(57)【要約】本文書は、酸性αグルコシダーゼ活性、および分子複合体の、哺乳類細胞の内部へ輸送される能力の増強をもたらす少なくとも１つの改変を有する分子複合体に関する。例えば、酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）活性を有し、かつ少なくとも２つのポリペプチドを含む単離された分子複合体であって、それぞれのポリペプチドが、配列番号１において示されるアミノ酸配列のセグメントと少なくとも８５％の配列同一性を有し、それぞれのセグメントが、アミノ酸５０とアミノ酸７４との間の１またはそれより多くの部位での、配列番号１において示されるアミノ酸配列のタンパク質分解によって誘導され、前記分子複合体が、前記分子複合体の、哺乳類細胞の内部へ輸送される能力の増強をもたらす少なくとも１つの改変を含む、単離された分子複合体が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）活性を有し、かつ少なくとも２つのポリペプチドを含む単離された分子複合体であって、それぞれのポリペプチドが、配列番号１において示されるアミノ酸配列のセグメントと少なくとも８５％の配列同一性を有し、それぞれのセグメントが、アミノ酸５０とアミノ酸７４との間の１またはそれより多くの部位での、配列番号１において示されるアミノ酸配列のタンパク質分解によって誘導され、前記分子複合体が、前記分子複合体の、哺乳類細胞の内部へ輸送される能力の増強をもたらす少なくとも１つの改変を含む、単離された分子複合体。
【請求項２】
それぞれのセグメントが、アミノ酸６０とアミノ酸６５との間の１またはそれより多くの部位での、配列番号１において示されるアミノ酸配列のタンパク質分解によって誘導される、請求項１に記載の分子複合体。
【請求項３】
前記複合体が、少なくとも３つのポリペプチドを含む、請求項１に記載の分子複合体。
【請求項４】
配列番号１において示されるアミノ酸配列の前記タンパク質分解が、配列番号１において示されるアミノ酸配列のアミノ酸７１９とアミノ酸７４６との間での１もしくはそれより多くの部位での切断またはアミノ酸１３７とアミノ酸１５１との間の１もしくはそれより多くの部位での切断をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の分子複合体。
【請求項５】
前記複合体が、少なくとも４つのポリペプチドを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の分子複合体。
【請求項６】
前記タンパク質分解が、配列番号１において示されるアミノ酸配列のアミノ酸７１９とアミノ酸７４６との間の１またはそれより多くの部位での切断、ならびに配列番号１において示されるアミノ酸配列のアミノ酸１３７とアミノ酸１５１との間の１またはそれより多くの部位での切断をさらに含む、請求項５に記載の分子複合体。
【請求項７】
前記ポリペプチドのうちの少なくとも１つが、１またはそれより多くのリン酸化Ｎ−グリカンを含み、前記改変が、少なくとも１つのリン酸化Ｎ−グリカンのキャップを外すことおよび脱マンノシル化を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の分子複合体。
【請求項８】
前記ポリペプチド上のＮ−グリカンの少なくとも４０％が、キャップを外されかつ脱マンノシル化されている、請求項５に記載の分子複合体。
【請求項９】
前記ポリペプチド上のＮ−グリカンの少なくとも６０％が、キャップを外されかつ脱マンノシル化されている、請求項８に記載の分子複合体。
【請求項１０】
前記ポリペプチド上のＮ−グリカンの少なくとも８０％が、キャップを外されかつ脱マンノシル化されている、請求項８に記載の分子複合体。
【請求項１１】
前記ポリペプチド上のＮ−グリカンの少なくとも９０％が、キャップを外されかつ脱マンノシル化されている、請求項８に記載の分子複合体。
【請求項１２】
それぞれのポリペプチドが、配列番号１において示されるアミノ酸配列のセグメントと少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の分子複合体。
【請求項１３】
それぞれのポリペプチドが、配列番号１において示されるアミノ酸配列のセグメントと少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の分子複合体。
【請求項１４】
前記少なくとも２つのポリペプチドのうちの１つについて、前記セグメントが、配列番号１のアミノ酸２２〜５７を含み、前記少なくとも２つのポリペプチドのうちの１つについて、前記セグメントが、配列番号１のアミノ酸６６〜８９６を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の分子複合体。
【請求項１５】
前記少なくとも３つのポリペプチドのうちの１つについて、前記セグメントが、配列番号１のアミノ酸２２〜５７を含み、前記少なくとも３つのポリペプチドのうちの１つについて、前記セグメントが、配列番号１のアミノ酸６６〜７２６を含み、前記少なくとも３つのポリペプチドのうちの１つについて、前記セグメントが、配列番号１のアミノ酸７３６〜８９６を含む、請求項３〜１４のいずれか一項に記載の分子複合体。
【請求項１６】
前記少なくとも４つのポリペプチドのうちの１つについて、前記セグメントが、配列番号１のアミノ酸２２〜５７を含み、前記少なくとも４つのポリペプチドのうちの１つについて、前記セグメントが、配列番号１のアミノ酸６６〜１４３を含み、前記少なくとも４つのポリペプチドのうちの１つについて、前記セグメントが、配列番号１のアミノ酸１５８〜７２６を含み、前記少なくとも４つのポリペプチドのうちの１つについて、前記セグメントが、配列番号１のアミノ酸７３６〜８９６を含む、請求項５〜１４のいずれか一項に記載の分子複合体。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの改変が、前記ポリペプチドのうちの少なくとも１つに融合された、細胞外受容体に対するリガンドを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の分子複合体。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの改変が、前記ポリペプチドのうちの少なくとも１つに融合された標的化ドメインを含み、前記標的化ドメインが、標的細胞の表面上の受容体の細胞外ドメインに結合する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の分子複合体。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの改変が、前記ポリペプチドのうちの少なくとも１つに融合されたウロキナーゼ型プラスミノゲン受容体を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の分子複合体。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの改変が、前記ポリペプチドのうちの少なくとも１つに融合されたヒトインスリン様成長因子ＩＩの認識ドメインを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の分子複合体。
【請求項２１】
前記分子複合体が、凍結乾燥されている、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の分子複合体を含む組成物。
【請求項２２】
前記組成物が、一回使い切りのバイアルとしてパッケージングされている、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の分子複合体および薬学的に許容され得るキャリアを含む医薬組成物。
【請求項２４】
前記組成物が、静脈内投与または皮下投与のために製剤化されている、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記組成物が、静脈内注入のために製剤化されている、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
ポンペ病を処置するための方法であって、ポンペ病と診断された患者に対して請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項２７】
前記患者が、乳児発症型ポンペ病と診断される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記患者が、遅発型ポンペ病と診断される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
分子複合体を作製するための方法であって、配列番号１において示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを、配列番号８において示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するプロテアーゼと接触させることを含み、前記プロテアーゼが、アミノ酸５０とアミノ酸７４との間の１またはそれより多くの部位で前記ポリペプチドを切断する、方法。
【請求項３０】
前記接触させることが、インビトロにおいて実行される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記プロテアーゼが、アミノ酸６０とアミノ酸６５との間の１またはそれより多くの部位で前記ポリペプチドを切断する、請求項２９または請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
キャップを外されかつ脱マンノシル化したリン酸化Ｎ−グリカンを含む分子複合体を作製するための方法であって、分子複合体を、（ｉ）マンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分をマンノース−６−リン酸に加水分解することができかつ（ｉｉ）末端のα−１，２マンノース結合、α−１，３マンノース結合、および／またはα−１，６マンノース結合を加水分解することのできるマンノシダーゼと接触させることを含み、前記分子複合体が、ＧＡＡ活性を有し、かつ少なくとも２つのポリペプチドを含み、それぞれのポリペプチドが、配列番号１において示されるアミノ酸配列のセグメントと少なくとも８５％の配列同一性を有し、それぞれのセグメントが、アミノ酸５０とアミノ酸７４との間の１またはそれより多くの部位での、配列番号１において示されるアミノ酸配列のタンパク質分解によって誘導され、前記ポリペプチドのうちの少なくとも１つが、１またはそれより多くのマンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分を含有するリン酸化Ｎ−グリカンを含む、方法。
【請求項３３】
前記マンノシダーゼが、ファミリー３８のグリコシルヒドロラーゼである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記マンノシダーゼが、Ｃａｎａｖａｌｉａ  ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓマンノシダーゼである、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記マンノシダーゼが、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａマンノシダーゼである、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記接触させることが、組換え真菌細胞において行われ、前記真菌細胞が、前記マンノシダーゼを発現する、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
キャップを外されかつ脱マンノシル化したリン酸化Ｎ−グリカンを含む分子複合体を作製する方法であって、分子複合体を、末端のα−１，２マンノース結合、α−１，３マンノース結合、および／またはα−１，６マンノース結合を加水分解することのできるマンノシダーゼと接触させることを含み、前記分子複合体が、ＧＡＡ活性を有し、かつ少なくとも２つのポリペプチドを含み、それぞれのポリペプチドが、配列番号１において示されるアミノ酸配列のセグメントと少なくとも８５％の配列同一性を有し、それぞれのセグメントが、アミノ酸５０とアミノ酸７４との間の１またはそれより多くの部位での、配列番号１において示されるアミノ酸配列のタンパク質分解によって誘導され、前記接触させることの前に、前記ポリペプチドのうちの少なくとも１つが、キャップを外されたマンノース−６−リン酸部分を含むリン酸化Ｎ−グリカンを含む、方法。
【請求項３８】
前記マンノシダーゼが、ファミリー４７のグリコシルヒドロラーゼである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記マンノシダーゼが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓａｔｏｉマンノシダーゼである、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記マンノシダーゼが、ファミリー９２のグリコシルヒドロラーゼである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
マンノシダーゼが、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌａｎｓマンノシダーゼである、請求項３７または４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記マンノシダーゼが、ファミリー３８のグリコシルヒドロラーゼである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
前記マンノシダーゼが、Ｃａｎａｖａｌｉａ  ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓマンノシダーゼである、請求項３７または請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記接触させることが、組換え真菌細胞において行われ、前記真菌細胞が、前記マンノシダーゼを発現する、請求項３７〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
キャップを外されかつ脱マンノシル化したリン酸化Ｎ−グリカンを含む分子複合体を作製する方法であって、分子複合体を、マンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分をマンノース−６−リン酸に加水分解することができるマンノシダーゼと接触させることを含み、前記分子複合体が、ＧＡＡ活性を有し、かつ少なくとも２つのポリペプチドを含み、それぞれのポリペプチドが、配列番号１において示されるアミノ酸配列のセグメントと少なくとも８５％の配列同一性を有し、それぞれのセグメントが、アミノ酸５０とアミノ酸７４との間の１またはそれより多くの部位での、配列番号１において示されるアミノ酸配列のタンパク質分解によって誘導され、前記接触させることの前に、前記ポリペプチドのうちの少なくとも１つが、マンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分を含む、方法。
【請求項４６】
前記マンノシダーゼが、ファミリー３８のグリコシルヒドロラーゼである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記マンノシダーゼが、Ｃａｎａｖａｌｉａ  ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓマンノシダーゼである、請求項４５または４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記マンノシダーゼが、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａマンノシダーゼである、請求項４５または４６に記載の方法。
【請求項４９】
キャップを外されかつ脱マンノシル化したリン酸化Ｎ−グリカンを含む分子複合体を作製する方法であって、
ａ）分子複合体を、マンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分をマンノース−６−リン酸に加水分解することができるマンノシダーゼと接触させて、前記分子複合体における少なくとも１つのポリペプチド上のマンノース−６−リン酸部分のキャップを外すステップであって、前記分子複合体が、ＧＡＡ活性を有し、かつ少なくとも２つのポリペプチドを含み、それぞれのポリペプチドが、配列番号１において示されるアミノ酸配列のセグメントと少なくとも８５％の配列同一性を有し、それぞれのセグメントが、アミノ酸５０とアミノ酸７４との間の１またはそれより多くの部位での、配列番号１において示されるアミノ酸配列のタンパク質分解によって誘導されるステップ、ならびに
ｂ）前記分子複合体を、末端のα−１，２マンノース結合、α−１，３マンノース結合、および／またはα−１，６マンノース結合を加水分解することのできるマンノシダーゼと接触させるステップ
を含む、方法。
【請求項５０】
ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）が、２つの異なる酵素によって触媒される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）が、単一の酵素によって触媒される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記接触させるステップが、組換え真菌宿主細胞において行われ、前記真菌宿主細胞が、ステップ（ａ）を触媒することができるマンノシダーゼおよびステップ（ｂ）を触媒することができるマンノシダーゼを発現する、請求項４９または５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記接触させるステップが、組換え真菌宿主細胞において行われ、前記真菌宿主が、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）を触媒することができるマンノシダーゼを発現する、請求項４９または５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記方法が、哺乳類細胞を、前記キャップを外されかつ脱マンノシル化したＮ−グリカンを含む少なくとも１つのポリペプチドを含む前記分子複合体と接触させるステップをさらに含み、前記接触させるステップの後に、前記分子複合体が、増強された効率により、前記哺乳類細胞の内部へ輸送される、請求項３２〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記哺乳類細胞が、ヒト細胞である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
ＧＡＡ活性を有する分子複合体を細胞の内部へと輸送する方法であって、哺乳類細胞を、前記分子複合体と接触させることを含み、前記分子複合体が、少なくとも２つのポリペプチドを含み、それぞれのポリペプチドが、配列番号１において示されるアミノ酸配列のセグメントと少なくとも８５％の配列同一性を有し、それぞれのセグメントが、アミノ酸５０とアミノ酸７４との間の１またはそれより多くの部位での、配列番号１において示されるアミノ酸配列のタンパク質分解によって誘導され、前記ポリペプチドのうちの少なくとも１つの上のリン酸化Ｎ−グリカンが、請求項３３〜５５のいずれか一項において示されるように、キャップを外されかつ脱マンノシル化されている、方法。
【請求項５７】
ＧＡＡ活性を有する分子複合体を細胞の内部へと輸送する方法であって、哺乳類細胞を、前記分子複合体と接触させることを含み、前記分子複合体が、少なくとも２つのポリペプチドを含み、それぞれのポリペプチドが、配列番号１において示されるアミノ酸配列のセグメントと少なくとも８５％の配列同一性を有し、それぞれのセグメントが、アミノ酸５０とアミノ酸７４との間の１またはそれより多くの部位での、配列番号１において示されるアミノ酸配列のタンパク質分解によって誘導され、前記分子複合体が、前記分子複合体の、哺乳類細胞の内部へ輸送される能力の増強をもたらす少なくとも１つの改変を含む、方法。
【請求項５８】
前記哺乳類細胞が、インビトロにある、請求項５６または請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記哺乳類細胞が、哺乳類被験体中にある、請求項５６または請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記哺乳類細胞が、ヒト細胞である、請求項５８〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記改変が、前記ポリペプチドのうちの少なくとも１つに融合された標的化ドメインを含み、前記標的化ドメインが、標的細胞の表面上の受容体の細胞外ドメインに結合する、請求項５７〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記少なくとも１つの改変が、前記ポリペプチドのうちの少なくとも１つに融合されたウロキナーゼ型プラスミノゲン受容体を含む、請求項５７〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記少なくとも１つの改変が、前記ポリペプチドのうちの少なくとも１つに融合された、ヒトインスリン様成長因子ＩＩの認識ドメインを含む、請求項５７〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
配列番号１において示されるＧＡＡアミノ酸配列をコードする核酸および配列番号８において示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するアルカリプロテアーゼをコードする核酸を含む単離された真菌細胞であって、前記真菌細胞が、ＧＡＡ活性を有しかつ少なくとも２つのポリペプチドを含む分子複合体を産生し、それぞれのポリペプチドが、配列番号１において示されるアミノ酸配列のセグメントと少なくとも８５％の配列同一性を有し、それぞれのセグメントが、前記アルカリプロテアーゼによる、アミノ酸５０とアミノ酸７４との間の１またはそれより多くの部位での、配列番号１において示されるアミノ酸配列のタンパク質分解によって誘導される、単離された真菌細胞。
【請求項６５】
それぞれのセグメントが、前記アルカリプロテアーゼによる、アミノ酸６０とアミノ酸６５との間の１またはそれより多くの部位での、配列番号１において示されるアミノ酸配列のタンパク質分解によって誘導される、請求項６４に記載の単離された真菌細胞。
【請求項６６】
前記真菌細胞が、マンノシダーゼをコードする核酸をさらに含み、前記マンノシダーゼが、（ｉ）マンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分をマンノース−６−リン酸に加水分解することができかつ（ｉｉ）末端のα−１，２マンノース結合、α−１，３マンノース結合、および／またはα−１，６マンノース結合を加水分解することができる、請求項６４または請求項６５に記載の真菌細胞。
【請求項６７】
前記真菌細胞が、マンノシダーゼをコードする核酸をさらに含み、前記マンノシダーゼが、マンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分をマンノース−６−リン酸に加水分解することができる、請求項６４または請求項６５に記載の真菌細胞。
【請求項６８】
前記真菌細胞が、マンノシダーゼをコードする核酸をさらに含み、前記マンノシダーゼが、末端のα−１，２マンノース結合、α−１，３マンノース結合、および／またはα−１，６マンノース結合を加水分解することができる、請求項６４または請求項６５に記載の真菌細胞。
【請求項６９】
前記真菌細胞が、マンノシルリン酸化を促進することができるポリペプチドをコードする核酸をさらに含む、請求項６５に記載の真菌細胞。
【請求項７０】
前記真菌細胞が、ＯＣＨ１活性を欠損するように遺伝子操作される、請求項６４〜６９のいずれか一項に記載の真菌細胞。
【請求項７１】
配列番号８において示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するアルカリプロテアーゼをコードする外因性核酸を含む単離された真菌細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、２０１２年３月１５日に出願された米国仮出願第６１／６１１，４８５号の利益を主張する。この先の出願の開示は、本願の開示の一部（であり、その開示に参考として援用される）とみなされる。
【０００２】
技術分野
本発明は、酸性αグルコシダーゼ活性を有する単離された分子複合体、より詳細には、タンパク質分解によって前駆体分子から誘導される少なくとも２つのポリペプチドを含む分子複合体であって、この分子複合体の、哺乳類細胞の内部へ輸送される能力の増強をもたらす少なくとも１つの改変を含む、分子複合体に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
ポンペ病（糖原病ＩＩ型または酸性マルターゼ欠損症とも呼ばれる）は、酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）の欠損によりリソソームにおけるグリコーゲンの蓄積をもたらす、まれな常染色体劣性疾患である。グリコーゲンの増加は、身体の至る所で進行性の筋力低下（ミオパシー）を引き起こし、心臓、骨格筋、肝臓、および神経系をはじめとする様々な体組織に影響する。
【０００４】
ポンペ病は、乳児発症型形態および遅発型形態におおまかに分類される。乳児発症型形態において、乳児は、典型的に、乳児期初期（４〜８ヶ月齢）の間に、虚弱および筋緊張低下（ｆｌｏｐｐｉｎｅｓｓ）の症状を示し、自分の頭部を持ち上げることができず、また、寝返りなどのような彼らの齢に普通の他の運動性の動作を行うことができない。処置をしなければ、ポンペ病を有する乳児は、通常、心不全および呼吸器系の虚弱により１２ヶ月齢前に死んでしまう。Ｕｎｉｔｅｄ  Ｐｏｍｐｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎを参照されたい。遅発型形態（若年性（ｊｕｖｅｎｉｌｅ）形態および成人型形態を含む）は、より遅い発症を有し、乳児型形態よりもゆっくり進行する。組換えヒトＧＡＡ（Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）またはＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標））は、ポンペ病を処置するために使用される。しかしながら、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）またはＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）は、両方とも、非常に高価であり、費用は、１年当たり３００，０００ドルをはるかに上回る。そのため、ポンペ病のための処置の改善の必要性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
概要
一態様において、本文書は、酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）活性を有し、かつ少なくとも２つのポリペプチド（例えば少なくとも３または少なくとも４つのポリペプチド）を含む単離された分子複合体であって、それぞれのポリペプチドが、配列番号１において示されるアミノ酸配列のセグメントと少なくとも８５％（例えば少なくとも９０％、９５％、９９％、または１００％）の配列同一性を有し、それぞれのセグメントが、アミノ酸５０とアミノ酸７４との間の１またはそれより多くの部位での（例えば、アミノ酸５６とアミノ酸６８との間またはアミノ酸６０とアミノ酸６５との間での）、配列番号１において示されるアミノ酸配列のタンパク質分解によって誘導される、単離された分子複合体を特徴づける。分子複合体は、分子複合体の、哺乳類細胞の内部へ輸送される能力の増強をもたらす、少なくとも１つの改変を含む。配列番号１において示されるアミノ酸配列のタンパク質分解は、アミノ酸７１９とアミノ酸７４６との間の１またはそれより多くの部位での切断、または配列番号１において示されるアミノ酸配列のアミノ酸１３７とアミノ酸１５１との間の１またはそれより多くの部位での切断をさらに含むことができる。タンパク質分解は、配列番号１において示されるアミノ酸配列のアミノ酸７１９とアミノ酸７４６との間の１またはそれより多くの部位での切断、ならびに配列番号１において示されるアミノ酸配列のアミノ酸１３７とアミノ酸１５１との間の１またはそれより多くの部位での切断をさらに含むことができる。
【０００６】
本明細書において記載される分子複合体のいずれかにおいて、ポリペプチドのうちの少なくとも１つは、１またはそれより多くのリン酸化Ｎ−グリカンを含むことができ、改変は、少なくとも１つのリン酸化Ｎ−グリカンのキャップを外すことおよび脱マンノシル化を含むことができる。ポリペプチドのうちの少なくとも１つの上のＮ−グリカンの少なくとも４０％（例えば少なくとも、６０％、８０％、９０％、９５％、または９９％）は、キャップを外し、かつ脱マンノシル化されることができる。
【０００７】
本明細書において記載される分子複合体のいずれかにおいて、少なくとも２つのポリペプチドのうちの１つについて、セグメントは、配列番号１のアミノ酸２２〜５７を含み、少なくとも２つのポリペプチドのうちの１つについて、セグメントは、配列番号１のアミノ酸６６〜８９６を含む。
【０００８】
少なくとも３つのポリペプチドを含有する、本明細書において記載される分子複合体のいずれかにおいて、少なくとも３つのポリペプチドのうちの１つについて、セグメントは、配列番号１のアミノ酸２２〜５７を含み、少なくとも３つのポリペプチドのうちの１つについて、セグメントは、配列番号１のアミノ酸６６〜７２６を含み、少なくとも３つのポリペプチドのうちの１つについて、セグメントは、配列番号１のアミノ酸７３６〜８９６を含む。
【０００９】
少なくとも４つのポリペプチドを含有する、本明細書において記載される分子複合体のいずれかにおいて、少なくとも４つのポリペプチドのうちの１つについて、セグメントは、配列番号１のアミノ酸２２〜５７を含み、少なくとも４つのポリペプチドのうちの１つについて、セグメントは、配列番号１のアミノ酸６６〜１４３を含み、少なくとも４つのポリペプチドのうちの１つについて、セグメントは、配列番号１のアミノ酸１５８〜７２６を含み、少なくとも４つのポリペプチドのうちの１つについて、セグメントは、配列番号１のアミノ酸７３６〜８９６を含む。
【００１０】
本明細書において記載される分子複合体のいずれかにおいて、少なくとも１つの改変は、分子複合体における少なくとも１つのポリペプチドに融合された以下のもののいずれか１つを含むことができる：細胞外受容体に対するリガンド、標的細胞の表面上の受容体の細胞外ドメインに結合する標的化ドメイン、ウロキナーゼ型プラスミノゲン受容体、またはヒトインスリン様成長因子ＩＩの認識ドメイン。
【００１１】
本文書はまた、本明細書において記載される分子複合体のいずれかを含む組成物であって、分子複合体が凍結乾燥されている組成物をも特徴づける。組成物は、一回使い切りのバイアルとしてパッケージングされることができる。
【００１２】
本文書はまた、本明細書において記載される分子複合体のいずれかおよび薬学的に許容され得るキャリアを含む医薬組成物をも特徴づける。組成物は、静脈内投与または皮下投与のために製剤化されることができる。組成物は、静脈内注入のために製剤化されることができる。
【００１３】
他の態様において、本文書は、ポンペ病を処置する方法を特徴づける。方法は、ポンペ病と診断された患者へ、本明細書において記載される組成物のいずれかを投与することを含む。患者は、乳児発症型ポンペ病または遅発型ポンペ病と診断されることができる。
【００１４】
本文書はまた、分子複合体を作製するための方法をも特徴づける。方法は、配列番号１において示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドを、配列番号８において示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％（例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％）の配列同一性を有するプロテアーゼと接触させることを含み、ここで、プロテアーゼが、アミノ酸５０とアミノ酸７４との間の１またはそれより多くの部位で（例えばアミノ酸５６とアミノ酸６８との間またはアミノ酸６０とアミノ酸６５との間で）ポリペプチドを切断する。接触させるステップは、インビトロにおいて実行することができる。
【００１５】
本文書はまた、キャップを外されかつ脱マンノシル化したリン酸化Ｎ−グリカンを含む分子複合体を作製するための方法をも特徴づける。方法は、分子複合体を、（ｉ）マンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分をマンノース−６−リン酸（mannose-6-phosphate）に加水分解することができかつ（ｉｉ）末端のα−１，２マンノース結合、α−１，３マンノース結合、および／またはα−１，６マンノース結合を加水分解することのできるマンノシダーゼと接触させることを含み、分子複合体が、ＧＡＡ活性を有し、かつ少なくとも２つのポリペプチドを含み、それぞれのポリペプチドが、配列番号１において示されるアミノ酸配列のセグメントと少なくとも８５％の配列同一性を有し、それぞれのセグメントが、アミノ酸５０とアミノ酸７４との間の（例えば、アミノ酸５６とアミノ酸６８との間またはアミノ酸６０とアミノ酸６５との間の）１またはそれより多くの部位での、配列番号１において示されるアミノ酸配列のタンパク質分解によって誘導され、ここで、接触させることの前に、ポリペプチドのうちの少なくとも１つが、１またはそれより多くのマンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分を含有するリン酸化Ｎ−グリカンを含む。マンノシダーゼは、ファミリー３８のグリコシルヒドロラーゼ（例えばＣａｎａｖａｌｉａ  ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓマンノシダーゼまたはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａマンノシダーゼ）であり得る。接触させることは、マンノシダーゼを発現する組換え真菌細胞において行われてもよい。
【００１６】
本文書はまた、キャップを外されかつ脱マンノシル化したリン酸化Ｎ−グリカンを含む分子複合体を作製する方法をも特徴づける。方法は、分子複合体を、末端のα−１，２マンノース結合、α−１，３マンノース結合、および／またはα−１，６マンノース結合を加水分解することのできるマンノシダーゼと接触させることを含み、分子複合体が、ＧＡＡ活性を有し、かつ少なくとも２つのポリペプチドを含み、それぞれのポリペプチドが、配列番号１において示されるアミノ酸配列のセグメントと少なくとも８５％の配列同一性を有し、それぞれのセグメントが、アミノ酸５０とアミノ酸７４との間の（例えば、アミノ酸５６とアミノ酸６８との間またはアミノ酸６０とアミノ酸６５との間の）１またはそれより多くの部位での、配列番号１において示されるアミノ酸配列のタンパク質分解によって誘導され、ここで、ポリペプチドのうちの少なくとも１つが、接触させることの前に、キャップを外されたマンノース−６−リン酸部分を含むリン酸化Ｎ−グリカンを含む。マンノシダーゼは、ファミリー４７のグリコシルヒドロラーゼ（例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓａｔｏｉマンノシダーゼ）、ファミリー９２のグリコシルヒドロラーゼ（例えばＣｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌａｎｓマンノシダーゼ）、またはファミリー３８のグリコシルヒドロラーゼ（例えばＣａｎａｖａｌｉａ  ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓマンノシダーゼ）とすることができる。接触させることは、マンノシダーゼを発現する組換え真菌細胞において行われてもよい。
【００１７】
本文書はまた、キャップを外されかつ脱マンノシル化したリン酸化Ｎ−グリカンを含む分子複合体を作製する方法をも特徴づける。方法は、分子複合体を、マンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分をマンノース−６−リン酸に加水分解することができるマンノシダーゼと接触させることを含み、分子複合体が、ＧＡＡ活性を有し、かつ少なくとも２つのポリペプチドを含み、それぞれのポリペプチドが、配列番号１において示されるアミノ酸配列のセグメントと少なくとも８５％の配列同一性を有し、それぞれのセグメントが、アミノ酸５０とアミノ酸７４との間の（例えば、アミノ酸５６とアミノ酸６８との間またはアミノ酸６０とアミノ酸６５との間の）１またはそれより多くの部位での、配列番号１において示されるアミノ酸配列のタンパク質分解によって誘導され、ここで、ポリペプチドのうちの少なくとも１つが、接触させることの前に、１またはそれより多くのマンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分を含む。マンノシダーゼは、ファミリー３８のグリコシルヒドロラーゼ（例えばＣａｎａｖａｌｉａ  ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓマンノシダーゼまたはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａマンノシダーゼ）であり得る。
【００１８】
他の態様において、本文書は、キャップを外されかつ脱マンノシル化したリン酸化Ｎ−グリカンを含む分子複合体を作製する方法を特徴づける。方法は、ａ）分子複合体を、マンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分をマンノース−６−リン酸に加水分解することができるマンノシダーゼと接触させて、分子複合体における少なくとも１つのポリペプチド上のマンノース−６−リン酸部分のキャップを外すステップであって、分子複合体が、ＧＡＡ活性を有し、かつ少なくとも２つのポリペプチドを含み、それぞれのポリペプチドが、配列番号１において示されるアミノ酸配列のセグメントと少なくとも８５％の配列同一性を有し、それぞれのセグメントが、アミノ酸５０とアミノ酸７４との間の（例えば、アミノ酸５６とアミノ酸６８との間またはアミノ酸６０とアミノ酸６５との間の）１またはそれより多くの部位での、配列番号１において示されるアミノ酸配列のタンパク質分解によって誘導される、ステップ、ならびにｂ）分子複合体を、末端のα−１，２マンノース結合、α−１，３マンノース結合、および／またはα−１，６マンノース結合を加水分解することのできるマンノシダーゼと接触させるステップを含む。ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）は、２つの異なる酵素によって触媒されてもよく、または単一の酵素によって触媒されてもよい。接触させるステップは、一緒にまたは別々に、そしてどちらの順序でも実行することができる。接触させることは、組換え真菌宿主細胞において行うことができ、真菌宿主細胞は、ステップ（ａ）を触媒することができるマンノシダーゼおよびステップ（ｂ）を触媒することができるマンノシダーゼを発現することができる。接触させることは、組換え真菌宿主細胞において行うことができ、真菌宿主は、ステップ（ａ）および（ｂ）を触媒することができるマンノシダーゼを発現する。
【００１９】
少なくとも１つのキャップを外されかつ脱マンノシル化したＮ−グリカンを含む、本明細書において記載される分子複合体のいずれも、哺乳類細胞に接触させるために使用することができ、接触させることの後に、分子複合体は、増強された効率により、哺乳類細胞の内部へ輸送される。哺乳類細胞は、ヒト細胞であり得る。
【００２０】
本文書はまた、ＧＡＡ活性を有する分子複合体を細胞の内部へと輸送する方法をも特徴づける。方法は、哺乳類細胞を分子複合体と接触させることを含み、分子複合体が、少なくとも２つのポリペプチドを含み、それぞれのポリペプチドが、配列番号１において示されるアミノ酸配列のセグメントと少なくとも８５％の配列同一性を有し、それぞれのセグメントが、アミノ酸５０とアミノ酸７４との間の（例えば、アミノ酸５６とアミノ酸６８との間またはアミノ酸６０とアミノ酸６５との間の）１またはそれより多くの部位での、配列番号１において示されるアミノ酸配列のタンパク質分解によって誘導され、ここで、ポリペプチドのうちの少なくとも１つの上のリン酸化Ｎ−グリカンは、本明細書において記載される方法において示されるように、キャップを外されかつ脱マンノシル化されている。哺乳類細胞は、インビトロまたは哺乳類被験体中に存在し得る。哺乳類細胞は、ヒト細胞であり得る。
【００２１】
他の態様において、本文書は、ＧＡＡ活性を有する分子複合体を細胞の内部へと輸送する方法をも特徴づける。方法は、哺乳類細胞を、少なくとも２つのポリペプチドを含む分子複合体と接触させることを含み、それぞれのポリペプチドが、配列番号１において示されるアミノ酸配列のセグメントと少なくとも８５％の配列同一性を有し、それぞれのセグメントが、アミノ酸５０とアミノ酸７４との間の（例えば、アミノ酸５６とアミノ酸６８との間またはアミノ酸６０とアミノ酸６５との間の）１またはそれより多くの部位での、配列番号１において示されるアミノ酸配列のタンパク質分解によって誘導され、分子複合体は、分子複合体の、哺乳類細胞の内部へ輸送される能力の増強をもたらす、少なくとも１つの改変を含む。哺乳類細胞は、インビトロまたは哺乳類被験体中に存在し得る。哺乳類細胞は、ヒト細胞であり得る。改変は、分子複合体における少なくとも１つのポリペプチドに融合された以下のもののいずれか１つを含むことができる：細胞外受容体に対するリガンド、標的細胞の表面上の受容体の細胞外ドメインに結合する標的化ドメイン、ウロキナーゼ型プラスミノゲン受容体、またはヒトインスリン様成長因子ＩＩの認識ドメイン。
【００２２】
他の態様において、本文書は、配列番号８において示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するアルカリプロテアーゼをコードする外因性核酸を含む単離された真菌細胞を特徴づける。
【００２３】
本文書はまた、配列番号１において示されるＧＡＡアミノ酸配列をコードする核酸および配列番号８において示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するアルカリプロテアーゼをコードする核酸を含む単離された真菌細胞をも特徴づける。真菌細胞は、ＧＡＡ活性を有しかつ少なくとも２つのポリペプチドを含む分子複合体を産生し、それぞれのポリペプチドが、配列番号１において示されるアミノ酸配列のセグメントと少なくとも８５％の配列同一性を有し、それぞれのセグメントが、アルカリプロテアーゼによる、アミノ酸５０とアミノ酸７４との間の（例えば、アミノ酸５６とアミノ酸６８との間またはアミノ酸６０とアミノ酸６５との間の）１またはそれより多くの部位での、配列番号１において示されるアミノ酸配列のタンパク質分解によって誘導される。一部の実施形態において、真菌細胞が、マンノシダーゼをコードする核酸をさらに含み、マンノシダーゼが、マンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分をマンノース−６−リン酸に加水分解することができる。一部の実施形態において、真菌細胞が、マンノシダーゼをコードする核酸をさらに含み、マンノシダーゼが、末端のα−１，２マンノース結合、α−１，３マンノース結合、および／またはα−１，６マンノース結合を加水分解することができる。一部の実施形態において、真菌細胞が、マンノシダーゼをコードする核酸をさらに含むことができ、マンノシダーゼが、（ｉ）マンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分をマンノース−６−リン酸に加水分解することができかつ（ｉｉ）末端のα−１，２マンノース結合、α−１，３マンノース結合、および／またはα−１，６マンノース結合を加水分解することができる。そのような真菌細胞のいずれも、マンノシルリン酸化を促進することができるポリペプチドをコードする核酸をさらに含むことができ、そして／またはＯＣＨ１活性を欠損するように遺伝子操作することができる。
【００２４】
別段に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明の属する分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似のまたは等価の方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および材料を下記に説明する。本明細書において記載されている刊行物、特許出願、特許、Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）受託番号、および他の参考文献はすべて、それらの内容が全体として参照により援用されている。矛盾する場合においては、定義を含む本出願が支配する。材料、方法、および実施例は、例示的であるに過ぎず、制限するよう意図するものではない。
【００２５】
本発明の他の特色および利点は、以下の詳細な記載から、および特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、シグナル配列の切断後のヒト酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）のアミノ酸配列（配列番号１）の記述である。
【図２Ａ−１】図２Ａは、ＤｓｂＡ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌａｎｓマンノシダーゼ５（ＣｃＭａｎ５）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列（配列番号２）の記述である。
【図２Ａ−２】図２Ａは、ＤｓｂＡ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌａｎｓマンノシダーゼ５（ＣｃＭａｎ５）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列（配列番号２）の記述である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、太字のシグナル配列を有するＣｃＭａｎ５ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号３）の記述である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、シグナル配列を有さないＣｃＭａｎ５ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号４）の記述である。シグナル配列を有さないＣｃＭａｎ５ポリペプチドの予想される分子量は１７３ｋＤａである。
【図３Ａ】図３Ａおよび３Ｂは、ＣｃＭａｎ５およびＪｂＭａｎにより処置したｒｈＧＡＡのＮ−グリカン分析を示す一連の電気泳動図である。分析は、ＤＮＡシーケンサー支援型フルオロフォア支援型炭水化物電気泳動（ＤＳＡ−ＦＡＣＥ）を使用して実行した。Ｙ軸は、それぞれのＮ−グリカン構造の量の指標としての相対的蛍光単位を示す。Ｘ軸は、キャピラリーのそれぞれのＮ−グリカン構造の相対的移動度を示す。図３Ａおよび図３Ｂの両方において、パネルＡは、ＰＮＧａｓｅＦによりＲＮａｓｅＢから放出されたＮ−グリカンを含有する参照試料である。図３Ａにおいて、パネルＢおよびＣは、それぞれＣｃＭａｎ５およびＪｂＭａｎによる処理の前および後のｈｕＧＡＡ（７６ｋＤバリアント）由来のＮ−グリカン分析を含む。図３Ｂにおいて、パネルＢ、Ｃ、およびＤは、それぞれｈｕＧＡＡ  ７６ｋＤ形態、９５ｋＤ形態、および１１０ｋＤ形態由来のＮ−グリカン分析を含む。
【図３Ｂ】図３Ａおよび３Ｂは、ＣｃＭａｎ５およびＪｂＭａｎにより処置したｒｈＧＡＡのＮ−グリカン分析を示す一連の電気泳動図である。分析は、ＤＮＡシーケンサー支援型フルオロフォア支援型炭水化物電気泳動（ＤＳＡ−ＦＡＣＥ）を使用して実行した。Ｙ軸は、それぞれのＮ−グリカン構造の量の指標としての相対的蛍光単位を示す。Ｘ軸は、キャピラリーのそれぞれのＮ−グリカン構造の相対的移動度を示す。図３Ａおよび図３Ｂの両方において、パネルＡは、ＰＮＧａｓｅＦによりＲＮａｓｅＢから放出されたＮ−グリカンを含有する参照試料である。図３Ａにおいて、パネルＢおよびＣは、それぞれＣｃＭａｎ５およびＪｂＭａｎによる処理の前および後のｈｕＧＡＡ（７６ｋＤバリアント）由来のＮ−グリカン分析を含む。図３Ｂにおいて、パネルＢ、Ｃ、およびＤは、それぞれｈｕＧＡＡ  ７６ｋＤ形態、９５ｋＤ形態、および１１０ｋＤ形態由来のＮ−グリカン分析を含む。
【図４】図４は、基質としてウサギ肝臓グリコーゲンを使用して、Ｍｙｏｚｙｍｅ（黒丸）、７６ｋＤａ  ＧＡＡ（上向き黒三角）、９５ｋＤａ  ＧＡＡ（下向き黒三角）、および１１０ｋＤａ  ＧＡＡ（黒ひし形）により１分あたりで形成されるグルコースの量の折れ線グラフである。
【図５Ａ】図５Ａは、心臓における個々のマウスのグリコーゲンレベル（タンパク質１ｍｇあたりのμｇ）についての２つの図を含む。赤色のドットは、メスであり、黒色のドットは、オスである。線は、それぞれのグループの中央値を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、骨格筋における個々のマウスのグリコーゲンレベル（タンパク質１ｍｇあたりのμｇ）についての２つの図を含む。赤色のドットは、メスであり、黒色のドットは、オスである。線は、それぞれのグループの中央値を示す。
【図６】図６は、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＡＭＳ１マンノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号５）の記述を含む。
【図７】図７は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓａｔｏｉマンノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号６）の記述を含む。
【図８】図８は、太字のシグナル配列を有する、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌａｎｓマンノシダーゼ４のアミノ酸配列（ＣｃＭａｎ４、配列番号７）の記述を含む。シグナル配列を有さないＣｃＭａｎ４ポリペプチドの推定分子量は１８４ｋＤａである。
【図９】図９は、シグナルペプチド（２１アミノ酸）、プロペプチド（１００アミノ酸）、および成熟タンパク質（２８２アミノ酸）を含むＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼのアミノ酸配列（配列番号９）の記述を含む。
【図１０】図１０は、Ａ．ｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼをコードするＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａコドン最適化配列を含有する融合構築物のヌクレオチド配列（配列番号１０）の記述を含む。クローニングのために使用される制限部位に下線を引く。リンカーをコードするヌクレオチド配列は、太字であり、Ｈｉｓタグ（１０個のＨｉｓ残基）をコードするヌクレオチド配列は、イタリック体である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
詳細な説明
一般に、本文書は、酸性アルファ−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）活性、および哺乳類細胞の内部へ輸送される能力の増強をもたらす少なくとも１つの改変を有する単離された分子複合体を提供する。ＧＡＡは、Ｎ結合型グリカンを含有する１１０ｋＤａ前駆体として合成される。前駆体は、タンパク質分解性にプロセシングされてシグナル配列が除去され、さらにタンパク質分解性にプロセシングされて９５ｋＤａ、７６ｋＤａ、および７０ｋＤａの主な種にされる。しかしながら、前駆体から放出されるペプチドのうちの少なくともいくつかは、主な種と会合し続ける。例えばＭｏｒｅｌａｎｄら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，２８０：６７８０−６７９１（２００５）を参照されたい。したがって、本明細書において記載されるＧＡＡ活性を有する分子複合体は、１またはそれより多くの部位での前駆体分子のタンパク質分解切断から誘導される、少なくとも２つのポリペプチド（少なくとも２つ、３つ、または４つのポリペプチド）を含む。分子複合体における少なくとも２つのポリペプチドは、前駆体における１またはそれより多くの部位でのタンパク質分解切断から結果として生じる。例えば、配列番号１において示されるアミノ酸配列のタンパク質分解は、アミノ酸５０とアミノ酸７４との間、例えば、アミノ酸５６とアミノ酸６８との間またはアミノ酸６０とアミノ酸６５との間にあることができ、少なくとも２つのポリペプチドを産生することができる。２つのポリペプチドを含有する分子複合体は、本明細書において９５ｋＤａ形態と呼ばれる。
【００２８】
一部の実施形態において、分子複合体における少なくとも３つのポリペプチドが、前駆体における２またはそれより多くの部位でのタンパク質分解切断から結果として生じる。例えば、配列番号１において示されるアミノ酸配列のタンパク質分解は、アミノ酸５０とアミノ酸７４との間での（例えば、アミノ酸５０とアミノ酸７４との間のまたはアミノ酸６０とアミノ酸６５との間での）切断に加えて、配列番号１において示されるアミノ酸配列のアミノ酸７１９とアミノ酸７４６との間での１またはそれより多くの部位での切断またはアミノ酸１３７とアミノ酸１５１との間の１またはそれより多くの部位での切断を含むことができる。３つのポリペプチドを含有する分子複合体は、本明細書において７６ｋＤａ形態と呼ばれる。
【００２９】
一部の実施形態において、分子複合体における少なくとも４つのポリペプチドが、前駆体における３またはそれより多くの部位でのタンパク質分解切断から結果として生じる。例えば、配列番号１において示されるアミノ酸配列のタンパク質分解は、アミノ酸５０とアミノ酸７４との間での（例えば、アミノ酸５６とアミノ酸６８との間のまたはアミノ酸６０とアミノ酸６５との間での）切断に加えて、配列番号１において示されるアミノ酸配列のアミノ酸７１９とアミノ酸７４６との間の１またはそれより多くの部位での切断、ならびに配列番号１において示されるアミノ酸配列のアミノ酸１３７とアミノ酸１５１との間の１またはそれより多くの部位での切断を含むことができる。４つのポリペプチドを含有する分子複合体は、本明細書において７０ｋＤａ形態と呼ばれる。
【００３０】
切断は、１つの分子において１またはそれより多くの部位で生じ得ること、および切断の部位は、異なる分子において異なり得ることが十分に理解される。
【００３１】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のプロテアーゼを含有する市販で入手可能なプロテアーゼミックス（例えばＳｉｇｍａまたはＮｏｖｏｚｙｍｅｓＣｏｒｐ製）は、アミノ酸５０と７４との間で、例えば、アミノ酸５６と６８との間でまたはアミノ酸６０と６５との間で、配列番号１において示されるアミノ酸配列を切断するために使用することができる、その代わりに、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のアルカリプロテアーゼ（配列番号８）と少なくとも８５％（例えば少なくとも、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアルカリプロテアーゼを使用することができる。例えば、本明細書において記載されるように、配列番号１において示されるアミノ酸配列を有するＧＡＡポリペプチドは、配列番号８または配列番号９において示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するプロテアーゼと接触させることができる。配列番号８は、成熟Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼのアミノ酸配列である。配列番号９は、シグナルペプチド、プロペプチド、および成熟タンパク質を含むＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅプロテアーゼのアミノ酸配列である。接触させることは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅから単離されたかまたは組換えで産生されたプロテアーゼを使用して、インビトロにおいて行うことができる。その代わりに、真菌宿主は、ＧＡＡポリペプチドおよびアルカリプロテアーゼが両方とも培養培地へ分泌されるように、遺伝子操作することができ、アルカリプロテアーゼは、アミノ酸５０とアミノ酸７４との間で（例えば、アミノ酸５６と６８との間でまたはアミノ酸６０とアミノ酸６５との間で）、配列番号１において示されるアミノ酸配列を切断することができる。
【００３２】
本明細書において記載される単離された分子複合体は、哺乳類細胞の内部へ輸送される能力の増強をもたらす少なくとも１つの改変を有する。複合体の、哺乳類細胞の内部へ輸送される能力を増強する改変の非限定的な例は、リン酸化Ｎ−グリカンのキャップを外すことおよび脱マンノシル化または輸送を容易にするペプチドタグを含む。方法および材料は、タグまたはキャップを外されかつ脱マンノシル化したＮ−グリカンを含有する分子複合体を調製することについて本明細書において記載される。
【００３３】
本明細書において記載される単離された分子複合体は、ポンペ病（乳児発症型ポンペ病および遅発型ポンペ病の両方）と診断された患者を含む、ポンペ病を有する患者を処置するのに特に有用である。ポンペ病は、ＧＡＡの欠損により、リソソームにおけるグリコーゲンの蓄積をもたらす。グリコーゲンの増加は、身体の至る所で進行性の筋力低下（ミオパシー）を引き起こし、心臓、骨格筋、肝臓、および神経系を包含する様々な体組織に影響する。
【００３４】
分子複合体におけるそれぞれのポリペプチドは、配列番号１において示されるアミノ酸配列のセグメントと少なくとも８５％の配列同一性（例えば少なくとも、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％）を有し、それぞれのセグメントが、アミノ酸５０とアミノ酸７４との間の（例えば、アミノ酸５６とアミノ酸６８との間またはアミノ酸６０とアミノ酸６５との間の）１またはそれより多くの部位での、配列番号１において示されるアミノ酸配列のタンパク質分解によって誘導される。特定のアミノ酸配列と配列番号１において示されるアミノ酸配列の間の同一性％は、以下のとおり決定することができる。まず、ＢＬＡＳＴＰバージョン２．０．１４を含有する独立型バージョンのＢＬＡＳＴＺ由来のＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（Ｂｌ２ｓｅｑ）プログラムを使用してアミノ酸配列を整列させる。この独立型バージョンのＢＬＡＳＴＺは、Ｆｉｓｈ＆Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎのウェブサイト（例えば、ｗｗｗ．ｆｒ．ｃｏｍ／ｂｌａｓｔ／）または米国政府の国立バイオテクノロジー情報センターのウェブサイト（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から得ることができる。Ｂｌ２ｓｅｑプログラムを使用する方法を説明する指示は、ＢＬＡＳＴＺに添付のリードミーファイルにおいて見出すことができる。Ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使用して２つのアミノ酸配列間の比較を実行する。２つのアミノ酸配列を比較するために、Ｂｌ２ｓｅｑのオプションは、以下のとおり設定される。−ｉは、比較されるべき第一のアミノ酸配列を含有するファイル（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ）に対して設定され、−ｊは、比較されるべき第二のアミノ酸配列を含有するファイル（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ）に対して設定され、−ｐはｂｌａｓｔｐに対して設定され、−ｏは任意の所望のファイル名（例えば、Ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ）に対して設定され、かつ他のオプションはすべて該オプションのデフォルト設定のままである。例えば、２つのアミノ酸配列間の比較を含有する出力ファイルを生じるために、以下のコマンド、すなわちＣ：＼Ｂｌ２ｓｅｑ  −ｉ  ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ  −ｊ  ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ  −ｐ  ｂｌａｓｔｐ  −ｏ  ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔを使用することができる。この２つの比較される配列が相同性を共有する場合、指定された出力ファイルは、それらの相同性の領域を整列した配列として示す。この２つの比較される配列が相同性を共有しない場合、指定された出力ファイルは整列した配列を示さない。類似の手順は、ｂｌａｓｔｎを使用することを除き、核酸配列について行なわれてよい。
【００３５】
一旦整列すると、マッチ数は、同一のアミノ酸残基が両配列中に存在する位置の数を計数することによって決定される。同一性％は、マッチ数を全長のポリペプチドアミノ酸配列の長さによって除した後に、結果として生じる値に１００を乗じることによって決定される。
【００３６】
同一性％の値は、最も近い１０分の１の位に丸められることは留意される。例えば、７８．１１、７８．１２、７８．１３、および７８．１４は７８．１へと切り捨てられるのに対し、７８．１５、７８．１６、７８．１７、７８．１８、および７８．１９は７８．２と切り上げられる。長さの値が常に整数であることも留意される。
【００３７】
多くの核酸が特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができることは認識される。遺伝暗号の縮重は、当該技術分野に周知であり、すなわち、多くのアミノ酸について、アミノ酸のためのコドンとして機能する１つを超えるヌクレオチドのトリプレットがある。例えば、所与のＧＡＡポリペプチドについてのコード配列におけるコドンは、特定の種（例えば、細菌または真菌）における最適な発現が、該種のための適切なコドンバイアス表を使用して得られるよう改変され得る。
【００３８】
一実施形態において、分子複合体が、少なくとも２つのポリペプチドを含むことができ、ポリペプチドのうちの１つが、配列番号１のアミノ酸２２〜５７を含み、もう１つのポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸６６〜８９６を含む。
【００３９】
一実施形態において、分子複合体が、少なくとも３つのポリペプチドを含むことができ、ポリペプチドのうちの１つが、配列番号１のアミノ酸２２〜５７を含み、１つのポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸６６〜７２６を含み、１つのポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸７３６〜８９６を含む。
【００４０】
一実施形態において、分子複合体が、少なくとも４つのポリペプチドを含むことができ、ポリペプチドのうちの１つが、配列番号１のアミノ酸２２〜５７を含み、１つのポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸６６〜１４３を含み、１つのポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸１５８〜７２６を含み、１つのポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸７３６〜８９６を含む。
【００４１】
ＧＡＡの生物活性のあるバリアントは、配列番号１に示す配列に対する付加、欠失、または置換を含有することができる。置換を有するＧＡＡタンパク質は一般的に、１０以下（例えば、１以下、２以下、３以下、４以下、５以下、６以下、７以下、８以下、９以下または１０以下）の保存的アミノ酸置換を有する。保存的置換とは、あるアミノ酸の、類似の特徴を有する別のアミノ酸との置換である。保存的置換には、以下の群内の置換が含まれる：バリン、アラニン、およびグリシン；ロイシン、バリン、およびイソロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギンおよびグルタミン；セリン、システイン、およびトレオニン；リジンおよびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。非極性疎水性アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれる。極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれる。正に帯電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが含まれる。負に帯電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。上記の極性基、塩基性基、または酸性基のうちのある構成員の、同一群の別の構成員による任意の置換は、保存的置換であるとみなすことができる。対照的に、非保存的置換とは、あるアミノ酸の、類似していない特徴を有する別のアミノ酸との置換である。
【００４２】
一部の実施形態においては、ＧＡＡポリペプチドは、（ａ）以外のアミノ酸配列を指す。異種性配列は、組換えタンパク質の精製のために用いられる配列（例えば、ＦＬＡＧ、ポリヒスチジン（例えば、ヘキサヒスチジン）、赤血球凝集素（ｈｅｍａｇｌｕｔｔａｎｉｎ）（ＨＡ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ））のような異種アミノ酸配列との融合タンパク質であることができる。
【００４３】
一部の実施形態において、異種性アミノ酸配列が、哺乳類細胞への分子複合体の輸送の効率を増強するために使用される。例えば、複合体におけるポリペプチドの少なくとも１つは、細胞外受容体に対するリガンド、標的細胞の表面上の受容体の細胞外ドメインに結合する標的化ドメイン、ウロキナーゼ型プラスミノゲン受容体、またはマンノース−６−リン酸受容体に結合するヒトインスリン様成長因子ＩＩのドメイン（例えば、ヒトインスリン様成長因子のアミノ酸１〜６７もしくは１〜８７；少なくともアミノ酸４８〜５５；少なくともアミノ酸８〜２８および４１〜６１；または少なくともアミノ酸８〜８７；ヒトインスリン様成長因子ＩＩのその配列バリアント（例えばＲ６８Ａ）もしくはヒトインスリン様成長因子の切断型形態（例えば、位置６２からのＣ末端切断型）に融合することができる。異種性アミノ酸配列は、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端で融合することができる。一実施形態において、ペプチドタグが、スペーサー（例えば５〜３０アミノ酸または１０〜２５アミノ酸）によってポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合される。例えば米国特許第７，７８５，８５６号明細書を参照されたい。
【００４４】
異種性アミノ酸配列（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ａｍｉｎｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、診断用マーカーまたは検出可能なマーカーとして有用なタンパク質、例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）であることもできる。
【００４５】
ある宿主細胞（例えば、酵母宿主細胞）においては、標的タンパク質の発現および／または分泌は、異種性シグナル配列の使用によって増大することができる。一部の実施形態においては、融合タンパク質は、例えば抗体産生のための免疫応答を惹起するのに有用なキャリア（例えば、ＫＬＨ）、または小胞体もしくはゴルジ装置の保持シグナルを含有することができる。異種性配列は多様な長さであることができ、一部の場合においては、異種性配列が結合する全長の標的タンパク質よりも長い配列であることができる。
【００４６】
（糖タンパク質を脱マンノシル化する、または糖タンパク質のキャップを外しかつ脱マンノシル化する方法）
リン酸化Ｎ−グリカンを含有する糖タンパク質は脱マンノシル化され得、マンノース−１−ホスホ−６−マンノース結合またはマンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分を含有するリン酸化Ｎ−グリカンを含有する糖タンパク質は、該糖タンパク質を（ｉ）マンノース−１−ホスホ−６−マンノース結合またはマンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分をマンノース−６−リン酸に加水分解することができかつ（ｉｉ）末端のα−１，２マンノース結合、α−１，３マンノース結合、および／もしくはα−１，６マンノース結合または末端のα−１，２マンノース部分、α−１，３マンノース部分、および／もしくはα−１，６マンノース部分を加水分解することのできるマンノシダーゼと接触させることによってキャップを外されかつ脱マンノシル化され得る。このようなマンノシダーゼの非限定例としては、Ｃａｎａｖａｌｉａ  ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ（タチナタマメ（Ｊａｃｋ  ｂｅａｎ））マンノシダーゼおよびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａマンノシダーゼ（例えば、ＡＭＳ１）が挙げられる。タチナタマメマンノシダーゼおよびＡＭＳ１マンノシダーゼの両方は、ファミリー３８のグリコシドヒドロラーゼである。
【００４７】
タチナタマメマンノシダーゼは、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（米国ミズーリ州セントルイス）から硫酸アンモニウム懸濁液（カタログ番号Ｍ７２５７）およびプロテオミクス等級の調製物（カタログ番号Ｍ５５７３）として市販されている。このような商業的調製物は、例えばホスファターゼのような混入物を除去するためにゲル濾過クロマトグラフィーによってさらに精製することができる。タチナタマメマンノシダーゼは、以下のアミノ酸配列ＮＫＩＰＲＡＧＷＱＩＤＰＦＧＨＳＡＶＱＧ（配列番号１１）を有するセグメントを含有する。Ｈｏｗａｒｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３（４）：２０６７−２０７２、１９９８を参照されたい。
【００４８】
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＡＭＳ１マンノシダーゼは、組換えで産生することができる。ＡＭＳ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号５において示される（図６もまた参照されたい）。
【００４９】
一部の実施形態においては、キャップを外すことおよび脱マンノシル化することは、２つの異なる酵素によって触媒される。例えば、マンノース−１−ホスホ−６マンノース結合またはマンノース−１−ホスホ−６マンノース部分のキャップを外す工程は、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌａｎｓ由来のマンノシダーゼ（例えば、ＣｃＭａｎ５）を使用して実施することができる。ＣｃＭａｎ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を配列番号２（図２Ａを参照されたい）に示す。シグナル配列を含有するＣｃＭａｎ５ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号３（図２Ｂを参照されたい）に示す。シグナル配列を有さないＣｃＭａｎ５ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号４（図２Ｃを参照されたい）に示す。一部の実施形態においては、ＣｃＭａｎ５ポリペプチドの生物活性断片を使用する。例えば、生物活性断片には、配列番号４に示すアミノ酸配列の１〜７７４番目の残基を含めることができる。国際公開第２０１１／０３９６３４号も参照されたい。ＣｃＭａｎ５マンノシダーゼは、ファミリー９２のグリコシドヒドロラーゼである。
【００５０】
キャップを外された糖タンパク質または糖タンパク質の分子複合体の脱マンノシル化は、（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐｈｏｅｎｉｃｉｓとしても公知の）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓａｔｏｉ（Ａｓ）由来のマンノシダーゼまたはＣｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌａｎｓ由来のマンノシダーゼ（例えば、ＣｃＭａｎ４）を使用して触媒することができる。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓａｔｏｉマンノシダーゼは、ファミリー４７のグリコシドヒドロラーゼであり、ＣｃＭａｎ４マンノシダーゼは、ファミリー９２のグリコシドヒドロラーゼである。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓａｔｏｉマンノシダーゼのアミノ酸配列を図７（配列番号６）に、およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号第ＢＡＡ０８６３４号に示す。ＣｃＭａｎ４ポリペプチドのアミノ酸配列を図８（配列番号７）に示す。
【００５１】
キャップを外された糖タンパク質または糖タンパク質の分子複合体の脱マンノシル化は、Ｃａｎａｖａｌｉａ  ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ（タチナタマメ）マンノシダーゼまたはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａマンノシダーゼ（例えば、ＡＭＳ１）のようなファミリー３８のグリコシドヒドロラーゼ由来のマンノシダーゼを使用して触媒することもできる。例えば、ＣｃＭａｎ５を使用して、糖タンパク質（または糖タンパク質の分子複合体）のマンノース−１−ホスホ−６マンノース部分のキャップを外すことができ、タチナタマメマンノシダーゼを使用して、キャップを外された糖タンパク質（または糖タンパク質の分子複合体）を脱マンノシル化することができる。
【００５２】
脱マンノシル化した糖タンパク質（または糖タンパク質の分子複合体）、またはキャップを外されかつ脱マンノシル化した糖タンパク質（または糖タンパク質の分子複合体）を産生するために、マンノース−１−ホスホ−６マンノース結合またはマンノース−１−ホスホ−６マンノース部分を含有する標的分子（または分子複合体）を、好適な条件下で、好適なマンノシダーゼ（複数可）と、および／または組換え産生した好適なマンノシダーゼ（複数可）を含有する細胞溶解産物と接触させる。好適なマンノシダーゼは上記している。細胞溶解産物は、真菌細胞、植物細胞、または動物細胞を含む、遺伝子操作した任意の細胞由来であることができる。動物細胞の非限定例としては、線虫、昆虫、植物、鳥類、爬虫類、および、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、アレチネズミ、イヌ、ネコ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、クジラ、サル、またはヒトのような哺乳類が挙げられる。
【００５３】
標的分子（例えば、分子複合体）を、精製したマンノシダーゼおよび／または細胞溶解産物と接触させると、マンノース−１−ホスホ−６−マンノース結合またはマンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分は、ホスホ−６−マンノースに加水分解することができ、そしてこのようなホスフェート含有グリカンの末端のα−１，２マンノース結合、α−１，３マンノース結合、および／もしくはα−１，６マンノース結合または末端のα−１，２マンノース部分、α−１，３マンノース部分、および／もしくはα−１，６マンノース部分は、加水分解され、キャップを外されかつ脱マンノシル化した標的分子を生成することができる。一部の実施形態においては、キャップを外す工程および脱マンノシル化する工程の両方を触媒する１つのマンノシダーゼを使用する。一部の実施形態においては、キャップを外す工程を触媒するために１つのマンノシダーゼを使用し、脱マンノシル化工程を触媒するために異なるマンノシダーゼを使用する。マンノシダーゼによる処理の後、標的分子または分子複合体を単離することができる。
【００５４】
細胞溶解産物におけるマンノシダーゼ活性の活性度または完全性を保存する該細胞溶解産物を得るのに好適な方法には、該細胞溶解産物におけるＮ−グリコシル化活性の変化を保存または最小化する適切なバッファーならびに／またはヌクレアーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、およびホスファターゼ阻害剤を含む阻害剤の使用を含めることができる。このような阻害剤は例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコールビス（Ｐ−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ１，Ｎ１−四酢酸（ＥＧＴＡ）のようなキレート剤、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、アプロチニン、ロイペプチン、アンチパインなどのようなプロテアーゼ阻害剤、ならびにホスフェート、フッ化ナトリウム、バナデートなどのようなホスファターゼ阻害剤が挙げられる。酵素活性を含有する溶解産物を得るのに適切なバッファーおよび条件は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（別冊４７）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）；Ｔｉｅｔｚ、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３版、ＢｕｒｔｉｓおよびＡｓｈｗｏｏｄ編、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９９９）に記載されている。
【００５５】
細胞溶解産物は適宜、干渉する物質の存在を除去または最小化するようさらに処理することができる。所望の場合、細胞溶解産物は、細胞下分画（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）、およびイオン交換クロマトグラフィー、疎水性および逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性電荷誘導クロマトグラフィーなどのようなクロマトグラフィー技術を含む、当業者に周知の種々の方法によって分画することができる。
【００５６】
一部の実施形態においては、細胞溶解産物は、細胞小器官全体が無傷および／または機能的であるままで調製することができる。例えば、溶解産物は、無傷の粗面小胞体、無傷の滑面小胞体、または無傷のゴルジ装置のうちの１またはそれより多くを含有することができる。無傷の細胞小器官を含有する溶解産物を調製して、該小器官の機能性について試験するのに好適な方法は、例えば、Ｍｏｒｅａｕら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（７）：４３２９〜４３３３；Ｍｏｒｅａｕら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（７）：４３２２〜４３２８；Ｒｅｘａｃｈら（１９９１）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１４（２）：２１９〜２２９；およびＰａｕｌｉｋら（１９９９）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３６７（２）：２６５〜２７３に記載されている。
【００５７】
哺乳類細胞の、キャップを外されかつ脱マンノシル化したホスフェートＮ−グリカンを含有する分子複合体と接触すると、分子複合体は、哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）の内部へ輸送され得る。キャップを外されたが脱マンノシル化していないリン酸化Ｎ−グリカンを有する分子複合体は、哺乳類細胞のマンノース−６−リン酸受容体を実質的に結合せず、それ自体、該細胞の内部へと効率的に輸送されない。本明細書で使用する場合、「実質的に結合しない」とは、哺乳類細胞のマンノース−６−リン酸受容体に糖タンパク質分子の１５％未満（例えば、１４％未満、１２％、１０％、８％、６％、４％、２％、１％、０．５％、またはそれより小、または０％）が結合することを意味する。しかしながら、基礎をなすマンノースがリン酸化される場合にこのような分子複合体が、末端α−１，２マンノース結合または末端α−１，２マンノース部分を加水分解することのできるマンノシダーゼと接触すれば、哺乳類細胞のマンノース−６−リン酸受容体に実質的に結合しかつ該細胞の内部へ効率よく輸送される脱マンノシル化した糖タンパク質が生成される。本明細書で使用する場合、「実質的に結合する」とは、分子複合体の１５％以上（例えば、１６％、１８％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％よりも大）が哺乳類細胞のマンノース−６−リン酸受容体に結合することを意味する。リン酸化Ｎ−グリカンのキャップを外すが脱マンノシル化しない酵素を含有する調製物（例えば、組換え宿主細胞または無細胞調製物）に、リン酸化Ｎ−グリカンを脱マンノシル化する酵素が混入し得ることは理解される。このような調製物との接触後の標的タンパク質試料は、キャップを外されるだけの一部のリン酸化Ｎ−グリカンを有するタンパク質分子、およびキャップを外されかつ脱マンノシル化したその他のリン酸化Ｎ−グリカンを有するタンパク質分子を含有することができる。キャップを外されかつ脱マンノシル化したリン酸化Ｎ−グリカンを含有する天然の上記タンパク質分子は、マンノース−６−リン酸受容体に実質的に結合することができる。「実質的に結合しない」に関する上の定義は、タンパク質分子におけるリン酸化Ｎ−グリカンが、キャップを外されたが脱マンノシル化していないことを特徴とすることができないので、このような標的タンパク質試料に適用されない。
【００５８】
したがって、本文書は、分子複合体を、哺乳類細胞のマンノース−６−リン酸受容体に結合しない第一の形態から、哺乳類細胞のマンノース−６−リン酸受容体に結合する第二の形態へ変換する方法を提供する。第一の形態においては、複合体におけるポリペプチドのうちの少なくとも１つが６位にリン酸残基を含有するマンノース残基に１位で結合する１またはそれより多くのマンノース残基を含有する１またはそれより多くのＮ−グリカンを含む分子複合体。このような方法においては、第一の形態の分子複合体は、末端マンノース残基を脱マンノシル化するマンノシダーゼと接触して、６位にホスフェートを含有するマンノースを結果として生じ、末端マンノースとなる。一部の実施形態においては、該マンノシダーゼは、キャップを外す活性も脱マンノシル化活性も有する（例えば、Ｃａｎａｖａｌｉａ  ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ（タチナタマメ（Ｊａｃｋ  ｂｅａｎ））マンノシダーゼまたはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＡＭＳ１マンノシダーゼ）。一部の実施形態においては、上記マンノシダーゼは、キャップを外す活性を有さない（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓａｔｏｉ由来のマンノシダーゼまたはＣｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌａｎｓ由来のマンノシダーゼ（例えば、ＣｃＭａｎ４））。
【００５９】
糖タンパク質または分子複合体の細胞の内部への輸送は、細胞取り込みアッセイを使用して評価することができる。例えば、キャップを外されかつ脱マンノシル化したリン酸化Ｎ−グリカンを含有する哺乳類細胞および分子複合体をインキュベートし、次に、細胞を洗浄および溶解することができる。細胞溶解産物は、ＧＡＡ複合体の存在について（例えば、ウェスタンブロット法によって）、または細胞溶解産物におけるＧＡＡの活性によって評価することができる。例えば、取り込みは、酸性αグルコシダーゼ活性を欠損する線維芽細胞において評価することができる。αグルコシダーゼの細胞内活性は、４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコピラノシド（４−ＭＵＧ）アッセイを使用して評価することができる。グルコシダーゼによる基質４−ＭＵＧの切断は、蛍光原性産物４−ＭＵの生成をもたらし、４−ＭＵは、紫外光による照射によって視覚化または検出することができる。
【００６０】
ポリペプチドの組換え産生
ポリペプチド（例えばマンノシダーゼ、アルカリプロテアーゼ、もしくはＧＡＡまたはその断片）をコードする単離された核酸分子は、標準的な技術によって産生することができる。「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において区別なく使用され、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、および核酸アナログを含有するＤＮＡ（またはＲＮＡ）を含め、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することができる。核酸は、二本鎖であってもよく、または一本鎖であってもよい（すなわち、センス鎖またはアンチセンス鎖）。ポリヌクレオチドの非限定的な例は、遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列についての単離されたＤＮＡ、任意の配列についての単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーならびに核酸アナログを含む。
【００６１】
「単離された核酸」は、天然に存在するゲノム（例えば酵母ゲノム）における核酸の片側または両側の側面に通常位置する核酸を含め、天然に存在するゲノムにおいて存在する他の核酸分子から分離されている核酸を指す。核酸に関して本明細書において使用される「単離された」という用語はまた、そのような天然に存在しない配列が自然界で見つけられず、また、天然に存在するゲノムにおいて直接隣接する配列を有していないので、任意の天然に存在しない核酸配列を含む。
【００６２】
単離された核酸は、例えば、ＤＮＡ分子であってもよい、ただし、天然に存在するゲノムにおけるそのＤＮＡ分子の側面に直接位置することが通常知られている核酸配列のうちの１つが、除去されているかまたは不在であることを条件とする。したがって、単離された核酸は、他の配列から独立した別々の分子として存在するＤＮＡ分子（例えば、化学的に合成された核酸またはＰＣＲもしくは制限エンドヌクレアーゼによる処置によって産生されたｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ断片）、ならびにベクター、自己複製プラスミド、ウイルス（例えば、任意のパラミクソウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、もしくはヘルペスウイルス）または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡへ組み込まれたＤＮＡを包含するがこれらに限定されない。そのうえ、単離された核酸は、ハイブリッドまたは融合核酸の一部であるＤＮＡ分子などのような操作された核酸を含むことができる。例えばｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノムライブラリーまたはゲノムＤＮＡ制限消化産物を含有するゲル切片内の何百〜何百万もの他の核酸の中で存在する核酸は、単離された核酸とみなされない。
【００６３】
核酸および特定の宿主細胞に関連して本明細書において使用される場合、「外因性」という用語は、自然界において見つけられるその特定の細胞において存在しない（およびそれから得ることができない）任意の核酸を指す。したがって、天然に存在しない核酸は、宿主細胞へ一度導入されたら、宿主細胞に対して外因性であると考えられる。天然に存在しない核酸は、自然界において見つけられる核酸サブ配列または核酸配列の断片を含有することができることに留意することは重要である、ただし、核酸が全体として、自然界において存在しないことを条件とする。例えば、発現ベクター内のゲノムＤＮＡ配列を含有する核酸分子は、天然に存在しない核酸であり、したがって、その核酸分子が全体として（ベクターＤＮＡプラスゲノムＤＮＡ）が自然界において存在しないので、宿主細胞へ一度導入されたら、宿主細胞に対して外因性である。したがって、自然界において全体として存在しない、任意のベクター、自律複製プラスミド、またはウイルス（例えばレトロウイルス、アデノウイルス、もしくはヘルペスウイルス）は、天然に存在しない核酸と考えられる。ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼによる処理によって産生されたゲノムＤＮＡ断片およびｃＤＮＡは、それらが自然界において見つけられない別々の分子として存在するので、天然に存在しない核酸と考えられることになる。自然界において見つけられない配置でプロモーター配列およびポリペプチドコード配列（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を含有する任意の核酸は、天然に存在しない核酸となることにもなる。天然に存在する核酸は、特定の細胞に対して外因性であり得る。例えば、酵母ｘの細胞から単離された染色体全体は、一度その染色体が酵母ｙの細胞へ導入されたら、酵母ｙの細胞に関して外因性の核酸となる。
【００６４】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術は、本明細書において記載されるヌクレオチド配列を含有する単離された核酸を得るために使用することができる。ＰＣＲは、全ゲノムＤＮＡまたは全細胞ＲＮＡ由来の配列を含め、ＤＮＡおよびＲＮＡ由来の特定の配列を増幅するために使用することができる。一般に、関心対象の領域の末端部またはそれを超える部分の配列情報は、増幅されることになっている鋳型の反対の鎖と配列が同一であるかまたは類似しているオリゴヌクレオチドプライマーを設計するために用いられる。部位特異的ヌクレオチド配列改変を鋳型核酸へ導入することができる様々なＰＣＲ戦略もまた、利用可能である。単離された核酸はまた、単一の核酸分子として（例えば、ホスホラミダイト技術を使用し、３’から５’の方向に自動化ＤＮＡ合成を使用して）または一連のオリゴヌクレオチドとして、化学的に合成することもできる。例えば、所望の配列を含有する長いオリゴヌクレオチド（例えば＞１００ヌクレオチド）の１またはそれより多くのペアを、合成することができ、それぞれのペアは、オリゴヌクレオチドペアをアニールした場合に二重鎖が形成されるように、相補性の短いセグメント（例えば約１５ヌクレオチド）を含有する。ＤＮＡポリメラーゼは、オリゴヌクレオチドを伸長させるために使用され、オリゴヌクレオチドペア当たり単一の二本鎖核酸分子がもたらされ、これは、次いで、ベクターへライゲーションすることができる。単離された核酸はまた、例えば天然に存在するＤＮＡの変異誘発によって得ることもできる。
【００６５】
ポリペプチド（例えばマンノシダーゼ、アルカリプロテアーゼ、もしくはＧＡＡまたはその断片）を組換えで産生するために、ポリペプチドをコードする核酸に対して作動可能に連結されたプロモーターを含有するベクターが、使用される。本明細書において使用される場合、「プロモーター」は、遺伝子が転写されるのを可能にするＤＮＡ配列を指す。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼによって認識され、これは、次いで、転写を開始する。したがって、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼが直接結合するかまたはＲＮＡポリメラーゼの動員に関与するＤＮＡ配列を含有する。プロモーター配列はまた、「エンハンサー領域」を含むことができ、これは、タンパク質（すなわち、転写因子のセットとよく似たトランス作用性因子）と結合して遺伝子クラスターにおける遺伝子の転写レベルを増強する（よってその名前がつけられている）ことができるＤＮＡの１またはそれより多くの領域である。エンハンサーは、典型的に、コーディング領域の５’末端部にあるが、プロモーター配列と離れていることもでき、また、例えば、遺伝子のイントロン領域内にまたは遺伝子のコーディング領域の３’側にあってもよい。
【００６６】
本明細書において使用される場合、「作動可能に連結される」は、発現コントロール配列が関心対象のコード配列の発現を有効にコントロールするように、遺伝的構築物（例えばベクター）へ組み込まれることを意味する。
【００６７】
発現ベクターは、コードポリペプチドの発現のために宿主細胞へ導入することができ（例えば形質転換またはトランスフェクションによって）、これは、次いで、精製することができる。ポリペプチド（例えばマンノシダーゼ、アルカリプロテアーゼ、もしくはＧＡＡまたはその断片）の小規模または大規模の生産に使用することができる発現系は、核酸分子を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌（例えば大腸菌）ならびに核酸分子を含有する組換え真菌発現ベクターにより形質転換された真菌（例えばＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのような微生物を包含するがこれらに限定されない。有用な発現系はまた、核酸分子を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系および核酸分子を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えばタバコモザイクウイルス）に感染したかまたは組換えプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）により形質転換された植物細胞系をも含む。マンノシダーゼまたはアルカリプロテアーゼのポリペプチドはまた、哺乳類発現系を使用して産生することもでき、これらは、哺乳類細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター）または哺乳類ウイルスに由来するプロモーター（例えばアデノウイルス後期プロモーターおよびサイトメガロウイルスプロモーター）を含有する組換え発現構築物を保有する細胞（例えばＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ヒト胎児由来腎臓２９３細胞、および３Ｔ３  Ｌ１細胞などのような不死化細胞株）を含む。
【００６８】
マンノシダーゼなどのような組換えポリペプチドは、タンパク質の精製を助けるために、ＦＬＡＧ、ポリヒスチジン（例えばヘキサヒスチジン）、赤血球凝集素（ｈｅｍａｇｌｕｔｔａｎｉｎ）（ＨＡ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）などのような異種性アミノ酸配列によりタグ付けすることができる。タンパク質を精製するための他の方法は、イオン交換、疎水性および逆相、サイズ排除、アフィニティー、疎水性電荷誘導クロマトグラフィーなどのようなクロマトグラフィー技術を含む。（例えばＳｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第３版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；ＢｕｒｔｏｎおよびＨａｒｄｉｎｇ、Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ａ  ８１４：７１−８１（１９９８）を参照されたい）。
【００６９】
（糖タンパク質のキャップを外しかつ脱マンノシル化するインビボでの方法）
本明細書において記載される遺伝子操作された細胞は、ＧＡＡ活性を有する分子複合体を産生するために使用することができる。例えば、遺伝子操作された細胞は、ＧＡＡ活性を有し、かつ少なくとも２つのポリペプチドを含み、それぞれのポリペプチドが、配列番号１において示されるアミノ酸配列のセグメントと少なくとも８５％の配列同一性を有し、それぞれのセグメントが、アミノ酸５０とアミノ酸７４との間の（例えば、アミノ酸５６とアミノ酸６８との間またはアミノ酸６０とアミノ酸６５との間の）１またはそれより多くの部位での、配列番号１において示されるアミノ酸配列のタンパク質分解によって誘導される分子複合体を産生するために使用することができる。例えば、真菌細胞は、コードされるポリペプチドのそれぞれが培養培地へ分泌されるように、配列番号１において示されるアミノ酸配列をコードする核酸および配列番号８において示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するアルカリプロテアーゼをコードする核酸を含むように操作することができ、アルカリプロテアーゼは、配列番号１において示されるアミノ酸配列を切断することができる。実施例１２において記載されるように、組換えＧＡＡがアルカリプロテアーゼと共に培養培地へ分泌される場合、１１０ｋＤａ前駆体の９５ｋＤａ形態へのプロセシングは、完全であった、すなわち、１１０ｋＤａ前駆体は、検出されなかった。
【００７０】
本明細書において記載される遺伝子操作された細胞はまた、キャップを外されかつ脱マンノシル化した分子複合体を産生するために使用することができる。そのような遺伝子操作された細胞は、配列番号１において示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸、本明細書において記載されるマンノシダーゼをコードする核酸、必要に応じて、配列番号８において示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するアルカリプロテアーゼをコードする核酸を含むことができる。
【００７１】
キャップを外されかつ脱マンノシル化した分子複合体を産生する細胞を基にした方法は、マンノース−１−ホスホ−６−マンノース結合または部分をホスホ−６−マンノースに加水分解することができるマンノシダーゼをコードする核酸を含むように遺伝子操作された真菌細胞に、配列番号１において示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸および必要に応じて、配列番号８において示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するアルカリプロテアーゼをコードする核酸を導入することを含むことができ、細胞が、キャップを外されたリン酸化Ｎ−グリカンを含有する、本明細書において記載される分子複合体を産生する。そのようなリン酸化Ｎ−グリカンは、上記に記載されるように脱マンノシル化することができる。一部の実施形態において、マンノシダーゼおよびＧＡＡが共分泌されるように、マンノシダーゼおよびＧＡＡをコードする核酸が、分泌配列を含有する。アルカリプロテアーゼをコードする核酸を含む、遺伝子操作された細胞において、分子複合体は、９５ｋＤａ形へとプロセシングされることができる。
【００７２】
細胞を基にした別の方法は、（ｉ）マンノース−１−ホスホ−６−マンノース結合またはマンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分をホスホ−６−マンノースに加水分解することができる工程と、（ｉｉ）ホスフェート含有グリカンの末端のα−１，２マンノース結合、α−１，３マンノース結合、および／もしくはα−１，６マンノース結合または末端のα−１，２マンノース部分、α−１，３マンノース部分、および／もしくはα−１，６マンノース部分を加水分解することのできるマンノシダーゼをコードする核酸を含むよう遺伝子操作された真菌細胞に配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸および場合によっては、配列番号８に示すアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するアルカリプロテアーゼをコードする核酸を導入する工程であって、ここで、該細胞は、キャップを外されかつ脱マンノシル化した分子複合体を産生することを含むことができる。一部の実施形態においては、上記マンノシダーゼおよびＧＡＡをコードする核酸は、該マンノシダーゼおよび標的分子が共分泌されるよう、分泌配列を含有する。アルカリプロテアーゼをコードする核酸を含む遺伝子操作された細胞において、分子複合体は、９５ｋＤａの形態へとプロセシングされ得る。
【００７３】
標的分子または分子複合体のインビボでの産生に好適な細胞は、
【化３】
2015516148.tif 000002
【化４】
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【化５】
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このような細胞は、本明細書に記載されるような遺伝子操作の前に、種々の商業的供給源および研究資源施設（例えば、米国培養細胞系統保存機関（米国メリーランド州ロックヴィルなど）から得ることができる。
【００７４】
細胞の遺伝子操作は、マンノシダーゼ、ＧＡＡおよび／またはアルカリプロテアーゼをコードする外来性核酸に加えて、（ｉ）外側鎖伸長（ＯＣＨ１）タンパク質をコードする内在性遺伝子の欠失、（ｉｉ）マンノシルリン酸化を促進してマンノース残基のリン酸化を増大させることができるポリペプチド（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、もしくはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓに由来するＭＮＮ４ポリペプチド、またはＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓに由来するＰＮＯ１ポリペプチド）をコードする組換え核酸の導入、（ｉｉｉ）ＯＣＨ１タンパク質の機能的発現に干渉するＲＮＡ分子の導入または発現、（ｉｖ）Ｎ−グリコシル化活性を有する野生型（例えば、内在性または外来性）タンパク質をコードする（すなわち、Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質を発現する）組換え核酸の導入、あるいは（ｖ）Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする１またはそれより多くの内在性遺伝子のプロモーターエレメントまたはエンハンサーエレメントを変更し、したがってそれらのコードタンパク質の発現を変更などの１種類以上の遺伝子改変を含むことができる。ＲＮＡ分子は、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が含まれる。遺伝子操作には、Ｎ−グリコシル化活性を有して、付加（例えば、異種性配列）、欠失、または置換（例えば、点変異のような変異、保存的変異または非保存的変異）を有するタンパク質を産生するタンパク質をコードする内在性遺伝子を変更することも含まれる。変異は、（例えば、部位特異的変異誘発または相同組換えによって）特異的に導入することができ、または無作為に導入することができる（例えば、細胞は、例えばＮｅｗｍａｎおよびＦｅｒｒｏ−Ｎｏｖｉｃｋ（１９８７）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０５（４）：１５８７）に記載されるように化学的に変異誘発され得る）。
【００７５】
本明細書に記載される遺伝子改変は結果的に、（ｉ）遺伝子改変細胞における１種類以上の活性の増大、（ｉｉ）遺伝子改変細胞における１種類以上の活性の低下、または（ｉｉｉ）遺伝子改変細胞における１種類以上の活性の局在性もしくは細胞内分布の変化、のうちの１またはそれより多くを生じることができる。特定の活性の量の増大（例えば、マンノシルリン酸化を促進すること）は、マンノシルリン酸化を促進することのできる１種類以上のタンパク質を過剰発現させること、内在性遺伝子のコピー数の増加（例えば、遺伝子重複）、または内在性遺伝子によってコードされるタンパク質の発現の増大を刺激する該遺伝子のプロモーターもしくはエンハンサーの変更によることができる。１種類以上の特定の活性の低下は、変異体形態（例えば、ドミナントネガティブ形態）の過剰発現、特定の活性を有する１種類以上のタンパク質の発現を低下させる１種類以上の干渉性ＲＮＡ分子の導入もしくは発現、または特定の活性を有するタンパク質をコードする１種類以上の内在性遺伝子の欠失によることができる。
【００７６】
相同組換えによって遺伝子を破壊させるために、「遺伝子置換」ベクターは、選択可能なマーカー遺伝子を含むような方法で構築することができる。選択可能なマーカー遺伝子は、５’末端および３’末端の両方で、相同組換えを仲介するのに十分な長さの遺伝子の部分に作動可能に連結され得る。選択可能なマーカーは、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子、およびＨＩＳ３遺伝子を含む、宿主細胞栄養要求性を補完するかまたは抗生物質耐性を提供するかのいずれかである任意の数の遺伝子のうちの１つであることができる。他の好適な選択可能なマーカーには、酵母細胞に対してクロラムフェニコール耐性を与えるＣＡＴ遺伝子、またはβ−ガラクトシダーゼの発現による青色コロニーを結果として生じるｌａｃＺ遺伝子が挙げられる。次に、遺伝子置換ベクターの線状化ＤＮＡ断片を、当該技術分野で周知の方法を使用して上記細胞へと導入する（下記を参照されたい）。その線状断片のゲノムへの組込みおよび上記遺伝子の破壊は、選択マーカーを基にして決定することができ、例えば、サザンブロット分析によって実証することができる。選択可能なマーカーは、例えばＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムによって宿主細胞のゲノムから除去することができる（下記を参照されたい）。
【００７７】
あるいは、遺伝子置換ベクターは、破壊されるべき遺伝子の一部を含むような方法で構築することができ、該一部は、任意の内在性遺伝子プロモーター配列がまったくなく、かつ該遺伝子のコード配列のいずれもコードせず、または該コード配列の不活性断片をコードする。「不活性断片」とは、上記遺伝子の全長のコード配列から生成されるタンパク質の活性の例えば約１０％未満（例えば、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、または０％）を有するタンパク質をコードする遺伝子の断片である。上記遺伝子のこのような一部を、公知のプロモーター配列が該遺伝子配列に作動可能に連結されないものの、終止コドンおよび転写終結配列が該遺伝子配列の一部に作動可能に連結されるような方法で、ベクターに挿入する。このベクターはその後、遺伝子配列の一部において線状化し、細胞へと形質転換することができる。単一の相同組換えによって、この線状化ベクターを次に、上記遺伝子の内在性対応物に組み込む。
【００７８】
発現ベクターは、自律的または組込み型であることができる。組換え核酸（例えばマンノシダーゼ、ＧＡＡまたはアルカリプロテアーゼをコードする組換え核酸）は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、またはウイルス粒子のような発現ベクターの形態で細胞へと導入することができる。組換え核酸は、染色体外で維持することができ、または酵母細胞染色体ＤＮＡへと組み込むことができる。発現ベクターは、所望の核酸で形質転換した細胞の検出および／または選択を可能にするために、選択された条件下で細胞生存度に必要なタンパク質をコードする選択マーカー遺伝子（例えば、ウラシル生合成に必要な酵素をコードするＵＲＡ３、またはトリプトファン生合成に必要な酵素をコードするＴＲＰ１）を含有することができる（例えば、米国特許第４，７０４，３６２号を参照されたい）。発現ベクターには、自律複製配列（ＡＲＳ）も含めることができる。例えば、米国特許第４，８３７，１４８号は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるプラスミドを維持するのに好適な手段を提供する自律複製配列を記載している。
【００７９】
組込み型ベクターは、例えば、米国特許第４，８８２，２７９号において開示されている。組込み型ベクターには一般的に、少なくとも１つの第一の挿入可能なＤＮＡ断片、１つの選択可能なマーカー遺伝子、および１つの第二の挿入可能なＤＮＡ断片からなる連続的に配置された配列が含まれる。第一および第二の挿入可能なＤＮＡ断片は各々、長さ約２００（例えば、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、または約１０００、またはそれより長い）ヌクレオチドであり、かつ形質転換されるべき種のゲノムＤＮＡの部分に対して相同的であるヌクレオチド配列を有する。発現のための関心対象の遺伝子（例えば、ＧＡＡをコードする遺伝子）を含有するヌクレオチド配列は、マーカー遺伝子の前であろうと後であろうと、このベクターにおいて、第一の挿入可能なＤＮＡ断片と第二の挿入可能なＤＮＡ断片との間に挿入される。組込み型ベクターは、関心対象のヌクレオチド配列の宿主細胞ゲノムへの組込みを促進するために、酵母形質転換前に線状化され得る。
【００８０】
発現ベクターは、酵母（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、または他の好適な真菌種）プロモーターの制御下での組換え核酸の特色をなすことができ、該プロモーターによって、真菌細胞において発現することができる。好適な酵母プロモーターには、例えば、ＡＤＣ１プロモーター、ＴＰＩ１プロモーター、ＡＤＨ２プロモーター、ｈｐ４ｄプロモーター、ＰＯＸプロモーター、およびＧａｌ１０プロモーターが含まれる（例えば、Ｇｕａｒｅｎｔｅら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９（２３）：７４１０を参照されたい）。追加の好適なプロモーターは、例えば、ＺｈｕおよびＺｈａｎｇ（１９９９）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １５（７〜８）：６０８〜６１１ならびに米国特許第６，２６５，１８５号に記載されている。
【００８１】
プロモーターは、構成的または誘導性（条件的）であることができる。構成的プロモーターは、は、標準的な培養条件下で発現が一定であるプロモーターであると理解されている。誘導性プロモーターとは、１またはそれより多くの誘導指示（Ｃｕｅ）に対して応答性であるプロモーターである。例えば、誘導性プロモーターは、化学的に調節されることができ（例えば、アルコール、テトラサイクリン、ステロイド、金属、または他の低分子のような化学的誘導剤の存在または不在によってその転写活性が調節されるプロモーター）、または物理的に調節され得る（例えば、光または高温もしくは低温のような物理的誘導因子の存在または不在によってその転写活性が調節されるプロモーター）。誘導性プロモーターは、化学的指示または物理的指示によってそれ自体が直接的に調節される１種類以上の転写因子によって間接的に調節されることもできる。
【００８２】
遺伝子操作された他の改変も条件的であることができることは理解される。例えば、遺伝子は、例えばＣｒｅ−ｌｏｘＰ系のような部位特異的ＤＮＡ組換え酵素を使用して、条件的に欠失させることができる（例えば、Ｇｏｓｓｅｎら（２００２）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３６：１５３〜１７３および米国特許出願公開第２００６００１４２６４号を参照されたい）。
【００８３】
組換え核酸は、スフェロプラスト技術または全細胞塩化リチウム酵母形質転換法のような種々の方法を使用して、本明細書に記載された細胞へと導入することができる。プラスミドまたは線状核酸ベクターの細胞への形質転換に有用な他の方法は、例えば、米国特許第４，９２９，５５５号、Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１９２９、Ｉｔｏら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３、米国特許第４，８７９，２３１号、およびＳｒｅｅｋｒｉｓｈｎａら（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５９：１１５に記載されており、これらの各々の開示は、それらのすべての内容が全体として引用により本明細書に組み込まれている。電気穿孔法およびＰＥＧ１０００全細胞形質転換法も、ＣｒｅｇｇおよびＲｕｓｓｅｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｉｃｈｉａ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第３章、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．、ｐｐ．２７〜３９（１９９８）に記載されているとおり使用してもよい。
【００８４】
形質転換した真菌細胞は、新たな表現型の選択および検出のために（細胞の栄養要求性により）必要とされる生化学的産物の不在下で形質転換後に栄養要求性細胞を培養すること、または形質転換体に含有される耐性遺伝子の不在下で酵母に対して毒性のある抗生物質の存在下で培養することを含むがこれらに限定されない適切な技術を使用することによって選択することができる。形質転換体は、例えばサザンブロットまたはＰＣＲ分析によって評価することのできる、ゲノムへの発現カセットの組込みによって選択および／または実証することもできる。
【００８５】
ベクターを関心対象の標的細胞に導入する前に、ベクターは、上に記載したとおり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌細胞において増殖させる（例えば、増幅させる）ことができる。ベクターＤＮＡは、ベクターＤＮＡの細菌環境からの精製を結果として生じる、当該技術分野で公知の方法のうちの何らかによって、細菌細胞から単離することができる。精製されたベクターＤＮＡは、大腸菌タンパク質が哺乳類細胞に対して毒性であることができるので、これらのタンパク質がプラスミドＤＮＡ調製物中に存在しないことを確保するために、フェノール、クロロホルム、およびエーテルで徹底的に抽出することができる。
【００８６】
一部の実施形態においては、遺伝子操作された真菌細胞は、ＯＣＨ１遺伝子またはその遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質）を欠いており、ＯＣＨ１活性を欠損している。一部の実施形態においては、遺伝子操作された細胞は、マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチド（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、もしくはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓに由来するＭＮＮ４ポリペプチド、またはＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓに由来するＰＮＯ１ポリペプチド）を発現する。例えば、真菌細胞は、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のＭＮＮ４ポリペプチド（Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）受託番号：ＸＭ＿５０３２１７、Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ参照コード：ＹＡＬＩ０Ｄ２４１０１ｇ）を発現することができる。一部の実施形態においては、遺伝子操作された細胞は、ＯＣＨ１活性を欠損しており、マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチドを発現する。
【００８７】
キャップを外しかつ脱マンノシル化の後、分子複合体は単離することができる。一部の実施形態においては、分子複合体は、酵母細胞内で維持され、細胞溶解の際に放出される。一部の実施形態においては、分子複合体は、上記細胞からの該分子の分泌を誘導する、（外来性核酸に対して天然であるかまたは発現ベクターへと操作されるかのいずれかである）コード配列によって提供される機序を介して培養培地へと分泌される。細胞溶解産物または培養培地中のキャップを外されかつ脱マンノシル化した分子複合体の存在は、該分子の存在を検出するための種々の標準的なプロトコル（例えば、ＧＡＡに特異的な抗体を使用するイムノブロッティングまたは比活性（例えば、グリコーゲン分解）についての試験）によって実証することができる。
【００８８】
一部の実施形態においては、単離後に、キャップを外されかつ脱マンノシル化した標的分子または分子複合体は、例えば酵素的手段または化学的手段を使用して異種性部分に結合することができる。「異種性部分」は、変更した標的分子に（例えば、共有結合でまたは非共有結合で）結合した任意の構成要素を指し、該構成要素は、変更した標的分子に元々存在する構成要素とは異なる。異種性部分には、例えばポリマー、キャリア、アジュバント、免疫毒素、または検出可能な（例えば、蛍光、発光、または放射性）部分を含む。一部の実施形態においては、追加のＮ−グリカンは、変更した標的分子に付加することができる。
【００８９】
分子のグリコシル化を検出するための方法には、ＤＮＡシーケンサー支援型（ＤＳＡ）、フルオロフォア支援型炭水化物電気泳動（ＦＡＣＥ）または表面支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析法（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）が挙げられる。例えば、分析は、例えば糖タンパク質を変性させた後に、例えばメンブラン上へ固定化するＤＳＡ−ＦＡＣＥを利用することができる。上記糖タンパク質は次に、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）またはβ−メルカプトエタノールのような好適な還元剤を用いて還元することができる。上記タンパク質のスルフヒドリル基は、ヨード酢酸のような酸を使用してカルボキシ化することができる。次に、Ｎ−グリカンは、Ｎ−グリコシダーゼＦのような酵素を使用して該タンパク質から放出することができる。Ｎ−グリカンは必要に応じて、還元アミノ化によって再構成および誘導体化することができる。例えば、放出されたＮ−グリカンは、還元的アミノ化によって、還元性末端で、ＡＰＴＳ（８−アミノピレン−１，３，６−トリスルホン酸）などのようなフルオロフォアにより標識することができる。標識の化学量論は、１つのＡＰＴＳ分子のみがオリゴ糖のそれぞれの分子へ付加されるようなものである。誘導体化したＮ−グリカンは次に濃縮することができる。Ｎ−グリカン分析に好適な計測手段には、例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７７  ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が含まれる。データ分析は、例えばＧＥＮＥＳＣＡＮ（登録商標）３．１ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施することができる。単離されたマンノプロテインは、そのＮ−グリカン状態を確認するために、仔ウシ腸ホスファターゼのような１種類以上の酵素を使用してさらに処理することができる。Ｎ−グリカン分析の追加の方法には、例えば、質量分析（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）、順相、逆相における高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、およびイオン交換クロマトグラフィー（例えば、グリカンが標識されていない場合にはパルス電流検出を使用し、グリカンが適切に標識されている場合、紫外吸収または蛍光を使用する）が含まれる。Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔら（２００１）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １１（４）：２７５〜２８１、およびＦｒｅｉｒｅら（２００６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１７（２）：５５９〜５６４も参照されたい。
【００９０】
（操作された細胞の培養物）
本文書は、本明細書に記載される遺伝子操作された細胞のうちの任意の実質的に純粋な培養物も提供する。本明細書において使用する場合、遺伝子操作された細胞の「実質的に純粋な培養物」とは、該培養物における生細胞の総数の約４０％未満（すなわち、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、約０．２５％未満、約０．１％未満、約０．０１％未満、約０．００１％未満、約０．０００１％未満、またはさらにより小）が遺伝子操作された細胞、例えば細菌細胞、真菌細胞（酵母を含む）、マイコプラズマ細胞、または原生動物細胞以外の生細胞である。本文脈における用語「約」とは、関連した百分率が、指定された百分率の１５％ほど指定された百分率を上回るまたは下回ることができることを意味する。したがって、例えば、約２０％とは、１７％〜２３％であることができる。遺伝子操作された細胞のこのような培養物には、細胞および、増殖媒体、保存媒体、または輸送媒体が含まれる。媒体は、液体、半固形（例えば、ゼラチン媒体）、または凍結であることができる。上記培養物には、液体または半固形媒体で増殖する細胞、または、凍結保存媒体または輸送媒体を含む保存媒体または輸送媒体中で保存または輸送される細胞が含まれる。上記培養物は、培養容器または保存容器または基材（例えば、培養皿、培養フラスコ、もしくは培養チューブ、または保存バイアルもしくは保存チューブ）の中にある。
【００９１】
本明細書に記載される遺伝子操作された細胞は、例えば、凍結した細胞懸濁液として、例えば、グリセロールまたはスクロースのような凍結保護物質を含有するバッファー中に、凍結乾燥した細胞として保存することができる。あるいは、上記細胞は、例えば、流動床乾燥もしくは噴霧乾燥、または任意の他の好適な乾燥方法によって得られる乾燥した細胞調製物として保存することができる。
【００９２】
（薬学的組成物および処置方法）
本明細書中に記載されたＧＡＡ分子および分子複合体（例えば、哺乳類細胞の内部への輸送を増強する少なくとも１つの改変を含む分子複合体）は、治療有効量の該分子と１種類以上のアジュバント、賦形剤、キャリア、および／または希釈剤とを含有する薬学的組成物へと組み込むことができる。許容し得る希釈剤、キャリア、および賦形剤は典型的には、受容者の恒常性（例えば、電解質平衡）に有害に影響することはない。許容し得るキャリアには、生体適合性、不活性、または生体吸収可能な塩、緩衝剤、オリゴ糖または多糖、ポリマー、粘度改善剤、保存剤などが含挙げられる。ある例示的なキャリアは、生理食塩水（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０〜７．４）である。別の例示的なキャリアは、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウムである。薬学的組成物の製剤化および投与についての技術に関するさらなる詳細は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、米国ペンシルバニア州イーストン）において得ることができる。補充用活性化合物も上記組成物中に組み込むことができる。
【００９３】
本明細書中に記載された１つまたは複数の改変を有する分子複合体を含有する薬学的組成物の投与は、全身性または局所性であることができる。薬学的組成物は、非経口投与および／または経口投与に好適であるよう製剤化することができる。具体的な投与様式には、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、経皮投与、髄腔内投与、経口投与、直腸投与、口腔投与、局所投与、鼻投与、眼投与、関節内投与、動脈内投与、くも膜下投与、気管支投与、リンパ投与、膣投与、および子宮内投与が含まれる。
【００９４】
投与は、薬学的組成物のボーラスによる周期的注入によることができるか、または外部（例えば、静脈内用の袋）または内部（例えば、生分解性埋没物、生体人工臓器、または植え込み型の改変Ｎ−グリコシル化分子産生細胞のコロニー）である貯蔵器からの静脈内投与または腹腔内投与によって中断されないでいることができ、もしくは持続的であることができる。例えば、米国特許第４，４０７，９５７号、同第５，７９８，１１３号、および同第５，８００，８２８号を参照されたい。薬学的組成物の投与は、ポンプ（例えば、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ，２７：９１２（１９９３）；Ｃａｎｃｅｒ、４１：１２７０（１９９３）；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４４：１６９８（１９８４）を参照されたい）、マイクロカプセル封入（例えば、米国特許第４，３５２，８８３号、同第４，３５３，８８８号、および同第５，０８４，３５０号を参照されたい）、持続放出性ポリマー埋没物（例えば、Ｓａｂｅｌの米国特許第４，８８３，６６６号を参照されたい）、マクロカプセル封入（例えば、米国特許第５，２８４，７６１号、同第５，１５８，８８１号、同第４，９７６，８５９号、および同第４，９６８，７３３号、ならびにＰＣＴ公開特許出願ＷＯ９２／１９１９５号、ＷＯ９５／０５４５２号を参照されたい）、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、もしくは他の好適な部位のいずれかへの注射、またはカプセル剤、液剤、錠剤、丸剤、もしくは持続放出製剤での経口投与のような好適な送達手段を使用して達成することができる。
【００９５】
非経口送達系の例としては、エチレン−酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、植え込み可能な注入系、ポンプ送達、被包細胞送達、リポソーム送達、針送達系注射、無針注射、ネブライザー、エーロゾライザー、電気穿孔法、および経皮パッチが挙げられる。
【００９６】
非経口投与に好適な製剤は、改変Ｎ−グリコシル化分子の滅菌水性調製物を便利に含有しており、好ましくは受容者の血液と等張である（例えば、生理学的塩類溶液）。製剤は、単位用量形態または複数回用量形態で提供することができる。
【００９７】
経口投与に好適な製剤は、各々、あらかじめ決めておいた量の改変Ｎ−グリコシル化分子を含有するカプセル剤、カシェ剤、錠剤、もしくはロゼンジ、またはシロップ剤、エリキシル剤、乳剤、もしくは頓服水剤（ｄｒａｕｇｈｔ）のような、水性リカーもしくは非水性液中の懸濁剤のような分離した単位として提供することができる。
【００９８】
局所投与に好適な哺乳類細胞の内部への分子複合体の輸送を増強する少なくとも１つの改変を含む分子複合体は、哺乳類（例えば、ヒト患者）へ、例えばクリーム、スプレー、泡状物質、ジェル、軟膏、塗薬、またはドライラブ（ｄｒｙ  ｒｕｂ）として投与することができる。ドライラブは、投与部位で再含水することができる。このような分子は、包帯、ガーゼ、またはパッチへも直接注入することができ（例えば、浸漬して、および乾燥して）、次に、それは局所的に適用することができる。このような分子は、局所投与のための包帯、ガーゼ、またはパッチに半液状、ゲル状、または完全に液状で維持することもできる（例えば、米国特許第４，３０７，７１７号を参照されたい）。
【００９９】
治療有効量の薬学的組成物は、それを必要とする被験体へ、当業者によって確かめることのできる投与計画で投与することができる。例えば、組成物は、上記被験体へ、例えば１投薬あたり、被験体の体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜１０，０００μｇの薬用量で全身投与することができる。別の例においては、薬用量は、１投薬あたり、被験体の体重１ｋｇあたり１μｇ〜１００μｇである。別の例においては、薬用量は、１投薬あたり、被験体の体重１ｋｇあたり１μｇ〜３０μｇ、例えば、１投薬あたり、被験体の体重１ｋｇあたり３μｇ〜１０μｇである。
【０１００】
治療効能を最適化するために、本明細書中に記載される分子複合体はまず、異なる投与計画で投与することができる。単位用量および計画は、例えば、哺乳類の種、その免疫状態、該哺乳類の体重を含む因子に左右される。典型的には、組織におけるこのような分子複合体のレベルは、例えば、所与の処置計画の効能を決定するための臨床試験手順の一部として適切なスクリーニングアッセイを使用して監視することができる。
【０１０１】
本明細書中に記載された分子複合体についての投与頻度は、医療従事者（例えば、医師または看護師）の技術および臨床的判断のうちにある。典型的には、投与計画は、最適な投与パラメータを確立し得る臨床試験によって確立する。しかしながら、上記従事者は、被験体の年齢、健康状態、体重、性別、および医学的状態に従ってこのような投与計画を変更してもよい。投与の頻度は、処置が予防的であるかまたは治療的であるかに応じて変更することができる。
【０１０２】
このような分子複合体またはその薬学的組成物の毒性および治療的効能は、例えば細胞培養物または実験動物における公知の医薬手順によって決定することができる。これらの手順は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％が致死する量）およびＥＤ５０（集団の５０％における治療有効量）を決定するために使用することができる。毒性作用と治療効果の間の用量比は治療指数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。高い治療指数を示す薬学的組成物が好ましい。毒性のある副作用を示す薬学的組成物を使用することはできるが、正常細胞（例えば、非標的細胞）に対する潜在的な障害を最小化し、それにより副作用を低減するために、影響される組織の部位にこのような化合物を向ける送達系を設計するよう注意を払うべきである。
【０１０３】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得たデータは、適切な被験体（例えば、ヒト患者）における使用のためのある範囲の薬用量を製剤化する上で使用することができる。このような薬学的組成物の薬用量は一般的に、ほとんどまたはまったく毒性を有さないＥＤ５０を含むある範囲の循環濃度内に収まる。薬用量は、採用される剤形および利用される投与経路に応じてこの範囲内で変化してもよい。（例えば、被験体における代謝障害を処置するために）本明細書に記載されるように使用される薬学的組成物については、治療有効量は、細胞培養アッセイから最初に概算することができる。用量は、細胞培養において決定されるようなＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量の阻害を達成する薬学的組成物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために、動物モデルにおいて処方することができる。このような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
【０１０４】
本明細書において定義する場合、分子複合体の「治療有効量」とは、処置された被験体における医学的に望ましい結果（例えば、ポンペ病の１種類以上の症状の改善）を生むことのできる複合体の量である。治療有効量（すなわち、有効薬用量）には、被験体の体重または試料の重量の１キログラムあたりの複合体のミリグラム量またはマイクログラム量（例えば、１キログラムあたり約１マイクログラム〜１キログラムあたり約５００ミリグラム、１キログラムあたり約１００マイクログラム〜１キログラムあたり約５ミリグラム、または１キログラムあたり約１マイクログラム〜１キログラムあたり約５０マイクログラム）を含めることができる。
【０１０５】
被験体は、任意の哺乳類、例えばヒト（例えば、ヒト患者）または非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー、ヒヒ、またはサル）、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、アレチネズミ、ハムスター、ウマ、ある種の家畜（例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、またはヤギ）、イヌ、ネコ、またはクジラであることができる。
【０１０６】
本明細書に記載される分子複合体またはその薬学的組成物は、被験体へ、ポンペプチド病に使用される別の処置との併用療法として投与することができる。例えば、併用療法には、被験体（例えば、ヒト患者）へ、ポンペ病を（例えば、ＧＡＡをコードする遺伝子の変異に起因して）を発達させる危険を有するまたは該危険にある被験体へ治療上の利点を提供する１種類以上の追加の薬剤を投与することを含めることができる。したがって、上記化合物または薬学的組成物および１種類以上の追加の薬剤は、同時に投与することができる。あるいは、上記分子複合体を第一に投与し、かつ第二に上記１種類以上の追加の薬剤を投与することができ、またはその逆を行なうこともできる。
【０１０７】
本明細書中に記載される分子複合体のうちの任意のものが凍結乾燥されることができる。
【０１０８】
本明細書に記載される薬学的組成物のうちの任意のものが、投与のための指示とともに、容器、パック、またはディスペンサーに含めることができる。一部の実施形態においては、上記組成物は、一回使い切りのバイアルとしてパッケージングされる。
【０１０９】
以下は、本発明の実施例である。該実施例は、本発明の範囲をいずれかの方法で制限するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１１０】
実施例１
ＣｃＭａｎ５およびタチナタマメα−マンノシダーゼによる組換えｈｕＧＡＡのキャップを外すことおよび脱マンノシル化
組換えヒトＧＡＡ（ｒｈＧＡＡ）は、ヒトαグルコシダーゼ遺伝子（酸性αグルコシダーゼまたは酸性マルターゼＥＣ３．２．１．３としても知られている）の３つのコピーおよびＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＭＮＮ４遺伝子の２つのコピーを含有するＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ産生株ＯＸＹＹｌ５８９を使用して、国際公開第２０１１／０３９６３４号において記載されるように産生した。ヒトＧＡＡのアミノ酸配列を図１に示す。
ＯＸＹｌ５８９株の遺伝子型は、以下のとおりである。
【化６】
2015516148.tif 000005
ＲｈＧＡＡは、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌａｎｓマンノシダーゼ（ＣｃＭａｎ５）およびタチナタマメαマンノシダーゼ（ＪｂＭａｎ）（Ｓｉｇｍａ製品Ｍ７２５７、３．０Ｍ硫酸アンモニウム懸濁液）によりキャップを外し、かつ脱マンノシル化した。ＣｃＭａｎ５は、まず、ＤｓｂＡシグナル配列を含有し、Ｎ末端ＨＩＳタグを有するタンパク質の発現をもたらすベクターｐＬＳＡＨ３６へ、ＣｃＭａｎ５ポリペプチドをコードする核酸をクローニングすることによって組換えで産生した（図２Ａ）。図２Ｂおよび２Ｃは、それぞれ、シグナル配列を有するおよびシグナル配列を有していないＣｃＭａｎ５ポリペプチドのアミノ酸配列を含む。プラスミドｐＬＳＡＨ３６を、大腸菌Ｂ２１細胞へクローニングし、ペリプラズム中に存在するタンパク質を、Ｔａｌｏｎカラムを使用して単離し、精製した。ＪｂＭａｎの硫酸アンモニウム懸濁液を使用する前に、それを、混入ホスファターゼ活性を除去するＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムによるゲルろ過によってさらに精製した。
【０１１１】
ＲｈＧＡＡ（２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）バッファー、ｐＨ５．０中約５ｍｇ／ｍＬの濃度）は、ｈｕＧＡＡ：ＣｃＭａｎ５：ＪｂＭａｎについて１００：５：１０のｗ：ｗ比で、ＣｃＭａｎ５（リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中約０．１５〜０．３０ｍｇ／ｍＬ）およびＪｂＭａｎ（ＰＢＳ中約０．５〜１ｍｇ／ｍＬ）と共にインキュベートすることによって、キャップを外し、かつ脱マンノシル化した。全反応容積を、５００ｍＭ  ＮａＯＡｃバッファー、ｐＨ５．０および１００ｍＭ  ＣａＣｌ２により希釈し、１００ｍＭ  ＮａＯＡｃおよび２ｍＭ  ＣａＣｌ２の最終濃度を得た。反応混合物は、１６時間、３０℃でインキュベートした。
【０１１２】
キャップを外すプロセスを評価し、精製ｈｕＧＡＡのＮ−グリカンプロファイルを分析するために、５μｇ糖タンパク質のＮ−グリカンは、Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ）により放出させ、ＡＰＴＳ（８−アミノ−１，３，６−ピレントリスルホン酸；三ナトリウム塩）により標識し、続いて、ＤＳＡ−ＦＡＣＥ（ＤＮＡシーケンサー支援型フルオロフォア支援型炭水化物電気泳動）で分析した。方法は、Ｌａｒｏｙら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，１：３９７−４０５（２００６）において記載されるプロトコルに本質的に従う。
【０１１３】
ＣｃＭａｎ５およびＪｂＭａｎによる処理の前（パネルＢ）および後（パネルＣ）のｈｕＧＡＡ（７６ｋＤ形態）由来のＮ−グリカンのＤＳＡ−ＦＡＣＥ電気泳動図を図３Ａに示す。パネルＡは、ＰＮＧａｓｅＦによりＲＮａｓｅＢから放出されたＮ−グリカンを含有する参照試料である。キャップの付いたｈｕＧＡＡから放出されるＮ−グリカン混合物は、主として、ＭａｎＰ−Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２および（ＭａｎＰ）２−Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２から構成される（図３Ａ、パネルＢ）。ＭａｎＰ−Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２よりもわずかに速く流れるピークは、ＭａｎＰ−Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２に帰属させることができる。キャップを外し、脱マンノシル化した後に観察される主なピークは、二重リン酸化Ｐ２−Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２ならびにモノリン酸化Ｐ−Ｍａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２、Ｐ−Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、およびＰ−Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２に帰属させることができる（パネルＣ）。
【０１１４】
ｈｕＧＡＡの異なるプロセシング形態のキャップを外すことは、７６ｋＤ形態（パネルＢ）、９５ｋＤ形態（パネルＣ）、および１１０ｋＤ形態（パネルＤ）について、同じＮ−グリカンプロファイル（図３Ｂ）をもたらす。
【０１１５】
実施例２
１１０ｋＤａ  ｒｈＧＡＡの精製
ｒｈＧＡＡの１１０ｋＤａ形態を、ＯＸＹＹ１５８９株から以下のように単離した。回収後、ブロスを遠心分離し、Ｄｕｒａｐｏｒｅ膜（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、ろ過した。硫酸アンモニウム（ＡＭＳ）を、１Ｍの濃度まで追加し、溶質を、２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６、１Ｍ硫酸アンモニウム中で平衡化した疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムにロードする前に、ろ過した。産物を、２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６により溶出した。
【０１１６】
第２のクロマトグラフィーカラムにロードする前に、産物を、まず、再生セルロース膜でタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）を介して濃縮し、次いで、バッファーを２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．５に交換した。この材料を、２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．５により平衡化した陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）カラムにロードした。カラムにロードした後に、ＵＶ吸光度シグナルがベースラインに到達するまで、それを平衡バッファーにより洗浄し、次いで、２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌにより洗浄した。産物を、２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中に溶出し、濃縮し、バッファーを２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５に交換した（下記を参照されたい）。
【０１１７】
試料を、実施例１において記載されるように、キャップを外し、かつ脱マンノシル化し、次いで、Ｄ−マンニトールを、１００ｍＭの濃度まで追加した。その材料の４分の３について、１０ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する再生セルロース膜を使用し、ＴＦＦを介して容積を減らし、２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  Ｄ−マンニトールにより４℃で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムでサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を介してさらに精製した。画分を、その後、変性条件下で、チバクロンブルー染色ポリアクリルアミドゲルで、純度についてスクリーニングした。プールした画分を、ＴＦＦを介して濃縮し、１０ｋＤ  ＭＷＣＯのＡｍｉｃｏｎ遠心分離フィルター（再生セルロース膜、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して超遠心分離した。
【０１１８】
実施例３
１１０ｋＤａ  ｒｈＧＡＡの精製
ｒｈＧＡＡの１１０ｋＤａ形態を、ＯＸＹＹ１５８９株から以下のように単離した。回収後、ＡＭＳの濃度が１Ｍまで増加する前に、この材料を遠心分離し、ろ過した。溶質を再びろ過し、産物を、２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６、１Ｍ  ＡＭＳにより平衡化したＨＩＣカラム上に捕捉し、２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６バッファー中１Ｍから０ＭまでのＡＭＳのステップ勾配で放出した。
【０１１９】
溶出物を、Ｖｉｖａｆｌｏｗ  ２００モジュール（ＰＥＳ膜、１０ｋＤ  ＭＷＣＯ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）上でＴＦＦを介して濃縮し、１０ｍＭ  ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、ｐＨ６にバッファー交換した。脱塩した材料を、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＣ）カラム上に持ってきた。ＵＶシグナルがほぼベースラインに到達するまでカラムを洗浄した後に、二相連続塩勾配を適用した；０Ｍから０．３ＭまでのＮａＣｌに進む第１の勾配、０．３Ｍから１ＭまでのＮａＣｌの第２の勾配。画分を、勾配の間に収集し、定性的４−メチルウンベリフェリル−ａ−Ｄ−グルコピラノシド（４−ＭＵＧ）を介してＧＡＡについてスクリーニングした。４−ＭＵＧアッセイにおいて、０．３５ｍＭ  ４−ＭＵＧ、０．１％  ＢＳＡ、および１００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４からなる反応バッファーを１０μｌの溶出画分に対して１０：１の容積の割合で追加することによって反応を開始した。３７℃で３０分間〜１時間インキュベートした後に、等容積の１００ｍＭグリシンｐＨ１１を、反応を停止するために追加した。蛍光発生反応産物４−メチルウンベリフェロンの放出を、ＵＶ光下で観察した。
【０１２０】
ＧＡＡを含有する画分をプールし、Ｖｉｖａｆｌｏｗ  ２００モジュール（ＰＥＳ膜、１０ｋＤ  ＭＷＣＯ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）上でのＴＦＦおよび１０ｋＤ  ＭＷＣＯのＡｍｉｃｏｎ遠心分離フィルター（再生セルロース膜、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する超遠心分離を介して濃縮した。
【０１２１】
濃縮した材料を２つに分割し、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０により４℃で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムでさらに精製した。画分を、その後、変性条件下で、チバクロンブルー染色ポリアクリルアミドゲルで、純度についてスクリーニングし、ホスファターゼ含有量を、４０５ｎｍの波長で黄色のｐ−ニトロフェノラート反応産物の酵素による放出を測定する、パラ−ニトロフェニルホスフェートを使用する比色定量試験を使用して決定した。
【０１２２】
パイロットプールを、ＧＡＡを含有する画分から作製した。パイロットプールの総タンパク質を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを介して決定した。選択した画分を、Ｖｉｖａｆｌｏｗ  ２００  ＴＦＦモジュール（ＰＥＳ膜、１０ｋＤ  ＭＷＣＯ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）での濃縮のためにプールした。１０ｋＤ  ＭＷＣＯの１５ｍｌ  Ａｍｉｃｏｎ遠心分離フィルター（再生セルロース膜、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、容積をさらに減らした。
【０１２３】
濃縮した材料を、１回目のＳＥＣステップと同じ条件を使用して、２回目のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）にかけた。画分を、変性条件下で、チバクロンブルー染色ポリアクリルアミドゲルで、純度について再びスクリーニングした。画分を、選んだパイロットプールに従ってプールし、１５ｍｌ  Ａｍｉｃｏｎの遠心分離フィルター（１０ｋＤ  ＭＷＣＯ、再生セルロース膜、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮した。
【０１２４】
実施例４
９５ｋＤａ  ｒｈＧＡＡの精製
ｒｈＧＡＡの９５ｋＤａ形態を、ＯＸＹＹ１５８９株から以下のように単離した。回収後、ブロスを遠心分離し、Ｄｕｒａｐｏｒｅ膜（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、ろ過した。産物を、その後、１０ｋＤの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する改変ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜でＴＦＦを介して濃縮した。ＡＭＳを、１Ｍの濃度まで追加し、溶質を、２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６、１Ｍ  ＡＭＳ中で平衡化したＨＩＣカラムにロードする前に、ろ過した。産物を、水により溶出し、溶出物のｐＨを、１０ｍＭの濃度まで、１００ｍＭ  ＢＩＳ−ＴＲＩＳ  ｐＨ６のストックバッファーを追加することによって調節し、それを１３日間、４℃で保存した。
【０１２５】
ＡＥＸカラム上にロードする前に、産物を、１０ｋＤのＭＷＣＯを有する再生セルロース膜でＴＦＦを介して濃縮し、１０ｍＭ  ＢＩＳ−ＴＲＩＳ  ｐＨ６にバッファー交換した。脱塩した材料を、実施例３において記載されるように実行したＡＥＸクロマトグラフィーを介してさらに処理した。画分を、勾配の間に収集し、定性的４−ＭＵＧアッセイを介してＧＡＡについてスクリーニングした。ＧＡＡを含有する画分を、さらなる精製のためにプールした。
【０１２６】
第３のクロマトグラフィーステップについて、ＡＭＳの濃度を１Ｍまで増加させ、ろ過の後、この材料を、ＨＩＣを介してさらに精製した。１Ｍから０ＭまでのＡＭＳの連続塩勾配を、勾配の間に画分を収集しながら適用した。画分をすべて、定性的アッセイを介してＧＡＡについてスクリーニングし、ＧＡＡを含有するものを、さらなる処理のためにプールした。
【０１２７】
プールを、１０ｋＤ  ＭＷＣＯ再生セルロース膜の１５ｍｌ  Ａｍｉｃｏｎ遠心分離フィルターを使用する超遠心分離を介して濃縮し、実施例３において記載されるものと同じ手順を使用して、ＳＥＣを介してさらに精製した。画分を、その後、変性条件下で、チバクロンブルー染色ポリアクリルアミドゲルで、純度についてスクリーニングした。９０％純粋なＧＡＡ画分を、プールし、ＴＦＦ  Ｖｉｖａｆｌｏｗ  ２００モジュール（ＰＥＳ膜、１０ｋＤ  ＭＷＣＯ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）でまず濃縮し、次いで、１５ｍｌ  Ａｍｉｃｏｎ遠心分離フィルター（１０ｋＤ  ＭＷＣＯ、再生セルロース膜、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する超遠心分離にかけた。濃縮した材料を、１回目のＳＥＣステップについてと同じ条件を使用して、２回目のＳＥＣにかけた。画分を、定性的４−ＭＵＧ  ＧＡＡアッセイを使用してＧＡＡについてスクリーニングした。ＧＡＡ活性を有する画分を、プールし、濃縮した。
【０１２８】
実施例１において示されるようにキャップを外し、脱マンノシル化した後に、Ｄ−マンニトールを、１００ｍＭの濃度まで追加し、２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  Ｄ−マンニトールにより４℃で平衡化した最終のＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ゲルろ過カラムにロードする前に容積を再び減らした。画分を、４−ＭＵＧ定性的アッセイを使用してＧＡＡについてスクリーニングし、産物を含有するものを、プールし、濃縮した。
【０１２９】
実施例５
９５〜１１０ｋＤａのｒｈＧＡＡミックスの精製
ｒｈＧＡＡの１１０ｋＤａ前駆体および９５ｋＤａ形態の両方を、以下のようにＯＸＹＹ１５８９株から単離した。回収の後に、その材料を、実施例２において記載される第２のクロマトグラフィーステップで処理した。ＨＩＣステップの後、産物を、濃縮し、ＴＦＦを介して１０ｍＭ  ＢＩＳ−ＴＲＩＳ  ｐＨ６にバッファーを交換し、ＡＥＸカラムにロードした。産物を、ｐＨ６（１０ｍＭ  ＢＩＳ−ＴＲＩＳ）で０ｍＭから３００ｍＭまでのＮａＣｌで単一のステップで溶出し、次いで、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ５０  ＴＦＦモジュール（１０ｋＤ  ＭＷＣＯを有する再生セルロース膜）を使用して濃縮した。この材料の半分を、サイズ排除クロマトグラフィーを介してさらに精製した。クロマトグラフィーステップを、実施例３において記載されるように実行したが、さらなる処理のための画分の選択を、変性条件下でのチバクロンブルー染色ポリアクリルアミドゲルでの純度に基づいてのみ行った。
【０１３０】
プールの半分を、濃縮し、ＡＥＸ材料の残りと組み合わせた。キャップを外し、脱マンノシル化した後に、Ｄ−マンニトールの濃度を１００ｍＭまで増加させ、続く濃縮およびＳＥＣステップを、実施例２において記載されるものと同じ手順に従って行った。画分を、４−ＭＵＧ定性的アッセイに基づいてプールし、実施例６からのキャップを外した産物と共にプールした。
【０１３１】
実施例６
９５ｋＤａ  ｒｈＧＡＡの精製
ｒｈＧＡＡの９５ｋＤａ形態を、ＯＸＹＹ１５８９株から以下のように単離した。回収の後に、この材料を、実施例３において記載されるように、ＡＥＸステップまで処理した。ＡＥＸステップにおいて、かなりの量の産物が、ローディングの間の伝導率の増加によりフロースルー画分中に存在した。そのため、フロースルー材料を、適切なバッファーに再びダイアフィルトレーションし、２回目のＡＥＸクロマトグラフィーにかけた。両方の量（バッチＡおよびバッチＢ）について、ここから別々に処理した。
【０１３２】
バッチＡを、実施例５からのＳＥＣプールの残りおよび実施例２からのＣＥＸプールの残りと組み合わせ、プールを、続いて濃縮し、１０ｍＭ  ＢＩＳ−ＴＲＩＳ  ｐＨ６、３００ｍＭ  ＮａＣｌを含有するバッファーにダイアフィルトレーションした。この材料を、６５時間、３０℃でインキュベートした。次いで、ｐＨを、１２５ｍＭの濃度まで、酢酸ナトリウムｐＨ５の１Ｍのストックバッファーを追加することによって、ｐＨ５まで低下させ、試料を３０℃で再びインキュベートした。２４時間後、産物を、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のプロテアーゼミックスであるＦｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ｃｏｒｐ）により、産物の総タンパク質含有量対プロテアーゼミックスの４０：１の重量：重量比を使用して処理し、最後に３０℃でインキュベートした。一晩のインキュベーションの後に、物質を、実施例３において記載されるものと同じ条件の下で実行する第１のＳＥＣステップを介して精製した。変性条件下でのチバクロンブルー染色ポリアクリルアミドゲルに基づいて純粋な産物を含有することが推定された画分をプールした。濃縮および２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５へのバッファー交換の後に、この材料を、実施例１において示されるように、キャップを外し、かつ脱マンノシル化した。Ｄ−マンニトールを１００ｍＭの濃度まで追加し、この材料を、実施例５からのキャップを外されかつ脱マンノシル化した材料と共にプールした。最終のＳＥＣステップおよび続く試料操作を、実施例２において記載されるように実行した。
【０１３３】
バッチＢを、実施例３からの末端材料と共にプールし、プールを、濃縮し、１０ｍＭ  ＢＩＳ−ＴＲＩＳ  ｐＨ６、３００ｍＭ  ＮａＣｌを含有するバッファーにダイアフィルトレーションした。次いで、産物を、実施例５において記載されるものと同じ重量比を使用して、３０℃で、一晩のインキュベーション期間の間、Ａ．ｏｒｙｚａｅプロテアーゼミックスにより処理し、その後、実施例３において記載されるものと同じ条件の下で実行する第１のＳＥＣステップを介して精製した。産物のさらなる処理を、実施例５において記載されるように行った。
【０１３４】
最終バッチにおいて、バッチＡおよびバッチＢからの産物を、ＧＡＡ含有量において１４：１の比で混合した。
【０１３５】
実施例７
７６ｋＤａ  ｒｈＧＡＡの精製
ｒｈＧＡＡの７６ｋＤａ形態を、ＯＸＹＹ１５８９株から以下のように単離した。回収の後、培養物を、２回の連続遠心分離にかけた。上清を、プールし、ＡＭＳをおよそ１Ｍの濃度まで導入した。溶解した後、２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６および１Ｍ  ＡＭＳにおいてあらかじめ平衡化した１容積のＨＩＣ樹脂を、バッチ取込みモードで産物に結合するように撹拌しながら、５０容積の上清に追加した。結果として生じるスラリーを、撹拌せずに４℃で一晩保存した。この期間の間に、褐色の層が、穏やかな吸引を介して午前中に除去した溶質の一番上に沈澱した。樹脂を、カラムに充填する前に、それぞれの回において３容積のリードバッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６、１Ｍ  ＡＭＳ）により３回洗浄した。充填した樹脂を、ＵＶシグナルがほぼベースラインに到達するまで洗浄し、産物を、その後、水により溶出した。溶出物のｐＨを、１０ｍＭの濃度まで、１００ｍＭ  ＢＩＳ−ＴＲＩＳ  ｐＨ６のストックバッファーを追加することによって調節した。次いで、この材料を、バッグ中で滅菌ろ過し、４℃で１１日間、保存した。
【０１３６】
第２および第３のクロマトグラフィーステップならびに材料の付随する操作を、実施例４において記載されるように実行した。第３のクロマトグラフィーステップの後のプールを、まず、並行につながれた２つのＴＦＦ  Ｖｉｖａｆｌｏｗ  ２００モジュール（ＰＥＳ膜、１０ｋＤ  ＭＷＣＯ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）でおよそ７倍濃縮し、次いで、１０ｋＤ  ＭＷＣＯの１５ｍｌ  Ａｍｉｃｏｎの遠心分離フィルター（再生セルロース膜、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、超遠心分離した。濃縮した材料を２つに分割し、実施例４で記載されるものと同じ条件を使用してＳＥＣを介してさらに精製した。画分を、その後、変性条件下で、チバクロンブルー染色ポリアクリルアミドゲルで、純度についてスクリーニングした。選択した画分を、並行につながれた２つのＶｉｖａｆｌｏｗ  ２００  ＴＦＦモジュール（ＰＥＳ膜、１０ｋＤ  ＭＷＣＯ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）での濃縮のためにプールした。１０ｋＤ  ＭＷＣＯの１５ｍｌ  Ａｍｉｃｏｎ遠心分離フィルター（再生セルロース膜、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、容積をさらに減らした。
【０１３７】
キャップを外し、脱マンノシル化した後に、Ｄ−マンニトールを、１００ｍＭの濃度になるように追加し、試料を、最終のＳＥＣカラム上にロードする前に、Ｖｉｖａｆｌｏｗ  ５０  ＴＦＦモジュール（ＰＥＳ膜、１０ｋＤ  ＭＷＣＯ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で再び濃縮し、実施例４において記載されるものと同じ方法で実行した。産物を含有する画分をプールし、濃縮した。
【０１３８】
実施例８
人工色素形成基質ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシドを使用する、ｈｕＧＡＡの異なるバリアント（７６、９５、および１１０ｋＤバリアント）の酵素の特徴付け
人工色素形成基質ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシド（ＰＮＰＧ）を使用して、実施例２において得られた未処理ｈｕＧＡＡ（１１０ｋＤａ）ならびに実施例７（７６ｋＤａ）、実施例６（９５ｋＤａ）、および実施例４（９５ｋＤａ）において得られた処理ｈｕＧＡＡバリアントの動態学的パラメーターを決定した。また、市販のヒトα−グルコシダーゼであるＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）（アルグルコシダーゼアルファ、Ｇｅｎｚｙｍｅ）と比較した。
【０１３９】
酵素は、０．１％  ＢＳＡおよび１００ｍＭ  ＡＭＳ（反応バッファー）を含有する１００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ４．０において、２０μｇ／ｍｌになるように希釈した。１０μｌの酵素溶液を、三連で、９６ウェルプレートに追加した。ＰＮＰＧ基質（Ｓｉｇｍａ）を、反応バッファーにおいて、様々な基質濃度（１０、６、４、２、１．６、１．２、０．８、および０．４ｍＭ）に希釈し、９０μｌの希釈した基質を、それぞれのウェルに追加した。酵素反応を３７℃で６０分間インキュベートし、その後、１００μｌ  １０％炭酸ナトリウム、ｐＨ１２を追加して反応を止めた。吸光度を、４０５ｎｍで測定した。ｐ−ニトロフェノール（ＰＮＰ）による標準曲線を、１分あたりで形成される産物の量を計算するために測定した。μＭ／分として表現される速度を、異なる基質濃度の関数としてプロットし、ミハエリス−メンテンの曲線を生成した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを、ミハエリス−メンテンの式に直接フィットさせることによって、ＶｍａｘおよびＫｍを計算するために使用した。触媒定数ｋｃａｔおよび触媒効率ｋｃａｔ／Ｋｍを計算した。様々な酵素の比活性を、Ｕ／ｍｇとして報告した。ここで、１ユニットを、１００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ４．０＋０．１％  ＢＳＡおよび１００ｍＭ  ＡＭＳ中２ｍＭの基質濃度で、１分あたりの１ｎｍｏｌの基質の加水分解を触媒する酵素の量として定義する。結果を表１に示す。
【表１】
2015516148.tif 000006
【０１４０】
ｈｕＧＡＡの未処理形態および処理形態ならびにＭｙｏｚｙｍｅは、基質ＰＮＰＧに対して同等の動態学的パラメーターを有する。これは、マウス乳およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）培地由来のヒト酸性α−グルコシダーゼについての文献において報告されるデータと一致する（Ｂｉｊｖｏｅｔら（１９９８）、Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，７、１８１５−１８２４）。未処理（１１０ｋＤ）および処理（７６ｋＤ）の形態は、人工基質４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコピラノシドに対して同じＫｍおよびｋｃａｔ値を有することが報告された。
【０１４１】
実施例９
基質としてウサギ肝臓グリコーゲンを使用したｈｕＧＡＡの異なるバリアント（７６、９５、および１１０ｋＤのバリアント）の酵素的特徴付け
未処理ｈｕＧＡＡ（１１０ｋＤバリアント；実施例２）ならびに処理ｈｕＧＡＡバリアント（７６ｋＤａ、実施例７；および９５ｋＤ、実施例６）の酵素パラメーターを、ウサギ肝臓グリコーゲン（ロットＮ°０９９Ｋ３７９３１Ｖ、Ｓｉｇｍａ）を使用して試験した。市販のヒトα−グルコシダーゼであるＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）（アルグルコシダーゼアルファ、Ｇｅｎｚｙｍｅ）と比較した。酵素を、１００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ４．０において５００ｎｇ／ｍｌになるように希釈した。５０μｌの酵素溶液を、二連、９６ウェルプレートに追加した。グリコーゲン基質を、酢酸バッファーにおいて、様々な基質濃度（２５０、２００、１５０、１００、７５、５０、２５ｍｇ／ｍｌ）になるように希釈し、１００μｌの希釈した基質を、それぞれのウェルに追加した。酵素反応物を、３７℃で６０分間インキュベートした。グルコースの量を、ａｍｐｌｅｘ赤色基質によりグルコースオキシダーゼ法を使用して測定した。
【０１４２】
グルコース標準曲線を、１分あたりで形成される産物の量を計算するために測定した。μＭ／分として表現される酵素速度を、異なる基質濃度の関数としてプロットし、ミハエリス−メンテンの曲線を作成した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して、ミハエリス−メンテンの式に直接フィットさせることによって、ＶｍａｘおよびＫｍを計算した。触媒定数ｋｃａｔおよび触媒効率ｋｃａｔ／Ｋｍを計算した。様々な酵素の比活性は、Ｕ／ｍｇとして報告した。ここで、１ユニットを、１００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ４．０中５０ｍｇ／ｍｌの最終基質濃度で、１分あたり１μｍｏｌのグルコースの形成を触媒する酵素の量として定義する。結果を表２に示す。
【表２】
2015516148.tif 000007
【０１４３】
この実験において、基質の飽和は、ウサギグリコーゲンの溶解性の限界により到達することができない（図４）。Ｍｙｏｚｙｍｅについては、見かけ上のＫｍおよびｋｃａｔ値のみが計算された。３つのｈｕＧＡＡバリアントについて、より低い見かけ上のＫｍ値が、決定された。処理形態の触媒効率は、未処理ｈｕＧＡＡおよびＭｙｏｚｙｍｅの触媒効率よりも２倍高かった。
【０１４４】
実施例１０
ポンペ病のマウスモデルにおけるグリコーゲンクリアランスに対する酸性αグルコシダーゼの効果
実施例７からのＧＡＡ産物（７６ｋＤａ、キャップを外されかつ脱マンノシル化した）、実施例６からのＧＡＡ産物（９５ｋＤａ、キャップを外されかつ脱マンノシル化した）、および実施例２からのＧＡＡ産物（１１０ｋＤａ、キャップを外されかつ脱マンノシル化した）を、ポンペ病のマウスモデルに対して投与して、骨格筋および心臓からのグリコーゲンクリアランスを決定した。
【０１４５】
実験を、ＦＶＢ  ＧＡＡノックアウトマウスおよびＦＶＢ野生型マウスにより実行した。この動物モデルは、この疾患の早期発症乳児性形態の好適な代表であるので、試験系に選んだ。生後、ＫＯマウスは、リソソームグリコーゲンの全身性で進行性の蓄積を有する（Ｂｉｊｖｏｅｔら、１９９８、前掲）。オスおよびメスのＦＶＢ  ＧＡＡ  ＫＯマウスを、Ｅｒａｓｍｕｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｒｏｔｔｅｒｄａｍから得た。処置の開始時に、マウスは、２６〜４９週齢であった。
【０１４６】
試験物質またはビヒクルを、４週間にわたって毎週１回、１０ｍｌ／ｋｇ体重（ｂｗ）の用量容積で、尾静脈に、ゆっくりしたボーラスによって静脈内に投与した。マウスを、剖検前に１６時間にわたって絶食させた。動物を、最後の注射の４日後に屠殺した。研究グループの詳細を表３に示す。
【表３】
2015516148.tif 000008
【０１４７】
器官の灌流および均質化
【０１４８】
心臓および骨格筋（大腿四頭筋、両側）を、ＰＢＳによる灌流の後に単離した。組織を、ｕｌｔｒａ−ｔｕｒｒａｘを使用することによって、１０重量容積の氷冷ＰＢＳ中でホモジナイズした。その後、ホモジネートを、１５分間にわたって２度、氷上で１６ミクロンで超音波処理した。１２０００ｇで３０分間の遠心分離の後に、上清を、グリコーゲンの測定のために収集した。
【０１４９】
バイオ分析
それぞれの個々のマウスの心臓および骨格筋におけるグリコーゲン含有量を、検証済の定量的酵素アッセイを使用して測定した。組織を沸騰させた後に、アミログルコシダーゼとα−アミラーゼとの混合物を、グリコーゲンのグルコースへの分解のためにインビトロにおいて追加した。グルコースの量を、ａｍｐｌｅｘ赤色基質によりグルコースオキシダーゼ法を使用して測定した。グリコーゲンの量を、グリコーゲンμｇ／タンパク質ｍｇとして報告する。
【０１５０】
統計分析
グループ２、３、４、５由来の心臓におけるグリコーゲン含有量を、ＡＮＯＶＡによって分析し、その後、Ｄｕｎｎｅｔのｔ検定によりグループ６（Ｍｙｏｚｙｍｅ）およびグループ２（プラセボ）に対する事後比較（ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）した。グループ１は、ＷＴマウスモデルにおけるグリコーゲン貯蔵がないため、統計分析から省き、品質チェックとして使用した。
【０１５１】
四頭筋データにおける異常値の存在のために、異なる産物のグリコーゲン含有量データの鑑別的な分布の可能性を評価するために、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定を使用した。
【０１５２】
四頭筋データの事後分析を、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定により実行した。それぞれの産物グループおよびＭｙｏｚｙｍｅグループをプラセボ（グループ２）グループと比較し、それぞれの産物グループをＭｙｏｚｙｍｅと比較した。
【０１５３】
結果
表４は、グループ当たり１６匹のマウスの心臓（Ａ）および骨格筋（Ｂ）における平均グリコーゲンレベル（μｇ／タンパク質ｍｇ）を示す。
【表４】
2015516148.tif 000009
【０１５４】
図５は、心臓（５Ａ）および骨格筋（５Ｂ）における個々のマウスのグリコーゲンレベル（μｇ／タンパク質ｍｇ）を示す。結果は、本明細書において産生されたＧＡＡ産物（１１０ｋＤａ、９５ｋＤａ、および７６ｋＤａ）が、２０ｍｇ／ｋｇでの４回の静脈内注射の後に、プラセボ処置マウスと比較して、心臓におけるグリコーゲンレベルを統計的に低下させることを示す。同じＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）用量は、心臓におけるグリコーゲンの量を低下させなかった。７６ｋＤａ産物処置グループおよび９５ｋＤａ処置グループの両方におけるグリコーゲンレベルは、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）処置グループと比較して、統計的に異なっていた。統計的に、本明細書において産生された３つの異なるＧＡＡ産物の間で差はなかった。
【０１５５】
本明細書において産生された７６ｋＤａ産物もまた、プラセボ処置またはＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）処置マウスと比較して、骨格筋におけるグリコーゲンの量を統計的に低下させた。９５ｋＤａおよび１１０ｋＤａの両方の産物におけるグリコーゲンレベルは、おそらく、個々のマウス間のより大きな変動に起因して、プラセボおよびＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）処置マウスと比較して、統計的に異なっていなかった。２０ｍｇ／ｋｇのＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）は、プラセボと比較して、骨格筋におけるグリコーゲンレベルを低下させることができなかった。
【０１５６】
実施例１１
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のプロテアーゼの同定
ＧＡＡは、酸性ｐＨで、少量のＦｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ｃｏｒｐ）（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のプロテアーゼミックス）とのインキュベーションの際に特異的なタンパク質分解切断を受ける。結果として生じるＧＡＡ産物は、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥでおよそ９５ｋＤの分子量を有する。同様のタンパク質分解性活性は、産生株（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）由来のバックグラウンドタンパク質を含有する、特定の精製したＧＡＡ調製物において観察された。
【０１５７】
タンパク質分解性の事象について評価するために、ＧＡＡのＮ−グリカンを、タンパク質分解処理前に、ＥｎｄｏＨを使用して除去し、Ｎ−グリコシル化部位当たり単一のＮ−アセチルグルコサミンにした。これは、ＳＤＳ  ＰＡＧＥを介してのより適切な評価を可能にする。次いで、ＧＡＡ産物を、Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅプロテアーゼカクテルまたはその精製試料と共にインキュベートした。反応を、１００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ５において３０℃で実行した。試料を、異なる時点で採取し、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを介して分析した。ＧＡＡの０．５μｇを含有する容積を、１レーン当たりにロードした。
【０１５８】
プロテアーゼカクテル中のどのプロテアーゼファミリーがＧＡＡの特異的なタンパク質分解を担うかについて調査するために、規定のプロテアーゼファミリーに対して特異的なプロテアーゼ阻害剤を、プロテアーゼの同定を容易にするために、アッセイに含めた。プロテアーゼ阻害剤がここで反応混合物に追加されたことを除いて、反応は、上記に記載されるように実行した。それぞれ１ｍＭおよび１０μＭの濃度の不可逆的阻害剤ＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ｐｒｏｄ．  ｎｒ．  Ｅ５１３４−５００Ｇ）およびＥ−６４（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ｐｒｏｄ．  ｎｒ．  ＣＡＬＢ３２４８９０−５）を、タンパク質分解反応の前に、希釈したプロテアーゼカクテルと共にインキュベートした。可逆的阻害剤キモスタチン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ｐｒｏｄ．  ｎｒ．  ＣＡＬＢ２３０７９０−５）、ＥＤＴＡ、およびロイペプチン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ｐｒｏｄ．  ｎｒ．  ＣＡＬＢ１０８９７６−１０ＭＧ）を、それぞれ６０μｇ／ｍｌ、５０ｍＭ、および１００μＭの濃度で反応混合物に直接追加した。
【０１５９】
ＧＡＡの特異的なタンパク質分解は、セリンプロテアーゼおよびシステインプロテアーゼの活性を消失させるプロテアーゼ阻害剤であるＰＭＳＦおよびキモスタチンによって阻害された。システインプロテアーゼを阻害する不可逆的阻害剤Ｅ−６４は、タンパク質分解をブロックしなかった。これらのデータは、特異的なタンパク質分解がセリンプロテアーゼファミリーメンバーであることを示唆する。この仮説を支持するより多くの証拠が、プロテアーゼカクテルを、ＰＭＳＦおよびジスルフィド結合を還元するレドックス剤ジチオスレイトール（ＤＴＴ）と共にインキュベートしたさらなるアッセイによってもたらされた。この還元剤の追加は、共有結合不活性システインプロテアーゼ：ＰＭＳＦ付加生成物を還元し、システインプロテアーゼ活性を回復させる。ＰＭＳＦによって阻害される場合、セリンプロテアーゼの活性は、ＤＴＴによって回復させることができない。挙動におけるこの差異は、ＧＡＡに対して作用するセリンプロテアーゼおよびシステインプロテアーゼをさらに区別するために使用した。
【０１６０】
ＤＴＴとのＰＭＳＦ阻害プロテアーゼのインキュベーションは、プロテアーゼカクテルのＧＡＡ特異的なタンパク質分解活性を回復させなかった。ＧＡＡ特異的タンパク質分解はまた、メタロプロテアーゼ阻害剤ＥＤＴＡおよび広域スペクトル阻害剤ロイペプチンによっても阻害されなかった。データはすべて、セリンプロテアーゼがこのＧＡＡタンパク質分解性事象を担うことを示す。
【０１６１】
混合物からプロテアーゼを同定するために、プロテアーゼを、一連のクロマトグラフィーステップを使用して精製した。第１のクロマトグラフィーステップは、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂（ＱセファロースＦＦ、ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。プロテアーゼカクテル材料を、ローディングの前に、２０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌバッファーｐＨ７において希釈した。２０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌバッファー中１００ｍＭ、３００ｍＭ、および５００ｍＭ  ＮａＣｌのフロースルーおよび溶出を収集した。フロースルー画分および溶出画分はすべて、上記に記載されるアッセイを使用して分析した。ＧＡＡに対して作用するプロテアーゼは、ランのフロースルー画分中に存在し、出発材料と比較してかなり豊富であった。
【０１６２】
フロースルー材料を、陽イオン交換クロマトグラフィー（ｐＨ５  １０ｍＭ  酢酸ＮａのＳＰセファロースＸＬ（ＧＥ  Ｈｅａｔｈｃａｒｅ）；０〜３００ｍＭ  ＮａＣｌにより溶出）を介してさらに処理した。溶出画分を、収集し、即時青色染色ＳＤＳ  ＰＡＧＥを介して分析し、上記に記載されるアッセイを使用して、関心対象のプロテアーゼの存在についてアッセイした。
活性の大部分は、ＣＥＸクロマトグラフィー溶出物の最後の画分中に存在した。最後の２つの画分を、以下のようにプールし、質量分析法を介して分析した。タンパク質混合物を、トリプシン消化前に脱塩し、還元し、アルキル化し、その後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法にかけた。得られたスペクトルを、Ｍａｓｃｏｔアルゴリズムを使用して、ＮＣＢＩデータベースとマッチさせた。以下の設定を適用した：
・トリプシン、キモトリプシン（４つまでの切断ミス（ｍｉｓｃｌｅａｖａｇｅ）が許容される）
・酸化（Ｍ，Ｗ）、脱アミド（Ｎ，Ｑ）（可変の改変（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ））
・カルバミドメチル化（固定の改変（ｆｉｘｅｄ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ））
・分類学上の地位：真核生物
・ＭＳ許容範囲：０．０５Ｄａ、ＭＳ／ＭＳ許容範囲：０．０５Ｄａ。
【０１６３】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来のアルカリプロテアーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＢＡＡ００２５８．１；ｇｉ２１７８０９）を、検索から同定した。この成熟プロテアーゼの配列は以下である：
＞ｇｉ｜２１７８０９｜ｄｂｊ｜ＢＡＡ００２５８．１｜アルカリプロテアーゼ［Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ］
GLTTQKSAPWGLGSISHKGQQSTDYIYDTSAGEGTYAYVVDSGVNVDHEEFEGRASKAYNAAGGQHVDSIGHGTHVSGTIAGKTYGIAKKASILSVKVFQGESSSTSVILDGFNWAANDIVSKKRTSKAAINMSLGGGYSKAFNDAVENAFEQGVLSVVAAGNENSDAGQTSPASAPDAITVAAIQKSNNRASFSNFGKVVDVFAPGQDILSAWIGSSSATNTISGTSMATPHIVGLSLYLAALENLDGPAAVTKRIKELATKDVVKDVKGSPNLLAYNGNA（配列番号８）。
【０１６４】
Ａ．ｏｒｙｚａｅ由来の精製プロテアーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析は、３０ｋＤａあたりのＭＷのバンド（成熟プロテアーゼ）および２０〜１０ｋＤａのＭＷを有するいくつかのバンドの存在を示す。低ＭＷバンドをゲルから切り取り、トリプシン消化し、ナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。これらのバンドは、Ａ．ｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼ由来の産物として同定された。これは、Ａ．ｏｒｙｚａｅ由来のアルカリプロテアーゼが、自己タンパク質分解に対して感受性であることを示す。
【０１６５】
実施例１２
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおけるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅプロテアーゼの発現
本実施例は、成熟タンパク質ＡＬＰを発現するＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの構築について記載する。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のアルカリプロテアーゼ（ＡＬＰ）をコードする遺伝子（ＥＣ．  ３．４．２１．６３）を、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ発現についてコドン最適化し、融合構築物として化学的に合成した。融合構築物は、シグナルペプチド（２１アミノ酸）、プロペプチド（１００アミノ酸）、および成熟タンパク質（２８２アミノ酸）、その後に続くリンカー（ＳＧＧＧ）およびＨｉｓタグ（１０×Ｈｉｓ残基）を含むこの酵素のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）全体をコードした。図９を参照されたい。融合構築物の完全なヌクレオチド配列を図１０に示す。
【０１６６】
ＡＬＰの合成ＯＲＦを、発現カセットの安定した組込みのために異なる遺伝子座を利用して、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａゲノムへの標的化した組込みのために、ＢａｍＨＩ／ＡｖｒＩＩ断片として、ｐＰＴベクターシリーズへクローニングした。ｐＰＴベクターにおいて、細菌部分は、プラスミドｐＨＳＳ６に由来し、細菌の複製開始点（ｏｒｉ）およびカナマイシンに対する耐性を与えるカナマイシン耐性遺伝子（ＫａｎＲ）を含む。組込みカセットは、ａ）Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａへの形質転換のための選択可能なマーカー（ＵＲＡ３；ＬＥＵ２；ＡＤＥ２）、ｂ）プロモーターから構成される発現カセット（ＰＯＸ２；Ｈｐ４ｄ）、ｃ）ＡＬＰ合成構築物を挿入するためのマルチプルクローニングサイト（ＭＣＳ）、およびｄ）ＹｌＬＩＰ２遺伝子のターミネーターを含む。組込みカセットは、相同組換えによるＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａゲノムへの安定した単一コピー標的化組込みのための特異的な座の上流（Ｐ）および下流（Ｔ）配列が側面に位置する。２つのＮｏｔＩ制限部位は、形質転換前の発現カセットの単離を可能にして、細菌部分の組込みを回避する。
【０１６７】
Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａに使用した培地および技術は、ＢａｒｔｈおよびＧａｉｌｌａｒｄｉｎ（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．，１９（４）：２１９−３７、１９９７）によって記載されており、酵母細胞を、１μｇの精製された組込みカセットおよび大腸菌に使用される標準的な技術を使用して、Ｌｅ  Ｄａｌｌら（Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ．，  ２６（１）：３８−４４、１９９４）によって記載されるように、酢酸リチウム法によって形質転換した。
【０１６８】
発現カセットＡＬＰの組込みを、挿入により、発酵プロセス中の望ましくない高度に分泌されるタンパク質（リパーゼ２およびリパーゼ８）の発現の排除がもたらされるという事実に基づいて、１つの自由な遺伝子座および２つの特異的な遺伝子座で実行した。最終のＯＸＹＹ２１８４株は、半恒常的Ｈｐ４Ｄプロモーターによって駆動されるＡＬＰの３つの発現カセットを含有する。
【０１６９】
ＯＸＹＹ２１８４は、組換えＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＡＬＰ成熟形態（３５ｋＤａ）を産生し、約２〜２．５ｇ／Ｌの発酵ブロスを平均してもたらす。総タンパク質を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ技術を使用してアッセイし、プロテアーゼ活性を、基質としてアゾカゼイン（ａｚｏｃａｓｅｉｎ）を用いるアッセイを使用して測定した。プロテアーゼは、アゾカゼインを消化してカゼインおよび遊離アゾ染料にする。消化されたタンパク質の沈降および遠心分離は、遊離アゾ染料がアルカリ性条件で測定されるのを可能にし、これは、タンパク質分解性活性の指標である。この産物の吸光度を、ＯＤ４４０ｎｍで測定する。消化されたアゾカゼインの量は、既知濃度のアゾカゼインの吸光度がＯＤ４４０ｎｍで測定されているアゾカゼイン希釈シリーズとの相関関係によって計算することができる。
【０１７０】
ＯＸＹＹ２１８４株の培養上清中のＡＬＰを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってアッセイし、抗Ｈｉｓポリクローナル抗体により免疫検出した。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおいて産生された組換えＡＬＰは、活性であり、精製天然酵素と同様の特性を有した。組換えＡＬＰのこれらの酵素特性は、それを使用して、ｒｈｕＧＡＡ前駆体を処理して、９５ｋＤａ  ｒｈｕＧＡＡ形態を得るのを可能にする。
【０１７１】
ＯＸＹＹ２１２２株を、ＡＬＰおよびｒｈｕＧＡＡを共発現するために構築した。ＡＬＰ発現カセットの１つのコピーを、ｒｈｕＧＡＡ（ｒｈｕＧＡＡの４つのコピー）を発現する受容株へ組み込んだ。ｈｕＧＡＡをコードする遺伝子およびＡＬＰをコードする遺伝子の両方とも、誘導性ＰＯＸ２プロモーター下で駆動される。結果として生じるＯＸＹＹ２１２２株は、ｒｈｕＧＡＡ前駆体（１１０Ｋｄａ）と一緒にＡＬＰの成熟形態を産生する。ＯＸＹＹ２１２２株の培養上清中の組換えｈｕＧＡＡを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、その後のイムノブロッティングによってアッセイし、ｒｈＧＡＡが上清において９５ｋＤａ形態にプロセシングされることを確認した。このプロセシングは、完全であった；１１０ｋＤａ形態は、検出されなかったが、ＡＬＰを有していない株の同様の培養において、プロセシングは起こらなかった。
【０１７２】
実施例１３
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおいて発現されるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼによるｒｈＧＡＡ発酵ブロスの処理の後に得られる９５ｋＤａ  ｒｈＧＡＡの精製
ｒｈＧＡＡの９５ｋＤａ形態を、ＯＸＹＹ１５８９株から以下のように単離した。回収の後に、ブロスは、セラミック膜（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して清澄化した。産物を、１０ｋＤの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する中空糸膜を介して濃縮した。ＡＭＳを、１Ｍの濃度まで追加し、溶質を、ろ過前に３０℃まで加熱した。ろ液を、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（ＯＸＹＹ２１８４株）において組換えで発現されたＡ．ｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼにより処理し、発酵ブロスの清澄化の後に、それ以上の精製を行わないで、使用した。総タンパク質：プロテアーゼについての２００：１の重量：重量比および３０℃での１６時間のインキュベーションにより、９５ｋＤａ産物への完全なタンパク質分解がもたらされた。
【０１７３】
さらなる精製ならびにリン酸化Ｎ−グリカンのキャップを外すことおよび脱マンノシル化の後の分析は、表１において報告されるように、ＰＮＰＧに対する同様の比活性を有する（ＳＤＳ−ＰＡＧＥで観察した場合に）９５ｋＤａのＧＡＡ産物を明らかにした。
【０１７４】
実施例１４
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼ（ＡＬＰ）による処理の後のｒｈＧＡＡにおけるタンパク質分解切断部位の同定
ｒｈＧＡＡを、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＡＬＰにより処置し、上記の実施例において記載されるようにさらに精製した。配列分析を容易にするために、ＰＮＧａｓｅ  Ｆが、配列中のＮ−グリコシル化アスパラギン残基を脱アミノ化してアスパルテートにするので、精製した試料を、ｒｈＧＡＡを脱グリコシル化するためにＰＮＧａｓｅＦにより処理した。
【０１７５】
ｒｈＧＡＡの配列を確認するために、脱グリコシル化タンパク質を、ジスルフィド架橋の還元およびシステイン残基のアルキル化の後に、トリプシンを使用して消化した。結果として生じるペプチド混合物を、ＬＣ−ＭＳおよびＭＳ／ＭＳにかけ、データを、遺伝子コードタンパク質配列とマッチさせ、それによって同一性を決定した。精密質量（＜１０ｐｐｍ）および断片化スペクトルは、絶対的な同定のために使用する基準であった。
【０１７６】
ほぼ全部の配列範囲が、ペプチド混合物（残基２３〜６０、６５〜５３５、および５３８〜８９８）から得られ、タンパク質分解切断部位は、アミノ酸６０と６５（配列番号１に従う配列ナンバリング）との間にあることが決定された。残基６０と６５との間のｒｈＧＡＡ配列中のギャップは、Ｇｌｙ６２の前および／またはＧｌｙ６５の前のタンパク質分解性事象から結果として生じることができた。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のアルカリプロテアーゼが、ＬｅｕとＧｌｙとの間で、合成ペプチドＩｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２を分解することが文献において報告されている（Ｎａｋａｄａｉら、１９７３、Ａｇｒ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，３７、２６８５−２６９４を参照されたい）。
【０１７７】
この実験において決定されたタンパク質分解切断部位は、リソソームにおいて観察されるＧＡＡのタンパク質分解性のプロセシングと一致する。９５ｋＤａポリペプチドについて、切断部位が、アミノ酸５９とアミノ酸６８（配列番号１に従う配列ナンバリング）との間で同定されたＭｏｒｅｌａｎｄら、２００５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０、６７８０−６７９１を参照されたい。切断されたＮ末端ペプチドは、鎖間ジスルフィド結合を介して会合し続ける。
【０１７８】
（他の実施形態）
本発明は、その詳細な説明とともに記載されてきたが、上の記載は、本発明の範囲を明示するよう意図されており、かつ該範囲を限定するものではなく、添付の特許請求の範囲によって定義される。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲内である。
【図１】
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【図２Ａ−１】
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【図２Ａ−２】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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