(57)【要約】本発明は、タンパク質ＣＥＡＣＡＭ１の特異的エピトープを認識し、場合によりＣＥＡＣＡＭタンパク質ファミリーの他のサブタイプにも結合する、抗体ならびに少なくとも抗体の抗原結合部分を有する分子を提供する。開示する抗体および抗体フラグメントは、特異的ＣＤＲ配列を特徴とする。前記抗体および抗体フラグメントの製造法ならびに治療および診断への使用も提供する。【選択図】図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示す配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２に示す配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３に示す配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号４に示す配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５に示す配列を含む軽鎖ＣＤＲ２および配列番号６に示す配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、ならびにその類似体および誘導体を有する、ヒトＣＥＡＣＡＭ１を認識するモノクローナル抗体またはその抗体フラグメント。
【請求項２】
配列番号７に示す配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号８に示す配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号９に示す配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項３】
配列番号１３に示す配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４に示す配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号１５に示す配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項４】
配列番号１０に示す配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１に示す配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１２に示す配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項５】
配列番号１６に示す配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７に示す配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１８に示す配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項６】
配列番号１３、１４、１５、１６、１７および１８に示すＣＤＲ配列を有する、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項７】
配列番号７、８、９、１０、１１および１２に示すＣＤＲ配列を有する、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項８】
前記モノクローナル抗体の抗原結合部分と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントの類似体または誘導体。
【請求項９】
配列番号２６に示す配列を有する重鎖可変ドメイン配列、または前記重鎖配列と少なくとも９７％の配列同一性を有するその類似体もしくは誘導体を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項１０】
配列番号２８に示す配列を有する軽鎖可変ドメイン配列、または前記軽鎖配列と少なくとも９７％の配列同一性を有するその類似体もしくは誘導体を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項１１】
配列番号２６に示す配列を有する重鎖可変ドメインおよび配列番号２８に示す配列を有する軽鎖可変ドメイン、あるいは前記抗体またはフラグメント配列と少なくとも９７％の配列同一性を有するその類似体または誘導体を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項１２】
ｉ．マウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇＧ２ｂ、マウスＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３からなる群から選択されるフレームワーク配列と、
ｉｉ．配列番号１３、１４、１５、１６、１７および１８に示す配列を有する６つのＣＤＲ；または配列番号７、８、９、１０、１１および１２に示す配列を有する６つのＣＤＲ；ならびに前記ＣＤＲ配列と少なくとも９７％の配列同一性を有するその類似体および誘導体と
を含み、少なくとも約５×１０−７Ｍのアフィニティで少なくとも２種のＣＥＡＣＡＭサブタイプに結合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項１３】
少なくとも約１０−８ＭのアフィニティでＣＥＡＣＡＭ１に結合することができる、請求項１２に記載のモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項１４】
少なくとも約５×１０−７ＭのアフィニティでＣＥＡＣＡＭ３およびＣＥＡＣＡＭ５の少なくとも１つに結合することができる、請求項１３に記載のモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項１５】
キメラモノクローナル抗体である、請求項１２に記載のモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項１６】
ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２およびヒトＩｇＧ３からなる群から選択されるヒト由来定常領域を含む、請求項１５に記載のキメラモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項１７】
配列番号１３、１４、１５、１６、１７および１８に示す配列を有する６つのＣＤＲ；または配列番号７、８、９、１０、１１および１２に示す配列を有する６つのＣＤＲ；ならびに前記ＣＤＲ配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するその類似体および誘導体を含む、請求項１６に記載のキメラモノクローナル抗体またはそのフラグメントであって、少なくとも約１０−８ＭのアフィニティでＣＥＡＣＡＭ１に結合するモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項１８】
ヒトＩｇＧ１サブタイプの定常領域サブクラスを含む、請求項１７に記載のキメラモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項１９】
配列番号３０で示される重鎖配列を含む、請求項１７に記載のキメラモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項２０】
配列番号３１で示される軽鎖配列を含む、請求項１７に記載のキメラモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項２１】
配列番号３０で示される重鎖配列および配列番号３１で示される軽鎖配列を含む、請求項１７に記載のキメラモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項２２】
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２１３０として２０１１年９月２８日に寄託されたプラスミドに含有される重鎖および軽鎖のＤＮＡ配列から産生されたＣＥＡＣＡＭ１を認識するモノクローナル抗体。
【請求項２３】
配列番号７、８、９、１０、１１および１２で示される６つのＣＤＲ配列または配列番号１３、１４、１５、１６、１７および１８で示される６つのＣＤＲ配列を有するモノクローナル抗体が結合するＣＥＡＣＡＭ１分子上の同一エピトープに結合することができる、ＣＥＡＣＡＭ１を認識するモノクローナル抗体または少なくとも抗原結合部分を含むそのフラグメント。
【請求項２４】
それぞれ配列ＶＬＬＬＶＨＮＬＰＱＱＬＦ（配列番号３２）およびＰＮＡＳＬＬＩＱＮＶＴ（配列番号３３）を有するヒトＣＥＡＣＡＭ１の残基１７〜２９および６８〜７９中のエピトープと反応性である、請求項２３に記載のモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項２５】
モノクローナル抗体が結合するＣＥＡＣＡＭ１分子上のエピトープが、配列ＶＬＬＬＶＨＮＬＰＱＱＬＦ（配列番号３２）およびＰＮＡＳＬＬＩＱＮＶＴ（配列番号３３）中のアミノ酸残基を含むエピトープである、請求項２３に記載のモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項２６】
モノクローナル抗体が結合するＣＥＡＣＡＭ１分子上のエピトープが、配列ＶＬＬＬＶＨＮＬＰＱＱＬＦ（配列番号３２）の少なくとも４個のアミノ酸を含む、請求項２３に記載のモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項２７】
モノクローナル抗体が結合するＣＥＡＣＡＭ１分子上のエピトープが、配列ＶＬＬＬＶＨＮＬＰＱＱＬＦ（配列番号３２）およびＰＮＡＳＬＬＩ（配列番号３４）中のエピトープである、請求項２３に記載のモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項２８】
配列ＶＬＬＬＶＨＮＬＰＱＱＬＦ（配列番号３２）の少なくとも３個のアミノ酸および配列ＰＮＡＳＬＬＩＱＮＶＴ（配列番号３３）の少なくとも３個のアミノ酸を含む６〜２０個のアミノ酸の単離ペプチド配列、あるいは前記親配列と少なくとも８５％の相同性を有する類似体または誘導体。
【請求項２９】
配列ＶＬＬＬＶＨＮＬＰＱＱＬＦ（配列番号３２）の少なくとも６個のアミノ酸を含む、請求項２８に記載の単離ペプチド。
【請求項３０】
配列ＶＬＬＬＶＨＮＬＰＱＱＬＦ（配列番号３２）およびＰＮＡＳＬＬＩ（配列番号３４）のアミノ酸を含む、請求項２８に記載の単離ペプチド。
【請求項３１】
ＣＥＡＣＡＭ１を認識する抗体を産生するための請求項２８に記載の単離ペプチドの使用。
【請求項３２】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体または抗体フラグメントをコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項３３】
配列番号２５もしくは配列番号２７に示すＤＮＡ配列または前記配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するその類似体を含む、請求項３２に記載の単離ポリヌクレオチド配列。
【請求項３４】
請求項３２に記載の少なくとも１種の単離ポリヌクレオチド配列を含むプラスミド。
【請求項３５】
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２１３０として２０１１年９月２８日に寄託された、請求項３４に記載のプラスミド。
【請求項３６】
治療有効量の請求項１〜２７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはフラグメントと、薬学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
【請求項３７】
ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３またはＣＥＡＣＡＭ５の発現、活性化または機能に関連する疾患または障害を処置するための請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
前記疾患または障害が細胞増殖性疾患または障害である、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
前記細胞増殖性疾患または障害が、胃腸、結腸直腸（ＣＲＣ）、膵臓、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）、乳房、甲状腺、胃、卵巣および子宮からなる群から選択されるがんである、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
前記細胞増殖性疾患または障害が、黒色腫、膵がん、肺がんおよび骨髄腫からなる群から選択されるがんである、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
少なくとも１種の請求項１〜２７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体または抗体フラグメントと、任意の担体または賦形剤とを含む診断用組成物。
【請求項４２】
治療有効量の請求項３６に記載の医薬組成物を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、ＣＥＡＣＡＭの発現、活性化または機能に関連する疾患または障害を予防、弱化または処置する方法。
【請求項４３】
前記疾患または障害ががんである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記疾患または障害がウイルス感染症である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記医薬組成物に含有される前記単離抗体または抗体フラグメントが細胞傷害性部分に付着しており、前記疾患ががんである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
ＣＥＡＣＡＭ１発現リンパ球を前記対象に投与するステップをさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４７】
前記リンパ球がＴ細胞、ＮＫ細胞または腫瘍浸潤リンパ球を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ＣＥＡＣＡＭ発現リンパ球を請求項１〜２７のいずれか一項に記載の抗体または抗体フラグメントと接触させるステップを含む、免疫調節法。
【請求項４９】
ＣＥＡＣＡＭ発現腫瘍細胞を請求項１〜２７のいずれか一項に記載の抗体または抗体フラグメントと接触させ、それによってＣＥＡＣＡＭ発現腫瘍細胞の移動を阻害するステップを含む、ＣＥＡＣＡＭ発現腫瘍細胞の移動を阻害する方法。
【請求項５０】
ＣＥＡＣＡＭ１発現リンパ球を請求項１〜２７のいずれか一項に記載の抗体または抗体フラグメントと接触させ、それによってＣＥＡＣＡＭ１ホモタイプまたはヘテロタイプタンパク質−タンパク質相互作用を阻害するステップを含む、ＣＥＡＣＡＭ１ホモタイプまたはヘテロタイプタンパク質−タンパク質相互作用を阻害する方法。
【請求項５１】
有効量の請求項１〜２７のいずれか一項に記載の抗体または抗体フラグメントを含む組成物および抗新生物組成物を対象に投与するステップを含む、がんを有する対象の応答または生存の持続時間または進行を増加させる方法であって、前記抗新生物組成物は少なくとも１種の化学療法剤を含み、それによって前記抗体および前記抗新生物組成物の同時投与により生存の持続時間または進行が有効に増加する方法。
【請求項５２】
対象由来の生体試料を請求項４１に記載の診断用組成物と接触させるステップを含む、それを必要とする対象のがんを診断する方法であって、所定の閾値を超える複合体形成は対象のがんを示す方法。
【請求項５３】
ｉ．生体試料を請求項１〜２７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体または抗体フラグメントと共にインキュベートするステップと、
ｉｉ．検出可能プローブを使用して結合したＣＥＡＣＡＭを検出するステップと、
ｉｉｉ．（ｉｉ）の量を既知の量のＣＥＡＣＡＭを含有する基準試料から得た標準曲線と比較するステップと、
ｉｖ．標準曲線から前記生体試料中のＣＥＡＣＡＭの量を計算するステップと
ｖ．（ｉｖ）の量を正常なＣＥＡＣＡＭ量と比較するステップと
を含む、ＣＥＡＣＡＭ発現に関連する疾患または障害を診断する方法が提供される。
【請求項５４】
細胞増殖性もしくは血管新生関連疾患または障害あるいはウイルス感染症の診断または処置のための、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体または抗体フラグメントの使用。
【請求項５５】
ＣＥＡＣＡＭの発現または活性化に関連する障害または疾患を処置するための医薬品を調製するための、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体または抗体フラグメントの使用。
【請求項５６】
細胞増殖性もしくは血管新生関連疾患または障害あるいはウイルス感染症を診断するための診断用組成物を調製するための、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体または抗体フラグメントの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌胎児抗原関連細胞接着分子（ＣＥＡＣＡＭ）の発現、活性化または機能が関与する疾患に有用な治療用および診断用抗体に関する。詳細には、本発明は、特異的相補性決定領域（ＣＤＲ）およびＣＥＡＣＡＭ１を認識する他の抗体に対して改善した特性を有する抗体を提供する。
【背景技術】
【０００２】
膜貫通タンパク質である癌胎児抗原関連細胞接着分子１（ＣＥＡＣＡＭ１、胆汁糖タンパク質（ＢＧＰ）、ＣＤ６６ａおよびＣ−ＣＡＭ１としても知られる）は、免疫グロブリンスーパーファミリーにも属する癌胎児抗原ファミリー（ＣＥＡ）のメンバーである。ＣＥＡＣＡＭ１は、ＣＤ６６ａ（ＣＥＡＣＡＭ１）、ＣＤ６６ｅ（ＣＥＡＣＡＭ６）およびＣＤ６６ｅ（ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡ）タンパク質を含む他の既知のＣＥＡＣＡＭタンパク質と相互作用する。これは、上皮細胞から造血性起源のもの（例えば、免疫細胞）にまで及ぶ広範囲の細胞で発現している。
【０００３】
多くの異なる機能がＣＥＡＣＡＭ１タンパク質に属するものとされてきた。ＣＥＡＣＡＭ１タンパク質は、結腸、前立腺の一部の癌ならびに他の型のがんで過剰発現している。追加のデータにより、血管新生および転移におけるＣＥＡＣＡＭ１の中心的な関与が裏付けられている。ＣＥＡＣＡＭ１はまた、自然および適応免疫応答の調節における役割も有する。例えば、ＣＥＡＣＡＭ１は、ヒト腸上皮中に含まれる活性化Ｔ細胞にとっての阻害性受容体であることが示された（国際公開第９９／５２５５２号およびＭｏｒａｌｅｓら  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９、１６３、１３６３〜１３７０）。追加の報告により、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）と架橋したＴ細胞受容体または淋菌Ｏｐａタンパク質のいずれかによるＣＥＡＣＡＭ１会合により、Ｔ細胞活性化および増殖が阻害されることが示された。
【０００４】
黒色腫は、色素産生細胞（メラニン形成細胞）の悪性腫瘍であり、主として広範な転移のため、世界の皮膚がん関連死亡率の７５％の原因となっている。転移性黒色腫（ＭＭ）は、ほとんどの抗がんレジメンにごくわずかしか応答せず、ＭＭの患者の平均全生存期間平均は８．５か月である。ＣＥＡＣＡＭ１の過剰発現が不良な予後と相関し、転移性黒色腫の症例の多数で検出されているという証拠が存在する。ＣＥＡＣＡＭ１は、正常なメラニン形成細胞ではめったに発現していないが、黒色腫細胞では頻繁に見られる。原発性皮膚黒色腫病変でのＣＥＡＣＡＭ１発現は、予後不良の転移性疾患の発症を強く予測する。さらに、健常なドナーと比べて、ＣＥＡＣＡＭ１発現の増加が何人かの転移性黒色腫の患者に由来するＮＫ細胞で観察された。
【０００５】
ＣＥＡＣＡＭ１がウイルス感染症において重要な役割を有し得ることが、証拠により示されている。例えば、Ｍａｒｋｅｌら（Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ２００２、１１０、９４３〜９５３）は、ＣＭＶ感染患者の脱落膜から単離したリンパ球がＣＥＡＣＡＭ１タンパク質を増加したレベルで発現していることを証明した。脱落膜リンパ球でのＣＥＡＣＡＭ１発現増加は、局所免疫応答を減少させ、主に活性化脱落膜リンパ球による認識および排除を回避するためのウイルスにより開発された別の機構として作用し得る。子宮頸がんおよびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染上の前駆領域におけるＣＥＡＣＡＭ１のタンパク質発現パターンを研究したＡｌｂａｒｒａｎ−Ｓｏｍｏｚａら（Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００６、５４、１３９３）は、ＣＥＡＣＡＭ１免疫染色が、低悪性度扁平上皮内病変（ＳＩＬ）および正常な子宮頚部組織と比べて高度ＳＩＬで有意に増加していることを示した。著者らは、ＣＥＡＣＡＭ１発現上昇が高度ＳＩＬにおけるＨＰＶ  ＤＮＡの組み込みと関連し得ることならびにＣＥＡＣＡＭ１がＳＩＬおよび子宮頚がん進行の重要な生物学的マーカーとなり得ることを示唆した。要するに、この証拠は、ＣＥＡＣＡＭ１が種々のウイルス感染症で重要な役割を果たすことを示している。さらに、ＣＥＡＣＡＭ１過剰発現は、種々のウイルス感染症のマーカーとして役立ち得る。
【０００６】
国際公開第２００７／０６３４２４号および米国特許公開出願第２００７０１１０６６８号は、免疫系を制御する方法、特に、リンパ球活性の制御を含む特異的免疫応答を制御する方法を開示している。これらの方法は、ＣＥＡＣＡＭ１タンパク質機能の負と正の両方の調節を含む。
【０００７】
米国特許公開出願第２００７００７１７５８号は、例えば、ＣＥＡＣＡＭ１に特異的な免疫グロブリンを使用するなど、ＣＥＡＣＡＭ１タンパク質の活性を負に調節することにより、がんの処置において腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）療法の効果を高めるための方法および組成物を教示している。
【０００８】
米国特許公開出願第２００８０１０８１４０号は、自己免疫疾患および組織の移植を必要とする疾患の処置で防御免疫を生み出す特異的免疫応答を調節する方法を開示している。特に、この文献は、標的組織中のＣＥＡＣＡＭ１タンパク質の機能的濃度を増加させることにより、標的化様式で免疫応答を抑制することに関する。
【０００９】
米国特許公開出願第２００４００４７８５８号は、ＣＥＡＣＡＭ１を介してＴ細胞活性を調節することができる特異的抗体および免疫応答関連疾患（例えば、移植片対宿主病、自己免疫疾患、がん等）の処置へのその使用を開示している。
【００１０】
米国特許公開出願第２００２００２８２０３号、第２００５０１６９９２２号および第２００８０１０２０７１号は、胆汁糖タンパク質結合剤などの、Ｔ細胞阻害性受容体分子に結合し、Ｔ細胞活性（例えば、細胞傷害性および増殖）を調節する（すなわち、増強もしくは抑制する）組成物、および疾患（例えば、自己免疫疾患、免疫不全、がん等）の処置などのために前記組成物を使用する方法を開示している。
【００１１】
本発明者らの国際公開第２０１０／１２５５７１号は、特異的ハイブリドーマ細胞により産生されるマウスモノクローナル抗体を開示している。ｍＡｂは、ＣＥＡＣＡＭ１に高度に選択性であり、ＣＥＡＣＡＭファミリーの他のメンバーと交差反応しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ＣＥＡＣＡＭ１を認識する既知の抗体のいずれも、本発明のモノクローナル抗体の結合特異性の範囲を有さない。したがって、ＣＥＡＣＡＭ発現または活性化が関与する疾患に診断的および治療的に使用可能なＣＥＡＣＡＭタンパク質の特異的サブセットを認識する抗体を提供するという要求が満たされていない。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、ＣＥＡＣＡＭサブタイプの特異的セットを認識するモノクローナル抗体を開示する。有利なことに、本発明の抗体は、ＣＥＡＣＡＭ１ならびにＣＥＡＣＡＭ５およびＣＥＡＣＡＭ３から選択される少なくとも１種の追加のサブタイプへの結合を示す。本発明の抗体は、特有のＣＤＲ配列およびフレームワーク組み合わせを有すること、ならびにＣＥＡＣＡＭ１分子内の新たに同定されたエピトープに結合することを特徴とする。本発明のモノクローナル抗体の特有の特異性は、追加の型の悪性腫瘍およびウイルス感染症の処置および診断のための治療上の有用性を広げた。また、本発明は、前記抗体を同定および単離する方法、その製造法、ならびにその治療的および診断的使用を提供する。
【００１４】
本発明に係るモノクローナル抗体は、ＣＤＲの特異的組み合わせを有し、特有の特性ならびに既知の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体に対して改善した特異性および能力を有する。
【００１５】
一態様によれば、本発明は、配列番号１、２および３に示す配列を含む重鎖ＣＤＲと配列番号４、５および６に示す配列を含む軽鎖ＣＤＲ、ならびにその類似体および誘導体を含む、ＣＥＡＣＡＭ１を認識するモノクローナル抗体または少なくともその抗原結合部分を含むその抗体フラグメントを提供する。
【００１６】
一部の実施形態によれば、配列番号１に示す配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２に示す配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３に示す配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号４に示す配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５に示す配列を含む軽鎖ＣＤＲ２および配列番号６に示す配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、ならびにその類似体および誘導体を有する、ＣＥＡＣＡＭ１を認識するモノクローナル抗体または抗体フラグメントが提供される。
【００１７】
一部の実施形態によれば、配列番号７、８および９に示す配列を有する重鎖ＣＤＲを含む、ＣＥＡＣＡＭ１を認識するモノクローナル抗体または少なくとも抗原結合部分を含むそのフラグメントが提供される。
【００１８】
一部の実施形態によれば、配列番号１３、１４および１５に示す配列を有する重鎖ＣＤＲを含む、ＣＥＡＣＡＭ１を認識するモノクローナル抗体または少なくとも抗原結合部分を含むそのフラグメントが提供される。
【００１９】
一部の実施形態によれば、配列番号１０、１１および１２に示す配列を有する軽鎖ＣＤＲを含む、ＣＥＡＣＡＭ１を認識するモノクローナル抗体または少なくとも抗原結合部分を含むそのフラグメントが提供される。
【００２０】
一部の実施形態によれば、配列番号１６、１７および１８に示す配列を有する軽鎖ＣＤＲを含む、ＣＥＡＣＡＭ１を認識するモノクローナル抗体または少なくとも抗原結合部分を含むそのフラグメントが提供される。
【００２１】
他の実施形態によれば、配列番号１３、１４、１５、１６、１７および１８に示すＣＤＲ配列を有するモノクローナル抗体が提供される。
【００２２】
さらに他の実施形態によれば、配列番号７、８、９、１０、１１および１２に示すＣＤＲ配列を有するモノクローナル抗体が提供される。
【００２３】
参照配列の抗原結合部分と少なくとも９０％の配列同一性を有するモノクローナル抗体またはそのフラグメントも本発明の範囲内にある。
【００２４】
一部の実施形態によれば、参照配列の抗原結合部分と少なくとも９５％の配列同一性を有するモノクローナル抗体またはそのフラグメントの類似体および誘導体が提供される。特定の実施形態によれば、抗体は、配列番号２６：
QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNNLIEWVKQRPGQGLEWIGVINPGSGDTNYNEKFKGKATLTADKSSNTAYMQLSSLTSDDSAVYFCARGDYYGGFAVDYWGQGTSVTVSS
の配列番号２６に示す配列を有する重鎖可変ドメイン配列、または重鎖配列と少なくとも９７％の配列同一性を有するその類似体もしくは誘導体を含む。
【００２５】
さらに別の実施形態によれば、抗体は、
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRTSQDIGNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGKSLPRTFGGGTKLEIK
の配列番号２８に示す配列を有する軽鎖可変ドメイン配列、または軽鎖配列と少なくとも９７％の配列同一性を有するその類似体もしくは誘導体を含む。
【００２６】
特定の実施形態によれば、抗体またはそのフラグメントは、配列番号２６に示す配列を有する重鎖可変ドメインおよび配列番号２８に示す配列を有する軽鎖可変ドメイン、あるいは抗体またはフラグメント配列と少なくとも９７％の配列同一性を有するその類似体または誘導体を含む。
【００２７】
本発明は、ハイブリドーマ細胞または他の生物系から単離したモノクローナル抗体、ならびに組換え的または合成的に産生されたモノクローナル抗体を包含する。本発明に係るモノクローナル抗体は、限定するものではないが、マウス、ラットおよびヒトを含む、任意の哺乳動物種の定常領域を含有し得る。本発明に係るモノクローナル抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、異種抗体、および抗体の少なくとも抗原結合部分を含む抗体フラグメントを含む。具体的な実施形態によれば、抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｄ’、Ｆｖ、ｄＡｂ、単離ＣＤＲ領域、単鎖抗体、「ダイアボディ」および「線状抗体」からなる群から選択される。
【００２８】
一部の特定の実施形態によれば、本発明は、
ｉ．マウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇＧ２ｂ、マウスＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３からなる群から選択されるフレームワーク配列と、
ｉｉ．配列番号１３、１４、１５、１６、１７および１８に示す配列を有する６つのＣＤＲのセット；または配列番号７、８、９、１０、１１および１２に示す配列を有する６つのＣＤＲのセット；ならびに前記ＣＤＲ配列と少なくとも９７％の配列同一性を有するその類似体および誘導体と
を含むモノクローナル抗体または抗体フラグメントであって、
少なくとも約５×１０−７Ｍのアフィニティで少なくとも２種のＣＥＡＣＡＭサブタイプに結合するモノクローナル抗体または抗体フラグメントを提供する。
【００２９】
一部の実施形態によれば、モノクローナル抗体またはそのフラグメントは、少なくとも約５×１０−７Ｍのアフィニティで少なくとも２種のＣＥＡＣＡＭサブタイプに結合する。
【００３０】
他の実施形態によれば、モノクローナル抗体またはそのフラグメントは、少なくとも約１０−８ＭのアフィニティでＣＥＡＣＡＭ１に結合する。
【００３１】
一部の具体的な実施形態によれば、モノクローナル抗体はキメラモノクローナル抗体である。
【００３２】
一部の実施形態によれば、キメラ抗体はヒト由来定常領域を含む。
【００３３】
一部の実施形態によれば、キメラ抗体のヒト定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２およびヒトＩｇＧ３からなる群から選択される。
【００３４】
特定の実施形態によれば、配列番号１３、１４、１５、１６、１７および１８に示す配列を有する６つのＣＤＲ；または配列番号７、８、９、１０、１１および１２に示す配列を有する６つのＣＤＲ；ならびに前記ＣＤＲ配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するその類似体および誘導体と、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２およびヒトＩｇＧ３から選択される定常領域サブクラスとを含む、ＣＥＡＣＡＭ１を認識するキメラまたはヒト化モノクローナル抗体であって、少なくとも約５×１０−７Ｍのアフィニティで少なくとも２種のＣＥＡＣＡＭサブタイプに結合するモノクローナル抗体が提供される。
【００３５】
具体的な実施形態によれば、キメラもしくはヒト化モノクローナル抗体またはそのフラグメントは、ヒトＩｇＧ１サブタイプの定常領域サブクラスを含む。
【００３６】
別の特定の実施形態によれば、配列番号３０で示される重鎖配列を含むキメラモノクローナル抗体または少なくとも抗原結合部分を含むそのフラグメントが提供される。
【００３７】
さらに別の特定の実施形態によれば、配列番号３１で示される軽鎖配列を含むキメラモノクローナル抗体または少なくとも抗原結合部分を含むそのフラグメントが提供される。
【００３８】
さらに別の特定の実施形態によれば、配列番号３０で示される重鎖配列および配列番号３１で示される軽鎖配列を有するキメラモノクローナル抗体または少なくとも抗原結合部分を含むそのフラグメントが提供される。
【００３９】
特定の実施形態によれば、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２１３０として２０１１年９月２８日に寄託されたプラスミドに含有される重鎖および軽鎖のＤＮＡ配列から産生されたＣＥＡＣＡＭ１を認識するモノクローナル抗体が提供される。
【００４０】
本発明のモノクローナル抗体は、一部の実施形態によれば、２種以上のＣＥＡＣＡＭサブタイプへの特異的結合を示す。一部の実施形態によれば、モノクローナル抗体は、少なくとも２種の異なるＣＥＡＣＡＭサブタイプに結合する。一部の具体的な実施形態によれば、モノクローナル抗体は、ＣＥＡＣＡＭ１ならびにＣＥＡＣＡＭ３およびＣＥＡＣＡＭ５の少なくとも１つに結合する。特定の実施形態によれば、モノクローナル抗体は、ＣＥＡＣＡＭ１およびＣＥＡＣＡＭ５に結合する。別の特定の実施形態によれば、モノクローナル抗体は、ＣＥＡＣＡＭ１およびＣＥＡＣＡＭ３に結合する。さらに他の実施形態によれば、本発明に係るモノクローナル抗体は、ＣＥＡＣＡＭサブタイプ１、３および５に結合する。
【００４１】
特定の実施形態によれば、本発明に係るモノクローナル抗体は、ＣＥＡＣＡＭ４およびＣＥＡＣＡＭ６に結合しない。
【００４２】
さらに別の態様によれば、本発明は、配列番号２６または配列番号３０で示される重鎖配列と配列番号２８または配列番号３１で示される軽鎖配列とを有するＣＥＡＣＡＭ１に対するモノクローナル抗体が結合するＣＥＡＣＡＭ１分子上の同一エピトープに結合することができる、ＣＥＡＣＡＭ１を認識するモノクローナル抗体または少なくとも抗原結合部分を含むそのフラグメントを提供する。
【００４３】
一部の実施形態によれば、モノクローナル抗体は、それぞれ配列ＶＬＬＬＶＨＮＬＰＱＱＬＦ（配列番号３２）およびＰＮＡＳＬＬＩＱＮＶＴ（配列番号３３）を有するヒトＣＥＡＣＡＭ１の残基１７〜２９および６８〜７９中のエピトープと反応性である。
【００４４】
一部の実施形態によれば、モノクローナル抗体が結合するＣＥＡＣＡＭ１分子上のエピトープは、配列ＶＬＬＬＶＨＮＬＰＱＱＬＦ（配列番号３２）およびＰＮＡＳＬＬＩＱＮＶＴ（配列番号３３）中のアミノ酸残基を含むエピトープである。
【００４５】
他の実施形態によれば、本発明に係るモノクローナル抗体は、配列ＶＬＬＬＶＨＮＬＰＱＱＬＦ（配列番号３２）の少なくとも４個のアミノ酸を含むエピトープに結合する。
【００４６】
さらに他の実施形態によれば、本発明に係るモノクローナル抗体は、配列ＶＬＬＬＶＨＮＬＰＱＱＬＦ（配列番号３２）およびＰＮＡＳＬＬＩ（配列番号３４）中のエピトープに結合する。
【００４７】
一部の実施形態によれば、モノクローナル抗体またはそのフラグメントは、配列番号７、８、９、１０、１１および１２で示される６つのＣＤＲ配列を有する抗体が結合するのと同じエピトープに結合する。
【００４８】
さらに他の実施形態によれば、モノクローナル抗体またはそのフラグメントは、配列番号１３、１４、１５，１６、１７および１８を有する抗体が結合するのと同じエピトープに結合する。
【００４９】
特定の実施形態によれば、モノクローナル抗体またはそのフラグメントは、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２１３０として２０１１年９月２８日に寄託されたＤＮＡ配列から産生された抗体が結合する同一エピトープに結合する。
【００５０】
本発明は、さらに別の態様によれば、配列ＶＬＬＬＶＨＮＬＰＱＱＬＦ（配列番号３２）の少なくとも３個のアミノ酸および配列ＰＮＡＳＬＬＩＱＮＶＴ（配列番号３３）の少なくとも３個のアミノ酸を含む６〜２０個のアミノ酸の単離ペプチド配列を提供する。親配列と少なくとも８５％、９０％、９５％または９８％の相同性を有する、前記ペプチドの類似体および誘導体も本発明の範囲内にある。
【００５１】
一部の実施形態によれば、単離ペプチドは、配列ＶＬＬＬＶＨＮＬＰＱＱＬＦ（配列番号３２）の少なくとも６個のアミノ酸を含む。
【００５２】
さらに他の実施形態によれば、単離ペプチドは、配列ＶＬＬＬＶＨＮＬＰＱＱＬＦ（配列番号３２）およびＰＮＡＳＬＬＩ（配列番号３４）のアミノ酸を含む。
【００５３】
モノクローナルまたはポリクローナル抗体を産生するための単離ペプチドの使用、ならびに診断または処置へのその使用も本発明の範囲内にある。
【００５４】
ＣＥＡＣＡＭ１に対するアフィニティおよび特異性を有する、本発明に係る抗体または抗体フラグメントをコードする核酸分子も本発明の範囲内にある。
【００５５】
この態様によれば、ＣＥＡＣＡＭ１を認識する抗体またはその抗体フラグメントをコードする単離ポリヌクレオチド配列も開示される。
【００５６】
一部の実施形態によれば、単離ポリヌクレオチド配列は、配列番号２５に示すＤＮＡ配列または前記ＤＮＡ配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するその類似体を含む。他の実施形態によれば、単離ポリヌクレオチド配列は、配列番号２７に示すＤＮＡ配列または前記ＤＮＡ配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するその類似体を含む。
【００５７】
本発明に係るモノクローナル抗体またはそのフラグメントをコートする少なくとも１種のポリヌクレオチド配列を含むプラスミド、ならびにこれらのプラスミドを含む宿主細胞も開示される。
【００５８】
特定の実施形態によれば、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２１３０として２０１１年９月２８日に寄託された配列番号２５および２７で示されるポリヌクレオチド配列を含むプラスミドが開示される。
【００５９】
別の態様では、本発明は、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３またはＣＥＡＣＡＭ５の発現、活性化または機能に関連する疾患または障害を予防、弱化または処置するのに有用な医薬組成物に関する。本発明に係る医薬組成物は、治療有効量の、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３またはＣＥＡＣＡＭ５を認識するモノクローナル抗体または少なくとも抗原結合部分を含むその抗体フラグメントと、薬学的に許容可能な担体とを含む。
【００６０】
一部の実施形態によれば、医薬組成物は、少なくとも１０−８ｋＤの結合アフィニティでＣＥＡＣＡＭ１に結合することができるモノクローナル抗体を含む。
【００６１】
追加の実施形態によれば、医薬組成物は、少なくとも約１０−８ｋＤのアフィニティでＣＥＡＣＡＭ１に結合するならびに少なくとも約５×１０−７ＭのアフィニティでＣＥＡＣＡＭ３およびＣＥＡＣＡＭ５の少なくとも１つに結合することができるモノクローナル抗体を含む。
【００６２】
特定の実施形態によれば、医薬組成物は、少なくとも約５×１０−７ＭのアフィニティでＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３およびＣＥＡＣＡＭ５に結合することができるモノクローナル抗体を含む。
【００６３】
特定の実施形態によれば、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３および／またはＣＥＡＣＡＭ５の発現、活性化または機能に関連する疾患または障害は、細胞増殖性疾患または障害である。一部の実施形態によれば、細胞増殖性疾患または障害はがんである。
【００６４】
一部の実施形態によれば、ＣＥＡＣＡＭ５の過剰発現に関連するがんは、胃腸、結腸直腸（ＣＲＣ）、膵臓、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬ）、乳房、甲状腺、胃、卵巣および子宮からなる群から選択される。
【００６５】
具体的な実施形態によれば、ＣＥＡＣＡＭ１の過剰発現に関連するがんは、黒色腫、膵がん、全ての型の肺がんおよび骨髄腫である。
【００６６】
本発明に係る医薬組成物は、単独処置として、または任意の他の治療剤を用いた処置に加えて投与され得る。具体的な実施形態によれば、本発明に係る抗体は、少なくとも１種の抗がん剤と併せて処置レジメンの一部としてそれを必要とする対象に投与される。本発明に係る医薬組成物は、他の薬剤と共にまたは別々に投与され得る。
【００６７】
別の態様では、本発明は、対象のＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３およびＣＥＡＣＡＭ５からなる群から選択される少なくとも１種のＣＥＡＣＡＭサブタイプを検出するのに有用な診断用組成物を提供する。本発明に係る診断用組成物は、治療有効量の、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３もしくはＣＥＡＣＡＭ５に対する少なくとも約５×１０−７Ｍのアフィニティを有するモノクローナル抗体、または少なくとも抗原結合部分を含むそのフラグメントと、任意の担体または賦形剤とを含む。
【００６８】
さらに別の態様では、本発明は、治療有効量のＣＥＡＣＡＭに対する抗体と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、ＣＥＡＣＡＭの発現、活性化または機能に関連する疾患または障害を予防、弱化または処置する方法に関する。
【００６９】
一部の実施形態によれば、疾患または障害は細胞増殖性疾患または障害である。特定の実施形態によれば、細胞増殖性疾患または障害はがんである。具体的な実施形態によれば、モノクローナル抗体またはそのフラグメントは、ＣＥＡＣＡＭ１に対する少なくとも約１０−８Ｍのアフィニティを有し、がんは黒色腫である。
【００７０】
他の実施形態によれば、モノクローナル抗体またはそのフラグメントは、ＣＥＡＣＡＭ５に対する少なくとも約５×１０−７Ｍのアフィニティを有し、がんは、胃腸、結腸直腸（ＣＲＣ）、膵臓、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬ）、乳房、甲状腺、胃、卵巣および子宮からなる群から選択される。
【００７１】
追加の実施形態によれば、ＣＥＡＣＡＭ１の過剰発現に関連する疾患または障害はウイルス感染症である。
【００７２】
一部の実施形態によれば、ウイルス感染症は、限定するものではないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス、肝炎ウイルスおよびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）などのＤＮＡウイルス；ならびに限定するものではないが、インフルエンザウイルスおよびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）などのＲＮＡウイルスからなる群から選択されるウイルスにより引き起こされる。
【００７３】
本発明の態様によれば、ＣＥＡＣＡＭ発現リンパ球を抗体または抗体フラグメントと接触させるステップを含む、免疫調節法が提供される。
【００７４】
本発明の態様によれば、ＣＥＡＣＡＭ発現腫瘍細胞を抗体または抗体フラグメントと接触させ、それによってＣＥＡＣＡＭ発現腫瘍細胞の移動を阻害するステップを含む、ＣＥＡＣＡＭ発現腫瘍細胞の移動を阻害する方法が提供される。
【００７５】
一部の実施形態によれば、腫瘍細胞は、黒色腫腫瘍細胞を含む。
【００７６】
本発明の態様によれば、治療有効量の抗体または抗体フラグメントを、それを必要とする対象に投与し、それによって対象のがんを処置するステップを含む、がんを処置する方法が提供される。
【００７７】
本発明の態様によれば、ＣＥＡＣＡＭ１発現リンパ球を抗体または抗体フラグメントと接触させ、それによってＣＥＡＣＡＭ１ホモタイプまたはヘテロタイプタンパク質−タンパク質相互作用を阻害するステップを含む、ＣＥＡＣＡＭホモタイプまたはヘテロタイプタンパク質−タンパク質相互作用を阻害する方法が提供される。
【００７８】
一部の実施形態によれば、単離抗体または抗体フラグメントは、細胞傷害性部分に付着している。
【００７９】
一部の実施形態によれば、細胞傷害性部分は、細胞毒、ケモカイン、化学療法組成物、アポトーシス促進性物質（ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）、インターフェロン、放射性部分、またはこれらの組み合わせを含む。
【００８０】
一部の実施形態によれば、抗体または抗体フラグメントは、同定可能部分に付着している。
【００８１】
一部の実施形態によれば、がんの細胞は、非罹患細胞に比べてＣＥＡＣＡＭ１の過剰発現を特徴とする。
【００８２】
一部の実施形態によれば、がんを処置する方法は、リンパ球を対象に投与するステップをさらに含む。
【００８３】
一部の実施形態によれば、リンパ球は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む。一部の実施形態によれば、リンパ球は、ＣＥＡＣＡＭ１を発現している。他の実施形態によれば、ＣＥＡＣＡＭ１発現リンパ球は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。他の実施形態によれば、ＣＥＡＣＡＭ１発現リンパ球は、細胞傷害性Ｔ細胞である。
【００８４】
本発明の抗体を使用して免疫エフェクター細胞（ＣＥＡＣＡＭ発現リンパ球、例えば、腫瘍浸潤細胞、Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞）および標的細胞（例えば、がん細胞などのＣＥＡＣＡＭ発現病理細胞）のいずれかまたは両方のＣＥＡＣＡＭを遮断することができる。この治療にとっての候補であるがん細胞の例としては、限定するものではないが、黒色腫、肺、甲状腺、乳房、結腸、前立腺、肝臓、膀胱、腎臓、子宮頸部、膵臓、白血病、リンパ腫、骨髄、卵巣、子宮、肉腫、胆汁、または子宮内膜細胞が挙げられる。
【００８５】
本発明のさらなる態様によれば、ＣＥＡＣＡＭ発現腫瘍細胞を免疫調節に感受性にする方法が提供される。この方法は、ＣＥＡＣＡＭ発現腫瘍細胞（例えば、黒色腫、肺、甲状腺、乳房、結腸、前立腺、肝臓、膀胱、腎臓、子宮頸部、膵臓、白血病、リンパ腫、骨髄、卵巣、子宮、肉腫、胆汁、または子宮内膜細胞）を上記抗体または抗体フラグメントと接触させ、それによってＣＥＡＣＡＭ発現腫瘍細胞を免疫調節に感受性にするステップを含む。
【００８６】
上記に加えてまたは上記に代えて、本発明は、ＣＥＡＣＡＭ１発現リンパ球を本明細書に記載する抗体または抗体フラグメントと接触させることによる、免疫調節（例えば、ＣＥＡＣＡＭ１ホモタイプまたはヘテロタイプタンパク質−タンパク質相互作用を阻害する）方法も想起する。
【００８７】
本教示の治療または予防法は、生体外で（例えば、Ｔ細胞系養子免疫療法で使用する）または生体内で行うことができる。
【００８８】
本発明の一部の実施形態の抗体は、上記免疫調節活性から独立した抗がん活性を有することができる。
【００８９】
別の態様では、本発明は、有効量の、ＣＥＡＣＡＭを認識する抗体を含む組成物および抗新生物組成物を対象に投与するステップを含む、がんを有する対象の応答または生存の持続時間または進行を増加させる方法であって、前記抗新生物組成物は少なくとも１種の化学療法剤を含み、それによって抗体および抗新生物組成物の同時投与により応答または生存の持続時間または進行が有効に増加する方法を提供する。
【００９０】
さらに、本発明は、有効量の、ＣＥＡＣＡＭに対する抗体を含む組成物および抗新生物組成物を対象に投与し、それによってＣＥＡＣＡＭに対する抗体および抗新生物組成物の同時投与により対象の群で応答発生率が有効に増加するステップを含む、がんを有する対象を処置する方法を提供する。
【００９１】
治療的用途とは別に、本発明の抗体を診断的用途に使用することもできる。
【００９２】
したがって、さらなる態様によれば、対象由来の生体試料（生体内、試験管内または生体外）を本明細書に記載する抗体または抗体フラグメントと接触させるステップを含む、それを必要とする対象のがんを診断する方法であって、所定の閾値を超える複合体形成は対象のがんを示す方法が提供される。一部の実施形態によれば、がんの細胞は、非罹患細胞に比べてＣＥＡＣＡＭの過剰発現を特徴とする。
【００９３】
特定の実施形態によれば、診断されるがんは、黒色腫、膵がん、肺がんおよび骨髄腫からなる群から選択される。
【００９４】
別の特定の実施形態によれば、測定されるタンパク質はＣＥＡＣＡＭ５であり、診断されるがんは胃腸、結腸直腸（ＣＲＣ）、膵臓、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬ）、乳房、甲状腺、胃、卵巣および子宮からなる群から選択される。
【００９５】
上記のように、本発明の方法は、免疫複合体を形成するのに十分な条件下で行われる。前記条件（例えば、適当な濃度、緩衝液、温度、反応時間）ならびに前記条件を最適化する方法は、当業者に知られており、例は本明細書に開示される。本明細書で使用する場合、「免疫複合体」という句は、本発明の抗体およびＣＥＡＣＡＭを含む複合体を指す。本発明の免疫複合体の存在またはレベルを決定することは直接的であっても抗体に付着し得る同定可能（検出可能）部分を検出することによってもよい。
【００９６】
試験細胞（例えば、それを必要とする対象の細胞）中の免疫複合体のレベルを所定の閾値と比較する。本発明の抗体を使用して血清可溶性ＣＥＡＣＡＭの量を測定することもできることが認識されるであろう。とにかく、閾値は既知の基準レベルおよび／または対照細胞もしくは血清中のレベルに基づいて決定され得る。対照細胞は、対照の健常対象（例えば、がんを患っていない対象）または疾患発症前もしくは処置後の同じ対象から得ることができる。本発明の一部の実施形態によれば、対照対象は、同じ種、例えば、好ましくはそれを必要とする対象と同じ年齢、体重、性別等に一致したヒトである。
【００９７】
診断を容易にするために、上記教示を、限定するものではないが、画像法、分子検査および外科生検を含む、当業界で公知の他のがん診断法と組み合わせることができる。
【００９８】
本発明の別の態様によれば、ＣＥＡＣＡＭの存在を検出または定量化する方法が提供される。したがって、また、本発明は、ＣＥＡＣＡＭを認識する抗体を使用して、ＣＥＡＣＡＭ発現に関連する状態を診断する方法も提供する。本発明に係る診断法は、試験管内または生体外で、具体的な実施形態に従って行うことができる。本発明に係る抗体を使用してスクリーニング法を構成することもできる。例えば、当業界で公知の標準的方法により、モノクローナルおよびポリクローナル抗体を使用して、ポリペプチドの分泌または細胞結合レベルを測定するために、ＥＬＩＳＡアッセイを構築することができる。
【００９９】
一実施形態によれば、
ｉ．生体試料をＣＥＡＣＡＭに対する抗体または少なくとも抗原結合部分を含むその抗体フラグメントと共にインキュベートするステップと、
ｉｉ．検出可能プローブを使用して結合したＣＥＡＣＡＭを検出するステップと、
ｉｉｉ．（ｉｉ）の量を既知の量のＣＥＡＣＡＭを含有する基準試料から得た標準曲線と比較するステップと、
ｉｖ．標準曲線から試料中のＣＥＡＣＡＭの量を計算するステップと
を含む、ＣＥＡＣＡＭの存在を検出または定量化する方法が提供される。
【０１００】
別の実施形態によれば、
ｉ.生体試料をＣＥＡＣＡＭに対する抗体または少なくとも抗原結合部分を含むその抗体フラグメントと共にインキュベートするステップと、
ｉｉ．検出可能プローブを使用して結合したＣＥＡＣＡＭを検出するステップと、
ｉｉｉ．（ｉｉ）の量を既知の量のＣＥＡＣＡＭを含有する基準試料から得た標準曲線と比較するステップと、
ｉｖ．標準曲線から試料中のＣＥＡＣＡＭの量を計算するステップと、
ｖ．（ｉｖ）の量を正常なＣＥＡＣＡＭ量と比較するステップと
を含む、ＣＥＡＣＡＭ発現に関連する疾患または障害を診断する方法が提供される。
【０１０１】
一部の実施形態によれば、生体試料は、哺乳動物対象の体液である。特定の実施形態によれば、哺乳動物対象はヒトである。
【０１０２】
本発明の抗体を、患者のＣＥＡＣＡＭレベルを評価し、処置の有効性を予測するためのスクリーニングアッセイに使用することもできる。本発明の抗体を用いたスクリーニングアッセイにより、ＣＥＡＣＡＭのレベルを決定すること、それゆえ処置成績の予測および適当な処置レジメンの計画が可能となり得る。
【０１０３】
他の実施形態によれば、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３およびＣＥＡＣＡＭ５の少なくとも１つのレベルを評価する。特定の実施形態によれば、ＣＥＡＣＡＭ１のレベルを評価する。
【０１０４】
本発明の一部の実施形態によれば、抗体または抗体フラグメントは同定可能部分に付着している。
【０１０５】
抗体またはそのフラグメントと同定可能部分の前記付着は、当業界で公知の方法による化学的接合または組換えＤＮＡ技術により行うことができることが認識されるであろう。
【０１０６】
同定可能部分は、結合対の追加のメンバーと直接可視化される標識の相互作用を通して同定可能な結合対のメンバーおよびであり得る。一例では、結合対のメンバーは、対応する標識抗体により同定される抗原である。一例では、標識は蛍光タンパク質または比色反応を引き起こす酵素である。
【０１０７】
本発明の別の態様は、細胞増殖性もしくは血管新生関連疾患または障害あるいはウイルス感染症の診断または処置のための、ＣＥＡＣＡＭに対する抗体またはその抗体フラグメントの使用に関する。
【０１０８】
一実施形態によれば、細胞増殖性疾患は黒色腫である。
【０１０９】
他の実施形態によれば、細胞増殖性疾患または障害は、胃腸、結腸直腸（ＣＲＣ）、膵臓、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬ）、乳房、甲状腺、胃、卵巣および子宮からなる群から選択されるがんである。
【０１１０】
一実施形態によれば、本発明は、限定するものではないが、がんおよびウイルス感染症を含む発現または活性化に関連する障害または疾患を処置するための医薬品を調製するための、ＣＥＡＣＡＭに対する抗体または少なくとも抗原結合部分を含むその抗体フラグメントの使用を提供する。
【０１１１】
また、本発明は、細胞増殖性もしくは血管新生関連疾患または障害あるいはウイルス感染症を診断するための診断用組成物を製造するための、ＣＥＡＣＡＭに対する抗体またはその抗体フラグメントの使用に関する。
【０１１２】
ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３およびＣＥＡＣＡＭ５抗体についての既知のまたは従来技術で想起される本質的に全ての使用を、これらのタンパク質に対する改善したアフィニティならびにＣＥＡＣＡＭ１保有細胞に対する優れた阻害および間接的免疫調節効果を有することが示されている本発明の抗体により達成することができる。これらの使用には、診断、予防および治療技術が含まれる。
【０１１３】
本発明のさらなる実施形態およびその利用可能性の完全な範囲は、以下に示す詳細な説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】キメラ抗体ＣＭ１０の軽鎖および重鎖を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ像を示す図である。
【図２】精製ｈＣＥＡＣＡＭ１へのＣＭ１０の特異的結合曲線を示す図である。
【図３】フローサイトメトリー分析により検出される、ＣＥＡＣＡＭ１へのＣＭ１０の特異的結合を示す図である。
【図４】ＣＭ１０が細胞間のＣＥＡＣＡＭ１−ＣＥＡＣＡＭ１相互作用を遮断することを確認する図である。種々のＣＭ１０濃度の存在下でインキュベートしたエフェクター細胞（ＣＥＡＣＡＭ１を発現しているＢＷ／２２１細胞）のマウスＩＬ−２分泌をＥＬＩＳＡにより測定した。
【図５】ＣＥＡＣＡＭ１−陽性黒色腫細胞の特異的死滅活性のＣＭ１０増強を示す図である。
【図６】ＣＭ１０が腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の死滅活性を刺激することを示す図である。
【図７】ＣＭ１０がＣＥＡＣＡＭ１陽性黒色腫細胞系に対するＮＫ細胞の死滅活性を増強することを示す図である。
【図８】ＣＭ１０免疫調節効果が生体内で腫瘍成長を阻害することを示す図である。矢印は投与の時間を示す（ＣＭ１０  円、ＴＩＬ  三角形、ＣＭ１０およびＴＩＬ  白抜き正方形）。
【図９】ＣＭ１０免疫調節作用様式の概略図である。
【図１０】抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体により決定される腫瘍中のＣＥＡＣＡＭ１結合強度レベルを表す図である。
【図１１】１細胞当たりに結合しているＣＭ１０分子の定量化を示す図である。
【図１２】ＣＭ１０がＰＢＭＣ増殖に効果を有さないことを確認する図である。結果は、各処理について３人のドナーからの平均増殖速度を表す。
【図１３−１】ＣＭ１０とＣＥＡＣＡＭファミリータンパク質間の結合のＦＡＣＳ分析を示す図である。ＣＥＡＣＡＭ１、および５を７２１．２２１細胞で発現させた。
【図１３−２】ＣＭ１０とＣＥＡＣＡＭファミリータンパク質間の結合のＦＡＣＳ分析を示す図である。ＣＥＡＣＡＭ６および８を７２１．２２１細胞で発現させた。
【図１３−３】ＣＭ１０とＣＥＡＣＡＭファミリータンパク質間の結合のＦＡＣＳ分析を示す図である。ＣＥＡＣＡＭ３および４をＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現させた。
【図１４】黒色腫細胞系での補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイの結果を表す図である。
【図１５】ＣＭ１０がＣＥＡＣＡＭ１およびＨＬＡ−Ａ２陽性黒色腫細胞の存在下でＴＩＬのグランザイムＢ分泌を増強することを示す図である。
【図１６】ＣＭ１０がＣＥＡＣＡＭ１−ＣＥＡＣＡＭ５相互作用を遮断することを示す図である。
【図１７】ＨＬＡ拘束性Ｔ細胞死滅のＣＭ１０増強を表す図である。
【図１８】ＣＭ１０の免疫調節活性が生体内で腫瘍成長を阻害することを示す図である。
【図１９】ＣＭ１０がＣＥＡＣＡＭ１陽性膵がん細胞系ＣＯＬＯ−３５７およびＢＸＰＣ３に対するＮＫ細胞の死滅活性を増強することを示す図である。
【図２０−１】ＣＭ１０がＣＥＡＣＡＭ１陽性膵がん細胞系の存在下でＮＫ細胞のグランザイムＢ分泌を増強することを示す図である。
【図２０−２】ＣＭ１０がＣＥＡＣＡＭ１陽性膵がん細胞系の存在下でＮＫ細胞のグランザイムＢ分泌を増強することを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１１５】
本発明は、改善した特有の特異性、選択性、アフィニティおよび／または活性を有するＣＤＲ配列の特異的セットを含むＣＥＡＣＡＭ１を認識する抗体を提供する。
【０１１６】
本発明に係る抗体は、他の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体よりも高いアフィニティでＣＥＡＣＡＭ１に結合し、全ての抗ＣＥＡＣＡＭ抗体がそうであるわけではないが、ポリクローナル抗ＣＥＡＣＡＭ抗体よりも効率的にＣＥＡＣＡＭ１の機能を遮断する。さらに、本発明に係る抗体は、がん細胞、特に黒色腫細胞に対して有効である。この抗体は、黒色腫細胞をリンパ球により感受性にし、生体内で黒色腫細胞成長速度を阻害し、抗体を生体内で養子Ｔ細胞移入と組み合わせるとその効果が増強する。
【０１１７】
本発明に係る抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の生体内抗黒色腫効果は、直接的抗腫瘍効果ならびに細胞を反応性リンパ球により感受性にする免疫調節効果の組み合わせであることがここで初めて示されている。
【０１１８】
本発明に係る抗体、フラグメントおよび誘導体は、診断、免疫調節およびがん処置のための有効なツールとして使用することができる。
【０１１９】
抗体は、免疫エフェクター細胞およびＣＥＡＣＡＭ１を発現している標的細胞の共インキュベーション、ならびにＩＬ−２分泌の評価、ならびに試験管内致死アッセイにより決定されるように、ＣＥＡＣＡＭ１同種アフィニティ相互作用を阻害する。
【０１２０】
本発明の抗体は、特異的標的細胞の存在下で、ＨＬＡ拘束性Ｔ細胞死滅を増強するＣＭ１０を増強し、エフェクターＮＫおよびＴ細胞からのグランザイムＢ（セリンプロテアーゼが標的細胞の媒介アポトーシスに関与する）分泌を増強することが示されており、したがって、抗体による標的細胞の観察される死滅の増強を可能にする。この抗体はまた、用量依存的様式でＣＥＡＣＡＭ１とＣＥＡＣＡＭ５の間の結合を阻害するので、これを使用して高レベルのＣＥＡＣＡＭ５を発現し、免疫細胞を抑制するためにＣＥＡＣＡＭ１−ＣＥＡＣＡＭ５軸を利用している悪性腫瘍を処置することができる。
【０１２１】
さらに、本明細書では、本発明に係る抗体が黒色腫細胞浸潤を阻害するのに有効であることが示されている。さらに、単独でまたは反応性リンパ球と組み合わせての本発明に係る抗体の生体内投与が、黒色腫腫瘍の成長を阻害するのに有効であることが示された。養子ヒトＴ細胞移入とモノクローナル抗体注入の組み合わせにより、アイソタイプ対照群と比べて有意な相乗作用が示され、異種移植片成長が強力に阻害された。
【０１２２】
本発明のさらなる態様によれば、上記特異的ＣＤＲセグメントを有する抗原認識ドメインを含む本明細書に定義する抗体と同じ結合特異性および選択性を有する単離抗体または抗体フラグメントが提供される。この態様によれば、単離抗体または抗体フラグメントは、その特異的ＣＤＲセグメント配列により上記抗体が結合するのと同じＣＥＡＣＡＭ１タンパク質のエピトープ決定基に結合することができる。
【０１２３】
本発明に係るモノクローナル抗体が結合するエピトープの提案される配列が、追加のモノクローナル抗体の産生させるために使用可能なこのエピトープ由来の提案される単離ペプチドと共に、同時に本明細書に開示される。
【０１２４】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、腫瘍細胞を選択的に標的化し、いったん結合したら種々の応答を誘発するよう設計することができる。これらの薬剤は、腫瘍細胞増殖を遮断するか、または免疫系を活性化するなどの異なる方法で腫瘍細胞を破壊することができる。本発明に係るキメラモノクローナル抗体を、ＣＥＡＣＡＭ１タンパク質および他のＣＥＡＣＡＭサブタイプタンパク質に特異的に結合し、その種々の機能を無効にする、および腫瘍細胞の特異的死を誘発するよう設計した。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、本発明に係るモノクローナル抗体は、がん性細胞に対する免疫系の活性化を通しても作用することが示唆される。
【０１２５】
臨床的および生物学的証拠の両方が、標的化免疫療法を開発するための有望な標的としてＣＥＡＣＡＭ１に脚光を当てている。ＣＥＡＣＡＭ１は、正常なメラニン形成細胞には見られないが、転移性黒色腫標本の大部分で新たな発現（ｎｅｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を受け、広範に発現している。ＣＥＡＣＡＭ１がＮＫ細胞およびＴ細胞のエフェクター機能を阻害することにより黒色腫細胞を保護することが以前に機構的に示されている。
【０１２６】
ＣＭ１０が高いアフィニティでヒトＣＥＡＣＡＭ１に結合するキメラモノクローナル抗体であることが本明細書で初めて示されている。試験管内で、ＣＭ１０は用量依存的様式でＣＥＡＣＡＭ１同種アフィニティ相互作用を効率的に遮断し、Ｔ細胞およびＮＫ細胞によるＣＥＡＣＡＭ１陽性黒色腫細胞死滅を改善する。さらに、ＣＭ１０は、黒色腫反応性ヒトＴリンパ球（腫瘍浸潤リンパ球、ＴＩＬ）と共に全身投与すると、黒色腫異種移植片の生体内成長を有意に阻害した。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、このことは、示唆された作用機構；活性化リンパ球による腫瘍細胞の免疫防御相互作用の抑止と一致する。
【０１２７】
いくつかの証拠により、ＣＥＡＣＡＭ１が結腸、前立腺、乳房、腎臓等を含む多種多様な上皮細胞で発現していることが報告された。ＩＨＣによる正常なおよび悪性の組織についてのＣＥＡＣＡＭ１発現プロファイルの幅広い調査が行われた。発現分析により、正常なヒト組織で試験した組織の大部分で染色がなかったのに対し、黒色腫細胞では強い染色が示された。それにもかかわらず、いくつかの臓器の限られた部位でいくらかの選択的染色が観察された。より定量的な方法を使用して、悪性のおよび正常な一次細胞に結合したＣＭ１０  ｍＡｂ分子の数を定量化すると、正常な細胞では極めて低いＣＭ１０分子が検出され、このことはＣＭ１０がほとんど患者の腫瘍細胞に結合することを示していると思われる。さらに、ＣＭ１０は、一次細胞増殖に効果を有さず、完全にまたはほとんど完全にＣＤＣもＡＤＣＣも誘発することができないことが示され、このことはヒト対象におけるこのモノクローナル抗体の潜在的安全性を示している。
【０１２８】
ＣＭ１０は免疫調節活性を有するので、考えられる免疫関連の副作用を評価する。ＰＢＭＣ活性化後、ＣＥＡＣＡＭ１を活性化リンパ球で上方制御する（Ｇｒａｙ−ＯｗｅｎおよびＢｌｕｍｂｅｒｇ  ２００６、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６、４３３〜４６）。生体外ヒトＰＢＭＣ増殖アッセイにより、ＣＭ１０がナイーブおよび活性化ＰＢＭＣ増殖応答に効果を有さないことが明らかになった。
【０１２９】
一般的阻害機構の抑止に対するＣＥＡＣＡＭ１遮断の主な利点は、腫瘍の近傍に対する予測される選択性、それゆえ他の一般的免疫毒性剤と比べて有害事象が少ないことである。
【０１３０】
本発明で示されるように、ＣＭ１０は、力強い活性および安全性プロファイルを示し、がん免疫療法のための有望な候補であり、これを戦略として使用して黒色腫および非小細胞肺がんなどの数種の悪性腫瘍における内因性免疫応答の抗腫瘍特性を選択的に増強することができる。
【０１３１】
追加のＣＥＡＣＡＭサブタイプへの結合により、抗体の治療プロファイルが増加するので、これを、ＣＥＡＣＡＭ１を広範には発現していないが、例えば、ＣＥＡＣＡＭ５を発現している他の型の悪性腫瘍の診断および処置に使用することができる。
【０１３２】
ＣＥＡＣＡＭ５は、胃腸、結腸直腸（ＣＲＣ）および膵がんの９０％、非小細胞肺がんの７０％、ならびに乳がんの５０％を含む、多くのヒト腫瘍の高い割合で過剰発現していることが分かっている。また、ＣＥＡＣＡＭ５は、甲状腺、胃、卵巣および子宮がんでも過剰発現している（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｇｒｕｎｅｒｔら  １９９１、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ａｎａｌ  ５、３４４〜６６）。ＣＥＡＣＡＭ５は、ＣＲＣの肝臓転移および結腸がんの術後監視のための臨床マーカーとして有用でさえある（Ｄｕｆｆｙ  ２００１、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ４７、６２４〜３０）。ＣＭ１０がＣＥＡＣＡＭ５に結合することができるという証拠は極めて重要であり、４〜５種の悪性腫瘍から１０種超までＣＭ１０により処置することができる可能な適応症を広げることができる。臨床試験に入った抗ＣＥＡＣＡＭ５剤には、種々の悪性腫瘍の診断目的と処置目的の両方のための放射性物質などの毒性物質と接合した抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体が含まれる。これらの毒性接合型でさえ安全性の課題を示さないように思われ、このことはＣＥＡＣＡＭ５が安全な標的であることを示し得る。
【０１３３】
マウスＩｇＧサブクラスのヒト対応物は、生物および機能活性の類似性に基づく。マウスＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂならびにヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、補体を固定し、タンパク質抗原に結合する能力を共有している（Ｈｕｓｓａｉｎら、１９９５、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７２６〜７３２）。マウスＩｇＧ１およびヒトＩｇＧ４は、肥満細胞への結合の特性のために類似しているとみなされる。ヒトＩｇＧ４は、補体を活性化しない唯一のヒトＩｇＧサブクラスであり、サブクラスＩｇＧ１および３は、補体を活性化するのに最も有効である。マウスについては、ＩｇＧ１と共に活性であるサブクラスはＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂであり、おそらくＩｇＧ３は不活性である（Ｃｌａｒｋ  ＭＲ．、Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７；６５：８８〜１１０）。
【０１３４】
ＣＥＡＣＡＭ１を認識する数種の既知のモノクローナル抗体は、サブタイプマウスＩｇＧ１のものである。マウスＩｇＧ１のヒト同等物はＩｇＧ４であるので、ヒトＩｇＧ４定常フレームワークを含むキメラ抗体を作成することが予想されるであろう。本発明の一部の実施形態によりキメラモノクローナル抗体がヒトＩｇＧ１定常フレームワークを含むことは予想外である。
【０１３５】
一態様によれば、本発明は、配列番号１、配列番号２および配列番号３からなる群から選択される配列を含む少なくとも１つの重鎖ＣＤＲと配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群から選択される配列を含む少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ、ならびにその類似体および誘導体を含む、ＣＥＡＣＡＭ１を認識するモノクローナル抗体または少なくともその抗原結合部分を含む抗体フラグメントを提供する。
【０１３６】
一部の実施形態によれば、参照配列の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントの類似体および誘導体が開示される。
【０１３７】
他の実施形態によれば、参照配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントの類似体および誘導体が開示される。
【０１３８】
さらに他の実施形態によれば、参照抗体のＣＤＲ配列と少なくとも９８％の配列同一性を有するモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントの類似体および誘導体が開示される。
【０１３９】
一実施形態によれば、抗体または抗体フラグメントは、配列番号１、配列番号２および配列番号３からなる群から選択される配列を含む少なくとも２つの重鎖ＣＤＲと配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群から選択される配列を含む少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ、ならびにモノクローナル抗体またはそのフラグメントの配列と少なくとも９７％の配列同一性を有するその類似体および誘導体を含む。
【０１４０】
他の実施形態によれば、抗体または抗体フラグメントは、配列番号１、配列番号２および配列番号３からなる群から選択される配列を含む少なくとも１つの重鎖ＣＤＲと配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群から選択される配列を含む少なくとも２つの軽鎖ＣＤＲ、ならびにモノクローナル抗体またはそのフラグメントの配列と少なくとも９７％の配列同一性を有するその類似体および誘導体を含む。
【０１４１】
さらに他の実施形態によれば、抗体または抗体フラグメントは、配列番号１、配列番号２および配列番号３からなる群から選択される配列を含む少なくとも２つの重鎖ＣＤＲと配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群から選択される配列を含む少なくとも２つの軽鎖ＣＤＲ、ならびにモノクローナル抗体またはそのフラグメントの配列と少なくとも９７％の配列同一性を有するその類似体および誘導体を含む。
【０１４２】
一部の実施形態によれば、抗体または抗体フラグメントは、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１からなる群から選択される配列に由来する少なくとも５個のアミノ酸の少なくとも１つの重鎖ＣＤＲと配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４からなる群から選択される配列に由来する少なくとも５個のアミノ酸の少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ、ならびにモノクローナル抗体またはそのフラグメントの配列と少なくとも９７％の配列同一性を有するその類似体および誘導体を含む。
【０１４３】
他の実施形態によれば、抗体またはそのフラグメントの抗体結合部位は、配列番号７、８、９、１３、１４および１５からなる群から選択される３つの重鎖ＣＤＲと配列番号１０、１１、１２、１６、１７、１８からなる群から選択される３つの軽鎖ＣＤＲ、ならびに抗体結合部位と少なくとも９７％の配列同一性を有するその類似体および誘導体からなる。
【０１４４】
さらに他の実施形態によれば、抗体結合部位は、配列番号１３、１４、１５、１６、１７および１８の６つのＣＤＲからなる。
【０１４５】
他の実施形態によれば、抗体結合部位は、配列番号７、８、９、１０、１１および１２の６つのＣＤＲからなる。
【０１４６】
本発明に係るＣＤＲ配列は、２つの異なるアルゴリズム法：ＩＭＧＴアルゴリズム（Ｌｅｆｒａｎｃら、１９９９、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２７、２０９〜２１２）；およびＫＡＢＡＴアルゴリズム（Ｗｕ  ＴＴおよびＫａｂａｔ  Ｅ．Ａ．、１９７０、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３２、２１１〜２５０）を使用して同定した。両方法により明らかになった配列を開示する。
【０１４７】
一部の実施形態によれば、本発明に係る抗体またはそのフラグメントの重鎖ＣＤＲ１は、ＮＮＬＩＥ（配列番号７）およびＧＹＡＦＴＮＮＬ（配列番号１３）から選択される。
【０１４８】
一部の実施形態によれば、本発明に係る抗体またはそのフラグメントの重鎖ＣＤＲ２は、ＩＮＰＧＳＧＤＴＶＩＮＰＧＳＧＤＴＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号８）およびＩＮＰＧＳＧＤＴ（配列番号１４）から選択される。
【０１４９】
一部の実施形態によれば、本発明に係る抗体またはそのフラグメントの重鎖ＣＤＲ３は、ＧＤＹＹＧＧＦＡＶＤＹ（配列番号９）およびＡＲＧＤＹＹＧＧＦＡＶＤＹ（配列番号１５）から選択される。
【０１５０】
一部の実施形態によれば、本発明に係る抗体またはそのフラグメントの軽鎖ＣＤＲ１は、ＱＤＩＧＮＹＲＴＳＱＤＩＧＮＹＬＮ（配列番号１０）およびＱＤＩＧＮＹ（配列番号１６）から選択される。
【０１５１】
一部の実施形態によれば、本発明に係る抗体またはそのフラグメントの軽鎖ＣＤＲ２は、YTSRLHS（配列番号１１）およびYTS（配列番号１７）から選択される。
【０１５２】
一部の実施形態によれば、本発明に係る抗体またはそのフラグメントの軽鎖ＣＤＲ３は、ＱＱＧＫＳＬＰ（配列番号１２）およびＱＱＧＫＳＬＰＲＴ（配列番号１８）から選択される。
【０１５３】
一部の実施形態によれば、重鎖ＣＤＲが配列番号７、８および９の配列からなる、ＣＥＡＣＡＭ１を認識するモノクローナル抗体または少なくとも抗原結合部分を含むそのフラグメントが提供される。
【０１５４】
一部の実施形態によれば、重鎖ＣＤＲが配列番号１３、１４および１５の配列からなる、ＣＥＡＣＡＭ１を認識するモノクローナル抗体または少なくとも抗原結合部分を含むそのフラグメントが提供される。
【０１５５】
一部の実施形態によれば、軽鎖ＣＤＲが配列番号１０、１１および１２の配列からなる、ＣＥＡＣＡＭ１を認識するモノクローナル抗体または少なくとも抗原結合部分を含むそのフラグメントが提供される。
【０１５６】
一部の実施形態によれば、軽鎖ＣＤＲが配列番号１６、１７および１８の配列からなる、ＣＥＡＣＡＭ１を認識するモノクローナル抗体または少なくとも抗原結合部分を含むそのフラグメントが提供される。
【０１５７】
具体的な実施形態によれば、抗体は、重鎖可変ドメイン配列を含む。
【０１５８】
具体的な実施形態によれば、抗体またはそのフラグメントは、配列番号２６からなる重鎖可変ドメイン配列および配列番号２８からなる軽鎖可変ドメイン、あるいは抗体またはフラグメント配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するその類似体または誘導体を含む。
【０１５９】
一部の特定の実施形態によれば、本発明は、ｉ．配列番号１３、１４、１５、１６、１７および１８とｉｉ．配列番号７、８、９、１０、１１および１２から選択される６つのＣＤＲのセット；ならびに前記ＣＤＲ配列と少なくとも９７％の配列同一性を有するその類似体および誘導体と、マウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇＧ２ｂ、マウスＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３から選択されるフレームワーク配列とを含むモノクローナル抗体または抗体フラグメントであって、少なくとも約５×１０−７Ｍのアフィニティで少なくとも２種のＣＥＡＣＡＭサブタイプに結合するモノクローナル抗体または抗体フラグメントを提供する。
【０１６０】
特定の実施形態によれば、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７および１８からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；ならびに前記ＣＤＲ配列と少なくとも９７％の配列同一性を有するその類似体および誘導体と、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２およびヒトＩｇＧ３から選択される定常領域配列とを含む、ＣＥＡＣＡＭ１を認識するキメラモノクローナル抗体であって、少なくとも約５×１０−７Ｍのアフィニティで少なくとも２種のＣＥＡＣＡＭサブタイプに結合するキメラモノクローナル抗体が提供される。
【０１６１】
特定の実施形態によれば、ｉ．配列番号１３、１４、１５、１６、１７および１８とｉｉ．配列番号７、８、９、１０、１１および１２から選択される６つのＣＤＲのセット；ならびに前記ＣＤＲ配列と少なくとも９７％の配列同一性を有するその類似体および誘導体と、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２およびヒトＩｇＧ３から選択される定常領域配列とを含む、ＣＥＡＣＡＭ１を認識するキメラまたはヒト化モノクローナル抗体であって少なくとも約５×１０−７Ｍのアフィニティで少なくとも２種のＣＥＡＣＡＭサブタイプに結合するモノクローナル抗体が提供される。
【０１６２】
さらに別の特定の実施形態によれば、配列番号３０による重鎖配列を含む、キメラモノクローナル抗体または少なくとも抗原結合部分を含むそのフラグメントが提供される。
【０１６３】
さらに別の特定の実施形態によれば、配列番号３１による軽鎖配列を含む、キメラモノクローナル抗体または少なくとも抗原結合部分を含むそのフラグメントが提供される。
【０１６４】
さらに別の特定の実施形態によれば、配列番号３０によるヒトＩｇＧ１重鎖配列および配列番号３１によるヒトＩｇＧ１軽鎖配列を含む、キメラモノクローナル抗体または少なくとも抗原結合部分を含むそのフラグメントが提供される。
【０１６５】
定義
「ＣＥＡＣＡＭ１」という用語は、ＣＥＡＣＡＭ１遺伝子のタンパク質産物、例えば、ＮＰ＿００１０２００８３．１、ＮＰ＿００１７０３．２を指すために使用される。ヒトでは、１１種の異なるＣＥＡＣＡＭ１スプライスバリアントが今までに検出されている。個々のＣＥＡＣＡＭ１アイソフォームは、細胞外免疫グロブリン様ドメインの数（例えば、４つの細胞外免疫グロブリン様ドメインを有するＣＥＡＣＡＭ１は、ＣＥＡＣＡＭ１−４として知られる）、膜固定および／またはその細胞質側末端の長さ（例えば、長い細胞質側末端を有するＣＥＡＣＡＭ１−４はＣＥＡＣＡＭ１−４Ｌとして知られ、短い細胞質側末端を有するＣＥＡＣＡＭ１−４はＣＥＡＣＡＭ１−４Ｓとして知られる）に関して異なる。ＣＥＡＣＡＭ１のＮ末端ドメインはシグナルペプチドの直後に始まり、その構造はＩｇＶ型とみなされる。例えば、ＣＥＡＣＡＭ１アノテーションＰ１３６８８では、Ｎ末端ＩｇＶ型ドメインは、アミノ酸３５から１４２までの１０８個のアミノ酸で構成されている。このドメインは、同種アフィニティ結合活性を担うものとして同定された（Ｗａｔｔら、２００１、Ｂｌｏｏｄ．９８、１４６９〜７９）。これらのスプライスバリアントを含む全てのバリアントが「ＣＥＡＣＡＭ１」という用語に含まれる。
【０１６６】
「抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体」、「ＣＥＡＣＡＭ１を認識する抗体」、「ＣＥＡＣＡＭ１に対する抗体」または「ＣＥＡＣＡＭ１に対する抗体」は、十分なアフィニティおよび特異性でＣＥＡＣＡＭ１タンパク質に結合する抗体である。典型的には、本教示による抗体は、約１０−８または１０−９Ｍの最小アフィニティでＣＥＡＣＡＭ１に結合することができる。本発明のモノクローナル抗体のいくつかは、約５×１０−７Ｍの最小アフィニティでＣＥＡＣＡＭ３、５および／または８に結合することができる。
【０１６７】
好ましくは、本発明の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体を、ＣＥＡＣＡＭ１発現または活性が関与する疾患または状態の標的化および妨害に診断または治療剤として使用することができる。
【０１６８】
「抗原」は、抗体形成を誘発し、抗体に結合され得る分子または分子の一部である。抗原は、１つまたは２つ以上のエピトープを有し得る。上記の特異的反応は、抗原が高度に選択的様式で、その対応する抗体と反応するが、他の抗原により誘起され得る他の抗体の多数とは反応しないことを示すものとされる。本発明に係る抗原は、ＣＥＡＣＡＭ１タンパク質またはそのフラグメントである。
【０１６９】
本発明に係る「抗原決定基」または「エピトープ」という用語は、特定の抗体と特異的に反応する抗原分子の領域を指す。エピトープ由来のペプチド配列を、当業界で公知の方法を適用して単独でまたは担体部分と併せて使用して、動物を免疫化する、および追加のポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を産生することができる。エピトープ由来の単離ペプチドを、抗体を検出するために診断法に、および前記抗体の阻害が必要な場合に治療剤として使用することができる。
【０１７０】
抗体または免疫グロブリンは、「Ｙ字型形状」のジスルフィド結合により互いに連結した２本の重鎖と、各軽鎖がジスルフィド結合によりそれぞれの重鎖と連結している２本の軽鎖とを含む。抗体のタンパク質分解により、Ｆｖ（フラグメント可変）およびＦｃ（フラグメント結晶）ドメインが得られる。抗原結合ドメイン、Ｆａｂは、ポリペプチド配列が変化する領域を含む。Ｆ（ａｂ’）２という用語は、ジスルフィド結合により連結した２本のＦａｂ’アームを表す。抗体の中心軸は、Ｆｃフラグメントと呼ばれる。各重鎖は、一端に、いくつかの定常ドメイン（ＣＨ）が続く可変ドメイン（ＶＨ）を有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）、および他端に定常ドメイン（ＣＬ）を有し、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと一直線に並び、軽鎖定常ドメインは重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）と一直線に並んでいる。軽鎖および重鎖の各対の可変ドメインは、抗原結合部位を形成する。軽鎖および重鎖上のドメインは同じ一般構造を有し、各ドメインはその配列が比較的保存されており、相補性決定領域（ＣＤＲ１〜３）として知られる３つの超可変ドメインにより結合した４つのフレームワーク領域を含む。これらのドメインは、抗原結合部位の特異性およびアフィニティに寄与する。重鎖のアイソタイプ（γ、α、δ、εまたはμ）が、免疫グロブリンクラス（それぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ）を決定する。軽鎖は、全抗体クラスで見られる２つのアイソタイプ（カッパ、κまたはラムダ、λ）のいずれかである。
【０１７１】
「抗体」という用語は、広義に使用され、所望の生物活性を示す限り、モノクローナル抗体（全長抗体もしくは完全抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多価抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体フラグメントを含む。
【０１７２】
本発明に係る抗体は、少なくとも抗体の抗原結合部分を含む分子である。本発明に係る抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）などの完全抗体ならびにＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントなどのそのタンパク質分解フラグメントを含む。キメラ抗体；ヒトおよびヒト化抗体；組換えおよび操作された抗体、ならびにこれらのフラグメントが本発明の範囲にさらに含まれる。さらに、抗体の可変領域をコードするＤＮＡを、他の抗体をコードするＤＮＡに挿入してキメラ抗体を産生することができる。鎖抗体も本発明の範囲に入る。
【０１７３】
「抗体フラグメント」は、一般的に完全抗体の抗原結合部位を含み、したがって抗原に結合する能力を保持している、完全抗体の一部のみを含む。本定義に包含される抗体フラグメントの例としては、（ｉ）ＶＬ、ＣＬ、ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有するＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ＣＨ１ドメインのＣ末端に１個または複数のシステイン残基を有するＦａｂフラグメントであるＦａｂ’フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有するＦｄフラグメント；（ｉｖ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインならびにＣＨ１ドメインのＣ末端に１個または複数のシステイン残基を有するＦｄ’フラグメント；（ｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインを有するＦｖフラグメント；（ｖｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  １９８９、３４１、５４４〜５４６）；（ｖｉｉ）単離ＣＤＲ領域；（ｖｉｉｉ）二価フラグメントがヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結した２つのＦａｂ’フラグメントを含むＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｘ）単鎖抗体分子（例えば、単鎖Ｆｖ；ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８８、２４２、４２３〜４２６；およびＨｕｓｔｏｎら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）１９８８、８５、５８７９〜５８８３）；（ｘ）同じペプチド鎖中の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と接続した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、２個の抗原結合部位を有する「ダイアボディ」（例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９３、９０、６４４４〜６４４８参照）；（ｘｉ）相補的軽鎖ポリペプチドと共に抗原結合領域の対を形成するタンデムＦｄセグメントの対（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む「線状抗体」（Ｚａｐａｔａら  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、１９９５、８、１０５７〜１０６２；および米国特許第５６４１８７０号）が挙げられる。
【０１７４】
単鎖抗体は、抗原結合能力を有し、免疫グログリン軽鎖および重鎖の可変領域、すなわち、連結したＶＨ−ＶＬまたは単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と相同または類似のアミノ酸配列を含む単鎖複合ポリペプチドであり得る。
【０１７５】
本明細書で使用する「中和抗体」とは、明細書通り、生体内または試験管内アッセイにより決定される、活性を低下もしくは阻害（遮断）するか、または受容体を通してシグナル伝達することができる特異的受容体またはリガンド標的に対する抗原結合部位を有する分子を指す。
【０１７６】
本明細書で使用する「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体、すなわち、集団を含む個々の抗体が微量に存在し得る考えられる自然発生突然変異を除いて同一である抗体を指す。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一抗原を標的とする。さらに、典型的には異なる決定基（エピトープ）を標的とする異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一決定基を標的とする。「モノクローナル」という修飾語句は、任意の特定の方法による抗体の産生を要するものと解釈されるべきではない。ｍＡｂは、当業者に既知の方法により得ることができる。例えば、本発明により使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  １９７５、２５６、４９５に初めて記載されているハイブリドーマ法により作成することができる、または組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４８１６５６７号参照）により作成することができる。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９１、３５２、６２４〜６２８またはＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９１、２２２：５８１〜５９７に記載されている技術を使用してファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【０１７７】
本発明のｍＡｂは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡを含む任意の免疫グロブリンクラスのものであり得る。ｍＡｂを産生するハイブリドーマは、試験管内でも生体内でも培養することができる。高力価のｍＡｂは、個々のハイブリドーマ由来の細胞を、初回抗原刺激した（ｐｒｉｓｔｉｎｅ−ｐｒｉｍｅｄ）Ｂａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射して高濃度の所望のｍＡｂを含有する腹水を得る生体内産生により得ることができる。アイソタイプＩｇＭまたはＩｇＧのｍＡｂは、当業者に周知のカラムクロマトグラフィー法を使用して、前記腹水または培養液上清から精製することができる。
【０１７８】
本明細書のモノクローナル抗体は、具体的には、所望の生物活性を示す限り、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種由来のまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であるが、鎖の残りは別の種由来のまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、ならびに前記抗体のフラグメントの対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体を含む（米国特許第４８１６５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１〜６８５５（１９８４））。さらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）グラフトを行い、アフィニティまたは特異性を含む抗体分子の特定の特性を変えることができる。ＣＤＲグラフトの非限定的例は、米国特許第５２２５５３９号に開示されている。
【０１７９】
キメラ抗体は、マウスｍＡｂ由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するものなどの、その異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。実質的にヒト抗体（アクセプター抗体と呼ばれる）由来の可変領域フレームワーク残基および実質的にマウス抗体（ドナー抗体と呼ばれる）由来の相補性決定領域を有する抗体は、ヒト化抗体とも呼ばれる。適用での免疫原性を低下させ、産生における収率を増加させるために、キメラ抗体が主に使用され、ここではマウスｍＡｂはハイブリドーマよりも高い収率を有するが、ヒトにおける免疫原性が高いので、ヒト／マウスキメラｍＡｂが使用される。キメラ抗体およびその製造法は、当業界で公知である（例えば、国際公開第８６／０１５３３号、第９７／０２６７１号、第９０／０７８６１号、第９２／２２６５３号ならびに米国特許第５６９３７６２号、第５６９３７６１号、第５５８５０８９号、第５５３０１０１号および第５２２５５３９号）。
【０１８０】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含有するキメラ抗体である。大部分は、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域の残基が、所望の特異性、アフィニティおよび能力を有するマウス、ラット、ウサギまたはヒト以外の霊長動物などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域の残基により置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基により置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基を含むことができる。これらの修飾を行って抗体性能をさらに精密化する。一般に、ヒト化抗体は、超可変ループの全部または実質的に全部が非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、ＦＲの全部または実質的に全部がヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、および典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含む。ヒト化抗体は、任意選択により免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  １９８６、３２１、５２２〜５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  １９８８、３３２、３２３〜３２９；およびＰｒｅｓｔａ  Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、１９９２  ２、５９３〜５９６を参照されたい。
【０１８１】
「ヒト抗体」は、ヒトにより産生された抗体のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するおよび／または本明細書に開示するヒト抗体を製造する技術のいずれかを使用して作成されたものである。ヒト抗体のこの定義では、特に、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体は除外される。ヒト抗体は、当業界で公知の種々の技術を使用して製造することができる。一実施形態では、ヒト抗体は、ファージライブラリーから選択され、そのファージライブラリーがヒト抗体を発現する（Ｖａｕｇｈａｎら  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９６  １４、３０９〜３１４；Ｓｈｅｅｔｓら  ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、１９９８、９５、６１５７〜６１６２）；ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９１、２２７、３８１；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９１、２２２、５８１）。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されたマウスに導入することにより作成することもできる。抗原攻撃により、遺伝子再構成、アセンブリおよび抗体レパートリーを含む全ての点で、ヒトで見られるのと酷似したヒト抗体産生が観察される。この手法は、例えば、米国特許第５５４５８０７号；第５５４５８０６号；第５５６９８２５号；第５６２５１２６号；第５６３３４２５号；第５６６１０１６号および以下の科学刊行物；Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｇｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９〜７８３（１９９２）；Ｌｏｎｇｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６〜８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８１２〜１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５〜５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８２６（１９９６）；ＬｏｎｇｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５〜９３（１９９５）に記載されている。あるいは、ヒト抗体は、標的抗原を標的とする抗体を産生するヒトＢリンパ球の不死化を通して調製することができる（前記Ｂリンパ球は個体から回収されても、試験管内で免疫化されていてもよい）。例えば、Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７頁（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（１）：８６〜９５（１９９１）；および米国特許第５７５０３７３号を参照されたい。
【０１８２】
「単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）」という用語は、短い（通常はセリン、グリシン）リンカーと連結で連結した、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域の融合体を意味する。単鎖抗体は、抗原結合能力を有し、免疫グロブリン軽鎖および重鎖の可変領域と相同または類似のアミノ酸配列を含む単鎖複合ポリペプチド（連結ＶＨ−ＶＬまたは単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ））であり得る。ＶＨおよびＶＬの両者が天然モノクローナル抗体配列をコピーし得る、または鎖の一方もしくは両方が、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５０９１５１３号に記載されている型のＣＤＲ−ＦＲ構築物を含み得る。軽鎖および重鎖の可変領域と類似の個々のポリペプチドが、ポリペプチドリンカーにより結合される。特に、ＶＨおよびＶＬ鎖のポリペプチド構造をコードするＤＮＡが知られている、前記単鎖抗体を製造する方法は、例えば、その各々の全内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４９４６７７８号、第５０９１５１３号および第５０９６８１５号に記載されている方法により達成され得る。
【０１８３】
本明細書で使用する「抗体の抗原結合部分を有する分子」は、任意のアイソタイプおよび任意の動物細胞系もしくは微生物により産生される完全免疫グロブリン分子だけでなく、限定するものではないが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、これらの重鎖および／または軽鎖の可変部分、Ｆａｂミニ抗体（その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第９３／１５２１０号、米国特許公開出願第０８／２５６７９０号、国際公開第９６／１３５８３号、米国特許公開出願第０８／８１７７８８号、国際公開第９６／３７６２１号、米国特許公開出願第０８／９９９５５４号参照）、二量体二重特異性ミニ抗体（Ｍｕｌｌｅｒら、１９９８参照）および前記反応性分画を組み込むキメラもしくは単鎖抗体、ならびに前記抗体反応性分画が物理的に挿入された任意の他の型の分子もしくは細胞、例えば、キメラＴ細胞受容体もしくは前記受容体を有するＴ細胞、または前記反応性分画を含有する分子の一部によって治療用部分を送達するよう開発された分子を含むその抗原結合反応性分画も含むことが意図されている。前記分子は、限定するものではないが、酵素切断、ペプチド合成または組換え技術を含む任意の既知の技術により提供され得る。
【０１８４】
本発明に係る抗体は、通常使用するプロトコルを使用して、ＣＥＡＣＡＭ１、もしくはエピトープ保持フラグメント、類似体、または発現細胞を動物、好ましくは非ヒトに投与することにより得ることができる。モノクローナル抗体を調製するために、連続細胞系培養により産生される抗体を提供する当業界で公知の任意の技術を使用することができる。例としては、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜４９７（１９７５）；Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２（１９８３）；Ｃｏｌｅら、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹの７７〜９６頁、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）のものなどの種々の技術が挙げられる。
【０１８５】
生体内で抗体を産生する従来法に加えて、ファージディスプレイ技術を使用して試験管内で抗体を産生することができる。組換え抗体の前記産生は、従来の抗体産生と比べてはるかに速く、多数の抗原に対して産生することができる。さらに、従来法を使用すると、多くの抗原は、非免疫原性または極めて毒性であることが分かり、それゆえ動物で抗体を産生するために使用することができない。さらに、組換え抗体のアフィニティ成熟（すなわち、アフィニティおよび特異性を高めること）は極めて単純で、比較的速い。最後に、特異的抗原に対する多数の異なる抗体を一選択手順で産生することができる。組換えモノクローナル抗体を産生するために、全てディスプレイライブラリーに基づく種々の方法を使用して異なる抗原認識部位を有する抗体の巨大なプールを産生することができる。前記ライブラリーは、いくつかの方法で作成することができる：重鎖生殖細胞系遺伝子のプールで合成ＣＤＲ３領域をクローニングすることにより合成レパートリーを産生することができるので、巨大な抗体レパートリーを産生することができ、そこから種々の特異性を有する組換え抗体フラグメントを選択することができる。抗体ライブラリーを構築するための出発材料としてヒトのリンパ球プールを使用することができる。ヒトＩｇＭ抗体のナイーブレパートリーを構築し、したがって多様性が大きなヒトライブラリーを作成することが可能である。この方法は、異なる抗原に対する多数の抗体を首尾よく選択するために広く使用されてきた。組換え抗体のバクテリオファージライブラリー構築および選択のためのプロトコルは、周知の参考文献テキストＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｌｉｇａｎら（編）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９２〜２０００）、第１７章、第１７．１節に提供されている。
【０１８６】
非ヒト抗体を当業界で公知の任意の方法によりヒト化することができる。１つの方法では、非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト抗体またはコンセンサス抗体フレームワーク配列に挿入する。次いで、さらなる変更を抗体フレームワークに導入してアフィニティまたは免疫原性を調節することができる。
【０１８７】
例えば、Ｑｕｅｅｎらの米国特許第５５８５０８９号は、ヒト化免疫グロブリンおよび同グロブリンを調製する方法を開示しており、ヒト化免疫グロブリンはドナー免疫グロブリンからの相補性決定領域（ＣＤＲ）とヒトアクセプター免疫グロブリン重鎖および軽鎖からの重鎖および軽鎖可変領域フレームワークとを含み、前記ヒト化免疫グロブリンはＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲの外側にドナー免疫グロブリンフレームワークからのアミノ酸を含み、ドナーアミノ酸はアクセプター免疫グロブリン重鎖または軽鎖フレームワーク中の対応するアミノ酸に置き換わっている。
【０１８８】
Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５２２５５３９号も、変化抗体もしくはその抗原結合フラグメントおよび同抗体もしくはフラグメントを調製する方法を開示しており、抗体もしくは抗原結合フラグメントの可変ドメインは第１の免疫グロブリン重鎖または軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域と、第２の免疫グロブリン重鎖または軽鎖可変ドメインの相補性決定領域とを有し、前記第２の免疫グロブリン重鎖または軽鎖ドメインは、前記第１の免疫グロブリン重鎖または軽鎖ドメインと抗原結合特異性、抗原結合アフィニティ、種、クラスまたはサブクラスが異なる。
【０１８９】
本発明の抗体と特異的に免疫反応性の抗イディオタイプ抗体も包含される。
【０１９０】
単鎖抗体を産生するための技術（米国特許第４９４６７７８号）を適合させて本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する単鎖抗体を産生することができる。また、トランスジェニックマウス、または他の哺乳動物などの他の生物を使用して本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに免疫特異性のヒト化抗体を発現することができる。
【０１９１】
あるいは、ファージディスプレイ技術を利用して、抗ＣＥＡＣＡＭ１を有するかスクリーニングしたヒトのリンパ球のＰＣＲ増幅ｖ遺伝子のレパートリーまたはライブラリーのいずれかから本発明のポリペプチドに対する結合活性を有する抗体遺伝子を選択することができる（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８、５５２〜５５４；Ｍａｒｋｓら、１９９２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０、７７９〜７８３）。これらの抗体のアフィニティを、例えば、チェーンシャッフリング（Ｃｌａｃｋｓｏｎら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２８）により改善することもできる。
【０１９２】
上記抗体を使用してポリペプチドを発現するクローンを単離または同定して、例えば、アフィニティークロマトグラフィーによりポリペプチドを精製することができる。
【０１９３】
また、本発明は、本発明に係る抗体分子の保存的アミノ酸変異型も提供する。コードされるタンパク質の全体的分子構造を保存する、本発明に係る変異型も製造され得る。開示されるタンパク質産物を含む個々のアミノ酸の特性が示されれば、いくつかの合理的置換当業者は認めるであろう。アミノ酸置換、すなわち、「保存的置換」は、例えば、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性の性質の類似性に基づいて行われ得る。
【０１９４】
「障害」は、抗体による処置からの利益を得る任意の状態である。これには、哺乳動物を当の障害に罹らせる病理学的状態を含む、慢性および急性の障害または疾患が含まれる。本明細書で処置される障害の非限定的例としては、良性および悪性腫瘍；白血病およびリンパ系腫瘍；ニューロン、グリア、星状細胞、視床下部および他の腺、マクロファージ、上皮、間質および割腔障害；ならびに炎症、血管新生、免疫障害または透過性亢進状態が挙げられる。
【０１９５】
「治療有効量」という用語は、哺乳動物の疾患または障害を処置するのに有効な薬物の量を指す。がんの場合、治療有効量の薬物は、がん細胞の数を減少させる；腫瘍サイズを減少させる；末梢器官へのがん細胞の浸潤を阻害する（すなわち、ある程度遅らせる、好ましくは停止させる）；腫瘍転移を阻害する（すなわち、ある程度遅らせる、好ましくは停止させる）；ある程度、腫瘍成長を阻害する；および／またはある程度障害に関連する症状の１つもしくは複数を軽減することができる。薬物が既存のがん細胞の成長を防ぐおよび／または死滅させることができる限り、この薬物は細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性となり得る。がん治療については、生体内での有効性は、例えば、生存期間、疾患進行までの時間（ＴＴＰ）、奏功率（ＲＲ）、奏功期間、および／または生活の質を評価することにより測定することができる。
【０１９６】
「処置」は、治療的処置および予防的もしくは防止的手段の両方を指す。処置を必要とする者には、既に障害を有する者ならびに障害を防ぐべき者が含まれる。
【０１９７】
「がん」および「がん性」という用語は、典型的には無秩序な細胞成長を特徴とする哺乳動物の病理学的状態を指すまたは説明する。がんの例としては、限定するものではないが、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫および白血病が挙げられる。前記がんのより具体的な例としては、黒色腫、肺、甲状腺、乳房、結腸、前立腺、肝臓、膀胱、腎臓、子宮頸部、膵臓、白血病、リンパ腫、骨髄、卵巣、子宮、肉腫、胆汁または子宮内膜がんが挙げられる。
【０１９８】
一部の実施形態によれば、本発明の抗体は、細胞傷害性または治療部分に付着している。細胞傷害性または治療部分は、例えば、その例が以下に提供される、細胞傷害性部分、毒性部分、サイトカイン部分、二重特異性抗体部分、細胞毒、ケモカイン、化学療法、アポトーシス促進性物質、インターフェロン、放射性部分またはこれらの組み合わせであり得る。
【０１９９】
「抗新生物組成物」という用語は、腫瘍成長もしくは機能を阻害または防止する、ならびに／あるいは腫瘍細胞の破壊を引き起こすことができる少なくとも１種の活性治療剤を含む、がんを処置するのに有用な組成物を指す。がんを処置するための抗新生物組成物に適当な治療剤には、限定するものではないが、化学療法剤、放射性同位元素、毒素、インターフェロンなどのサイトカイン、およびサイトカイン、サイトカイン受容体もしくは腫瘍細胞に関連する抗原を標的化する拮抗剤が含まれる。好ましくは、治療剤は化学療法剤である。
【０２００】
本明細書で使用する場合、「診断する」という用語は、病態の存在または非存在を決定する、病態または症状を分類する、病態の重症度を決定する、病態進行を監視する、病態の結果および／または回復の見込みを予測することを指す。
【０２０１】
薬理学
また、本発明は、本明細書に多様に記載する状態を処置、診断または予防するための治療用または診断用組成物を製造するための、活性剤としてＣＥＡＣＡＭ１を認識する少なくとも１種の抗体を含む、ヒトの医療用の医薬製剤も熟慮する。
【０２０２】
前記医薬および薬剤製剤では、活性剤は、好ましくは１種または複数の薬学的に許容可能な担体ならびに任意選択により他の治療成分と共に利用される。担体は、製剤の他の成分と適合性であり、そのレシピエントに過度に有害ではないという意味で薬学的に許容可能でなければならない。活性剤は、上記のように所望の薬理学的効果を達成するのに有効な量で、および所望の１日量を達成するのに適当な量で提供される。
【０２０３】
典型的には、抗体の抗原結合部分を含むかまたはペプチド模倣物を含む別のポリペプチドを含む本発明の分子は、治療用途のために滅菌生理食塩水溶液に懸濁される。あるいは、医薬組成物は、有効成分（抗体の抗原結合部分を含む分子）の放出を制御するか、または患者の系中でのその存在を延長するよう製剤化され得る。多数の適当な薬物送達システムが知られており、これには、例えば、植込み型薬物放出システム、ヒドロゲル、ヒドロキシメチルセルロース、マイクロカプセル、リポソーム、マイクロエマルジョン、マイクロスフェアなどが含まれる。制御放出製剤は、本発明に係る分子を複合体化または吸着するためにポリマーを使用して調製することができる。例えば、生体適合性ポリマーには、ポリ（エチレン−コ−酢酸ビニル）のマトリックスおよびステアリン酸二量体とセバシン酸のポリ酸無水物共重合体のマトリックスが含まれる。前記マトリックスからの本発明による、すなわち、抗体または抗体フラグメントの分子の放出速度は、分子の分子量、マトリックス中の分子の量、および分散した粒子のサイズに依存する。
【０２０４】
本発明の医薬組成物は、経口、局所、鼻腔内、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、関節内、病変内または非経口などの任意の適当な手段により投与することができる。通常は、静脈内（ｉ．ｖ．）、関節内、局所または非経口投与が好ましい。
【０２０５】
本発明に係る分子の治療有効量は、特に、投与計画、投与する分子の単位用量、分子を他の治療剤と組み合わせて投与するかどうか、患者の免疫状態および健康、投与する分子の治療活性ならびに治療する医師の判断に依存する。本明細書で使用する場合、「治療有効量」は、一定期間にわたって処置する障害に関連する１つまたは複数の症状を緩和するのに必要な分子の量を指す。
【０２０６】
本発明の分子の適当な用量は、投与経路、分子の型（ポリペプチド、ポリヌクレオチド、有機分子等）、患者の年齢、体重、性別または状態に応じて変化し、最終的に医師により決定される必要があるが、経口投与の場合、１日量は、体重１ｋｇ当たり、一般的に約０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇ、好ましくは約０．０１ｍｇ〜約５０ｍｇ、より好ましくは約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇの間であり得る。非経口投与の場合、１日量は、体重１ｋｇ当たり、一般的に約０．００１ｍｇ〜約１００ｍｇ、好ましくは約０．００１ｍｇ〜約１０ｍｇ、より好ましくは約０．０１ｍｇ〜約１ｍｇの間であり得る。１日量は、例えば、１日に１〜４回の個々の投与という典型的なレジメンで投与することができる。投与の他の好ましい方法には、体重１ｋｇ当たり、約０．０１ｍｇ〜約１００ｍｇの関節内投与が含まれる。有効量に達するための種々の留意点は、例えば、ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎの：Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第８版、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、１９９０；ならびにＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９９０に記載されている。
【０２０７】
併用化学療法の適当な投与レジメンは当業界で公知であり、例えば、Ｓａｌｔｚら  Ｐｒｏｃ  ＡＳＣＯ  １９９９、１８、２３３ａおよびＤｏｕｉｌｌａｒｄら、Ｌａｎｃｅｔ  ２０００、３５５、１０４１〜７に記載されている。
【０２０８】
有効成分としての本発明の分子は、周知のように、薬学的に許容可能であり、有効成分と適合性の賦形剤に溶解、分散または混和される。適当な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ブドウ糖、グリセリン、エタノールなどおよびこれらの組み合わせである。他の適当な担体は当業者に周知である。さらに、所望であれば、組成物は、微量の湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの補助剤を含有することができる。
【０２０９】
本発明に係る医薬組成物は、抗新生物組成物と共に投与され得る。具体的な実施形態によれば、抗新生物組成物は、少なくとも１種の化学療法剤を含む。本発明に係る抗体と共にまたは別々に投与され得る化学療法剤は、限定するものではないが、ミトキサントロン、トポイソメラーゼ阻害剤、紡錘体毒ビンカ：ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン（タキソール）、パクリタキセル、ドセタキセル；アルキル化剤：メクロレタミン、クロラムブシル、シクロホスファミド、メルファラン、イホスファミド；メトトレキサート；６−メルカプトプリン；５−フルオロウラシル、シタラビン、ゲムシタビン；ポドフィロトキシン：エトポシド、イリノテカン、トポテカン、デカルバジン；抗生物質：ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ブレオマイシン、ミトマイシン；ニトロソウレア：カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン、エピルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン；無機イオン：シスプラチン、カルボプラチン；インターフェロン、アスパラギナーゼ；ホルモン：タモキシフェン、リューブロリド、フルタミドおよび酢酸メゲストロールを含む、抗がん活性を示す当業界で公知の任意のこのような薬剤を含むことができる。
【０２１０】
具体的な実施形態によれば、化学療法剤は、アルキル化剤、代謝拮抗薬、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体および関連する阻害剤、ビンカアルカロイド、エピポドフィロトキシン、抗生物質、Ｌ−アスパラギナーゼ、トポイソメラーゼ阻害剤、インターフェロン、白金配位錯体、アントラセンジオン置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、副腎皮質ステロイド、プロゲスチン、エストロゲン、抗エストロゲン薬、アンドロゲン、抗アンドロゲン薬および性腺刺激ホルモン放出ホルモン類似体からなる群から選択される。別の実施形態によれば、化学療法剤は、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリン（ＬＶ）、イリノテカン、オキサリプラチン、カペシタビン、パクリタキセルおよびドセタキセルからなる群から選択される。２種以上の化学療法剤をカクテルで使用して抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の投与と組み合わせて投与するこができる。
【０２１１】
以下の実施例は、本発明の化合物および方法の製造および使用の仕方を説明することを意図したものであり、決して限定するものとして解釈すべきでない。本発明をここでその具体的な実施形態と併せて記載するが、多くの修正および変形が当業者に明らかであることが明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨および広範な範囲に入る全てのこのような修正および変形を包含することが意図されている。
【実施例】
【０２１２】
抗体を調製およびキャラクタライゼーションする手段は当業界で公知である。本発明に係る抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体を製造、キャラクタライゼーションおよび使用するための技術を例示する説明を以下に記載する。
【０２１３】
一般的に、本明細書で使用する命名法および本発明で利用する実験室手順には、分子、生化学、微生物学および組換えＤＮＡ技術が含まれる。前記技術は、文献に完全に説明されている。例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」第Ｉ〜ＩＩＩ巻  Ａｕｓｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編  １９９４；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ  １９８９；Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８８；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎら（編）「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」、第１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９８；米国特許第４６６６８２８号；第４６８３２０２号；第４８０１５３１号；第５１９２６５９号および第５２７２０５７号に示されている方法論；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」第Ｉ〜ＩＩＩ巻  Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編  １９９４；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」第Ｉ〜ＩＩＩ巻  Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．編  １９９４；Ｓｔｉｔｅｓら（編）、「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ  １９９４；ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ（編）、「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８０を参照されたい。利用可能な免疫測定法は、特許および科学文献に広範に記載されている。例えば、米国特許第３７９１９３２号；第３８３９１５３号；第３８５０７５２号；第３８５０５７８号；第３８５３９８７号；第３８６７５１７号；第３８７９２６２号；第３９０１６５４号；第３９３５０７４号；第３９８４５３３号；第３９９６３４５号；第４０３４０７４号；第４０９８８７６号；第４８７９２１９号；第５０１１７７１号および第５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｎ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編  １９８５；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編  １９８４；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編  １９８６；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬＰｒｅｓｓ、（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉ���ａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．、１９８４および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」第１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ  １９９０；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９９６を参照されたい。これらの文献中の手順は当業界で公知であると考えられる。
【０２１４】
実施例１：ＣＥＡＣＡＭを認識したモノクローナル抗体の産生およびキャラクタライゼーション
組換えヒトＣＥＡＣＡＭ１タンパク質を用いてマウスを免疫化することにより、ナノモル濃度で、試験管内でＣＥＡＣＡＭ１同種アフィニティ相互作用を有効に遮断するモノクローナル抗体を産生した。ＣＥＡＣＡＭ１遮断抗体を産生するハイブリドーマを産生し、数回再クローニングして安定なクローンを得た。
【０２１５】
ＣＥＡＣＡＭ１を認識する１つの代表的なモノクローナル抗体のＤＮＡおよびアミノ酸配列を、Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｌｔｄにより決定した。ｍＲＮＡをハイブリドーマ細胞ペレットから抽出し、ＲＮＡ抽出プロトコルを使用して、全ＲＮＡをペレットから抽出した。オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いた逆転写により、ＲＴ−ＰＣＲ−ｃＤＮＡをＲＮＡから作成した。可変ドメインプライマーを使用したＰＣＲ反応を使用してモノクローナル抗体ＤＮＡのＶＨおよびＶＬの両方を増幅した。
【０２１６】
ＶＨおよびＶＬ産物をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ配列決定ベクターｐＣＲ２．１にクローニングし、正の形質転換体についての上位１０位に形質転換させた。選択されたコロニーを選び、配列決定により分析した。決定され得られたＤＮＡおよびアミノ酸配列を以下に示す。
可変重鎖（ＶＨ）
ＶＨドメインのＤＮＡ配列：
ATGGGATGGACCTTGGTCTTTCTCTTTCTCCTGTCAGTAACTGCAGGTGTTCACTCCCAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGTAAGGCCTGGGACTTCAGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACGCCTTCACTAATAACTTGATAGAGTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGAGTGATTAATCCTGGAAGTGGTGATACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCAACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAACACTGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGATGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAGGGGATTACTACGGTGGCTTTGCTGTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCCGTTTATCCCTTGGCCCCTGGAAGCTTGGG（配列番号２５）。
ＶＨドメインのアミノ酸配列：
QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNNLIEWVKQRPGQGLEWIGVINPGSGDTNYNEKFKGKATLTADKSSNTAYMQLSSLTSDDSAVYFCARGDYYGGFAVDYWGQGTSVTVSS（配列番号２６）。
可変軽鎖（ＶＬ）
ＶＬドメインのＤＮＡ配列：
ATGGTGTCCTCAGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGAACCAGATGTGATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGACAAGTCAGGACATTGGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAAAAGCCTTCCTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGTTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAGAGA（配列番号２７）。
ＶＬドメインのアミノ酸配列：
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRTSQDIGNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGKSLPRTFGGGTKLEIK（配列番号２８）。
Ｎ末端アミノ酸配列決定および質量スペクトル分析を使用してＶＬおよびＶＨ同一性を確認した。
【０２１７】
実施例２：Ｎ末端アミノ酸配列の検証
エドマン分解法により、軽鎖のアミノ酸配列解析を行ってモノクローナル抗体の１つの軽鎖のＮ末端配列を検証した。得られたＮ末端配列は、DIQMTQTTSS（配列番号２９）であり、これはＤＮＡ配列に基づいて予想したＮ末端と一致している。
【０２１８】
実施例３：相補性決定領域（ＣＤＲ）配列
ＣＤＲセグメントを２つの異なるアルゴリズム法を使用して同定した：
１．ＩＭＧＴアルゴリズム（Ｌｅｆｒａｎｃら、１９９９、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２７、２０９〜２１２）；
２．ＫＡＢＡＴアルゴリズム（Ｗｕ  ＴＴおよびＫａｂａｔ  Ｅ．Ａ．、１９７０、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３２、２１１〜２５０）。
【０２１９】
表１は、２つの方法を使用して決定したＣＤＲ配列ならびに両方法を使用して同定した最小コンセンサス配列および結合配列を要約している。
【表１】
2015502138.tif 000003
【０２２０】
実施例４：キメラモノクローナル抗体の設計および産生
可変重鎖および軽鎖のＤＮＡ配列（配列番号２５および２７）を使用して、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ定常ドメインおよび定常軽（ＣＬ）ヒトＩｇκドメインを含むキメラ抗体を構築した。親モノクローナル抗体はマウスＩｇＧ１であり、そのヒト同等物はＩｇＧ４であるが、ヒトＩｇＧ１フレームワークを使用して本発明のキメラ抗体のいくつかを構築した。軽鎖および重鎖についてのＤＮＡ配列を合成し、別々のプロモーターの下で発現ベクターｐＦＵＳＩＯＮ−ＤＨＦＲ１にクローニングした。
【０２２１】
ＣＨＯ細胞の一過性導入
懸濁ＣＨＯ細胞（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）を、２５０および５００ｍｌベント型エルレンマイヤーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、オランダ）中、Ｐｒｏ  ＣＨＯ  ５無血清培地（Ｌｏｎｚａ、ＵＫ）において１３０ｒｐｍ、８％ＣＯ２、３７℃で培養した。導入日に、細胞を２．０Ｘ１０６個細胞／ｍｌの密度で播種し、２．５ｇ／ｍｌのプラスミドＤＮＡ（Ｇｅｎｅａｒｔ、ドイツ）をポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ、ＰＡ、ＵＳ）を使用して細胞に導入した。導入培養液を１３０ｒｐｍ、８％ＣＯ２、３７℃で９〜１０日間インキュベートした。培養液の収穫前に、上清を４０００ｒｐｍで４０分間スピンさせた。
【０２２２】
培養液を収穫し、２つの別々のバッチで精製した。培養液を０．８μｍ  ｇｙｒｏｄｉｓｃフィルターを通して濾過し、１ｍｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムを使用して精製した。抗体をＦＰＬＣにより精製した。試料３２０ｍｌを０．２ｍｌ／分で一晩充填し、１７時間後に０．５ｍｌ／分に増加させた。ｐＨ３．０のＧｌｙ／ＨＣＬ溶出緩衝液で溶出する前に、カラムをＰＢＳにより０．５ｍｌ／分で洗浄／平衡化した。良好なピークが観察され、分画１〜５をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイにより定量化した。Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイは、ＰＢＳ１ｌ中（４℃、１２０ＲＰＭ）に一晩プールし、緩衝液交換のために透析した分画１〜４中にタンパク質が存在することを示した。１．８２３ｍｇ／ｍｌの濃度が４ｍｌ試料で観察されたので、約７．３２ｍｇの総収量を精製した。第２のバッチでは、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイの結果により、プールし、透析した分画１〜３中にタンパク質が存在することが示された。馴化培地３２０ｍｌから、約７．３２ｍｇの総収量を精製した（バッチＡ）。培養液９１０ｍｌから、約１５．７４ｍｇの総収量を精製した（バッチＢ）。全一過性発現により、精製タンパク質約２３ｍｇが得られた。濃度決定およびＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析後、キメラ抗体１９．６５ｍｇが得られた。精製抗体試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析して純度を評価した。図１は、キメラ抗体の軽鎖および重鎖を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル像を示している。ＭＳ分析により、ＣＭ１０重鎖の分子量が４８．６ｋＤａであり、軽鎖の分子量が２３．３ｋＤａであることが明らかになった。
【０２２３】
得られた抗体（ＣＭ１０と示す）は、重鎖および軽鎖の以下のアミノ酸配列を有する。
重鎖アミノ酸配列（シグナルペプチドを含まない）：
【表２】
2015502138.tif 000004
【０２２４】
ＣＭ１０と示す代表的なキメラモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖のＤＮＡ配列を含むプラスミドを、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２１３０として２０１１年９月２８日に寄託した。
【０２２５】
実施例５：キメラモノクローナル抗体ＣＭ１０のアフィニティキャラクタライゼーション
ＣＭ１０の精製ヒトＣＥＡＣＡＭ１への結合
精製ヒトＣＥＡＣＡＭ１を使用したＥＬＩＳＡアッセイで、ＣＭ１０のヒトＣＥＡＣＡＭ１への結合特異性を試験した。２３の二重希釈のＣＭ１０を使用した間接ＥＬＩＳＡを使用して、特異的結合曲線を作成した。図２に示す結果は、３つの複製からの平均Ｏ．Ｄ．±ＳＥを表す。他の１０の独立した実験からも同様の結果が得られた。
【０２２６】
キメラ化プロセスが抗体の結合アフィニティに影響を及ぼすかどうかを試験するために、競合ＥＬＩＳＡおよびＢＩＡｃｏｒｅ分析により、キメラ抗体ＣＭ１０のＣＥＡＣＡＭ１結合について評価した。
【０２２７】
ＥＬＩＳＡについては、組換え精製ヒトＣＥＡＣＡＭ１をプレートに結合させた。化学的ビオチン化ＣＭ１０を一定濃度でトレーサーとして使用し、増加する濃度の標識されていないＣＭ１０と競合させた。インキュベーションおよび洗浄後、プレートをＳｔｒｅｐＡｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ複合体で展開し、ＨＲＰ基質としてのＴＭＢで色反応を発色させた。
【０２２８】
５０ｎｇ／ｍｌのトレーサーを使用して、ＣＭ１０について検出された見かけのアフィニティ値は１．２〜１．６ｎＭであった。
【０２２９】
ＢＩＡｃｏｒｅ分析
各抗体をＮＨＳ−ＥＤＣ結合化学によりＢｉａｃｏｒｅ３０００装置のＣＭ５センサーチップの単一チャネル上に固定した。
【０２３０】
組換えＣＥＡＣＡＭ１を種々の濃度（０．１９、０．３９、０．７８、１．５６、３．１２、６．２５、１２．５および２５ｎＭ）でチップ上に５０μｌ／分で流した。ランニングバッファーはＰＢＳ−ＥＴ（１０ｍＭ  ｐ−バッファー  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３．４ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．００５％ｔｗｅｅｎ２０）とした。ＢＩＡＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア３．０を使用してデータを分析し、３つの独立した実験から計算したＣＭ１０−ＣＥＡＣＡＭ１アフィニティのＫＤ値は、（ＫＤ）：４．０７〜５．０５ｎＭ（平均４．５６ｎＭ）であった。
【０２３１】
ＣＭ１０の膜結合内因性ＣＥＡＣＡＭ１に対する結合特異性
ＣＭ１０の膜結合内因性ＣＥＡＣＡＭ１への結合を試験するために、ＦＡＣＳ分析を行った。いくつかのヒト黒色腫細胞系をｈＣＥＡＣＡＭ１発現についてスクリーニングする一方で、５２６ｍｅｌ細胞系を正の対照として、また００３ｍｅｌを負の対照系として使用した。５２６ｍｅｌ、００３ｍｅｌ、Ｍａｌｍｅ３Ｍ、Ｓｋｍｅｌ５およびＡ３７５細胞系をＣＭ１０で染色した。空のヒストグラムはｍＡｂ染色を表し、暗いヒストグラムは背景染色を表す。少なくとも５０００個の細胞を使用して各ヒストグラムのＣＥＡＣＡＭ１発現を分析した。
【０２３２】
図３からわかるように、ＣＭ１０は、膜結合内因性ＣＥＡＣＡＭ１を検出する。Ｍａｌｍｅ３ＭおよびＳｋｍｅｌ５細胞系は高いＣＥＡＣＡＭ１発現を示したが、Ａ３７５黒色腫細胞系では発現は検出されなかった。
【０２３３】
結論
キメラ化プロセスは首尾よく行われた。キメラ抗体は、２つの異なる手法により検証されるとおり、１．４ｎＭのアフィニティでＣＥＡＣＡＭ１に結合する。ＣＭ１０の種々の黒色腫細胞系に対する結合特異性を試験するＦＡＣＳ分析により、抗体がその生物学的結合能力を保持したことが示されている。
【０２３４】
実施例６．ＣＭ１０の活性の評価
細胞−細胞相互作用遮断アッセイ
抗ＣＥＡＣＡＭ１  ｍＡｂがＣＥＡＣＡＭ１細胞−細胞相互作用を遮断する能力を決定するアッセイは、マウスｚ鎖に融合したヒトＣＥＡＣＡＭ１の細胞外部分で構成されたキメラ分子（ＢＷ／ＣＥＡＣＡＭ１）に安定的にトランスフェクトされたマウスＴ細胞（ＢＷ細胞）を使用する。ＢＷ／ＣＥＡＣＡＭ１細胞とＣＥＡＣＡＭ１に安定的にトランスフェクトされたＢ細胞（２２１／ＣＥＡＣＡＭ１）のコインキュベーションによるＣＥＡＣＡＭ１の会合により、ｚ鎖により媒介されるマウスＩＬ−２の分泌がもたらされる。
【０２３５】
氷上で３０分間、ＣＭ１０またはＰＢＳの存在下で、エフェクター細胞（ＢＷ、ＣＥＡＣＡＭ１を発現している）をインキュベートした。インキュベーション後、エフェクター細胞を、ＣＥＡＣＡＭ１を発現している（２２１＋）またはＣＥＡＣＡＭ１を発現していない（２２１−）標的細胞と共に一晩共培養した。商業的ＥＬＩＳＡによりマウスＩＬ−２分泌を測定した。図４に示す結果は、複製ウェルからの平均ＩＬ−２分泌を表す。図に示すように、ＣＭ１０を添加すると、Ｔ細胞とＢ細胞との間のＣＥＡＣＡＭ１媒介細胞−細胞相互作用が、ＩＬ−２分泌の遮断により、示されるように用量依存的様式で消滅した。
【０２３６】
試験管内免疫調節死滅アッセイ
Ｔ細胞死滅アッセイ：黒色腫反応性Ｔ細胞ＴＩＬ（腫瘍浸潤リンパ球、黒色腫患者由来）は、ＨＬＡが適合した黒色腫細胞を破壊することができる。ＴＩＬは、Ｓｈｉｂａ医療センターのＥＬＬＡ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから購入し、臨床検査室プロトコルに従って培養した。ＣＦＳＥ標識黒色腫細胞（ＳＫｍｅｌ５）を氷上で３０分間、ＣＭ１０（１０μｇ／ｍｌ）と共にプレインキュベートした。ＴＩＬを添加して３７℃でさらに１０時間インキュベートした。ＣＦＳＥ標識黒色腫細胞のＰＩ染色により死滅の割合を決定した。エフェクター対標識比は５：１であった。別のアッセイでは、ＣＦＳＥ標識黒色腫細胞を氷上で３０分間、ＣＭ１０と共にプレインキュベートした。ＴＬＬを添加して３７℃でさらに５時間インキュベートした。ＣＦＳＥ標識黒色腫細胞のＰＩ染色により死滅の割合を決定した。結果は、１処理当たりの３複製ウェルからの特異的死滅％の平均±ＳＥを表す。エフェクター対標的比は５：１であった。
【０２３７】
図５に示す結果は、Ｔ細胞の死滅活性が抗ＣＥＡＣＡＭ１  ｍＡｂ、ＣＭ１０の存在下で増強することを示している。さらに、ＴＩＬが黒色腫細胞を死滅させることができないアッセイ条件（短いインキュベーションまたは低いＴＩＬ比）下で、ＣＭ１０を添加すると、ＴＩＬの死滅活性が刺激されたが、ＩｇＧ１アイソタイプ対照では死滅を検出することはできなかった（図６）。
【０２３８】
ＮＫ細胞死滅アッセイ
ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）は、アポトーシスにより標的細胞を死滅させるパーフォリンと呼ばれる小タンパク質およびグランザイムを放出することにより、悪性細胞を破壊することができるタイプの細胞傷害性リンパ球である。ＮＫ細胞は、いくつかの異なる経路、中でもサイトカイン、ＦＣ受容体およびＭＨＣクラス１が標的細胞に存在しない経路を通して活性化され得る。標的細胞上の種々のリガンドに対するいくつかの活性化および阻害受容体は、ＮＫ細胞の最終的な細胞傷害活性を調節する。ＮＫ９２ＭＩ細胞は、ＡＴＣＣから購入したＩＬ−２独立ＮＫ細胞系である。
【０２３９】
ＮＫ９２ＭＩをＣＭ１０（０．２μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌもしくは５μｇ／ｍｌ）またはアイソタイプ一致対照Ａｂ（５μｇ／ｍｌ）と共に３７℃で３０分間インキュベートし、ＣＥＡＣＡＭ１を発現している標的細胞をさらに５時間添加した。古典的ＬＤＨ放出アッセイにより、死滅の割合を決定した。結果は、１処理当たり３複製ウェルからの細胞傷害％の平均±ＳＥを表す。エフェクター対標的比は２．５：１であった。
【０２４０】
図７に示すアッセイは、ＣＭ１０が、ＰＢＳまたはアイソタイプ一致ＩｇＧと比べて、ＣＥＡＣＡＭ１を発現している２種の黒色腫細胞系（ＳＫｍｅｌ５およびＧ３６１）でＮＫ細胞の死滅活性を強力に増強したことを示している。２種の他のＣＥＡＣＡＭ１＋黒色腫細胞系および種々のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比でも同様の結果が示された。
【０２４１】
抗体依存性細胞媒介細胞傷害
抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、免疫系のエフェクター細胞（ほとんどＮＫ細胞）が、特異的抗体が結合した標的細胞を活発に溶解する細胞媒介免疫の機構である。ＣＭ１０の安全性プロファイルを評価するために、本発明者らは、ＣＭ１０がＡＤＣＣを誘発する能力を３種の黒色腫細胞系（ＣＥＡＣＡＭ１陽性細胞系：Ｇ３６１およびＳＫｍｅｌ５ならびにＣＥＡＣＡＭ１陰性細胞系：ＳＫｍｅｌ２８）で調べる予備ＡＤＣＣアッセイを行った。
【０２４２】
ＣＭ１０がＡＤＣＣを誘発する能力を、陽性対照抗体（予備実験でＡＤＣＣ活性を示したポリクローナルＡｂ抗ＣＥＡＣＡＭ１）と比較して調査した。アイソタイプ一致抗体が陰性対照として役立った（ｈＩｇＧ１Ｋ）。結果は、ＣＭ１０が試験した設定でＡＤＣＣを誘因しないことを示している。
【０２４３】
補体依存性細胞傷害
補体タンパク質は血液中に見られ、その作用は抗体の働きを「補完する」。補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）は、標的細胞表面に結合した抗体が補体を固定し、標的細胞膜中に孔を作り出し、最終的に細胞溶解を引き起こす膜攻撃複合体を会合させ、細胞を死滅させる機構である。
【０２４４】
ＣＭ１０の安全性プロファイルを評価するために、ＣＭ１０がＣＤＣを誘発する能力を、ＣＥＡＣＡＭ１を発現している２種の黒色腫細胞系（ＳＫｍｅｌ２８およびＳＫｍｅｌ５）で調査した。商業的プールヒト血清を補体タンパク質源として使用した。Ｄａｕｄｉ細胞と共にインキュベートした商業的モノクローナル抗体リツキシマブをＣＭ１０に対するアッセイの陽性対照として、また商業的ＩｇＧ１Ｋをアイソタイプ一致対照として使用した。黒色腫細胞系−ＳＫＭＥＬ５およびＳＫＭＥＬ２８または陽性対照Ｄａｕｄｉ細胞を、それぞれＣＭ１０またはリツキシマブと共に室温で１時間インキュベートし、次に加湿インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中で５０％の最終濃度で正常ヒト血清をさらに２時間添加した。溶解細胞の割合をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色により決定した。結果（図１４）は、複製して行った２つの独立した実験の平均＋Ｓ．Ｅ．を表しており、ＣＭ１０が試験した設定でＣＤＣ溶解を誘発しなかったことを示している。
【０２４５】
生体内有効性実験
この実験の目的は、生体内でのＣＭ１０の黒色腫細胞への直接効果を試験すること、ならびに異種移植片設定では見つからない免疫調節効果を評価することである。
【０２４６】
異種移植片実験の較正
「ＡＴＣＣ」から購入したＣＥＡＣＡＭ１陽性ヒト黒色腫細胞系（ＳＫｍｅｌ５）および「Ｈａｒｌａｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ」製のＮＯＤ−ＳＣＩＤ、齢一致マウスを使用した。腫瘍の成長を監視し、最適なＴＩＬレジメンを見出すために、較正アッセイを行った。ＳＫｍｅｌ５黒色腫細胞をＳＣＩＤ−ＮＯＤマウスにＳＣ（皮下）注射し、腫瘍体積を物理的測定により監視した。腫瘍体積が１００ｍｍ＾３に達したら、マウスを５つのランダム化群に分けた。ＴＩＬを２種の異なる濃度でＩＴ（腫瘍内）または１種の濃度（１マウス当たり２０×１０＾６）でＩＶ（静脈内）注射し、１つの群は１回の注射のみ受け、第２の群は２回のＴＩＬ注射を受けた。各ＴＩＬ注射の後、５日間のｈＩＬ−２投与を行った。較正実験により、ＴＩＬ  ＩＶ注射がＩＴ投与よりも腫瘍サイズに与える影響が大きいことが示された。さらに、反復したＴＩＬ管理体制により、Ｔ細胞半減期から予測され得るように、単回注射よりも優れた腫瘍成長阻害が引き起こされる。このデータに基づいて、ＴＩＬを以後の異種移植片実験で、ＩＶ注射により１０日毎に投与する。
【０２４７】
ＣＭ１０の生体内免疫調節性抗がん活性
ヒトＣＥＡＣＡＭ１陽性ＳＫｍｅｌ５黒色腫細胞を、ＳＣＩＤ−ＮＯＤマウスにＳＣ注射した。腫瘍が約１００ｍｍ３の体積に達したら、マウスを以下の処理群の１つにランダム化した：ａ）週１回のＰＢＳのＩＶ注射；ｂ）週１回のＣＭ１０  ０．４５ｍｇのＩＶ注射；ｃ）３回の２０×１０６抗腫瘍反応性ヒトＴ細胞（ＴＩＬ）のＩＶ注射および週１回のＰＢＳのＩＶ注射；ｄ）３回の２０×１０６抗腫瘍反応性ヒトＴ細胞（ＴＩＬ）のＩＶ注射および週１回のＣＭ１０  ０．４５ｍｇのＩＶ注射。実験設定を知らない人が１週間に２〜３回腫瘍体積を測定した。図８の結果は、１群当たり６〜１０匹のマウスからの平均腫瘍体積±ＳＥを表す。矢印は、投与の時間を示している（ＣＭ１０  円、ＴＩＬ  三角形、ＣＭ１０およびＴＩＬ  白抜き正方形）。示すように、腫瘍成長の中等度の阻害がＣＭ１０単独またはＴＩＬ単独で観察されたが、対照処理と比べると、差は統計学的有意性に達しなかった。養子ヒトＴ細胞移入とＣＭ１０注射の組み合わせは、有意な相乗作用を著しく示し、異種移植片成長を強力に阻害した。この所見は、ＣＭ１０のＴ細胞死滅への増強効果を示す試験管内データと一致する（図５および図６）。
【０２４８】
ＴＩＬの存在下、ＣＭ１０で処理した群では有意な成長阻害が観察された。これらの結果は、異なる細胞系での抗ＣＥＡＣＡＭ１  ｍＡｂの免疫刺激効果を補強し、ＣＭ１０を有望な免疫調節抗体として使用することができることを示している。この所見は、ＣＭ１０のＴ細胞による黒色腫細胞死滅への刺激効果を示す試験管内データと一致する。
【０２４９】
結論
ＣＥＡＣＡＭ１は、白血球活性化の制御因子であることが知られている。ＣＭ１０は、２つのＣＥＡＣＡＭ１分子間の相互作用を遮断する（図４）ので、ＣＥＡＣＡＭ１により媒介される阻害シグナルを除去し、腫瘍細胞に対するより強力な細胞傷害性リンパ球活性化を引き起こす（図６および図７）。生体内異種移植片結果（図８）は、ＣＭ１０の免疫刺激性の性質を補強し、ＴＩＬの存在下、ＣＭ１０で処理したマウスにおいて腫瘍の有意な成長阻害を示している。図９に示すスキームは、免疫系細胞による死滅シグナルの活性化を可能にする、ＣＥＡＣＡＭ１−ＣＥＡＣＡＭ１相互作用を防ぐＣＭ１０の作用様式の非限定的理論を示している。
【０２５０】
実施例７：ＣＭ１０試験管内安全性評価
ＣＭ１０の正常なヒト細胞への効果
免疫系から逃れるために、がん細胞は、多くの分子の発現を変化させる。いくつかの証拠により、黒色腫細胞の悪性形質転換中にＣＥＡＣＡＭ１発現が増加していることが示されている。文献によると、ＣＥＡＣＡＭ１は正常な細胞でも発現しているので、体のＣＭ１０の可能な結合部位をマッピングし、正常な細胞へのＣＭ１０の結合が、何らかの望ましくない結果をもたらすおそれがあるかどうかを確認することが重要である。
【０２５１】
正常なヒト組織の交差反応性
この試験では、正常なおよび悪性の黒色腫試料を含有するヒト組織マイクロアレイにおける抗ＣＥＡＣＡＭ１  ｍＡｂの結合強度を調査した。結合強度は、標準的病理学的点数化システムを使用して評価した。標準的ＩＨＣ手順により、悪性黒色腫（原発性、転移）および良性母斑の１００例を含有する組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）の抗ＣＥＡＣＡＭ１結合強度を分析した。腫瘍の各コアを０から＋３まで類別した。図１０に示すように、抗ＣＥＡＣＡＭ１  ｍＡｂの結合強度は、黒色腫試料の５０％超および転移性黒色腫試料の６５％に見られた。
【０２５２】
多くの正常なヒト器官組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）は、各型を３人の正常なヒト個体から採取した３３の型の正常な器官を含んでいた。年齢は２〜６７歳に及び、４３標本は女性から得て、５７標本は男性から得た。以下の組織は、抗ＣＥＡＣＡＭ１  ｍＡｂ結合について陰性であった：大脳、小脳、卵巣、膵臓、副甲状腺、下垂体、甲状腺、扁桃、骨髄、脾臓、胸腺、肺、心筋、胃、骨格筋、皮膚、末梢神経、中皮および網膜。細胞特異的染色がいくつかの器官、主に小腸の刷子縁；いくつかの頂端結腸腺；乳管上皮；肝臓毛細胆管；尿細管の内部表面；わずかな子宮内膜腺；唾液腺の管腔部分などの管腔臓器器官中の管または腺を形成する上皮細胞の管腔側で検出された。さらに、いくらかの低い細胞染色が、副腎皮質、前立腺の頂端膜側、精巣のライディッヒ細胞および膵臓の単一散乱細胞で観察された。陽性と分かった免疫系の唯一の細胞は、毛細血管中の好中球であった。組織およびリンパ器官では、リンパ球の染色は見られなかった。最後に、弱〜中等度の陽性染色が、卵巣、副腎、腎臓を含む選択的部位の小血管の上皮細胞、ならびにまれに膵臓、前立腺、下垂体および子宮内膜で見られた。
【０２５３】
ＩＨＣ分析により、正常なヒト組織で試験した組織の大多数で染色がなかったのに対し、黒色腫細胞の強い抗ＣＥＡＣＡＭ１染色が示された。それにもかかわらず、いくらかの選択的染色が、管腔臓器の管または腺の上皮細胞の管腔側で観察された。この細胞側は、一般的に末梢血を通して投与された抗体にあまり接近できない。
【０２５４】
１細胞当たりに結合したＣＭ１０分子の定量化
各細胞型に結合したＣＭ１０分子の正確な数を定量化するために、ＱｕａｎｔｉＢＲＩＴＥキットを使用した。このキットを使用して、ＭＦＩ（平均蛍光強度）を、１細胞当たりに結合した分子の数に直接変換した。抗ＣＥＡＣＡＭ１結合について陽性であることが分かった組織の３種のヒト一次細胞をＡＴＣＣから購入した。上皮細胞で見られた陽性染色を表すためのＨＵＶＥＣ細胞；前立腺が陽性染色を示したので一次前立腺上皮細胞、および管の内部表面が陽性染色したので一次腎近位尿細管上皮細胞である。より詳細には、ＳＫｍｅl５、Ｇ３６１、Ｍａｌｍｅ３Ｍ、ＮＫ９２ＭＩ、ＨＵＶＥＣ、腎臓一次細胞および前立腺一次細胞をＡＴＣＣプロトコルに従って培養した。ＣＭ１０を製造業者のプロトコルに従ってＰＥ分子（ＲＰＥ  ＬＹＮＸ  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）に結合し、ＱｕａｎｔｉＢＲＩＴＥ  ＰＥビーズキット（ＢＤ）と共に使用して（１μｇ／ｍｌ）フローサイトメトリーによりＡＢＣ（１細胞当たりに結合した抗体）を測定した。黒色腫細胞系と比較して示した一次細胞でフローサイトメトリーを使用して１細胞当たりに結合したＣＭ１０分子の数を分析した。少なくとも１０００個の細胞を各細胞系についてカウントした。
【０２５５】
定量分析（図１１、結果は２〜３の独立した実験の平均±ＳＥを表す）により、ＣＥＡＣＡＭ１陽性黒色腫細胞が、２００００〜５００００個の間のＣＭ１０分子に結合する一方で、いくらかのＣＥＡＣＡＭ１発現をすることが報告された正常な内皮および上皮細胞（例えば、ＨＵＶＥＣ、腎臓および前立腺）は最大でも２０００個のＣＭ１０分子にしか結合しないことが示された。さらに、多数のＣＭ１０抗体がＮＫ細胞（約２００００）に結合し、これは活性化リンパ球で高いＣＥＡＣＡＭ１発現を示す発表データと相関する。これらの結果は、活性化リンパ球媒介細胞溶解におけるプレーヤーとしてのＣＭ１０の安全性プロファイル（一次細胞で低発現）およびその活性（ＮＫ結果）を補強する。
【０２５６】
ＣＭ１０の存在下でのヒト一次細胞の増殖
いくらかの陽性染色が正常な組織で見られたので、ＣＭ１０の一次細胞成長への効果を調査した。ＨＵＶＥＣおよび一次前立腺細胞をＡＴＣＣプロトコルに従って培養し、ＸＴＴ標準アッセイを使用して細胞増殖について監視した。細胞増殖への効果は検出されなかった。
【０２５７】
要約
抗ＣＥＡＣＡＭ１  ｍＡｂの正常な組織および黒色腫細胞への結合プロファイルを確認した。ＣＥＡＣＡＭ１は正常なメラニン形成細胞では不在であるが、新たな発現を受け、転移性黒色腫標本の大多数で広く発現し（図１０）、他の正常な器官では、ＣＥＡＣＡＭ１の発現はいくつかの組織内の特異的細胞中に限られている。細胞に結合したＣＭ１０分子の数を測定する定量分析により、正常なヒト一次細胞上の結合ＣＭ１０の数が極めて少ないことが明らかになった（図１１）。これらの結果は、患者に注射したＣＭ１０分子の大部分が、発現の差により、主にがん細胞を標的化し、正常な組織を標的化しないことを暗示している。さらに、ＣＭ１０は、細胞増殖、ＣＤＣ活性に効果を及ぼさず、無視できるまたは低いＡＤＣＣ活性を有し、このことはＣＭ１０の非標的細胞への結合が望ましくない細胞成績をもたらさないことを示唆している。
【０２５８】
ＣＭ１０の免疫系への効果
ＣＭ１０は、２つのＣＥＡＣＡＭ１分子間の相互作用を遮断する免疫刺激性抗体であり、そうすることにより、悪性細胞に対するリンパ球の刺激を媒介する。抗体が重度の有害事象を引き起こすおそれがある免疫系の抑えられていない刺激を引き起こさないことを検証することが重要である。正常なリンパ球では、細胞膜上でＣＥＡＣＡＭ１の発現は無視でき、細胞活性化後にのみＣＥＡＣＡＭ１が膜に動員され、活性化リンパ球上で急速かつ強力に上方制御される（Ｇｒａｙ−Ｏｗｅｎ  ａｎｄ  Ｂｌｕｍｂｅｒｇ  ２００６、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６、４３３〜４６）。上に示すように、正常なリンパ組織（脾臓、胸腺、骨髄）またはリンパ球に対する交差反応性は観察されなかった。それにもかかわらず、種々の試験管内および生体外免疫毒性分析を行い、潜在的副作用を予測するのに役立てた。
【０２５９】
ＣＭ１０のヒトリンパ球増殖への効果
試験管内で免疫調節性抗体の安全性を評価するための最も一般的かつ許容される方法の１つは、その増殖への効果および正常なヒトＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）のサイトカイン分泌を調べることである。３人の非血縁者ドナーからのヒトＰＢＭＣを単離し、３つの異なる濃度（２μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌもしくは２００μｇ／ｍｌ）のＣＭ１０または対照ｍＡｂ  ＩｇＧ１Ｋ（２００μｇ／ｍｌ）と共に６０分間および８複製ウェルでインキュベートした。ＰＨＡ（１μｇ／ｍｌ）をアッセイ複製ウェルの４に添加し、９６時間インキュベートした。３Ｈ−チミジンの組み込みを使用して細胞増殖を分析した。ｍｏｃｋ刺激細胞およびＰＨＡのみ刺激細胞をそれぞれアッセイの陰性および陽性対照として使用した。残りのリンパ球ならびに活性化リンパ球（ＰＨＡ処理）で増殖を評価した。ｍｏｃｋ刺激細胞およびＰＨＡのみ刺激細胞をそれぞれアッセイの陰性および陽性対照として使用した。結果（図１２）は、ＣＭ１０がナイーブまたは活性化ヒトリンパ球の増殖に効果を有さないことを明確に示している。ＰＢＭＣ増殖試験に加えて、ＣＭ１０のヒトＰＢＭＣからのサイトカイン分泌への効果を評価する。サイトカイン分泌試験は、ＣＭ１０の免疫調節効果を規定し、潜在的副作用を予測するのに役立つ。
【０２６０】
実施例８．ＣＭ１０選択性パネル
異なるＣＥＡＣＡＭファミリータンパク質を過剰発現している細胞系およびフローサイトメトリー分析を使用して、結合プロファイルのキャラクタライゼーションを行った。ヒトでは、ＣＥＡファミリーは、染色体１９ｑ１３．２上の１８の遺伝子および１１の偽遺伝子によりコードされている。いくつかの密接に関連するメンバーは、ＣＥＡＣＡＭファミリーに属し（ＣＥＡＣＡＭ１、３、４、５、６、７、８）、種々のヒト細胞型で差次的に発現している。ＣＥＡＣＡＭタンパク質は、正常な細胞およびがん性細胞の成長ならびに分化を支配する種々の接着媒介効果と関係づけられてきた（Ｇｒａｙ−Ｏｗｅｎ  ａｎｄ  Ｂｌｕｍｂｅｒｇ  ２００６、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６、４３３〜４６）。ファミリーの密接に関連するタンパク質は、特定のメンバー間で４５％から最大９０％の類似性まで変化する高いアミノ酸類似性を共有する。
【０２６１】
標準的ＦＡＣＳプロトコルを、ビオチン分子および二次薬剤としてのＳｔｒｅｐ−Ａｖｉｄｉｎ  ＡＰＣと結合したＣＭ１０を用いて使用した。ＣＥＡＣＡＭ１、５、６、８を発現している７２１．２２１細胞またはＣＥＡＣＡＭ３、４を一過性発現しているＨＥＫ２９３Ｔをビオチン化ＣＭ１０（１μｇ／ｍｌ）および二次薬剤としてのＳｔｒｅｐ−Ａｖｉｄｉｎ  ＡＰＣで染色した。空のヒストグラムはｍＡｂ染色を表し、赤色ヒストグラムは背景染色を表す。各ヒストグラムに少なくとも１０００個の細胞を使用してＣＭ１０結合を分析した。染色細胞のＭＦＩを背景染色のＭＦＩで割ることによりＦＡＢを計算した。図１３に示す結果は、ＣＭ１０がＣＥＡＣＡＭ１を発現している細胞に強く結合することを明確に示している。ＣＥＡＣＡＭ３および５を発現している細胞で、中等度の染色が観察された。ＣＥＡＣＡＭ４、６、８を発現している細胞で、弱いまたは無視できる結合が示された。
【０２６２】
結論
ＣＭ１０は、ヒトＣＥＡＣＡＭ１、がん、一般に、特に黒色腫に関連することが分かったタンパク質を認識するために開発されたｍＡｂである。数種の悪性腫瘍、特に黒色腫、ＮＳＣＬＣ、甲状腺がんおよび胃がんでＣＥＡＣＡＭ１の過剰発現が確認されている。証拠により、ＣＥＡＣＡＭ１の過剰発現が黒色腫およびＮＳＣＬＣ患者の予後不良と相関し得ることが示されている。ＣＥＡＣＡＭ５は、胃腸、結腸直腸（ＣＲＣ）および膵がんの９０％、非小細胞肺がん細胞の７０％、ならびに乳がんの５０％を含む、多くのヒト腫瘍の高い割合で過剰発現していることが分かった。ＣＥＡＣＡＭ５はまた、甲状腺、胃、卵巣および子宮がんでも過剰発現している（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｇｒｕｎｅｒｔら  １９９１、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ａｎａｌ  ５、３４４〜６６）。ＣＥＡＣＡＭ５は、ＣＲＣの肝臓転移および結腸がんの術後監視のための臨床マーカーとして有用でさえある（Ｄｕｆｆｙ  ２００１、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ４７、６２４〜３０）。ＣＭ１０がＣＥＡＣＡＭ５に結合することができるという証拠は極めて重要であり、４〜５種の悪性腫瘍から１０種超までＣＭ１０により処置することができる可能な適応症を広げることができる。臨床試験に入った抗ＣＥＡＣＡＭ５剤には、種々の悪性腫瘍の診断目的と処置目的の両方のための放射性物質などの毒性物質と接合した抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体が含まれる。これらの毒性接合型でさえ安全性の課題を示さないように思われ、このことはＣＥＡＣＡＭ５が安全な標的であることを示し得る（Ｌｉｅｒｓｃｈら、２００５、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２３（２７）、６７６３〜７０；Ｙｃｈｏｕ  Ｃｌｉｎら  ２００８、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １４（１１）、３４８７〜９３）。他方、これらの薬剤のいずれも腫瘍の免疫学的制御を標的化せず、これはＣＭ１０などのＣＥＡＣＡＭ１とＣＥＡＣＡＭ５の両方に結合することができる抗体により標的化され得る。
【０２６３】
実施例９：ＣＭ１０のエピトープマッピング
標的分子の不連続エピトープを再構築するために、構築ペプチドのライブラリーを合成した。標的分子は、以下の配列を有するヒトＣＥＡＣＡＭ１分子のＮドメインであった：
1      QLTTESMPFN  VAEGKEVLLL  VHNLPQQLFG  YSWYKGERVD  GNRQIVGYAI50
51      GTQQATPGPA  NSGRETIYPN  ASLLIQNVTQ  NDTGFYTLQV  IKSDLVNEEA100
101    TGQFHVYP108（配列番号３５）
【０２６４】
ペプチドを単一ループ、二重ループ、三重ループ、シート状折りたたみおよびこれらの組み合わせに構築することを可能にするＰｅｐｓｃａｎ’ｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｎ  Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ（ＣＬＩＰＳ）技術を使用してライブラリーを合成した（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎら  ２００７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．２０：２８３〜９９およびＳｌｏｏｔｓｔｒａ  １９９６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  １：８７〜９６）。ＣＬＩＰＳ鋳型をシステイン残基に結合させる。ペプチド中の多数のシステインの側鎖を１つまたは２つのＣＬＩＰＳ鋳型に結合させる。例えば、Ｔ２  ＣＬＩＰＳの１,３−ビス（ブロモメチル）ベンゼン中０．５ｍＭ溶液を重炭酸アンモニウム（２０ｍＭ、ｐＨ７．９）／アセトニトリル（１：１（ｖ／ｖ））に溶解する。この溶液をペプチドアレイに添加する。ＣＬＩＰＳ鋳型は、ペプチドアレイ（３μｌウェルで４５５ウェルプレート）の固相結合ペプチド中に存在する２個のシステインの側鎖に結合する。ペプチドアレイを、溶液に完全に被覆しながら、溶液中で３０〜６０分間穏やかに振盪する。最後に、ペプチドアレイを過剰のＨ２Ｏで広範に洗浄し、７０℃でＰＢＳ（ｐＨ７．２）中１％ＳＤＳ／０．１％β−メルカプトエタノールを含有する破壊緩衝液中３０分間超音波処理し、次にＨ２Ｏ中でさらに４５分間超音波処理する。ペプチドを保有するＴ３  ＣＬＩＰＳを、同様であるが３個のシステインを用いる方法で作成した。
【０２６５】
総数３００２個のペプチドを合成した。このペプチドは以下を含む：天然システインがアラニンで置き換えられた全タンパク質の２つの異なる領域を組み合わせたＣＬＩＰＳマトリックスセット；長さ６、１０、１５、２０、２５および３３の直鎖ペプチドセット；中央残基がアラニンで置き換えられた長さ１５の直鎖ペプチドセット；天然システインがアラニンで置き換えられた長さ１５のＣＬＩＰＳ構造的ループセット；および天然システインがアラニンで置き換えられた、アラニンで置き換えられた中央残基を有する長さ１５のＣＬＩＰＳ構造的ループセット。
【０２６６】
抗体の合成ペプチドの各々への結合を、ＰＥＰＳＣＡＮをベースとするＥＬＩＳＡで試験した。ペプチドアレイを一次抗体（ＣＭ１０）溶液と共にインキュベートした（４℃で一晩）。洗浄後、ペプチドアレイを抗体ペルオキシダーゼ複合体の１／１０００希釈と共に２５℃で１時間インキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ基質２，２’−アジノ−ジ−３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸（ＡＢＴＳ）および２μｌ／ｍｌの３％Ｈ２Ｏ２を添加した。１時間後、発色を測定した。発色は、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラおよび画像処理システムを用いて定量化した。
【０２６７】
ＣＣＤから得られる値は、０〜３０００ｍＡＵに及び、標準的９６ウェルプレートＥＬＩＳＡリーダーと類似である。結果を定量化し、Ｐｅｐｌａｂデータベースに保存する。二次元マップで変数がとる値を色として表すデータのグラフ表示を使用して、結合値を分析のために抽出する。
【０２６８】
観察された結合パターンに基づいて、ＣＭ１０．Ｓ９１のエピトープのコアは、残基17VLLLVHNLPQQLF29からなる。二次結合領域は、68YPNASLLIQNVT79の周りの配列で観察された。観察された結合パターンを標的タンパク質の利用可能な結晶構造と比較すると、ＣＭ１．Ｓ９１についての不連続エピトープが68PNASLLI75（担体）と共に17VLLLVHNLPQQLF29（コア）からなることが提案される。
【０２６９】
実施例１０：ＣＭ１０の活性を評価する追加の実験
潜在的ＰＤマーカーとしてのエフェクター細胞によるグランザイムＢ分泌
堅牢な薬力学的（ＰＤ）マーカーの開発は、臨床試験における薬物の成功を改善するために重要であり、有効性と毒性の釣り合いを取る最適な薬物用量の選択を補佐する。ＰＤマーカーは通常、分子経路において薬物標的に近位であり、治療効果にかかわらず薬物の効果を測定するために使用される。グランザイムＢは、特異的標的を認識すると、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）およびＮＫ細胞の細胞質顆粒を通して放出されるセリンプロテアーゼである。これが、今度は標的細胞のアポトーシスを媒介する。本発明者らは、ＣＭ１０が特異的標的細胞の存在下でエフェクターＮＫおよびＴ細胞からのグランザイムＢ分泌を増強し、したがって抗体による標的に死滅の増強が観察されることを可能にするかどうかを決定しようとした。
【０２７０】
ＴＩＬをＣＭ１０（０．２μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌもしくは１０μｇ／ｍｌ）またはアイソタイプ一致対照Ａｂ（ＩＰＩ−イピリムマブ１０μｇ／ｍｌ）と共に３７℃で３０分間インキュベートした。ＣＥＡＣＡＭ１を発現している標的陽性黒色腫細胞およびＨＬＡ−Ａ２−ＳＫｍｅｌ５を２．５：１のエフェクター対標的比で一晩のインキュベーションに添加した。グランザイムＢ分泌をＥＬＩＳＡにより測定した。結果は、１処理当たり６反復からのグランザイムＢ放出値の平均±Ｓ．Ｅ．を表す。別の独立した実験でも同様の結果が見られた。
【０２７１】
図１５に示すように、ＴＩＬは、ＣＭ１０単独の存在下で低いままであった低い初期レベルのグランザイムＢを分泌する。標的細胞をＴＩＬに添加した場合にのみ、グランザイムＢは劇的に上昇した。しかし、ＣＭ１０は、グランザイムＢ分泌を高い初期レベルより上に有意に増加させることができた。ＮＫ９２ＭＩ細胞をエフェクター細胞として使用した場合にも同様の結果が見られ、ＣＭ１０がＮＫ細胞からのグランザイムＢ分泌を同様の様式で増強することができることを示している。生体内モデルおよび患者標本を含む補完的セットの実験で、ＣＭ１０処理に対するＰＤマーカーとしてのグランザイムＢの使用も調べる。
【０２７２】
ＣＭ１０はＣＥＡＣＡＭ１−ＣＥＡＣＡＭ５相互作用を遮断する
癌胎児性抗原（ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５およびＣＤ６６ｅ）は、種々の型のがん、特に結腸直腸癌、ならびに胃腸、膵がん、非小細胞肺がん、乳がん、甲状腺、胃および卵巣がんと関連することが分かっている。がん診断および治療のための標的となる分子が開発されてきた。
【０２７３】
ＭＨＣ−Ｉ欠損黒色腫細胞系とＮＫ細胞との間の同種アフィニティＣＥＡＣＡＭ１相互作用は、ＮＫ細胞によるがん細胞の死滅を有意に阻害した（Ｍａｒｋｅｌら  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２；１６８：２８０３〜２８１０）。同様に、ＨＬＡクラスＩ欠損７２１．２２１細胞の強制発現もＮＫ媒介細胞傷害を抑制し（Ｓｔｅｒｎら  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５；１７４：６６９２〜６７０１）、ＣＥＡＣＡＭ５−ＣＥＡＣＡＭ１異種アフィニティ相互作用も免疫細胞における阻害性ＣＥＡＣＡＭ１シグナル伝達を誘因することができることを示している。
【０２７４】
ＣＥＡＣＡＭ１陽性細胞系（ＳＫｍｅｌ５）をアイソタイプ対照または種々の濃度のＣＭ１０と共にインキュベートし、結合していないＣＭ１０を２回洗浄し、次に可溶性ビオチン化ＣＥＡＣＡＭ５を用いてまたは用いずにインキュベートした。ビオチン化ＣＥＡＣＡＭ５の細胞への結合は、二次ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ−ＡＰＣおよびＦＡＣＳ分析により検出した。結果は、複製ウェルの平均±ＳＥを表す。２つの他の独立した実験でも同様の結果が得られた。
【０２７５】
図１６の結果は、ＣＭ１０がＣＥＡＣＡＭ１とＣＥＡＣＡＭ５との間の結合を用量依存的様式で阻害することを示している。そのため、ＣＭ１０を使用して高レベルのＣＥＡＣＡＭ５を発現し、免疫細胞を抑制するためにＣＥＡＣＡＭ１−ＣＥＡＣＡＭ５軸を利用している悪性腫瘍を処置することができる。
【０２７６】
ＣＭ１０はＨＬＡ拘束性Ｔ細胞死滅を増強する
細胞傷害性Ｔ細胞は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植拒絶にも関与する。これらの細胞は、体のほぼ全細胞の表面上に存在するＨＬＡ分子と関連する抗原に結合することによりその標的を認識する。感染細胞または悪性細胞の死滅には、適切な応答を発生させるためにいくつかの経路を採用することを要する。
【０２７７】
このアッセイのセットは、ＣＭ１０がＨＬＡ拘束性のあるいは免疫系の全体的刺激を引き起こす「天然」ＣＴＬ活性を増強するかどうかを決定しようとしたものである。
【０２７８】
ＴＩＬをＣＭ１０（０．２μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌもしくは１０μｇ／ｍｌ）またはアイソタイプ一致対照抗体と共に３７℃で３０分間インキュベートした。ＣＥＡＣＡＭ１を発現している標的陽性黒色腫細胞ＳＫｍｅｌ５およびＨＬＡ−Ａ２を、ＨＬＡ−Ａ２遮断モノクローナル抗体を用いてまたは用いずに１時間プレインキュベートし、２．５：１のエフェクター対標的比で一晩のインキュベーションに添加した。標準的ＬＤＨ放出アッセイにより死滅を測定した。結果は、１処理当たり３反復からのＬＤＨ放出値の平均±Ｓ．Ｅ．を表す。
【０２７９】
図１７の結果は、ＨＬＡ−Ａ２遮断抗体の存在下で、ＣＭ１０がＴＩＬによる黒色腫細胞死滅を増大させることができなかったこと、およびＣＭ１０の活性がＨＬＡ拘束性であることを示している。別の独立した実験でも同様の結果が見られた。そのため、これらの結果によると、ＣＭ１０が生体内での悪性細胞に対するＣＴＬの活性を改善し、免疫系の非特異的活性化を促進しないことが示唆される。
【０２８０】
ＣＭ１０の免疫調節活性が生体内で腫瘍成長を阻害する
新規な抗がん剤の生体内での作用を評価するために最も広く使用されているモデルの１つは、ヒト腫瘍異種移植片モデルである。このモデルでは、ヒト腫瘍細胞を、ヒト細胞を拒絶しない免疫無防備状態のマウスの皮膚下に移植する。注射する細胞の数および細胞の増殖速度に応じて、腫瘍は数週間にわたって成長し、適当な治療レジメンに対する応答を生体内で試験することができる。腫瘍形成の初期段階の処理を伴うモデルの利点は、患者における転移の広がりにより類似し得る設定で薬剤の影響を試験する、および処理の初期腫瘍移植への効果を確認する機会があることである。
【０２８１】
そのため、生体内でのＣＭ１０の免疫調節活性を、予防的処置体制下でヒト黒色腫細胞を移植したＳＣＩＤ−ＮＯＤマウスで調査した。ＳＣＩＤ−ＮＯＤマウスを図１８に示す５つの処置群に従ってランダム化した。６Ｘ１０６個のＳＫｍｅｌ５細胞（黒色腫細胞系）を０日にＳＣ注射した。マウスを図に示すように抗体／ＴＩＬで処理した。矢印は投与時間を示し、薄い矢印は抗体−０．２５ｍｇ／マウス／注射（ＣＭ１０、ＩｇＧ対照およびイピリムマブ対照）を表し、広い矢印はＴＩＬ（１注射当たり１マウス当たり２０Ｘ１０＾６個の細胞）を表す。腫瘍体積を１週間当たり２〜３回盲検的に測定した。結果は、１群当たり８〜９匹のマウスからの平均腫瘍体積±ＳＥを表す。
【０２８２】
図１８は、養子ヒトＴ細胞移入とＣＭ１０の組み合わせが有意な相乗作用を示し、アイソタイプ対照群と比較して強力に異種移植片成長を阻害した（６９％ＴＧＩ）ことを示している。この結果は、ＣＭ１０が単一薬剤としても効果を有し（３２日で４５％ＴＧＩ）、おそらくは増殖、血管新生を阻害することによりまたは他の生物学的経路を通して腫瘍細胞または腫瘍の周囲に直接作用したことを示している。
【０２８３】
同じ実験セットで、実験終了日に腫瘍の総重量を測定した。得られた結果は体積測定値を支持し、ＴＩＬ＋ＣＭ１０処理群の腫瘍量の劇的減少およびＣＭ１０処理群の腫瘍重量の統計学的に有意な減少も示している。
【０２８４】
ＣＭ１０はＮＫ細胞のＣＥＡＣＡＭ１陽性膵がん細胞系への免疫調節死滅活性を増強する
予備的スクリーニングにより、膵がん細胞系および患者標本が高レベルのＣＥＡＣＡＭ１を発現していることが示された（膵がん標本の９４％がＣＥＡＣＡＭ１陽性であった）。そのため、ＣＭ１０が膵がん細胞系に対する免疫細胞の活性を増強することができるかどうかを調べるための実験を行った。異なるＣＥＡＣＡＭ１陽性標的膵がん細胞系との、種々の濃度のＣＭ１０で前処理したＮＫ９２ＭＩ細胞の共培養により、死滅アッセイを行った。ＮＫ９２ＭＩをＣＭ１０（０．２μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌもしくは１０μｇ／ｍｌ）またはアイソタイプ一致対照Ａｂ（１０μｇ／ｍｌ）と共に３７℃で３０分間インキュベートした。Ａ．ＣＥＡＣＡＭ１を発現している標的細胞を、２．５：１のエフェクター対標的比（ＣＯＬＯ−３５７）でさらに５時間または５：１のエフェクター対標的比（ＢＸＰＣ３）で一晩添加した。結果は、１処理当たり３複製からの古典的ＬＤＨ放出アッセイにより決定される細胞傷害％の平均±Ｓ．Ｅ．を表す。
【０２８５】
図１９に表す結果は、ＮＫ細胞による膵がん細胞の死滅は比較的低かったが、ＣＭ１０がこの活性をベースラインの細胞傷害（ＰＢＳまたは対照Ａｂ）から最大で２倍まで増強したことを示している。追加の２つの系でも同様の結果が見られた。
【０２８６】
ＣＭ１０はＣＥＡＣＡＭ１陽性膵がん細胞系の存在下でＮＫ細胞のグランザイムＢ分泌を増強する
黒色腫細胞と同様に、ＣＭ１０が膵がん細胞の存在下でＮＫ細胞からのグランザイムＢの分泌を増強することができるかどうかを決定するための実験を設計した。死滅アッセイと同様の設定で、ＮＫ細胞を種々の濃度のＣＭ１０で前処理し、次いで、４種の異なる標的膵がん細胞系と共培養した。特異的ＥＬＩＳＡにより上清のグランザイムＢ含量を分析した。ＮＫ９２ＭＩをＣＭ１０（０．２μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌもしくは１０μｇ／ｍｌ）またはアイソタイプ一致対照抗体（１０μｇ／ｍｌ）と共に３７℃で３０分間インキュベートした。ＣＥＡＣＡＭ１を発現している標的膵臓細胞を、２．５：１のエフェクター対標的比Ａ．（ＣＯＬＯ−３５７およびＡＳＰＣ−１）とＢ．（ＳＵ８６８６）または１０：１のＥ：Ｔ  Ｃ．（ＢＸＰＣ３）でさらに５時間添加した。グランザイムＢ分泌をＥＬＩＳＡにより測定した。結果は、１処理当たり２〜６複製からのグランザイムＢ放出値の平均±Ｓ．Ｅ．を表す。
【０２８７】
図２０は、ＣＭ１０が膵がん細胞の存在下でＮＫ細胞からのグランザイムＢ分泌を増加させることを明確に示している。
【０２８８】
実施例１１：ヒト化およびヒト抗体
ヒト化抗体は、典型的には非ヒトＣＤＲが移植されたヒトフレームワークを有する。したがって、ヒト化抗体は、ヒト以外の源から導入された１個または複数のアミノ酸配列を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は通常、「移入」残基と呼ばれ、これらは典型的には「移入」可変ドメインから得られる。ヒト化は、齧歯動物ＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより、本質的にはＷｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法に従って行うことができる（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５、１９８６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２７、１９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４〜１５３６、１９８８）。したがって、前記「ヒト化」抗体は、実質的に完全ヒト可変ドメイン未満がヒト以外の種からの対応する配列により置換されたキメラ抗体である（米国特許第４８１６５６７号）。実際、ヒト化抗体は、典型的にはいくつかのＣＤＲ残基およびおそらくはいくつかのＦＲ残基が齧歯動物抗体中の類似部位からの残基により置換されているヒト抗体である。
【０２８９】
ヒト化抗体を作成するために使用される、軽鎖と重鎖の両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低下させるために極めて重要である。いわゆる「最良適合」法によると、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングする。次いで、齧歯動物のものに最も近いヒト配列をヒト化抗体用のヒトフレームワーク（ＦＲ）と認める（Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１：２２９６、１９９３；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１、１９８７）。別の方法は、特定のサブグループの軽鎖または重鎖の全ヒト抗体のコンセンサス配列由来の特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用することができる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４２８５、１９９２；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１：２６２３、１９９３）。
【０２９０】
抗体を抗原との高いアフィニティおよび他の好ましい生物学的特性を保持しながらヒト化することがさらに重要である。この目的を達成するために、好ましい方法によると、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを使用して親配列および種々の概念的ヒト化産物を分析する方法によりヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルが一般的に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の可能な三次元形態構造を説明し示すコンピュータプログラムが利用可能である。これらのディスプレイの検査により、候補免疫グロブリンの機能における残基のもっともらしい役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。こうして、ＦＲ残基をレシピエントから選択し組み合わせ、所望の抗体特性、例えば標的抗原に対するアフィニティ増加が得られるように配列を移入することができる。一般に、ＣＤＲ残基は抗原結合に影響を及ぼすことに直接的およびほとんど実質的に関与している。
【０２９１】
あるいは、免疫化すると、内因性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体の全レパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を製造することがここで可能である。例えば、キメラおよび生殖細胞系突然変異マウスの抗体重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合欠損により、内因性抗体産生の完全な阻害がもたらされることが記載されている。前記生殖細胞系突然変異マウスへのヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの移入により、抗原攻撃時にヒト抗体の産生がもたらされる（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：２５５１、１９９３；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：２５５〜２５８、１９９３；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．、７：３３、１９９３；およびＤｕｃｈｏｓａｌら  Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：２５８、１９９２）。ヒト抗体をファージディスプレイライブラリーから得ることもできる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１、１９９１；Ｍａｒｋｓ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１  ５９７  １９９１；Ｖａｕｇｈａｎら  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １４：３０９、１９９６）。
【０２９２】
実施例１２．抗体フラグメント
抗体フラグメントを産生するための種々の技術が開発されてきた。伝統的には、これらのフラグメントは、完全抗体のタンパク質分解を通して得られた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７〜１１７、１９９２およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：８１、１９８５）。しかしながら、これらのフラグメントは現在、組換え宿主細胞により直接産生することができる。例えば、抗体フラグメントを上記抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントを大腸菌から直接回収し、化学的に結合してＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成することができる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３〜１６７、１９９２）。別の手法によると、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを組換え宿主細胞培養液から直接単離することができる。抗体フラグメントを産生するための他の技術は当業者に明らかである。他の実施形態では、好まれる抗体は単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。
【０２９３】
実施例１３．ウイルス感染症に対する抗ＣＥＡＣＡＭ抗体の能力
以下の実験を使用してウイルス感染症に対するＣＭ１０の能力を測定する。実験は異なる標的細胞、種々のウイルスならびにいくつかの生体内および試験管内モデルを含む。
検出／診断：ＦＡＣＳ分析、ＲＴ  ＰＣＲおよび免疫組織化学による、異なるウイルス型に感染した細胞系および一次細胞におけるＣＥＡＣＡＭ発現レベルの調査。
予防：抗ＣＥＡＣＡＭ抗体との標的細胞のプレインキュベーションならびにウイルス感染後のウイルス負荷またはウイルス複製の測定。
処理：ウイルス感染後、感染細胞を免疫系細胞と共にインキュベートし、エフェクター細胞の死滅能力およびウイルス負荷を調べる。さらに、ウイルス感染および抗ＣＥＡＣＡＭ抗体による処理後にウイルス負荷および複製および全生存を生体内で測定する。
【０２９４】
上に記載した具体的な実施形態の説明により、本発明の一般的性質が完全に明らかになるので、現在の知識を適用することにより、過度の実験を行うことなくまた一般概念から逸脱することなく具体的な実施形態を容易に修正する、および／または種々の用途に適合させることができる。このため、前記適合および修正は、開示する実施形態の同等物の意味および範囲に包含されるべきであり、そのように意図されている。本明細書で使用する文言および用語は、説明を目的とするものであり、限定を目的としないことを理解すべきである。種々の開示する機能を実施するための手段、材料およびステップは、本発明から逸脱することなく、各種の代替形態をとることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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