(57)【要約】体液内の標的検体を、標的検体に対して特異的な蛍光検出分子によって生成された信号を使用して分析し、信号減衰色素によってチャンバの面に非特異的に結合された蛍光検出分子によって放射される信号を減衰させる、浅いチャンバを含むデバイス及びその方法。使い捨てマイクロ流体デバイスにおける蛍光測定及びその方法。【選択図】図１Ａ
2015500500.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロ流体デバイスにおいて非特異的な蛍光を減衰させる方法であって、
少なくとも一部が光学的に透明である第１壁と、前記第１壁とは反対側の別の壁と、内腔と、を含むアッセイ測定チャンバを有するマイクロ流体デバイスを提供するステップであって、前記第１壁の内腔面が、生物学的試料における標的検体に対して特異的な結合パートナーによってコーティングされる、ステップと、
前記標的検体に対する結合パートナーを含む蛍光検出分子を前記チャンバの内腔に導入するステップと、
減衰色素を含む溶液を導入するステップと、を含み、
前記減衰色素が、前記チャンバの前記内腔面に非特異的に結合されるあらゆる前記蛍光検出分子の放射波長範囲、励起波長範囲又はそれらの組合せから構成される群から選択された波長範囲の光を吸収する、方法。
【請求項２】
前記第１壁の前記内腔面にコーティングされた前記結合パートナーが中間結合パートナーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記減衰色素が色素の組合せを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記別の壁の前記内腔面が結合剤又はブロッキング剤でコーティングされていない、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１壁が完全に光学的に透明である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第１壁の１００％未満の部分が光学的に透明である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記蛍光検出分子が、前記反対側の壁の前記内腔面に非特異的に結合される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記チャンバの内腔に前記蛍光検出分子を導入する前に前記チャンバの前記内腔を洗浄することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記色素を導入する前に前記内腔を洗浄剤で洗浄するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記洗浄剤の体積が、前記チャンバの容積と同じか又はそれを超える、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記減衰色素を含む洗浄剤で前記内腔を洗浄するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記チャンバ内腔が、少なくとも前記第１壁と反対側の壁、及び前記第１壁によって完全に密閉され、
前記標的検体を、ポートを介してチャンバ壁を通して導入するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記洗浄するステップが、前記チャンバの入口ポートを介して洗浄剤を導入することと、前記チャンバの出口ポートを介して前記洗浄剤を除去することと、を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記蛍光検出分子の前記結合パートナーが、前記標的検体に対して特異的な第１抗体を含み、前記光学的に透明な壁にコーティングされた前記結合パートナーが、前記標的検体に対して特異的な第２抗体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記非特異的に結合された蛍光検出分子が別の分子と複合体を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記チャンバの前記内腔面への前記蛍光検出分子複合体の前記非特異的結合が前記別の分子によって仲介される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記別の分子が非標的検体を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
光学的に測定することが、前記第１壁の前記内腔面から発生する光信号を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１壁と前記反対側の壁の間の距離が約１０ミクロン〜５．０ミリメートルの範囲である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１壁と前記反対側の壁の間の距離が約７５ミクロンの範囲である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１壁と前記反対側の壁の間の距離が約５０ミクロン〜２００ミクロンの範囲である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１壁と前記反対側の壁の間の距離が約７５ミクロン〜１００ミクロンの範囲である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２３】
前記色素が、アマランス、エリオグラウシン、ブリリアントグリーン及びそれらの組合せから構成される群から選択された色素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも一部が光学的に透明である第１壁と、前記第１壁とは反対側の壁と、内腔と、を含む、標的検体を検出するためのアッセイチャンバを有するマイクロ流体デバイスであって、前記第１壁が内腔面上で、生物学的試料における標的検体に対して特異的な結合パートナーによってコーティングされている、マイクロ流体デバイスと、
前記標的検体に対する結合パートナーを含む蛍光検出分子と、
色素を含む溶液であって、前記色素が、前記チャンバの前記内腔面に非特異的に結合されるあらゆる前記蛍光検出分子の放射波長範囲、励起波長範囲又はそれらの組合せから構成される群から選択された波長範囲の光を吸収することができる、溶液と、を備える組成物。
【請求項２５】
前記第１壁にコーティングされた前記結合パートナーが、前記標的検体に対して特異的な抗体を含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記蛍光検出分子の前記結合パートナーが、前記標的検体に対して特異的な別の抗体を含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記第１壁と前記反対側の壁との間の距離が約１００ミクロン〜５．０ミリメートルの範囲である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２８】
前記第１壁と前記反対側の壁との間の距離が約７５ミクロンの範囲である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２９】
前記第１壁と前記反対側の壁との間の距離が約５０ミクロン〜２００ミクロンの範囲である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項３０】
前記第１壁と前記反対側の壁との間の距離が約７５ミクロン〜１００ミクロンの範囲である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項３１】
前記第１壁の前記内腔面にコーティングされた前記結合パートナーが中間結合パートナーを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３２】
蛍光標識された標的検体分子をさらに含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項３３】
前記色素が、アマランス、エリオグラウシン、ブリリアントグリーン及びそれらの組合せから構成される群から選択された色素を含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項３４】
前記反対側の壁の前記内腔面が結合剤又はブロッキング剤でコーティングされていない、請求項２４に記載の組成物。
【請求項３５】
前記第１壁が完全に光学的に透明である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記蛍光検出分子が、前記反対側の壁の前記内腔面に非特異的に結合される、請求項２４に記載の組成物。
【請求項３７】
生物学的試料における標的検体の存在を検出する方法であって、
少なくとも一部が光学的に透明である第１壁と、前記第１壁とは反対側の別の壁と、内腔と、を含むアッセイ測定チャンバを有するマイクロ流体デバイスを提供するステップであって、前記第１壁の内腔面が、前記生物学的試料における標的検体に対して特異的な結合パートナーによってコーティングされる、ステップと、
前記生物学的試料を前記チャンバの内腔内に導入するステップと、
前記標的検体に対する結合パートナーを含む蛍光検出分子を前記チャンバの内腔内に導入するステップと、
減衰色素を含む溶液を導入するステップであって、前記減衰色素が、前記チャンバの前記内腔面に非特異的に結合されるあらゆる前記蛍光検出分子の放射波長範囲、励起波長範囲又はそれらの組合せから構成される群から選択された波長範囲の光を吸収する、ステップと、
前記標的検体の蛍光信号を光学的に測定するステップであって、前記光学的測定値が、前記生物学的試料における前記標的検体の濃度に関連する、ステップと、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、患者の体液等、生物学的試料における標的生物学的検体のタイプの定量的光学的検出に関する。本発明は、より詳細には、蛍光標識された標的検体から放射された真のかつ特異的な光信号を得る装置及び方法に関する。真のかつ特異的な光信号は、アッセイチャンバの内腔面に非特異的に結合される蛍光検出分子から放射される干渉蛍光を減衰させることによって得られる。光信号は、本明細書に記載される発明によるマイクロ流体デバイスのアッセイチャンバにおいて分析される場合、生物学的試料における標的検体の濃度を正確に反映する。
【背景技術】
【０００２】
生物医学的アッセイにおける標的検体の蛍光測定は、アッセイチャンバで行うことができ、チャンバの一部は、生物学的サンプル中の対象となる標的検体に対して特異的な結合パートナーによってコーティングされる光学的に透明な面を有している。細胞ベースアッセイでは、細胞は、細胞アッセイ容器の光学的に透明な内腔面において成長する。細胞ベースアッセイでは、容器は、栄養、酸素及び廃棄物除去等、適切な要求を満たして細胞を維持するために十分に大きくなければならず、すなわち、十分な流体（多くの場合、１００マイクロリットルを超える）を保持することができなければならない。こうした細胞ベースアッセイ容器の光学的に透明な内腔面は、細胞がその内腔面に付着するのを可能にするように特異的に処理される。細胞アッセイ容器の他の内腔面は、これらの他の内腔面への非特異的な結合を最小限にするようにブロッキング剤で処理される。例えば、細胞膜電位変化を、蛍光信号を放射するように細胞と相互作用する膜電位感受性色素の蛍光変化に基づいて分析することができる。蛍光は、容器の光学的に透明な内腔面、通常は底面を通して光検出器によって光学的に測定される。
【０００３】
生物学的サンプルにおける細胞に結合されない標的生物学的検体の蛍光測定に関して、通常、対象となる標的検体を有していると考えられる生物学的サンプルは、標的検体に対して特異的でありかつそれに結合する結合パートナーを有する蛍光検出分子と、溶液内で混合される。蛍光検出分子に結合された対象となる標的検体を含む生物学的サンプルは、光学的に透明である部分を有するアッセイチャンバの内腔内に溶液として流れ込む。光学的に透明な部分の内腔面は、標的検体の結合パートナーによってコーティングされる。生物学的サンプルにおける標的検体は、蛍光検出分子をもたらす光学的に透明な面の上の結合パートナーに結合する。
【０００４】
標的検体を検出する別の典型的なアッセイフォーマットでは、生物学的試料が（適切なアッセイ試薬と最初に混合されてもされなくても）アッセイチャンバ内に導入され、それにより、あらゆる検体が、光学的に透明な内腔面の上の結合パートナーに特異的に結合される。適切なインキュベーション期間に続き、チャンバは、洗浄されて、未結合の検体及び試料成分が除去され、蛍光検出分子で再充填される。検出分子の標的検体（面の上に存在する場合）への結合を可能にする第２の適切なインキュベーション期間の後、チャンバは再度洗浄され、未結合蛍光検出分子が除去される。
【０００５】
上記タイプの生物学的アッセイで直面する典型的な問題は、蛍光検出分子がチャンバの内腔面に非特異的に結合することである。こうした非特異的な面結合は、サンプル内に見られる生物学的部分、例えばタンパク質とともに複合体を形成する蛍光検出分子によって直接的又は間接的に発生する可能性がある。複合体は、アッセイチャンバの光学的に透明な面の結合パートナーでコーティングされた内腔面以外のアッセイチャンバの内腔面に結合する。
【０００６】
細胞ベースアッセイでは同様のアッセイステップが行われる。しかしながら、細胞ベースアッセイにおける洗浄は、洗浄によってアッセイ容器の光学的に透明な面に付着した細胞が粉砕する可能性があるため、望ましくない可能性がある。さらに、光学的に透明な内腔面以外の細胞ベースアッセイ容器の内腔面を、カゼイン、ウシ血清アルブミン及び新生仔牛血清等のブロッキング剤で処理して、これらの面に対する蛍光検出分子の非特異的結合を阻止することができる。この追加の処理ステップすなわちブロッキングは、環境によっては、標的検体を検出する自動化アッセイにおいて、多数の試験装置を製造することに関連して労力、コスト、時間及びばらつきが増大しスループットが低下するために、望ましくない可能性がある。
【０００７】
上述したように、アッセイが標的検体の存在を検出しかつアッセイチャンバで行われる診断アッセイ設計で直面する、典型的な問題としては、コーティングされた光学的に透明な面以外の面に蛍光検出分子が非特異的に結合することが挙げられる。これにより、標的検体が存在しない場合であっても、偽陽性又は異常に高い診断結果に至る、検出可能な蛍光を発生させる可能性がある。この影響は、チャンバの深さが極めて浅い閉鎖アッセイチャンバ、すなわち、光学的に透明な面と反対側のチャンバ面との間が１ミリメートルの何分の１である場合に特に問題がある。このチャンバタイプでは、反対側のチャンバ面は、励起光を提供し放射蛍光を収集する光学系にアクセス可能なままである。したがって、非特異的結合及び背景蛍光が、標的検体から放射される実際の蛍光信号の純度を落とし、本来は、患者の体液等、生物学的サンプルにおける標的検体の品質を正確に反映する光信号を不明瞭にする。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、アッセイチャンバの内腔面に非特異的に結合された検出分子の背景蛍光を最小化するとともに、非機能化チャンバ内腔面をブロッキングすることに関する問題及びコストを回避する、自動化された、費用効率の高い、高スループット解決法に関する。特に、活性処理された光学的に透明な面と反対側の内腔面から発生する背景蛍光は、光学的に透明な活性面に結合された標的検体から発生する光信号を減衰させることなく、実質的に低減する。本発明によって定義される特異的な標的検体を測定するアッセイは、同時にアッセイ感度及び精度を向上させかつコストのかかる試薬の消費を最小限にしながら、極めて迅速な試験結果を可能にするマイクロ流体デバイスにおいて行われる。
【０００９】
一態様では、本発明は、アッセイチャンバにおいて蛍光標識された標的生物学的検体から放射される真のかつ特異的な光信号を達成する装置、キット又は組成物に関する。一実施形態では、本発明は、標的検体を検出するためのアッセイチャンバを有するマイクロ流体デバイスを含む。アッセイチャンバは、少なくとも一部が光学的に透明である第１壁と、反対側の壁と、内腔と、を含む。任意選択的に、第１壁の全体が光学的に透明である。第１壁は、内腔面が、生物学的サンプルにおける標的検体に対して特異的な結合パートナーでコーティングされる。反対側の壁の内腔面を、結合剤又はバインディング剤でコーティングしてもよく、又は任意選択的にコーティングしなくてもよい。
【００１０】
本装置、キット又は組成物は、標的検体に対する結合パートナーを含む蛍光検出分子と、チャンバの内腔面に非特異的に結合されるあらゆる蛍光検出分子の放射波長範囲、励起波長範囲又はそれらの組合せから構成される群から選択された波長範囲の光を吸収することができる色素を含む、アッセイチャンバ内の溶液と、を含む。色素は、例えばアマランス、ブリリアントグリーン、エリオグラウシン又は標準色素の組合せの群から選択された単一標準色素であってよい。
【００１１】
一実施形態では、第１壁の内腔面又は単に第１壁の内腔面の光学的に透明な部分にコーティングされる結合パートナーは、標的検体に対して特異的な抗体を含む。蛍光検出分子の結合パートナーは、標的検体に対して特異的な別の抗体を含む。任意選択的に、第１壁の内腔面にコーティングされる結合パートナーは中間結合パートナーを含んでよい。
【００１２】
一実施形態では、第１壁と反対側の壁との間の距離は、約１０ミクロン〜５．０ミリメートル、約７５ミクロン、約５０ミクロン〜２００ミクロン又は約７０ミクロン〜１００ミクロンの範囲である。
【００１３】
別の実施形態では、本組成物、キット又は装置は、蛍光標識された標的検体分子を含む。蛍光標識された標的検体分子は競合結合アッセイで有用であり得る。
【００１４】
別の態様では、本発明は、生物学的試料における蛍光標識された標的検体を測定するために使用されるマイクロ流体デバイスにおいて非特異的蛍光を減衰させる方法に関する。本発明の方法の一実施形態によれば、上述したマイクロ流体デバイスのチャンバ内腔内にサンプルが導入される。標的検体に対する結合パートナーを含む蛍光検出分子が、チャンバ内腔内に導入される。任意選択的に、チャンバ内腔を洗浄することができる。洗浄液の体積は、チャンバ内腔の容積を下回るか、同じであるか、上回ることができる。
【００１５】
蛍光検出分子の導入後、減衰色素、例えばアマランス、エリオグラウシン、ブリリアントグリーン又は標準色素の組合せを含む溶液がチャンバ内に導入される。色素は、チャンバの内腔面に非特異的に結合されるあらゆる蛍光検出分子の放射波長範囲、励起波長範囲又はそれらの組合せから構成される群から選択された波長範囲の光を吸収することができる。光学的測定が行われ、光学的測定値はサンプルにおける標的検体の濃度に関連する。光学的測定は、第１壁の内腔面から発生する光信号を測定することを含む。
【００１６】
一実施形態では、本発明の方法は、チャンバの内腔内に蛍光標識された標的検体分子を導入するステップを含む競合結合アッセイである。
【００１７】
本発明の方法の特定の実施形態では、サンプルと前記標的検体に対する結合パートナーを含む蛍光検出分子とは、サンプル及び蛍光検出分子をチャンバ内に導入する前に混合される。代替的に、チャンバの内腔は、サンプルをチャンバの内腔内に導入した後、かつチャンバの内腔内に流体検出分子を導入する前に洗浄される。チャンバの内腔を、色素を導入する前に洗浄剤で洗浄することができる。代替的に、チャンバの内腔は、減衰色素を含む洗浄剤で洗浄される。洗浄剤の体積は、チャンバの容積と同じであるか又はそれを超える。一実施形態では、洗浄ステップは、チャンバの入口ポートを介して洗浄剤を導入し、チャンバの出口ポートを介して洗浄剤を除去する。
【００１８】
一実施形態では、本発明の方法による非特異的に結合された蛍光検出分子は、別の分子、例えば非標的検体に結合される。
【００１９】
本発明の上述した及び他の特徴及び利点は、説明図面及び続く特許請求の範囲からより明らかとなろう。
【００２０】
本発明のこれらの実施形態及び他の態様は、本発明を限定するのではなく例示するように意図されている、以下の詳細な説明及び添付図面から容易に明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】本発明の一実施形態に係るマイクロ流体デバイスを含む例示的な計測システムの平面図である。
【図１Ｂ】本発明の一実施形態に係る例示的なアッセイチャンバの上面切取図を示す。
【図１Ｃ】図１Ｂに示す例示的なアッセイチャンバの底面切取図を示す。
【図１Ｄ】本発明の一実施形態に係る別の例示的な円柱状アッセイチャンバの上面切取図を示す。
【図１Ｅ】図１Ｄに示す例示的な円柱状アッセイチャンバの底面切取図を示す。
【図１Ｆ】本発明の一実施形態に係る例示的なアッセイチャンバ及び作製方法の上面図を示す。
【図２】減衰色素なしのアッセイチャンバの概略断面図である。
【図３】本発明の一実施形態に係る減衰色素を含む例示的なアッセイチャンバの概略断面図である。
【図４】本発明の一実施形態に係る壁の光信号部を含む例示的なアッセイチャンバの斜視図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、添付図面とともに読まれるべき以下の説明を通してより完全に理解されるであろう。この説明では、本発明のさまざまな実施形態の範囲において同様の数字は同様の要素を指す。本説明の範囲において、請求項に係る発明を、実施形態に関して説明する。当業者は、本明細書に記載される方法及びシステムが単に例示的なものであることと、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく変更を行うことができることとを容易に理解するであろう。
【００２３】
本明細書で使用するマイクロ流体デバイスは、およそピコリットルからマイクロリットルの流体体積を利用する生物学的アッセイ用のデバイスを意味する。それらデバイスは、ミリメートルからマイクロメートルの範囲の寸法のチャネル及び／又はチャンバを有している。
【００２４】
本明細書で使用する標的生物学的検体は、限定されないが、病原体、タンパク質、核酸、脂質、抗体、抗原及び酵素等、生物学的試料における対象となる検体又は検体群を意味する。例えば、検体群は、複数のタンパク質、例えばミオグロビン、ｐｒｏＢＮＰ及びミオシン、心不全を検出するため有用なタンパク質であってよい。
【００２５】
本明細書で使用する蛍光検出分子は、別の分子あるいは物質と直接又は間接的に複合体を形成することができ、かつ好適な蛍光光学系を使用して検出することができる、あらゆる分子、結合パートナー又は実体を意味し、そうした蛍光光学系では、分子、結合パートナー又は実体は、適切な波長の光によって励起され、（波長の異なる）放射光が測定される。分子、結合パートナー又は実体は、固有に蛍光性であり得るか、又は適切なフルオロフォアの付着によって蛍光性になり得る。
【００２６】
本明細書で使用する減衰色素は、あらゆる蛍光検出分子の放射波長範囲、励起波長範囲又は放射波長範囲及び励起波長範囲の組合せを含む波長範囲の光を吸収する色素を意味する。
【００２７】
本明細書で使用する結合パートナーは、分子、例えば、標的生物学的検体に特異的に結合する抗体、結合カスケードにおける中間体（例えば中間結合パートナーとして面にストレプトアビジンがコーティングされ、その後、ストレプトアビジンが、標的生物学的検体に対して特異的な結合パートナーである抗体に共役したビオチンに結合する場合）を意味する。
【００２８】
本明細書で使用する背景蛍光は、対象となる標的検体に結合された蛍光検出分子から発生していない蛍光を意味する。
【００２９】
一態様では、本発明は、限定されないが、身体組織又は患者の体液、例えば血液、血清、血漿、尿、唾液、髄液、関節滑液、消化液、組織吸引物、滲出液及び浸出物等の生物学的試料における標的生物学的検体の光学的測定用の使い捨てマイクロ流体デバイスに関する。
【００３０】
本発明の実施形態は、マイクロ流体デバイスのアッセイチャンバ内で標的検体を検出する、装置、キット、組成物又は方法、例えば免疫学的検定（イムノアッセイ）法に関する。
【００３１】
図１Ａ〜図１Ｆは、対象となる標的検体の高感度の、正確な、費用効率の高いかつ自動化された診断試験に対して開発され、かつ迅速な試験結果を生成する、本発明に係る使い捨てマイクロ流体デバイス及び計測システムの例示的な実施形態である。一実施形態では、図１Ａを参照すると、計測システムは、アッセイチャンバ１０及び流体導管２を有するマイクロ流体デバイス９と、マイクロ流体デバイスホルダ４と、マイクロプロセッサ６と、電子回路８と、光源９０、及びアッセイチャンバ内の標的検体に結合された蛍光検出分子によって生成される光信号等の光信号を測定する光検出器１００を含む光学系９２とを含む。
【００３２】
図１Ｂを参照すると、一実施形態では、マイクロ流体デバイスは、チャンバ内腔１６を包囲する６つの壁１２ｎ、具体的には１２ａ、１２ｂ、１２ｃ、１２ｄ、１２ｅ及び１２ｆを有する矩形アッセイチャンバ１０を含む。アッセイチャンバ１０は、いずれかの壁が引力源に最も近い壁であり得る時に流体を保持することができる。言い換えれば、組立後、チャンバ１０は、任意選択的なポート、例えば入口ポート及び出口ポートを除くすべての面が完全に密閉される。一実施形態では、チャンバ１０は、端部に任意選択的な入口ポート及び／又は出口ポートがあるチャネルであり得る。マイクロ流体デバイスのチャンバ１０の形状は、添付の図に示す形状によって限定されない。
【００３３】
チャンバ１０の各壁１２ａ〜１２ｆは、内腔１６に隣接する内腔面１４を有している。本発明による一実施形態では、チャンバ１０は入口ポート２０及び出口ポート２２を有している。
【００３４】
壁１２ｆ内に、活性の光学的に透明な壁部分が配置され、又は任意選択的に、図１Ｂに示すように、壁１２ｆ全体が光学的に透明である。壁１２ｆの内腔面１４ｆ又は任意選択的に壁１２ｆの光学的に透明な部分のみが、その面を、対象となる標的検体に特異的な結合パートナーでコーティングすることによって活性化される。壁１２ｄ及び１２ｆは平面であってもよく、又は、１以上の曲線部を有していてもよい。一実施形態では、光学的に透明な壁１２ｆとは反対側のチャンバ壁１２ｄは、光学的に透明な壁１２ｆの平面に対して、例えば実質的に平行であるか、０度〜４５度であるか、０度〜１０度であるか又は１０度〜４５度である。代替的に、チャンバ壁１２ｄの内腔面は、光学的に透明な壁１２ｆの内腔面の平面に対して、例えば実質的に平行であるか、０度〜４５度であるか、０度〜１０度であるか又は１０度〜４５度である。一実施形態では、光学的に透明な壁１２ｆの内腔面１４ｆ以外のチャンバ壁１２ａ〜１２ｅの内腔面１４は、結合パートナーで、かつアッセイの開始前に、本来これらの壁の内腔面に対して非特異的な結合をブロックするブロッキング剤又は他の何らかの薬剤でコーティングされていない。
【００３５】
アッセイチャンバ１０は、ポリマー、例えば限定されないがポリスチレンから形成されてよい。
【００３６】
図１Ｂ〜図１Ｃを参照すると、本発明による特定の実施形態では、アッセイチャンバ１０は実質的に矩形であり、光学的に透明な壁１２ｆ（又はその一部）と、光学的に透明な壁１２ｆの反対側の壁１２ｄと、を備えている。光学的に透明な壁１２ｆの内腔面１４ｆと、光学的に透明な壁１２ｆとは反対側の壁１２ｄの内腔面１４ｄとの間の距離８０は、約１０ミクロン〜５ミリメートル、１０ミクロン〜２ミリメートル、１０ミクロン〜１ミリメートル、５０ミクロン〜２００ミクロン、５０ミクロン〜１２５ミクロン、７０ミクロン〜１００ミクロン、７５ミクロン〜１５０ミクロン、好ましくは５０ミクロン〜１００ミクロン、より好ましくは７５ミクロンの範囲である。チャンバ内腔１６は、チャンバ１０の光学的に透明な壁１２ｆと、光学的に透明な壁とは反対側の壁１２ｄと、を含む壁１２ａ〜１２ｆによって境界が決められかつ密閉されている。光学的に透明な壁以外の壁を、光遮断材料、例えば黒色プラスチックから作製することができる。代替的に、それらの壁は光学的に透明であってよい。
【００３７】
図１Ｄ〜図１Ｅを参照すると、本発明の別の実施形態では、アッセイチャンバ１０は実質的に円柱状であり、円柱状チャンバ１０の両端の壁１２ｆ及び１２ｄと壁１２ｆ及び１２ｄを接合する壁１２ｂとを備えている。チャンバ１０の壁１２ｆは光学的に透明であり、又は任意選択的に、壁１２ｆの一部が光学的に透明である。光学的に透明な壁１２ｆの反対側のチャンバ壁１２ｄは、光学的に透明な壁１２ｆの平面に対して、実質的に平行であるか、０度〜４５度であるか、０度〜１０度であるか、又は１０度〜４５度である。代替的に、チャンバ壁１２ｄの内腔面は、光学的に透明な壁１２ｆの内腔面の平面に対して、例えば実質的に平行であるか、０度〜４５度であるか、０度〜１０度であるか又は１０度〜４５度である。
【００３８】
さらに図１Ｄ〜図１Ｅを参照すると、円柱状チャンバ１０の光学的に透明な壁１２ｆの内腔面１４ｆ又は内腔面壁１２ｆの一部は、当業者には既知である標準的な方法によって対象となる標的検体に対して特異的な結合パートナーでその面をコーティングすることによって活性化される。一実施形態では、壁１２ｂ及び１２ｄの内腔面は、結合パートナーで、かつアッセイの開始前に、本来これらの壁の内腔面に対して非特異的結合をブロックするブロッキング剤又は他の何らかの薬剤で、コーティングされていない。光学的に透明な壁１２ｆの内腔面１４ｆと壁１２ｄの内腔面１４ｄとの間の距離８０は、約１０ミクロン〜５ミリメートル、１０ミクロン〜２ミリメートル、１０ミクロン〜１ミリメートル、５０ミクロン〜２００ミクロン、５０ミクロン〜１２５ミクロン、７０ミクロン〜１００ミクロン、７５ミクロン〜１５０ミクロン、好ましくは５０ミクロン〜１００ミクロン、より好ましくは７５ミクロンの範囲である。
【００３９】
チャンバは、他の形状（例えば、直交する縁とは対照的に湾曲する側部を含む形状は、チャンバに溶液を導入しチャンバから溶液を除去する時に最適な流体特性を促進することができる）、例えばチャネルであってもよく、図示する矩形形状又は円柱形状に限定されない。光学的に透明な壁以外の壁は、光遮断材料、例えば黒色プラスチックから形成されてよい。代替的に、壁は光学的に透明であってよい。
【００４０】
図１Ｆを参照すると、本発明に係る生物学的試料内の標的検体を検出するマイクロ流体デバイスの一実施形態では、チャンバ１０は、複数の部品から単一の一体型チャンバ１０に組み立てられる。例えば、一実施形態では、第１チャンバ部品は、ポリマー材料製の浅いウェル４０であり、浅いウェル４０は、浅いウェル４０の底部の壁１２ｄと、浅いウェルの頂部の開放面４２と、ウェル側壁１２ａ、１２ｂ、１２ｃ及び１２ｅと、を有している。ウェル４０の形状は、矩形に限定されないが、例えば楕円形、円形又は他の形状であってよい。
【００４１】
浅いウェル４０の深さは、約１０ミクロン〜５ミリメートル、１０ミクロン〜２ミリメートル、１０ミクロン〜１ミリメートル、５０ミクロン〜２００ミクロン、５０ミクロン〜１２５ミクロン、７０ミクロン〜１００ミクロン、７５ミクロン〜１５０ミクロン、好ましくは５０ミクロン〜１００ミクロン、より好ましくは７５ミクロンの範囲である。寸法が浅いウェル４０の開放面４２に実質的に対応する、光学的に透明な平面の壁１２ｆ又は光学的に透明な部分を含む壁は、浅いウェル４０に接合されてアッセイチャンバ１０を形成する第２チャンバ部品を形成している。アッセイチャンバ１０の光学的に透明な壁１２ｆ、又は任意選択的に壁１２ｆの一部は、壁の一方の側の面を、対象となる標的検体に対して上に定義した結合パートナーでコーティングすることによって活性化される（例えば、図２を参照）。面にコーティングされる結合パートナーは、限定されないが、例えば、標的検体に対して特異的なポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体及びそのフラグメント、他のタンパク質、レクチン、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質バイオマーカー、アプタマー、レセプター、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、ビオチン又はストレプトアビジンであってよい。光学的に透明な壁１２ｆのコーティングされた面は、新たに形成されたチャンバ１０の内腔側にあるように、浅いポリマーウェル４０の開放面４２に下向きに配置される。
【００４２】
光学的に透明な壁１２ｆは、浅いポリマーウェル４０の壁の頂部に、接着剤、熱結合、超音波溶接又は他の永久取付方法によって取り付けられる。任意選択的に、浅いウェル４０の基部の壁１２ｄの内腔面１４ｄを含む、チャンバ１０の浅いウェル部分４０の内腔面１４は、アッセイの開始前に、ブロッキング剤、例えば限定されないが、ブロッキング剤カゼイン、ウシ血清アルブミン及び新生仔牛血清等、いかなる薬剤によっても処理されていない。
【００４３】
図２を参照すると、上述したようなチャンバ１０がアッセイのために用意される。チャンバ１０は、対象となる標的検体を有していると考えられる生物学的サンプルで充填される。標的検体が光学的に透明な壁の結合パートナーに結合することを可能にするのに適切なインキュベーション期間の後、チャンバ内腔１６は、チャンバ内腔の容積を超えるか又はそれに等しい体積の洗浄液を、入口ポート２０を介して導入することにより、洗浄される。洗浄液を、出口ポート２２を介して除去することができる。標的検体に対して結合親和性を有する蛍光検出分子が、チャンバ内腔に追加され、結合が発生するのを可能にするのに十分な時間、インキュベートされる。チャンバは、光学的検出の前に再度洗浄され、未結合蛍光検出分子が除去される。任意選択的に、対象となる標的に対して結合親和性がある蛍光検出分子を、サンプルと事前に混合することができる。そして、混合物がチャンバ内に導入され、その後チャンバ内腔が洗浄され、その後光学的検出が行われる。
【００４４】
本発明に係る一実施形態では、生物学的サンプルと混合される蛍光検出分子の結合パートナーは、光学的に透明な壁の内腔面にコーティングされる標的検体に対する結合パートナーと異なっている。代替的に、蛍光検出分子と一体的な結合パートナーと内腔面にコーティングされた結合パートナーとは、例えば標的検体が多価である場合、同じであり得る。場合によっては、結合パートナーを、例えば別個であるが密接に関連するＨＩＶウイルスの亜型の全種を検出するために、密接に関連する標的検体の群に結合するように意図的に設計することができる。さらに、結合パートナーは、例えばストレプトアビジンが中間結合パートナーとして面にコーティングされる場合、結合カスケードにおける中間体であり得る。そして、ストレプトアビジンは、対象となる検体に対して特異的な抗体に共役したビオチンに結合する。サンプルにおける標的検体は、標的検体及び結合パートナーが溶液内で接触する時、蛍光検出分子のその特異的な結合パートナーに結合し、それにより、蛍光標識された標的検体を形成する。
【００４５】
光学的検出に対して、計測システムの光学系９０からの励起光は、アッセイチャンバ１０の光学的に透明な壁１２ｆ又は光学的に透明な壁１２ｆの一部を通るように向けられ、それにより、光学的に透明な壁１２ｆの内腔面１４ｆの結合パートナー５７に結合される標的検体５５に結合された、蛍光検出分子５２の蛍光５６を励起する。アッセイチャンバの一部の未処理内腔面に、特に反対側の壁の内腔面１４ｄに、非特異的に結合された蛍光検出分子５２から光検出器１００によって検出される蛍光５０は、望ましくない背景蛍光である。背景蛍光５０は、アッセイチャンバ１０の光学的に透明な壁１２ｆの内腔面１４ｆの結合パートナー５７に結合された標的検体５５から放射される蛍光５６とオーバラップする。従って、上記チャンバの変更及び後述する方法なしでは、光検出器によって受け取られる光信号は、標的検体の濃度に関連しない背景寄与を含む。従って、アッセイの感度及び精度が損なわれる。
【００４６】
図３を参照すると、上述した本発明に係るマイクロ流体デバイスのアッセイチャンバでは、アッセイチャンバ１０の反対側の壁１２ｄの非処理内腔面１４ｄと光学的に透明な壁１２ｆの活性内腔面１４ｆとからの蛍光励起及び収集の効率は、光学的に透明な壁１２ｆの内腔面１４ｆと、光学的に透明な壁とは反対側の壁１２ｄの内腔面１４ｄとの間の狭い距離８０（上述した一実施形態では、１０ミクロン程度）を考慮すると、本質的に同じである。対照的に、活性面と反対側に容器面のない頂部開放容器、又は処理された光学的に透明な内腔面と反対側の壁の面との間の距離が光学系の被写界深度より大きい、例えば約５ミリメートルより大きいアッセイチャンバにおける、活性面以外の面からの蛍光励起及び収集の効率は、チャンバの活性（処理された光学的に透明な内腔）面より蛍光の効率がはるかに低い。本チャンバでは、活性面は、反対側の面から、わずかに約１０ミクロン〜５ミリメートル、１０ミクロン〜２ミリメートル、１０ミクロン〜１ミリメートル、５０ミクロン〜２００ミクロン、５０ミクロン〜１２５ミクロン、７０ミクロン〜１００ミクロン、７５ミクロン〜１５０ミクロン、好ましくは５０ミクロン〜１００ミクロン、より好ましくは７５ミクロンである。したがって、本出願における深さ８０は、光学系の被写界深度より小さい。標的検体を正確に検出することには、処理された光学的に透明な内腔面の結合パートナーに結合された標的検体から放射された蛍光のみが関連し、チャンバの内腔面の他の部分に非特異的に結合された検出標識の蛍光は関連しない。背景蛍光もまた検出される場合、特異的な標的検体の検出に向けられたアッセイの精度及び感度は極度に損なわれる。
【００４７】
マイクロ流体デバイスのアッセイチャンバ内に特定の特性を有する色素６０を導入することは、さらに、図３に示しかつ後述する本発明の追加の変更である。導入された色素６０は、光学的に透明な壁１２ｆの活性内腔面１４ｆに特異的に結合される蛍光標識された標的検体５４によって放射された特異的な蛍光５６ではなく、蛍光検出分子５２が光学的に透明な壁１２ｆとは反対側の壁１２ｄの内腔面１４ｄに非特異的に結合することによって放射される背景蛍光５０の影響を減衰させる。
【００４８】
本発明のこの実施形態では、サンプル及び未結合蛍光検出分子を含むあらゆる未結合物質が、チャンバから除去され、チャンバ内腔は、上述したようにチャンバ内腔の容積を超えるか又はそれに等しい体積の洗浄液によって洗浄される。次に、上述したような減衰色素６０がチャンバの内腔内に導入される。色素の最適な濃度は、以下の基準を満たす色素の最高濃度である。すなわち、色素は、輸送、保管及び使用のすべての条件下で溶液に残らなければならず、アッセイの結果を変化させる化学的影響又は生物化学的影響をもたらしてはならない。色素溶液体積は、チャンバの容積におよそ等しい。一実施形態では、減衰色素を、蛍光検出分子とともに、又は任意選択的に、チャンバから未結合蛍光検出分子及びサンプルを除去するために使用される洗浄液に含めることができる。減衰色素６０は、アマランス、エリオグラウシン、ブリリアントグリーン又はさまざまな標準色素の組合せ等の標準色素を含む。蛍光標識は、キサンテン（例えば、フルオレセイン（Fluorescein）、Texas Red）、シアニン、ナフタレン、クマリン、オキサジアゾール、ピレン、オキサジン、アクリジン、アリールメチン（arylmethine）、テトラピロール、及びTOTO-1、YOYO-1、Alexa Fluor、Cy系（Cy2、Cy5、Cy7）及び他の多くのものを含む市販の色素に由来する一般的な色素系からの蛍光分子とともに、ランタニド、ユーロピウム、サマリウム及びテルビウムのキレート等、時間分解蛍光で有用な蛍光分子を含む。チャンバの内腔面、例えば面１４ｄに非特異的に結合される蛍光検出分子５２からの蛍光５０は、チャンバ内腔内に導入される１つ又は複数の減衰色素６０によって「マスク」される。光学的に透明な壁１２ｆの内腔面１４ｆに結合された蛍光標識された標的検体５４の特異的な蛍光５６はマスクされない。特に光学的に透明な壁とは反対側の壁に非特異的に結合された蛍光検出分子から発生する蛍光である非特異的蛍光をマスクすることにより、標的検体を検出するためのチャンバ１０の感度及び精度が向上する。従って、対象となる標的検体の濃度を測定することは、非特異的に結合された蛍光検出分子５２の蛍光５０によってもたらされる、光信号によって反映される標的検体の濃度の測定値に対して不明瞭にする影響なしに達成される。
【００４９】
図４を参照すると、本発明に係る一実施形態では、機器の光学部品は、光学的に透明な壁１２ｆ又は壁１２ｆの一部からかつ光学的に透明な壁とは反対側の壁１２ｄからからのみの蛍光を検出し、チャンバ１０の側壁又は他のいかなる壁から放射される可能性がある蛍光も検出しないように配置されている。
【００５０】
例えば、さらに図４を参照すると、一実施形態では、チャンバ深さが０．１ｍｍであり外側寸法が６ｍｍ×２ｍｍである、本発明による矩形アッセイチャンバ１０において、チャンバの光学的に透明な壁１２ｆは６ｍｍ×２ｍｍである。さらに図４を参照すると、この実施形態では、光信号に対して、６ｍｍ×２ｍｍの光学的に透明な壁１２ｆの１ｍｍ×１ｍｍ光信号部分１２０、例えば中心のみが利用される。したがって、反対側の壁面１２ｄ以外のチャンバの側面等の壁面の蛍光検出分子の非特異的結合による信号は、実質的に除去される。
【００５１】
チャンバの外側寸法を光学的に透明な領域より大きくすることができ、光学的に透明な領域を、さらに、光学的測定を行うために使用される部分より大きくすることができる。
【００５２】
実施例
ミオグロビンが、上述した本発明に係るマイクロ流体デバイスにおいて検出することができる生物学的試料において見られる例示的な標的検体である。再び図２を参照すると、例示的なチャンバは、浅く、深さ８０が例えば約７５ミクロンである。ミオグロビンの特異的なエピトープに向けられた、例えばモノクローナル抗体を、光学的に透明な壁１２ｆの内腔面１４ｆに施される結合パートナーとして使用することができる。ミオグロビンの異なるエピトープに向けられた別のモノクローナル抗体が、ユーロピウムの蛍光キレート等の蛍光検出分子で標識される。蛍光標識されたモノクローナル抗体は、ミオグロビン標的検体を含む可能性がある生物学的試料と混合される。十分なインキュベーション時間の後、蛍光標識されたモノクローナル抗体はミオグロビン検体と結合して、蛍光標識されたミオグロビン標的検体を形成する。減衰色素、例えばアマランスをシステムに追加することなく、蛍光検出分子の非特異的結合によってもたらされる反対側の壁１２ｄの内腔面１４ｄからの非特異的な蛍光、及び光学的に透明な壁１２ｆの内腔面１４ｆでの特異的なモノクローナル抗体結合パートナーへの蛍光標識されたミオグロビン標的検体の結合からの特異的な蛍光が、光検出器１００によって測定される。アッセイチャンバ１０からの測定された光信号は、壁１２ｄの未処理内腔面１４ｄへの蛍光検出分子５２の非特異的結合からの蛍光５０と、光学的に透明な壁１２ｆの内腔面１４ｆのモノクローナル抗体結合パートナー５７に特異的に結合されたユーロピウム標識ミオグロビン標的検体５５の蛍光キレートによって放射された蛍光５６とを含み、それにより、生物学的試料におけるミオグロビンの濃度を正確に反映しない人為的に上昇した蛍光値がもたらされる。色素なしの洗浄剤による未結合蛍光検出分子の除去に続き、チャンバの内腔面、特に浅いチャンバの光学的に透明な壁１２ｆとは反対側の壁１２ｄでの内腔面１４ｄにおける、残っている非特異的に結合された蛍光検出分子は、光学的に透明な壁１２ｆの内腔面１４ｆの特異的なモノクローナル抗体結合パートナーに結合された蛍光標識されたミオグロビン標的検体から放射された真のかつ特異的な光信号を干渉する。
【００５３】
上述したように、例えば標的検体ミオグロビンを検出する方法は、好ましくは、限定されないがアマランス又は上述したような色素の組合せ等、減衰色素の追加も組み込む。図３を参照すると、本発明の好ましい実施形態では、例示的なチャンバは、深さ８０が例えば約７５ミクロンである浅いチャンバである。結合が発生するのを可能にする十分なインキュベーションの後、ミオグロビン標的検体に向けられた未結合蛍光標識モノクローナル抗体が除去され、チャンバ内腔１６は、チャンバ内腔の容積を超えるか又はそれに等しい体積の洗浄剤で洗浄される。洗浄剤は、図３に関して上述したように、減衰色素、この例ではアマランスを含んでもよく、又はそうした減衰色素がなくてもよい。洗浄剤が、減衰色素を含まない場合、色素は、洗浄の後にチャンバ内腔に追加される。この例示的な実施形態では、図２に関して上述したように、アッセイチャンバ１０の未処理内腔面１４ｄへの蛍光検出分子の非特異的結合が発生する。しかしながら、特に光学的に透明な壁１２ｆの反対側の壁１２ｄの内腔面１４ｄ上の非特異的に結合された蛍光検出分子５２と、光学系９２との間に配置されたアマランス色素６０分子は、非特異的な蛍光を有効に減衰させる。この例ではアマランスの適用により、光学的に透明な壁１２ｆの内腔面１４ｆにコーティングされるモノクローナル抗体結合パートナー５７に結合されたミオグロビン標的検体５５の特異的な蛍光が正確に求められる。
【００５４】
好ましい実施形態では、マイクロ流体アッセイデバイスの周知の特性である短いインキュベーション時間並びに小さいサンプル及び試薬体積を達成するために、アッセイチャンバ１０は、マイクロ流体アッセイデバイス内のマイクロ流体要素である。これらの特性を、上述したようにアッセイチャンバが浅く、好ましくは１０ミクロン〜２００ミクロンで維持される場合にのみ達成することができる。アッセイチャンバが過度に深い場合、拡散による物質移動には、長いインキュベーション時間が必要となり、アッセイチャンバの充填及び洗浄には、より体積の大きい、コストのかかる試薬が必要となる。しかしながら、再び図３を参照すると、非常に高感度のアッセイを達成するために、アッセイチャンバ１０の光学的に透明１２ｆの活性の処理された内腔面１４ｆに特異的に結合された検出分子からの蛍光のみを検出し、アッセイチャンバ１０の反対側の壁１２ｄの未処理内腔面１４ｄに非特異的に結合された検出分子からの蛍光は検出しないことも望ましい。上述したようにアッセイチャンバが浅く維持される場合、面１４ｄ及び面１４ｆはともに、励起光を送達し蛍光を収集する実際的な光学系の被写界深度内にあることになる（この問題に対処する専用の光学設計は可能であり得るが、それら設計により、コスト、複雑性及び誤動作のリスクが追加される）。本発明によれば、減衰色素の使用が、マイクロ流体設計と光学設計との基本的な対立を解決する。
【００５５】
本発明に係る別の実施形態では、競合結合アッセイを行うことができる。この実施形態によれば、標的検体に対する結合パートナーが、上述したように、光学的に透明な壁の内腔面にコーティングされる。光学的に透明な壁の内腔面にコーティングされた結合パートナーに特異的に結合する標的検体と競合する、蛍光標識された標的検体分子が用意される。蛍光標識された標的検体分子とサンプルにおける未標識検体分子とが競合して、光学的に透明な壁の内腔面にコーティングされた結合パートナーと結合する。したがって、サンプルにおける未標識検体分子の濃度が上昇するに従い、内腔面にコーティングされた結合パートナーに特異的に結合された標識分子の数が対応して低減する。それにも関らず、上述した他の実施形態に対して当てはまるように、サンプルにおける未標識検体の定量化は、光学的に透明な壁の内腔面の特異的に結合された蛍光分子からの蛍光の測定値に基づく。光学系の被写界深度内の他の面における非特異的に結合された蛍光分子からの蛍光は、アッセイの解析性能を低下させ、本発明による減衰色素の使用がこの問題を解決する。
【００５６】
面蛍光減衰の具体例
原理を証明するために、上述したアッセイチャンバの内腔面、特に光学的に透明な面と反対側の面とに対する非特異的に結合された蛍光標識粒子を減衰させる解決法におけるさまざまな色素の効果を確定する研究がなされた。この研究のために、ユーロピウムの蛍光キレートで標識されたラテックスナノ粒子が、上述したチャンバの光学的に透明な壁１２ｆとは反対側の壁１２ｄの未処理内腔面１４ｄに直接追加されて、実際の診断アッセイ中に発生する可能性がある非特異的に結合された蛍光標識がシミュレートされた。
【００５７】
ユーロピウムの蛍光キレートで標識されたラテックスナノ粒子は、上述したポリスチレンチャンバ（６ｍｍ×２．５ｍｍ×０．０７５ｍｍ）の光学的に透明な壁とは反対側の壁の内腔面に直接分配された。１×１０５、１×１０６又は１×１０７のナノ粒子が１μＬ水性緩衝液で面に追加され、空気乾燥した。そして、処理されていない光学的に透明な壁がチャンバ上に超音波溶接され、上述したアッセイチャンバ１０が形成された。
【００５８】
上述したアッセイチャンバの各々の内腔が、チャンバの内腔面の緩く結合された物質を除去するために、減衰色素なしに１００μＬの水溶液で３回洗浄された。各洗浄の後、３４０ｎｍ励起を使用し、６１５ｎｍバンドパスフィルタを使用して放射光を収集して、蛍光が測定された。光学的に透明な壁１２ｆとは反対側の壁１２ｄの内腔面１４ｄからの蛍光の量が、光学的に透明な壁１２ｆを通して測定された。以下の表１に示すように、後続する洗浄が面から追加の蛍光を除去するように続けられたが、最初の洗浄の後に蛍光が９２％低減したため、最初の３回の洗浄で緩く結合されたナノ粒子の大部分が除去された。２回目の洗浄の後、残っている数の約４１％が除去され、３回目の洗浄の後、残っている数の約１０％のみが除去された（３回目の洗浄の後、蛍光が実際にわずかに増大した１×１０５の場合を除いて、３回目の洗浄の後、低下は約２２％であった）。
【００５９】
３回目の洗浄に続き、その後、アッセイチャンバは、１００μＬの洗浄剤に、ユーロピウムの蛍光キレートの励起に使用される波長の近くの３６０ｎｍで強力に吸収する、７ｍｇ／ｍＬのアマランス色素（CAS No:[915-67-3]）を足したもので洗浄された。アマランス色素が存在する場合、測定された蛍光は、平均して、色素なしの測定値の約６７％未満であり、面からの追加の蛍光ナノ粒子の除去によってのみ説明するのは大きすぎる低下であった（ただし明らかに、わずかな量の追加の緩く結合された物質が除去された可能性はある、以下を参照）。むしろ、これらの結果は、光学的に透明な壁１２ｆとは反対側の（活性面ではない）壁の面１４ｄに結合されたナノ粒子から発生する蛍光の色素による減衰として解釈された。
【００６０】
この結論は、この場合もまた色素なしの洗浄剤を使用して、内腔面を５回目に洗浄することによって支持された。５回目の洗浄による色素の除去の後、蛍光は平均して２倍増大し、それは、色素を含む４回目の洗浄の後の蛍光の大幅な低減は、面１４ｄからの緩く結合されたナノ粒子の除去のみによるものではなかった可能性があることを示す。
【００６１】
５回目の洗浄の後、蛍光は、３回目の洗浄の後に達成されたレベルに戻らず、それは、４回目の洗浄及び５回目の洗浄中に追加の緩く結合された材料が除去されたことを示す。これらの最後の２回の洗浄の各々における面からの緩く結合された物質の除去によって等しく喪失したとすると、その喪失は、以下の表Ｉに示すように３回目の洗浄からみられるものと同様に、１回の洗浄毎に約１９％で推定された。
【００６２】
【表１】
2015500500.tif 000003
【００６３】
本発明のさらなる具体例（表ＩＩ参照）として、上記実験が、洗浄剤に以下の色素のうちの１つを加えて繰り返された。すなわち、１）７ｍｇ／ｍＬアマランス（対照）、２）１４ｍｇ／ｍＬアマランス、３）２２．５ｍｇ／ｍＬエリオグラウシン（CAS No:[3844-45-9]）、及び４）３０ｍｇ／ｍＬブリリアントグリーン（CAS No.[633-03-4]）。励起光の波長の近くを吸収するアマランスとは異なり、エリオグラウシン及びブリリアントグリーンは、６１５ｎｍ、すなわちユーロピウムのキレートの蛍光放射波長の近くを強力に吸収する。この実験では、上述したように、２×１０６の蛍光ナノ粒子が、ポリスチレンチャンバの光学的に透明な壁１２ｆと反対側の壁の内腔面１４ｄの上に直接分配された。
【００６４】
以下の表ＩＩに示すように、光学的に透明な壁１２ｆとは反対側の壁１２ｄの内腔面１４ｄに付着した蛍光粒子では、上で観察された減衰のレベルと同様に、７ｍｇ／ｍＬアマランスを使用して、面結合蛍光の６３％減衰が観察された。アマランス色素濃度を７ｍｇ／ｍＬから１４ｍｇ／ｍＬまで増大させることにより、面１４ｄからの蛍光がさらに大きく減衰する結果となり、この時７７％の低減となった。エリオグラウシン又はブリリアントグリーン色素が使用された場合、面結合蛍光の約２％のみが測定され、それは、使用される濃度でこれらの色素が存在する場合に、チャンバの光学的に透明な壁１２ｆと反対側の壁１２ｄの内腔面１４ｄに結合された蛍光の約９８％の減衰を示す。
【００６５】
説明した第１具体例と同様に、減衰色素を除去する５回目の洗浄の後、蛍光の実質的な増大が測定され、この場合もまた、減衰色素が、光学的に透明な壁１２ｆと反対側の壁１２ｄの内腔面１４ｄに結合されたナノ粒子を除去するのではなく、その蛍光を遮断したことを表す。
【００６６】
【表２】
2015500500.tif 000004
【００６７】
第１原理は、色素分子吸収によってもたらされる減衰の大きさが、色素の濃度の増大によって増大するはずであるということを示す。実際には、これは、アマランス濃度を２倍にすることで観察された（表ＩＩを参照）。さらに、高濃度のエリオグラウシン及びブリリアントグリーンが、面結合蛍光の約９８％を遮断した（表ＩＩ参照）。後に色素が除去されることにより、蛍光が回復し、それは、色素の効果が、面結合ナノ粒子を除去するのではなくナノ粒子から蛍光を遮断することであったことを証明する。原理実験のこの証明により、減衰色素を適用することにより、光学的に透明な壁と反対側の内腔壁の面からの非特異的に結合された蛍光を略完全に遮断することができることが分かる。結果が示すように、色素及び濃度の選択は、減衰の大きさに影響を与える重要なパラメータである。色素の最適な濃度は、以下の基準を満たす色素の最高濃度である。すなわち、色素は、輸送、保管及び使用のすべての条件下で溶液内に残らなければならず、アッセイの結果を変化させる化学的影響又は生物化学的影響をもたらしてはならない。
【００６８】
生物学的サンプルにおける標的検体を測定するアッセイにおいて望ましくない背景蛍光を低減する本発明の方法の一実施形態によれば、アッセイチャンバを有するマイクロ流体デバイスが提供される。アッセイチャンバは、壁と任意選択的な入口ポート及び出口ポートとによって密閉された内腔を有している。１つのチャンバ壁又は別法としてチャンバ壁の一部は、チャンバ内の蛍光の量を測定するチャンバの外側の光検出器に、チャンバ内から放射された励起光及び蛍光光を伝達するために光学的に透明である。
【００６９】
チャンバの光学的に透明な壁の内腔面又は一部は、上述したように、生物学的サンプルにおける対象となる標的検体に対する特異的な結合パートナーでコーティング（活性化）される。光学的に透明な壁と反対側の壁の内腔面は、アッセイを開始する前に処理されない。
【００７０】
生物学的サンプルは、標的検体に対して特異的な別の結合パートナーを含む蛍光検出分子と混合される。この結合パートナーは、光学的に透明な面にコーティングされた結合パートナーと同じであるか、又は任意選択的に異なっていてもよい。サンプル及び蛍光検出分子は、個別に又は組み合わせて、アッセイチャンバの内腔内に導入される。代替的に、サンプルがチャンバに追加され、チャンバは洗浄され、その後、チャンバに蛍光検出分子が追加される。
【００７１】
結合を可能にするインキュベーションの後、生物学的サンプル及び蛍光検出分子を含む溶液が、チャンバから除去される。一実施形態では、チャンバは、チャンバの容積を超えるか又はそれに等しい体積の、水性緩衝液等の洗浄剤で洗浄される。次に、チャンバは、１以上の減衰色素を含む水性緩衝液等のある体積の溶液で充填される。色素溶液の体積は、チャンバの容積におよそ等しい。任意選択的に、洗浄液は色素を含むことができる。チャンバの内腔内で生成された光信号は、減衰色素がチャンバ内腔内に存在している間に光検出器によって測定され、光信号は標準曲線と比較されて、サンプルにおける標的検体の濃度が求められる。
【００７２】
上述した装置及び方法を使用して、主な、光学的に透明な機能化活性反応面を除く、広く及び変化する設計の診断試験デバイスの未処理内腔面に非特異的に結合する蛍光検出分子から発生する干渉信号を低減することができる。したがって、本発明の上述した装置及び方法は、精度感度を向上させ、製造コストを低減し、蛍光ベースのインビトロ医療診断試験におけるコストのかかる試薬の使用を最小限にし、それにより、患者治療の改善につながる。
【００７３】
本発明を、その趣旨又は本質的な特性から逸脱することなく他の具体的な形式で具現化することができる。したがって、上述した実施形態は、すべてに関して本発明に対する限定ではなく例示的であるとみなされるべきである。本発明の範囲は、特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の均等の意味及び範囲内にあるすべての変更が、包含されるように意図されている。
【図１Ａ】
2015500500.tif 000005
【図１Ｂ】
2015500500.tif 000006
【図１Ｃ】
2015500500.tif 000007
【図１Ｄ】
2015500500.tif 000008
【図１Ｅ】
2015500500.tif 000009
【図１Ｆ】
2015500500.tif 000010
【図２】
2015500500.tif 000011
【図３】
2015500500.tif 000012
【図４】
2015500500.tif 000013
【国際調査報告】
2015500500.tif 000014
2015500500.tif 000015