(57)【要約】  本発明は、微細藻類の発酵によって産生されるスクアレンが非常に豊富である組成物を調製する方法に関する。本方法は、抽出物還流を用いた多段向流分画カラム内での超臨界ＣＯ２抽出、および短経路分子蒸留を含む群から選択される精製ステップを含むことを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抽出物還流と向流で動作する多段分画カラム内での超臨界ＣＯ２を用いた抽出、およびいわゆる「短経路」分子蒸留からなる群から選択される精製ステップを含むことを特徴とする、微生物の発酵により産生される高スクアレン含量を有する組成物を調製する方法。
【請求項２】
前記微生物が、スラウストキトリアレス科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ  ｓｐ．）に属する微細藻類であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記スラウストキトリアレス科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ  ｓｐ．）に属する微細藻類が、スキゾキトリウム種（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）、オーランチオキトリウム種（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）およびスラウストキトリウム種（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）の微細藻類であることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
下記のステップ：
１）スラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）科に属する微細藻類のバイオマスを調製するステップ、
２）少なくとも１０重量％のスクアレン、好ましくは少なくとも１５重量％のスクアレンを含有する粗製油を得るために、前記バイオマスを処理するステップ、
３）７０〜７５％のスクアレン含量を有する抽出物および１．５％未満のスクアレンを有するラフィネートを製造するために、このようにして得られる前記粗製油を、抽出物還流と向流で動作する多段分画カラム内で超臨界圧の流体と接触させることにより分画するステップ、
４）９５〜９９重量％のスクアレン含量を得るために、このようにして得られる前記抽出物を、ステップ３）におけるものと同様の、抽出物還流と向流で動作する多段分画カラム内で超臨界圧の流体と接触させるステップ、
５）このようにして得られる前記スクアレン組成物を回収するステップ、
を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記向流で動作する多段分画カラムが、構造化パッキングを備えたカラムであることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ステップ３）で使用される前記超臨界圧の流体を、圧力１０〜５０ＭＰａ、好ましくは１５〜２５ＭＰａ、および温度４０〜８０℃に上昇させることを特徴とする、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
ステップ４）で使用される前記超臨界圧の流体を、圧力１０〜３０ＭＰａ、好ましくは１０〜２０ＭＰａ、および温度４０〜８０℃に上昇させることを特徴とする、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記超臨界圧の流体が純二酸化炭素であることを特徴とする、請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
下記のステップ：
１）スラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）科に属する微細藻類のバイオマスを調製するステップ、
２）少なくとも１０重量％のスクワレン、好ましくは少なくとも１５重量％のスクワレンを含有する粗製油を得るために、前記バイオマスを処理するステップ、
３）このようにして得られる前記粗製油を、脱ガム、脱酸、脱色および脱臭という一連のステップによって、任意選択的に精製するステップ、
４）６０重量％超、好ましくは８０重量％超のスクアレン含量を有する軽質画分を得るために、いわゆる「短経路」分子蒸留によって前記スクアレンを抽出するステップ、
５）スクアレン含量９５〜１００％を有するラフィネートを得るために、鹸化、２相分離、洗浄、脱色および脱臭という一連のステップによってこの軽質画分を精製するステップ、
６）このようにして得られる前記スクアレン組成物を回収するステップ、
を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
分子蒸留のステップ４）が、０．１ｍｂａｒ未満の値の、高真空で実施されることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
「短経路」が１分未満の期間、接触することを意味することを特徴とする、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項により得られるスクアレン組成物の、化粧品分野、製薬分野および医学分野における使用。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法を実施することによって得られる前記高純度スクアレン組成物の水素化により、スクアランを多く含む組成物を調製する方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載のスクアラン組成物の、化粧品分野における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物、より詳細には微細藻類、さらに詳細にはスラウストキトリアレス科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ  ｓｐ．）のものから出発して、発酵により産生されるスクアレンを精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の意味で、「スラウストキトリアレス科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ  ｓｐ．）の微細藻類」は、スキゾキトリウム種（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）、オーランチオキトリウム種（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）およびスラウストキトリウム種（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）に属する微細藻類を意味する。
【０００３】
スクアレンは、全ての高等生物に存在する脂質であり、動物および植物両者のステロイドホルモン類、および一部のビタミン、たとえばビタミンＤ類の、共通の前駆体である。
【０００４】
スクアレンは多くの細胞膜に存在して、それらに流動性を与える。
【０００５】
この不飽和線状炭化水素は、式：２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン、Ｃ３０Ｈ５０という、３０個の炭素原子および５０個の水素原子を有するイソプレノイドである、すなわち、６つのイソプレン単位から成り、全てトランス立体配座である。
【０００６】
全てのテルペン類と同様、スクアレンはイソペンチルピロリン酸から形成され、イソペンチルピロリン酸はジメチルアリルピロリン酸とカップリングして、ゲラニルピロリン酸を、次いで、ファルネシルピロリン酸を、連続的に供給し、その２分子をＮＡＤＰＨで還元後に縮合し、スクアレンシンターゼの作用下でスクアレンを形成する。
【０００７】
植物および多数の微生物において、この経路は、クロロフィル、カロテノイド色素、およびラテックス中のテルペンの前駆体である、フィトエンにつながる他の代謝経路と共存する。
【０００８】
スクアレン、および末端二重結合上でエポキシ化されたその誘導体は、特化された酵素（シクラーゼ）のために、注目すべきは位置選択的および立体選択的に、構造的にかなり多様な多環トリテルペン類に、変換される特性を有する：真核生物におけるホペンおよびジプロプテロールならびに原生動物におけるテトラヒマノール（ペンタサイクリックトリペルペン類）；酵母、真菌および哺乳動物におけるラノステロール、植物におけるシクロアルテノール（テトラサイクリックトリペルペン類）。
【０００９】
スクアレンの用途
スクアレンは、特に日本では、栄養補助食品として、長期にわたって使用されてきた。
【００１０】
さらに、スクアレンを１９０６年に発見して１９１６年にその構造を決定したのは、日本人化学者、辻本満丸であった。
【００１１】
スクアレンは、天然薬物における多くの有益な特性を有する、有効な抗酸化剤であると考えられる。
【００１２】
その従来の用途は化粧品を含むが、そこでは、その水素化誘導体、スクアラン（酸化しないので、悪臭がするようにならない）を使用することがより一般的である。
【００１３】
高純度のものであるとき、スクアレンは、免疫系を刺激するアジュバントと組み合わせてある種ワクチンに使用されてきており、依然として使用されている：「水中油」エマルジョンの形で、界面活性剤の役割を果たし、したがってワクチンの応答を高める。
【００１４】
これは、Ｈ５Ｎ１およびＨ１Ｎ１等の、出現ウイルスを標的とする実験的ワクチンで使用されるが、特に季節性インフルエンザの抗原と組合せて、１９９７年以来投与された２２００万回量の組成物中で（ＦＬＵＡＤ（登録商標）１回量当たり１０ｍｇの率の、ＭＦ５９）、重大なワクチン後反応なしに使用されている。
【００１５】
ある種ワクチンは、不活化ワクチンであるかまたはサブユニットワクチンであるため、免疫系が適切な防御機構を使用することを可能にするシグナルを含まず、アジュバント、スクアレンまたはアルミニウム塩類（１９２６年以来使用されている）の添加が目下必要である。
【００１６】
スクアレンは、良好な防護を確実にするために反復注射する必要をなくす。
【００１７】
スクアレンのこうした用途は、高純度のスクアレンを製造する方法を確保しようとする当業者の決意を強固にする。
【００１８】
さらに、この品質は、医学分野における他の活用ルートを開拓し得る。
【００１９】
スクアレンとヌクレオシド類似体との化学的カップリングは、したがって、将来的に、ある種の癌の治療またはＨＩＶタイプのウイルス疾患においてかなりの進歩を生じさせ得る。
【００２０】
様々なスクアレン源
スクアレンは、従来、深海のサメ肝臓から抽出される。
【００２１】
しかし肝臓は、重金属（水銀を含む）や他の脂溶性毒素等の、多数の毒性化合物を蓄積する。
【００２２】
化粧品で使用される濃度で、スクアレンおよびその水素化形スクアランは有毒ではなく、またヒト皮膚に対して刺激性または感作性ではないことが、毒性学的研究で証明されている。
【００２３】
しかし、医学分野で、特にワクチン用アジュバントとして使用されるとき、スクアレンの純度レベルは非常に重要である。
【００２４】
不純物（微量の金属類、特に水銀、および他の毒素）を含まない、高品質のスクアレンを所有することが絶対必要である。
【００２５】
サメ肝臓からの抽出以外の、幾つかのスクアレン製造経路が文献で提案されている。
【００２６】
第１の代替法として、オリーブ油、パーム油、および他の穀物油、またはアマランサス、種子類、米ぬか、および小麦胚芽に由来する油類から、スクアレンを分離することができる。
【００２７】
しかし、ここで主要な欠点は、スクアレンが、およそ０．１〜０．７重量％という、非常に少量でこれらから抽出されること、そして非常に多くの骨が折れて高価な精製工程を必要とすることである。
【００２８】
第２の代替法として、微生物、より詳細には、特にサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）タイプの、天然酵母または組み換え酵母からの、第１のスクアレン製造方法が提案されてきた。
【００２９】
このように、サカロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、スクアレンを産生できることが知られているが、非常に少量であり：およそ０．０４１ｍｇ／ｇバイオマスである（ＢＨＡＴＴＡＣＨＡＲＪＥＥ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１７，ｐｐ  ８１１−８１６）。
【００３０】
そこで、遺伝子組換えにより、これらの製造能力の最適化が試みられてきた。
【００３１】
しかし、医学分野（ワクチン用アジュバントとして、純度９７％超のスクアレン製造）の特許出願国際公開第２０１０／０２３５５１号パンフレットに示されている通り、この第１の代替法は、スクアレンを過剰生産（乾燥細胞の１５重量％超）する組み換え酵母を利用できる場合に工業的に応用できるにすぎない。
【００３２】
ここで、こうした組み換え細胞の入手には、スクアレン生合成経路の刺激およびスクアレン異化経路の阻害に導く、分子生物学の道具を使用することにより、多数の骨の折れる、長く複雑な代謝工学の工程を適用することが必要である。
【００３３】
事実、前記特許出願国際公開第２０１０／０２３５５１号パンフレットでさらに想起される通り、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ピロホスホメバロン酸脱炭素酵素、イソペンテニルピロリン酸イソメラーゼ、ＨＭＧＲ（３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ）、およびスクアレンシンセターゼを含む、多数の遺伝子がスクアレンの生合成に関与している。
【００３４】
異化経路に関して、スクアレンのエルゴステロールへの変換に関与する多数の酵素をコード化する遺伝子としては、スクアレンエポキシダーゼ（ＥＲＧ１）、ラノステロールシンセターゼ、Ｃ１４−ジメチラーゼ、ｄ１４−レダクターゼ、Ｃ４−メチルオキシダーゼ、Ｃ４−脱炭素酵素（ＥＲＧ２６）、３−ケトレダクターゼ、Ｃ２４−メチルトランスフェラーゼ、Ｃ８−イソメラーゼ、Ｃ５−デサチュラーゼ、ｄ２２−デサチュラーゼおよびｄ２４−レダクターゼなどが挙げられる。
【００３５】
さらに、他の分解酵素も考慮しなければならない：ＬＥＵ２（［β］−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ）、オキシドスクアレンシクラーゼ、チモステロール−２４−メチルトランスフェラーゼおよびエルゴスタ−５，７，２４（２８）−トリエノール−２２−デヒドロゲナーゼ。
【００３６】
サメの肝臓から抽出する方法の第３の代替法として、特にスラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）科（スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属およびスキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属を含む）、より詳細にはスキゾキトリウム  マングロベイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）またはスキゾキトリウム  リマシヌム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｎｕｍ）の微細藻類からスクアレンを産生するための有望な方法が提案されている。
【００３７】
さらに、こうした微細藻類は、従属栄養条件（光の欠如；炭素含有源としてのグルコースの供給）でスクアレンを産生し、したがって、微生物の発酵技術における当業者により容易に操作され得る。
【００３８】
しかし、こうしたスラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）科の微細藻類では、スクアレンは、関心事の他の脂質化合物、たとえばω３ファミリーの多価不飽和脂肪酸である、ドコサヘキサエン酸（すなわちＤＨＡ）等の、副産物である。
【００３９】
したがって、スクアレンは、ＤＨＡの工業用油の非鹸化性画分の構成要素の１つ（カロテノイド類およびステロール類に加えて）として特記されていると考えられる。
【００４０】
比較のために、スキゾキトリウム  マングロベイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）のＦＢ１株は、スクアレンの０．０１７％まで、細胞の乾燥重量の６．２％の率でＤＨＡを産生する。
【００４１】
したがって、自然にスクアレンを産生するこうした微生物は、少量で産生する：
−  スラウストキトリド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）ＡＣＥＭ  ６０６３では、およそ０．１ｍｇ／ｇバイオマス（ＬＥＷＩＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００１，ｐｐ  ４３９−４４７参照）、
−  スキゾキトリウム  マングロベイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）ＦＢ１では、およそ０．１６２ｍｇ／ｇバイオマス（ＪＩＡＮＧ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，２００４，５２，ｐｐ  １１９６−１２００参照）。
【００４２】
しかし、発酵による産生の最適化によって、この分野における専門家は、下記の水準の製造に成功した：
−  スラウストキトリド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）ＡＣＥＭ  ６０６３のバイオマス１ｇ当たり１ｍｇ〜１．２ｍｇのスクアレン（ＱＩＡＮ  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，２００９，５７，４２６７−４２７２またはＭａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００１，３，４３９−４４７のＬＥＷＩＳ  ｅｔ  ａｌ．参照）。
−  スキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）のバイオマス１ｇ当たり０．７２ｍｇのスクアレン（Ｇ．ＣＨＥＮ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，２７−４，ｐｐ  ３８２−３８９参照）。
−  オーランチオキトリウム  マングロベイ（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）ＦＢ３１のバイオマス１ｇ当たり０．５３ｍｇのスクアレン（Ｋ．Ｗ．ＦＡＮ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１０，２６−３，ｐｐ  １３０３−１３０９参照）。
−  スキゾキトリウム  マングロベイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）のバイオマス１ｇ当たり１．１７±０．６ｍｇのスクアレン（Ｃ−Ｊ  ＹＵＥ  ａｎｄ  Ｙ．ＪＩＡＮＧ，Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００９，４４，９２３−９２７参照）。
【００４３】
本出願人はまた、この分野の文献でこれまで決して到達したことのないレベルで、すなわち、バイオマス１００ｇ当たり少なくとも８ｇのスクアレンで、スクアレンを産生する方法を提供し（そのフランスの特許出願が審査中）、スラウストキトリアレス科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ  ｓｐ．）の微細藻類によるスクアレン産生のさらなる向上にも貢献した。
【００４４】
このように、スラウストキトリアレス科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ  ｓｐ．）の微細藻類により、今や相当量のスクアレン産生が可能であるが、食物、化粧品および特に医学的な要件を満たすために、それを精製することが依然として必要である。
【００４５】
幾つかのスクアレン精製法が文献に提案されているが、これらの方法は、当業者により、従来のスクアレン産生源（動物、植物または酵母タイプの微生物）に合うように改変されている。
【００４６】
４つの主要なテクノロジーが、単独でまたは組み合わせて、一般に使用される：
−  結晶化、
−  クロマトグラフィ、
−  蒸留または
−  超臨界流体（超臨界ＣＯ２等）を使用した抽出。
【００４７】
以下で説明する通り、最後に述べた２つのテクノロジーは、最も頻繁に遭遇するものである。
【００４８】
植物起源のスクアレンの精製の場合、たとえば米国特許出願公開第２００３／１３０５３２号明細書では、植物油から非鹸化性物質を抽出する方法であって、少なくとも１つの鹸化ステップ（それによって前記油が水性アルコール溶液に変換される）、クロロ−１−ブタン等の有機溶媒を用いた水性アルコール溶液の向流抽出ステップ、ステロール類および／または併産されるトリテルペンアルコール類の結晶化ステップおよび最終的に蒸留によるスクアレンの分離を含む、抽出方法が主張されている。
【００４９】
好ましくは、処理される植物油はアボカド油または大豆油である。
【００５０】
やはり植物から出発する、国際特許出願国際公開第２０１０／００４１９３号パンフレットでは、有機溶媒の使用を回避するために、たとえば、植物油の脱臭からの蒸留液から、ステロール類、ビタミンＥ、スクアレンおよび他の炭化水素類を抽出するための総括的な方法が記述されている。
【００５１】
遊離脂肪酸のエステル化、およびその後の複合脂肪酸（グリセリド類およびステライド類（ｓｔｅｒｉｄｅｓ））と同一「短」アルコールとのエステル交換後、連続３つの蒸留により連続回収（炭化水素、次いで、アルキルエステル類、および最後にスクアレンを含む最も重いアルキルエステル）が可能である。
【００５２】
このように第３蒸留液は、スクアレン（残留炭化水素の第２画分と共に、第１画分から分離される）の製造に役立つ。
【００５３】
第３蒸留の残留物は、ステロール類およびビタミンＥの製造に役立つであろう。
【００５４】
したがって本方法では、石油起源の溶媒を使用せずに４つの非鹸化性物質のそれぞれを抽出することが可能であり、自然の物理的および化学的方法で得られる製品ラベルを請求することが可能である。
【００５５】
しかし、上記の通り、こうした植物スクアレンの抽出方法は、毒性溶媒の使用のため、また魅力のない価格のため、工業規模にあてはめることがまだ難しい方法である。
【００５６】
Ｓ．セルビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）タイプの微生物により産生されるスクアレンの精製方法に関して、従来、溶媒抽出法が使用される。
【００５７】
第１抽出ステップは一般に、細胞溶解後に回収される脂質に対してメタノール／クロロホルム（２：１）で実施され、クロマトグラフィステップが後続する。
【００５８】
それに関して、たとえばＷｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００３，１９−６，ｐｐ  ６０５−６０８のＢＨＡＴＴＡＣＨＡＲＪＥＥ  ａｎｄ  ＳＩＮＧＨＡＬという論文に記述されている通り、有機溶媒の使用を最小限に抑えるために、多くの場合、超臨界ＣＯ２を用いた抽出が好ましい。
【００５９】
特に植物起源のスクアレンを抽出するための、このテクノロジーの応用について記述している文献または特許も多数ある（たとえば、パーム油からの、特許出願特開２００５／０８７９９８号公報、またはオリーブ油からの、特許出願米国特許出願公開２００４／００１５０３３号明細書等）。
【００６０】
国際特許出願国際公開第９４／０２６６８３号パンフレットは、オリーブ油残留物からスクアレンを製造するための方法および装置を示している。
【００６１】
この方法は、下記の４ステップを含む：鹸化、クラッキング、脂肪酸のエステル化および超臨界流体を用いた抽出。
【００６２】
しかし、超臨界流体を用いた抽出には、事前に金属触媒でエステル化された生成物が使用され、その後、多様な温度帯のある高圧抽出塔内に噴霧される。
【００６３】
こうした方法および装置では、純度９０％超の、市場性あるスクアレンを得ることが可能であるが、魅力的な価格で工業規模にあてはめることは困難である。
【００６４】
微細藻類により産生されるスクアレンを精製する好ましい方法を記述した文献は非常に少ない。
【００６５】
本発明者らは、たとえば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，２００３，９９４，３７−４３に発表された、ＬＵらの科学論文（スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ  ２６１８５により産生されるスクアレンの調製的分離および精製のための高速向流クロマトグラフィのメリットを賞賛している）を見つけることができる。
【００６６】
これらの著者によれば、このテクノロジーは、固体支持体を使用しない（したがって、前記固体支持体上への不可逆的吸着による材料の損失がない）、１回の液体／液体クロマトグラフィ分配を提案するため、より従来型のＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）よりはるかに効率的な方法を提案するというメリットを有する。
【００６７】
しかし、この論文に詳述されている通り、この方法は、実験室規模で想定され得るにすぎず、さらにメタノール／クロロホルムによる予備的抽出ステップを必要とする。
【００６８】
最高水準の技術で、ボツリオコッカス  ブラウニー（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ）、セネデスムス  オブリカス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｏｂｌｉｑｕｕｓ）またはトルラスポラ  デルブルッキ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）に関して、超臨界流体を用いた抽出について幾つかの予備研究が開始されている。
【００６９】
しかし、推奨される操作条件を工業規模に移すことも困難である。
【００７０】
出願人の知る限り、超臨界流体または分子蒸留タイプのテクノロジーを使用して、微細藻類から産生されるスクアレンを精製するための、産業応用に好適な、当業者に実際に利用できる効率的な方法は皆無である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００７１】
出願人は、微細藻類により産生されるスクアレンを精製する効率的な方法の開発を切望して、独自の調査研究に着手し、９５％超、好ましくは９７％超、またはおよそ１００％ものスクアレンレベルを保証するために、超臨界流体を用いた抽出および分子蒸留による抽出に、テクノロジーを合わせることに成功した。
【００７２】
この純度レベルは、このようにして得られるスクアレンを医学分野で使用することを可能にするばかりでなく、化粧品用途のためのスクアランへの容易な水素化を想像することも可能にする。
【００７３】
本発明はしたがって、抽出物還流と向流で動作する多段分画カラム内での超臨界ＣＯ２を用いた抽出、およびいわゆる「短経路」分子蒸留からなる群から選択される精製ステップを含むことを特徴とする、微生物の発酵により産生される高スクアレン含量を有する組成物を調製する方法に関する。
【００７４】
微生物は、好ましくはスラウストキトリアレス科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ  ｓｐ．）に属する微細藻類であり、いっそう好ましくはスキゾキトリウム種（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）、オーランチオキトリウム種（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）、およびスラウストキトリウム種（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）に属する微細藻類である。
【００７５】
本発明の意味で、「高スクアレン含量を有する組成物」は、９５重量％超、好ましくは９７重量％超、いっそう好ましくはおよそ１００重量％のスクアレン含量を有する組成物を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００７６】
超臨界ＣＯ２を用いた抽出の２つの連続ステップの実行
本発明による方法の第１の好ましい実施形態において、下記のステップ：
１）スラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）科に属する微細藻類のバイオマスを調製するステップ、
２）少なくとも１０重量％のスクアレン、好ましくは少なくとも１５重量％のスクアレンを含有する粗製油を得るために、バイオマスを処理するステップ、
３）７０〜７５％のスクアレン含量を有する抽出物および１．５％未満のスクアレンを有するラフィネートを製造するために、このようにして得られる粗製油を、抽出物還流と向流で動作する多段分画カラム内で、超臨界圧の流体と接触させることにより分画するステップ、
４）９５〜９９重量％のスクアレン含量を得るために、このようにして得られる抽出物を、ステップ３）におけるものと同様の、抽出物還流と向流で動作する多段分画カラム内で超臨界圧の流体と接触させるステップ、
５）このようにして得られるスクアレン組成物を回収するステップ
を含むことを特徴とする、方法が実施される。
【００７７】
この第１の好ましい実施形態の第１ステップは、スラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）科に属する微細藻類のバイオマスを調製することから成る。
【００７８】
スラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）科に属する微細藻類として、たとえば、下記の市販の株が入手可能である：
−  スキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）標準（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｄ）ＡＴＣＣ  ２０８８８、
−  オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）標準ＡＴＣＣ  ＰＲＡ  ２７６。
【００７９】
さらに、出願人はまた、２０１１年４月１４日に、フランスのパスツール研究所の国立微生物培養物寄託機関（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ［Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ］）に第ＣＮＣＭ  Ｉ−４４６９号で寄託し、中国の武漢大学の中国標準菌株保蔵機関（ＣＨＩＮＡ  ＣＥＮＴＥＲ  ＦＯＲ  ＴＹＰＥ  ＣＵＬＴＵＲＥ  ＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮ）（武漢４３００７２、Ｐ．Ｒ．中国）に第Ｍ  ２０９１１８号で寄託した、その生産株、スキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）も所有する。
【００８０】
培養は、従属栄養条件で実施される。一般に、培養ステップは、株を復活させるための、前培養ステップ、次いで、本来の培養ステップまたは発酵ステップを含む。この最後に述べたステップは、関心事の脂質化合物の産生ステップに相当する。
【００８１】
こうした微細藻類の培養条件は当該技術分野で周知である。
【００８２】
たとえば、Ｎｅｗ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，２７−４，ｐｐ  ３８２−３８９のＧ．ＣＨＥＮの論文には、下記の連続ステップを含む方法が見られる：
−  グルコース、グルタミン酸ナトリウム、酵母エキスおよび様々な微量元素を含む寒天栄養培地で維持された株から出発するステップ、
−  復活したバイオマスを得るために、オービタルスターラ上の三角フラスコ内、ｐＨ６、温度２５℃で、前培養を実施するステップ、
−  前培養で使用されるものと同じ培地が入っている別シリーズの生産三角フラスコに、前ステップで得られるバイオマス約０．５％（ｖ／ｖ）をまき、温度２５℃で維持するステップ。
【００８３】
この第１の好ましい実施形態の第２ステップは、少なくとも１０重量％のスクアレン、好ましくは少なくとも１５重量％のスクアレンを含む粗製油を得るために、バイオマスを処理することから成る。
【００８４】
こうした処理は、当業者によってさらに知られている任意の方法で実施してもよく、少なくとも１０重量％のスクアレン含量を、上述の株ＣＮＣＭＩ−４４６９から得ることができる。
【００８５】
以下に示す実施例に記述されている通り、出願人は下記を推奨する：
−  バイオマスを脱塩水で、乾燥物含量６〜１２％に、好ましくは乾燥物含量１０〜１２％に、調整すること、
−  前記微細藻類の細胞壁を破壊するために、このようにして得られるバイオマスを、アルカラーゼタイプの酵素を使用して処理すること、
−  ５％（ｖ／ｖ）超、好ましくは約１０％（ｖ／ｖ）のエタノールを反応混合物に加えること（水中油エマルジョンの形）、
−  水相から油を分離するために、このようにして得られる反応混合物を遠心分離すること、
−  スクアレン中で濃縮された油性の上相を回収すること。
【００８６】
この濃縮は、少なくとも１０重量％、好ましくは少なくとも１５重量％のスクアレン含量と理解される。
【００８７】
この第１の好ましい実施形態の第３ステップは、７０〜７５％のスクアレン含量を有する抽出物および１．５％未満のスクアレンを有するラフィネートを製造するために、このようにして得られる粗製油を、抽出物還流と向流で動作する多段分画カラム内で、超臨界圧の流体と接触させることにより分画することから成る。
【００８８】
出願人の知る限り、抽出物還流と向流で動作する多段分画カラムを使用する、この独特の形のスクアレン抽出が、一般に微生物の発酵により産生されるスクアレンに、特にスラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）科に属する微細藻類タイプの微生物に、利用されたことはない。
【００８９】
出願人はそこで、超臨界圧の二酸化炭素中で、スクアレン（無極性炭化水素）と、油の脂質を構成しているトリグリセリドとの間の大きな溶解度差（スクアレンはトリグリセリドよりはるかに溶けやすい）を利用した。
【００９０】
このために、抽出物還流と向流で動作する多段分画カラム（構造化パッキングを備えているカラム）を使用することにより、予想外に、出発油と比較して優れた収率で高純度のスクアレンを獲得できることを、出願人は発見した。
【００９１】
超臨界圧の流体を用いた抽出は、非常に高品質の抽出物につながることを、当業者は知っている。
【００９２】
超臨界圧の流体を用いた方法の主な利点の１つは、多数の出版物に、およびある特定の重要な実施態様のために仏国特許第２５８４６１８号明細書に、記述されている通り、溶媒（流体）と抽出物および溶質との間で分離を実施することが容易なことである。
【００９３】
超臨界流体の他の重要な利点の１つは、混合物の構成要素に関して「適応可能な」選択性を有することである。
【００９４】
この非常に高い選択性は、超臨界流体の特定の特性と、特に超臨界圧における二酸化炭素の特性と関連している：溶解力は、流体の圧力および温度を変えることによって、細かく制御することが可能である。
【００９５】
溶解力が低下するにつれて溶媒はますます選択的になるため、出願人は「穏和な」条件が最も選択的であることを確認した。
【００９６】
したがって、好ましくは、その溶解力を高めるであろう添加補助溶媒よりむしろ、純粋な二酸化炭素を使用することを、出願人は推奨する。
【００９７】
さらに、動作圧１０〜５０ＭＰａ、好ましくは１５〜２５ＭＰａ、および温度４０〜８０℃を選択する。
【００９８】
超臨界圧の流体を、ポンプによって高圧でポンプ圧送し、一定に維持されて質量流量計に表示される流量でカラムの底部に注入する前に、熱交換器内で所望の温度まで上昇させる。
【００９９】
フィードは、カラムの底から数えて、セクション１と２の間、または２と３の間、または３と４の間で、構造化パッキングが付いたカラム中程の高圧ポンプにより、一定に保たれて質量流量計に表示される流量で、注入される。
【０１００】
抽出物の多い流体は、カラムの最上部で出て行き、その後、流体は６ＭＰａまで幾分か減圧され、特に直列に搭載されたサイクロンセパレータ（そのボディはジャケット内で水の循環によって加熱される）を含む、幾つかの分離ステージに送られる。
【０１０１】
液体抽出物がこうしたセパレータの底部で回収されるのに対して、気体状態の流体はその後、従来の方式でリサイクルされる：０〜５℃に冷却されたコンデンサ内での凝縮、外部貯蔵タンクからの新鮮な流体の給送、高圧でのポンプ圧送および所望の温度までの加熱によって、液位が一定に維持されるバッファフラスコでの中間貯蔵。
【０１０２】
ラフィネートは、レベルセンサによって制御される膨張弁を通してカラム底で回収され、このようにしてカラム下部の油−流体界面を維持する；カラム内での分画に有害な圧力動揺を避けるために、このラフィネートは、直列の２つの沈降槽で回収され、第１の槽の圧力は、カラム内の一般的な圧力より約１〜４ＭＰａ未満だけ低い値に維持されている。
【０１０３】
これらの槽ではこのように、ラフィネートに溶解した流体の最小限の損失で、動揺なしに、ラフィネートを回収することができる。
【０１０４】
出願人が示す通り、分離流体と液体フィードとの多段向流接触を使用することにより、使用される流体のこの選択性を最高に利用することができる。
【０１０５】
さらに、抽出物還流は、分画操作の総括的選択性の改善に特に貢献する。
【０１０６】
抽出物還流はここで発生し、後者の直径が壁への良好な熱伝達を可能にするとき、一方ではフィードと接触している流体と、他方ではこの勾配を利用できるように幾つかの独立した区域に分けられたジャケット内を循環している熱水との間で、カラムに沿って熱勾配を確立することによって慎重に制御される。
【０１０７】
事実、臨界圧（すなわち７．４ＭＰａ）から３０ＭＰａまでの範囲の帯域で固定された、超臨界圧の二酸化炭素中でのほとんどの有機化合物の溶解度は、温度が上昇するとき低下する；このように、油と向流で流体がカラム内で上昇するとき、加熱することができ、したがって抽出物の一部と、油と混合されたその還流との脱混合を引き起こす。
【０１０８】
２００ｍｍより大きい直径を有するカラムが使用されるのであれば、壁への熱伝達が不十分になるので、外部抽出物還流（カラムを出る流体の部分的減圧によって抽出物の一部がカラムの最上部で分離され、液体抽出物のこの画分は次にはポンプによって再加圧されて、カラムの最上部で注入される）を使用することが好ましい。
【０１０９】
さらに、超臨界圧の流体は、液体よりはるかに良い優れた熱伝達特性および物質移動特性を有し、観察された優れた選択性に貢献している。
【０１１０】
この第１の好ましい実施形態の第４ステップは、９５〜９９重量％のスクアレン含量を得るために、このようにして得られる抽出物を、ステップ３）におけるものと同様の、抽出物還流と向流で動作する多段分画カラム内で超臨界圧の流体と接触させることから成る。
【０１１１】
スクアレン濃縮のこのステップは、前ステップの条件と類似しているが、圧力および温度が僅かに異なる条件で実施される。
【０１１２】
したがって、動作圧は１０〜３０ＭＰａ、ここで好ましくは１０〜２０ＭＰａ、温度は４０〜８０℃で選択される。
【０１１３】
この第１の好ましい実施形態の第５ステップは最終的に、このようにして得られるスクアレン組成物を回収することから成る。
【０１１４】
以下に示す実施例で説明される通り、このようにして精製された組成物は９７％以上のスクアレン含量を有することが可能である。
【０１１５】
分子蒸留の利用
本発明による方法の第２の好ましい実施形態で、下記のステップ：
１）スラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）科に属する微細藻類のバイオマスを調製するステップ、
２）少なくとも１０重量％のスクアレン、好ましくは少なくとも１５重量％のスクアレンを含有する粗製油を得るために、バイオマスを処理するステップ、
３）このようにして得られる粗製油を、脱ガム、脱酸、脱色および脱臭という一連のステップによって任意選択的に精製するステップ、
４）６０重量％超、好ましくは８０重量％超のスクアレン含量を有する軽質画分を得るために、いわゆる「短経路」分子蒸留によってスクアレンを抽出するステップ、
５）スクアレン含量９５〜１００％を有するラフィネートを得るために、鹸化、２相分離、洗浄、脱色および脱臭という一連のステップによってこの軽質画分を精製するステップ、
６）このようにして得られるスクアレン組成物を回収するステップ
を含むことを特徴とする、方法が実施される。
【０１１６】
本発明による方法のこの第２の好ましい実施形態の第１および第２ステップは、上述の第１の好ましい実施形態の第１および第２ステップと全く同じである。
【０１１７】
このようにして得られる粗製油は、グリセリド類（主としてトリグリセリド類）、非鹸化性物質（主としてスクアレン）および任意選択で少量の遊離脂肪酸およびリン脂質から成る。
【０１１８】
分子蒸留によるスクアレンの抽出に先立って、この粗製油に予め粗雑な精製を行ってもよい。
【０１１９】
下記ステップの１つまたは複数が想定される：
−  脱ガム：酸性媒体中で沈殿によりリン脂質の除去を可能にする；
−  脱酸：塩基の使用により遊離脂肪酸の中和を提供する；
−  脱色：従来、活性炭で実施される；
−  脱臭：真空蒸留、いわゆる水蒸気「ストリッピング」による。
【０１２０】
これらの精製ステップは、植物油の精製でよく使用されるステップである。
【０１２１】
本発明による方法のこの第２の好ましい実施形態の第４ステップは、６０重量％超、好ましくは８０重量％超のスクアレン含量を有する軽質画分を得るために、いわゆる「短経路」分子蒸留によってスクアレンを抽出することから成る。
【０１２２】
任意選択的に精製された、粗製油のスクアレンは、分子蒸留により抽出される。
【０１２３】
０．１ｍｂａｒ未満の高真空では、スクアレンの沸点はおよそ２００℃である。
【０１２４】
この高真空では、温度を制限することが可能になる、したがってスクアレンの分解／重合のリスクを制限することが可能になる。
【０１２５】
さらに、滞留時間は非常に短い、１分未満に維持される。
【０１２６】
この圧力−温度−接触時間方式で、トリグリセリド画分（高分子量）は揮発性ではない。
【０１２７】
このように、こうした条件で、いわゆる「短経路」分子蒸留は、主としてトリグリセリドとスクアレンであるこれら２つの画分を分離するのに特に適したテクノロジーであることを、出願人は発見した。
【０１２８】
出願人により推奨される操作条件は以下の通りである。
【０１２９】
窒素不活性フィードタンクから、２５〜１００℃の範囲内で自動調温制御される第１回路を通って脱ガス装置に、油をポンプ圧送する（微量の水と溶媒の除去）。
【０１３０】
脱ガス装置出口で、５０〜１５０℃の温度範囲内で自動調温制御される回路を通って（「短経路」）蒸発チャンバ内に、油をポンプ圧送する。
【０１３１】
蒸発器の温度を、１５０〜２５０℃の範囲内で調節する。
【０１３２】
コンデンサを、０〜５０℃の温度範囲で調節する。
【０１３３】
蒸発チャンバ内の圧力を、１０−２〜１０−４ｍｂａｒの範囲内で調節する。
【０１３４】
主としてスクアレンを含有する蒸留液および主としてトリグリセリドを含有する残留物は、回収回路を経て不活性貯蔵タンクに運ばれる。
【０１３５】
蒸留液の軽質画分中のスクアレン含量は、６０重量％超、好ましくは８０重量％超である。
【０１３６】
本発明による方法のこの第２の好ましい実施形態の第５ステップは、スクアレン含量９５〜１００％を有するラフィネートを得るために、鹸化、２相分離、洗浄、脱色および脱臭という一連のステップによってこの軽質画分を精製することから成る。
【０１３７】
鹸化は、蒸留中に連行された可能性がある残留グリセリドを加水分解するために予め実施されるが、エステル化されたステロール類を加水分解するためでもある。
【０１３８】
後者は、その後遊離形（より極性）で、次のステップの間に、より容易に除去される。
【０１３９】
鹸化は、温度約８０℃で０．５〜２時間、エタノール性カリで実施される。
【０１４０】
冷却後、鹸化の結果生じる２相の混合物を、次には傾瀉または遠心分離で分離することが可能である。
【０１４１】
乳化は、分離をより複雑にするようである；水を加えることにより、その後分離が容易になる可能性がある。
【０１４２】
エタノール相は、遊離脂肪酸を濃縮するが、生成した極性不純物の比率も増す。油相はスクアレンを濃縮する。
【０１４３】
鹸化後に分離されるスクアレン相を、水洗する。
【０１４４】
数回連続して洗浄を実施してもよい。
【０１４５】
塩基性の水（カリまたはソーダで処理）を使用して、最初の洗浄サイクルの間に、残留鹸化不純物を連行することが可能である。
【０１４６】
水洗による洗浄液の上澄が中性ｐＨのとき、洗浄が完了する。
【０１４７】
各サイクルの間に、傾瀉または遠心分離によって、相（洗浄水とスクアレン）を分離する。
【０１４８】
この段階で、ステロールの一部ならびに残留グリセリド類（モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド）からスクアレン画分が精製される。
【０１４９】
黄色がかった着色を減らすために、この段階で追加的脱色ステップを実施することが可能である。
【０１５０】
この脱色ステップは、植物油精製で従来使用されている脱色と同様に活性炭で実施される。
【０１５１】
スクアレン画分の精製は脱臭ステップで終了する。
【０１５２】
脱臭は、真空下で０．５〜１時間、熱（１５０〜２００℃）蒸気「ストリッピング」によって実施される。
【０１５３】
このようにして精製されたスクアレンは、制御雰囲気下（理想的には窒素不活性）で貯蔵される。
【０１５４】
抗酸化剤の添加は、この画分の安定化に有利な可能性がある。
【０１５５】
本発明はまた、本発明による方法を実施することにより得られるスクアレン組成物の、化粧品、製薬および医学分野における使用にも関する。
【０１５６】
本発明はさらに、本発明による方法を実施することにより得られる高純度スクアレン組成物の水素化によってスクアランを多く含む組成物を調製する方法、ならびにこのスクアラン組成物の化粧品分野における使用にも関する。
【０１５７】
本発明は、説明のために供給されるのであって限定されない、以下に示す実施例からよりよく理解されるであろう。
【実施例】
【０１５８】
実施例１．２０リットル発酵槽内での、スラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）科に属する微細藻類の発酵による、少なくとも１０重量％のスクアレンを含有する油の調製。
この実施例は、出願人に属する微細藻類スキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）（２０１１年４月１４日に、フランスのパスツール研究所の国立微生物培養物寄託機関（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ［Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ］）に第ＣＮＣＭＩ−４４６９号で寄託された）の発酵により産生されるスクアレンを多く含む油を抽出する方法を説明する。
【０１５９】
発酵はここで、２０リットル反応装置で、本来の培養／生産段階の前に、連続した２つの予備的前培養相で実施された。
【０１６０】
これらの実験の場合、最初の前培養培地ではビタミン類が添加されたが、第２の前培養培地および生産では、任意選択的であった。
【０１６１】
前培養培地はそのとき、下表ＩおよびＩＩに示す組成を有していた。
【０１６２】
【表１】
2015516152.tif 000002
【０１６３】
【表２】
2015516152.tif 000003
【０１６４】
一般に、クレロール（Ｃｌｅｒｏｌ）「ＦＢＡ３１０７」消泡剤を１ｍｌ／ｌで使用した。任意選択的に、汚染細菌の増殖を防止するために、５０ｍｇ／ｌのペニシリンＧ「ナトリウム塩」を使用した。
【０１６５】
残りの培地と別に、グルコースをＫＨ２ＰＯ４で滅菌し、沈殿（アンモニウム−リン酸塩−マグネシウム）の形成を避けた。滅菌濾過後に、ビタミン類の混合物および微量元素を添加した。培養／生産培地の組成を下表ＩＩＩに示す。
【０１６６】
【表３】
2015516152.tif 000004
【０１６７】
ビタミン類の混合物および微量元素の組成を下表ＩＶおよびＶに示す。
【０１６８】
【表４】
2015516152.tif 000005
【０１６９】
【表５】
2015516152.tif 000006
【０１７０】
前培養条件
第１の前培養は、バッフルを備えた５００ｍｌ三角フラスコ内で、ＣＯＧＮＩＳ  ＧｍｂＨ  Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆにより販売されているＣＬＥＡＲＯＬ  ＦＢＡ  ３１０７消泡剤一滴を添加して実施した。
【０１７１】
培地は、その構成成分を完全に溶解した後にろ過し、任意選択的にペニシリンＧ「ナトリウム塩」を０．２５ｍｇ／ｌの率で補足した。
【０１７２】
接種は、ペトリ皿で培養した微細藻類のコロニーを採取することにより実施した（１０μｌループ１つの率）。
【０１７３】
インキュベーションは、１００ｒｐｍで撹拌しながら（オービタルスターラ上）、温度２８℃で、２４〜３６時間を要した。
【０１７４】
バイオマス傾斜のとき（言い換えれば壁に付着する）、本発明者らは三角フラスコをよく撹拌した後、３〜５ｍｌを注意深く採取した。
【０１７５】
第２の前培養には、バッフルおよび配管を備えた２リットル三角フラスコを使用した。
【０１７６】
消泡剤一滴および酵母エキスを、水１００ｍｌに添加した。
【０１７７】
培地の全構成成分を脱塩水３００ｍｌに溶解した後、濾過した。ペニシリンＧ「ナトリウム塩」を任意選択的に添加することも可能であり、滅菌前に、三角フラスコ内に、消泡剤一滴を予め添加することも可能である。
【０１７８】
次いで、第１の前培養３〜５ｍｌを用いて、播種を実施した。
【０１７９】
１００ｒｐｍで撹拌しながら、２８℃でさらに２４〜３６時間、インキュベーションを実施した。
【０１８０】
２０リットル反応装置での生産
本来の培養を、下記の通りに２０リットル反応装置で実施した。
−  培地の滅菌（沈殿の形成を避けるために、一部は反応装置内で、残りは別途）、
−  培地の０．５％ｖ／ｖの比率で、第２の前培養の終わりに産生されたバイオマスを用いて実施される播種、
−  ３０℃に維持される培養。
−  ３５〜４０ｍｍｏｌ／ｌ／時間に固定された酸素の移動率、
−  ０．２〜０．３ＶＶＭの通気、
−  初期ｐＨ＞５．５、
−  一度のグルコースフィード（グルコース濃度を１５〜７０ｇ／ｌに維持するために、濃度は＞２０％である）。
【０１８１】
下表ＩＶは、出願人のスキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）を用いて得られた結果示す。
【０１８２】
【表６】
2015516152.tif 000007
【０１８３】
バイオマス回収
発酵槽から取り出され、遠心分離（５０００ｇで５分）およびバイオマスの希釈（１／３Ｖｐｅｌｌｅｔ／Ｖｗａｔｅｒの比率）により、連続した２つの濃度系列で間質可溶物から洗浄された、バイオマス。
【０１８４】
全粗乾燥物に対する乾燥細胞濃度は９５％である。
【０１８５】
次いで、乾燥物を蒸留水で１２％に調整する。
【０１８６】
スクアレンを多く含む粗製油の獲得
洗浄したバイオマスを、船用プロペラおよびバッフルを備えた２リットル発酵槽タイプの実験室規模反応装置（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ社により販売されているもの等）内で撹拌する。
【０１８７】
このシステムでは、溶解酵素の作用に不可欠な、十分な混合をしている間に生成した細胞溶解物の乳化を制限することが可能になる。
【０１８８】
温度を６０℃に調整し、ｐＨを、ソーダで約８に制御する。
【０１８９】
これらの条件は、１％／秒のレベルで添加されるアルカラーゼ酵素（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）の活性に最適である。
【０１９０】
溶解時間を４時間に固定する。
【０１９１】
溶解の終わりに、１０％のエタノール（Ｖｅｔｈａｎｏｌ／Ｖｌｙｓａｔｅ）を反応混合物（水中油エマルジョン）に添加し、これをさらに１５分間撹拌する。
【０１９２】
溶解物を１２０００ｇで５分間、遠心分離する。表面で脱相しておいた、スクアレンを含有する油を、このように抽出する。
【０１９３】
実施例２：１ｍ３発酵槽内、スラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）科に属する微細藻類の発酵による、少なくとも１０重量％のスクアレンを含有する油の調製。
１ｍ３発酵槽で実施される産生（実施例１のものと同様の発酵条件）から出発して、バイオマスを、Ｆｌｏｔｔｗｅｇ  Ｓ３Ｅ  Ｓｅｄｉｃａｎｔｅｕｒ（清澄剤）を給送するＳＥＥＰＥＸ容積移送型ポンプで発酵槽から抜き取る。
【０１９４】
このような方法で、バイオマスを２００ｇ／ｌに濃縮する。
【０１９５】
１ｍ３タンク内で、濃縮物を脱炭酸水で希釈し（１  水の容量／濃縮物の容量）、次いで前述と同じ操作によって再度濃縮し、洗浄したバイオマス６２０ｋｇを得て、１１０ｇ／ｌに濃縮する。
【０１９６】
１ｍ３タンク内で、バイオマスを１５０ｒｐｍで撹拌し、６０℃に加熱する。
【０１９７】
次いで４５％カリでｐＨを８に調整する。
【０１９８】
ＮＯＶＯの酵素アルカラーゼ２．４Ｌ  ＦＧを、１％（／乾燥バイオマス）レベルで添加する。溶解パラメータを、６時間維持する。
【０１９９】
溶解の質を、光学顕微鏡および試料の遠心分離（２分、１００００ｇ）で監視する。
【０２００】
溶解の終わりに、エタノール（約１０％ｖｏｌ／ｖｏｌ）６０ｌを、６０℃に維持されたタンクに、撹拌しながら添加する。
【０２０１】
実施例１と同様に、次には温度を８０℃まで再度上昇させ、その後、出口が３つある濃縮器モードで構成されたＡＬＰＨＡ  ＬＡＶＡＬ  ＣＬＡＲＡ  ２０遠心分離ユニットで、遠心分離を実施する。
【０２０２】
この構成は、固相／液相／液相タイプの３相混合物の分離に特に適する。
【０２０３】
９６００回／分での回転で、約１００００ｇに達することが可能である。
【０２０４】
容積移送型ポンプを流量１００〜４００ｌ／時間で使用して、細胞溶解物のフィードが提供される。
【０２０５】
重質相出口で逆圧を制御することにより、重質相と軽質相との間の界面を変位させる。
【０２０６】
自動スライム除去の頻度を、２〜１５分の頻度に調節する。
【０２０７】
スクアレンを多く含む粗製油１３ｋｇはこのように、収率５０％超で回収される。
【０２０８】
実施例３：分子蒸留によるスクアレンの抽出
実施例２に従って調製される微細藻類のバイオマスからの抽出によって、スクアレン２１．８％を含有する粗製油が得られる。
【０２０９】
窒素不活性フィードタンクから、油８ｋｇを３．５ｋｇ／時間で温度１２０℃の脱ガス装置にポンプ圧送する。
【０２１０】
脱ガス装置出口にて、油は８５℃に維持された回路を経て蒸発チャンバを通過する（「短経路」）。蒸発器の温度を２２０℃に調整する。
【０２１１】
コンデンサを、温度２０℃に調整する。最大真空は、蒸発チャンバ内で生じる（＜１０−３ｍｂａｒ）。
【０２１２】
スクアレンを含有する蒸留液およびトリグリセリドを含有する残留物は、回収回路を経て、不活性貯蔵タンクに運ばれる。この段階で、蒸留液約１．５ｋｇおよび残留液６ｋｇが回収される。
【０２１３】
蒸留液中のスクアレン含量（ＮＭＲ解析に基づいた重量基準によるパーセンテージ）は９４％に等しい。
【０２１４】
残留物のスクアレン含量は２％未満である。
【０２１５】
上述の分子蒸留で抽出されたスクアレン１０ｇの試料から出発して、一連の精製操作をここで実施する。
【０２１６】
エタノール性溶媒（比率９／１（ｍｅｔｈａｎｏｌ／ｍｗａｔｅｒ））で比率１／２（ｍｏｉｌ／ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃ  ｐｏｔａｓｈ）を維持しながら、カリ（２Ｎ）を含有する媒体中で鹸化操作を実施する。
【０２１７】
鹸化媒体を、還流下で４５分間、８０℃に維持する。
【０２１８】
遊離脂肪酸含量はこのように、０．２９から３．１（ｇｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｅｑ．／％ｇｏｉｌ）に上昇する。
【０２１９】
これらの遊離脂肪酸は、エステル化されたステロール類の加水分解に一部由来する。
【０２２０】
部分的に乳化された鹸化混合物の２相を遠心分離（２５０００ｇで１０分）で分離する。
【０２２１】
抽出された油相（スクアレン）を、カリを少量添加した水（比率３／１（ｍｗａｔｅｒ／ｍｏｉｌ））で洗浄する。
【０２２２】
中性ｐＨの上澄が得られるまで、浄水で洗浄を繰り返す。
【０２２３】
各洗浄ステップの間に、２５０００ｇで１０分間の遠心分離によって分離を実施する。
【０２２４】
この段階でスクアレン７ｇが、収率７０％で得られる。
【０２２５】
鹸化により精製される画分を、撹拌しながら活性炭（５％／油）で脱色し、次いで活性炭を、０．２μｍでの濾過により分離する。
【０２２６】
真空下１８０℃で３０分間の水蒸気ストリッピングにより、最終ステップの脱臭を実施する。
【０２２７】
このようにして得られる精製スクアレンは、９８％に近い純度を有する。
【０２２８】
ＮＭＲ解析の手順では、正確な純度の値を得ることができず、不純物の除去率は約７５％と評価される。
【０２２９】
実施例４．超臨界ＣＯ２を用いた連続２ステップの抽出を実施することによるスクアレンの精製
これは、実施例１および２に近い操作条件で、１０ｍ３発酵槽内で培養されたスキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）藻から産生されるスクアレン１５％超を含有する油２００リットルを使用した。
【０２３０】
この油は、より詳細には主として脂肪酸：
−  Ｃ１４、Ｃ１６短鎖、２７％まで
−  Ｃ２０および特にＣ２２長鎖、４３％まで、および
加えて、本質的にスクアレンから成る（約１５．５％）、この大量の非鹸化性物質、
と共に、トリグリセリド類を含む。
【０２３１】
目的は、一方では、９５％超まで精製されたスクアレンを得ることであり、他方ではスクアレンが除去されている油を得ることである。
【０２３２】
本発明に従って使用される分画方法はしたがって、このように要約することが可能な２つのステップ：
−  ステップ１：スクアレンを多く含む抽出物およびスクアレンを含まないラフィネートを生じる超臨界圧の流体との接触による粗製油の分画；
−  ステップ２：超臨界圧の流体との接触により、ステップ１で得られた抽出物の分画によるスクアレンの精製；
を含む。
【０２３３】
この分画は、スクアレン（無極性炭化水素）と油の脂質を構成するトリグリセリド類との間の、大きい溶解度差に基づき、スクアレンはトリグリセリド類よりはるかに溶けやすい。
【０２３４】
２つの分画ステップは、内部抽出物還流と向流で動作する充填分画カラムで実施される。
【０２３５】
使用する分画ユニットは、内径１２５ｍｍ、および２ｍの４区域で温度勾配を確立できる高さ８ｍを有する、向流分画カラムを備えている。
【０２３６】
このカラムは、高性能充填物（Ｓｕｌｚｅｒ  ＢＸタイプ）で満たされている。このユニットは完全に自動化されており、連続動作を提供する。
【０２３７】
ステップ１：スクアレンを抽出するための粗製油の処理
カラムの底から数えて、区域３と４の間で、カラムに油を給送する。プロセスパラメータを、下表Ｖに提示する。
【０２３８】
【表７】
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【０２３９】
スクアレンはこのように、比較的高濃度で抽出物中に回収される。
【０２４０】
粗製油の処理で、スクアレンの大部分を抽出することが可能である。
【０２４１】
ステップ２：スクアレンの精製：
粗製油に使用したものと同様の条件ではあるが、下表ＶＩに示す通り、圧力および温度が僅かに異なる条件で、スクアレンの超臨界分画をもう一度実施する。
【０２４２】
【表８】
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【０２４３】
超臨界ＣＯ２を用いた連続した２つの抽出ステップを使用するこの方法で、スクアレン含量９７％の組成物を得ることを保証することが可能である。
【国際調査報告】
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