(57)【要約】  本発明は、胃および膵臓の酵素による切断に対して耐性があり、腸管腔内に存在することにより毒性作用を生じるグルテンオリゴペプチドを、３から８の間のｐＨにおいて加水分解する能力を有するタンパク質分解酵素（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｘｙｍｅ）の新規ファミリーに関する。この酵素は、Ｓ８／Ｓ５３ファミリーのエンドペプチダーゼとして同定されており、アクチノアロムルス（Ａｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓ）株により産生される。本発明の目的はまた、エンドペプチダーゼを体系化する核酸を含む天然アクチノアロムルス株、この変異体または組換え宿主細胞の培養によりエンドペプチダーゼを含む酵素組成物を産生する方法を含む。当該核酸は本発明のさらなる目的を構成する。本発明の少なくとも１つのエンドペプチダーゼを含む酵素組成物は、医薬製剤の成分としてまたは食品および飲み物の添加剤として、セリアック病、疱疹状皮膚炎およびグルテン不耐性に関連する任意の他の障害の治療および／または予防に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号１、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−１４０、
ｂ）配列番号２、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−４０、
ｃ）配列番号３、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−１２０、
ｄ）配列番号４、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−６０ならびに
ｅ）配列番号５、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−４１
からなる群から選択される、３から８の間のｐＨにおいて活性なＳ８／Ｓ５３ファミリーの少なくとも１つのエンドペプチダーゼを含む酵素組成物。
【請求項２】
エンドペプチダーゼが、
ａ）配列番号１または少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−１４０、
ｂ）配列番号２または少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−４０、
ｃ）配列番号３または少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−１２０、
ｄ）配列番号４または少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−６０、
ｅ）配列番号５または少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−４１
からなる群から選択される、請求項１に記載の酵素組成物。
【請求項３】
エンドペプチダーゼが、
ａ）配列番号１または少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−１４０、
ｂ）配列番号２または少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−４０
からなる群から選択される、請求項１または２に記載の酵素組成物。
【請求項４】
エンドペプチダーゼが、アクチノアロムルス（Ａｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓ）株から得られる、請求項１から３のいずれか一項に記載の酵素組成物。
【請求項５】
エンドペプチダーゼが、アクチノアロムルス属種（Ａｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓ  ｓｐ．）ＤＳＭ２４９８８から得られる、請求項４に記載の酵素組成物。
【請求項６】
胃および膵臓の酵素による切断に対して耐性があり、腸管腔内に存在することにより毒性作用を生じる、グルテンオリゴペプチドを加水分解できる、請求項１から５のいずれか一項に記載の酵素組成物。
【請求項７】
プロリル−エンドプロテアーゼ、ｘ−プロリル−ジペプチジルアミノペプチダーゼおよびプロリル−アミノペプチダーゼから選択される１つ以上の他のタンパク質分解酵素を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の酵素組成物。
【請求項８】
エンドペプチダーゼが、別のポリペプチドに作動可能に融合されてキメラまたは標識（ｔａｐｐｅｄ）タンパク質を形成する、請求項１から７のいずれか一項に記載の酵素組成物。
【請求項９】
ａ）配列番号１または少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−１４０、
ｂ）配列番号２または少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−４０、
ｃ）配列番号３または少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−１２０、
ｄ）配列番号４または少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−６０、
ｅ）配列番号５または少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−４１
から選択される、３から８の間のｐＨにおいて活性なＳ８／Ｓ５３ファミリーの単離されたエンドペプチダーゼ。
【請求項１０】
ａ）配列番号１または少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−１４０および
ｂ）配列番号２または少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−４０
から選択される、請求項９に記載のＳ８／Ｓ５３ファミリーの単離されたエンドペプチダーゼ。
【請求項１１】
セリアック病、疱疹状皮膚炎および／またはグルテン不耐性に関連する任意の他の障害を治療または予防するための医薬として使用するための請求項１から８のいずれか一項に記載の酵素組成物または請求項９もしくは１０に記載のＳ８／Ｓ５３ファミリーの単離されたエンドペプチダーゼ。
【請求項１２】
食品および飲み物に使用されるタンパク質加水分解物を産生するための請求項１から８のいずれか一項に記載の酵素組成物または請求項９もしくは１０に記載のＳ８／Ｓ５３ファミリーの少なくとも１つの単離されたエンドペプチダーゼの使用。
【請求項１３】
請求項１から８のいずれか一項に記載の酵素組成物または請求項９もしくは１０に記載のＳ８／Ｓ５３ファミリーの少なくとも１つの単離されたエンドペプチダーゼを、活性タンパク質分解成分として含む、医薬製剤。
【請求項１４】
経口医薬製剤である、請求項１３に記載の医薬製剤。
【請求項１５】
請求項１から８のいずれか一項に記載の酵素組成物または請求項９もしくは１０に記載のＳ８／Ｓ５３ファミリーの少なくとも１つの単離されたエンドペプチダーゼを、活性タンパク質分解成分として含む、栄養補助食品。
【請求項１６】
配列番号７、８、９、１０および１１から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列または配列番号７、８、９、１０および１１のいずれか１つに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％の同一性を有する少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の少なくとも１つのエンドペプチダーゼをコードする単離された核酸。
【請求項１７】
配列番号７、８、９、１０および１１のいずれか１つに対して少なくとも９５％の同一性を有する、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む、請求項１６に記載の単離された核酸。
【請求項１８】
配列番号７および８から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む、請求項１６または１７に記載の単離された核酸。
【請求項１９】
Ａ）酵素組成物を産生するのに適した条件下で培養培地中に、請求項１に定義されたＳ８／Ｓ５３ファミリーの少なくとも１つのエンドペプチダーゼを産生できる天然に存在するアクチノアロムルス株を培養し、培養バッチから酵素組成物を回収する工程または
Ｂ）Ｓ８／Ｓ５３ファミリーの少なくとも１つのエンドペプチダーゼを産生する能力を維持する、Ａ）で定義された天然に存在する株から従来の変異および／もしくは選択手順により得られたアクチノアロムルス株を、酵素組成物を産生するのに適した条件下で培養培地中に培養し、培養バッチから酵素組成物を回収する工程または
Ｃ）
ａ）配列番号１、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−１４０、
ｂ）配列番号２、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−４０、
ｃ）配列番号３、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−１２０、
ｄ）配列番号４、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−６０および
ｅ）配列番号５、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−４１
からなる群から選択されるＳ８／Ｓ５３ファミリーの少なくとも１つのエンドペプチダーゼをコードする核酸を宿主細胞内に組み込む工程、
エンドペプチダーゼを産生するのに適した条件下で培養培地中に細胞を培養し、培養バッチからエンドペプチダーゼを回収する工程
を含む、請求項１に記載の酵素組成物を産生する方法。
【請求項２０】
アクチノアロムルス株が、請求項１８に記載の少なくとも１つのエンドペプチダーゼを産生できるカテヌリスポラ（Ｃａｔｅｎｕｌｉｓｐｏｒａ）、クテドノバクター（Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ）またはストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の属に属している株により置き換えられる、請求項１９の項Ａ）またはＢ）に記載の方法。
【請求項２１】
アクチノアロムルス株が、アクチノアロムルス属種ＤＳＭ２４９８８である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
核酸が、請求項１６または１７において同定されたポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つを含む、請求項１９の項Ｃ）に記載の方法。
【請求項２３】
核酸が、配列番号７および８のポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つまたは配列番号７および８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
宿主細胞が、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）およびエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）から選択される微生物である、請求項１９の項Ｃ）、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
宿主細胞が、エシェリキア・コリＤＨ１０Ｂである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
株アクチノアロムルスＤＳＭ２４９８８。
【請求項２７】
胃および膵臓の酵素による切断に対して耐性があり、腸管腔内に存在することにより毒性作用を生じる、グルテンオリゴペプチドを分解する方法であって、グルテンオリゴペプチドを、請求項１から８のいずれか一項に記載の酵素組成物または請求項９もしくは１０に記載の少なくとも１つの単離されたエンドペプチダーゼと接触させる工程を含む、方法。
【請求項２８】
請求項１から８のいずれか一項に記載の酵素組成物または請求項９もしくは１０に記載の少なくとも１つの単離されたエンドペプチダーゼの有効量を、これを必要とする患者に投与する工程を含む、セリアック病、疱疹状皮膚炎および／またはグルテン不耐性に関連する任意の他の障害を治療または予防するための、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
酵素組成物または単離されたエンドペプチダーゼが、医薬製剤、栄養補助食品、飲み物または飲料内に取り込まれる、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロリンを豊富に含む、大きなポリペプチドを分解できる固有の触媒特性を有する新規エンドペプチダーゼファミリーに関する。本発明はさらに、酵素組成物を産生する方法ならびに酵素組成物を含有する医薬組成物および栄養補助食品およびポリペプチドの分解におけるこの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
セリアック病（ＣＤ）は、小麦、ライ麦、大麦およびこれらの相互関連種から作製された食品に存在するグルテンの摂取によって、遺伝的に感受性の高い個体における自己免疫機構により小腸粘膜の損傷を導く、慢性消化管障害である（Ｇｒｅｅｎ  Ｐ．Ｈ．Ｒ．、Ｃｅｌｌｉｅｒ  Ｃ．「Ｃｅｌｉａｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ」Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、２００７年、３５７、１７３１−１７４３頁；Ｋａｇｎｏｆｆ  Ｍ．Ｆ．「Ｃｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ」Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、２００７年、１１７、４１−９）。グルテンがこの病原性作用を誘発する機構は近年明らかになっている。先天性免疫機構および適応免疫機構の両方が関連し、これらが最終的な粘膜損傷の原因となる。
【０００３】
グルテンはグリアジンおよびグルテニンからなり、貯蔵タンパク質の水／塩不溶画分が穀物に存在している。小麦粉および水がパン生地の調製において混合される場合、グルテンネットワークが２つのタンパク質間の相互作用により生成される。
【０００４】
一旦、摂取されると、多くのプロテアーゼがプロリンのＮ末端またはＣ末端に位置するペプチド結合を切断できないので、グルテンは、プロリン残基の多い含有量に起因してさらなる消化に耐性がある、異なる長さ（少数から３０より多いアミノ酸）の多くのペプチドを生じる胃−膵臓および刷子縁タンパク質分解酵素により部分消化のために使用される（Ｈａｕｓｃｈ  Ｆ．、Ｓｈａｎ  Ｌ．、Ｓａｎｔｉａｇｏ  Ｎ．Ａ．、Ｇｒａｙ  Ｇ．Ｍ．、Ｋｈｏｓｌａ  Ｃ．「Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ  ｇｌｉａｄｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ」．Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２００２年、２８３、９９６−１００３頁；Ｓｈａｎ  Ｌ．、Ｍｏｌｂｅｒｇ  Ｏ．、Ｐａｒｒｏｔ  Ｉ．、Ｈａｕｓｃｈ  Ｆ．、Ｆｉｌｉｚ  Ｆ．、Ｇｒａｙ  Ｇ．Ｍ．、Ｓｏｌｌｉｄ  Ｌ．Ｍ．、Ｋｈｏｓｌａ  Ｃ．「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｇｌｕｔｅｎ  ｉｎｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎ  ｃｅｌｉａｃ  ｓｐｒｕｅ」Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００２年、２９７、２２７５−２２７９頁）。プロリン特異的切断酵素の欠如は、過去に示唆されているように、セリアック病被験者における特異的酵素の欠損ではないが、この被験者の食事中に非常に多いプロリン含有量を有するタンパク質を消費するように発達していない哺乳動物の消化器の特性である。
【０００５】
未消化のグルテンペプチドは、まだ明確に説明されていない機構であるが、最近報告されている、トランスサイトーシスおよびレトロトランスサイトーシスを介するゾヌリン媒介性傍細胞経路および経細胞様式により上皮性関門を通過できる（Ｄｒａｇｏ  Ｓ．、Ｅｌ  Ａｓｍａｒ  Ｒ．、Ｄｉ  Ｐｉｅｒｒｏ  Ｍ．、Ｇｒａｚｉａ  Ｃｌｅｍｅｎｔｅ  Ｍ．、Ｔｒｉｐａｔｈｉ  Ａ．、Ｓａｐｏｎｅ  Ａ．、Ｔｈａｋａｒ  Ｍ．、Ｉａｃｏｎｏ  Ｇ．、Ｃａｒｒｏｃｃｉｏ  Ａ．、Ｄ’Ａｇａｔｅ  Ｃ．、Ｎｏｔ  Ｔ．、Ｚａｍｐｉｎｉ  Ｌ．、Ｃａｔａｓｓｉ  Ｃ．、Ｆａｓａｎｏ  Ａ．「Ｇｌｉａｄｉｎ，ｚｏｎｕｌｉｎ  ａｎｄ  ｇｕｔ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ：Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｃｅｌｉａｃ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｃｅｌｉａｃ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｕｃｏｓａ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ」Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、２００６年、４１、４０８−１９頁；Ｓｃｈｕｍａｎｎ  Ｍ．、Ｒｉｃｈｔｅｒ  Ｊ．Ｆ．、Ｗｅｄｅｌｌ  Ｉ．、Ｍｏｏｓ  Ｖ．、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ−Ｋｏｒｄｍａｎｎ  Ｍ．、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｔ．、Ｄａｕｍ  Ｓ．、Ｚｅｉｔｚ  Ｍ．、Ｆｒｏｍｍ  Ｍ．、Ｓｃｈｕｌｚｋｅ  Ｊ．Ｄ．「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａ（２）−ｇｌｉａｄｉｎ−３３ｍｅｒ  ｉｎ  ｃｏｅｌｉａｃ  ｓｐｒｕｅ」Ｇｕｔ、２００８年、５７、７４７−７５４頁；Ｍａｔｙｓｉａｋ−Ｂｕｄｎｉｋ  Ｔ．、Ｍｏｕｒａ  Ｉ．Ｃ．、Ａｒｃｏｓ−Ｆａｊａｒｄｏ  Ｍ．、Ｌｅｂｒｅｔｏｎ  Ｃ．、Ｍｅｎａｒｄ  Ｓ．、Ｃａｎｄａｌｈ  Ｃ．、Ｂｅｎ−Ｋｈａｌｉｆａ  Ｋ．、Ｄｕｇａｖｅ  Ｃ．、Ｔａｍｏｕｚａ  Ｈ．、ｖａｎ  Ｎｉｅｌ  Ｇ．、Ｂｏｕｈｎｉｋ  Ｙ．、Ｌａｍａｒｑｕｅ  Ｄ．、Ｃｈａｕｓｓａｄｅ  Ｓ．、Ｍａｌａｍｕｔ  Ｇ．、Ｃｅｌｌｉｅｒ  Ｃ．、Ｃｅｒｆ−Ｂｅｎｓｕｓｓａｎ  Ｎ．、Ｍｏｎｔｅｉｒｏ  Ｒ．Ｃ．、Ｈｅｙｍａｎ  Ｍ．「Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ＩｇＡ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｔａｃｔ  ｇｌｉａｄｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｃｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ」Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２００８年、２０５、１４３−１５４頁）。
【０００６】
一旦、粘膜固有層（ＬＭ）において、組織トランスグルタミナーゼ（ｔＴＧ、ＣＤにおける自己抗原）によりグルタミンがグルタミン酸残基へ脱アミド化されると、主要なサイトカインエフェクターとしてのインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）による炎症性反応を生じる、ＤＱ２またはＤＱ８  ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するこれらのグルタミン酸残基の提示を増強する（Ｍｏｌｂｅｒｇ  Ｏ．、ＭｃＡｄａｍ  Ｓ．、Ｌｕｎｄｉｎ  Ｋ．Ｅ．、Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ  Ｃ．、Ａｒｅｎｔｚ−Ｈａｎｓｅｎ  Ｈ．、Ｋｅｔｔ  Ｋ．、Ｓｏｌｌｉｄ  Ｌ．Ｍ．「Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｃｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ  ｇｌｉａｄｉｎ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｄｅａｍｉｄａｔｅｄ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｂｙ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｔｉｓｓｕｅ  ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ」Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００１年、３１、１３１７−２３頁）。いくつかのグルテンペプチドはまた、ＣＤ４＋Ｔリンパ球による特異的認識とは独立して粘膜損傷を引き起こすが、ＬＭ単核細胞においてＩＬ−１５、シクロオキシゲナーゼ−２ならびに活性化マーカーＣＤ２５およびＣＤ８３の発現を上方制御することにより先天性免疫応答を誘導し、これらの中で、最適に特徴付けられているのはα１−グリアジンのペプチドｐ３１−４３／４９（ＰＧＱＱＱＰＦＰＰＱＱＰＹ／ＰＱＰＱＰＦ）であることが示されている（Ｃｉｃｃｏｃｉｏｐｐｏ  Ｒ．、Ｄｉ  Ｓａｂａｔｉｎｏ  Ａ．、Ｃｏｒａｚｚａ  Ｇ．Ｒ．「Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｕｔｅｎ  ｉｎ  ｃｏｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ」Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００５年、１４０、４０８−１６頁）。
【０００７】
欧州人および北米人の両方の集団の約１％がＣＤに冒されていると推定されており、フィンランドからの研究により、老齢の人々において高い比率（１：４７）が示されている（Ｖｉｌｐｐｕｌａ  Ａ．、Ｋａｕｋｉｎｅｎ  Ｋ．、Ｌｕｏｓｔａｒｉｎｅｎ  Ｌ．、Ｋｒｅｋｅｌａ  Ｉ．、Ｐａｔｒｉｋａｉｎｅｎ  Ｈ．、Ｖａｌｖｅ  Ｒ．、Ｍａｋｉ  Ｍ．、Ｃｏｌｌｉｎ  Ｐ．「Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ  ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｅｌｄｅｒｌｙ  ｐｅｏｐｌｅ：ａ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｓｔｕｄｙ」ＢＭＣ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、２００９年、２９、９−４９頁）。しかしながら、多くの研究により、ＣＤは同様の有病率の値で世界中に広がっていることが示されている（Ｂａｒａｄａ  Ｋ．、Ｂｉｔａｒ  Ａ．、Ｍｏｋａｄｅｍ  Ｍ．Ａ．、Ｈａｓｈａｓｈ  Ｊ．Ｇ．、Ｇｒｅｅｎ  Ｐ．「Ｃｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  Ｍｉｄｄｌｅ  Ｅａｓｔｅｒｎ  ａｎｄ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｆｒｉｃａｎ  ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ：ａ  ｎｅｗ  ｂｕｒｄｅｎ？」Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、２０１０年、１６、１４４９−５７頁；Ｄａｌｇｉｃ  Ｂ．、Ｓａｒｉ  Ｓ．、Ｂａｓｔｕｒｋ  Ｂ．、Ｅｎｓａｒｉ  Ａ．、Ｅｇｒｉｔａｓ  Ｏ．、Ｂｕｋｕｌｍｅｚ  Ａ．、Ｂａｒｉｓ  Ｚ．、Ｔｕｒｋｉｓｈ  Ｃｅｌｉａｃ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ「Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  Ｔｕｒｋｉｓｈ  ｓｃｈｏｏｌ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ」Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、２０１１年、１０６、１５１２−７頁；Ｍａｋｈａｒｉａ  Ｇ．Ｋ．、Ｖｅｒｍａ  Ａ．Ｋ．、Ａｍａｒｃｈａｎｄ  Ｒ．、Ｂｈａｔｎａｇａｒ  Ｓ．、Ｄａｓ  Ｐ．、Ｇｏｓｗａｍｉ  Ａ．、Ｂｈａｔｉａ  Ｖ．、Ａｈｕｊａ  Ｖ．、Ｄａｔｔａ  Ｇｕｐｔａ  Ｓ．、Ａｎａｎｄ  Ｋ．「Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｐａｒｔ  ｏｆ  Ｉｎｄｉａ：ａ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  ｂａｓｅｄ  ｓｔｕｄｙ」Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．、２０１１年、２６、８９４−９００頁；Ｗａｎｇ  Ｘ．Ｑ．、Ｌｉｕ  Ｗ．、Ｘｕ  Ｃ．Ｄ．、Ｍｅｉ  Ｈ．、Ｇａｏ  Ｙ．、Ｐｅｎｇ  Ｈ．Ｍ．、Ｙｕａｎ  Ｌ．、Ｘｕ  Ｊ．Ｊ．「Ｃｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ｄｉａｒｒｈｅａ  ｉｎ  ４  ｃｉｔｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｉｎａ」Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｎｕｔｒ．、２０１１年、５３、３６８−７０頁）。
【０００８】
現時点で利用可能な治療は存在せず、ＣＤ特異的粘膜損傷およびこの結果として起こる吸収不良関連障害（鉄欠乏性貧血または骨粗鬆症など）だけでなく、１型糖尿病および自己免疫甲状腺炎のようなＣＤまたは腸疾患関連Ｔ細胞リンパ腫のような重度の合併症に伴う他の自己免疫疾患も予防するために、厳格な生涯にわたるグルテンを含まない食事が必要である疾患に対する改善のみが存在する。
【０００９】
グルテンの全ての回避は（安全なグルテン摂取閾値は一般に５０ｍｇ／日で示されているが、１０ｍｇ／日がより安全であるとみなされている）、反応しない形態を被っているわずかな割合の患者（２−５％）を除いて寛解期においてＣＤを維持する。しかしながら、このような食事は、患者の一般的な活動を制限し、社会的隔離を受けることをこれらの患者に強く要求する。食品加工における添加剤としてのグルテンの使用は普及しており、これがグルテンの不注意な摂取の主な原因となっており、この食事を実際に維持することは困難である。
【００１０】
これらの理由のために、ＣＤ患者の毎日の食事に少なくとも最小量のグルテンが存在すると仮定することができる任意の代替法がこれらのＣＤ患者により強く歓迎されている。
【００１１】
グルテン解毒のための外因性タンパク質分解酵素の使用はＣＤ治療のための最も有望な戦略のうちの１つである。異なる方法の適用がこれらの酵素の可能性を利用できる：パン生地発酵の前または間に小麦粉を含有し、したがって「新規食品」の産生に使用されるグルテンの処理、同様に同時に起こるグルテンおよび適切なタンパク質分解酵素の消費、したがって、ラクトース不耐性のためのラクトースの使用と同様に「栄養補助食品」として使用される。必然的に、異なる酵素特性が異なる目的を満たすために必要とされる。
【００１２】
ＣＤ治療のための酵素的研究は、特異的残基上でグルテンペプチドを切断し、毒性／免疫毒性特異的ペプチド配列を取り除く微生物の酵素の能力のＳｈａｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００２年）による証明に基づく。特に、彼らは、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）に由来する外因性プロリル特異的エンドプロテアーゼ（ＦＭ−ＰＥＰ）がグリアジンペプチドの消化において有用性を生じることを示した。刷子縁膜（ＢＢＭ）抽出物の存在下においてインビトロでのまたはラット小腸のインビボでの灌流の間のいずれかのＰＥＰの添加により、免疫優勢３３量体ペプチド（「３３量体」）の急速な分解およびグリアジン特異的Ｔ細胞を刺激するこの能力の損失が生じた（Ｈａｕｓｃｈら、２００２年）。
【００１３】
他の細菌株（すなわち、スフィンゴモナス・カプスラータ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｃａｐｓｕｌａｔａ）およびミキソコッカス・ザンサス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ  ｘａｎｔｈｕｓ））由来の同じファミリー（ＥＣ．３．４．２１．２６）の他の酵素が同じ著者によりこの目的のために評価されている（Ｓｈａｎ  Ｌ．、Ｍａｒｔｉ  Ｔ．、Ｓｏｌｌｉｄ  Ｌ．Ｍ．、Ｇｒａｙ  Ｇ．Ｍ．、Ｋｈｏｓｌａ  Ｃ．「Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｒｏｌｙｌ  ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｃｏｅｌｉａｃ  ｓｐｒｕｅ」Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２００４年、３８３、３１１−３１８頁）。全体的に、これらの研究により、鎖長およびサブサイト特異性に対して３つの酵素の間でかなりの相違が示され、経口酵素療法の可能性が確認されたが、基質特異性に対する制限、活性のｐＨ（胃で作用するのに必要とされるような酸性ｐＨの代わりにほぼ中性のｐＨでの最適活性）、毒性ペプチドの消化を完了するのに必要な長時間およびペプシンによる分解に対する耐性に起因して、インビボでこれらの起こり得る有効性に関する懸念が増加した。次いで胃活動および相補的基質特異性に関する２つの酵素の組合せが示唆され（Ｇａｓｓ  Ｊ．、Ｂｅｔｈｕｎｅ  Ｍ．Ｔ．、Ｓｉｅｇｅｌ  Ｍ．、Ｓｐｅｎｃｅｒ  Ａ．、Ｋｈｏｓｌａ  Ｃ．「Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｅｔａｒｙ  ｇｌｕｔｅｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｅｌｉａｃ  ｓｐｒｕｅ」Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、２００７年、１３３、４７２−４８０頁）：ＥＰ−Ｂ２に関連するＳ．カプスラータ由来のＰＥＰ、ホルデウム・バルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）由来のグルタミン特異的エンドプロテアーゼＢアイソフォーム２、酸性ｐＨにておよびペプシンにより活性化される発芽オオムギ種子由来のシステインプロテアーゼ（Ｂｅｔｈｕｎｅ  Ｍ．Ｔ．、Ｓｔｒｏｐ  Ｐ．、Ｔａｎｇ  Ｙ．、Ｓｏｌｌｉｄ  Ｌ．Ｍ．、Ｋｈｏｓｌａ  Ｃ．「Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ，ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＥＰ−Ｂ２，ａ  ｓｅｌｆ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｂａｒｌｅｙ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｅｎｄｏｐｒｏｔｅａｓｅ」Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、２００６年、１３、６３７−４７頁）は、潜在的により有力な治療手段であることが示された。別の研究により、胃内の酸性条件下でこの主な活性を破壊する、アスペルギウス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）に由来するＰＥＰが、グリアジンが腸管腔に到達する前にこのグリアジンを分解し始めることができると報告されている（Ｓｔｅｐｎｉａｋ  Ｄ．、Ｓｐａｅｎｉｊ−Ｄｅｋｋｉｎｇ  Ｌ．、Ｍｉｔｅａ  Ｃ．、Ｍｏｅｓｔｅｒ  Ｍ．、ｄｅ  Ｒｕ  Ａ．、Ｂａａｋ−Ｐａｂｌｏ  Ｒ．ｖａｎ  Ｖｅｅｌｅｎ  Ｐ．、Ｅｄｅｎｓ  Ｌ．、Ｋｏｎｉｎｇ  Ｆ．「Ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｌｕｔｅｎ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｅｗｌｙ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｐｒｏｌｙｌ  ｅｎｄｏｐｒｏｔｅａｓｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｃｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ」Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２００６年、２９１、Ｇ６２１−９頁）。
【００１４】
これらの見解はいくつかの特許文献により扱われている。ＷＯ２００３／０６８１７０（ＥＰ５７２１２７）において、発明者らは、有効量のグルテナーゼをセリアック病患者または疱疹状皮膚炎患者へ投与することにより、毒性グルテンオリゴペプチドのレベルを減少させ、それによりグルテンの損傷効果を軽減または除去することを主張している。この手法に対するさらなる支持は、ＷＯ２００５／１０７７８６（ＥＰ１７４０１９７）において与えられており、セリアック病患者または疱疹状皮膚炎患者の治療に使用するためのグルテナーゼ酵素の医薬製剤が開示されている。ＷＯ２００５／０２７９５３（ＥＰ１６６６３２９８）は、毒性グルテンペプチドの消化において有用性を生じているアスペルギウス・ニガー由来の新規のプロリル特異的エンドプロテアーゼ（ＡＮ−ＰＥＰ）による治療を記載している。ＷＯ２００５／０１９２５１は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤｐｐＩＶ）と組み合わせた２つの異なる真菌種である、トリコフィトン・ルブルム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ）およびアスペルギウス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）のロイシンアミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）を提供している。ＬＡＰの最適活性が、ｐＨ６から８の間の活性の範囲で約７．０であると推定されており、したがって胃液内でのグリアジンの起こり得る分解を除外または制限するため、これらの酵素は中性ｐＨ条件下で３３量体の切断について評価されている。
【００１５】
Ａ．フミガーツスのトリペプチジルペプチダーゼが、酸性ｐＨにてタンパク質を分解できることも示されている（Ｒｅｉｃｈａｒｄ  Ｕ．、Ｌｅｃｈｅｎｎｅ  Ｂ．、Ａｓｉｆ  Ａ．Ｒ．、Ｓｔｒｅｉｔ  Ｆ．、Ｇｒｏｕｚｍａｎｎ  Ｅ．、Ｊｏｕｓｓｏｎ  Ｏ．、Ｍｏｎｏｄ  Ｍ．「Ｓｅｄｏｌｉｓｉｎｓ，ａ  ｎｅｗ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｄｏｐｒｏｔｅａｓｅ  ｏｒ  ｔｒｉｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｔ  ａｃｉｄｉｃ  ｐＨｓ」Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．、２００６年、７２、１７３９−４８頁）。ＷＯ２０１１／０７７３５９において、プロリルプロテアーゼ（ＡｆｕＳ２８）およびＣＤ治療にも有用な栄養補助食品として使用されるセドリシン（ｓｅｄｏｌｉｓｉｎ）のファミリーに属している少なくとも１つのトリペプチジルプロテアーゼにより構成されるキットが提供されている。
【００１６】
ＣＤ治療のための酵素または酵素組成物の治療的価値が、ａ）他の胃腸酵素による分解に耐性がある、ｂ）３３量体および他の毒性ペプチドが産生される環境に効果的であるならびにｃ）グルテンペプチドに対して迅速で高いタンパク質分解活性を示す、酵素に関連することは明確である。これらの酵素は、酸性ｐＨにて活性であるべきであり、焼かれたまたは料理された通常の食品の他の成分により妨げられるグルテンの複合組成を得ることができるはずである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】国際公開第２００３／０６８１７０号（欧州特許第５７２１２７号明細書）
【特許文献２】国際公開第２００５／１０７７８６号（欧州特許第１７４０１９７号明細書）
【特許文献３】国際公開第２００５／０２７９５３号（欧州特許第１６６６３２９８号明細書）
【特許文献４】国際公開第２００５／０１９２５１号
【特許文献５】国際公開第２０１１／０７７３５９号
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｇｒｅｅｎ  Ｐ．Ｈ．Ｒ．、Ｃｅｌｌｉｅｒ  Ｃ．「Ｃｅｌｉａｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ」Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、２００７年、３５７、１７３１−１７４３頁
【非特許文献２】Ｋａｇｎｏｆｆ  Ｍ．Ｆ．「Ｃｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ」Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、２００７年、１１７、４１−９頁
【非特許文献３】Ｈａｕｓｃｈ  Ｆ．、Ｓｈａｎ  Ｌ．、Ｓａｎｔｉａｇｏ  Ｎ．Ａ．、Ｇｒａｙ  Ｇ．Ｍ．、Ｋｈｏｓｌａ  Ｃ．「Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ  ｇｌｉａｄｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ」．Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２００２年、２８３、９９６−１００３頁
【非特許文献４】Ｓｈａｎ  Ｌ．、Ｍｏｌｂｅｒｇ  Ｏ．、Ｐａｒｒｏｔ  Ｉ．、Ｈａｕｓｃｈ  Ｆ．、Ｆｉｌｉｚ  Ｆ．、Ｇｒａｙ  Ｇ．Ｍ．、Ｓｏｌｌｉｄ  Ｌ．Ｍ．、Ｋｈｏｓｌａ  Ｃ．「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｇｌｕｔｅｎ  ｉｎｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎ  ｃｅｌｉａｃ  ｓｐｒｕｅ」Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００２年、２９７、２２７５−２２７９頁
【非特許文献５】Ｄｒａｇｏ  Ｓ．、Ｅｌ  Ａｓｍａｒ  Ｒ．、Ｄｉ  Ｐｉｅｒｒｏ  Ｍ．、Ｇｒａｚｉａ  Ｃｌｅｍｅｎｔｅ  Ｍ．、Ｔｒｉｐａｔｈｉ  Ａ．、Ｓａｐｏｎｅ  Ａ．、Ｔｈａｋａｒ  Ｍ．、Ｉａｃｏｎｏ  Ｇ．、Ｃａｒｒｏｃｃｉｏ  Ａ．、Ｄ’Ａｇａｔｅ  Ｃ．、Ｎｏｔ  Ｔ．、Ｚａｍｐｉｎｉ  Ｌ．、Ｃａｔａｓｓｉ  Ｃ．、Ｆａｓａｎｏ  Ａ．「Ｇｌｉａｄｉｎ，ｚｏｎｕｌｉｎ  ａｎｄ  ｇｕｔ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ：Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｃｅｌｉａｃ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｃｅｌｉａｃ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｕｃｏｓａ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ」Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、２００６年、４１、４０８−１９頁
【非特許文献６】Ｓｃｈｕｍａｎｎ  Ｍ．、Ｒｉｃｈｔｅｒ  Ｊ．Ｆ．、Ｗｅｄｅｌｌ  Ｉ．、Ｍｏｏｓ  Ｖ．、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ−Ｋｏｒｄｍａｎｎ  Ｍ．、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｔ．、Ｄａｕｍ  Ｓ．、Ｚｅｉｔｚ  Ｍ．、Ｆｒｏｍｍ  Ｍ．、Ｓｃｈｕｌｚｋｅ  Ｊ．Ｄ．「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａ（２）−ｇｌｉａｄｉｎ−３３ｍｅｒ  ｉｎ  ｃｏｅｌｉａｃ  ｓｐｒｕｅ」Ｇｕｔ、２００８年、５７、７４７−７５４頁
【非特許文献７】Ｍａｔｙｓｉａｋ−Ｂｕｄｎｉｋ  Ｔ．、Ｍｏｕｒａ  Ｉ．Ｃ．、Ａｒｃｏｓ−Ｆａｊａｒｄｏ  Ｍ．、Ｌｅｂｒｅｔｏｎ  Ｃ．、Ｍｅｎａｒｄ  Ｓ．、Ｃａｎｄａｌｈ  Ｃ．、Ｂｅｎ−Ｋｈａｌｉｆａ  Ｋ．、Ｄｕｇａｖｅ  Ｃ．、Ｔａｍｏｕｚａ  Ｈ．、ｖａｎ  Ｎｉｅｌ  Ｇ．、Ｂｏｕｈｎｉｋ  Ｙ．、Ｌａｍａｒｑｕｅ  Ｄ．、Ｃｈａｕｓｓａｄｅ  Ｓ．、Ｍａｌａｍｕｔ  Ｇ．、Ｃｅｌｌｉｅｒ  Ｃ．、Ｃｅｒｆ−Ｂｅｎｓｕｓｓａｎ  Ｎ．、Ｍｏｎｔｅｉｒｏ  Ｒ．Ｃ．、Ｈｅｙｍａｎ  Ｍ．「Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ＩｇＡ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｔａｃｔ  ｇｌｉａｄｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｃｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ」Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２００８年、２０５、１４３−１５４頁
【非特許文献８】Ｍｏｌｂｅｒｇ  Ｏ．、ＭｃＡｄａｍ  Ｓ．、Ｌｕｎｄｉｎ  Ｋ．Ｅ．、Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ  Ｃ．、Ａｒｅｎｔｚ−Ｈａｎｓｅｎ  Ｈ．、Ｋｅｔｔ  Ｋ．、Ｓｏｌｌｉｄ  Ｌ．Ｍ．「Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｃｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ  ｇｌｉａｄｉｎ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｄｅａｍｉｄａｔｅｄ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｂｙ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｔｉｓｓｕｅ  ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ」Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００１年、３１、１３１７−２３頁
【非特許文献９】Ｃｉｃｃｏｃｉｏｐｐｏ  Ｒ．、Ｄｉ  Ｓａｂａｔｉｎｏ  Ａ．、Ｃｏｒａｚｚａ  Ｇ．Ｒ．「Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｕｔｅｎ  ｉｎ  ｃｏｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ」Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００５年、１４０、４０８−１６頁
【非特許文献１０】Ｖｉｌｐｐｕｌａ  Ａ．、Ｋａｕｋｉｎｅｎ  Ｋ．、Ｌｕｏｓｔａｒｉｎｅｎ  Ｌ．、Ｋｒｅｋｅｌａ  Ｉ．、Ｐａｔｒｉｋａｉｎｅｎ  Ｈ．、Ｖａｌｖｅ  Ｒ．、Ｍａｋｉ  Ｍ．、Ｃｏｌｌｉｎ  Ｐ．「Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ  ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｅｌｄｅｒｌｙ  ｐｅｏｐｌｅ：ａ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｓｔｕｄｙ」ＢＭＣ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、２００９年、２９、９−４９頁
【非特許文献１１】Ｂａｒａｄａ  Ｋ．、Ｂｉｔａｒ  Ａ．、Ｍｏｋａｄｅｍ  Ｍ．Ａ．、Ｈａｓｈａｓｈ  Ｊ．Ｇ．、Ｇｒｅｅｎ  Ｐ．「Ｃｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  Ｍｉｄｄｌｅ  Ｅａｓｔｅｒｎ  ａｎｄ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｆｒｉｃａｎ  ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ：ａ  ｎｅｗ  ｂｕｒｄｅｎ？」Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、２０１０年、１６、１４４９−５７頁
【非特許文献１２】Ｄａｌｇｉｃ  Ｂ．、Ｓａｒｉ  Ｓ．、Ｂａｓｔｕｒｋ  Ｂ．、Ｅｎｓａｒｉ  Ａ．、Ｅｇｒｉｔａｓ  Ｏ．、Ｂｕｋｕｌｍｅｚ  Ａ．、Ｂａｒｉｓ  Ｚ．、Ｔｕｒｋｉｓｈ  Ｃｅｌｉａｃ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ「Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  Ｔｕｒｋｉｓｈ  ｓｃｈｏｏｌ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ」Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、２０１１年、１０６、１５１２−７頁
【非特許文献１３】Ｍａｋｈａｒｉａ  Ｇ．Ｋ．、Ｖｅｒｍａ  Ａ．Ｋ．、Ａｍａｒｃｈａｎｄ  Ｒ．、Ｂｈａｔｎａｇａｒ  Ｓ．、Ｄａｓ  Ｐ．、Ｇｏｓｗａｍｉ  Ａ．、Ｂｈａｔｉａ  Ｖ．、Ａｈｕｊａ  Ｖ．、Ｄａｔｔａ  Ｇｕｐｔａ  Ｓ．、Ａｎａｎｄ  Ｋ．「Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｐａｒｔ  ｏｆ  Ｉｎｄｉａ：ａ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  ｂａｓｅｄ  ｓｔｕｄｙ」Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．、２０１１年、２６、８９４−９００頁
【非特許文献１４】Ｗａｎｇ  Ｘ．Ｑ．、Ｌｉｕ  Ｗ．、Ｘｕ  Ｃ．Ｄ．、Ｍｅｉ  Ｈ．、Ｇａｏ  Ｙ．、Ｐｅｎｇ  Ｈ．Ｍ．、Ｙｕａｎ  Ｌ．、Ｘｕ  Ｊ．Ｊ．「Ｃｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ｄｉａｒｒｈｅａ  ｉｎ  ４  ｃｉｔｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｉｎａ」Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｎｕｔｒ．、２０１１年、５３、３６８−７０頁
【非特許文献１５】Ｓｈａｎ  Ｌ．、Ｍａｒｔｉ  Ｔ．、Ｓｏｌｌｉｄ  Ｌ．Ｍ．、Ｇｒａｙ  Ｇ．Ｍ．、Ｋｈｏｓｌａ  Ｃ．「Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｒｏｌｙｌ  ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｃｏｅｌｉａｃ  ｓｐｒｕｅ」Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２００４年、３８３、３１１−３１８頁
【非特許文献１６】Ｇａｓｓ  Ｊ．、Ｂｅｔｈｕｎｅ  Ｍ．Ｔ．、Ｓｉｅｇｅｌ  Ｍ．、Ｓｐｅｎｃｅｒ  Ａ．、Ｋｈｏｓｌａ  Ｃ．「Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｅｔａｒｙ  ｇｌｕｔｅｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｅｌｉａｃ  ｓｐｒｕｅ」Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、２００７年、１３３、４７２−４８０頁
【非特許文献１７】Ｂｅｔｈｕｎｅ  Ｍ．Ｔ．、Ｓｔｒｏｐ  Ｐ．、Ｔａｎｇ  Ｙ．、Ｓｏｌｌｉｄ  Ｌ．Ｍ．、Ｋｈｏｓｌａ  Ｃ．「Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ，ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＥＰ−Ｂ２，ａ  ｓｅｌｆ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｂａｒｌｅｙ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｅｎｄｏｐｒｏｔｅａｓｅ」Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、２００６年、１３、６３７−４７頁
【非特許文献１８】Ｓｔｅｐｎｉａｋ  Ｄ．、Ｓｐａｅｎｉｊ−Ｄｅｋｋｉｎｇ  Ｌ．、Ｍｉｔｅａ  Ｃ．、Ｍｏｅｓｔｅｒ  Ｍ．、ｄｅ  Ｒｕ  Ａ．、Ｂａａｋ−Ｐａｂｌｏ  Ｒ．ｖａｎ  Ｖｅｅｌｅｎ  Ｐ．、Ｅｄｅｎｓ  Ｌ．、Ｋｏｎｉｎｇ  Ｆ．「Ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｌｕｔｅｎ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｅｗｌｙ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｐｒｏｌｙｌ  ｅｎｄｏｐｒｏｔｅａｓｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｃｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ」Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２００６年、２９１、Ｇ６２１−９頁
【非特許文献１９】Ｒｅｉｃｈａｒｄ  Ｕ．、Ｌｅｃｈｅｎｎｅ  Ｂ．、Ａｓｉｆ  Ａ．Ｒ．、Ｓｔｒｅｉｔ  Ｆ．、Ｇｒｏｕｚｍａｎｎ  Ｅ．、Ｊｏｕｓｓｏｎ  Ｏ．、Ｍｏｎｏｄ  Ｍ．「Ｓｅｄｏｌｉｓｉｎｓ，ａ  ｎｅｗ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｄｏｐｒｏｔｅａｓｅ  ｏｒ  ｔｒｉｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｔ  ａｃｉｄｉｃ  ｐＨｓ」Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．、２００６年、７２、１７３９−４８頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の出願人は、酵素の新規ファミリーを同定し、固有の触媒特性を有するこの酵素ファミリーの酵素または組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
出願人は、この酵素ファミリーの生産者としてアクチノアロムルス属種（Ａｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓ  ｓｐ）を同定した。本発明のエンドペプチダーゼは、例えば大豆を含有している適切な培養培地中でのアクチノアロムルスの培養により産生される。出願人による記号でＡ８と最初に同定されたこの株は、イタリアの土壌から単離し、ブダペスト条約の規定により、ＤＳＭＺ、−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ、（現在、Ｌｅｉｂｎｉｚ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔａｒｓｓｅ  ７ｂ、Ｄ−３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙに２０１１年６月２４日に寄託された。この株は、受託番号ＤＳＭ  ２４９８８を与えられた。
【００２１】
本発明のエンドペプチダーゼは、胃および膵臓の酵素による切断に対して耐性があり、腸管腔内に存在することにより毒性作用を生じる、特定のグルテンオリゴペプチドを加水分解できる。酵素処理はこのようなペプチドおよびこれらの毒性作用を取り除くことができ、これはグリアジンを分解できるので、任意のＰＥＰを添加せずにグルテンを解毒する。本発明のペプチダーゼは広範囲のｐＨ活性を有し、ｐＨ３からｐＨ８までタンパク質分解活性を発揮できる。このような活性はグルテナーゼ活性と定義される。
【００２２】
これらのグルテナーゼ酵素は、患者による摂取の前または後のいずれかで、食品内の毒性グルテンオリゴペプチドのレベルを減少させることによってセリアック病および／または疱疹状皮膚炎の症状を予防する方法を提供する。これらの酵素は、食品および飲み物ならびに医薬に使用されるタンパク質加水分解物を効果的に産生するためにプロテイナーゼおよびアミノペプチダーゼなどの他のタンパク質分解酵素と一緒に使用されてもよい。
【００２３】
これらの酵素は、適切な培地中で異なるアクチノロムルス（Ａｃｔｉｎｏｌｌｏｍｕｒｕｓ）株を培養することによってこれらのアクチノロムルス株により分泌され、これらの活性が、発色基質および酵素電気泳動分析の両方を使用することにより評価され得る。
【００２４】
さらに、本発明の酵素は、これらの酵素をコードする核酸を組み込み、酵素を産生および回収するのに適した条件下で培養培地中に細胞を培養することにより宿主細胞内で産生され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明のグルテナーゼおよびセドリシンまたはクマモリシンプロテアーゼの配列から推論される系統ツリー。タンパク質配列はＣＬＵＳＴＡＬＷプログラムで並べ、ブートストラップ値を有する最大尤度ツリーはＭＥＧＡ５ソフトウェアを使用して計算した。アクチノアロムルス属種エンドペプチダーゼは太字である。ＳｅｄＥを外集団として使用した。次いでツリーを、ＭＥＧＡ５ソフトウェアを用いて可視化した。５０％以上のブートストラップ値はノードにて示される。スケールバーは部位あたりのアミノ酸置換の数を示す。ＳｅｄＥ＝Ａ．フミガーツスＡｆ２９３（ＥＡＬ８６８５０）由来のセドリシンＥ；ＳｅｄＢ＝アスペルギウス・フミガーツスＡｆ２９３（ＣＡＥ１７６７４）由来のセドリシンＢ；ＴＰＰａ＝Ａ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＲＩＢ４０（ＢＡＣ５６２３２）由来のトリペプチジルペプチダーゼＡ；ＳｅｄＤ＝Ａ．フミガーツスＡｆ２９３（ＣＡＥ１７６７５）由来のセドリシンＤ；ＳｅｄＣ＝Ａ．フミガーツスＡｆ２９３（ＣＡＥ４６４７３）由来のセドリシンＣ；ＳｅｄＡ＝Ａ．フミガーツスＡｆ２９３（ＣＡＥ５１０７５）由来のセドリシンＡ；ＫｕｍａＡ＝アリシクロバチルス・センダイエンシス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｅｎｄａｉｅｎｓｉｓ）（Ｑ８ＧＢ８８）由来のクマモリシン−Ａｓ；ＫｕｍａＢ＝バチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＭＮ−３２（Ｑ８ＲＲ５６）由来のクマモリシン；セドリシンＡ＝シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）１０１（Ｐ４２７９０）由来のセドリシン；セドリシンＢ＝キサントモナス属種（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）Ｔ−２２（Ｑ６０１０６）由来のセドリシン−Ｂ；Ｅｎｄｏｐｅｐ−は本発明のグルテナーゼである。タンパク質配列の受託番号は丸括弧で報告している。
【図２】種々のｐＨ条件下で蛍光基質スクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＡＭＣで測定したｅｎｄｏｐｅｐ−１４０（＞１００ｋＤａ）およびｅｎｄｏｐｅｐ−４０（＜１００ｋＤａ）の活性プロファイル。蛍光は３７℃にて２時間後に測定した。特定のｐＨ値をＸ軸に示し、相対活性の百分率をＹ軸に示す。
【図３】ｐＨ３およびｐＨ５にて蛍光基質スクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＡＭＣで測定したｅｎｄｏｐｅｐ−１４０（＞１００ｋＤａ）およびｅｎｄｏｐｅｐ−４０（＜１００ｋＤａ）のエンドペプチダーゼ活性。蛍光は３７℃にて種々の時間間隔で測定した。インキュベーション時間をＸ軸に示し、任意の蛍光単位（ｒｆｕ）をＹ軸に示す。
【図４】組換えグルテナーゼのクマシーブルーで染色した８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。２２℃にて一晩、０．２μＭのＩＰＴＧを用いてタンパク質発現を誘導した。Ｓ１はｐＥＴ２８ｂ−ｅｎｄｏｐｅｐ−１４０で形質転換したＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を示し；Ｓ３はｐＥＴ２８ｂ−ｅｎｄｏｐｅｐ−４０で形質転換したＥ．コリ株を示す。使用したマーカーの分子量を左側に示す。左から：レーン１＝分子量マーカー；レーン２＝誘導されていないＳ１；レーン３＝誘導されたＳ１、３時間収集；レーン４＝誘導されたＳ１、一晩（ｏ．ｎ．）収集；レーン５＝ブランク；レーン６＝誘導されていないＳ３；レーン７＝誘導されたＳ３、３時間収集；レーン８＝誘導されたＳ３、ｏ．ｎ．収集。
【図５Ａ】ｅｎｄｏｐｅｐ−１４０による３３量体グリアジンペプチドの分解。経時変化反応産物を逆相ＨＰＬＣにより分離した。図５Ａ：ＭＳトレース、イオン計数ｍ／ｚ＝３００−２０００。０、３０分、２時間の時点で得られたプロファイルを比較する。インタクトな３３量体ペプチド（［Ｍ−２Ｈ］＝１９５７）に対応する１つのシグナルのみが０の時点で存在した。このシグナルは時間と共に効果的に減少した。３０分のインキュベーション後にいくつかのピークが現れ、これらの量は２時間の時点で増加した。観察した全ての分子イオンを表２に報告する。最大の特性ピークのサイズを図で強調している。
【図５Ｂ】ｅｎｄｏｐｅｐ−１４０による３３量体グリアジンペプチドの分解。経時変化反応産物を逆相ＨＰＬＣにより分離した。図５Ｂ：ＵＶ−プロファイル２３０ｎｍ、μＡＵは吸光度マイクロ単位である。０、３０分、２時間の時点で得られたプロファイルを比較する。インタクトな３３量体ペプチド（［Ｍ−２Ｈ］＝１９５７）に対応する１つのシグナルのみが０の時点で存在した。このシグナルは時間と共に効果的に減少した。３０分のインキュベーション後にいくつかのピークが現れ、これらの量は２時間の時点で増加した。観察した全ての分子イオンを表２に報告する。最大の特性ピークのサイズを図で強調している。
【図６Ａ】ペプシン（１ｍｇ／ｍｌ）の存在下でのｅｎｄｏｐｅｐ−１４０による３３量体グリアジンペプチドの分解。経時的反応産物を逆相ＨＰＬＣにより分離した。図６Ａ：ＭＳトレース、イオン計数ｍ／ｚ＝３００−２０００。０、３０分、２時間の時点で得られたプロファイルを比較する。インタクトな３３量体のペプチドに対応する１つのシグナル（［Ｍ−２Ｈ］＝１９５７）のみが０の時点で存在したのに対して、３０分のインキュベーション後にいくつかのピークが現れ、これらの量は２時間の時点で増加した。観察した全ての分子イオンを表３に報告する。最大の特性ピークのサイズを図で強調している。９個のアミノ酸のペプチドに対応するシグナル（［Ｍ−Ｈ］＝１０６８）は３３量体の配列に存在する。シグナル６８９．７はペプシンに起因する。
【図６Ｂ】ペプシン（１ｍｇ／ｍｌ）の存在下でのｅｎｄｏｐｅｐ−１４０による３３量体グリアジンペプチドの分解。経時的反応産物を逆相ＨＰＬＣにより分離した。図６Ｂ：ＵＶ−プロファイル２３０ｎｍ、μＡＵは吸光度マイクロ単位である。０、３０分、２時間の時点で得られたプロファイルを比較する。インタクトな３３量体のペプチドに対応する１つのシグナル（［Ｍ−２Ｈ］＝１９５７）のみが０の時点で存在したのに対して、３０分のインキュベーション後にいくつかのピークが現れ、これらの量は２時間の時点で増加した。観察した全ての分子イオンを表３に報告する。最大の特性ピークのサイズを図で強調している。９個のアミノ酸のペプチドに対応するシグナル（［Ｍ−Ｈ］＝１０６８）は３３量体の配列に存在する。シグナル６８９．７はペプシンに起因する。
【図７Ａ】ＨＰＬＣ−ＭＳ分析。３３量体のグリアジンペプチドをペプシンとインキュベートした。図７Ａ：ＭＳトレース。０および２時間の時点で得られたプロファイルを比較する。３３量体の分解はほぼ観察されなかった。
【図７Ｂ】ＨＰＬＣ−ＭＳ分析。３３量体のグリアジンペプチドをペプシンとインキュベートした。図７Ｂ：ＵＶ−プロファイル２３０ｎｍ、μＡＵは吸光度マイクロ単位である。０および２時間の時点で得られたプロファイルを比較する。３３量体の分解はほぼ観察されなかった。
【図８】クマシーブルーで染色したグリアジンＳＤＳ−ＰＡＧＥのタンパク質分解。ペプシンの存在下または非存在下での２つの異なるグルテナーゼによるグリアジン消化。３７℃にて２時間、グリアジンをインキュベートした。左から：レーン１＝分子量マーカー；レーン２＝グリアジン；レーン３＝グリアジン＋ｅｎｄｏｐｅｐ−４０（＜１００ｋＤａ）；レーン４＝グリアジン＋ｅｎｄｏｐｅｐ−４０（＜１００ｋＤａ）＋ペプシン；レーン５＝１０分のインキュベーション後に停止させた反応３；レーン６＝グリアジン＋ｅｎｄｏｐｅｐ−１４０（＞１００ｋＤａ）；レーン７＝グリアジン＋ｅｎｄｏｐｅｐ−１４０（＞１００ｋＤａ）＋ペプシン。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
表１．アクチノアロムルスのセクレトームから精製された推定タンパク質。
【００２７】
表２．ｅｎｄｏｐｅｐ−１４０を用いた３３量体の消化により放出されたペプチド。
【００２８】
表３．ｅｎｄｏｐｅｐ−４０を用いた３３量体の消化により放出されたペプチド。
【００２９】
アクチノミセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）は、主に二次生物活性代謝産物を産生するこれらの能力について知られている、線維状グラム陽性菌である。アクチノミセスはヒドロラーゼの供給源として使用されているが、少しだけ、特に好アルカリ性のものが、これらの酵素潜在力についてこれまでに調査されている（Ｅｎｄｏ  Ａ．、Ｍｕｒａｋａｗａ  Ｓ．、Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｈ．、Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ  Ｙ．「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ」Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９８７年、１０２、１６３−７０頁；Ｓａｋｕｒａｉ  Ｙ．、Ｉｎｏｕｅ  Ｈ．、Ｎｉｓｈｉｉ  Ｗ．、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｔ．、Ｉｉｎｏ  Ｙ．、Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｍ．、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ．「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｍａｊｏｒ  Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐａｒｖｕｌｕｓ」Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００９年、７３、２１−２８頁；Ｍｅｈｔａ  Ｖ．Ｊ．、Ｔｈｕｍａｒ  Ｊ．Ｔ．、Ｓｉｎｇｈ  Ｓ．Ｐ．、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  ａｎ  ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｉｃ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ」Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００６年、９７、１６５０−１６５４頁）。
【００３０】
さらに、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）の完全なゲノム配列は、８１９個の可能性のある分泌されたタンパク質の中から６０個の分泌された推定プロテアーゼおよびペプチダーゼの存在を予測し（Ｂｅｎｔｌｅｙ  Ｓ．Ｄ．、Ｃｈａｔｅｒ  Ｋ．Ｆ．、Ｃｅｒｄｅｎｏ−Ｔａｒｒａｇａ  Ａ．Ｍ．、Ｃｈａｌｌｉｓ  Ｇ．Ｌ．、Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｎ．Ｒ．、Ｊａｍｅｓ  Ｋ．Ｄ．、Ｈａｒｒｉｓ  Ｄ．Ｅ．、Ｑｕａｉｌ  Ｍ．Ａ．、Ｋｉｅｓｅｒ  Ｈ．、Ｈａｒｐｅｒ  Ｄ．、Ｂａｔｅｍａｎ  Ａ．、Ｂｒｏｗｎ  Ｓ．、Ｃｈａｎｄｒａ  Ｇ．、Ｃｈｅｎ  Ｃ．Ｗ．、Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｍ．、Ｃｒｏｎｉｎ  Ａ．、Ｆｒａｓｅｒ  Ａ．、Ｇｏｂｌｅ  Ａ．、Ｈｉｄａｌｇｏ  Ｊ．、Ｈｏｒｎｓｂｙ  Ｔ．、Ｈｏｗａｒｔｈ  Ｓ．、Ｈｕａｎｇ  Ｃ．Ｈ．、Ｋｉｅｓｅｒ  Ｔ．、Ｌａｒｋｅ  Ｌ．、Ｍｕｒｐｈｙ  Ｌ．、Ｏｌｉｖｅｒ  Ｋ．、Ｏ’Ｎｅｉｌ  Ｓ．、Ｒａｂｂｉｎｏｗｉｔｓｃｈ  Ｅ．、Ｒａｊａｎｄｒｅａｍ  Ｍ．Ａ．、Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ  Ｋ．、Ｒｕｔｔｅｒ  Ｓ．、Ｓｅｅｇｅｒ  Ｋ．、Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｄ．、Ｓｈａｒｐ  Ｓ．、Ｓｑｕａｒｅｓ  Ｒ．、Ｓｑｕａｒｅｓ  Ｓ．、Ｔａｙｌｏｒ  Ｋ．、Ｗａｒｒｅｎ  Ｔ．、Ｗｉｅｔｚｏｒｒｅｋ  Ａ．、Ｗｏｏｄｗａｒｄ  Ｊ．、Ｂａｒｒｅｌｌ  Ｂ．Ｇ．、Ｐａｒｋｈｉｌｌ  Ｊ．、Ｈｏｐｗｏｏｄ  Ｄ．Ａ．「Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｄｅｌ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）」Ｎａｔｕｒｅ、２００２年、４１７、１４１−７頁）、新規の加水分解酵素についての潜在的な供給源としてのアクチノミセスのさらなる有益性を与えている。アクチノミセスの中でも、好酸性株が、ＣＤに効果的である要件、すなわち酸性ｐＨにおける活性に最適に適合する特性を有する酵素を産生する、より高い機会を与える。好酸性アクチノミセスのいくつかの新たな属（すなわち、カテヌリスポラ（Ｃａｔｅｎｕｌｉｓｐｏｒａ）、アクチノスピカ（Ａｃｔｉｎｏｓｐｉｃａ）、ルゴシモノスポラ（Ｒｕｇｏｓｉｍｏｎｏｓｐｏｒａ）、ストレプトアシジフィラス（Ｓｔｒｅｐｔａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｓ））および以前に知られていない細菌系統（すなわちクテドノバクター（Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ））に属している好酸性特性を有する線維状細菌が、近年初めて記載されている（Ｂｕｓｔｉ  Ｅ．、Ｃａｖａｌｅｔｔｉ  Ｌ．、Ｍｏｎｃｉａｒｄｉｎｉ  Ｐ．、Ｓｃｈｕｍａｎｎ  Ｐ．、Ｒｏｈｄｅ  Ｍ．、Ｓｏｓｉｏ  Ｍ．、Ｄｏｎａｄｉｏ  Ｓ．「Ｃａｔｅｎｕｌｉｓｐｏｒａ  ａｃｉｄｉｐｈｉｌａ  ｇｅｎ．ｎｏｖ．，ｓｐ．ｎｏｖ．，ａ  ｎｏｖｅｌ，ｍｙｃｅｌｉｕｍ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ，ａｎｄ  ｐｒｏｐｏｓａｌ  ｏｆ  Ｃａｔｅｎｕｌｉｓｐｏｒａｃｅａｅ  ｆａｍ．ｎｏｖ．」Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、２００６年、５６、１７４１−１７４６頁；Ｃａｖａｌｅｔｔｉ  Ｌ．、Ｍｏｎｃｉａｒｄｉｎｉ  Ｐ．、Ｂａｍｏｎｔｅ  Ｒ．、Ｓｃｈｕｍａｎｎ  Ｐ．、Ｒｏｈｄｅ  Ｍ．、Ｓｏｓｉｏ  Ｍ．、Ｄｏｎａｄｉｏ  Ｓ．「Ｎｅｗ  ｌｉｎｅａｇ���  ｏｆ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ，ｓｐｏｒｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ，ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｆｒｏｍ  ｓｏｉｌ」Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２００６年、７２、４３６０−４３６９頁；Ｃａｖａｌｅｔｔｉ  Ｌ．、Ｍｏｎｃｉａｒｄｉｎｉ  Ｐ．、Ｓｃｈｕｍａｎｎ  Ｐ．、Ｒｏｈｄｅ  Ｍ．、Ｂａｍｏｎｔｅ  Ｒ．、Ｂｕｓｔｉ  Ｅ．、Ｓｏｓｉｏ  Ｍ．、Ｄｏｎａｄｉｏ  Ｓ．「Ａｃｔｉｎｏｓｐｉｃａ  ａｃｉｄｉｐｈｉｌａ  ｇｅｎ．ｎｏｖ．，ｓｐ．ｎｏｖ．ａｎｄ  Ａｃｔｉｎｏｓｐｉｃａ  ｒｏｂｉｎｉａｅ  ｇｅｎ．ｎｏｖ．，ｓｐ．ｎｏｖ．；ｐｒｏｐｏｓａｌ  ｆｏｒ  Ａｃｔｉｎｏｓｐｉｃａｃｅａｅ  ｆａｍ．ｎｏｖ．ａｎｄ  Ｃａｔｅｎｕｌｉｓｐｏｒｉｎａｅ  ｓｕｂｏｒｄｏ．ｎｏｖ．ｉｎ  ｔｈｅ  ｏｒｄｅｒ  Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ」Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、２００６年、５６、１７４７−１７５３頁；Ｍｏｎｃｉａｒｄｉｎｉ  Ｐ．、Ｃａｖａｌｅｔｔｉ  Ｌ．、Ｒａｎｇｈｅｔｔｉ  Ａ．、Ｓｃｈｕｍａｎｎ  Ｐ．、Ｒｏｈｄｅ  Ｍ．、Ｂａｍｏｎｔｅ  Ｒ．、Ｓｏｓｉｏ  Ｍ．、Ｍｅｚｚｅｌａｎｉ  Ａ．、Ｄｏｎａｄｉｏ  Ｓ．「Ｎｏｖｅｌ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆａｍｉｌｙ  Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ，Ｒｕｇｏｓｉｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ａｃｉｄｉｐｈｉｌａ  ｇｅｎ．ｎｏｖ．，ｓｐ．ｎｏｖ．ａｎｄ  Ｒｕｇｏｓｉｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ａｆｒｉｃａｎａ  ｓｐ．ｎｏｖ」Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、２００９年、５９、２７５２−２７５８頁；Ｋｉｍ  Ｓ．Ｂ．、Ｌｏｎｓｄａｌｅ  Ｊ．、Ｓｅｏｎｇ  Ｃ．Ｍ．、Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ  Ｍ．「Ｓｔｒｅｐｔａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｓ  ｇｅｎ．ｎｏｖ．，ａｃｉｄｏｐｈｉｌｉｃ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｗａｌｌ  ｃｈｅｍｏｔｙｐｅ  Ｉ  ａｎｄ  ｅｍｅｎｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆａｍｉｌｙ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ（Ｗａｋｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｈｅｎｒｉｃｉ（１９４３）ＡＬ）ｅｍｅｎｄ．Ｒａｉｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）」Ａｎｔｏｎｉｅ  ｖａｎ  Ｌｅｅｗｅｎｈｏｅｋ、２００３年、８３、１０７−１１６頁）。
【００３１】
多くの他のアクチノミセスと同様に、アクチノアロムルスは、単一窒素および炭素源としてタンパク質を含有している培地中で増殖できる。タンパク質培地中で増殖するこの能力は、分泌されたエンドプロテアーゼおよびエキソプロテアーゼの相乗作用に依存する。なぜなら、アミノ酸および短いペプチドのみが膜輸送を介して同化され得るからである。アクチノアロムルス株はわずかに酸性ｐＨにて最適に増殖するので、タンパク質分解酵素が、このｐＨにて発現され得、酸性条件において複合タンパク質を消化できることが示唆されている。出願人の知識によれば、他の報告では、アクチノミセス由来の酸性ｐＨにて作用するプロテアーゼの産生は記載されていない。
【００３２】
アクチノアロムルス属種ＤＳＭ２４９８８は、イタリアの土壌から出願人により単離され、出願人の菌コレクションに保存され、ブダペスト条約の規定により、２０１１年６月２４日にＤＳＭＺ、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒ．７ｂ、Ｄ−３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ（現在、Ｌｅｉｂｎｉｚ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）に寄託された。この株は受託番号ＤＳＭ２４９８８を与えられた。アクチノアロムルス属種ＤＳＭ２４９８８は、ＨＣｌを含み、ｐＨ５．５に酸性化した種々の標準的な固体培地（Ｓｈｉｒｌｉｎｇ  Ｅ．Ｂ．、Ｇｏｔｔｌｉｅｂ  Ｄ．「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ」Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９６６年、１６、３１３−３４０頁）で増殖する。２８℃でのインキュベーションの１５日後、基質菌糸は包旋形であり、この色はクリーム色で、時間が経つと紫色になり、気中菌糸体はＩＳＰ２寒天上で産生しない。ＨＳＡ５上で生成する場合、気中菌糸体の色は白色である（Ｂｕｓｔｉら、２００６年）。包旋形のクリーム色／茶色の栄養菌糸の豊富な増殖および産生を、インキュベーションの１５日後にＩＳＰ３寒天上で観察した。茶色がかった可溶性色素のわずかな産生がインキュベーションの２０日後に存在する。この株は２１℃から３５℃の間の温度で増殖でき、最適温度はＩＳＰ２およびＨＳＡ５上で２８℃である。アクチノアロムルス属種ＤＳＭ２４９８８は、２．５％（ｗ／ｖ）までＮａＣｌの存在下で増殖でき、１％（ｗ／ｖ）およびより高い濃度にて、この株は、包旋形のクリーム色の基質菌糸だけでなく、紫色の栄養菌糸に分化しない。ＨＣｌまたはＮａＯＨを含む所望のｐＨ値に調整されたＩＳＰ２寒天上に播種された株は、４．０から７．０の間のｐＨ、最適ｐＨ５．５で良く増殖する。豊富な包旋形のクリーム色の栄養菌糸は、グルテンを添加された酸性ＩＳＰ９上で増殖する場合に観察される。気中菌糸および可溶性色素は産生されない。
【００３３】
分泌されたアクチノアロムルスタンパク質のプロテオミクス研究により、中性、塩基性または酸性ｐＨにおける異なるセットのプロテアーゼ活性、特にＳ８／Ｓ５３ペプチダーゼファミリーのいくつかのメンバーが分泌されていることが確認されている。
【００３４】
本発明のグルテナーゼは、ＭＥＲＯＰＳペプチダーゼＳ８［サブファミリーＳ８Ａ（スブチリシン）およびＳ８Ｂ（ケキシン）ファミリー］およびＳ５３（セドリシン）ファミリーに属している（Ｒａｗｌｉｎｇｓ  Ｎ．Ｄ．、Ｂａｒｒｅｔｔ  Ａ．Ｊ．、Ｂａｔｅｍａｎ  Ａ．「ＭＥＲＯＰＳ：ｔｈｅ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｄａｔａｂａｓｅ」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２０１０年、３８、Ｄ２２７−Ｄ２３３頁）。
【００３５】
グルテンは、弾性および他の所望の特性をパン生地および多くの他の食品に提供するこの能力に固有である、小麦、大麦、ライ麦および関連種のタンパク質（ｐｒｏｔｅｉｃ）成分である。グルテンタンパク質は、グルタミン（３５％）およびプロリン（１５％）残基が豊富にあり、疾患に特異的なＴ細胞により認識されているグルテンエピトープの中で特に注目に値する。小麦グルテンの主要な毒性成分はグリアジンであり、いくつかのＴ細胞刺激エピトープを含有するプロリンリッチおよびグルタミンリッチのタンパク質のファミリーである。ペプシン、トリプシン、キモトリプシンによる消化管内のこれらの部分分解は、いくつかの毒性ペプチドの形成を導き、これらの中で、α１−グリアジン画分のペプチドｐ３１−４９およびこの誘導されたｐ３１−４３ならびにα２−画分のｐ５６−８３（３３量体）は最適に特徴付けられている。３３量体は、生理学的胃腸酵素消化をインビトロで模倣することによっても得られる３３個の残基のペプチド断片であり（Ｓｈａｎら、２００２年）、このアミノ酸配列はＬＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＰＦ（配列番号６）である。これはセリアック病を患っている患者内の免疫原性であるこれらのエピトープの複数のコピーを保有するので、これは最も強力な免疫刺激ペプチドであり、それ故、これは強力な免疫毒性反応に関与しており（Ｑｉａｏ  Ｓ．Ｗ．、Ｂｅｒｇｓｅｎｇ  Ｅ．、Ｍｏｌｂｅｒｇ  Ｏ．、Ｘｉａ  Ｊ．、Ｆｌｅｃｋｅｎｓｔｅｉｎ  Ｂ．、Ｋｈｏｓｌａ  Ｃ．、Ｓｏｌｌｉｄ  Ｍ．Ｌ．「Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｉａｃ  Ｌｅｓｉｏｎ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ａ  ３３−ｍｅｒ  Ｇｌｉａｄｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎａｔｕｒａｌｌｙ  Ｆｏｒｍｅｄ  ｂｙ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ」Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００４年、１７３、１７５７−１７６２頁）、したがってこれは、グルテン解毒のためのモデルとして使用されている。３３量体ペプチドは、固有層内のグリアジンペプチドを脱アミド化する酵素トランスグルタミナーゼ２（ＴＧ２）のための優れた基質であり、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ＤＱ２またはＤＱ８分子に対するこれらの親和性を増加させ、それ故、臨床的帰結を導くＴ細胞媒介性粘膜免疫反応を増強する。腸細胞層を横切るインタクトな３３量体の腸管輸送は、ＣＤ内のトランスフェリン受容体の過剰発現に起因し得るおよび／または増強された粘膜透過性に起因し得る。とにかく、ペプチドは、酸性エンドソーム−リソソーム経路による分解を免れることができ、未変化の漿膜境界に到達できる。３３量体のグリアジンペプチドの、９個未満の残基を含有しているペプチドへの分解は、グルテンの毒性を生じない。
【００３６】
消化管は、グルテン由来のプロリンリッチペプチドを効果的に切断する酵素機能を有さず、セリアック病を患っている患者において異常免疫腸反応を引き起こすので、毒性グリアジンペプチドが粘膜に到達する前にこれらの毒性グリアジンペプチドを分解する経口活性プロテアーゼの使用は、食事に対する代替の治療とみなされ得る。
【００３７】
出願人は、胃液のｐＨに対応する、酸性ｐＨにおいてプロリンリッチペプチドなどのペプチドに対してタンパク質分解活性を示すタンパク質の新規サブファミリーを同定し、この酵素組成物がまた、３３量体のグリアジンペプチドを分解できることを発見した。バイオインフォマティクス分析により得られた構造特性に基づいて、出願人は、この新規サブファミリーが、ペプチダーゼＳ８／Ｓ５３（スブチリシン、ケキシン、セドリシン）に属しており、Ｓ５３ファミリーに属している既に知られていたセドリシンまたはクマモリシンと異なる新規サブグループ分類され得ることを示した（図１）。
【００３８】
出願人はこれらのエンドペプチダーゼの特定の組成物を開発した。この組成物は、完全長ポリペプチドを消化し、プロテアーゼ作用に耐性があることが知られていたグリアジンの断片を分解するアクチノアロムルスにより産生されたペプチダーゼＳ８／Ｓ５３（スブチリシン、ケキシン、セドリシン）ファミリーのエンドプロテアーゼの少なくとも１つを含む。したがって、少なくとも１つのエンドプロテアーゼが、セリアック病または吸収不良などの消化プロセスの任意の疾患の治療に使用されてもよい。さらに、この酵素はペプシンに耐性があるので、これらの２つのタンパク質分解活性の組合せは、グリアジンなどのポリペプチドおよびタンパク質のより広範囲の分解を生じることができる。出願人は、３３量体が６個のアミノ酸のペプチドに分解されることを発見した（表２および３）。本発明の酵素は単独で活性であるが、プロリル−エンドプロテアーゼおよび／またはｘ−プロリル−ジペプチジルアミノペプチダーゼおよび／またはプロリル−アミノペプチダーゼなどのプロリンリッチペプチドに対して作用する１つ以上のペプチドのこれらへの添加は、より急速な作用を生じることができる。
【００３９】
単独または場合によって他のプロテアーゼと組み合わせた本発明のＳ８／Ｓ５３タンパク質ファミリーは、限定されないが、苦味の基質を分解するため、肉の処理、石鹸業界またはプリオン、ウイルスおよび毒性もしくは汚染タンパク質を短いペプチドおよび／もしくは遊離アミノ酸に分解するためなどで食品産業において有用であり得る。
【００４０】
したがって、本発明は、
ａ）配列番号１、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−１４０、
ｂ）配列番号２、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−４０、
ｃ）配列番号３、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−１２０、
ｄ）配列番号４、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−６０、
ｅ）配列番号５、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−４１
からなる群から選択される、３から８の間（含む）のｐＨにおいて活性な少なくとも１つのＳ８／Ｓ５３エンドペプチダーゼを含む、酵素組成物を提供する。
【００４１】
本明細書で使用している場合、「本発明のペプチダーゼ」、「本発明のプロテアーゼ」または「本発明のエンドペプチダーゼ」という用語は、上記に定義したエンドペプチダーゼの１つ以上を特定している。
【００４２】
本発明はまた、上記に示した配列のいずれか１つに由来するエンドペプチダーゼを含み、このアミノ酸のいずれかは、この生物活性および生理機能またはこの生物学的活性断片をさらに維持しながら、配列番号１、２、３、４または５に示された対応する残基から変化されてもよい。本発明の目的はまた、生物活性および天然アミノ酸配列の生理機能を保存するこの天然アミノ酸配列のアミノ酸配列内の特定の位置において置換、欠失、側鎖修飾および／または挿入を含有している任意のペプチダーゼバリアントを含む。置換の例は、当業者に周知であり、例えば、ＷＯ２０１１／０７７３５９に示されている。
【００４３】
別の態様において、本発明は、本発明の単離されたプロテアーゼおよびこの生物学的活性断片（またはこの誘導体、部分、類似体もしくは相同体）に関する。生物学的活性断片とは、特異的プロテアーゼ活性に必要である、本発明のプロテアーゼの領域を指している。
【００４４】
さらなる実施形態において、本発明のプロテアーゼは、配列番号１、２、３、４または５を含むアミノ酸配列に対して少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは８０％、なおより好ましくは９０％、最も好ましくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１、２、３、４もしくは５を含むプロテアーゼの活性を保持するプロテアーゼである。
【００４５】
ヌクレオチドまたはアミノ酸配列について言及する場合、「同一性」および「相同性」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が、特定の領域の比較にわたって残基ごとのベースで同一または相同である程度を指している。アラインメントおよび同一性または相同性パーセントは、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．ら、「Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｌｙ  Ａｖａｉｌａｂｌｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９８７年、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３０、Ｓｅｃｔｉｏｎ  ７．７．１８、Ｔａｂｌｅ  ７．７．１）に記載されているものなどの当該技術分野において公知の任意の適切なソフトウェアプログラムを使用して決定され得る。好ましいプログラムには、ＧＣＧ  Ｐｉｌｅｕｐプログラム、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｒ．およびＬｉｐｍａｎ  Ｄ．Ｊ．「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．、Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８８年、８５、２４４４−２４４８頁）およびＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．、Ｇｉｓｈ  Ｗ．、Ｍｉｌｌｅｒ  Ｗ．、Ｍｙｅｒｓ  Ｅ．Ｗ．、Ｌｉｐｍａｎ  Ｄ．Ｊ．「Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９０年、２１５、４０３−４１０頁）が含まれる。
【００４６】
本発明はまた、当業者によりキメラまたは標識タンパク質と呼ばれる、別のポリペプチドに作動可能に融合された本発明のプロテアーゼを提供する。このポリペプチドは、本発明のプロテアーゼのＮ末端および／またはＣ末端に融合され得る。異なる標識融合タンパク質は当業者により扱われ得、標準的な組換えＤＮＡ技術または自動化ＤＮＡ合成を含む従来技術により産生され得る。このような融合タンパク質は、本発明の組換えプロテアーゼの精製または宿主細胞内でのこれらの発現および分泌を容易にできる。これらの技術は当業者に周知である。
【００４７】
出願人は、３３量体グリアジンペプチドなどの大きなペプチドが、エンドペプチダーゼにより酸性ｐＨにおいて分解され得ることを示している。分泌されたｅｎｄｏｐｅｐ−１４０は、６個のアミノ酸の異なる小さなペプチドを生成するいくつかの点においてポリペプチド鎖を切断することにより作用する（表２、図５）。このエンドペプチダーゼは、Ｐ１位においてチロシンまたはロイシンまたはフェニルアラニンならびにＰ２およびＰ１’位においてプロリンを有する部位を選択することを示している。エンドペプチダーゼの量および／またはインキュベーション時間の増加は３３量体のポリペプチドの完全な分解を導く。検出された分子量によれば、グルタミン残基はグルタミン酸残基に変換しているようなので、アミドトランスフェラーゼ活性の関与を示唆している。本発明の酵素組成物のエンドペプチダーゼは哺乳動物ペプシンの存在下で作用できる（表２、図６）。
【００４８】
ｅｎｄｏｐｅｐ−４０を用いて同じ分析が実施され、表３に示した、得られた結果は、このグルテナーゼが同様に作用することを示している。
【００４９】
ｅｎｄｏｐｅｐ−１４０は本発明の他のエンドペプチダーゼに対して高い相同性を有する構造ドメインを含有する。例えば、ＢＬＡＳＴアラインメントは、同一性＝２２３／３７０（６０％）、陽性＝ｅｎｄｏｐｅｐ−１４０とｅｎｄｏｐｅｐ−４０との間で２６１／３７０（７１％）または同一性＝２２７／４３１（５３％）、陽性＝ｅｎｄｏｐｅｐ−１４０とｅｎｄｏｐｅｐ−４１との間で２７３／４３１（６３％）を与える。同様の結果が、ｅｎｄｏｐｅｐ−４０とｅｎｄｏｐｅｐ−４１との間のＢＬＡＳＴアラインメントにより得られ、同一性＝２３０／４１９（５５％）、陽性＝２７８／４１９（６６％）を有する。陽性は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスで決定された場合、これらの物理化学的特徴において互いに同一または非常に類似しているアミノ酸残基である。
【００５０】
本発明の酵素組成物のエンドペプチダーゼは、上記に定義された少なくとも１つのＳ８／Ｓ５３エンドペプチダーゼを産生できる天然に存在するアクチノアロムルス株もしくはこの変異体または組換えＤＮＡ技術により得られた宿主細胞の培養により産生され得る。
【００５１】
細胞に言及して使用されている場合、「組換え体」という用語は、細胞が異種核酸を複製するまたは異種核酸によりコードされたペプチドもしくはタンパク質を発現することを示している。組換え細胞には、細胞の天然（非組換え体）形態内に見られなかった遺伝子または修飾および人工手段によって細胞内に再組み込まれた天然（非組換え体）形態内に見られる遺伝子が含まれる。
【００５２】
当業者は、これらの細胞が単細胞または多細胞トランスジェニック生物であり得ることを認識している。
【００５３】
本発明はまた、細胞から核酸を除去せずに修飾されている細胞に内在する核酸を含有する細胞の培養に基づいた方法を含み、このような修飾には、遺伝子置換、部位特異的変異および関連技術、例えば、変異誘発物質または電離放射線を用いた処理により得られたものが含まれる。
【００５４】
「対立遺伝子バリアント」という用語は、同じ染色体座を占める遺伝子の２つ以上の代替形態のいずれかを示す。対立遺伝子変化は、変異を介して天然に発生し、集団内に表現型多型を生じ得る。遺伝子変異は、サイレント（コードされたポリペプチドにおいて変化なし）であってもよいまたは変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしてもよい。対立遺伝子バリアントという用語はまた、遺伝子の対立遺伝子バリアントによりコードされたタンパク質を指している。
【００５５】
したがって、本発明は、
Ａ）上記に定義された少なくとも１つのＳ８／Ｓ５３エンドペプチダーゼを産生できる天然に存在するアクチノアロムルス株を培養する工程および培養バッチからエンドペプチダーゼを回収する工程または
Ｂ）上記に定義されたエンドペプチダーゼの少なくとも１つを産生する能力を維持する、従来の変異および／もしくは選択技術により上記に定義した少なくとも１つのＳ８／Ｓ５３エンドペプチダーゼを産生できる天然に存在するアクチノアロムルス株に由来するアクチノアロムルス株を培養する工程ならびに培養バッチからエンドペプチダーゼを回収する工程または
Ｃ）以下の工程を含む組換えＤＮＡ技術：
１）
ａ）配列番号１、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−１４０、
ｂ）配列番号２、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−４０、
ｃ）配列番号３、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−１２０、
ｄ）配列番号４、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−６０ならびに
ｅ）配列番号５、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−４１
からなる群から選択されるＳ８／Ｓ５３スブチリシン、ケキシン、セドリシンクラスの少なくとも１つのエンドペプチダーゼをコードする核酸を宿主細胞内に組み込む工程、
２）エンドペプチダーゼを産生するのに適した条件下で、培養培地中で工程１）の細胞を培養する工程および
３）培養バッチからエンドペプチダーゼを回収する工程
を含む、本発明の酵素組成物を産生する方法を提供している。
【００５６】
本発明の１つ以上のエンドペプチダーゼは上記に定義された１つの方法を実施するのに産生され得る。単一のエンドペプチダーゼが上記に定義された方法を実施して別々に産生される場合、本発明は場合によって、前記エンドペプチダーゼの混合物を含有する酵素組成物を提供するために、得られたエンドペプチダーゼの２つ以上を組み合わせる工程を含む。前記エンドペプチダーゼは単離されたエンドペプチダーゼとして得られてもよい。本明細書で使用されている場合、「単離されたエンドペプチダーゼ」という用語に関して、エンドペプチダーゼの精製された形態は、エンドペプチダーゼが由来する細胞由来の他のタンパク質または細胞物質を実質的に含まないことを意図とする。
【００５７】
本明細書において使用されているこれらの関連した操作技術について言及されている全てのＤＮＡ／ＲＮＡ核酸という用語はまた、分子生物学の分野において当業者に周知であり、今までこれらの用語は、Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ  Ｅ．Ｆ．、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８２年またはＡｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９３年またはＳａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２  ｎｄ  Ｅｄ．」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９年に報告されているような全てのこれらの広範で一般的な意味において使用されている。
【００５８】
本発明の酵素組成物のエンドペプチダーゼをコードする核酸は、この配列が本明細書において提供されており、配列番号７、８、９、１０もしくは１１として定義された核酸またはこれらの断片を含む本発明のさらなる目的である。本発明はまた、変異体もしくはバリアント核酸またはこれらの核酸の部分を含む。したがって、本発明の核酸は、配列番号７、８、９、１０もしくは１１に示されたポリヌクレオチド配列または配列番号７、８、９、１０もしくは１１を含む核酸配列に対して少なくとも５０％、好ましくは６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは８０％、なおより好ましくは９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、前記アミノ酸配列の生物学的活性および生理機能をさらに維持しているアミノ酸配列をコードする。
【００５９】
ヌクレオチドレベルにおける同一性により特徴付けられている配列は、「相同核酸配列」またはこのバリアントとしてもまた、本明細書に示されている。相同ヌクレオチド配列は本発明のプロテアーゼのアイソフォームをコードするこれらの配列をコードする。アイソフォームは、例えば、ＲＮＡの選択的スプラインシングの結果として同じ生物内で発現され得る。代替として、アイソフォームは異なる遺伝子によりコードされてもよい。
【００６０】
相同ヌクレオチド配列はまた、限定されないが、本明細書に記載されているヌクレオチド配列の天然に存在する対立遺伝子バリアントおよび変異体を含む。相同核酸配列は、配列番号１、２、３、４もしくは５における保存アミノ酸置換をコードするこれらの核酸配列を含む。
【００６１】
本発明において、相同ヌクレオチド配列は、アクチノアロムルスに属している他の種および例えばカテヌリスポラ、アクチノスピカ、クテドノバクター、ストレプトマイセス、ストレプトアシジフィルス（Ｓｔｒｅｐｔａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｓ）、ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）、ルゴシモノスポラなどのアクチノアロムルス以外の属の本発明のプロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。出願人は、ＢＬＡＳＴ分析により、カテヌリスポラ、クテドノバクター、ストレプトマイセスゲノムが、本発明の対応するプロテアーゼに対して５０％より高い相同性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含有することを決定した。例えば、カテヌリスポラ・アシジフィラ（Ｃａｔｅｎｕｌｉｓｐｏｒａ  ａｃｉｄｉｐｈｉｌａ）の受託番号ＡＣＵ７２５３４およびＡＣＵ７２３２０を有する推定タンパク質は、それぞれ、ｅｎｄｏｐｅｐ−４０配列番号２について同一性＝２６１／４００（６５％）、陽性＝２９５／４００（７４％）ならびにｅｎｄｏｐｅｐ−１４０配列番号１について同一性＝７０５／１３４２（５３％）、陽性＝８７８／１３４２（６５％）を有するまたはクテドノバクター・ラセミファー（Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｒａｃｅｍｉｆｅｒ）の受託番号ＥＦＨ８１８３７を有する推定タンパク質は、ｅｎｄｏｐｅｐ−４０配列番号２について同一性＝２４４／４０２（６１％）、陽性２９９／４０２（７４％）を有するまたは受託番号ＥＦＦ９１２７０を有するストレプトマイセス属種ｅ１４タンパク質配列は、同様にｅｎｄｏｐｅｐ−４０配列番号２について同一性＝２３０／３７１（６２％）、陽性＝２７４／３７１（７４％）を有する。遺伝子をコードする相同エンドペプチダーゼは、ゲノム配列が公開データベースにより入手可能でない上述のものと系統発生的に関連した属に属している株に存在し得る。
【００６２】
本発明のエンドプロテアーゼの「生物学的活性断片」は、（例えば、インビトロでの組換え発現により）エンドプロテアーゼのコードされた部分を発現し、エンドプロテアーゼのコードされた断片の活性を評価する、本発明のエンドプロテアーゼの同じ生物活性を有するエンドプロテアーゼをコードする配列番号７、８、９、１０もしくは１１の核酸断片を単離することにより調製され得る。本発明は、遺伝コードの縮重に起因する配列番号７、８、９、１０または１１に示された核酸配列と異なる核酸分子をさらに包含し、したがって、配列番号７、８、９、１０または１１に示された核酸配列によりコードされている同じプロテアーゼをコードする。
【００６３】
遺伝子操作およびタンパク質発現のための技術は当業者に公知であり、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ  Ｍ．「Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９９０年にも見出され得る。
【００６４】
出願人は、「生物活性」または「機能活性」という用語に関して、本発明のプロテアーゼの天然または正常な機能、例えば他のタンパク質を分解する能力を示している。本発明のプロテアーゼの間で保存されているアミノ酸残基は特に変化を受けにくいことが予測されている。保存的置換がなされ得るアミノ酸は当該技術分野内で周知である。全ての当業者が認識しているように、核酸内の各コドン（通常、メチオニンについてのコドンのみである、ＡＵＧ以外）は標準的な技術により機能的に同一の分子を生じるように修飾されてもよい。さらに、コードされた配列内の単一のアミノ酸またはわずかな割合のアミノ酸（典型的に５％未満、より典型的には１％未満）を変化する、付加するまたは欠失する個々の置換、欠失または付加は「保存的変異」であり、この変化は、化学的に類似しているアミノ酸とのアミノ酸の置換を生じる。
【００６５】
本発明の別の態様は、活性に必須でないアミノ酸残基における変化を含有する本発明のプロテアーゼをコードする核酸分子に関する。本発明のこのようなプロテアーゼは、配列番号１、２、３、４または５由来のアミノ酸配列と異なるが、生物活性を保持する。一実施において、単離された核酸分子はプロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を含み、このプロテアーゼは、配列番号１、２、３、４もしくは５のアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００６６】
本明細書において使用されている場合、「単離された核酸」または「単離されたポリヌクレオチド配列」という用語は、核酸が由来する細胞内に存在する他の核酸分子から分離されており、前記核酸分子が天然に存在する微生物、それに由来する微生物または組換え技術により得られた微生物から得られる場合、他の細胞物質または培養培地物質を実質的に含まない核酸分子を特定している。
【００６７】
配列番号１、２、３、４または５のタンパク質に相同である本発明のエンドプロテアーゼをコードする単離された核酸分子は、１つ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を配列番号７、８、９、１０もしくは１１の核酸内に組み込むことにより作製され得、それにより１つ以上のアミノ酸置換、付加または欠失はコードされたプロテアーゼ内に組み込まれる。変異が、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ媒介変異誘発およびＤＮＡシャフリングなどの標準的な技術により、配列番号７、８、９、１０もしくは１１内に組み込まれてもよい。代替として、変異は、飽和変異誘発などにより、本発明のプロテアーゼのコード配列の全てまたは一部に沿って無作為に組み込まれてもよく、得られた変異体は、活性を保持する変異体を識別するために本発明のプロテアーゼの生物活性についてスクリーニングされてもよい。
【００６８】
本発明に係るグルテナーゼ酵素組成物はまた、固定化形態で使用されてもよく、例えば、流動食品の処理のために使用されてもよい。本発明の酵素組成物はまた、機器の洗浄およびメンテナンスのために果物および醸造業において使用されてもよい。例えば、グルテンを含有する流動食品は、本発明の酵素組成物が埋め込まれているグルテンを透過できるマトリクスと一緒に流れることができる。グルテンは、食品から抽出され、酵素の作用により消化される。本発明の酵素組成物はまた、食品の有効エネルギーに寄与し得る。例えば、部分的に消化するまたは不消化のプロリンを含むタンパク質は、本発明の酵素組成物により完全または部分的に分解され、ヒトまたは動物のためのより消化しやすい食品の利用可能性を生じる。したがって、ヒトまたは動物の成長率および／または食品転換率（すなわち、体重増加に対する摂取した食品の重量）が改善される。
【００６９】
エンドペプチダーゼの産生方法およびこれらの特徴付け
本発明はまた、（ａ）野生型形態である株または（ｂ）一般的な変異技術により、例えば、変異誘発物質または電離放射線を用いた処理により、この株から誘導された形態または（ｃ）本発明のポリペプチドを産生できる宿主細胞を培養する工程および培養バッチから前記ポリペプチドを回収する工程を含む、本発明の酵素を産生する方法に関する。本発明の産生方法において、細胞培養のための培地は、野生型株、この野生型株から誘導された株または組換え宿主細胞の培養に従うタンパク質産生のための当該技術分野において公知のものから異なって選択される。培養は、当該技術分野において公知の手順を使用して、炭素および窒素源ならびに無機塩を含む適切な栄養培地中で行われる。適切な培地は、（例えばアメリカンタイプカルチャーコレクションのカタログにおいて）商業的供給業者から入手可能であるまたは公開された組成に従って調製され得る。例えば、大豆を含有している培地は、野生型微生物により本発明の酵素の産生を可能にしやすい傾向がある。
【００７０】
細胞は、適切な培地中で、ポリペプチドが発現および／または単離できる条件下で実施される実験または工業発酵において振盪フラスコ培養、小規模または大規模発酵（連続、バッチ、供給バッチまたは固体状態発酵を含む）により培養され得る。ポリペプチドが栄養培地中で分泌される場合、ポリペプチドは培地から直接回収され得る。ポリペプチドが分泌されない場合、このポリペプチドは細胞溶解物から回収され得る。いくつかのタンパク質分解活性が生じ、エンドペプチダーゼの産生が最大に到達した場合、培養は停止される。培養の完了後、培養培地は微生物本体を分離するために濾し取られ、濾液は、限外濾過、減圧下での濃縮、塩析、有機溶媒による沈殿、透析、ゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、電気集束および凍結乾燥などと組み合わされたいくつかの手順によりエンドペプチダーゼの回収のために通常の方法で処理される。適切な手順は、エンドペプチダーゼの所望の物理特性および化学特性を考慮して選択されるべきである。
【００７１】
野生型アクチノアロムルス株を培養することによって本発明のエンドペプチダーゼを産生する代表的な例は本明細書以下の実施例１に提供されている。本発明のエンドペプチダーゼは、エンドペプチダーゼの意図とした使用および比活性に依存し得る所望の程度の純度に精製され得る。
【００７２】
宿主細胞内の異種発現
組換え細胞および微生物は本発明のエンドペプチダーゼを産生するために使用され得る。宿主細胞は、原核細胞、真核細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、酵母細胞および／または植物細胞を含む、当業者によく知られている宿主細胞のいずれかであってもよい。適切な宿主の選択は当業者の能力の範囲内である。
【００７３】
有用な微生物は、限定されないが、バチルス細胞（例えば、バチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ））もしくはストレプトマイセス細胞または乳酸菌の細胞を含む、グラム陽性菌またはＥ．コリおよびシュードモナスなどのグラム陰性菌などの細菌細胞である。好ましい産生細胞には、原核生物であるラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、バチルス、ストレプトマイセスおよび真核生物であるアスペルギウスなどの、一般に安全とみなされていることが知られている生物由来の細胞が含まれる。より好ましい細胞には、ラクトバチルス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）および／またはアルペルギウス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）などの食品の調製に既に使用されている細胞が含まれる。
【００７４】
酵素の細胞外産生物は、アスペルギウス・オリゼ、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）またはストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）などの微生物から得られ得る。
【００７５】
ベクターの細菌宿主細胞内への組み込みは、例えば、コンピテント細胞（例えば、Ｄｕｂｎａｕ  Ｄ．、Ｄａｖｉｄｏｆｆ−Ａｂｅｌｓｏｎ  Ｒ．「Ｆａｔｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ＤＮＡ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｕｐｔａｋｅ  ｂｙ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ．Ｉ．Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｏｎｏｒ−ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ  ｃｏｍｐｌｅｘ」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９７１年、５６、２０９−２２１頁）、エレクトロポレーション（例えば、Ｓｈｉｇｅｋａｗａ，Ｋ．、Ｄｏｗｅｒ  Ｗ．Ｊ．「Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ：ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎｔｏ  ｃｅｌｌｓ」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９８８年、６、７４２−７５１頁）またはコンジュゲーション（例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ  Ｔ．Ｍ．、Ｔｈｏｒｎｅ  Ｃ．Ｂ．「Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ｎａｔｔｏ）ｐｌａｓｍｉｄ  ｐＬＳ２０  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｔｒａｎｓｆｅｒ」Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９８７年、１６９、５７７１−５２７８頁）を使用して、プロトプラスト形質転換（例えば、Ｃｈａｎｇ  Ｓ．、Ｃｏｈｅｎ  Ｓ．Ｎ．「Ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ  ｂｙ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ」Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、１９７９年、１６８、１１１−１１５頁）により行われ得る。
【００７６】
宿主細胞として使用される有用な多細胞生物は、例えば、植物、植物部分、種子または植物細胞である。好ましい産生多細胞生物は、例えば、本発明のプロテアーゼをコードする核酸を含有している穀物またはトマトなどの野菜などのトランスジェニック食用作物である。
【００７７】
組換え宿主細胞における本発明のエンドペプチダーゼの産生の代表的な例は本明細書以下の実施例２に示されている。
【００７８】
医薬製剤
本発明のエンドペプチダーゼ剤は単独で投与されてもよいまたは種々の製剤内に組み込まれて投与されてもよい。本発明の医薬組成物は、好ましくは経口投与である、その目的とする投与経路と適合するように製剤化される。例えば、本発明の酵素組成物のエンドペプチダーゼの一部は分泌されるので、アクチノアロムルスまたは限定されないが、バチルス細胞、ストレプトマイセス細胞、乳酸細菌細胞を含む、グラム陽性菌、Ｅ．コリなどのグラム陰性菌などの他の有用な単細胞組換え微生物の細胞培養培地から得られた粗調製物が経口投与されてもよい。乳酸細菌には、限定されないが、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクチノバチルス、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）およびエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）の属種が含まれる。代替として、本発明の酵素組成物は精製後に経口投与されてもよい。
【００７９】
このような製剤は、液体形態、例えば、溶液、エマルションの形態または錠剤、カプセル剤などの固体形態または半固体において調製物を生成するために適切な成分と共に調製されてもよい。酵素組成物の製剤は食品と混合するのに特に適した方法を含む種々の方法で投与されてもよい。酵素成分は、摂取前または摂取の間、活性であってもよく、例えば、活性のタイミングを制御するために適切なカプセル化により処理されてもよい。
【００８０】
本発明のエンドペプチダーゼの適切な医薬組成物を調製するために、放射もしくは温度変調またはこれらの組合せに基づいた物質を含む、当該技術分野において公知の化学物質または生物物質を安定化するための任意の方法が使用されてもよい。
【００８１】
セリアック病を治療するために、利用される医薬組成物は、好ましくは、胃液内にこれらの活性を放出するように製剤化される。この種類の製剤は、適所に最適な活性を提供する、例えば胃内に本発明のエンドプロテアーゼの放出を提供する。
【００８２】
代替として、活性剤を産生できる細菌などの微生物または酵母培養物が患者に投与されてもよい。このような培養物は食品調製物と混合されてもよいまたは例えば腸溶カプセルとして製剤化されてもよい。
【００８３】
本発明は、本発明の酵素組成物を含む栄養補助食品をさらに提供する。本発明に関して「栄養補助食品」という用語は、食品添加物、健康補助食品および栄養補給剤と交換可能である。
【００８４】
本発明の栄養補助食品は、ヒト疾患に関連する症状を治療および／または予防する方法を提供する本発明の分野に関する他の先行文献（ＷＯ２０１１／０７７３５９、ＷＯ２００３／０６８１７０、ＷＯ２００５１０７７８６）に記載されているように製剤化され、調製され、供給され、分配されてもよく、前記疾患は、セリアック病、疱疹状皮膚炎、消化管の悪い吸収、アレルギー反応、酵素欠損症、真菌感染、クローン病、真菌症およびスプルーを含む群から選択される。
【００８５】
一例として、本発明の栄養補助食品は、食品成分と容易に混合され得る、粒状酵素がコーティングされた製品またはコーティングされていない製品であってもよく、代替として、本発明の栄養補助食品はプレミックスの成分を形成してもよい。代替として、本発明の栄養補助食品は、安定化された液体、水性または油性スラリーであってもよい。本発明の酵素組成物は、穀物、穀類、トウモロコシ、大豆、ナタネ、ルピナスなどのトランスジェニック食用作物（例えば、トランスジェニック植物、種子など）中で酵素を直接発現させることにより供給されてもよい。
【００８６】
本発明の医薬組成物または栄養補助食品は、食事前、食事の直前、食事と一緒または食後すぐに提供されてもよく、それにより本発明の酵素組成物のエンドプロテアーゼは、上部消化管腔内に放出されるまたは活性化され、エンドプロテアーゼは、摂取したグルテンを解毒し、有害なペプチドが腸細胞層を通過することを防ぐために胃および膵臓酵素を補完できる。
【００８７】
本発明の酵素組成物は食品加工業において非常に多くの用途を有し、特にこれらは上述の先行文献に記載されている栄養補助食品の製造に使用され得る。
【００８８】
この説明から、本発明のさらなる目的が、胃および膵臓の酵素による切断に対して耐性があり、内部管腔に存在することにより毒性作用を生じる、グルテンオリゴペプチドを分解する方法であって、前記グルテンオリゴペプチドを、本発明の酵素組成物または少なくとも１つの単離されたエンドペプチダーゼと接触させることを含む、方法を提供することにあることが明らかになる。
【００８９】
特に、前記方法の１つの態様は、好ましくは、医薬製剤、栄養補助食品、飲み物または飲料内に組み込まれた、本発明の有効量の酵素組成物または少なくとも１つの単離されたエンドペプチダーゼを、これを必要とする患者に投与することを含む、セリアック病、疱疹状皮膚炎および／またはグルテン不耐性に関連する任意の他の障害の治療または予防にある。
【実施例】
【００９０】
［実施例１］  アクチノアロムルス属種ＤＳＭ２４９８８エンドペプチダーゼ同定および特徴付け
１．１  株培養およびタンパク質産生
本発明に従って使用されたアクチノアロムルス株は出願人の菌コレクションに由来する。
【００９１】
アクチノアロムルス属種ＤＳＭ２４９８８を、ＨＣｌを用いてｐＨ５．５に酸性化したＩＳＰ２寒天培地（ＳｈｉｒｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｌｉｅｂ、１９６６年）上に維持した。１つのプレートの微生物含有物を擦り、ブドウ糖２０、酵母エキス２、大豆ミール８、ＮａＣｌ１およびＭＥＳ１０（ｇ／ｌ）からなる１５ｍｌの培地ＡＦ５を含有している１つの５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコ内に接種した。培地を蒸留水中で調製し、２０分間、１２１℃での滅菌前にｐＨを５．５に調製した。接種したフラスコを２８℃において、２００ｒｐｍにて作動している回転振盪機で増殖させた。インキュベーションの５−６日後、５％の培養液を１００ｍｌの同じ発酵培地を含有している第２系列の５００ｍｌエルレンマイヤーフラスコ内に接種した。タンパク質産生を、２００ｒｐｍにて作動している回転振盪機で２８℃において１５日間インキュベートしたフラスコ内で実施した。タンパク質の産生物が以下に記載されているバイオアッセイによりモニターされた。
【００９２】
いくつかのタンパク質分解活性が生じ、エンドペプチダーゼが産生され、続いて以下に記載されているアッセイにより、最大に達した場合、培養を停止した。１５日後に発酵物が収集され、ブロスを４０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離した。培養培地を濾し取って微生物体を分離し、濾液を処理した。エンドペプチダーゼの所望の物理特性および化学特性を考慮して適切な手順を選択した。
【００９３】
１．２  タンパク質分解活性の決定
酵素活性を、０．２ｍｌの全体積で３７℃にて酢酸緩衝液（酢酸アンモニウム−ＡＭＡＣ、５０ｍＭの最終濃度、ｐＨ４．０−８．０；酢酸２０ｍＭ、ｐＨ３．０）中で異なるｐＨにて測定した。
【００９４】
エンドペプチダーゼの酵素活性を、基質としてスクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｅ−ＡＭＣ（アミノ−メチル−クマリン）（Ｂａｃｈｅｍ  ＡＧ、Ｈａｕｐｔｓｔｒａｓｓｅ  １４４、４４１６  Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の加水分解を測定することにより決定した。
【００９５】
基質ストック溶液を１０ｍＭ濃度にて調製し、−２０℃にて保存した。基質を、２ｍＭのスクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＡＭＣおよび５０−１５０μｌの酢酸緩衝液を含有している１０−２０μｌの６０％メタノール溶液から調製した。反応混合物は、異なるｐＨ値にて２００μｌの酢酸緩衝液中に０．２ｍＭの濃度の基質および酵素調製物（１０から４０μｌの間または１．０μｇ／アッセイ）を含有した。
【００９６】
１０分間３７℃で以前に加熱された基質に、１０−４０μｌの酵素溶液を添加し、反応を３７℃にて最大２時間まで実施した。放出されたＡＭＣを、３６０ｎｍの励起波長および４６０ｎｍの発光波長にて融合マイクロプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｉｔａｌｉａ  ＳｐＡ、Ｍｏｎｚａ、Ｉｔａｌｉａ）を用いて測定した。対照として、酵素を用いずに基質をインキュベートした。
【００９７】
１分で１ｍｍｏｌのＡＭＣを放出する酵素活性を１単位と定義している。
【００９８】
１．３  エンドペプチダーゼ精製
菌糸体をペーパー濾過（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（ＵＳＡ）製のＭｉｒａｃｌｏｔｈ）により培養培地から分離した。その後、２００ｍｌの上清を、残渣を除去するために５０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離し、次いで上清を、不溶性画分を除去するために４℃にて２０分間１００００ｒｐｍにてさらに遠心分離した。タンパク質が、エタノール（１：４ｖ／ｖ）または硫酸アンモニウム２０−７５％飽和により上清（ｓｕｒｎａｔａｎｔ）から沈殿した。ペレットを再懸濁し、透析し、発生時に、５ｋＤａのカットオフを用いてＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ−７０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．、ＵＳＡ）を使用して濃縮した。ｐＨ５にて試験した場合、スクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＡＭＣを加水分解できるプロテアーゼの存在が強調された。透析後のタンパク質懸濁液のアリコートを、ＭＳ−ショットガン分析に供するために煮沸した。煮沸手順は自己消化を回避するために必要である。Ｓ８／Ｓ５３ファミリープロテアーゼに属している少なくとも５個のタンパク質が検出された。
【００９９】
再懸濁したタンパク質を、イオン交換樹脂Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ９００（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ  ＧｍｂＨ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、７６１８５  Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＤＥ−５２セルロース（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｉｎｔｅｒ．Ｌｔｄ、Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ  Ｅｎｇｌａｎｄ）または他のマトリクス上でクロマトグラフにかけ、得られた画分をスクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＡＭＣ加水分解について試験し、プールした活性画分を１Ｄ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび酵素電気泳動分析に供した。
【０１００】
タンパク質を、分子量カットオフ３００ｋＤａ、１００ｋＤａ、５０ｋＤａ、３０ｋＤａ、１０ｋＤａ（Ｎａｎｏｓｅｐ  Ｐａｌｌ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ．ＵＳＡ、Ｖｉｖａｓｐｉｎ  Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＧｍｂＨ  ３７０７０  Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）でサイズ排除濾過によりさらに断片化した。これらの活性を記載したように試験した。異なる分子量を有する活性画分が得られた。これらの画分のアリコートを煮沸し、ＭＳ−ショットガンにより分析した。
【０１０１】
タンパク質を、均一の１０％またはディスクゲル４−１５％または任意のｋｄポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、９６４０、ＣＡ、ＵＳＡ）上で電気泳動により分離し、続いて、クマシーブリリアントブルーＲ−２５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）もしくは銀（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を用いて染色したまたは所望のｐＨにて５０−１００μＭの蛍光基質であるスクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＡＭＣと共に３７℃にてゲルをインキュベートすることにより実施した酵素活性染色（酵素電気泳動）により染色した。
【０１０２】
電気泳動分析が銀染色および酵素電気泳動の両方により検出された単一バンドの存在を示すまでＳ８／Ｓ５３ファミリーに属している２つのエンドペプチダーゼを精製した。
【０１０３】
第１のエンドペプチダーゼは分子量濾過後に得られた：これは＞１００ｋＤａのカットオフで保持された。対応する煮沸されたアリコートのＭＳ−ショットガン分析により、１４２４４９．４の分子量および５．１８の理論的ｐＩを有する、ｅｎｄｏｐｅｐ−１４０、配列番号１（表１Ａ）の存在が明らかにされ、２つの他のタンパク質のトレースが検出された。このタンパク質画分は、４から８のｐＨ範囲の活性を生じ、最適ｐＨは５であった（図２）。ｐＨ３にて試験した場合、酵素は、３７℃でのインキュベーションの３０分後、ｐＨ５にて９５％のその活性を示す（図３）。このタンパク質画分は、実施例３に示したようにスクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＡＭＣの加水分解においてより効率的な３３量体の消化を生じた。
【０１０４】
ｅｎｄｏｐｅｐ−４０、配列番号２として示された、第２のグルテナーゼは、３９９０８．４の分子量および５．９４の理論的ｐＩを有する、＜１００ｋＤａのカットオフタンパク質画分内に含まれた（表１Ｂ）。このタンパク質は、４から６のｐＨ範囲の活性を生じ、最適ｐＨは５であった。ｐＨ３にて試験した場合、酵素は、３７℃でのインキュベーションの３０分後、ｐＨ５にて８５％のその活性を示す（図３）。酵素電気泳動により強調された蛍光バンドは約４０ｋＤａの分子量を示す。ゲルバンドまたは対応する分子サイズカットオフ残余分から溶出されたいずれかの活性タンパク質を酵素活性について特徴付けた。ＭＳ−ショットガン分析により、他のタンパク質の存在が明らかにされ、ｅｎｄｏｐｅｐ−１４０配列の存在を示しているシグナルは、その分解により生成された、より小さなポリペプチド（＜１００ｋＤａ）に起因し得る。
【０１０５】
他の３つのエンドペプチダーゼ（ｅｎｄｏｐｅｐ−１２０、配列番号３、ｅｎｄｏｐｅｐ−６０、配列番号４、ｅｎｄｏｐｅｐ−４１、配列番号５として示された）は均質に精製されなかった。これらの存在は第１の精製工程のセクレトーム中および活性画分中のＭＳ−ショットガンにより検出された。ＭＳ−ショットガン分析は、本明細書で報告されている、これらのアミノ酸配列の同定を可能にした。出願人は、これらの推定された分子量に従ってタンパク質を命名した。したがって、ｅｎｄｏｐｅｐ−１２０は１１２０１２．８の分子量および６．７５の理論的ｐＩを有し、ｅｎｄｏｐｅｐ−６０は５９６４６．０の分子量および６．０２の理論的ｐＩを有し、ｅｎｄｏｐｅｐ−４１は４１６４６．１の分子量および５．２２の理論的ｐＩを有する。
【０１０６】
１．４  タンパク質ＭＳ分析：ショットガンＭＳ実験
今日、プロテオミクス方法は仮説指向バイオマーカーまたはタンパク質特徴付け研究にとって最重要である。
【０１０７】
古典的なプロテオミクスアプローチは２次元ゲル電気泳動（２ＤＧ）に基づき、対象のタンパク質スポットが単離され、質量分析（ＭＳ）により同定される。
【０１０８】
２ＤＧアプローチは比較的高い分解能を有するが、これは特定のクラスのタンパク質を検出する困難さにより制限されている。これらには、ゲル電気泳動緩衝液中の膜タンパク質の低い溶解度に起因するこれらの膜タンパク質、低い（＜１０ｋＤａ）または高い（＞２００ｋＤａ）分子量のいずれかを有するタンパク質ならびに極値の等電点（ｐＩ＜４または＞９）を有するものが含まれる。このアプローチのさらなる制限は、あまり表れないタンパク質の分析の困難さにあり、これが退屈で時間を浪費するという事実にある。
【０１０９】
これらの問題は、ＭｕｄＰＩＴ（Ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とも命名されている、タンデム質量分析に結合された２次元キャピラリークロマトグラフィー（２ＤＣ−ＭＳ／ＭＳ）に基づいた新たなプロテオミクス方法を使用して解決されている（Ｗａｓｈｂｕｒｎ、Ｍ．Ｐ．、Ｗｏｌｔｅｒｓ  Ｄ．、Ｙａｔｅｓ  Ｊ．Ｒ．３ｒｄ「Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００１年、１９、２４２−７頁）。これは、複合タンパク質混合物の酵素消化からのペプチドの生成、２つのマイクロ−ＨＰＬＣカラムの手段によるこれらの分離およびＭＳ／ＭＳにより溶出されたピークの直接分析に関与する。２ＤＣ−ＭＳ／ＭＳは、イオン交換を、全（または予め分画した）タンパク質の直接消化から得られたペプチド混合物の逆相分離と組み合わせる。特に、ペプチド混合物は、７工程の増加させた塩化アンモニウム濃度（０−１０００ｍＭ）を使用してイオン交換クロマトグラフィー（ＳＣＸカラム、５μｍ、０．３ＩＤ×１５０ｍｍ）によって最初に分離される。各々の塩工程は、逆相カラム（Ｃ１８、０．１８０ＩＤ×１００ｍｍ）上に直接負荷され、アセトニトリル勾配：溶出Ａ、水中の０．１％ギ酸；溶出Ｂ、アセトニトリル中の０．１％ギ酸を用いて分離される。Ｃ１８カラムから溶出されたペプチドは、イオントラップ質量分析計を用いて直接分析され、検出限界は約１０ｆｍｏｌ以下である。スペクトルは、ＭＳ／ＭＳ分析についての動的排除を使用してポジティブモード（典型的に４００−１６００ｍ／ｚの範囲）において獲得される。異なるプロテアーゼは試料からのタンパク質抽出物を消化するために使用される（トリプシン、ペプシンまたはプロテイナーゼＫ）。
【０１１０】
次いで対応するタンパク質の同定は、質量スペクトルを扱うデータのためのＳＥＱＵＥＳＴアルゴリズムなどの適切なソフトウェアを用いて自動化データベース検索を介して得られる（Ｅｎｇ，Ｊ．Ｋ．、ＭｃＫｏｒｍａｃｋ，Ａ．Ｌ．、Ｙａｔｅｓ，Ｊ．Ｒ．「Ａｎ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｅ  Ｔａｎｄｅｍ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｄａｔａ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  Ａｍｉｎｏ  Ａｍｉｎｏａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ」Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．、１９９４年、５、９７６−９８４頁）。生成された実験の質量スペクトルは、ＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）または他のウェブサイトからダウンロードされたタンパク質データベースにおける理論的質量スペクトルとの比較により得られたペプチド配列と相関がある。
【０１１１】
１．５  タンパク質同定のための基準
ペプチド予測アルゴリズム（Ｋｅｌｌｅｒ  Ａ．、Ｎｅｓｖｉｚｈｓｋｉｉ  Ａ．Ｉ．、Ｋｏｌｋｅｒ  Ｅ．、Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ  Ｒ．「Ｅｍｐｉｒｉｃａｌ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｔｏ  ｅｓｔｉｍａｔｅ  ｔｈｅ  ａｃｃｕｒａｃｙ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｍａｄｅ  ｂｙ  ＭＳ／ＭＳ  ａｎｄ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ」Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２００２年、１５、５３８３−９２頁）によって特定されるように、ペプチドが９０．０％超の可能性で確立され得る場合、ペプチド同定が認められた。タンパク質が９５．０％超の可能性で確立され、少なくとも１つの同定されたペプチドを含有し得る場合、タンパク質同定が認められた。５０％以下の同一性がタンパク質公開データベースを用いて見られたので、アクチノアロムルスのゲノムが配列決定され、６個の可能なリーディングフレーム内に移された。アクチノアロムルス推定タンパク質に対して検出されたペプチドのＢＬＡＳＴによるその後のアラインメントは公知の相同タンパク質を同定した。
【０１１２】
合計９４個のタンパク質がアクチノアロムルスのセクレトームにおいて推定上同定された。酵素はこれらの顕著な画分から構成され、１７個のタンパク質分解酵素が検出され、グリコシダーゼ、リパーゼ、酸ホスファターゼおよびジエステラーゼも見出された。機能なしがＢＬＡＳＴ分析により２５個の配列に割り当てられ得る。
【０１１３】
プロテアーゼの中で、Ｓ８／Ｓ５３ペプチダーゼファミリーに属している５個のタンパク質が検出され得、そのうちの２つは最も表れたタンパク質の中からであった。
【０１１４】
同じ分析が、少しのみの配列が検出されるまで、全ての後の精製工程において実施された。
【０１１５】
煮沸した活性画分のＭＳ分析により得られたデータは少しのタンパク質配列を示したが、単一バンドが銀で染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に存在した。表１に示されているように、ｅｎｄｏｐｅｐ−１４０（配列番号１）およびｅｎｄｏｐｅｐ−４０（配列番号２）が２つの記載された活性に関与するタンパク質として検出された。＜１００ｋＤａとして同定された試料中のｅｎｄｏｐｅｐ−１４０の存在は、より小さなポリペプチド中のタンパク質の部分的分解に起因する可能性がある。
【０１１６】
コンピュータによる分析により、ｅｎｄｏｐｅｐ−１４０およびｅｎｄｏｐｅｐ−４０の両方が、分泌を導くシグナルペプチドを含有しているグリコシル化タンパク質であることが示され、これらがプレプロ酵素（ｐｒｅｐｒｏｅｎｚｙｍｅ）として産生され得ることを示唆している。
【０１１７】
コンピュータによる分析により、Ｓ８／Ｓ５３ファミリーにおいて５個全てのｅｎｄｏｐｅｐが分類され、全てがグリコシル化タンパク質であることが示された。高い相同性が、ｅｎｄｏｐｅｐ−１４０、ｅｎｄｏｐｅｐ−４０およびｅｎｄｏｐｅｐ−４１（配列番号５）の間で見出され、図１の系統ツリーにより示されているサブグループにおけるこれらのクラスタリングを可能にした。シグナルペプチド配列がｅｎｄｏｐｅｐ−６０（配列番号４）についても検出されたが、これはｅｎｄｏｐｅｐ−１２０（配列番号３）およびｅｎｄｏｐｅｐ−４１に存在しなかった。図１に示された系統ツリーはこれらのＳ８／Ｓ５３グルテナーゼの新規性を強調し、クマモリシンまたはセドリシンのいずれともクラスターにならず、Ｓ５３ファミリーに属している、ＷＯ２０１１／０７７３５９に開示されているトリペプチジル−ペプチダーゼ酵素（ｓｅｄＡからｓｅｄＤ）ともクラスターにならない。これらの酵素の新規性は実施例３に示されているように基質特異性によりさらに支持された。ｅｎｄｏｐｅｐ−１４０またはｅｎｄｏｐｅｐ−４０を用いた消化により得られた３３量体の分解パターンはｅｎｄｏ−タンパク質分解活性を示した。
【０１１８】
［実施例２］  組換え宿主細胞内でのエンドペプチダーゼ産生
２．１  株およびプラスミド
アクチノアロムルス属種ＤＳＭ２４９８８をこの研究において使用した。全てのプラスミドのサブクローニング実験を、プラスミドｐＴＺ５７Ｒ／Ｔ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、ＵＡＢ、Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）を使用してＥ．コリＤＨ１０Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）において実施した。
【０１１９】
エシェリキア・コリＢｌ２１（ＤＥ３）Ｓｔａｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｉｔａｌｉａ、Ｐｏｄｅｎｚａｎｏ、ＰＣ）を、異種（組換え）ペプチダーゼを産生するために使用した。
【０１２０】
２．２  組換えプロテアーゼ産生
組換えアクチノアロムルスプロテアーゼを、発現系として使用したエシェリキア・コリＢｌ２１（ＤＥ３）Ｓｔａｒから産生し、精製した。
【０１２１】
Ｅｎｄｏｐｅｐ−１４０およびＥｎｄｏｐｅｐ−４０を産生するＥ．コリ株を構築するために、遺伝子のヌクレオチド配列を、以下のセットのプライマー：
【０１２２】
【化１】
2015500641.tif 000002
を使用して増幅させた。
【０１２３】
ＰＣＲ産物をｐＴＺ５７Ｒ／Ｔベクター内にクローニングし、変異がＰＣＲ増幅の間に組み込まれていないことを検証するために発現ベクター内にクローニングする前に配列決定した。
【０１２４】
次いでｅｎｄｏｐｅｐ−遺伝子をｐＥＴ２８ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位内にクローニングし、発現宿主ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｓｔａｒ内に形質転換した。
【０１２５】
形質転換した細胞を、ＯＤ６００  ０．６−１を達成するまで、３７℃にて３０μ／ｍｌのカナマイシンを含有しているＬＢ培地の５０ｍｌ培養物中で増殖させた。グルタナーゼの発現を、０．２μＭのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（Ｓｉｇｍａ）を添加することで誘導し、培養物を２２℃にて一晩インキュベートした。図４に示されているように、ｅｎｄｏｐｅｐ−１４０およびｅｎｄｏｐｅｐ−４０の所望の分子量に対応しているタンパク質バンドが得られた。
【０１２６】
２．３  異種産生したエンドペプチダーゼの精製
組換えエンドペプチダーゼを発現している細胞を、２０分間、５０００ｇにて遠心分離した。ペレットを８ｍｌの緩衝溶液（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．８）中に再懸濁し、次いでリゾチーム１ｍｇ／ｍｌを加えて細胞を完全に溶解した。Ｈｉｓ標識タンパク質を、製造業者の指示書に従ってＮｉ−ＮＴＡ精製システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して固定化Ｎｉ２＋−アフィニティクロマトグラフィーにより粗細胞抽出物から精製した。溶出した画分の５マイクロリットルのアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより移動させ、ブルー−クマシーまたは銀染色で染色して発現したエンドペプチダーゼの存在および純度を検証した。図４は、誘導されていない対照株と比較して誘導後にｅｎｄｏｐｅｐ−１４０およびｅｎｄｏｐｅｐ−４０について得られた発現レベルを示す。
【０１２７】
ｐＥＴ２８ｂなしおよびｐＥＴ２８ｂ−ｅｎｄｏｐｅｐ−１４０またはｐＥＴ２８ｂ−ｅｎｄｏｐｅｐ−４０のそれぞれで形質転換したＥ．コリ株から得られた全抽出物の酵素活性を、基質としてスクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＡＭＣを用いて試験した。酵素活性をｐＥＴ２８ｂ−ｅｎｄｏｐｅｐ株から抽出物中で検出したが、活性は陰性対照により示されなかった。
【０１２８】
［実施例３］  エンドペプチダーゼ生物活性
３．１  酸性ｐＨにおけるグリアジンの３３量体毒性ペプチドの分解
グリアジン（５０μＭ）の３３量体免疫毒性ペプチドの溶液を、ペプシン１ｍｇ／ｍｌの存在または非存在下で、４μＵのｅｎｄｏｐｅｐ−１４０または２μＵのｅｎｄｏｐｅｐ−４０の存在下で最大２時間まで３７℃にてインキュベートした。酢酸２０ｍＭ、ｐＨ３、３００μｌの全体積中で反応を実施した。この反応を、３７℃にて、０から１２０分の異なる時間（ｔ０、ｔ３、ｔ１５、ｔ６０およびｔ１２０分）にてモニターした。３３量体ペプチドの消失および分解産物の出現をＨＰＬＣ−ＭＳ分析によりモニターした。５０μｌのアリコートを得て、酵素活性を５０μｌのＨ２Ｏ：ＣＨ３ＣＮ  ５０：５０（＋０．１％ギ酸）で停止させた。試料をＨＰＬＣ−ＭＳにかけ、ＬＴＱ−ＸＬ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）で分析した。ｅｎｄｏｐｅｐ−１４０、ｅｎｄｏｐｅｐ−１４０およびペプシン、ペプシン単独を用いて得られたＨＰＬＣ−ＭＳプロファイルを図５、６、７にそれぞれ報告している。３３量体ペプチドの消失は２時間のインキュベーション後に証明された。４μＵのｅｎｄｏｐｅｐ−１４０または２μＵのｅｎｄｏｐｅｐ−４０を用いて３３量体ペプチドのインキュベーション後に検出された全てのペプチドを表２および３にそれぞれ報告している。
【０１２９】
２時間のインキュベーション後、観察された最も強いピークは１の荷電状態を有し、７４８．４の［ＭＨ］＋に対応し、小さいペプチドの存在を示している。このシグナルはまた、最初に現れる。３３量体配列に基づいて、４つ（１−６、８−１３、１５−２０、２２−２７）のペプチドがこの分子量に対応し、全ては６個の残基からなった。消化された３３量体のＭＳ分析によれば、グルタミン残基の代わりにグルタミン酸残基が加水分解されたペプチド配列に存在したので、基質の脱アミド化が示唆される。この分析により、ペプシンを用いた３３量体のインキュベーションの２時間後、文献データと一致して加水分解はほとんど観察されなかった（図７ならびに表２および３）ことが示された。
【０１３０】
最大８μＵまでのｅｎｄｏｐｅｐ−１４０または９μＵまでのｅｎｄｏｐｅｐ−４０の量の増加により、ｐＨ３における２時間後、完全な３３量体の消失が生じた（示さず）。
【０１３１】
ペプシンの存在下でさえも、同じパターンの分解が観察されたが、２時間後のインタクトなペプチドの量はこのペプシンの非存在下においてより高く、エンドペプチダーゼがペプシンにより破壊されないことが示唆される。
【０１３２】
３．２  ＨＰＬＣ／ＭＳ分析
イオントラップ質量分析計を使用してＨＰＬＣ分析を実施した。ＡｃｃｅｌａまたはＳｕｒｖｅｙｏｒポンプ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）に結合されたＬＴＱ−ＸＬまたはＡｄｖａｎｔａｇｅを、酵素混合物により産生された酵素タンパク質加水分解物を特徴付けることに使用した。溶出のためにＭｉｌｌｉ  Ｑ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．、ＵＳＡ）中の０．１％のギ酸（溶液Ａ）およびアセトニトリル中の０．１％のギ酸（溶液Ｂ）の勾配と組み合わせたＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＨｙｐｅｒｓｉｌゴールドまたはＣ１８対称カラム（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．、ＵＳＡ）を使用してペプチドを分離した。勾配は９５％の溶液Ａで開始して６０％の溶液Ｂまで増加させた。個々のペプチドについての詳細な情報は、イオントラップ質量分析計についての特徴的アルゴリズムである、「スキャン依存」ＭＳ／ＭＳアルゴリズムを使用することにより得た。完全スキャン質量範囲において最も強いイオンの荷電状態を決定するために完全スキャン分析に続いてズームスキャン分析を行った。３３量体（Ｍ＝３９１０）を使用して、ＭＳモードにおいて最適感度に調整し、ＭＳ／ＭＳモードにおいて最適断片化に調整し、６０μｇ／ｍｌの一定注入を実施し、ＭＳモードにおいて主に二重および三重の荷電種を生じ、ＭＳ／ＭＳモードにおいて約３５％の最適な衝突エネルギーを生じた。
【０１３３】
［実施例４］  エンドペプチダーゼ生物活性
４．１  グリアジンおよびグルテン加水分解混合物の分解
特定の構造特徴に起因して、プロリルオリゴペプチドは、通常、３０個のアミノ酸より長い大きなペプチドを消化できない。また、トリペプチジル−プロテアーゼセドリシンはプロリルプロテアーゼを添加せずにグリアジンを加水分解できない。この制限は、全ての可能性のある毒性のプロリンリッチペプチドを可能な限り迅速および効率的に加水分解することを意図する、酵素にとって明らかに不都合である。
【０１３４】
アクチノアロムルスエンドプロテアーゼが全タンパク質を消化できるかどうかを調べるために、アクチノアロムルス由来のｅｎｄｏｐｅｐ−１４０およびｅｎｄｏｐｅｐ−４０をグリアジンとインキュベートした。生成した加水分解産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０１３５】
１０ｍｇ／ｍｌ（２０μＭ）の濃度で７０℃にてエタノール７０％中のグリアジン粉末（Ｓｉｇｍａ  Ｇ３３７５）を溶解することによりグリアジンの溶液を調製した。インタクトなグリアジン分子は４０−５５ｋＤａのタンパク質混合物からなる。０．３ｍｌの最終体積にて酢酸２０ｍＭ、ｐＨ３中の１０μｌ（５μＵ）のアクチノアロムルスエンドプロテアーゼと共にグリアジンを３７℃にてインキュベートした。１ｍｇ／ｍｌにてペプシンの非存在および存在の両方でＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＡＧ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｒｍａｎｙ）中で反応を実施した（図８）。この反応を異なる時間間隔でモニターし、３０μｌの試料を、０分、３０分、１時間および２時間の時点にてインキュベーション混合物から引き出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまで４℃に維持した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび染色に使用した全ての物質は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。製造業者の指示書に従って試料緩衝液を使用して試料を調製し、製造業者の指示書に従ってＳＤＳ緩衝液系を使用して任意のｋｄ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上で分離した。クマシーＲ２５０または銀を使用して染色を実施した。
【０１３６】
図８に見られ得るように、グリアジンは、アクチノアロムルスに由来するエンドペプチダーゼにより小さなペプチドに切断されており、ほぼ２時間で完全に消化している。産生物の減衰はＳＤＳゲル上のバンドの強度の減少により見られ得る。この実験はまた、ペプシンが消化の有効性に影響を与えないことを示している。
【０１３７】
表１．アクチノアロムルスのセクレトームから精製された推定タンパク質
【０１３８】
アクチノアロムルス精製画分を１００ｋＤａの分子量カットオフで濾過し、ＭＳ−ショットガン分析に供した。同定したペプチドを、アクチノアロムルスゲノム翻訳（タンパク質＿Ｉｄ：推定タンパク質配列についての内部コード）により推測されたタンパク質に対して並べ、続いてＢＬＡＳＴによるコンピュータでの分析により、相同の公知のタンパク質（ＢＬＡＳＴ受託番号：配列コード；ＢＬＡＳＴ注釈：タンパク質名；ｎ．ｒ．：結果なし）が証明された。一致したスペクトルの番号は、頻度として示された、タンパク質量の半定量的測定を与える（Ｆ＿平均）。
【０１３９】
Ａ：＞１００ｋＤａ画分から得られたデータ；Ｂ：＜１００ｋＤａ画分から得られたデータ
【０１４０】
【表１】
2015500641.tif 000003
【０１４１】
表２．ｅｎｄｏｐｅｐ−１４０を用いた３３量体消化により放出されたペプチド
【０１４２】
全ての分子量は、ペプシン（１ｍｇ／ｍｌ）の存在および非存在下で４μＵのｅｎｄｏｐｅｐ−１４０を用いた３３量体グリアジンペプチド（５０μＭ）の消化後にＨＰＬＣ−ＭＳにより検出された。対照はペプシン単独で３３量体をインキュベートすることにより得られる。３７℃、酢酸２０ｍＭ、ｐＨ３にてインキュベーション。
【０１４３】
【表２】
2015500641.tif 000004
【０１４４】
表３．ｅｎｄｏｐｅｐ−４０を用いた３３量体消化により放出されたペプチド
【０１４５】
全ての分子量は、異なる時間間隔にてペプシン（１ｍｇ／ｍｌ）の存在および非存在下で２μＵのｅｎｄｏｐｅｐ−４０を用いた３３量体グリアジンペプチド（５０μＭ）の消化後にＨＰＬＣ−ＭＳにより検出された。対照はペプシン単独で３３量体をインキュベートすることにより得られる。３７℃、酢酸２０ｍＭ、ｐＨ３にてインキュベーション。
【０１４６】
【表３】
2015500641.tif 000005
【図１】
2015500641.tif 000006
【図２】
2015500641.tif 000007
【図３】
2015500641.tif 000008
【図４】
2015500641.tif 000009
【図５Ａ】
2015500641.tif 000010
【図５Ｂ】
2015500641.tif 000011
【図６Ａ】
2015500641.tif 000012
【図６Ｂ】
2015500641.tif 000013
【図７Ａ】
2015500641.tif 000014
【図７Ｂ】
2015500641.tif 000015
【図８】
2015500641.tif 000016
【配列表】
2015500641000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年8月6日(2014.8.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１９】
エシェリキア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）Ｓｔａｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｉｔａｌｉａ、Ｐｏｄｅｎｚａｎｏ、ＰＣ）を、異種（組換え）ペプチダーゼを産生するために使用した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２０】
２．２  組換えプロテアーゼ産生
組換えアクチノアロムルスプロテアーゼを、発現系として使用したエシェリキア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）Ｓｔａｒから産生し、精製した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号１、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−１４０、
ｂ）配列番号２、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−４０、
ｃ）配列番号３、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−１２０、
ｄ）配列番号４、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−６０、ならびに
ｅ）配列番号５、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−４１
からなる群から選択される、３から８の間のｐＨにおいて活性なＳ８／Ｓ５３ファミリーの少なくとも１つのエンドペプチダーゼを含む、酵素組成物。
【請求項２】
エンドペプチダーゼが、
ａ）配列番号１または少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−１４０、
ｂ）配列番号２または少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−４０、
ｃ）配列番号３または少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−１２０、
ｄ）配列番号４または少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−６０、
ｅ）配列番号５または少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−４１
からなる群から選択される、請求項１に記載の酵素組成物。
【請求項３】
エンドペプチダーゼが、
ａ）配列番号１または少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−１４０、
ｂ）配列番号２または少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−４０
からなる群から選択される、請求項１または２に記載の酵素組成物。
【請求項４】
エンドペプチダーゼが、アクチノアロムルス（Ａｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓ）株から得られる、請求項１から３のいずれか一項に記載の酵素組成物。
【請求項５】
エンドペプチダーゼが、アクチノアロムルス属種（Ａｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓ  ｓｐ．）ＤＳＭ２４９８８から得られる、請求項４に記載の酵素組成物。
【請求項６】
胃および膵臓の酵素による切断に対して耐性があり、腸管腔内に存在することにより毒性作用を生じる、グルテンオリゴペプチドを加水分解できる、請求項１から５のいずれか一項に記載の酵素組成物。
【請求項７】
プロリル−エンドプロテアーゼ、ｘ−プロリル−ジペプチジルアミノペプチダーゼおよびプロリル−アミノペプチダーゼから選択される１つ以上の他のタンパク質分解酵素を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の酵素組成物。
【請求項８】
エンドペプチダーゼが、別のポリペプチドに作動可能に融合されてキメラまたは標識（ｔａｐｐｅｄ）タンパク質を形成する、請求項１から７のいずれか一項に記載の酵素組成物。
【請求項９】
ａ）配列番号１または少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−１４０、
ｂ）配列番号２または少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−４０、
ｃ）配列番号３または少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−１２０、
ｄ）配列番号４または少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−６０、
ｅ）配列番号５または少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−４１
から選択される、３から８の間のｐＨにおいて活性なＳ８／Ｓ５３ファミリーの単離されたエンドペプチダーゼ。
【請求項１０】
ａ）配列番号１または少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−１４０および
ｂ）配列番号２または少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−４０
から選択される、請求項９に記載のＳ８／Ｓ５３ファミリーの単離されたエンドペプチダーゼ。
【請求項１１】
セリアック病、疱疹状皮膚炎および／またはグルテン不耐性に関連する任意の他の障害を治療または予防するための医薬として使用するための、請求項１から８のいずれか一項に記載の酵素組成物または請求項９もしくは１０に記載のＳ８／Ｓ５３ファミリーの単離されたエンドペプチダーゼ。
【請求項１２】
食品および飲み物に使用されるタンパク質加水分解物を産生するための、請求項１から８のいずれか一項に記載の酵素組成物または請求項９もしくは１０に記載のＳ８／Ｓ５３ファミリーの少なくとも１つの単離されたエンドペプチダーゼの使用。
【請求項１３】
請求項１から８のいずれか一項に記載の酵素組成物または請求項９もしくは１０に記載のＳ８／Ｓ５３ファミリーの少なくとも１つの単離されたエンドペプチダーゼを、活性タンパク質分解成分として含む、医薬製剤。
【請求項１４】
経口医薬製剤である、請求項１３に記載の医薬製剤。
【請求項１５】
請求項１から８のいずれか一項に記載の酵素組成物または請求項９もしくは１０に記載のＳ８／Ｓ５３ファミリーの少なくとも１つの単離されたエンドペプチダーゼを、活性タンパク質分解成分として含む、栄養補助食品。
【請求項１６】
配列番号７、８、９、１０および１１から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列または配列番号７、８、９、１０および１１のいずれか１つに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％の同一性を有する少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の少なくとも１つのエンドペプチダーゼをコードする、単離された核酸。
【請求項１７】
配列番号７、８、９、１０および１１のいずれか１つに対して少なくとも９５％の同一性を有する、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む、請求項１６に記載の単離された核酸。
【請求項１８】
配列番号７および８から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む、請求項１６または１７に記載の単離された核酸。
【請求項１９】
Ａ）酵素組成物を産生するのに適した条件下で培養培地中に、請求項１に定義されたＳ８／Ｓ５３ファミリーの少なくとも１つのエンドペプチダーゼを産生できる天然に存在するアクチノアロムルス株を培養し、培養バッチから酵素組成物を回収する工程、または
Ｂ）請求項１に定義されたＳ８／Ｓ５３ファミリーの少なくとも１つのエンドペプチダーゼを産生する能力を維持する、Ａ）で定義された天然に存在する株から従来の変異および／もしくは選択手順により得られたアクチノアロムルス株を、酵素組成物を産生するのに適した条件下で培養培地中に培養し、培養バッチから酵素組成物を回収する工程、または
Ｃ）
ａ）配列番号１、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−１４０、
ｂ）配列番号２、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−４０、
ｃ）配列番号３、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−１２０、
ｄ）配列番号４、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−６０および
ｅ）配列番号５、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％の同一性を有する配列を含むｅｎｄｏｐｅｐ−４１
からなる群から選択されるＳ８／Ｓ５３ファミリーの少なくとも１つのエンドペプチダーゼをコードする核酸を宿主細胞内に組み込む工程、
エンドペプチダーゼを産生するのに適した条件下で培養培地中に細胞を培養し、培養バッチからエンドペプチダーゼを回収する工程
を含む、請求項１に記載の酵素組成物を産生する方法。
【請求項２０】
アクチノアロムルス株が、請求項１に記載の少なくとも１つのエンドペプチダーゼを産生できるカテヌリスポラ（Ｃａｔｅｎｕｌｉｓｐｏｒａ）、クテドノバクター（Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ）またはストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の属に属している株により置き換えられる、請求項１９の項Ａ）またはＢ）に記載の方法。
【請求項２１】
アクチノアロムルス株が、アクチノアロムルス属種ＤＳＭ２４９８８である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
核酸が、請求項１６または１７において同定されたポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つを含む、請求項１９の項Ｃ）に記載の方法。
【請求項２３】
核酸が、配列番号７および８のポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つまたは配列番号７および８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
宿主細胞が、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）およびエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）から選択される微生物である、請求項１９の項Ｃ）、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
宿主細胞が、エシェリキア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）Ｓｔａｒである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
株アクチノアロムルスＤＳＭ２４９８８。
【請求項２７】
胃および膵臓の酵素による切断に対して耐性があり、腸管腔内に存在することにより毒性作用を生じる、グルテンオリゴペプチドを分解する方法であって、グルテンオリゴペプチドを、請求項１から８のいずれか一項に記載の酵素組成物または請求項９もしくは１０に記載の少なくとも１つの単離されたエンドペプチダーゼと接触させる工程を含む、方法。
【請求項２８】
請求項１から８のいずれか一項に記載の酵素組成物または請求項９もしくは１０に記載の少なくとも１つの単離されたエンドペプチダーゼの有効量を、これを必要とする患者に投与する工程を含む、セリアック病、疱疹状皮膚炎および／またはグルテン不耐性に関連する任意の他の障害を治療または予防するための、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
酵素組成物または単離されたエンドペプチダーゼが、医薬製剤、栄養補助食品、飲み物または飲料内に取り込まれる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
胃および膵臓の酵素による切断に対して耐性があり、内部管腔に存在することにより毒性作用を生じる、グルテイン（ｇｌｕｔｅｉｎ）オリゴペプチドを加水分解するための、栄養補助食品の製造における請求項１から８のいずれか一項に記載の酵素組成物または請求項９もしくは１０に記載の少なくとも１つの単離されたエンドペプチダーゼの使用。
【請求項３１】
酵素組成物または単離されたエンドペプチダーゼが固定化形態である、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
流動食品を処理するための、請求項３１に記載の使用。
【国際調査報告】
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