(57)【要約】  治療有効量のアニソメル酸またはその塩を含む、哺乳動物における抗ウイルス性癌治療のための医薬組成物。該医薬組成物は、アニソメル酸またはその塩を、水中油型エマルション中に、例えば、少なくとも１種の油と少なくとも１種の界面活性剤との等方性混合物中に、あるいは親水性の溶媒および共溶媒もしくは界面活性剤またはそれらの混合物中に含むことができる。哺乳動物において癌を治療または予防する方法であって、ｐ５３経路がウイルス性癌タンパク質によって調節解除される方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療有効量のアニソメル酸またはその塩を含む、哺乳動物における抗ウイルス性癌治療で使用するための医薬組成物。
【請求項２】
水性、油性の懸濁剤、分散剤の形態の、注射用液剤もしくは注射用分散剤を即時調製するために使用できる滅菌粉末または無毒性の希釈剤もしくは溶媒中の液剤もしくは懸濁剤としての、アニオソメリック酸（Ａｎｉｏｓｏｍｅｌｉｃ  ａｃｉｄ）またはその塩を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
アニソメル酸またはその塩が、エマルション、好ましくはマイクロエマルションの形態で、例えば微細な水中油型マイクロエマルションの形態で投与されるまたはｉｎ  ｖｉｖｏで提供される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記アニオソメリック酸（Ａｎｉｏｓｏｍｅｌｉｃ  ａｃｉｄ）またはその塩が、少なくとも１種の（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎ）天然もしくは合成油と、界面活性剤あるいは１種もしくは複数の親水性溶媒および共溶媒または界面活性剤とを組み合わせた等方性混合物を好ましくは含む、ｉｎ  ｖｉｖｏでエマルションを形成することが可能な自己マイクロ乳化薬物送達組成物（ｓｅｌｆ−ｍｉｃｒｏｅｍｕｌｓｉｆｙｉｎｇ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）の形態で提供される、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
ｐ５３経路がウイルス性癌タンパク質によって調節解除される、癌または同様の状態を治療または予防するための、請求項１から４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
子宮頸癌を治療または予防するための、請求項１から５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
癌タンパク質および細胞性アポトーシス阻害タンパク質２（ｃＩＡＰ２）を下方制御するための、請求項１から６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項８】
ｐ５３−ｐ２１経路を活性化することによって細胞周期停止を再活性化し、ｐ５３非依存的アポトーシスも誘導する、請求項１から７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項９】
ヒトパピローマ（Ｐａｐｐｉｌｏｍａ）ウイルスに媒介される癌の治療に使用するための、請求項１から８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１０】
性器の良性または腫瘍性のヒトパピローマ（Ｐａｐｐｉｌｏｍａ）ウイルス関連疾患、特にヒトパピローマ（Ｐａｐｐｉｌｏｍａ）ウイルスに媒介される性器疣贅の治療に使用するための、ならびに非性器疣贅の治療に使用するための、医薬組成物。
【請求項１１】
水中油型エマルション中またはその前駆物質中に治療有効量のアニソメル酸またはその塩を含む、医薬組成物。
【請求項１２】
少なくとも１種の油と少なくとも１種の界面活性剤との等方性混合物中に、あるいは親水性溶媒および共溶媒もしくは界面活性剤またはそれらの組み合わせの中に、治療有効量のアニソメル酸またはその塩を含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
撹拌した後に消化管液などの水性媒体で希釈すると微細な水中油型（ｏ／ｗ）マイクロエマルションを形成することが可能な、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
酸化防止剤、共界面活性剤および共溶媒ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、補助剤または添加剤をさらに含む、請求項１１から１３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記エマルションが充填された、軟ゼラチンカプセルまたは硬ゼラチンカプセルの形態で提供される、請求項１１から１４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記組成物の治療的に有効な薬剤が、アニソメル酸もしくはその塩からなるまたは本質的になる、請求項１１から１５のいずれかに医薬組成物。
【請求項１７】
ｐ５３経路がウイルス性癌タンパク質によって調節解除される、哺乳動物において癌または同様の状態を治療するまたは予防する方法であって、治療有効量のアニソメル酸またはその塩を前記哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項１８】
子宮頸癌を治療するまたは予防することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
癌タンパク質および細胞性アポトーシス阻害タンパク質２（ｃＩＡＰ２）を下方制御することを含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
ｐ５３−ｐ２１経路を活性化することによって細胞周期停止を再活性化すること、およびまたｐ５３非依存的アポトーシスも誘導することを含む、請求項１７から１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
ヒトパピローマ（Ｐａｐｐｉｌｏｍａ）ウイルスに媒介される癌を治療することを含む、請求項１７から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
アニソメル酸またはその塩を、１日当たり０．００１ｍｇ／ｋｇから約１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇ体重、特に０．００１から１００ｍｇ／ｋｇ体重、有利には０．０１から５０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で哺乳動物に投与することを含む、請求項１７から２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
性器の良性または腫瘍性のヒトパピローマ（Ｐａｐｐｉｌｏｍａ）ウイルス関連疾患、特にヒトパピローマ（Ｐａｐｐｉｌｏｍａ）ウイルスに媒介される性器疣贅、ならびに非性器疣贅を治療する方法であって、治療有効量のアニソメル酸またはその塩を前記哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項２４】
哺乳動物にアニソメル酸またはその塩を局所的に投与することを含む、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化合物、すなわち、Ａｎｉｓｏｍｅｌｅｓ  ｍａｌａｂａｒｉｃａから単離されたアニソメル酸（ＡＡ）の新規の使用に関する。特に、本発明はアニソメル酸の医薬組成物に関する。本発明はまた、抗ウイルス性癌治療におけるアニソメリック（Ａｎｉｓｏｍｅｌｉｃ）およびその組成物の使用を開示する。
【背景技術】
【０００２】
子宮頸癌は、世界中の女性に影響を与える、二番目に多い悪性腫瘍であり、毎年およそ５００，０００例の新たな症例が診断され、２８０，０００人が死亡している。外科手術および放射線化学療法は、早期癌の女性の８０〜９５％、および局所進行癌の女性の６０％を治癒させることができるが、再発性および転移性の疾患は依然として癌死亡の主な原因である。進行癌および転移癌に対する現在の細胞障害治療の選択肢は比較的低い結果を示しており、奏効率は最大３０％であり、全生存は１０カ月に満たない。従来の療法ではこのように成功の度合いが限られていることから、子宮頸癌に対する他の治療代替法に対する関心が高まっている。
【０００３】
ほとんどの子宮頸癌は、一連の高リスク「発癌性」ヒトパピローマウイルス（ｐａｐｐｉｌｏｍａ）（ＨＰＶ）型に感染することにより引き起こされ、子宮頸癌の９９％以上がＨＰＶ感染によって始まることが現在の通説である。ＨＰＶに持続的に感染すると、様々な程度の子宮頸部異形成およびまた子宮頸癌を続発する。子宮頸癌に関連する主要な高リスク遺伝子型はＨＰＶ１６および１８であり、これら２つは合わせて子宮頸癌の原因のおよそ７０％を占める。
【０００４】
ＨＰＶウイルスゲノムの組み込みならびにＥ６およびＥ７ウイルスタンパク質の発現は、この癌の発生における極めて重要な段階である。Ｅ６タンパク質による栄養監視応答（ｔｒｏｐｈｉｃ  ｓｅｎｔｉｎｅｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）の排除は、幾つかの重要な機序を通して起こる。最も特徴的な機序は、腫瘍抑制因子ｐ５３の不活性化および分解を含む。Ｅ６は、Ｅ６関連タンパク質（Ｅ６−ＡＰ）と呼ばれる細胞タンパク質と複合体を形成することによって、ｐ５３の腫瘍抑制因子機能を弱める。その結果、Ｇ１／ＳおよびＧ２／Ｍ細胞周期チェックポイントが失われ、細胞はゲノム不安定性の影響を受けやすくなり、それによって新生物の発生が可能となり得る。
【０００５】
高リスクＥ６はまたテロメラーゼを活性化するので、テロメアの侵食が防止され、宿主細胞がＤＮＡを損傷することなく何回も分裂し続けることが可能となる。Ｅ６は、ＨＰＶ１６のＥ６によって不死化されたヒト口腔角化細胞および初代ヒト気道上皮細胞において核内因子κＢ（ＮＦ−κＢ）を活性化し、それによってアポトーシス阻害タンパク質２（ＩＡＰ２）の発現が増強されることも報告されている。ｃ−ＩＡＰ２が枯渇すると細胞死に至ることも観察されており、ＨＰＶ１６に誘導されるｃ−ＩＡＰ２の発現は、不死化表現型の維持に必要であることが示唆される。
【０００６】
ＨＰＶ感染で極めて速く発現する第２の遺伝子は、Ｅ７である。Ｅ７タンパク質は、宿主細胞侵入後のウイルスゲノムの維持の中枢であり、最も重要な機能の一つは、細胞タンパク質である網膜芽細胞腫抑制因子（Ｒｂ）ファミリーに対するその結合能である。Ｅ７はｐＲｂに結合し、それをプロテオソーム（ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ）の分解の標的とすることによって、ｐＲｂのリン酸化および不活性化を模倣する。そうなると、Ｅ２Ｆ転写因子は腫瘍細胞を自由にＳ期に移すことができるようになる。Ｅ７は、ｐ２１Ｃｉｐおよびｐ２７Ｋｉｐと相互作用することで、そのサイクリン−ｃｄｋ活性阻害能に干渉し、ひいては細胞周期に干渉する。よって、Ｅ７タンパク質は、ウイルス複製に好適な細胞環境の維持に大きな役割を果たす。
【０００７】
癌の苦痛を治療するまたは改善することができる薬剤の模索が続けられる中で、天然産物は、ますます利用されるようになっている活性化合物を絶え間なく提供している。植物由来の幾つかの化合物は、現在では癌の治療に成功裡に用いられている。
【０００８】
アニソメル酸は、Ｌａｂｉａｔａｅ科に属する薬用植物である、Ａｎｉｓｏｍｅｌｅｓ  ｍａｌａｂａｒｉｃａ（Ｌ．）Ｒ．Ｂｒから単離されるジテルペノイドである。この植物は、一般にマラバーキャットミント（Ｍａｌａｂａｒ  ｃａｔｍｉｎｔ）と呼ばれ、古代医学では、カタル、間欠熱、腸疾患および癌での使用が推奨されている。この植物のエタノール水溶液（５０％）抽出物には抗癌活性があることが示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ａｒｉｓａｗａ，Ｍ．ら、１９８６年。Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｅ  ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃ  ｄｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｄｒｕｇ  「Ｆａｎｇ  Ｆｅｎｇ  Ｃａｏ」；ＩＩ．Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  ｏｖａｔｏｄｉｏｌｉｄｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｔｙ．Ｐｌａｎｔａ  ｍｅｄｉｃａ、（４）、２９７〜９頁。
【非特許文献２】Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｊ．Ａ．＆ＤｅＨｏｆｆ，Ｂ．Ｓ．、１９８７年。Ｃｅｍｂｒａｎｏｌｉｄｅ  ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ。Ａｎｉｓｏｍｅｌｉｃ  ａｃｉｄ。Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、４３（２１）、４８４９〜４８６０頁。
【非特許文献３】Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｊ．Ａ．＆ＤｅＨｏｆｆ、Ｂ．Ｓ．、１９８６年。Ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｍｂｒａｎｏｌｉｄｅ  ｄｉｔｅｒｐｅｎｅ  ａｎｉｓｏｍｅｌｉｃ  ａｃｉｄ。Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２７（４０）、４８７３〜４８７６頁。
【非特許文献４】Ｔｉｕｓ、Ｍ．Ａ、１９８８。Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｃｅｍｂｒａｎｅｓ  ａｎｄ  ｃｅｍｂｒａｎｏｌｉｄｅｓ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、８８（５）、７１９〜７３２頁。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
今までのところ、アニソメル酸それ自体は、抗ウイルス性癌治療に提案されておらず、使用されてもいない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ＡＡがＨＰＶ１６陽性子宮頸癌細胞におけるアポトーシスの誘導に良好な効率を示すという発見に基づいている。ＡＡは、非子宮頸癌細胞ではアポトーシスを有効に誘導せず、非癌性ＭＥＦ細胞でも同様である。
【００１２】
驚いたことに、ＡＡはＥ６およびＥ７のタンパク質レベルの発現を阻害し、よって抗ＨＰＶ剤として作用する能力があることが見出された。
【００１３】
ＡＡは、主に細胞性アポトーシス阻害タンパク質２（ｃＩＡＰ２）を下方制御し、アポトーシス性カスパーゼの内因性活性化をもたらすことによって、ｐ５３非依存性アポトーシスを誘導することも見出された。
【００１４】
ＡＡが、新規な作用機序を有する化合物として、子宮頸癌細胞においてｐ５３に媒介される増殖停止を回復させ、アポトーシスを誘導することが、本発明に関して得られた結果から明らかにされている。
【００１５】
本発明者らの知る限りにおいて、これは、ウイルス性癌タンパク質発現の阻害剤としての、およびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に誘導される癌腫の化学療法剤としてのＡＡの最初の開示である。Ｅ６／Ｅ７癌タンパク質およびｃＩＡＰ２タンパク質の役割は癌において一般的に重要なので、前記化合物およびその誘導体は、抗癌および抗ウイルス療法においてさらに広範に使用することができる。
【００１６】
これらの知見に基づいて、本発明は、ヒトおよび動物を含めた哺乳動物における抗癌療法、特に子宮頸癌で使用するための、アニソメル酸およびその塩の医薬組成物を提供する。
【００１７】
さらに、本発明は、エマルションまたはその前駆物質、特に水中油型マイクロエマルションまたはその前駆物質の形態のアニソメル酸およびその塩の、改良された組成物を提供する。
【００１８】
本発明はまた、任意選択によりｉｎ  ｖｉｖｏで形成されるエマルションの形態のアニソメル酸およびその塩の、抗ウイルス性癌療法における使用、ならびに改良された抗ウイルス性癌療法の方法であって、哺乳動物に有効量のアニソメル酸またはその塩を投与する工程を含む方法を提供する。
【００１９】
より詳細には、本発明による癌の抗ウイルス治療に使用するための医薬組成物は、主に請求項１の特徴部に記載される内容によって特徴付けられる。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態による組成物は、請求項９の特徴部に記載される内容によって特徴付けられ、哺乳動物の対象を治療する方法は、請求項１５の特徴部に記載される内容によって特徴付けられる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】０および４０μＭのアニソルミック酸（Ａｎｉｓｏｌｅｍｉｃ  ａｃｉｄ）（ＡＡ）で処理した細胞の４８時間の時点での代表的な位相差顕微鏡の画像を示す図である。
【図１Ｂ】増大する用量範囲でのＡＡによるカスパーゼ−３の活性化を示す図である。
【図１Ｃ】高用量のＡＡがネクローシス性細胞死を与えないことを示す図である。
【図１Ｄ】ＨＰＶ陽性ＨｅＬａ細胞およびＣａｓｋｉ細胞（ｐ５３＋）におけるＡＡの効果（この細胞ではＡＡはアポトーシスを誘導する）およびＨＰＶ陰性ｃ３３ａ細胞（ｐ５３−）における効果（この細胞ではアポトーシス誘導は極めて少ない）を示す図である。
【図１Ｅ】乳癌細胞であるＭＣＦ７細胞（ｐ５３＋）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ｐ５３−）においてＡＡが有効なアポトーシスを誘導しなかったことを示す図である。
【図１Ｆ】非癌性ＭＥＦ細胞においてＡＡが４０μＭで細胞死を誘導しなかったことを示す図である。
【図２Ａ】ＡＡが、プロカスパーゼ８、９、３、およびカスパーゼ−３の基質であるポリ−ＡＤＰ−リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の切断を誘導することを明示する図である。
【図２Ｂ】２０〜４０μＭのＡＡに応答してミトコンドリア膜脱分極が時間依存的に起こることを示す図である。
【図３Ａ】ｐ５３がＡＡ処理に応答して用量および時間依存的に有意に安定化することを示す図である。同時に、Ｅ６ウイルスタンパク質が下方制御された。同様に、Ｅ７タンパク質の発現も１２時間のＡＡ処理後に下方制御されたが、ｐ２１タンパク質の明白な誘導は、２０μＭのＡＡで２４時間後しか見られなかった。一方、４０μＭのＡＡはｐ２１の発現を誘導しなかった。
【図３Ｂ】ＡＡで処理した、またはしていない同期化細胞の細胞周期分析を明示する図である。ＡＡは、処理２４時間後に細胞をＧ２／Ｍ期に蓄積させる。Ｇ２／Ｍ停止は、ＡＡ用量２０μＭでより有効に生じ、それは観察されたｐ２１の誘導と一致していた。
【図４Ａ】ＡＡに誘導されるアポトーシスおよび細胞周期停止におけるｐ５３の有意性を示す図である（ｐ５３の発現はｐ５３−ｓｈＲＮＡを使用して下方制御された）。ｐ５３およびｐ２１のウエスタンブロット分析により、２０μＭのＡＡによるこれらのタンパク質の誘導が、ｐ５３が下方制御された細胞では抑止されたことが明らかになった。
【図４Ｂ】処理の開始から２４時間後に細胞がもはやＧ２／Ｍ期で蓄積しなかったので、ｐ５３がないとＡＡに誘導される細胞周期停止が逆戻りすることを確認する図である。
【図４Ｃ】ｐ５３の発現がなくても、４０μＭのＡＡで処理するとカスパーゼ−９、カスパーゼ−３およびＰＡＲＰが切断されたので、ｓｈＲＮＡによってｐ５３タンパク質が抑制されていてもＡＡに誘導されるアポトーシスが阻害されないことを示す図である。
【図４Ｄ】ｐ５３が存在しない場合にアポトーシス細胞の割合（％）の有意な減少がなかったことを示す図である。
【図４Ｅ】ＡＡ処理によるｃＩＡＰ２タンパク質レベルの下方制御を示す図である。
【図４Ｆ】ＡＡに媒介されるＥ６およびｃＩＡＰ２タンパク質の下方制御がプロテアソーム経路によって媒介されることを示す図である（細胞がプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２で処理されたとき、Ｅ６およびｃＩＡＰ２タンパク質の分解が阻害された）。
【図５Ａ】Ｅ６をトランスフェクトしたｃ３３ａ細胞において、ＡＡ処理によるカスパーゼ３及びＰＡＲＰの切断が阻害されることを示す図である。
【図５Ｂ】Ｅ６をトランスフェクトしたｃ３３ａ細胞において、誘導されるアポトーシスの割合を示す図である。
【図６】提示するＡＡ作用機序モデルの概略を示す図である。
【図７】４０μＭのＡＡおよびＡＡエマルションによる２４時間および４８時間でのカスパーゼ−３の活性化を示す図である。
【図８】ＣＡＭに移植されたＳｉＨａ腫瘍におけるＡＡエマルションの効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本研究の手段によって多大な利点が得られる。
【００２３】
本発明は、アニソメル酸が既にそれ自体で、子宮頸癌に発現するＨＰＶ１６−Ｅ６およびＥ７癌タンパク質の有効な阻害剤であることを開示するものである。アニソメル酸は子宮頸癌細胞において細胞周期停止とアポトーシスの両方を誘導することから、癌細胞増殖を停止させ、癌細胞を死滅させるための薬物としてそれを使用することもできると見込まれる。ｐ５３に非依存的にアポトーシスを誘導するアニソメル酸の能力は、ｐ５３変異型またはｐ５３欠損型の癌の治療にそれを使用する上での利点となる。アニソメル酸の商業的用途は、さらに皮膚疣贅および性器疣贅などの他のＨＰＶ関連感染症の治療にも広がる可能性がある。
【００２４】
好ましい一実施形態では、アニソメル酸はエマルションの形態で使用される。エマルションの形態で、または投与したときもしくはｉｎ  ｖｉｖｏでエマルションを形成する混合物の形態で医薬組成物を調製することによって、アニソメル酸の溶解性および送達を向上させることができ、よって化合物の治療上の使用量を増大させることができることが、本発明に関して得られた結果から示されている。
【００２５】
よって、以降でより詳細に論じるように、エマルションの形態のアニソメル酸を、ＳｉＨａ細胞において２４時間および４８時間の時点でアポトーシスを誘導するその効果について試験した。アニソメル酸に誘導されるアポトーシスは、アニソメル酸のみの場合と比較して極めて効率的であることが観察された。アニソメル酸エマルションによる２４時間および４８時間でのアポトーシス誘導は、アニソメル酸より高かった。アニソメル酸エマルションによって誘導されるアポトーシスの最大の割合（％）は２４時間で実現されたが、一方アニソメル酸の場合は４８時間かかる。これは、アニソメル酸エマルションが薬物の生物学的利用率および細胞内への薬物の効率的な移送を向上させ、その結果２４時間だけでアポトーシスの割合（％）が増大したということを明らかに示している。エマルションは、それ自体では細胞に対して毒性がなかった。
【００２６】
ＣＡＭに接種された腫瘍を、エマルションのみまたはアニソメル酸エマルションで、５日間様々な濃度で局所的に処理した。その結果は、アニソメル酸エマルションで処理すると腫瘍が発生せず、それが抑制されたことを示している。これは、代替のｉｎ  ｖｉｖｏ  ＣＡＭモデルにおけるアニソメル酸エマルションに関する効力の良い証拠となる。
【００２７】
次に、添付の図面を参照する詳細な説明の下で新規技術をさらに詳しく検討する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
上で論じたように、本発明は、アニソメル酸およびその塩がウイルス性癌タンパク質Ｅ６およびＥ７の下方制御に効率的であり、特にそれらがｐ５３依存性の細胞周期停止およびｃＩＡＰ２の下方制御によるｐ５３非依存性アポトーシスも誘導するという発見に基づいている。
特に、ＡＡは、ＨＰＶ１６陽性子宮頸癌細胞におけるアポトーシスの誘導に４０μＭで良好な効率を示す一方で、非子宮頸癌細胞においてはアポトーシスを有効に誘導せず、非癌性ＭＥＦ細胞においても同様である。
【００２９】
アニソメル酸（およびその塩）は、エマルションとして調製されるとさらに一層有効である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方から得られた結果はこの結論を裏付けている。
【００３０】
本発明の範囲内で、略語「ＡＡ」はアニソメル酸を表す。アニソメル酸は、以下の一般式Ｉを有する。
【００３１】
【化１】
2015530381.tif 000002
そのＣＡＳ番号は５９６３２−７６−７である。
【００３２】
アニソメル酸の医薬として許容される塩および同様の活性を有するアニソメル酸の任意の誘導体も概念に含まれており、適当な場合には略語「ＡＡ」が適用される。ＡＡのラセミ化合物のみならず光学異性体およびその誘導体も本明細書に含まれる。
【００３３】
本明細書で使用される場合、用語「医薬として許容される塩」は、アニソメル酸の塩または双性イオンの形態を指す。アニソメル酸の塩は、例えば、酸の単離および精製の間に調製されてもよく、または酸を適切な陽イオンを有する化合物と反応させることによって別々に調製されてもよい。適切な医薬として許容される陽イオンには、アルカリ金属（例えば、ナトリウムまたはカリウム）およびアルカリ土類金属（例えば、カルシウムまたはマグネシウム）陽イオンが含まれる。
【００３４】
本技術の目的のために、アニソメル酸は、本質的に純粋な形態、すなわち、（医薬組成物の活性成分の）重量で少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、有利には少なくとも９５％、適切には少なくとも９８％、特に少なくとも９９．５％、またはさらには９９．９５％の純度で使用される。ＡＡは、前記化合物を含有する天然の原料の抽出によって得ても、または合成化合物として使用されてもよく、後者が特に好ましい。ＡＡを提供する幾つかの代替方法を以下に論じる。
【００３５】
ＡＡそれ自体は、例えば、Ａ．ｍａｌａｂａｒｉｃａ、Ａ．ｉｎｄｉｃａ、またはＡ．ｏｖａｔａから単離する方法によって得ることができる。よって、一実施形態では、Ａｒｉｓａｗａら、１９８６年によって記載される方法を用いることができる。すなわち、植物全体を日陰で干し、粉末にし、ソックスレー抽出器内で９０％メタノールで抽出し、次いで真空乾燥する。このメタノール粗抽出物をクロロホルムと水に分配した。クロロホルム層を濃縮し、９０％メタノールと石油エーテルに分配した。９０％エタノール抽出物を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけると、様々な化合物が得られることとなり、そのうちの一つがアニソメル酸である。それは無色の結晶角柱として得られ、融点は約１４８〜１５０℃であり、分子式はＣ２０Ｈ２６Ｏ４である。
【００３６】
Ｍａｒｓｈａｌｌのｄｌ−アニソメル酸合成（Ｍａｒｓｈａｌｌ＆ＤｅＨｏｆｆ  １９８７；Ｍａｒｓｈａｌｌ＆ＤｅＨｏｆｆ  １９８６）は、２−選択的ホーナー−エモンズ縮合を主要な環化工程に利用する。
【００３７】
【化２】
2015530381.tif 000003
Ｔｉｕｓ  １９８８
【００３８】
１１６中の末端アルケン結合をジシアミルボラン、続いて塩基性過酸化物を用いて選択的ヒドロホウ素化を行うとアルコールが得られ、それを、イミダゾールの存在下でヨウ素およびトリフェニルホスフィンを用いて対応するヨウ化物に変換する。ヨウ化物をメチル（ジメチルホスフィノ）アセテートのナトリウム塩で置換すると１１８を収率８５％で生じる。１１８のシリルエーテルの切断をメタノール性ピリジニウムトシレートとの還流で行う。スワーン酸化によってアルデヒド１１９が得られる。最初に、分子内のホーナー−エモンズ反応を、ＤＭＥ中、１８−クラウン−６エーテルの存在下で水素化ナトリウムを用いて行った。この反応の成功は、条件に大きく依存することが見出された。Ｍａｓａｍｕｎｅ−Ｒｏｕｓｈの条件を使用することで、７１％（Ｚ／Ｅ＝９５／５１の収率が達成される。ピリジニウムトシレート（ＰＰＴＳ）水溶液で環状アセタール加水分解を行い、続いてＰＣＣで酸化すると、ラクトンエステル１２０が収率７０％で得られる。この化合物をｄｌ−アニソメル酸に変換する。１２０が２種の幾何異性体として得られるのは興味深い。１１５、１１２、および１１０に観察されるものとは反対である、その選択性の理由は論じられていない。安定化されたウィッティヒ試薬のアルデヒドとの反応からの生成物のＥ／Ｚ比に、溶媒効果が強い影響を及ぼすことが見出されたことは注目に値する。
【００３９】
ＡＡで処理すると、ウイルス性癌タンパク質および細胞性アポトーシス阻害タンパク質２（ｃＩＡＰ２）を下方制御することによって、ＨＰＶ陽性子宮頸癌細胞において効率的なアポトーシスをもたらす。こうした事象は、すべてアポトーシス細胞死の典型的な特徴である、ミトコンドリア膜脱分極ならびにカスパーゼ−９、カスパーゼ−３およびＰＡＲＰの切断に先立って起こる。
【００４０】
本発明者らの知識の及ぶ限りでは、これは、ＳｉＨａ子宮頸癌細胞においてＡＡに誘導されるアポトーシスの背後の分子機序の直接的な実験的証拠を提供する最初の報告である。よって、この結果は、抗腫瘍剤としてのその新規な使用に加えて、アニソメル酸の可能性のある分子機序への新規な洞察をもたらす。
【００４１】
ウイルスタンパク質Ｅ６およびＥ７に対する療法による細胞周期停止の回復は、一実施形態では有効で実用的な手法となる。細胞分裂は妨げられる。これにより、ＡＡにはｐ５３に非依存的にアポトーシスを誘導する能力があり、その能力はｐ５３が変異したまたはｐ５３が欠損した癌に対する抗癌療法に利点をもたらす可能性があるということも認識される。要するに、この結果は、アニソメル酸を抗子宮頸癌および抗ＨＰＶ化合物として使用することの正当な理由となる。
【００４２】
本発明は、癌を治療するための治療用途であって、ＡＡ、特に単離された形態または単離され精製された形態のＡＡを含む治療用途を提供する。
【００４３】
アニソメル酸は、ＤＭＳＯおよび熱エタノールに溶解する疎水性の化合物であり、水または他の水性溶媒には大抵の場合不溶性である。薬物が水に難溶性であると、生物学的利用率の低さ、個体内／個体間での変動の大きさ、および用量比例性の欠如につながるために、それは深刻な懸念事項である。それ故に、薬物を経口的におよびまた他の手段によって、そのいずれにおいても成功裡に送達するために、溶解性を向上させることが必要である。
【００４４】
本発明は、この目的のために、固体分散体、逆溶剤、シクロデキストリンと脂質ベースの配合物の複合体形成のような様々な手法を提供する。様々な脂質ベースのエマルション送達システムが存在し、それらのうちの一つは自己マイクロ乳化薬物送達システム（ｓｅｌｆ−ｍｉｃｒｏｅｍｕｌｓｉｆｙｉｎｇ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ）（ＳＭＥＤＤＳ）である。ＳＭＥＤＤＳは、穏やかに撹拌した後に消化管液などの水性媒体で希釈すると微細な水中油型（ｏ／ｗ）マイクロエマルションを形成するという独特の能力を有する、天然もしくは合成油、固体もしくは液体界面活性剤、あるいは１種もしくは複数の親水性溶媒および共溶媒／界面活性剤の等方性混合物として定義される。
【００４５】
ＳＭＥＤＤＳは消化管中に容易に広がり、胃および腸の消化運動が自己乳化に必要な撹拌をもたらす。
【００４６】
ＳＭＥＤＤＳ混合物は、軟ゼラチンカプセルまたは硬ゼラチンカプセルのいずれかに充填することができる。本発明によるＳＭＥＤＤＳ配合物は、油、界面活性剤および必要に応じて酸化防止剤を含む。共界面活性剤および共溶媒を添加して、配合物の特性を向上させてもよい。アニソメル酸エマルションを調製し、アポトーシスを誘導するその効力について試験する。
【００４７】
よって、一実施形態では、アニソメル酸を熱エタノールに溶解して混合物を形成し、それを、界面活性剤、または界面活性剤、ポリ（エチレングリコール）および油の混合物に溶解する。液体構成成分間の比率は、アルコール１重量部対混合物（界面活性剤、ＰＥＧおよび油から形成された混合物）１００重量部から、アルコール１００重量部対混合物１重量部までの間で変動してもよい。好ましくは、該比率はアルコール約１重量部対混合物５重量部〜アルコール５重量部対混合物１重量部、例えば、先に示した順で構成成分の約１〜２重量部対０．５から１重量部である。
【００４８】
化合物の化学的性質を考えると、ＡＡはよく知られた抗腫瘍剤であるパクリタキセルのようなジテルペノイドなので、ＡＡは局所的、非経口的、腹腔内または静脈内に投与することができる。ＡＡエマルションは、経口的に投与することができる。
【００４９】
活性構成成分は、有効量で使用される。投与経路、投与量のみならず正確な配合も、対象の状態に応じて選択される。よって、所望の治療効果を得て維持するのに十分なレベルの活性化合物を血漿中にもたらすために、個別に間隔を調整することができる。しかしながら、一般に、ヒトに用いられる用量は、典型的には１日当たり０．００１ｍｇ／ｋｇから約１０００ｍｇ／ｋｇの範囲内、好ましくは阻害剤の用量当たり約０．１ｍｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇの範囲内である。典型的には、ＡＡは、０．００１から１００ｍｇ／ｋｇ体重で、例えば０．０１から５０ｍｇ／ｋｇ体重で投与される。幾つかの実施形態では、ＡＡは、約０．１から約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．５から約４０ｍｇ／ｋｇまたは約０．７から約３０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で用いることができる。企図される具体的な用量には、前述の範囲のいずれかの部分範囲が０．１ｍｇ／ｋｇ刻みで含まれる。
【００５０】
医薬組成物は、治療的に効率的な主構成成分（または薬剤）または単一構成成分（または薬剤）のいずれかとしてＡＡを含むこととなろう。したがって、本技術の範囲内において、有効な薬剤がアニソメル酸およびその塩からなるまたは本質的になる組成物も提供される。当然のことながら、ＡＡを他の抗腫瘍形成化合物（例えばチロシンキナーゼ阻害剤、例えばパゾパニブ）および血管新生剤（例えば血管内皮増殖因子阻害剤、例えばベバシズマブ）と併用することが可能である。
【００５１】
医薬組成物は、任意の適切な形態であってもよい。典型的な医薬品形態には、水性、油性の懸濁剤、分散剤、ならびに注射用液剤または注射用分散剤を即時調製するために使用できる滅菌粉末が含まれる。それは、例えば、膣内用クリームの形態で、または持続放出固体調製物、例えば徐放性の医薬用貼付剤を施用することによって、局所（例えば膣内）投与用に使用することができる。組成物はまた、無毒性の希釈剤または溶剤中の液剤または懸濁剤であってもよく、例えば１，３−ブタンジオール中溶液として存在してもよい。あるいは、それらはマイクロエマルションとして調製され、例えば経口で投与されてもよい。
【００５２】
担体は、例えば、水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液状ポリエチレングリコールなど）、エタノール、および示した構成成分の混合物、様々な植物油、リンゲル液（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ  ｏｌｕｔｉｏｎ）ならびに等張食塩水を含有する溶媒または分散媒であってもよい。加えて、不揮発性油を溶媒または懸濁媒として用いてもよい。用いることができる不揮発性油には、合成モノグリセリドまたはジグリセリドが含まれる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は、注射剤の調製に用途が見出される。
【００５３】
従来通りに、医薬組成物は、組成物の、例えば、ｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解もしくは放出速度、吸着または浸透を改変する、維持するまたは保持するための配合材料を含有してもよい。
【００５４】
医薬組成物を、吸入用または経口などの消化管を介する送達用に選択することもできる。医薬として許容されるかかる組成物の調製は、当該分野の技術の範囲内である。ＡＡは、同一の医薬組成物に存在してもよい。それらはまた、例えば同一の包装品で供給される、異なる医薬組成物に含まれてもよい。
【００５５】
上の説明は主にヒト対象に関するものであるが、獣医学的に使用するための医薬組成物も本明細書に含まれる。
【００５６】
以下の非限定的な例は、本発明の一実施形態を例示する。
【実施例】
【００５７】
以降に提示する実験結果は、ＡＡが、ＳｉＨａ  ＨＰＶ１６陽性子宮頸癌細胞においてウイルス性癌タンパク質Ｅ６／Ｅ７および細胞性アポトーシス阻害タンパク質２（ｃＩＡＰ２）を枯渇させ、それによってアポトーシスを誘導することを明示する。ＡＡはまたｐ５３−ｐ２１経路を活性化し、Ｇ２／Ｍ細胞周期停止をもたらす。
【００５８】
この結果は、ＡＡエマルションが、ＡＡのみと比較して、より早い時点でより効率的にアポトーシスを誘導したことを示している。ＡＡエマルションは、ＣＡＭモデルにおいて腫瘍の増殖を抑制するのにも効率的であった。
【００５９】
哺乳動物モデルは、新規な薬物送達システム（ＤＤＳ）の前臨床的評価によく使用される。しかし、妥当な哺乳動物モデルは高価であり、時間がかかり、設定および評価が容易ではない。さらに、それらは倫理的および法的な面に関する事務的負担につながることが多い。それ故に、本発明者らは、ＤＤＳを評価するために哺乳動物モデルの代替として絨毛尿膜（ＣＡＭ）を使用する。ＣＡＭの特徴、すなわち胚の解剖学的形態および血液を調査して、薬物担体の性質、例えば、毒性および生体適合性、ならびに薬物の活性、毒性、生体内分布および薬物動態を評価した。鶏胚を用いて行うことができる様々なアッセイが簡単で速く、低コストであることから、製剤技術研究に日常的にこのモデルを使用することへの関心が高まっている。
【００６０】
絨毛尿膜はすべてのタイプの腫瘍細胞に優れた天然の基質を提供する。薬物送達システムを開発する間に、鶏胚（ｃｈｉｃｋ  ｅｍｂｒｏｙ）を使用して、ＣＡＭおよびＣＡＭに移植した腫瘍の両方について薬物の活性または毒性を評価することができる。ヒトへの薬物の投与経路、すなわち、局所、静脈内（ＩＶ）、および腹腔内（ＩＰ）投与を、鶏胚（ｃｈｉｃｋ  ｅｍｂｒｏｙ）で使用することができる。鶏胚でのアッセイは低コストで簡単なので、このモデルにより、哺乳動物モデルを使用する前に薬物送達システムのハイスループットスクリーニングを行うことが可能である。天然のままで免疫が不十分なので、鶏胚は、薬物送達システムを評価するための代替モデルシステムを代表するものである。ＣＡＭにおけるＳｉＨａ腫瘍細胞の増殖は既に十分に確立されており、腫瘍を局所的に５日間処理することによってＡＡエマルションの効力を試験した。
【００６１】
材料および方法
ＡＡを、Ａｎｉｓｏｍｅｌｅｓ  ｍａｌａｂａｒｉｃａから、Ａｒｉｓａｗａら、１９８６年によって以前に記載されたように、わずかに改変して単離した。１００ｍＭの原液をＤＭＳＯ中室温で調製した。
【００６２】
ＳｉＨａ、ＨｅＬａ、Ｃａｓｋｉおよびｃ３３ａ子宮頸癌細胞およびマウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）をＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）中で培養した。ＭＣＦ７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞をＲＰＭＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中で培養した。培地に、１０％ウシ胎児血清（ＢｉｏＣｌｅａｒ、ウィルトシャー、ＵＫ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（ｐｅｎｃｉｌｉｉｎ）、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補給した。
【００６３】
細胞死およびミトコンドリアの脱分極の評価
ＳｉＨａ細胞を、０〜５０μＭのＡＡまたは溶媒対照で、１０μＭの間隔で処理した。本発明者らの予備的研究では５０μＭで≧９５％が死滅することが示されたので（ＭＴＴ細胞毒性アッセイ、未発表データ）、用量範囲を５０μＭまでに限定した。４８時間後に、細胞を収集し、アポトーシスおよび／またはネクローシスについて分析した。細胞中の活性化カスパーゼ−３を、製造業者のプロトコル（ＰＥ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｃａｓｐａｓｅ−３  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｋｉｔ；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、サンディエゴ、ＣＡ）に従ってフィコエリトリン結合抗体で標識し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＦＬ−２、ＦＳＣ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）によって分析した。
【００６４】
ＳｉＨａ細胞を、４０μＭのＡＡおよびＡＡエマルションでも２４時間および４８時間試験した。細胞を収集し、ＦＡＣＳによるＰＥ活性カスパーゼ−３アッセイを採用してアポトーシスについて分析した。
【００６５】
透過性（ネクローシス）細胞を検出するために、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳ中５０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に室温で１０分間再懸濁させた。試料をフローサイトメトリーによって分析した。
【００６６】
テトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、セルジーポントワーズ、フランス）を２０ｍＭジメチルスルホキシド原液として保存し、使用前に培地で希釈した。細胞を２０ｎＭテトラメチルローダミン中で１０分間、３７℃の水浴でインキュベートした。細胞を氷の上に置き、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリーによって直ちに分析した。
【００６７】
ＨｅＬａ、Ｃａｓｋｉ、ｃ３３ａ、ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＥＦ細胞を、０および４０μＭのＡＡで処理した。４８時間後に細胞を収集し、アポトーシスについて分析した。
【００６８】
細胞周期分析
細胞を４８時間の血清飢餓（１％血清）によって同期化し、次いで１０％ＦＣＳを含有する培地で２４時間培養した。この後、細胞を０、２０および４０μＭのＡＡと２４の間インキュベートした。これらの用量を選択した理由は、アポトーシス誘導が４０μＭで最大であったからである（以降の研究では用量を４０μＭまでに限定した）。細胞を収集し、破壊し、クエン酸ナトリウム緩衝液［４０ｍＭクエン酸Ｎａ、０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５０μｇ／ｍｌ  ＰＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）］中に再懸濁させることによってＤＮＡ含有量のために核をＰＩで標識した。室温で１０分間のインキュベーション後に、試料をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリーによって直ちに分析した。
【００６９】
ＲＮＡ干渉
ヒトｐ５３を標的とするｓｈＲＮＡ（５’ＧＡＣＵＣＣＡＧＵＧＧＵＡＡＵＣＵＡＣＵＵＣＡＡＧＡＧＡＧＵＡＧＡＵＵＡＣＣＡＣＵＧＧＡＧＵＣＵＵ３’、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら、２００２年）を発現させるためのｐＳＵＰＥＲベクター（Ｏｌｉｇｏｅｎｇｉｎｅ、シアトル、ＷＡ、ＵＳＡ）はＰｉａ  Ｒｏｏｓ−Ｍａｔｔｊｕｓ博士に提供していただいた。スクランブル（Ｓｃｒ）ｐＳＵＰＥＲベクター（５’ＧＣＧ  ＣＧＣ  ＴＴＴ  ＧＴＡ  ＧＧＡ  ＴＴＣ  Ｇ３’、Ｏｓｔｌｉｎｇら、２００７年）を対照細胞にトランスフェクトした。トリプシン処理したＳｉＨａ細胞に、ｓｈＲＮＡ発現プラスミドをＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）中で電気穿孔法を行うことによりトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後に培養培地を変え、細胞をＡＡで処理するか未処理のままとし、その後細胞をさらに２４時間または４８時間培養した。ｓｈＲＮＡ発現ベクターの効率をｐ５３発現についてウエスタンブロット法により決定した。
【００７０】
プラスミドトランスフェクション
ｃ３３ａ細胞をペレットにし、ＯＰＴＩＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、ワシントンＤＣ、ＵＳＡ）に再懸濁させ、偽のまたはＨｉｓタグＥ６プラスミドを用いて２２０Ｖおよび９７５μＦで電気穿孔処理した。トランスフェクションから２４時間後に、培養培地を変え、細胞をＡＡで処理するか未処理のままとし、その後細胞をさらに２４時間または４８時間培養し、ウエスタンブロット法を採用するさらなる分析およびＦＡＣＳによる細胞死アッセイを行った。
【００７１】
ウエスタンブロット法
細胞をＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（Ｌａｅｍｍｌｉ、１９７０年）に溶解することによって全細胞溶解物を調製し、その試料を１０分間煮沸し、その後タンパク質を１２．５〜１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。ウエスタンブロット法を、以下に対する抗体を使用して行った：ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ｃｌｏｎｅ  Ｃ−２−１０；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｂｉｄ、Ｂａｘ、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ３、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ、Ｐｈｏｓｐｈｏ  ＳＡＰＫ／ＪＮＫ（Ｔｈｒ１８３／Ｔｙｒ１８５）、ｃＩＡＰ２（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ａｋｔ、Ｐｈｏｓｐｈｏ  Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ダバース（Ｄａｖｅｒｓ）、ＭＡ、ＵＳＡ）、ｐ２１、Ｂｃｌ−ｘＬ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ、サンタクルーズ、ＣＡ）、β−アクチン（ｃｌｏｎｅ  ＡＣ−４０；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびｐ５３（ｃｌｏｎｅ  ＤＯ−１；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体を、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（バーミンガム、ＡＬ）、Ｐｒｏｍｅｇａ（マディソン、ＷＩ）およびＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（フライブルグ、ドイツ）から得た。結果を、ＥＣＬ法（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＸ線フィルム上に可視化した。提示したウエスタンブロットの結果は、少なくとも３回の独立した実験のうち代表的なものである。
【００７２】
ＡＡエマルションの調製
アニソメル酸を熱エタノールに溶解し、この混合物をＴｗｅｅｎ  ３０：ＰＥＧ４００：オリーブ油中に４：１：１：１の比率（ｒａｔｉｏｎ）で溶解した。
【００７３】
ＣＡＭ腫瘍におけるＡＡエマルションの試験
２百万個のＳｉＨａ細胞をＭａｔｒｉｇｅｌに１：１の比率で混合し、この混合物を胚発生８日目のＣＡＭ膜に移植した。腫瘍を有するＣＡＭを、癌細胞接種から１日後から連続５日まで、エタノール（対照）、ＡＡを含むまたは含まないエマルションで処理した。５日間の薬物処理後に、腫瘍を撮影した。
【００７４】
結果
前に報告したＡＡの細胞毒性の根底にある機序を検討するために、培養したＳｉＨａ子宮頸癌細胞のアポトーシス死をＡＡが誘導するかどうかを調査した。ＡＡに誘導される細胞死の代表的な位相差画像を図１Ａに示す。次いで、細胞を０〜５０μＭのＡＡと２４時間および４８時間インキュベートし、アポトーシスの尺度として、活性化カスパーゼ−３を含有する細胞の割合（％）を決定した。４０μＭのＡＡで４８時間後にカスパーゼ−３の著しい活性化が観察された（図１Ｂ）。４０μＭのＡＡで処理する前に、ＳｉＨａ細胞を４０μＭのＺ−ＶＡＤ．ｆｍｋ（広範なカスパーゼの阻害剤）とプレインキュベートすると、カスパーゼ−３の活性化およびアポトーシス細胞の形態が逆戻りしたことから、ＡＡに誘導される細胞死におけるカスパーゼの役割が確認された（データは割愛する）。興味深いことに、ＡＡの用量が４０μＭより多くなると、カスパーゼ−３の切断が劇的に減少した（図１Ｂ）。こうしたより高い用量範囲において細胞の透過化の増大をＰＩ標識によって検出することができなかったので（図１Ｃ）、恐らくＡＡがネクローシス性細胞死を誘導することはないと思われ、カスパーゼ非依存性細胞死または細胞老化をトリガーすることもできないと思われる。アポトーシスの最良の誘導が４０μＭのＡＡで得られたために、さらなる研究を０〜４０μＭのＡＡに限定した。
【００７５】
他の子宮頸癌および乳癌細胞株におけるＡＡの効果も０および４０μＭで試験した。図１Ｄに見られるように、ＡＡはＨＰＶ陽性ＨｅＬａ細胞およびＣａｓｋｉ細胞（ｐ５３＋）においてアポトーシスを有効に誘導したが、一方、ＨＰＶ陰性ｃ３３ａ細胞（ｐ５３−）におけるアポトーシス誘導は有意に少なかった。ＡＡは、乳癌細胞ＭＣＦ７細胞（ｐ５３＋）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ｐ５３−）細胞においても有効なアポトーシスを誘導しなかった（図１Ｅ）。ＡＡは、非癌性ＭＥＦ細胞においても４０μＭで細胞死を誘導しなかった（図１Ｆ）。
【００７６】
観察されたアポトーシスの実行経路を調査するために、ＡＡが、内因性アポトーシスシグナル伝達経路の良い活性化マーカーであるミトコンドリア膜脱分極も促進するかどうかを検討した。ミトコンドリア膜の極性は、テトラメチルローダミン（ＴＭＲＭ）標識によってＡＡ処理の開始から８〜４８時間後に評価した。実際に、２０〜４０μＭのＡＡに応答してミトコンドリア脱分極が時間依存的に生じた（図２Ａ）。ＡＡで処理したＳｉＨａ細胞の溶解物を、カスパーゼ−９、カスパーゼ−８、カスパーゼ−３およびＰＡＲＰの切断について分析した。プロカスパーゼ−９が３５／３７ｋＤａの断片に切断されたことが、２０および４０μＭのＡＡと１２時間インキュベートした後に見られた（図２Ｂ）。細胞死受容体に関連するカスパーゼであるプロカスパーゼ−８の切断はその後で起こった。それは、カスパーゼ−８が切断された断片が豊富に観察されたのは、ＡＡ処理の２４時間後のみだったからである（図２Ｂ）。これらの結果により、ＡＡは主に、カスパーゼ−９の活性化を伴う、内因性であるアポトーシスのミトコンドリア経路を活性化することが示唆される。２０〜４０μＭのＡＡで処理すると、カスパーゼ−３およびカスパーゼ−３の基質であるポリ−ＡＤＰ−リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の切断も誘導された（図２Ｂ）。総じて、これらの結果により、２０〜４０μＭの用量範囲内のＡＡは、カスパーゼ−９およびカスパーゼ−３の活性化を通してアポトーシスを誘導することが明示される。
【００７７】
ＳｉＨａ子宮頸癌細胞は、高リスクヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）によって形質転換されている。Ｅ６およびＥ７は、ＳｉＨａ細胞の形質転換にこのような極めて重要な役目を果たしているので、これらのウイルスタンパク質ならびにｐ５３およびｐ２１の発現を検討した。実際に、Ｅ６ウイルスタンパク質が下方制御され、それに対応してｐ５３タンパク質が安定化した（図３Ａ）。同様に、Ｅ７タンパク質の発現もＡＡ処理１２時間後に下方制御されたが、ｐ２１タンパク質の明らかな誘導は２０μＭのＡＡで２４時間後にのみ見られた（図３Ａ）。それに対して４０μＭのＡＡはｐ２１の発現を誘導しなかったことから、低用量のＡＡが、ｐ５３応答性遺伝子の１つであるｐ２１を誘導することが示される。同様の結果が他の研究において得られ、ｐ５３の細胞応答および標的が侵襲物の用量によって異なることを示している。これらの結果により、ＡＡにはＥ６およびＥ７ウイルスタンパク質の分解を有効に誘導する能力があり、それによって、ｐ５３およびｐ２１をＥ６およびＥ７の阻害からそれぞれ解放することができることが明示される。ｐ５３に及ぼすこのような顕著な効果は、細胞周期停止に反映されることが期待される。実際に、同期化し、ＡＡで処理した細胞を細胞周期分析すると、処理２４時間後にＧ２／Ｍ期に蓄積していた（図３Ｂ）。Ｇ２／Ｍ停止は、ＡＡ用量２０μＭでより有効に生じ、それは観察されたｐ２１の誘導と一致していた（図３Ａおよび３Ｂ）。
【００７８】
細胞周期の調節における役割に加えて、ｐ５３は、内因性と外因性の両方のアポトーシス経路のメンバーである、アポトーシス促進性の標的遺伝子の転写活性化を通してアポトーシスを促進する。ＡＡに誘導されるアポトーシスの誘導および細胞周期停止におけるｐ５３の有意性を評価するために、ｐ５３−ｓｈＲＮＡを使用してｐ５３の発現を下方制御した。ｐ５３およびｐ２１のウエスタンブロット分析により、４０μＭおよび２０μＭのＡＡによるこれらのタンパク質の誘導は、ｐ５３が下方制御された細胞においてそれぞれ抑止されたことが明示された（図４Ａおよび４Ｂ）。その結果、ｐ５３がないためにＡＡに誘導される細胞周期停止は逆戻りした。なぜなら、ＡＡ処理の開始から２４時間後に細胞はもはやＧ２／Ｍ期で蓄積しなかったからである（図４Ｃ）。これらの観察は、ＡＡ処理によってｐ５３タンパク質を活性化すると、その転写標的の１つであるｐ２１の発現を直接もたらすだけでなく、Ｇ２／Ｍ期停止も直接もたらすことを意味している。ＡＡ処理に応答する細胞周期停止は、明らかにｐ５３依存性のプロセスである（図４Ｃ）。興味深いことに、ｐ５３の発現がなくても、４０μＭのＡＡで処理するとカスパーゼ−９、カスパーゼ−３およびＰＡＲＰが切断されたので、ｓｈＲＮＡによってｐ５３タンパク質が抑制されていてもＡＡに誘導されるアポトーシスが阻害されなかった（図４Ａ）。これらの結果は、ＡＡに応答するカスパーゼ−３の活性化をフローサイトメトリー分析することによってさらに検証された。ｐ５３の発現がない場合に、ＡＡに誘導されるアポトーシスの割合（％）の有意な減少は何も観察されなかった（図４Ｄ）。このデータは、ＡＡに誘導されるアポトーシスが、ＨＰＶ陽性ＳｉＨａ細胞株においてｐ５３非依存性であることを明らかにしている。ｐ５３の安定化がアポトーシスの誘導に不可欠ではないことが観察されたので、アポトーシスはＩＡＰファミリーのメンバーの作用の不活性化によって誘導されると推測した。特に、ｃＩＡＰ２がＨＰＶ１６−Ｅ６感染細胞に過剰発現することが示されており、ｃＩＡＰ２はこうしたウイルス感染癌細胞において極めて重要で強力な抗アポトーシス因子として機能していると思われる。実際に、ＡＡに誘導されるｃＩＡＰ２タンパク質の発現の低下が、Ｅ６癌タンパク質の下方制御と同じ動態で起こったことが観察された（図４Ｅおよび３Ａ）ことから、ＡＡに誘導されるアポトーシスに至るｐ５３非依存性経路はｃＩＡＰ２発現の減少によって媒介された可能性があることが示唆される。
【００７９】
また、ＡＡに媒介されるＥ６およびｃＩＡＰ２タンパク質の下方制御がプロテアソーム経路によって媒介されるのかどうかを決定するために、細胞をプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２で処理し、ウエスタンブロット法によって分析した。結果からわかるように、ＭＧ１３２はＡＡ処理後にＥ６およびｃＩＡＰ２タンパク質の分解を阻害した（図４Ｆ）。
【００８０】
ＡＡに誘導されるアポトーシスにおけるＥ６の役割を確かめるために、ＨＰＶ陰性ｃ３３ａ細胞に偽のプラスミドおよびＨｉｓタグＥ６プラスミドをトランスフェクトし、それらを０および７０μＭのＡＡで処理し、その細胞を、ＡＡに誘導されるアポトーシスについてウエスタンブロットおよびＦＡＣＳを採用してアッセイした。ｃ３３ａ細胞は４０μＭでアポトーシスを起こさないが（図１Ｄ）、それより高い７０μＭという用量でアポトーシスを起こす。図５に見られるように、Ｅ６をトランスフェクトするとｃ３３ａ細胞がアポトーシスから有意に救済されたことから、ＡＡに誘導されるアポトーシスはＥ６の下方制御に依存することが確認される。Ｃ３３ａ細胞は変異ｐ５３を有しており、それはＥ６のトランスフェクションによって影響を受けないが、カスパーゼ３およびＰＡＲＰの切断が阻害される（図５Ａ）。誘導されるアポトーシスの割合（％）も有意に減少する（図５Ｂ）。
【００８１】
ＡＡの分子作用について提示する機序を図６に示す。ＡＡはウイルス性癌タンパク質Ｅ６およびＥ７を１２時間で下方制御することで、１２時間でｐ５３の安定化、２４時間でｐ２１の安定化をもたらし、それにより２４時間で細胞周期停止が可能となる。２４時間でミトコンドリア脱分極がカスパーゼ８および３の切断のような他の事象とともに始まり、４８時間でアポトーシスにおいて終わる。カスパーゼ９は１２時間で既に切断されているので、カスパーゼ９の活性化がこれらの事象に先立って起こる。カスパーゼ９の切断は、ｃＩＡＰ２の下方制御に起因する可能性もあると考えられ、それはウイルス性癌タンパク質の下方制御に応答して起こる可能性があると考えられる。こうしたことから、総じて本発明者らの結果により、ＡＡの抗癌活性の可能性のある機序への新規な洞察がもたらされる。これらの結果は、アニソメル酸を子宮頸癌に対する強力な化合物および抗ＨＰＶ療法として使用することに期待が持てることも指し示している。
【００８２】
４０μＭのＡＡは２４時間および４８時間でより高い割合（％）のアポトーシスを誘導したので、ＳｉＨａ細胞を０および４０μＭのＡＡならびにＡＡエマルションとインキュベートし、アポトーシスの尺度として、活性化カスパーゼ−３を含有する細胞の割合（％）を決定した。ＡＡエマルションを用いると、ＡＡと比較してカスパーゼ−３の著しい活性化が２４時間だけで観察された（図７）。
【００８３】
ＣＡＭに接種した腫瘍を、ＡＡを含むまたは含まないエマルションで処理した。その結果から、ＡＡがＳｉＨａ腫瘍の増殖を抑制することは明らかである。ＡＡを含まないエマルションはそれ自体では腫瘍に対して毒性がない（図８）。
【００８４】
上記の結果を要約すると、Ｅ６およびＥ７の活性を阻止することによってｐ５３またはｐ２１の機能を回復させることは、これらの癌細胞における興味深く重要な治療標的となることに着目できる。本発明では、天然のジテルペノイドであるアニソメル酸（ＡＡ）およびその塩の効果を、ＨＰＶ陽性子宮頸癌細胞株（ＳｉＨａ）において検討してきた。ＡＡで処理すると、Ｅ６およびＥ７タンパク質が枯渇する。結果的に、上の結果によって証明されたように、ｐ５３およびｐ５３応答性遺伝子であるｐ２１が劇的に誘導され、Ｇ２／Ｍ期細胞周期停止に至る。ＡＡに媒介される細胞周期停止およびｐ２１の発現は、ｐ５３がｐ５３−ｓｈＲＮＡによって下方制御されたときに大幅に減少した。
【００８５】
ＡＡは主に、細胞性アポトーシス阻害タンパク質２（ｃＩＡＰ２）を下方制御し、アポトーシス性カスパーゼの内因性活性化をもたらすことによって、ｐ５３非依存的アポトーシスを誘導する。ＳｉＨａ細胞をＡＡエマルションで処理すると２４時間だけでより高いアポトーシスを示し、またＡＡエマルションはＣＡＭモデルにおける腫瘍の抑制に効率的である。したがって、本発明は、子宮頸癌細胞においてｐ５３に媒介される増殖停止を回復させ、アポトーシスを誘導することにおけるＡＡの使用を提供する。したがって、ＡＡは、それ自体で、またはその分子原理を使用することによって、子宮頸癌に対する療法の開発に使用することができる。加えて、この原理は、ＨＰＶに媒介される他の癌、例えば、外陰癌、膣癌、陰茎癌、肛門癌および一部の中咽頭癌に用いることができる。
【００８６】
ＡＡは、ＨＰＶ陽性子宮頸癌細胞を特異的に標的とすることが可能な独自の機序を通して作用する。本発明者らの結果により、ＡＡの分子原理は、抗癌療法用と抗ＨＰＶ療法用のいずれの薬物分子を開発するときにも用いることができることが示される。
【００８７】
癌を除けば、性器疣贅がＨＰＶの最も一般的な疾患の症状発現であり、それは性器の良性および腫瘍性のＨＰＶ関連疾患に至る可能性がある。したがって、これらの結果により、子宮頸癌、ＨＰＶに媒介される性器疣贅に対する療法およびＨＰＶに媒介される癌のリスクの予防策を開発するための強力な薬理学的戦略としての、ＡＡおよびその誘導体の使用が指し示される。加えて、ＨＰＶは他のタイプの疣贅の最も一般的な原因であり、ＡＡおよびＡＡの分子原理は非性器の疣贅に対する治療にも用いることができる。
【００８８】
疣贅の治療において、アニソメル酸およびその塩は局所的に投与することができる。アニソメル酸およびその塩は、１から１０００ｍｇの投与量で治療対象の表面上に、すなわち、例えば疣贅が発生した皮膚上に投与することができる。上で論じたような水中油型エマルションの形態のアニソメル酸およびその塩の使用。
【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図８】
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【国際調査報告】
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