(57)【要約】均一な混合物中の脂質および油状物質を酵素的に加水分解するための効率的な方法が、本発明によって提供される。本発明は、詳細には、脂質から脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを製造する方法であって、98%超の脂質が所望の生成物に変換される方法を提供する。本発明はまた、最終生成物においてsn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)を5%未満で含むが実質的にsn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)を含むことなく、脂肪酸およびグリセロールを製造する方法を提供する。
2015509358.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質、極性有機溶媒、および水から構成される均一な混合物を調製するステップと、
前記均一な混合物をリパーゼで酵素的に加水分解し、加水分解物を得るステップであって、前記加水分解物が、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを含む、ステップ
とを含む、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを製造する方法。
【請求項２】
請求項１に記載の前記加水分解をイオン交換樹脂で処理した後、リパーゼでさらに酵素的に加水分解して、混合物を得るステップを含み、
前記混合物が、脂肪酸およびグリセロールを含み、モノアシルグリセロール(MAG)を5%未満で含む、
脂肪酸およびグリセロールを製造する方法。
【請求項３】
前記脂質が油状物質である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記油状物質が、植物油、樹木油、微生物油、動物由来油、魚油、ヒマシ油、オリーブ油、カラシ油、亜麻仁油、キャノーラ油、ココヤシ油、コリアンダー油、トウモロコシ油、綿実油、ヘーゼルナッツ油、オリーブ油、ニーム油、ヤシ油、落花生油、菜種油、米ぬか油、紅花油、大豆油、ヒマワリ油、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記脂質が、飽和脂質、不飽和脂質、ヒドロキシ不飽和脂質、ヒドロキシ飽和脂質、エポキシ脂質、リン脂質、ワックスエステル、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記脂質が、脂肪酸のポリオールエステルである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記極性有機溶媒が、t-ブタノール、iso-アミルアルコール、ジ-アセトンアルコール、エタノール、プロパノール、およびt-ペンタノール、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
リパーゼによる酵素的加水分解が、固定されたリパーゼを用いて実施される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
リパーゼが担体に固定され、前記担体の主材料が、ポリスチレンとジビニルベンゼンとの共重合体、ポリアクリル酸、ポリスチレン、およびポリメタクリラートからなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記イオン交換樹脂が、強酸性陽イオン交換樹脂である、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記イオン交換樹脂が、スルホン酸基含有ポリマー樹脂、Indion130、Indion140、Indion190、Indion770、DIAION(R) SK1B、DIAION(R) SK104、DIAION(R) SK110、DIAION(R) SK112、DIAION(R) SK116、DIAION(R) PK208、DIAION(R) PHK212、DIAION(R) PK216、DIAION(R) PK220、DIAION(R) PK228、およびDIAION(R) HPK25からなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
リパーゼによる酵素的加水分解が、30℃〜80℃の温度で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
リパーゼによる酵素的加水分解が、50℃〜65℃の温度、好ましくは60℃で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法により、前記脂質の99%超が脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールに変換される、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
前記均一な混合物が、脂質、極性有機溶媒、および水を1:4:0.15〜1:7:0.5の比で含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記脂質と極性有機溶媒との比が1:4〜1:7である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記脂質と水との比が1:0.15〜1: 0.5である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
リパーゼによる酵素的加水分解が、バッチ反応器、連続反応器、または半連続反応器のいずれかにおいて実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
リパーゼによる酵素的加水分解が、連続反応器において滞留時間10〜60分間で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
リパーゼによる酵素的加水分解が、連続反応器において滞留時間10〜150分間で実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項２１】
リパーゼによる酵素的加水分解が、バッチ反応器または半連続反応器において、滞留時間0.5〜2時間で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
リパーゼによる酵素的加水分解が、バッチ反応器または半連続反応器において、滞留時間0.5〜24時間で実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項２３】
脂質、極性有機溶媒、および水から構成される均一な混合物を調製するステップと、
前記均一な混合物をリパーゼで酵素的に加水分解し、加水分解物を得るステップであって、前記加水分解物が、脂肪酸、MAG、DAG、およびグリセロールを含む、ステップと、
前記加水分解物をイオン交換樹脂で処理した後、リパーゼでさらに酵素的に加水分解して、混合物を得るステップであって、前記混合物が、脂肪酸およびグリセロールを含み、モノアシルグリセロール(MAG)を5%未満で含む、ステップ
とを含む、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪酸およびグリセロールなどの油脂化学物質を脂質から効率的かつ経済的に製造するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
油および脂質は、典型的にはグリセロールならびに飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸から構成される、トリグリセリドである。これらの物質の使用は近年、消費者に優しくかつ環境に配慮した、競争力のある有力な製品の開発に関して増加している(Hill K, Pure and Applied Chemistry 72 (2000) pp.1255-1264)。さらなる使用のほとんどのために、油および脂質は、いわゆる油脂化学系物質、主に脂肪酸とグリセロールに分離されなければならない。中間体、ならびにモノアシルグリセロール(MAG)、ジアシルグリセロール(DAG)、脂肪酸メチルエステル、さらに脂肪酸メチルエステルの水素化生成物（すなわち脂肪族アルコール）には、油脂化学産業において計り知れない用途が存在する(Falbe et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 27 (1988) pp. 41-62)。
【０００３】
トリグリセリド(TAG)の加水分解によって遊離脂肪酸(FA)、MAG、およびグリセロールを得る反応が主な反応であり、このようにして生成した脂肪酸はさらに、エステル交換される（interesterified, transesterified）か、高付加価値のある脂肪族アルコールに変換される。これらのベース材料はその後、洗浄剤および洗剤、化粧品、界面活性剤、ポリマー、および潤滑剤の製造において中間体として使用される。グリセロールのモノステアラート、モノオレアート、およびモノリシノレアートのように、計り知れない商業的重要性を有する多くの有用なモノグリセリドがあり、これらの物質は、脂肪酸とグリセロールとからの合成によって、年10,000トン超もの量が製造されている。
【０００４】
油の加水分解は、Twitchell法およびColgate-Emery法のように、高温高圧下で触媒を用いることにより工業的に達成されてきた。着色、副生成物の形成、重合化の誘導、およびその後に蒸留が必要なことが、これらの方法の主な欠点である。反応副生成物は、望ましくない暗色および焦げた味と関係があり、したがって、着色および副生成物を除去するために特殊な技術（例えば、分子蒸留）が必要である。この分野の急速な進展により、脂質分離のためのより穏やかな化学反応条件が導入されるに至っているが、しかしながら、その方法でもなお、設備投資（CAPEX）が非常に高くつき、より良い技術が求められている。
【０００５】
油または脂質の加水分解、具体的にはリパーゼを生体触媒として用いた油または脂質の加水分解は、大気圧および低温での反応を含むいくつかの利点を提供する。MAGを生成する反応を制御する可能性に加えて、酵素的方法にはいくつかのさらなる利点が存在する。しかしながら、現在まで、脂質分解酵素を用いることによる脂質分離は、実験的試行においてのみ実施されてきた。酵素的方法は、高いコストと長い反応時間ゆえに、いまだかつて工業化されてこなかった。
【０００６】
Hammondら (Journal of American Oil Chemist’s Society, 67 (1990), pp.761-765)は、約58日間で90%の脂質分解が達成されたことを記載しているが、4日間では僅か10%の変換が達成されただけであった。著者らは、加水分解速度が遅かったのは、反応生成物であるグリセロールによって酵素が阻害されたためであり得ると仮定している。US5932458は、飽和度または水酸化度が異なる様々な種類の脂質および油の脂質分離のための、粉末状にされたシードから回収されるリパーゼ触媒の使用について記載している。
【０００７】
微生物のリパーゼもまた、二相混合物ヘプタン-緩衝液（pH 7.0）中60℃で、ヒマワリ油、大豆レシチン、およびこれらの混合物を加水分解する際の触媒として研究されてきた(Ferreira et al., Enzyme and Microbial Technology, 41(1-2) 2007, pp. 35-43)。ヤシ油の加水分解は、二相反応系において膜結合リパーゼを用いて、収率32〜50%のMAGの生成を伴った(Tianwei Tan et al., Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 18 (2002), pp. 325-331)。Fernandesa MLM ら(Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 30 (1) 2004, pp. 43-49)は、AOT/イソオクタン中TLLリパーゼにより触媒される加水分解および合成反応により、ミセル系が逆転したことを記載している。Bilyk ら(Journal of American Oil Chemist’s Society, 68 (1991), pp. 320-323)は、第2級アミンの存在下、菌類リパーゼを用いることにより、適度な温度で20時間以内に76％の加水分解が達成されたことを報告している。その収率は45℃でさらに改善されたこともまた、報告されている。
【０００８】
Kulkarni ら(Indian Journal of Biotechnology, 4 (2005), pp. 241-245)は、反応器および反応条件に関して、ヒマシ油の酵素的加水分解の最適化を報告している。Ramachandran ら(Biochemical Engineering Journal, 34(2007), pp. 228-235) は、様々な油の加水分解反応速度の研究のために、および、加水分解反応において用いられるリパーゼの操作上の安定性を改善するために、固定されたリパーゼを用いた詰め床反応器を使用することについて記載している。Goswamiら(Bioresource technology, 101 (1) 2010, pp. 6-13)は、界面活性剤が脂肪酸の製造のためのヒマシ油の加水分解を促進したことを記載している。Martinezらは、詰め床反応器を用いた、超臨界CO2の連続流におけるキャノーラ油の加水分解について記載している(Biocatalysis and Biotransformation, 12 (2) 2002, pp. 147-157)。Helena Sovova らは、超臨界CO2を用い、詰め床反応器中でLipozyme（登録商標）により触媒される、クロスグリ油の加水分解について記載している(Chemical Engineering Science, 58 (11) 2003, pp. 2339-2350)。
【０００９】
WO 91/016442 およびUS5116745は、トリグリセリドを選択的に加水分解して2-アシルグリセリドを得る方法を記載している。この方法では、第1級低級アルキルアルコール、水性緩衝系、および1,3-リパーゼが用いられる。2-アシルモノグリセリドは、酸無水物と1,3-リパーゼ触媒とを用いたエステル化によって、立体特異的に1,2-ジアシルグリセリドまたは2,3-ジアシルグリセリドを製造するために用いられ得る。立体特異的トリグリセリドは、転位を制御する条件下における標準的なエステル化反応により、これらの物質から製造することができる。
【００１０】
WO90/013656は、リパーゼにより触媒されるトリグリセリドのエステル交換の後、油状生成物を調製するための低温結晶化を含む、２段階酵素反応により、オメガ‐3脂肪酸が著しく増加したことを記載している。この方法では、非常に純度の高いモノグリセリドの混合物が得られ、その少なくとも60％はオメガ‐3脂肪酸を含む。WO 90/04033は、リパーゼにより触媒されるエステル交換により、非常に純度の高いモノグリセリドを製造するための方法を記載している。記載されているこの方法は、油状物質あるいは純粋なトリグリセリドをアルコール、少量の水、およびリパーゼと混合することを含む。この反応は、穏やかな条件下で進行し、β‐モノグリセリド生成物を高収率で生成する。
【００１１】
US6500974は、脂肪酸とグリセロールとを食品等級極性溶媒の存在下で反応させ、触媒の使用を避けることにより、モノグリセリドを調製する方法を記載している。Eitel Pastorら (Biocatalysis and Biotransformation, 12 (2) 1995, pp. 147-157)は、ステアリン酸を用いたグリセロールの直接エステル化、あるいは、異なる極性を有する様々な溶媒を用いてCandida antarctica リパーゼ(Novozym- 435)の存在下アシルドナーとしてステアリン酸エチルを用いたエステル交換について記載している。
【００１２】
ほとんどすべての場合において、加水分解は、不完全であるか、または完了するまで3日間を超える長い反応時間を必要とした。触媒としてのリパーゼの有効性はしばしば、製造および単離のコストの高さによって相殺されるため、研究グループは、酵素の収量や酵素の生産性を高めることに絶えず励んでいる。さらに、工業的使用の成功を妨げてきた酵素の多量消費、長い反応時間、および低生産性によって、商業的使用は制限されてきた。
【００１３】
一般的に、リパーゼによって触媒される酵素的加水分解は、水中油型または油中水型のエマルションを用いて実施されてきたが、ここでは、酵素を遊離形態で使用する場合に酵素溶液の再利用が問題となる。また、固定された酵素を調製することは、非均一媒体中における基質の拡散性が低いためにその効率的な変換を制限するという、基質の利用容易性の問題を有する。
【００１４】
先行技術の方法はいずれも、３つの望ましい特質、すなわち、酵素触媒のコストの低さ、油状物質の完全な加水分解、および酵素の高い安定性を提供していない。引用される先行技術においては、加水分解が不完全な油状物質(MAGおよびDAG)およびFAを分離しようとする試みは何もなされていない。
【００１５】
モノグリセリドの酵素的合成に関する報告はいずれも主に、グリセロールを用いたヒマシ油、大豆油、ココヤシ油、ヤシ油、菜種油、米ぬか油などの様々な基質のグリセロール分解に焦点を当てている。様々な油状物質とグリセロールを用いるグリセロール分解によるMAGの製造は、費用のかかる方法である。
【００１６】
したがって、油状物質から脂肪酸およびグリセロールなどの油脂化学物質を製造するための効率的な方法を開発する必要性がある。そのような方法は、油状物質および／または脂質の加水分解法であり得、この方法ではグリセロールによって媒介される加水分解、すなわちグリセロール分解が回避され、制御された油状物質の加水分解によって直接的に脂肪酸、MAGをより多く得る。
【００１７】
本開示のさらなる態様は、下記の説明中に部分的に示され、下記の説明から部分的に明確になり、あるいは、本発明を実施することにより習得され得る。本発明は、添付の特許請求の範囲において示されて具体的に指摘されるが、本開示は、いかようにも特許請求の範囲に記載の範囲に制限されるように解釈されるべきではない。下記の詳細な説明には、本発明の様々な実施形態の例示的な説明が含まれるが、これらの実施形態は、特許請求の範囲に記載される本発明を限定するものではない。付随する図は、本明細書の一部を構成し、詳細な説明と共に、様々な実施形態を説明する役割のみを果たすものであって本発明を限定するものではない。
【００１８】
本出願における様々な参考文献の引用は、これらの参考文献が本発明の先行技術であることを認めるものではない。
【００１９】
当技術分野において開示されている酵素的加水分解法はいずれも、油状物質と水との均一な混合物の形成については何も記載していない。さらに、これらの方法には、非常に時間がかかり、加水分解が完了するまで最大72時間かかる。したがって、均一な混合物中における脂質および油状物質の酵素的加水分解のための迅速で簡便な方法が、当技術分野において必要である。
【００２０】
本発明は、6時間以内で完了することができる、脂質、油状物質、および脂質と油状物質との組み合わせの加水分解のための酵素触媒方法が提供される。
【発明の概要】
【００２１】
したがって、本発明は、
脂質、極性有機溶媒、および水から構成される均一な混合物を調製するステップと、
前記均一な混合物をリパーゼで酵素的に加水分解し、加水分解物を得るステップであって、前記加水分解物が、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを含む、ステップ
とを含む、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを製造する方法
を提供する。
【００２２】
また、本発明は、
脂質、極性有機溶媒、および水から構成される均一な混合物を調製するステップと、
前記均一な混合物をリパーゼで酵素的に加水分解し、加水分解物を得るステップであって、前記加水分解物が、脂肪酸、MAG、DAG、およびグリセロールを含む、ステップと、
前記加水分解をイオン交換樹脂で処理した後、リパーゼでさらに酵素的に加水分解して、混合物を得るステップであって、前記混合物が、脂肪酸およびグリセロールを含み、モノアシルグリセロール(MAG)を5%未満で含む、ステップ
とを含む、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを製造する方法
を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
下記の図面は、本明細書の一部をなし、本発明の態様をさらに説明するために含まれる。本発明は、本明細書に示される特定の実施形態に関する詳細な説明と組み合わせて図面を参照することにより、よりよく理解され得る。
【図１】図１は、均一媒体中において様々なリパーゼを用いたヒマシ油の加水分解を示す。
【図２】図２は、ヒマシ油、t-ブタノール、および水からなる3相の状態図を示す。
【図３】図３は、溶媒無しまたは様々な極性有機溶媒中でHypLIP (固定された Thermomyces langinousa リパーゼ)を用いたバッチ条件下において６時間後に得られた遊離脂肪酸変換率（％）を示す。
【図４】図４は、油状物質の加水分解のための半連続反応法についてのスキームを示す。
【図５】図５は、ジアシルグリセロールおよび脂肪酸の製造のための連続法についてのスキームを示す。
【図６】図６は、sn-2 モノグリセリドおよび脂肪酸の製造法を示す。
【図７】図７は、固定リパーゼカラムから得られる加水分解生成物のHPLC-MSプロファイルを示す。
【図８】図８は、油状物質を加水分解してsn-1(3) モノグリセリドおよび脂肪酸を製造するための2段階スキームを示す。
【図９】図９は、再分配カラム（rearrangement column）から得られる加水分解生成物のHPLC-MSプロファイルを示す。
【図１０】図１０は、脂肪酸とグリセロールとを製造するための油状物質の加水分解についての３段階PBRスキームを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
当業者であれば、本明細書において説明される本発明は、本明細書において具体的に説明されるもの以外の変形や変更がなされることを理解するものである。本明細書において説明される本発明は、そのような変形や変更のすべてを含むものであることを理解されたい。本発明はまた、個別にせよひとまとめにせよ、本明細書において意味されるかまたは示されるステップ、特徴、組成物、および化合物のすべて、ならびにこのようなステップや特徴の任意の2つ以上から構成される任意のおよびすべての組み合わせを含むものである。
【００２５】
＜定義＞
便宜上、本発明をさらに説明する前に、本明細書、実施例、添付の特許請求の範囲において用いられる特定の用語がここに集められる。これらの定義は、本開示の他の部分に照らして読まれるべきであり、当業者によって理解されるように理解されるべきである。他に定義されなければ、本明細書において用いられる技術用語および科学用語のすべては、当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書を通して用いられる用語は、特定の例において異なる限定がされなければ、下記のように定義される。
【００２６】
冠詞「a」、「an」および「the」は、1または1超（すなわち、少なくとも1）の、その冠詞の文法上の対象を意味するために用いられる。
【００２７】
用語「含む（comprise、comprising、including、containing”）」、「特徴とする（characterized by）」、およびその文法上等価な用語は、更なる構成要素が含まれ得るという、包括的、非制限的（open sense）意味で用いられる。「のみからなる（consists of only）」のように解釈されることは意図されていない。
【００２８】
本明細書において用いられる場合、「からなる（consisting of）」およびその文法上等価な用語は、特許請求の範囲に特定されていないいずれの構成要素、ステップ、または成分をも排除する。
【００２９】
本明細書において用いられる用語「油脂化学物質」は、植物、微生物、または動物の脂質に由来する物質を意味する。油脂化学物質の例には、脂肪酸、脂肪酸メチルエステル(FAME)、脂肪族アルコール、脂肪族アミン、グリセロール、アルコール エトキシラート、アルコール硫酸エステル、アルコールエーテル硫酸エステル、四級アンモニウム塩、モノアシルグリセロール(MAG)、ジアシルグリセロール(DAG)、構造化トリアシルグリセロール(TAG)、糖エステル、および他の油脂化学物質が含まれるが、これらに限定されない。
【００３０】
本発明において用いられる用語「極性有機溶媒」は、溶解する媒体中の溶質のイオン化を可能にする有機溶媒を意味する。
【００３１】
用語「脂質」は、その最も広い意味を有するものとすべきであり、油状物質、脂肪、および脂質を含む。本明細書において用いられる用語「脂質」は、トリグリセリド、グリセロールのトリエステル、およびいくつかの脂肪酸のうちの任意のものを意味する。
【００３２】
本明細書において用いられる用語「位置選択的酵素」は、脂質のグリセロール骨格における脂肪酸の位置に関する酵素の選択性を意味する。
【００３３】
用語「位置選択的酵素」および「特異的酵素」は互換的に用いることができる。
【００３４】
用語「基質混合物」は、脂質、油状物質、またはこれらの混合物、極性有機溶媒および水を含む単一相系（均一な混合物）を意味し、用語「基質混合物」は、「反応混合物」と互換的に用いることができる。
【００３５】
本発明は、本明細書において説明される特定の実施形態によって範囲が限定されるものではなく、特定の実施形態は、例示のみを目的とすることが意図される。機能的に等価な生成物、組成物、および方法は、本明細書において説明されるように、本発明の範囲内に明確に含まれる。
【００３６】
本発明は、脂肪酸、グリセロール、および／またはsn-位置 モノアシルグリセロール(sn-位置MAG異性体)などの油脂化学物質を油状物質、脂質、およびこれらの混合物から効率的かつ経済的に製造するための方法に関する。これらの加水分解産物は、油脂化学産業において計り知れない可能性を有する。
【００３７】
本発明は特に、固定リパーゼおよび単一相基質混合物を用いることにより、油状物質、脂質、およびこれらの混合物を加水分解するための効率的な方法を開示するものであり、この方法において、極性有機溶媒は油状物質を水に可溶化するのに用いられる。本発明はさらに、多数のステップを含む加水分解方法を開示し、この方法により加水分解方法は制御されて、脂肪酸、グリセリン、および／またはsn-位置 モノアシルグリセロールを得ることができる。
【００３８】
さらに、本発明において開示される方法によって、選択される媒体（すなわち固定化されたリパーゼ）における酵素の再利用性および安定性を向上させる結果となる。
【００３９】
本発明において開示される油脂化学物質の製造方法は、
基質混合物を含む単一相系を第一の酵素的加水分解にかけることにより部分的加水分解物を得るステップと
前記部分的加水分解物を陽イオン交換樹脂で処理して第一の生成物を得るステップと、
前記第一の生成物を第二の酵素的加水分解にかけることにより第二の生成物を得るステップと、
前記第一の生成物または第二の生成物を蒸留することにより前記第一の生成物または第二の生成物から油脂化学物質／脂肪酸を分離し、濃縮生成物混合物を得、有機溶媒を回収するステップと、
遠心分離または非極性水非混和性有機溶媒を用いる抽出法により、前記濃縮生成物混合物から脂肪酸とグリセロールとを回収するステップ
とを含み、
前記基質混合物は、脂質、油状物質、およびこれらの混合物を水および極性有機溶媒と混合することにより調製され、前記酵素は固定されている。
【００４０】
本明細書において開示される極性有機溶媒の使用により、脂質と水との均一な混合物の形成が可能となり、これにリパーゼが作用し、加水分解反応の完了時に均一な混合物を生成することができる。
【００４１】
脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを脂質から製造する方法は、2時間後に完全に加水分解され、本明細書において開示される第一の酵素的加水分解から得ることができる脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールから、脂肪酸とグリセロールとを製造する方法は、完了に3時間を必要とする。よって、脂質から脂肪酸およびグリセロールへの完全な加水分解は、6時間未満で完了することができる。
【００４２】
脂質から得られる脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを脂肪酸とグリセロールとに加水分解することを含む、本明細書において開示される加水分解の第２ステップにより、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)を実質的に含まず、最終生成物に微量が存在するのみで、加水分解生成物を得ることができる。観察される主反応生成物は脂肪酸とグリセロールであり、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)は加水分解生成物の5％未満を構成する。
【００４３】
本発明の実施形態は、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを製造する方法であって、
脂質、極性有機溶媒、および水から構成される均一な混合物を調製するステップと、
前記均一な混合物をリパーゼで酵素的に加水分解し、加水分解物を得るステップであって、前記加水分解物が、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを含む、ステップ
とを含む、方法を提供する。
【００４４】
本発明の実施形態において、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを含む加水分解物をイオン交換樹脂で処理した後、リパーゼでさらに酵素的に加水分解して、混合物を得るステップであって、前記混合物が、脂肪酸およびグリセロールを含み、モノアシルグリセロール(MAG)を5%未満で含む、ステップを含む、脂肪酸とグリセロールとを製造する方法が提供される。
【００４５】
本発明の別の実施形態において、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを含む加水分解物を固体酸触媒で処理した後、リパーゼでさらに酵素的に加水分解して、混合物を得るステップであって、前記混合物が、脂肪酸およびグリセロールを含み、モノアシルグリセロール(MAG)を5%未満で含む、ステップを含む、脂肪酸とグリセロールとを製造する方法が提供される。
【００４６】
本発明の別の実施形態は、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを含む加水分解物を固体酸触媒で処理した後、リパーゼでさらに酵素的に加水分解して、混合物を得るステップであって、前記混合物が、脂肪酸およびグリセロールを含み、モノアシルグリセロール(MAG)を5%未満で含み、前記固体酸触媒が、ゼオライト、クレー、酸性陽イオン交換樹脂、SO4酸化物、非晶質混合酸化物、およびヘテロポリ酸からなる群より選択される、ステップを含む、脂肪酸とグリセロールとを製造する方法を提供する。
【００４７】
本発明のさらに別の実施形態において、
脂質、極性有機溶媒、および水から構成される均一な混合物を調製するステップと、
前記均一な混合物をリパーゼで酵素的に加水分解し、加水分解物を得るステップであって、前記加水分解物が、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを含む、ステップ
とを含む、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを製造する方法であって、
前記脂質が油状物質である、方法を提供する。
【００４８】
本発明の別の実施形態において、
脂質、極性有機溶媒、および水から構成される均一な混合物を調製するステップと、
前記均一な混合物をリパーゼで酵素的に加水分解し、加水分解物を得るステップであって、前記加水分解物が、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを含む、ステップ
とを含む、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを製造する方法であって、
前記脂質が、植物油、樹木油、微生物油、動物由来油、魚油、ヒマシ油、オリーブ油、カラシ油、亜麻仁油、キャノーラ油、ココヤシ油、コリアンダー油、トウモロコシ油、綿実油、ヘーゼルナッツ油、オリーブ油、ニーム油、ヤシ油、落花生油、菜種油、米ぬか油、紅花油、大豆油、ヒマワリ油、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される油状物質である、方法を提供する。
【００４９】
本発明の別の実施形態において、
脂質、極性有機溶媒、および水から構成される均一な混合物を調製するステップと、
前記均一な混合物をリパーゼで酵素的に加水分解し、加水分解物を得るステップであって、前記加水分解物が、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを含む、ステップ
とを含む、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを製造する方法であって、
前記脂質が、飽和脂質、不飽和脂質、ヒドロキシ不飽和脂質、ヒドロキシ飽和脂質、エポキシ脂質、リン脂質、ワックスエステル、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、方法を提供する。
【００５０】
本発明のさらに別の実施形態において、
脂質、極性有機溶媒、および水から構成される均一な混合物を調製するステップと、
前記均一な混合物をリパーゼで酵素的に加水分解し、加水分解物を得るステップであって、前記加水分解物が、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを含む、ステップ
とを含む、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを製造する方法であって、
前記脂質が、脂肪酸のポリオールエステルである、方法を提供する。
【００５１】
本発明のさらに別の実施形態において、
脂質、極性有機溶媒、および水から構成される均一な混合物を調製するステップと、
前記均一な混合物をリパーゼで酵素的に加水分解し、加水分解物を得るステップであって、前記加水分解物が、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを含む、ステップ
とを含む、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを製造する方法であって、
前記極性有機溶媒が、t-ブタノール、iso-アミルアルコール、ジ-アセトンアルコール、エタノール、プロパノール、およびt-ペンタノール、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される、方法を提供する。
【００５２】
本発明の別の実施形態において、
脂質、極性有機溶媒、および水から構成される均一な混合物を調製するステップと、
前記均一な混合物をリパーゼで酵素的に加水分解し、加水分解物を得るステップであって、前記加水分解物が、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを含む、ステップ
とを含む、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを製造する方法であって、
リパーゼによる酵素的加水分解が、固定されたリパーゼを用いて実施される、方法を提供する。
【００５３】
本発明の別の実施形態において、
脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを含む加水分解物をイオン交換樹脂で処理した後、リパーゼでさらに酵素的に加水分解して、混合物を得るステップであって、前記混合物が、脂肪酸およびグリセロールを含み、モノアシルグリセロール(MAG)を5%未満で含む、ステップ
を含む、脂肪酸およびグリセロールを製造する方法であって、
リパーゼによる酵素的加水分解が、固定されたリパーゼを用いて実施される、方法を提供する。
【００５４】
本発明のさらに別の実施形態において、
脂質、極性有機溶媒、および水から構成される均一な混合物を調製するステップと、
前記均一な混合物をリパーゼで酵素的に加水分解し、加水分解物を得るステップであって、前記加水分解物が、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを含む、ステップ
とを含む、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを製造する方法であって、
リパーゼによる酵素的加水分解が、担体に固定されたリパーゼを用いて実施され、前記担体の主材料が、ポリスチレンとジビニルベンゼンとの共重合体、ポリアクリル酸、ポリスチレン、およびポリメタクリラートからなる群より選択される、方法を提供する。
【００５５】
本発明の別の実施形態において、
脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを含む加水分解物をイオン交換樹脂で処理した後、リパーゼでさらに酵素的に加水分解して、混合物を得るステップであって、前記混合物が、脂肪酸およびグリセロールを含み、モノアシルグリセロール(MAG)を5%未満で含む、ステップ
を含む、脂肪酸およびグリセロールを製造する方法であって、
リパーゼによる酵素的加水分解が、担体に固定されたリパーゼを用いて実施され、前記担体の主材料が、ポリスチレンとジビニルベンゼンとの共重合体、ポリアクリル酸、ポリスチレン、およびポリメタクリラートからなる群より選択される、方法を提供する。
【００５６】
本発明の別の実施形態において、
脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを含む加水分解物をイオン交換樹脂で処理した後、リパーゼでさらに酵素的に加水分解して、混合物を得るステップであって、前記混合物が、脂肪酸およびグリセロールを含み、モノアシルグリセロール(MAG)を5%未満で含む、ステップ
を含む、脂肪酸およびグリセロールを製造する方法であって、
前記イオン交換樹脂が、強酸性陽イオン交換樹脂である、方法を提供する。
【００５７】
本発明のさらに別の実施形態において、
脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを含む加水分解物をイオン交換樹脂で処理した後、リパーゼでさらに酵素的に加水分解して、混合物を得るステップであって、前記混合物が、脂肪酸およびグリセロールを含み、モノアシルグリセロール(MAG)を5%未満で含む、ステップ
を含む、脂肪酸およびグリセロールを製造する方法であって、
前記イオン交換樹脂が、スルホン酸基含有ポリマー樹脂、Indion130、Indion140、Indion190、Indion770、DIAION(R) SK1B、DIAION(R) SK104、DIAION(R) SK110、DIAION(R) SK112、DIAION(R) SK116、DIAION(R) PK208、DIAION(R) PHK212、DIAION(R) PK216、DIAION(R) PK220、DIAION(R) PK228、およびDIAION(R) HPK25からなる群より選択される強酸性陽イオン交換樹脂である、方法を提供する。
【００５８】
本発明のさらに別の実施形態において、
脂質、極性有機溶媒、および水から構成される均一な混合物を調製するステップと、
前記均一な混合物をリパーゼで酵素的に加水分解し、加水分解物を得るステップであって、前記加水分解物が、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを含む、ステップ
とを含む、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを製造する方法であって、
リパーゼによる酵素的加水分解が、30℃〜80℃の温度で実施される、方法を提供する。
【００５９】
本発明の別の実施形態において、
脂質、極性有機溶媒、および水から構成される均一な混合物を調製するステップと、
前記均一な混合物をリパーゼで酵素的に加水分解し、加水分解物を得るステップであって、前記加水分解物が、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを含む、ステップ
とを含む、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを製造する方法であって、
リパーゼによる酵素的加水分解が、50℃〜65℃の温度、好ましくは60℃の温度で実施される、方法を提供する。
【００６０】
本発明のさらに別の実施形態において、
脂質、極性有機溶媒、および水から構成される均一な混合物を調製するステップと、
前記均一な混合物をリパーゼで酵素的に加水分解し、加水分解物を得るステップであって、前記加水分解物が、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを含む、ステップ
とを含む、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを製造する方法であって、
前記方法により、前記脂質の99%超が脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールに変換される、方法を提供する。
【００６１】
本発明のさらに別の実施形態において、
脂質、極性有機溶媒、および水から構成される均一な混合物を調製するステップと、
前記均一な混合物をリパーゼで酵素的に加水分解し、加水分解物を得るステップであって、前記加水分解物が、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを含む、ステップ
とを含む、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを製造する方法であって、
前記方法により、前記脂質中に存在するTAGS（トリアシルグリセロール）の99%超が脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールに変換される、方法を提供する。
【００６２】
本発明のさらに別の実施形態において、
脂質、極性有機溶媒、および水から構成される均一な混合物を調製するステップと、
前記均一な混合物をリパーゼで酵素的に加水分解し、加水分解物を得るステップであって、前記加水分解物が、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを含む、ステップ
とを含む、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを製造する方法であって、
前記均一な混合物が、脂質、極性有機溶媒、および水を1:4:0.15〜1:7:0.5の比で含む、方法を提供する。
【００６３】
本発明の別の実施形態において、
脂質、極性有機溶媒、および水から構成される均一な混合物を調製するステップと、
前記均一な混合物をリパーゼで酵素的に加水分解し、加水分解物を得るステップであって、前記加水分解物が、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを含む、ステップ
とを含む、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを製造する方法であって、
前記脂質と極性有機溶媒との比が1:4〜1:7である、方法を提供する。
【００６４】
本発明のさらに別の実施形態において、
脂質、極性有機溶媒、および水から構成される均一な混合物を調製するステップと、
前記均一な混合物をリパーゼで酵素的に加水分解し、加水分解物を得るステップであって、前記加水分解物が、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを含む、ステップ
とを含む、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを製造する方法であって、
前記脂質と水との比が1:0.15〜1: 0.5である、方法を提供する。
【００６５】
本発明のさらに別の実施形態において、
脂質、極性有機溶媒、および水から構成される均一な混合物を調製するステップと、
前記均一な混合物をリパーゼで酵素的に加水分解し、加水分解物を得るステップであって、前記加水分解物が、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを含む、ステップ
とを含む、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを製造する方法であって、
リパーゼによる酵素的加水分解が、バッチ反応器、連続反応器、または半連続反応器のいずれかにおいて実施される、方法を提供する。
【００６６】
本発明の別の実施形態において、
脂質、極性有機溶媒、および水から構成される均一な混合物を調製するステップと、
前記均一な混合物をリパーゼで酵素的に加水分解し、加水分解物を得るステップであって、前記加水分解物が、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを含む、ステップ
とを含む、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを製造する方法であって、
リパーゼによる酵素的加水分解が、連続反応器において滞留時間10〜60分間で実施される、方法を提供する。
【００６７】
本発明の別の実施形態において、
脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを含む加水分解物をイオン交換樹脂で処理した後、リパーゼでさらに酵素的に加水分解して、混合物を得るステップであって、前記混合物が、脂肪酸およびグリセロールを含み、モノアシルグリセロール(MAG)を5%未満で含む、ステップ
を含む、脂肪酸およびグリセロールを製造する方法であって、
リパーゼによる酵素的加水分解が、連続反応器において滞留時間10〜150分間で実施される、方法を提供する。
【００６８】
本発明のさらに別の実施形態において、
脂質、極性有機溶媒、および水から構成される均一な混合物を調製するステップと、
前記均一な混合物をリパーゼで酵素的に加水分解し、加水分解物を得るステップであって、前記加水分解物が、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを含む、ステップ
とを含む、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを製造する方法であって、
リパーゼによる酵素的加水分解が、バッチ反応器または半連続反応器において、滞留時間0.5〜2時間で実施される、方法を提供する。
【００６９】
本発明の別の実施形態において、
脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを含む加水分解物をイオン交換樹脂で処理した後、リパーゼでさらに酵素的に加水分解して、混合物を得るステップであって、前記混合物が、脂肪酸およびグリセロールを含み、モノアシルグリセロール(MAG)を5%未満で含む、ステップ
を含む、脂肪酸およびグリセロールを製造する方法であって、
リパーゼによる酵素的加水分解が、バッチ反応器または半連続反応器において、滞留時間0.5〜24時間で実施される、方法を提供する。
【００７０】
本発明の別の実施形態において、
脂質、極性有機溶媒、および水から構成される均一な混合物を調製するステップと、
前記均一な混合物をリパーゼで酵素的に加水分解し、加水分解物を得るステップであって、前記加水分解物が、脂肪酸、MAG、DAG、およびグリセロールを含む、ステップと、
前記加水分解物をイオン交換樹脂で処理した後、リパーゼでさらに酵素的に加水分解して、混合物を得るステップであって、前記混合物が、脂肪酸およびグリセロールを含み、モノアシルグリセロール(MAG)を5%未満で含む、ステップ
とを含む、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを製造する方法を提供する。
【００７１】
本発明の別の実施形態において、
脂質、極性有機溶媒、および水から構成される均一な混合物を調製するステップと、
前記均一な混合物をリパーゼで酵素的に加水分解し、加水分解物を得るステップであって、前記加水分解物が、脂肪酸、MAG、DAG、およびグリセロールを含む、ステップと、
前記加水分解物をイオン交換樹脂で処理した後、リパーゼでさらに酵素的に加水分解して、混合物を得るステップであって、前記混合物が、脂肪酸およびグリセロールを含み、モノアシルグリセロール(MAG)を5%未満で含む、ステップ
とを含む、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを製造する方法であって、
前記脂質が油状物質である、方法を提供する。
【００７２】
本発明のさらに別の実施形態において、
脂質、極性有機溶媒、および水から構成される均一な混合物を調製するステップと、
前記均一な混合物をリパーゼで酵素的に加水分解し、加水分解物を得るステップであって、前記加水分解物が、脂肪酸、MAG、DAG、およびグリセロールを含む、ステップと、
前記加水分解物をイオン交換樹脂で処理した後、リパーゼでさらに酵素的に加水分解して、混合物を得るステップであって、前記混合物が、脂肪酸およびグリセロールを含み、モノアシルグリセロール(MAG)を5%未満で含む、ステップ
とを含む、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを製造する方法であって、
前記脂質が、植物油、樹木油、微生物油、動物由来油、魚油、ヒマシ油、オリーブ油、カラシ油、亜麻仁油、キャノーラ油、ココヤシ油、コリアンダー油、トウモロコシ油、綿実油、ヘーゼルナッツ油、オリーブ油、ニーム油、ヤシ油、落花生油、菜種油、米ぬか油、紅花油、大豆油、ヒマワリ油、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される油状物質である、方法を提供する。
【００７３】
本発明のさらに別の実施形態において、
脂質、極性有機溶媒、および水から構成される均一な混合物を調製するステップと、
前記均一な混合物をリパーゼで酵素的に加水分解し、加水分解物を得るステップであって、前記加水分解物が、脂肪酸、MAG、DAG、およびグリセロールを含む、ステップと、
前記加水分解物をイオン交換樹脂で処理した後、リパーゼでさらに酵素的に加水分解して、混合物を得るステップであって、前記混合物が、脂肪酸およびグリセロールを含み、モノアシルグリセロール(MAG)を5%未満で含む、ステップ
とを含む、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを製造する方法であって、
前記脂質が、飽和脂質、不飽和脂質、ヒドロキシ不飽和脂質、ヒドロキシ飽和脂質、エポキシ脂質、リン脂質、ワックスエステル、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、方法を提供する。
【００７４】
本発明のさらに別の実施形態において、
脂質、極性有機溶媒、および水から構成される均一な混合物を調製するステップと、
前記均一な混合物をリパーゼで酵素的に加水分解し、加水分解物を得るステップであって、前記加水分解物が、脂肪酸、MAG、DAG、およびグリセロールを含む、ステップと、
前記加水分解物をイオン交換樹脂で処理した後、リパーゼでさらに酵素的に加水分解して、混合物を得るステップであって、前記混合物が、脂肪酸およびグリセロールを含み、モノアシルグリセロール(MAG)を5%未満で含む、ステップ
とを含む、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを製造する方法であって、
前記脂質が、脂肪酸のポリオールエステルである、方法を提供する。
【００７５】
本発明の別の実施形態において、
脂質、極性有機溶媒、および水から構成される均一な混合物を調製するステップと、
前記均一な混合物をリパーゼで酵素的に加水分解し、加水分解物を得るステップであって、前記加水分解物が、脂肪酸、MAG、DAG、およびグリセロールを含む、ステップと、
前記加水分解物をイオン交換樹脂で処理した後、リパーゼでさらに酵素的に加水分解して、混合物を得るステップであって、前記混合物が、脂肪酸およびグリセロールを含み、モノアシルグリセロール(MAG)を5%未満で含む、ステップ
とを含む、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを製造する方法であって、
前記極性有機溶媒が、t-ブタノール、iso-アミルアルコール、ジ-アセトンアルコール、エタノール、プロパノール、およびt-ペンタノール、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される、方法を提供する。
【００７６】
本発明のさらに別の実施形態において、
脂質、極性有機溶媒、および水から構成される均一な混合物を調製するステップと、
前記均一な混合物をリパーゼで酵素的に加水分解し、加水分解物を得るステップであって、前記加水分解物が、脂肪酸、MAG、DAG、およびグリセロールを含む、ステップと、
前記加水分解物をイオン交換樹脂で処理した後、リパーゼでさらに酵素的に加水分解して、混合物を得るステップであって、前記混合物が、脂肪酸およびグリセロールを含み、モノアシルグリセロール(MAG)を5%未満で含む、ステップ
とを含む、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを製造する方法であって、
リパーゼによる酵素的加水分解が、固定されたリパーゼを用いて実施される、方法を提供する。
【００７７】
本発明の別の実施形態において、
脂質、極性有機溶媒、および水から構成される均一な混合物を調製するステップと、
前記均一な混合物をリパーゼで酵素的に加水分解し、加水分解物を得るステップであって、前記加水分解物が、脂肪酸、MAG、DAG、およびグリセロールを含む、ステップと、
前記加水分解物をイオン交換樹脂で処理した後、リパーゼでさらに酵素的に加水分解して、混合物を得るステップであって、前記混合物が、脂肪酸およびグリセロールを含み、モノアシルグリセロール(MAG)を5%未満で含む、ステップ
とを含む、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを製造する方法であって、
リパーゼによる酵素的加水分解が、担体に固定されたリパーゼを用いて実施され、前記担体の主材料が、ポリスチレンとジビニルベンゼンとの共重合体、ポリアクリル酸、ポリスチレン、およびポリメタクリラートからなる群より選択される、方法を提供する。
【００７８】
本発明のさらに別の実施形態において、
脂質、極性有機溶媒、および水から構成される均一な混合物を調製するステップと、
前記均一な混合物をリパーゼで酵素的に加水分解し、加水分解物を得るステップであって、前記加水分解物が、脂肪酸、MAG、DAG、およびグリセロールを含む、ステップと、
前記加水分解物をイオン交換樹脂で処理した後、リパーゼでさらに酵素的に加水分解して、混合物を得るステップであって、前記混合物が、脂肪酸およびグリセロールを含み、モノアシルグリセロール(MAG)を5%未満で含む、ステップ
とを含む、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを製造する方法であって、
前記イオン交換樹脂が、強酸性陽イオン交換樹脂である、方法を提供する。
【００７９】
本発明の別の実施形態において、
脂質、極性有機溶媒、および水から構成される均一な混合物を調製するステップと、
前記均一な混合物をリパーゼで酵素的に加水分解し、加水分解物を得るステップであって、前記加水分解物が、脂肪酸、MAG、DAG、およびグリセロールを含む、ステップと、
前記加水分解物をイオン交換樹脂で処理した後、リパーゼでさらに酵素的に加水分解して、混合物を得るステップであって、前記混合物が、脂肪酸およびグリセロールを含み、モノアシルグリセロール(MAG)を5%未満で含む、ステップ
とを含む、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを製造する方法であって、
前記イオン交換樹脂が、スルホン酸基含有ポリマー樹脂、Indion130、Indion140、Indion190、Indion770、DIAION(R) SK1B、DIAION(R) SK104、DIAION(R) SK110、DIAION(R) SK112、DIAION(R) SK116、DIAION(R) PK208、DIAION(R) PHK212、DIAION(R) PK216、DIAION(R) PK220、DIAION(R) PK228、およびDIAION(R) HPK25からなる群より選択される強酸性陽イオン交換樹脂である、方法を提供する。
【００８０】
本発明のさらに別の実施形態において、
脂質、極性有機溶媒、および水から構成される均一な混合物を調製するステップと、
前記均一な混合物をリパーゼで酵素的に加水分解し、加水分解物を得るステップであって、前記加水分解物が、脂肪酸、MAG、DAG、およびグリセロールを含む、ステップと、
前記加水分解物をイオン交換樹脂で処理した後、リパーゼでさらに酵素的に加水分解して、混合物を得るステップであって、前記混合物が、脂肪酸およびグリセロールを含み、モノアシルグリセロール(MAG)を5%未満で含む、ステップ
とを含む、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを製造する方法であって、
リパーゼによる酵素的加水分解が、30℃〜80℃の温度で実施される、方法を提供する。
【００８１】
本発明のさらに別の実施形態において、
脂質、極性有機溶媒、および水から構成される均一な混合物を調製するステップと、
前記均一な混合物をリパーゼで酵素的に加水分解し、加水分解物を得るステップであって、前記加水分解物が、脂肪酸、MAG、DAG、およびグリセロールを含む、ステップと、
前記加水分解物をイオン交換樹脂で処理した後、リパーゼでさらに酵素的に加水分解して、混合物を得るステップであって、前記混合物が、脂肪酸およびグリセロールを含み、モノアシルグリセロール(MAG)を5%未満で含む、ステップ
とを含む、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを製造する方法であって、
リパーゼによる酵素的加水分解が、50℃〜65℃の温度、好ましくは60℃の温度で実施される、方法を提供する。
【００８２】
本発明の別の実施形態において、
脂質、極性有機溶媒、および水から構成される均一な混合物を調製するステップと、
前記均一な混合物をリパーゼで酵素的に加水分解し、加水分解物を得るステップであって、前記加水分解物が、脂肪酸、MAG、DAG、およびグリセロールを含む、ステップと、
前記加水分解物をイオン交換樹脂で処理した後、リパーゼでさらに酵素的に加水分解して、混合物を得るステップであって、前記混合物が、脂肪酸およびグリセロールを含み、モノアシルグリセロール(MAG)を5%未満で含む、ステップ
とを含む、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを製造する方法であって、
前記均一な混合物が、脂質、極性有機溶媒、および水を1:4:0.15〜1:7:0.5の比で含む、方法を提供する。
【００８３】
本発明のさらに別の実施形態において、
脂質、極性有機溶媒、および水から構成される均一な混合物を調製するステップと、
前記均一な混合物をリパーゼで酵素的に加水分解し、加水分解物を得るステップであって、前記加水分解物が、脂肪酸、MAG、DAG、およびグリセロールを含む、ステップと、
前記加水分解物をイオン交換樹脂で処理した後、リパーゼでさらに酵素的に加水分解して、混合物を得るステップであって、前記混合物が、脂肪酸およびグリセロールを含み、モノアシルグリセロール(MAG)を5%未満で含む、ステップ
とを含む、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを製造する方法であって、
前記脂質と極性有機溶媒との比が1:4〜1:7である、方法を提供する。
【００８４】
本発明のさらに別の実施形態において、
脂質、極性有機溶媒、および水から構成される均一な混合物を調製するステップと、
前記均一な混合物をリパーゼで酵素的に加水分解し、加水分解物を得るステップであって、前記加水分解物が、脂肪酸、MAG、DAG、およびグリセロールを含む、ステップと、
前記加水分解物をイオン交換樹脂で処理した後、リパーゼでさらに酵素的に加水分解して、混合物を得るステップであって、前記混合物が、脂肪酸およびグリセロールを含み、モノアシルグリセロール(MAG)を5%未満で含む、ステップ
とを含む、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロールを製造する方法であって、
前記脂質と水との比が1:0.15〜1: 0.5である、方法を提供する。
【００８５】
本発明の方法が、下記に詳細に説明される。
【００８６】
脂質、油状物質、およびこれらの混合物は、水および極性有機溶媒と混合して、単一相系を作製した。このようにして作製されたこの単一相系を均一な基質混合物と称する。このようにして得られた均一な基質混合物は、吸着剤から構成される詰め床（a packed bed）を通過させて酵素阻害剤（具体的には、リパーゼ阻害剤）を除去することにより、任意に前処理を行ってもよく、この前処理によって、油状物質中に存在するリパーゼを阻害する構成成分が吸着剤に選択的に吸着される。これらの阻害剤成分（例えばアルデヒド、ケトン、およびリン脂質など）を除去することにより、確実に、固定化された酵素を次のステップにおいて繰り返し使用することができ、これによって、この方法が経済的になる。その後、前処理有りまたは前処理なしでこのようにして得られた基質混合物は、固定化された酵素から構成される第一の詰め床反応器、または固定化された酵素と吸着剤とから構成される詰め床反応器を、制御された温度および滞留時間の条件下で通過させることにより、加水分解した。このようにして得られた加水分解混合物はさらに、イオン交換吸着剤から構成される別の詰め床反応器を、制御された温度および滞留時間の条件下で通過させた。この後、固定化された酵素から構成される第二の詰め床反応器を、制御された温度および滞留時間の条件下で通過させた。固定化された酵素から構成される第一の詰め床反応器または固定化された酵素から構成される第二の詰め床反応器得られた生成物（例えば、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、sn-位置 ジアシルグリセロール(DAG)、およびグリセロール）は、従来の方法（例えば蒸留、結晶化、および吸着もしくはクロマトグラフィーによる技術）を用いて分離された。
【００８７】
上述のように前処理後に得られた均一な基質混合物は、その後、適切な固定化酵素を用いて30℃〜80℃に制御された温度で10〜150分間の滞留時間の条件下で、固定化されたリパーゼおよび吸着剤から構成される一連の詰め床反応器を通過させて、油状物質の所望される加水分解(66%〜90%)を達成した。その後、固定化された酵素から構成される第二の詰め床反応器を、20℃〜80℃に制御された温度で5〜60分間の滞留時間の条件下で、通過させた。固定化された酵素から構成される第一の詰め床反応器または固定化された酵素から構成される第二の詰め床反応器得られた生成物（例えば、脂肪酸、sn-位置 モノアシルグリセロール(MAG)、およびグリセロール）は、従来の方法（例えば蒸留、結晶化、および吸着もしくはクロマトグラフィーによる技術）を用いて分離された。
【００８８】
本発明では、部分的に加水分解された均一な混合物をイオン交換樹脂で処理した後、上述のステップで用いられた固定化されたリパーゼなどの任意の他のまたは同一の適切な調製物から構成される別の詰め床反応器を、制御された温度と時間の条件下で通過させることにより、トリグリセリドの99％超の変換が、遊離脂肪酸の収率95％で達成される。
【００８９】
先行技術に記載された方法は、いずれの位置の酵素を用いても100％近い変換は達成することができず、100％近い変換を達成するためには、要する時間があまりに長く、工業的使用には適していない。これとは対照的に、本発明において開示される加水分解法は、単一相系および固定化リパーゼを用いて、トリグリセリドの99％超の加水分解が、遊離脂肪酸の収率95％で達成される。
【００９０】
本発明において開示される方法はまた、バッチ半連続方式または連続方式を用いて実行することができる。
【００９１】
均一な基質反応混合物に4%の酵素を装填したバッチ反応により、トリグリセリドの99％超の加水分解が、遊離脂肪酸の収率80〜88％、モノグリセリドの収率12〜20％で得られる。
【００９２】
油状物質の加水分解のための半連続方法は、固定化されたリパーゼから構成される詰め床反応器において、反応時間12時間で実施されたが、トリグリセリドの99％超の加水分解が、遊離脂肪酸の収率88％で得られる。
【００９３】
固定化酵素を用いる連続方法は、滞留時間9〜15分間で実施され、トリグリセリドの99％超の加水分解が、遊離脂肪酸の収率33％、ジグリセリドの収率66％で得られる。
【００９４】
固定化リパーゼカラムとイオン交換樹脂カラムとを組み合わせて用いた、油状物質の加水分解の別の実施形態では、90〜120分間の滞留時間内に、トリグリセリドの99％超の加水分解が、遊離脂肪酸の収率66％、モノグリセリドの収率33％で得られる。
【００９５】
固定化リパーゼカラム、イオン交換樹脂カラムから構成される３つのカラムを組み合わせて用いた、油状物質の加水分解の連続方法により、トリグリセリドの99％超の加水分解が、遊離脂肪酸の収率95％、モノグリセリドの収率5％で得られる。
【００９６】
第一の酵素反応器、または最後の酵素反応器から得られる生成物流は、例えば蒸留、結晶化、および／または吸着もしくはクロマトグラフィーによる技術などの方法を用いて、sn-位置 MAG異性体および遊離脂肪酸に分離することができる。したがって、本発明の方法により、遊離脂肪酸、sn-位置 MAG異性体、ならびにグリセロールを様々な工業的用途のために製造することができる。
【００９７】
油状物質および脂質の中の副化合物（例えば、脂質過酸化物、リン脂質、乳化剤、クロロフィル、カロテノイド、脂質ポリマー、重金属イオン、およびさらには抗酸化物質など）は、加水分解反応に用いられるリパーゼの安定性に対して有害な影響を及ぼす(Xu et al., Stability and Stabilization of Biocatalysts, Amsterdam: Elsevier Science, 1998, pp. 441-446)。したがって、カラム反応器において吸着剤を用いた前処理を行うことにより、これらのリパーゼを阻害する構成成分を除去することが必須である。副化合物を除去することにより、確実に、その後に使用される酵素反応器を繰り返し用いることができるようになり、これによって、この方法が経済的になる。
【００９８】
本発明において説明される脂質および油状物質には、通常の植物油、動物由来の脂質、ならびに加工された脂質および油状物質、ならびにこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。これらの例には、大豆油、ヒマシ油、綿実油、カラシ油、亜麻仁油、菜種油、オリーブ油、トウモロコシ油、ココヤシ油、紅花油、ヤシ油、オリーブ油、ツバキ油、サザンカ油、牛脂、ラード、および魚油、サル脂(sal fat)、イリッペ脂(illippe butter)、コクムバター(kokum butter)、シアバター、モーラー脂(mowrah fat)、フルワラバター(phulwara butter)、ボルネオ脂、およびこれらの分画、ならびに植物由来／動物由来／微生物由来（原核生物／真核生物）の任意の油状物質が含まれるが、これらに限定されない。また、脂肪酸のポリオールエステルなどの油脂化学物質（例えば、ペンタエリスリトールテトラモノリシノレアート(pentaerythritol tetramonoricinoleate)、トリメチロールプロパンオレイン酸エステル(trimethyl propane oleic acid esters)など）は、酵素的加水分解法のための油状物質を主成分とする供給原料として含まれ得る。
【００９９】
本発明の方法によれば、本発明において用いられる固定化リパーゼは、商業的に入手可能な任意の調製物であるかまたは特別に調製され、本発明に適していることが証明されたものであってもよい。本明細書においてその調製物が適していることは、安定で長寿命であってその方法が経済的になることを意味する。
【０１００】
微生物（例えば、Thermomyces lanuginosus、Rhizopus（Rhizopus delemar および Rhizopus japonicusを含む）、Aspergillus、Candida（Candida antarcticaを含む）、およびMucor（例えば Mucor japonicus）によって産生されるリパーゼが用いられ得る。膵臓リパーゼもまた、用いられ得る。リパーゼは、商業的に入手可能である。Yarrowia spp.においてクローン化され適切な宿主で発現した特定のリパーゼもまた、用いられ得る。
【０１０１】
本発明に従う加水分解反応において説明される極性有機溶媒は、リパーゼに対して不活性な極性有機溶媒である。極性有機溶媒の例には、t-ブタノール、iso-アミルアルコール、ジ-アセトンアルコール、エタノール、プロパノール、およびt-ペンタノール、ならびに上述の溶媒の異なる組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０２】
油状物質の前処理に用いられる、吸着剤から構成される詰め床の例には、Diaion（登録商標）、HP2MG、またはHPA-75、またはHPA-25、またはWK10、またはWA11、またはSepabeads（登録商標） SP207またはSP700が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０３】
イオン交換樹脂の例には、スルホン酸基含有ポリマー樹脂が含まれるがこれに限定されず、例えばIndion130、140、190、または770、Indion FFIP、NIP、GS 300/400、Indion 204、214、234、284/294、404、414；DIAION(R) SK1B、SK104、SK110、SK112、SK116、PK208、PHK212、PK216、PK220、PK228、およびHPK25が含まれるがこれらに限定されない。
【０１０４】
したがって、本発明に開示される油状物質および／または脂質の加水分解法は、油状物質および／または脂質、極性有機溶媒、および水を混合して、均一な基質混合物である単一相系を作製し、これに固定化リパーゼを含む連続式またはバッチ式の詰め床混合反応器、吸着系、および／または固体触媒反応器における一連の操作を行うことにより、遊離脂肪酸、グリセロール、および／またはsn-位置MAG異性体を含む油脂化学物質を高い収率で得る。
【０１０５】
本発明者らは、油状物質、脂質、またはこれらの混合物を水および極性有機溶媒と混合することにより得られる単一相系が、酵素的加水分解される場合に、油状物質または脂質の加水分解を＞99%に増加させ、95%以上の収率で遊離脂肪酸とグリセロールを生成することを見出した。遊離脂肪酸、グリセロール、および／またはsn-位置MAG異性体などの油脂化学物質は、著しく短い時間の間に、高い収率と純度で得られる。
【０１０６】
本発明において開示される方法によれば、互いに混和しない油状物質および水が、極性有機溶媒中で混合される。３つの構成成分が混合されて、一定の範囲の比率で単一相系を形成する。これらの３つの構成成分が互いに可溶化することが、単一相基質混合物のベースを形成する。油-水２相系に極性有機溶媒を加えることは、固定化リパーゼを用いた油状物質の加水分解を実施するために本発明において開示された新規のアプローチである。
【０１０７】
＜特異的または非特異的な固定化リパーゼの使用＞
Novozym（登録商標）435 (Sigma Chemicals, L4777)、リパーゼ アクリル酸樹脂（Candida antarctica由来）、および固定化Lipolase（登録商標）100 L (HypLIP) (Sigma Chemical Co. L0777)、1,3-特異的リパーゼ（Thermomyces lanuginosus由来）は、本発明に開示される加水分解反応について評価した。
【０１０８】
極性有機溶媒、t-ブタノール、iso-アミルアルコール、ジ-アセトン アルコール、エタノール、プロパノール、t-ペンタノールは、本発明における反応について評価した。ｔ-ブタノールでは、両方の酵素に関して最も高い変換収率（％）が見いだされた。
【０１０９】
本発明の方法は、操作方式を適切に変化させてバッチ方式および連続方式に適用することができると推測され得る。また、有機溶媒は回収され、再生利用および再利用することができる。
【０１１０】
本発明の適切な実施形態が、下記に説明される。具体的な構成及び配置が説明されるが、これは例示のみを目的としていることを理解されたい。関連する技術分野における当業者であれば、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、他の構成及び配置が用いられ得ることを認識するものである。よって、添付の特許請求の範囲に記載された本発明の精神および範囲は、本明細書に含まれる好ましい実施形態の説明に限定されるべきではない。
【０１１１】
本発明はその特定の好ましい実施形態に関してかなり詳細に説明されてきたが、他の実施形態も可能である。よって、添付の特許請求の範囲に記載された本発明の精神および範囲は、本明細書に含まれる好ましい実施形態の説明に限定されるべきではない。
【実施例】
【０１１２】
本開示は、実施例を用いて下記に説明されるが、これらの実施例は、本開示の実施を説明することを意図するものであって、本開示の範囲について制限的にいかなる限定を与えることをも意図しない。他の定義がなされなければ、本明細書において用いられるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野における当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。本明細書において説明されるのと同様または等価の方法および材料が本開示の方法および組成物の実施に用いられ得るが、例示的な方法、装置および材料が本明細書において説明される。
【０１１３】
[実施例１]
＜バッチ法−加水分解のための溶媒としてt-ブタノール＞
１）基質として油状物質：24時間後に〜80-88%変換
ａ．脂肪酸およびモノグリセリドの形成
1g の異なる固定化リパーゼを含む100mlの反応フラスコにおいて、10gのヒマシ油をt-ブタノールおよび水に加え（比率1:4:0.15）、均一な反応混合物を作製する。基質混合物は、オービタルシェーカーで60℃（実験は50℃および55℃について同様に実施される）に維持され、反応は酸価を用いて24時間モニターされた。24時間終了時に、得られたトリグリセリド変換は99%であり、油状物質から脂肪酸およびモノグリセリドへの変換率（％）は、それぞれ80〜88%および12〜20%であることが分かった。
【０１１４】
ｂ．脂肪酸およびグリセロールの形成
反応は、第一の酵素的加水分解反応後に生成する加水分解生成物に作用する、リパーゼ酵素HypLIP (固有に固定化された（Indigenously immobilized） Lipolase（登録商標）100L)、Lipozyme（登録商標）TL IM (固定化Lipolase（登録商標）100L)、Lipozyme（登録商標）RM IM Novozym（登録商標）435、およびPseudomonas cepacia由来のリパーゼを用いて繰り返された。図１は、均一な媒体中におけるヒマシ油の加水分解率についてのプロファイルを示す。図３は、溶媒無しまたは異なる極性有機溶媒中における、HypLIPを用いたバッチ条件下で6時間後に得られた遊離脂肪酸の変換率（％）を示す。HypLIPは、本研究に用いられた他の酵素調製物のいずれかと比較した場合に、高い初期変換率を示す。
【０１１５】
２）基質として脂質：24時間後に〜70-80%変換
ａ．脂肪酸およびモノグリセリドの形成
1g の異なる固定化リパーゼを含む100mlの反応フラスコにおいて、10gのトリステアリンをt-ブタノールおよび水に加え（比率1:6:0.15）、均一な反応混合物を作製する。基質混合物は、オービタルシェーカーで60℃（実験は50℃および55℃について同様に実施される）に維持され、反応は酸価を用いて24時間モニターされた。24時間終了時に、得られたトリグリセリド変換は99%であり、油状物質から脂肪酸およびモノグリセリドへの変換率（％）は、それぞれ74%および26%であることが分かった。
【０１１６】
ｂ．脂肪酸およびグリセロールの形成
反応は、第一の酵素的加水分解反応後に生成する加水分解生成物に作用する、リパーゼ酵素HypLIP (固有に固定化された（Indigenously immobilized） Lipolase（登録商標）100L)、Lipozyme（登録商標）TL IM (固定化Lipolase（登録商標）100L)、Lipozyme（登録商標）RM IM Novozym（登録商標）435、およびPseudomonas cepacia由来のリパーゼを用いて繰り返された。図１は、均一な媒体中におけるヒマシ油の加水分解率についてのプロファイルを示す。図３は、溶媒無しまたは異なる極性有機溶媒中における、HypLIPを用いたバッチ条件下で6時間後に得られた遊離脂肪酸の変換率（％）を示す。HypLIPは、本研究に用いられた他の酵素調製物のいずれかと比較した場合に、高い初期変換率を示す。
【０１１７】
３）基質として油状物質および脂質：24時間後に〜80-88%変換
ａ．脂肪酸およびモノグリセリドの形成
1g の固定化リパーゼ（HypLIP）を含む100mlの反応フラスコにおいて、10gのヤシ油およびトリステアリン（比率1:1）をt-ブタノールおよび水に加え（比率1:4:0.25）、均一な反応混合物を作製する。基質混合物は、オービタルシェーカーで60℃（実験は50℃および55℃について同様に実施される）に維持され、反応は酸価を用いて24時間モニターされた。24時間終了時に、得られたトリグリセリド変換は99%であり、油状物質から脂肪酸およびモノグリセリドへの変換率（％）は、それぞれ84%および16%であることが分かった。
【０１１８】
ｂ．脂肪酸およびグリセロールの形成
反応は、第一の酵素的加水分解反応後に生成する加水分解生成物に作用する、リパーゼ酵素HypLIP (固有に固定化された（Indigenously immobilized） Lipolase（登録商標）100L)、Lipozyme（登録商標）TL IM (固定化Lipolase（登録商標）100L)、Lipozyme（登録商標）RM IM Novozym（登録商標）435、およびPseudomonas cepacia由来のリパーゼを用いて繰り返された。図１は、均一な媒体中におけるヒマシ油の加水分解率についてのプロファイルを示す。図３は、溶媒無しまたは異なる極性有機溶媒中における、HypLIPを用いたバッチ条件下で6時間後に得られた遊離脂肪酸の変換率（％）を示す。HypLIPは、本研究に用いられた他の酵素調製物のいずれかと比較した場合に、高い初期変換率を示す。
【０１１９】
＜バッチ法- 加水分解のための溶媒としてiso-アミルアルコール＞
１）基質として油状物質：24時間後に〜65-70%変換
ａ．脂肪酸およびモノグリセリドの形成
1g の固定化Thermomyces langinousaリパーゼ（HypLIP）を含む100mlの反応フラスコにおいて、10gのヒマシ油をiso-アミルアルコールおよび水に加え（比率1:5:0.15）、均一な反応混合物を作製する。基質混合物は、オービタルシェーカーで60℃（実験は50℃および55℃について同様に実施される）に維持され、反応は酸価を用いて24時間モニターされた。24時間終了時に、得られたトリグリセリド変換は99%であり、油状物質から脂肪酸およびモノグリセリドへの変換率（％）は、それぞれ68%および32%であることが分かった。
【０１２０】
ｂ．脂肪酸およびグリセロールの形成
反応は、第一の酵素的加水分解反応後に生成する加水分解生成物に作用する、リパーゼ酵素HypLIP (固有に固定化された（Indigenously immobilized） Lipolase（登録商標）100L)、Lipozyme（登録商標）TL IM (固定化Lipolase（登録商標）100L)、Lipozyme（登録商標）RM IM Novozym（登録商標）435、およびPseudomonas cepacia由来のリパーゼを用いて繰り返された。図１は、均一な媒体中におけるヒマシ油の加水分解率についてのプロファイルを示す。図３は、溶媒無しまたは異なる極性有機溶媒中における、HypLIPを用いたバッチ条件下で6時間後に得られた遊離脂肪酸の変換率（％）を示す。HypLIPは、本研究に用いられた他の酵素調製物のいずれかと比較した場合に、高い初期変換率を示す。
【０１２１】
２）基質として脂質：24時間後に〜62-68%変換
ａ．脂肪酸およびモノグリセリドの形成
1g の固定化リパーゼ（HypLIP）を含む100mlの反応フラスコにおいて、10gのトリステアリンをiso-アミルアルコールおよび水に加え（比率1:6:0.2）、均一な反応混合物を作製する。基質混合物は、オービタルシェーカーで60℃（実験は50℃および55℃について同様に実施される）に維持され、反応は酸価を用いて24時間モニターされた。24時間終了時に、得られたトリグリセリド変換は99%であり、油状物質から脂肪酸およびモノグリセリドへの変換率（％）は、それぞれ64%および36%であることが分かった。
【０１２２】
ｂ．脂肪酸およびグリセロールの形成
反応は、第一の酵素的加水分解反応後に生成する加水分解生成物に作用する、リパーゼ酵素HypLIP (固有に固定化された（Indigenously immobilized） Lipolase（登録商標）100L)、Lipozyme（登録商標）TL IM (固定化Lipolase（登録商標）100L)、Lipozyme（登録商標）RM IM Novozym（登録商標）435、およびPseudomonas cepacia由来のリパーゼを用いて繰り返された。図１は、均一な媒体中におけるヒマシ油の加水分解率についてのプロファイルを示す。図３は、溶媒無しまたは異なる極性有機溶媒中における、HypLIPを用いたバッチ条件下で6時間後に得られた遊離脂肪酸の変換率（％）を示す。HypLIPは、本研究に用いられた他の酵素調製物のいずれかと比較した場合に、高い初期変換率を示す。
【０１２３】
３）基質として油状物質および脂質：24時間後に〜60-65%変換
ａ．脂肪酸およびモノグリセリドの形成
1g の固定化リパーゼ（HypLIP）を含む100mlの反応フラスコにおいて、10gのヤシ油およびトリステアリンをt-ブタノールおよび水に加え（比率1:4:0.2）、均一な反応混合物を作製する。基質混合物は、オービタルシェーカーで60℃（実験は50℃および55℃について同様に実施される）に維持され、反応は酸価を用いて24時間モニターされた。24時間終了時に、得られたトリグリセリド変換は99%であり、油状物質から脂肪酸およびモノグリセリドへの変換率（％）は、それぞれ65%および35%であることが分かった。
【０１２４】
ｂ．脂肪酸およびグリセロールの形成
反応は、第一の酵素的加水分解反応後に生成する加水分解生成物に作用する、リパーゼ酵素HypLIP (固有に固定化された（Indigenously immobilized） Lipolase（登録商標）100L)、Lipozyme（登録商標）TL IM (固定化Lipolase（登録商標）100L)、Lipozyme（登録商標）RM IM Novozym（登録商標）435、およびPseudomonas cepacia由来のリパーゼを用いて繰り返された。図１は、均一な媒体中におけるヒマシ油の加水分解率についてのプロファイルを示す。図３は、溶媒無しまたは異なる極性有機溶媒中における、HypLIPを用いたバッチ条件下で6時間後に得られた遊離脂肪酸の変換率（％）を示す。HypLIPは、本研究に用いられた他の酵素調製物のいずれかと比較した場合に、高い初期変換率を示す。
【０１２５】
上述の方法を用いた油状物質および／または脂質の変換率は、先行技術と比較された。比較分析は、表1に示される。
【０１２６】
[実施例２]
＜半連続法＞
１）単一カラム：12時間後に〜88%変換
ａ．脂肪酸およびモノグリセリドの形成
油状物質の加水分解のための連続法は、60℃に維持されたジャケット付ガラスカラムから構成される詰め床反応器（PBR）において実施された。実験は、50℃および55℃について同様に実施され得る。メタクリラート担体（体積50 ml）に固定された1,3-特異的酵素を含むPBRに、ヒマシ油、t-ブタノール、および水（比率1:6:0.15）を含む基質混合物を供し、マグネチックスターラーを用いて連続的に撹拌した。基質混合物は、12時間に亘って、PBRにより再生利用された。得られたトリグリセリド変換率は99％であり、油状物質から脂肪酸への変換率は88％であり、未反応のモノグリセリドは12％であった。形成された生成物は、脂肪酸、グリセロール、およびモノグリセリドであった。図４は、油状物質の加水分解のための半連続法についてのスキームを示す。本明細書に説明されるスキームから、ヒマシ油の99％から88％の収率で遊離脂肪酸を得ることができた（図７）。リシノール酸と共にモノリシノレアートなどの、ヒマシ油加水分解生成物が主生成物として見出される。他の脂肪酸もまた、このプロファイル中に見出すことができる。
【０１２７】
ｂ．脂肪酸およびグリセロールの形成
反応は、第一の酵素的加水分解反応後に生成する加水分解生成物に作用する、リパーゼ酵素HypLIP (固有に固定化された（Indigenously immobilized） Lipolase（登録商標）100L)、Lipozyme（登録商標）TL IM (固定化Lipolase（登録商標）100L)、Lipozyme（登録商標）RM IM Novozym（登録商標）435、およびPseudomonas cepacia由来のリパーゼを用いて繰り返された。図１は、均一な媒体中におけるヒマシ油の加水分解率についてのプロファイルを示す。図３は、溶媒無しまたは異なる極性有機溶媒中における、HypLIPを用いたバッチ条件下で6時間後に得られた遊離脂肪酸の変換率（％）を示す。HypLIPは、本研究に用いられた他の酵素調製物のいずれかと比較した場合に、高い初期変換率を示す。
【０１２８】
[実施例３]
＜連続法＞
１）単一カラム：10〜15分間未満に〜30-33%変換
ａ．脂肪酸およびモノグリセリドの形成
油状物質の加水分解のための連続法は、メタクリラート担体に固定された1,3-特異的酵素を含む、60℃に維持されたジャケット付ガラスカラムから構成される詰め床反応器（PBR）において実施された（実験は、50℃および55℃について同様に実施され得る）。上述の実施例において説明される反応混合物をPBRに供し、滞留時間を9〜15分間に維持した。トリグリセリドの加水分解収率は99％超であり、脂肪酸の収率は33％であることが見いだされる。このようにして形成されるジアシルグリセロールは、脂肪酸からさらに分離することができる（図５）。
【０１２９】
ｂ．脂肪酸およびグリセロールの形成
反応は、第一の酵素的加水分解反応後に生成する加水分解生成物に作用する、リパーゼ酵素HypLIP (固有に固定化された（Indigenously immobilized） Lipolase（登録商標）100L)、Lipozyme（登録商標）TL IM (固定化Lipolase（登録商標）100L)、Lipozyme（登録商標）RM IM Novozym（登録商標）435、およびPseudomonas cepacia由来のリパーゼを用いて繰り返された。図１は、均一な媒体中におけるヒマシ油の加水分解率についてのプロファイルを示す。図３は、溶媒無しまたは異なる極性有機溶媒中における、HypLIPを用いたバッチ条件下で6時間後に得られた遊離脂肪酸の変換率（％）を示す。HypLIPは、本研究に用いられた他の酵素調製物のいずれかと比較した場合に、高い初期変換率を示す。
【０１３０】
２）単一カラム： 15分後に66-70%変換
ａ．脂肪酸およびモノグリセリドの形成
油状物質の加水分解のための連続法は、メタクリラート担体に固定された1,3-特異的酵素を含む、60℃に維持されたジャケット付ガラスカラムから構成される詰め床反応器（PBR）において実施された（実験は、50℃および55℃について同様に実施され得る）。上述の実施例において説明される反応混合物をPBRに供し、滞留時間を15〜20分間に維持した。油状物質の加水分解収率は99％超であり、脂肪酸の収率は66％であった。sn-2 モノグリセリドおよび脂肪酸は、さらに分離することができる（図６）。
【０１３１】
ｂ．脂肪酸およびグリセロールの形成
反応は、第一の酵素的加水分解反応後に生成する加水分解生成物に作用する、リパーゼ酵素HypLIP (固有に固定化された（Indigenously immobilized） Lipolase（登録商標）100L)、Lipozyme（登録商標）TL IM (固定化Lipolase（登録商標）100L)、Lipozyme（登録商標）RM IM Novozym（登録商標）435、およびPseudomonas cepacia由来のリパーゼを用いて繰り返された。図１は、均一な媒体中におけるヒマシ油の加水分解率についてのプロファイルを示す。図３は、溶媒無しまたは異なる極性有機溶媒中における、HypLIPを用いたバッチ条件下で6時間後に得られた遊離脂肪酸の変換率（％）を示す。HypLIPは、本研究に用いられた他の酵素調製物のいずれかと比較した場合に、高い初期変換率を示す。
【０１３２】
[実施例４]
＜単一カラム+再分配のための吸着剤：115分後に66-70%変換＞
ａ．脂肪酸およびモノグリセリドの形成
油状物質の加水分解のための連続法は、固定化リパーゼおよび吸着剤を含む、60℃に維持されたジャケット付ガラスカラムから構成される詰め床反応器（PBR）において実施された（実験は、50℃および55℃について同様に実施され得る）。上述の実施例において説明される反応混合物を、固定化リパーゼから構成される第1のPBRに15分間供し、再分配のための吸着剤から構成される第2のPBRに90〜120分間供した（図８）。99％のトリグリセリドが加水分解されて、脂肪酸が66-70％の収率で得られ、1/3-MAGおよび脂肪酸を含んでいた。sn-1(3) モノリシノレアートなどのヒマシ油加水分解生成物が主生成物として見出された。リシノール酸もまた、このプロファイル中に見出すことができる（図９）。
【０１３３】
ｂ．脂肪酸およびグリセロールの形成
反応は、第一の酵素的加水分解反応後に生成する加水分解生成物に作用する、リパーゼ酵素HypLIP (固有に固定化された（Indigenously immobilized） Lipolase（登録商標）100L)、Lipozyme（登録商標）TL IM (固定化Lipolase（登録商標）100L)、Lipozyme（登録商標）RM IM Novozym（登録商標）435、およびPseudomonas cepacia由来のリパーゼを用いて繰り返された。図１は、均一な媒体中におけるヒマシ油の加水分解率についてのプロファイルを示す。図３は、溶媒無しまたは異なる極性有機溶媒中における、HypLIPを用いたバッチ条件下で6時間後に得られた遊離脂肪酸の変換率（％）を示す。HypLIPは、本研究に用いられた他の酵素調製物のいずれかと比較した場合に、高い初期変換率を示す。
【０１３４】
[実施例５]
＜二重カラム+再分配のための吸着剤：140分後に88-95%変換＞
ａ．脂肪酸およびモノグリセリドの形成
油状物質の加水分解のための連続法は、60℃に維持されたジャケット付ガラスカラムから構成される詰め床反応器（PBR）において実施された。実験は、50℃および55℃について同様に実施され得る。メラクリラート担体（体積50ml）に固定された1,3-特異的酵素を含む第1のPBRに、実施例１ａに記載される反応混合物を供した。滞留時間は3〜100分間であった。
【０１３５】
ｂ．脂肪酸およびグリセロールの形成
第1のPBRからの精製混合物は、再分配のための吸着剤（体積100ml）を含む第2のPBRに供し、滞留時間を40〜120分間とした。第2のPBRからの生成物流はその後、固定化された1,3-特異的酵素（体積25ml）を含む第3のPBRに通し、滞留時間を5〜50分間とした。油状物質の加水分解のための３段階PBRスキームにより、トリアシルグリセロールは脂肪酸とグリセロールとに完全に変換される。滞留時間140分間の場合に遊離脂肪酸は95％超で得られ、得られる生成物（すなわち脂肪酸とグリセロール）はさらに分離することができる（図１０）。
【０１３６】
【表１】
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2015509358.tif 000004
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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