【手続補正書】
【提出日】平成21年12月4日(2009.12.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
[lip32遺伝子の取得]
#375株の32 kDaタンパク質をコードすると予想される遺伝子（以下lip32遺伝子とする）を取得するため、当該タンパク質のN-末端15アミノ酸残基の配列（GDAPAYERYVALGDS）を、genebankのアミノ酸配列データベースに対してblastp検索を行った結果、#375株と比較的近縁なStreptomyces属菌の推定分泌タンパク質（アクセッションNo.CAC42140）と高い同一性を示していた。このStreptomyces属菌推定分泌タンパク質は、幾つかのリパーゼ等のアミノ酸配列と同一性があった。そのうちStreptomyces rimosus由来GDSL-リパーゼ（アクセッションNo. AAK84028）とのClustalWによるアラインメント結果を図3に示す。これらタンパク質で保存された配列のうち、下線部で示した2つの配列VALGDSYS（配列番号:4）とIGGNDS（配列番号:5）を基に、センス鎖の縮重プライマー375-dg-F3（5’- TGGCCCTCGGCGACTCSTAC -’3）（配列番号:6）とアンチセンス鎖縮重プライマー375-dg-R3（5’- CGTCGTTGCCNCCGATG -3’）（配列番号:7）を設計した。#375株cDNAを鋳型に、プライマー375-dg-F3とプライマー375-dg-R3により、ExTaq（タカラバイオ）を用い、98℃  2分、（98℃  20秒、55℃  30秒、72℃  1分）ｘ35サイクル、72℃  5分のPCRによってDNAを増幅した。得られたDNA断片の塩基配列を決定し、配列番号:10の73番目〜290番目の部分塩基配列を得た。次に、得られた配列上に外向きにプライマー375-IPC32-F1（5’- CGGCGCGGACACGACGGACATGACG -3’）（配列番号:8）と375-IPC32-R1（5’- GGTAGCAGCCGCCCGCGATGTCGAG -3’）（配列番号:9）を設計した。#375株gDNAを制限酵素PstIあるいはNotIで消化したのち、セルフライゲーションすることで環状化したものを鋳型に、プライマー375-IPC32-F1とプライマー375-IPC32-R1により、LATaq（タカラバイオ）を用いて、98℃  20秒、68℃15分（+10秒/サイクル）ｘ35サイクルのPCR（インバースPCR）によって、近傍配列を増幅した。得られたDNA断片をクローニングし、その一部の塩基配列を決定した。先に得られた部分塩基配列とあわせて、合計約900bpのlip32領域gDNAの塩基配列を決定した。実施例1で決定したN-末端アミノ酸配列（配列番号2）から、LIP32タンパク質のアミノ酸配列を推定した。本菌のlip32遺伝子領域のDNA配列及び推定アミノ酸配列を、図4及び配列表（配列番号:10、配列番号:11）に示す。実施例1で決定したN-末端アミノ酸配列（配列番号:2）は、図4のN-末端アミノ酸配列と一致した。以上の結果から、LIP32成熟タンパク質は259アミノ酸残基から成るタンパク質であると考えられた。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
【表４】
2007181456.tif 000001
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
〔実施例６〕lip32遺伝子の全長配列の決定：
#375株gDNAを制限酵素PstIあるいはNotIで消化したのち、セルフライゲーションすることで環状化したものを鋳型に、プライマー375-IPC32-F1とプライマー375-IPC32-R1により、LATaq（タカラバイオ）を用いて、98℃  20秒、68℃15分（+10秒/サイクル）ｘ35サイクルのPCR（インバースPCR）によって、近傍配列を増幅した。得られたDNA断片をクローニングし、その一部の塩基配列を決定し、先に得た塩基配列（配列番号:10）と連結し、LIP32をコードするORFを含むゲノムDNA配列（配列番号:15、図8）、及び推定アミノ酸配列（配列番号:16、図8）を得た。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
〔実施例７〕LIP32タンパク質の推定プレ配列及びプロ配列に関する検討：
LIP32タンパク質の、全長アミノ酸配列をコードするLIP32-Fの増幅用にプライマーLIP32-Full-Nde-F（5’- CATATGAGCTCGTCACGTCGTACCGTCCGCACC -3’）（配列番号：17）とLIP32stop-Xho-Rv（5’- CTCGAGTCAGGTGAGCTCGTCGATGAGCAGGTC -3’）（配列番号：18）を、プレ配列を除くアミノ酸配列をコードするLIP32-Mの増幅用にプライマーLIP32-Mid-Nco-F（5’- CCATGGCGACCGAGCGGGCGTCGGCGCCCACG -3’）（配列番号：19）とLIP32stop-Xho-Rvを、プレ-プロ配列を除くアミノ酸配列をコードするLIP32-Sの増幅用にプライマーLIP32-sht-Nco-F（5’- CCATGGGCGACGCACCGGCATACGAACGCTAT -3’）（配列番号：20）とLIP32stop-Xho-Rvをそれぞれ合成した。#375株gDNAを鋳型に、各々のプライマーセットを用いたPCRによって増幅したDNA断片を、pCR4Blunt-TOPOベクター（インビトロジェン社製）に、クローニングし、塩基配列を確認した。制限酵素のNdeIとXhoI（LIP32-F）又はNcoIとXhoI（LIP32-M, -S）で切り出した各lip32遺伝子断片を、大腸菌発現用ベクターpET22b(+)（Novagen）の同制限酵素認識部位に組込み、それぞれをpETLIP32-F、pETLIP32-M、pETLIP32-Sベクターとした（図9）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９５】
〔実施例８〕lip40遺伝子のクローニング：
分子量40 kDaのリパーゼについて、SDS-PAGEよりバンドを切り出し、トリプシンによる消化後、逆相HPLCによる断片ペプチドの分離を行った。任意のピークのペプチドから、先に得たアミノ酸配列（配列番号:3、配列番号:14）に加え、以下のアミノ酸部分配列を得た。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
#375のゲノムDNA100ngを鋳型として、LA Taq with GC buffer（タカラバイオ）でGC buffer IIを用いて、プライマーLIP40-9とプライマーLIP40-5をそれぞれ終濃度10mＭ、LA Taq 0.2unit添加し全量20μlとし、94℃  1分、（94℃  30秒、50℃  30秒、72℃  2分）を40サイクル、72℃  5分のPCRを行った。PCR産物をアガロースゲル電気泳動で分析したところ、約0.7kbのDNA断片が確認されたので、ゲルより切り出し、GFXキット（アマシャム）により精製し、TOPO-TAクローニングキット（インビトロジェン）によりクローニングした。クローン化されたDNAの塩基配列を決定し、部分塩基配列（配列番号:28の932〜1571）が得られた。次に、lip40遺伝子の全長をクローン化するために、逆PCR(inverse PCR)を行った。＃375ゲノムDNAを制限酵素NotIで完全に消化したのち、セルフライゲーションさせた。それを鋳型として、プライマーLIP40-13（gacgcggttcatgtaggtgtgcgtcc）（配列番号:26）とLIP40-14（gtgcgccaagggcgccaacgtccgcc）（配列番号:27）を用いてLA Taq with GC buffer（タカラバイオ）でPCRを行った。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０８】
〔実施例１０〕大腸菌発現系によるLIP40タンパク質（LIP40HP）の調製：
#375株のLIP40タンパク質に6His-tagを付加して大腸菌で発現させるために以下のとおりベクターを構築した。MBI375株のゲノムDNAを鋳型に、プライマー 375L40EcoRI-His-F（5’- GAATTCGCACCACCACCACCACCACGGACCGGACTCCGTGCCCGGCAC -3’）（配列番号：33）と375L40HindIII-R1(5’- AAGCTTCTAGACGGCCCAGCAGTTGCTGAG -3’)（配列番号：34）を用いたPCRによって増幅後、pCR2.1TOPOベクターへクローニングした。塩基配列を確認後、制限酵素のEcoRIとHindIIIにより消化、抽出したLip40遺伝子断片は、大腸菌発現用ベクターpET22b(+)（Novagen）の同制限酵素認識部位に組込み、これをpETLIP40HPベクターとした（図11）。pETLIP40HPベクターで形質転換したE. coli strain BL21 (DE3)をタンパク質発現に用いた。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１７】
【図１】図1は、Tetrasphaera sp. NITE P-154（#375）の16S rRNA遺伝子の塩基配列を示した図である。
【図２】図2は、HPLC分画後の各フラクションのSDS-PAGEの写真である。MWは、分子量マーカー、21〜35はフラクション#21〜35を泳動したレーンを示す。
【図３】図3は、Streptomyces属菌推定分泌タンパク質と、Streptomyces rimosus由来GDSL-リパーゼとのアラインメント結果を示した図である。#375株の生産する32 kDaタンパク質のN-末端15アミノ酸残基は、比較的近縁なStreptomyces属菌の推定分泌タンパク質と高い同一性を示し、このStreptomyces属菌推定分泌タンパク質は、Streptomyces rimosus由来GDSL-リパーゼを含む幾つかのリパーゼ等のアミノ酸配列と同一性があった。
【図４】図4は、32 kDaタンパク質をコードすると予想される遺伝子（lip32遺伝子）の塩基配列と対応するアミノ酸配列を示した図である。lip32遺伝子は少なくとも777bpで構成され、259アミノ酸残基から成るタンパク質をコードすると考えられる。
【図５】図5は、LIP32タンパク質発現ベクター（pET22b::lip32Nc）の構成を示した図である。
【図６】図6は、カラム精製後のLIP32タンパク質のSDS-PAGEの写真である。Mはマーカー、2はフラクション#2、3はフラクション#3を泳動したレーンを示す。
【図７】図7は、カラム精製後のLIP32タンパク質のBradford法による結果を示したグラフである。
【図８】図8は、LIP32をコードする遺伝子を含むゲノムDNAの塩基配列とLIP32のアミノ酸配列を示した図である。網掛け部は精製LIP32のN末端アミノ酸配列と一致した配列を示す。
【図９】図9は、LIP32の推定プレ配列及びプロ配列と、pETLIP32-F、pETLIP32-M、pETLIP32-Sベクターを示した図である。
【図１０】図10は、LIP40をコードする遺伝子を含むゲノムDNAの塩基配列とLIP40のアミノ酸配列を示した図である。下線部は分泌シグナル配列、網掛け部は精製LIP40の部分アミノ酸配列と一致した配列を示す。２重下線部はリパーゼの保存領域である。
【図１１】図11は、LIP40タンパク質発現ベクター（pETLIP40HP）の構成を示した図である。
【図１２】図12は、LIP32PH及びLIP40HPの至適温度を示したグラフである。
【図１３】図13は、LIP32PH及びLIP40HPの至適pHを示したグラフである。
【図１４】図14は、固定化したLIP40HP又は対照（pET22b）を用いてアスタキサンチンへの脂肪酸転移反応を行った際の、反応液のHPLC分析チャートである。
【図１５】図15は、LIP40HP又は対照（pET22b）を用いてカテキンへの脂肪酸転移反応を行った際の、反応液のHPLC分析チャートである。
【図１６】図16は、LIP40成熟タンパク質のアミノ酸配列を示した図である。
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９】
2007181456.tif 000002