(57)【要約】【課題】  高いコラゲナーゼ阻害作用を有するとともに、病原体の感染や病原性因子の伝達を生じる危険性や好ましくない副作用の虞がなく、生体内で分解可能なコラゲナーゼ阻害剤を提供する。【解決手段】  本発明の新規なポリペプチドは、下記式(1)で表されるペプチドユニットと、下記式(2)で表されるペプチドユニットとを含み、かつコラゲナーゼの活性を阻害するために用いられる。              -Pro-X-Gly-                        (1)              -Pro-Y-Gly-Z-Ala-Gly-              (2)（式中、ＸはProまたはHyp、ＹはGln、Asn、Leu、Ile、ValまたはAla、ＺはIleまたはLeuを表す）【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式(1)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドユニットと、下記式(2)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドユニットとを含み、かつコラゲナーゼの活性を阻害するために用いられるポリペプチド。
-Pro-X-Gly-                          (1)
-Pro-Y-Gly-Z-Ala-Gly-                (2)
（式中、ＸはProまたはHyp、ＹはGln、Asn、Leu、Ile、ValまたはAla、ＺはIleまたはLeuを表す。）
【請求項２】
ペプチドユニット(1)とペプチドユニット(2)との割合（モル比）が、(1)／(2)＝９９／１〜１／９９である請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
ポリペプチドが、円二色性スペクトルにおいて、波長２２０〜２３０ｎｍに正のコットン効果を示し、波長１９５〜２０５ｎｍに負のコットン効果を示す請求項１又は２記載のポリペプチド。
【請求項４】
ポリペプチドの少なくとも一部が３重らせん構造を形成可能である請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５】
ポリペプチドが分子量５×１０2〜５００×１０4の範囲にピークを示す請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項６】
請求項１記載のポリペプチドを含み、かつコラゲナーゼの活性を阻害するために用いられる化粧料。
【請求項７】
請求項１記載のポリペプチドを含み、かつコラゲナーゼの活性を阻害するために用いられる食用組成物。
【請求項８】
下記式(1)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドユニットと、下記式(2)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドユニットとを含む新規なポリペプチドを用いて、コラゲナーゼの活性を阻害する方法。
-Pro-X-Gly-                          (1)
-Pro-Y-Gly-Z-Ala-Gly-                (2)
（式中、ＸはProまたはHyp、ＹはGln、Asn、Leu、Ile、ValまたはAla、ＺはIleまたはLeuを表す）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体内分解吸収性を有する新規なポリペプチドで構成されたコラゲナーゼ阻害剤に関する。さらに詳しくは、本発明は、病原体感染の危険性や好ましくない副作用がなく、安全性の高い生体材料又は医用材料、医薬品の有効成分、化粧品の素材や食用組成物の添加剤などとして有用なコラゲナーゼ阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは、あらゆる多細胞動物にみられる繊維状蛋白質であり、皮膚や骨の主成分として哺乳類では全蛋白質の２５％を占める。典型的なコラーゲン分子は、３本のコラーゲンポリペプチド鎖が三重らせん構造と呼ばれるロープ状の超らせん構造をとる。コラーゲンには、プロリン（Pro）とグリシン（Gly）とが特に多く含まれ、両アミノ酸残基とも安定な３重らせん構造の形成に重要である。
【０００３】
コラーゲンを特異的に分解する酵素であるコラゲナーゼ（Matrix metalloproteinase-1）は、炎症反応や炎症性疾患、加齢などによって、活性が上昇し、コラーゲンを分解することが知られている。したがって、コラゲナーゼ活性の阻害は、炎症反応の抑制、炎症反応によって引き起こされる種々の症状の緩和、皮膚の加齢による老化の防止、骨粗しょう症の予防などに効果があると考えらていれる。
【０００４】
コラゲナーゼ阻害作用を持つ物質の利用について種々の提案がなされている。例えば、特開２００３−１９２５６５号公報（特許文献１）には、コラゲナーゼ阻害作用を有する植物エキスと魚類由来コラーゲンとを含有する抗老化化粧料が開示されている。
【０００５】
特開２００３−１８３１７３号公報（特許文献２）には、ニクタンティス・アルボートリスティス、パイパー・チャバ、アントセファランス・インディカンス、クロタラリアサイチソイデスなどの植物からの抽出物を有効成分とするコラゲナーゼ阻害剤を配合した皮膚外用剤および飲食品が開示されている。
【０００６】
特開２００３−１７６２１９号公報（特許文献３）には、防腐防黴剤と、コラーゲン又はゼラチンの分解物であり、(Gly-X-Y)n（式中、Glyは、グリシン残基を表し、X、Yはアミノ酸残基を表し、互いにX、Yは同一であっても、異なってもよく、ｎは正の整数を表す）で表されるアミノ酸配列を有するトリペプチドとを含有する皮膚外用剤が開示されている。
【０００７】
特開２００２−１０４９８６号公報（特許文献４）には、五味子抽出物を有効成分として含有する抗歯周病剤であって、歯周病病原菌ポリフィロモナス・ジンジバリスが産生するコラゲナーゼを阻害する作用を有する抗歯周病剤が開示されている。
【０００８】
特開２００１−２４７４６９号公報（特許文献５）には、オトギリソウ科マンゴスチン及びその果皮から抽出されるα−及び／又はγ−マンゴスチンを有効成分とし、かつ歯周病病原菌ポリフィロモナス・ジンジバリスが産生するコラゲナーゼを阻害する作用を有する抗齲蝕、歯周病剤、並びにこれらを含む口腔用組成物及び飲食品が開示されている。
【０００９】
特開平０９−２４１２８７号公報（特許文献６）には、アスペルギラス・ニガーなどのアスペルギラス属に属する微生物の培養物から採取されたコラゲナーゼ阻害物質であって、抗リウマチ剤、抗炎症剤、抗がん剤、抗インフルエンザウイルス感染に対する治療剤として有用なコラゲナーゼ阻害物質ＦＯ−５９０４が開示されている。
【００１０】
特開平０９−２３５２９３号公報（特許文献７）には、ホウロウタケなどのキノコ子実体から抽出され、コラゲナーゼ阻害作用を有する新規なトリテルペン類が開示されている。この文献には、前記トリテルペン類が、関節疾患、骨吸収疾患、歯周疾患、角膜潰瘍、表皮水疱症などの疾患の治療剤として有用であると記載されている。
【００１１】
特開平０７−３０４７７０号公報（特許文献８）には、強いコラゲナーゼ阻害作用を有しコラゲナーゼ活性の亢進に起因する各種疾患の治療薬として有用な新規ベンゾアゼピノン誘導体が開示されている。
【００１２】
特開平０７−２９１８７３号公報（特許文献９）には、グアバの葉、西河柳および菱実よりなる群より選んだ少なくとも一種の溶媒抽出液を含み、食用又は医薬用として有用なコラゲナーゼ活性阻害剤が開示されている。
【００１３】
特開平０５−１６３２８７号公報（特許文献１０）には、亜鉛の金属結合タンパク質の種類に属する細菌性コラゲナーゼの阻害剤として用いられるペプチド誘導体であって、コラゲナーゼの活性部位の亜鉛原子と強力に相互に作用することが可能なホスフィンのキレート基ＰＯ2−ＣＨ2を有する新規なペプチド誘導体が開示されている。
【００１４】
また、Ｉ型コラーゲンのコラゲナーゼ分解部位を模倣したコラーゲン用ヘテロ３量体の構造的な特徴についても報告されている（「J. Mol. Biol., Vol.319」（非特許文献１）、pp.1235-1242, 2002）。
【００１５】
また、コラーゲン類似物の化学合成の方法に関し、式Pro-Ser-Glyで示されるペプチドのp-ニトロフェニルエステル、あるいは式Pro-Ala-Glyで示されるペプチドのp-ニトロフェニルエステルをジメチルホルムアミドに溶解し、トリエチルアミンを加えて24時間静置することにより、分子量が16,000〜21,000の可溶性ポリアミドが得られることが報告されている（「J. Mol. Biol., Vol.63」（非特許文献２）、pp.85-99, 1972）。これらの可溶性ポリアミドは円二色性スペクトルから３重らせん構造をとることが推定されているが、得られたポリマーの性質に関する記述はない。
【００１６】
エラスチン由来のVal-Pro-Gly-Val-Gly配列を含む５０量体のペプチドをジメチルスルホキシドに溶解し、２当量の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドと１当量の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、および１．６当量のＮ−メチルモルフォリンを加えて１４日間静置した後、分子量カットオフが５万の透析膜で透析してポリアミドを得る方法も報告されている（「Int. J. Peptide Protein Res., Vol.46」（非特許文献３）、pp.453-463, 1995）。
【００１７】
一方、ヒツジの振戦病やウシの海綿状脳症の原因物質がプリオンと呼ばれる伝染性蛋白質であり、この伝染性タンパク質がヒトのクロイツフェルドーヤコブ病伝染の原因の一つと言われている。プリオンは、蛋白質であり、通常の滅菌、殺菌方法では失活し難く、しかも種を越えて感染することが指摘されている（「Nature Review, Vol.2」（非特許文献４）、pp.118-126, 2001）。
【００１８】
一般に、医薬品、化粧品、飲食品では天然物及びこれらからの抽出物を原料として用いることが多い。そのため、通常の滅菌、殺菌方法では除去できないプリオンなどの未知の病原体（又は病原性因子）の感染（又は伝達）の危険性が常に存在している。一方、特許文献８に記載されているような合成化学物質では、生体内での分解又は吸収性が充分でなく、副作用などの危険性も有している。
【特許文献１】特開２００３−１９２５６５号公報（請求項１及び２）
【特許文献２】特開２００３−１８３１７３号公報（請求項３、６及び７）
【特許文献３】特開２００３−１７６２１９号公報（請求項１）
【特許文献４】特開２００２−１０４９８６号公報（請求項１）
【特許文献５】特開２００１−２４７４６９号公報（請求項１〜５、段落番号［0047］）
【特許文献６】特開平０９−２４１２８７号公報（請求項１〜５、段落番号［0001］）
【特許文献７】特開平０９−２３５２９３号公報（段落番号［0008］）
【特許文献８】特開平０７−３０４７７０号公報（請求項１、段落番号［0026］）
【特許文献９】特開平０７−２９１８７３号公報（請求項１、段落番号［0046］）
【特許文献１０】特開平０５−１６３２８７号公報（段落番号［0001］）
【非特許文献１】「J. Mol. Biol., Vol.319」、pp.1235-1242, 2002
【非特許文献２】「J. Mol. Biol., Vol.63」、pp.85-99, 1972
【非特許文献３】「Int. J. Peptide Protein Res., Vol.46」、pp.453-463, 1995
【非特許文献４】「Nature Review, Vol.2」、pp.118-126, 2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
従って、本発明の目的は、高いコラゲナーゼ阻害作用を有するとともに、病原体の感染や病原性因子の伝達を生じる危険性や好ましくない副作用の虞がなく、生体内で分解可能なコラゲナーゼ阻害剤（又は新規ポリペプチド）を提供することにある。
【００２０】
本発明の他の目的は、安全性が高く、生体材料又は医用材料、製剤組成物、化粧料、食用組成物の含有成分として有用なコラゲナーゼ阻害剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者は前記課題を解決するため鋭意検討の結果、特定のペプチド成分を縮合すると環化することなくコラーゲン様ポリペプチドが生成し、生体内で分解が可能で、コラゲナーゼ阻害作用を有することを見出し、本発明を完成した。
【００２２】
すなわち、本発明の新規ポリペプチドは、下記式(1)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドユニットと、下記式(2)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドユニットとを含み、かつコラゲナーゼの活性を阻害するために用いられる。
【００２３】
-Pro-X-Gly-                          (1)
-Pro-Y-Gly-Z-Ala-Gly-                (2)
（式中、ＸはProまたはHyp、ＹはGln、Asn、Leu、Ile、ValまたはAla、ＺはIleまたはLeuを表す。）
前記ペプチドユニット(1)とペプチドユニット(2)との割合（モル比）は、(1)／(2)＝９９／１〜１／９９程度であってもよい。
【００２４】
本発明のポリペプチド又はコラゲナーゼ阻害剤は、コラーゲン分解酵素であるコラゲナーゼに認識されるアミノ酸配列を含んでいる。したがって、前記ポリペプチドは、コラゲナーゼに結合したり、コラゲナーゼによって分解され、あるいはコラゲナーゼに結合し、かつコラゲナーゼにより分解される。前記ポリペプチドは、このような性質を有しているため、コラゲナーゼの作用を阻害することができる。また、前記ポリペプチドは、アミド結合を有するコラーゲン様ポリペプチドであるため、哺乳類動物の生体内でも分解可能である。即ち、前記ポリペプチドは生体内で分解し吸収可能である。前記ポリペプチドは、円二色性スペクトルにおいて、波長２２０〜２３０ｎｍに正のコットン効果を示し、波長１９５〜２０５ｎｍに負のコットン効果を示す。これは、ポリペプチドの少なくとも一部（一部または全部）が、３重らせん構造を形成していることを示している。前記ポリペプチドは、分子量５×１０2〜５００×１０4の範囲にピークを示してもよい。前記コラゲナーゼ阻害剤は、例えば、生体材料又は医用材料、製剤組成物、化粧料、食用組成物などの含有成分として用いられてもよい。
【００２５】
本発明には、前記ポリペプチドを含み、かつコラゲナーゼの活性を阻害するために用いられる化粧料や食用組成物なども含まれる。また、本発明には、前記ポリペプチドを用いて、コラゲナーゼの活性を阻害する方法も含まれる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明のポリペプチド又はコラゲナーゼ阻害剤は、高いコラゲナーゼ阻害作用を有するとともに、病原体感染の危険性や副作用の虞がなく、生体内で分解可能である。従って、生体適合性にも優れるため、安全性が高く、生体材料又は医用材料、製剤組成物、化粧料や食用組成物などの含有成分として有用である。さらに、このポリペプチドは、二量化や環化反応を抑制しつつ、縮合反応という簡単な操作で製造できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明においては各種アミノ酸残基を次の略号で記述する。
【００２８】
Ala ：Ｌ−アラニン残基
Arg ：Ｌ−アルギニン残基
Asn ：Ｌ−アスパラギン残基
Asp ：Ｌ−アスパラギン酸残基
Cys ：Ｌ−システイン残基
Gln ：Ｌ−グルタミン残基
Glu ：Ｌ−グルタミン酸残基
Gly ：グリシン残基
His ：Ｌ−ヒスチジン残基
Hyp ：Ｌ−ヒドロキシプロリン残基
Ile ：Ｌ−イソロイシン残基
Leu ：Ｌ−ロイシン残基
Lys ：Ｌ−リジン残基
Met ：Ｌ−メチオニン残基
Phe ：Ｌ−フェニルアラニン残基
Pro ：Ｌ−プロリン残基
Sar ：サルコシン残基
Ser ：Ｌ−セリン残基
Thr ：Ｌ−トレオニン残基
Trp ：Ｌ−トリプトファン残基
Tyr ：Ｌ−チロシン残基
Val ：Ｌ−バリン残基
また、本明細書においては、常法に従って、Ｎ末端のアミノ酸残基を左側に位置させ、Ｃ末端のアミノ酸残基を右側に位置させて、ペプチド鎖のアミノ酸配列を記述する。
【００２９】
本発明における新規なポリペプチドは、-Pro-X-Gly-で表されるアミノ酸配列を有するペプチドユニットを含むことが必要である。-Pro-X-Gly-で表される配列は、３重らせん構造の安定性に寄与するため、この配列の割合が少ないと３重らせん構造の安定性が減少する。さらに、このユニットは、３重らせん構造の安定性の点から、ポリペプチド中において、-(Pro-X-Gly)n-で表される繰返し構造（オリゴ又はポリペブチドユニット構造）を形成してもよい。この配列の繰返し数ｎは、例えば、１〜５０００、好ましくは２〜３０００程度である。Ｘは、ProまたはHypのいずれであってもよいが、３重らせん構造の安定性からHypであるのがより好ましい。なお、Hypは、通常、４Hyp（例えば、trans−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン）残基である。
【００３０】
また、このポリペプチドは、-Pro-Y-Gly-Z-Ala-Gly-で表されるアミノ酸配列を有するペプチドユニットを含むことが必要である。この配列を含まない場合や少なすぎる場合には、コラゲナーゼの阻害作用が低下する。一方、この配列が多すぎると３重らせん構造の安定性が低下する。ＹはGln、Asn、Leu、Ile、ValまたはAlaのいずれであってもよいが、Gln、Asn、Leu、Val、Ala、特にGln、Leuがより好ましい。ZはIleまたはLeuのいずれでもよいが、Ileがより好ましい。ＹとＺとの組み合わせは、例えば、ＹがGln、Asn、Leu、Ile、ValおよびAlaから選択された一種（例えば、Gln又はLeu）であり、ＺがIleであるペプチドや、ＹがGln、Asn、Leu、Ile、ValおよびAlaから選択された一種（例えば、Gln又はLeu）であり、ＺがLeuであるペプチドなどが挙げられる。
【００３１】
ＸとＹとＺとの組み合わせは、ＸがHyp、ＹがGln、Asn、Leu、Ile、ValおよびAlaから選択された一種（例えば、Gln又はLeu）、ＺがIle又はLeuであるペプチドや、ＸがPro、ＹがGln、Asn、Leu、Ile、ValおよびAlaから選択された一種（例えば、Gln又はLeu）、ＺがIle又はLeuであるペプチドなどが挙げられる。
【００３２】
さらに、得られるポリペプチドの物理的および生物学的性質を損なわない限り、本発明におけるポリペプチドは他のアミノ酸残基やペプチド残基（ユニット）を含んでいてもよい。本発明におけるポリペプチドが有用な物理的および生物学的性質を発揮するためには、例えば、Gly、Sar、Ser、Glu、Asp、Lys、His、Ala、Val、Leu、Arg、Pro、Tyr、Ileから選択された少なくとも一種のアミノ酸残基又はペプチド残基、特に、Gly、Sar、Ser、Glu、Asp、Lys、Arg、Pro、Valから選択された少なくとも一種のアミノ酸残基又はペプチド残基を有している場合が多い。具体的には、例えば、Gly、Sar、Ser、Glu、Asp、Lys、Arg-Gly-Asp、Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg、Ile-Lys-Val-Ala-Val、Val-Pro-Gly-Val-Gly、Asp-Gly-Glu-Ala、Gly-Ile-Ala-Gly、His-Ala-Val、Glu-Arg-Leu-Glu、Lys-Asp-Pro-Lys-Arg-Leu、Arg-Ser-Arg-Lysで示されるアミノ酸残基やペプチド残基を含むのが好ましい。
【００３３】
本発明におけるポリペプチドは、生理学的又は薬理学的に許容される塩であってもよく、例えば、無機酸（塩酸、硫酸、リン酸など）、有機酸（酢酸、トリフルオロ酢酸、乳酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、シュウ酸、リンゴ酸、クエン酸、オレイン酸、パルミチン酸など）、金属（ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属、カルシウムなどのアルカリ土類金属、アルミニウムなど）、有機塩基（トリメチルアミン、トリエチルアミン、ｔ−ブチルアミン、ベンジルアミン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、アルギニンなど）との塩であってもよい。これらの塩形成化合物は、単独で又は二種以上組み合わせて使用できる。これらの塩は、通常の塩形成反応によって得ることができる。
【００３４】
本発明におけるポリペプチドにおいて、前記ペプチドユニット(1)と前記ペプチドユニット(2)との割合（モル比）は、(1)／(2)＝９９／１〜１／９９、好ましくは９８／２〜２／９８、さらに好ましくは９５／５〜５／９５程度である。
【００３５】
前記ペプチドユニット(1)および前記ペプチドユニット(2)の合計量と、他のペプチドユニットとの割合（モル比）は、前者／後者＝１００／０〜５０／５０、好ましくは１００／０〜６０／４０、さらに好ましくは１００／０〜７０／３０程度である。
【００３６】
このようなポリペプチドは、環化により６員環を形成することなく、鎖状のポリペプチドを形成しており、溶媒（水、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ-メチルピロリドンなどの親水性溶媒又はそれらの混合溶媒）に可溶である。本発明のポリペプチドは、水系ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）において、球状蛋白質換算で、例えば、分子量５×１０2〜５００×１０4、好ましくは分子量１×１０3〜３００×１０4、好ましくは分子量３×１０3〜２００×１０4、さらに好ましくは分子量５×１０3〜１００×１０4程度の範囲にピークを示す。
【００３７】
さらに、本発明におけるポリペプチドは、円二色性スペクトルにおいて、波長２２０〜２３０ｎｍに正のコットン効果を示し、波長１９５〜２０５ｎｍに負のコットン効果を示す。そのため、ポリペプチドの少なくとも一部（すなわち、一部または全部）が３重らせん構造を形成可能であり、コラーゲン様ポリペプチドを形成する。なお、コットン効果とは、旋光性物質において特定の波長で左右の円偏光に対する吸収係数が異なるために起こる現象をいう。
【００３８】
本発明における新規なポリペプチドは、アミノ酸やペプチドフラグメント（又はセグメント）を縮合反応に供する慣用の方法により得ることができ、最終的にペプチドユニット(1)とペプチドユニット(2)とがポリペプチド中に含まれている限り特に制限されず、例えば、構成アミノ酸の縮合反応や、ペプチドフラグメントとアミノ酸との縮合反応を利用して得てもよいが、予め、式(1)及び／又は(2)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを調製し、このペプチドを含むペプチド成分を縮合する方法により得るのが好ましい。
【００３９】
予め調製したペプチド成分を縮合する方法において、ペプチド成分のペプチド鎖の合成は、通常のペプチド合成方法に従って行うことができる。ペプチドは、例えば、固相合成法または液相合成法によって調製できるが、固相合成法が操作上簡便である〔例えば、日本生化学会編「続生化学実験講座２  タンパク質の化学(下)」(昭和６２年５月２０日  株式会社東京化学同人発行)、第６４１−６９４頁参照〕。ペプチド合成には、慣用の方法、例えば、縮合剤を用いるカップリング方法、活性エステル法（ｐ−ニトロフェニルエステル（ONp）、ペンタフルオロフェニルエステル（Opfp）などのフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ONSu）などのＮ−ヒドロキシジカルボン酸イミドエステル、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル（Obt）など）、混合酸無水物法、アジド法などが利用できる。好ましい方法では、少なくとも縮合剤（好ましくは後述する縮合剤、特に後述する縮合剤と縮合助剤との組合せ）を用いる場合が多い。
【００４０】
さらに、ペプチドの合成では、アミノ酸又はペプチドセグメントの種類に応じて、アミノ基、カルボキシル基、他の官能基（グアニジノ基、イミダゾリル基、メルカプト基、ヒドロキシル基、ω−カルボキシル基など）の保護基による保護と、接触還元や強酸処理（無水フッ化水素、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸など）による保護基の脱離・除去とが繰り返し行われる。例えば、アミノ基の保護基には、ベンジルオキシカルボニル基(Z)、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル基(Z(OMe))、９−フルオレニルメトキシカルボニル基(Fmoc)、ｔ−ブトキシカルボニル基(Boc)、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル基(Npys)などが利用でき、カルボキシル基の保護基には、ベンジルオキシ基(OBzl)，フェナシルオキシ基(OPac)、ｔ−ブトキシ基(OBu)、メトキシ基(OMe)、エトキシ基(OEt)などが利用できる。なお、ペプチド合成には自動合成装置を利用してもよい。
【００４１】
より具体的には、前記ペプチド鎖の固相合成法による調製は、慣用の方法で行うことができる。固相樹脂（又は担体）としては、反応溶媒に不溶性の重合体、例えば、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、例えば、クロロメチル化樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ヒドロキシメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂などが利用できる。
【００４２】
固相合成法では、通常、(i)前記重合体（樹脂）に対して、目的とするペプチドのＣ末端からＮ末端の方向に向かって、遊離のα−ＣＯＯＨ基を有するとともに官能基（少なくともＮ末端のα−アミノ基など）が保護基で保護されたアミノ酸又はペプチド断片を結合させる操作と、(ii)結合したアミノ酸又はペプチド断片のうちペプチド結合を形成するα−アミノ基の保護基を除去する操作と、(iii)上記結合操作と除去操作とを順次繰り返すことにより、ペプチド鎖を伸長させて目的ペプチドに対応するペプチド鎖を形成する工程と、(iv)ペプチド鎖を重合体（樹脂）から脱離させ、かつ保護されている官能基から保護基を除去することにより、目的とするペプチドを生成させ、生成したペプチドを精製することにより、ペプチドを製造できる。前記アミノ酸又はペプチド断片を結合させる操作(i)では、前記ペプチド鎖のＣ末端に対応し、かつ遊離のα−ＣＯＯＨ基を有するとともに少なくともＮ末端が保護基で保護されたアミノ酸（例えば、Fmoc−アミノ酸、Boc−アミノ酸など）が使用される。なお、ペプチド鎖の重合体からの脱離および保護基の除去は、トリフルオロ酢酸を用いて同時に行うのが副反応を抑制する観点から好ましい。また、生成したペプチドの精製は、逆相液体クロマトグラフィーやゲルパーミエイションクロマトグラフィーなどの分離精製手段を利用して行うことができる。
【００４３】
このようにして合成されたペプチドを含むペプチド成分を縮合する方法には、（ａ）式(1)及び(2)で表される双方のアミノ酸配列を有するペプチドを少なくとも含むペプチド成分を縮合する方法と、（ｂ）式(1)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドと、式(2)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドとを少なくとも含むペプチド成分を縮合する方法とが含まれる。
【００４４】
前者の方法（ａ）において、式(1)及び(2)で表される双方のアミノ酸配列を有するペプチド（すなわち、式(1)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドユニツトと式(2)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドユニットとの双方のユニットを含むペプチド）は、単独で又は二種以上組み合わせて使用できる。また、この方法において、ペプチド成分としては、前記双方のユニットを含むペプチドに加え、目的のポリペプチドに応じて他のペプチドを用いてもよい。他のペプチドとしては、例えば、前述の他のアミノ酸残基やペプチド残基を含むペプチドなどが挙げられる。これらの他のペプチドも、単独で又は二種以上組み合わせて使用できる。なお、この方法において、式(1)又は(2)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを共縮合することにより、ユニット(1)とユニット(2)との割合を容易に調整することができる。
【００４５】
後者の方法（ｂ）においても、式(1)で表されるアミノ酸配列を有するペプチド（オリゴ又はポリペプチドユニット）、式(2)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、それぞれ、単独で又は二種以上組み合わせて使用できる。また、この方法においても、ペプチド成分としては、これらのペプチド(1)及びペプチド(2)に加え、目的のポリペプチドに応じて他のペプチド、例えば、前述の他のアミノ酸残基やペプチド残基を含むペプチドなどを用いてもよい。これらの他のペプチドも、単独で又は二種以上組み合わせて使用できる。
【００４６】
これらのペプチドの縮合反応は、通常、溶媒中で行われる。溶媒は、上記ペプチド成分および化合物を溶解又は懸濁（一部または全部を溶解）可能であればよく、通常、水及び／又は有機溶剤が使用できる。溶媒としては、例えば、水、アミド類（ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ヘキサメチルホスホロアミドなど）、スルホキシド類（ジメチルスルホキシドなど）、窒素含有環状化合物（Ｎ−メチルピロリドン、ピリジンなど）、ニトリル類（アセトニトリルなど）、エーテル類（ジオキサン、テトラヒドロフランなど）、アルコール類（メチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコールなど）、およびこれらの混合溶媒が例示できる。これらの溶媒のうち、水、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドが繁用される。
【００４７】
これらのペプチドの反応は、通常、少なくとも脱水剤（脱水縮合剤）又は縮合剤の存在下で行うことができ、脱水縮合剤と縮合助剤との存在下で反応させると、二量化や環化を抑制しつつ、円滑にポリペプチドを生成できる。
【００４８】
脱水縮合剤は、前記溶媒中で脱水縮合を効率よく行える限り特に制限されず、例えば、カルボジイミド系縮合剤［ジイソプロピルカルボジイミド(DIPC)、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド(EDC=WSCI)、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩(WSCI・HCl)、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)など］、フルオロホスフェート系縮合剤［Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、ベンゾトリアゾール−１−イル−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロリン化物塩(BOP)など］、ジフェニルホスホリルアジド(DPPA)などが例示できる。これらの脱水縮合剤は単独で又は二種以上組み合わせて混合物として使用できる。好ましい脱水縮合剤は、カルボジイミド系縮合剤［例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩］である。
【００４９】
縮合助剤は、上記縮合剤の反応を促進する限り特に制限されず、例えば、Ｎ−ヒドロキシ多価カルボン酸イミド類［例えば、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド(HONSu)、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミド（HONB）などのＮ−ヒドロキシジカルボン酸イミド類］、Ｎ−ヒドロキシトリアゾール類［例えば、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)などのＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール類］、３−ヒドロキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベンゾトリアジン(HOObt)などのトリアジン類、２−ヒドロキシイミノ−２−シアノ酢酸エチルエステルなどが例示できる。これらの縮合助剤も単独で又は二種以上組み合わせて使用できる。好ましい縮合助剤は、Ｎ−ヒドロキシジカルボン酸イミド類［HONSuなど］、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール又はＮ−ヒドロキシベンゾトリアジン類［HOBtなど］である。
【００５０】
前記脱水縮合剤と縮合助剤とは適当に組み合わせて使用できる。前記脱水縮合剤と縮合助剤との組合せとしては、例えば、DCC-HONSu（HOBt又はHOObt）、WSCI-HONSu（HOBt又はHOObt）などが例示できる。
【００５１】
脱水縮合剤の使用量は、前記ペプチドの総量１モルに対して、通常、水を含まない非水系溶媒を用いる場合０．７〜５モル、好ましくは０．８〜２．５モル、さらに好ましくは０．９〜２．３モル（例えば１〜２モル）程度である。水を含む溶媒（水系溶媒）においては、水による脱水縮合剤の失活があるので、脱水縮合剤の使用量は、前記ペプチドの総量１モルに対して、通常、２〜５００モル（例えば、２〜５０モル）、好ましくは５〜２５０モル（例えば、５〜２５モル）、さらに好ましくは１０〜１２５モル（例えば、１０〜２０モル）程度である。縮合助剤の使用量は、溶媒の種類に関係なく、前記ペプチドの総量１モルに対して、例えば、０．５〜５モル、好ましくは０．７〜２モル、さらに好ましくは０．８〜１．５モル程度である。
【００５２】
本発明の縮合反応において、反応系のｐＨを調節してもよく、反応に関与しない塩基を添加してもよい。ｐＨの調節は、通常、無機塩基［水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなど］、有機塩基、無機酸［塩酸など］や有機酸を用いて行うことができ、通常、反応溶液が中性付近（ｐＨ＝６〜８程度）にｐＨ調整される。前記反応に関与しない塩基としては、第三級アミン類、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンなどのトリアルキルアミン類、Ｎ−メチルモルホリン、ピリジンなどの複素環式第三級アミン類などが例示できる。このような塩基の使用量は、通常、ペプチドの総モル数の１〜２倍程度の範囲から選択できる。
【００５３】
本発明におけるポリペプチドが３重らせん構造を形成することは、通常、ポリペプチドの溶液について、円二色性スペクトルを測定することにより立証できる。円二色性スペクトルにおいては、３重らせん構造を形成する天然のコラーゲンおよびペプチド鎖が、波長２２０ｎｍ〜２３０ｎｍに正のコットン効果、および波長１９５ｎｍ〜２０５ｎｍに負のコットン効果を特徴的に示すことが報告されている（J. Mol. Biol., Vol.63 pp.85-99, 1972）。
【００５４】
このようなポリペプチドは、コラーゲン分解酵素であるコラゲナーゼに認識されるアミノ酸配列を含み、コラゲナーゼに結合し、コラゲナーゼにより分解する。従って、このポリペプチドは、コラゲナーゼ活性に対する高い阻害作用を有しているため、コラゲナーゼ阻害剤として使用できる。
【００５５】
また、本発明のポリペプチド（コラゲナーゼ阻害剤）は、コラーゲン様ポリペプチドであるため、病原体や病原性因子［例えば、病原性に転化したタンパク質（例えば、異常型プリオンなど）など］の感染や伝達の危険性がない。また、生体内で分解吸収が可能であるため、好ましくない副作用を起こす虞もない。このように、本発明のコラゲナーゼ阻害剤は、安全性が高く、また、生体適合性にも優れている。そのため、本発明のコラゲナーゼ阻害剤は、コラゲナーゼの活性を阻害する必要がある被検体（ヒトの他、サル、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウスなどの非ヒト動物など）に関する幅広い用途に使用することができ、例えば、生体材料、医用材料、製剤組成物、化粧料、食用組成物などに含まれる成分（基材、有効成分、添加剤など）などとして利用できる。特に、本発明のコラゲナーゼ阻害剤は、コラゲナーゼ活性が増大している患部（例えば、炎症部位、関節、齲蝕部位、歯周部位、骨、角膜などの生体組織）などに安全に適用できるため、有用である。
【００５６】
生体材料又は医用材料において、前記コラゲナーゼ阻害剤は添加剤として用いられてもよい。また、前記コラゲナーゼ阻害剤は成膜性又は成形性が高く、所望の形状に容易に成形できるため、生体材料又は医用材料を前記コラゲナーゼ阻害剤単独で構成してもよい。例えば、生体材料は、前記コラゲナーゼ阻害剤で構成された種々の形態、例えば、液状（溶液又は懸濁液など）、粉粒状、二次元的形態（フィルムやシートなど）や三次元的形態で使用できる。生体材料又は医療材料としては、例えば、被覆材又は塗布剤、埋入材、止血材、癒着防止材、接着材、管腔材、膜材などが挙げられる。
【００５７】
生体材料又は医用材料における添加剤として、コラゲナーゼ阻害剤を使用する場合は、コラゲナーゼ阻害剤の割合は、例えば、基材１００重量部に対して、０．１〜５００重量部、好ましくは１〜３００重量部、さらに好ましくは５〜２００重量部程度であってもよい。
【００５８】
製剤組成物は、少なくともコラゲナーゼ阻害剤を含んでいればよく、固形製剤、半固形剤、液状製剤のいずれであってもよい。製剤組成物は、医薬品であっても、医薬部外品であってもよく、各種剤形の製剤として利用できる。固形製剤としては、例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、トローチ剤、グミ剤、丸剤、カプセル剤などが例示でき、半固形製剤としては、例えば、軟膏剤（クリーム、眼軟膏剤も含む）、パップ剤、貼付剤、及び坐剤などが例示でき、液状製剤としては、エアゾール剤、懸濁剤、乳剤、注射剤、点眼剤、ローション剤、及びリニメント剤などが例示できる。製剤全体に対するコラゲナーゼ阻害剤の割合は、０．００１〜９９重量％、好ましくは０．０１〜９５重量％、さらに好ましくは０．１〜９０重量％程度であってもよい。
【００５９】
化粧料は、少なくとも前記コラゲナーゼ阻害剤を含んでいればよく、粉末状基剤を含む粉末状化粧料、固形又は半固形状基剤（水性基剤、ゲル基剤、又は油性基剤）を含む固形又は半固形状化粧料、液状基剤（水性又は油性基剤）を含む液状化粧料のいずれであってもよい。また、化粧料は、通常、基剤（又は担体）と有効成分（保湿剤など）と添加剤とを含んでおり、前記コラゲナーゼ阻害剤は、これらの成分のうち少なくとも１つの成分として含有されていればよい。
【００６０】
前記コラゲナーゼ阻害剤の割合は、化粧料の種類や剤形などに応じて広い範囲、例えば、０．００１〜９９重量％程度の範囲から選択できる。前記コラゲナーゼ阻害剤の割合は、基剤として用いる場合、化粧料全体に対して、例えば１０〜９９重量％、好ましくは２０〜９９重量％程度であってもよい。有効成分として用いる場合、前記割合は、例えば０．００１〜９５重量％、好ましくは０．０１〜９０重量％程度であってもよい。また、添加剤として用いる場合、前記割合は０．００１〜４０重量％、好ましくは０．０１〜３０重量％程度であってもよい。
【００６１】
食用組成物は、少なくとも前記コラゲナーゼ阻害剤を含んでいればよく、粉末状基剤を含む粉末状組成物、固形又は半固形状基剤を含む固形又は半固形組成物、液状基剤を含む液状組成物、あるいはこれらの混合物などのいずれであってもよい。食用組成物は、通常、基剤（又は担体）と、有効成分と、添加剤（食品添加物、調味料など）とを含んでいる。前記コラゲナーゼ阻害剤は、これらの成分のうち少なくとも１つの成分として含有されていればよい。食用組成物としては、各種食品の他、機能性食品、例えば、健康食品、健康補助食品、機能性食品、特定用途食品、保健機能食品などに有用である。また、本発明の食用組成物には、家畜類（牛、豚、羊など）、ペット類（犬、猫などの哺乳類、鳥類、は虫類など）、魚類（鯛、ウナギなどの養殖魚；金魚などの観賞魚など）、実験動物（ラットなど）などの飼料も含まれる。
【００６２】
コラゲナーゼ阻害剤の割合は、食用組成物の種類や形態などに応じて広い範囲、例えば、０．００１〜９９重量％程度の範囲から選択できる。前記コラゲナーゼ阻害剤の割合は、基剤として用いる場合、食用組成物全体に対して、例えば１０〜９０重量％、好ましくは２０〜８０重量％程度であってもよい。添加剤として用いる場合、前記割合は０．００１〜４０重量％、好ましくは０．０１〜３０重量％程度であってもよい。また、有効成分として用いる場合、前記割合は、例えば０．００１〜９０重量％、好ましくは０．０１〜８０重量％程度であってもよい。
【００６３】
本発明のポリペプチド又はコラゲナーゼ阻害剤は、殺菌又は滅菌して用いることが好ましい。殺菌、滅菌方法としては、種々の殺菌・滅菌方法、例えば、湿熱蒸気滅菌、ガンマ線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、薬剤殺菌、紫外線殺菌などが用いられる。これらの方法のうち、ガンマ線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌は、滅菌効率と材料に与える影響が少なく好ましい。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明のポリペプチド又はコラゲナーゼ阻害剤は、病原体の感染や病原性因子の伝達を生じる危険性や好ましくない副作用の虞がなく、生体内で分解可能であるため、生体材料又は医用材料、製剤組成物、化粧料、食用組成物などに利用できる。
【実施例】
【００６５】
以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００６６】
実施例１
式：H-(Pro-Hyp-Gly)4-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-(Pro-Hyp-Gly)4-OH（配列番号：１）で示されるペプチド鎖を、ペプチド自動合成装置を用いて固相合成法により合成した。すなわち、４−(Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−グリシン)−オキシメチル−フェノキシ−メチル基を0.65mmol/g(樹脂)の割合で含むスチレン−ジビニルベンゼン共重合体〔スチレンとジビニルベンゼンとの構成モル比：９９対１〕からなる粒状樹脂〔米国アプライド・バイオシステムズ社製、ＨＭＰグリシン〕0.1mmolを用い、目的とするペプチドのカルボキシル末端からアミノ末端に向かって順次対応するアミノ酸を結合させた。結合反応において、アミノ酸として、米国アプライド・バイオシステムズ社製のＮα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｌ−プロリン〔Fmocプロリン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−グリシン〔Fmocグリシン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｎγ−トリチル−Ｌ−グルタミン〔Fmocグルタミン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｌ−イソロイシン〔Fmocイソロイシン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｌ−アラニン〔Fmocアラニン〕、バッケム社製のＮα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン〔Fmocヒドロキシプロリン〕を、各結合ステップについてそれぞれ1mmolずつ用いた。
【００６７】
得られたペプチド樹脂を、５％の水を含むトリフルオロ酢酸10mLで３時間処理した。得られた溶液をジエチルエーテルに加えて生じる沈殿をさらに数回ジエチルエーテルで洗浄して、ポリペプチドの脱保護と樹脂からの脱離を行った。粗生成物を、カラム（アマシャム・バイオサイエンス（株）製、ＰＤ１０カラム）で精製してポリペプチドを得た。得られたポリペプチドをカラムクロマトグラフィー〔アマシャム・バイオサイエンス（株）製、「AKTA explorer10XT」、カラム：ミリポア（株）製、「ノバパックＣ１８」、3.9mmφ×150mm、移動相：トリフルオロ酢酸を0.05容量％含有するアセトニトリルと水との混合溶媒(アセトニトリル濃度を３０分間で5容量％から50容量％に直線的に変化させた)、流速1.0mL/min〕に供したところ、リテンションタイム12.4minに単一のピ−クが示された。ＦＡＢ法マススペクトルにより求めたポリペプチドの分子量は2681.3であった(理論値：2679.9)。ペプチドユニット(1)とペプチドユニット(2)との割合（(1)/(2)）は8/1（88.9/11.1）（モル比）である。
【００６８】
得られたポリペプチドの円二色性スペクトルを測定したところ、224nmに正のコットン効果、198nmに負のコットン効果が観測され、３重らせん構造を形成していることが確認された。
【００６９】
実施例２
実施例１で得られたH-(Pro-Hyp-Gly)4-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-(Pro-Hyp-Gly)4-OHの2.5mg（0.0009mmol）を1mLのジメチルスルホキシドに懸濁し、室温で撹拌した。この混合液に、0.12mg（0.0009mmol）のジイソプロピルエチルアミン、0.12mg（0.0009mmol）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、0.34mg（0.0018mmol）の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩を添加して、さらに20℃で２日間撹拌を続けた。得られた反応溶液を水で３倍に希釈し、水に対して３日間透析して、縮合剤などの試薬と未反応モノマーを除去し、ポリペプチドを得た。ペプチドユニット(1)とペプチドユニット(2)との割合（(1)/(2)）は8/1（88.9/11.1）（モル比）である。
【００７０】
得られたポリペプチドをゲルパーミエーションクロマトグラフィー（アマシャム・バイオサイエンス（株）製、AKTApurifierシステム、カラム：Superose 6 HR GL、流速：0.5mL/min、溶離液：150mMのNaClを含む10mM phosphate buffer（pH 7.4））に供したところ、分子量が7万〜100万の範囲にポリペプチドのピークが認められた。分子量はアマシャム・バイオサイエンス（株）製のGel Filtration HMW Calibration Kitを標準物質として使用し、算出した。
【００７１】
得られたポリペプチドの円二色性スペクトルを測定したところ、223nmに正のコットン効果、198nmに負のコットン効果が観測され、３重らせん構造を形成していることが確認された。
【００７２】
実施例３
1.2mg（0.00045mmol）の式：H-(Pro-Hyp-Gly)10-OH（配列番号：２）で示されるペプチド((株)ペプチド研究所)と、1.2mg（0.00045mmol）の実施例１で得られた式：H-(Pro-Hyp-Gly)4-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-(Pro-Hyp-Gly)4-OH（配列番号：１）で示されるペプチドを0.25mLの10mMリン酸塩緩衝液（pH=7.4）に溶解し、0.12mg（0.0009mmol）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、15.7mg（0.082mmol）の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩を添加して、さらに20℃で２日間撹拌を続けた。得られた反応溶液を水で10倍に希釈し、水に対して３日間透析して、縮合剤などの試薬と未反応モノマーを除去し、ポリペプチドを得た。ペプチドユニット(1)とペプチドユニット(2)との割合（(1)/(2)）は、18/1（94.7/5.3）（モル比）である。
【００７３】
得られたポリペプチドをゲルパーミエーションクロマトグラフィー（アマシャム・バイオサイエンス（株）製、AKTApurifierシステム、カラム：Superose 6 HR GL、流速：0.5mL/min、溶離液：150mMのNaClを含む10mM phosphate buffer（pH 7.4））に供したところ、分子量が14万〜100万の範囲にポリペプチドのピークが認められた。分子量はアマシャム・バイオサイエンス（株）製のGel Filtration HMW Calibration Kitを標準物質として使用し、算出した。
【００７４】
得られたポリペプチドの円二色性スペクトルを測定したところ、224nmに正のコットン効果、196nmに負のコットン効果が観測され、３重らせん構造を形成していることが確認された。
【００７５】
実施例４
2.2mg（0.00081mmol）の式：H-(Pro-Hyp-Gly)10-OH（配列番号：２）で示されるペプチド((株)ペプチド研究所)と、0.24mg（0.00009mmol）の実施例１で得られた式：H-(Pro-Hyp-Gly)4-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-(Pro-Hyp-Gly)4-OH（配列番号：１）で示されるペプチドを0.25mLの10mMリン酸塩緩衝液（pH=7.4）に溶解し、0.12mg（0.0009mmol）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、15.7mg（0.082mmol）の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩を添加して、さらに20℃で２日間撹拌を続けた。得られた反応溶液を水で10倍に希釈し、水に対して３日間透析して、縮合剤などの試薬と未反応モノマーを除去し、本発明のポリペプチドを得た。ペプチドユニット(1)とペプチドユニット(2)との割合（(1)/(2)）は、98/1（≒99/1）（モル比）である。
【００７６】
得られたポリペプチドをゲルパーミエーションクロマトグラフィー（アマシャム・バイオサイエンス（株）製、AKTApurifierシステム、カラム：Superose 6 HR GL、流速：0.5mL/min、溶離液：150mMのNaClを含む10mM phosphate buffer（pH 7.4））に供したところ、分子量が14万〜40万の範囲にポリペプチドのピークが認められた。分子量はアマシャム・バイオサイエンス（株）製のGel Filtration HMW Calibration Kitを標準物質として使用し、算出した。
【００７７】
得られたポリペプチドの円二色性スペクトルを測定したところ、224nmに正のコットン効果、197nmに負のコットン効果が観測され、３重らせん構造を形成していることが確認された。
【００７８】
比較例１
式：H-(Pro-Hyp-Gly)10-OH（配列番号：２）で示されるペプチド（（株）ペプチド研究所）を比較例１とした。ペプチドユニット(1)とペプチドユニット(2)との割合（(1)/(2)）は、１／０（＝１００／０）（モル比）である。このポリペプチドの円二色性スペクトルを測定したところ、225nmに正のコットン効果、196nmに負のコットン効果が観測され、３重らせん構造を形成していることが確認された。
【００７９】
比較例２
2.4mg（0.0009mmol）の式：H-(Pro-Hyp-Gly)10-OH（配列番号：２）で示されるペプチド（（株）ペプチド研究所）を1mLのジメチルスルホキシドに懸濁し、室温で撹拌した。この混合液に、0.12mg（0.0009mmol）のジイソプロピルエチルアミン、0.12mg（0.0009mmol）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、0.34mg（0.0018mmol）の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩を添加して、さらに20℃で２日間撹拌を続けた。得られた反応溶液を水で３倍に希釈し、水に対して３日間透析して、縮合剤などの試薬と未反応モノマーを除去し、ポリペプチドを得た。ペプチドユニット(1)とペプチドユニット(2)との割合（(1)/(2)）は、100/0（モル比）である。
【００８０】
得られたポリペプチドをゲルパーミエーションクロマトグラフィー（アマシャム・バイオサイエンス（株）製、AKTApurifierシステム、カラム：Superose 6 HR GL、流速：0.5mL/min、溶離液：150mMのNaClを含む10mM phosphate buffer（pH 7.4））に供したところ、分子量が14万〜60万の範囲にポリペプチドのピークが認められた。分子量はアマシャム・バイオサイエンス（株）製のGel Filtration HMW Calibration Kitを標準物質として使用し、算出した。
【００８１】
得られたポリペプチドの円二色性スペクトルを測定したところ、224nmに正のコットン効果、196nmに負のコットン効果が観測され、３重らせん構造を形成していることが確認された。
【００８２】
実施例５
式：H-(Pro-Hyp-Gly)4-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-(Pro-Hyp-Gly)4-OH（配列番号：３）で示されるペプチド鎖を、ペプチド自動合成装置を用いて固相合成法により合成した。すなわち、４−(Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−グリシン)−オキシメチル−フェノキシ−メチル基を0.65mmol/g(樹脂)の割合で含むスチレン−ジビニルベンゼン共重合体〔スチレンとジビニルベンゼンとの構成モル比：９９対１〕からなる粒状樹脂〔米国アプライド・バイオシステムズ社製、ＨＭＰグリシン〕0.1mmolを用い、目的とするペプチドのカルボキシル末端からアミノ末端に向かって順次対応するアミノ酸を結合させた。結合反応において、アミノ酸として、米国アプライド・バイオシステムズ社製のＮα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｌ−プロリン〔Fmocプロリン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−グリシン〔Fmocグリシン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｌ−ロイシン〔Fmocロイシン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｌ−イソロイシン〔Fmocイソロイシン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｌ−アラニン〔Fmocアラニン〕、バッケム社製のＮα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン〔Fmocヒドロキシプロリン〕を、各結合ステップについてそれぞれ1mmolずつ用いた。
【００８３】
得られたペプチド樹脂を、５重量％の水を含むトリフルオロ酢酸10mLで３時間処理した。得られた溶液をジエチルエーテルに加えて生じる沈殿をさらに数回ジエチルエーテルで洗浄して、ポリペプチドの脱保護と樹脂からの脱離を行った。粗生成物を、カラム（アマシャム・バイオサイエンス（株）製、ＰＤ１０カラム）で精製してペプチドを得た。得られたポリペプチドをカラムクロマトグラフィー〔アマシャム・バイオサイエンス（株）製、「AKTA explorer10XT」、カラム：ミリポア（株）製、「ノバパックＣ１８」、3.9mmφ×150mm、移動相：トリフルオロ酢酸を0.05容量％含有するアセトニトリルと水との混合溶媒(アセトニトリル濃度を３０分間で5容量％から50容量％に直線的に変化させた)、流速1.0mL/min〕に供したところ、リテンションタイム15minに単一のピ−クが示された。ＦＡＢ法マススペクトルにより求めた精製ペプチドの分子量は2666.3であった(理論値：2664.9)。ペプチドユニット(1)とペプチドユニット(2)との割合（(1)/(2)）は8/1（88.9/11.1）（モル比）である。
【００８４】
得られたポリペプチドの円二色性スペクトルを測定したところ、225nmに正のコットン効果、199nmに負のコットン効果が観測され、３重らせん構造を形成していることが確認された。
【００８５】
実施例６
実施例５で得られたポリペプチドH-(Pro-Hyp-Gly)4-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-(Pro-Hyp-Gly)4-OHの1.2mg（0.00045mmol）を0.25mLの10mMリン酸塩緩衝液（pH=7.4）に溶解し、0.12mg（0.0009mmol）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、15.7mg（0.082mmol）の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩を添加して、さらに20℃で２日間撹拌を続けた。得られた反応溶液を水で10倍に希釈し、水に対して３日間透析して、縮合剤などの試薬と未反応モノマーを除去し、ポリペプチドを得た。ペプチドユニット(1)とペプチドユニット(2)との割合（(1)/(2)）は、8/1（88.9/11.1）（モル比）である。
【００８６】
得られたポリペプチドをゲルパーミエーションクロマトグラフィー（アマシャム・バイオサイエンス（株）製、AKTApurifierシステム、カラム：Superose 6 HR GL、流速：0.5mL/min、溶離液：150mMのNaClを含む10mM phosphate buffer（pH 7.4））に供したところ、分子量が8万〜100万の範囲にポリペプチドのピークが認められた。分子量はアマシャム・バイオサイエンス（株）製のGel Filtration HMW Calibration Kitを標準物質として使用し、算出した。
【００８７】
得られたポリペプチドの円二色性スペクトルを測定したところ、224nmに正のコットン効果、197nmに負のコットン効果が観測され、３重らせん構造を形成していることが確認された。
【００８８】
試験例１
実施例１〜６で得られたポリペプチド、および比較例１、２で得られたポリペプチドのそれぞれ0.025mgを、0.05mLの50mMのNaClと10mMのCaCl2を含む50mM Tris/HCl緩衝液（pH=7.5）に溶解した。さらに、同じ緩衝液0.05mLに溶解した200ngのコラゲナーゼ（MMP-1, human rheumatoid synovial fibroblast）と0.01mLの1mM Dnp-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-Arg-NH2（（株）ペプチド研究所）DMSO溶液を添加し、３７℃で１時間静置した。その後、アセトニトリル0.2mLを加えて、10,000rpmで10分間遠心処理した。得られた上清を、カラムクロマトグラフィー〔アマシャム・バイオサイエンス（株）製、「AKTA explorer10XT」、カラム：ミリポア（株）製、「ノバパックＣ１８」、3.9mmφ×150mm、移動相：トリフルオロ酢酸を0.05容量％含有するアセトニトリルと水との混合溶媒(アセトニトリル濃度を３０分間で5容量％から50容量％に直線的に変化させた)、流速1.0mL/min〕に供し、Dnp-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-Arg-NH2がコラゲナーゼによって分解されて生じるDnp-Pro-Leu-Glyのピーク面積を検出した。
【００８９】
なお、対照として、ポリペプチドを添加することなく、Dnp-Pro-Leu-Glyピーク面積を求めた。このピーク面積を「１００」とし、実施例及び比較例で得られたポリペプチドを添加して検出されたピーク面積を、対照に対する相対値として算出した。その結果、実施例１〜６のポリペプチドを添加すると、検出されるピーク面積の相対値は、それぞれ、５、３、１２、２２、４、２であり、コラゲナーゼの活性が阻害された。これに対して、比較例１、２のポリペプチドを添加すると、検出されるピーク面積の相対値は、それぞれ９６、９７であり、コラゲナーゼの活性阻害作用は認められなかった。
【配列表】
2005126360000001.app