(57)【要約】  本発明は、シュードモナス・エルジノーサ感染の診断および／またはシュードモナス・エルジノーサ感染に関連した疾患の予防／治療において使用される、シュードモナス・エルジノーサ外膜タンパク質ＯｐｒＭに由来するペプチド抗原に関する。ＯｐｒＭ外側ループに由来するペプチド抗原およびその誘導体または断片を使用するシュードモナス・エルジノーサに対する免疫応答の誘導方法も本発明に含まれる。本発明の方法を実施するために使用される組成物も含まれる。
2015509083.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＯｐｒＭの外側ループを含む１以上のポリペプチドの免疫学的有効量及び医薬上許容される担体を含む組成物。
【請求項２】
ＯｐｒＭが配列番号５である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
１以上のポリペプチドが、配列番号１および２からなる群から選択される外側ループを含む、請求項１〜２のいずれか１項記載の組成物。
【請求項４】
１以上のポリペプチドが、外側ループに隣接している１０個までのアミノ酸残基を更に含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項５】
１以上のポリペプチドが配列番号３または４を含む、請求項４記載の組成物。
【請求項６】
ＯｐｒＭ外側ループを含むポリペプチドが担体タンパク質にコンジュゲート化されている、請求項１〜５のいずれか１項記載の組成物。
【請求項７】
担体タンパク質がＫＬＨである、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
組成物がアジュバントを更に含む、請求項１〜７のいずれか１項記載の組成物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項記載の組成物の免疫学的有効量を患者に投与する工程を含む、シュードモナス・エルジノーサ感染に対して患者において防御免疫応答を誘導する方法。
【請求項１０】
患者がヒトである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
患者が、嚢胞性線維症患者、熱傷患者、入院患者、手術を受けている患者、ベンチレータを使用している患者、および免疫低下を示す患者からなる群から選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
免疫低下を示す患者がＨＩＶまたはエイズを有する、または癌患者である、または移植レシピエントである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
シュードモナス・エルジノーサ感染に対して患者において防御免疫応答を誘導するための医薬の製造における、請求項１〜８のいずれか１項記載の１以上の組成物の使用。
【請求項１４】
１以上のポリペプチドが、配列番号１および２からなる群から選択される外側ループを含む、請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
１以上のポリペプチドが、外側ループに隣接している１０個までのアミノ酸残基を更に含む、請求項１３〜１４のいずれか１項記載の使用。
【請求項１６】
１以上のポリペプチドが配列番号３または４を含む、請求項１５記載の使用。
【請求項１７】
ＯｐｒＭ外側ループを含む１以上のポリペプチドが担体タンパク質にコンジュゲート化されている、請求項１３〜１６のいずれか１項記載の使用。
【請求項１８】
担体タンパク質がＫＬＨである、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
シュードモナス・エルジノーサＯｐｒＭの外側ループに特異的に結合する１以上の抗体を患者に投与することを含む、患者においてシュードモナス・エルジノーサ感染に対する受動免疫を付与する方法。
【請求項２０】
１以上の抗体がモノクローナル抗体である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
１以上の抗体が、ヒト抗体およびヒト化抗体からなる群から選択される、選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
１以上の外側ループが、配列番号１および２からなる群から選択される、請求項１９〜２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
ａ）患者から生物学的サンプルを集め、
ｂ）シュードモナス・エルジノーサＯｐｒＭの外側ループに結合する抗体と生物学的サンプルを、免疫複合体の形成を可能にする条件下で接触させ、
ｃ）生物学的サンプルへの抗体の結合を検出することを含む、患者におけるシュードモナス・エルジノーサ感染を検出する方法であって、前記の結合が患者におけるシュードモナス・エルジノーサ感染の存在を示す、方法。
【請求項２４】
生物学的サンプルが、喀痰、気管内吸引物、細気管支洗浄液、気道サンプル、尿、血液、血漿、唾液、膿、腹水、創傷滲出液、腹腔液、腹部液および涙からなる群から選択される、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ＯｐｒＭが配列番号５である、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
外側ループが、配列番号１および２からなる群から選択される、請求項２３〜２５のいずれか１項記載の方法。
【請求項２７】
抗体がポリクローナルまたはモノクローナル抗体である、請求項２３〜２６のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）感染の診断、予防および／または治療に使用されるシュードモナス・エルジノーサ外膜タンパク質ＯｐｒＭに由来するペプチド抗原に関する。ＯｐｒＭに由来するペプチド抗原およびその誘導体または断片を使用してシュードモナス・エルジノーサに対する免疫応答を誘導する方法も本発明に含まれる。
【背景技術】
【０００２】
シュードモナス・エルジノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）は、健常人においては稀にしか疾患を引き起こさないが、重病または免疫無防備状態の個体では重大な問題となる日和見病原体である。シュードモナス・エルジノーサが細菌による反復性および慢性気道感染症から生じる肺機能の進行性喪失の原因因子である、嚢胞性線維症を有する個体においては、感染は重大な問題である。シュードモナス・エルジノーサ感染のリスクを有する他の者には、機械的ベンチレータを使用している患者、カテーテル装着患者、癌患者、臓器移植レシピエントおよび熱傷患者が含まれる。シュードモナス・エルジノーサは全院内感染の１０％〜２０％を占める（Ｃｏｒｎｅｌｌｓ  Ｐ（編）（２００８）．Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ：Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１ｓｔ  ｅｄ．）．Ｃａｉｓｔｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）。
【０００３】
現在、シュードモナス・エルジノーサ感染は、抗生物質、特に薬物の組合せを用いることにより防除可能である。しかし、一般的な抗生物質の幾つかに対する耐性が示されており、集中治療室においては特に問題である。
【０００４】
シュードモナス・エルジノーサポリペプチド配列に関する情報はシュードモナス・エルジノーサゲノムの配列決定から得られている（Ｓｔｏｖｅｒら，２０００，Ｎａｔｕｒｅ  ４０６（６７９９）：９５９−６４およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＥ００４０９１）。シュードモナス・エルジノーサは、ＭｅｘＡＢ−ＯｐｒＭ多薬剤輸送体を含む幾つかの輸送体をコードしている。この輸送体は、構成的に発現される唯一の流出ポンプであり、この生物における固有の多剤耐性において中心的な役割を果たしている（Ｓｒｉｋｕｍａｒら，２０００，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２：１４１０−１４およびＳａｉｔｏら，１９９９，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１７９：６７−７２）。この輸送体は３つのサブユニットタンパク質ＭｅｘＡ、ＭｅｘＢおよびＯｐｒＭからなる。外膜上に位置する唯一のサブユニットはＯｐｒＭである（Ｍｏｒｓｈｅｄら，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２１０：３５６−６２およびＰｏｏｌｅら，１９９３，Ｊ．Ｂａｔｅｒｉｏｌ．１７５：７３６３−７２）。外膜タンパク質ＯｐｒＭは結晶化されており、その構造はＡｋａｍａら，２００４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：５２８１６−９において報告されている。構造は、ＯｐｒＭが、生物の表面に露出した２つの外側ループを有することを示している。
【０００５】
現在、シュードモナス・エルジノーサ感染の診断は、臨床所見、微生物培養および生化学試験に基づくものである。患者からの直接塗抹のグラム染色はほとんど又は全く役立たない。実際、現在のところ最も信頼されうる方法は、純粋培養での細菌の単離、およびそれに続く生化学的または血清学的方法によるその同定である。通常の実験室用培養技術は、肉眼的に検出可能なレベルまで生物を増殖させるために臨床サンプルを約２４〜約４８時間インキュベートすることを含む。ついで、シュードモナス・エルジノーサを関連シュードモナスおよび他の腸管内細菌から識別するために継代培養技術および代謝アッセイが要求され、更に２４〜４８時間を要しうる。したがって、シュードモナス・エルジノーサ感染の迅速かつ正確な診断が非常に望まれているが、現在のところ、既存の試薬および技術を用いては不可能である。
【０００６】
本出願において引用されている参考文献は、特許請求している本発明に対する先行技術であることを自認するものではない。
【発明の概要】
【０００７】
発明の概括
本発明は、患者におけるシュードモナス・エルジノーサによる感染またはそのような感染に関連した病状を治療するおよび／または感染の可能性を減少させるための組成物および方法に関する。本発明の方法は、防御免疫応答を生成させるために、ＯｐｒＭ外側ループを含むポリペプチド、その誘導体または断片を含む組成物をそれを要する患者に投与することを含む。もう１つの実施形態においては、本発明の方法は、受動免疫を要する患者に受動免疫を付与するために、ＯｐｒＭ外側ループに特異的に結合する抗体を投与することを含む。
【０００８】
したがって、本発明の１つの態様においては、ＯｐｒＭ外側ループを含む単離されたポリペプチド、その誘導体または断片及び医薬上許容される担体を含む組成物を提供する。好ましくは、組成物は医薬組成物、例えばワクチンである。
【０００９】
本発明の特定の実施形態においては、ＯｐｒＭ外側ループを含む単離されたポリペプチド、その誘導体または断片を含む組成物中に１以上の追加的な抗原が配合されている。存在しうる追加的抗原には、１以上の追加的なシュードモナス・エルジノーサ免疫原、他のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）生物からの１以上の免疫原、および／または他の感染性生物からの１以上の免疫原が含まれる。
【００１０】
本発明のもう１つの態様においては、ＯｐｒＭ外側ループに特異的に結合する抗体を含む組成物を提供する。好ましくは、抗体はヒトまたはヒト化モノクローナル抗体である。
【００１１】
本発明はまた、患者におけるシュードモナス・エルジノーサ感染を検出または診断する方法を含む。そのような方法は、生物学的サンプルを患者から得、サンプル中にＯｐｒＭ外側ループが存在するかどうかを決定することを含む。１つの実施形態においては、生物学的サンプルを、ＯｐｒＭ外側ループに結合する抗体と接触させ、生物学的サンプルへの抗体結合はシュードモナス・エルジノーサの存在を示す。本発明の検出／診断方法において使用される抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルでありうる。もう１つの実施形態においては、シュードモナス・エルジノーサの存在を示すために、ＯｐｒＭ外側ループをコードする核酸の存在を生物学的サンプルにおいて検出する。もう１つの実施形態においては、生物学的サンプルを、ＯｐｒＭ外側ループに結合するアプタマーと接触させ、生物学的サンプルへのアプタマー結合はシュードモナス・エルジノーサの存在を示す。本発明の検出／診断方法において使用されるアプタマーは、核酸またはペプチドアプタマーでありうる。
【００１２】
本発明の他の特徴および利点は、種々の実施例を含む本明細書に記載されている追加的な説明から明らかである。記載されている実施例は、本発明の実施において有用な種々の成分および方法を例示する。実施例は、特許請求されている本発明を限定するものではない。本開示に基づいて、当業者は、本発明の実施に有用な他の成分および方法を特定し使用することが可能である。
【００１３】
発明の詳細な説明
ＯｐｒＭは、２つの表面露出ループを含有するシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の表面上の膜貫通タンパク質である。ＯｐｒＭの完全長アミノ酸配列は２４個のシュードモナス・エルジノーサ臨床分離体における相違を示した。しかし、外側ループのアミノ酸配列は、２４個の臨床分離体の全てにおいて１００％同一であると決定された。外側ループは哺乳動物において免疫原性である。
【００１４】
本明細書中で用いる「ＯｐｒＭ」なる語は、ＭｅｘＡおよびＭｅｘＢと共にＭｅｘＡＢ−ＯｐｒＭ多薬剤輸送体流出ポンプの成分であるシュードモナスの表面上の内在性膜タンパク質を意味する。この語はシュードモナス・エルジノーサのＰＡＯ１株からの配列番号５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＧ０３８１６）のポリペプチドまたはシュードモナス・エルジノーサ株からの天然に存在する対立遺伝子変異体もしくはホモログを含む。シュードモナス・エルジノーサの他の株の例には、ＣＬ５６７３、ＣＬ５７２７、ＣＬ５７２８、ＣＬ５７２９、ＣＬ５７３０、ＣＬ５７３１、ＣＬ５７３２、ＣＬ５７３３、ＣＬ５７３４、ＣＬ５７３６、ＣＬ５７３７、ＣＬ５７３９、ＣＬ５７０１、ＣＢ０４６、ＣＢ３９１、ＣＢ３９２、ＣＢ３９８、ＣＬＢ２４２２８、ＣＬＢ２４３８８、ＬＥＳＢ５８、ＰＡ７およびＵＣＢＰＰ−ＰＡ１４が含まれる。１つの実施形態においては、ＯｐｒＭは配列番号５である。
【００１５】
本明細書中で用いる「外側ループ」なる語は、ＯｐｒＭの外部に面している２つの表面露出ループを意味する。外側ループの位置は、ＯｐｒＭの結晶構造に基づいて決定された（Ａｋａｍａら，２００４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９：５２８１６−９）。外側ループ１（配列番号１）は配列番号５のアミノ酸残基１１７−１２６である。外側ループ２（配列番号２）は配列番号５のアミノ酸残基３２８−３３６である。
【００１６】
１つの実施形態においては、シュードモナス・エルジノーサ感染の治療および／または感染の可能性の低減のためのワクチンとして、１以上のＯｐｒＭ外側ループを含むポリペプチド、その誘導体または断片が使用される。本発明の方法は、免疫応答を誘導するために、本発明のワクチンを含む組成物をそれを要する患者に投与することを含む。
【００１７】
本明細書中で用いる「免疫応答を誘導する」なる語は、ポリペプチド、その誘導体または断片が、それが投与された患者、好ましくは哺乳動物において免疫応答を生成しうることを意味し、応答は、シュードモナス・エルジノーサまたはポリペプチド、その誘導体もしくは断片に特異的に結合する抗体のような成分の産生を含むが、これに限定されるものではない。免疫応答は、シュードモナス・エルジノーサ感染に対する防御効果をもたらし、シュードモナス・エルジノーサ感染に関連した少なくとも１つの病状を改善し、および／または患者がシュードモナス・エルジノーサ感染に罹る可能性を低減する。
【００１８】
本明細書中で用いる「免疫学的有効量」なる語は、患者に投与された場合にシュードモナス・エルジノーサに対する防御免疫応答を誘導しうる免疫原の量を意味する。量は、シュードモナス・エルジノーサ感染の可能性または重症度を有意に低減するのに十分なものであるべきである。免疫原の投与の防御効果を評価するためには、当技術分野で公知の動物モデルが使用されうる。動物モデルには、げっ歯類肺感染モデル（例えば、Ｈｏｆｆｍａｎｎら，２００５，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７３：２５０４−１４；Ｋｕｋａｖｉｃａ−ＩｂｒｕｌｊおよびＬｅｖｅｓｑｕｅ，２００８，Ｌａｂ．Ａｎｉｍａｌ  ４２：３８９−４１２ならびにＫｕｋａｖｉａ−Ｉｂｒｕｌｊら，２００８，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９０：２８０４−１３を参照されたい）、マウス大腿感染モデル（Ｆａｎｔｉｎら，１９９１，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３５：１４１３−２２およびＳｕｇｉｈａｒａら，２０１１，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５５：５００４−９）およびげっ歯類生存アッセイ（Ｆａｒｉｎｈａら，１９９４，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６２：４１１８−２３）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００１９】
もう１つの実施形態においては、抗体を産生させるための標的として、ＯｐｒＭ外側ループ、その誘導体または断片が使用される。これらの抗体は、受動免疫によるシュードモナス・エルジノーサ感染の治療および／または感染の可能性の低減のために患者に投与されうる。
【００２０】
本明細書中で用いる「受動免疫」なる語は、抗体の形態での能動的体液性免疫の転移を意味する。受動免疫は、投与された抗体により認識される病原体に対する即時型防御効果を患者にもたらし、および／または病原体の感染に関連した少なくとも１つの病状を改善する。しかし、患者は病原体に対する免疫記憶を生成せず、したがって、病原体に対する防御が持続するためには、投与抗体の投与を受け続けなければならない。好ましい実施形態においては、受動免疫を付与するために、モノクローナル抗体、より好ましくはヒトまたはヒト化抗体を患者に投与する。
【００２１】
もう１つの実施形態においては、患者におけるシュードモナス・エルジノーサ感染を検出／診断するために、生物学的サンプル中のＯｐｒＭ外側ループの存在を用いる。１以上のＯｐｒＭ外側ループの検出方法は、生物学的サンプルをＯｐｒＭ外側ループタンパク質またはＯｐｒＭ外側ループタンパク質をコードする核酸を検出する物質と接触させることを含む。物質には、抗体（例えば、モノクローナルまたはポリクローナル）、プライマーおよびアプタマー（すなわち、核酸またはペプチド）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２２】
本明細書中で用いる「生物学的サンプル」なる語は、患者から採集された喀痰、気管内吸引物、細気管支洗浄液、気道サンプル、尿、血液、血漿、唾液、膿、腹水、創傷滲出液、腹腔液、腹部液および涙を意味する。
【００２３】
本明細書中で用いる「アプタマー」なる語は、特定の三次元コンホメーションをとり、関心のある分子（例えば、ＯｐｒＭ外側ループ）に特異的に標的化／結合する能力に関して選択された小さな核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）またはペプチド分子を意味する（Ｓｏｎｇら，２０１２，Ｓｅｎｓｏｒｓ  １２：６１２；Ｂｉｎｎｉｎｇら，２０１２，Ｆｒｏｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３：２９；Ｍａｓｃｉｎｉら，２０１２，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ５１（６）：１３１６−３２）。
【００２４】
実施形態はまた、（ａ）療法（例えば、人体の療法）、（ｂ）医薬、（ｃ）シュードモナス・エルジノーサの複製の抑制、（ｄ）シュードモナス・エルジノーサによる感染の治療または予防、あるいは（ｅ）シュードモナス・エルジノーサ関連疾患の治療、予防または発現もしくは進行の遅延における、（ｉ）使用のための、（ｉｉ）医薬としての使用のための、または（ｉｉｉ）医薬の製造における使用のための、１以上の本明細書に記載されているポリペプチド免疫原またはその組成物、免疫原または組成物を含む又はそれらからなるワクチンを含む。これらの使用においては、ポリペプチド免疫原、その組成物、および／または免疫原もしくは組成物を含む若しくはそれらからなるワクチンは、所望により、１以上の抗細菌物質（例えば、抗細菌化合物、組合せワクチン（後記のもの））と共に使用されうる。
【００２５】
ポリペプチド
シュードモナス・エルジノーサ株ＰＡＯ１からの野生型完全長ＯｐｒＭのアミノ酸配列は、配列番号５である。ＯｐｒＭ外側ループ１および２のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１および２である。１以上のＯｐｒＭ外側ループを含むポリペプチドが本発明の方法において使用されうる。２以上のＯｐｒＭ外側ループを含むポリペプチドは、互いに隣接した又はリンカーアミノ酸配列により隔てられた外側ループを有しうる。
【００２６】
ＯｐｒＭ内の外側ループに隣接した１０個までのアミノ酸残基を含有するＯｐｒＭ外側ループを含むポリペプチドも、本発明の方法において使用されうる。追加的アミノ酸残基は、外側ループのＮ末端およびＣ末端の一方または両方に存在しうる。１つの特定の実施形態においては、ＯｐｒＭ外側ループ１は、ループのＮ末端に含まれる２個のアミノ酸残基、およびＣ末端に含まれる１個のアミノ酸残基を有しうる（配列番号３）。もう１つの特定の実施形態においては、ＯｐｒＭ外側ループ２は、ループのＮ末端に含まれる１個のアミノ酸残基、およびＣ末端に含まれる３個のアミノ酸残基を有しうる（配列番号４）。
【００２７】
ＯｐｒＭ外側ループの誘導体および断片も本発明の方法において使用されうる。配列番号１および２の誘導体および断片は「改変ポリペプチド」と総称される。
【００２８】
本明細書中で用いる「単離されたペプチド」なる語は、ペプチドの天然源に存在するその他のアミノ酸配列の少なくとも幾つかから分離されたペプチドを示す。好ましくは、「単離されたペプチド」は、ペプチドが由来する完全長ポリペプチドにおいてペプチドに天然で隣接しているアミノ酸配列の幾つかを含有しない。例えば、種々の実施形態においては、単離されたペプチドは、好ましくは、ペプチドが由来する完全長ポリペプチドにおいてペプチドに天然で隣接しているアミノ酸配列の１０個以下のアミノ酸、８個以下のアミノ酸、６個以下のアミノ酸、４個以下のアミノ酸、２個以下のアミノ酸または１個以下のアミノ酸を含む。
【００２９】
本明細書中で用いる「精製されたペプチド」なる語は、環境中でそれが天然で付随している１以上の他のポリペプチドを欠くそのようなポリペプチドの存在を示し、および／または存在する全タンパク質の少なくとも約１０％により表される。種々の実施形態においては、精製されたポリペプチドは、サンプルまたは調製物中の全タンパク質の少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％に相当する。１つの実施形態においては、この語は、当該ペプチドの天然状態では通常付随している成分を実質的または本質的に含有しないペプチドを意味する。更に、「精製されたペプチド」は、組換え技術により製造された場合に、他の細胞物質、ウイルス物質または培地を実質的に含有せず、あるいは化学合成された場合に化学前駆体または他の化学物質を含有しない。
【００３０】
本明細書中で用いる「断片」なる語は、少なくとも５アミノ酸残基、少なくとも６アミノ酸残基、少なくとも７アミノ酸残基または少なくとも８アミノ酸残基を有し完全長ＯｐｒＭ外側ループより短い、ＯｐｒＭ外側ループ（すなわち、配列番号１または２）またはその誘導体の連続的セグメントを意味する。好ましくは、断片は少なくとも１つの抗原決定基またはエピトープ領域を含む。少なくとも１つの抗原決定基またはエピトープ領域を含む２以上の断片が融合されうる。
【００３１】
本明細書中で用いる「エピトープ」または「抗原決定基」なる語は、抗体および／またはＴ細胞受容体が結合する抗原上の部位を意味する。エピトープは、連続的アミノ酸またはタンパク質の三次フォールディングにより並置した不連続的アミノ酸の両方から形成されうる。連続的アミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒にさらされても維持されるが、三次フォールディングにより形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒で処理されると失われる。エピトープは、典型的には、特有の空間的コンホメーションにおいて、少なくとも３個、より通常は少なくとも５個または８〜１０個のアミノ酸を含む。エピトープの空間的コンホメーションを決定するための方法には、例えば、ｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴が含まれる。
【００３２】
本明細書中で用いる「誘導体」なる語は、アミノ酸配列内の変化（アミノ酸残基の付加、欠失および置換を含む）および／または化学修飾でありうる１以上の改変を有するポリペプチドを意味する。一般に、誘導体は、免疫応答、好ましくは防御免疫応答を誘導する活性を保持するか、または実質的に保持する。幾つかの実施形態においては、ＯｐｒＭ外側ループまたはその断片は、１以上のエピトープが増強されるように本発明の誘導体に改変されている。エピトープ増強は、免疫応答、好ましくは防御免疫応答を誘導するポリペプチドの効力を改善する。エピトープ増強は、種々の技術、例えば、ＭＨＣ分子に対するペプチドアフィニティを改善するためのアンカー残基の改変を含む技術、およびＴ細胞受容体に対するペプチド−ＭＨＣ複合体のアフィニティを増加させる技術を用いて行われうる（Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙら，２００１，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  １：２０９−２１９）。
【００３３】
幾つかの実施形態においては、誘導体は、それが由来する塩基配列とは１以上のアミノ酸置換により異なっているアミノ酸配列を有するポリペプチドである。アミノ酸置換は、アミノ酸が広く類似した特性を有する別のアミノ酸で置換されている場合に「保存的」とみなされうる。「非保存的」置換は、アミノ酸が別のタイプのアミノ酸で置換されている場合である。大まかに言えば、ポリペプチドの生物活性を改変することなく、より少数の非保存的置換が可能であろう。幾つかの実施形態においては、５個以下のアミノ酸残基、４個以下のアミノ酸残基、３個以下のアミノ酸残基、２個以下のアミノ酸残基または１個以下のアミノ酸残基が置換されている。
【００３４】
他の実施形態においては、誘導体は、それが由来する塩基配列とは１以上のアミノ酸の欠失および／または付加を任意の組合せで有することにより異なっているアミノ酸配列を有するポリペプチドである。欠失または付加アミノ酸は、連続的な又は個々の残基でありうる。幾つかの実施形態においては、２５個以下のアミノ酸残基、１０個以下のアミノ酸残基、８個以下のアミノ酸残基、５個以下のアミノ酸残基、３個以下のアミノ酸残基または１個以下のアミノ酸残基が付加されている。他の実施形態においては、５個以下のアミノ酸残基、４個以下のアミノ酸残基、３個以下のアミノ酸残基、２個以下のアミノ酸残基または１個以下のアミノ酸残基が欠失している。アミノ酸の付加は、マーカーポリペプチド、担体ポリペプチド（限定的なものではないが、ＫＬＨ、ＯＭＰＣ、ＢＳＡ、ＯＶＡ、ＴＨＹ、破傷風トキソイド、ＨｂＳＡｇ、ＨＢｃＡｇ、ロタウイルスカプシドタンパク質、ヒトパピローマウイルスのＬ１タンパク質、ジフテリアトキソイドＣＲＭ１９７タンパク質、フラジェリンおよびＶＬＰ、特に６、１１および１６型を含む）、アジュバント特性を有するポリペプチド、または精製を補助するポリペプチドを含むがこれらに限定されない少なくとも１つの機能性タンパク質ドメインへの融合（直接的なもの又はリンカーを介したもの）を含みうる。また、追加的アミノ酸残基はシュードモナス・エルジノーサまたは無関係な源に由来することが可能であり、シュードモナス・エルジノーサまたは別の病原体に対して有効な免疫応答を生成しうると理解されるであろう。特定の実施形態においては、完全長ＯｐｒＭポリペプチドにおいてＯｐｒＭ外側ループに通常隣接しているアミノ酸残基がＯｐｒＭ外側ループに付加される。
【００３５】
他の実施形態においては、誘導体は、１以上のタンパク質化学修飾を有することによりそれが由来する塩基配列とは異なっているアミノ酸配列を有するポリペプチドである。化学修飾には、官能基の修飾（例えば、アルキル化、ヒドロキシル化、リン酸化、チオール化、カルボキシル化など）、タンパク質合成中の非天然アミノ酸および／またはそれらの誘導体の組込み、ならびにポリペプチドにコンホメーション拘束を課す架橋剤および他の方法の使用が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３６】
同一誘導体中に付加、欠失、置換および化学修飾の組合せが存在しうる。
【００３７】
ポリペプチドが、完全長ＯｐｒＭポリペプチドにおいて外側ループに隣接している１以上のアミノ酸残基と共にＯｐｒＭ外側ループを含む特定の実施形態においては、隣接アミノ酸配列は、置換、欠失、付加および／または化学修飾を含有しうる。
【００３８】
ＯｐｒＭ外側ループ（例えば、配列番号１および２）と誘導体との間の相違の度合を決定するためには、当技術分野で公知の方法が用いられうる。
【００３９】
第１の実施形態においては、関連性を決定するために配列同一性が用いられる。同一性（％）は、同一残基の数を残基の総数で割り算し１００を掛けたものとして定義される。アライメントにおける配列が（ギャップまたは伸長により）異なる長さのものである場合、最長配列の長さが計算において用いられ、全体の長さの値を表す。好ましい実施形態においては、誘導体は改変前の元の配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％の配列同一性を有する。配列同一性は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｊ．，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；ならびにＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１；ならびにＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に記載されているもの（これらに限定されるものではない）を含む公知方法により計算されうる。
【００４０】
第２の実施形態においては、関連性を決定するために配列類似性または相同性が用いられる。そのような分析においては、機能的に同等な物理化学的特性（例えば、正電荷、負電荷または嵩だかさ）を有するアミノ酸が類似性または相同性の決定に含まれる。保存的とみなされるアミノ酸置換（アミノ酸が、広く類似した特性を有する別のアミノ酸で置換されている場合）は類似または相同残基として含まれ、一方、非保存的置換（アミノ酸が別のタイプのアミノ酸で置換されている場合）は含まれない。そのような実施形態においては、誘導体は改変前の元の配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％の配列類似性を有する。配列類似性または相同性は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｊ．，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；ならびにＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１；ならびにＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に記載されているもの（これらに限定されるものではない）を含む公知方法により計算されうる。
【００４１】
第３の実施形態においては、関連性を決定するために核酸ハイブリダイゼーションが用いられる。そのような実施形態においては、誘導体をコードする核酸は高ストリンジェント条件下でＯｐｒＭ外側ループ（例えば、配列番号１および２）をコードする核酸にハイブリダイズするであろう。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーは当業者により容易に決定され、一般に、プローブ長、洗浄温度および塩濃度に左右される経験的計算である。一般に、適切なアニーリングのためには、より長いプローブはより高い温度を要し、一方、より短いプローブはより低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは、一般に、相補鎖がそれらの融解温度未満の環境中に存在する場合に、変性ＤＮＡが再アニールしうることに基づいている。プローブとハイブリダイズ可能配列との間の所望の相同性の度合が高くなればなるほど、用いられうる相対温度は高くなる。その結果、より高い相対温度は反応条件をより高いストリンジェンシートにし、より低い温度はより低いストリンジェンシーする傾向にあるということになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの更なる詳細および説明に関しては、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（１９９５）を参照されたい。
【００４２】
本明細書中で用いる「高いストリンジェンシー」なる語は、（１）洗浄のために、低いイオン強度および高温を用いる条件、例えば、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳを５０℃で用いる条件、（２）ハイブリダイゼーション中に、変性剤、例えばホルムアミドを用いる条件、例えば、４２℃の７５０ｍＭ塩化ナトリウム／５０ｍＭクエン酸ナトリウムを伴う、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール、０．１％ＢＳＡを伴う５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドを用いる条件、または（３）０．２×ＳＳＣ中で４２℃および５０％ホルムアミド中で５５℃での洗浄、ならびにそれに続く、５５℃におけるＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣからなる高いストリンジェンシーの洗浄と共に、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト液、超音波処理サケ精子（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳおよび１０％硫酸デキストラン（４２℃）を用いる条件を意味する。
【００４３】
ポリペプチドの製造
本発明の方法において使用されるポリペプチド、その誘導体または断片は、組換え的製造または化学合成されうる。
【００４４】
本発明の方法において使用されるポリペプチドは、固相ペプチド合成または液相ペプチド合成のいずれかを用いる化学合成により製造されうる（Ｊｏｎｅｓ，Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）（１９９４））。固相法においては、種々の商業的に入手可能なペプチド合成装置（例えば、Ｍｏｄｅｌ  ＭｕｌｔｉＰｅｐ  ＲＳ（Ｉｎｔａｖｉｓ  ＡＧ））を使用することが可能である。
【００４５】
オリゴマー支持液相合成においては、生成中の産物を大きな可溶性重合体基に結合させる。ついで合成の各工程からの産物を、比較的大きな重合体結合産物と未反応反応物との間のサイズにおける大きな相違に基づいて未反応の反応物から分離することが可能である。これは均一溶液中で反応が生じることを可能にし、伝統的な液相合成に伴う面倒な精製工程を不要にする。また、オリゴマー支持液相合成はペプチドの自動液相合成に適合化されている。
【００４６】
固相ペプチド合成では、方法は、生成中のペプチドの末端が不溶性支持体に連結されたまま、適当なアミノ酸が所望の配列のペプチドへと逐次的に会合することを含む。通常、ペプチドのカルボキシル末端は、切断試薬での処理に際してそれが遊離しうる重合体に連結される。一般的方法においては、ある１つのアミノ酸が樹脂粒子に結合され、アミノ酸の鎖を与えるために、保護アミノ酸の連続的付加により逐次的にペプチドが生じる。メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）により記載されている技術の変法が一般に用いられる（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９６４，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９６：２９８９−９３を参照されたい）。自動化固相法においては、ジビニルベンゼンで架橋された不溶性ポリスチレン樹脂に共有結合した有機リンカー（例えば、ＰＡＭ、４−オキシメチルフェニルアセトアミドメチル）上にカルボキシ末端アミノ酸をローディングすることによりペプチドが合成される。末端アミンは、ｔ−ブチルオキシカルボオニルで保護することにより保護されうる。ヒドロキシルおよびカルボキシル基は、一般に、Ｏ−ベンジル基で保護することにより保護される。合成は自動化ペプチド合成装置（その幾つかは商業的に入手可能である）において行われる。合成後、生成物は樹脂から除去されうる。保護基は、典型的には、確立された方法（例えば、ＢｅｒｇｏｔおよびＭｃＣｕｒｄｙ，１９８７，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ）により、フッ化水素酸またはトリフルオロメチルスルホン酸を使用することにより除去される。切断および精製後、約６０〜７０％の収率が典型的に得られる。生成ペプチドの精製は、例えば、メチル−ブチルエーテルのような有機溶媒からペプチドを結晶化し、ついで蒸留水中に溶解し、対象ペプチドの分子量が約５００ダルトンより大きい場合には透析を、またはペプチドの分子量が５００ダルトン未満の場合には逆相高圧液体クロマトグラフィー（例えば、溶媒としての０．１％  トリフルオロ酢酸およびアセトニトリルと共にＣ１８カラムを使用）を用いることにより行われる。精製ペプチドは凍結乾燥され、使用まで乾燥状態で貯蔵されうる。生じたペプチドの分析は、分析用高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）およびエレクトロスプレー質量分析（ＥＳ−ＭＳ）の一般的方法を用いて行われうる。
【００４７】
あるいは、ポリペプチドの組換え発現は、関心のあるポリペプチド（例えば、ＯｐｒＭ外側ループ、その誘導体または断片）をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を要する。関心のあるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが得られたら、関心のあるポリペプチドの製造のためのベクターが組換えＤＮＡ技術により製造されうる。したがって、関心のあるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させることによる、関心のあるポリペプチドの製造方法が本明細書に記載されている。
【００４８】
関心のあるポリペプチドのコード配列ならびに適当な転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築するためには、当業者によく知られた方法が用いられうる。これらの方法には、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術およびインビボ遺伝的組換えが含まれる。したがって、本発明は、プロモーターに機能的に連結された関心のあるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。
【００４９】
発現ベクターは通常の技術により宿主細胞に導入され、ついでトランスフェクトされた細胞は、通常の技術により培養されて、関心のあるポリペプチドを与えうる。したがって、本発明は、異種プロモーターに機能的に連結された関心のあるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を含む。
【００５０】
関心のあるポリペプチドを発現させるためには、種々の宿主−発現ベクター系が使用されうる。そのような宿主−発現系は、関心のあるコード配列が産生され、ついで精製されうるビヒクルを提供するが、適当なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされると関心のあるポリペプチドをｉｎ  ｓｉｔｕで発現する細胞をも提供する。これらには以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：関心のあるコード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌［例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、スタヒロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属のメンバー、例えばスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）およびスタヒロコッカス・エピデルミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）；ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属のメンバー、例えばラクトバシラス・プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）；ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属のメンバー、例えばラクトコッカス・ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）；バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属のメンバー、例えばバシラス・サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属のメンバー、例えばコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）；およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属のメンバー、例えばシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）］；関心のあるコード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母［例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはサッカロミセス・ピチア（Ｓ．ｐｉｃｈｉａ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属のメンバー、例えばピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属のメンバー、例えばハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クライベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属のメンバー、例えばクライベロミセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）またはクライベロミセス・フラジリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）およびシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属のメンバー、例えばシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）］；関心のあるコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；関心のあるコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス，ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス，ＴＭＶ）に感染した又は組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは哺乳類細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳類ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）および関心のあるコード配列を含有する組換え発現構築物を含有する哺乳類細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、Ｎ���Ｏおよび３Ｔ３細胞）。
【００５１】
また、挿入配列の発現をモジュレーションするかまたは望まれる特定の様態で遺伝子産物を修飾しプロセシングする宿主細胞株が選択されうる。真核生物修飾は、タンパク質産物のグリコシル化およびプロセシング（例えば、切断）を含みうる。種々の宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾のための特徴的かつ特異的なメカニズムを有する。発現された外来タンパク質の適切な修飾およびプロセシングを確保するために、適当な細胞系または宿主系が選択されうる。この目的には、一次転写産物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞装置を有する宿主細胞が使用されうる。本明細書中で用いる「ポリペプチド」または「ポリペプチドのアミノ酸配列」なる語は、酵母宿主のような宿主細胞からの翻訳後修飾の構造を有する１以上のアミノ酸を含有するポリペプチドを含む。
【００５２】
所望により、特定の宿主における発現がコドン最適化により増強されうる。コドン最適化は、より好ましいコドンの使用を含む。種々の宿主におけるコドン最適化のための技術は、当技術分野においてよく知られている。
【００５３】
関心のあるポリペプチドが産生されたら、それは種々の方法、例えばクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティ、サイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、またはタンパク質の精製のためのいずれかの他の標準的な技術により精製されうる。更に、関心のあるポリペプチドは、精製を促進するための本明細書に記載されている又は当技術分野で公知である異種ポリペプチド配列に融合または結合されうる。そのようなタンパク質タグの例には、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリ−ヒスチジン、赤血球凝集素（ＨＡ）およびポリアニオンアミノ酸が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５４】
免疫原性および防御効果の測定
ＯｐｒＭ外側ループを含むポリペプチドの免疫原性は、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＰＯＴ（これらに限定されるものではない）を含む、抗体価をアッセイするための当技術分野において公知の方法により測定されうる。
【００５５】
免疫原として使用された場合または改変ポリペプチドに応答して産生された抗体が受動免疫として投与された場合、改変ポリペプチドの防御効果をアッセイするためには動物モデルが使用されうる。
【００５６】
幾つかの実施形態においては、シュードモナス・エルジノーサ感染に対する正常な感受性を有する動物が後記のインビボアッセイにおいて使用される。他の実施形態においては、後記のインビボアッセイにおいて使用される動物は、シュードモナス・エルジノーサ感染に対してより感受性である。
【００５７】
１つの特定の実施形態においては、動物は、感染前に免疫抑制処置に付されることにより、シュードモナス・エルジノーサ感染に対してより感受性にされる。そのような免疫抑制処置には、シクロホスファミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の投与による末梢血好中球の低減が含まれるが、これに限定されるものではない。例えば、第５、２および０日（感染日）に、生理食塩水中の１２．５ｍｇ／ｍＬのシクロホスファミドをマウスに腹腔内投与する。これらのマウスは免疫化および受動免疫アッセイにおいて使用されうるが、好ましい実施形態においては、これらのマウスは受動免疫アッセイにおいて使用される。
【００５８】
もう１つの特定の実施形態においては、シュードモナス・エルジノーサに対して元々低い抵抗性を有する動物がアッセイにおいて使用される。例えば、Ａ．ＢＹ／ＳｎＪマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）において開発されたコンジェニック系統であり、シュードモナス・エルジノーサに対して、通常の実験用マウスより低いＬＤ５０を有する（Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎら，１９７９，Ｊ．ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１２９：３９６−９９およびＦａｒｉｎｈａら，１９９４，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６２：４１１８−２３）。これらのマウスは、免疫化および受動免疫アッセイにおいて使用されうる。
【００５９】
簡潔に説明すると、生きたシュードモナス・エルジノーサを生理食塩水に懸濁させ、第０日に１×１０５  ｃｆｕ／マウス（致死量）で４週齢のマウスに腹腔内投与する。マウスは、ＯｐｒＭ外側ループワクチンの投与を既に受けているか、または感染直後に１以上のＯｐｒＭ外側ループ抗体をマウスに投与する。７日後の生存に基づいて感染に対する防御活性を評価する。
【００６０】
幾つかの実施形態においては、前記アッセイにおいて使用される生きたシュードモナス・エルジノーサは、多剤耐性シュードモナス・エルジノーサ、例えば株ＭＳＣ０６１２０でありうる。通常、イミペネム、アミカシンおよびシプロフロキサシンのＭＳＣ０６１２０増殖阻止濃度は、それぞれ、３２μｇ／ｍｌ、６４μｇ／ｍｌおよび＞２５６μｇ／ｍｌである。ＯｐｒＭワクチン接種またはＯｐｒＭ外側ループ抗体の投与がＭＳＣ０６１２０の増殖を抑制するのに必要な抗生物質の量を減少させるかどうかを判定するために、アッセイを行う。ＭＳＣ０６１２０は、第０日に、１×１０５  ｃｆｕ／マウス（致死量）で腹腔内投与されうる。７日後、生存に基づいて感染に対する防御活性を評価する。
【００６１】
本発明は、ＯｐｒＭ外側ループの免疫反応性誘導体または断片（「改変ポリペプチド」と総称される）を特定する方法をも含む。この方法は実質的に、ポリペプチドの誘導体または断片を得、改変ポリペプチドを哺乳動物に投与し、哺乳動物における免疫応答を検出することを含む。そのような応答は、シュードモナス・エルジノーサおよび／またはポリペプチド、誘導体もしくは断片に特異的に結合する成分の産生を含み、ならびに／またはシュードモナス・エルジノーサ感染に対する防御効果を有するであろう。ついで天然または親ポリペプチドに対する抗体価および免疫反応性を決定することが可能である。
【００６２】
アジュバント
アジュバントは、免疫応答の生成において免疫原（例えば、ポリペプチド、ポリペプチド含有医薬組成物）を補助しうる物質である。アジュバントは以下の１以上のような種々のメカニズムにより機能しうる：抗原の生物学的または免疫学的半減期の増加；抗原提示細胞への抗原運搬の改善；抗原提示細胞による抗原プロセシングおよび提示の改善；ならびに免疫調節性サイトカインの産生の誘導（Ｖｏｇｅｌ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ３０  ｓｕｐｐｌ．３：Ｓ２６６−２７０，２０００）。本発明の１つの実施形態においては、アジュバントが使用される。
【００６３】
免疫応答の生成を補助するためには、多種多様なタイプのアジュバントが使用されうる。特定のアジュバントの例には、水酸化アルミニウム；リン酸アルミニウム、アルミニウムヒドロキシホスファート、無定形アルミニウムヒドロキシホスファートスルファートアジュバント（ＡＡＨＳＡ）または他のアルミニウム塩；リン酸カルシウム；ＤＮＡ  ＣｐＧモチーフ；モノホスホリルリピドＡ；コレラ毒素；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素；百日咳毒素；ムラミルジペプチド；フロイント不完全アジュバント；ＭＦ５９；ＳＡＦ；免疫刺激性複合体；リポソーム；生分解性ミクロスフェア；サポニン；ノニオンブロック共重合体；ムラミルペプチド類似体；ポリホスファゼン；合成ポリヌクレオチド；ＩＦＮ−γ；ＩＬ−２；ＩＬ−１２；およびＩＳＣＯＭＳが含まれる（Ｖｏｇｅｌ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ５０（ｓｕｐｐｌ  ３）：Ｓ２６６−２７０，２０００；Ｋｌｅｉｎら，２０００，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８９：３１１−３２１；Ｒｉｍｍｅｌｚｗａａｎら，２００１，Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：１１８０−１１８７；Ｋｅｒｓｔｅｎ，２００３，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２１：９１５−９２０；Ｏ’Ｈａｇｅｎ，２００１，Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｏｒｄ．１：２７３−２８６）。
【００６４】
併用療法
ＯｐｒＭ外側ループを含むポリペプチド、その誘導体もしくは断片および／または抗ＯｐｒＭ外側ループ抗体は、単独でまたは免疫応答を誘導するための他の免疫原と組合せて、およびシュードモナス・エルジノーサを処置するための抗生物質と組合せて使用されうる。２以上のＯｐｒＭ外側ループ免疫原および／または抗体が組み合せて投与されうる。２以上のＯｐｒＭ外側ループ免疫原は、別々のポリペプチド上でまたは同一ポリペプチドの一部として投与されうる。
【００６５】
１つの実施形態においては、存在しうる追加的免疫原には、１以上の追加的なシュードモナス・エルジノーサ免疫原が含まれる。追加的なシュードモナス・エルジノーサ免疫原には、ＰＡ  ４７１０（米国特許公開２０１０／０３３０１００）、ＰＡ１６９８（米国特許公開第２０１０／０２９１０７０号）、ＩＶ型ピリンタンパク質（国際公開番号ＷＯ  ２００４／０９９２５０）、ＰＡ１７０６（米国特許第６，３０９，６５１号および第６，８２７，９３５号）、ＰＡ５１５８（国際公開番号ＷＯ  ２００７／０４９７７０）およびＩＩＩ型分泌タンパク質ＰｃｒＶ（Ｂａｅｒら，２００９，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７７：１０８３−９０およびＨｏｌｄｅｒら，２００１，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：５９０８−１０）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００６６】
もう１つの実施形態においては、存在しうる追加的免疫原には、１以上の他のシュードモナス生物、例えばシュードモナス・オリジハビタンス（Ｐ．ｏｒｙｚｉｈａｂｉｔａｎｓ）およびシュードモナス・プレコグロシッシダ（Ｐ．ｐｌｅｃｏｇｌｏｓｓｉｃｉｄａ）を標的化する１以上の免疫原が含まれる。
【００６７】
もう１つの実施形態においては、存在しうる追加的免疫原には、病原性細菌スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、ヘモフィルス・インフルエンゼ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、モラクセラ・カタラーリス（Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、ナイセリア・ゴノレエ（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレプトコッカス・ニゥモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（これらに限定されるものではない）を含む他の感染性生物を標的化する１以上の免疫原が含まれる。
【００６８】
他の実施形態においては、患者を治療するために、抗生物質が本発明のワクチンおよび／または受動免疫と組合せて使用されうる。シュードモナス・エルジノーサを処置するために使用される１以上の抗生物質の最小阻止濃度（ＭＩＣ）は、本発明のワクチンおよび／または受動免疫と組合された抗生物質の投与により低下しうる。抗ＯｐｒＭ療法と組合せて投与される抗生物質には、アミノグリコシド抗生物質［例えば、トブラマイシン（ｔｏｂｒａｍｙｃｉｎ）、ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）、ネチルマイシン（ｎｅｔｉｌｍｉｃｉｎ）、トブラマイシン（ｔｏｂｒａｍｙｃｉｎ）、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）、ネオマイシン（ｎｅｏｍｙｃｉｎ）、アミカシン（ａｍｉｋａｃｉｎ）、アルベカシン（ａｒｂｅｋａｃｉｎ）、アジトロマイシン（ａｚｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）、ネチルマイシン（ｎｅｔｉｌｍｉｃｉｎ）、パロモマイシン（ｐａｒｏｍｏｍｙｃｉｎ）、ロードストレプトマイシン（ｒｈｏｄｏｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）およびアプラマイシン（ａｐｒａｍｙｃｉｎ）］、セファロスポリン抗生物質［例えば、セフタジジム（ｃｅｆｔａｚｉｄｉｍｅ）、セフェピム（ｃｅｆｅｐｉｍｅ）、セフピロム（ｃｅｆｐｉｒｏｍｅ）およびセフォペラゾン（ｃｅｆｏｐｅｒａｚｏｎｅ）］、キナロン抗生物質［例えば、シプロフロキサシン（ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ）、モキシフロキサシン（ｍｏｘｉｆｌｏｘａｃｉｎ）およびレボフロキサシン（ｌｅｖｏｆｌｏｘａｃｉｎ）］、ウレイドペニシリン抗生物質［例えば、ペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）、ピペリシリン（ｐｉｐｅｒｉｃｉｌｌｉｎ）、チカルシリン（ｔｉｃａｒｃｉｌｌｉｎ）およびアズロシリン（ａｚｌｏｃｉｌｌｉｎ）］、カルバペネム抗生物質［例えば、メロペネム（ｍｅｒｏｐｅｎｅｍ）、ドリペネム（ｄｏｒｉｐｅｎｅｍ）およびイミペネム（ｉｍｉｐｅｎｅｍ）］、ポリミキシン抗生物質［例えば、ポリミキシンＢおよびコリスチン（ｃｏｌｉｓｔｉｎ）］、モノバクタム抗生物質［例えば、アズトレオナム（ａｚｔｒｅｏｎａｍ）］、スルホンアミド抗生物質、テトラサイクリン抗生物質、グリシルシクリン抗生物質［例えば、チゲシクリン（ｔｉｇｅｃｙｃｌｉｎｅ）］およびマクロライド抗生物質が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００６９】
ＯｐｒＭ外側ループ抗体
ＯｐｒＭ外側ループを含むポリペプチド、その誘導体または断片は、ＯｐｒＭまたはシュードモナス・エルジノーサに結合する抗体および抗体フラグメントを産生させるために使用されうる。そのような抗体および抗体フラグメントは、ポリペプチドの精製、シュードモナス・エルジノーサの診断、シュードモナス・エルジノーサの同定および／またはシュードモナス・エルジノーサ感染の治療において使用されうる。幾つかの実施形態においては、抗体および／またはその抗体フラグメントは、シュードモナス・エルジノーサに対する受動免疫を付与するために、それを要する患者に投与される。
【００７０】
本明細書中で用いる「抗体」なる語には、所望の生物活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（二重特異性ｓｃＦｖを含む）、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）および前記のいずれかのエピトープ結合性フラグメントを含む。好ましい実施形態においては、患者において受動免疫を付与するために使用される本発明の抗体はモノクローナル抗体、より好ましくは、ヒト化またはヒト抗体である。
【００７１】
本明細書中で用いる「モノクローナル抗体」なる語は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を意味し、例えば、集団を含む個々の抗体は、僅かな量で存在しうる天然で生じる考えられうる突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に高特異的である。更に、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。本発明に従い使用されるモノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５により最初に記載されたハイブリドーマ法により製造可能であり、あるいは組換え法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているとおり）により製造可能である。また、本発明で使用されるモノクローナル抗体は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載されている技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離されうる。
【００７２】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合性部分配列）である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、アフィニティおよび能力を有するマウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基により置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。したがって、ヒト化抗体は、１つの種からの抗体、例えばげっ歯類抗体からのＣＤＲがげっ歯類抗体の重および軽可変鎖からヒト重および軽可変ドメイン内に移された組換えタンパク質でありうる。抗体分子の定常ドメインは、ヒト抗体のものに由来する。幾つかの場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が対応する非ヒト残基により置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも移入ＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見出されない残基を含みうる。これらの修飾は、抗体の性能を更に改善し最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（典型的には、ヒト免疫グロブリンのもの）の少なくとも一部を含むであろう（例えば、Ｙａｍａｓｈｉｔａら，２００７，Ｃｙｔｏｔｅｃｈ．５５：５５；ＫｉｐｒｉｙａｎｏｖおよびＬｅ  Ｇａｌｌ，２００４，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：３９ならびにＧｏｎｚａｌｅｓら，２００５，Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ．２６：３１を参照されたい）。
【００７３】
ヒト患者の治療には完全ヒト抗体が望ましいかもしれない。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブライリーを使用する前記のファージディスプレイ法を含む当技術分野で公知の種々の方法により製造されうる。米国特許第４，４４４，８８７号および第４，７１６，１１１号；ならびにＰＣＴ公開ＷＯ  ９８／４６６４５；ＷＯ  ９８／５０４３３；ＷＯ  ９８／２４８９３およびＷＯ  ９８／１６６５４（それらのそれぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。また、ヒト抗体は、機能性内因性免疫グロブリンを発現し得ないがヒト免疫グロブリン遺伝子を発現しうるトランスジェニックマウスを使用して製造されうる。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ  ９８／２４８９３；欧州特許第０  ５９８  ８７７号；米国特許第５，９１６，７７１号および第５，９３９，５９８号（それらのそれぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。
【００７４】
幾つかの実施形態においては、本発明のＦｃ操作変異抗体も本発明に含まれる。そのような変異体には、基礎抗体分子のエフェクター機能を未修飾抗体に対して改善またはモジュレーションするために抗体分子のＦｃ領域に突然変異または置換を導入するために操作された抗体またはその抗原結合性フラグメントが含まれる。一般に、改善されたエフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣおよび抗体半減期のような活性を意味する（例えば、米国特許第７，３７１，８２６号、第７，２１７，７９７号、第７，０８３，７８４号、第７，３１７，０９１号および第５，６２４，８２１号（それらのそれぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい）。
【００７５】
５つのクラスの免疫グロブリン、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在する。ＩｇＧおよびＩｇＡクラスは更に、定常重領域配列および機能における比較的小さな相違に基づいて幾つかのサブクラスに分けられ、例えば、ヒトは以下のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を発現する。好ましい実施形態においては、本発明の抗体はＩｇＧ１である。
【００７６】
抗体機能のためには、適切なグリコシル化が重要でありうる（Ｙｏｏら，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６１：１−２０；Ｌｉら，２００６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：２１０−２１５）。天然に存在する抗体は、重鎖に結合した少なくとも１つのＮ結合炭水化物を含有する（Ｙｏｏら，前掲）。追加的なＮ結合炭水化物およびＯ結合炭水化物が存在することが可能であり、抗体機能に重要でありうる（同誌）。
【００７７】
効率的な翻訳後修飾をもたらすために、哺乳類宿主細胞および非哺乳類細胞を含む種々のタイプの宿主細胞が使用されうる。哺乳類宿主細胞の例には、チャイニーズハムスター卵巣（Ｃｈｏ）、ＨｅＬａ、Ｃ６、ＰＣ１２および骨髄腫細胞が含まれる（Ｙｏｏら，前掲；Ｐｅｒｓｉｃら，１９９７，Ｇｅｎｅ  １８７：９−１８）。非哺乳類細胞は、ヒトグリコシル化を複製するように修飾されうる（Ｌｉら，２００６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：２１０−２１５）。糖操作されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、そのような修飾非哺乳類細胞の一例である（Ｌｉら，前掲）。
【００７８】
患者集団
「患者」は、シュードモナス・エルジノーサに感染しうる哺乳動物を意味する。好ましい実施形態においては、患者はヒトである。患者は予防的または治療的に治療されうる。予防的処置は、シュードモナス・エルジノーサ感染の可能性または重症度を低減するのに十分な防御免疫をもたらす。治療的処置は、シュードモナス・エルジノーサ感染の重症度を低減するために行われうる。
【００７９】
予防的処置は、本明細書に記載されているポリペプチド、免疫原または抗体を含有する医薬組成物を使用して行われうる。医薬組成物は、一般集団、またはシュードモナス・エルジノーサ感染の高いリスクを有する者に投与されうる。
【００８０】
治療を要する者には、既に感染している者、および感染し易い者、または感染の可能性の低減が望まれる者が含まれる。シュードモナス・エルジノーサ感染の高いリスクを有する者には、嚢胞性線維症患者、熱傷患者、入院患者、手術を受けている患者または手術後の患者、ベンチレータを使用している患者、免疫低下を示す患者（エイズ患者、癌患者、移植レシピエントを含む）、免疫低下を招く療法に直面している患者（例えば、癌に対する化学療法もしくは放射線療法を受けている、または免疫抑制薬を服用している患者）、異物インプラント（例えば、カテーテルまたは血管装置）を受けている患者、異物を使用する診断処置を受けている患者、腎臓透析を受けている患者、および熱傷または創傷の高いリスクを有する従事者が含まれる。本明細書中で用いる「免疫低下」は、免疫応答が適切に機能しないまたは健常成体のレベルで機能しないため、免疫系が感染に対抗する能力の低下を示していることを意味する。免疫低下を示す患者の例としては、乳児、小児、高齢者、妊婦である患者、または免疫系の機能を損なう疾患、例えばＨＩＶまたはエイズを有する患者が挙げられる。
【００８１】
診断または治療処置において使用される異物には、留置カテーテルまたは移植高分子装置が含まれる。異物関連シュードモナス・エルジノーサ感染の例には、敗血症／心内膜炎（例えば、血管内カテーテル、血管プロテーゼ、ペースメーカ誘導、細動除去系、人工心臓弁および左心室補助装置）；腹膜炎（例えば、脳室腹腔脳脊髄液（ＣＳＦ）シャントおよび持続的携行式腹膜透析カテーテル系）；脳室炎（例えば、内部および外部ＣＳＦシャント）；ならびに慢性ポリマー関連症候群（例えば、人工関節／股関節の緩み、シリコーンプロテーゼでの豊胸後の線維被膜拘縮症候群および白内障手術後の人工眼内レンズの移植後の遅発性内眼球炎）が含まれる。
【００８２】
シュードモナス・エルジノーサ感染により引き起こされる疾患または障害に罹患している患者は、本発明の組成物で治療されうる。そのような疾患または障害には、全身感染症（すなわち、敗血症、髄膜炎および心内膜炎）、耳鼻科感染症（すなわち、中耳炎および副鼻腔炎）、肺感染症（すなわち、肺炎、ベンチレータ関連肺炎、慢性気道感染）、外科的感染症（すなわち、術後腹膜炎および放射状角膜切開後の術後感染）、眼科的感染症（すなわち、まぶたの膿瘍、涙嚢炎、結膜炎、角膜潰瘍、角膜膿瘍、全眼球炎および眼窩感染症）、尿道感染症（すなわち、カテーテル挿入によるもの）、皮膚炎、軟組織感染、菌血症、骨感染症、関節感染症および胃腸感染症が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００８３】
非シュードモナス・エルジノーサに感染しうる非ヒト患者には、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ウマ、イヌ、ネコ、ラットおよびマウスが含まれる。非ヒト患者の治療はペットおよび家畜の防御ならびに個々の治療の効力の評価の両方において有用である。
【００８４】
１つの実施形態においては、異物が関わる治療用または医学的処置と組合せて、患者を予防的に処置する。追加的実施形態においては、処置前に約２週間、１カ月間、約２か月間または約２〜６カ月間にわたり患者を免疫化する。もう１つの実施形態においては、個々の想定される処置と組合せないで、患者を予防的に免疫化する。ワクチン接種では、必要に応じて、追加接種を行う。また、予防的に治療される患者は、シュードモナス・エルジノーサに対する抗体の投与のみによる、またはそれとワクチン接種との組合せによる受動免疫療法を受けることも可能である。シュードモナス・エルジノーサに対する抗体またはワクチン接種での受動免疫療法は、シュードモナス・エルジノーサ感染を治療するために使用される１以上の抗生物質の投与と組合せて行われうる。
【００８５】
医薬組成物
本発明の他の主題は、シュードモナス・エルジノーサ感染を有する患者を治療するための、および／またはシュードモナス・エルジノーサ感染の可能性を低減するための組成物である。１つの実施形態においては、本発明の組成物は、本明細書に記載されているＯｐｒＭ外側ループを含むポリペプチド、その誘導体または断片（「免疫原性物質」）を、単独でまたは１以上の追加的抗原と共に含み、好ましくは、免疫原性組成物またはワクチンである。もう１つの実施形態においては、本発明の組成物は、ＯｐｒＭ外側ループに結合する抗体を、単独でまたは１以上の追加的抗体と共に含み、好ましくは、患者に受動免疫をも付与する。適切には、本発明の組成物は医薬上許容される担体を含む。
【００８６】
「医薬上許容される担体」とは、全身投与において安全に使用されうる液体充填剤、希釈剤またはカプセル化物質を意味する。個々の投与経路に応じて、当技術分野でよく知られた種々の医薬上許容される担体が使用されうる。これらの担体は、糖、デンプン、セルロースおよびその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝生理食塩水を含むリン酸緩衝溶液、乳化剤、等張生理食塩水および発熱物質非含有水を含む群から選択されうる。特に、医薬上許容される担体は、バッファー、注射用無菌水、正常生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水、スクロース、ヒスチジン、塩およびポリソルベートのような種々の成分を含有しうる。「生理的に許容される」、「希釈剤」または「賦形剤」のような語は互換的に用いられうる。
【００８７】
前記組成物は、治療用／予防用ワクチンとして又は受動免疫を付与するための組成物として使用されうる。したがって、本発明は、本発明の免疫原性物質または抗体の１以上を有効成分として含有する組成物の製造を含む。そのようなワクチンを製造するためには、任意の適当な方法が想定される。典型的な方法には、例えば、Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ（１９９７，Ｌｅｖｉｎｅら，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｂａｓｅｌ  Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ）（これを参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されているものが含まれる。
【００８８】
本発明のＯｐｒＭ外側ループを含むポリペプチドは、免疫原性担体に融合または結合されうる。有用な担体は当技術分野でよく知られており、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、チログロブリン；アルブミン、例えばヒト血清アルブミン；破傷風、ジフテリア、百日咳、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、スタヒロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）およびストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）からの毒素、トキソイドまたは該毒素の任意の突然変異体交差反応性物質（ＣＲＭ）；ポリアミノ酸、例えばポリ（リジン：グルタミン酸）；インフルエンザ；ロタウイルスＶＰ６、パルボウイルスＶＰ１およびＶＰ２；Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質；Ｂ型肝炎ウイルス組換えワクチンなどを包含する。あるいは、担体タンパク質または他の免疫原性タンパク質の断片またはエピトープが使用されうる。例えば、本発明のポリペプチドは、細菌毒素、トキソイドまたはＣＲＭのＴ細胞エピトープに結合されうる。この点に関して、米国特許第５，７８５，９７３号（これを参照により本明細書に組み入れることとする）が参照されうる。
【００８９】
投与
ＯｐｒＭ外側ループを含むポリペプチド、その誘導体または断片（の単独体または１以上の免疫原と組合されたもの）または本明細書に記載されている抗体は、当技術分野でよく知られている技術と共に本明細書に記載の指針を用いて製剤化され、患者に投与されうる。医薬投与に関する一般的指針は、例えば、Ｖａｃｃｉｎｅｓ，ＰｌｏｔｋｉｎおよびＯｒｅｎｓｔｅｉｎ編，Ｗ．Ｂ．Ｓａｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９９；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０００；およびＭｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＢａｎｋｅｒおよびＲｈｏｄｅｓ編，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９９０に記載されている。
【００９０】
ワクチンおよび／または抗体は、皮下、筋肉内、静脈内、粘膜、非経口または経皮のような種々の経路により投与されうる。皮下および筋肉内投与は、例えば無針またはジェット式注射器を使用して行われうる。
【００９１】
幾つかの実施形態においては、本発明のワクチンおよび／または抗体は、ウイルス様粒子（例えば、国際公開番号ＷＯ９４／２０１３７；Ｗ０９６／１１２７２；米国特許第５，９８５，６１０号；第６，５９９，５０８号；第６，３６１，７７８号を参照されたい）、リポソーム（例えば、米国特許第５，７０９，８７９号を参照されたい）、細菌または酵母ゴースト（無傷エンベロープを有する中空細胞；例えば、国際公開ＷＯ  ９２／０１７９１、ＵＳ公開第２００９／０２３９２６４号および第２００８／０００３２３９号、米国特許第６，９５１，７５６号を参照されたい）および外膜小胞またはブレブ（ｄｅ  Ｍｏｒａｅｓら，１９９２，Ｌａｎｃｅｔ  ３４０：１０７４およびＢｊｕｎｅら，１９９１，Ｌａｎｃｅｔ  ３３８：１０９３）内または上に製剤化されうる。
【００９２】
本明細書に記載されている組成物は、剤形に適合した方法で、そしてシュードモナス・エルジノーサ感染を治療しおよび／または感染の可能性を低減するのに免疫学的に有効な量で投与されうる。本発明の場合における患者に投与される用量は、経時的に患者における有益な応答（例えば、シュードモナス・エルジノーサのレベルの低下）を引き起こすのに、またはシュードモナス・エルジノーサによる感染の可能性を低減するのに十分なものであるべきである。投与されるべき免疫原性物質／抗体の量は、好ましくは、患者の年齢、性別、体重および医学的症状；組成物の投与経路；所望の効果；ならびに使用される個々の化合物を含む当技術分野でよく知られた要因を考慮して決定される。これに関して、投与される必要のある免疫原性物質／抗体の厳密な量は、実施者の判断によるであろう。シュードモナス・エルジノーサに対する治療または予防において投与される免疫原性物質／抗体の有効量の決定の際には、医師が、循環血漿レベル、疾患の進行および抗シュードモナス・エルジノーサ抗体の産生を評価しうる。いずれの場合にも、本発明の免疫原性物質／抗体の適切な投与量は、当業者により容易に決定されうる。そのような投与量は本発明の免疫原性物質／抗体のナノグラムからミリグラムのオーダーでありうる。
【００９３】
ワクチンおよび／または抗体組成物は多用量形態で使用されうる。ワクチン組成物の用量は、全ポリペプチド１．０μｇ〜１．０ｍｇの範囲からなると予想される。本発明の種々の実施形態においては、投与量範囲は５．０μｇ〜５００μｇ、０．０１ｍｇ〜１．０ｍｇ、または０．１ｍｇ〜１．０ｍｇである。２以上のポリペプチドを投与する場合には（すなわち、組合せワクチン）、各ポリペプチドの量は、記載されている範囲内である。
【００９４】
本発明の受動免疫組成物の用量は、抗体１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲からなると予想される。本発明の種々の実施形態においては、投与量範囲は１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ〜２．０ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇである。
【００９５】
投与の時機は、当技術分野でよく知られた要因に左右される。初期投与後、抗体価を維持および／または増強するために、１以上の追加的な用量が投与されうる。
【００９６】
組合せワクチン接種の場合、ポリペプチドの各々は１つの組成物中で一緒に、または異なる組成物中で別々に投与されうる。本明細書に記載されているＯｐｒＭ外側ループを含むポリペプチドは１以上の所望の免疫原と共に投与されうる。「共に」なる語は、複数の治療用物質が厳密に同時に投与されることには限定されず、それは、本明細書に記載されているポリペプチドとその他の所望の免疫原とが、それ以外の様態で投与される場合と比較してそれらが一緒になって大きな利益をもたらすような順序および時間間隔で対象に投与されることを意味する。例えば、各治療用物質は、同時にまたは異なる時点で任意の順序で連続的に投与されうるが、同時に投与されない場合には、それらは所望の治療効果が得られるように時間的に十分に近くなるように投与されるべきである。各治療用物質は任意の適当な形態および任意の適当な経路で別々に投与されうる。
【００９７】
感染の検出および診断
シュードモナス・エルジノーサの迅速かつ正確な検出および／または定量が非常に望ましいが、通常の試薬および技術を用いて実際にそれを達成することは困難であった。例えば、実験室用培養技術は、肉眼的に検出可能なレベルまで生物を増殖させるためにサンプルを約２４〜約４８時間インキュベートすることを含む。ついで、シュードモナス・エルジノーサを関連シュードモナスおよび他の腸管内細菌から識別するために、継代培養技術および代謝アッセイが要求され、更に２４〜４８時間を要しうる。
【００９８】
本発明は、ＯｐｒＭ外側ループに特異的に結合する物質を使用して患者におけるシュードモナス・エルジノーサ感染を検出／診断するための、現在使用されている方法より迅速な方法を含む。物質には、抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）、核酸プライマー（例えば、ＰＣＲまたはＴａｑＭａｎ用）およびアプタマー（核酸またはペプチド）が含まれる。
【００９９】
そのような方法は、患者から生物学的サンプルを得、ＯｐｒＭループに特異的に結合する物質と生物学的サンプルを接触させ、結合を可能にする条件下、物質／生物学的サンプルをインキュベートし、生物学的サンプルへの物質の結合を検出することを含む。生物学的サンプルへの物質の結合の検出は、シュードモナス・エルジノーサおよび／またはシュードモナス・エルジノーサ感染の存在を示す。
【０１００】
本明細書中で用いる「生物学的サンプル」なる語は、患者から採集された喀痰、気管内吸引物、細気管支洗浄液、気道サンプル、尿、血液、血漿、唾液、膿、腹水、創傷滲出液、腹腔液、腹部液および涙を意味する。
【０１０１】
本発明の検出／診断方法において使用される物質は、シュードモナス・エルジノーサの実質的に全ての株に結合する。シュードモナスの他の種または他の臨床的に重要なグラム陰性もしくはグラム陰性種との有意な交差反応性は観察されないはずである。
【０１０２】
診断アッセイにおける使用では、物質は直接的に標識化されうる。放射性核種、発蛍光団、発色団、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、リガンド（特にハプテン）などのような多種多様な標識が使用されうる。幾つかの実施形態においては、本発明の検出／診断アッセイにおいて使用される抗体に対して使用される標識は、例えば、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣおよびテキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）（これらに限定されるものではない）を含む発蛍光団である。発蛍光団で抗体を標識する方法は当技術分野で公知である。
【０１０３】
物質が抗体である実施形態においては、抗体は未標識であり、凝集アッセイにおいて使用されうる。また、未標識抗体は、本発明の抗体と反応性である他の標識抗体（二次抗体）と組合せて使用されうる。
【０１０４】
多数のタイプのイムノアッセイが利用可能であり、当業者によく知られている。
【０１０５】
本発明の抗体と共に使用するためのキットも提供されうる。キットは、（１）シュードモナス・エルジノーサＯｐｒＭ外側ループに結合しうる１以上の抗体、（２）標識、および（３）検出可能なシグナルを得るために必要な試薬、を含有する区画を含む。したがって、本発明の抗体組成物は、単独でまたはシュードモナス・エルジノーサの他の抗原に特異的な追加的抗体と共に、通常は凍結乾燥形態で提供されうる。抗体は、標識にコンジュゲート化（結合）されることが可能であり、バッファー、例えばトリス（Ｔｒｉｓ）、ホスファート、カルボナートなど、安定剤、生物致死剤、不活性タンパク質、例えばウシ血清アルブミンなどと共にキット内に含まれる。一般に、これらの物質は活性抗体の量に対して約５重量％未満で存在し、通常、再び抗体濃度に対して少なくとも約０．００１重量％の合計量で存在するであろう。しばしば、有効成分を希釈するために不活性増量剤または賦形剤を加えることが望ましく、この場合、賦形剤は全組成物に対して約１重量％〜９９重量％で存在しうる。抗ＯｐｒＭ外側ループ抗体に結合しうる二次抗体を使用する場合には、これは、通常、別のバイアル内で存在するであろう。二次抗体は、前記の抗体製剤に類似した方法で標識にコンジュゲート化され、製剤化されうる。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】図１は、４頭の異なるウサギにおいて（配列番号３の免疫原を使用して）ＯｐｒＭ外側ループ１に対して誘導されたポリクローナル抗体の力価を示す。ＥＬＩＳＡ実験において使用された抗原は外側ループ１（配列番号３）（黒色の記号）または外側ループ２（配列番号４）（白色の記号）であった。
【図２】図２は、４頭の異なるウサギにおいて（配列番号４の免疫原を使用して）ＯｐｒＭ外側ループ２に対して誘導されたポリクローナル抗体の力価を示す。ＥＬＩＳＡ実験において使用された抗原は外側ループ２（配列番号４）（黒色の記号）または外側ループ１（配列番号３）（白色の記号）であった。
【図３Ａ】図３Ａは、４頭の異なるウサギ（Ａ〜Ｄ）において（配列番号３の免疫原を使用して）ＯｐｒＭ外側ループ１に対して誘導されたポリクローナル抗体を示す。シュードモナス・エルジノーサ細胞系５８９０、５９１９、６４７６および６４７７からの外膜調製物（ＯＭＰ）をプローブするために免疫前血清（レーン１〜６）または免疫後血清（レーン７〜１２）のいずれかを使用したウエスタンブロットが示されている。レーンは以下のとおりである：（１）分子量マーカー、（２）バッファーブランク、（３）５８９０からのＯＭＰ、（４）５９１９からのＯＭＰ、（５）６４７６からのＯＭＰ、（６）６４７７からのＯＭＰ、（７）分子量マーカー、（８）バッファーブランク、（９）５８９０からのＯＭＰ、（１０）５９１９からのＯＭＰ、（１１）６４７６からのＯＭＰ、（１２）６４７７からのＯＭＰ。細胞系５９１９および６４７７のみがＯｐｒＭを発現する。
【図３Ｂ】図３Ｂは、４頭の異なるウサギ（Ａ〜Ｄ）において（配列番号３の免疫原を使用して）ＯｐｒＭ外側ループ１に対して誘導されたポリクローナル抗体を示す。シュードモナス・エルジノーサ細胞系５８９０、５９１９、６４７６および６４７７からの外膜調製物（ＯＭＰ）をプローブするために免疫前血清（レーン１〜６）または免疫後血清（レーン７〜１２）のいずれかを使用したウエスタンブロットが示されている。レーンは以下のとおりである：（１）分子量マーカー、（２）バッファーブランク、（３）５８９０からのＯＭＰ、（４）５９１９からのＯＭＰ、（５）６４７６からのＯＭＰ、（６）６４７７からのＯＭＰ、（７）分子量マーカー、（８）バッファーブランク、（９）５８９０からのＯＭＰ、（１０）５９１９からのＯＭＰ、（１１）６４７６からのＯＭＰ、（１２）６４７７からのＯＭＰ。細胞系５９１９および６４７７のみがＯｐｒＭを発現する。
【図３Ｃ】図３Ｃは、４頭の異なるウサギ（Ａ〜Ｄ）において（配列番号３の免疫原を使用して）ＯｐｒＭ外側ループ１に対して誘導されたポリクローナル抗体を示す。シュードモナス・エルジノーサ細胞系５８９０、５９１９、６４７６および６４７７からの外膜調製物（ＯＭＰ）をプローブするために免疫前血清（レーン１〜６）または免疫後血清（レーン７〜１２）のいずれかを使用したウエスタンブロットが示されている。レーンは以下のとおりである：（１）分子量マーカー、（２）バッファーブランク、（３）５８９０からのＯＭＰ、（４）５９１９からのＯＭＰ、（５）６４７６からのＯＭＰ、（６）６４７７からのＯＭＰ、（７）分子量マーカー、（８）バッファーブランク、（９）５８９０からのＯＭＰ、（１０）５９１９からのＯＭＰ、（１１）６４７６からのＯＭＰ、（１２）６４７７からのＯＭＰ。細胞系５９１９および６４７７のみがＯｐｒＭを発現する。
【図３Ｄ】図３Ｄは、４頭の異なるウサギ（Ａ〜Ｄ）において（配列番号３の免疫原を使用して）ＯｐｒＭ外側ループ１に対して誘導されたポリクローナル抗体を示す。シュードモナス・エルジノーサ細胞系５８９０、５９１９、６４７６および６４７７からの外膜調製物（ＯＭＰ）をプローブするために免疫前血清（レーン１〜６）または免疫後血清（レーン７〜１２）のいずれかを使用したウエスタンブロットが示されている。レーンは以下のとおりである：（１）分子量マーカー、（２）バッファーブランク、（３）５８９０からのＯＭＰ、（４）５９１９からのＯＭＰ、（５）６４７６からのＯＭＰ、（６）６４７７からのＯＭＰ、（７）分子量マーカー、（８）バッファーブランク、（９）５８９０からのＯＭＰ、（１０）５９１９からのＯＭＰ、（１１）６４７６からのＯＭＰ、（１２）６４７７からのＯＭＰ。細胞系５９１９および６４７７のみがＯｐｒＭを発現する。
【図４Ａ】図４Ａは、４頭の異なるウサギ（Ａ〜Ｄ）において（配列番号４の免疫原を使用して）ＯｐｒＭ外側ループ２に対して誘導されたポリクローナル抗体を示す。シュードモナス・エルジノーサ細胞系５８９０、５９１９、６４７６および６４７７からの外膜調製物（ＯＭＰ）をプローブするために免疫前血清（レーン１〜６）または免疫後血清（レーン７〜１２）のいずれかを使用したウエスタンブロットが示されている。レーンは以下のとおりである：（１）分子量マーカー、（２）バッファーブランク、（３）５８９０からのＯＭＰ、（４）５９１９からのＯＭＰ、（５）６４７６からのＯＭＰ、（６）６４７７からのＯＭＰ、（７）分子量マーカー、（８）バッファーブランク、（９）５８９０からのＯＭＰ、（１０）５９１９からのＯＭＰ、（１１）６４７６からのＯＭＰ、（１２）６４７７からのＯＭＰ。細胞系５９１９および６４７７のみがＯｐｒＭを発現する。
【図４Ｂ】図４Ｂは、４頭の異なるウサギ（Ａ〜Ｄ）において（配列番号４の免疫原を使用して）ＯｐｒＭ外側ループ２に対して誘導されたポリクローナル抗体を示す。シュードモナス・エルジノーサ細胞系５８９０、５９１９、６４７６および６４７７からの外膜調製物（ＯＭＰ）をプローブするために免疫前血清（レーン１〜６）または免疫後血清（レーン７〜１２）のいずれかを使用したウエスタンブロットが示されている。レーンは以下のとおりである：（１）分子量マーカー、（２）バッファーブランク、（３）５８９０からのＯＭＰ、（４）５９１９からのＯＭＰ、（５）６４７６からのＯＭＰ、（６）６４７７からのＯＭＰ、（７）分子量マーカー、（８）バッファーブランク、（９）５８９０からのＯＭＰ、（１０）５９１９からのＯＭＰ、（１１）６４７６からのＯＭＰ、（１２）６４７７からのＯＭＰ。細胞系５９１９および６４７７のみがＯｐｒＭを発現する。
【図４Ｃ】図４Ｃは、４頭の異なるウサギ（Ａ〜Ｄ）において（配列番号４の免疫原を使用して）ＯｐｒＭ外側ループ２に対して誘導されたポリクローナル抗体を示す。シュードモナス・エルジノーサ細胞系５８９０、５９１９、６４７６および６４７７からの外膜調製物（ＯＭＰ）をプローブするために免疫前血清（レーン１〜６）または免疫後血清（レーン７〜１２）のいずれかを使用したウエスタンブロットが示されている。レーンは以下のとおりである：（１）分子量マーカー、（２）バッファーブランク、（３）５８９０からのＯＭＰ、（４）５９１９からのＯＭＰ、（５）６４７６からのＯＭＰ、（６）６４７７からのＯＭＰ、（７）分子量マーカー、（８）バッファーブランク、（９）５８９０からのＯＭＰ、（１０）５９１９からのＯＭＰ、（１１）６４７６からのＯＭＰ、（１２）６４７７からのＯＭＰ。細胞系５９１９および６４７７のみがＯｐｒＭを発現する。
【図４Ｄ】図４Ｄは、４頭の異なるウサギ（Ａ〜Ｄ）において（配列番号４の免疫原を使用して）ＯｐｒＭ外側ループ２に対して誘導されたポリクローナル抗体を示す。シュードモナス・エルジノーサ細胞系５８９０、５９１９、６４７６および６４７７からの外膜調製物（ＯＭＰ）をプローブするために免疫前血清（レーン１〜６）または免疫後血清（レーン７〜１２）のいずれかを使用したウエスタンブロットが示されている。レーンは以下のとおりである：（１）分子量マーカー、（２）バッファーブランク、（３）５８９０からのＯＭＰ、（４）５９１９からのＯＭＰ、（５）６４７６からのＯＭＰ、（６）６４７７からのＯＭＰ、（７）分子量マーカー、（８）バッファーブランク、（９）５８９０からのＯＭＰ、（１０）５９１９からのＯＭＰ、（１１）６４７６からのＯＭＰ、（１２）６４７７からのＯＭＰ。細胞系５９１９および６４７７のみがＯｐｒＭを発現する。
【図５Ａ】図５Ａは、ウサギ＃１において（配列番号３の免疫原を使用して）ＯｐｒＭ外側ループ１に対して誘導されたポリクローナル抗体の、天然ＯｐｒＭタンパク質への結合能を示す。シュードモナス・エルジノーサ細胞系５８９０、５９１９、６４７６および６４７７からの外膜調製物（ＯＭＰ）をプローブするために（Ａ）免疫前血清（レーン１〜５）または（Ｂ）免疫後血清（レーン６〜１０）のいずれかを使用したウエスタンブロットが示されている。レーンは以下のとおりである：（１）分子量マーカー、（２）５８９０からのＯＭＰ、（３）５９１９からのＯＭＰ、（４）６４７６からのＯＭＰ、（５）６４７７からのＯＭＰ、（６）分子量マーカー、（７）５８９０からのＯＭＰ、（８）５９１９からのＯＭＰ、（９）６４７６からのＯＭＰ、（１０）６４７７からのＯＭＰ。細胞系５９１９および６４７７のみがＯｐｒＭを発現する。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ウサギ＃１において（配列番号３の免疫原を使用して）ＯｐｒＭ外側ループ１に対して誘導されたポリクローナル抗体の、天然ＯｐｒＭタンパク質への結合能を示す。シュードモナス・エルジノーサ細胞系５８９０、５９１９、６４７６および６４７７からの外膜調製物（ＯＭＰ）をプローブするために（Ａ）免疫前血清（レーン１〜５）または（Ｂ）免疫後血清（レーン６〜１０）のいずれかを使用したウエスタンブロットが示されている。レーンは以下のとおりである：（１）分子量マーカー、（２）５８９０からのＯＭＰ、（３）５９１９からのＯＭＰ、（４）６４７６からのＯＭＰ、（５）６４７７からのＯＭＰ、（６）分子量マーカー、（７）５８９０からのＯＭＰ、（８）５９１９からのＯＭＰ、（９）６４７６からのＯＭＰ、（１０）６４７７からのＯＭＰ。細胞系５９１９および６４７７のみがＯｐｒＭを発現する。
【図６Ａ】図６Ａは、ウサギ＃８において（配列番号４の免疫原を使用して）ＯｐｒＭ外側ループ２に対して誘導されたポリクローナル抗体の、天然ＯｐｒＭタンパク質への結合能を示す。シュードモナス・エルジノーサ細胞系５８９０、５９１９、６４７６および６４７７からの外膜調製物（ＯＭＰ）をプローブするために（Ａ）免疫前血清（レーン１〜５）または（Ｂ）免疫後血清（レーン６〜１０）のいずれかを使用したウエスタンブロットが示されている。レーンは以下のとおりである：（１）分子量マーカー、（２）５８９０からのＯＭＰ、（３）５９１９からのＯＭＰ、（４）６４７６からのＯＭＰ、（５）６４７７からのＯＭＰ、（６）分子量マーカー、（７）５８９０からのＯＭＰ、（８）５９１９からのＯＭＰ、（９）６４７６からのＯＭＰ、（１０）６４７７からのＯＭＰ。細胞系５９１９および６４７７のみがＯｐｒＭを発現する。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ウサギ＃８において（配列番号４の免疫原を使用して）ＯｐｒＭ外側ループ２に対して誘導されたポリクローナル抗体の、天然ＯｐｒＭタンパク質への結合能を示す。シュードモナス・エルジノーサ細胞系５８９０、５９１９、６４７６および６４７７からの外膜調製物（ＯＭＰ）をプローブするために（Ａ）免疫前血清（レーン１〜５）または（Ｂ）免疫後血清（レーン６〜１０）のいずれかを使用したウエスタンブロットが示されている。レーンは以下のとおりである：（１）分子量マーカー、（２）５８９０からのＯＭＰ、（３）５９１９からのＯＭＰ、（４）６４７６からのＯＭＰ、（５）６４７７からのＯＭＰ、（６）分子量マーカー、（７）５８９０からのＯＭＰ、（８）５９１９からのＯＭＰ、（９）６４７６からのＯＭＰ、（１０）６４７７からのＯＭＰ。細胞系５９１９および６４７７のみがＯｐｒＭを発現する。
【図７Ａ】図７Ａは、ウサギ＃３において（配列番号３の免疫原を使用して）ＯｐｒＭ外側ループ１に対して誘導されたポリクローナル抗体の、シュードモナス・エルジノーサの全細胞への結合能を示す。一次抗体としてポリクローナル抗体を使用して、全細胞免疫染色を行った。（Ａ）ＯｐｒＭ発現を欠くシュードモナス・エルジノーサ細胞（細胞系６４７６）または（Ｂ）ＯｐｒＭを発現するシュードモナス・エルジノーサ細胞（細胞系６４７７）を使用した。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ウサギ＃３において（配列番号３の免疫原を使用して）ＯｐｒＭ外側ループ１に対して誘導されたポリクローナル抗体の、シュードモナス・エルジノーサの全細胞への結合能を示す。一次抗体としてポリクローナル抗体を使用して、全細胞免疫染色を行った。（Ａ）ＯｐｒＭ発現を欠くシュードモナス・エルジノーサ細胞（細胞系６４７６）または（Ｂ）ＯｐｒＭを発現するシュードモナス・エルジノーサ細胞（細胞系６４７７）を使用した。
【図８Ａ】図８Ａは、ウサギ＃５において（配列番号４の免疫原を使用して）ＯｐｒＭ外側ループ２に対して誘導されたポリクローナル抗体の、シュードモナス・エルジノーサの全細胞への結合能を示す。一次抗体としてポリクローナル抗体を使用して、全細胞免疫染色を行った。（Ａ）ＯｐｒＭ発現を欠くシュードモナス・エルジノーサ細胞（細胞系６４７６）または（Ｂ）ＯｐｒＭを発現するシュードモナス・エルジノーサ細胞（細胞系６４７７）を使用した。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ウサギ＃５において（配列番号４の免疫原を使用して）ＯｐｒＭ外側ループ２に対して誘導されたポリクローナル抗体の、シュードモナス・エルジノーサの全細胞への結合能を示す。一次抗体としてポリクローナル抗体を使用して、全細胞免疫染色を行った。（Ａ）ＯｐｒＭ発現を欠くシュードモナス・エルジノーサ細胞（細胞系６４７６）または（Ｂ）ＯｐｒＭを発現するシュードモナス・エルジノーサ細胞（細胞系６４７７）を使用した。
【０１０７】
本発明の他の特徴および利点は、本発明を例示的に記載している以下の実験の説明から明らかとなるであろう。これらの実施例は例示として記載されており、限定的なものではない。
【０１０８】
実施例
本発明の種々の特徴を更に例示するために、以下に実施例を記載する。これらの実施例は、特許請求している本発明を限定するものではない。
【０１０９】
実施例１：ＯｐｒＭ外側ループの特定
２４個のイミペネム耐性シュードモナス・エルジノーサ臨床分離体のパネルにわたるＯｐｒＭ流出ポンプの類似性／保存性を判定した。臨床分離体は全て株ＰＡＯ１のものであり、米国および世界中の幾つかの異なる病院において異なる患者から集められた。サンプルは、気管内吸引物、喀痰、気管支洗浄液、尿、血液または創傷から集められた。
【０１１０】
ＤＮＡを各臨床分離体から単離して、それぞれからＯｐｒＭ外側ループを増幅し、配列決定した。簡潔に説明すると、培養をＴＢＳ内で３７℃で一晩成長させた後、１３，０００×Ｇで５分間遠心分離した。ペレットを２００μｌの水に再懸濁させ、再懸濁させて９５℃に１０分間加熱した。サンプルを氷上で冷却した後、１３，０００×Ｇで５分間遠心分離した。上清を集めた。
【０１１１】
ＯｐｒＭの結晶構造（Ａｋａｍａら，２００４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９：５２８１６−９）に基づいて同一アンプリコン（〜９２０塩基対）においてＯｐｒＭ外側ループ１および２の両方をコードするＤＮＡの領域を増幅するＰＣＲプライマー（配列番号６および７）を設計した。以下の条件下でＰＣＲを行った：９４℃で２分間の変性の後、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、６８℃で１分間の３５サイクル。３５サイクルの後、サンプルを６８℃で１０分間維持し、ついで４℃で維持した。ＤＮＡ配列の二重のカバーをもたらすように設計されたプライマー（配列番号８〜１１）を使用する配列決定のために、各分離体に関するＰＣＲアンプリコンを、二重で、Ｓｅｑ  Ｗｒｉｇｈｔ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）に送った。
【０１１２】
Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩソフトウェアパッケージ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して配列分析を行った。複数の生配列データファイルを１つのアンプリコンへと合体させるために、ＣｏｎｔｉｇＥｘｐｒｅｓｓを使用した。各分離体の最終アンプリコン（ヌクレオチドおよびアミノ酸の両方）を比較するために、ＡｌｉｇｎＸを使用した。
【０１１３】
配列データの比較は臨床分離体の全てのうちの２つのＯｐｒＭ外側ループにおいて１００％のアミノ酸配列同一性を示した。しかし、ＯｐｒＤ、ＡｍｐＣおよびＡｍｐＤのアミノ酸配列相違により示されるとおり、それらの臨床分離体は互いに関連していなかった（データ非表示）。この保存性ゆえに、それらの外側ループエピトープはシュードモナス・エルジノーサの多数の株を認識するであろう。
【０１１４】
実施例２：抗原の製造
ＯｐｒＭ結晶構造（Ａｋａｍａら，２００４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９：５２８１６−９）を指針として用いて、ＯｐｒＭ外側ループを幾つかの周辺アミノ酸残基と共に含むペプチドを合成した。ＯｐｒＭ外側ループ１では、２つのアミノ酸残基をループのＮ末端に含有させ、１つのアミノ酸残基をＣ末端に含有させた。ＯｐｒＭ外側ループ２では、１つのアミノ酸残基をループのＮ末端に含有させ、３つのアミノ酸残基をＣ末端に含有させた。含まれている周辺残基を含有する外側ループ配列を配列番号３および４に示す。
【０１１５】
また、各ペプチドの溶解度を増加させ、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）担体タンパク質へのその結合を促進するために、３つのアミノ酸残基（ＣＫＫ）を各ペプチドのＮ末端に付加した。
【０１１６】
Ｆｍｏｃ化学を用いる固相ペプチド合成により、ペプチドを合成した。初期固体支持体はＣｈｅｍａｔｒｉｘ樹脂であった。ＦｍｏｃをＤＭＦ中の２０％  ピペリジンにより除去し、ついでＤＭＦで洗浄した。アミノ酸をＨＢＴＵ／ＤＩＥＡで活性化させ、ニンヒドリン試験が検出可能なアミノ基を示さなくなるまで３０分間カップリングさせた。所望の配列に応じた同じカップリング法により、ペプチドを構築した。
【０１１７】
固体支持体上のペプチドをＴＦＡ／ジチオエタノール／フェノール／チオアニソール（８５：５：５：５の体積比）の混合物により２時間切断した。ペプチドを冷エーテル中で沈殿させた後、それらを集め、洗浄し、乾燥させて粗製物を得た。
【０１１８】
粗ペプチドをアセトニトリルおよび水の混合物に溶解させ、ついで逆相ＨＰＬＣカラムに通過させた。所望のペプチドを多数の画分中に集め、その純度を分析用ＨＰＬＣにより調べた。純度８０％を超える全画分を一緒にし、凍結乾燥させて最終ペプチド粉末を得た。
【０１１９】
ＫＬＨ（５ｍｇ）をヘテロ二官能性リンカーにより３０分間活性化させた。過剰のリンカーを透析により除去した。生じた溶液を精製ペプチド（５ｍｇ）に加え、１６時間反応させ、ついで未コンジュゲート化ペプチドを除去するために透析に付し、ついで凍結乾燥して最終産物を得た。
【０１２０】
実施例３：ポリクローナル抗体の製造
免疫原としてＫＬＨにコンジュゲート化されたＯｐｒＭ外側ループ（周辺アミノ酸残基を伴うもの）のそれぞれを使用して、ポリクローナル抗体を製造した。抗原注射の前に、使用されるＯｐｒＭ外側ループ免疫原（すなわち、配列番号３および４）を認識するバックグラウンド抗体に関してウサギをスクリーニングした。免疫前ウサギ血清を免疫原に対する抗体に関してＥＬＩＳＡによりアッセイした。ＯｐｒＭ外側ループ免疫原を認識するバックグラウンド抗体を示したウサギは免疫化に使用されなかった。
【０１２１】
８匹のＮＺＷウサギを、第０、２１、４２、６３、８４および１０５日に、ＫＬＨコンジュゲート化ＯｐｒＭ外側ループ１（配列番号３）または外側ループ２（配列番号４）ペプチド（５００μｇ／注射）で皮下に免疫化した。第０日の注射はタイターマックス（Ｔｉｔｅｒｍａｘ）で処方され、後続の全ての注射はフロイント不完全アジュバントで処方された。第５２日（５ｍｌの血清を入手）、第７３日（２０ｍｌの血清を入手）、第９４日（２０ｍｌの血清を入手）、第１１５日（２０ｍｌの血清を入手）および第１１８日（５０ｍｌの血清を入手）にウサギから採血した。それらの血清をＯｐｒＭ外側ループに対する免疫反応の存在に関してスクリーニングし、ＫＬＨコンジュゲート化外側ループペプチドの両方が免疫化ウサギにおいて免疫応答を生成すると判定された。
【０１２２】
実施例４：ポリクローナル抗体の特徴づけ
免疫化ウサギの血清を２つのインビトロアッセイ、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット分析により分析した。
【０１２３】
免疫化により誘導された抗ＯｐｒＭ抗体の量を測定するために、血清をＥＬＩＳＡによりアッセイした。外側ループ１または外側ループ２のいずれかからの精製ペプチドを９６ウェルプレートの各ウェルにおいてプレーティングした。ＰＢＳ＋３％  ＢＳＡの溶液を非特異的ブロッキングおよびサンプル／対照／二次抗体の希釈に使用した。サンプル血清を陰性対照（正常血清）および陽性対照（抗オボアルブミン）との比較において実験に付した。ＨＲＰコンジュゲート化抗ウサギ二次抗体およびＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質系を使用して、シグナルを検出した。プレートを、５７０ｎｍの対照を使用して、４１５ｎｍの波長で読取った。
【０１２４】
図１は、ＯｐｒＭ外側ループ１を含むペプチドで免疫化されたウサギが、外側ループ１を含有するペプチド（配列番号３）（黒色の記号）に対して高い抗体価を生成したことを示している。外側ループ２を含有するペプチド（配列番号４）をアッセイにおける抗原として使用した場合には、１頭のウサギのみが少量の交差反応性を示した（白色の記号）。
【０１２５】
図２は、ＯｐｒＭ外側ループ２を含むペプチドで免疫化されたウサギが外側ループ２を含有するペプチド（配列番号４）（黒色の記号）に対して高い抗体価を生成したことを示している。外側ループ１を含有するペプチド（配列番号３）をアッセイにおける抗原として使用した場合には、２頭のウサギが少量の交差反応性を示した（白色の記号）。
【０１２６】
また、免疫化により誘導された抗ＯｐｒＭポリクローナル抗体を更に特徴づけるために、ウエスタンブロットにより血清を分析した。ウエスタンブロットアッセイにおいて使用した抗原は、シュードモナス・エルジノーサ細胞系から得られた外膜調製物（ＯＭＰ）であった。公開方法（Ｙｏｓｈｉｈａｒａら，１９９６，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３９４：１７９−８２；Ｈｏｓａｋａら，１９９５，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１７３１−５）から応用された方法を用いて、シュードモナス株の外膜からのサルコシル抽出物を単離した。簡潔に説明すると、完全増殖前培養の１０倍希釈の後、シュードモナス・エルジノーサを、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２で補足されたＬ−ブロス内で３７℃で５時間増殖させた。細菌細胞を２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）に懸濁させ、超音波処理により破裂させた。膜を１００，０００×ｇ、１５℃で４５分間の遠心分離によりペレット化し、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）に懸濁させた。膜懸濁液を１％（重量／体積）のＮ−ラウロイルサルコシナート（サルコシル）と混合し、３０℃で３０分間インキュベートした。外膜タンパク質を１００，０００×ｇ、１５℃で４５分間の遠心分離によりペレット化し、２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳまたはリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）で２回洗浄した。
【０１２７】
外膜調製物を調製するために、幾つかの細胞系を使用した。細胞は野生型のシュードモナス・エルジノーサであるか、またはＯｐｒＭおよびＯｐｒＤの一方または両方を欠いていた。細胞系５９１９および６４７７はＯｐｒＭを発現し、細胞系５８９０および６４７６はＯｐｒＭを発現しない（Ｄｕｎｃａｎら，“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｓｔｒａｉｎ  ｐａｎｅｌ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎ  ｆｉｆｔｙ−ｔｗｏ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｄｒｕｇ  ｅｆｆｌｕｘ  ｓｙｓｔｅｍｓ”４４ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，２００４年１０月３０日〜１１月２日，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（２００４）．Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｄ−１５３２を参照されたい）。
【０１２８】
Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５０：４００７−２１，１９７５）により修飾されたＬａｅｍｍｌｉ（Ｎａｔｕｒｅ  ２２７：６８０−５，１９７０）の方法に従い、ＳＤＳスラブゲル電気泳動を行った。サンプルをＳＤＳ煮沸バッファー中で０．５ｍｇ／ｍｌに希釈し、レーン当たり全タンパク質５μｇが存在するように１０％アクリルアミドスラブゲルのウェル内にローディングした。ＳＤＳスラブゲル電気泳動を１５ｍＡ／ゲルで約４時間行った。分子量マーカーをＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。ゲルをクーマシーで染色し、セロファンシートの間で乾燥させた。ゲルスラブ電気泳動後、ブロッティング用ゲルをトランスファーバッファー（１０ｍＭ  ＣＡＰＳ，ｐＨ１１，１０％ＭｅＯＨ）中に配置し、２００ｍＡおよび約１００ボルト／２ゲルでＰＶＤＦ膜上に一晩にわたりトランスブロットした。
【０１２９】
ブロットをＴＴＢＳ生理食塩水中の５％脱脂乾燥乳中で２時間ブロッキングした。ブロットを一次抗体中で一晩インキュベートし、ＴＴＢＳ中で３×１０分間洗浄した。免疫化ウサギから集めた血清を、一次抗体として使用するために１：５００，０００希釈した（ＴＴＢＳ中の２％脱脂乾燥乳中）。ついでブロットを二次抗体（抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ）中に２時間配置し、ＴＴＢＳ中で３×１０分間洗浄し、ＥＣＬで処理し、ｘ線フィルムに１時間露出させた。
【０１３０】
図３Ａ〜３Ｄは、ＯｐｒＭ外側ループ１（配列番号３）で免疫化された４頭の異なるウサギから集められた血清が、ＯｐｒＭ発現細胞から調製された２つの外膜調製物（レーン１０および１２）においてＯｐｒＭを認識したことを示している。全てのウサギは免疫化後のみにおいてＯｐｒＭ認識を示している。
【０１３１】
図４Ａ〜４Ｄは、ＯｐｒＭ外側ループ２（配列番号４）で免疫化された４頭の異なるウサギから集められた血清が、ＯｐｒＭ発現細胞から調製された２つの外膜調製物（レーン１０および１２）においてＯｐｒＭを認識したことを示している。パネルＡ、ＢおよびＤに示されているウサギは免疫化後のみにおいてＯｐｒＭ認識を示している。
【０１３２】
実施例５：ポリクローナル抗体は天然タンパク質を検出しうる
ポリクローナル抗体を、ウエスタンブロットおよび全細胞免疫染色により天然（非変性）ＯｐｒＭを検出するそれらの能力に関してアッセイした。
【０１３３】
ＯｐｒＭタンパク質がその天然コンホメーションを保持するように外膜調製物を還元条件下で泳動させないこと以外は実施例４に記載されているのと実質的に同様にして、ウエスタンブロットを行った。サンプルおよび分子量マーカーをＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘプレキャスト３〜１２％  ビス・トリス（Ｂｉｓ  Ｔｒｉｓ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ  ＃  ＢＮ  １００１ＢＯＸ  Ｌｏｔ＃  １１１０２７３１）、厚さ１．０ｍｍの小型ゲル上で泳動させた。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの“ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ  Ｓｙｓｔｅｍ”，Ｖｅｒｓｉｏｎ  Ａ（２００６年１月２０日，２５−０８９４）に従いＮａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥランニング（Ｒｕｎｎｉｎｇ）バッファーおよびＮａｔｉｖｅＰＡＧＥカソード添加物（Ｃａｔｈｏｄｅ  Ａｄｄｉｔｉｖｅ）を使用して、ゲルを泳動させた。簡潔に説明すると、サンプルをローディングした後、ダーク・カソード（Ｄａｒｋ  Ｃａｔｈｏｄｅ）［１部のＮａｔｉｖｅＰＡＧＥカソードバッファー添加物（Ｃａｔｈｏｄｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ａｄｄｉｔｉｖｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ＃  ＢＮ２００２  Ｌｏｔ  ＃  １０７６３０３）で希釈された１部のＮａｔｉｖｅＰＡＧＥランニングバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ＃  ＢＮ２００１  Ｌｏｔ  ＃  １１１４３８５）］を使用して、ゲルを一定の１５０Ｖで約１５分間泳動させた。ついで、色素最前部がゲルの最下部に達するまでないしその後７０分間にわたり、ライト・カソード（Ｌｉｇｈｔ  Ｃａｔｈｏｄｅ）［１部のＮａｔｉｖｅＰＡＧＥカソードバッファー添加物（Ｃａｔｈｏｄｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ａｄｄｉｔｉｖｅ）で希釈された１０部のＮａｔｉｖｅＰＡＧＥランニング（Ｒｕｎｎｉｎｇ）バッファー］を使用して、ゲルを一定の１５０Ｖで泳動させた。実施例４に記載されているとおりに、ゲルをＰＶＤＦ膜上にブロッティングし、ＯｐｒＭタンパク質を検出した。
【０１３４】
図５Ａ〜５Ｂは、ループ１（配列番号３）で免疫化されたウサギ＃１から集められた血清が天然ＯｐｒＭを認識するが（レーン８および１０）、免疫前血清においてもＯｐｒＭを発現しない細胞系からの膜調製物上においてもＯｐｒＭシグナルが認められない（レーン７および９）ことを示している。
【０１３５】
図６Ａ〜６Ｂは、ループ２（配列番号４）で免疫化されたウサギ＃８から集められた血清が天然ＯｐｒＭを認識するが（レーン８および１０）、免疫前血清においてもＯｐｒＭを発現しない細胞系からの膜調製物上においてもＯｐｒＭシグナルが認められない（レーン７および９）ことを示している。
【０１３６】
ループ１およびループ２に対して産生させたポリクローナル抗体を、全シュードモナス・エルジノーサ上でＯｐｒＭを検出するそれらの能力に関して試験した。以下の２つの細胞系をアッセイにおいて使用した：ＯｐｒＭを発現する６４７７、およびＯｐｒＭを発現しない６４７６（陰性対照として）。簡潔に説明すると、中期対数増殖期の細胞を遠心分離によりペレット化し、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ中の３％  熱不活性化ウシ胎児血清）中に再懸濁させ、３７℃で３０分間ブロッキングした。細胞をペレット化し、ＰＢＳ中の種々の希釈度（図７および８においては１：１００希釈を用いた）の一次ポリクローナル抗体中に再懸濁させた。抗体を３７℃で４５分間結合させた。細胞をＰＢＳ中で２回洗浄した。蛍光標識二次抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ａｌｅｘａ−４８８）をＰＢＳ中の１：２００希釈で使用した。二次抗体を３７℃で４５分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、３８４ウェルのグレイナー（Ｇｒｅｉｎｅｒ）イメージングプレート中に分注した。ＢＤ  Ｐａｔｈｗａｙ  ４３５自動イメージングプラットフォームおよび６０倍対物レンズを使用して、イメージを得た。
【０１３７】
Ａｌｅｘａ  ４８８チャネルからのイメージを図７（ウサギ＃３においてループ１に対して産生されたポリクローナルの場合）および図８（ウサギ＃５においてループ２に対して産生されたポリクローナルの場合）に示す。
【０１３８】
実施例６：尿中のシュードモナスタンパク質の検出
診断として有用になるためには、ＯｐｒＭは感染患者からの生物学的サンプルにおいて検出可能でなければならない。生物学的サンプル中のＯｐｒＭに関してアッセイするために、およびタンデム質量分析と組合された液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によるショットガンシークエンシングが尿中のシュードモナスペプチドを特定する能力を判定するために、実験を行った。
【０１３９】
ショットガンシークエンシング（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いてヒトの尿において検出されうる細菌タンパク質の検出限界を、２つの方法、すなわち、（１）尿タンパク質中に加えられた３つのシュードモナスタンパク質対照を検出することにより、および（２）ヒト尿サンプル中に種々の希釈度で加えられた種々の培養条件で増殖させたシュードモナスからの排出タンパク質抽出物を検出することにより、決定した。ヒト尿中の細菌タンパク質を特定するために、溶液内およびゲル内（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）の消化方法ならびにそれらに続くショトガンシークエンシングＬＣ−ＭＳ／ＭＳを評価した（例えば、Ｓｐａｈｒら，２００１，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １：９３−１０７を参照されたい）。細菌タンパク質が加えられていない尿を陰性対照として使用した。
【０１４０】
尿中の細菌タンパク質の検出
尿サンプルを、粒子を除去するために遠心沈降させ、ついで分子カットオフ濾過装置（Ａｍｉｃｏｎ  ３Ｋ  Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  Ｆｉｌｔｅｒ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用して濃縮した。バッファー交換のために炭酸水素アンモニウムを使用して、濾過をもう一度繰返した。保持物質のタンパク質濃度をＢＣＡアッセイにより測定した。
【０１４１】
３つのシュードモナス・エルジノーサタンパク質対照（レクチン  １００ｆｍｏｌ／μｌ、アズリン  １０ｆｍｏｌ／μｌ、外毒素  １ｆｍｏｌ／μｌ）を２０μｇの全尿タンパク質中に加えた。サンプル中に存在するタンパク質をショットガンＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析のための調製物中のタンパク質へと加水分解するために、溶液内消化を用いた。
【０１４２】
５０ｍＭ  炭酸水素アンモニウム中の１０μｌの１００ｍＭ  ＤＴＴを添加尿サンプルに加えた。ついで５０ｍＭ  炭酸水素アンモニウムを１８０μｌの最終体積まで加え、６０℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、５０ｍＭ  炭酸水素アンモニウム溶液中の１０μｌの３００ｍＭ  ヨードアセトアミドを加え、室温で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、１０μｌの０．０５μｇ／μｌ  トリプシン溶液をサンプルに加え、３７℃で１２〜１６時間インキュベートした。
【０１４３】
ショットガンＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法の液体クロマトグラフィー部分は、２％から７０％までの溶媒Ｂ（アセトニトリル中の０．１％  ＴＦＡ）の勾配を用いてＣ１８ナノ−スプレーカラムからペプチドを溶出することにより行った。
【０１４４】
ショットガンＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法のタンデム質量分析部分は、ＬＴＱ−オービトラップ（Ｏｒｂｉｔｒａｐ）分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）においてデータ依存的獲得モードを用いてペプチドを検出することにより行った。３００〜２０００のｍ／ｚを有するイオンを６００００の分解能でオービトラップにおいて走査した。ペプチドの特定およびデータベースの検索のためにＭＳＭＳスペクトルを得るために、各走査において最高強度を有する最上部の２０個のイオンを断片化した。
【０１４５】
ショットガンＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析はレクチン（１００ｆｍｏｌ／μｌで添加）の１つのペプチドおよびアズリン（１０ｆｍｏｌ／μｌ）の１つのペプチドを示したが、このことは、標準物に関する検出限界が溶液内消化サンプルにおいては１０〜１００ｆｍｏｌ／μｌであったことを示唆している。したがって、この方法は、シュードモナス・エルジノーサ培養における排出タンパク質としてＯｐｒＭが検出可能であるかどうかを判定するために用いられうる。
【０１４６】
培養上清中のＯｐｒＭ
シュードモナス・エルジノーサにより培地へと排出されたタンパク質を特徴づける研究を、４つのシュードモナス・エルジノーサ株（ＣＬＢ  ２４２８、ＣＬ５７０１、ＣＬＢ２４３８８およびＰＡＯ−１）を使用して行った。４つ全ての株がＭ９およびＭＨ２培地の両方において増殖した。培地のいずれにおいても、汚染タンパク質の有意なバックグラウンドレベルは認められなかった。上清を集め、排出タンパク質を単離した。細菌タンパク質がサンプルにおいて特定されうるように、ショットガンＬＣ−ＭＳ／ＭＳ用のサンプルを調製するために、溶液内およびゲル利用（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）消化アプローチの両方を用いた。
【０１４７】
溶液内消化は前記のとおりに行った。ゲル内トリプシン消化は以下のとおりに行った。ＰＡＧＥゲルバンドを顕微鏡スライド上で１：１ｍｍ片に切断し、１．５ｍｌエッペンドルフチューブ内に配置した。ゲルが染色されていた場合には、ゲル薄片を約４００μｌの２５ｍＭ  炭酸水素アンモニウム／３０％  アセトニトリル溶液中の１０分間の浸漬により脱染した。溶液を、ピペットを使用して取り出し、廃棄した。ゲル薄片が透明になるまでこの過程を繰返した。
【０１４８】
ゲル薄片が収縮し不透明〜白色になるまで、４００μＬの１００％  アセトニトリルを加えることにより、ゲル薄片を脱水させた。アセトニトリルを除去し、５〜１０分間空気乾燥させた。
【０１４９】
１００μｌの０．１５ｍＭ  ＤＴＴ溶液を各サンプルに加え、６０℃で３０分間インキュベートした。ついで液体を除去した後、ゲル薄片が完全に収縮するまでアセトニトリルでの洗浄を行った。アセトニトリルを除去した後、ゲル薄片を空気乾燥させた。
【０１５０】
１００μｌの０．３ｍＭ  炭酸水素アンモニウム溶液を各ゲル薄片に加え、暗所中、室温で１５分間インキュベートした。ついで液体を除去した後、ゲル薄片が完全に収縮するまでアセトニトリルでの洗浄を行った。アセトニトリルを除去した後、ゲル薄片を空気乾燥させた。
【０１５１】
５０μｌの１２．５ｎｇ／μｌ  トリプシン溶液を各ゲル薄片に加え、氷上で３０分間インキュベートした。ついでゲル薄片を３７℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、ゲル薄片を移さないように注意しながら、液体を０．５ｍｌ  エッペンドルフチューブに移した。２００μｌの５０％  アセトニトリル／５％  酢酸溶液を加え、室温で２０分間インキュベートした。ついでサンプルを低加熱ないし乾燥付近でのスピード・バック（ｓｐｅｅｄ  ｖａｃ）に付し、分析まで−２０℃で保存した。
【０１５２】
排出タンパク質の溶液内消化およびそれに続くＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて、重複しない（ｕｎｉｑｕｅ）４２６個のタンパク質を特定した。ゲル内アプローチおよびそれに続くＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて、９１２個のタンパク質を特定した。ＭＨ２およびＭ９培地内で増殖させた４個の細菌株を使用して、重複しない合計１１５７個のシュードモナス・エルジノーサタンパク質を特定した。
【０１５３】
どちらの方法を用いてもＯｐｒＭが特定された。ＯｐｒＭはサンプル中に放出されると考えられるため、このことは、ＯｐｒＭが、本発明の生物学的サンプルを使用する感染検出のための良好な候補であることを示した。
【０１５４】
また、ＯｐｒＭがそれらの条件において検出されうるかどうかを判定するために、上清タンパク質を使用して尿サンプル中に添加した。上清タンパク質をヒトの尿中に１０：１、１００：１および１０００：１（ヒト尿タンパク質：細菌タンパク質）で添加した。シュードモナスタンパク質は、１０００：１のヒト尿タンパク質：細菌タンパク質の比で混合された場合であっても、溶液内およびゲル内消化サンプルの両方において特定された。
【０１５５】
他の実施形態も以下の特許請求の範囲内である。幾つかの実施形態が示され記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、種々の修飾が施されうる。
【図１】
2015509083.tif 000003
【図２】
2015509083.tif 000004
【図３Ａ】
2015509083.tif 000005
【図３Ｂ】
2015509083.tif 000006
【図３Ｃ】
2015509083.tif 000007
【図３Ｄ】
2015509083.tif 000008
【図４Ａ】
2015509083.tif 000009
【図４Ｂ】
2015509083.tif 000010
【図４Ｃ】
2015509083.tif 000011
【図４Ｄ】
2015509083.tif 000012
【図５Ａ】
2015509083.tif 000013
【図５Ｂ】
2015509083.tif 000014
【図６Ａ】
2015509083.tif 000015
【図６Ｂ】
2015509083.tif 000016
【図７Ａ】
2015509083.tif 000017
【図７Ｂ】
2015509083.tif 000018
【図８Ａ】
2015509083.tif 000019
【図８Ｂ】
2015509083.tif 000020
【配列表】
2015509083000001.app
【国際調査報告】
2015509083.tif 000021
2015509083.tif 000022
2015509083.tif 000023