(57)【要約】  本発明は、イオン強度媒介のｐＨ勾配イオン交換クロマトグラフィーにより、抗体等のポリペプチドの組成物を分析するための方法を提供する。いくつかの態様において、該方法は、ポリペプチドの電荷変異体からポリペプチドを分離するために、ｐＨ勾配とイオン強度勾配との組み合わせを使用する。いくつかの態様において、該方法は、電荷変異体からポリペプチドを分離するためのｐＨ勾配分離ウィンドウを最適化するために、安定したイオン強度を使用する。このような方法は、９より大きいｐＩ又は７より小さいｐＩを有するポリペプチド、例えば抗体を分析するのに有用である。いくつかの態様において、本発明は、異なるｐＩのポリペプチドの分析のための多種の方法を提供する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチド及び一又は複数の混入物を含む組成物を分析するための方法であって、該方法が、
ａ）ローディングバッファーを使用して、ポリペプチド及び一又は複数の混入物をイオン交換クロマトグラフィー材料に結合させる工程であって、ローディングバッファーが最初のｐＨであり、且つ最初のイオン強度を含む工程と；
ｂ）溶出バッファーを使用して、イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチド及び一又は複数の混入物を溶出する工程であって、溶出バッファーのｐＨはｐＨ勾配で変更され、且つ溶出バッファーのイオン強度はイオン強度勾配で変更され、ポリペプチド及び一又は複数の混入物がｐＨ勾配及びイオン強度勾配の組み合わせにより分離される工程と；
ｃ）ポリペプチド及び一又は複数の混入物を検出する工程
とを含む方法。
【請求項２】
ポリペプチドが抗体若しくはイムノアドヘシン又はそれらの断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ポリペプチドがモノクローナル抗体又はその断片である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
抗体がヒト抗体である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
抗体がヒト化抗体である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項６】
抗体がキメラ抗体である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項７】
抗体が抗体断片である、請求項２から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
混入物がポリペプチドの変異体である、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
混入物がポリペプチドの分解産物である、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ポリペプチドが約９．０より大きいｐＩを有する、請求項１から９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
クロマトグラフィー材料が陽イオン交換クロマトグラフィー材料である、請求項１から１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
陽イオン交換クロマトグラフィー材料がスルホン化されたクロマトグラフィー材料又はカルボキシル化されたクロマトグラフィー材料である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ｐＨ勾配が直線勾配である、請求項１から１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ｐＨ勾配が段階勾配である、請求項１から１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ｐＨ勾配が約ｐＨ５から約ｐＨ１１への増加を含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
ｐＨ勾配が一又は複数のバッファーを使用してつくられる、請求項１から１５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
一又は複数のバッファーが、ピペラジン、イミダゾール、トリス、ホスフェート又はＣＡＰＳから選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
イオン強度勾配が直線勾配である、請求項１から１７の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９】
イオン強度勾配が段階勾配である、請求項１から１７の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０】
イオン強度勾配が約０ｍＭから約２００ｍＭへの塩濃度の増加を含む、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
イオン強度勾配がＮａＣｌ勾配、ＫＣｌ勾配又はＮａ２ＳＯ４勾配である、請求項１８から２０の何れか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ポリペプチドが約７．０より小さいｐＩを有する、請求項１から９の何れか一項に記載の方法。
【請求項２３】
クロマトグラフィー材料が陰イオン交換クロマトグラフィー材料である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
陰イオン交換クロマトグラフィー材料が第四級アミンクロマトグラフィー材料又は第三級アミンクロマトグラフィー材料である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ｐＨ勾配が直線勾配である、請求項２２から２４の何れか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ｐＨ勾配が段階勾配である、請求項２２から２４の何れか一項に記載の方法。
【請求項２７】
ｐＨ勾配が約ｐＨ８から約ｐＨ５への減少を含む、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項２８】
ｐＨ勾配が一又は複数のバッファーを使用してつくられる、請求項２２から２７の何れか一項に記載の方法。
【請求項２９】
一又は複数のバッファーが、ピペラジン、イミダゾール又はトリスから選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
イオン強度勾配が直線勾配である、請求項２２から２９の何れか一項に記載の方法。
【請求項３１】
イオン強度勾配が段階勾配である、請求項２２から２９の何れか一項に記載の方法。
【請求項３２】
イオン強度勾配が約０ｍＭから約２００ｍＭへの塩濃度の増加を含む、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
イオン強度勾配がＮａＣｌ勾配、ＫＣｌ勾配又はＮａ２ＳＯ４勾配である、請求項３０から３２の何れか一項に記載の方法。
【請求項３４】
ポリペプチド及び一又は複数の混入物を含む組成物を分析するための方法であって、該方法が、
ａ）ローディングバッファーを使用して、ポリペプチド及び一又は複数の混入物をイオン交換クロマトグラフィー材料に結合させる工程であって、ローディングバッファーが初期ｐＨであり、且つ初期イオン強度を含む工程と；
ｂ）溶出バッファーを使用して、イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチド及び一又は複数の混入物を溶出する工程であって、溶出バッファーのｐＨはｐＨ勾配で変更され、且つ溶出バッファーのイオン強度はローディングバッファーの初期イオン強度と基本的に同一であり、ポリペプチド及び一又は複数の混入物はｐＨ勾配によりほぼ初期イオン強度で分離される工程と；
ｃ）ポリペプチド及び一又は複数の混入物を検出する工程
とを含む方法。
【請求項３５】
ポリペプチドが抗体若しくはイムノアドヘシン又はそれらの断片である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ポリペプチドがモノクローナル抗体又はその断片である、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３７】
抗体がヒト抗体である、請求項３５又は３６に記載の方法。
【請求項３８】
抗体がヒト化抗体である、請求項３５又は３６に記載の方法。
【請求項３９】
抗体がキメラ抗体である、請求項３５又は３６に記載の方法。
【請求項４０】
抗体が抗体断片である、請求項３５から３９の何れか一項に記載の方法。
【請求項４１】
混入物がポリペプチドの変異体である、請求項３４から４０の何れか一項に記載の方法。
【請求項４２】
混入物がポリペプチドの分解産物である、請求項３４から４０の何れか一項に記載の方法。
【請求項４３】
ポリペプチドが約９．０より大きいｐＩを有する、請求項３４から４２の何れか一項に記載の方法。
【請求項４４】
クロマトグラフィー材料が陽イオン交換クロマトグラフィー材料である、請求項３４から４３の何れか一項に記載の方法。
【請求項４５】
陽イオン交換クロマトグラフィー材料がスルホン化されたクロマトグラフィー材料又はカルボキシル化されたクロマトグラフィー材料である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ｐＨ勾配が直線勾配である、請求項３４から４５の何れか一項に記載の方法。
【請求項４７】
ｐＨ勾配が段階勾配である、請求項３４から４５の何れか一項に記載の方法。
【請求項４８】
ｐＨ勾配が約ｐＨ５から約ｐＨ１１への増加を含む、請求項４６又は４７に記載の方法。
【請求項４９】
ｐＨ勾配が一又は複数のバッファーを使用してつくられる、請求項３４から４８の何れか一項に記載の方法。
【請求項５０】
一又は複数のバッファーが、ピペラジン、イミダゾール、トリス、ホスフェート又はＣＡＰＳから選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
溶出バッファーのイオン強度が約０ｍＭから約１００ｍＭである、請求項３４から５０の何れか一項に記載の方法。
【請求項５２】
溶出バッファーが約０ｍＭのＮａＣｌから約１００ｍＭのＮａＣｌ、約０ｍＭのＫＣｌから約１００ｍＭのＫＣｌ、又は約０ｍＭのＮａ２ＳＯ４から約１００ｍＭのＮａ２ＳＯ４を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
ポリペプチドが約７．０より小さいｐＩを有する、請求項３４から４２の何れか一項に記載の方法。
【請求項５４】
クロマトグラフィー材料が陰イオン交換クロマトグラフィー材料である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
陰イオン交換クロマトグラフィー材料が第四級アミンクロマトグラフィー材料又は第三級アミンクロマトグラフィー材料である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
ｐＨ勾配が直線勾配である、請求項５３から５５の何れか一項に記載の方法。
【請求項５７】
ｐＨ勾配が段階勾配である、請求項５３から５５の何れか一項に記載の方法。
【請求項５８】
ｐＨ勾配が約ｐＨ８から約ｐＨ５への減少を含む、請求項５６又は５７に記載の方法。
【請求項５９】
ｐＨ勾配が一又は複数のバッファーを使用してつくられる、請求項５３から５８の何れか一項に記載の方法。
【請求項６０】
一又は複数のバッファーが、ピペラジン、イミダゾール又はトリスから選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
溶出バッファーのイオン強度が約０ｍＭから約１００ｍＭである、請求項５３から６０の何れか一項に記載の方法。
【請求項６２】
溶出バッファーが約０ｍＭのＮａＣｌから約１００ｍＭのＮａＣｌを含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
分析が高速液体クロマトグラフィーによる、請求項１から６２の何れか一項に記載の方法。
【請求項６４】
ポリペプチド及び一又は複数の混入物を含む組成物中のポリペプチドを分析するための方法であって、該方法はポリペプチドから一又は複数の混入物を分離し、該方法が、
ａ）ローディングバッファーを使用して、ポリペプチド及び一又は複数の混入物をイオン交換クロマトグラフィー材料に結合させる工程であって、ローディングバッファーが最初のｐＨであり、且つ最初のイオン強度を含む工程と；
ｂ）溶出バッファーを使用して、イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチド及び一又は複数の混入物を溶出する工程であって、溶出バッファーのｐＨはｐＨ勾配で変更され、且つ溶出バッファーのイオン強度はイオン強度勾配で変更され、ポリペプチド及び一又は複数の混入物はｐＨ勾配及びイオン強度勾配の組み合わせにより分離される工程と；
ｃ）ポリペプチド及び一又は複数の混入物を検出する工程
とを含み、
該方法が約７．０から約９．５の範囲のｐＩを有するポリペプチドを分析するために使用される方法。
【請求項６５】
ポリペプチド及び一又は複数の混入物を含む組成物中のポリペプチドを分析するための方法であって、該方法が、
ａ）ローディングバッファーを使用して、ポリペプチド及び一又は複数の混入物をイオン交換クロマトグラフィー材料に結合させる工程であって、ローディングバッファーが初期ｐＨであり、且つ初期イオン強度を含む工程と；
ｂ）溶出バッファーを使用して、イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチド及び一又は複数の混入物を溶出する工程であって、溶出バッファーのｐＨはｐＨ勾配で変更され、且つ溶出バッファーのイオン強度はローディングバッファーの初期イオン強度と基本的に同一であり、ポリペプチド及び一又は複数の混入物はほぼ初期イオン強度においてｐＨ勾配により分離される工程と；
ｃ）ポリペプチド及び一又は複数の混入物を検出する工程
とを含み、
該方法が約７．０から約９．５の範囲のｐＩを有するポリペプチドを分析するために使用される方法。
【請求項６６】
ポリペプチドが抗体若しくはイムノアドヘシン又はそれらの断片である、請求項６４又は６５に記載の方法。
【請求項６７】
ポリペプチドがモノクローナル抗体又はその断片である、請求項６４から６６の何れか一項に記載の方法。
【請求項６８】
抗体がヒト抗体である、請求項６６又は６７に記載の方法。
【請求項６９】
抗体がヒト化抗体である、請求項６６又は６７に記載の方法。
【請求項７０】
抗体がキメラ抗体である、請求項６６又は６７に記載の方法。
【請求項７１】
抗体が抗体断片である、請求項６５から７０の何れか一項に記載の方法。
【請求項７２】
混入物がポリペプチドの変異体である、請求項６４から７１の何れか一項に記載の方法。
【請求項７３】
混入物がポリペプチドの分解産物である、請求項６４から７２の何れか一項に記載の方法。
【請求項７４】
混入物がポリペプチドの電荷変異体である、請求項６４から７３の何れか一項に記載の方法。
【請求項７５】
ローディングバッファー及び／又は溶出バッファー中のバッファーの濃度が約１０ｍＭから約５０ｍＭで変化する、請求項１から７４の何れか一項に記載の方法。
【請求項７６】
最初のｐＨが約ｐＨ５．０から約ｐＨ７．０で変化する、請求項１から７５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７７】
クロマトグラフィー材料の温度が約２０℃から約５０℃で変化する、請求項１から７６の何れか一項に記載の方法。
【請求項７８】
ローディング及び溶出が約０．５ｍｌ／分から約２．０ｍｌ／分で変化する流量で行われる、請求項１から７７の何れか一項に記載の方法。
【請求項７９】
請求項１から７８の方法の何れか一つにより組成物を分析する工程と、組成物中のポリペプチド対混入物の比率を決定する工程とを含む、組成物中のポリペプチドの純度を決定する方法。
【請求項８０】
ポリペプチドを含む組成物中のポリペプチドの安定性を決定する方法であって、該方法が、
ａ）ポリペプチドを含む組成物を４０℃で３又は６週間インキュベートする工程、
ｂ）請求項１から７９に記載の方法の何れかにより、工程ａ）の組成物を分析する工程、及び
ｃ）組成物中のポリペプチドに対する変異体の比率を決定する工程であって、インキュベートされなかった組成物と比較した組成物中のポリペプチドに対する変異体の比率の増加が、組成物中のポリペプチドの分解を示す工程
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イオン強度媒介のｐＨ勾配イオン交換クロマトグラフィーを使用してポリペプチドの調製物を分析するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のようなタンパク質は、水性環境下で、大抵は電荷で極性のアミノ酸を表面に有する（Barlow, DJ and Thornton, JM (1986) Biopolymers 25:1717）。溶液成分との分子間相互作用により、表面残留物は、多数の化学的及び酵素的修飾を受ける可能性があり、これは、その静電表面上で僅かに異なるタンパク質変異体の不均一混合物をもたらす（Dick, LW et al., (2009) J. Chromatogr. B 877:3841; Liu, HW et al., (2008) Rapid CoｍＭun. Mass Spectrom. 22:4081; Miller, AK, et al., (2011) J. Pharm. Sci. 100:2543; Wang, WR et al., (2011) Mol. Immunol. 48:860）。陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＣ）は、Vlasak, J及びIonescu, Rによる最近の総説により、タンパク質治療の電荷不均一性をプロファイルする代表的な基準であると考えられている（2008 Curr. Pharm. Biotechnol. 9:468）。電荷敏感分離方法は、製造中の生産整合性を保証するため及びタンパク質治療の分解レベルをモニターするために、規制当局により典型的に必要とされる（Miller, AK, et al., (2011) J. Pharm. Sci. 100:2543; He, XPZ (2009) Electrophoresis 30:714; Sosic, Z et al., (2008) Electrophoresis 29:4368; Kim, J et al.,(2010) J. Chromatogr. 8781973 Teshima, G et al., (2010) J. Chromatogr. 1218:2091）。
【０００３】
ｐＨ勾配を使用した分析的イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）方法は、治療用タンパク質の電荷不均一性をプロファイルするための従来の塩勾配ＩＥＣに対する代替技術として浮上した（Farnan, D and Moreno, GT (2009) Anal. Chem. 81:8846; Tsonev, LI and Hirsh, AG (2008) J. Chromatogr. A 1200:166; Nordborg, A et al., (2009) J. Sep. Sci. 32:2668; Rozhkova, A (2009) J. Chromatogr. A 1216: 5989; Rea, JC et al. (2010) J. Pharm. Biomed. Anal. 54:317）。この技術において、陽イオン交換固定相に典型的にロードされるタンパク質は、移動相のｐＨを増加させることにより溶出する。最近、６．０から９．５の比較的広範なｐＨウィンドウを用いるｐＨ勾配ＩＥＣ（ｐＨ−ＩＥＣ）法は、従来型の塩勾配ＩＥＣよりも良好な分解を提供するだけでなく、７．３から９．０のｐＩを有する１２のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の分析を通じて多産物能力を提供することが実証されてきた（Farnan, D and Moreno, GT (2009) Anal. Chem. 81: 8846）。そのｐＨ−ＩＥＣ法はまた、様々なイオン強度（０から２５０ｍＭ ＮａＣｌ）及びｐＨ値（５．０から８．５）を有する試料マトリクスに対して非常に耐性がある（Farnan, D and Moreno, GT (2009) Anal. Chem. 81:8846）。更に、報告されたｐＨ−ＩＥＣ法は、カラムの長さには明らかに影響されておらず、短いカラムを用いる化学的で高速な分離は、タンパク質変異体分析のスループットを改善するためになされ得る。最近の検証報告（Rea, JC et al. (2010) J. Pharm. Biomed. Anal. 54:317）によると、開発されたｐＨ−ＩＥＣ法は、異なるクロマトグラフィー条件での優れた精度及び異なるカラムロードでの良好な直線性を示してきた。したがって、報告されたｐＨ−ＩＥＣ法は、バイオテクノロジー産業における定期的試験に適している。
【０００４】
多くの優位性にも関わらず、報告されたｐＨ−ＩＥＣ法は、主に、７．３から９．０の研究範囲におけるｐＩ値を有するｍＡｂを意図した。ｍＡｂの溶出プロファイルは異なるバッファー組成物及び濃度、並びにｍＡｂが溶出するｐＨ値で変化し得るという事実は、ｐＨ勾配ＩＥＣが組み合わされたイオン強度及びｐＨ勾配溶出メカニズムに関係していることを示す（Farnan, D and Moreno, GT (2009) Anal. Chem. 81:8846）。これは、ｐＨ勾配陰イオン交換クロマトグラフィー（ｐＨ−ＡＩＥＣ）に関するＡｎｄｅｒｓｏｎと同僚の報告とも一致している（Anderson, DJ and Shan, L (2001) Clin. Chem. 47:128; Shan, L and Anderson, DJ (2001) J. Chromatogr. A 909:191; Shan, L and Anderson, DJ (2002) Anal. Chem. 74:5641）。バイオテクノロジー産業で開発段階にあるｍＡｂ、特により低いｐＩのｍＡｂの数がますます増加していることは、動物実験に基づく半減期が潜在的に長くなることを示す（Igawa, T. (2010) Protein Eng. Des. Sel. 23:385）。ｐＨ−ＩＥＣ法の適用性を、治療用ｍＡｂの広範囲に拡大することが必要である。
【０００５】
特許出願及び特許公開を含む、本明細書に引用される全ての参照文献は、その全文が参照により援用される。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、ポリペプチド及び一又は複数の混入物を含む組成物を分析するための方法であって、該方法が、ａ）ローディングバッファーを使用して、ポリペプチド及び一又は複数の混入物をイオン交換クロマトグラフィー材料に結合させる工程であって、ローディングバッファーが最初のｐＨであり、且つ最初のイオン強度を含む工程と；ｂ）溶出バッファーのｐＨがｐＨ勾配で変更され、且つ溶出バッファーのイオン強度がイオン強度勾配で変更される溶出バッファーを使用して、イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチド及び一又は複数の混入物を溶出する工程であって、ポリペプチド及び一又は複数の混入物がｐＨ勾配及びイオン強度勾配の組み合わせにより分離される工程と；ｃ）ポリペプチド及び一又は複数の混入物を検出する工程とを含む方法を提供する。本発明のいくつかの実施態様において、６．０から９．５の範囲のｐＩを有するポリペプチドは、同一の方法を使用して分析され得る。
【０００７】
いくつかの実施態様において、ポリペプチドは抗体若しくはイムノアドヘシン又はそれらの断片である。更なる実施態様においてポリペプチドはモノクローナル抗体又はそれらの断片である。更なる実施態様において、抗体はヒト抗体である。その他の実施態様において、抗体はヒト化抗体である。その他の実施態様において、抗体はキメラ抗体である。いくつかの実施態様において、抗体は抗体断片である。
【０００８】
上記の実施態様のいくつかの実施態様において、混入物はポリペプチドの変異体である。更なる実施態様において、混入物はポリペプチドの分解産物である。
【０００９】
いくつかの実施態様において、ポリペプチドは約９．０より大きいｐＩを有する。更なる実施態様において、クロマトグラフィー材料は陽イオン交換クロマトグラフィー材料である。更なる実施態様において、陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、スルホン化クロマトグラフィー材料又はカルボキシル化クロマトグラフィー材料である。
【００１０】
上記の実施態様の何れかの更なる実施態様において、ｐＨ勾配は直線勾配である。上記の実施態様の何れか一つのその他の実施態様において、ｐＨ勾配は段階勾配である。更なる実施態様において、ｐＨ勾配は約ｐＨ５から約ｐＨ１１への増加を含む。上記の実施態様のいくつかの実施態様において、ｐＨ勾配は一又は複数のバッファーを使用して生成される。更なる実施態様において、一又は複数のバッファーは、ピペラジン、イミダゾール、トリス、ホスフェート又はＣＡＰＳである。
【００１１】
何れか一つの実施態様のいくつかの実施態様において、イオン強度勾配は直線勾配である。その他の実施態様において、イオン強度勾配は段階勾配である。いくつかの実施態様において、イオン強度勾配は約０ｍＭから約２００ｍＭへの塩濃度の増加を含む。更なる実施態様において、イオン強度勾配はＮａＣｌ勾配、ＫＣｌ勾配、又はＮａ２ＳＯ４勾配である。
【００１２】
上記の実施態様のいくつかの実施態様において、ポリペプチドは約７．０より小さいｐＩを有する。更なる実施態様において、クロマトグラフィー材料は陰イオン交換クロマトグラフィー材料である。更なる実施態様において、陰イオン交換クロマトグラフィー材料は第四級アミンクロマトグラフィー材料又は第三級アミンクロマトグラフィー材料である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配は直線勾配である。その他の実施態様において、ｐＨ勾配は段階勾配である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配は約ｐＨ８から約ｐＨ５への減少を含む。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配は一又は複数のバッファーを使用して生成される。更なる実施態様において、一又は複数のバッファーは、ピペラジン、イミダゾール又はトリスである。いくつかの実施態様において、イオン強度勾配は直線勾配である。その他の実施態様において、イオン強度勾配は段階勾配である。更なる実施態様において、イオン強度勾配は約０ｍＭから約２００ｍＭへの塩濃度の増加を含む。いくつかの実施態様において、イオン強度勾配はＮａＣｌ勾配、ＫＣｌ勾配、又はＮａ２ＳＯ４勾配である。
【００１３】
いくつかの態様において、本発明は、ａ）ローディングバッファーを使用して、ポリペプチド及び一又は複数の混入物をイオン交換クロマトグラフィー材料に結合させる工程であって、ローディングバッファーが初期ｐＨであり、且つ初期イオン強度を含む工程と；ｂ）溶出バッファーのｐＨがｐＨ勾配で変更され、且つ溶出バッファーのイオン強度がローディングバッファーの初期イオン強度と基本的に同一である溶出バッファーを使用して、イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチド及び一又は複数の混入物を溶出する工程であって、ポリペプチド及び一又は複数の混入物はｐＨ勾配によりほぼ初期イオン強度で分離される工程と；ｃ）ポリペプチド及び一又は複数の混入物を検出する工程とを含む方法を提供する。本発明のいくつかの実施態様において、６．０から９．５の範囲のｐＩを有するポリペプチドは、基本的に同一の方法を使用して分析され得る。
【００１４】
上記の態様のいくつかの実施態様において、ポリペプチドは抗体若しくはイムノアドヘシン又はそれらの断片である。更なる実施態様においてポリペプチドはモノクローナル抗体又はそれらの断片である。実施態様の更なる実施態様において、抗体はヒト抗体である。その他の実施態様において、抗体はヒト化抗体である。その他の実施態様において、抗体はキメラ抗体である。いくつかの実施態様において、抗体は抗体断片である。
【００１５】
上記の態様のいくつかの実施態様において、混入物はポリペプチドの変異体である。いくつかの実施態様において、混入物はポリペプチドの分解産物である。
【００１６】
上記の態様のいくつかの実施態様において、ポリペプチドは約９．０より大きいｐＩを有する。更なる実施態様において、クロマトグラフィー材料は陽イオン交換クロマトグラフィー材料である。更なる実施態様において、陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、スルホン化クロマトグラフィー材料又はカルボキシル化クロマトグラフィー材料である。
【００１７】
上記の態様のいくつかの実施態様において、ｐＨ勾配は直線勾配である。その他の実施態様において、ｐＨ勾配は段階勾配である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配は約ｐＨ５から約ｐＨ１１への増加を含む。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配は一又は複数のバッファーを使用して生成される。更なる実施態様において、一又は複数のバッファーは、ピペラジン、イミダゾール、トリス、ホスフェート又はＣＡＰＳである。
【００１８】
上記の実施態様のいくつかの実施態様において、溶出バッファーのイオン強度は約０ｍＭから約１００ｍＭである。更なる実施態様において、溶出バッファーは、約０ｍＭ ＮａＣｌから約１００ｍＭ ＮａＣｌ、約０ｍＭ ＫＣｌから約１００ｍＭ ＫＣｌ、又は約０ｍＭ Ｎａ２ＳＯ４から約１００ｍＭ Ｎａ２ＳＯ４を含む。
【００１９】
上記の態様のいくつかの実施態様において、ポリペプチドは約７．０より小さいｐＩを有する。更なる実施態様において、クロマトグラフィー材料は陰イオン交換クロマトグラフィー材料である。更なる実施態様において、陰イオン交換クロマトグラフィー材料は第四級アミンクロマトグラフィー材料又は第三級アミンクロマトグラフィー材料である。上記の実施態様のいくつかの実施態様において、ｐＨ勾配は直線勾配である。その他の実施態様において、ｐＨ勾配は段階勾配である。上記の実施態様のいくつかの実施態様において、ｐＨ勾配は約ｐＨ８から約ｐＨ５への減少を含む。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配は一又は複数のバッファーを使用して生成される。更なる実施態様において、一又は複数のバッファーは、ピペラジン、イミダゾール又はトリスである。いくつかの実施態様において、溶出バッファーのイオン強度は約０ｍＭから約１００ｍＭである。更なる実施態様において、溶出バッファーは約１０ｍＭ ＮａＣｌから約１００ｍＭ ＮａＣｌを含む。
【００２０】
上記の実施態様の何れか一つのいくつかの実施態様において、分析は高速液体クロマトグラフィーにより行われる。
【００２１】
いくつかの態様において、本発明は、上記の実施態様の方法の何れか一つにより組成物を分析すること及び組成物中のポリペプチド対混入物の比率を決定することを含む、組成物中のポリペプチドの純度を決定する方法を提供する。
【００２２】
いくつかの態様において、本発明は、ポリペプチドを含む組成物中のポリペプチドの安定性を決定する方法であって、該方法がａ）ポリペプチドを含む組成物を０℃から４０℃で１から６週間インキュベートする工程、ｂ）実施態様１から６３の方法の何れかにより工程ａ）の組成物を分析する工程、及びｃ）組成物中の変異体対ポリペプチドの比率を決定する工程であって、インキュベートされなかった組成物と比較した、組成物中の変異体対ポリペプチドの比率の増加は組成物中のポリペプチドの分解を示す工程を含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、ｐＨ勾配イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）法で得られた異なるｐＩを有する三つのモノクローナル抗体（ｍＡｂ１、ｍＡｂ２及びｍＡｂ３）に対する電荷不均一性プロファイルを示す。
【図２】図２は、最適化前のカラム出口でのイオン強度とｐＨプロファイル（パネルＡ）及びｐＨ勾配におけるカラム背圧（パネルＢ）、並びに、最適化後のカラム出口でのイオン強度とｐＨプロファイル（パネルＣ）及びｐＨ勾配におけるカラム背圧（パネルＤ）を示す。モデル化された実験的なｐＨプロファイル及び導電率プロファイルは、パネルＡ及びＣに示す。
【図３】図３は、四つの異なるバッファー濃度で得られた、ｍＡｂ１（パネルＡ）及びｍＡｂ２（パネルＢ）のイオン強度媒介のｐＨＩＥＣクロマトグラムを示す。クロマトグラムにおける主ピークの半値全幅（ＦＷＨＭ）は、バッファー濃度（パネルＣ）及び塩濃度（パネルＤ）に対してプロットされる。
【図４】図４は、６．２から９．４の範囲のｐＩを有する１６のモノクローナル抗体のイオン強度媒介のｐＨ勾配ＩＥＣで得られた電荷不均一性プロファイル示す。挿入図は、溶出ｐＨに対してプロットされたノミナルｐＩ値のグラフを示す。
【図５】図５は、天然ｍＡｂ１（０ｗｋ）及び熱ストレスを加えたｍＡｂ１（４０℃で３週間及び６週間）のイオン強度媒介のｐＨ勾配ＩＥＣで得られたクロマトグラムを示す。
【図６】図６は、イオン強度媒介のｐＨ勾配ＩＥＣで得られた１０、２０、５０、１００及び２００μｇのカラムロードを用いたｍＡｂ１のクロマトグラムを示す。
【図７】図７は、ｐＨ６からｐＨ９．５の半直線ｐＨ勾配におけるピペラジン、イミダゾール、トリス（ＰＩＴ）バッファー溶液のアミノ官能基を通じたバッファリングを示す。
【図８】図８は、イオン強度媒介のＩＥＣを使用した、ｐＩ６．２からｐＩ９．４の範囲のｐＩを有するｍＡｂのクロマトグラムを示す。カラムは、Ｐｒｏｐａｃ ＷＣＸ−１０、４×２５０ｍｍであった。
【図９】図９は、４×２５０ｍｍカラムを使用したとき、同様のプロファイルが元のｐＨ−ＩＥＣとイオン強度媒介のｐＨ−ＩＥＣとの間で観察されることを示す。
【図１０】図１０は、ｐＨが増加する際、導電率を維持するためにホスフェートを使用するｐＨ６からｐＨ１１のモデル直線ｐＨ勾配を示す。
【図１１】図１１は、観察されたｐＨ（パネルＡ）及び導電率（パネルＣ）プロファイルがモデル予測（パネルＢ及びＤ）と一致していることを示すグラフである。
【図１２】図１２は、ＴＰＰバッファーを使用して、短時間の実行が可能であることを示す。上のクロマトグラムは、１６分間勾配の４×５０ｍｍ Ｐｒｏｐａｃ ＷＣＸ−１０ＨＴカラムでの結果を示し、下のクロマトグラムは、５８分勾配の４×２５０ｍｍカラムでの結果を示す。
【図１３】図１３は、異なるｐＩを有するモノクローナル抗体の電荷を計算するモデル化ツールを使用した、異なるｐＨでの異なる分子の荷電状態を実証するグラフである。モノクローナル抗体の電荷は、Ｘ軸を交差する場合、中性である。好適なｐＨ−ＩＥＣ分離ウィンドウは、曲線が比較的フラットなｐＨ範囲に相当する。
【図１４】図１４は、ｐＨが増加する際、分子は、高ｐＩでは、分解時間が短いことを示すグラフである。
【図１５】図１５は、ｐＩ＞９．０の抗体の最善の電荷遮へい効果のための最適な塩濃度を決定する研究の結果を示す。０ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ及び５０ｍＭの塩濃度が試験された。
【図１６】図１６は、８．９から９．１の範囲のｐＩの抗体の最善の電荷遮へい効果のための最適な塩濃度を決定する研究の結果を示す。
【図１７】図１７は、７．６から８．７の範囲のｐＩの抗体の最善の電荷遮へい効果のための最適な塩濃度を決定する研究の結果を示す。
【図１８】図１８は、遮へい追加電荷への塩の付加が、荷電状態を好適な分離ウィンドウへ移動させることを示すグラフである。
【図１９】図１９は、浅いｐＨ勾配の使用が、７．６のｐＩを有するＭＡｂを使用したピーク分解を改善し得ることを示すグラフである。勾配は以下のように試験された：ＰＩＴ（２．４ｍＭ トリス、１．５ｍＭ イミダゾール、１１．６ｍＭ ピペラジン、ｐＨ６−１１）；塩媒介のＰＩＴ（４ｍＭ トリス、４ｍＭ イミダゾール、４ｍＭ ピペラジン、ｐＨ６−１１、０−１６ｍＭ ＮａＣｌ勾配）；塩媒介のＴＰＰ（５ｍＭ トリス、５ｍＭ ピペラジン、５ｍＭ ホスフェート、ｐＨ６−１１、０−３０ｍＭ ＮａＣｌ勾配）；複合ｐＨ−ＩＥＣ、ＴＰＰ（５ｍＭ トリス、５ｍＭ ピペラジン、５ｍＭ ホスフェート、ｐＨ６−９、０ｍＭ ＮａＣｌ）；ＴＩＣ（５ｍＭ トリス、５ｍＭ ピペラジン、５ｍＭ ＣＡＰＳ、ｐＨ６−９、１０ｍＭ ＮａＣｌ）。実行時間は２０−２２分であった。
【図２０】図２０は、浅いｐＨ勾配の使用が、８．６から９．３のｐＩを有するＭＡｂを使用したピーク分解を改善し得ることを示すグラフである。勾配は以下のように試験された：ＰＩＴ（２．４ｍＭ トリス、１．５ｍＭ イミダゾール、１１．６ｍＭ ピペラジン、ｐＨ６−１１）；塩媒介のＰＩＴ（４ｍＭ トリス、４ｍＭ イミダゾール、４ｍＭ ピペラジン、ｐＨ５−１１、１６ｍＭ ＮａＣｌ）；塩媒介のＴＰＰ（５ｍＭ トリス、５ｍＭ ピペラジン、５ｍＭ ホスフェート、ｐＨ６−１１、２０ｍＭ ＮａＣｌ勾配）；ＴＰＰ（５ｍＭ トリス、５ｍＭ ピペラジン、５ｍＭ ホスフェート、ｐＨ６−９、２０ｍＭ ＮａＣｌ）；ＴＩＣ（５ｍＭ トリス、５ｍＭ ピペラジン、５ｍＭ ＣＡＰＳ、ｐＨ７−１０、３０ｍＭ ＮａＣｌ）。実行時間は２０−２２分であった。
【図２１】図２１は、浅いｐＨ勾配の使用が、９．０のｐＩを有するＭＡｂを使用したピーク分解を改善し得ることを示すグラフである。勾配は以下のように試験された：ＰＩＴ（２．４ｍＭ トリス、１．５ｍＭ イミダゾール、１１．６ｍＭ ピペラジン、ｐＨ６−１１）；塩媒介のＰＩＴ（４ｍＭ トリス、４ｍＭ イミダゾール、４ｍＭ ピペラジン、ｐＨ５−１１、１６ｍＭ ＮａＣｌ）；ＴＰＰ（５ｍＭ トリス、５ｍＭ ピペラジン、５ｍＭ ホスフェート、ｐＨ６−１１、３０ｍＭ ＮａＣｌ勾配）；ＴＰＰ（５ｍＭ トリス、５ｍＭ ピペラジン、５ｍＭ ホスフェート、ｐＨ７−１０、２０ｍＭ ＮａＣｌ）；ＴＩＣ（５ｍＭ トリス、５ｍＭ ピペラジン、５ｍＭ ＣＡＰＳ、ｐＨ７−１０、３０ｍＭ ＮａＣｌ）。実行時間は２０−２２分であった。
【図２２】図２２は、１５分間の実行時間が可能であることを示すグラフである。Ｍａｂは８．８のｐＩを有する。二つのクロマトグラムが示され、一方は、２２分間で２０ｍＭ ＮａＣｌ中６から１０のｐＨ勾配であり、もう一方は、１５分間で２０ｍＭ ＮａＣｌ中７から１０のｐＨ勾配である。
【図２３】図２３は、１５分間の実行時間が可能であることを示すグラフである。Ｍａｂは９．０のｐＩを有する。二つのクロマトグラムが示され、一方は、２２分間で２０ｍＭ ＮａＣｌ中６から１０のｐＨ勾配であり、もう一方は、１５分間で２０ｍＭ ＮａＣｌ中７から１０のｐＨ勾配である。
【図２４】図２４は、目標条件での三つのモノクローナル抗体の二重分析のオーバーレイクロマトグラムを示すグラフである。
【図２５】図２５は、異なるクロマトグラフィー条件でのＭＡｂ３のオーバーレイクロマトグラムを示すグラフである。主ピークは一列に並んだ。
【図２６】図２６は、クロマトグラフィー実施における塩濃度の影響を示す分配プロットである。円は主ピークの割合を示し、菱形は酸性変異体の割合を示し、×は塩基性変異体の割合を示し、三角形は分解１を示し、＊は分解２を示す。
【図２７】図２７は、クロマトグラフィー実施におけるその他のパラメータの影響を示す分配プロットを示す。上段左はバッファー濃度（ｍＭ）の影響を示す。上段右は出発ｐＨの影響を示す。下段左はカラム温度（℃）の影響を示す。下段右は流量（ｍｌ／分）の影響を示す。
【００２４】
発明の詳細な説明
本発明は、ポリペプチド及び一又は複数の混入物、例えばポリペプチド変異体を含む組成物を分析する方法であって、初期ｐＨ及び初期イオン強度を有するローディングバッファーを使用して、ポリペプチド及び一又は複数の混入物をイオン交換クロマトグラフィー材料に結合させる工程と、溶出バッファーのｐＨがｐＨ勾配により変更され、且つ溶出バッファーのイオン強度がイオン強度勾配により変更される溶出バッファーを使用して、イオン交換カラムからポリペプチド及び一又は複数の混入物を溶出し、ポリペプチド及び一又は複数の混入物が明確に分離された構成要素としてクロマトグラフィー材料から溶出するようにする工程とを含む方法を提供する。本発明の方法は、中性ｐＨ範囲には存在しない等電点を用いて、ポリペプチドを分析するのに使用され得る。いくつかの実施態様において、本方法は、９より大きいｐＩを有するポリペプチドを混入物から効果的に分離するのに使用されてもよい。他の実施態様において、本方法は、７より小さいｐＩを有するポリペプチドを混入物から効果的に分離するのに使用されてもよい。いくつかの実施態様において、本方法は、一又は複数の混入物からポリペプチドを効果的に分離し、ポリペプチドは約７．０から約１２の範囲のｐＩを有する。いくつかの実施態様において、本方法は、一又は複数の混入物からポリペプチドを効果的に分離するのに使用され得、ポリペプチドは約７．０から約１２の範囲のｐＩを有する。ポリペプチドの例は、抗体及び抗体断片を含むが、これらに限定されない。混入物の例は、抗体電荷変異体等の抗体変異体を含むが、これらに限定されない。
【００２５】
他の態様において、本発明は、ポリペプチド及び一又は複数の混入物、例えばポリペプチド変異体を含む組成物を分析する方法であって、初期ｐＨ及び初期イオン強度を有するローディングバッファーを使用して、ポリペプチド及び一又は複数の混入物をイオン交換クロマトグラフィー材料に結合させる工程と、溶出バッファーのｐＨがｐＨ勾配により変更され、且つ溶出バッファーのイオン強度が基本的に同一のままである溶出バッファーを使用して、イオン交換カラムからポリペプチド及び一又は複数の混入物を溶出し、ポリペプチド及び一又は複数の混入物が明確に分離された構成要素としてクロマトグラフィー材料から溶出するようにする工程とを含む方法を提供する。本発明の方法は、中性ｐＨ範囲には存在しない等電点を用いて、ポリペプチドを分析するのに使用され得る。いくつかの実施態様において、本方法は、９より大きいｐＩを有するポリペプチドを混入物から効果的に分離するのに使用されてもよい。他の実施態様において、本方法は、７より小さいｐＩを有するポリペプチドを混入物から効果的に分離するのに使用されてもよい。ポリペプチドの例は、抗体及び抗体断片を含むが、これらに限定されない。混入物の例は、抗体電荷変異体等の抗体変異体を含むが、これらに限定されない。
【００２６】
いくつかの態様において、本発明は、ポリペプチド及び一又は複数の混入物、例えば、ポリペプチド変異体を含む組成物を分析する方法であって、初期ｐＨ及び初期イオン強度を有するローディングバッファーを使用して、ポリペプチド及び一又は複数の混入物をイオン交換クロマトグラフィー材料に結合させ、溶液中のポリペプチドの荷電状態が最適なｐＨ勾配イオン交換分離ウィンドウ内に収まるようにする工程を含む方法を提供する。次いで、ポリペプチド及び一又は複数の混入物は、明確に分離された構成要素として、クロマトグラフィー材料から溶出する。
【００２７】
本発明のいくつかの実施態様において、混入物は、酸性変異体を含むポリペプチド電荷変異体、即ち、陽イオン交換モードの主ピークよりも短い保持時間を有する変異体である。酸性変異体の例は、一又は複数のグルタミン及び／又はアスパラギン残基が脱アミド化されているポリペプチドを含むが、これらに限定されない。本発明のいくつかの実施態様において、混入物は、塩基性変異体を含むポリペプチド電荷変異体、即ち、陽イオン交換モードの主ピークよりも長い保持時間を有する変異体である。例は、アスパラギン酸残基がスクシンイミド部分への化学修飾を受ける変異体を含むが、これらに限定されない。
【００２８】
いくつかの実施態様において、本発明は、ポリペプチド及び一又は複数の混入物を含む組成物を分析する方法を提供し、基本的に同一の方法が、異なるｐＩを有するポリペプチドを分析するのに使用され得る。例えば、該方法は、６．０から９．５のｐＩの範囲を有するポリペプチドを分析するのに使用されてもよい。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは抗体又はそれらの断片である。いくつかの実施態様において、混入物は抗体変異体又は抗体断片の変異体である。いくつかの実施態様において、混入物は抗体電荷変異体又は抗体断片の電荷変異体である。いくつかの実施態様において、本発明は、電荷変異体（例えば、酸性変異体及び／又は塩基性変異体）の有無に関して抗体又は抗体断片の組成物を分析する方法であって、該方法が６．０から９．５の範囲のｐＩを有する抗体を含む異なる組成物を分析するために使用され得る方法を提供する。
【００２９】
Ｂ．定義
用語「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、本明細書においては、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために互換的に使用される。ポリマーは、直鎖状でも分枝状でもよく、改変されたアミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸が割り込んでいてもよい。この用語はまた、自然に又は介入により改変されているアミノ酸ポリマーを包含しており；その例として、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は任意の他の操作若しくは改変、例えば、標識化成分とのコンジュゲーションが挙げられる。この定義には、例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸等を含む）の一又は複数の類似体を含むポリペプチド、並びに、当該技術分野において公知の他の改変体も含まれる。用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書において使用される場合、特に抗体を包含する。
【００３０】
用語「ポリペプチド電荷変異体」は、本明細書において使用される場合、ポリペプチドの電荷が変更されるように、自然の状態から改変されているポリペプチドを指す。いくつかの例において、電荷変異体は、親ポリペプチドよりも酸性である；即ち、親ペプチドよりも低いｐＩを有する。その他の例において、電荷変異体は、親ポリペプチドよりも塩基性である；即ち、親ペプチドよりも高いｐＩを有する。このような改変は操作されてもよく、又は、酸化、脱アミド化、リジン残基のＣ末端プロセシング、Ｎ末端ピログルタミン酸形成及び糖化等の天然のプロセスの結果であってもよい。いくつかの例において、ポリペプチド電荷変異体は、タンパク質に結合するグリカンが、親糖タンパク質と比較して、例えば、シアル酸又はその誘導体の付加により、糖タンパク質の電荷が変更されるように改変されている、糖タンパク質である。「抗体電荷変異体」とは、本明細書において使用される場合、抗体又はその断片が、抗体又はその断片の電荷が変更されるように、その自然な状態から改変されている、抗体又はその断片である。
【００３１】
「精製された」ポリペプチド（例えば、抗体又はイムノアドヘシン）とは、ポリペプチドの純度が増加し、その天然環境に存在するよりも、及び／又は実験室条件下で最初に合成及び／又は増幅された時よりも純粋な形態で存在することを意味する。純度は相対用語であり、必ずしも絶対純度を意味するのではない。
【００３２】
用語「アンタゴニスト」は最も広い意味で使用され、天然ポリペプチドの生物学的活性を部分的に又は完全に阻止、阻害、又は中和する任意の分子を含む。同様に用語「アゴニスト」は最も広い意味で使用され、天然ポリペプチドの生物学的活性を模倣する任意の分子を含む。好適なアゴニスト又はアンタゴニスト分子は特に、アゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片、天然ポリペプチドの断片又はアミノ酸配列変異体等を含む。ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定するための方法は、ポリペプチドを候補アゴニスト又はアンタゴニスト分子に接触させること及びポリペプチドに通常関連する一又は複数の生物学的活性における検出可能な変化を測定することを含む。
【００３３】
目的とする抗原、例えば、腫瘍関連ポリペプチド抗原標的と「結合する」ポリペプチドとは、十分な親和性で抗原と結合することから、その抗原を発現する細胞又は組織の標的化における診断剤及び／又は治療剤として有用であり、他のポリペプチドとはそれほど交差反応しないような、ポリペプチドである。そのような実施態様において、ポリペプチドと「非標的」ポリペプチドとの結合度は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析又は放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）により決定した場合、ポリペプチドとその特定の標的ポリペプチドとの結合の約１０％未満であろう。
【００３４】
ポリペプチドと標的分子との結合に関しては、特定のポリペプチド、又は特定のポリペプチド標的上のエピトープについて、その「特異的結合」、又はそれと「特異的に結合する」、又はそれに対して「特異的である」という用語は、非特異的相互作用とは測定可能な程度に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、分子の結合を対照分子の結合との比較で決定することにより測定でき、対照分子は、一般に、結合活性を有さない類似構造の分子である。例えば、特異的結合は、標的と類似している対照分子、例えば過剰な非標識標的との競合により決定され得る。この場合、特異的結合は、プローブとの標識標的の結合が、過剰な非標識標的により競合的に阻害される場合に示される。
【００３５】
用語「抗体」とは、本明細書では最も広い意味で使用され、具体的には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも二つのインタクトな抗体から形成される多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び、所望の生物学的活性を示す限り、抗体断片を含む。用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、本明細書では抗体と互換的に使用される。
【００３６】
抗体は、全て免疫グロブリンフォールドに基づく、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子である。例えば、ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合されて機能的抗体を形成する、二つの「重」鎖及び二つの「軽」鎖を有する。各重鎖及び軽鎖自体は、「定常」（Ｃ）及び「可変」（Ｖ）領域を含む。Ｖ領域は抗体の抗原結合特異性を決定し、一方、Ｃ領域は、構造的な支持をもたらし、免疫エフェクターとの非抗原特異的相互作用において機能する。抗体又は抗体の抗原結合断片の抗原結合特異性とは、抗体が特定の抗原と特異的に結合する能力のことである。
【００３７】
抗体の抗原結合特異性は、Ｖ領域の構造的特徴により決定される。可変性は、可変ドメインの１１０個のアミノ酸全長にわたり一様に分布してはいない。そうではなく、Ｖ領域は、それぞれ９〜１２アミノ酸長である「超可変領域」と呼ばれる極度の可変性のより短い領域で分割されている、１５〜３０個のアミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変のストレッチから成る。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ四つのＦＲを含み、大部分がβシート立体配置をとり三つの超可変領域により繋がっており、この三つの超可変領域はβシート構造と繋がり、場合によってはβシート構造の一部を形成している、ループを形成する。各鎖における超可変領域は、ＦＲにより互いに極めて近接した状態で保持され、他の鎖由来の超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md, (1991)を参照のこと）。定常ドメインは、抗原との抗体の結合には直接関わっていないが、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）における抗体の関与など、多様なエフェクター機能を呈する。
【００３８】
各Ｖ領域は典型的には三つの相補性決定領域（それぞれが「高頻度可変ループ」を含む「ＣＤＲ」）と四つのフレームワーク領域を含む。特定の所望の抗原に対して実質的な親和性で結合するのに必要とされる最少の構造単位である抗原結合部位は、したがって三つのＣＤＲと、適切な高次構造でＣＤＲを保持し提示するためにそれらの間に散在した少なくとも三つ、好ましくは四つのフレームワーク領域を含むであろう。古典的な四本鎖抗体は、ＶＨ及びＶＬドメインが協働して定める抗原結合部位を有している。ある種の抗体、例えばラクダ及びサメ抗体は、軽鎖を欠き、重鎖のみによって形成される結合部位に依存する。結合部位が重鎖又は軽鎖のみによって形成され、ＶＨ及びＶＬの間に協働がない単一ドメイン操作免疫グロブリンを調製することができる。
【００３９】
「可変」なる用語は、可変ドメインのある部分が、抗体間で配列が広範囲に相違しているという事実を指し、それぞれの特定の抗体のその特定の抗原への結合及び特異性に使用される。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメインにわたって均一に分布しているのではない。それは、軽鎖及び重鎖可変ドメインの双方において、高頻度可変領域と称される三つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存されている部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ四つのＦＲを含み、大部分がβシート立体配置をとり三つの超可変領域により繋がっており、この三つの超可変領域はβシート構造と繋がり、場合によってはβシート構造の一部を形成している、ループを形成する。各鎖における超可変領域は、ＦＲにより互いに極めて近接した状態で保持され、他の鎖由来の超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)を参照のこと）。定常ドメインは、抗原との抗体の結合には直接関わっていないが、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）における抗体の関与など、多様なエフェクター機能を呈する。
【００４０】
「高頻度可変領域」なる用語は、本明細書において使用される場合、抗原結合性を生じる抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（例えば、ＶＬの残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７（Ｌ３）、並びにＶＨの３１−３５Ｂ（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）及び９５−１０２（Ｈ３）（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)）及び／又は「高頻度可変ループ」からの残基（例えば、ＶＬの残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）及び９１−９６（Ｌ３）、並びにＶＨの残基２６−３２（Ｈ１）、５２Ａ−５５（Ｈ２）及び９６−１０１（Ｈ３）（Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)）を含み得る。
【００４１】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、本明細書で定義している高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００４２】
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部、好ましくはその抗原結合領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ；タンデムダイアボディ（ｔａＤｂ）、線状抗体（例えば、米国特許第５６４１８７０号、実施例２；Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)）；１アーム抗体、単一可変ドメイン抗体、ミニボディ、単鎖抗体分子；抗体断片（例えば、限定されるものではないが、Ｄｂ−Ｆｃ、ｔａＤｂ−Ｆｃ、ｔａＤｂ−ＣＨ３、（ｓｃＦＶ）４−Ｆｃ、ジ−ｓｃＦｖ、バイ−ｓｃＦｖ、又はタンデム（ジ，トリ）−ｓｃＦｖが挙げられる）から形成される多特異性抗体；及び二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）が挙げられる。
【００４３】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる二つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処置は、二つの抗原結合部位を有し、なお抗原を結合することが可能なＦ（ａｂ’）２断片を産生する。
【００４４】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、密接に非共有結合した一本の重鎖と一本の軽鎖の可変領域の二量体からなる。この配置において、各可変ドメインの三つの超可変領域は相互作用し、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、６つの超可変領域が抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に対して特異的な３つの超可変領域のみを含むＦｖの半分）でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有する。
【００４５】
Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加されている点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書において、Ｆａｂ’の一般名称であり、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を持つ。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生産された。抗体断片の他の化学結合も知られている。
【００４６】
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる二つの明確に区別される型の一つが割り当てられ得る。
【００４７】
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体は異なるクラスが割り当てられ得る。インタクトな抗体には５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けられ得る。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位はよく知られている。
【００４８】
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。いくつかの実施態様において、ｓｃＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓｃＦＶが抗原結合に所望の構造を形成することを可能にする。ｓｃＦｖの総説については、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照のこと。
【００４９】
用語「ダイアボディ」は、二つの抗原結合部位を持つ抗体断片を指し、その断片は、同一ポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。非常に短いために同一鎖上で２つのドメインの対形成ができないリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、２つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４０９７；ＷＯ９３／１１１６１；及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)において、より詳しく説明される。
【００５０】
用語「多特異性抗体」は、最も広い意味で使用され、ポリエピトープ特異性を有する抗体を特に網羅する。そのような多特異性抗体としては、限定されるものではないが、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含みＶＨＶＬ単位がポリエピトープ特異性を有する抗体、２つ以上のＶＬ及びＶＨドメインを有し各ＶＨＶＬ単位が異なるエピトープと結合する抗体、２つ以上の単一可変ドメインを有し各単一可変ドメインが異なるエピトープと結合する抗体、完全長抗体、抗体断片、例えばＦａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性を有するダイアボディ、トリアボディ、三重機能性抗体、共有結合的又は非共有結合的に連結している抗体断片が挙げられる。「ポリエピトープ特異性」とは、同じ又は異なる標的（複数可）上で２つ以上の異なるエピトープと特異的に結合する能力を指す。「単一特異性の」とは、１つのエピトープのみと結合できることを指す。一実施態様によれば、多特異性抗体は、親和性が５μＭから０．００１ｐＭ、３μＭから０．００１ｐＭ、１μＭから０．００１ｐＭ、０．５μＭから０．００１ｐＭ，又は０．１μＭから０．００１ｐＭである各エピトープと結合するＩｇＧ抗体である。
【００５１】
単一ドメイン抗体」（ｓｄＡｂ）又は「単一可変ドメイン（ＳＶＤ）抗体」という表現は、一般的に、単一可変ドメイン（ＶＨ又はＶＬ）が抗原結合をもたらし得る抗体を指す。言い換えれば、単一可変ドメインは、標的抗原を認識するために別の可変ドメインと相互作用する必要がない。単一ドメイン抗体の例としては、ラクダ科の動物（ラマ及びラクダ）並びに軟骨魚（例えば、テンジクザメ）に由来するもの、並びに、ヒト及びマウス抗体からの組換法に由来するものが挙げられる（Nature (1989) 341:544-546; Dev Comp Immunol (2006) 30:43-56; Trend Biochem Sci (2001) 26:230-235; Trends Biotechnol (2003):21:484-490; WO 2005/035572; WO 03/035694; Febs Lett (1994) 339:285-290; WO00/29004; WO 02/051870）。
【００５２】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、モノクローナル抗体の産生中に生じ得る変異体（通常少量で存在する変異体など）を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンで汚染されていないという点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られているという抗体の特徴を示し、抗体を何か特定の方法で作製しなければならないことを意味するものではない。例えば、本明細書において提供される方法により使用されることになるモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法により作製されてもよく、又は、組換えＤＮＡ法により作製されてもよい（例えば、米国特許第４８１６５６７号を参照のこと）。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)及びMarks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)に記載されている手法を用いてファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。
【００５３】
本明細書においては、モノクローナル抗体は、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、即ち、重鎖及び／又は軽鎖の一部分は特定の種に由来する抗体又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一若しくは相同であるが、鎖（複数可）の残りの部分は別の種に由来する抗体又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一若しくは相同である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、並びに、所望の生物学的活性を呈するものである限りそのような抗体の断片を、特に含む（米国特許第４８１６５６７号； Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)）。本明細書における目的のキメラ抗体は、非ヒト霊長動物（例：旧世界サル、例えばヒヒ、アカゲザル、又はカニクイザル）に由来する可変ドメイン抗原結合配列及びヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体を含む（米国特許第５６９３７８０号）。
【００５４】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大抵の場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、非ヒト種、例えば、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長動物の超可変領域（ドナー抗体）由来の残基により置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例においては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。更に、ヒト化抗体はレシピエント抗体又はドナー抗体において見出されない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能を更に改良するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの全てを実質的に含み、超可変ループの全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、上記のＦＲ置換基（複数可）を除く、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである。また、ヒト化抗体は、場合によっては、免疫グロブリン、通常はヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。更なる詳細については、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988);及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。
【００５５】
本明細書での目的に関して、「インタクトな抗体」は、重及び軽可変ドメイン並びにＦｃ領域を含むものである。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列変異体であり得る。好ましくは、インタクトな抗体は、一又は複数のエフェクター機能を有する。
【００５６】
「天然抗体」は、通常、二つの同一の軽（Ｌ）鎖及び二つの同一の重（Ｈ）鎖からなる、約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖内ジスルフィド架橋を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン（ＶＨ）を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を、他端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基は、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられる。
【００５７】
「ネイキッド抗体」は、細胞傷害性部分又は放射性標識などの異種分子とコンジュゲートされない、（本明細書において定義する）抗体である。
【００５８】
いくつかの実施態様において、抗体「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に起因しうる生物学的活性を指し、抗体のアイソタイプにより変化する。抗体のエフェクター機能の例は：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害；Ｆｃ受容体結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；貪食作用；細胞表面受容体のダウンレギュレーションを含む。
【００５９】
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」及び「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的な細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が、標的細胞上の結合された抗体を認識し、引き続き標的細胞を溶解させる、細胞媒介性の反応を指す。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞ＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)の４６４ページの表３に要約されている。対象の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５５００３６２号又は同第５８２１３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを実施してもよい。このようなアッセイにおいて有用なエフェクター細胞は、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。代替的又は追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656 (1998)において開示されているような動物モデルにおいて、インビボで評価され得る。
【００６０】
「ヒトエフェクター細胞」とは、一又は複数のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を実行する白血球である。いくつかの実施態様において、その細胞が少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例は、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞障害性Ｔ細胞及び好中球を含むが、ＰＢＭＣとＮＫ細胞が好適である。
【００６１】
「補体依存性細胞傷害」又は「ＣＤＣ」は、分子が補体の存在下で標的を溶解する能力を指す。補体活性化経路は、補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）が、同種抗原と複合体化された分子（例えばポリペプチド（例：抗体））と結合することにより引き起こされる。補体活性化を検討評価するために、ＣＤＣアッセイ、例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているようなＣＤＣアッセイを実施してもよい。
【００６２】
用語「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域と結合する受容体を説明するために使用される。いくつかの実施態様において、ＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。更に、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）と結合するものであり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含み、これらの受容体の対立遺伝子変異体及び代替的にスプライスされた形態も含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化型受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「抑制型受容体」）を含み、これらは、その細胞質ドメインが主に異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化型受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメイン中に免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。抑制型受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメイン中に免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)を参照のこと）。ＦｃＲは、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994);及びde Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)において総説されている。将来的に同定されることになるものを含め、他のＦｃＲは、本明細書においては用語「ＦｃＲ」に包含される。この用語には、胎児への母親のＩｇＧの移行に関与している新生児の受容体ＦｃＲｎも含まれる（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)及びKim et al., J. Immunol. 249 (1994)）。
【００６３】
「混入物」とは、所望のポリペプチド産物とは異なる物質を指す。本発明のいくつかの実施態様において、混入物はポリペプチドの電荷変異体を含む。本発明のいくつかの実施態様において、混入物は抗体又は抗体断片の電荷変異体を含む。本発明の他の実施態様において、混入物は、限定するものではないが：宿主細胞物質、例えばＣＨＯＰ；浸出されたプロテインＡ；核酸；所望のポリペプチドの変異体、断片、凝集体又は誘導体；別のポリペプチド；エンドトキシン；ウイルス性混入物；細胞培養培地成分等を含む。いくつかの例において、混入物は、例えば限定されるものではないが、細菌細胞（大腸菌細胞など）、昆虫細胞、原核細胞、真核細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞、真菌細胞に由来する宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）であってもよい。
【００６４】
本明細書において使用される場合、用語「イムノアドヘシン」は、異種ポリペプチドの結合特異性を免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能と組み合わせた抗体様の分子を指している。構造的に、イムノアドヘシンは、抗原認識以外の所望の結合特異性を有するアミノ酸配列と、抗体の結合部位との融合（すなわち、「異種の」である）、及び免疫グロブリン定常ドメイン配列を含む。イムノアドヘシン分子のアドヘシン部は、典型的には、少なくとも受容体又はリガンドの結合部位を含む近接するアミノ酸配列である。イムノアドヘシンにおける免疫グロブリン定常ドメイン配列は、任意の免疫グロブリン、例えばＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３若しくはＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はＩｇＭから得てもよい。
【００６５】
本明細書において使用される場合、「基本的に同一」とは、値又はパラメータが有意な影響により変更されていないことを示す。例えば、カラム出口のクロマトグラフィー移動相は、イオン強度が有意に変化していない場合、移動相の初期イオン強度と基本的に同一である。例えば、初期イオン強度の１０％、５％又は１％内のカラム出口のイオン強度は、初期イオン強度と基本的に同一である。
【００６６】
本明細書中の「約」の値又はパラメータへの言及は、その値又はパラメータ自体に対するバリエーションを含む（記載する）。例えば、「約Ｘ」との記載には「Ｘ」の記載が含まれる。
【００６７】
本明細書において使用される場合、単数形「ａ」、「ｏｒ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を指さない限り複数系を含む。本明細書に記載の本発明の態様及び変形形態は、態様及び変形形態「からなる」及び／又は「基本的にからなる」を含む。
【００６８】
ＩＩ．クロマトグラフィーの方法
ある態様において、本発明は、ポリペプチド及び一又は複数の混入物、例えばポリペプチド電荷変異体を含む組成物を分析する方法であって、初期ｐＨ及び初期イオン強度を有するローディングバッファーを使用して、ポリペプチド及び一又は複数の混入物をイオン交換クロマトグラフィー材料に結合させる工程と、溶出バッファーのｐＨがｐＨ勾配により変更され、且つ溶出バッファーのイオン強度がイオン強度勾配により変更される溶出バッファーを使用して、イオン交換カラムからポリペプチド及び一又は複数の混入物を溶出し、ポリペプチド及び一又は複数の混入物が明確に分離された構成要素としてクロマトグラフィー材料から溶出するようにする工程とを含む方法を提供する。
【００６９】
他の態様において、本発明は、ポリペプチド及び一又は複数の混入物、例えばポリペプチド変異体を含む組成物を分析する方法であって、初期ｐＨ及び初期イオン強度を有するローディングバッファーを使用して、ポリペプチド及び一又は複数の混入物をイオン交換クロマトグラフィー材料に結合させる工程と、溶出バッファーのｐＨがｐＨ勾配により変更され、且つ溶出バッファーのイオン強度がイオン強度勾配により変更される溶出バッファーを使用して、イオン交換カラムからポリペプチド及び一又は複数の混入物を溶出し、ポリペプチド及び一又は複数の混入物が明確に分離された構成要素としてクロマトグラフィー材料から溶出するようにする工程とを含む方法を提供する。
【００７０】
本明細書に記載の方法の何れかのいくつかの実施態様において、クロマトグラフィー材料は陽イオン交換材料である。いくつかの実施態様において、陽イオン交換材料は、固体相を通り越させられる又は通り過ぎさせられる水溶液中で陽イオンと交換させるために、負に帯電しており遊離陽イオンを有する固体相である。本明細書に記載の方法の何れかのいくつかの実施態様において、陽イオン交換材料は、膜、モノリス、又は樹脂であってもよい。いくつかの実施態様において、陽イオン交換材料は、樹脂であってもよい。陽イオン交換材料は、カルボン酸官能基又はスルホン酸官能基、例えば、限定されるものではないが、スルホナート、カルボン酸、カルボキシメチルスルホン酸、スルホイソブチル、スルホエチル、カルボキシル、スルホプロピル、スルホニル、スルホキシエチル、又はオルトホスファートを含んでもよい。上記のいくつかの実施態様において、陽イオン交換クロマトグラフィー材料は陽イオン交換クロマトグラフィーカラムである。いくつかの実施態様において、陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、約９より大きいｐＩを有するポリペプチド、例えば、抗体又はその断片に使用される。例えば、抗体又はその断片は、９−１０、９−１１、１０−１１、９−１２、１０−１２、又は１１−１２のｐＩを有してもよい。
【００７１】
本明細書に記載の方法の何れかのいくつかの実施態様において、クロマトグラフィー材料は陰イオン交換材料である。いくつかの実施態様において、陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、固体相を通り越させられる又は通り過ぎさせられる水溶液中で陰イオンと交換させるために、陽に帯電しており遊離陰イオンを有する固体相である。本明細書に記載の方法の何れかのいくつかの実施態様において、陰イオン交換材料は、膜、モノリス、又は樹脂であってもよい。一実施態様において、陰イオン交換材料は、樹脂であってもよい。いくつかの実施態様において、陰イオン交換材料は、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン若しくは第四級アンモニウムイオン官能基、ポリアミン官能基、又はジエチルアミノエチル官能基を含んでもよい。上記のいくつかの実施態様において、陰イオン交換クロマトグラフィー材料は陰イオン交換クロマトグラフィーカラムである。いくつかの実施態様において、陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、約７より小さいｐＩを有するポリペプチド、例えば、抗体又はその断片に使用される。例えば、抗体又はその断片は、６−７、５−７、５−６、４−７、４−６、又は４−５のｐＩを有してもよい。
【００７２】
本明細書に記載の何れかの方法のいくつかの実施態様において、イオン交換材料は、従来のクロマトグラフィー材料又は対流性のクロマトグラフィー材料を利用してもよい。従来のクロマトグラフィー材料は、例えば、灌流性の材料（例えば、ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）樹脂）及び拡散性の材料（例えば、架橋アガロース樹脂）を含む。いくつかの実施態様において、ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）樹脂は、Ｐｏｒｏｓ樹脂であり得る。いくつかの実施態様において、架橋アガロース樹脂は、スルホプロピル−Sepharose Fast Flow（「ＳＰＳＦＦ」）樹脂であってもよい。対流性のクロマトグラフィー材料は、膜（例えば、ポリエーテルスルホン）又はモノリス材料（例えば架橋ポリマー）であってもよい。ポリエーテルスルホンの膜は、Ｍｕｓｔａｎｇであってもよい。架橋ポリマーのモノリス材料は、架橋ポリ（メタクリル酸グリシジル−コ−ジメタクリル酸エチレン）であってもよい。
【００７３】
本明細書に記載の方法の何れかのいくつかの実施態様において、クロマトグラフィー材料はクロマトグラフィーカラム中；例えば、陽イオン交換クロマトグラフィーカラム又は陰イオン交換クロマトグラフィーカラム中にある。いくつかの実施態様において、クロマトグラフィーカラムは液体クロマトグラフィーに使用される。いくつかの実施態様において、クロマトグラフィーカラムは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に使用される。いくつかの実施態様において、クロマトグラフィーカラムはＨＰＬＣクロマトグラフィーカラム中；例えば、陽イオン交換ＨＰＬＣカラム又は陰イオン交換ＨＰＬＣカラム中にある。
【００７４】
陽イオン交換材料の例は、当該技術分野で知られており、限定するものではないが、Mustang S、Sartobind S、SO3 Monolith、S Ceramic HyperD、Poros XS、Poros HS50、Poros HS20、SPSFF、SP-Sepharose XL (SPXL)、CM Sepharose Fast Flow、Capto S、Fractogel Se HiCap、Fractogel SO3、又はFractogel COOを含む。本明細書に記載の方法の何れかのいくつかの実施態様において、陽イオン交換材料は、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ５０である。いくつかの実施態様において、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ樹脂は、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ ５０μｍ粒子又はＰｏｒｏｓ ＨＳ ２０μｍ粒子であってもよい。本発明の方法での使用のための陽イオン交換クロマトグラフィーカラムの例は、ＰｒｏＰａｃ ＷＣＸ−１０及びＰｒｏＰａｃ ＷＣＸ−１０ＨＴを含むがこれらに限定されない。
【００７５】
陰イオン交換材料の例は、当該技術分野で知られており、限定するものではないが、Poros HQ 50、Poros PI 50、Poros D、Mustang Q、Q Sepharose FF及びDEAE Sepharoseを含む。本発明の方法での使用のための陰イオン交換クロマトグラフィーカラムの例はＤｉｏｎｅｘ ＰｒｏＰａｃ １０ ＳＡＸ及びＴｏｓｏｈ ＧＳＫｇｅｌ Ｑ ＳＴＡＴ ７μＭ ＷＡＸを含むがこれらに限定されない。
【００７６】
本発明の方法に使用されてもよい例示的なＨＰＬＣ手順は以下の通りであるが、本発明の方法は、これらの手順により制約されると解釈されない。試料をオートサンプラーに付加し、冷蔵する（５±３℃）。カラムをカラムコンパートメントに置き、分析中、コンパートメントの温度を設定点から狭い範囲内（±１℃）に維持するために温度調節機能を用いてもよい。カラム溶出物を２８０ｎｍでモニターする。
【００７７】
試料を移動相でおよそ１〜２ｍｇ／ｍＬの目標ポリペプチド濃度に希釈する。いくつかの実施態様において、ポリペプチドはカルボキシペプチダーゼＢ（ＣｐＢ）で消化され、１：１００（ｗ／ｗ）の比率で付加され、３７℃で２０分間インキュベートされてもよい。試料は分析するまで５℃で保管されてもよい。
【００７８】
機器は、低圧四元勾配ポンプ、温度調節能力を有する高速分離オートサンプラー、熱制御カラムコンパートメント及びダイオードアレイＵＶ検出器を含んでもよい。ＰＣＭ−３０００ ｐＨ及び導電率モニターは、検出器の出口で、リアルタイムでｐＨ及び導電率データを収集するように接続されてもよい。機器制御、データ習得及びデータ分析は、例えば、Thermo Scientific Dionex Chromeleonソフトウェア、バージョン６．８を使用して実施され得る。
【００７９】
移動相調製物の非限定的な例は、以下の通りである。トリス及びイミダゾールの個々のストックバッファー溶液は１．０Ｍで調製され、ＣＡＰＳの溶液は、ｐＨ値を調整せずに０．１  Ｍの濃度で調製され、室温で保管される。個々の成分は、およそ９０％の目標体積中で、脱イオン水を使用して１０ｍＭの最終濃度に希釈され、混合できるようにされる。溶液が最終体積にクエンチされた時点で、混合物は二つの等量のアリコートに分割される。
【００８０】
バッファーのｐＨ値は、塩化水素酸により６．０（バッファーＡ）に、及び、水酸化ナトリウムにより１１．０（バッファーＢ）に調整される。塩化ナトリウムは、脱イオン水（バッファーＣ）で０．１  Ｍ溶液として調製される。ＭｉｌｌｉＱ水（１８ＭＯｈｍｓ）は、別個の容器中に分配される（バッファーＤ）。次いで、全ての移動相は、使用前に、０．２μｍナイロンフィルターを通じて個別に濾過される。
【００８１】
陽イオン交換クロマトグラフィーの非限定的な例は、以下の通りである。モノクローナル抗体試料は、バッファーＡとバッファーＤが１：１の混合物で１ｍｇ／ｍＬに希釈され、５±３℃でオートサンプラー中に保たれる。Ｐｒｏｐａｃ ＷＣＸ−１０ＨＴ、４ｘ５０ ｍｍカラムは、４０±１℃の温度設定でカラムコンパートメント中に置かれる。各クロマトグラフ実行に関して、２０μＬのタンパク質（２０μｇ）が注入される。移動相の流量は、１．０ｍＬ／分である。タンパク質は、２８０ｎｍでの紫外線（ＵＶ）吸光度により検出される。
【００８２】
いくつかの例において、複合ｐＨ勾配は、バッファーＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ使用の四元ポンプ上に形成される四元勾配を使用して確立される。この配置は、１）バッファーＡ及びＢを使用しての出発及び終了ｐＨ、及び２）バッファーＣ及びＤを使用しての各勾配に係る塩の量を調整するフレキシビリティを提供する。例えば、１０ｍＭの一定塩濃度を有する６から１０のｐＨ勾配は、バッファーＢを０から４０％へ増加させる一方、バッファーＣ及びＤをそれぞれ１０％及び４０％に維持することにより、確立される。複合勾配の例は、以下の実施例の表２で提供される。
【００８３】
様々なバッファーが、例えば、バッファーの所望のｐＨ、バッファーの所望の導電率、目的とするタンパク質の特性及び分析的方法に依拠して用いられ得る。
【００８４】
溶出とは、本明細書において使用される場合、クロマトグラフィー材料から産物、例えばポリペプチド及び／又は混入物を除去することである。溶出バッファーは、クロマトグラフィー材料からポリペプチド又は目的とするその他の産物を溶出するために使用されるバッファーである。いくつかの実施態様において、溶出バッファーは、クロマトグラフィーの移動相の一部である。いくつかの実施態様において、ポリペプチド及び混入物を含む組成物は、移動相の一部としてクロマトグラフィー材料に適用される。次いで、ポリペプチド及び混入物がクロマトグラフィー材料から溶出する際、移動相は、混入物からのポリペプチドの分離が可能になるように変更される。多くの場合、溶出バッファーは、ロードバッファーとは異なる物理的特性を有する。例えば、溶出バッファーは、ロードバッファーとは異なるｐＨ及び／又はロードバッファーとは異なるイオン強度を有してもよい。いくつかの実施態様において、ポリペプチド及び混入物は、溶出バッファーのｐＨ及びイオン強度を変更することにより、クロマトグラフィー材料から溶出する。いくつかの実施態様において、溶出バッファーのｐＨ及び溶出バッファーのイオン強度は、ロードバッファーと比較して、溶出中に増加する。いくつかの実施態様において、溶出バッファーのｐＨは、ロードバッファーと比較して、溶出中に増加し、溶出バッファーのイオン強度は、基本的に同一のままである。
【００８５】
本発明のいくつかの実施態様において、ｐＩ＞９を有するポリペプチドは、陽イオン交換クロマトグラフィー材料に適用され、ポリペプチドは、クロマトグラフィーの移動相のｐＨ及びイオン強度を増加させることにより、陽イオン交換クロマトグラフィー材料から溶出する。本発明のいくつかの実施態様において、ｐＩ＞９を有するポリペプチドは、陽イオン交換クロマトグラフィー材料に適用され、ポリペプチドは、クロマトグラフィーの移動相のｐＨを増加させる一方、移動相のイオン強度を維持することにより、陽イオン交換クロマトグラフィー材料から溶出する。
【００８６】
本発明のいくつかの実施態様において、ｐＩ＜７を有するポリペプチドは、陰イオン交換クロマトグラフィー材料に適用され、ポリペプチドは、クロマトグラフィーの移動相のｐＨを減少させ、クロマトグラフィーの移動相のイオン強度を増加させることにより、陰イオン交換クロマトグラフィー材料から溶出する。本発明のいくつかの実施態様において、ｐＩ＜７を有するポリペプチドは、陰イオン交換クロマトグラフィー材料に適用され、ポリペプチドは、クロマトグラフィーの移動相のｐＨを減少させる一方、移動相のイオン強度を維持することにより、陰イオン交換クロマトグラフィー材料から溶出する。
【００８７】
上記の実施態様の何れかのいくつかの態様において、溶出バッファーのｐＨは、直線勾配又は段階勾配によりロードバッファーから変化する。
【００８８】
本発明のいくつかの実施態様において、ポリペプチドは、移動相における溶出バッファーのｐＨを増加させることにより、クロマトグラフィー材料から溶出する。いくつかの実施態様において、溶出バッファーのｐＨは約５から約１１へ増加する。いくつかの実施態様において、溶出バッファーのｐＨは約６から約９へ増加する。いくつかの実施態様において、溶出バッファーのｐＨは約６から約１０へ増加する。いくつかの実施態様において、溶出バッファーのｐＨは約６から約１１へ増加する。いくつかの実施態様において、溶出バッファーのｐＨは約７から約９へ増加する。いくつかの実施態様において、溶出バッファーのｐＨは約７から約１０へ増加する。いくつかの実施態様において、溶出バッファーのｐＨは約７から約１１へ増加する。いくつかの実施態様において、溶出バッファーのｐＨは約８から約９へ増加する。いくつかの実施態様において、溶出バッファーのｐＨは約８から約１０へ増加する。いくつかの実施態様において、溶出バッファーのｐＨは約８から約１１へ増加する。いくつかの実施態様において、溶出バッファーのｐＨは約９から約１１へ増加する。上記の実施態様の何れにおいても、溶出バッファーのｐＨにおける増加は、溶出バッファーのイオン強度における増加と組み合される。上記の実施態様の何れかのその他の実施態様において、溶出バッファーのｐＨは増加されるが、溶出バッファーのイオン強度は、基本的に同一のままである。上記の実施態様の何れにおいても、ｐＨ勾配は、約１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分又は６０分の何れかを超えて確立される。上記の実施態様の何れにおいても、クロマトグラフィー材料は陽イオン交換クロマトグラフィー材料である。上記の実施態様の何れにおいても、ポリペプチドはｐＩ＞９を有する。上記の実施態様の何れにおいても、ポリペプチドは抗体又はその断片である。
【００８９】
本発明のいくつかの実施態様において、ポリペプチドは、移動相における溶出バッファーのｐＨを減少させることにより、クロマトグラフィー材料から溶出する。いくつかの実施態様において、溶出バッファーのｐＨは約９から約５へ減少する。いくつかの実施態様において、溶出バッファーのｐＨは約９から約６へ減少する。いくつかの実施態様において、溶出バッファーのｐＨは約９から約７へ減少する。いくつかの実施態様において、溶出バッファーのｐＨは約８から約５へ減少する。いくつかの実施態様において、溶出バッファーのｐＨは約８から約６へ減少する。いくつかの実施態様において、溶出バッファーのｐＨは約８から約７へ減少する。いくつかの実施態様において、溶出バッファーのｐＨは約７から約５へ減少する。上記の実施態様の何れにおいても、溶出バッファーのｐＨにおける減少は、溶出バッファーのイオン強度における増加と組み合される。上記の実施態様の何れかのその他の実施態様において、溶出バッファーのｐＨは減少するが、溶出バッファーのイオン強度は、基本的に同一のままである。上記の実施態様の何れにおいても、ｐＨ勾配は、約１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分又は６０分の何れかを超えて確立される。上記の実施態様の何れにおいても、クロマトグラフィー材料は陰イオン交換クロマトグラフィー材料である。上記の実施態様の何れにおいても、ポリペプチドはｐＩ＜７を有する。上記の実施態様の何れにおいても、ポリペプチドは抗体又はその断片である。
【００９０】
溶出バッファーは、当該技術分野で知られるバッファーを使用して、特定のｐＨを用いて調製され得る。バッファーの例は、ピペラジン、イミダゾール、トリス、ホスフェート、及びＮ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）を含むがこれらに限定されない。いくつかの実施態様において、バッファーのｐＨは、例えば、バッファーをより酸性にするためにＨＣｌを付加することにより、又はバッファーをより塩基性にするためにＮａＯＨを付加することにより、調製されてもよい。いくつかの実施態様において、溶出バッファーはバッファーの組み合わせを含む。いくつかの実施態様において、溶出バッファーは、ピペラジン、イミダゾール及びトリスの組み合わせ（例えばＰＩＴバッファー）を含む。いくつかの実施態様において、溶出バッファーは、１１．６ｍＭ ピペラジン、１．５ｍＭ イミダゾール及び２．４ｍＭ トリスを含む。いくつかの実施態様において、溶出バッファーは、４ｍＭ ピペラジン、４ｍＭ イミダゾール及び４ｍＭ トリスを含む。本発明のいくつかの実施態様において、ピペラジン、イミダゾール及びトリスの組み合わせを含む溶出バッファーは、ポリペプチドの陽イオン交換クロマトグラフィーの移動相で使用される。本発明のいくつかの実施態様において、ピペラジン、イミダゾール及びトリスの組み合わせを含む溶出バッファーは、ｐＩ＞９を有するポリペプチドの陽イオン交換クロマトグラフィーの移動相で使用される。本発明のいくつかの実施態様において、ピペラジン、イミダゾール及びトリスの組み合わせを含む溶出バッファーは、抗体の陽イオン交換クロマトグラフィーの移動相で使用される。本発明のいくつかの実施態様において、ピペラジン、イミダゾール及びトリスの組み合わせを含む溶出バッファーは、ｐＩ＞９を有する抗体の陽イオン交換クロマトグラフィーの移動相で使用される。本発明のいくつかの実施態様において、ピペラジン、イミダゾール及びトリスの組み合わせを含む溶出バッファーは、ポリペプチドの陰イオン交換クロマトグラフィーの移動相で使用される。本発明のいくつかの実施態様において、ピペラジン、イミダゾール及びトリスの組み合わせを含む溶出バッファーは、ｐＩ＜７を有するポリペプチドの陰イオン交換クロマトグラフィーの移動相で使用される。本発明のいくつかの実施態様において、ピペラジン、イミダゾール及びトリスの組み合わせを含む溶出バッファーは、抗体の陰イオン交換クロマトグラフィーの移動相で使用される。本発明のいくつかの実施態様において、ピペラジン、イミダゾール及びトリスの組み合わせを含む溶出バッファーは、ｐＩ＜７を有する抗体の陰イオン交換クロマトグラフィーの移動相で使用される。いくつかの実施態様において、溶出バッファーは、トリス、ピペラジン及びホスフェートの組み合わせ（例えばＴＰＰバッファー）を含む。いくつかの実施態様において、溶出バッファーは、５ｍＭ トリス、５ｍＭ ピペラジン及び５ｍＭ ホスフェートを含む。いくつかの実施態様において、溶出バッファーは、１０ｍＭ トリス、１０ｍＭ ピペラジン及び１０ｍＭ ホスフェートを含む。本発明のいくつかの実施態様において、トリス、ピペラジン及びホスフェートの組み合わせを含む溶出バッファーは、ポリペプチドの陽イオン交換クロマトグラフィーの移動相で使用される。本発明のいくつかの実施態様において、トリス、ピペラジン及びホスフェートの組み合わせを含む溶出バッファーは、ｐＩ＞９を有するポリペプチドの陽イオン交換クロマトグラフィーの移動相で使用される。本発明のいくつかの実施態様において、トリス、ピペラジン及びホスフェートの組み合わせを含む溶出バッファーは、抗体の陽イオン交換クロマトグラフィーの移動相で使用される。本発明のいくつかの実施態様において、トリス、ピペラジン及びホスフェートの組み合わせを含む溶出バッファーは、ｐＩ＞９を有する抗体の陽イオン交換クロマトグラフィーの移動相で使用される。いくつかの実施態様において、溶出バッファーは、トリス、イミダゾール及びＣＡＰＳの組み合わせ（例えばＴＩＣバッファー）を含む。いくつかの実施態様において、溶出バッファーは、５ｍＭ トリス、５ｍＭ イミダゾール及び５ｍＭ ＣＡＰＳを含む。本発明のいくつかの実施態様において、トリス、イミダゾール及びＣＡＰＳの組み合わせを含む溶出バッファーは、ポリペプチドの陽イオン交換クロマトグラフィーの移動相で使用される。本発明のいくつかの実施態様において、トリス、イミダゾール及びＣＰＡＳの組み合わせを含む溶出バッファーは、ｐＩ＞９を有するポリペプチドの陽イオン交換クロマトグラフィーの移動相で使用される。本発明のいくつかの実施態様において、トリス、イミダゾール及びＣＡＰＳの組み合わせを含む溶出バッファーは、抗体の陽イオン交換クロマトグラフィーの移動相で使用される。本発明のいくつかの実施態様において、トリス、イミダゾール及びＣＰＡＳの組み合わせを含む溶出バッファーは、ｐＩ＞９を有する抗体の陽イオン交換クロマトグラフィーの移動相で使用される。
【００９１】
本発明のいくつかの実施態様において、上記のように溶出バッファーのｐＨを増加させることにより、及び移動相における溶出バッファーのイオン強度を増加させ、それによってｐＨ勾配及びイオン強度勾配を形成することにより、ポリペプチドはクロマトグラフィー材料から溶出する。いくつかの実施態様において、溶出バッファーのイオン強度は、クロマトグラフィーの移動相の塩濃度を増加させることにより、増加する。本発明のその他の実施態様において、溶出中の塩濃度を維持することにより、溶出バッファーのイオン強度が溶出中に基本的に同一のままである、溶出バッファーのｐＨを増加させることにより、ポリペプチドはクロマトグラフィー材料から溶出する。いくつかの実施態様において、塩濃度は、ポリペプチドの荷電状態が最適なｐＨ勾配イオン交換クロマトグラフィー分離ウィンドウを提供するように選定される。ポリペプチドの荷電状態は、当該技術分野で知られるモデル化手順により決定され得る。塩の例は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ及びＮａ２ＳＯ４を含むがこれらに限定されない。
【００９２】
いくつかの実施態様において、イオン強度勾配は塩勾配である。いくつかの実施態様において、塩勾配は約０ｍＭ塩から約２００ｍＭ塩の勾配である。いくつかの実施態様において、塩勾配は、約０ｍＭから約１００ｍＭ、０ｍＭから約６０ｍＭ、０ｍＭから約５０ｍＭ、０ｍＭから約４０ｍＭ、０ｍＭから約３０ｍＭ、０ｍＭから約２０ｍＭ、０ｍＭから約１０ｍＭ、１０ｍＭから約２００ｍＭ、１０ｍＭから約１００ｍＭ、１０ｍＭから約５０ｍＭ、１０ｍＭから約４０ｍＭ、１０ｍＭから約３０ｍＭ、１０ｍＭから約２０ｍＭ、２０ｍＭから約２００ｍＭ、２０ｍＭから約１００ｍＭ、２０ｍＭから約５０ｍＭ、２０ｍＭから約３０ｍＭ、３０ｍＭから約２００ｍＭ、３０ｍＭから約１００ｍＭ、及び３０ｍＭから約５０ｍＭの何れかである。
【００９３】
上記の実施態様のいくつかの実施態様において、ポリペプチド及び／又は一若しくは複数の混入物は、ｐＨ勾配とイオン強度勾配との組み合わせにより、クロマトグラフィー材料から溶出する。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ５からｐＨ１０．８であり、イオン強度勾配は０ｍＭ塩から１６ｍＭ塩である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ６からｐＨ１１であり、イオン強度勾配は０ｍＭ塩から６０ｍＭ塩である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ５からｐＨ９．５であり、イオン強度勾配は０ｍＭ塩から１６ｍＭ塩である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ５からｐＨ９．５であり、イオン強度勾配は０ｍＭ塩から３０ｍＭ塩である。上記の実施態様の何れにおいても、塩はＮａＣｌ、ＫＣｌ又はＮａ２ＳＯ４である。上記の実施態様の何れにおいても、クロマトグラフィー材料は陽イオン交換クロマトグラフィー材料である。上記の実施態様の何れにおいても、ポリペプチドはｐＩ＞９を有する。上記の実施態様の何れにおいても、ポリペプチドはｐＩ＞９を有する抗体である。
【００９４】
本発明のいくつかの実施態様において、ポリペプチド及び／又は一若しくは複数の混入物は、ポリペプチド及び／又は一若しくは複数の混入物が、ｐＨ勾配とイオン強度勾配との組み合わせによりクロマトグラフィー材料から溶出する、イオン交換クロマトグラフィーにより分析される。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ７からｐＨ５であり、イオン強度勾配は０ｍＭ塩から２５ｍＭ塩である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ７からｐＨ５であり、イオン強度勾配は０ｍＭ塩から１００ｍＭ塩である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ７からｐＨ５であり、イオン強度勾配は０ｍＭ塩から２００ｍＭ塩である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ７からｐＨ５であり、イオン強度勾配は０ｍＭ塩から３００ｍＭ塩である。上記の実施態様の何れにおいても、塩はＮａＣｌ、ＫＣｌ又はＮａ２ＳＯ４である。上記の実施態様の何れにおいても、クロマトグラフィー材料は陰イオン交換クロマトグラフィー材料である。上記の実施態様の何れにおいても、ポリペプチドはｐＩ＜７を有する。上記の実施態様の何れにおいても、ポリペプチドはｐＩ＜７を有する抗体である。
【００９５】
本発明のいくつかの実施態様において、ポリペプチド及び／又は一若しくは複数の混入物は、ポリペプチド及び／又は一若しくは複数の混入物が、移動相のイオン強度が溶出中に基本的に同一のままであるｐＨ勾配によりクロマトグラフィー材料から溶出する、イオン交換クロマトグラフィーにより分析される。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ６からｐＨ１１であり、移動相のイオン強度は約１０ｍＭ塩である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ６からｐＨ１１であり、移動相のイオン強度は約２０ｍＭ塩である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ６からｐＨ１１であり、移動相のイオン強度は約３０ｍＭ塩である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ６からｐＨ１１であり、移動相のイオン強度は約４０ｍＭ塩である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ６からｐＨ１１であり、移動相のイオン強度は約５０ｍＭ塩である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ６からｐＨ１０であり、移動相のイオン強度は約１０ｍＭ塩である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ６からｐＨ１０であり、移動相のイオン強度は約２０ｍＭ塩である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ６からｐＨ１０であり、移動相のイオン強度は約３０ｍＭ塩である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ６からｐＨ１０であり、移動相のイオン強度は約４０ｍＭ塩である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ６からｐＨ１０であり、移動相のイオン強度は約５０ｍＭ塩である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ６からｐＨ９であり、移動相のイオン強度は約１０ｍＭ塩である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ６からｐＨ９であり、移動相のイオン強度は約２０ｍＭ塩である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ６からｐＨ９であり、移動相のイオン強度は約３０ｍＭ塩である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ６からｐＨ９であり、移動相のイオン強度は約４０ｍＭ塩である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ６からｐＨ９であり、移動相のイオン強度は約５０ｍＭ塩である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ７からｐＨ１１であり、移動相のイオン強度は約１０ｍＭ塩である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ７からｐＨ１１であり、移動相のイオン強度は約２０ｍＭ塩である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ７からｐＨ１１であり、移動相のイオン強度は約３０ｍＭ塩である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ７からｐＨ１１であり、移動相のイオン強度は約４０ｍＭ塩である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ７からｐＨ１１であり、移動相のイオン強度は約５０ｍＭ塩である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ７からｐＨ１０であり、移動相のイオン強度は約１０ｍＭ塩である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ７からｐＨ１０であり、移動相のイオン強度は約２０ｍＭ塩である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ７からｐＨ１０であり、移動相のイオン強度は約３０ｍＭ塩である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ７からｐＨ１０であり、移動相のイオン強度は約４０ｍＭ塩である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ７からｐＨ１０であり、移動相のイオン強度は約５０ｍＭ塩である。上記の実施態様の何れにおいても、塩はＮａＣｌ、ＫＣｌ又はＮａ２ＳＯ４である。上記の実施態様の何れにおいても、クロマトグラフィー材料は陽イオン交換クロマトグラフィー材料である。上記の実施態様の何れにおいても、ポリペプチドはｐＩ＞９を有する。上記の実施態様の何れにおいても、ポリペプチドはｐＩ＞９を有する抗体である。
【００９６】
本発明のいくつかの実施態様において、ポリペプチド及び／又は一若しくは複数の混入物は、ポリペプチド及び／又は一若しくは複数の混入物が、移動相のイオン強度が溶出中に基本的に同一のままであるｐＨ勾配の組み合わせによりクロマトグラフィー材料から溶出する、イオン交換クロマトグラフィーにより分析される。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ８からｐＨ５であり、移動相のイオン強度は約１０ｍＭ塩である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ８からｐＨ５であり、移動相のイオン強度は約２０ｍＭ塩である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ８からｐＨ５であり、移動相のイオン強度は約３０ｍＭ塩である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ８からｐＨ５であり、移動相のイオン強度は約４０ｍＭ塩である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ８からｐＨ５であり、移動相のイオン強度は約５０ｍＭ塩である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ８からｐＨ５であり、移動相のイオン強度は約１００ｍＭ塩である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ８からｐＨ５であり、移動相のイオン強度は約２００ｍＭ塩である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ７からｐＨ５であり、移動相のイオン強度は約１０ｍＭ塩である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ７からｐＨ５であり、移動相のイオン強度は約２０ｍＭ塩である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ７からｐＨ５であり、移動相のイオン強度は約３０ｍＭ塩である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ７からｐＨ５であり、移動相のイオン強度は約４０ｍＭ塩である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ７からｐＨ５であり、移動相のイオン強度は約５０ｍＭ塩である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ７からｐＨ５であり、移動相のイオン強度は約１００ｍＭ塩である。いくつかの実施態様において、ｐＨ勾配はｐＨ７からｐＨ５であり、移動相のイオン強度は約２００ｍＭ塩である。上記の実施態様の何れにおいても、塩はＮａＣｌ、ＫＣｌ又はＮａ２ＳＯ４である。上記の実施態様の何れにおいても、クロマトグラフィー材料は陰イオン交換クロマトグラフィー材料である。上記の実施態様の何れにおいても、ポリペプチドはｐＩ＜７を有する。上記の実施態様の何れにおいても、ポリペプチドはｐＩ＜７を有する抗体である。
【００９７】
本発明のいくつかの実施態様において、移動相、例えば溶出バッファーのイオン強度は、移動相の導電率により測定される。導電率とは、二つの電極間の電流を導電する水溶液の能力を指す。溶液中、電流はイオン輸送により流れる。したがって、水溶液中のイオン量が増加すると、溶液はより高い導電率を有することになる。導電率の基本測定単位は、Ｓｉｅｍｅｎ（又はｍｈｏ）、ｍｈｏ（ｍＳ／ｃｍ）であり、Ｏｒｉｏｎ導電率計の様々なモデル等の導電率計を使用して測定され得る。電解導電率は溶液中のイオンの電流を流す能力であるため、溶液の導電率は、その中のイオンの濃度を変化させることにより変更されてもよい。例えば、溶液中のバッファー剤の濃度及び／又は塩（例えば塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム及び塩化カリウム）の濃度は、所望の導電率を達成するために変更されてもよい。好ましくは、様々なバッファーの塩濃度は、所望の導電率を達成するために改変される。
【００９８】
いくつかの実施態様において、クロマトグラフィーの移動相は、約０．０ｍＳ／ｃｍ、０．５ｍＳ／ｃｍ、１．０ｍＳ／ｃｍ、１．５ｍＳ／ｃｍ、２．０ｍＳ／ｃｍ、２．５ｍＳ／ｃｍ、３．０ｍＳ／ｃｍ、３．５ｍＳ／ｃｍ、４．０ｍＳ／ｃｍ、４．５ｍＳ／ｃｍ、５．０ｍＳ／ｃｍ、５．５ｍＳ／ｃｍ、６．０ｍＳ／ｃｍ、６．５ｍＳ／ｃｍ、７．０ｍＳ／ｃｍ、７．５ｍＳ／ｃｍ、８．０ｍＳ／ｃｍ、８．５ｍＳ／ｃｍ、９．０ｍＳ／ｃｍ、９．５ｍＳ／ｃｍ、１０ｍＳ／ｃｍ、１１ｍＳ／ｃｍ、１２ｍＳ／ｃｍ、１３ｍＳ／ｃｍ、１４ｍＳ／ｃｍ、１５ｍＳ／ｃｍ、１６ｍＳ／ｃｍ、１７．０ｍＳ／ｃｍ、１８．０ｍＳ／ｃｍ、１９．０ｍＳ／ｃｍ、又は２０．０ｍＳ／ｃｍの何れかより大きい初期導電率を有する。いくつかの実施態様において、移動相の導電率は、例えばイオン強度勾配により、クロマトグラフィー中に増加する。いくつかの実施態様において、溶出完了時の移動相の導電率は、約１．０ｍＳ／ｃｍ、１．５ｍＳ／ｃｍ、２．０ｍＳ／ｃｍ、２．５ｍＳ／ｃｍ、３．０ｍＳ／ｃｍ、３．５ｍＳ／ｃｍ、４．０ｍＳ／ｃｍ、４．５ｍＳ／ｃｍ、５．０ｍＳ／ｃｍ、５．５ｍＳ／ｃｍ、６．０ｍＳ／ｃｍ、６．５ｍＳ／ｃｍ、７．０ｍＳ／ｃｍ、７．５ｍＳ／ｃｍ、８．０ｍＳ／ｃｍ、８．５ｍＳ／ｃｍ、９．０ｍＳ／ｃｍ、９．５ｍＳ／ｃｍ、１０ｍＳ／ｃｍ、１１ｍＳ／ｃｍ、１２ｍＳ／ｃｍ、１３ｍＳ／ｃｍ、１４ｍＳ／ｃｍ、１５ｍＳ／ｃｍ、１６ｍＳ／ｃｍ、１７．０ｍＳ／ｃｍ、１８．０ｍＳ／ｃｍ、１９．０ｍＳ／ｃｍ、又は２０．０ｍＳ／ｃｍの何れかより大きい。いくつかの実施態様において、移動相の導電率は、直線勾配により増加する。いくつかの実施態様において、移動相の導電率は、一又は複数の工程を含む段階勾配により増加する。
【００９９】
いくつかの実施態様において、ポリペプチドの溶出時のクロマトグラフィーの移動相の初期導電率及び移動相の最終導電率は、基本的に同一である。いくつかの実施態様において、移動相の導電率は、基本的に約０．０ｍＳ／ｃｍ、０．５ｍＳ／ｃｍ、１．０ｍＳ／ｃｍ、１．５ｍＳ／ｃｍ、２．０ｍＳ／ｃｍ、２．５ｍＳ／ｃｍ、３．０ｍＳ／ｃｍ、３．５ｍＳ／ｃｍ、４．０ｍＳ／ｃｍ、４．５ｍＳ／ｃｍ、５．０ｍＳ／ｃｍ、５．５ｍＳ／ｃｍ、６．０ｍＳ／ｃｍ、６．５ｍＳ／ｃｍ、７．０ｍＳ／ｃｍ、７．５ｍＳ／ｃｍ、８．０ｍＳ／ｃｍ、８．５ｍＳ／ｃｍ、９．０ｍＳ／ｃｍ、９．５ｍＳ／ｃｍ、１０ｍＳ／ｃｍ、１１ｍＳ／ｃｍ、１２ｍＳ／ｃｍ、１３ｍＳ／ｃｍ、１４ｍＳ／ｃｍ、１５ｍＳ／ｃｍ、１６ｍＳ／ｃｍ、１７．０ｍＳ／ｃｍ、１８．０ｍＳ／ｃｍ、１９．０ｍＳ／ｃｍ、又は２０．０ｍＳ／ｃｍの何れかより大きいままである。
【０１００】
本明細書に記載の方法の何れかのいくつかの実施態様において、ポリペプチド及び一又は複数の混入物を含む組成物は、約１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇ、１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ、２５μｇ、又は５０μｇの何れかより大きい量でクロマトグラフィー材料にロードされる。いくつかの実施態様において、組成物は、約０．５ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ／ｍＬ、２．０ｍｇ／ｍＬ、２．５ｍｇ／ｍＬ、及び５．０ｍｇ／ｍＬの何れかより大きい濃度でクロマトグラフィー材料にロードされる。いくつかの実施態様において、組成物は、クロマトグラフィー材料にロードされる前に希釈される；例えば、１：１、１：２、１：５、１：１０又は１：１０超で希釈される。いくつかの実施態様において、組成物はクロマトグラフィーの移動相中に希釈される。いくつかの実施態様において、組成物はローディングバッファー中に希釈される。
【０１０１】
本明細書に記載の方法の何れかのいくつかの実施態様において、流量は、約０．５ｍＬ／分、０．６ｍＬ／分、０．７ｍＬ／分、０．８ｍＬ／分、０．９ｍＬ／分、１．０ｍＬ／分、１．１ｍＬ／分、１．２ｍＬ／分、１．３ｍＬ／分、１．４ｍＬ／分、１．５ｍＬ／分、１．７５ｍＬ／分及び２．０ｍＬ／分の何れかより大きい。
【０１０２】
本明細書に記載の方法の何れかのいくつかの実施態様において、クロマトグラフィー材料はカラムである。いくつかの実施態様において、カラムはＨＰＬＣカラムである。いくつかの実施態様において、カラムは以下の寸法の何れか一つを有する：４×５０ｍｍ、４×１００ｍｍ、４×１５０ｍｍ、４×２００ｍｍ、４×２５０ｍｍ、又は２×２５０ｍｍ。
【０１０３】
本発明のいくつかの実施態様において、方法はロバストである；即ち、一又は複数の実行パラメータは、分析結果（例えば、主ピーク及び混入物ピークの相対的割合）に影響を及ぼすことなく、摂動を与えられ得る。いくつかの実施態様において、ローディングバッファー及び／又は溶出バッファー中のバッファー濃度は、約１０ｍＭから５０ｍＭ、１０ｍＭから４０ｍＭ、１０ｍＭから３０ｍＭ、１０ｍＭから２０ｍＭ、２０ｍＭから５０ｍＭ、２０ｍＭから４０ｍＭ、２０ｍＭから３０ｍＭ、３０ｍＭから５０ｍＭ、３０ｍＭから４０ｍＭ、又は４０ｍＭから５０ｍＭの何れか一つで変化する。いくつかの実施態様において、ローディングバッファー及び／又は溶出バッファー中のバッファー濃度は、約１０ｍＭから約２０ｍＭで変化する。いくつかの実施態様において、最初のｐＨは、約ｐＨ５．０からｐＨ７．０、ｐＨ５．０からｐＨ６．５、ｐＨ５．０からｐＨ６．０，ｐＨ５．０からｐＨ５．５、ｐＨ５．５からｐＨ７．０、ｐＨ５．５からｐＨ６．５、ｐＨ５．５からｐＨ６．０、ｐＨ６．０からｐＨ７．０、ｐＨ６．０からｐＨ６．５又はｐＨ６．５からｐＨ７．０の何れか一つで変化する。いくつかの実施態様において、最初のｐＨは、約ｐＨ５．７から約  ｐＨ６．３で変化する。いくつかの実施態様において、クロマトグラフィー材料の温度は、約２０℃から５０℃、２５℃から５０℃、３０℃から５０℃、３５℃から５０℃、４０℃から５０℃、４５℃から５０℃、２０℃から４５℃、２５℃から４５℃、３０℃から４５℃、３５℃から４５℃、４０℃から４５℃、２０℃から４０℃、２５℃から４０℃、３０℃から４０℃、３５℃から４０℃、２０℃から３５℃、２５℃から３５℃、３０℃から３５℃、２０℃から３０℃、２５℃から３０℃又は２０℃から２５℃の何れか一つで変化する。いくつかの実施態様において、クロマトグラフィー材料の温度は、約３６℃から約４４℃で変化する。いくつかの実施態様において、ローディング及び溶出は、約０．５ｍｌ／分から２．０ｍｌ／分、０．８ｍｌ／分から２．０ｍｌ／分、１．０ｍｌ／分から２．０ｍｌ／分、１．２ｍｌ／分から２．０ｍｌ／分、１．５ｍｌ／分から２．０ｍｌ／分、１．８ｍｌ／分から２．０ｍｌ／分、０．５ｍｌ／分から１．８ｍｌ／分、０．８ｍｌ／分から１．８ｍｌ／分、１．０ｍｌ／分から１．８ｍｌ／分、１．２ｍｌ／分から１．８ｍｌ／分、１．５ｍｌ／分から１．８ｍｌ／分、０．５ｍｌ／分から１．５ｍｌ／分、０．８ｍｌ／分から１．５ｍｌ／分、１．０ｍｌ／分から１．５ｍｌ／分、１．２ｍｌ／分から１．５ｍｌ／分、０．５ｍｌ／分から１．２ｍｌ／分、０．８ｍｌ／分から１．２ｍｌ／分、１．０ｍｌ／分から１．２ｍｌ／分、０．５ｍｌ／分から１．０ｍｌ／分、０．８ｍｌ／分から１．０ｍｌ／分、又は０．５ｍｌ／分から０．８ｍｌ／分の何れか一つで変化する流量で行われる。いくつかの実施態様において、ローディング及び溶出は、約０．８ｍｌ／分から約１．２ｍｌ／分で変化する流量で行われる。いくつかの実施態様において、ローディング及び溶出は、約１．５ｍｌ／分から約２．０ｍｌ／分で変化する流量で実施される。更なる実施態様において、バッファー濃度、出発ｐＨ、クロ���トグラフィー材料の温度及び／又は流量の任意の組み合わせは、上記の実施態様に従って変化し得る。
【０１０４】
電荷変異体の検出
いくつかの態様において、本発明は、ポリペプチドの組成物中にポリペプチド及び一又は複数の変異体を含む組成物中のポリペプチドの変異体を検出する方法を提供する。該方法は、初期ｐＨ及び初期イオン強度を有するローディングバッファーを使用して、ポリペプチド及び一又は複数の変異体をイオン交換クロマトグラフィー材料に結合させる工程と、溶出バッファーのｐＨがｐＨ勾配により変更され、且つ溶出バッファーのイオン強度がイオン強度勾配により変更される溶出バッファーを使用して、イオン交換カラムからポリペプチド及び一又は複数の混入物を溶出し、ポリペプチド及び一又は複数の混入物が明確に分離された構成要素としてクロマトグラフィー材料から溶出するようにする工程とを含む方法を提供する。次いで、クロマトグラフィーの溶出物は、親ポリペプチドに関して、及び変異体の有無に関して分析される。ポリペプチドの変異体は、ポリペプチドの酸性変異体及び親ポリペプチドの塩基性変異体を含んでもよい。酸性変異体、即ち親ポリペプチドのｐＩより小さいｐＩを有する変異体の例は、一若しくは複数のグルタミン及び／又はアスパラギン残基が脱アミド化されているポリペプチドを含むが、これらに限定されない。塩基性変異体、即ち親ポリペプチドのｐＩより大きいｐＩを有する変異体の例は、アスパラギン残基がスクシンイミド部分に修飾を受けている変異体を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、本発明の方法は、中性ｐＨ範囲にはない等電点を有するポリペプチドを含む組成物中のポリペプチドの変異体を検出するのに使用される。いくつかの実施態様において、該方法は、９より大きいｐＩを有するポリペプチドを含む組成物中の電荷変異体を混入物から効果的に検出するのに使用されてもよい。いくつかの実施態様において、陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、９より大きいｐＩを有するポリペプチドを含む組成物中の電荷変異体を効果的に検出するのに使用される。その他の実施態様において、該方法は、７より小さいｐＩを有するポリペプチドを混入物から効果的に分離するのに使用されてもよい。いくつかの実施態様において、陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、７より小さいｐＩを有するポリペプチドを含む組成物中の電荷変異体を効果的に検出するのに使用される。ポリペプチドの例は、抗体及び抗体断片を含むが、これらに限定されない。
【０１０５】
いくつかの態様において、本発明は、ポリペプチド及びポリペプチドの一又は複数の変異体を含む組成物中のポリペプチドの変異体を検出する方法を提供する。該方法は、初期ｐＨ及び初期イオン強度を有するローディングバッファーを使用して、ポリペプチド及び一又は複数の変異体をイオン交換クロマトグラフィー材料に結合させる工程と、溶出バッファーのｐＨがｐＨ勾配により変更され、且つ溶出バッファーのイオン強度が初期イオン強度と基本的に同一のままである溶出バッファーを使用して、イオン交換カラムからポリペプチド及び一又は複数の混入物を溶出し、ポリペプチド及び一又は複数の混入物が明確に分離された構成要素としてクロマトグラフィー材料から溶出するようにする工程とを含む。次いで、クロマトグラフィーの溶出物は、親ポリペプチドの有無及び変異体の有無に関して分析される。ポリペプチドの変異体は、ポリペプチドの酸性変異体及び親ポリペプチドの塩基性変異体を含んでもよい。酸性変異体、即ち親ポリペプチドのｐＩより小さいｐＩを有する変異体の例は、一若しくは複数のグルタミン及び／又はアスパラギン残基が脱アミド化されているポリペプチドを含むが、これらに限定されない。塩基性変異体、即ち親ポリペプチドのｐＩより大きいｐＩを有する変異体の例は、アスパラギン残基がスクシンイミド部分に修飾を受けている変異体を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、本発明の方法は、中性ｐＨ範囲にはない等電点を有するポリペプチドを含む組成物中のポリペプチドの変異体を検出するのに使用される。いくつかの実施態様において、該方法は、９より大きいｐＩを有するポリペプチドを含む組成物中の電荷変異体を効果的に検出するのに使用されてもよい。いくつかの実施態様において、陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、９より大きいｐＩを有するポリペプチドを含む組成物中の電荷変異体を効果的に検出するのに使用される。その他の実施態様において、該方法は、７より小さいｐＩを有するポリペプチドを含む組成物中の電荷変異体を効果的に検出するのに使用されてもよい。いくつかの実施態様において、陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、７より小さいｐＩを有するポリペプチドを含む組成物中の電荷変異体を効果的に検出するのに使用される。ポリペプチドの例は、抗体及び抗体断片を含むが、これらに限定されない。
【０１０６】
組成物中のポリペプチドの純度の決定
いくつかの態様において、本発明は、ポリペプチドを含む組成物中のポリペプチドの純度を決定する方法を提供する。該方法は、初期ｐＨ及び初期イオン強度を有するローディングバッファーを使用して、ポリペプチド及び一又は複数の混入物をイオン交換クロマトグラフィー材料に結合させる工程と、溶出バッファーのｐＨがｐＨ勾配により変更され、且つ溶出バッファーのイオン強度がイオン強度勾配により変更される溶出バッファーを使用して、イオン交換カラムからポリペプチド及び一又は複数の混入物を溶出し、ポリペプチド及び一又は複数の混入物が明確に分離された構成要素としてクロマトグラフィー材料から溶出するようにする工程とを含む。ポリペプチドの純度は、クロマトグラフィー材料から溶出するポリペプチドの量対クロマトグラフィー材料から溶出する混入物、例えば、電荷変異体の総量の比率を決定することにより評価され得る。いくつかの実施態様において、本発明の方法は、中性ｐＨ範囲にはない等電点を有するポリペプチドを含む組成物中のポリペプチドの純度を決定するのに使用される。いくつかの実施態様において、該方法は、９より大きいｐＩを有するポリペプチドを含む組成物中のポリペプチドの純度を混入物から効果的に決定するのに使用されてもよい。いくつかの実施態様において、陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、９より大きいｐＩを有するポリペプチドを含む組成物中のポリペプチドの純度を効果的に決定するのに使用される。その他の実施態様において、該方法は、７より小さいｐＩを有するポリペプチドを含む組成物中のポリペプチドの純度を混入物から効果的に決定するのに使用されてもよい。いくつかの実施態様において、陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、７より小さいｐＩを有するポリペプチドを含む組成物中のポリペプチドの純度を効果的に決定するのに使用される。ポリペプチドの例は、抗体及び抗体断片を含むが、これらに限定されない。
【０１０７】
いくつかの態様において、本発明は、ポリペプチドを含む組成物中のポリペプチドの純度を決定する方法を提供する。該方法は、初期ｐＨ及び初期イオン強度を有するローディングバッファーを使用して、ポリペプチド及び一又は複数の混入物をイオン交換クロマトグラフィー材料に結合させる工程と、溶出バッファーのｐＨがｐＨ勾配により変更され、且つ溶出バッファーのイオン強度が初期イオン強度と基本的に同一のままである溶出バッファーを使用して、イオン交換カラムからポリペプチド及び一又は複数の混入物を溶出し、ポリペプチド及び一又は複数の混入物が明確に分離された構成要素としてクロマトグラフィー材料から溶出するようにする工程とを含む。ポリペプチドの純度は、クロマトグラフィー材料から溶出するポリペプチドの量対クロマトグラフィー材料から溶出する混入物、例えば、電荷変異体の総量の比率を決定することにより評価され得る。いくつかの実施態様において、本発明の方法は、中性ｐＨ範囲にはない等電点を有するポリペプチドを含む組成物中のポリペプチドの純度を決定するのに使用される。いくつかの実施態様において、該方法は、９より大きいｐＩを有するポリペプチドを含む組成物中のポリペプチドの純度を混入物から効果的に決定するのに使用されてもよい。いくつかの実施態様において、陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、９より大きいｐＩを有するポリペプチドを含む組成物中のポリペプチドの純度を効果的に決定するのに使用される。その他の実施態様において、該方法は、７より小さいｐＩを有するポリペプチドを含む組成物中のポリペプチドの純度を混入物から効果的に決定するのに使用されてもよい。いくつかの実施態様において、陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、７より小さいｐＩを有するポリペプチドを含む組成物中のポリペプチドの純度を効果的に決定するのに使用される。ポリペプチドの例は、抗体及び抗体断片を含むが、これらに限定されない。
【０１０８】
組成物中のポリペプチドの安定性の決定
いくつかの態様において、本発明は、ポリペプチドを含む組成物中のポリペプチドの安定性を決定する方法を提供する。いくつかの実施態様において、ポリペプチドを含む組成物の試料は経時的に分析される。いくつかの実施態様において、組成物は、分析前に何度もインキュベートされる。いくつかの実施態様において、組成物は、分析前に約０℃、２０℃、３７℃又は４０℃の何れか一つよりも高温でインキュベートされる。いくつかの実施態様において、組成物は、分析前に１日間、２日間、３日間、５日間、１週間、２週間、３週間、４週間、６週間、２か月間、３か月間、６か月間、１年間の一又は複数でインキュベートされる。次いで、組成物は、初期ｐＨ及び初期イオン強度を有するローディングバッファーを使用して、組成物中のポリペプチド及び一又は複数の混入物をイオン交換クロマトグラフィー材料に結合させる工程と、溶出バッファーのｐＨがｐＨ勾配により変更され、且つ溶出バッファーのイオン強度がイオン強度勾配により変更される溶出バッファーを使用して、イオン交換カラムからポリペプチド及び一又は複数の混入物を溶出し、ポリペプチド及び一又は複数の混入物が明確に分離された構成要素としてクロマトグラフィー材料から溶出するようにする工程とにより、分析される。その他の実施態様において、組成物は、初期ｐＨ及び初期イオン強度を有するローディングバッファーを使用して、組成物中のポリペプチド及び一又は複数の混入物をイオン交換クロマトグラフィー材料に結合させる工程と、溶出バッファーのｐＨがｐＨ勾配により変更され、且つ溶出バッファーのイオン強度が初期イオン強度と基本的に同一のままである溶出バッファーを使用して、イオン交換カラムからポリペプチド及び一又は複数の混入物を溶出し、ポリペプチド及び一又は複数の混入物が明確に分離された構成要素としてクロマトグラフィー材料から溶出するようにする工程とにより、分析される。上記の実施態様の何れかに関して、ポリペプチド対混入物の比率における変化は、組成物中のポリペプチドの安定性を示す。例えば、ポリペプチド対混入物の比率が経時的に変化しない場合、ポリペプチドは安定していると考えられてもよいのに対し、組成物中のタンパク質量における混入物減少を有する混入物の高速蓄積は、組成物中のポリペプチドはより不安定であることを示す。いくつかの実施態様において、本発明の方法は、中性ｐＨ範囲にはない等電点を有するポリペプチドを含む組成物中のポリペプチドの安定性を決定するのに使用される。いくつかの実施態様において、該方法は、９より大きいｐＩを有するポリペプチドを含む組成物中のポリペプチドの安定性を混入物から効果的に決定するのに使用されてもよい。いくつかの実施態様において、陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、９より大きいｐＩを有するポリペプチドを含む組成物中のポリペプチドの安定性を決定するのに使用される。その他の実施態様において、該方法は、７より小さいｐＩを有するポリペプチドを含む組成物中のポリペプチドの安定性を混入物から決定するのに使用されてもよい。いくつかの実施態様において、陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、７より小さいｐＩを有するポリペプチドを含む組成物中のポリペプチドの安定性を決定するのに使用される。ポリペプチドの例は、抗体及び抗体断片を含むが、これらに限定されない。
【０１０９】
ポリペプチドの精製
いくつかの態様において、本発明は、ポリペプチド及びポリペプチドの一又は複数の変異体を含む組成物からポリペプチドを精製する方法を提供する。該方法は、初期ｐＨ及び初期イオン強度を有するローディングバッファーを使用して、ポリペプチド及び一又は複数の変異体をイオン交換クロマトグラフィー材料に結合させる工程と、溶出バッファーのｐＨがｐＨ勾配により変更され、且つ溶出バッファーのイオン強度がイオン強度勾配により変更される溶出バッファーを使用して、イオン交換カラムからポリペプチド及び一又は複数の混入物を溶出し、ポリペプチド及び一又は複数の混入物が明確に分離された構成要素としてクロマトグラフィー材料から溶出するようにする工程とを含む。断片はクロマトグラフィーの溶出相中で収集され、混入物を含まないか又は最小量の混入物を有するポリペプチドを含む断片は、更なるプロセシングに関して、又は、医薬製剤に関してプールされる。いくつかの実施態様において、本発明の方法は、中性ｐＨ範囲にはない等電点を有するポリペプチドを含む組成物中のポリペプチドを精製するのに使用される。いくつかの実施態様において、本方法は、９より大きいｐＩを有するポリペプチドを精製するのに使用されてもよい。いくつかの実施態様において、陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、９より大きいｐＩを有するポリペプチドを精製するのに使用される。その他の実施態様において、本方法は、７より小さいｐＩを有するポリペプチドを混入物から精製するのに使用されてもよい。いくつかの実施態様において、陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、７より小さいｐＩを有するポリペプチドを精製するのに使用される。ポリペプチドの例は、抗体及び抗体断片を含むが、これらに限定されない。
【０１１０】
いくつかの態様において、本発明は、ポリペプチド及びポリペプチドの一又は複数の変異体を含む組成物からポリペプチドを精製する方法を提供する。該方法は、初期ｐＨ及び初期イオン強度を有するローディングバッファーを使用して、ポリペプチド及び一又は複数の変異体をイオン交換クロマトグラフィー材料に結合させる工程と、溶出バッファーのｐＨがｐＨ勾配により変更され、且つ溶出バッファーのイオン強度が初期イオン強度と基本的に同一である溶出バッファーを使用して、イオン交換カラムからポリペプチド及び一又は複数の混入物を溶出し、ポリペプチド及び一又は複数の混入物が明確に分離された構成要素としてクロマトグラフィー材料から溶出するようにする工程とを含む。断片はクロマトグラフィーの溶出相中で収集され、ポリペプチドを含むが混入物は含まない断片は、更なるプロセシングに関して、又は、医薬製剤に関してプールされる。いくつかの実施態様において、本発明の方法は、中性ｐＨ範囲にはない等電点を有するポリペプチドを含む組成物中のポリペプチドを精製するのに使用される。いくつかの実施態様において、本方法は、９より大きいｐＩを有するポリペプチドを精製するのに使用されてもよい。いくつかの実施態様において、陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、９より大きいｐＩを有するポリペプチドを精製するのに使用される。その他の実施態様において、本方法は、７より小さいｐＩを有するポリペプチドを混入物から精製するのに使用されてもよい。いくつかの実施態様において、陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、７より小さいｐＩを有するポリペプチドを精製するのに使用される。ポリペプチドの例は、抗体及び抗体断片を含むが、これらに限定されない。
【０１１１】
ＩＩＩ．ポリペプチド
ポリペプチドは、本明細書に記載のイオン強度媒介のｐＨ勾配イオン交換クロマトグラフィーの方法の何れかにおける使用のために提供される。本発明のいくつかの実施態様において、ポリペプチドの組成物は、イオン強度媒介のｐＨ勾配イオン交換クロマトグラフィーにより分析される。そのような方法は、組成物中のポリペプチドの電荷変異体を同定することにおいて有用である。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは抗体又はその断片である。
【０１１２】
いくつかの実施態様において、ポリペプチドは治療的ポリペプチドである。治療的ポリペプチドは、腫瘍細胞の成長を阻害し、アポトーシスを誘発し、及び／又は細胞死を誘発し得る。いくつかの実施態様において、ポリペプチドはアンタゴニストである。いくつかの実施態様において、ポリペプチドはアゴニストである。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは抗体である。いくつかの実施態様において、ポリペプチドはイムノアドヘシンである。
【０１１３】
いくつかの実施態様において、ポリペプチドは、約５０００ダルトン、１００００ダルトン、１５０００ダルトン、２５０００ダルトン、５００００ダルトン、７５０００ダルトン、１０００００ダルトン、１２５０００ダルトン、又は１５００００ダルトンの何れかより大きい分子量を有する。ポリペプチドは、約５００００ダルトンから２０００００ダルトン又は１０００００ダルトンから２０００００ダルトンの何れかの分子量を有してもよい。あるいは、本明細書における使用のためのポリペプチドは、約１２００００ダルトン又は約２５０００ダルトンの分子量を有してもよい。
【０１１４】
ｐＩは、等電点であり、特定の分子又は表面が正味電荷を持たないｐＨのことである。本明細書に記載の方法何れかのいくつかの実施態様において、ポリペプチド、例えば抗体のｐＩは９より大きくてもよい。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは、約９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、又は１２の何れかのｐＩを有する。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは約９から１２のｐＩを有する。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは約９から１１のｐＩを有する。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは約９から１０のｐＩを有する。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは約１０から１２のｐＩを有する。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは約１０から１１のｐＩを有する。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは約１１から１２のｐＩを有する。
【０１１５】
本明細書に記載の方法の何れかのいくつかの実施態様において、ポリペプチド、例えば抗体のｐＩは７より小さくてもよい。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは、約７、６．５、６、５．５、５、４．５、又は４の何れかのｐＩを有する。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは約４から７のｐＩを有する。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは約４から６のｐＩを有する。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは約４から５のｐＩを有する。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは約５から７のｐＩを有する。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは約５から６のｐＩを有する。
【０１１６】
本明細書に記載の方法の何れかの実施態様において、ポリペプチド及び一又は複数の混入物を含む組成物中の一又は複数の混入物は、ポリペプチド電荷変異体である。いくつかの実施態様において、ポリペプチド電荷変異体は、ポリペプチドの電荷が変更されるように、自然の状態から改変されているポリペプチドである。いくつかの実施態様において、電荷変異体は、親ポリペプチドよりも酸性である；即ち、親ペプチドよりも低いｐＩを有する。その他の実施態様において、電荷変異体は、親ポリペプチドよりも塩基性である；即ち、親ペプチドよりも高いｐＩを有する。いくつかの実施態様において、ポリペプチド電荷変異体は操作される。いくつかの実施態様において、ポリペプチド電荷変異体は、例えば、酸化、脱アミド化、リジン残基のＣ末端プロセシング、Ｎ末端ピログルタミン酸形成及び糖化等の天然のプロセスの結果であってもよい。いくつかの実施態様において、ポリペプチド電荷変異体は、タンパク質に結合するグリカンが、親糖タンパク質と比較して、例えば、シアル酸又はその誘導体の付加により、糖タンパク質の電荷が変更されるように改変されている、糖タンパク質である。いくつかの実施態様において、ポリペプチド電荷変異体は、抗体電荷変異体である。
【０１１７】
本明細書に記載の方法を使用して分析されることになるポリペプチドは、一般に、組換え技術を使用して産生される。組換えタンパク質を産生するための方法は、例えば、参照により本明細書に具体的に援用されている米国特許第５５３４６１５号及び第４８１６５６７号に記載されている。いくつかの実施態様において、目的のタンパク質は、ＣＨＯ細胞において産生される（例えば、ＷＯ９４／１１０２６を参照のこと）。組換え技術を使用した場合、ポリペプチドは、細胞周辺腔内で細胞内に産生されるか又は、培地中に直接分泌され得る。
【０１１８】
ポリペプチドは、培養培地又は宿主細胞溶解物から回収されてもよい。ポリペプチドの発現に用いられる細胞は、様々な物理的又は化学的手段、例えば凍結融解サイクリング、超音波処理、機械的破壊又は細胞溶解剤により破壊され得る。ポリペプチドが細胞内に産生される場合、最初の工程として、宿主細胞か又は溶解断片の何れかである微粒子状破片は、例えば遠心分離又は限外濾過により除去される。Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞周辺腔に分泌されるポリペプチドを単離するための手順を記載する。簡潔には、細胞ペーストは、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ及びフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で、約３０分間にわたって融解される。細胞破片は、遠心分離により除去され得る。ポリペプチドが培地中に分泌される場合、一般的に、そのような発現系からの上清は、市販のポリペプチド濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はMillipore Pellicon限外濾過ユニットを使用して、最初に濃縮される。ＰＭＳＦ等のプロテアーゼ阻害剤は、タンパク質分解を阻害するように任意の前述の工程に含まれてもよく、抗生物質は、偶発性混入物の成長を妨げるように含まれてもよい。
【０１１９】
いくつかの実施態様において、ポリペプチド及び一又は複数の混入物を含む組成物中のポリペプチドは、本発明の方法により、分析前に精製されているか又は部分的に精製されている。例えば、該方法のポリペプチドは、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィーからの溶出物中にある。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは、プロテインＡクロマトグラフィーからの溶出物である。
【０１２０】
本発明の方法により分析されてもよいポリペプチドの例は、限定するものではないが、免疫グロブリン、イムノアドヘシン、抗体、酵素、ホルモン、融合タンパク質、Ｆｃ含有タンパク質、免疫抱合体、サイトカイン及びインターロイキンを含む。
【０１２１】
いくつかの実施態様において、ポリペプチドは薬学的組成物である。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは、薬学的組成物中の抗体又はその断片に結合する抗原である。いくつかの実施態様において、薬学的組成物は、ポリペプチド、及びバッファー、賦形剤、安定剤又は保存料を含むがこれらに限定されない薬学的に許容される担体を含む。いくつかの実施態様において、薬学的組成物は、抗体又はその断片に結合する抗原、及びバッファー、賦形剤、安定剤又は保存料を含むがこれらに限定されない薬学的に許容される担体を含む。
【０１２２】
（Ａ）抗体
本明細書に記載の方法の何れかのいくつかの実施態様において、ポリペプチド及び本明細書に記載の方法によるポリペプチドを含む製剤を分析する方法の何れかにおける使用のためのポリペプチドは、抗体である。
【０１２３】
抗体の分子標的は、ＣＤタンパク質及びそのリガンド、例えば限定するものではないが以下を含む：（ｉ）ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ７９α（ＣＤ７９ａ）、及びＣＤ７９β（ＣＤ７９ｂ）；（ｉｉ）ＥｒｂＢ受容体ファミリーのメンバー、例えば、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２受容体、ＨＥＲ３受容体又はＨＥＲ４受容体；（ｉｉｉ）細胞接着分子、例えば、ＬＦＡ−１、Ｍａｃ１、ｐ１５０，９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ及びαｖ／β３インテグリン（そのアルファ又はベータサブユニットの何れかを含む）等（例：抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８又は抗ＣＤ１１ｂ抗体）；（ｉｖ）成長因子、例えばＶＥＧＦ；ＩｇＥ；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ−４；タンパク質Ｃ、ＢＲ３、ｃ−ｍｅｔ、組織因子、β７等；並びに（ｖ）細胞表面及び膜貫通腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、例えば米国特許第７５２１５４１号に記載されるもの。
【０１２４】
その他の例示的な抗体は、限定するものではないが、抗エストロゲン受容体抗体、抗プロゲステロン受容体抗体、抗ｐ５３抗体、抗ＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗カテプシンＤ抗体、抗Ｂｃｌ−２抗体、抗Ｅ−カドヘリン抗体、抗ＣＡ１２５抗体、抗ＣＡ１５−３抗体、抗ＣＡ１９−９抗体、抗ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体、抗Ｐ−糖タンパク質抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗網膜芽細胞腫タンパク抗体、抗ｒａｓがんタンパク抗体、抗Ｌｅｗｉｓ Ｘ抗体、抗Ｋｉ−６７抗体、抗ＰＣＮＡ抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ５抗体、抗ＣＤ７抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ９／ｐ２４抗体、抗ＣＤ１０抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＣＤ１１ｃ抗体、抗ＣＤ１３抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１５抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ２３抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ３５抗体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＣＤ４１抗体、抗ＬＣＡ／ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ４５ＲＯ抗体、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体、抗ＣＤ３９抗体、抗ＣＤ１００抗体、抗ＣＤ９５／Ｆａｓ抗体、抗ＣＤ９９抗体、抗ＣＤ１０６抗体、抗ユビキチン抗体、抗ＣＤ７１抗体、抗ｃ−ｍｙｃ抗体、抗サイトケラチン抗体、抗ビメンチン抗体、抗ＨＰＶタンパク抗体、抗カッパ軽鎖抗体、抗ラムダ軽鎖抗体、抗メラノソーム抗体、抗前立腺特異抗原抗体、抗Ｓ−１００抗体、抗タウ抗原抗体、抗フィブリン抗体、抗ケラチン抗体及び抗Ｔｎ−抗原抗体から選択されるものを含む。
【０１２５】
（ｉ）モノクローナル抗体
いくつかの実施態様において、抗体はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体の集団から得られ、即ち、モノクローナル抗体の産生中に生じ得る変異体（通常少量で存在する変異体など）を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。したがって、修飾語「モノクローナル」は、個別抗体又はポリクローナル抗体の混合物ではないという抗体の性質を示す。
【０１２６】
例えば、モノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法により作製されてもよく、又は、組換えＤＮＡ法により作製されてもよい（米国特許第４８１６５６７号）。
【０１２７】
ハイブリドーマ法において、マウス又はハムスター等のその他適切な宿主動物は、免疫付与に使用されるポリペプチドと特異的に結合することになる抗体を産生するか又は産生する能力があるリンパ球を引き起こすように、本明細書に記載されるように免疫を与えられる。あるいは、リンパ球はインビトロで免疫を与えられてもよい。次いで、リンパ球は、ポリエチレングリコール等の好適な融合剤を使用して骨髄腫細胞と融合され、ハイブリドーマ細胞を形成する（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)）。
【０１２８】
したがって、ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、非融合の親骨髄腫細胞の成長又は生存を阻害する一又は複数の物質を含む好適な培養培地中で播種され、培養される。例えば、親骨髄腫細胞に酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）がない場合、ハイブリドーマの培養培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン（ＨＡＴ培地）を含むことになり、この物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を妨げる。
【０１２９】
いくつかの実施態様において、骨髄腫細胞は、効率的に融合するものであり、選択された抗体産生細胞による抗体の安定した高レベルの産生をサポートし、ＨＡＴ培地等の培地に対して感受性がある。いくつかの実施態様において、これらの中で、骨髄腫細胞株は、マウス骨髄種株、例えば、Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USAから入手可能なＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍から誘導されるもの及びAmerican Type Culture Collection, Rockville, Maryland USAから入手可能なＳＰ−２又はＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞である。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株もまた記載されている（Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。
【０１３０】
ハイブリドーマ細胞が成長する培養培地は、抗原に対するモノクローナル抗体の産生のためにアッセイされる。いくつかの実施態様において、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降により又はインビトロ結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により決定される。
【０１３１】
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Scatchard analysis of Munson et al., Anal. Biochem. 107:220 (1980)により決定され得る。
【０１３２】
ハイブリドーマ細胞が所望の特異性、親和性及び／又は活性の抗体を産生するとして同定された後、クローンは、限定希釈手順によりサブクローンされ、標準的な方法により培養されてもよい（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice pp. 59-103 (Academic Press, 1986))。この目的のための好適な培養培地は、例えば、D-MEM又はRPMI-1640培地である。加えて、ハイブリドーマ細胞は、動物における腹水腫瘍としてインビボで培養されてもよい。 
【０１３３】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順、例えば、ポリペプチドＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィー等により、培養培地、腹水又は血清から適切に分離される。
【０１３４】
モノクローナル抗体をコードしたＤＮＡは、容易に単離され、従来の手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定される。いくつかの実施態様において、ハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡのソースとして機能する。ＤＮＡは、単離されると、発現ベクター中に配置され、次いで、これは、他の形では免疫グロブリンポリペプチドを産生しない宿主細胞中、例えば、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は骨髄腫細胞中にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞中のモノクローナル抗体の合成を得てもよい。抗体をコードするＤＮＡの最近における組換え発現に関する総説は、Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol. 5:256-262 (1993) and Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992)を含む。
【０１３５】
更なる実施態様において、抗体又は抗体断片は、McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)に記載される技術を使用して生成される抗体ファージライブラリーから単離され得る。Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)及びMarks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリーを使用した、それぞれ、マウス及びヒト抗体の単離を記載する。後の出版物は、鎖シャッフリングによる高親和性（ｎＭレンジ）ヒト抗体の産生（Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)）、並びに、非常に大きなファージライブラリーを構成するための戦略としてのコンビナトリアル感染及びインビボ組換え（Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993)）を記載する。したがって、これらの技術は、モノクローナル抗体を単離するための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術の実行可能な代替手段である。
【０１３６】
ＤＮＡは、例えば相同マウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより（米国特許第４８１６５６７号；Morrison et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 81:6851 (1984)）、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部若しくは一部を共有結合することにより、改変され得る。
【０１３７】
典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインに置換され、あるいは抗体の一の抗原結合部位の可変ドメインに置換されて、抗原に対して特異性を有する一の抗原結合部位と異なる抗原に対して特異性を有する別の抗原部位とを含むキメラ二価抗体が創出される。
【０１３８】
本明細書に記載の任意の方法のいくつかの実施態様において、抗体はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭである。いくつかの実施態様において、抗体はＩｇＧモノクローナル抗体である。
【０１３９】
（ｉｉ）ヒト化抗体
いくつかの実施態様において、抗体はヒト化抗体である。非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該技術分野で記載されている。いくつかの実施態様において、ヒト化抗体は、非ヒトであるソースから導入された一又は複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「インポート」残基と呼ばれ、典型的には「インポート」可変ドメインから取得される。ヒト化は、基本的には、Winter and co-workers (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988))の方法に従って、超可変領域の配列をヒト抗体の対応する配列と置換することにより、実施され得る。したがって、そのような「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に少ないドメインが、非ヒト種由来の対応する配列により置換されている、キメラ抗体（米国特許第４８１６５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかの超可変領域残基及び可能であればいくつかのＦＲ残基が齧歯動物抗体における相似部位由来の残基により置換されているヒト抗体である。
【０１４０】
ヒト化抗体を作製する際に使用することになるヒト可変ドメイン（軽鎖と重鎖の両方）の選定は、抗原性を低下させることが非常に重要である。いわゆる「最も適した」方法によれば、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメインの配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次いで、その齧歯動物の配列と最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク領域（ＦＲ）として採択する（Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901 (1987))。別の方法は、軽鎖又は重鎖可変領域の特定のサブグループである、すべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークを、いくつかの異なるヒト化抗体について使用してもよい(Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)）。
【０１４１】
抗体が、抗原に対する高親和性及び他の望ましい生物学的特性を保持した状態でヒト化されることは、更に重要である。この目標を達成するために、本方法のいくつかの実施態様において、ヒト化抗体は、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを使用した、親配列及び多様な概念的ヒト化産物の分析のプロセスにより調製される。三次元の免疫グロブリンモデルは、一般に入手可能であり、当業者にはなじみがある。選択された候補免疫グロブリン配列の推定される三次元立体配座構造を図示及び表示するコンピュータープログラムは、入手可能である。これらの表示を精査することにより、候補免疫グロブリン配列が機能する際に残基が果たすと考えられる役割の分析、即ち、候補免疫グロブリンがその抗原と結合する能力に影響する残基の分析が可能になる。この方式では、ＦＲ残基は、レシピエント配列及びインポート配列から選択され、組み合わされることで、所望の抗体特徴（例えば、標的抗原（複数可）に対する親和性の向上）が達成されるようにすることができる。一般に、超可変領域残基は、抗原結合への影響を及ぼすことに直接かつ最も実質的に関わっている。
【０１４２】
（ｉｉｉ）ヒト抗体
いくつかの実施態様において、抗体はヒト抗体である。ヒト化の代替策として、ヒト抗体が生成され得る。例えば、免疫化の際に、内因性の免疫グロブリンが産生されなくてもヒト抗体の完全なレパートリーを産生する能力があるトランスジェニック動物（例えばマウス）を作製することが、現在可能である。例えば、キメラマウス及び生殖細胞系突然変異マウスにおいて、抗体の重鎖接合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性が欠失していると、内因性抗体産生は完全に阻害されることが記載されている。そのような生殖細胞系突然変異マウスにおいてヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイを移入することにより、抗原による攻撃を行った際にヒト抗体が産生されるであろう。例えば、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno. 7:33 (1993)；並びに米国特許第５５９１６６９号；第５５８９３６９号；及び第５５４５８０７号を参照のこと。
【０１４３】
あるいは、ファージディスプレイ技術（McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)）が使用され、免疫化されていないドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメインの遺伝子レパートリーからインビトロでヒト抗体及び抗体断片が産生され得る。この技術によれば、抗体のＶドメインの遺伝子は、インフレームでクローニングされて、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３又はｆｄの主要又は微働何れかのコートポリペプチド遺伝子となり、ファージ粒子の表面上で機能的抗体断片としてディスプレイされる。繊維状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡのコピーを含んでいるため、抗体の機能特性に基づいて選択すれば、それらの特性を呈する抗体をコードする遺伝子を選択したことにもなる。したがって、ファージは、Ｂ細胞の特性の一部を模倣する。ファージディスプレイは、さまざまなフォーマットで実施され得、それらの総説については、例えば、Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)を参照のこと。複数のソースのＶ遺伝子セグメントが、ファージディスプレイに使用され得る。Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)は、免疫化されたマウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小規模なランダムコンビナトリアルライブラリーから、抗オキサゾロン抗体の多種多様なアレイを単離した。免疫化されていないヒトドナー由来のＶ遺伝子のレパートリーが構築され、抗原の多種多様なアレイに対する抗体（自己抗原を含む）は、Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), or Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)により記載された技術に基本的に従って、単離され得る。米国特許第５５６５３３２号及び第５５７３９０５号も参照のこと。
【０１４４】
ヒト抗体は、また、インビトロ活性化されたＢ細胞により生成されてもよい（米国特許第５５６７６１０号及び第５２２９２７５号を参照のこと）。
【０１４５】
（ｉｖ）抗体断片
いくつかの実施態様において、抗体は抗体断片である。様々な技術が抗体断片の産生のために開発されてきた。従来、これらの断片は、インタクトな抗体のタンパク分解性消化を介して誘導された（例えば、Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) and Brennan et al., Science 229:81 (1985)を参照のこと）。しかしながら、これらの断片は、今では組換え宿主細胞により直接産生され得る。例えば、抗体断片は、前述の抗体ファージライブラリーから単離され得る。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は、大腸菌から直接回収され、化学的に結合してＦ（ａｂ’）２断片を形成し得る（Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)）。Ｆ（ａｂ’）２断片は、別の方法によって、組換え宿主細胞培養物から直接単離され得る。抗体断片の産生のためのその他の技術は、当業者にとって明らかであろう。その他の実施態様において、抗体の選定は、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。国際公開第９３／１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号を参照のこと。抗体断片はまた、例えば、米国特許第５６４１８７０号に記載されるように「直線抗体」であってもよい。そのような直線抗体断片は、単一特異的であってよく、又は二重特異的であってもよい。
【０１４６】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の抗体の断片が提供される。いくつかの実施態様において、抗体断片は抗原結合断片である。いくつかの実施態様において、抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ、Ｆｖ及びダイアボディからなる群より選択される。
【０１４７】
（ｖ）二重特異的抗体
いくつかの実施態様において、抗体は二重特異的抗体である。二重特異性抗体は、少なくとも二つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、二つの異なるエピトープに結合してもよい。あるいは、二重特異性抗体の結合アームは、白血球上のトリガー分子、例えばＴ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ２若しくはＣＤ３）、又は、ＩｇＧのＦｃ受容体（ＦｃγＲ）、例えばＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）と結合するアームと組み合わせて、細胞防御機構を細胞に集中させるようにしてもよい。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片（例えばＦ（ａｂ’）２二重特性抗体）として調製され得る。
【０１４８】
二重特異性抗体を作製するための方法は、当該技術分野において公知である。完全長の二重特異性抗体の従来の産生は、二つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づいており、この場合の二本の鎖は、異なる特異性を有する（Millstein et al., Nature 305:537-539 (1983)）。免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖はランダムに取り合わされるため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０個の異なる抗体分子の潜在的な混合物を産生し、１個のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、通常はアフィニティークロマトグラフィー工程により行われるが、相当に面倒であり、産物の収率は低い。類似の手順は、ＷＯ９３／０８８２９、及びTraunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)に開示されている。
【０１４９】
異なるアプローチによれば、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原合体部位）は、免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合される。いくつかの実施態様において、融合は、ヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖の定常ドメインとの間で行われる。いくつかの実施態様において、軽鎖結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）が、融合体のうち少なくとも一に存在する。免疫グロブリン重鎖融合体と、所望により免疫グロブリン軽鎖とをコードしているＤＮＡを別々の発現ベクター中に挿入し、好適な宿主生物の中に共にトランスフェクトする。これは、不均等な比率の三本のポリペプチド鎖が構造中で使用された場合に最適な収率が得られる実施態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合を調節する際に大きな柔軟性を提供する。ただし、少なくとも二本のポリペプチド鎖が等しい比率で発現することで収率が高くなるとき、又はその比率が特に重要性をもたないときは、一つの発現ベクター中の二本又は全三本のポリペプチド鎖のコード配列を挿入することが可能である。
【０１５０】
このアプローチのいくつかの実施態様において、二重特異性抗体は、第１の結合特異性を一方のアームに、複合免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性を提供する）を他方のアームに有する、複合免疫グロブリン重鎖から構成される。この非対称構造は、望ましくない免疫グロブリン鎖の組合せからの所望の二重特異性化合物の分離を容易にすることが見出されたが、これは、二重特異性分子の半分のみに免疫グロブリン軽鎖が存在することが容易な分離方式を提供するからである。このアプローチは、ＷＯ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体の生成の更なる詳細については、例えば、Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986)を参照のこと。
【０１５１】
米国特許第５７３１１６８号に記載されている別のアプローチによれば、抗体分子対の間の接点は工学操作され、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の比率（％）が最大化され得る。いくつかの実施態様において、接点は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法において、第１の抗体分子の接点由来の一又は複数の小さいアミノ酸側鎖は、より大きい側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）で置き換えられる。大きい側鎖（複数可）と同一又は類似のサイズの代償的な「空洞」は、大きいアミノ酸側鎖をより小さい側鎖（例えばアラニン又はトレオニン）で置き換えることにより、第２の抗体分子の接点上に創出される。これは、ヘテロ二量体の収率をホモ二量体等の他の望ましくない最終産物より高くするメカニズムを提供する。
【０１５２】
二重特異性抗体は、架橋抗体又は「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲートにおける抗体のうち一方はアビジンと、他方はビオチンと、カップリングされ得る。そのような抗体は、例えば、望ましくない細胞に対して免疫系細胞を標的化すること（米国特許第４６７６９８０号）、及びＨＩＶ感染症の治療に用いること（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３及びＥＰ０３０８９）が提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋方法を使用して作製され得る。好適な架橋剤は当該技術分野において公知であり、米国特許第４６７６９８０号において、いくつかの架橋手法と共に開示されている。
【０１５３】
抗体断片から二重特異性抗体を生成させるための技術も、文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学的連結を使用して調製され得る。Brennan et al., Science 229: 81 (1985)は、インタクト抗体をタンパク質分解的に開裂してＦ（ａｂ’）２断片を生成させる手順が記載されている。これらの断片は、ジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元され、隣接するジチオールを安定化させ、分子間のジスルフィド形成を防止する。次いで、生成されたＦａｂ’断片をチオニトロベンゾアート（ＴＮＢ）誘導体に変換させる。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体のうち一方を、メルカプトエチルアミンを用いた還元によりＦａｂ’−チオールに再変換させ、等モル量の他方のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合させて二重特異性抗体を形成させる。産生された二重特異性抗体は、酵素の選択的な固定化のための作用剤として使用され得る。
【０１５４】
組換え細胞培養物から直接、二重特異性抗体断片を作製し単離するための様々な技術も記載されている。例えば、ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体が産生されている（Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)）。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合により、二つの異なる抗体のＦａｂ’部分と連結された。抗体ホモ二量体は、ヒンジ領域で還元されて単量体を形成し、次いで、再酸化されて抗体ヘテロ二量体を形成した。この方法は、抗体ホモ二量体の産生にも利用することができる。Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)により記載された「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体断片を作製するための代替的メカニズムを提供した。この断片は、きわめて短いために同一鎖上の二つのドメイン間の対形成を可能にするリンカーにより軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と繋がっている重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは、もう一つの断片の相補的なＶＬ及びＶＨドメインとの対形成を強いられ、それにより、二つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用により二重特異性抗体断片を作製するための別の戦略も報告されている。Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)を参照のこと。
【０１５５】
３価以上の抗体が企図される。例えば、三重特異性抗体が調製され得る（Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991)）。
【０１５６】
（ｖ）多価抗体
いくつかの実施態様において、抗体は多価抗体である。多価抗体は、抗体が結合する対象である抗原を発現する細胞により、二価抗体より速く内部移行（及び／又は異化）してもよい。本明細書において提供される抗体は、三つ以上の抗原結合部位を有する多価抗体（ＩｇＭクラスの抗体以外である）であってもよく（例えば四価抗体）、そのような抗体は、抗体のポリペプチド鎖をコードしている核酸の組換え発現により、容易に産生され得る。多価抗体は、二量体化ドメイン及び三つ以上の抗原結合部位を含み得る。好ましい二量体化ドメインは、Ｆｃ領域又はヒンジ領域を含む（又は、それらからなる）。この場合、抗体は、一つのＦｃ領域と、Ｆｃ領域のアミノ末端に三つ以上の抗原結合部位を含むであろう。本明細書における好ましい多価抗体は、三つから約八つ、ただし好ましくは四つの抗原結合部位を含む（又は、それらからなる）。多価抗体は、少なくとも一本のポリペプチド鎖（好ましくは二本のポリペプチド鎖）を含み、そのポリペプチド鎖（複数可）は、二つ以上の可変ドメインを含む。例えば、ポリペプチド鎖（複数可）は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−（Ｘ２）ｎ−Ｆｃ（ここで、ＶＤ１は、第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の可変ドメインであり、Ｆｃは、Ｆｃ領域の一方のポリペプチド鎖であり、Ｘ１及びＸ２は、アミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは、０又は１である）を含んでもよい。例えば、ポリペプチド鎖（複数可）は、ＶＨ−ＣＨ１−柔軟なリンカー−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖、又はＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖を含んでもよい。本明細書における多価抗体は、好ましくは、少なくとも二つ（好ましくは四つ）の軽鎖可変ドメインポリペプチドを更に含む。本明細書における多価抗体は、例えば、約二つから約八つの軽鎖可変ドメインポリペプチドを含んでもよい。ここで企図される軽鎖可変ドメインポリペプチドは、軽鎖可変ドメインを含み、場合により、ＣＬドメインを更に含む。
【０１５７】
いくつかの実施態様において、抗体は多重特異性抗体である。特異性抗体の例としては、限定されるものではないが、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含みＶＨＶＬ単位がポリエピトープ特異性を有する抗体、２つ以上のＶＬ及びＶＨドメインを有し、各ＶＨＶＬ単位が異なるエピトープと結合する抗体、２つ以上の単一可変ドメインを有し、各単一可変ドメインが異なるエピトープと結合する抗体、完全長抗体、抗体断片、例えばＦａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性を有するダイアボディ、トリアボディ、三重機能性抗体、共有結合的又は非共有結合的に連結している抗体断片が挙げられる。いくつかの実施態様において、当該抗体は、ポリエピトープ特異性、例えば、同じ又は異なる標的（複数可）に対して二つ以上の異なるエピトープと特異的に結合する能力を有する。いくつかの実施態様において、抗体は、単一特異性の抗体、例えば、一つのエピトープのみと結合する抗体である。一実施態様によれば、多特異性抗体は、親和性が５μＭから０．００１ｐＭ、３μＭから０．００１ｐＭ、１μＭから０．００１ｐＭ、０．５μＭから０．００１ｐＭ、又は０．１μＭから０．００１ｐＭである各エピトープと結合するＩｇＧ抗体である。
【０１５８】
（ｖｉ）その他の抗体改変体
本明細書において提供される抗体を改変することは、エフェクター機能、例えば、抗体の抗原依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を強化するためのエフェクター機能に関して、望ましい場合がある。これは、抗体のＦｃ領域において一又は複数のアミノ酸置換基を導入することにより達成してもよい。代替的又は追加的に、システイン残基（複数可）をＦｃ領域に導入して、それにより、この領域における鎖間ジスルフィド結合形成が可能になるようにしてもよい。このようにして生成されたホモ二量体型抗体は、内部移行の可能性が向上してもよく、及び／又は、補体媒介性細胞殺傷及び抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）が増加していてもよい。Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992)及びShopes, B. J., Immunol. 148:2918-2922 (1992)を参照のこと。抗腫瘍活性が強化されているホモ二量体型抗体は、Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565 (1993)に記載されているように、ヘテロ二官能性の架橋剤を使用して調製されてもよい。あるいは、二つのＦｃ領域を有しており、それにより補体媒介性溶解及びＡＤＣＣの能力が強化されていてもよい抗体は工学操作され得る。Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)を参照のこと。
【０１５９】
抗体の血清中半減期を長期化するために、アミノ酸の変性は、米国特許公開第２００６／００６７９３０号に記載されているように抗体中で行うことができ、同文献は、出典明示によりその全体が本明細書に援用される。
【０１６０】
（Ｂ）ポリペプチドの変異体及び改変体
本明細書に記載されているポリペプチド（抗体を含む）のアミノ酸配列改変体（複数可）は、本明細書に記載されているポリペプチド（例えば、抗体）を精製する方法において使用してもよい。
【０１６１】
（ｉ）変異体ポリペプチド
「ポリペプチド変異体」は、本明細書において定義するポリペプチド、好ましくは活性のあるポリペプチドであり、完全長天然配列のポリペプチド、シグナルペプチドが欠如しているポリペプチド配列、ポリペプチドの細胞外ドメイン（シグナルペプチドの有無を問わない）と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有するものを意味する。そのようなポリペプチド変異体は、例えば、完全長天然アミノ酸配列のＮ又はＣ末端で一又は複数のアミノ酸残基が付加され又は欠失しているポリペプチドを含む。通常、ＴＡＴポリペプチド変異体は、完全長天然配列ポリペプチドの配列、シグナルペプチドが欠如しているポリペプチド配列、ポリペプチドの細胞外ドメイン（シグナルペプチドの有無を問わない）と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の何れかのアミノ酸配列同一性を有するであろう。場合により、変異体ポリペプチドは、天然ポリペプチド配列と比較して一以下の保存的なアミノ酸置換、あるいは、天然ポリペプチド配列と比較して、約２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の何れか以下の保存的なアミノ酸置換を有するであろう。
【０１６２】
変異体ポリペプチドは、Ｎ末端又はＣ末端で切断されていてもよく、又は、例えば、完全長天然ポリペプチドと比較して内部残基が欠如していてもよい。特定の変異体ポリペプチドは、所望の生物活性に必須ではないアミノ酸残基が欠如していてもよい。切断、欠失、及び挿入がみられるこれらの変異体ポリペプチドは、いくつかの従来の技術のうちのあらゆるものにより調製してもよい。所望の変異体ポリペプチドは、化学合成されてもよい。別の好適な技術は、所望の変異体ポリペプチドをコードしている核酸断片を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により単離及び増幅することを含んでいる。核酸断片の所望の末端を規定するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲにおいて５’及び３’プライマーの位置で用いられる。好ましくは、変異体ポリペプチドは、本明細書において開示する天然ポリペプチドと、少なくとも一の生物学的及び／又は免疫学的活性を共有する。
【０１６３】
アミノ酸配列挿入は、一残基から百以上の残基を含有するポリペプチド長にわたるアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニン残基を有する抗体又は細胞傷害性ポリペプチドと融合した抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体は、酵素に対する抗体のＮ末端又はＣ末端への融合、又は抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへの融合を含む。
【０１６４】
例えば、ポリペプチドの結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれ得る。ポリペプチドのアミノ配列変異体は、適切なヌクレオチド変化を抗体核酸に導入することにより、又はペプチド合成により調整される。このような改変は、例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列内における、残基の欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終構築物に到達させるために作製され得る。アミノ酸の変更により、グリコシル化部位の数又は位置が変更されるなど、ポリペプチド（例えば抗体）の翻訳後プロセスが変化することもある。
【０１６５】
所望の活性に悪影響を及ぼすことなくどのアミノ酸残基を挿入、置換、又は欠失させ得るかを決定する際の指標は、ポリペプチドの配列を相同の既知のポリペプチド分子の配列と比較して、相同性の高い領域においてなされるアミノ酸配列変更の数を最小限にすることにより見出してもよい。
【０１６６】
突然変異誘発にとって好ましい場所である、ポリペプチド（例えば抗体）の一定の残基又は領域の同定のための有用な方法は、Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)により記載されるように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基又は基が同定され（例：荷電残基、例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及びＧｌｕ）、中性の又は負に帯電したアミノ酸（最も好ましくはアラニン又はポリアラニン）により置き換えられ、抗原とのアミノ酸の相互作用に影響を及ぼさせる。次いで、置換に対する機能的感受性を示している当該アミノ酸の場所を、更なる又は他の変異体を置換部位に、又は置換部位の代わりに導入することにより、洗練させる。したがって、アミノ酸配列バリエーションを導入するための部位は予め決めておくが、突然変異の性質自体は、予め決まっている必要はない。例えば、所与の部位での突然変異の成果を分析するために、ａｌａスキャニング又はランダム突然変異誘発が標的コドン又は領域で行われ、発現された抗体変異体が所望の活性についてスクリーニングされる。
【０１６７】
別のタイプの変異体は、アミノ酸置換変異体である。この変異体では、抗体分子中の少なくとも一のアミノ酸残基が、異なる残基により置き換えられている。置換による突然変異誘発のための最も関心の高い部位としては、超可変領域が挙げられるが、ＦＲの変性も企図される。保存的置換は、表１の「好ましい置換基」の見出しの下に示されている。そのような置換により生物活性が変わる場合は、より実質的な変更（表１で「例示的な置換基」と名付けられている変更、又はアミノ酸クラスに関連して更に後述するような変更）を導入してから産物をスクリーニングしてもよい。
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【０１６８】
ポリペプチドの生物学的特性の実質的な改変は、（ａ）置換エリアにおけるポリペプチド骨格の構造（例えば、シート若しくは螺旋の立体配座として）の維持、（ｂ）標的部位での分子の電荷若しくは疎水性の維持、又は（ｃ）側鎖の嵩高さの維持に及ぶ効果が有意に異なる置換基を選択することにより達成される。アミノ酸は、側鎖の特性の類似性によってグルーピングしてもよい（A. L. Lehninger, Biochemistry second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)中）：
（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）
（２）非電荷極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）
【０１６９】
あるいは、天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて、以下の群に分けてもよい：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ．
【０１７０】
非保存的置換は、これらのクラスの一つのメンバーを他のクラスに交換することを必要とするであろう。
【０１７１】
また、抗体の正確な立体配座の維持に関わっていない一切のシステイン残基は、一般にはセリンで置き換えられ、分子の酸化的安定性を改善し異常な架橋を防止してもよい。逆に、システイン結合（複数可）がポリペプチドに付加され、その安定性を改善してもよい（特に、抗体が、Ｆｖ断片等の抗体断片である場合）。
【０１７２】
特に好ましいタイプの置換型変異体には、親抗体（例えばヒト化抗体）の一又は複数の超可変領域残基の置換えが関わっている。一般に、その結果得られる、更なる開発のために選択される変異体（複数可）は、その変異体が生成された元である親抗体と比較して生物学的特性が改善されることになる。そのような置換型変異体を生成するための簡便な方式は、ファージディスプレイを使用した親和性成熟を含んでいる。簡潔に言えば、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７部位）を突然変異させて、各部位で、可能なアミノ置換をすべて生成させる。このようにして生成された抗体変異体は、各粒子内にパッケージされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物との融合物として、繊維状ファージ粒子から一価の様式でディスプレイされる。次いで、ファージディスプレイされた変異体は、本明細書において開示するように、その生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。改変について候補となる超可変領域部位を同定するために、アラニンスキャニング突然変異誘発が実施され、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基が同定され得る。代替的又は追加的に、抗原抗体複合体の結晶構造が分析され、抗体と標的との間の接点が同定されることが有益である場合がある。そのような接触残基及び隣接残基は、本明細書において詳述した技術による置換のための候補である。そのような変異体が生成されると、本明細書に記載されているように、変異体のパネルはスクリーニングにかけられ、一又は複数の関連するアッセイにおいて優れた特性を示した抗体が、さらなる開発のために選択されてもよい。
【０１７３】
ポリペプチドの別のタイプのアミノ酸変異体は、抗体の元のグリコシル化パターンを変性させる。ポリペプチドは、非アミノ酸部分を含んでもよい。例えば、ポリペプチドは、グリコシル化されてもよい。そのようなグリコシル化は、宿主細胞又は宿主生物におけるポリペプチドの発現の間に自然に起きてもよく、又は、ヒトの介入により生じる計画的な改変であってもよい。変性とは、ポリペプチドにおいて見出される一又は複数の炭水化物部分を欠失させること、及び／又は、そのポリペプチドに存在しない一又は複数のグリコシル化部位を加えることを意味する。
【０１７４】
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ−連結型又はＯ−連結型の何れかである。Ｎ−連結型は、炭水化物部分がアスパラギン残基の側鎖に付着していることを指す。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−トレオニン（ここで、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）は、炭水化物部分をアスパラギン側鎖に酵素的に付着させるための認識配列である。したがって、これらのトリペプチド配列の何れかがポリペプチド中に存在していると、潜在的なグリコシル化部位が創出される。Ｏ−連結型グリコシル化は、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースのうち一つを、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はトレオニンに付着させることを指すが、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリジンも使用されてもよい。
【０１７５】
ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を変性させて前述のトリペプチド配列のうち一又は複数を含むようにすることにより、簡便に達成される（Ｎ−連結型グリコシル化部位の場合）。この変性は、一又は複数のセリン又はトレオニン残基を元の抗体の配列に付加する、又は該残基により置換することによってもなされ得る（Ｏ−連結型グリコシル化部位の場合）。
【０１７６】
ポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的若しくは酵素的に、又は、グリコシル化のための標的として役立つアミノ酸残基をコードするコドンの突然変異置換により、達成され得る。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的開裂は、様々なエンドグリコシダーゼ及びエキソグリコシダーゼの使用により達成され得る。
【０１７７】
他の改変は、グルタミニル残基及びアスパラギニル残基の、それぞれ対応するグルタミル残基及びアスパルチル残基への脱アミド化、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化、Ｎ末端アミンのアセチル化、並びに、任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【０１７８】
（ｉｉ）キメラポリペプチド
本明細書に記載されているポリペプチドは、別の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列と融合されるポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方式で改変されてもよい。いくつかの実施態様において、キメラ分子は、ポリペプチドと、抗タグ抗体が選択的に結合することができるエピトープをもたらすタグポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般に、ポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に配置される。そのようなエピトープタグが付加された形態のポリペプチドの存在は、タグポリペプチドに対する抗体を使用して検出され得る。また、エピトープタグがもたらされることで、抗タグ抗体、又は、エピトープタグと結合する別のタイプの親和性マトリックスを使用したアフィニティー精製により、ポリペプチドを容易に精製することができるようになる。
【０１７９】
代替的な一実施態様において、キメラ分子は、ポリペプチドと免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合を含んでもよい。二価の形態のキメラ分子は、「イムノアドヘシン」と称される。
【０１８０】
本明細書において使用される場合、用語「イムノアドヘシン」は、異種ポリペプチドの結合特異性を免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能と組み合わせた抗体様の分子を指している。構造的に、イムノアドヘシンは、抗原認識以外の所望の結合特異性を有するアミノ酸配列と、抗体の結合部位との融合（すなわち、「異種の」である）、及び免疫グロブリン定常ドメイン配列を含む。イムノアドヘシン分子のアドヘシン部は、典型的には、少なくとも受容体又はリガンドの結合部位を含む近接するアミノ酸配列である。イムノアドヘシンにおける免疫グロブリン定常ドメイン配列は、任意の免疫グロブリン、例えばＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３若しくはＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はＩｇＭから得てもよい。
【０１８１】
Ｉｇ融合は、好ましくは、Ｉｇ分子内の少なくとも一の可変領域の代わりに、可溶性の（膜貫通ドメインが欠失又は不活性化されている）形態のポリペプチドを置換することを含む。特に好ましい一実施態様において、免疫グロブリン融合体は、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域、又は、ＩｇＧ１分子の、ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３領域を含む。
【０１８２】
（ｉｉｉ）ポリペプチドコンジュゲート
ポリペプチド製剤において使用するためのポリペプチドは、細胞傷害剤、例えば化学療法剤、成長阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、若しくは動物起源の酵素活性毒素、又はそれらの断片）、又は放射性同位元素（即ち、ラジオコンジュゲート）とコンジュゲートしてもよい。
【０１８３】
そのようなコンジュゲートの生成に有用な化学療法剤が使用され得る。加えて、酵素的に活性な毒素及び使用され得るその断片は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、アルファ−サルシン、アレウリテス・フォーディタンパク質、ジアンチンタンパク質、フィトラカ・アメリカーナタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・チャランチアインヒビター、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリスインヒビター、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテセンを含む。様々な放射性核種は、ラジオコンジュゲートされたポリペプチドの産生のために入手可能である。その例は、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、及び１８６Ｒｅを含む。ポリペプチドと細胞障害剤のコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ）、活性エステル類（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド類（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン−２，６−ジイソシアネート）、及び二活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作製され得る。例えば、リシンイムノトキシンは、Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987)に記載されるように調製され得る。カーボン−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドのポリペプチドへの抱合のためのキレート剤の例である。
【０１８４】
ポリペプチドと一又は複数の小分子毒素（例えば、カリケアマイシン、マイタンシノイド、トリコテセン、及びＣＣ１０６５、並びに、毒素活性を有する、これらの毒素の誘導体）とのコンジュゲートもまた、本明細書において企図される。
【０１８５】
マイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害することにより作用する有糸分裂阻害剤である。マイタンシンは、東アフリカの低木マイテヌス・セルラタから最初に単離された。続いて、ある微生物も、マイタンシノイド、例えばマイタンシノール及びＣ−３マイタンシノールエステル等のマイタンシノイドを産生することが発見された。合成のマイタンシノール並びにその誘導体及び類似体も企図される。ポリペプチド−マイタンシノイドコンジュゲートを作製するための、当該技術分野において公知の多くの連結基（例えば、米国特許第５２０８０２０号において開示されているものを含む）がある。そのような連結基は、上で同定した特許において開示されている、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸解離性基、光解離性基、ペプチダーゼ解離性基、又はエステラーゼ解離性基を含み、ジスルフィド基及びチオエーテル基が好ましい。
【０１８６】
リンカーは、連結のタイプに応じて、多様な位置でマイタンシノイド分子と付着させてもよい。例えば、エステル連結は、従来のカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることにより形成されてもよい。この反応は、ヒドロキシル基を有するＣ−３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ−１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ−２０位で起きることがある。好ましい一実施態様において、連結は、マイタンシノール又はマイタンシノール類似体のＣ−３位で形成される。
【０１８７】
別の目的コンジュゲートは、一又は複数のカリケアマイシン分子とコンジュゲートされたポリペプチドを含むカリケアマイシンファミリーの抗生物質は、ピコモル濃度未満で二本鎖ＤＮＡ切断を生じさせる能力がある。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、例えば、米国特許第５７１２３７４号を参照のこと。使用してもよいカリケアマイシンの構造類似体は、限定されるものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθ１Ｉを含む。抗体をコンジュゲートすることができる別の抗腫瘍薬は、抗葉酸薬であるＱＦＡである。カリケアマイシンとＱＦＡはどちらも、細胞内作用部位を有しており、原形質膜を容易に越えない。したがって、細胞がポリペプチド（例えば、抗体）媒介性の内部移行を通じてこれらの薬剤を取り込むと、その細胞傷害効果は大きく強化される。
【０１８８】
本明細書に記載されているポリペプチドとコンジュゲートすることができる他の抗腫瘍剤は、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び５−フルオロウラシル、総称的にＬＬ−Ｅ３３２８８複合体として公知の薬剤ファミリー、並びにエスペラマイシンを含む。
【０１８９】
いくつかの実施態様において、ポリペプチドは、ポリペプチドと、核酸分解活性を有する化合物（例：リボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮａｓｅ）との間のコンジュゲートであってもよい。
【０１９０】
また別の実施態様において、ポリペプチド（例えば、抗体）は、腫瘍の事前標的化において利用するための「受容体」（例えばストレプトアビジン）とコンジュゲートしてもよく、この場合、ポリペプチド受容体コンジュゲートが患者に投与され、続いて、洗浄剤を使用して、結合されていないコンジュゲートの循環からの除去、次いで、細胞傷害剤（例えば、放射性ヌクレオチド）とコンジュゲートされている「リガンド」（例えば、アビジン）の投与が行われる。
【０１９１】
いくつかの実施態様において、ポリペプチドは、プロドラッグ（例えば、ペプチジル化学療法剤）を活性のある抗癌薬に変換させるプロドラッグ活性化酵素とコンジュゲートされてもよい。免疫コンジュゲートの酵素成分は、プロドラッグに対して、それをより活性のある細胞傷害性の形態に変換させるような方式で作用する能力がある任意の酵素を含む。
【０１９２】
有用である酵素としては、限定されるものではないが、以下を含む：ホスフェート含有プロドラッグを遊離薬剤に変換させるのに有用なアルカリホスファターゼ；スルフェート含有プロドラッグを遊離薬剤に変換させるのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性の５−フルオロシトシンを抗癌薬の５−フルオロウラシルに変換させるのに有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチド含有プロドラッグを遊離薬剤に変換させるのに有用なプロテアーゼ、例えば、セラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ、及びカテプシン（例えばカテプシンＢ及びＬ）；Ｄ−アミノ酸置換基を含有するプロドラッグを変換させるのに有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化されたプロドラッグを遊離薬剤に変換させるのに有用な炭水化物開裂酵素、例えばβ−ガラクトシダーゼ及びノイラミニダーゼ；β−ラクタムで誘導体化されている薬剤を遊離薬剤に変換させるのに有用なβ−ラクタマーゼ；並びに、アミン窒素の位置にてそれぞれフェノキシアセチル基又はフェニルアセチル基で誘導体化されている薬剤を遊離薬剤に変換させるのに有用なペニシリンアミダーゼ、例えばペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼ。あるいは、酵素活性を有する抗体は、当該技術分野においては「アブザイム」としても公知であるが、これを使用してプロドラッグを遊離活性薬物に変換させることができる。
【０１９３】
（ｉｖ）その他
ポリペプチドの、別のタイプの共有結合性改変は、ポリペプチドを、様々な非タンパク質ポリマーの一つ、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又は、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーと連結させることを含む。ポリペプチドは、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合法によって、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メチルメタシレート）マイクロカプセル）、コロイド薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロ・エマルジョンなどの調製されたマイクロカプセルに封入されてもよい。このような技術は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Gennaro, A.R., Ed., (1990)に開示される。
【０１９４】
ＩＶ．製剤及び方法において使用するためのポリペプチドの入手
本明細書に記載されている精製方法において使用されるポリペプチドは、組換え法を含め、当該技術分野において公知の方法を使用して入手し得る。次の項では、これらの方法に関する手引きを提供する。
【０１９５】
（Ａ）ポリヌクレオチド
「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、本明細書においては互換的に使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、その例としてはＤＮＡ及びＲＮＡが挙げられる。
【０１９６】
ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、任意の供給源から入手されてもよく、そのような供給源としては、限定されるものではないが、ポリペプチドｍＲＮＡが備わっており検出可能なレベルでそれを発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーを含む。したがって、ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、ヒト組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから簡便に入手され得る。ポリペプチドをコードしている遺伝子はまた、ゲノムライブラリーから、又は、公知の合成手順（例えば、自動化された核酸合成）により、入手されてもよい。
【０１９７】
例えば、ポリヌクレオチドは、免疫グロブリン分子鎖全体、例えば軽鎖又は重鎖をコードしていてもよい。完全な重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）だけでなく重鎖定常領域（ＣＨ）を含み、ＣＨは、典型的には、三つの定常ドメイン：ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３；並びに「ヒンジ」領域を含むであろう。状況によっては、定常領域が存在することが望ましい。
【０１９８】
ポリヌクレオチドによりコードされ得る他のポリペプチドは、抗原結合抗体断片、例えば単一ドメイン抗体（「ｄＡｂ」）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、並びに「ミニボディ」が挙げられる。ミニボディは、そこからＣＨ１及びＣＫ又はＣＬドメインが切り取られる、（典型的には）二価の抗体断片である。ミニボディは従来の抗体より小さいため、臨床的／診断的用途において、より良好な組織浸透を達成するはずであるが、二価であることから、ｄＡｂ等の一価抗体断片より高い結合親和性を保持するはずである。したがって、文脈でそうでないことが指示されない限り、用語「抗体」は、本明細書において使用される場合、全抗体分子だけでなく、上述のタイプの抗原結合抗体断片を包含する。好ましくは、コードされているポリペプチド中に存在する各フレームワーク領域は、対応するヒトアクセプターフレームワークに関連する少なくとも一のアミノ酸置換を含むであろう。したがって、例えば、フレームワーク領域は、アクセプターフレームワーク領域に関して合計で３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５のアミノ酸置換基を含んでもよい。
【０１９９】
ＶＩ．例示的な実施態様
１．一実施態様において、本発明は、ポリペプチド及び一又は複数の混入物を含む組成物を分析するための方法であって、ａ）ローディングバッファーを使用して、ポリペプチド及び一又は複数の混入物をイオン交換クロマトグラフィー材料に結合させる工程であって、ローディングバッファーは最初のｐＨであり、且つ最初のイオン強度を含む工程と；ｂ）溶出バッファーのｐＨがｐＨ勾配で変更され、且つ溶出バッファーのイオン強度がイオン強度勾配で変更される溶出バッファーを使用して、イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチド及び一又は複数の混入物を溶出する工程であって、ポリペプチド及び一又は複数の混入物はｐＨ勾配及びイオン強度勾配の組み合わせにより分離される工程と；ｃ）ポリペプチド及び一又は複数の混入物を検出する工程とを含む方法を提供する。本実施態様のいくつかの態様において、本発明は、ポリペプチド及び一又は複数の混入物を含む組成物中のポリペプチドを分析するための方法であって、該方法はポリペプチドから一又は複数の混入物を分離し、該方法が、ａ）ローディングバッファーを使用して、ポリペプチド及び一又は複数の混入物をイオン交換クロマトグラフィー材料に結合させる工程であって、ローディングバッファーは最初のｐＨであり、且つ最初のイオン強度を含む工程と；ｂ）溶出バッファーのｐＨがｐＨ勾配で変更され、且つ溶出バッファーのイオン強度がイオン強度勾配で変更される溶出バッファーを使用して、イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチド及び一又は複数の混入物を溶出する工程であって、ポリペプチド及び一又は複数の混入物はｐＨ勾配及びイオン強度勾配の組み合わせにより分離される工程と；ｃ）ポリペプチド及び一又は複数の混入物を検出する工程とを含み、該方法は約７．０から約９．５の範囲のｐＩを有するポリペプチドを分析するのに使用される方法を提供する。
【０２００】
２．実施態様１の更なる実施態様において、ポリペプチドは抗体若しくはイムノアドヘシン又はそれらの断片である。
【０２０１】
３．実施態様１又は２の更なる実施態様において、ポリペプチドはモノクローナル抗体又はそれらの断片である。
【０２０２】
４．実施態様２又は３の更なる実施態様において、抗体はヒト抗体である。
【０２０３】
５．実施態様２又は３の更なる実施態様において、抗体はヒト化抗体である。
【０２０４】
６．実施態様２又は３の更なる実施態様において、抗体はキメラ抗体である。
【０２０５】
７．実施態様２から６の何れか一つの更なる実施態様において、抗体は抗体断片である。
【０２０６】
８．実施態様１から７の何れか一つの更なる実施態様において、混入物はポリペプチドの変異体である。
【０２０７】
９．実施態様１から７の何れか一つの更なる実施態様において、混入物はポリペプチドの分解産物である。例えば、電荷変異体である。
【０２０８】
１０．実施態様１から９の何れか一つの更なる実施態様において、ポリペプチドは９．０より大きいｐＩを有する。
【０２０９】
１１．実施態様１から１０の何れか一つの更なる実施態様において、クロマトグラフィー材料は陽イオン交換クロマトグラフィー材料である。
【０２１０】
１２．実施態様１１の更なる実施態様において、陽イオン交換クロマトグラフィー材料はスルホン化クロマトグラフィー材料又はカルボキシル化クロマトグラフィー材料である。
【０２１１】
１３．実施態様１から１２の何れか一つの更なる実施態様において、ｐＨ勾配は直線勾配である。
【０２１２】
１４．実施態様１から１２の何れか一つの更なる実施態様において、ｐＨ勾配は段階勾配である。
【０２１３】
１５．実施態様１３又は１４の更なる実施態様において、ｐＨ勾配は約ｐＨ５から約ｐＨ１１への増加を含む。
【０２１４】
１６．実施態様１から１５の何れか一つの更なる実施態様においてｐＨ勾配は一又は複数のバッファーを使用して生成される。
【０２１５】
１７．実施態様１５の更なる実施態様において、一又は複数のバッファーは、ピペラジン、イミダゾール、トリス、ホスフェート又はＣＡＰＳから選択される。
【０２１６】
１８．実施態様１から１７の何れか一つの更なる実施態様において、イオン強度は直線勾配である。
【０２１７】
１９．実施態様１から１７の何れか一つの更なる実施態様において、イオン強度は段階勾配である。
【０２１８】
２０．実施態様１８又は１９の更なる実施態様において、イオン強度勾配は約０ｍＭから約２００ｍＭへの塩濃度の増加を含む。
【０２１９】
２１．実施態様１８から２０の何れか一つの更なる実施態様において、イオン強度勾配はＮａＣｌ勾配、ＫＣｌ勾配又はＮａ２ＳＯ４勾配である。
【０２２０】
２２．実施態様１から９の何れか一つの更なる実施態様において、ポリペプチドは７．０より小さいｐＩを有する。
【０２２１】
２３．実施態様２２の更なる実施態様において、クロマトグラフィー材料は陰イオン交換クロマトグラフィー材料である。
【０２２２】
２４．実施態様２３の更なる実施態様において、陰イオン交換クロマトグラフィー材料は第四級アミンクロマトグラフィー材料又は第三級アミンクロマトグラフィー材料である。
【０２２３】
２５．実施態様２２から２４の何れか一つの更なる実施態様において、ｐＨ勾配は直線勾配である。
【０２２４】
２６．実施態様２２から２４の何れか一つの更なる実施態様において、ｐＨ勾配は段階勾配である。
【０２２５】
２７．実施態様２５又は２６の更なる実施態様において、ｐＨ勾配は約ｐＨ８から約ｐＨ５への減少を含む。
【０２２６】
２８．実施態様２２から２７の何れか一つの更なる実施態様においてｐＨ勾配は一又は複数のバッファーを使用して生成される。
【０２２７】
２９．実施態様２８の更なる実施態様において、一又は複数のバッファーは、ピペラジン、イミダゾール又はトリスから選択される。
【０２２８】
３０．実施態様２２から２９の何れか一つの更なる実施態様において、イオン強度は直線勾配である。
【０２２９】
３１．実施態様２２から２９の何れか一つの更なる実施態様において、イオン強度は段階勾配である。
【０２３０】
３２．実施態様３０又は３１の更なる実施態様において、イオン強度勾配は約０ｍＭから約２００ｍＭへの塩濃度の増加を含む。
【０２３１】
３３．実施態様３０から３２の何れか一つの更なる実施態様において、イオン強度勾配はＮａＣｌ勾配、ＫＣｌ勾配又はＮａ２ＳＯ４勾配である。
【０２３２】
３４．一実施態様において、本発明は、ポリペプチド及び一又は複数の混入物を含む組成物を分析するための方法であって、該方法が、ａ）ローディングバッファーを使用して、ポリペプチド及び一又は複数の混入物をイオン交換クロマトグラフィー材料に結合させる工程であって、ローディングバッファーは初期ｐＨであり、且つ初期イオン強度を含む工程と；ｂ）溶出バッファーのｐＨがｐＨ勾配で変更され、且つ溶出バッファーのイオン強度はローディングバッファーの初期イオン強度と基本的に同一である溶出バッファーを使用して、イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチド及び一又は複数の混入物を溶出する工程であって、ポリペプチド及び一又は複数の混入物はほぼ初期イオン強度でｐＨ勾配により分離される工程と；ｃ）ポリペプチド及び一又は複数の混入物を検出する工程とを含む方法を提供する。本実施態様のいくつかの態様において、本発明は、ポリペプチド及び一又は複数の混入物を含む組成物中のポリペプチドを分析するための方法であって、該方法が、ａ）ローディングバッファーを使用して、ポリペプチド及び一又は複数の混入物をイオン交換クロマトグラフィー材料に結合させる工程であって、ローディングバッファーは初期ｐＨであり、且つ初期イオン強度を含む工程と；ｂ）溶出バッファーのｐＨがｐＨ勾配で変更され、且つ溶出バッファーのイオン強度がローディングバッファーの初期イオン強度と基本的に同じである溶出バッファーを使用して、イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチド及び一又は複数の混入物を溶出する工程であって、ポリペプチド及び一又は複数の混入物はほぼ初期イオン強度でｐＨ勾配により分離される工程と；ｃ）ポリペプチド及び一又は複数の混入物を検出する工程を含み、該方法は約７．０から約９．５の範囲のｐＩを有するポリペプチドを分析するのに使用される方法を提供する。
【０２３３】
３５．実施態様３４の更なる実施態様において、ポリペプチドは抗体若しくはイムノアドヘシン又はそれらの断片である。
【０２３４】
３６．実施態様３４又は３５の更なる実施態様において、ポリペプチドはモノクローナル抗体又はそれらの断片である。
【０２３５】
３７．実施態様３５又は３６の更なる実施態様において、抗体はヒト抗体である。
【０２３６】
３８．実施態様３５又は３６の更なる実施態様において、抗体はヒト化抗体である。
【０２３７】
３９．実施態様３５又は３６の更なる実施態様において、抗体はキメラ抗体である。
【０２３８】
４０．実施態様３５から３９の何れか一つの更なる実施態様において、抗体は抗体断片である。
【０２３９】
４１．実施態様３４から４０の何れか一つの更なる実施態様において、混入物はポリペプチドの変異体である。
【０２４０】
４２．実施態様３４から４０の何れか一つの更なる実施態様において、混入物はポリペプチドの分解産物である。
【０２４１】
４３．実施態様３４から４２の何れか一つの更なる実施態様において、ポリペプチドは９．０より大きいｐＩを有する。
【０２４２】
４４．実施態様３４から４３の何れか一つの更なる実施態様において、クロマトグラフィー材料は陽イオン交換クロマトグラフィー材料である。
【０２４３】
４５．実施態様４４の更なる実施態様において、陽イオン交換クロマトグラフィー材料はスルホン化クロマトグラフィー材料又はカルボキシル化クロマトグラフィー材料である。
【０２４４】
４６．実施態様３４から４５の何れか一つの更なる実施態様において、ｐＨ勾配は直線勾配である。
【０２４５】
４７．実施態様３４から４５の何れか一つの更なる実施態様において、ｐＨ勾配は段階勾配である。
【０２４６】
４８．実施態様４６又は４７の更なる実施態様において、ｐＨ勾配は約ｐＨ５から約ｐＨ１１への増加を含む。
【０２４７】
４９．実施態様３４から４８の何れか一つの更なる実施態様において、ｐＨ勾配は一又は複数のバッファーを使用して生成される。
【０２４８】
５０．実施態様４９の更なる実施態様において、一又は複数のバッファーは、ピペラジン、イミダゾール、トリス、ホスフェート又はＣＡＰＳから選択される。
【０２４９】
５１．実施態様３４から５０の何れか一つの更なる実施態様において、溶出バッファーのイオン強度は約０ｍＭから約１００ｍＭである。
【０２５０】
５２．実施態様５１の更なる実施態様において、溶出バッファーは、約０ｍＭ ＮａＣｌから約１００ｍＭ ＮａＣｌ、約０ｍＭ ＫＣｌから約１００ｍＭ ＫＣｌ、又は約０ｍＭ Ｎａ２ＳＯ４から約１００ｍＭ Ｎａ２ＳＯ４を含む。
【０２５１】
５３．実施態様３４から４２の何れか一つの更なる実施態様において、ポリペプチドは７．０より小さいｐＩを有する。
【０２５２】
５４．実施態様５３の更なる実施態様において、クロマトグラフィー材料は陰イオン交換クロマトグラフィー材料である。
【０２５３】
５５．実施態様５４の更なる実施態様において、陰イオン交換クロマトグラフィー材料は第四級アミンクロマトグラフィー材料又は第三級アミンクロマトグラフィー材料である。
【０２５４】
５６．実施態様５３から５５の何れか一つの更なる実施態様において、ｐＨ勾配は直線勾配である。
【０２５５】
５７．実施態様５３から５５の何れか一つの更なる実施態様において、ｐＨ勾配は段階勾配である。
【０２５６】
５８．実施態様５６又は５７の更なる実施態様において、ｐＨ勾配は約ｐＨ８から約ｐＨ５への減少を含む。
【０２５７】
５９．実施態様５３から５８の何れか一つの更なる実施態様において、ｐＨ勾配は一又は複数のバッファーを使用して生成される。
【０２５８】
６０．実施態様５９の更なる実施態様において、一又は複数のバッファーは、ピペラジン、イミダゾール又はトリスから選択される。
【０２５９】
６１．実施態様５３から６０の何れか一つの更なる実施態様において、溶出バッファーのイオン強度は約０ｍＭから約１００ｍＭである。
【０２６０】
６２．実施態様６１の更なる実施態様において、溶出バッファーは約１０ｍＭ ＮａＣｌから約１００ｍＭ ＮａＣｌを含む。
【０２６１】
６３．実施態様１から６２の何れか一つの更なる実施態様において、分析は高速液体クロマトグラフィーにより行われる。
【０２６２】
６４．実施態様１から６３の何れか一つの更なる実施態様において、ローディングバッファー及び／又は溶出バッファー中のバッファーの濃度は約１０ｍＭから約５０ｍＭで変化する。
【０２６３】
６５．実施態様１から６４の何れか一つの更なる実施態様において、最初のｐＨは約ｐＨ５．０から約ｐＨ７．０で変化する。
【０２６４】
６６．実施態様１から６５の何れか一つの更なる実施態様において、クロマトグラフィー材料の温度は約２０℃から約５０℃で変化する。
【０２６５】
６７．実施態様１から６６の何れか一つの更なる実施態様において、ローディング及び溶出は約０．５ｍｌ／分から約２．０ｍｌ／分で変化する流量で行われる。
【０２６６】
６８．別の実施態様において、本発明は、実施態様１から６７の方法の何れか一つにより組成物を分析すること、及び組成物中のポリペプチド対混入物の比率を決定することを含む、組成物中のポリペプチドの純度を決定する方法を提供する。
【０２６７】
６９．別の実施態様において、本発明は、ポリペプチドを含む組成物中のポリペプチドの安定性を決定する方法であって、該方法が
ａ）ポリペプチドを含む組成物を０℃から４０℃で１から６週間インキュベートする工程、ｂ）実施態様１から６７の方法の何れかにより工程ａ）の組成物を分析する工程、及びｃ）組成物中の変異体対ポリペプチドの比率を決定する工程であって、インキュベートされなかった組成物と比較した組成物中の変異体対ポリペプチドの比率の増加は、組成物中のポリペプチドの分解を示す工程を含む方法を提供する。
【０２６８】
本明細書に開示される特徴の全ては、任意の組合せで組み合わされてもよい。本明細書に開示される各特徴は、同一の、等価な、又は類似の目的を果たす代替的な特徴により置き換えられてもよい。したがって、別段の明示的な指定のない限り、開示される各特徴は、一般的な一連の等価物又は類似の特徴の一例に過ぎない。
【０２６９】
本発明の更なる詳細は、以下の非限定的な実施例により説明される。本明細書中の全ての参照文献の開示は、参照により本明細書中に明示的に援用される。
【実施例】
【０２７０】
以下の実施例は、単に本発明の例示であると意図されており、したがって、決して本発明を限定するものと考えられるべきではない。以下の実施例及び詳細な記述は、説明のために提供されるものであり、限定のために提供されるものではない。
【０２７１】
実施例のための物質及び方法
別段の注記がない限り、以下の物質及び方法が実施例で使用された。
【０２７２】
物質
安定したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株を使用して、全てのｍＡｂをGenentech (South San Francisco, CA)で自社製造した。７のｐＩマーカーを用いる、機器製造業者からのｉｃＩＥＦプロトコル（Wu, J and Huang, T (2006) Electrophoresis 27:3584）を使用して、使用するｍＡｂのためのｐＩ値を実験的に決定した。熱的ストレスを加えた試料を、ｍＡｂを４０℃でそれぞれ３及び６週間インキュベートすることにより入手した。クロマトグラフィー分析前に、ストレスを加えたｍＡｂを−８０℃で保管した。
【０２７３】
Ｐｒｏｐａｃ ＷＣＸ−１０カラムをDionexから購入した。イミダゾールをEMD Biosciences又はFlukaから入手した。ピペラジン（無水）を東京化成工業株式会社から得た。Ｔｒｉｓｍａ（トリス）をMallinckrodt Baker Inc.又はSigma (St. Louis, MO)から入手し、Ｔｒｉｚｍａ塩基及びＣＡＰＳをSigmaから入手した。塩化ナトリウム、水酸化ナトリウム（１０Ｎ）及び塩化水素酸（１２Ｎ）をMallinckrodt Baker Inc.から入手した。リン酸（８５％）をEMD Milliporeから入手した。
【０２７４】
ＨＰＬＣ設定
陽イオン交換クロマトグラフィー実験を、主にWaters 2796 BioAlliance液体クロマトグラフィー機器又はUltiMate 3000 Quaternary Rapid Separation LC （Thermo Scientific Dionex）上で実施した。機器には、低圧四元勾配ポンプ、温度調節能力を有するオートサンプラー、正確な温度調節のための熱カラムコンパートメント、及び二波長ダイオードアレイＵＶ検出器が含まれた。インラインｐＨセンサー（SensorexからのModel S450CD）及び導電率センサー（Amber Sicence, Eugene, ORからのModel 529）をカラムの出口でタンデム接続した。ｐＨセンサーをMettler ToledoからのモデルSeven Multi pHメーターにより制御し；導電率センサーをAmber Scienceからのモデル１０５６デジタル導電率メーターにより制御した。二つのメーターからのｐＨ及び導電率の測定値を、Ｄｉｏｎｅｘ ＵＣＩ ５０アナログ／デジタルコンバータを通じて、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎへ収集した。Ｄｉｏｎｅｘ Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎソフトウェア、バージョン６．８を用いて、機器制御、データ習得及びデータ分析を実施した。
【０２７５】
移動相調製
トリス及びイミダゾールの個々のストックバッファー溶液を１．０Ｍで調製し、ＣＡＰＳの溶液を、ｐＨ値を調整せずに０．１Ｍの濃度で調製し、室温で保管した。４０ｍＭのピペラジン、４０ｍＭのイミダゾール及び４０ｍＭのトリス（全て遊離塩基）を含むストックバッファー溶液を、ｐＨ値を調製せずに最初に調整し、室温で保管した。クロマトグラフィー実験前に、バッファーストック溶液を脱イオン水で希釈することにより、ピペラジン、イミダゾール及びトリスを１、２、４又は８ｍＭの等モル濃度で含む一連の移動相バッファーをそれぞれ作製した。次いで、バッファーのｐＨ値を塩化水素酸を使用して５．０（バッファーＡ）及び１０．８（バッファーＢ）に調整した。０．５Ｍの塩化ナトリウム溶液を脱イオン水（食塩水）を用いて調製した。次いで、使用前に、移動相を０．２μｍナイロンフィルターを通じて個別に濾過した。
【０２７６】
１１．６ｍＭのピペラジン、１．５ｍＭのイミダゾール及び２．４ｍＭのトリスを含む移動相バッファーを文献（Farnan, D and Moreno, GT (2009) Anal. Chem. 81:8846; Rea, JC et al. (2010) J. Pharm. Biomed. Anal. 54:317）に報告されているように調製した。１１６ｍＭのピペラジン、１５ｍＭのイミダゾール及び２４ｍＭのトリスを含む１０倍に濃縮したストック溶液を最初に調製し、室温で保管した。各実験前に、ストック溶液の二つのアリコートを脱イオン水で１０倍希釈し、続いてそれらのｐＨ値を塩化水素酸を使用して５．０（バッファーＣ）及び９．５（バッファーＤ）に調整した。次いで、使用前に、移動相を０．２μｍナイロンフィルターを通じて個別に濾過した。
【０２７７】
陽イオン交換クロマトグラフィー
別段の指定のない限り、クロマトグラフィー条件は以下の通りであった。ｍＡｂ試料（コントロール及びストレス付与）を脱イオン水で２ｍｇ／ｍＬに希釈し、５±３℃でオートサンプラー中に保った。あるいは、ｍＡｂ試料をバッファーＡとバッファーＤが１：１の混合物で１ｍｇ／ｍＬに希釈し、５±３℃でオートサンプラー中に保った。Ｐｒｏｐａｃ ＷＣＸ−１０ＨＴ、４ｘ５０ｍｍカラムを、４０±１℃の温度設定でカラムコンパートメント中に置いた。４×２５０ｍｍ Ｄｉｏｎｅｘ Ｐｒｏｐａｃ ＷＣＸカラムをクロマトグラフィー分離のために使用し、４０±１℃の温度設定でカラムコンパートメント中に置いた。各クロマトグラフの実行に関して、１０μＬのタンパク質（２０μｇ）を注入した。
【０２７８】
バッファーＡ、Ｂ及び食塩水（０．５Ｍ ＮａＣｌ）を使用した四元ポンプ上に形成された三元勾配を使用して、塩媒介のｐＨ勾配を確立した。５８分間における１００％のＡから９６．８％のＢと３．２％の食塩水の直線勾配を送達し、５．０から１０．８（０．１ｐＨユニット／分）のｐＨ勾配及び０から１６ｍＭ ＮａＣｌ（０．２８ｍＭ／分）の塩媒介の勾配を確立した。最終勾配（分、％Ｂ及びＣ）は以下の通りである：０、１００％ Ａ；２、１００％ Ａ；６０、９６．８％ Ｂ及び３．２％ Ｃ；６４、９６．８％ Ｂ及び３．２％ Ｃ；６５、１００％ Ａ；７５、１００％ Ａ。移動相の流量は１．０ｍＬ／分であった。
【０２７９】
５．０から９．５の報告されたｐＨ勾配（Farnan, D and Moreno, GT (2009) Anal. Chem. 81:8846）をバッファーＣ及びＤにより確立した。４５分間における０から１００％のバッファーＤの直線的増加を送達し、５．０から９．５（０．１ｐＨユニット／分）のｐＨ勾配を確立した。移動相の流量は、１．０ｍＬ／分であった。タンパク質を２８０ｎｍでの紫外線（ＵＶ）吸光度により検出した。
【０２８０】
複合ｐＨ勾配を、バッファーＡ、Ｂ、Ｃ及びＤを使用した四元ポンプ上に形成される四元勾配を使用して確立した。この配置は、１）バッファーＡ及びＢを使用した、出発及び終了ｐＨと、２）バッファーＣ及びＤを使用した、各勾配に係る塩の量とを調整するフレキシビリティを提供した。バッファーＢを０から４０％へ増加させる一方、バッファーＣ及びＤをそれぞれ１０％及び４０％に維持することにより、これらの実験で使用した方法の一例である、１０ｍＭの一定した塩濃度を有する６から１０のｐＨ勾配を確立した。使用した勾配を表２に記す。
【０２８１】
ｐＨ−ＩＥＣのモデル化
理想溶液モデルに基づき、成分のそれぞれに関するヘンダーソン−ハッセルバルヒ（Ｈ−Ｈ）等式を使用して、二つのｐＨバッファーの直線的混合勾配のｐＨを確立した。最初に各出発バッファーに関して、続いて、０．１ｐＨユニットの工程での二つのバッファー間の各ｐＨ値に関して、入手可能な／解離性プロトンの数を決定した。プロトンの必要数に基づき、二つのバッファーのモル比率を導き出した。勾配中のｐＨ点を得るための各バッファーの割合を入手した。推定されたイオン成分を使用して、イオン強度を各ｐＨ点で計算した。
【０２８２】
実施例１  ｐＨ−ＩＥＣ法の評価
ｐＨ−ＩＥＣ法の実施を評価した。報告されたｐＨ−ＩＥＣ法は複数のｍＡｂの電荷不均一性をプロファイリングする能力を示すが、主に約７から９のｐＩ値を有するｍＡｂを対象としている。この範囲を超える（ｐＩ＜７又はｐＩ＞９、ｐＩ極値とも称される）ｍＡｂに関し、ｐＨ−ＩＥＣ法はしばしば許容できない電荷不均一性プロファイルを生み出す。この方法を評価するために、既に報告された以下の手順に従って５．０から９．５のｐＨ勾配を生じさせた（Farnan, D and Moreno, GT (2009) Anal. Chem. 81:8846; Rea, JC et al. (2010) J. Pharm. Biomed. Anal. 54:317）。バッファーは、１１．４ｍＭ ピペラジン、１．５ｍＭ イミダゾール及び２．４ｍＭトリスから構成され、ｐＨをそれぞれ５．０及び９．５に調整した。広範囲のｐＩ（６．２、８．２及び９．４）にわたる三つのｍＡｂを分析し、得られたクロマトグラムを図１に示す。これらのｍＡｂのうち、ｍＡｂ２（ｐＩ８．２）のみが、電荷変異体の良好な分離により特徴づけられる、許容される電荷不均一性プロファイルを示した。低ｐＩのｍＡｂ１（ｐＩ＝６．２）の電荷変異体はうまく分離せず、高ｐＩのｍＡｂ３（ｐＩ９．４）はｐＨ勾配中溶出しなかった。ｐＨ勾配がｐＨ１０．８にまで及んだ場合にｍＡｂ３は溶出したが、カラム背圧はカラムの圧力上限の寸前であり、クロマトグラフィープロファイルは異なる実験間で一貫性がなかった。この実験は、報告されたｐＨ−ＩＥＣ法が７から９の間のｐＩ値を有するｍＡｂに関してうまく機能したが、ｐＩ極値を有するｍＡｂの電荷不均一性をプロファイルすることはできなかったことを明らかに実証した。
表２  試料勾配
2015537212.tif 000004
【０２８３】
カラム出口でｐＨは５．０から９．５に増加し、溶媒の導電率は、２７００から８００μＳ／ｍのほぼ直線型で減少した（５ｍＭ ＫＣｌの導電率が７２０μＳ／ｍである一方、脱イオン水の導電率は５．５μＳ／ｍであることに留意すること）。三つのｐＨバッファー成分は全て、広範囲にわたるｐＫａを有するアミンである：ｐＫａ１＝５．６８及びｐＫａ２＝９．８２を含有するピペラジン、ｐＫａ＝６．９５を含有するイミダゾール及びｐＫａ＝８．１０を含有するトリス（室温）。溶液のｐＨがそのｐＫａより低い場合、これらの化合物はプロトン化（又は正に帯電）するが、ｐＨがそのｐＫａより大きい場合は中性になる。溶液のｐＨが増加する場合、バッファー成分はプロトン化した状態から次第に中性になり、したがって、バッファーの導電率は減少する。ピペラジンがバッファー中で最も多い成分であるため、ｐＨプロファイルがｐＨおよそ６で凹であり、よって、ｐＨ曲線がその５．６８及び９．８２の二つのｐＫａ周辺で比較的平坦であることは注目に値する。
【０２８４】
図２Ａの破線で示す理想溶液モデルに基づき、ｐＨ勾配のｐＨ及びイオン強度プロファイも計算した。モデル化ｐＨ曲線は、システム保圧体積及びカラム体積のため、実験プロファイルが５分間遅れたことを除き、実験ｐＨプロファイルと非常に類似している。同様に、モデル化イオン強度曲線は、実験的に観察された導電率プロファイルと類似した形状を示した。モデル化データと実験データとの間の一致は、アミンベースのバッファー成分を混合することにより理想溶液モデルが生じたことを示唆する。したがって、確立したモデルは、他のクロマトグラフィー条件での実験ｐＨ及びイオン強度プロファイルを推定するのに使用され得る。
【０２８５】
更に、ｐＨ−ＩＥＣ中のカラム背圧は、移動相のｐＨと共に有意に増加した（図２Ｂ）。ｐＨ勾配中の移動相の組成物が一定であったことを考慮すると、これは、イオン強度の減少によるものである。二重層モデル（Staahlberg, J (1994) Anal. Chem. 66:440; Stahlberg, J (1999) J. Chromatogr. A 855:3）によると、移動相のイオン強度が低い場合、固定相表面上の静電ポテンシャルは高くなる。高い静電ポテンシャルは、樹脂の立体配座を変更してもよく（例えば、樹脂を膨張させて表面電荷密度を低減させる）、これにより、カラム背圧は増加する可能性が高い（Product Manual for Propac WCX-10 and Propac SCX-10, 7th ed., Dionex Incorporation, Sunnyvale, CA, 2007）。
【０２８６】
実験導電率及びモデル化イオン強度プロファイルは、ｐＩ極値を有するｍＡｂに関する低い電荷不均一性プロファイルを説明するのに使用され得る。低ｐＩのｍＡｂは、バッファー成分がプロトン化され、移動相が比較的高いイオン強度を有する低ｐＨ領域で溶出する。ｐＨ勾配ＩＥＣ分離が、イオン強度ベース及びｐＨベースの溶出メカニズムの組合せに関係することを明らかにしている（Anderson, DJ and Shan, L (2001) Clin. Chem. 47:128; Shan, L and Anderson, DJ (2001) J. Chromatogr. A 909:191; Shan, L and Anderson, DJ (2002) Anal. Chem. 74:5641）ため、高いイオン強度ベースの溶出はｐＨベースの溶出を包含してもよく、これらの低ｐＩのｍＡｂ電荷変異体の分解能は低くなる。他方、高ｐＩのｍＡｂは、典型的には、バッファー成分が中性になる高ｐＨ領域で溶出する。移動相中の低いイオン強度のため、これらの高ｐＩのｍＡｂが陽イオン交換カラムから溶出することは難しい。イオン強度がｐＨ−ＩＥＣ分離に有意に影響を及ぼし、ｐＩ極値を有するｍＡｂに関するｐＨ−ＩＥＣ法を改善することを確認するため、ｐＨ勾配ＩＥＣ法におけるｐＨバッファーのイオン強度を以下に記載されるように調節した。
【０２８７】
実施例３  イオン強度の制御によるｐＨ勾配ＩＥＣ法の改善
ｐＨ勾配中のイオン強度を二つの方式で調節した。第一には、低ｐＨ領域でのイオン強度を、異なる濃度のバッファーを使用することにより制御した。一連のバッファー濃度を、以下に述べるように、ｐＨ勾配ＩＥＣに対するその影響を評価するために試験した。第二には、高ｐＨ領域でのイオン強度を、ｐＨ勾配に塩勾配を付加することにより調節した。塩濃度の影響も調査した。したがって、新たな方法は「イオン強度媒介のｐＨ−ＩＥＣ」法と称される。
【０２８８】
バッファー濃度：この方法において、二つの検討に基づいて、報告された方法（Farnan, D and Moreno, GT (2009) Anal. Chem. 81:8846）で使用された混合比率ｐＨ勾配よりも等モルｐＨ勾配を使用した。第一は、ほぼ直線のｐＨ勾配は、ピペラジン、イミダゾール及びトリスの等モル濃度を使用することにより入手され得る（図２Ｃ）点である。広範囲のｐＨにわたる確立した直線勾配は、所与のｐＨ領域に関する分離を犠牲にすることはなかった（Tsonev, LI and Hirsh, AG (2008) J. Chromatogr. A 1200:166）。第二は、勾配傾斜の最適化を提供する点である。
【０２８９】
ピペラジン、イミダゾール及びトリスの１、２、４及び８ｍＭでの等モル濃度からなる四つのバッファーを調査した。これらのバッファーは、１、２、４及び８ｍＭバッファーと称され、それぞれをｐＨ５．０から１０．８のｐＨ勾配及び０から１６ｍＭ ＮａＣｌの直線塩勾配で媒介した。四つのバッファーを用いたｍＡｂ１（ｐＩ＝６．２）のクロマトグラムを図３Ａに示す。電荷変異体間の分解は、バッファー濃度に明らかに依拠した。１ｍＭバッファーでは、電荷変異体はほとんど分離しなかった。２ｍＭバッファーで分解は改善し、４ｍＭバッファーでピークとなった。しかしながら、８ｍＭバッファーでは分解は有意に減少した。反対に、ｍＡｂ２（ｐＩ＝８．２）の分解は、ｍＡｂ１よりもバッファー濃度に対して敏感ではなかった（図３Ｂ）。４ｍＭバッファーが他の三つのバッファーよりもわずかに良好な分解をもたらしたが、四つのバッファー全てでｍＡｂ２（ｐＩ＝８．２）に関する良好な分解が達成された。上記の目視検査に基づき、４ｍＭバッファーがｍＡｂ１及びｍＡｂ２に関する最善の分解を提供することが明らかであった。
【０２９０】
ｐＨ−ＩＥＣに対するバッファー濃度の影響をより良好に視覚化するために、バッファー濃度に応じてプロットしたｍＡｂの主ピークの半値全幅（ＦＷＨＭ）を図３Ｃに示す。主ピークのＦＷＨＭは、一般的に、ＦＷＨＭが低くなることは分解能が高くなることを表すという点において、ｐＨ−ＩＥＣの分解と関連がある。ｍＡｂ１とｍＡｂ２の両方に関して、４ｍＭバッファーを用いた主ピークのＦＷＨＭは、四つのバッファー中で最も低く、これは、４ｍＭバッファーは最も狭いピーク幅、故に良好な分解を提供することを示唆している。反対に、ｍＡｂ３（ｐＩ＝９．４）に関して、バッファー濃度が１から８ｍＭに増加した場合、主ピークのＦＷＨＭは僅かに減少した。したがって、８ｍＭバッファーは、ｍＡｂ３に対して最善の分解を提供する可能性が高かった。
【０２９１】
ｍＡｂのｐＨ−ＩＥＣに対するバッファー濃度の影響は、ｍＡｂのｐＩ値次第であった。低いｐＩ値（６．２）及び中程度のｐＩ値（８．２）を有するｍＡｂは、４ｍＭバッファーで最適な分離を示し、その一方、高いｐＩ値（９．４）を有するｍＡｂには、高濃度のバッファーが好ましいと思われた。高ｐＩのｍＡｂはカラムと強力に結合し、それ故、最適な分離を達成するために、低ｐＩ及び中程度のｐＩのｍＡｂよりも多くのイオン強度ベースの溶出を要することがあるため、上記は妥当である。バッファー濃度及び導電率が、ｐＨ勾配ＩＥＣ中のｍＡｂの分解に明らかに影響を及ぼすため、高い分解能が所望される場合はいつでも、これらは各個別のｍＡｂに関して最適化されるべきである。広範囲のｐＩにわたるｍＡｂに関して、主ピークから酸性及び塩基性変異体を分解し得るＩＥＣ法を開発された。４ｍＭバッファーは、この要件を満たすと思われ、したがって多産物の塩媒介のｐＨ−ＩＥＣ法に選定した。
【０２９２】
塩濃度：イオン強度がｐＨ−ＩＥＣ分離にどのように影響するかを調査するため、五つの異なるレベル（０、８、１６、３２及び６４ｍＭ）の塩化ナトリウムをｐＨ５．０から１０．８の直線勾配を通じてｐＨ勾配（４ｍＭバッファーにより確立）に付加した。ｍＡｂ１、ｍＡｂ２及びｍＡｂ３を並行して分析した。ｍＡｂの主ピークのＦＷＨＭを、図３Ｄに示すように、塩濃度に応じてプロットした。ｍＡｂ１に関して、主ピークのＦＷＨＭは、塩濃度に対し非常に敏感であり、８ｍＭ ＮａＣｌで最小値に達した。これは、８ｍＭ ＮａＣｌはｍＡｂ１に関して最善の分解を提供したことを示唆する。ｍＡｂ２に関して、主ピークのＦＷＨＭは、全範囲の塩濃度にわたり、基本的に平坦であり、このことは、塩濃度はｍＡｂ２の分解に明らかには影響しなかったことを示唆した。反対に、ｍＡｂ３に関して、主ピークのＦＷＨＭは、８から３２ｍＭへの塩濃度の増加を伴って減少し、３２ｍＭから６４ｍＭの間の塩では変化がなかった。これは、ｍＡｂ３は最適な分解を達成するためには３２ｍＭの塩が必要であったことを示唆する。
【０２９３】
ｍＡｂのｐＨ勾配ＩＥＣに対するイオン強度の影響は、ｍＡｂのｐＩとも関連がある。低ｐＩのｍＡｂは、８ｍＭの塩での分離を示し；高ｐＩのｍＡｂは、高濃度の塩での分離を示し、一方、中程度のｐＩのｍＡｂは塩濃度から独立していた。分解に対する明らかな影響のため、塩濃度は、高い分解能が所望される場合はいつでも、各個別のｍＡｂに関して最適化されてもよい。五つの塩濃度のうち、１６ｍＭ ＮａＣｌの塩勾配を伴うｐＨ−ＩＥＣ法は、６．２から９．２の広範囲にわたるｐＩ値を有するｍＡｂに関する許容される分解能を提供し、したがって、これをこの研究における多産物の塩媒介のｐＨ−ＩＥＣ法として選定した。
【０２９４】
最適化したイオン強度媒介のｐＨ−ＩＥＣ法：最適化した塩媒介のｐＨ−ＩＥＣ法は、ｐＨ勾配を確立するために４ｍＭ ピペラジン、４ｍＭ イミダゾール及び４ｍＭトリスを用い、０から１６ｍＭのＮａＣｌの直線塩勾配で媒介された。この方法のｐＨ及び導電率プロファイルを図２Ｃ中の実線で示す。比較のため、モデル化ｐＨ及びイオン強度を破線で示す。カラム出口での実験ｐＨは、ｐＨ８．５から９．０での小さな凹を除き、保持時間と共にほぼ直線的に増加し、これはシステム空隙容量による５分間の遅延時間を除き、モデル化ｐＨと一致している。塩媒介により、移動相の実験導電率は、ｐＨ勾配中（１５７０から１８００μＳ）僅かな増加を示した。同様に、モデル化イオン強度は、ｐＨ勾配中基本的に一致していた。バッファー濃度を減少させること及び直線塩勾配を付加することにより、アミノベースのｐＨ勾配のイオン強度を首尾よく制御した。制御されたイオン強度により、カラム背圧を高ｐＨ領域で９５バール未満に維持した（図２Ｄ）。ｍＡｂ１〜３（非表示）の得られたクロマトグラムは再現性があり、陽イオン交換カラムはこの圧力範囲において安定していたことを示した。
【０２９５】
実施例４  １６のｍＡｂの電荷不均一性のプロファイリング
塩媒介の新たなｐＨ−ＩＥＣ法の多産物能力を更に実証するために、６．２から９．４のｐＩ値を有する１６のｍＡｂを分析し、それらのクロマトグラムを図４に示す。ｐＨ５からｐＨ１０．８のｐＨ勾配及び０ｍＭ ＮａＣｌから１６ｍＭ ＮａＣｌの塩勾配で抗体をカラムから溶出させた。低ｐＩのｍＡｂ１（６．２）と高ｐＩのｍＡｂ３（９．４）の両方に関して、電荷変異体をうまく分離し、許容される電荷不均一性プロファイルを生じさせた。これは、報告されたｐＨ−ＩＥＣ法と比較して、実質的な改善である（図１）。１６のｍＡｂ全ての電荷変異体をうまく分離し、このことは、開発された塩媒介のｐＨ−ＩＥＣ法が、追加方法の開発努力なく、複数のｍＡｂ産物の電荷不均一性をプロファイルする能力があることを示した。
【０２９６】
広範な適用性に加えて、塩媒介のｐＨ勾配は、報告されたｐＨ−ＩＥＣ法よりも良好な分解を提供した。ｍＡｂ２（ｐＩ＝８．２）に関して、塩媒介のｐＨ−ＩＥＣ法は、電荷変異体間の基準分解を提供した（図４）。しかしながら、以前のｐＨ−ＩＥＣ法による分解能は、はるかに低かった（図１）。塩媒介のｐＨ勾配は、以前のｐＨ勾配（４５分）よりも長かった（５８分）が、二つの方法の勾配傾斜は、同一（０．１ｐＨユニット／分）であった。したがって、塩媒介のｐＨ−ＩＥＣ法により改善された分解は、勾配の長さにおける変化の結果ではなく、イオン強度を制御することの効果によるものであった。
【０２９７】
実施例５  ｍＡｂの熱安定性のモニタリング
陽イオン交換クロマトグラフィーは、生成中の生物薬剤学的タンパク質の分解及びロット間変動を評価するために、一般的に使用される（Vlasak, J and Ionescu, R(2008) Curr. Pharm. Biotechnol. 9:468）。タンパク質分解をモニターする能力を実証するために、開発されたイオン強度媒介のｐＨ−ＩＥＣ法を使用し、熱ストレス後のｍＡｂ１の電荷不均一性をプロファイルした。ｍＡｂ１をこの研究で選定したのは、それがｍＡｂ間で最も低い保持力を有し、そのｐＨ−ＩＥＣプロファイルがクロマトグラフィーパラメータにおける変化の影響を最も受けやすかったためである。ｐＨ５からｐＨ１０．８のｐＨ勾配及び０ｍＭ ＮａＣｌから１６ｍＭ ＮａＣｌの塩勾配で抗体をカラムから溶出させた。
【０２９８】
ｍＡｂ１のコントロール物質及びストレスを加えた物質のクロマトグラムは、主ピークで標準化された（図５）。熱ストレス後、酸性変異体と塩基性変異体の両方が増加した。ストレスを加えた試料に関する主ピークの右に山の肩が見られた。これらのプロファイルの変化は、４０℃で３及び６週間のインキュベート後にｍＡｂ１が分解したことを明らかに示す。同様に、熱ストレス下のｍＡｂ２及びｍＡｂ３の分解も、塩媒介のｐＨ−ＩＥＣ法により検出された（データ非表示）。
【０２９９】
実施例６  イオン強度媒介のｐＨ−ＩＥＣのロバスト性試験
塩媒介のｐＨ−ＩＥＣ法の複合溶出プロセスのため、定期的な試料試験に関するロバスト性を保証することが必要である。上述の通り、出願人は、ｐＨバッファー組成物及び塩濃度がｍＡｂの保持及び分解に影響を与えたことを理解している。更なる研究の目的は、最適化されたｐＨバッファー組成物及び塩濃度を使用した場合の、カラム、バッファーロット、及び機器から生じる変動性を調査することであった。三つのカラム、三つのバッファーロット、二つの機器を異なる四日間で試験した。実験計画を表３に示す。ｍＡｂ１のｐＨ−ＩＥＣプロファイルがクロマトグラフィーパラメータにおける変化の影響を最も受けやすかったため、それをこの研究で再度選定した。
【０３００】
異なるカラム及びバッファーロットで得られたｍＡｂ１のクロマトグラムは比較可能であったが、異なる機器で得られたクロマトグラムは、僅かに異なる保持時間を示した。機器間で見込まれる遅延容量の差異は、保持時間における変動を説明するが、この方法の実施に影響を及ぼさない。ｍＡｂ１の電荷変異体の定量を表４に概説する。二つの異なる機器、三つのカラム及び三つのバッファー調製物で得られた１６のクロマトグラムに関して、電荷変異体の定量は一致しており、これは、塩媒介のｐＨ−ＩＥＣがこれらのクロマトグラフィー条件でロバストであったことを示す。
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【０３０１】
塩媒介のｐＨ勾配ＩＥＣはまた、カラム上の広範囲の試料質量負荷にわたってロバストであった。図６に示すように、５−２００μｇのｍＡｂ１がカラムにロードされた場合、一致した溶出プロファイルが観察された。カラムロードが５０μｇを超えた場合、主ピークはわずかに拡大したが、電荷変異体の定量は、試験された全てのカラムロード間で一致していた（表５）。
【０３０２】
ロバスト性研究中、典型的なＨＰＬＣ実験で生じた多くの変異体を網羅するための十分なデータを得た。塩媒介のｐＨ−ＩＥＣ法は、比較可能なクロマトグラム及び典型的なｍＡｂに関する電荷変異体の一致した定量化の結果を提供し、これは、この方法がここで研究された全てのクロマトグラフィー条件でロバストであることを実証する。
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【０３０３】
実施例７：イオン強度媒介のｐＨ−ＩＥＣに関する実行時間の削減
以前は、ｐＨ媒介のＩＥＣ法は、ピペラジン、イミダゾール、トリス（ＰＩＴ）をバッファー試薬として使用した（Farnan, D and Moreno), GT 2009 Anal. Chem. 81:884-8857）。ｐＨ勾配を生成するため、半直線ｐＨ曲線をｐＨ６から９．５で生成した。各バッファー試薬のアミノ官能基は、図７に示すように、移動相ｐＨが試薬のｐＫａより小さい場合は正電荷を維持し、移動相ｐＨが試薬のｐＫａより大きい場合は中性を維持した。ｐＨ勾配は、３５分間のｐＨ５からｐＨ９．５の勾配でバッファーＡ（ｐＨ５．０）及びバッファーＢ（ｐＨ９．５）を使用して生成した。カラムは、Ｐｒｏｐａｃ  ＷＣＸ−１０、４×２５０ｍＭであった。このバッファー試薬系ｐＨ勾配は、７から８．５の間のｐＩ値を有する広範な分子に関してうまく機能する。しかしながら、この機能範囲外の分子に関する電荷変異体は、同様には分解されない。予察作業により、バッファー試薬の濃度及びイオン強度がｐＨ曲線の直線性及び試料の保持時間に影響を及ぼすことが明らかになった。図２に示すように、ｐＨが経時的に増加するにつれて、イオン強度は著しく減少する。バッファー濃度の調整及び同時的な塩勾配の導入は、ｐＨ勾配中終始割と安定したイオン強度を提供した。同時的な塩勾配で、ｐＨ勾配分離は、６．２−９．４のｐＩ値を有する分子変異体を分解し得る。図８に示すように、５８分間の長い勾配を使用して、ｐＨが０．１ｐＨユニット／分の傾斜でｐＨ５からｐＨ１０．８に増加し、且つ塩濃度がＰＩＴバッファー（４ｍＭ ピペラジン、４ｍＮ イミダゾール及び４ｍＭトリス）中で０ｍＭ ＮａＣｌから１６ｍＭ ＮａＣｌに増加した場合、６．２（Ｍａｂ１）、８．２（Ｍａｂ２）及び９．４（Ｍａｂ３）のｐＩ値を有するモノクローナル抗体は分解する。改善された方法は、「イオン強度媒介のｐＨ勾配」又は「塩媒介のｐＨ勾配」と称される。
【０３０４】
実行時間を削減し、スループットを増加させるため、短いカラム（４×５０ｍｍ）上の塩媒介のｐＨ勾配を評価した。Farnan, D and Moreno, GT (2009) Anal. Chem. 81:8846-8857は、同一のｐＨ−ＩＥＣ分離モード（ＷＣＸ又はＳＣＸ）であることを条件として、カラムの長さに関係なく、ｐＨ−ＩＥＣを使用して同様の溶出プロファイルが得られることを示した。短いカラムが溶出時間を削減し得るかを決定するため、元のｐＨ−ＩＥＣ及びＷＣＸ−１０、４×５０ｍｍカラムを使用の塩媒介のｐＨ−ＩＥＣ移動相の両方を使用して、異なるｐＩ値を有する三つのＭａｂの分離を比較した。ｍＡｂは、Ｍａｂ１、ｐＩ７．６；Ｍａｂ２、ｐＩ８．６−９．３；及びＭａｂ３、ｐＩ９．１であった。ｐＨ勾配は、２２分間の合計実行時間に関して、ｐＨ６−１１で０−１６分間、ｐＨ１１で２分間保持、続いてｐＨ６で４分間の再平衡であった。元のｐＨ−ＩＥＣのバッファーは、２．４ｍＭトリス、１．５ｍＭ イミダゾール及び１１．６ｍＭ ピペラジンであった。イオン強度媒介のｐＨ−ＩＥＣのバッファーは、１６ｍＭ ＮａＣｌを伴う、４ｍＭトリス、４ｍＭ イミダゾール及び４ｍＭ ピペラジンであった。図９で見られるように、これら三つのｍＡｂに関する同様のピークプロファイルを得たが、分子のｐＩが増加するにつれて電荷変異体の分解は減少した。短い実行時間で広範囲のｐＩを有する分子の適切な分離を達成するために、変異体分離メカニズム及び異なるバッファーシステムに対する調査を開始した。
【０３０５】
バッファースクリーニングを助けるために、ｐＨ及び導電率予測ツールを使用してもよい。異なる組み合わせ、ｐＨ範囲及び勾配時間で一般的に使用されるバッファー及びＮａＣｌ塩のｐＨ及び導電率曲線は、バッファーのｐＫａに基づいて計算され、プロットされ得る。視覚化予測ツールは、所望の特性、例えば、線形ｐＨ曲線、経時的なイオン強度の安定若しくは増加、及びバッファー毒性の低下を有するバッファーシステムの迅速な最適化を可能にする。このモデルを使用して、様々なバッファーの組合せをスクリーンした。トリス、ピペラジン及びホスフェート（ＴＰＰ）バッファーの組合せは、１６分間勾配にわたり、線形ｐＨ勾配を形成することを発見した（図１０）。バッファーは、５．３３のｐＫａを有するピペラジンｐＫ１（範囲５．０−６．０）、７．２０のｐＫａを有するホスフェートｐＫ２（範囲５．８−８．０）、８．０６のｐＫａを有するトリスベース（範囲７．５−９．０）、９．７３のｐＫａを有するピペラジンｐＫ２（範囲９．５から９．８）及び１２．３３のｐＫａを有するホスフェートｐＫ３を含んだ。図１０のプロットは、ホスフェート分子がｐＨ範囲間終始、荷電のままであり、ｐＨが増加する際のトリス及びピペラジン中のアミノ官能基の脱プロトン化によるイオン強度の損失をある程度補償することを解明する。クロマトグラフィー条件は以下の通りであった：
カラム：Ｐｒｏｐａｃ ＷＣＸ−１０ＨＴ、４ｘ５０ｍｍ
ｐＨ勾配：５．０ｍＭトリス、ピペラジン、ホスフェート（ＴＰＰ）
バッファーＡ＝ｐＨ６．０
バッファーＢ＝ｐＨ１１．０  勾配：１６分間中６−１１
バッファーＣ＝６０ｍＭ ＮａＣｌ
バッファーＤ＝ＭｉｌｌｉＱ水
【０３０６】
予測されたｐＨ及び導電率曲線（図１１右パネル）は、実験で得られたそれら（左パネル）と一致していた。バッファーシステムは、５ｍＭのトリス、ピペラジン及びホスフェート、並びに１０ｍＭ、２０ｍＭ又は３０ｍＭ（モデルで使用）の何れかでの一定のＮａＣｌ濃度を含んだ。実験の流量は、１ｍＬ／分又は２ｍＬ／分であった。
【０３０７】
実施例８  最適なイオン強度範囲の決定
１６分間勾配の塩媒介のＴＰＰ法を使用して、様々な試料を分析した。４×５０及び４×２５０ Ｐｒｏｐａｃ ＷＣＸ−１０カラムからの２２分間方法と５８分間方法の間の一致したプロファイルの一例を、それぞれ図１２に示す。４×５０カラムを用いた溶出は、１６分間にわたるｐＨ６−１１及び０−３０ｍＭ ＮａＣｌの塩媒介のトリス／ピペラジン／ホスフェート（ＴＰＰ）を伴った。４×２５０カラムを用いた溶出は、５８分間にわたるｐＨ５−１０．８及び０−１６ｍＭ ＮａＣｌの塩媒介のピペラジン／イミダゾール／トリス（ＰＩＴ）を伴った。ｐＩの範囲が主に７−８．５の分子にとって塩媒介のＴＰＰ法は十分であることが決定され、これは元のＰＩＴ法で得られたものと類似的な範囲であった。バッファー試薬及びイオン強度は分離に関与するが、他の要因が関わっていてもよいことが結論付けられた。
【０３０８】
ｐＨ範囲にわたるｍＡｂの正味荷電状態をモデル化した。図１３は、異なるｐＩを有するｍＡｂに対するｐＨにわたる正味荷電のオーバーレイを示す。陽イオン交換モードにおいて、ｍＡｂは、ｐＨが減少してそのｐＩ（ｘ交差）に達するまで正電荷を運び、次いでカラムから溶出する。ｐＨが増加するにつれて、ｍＡｂは負に帯電するようになる。所与のタンパク質分子に関する電荷変異体プロファイルは、主ピーク、酸性領域及び塩基性領域からなる（下パネルに示す）。通常、電荷変異体は、主ピークから一又は少数の電荷分離れており、５−７の電荷に及ぶ最も酸性の変異体から最も塩基性の変異体の電荷エンベロープ全体を含む。最適なｐＨ勾配分離ウィンドウは、ｐＨ６．５からｐＨ８．５の間の曲線の平坦領域にあってもよく（図１３）；例えば、約８．５より小さいｐＩ値を有する分子に関して、理論ｐＩの直下の正味荷電はほとんど変化せず、その曲線はｐＨ６．５から８．５の間で比較的平坦である。ｐＨ勾配の実行中、ｐＨが経時的に増加するにつれて、電荷変異体が異なる保持時間でカラムから別々に溶出するのに十分な時間がある。
【０３０９】
逆に、８．５より大きいｐＩ値及び６．５より小さいｐＩ値を有する分子に関して、正味荷電状態はその理論ｐＩで著しく変化する（図１４）。プラットフォーム直線ｐＨ勾配の実行中、１分当たりの電荷傾斜は、これらのｐＨで急すぎて適正な分離ができず、一ピークが観察される（挿入図）。
【０３１０】
電荷対ｐＨ曲線の比較的平坦な部分においてより良好なピーク分離及びロバスト性が達成されたため、この領域において、それらのｐＩに関係なく、どのようにタンパク質電荷変異体を溶出させるかが問題である。これには、ｐＨ以外の要因を使用した、高ｐＩ分子に関する荷電状態の事前改変が必要である。この要因は、バッファーイオン強度である。移動相におけるイオン強度が高くなると、分子表面上の電荷がより多く固定相から保護される。したがって、見掛けの正味電荷が減少し、変異体がそのｐＩより下のｐＨで溶出することが可能になる。
【０３１１】
実施例１から６に表された研究において、塩勾配（塩媒介のｐＨ勾配）と組み合わされたＰＩＴ移動相におけるイオン強度の欠如を修正することにより、９より大きいｐＩ値（陽イオン交換モード）を有する分子の電荷変異体及び７より小さいｐＩ値（陰イオン交換モード）を有する分子の電荷変異体をうまく分離した。ｐＨ及び塩勾配の組み合わされた駆動力により、ｐＨ勾配単独の場合と比較して、分子の見掛けの荷電状態が経時的に速く減少することが可能になる。これは、ｐＨ７−８間での狭い平坦領域及び９より大きいｐＨでの浅い傾斜を有する、垂直に伸長された見掛けの電荷対ｐＨ曲線として説明され得る。したがって、高ｐＩを有する分子に関して、分離はそのｐＩをわずかに下回るｐＨで生じた。長いカラム（２５０ｍｍ）及び長い実行時間（６０分間）を使用すると、電荷変異体が溶出するのに十分な時間があった。しかしながら、塩媒介のｐＨ勾配法では、短い実行時間（２０分間）中短いカラム（５０ｍｍ）上で高ｐＩ分子に関する電荷変異体を分解することはできなかった。
【０３１２】
短い実行時間は致命的であるため、見掛けの電荷を６０分間にわたる塩勾配で次第に減少させる代わりに、塩を早く導入することにより、所望の荷電状態が実行開始時に達成され、終始一定に保たれ得る。
【０３１３】
図１５は、異なる濃度でのＮａＣｌ塩の存在下の高ｐＩのｍＡｂ（ｐＩ９．２）のｐＨ勾配分離のオーバーレイである。四元システムを使用して、ｐＨ６−１１のｐＨ勾配をＡ及びＢのラインを使用して生み出し、０、１０、２０、３０、４０又は５０ｍＭのＮａＣｌ塩濃度をＣ及びＤのラインを使用して維持した。勾配条件及び実行時間は以下の通りであった：機器：Ｕ３０００ ２ＤＬＣ；移動相：１０ｍＭトリス、ピペラジン、ホスフェート、Ａ）ｐＨ６．０、Ｂ）ｐＨ１１．０；Ｃ）１００ｍＭ ＮａＣｌ、Ｄ）ｍｉｌｌｉＱ 水；カラム：Ｐｒｏｐａｃ ＷＣＸ−１０、４×５０ｍｍ、１０μｍ；カラム温度：４０℃；流量：１ｍＬ／分；ｐＨ勾配：１０−５０％ Ｂ；塩定量：０ｍＭ＝０％ Ｃ、５０％ Ｄ；１０ｍＭ＝１０％ Ｃ、４０％ Ｄ；２０ｍＭ＝２０％ Ｃ、３０％ Ｄ、３０ｍＭ＝３０％ Ｃ、２０％ Ｄ、４０ｍＭ＝４０％ Ｃ、１０％ Ｄ、５０ｍＭ＝５０％ Ｃ、０％ Ｄ；試料濃度：１μｇ／μＬ；ロード容量：２０μＬ。
【０３１４】
低い塩濃度では、分離はほとんど観察されなかった。続く高い塩濃度では、溶出時間が減少する一方、分離は改善した。塩濃度を増加させて溶出時間を減少させることにより、見掛けの電荷が減少してそのｐＩを下回るｐＨで変異体の分離が可能になるよう、分子表面上の超過電荷が固定相から保護されることが裏付けられる。この場合、最適な分離は４０−５０ｍＭ ＮａＣｌで達成され、ここで、このｍＡｂの見掛けの電荷は、推定上、電荷対ｐＨ曲線の比較的平坦な部分に存在した。
【０３１５】
異なるｐＩを有する様々なｍＡｂの分析を、同一のｐＨ勾配を適用する一方、異なる一定の塩濃度で実施した。一般的に、最適な分離は、見掛けの電荷状態が電荷対ｐＨ曲線の平坦部分に収まるような一定の塩濃度で達成された。例えば、７−８．３のｐＩ範囲におけるｍＡｂは塩を必要とせず、８．３−８．８のｐＩ範囲におけるｍＡｂは２０ｍＭの塩を必要とし、８．８−９．０のｐＩ範囲におけるｍＡｂは５０ｍＭの塩を必要とした（図１６及び１７）。電荷対ｐＨ曲線上で、塩の付加はｘ軸を分子の所望の荷電状態へと基本的に移動させ、曲線の平坦領域における最適な分離を可能にする。この種の分離は「複合」ｐＨ勾配と称される（図１８）。
【０３１６】
勾配条件を変更することにより、改善された分離を達成した。浅い複合ｐＨ−ＩＥＣ勾配（ＴＰＰ移動相を使用）は、元の方法と塩媒介のｐＨ−ＩＥＣ法との何れと比較しても、改善したピーク分離をもたらした（図１９及び２０）。同様の分離を１０ｍＭ ＮａＣｌを伴うＴＩＣバッファー（トリス、イミダゾール、ＣＡＰＳ）を使用して達成し、ピペラジン（危険物処理に関するもの）、及びホスフェート（バッファー触媒翻訳語修飾によるアッセイのアーチファクトを不利に誘発し得る多用途の生物学的バッファー）を置き換えた（図２１）。
【０３１７】
短時間複合ｐＨ−ＩＥＣ法は、より高速の分析時間が可能であるかを決定するために、更にチャレンジを要した。ｐＨ勾配は、１５分間の合計実行時間に関して、１０分間ｐＨ７−１０で設定され、ｐＨ１０で２分間保持及び３分間の平衡を伴った。
【０３１８】
クロマトグラフィー条件は以下の通りであった：機器：Ｕ３０００ ２ＤＬＣ；移動相：１０ｍＭトリス、ピペラジン、ホスフェート、Ａ）ｐＨ６．０、Ｂ）ｐＨ１１．０；Ｃ）１００ｍＭ ＮａＣｌ、Ｄ）ｍｉｌｌｉＱ水；カラム：Ｐｒｏｐａｃ ＷＣＸ−１０ＨＴ、４×５０ｍｍ、１０μｍ；カラム温度：４０℃；流量：１ｍＬ／分；ｐＨ勾配：０−３０％ Ｂ；塩定量：０ｍＭ＝０％ Ｃ、５０％ Ｄ；１０ｍＭ＝１０％ Ｃ、４０％ Ｄ；２０ｍＭ＝２０％ Ｃ、３０％ Ｄ、３０ｍＭ＝３０％ Ｃ、２０％ Ｄ、４０ｍＭ＝４０％ Ｃ、１０％ Ｄ、５０ｍＭ＝５０％ Ｃ、０％ Ｄ；試料濃度：１μｇ／μＬ；ロード容量：２０μＬ。
【０３１９】
図２２及び２３に示すように、それぞれ８．８及び９．０のｐＩ値を有する二つの異なるｍＡｂに関する、１５分間と２２分間との実行の間で、プロファイルは類似していた。しかしながら、実行時間が短くなると、より産物に特異的な出発／終了ｐＨ値及び塩濃度が必要であった。
【０３２０】
産物に特異的な方法を開発する際、分子のｐＩに基づいて適切なｐＨ勾配傾斜及び塩濃度を注意深く選択することにより、最適な分離を達成し得る。一の産物のみが単独で順番に分析される場合、産物に特異的な方法は有益であろう。それぞれ異なるｐＩを有する様々なｍＡｂを分析する研究室にとって、ｐＨ勾配を送達し得る四元システムを使用し、一定の塩濃度を維持することが望ましい。そうでなければ、２２分間の長い実行時間は、固定の塩濃度でｐＨ勾配を送達する二元システムを使用したプラットフォーム法として必要であることがある。
【０３２１】
実施例９  イオン強度媒介のｐＨ勾配イオン交換クロマトグラフィーのロバスト性
実験計画（ＤＯＥ）アプローチを使用して、広範囲のｐＩを有する複数のモノクローナル抗体産物の分析に適した、イオン強度媒介のｐＨ勾配イオン交換クロマトグラフィーのロバスト性ウィンドウ及び目的実行条件を実証する。主ピーク（主％）、酸性変異体ピーク（ＡＶ％）及び塩基性変異体ピーク（ＢＶ％）の関連するピーク領域を含む報告可能な値に関して有意な変化が見られない場合、該方法は、適切にロバストである。加えて、ピーク分解（Ｒｓ１及びＲｓ２）により測定される一般的なピークプロファイル。ロバスト性を試験するため、塩濃度、バッファー濃度、ｐＨ、カラム温度及び流量等の実行パラメータを意図的に摂動した。
【０３２２】
物質及び方法
以下の三つの抗体を試験した：
ｍＡｂ１、ｐＩ＝８．２
ｍＡｂ２、ｐＩ＝８．５
ｍＡｂ３、ｐＩ＝９．０
【０３２３】
８ポート、カラム用３方式スイッチバルブ、ラインＣ及びＤ用の６ポート溶媒セレクターバルブを備えるWaters 2796 Bioseparations Module及びWaters 2487 Dual λ UV検出器をクロマトグラフィーに使用した。
【０３２４】
クロマトグラフィーカラムは、Ｄｉｏｎｅｘ ＰｒｏＰａｃ ＷＣＸ−１０ＨＴ、４×５０ｍｍカラムであった。
【０３２５】
バッファーシステムは以下の通りであった：等モルのイミダゾール、トリス並びにバッファーＡ及びＢ用のＣＡＰＳ。バッファーＣは１００ｍＭのＮａＣｌであり、バッファーＤは水であった。
【０３２６】
バッファーＡのｐＨは実験計画表（表６）に明記される通りであり、バッファーＢのｐＨは１０．０であった。使用された総バッファー強度及び塩濃度を実験計画表に示す。
【０３２７】
勾配は以下の通りであった：出発ｐＨで０−２分；出発ｐＨからｐＨ１０で２−１６分；ｐＨ１０で１６−１８分；出発ｐＨで１８−２２分。選択された塩濃度は勾配を通じて一定したままであった。
【０３２８】
カラム温度及び流量を表６に示すように使用した。
【０３２９】
３ｍＡｂ：
ｍＡｂ１、ｐＩ＝８．２
ｍＡｂ２、ｐＩ＝８．５
ｍＡｂ３、ｐＩ＝９．０
【０３３０】
８ポート、カラム用３方式スイッチバルブ、ラインＣ及びＤ用の６ポート溶媒セレクターバルブを備えるWaters 2796 Bioseparations Module及びWaters 2487 Dual λ UV検出器をクロマトグラフィーに使用した。
【０３３１】
Ｄｉｏｎｅｘ ＰｒｏＰａｃ ＷＣＸ−１０ＨＴ、４ｘ５０ｍｍカラム。
【０３３２】
バッファーシステム：等モルのイミダゾール、トリス並びにバッファーＡ及びＢ用のＣＡＰＳ。バッファーＣは１００ｍＭのＮａＣｌであり、バッファーＤは水である。
【０３３３】
バッファーＡのｐＨは実験計画表に明記され、バッファーＢのｐＨは１０．０である。総バッファー強度及び塩濃度を実験計画表に示す。
【０３３４】
勾配：出発ｐＨで０−２分；出発ｐＨからｐＨ１０で２−１６分；ｐＨ１０で１６−１８分；出発ｐＨで１８−２２分。選択された塩濃度は勾配を通じて一定したままである。
【０３３５】
カラム温度及び流量：実験計画表を参照のこと。
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【０３３６】
複数のモノクローナル抗体産物の分析に関するクロマトグラフィー手順のロバスト性を、２０ｍＭの塩、１５ｍＭバッファー、出発ｐＨ６．０、カラム温度４０℃及び流量１．０ｍｌ／分の目的実行条件（表６の０に指定される）からの、体系的に摂動するパラメータにより試験した。８．２、８．５及び９．０のｐＩを有する三つの異なるｍＡｂを試験した。目的実行条件での二重クロマトグラフィーの得られたクロマトグラムを図２４に表す。表６に従って実行条件を摂動することによる、ＭＡｂ３の目的実行条件のロバスト性に関する試験の一例を図２５に表す。分解においていくつかの僅かな相違があるが、一般的なピークプロファイル、特に三つの領域（酸性、主及び塩基性）は維持され、定量化を可能にする。
【０３３７】
この方法を実施する上での実行パラメータの効果は、分配プロットを使用して視覚化され得る（図２６）。このプロットにおいて、異なる条件での分析に関する報告可能な値（主％、ＡＶ％及びＢＶ％）は、目的条件（各パネルの中心、即ち、２０ｍＭの塩）でのそれらの値付近に分配された。結果は、塩濃度による報告可能な値への有意な効果は見られなかったことを示す。しかしながら、塩濃度の増加を伴う分解における傾向：ＭＡｂ１（ｐＩ＝８．２）及びＭＡｂ２（ｐＩ＝８．５）に関するわずかな減少傾向、並びにＭＡｂ３（ｐＩ＝９）に関する増加傾向があった。産物特異的方法に関して、分子のｐＩの増加に伴い、塩濃度を増加させることにより分解能は更に改善され得ることが示唆される。多産物方法として、塩濃度を広範囲にわたるｐＩを有するｍＡｂに関して最適化した。これらの研究の結果は、７．０から９．５の範囲のｐＩを有する抗体の分析に関して、２０ｍＭが有用な塩濃度であることを実証した。
【０３３８】
他の実行パラメータの効果もプロットし、図２７に表す。これらのプロットにおいて、異なる条件での分析に関する報告可能な値（主％、ＡＶ％及びＢＶ％）はまた、目的条件でのそれらの値付近に集中した。結果は、実行条件の意図的な摂動による報告可能な値への有意な効果は見られなかったことを実証する。したがって、目的実行条件で、多産物方法は適切にロバストである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図３Ｃ−Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2015537212.tif 000018
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ−Ｂ】
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【図１１Ｃ−Ｄ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
2015537212.tif 000040
【図２７Ｂ】
2015537212.tif 000041
【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【国際調査報告】
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