(57)【要約】  哺乳動物胎児肺組織に由来する細胞懸濁物の単離された集団を有効成分として含む医薬組成物が開示される。前記胎児肺組織は、妊娠の約２０週〜約２２週の範囲から選択される妊娠段階におけるヒトの肺器官／組織の発達段階に対応する発達段階にある。この医薬組成物を使用する方法もまた開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物胎児肺組織に由来する細胞懸濁物の単離された集団を有効成分として含む医薬組成物であって、前記胎児肺組織が、妊娠の約２０週〜約２２週の範囲から選択される妊娠段階におけるヒトの肺器官／組織の発達段階に対応する発達段階にある医薬組成物。
【請求項２】
前記妊娠段階は妊娠の２０週から２１週までである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記妊娠段階は妊娠の２１週から２２週までである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記哺乳動物胎児肺組織はヒト組織である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記細胞懸濁物の単離された集団は細胞の不均一な集団を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記細胞懸濁物の単離された集団は始原体細胞を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記始原体細胞が、上皮始原体細胞、間葉系始原体細胞および内皮始原体細胞からなる群から選択される、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記細胞はサイトケラチン５＋（ＣＫ５＋）のマーカー発現を含む、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記細胞はサイトケラチン５＋（ＣＫ５＋）およびサイトケラチン１４＋（ＣＫ１４＋）のマーカー発現を含む、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記細胞はｃ−Ｋｉｔ＋ＣＤ４５−ＣＤ３４−ＣＤ３１−ＣＤ３２６−ＣＤ２７１−のマーカー発現を含む、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記細胞はｃ−Ｋｉｔ＋ＣＤ３４＋ＣＤ３１＋のマーカー発現を含む、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記細胞はｃ−Ｋｉｔ＋ＣＤ３４＋ＣＤ３２６＋のマーカー発現を含む、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記細胞はＣＤ３４＋ＣＤ３１＋ＣＤ１４＋ＣＤ４５＋のマーカー発現を含む、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記細胞はＣＤ３４＋ＣＤ３１＋ＣＤ４５−ＣＤ１０５＋のマーカー発現を含む、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記細胞はネスチン＋および／またはカルシトニン遺伝子関連タンパク質＋（ＣＧＲＰ＋）のマーカー発現を含む、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記細胞はアルファ平滑筋アクチン＋（アルファ−ＳＭＡ＋）および／またはビメンチン＋のマーカー発現を含む、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記細胞は、構造的／機能的な肺組織を再生することができる、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記構造的／機能的な肺組織はキメラ肺の生成を含む、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記キメラ肺は、肺胞構造、気管支構造および／または細気管支構造、ならびに／あるいは、血管構造の形成を含む、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記構造的／機能的な肺組織は、界面活性剤を合成する能力、および／または、イオンを輸送する能力を含む、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記細胞は、上皮組織、間葉組織および／または内皮組織を再生することができる、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記細胞は、ＣＦＴＲを発現する上皮細胞である、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
上皮組織、間葉組織および／または内皮組織をその必要性のある対象において再生する方法であって、請求項１〜２２のいずれかに記載の治療効果的な量の医薬組成物を前記対象に投与し、それにより、前記上皮組織、間葉組織および／または内皮組織を再生することを含む方法。
【請求項２４】
前記上皮組織が、肺組織、胃腸管組織、生殖器官組織、尿路組織、腎臓組織、皮膚組織、心臓組織、虚血組織および脳組織からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記間葉組織が、リンパ組織、循環系組織および結合組織からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記内皮組織が、リンパ組織および循環系組織からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
上皮組織、間葉組織および／または内皮組織の再生が有益である疾患または状態をその必要性のある対象において処置する方法であって、請求項１〜２２のいずれかに記載の治療効果的な量の医薬組成物を前記対象に投与し、それにより、上皮組織、間葉組織および／または内皮組織の再生が有益である前記疾患または状態を処置することを含む方法。
【請求項２８】
肺の障害または傷害をその必要性のある対象において処置する方法であって、請求項１〜２２のいずれかに記載の治療効果的な量の医薬組成物を前記対象に投与し、それにより、前記肺の障害または傷害を処置することを含む方法。
【請求項２９】
前記対象を、前記投与することに先立って、亜致死的前処置プロトコル、致死的前処置プロトコルまたは超致死的前処置プロトコルのもとで前処置することをさらに含む、請求項２３〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記投与することが静脈内経路によって行われる、請求項２３〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記投与することが、気管内、気管支内、肺胞内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、皮下、髄内、クモ膜下腔内、心室内、心臓内、筋肉内、漿膜内、粘膜内、経粘膜、経鼻、直腸および腸管からなる群から選択される経路によって行われる、請求項２３〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記対象を、投与前、投与と同時、または、投与後において免疫抑制療法により処置することをさらに含む、請求項２３〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
上皮組織、間葉組織および／または内皮組織の再生が有益である疾患または状態をその必要性のある対象において処置することにおいて使用するための、請求項１〜２２のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項３４】
肺の障害または傷害をその必要性のある対象において処置することにおいて使用するための、請求項１〜２２のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項３５】
前記組成物は静脈内投与のために配合される、請求項３３または３４に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記組成物は、気管内、気管支内、肺胞内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、皮下、髄内、クモ膜下腔内、心室内、心臓内、筋肉内、漿膜内、粘膜内、経粘膜、経鼻、直腸および腸管からなる群から選択される経路による投与のために配合される、請求項３３または３４に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
亜致死的前処置プロトコル、致死的前処置プロトコルまたは超致死的前処置プロトコルをさらに含む、請求項３３または３４に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
前記亜致死的前処置プロトコル、致死的前処置プロトコルまたは超致死的前処置プロトコルが、全身照射（ＴＢＩ）、部分照射、骨髄破壊的前処置、共刺激遮断、化学療法剤および／または抗体免疫療法からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法または請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
前記前処置はナフタレン処置を含む、請求項２９に記載の方法または請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
前記前処置はさらに、全身照射（ＴＢＩ）を含む、請求項３９に記載の方法または医薬組成物。
【請求項４１】
前記前処置は、全身照射（ＴＢＩ）を含む、請求項２９に記載の方法または請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
前記ＴＢＩは、１Ｇｙ〜７．５Ｇｙの範囲に含まれる単回照射線量または分割照射線量を含む、請求項４０または４１に記載の方法または医薬組成物。
【請求項４３】
前記対象はヒト対象である、請求項２３〜２８のいずれかに記載の方法または請求項３３〜３４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項４４】
前記哺乳動物胎児肺組織はヒト組織である、請求項２３〜２８のいずれかに記載の方法または請求項３３〜３４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項４５】
前記細胞懸濁物の単離された集団は前記対象と非同系である、請求項２３〜２８のいずれかに記載の方法または請求項３３〜３４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項４６】
前記細胞懸濁物の単離された集団は前記対象と同種である、請求項４５に記載の方法または医薬組成物。
【請求項４７】
前記同種細胞が、前記対象とＨＬＡ同一、部分的ＨＬＡ同一およびＨＬＡ非同一からなる群から選択される、請求項４６に記載の方法または医薬組成物。
【請求項４８】
前記細胞懸濁物の単離された集団は前記対象と異種である、請求項４５に記載の方法または医薬組成物。
【請求項４９】
肺の前記障害または傷害が、嚢胞性線維症、気腫、石綿肺、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺線維症、特発性肺線維症、肺高血圧症、肺ガン、サルコイドーシス、急性肺傷害（成人呼吸窮迫症候群）、未熟児呼吸窮迫症候群、未熟児慢性肺疾患（気管支肺異形成症）、界面活性タンパク質Ｂ欠乏症、先天性横隔膜ヘルニア、肺胞タンパク症、肺形成不全および肺傷害からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法または請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項５０】
上皮組織、間葉組織および／または内皮組織の再生が有益である前記疾患または状態が、肺の障害、疾患または傷害、腎臓の障害、疾患または傷害、肝臓の障害、疾患または傷害、心臓の障害、疾患または傷害、胃腸管の障害、疾患または傷害、皮膚の障害、疾患または傷害、および、脳の障害、疾患または傷害からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法または請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項５１】
上皮組織の再生が有益である前記疾患または状態が、慢性潰瘍、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、アルツハイマー病、創傷治癒欠損、ガン、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺線維症、特発性肺線維症、肺高血圧症、肺ガン、サルコイドーシス、急性肺傷害（成人呼吸窮迫症候群）、未熟児呼吸窮迫症候群、未熟児慢性肺疾患（気管支肺異形成症）、界面活性タンパク質Ｂ欠乏症、先天性横隔膜ヘルニア、肺胞タンパク症、肺形成不全、肺傷害および角膜変性からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法または請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項５２】
間葉組織の再生が有益である前記疾患または状態が、心臓の疾患または状態、糖尿病、難聴、クローン病、自己免疫障害、白血病、ガン、鎌状赤血球病、筋萎縮性側索硬化症および代謝障害からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法または請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項５３】
内皮組織の再生が有益である前記疾患または状態が、血管疾患、虚血、鎌状赤血球病、心臓血管疾患、アテローム性動脈硬化、糖尿病および自己免疫障害からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法または請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項５４】
哺乳動物胎児肺組織から単離される複数の細胞集団を含む細胞バンクであって、前記胎児肺組織が、妊娠の約２０週〜約２２週の範囲から選択される妊娠段階におけるヒトの肺器官／組織の発達段階に本質的に対応する発達段階にあり、かつ、前記複数の細胞集団が、同種細胞バンクを形成するためにＨＬＡ型分類されており、ただし、それぞれが個々に別個の容器に配置される細胞バンク。
【請求項５５】
前記複数の細胞集団のＨＬＡ型分類された細胞に関する情報を含むカタログをさらに含む、請求項５４に記載の細胞バンク。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はそのいくつかの実施形態において、哺乳動物の胚性肺細胞に関連し、より具体的には、しかし、限定ではなく、治療的用途のための該細胞の使用に関連する。
【背景技術】
【０００２】
呼吸器疾患は死亡および疾病の主要な原因の１つであり、発生率、有病率、罹患率、死亡率および費用において二番目に多いとして世界保健機関によって位置づけられている。ほとんどの現在利用可能な治療法は肺疾患患者の生活の質をほんのわずかに改善するだけであり、様々な肺病理における進行の主要な結果であるガス交換表面の喪失を防止していない。したがって、現時点では、末期肺疾患のための唯一の最終的処置が損傷器官の置換であり、しかし、多くの患者が、移植用器官の深刻な不足のために、待機リストに載りながら死亡している。
【０００３】
以前の研究では、種々の器官のヒト胚性前駆体およびブタ胚性前駆体を移植するための「最適な窓」が定義された。移植のためのこれらの「最適な窓」が下記の３つのパラメーターによって定義された：奇形腫に対する危険性がないこと、成長している組織の機能的性質、同様にまた、低い免疫原性。例えば、種々のブタ胚性前駆体組織をＳＣＩＤマウスに埋め込むことにより、組織が移植のための好適な性質を呈示する明確な時間‘窓’が明らかにされ、この場合、腎臓および肝臓はブタの在胎期間の２８日において最適な性質を呈示し、一方、肺の‘窓’は、はるかに後期において、すなわち、ブタの在胎期間の５６日において生じることが示された［Ｅｖｅｎｔｏｖ−Ｆｒｉｅｄｍａｎ  Ｓ．他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、（２００５）１０２（８）：２９２８］。ブタの膵臓前駆体組織を使用する研究では、４２日におけるその最適性が示唆され、そのような時期において、この組織は、ストレプトゾトシン誘導の高血糖症を免疫抑制マウスにおいて、また、より近年には非ヒト霊長類において治す際立った能力を明らかにした。そのうえ、最近の研究では、特定の妊娠時点で採取されたブタ胚性脾臓組織の移植は血友病をＦＶＩＩＩ欠損マウスにおいて治すことができることが示されている。
【０００４】
この１０年間、幹細胞に基づく治療法の潜在的な根治的役割が広範囲に調べられている。最近の知見では、間葉系幹細胞、内皮始原体または循環線維細胞および様々な他の集団を含めて、成体組織（例えば、骨髄など）に由来するか、あるいは、臍帯血、羊水または胎盤に由来する初期の始原体が、構造的に生着し、気道および肺胞の上皮細胞として、あるいは、血管内皮細胞または間質肺細胞として分化し得ること、また、傷害を受けた肺または病的な肺の修復および再生において利用され得ることが示唆される［Ｂａｂｅｒ  ＳＲ他、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｈｅａｒｔ  ａｎｄ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、（２００７）２９２（２）：Ｈ１１２０；Ｗｅｉｓｓ  ＤＪ、Ｐｕｌｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ、（２００８）２１（４）：５８８〜９４；Ｗｅｉｓｓ  ＤＪ他、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｔｈｏｒａｃｉｃ  ｓｏｃｉｅｔｙ：Ａｍ  Ｔｈｏｒａｃｉｃ  Ｓｏｃ；（２００８）  ｐ．６３７；Ｓｕｅｂｌｉｎｖｏｎｇ  ＶおよびＷｅｉｓｓ  ＤＪ、Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、（２０１０）１５６（３）１８８〜２０５］。しかしながら、著しい上皮分化転換がないこと、４０を超える異なる細胞タイプから構成される肺の極めて複雑な構造、および、異なる実験モデルでの肺における移植細胞の低い生着率が、大きな課題となっている。
【０００５】
さらなる背景技術には、下記のものが含まれる：
ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００６／０３８２１１は、膵臓、リンパ系／造血系または肺の器官機能および／または組織機能を哺乳動物対象に提供する方法に関連する。この方法は、発達途中にある哺乳動物の膵臓、リンパ系／造血系または肺の器官／組織移植片を対象にそれぞれ移植することを含む。ＷＯ２００６／０３８２１１に開示される肺移植片は、妊娠の約４２日から約８０日までの範囲から選択される妊娠段階におけるブタの肺器官／組織の発達段階に本質的に対応する発達段階にある。
【０００６】
ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００４／０７８０２２は、病理学的な器官または組織の生理学または形態学が伴う障害を処置する方法に関連する。この方法は、免疫応答の刺激または強化を対象においてもたらすことができる少なくとも１つの分子を実質的に発現しないか、または提示しない選択された哺乳動物の器官移植片または組織移植片（例えば、腎臓、膵臓、肝臓、心臓またはリンパ系の器官移植片または組織移植片）を対象に移植することによって達成される。
【発明の概要】
【０００７】
本発明のいくつかの実施形態の１つの態様によれば、哺乳動物胎児肺組織に由来する細胞懸濁物の単離された集団を有効成分として含む医薬組成物であって、前記胎児肺組織が、妊娠の約２０週〜約２２週の範囲から選択される妊娠段階におけるヒトの肺器官／組織の発達段階に対応する発達段階にある医薬組成物が提供される。
【０００８】
本発明のいくつかの実施形態の１つの態様によれば、上皮組織、間葉組織および／または内皮組織をその必要性のある対象において再生する方法であって、本発明のいくつかの実施形態の治療効果的な量の医薬組成物を前記対象に投与し、それにより、前記上皮組織、間葉組織および／または内皮組織を再生することを含む方法が提供される。
【０００９】
本発明のいくつかの実施形態の１つの態様によれば、上皮組織、間葉組織および／または内皮組織の再生が有益である疾患または状態をその必要性のある対象において処置する方法であって、本発明のいくつかの実施形態の治療効果的な量の医薬組成物を前記対象に投与し、それにより、上皮組織、間葉組織および／または内皮組織の再生が有益である前記疾患または状態を処置することを含む方法が提供される。
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態の１つの態様によれば、肺の障害または傷害をその必要性のある対象において処置する方法であって、本発明のいくつかの実施形態の治療効果的な量の医薬組成物を前記対象に投与し、それにより、肺の前記障害または傷害を処置することを含む方法が提供される。
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態の１つの態様によれば、上皮組織、間葉組織および／または内皮組織の再生が有益である疾患または状態をその必要性のある対象において処置することにおいて使用するための、本発明のいくつかの実施形態の医薬組成物が提供される。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態の１つの態様によれば、肺の障害または傷害をその必要性のある対象において処置することにおいて使用するための、本発明のいくつかの実施形態の医薬組成物が提供される。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態の１つの態様によれば、哺乳動物胎児肺組織から単離される複数の細胞集団を含む細胞バンクであって、前記胎児肺組織が、妊娠の約２０週〜約２２週の範囲から選択される妊娠段階におけるヒトの肺器官／組織の発達段階に本質的に対応する発達段階にあり、かつ、前記複数の細胞集団が、同種細胞バンクを形成するためにＨＬＡ型分類されており、ただし、それぞれが個々に別個の容器に配置される細胞バンクが提供される。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記妊娠段階は妊娠の２０週から２１週までである。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記妊娠段階は妊娠の２１週から２２週までである。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記哺乳動物胎児肺組織はヒト組織である。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞懸濁物の上記単離された集団は細胞の不均一な集団を含む。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞懸濁物の上記単離された集団は始原体細胞を含む。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記始原体細胞が、上皮始原体細胞、間葉系始原体細胞および内皮始原体細胞からなる群から選択される。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細胞はサイトケラチン５＋（ＣＫ５＋）のマーカー発現を含む。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細胞はサイトケラチン５＋（ＣＫ５＋）およびサイトケラチン１４＋（ＣＫ１４＋）のマーカー発現を含む。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細胞はｃ−Ｋｉｔ＋ＣＤ４５−ＣＤ３４−ＣＤ３１−ＣＤ３２６−ＣＤ２７１−のマーカー発現を含む。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細胞はｃ−Ｋｉｔ＋ＣＤ３４＋ＣＤ３１＋のマーカー発現を含む。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細胞はｃ−Ｋｉｔ＋ＣＤ３４＋ＣＤ３２６＋のマーカー発現を含む。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細胞はＣＤ３４＋ＣＤ３１＋ＣＤ１４＋ＣＤ４５＋のマーカー発現を含む。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細胞はＣＤ３４＋ＣＤ３１＋ＣＤ４５−ＣＤ１０５＋のマーカー発現を含む。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細胞はネスチン＋および／またはカルシトニン遺伝子関連タンパク質＋（ＣＧＲＰ＋）のマーカー発現を含む。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細胞はアルファ平滑筋アクチン＋（アルファ−ＳＭＡ＋）および／またはビメンチン＋のマーカー発現を含む。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細胞は、構造的／機能的な肺組織を再生することができる。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記構造的／機能的な肺組織はキメラ肺の生成を含む。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記キメラ肺は、肺胞構造、気管支構造および／または細気管支構造、ならびに／あるいは、血管構造の形成を含む。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記構造的／機能的な肺組織は、界面活性剤を合成する能力、および／または、イオンを輸送する能力を含む。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細胞は、上皮組織、間葉組織および／または内皮組織を再生することができる。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細胞は、ＣＦＴＲを発現する上皮細胞である。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記上皮組織が、肺組織、胃腸管組織、生殖器官組織、尿路組織、腎臓組織、皮膚組織、心臓組織、虚血組織および脳組織からなる群から選択される。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記間葉組織が、リンパ組織、循環系組織および結合組織からなる群から選択される。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記内皮組織が、リンパ組織および循環系組織からなる群から選択される。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、上記対象を、上記投与することに先立って、亜致死的前処置プロトコル、致死的前処置プロトコルまたは超致死的前処置プロトコルのもとで前処置することを含む。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記投与することが静脈内経路によって行われる。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記投与することが、気管内、気管支内、肺胞内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、皮下、髄内、クモ膜下腔内、心室内、心臓内、筋肉内、漿膜内、粘膜内、経粘膜、経鼻、直腸および腸管からなる群から選択される経路によって行われる。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、上記対象を、移植前、移植と同時、または、移植後において免疫抑制療法により処置することを含む。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記組成物は静脈内投与のために配合される。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記組成物は、気管内、気管支内、肺胞内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、皮下、髄内、クモ膜下腔内、心室内、心臓内、筋肉内、漿膜内、粘膜内、経粘膜、経鼻、直腸および腸管からなる群から選択される経路による投与のために配合される。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記医薬組成物はさらに、亜致死的前処置プロトコル、致死的前処置プロトコルまたは超致死的前処置プロトコルを含む。
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記亜致死的前処置プロトコル、致死的前処置プロトコルまたは超致死的前処置プロトコルが、全身照射（ＴＢＩ）、部分照射、骨髄破壊的前処置、共刺激遮断、化学療法剤および／または抗体免疫療法からなる群から選択される。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記前処置はナフタレン処置を含む。
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記前処置はさらに、全身照射（ＴＢＩ）を含む。
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記前処置は、全身照射（ＴＢＩ）を含む。
【００４９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＴＢＩは、１Ｇｙ〜７．５Ｇｙの範囲に含まれる単回照射線量または分割照射線量を含む。
【００５０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記対象はヒト対象である。
【００５１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記哺乳動物胎児肺組織はヒト組織である。
【００５２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞懸濁物の上記単離された集団は上記対象と非同系である。
【００５３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞懸濁物の上記単離された集団は上記対象と同種である。
【００５４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記同種細胞が、上記対象とＨＬＡ同一、部分的ＨＬＡ同一およびＨＬＡ非同一からなる群から選択される。
【００５５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞懸濁物の上記単離された集団は上記対象と異種である。
【００５６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、肺の上記障害または傷害が、嚢胞性線維症、気腫、石綿肺、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺線維症、特発性肺線維症、肺高血圧症、肺ガン、サルコイドーシス、急性肺傷害（成人呼吸窮迫症候群）、未熟児呼吸窮迫症候群、未熟児慢性肺疾患（気管支肺異形成症）、界面活性タンパク質Ｂ欠乏症、先天性横隔膜ヘルニア、肺胞タンパク症、肺形成不全および肺傷害からなる群から選択される。
【００５７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上皮組織、間葉組織および／または内皮組織の再生が有益である上記疾患または状態が、肺の障害、疾患または傷害、腎臓の障害、疾患または傷害、肝臓の障害、疾患または傷害、心臓の障害、疾患または傷害、胃腸管の障害、疾患または傷害、皮膚の障害、疾患または傷害、および、脳の障害、疾患または傷害からなる群から選択される。
【００５８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上皮組織の再生が有益である上記疾患または状態が、慢性潰瘍、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、アルツハイマー病、創傷治癒欠損、ガン、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺線維症、特発性肺線維症、肺高血圧症、肺ガン、サルコイドーシス、急性肺傷害（成人呼吸窮迫症候群）、未熟児呼吸窮迫症候群、未熟児慢性肺疾患（気管支肺異形成症）、界面活性タンパク質Ｂ欠乏症、先天性横隔膜ヘルニア、肺胞タンパク症、肺形成不全、肺傷害および角膜変性からなる群から選択される。
【００５９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、間葉組織の再生が有益である上記疾患または状態が、心臓の疾患または状態、糖尿病、難聴、クローン病、自己免疫障害、白血病、ガン、鎌状赤血球病、筋萎縮性側索硬化症および代謝障害からなる群から選択される。
【００６０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、内皮組織の再生が有益である上記疾患または状態が、血管疾患、虚血、鎌状赤血球病、心臓血管疾患、アテローム性動脈硬化、糖尿病および自己免疫障害からなる群から選択される。
【００６１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細胞バンクはさらに、上記複数の細胞集団のＨＬＡ型分類された細胞に関する情報を含むカタログを含む。
【００６２】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および／または科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
本明細書では本発明のいくつかの実施形態を単に例示し添付の図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の実施形態を例示考察することだけを目的としていることを強調するものである。この点について、図面について行う説明によって、本発明の実施形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【００６４】
【図１Ａ−１Ｉ】図１Ａ〜図１Ｉは、種々の妊娠時点で採取されたヒトの胚性前駆体組織の成長および発達を示す。ヒト胚性組織をＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの腎被膜の下に埋め込んだ。移植組織を８週間後に肉眼または免疫組織学的染色によって評価した。図１Ａは、種々の妊娠時点の移植組織に由来する移植組織の肉眼的サイズのまとめである：移植後６週〜８週の移植組織の長軸（Ｌ）および短軸（Ｗ）ならびに高さ（Ｈ）に基づく平均（±ＳＤ）サイズ（示されるデータは６つの独立した実験の平均である）；図１Ｂは、妊娠の２０週で採取された移植組織の典型的な肉眼的外観を例示する写真である；図１Ｃ〜図１Ｆは、２０週の組織に由来する移植組織の顕微鏡法でのヘマトキシリン・エオシン染色（Ｈ＆Ｅ）試験の写真であって、肺胞管、肺胞、線毛上皮により覆われる気管、筋層および軟骨、ならびに、肺胞／上皮単層の正常な外観を示す写真である；図１Ｇ〜図１Ｈは、赤色での界面活性タンパク質Ｃ（ｓｐ−Ｃ）および緑色でのサイトケラチン−１８（ＣＫ−１８）についての免疫染色を低倍率（図１Ｇ）および高倍率（図１Ｈ）において例示する写真である；図１Ｉは、赤色でのＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜貫通調節因子）および緑色でのＣＫ−１８についての免疫染色を例示する写真である。
【図１Ｊ−１Ｒ】図１Ｊ〜図１Ｒは、種々の妊娠時点で採取されたヒトの胚性前駆体組織の成長および発達を示す。ヒト胚性組織をＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの腎被膜の下に埋め込んだ。移植組織を８週間後に肉眼または免疫組織学的染色によって評価した。図１Ｊ〜図１Ｒは、１５週の組織に由来する移植組織の典型的なＨ＆Ｅ染色（図１Ｊ〜図１Ｌ）、１８週の組織に由来する移植組織の典型的なＨ＆Ｅ染色（図１Ｐ〜図１Ｒ）、および、２４週の組織に由来する移植組織の典型的なＨ＆Ｅ染色（図１Ｍ〜図１Ｏ）をそれぞれ例示する写真である。矢印は嚢胞を示している。（図１Ｍ）において、嚢胞の肉眼的画像が例示される。
【００６５】
【図２Ａ−２Ｊ】図２Ａ〜図２Ｊは、ヒト胚性肺における初期始原体およびそれらのニッチの特定を示す。図２Ａ〜図２Ｄは、種々の妊娠時点におけるヒト胚性肺組織のＨ＆Ｅ染色を例示する写真であって、肺胞構造を何ら伴わない気管支構造および細気管支構造を明らかにする写真である；図２Ｅ〜図２Ｆは、太い気道におけるＣＫ５＋細胞の高発現、ならびに、太い気管支におけるＣＫ５およびＣＫ１４の共発現を示す免疫組織化学的染色を例示する写真である。矢印および矢じりは、高いＣＫ５発現および低いＣＫ５発現を有する領域をそれぞれ示している。気管支構造および発達中の肺胞構造におけるＣＫ５＋細胞には、ネスチン＋およびＣＧＲＰ＋の細胞との接触（図２Ｇ）によって、同様にまた、神経フィラメント（ＮＦ）についての染色（図２Ｈ）によって例示される、豊富な神経支配が伴う。図２Ｉは、アルファ−平滑筋アクチン陽性細胞を例示する写真である；図２Ｊは、ＣＫ５＋始原体の非常に近いところに存在するビメンチン＋間葉細胞を例示する写真である。
【図２Ｋ−２Ｏ】図２Ｋ〜図２Ｏは、ヒト胚性肺における初期始原体およびそれらのニッチの特定を示す。図２Ｋ〜図２Ｎは、ＣＫ５発現レベルにおける差異を明らかにする、ヒト妊娠の１５週（図２Ｋ）、１７週（図２Ｌ）、２０週（図２Ｍ）および２２週（図２Ｎ）を含む種々の時点におけるＣＫ５（赤色）についての染色を例示する写真である；図２Ｏは、有意に（ｔ検定）より大きいレベルを２０週〜２２週において示す、ＣＫ５＋始原体によって占められる組織領域の定量的形態計測分析を例示するグラフである（１個の菱形は、非有意であるｐ値を表し、２個の菱形はｐ＜０．００２を表す）。
【００６６】
【図２Ｐ−２Ｚ】図２Ｐ〜図２Ｚは、種々の妊娠時点で採取されたヒト胚性肺組織における初期の非造血始原体のＦＡＣＳ分析を示す。図２Ｐ〜図２Ｑは、抗ＣＤ４５および抗ＣＤ３４による二重染色を示す、２０週の肺細胞の代表的なＦＡＣＳ分析を例示する。ＣＤ４５−ＣＤ３４ｈｉｇｈ細胞、ＣＤ４５−ＣＤ３４ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ細胞およびＣＤ４５−ＣＤ３４ｎｅｇ細胞を含む、非造血ＣＤ４５−細胞に含まれる３つの亜集団が示される；図２Ｒ〜図２Ｔは、それぞれの亜集団のレベルを明らかにする、抗ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）および抗ＣＤ２７１（間葉分化マーカー）による二重染色を例示する；図２Ｕ〜図２Ｚは、種々のヒト胚性肺組織におけるＣＤ４５−ＣＤ３４ｎｅｇ集団内の単陽性ＣＤ１１７＋細胞の百分率を例示する。
【００６７】
【図３Ａ−３Ｃ】図３Ａ〜図３Ｃは、２１週で採取された肺組織の移植前における、ＣＫ５、ＵＬＥＸレクチンおよびＣＤ１１７による三重染色を示す。太い血管によって取り囲まれる、太い気道におけるＣＫ５の高発現を示す中枢気道（図３Ａ）および主気管支（図３Ｂ）。まれなＣＤ１１７＋細胞が血管周囲空間に存在する。より小さい気道の領域（図３Ｃ）において、ＣＫ５のより低い発現が、より小さい血管と密着して認められ、一方、数多くのＣＤ１１７＋細胞がこれらの血管の内部に存在する（ピンク色；ＵＬＥＸレクチンおよびＣＤ１１７について二重陽性）。
【００６８】
【図４Ａ−４Ｋ】図４Ａ〜図４Ｋは、２１週で採取された肺組織の移植前における、Ｅ−カドヘリン、ＣＤ３４およびＣＤ１１７による三重染色を示す。図４Ａは、ＣＤ３４についての単染色を例示する；図４Ｂは、ＣＤ１１７についての単染色を例示する；図４Ｃは、Ｅ−カドヘリン染色との併合を例示する。太い気管支および発達中の肺胞構造を含む２つの隣接領域のパノラマ画像が示される。発達中の肺胞構造の領域におけるＣＤ３４＋細胞の大部分がＣＤ１１７を共発現し（図４Ｄ〜図４Ｇ）、一方、太い気道領域では、まれな単陽性ＣＤ１１７＋細胞が血管の非常に近いところに見られる場合がある（図４Ｈ〜図４Ｋ）。
【００６９】
【図５Ａ−５Ｄ】図５Ａ〜図５Ｄは、異なる発現強度を有するＣＫ５陽性領域（赤色、図５Ａ）の存在を例示する、２０週のヒト肺における３つの隣接視野のパノラマ像を示す写真であり、この場合、ＣＫ５陽性領域が、血管（青色、図５Ｂ）およびアルファ−ＳＭＡ陽性細胞（緑色、図５Ｃ）によってともに太い気管支および発達中の肺胞において取り囲まれており（青色、図５Ｂ）、このＣＫ５陽性領域は、明確なニッチを示唆している（３つすべての区画の重ね合わせが図５Ｄに示される）。バー＝５０μｍ。
【００７０】
【図６Ａ−６Ｌ】図６Ａ〜図６Ｌは、２つの異なる成人肺サンプルの多染性ＦＡＣＳ分析を示す。成人肺組織の多染性ＦＡＣＳ分析をヒト胚性肺組織と並行して行った。単一細胞懸濁物をコラゲナーゼおよびディスパーゼによる組織の酵素的解離の後で染色し、ＣＤ３４（造血系始原体および内皮始原体に対して特異的）、ＣＤ４５（造血細胞）、ＣＤ３１（内皮細胞のためのマーカー）、ＣＤ１１７（ｃ−ＫＩＴ、初期始原体を特定するために）、ＣＤ２７１（ＮＧＦＲ−間葉系幹細胞マーカー）およびＣＤ３２６（ＥＰＣＡＭ−上皮分化マーカー）に特異的な抗体または同等なイソタイプコントロールによって染色した。両方のサンプルにおいて、ＣＤ３４＋集団およびＣＤ３４−集団が特定された（図６Ａ、図６Ｄ、図６Ｇおよび図６Ｊ）。顕著な違いが成体肺組織と胚性肺組織との間で認められた。はるかにより低いレベルのＣＤ３４＋細胞が成体肺において特定された。ｃ−ｋｉｔ＋集団の存在について試験したとき、非常に小さいＣＤ３４＋ＣＤ１１７＋集団およびＣＤ３４−ＣＤ１１７＋集団が特定された（図６Ｂ、図６Ｅ、図６Ｈおよび図６Ｋ）；ＣＤ３４＋ＣＤ１１７＋細胞の大部分がＣＤ３１マーカーについて陽性であり、ほんの小さい割合がＣＤ３１マーカーについて陰性であり（図６Ｃ、図６Ｆ、図６Ｉおよび図６Ｌ）、ＣＤ３４−ＣＤ１１７＋集団の大部分がＣＤ３１およびＣＤ３２６について陰性であったことが見出された（図６Ｆおよび図６Ｌ）。
【００７１】
【図７Ａ−７Ｉ】図７Ａ〜図７Ｉは、ＣＤ４５−ＣＤ３４＋亜集団およびＣＤ４５−ＣＤ３４−亜集団を明らかにする、２０週ＨＥＬのＦＡＣＳ分析を示す（図７Ａ）。ＣＤ３４陽性細胞の亜集団（図７Ｂ）およびＣＤ３４陰性細胞の亜集団（図７Ｃ）の中におけるＣＤ１１７＋染色。ＣＤ３４＋ＣＤ１１７＋亜集団の大部分がＣＤ３１マーカーまたはＣＤ３２６マーカーについて陽性である（図７Ｄ、図７Ｆ〜図７Ｇ）。ＣＤ３４−ＣＤ１１７＋細胞の大部分がＣＤ３１マーカーおよびＣＤ３２６マーカーについて陰性である（図７Ｅ、図７Ｈ〜図７Ｉ）。図７Ｆ〜図７Ｉにおいて、代表的なヒストグラムが明らかにされており、この場合、赤色線はＣＤ３１マーカーおよびＣＤ３２６マーカーのイソタイプコントロールを示し、青色線はＣＤ３４＋ＣＤ３１＋亜集団を示し、緑色線はＣＤ３４＋ＣＤ３２６＋亜集団を示す（図７Ｆ〜図７Ｇ）；図７Ｈ〜図７Ｉにおいて、青色線はＣＤ３４−ＣＤ３１＋亜集団を示し、緑色線はＣＤ３４−ＣＤ３２６＋亜集団を示す。これらの知見により、免疫組織化学によって明らかにされるように、２つの異なるＣＤ１１７＋集団の存在が確認される。
【００７２】
【図８Ａ−８Ｄ】図８Ａ〜図８Ｄは、二重のＣＤ１１７発現パターンを示す、ｕｌｉｘ−血管マーカー（青色）、ＣＫ５（緑色）およびＣＤ１１７（赤色）についての１５週ＨＥＬの免疫組織化学的染色（図８Ａ〜図８Ｂ）および１７週ＨＥＬの免疫組織化学的染色（図８Ｃ〜図８Ｄ）を示す。いくつかの単一ＣＤ１１７＋細胞が、太い気道および血管の非常に近いところに見出され、一方で、それらのほとんどが、発達中の肺胞構造の周りの血管の内部に局在化している。
【００７３】
【図９Ａ−９Ｄ】図９Ａ〜図９Ｄは、初期および後期の内皮始原体（ＥＰＣ）の存在についての２０週ヒト肺の分析を示す。この図では、２つの小さい明確なＣＤ３４＋ＣＤ３１＋亜集団の存在が特定される（図９Ｂ）。第１の亜集団が、ＣＤ１４およびＣＤ４５についての陽性染色によって特定され（図９Ｃ）、これに対して、第２の亜集団がＣＤ４５−ＣＤ１０５＋である（図９Ｄ）。
【００７４】
【図１０Ａ−１０Ｆ】図１０Ａ〜図１０Ｅは、同系マウスの腎被膜の下への埋め込みの前後における胚性組織の特徴づけを示す。図１０Ａ〜図１０Ｃは、Ｅ１６マウス胚性移植組織（ｎ＝５）の後で達成される際立った成長および分化（図１０Ｃ〜図１０Ｅ）と比較して、ＳＣＩＤマウス（ｎ＝７）の腎被膜の下における移植後１２週でのＥ１４肺組織（図１０Ａ）およびＥ１７肺組織（図１０Ｂ）の不良な成長を明らかにする、典型的なＨ＆Ｅ染色を例示する写真である；図１０Ｄ〜図１０Ｅは、Ｅ１６マウス胎児肺の移植組織における太い気道（大きい矢印）および肺胞構造（小さい矢印）ならびにサイトケラチン染色を明らかにするＨ＆Ｅ染色を例示する写真である。図１０Ｆは、マウスおよびヒトの肺発達における相応段階の概略図を示す。移植のための「最適な窓」が発達の小管段階においてである。
【００７５】
【図１１Ａ−１１Ｉ】図１１Ａ〜図１１Ｉは、移植前のＥ１６マウス胚性肺における肺始原体の特徴づけを示す。図１１Ａは、肺胞構造の未成熟な構造および非存在を明らかにするＥ１６胚性肺のＨ＆Ｅ染色を例示する写真である；図１１Ｂは、ヒト胚性肺に類似するＥ１６マウス組織におけるＣＫ−５陽性細胞（青色）がより大きい発現を太い気道において有することを例示する写真である。ＣＧＲＰ（赤色）およびチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ、緑色）によって陽性染色される数多くの神経上皮体がサンプル全体に見出され、ニッチにおいて局在化している；図１１Ｃは、ＣＣＳＰ陽性細胞が太い気道の領域において見出され、この領域もまた、ネスチン陽性細胞に富み、かつ、アルファ−ＳＭＡ陽性細胞によって取り囲まれ（図１１Ｄ、白矢印）、幹細胞ニッチを示唆することを例示する写真である；図１１Ｅ〜図１１Ｉは、コラゲナーゼおよびディスパーゼによる処置の後におけるＥ１３肺由来単一細胞懸濁物、Ｅ１４肺由来単一細胞懸濁物、Ｅ１５肺由来単一細胞懸濁物およびＥ１６肺由来単一細胞懸濁物のＣＤ４５−ＣＤ３１−ＣＤ３２６＋  ＣＤ２４＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ１０４＋細胞の代表的な多染性ＦＡＣＳ分析である（それぞれ、ｎ＝１０、１０、１２および１０；値は、２つの異なる実験から得られる平均±ＳＤを表す）。Ｅ１５〜Ｅ１６の肺におけるこの細胞集団の有意により大きい存在量が明らかにされる（ｐ＜０．００７）。
【図１１Ｊ−１１Ｙ】図１１Ｊ〜図１１Ｙは、移植前のＥ１６マウス胚性肺における肺始原体の特徴づけを示す。図１１Ｊ〜図１１Ｘは、コラゲナーゼおよびディスパーゼによる処置の後におけるＥ１３肺由来単一細胞懸濁物、Ｅ１４肺由来単一細胞懸濁物、Ｅ１５肺由来単一細胞懸濁物およびＥ１６肺由来単一細胞懸濁物のＣＤ４５−ＣＤ３１−ＣＤ３２６＋  ＣＤ２４＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ１０４＋細胞の代表的な多染性ＦＡＣＳ分析である（それぞれ、ｎ＝１０、１０、１２および１０；値は、２つの異なる実験から得られる平均±ＳＤを表す）。Ｅ１５〜Ｅ１６の肺におけるこの細胞集団の有意により大きい存在量が明らかにされる（ｐ＜０．００７）；図１１Ｙは、スチューデントｔ検定によって計算される統計学的有意性を示す、ＣＤ４５−ＣＤ３１−ＣＤ３２６＋  ＣＤ２４＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ１０４＋細胞レベルのまとめである（１個の菱形はｐ＜０．０３７を表し、２個の菱形はｐ＜０．００７を表し、細胞ゲート処理方策が下記の実施例の節において記載される）。
【００７６】
【図１２Ａ−１２Ｆ】図１２Ａ〜図１２Ｆは、成体Ｃ５７Ｂ１の肺の免疫組織化学的染色を示す写真であり、ネスチンおよびＣＧＲＰの存在を、胚性マウス肺における幹細胞ニッチでのそれらの発現と類似して明らかにする（図１２Ａ〜図１２Ｂ）（図１２Ａ−低倍率−バー＝５０μｍ、図１２Ｂ−高倍率−バー＝２０μｍ）。（図１２Ａ）における四角は、（図１２Ｂ）に示される拡大図の位置を示している；図１２Ｃ〜図１２Ｆは、アルファ−ＳＭＡ（緑色、図１２Ｃ）、ＣＧＲＰ（赤色、図１２Ｄ）およびＥ−カドヘリン（青色、アルファ−ＳＭＡおよびＣＧＲＰとの重ね合わせ、図１２Ｅ）についての、成体Ｃ５７Ｂ１の肺の三重染色を例示する写真である（バー＝５０μｍ）；図１２Ｆは、図１２Ｅにおいて印がつけられる四角部の拡大領域を例示する（バー＝２０μｍ）。
【００７７】
【図１３Ａ−１３Ｄ】図１３Ａ〜図１３Ｄは、種々の前処置療法の後における生着ＧＦＰ＋細胞の増殖巣の異なる数を明らかにする低倍率下でのキメラ肺の蛍光顕微鏡法を示す。図１３Ａ〜図１３Ｃは、６ＧｙのＴＢＩにより処置された動物のキメラ肺の代表的画像の写真（図１３Ａ）、ＮＡのみにより処置された動物のキメラ肺の代表的画像の写真（図１３Ｂ）、および、ＮＡ＋６ＧｙのＴＢＩにより処置された動物のキメラ肺の代表的画像の写真（図１３Ｃ）である；図１３Ｄは、種々の前処置療法の後における、ｍｍ３あたりの生着細胞のＧＦＰ＋部分の定量的形態計測分析である（ｎ＝１０、各群において）。３つの独立した実験の結果が示される。
【００７８】
【図１４Ａ−１４Ｌ】図１４Ａ〜図１４Ｌは、Ｅ１６細胞の注入の前後におけるＣＣＳＰ＋細胞の染色を示す写真である。図１４Ａは、処置されていないコントロールマウスの太い気道の管腔を例示する；図１４Ｂは、ＣＣＳＰ＋細胞の剥離を示す、ナフタレンおよび６ＧｙのＴＢＩによる前処置の１日後における実験動物の肺を例示する；図１４Ｃは、ナフタレンおよび６ＧｙのＴＢＩにより前処置された動物の肺をＥ１６細胞注入後３０日において例示しており、Ｖ−Ｅカドヘリンについての染色によって示されるように、血管形成される気管支管腔における生着したＧＦＰ＋細胞（緑色）を伴う上皮層の際立った再生を示す；図１４Ｄ〜図１４Ｌは、移植された細胞（図１４Ｄ〜図１４Ｆ）が上皮層に合体し、ＣＣＳＰ＋細胞（赤色）を再生し、界面活性剤を産生することができ（図１４Ｇ〜図１４Ｉ）、かつ、ＣＦＴＲについての染色によって示されるように、イオン輸送能を呈示すること（図１４Ｊ〜図１４Ｌ）を例示する。
【００７９】
【図１５Ａ−１５Ｃ】図１５Ａ〜図１５Ｃは、キメラ現象のレベルを埋め込まれた肺において明らかにする２光子顕微鏡法を示す写真である。移植を受けたマウスの代表的な２光子顕微鏡法肺画像であって、移植後６週での肺画像（図１５Ａ〜図１５Ｂ）および移植後１６週での肺画像（図１５Ｃ）、ただし、非標的化量子ドットによる血管の共染色を伴わない場合（図１５Ａ）、および、非標的化量子ドットによる血管の共染色（赤色）を伴う場合（図１５Ｂ）。
【００８０】
【図１６Ａ−１６Ｌ】図１６Ａ〜図１６Ｌは、移植後１６週でのキメラ肺の免疫組織化学的特徴づけを示す写真である。図１６Ａ〜図１６Ｄは、移植肺の血管区画および上皮区画におけるＧＦＰ＋細胞の取り込みを、瘢痕化または線維症を伴うことなく明らかにする、抗ＧＦＰ抗体（緑色）、抗ＣＤ３１抗体（赤色）および抗汎サイトケラチン抗体（青色）により染色されるキメラ肺の代表的画像である；図１６Ｅ〜図１６Ｈは、移植された組織がＩ型肺胞細胞（ａｌｖｅｏｃｙｔｅ）のガス交換表面に取り込まれることを示す、抗ＧＦＰ抗体（緑色）および抗ＡＱＰ−５抗体（赤色）により染色されるキメラ肺の代表的画像である；図１６Ｉ〜図１６Ｌは、界面活性剤合成における移植された細胞のＩＩ型肺胞細胞関与を明らかにする、抗ＧＦＰ抗体（緑色）、抗ＣＤ３１抗体（赤色）および抗ｓｐ−Ｃ抗体（青色）により染色されるキメラ肺の画像である。
【００８１】
【図１７Ａ−１７Ｅ】図１７Ａ〜図１７Ｅは、コントロールの、移植を受けていないＣ５７Ｂ１の肺の外観を示す写真であって、２光子顕微鏡法によって分析される場合の写真（バー＝９０μｍ）（コントロール肺、図１７Ａ）、または、抗ＧＦＰ抗体（緑色）、抗サイトケラチン抗体（青色）および抗ＣＤ３１抗体によるキメラ肺の三重染色によって分析される場合の写真であり、これらから、肺の上皮区画および血管区画の両方におけるキメラ現象、ならびに、瘢痕化または線維症を伴わない、構造体における完全な取り込みが低倍率において明らかにされる（バー＝２００μｍ）（図１７Ｂ〜図１７Ｅ）。緑色蛍光チャネルにおいて、ＧＦＰ＋のキメラ増殖巣が点線によって示される（図１７Ｂ）。赤色チャネルおよび青色チャネルにおいて、同じキメラ領域がまた点線によって示され、これらのキメラ領域により、レシピエント組織からドナー組織への円滑な移行が血管区画（図１７Ｃ）および上皮区画（図１７Ｄ）の両方において明らかにされ、これらの層のすべての重ね合わせが（図１７Ｅ）に示される。
【００８２】
【図１８Ａ−１８Ｉ】図１８Ａ〜図１８Ｉは、ヒト由来肺細胞のマウス肺への生着および取り込みを移植後の種々の時点において示す写真である。図１８Ａ〜図１８Ｃは、マウスＭＨＣについての染色（赤色）およびＭＮＦ−１１６について陽性であるヒト組織（緑色）を低倍率で示す、移植後６週でのマウス肺におけるキメラ現象を例示する；図１８Ｄ〜図１８Ｆは、マウスＭＨＣについての染色（赤色）およびＭＮＦ−１１６について陽性であるヒト組織（緑色）を高倍率で示す、移植後６週でのマウス肺におけるキメラ現象を例示する；図１８Ｇ〜図１８Ｉは、（図１８Ｄ〜図１８Ｆ）の場合のように染色されるさらなる領域を例示する。
【００８３】
【図１９Ａ−１９Ｆ】図１９Ａ〜図１９Ｆは、移植を受けたマウスの肺の気管支における典型的なキメラ現象を移植後７週において示す写真である。図１９Ａおよび図１９Ｄは、Ｄａｙｌｉｇｈｔ４８８（緑色）により標識される抗ＭＮＦ（上皮マーカー）、抗ヒトビメンチン９（間質細胞に典型的）およびマウス抗ヒトＣＤ３１（内皮細胞マーカー）を含むマウス抗ヒト抗体のカクテルにより選択的に染色された、ヒト胚性細胞に起源を有するヒト細胞を例示する；図１９Ｂおよび図１９Ｅは、Ａｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ５４６（赤色）により標識されるＢａｎｄｅｒｉａレクチンにより染色された、マウス肺におけるマウス起源の細胞を例示する。後者は、マウスの上皮細胞および内皮細胞に発現されるａ−Ｇａｌに結合することが知られている。上段パネルはキメラ領域を低倍率のもとで示し（図１９Ｃ）、下段パネルは同じ領域を高倍率のもとで示す（図１９Ｆ）。
【００８４】
【図２０Ａ−２０Ｆ】図２０Ａ〜図２０Ｆは、移植を受けたマウスの肺の肺胞における典型的なキメラ現象を移植後７週において示す写真である。図２０Ａおよび図２０Ｄは、Ｄａｙｌｉｇｈｔ４８８（緑色）により標識される抗ＭＮＦ（上皮マーカー）、抗ヒトビメンチン９（間質細胞に典型的）およびマウス抗ヒトＣＤ３１（内皮細胞マーカー）を含むマウス抗ヒト抗体のカクテルにより選択的に染色された、ヒト胚性細胞に起源を有するヒト細胞を例示する。図２０Ｂおよび図２０Ｅは、Ａｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ５４６（赤色）により標識されるＢａｎｄｅｒｉａレクチンにより染色された、マウス肺におけるマウス起源の細胞を例示する。後者は、マウスの上皮細胞および内皮細胞に発現されるａ−Ｇａｌに結合するが、それらのヒト対応体において発現するａ−Ｇａｌには結合しないことが知られている。上段パネルはキメラ領域を低倍率のもとで示す（図２０Ｃ）；下段パネルは同じ領域を高倍率のもとで示す（図２０Ｆ）。
【００８５】
【図２１Ａ−２１Ｃ】図２１Ａ〜図２１Ｃは、ヒト細胞が肺実質に取り込まれることを示す写真である。図２１Ａは、上記で記載されるような、抗ＭＮＦ１１７、抗Ｖ９、抗ＣＤ３１を含む抗ヒト抗体の混合物により（緑色に）染色されたヒト細胞を例示し、また、マウスおよびヒトの両方のサイトケラチンを染色するウサギ抗サイトケラチン抗体により（赤色に）染色されたヒト細胞を例示する（図２１Ｂ）。両方の色を併合することにより、肺実質内のヒト細胞が明らかにされる（図２１Ｃ）。
【００８６】
【図２２Ａ−２２Ｃ】図２２Ａ〜図２２Ｃは、ヒト細胞が肺のガス交換表面に取り込まれることを示す写真である。ヒト細胞が、上記で記載されるような、抗ＭＮＦ１１７、抗Ｖ９、抗ＣＤ３１を含む抗ヒト抗体の混合物により（緑色に）染色され（図２２Ａ）、また、マウスおよびヒトの両方のＡＱＰ−５を染色するヤギ抗ＡＱＰ−５により（赤色に）染色された（図２２Ｂ）。両方の色を併合することにより、肺のガス交換表面の内部におけるヒト細胞が明らかにされる（図２２Ｃ）。
【００８７】
【図２３Ａ−２３Ｆ】図２３Ａ〜図２３Ｆは、キメラマウスの肺胞の内部における生着したヒト肺細胞が界面活性剤の産生に関与することを示す写真である。ヒト細胞が、上記で記載されるような、抗ＭＮＦ１１７、抗Ｖ９、抗ＣＤ３１を含む抗ヒト抗体の混合物により（緑色に）染色され（図２３Ａおよび図２３Ｄ）、また、マウスおよびヒトの両方の界面活性タンパク質Ｃを染色するウサギ抗ＳＰＣ抗体により（赤色に）染色された（図２３Ｂ）。両方の色を併合することにより、移植されたヒト組織が界面活性剤の産生において関与することが明らかにされる（図２３Ｃ）。下段パネル（図２３Ｄ〜図２３Ｆ）は、（図２３Ｃ）に示される四角領域の高倍率での染色を示す。
【００８８】
【図２４Ａ−２４Ｈ】図２４Ａ〜図２４Ｈは、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの肺における、ＣＭＴＭＲにより染色される２０週ヒト肺由来の単一細胞懸濁物の生着を示す写真（バー＝５００μｍ）（図２４Ａ）；同系移植モデルにおける移植されたマウス胚性肺細胞に起源を有する肺細胞を示すＧＦＰ＋部分を示す写真（バー＝１ｍｍ）（図２４Ｂ）である；図２４Ｃ〜図２４Ｅは、ＭＮＦ１１６に対して陽性であり、かつ、マウスＭＨＣに対して陰性であるヒト胚性肺組織の、マウス抗ヒトサイトケラチンＭＮＦ１１６抗体によるコントロール染色（緑色、図２４Ｃ）およびラット抗マウスＭＨＣによるコントロール染色（赤色、図２４Ｄ）を例示する（２つの重ね合わせが図２４Ｅに示される）；図２４Ｆ〜図２４Ｈは、ＭＮＦ１１６についての陰性染色およびマウスＭＨＣについての陽性染色を明らかにする、抗ヒトＭＦＮ１１６抗体および抗マウスＭＨＣ抗体によるマウス肺細胞のコントロール染色を例示する（バー＝５０μｍ）。
【００８９】
【図２５Ａ−２５Ｄ】図２５Ａ〜図２５Ｄは、奇形腫の証拠を何ら示さないＥ１６マウス胚性肺組織が埋め込まれたマウスの長期追跡調査を示す写真である。図２５Ａは、滑らかな辺縁部および腫瘍の非存在を示す、移植後１年での移植肺の肉眼的外観を例示する；図２５Ｂ〜図２５Ｃは、低倍率（図２５Ｂ）および高倍率（図２５Ｃ）のもとでの移植肺の正常な形態学を移植後１年において示すＨ＆Ｅ染色を例示する；図２５Ｄは、実験肺の正常な放射線学的外観を示す典型的な移植動物のインビボ肺ＣＴ画像の冠状面画像を例示する。
【発明を実施するための形態】
【００９０】
本発明はそのいくつかの実施形態において、哺乳動物の胚性肺細胞に関連し、より具体的には、しかし、限定ではなく、治療的用途のための該細胞の使用に関連する。
【００９１】
本発明の原理および操作は、図面および付随する説明を参照してより良く理解されることができる。
【００９２】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示される細部、または、実施例によって例示される細部に必ずしも限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、あるいは、様々な方法で実施、または、実行される。また、本明細書中において用いられる表現法および用語法は説明のためであって、限定として見なされるべきでないことを理解しなければならない。
【００９３】
以前の研究では、腎臓、肝臓、膵臓、肺および心臓を含めて、種々の器官のヒト胚性組織およびブタ胚性組織を移植するための「窓」が明確化されている。したがって、例えば、肺の‘窓’が、ブタの在胎期間の４２日〜８０日において生じることが示された［ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００６／０３８２１１；Ｅｖｅｎｔｏｖ−Ｆｒｉｅｄｍａｎ  Ｓ．他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、（２００５）１０２（８）：２９２８］。さらなる研究により、間葉系幹細胞、内皮始原体または循環線維細胞および様々な他の集団を含めて、成体組織（例えば、骨髄など）に由来する初期の始原体、あるいは、臍帯血、羊水または胎盤に由来する初期の始原体が、構造的に生着し、かつ、気道および肺胞の上皮細胞として、あるいは、血管内皮細胞または間質肺細胞として分化し得ること、また、傷害を受けた肺または病的な肺の修復および再生において利用され得ることが示唆される。
【００９４】
本発明を実施に移している間に、本発明者らは、傷害を受けた肺／病的な肺の修復のために使用することができる多数の肺始原体細胞を含む、ヒトの在胎期間の２０週〜２２週の‘窓’から得られる胚性肺組織の特異な細胞集団を特定している。驚くべきことに、そのような細胞集団の懸濁物は組織構造を維持していないが、上皮肺組織、間葉肺組織および内皮肺組織を再生するために使用することができる。
【００９５】
本明細書中下記において、また、下記の実施例の節において示されるように、本発明者らは、単離された細胞集団懸濁物、すなわち、ヒト妊娠の２０週〜２２週における単離された細胞集団懸濁物（下記の実施例の節における実施例１を参照のこと）が、投与されたとき、肺組織を再生し、かつ、肺の機能性を再開させるために使用され得ることを初めて例示している。
【００９６】
したがって、本発明者らは、ヒト妊娠の２０週〜２２週の単離された細胞集団、および、マウス胚性肺組織の類似する小管‘窓’（これは妊娠の１５日〜１６日において定義される）（下記の実施例の節において実施例１を参照のこと）が、より初期またはより後期の妊娠時点で採取される組織と比較して、最高レベルの推定される肺前駆体（上皮始原体細胞、内皮始原体細胞および間葉始原体細胞を含む）を呈示したことを示している（下記の実施例の節における実施例１を参照のこと）。さらに、この妊娠窓の組織から得られる単一細胞懸濁物の投与（例えば、静脈内投与）により、注目に値する肺修復が達成された。具体的には、肺前駆体細胞がマウスの傷害を受けた肺において集まり、分化し、一体化し、これにより、新しい上皮細胞および新しい脈管構造の形成を含む完全な呼吸性単位の形成をもたらした（下記の実施例の節において実施例２を参照のこと）。さらに、このプロセスが、レシピエントマウスのさらなる前処置を、亜致死的な全身照射（ＴＢＩ）の有無にかかわらず、ナフタレン処置を使用して行ったとき、著しく強化され、このことにより、実質的かつ永続的なキメラ現象が、傷害を受けた肺の種々の細胞系譜において引き起こされた（下記の実施例の節において実施例２を参照のこと）。まとめると、これらの結果は、肺の疾患および傷害を含む様々な上皮状態、間葉状態および内皮状態を処置するための、２０週〜２２週の妊娠において採取されるヒト胚性肺前駆体組織の単一細胞懸濁物の使用を実証するものである。
【００９７】
したがって、本発明の１つの態様によれば、哺乳動物胎児肺組織に由来する細胞懸濁物の単離された集団を有効成分として含む医薬組成物であって、前記胎児肺組織が、妊娠の約２０週〜約２２週の範囲から選択される妊娠段階におけるヒトの肺器官／組織の発達段階に対応する発達段階にある医薬組成物が提供される。
【００９８】
表現「細胞懸濁物の単離された集団」は、本明細書中で使用される場合、生存能を維持しながら、それらの天然の環境（例えば、ヒト身体）から単離され、組織から取り出されているが、組織構造を維持しておらず（すなわち、血管形成した組織構造を何ら有しておらず）、かつ、固体担体に結合していない細胞を示す。
【００９９】
適用に依存して、本発明の方法は、（対象に関して）同系または非同系の細胞を含む細胞懸濁物の単離された集団を使用して行われる場合がある。
【０１００】
本明細書中で使用される場合、用語「同系（の）」細胞は、当該対象または当該対象の本質的に全てのリンパ球と本質的に遺伝子的に同一である細胞を示す。同系の細胞の例には、当該対象に由来する細胞（これらは「自己」としてこの技術分野では示される）、当該対象のクローンに由来する細胞、あるいは、当該対象の一卵性双胎子に由来する細胞が含まれる。
【０１０１】
本明細書中で使用される場合、用語「非同系（の）」細胞は、同種細胞または異種細胞のような、当該対象または当該対象の本質的に全てのリンパ球と本質的に遺伝子的に同一でない細胞を示す。
【０１０２】
本明細書中で使用される場合、用語「同種（の）」は、当該対象と同じ種であるが、当該対象とは実質的に非クローンであるドナーの肺組織に由来する細胞を示す。典型的には、同じ種の非近交系の非接合体（ｎｏｎ−ｚｙｇｏｔｉｃ）双胎哺乳動物は互いに同種である。同種細胞は対象に関してＨＬＡ同一、部分的にＨＬＡ同一、またはＨＬＡ非同一（すなわち、一つ以上の異なるＨＬＡ決定基を示す）であってもよいことが理解される。
【０１０３】
本明細書中で使用される場合、用語「異種（の）」は、当該対象のリンパ球の実質的割合の種に対して異なる種の抗原を実質的に発現する細胞を示す。典型的には、異なる種の非近交系哺乳動物は互いに異種である。
【０１０４】
本発明では、異種の細胞が以下にさらに詳細に記載されるように、様々な種に由来することが想定される。
【０１０５】
異種起源（例えば、ブタ起源）の細胞または組織が好ましくは、人畜共通感染症（例えば、ブタの内因性レトロウイルスなど）を有しないことが知られている供給源から得られる。同様に、ヒト由来の細胞または組織が好ましくは、実質的に病原体非含有の供給源から得られる。
【０１０６】
本発明の１つの実施形態によれば、対象はヒトであり、単離された細胞集団はヒト起源（例えば、ヒト胎児）に由来する。
【０１０７】
適用および利用可能な供給源に依存して、本発明の細胞は未処置である場合があり、または、遺伝子改変される場合がある。そのような決定は十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１０８】
非同系の細胞は、対象に投与されたときには免疫反応を誘導する可能性があるので、いくつかの取り組みが、非同系細胞を拒絶する可能性を軽減するために開発されている。これらには、レシピエントの免疫系を抑制すること、または、非自己細胞を移植前に、免疫隔離する半透過性膜でカプセル化することのどちらかが含まれる。代替において、異種表面抗原を発現しない細胞が使用される場合がある（例えば、トランスジェニック動物（例えば、ブタ）において開発された細胞など）。
【０１０９】
表現「肺組織」は、本明細書中で使用される場合、肺の組織または器官を示す。本発明の肺組織は、完全な器官または組織あるいは部分的な器官または組織である場合がある。したがって、本発明の肺組織は、右肺、左肺または両方を含む場合がある。本発明の肺組織は、（右肺または左肺のどちらにも由来する）１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの肺葉を含む場合がある。そのうえ、本発明の肺組織は、１つまたは複数の肺区域または肺小葉を含む場合がある。さらに、本発明の肺組織は、任意の数の気管支および細気管支（例えば、気管支樹）ならびに任意の数の肺胞または肺胞嚢を含む場合がある。
【０１１０】
本発明の１つの実施形態によれば、肺組織は、妊娠の約２０日〜約２１日の妊娠段階、妊娠の約２０．５日〜約２１．５日の妊娠段階、妊娠の約２０日〜約２２日の妊娠段階、妊娠の約２０．５日〜約２２．５日の妊娠段階、妊娠の約２１日〜約２２日の妊娠段階、妊娠の約２１．５日〜約２２．５日の妊娠段階におけるヒトの肺器官／組織の発達段階に対応する発達段階にある。
【０１１１】
本発明の具体的な実施形態によれば、肺組織は、妊娠の約２０日〜約２２日の妊娠段階におけるヒトの肺器官／組織の発達段階に対応する発達段階にある。
【０１１２】
本発明の別の具体的な実施形態によれば、肺組織は、妊娠の約２１日〜約２２日の妊娠段階におけるヒトの肺器官／組織の発達段階に対応する発達段階にある。
【０１１３】
本発明の別の具体的な実施形態によれば、肺組織は、妊娠の約２０日〜約２１日の妊娠段階におけるヒトの肺器官／組織の発達段階に対応する発達段階にある。
【０１１４】
述べられたように、本発明の肺組織は哺乳動物生物から得られる。
【０１１５】
したがって、本発明の肺組織は、どのような哺乳動物にも由来する場合がある。肺組織のための好適な生物種起源は、分化の段階と妊娠段階との相関に関して広範囲に特徴づけされている主要な飼育動物または家畜動物および霊長類を含む。このような動物は、例えば、ブタ類（例えば、ブタ）、ウシ属の動物（例えば、ウシ）、ウマ科の動物（例えば、ウマ）、ヒツジ類（例えば、ヤギ、ヒツジ）、ネコ属の動物（例えば、イエネコ（Ｆｅｌｉｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ））、イヌ科の動物（例えば、イヌ（Ｃａｎｉｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ））、齧歯類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、アレチネズミ、ハムスター）、および霊長類（例えば、チンパンジー、アカゲザル、マカクザル、マーモセット）などが挙げられる。
【０１１６】
１つの具体的な実施形態によれば、肺組織はヒトに由来する。
【０１１７】
１つの具体的な実施形態によれば、肺組織は非ヒト生物に由来する。
【０１１８】
様々な方法が、現時点で教示されるように、あるヒト由来肺組織の発達段階に本質的に対応する発達段階にある肺組織を得るために用いられるかもしれない。そのような肺組織を得ることが、肺組織を、例えば、外科的手順により、そのような妊娠段階（すなわち、ヒトの２０週〜２２週の妊娠に対応する妊娠段階）にある発達中の胎児から採取することによって達成される場合がある。生物の妊娠段階は、当該生物を生じさせる卵母細胞の受精後の経過した期間であることが、当業者によって理解されるであろう。
【０１１９】
代替において、所望される発達段階にある肺組織が、細胞、器官／組織のインビトロ培養によって得られる場合がある。細胞、組織または器官のそのような制御されたインビトロ分化が、例えば、所望される系譜の細胞／組織／器官を含有する培養物を生じさせるための胚性幹細胞株の培養を使用して常法的に行われる。例えば、肺系譜の生成については、例えば、Ｏｔｔｏ  ＷＲ．、１９９７、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｐａｔｈｏｌ、７８：２９１〜３１０を参照のこと。
【０１２０】
下記の表は、対応する段階に本質的にある肺組織を提供することができるヒト肺組織およびブタ肺組織の妊娠段階の一例を提供する：
【０１２１】
【表１】
2015500279.tif 000002
ブタ肺組織の発達段階に本質的に対応する発達段階にある、所与生物種に属する肺組織の（日数での）妊娠段階を、下記の式に従って計算することができる：［日数でのブタ肺組織の妊娠段階］／［日数でのブタの妊娠期間］×［日数での所与生物種の肺組織の妊娠段階］。同様に、ヒト肺組織の発達段階に本質的に対応する発達段階にある、所与生物種に属する肺組織の（日数での）妊娠段階を、下記の式に従って計算することができる：［日数でのヒト肺組織の妊娠段階］／［日数でのヒトの妊娠期間］×［日数での所与生物種の肺組織の妊娠段階］。ブタの妊娠期間は約１１５日であり、ヒトの妊娠期間は約２８０日である。
＊週計算のために、数字を７によって除算する。
【０１２２】
胎児肺組織が得られた後、本発明はさらに、単離された細胞集団を該胎児肺組織から作製することを意図する。
【０１２３】
本明細書中で使用される場合、「単一細胞懸濁物」は、単一細胞、または、最大でも５個、１０個、５０個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、１０００個、１５００個、２０００個の細胞が凝集物に存在する細胞凝集物を含む胎児肺の単一細胞懸濁物を示す。
【０１２４】
本発明の単一細胞懸濁物は、どのような機械的手段または化学的（例えば、酵素的）手段によってでも得られる場合がある。いくつかの方法が、単一細胞懸濁物を初代組織から形成するために細胞クラスターを解離させるために、また、培養における付着細胞、および、凝集物を解離させるために存在する：例えば、物理的力（機械的解離、例えば、細胞スクレーパー、狭い内腔ピペットに通す研和、細いニードルでの吸引、ボルテックス離解、および、細かいナイロンメッシュまたはステンレススチールメッシュに通す強制ろ過など）、酵素（酵素的解離、例えば、トリプシン、コラゲナーゼおよびＡｃｕｔａｓｅなど）、または、両者の組合せ。
【０１２５】
したがって、例えば、単離した細胞への胎児肺組織の酵素的消化を、組織を酵素（例えば、ＩＶ型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＮＪ、米国）および／またはディスパーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、米国）など）に供することによって行うことができる。例えば、肺組織が、組織をかみそり刃により細かく切り刻むことによって、例えば、コラゲナーゼ、ディスパーゼおよびＣａＣｌ２の存在下、３７℃で約１時間、酵素消化される場合がある。この方法はさらに、本質的には下記の実施例の節の「一般的な材料および実験方法」のもとで記載されるように、非特異的な破片を、例えば、フィルター（例えば、７０μｍおよび４０μｍのフィルター）での逐次ろ過によって、得られた細胞懸濁物から除くことを含む場合がある。
【０１２６】
さらに、単離した細胞への胎児肺組織の機械的解離を、組織を所定のサイズに破砕するために設計されるデバイスを使用して行うことができる。そのようなデバイスを、ＣｅｌｌＡｒｔｉｓ  Ｇｏｔｅｂｏｒｇ（スウェーデン）から得ることができる。加えて、または、代替において、機械的解離を、組織／細胞を倒立顕微鏡で見ながら、ニードル（例えば、２７ｇのニードル（ＢＤ  Ｍｉｃｒｏｌａｎｃｅ（Ｄｒｏｇｈｅｄａ、アイルランド）など）を使用して手作業で行うことができる。
【０１２７】
胎児肺組織の酵素的解離または機械的解離の後、解離させられた胎児肺細胞はさらに、２００μｌのＧｉｌｓｏｎピペット先端を使用して、（例えば、細胞を上方および下方にピペッティングすることによって）小さい凝集塊にまで破砕される。
【０１２８】
本発明によれば、ヒト胎児肺細胞の単一細胞懸濁物は生細胞を含む。細胞生存性が、どのような方法であれ、この技術分野で知られている方法を使用して、例えば、細胞生存性アッセイ（例えば、ＭｕｌｔｉＴｏｘ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ａｓｓａｙ、これはＰｒｏｍｅｇａから入手可能である）、フローサイトメトリー、トリパンブルーなどを使用してモニターされる場合がある。
【０１２９】
典型的には、胎児肺細胞の単離された集団は移植のために直ちに使用される。しかしながら、細胞が、移植に先立って、懸濁状態で、例えば、１時間〜１２時間にわたって維持されることになる状況では、細胞が、それらの生存能を支援することができる培養培地において培養される場合がある。このような培養培地は、水に基づく培地であることができ、それは、塩、栄養素、ミネラル、ビタミン、アミノ酸、核酸、タンパク質、例えば、サイトカイン、増殖因子およびホルモンなどの物質の組み合わせを含み、それらのすべては、胎児肺組織の単離された集団を生存状態で維持するために必要とされる。例えば、本発明のこの態様に従う培養培地は、合成組織培養培地、例えば、必要な添加物が補充された、Ｋｏ−ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製品（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ））、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｂｉｅｔ  Ｈａｅｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌ））、Ｍａｂ  ＡＤＣＢ培地（ＨｙＣｌｏｎｅ（Ｕｔａｈ，ＵＳＡ））またはＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｂｉｅｔ  Ｈａｅｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌ）でありうる。好ましくは、本発明の培養培地に含まれる全ての成分は、実質的に純粋であり、組織培養グレードを持つ。
【０１３０】
胎児肺組織から単離された集団は細胞の不均一な集団を含む。
【０１３１】
本発明の一つの実施形態によれば、細胞懸濁物の上記単離された集団は始原体細胞を含む。上記始原体細胞は、例えば、上皮始原体細胞、間葉系始原体細胞、造血始原体細胞および／または内皮始原体細胞を含むことができる。
【０１３２】
本発明の一つの実施形態によれば、上記細胞はサイトケラチン５＋（ＣＫ５＋）のマーカー発現を含む。
【０１３３】
本発明の一つの実施形態によれば、上記細胞はサイトケラチン５＋（ＣＫ５＋）およびサイトケラチン１４＋（ＣＫ１４＋）のマーカー発現を含む。
【０１３４】
本発明の一つの実施形態によれば、上記細胞はｃ−Ｋｉｔ＋ＣＤ４５−ＣＤ３４−のマーカー発現を含む。
【０１３５】
本発明の一つの実施形態によれば、上記細胞はｃ−Ｋｉｔ＋ＣＤ４５−ＣＤ３４−ＣＤ３１−ＣＤ３２６−ＣＤ２７１−のマーカー発現を含む。
【０１３６】
本発明の一つの実施形態によれば、上記細胞はｃ−Ｋｉｔ＋ＣＤ３４＋のマーカー発現を含む。
【０１３７】
本発明の一つの実施形態によれば、上記細胞はｃ−Ｋｉｔ＋ＣＤ３４＋ＣＤ３１＋のマーカー発現を含む。
【０１３８】
本発明の一つの実施形態によれば、上記細胞はｃ−Ｋｉｔ＋ＣＤ３４＋ＣＤ３２６＋のマーカー発現を含む。
【０１３９】
本発明の一つの実施形態によれば、上記細胞はＣＤ３４＋ＣＤ３１＋ＣＤ１４＋ＣＤ４５＋のマーカー発現を含む。
【０１４０】
本発明の一つの実施形態によれば、上記細胞はＣＤ３４＋ＣＤ３１＋ＣＤ４５−ＣＤ１０５＋のマーカー発現を含む。
【０１４１】
本発明の一つの実施形態によれば、上記細胞はネスチン＋のマーカー発現を含む。
【０１４２】
本発明の一つの実施形態によれば、上記細胞はカルシトニン遺伝子関連タンパク質＋（ＣＧＲＰ＋）のマーカー発現を含む。
【０１４３】
本発明の一つの実施形態によれば、上記細胞はアルファ平滑筋アクチン＋（アルファ−ＳＭＡ＋）のマーカー発現を含む。
【０１４４】
本発明の一つの実施形態によれば、上記細胞はビメンチン＋のマーカー発現を含む。
【０１４５】
１つの具体的な実施形態によれば、本明細書中上記で述べられた細胞集団のそれぞれが、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の純化である場合がある。
【０１４６】
特定の細胞タイプの純化が、どのような方法であれ、当業者に知られている方法によって、例えば、上記細胞マーカーのいずれか（例えば、ＣＫ５、ＣＫ１４、ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１０５、ＣＤ２７１、ＣＤ３２６など）を認識する特異的な抗体を使用する親和性に基づく純化などによって（例えば、ＭＡＣＳビーズ、ＦＡＣＳソーターおよび／または捕獲ＥＬＩＳＡ標識化の使用などによって）行われる場合がある。
【０１４７】
本発明の１つの実施形態によれば、細胞懸濁物の単離された集団は、胎児肺細胞の単離された集団の非純化混合物を含む。
【０１４８】
別の実施形態によれば、細胞懸濁物の単離された集団は、（さらに詳しくは上記で示されるような）胎児肺細胞の細胞タイプ特異的な集団を含む。そのような細胞を単離することが、どのような方法であれ、当業者に知られている方法によって、例えば、親和性に基づく純化などによって（例えば、上述のようなＭＡＣＳビーズ、ＦＡＣＳソーターおよび／または捕獲ＥＬＩＳＡ標識化の使用などによって）、あるいは、望まれない細胞の根絶（例えば、死滅）を、当該細胞を標的とする特異的な抗体により行うことによって行われる場合がある。
【０１４９】
細胞懸濁物の単離された集団に含まれる細胞は、キメラ肺の生成を含めて、構造的／機能的な肺組織を再生する能力があることが理解されるであろう。キメラ肺は、肺胞構造、気管支構造および／または細気管支構造、ならびに／あるいは、血管構造を含む。さらに、構造的／機能的な肺組織は、界面活性剤［例えば、クララ細胞分泌タンパク質（ＣＣＳＰ）、アクアポリン−５（ＡＱＰ−５）および界面活性タンパク質Ｃ（ｓｐ−Ｃ）］を合成する能力（これは、特異的な細胞染色によって検出可能である）、および／または、（例えば、ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜貫通調節因子）について染色することによって示されるような）イオンを輸送する能力を含む。細胞懸濁物の単離された集団に含まれる細胞はさらに、上皮組織、間葉組織および／または内皮組織（例えば、これらの成分のすべてを含む完全なキメラ肺組織の形成によって示されるような上皮組織、間葉組織および／または内皮組織）を再生する能力がある。
【０１５０】
したがって、胎児肺組織から単離される細胞の使用が、肺組織を含めて、上皮組織、間葉組織および／または内皮組織を再生することが求められている状況ではとりわけ有益である。
【０１５１】
したがって、本発明の別の態様によれば、上皮組織、間葉組織および／または内皮組織をその必要性のある対象において再生する方法であって、本発明のいくつかの実施形態の治療効果的な量の医薬組成物を前記対象に投与することを含む方法が提供される。
【０１５２】
本発明の別の態様によれば、上皮組織、間葉組織および／または内皮組織の再生が有益である疾患または状態をその必要性のある対象において処置する方法であって、本発明のいくつかの実施形態の治療効果的な量の医薬組成物を前記対象に投与することを含む方法が提供される。
【０１５３】
本発明の別の態様によれば、肺の障害または傷害をその必要性のある対象において処置する方法であって、本発明のいくつかの実施形態の治療効果的な量の医薬組成物を前記対象に投与することを含む方法が提供される。
【０１５４】
本明細書中で使用される場合、用語「上皮組織」は、哺乳動物の身体の至るところの構造体の空洞または表面のいずれであれ、その内側を覆う組織を示す。例示的な上皮組織には、肺組織、胃腸管組織、生殖器官組織、尿路組織、腎臓組織、皮膚組織、虚血組織、心臓組織、内皮組織、循環器組織および脳組織が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５５】
本明細書中で使用される場合、用語「間葉組織」は、ほとんどが中胚葉に由来する哺乳動物体内の結合組織を示す。例示的な間葉組織には、身体の結合組織、血管およびリンパ管が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５６】
本明細書中で使用される場合、用語「内皮組織」は、血管およびリンパ管の内側表面を裏打ちする薄い細胞層を示す。例示的な内皮組織には、リンパ組織および循環系組織（例えば、血管）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５７】
本明細書中で使用される場合、用語「組織を再生する」は、機能的組織（すなわち、指定の領域において生来的組織として機能する組織）が形成されるように、上皮組織、間葉組織または内皮組織を再構成することを示す。したがって、本発明のいくつかの実施形態において、再生するとは、上皮組織、間葉組織または内皮組織における少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の増大を示す。
【０１５８】
当業者に知られている方法はどれも、上皮組織（例えば、肺組織）、間葉組織（例えば、結合組織）または内皮組織（例えば、血管）の再生を評価するために使用されるかもしれず、そのような方法では、例えば、ｘ線、超音波、ＣＴ、ＭＲＩ、上皮組織由来の組織サンプルの組織学的染色（例えば、クララ細胞分泌タンパク質（ＣＣＳＰ）、アクアポリン−５および界面活性タンパク質Ｃの発現について染色することによって）、間葉組織由来の組織サンプルの組織学的染色（例えば、ビメンチン＋の発現について染色することによって）または内皮組織由来の組織サンプルの組織学的染色（例えば、ＣＤ３１の発現について染色することによって）などが使用される。
【０１５９】
本明細書中で使用される場合、用語「対象」または用語「その必要性のある対象」は、障害、疾患または傷害の結果として上皮組織、間葉組織または内皮組織の損傷または欠陥を患うか、または掛かりやすくした、任意の年齢の雄性または雌性の哺乳動物（好ましくは、ヒト）を示す。
【０１６０】
本明細書中で使用される場合、用語「治療する／処置する」には、状態の進行を取り消すこと、実質的に阻害すること、遅くすること、または、逆向きにすること、状態の臨床的症状または審美的症状を実質的に改善すること、あるいは、状態の臨床的症状または審美的症状の出現を実質的に防止することが含まれる。
【０１６１】
本明細書中で使用される場合、用語「上皮組織、間葉組織および／または内皮組織の再生が有益である疾患または状態」は、上皮組織、間葉組織および／または内皮組織における喪失または欠損を伴う疾患、障害、状態のいずれをも、あるいは、上皮組織、間葉組織および／または内皮組織における喪失または欠損を伴う病理学的な、または望まれていない健康状態、状態または症候群のいずれをも、あるいは、上皮組織、間葉組織および／または内皮組織における喪失または欠損を伴う身体的異常、形態学的異常または生理学的異常のいずれをも示す。典型的には、そのような疾患または状態には、肺の障害、疾患または傷害、腎臓の障害、疾患または傷害、肝臓の障害、疾患または傷害、胃腸管の障害、疾患または傷害、皮膚の障害、疾患または傷害、血管の障害、疾患または傷害、心臓の障害、疾患または傷害、あるいは、脳の障害、疾患または傷害が含まれる。
【０１６２】
上皮組織の再生が有益である例示的な疾患または状態には、慢性潰瘍、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、アルツハイマー病、パーキンソン病、皮膚火傷、皮膚潰瘍、皮膚創傷、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、気腫、石綿肺、肺線維症（例えば、特発性肺線維症）、肺高血圧症、肺ガン、サルコイドーシス、肺不全、急性肺傷害（成人呼吸窮迫症候群）、先天性横隔膜ヘルニア、未熟児呼吸窮迫症候群、未熟児慢性肺疾患（気管支肺異形成症）、界面活性タンパク質Ｂ欠乏症（例えば、ホモ接合性界面活性タンパク質Ｂ欠乏症）、肺胞タンパク症、肺形成不全、ならびに、肺傷害、角膜変性およびガンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１６３】
間葉組織の再生が有益である例示的な疾患または状態には、心臓の疾患または状態、糖尿病、難聴、クローン病、自己免疫障害、白血病およびリンパ腫、ガン（例えば、乳ガン）、鎌状赤血球病、筋萎縮性側索硬化症ならびに代謝障害が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６４】
内皮組織の再生が有益である例示的な疾患または状態には、血管疾患、虚血、鎌状赤血球病、心臓血管疾患、アテローム性動脈硬化、糖尿病および自己免疫障害［例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および抗リン脂質抗体症候群（ａＰＳ）］が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６５】
ガンの例には、ガン腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病が含まれるが、これらに限定されない。がん性疾患の具体的な例には、下記のものが含まれるが、それらに限定されない：骨髄性白血病、例えば、慢性骨髄性白血病など。急性分化型骨髄性白血病。急性前骨髄球性白血病、増大した好塩基球を伴う急性非リンパ性白血病、急性単球性白血病。好酸球増加症を伴う急性骨髄単球性白血病；悪性リンパ腫、例えば、バーキット非ホジキン病など；リンパ球性白血病、例えば、急性リンパ芽球性白血病など。慢性リンパ性白血病；骨髄増殖性疾患、例えば、固形腫瘍、良性髄膜腫、唾液腺混合腫瘍、大腸腺腫など；腺ガン、例えば、小細胞肺ガン、腎臓、子宮、前立腺、膀胱、卵巣、結腸、肉腫、脂肪肉腫、粘液様、滑膜肉腫、横紋筋肉腫（肺胞）、骨外性粘液様軟骨肉腫、ユーイング腫瘍；他のものには、精巣および卵巣の未分化胚細胞腫、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、悪性黒色腫、中皮腫、乳房、前立腺および卵巣が含まれる。
【０１６６】
自己免疫障害／疾患の例には、下記のものが含まれるが、それらに限定されない：心臓血管疾患（例えば、アテローム性動脈硬化、血栓症、心筋梗塞など）、リウマチ様疾患（例えば、関節リウマチおよび強直性脊椎炎）、腺疾患（例えば、膵臓疾患、Ｉ型糖尿病、甲状腺疾患、グレーブス病、甲状腺炎など）、胃腸疾患（例えば、慢性炎症性腸疾患、セリアック病、大腸炎、回腸炎、クローン病）、皮膚疾患（例えば、自己免疫性水疱性皮膚疾患（例えば、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡および落葉状天疱瘡など、これらに限定されない）など）、肝臓疾患（例えば、肝炎、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変および自己免疫性肝炎）、神経学的疾患（例えば、多発性硬化症、アルツハイマー病、重症筋無力症、神経障害、運動神経障害；ギラン・バレー症候群および自己免疫性神経障害、筋無力症、ランバート・イートン筋無力症症候群；腫瘍随伴性神経学的疾患、小脳萎縮症、腫瘍随伴性小脳萎縮症およびスティフマン症候群；腫瘍非随伴性スティフマン症候群、進行性小脳萎縮症、脳炎、ラスムッセン脳炎、筋萎縮性側索硬化症、シデハム舞踏病、ジル・ド・ラ・トゥレット症候群および自己免疫性多腺性内分泌不全症；異常免疫神経障害；後天性神経性筋強直症、先天性多発性関節拘縮症、神経炎、視神経炎および神経変性疾患）、筋疾患（例えば、筋炎、自己免疫性筋炎、原発性シェーグレン症候群および平滑筋自己免疫性疾患）、腎疾患（例えば、腎炎および自己免疫性間質性腎炎）、生殖関連疾患（例えば、繰り返される胎児消失）、結合組織疾患（例えば、耳疾患、自己免疫性耳疾患および内耳の自己免疫性疾患）、および、全身性疾患（例えば、全身性エリテマトーデスおよび全身性硬化症）。本明細書中で使用される場合、用語「肺の障害または傷害」は、肺組織における喪失または欠損を伴う疾患、障害、状態のいずれをも、あるいは、肺組織における喪失または欠損を伴う病理学的な、または望まれていない健康状態、状態または症候群のいずれをも、あるいは、肺組織における喪失または欠損を伴う身体的異常、形態学的異常または生理学的異常のいずれをも示す。
【０１６７】
肺障害または傷害と関連した例示的な疾患または状態は、嚢胞性線維症、気腫、石綿肺、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺線維症（例えば特発性肺線維症）、肺高血圧症、肺ガン、サルコイドーシス、肺不全、急性肺傷害（例えば成人呼吸窮迫症候群）、先天性横隔膜ヘルニア、未熟児呼吸窮迫症候群、未熟児慢性肺疾患（気管支肺異形成症）、界面活性タンパク質Ｂ欠乏症（例えばホモ結合界面活性タンパク質欠乏症）、肺胞タンパク症、肺形成不全および肺傷害が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６８】
細胞懸濁物の単離された集団の対象への投与が、様々なパラメーターに依存して、例えば、処置される疾患のタイプ、病期または重篤度、個々の対象に対して特異的な身体的または生理学的なパラメーター、および／あるいは、所望される治療結果などに依存して、数多くの方法で行われる場合がある。例えば、適用および目的に依存して、細胞懸濁物の単離された集団の投与が、気管内、気管支内、肺胞内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、皮下、髄内、クモ膜下腔内、心室内、心臓内、筋肉内、漿膜内、粘膜内、経粘膜、経鼻、直腸および腸管からなる群から選択される経路によって行われる場合がある。
【０１６９】
１つの実施形態によれば、投与することが静脈内経路によって行われる。
【０１７０】
代替において、細胞懸濁物の単離された集団の対象への投与が、治療効果的であるように、様々な好適な解剖学的部位へのその投与によって行われる場合がある。したがって、適用および目的に依存して、胎児肺細胞の単離された集団が、同位置の解剖学的部位（当該細胞の器官タイプまたは組織タイプについての通常の解剖学的部位）に、または、異所性の解剖学的部位（当該細胞の器官タイプまたは組織タイプについての通常でない解剖学的部位）に投与される場合がある。
【０１７１】
したがって、適用および目的に依存して、胎児肺細胞の単離された集団が、腎被膜の下に、あるいは、腎臓、精巣脂肪、皮下組織、網、門脈、肝臓、脾臓、心臓腔、心臓、胸腔、肺、膵臓、皮膚および／または腹腔内空間の中に都合よく埋め込まれる（移植される）場合がある。
【０１７２】
例えば、胃腸の疾患または状態を処置するために、本発明の細胞懸濁物の単離された集団が、肝臓、門脈、腎被膜、皮下組織、網、脾臓、腹腔内空間、膵臓、精巣脂肪および／または腸係蹄（小腸のＵ係蹄の漿膜下組織）の中に投与される場合がある。肺の疾患または状態を処置するために、本発明の細胞懸濁物の単離された集団が、肺の中に、腎被膜の下に、肝臓、門脈、皮下組織、網、脾臓、腹腔内空間、膵臓および／または精巣脂肪の中に投与される場合がある。
【０１７３】
本発明のいくつかの実施形態の胎児肺細胞の単離された集団はそれ自体で生物に投与することができ、あるいは、当該単離された集団が好適なキャリアまたは賦形剤と混合される医薬組成物において生物に投与することができる。
【０１７４】
本明細書中で使用される「医薬組成物」は、本明細書中に記載される有効成分の１つまたは複数と、他の化学的成分（例えば、生理学的に好適な担体および賦形剤など）との調製物を示す。医薬組成物の目的は、生物に対する化合物の投与を容易にすることである。
【０１７５】
本明細書中において、用語「有効成分（活性成分）」は、生物学的効果を説明することができる哺乳動物胎児肺組織に由来する細胞懸濁物の単離された集団を示す。
【０１７６】
本明細書中以降、表現「生理学的に許容され得る担体」および表現「医薬的に許容され得る担体」は、交換可能に使用され得るが、生物に対する著しい刺激を生じさせず、かつ、投与された化合物の生物学的な活性および性質を妨げない担体または希釈剤を示す。アジュバントはこれらの表現に包含される。
【０１７７】
本明細書中において、用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１７８】
薬物の配合および投与のための技術が「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）に見出されることができ、これは参考として本明細書中に組み込まれる。
【０１７９】
好適な投与経路には、例えば、経口送達、直腸送達、経粘膜送達、特に経鼻送達、腸管送達、または非経口送達（これには、筋肉内注射、皮下注射および髄内注射、ならびに、クモ膜下注射、直接的な脳室内注射、例えば左または右心室腔内への、総冠状動脈内への心臓内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻内注射または眼内注射が含まれる）が含まれることができる。
【０１８０】
神経系（ＣＮＳ）への薬物送達のための従来の取り組みには、下記のことが含まれる：神経外科的戦略（例えば、脳内注射または脳室内注入）；ＢＢＢの内在性輸送経路の１つを利用するための試みでの作用因の分子的操作（例えば、内皮細胞表面分子に対する親和性を有する輸送ペプチドを、自身でＢＢＢを越えることができない作用因との組合せで含むキメラな融合タンパク質の製造）；作用因の脂質溶解性を増大させるために設計される薬理学的戦略（例えば、水溶性作用因を脂質キャリアまたはコレステロールキャリアにコンジュゲート化すること）；および、ＢＢＢの一体性を（頸動脈内へのマンニトール溶液の注入または生物学的活性剤（例えば、アンギオテンシンペプチドなど）の使用から生じる）高浸透圧破壊によって一時的に破壊すること。しかしながら、これらの戦略のそれぞれが、これらの戦略のそれぞれを最適でない送達方法にする様々な制限を有する：例えば、浸襲的な外科的手順に伴う固有的危険性、内在性輸送系において固有的である制限によって強いられるサイズ制限、ＣＮＳの外側で活性であり得るかもしれないキャリアモチーフから構成されるキメラ分子の全身投与に伴う潜在的に望ましくない生物学的副作用、および、ＢＢＢが損なわれる脳の領域における脳損傷の起こり得る危険性など。
【０１８１】
あるいは、例えば、患者の組織領域（例えば肺組織）に直接的に医薬組成物の注射をすることによって、全身的な方法よりも局所的に医薬組成物を投与することができる。
【０１８２】
本発明のいくつかの実施形態の医薬組成物は、この分野で十分に知られているプロセスによって、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥のプロセスによって製造されることができる。
【０１８３】
本発明のいくつかの実施形態に従って使用される医薬組成物は、医薬品として使用されることができる調製物への有効成分の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容され得る担体を使用して従来の様式で配合されることできる。適正な配合は、選ばれた投与経路に依存する。
【０１８４】
注射の場合、該医薬組成物の有効成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合しうる緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的な食塩緩衝液など）において配合されることができる。経粘膜投与の場合、浸透されるバリヤーに対して適切な浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤はこの分野では一般に知られている。
【０１８５】
経口投与の場合、該医薬組成物は、活性化合物をこの分野でよく知られている医薬的に許容され得る担体と組み合わせることによって容易に配合されることができる。そのような担体は、本発明の医薬組成物が、患者によって経口摂取される錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー剤および懸濁物などとして配合されることを可能にする。経口使用される薬理学的調製物は、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し、錠剤または糖衣錠コアを得るために、望ましい好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製されることができる。好適な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容され得るポリマーである。もし望むなら、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤が加えられることができる。
【０１８６】
糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液、および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有しうる。色素または顔料は、活性化合物の量を明らかにするために、または活性化合物の量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに加えられることができる。
【０１８７】
経口使用されうる医薬組成物としては、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセル、ならびに、ゼラチンおよび可塑剤（例えば、グリセロールまたはソルビトールなど）から作製された軟いシールされたカプセルが挙げられる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤（例えば、ラクトースなど）、結合剤（例えば、デンプンなど）、滑剤（例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）、および場合により安定化剤との混合で有効成分を含有することができる。軟カプセルでは、有効成分は、好適な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁されることができる。さらに、安定化剤が加えられることができる。経口投与される配合物はすべて、選ばれた投与経路について好適な投薬形態でなければならない。
【０１８８】
口内投与の場合、組成物は、従来の方法で配合された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。
【０１８９】
鼻吸入による投与の場合、本発明のいくつかの実施形態による使用のための有効成分は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投与量は、計量された量を送達するためのバルブを備えることによって決定されることができる。ディスペンサーにおいて使用される、例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジは、化合物および好適な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプンなど）の粉末混合物を含有して配合されることができる。
【０１９０】
本明細書中に記載される医薬組成物は、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために配合されることができる。注射用配合物は、場合により保存剤が添加された、例えば、アンプルまたは多回用量容器における単位投薬形態で提供されることができる。組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクルにおける懸濁物または溶液剤またはエマルションにすることができ、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤などの配合剤を含有することができる。
【０１９１】
非経口投与される医薬組成物には、水溶性形態の活性調製物の水溶液が含まれる。さらに、有効成分の懸濁物は、適切な油性または水性の注射用懸濁物として調製されることができる。好適な親油性の溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油（例えば、ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）、トリグリセリドまたはリポソームが挙げられる。水性の注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含有することができる。場合により、懸濁物はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために、有効成分の溶解性を増大させる好適な安定化剤または薬剤を含有することができる。
【０１９２】
あるいは、有効成分は、好適なビヒクル（例えば、無菌の、パイロジェン不含水溶液）を使用前に用いて構成される粉末形態であることができる。
【０１９３】
本発明のいくつかの実施形態の医薬組成物はまた、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの従来の座薬基剤を使用して、座薬または停留浣腸剤などの直腸用組成物に配合されることができる。
【０１９４】
本発明のいくつかの実施形態の医薬組成物に関連した使用のために好適な医薬組成物として、有効成分が、その意図された目的を達成するために有効な量で含有される組成物が含まれる。より具体的には、「治療有効量（治療効果的な量）」は、処置されている対象の疾患（例えば肺疾患または状態のような上皮疾患）の症状を予防、緩和あるいは改善するために効果的であるか、または、処置されている対象の生存を延ばすために効果的である、有効成分（すなわち胎児肺細胞を含む細胞懸濁物の単離された集団）の量を意味する。
【０１９５】
治療有効量の決定は、特に本明細書で与えられた詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１９６】
本発明の方法において使用されるいかなる調製物についても、投与量または治療有効量は、生体外および細胞培養アッセイから最初に推定されることができる。例えば、投与量は、所望の濃度または力価を決定するために動物モデルにおいて決定されることができ、そのような情報は、ヒトにおける有用な投与量をより正確に決定するために使用されることができる。
【０１９７】
治療効果的な量の胎児肺細胞の単離された集団を評価するために使用され得る例示的な動物モデルは、下記の実施例の節において詳しく記載されるように、肺傷害が、例えば、ナフタレン（例えば、９９％超の純度）の腹腔内注射を、さらなる放射線照射（例えば、ナフタレン投与後４０時間〜４８時間での放射線照射）を伴って、または伴うことなく行うことによって誘導されるネズミ動物モデル（例えば、マウス）を含む。
【０１９８】
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、生体外、細胞培養物、または実験動物における標準的な薬学的手法によって決定されることができる。これらの生体外、細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投与量範囲を定めるために使用されることができる。投与量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存して変化しうる。正確な配合、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択されることができる（例えば、Ｆｉｎｇｌら、（１９７５）「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ｃｈ．１  ｐ．１を参照のこと）。
【０１９９】
投薬量および投薬間隔を、生物学的な効果を誘発または抑制するために十分である活性成分の余裕のあるレベル（最小有効濃度（ＭＥＣ））を提供するために個々に調節することができる。ＭＥＣはそれぞれの調製物について変化するが、インビトロデータから推定することができる。ＭＥＣを達成するために必要な投薬量は個々の特性および投与経路に依存する。検出アッセイを使用して、血漿中濃度を求めることができる。
【０２００】
処置される状態の重篤度および応答性に依存して、投薬は、単回または複数回投与で行われることができ、この場合、処置期間は、数日から数週間まで、または治療が達成されるまで、または疾患状態の軽減が達成されるまで続く。
【０２０１】
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている対象、苦痛の重篤度、投与様式、処方医の判断などに依存するだろう。
【０２０２】
１つの実施形態によれば、細胞懸濁物の単離された集団は、対象の体重１キログラムあたり少なくとも約０．５×１０５個、１×１０５個、０．５×１０６個、１×１０６個、１．５×１０６個、２×１０６個、２．５×１０６個、３×１０６個、３．５×１０６個、４×１０６個、４．５×１０６個、５×１０６個、５．５×１０６個、６×１０６個、６．５×１０６個、７×１０６個、７．５×１０６個、８×１０６個、８．５×１０６個、９×１０６個、９．５×１０６個、１０×１０６個の細胞を含む。
【０２０３】
１つの具体的な実施形態によれば、細胞懸濁物の単離された集団は、対象の体重１キログラムあたり少なくとも約１×１０６個の細胞を含む。
【０２０４】
本発明のいくつかの実施形態の組成物は、所望されるならば、有効成分を含有する１つまたは複数の単位投薬形態物を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス（例えば、ＦＤＡ承認キットなど）で提供され得る。パックは、例えば、金属ホイルまたはプラスチックホイルを含むことができる（例えば、ブリスターパックなど）。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が付随し得る。パックまたはディスペンサーデバイスはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局によって定められた形式で、容器に関連した通知によって適応させることがあり、この場合、そのような通知は、組成物の形態、あるいはヒトまたは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物について米国食品医薬品局によって承認されたラベル書きであり得るか、または、承認された製品添付文書であり得る。適合し得る医薬用担体に配合された本発明の調製物を含む組成物もまた、上でさらに詳述されたように、示された状態を処置するために調製され、適切な容器に入れられ、かつ標識され得る。
【０２０５】
カプセル化技術は一般には、小さい球状ビヒクルを伴うマイクロカプセル化として、また、より大きい平坦シート膜および中空繊維膜を伴うマクロカプセル化として分類される（Ｕｌｕｄａｇ，Ｈ．他、（２０００）、Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ４２，２９〜６４）。
【０２０６】
マイクロカプセルを調製する様々な方法がこの技術分野では公知であり、これらには、例えば、Ｌｕ，Ｍ．Ｚ．他、（２０００）、Ｃｅｌｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｌｇｉｎａｔｅ  ａｎｄ  ａｌｐｈａ−ｐｈｅｎｏｘｙｃｉｎｎａｍｙｌｉｄｅｎｅ−ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ  ｐｏｌｙ（ａｌｌｙｌａｍｉｎｅ）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ７０，４７９〜４８３；Ｃｈａｎｇ，Ｔ．Ｍ．およびＰｒａｋａｓｈ，Ｓ．（２００１）、Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅｓ，ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７，２４９〜２６０；および、Ｌｕ，Ｍ．Ｚ．他、（２０００）、Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｅｌｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｐｏｌｙ（ａｌｌｙｌａｍｉｎｅ  ａｌｐｈａ−ｃｙａｎｏｃｉｎｎａｍｙｌｉｄｅｎｅａｃｅｔａｔｅ）、Ｊ  Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ  １７，２４５〜５２１によって開示される方法が含まれる。
【０２０７】
例えば、マイクロカプセルが、修飾コラーゲンを、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル（ＨＥＭＡ）、メタクリル酸（ＭＡＡ）、およびメタクリル酸メチル（ＭＭＡ）のターポリマー殻との複合体中で使用することによって、２μｍ〜５μｍのカプセル厚に調製される。そのようなマイクロカプセルはさらに、負に帯電した平滑な表面を与えるために、また、血漿タンパク質の吸収を最小限に抑えるために、さらなる２μｍ〜５μｍのターポリマー殻によりカプセル化することができる（Ｃｈｉａ，Ｓ．Ｍ．他、（２００２）、Ｍｕｌｔｉ−ｌａｙｅｒｅｄ  ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２３，８４９〜８５６）。
【０２０８】
他のマイクロカプセルが、アルギン酸塩、すなわち、海洋多糖類（Ｓａｍｂａｎｉｓ，Ａ．（２００３）、Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｉｓｌｅｔｓ  ｉｎ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｔｈｅｃｈｎｏｌ．Ｔｈｅｒ  ５，６６５〜６６８）、または、その誘導体に基づく。例えば、マイクロカプセルを、ポリアニオンのアルギン酸ナトリウムおよびセルロース硫酸ナトリウムと、ポリカチオンのポリ（メチレン−ｃｏ−グアニジン）塩酸塩との間における塩化カルシウム存在下での多電解質複合体化によって調製することができる。
【０２０９】
より小さいカプセルが使用されるとき、細胞カプセル化が改善されることが理解されるであろう。したがって、例えばカプセルサイズが１ｍｍから４００μｍに縮小されたとき、カプセル化された細胞の品質管理、機械的安定性、拡散特性およびインビトロ活性が改善された（Ｃａｎａｐｌｅ  Ｌ．他、（２００２）、Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｉｚｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｊ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ  Ｐｏｌｙｍ  Ｅｄ  １３，７８３〜９６）。そのうえ、７ｎｍもの小さい十分に制御された細孔サイズ、目的に適合した表面化学、および、精密な微細構造を有するナノ多孔性バイオカプセルは、細胞のための微小環境を首尾よく免疫隔離することが見出された（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｄ、（１９９９）、Ｓｍａｌｌ  ｉｓ  ｂｅａｕｔｉｆｕｌ：ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ａｎｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｍｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  １０，６〜９；およびＤｅｓａｉ，Ｔ．Ａ．（２００２）、Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２，６３３〜６４６を参照）。
【０２１０】
述べられたように、非同系細胞の生着を促進させるために、本発明はさらに、対象を、細胞懸濁物の単離された集団を投与する前、または投与するのと同時、または投与した後において免疫抑制療法により処置することを意図する。
【０２１１】
移植のための好適な免疫抑制療法を選択し、施すための十分な指針がこの技術分野の文献において提供される（例えば、下記を参照されたい：Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ  ＣＨ．およびＲｏｗｌａｎｄｓ  ＤＴ  Ｊｒ．、１９９２、ＪＡＭＡ．、２６８、２９５２；Ｈｉｇｉｎｓ  ＲＭ．他、１９９６、Ｌａｎｃｅｔ、３４８、１２０８；Ｓｕｔｈａｎｔｈｉｒａｎ  Ｍ．およびＳｔｒｏｍ  ＴＢ．、１９９６、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．、３３１、３６５；Ｍｉｄｔｈｕｎ  ＤＥ．他、１９９７、Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒｏｃ．、７２、１７５；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＶＡ．他、１９９４、Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ．、９７、１４；Ｈａｎｔｏ  ＤＷ．、１９９５、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ．、４６、３８１；Ｓｅｎｄｅｒｏｗｉｃｚ  ＡＭ．他、１９９７、Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．、１２６、８８２；Ｖｉｎｃｅｎｔｉ  Ｆ．他、１９９８、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．、３３８、１６１；Ｄａｎｔａｌ  Ｊ．他、１９９８、Ｌａｎｃｅｔ、３５１、６２３）。
【０２１２】
一つの実施形態によれば、免疫抑制療法は、少なくとも１つの免疫抑制剤を対象に投与することからなる。
【０２１３】
免疫抑制剤の例には、メトトレキサート、タクロリムス、シクロホスファミド、シクロスポリン、シクロスポリンＡ、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン（スルファサラゾピリン）、金塩、Ｄ−ペニシラミン、レフルノミド、アザチオプリン、アナキンラ、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ）、エタネルセプト、Ｃｏｐａｘｏｎｅ、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、アザチオプレン、シクロホスファミドおよびフルダラビン、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ４０リガンド抗体、抗Ｂ７抗体、抗ＣＤ３抗体（例えば抗ヒトＣＤ３抗体ＯＫＴ３）、ミコフェノール酸モフェチル、ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ［ヒト化（ＩｇＧ１  Ｆｃ）抗ＩＬ−２Ｒアルファ鎖（ＣＤ２５）抗体］、および毒素（例えばコレラＡ鎖、またはシュードモナス毒素）にコンジュゲートされた抗Ｔ細胞抗体、ＴＮＦ．アルファ．遮断剤、炎症性サイトカインを標的とする生物学的薬剤、および、非ステロイド系抗炎症性薬物（ＮＳＡＩＤ）が含まれるが、これらに限定されない。ＮＳＡＩＤの例には、アセチルサリチル酸、サリチル酸コリンマグネシウム、ジフルニサル、サリチル酸マグネシウム、サルサラート、サリチル酸ナトリウム、ジクロフェナク、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、メクロフェナマート、ナプロキセン、ナブメトン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、トルメチン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、Ｃｏｘ−２阻害剤、トラマドール、ラパマイシン（シロリムス）およびラパマイシンアナログ（例えば、ＣＣＩ−７７９、ＲＡＤ００１、ＡＰ２３５７３）が含まれる。これらの薬剤は個々に投与することができ、または、組み合わせて投与することができる。
【０２１４】
細胞のタイプおよび処置される疾患または状態に依存して、また、胎児肺細胞の単離された集団の生着を促進させるために、本方法はさらに好都合には、対象を、細胞懸濁物の単離された集団を投与する前に、亜致死的、致死的または超致死的な条件のもとで前処置することを含む場合がある。
【０２１５】
本明細書中で使用される場合、本発明の対象の前処理に関連するときにおける用語「亜致死的」、用語「致死的」および用語「超致死的」は、当該対象の代表的集団に適用されるとき、それぞれ典型的には、無菌の通常の条件のもとで当該集団の本質的にすべてのメンバーに対して非致死的であり、または、当該集団のすべてのメンバーではなく、一部のメンバーに対して致死的であり、または、当該集団の本質的にすべてのメンバーに対して致死的である骨髄毒性処置および／またはリンパ球毒性処置を示す。
【０２１６】
１つの実施形態によれば、前処置は、全身照射（ＴＢＩ）、全身リンパ節照射（ＴＬＩ、すなわち、全リンパ節、胸腺および脾臓の暴露）、部分照射（例えば、肺、腎臓、脳などの特異的暴露）、骨髄破壊的前処置、共刺激遮断、化学療法剤および／または抗体免疫療法を含む。
【０２１７】
下記の実施例の節において例示されるように、ナフタレンを使用して対象を前処置することにより、クララ細胞の部位特異的な消失が呼吸細気管支および気管支肺胞接合部において誘導され、したがって、胎児肺細胞の単離された集団の生着が促進される。（ナフタレン処置後に急速に増殖することがある）定住肺幹細胞をさらに効率的に排除するために、対象はさらに、胎児肺細胞の単離された集団が投与される前に亜致死的ＴＢＩ（例えば、６Ｇｙ）に供された（下記の実施例の節の実施例２を参照のこと）。
【０２１８】
したがって、本発明の１つの実施形態によれば、前処置プロトコルはナフタレン処置を含む。
【０２１９】
１つの実施形態によれば、ナフタレン処置が、細胞懸濁物の単離された集団が投与される１日前〜１０日前（例えば、３日前）に対象に施される。
【０２２０】
１つの実施形態によれば、前処置はナフタレン処置およびＴＢＩ処置を含む。
【０２２１】
１つの実施形態によれば、ＴＢＩは、０．５〜１Ｇｙ、０．５〜１．５Ｇｙ、０．５〜２．５Ｇｙ、０．５〜５Ｇｙ、０．５〜７．５Ｇｙ、０．５〜１０Ｇｙ、０．５〜１５Ｇｙ、１〜１．５Ｇｙ、１〜２Ｇｙ、１〜２．５Ｇｙ、１〜３Ｇｙ、１〜３．５Ｇｙ、１〜４Ｇｙ、１〜４．５Ｇｙ、１〜１．５Ｇｙ、１〜７．５Ｇｙ、１〜１０Ｇｙ、２〜３Ｇｙ、２〜４Ｇｙ、２〜５Ｇｙ、２〜６Ｇｙ、２〜７Ｇｙ、２〜８Ｇｙ、２〜９Ｇｙ、２〜１０Ｇｙ、３〜４Ｇｙ、３〜５Ｇｙ、３〜６Ｇｙ、３〜７Ｇｙ、３〜８Ｇｙ、３〜９Ｇｙ、３〜１０Ｇｙ、４〜５Ｇｙ、４〜６Ｇｙ、４〜７Ｇｙ、４〜８Ｇｙ、４〜９Ｇｙ、４〜１０Ｇｙ、５〜６Ｇｙ、５〜７Ｇｙ、５〜８Ｇｙ、５〜９Ｇｙ、５〜１０Ｇｙ、６〜７Ｇｙ、６〜８Ｇｙ、６〜９Ｇｙ、６〜１０Ｇｙ、７〜８Ｇｙ、７〜９Ｇｙ、７〜１０Ｇｙ、８〜９Ｇｙ、８〜１０Ｇｙ、１０〜１２Ｇｙ、または、１０〜１５Ｇｙの範囲に含まれる単回照射線量または分割照射線量を含む。
【０２２２】
１つの具体的な実施形態によれば、ＴＢＩは、１〜７．５Ｇｙの範囲に含まれる単回照射線量または分割照射線量を含む。
【０２２３】
１つの実施形態によれば、ＴＢＩ処置が、細胞懸濁物の単離された集団が投与される１日前〜１０日前（例えば、１日前〜３日前）に対象に施される。
【０２２４】
１つの実施形態によれば、ナフタレン処置が、細胞懸濁物の単離された集団が投与される２日前〜１０日前（例えば、３日前）に対象に施され、かつ、ＴＢＩ処置が、その後４０時間〜４８時間で、細胞懸濁物の単離された集団が投与される（例えば、１日）前に対象に施される。
【０２２５】
１つの実施形態によれば、部分照射が使用されるとき、暴露は、処置される器官または組織（例えば、肺、腎臓、肝臓、膵臓、脳など）に対して特異的である。そのような場合、望まれない器官／組織損傷を避けるために、照射されない身体器官を遮蔽することが望ましい。
【０２２６】
１つの実施形態によれば、前処置は化学療法剤（例えば、骨髄破壊剤）を含む。例示的な化学療法剤には、ブスルファン、ミレラン、ブスルフェクス、フルダラビン、メルファラン、ジメチルミレランおよびチオテパおよびシクロホスファミドが含まれるが、これらに限定されない。化学療法剤は、移植前に、単回用量で、あるいは、数回の用量で、例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回またはそれ以上の用量（例えば、１日用量）で対象に投与される場合がある。
【０２２７】
１つの実施形態によれば、前処置は抗体免疫療法を含む。例示的な抗体には、抗ＣＤ５２抗体（例えば、アレムツズマブ、例えば、Ｃａｍｐａｔｈ、ＭａｂＣａｍｐａｔｈ、Ｃａｍｐａｔｈ−１ＨおよびＬｅｍｔｒａｄｅの商品名で販売されるもの）、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）剤［例えば、Ｔｈｙｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（ウサギＡＴＧ、ｒＡＴＧ、Ｇｅｎｚｙｍｅから入手可能）およびＡｔｇａｍ（ウマＡＴＧ、ｅＡＴＧ、Ｐｆｉｚｅｒから入手可能）］が含まれるが、これらに限定されない。１つの実施形態によれば、抗体は、移植前に、単回用量で、あるいは、数回の用量で、例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回またはそれ以上の用量（例えば、１日用量）で対象に投与される。
【０２２８】
１つの実施形態によれば、前処置は共刺激遮断を含む。したがって、例えば、前処置は、少なくとも１つのＴ細胞共刺激阻害剤および少なくとも１つのＣＤ４０リガンド阻害剤を対象に一時的に投与することを含む場合があり、また、より好ましくは、Ｔ細胞増殖の阻害剤を対象に投与することをさらに含む場合がある。
【０２２９】
１つの実施形態によれば、Ｔ細胞共刺激阻害剤がＣＴＬＡ４−Ｉｇであり、ＣＤ４０リガンド阻害剤が抗ＣＤ４０リガンド抗体であり、Ｔ細胞増殖の阻害剤がラパマイシンである。代替において、Ｔ細胞共刺激阻害剤が抗ＣＤ４０抗体である場合がある。代替において、Ｔ細胞共刺激阻害剤が、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ２８、抗ＬＦＡ−１および／または抗ＬＦＡ３について特異的な抗体である場合がある。
【０２３０】
細胞懸濁物の単離された集団を本発明の教示に従って対象に移植した後では、標準的な医療実務によれば、移植された細胞の成長機能性および免疫適合性を当該技術分野での様々な標準的な技術のいずれか１つに従ってモニターすることが望ましい。例えば、再生された肺組織の機能性が、標準的な肺機能試験（例えば、界面活性剤を合成する能力、すなわち、界面活性タンパク質Ｃ（ｓｐ−Ｃ）について染色することによって検出可能である能力、および、イオンを輸送する能力、すなわち、ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜貫通調節因子）について染色することによって示されるような能力によって示されるように、発達中の移植組織の機能的性質の分析）によって移植後にモニターされる場合がある。
【０２３１】
本明細書中に記載される胎児肺細胞の単離された集団は個々に貯蔵される場合があり、または、バンクに含まれる場合があり、この場合、それぞれの集団が特定のパラメーター（例えば、ＨＬＡタイプ）に従って分類される。
【０２３２】
したがって、本発明のさらに別の態様によれば、哺乳動物胎児肺組織から単離される複数の細胞集団を含む細胞バンクであって、前記胎児組織が、妊娠の約２０週〜約２２週の範囲から選択される発達段階にあるヒトの肺器官／組織の発達段階に本質的に対応する発達段階にあり、かつ、前記複数の細胞集団が、同種細胞バンクを形成するためにＨＬＡ型分類されており、ただし、それぞれが個々に別個の容器の中に配置される細胞バンクが提供される。
【０２３３】
１つの実施形態によれば、ヒトの肺器官／組織は、本明細書中上記で詳しく記載されるような妊娠段階にある。
【０２３４】
１つの実施形態によれば、バンクは、上記以外の妊娠段階に由来する細胞を含まない。
【０２３５】
１つの実施形態によれば、バンクは、妊娠の上記２０週〜２２週とは異なる妊娠段階に由来する細胞を含まない。
【０２３６】
１つの実施形態によれば、バンクは、肺以外の組織に由来する細胞を含まない。
【０２３７】
１つの実施形態によれば、バンクは、出生後の組織または成体の組織に由来する細胞を含まない。
【０２３８】
本発明のこの態様の哺乳動物胎児肺細胞バンクは、ヒトの妊娠の２０週〜２２週に対応する在胎期間にある胎児に由来する１つまたは複数の哺乳動物胎児肺細胞集団の物理的収集物である。そのようなバンクは好ましくは、それぞれの胎児肺細胞集団の２つ以上のサンプル（すなわち、アリコート）を含有する。胎児肺細胞集団を採取することが本明細書中上記で記載される。胎児肺細胞集団が、本明細書中上記で記載されるように、様々な哺乳動物生物に由来する場合がある。
【０２３９】
胎児肺細胞集団は、細胞（例えば、始原体細胞）を生存したままで、かつ、機能を有したままで保つために（典型的には凍結による）適切な条件のもとで貯蔵される。１つの実施形態によれば、胎児肺細胞集団は、凍結保存された集団として貯蔵される。他の保存方法が、米国特許第５６５６４９８号、同第５００４６８１号、同第５１９２５５３号、同第５９５５２５７号および同第６４６１６４５号に記載される。幹細胞をバンク化するための方法が、例えば、米国特許出願公開第２００３／０２１５９４２号に記載される。
【０２４０】
１つの実施形態によれば、バンクに貯蔵される胎児肺細胞集団は、形態学的特徴、分化プロフィル、血液型、主要組織適合遺伝子複合体［ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）］、ドナーの疾患状態、あるいは、疾患または状態に関連または非関連の遺伝子型情報（これらに限定されない）を含めて、所定の特徴に従って特徴づけられる。
【０２４１】
１つの実施形態によれば、バンクに貯蔵される胎児肺細胞集団は、ＨＬＡ型分類に従って特徴づけられる。
【０２４２】
本発明の１つの実施形態によれば、細胞バンクはさらに、胎児肺細胞集団の所定の特徴（例えば、ＨＬＡ型分類された細胞）に関する情報を含むカタログを含む。
【０２４３】
カタログ作成は、それぞれの細胞集団について得られる特徴の集中記録、例えば、集められた文書記録、または、情報が入力されているコンピューターデータベースなどを新たに作ることの一部となる場合がある。胎児肺細胞バンクは、研究者または臨床医の要求のために好適である特定の胎児肺細胞サンプルを複数のサンプルから選択することを容易にする。
【０２４４】
本発明のなおさらに別の態様によれば、哺乳動物胎児肺始原体細胞を単離する方法であって、（ａ）妊娠の約２０週〜約２２週の範囲から選択される妊娠段階にあるヒトの肺器官／組織の発達段階に本質的に対応する発達段階にある哺乳動物胎児肺組織を得ること、（ｂ）ＣＫ５、ＣＫ１４、ＣＤ２７１、ＣＤ３４、ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ３２６、ＣＤ３１およびＣＤ４５ならびにそれらの組合せからなる群から選択されるマーカーの胎児肺組織細胞におけるマーカー発現を検出すること、および、（ｃ）前記マーカー発現を呈示する細胞を単離し、それにより、哺乳動物胎児肺始原体細胞を単離することを含む方法が提供される。
【０２４５】
１つの実施形態によれば、単離された細胞集団は、妊娠の約１５週または１７週から得られる肺組織または肺器官と比較して、少なくとも２倍を超えるＣＫ５＋細胞を含む。
【０２４６】
１つの実施形態によれば、単離された細胞集団は、新たに形成された上皮細胞を対象の肺の小さい細気管支においてももたらす。
【０２４７】
１つの実施形態によれば、単離された細胞集団は肺細胞１型細胞および／または肺細胞２型細胞の発現を対象の肺の肺胞においてもたらす。
【０２４８】
１つの実施形態によれば、単離された細胞集団はＣＤ３１＋細胞の発現を対象の肺の血管においてももたらす。
【０２４９】
１つの実施形態によれば、単離された細胞集団は、妊娠の約１８週から得られる肺組織または肺器官と比較して、より広い肺胞管をもたらす。
【０２５０】
１つの実施形態によれば、単離された細胞集団は、妊娠の約１８週から得られる肺組織または肺器官と比較して、より薄い肺胞壁をもたらす。
【０２５１】
１つの実施形態によれば、単離された細胞集団は、妊娠の約１８週から得られる肺組織または肺器官と比較して、より多い気管支構造および細気管支構造をもたらす。
【０２５２】
１つの実施形態によれば、単離された細胞集団は、妊娠の約１５週または２４週から得られる肺組織または肺器官と比較して、嚢胞の形成をもたらさない。
【０２５３】
１つの実施形態によれば、単離された細胞集団は、妊娠の約１５週または２４週から得られる肺組織または肺器官と比較して、界面活性タンパク質Ｃ（ｓｐ−Ｃ）および／またはＣＦＴＲの陽性発現をもたらす。
【０２５４】
本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を示す。
【０２５５】
用語「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの同根語は、「含むが、それらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。
【０２５６】
用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、「含み、それらに限定される（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。
【０２５７】
表現「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、さらなる成分、工程および／または部分が、主張される組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にだけ、組成物、方法または構造がさらなる成分、工程および／または部分を含み得ることを意味する。
【０２５８】
本明細書中で使用される場合、単数形態（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照物を包含する。例えば、用語「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または用語「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含めて、複数の化合物を包含し得る。
【０２５９】
本開示を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解しなければならない。従って、範囲の記載は、具体的に開示された可能なすべての部分範囲、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値を有すると見なさなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、具体的に開示された部分範囲（例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など）、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値（例えば、１、２、３、４、５および６）を有すると見なさなければならない。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。
【０２６０】
数値範囲が本明細書中で示される場合には常に、示された範囲に含まれる任意の言及された数字（分数または整数）を含むことが意味される。第１の示された数字および第２の示された数字「の範囲である／の間の範囲」という表現、および、第１の示された数字「から」第２の示された数「まで及ぶ／までの範囲」という表現は、交換可能に使用され、第１の示された数字と、第２の示された数字と、その間のすべての分数および整数とを含むことが意味される。
【０２６１】
本明細書中で使用される用語「方法（ｍｅｔｈｏｄ）」は、所与の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を示し、これには、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者に知られているそのような様式、手段、技術および手順、または、知られている様式、手段、技術および手順から、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者によって容易に開発されるそのような様式、手段、技術および手順が含まれるが、それらに限定されない。
【０２６２】
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供されることもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで、あるいは本発明の他の記載される実施形態において好適なように提供することもできる。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。
【０２６３】
本明細書中上記に描かれるような、および、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【実施例】
【０２６４】
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
【０２６５】
一般に、本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技術は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、米国メリーランド州バルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、米国ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク（１９９８）；米国特許の第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号および同第５２７２０５７号に記載される方法；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニューヨーク（１９８０）；利用可能な免疫アッセイ法は、特許と科学文献に広範囲にわたって記載されており、例えば：米国特許の第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号および同第５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌ���ｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらの文献の全ては、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。それらの文献に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０２６６】
一般的な材料および実験手順
胎児肺異種移植片
動物
動物を、Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの施設内動物管理使用委員会によって承認された条件のもとで維持した。使用されたマウス系統には、下記のものが含まれた：ＮＯＤ−ＳＣＩＤ、ＲＡＧ−／−、Ｂａｌｂ−Ｎｕｄｅ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ＣＤ４５．２）およびＣ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＣＡＧ−ＥＧＦＰ）１Ｏｓｂ／Ｊ。すべてのマウスが６週齢〜１０週齢であった。マウスを小型ケージにおいて飼育し（それぞれのケージにおいて最大で５匹の動物）、無菌餌および酸性水を与えた。
【０２６７】
動物手順
移植手順
胚性前駆体組織の移植を、以前の記載［Ｋａｔｃｈｍａｎ  Ｈ．他、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、（２００８）２６（５）：１３４７〜５５］の通り、全身麻酔（ＰＢＳにおける２．５％の２，２，２−トリブロモエタノール（９７％）を１０ｍｌ／ｋｇで腹腔内投与した）のもとで行った。（２００８）  ２６（５）：１３４７−５５］．
【０２６８】
腎臓被膜下における埋め込み
宿主の腎臓を左側の側方切開により露出させた。１．５ｍｍの切開を腎臓被膜の尾方端において行い、ドナー前駆体組織を、直径が１〜２ｍｍでの断片で腎臓被膜の下に移植した。
【０２６９】
妊娠の１５週から２４週にまで及ぶヒト胎児肺組織を、肺組織の使用のための文書によるインフォームドコンセントが、ヘルシンキ倫理委員会によって承認されたプロトコルに従って得られた合法中絶者から得た。胎齢を臨床情報に基づいて決定し、胎児の足長測定によって確認した。移植片組織が胎児肺に由来したことを保証するために、すべての肺葉のみを異種移植片組織の調製のために使用した。新鮮な下部気道を無菌条件下で１ｍｍ３〜３ｍｍ３の小片に切断した。手術を麻酔した免疫不全マウスに対して行い、ヒト胎児肺組織をそれぞれのマウスの腎被膜の真下に置いた（１個の小片）。異種移植片を移植後の種々の時点で採取した。
【０２７０】
Ｃ５７ＢＬマウスの腎臓被膜の下におけるマウス胚性肺の同系移植のために、種々の在胎期間の胚（妊娠の１４日〜１７日）から得られる肺を採取し、直径が１ｍｍ〜２ｍｍの断片で腎臓被膜の下に移植した。移植片組織が胎児肺に由来したことを保証するために、すべての肺葉のみを移植片組織の調製のために使用した。
【０２７１】
移植組織を受けた動物を移植後２週〜２０週で屠殺した。その後、移植された移植片を有する腎臓を取り出し、４％パラホルムアルデヒドにおいて固定処理し、または凍結保存した。
【０２７２】
組織切片をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）によって常法的に染色した。移植片の分化および機能の評価を組織化学的標識化および免疫組織化学的標識化によって行った。
【０２７３】
形態計測分析
在胎期間が異なるヒト胚性肺を、Ｏｐｔｉｍａｌ  Ｃｕｔｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅコンパウンド（ＯＣＴ）において凍結し、クライオカットで切断した。連続する１２ｉｍ切片を、一次のウサギ抗ヒトＣＫ５抗体（Ａｂｃａｍ）により、そして、二次のロバ抗ウサギＤａｙ  Ｌｉｇｈｔ５９４抗体により染色した。目的とする領域を、Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏプログラム（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、Ｃｒｏｆｔｏｎ、ＭＤ）を使用して定量化した。在胎期間が同じである肺の少なくとも３個〜４個の異なるサンプルを分析した。
【０２７４】
ナフタレン肺傷害
肺傷害研究のために、マウスに、トウモロコシ油に溶解されたナフタレン（９９％超の純度；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の腹腔内注射を、体重１ｋｇあたり２００ｍｇで、移植前４０時間〜４８時間において与えた。
【０２７５】
「二重肺」傷害のために、ナフタレン処置マウスにはさらに、（ナフタレン投与後４０時間〜４８時間において）放射線照射した。Ｃ５７ＢＬマウスには６ＧｙのＴＢＩにより放射線照射し、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスには３Ｇｙ〜４ＧｙのＴＢＩにより放射線照射した。
【０２７６】
肺の単一細胞懸濁物および移植
細胞の調製および注射
細胞懸濁物を、酵素消化された１５週〜２４週の肺から得た。簡単に記載すると、肺の消化を、組織を、０．１％のコラゲナーゼ、２．４Ｕ／ｍｌのディスパーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）および２．５ｍＭのＣａＣｌ２の存在下、３７℃で１時間、かみそり刃により細かく切り刻むことによって行った。非特異的な破片の除去を７０μｍおよび４０μｍのフィルターでの逐次ろ過によって達成した。
【０２７７】
ナフタレン（ＮＡ）、ＴＢＩまたは両方による前処置の後、それぞれの動物に、１×１０６個のＧＦＰ陽性胚性肺細胞を照射後４時間〜８時間において尾静脈に注射して移植した。
【０２７８】
フローサイトメトリー
ヒト（１５週〜２４週）およびマウス（１４週〜１７週）の胚性肺に由来する単一細胞懸濁物、ならびに、成体マウスおよび成人の単一細胞懸濁物を多染性フローサイトメトリーによって分析した。サンプルのすべてを製造者の説明書に従ってコンジュゲート化抗体または一致するイソタイプコントロールにより染色した。抗体を、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＢＤおよびＢｉｏｌｅｄｅｎｄから得た。研究で使用された抗体の完全なリストが本明細書中下記の表２に要約される。データをＬＳＲＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメーターで取得し、Ｆｌｏｗ  Ｊｏソフトウエア（バージョン７．６．５）を使用して分析した。
【０２７９】
免疫組織化学
動物を移植後の種々の時点で屠殺した；肺を４％ＰＦＡ溶液により膨らませ、２４時間保ち、その後、３０％スクロースにおいて凍結保存し、液体空気によって事前に冷却されたイソペンタンにおいて急速凍結し、または、パラフィン包埋のために処理した。パラフィンブロックを４μｍの切片で切断し、キシレンによる脱パラフィン化および再水和を以前の記載［Ｈｅｃｈｔ  Ｇ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  ｏｆ  Ｓｃｉ、（２００９）１０６（２１）：８６５９］の通りに行った後で染色した。研究で使用された抗体のまとめが本明細書中下記の表２に示される。すべての二次抗体を、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た。
【０２８０】
画像をＯｌｙｍｐｕｓデジタルカメラ（ＤＰ７０）によって取得し、時にはＡｄｏｂｅフォトショップ７．０によって処理した。すべての免疫組織化学的染色のために、陰性コントロールを、一次抗体を省き、一方、標識された二次抗体を加えることを除いて、同じ技術を使用して操作した。
【０２８１】
【表２】
2015500279.tif 000003
（備考、二次抗体のすべてをＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈまたはＡｂｃａｍから購入した）
【０２８２】
二光子顕微鏡法
画像化の前に、マウスを安楽死させたか、または、マウスに血管標識化のための血液トレーサーの量子ドット６５５ナノ粒子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）をＩ．Ｖ．注射し、その後、マウスを安楽死させた。肺を切除し、ガラスで覆われた画像化チャンバーの下に置いた。
【０２８３】
パルス化Ｍａｉ  Ｔａｉ（商標）Ｔｉ−サファイアレーザー（Ｎｅｗｐｏｒｔ  Ｃｏｒｐ．、ＣＡ）を組み込むＵｌｔｉｍａ（商標）Ｍｕｌｔｉｐｈｏｔｏｎ顕微鏡（Ｐｒａｉｒｉｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ）を使用した。レーザーを、ＥＧＦＰおよび血液トレーサーを同時に励起させるために８５０ｎｍに調整した。Ｏｌｙｍｐｕｓから得られる水浸型の２０×対物レンズ（ＮＡ０．９５）または４０×対物レンズ（ＮＡ０．８）、あるいは、１０×空気対物レンズ（ＮＡ０．３）を使用した。
【０２８４】
典型的なＺスタックを作製するために、ＧＦＰ細胞を含有する肺の切片を３μｍのＺステップによりおよそ３０μｍ〜１５０μｍの深さで走査した。データを、Ｖｏｌｏｃｉｔｙ（登録商標）ソフトウエア（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｃｏｖｅｎｔｒｙ、英国）を使用して分析した。
【０２８５】
マイクロＣＴ画像化
マイクロＣＴ画像化を全身麻酔（ＰＢＳにおける２．５％の２，２，２−トリブロモエタノール（９７％）を１０ｍｌ／ｋｇで腹腔内投与した）のもとで行った。
【０２８６】
インビボマイクロＣＴ実験を、２つの線源−検出器系を備えるＴｏｍｏＳｃｏｐｅ（登録商標）３０Ｓ  Ｄｕｏスキャナー（ＣＴ  Ｉｍａｇｉｎｇ、ドイツ）で行った。両方の線源管の操作電圧が４０ｋＶであった。第１のプロトコルおよび第２のプロトコルの積分時間が９０ｍｓ（３６０回転）および５分（３６００回転）であり、軸方向の画像を８０μｍの等方性分解能で得た。ＣＴデータの処理を、ＩｍａｇｅＪソフトウエアを使用して分析した。
【０２８７】
統計学的分析
群間の差をスチューデントｔ検定によって評価した。データが、示されるように、平均±ＳＤ、または、平均±ＳＥＭとして表される。データは、０．０５以下のｐ値について統計学的に有意であると見なした。
【０２８８】
実施例１
ヒト胚性肺前駆体組織を採取するための最適な‘窓’
種々の妊娠時点で採取されたヒト胚性肺組織の成長能
成長能および分化能に対する胚段階の影響を評価するために、１５週〜２４週のヒト胎児に起源を有する肺の胚性始原体組織を最初、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの腎被膜の下に移植した。全体として、移植後８週で調べたとき、すべての週齢のドナー組織に由来する移植片の９８％超が生存し、かつ、すべての回収された移植片が、新形成の証拠を回収された移植片のいずれにおいても伴うことなく、増大したサイズを明らかにした。それにもかかわらず、類似した移植が、より初期またはより後期の妊娠の肺をドナー組織として使用して試みられたときには、結果が明らかに異なっていた。
【０２８９】
図１Ａにおいて認められ得るように、２０週〜２２週で採取された組織（ｎ＝２５、サイズにおいて１ｍｍ〜３ｍｍ）では、妊娠の１５週〜１９週または２３週〜２４週で採取された組織と比較した場合（それぞれ、６１．６＋／−３．５ｍｍ、および、１０．６＋／−２．０ｍｍ）、移植後８週における高まった成長が示された（３００．７＋／−１５．２ｍｍのサイズに達した）。
【０２９０】
図１Ｂに肉眼的に示される成長している肺移植組織における種々の構造的属性の定量的評価を得るために、形態計測分析を用いた。
【０２９１】
図１Ｃ〜図１Ｆに示されるように、成人の肺組織とそれらの外観が類似している呼吸樹のすべての要素が、２０週〜２２週の組織から成長している移植組織において検出された。したがって、肺胞を伴う肺胞管の形成（図１Ｃ〜図１Ｆ）、線毛上皮により覆われる気管の形成（図１Ｅ）、筋層および軟骨の形成（図１Ｅ）、ならびに、肺胞上皮単層の形成（図１Ｆ）がすべて、成長中の移植組織によって示された。同様に、発達中の移植組織の機能的性質を定義するパラメーターが、界面活性剤を合成する能力、すなわち、界面活性タンパク質Ｃ（ｓｐ−Ｃ）について染色することによって検出可能である能力（図１Ｇ〜図１Ｈ）、および、イオンを輸送する能力、すなわち、ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜貫通調節因子）について染色することによって示されるような能力（図１Ｉ）によって示されているように、明らかに発現された。典型的には、成熟化プロセスの期間中において比較的後期に現れるこれらの機能的マーカーは、サイトケラチン１８（ＣＫ１８）を発現するより分化した要素と同時に生じており、また、移植前には２０週の組織において発現していない（データは示されず）。
【０２９２】
驚くべきことに、また、上記結果とは対照的に、１５週（図１Ｊ〜図１Ｌ）または２４週（図１Ｍ〜図１Ｏ）で採取された組織に起源を有する移植組織は嚢胞を発達させ、かつ、ｓｐ−Ｃ染色およびＣＦＴＲ染色について陰性であり（データは示されず）、一方、１８週の組織に起源を有する移植組織は、ｓｐ−ＣおよびＣＦＴＲについての染色を含めて、分化および成熟化のパターンのすべてを呈示したにもかかわらず（データは示されず）、形成された肺胞管はより狭く、かつ、肺胞壁はより薄いという点で（図１Ｐ〜図１Ｒ）、依然として不完全であった。まとめると、これらの結果は、移植のためのヒト胚性肺組織を採取するための最適な‘窓’が妊娠の２０週〜２２週の間であることを示唆する。
【０２９３】
種々の妊娠時点でのヒト胚性肺組織における幹細胞始原体およびそれらのニッチの特定
移植のための最適な‘窓’のヒト胚性肺組織を特定した後、この‘窓’組織における推定される幹細胞の存在を、より早期またはより後期の妊娠時点で採取された組織と比較して評価した。
【０２９４】
図２Ａ〜図２Ｄに示されるように、Ｈ＆Ｅ染色により、より多くの気管支構造および細気管支構造が、より早期の時点で採取された組織と比較して、２０週〜２２週で採取された組織において見出されることが明らかにされた。始原体レベルにおける潜在的な差異をこれらの組織において明確にするために、サイトケラチン５（ＣＫ５）およびサイトケラチン１４（ＣＫ１４）を発現することが以前に示される基底上皮肺細胞の推定される始原体亜集団の存在を調べた。これらの明確なマーカーが、より成熟したＣＫ８／ＣＫ１８陽性表現型の発現と並行して、分化したときにはダウンレギュレーションされる。
【０２９５】
図２Ｅにおいて認められ得るように、ＣＫ５陽性細胞の際立った頻度が、ＣＤ１４の発現と一緒に、太い気道において見出され（図２Ｆ）、一方、若干より少ない存在量が発達中の肺胞において見出された。さらに、この免疫組織化学的染色では、ＣＫ５＋細胞がネスチン＋細胞によって取り囲まれ（図２Ｇ）、それらの一部が、カルシトニン遺伝子関連タンパク質（ＣＧＲＰ）によって表される神経上皮小体の性質を示すことが明らかにされた。図２Ｈにおいて認められ得るように、この神経支配がさらに、神経フィラメント（ＮＦ）についての染色によって明らかにされ、このことから、骨髄において造血幹細胞について、また、成体マウスの気道において以前に明確にされた幹細胞ニッチと類似する幹細胞ニッチの構造が示唆される。さらに、このＢＭニッチに関するごく最近の報告と一致して、上皮のＣＫ５＋ニッチはまた、アルファ−平滑筋アクチン陽性細胞を含有し（図２Ｉおよび図５Ａ〜図５Ｄ）、かつ、ビメンチン＋間葉細胞を含有した（図２Ｊ）。
【０２９６】
重要なことに、形態計測分析により、妊娠の２０週〜２２週の‘窓’組織におけるＣＫ５＋始原体細胞の相対的に多い存在量が明らかにされた。このことは、最適な窓にはおそらくは、より多数のこれらの始原体が伴うことを示唆している。したがって、妊娠の２０週〜２２週で採取された組織において、ＣＫ５＋領域が、１５週および１７週の組織におけるそれぞれ、５．２６％±１．０６（ｐ＝０．０００６）および６．０５％±０．１８（ｐ＝０．００２）と比較して、平均して肺組織全体の１４．１％±５．６を表すことが見出された（図２Ｋ〜図２Ｏ）。
【０２９７】
まとめると、胚性肺を移植のための供給源として採取するためのこの‘好機の窓’が部分的には、ＣＫ５陽性の上皮始原体細胞の頻度およびそれらのそれぞれのニッチによって説明され得る。種々の胚性組織における他の推定される始原体をさらに調べるために、ＦＡＣＳ分析を、多能性のヒト肺幹細胞に起因すると近年では考えられるいくつかの表現型の存在を求めるために使用した。特に、２つの表現型に注目した。第１に、ｃ−ｋｉｔ（ＣＤ１１７）について陽性に染色され、かつ、ＣＤ３４を含む多くの分化マーカーについては陰性に染色されるまれな亜集団が、近年にはＫａｊｓｔｕｒａ他によって主に成体肺組織において記載され、しかし、胚性組織においてもまた記載され、著者らは、これらの細胞が、自己複製能［Ｋａｊｓｔｕｒａ  Ｊ．他、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、（２０１１）３６４（１９）：１７９５〜８０６；Ａｎｖｅｒｓａ  Ｐ．他、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、（２００１）１７（９）：１０３８〜９］を有し、かつ、すべての肺系譜のための再生能を有する多分化能の肺幹細胞を表すことを示唆した。しかしながら、Ｓｕｚｕｋｉ他は、胚性肺において、Ｃ−Ｋｉｔ＋細胞がまたＣＤ３４を発現し、おそらくは内皮始原体であると主張する［Ｍｏｏｄｌｅｙ  Ｙ．他、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、（２０１１）３６５（５）：４６４〜６；Ｓｕｚｕｋｉ  Ｔ．他、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｅｎｅ、（２０１０）１８１（１  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ）：Ａ４８９８］。したがって、Ｃ−Ｋｉｔ＋ＣＤ３４＋細胞の存在もまた評価した（図２Ｐ〜図２Ｚ）。
【０２９８】
その目的のために、妊娠の１６週、１８週および２０週で採取された酵素処理後のヒト胚性肺組織から得られる単一細胞懸濁物を、ＣＤ３４（造血始原体および内皮始原体に対して特異的）、ＣＤ４５（造血細胞）、ＣＤ３１（内皮細胞のためのマーカー）、ＣＤ１１７（ｃ−ＫＩＴ、初期始原体を特定するために）、ＣＤ２７１（ＮＧＦＲ、間葉系幹細胞マーカー）およびＣＤ３２６（ＥＰＣＡＭ、上皮分化マーカー）を含むいくつかの分化マーカーの発現について分析した。
【０２９９】
驚くべきことに、非造血系のＣＤ４５陰性集団は、ＣＤ３４ｈｉｇｈ細胞、ＣＤ３４ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ細胞およびＣＤ３４ｎｅｇａｔｉｖｅ細胞を含めて、３つの明確なＣ−Ｋｉｔ＋始原体集団を含むことが見出された（図２Ｐ〜図２Ｔ）。後者の集団は初期の多能性の成体肺幹細胞と適合するが、それ以外のＣＤ３４＋細胞は、高レベルのＣＤ３１もまた発現する内皮系譜に向かってより強く分化しているかもしれない（図５Ａ〜図５Ｉ）。
【０３００】
興味深いことに、Ｃ−Ｋｉｔ＋ＣＤ３４ｎｅｇ亜集団は、より初期の在胎期間の場合（０．１５％未満）またはコントロールとして使用された成体肺組織の場合（０．４５％未満）と比較して、２０週で採取された組織において明らかにより多く存在していた（ＣＤ３４ｎｅｇ集団の約２％〜３％にまで達した）（図６Ａ〜図６Ｌ）。これらの特異なＣ−Ｋｉｔ＋ＣＤ４５−ＣＤ３４−ＣＤ２７１−細胞はまた、Ｋａｊｔｕｒａ他と一致してＣＤ３１およびＣＤ３２６について陰性であり（図７Ａ〜図７Ｉ）、これらの特異な細胞もまた、免疫組織化学によって特定することができた。したがって、図３Ａ〜図３Ｃに示されるように、これらの推定される始原体が、太い気道の極近くに、主に血管周囲空間において、低いレベルで存在した。
【０３０１】
重要なことに、肺組織がＣＤ１１７およびＣＤ３４について免疫組織化学的染色によって分析されたとき、いくつかの明確な細胞亜集団が、ＦＡＣＳ分析によって見出される細胞亜集団と類似していることが見出された。２０週のヒト肺の分析が図４Ａ〜図４Ｋに示される；ＣＤ１１７＋細胞の大部分がＣＤ３４を共発現し、発達中の肺胞（図４Ｄ〜図４Ｇ）を取り囲む血管に存在し（図４Ａ〜４Ｃ）、一方、少ないＣＤ１１７＋単陽性細胞亜集団が、太い血管および太い気道の極近くに見出された（図４Ｈ〜図４Ｋ）。ＣＤ１１７＋細胞分布の類似するパターンが、より早期の在胎期間の肺組織において見出された（図８Ａ〜図８Ｄ）。しかし、ＦＡＣＳ分析によって明らかにされるような総割合が２０週の組織では著しくより大きかった（図２Ａ〜図２Ｚ）。さらに、図９Ａ〜図９Ｄに示されるように、２０週の胚性組織はまた、特異な役割を肺の微小血管修復において有するかもしれない初期および後期の内皮始原体細胞（ＥＰＣ）を呈示する。したがって、この組織はまた、２つの明確なＣＤ３４＋ＣＤ３１＋亜集団の存在を呈示することが見出された。第１の亜集団が、ＣＤ１４およびＣＤ４５についての陽性染色によって特定され、これに対して、第２の亜集団がＣＤ４５−ＣＤ１０５＋であり、このことは、ヒト末梢血におけるＥＰＣのこれら２つの主要なタイプの存在を示唆する以前の研究と一致している［Ｙｏｄｅｒ  ＭＣ他、Ｂｌｏｏｄ、（２００７）１０９（５）：１８０１〜９］。‘初期ＥＰＣ’と呼ばれる前者は、インビトロでの早期成長、ＣＤ３４／ＣＤ３１／ＣＤ１４の陽性、管をマトリゲル管形成アッセイにおいて形成できないこと、および、高レベルのサイトカイン分泌によって特徴づけられる。もう一方のタイプのＥＰＣは、‘後期伸長ＥＰＣ’、‘伸長内皮細胞（ＯＥＣ）’または‘内皮コロニー形成細胞（ＥＣＦＣ）’と呼ばれるものであり、ＣＤ３１およびＣＤ１０５の陽性、ＣＤ４５およびＣＤ１４の欠如、ならびに、免疫不全マウスにゲルにおいて埋め込まれたときにはヒト血管を自発的に形成し、これにより、全身循環のマウス血管と一体化する特異な能力によって特徴づけられる。
【０３０２】
実施例２
‘窓’胚性肺移植片の再生能についてのマウスモデルにおける概念の証明
マウス胚性肺前駆体組織を移植のために採取するための最適な‘窓’
胚性肺由来組織の潜在的治療能力を適切なマウスモデルにおいて評価するために、マウス胚性肺を移植のために採取するための最適な‘窓’を最初、そのヒト対応体に関して明確にした。したがって、マウス肺の胚性組織を種々の妊娠時点（Ｅ１４〜Ｅ１７）で採取し、同系マウスの腎臓被膜の下に埋め込み、移植後８週で、移植組織を、肺の実質、気管支構造および肺胞構造について、同様にまた、線維症および嚢胞の望まれない存在について評価した。
【０３０３】
図１０Ａ〜図１０Ｅにおいて認められ得るように、被膜下腎移植後１２週で、Ｅ１４およびＥ１７の肺組織は嚢胞性組織および線維症組織の形成をもたらし（図１０Ａ〜図１０Ｂ）、一方、Ｅ１５〜Ｅ１６のマウス胚性肺は、さらに分化し、肺胞段階に達する際立った能力を呈示した（図１０Ｃ〜図１０Ｅ）。したがって、ヒト肺組織と類似して、肺発達の小管段階が、移植のための組織の採取のための最適な‘窓’を提供する（図１０Ｆ）。また、ヒト‘窓’組織と類似して、Ｅ１６の肺組織は肺胞を何ら呈示しなかった（図１１Ａ）；ＣＫ−５陽性細胞が、太い気道に多く存在し、かつ、数多くの神経上皮小体がサンプル全体に見出され、これらはＣＧＲＰについて陽性に染色され、骨髄および成体マウス肺と類似して（図１２Ａ〜図１２Ｆ）、ニッチにおいて局在化していた（図１１Ｂ）。同様に、ＣＣＳＰ陽性細胞が、太い気道の領域において見出され、この領域は、幹細胞ニッチを連想させるネスチン陽性細胞に富み（図１１Ｃ）、また、アルファ−ＳＭＡ陽性細胞によって取り囲まれていた（図１１Ｄ）。
【０３０４】
加えて、それらのヒト対応物と類似して、Ｅ１５〜Ｅ１６の組織は、ＣＤ４５−ＣＤ３１−ＥｐＣＡＭ＋ＣＤ２４＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ１０４＋細胞のＦＡＣＳ分析によって示されるように、初期またはより後期の妊娠組織と比較して、推定される始原体により富化された。なお、この細胞は近年、推定される肺始原体として成体マウス肺において立証された［ＭｃＱｕａｌｔｅｒ  ＪＬ他、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、（２０１０）１０７（４）：１４１４］。したがって、Ｅ１３、Ｅ１４、Ｅ１５およびＥ１６の単一細胞懸濁物の代表的なＦＡＣＳ分析を示す図３Ｅ〜図３Ｙにおいて認められ得るように、顕著により大きいレベルのＣＤ４５−ＣＤ３１−ＥｐＣＡＭ＋ＣＤ２４＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ１０４＋細胞が、Ｅ１３およびＥ１４の組織におけるレベル（それぞれ、０．００２±０．０００５７％、および、０．０１２±０．００５７％）と比較して、Ｅ１５およびＥ１６の肺組織において見出された（それぞれ、０．０６２％±０．００７、および、０．０７３％±０．００５）。
【０３０５】
肺傷害を処置するためのＥ１６マウス胚性肺細胞の移植
Ｅ１５〜Ｅ１６の組織が、移植されたとき、際立った成長能および分化能を呈示することを考慮して、この‘窓’組織を肺傷害についてマウスモデルにおいてさらに評価した。
【０３０６】
その目的のために、これらの細胞を最初、以前の記載［Ｓｔｒｉｐｐ  Ｂ他、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、（１９９５）２６９（６）：７９１］のように、ナフタレンによる傷害誘導に基づくモデルにおいて評価した。（１９９５）  ２６９（６）：７９１］この肺傷害モデルは、肺のクララ細胞の発現における変化によって検出可能である軽度の上皮障害によって引き起こされる肺疾患を模倣する。
【０３０７】
呼吸細気管支および気管支肺胞接合部におけるクララ細胞の特定の解剖学的局在化により、ナフタレン暴露後の傷害部位を正確に突き止めることが可能であり、また、胚性‘窓’細胞の単一細胞懸濁物が同系レシピエントにおいてコロニー形成し、傷害を受けた上皮層を修復することができるかを試験することが可能であった。
【０３０８】
ナフタレン投与の２日後、レシピエントＣ５７ＢＬマウスに、ＧＦＰ陽性妊娠マウスに由来する１×１０６個のＥ１６肺細胞を注入した。続いて、処置された動物の肺をＧＦＰ陽性細胞の存在について種々の時点で組織学的に評価した。これらの初期実験（示されず）では、ナフタレンによるクララ細胞の消失が一時的であり、ドナー由来のクララ細胞の有意な生着および発達を可能にすることができなかったことが明らかにされた。したがって、本発明者らは、より攻撃的な前処置療法、すなわち、定住幹細胞の増殖をより効果的に除くことが、骨髄移植後のキメラ現象誘導を測定する研究において一般に見出されるような、ドナー細胞の再生能力を評価するために必要であるかもしれないと仮定した。
【０３０９】
この仮定を検証するために、ナフタレン傷害後４０時間で、動物をさらに、亜致死的ＴＢＩ（６Ｇｙ）により処置して、その結果、事前のナフタレン処置によって増殖することが潜在的に誘導される定住肺幹細胞を排除するようにした。
【０３１０】
１日後、マウスはＥ１６肺細胞を受け、それらの肺におけるドナー由来細胞の生着および発達についての経過を、形態計測分析と一緒になった免疫組織化学的染色によって、同様にまた、２光子顕微鏡法によって追った。
【０３１１】
図１３Ａ〜図１３Ｃに示されるように、レシピエントの肺におけるドナー由来細胞の生着を示すＧＦＰ陽性‘部分’が、ＴＢＩ単独（図１３Ａ）またはナフタレン単独（図１３Ｂ）と比較して、ナフタレンと６ＧｙのＴＢＩとの両方により前処置されたマウス（図１３Ｃ）において、移植後３０日で顕著に高まった。肺のキメラ現象レベルに対する前処置のこの際立った影響が、合計で９匹のマウスを各群に含む３つの独立した実験において見出されるＧＦＰ部分の形態計測分析を示す図１３Ｄに定量的に明らかにされる。したがって、ｍｍ３あたり５５個の増殖巣のドナー由来増殖巣が、ナフタレンおよび６ＧｙのＴＢＹにより前処置されたマウスにおいて見出されたが、ｍｍ３あたりほんの１０個〜１２個の増殖巣、および、ｍｍ３あたり２個〜３個の増殖巣が、ナフタレンまたはＴＢＩにより単独で前処置されたマウスにおいてそれぞれ見出された。
【０３１２】
キメラ肺を示すマウスの免疫組織化学的検査ではさらに、レシピエントの肺における機能的要素への一体化のレベルが明らかにされた。図１４Ａに示されるように、処置されていないコントロールマウスの太い気道の内腔は明らかに、ＣＣＳＰ＋クララ細胞の存在を呈示しており、これらの細胞は消失および剥離を前処置の直後に経た（図１４Ｂ）。しかしながら、選ばれた前処置の後で移植を受けたマウスは、移植後３０日において、新しい上皮層の形成を呈示し、生着したＧＦＰ＋細胞が気管支内腔において見出された。これらのドナー由来ＧＦＰ＋細胞は宿主の気管支および肺胞の気道に合体し、Ｖ−カドヘリンについての染色によって示されるように血管形成した（図１４Ｃ）；それらはまた、ＣＣＳＰを発現し（図１４Ｄ〜図１４Ｆ）、Ｓｐ−ｃ発現（図１４Ｇ〜図１４Ｉ）およびＣＦＴＲ発現（図１４Ｊ〜図１４Ｌ）について陽性であった。このことは、界面活性剤を産生し、かつ、イオン輸送に関与するそれらの能力を示唆している。予想されたように、これらの特異的な機能的マーカーが、生着したＧＦＰ＋細胞によって、それらの部位に従って示差的に示された。したがって、太い気道において、これらの細胞はＣＣＳＰについて陽性であり、また、肺胞において、生着した細胞はｓｐ−Ｃについて陽性であり、しかし、これらの細胞のすべてが、ＣＦＴＲを発現することが見出された。このことは、嚢胞性線維症（ＣＦ）の潜在的な矯正について特に重要である。
【０３１３】
興味深いことに、移植後のより後期の時点で調べられたとき、最初の増殖巣がサイズにおいて明らかに成長し続け、それにより、生着した肺のより大きな割合を占有し続けた。このことが、蛍光性の血管標識化のための赤色量子ドットによる血管の生体共染色（データは示されず）を伴って、または伴うことなく、屠殺直後の肺を直接に見ることを可能にする２光子顕微鏡法によってさらに明らかにされた。図１５Ａ〜図１５Ｃにおいて認められ得るように、ドナータイプの細胞による肺の適度な生着が、気管支肺胞構造および血管構造における移植されたＧＦＰ＋細胞の優勢な一体化（図１５Ａ〜図１５Ｂ）を伴って移植後６週で見出されたが、肺組織のほぼ３分の１を占めるドナータイプの細胞のさらなる進行が移植後４ヶ月において見出された（図１５Ｃ）。
【０３１４】
さらに、移植後１６週におけるこれらのキメラ肺の免疫組織化学的評価では、ドナー由来細胞の完全な一体化が、血管の境界部でのガス交換表面において、また、肺胞上皮構造において明らかにされた（図１６Ａ〜図１６Ｌ）。したがって、ＧＦＰ＋細胞が、瘢痕形成または線維症の兆候を伴うことなく、血管および移植された肺の上皮区画に組み込まれていることが、ＣＤ３１抗体および抗汎サイトケラチン抗体による三重染色によって見出された（図１６Ａ〜図１６Ｄおよび図１７Ａ〜図１７Ｅ）。同様に、ＡＱＰ染色（図１６Ｅ〜図１６Ｈ）およびＳＰ−Ｃ染色（図１６Ｉ〜図１６Ｌ）により、ドナー由来細胞がＩ型肺胞細胞およびＩＩ型肺胞細胞のガス交換表面において取り込まれていることがそれぞれ明らかにされた。
【０３１５】
まとめると、これらの結果は、‘窓’組織から採取された胚性肺細胞が肺組織修復のための新規な細胞供給源を提供し得ることを強く示唆している。さらに、そのような細胞による治療は、亜致死的な前処置と併用されるならば、より効果的であり得ることが予想される。だが、このことは、宿主の肺始原体が進行中の傷害によって著しく消失させられる臨床状況ではあまり重要でないかもしれない。
【０３１６】
２０週〜２２週のヒト胚性肺に由来する単一細胞懸濁物の、ナフタレンおよびＴＢＩによる肺傷害誘導の後におけるＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスへの移植
‘窓’のヒト胚性肺細胞が傷害を受けた肺に一体化し得るかを調べるために、肺傷害モデルを免疫不全ＳＣＩＤマウスにおいて確立した。ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスはＴＢＩに対してより感受性であることを考慮して、３．０ＧＹのＴＢＩを、上記のマウスドナー組織による研究において使用される６．０ＧｙのＴＢＩの代わりに使用した。さらに、遺伝子によるＧＦＰ標識化に代わる代替として、マウス特異的抗体およびヒト特異的抗体による免疫組織化学を、宿主およびドナーの上皮細胞、内皮細胞および間葉細胞を識別するために使用した。
【０３１７】
例えば、２０週のヒト胚性肺細胞の酵素消化の後で採取された１×１０６個の細胞が、ＮＡ単独により前処置されたＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに注入された場合、感知できるレベルの生着が何ら生じなかった（データは示されず）が、際立ったキメラ現象が、ナフタレンと、３．０ＧｙのＴＢＩによるそれに続く処置とにより前処置されたＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに同じ数の細胞が注入された後では達成された（図１８Ａ〜図１８Ｉおよび図１９Ａ〜図１９Ｆ）。
【０３１８】
最初の短期実験において、ヒト胚性（２０週）肺に由来する単一細胞懸濁物を追跡用蛍光色素の５−（および−６）（（（４クロロメチル）ベンゾイル）アミノ）テトラメチルローダミン）（ＣＭＴＭＲ）により染色し、細胞を、前処置されたＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに注入した。２週間後に調べたとき、生着したヒト細胞を、同系移植モデルにおいて見出されるＧＦＰ＋部分（図２４Ｂ）と類似して、レシピエントマウスの肺における明確な部分において視覚化することができた（図２４Ａ）。ＣＭＴＭＲ染色は一過性であるので、第２の一組の実験を、図２４Ｆ〜図２４Ｈにおける二重染色によって確認されるように、コントロールのヒト組織との交差反応性がない抗マウスＭＨＣ抗体（図２４Ｃ〜図２４Ｅ）、および、コントロールのマウス組織との交差反応性がない抗ヒトサイトケラチンＭＮＦ１１６抗体（これはヒト上皮細胞を染色する）を使用する免疫組織化学的染色によって移植後のより後期の時点においてヒトおよびマウスの細胞を識別するために行った。
【０３１９】
重要なことに、移植後６週において、これらの抗体による二重染色は、著しいレベルのキメラ現象を明瞭に明らかにした。低倍率のマウス気管支を示す図１８Ａ〜図１８Ｃにおいて認められ得るように、マウスマーカーおよびヒトマーカーによる二重染色は、肺構造へのヒト由来細胞の取り込みを明瞭に明らかにしており、このことをさらに、高倍率の２つの異なる視野のもとで認識することができる（それぞれ、図１８Ｄ〜図１８Ｆおよび図１８Ｇ〜図１８Ｉ）。
【０３２０】
第３の一組の実験において、２０週で採取されるヒト胚性肺細胞を、ＮＡおよびわずかにより大きいＴＢＩ（４Ｇｙ）により処置されるＮＯＤ−ＳＣＩＤに移植した。
【０３２１】
マウス肺を識別のためのさらなる抗マウスマーカーおよび抗ヒトマーカーにより移植後７週で染色した。したがって、マウス抗ヒトサイトケラチンＭＮＦ１１６抗体（これはヒト上皮細胞を染色する）、マウス抗ヒトＶ９（これは、間質細胞に典型的であるビメンチン９を染色する）およびマウス抗ヒトＣＤ３１（これは内皮細胞を染色する）を一緒に混合し、組織切片に置いた；その後、切片を、Ｄａｙｌｉｇｈｔ４８８（緑色）により標識された二次の抗マウスＩｇＧ抗体とインキュベーションした。図１９Ａおよび図１９Ｄは、この抗体カクテルによるマウス肺の気管支構造におけるヒト組織の選択的染色を示す。マウス肺におけるマウス起源の細胞をＢａｎｄｅｒｉａレクチンにより染色した。後者は、マウスの上皮細胞および内皮細胞に発現されるα−Ｇａｌ成分に結合することが知られており、また、認められ得るように、単独でモニターされるとき（図１９Ｂおよび図１９Ｅ）、または、ＭＮＦ染色と併用される場合（図１９Ｃおよび図１９Ｆ）、ヒト組織との交差反応性がない。さらに、類似するマーカーを使用した場合、際立ったキメラ現象がまた、移植を受けたマウスの肺胞において検出することができた（図２０Ａ〜図２０Ｆ）。重要なことに、ヒト胚性細胞の移植に由来するヒト肺細胞はまた、いくつかの重要な機能的マーカーを呈示することが見出された。
【０３２２】
図２１Ａ〜図２１Ｃにおいて認められ得るように、サイトケラチンの全般的マーカーと一緒での、上記カクテルによって緑色で表されるヒト細胞の二重染色（図２１Ａ）は、マウス起源およびヒト起源の両方のすべての上皮細胞の染色をもたらした（図２１Ｂ）。このことは、生着した肺におけるヒト細胞集団に含まれる明確な上皮細胞を例示する（図２１Ｃ）。同様に、Ｉ型肺胞細胞に典型的なアクアポリン−５（ＡＱＰ−５）について陽性であるヒト細胞（図２２Ａ〜図２２Ｃ）、および、ＩＩ型肺胞細胞に特徴的である界面活性タンパク質Ｃ（ＳＰ−Ｃ）について陽性であるヒト細胞（図２３Ａ〜図２３Ｆ）が、移植後７週で、移植を受けた動物のキメラ肺の中において明瞭に識別された。
【０３２３】
したがって、ヒト由来肺細胞は、傷害を受けたマウス肺に取り込まれるだけでなく、ガス交換を行うために要求されるＡＱＰ−５、または、肺胞による界面活性剤の産生を示すＳＰ−Ｃもまた発現する。
【０３２４】
胚性肺由来幹細胞による処置は奇形腫発生が伴わない
胚性幹細胞移植におけるほとんどの論争中の問題の１つが、それによりそれらの臨床適用が制限されているが、移植された組織の潜在的な腫瘍原性である。本発明者らが種々のブタ胚性前駆体組織についての最適な‘窓’を明確にすることを試みた以前の研究では、結果は、Ｅ２８を超えた場合、試験された組織のどれもが、奇形腫形成に対する危険性を何ら呈示しないことを示した［Ｅｖｅｎｔｏｖ−Ｆｒｉｅｄｍａｎ  Ｓ他、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、（２００５）１０２（８）：２９２８］。したがって、胚性肺が胚形成において遅れて発達すること、および、それにしたがって、マウス、ブタまたはヒトの胚性肺組織のための選ばれた‘窓’が妊娠の比較的後期の段階を表すことを考慮すると、そのような前駆体組織に伴う奇形腫誘導に対する危険性は非常に低いと考えられる。しかしながら、この重要な問題をさらに証明するために、移植を受けたマウス（ｎ＝３０）の詳細な組織学的分析を移植後１２ヶ月に至るまで行った；移植された肺組織における何らかの腫瘍の証拠が全く見出されなかった。さらに、移植を受けたマウスの肺マイクロＣＴ（８０μｍの分解能）による長期追跡調査では、これらのマウスにおける疑われる占拠性病変が何ら明らかにされなかった。代表的な画像とともにこれらの結果のまとめが図２５Ａ〜図２５Ｄに明らかにされる。
【０３２５】
考察
今回の結果は、マウスまたはヒトの肺の胚性組織が、小管段階で得られた場合、移植による組織置換のための最適な供給源を提供し得ることを例示する。さらに、ヒト胚性肺は、初期の始原体に富むものであり、その属性が、造血系疾患における移植のための使用がこの１０年間にわたって劇的に増大している骨髄および臍帯血の組織に類似することが提案された。同系マウスまたはＳＣＩＤマウスに埋め込まれたときに最適な成長および分化を呈示した‘窓’胚性組織は、より初期またはより後期の妊娠時点に由来する組織と比較して、様々な上皮始原体、間葉始原体および内皮始原体について著しく富化される。そのうえ、これらの初期始原体の、それらのそれぞれの胚性組織における詳細な分析では、上皮始原体が、骨髄における造血幹細胞ニッチについて広範囲に記載されるニッチと類似する特定のニッチに存在することが明らかにされた。したがって、今回の結果から、推定される肺始原体細胞の近傍において、内皮細胞、ネスチン陽性細胞および間葉細胞（これらもまた、ＣＧＲＰおよび神経フィラメントについての陽性染色によって見出されるように、典型的には神経支配される）の集合が立証された。これらの結果は、成体マウス肺における幹細胞ニッチの潜在的な存在を示す研究と一致している［Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ  ＪＦ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ、（２００１）２４（６）：６４９〜５２］。
【０３２６】
ヒト胚性肺始原体ニッチの出現と相関させて、移植における胎児組織の使用のための最適な窓を明確にすることに加えて、本研究はまた、ヒト肺始原体の表現型に関する進行中の論争に光を当てている。例えば、Ｋａｊｓｔｕｒａ他［Ｋａｊｓｔｕｒａ他、２０１１、上掲］は、すべての他のマーカーについて陰性であり、かつ、太い気道構造に近い離散している血管周囲領域に存在するｃ−ｋｉｔ＋細胞の小さい集団を記載したが、本発明者らは、Ｓｕｚｕｋｉ他（Ｓｕｚｕｋｉ他、２０１０、上掲）によって示唆されるように、発達中の肺胞において、ＣＤ３４抗原およびＣＤ３１抗原の両方を発現するＣＫ５＋始原体の極近くにおいて血管に存在する別のｃ−ｋｉｔ＋細胞集団を見出した。したがって、この場合に特徴づけられる‘窓’肺胚性組織は、両方の推定されるｃ−ｋｉｔ陽性始原体集団を含有する。ｃ−ｋｉｔ陽性細胞の近い近接性およびＣＫ５＋上皮始原体との潜在的相互作用は、ｃ−ｋｉｔが引き金になることが肺胞構造の正常な発達および維持のために非常に重要であるという最近の示唆［Ｌｉｎｄｓｅｙ  ＪＹ他、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、（２０１１）１８３（１  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ａｂｓｔｒａｃｔ）：Ａ２４４５］と一致している。
【０３２７】
重要なことに、「最適な小管窓」組織により、より初期の発達段階に由来する肺組織に関して、最高レベルのすべてのタイプの始原体が示される；したがって、本発明者らは、未分画細胞混合物の静脈内移植が、骨髄移植において使用される方法論と類似して、好ましい取り組みであり得るかもしれないと仮定した。実際、Ｅ１５〜Ｅ１６のマウス肺組織または２０週〜２２週のヒト肺組織の単一細胞懸濁物の移植では、ナフタレンおよび６．０Ｇｙの亜致死的ＴＢＩを組み合わせることによって誘導される肺傷害の後におけるこれらの細胞の顕著な再生能力が明らかにされた。非常に重要なことに、移植に先立つこのレベルの前処置が、ナフタレンによる傷害誘導の後で見出されるように、宿主の肺始原体が著しいレベルで存在したときにはキメラ現象を確立するために必要であった。同様なことが近年にはＤｕｃｈｅｓｎｅａｕ他によって認められ［Ｄｕｃｈｅｓｎｅａｕ  Ｐ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、（２０１０）１８（１０）：１８３０〜６］、Ｄｕｃｈｅｓｎｅａｕ他は、肺構造における骨髄由来細胞の生着が、ナフタレンに加えて骨髄破壊的薬剤のブスルファンを使用して前処置を強化することによって顕著に増強され得ることを明らかにした。明らかに、前処置のためのこの要求は、病理学的プロセスによって影響される宿主始原体に対する肺傷害のレベルに依存して、その強度が種々の臨床状況では変化するかもしれない。
【０３２８】
まとめると、今回の結果から、宿主肺の種々の区画における影響されにくい生着、および、下記の要素を含む呼吸ユニット全体の影響されにくい形成が明らかにされた：ａ）ＧＦＰ＋のＣＣＳＰ＋細胞によって証明されるように、小さい細気管支における新たに形成された上皮細胞、ｂ）肺胞内のガス交換表面のために重要である肺細胞１型細胞（ＧＦＰ＋  ＡＱＰ−５＋）、ｃ）肺胞における界面活性剤産生のために重要である肺細胞２型細胞（ＧＦＰ＋  Ｓｐ−Ｃ＋）、ｄ）脈管構造におけるＧＦＰ＋  ＣＤ３１＋細胞の影響されにくい存在。加えて、生着した組織により、呼吸要素と一緒に、とりわけＣＦ患者については非常に重要な、イオン輸送のために要求されるＣＦＴＲの発現が呈示される。
【０３２９】
「二重傷害」後におけるこのかなり劇的な生着は、それぞれの薬剤が単独で用いられる前処置とは対照的に、宿主の始原体とドナーの始原体との間における、それらのそれぞれのニッチについての競合によって説明されるかもしれない。Ｒｅｙｎｏｌｄｓ他［Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ＳＤ他、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、（２００４）２８７（６）：Ｌ１２５６〜６５］は、ＣＣＳＰ発現細胞集団のナフタレンによる排除により、二次的な肺胞炎症、浮腫、および、肺胞のＩＩ型細胞集団の枯渇化がもたらされることを明らかにした。したがって、選択的な気道傷害は、重度に損なわれた肺胞機能によって特徴づけられる疾患において誘発傷害として役立ち得ることを明らかにした。さらに、Ｖｏｌｓｃａｅｒｔ他［Ｖｏｌｃｋａｅｒｔ  Ｔ他、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、（２０１１）１２１（１１）：４４０９］は、胚のＷｎｔ／Ｆｇｆ１０シグナル伝達カスケードが、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達およびそれに続く上皮から間葉への移行を活性化する様式で、ナフタレン誘導傷害後の成熟した傍気管支平滑筋細胞（ＰＳＭＣ）において再活性化されることを明らかにした；この発見は、この胚経路の活性化がおそらくは、種々の胚区画における胚性肺由来組織の効果的な取り込みのための引き金として役立ち得ることを示している。同様に、放射線誘導の肺傷害は、血液−肺胞バリアの破壊および微小循環機能障害を誘導することが示され、それにより、ドナー由来内皮細胞の優勢を可能にすることができた（４５〜４７）。
【０３３０】
関与する機構にかかわらず、細気管支構造および肺胞構造の両方において達成されるドナー由来細胞のマウスモデルにおける際立った生着は驚くべきものである。このキメラ現象は、時間とともに増大しており、初期の自己複製する多能性幹細胞の子孫が、より後期の前駆体に由来する宿主細胞またはドナー細胞に徐々に取って代わることを可能にする埋め込まれた胚性肺組織における多数のドナー始原体に起因しているとおそらくは考えられ得る。
【０３３１】
類似した肺一体化および肺発達がまた、ヒト肺始原体をＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおいて試験したときに認められた。だが、この系では、マウスのサイトカインとのクロストークの潜在的な喪失が生着を低下させるかもしれない。したがって、３組の実験において、今回の結果は、ドナー由来のヒト細胞が細気管支構造および肺胞構造の両方に合体し、これにより、同系の胚性マウス肺細胞について上記で記載される特徴と類似する特徴を呈示したことを例示した。
【０３３２】
さらなる研究が、成功した移植を同種レシピエントにおいて可能にするであろう最適な免疫抑制プロトコルを明確にするために必要である。一般に、初期の胚段階は、埋め込まれたドナー組織をそれほど免疫原性にしないかもしれない；しかしながら、胚性組織の移植片は拒絶の間接的経路を逃れることができない。それにもかかわらず、この難題は、共刺激遮断を誘導する作用因を含むプロトコルによって対処することができる。代替において、胚性肺組織における造血始原体の際立ったレベル（未発表の結果）は、移植後におけるドナー由来肺細胞に対する中枢性免疫寛容を誘導し得る造血キメラ現象を生じさせるかもしれない。加えて、２０週〜２２週の肺組織の単一細胞懸濁物を凍結保存するという可能性は移植片の利用可能性を著しく強化し得るので、この可能性はまた、臍帯血のためのようなＨＬＡ型分類されたドナーのバンクを確立することを可能にするかもしれず、したがって、潜在的には免疫抑制要求を軽減し得る。
【０３３３】
最後に、今回の‘窓’マウス胚性組織は、移植後長期間にわたって経過を追ったとき、奇形腫の危険性を高分解能（８０μｍ）マイクロＣＴによって、同様にまた、追跡調査期間終了時における病理学的検査によって何ら呈示しなかった。
【０３３４】
要約すると、今回の結果は、妊娠の小管段階が、マウスおよびヒトの胚性肺前駆体組織を再生移植のために採取するための最適な‘窓’を提供することを初めて明らかにする。奇形腫の危険性がないこの組織は、骨髄におけるＨＳＣと類似して、免疫組織化学によってそれらのそれぞれのニッチにおいて特定されたいくつかの始原体タイプについて高度に富化されている。際立った生着、分化、および、傷害を受けた肺へのこれらの始原体の影響されにくい取り込みが、胚性肺組織の酵素消化により調製される単一細胞懸濁物の注入によってもたらされ得る。骨髄移植の場合のように、肺キメラ現象の誘導は、宿主タイプの内因性前駆体との競合を軽減するように、前処置の何らかの形態に依存している。多能性幹細胞を成体肺から単離し、これらの細胞を再生移植のために培養において拡大するための様々な試みが主張されているが、今回の結果は、妊娠の２０週〜２２週で採取された胚性肺組織が潜在的には、肺修復のためのより簡便な代替様式を提供し得ることを明らかにしている。
【０３３５】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。
【０３３６】
本明細書で挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、個々の刊行物、特許および特許出願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。節の見出しが使用されている程度まで、それらは必ずしも限定であると解釈されるべきではない。
【図１Ａ−１Ｉ】
2015500279.tif 000004
【図１Ｊ−１Ｒ】
2015500279.tif 000005
【図２Ａ−２Ｊ】
2015500279.tif 000006
【図２Ｋ−２Ｏ】
2015500279.tif 000007
【図２Ｐ−２Ｚ】
2015500279.tif 000008
【図３Ａ−３Ｃ】
2015500279.tif 000009
【図４Ａ−４Ｋ】
2015500279.tif 000010
【図５Ａ−５Ｄ】
2015500279.tif 000011
【図６Ａ−６Ｌ】
2015500279.tif 000012
【図７Ａ−７Ｉ】
2015500279.tif 000013
【図８Ａ−８Ｄ】
2015500279.tif 000014
【図９Ａ−９Ｄ】
2015500279.tif 000015
【図１０Ａ−１０Ｆ】
2015500279.tif 000016
【図１１Ａ−１１Ｉ】
2015500279.tif 000017
【図１１Ｊ−１１Ｙ】
2015500279.tif 000018
【図１２Ａ−１２Ｆ】
2015500279.tif 000019
【図１３Ａ−１３Ｄ】
2015500279.tif 000020
【図１４Ａ−１４Ｌ】
2015500279.tif 000021
【図１５Ａ−１５Ｃ】
2015500279.tif 000022
【図１６Ａ−１６Ｌ】
2015500279.tif 000023
【図１７Ａ−１７Ｅ】
2015500279.tif 000024
【図１８Ａ−１８Ｉ】
2015500279.tif 000025
【図１９Ａ−１９Ｆ】
2015500279.tif 000026
【図２０Ａ−２０Ｆ】
2015500279.tif 000027
【図２１Ａ−２１Ｃ】
2015500279.tif 000028
【図２２Ａ−２２Ｃ】
2015500279.tif 000029
【図２３Ａ−２３Ｆ】
2015500279.tif 000030
【図２４Ａ−２４Ｈ】
2015500279.tif 000031
【図２５Ａ−２５Ｄ】
2015500279.tif 000032
【国際調査報告】
2015500279.tif 000033
2015500279.tif 000034