【手続補正書】
【提出日】平成22年7月6日(2010.7.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
アフリカツメガエル由来の乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入された酵母であって、ピルビン酸脱炭酸酵素１をコードする遺伝子が欠失し、野生型ピルビン酸脱炭酸酵素５をコードする遺伝子の塩基配列の一部が欠失、挿入、置換及び／又は付加された塩基配列からなる変異型ピルビン酸脱炭酸酵素５遺伝子を有することを特徴とする酵母。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
すなわち、本発明は、アフリカツメガエル由来の乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入された酵母であって、ピルビン酸脱炭酸酵素１をコードする遺伝子が欠失し、野生型ピルビン酸脱炭酸酵素５をコードする遺伝子の塩基配列の一部が欠失、挿入、置換及び／又は付加された塩基配列からなる変異型ピルビン酸脱炭酸酵素５遺伝子を有することを特徴とする酵母、および該酵母を培養することによる乳酸の製造方法を提供するものである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
アフリカツメガエル由来の乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入され、ピ
ルビン酸脱炭酸酵素活性が低下した本発明の酵母を用いることにより、効率的に乳酸を製
造することが可能となる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
本発明は、アフリカツメガエル由来の乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入された酵母であって、ピルビン酸脱炭酸酵素１をコードする遺伝子が欠失し、野生型ピルビン酸脱炭酸酵素５をコードする遺伝子の塩基配列の一部が欠失、挿入、置換及び／又は付加された塩基配列からなる変異型ピルビン酸脱炭酸酵素５遺伝子を有する酵母と、概酵母を培養することを特徴とする乳酸の製造方法である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
本発明において、乳酸脱水素酵素コードする遺伝子（以下、ｌｄｈ遺伝子ということがある）は、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）とピルビン酸を乳酸と酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）に変換する活性を持つ乳酸脱水素酵素をコードしている遺伝子である。本発明で使用するｌｄｈ遺伝子は、アフリカツメガエル（ゼノプス・レービス）由来のｌｄｈ遺伝子である。具体的には、本発明で使用するアフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子は、好ましくは、配列番号６に示す塩基配列を有するｌｄｈ遺伝子である。該ｌｄｈ遺伝子には、遺伝子上の自然突然変異により遺伝子の塩基配列が一部変化している遺伝的多型性や、既知の方法を用いて人工的に遺伝子に変異を導入する変異誘発などによる変異型の遺伝子も含まれる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子の酵母への導入方法としては、該遺伝子をプラスミドにクローニングして導入しても良いし、酵母染色体上に組み込んでも良い。該遺伝子の発現様式としては、詳細は後記するが、遺伝子を発現させることができるプロモーターの支配下に該遺伝子が連結されていれば、プラスミドによる発現、または染色体への組み込みによる発現など特に限定されない。得られたプラスミドまたはＰＣＲ断片を酵母に導入するには、形質転換、形質導入、トランスフェクション、コトランスフェクションまたはエレクトロポレーション等の方法を用いることができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
アフリカツメガエル由来の乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子（ｌｄｈ遺伝子）が導入され、ＰＤＣ１遺伝子が欠失し、変異型ＰＤＣ５遺伝子を有する本発明の酵母を培養することによって、効率的に乳酸を製造することができる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
参考例１  ヒト由来Ｌ−ｌｄｈ遺伝子のクローニング
ヒト由来Ｌ−ｌｄｈ遺伝子のクローニングは下記のように実施した。具体的には、ヒト由来ＬＤＨ遺伝子を酵母ゲノム上のＰＤＣ１プロモーターの下流に連結することでＬ−乳酸発酵能力を持つ酵母を造成した。ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）には、Ｌａ−Ｔａｑ（宝酒造）、あるいはKOD-Plus-polymerase（東洋紡）を用い、付属の取扱説明に従って行った。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
実施例１  アフリカツメガエル由来Ｌ−ＬＤＨ遺伝子のクローニング
アフリカツメカエル（ゼノプス・レービス）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子のクローニングは下記のように行った。Ｌ−ｌｄｈ遺伝子は、ＰＣＲ法によりクローニングを行った。ＰＣＲには、アフリカツメカエル（ゼノプス・レービス）の腎臓由来ｃＤＮＡライブラリー（STRATAGENE社製）より、各付属のプロトコールに従い調製したファージミドＤＮＡをＰＣＲの鋳型とした。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９５】
実施例２  Δｐｄｃ１  Δｐｄｃ５二重欠失株の造成
下記、酵母分子遺伝学的な手法を実施に用いた生育培地としてはYPD培地、YPAD培地、YPG培地、YPAG培地、SD培地、SPO培地、は「「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、１９９１年、（米国）、第１９４巻」に従い調整した。酵母最小培地であるSD培地には必要に応じて、アミノ酸及び核酸塩基［トリプトファン、チロシン、ヒスチジン、アルギニン、メチオニン、ウラシル（最終濃度各20mg/L）、チロシン、ロイシン、イソロイシン、リジン（各30 mg/L）、バリン（150 mg/L）、フェニルアラニン（60 mg/L）、スレオニン（200 mg/L）、およびアデニン（40 mg/L）］を加えて用いた。グリセロールを炭素源とした最小培地にはSG培地［グルコースの代わりにグリセロール30 g］を用いた。酵母の合成完全培地にはSC培地[1 literあたりグルコース20 g、Yeast Nitrogen Base w/o amino acids（Difco社製）6.7 g、ロイシンを除く標準19種アミノ酸76 mg、ロイシン380 mg、イノシトール76 mg、p-アミノ安息香酸8 mg、アデニン40 mg、およびウラシル76 mg]を用い、グリセロールを炭素源とした培地にはSCG培地[グルコースの代わりにグリセロール30 g]を用いた。必要に応じて任意のアミノ酸及び核酸塩基を加えない培地（例えばウラシルを加えない培地はSCＧ-Ura培地）を用いた。尚、これらはYeast Synthetic Drop-out Medium Supplements（Sigma-Aldrich社製）を用いても調整できる。四分子解剖用培地にはYPAD培地あるいはYPAG培地1 literに精製寒天粉末（ナカライ社製）20 gを加え、90 mmシャーレ（岩城硝子社製）に寒天培地12 mlを満たすことで調整した。5-FOA培地は1 literあたりグルコース20 g、Yeast Nitrogen Basew/o amino acids 6.7 g、Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements w/o uracil（Sigma-Aldrich社製） 1.92 g、ウラシル50 mg、および5-FOA（和光純薬社製）1 g（高圧蒸気滅菌後添加）を含む。平板培地を調整するときは、断らない限り1 literあたりBactoagar（Difco）20 g、あるいは精製寒天粉末（ナカライ社製）20 gを加えた。滅菌は1 kg/cm2、20分間の条件でオートクレーブを用い高圧蒸気滅菌した。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９９】
実施例３  ｐｄｃ５ｔｓ変異遺伝子の取得
ＢＹ４７４１株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号１５及び配列番号１６で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより、ＰＤＣ５遺伝子を含む２．７ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を得た。該断片をＮｏｔＩで消化し、予めＮｏｔＩで消化しておいたプラスミドｐＲＳ３１６のＮｏｔＩ間隙に挿入した。得られたプラスミドｐＲＳ３１６−ＰＤＣ５によって、ＳＷ０１３株をウラシル非要求性に形質転換した。該形質転換体がグルコースを唯一炭素源として生育能力が回復し、且つ３７℃での生育能力を有していることを確認した。該形質転換体から、プラスミドｐＲＳ３１６−ＰＤＣ５を常法によって回収し、ｐＲＳ３１６に挿入した２．７ｋｂの塩基配列を常法によって決定し、ｐＲＳ３１６−ＰＤＣ５はＰＤＣ５遺伝子が含まれていることを確認した。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０１】
実施例４  ｐｄｃ５ｔｓ変異株の造成
プラスミドｐＲＳ３１６−ｐｄｃ５ｔｓ９およびｐＲＳ３１６−ｐｄｃ５ｔｓ１１をＮｏｔＩで消化し、ｐｄｃ５ｔｓ９およびｐｄｃ５ｔｓ１１変異遺伝子を含む２．７ｋｂ断片を得た。該断片を用いてＳＷ０１２株をウラシル要求性に形質転換し、５ＦＯＡ培地で２５℃に保温し生育する形質転換体を選択した。得られた形質転換体群を新鮮なＳＣ−Ｕｒａ培地にレプリカし３４℃で保温した。レプリカした形質転換体群の中で３４℃で生育しない形質転換体を選択し、ｐｄｃ５ｔｓ９温度感受性変異株ＳＷ０１５株、ｐｄｃ５ｔｓ１１温度感受性変異株ＳＷ０１６株とした。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０２】
実施例５  ｐｄｃ５ｔｓ変異株の諸性質
ＰＤＣ野生型株、Δｐｄｃ１欠失株およびΔｐｄｃ１  ｐｄｃ５温度感受性株のＰＤＣ活性を測定した。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０９】
比較例１、２  ｐｄｃ５温度感受性変異株による乳酸発酵試験（ヒト由来ＬＤＨ遺伝子）
上記で取得したｐｄｃ５温度感受性変異株の乳酸発酵試験を行った。ヒト由来ＬＤＨ遺
伝子を含むプラスミドｐＬ−ｌｄｈ５でＳＷ０１５株、およびＳＷ０１６株を形質転換す
ることで、ヒト由来ＬＤＨを導入した。乳酸発酵試験には表３に示す乳酸発酵培地を高圧
蒸気滅菌（１２１℃、１５分）した。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２０】
まず、ＳＷ０１５株（比較例１）、およびＳＷ０１６株（比較例２）を試験管で５ｍｌの乳酸発酵培地で一晩振とう培養した（前々培養）。前々培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間振とう培養した（前培養）。前培養液を発酵装置に植菌し、乳酸発酵試験を行った。その結果を表４に示した。尚、産生されたＬ−乳酸の光学純度はすべて９９．９％であった。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２１】
実施例６、７  ｐｄｃ５温度感受性変異株による乳酸発酵試験（アフリカツメガエル由来ＬＤＨ遺伝子）
上記で取得したｐｄｃ５温度感受性変異株の乳酸発酵試験を行った。アフリカツメガエ
ル由来ＬＤＨ遺伝子を含むプラスミドｐＬ−ｌｄｈ９でＳＷ０１５株、およびＳＷ０１６
株を形質転換することで、アフリカツメガエル由来ＬＤＨを導入した。乳酸発酵試験には
表３に示す乳酸発酵培地を高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）した。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３１】
まず、アフリカツメガエル由来プラスミドｐＬ−ｌｄｈ９で形質転換したＳＷ０１５株（実施例６）、およびＳＷ０１６株（実施例７）を試験管で５ｍｌの乳酸発酵培地で一晩振とう培養した（前々培養）。前々培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間振とう培養した（前培養）。前培養液を発酵装置に植菌し、乳酸発酵試験を行った。その結果を表４に示した。尚、産生されたＬ−乳酸の光学純度はすべて９９．９％であった。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３２】
比較例３  ＰＤＣ５野生型株を用いた乳酸発酵（ヒト由来ＬＤＨ遺伝子）
また、対照比較例としてＰＤＣ５野生型株を用いた発酵試験を行った。ヒト由来ＬＤＨ遺伝子を含むプラスミドｐＬ−ｌｄｈ５でＰＤＣ５野生型株であるＳＷ０１１株を形質転換した形質転換細胞を用い、ｐｄｃ５温度感受性変異株と同条件で発酵試験を行った。その試験結果を表４に示した。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３３】
比較例４  ＰＤＣ５野生型株を用いた乳酸発酵（アフリカツメガエル由来ＬＤＨ遺伝子）
更に、対照比較例としてアフリカツメガエル由来ＬＤＨ遺伝子を含むプラスミドｐＬ−ｌｄｈ９で形質転換したＳＷ０１１株を、ｐｄｃ５温度感受性変異株と同条件で発酵試験を行った。その試験結果を表４に示した。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３４】
【表４】
2008048726.tif 000001
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３５】
これらの結果から、ｐｄｃ５温度感受性変異株を用いることで、高い収率で乳酸の製造できることが明らかになった。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３６】
参考例２  多孔性膜の作成
樹脂としてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）樹脂を、また溶媒としてＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）をそれぞれ用い、これらを９０℃の温度下に十分に攪拌し、下記組成を有する原液を得た。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４０】
実施例８  ｐｄｃ５温度感受性変異株による乳酸連続発酵試験
本発明の酵母としてアフリカツメガエル由来プラスミドｐＬ−ｌｄｈ９で形質転換した
ＳＷ０１５株を用い、発酵培地として表３に示す組成の乳酸発酵培地を用い、図２に示す
連続発酵装置を用いて連続培養を行い、乳酸の連続発酵試験を行った。また、上記の乳酸
発酵培地は、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌して用いた。分離膜エレメント部材
には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成型品を用いた。分離膜には、参考例２で作
成したポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を主成分とする多孔性膜を用いた。この実施例
９における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４４】
比較例５  ＰＤＣ５野生型株を用いた連続乳酸発酵試験
対照比較例として、アフリカツメガエル由来ＬＤＨを含むプラスミドｐＬ−ｌｄｈ９で形質転換したＳＷ０１１株を用いて、その他の条件はすべて実施例７と同様で連続乳酸発酵試験を行った。その試験結果を表５に示した。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４５】
【表５】
2008048726.tif 000002
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４６】
これらの結果、ｐｄｃ５温度感受性変異株を用いた連続発酵を行うことで、高い収率かつ高い生産速度で乳酸が製造できることが明らかになった。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４７】
以上の結果、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子を導入したｐｄｃ５温度感受性変異株を培養して乳酸発酵を行うと、ＰＤＣ５遺伝子野生型株やヒト由来のｌｄｈ遺伝子を導入したｐｄｃ５温度感受性変異株を用いた場合より、乳酸の対糖収率ならびに乳酸生産速度が向上した。このことから、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子と変異型ＰＤＣ５遺伝子を有する比活性が低下した酵母を用いることで乳酸の効率的な生産が可能になることが明らかになった。