(57)【要約】  本発明は、ウイルス性疾患を治療するための組成物および方法に関する。ウイルス感染を治療するための組成物の調製のためのＰ２Ｘ受容体アンタゴニストの新規な使用が、初めて開示される。Ｐ２Ｘ受容体アンタゴニストは、ウイルスを阻害することにより、手足口病に対する予防または治療効果を達成する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポジティブセンス一本鎖ＲＮＡピコルナウイルスを阻害するための組成物の調製のための、
Ｐ２Ｘ受容体アンタゴニストの使用。
【請求項２】
請求項１に記載の使用であって、
手足口病を予防、緩和、または治療するための組成物の調製のための使用であることを特徴とする、
使用。
【請求項３】
請求項１または２に記載の使用であって、
前記組成物が、全身投与または非経口投与に用いられ；
好ましくは、前記組成物が、経口投与、静脈内注射、筋肉内注射、または吸入に用いられることを特徴とする、
使用。
【請求項４】
ポジティブセンス一本鎖ＲＮＡピコルナウイルスの阻害のための方法であって、
有効量のＰ２Ｘ受容体アンタゴニストを、それを必要とする対象に投与するステップを含む、
方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、
前記対象が、ウイルスにより感染された哺乳類であり、
エンテロウイルス７１またはコクサッキーウイルスにより感染されたヒト、サル、またはマウスなどを含み、
好ましくは、前記対象が、手足口病を有することを特徴とする、
方法。
【請求項６】
請求項１の使用または請求項４の方法であって、
前記Ｐ２Ｘ受容体アンタゴニストが、ＰＰＡＤＳ、ｉｓｏ−ＰＰＡＤＳ、ＰＰＮＤＳ、スラミン、ＮＦ０２３、ＴＮＰ−ＡＴＰ、ＮＦ２７９、ＮＦ１５７、エバンスブルー、および／またはそれらの類似体またはそれらの誘導体、および／または、薬学的に許容できるそれらの塩からなる群より選択されることを特徴とする、
使用または方法。
【請求項７】
請求項１の使用または請求項４の方法であって、
前記ウイルスがエンテロウイルスであることを特徴とする、
使用または方法。
【請求項８】
請求項１の使用または請求項４の方法であって、
前記ウイルスがエンテロウイルスＡであることを特徴とする、
使用または方法。
【請求項９】
請求項１の使用または請求項４の方法であって、
前記ウイルスが、ヒトエンテロウイルス７１およびコクサッキーウイルスであることを特徴とする、
使用または方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物医学の分野に属する。より具体的には、本発明は、ウイルス性疾患の治療のための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
手足口病（ＨＦＭＤ）は、西太平洋地域における一般的なウイルス感染であり、中国およびアジアにおける主な死因および小児疾患である。２０１１年に、西太平洋地域においてＨＦＭＤを患っている小児は２００万人いた（中国で１６０万人を超え、日本で３４万人を超え、ベトナムで１１００万を超える）。過去２０年間で、２〜３年に１回、夏および初秋に温帯気候の国々において集団発生した（Ｓｏｌｏｍｏｎ，Ｌｅｗｔｈｗａｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。中国本土では、２００８年以来、春および夏ごとに発生している。
【０００３】
ＨＦＭＤは、５歳未満の小児に主に発症する。主な症状は、口内炎、手足口の痛み、口の痛みおよび炎症（ヘルペスアンギーナ）を含む。ほとんどの症例は軽い症状を示すのみであり、自然治癒するである。しかしながら、数多くの症例が未だ存在し（２０１０年に、中国において、２７０００を超える症例（約１．６％））、重度の神経症状、例えば、無菌性髄膜炎、脳炎、およびポリオのような麻痺、および、中枢神経障害および神経原性肺水腫および心機能不全を示した（Ｈｕａｎｇ，Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．１９９９；Ｙａｎｇ，Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００９；Ｗｅｎｇ，Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１０；Ｒｈｏａｄｅｓ，Ｔａｂｏｒ−Ｇｏｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。中国で２０１０年および２０１１年に、それぞれ９０５および５０６の死亡例が生じた。
【０００４】
ＨＦＭＤは、非ポリオエンテロウイルスによって引き起こされる。２００８年の安徽省におけるＨＦＭＤ発症の原因の主な病原ウイルスは、ＥＶ７１およびＣＶＡ１６であった（Ｙａｎ，Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．；Ｚｈａｎｇ，Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１０；Ｚｈｕ，Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。重症例および死亡例の大部分は、ＥＶ７１感染に起因するものであった。ＥＶ７１のＣ４サブタイプは、中国における主な流行株であり、一方、ＥＶ７１のＣ１、Ｃ２、Ｃ４、Ｂ３、およびＢ４サブタイプは、アジアの他の地域における流行株である（Ｙａｎｇ，Ｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。
【０００５】
ＨＦＭＤは、感染者からの口および鼻の分泌物、水疱液、および排泄物との直接接触により、患者から人々に広がる（Ｓｏｌｏｍｏｎ，Ｌｅｗｔｈｗａｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。感染者は疾患の発症後１週間が最も感染性であるが、接触感染性は、症状が進行した後もなお持続する（Ｈａｎ，Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。多くの感染者（大部分の感染した成人を含む）は、症状を有さない。口の発疹がある小児は、臨床的および引き続きのウイルス学的診断を介して、診断がよりされやすい。
【０００６】
現在のところ、ＨＦＭＤのワクチンおよび薬は利用可能でない。患者を治療する、および、拡散を防ぐための唯一の方法は、衛生、支持療法、疼痛緩和、うがい薬、および静脈内免疫グロブリン（中国衛生部２０１０）である。ワクチンが開発中であるが、しかしながら、予防効果は未知のままであり、大スケールのワクチン接種が実施されるためには、未だ長期間が必要である。
【０００７】
したがって、当該分野において、ＨＦＭＤを予防および治療することのできる薬を開発する、特に、ＥＶ７１およびＣＶＡ１６ウイルス感染を阻害して根本からの予防および治療を達成する薬を開発する、緊急の必要性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、ウイルス性疾患の治療のための組成物および方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１の態様では、ポジティブセンス一本鎖ＲＮＡピコルナウイルスを阻害するための組成物の調製のための、Ｐ２Ｘ受容体アンタゴニストの使用を提供する。
【００１０】
好ましい実施態様では、Ｐ２Ｘ受容体アンタゴニストは、ＨＦＭＤを予防、緩和、または治療するための組成物の調製に用いられる。
【００１１】
別の好ましい実施態様では、組成物は、全身投与または非経口投与にも用いられ；好ましくは、組成物は、経口投与、静脈内注射、筋肉内注射、または吸入に用いられる。
【００１２】
本発明の別の態様では、有効量のＰ２Ｘ受容体アンタゴニストを、それを必要とする対象に投与するステップを含む、ポジティブセンス一本鎖ＲＮＡピコルナウイルスを阻害する方法を提供する。
【００１３】
好ましい実施態様では、対象は、ウイルスに感染した哺乳類であり、エンテロウイルス７１またはコクサッキーウイルスに感染したヒト、サル、またはマウスなどを含み、好ましくは、ＨＦＭＤを有する対象である。
【００１４】
別の好ましい実施態様では、Ｐ２Ｘ受容体アンタゴニストは、ＰＰＡＤＳ、ｉｓｏ−ＰＰＡＤＳ、ＰＰＮＤＳ、スラミン、ＮＦ０２３、ＴＮＰ−ＡＴＰ、ＮＦ２７９、ＮＦ１５７、エバンスブルー、および／またはそれらの類似体またはそれらの誘導体、および／または薬学的に許容できるそれらの塩からなる群より選択される。
【００１５】
別の好ましい実施態様では、ウイルスは、エンテロウイルスである。
【００１６】
別の好ましい実施態様では、ウイルスは、エンテロウイルスＡである。
【００１７】
別の好ましい実施態様では、ウイルスは、ヒトエンテロウイルス７１およびコクサッキーウイルスである。
【００１８】
さらに好ましくは、ウイルスは、ヒトエンテロウイルス７１のＣ４サブタイプおよびコクサッキーウイルスのＡ１６サブタイプである。
【００１９】
本明細書中の開示に起因して、本発明の他の態様が、当業者にとって明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】異なるＥ０２濃度において、ＥＶ７１臨床分離株を用いて、０．１のＭＯＩでＲＤ細胞に感染させたことを示す。４６時間のインキュベーション後、培養上清中のウイルスＲＮＡを抽出した。相対的なＥＶ７１ウイルス量を定量ＲＴ−ＰＣＲにより決定した。表のカラム２、３、４における数字は、３回の繰り返し試験から得られた結果を表す。右側のパネルは、３回の結果の平均値を示す。
【図２】異なるＥ０２濃度において、１０倍段階希釈でのＥＶ７１を用いてＲＤ細胞に感染させたことを示す。３〜４日間のインキュベーション後、ＣＰＥ（細胞変性効果）を光学顕微鏡の下で観察し、クリスタルバイオレットで染色して５０％の組織培養感染量を計算した（ＴＣＩＤ５０）。
【図３】異なるＥ０２濃度において、ＥＶ７１を用いて、１２ウェルプレート中で培養したＲＤ細胞に感染させたことを示す。５〜７日間のインキュベーション後、染色してプラーク形成単位（ＰＦＵ）を計算した。
【図４】異なるＥ０２濃度において、１０倍段階希釈でのＥＶ７１  Ｍ．Ａ．Ｖ．を用いてＲＤ細胞に感染させたことを示す。３〜４日間のインキュベーション後、ＣＰＥを光学顕微鏡の下で観察し、クリスタルバイオレットで染色して５０％の組織培養感染量を計算した（ＴＣＩＤ５０）。
【図５】異なるＥ０２濃度において、ＥＶ７１  Ｍ．Ａ．Ｖ．を用いて、１２ウェルプレート中で培養したＲＤ細胞に感染させたことを示す。５〜７日間のインキュベーション後に染色し、プラーク形成単位（ＰＦＵ）を計算した。
【図６】異なるＥ０２濃度において、１０倍段階希釈でのコクサッキーウイルスＡ１６を用いてＲＤ細胞に感染させたことを示す。２日間のインキュベーション後、ＣＰＥを光学顕微鏡の下で観察し、クリスタルバイオレットで染色して５０％の組織培養感染量を計算した（ＴＣＩＤ５０）。
【図７】ＥＶ７１臨床分離株を３日齢の新生ＩＣＲマウスに感染させたことを示す。感染の５日後、血液を回収し、血清を分離した。血清中のウイルスＲＮＡを抽出した。ウイルス量を、ワンステップのリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲにより決定した。
【図８】ＩＣＲ新生マウスの様々な器官または組織における、ＣＶＡ１６の分布を示す。ここで、１番および２番は、それぞれ２匹のマウスから得られた血液サンプルを示す。
【図９】ＣＶＡ１６を３日齢の新生ＩＣＲマウスに感染させたことを示す。感染の６日後に組織を得て、血液を回収し、血清を分離した。組織および血清からＲＮＡを抽出した。ＣＶＡ１６  ＲＮＡを測定してウイルス量を計算した。
【図１０】Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ試薬を用いて決定された異なるＥ０２濃度での、ＲＤ細胞の細胞毒性を示す。
【図１１】５０μｌの５０ｍｇ／ｋｇのＥ０２、２０ｍｇ／ｋｇのＥ０２、または５０μｌのＤＭＥＭの投与量で、連続して４日間、毎日、３日齢のＩＣＲマウスに腹腔内注射したことを示す。毒性結果を観察した。
【図１２】Ｅ０２添加時間アッセイの試験を示す。Ｅ０２がＥＶ７１感染を阻害する能力を、感染前（Ｂ、Ｃ）、感染中（Ｄ、Ｅ）、および感染後（Ｆ）にそれぞれＥ０２を添加することにより試験した。
【図１３】異なるＰＰＡＤＳ濃度において、ＥＶ７１臨床分離株を用いてＲＤ細胞に感染させたことを示す。ＥＶ７１複製に対するＰＰＡＤＳの阻害能力を決定した。
【図１４】ＲＤ細胞において、６つのＰ２ＸサブタイプのｍＲＮＡ発現レベルをＲＴ−ＰＣＲ法により決定したことを示す。
【図１５】ＲＤ細胞において、ＥＶ７１分離株ＳＨ−ＴＳおよびＳＨ−ＲＳの複製を、Ｅ０２が阻害することを示す。
【図１６】ＲＤ細胞において、ＥＶ７１分離株ＳＨ−ＴＳ、ＳＨ−ＲＳのＰＦＵを、Ｅ０２が減少させることを示す。
【図１７】Ｖｅｒｏ細胞において、ＥＶ７１分離株ＳＥＰ−４の複製を、Ｅ０２が阻害することを示す。
【図１８】アカゲザルにおいてインビボで、Ｅ０２が、ＥＶ７１の複製を阻害することを示す。
【図１９】アカゲザルにおいて、Ｅ０２が、ＥＶ７１に起因する体温上昇を阻害することを示す。
【図２０】ＲＤ細胞において、Ｐ２Ｘ受容体アンタゴニストが、ＥＶ７１複製を阻害することを示す。
【図２１】ＥＶ７１に対する、他のアンタゴニストおよびアゴニストの効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
鋭意研究の結果、本発明者らは、ウイルス組成物の調製のためのＰ２Ｘ受容体アンタゴニストの新規な使用を、始めて明らかにした。Ｐ２Ｘ受容体アンタゴニストは、ウイルスを阻害することにより、ＨＦＭＤに対する予防または治療効果を達成する。
【００２２】
Ｐ２Ｘ受容体アンタゴニストおよびその使用
【００２３】
Ｐ２Ｘは、細胞膜上に発現されるＡＴＰ依存性イオンチャネルファミリータンパク質のクラスであり、通常、細胞外ドメイン、２つの膜貫通ドメイン、および２つの細胞内ドメインにより形成される同種または異種の三量体である。Ｐ２Ｘファミリーは、７つのサブタイプを含む。細胞外ＡＴＰが引き金となって、Ｐ２Ｘイオンチャネルが開き、カルシウムイオンの流入および細胞内のカルシウム蓄積を引き起こす。一連の下流のシグナル伝達が、ＭＡＰＫ、ＰＫＣ、およびカルモジュリンを介して活性化される（Ｅｒｂ，Ｌｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．２００６）。
【００２４】
綿密な研究の後、本発明者らは、一部のＰ２Ｘ受容体アンタゴニストが、ウイルスの阻害に有用であることを見いだした。ウイルスは、ポジティブセンス一本鎖ＲＮＡピコルナウイルスファミリーのウイルスであり、アフトウイルス、アビヘパトウイルス、カルジオウイルス、タイロウイルス、エンテロウイルス、エルボウイルス、へパトウイルス、コブウイルス、パレコウイルスなどを含み；好ましくは、ウイルスは、エンテロウイルスであり、エンテロウイルスのＡ〜Ｈクラス、ライノウイルスＡ〜Ｃを含み；好ましくは、ウイルスはエンテロウイルスＡであり、ヒヒのエンテロウイルス、ヒトのコクサッキーウイルスのタイプＡ２〜８、Ａ１０、Ａ１２、Ａ１４、Ａ１６、ヒトのエンテロウイルスのタイプ７１、７６、８９、９０〜９２などを含み；好ましくは、エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）（サブタイプＡ、Ｂ、およびＣを含む）、コクサッキーウイルス（クラスＡおよびＢを含み、好ましくは、Ａ１６サブタイプ；ＣＶＡ１６を含む）を含む。
【００２５】
エンテロウイルス７１またはコクサッキーウイルスＡ１６の感染が、ＨＦＭＤの主な原因であることが知られている。中国衛生部により発行された研究「手足口病の治療ガイドライン（Ｈａｎｄ  Ｆｏｏｔ  ａｎｄ  Ｍｏｕｔｈ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ）（２０１０年版）」、および、多くの発行された研究は全て、ＥＶ７１およびＣＶＡ１６が主な病原体であることを示す。したがって、Ｐ２Ｘ受容体アンタゴニストを、ＨＦＭＤの予防および治療のために用いることができる。
【００２６】
本発明の代替の実施態様としては、Ｐ２Ｘ受容体は、Ｐ２Ｘ１−７受容体サブタイプである。
【００２７】
本発明の好ましい別の実施態様としては、Ｐ２Ｘ受容体アンタゴニストは、ＰＰＡＤＳ、Ｉｓｏ−ＰＰＡＤＳ、ＰＰＮＤＳ、スラミン、ＮＦ０２３（スラミン誘導体）、ＴＮＰ−ＡＴＰ、ＮＦ２７９、ＮＦ  １５７、およびエバンスブルーから選択される。
【００２８】
本発明の、より好ましい別の実施態様では、Ｐ２Ｘ受容体アンタゴニストは、スラミン、ＰＰＡＤＳ、ｉｓｏ−ＰＰＡＤＳ、ＰＰＮＤＳ、ＮＦ０２３、ＮＦ２７９、ＴＮＰ−ＡＴＰ、ＮＦ１５７、およびエバンスブルーであってよい。
【００２９】
また、本発明は、異性体、ラセミ体、薬学的に許容できる塩、水和物、誘導体または類似体がウイルス（例えばエンテロウイルス７１またはコクサッキーウイルスＡ１６サブタイプ）を阻害する機能を有する限り、上記に例示される様々な化合物の異性体、ラセミ体、薬学的に許容できる塩、水和物、前駆体、それらの誘導体または類似体も含む。
【００３０】
用語「異性体」は、配座異性体、光学異性体（例えばエナンチオマーおよび非エナンチオマー）、幾何異性体（例えば、シスおよびトランス異性体）を含む。
【００３１】
用語「誘導体または類似体」は、上記に例示されたものと類似する構造式を有するＰ２Ｘ受容体アンタゴニスト、特に、同一のコア構造を有するものであるが類似する基で置換された基をいくつか有する化合物を指す。その化合物は、ウイルス（例えばエンテロウイルス７１またはコクサッキーウイルスＡ１６サブタイプ）を阻害する機能を維持したままである。例えば、ＨがＣ１〜Ｃ４のアルキルで置換され；Ｃ１アルキルがＣ２アルキルで置換され；ハロゲン基メンバー（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩを含む）の間で置換が生じる；および、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３などの間で置換が生じる。
【００３２】
用語「薬学的に許容できる塩」は、上述の化合物を無機酸、有機酸、アルカリ金属またはアルカリ土類金属と反応させることにより形成される塩を指す。これらの塩は、（限定されないが）以下を含む：（１）以下の無機酸と形成される塩：例えば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸；（２）以下の有機酸と形成される塩、例えば、酢酸、乳酸、クエン酸、コハク酸、フマル酸、グルコン酸、安息香酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シュウ酸、コハク酸、酒石酸、マレイン酸、またはアルギニン。他の塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、またはマグネシウム）と形成される塩、アンモニウム塩、または水溶性アミン塩（例えばＮ−メチルグルカミン塩）、より低いアルカノールアンモニウム塩および他の薬学的に許容できるアミン塩（例えば、メチルアミン塩、エチルアミン塩、プロピルアミン塩、ジメチルアミン塩、トリメチルアミン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ｔｅｒｔ−ブチルアミン塩、エチレンジアミン塩、ヒドロキシエチルアミン塩、ジ−ヒドロキシエチルアミン塩、トリス−ヒドロキシエチルアミン塩、およびアンモニウム塩（それぞれ、モルホリン、ピペラジン、リジンと形成される））または、他の「プロドラッグ」の従来の形態を含む。化合物は、１つまたは複数の不斉中心を有する。したがって、これらの化合物は、ラセミ混合物、個々のエナンチオマー、個々の非エナンチオマー異性体、非エナンチオマー混合物、シスまたはトランス異性体として存在してよい。
【００３３】
用語「前駆体化合物」は、患者内に適切な方法により投与され、代謝され、または化学的に反応した後に、Ｐ２Ｘ受容体アンタゴニスト化合物、または、本発明においてこれまでに例示されたＰ２Ｘ受容体アンタゴニスト化合物と形成された塩または溶液に、変換される前駆体化合物を指す。前駆体化合物は、限定されないが、カルボン酸エステル、炭酸エステル、リン酸エステル、硝酸エステル、硫酸エステル、スルホンエステル、スルホキシドエステル、アミド類、カルバメート類、アゾ化合物、リンアミド、グルコシド、エーテル、アセタール類などの形態を含む。
【００３４】
薬剤スクリーニング方法
【００３５】
本発明者らは、Ｐ２Ｘ受容体アンタゴニストの１つのクラスが、ウイルス複製を阻害することができることを見いだした。そのような阻害効果は、場合により、Ｐ２Ｘ受容体のターゲッティングにより達成される。
【００３６】
Ｐ２Ｘ受容体アンタゴニストがＰ２Ｘ受容体に選択的に結合して、ウイルス阻害効果を誘導することができるということを知った後に、これらの特性に基づいて、Ｐ２Ｘ受容体に結合する物質をスクリーニングすることができる。その後、ウイルスを阻害するのに本当に有用な薬剤を、上述の物質から見つけることができる。
【００３７】
したがって、本発明は、ＨＦＭＤの予防および治療のための潜在的な薬剤をスクリーニングする方法を提供し、前記方法は、（１）Ｐ２Ｘ受容体を含む（例えば発現する）系を提供するステップ；（２）ステップ（１）の系に対する候補物質を提供して、Ｐ２Ｘ受容体に対する候補物質の結合状態を観察するステップを含む。候補物質がＰ２Ｘ受容体に結合することができる場合は、その候補物質は、ＨＦＭＤを予防および治療するための潜在的な薬剤である。Ｐ２Ｘ受容体を含む（例えば発現する）系は、例えば、細胞系であってよい。細胞は、内因性Ｐ２Ｘ受容体を発現する細胞、または、Ｐ２Ｘ受容体を発現するように改変された細胞であってよい。Ｐ２Ｘ受容体を含む系は、亜細胞系、溶液系、組織系、器官系または動物系（例えば動物モデル、好ましくは非ヒトの哺乳類動物モデル、例えば、マウス、ウサギ、ヒツジ、サルなど）などであってもよい。化合物が受容体または受容体サブユニットに結合するか否かを検出する技術は、当技術分野で知られている。
【００３８】
本発明の好ましい実施態様では、スクリーニングの間、候補物質に対するＰ２Ｘ受容体の結合の違いをより容易に観察するために、コントロール群を設定してよい。コントロール群は、候補物質を添加せずにＰ２Ｘ受容体を含む系であってよい。
【００３９】
候補物質は、（限定されないが、）小分子化合物、ポリペプチド、およびリガンドを含んでよい。好ましくは、候補物質は小分子化合物である。例えば、候補物質は、様々なＰ２Ｘ受容体アンタゴニストであってよい。
【００４０】
本発明の好ましい実施態様としては、前記方法は、得られた潜在的物質に対してさらに細胞実験および／または動物試験を行なって、ウイルスを阻害するのに本当に有用な物質をさらに選択および決定するステップをさらに含む。
【００４１】
別の態様では、本発明はまた、そのスクリーニング方法により得られたウイルスを阻害するための物質も含む。
【００４２】
組成物
【００４３】
本発明の化合物は、医薬組成物を調製するために用いてよい。薬学的に許容できる担体は、固体または液体であることができる。固体製剤は、粉剤、錠剤、丸薬、カプセル、ウエハー、坐薬、および分散顆粒を含む。固体担体は、１または数個の物質であることができ、希釈剤、香料、結合剤、防腐剤、錠剤崩壊剤、または封入材料としての役割を果たしてよい。粉剤では、担体は、細かく分割された固体である。本発明の化合物、および、細かく分割された活性成分は、混合物中に存在する。錠剤では、そのような化合物は、必要な接着担体と適切な比率で混合されて、所望の形状およびサイズに収められる。適切な担体は、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、滑石、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、スターチ、ゼラチン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、およびココアバターなどである。ウエハーまたはトローチ剤、錠剤、粉剤、カプセル、および丸薬も同様である。ウエハーおよびトローチ剤は、経口投与に適切な固体製剤であり得る。
【００４４】
液体製剤は、溶液、懸濁液、およびエマルション、例えば、水または水性プロピレングリコール溶液を含む。非経口でない（ｎｏｎ−ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）注入のために、液体製剤は、ポリエチレングリコール水溶液中に調製することができる。経口投与に適切な水溶液は、活性成分を水に溶解させて、必要に応じて適切な着色剤、香料、乳化剤、および増粘剤を添加することにより調製することができる。
【００４５】
組成物は、全身投与、局所投与、または非経口投与に用いることができる。
【００４６】
経口投与に適切な水性懸濁液は、細かく分割された活性成分を、水性粘性物質、例えば、天然または合成のガム、樹脂、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および他の公知の懸濁液中に、分散させることにより調製することができる。
【００４７】
治療用途では、本発明で用いられる化合物の毎日の最初の投与量は、０．０１〜２００ｍｇ／ｋｇ体重、さらに好ましくは０．２５〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、さらに好ましくは０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ体重である。しかしながら、これらの投与量は、患者の必要性および治療する疾患の重症度、および用いられる化合物に基づいて変更してよい。一般的に言えば、治療は、化合物の最適投与量よりも少ない投与量で始めて、その後に、この投与量を、最良の結果に到達するまで、少ない量で増加させる。便宜上、必要に応じて、１日の総投与量は、１日の投与を数回の投与量に分けてよい。
【００４８】
また、本発明の医薬組成物は、他の治療薬またはアジュバントと組み合わせて同時に使用してもよい。
【００４９】
キット
【００５０】
本発明のＰ２Ｘ受容体アンタゴニスト、またはＰ２Ｘ受容体アンタゴニストを含む組成物は、販売または使用に便利なキット中に存在してよい。
【００５１】
Ｐ２Ｘ受容体アンタゴニスト、またはＰ２Ｘ受容体アンタゴニストを含む組成物は、キット中に存在する単位用量形態で調製してよい。「単位用量形態」は、投与の便宜のために、本発明のＰ２Ｘ受容体アンタゴニストまたはＰ２Ｘ受容体アンタゴニストを含む組成物を用いて調製される、単回投与に必要とされる投与形態を指し、制限されないが、様々な固体投与形態（例えば錠剤）、液体、カプセル、および放出制御製剤を含む。単位用量形態を調製すれば、１〜３用量の単位用量形態の組成物を１日に投与してよい。
【００５２】
また、キットは、人々が薬剤の正しい服用法を知るように、ウイルス阻害を必要とする対象（例えば、ウイルス性疾患にかかっている患者、またはウイルスを含む場所）に対する、Ｐ２Ｘ受容体アンタゴニストの投与に関する投与説明書も含む。
【００５３】
本発明は、以下の具体的な実施態様と組み合わせて、さらに説明される。これらの実施態様は、単に本発明を説明するためにのみ用いられ、本発明の範囲を限定することを意図しないことが理解されるであろう。以下の実施態様に示されない実験方法における特定の条件は、通常、従来の条件により記載されるもの、例えば「Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｅｓｓ，２００２」に記載されるもの、または、メーカーにより推奨される条件である。別段の記載がない限り、％および部は、容積に基づいて計算される。
【実施例】
【００５４】
Ｉ．実験材料
１．細胞株
横紋筋肉腫細胞（ＲＤ細胞）を、ＡＴＣＣカタログ番号ＶＲ−８０５から購入した。細胞培養培地は、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＤＭＥＭであり、１％（ｗ／ｖ）アンピシリン／ストレプトマイシン溶液を添加した。
【００５５】
２．ウイルス株
ＥＶ７１臨床分離株：２００８年の中国安徽省ＨＦＭＤサンプルから分離したＥＶ７１  ＦＹ  ５７３；遺伝子型ＥＶ７１  Ｃ４；Ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＨＭ＿０６４４５６；中国科学院の上海生命科学研究院より提供。
ＥＶ７１臨床分離株ＳＨ−ＴＳおよびＳＨ−ＲＳ、中国科学院の上海生命科学研究院より提供、遺伝子型Ｃ４。
ＥＶ７１臨床分離株ＳＥＰ−４、カンボジアのパスツール研究所によるカンボジア臨床株ＨＦＭＤサンプルから提供されて分離、遺伝子型Ｃ４。
ＥＶ７１−ＦＹ２３株：中国薬学科学院の薬学生物学研究所のウイルス免疫部門より提供、バッチ番号：２０１２１００１、Ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＥＵ８１２５１５．１。
ＥＶ７１  Ｍ．Ａ．Ｖ．：新生マウスでのＥＶ７１  ＦＹ  ５７３の継代培養の繰り返しにより得られたＥＶ７１マウス適応株。
ＣＶＡ１６：コクサッキーＡ１６ウイルスサブタイプ、ｓｈｚｈ０５−１（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＥＵ２６２６５８）。
【００５６】
３．化合物
Ｅ０２をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、スラミンナトリウムとして投与した。
サルの実験で用いられたスラミンはＢａｙｅｒより提供され、スラミン遊離酸として投与した。
ｉｓｏ−ＰＰＡＤＳ（０６８３−１０ｍｇ）、ＮＦ  ２７９（１１９９−１０ｍｇ）、およびＰＰＮＤＳ（１３０９）はＴｏｃｒｉｓから購入した。
別段の記載がない限り、他の化合物はＳｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈおよびＴｏｃｉｓから購入した。
【００５７】
４．ＲＴ−ＰＣＲプライマーおよびプローブ（５’→３’）：
ＥＶ７１フォワードプライマー：ＣＣＣＴＧＡＡＴＧＣＧＧＣＴＡＡＴＣ（配列番号：１）；
ＥＶ７１リバースプライマー：ＡＴＴＧＴＣＡＣＣＡＴＡＡＧＣＡＧＣＣＡ（配列番号：２）；
ＥＶ７１プローブ：ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）−ＡＡＣＣＧＡＣＴＡＣＴＴＴＧＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＴＴＴＣ（配列番号：３）−ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン）；
ＧＡＰＤＨフォワードプライマー：ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ（配列番号：４）；
ＧＡＰＤＨリバースプライマー：ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ（配列番号：５）；
Ｐ２Ｘ１−１６４Ｆ：ＣＣＴＣＴＴＣＧＡＧＴＡＴＧＡＣＡＣＣ（配列番号：６）；
Ｐ２Ｘ１−１６４Ｒ：ＣＡＧＡＧＡＣＡＣＴＧＣＴＧＡＴＧＡＧ（配列番号：７）；
Ｐ２Ｘ２−２０２Ｆ：ＣＴＧＧＡＣＡＴＧＣＴＧＧＧＡＡＡＣＧ（配列番号：８）；
Ｐ２Ｘ２−２０２Ｒ：ＴＧＣＣＣＴＴＧＧＡＧＡＡＧＴＧＧＡＡＴ（配列番号：９）；
Ｐ２Ｘ３−１５３Ｆ：ＧＧＣＴＣＧＡＣＡＧＣＧＴＴＴＣＴ（配列番号：１０）；
Ｐ２Ｘ３−１５３Ｒ：ＴＧＣＣＡＧＣＡＴＴＣＣＣＧＴＡＴ（配列番号：１１）；
Ｐ２Ｘ４−２０１Ｆ：ＴＧＧＧＡＴＧＴＧＧＣＧＧＡＴＴＡＴ（配列番号：１２）；
Ｐ２Ｘ４−２０１Ｒ：ＴＡＣＧＣＡＣＣＴＧＣＣＴＧＴＴＧＡＧＡ（配列番号：１３）；
Ｐ２Ｘ５−２２０Ｆ：ＴＣＴＴＴＧＣＣＴＧＧＴＧＣＣＣＧＴＴＧ（配列番号：１４）；
Ｐ２Ｘ５−２２０Ｒ：ＡＴＣＡＣＧＧＡＧＣＣＣＡＧＴＣＧＧＡＡＧ（配列番号：１５）；
Ｐ２Ｘ６−２０５Ｆ：ＧＧＡＧＧＡＣＡＡＡＧＴＡＴＧＡＧＧＡＧＧ（配列番号：１６）；
Ｐ２Ｘ６−２０５Ｒ：ＧＡＡＴＧＧＧＴＴＧＧＣＡＡＧＴＧＧ（配列番号：１７）；
Ｐ２Ｘ７−１７５Ｆ：ＣＧＴＧＧＡＧＡＡＧＴＧＡＡＧＡＡＧ（配列番号：１８）；
Ｐ２Ｘ７−１７５Ｒ：ＴＣＧＧＴＣＡＧＡＧＧＡＡＣＡＧＡＧＣ（配列番号：１９）。
【００５８】
５．試薬およびキット
ＤＭＥＭ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１１９６５１１８；
ＦＢＳ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１００９９１４１；
トリプシン０．２５％ＥＤＴＡ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号５２５２０００７２；
ウイルスＲＮＡ抽出キット：ＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡミニキット、ＱＩＡＧＥＮカタログ番号５２９０６；
細胞の全ＲＮＡ抽出キット：ＲＮｅａｓｙミニキット（２５０）、ＱＩＡＧＥＮカタログ番号７４１０６；
組織保存溶液：ＲＮＡｓｔｏｒｅサンプル保存溶液、Ｔｉａｎｇｅｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）Ｃｏ．ＤＰ４０８−０２；
組織ＲＮＡ抽出キット：ＲＮＡｐｒｅｐ  ｐｕｒｅ  ａｎｉｍａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ，Ｔｉａｎｇｅｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）Ｃｏ．，ＤＰ４３；
ＴａｑｍａｎリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ試薬：ＡＢＩ  ｔａｑＭａｎ（登録商標）ワンステップＲＴ−ＰＣＲ、ＡＢＩカタログ番号４３０９１６９；
ＳＹＢＲリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ試薬：ＱＩＡＧＥＮ  ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＴ−ＰＣＲキット（２００）、カタログ番号２０４２４３；
ワンステップＲＴ−ＰＣＲ試薬：ＱＩＡＧＥＮワンステップＲＴ−ＰＣＲキット（１００）；カタログ番号２０１２１２；
ＤＮＡ電気泳動アガロース：Ｂｉｏｗｅｓｔアガロース、カタログ番号ＢＷ−Ｒ０１００；
ＤＮＡマーカー：ＤＬ２，０００  ＤＮＡマーカー、カタログ番号Ｄ５０１；
クリスタルバイオレット：Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚカタログ番号ｓｃ−２０７４６０；
Ｓｅａｐｌａｑｕｅアガロース：ｌｏｎｚａ／ａｍａｘａ  ４  ５０１０１；
Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ：Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｇ７５７２；
ペニシリンストレプトマイシン：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１５１４０１２２。
【００５９】
６．略称
ＣＰＥ：細胞変性効果、
ＣＴ：サイクルの閾値、
ＥＣ５０：５０％効果濃度、
ＥＶ７１：エンテロウイルス７１、
エバンスブルー：６，６−［（３，３’−ジメチル［１，１’−ビフェニル］−４，４’−ジイル）ビス（アゾ）ビス［４−アミノ−５−ヒドロキシ−１，３−ナフタレンジスルホン酸］四ナトリウム塩；
ＨＦＭＤ：手足口病、
ｉｓｏ−ＰＰＡＤＳ：ピリドキサール−ホスフェート−６−アゾフェニル−２’，５’−ジスルホン酸；
Ｍ．Ａ．Ｖ．：マウス適応ウイルス、
ＭＡＰＫ：マイトジェン活性化プロテインキナーゼ、
ＭＯＩ：感染の多重度
ＮＦ  ０２３：８，８’−［カルボニルビス（イミノ−３，１−フェニレンカルボニルイミノ）］ビス−１，３，５−ナフタレン−トリスルホン酸，ヘキサナトリウム塩；
ＮＦ  １５７：８，８’−［カルボニルビス［イミノ−３，１−フェニレンカルボニルイミノ（４−フルオロ−３，１−フェニレン）カルボニルイミノ］］；
ＮＦ  ２７９：８，８’−（カルボニルビス（イミノ−４，１−フェニレンカルボニルイミノ−４，１−フェニレンカルボニルイミノ））ビス（１，３，５−ナフタレントリスルホン酸）
ＰＦＵ：プラーク形成単位
ＰＫＣ：プロテアーゼキナーゼＣ、
ＰＰＡＤＳ：ピリドキサール−ホスフェート−６−アゾフェニル−２’，４’−ジスルホン酸；
ＰＰＮＤＳ：ピリドキサール−５’−ホスフェート−６−（２’−ナフチルアゾ−６’−ニトロ−４’，８’−ジスルホネート）四ナトリウム塩、
ＲＤ細胞：横紋筋肉腫細胞、
ＴＯＡ：添加時間アッセイ（Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ａｄｄｉｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）、
ＴＣＩＤ５０：５０％組織培養感染量、
ＴＮＰ−ＡＴＰ：トリニトロフェノール−ＡＴＰ、
ＵＴＰ：ウリジントリホスフェート、
【００６０】
７．化合物  構造およびＣＡＳ番号
【化１】
2015510870.tif 000002
2015510870.tif 000003
【００６１】
ＩＩ．実施態様
ＥＶ７１およびＣＶＡ１６は、ＨＦＭＤの主な病原体である。以下の実施例において、本発明者らは、Ｅ０２（スラミンナトリウム）またはその類似体が、ＥＶ７１およびＣＶＡ１６感染をインビトロおよびインビボで阻害する能力を決定した。
【００６２】
（実施例１）Ｅ０２は、ＲＤ細胞の、ＥＶ７１臨床分離株（ＥＶ７１  ＦＹ  ５７３）感染を阻害する（インビトロ試験）。
【００６３】
１．Ｅ０２は、ＲＤ細胞において、ＥＶ７１複製を阻害することができる。
【００６４】
異なるＥ０２濃度において、０．１のＭＯＩ（感染の多重度）で、ＥＶ７１臨床分離株（ＥＶ７１  ＦＹ  ５７３）をＲＤ細胞に感染させた。感染後４６時間に、培養上清中のウイルスＲＮＡを抽出し、相対的なＥＶ７１ウイルス量を定量ＲＴ−ＰＣＲにより決定した。手順を以下に詳細に述べる：
【００６５】
（１）細胞のシーディング：感染の２４時間前に、９６ウェルの細胞培養プレートにウェルあたり５×１０４細胞でＲＤ細胞をシーディングした。
【００６６】
（２）感染：
ａ．薬剤とともに事前インキュベートしたウイルス：ウイルス保存溶液を、ＤＭＥＭで５×１０４ＴＣＩＤ５０／ｍｌに希釈して、９６ウェルプレートにウェルあたり１００μｌで分注し、１１μｌの、対応する濃度でＤＭＥＭに溶解されたＥ０２またはＤＭＥＭを添加し、３７℃で１時間インキュベートした；
ｂ．薬剤とともに事前インキュベートした細胞：細胞培養培地を９６ウェルプレートから除去し、各ウェルに１００μｌのＤＭＥＭを添加し、それから、対応する濃度でのＥ０２溶液またはＤＭＥＭを１１μｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートした；
ｃ．１時間のインキュベーション後、細胞培養プレートから薬剤を捨て、薬剤とともに事前インキュベートした１１１μｌのウイルスを細胞培養プレートに移し、３７℃で１時間インキュベートした；
ｄ．インキュベーション後、上清を捨てて、細胞を５０μｌのＤＭＥＭで２回洗浄し、２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを１８０μｌ、対応する濃度でのＥ０２溶液またはＤＭＥＭを２０μｌ、各ウェルに添加した。インキュベーションのために、細胞培養プレートを、３７℃の５％（ｖ／ｖ）二酸化炭素インキュベーターに置いた。
（３）ウイルス回収およびＲＮＡ抽出：感染後、細胞を４６時間培養し、１４０μｌの上清を深い９６ウェルプレートに移し、ウイルスＲＮＡ抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡミニキット、カタログ番号５２９０６）を用いて、標準的な操作手順に従ってウイルスＲＮＡ抽出を行なった。
【００６７】
（４）ウイルス量の測定：ＥＶ７１の５’ＵＴＲ遺伝子を、ＡＢＩ  ７９００ＨＴ  ３８４ウェルプレートＰＣＲシステムのＡＢＩ  ＴａｑｍａｎワンステップＲＴ−ＰＣＲキット（ＡＢＩ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）ワンステップＲＴ−ＰＣＲ、カタログ番号４３０９１６９）を用いて検出した。反応系およびＰＣＲプログラムを表１および表２に示す。ＥＶ７１の５’ＵＴＲ定量ＲＴ−ＰＣＲの熱サイクルプログラム（Ｔａｑｍａｎ）；
【００６８】
（５）ＰＣＲ検量線（検量線は、規定された力価で、１０倍で段階希釈されたウイルスから抽出されたＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを行なうことにより決定されたＣＴ値により得られた）を用いて、ＰＣＲのＣＴ値をウイルス量に変換した。
【００６９】
【表１】
2015510870.tif 000004
【００７０】
【表２】
2015510870.tif 000005
【００７１】
結果は、Ｅ０２が、ＲＤ細胞において、ＥＶ７１複製を阻害できることを示す。ＥＣ５０（５０％効果濃度）は６．９３μＭである。３．４４μＭでは、ＥＶ７１複製を１０倍減少させることができる。５．１９μＭでは、ＥＶ７１複製は１００倍減少し；６．４５μＭでは１，０００倍減少し、７．６３μＭでは１０，０００倍減少する。図１を参照。
【００７２】
２．Ｅ０２は、ＲＤ細胞において、ＥＶ７１のＴＣＩＤ５０を有意に減少させる。
異なるＥ０２濃度において、ＥＶ７１（臨床分離株ＥＶ７１  ＦＹ  ５７３）を１０倍段階希釈で用いてＲＤ細胞に感染させた。３〜４日インキュベーションした後、ＣＰＥ（細胞変性効果）を光学顕微鏡下で観察し、クリスタルバイオレットで染色して５０％組織培養感染量を計算した。手順を以下に詳細に述べる：
【００７３】
（１）細胞シーディング：感染の２４時間前に、９６ウェル細胞培養プレートにウェルあたり５×１０４細胞でＲＤ細胞をシーディングした。
【００７４】
（２）感染：
ａ．薬剤とともに事前インキュベートしたウイルス：ウイルス保存溶液をＤＭＥＭで１０倍段階希釈し、９６ウェルプレートにウェルあたり１００μｌで分注し、対応する濃度でＤＭＥＭ中に溶解されたＥ０２を１１μｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートした；
ｂ．薬剤とともに事前インキュベートした細胞：細胞培養培地を９６ウェルプレートから除去し、各ウェルに１００μｌのＤＭＥＭを添加し、それから、対応する濃度でのＥ０２溶液を１１μｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートした；
ｃ．１時間のインキュベーション後、細胞培養プレートから薬剤を捨てて、薬剤とともに事前インキュベートした１１１μｌのウイルスを細胞培養プレートに移し、３７℃で１時間インキュベートした；
ｄ．インキュベーション後、ウイルスと薬剤の混合物を除去し、細胞を５０μｌのＤＭＥＭで２回洗浄し、２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを１８０μｌ、対応する濃度でのＥ０２溶液を２０μｌ、各ウェルに添加し、インキュベーションのために、細胞培養プレートを３７℃の５％（ｖ／ｖ）二酸化炭素インキュベーター中に置いた。
【００７５】
（３）３〜４日間培養した後、ＣＰＥを光学顕微鏡下で観察し、クリスタルバイオレットで染色し、Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法を用いてＴＣＩＤ５０を計算した。
【００７６】
結果は、Ｅ０２が、ＲＤ細胞において、ＥＶ７１感染に起因するＣＰＥを阻害することができることを示す。ＲＤ細胞における、ＥＶ７１のＴＣＩＤ５０を減少させるＥ０２のＥＣ５０は、４．７μＭである。図２を参照。したがって、Ｅ０２は、ＲＤ細胞において、ＥＶ７１のＴＣＩＤ５０を有意に減少させる。
【００７７】
３．Ｅ０２は、ＲＤ細胞において、ＥＶ７１のプラーク形成単位を減少させる。
【００７８】
異なるＥ０２濃度において、ＥＶ７１（臨床分離株ＥＶ７１  ＦＹ  ５７３）を用いて、１２ウェルプレート中で培養されたＲＤ細胞に感染させた。５〜７日間培養した後、染色し、プラーク形成単位を計算した。手順を以下に詳細に述べる：
【００７９】
（１）細胞シーディング：感染の２４時間前に、１２ウェル細胞培養プレートにウェルあたり２×１０５細胞でＲＤ細胞をシーディングした。
【００８０】
（２）細胞の感染：
ａ．薬剤とともに事前インキュベートしたウイルス：ウイルス保存溶液を、５０，０００ＰＦＵ／ｍｌ、５，０００ＰＦＵ／ｍｌ、および５００ＰＦＵ／ｍｌに、ＤＭＥＭで１０倍に段階希釈し；１２ウェルプレートにウェルあたり５００μｌ分注し、対応する濃度でＤＭＥＭ中に溶解されたＥ０２を５６μｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートした；
ｂ．薬剤とともに事前インキュベートした細胞：細胞培養培地を１２ウェルプレートから除去し、各ウェルにＤＭＥＭを５００μｌ添加し、それから、対応する濃度でのＥ０２溶液を５６μｌ添加し、３７℃で時間インキュベートした；
ｃ．１時間インキュベーションした後、薬剤を細胞培養プレートから捨て、薬剤とともに事前インキュベートしたウイルスを５５６μｌ、細胞培養プレートに移し、３７℃で１時間インキュベートした；
ｄ．インキュベーション後、ウイルスおよび薬剤の混合物を除去し、細胞を３００μｌのＤＭＥＭで２回洗浄し、対応する濃度のＥ０２を含むＤＭＥＭを各ウェルに１５０μｌ添加し、１％低融点ｓｅａｐｌａｑｕｅ、２％ＦＢＳを含む、前もって加熱して溶解した（３７〜４０℃に冷却された）ＤＭＥＭを、１３５０μｌ添加した。インキュベーションのために、細胞培養プレートを、３７℃の５％（ｖ／ｖ）二酸化炭素インキュベーター内に置いた。
【００８１】
（３）５〜７日間培養した後、ゲルを除去し、クリスタルバイオレットで染色し、ＰＢＳで１回洗浄し、プラーク数を記録し、プラーク形成単位を計算した。
【００８２】
結果は、Ｅ０２が、ＲＤ細胞において、ＥＶ７１により形成されるプラークの数を減少させることができることを示す。ＲＤ細胞において、ＥＶ７１のＰＦＵを減少させるＥ０２のＥＣ５０は２．６μＭである。図３参照。したがって、Ｅ０２は、ＲＤ細胞において、ＥＶ７１のプラーク形成単位を減少させることができる。
【００８３】
要するに、３つの試験方法：リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ、ＴＣＩＤ５０およびＰＦＵを介して、結果は、Ｅ０２が、ＲＤ細胞のＥＶ７１臨床分離株感染を阻害することができ：ＲＤ細胞においてＥＶ７１複製を阻害するＥＣ５０は６．９３μＭであり；ＲＤ細胞においてＴＣＩＤ５０を減少させるＥＣ５０は４．７μＭであり；ＰＦＵを減少させるＥＣ５０は２．６μＭであることを示す。
【００８４】
（実施例２）Ｅ０２は、ＲＤ細胞において、ＥＶ７１マウス適応株感染を阻害する（インビトロ試験）。
【００８５】
１．Ｅ０２は、ＲＤ細胞において、ＥＶ７１  Ｍ．Ａ．Ｖ．のＴＣＩＤ５０を減少させる。
異なるＥ０２濃度において、１０倍段階希釈でのＥＶ７１  Ｍ．Ａ．Ｖ．を用いてＲＤ細胞に感染させた。３〜４日間培養した後、ＣＰＥを光学顕微鏡下で観察し、クリスタルバイオレットで染色して５０％組織培養感染量を計算した。具体的なステップは、実施例１の対応するＴＣＩＤ５０を試験するステップと同様である。
【００８６】
結果は、ＲＤ細胞においてＥＶ７１  Ｍ．Ａ．Ｖ．のＴＣＩＤ５０を減少させるＥ０２のＥＣ５０は８．０７μＭであることを示す。図４参照。したがって、Ｅ０２は、ＲＤ細胞において、ＥＶ７１  Ｍ．Ａ．Ｖ．のＴＣＩＤ５０を減少させる。
【００８７】
２．Ｅ０２は、ＲＤ細胞において、ＥＶ７１  Ｍ．Ａ．Ｖ．のＰＦＵを減少させる。
【００８８】
異なるＥ０２濃度において、ＥＶ７１  Ｍ．Ａ．Ｖ．を用いて、１２ウェルプレート中で培養されたＲＤ細胞に感染させた。５〜７日間培養した後、染色し、プラーク形成単位を計算した。詳細の手順は、実施例１の対応するＰＦＵ試験方法と同じであった。
【００８９】
ＲＤ細胞において、ＥＶ７１  Ｍ．Ａ．Ｖ．のＰＦＵを減少させるＥ０２のＥＣ５０は２．０μＭである。図５参照。したがって、Ｅ０２は、ＲＤ細胞において、ＥＶ７１  Ｍ．Ａ．Ｖ．のＰＦＵを減少させる。
【００９０】
要するに、ＴＣＩＤ５０およびＰＦＵ試験は、Ｅ０２が、ＥＶ７１マウス適応株に起因するＲＤ細胞での感染を、それぞれ８．０７μＭおよび２．０μＭのＥＣ５０で阻害することができることを示す。
【００９１】
（実施例３）Ｅ０２は、ＲＤ細胞において、コクサッキーウイルスＡ１６（ＣＶＡ１６）感染を阻害する（インビトロ試験）。
異なるＥ０２濃度において、１０倍段階希釈でのコクサッキーウイルスＡ１６を用いて、ＲＤ細胞に感染させた。２日間培養した後、ＣＰＥを光学顕微鏡下で観察し、クリスタルバイオレットで染色して５０％組織培養感染量を計算した。具体的な手順は、実施例１のＴＣＩＤ５０試験方法と同じであった。
【００９２】
結果は、２５μＭのＥ０２が、ＲＤ細胞において、１×１０９のＴＣＩＤ５０／ｍｌ〜１×１０４のＴＣＩＤ５０／ｍｌのＣＶＡ１６の力価の減少を引き起こしたことを示す。図６参照。したがって、Ｅ０２は、ＲＤ細胞において、ＣＶＡ１６のＴＣＩＤ５０を減少させる。
【００９３】
上記実施例１〜３の試験結果は、Ｅ０２が、ＲＤ細胞のＥＶ７１およびＣＶＡ１６感染をインビトロで阻害することができることを示す。ＥＶ７１臨床株を阻害するＥ０２のＥＣ５０は、６．９３μＭ未満である。１０μＭのＥ０２は、ＲＤ細胞の、Ｅ０２臨床株およびマウス適応株の感染を完全に阻害することができ、ＲＤ細胞において、ＣＶＡ１６のＴＣＩＤ５０の減少を生じさせる。
【００９４】
（実施例４）Ｅ０２は、ＩＣＲ新生マウスにおいて、ＥＶ７１感染を阻害する。
【００９５】
ＥＶ７１臨床分離株（ＥＶ７１  ＦＹ  ５７３）を用いて３日齢の新生ＩＣＲマウスを感染させて、Ｅ０２がインビボでＥＶ７１を阻害する有効性を試験した。試験マウスを３つの群：薬剤群、感染群、およびプラセボ群に分けた。マウスが２日齢になったときに、薬剤群に、５０μｌのＥ０２を５０ｍｇ／ｋｇの投与量を腹腔内注射した。感染群およびプラセボ群は、５０μｌのＤＭＥＭで腹腔内注射した。３日齢のときに、５０ｍｇ／ｋｇの投与量でのＥ０２と、５×１０７のＴＣＩＤ５０の投与量でのＥＶ７１臨床分離株との混合物（５０μｌ）を、薬剤群に腹腔内注射した。感染群は、５×１０７のＴＣＩＤ５０ウイルス（２５μｌ）および２５μｌのＤＭＥＭの混合物を注射した。プラセボ群は、５０μｌのＤＭＥＭを注射した。
【００９６】
感染の５日後に、血液を回収し、血清を分離した。血清中のウイルスＲＮＡを抽出した（ウイルスＲＮＡ抽出キット、ＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡミニキット、カタログ番号５２９０６）。ＡＢＩ  ７９００ＨＴ  ３８４ウェルプレートＰＣＲシステムでのワンステップリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲキット（ＱＩＡＧＥＮ  ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮ  ＲＴ−ＰＣＲキット）を用いて、ＥＶ７１の５’ＵＴＲ遺伝子およびＧＡＰＤＨ遺伝子のコピーを検出した。反応系およびＰＣＲプログラムを、表３および表４に示す。
【００９７】
【表３】
2015510870.tif 000006
【００９８】
【表４】
2015510870.tif 000007
【００９９】
ＥＶ７１とＧＡＰＤＨの間のＲＮＡの負荷比率を計算した。感染群に関する平均値は１５．０であり、薬剤群に関する平均値は１．８である。図７参照。結果は、Ｅ０２が、マウス血清中のＥＶ７１ウイルス量を減少させることを示す。５０ｍｇ／ｋｇのＥ０２は、ＥＶ７１を注射したＩＣＲ新生マウスの血清中のウイルス量を減少させることができる。
【０１００】
（実施例５）Ｅ０２は、ＩＣＲ新生マウスにおいて、コクサッキーウイルスＡ１６感染を阻害する。
【０１０１】
１．マウスにおけるＣＶＡ１６組織分布
【０１０２】
５×１０６のＴＣＩＤ５０のＣＶＡ１６ウイルス（５０μｌ）を注射して、２匹の３日齢ＩＣＲ新生マウスに感染させた。感染の５日後、血清および組織（脳、骨髄、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、筋肉、脾臓、および胸腺）を回収した。血清中のウイルスＲＮＡを抽出した（ウイルスＲＮＡ抽出キット、ＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡミニキット、カタログ番号５２９０６）。組織サンプルをＲＮＡｓｔｏｒｅ保存溶液（Ｔｉａｎｇｅｎ，ＤＰ４０８−０２）中に入れ、−８０℃の冷凍庫内に保管した。組織ＲＮＡ抽出キット（ＲＮＡｐｒｅｐ  ｐｕｒｅ  ｔｏｔａｌ  ａｎｉｍａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ＲＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ）を用いて全組織ＲＮＡを抽出した。ＡＢＩ  ７９００ＨＴ  ３８４ウェルプレートＰＣＲシステムでのワンステップリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲキット（ＱＩＡＧＥＮ  ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮ  ＲＴ−ＰＣＲキット）を用いて、ＣＶＡ１６ウイルスゲノムおよびＧＡＰＤＨ遺伝子のコピーを検出した。プライマーは、ＥＶ７１の５’ＵＴＲプライマーと同じものである。反応系およびＰＣＲプログラムに関しては、表３および表４を参照。各組織および血清中の相対的ウイルス量については図８参照。明らかに、ＣＶＡ１６ウイルスは、脳、脊髄、筋肉、および血清中に主に検出された。
【０１０３】
２．Ｅ０２は、ＩＣＲ新生マウスにおいて、ＣＶＡ１６感染を阻害する。
【０１０４】
３日齢のＩＣＲ新生マウスにＣＶＡ１６を感染させて、Ｅ０２がインビボでＥＶ７１を阻害する有効性を試験した。試験マウスを３つの群：薬剤群、感染群、およびプラセボ群に分けた。マウスが２日齢になったときに、薬剤群に５０μｌのＥ０２を５０ｍｇ／ｋｇの投与量で腹腔内注射した。感染群およびプラセボ群に、５０μｌのＤＭＥＭを腹腔内注射した。３日齢のときに、薬剤群に、５０ｍｇ／ｋｇの投与量でのＥ０２、および、１×１０４のＴＣＩＤ５０（５０μｌ）の投与量でのＣＶＡ１６を、腹腔内注射した。感染群は、１×１０４のＴＣＩＤ５０（２５μｌ）の投与量でのＣＶＡ１６および２５μｌのＤＭＥＭの混合物を注射した。プラセボ群は、５０μｌのＤＭＥＭを腹腔内注射した。感染の６日後に、組織を得て血液を回収し、血清を分離した。組織および血清由来のＲＮＡを抽出し、ＣＶＡ１６ウイルスＲＮＡを決定した。処理手順は、「１」に前述したのと同じであった。
【０１０５】
結果については図９を参照。結果は、５０ｍｇ／ｋｇのＥ０２が、ＩＣＲ新生マウスの脳、骨髄、筋肉、および血清において、ＣＶＡ１６  ＲＮＡを有意に減少させたことを示す。
【０１０６】
実施例４〜５を要約すると、ＩＣＲ新生マウスでの試験は、５０ｍｇ／ｋｇのＥ０２が、ＥＶ７１およびコクサッキーウイルスＡ１６をインビボで阻害することができることを示す。
【０１０７】
（実施例６）Ｅ０２の安全性、耐容性、および毒性試験
【０１０８】
１．Ｅ０２はインビトロで細胞毒性を有さない。
【０１０９】
異なるＥ０２濃度でのＲＤ細胞に対する細胞毒性を、以下のようにＣｅｌｌｔｉｔｒ  Ｇｌｏ試薬を用いて測定した：
【０１１０】
（１）細胞シーディング：試験をする２４時間前に、ＲＤ細胞を、９６ウェル細胞培養プレートにウェルあたり５×１０４でシーディングした；
（２）Ｅ０２とともにインキュベートした細胞：培地を細胞培養プレートから除去し、２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを１８０μｌ添加し、それから、対応する濃度のＥ０２を含むＤＭＥＭ溶液を２０μｌ添加し、インキュベーションのために、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内に置いた；
（３）４６時間培養した後、細胞のＡＴＰレベルを、ＰＲＯＭＥＧＡ  Ｃｅｌｌｔｉｔｒ  Ｇｌｏ試薬を用いて試薬の説明書に従って測定した。
試験結果は、１×１０−６〜１×１０４μＭのＥ０２が、ＲＤ細胞に対して細胞毒性を有さなかったことを示す。図１０参照。
【０１１１】
２．Ｅ０２は、ＩＣＲ新生マウスに対して非毒性である。
【０１１２】
５０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇの投与量での５０μｌのＥ０２を毎日、または５０μｌのＤＭＥＭを４日間連続して、３日齢のＩＣＲマウスに腹腔内注射した。図１１に示すように、毒性は観察されなかった。
【０１１３】
（実施例７）Ｅ０２は、ＲＤ細胞の、ＥＶ７１臨床分離株ＳＨ−ＴＳおよびＳＨ−ＲＳ感染を阻害する。
【０１１４】
１．Ｅ０２は、ＲＤ細胞において、ＥＶ７１  ＳＨ−ＴＳおよびＳＨ−ＲＳの複製を阻害する。
異なるＥ０２濃度において、ＥＶ７１  ＳＨ−ＴＳまたはＳＨ−ＲＳを、０．１のＭＯＩでＲＤ細胞に感染させた。４６時間培養した後、培養上清中のウイルスＲＮＡを抽出した。相対的なＥＶ７１ウイルス量を定量ＲＴ−ＰＣＲにより決定した。定量ＲＴ−ＰＣＲの具体的手順については、実施例１参照。
【０１１５】
結果は、Ｅ０２が、ＲＤ細胞において、ＥＶ７１臨床分離株ＳＨ−ＴＳ  ＳＨ−ＲＳの複製を阻害することができることを示す。ＳＨ−ＴＳについては、７．１４μＭではＥＶ７１複製を１０倍減少させることができ、２５．３５μＭではＥＶ７１複製を１００倍減少させることができた。ＳＨ−ＲＳについては、図１５に示すように、４．４１μＭではＥＶ７１複製を１０倍減少させることができ、１６．２９μＭではＥＶ７１複製を１０００倍減少させることができる。
したがって、Ｅ０２は、ＲＤ細胞において、ＥＶ７１  ＳＨ−ＴＳおよびＳＨ−ＲＳの複製を阻害する。
【０１１６】
２．Ｅ０２は、ＲＤ細胞のＥＶ７１  ＳＨ−ＴＳおよびＳＨ−ＲＳ感染を阻害する（プラーク形成単位、ＰＦＵ）。
異なるＥ０２濃度において、ＥＶ７１  ＳＨ−ＴＳまたはＳＨ−ＲＳを、１２ウェルプレート中に培養されたＲＤ細胞に感染させた。５〜７日間培養した後、細胞を染色し、プラーク形成単位を計算した。実施例１の「３．Ｅ０２は、ＲＤ細胞において、ＥＶ７１のプラーク形成単位を減少させる。」において詳しく述べられているのと同じ手順である。
【０１１７】
結果は、図１６に示すように、ＲＤ細胞において、ＥＶ７１  ＳＨ−ＴＳ  ＰＦＵを減少させるＥ０２のＥＣ５０は２．２４μＭであり、ＳＨ−ＲＳについては３．４７μＭである。
【０１１８】
ウイルス複製およびＰＦＵ試験は、Ｅ０２が、ＲＤ細胞のＥＶ７１臨床分離株ＳＨ−ＴＳおよびＳＨ−ＲＳ感染を阻害することができることを示す。
【０１１９】
（実施例８）Ｅ０２は、Ｖｅｒｏ細胞のカンボジアＥＶ７１分離株ＳＥＰ−４感染を阻害する。
異なるＥ０２濃度において、ＥＶ７１  ＳＥＰ−４ウイルス株（カンボジアのパスツール研究所より提供された、カンボジア株）を、０．１のＭＯＩでＶｅｒｏ細胞に感染させた。４６時間培養した後、培養上清中のウイルスＲＮＡを抽出した。定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて相対的なＥＶ７１ウイルス量を決定した。具体的な手順については、実施例１を参照。
【０１２０】
結果は、Ｅ０２が、Ｖｅｒｏ細胞において、ＥＶ７１  ＳＥＰ−４複製を阻害することができることを示す。図１７に示すように、５．８９μＭのＥ０２は、ＥＶ７１複製を１０倍減少させることができ、１５．４９μＭでは、ＥＶ７１複製を１００倍減少させる。
【０１２１】
（実施例９）Ｅ０２は、アカゲザルにおいて、ＥＶ７１複製を阻害する。
【０１２２】
ＥＶ７１抗体に関して陰性検出された１０匹の成体アカゲザル（アカゲザル（Ｍａｃａｃａ）、由来：中国薬学科学院の薬学生物学研究所、実験動物使用ライセンス番号：ＳＹＸＫ（雲南）２０１０−０００９、認証ユニット：雲南省科学技術庁）を、２つの群、すなわち：５匹のコントロール群（年齢約４才、体重約５．３ｋｇ、生理食塩水を注射）、５匹の治療群（年齢約４．６才、体重約５．４４ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇのスラミンを注射）に無作為に分けた。多数回のスラミン静脈内注射（５０ｍｇ／ｋｇ）を用いた。最初のスラミン注射の１日後、４．５  ｌｇＣＣＩＤ５０ＥＶ７１  ＦＹ−２３（ＥＶ７１−ＦＹ２３株（中国薬学科学院の薬学生物学研究所のウイルス免疫研究室より提供）、バッチ番号：２０１２１００１、内容：７．５  ｌｇＣＣＩＤ５０／ｍｌ、保管状態：−８０℃）を感染させて、感染させた成体アカゲザル（>３才）においてウイルス量を毎日決定し、臨床症状および体温を観察して、ＥＶ７１感染の治療および予防に対する薬剤効果を分析した。具体的な実験手順は以下である：
【０１２３】
１）感染の１日前：バックグラウンドの全血および血清を回収し、体温を計測し、動物の外観、行動、精神状態、および局所的薬剤投与の異常などについて観察した。それから、薬剤を５０ｍｇ／ｋｇのスラミンまたは生理食塩水の投与量で静脈内投与した。
【０１２４】
２）感染の日（０日）：体温を計測し、動物の外観、行動、精神状態、および局所的薬剤投与の異常などについて観察した。４．５  ｌｇＣＣＩＤ５０ＥＶ７１  ＦＹ−２３で静脈内ウイルスチャレンジを行なった。
【０１２５】
３）感染期間中（１〜１４日）：体温を毎日計測し、動物の外観、行動、精神状態、および局所的薬剤投与の異常などについて観察し、ウイルス量を決定した。５０ｍｇ／ｋｇのスラミンまたは生理食塩水の投与量で、感染の１日後、３日後、５日後に、静脈内投与。
【０１２６】
４）感染後期（２１日および２８日）、体温を計測し、動物の外観、行動、精神状態、および局所的薬剤投与の異常などについて観察し、ウイルス量を決定した。
【０１２７】
血液ウイルス量試験
全血ＲＮＡ抽出：０．２ｍｌの血液を取得し、０．８ｍｌのＴＲＮｚｏｌ−Ａ＋を添加し、混合後、ウェルを室温で１０分間置き；０．２ｍｌのクロロホルムを添加し、蓋を閉め、１５秒間激しく振とうし、室温で５分間置き、１２５００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離し、０．４ｍｌの水相を別の新しいチューブに移し、等量のイソプロパノールを添加して混合し、室温で３０分間置き；１２５００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離し、上清を捨て、１ｍｌの７５％エタノールを添加して沈殿物を洗浄し、１２５００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離した。上清を捨て、室温で３０分間置き、ＲＮＡを乾燥させ、２０μｌのＲＮａｓｅフリーのｄｄＨ２Ｏを添加し、そしてＲＮＡを完全に溶解させた。以下の測定方法によりウイルス量を決定した：
【０１２８】
１）標準希釈：標準を作成（ＴａＫａＲａ  ＭｉｎｉＢＥＳＴウイルスＲＮＡ／ＤＮＡ抽出キットＶｅｒ３．０の説明書に従って行った）し、１０μｌの標準を採取して、１０倍段階希釈１０６、１０５、１０４、１０３、１０２、１０１、１００を行った。
【０１２９】
２）プライマー配列（Ｔａｑｍａｎプローブ法）：
上流プライマー（１０μＭ）：５’−ａｇｃｃｃａａａａｇａａｃｔｔｃａｃｔａ−３’；
下流プライマー（１０μＭ）：５’−ａｔｃｃａｇｔｃｇａｔｇｇｃｔｇｃｔｃａ−３’；
プローブ５−ＦＡＭ−ａｇｔｇａｔａｔｃｃｔｇｃａｇａｃｇｇｇｃａｃｃａｔｃｃ−ＴＡＭＲＡ−３．
【０１３０】
３）ＲＴ−ＰＣＲ反応溶液の調製（反応溶液は氷上で調製した）：
２×ワンステップＲＴ−ＰＣＲバッファーIII：１０μｌ
ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  ＴａｑＴＭ  ＨＳ（５Ｕ／μｌ）：０．４μｌ
Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ  酵素ミックスII：０．４μｌ
上流プライマー（１０μＭ）：０．４μｌ
下流プライマー（１０μＭ）：０．４μｌ
プローブ：０．８μｌ
ＲＯＸ参照色素II：０．４μｌ
全ＲＮＡ：２μｌ
ＲＮａｓｅフリーｄＨ２Ｏ：５．２μｌ
合計：２０μｌ
【０１３１】
４）リアルタイムワンステップＲＴ−ＰＣＲの実施
【０１３２】
１．ウイルス量試験
【０１３３】
１０匹の試験動物を、４．５  ｌｇＣＣＩＤ５０のＥＶ７１  ＦＹ２３でチャレンジした。コントロール群の動物は、ウイルスチャレンジ後６日目および７日目に一過的なウイルス量増加を示し（１〜１．５×１０３コピー／ｍｌに到達）、８日目以降、減少し始めた。ウイルスチャレンジ後９日目には、それらは一過的なウイルス量増加を示し（５．２５×１０２コピー／ｍｌに到達）、１０日目以降、減少し始めた。薬剤治療群の動物は、４日目、７日目、および１３日目に、それぞれ、わずかに上昇したウイルス量（平均１．５×１０１コピー／ｍｌ）を示した。図１８に示すように、ウイルス量は、コントロール群におけるウイルス量よりも有意に低かった。
【０１３４】
２．体温計測
【０１３５】
コントロール群の動物は、感染の１日後、ある程度の体温の上昇を示し、その後（感染の約３日後）、正常の範囲内に低下した。薬剤治療群の動物は、基本的に、図１９に示すように、正常の範囲内の体温を維持した。
【０１３６】
結論：本実験条件下では、４．５  ｌｇＣＣＩＤ５０  ＥＶ７１の静脈内感染後、コントロール群の成体アカゲザルは、特定の時間内でウイルス量のある程度の増加を示し、また体温のわずかな上昇も示した。対照的に、薬剤治療群の成体アカゲザルは、その特定の時間内で、わずかに上昇したウイルス量を示し、それはコントロール群のものよりも有意に低く、そして体温計測は有意な変化を示さなかった。
【０１３７】
（実施例１０）Ｅ０２ターゲットの同定
【０１３８】
１．Ｅ０２は、ＥＶ７１の細胞内侵入を阻害する。
【０１３９】
ＭＯＩ  １０  ＥＶ７１臨床分離株ＥＶ７１  ＦＹ５７３を、９６ウェルプレート中のＲＤ細胞に感染させた。感染前、感染中、および感染後の３つの期間において、３２μＭのＥ０２（ＤＭＥＭ中に溶解）またはＤＭＥＭを加え、ＥＶ７１複製を測定して、Ｅ０２がＥＶ７１感染を阻害する段階を決定した。ステップを以下に詳細に述べる：
【０１４０】
（１）細胞シーディング：感染の２４時間前に、ＲＤ細胞を、９６ウェル細胞培養プレートにウェルあたり５×１０４細胞でシーディングした。
【０１４１】
（２）薬剤とともに事前インキュベートした細胞：細胞培養培地を９６ウェルプレートから除去し、各ウェルに１００μｌのＤＭＥＭを添加し、それから、１１μｌの３２０μＭ  Ｅ０２溶液（薬剤処理した細胞群）または１１μｌのＤＭＥＭ（薬剤処理しなかった細胞群）を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。
【０１４２】
（３）薬剤とともに事前インキュベートしたウイルス：ウイルス保存溶液をＤＭＥＭで５×１０６のＴＣＩＤ５０／ｍｌに希釈し、９６ウェルプレートにウェルあたり１００μｌ分注し、そして、１１μｌの３２０μＭ  Ｅ０２溶液（Ｂ群およびＣ群）または１１μｌのＤＭＥＭ（Ａ群およびＦ群）を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。
【０１４３】
（４）感染：細胞およびウイルスを１時間インキュベートした後、薬剤を細胞培養プレートから捨てた。薬剤（Ｂ群およびＣ群）またはＤＭＥＭ（Ａ群およびＦ群）とともに事前インキュベートしたウイルスを１１１μｌ、細胞培養プレートに移した。１００μｌのウイルス溶液をＤ群およびＥ群に移した後、１１μｌの３２０μＭ  Ｅ０２を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。
【０１４４】
（５）細胞のウイルス感染の１時間後に、ウイルスと薬剤の混合物を細胞培養プレートから捨てた。細胞を、５０μｌのＤＭＥＭで２回洗浄した。ウェルあたり１８０μｌの２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ、２０μｌの３２０μＭ  Ｅ０２溶液（Ｂ群、Ｅ群、およびＦ群）または、２０μｌのＤＭＥＭ（Ａ群、Ｃ群、およびＤ群）を添加した。インキュベーションのために、細胞培養プレートを３７℃の５％二酸化炭素インキュベーター内に置いた。
【０１４５】
（６）ウイルス回収およびＲＮＡ抽出：感染の１８時間後に、１４０μｌの上清を深い９６穴プレートに移し、ウイルスＲＮＡ抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡミニキット、カタログ番号５２９０６）を用いてキットの標準的な操作手順に従って、ウイルスＲＮＡ抽出を行なった。
【０１４６】
（７）ウイルス量の決定：ＥＶ７１の５’ＵＴＲ遺伝子を、ＡＢＩ  ７９００ＨＴ  ３８４ウェルプレートＰＣＲシステムでのＡＢＩ  ＴａｑｍａｎワンステップＲＴ−ＰＣＲキット（ＡＢＩ  ｔａｑＭａｎ（登録商標）ワンステップＲＴ−ＰＣＲ、カタログ番号４３０９１６９）を用いて検出した。反応系およびＰＣＲプログラムについては、表１および表２参照。
【０１４７】
（８）ＰＣＲ検量線を用いて、ＰＣＲのＣＴ値をウイルス量に変換した（検量線は、１０倍段階希釈で、規定された力価でのウイルスから抽出されたＲＮＡに対するＲＴ−ＰＣＲを行なうことにより決定されたＣＴ値により得られた）。
【０１４８】
高いＭＯＩでの細胞の感染は、ほとんどの細胞を、同期的に感染させた。１８時間のインキュベーションは、ウイルスを１回のみ複製させた。感染状態は、ウイルスのライフサイクルのどの段階が、薬剤で誘導されるウイルス阻害に関与するかを決定し得る（Ｂｏｎａｖｉａ，Ｆｒａｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｄａｅｌｅｍａｎｓ，Ｐａｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。図１２に示すように、Ｅ０２添加時間アッセイの試験結果は、感染前（Ｂ、Ｃ）、および感染中（Ｄ、Ｅ）のＥ０２添加が、ＥＶ７１感染を阻害することができることを示し、一方で、感染後のＥ０２添加（Ｆ）は、ＥＶ７１感染を阻害することができないことを示した。薬剤が感染中に添加されたならば、感染後に薬剤が添加されようとなかろうと（ＤおよびＥ）、ウイルス複製に対する大きな効果はなかった。結果は、Ｅ０２が、ＥＶ７１の細胞内侵入を阻害することにより、ＥＶ７１感染を阻害することを示す。
【０１４９】
２．Ｐ２Ｘ受容体アンタゴニストは、ＥＶ７１感染を阻害することができる。
【０１５０】
Ｅ０２は、センシング受容体Ｐ２Ｘに対するアンタゴニストであり、Ｐ２Ｘ１、Ｐ２Ｘ２、Ｐ２Ｘ３、およびＰ２Ｘ５サブタイプ受容体を阻害することができ（Ｋｈａｋｈ，Ｂｕｒｎｓｔｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；．Ｂｕｒｎｓｔｏｃｋ，２００４；Ｃｏｄｄｏｕ，Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、すなわち、Ｐ２Ｘ１、Ｐ２Ｘ２、Ｐ２Ｘ３、およびＰ２Ｘ５サブタイプ受容体のアンタゴニストである。Ｐ２Ｘは、ＡＴＰ依存性イオンチャネルファミリータンパク質のメンバーであり、細胞膜上に発現され、通常、細胞外ドメイン、２つの膜貫通ドメインおよび２つの細胞内ドメインにより形成される同種または異種の三量体である。Ｐ２Ｘファミリーは、７つのサブタイプを含む。細胞外ＡＴＰを引き金にして、Ｐ２Ｘイオンチャネルが開き、カルシウムの流入、細胞内カルシウムの蓄積を引き起こす。ＭＡＰＫ、ＰＫＣおよびカルモジュリンを介して、一連の下流シグナル伝達が活性化される（Ｅｒｂ，Ｌｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。Ｐ２Ｘ受容体は、高等動物の組織内に広く分布しており（Ｖａｌｅｒａ，Ｈｕｓｓｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）、ＣＮＳの様々な部位で発現し、神経シナプスが引き金となる感覚シグナル（例えば、痛覚、味覚、聴覚など）、平滑筋収縮、心血管系における血圧コントロール、および炎症性応答（Ｓｕｒｐｒｅｎａｎｔ  ａｎｄ  Ｎｏｒｔｈ，２００９）の伝達に関与する。
【０１５１】
中枢神経系のＥＶ７１感染は、急性弛緩麻痺、急性散在性脊髄炎（ａｃｕｔｅ  ｓｐｒｅａｄ  ｍｙｅｌｉｔｉｓ）、および急性横断性脊髄炎を引き起こす可能性があり、また、無菌性髄膜炎および脳炎を引き起こす場合もある。また、エンテロウイルス感染は、潜在的行動および記憶障害を引き起こす場合がある（Ｙａｎｇ，Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｒｈｏａｄｅｓ，Ｔａｂｏｒ−Ｇｏｄｗｉｎ，ｅｔ  ａｌ．２０１１）。ＥＶ７１は、ウイルス感染を有する患者において、ＣＮＳ炎症を誘導することにより、主に神経障害をもたらす。ＥＶ７１感染は、大脳皮質、脳幹、および脊髄の、全レベルでの炎症を引き起こす可能性がある。ＥＶ７１に感染した患者は、肺浮腫または肺出血で死亡することが多い。研究は、ＥＶ７１肺浮腫は神経性であることを示した（Ｓｏｌｏｍｏｎ，Ｌｅｗｔｈｗａｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。肺症候群で死亡したＥＶ７１の感染患者のうち、炎症は脊髄および脳においてのみ検出され、一方で、ウイルス粒子および炎症は、肺および心臓では検出されなかった（Ｗｅｎｇ，Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。分散を伴うＥＶ７１感染に起因する疾患の特徴およびＰ２Ｘの生理学的役割に関連して、本発明者らは、ＥＶ７１病理において、Ｐ２Ｘが重要な役割を果たすと考える。
【０１５２】
したがって、本実施態様では、本発明者らは、化学プローブ（公知のＰ２Ｘアンタゴニストまたはアゴニスト）を用いて、ＥＶ７１感染におけるＰ２Ｘ受容体の役割を決定した。
【０１５３】
１．ＰＰＡＤＳは、ＲＤ細胞のＥＶ７１感染を阻害する。
ＰＰＡＤＳは、Ｅ０２アナログであり（Ｋｈａｋｈ，Ｂｕｒｎｓｔｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；．Ｂｕｒｎｓｔｏｃｋ  ２００４；Ｃｏｄｄｏｕ，Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）、Ｅ０２の効果と同様のＰ２Ｘサブタイプに対する阻害効果を有する。ＲＤ細胞に、ＥＶ７１臨床分離株ＦＹ  ５７３を、異なるＰＰＡＤＳ濃度で感染させて、ＥＶ７１複製に対するＰＰＡＤＳの阻害効果を決定した。詳しい手順は、実施例１の「１」での手順と同様である。加えて、各濃度のＰＰＡＤＳにおける、ＲＤ細胞に対する細胞毒性を決定した。詳しい手順は、実施例６の「１」での手順と同様である。
【０１５４】
結果を図１３に示し、６４μＭ未満のＰＰＡＤＳ濃度は、細胞に対して細胞毒性がない。ＥＶ７１複製を阻害するＥＣ５０は１８．９μＭである。
【０１５５】
２．ＲＤ細胞でのＰ２Ｘ受容体発現
【０１５６】
全ＲＮＡをＲＤ細胞から抽出した。各Ｐ２ＸサブタイプｍＲＮＡを、ワンステップＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物の長さをゲル電気泳動により決定した。具体的な手順は以下である：
【０１５７】
（１）細胞の全ＲＮＡ抽出：２×１０６のＲＤ細胞を得て、ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙキットを用いて全ＲＮＡを抽出した。実験は、キットの説明書に従って行なった。産物を、５０μｌのヌクレアーゼフリーの水に溶解させた。
【０１５８】
（２）ＰＣＲ：各Ｐ２ＸサブタイプおよびＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを、ワンステップＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。反応系およびサイクルプログラムは、表５および表６に示すとおりである。
【０１５９】
（３）電気泳動：ＰＣＲ産物のサイズを、２％ゲル電気泳動により検出した。
【０１６０】
【表５】
2015510870.tif 000008
【０１６１】
【表６】
2015510870.tif 000009
【０１６２】
電気泳動の結果は、Ｐ２Ｘ７を除いて、他の６つのＰ２Ｘサブタイプ受容体が、ＲＤ細胞に発現されることを示す。結果を図１４に示す。
【０１６３】
３．Ｐ２Ｘ受容体アンタゴニストは、ＲＤ細胞のＥＶ７１感染を阻害する。
【０１６４】
ＥＶ７１複製に対する、各Ｐ２Ｘ受容体アンタゴニストおよびアゴニストの阻害効果を、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、および１００μＭで測定した。具体的な手順は、実施例１の「１」参照。感染後、細胞を３〜４日間インキュベートする必要があるが、クリスタルバイオレットで染色し、光学顕微鏡下で観察して、ＣＰＥ（細胞変性効果）が存在するか否か決定した。さらに、ＲＤ細胞に対する細胞毒性に関する、各濃度での化合物の効果を決定した。様々な濃度の化合物中で３〜４日間、ＲＤ細胞を培養した後、クリスタルバイオレットで染色し、光学顕微鏡で観察して、細胞層が損傷しているか否か観察した。健康細胞層を損傷させずに細胞を感染から防御することが可能な化合物は、ＲＤ細胞において、ＥＶ７１複製を阻害することができる。
【０１６５】
結果を表７および図２０に示す。Ｅ０２およびＰＰＡＤＳを除き、Ｐ２Ｘ受容体アンタゴニストｉｓｏ−ＰＰＡＤＳ、ＮＦ０２３、ＮＦ２７９、ＮＦ１５７、ＴＮＰ−ＡＴＰ、ＰＰＮＤＳ、およびエバンスブルーもまた、ＥＶ７１複製を阻害することができる。
【０１６６】
【表７】
2015510870.tif 000010
【０１６７】
表８に示すように、Ｐ２ＸおよびＥＶ７１感染に対する、これらの化合物の阻害効果の比較は、Ｐ２Ｘ受容体が、ＲＤ細胞のＥＶ７１感染において重要な役割を果たすことを示す。
【０１６８】
【表８】
2015510870.tif 000011
注記：アゴニスト：−：活性無し、＋：活性化濃度>１０μＭ、＋＋：活性化濃度１〜１０μＭ、＋＋＋：活性化濃度<１μＭ；
アンタゴニスト：−：活性無し、＋：阻害濃度>３００ｎＭ、＋＋：阻害濃度＝１０〜３００ｎＭ、＋＋＋：阻害濃度<１０ｎＭ．
【０１６９】
ＥＶ７１に対する、他のアンタゴニストおよびアゴニストの効果を、表９および図２１に示す。
【０１７０】
【表９】
2015510870.tif 000012
表では、「空欄」は、報告データがないことを示し、「無」は、ネガティブであることを示す。
アンタゴニストに関して：＋＋＋活性化濃度<１０ｎＭ、＋＋活性化濃度１０ｎＭ〜３００ｎＭ、＋活性化濃度>３００ｎＭ、−活性無し。
アゴニストに関して：＋＋＋活性化濃度<１μＭ、＋＋活性化濃度１〜１０μＭ、＋活性化濃度>１０μＭ。
【０１７１】
したがって、Ｐ２Ｘ１〜６サブタイプｍＲＮＡは、ＲＤ細胞で発現される。加えて、Ｐ２Ｘ受容体アンタゴニストの１つのグループは、感染されたＲＤ細胞において、ＥＶ７１複製を阻害することができる。Ｐ２Ｘシグナル伝達と、疾患を伴うＰ２Ｘ異常との間の関連性と組み合わせて、Ｐ２Ｘが、ＥＶ７１感染において重要な役割を果たすことが示唆される。ＥＶ７１とＰ２Ｘの役割と、ＥＶ７１感染に起因するＨＦＭＤ病理との間には、密接な関係がある。
【０１７２】
上記の実施例を要約すると、以下の結論を導き出すことができる：
（１）Ｐ２Ｘ受容体アンタゴニスト化合物Ｅ０２は、ＲＤ細胞のＥＶ７１感染を阻害することができる；
（２）化合物Ｅ０２は、コクサッキーウイルスＡ１６がＲＤ細胞に感染する能力を低下させることができる；
（３）化合物Ｅ０２は、ＩＣＲ新生マウスの血清中のＥＶ７１ウイルス量を減少させることができる；
（４）化合物Ｅ０２は、ＩＣＲ新生マウスの、脳、骨髄、筋肉、および血清中のＣＶＡ１６ウイルス量を減少させることができる；
（５）Ｅ０２は、アカゲザルにおけるＥＶ７１複製をインビボで阻害し、アカゲザルにおいて、ＥＶ７１に起因する体温上昇を阻害する；
（６）Ｐ２Ｘ１〜６受容体サブタイプのｍＲＮＡは、ＲＤ細胞中に検出することができる；
（７）多くのＰ２Ｘ受容体アンタゴニストは、ＲＤ細胞のＥＶ７１感染を阻害することができる。
【０１７３】
本発明で示される全ての文献は、あたかも各参考文献が参照により個々に援用されるかのように、本出願中に参照により援用される。本発明の前述の教示を読んだ後に、当業者が、本発明に対して様々な改良または変更を施し得ることもまた、理解されよう。これらの同等物は、本出願に添付された特許請求の範囲の範囲内に同様に入る。
［参考文献］
References
Bonavia，A.，M. Franti，et al. (2011). "Identification of broad-spectrum antiviral compounds and assessment of the druggability of their target for efficacy against respiratory syncytial virus (RSV)." Proceedings of the National Academy of Sciences 108(17): 6739-6744.
Burnstock，G. (2004). "Introduction: P2 Receptors." Current Topics in Medicinal Chemistry 4(8): 793-803.
Chong，J.-H.，G.-G. Zheng，et al. (2010). "Abnormal expression of P2X family receptors in Chinese pediatric acute leukemias." Biochemical and Biophysical Research Communications 391(1): 498-504.
Coddou，C.，Z. Yan，et al. (2011). "Activation and Regulation of Purinergic P2X Receptor Channels." Pharmacological Reviews 63(3): 641-683.
Daelemans，D.，R. Pauwels，et al. (2011). "A time-of-drug addition approach to target identification of antiviral compounds." Nat. Protocols 6(6): 925-933.
Erb，L.，Z. Liao，et al. (2006). "P2 receptors: intracellular signaling." Pflugers Archiv European Journal of Physiology 452(5): 552-562.
Gever，J. R.，R. Soto，et al. (2010). "AF-353，a novel，potent and orally bioavailable P2X3/P2X2/3 receptor antagonist." British Journal of Pharmacology 160(6): 1387-1398.
Han，J.，X.-J. Ma，et al. (2010). "Long persistence of EV71 specific nucleotides in respiratory and feces samples of the patients with Hand-Foot-Mouth Disease after recovery." BMC Infectious Diseases 10(1): 178.
Huang，C.-C.，C.-C. Liu，et al. (1999). "Neurologic Complications in Children with Enterovirus 71 Infection." New England Journal of Medicine 341(13): 936-942.
Khakh，B. S.，G. Burnstock，et al. (2001). "International Union of Pharmacology. XXIV. Current Status of the Nomenclature and Properties of P2X Receptors and Their Subunits." Pharmacological Reviews 53(1): 107-118.
Khakh，B. S.，W. R. Proctor，et al. (1999). "Allosteric Control of Gating and Kinetics at P2X4 Receptor Channels." The Journal of Neuroscience 19(17): 7289-7299.
Piqueur，M.，W. Verstrepen，et al. (2009). "Improvement of a real-time RT-PCR assay for the detection of enterovirus RNA." Virology Journal 6(1): 95.
Rhoades，R. E.，J. M. Tabor-Godwin，et al. (2011). "Enterovirus infections of the central nervous system." Virology 411(2): 288-305.
Solomon，T.，P. Lewthwaite，et al. (2010). "Virology，epidemiology，pathogenesis，and control of enterovirus 71." The Lancet Infectious Diseases 10(11): 778-790.
Surprenant，A. and R. A. North (2009). "Signaling at Purinergic P2X Receptors." Annual Review of Physiology 71(1): 333-359.
Valera，S.，N. Hussy，et al. (1994). "A new class of ligand-gated ion channel defined by P2X receptor for extracellular ATP." Nature 371(6497): 516-519.
Weng，K.-F.，L.-L. Chen，et al. (2010). "Neural pathogenesis of enterovirus 71 infection." Microbes and Infection 12(7): 505-510.
Yan，X.-F.，S. Gao，et al. "Epidemic characteristics of hand，foot，and mouth disease in Shanghai from 2009 to 2010: Enterovirus 71 subgenotype C4 as the primary causative agent and a high incidence of mixed infections with coxsackievirus A16." Scandinavian Journal of Infectious Diseases 0(0): 1-9.
Yang，F.，L. Ren，et al. (2009). "Enterovirus 71 Outbreak in the People’s Republic of China in 2008." Journal of Clinical Microbiology 47(7): 2351-2352.
Yang，Y.，H. Wang，et al. (2009). "Neuropathology in 2 cases of fatal enterovirus type 71 infection from a recent epidemic in the People’s Republic of China: a histopathologic，immunohistochemical，and reverse transcription polymerase chain reaction study." Human Pathology 40(9): 1288-1295.
Zhang，Y.，D. Wang，et al. (2010). "Molecular Evidence of Persistent Epidemic and Evolution of Subgenotype B1 Coxsackievirus A16-Associated Hand，Foot，and Mouth Disease in China." Journal of Clinical Microbiology 48(2): 619-622.
Zhu，Z.，S. Zhu，et al. (2010). "Retrospective seroepidemiology indicated that human enterovirus 71 and coxsackievirus A16 circulated wildly in central and southern China before large-scale outbreaks from 2008." Virology Journal 7(1): 300.
Chinese Ministry of Health (2010) Hand foot and mouth disease treatment guidelines (2010 edition.) 
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図２０−１】
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【図２１−２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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