換方法により測定した。直鎖状ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩは、４、６及び１２時間での腫脹を著しく減少させた（図４）。１２時間で、５及び２５μｇ／ｋｇ  ＮＢＤ  ＭＣｏＴＩ−ＩＩは、腫脹をそれぞれ３０及び５０％減少させた（図５）。比較として、５μｇ／ｋｇのＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩは、２５ｍｇ／ｋｇのＮＢＤペプチドと同様の効果があり（図４、ｄｉ  Ｍｅｇｌｉｏ  Ｐら、（２００５）Ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｅｌｌ−ｐｅｒｍｅａｂｌｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ＮＦ−κβ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ５２：９５１〜８頁、この内容は全体が参照により本明細書に組み込まれている）、直鎖状ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩのインビボ効力がＮＢＤペプチドに対して観察されたものより５０００倍大きいことを示している（図５）。
【００６０】
ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩは治療マウスＣＩＡモデルにおける炎症反応を減少させる
次に本発明者らは、治療モードでのマウスＣＩＡモデル（抗関節炎活性を評価するための標準モデル）において直鎖状ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩの有効性をテストした。マウスにＩＩ型コラーゲンを注射した。ＣＩＡは、完全フロイントアジュバントと混合したＩＩ型コラーゲン（１００μｇ）の尾注射によりオスＤＢＡ／１Ｊマウスにおいて誘導した。２１日目に、コラーゲン（１００μｇ）／不完全フロイントアジュバントのブースター注射（腹腔内）を投与した。関節炎の重症度（関節炎指標（ＡＩ））は次のように各足でスコア化した：０−紅斑及び腫脹の証拠なし、１−足中部（足根骨）又は足首関節に限局した紅斑及び軽度の腫脹、２−足首から足中部に広がる紅斑及び軽度の腫脹、３−足首から中足関節に広がる紅斑及び中程度の腫脹、並びに４−紅斑及び重度の腫脹が足首、足及び指を包含する。ＡＩスコアを各足で測定し、合計した（マウス１匹当たり最大スコア１６）。ＡＩスコアが２７日目に３．１の平均に達した後、マウスを３つの治療群に分け、毎日、生理食塩水、１００μｇ／ｋｇ  ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩ及び３ｍｇ／ｋｇデキサメタゾンを１４日間投与（腹腔内）した。ＡＩスコア、体重、足の厚み及び苦痛のいずれかの徴候を毎日モニターした。２９日目までＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩ（１００μｇ／ｋｇ）は、陽性対照デキサメタゾンと同様に直ちに及び有意に（ｐ＜０．０１）関節炎の進行を止めた（図６）。ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩによる関節炎疾患進行の著しい阻害は、試験期間の間持続した。ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩは、マウスＣＩＡモデルにおける関節炎症状の改善において、ＰｆｉｚｅｒのＪＡＫ  １／２阻害剤ＣＰ６９０５５０（Ｘｅｌｊａｎｚ（商標））及び抗ＴＮＦ  Ａｂ対照と少なくとも同程度に有効であった（Ｍｉｌｉｃｉ  ＡＪら、（２００８）Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｊａｎｕｓ  ｋｉｎａｓｅ  ３  ｉｎ  ｔｗｏ  ｒｏｄｅｎｔ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ  １０：Ｒ１４参照）。最終的に、ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩはＣＩＡに伴う足の厚みの増大も有意に（ｐ＜０．０１）ブロックした（図７）。該効果は試験期間中持続した。
【００６１】
直鎖状ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩの有効性をさらに評価するために、本発明者らは、生理食塩水及びＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩ（１００μｇ／ｋｇ）で治療したＣＩＡマウスの関節試験の組織病理学的分析を行った。生理食塩水で治療したマウスは、炎症、パンヌス、軟骨損傷及び骨吸収に関する測定可能なスコア（図８、パネルＢ）により示された著しい関節損傷を示した（図８、パネルＡ）。著しく対照的に、ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩ（１００μｇ／ｋｇ）によるＣＩＡマウスの治療は、組織病理学的スコアによる関節損傷をゼロ又はほぼゼロで防いだ（図８、パネルＡ及びＢ）。
【００６２】
ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩ対既存の抗関節炎薬の有効性を比較するために、本発明者らは、炎症、パンヌス、軟骨損傷及び骨吸収の個々のスコアから、それらを加算してＣＩＡマウスの組織病理学的総合スコアを計算した。ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩ（１００μｇ／ｋｇ）の組織病理学的総合スコア対既存の抗関節炎薬エンブレル（商標）（１５ｍｇ／ｋｇ）、オレンシア（商標）（５ｍｇ／ｋｇ）、ゼルヤンツ（商標）（１０ｍｇ／ｋｇ）及びＩＮＣＢ０２８０５０（１５／ｍｇ）の公表値の比較が図９に示されている。データは、生理食塩水で治療したＣＩＡマウスの組織病理学的総合スコアのパーセントとして示される。図９は、ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩが、既存の抗関節炎薬（例えば、Ｓｅｅｕｗｓ  Ｓ．ら、（２０１０）Ａ  ｍｕｌｔｉｐａｒａｍｅｔｅｒ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｍｏｎｉｔｏｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ  １２：Ｒ１６０；Ｍｉｌｉｃｉ  ＡＪら、（２００８）Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｊａｎｕｓ  ｋｉｎａｓｅ  ３  ｉｎ  ｔｗｏ  ｒｏｄｅｎｔ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ  １０：Ｒ１４；及びＦｒｉｄｍａｎ  ＪＳら、（２０１０）Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＪＡＫ１  ａｎｄ  ＪＡＫ２  ｉｓ  ｅｆｆｉｃａｃｉｏｕｓ  ｉｎ  ｒｏｄｅｎｔ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＮＣＢ０２８０５０．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８４：５２９８〜３０７頁（これらの内容は全体が参照により本明細書に組み込まれている）に示されたエンブレル（商標）、オレンシア（商標）、ゼルヤンツ（商標）及びＩＮＣＢ０２８０５０に関するデータ）と比較して、組織病理学的総合スコアの著しい低下を示すことを示している。ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩはほとんどゼロの組織病理学的総合スコアであったが、既存の抗関節炎薬は、組織病理学的総合スコアを約４０〜６０％低下させることができるのみであった。故に、直鎖状ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩは関節損傷を防いだが、他の抗関節炎薬は関節損傷を低減することができるのみであった。
【００６３】
脾腫は関節炎を伴い、マウスＣＩＡモデルにおいて観察されている［（例えば、Ｆｏｅｌｌ  ＪＬら、（２００４）Ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ａｎｄ  ｒｅｖｅｒｓｅｓ  ｔｈｅ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｉｎ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｓ  ｌａｓｔｉｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １１３：８９〜９８頁；及びＬｉｕ  Ｙら、（２０１１）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＴＡＣＩ−Ｉｇ  ｏｎ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｂｙ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  Ｔ  ａｎｄ  Ｂ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ＤＢＡ／１  ｍｉｃｅ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６５４：３０４〜１４頁参照）；これら各々の内容は全体が参照により本明細書に組み込まれている）］。本発明者らの試験において、生理食塩水治療ＣＩＡマウスは、平均重量が１３５±２７ｍｇの肥大した脾臓を有した（オスＤＢＡ／１Ｊマウスにおける正常な脾臓重量は約８０ｍｇ）である［（例えば、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  Ｓら、（２０１１）Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｐｏｒｔａｂｅｌｌａ  ｍｕｓｈｒｏｏｍｓ  ｏｎ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ、ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ、ａｎｄ  ｂｏｄｙ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｉｌｕｔｅ  ｂｒｏｗｎ  ｎｏｎ−ａｇｏｕｔｉ（ＤＢＡ１）ｍｉｃｅ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｏｄｓ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ  １：２７９〜２９６頁参照）、この内容は全体が参照により本明細書に組み込まれている］。ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩ治療は、脾臓重量を１００±１７ｍｇまで有意に（ｐ＜０．０１）減少させた。
【００６４】
ＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩは、毒性又は苦痛の明白な徴候を示さなかった。マウス体重は、生理食塩水対照と比べて変わらなかった。一般的な血液化学検査、腎臓機能検査、肝臓酵素レベル（ＡＬＴ、ＡＳＴ）及び血球数を含む臨床血液分析は、正常範囲内であった。腎臓、肝臓及び腸重量は正常範囲内であり、生理食塩水治療ＣＩＡマウスとＮＢＤ−ＭＣｏＴＩ−ＩＩ治療ＣＩＡマウスの間に差は観察されなかった。
【００６５】
本発明は、特定の好ましい実施態様に関してかなり詳細に記載されてきたが、他の実施態様が可能である。例えば、本方法について開示されたステップは限定を意図するものでもなく、各ステップが方法にとって必ず不可欠であることを示すものでもなく、代わりに例示的なステップのみである。したがって、添付の特許請求の範囲の範囲は、この開示に含有された好ましい実施態様の記載に限定されるべきではない。
【００６６】
本明細書の値の範囲の列挙は、該範囲内にある各別個の値に個別に言及する簡単な方法として役立つことが意図されるのみである。本明細書で特に指示がない限り、各別個の値は、本明細書に個別に列挙されているかのように本明細書に援用される。本明細書に引用された全ての参考文献は、全体が出典明示により援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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