【手続補正書】
【提出日】平成22年5月19日(2010.5.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物由来の、イソロイシンから４−ヒドロキシイソロイシンを生成する水酸化酵素存在下でイソロイシン又はその塩を水酸化反応に供し、４−ヒドロキシイソロイシンを生成させる工程を含むことを特徴とする、４−ヒドロキシイソロイシン又はその塩の製造方法。
【請求項２】
水酸化反応が、
(f) 配列番号２、８、１３、１７又は２１のアミノ酸配列を有するタンパク質、
(g)配列番号２、８、１３、１７又は２１のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、L-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質、及び、
(h)配列番号２、８、１３、１７又は２１のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％の相同性を示すアミノ酸配列を有し、L-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質からなる群から選ばれる少なくとも１種のL-イソロイシンジオキシゲナーゼの存在下で水性溶媒中で行われる、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
水酸化反応が、
(f) 配列番号２、８、１３、１７又は２１のアミノ酸配列を有するタンパク質、
(g)配列番号２、８、１３、１７又は２１のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、L-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質、及び、
(h)配列番号２、８、１３、１７又は２１のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％の相同性を示すアミノ酸配列を有し、L-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質からなる群から選ばれるL-イソロイシンジオキシゲナーゼを含む細菌の存在下で水性溶媒中で行なわれる、請求項１の製造方法。
【請求項４】
微生物がバチルス属に属する微生物である、請求項１記載の製造方法。
【請求項５】
バチルス属に属する微生物がBacillus thuringiensis、Bacillus licheniformis、及び、Bacillus sphaericusから選択される微生物である、請求項４記載の製造方法。
【請求項６】
水酸化反応が、微生物の対数増殖期細胞から調製された破砕液の存在下で行われる請求項１〜２及び４〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
L-イソロイシンを水酸化反応に供する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
水酸化酵素が、ジオキシゲナーゼである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項９】
水酸化酵素が以下の性質を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の製造方法。
（ａ）補因子として、酸素、Ｆｅ2+、アスコルビン酸、及び、２−オキソグルタル酸を要求する。
（ｂ）反応至適ｐＨがｐＨ５〜ｐＨ８。
（ｃ）反応至適温度が４５℃以下。
（ｄ）５０℃以上で失活する。
（ｅ）ＥＤＴＡやＣｕ2+、Ｚｎ2+により阻害される。
【請求項１０】
以下の性質を有し、バチルス属細菌から単離されうるジオキシゲナーゼ。
（ａ）補因子として、酸素、Ｆｅ2+、アスコルビン酸、及び、２−オキソグルタル酸を要求する。
（ｂ）反応至適ｐＨがｐＨ５〜ｐＨ８。
（ｃ）反応至適温度が４５℃以下。
（ｄ）５０℃以上で失活する。
（ｅ）ＥＤＴＡやＣｕ2+、Ｚｎ2+により阻害される。
（ｆ）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定される分子量が３１，０００±２０，０００のサブユニットからなる。
（ｇ）配列番号２に示すアミノ酸配列をＮ末端に有する。
【請求項１１】
バチルス属細菌が、Bacillus thuringiensisである、請求項１０記載のジオキシゲナーゼ。
【請求項１２】
(a) 配列番号１の塩基配列を含むDNA、
(b) 配列番号１の塩基配列に相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、L-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA、
(c) 配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA、
(d)配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、L-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA、及び、
(e)配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも９８％の相同性を示すアミノ酸配列を有し、L-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
からなる群から選ばれるDNA。
【請求項１３】
請求項１２に記載のDNAとベクターDNAとを連結することにより得られる組換えDNA。
【請求項１４】
請求項１３に記載の組換えDNAにより形質転換された細胞。
【請求項１５】
請求項１４に記載の細胞を培地に培養し、L-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質を、培地、細胞又はそれらの両方に蓄積させることを含む、L-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
【請求項１６】
(f) 配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質、
(g)配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、L-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質、及び、
(h)配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも９８％の相同性を示すアミノ酸配列を有し、L-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質
からなる群から選ばれるタンパク質。
【請求項１７】
下記の性質を有するタンパク質。
(A)L-イソロイシンの水酸化により(2S,3R,4S)-4-ヒドロキシ-L-イソロイシンを生成する反応を触媒する活性を有する。
(B)前記活性が二価カチオンFe2+に依存する。
(C)SDS-PAGEにより測定した分子量が約29±2.0 kDaである。
【請求項１８】
(f) 配列番号２、８、１３、１７又は２１のアミノ酸配列を有するタンパク質、
(g)配列番号２、８、１３、１７又は２１のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、L-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質、及び、
(h)配列番号２、８、１３、１７又は２１のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％の相同性を示すアミノ酸配列を有し、L-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質からなる群から選ばれる少なくとも１種のL-イソロイシンジオキシゲナーゼの存在下で水性溶媒中でL-イソロイシンを反応させ、生成した (2S,3R,4S)-4-ヒドロキシ-L-イソロイシンを単離することを含む(2S,3R,4S)-4-ヒドロキシ-L-イソロイシン又はその塩の製造方法。
【請求項１９】
(f) 配列番号２、８、１３、１７又は２１のアミノ酸配列を有するタンパク質、
(g)配列番号２、８、１３、１７又は２１のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、L-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質、及び、
(h)配列番号２、８、１３、１７又は２１のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％の相同性を示すアミノ酸配列を有し、L-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質からなる群から選ばれるL-イソロイシンジオキシゲナーゼを含む細菌の存在下で水性溶媒中でL-イソロイシンを反応させ、生成した (2S,3R,4S)-4-ヒドロキシ-L-イソロイシンを単離することを含む(2S,3R,4S)-4-ヒドロキシ-L-イソロイシン又はその塩の製造方法。
【請求項２０】
前記細菌がL-イソロイシンジオキシゲナーゼの活性が増強されるように改変されている請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
L-イソロイシンジオキシゲナーゼの活性が、前記L-イソロイシンジオキシゲナーゼをコードする遺伝子の発現の増大により増強されている請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
L-イソロイシンジオキシゲナーゼの活性が、前記L-イソロイシンジオキシゲナーゼをコードする遺伝子の発現調節配列の改変、又は、前記L-イソロイシンジオキシゲナーゼをコードする遺伝子のコピー数の増大により増強されている請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細菌が、Escherichia, Pseudomonas, Corynebacterium, Arthrobacter, Aspergillus又は Bacillus属に属する請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記細菌が、Escherichia coli, Arthrobacter simplex, Corynebacterium glutamicum, 
Arthrobactor globiformis, Arthrobactor sulfureus, Arthrobactor viscosus 又はBacillus subtilisに属する請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記細菌が、細菌培養物、細胞、細胞処理物又は細胞破砕液である請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の方法。