(57)【要約】本発明は、化膿性鼻副鼻腔炎を予防または処置するための方法を提供する。これらの方法は、チモシンα1を含む組成物を対象に投与する段階を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における化膿性鼻副鼻腔炎の予防、改善、または処置のための方法であって、化膿性鼻副鼻腔炎を処置、改善、または予防するために、有効量のチモシンペプチドを含む、液性因子を含有しない組成物を対象に投与する段階を含む、方法。
【請求項２】
チモシンペプチドがチモシンα1（TA1）である、前記請求項に記載の方法。
【請求項３】
組成物がチモスチムリン（TP-1）ではない、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
TA1が合成物または組換え体である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
対象が、慢性または再燃性の化膿性鼻副鼻腔炎を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
化膿性鼻副鼻腔炎が、細菌性、ウイルス性、混合型、または未知の原因によるものである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
対象が、チモシンペプチドの投与前に単球の正常でない極性化について陽性と判定されている、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
チモシンペプチドの投与が、単球の極性化の増加を結果としてもたらす、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
対象が、化膿性鼻副鼻腔炎について抗生物質および／または手術での処置に成功していない、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
チモシンペプチドが、化膿性鼻副鼻腔炎のために抗生物質と共におよび／または手術後に投与される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
対象が抗生物質を投与されない、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
チモシンペプチドが約1 mgから約5 mgまでの用量で投与される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
チモシンペプチドが約1.6 mgの用量で投与される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
チモシンペプチドが約3.2 mgの用量で投与される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
チモシンペプチドが注射または注入により投与される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
チモシンペプチドが筋肉内注射または皮下注射により投与される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
チモシンペプチドが、対象におけるチモシンペプチドの血漿半減期を増大させるために水溶性ポリマーに結合されている、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
チモシンペプチドが、毎日の注射により約2週間、その後、1週あたり2回の注射により約6週間投与される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
対象における単球または顆粒球の極性化異常の予防、改善、または処置のための方法であって、単球または顆粒球の極性化を誘導するために、有効量のチモシンペプチドを含む、液性因子を含有しない組成物を対象に投与する段階を含む、方法。
【請求項２０】
単球または顆粒球の極性化異常を有する対象において単球または顆粒球の極性化を増加させるための方法であって、単球または顆粒球の極性化を増加させるために、有効量のチモシンペプチドを含む、液性因子を含有しない組成物を対象に投与する段階を含む、方法。
【請求項２１】
対象が、チモシンペプチドの投与前に単球または顆粒球の極性化異常について陽性と判定されている、請求項19または20記載の方法。
【請求項２２】
（1）合成または組換えチモシンペプチド投与単位のセット、および
（2）化膿性鼻副鼻腔炎または単球もしくは顆粒球の極性化異常の処置、改善、または予防のためにチモシンペプチドを含む組成物を投与することについての指示書、および／または
（3）単球または顆粒球の極性化を試験するための1つまたは複数の試薬
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、全体として参照により本明細書に組み入れられる、2012年3月8日に出願された米国特許仮出願第61/608,427号の優先権および恩典を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、化膿性鼻副鼻腔炎の処置のためのチモシンペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
副鼻腔炎は、副鼻腔の細菌および／またはウイルスの感染症を含む。急性副鼻腔炎は、典型的に、4週間以内に処置で消散する。再発性急性（亜急性）副鼻腔炎は、感染症の2〜4回の症状発現が、1年あたりに症状発現の間が少なくとも8週間で起きた後に診断される。再発性急性副鼻腔炎の症状発現は、およそ4〜8週間続く。副鼻腔粘膜は、典型的に、急性および再発性の両方について、感染症の間は正常である。慢性副鼻腔炎は、8週間を超えて持続する症候が存在する際に診断される。
【０００４】
化膿性鼻副鼻腔炎は、急性または慢性であり得、典型的に色が緑であり、かつ膿および／または血液を含有し得る排泄物を特徴とする。
【０００５】
副鼻腔炎はしばしば、限局性の頭痛または歯痛を伴う。眼窩の感染症の可能性があり、これは、視力の喪失を結果としてもたらし得、かつ発熱および重篤な疾病を伴い得る。別の可能性がある合併症は、前頭の骨の感染症（骨髄炎）、および同様に他の顔の骨の感染症（ポット腫脹性腫瘍）である。
【０００６】
鼻副鼻腔炎はまた、顔面痛、顔面圧迫、鼻閉塞、排泄物、発熱、頭痛、口臭、疲労、咳、耳の痛み／圧迫／膨満感、倦怠感、および／または咽喉炎を含む、様々な症候をもたらし得る。副鼻腔感染症はまた、鼻道のうっ血による追加的な内耳の問題を引き起こし得、かつ、めまい、「加圧されたもしくは重い頭」、または頭部における振動する感覚をもたらし得る。
【０００７】
脳が副鼻腔に非常に接近していることによって、骨または血管を通した嫌気性細菌の侵入により、脳の副鼻腔感染症の最も危険な合併症の1つがもたらされる。膿瘍、髄膜炎、および他の生命を脅かす状態は、そのような感染症に起因し得る。極端な場合には、軽度の人格変化、頭痛、意識変容、視覚の問題、ならびに、最終的には、発作、昏睡、およびことによると死が起こり得る。
【０００８】
副鼻腔炎はしばしば、ウイルスにより引き起こされ、時には抗生物質無しで消散し得る。しかしながら、症候が10日ほど以内に消散しない場合、抗生物質を使用することができる。しかしながら、これらの抗生物質単独では、しばしば無効であり、いくつかの場合には、プラセボよりも有効ではない可能性がある。いくつかの研究により、人々の60％〜90％が、抗生物質を用いた症候の消散を経験しないことが見出されている（例えば、Ian G. Williamson et al. JAMA 298 (21): 2487-96 (2007)（非特許文献1）およびvan Buchem, F. L.; Knottnerus, J. A., Schrijnemaekers, V. J. J., Peeters, M. F. Lancet 349 (9053): 683-7 (1997)（非特許文献2）を参照されたい）。
【０００９】
現在、慢性または再発性副鼻腔炎については、耳鼻咽喉科医の専門家への照会が必要とされ得、処置選択肢は鼻の手術を含み得る。短期過程（3〜7日）の抗生物質が、重篤な疾患またはいかなる複雑化要因も呈さない患者にとって時には有効であり得るが、慢性または再発性副鼻腔炎、特に慢性または再発性鼻副鼻腔炎を有する個体のための追加的な処置の必要性が残されている。
【００１０】
本発明は、化膿性鼻副鼻腔炎、特に慢性化膿性鼻副鼻腔炎を処置および／または予防するための、非侵襲的方法を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ian G. Williamson et al. JAMA 298 (21): 2487-96 (2007)
【非特許文献２】van Buchem, F. L.; Knottnerus, J. A., Schrijnemaekers, V. J. J., Peeters, M. F. Lancet 349 (9053): 683-7 (1997)
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、化膿性鼻副鼻腔炎の予防、改善、および／または処置のための方法を提供する。対象における化膿性鼻副鼻腔炎の予防、改善、および／または処置のためのそのような方法は、液性因子を含有しない組成物中の、有効量のチモシンペプチド、例えばチモシンα1（TA1）を対象に投与する段階を含む。いくつかの態様において、投与される組成物はチモスチムリン（TP-1）ではない。TA1は、合成であってもよく、または組換えで生産されてもよい。
【００１３】
本方法により予防または処置される化膿性鼻副鼻腔炎は、慢性鼻副鼻腔炎または再燃性化膿性鼻副鼻腔炎を含み得、それらは、細菌性、ウイルス性、混合型、または未知の原因によるものであってもよい。
【００１４】
いくつかの態様において、対象は、単球または顆粒球の極性化について試験され、対象が、単球または顆粒球の、不完全であるかまたは正常でない極性化を呈する場合に、対象は、本明細書において記載されるチモシンペプチドレジメンを施される。
【００１５】
従って、別の局面において、本発明は、有効または正常な極性化を誘導するために、本明細書において記載されるチモシンペプチドの組成物またはレジメンを対象に施す段階を含む、対象における単球または顆粒球の極性化異常の予防および／または処置を提供する。
【００１６】
本発明はまた、本明細書において記載されるチモシンペプチドレジメンに従って対象を処置するため、およびそのような処置を必要とする対象を同定するためのキットも提供する。いくつかの態様において、キットは、（1）合成または組換えチモシンペプチド投与単位のセット、および（2）化膿性鼻副鼻腔炎または単球もしくは顆粒球の極性化異常の処置、改善、または予防のためにチモシンペプチドを含む組成物を投与することについての指示書、および／または（3）単球または顆粒球の極性化を試験するための1つまたは複数の試薬、を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】チモシンαでの処置を伴うおよび伴わない、化膿性鼻副鼻腔炎を有する患者における単球および顆粒球の極性化を示す。
【図２】N-ホルミルメチオニル-ロイシル-フェニルアラニン（fMLP）により誘導される、健康なドナー単球の極性化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
詳細な説明
本発明は、有効量のチモシンペプチド、例えばチモシンα1を投与することが、化膿性鼻副鼻腔炎を処置、予防、または改善するために利益をもたらすという驚くべき発見に、一部基づく。そのように、本発明は、対象において化膿性鼻副鼻腔炎を予防、処置、または改善するための方法を提供する。これらの方法は、有効量のチモシンペプチドを含む組成物を対象に投与する段階を含む。化膿性鼻副鼻腔炎を処置または予防するために、本組成物は有効な濃度でチモシンペプチドを含むが、液性因子を含有しない。
【００１９】
対象は、化膿性鼻副鼻腔炎を有してもよく、または、1つもしくは複数の症候の存在に基づいて化膿性鼻副鼻腔炎を有すると判定されてもよい。化膿性鼻副鼻腔炎は、しばしば、慢性または再燃性である副鼻腔の1つまたは複数における炎症として特徴づけられる。感染症は、ウイルス感染、細菌感染、および／または真菌感染に起因し得る。感染症は、混合型または未知の原因によるものであり得る。症候は、頭痛、歯痛、眼窩の感染症、発熱、ならびにいくつかの場合には、前頭の骨の感染症（骨髄炎）、および／または、いくつかの場合にポット腫脹性腫瘍と呼ばれる他の顔の骨の感染症を含み得る。追加的な症候は、鼻道のうっ血による内耳の問題を含み得、めまい、加圧されたもしくは頭が重い感触、および／または頭部における振動する感覚が伴い得る。
【００２０】
化膿性鼻副鼻腔炎は、急性、慢性、または再燃性の化膿性鼻副鼻腔炎であり得る。処置の前に、急性鼻副鼻腔炎は、1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、1週間、2週間、3週間、または4週間、またはそれより長く持続し得る。慢性副鼻腔炎は、本明細書において記載される処置の前に、約8週間、約10週間、約12週間、約1か月間、約2か月間、約6か月間、または約1年間、またはそれより長く持続し得る。しばしば再発性とも呼ばれる再燃性は、12か月の期間内に急性疾患の4回、5回、6回、7回、8回、またはそれより多い再発を含み得る。いくつかの場合に、症候は、各症状発現の間に消散する。
【００２１】
いくつかの態様において、患者がチモシンペプチド療法にとって最適な候補者であるか否かを判定するために、対象を、顆粒球または単球の正常でない極性化について試験する。例えば、末梢血単球を患者血液から調製または単離してもよく、適切な試薬、例えばN-ホルミルメチオニル-ロイシル-フェニルアラニン（FMLPまたはfMLP）に応答する極性化を試験してもよい。単球は、密度勾配遠心分離により調製または単離してもよく、極性化は、光学顕微鏡、または他の適切な技術により検出または定量化してもよい。試料が、約20％より少ない、FMLPにより誘導される極性化を呈する場合に、対象は、極性化異常または不十分な極性化を有すると同定され、チモシンペプチド処置にとって最適な対象である。いくつかの態様において、試料は、約20％より少ない、約19％より少ない、約18％より少ない、約17％より少ない、約16％より少ない、約15％より少ない、約14％より少ない、約13％より少ない、約12％より少ない、約11％より少ない、約10％より少ない、約9％より少ない、約8％より少ない、約7％より少ない、約6％より少ない、約5％より少ない、約4％より少ない、約3％より少ない、約2％より少ない、または約1％より少ない、FMLPにより誘導される極性化を呈する。
【００２２】
本発明に従って、チモシンペプチドは有効量で投与される。いくつかの態様において、チモシンペプチドはチモシンαである。有効量は、本明細書において記載される利益をもたらすのに十分な、チモシンペプチドの任意の量を含む。化膿性鼻副鼻腔炎を有する対象にチモシンペプチドを投与することによりもたらされる利益は、例えば、化膿性鼻副鼻腔炎状態の処置、予防、および／もしくは改善、ならびに／または、化膿性鼻副鼻腔炎と関連する症候の改善を含み得るが、本明細書において列挙されるものに限定されない。あるいは、有益な効果は、顆粒球または単球の極性化について患者を試験することにより観察され得る。医学分野の当業者は、チモシンペプチド処置に応答するそのような有益な効果を容易に判定することができるであろう。
【００２３】
チモシンペプチドは、チモシンα1（「TA1」）、およびTA1に構造的相同性を有するペプチドを含む。TA1は、アミノ酸配列(N-アセチル)-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH（SEQ ID NO: 1） を有するペプチドである。TA1のアミノ酸配列は、その開示が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,079,137号において開示されている。TA1は、アセチル化されたN末端、および約3108の分子量を有する、グリコシル化されていない28アミノ酸のペプチドである。TA1の合成版は、ある特定の国において商品名ZADAXINで市販されている。本発明のチモシンα1はまた、SEQ ID NO:1、ならびに、SEQ ID NO:1のチモシンα1に類似した活性を呈するその誘導体および変異体も含む。本発明の方法により企図されるチモシンペプチド組成物は、液性因子を含有しない。本発明のいくつかの態様において、組成物はチモスチムリン（TP-1）ではない。
【００２４】
TA1は、約0.1〜1.0 ng/mlで血清中を循環する。3.2 mgのTA1（約40μg/kg）の注射後のピーク血漿レベルは、およそ100 ng/mlである。循環中のTA1の半減期は、約2時間である。
【００２５】
本発明で用途を見出すチモシンペプチドは、天然に存在するTA1（例えば、組織から精製または単離されたTA1）、ならびに、合成TA1および組換えTA1を含む。いくつかの態様において、チモシンペプチドは、（N末端がアシル化、例えばアセチル化されていてもよい）SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、チモシンペプチドは、TA1に実質的に類似したアミノ酸配列を含み、かつ、TA1の免疫調節活性を維持する。実質的に類似した配列は、例えば、TA1に対して（合わせて）約1個〜約10個のアミノ酸の欠失、挿入、および／または置換を有してもよい。例えば、チモシンペプチドは、TA1に対して（合わせて）約1個〜約5個（例えば、1個、2個、または3個）のアミノ酸の挿入、欠失、および／または置換を有してもよい。
【００２６】
従って、チモシンペプチドは、例えば、TA1に対して1個〜約10個のアミノ酸、または約1個〜約5個のアミノ酸、または1個、2個、もしくは3個のアミノ酸の欠失を有する、短縮されたTA1配列を含んでもよい。そのような欠失は、ペプチドの活性が実質的に維持される限り、N末端もしくはC末端、および／または内部であってもよい。あるいは、または加えて、実質的に類似した配列は、TA1の活性が実質的に維持される場合、TA1に対して約1個〜約5個のアミノ酸の挿入（例えば、1個、2個、または3個のアミノ酸の挿入）を有してもよい。あるいは、または加えて、実質的に類似した配列は、活性が実質的に維持される場合、1個〜約10個のアミノ酸の置換を有してもよい。例えば、実質的に類似した配列は、保存的置換および非保存的置換を含んでもよい、1個〜約5個、または1個、2個、もしくは3個のアミノ酸置換を有してもよい。いくつかの態様において、置換は保存的である。一般的に、保存的置換は、化学的に類似したアミノ酸（例えば、極性、非極性、または荷電）の置換を含む。置換されるアミノ酸は、標準的な20種のアミノ酸から選択されてもよく、または非標準的なアミノ酸（例えば、保存された非標準的なアミノ酸）であってもよい。
【００２７】
いくつかの態様において、チモシンペプチドは、TA1の活性を維持しながら、SEQ ID NO:1に対して少なくとも70％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、チモシンペプチドは、SEQ ID NO:1に対して少なくとも80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。チモシンペプチドは、SEQ ID NO:1に対して100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。すべての場合に、N末端は、任意で、例えば、C1〜C10またはC1〜C7のアシル基またはアルキル基で、アシル化（例えばアセチル化）またはアルキル化されてもよい。
【００２８】
ある特定の態様において、上記の実質的に類似したペプチドおよび相同のペプチドは、TA1（SEQ ID NO:1）に比べて少なくとも約50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、または約100％のレベルで機能し得る。
【００２９】
チモシンペプチドは、合成で、例えば固相合成によって調製されてもよく、または、公知の技術により組換えで作製されて精製されてもよい。
【００３０】
チモシンペプチドはまた、水溶性ポリマーに結合させることもできる。そのような水溶性ポリマーは、対象におけるチモシンペプチドの血漿半減期を増大させるように機能する。水溶性ポリマーは、ポリアルキレンオキシドホモポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール、これらのポリマーのコポリマー、およびこれらのポリマーのブロックコポリマーを含むことができる。
【００３１】
ある特定の態様において、チモシンペプチドは、循環中のその半減期を増大させるためにペグ化される。治療用タンパク質の半減期を増大させるためのそのような戦略は、周知である。
【００３２】
チモシンペプチドの有効量は、約1 mgから約5 mgまで、または約2 mg〜約4 mg、または約1.6 mg〜約3.2 mgの投与量範囲を含むことができる。いくつかの態様において、チモシンαは、約1 mgから約5 mgまで投与される。チモシンペプチドは、一般的に、約0.1〜20 mgのTA1、または約1〜10 mgのTA1、または約2〜10 mgのTA1、または約2〜8 mgのTA1、または約2〜7 mgのTA1に対応する範囲内で投与されてもよい。いくつかの態様において、チモシンαは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、または20 mgで投与される。いくつかの態様において、チモシンペプチドは約1.6 mgの投与量で投与される。いくつかの態様において、チモシンペプチドは約3.2 mgの投与量で投与される。いくつかの態様において、チモシンペプチドはチモシンα1である。いくつかの態様において、チモシンα1は約1.6 mgで投与される。いくつかの態様において、チモシンα1は約3.2 mgで投与される。いくつかの態様において、TA1用量は、患者のサイズに調整され、10〜100μg / kg（例えば、約20、40、60、または80μg / kg）で提供されてもよい。用量は、対象または患者の種に応じて調整されてもよいが、各場合には、TA1のヒト等価量（mg/kg）にほぼ対応する。
【００３３】
チモシンペプチドは、凍結乾燥形態において提供され、投与前に滅菌された（例えば水性の）希釈剤で再構成されてもよい。チモシンペプチド（例えば、TA1とも呼ばれるチモシンα1）は、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮内注射、静脈内注射もしくは注入によるか、舌下または経口を含む、任意の有効な経路によって投与されてもよい。チモシンペプチドは、凍結乾燥形態において提供され、投与前に滅菌された（例えば水性の）希釈剤で再構成されてもよい。ある特定の態様において、チモシンペプチドは、皮下注射によりまたは静脈内注入により投与される。いくつかの態様において、注射の方法は筋肉内注射である。一般的に、チモシンの予定された用量は、単一用量として投与されてもよく（例えば注射）、または、例えば、持続注入または部分用量（subdose）の反復注射などにより、24時間またはそれより短い過程にわたって間隔をおいて配置されてもよい。チモシンペプチドの予定された用量は、単回注射として投与されてもよい。
【００３４】
いくつかの態様において、TA1は、持続注入により投与されてもよい。TA1の持続注入は、その全体の開示が参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第2005/0049191号に、詳細に記載されている。簡潔に言うと、チモシンペプチドの持続注入は、患者の循環系において有効量のチモシンペプチドをより長い期間維持する。皮下注射されたTA1の血漿半減期は約2時間であり、従って、ある特定の態様に従い、チモシンペプチドは、少なくとも約6、10、12時間、またはより長い処置期間にわたって患者に投与されてもよく、これは、いくつかの態様において有効性を改善し得る。注入は、ミニポンプによるなどの、任意の適当な手段により実施されてもよい。
【００３５】
あるいは、チモシンペプチドは、患者の循環系において有効量のチモシンペプチドをより長い時間維持するように、処置日に複数回の注射（部分用量のチモシンペプチド）により投与することができる。適当な注射レジメンは、チモシン処置の日に患者の循環系において有効量のチモシンペプチドを実質的に持続的に維持するように、投与の日に2、3、4、6、8時間毎などの注射（例えば、2〜5回の注射）を含んでもよい。
【００３６】
有効量のチモシンペプチド（例えばTA1）は、チモシンペプチドを患者に約0.0001〜0.1 mg/時間/kg患者体重の範囲内の速度で投与することにより、患者の循環系において実質的に持続的に維持されてもよい。例示的な投与速度は、約0.0003〜0.03 mg/時間/kg患者体重の範囲内である。持続注入のために、TA1ペプチドは、注射用の水、または生理的濃度の生理食塩水などの、薬学的に許容される液体担体中に存在する。
【００３７】
いくつかの態様において、処置レジメンは8週間続く。いくつかの態様において、処置の最初の2週間は、チモシンの毎日の注射を含んだ。いくつかの態様において、注射は、1週間に2回与えられる。いくつかの態様において、注射は、3週目から始まって、1週間に2回与えられる。いくつかの態様において、注射は、2週間毎日、その後、3週目から始まって1週間に2回与えられる。いくつかの態様において、注射は、2週間毎日、および3〜5週間、1週間に2回与えられる。いくつかの態様において、処置レジメンは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10週間、またはそれより長い週間続く。いくつかの態様において、処置レジメンは、1、2、3、4、5、6か月、またはそれより長い月間続く。いくつかの態様において、チモシンペプチドは、約1〜約4週間（例えば約2週間）のチモシンペプチドの毎日の注射、その後、約4〜8週間（例えば約6週間）の1週あたり2回の注射を含む、レジメンにおいて投与される。
【００３８】
本発明は、ヒトおよび獣医学的健康の両方に適用可能である。従って、対象は、一般的に、ヒト、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジなど）、または家庭内の哺乳動物（例えば、ネコもしくはイヌ）などの哺乳動物である。
【００３９】
いくつかの態様において、対象は、喘息またはアレルギー疾患を有する。いくつかの態様において、対象は免疫不全である。免疫不全の対象（例えばヒト対象）は、感染性疾患と戦う能力の低下、および／または病原体曝露に応答する能力の低下を呈する。そのような免疫不全の対象の例は、高齢の患者、新生児、白血病または好中球減少症の患者、血液透析中の患者（例えば、慢性腎疾患の処置のため）、免疫抑制療法を受けている患者、AIDS患者、糖尿病患者、癌のために化学療法または放射線療法を受けている患者、遺伝的欠損、栄養不良、薬物乱用、アルコール中毒、または他の免疫を損なう疾病もしくは状態により引き起こされる免疫不全を含む。
【００４０】
レジメンは、化膿性鼻副鼻腔炎のための抗生物質療法または手術の不成功後に、施されてもよい。感染症が抗生物質に対して抵抗性であると考えられる場合、チモシンペプチドは、抗生物質療法無しで単独で投与されてもよい。あるいは、抗生物質療法が、チモシンペプチドレジメンと共に施されてもよい。
【００４１】
本発明に従って、チモシンペプチドは、単独で、または、抗生物質、抗真菌剤、もしくは抗ウイルス剤などの他の作用物質と組み合わせて、投与することができる。いくつかの態様において、チモシンペプチドは、チモシンペプチドと、1つまたは複数の抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス剤、うっ血除去剤／去痰剤、ステロイド、または他の作用物質とを、投与用の単一組成物として含有するように製剤化することができる。他の態様において、薬学的組成物は、チモシンペプチドを1つの組成物として、および1つまたは複数の抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス剤、うっ血除去剤／去痰剤、ステロイド、または他の作用物質を投与用の別々の組成物として、含有するように製剤化することができる。いくつかの態様において、より多い抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス剤、うっ血除去剤／去痰剤、ステロイド、および／または他の作用物質の組み合わせを、単回投与用にチモシンペプチドと共に、または投与用の別々の組成物として製剤化することができる。
【００４２】
抗生物質は、例えば、ペニシリン（アモキシシリンまたはアモキシシリン／クラブラナートなどであるがこれらに限定されない）、フルオロキノロン（モキシフロキサシンなどであるがこれに限定されない）、マクロライド抗生物質（クラリスロマイシンおよびアジスロマイシンなどであるがこれらに限定されない）、テトラサイクリン（ドキシサイクリンなどであるがこれに限定されない）、またはアミノグリコシド抗生物質（ゲンタマイシンなどであるがこれに限定されない）を含むことができるが、これらに限定されない。
【００４３】
抗真菌剤は、例えば、アンホテリシンB、イトラコナゾール、およびボリコナゾールを含むことができるが、これらに限定されない。
【００４４】
抗ウイルス剤は、例えば、リバビリンを含むことができるが、これに限定されない。
【００４５】
うっ血除去剤／去痰剤は、グアイフェネシン、偽性エフェドリン、またはMucinex D（グアイフェネシンおよび偽性エフェドリンHCL）などの組み合わせを含むことができるが、これらに限定されない。
【００４６】
ステロイドは、メチルプレドニゾロン、コルチコステロイド（トリアムシノロンなどであるがこれに限定されない）、プレドニゾン、および糖質コルチコステロイド（モメタゾンフロアートおよびデキサメタゾンなどであるがこれらに限定されない）を含むことができるが、これらに限定されない。
【００４７】
他の作用物質は、ドルナーゼα（Pulmozyme；肺において粘性を低下させる組換えヒトデオキシリボヌクレアーゼI（rhDNase））、オマリズマブ（Xolair；組換えDNA由来のヒト化IgG1kモノクローナル）、テオフィリン（ジメチルキサンチンとしても公知である）、麻酔薬（プロポフォールおよびセボフルランなどであるがこれらに限定されない）、およびオピオイド鎮痛薬（レミフェンタニルなどであるがこれに限定されない）を含むことができるが、これらに限定されない。
【００４８】
いくつかの態様において、チモシンペプチドは、副鼻腔洗浄および／または外科的手順との組み合わせで使用することができる。副鼻腔洗浄は、生理食塩溶液での洗浄などの手順を含むことができる。外科的手順は、長期または慢性の炎症のために引き起こされ得る鼻ポリープの除去を含むことができる。
【００４９】
本発明に従って、対象における単球または顆粒球の極性化異常の予防、改善、または処置の方法、および、単球または顆粒球の極性化を誘導するための方法もまた、提供される。単球の極性化異常は、化膿性鼻副鼻腔炎、ならびに、グレーブス病および甲状腺自己免疫疾患（TAID）を含む自己免疫疾患および状態を含む、様々な疾患および状態と関連し得る。これらの方法は、単球または顆粒球の極性化異常を予防、改善、または処置するために（例えば、極性化を誘導することにより）、チモシンα1を含む組成物を対象に投与する段階を含む。これらの方法に従って、投与用の組成物およびレジメンは、上記のようである。いくつかの態様において、チモシンαを含む組成物を、極性化異常による影響を受けていない個体に関する標準レベルと比較して、単球の極性化を正常レベルに増大させるために使用することができる。極性化に異常を有する対象は、本明細書において記載されるように、末梢血単球においてFMLPにより誘導される極性化によって、同定されてもよい。
【００５０】
本発明はまた、（1）投与単位のチモシンペプチドのセット、および（2）化膿性鼻副鼻腔炎または単球もしくは顆粒球の極性化異常の処置、改善、または予防のためにチモシンペプチドを含む組成物を投与することについての指示書、および／または（3）極性化を試験するための1つまたは複数の試薬、を含むキットも提供する。いくつかの態様において、組成物中のチモシンペプチドは、本明細書において記載される処置レジメンを施すために提供される十分な数の用量のチモシンα1である。用量は、通常のバイアルにおいて提供されてもよく、または、個々の投与単位（例えば、皮下注射のためのあらかじめ適量に分けられた（pre-dosed）ペン）として提供されてもよい。極性化を試験するための試薬は、1つまたは複数のFMLPおよび密度勾配遠心分離のために十分な試料チューブを含んでもよい。いくつかの態様において、キット中のチモシンペプチドは、液性因子を含有しない。いくつかの態様において、組成物中のチモシンペプチドはチモシンα1であり、組成物は液性因子を含有しない。
【実施例】
【００５１】
実施例1：
10人の患者において結果を評定した。10人の患者において単球および顆粒球の極性化を評定した。最初に、極性化が減少した3〜4人の患者から始めた。チモスチムリン（TP-1）は、インビトロで極性化の改善を示した。特に、チモシンα（チマルファシン）は、インビトロで極性化を改善および回復するように非常に良好に働いた。（図1を参照されたい。）対照として、N-ホルミルメチオニル-ロイシル-フェニルアラニン（fMLP）により誘導される健康なドナー単球の極性化。（図2を参照されたい。）濃度は、TP-1、1 mg/ml、チマルファシン、0.1 mg/ml、およびfMLP、10-8Mであった。
【００５２】
インビボで、単球の極性化が低減した患者を、インビボでの単球極性化に対する効果を判定するための予備研究において、チモシンα1で処置することになる。
【００５３】
実施例2：
化膿性鼻副鼻腔炎を有する患者を、チモシンα1で処置する。Tas, et al.（Clin. Exp. Immunol. 80:304-313 (1990)）において記載されている研究と同様に、本研究に含めるための患者は、以下の基準（例えば、Drexhage et al., Clin. Immunol. Immunopathol. 28:218 (1983)およびRecent Advances in Primary and Acquired Immunodeficiencies, vol. 28 (ed. by F. Aiuti, F. Rosen & M. D. Cooper) p. 395. Serono Symposia Publications, Raven Press, New York (1985)を参照されたい）を用いてスクリーニングすることになる：
（1）（a）事前の試験での単球の極性化の異常、ならびに／または（b）事前の試験でのカンジジン、ストレプトキナーゼ-ストレプトドルナーゼ（Sk/Sd）、および／もしくはH. インフルエンザ（H. influenzae）抗原に対する皮膚試験の異常、ならびに／または（c）事前の試験でのカンジジン、Sk/Sd、および／もしくはH. インフルエンザに対するMIF産生の異常により示されるような、片利共生微生物に対する細胞媒介性免疫（CMI）の異常；
（2）（a）少なくとも18か月の疾患の持続期間、（b）H. インフルエンザ、S.ニューモニエ（S. pneumoniae）、他の連鎖球菌、またはブドウ球菌についての1回または複数の機会での陽性培養、（c）いくつかの過程の抗生物質での処置に対する応答無し、またはその後の一時的のみの軽減、（d）篩骨洞および上顎洞のドレナージを改善することにより永久治癒を与える手術の失敗、（e）粘膜繊毛輸送においてひどい撹乱が無いことにより示されるような、慢性化膿性鼻副鼻腔炎の再燃。
【００５４】
患者は、正常なレベルの総血清IgG、IgM、およびIgA、正常な末梢血白血球の総数、ならびに正常な異なるリンパ球数を有することになる。
【００５５】
免疫系に影響を及ぼすことが公知である抗生物質および／または他の薬物での追加的な処置は、チモシンα治験中には与えられないことになる。しかしながら、その後の併用療法は、適用されてもよい。
【００５６】
患者は、インフォームドコンセントを与えることになり、治験が行われる病院の倫理委員会が、治験を承認することになる。
【００５７】
処置は、チモシンα1（1 mg/kg体重）またはそのプラセボ［溶媒（発熱物質を含まない塩化ナトリウム溶液）＋担体（マンニトール）；具体的にはSeronoにより調製されたもの］のいずれかの筋肉内注射からなることになる。患者は、無作為に2つの群に割り当てられることになり；1つの群はチモシンα1注射から始まり、もう1つの群はプラセボ注射から始まる。
【００５８】
処置は、8週間与えられることになる。最初の2週間、注射は毎日与えられ、その後6週間、1週に2回になる。9週目に、患者の細胞媒介性免疫を試験するために、いかなる処置も与えられないことになる。
【００５９】
その後、スケジュールは、「交差する」ことになり：チモシンα1が、以前にプラセボを与えられていた患者に与えられ、プラセボが、以前にチモシンα1を与えられていた患者に与えられることになる。処置は、さらに8週間与えられることになる。
【００６０】
治験前の週に、以下の試験が、各患者について実施されることになる（技術については下記を参照されたい）：（1）鼻の視診、（2）鼻からの細菌培養、（3）BSR、（4）細菌抗原でのDTH皮膚試験、（5）末梢血中のリンパ球サブセットの測定、（6）MIFアッセイ、（7）末梢血単球での極性化アッセイ、（8）血清中のP15E様因子の測定。
【００６１】
試験1、2、3、7、および8を、4、8、13、および17週目（治験の終わり）に繰り返すことになる。試験4、5、および6は、8週目（交差前）および17週目（治験の終わり）に繰り返すのみになる。
【００６２】
すべての患者において、肝機能（ビリルビン、ALAT、ASAT）および腎機能（クレアチニン、タンパク尿）に関連するパラメータを、処置中に調べることになる。
【００６３】
DTH皮膚試験
以下の皮膚試験抗原を使用することになる（Drexhage et al., Recent Advances in Primary and Aquired Immunodeficiencies, vol. 28 (ed. by F. Aiuti, F. Rosen & M. D. Cooper) p. 395. Serono Symposia Publications, Raven Press, New York (1985)もまた参照されたい）：（1）記載されているように（Drexhage et al., 1983；van der Plassche-Boers et al., J. Immunol. Methods, 83:353 (1985)）調製された250 pg/mlの体性H. インフルエンザ抗原；（2）2つの市販されている調製物；すなわち、1％カンジダ1抗原（HAL allergens, Haarlem, The Netherlands）；ならびに100 U/ml Skおよび50 U/ml Sd（Varidase, Lederle, Wayne, MI）。
【００６４】
遅延した応答性を、前腕中の各抗原調製物の0.1 ml懸濁液の皮内注射により試験することになる。皮膚反応を、30分、6時間、24時間、および48時間で読み取り、直角をなす2つの測定値の平均として表される、硬結の直径を記録することになる。
【００６５】
総末梢血リンパ球およびリンパ球サブセットの列挙
リンパ球およびリンパ球サブセットの割合(%)を、Ficoll-Isopaque密度勾配遠心分離（Pharmacia, Uppsala, Sweden）により単離された末梢血リンパ球を、T細胞に対するCD3＋抗体（Leu 4; Becton Dickinson, Mountain View, CA）、活性T細胞に対するCD2＋抗体（OKT I 1; Orthoclone Ortho, Raritan, NJ）、CD4＋ヘルパー／インデューサーT細胞（Leu 3a）、CD8＋サプレッサー／細胞傷害性T細胞（Leu 2a）、およびCD24＋B細胞（BA-1; Hybritech, San Diego, CA）と、製造業者により示されるように反応させることによって測定することになる。およそ200個の細胞を蛍光顕微鏡において計数し；試験を二連で行うことになる。T細胞およびT細胞サブセットの絶対数を、総末梢リンパ球数から乗法により算出することになる。
【００６６】
マクロファージ遊走阻害因子試験
マクロファージ阻害因子（MIF）産生を、間接微液滴アガロースアッセイで概算することになる（詳細については、van der Plassche-Boers et al. Clin. Exp. Immunol. 66:516 (1986)を参照されたい）。簡潔に言うと、末梢血単核細胞（およそ2.5×106個）を、H. インフルエンザの抗原、カンジジン、およびSk/Sdと共に培養することになる。上清を、マイトジェンであるコンカナバリンA（Con A, Sigma, St Louis, MO）を用いて調製することになる。上清をまた、培養（37℃、空気中5％ CO2）の3日後にも収集することになり、MIF活性についての試験まで−20℃で保存することができる。
【００６７】
アガロース微液滴アッセイを、指標細胞としてヒト単球様U937を用いて（Singh & Khan, J. Clin. Hemat. Oncol. 12:29 (1982)）、Thurman et al. (1983)に従って行うことになる。0.2％アガロース（Marine Colloids, Rockland, USA）中の細胞（およそ2×107細胞／ml）から、1μLの液滴を、0.05 mL気密性シリンジを有するHamilton Repeating Dispenser（Hamilton, Reno, AR）を用いて、平底のマイクロタイタープレート（Nunc, Denmark）のウェルの中心に置くことになる。液滴を、4℃で10〜20分間、凝固するようにさせ、新鮮な培地で1：1に希釈した、融解した上清の0.1 mlで注意深く表面を覆うことになる。各上清を、5回試験することになる。
【００６８】
覆われたプレートの21時間、37℃、および空気中5％ CO2でのインキュベーション後、遊走面積（細胞遊走面積−アガロース液滴の面積）をコンピュータで計算することになる。MIF産生は、遊走阻害の割合(%)として表されることになる。
MI＝
100−（（抗原で刺激された培養物中の平均遊走面積）／（培地中の平均遊走面積））×100(％)
【００６９】
末梢血単球の単離および極性化アッセイ
Ficoll-Isopaque密度勾配遠心分離により単離された末梢血単核細胞（20×106個）を、0.5％ウシ血清アルブミン（BSA）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（PBS）、pH 7.4中で2回洗浄し、次に、非特異的エステラーゼでの陽性染色を使用して懸濁液中で計数することになる（Mullink et al., J. Immunol. Methods, 29:133 (1979)）。NSE陽性細胞の割合(%)は、5〜25％で変動した。Ficoll-Paqueで単離された画分中の単球の濃縮は、Percoll勾配遠心分離により得ることになる（Pertoft et al., J. Immunol. Methods 33:22 (1980)）。洗浄後、単球を含有する沈殿を、上述の培地中に再懸濁し、等容量のPercoll 1.063（Pharmacia, Uppsala, Sweden）を注意深く下層に置くことになる。遠心分離（40分、450 g）後、細胞を界面から収集し、培地中で2回洗浄し（10分、500×g）、計数することになる：懸濁液は、今度は70〜95％のNSE陽性細胞を含有した。
【００７０】
わずかな改変を伴う、単球の極性化についてのCianciolo & Snydermanアッセイを、行うことになる（例えば、Tan et al., Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 112:541 (1986)を参照されたい）；0.2×106個の単球を含有する、Percollまたはelecticatorで精製された細胞懸濁液の0.2mlアリコートを、0.05 mLの培地または10 nMの最終濃度に達する培地中のN-ホルミルメチオニル-ロイシル-フェニルアラニン（FMLP）のいずれかを含有する12-75 mmポリプロピレンチューブ（Falcon Labware Division of Becton Dickinson Co., Oxnard, CA）に添加することになる。すべての実験を、二連で実施することになる。チューブを、37℃の水浴中で15分間、インキュベーションすることになる。インキュベーションを、0.25 mlの氷冷した0.05％ PBS（pH 7.2）中の10％ホルムアルデヒドの添加により停止することになる。細胞懸濁液を、通常の光学顕微鏡（倍率250×）を用いた血球計算板における計数まで、4℃で保つことになる。試験は2人によって「盲検的に」読み取られ、各チューブから200個の細胞が計数されることになる。細胞は、以下のいずれかが起きた場合に「極性化した」と考えられることになる：（1）伸長したかまたは三角形の形状、（2）広幅化した膜状仮足、（3）膜の波打ち運動。
【００７１】
極性化した単球の割合(%)を、以下のように算出することになる：
（（極性化した全細胞の割合(%)×100(%)）／（NSE陽性細胞の割合(%)））×100(%)
リンパ球は、このアッセイにおいていかなる極性化活性も呈さないであろう（Cianiolo & Snyderman, J. Clin. Invest. 67:60-68 (1981)）。
【００７２】
単球集団の走化性応答は、FMLPの存在下での極性化した単球の割合(%)から、FMLPの非存在下での極性化した単球の割合(%)を引いたものとして表される。アッセイは、単球の走化性を試験するための迅速な方法であることが証明されており、アッセイの結果は、走化性を測定するための従来のボイデンチャンバーアッセイと十分に相関する（Tan et al., Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 112:541 (1986)）。20％より低い、FMLPにより誘導される極性化の値は、正常でないと考えられることになる。
【００７３】
単球の極性化を阻害する低分子量因子（LMWF）の患者血清中の測定
血清を、静脈穿刺により患者から収集し、生理食塩水中に1:1で希釈することになる。これらの希釈物を、15分間、700 gでの限外濾過に供することになる（「カットオフポイント」の分子量は25 kDになる）。残渣を再懸濁して、さらなる使用まで−70℃で保存することになる。
【００７４】
健康なドナー単球のFMLPにより誘導される極性化を阻害する血清画分の能力を、単球（1×106/ml）を、FMLP単独、または血清画分（最終希釈1:60）と組み合わせたFMLPのいずれかと、15分間、37℃でインキュベーションする段階により、測定することになる。
【００７５】
ドナー単球への血清画分のみの添加は、極性化に影響を及ぼさないであろう。血清画分の添加により引き起こされる、FMLPにより誘導される極性化から自発的な極性化を引いたものの阻害の割合(%)を、算出することになる。
【００７６】
血清LMWFの活性に対する抗PiSEモノクローナル抗体およびチモシンα1のインビトロの効果
この一連の実験において、1人の健康なドナーのエルトリエータで精製された単球（de Boer & Roos,J. Immunol. 136:3447 (1986)）を、指標システムとして使用することになる。簡潔に言うと、単核細胞を、percoll遠心分離（20分、1000 g、室温）を介して450 mlの全血から分離することになる。その後、単核細胞を、エルトリエーション遠心分離システム（JE-6エルトリエーションローターを有するBeckman J21遠心機）中に投入することになる。エルトリエーション培地は、13 mMクエン酸三ナトリウムおよび1 mlあたり5 mgのヒトアルブミンを含むPBSになる。異なる細胞集団を分離するために、流速を20 ml／分で一定に保つことになり、他方、ローター速度を4000から0回転／分に減少させることになる。2500回転／分の画分を収集した。Percoll勾配遠心分離の後、非特異的エステラーゼ活性について陽性であることにより判断した際に、この画分は93〜97％の単球を含有する。単球を、使用まで液体窒素中で保存することになる。
【００７７】
この指標システムで、LMWFのP15E様の特徴を確証することになる。吸着実験を、血清画分を、2種のP15E特異的モノクローナル抗体（下記参照）の組み合わせと1:200の最終希釈において4℃で16時間インキュベーションする段階、その後の、形成された複合体を除去するためのAmicon限外濾過によって実施することになり；この吸着手順を、2回実施することになる（Tan et al., Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 112:541 (1986)およびTan et al., Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 112:942 (1986)）。使用するモノクローナル抗体は、4F5および19F8（抗PI SEアイソタイプIgG2aおよびIgG2b；Genentech Inc., Pharmacological Sciences, South San Francisco, CAのG. J. Cianciolo博士により好意で提供されたもの）の組み合わせになる。対照抗体として、抗ヒトIgGを使用することになる（Tago, Burlingame, CA）。
【００７８】
培養液中に希釈したかまたはチモシン（最終希釈67jug/ml）とインキュベーションした25 kDaより小さい患者血清画分およびモノクローナル抗体との吸着後の血清画分を、単球極性化アッセイにおいて試験することになる。チモシンα1は、単球極性化の増加をもたらすことになる。
【００７９】
本明細書において議論および引用されるすべての刊行物は、全体として参照により本明細書に組み入れられる。開示される発明は、記載される特定の方法論、プロトコル、および材料が変動し得るため、これらに限定されないことが理解される。本明細書において使用される用語は、特定の態様を説明することのみを目的とし、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることになる本発明の範囲を限定するようには意図されないこともまた、理解される。
【００８０】
当業者は、本明細書において記載される本発明の具体的態様に対する多くの等価物を認識するか、または日常的に過ぎない実験法を用いて確認することができるであろう。そのような等価物は、添付の特許請求の範囲により包含されるように意図される。
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【図１】
2015510887.tif 000003
【図２】
2015510887.tif 000004
【配列表】
2015510887000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成26年10月28日(2014.10.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2015510887000001.app
【国際調査報告】
2015510887.tif 000006
2015510887.tif 000007
2015510887.tif 000008