(57)【要約】  一態様において、本開示は、α１−抗トリプシン（ＡＡＴ）を含む組成物及びその生成に関する。ある実施形態において、このＡＡＴは、組換えにより生成される。本開示はまた、α１−抗トリプシン（ＡＡＴ）を含む組成物を投与する方法にも関する。
2015502370.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
α１−抗トリプシン（ＡＡＴ）を含む組成物であって、前記ＡＡＴが、組換えにより生成されることを特徴とする、組成物。
【請求項２】
前記ＡＡＴが、非ヒト哺乳動物の乳腺上皮細胞において生成されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＡＡＴが、トランスジェニック非ヒト哺乳動物において生成されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記非ヒト哺乳動物が、ヤギ、ヒツジ、バイソン、ラクダ、ウシ、ブタ、ウサギ、スイギュウ、ウマ、ラット、マウス又はラマであることを特徴とする、請求項２又は３に記載の組成物。
【請求項５】
前記非ヒト哺乳動物が、ヤギであることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記組換えにより生成されるＡＡＴが、血漿由来のＡＡＴと比較して、増大したデオキシヘキソースグリコシル化を有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記組換えにより生成されるＡＡＴが、ＡＡＴ−糖モチーフでのシアル化を増大するように修飾されていることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
ＡＡＴを含む組成物であって、前記ＡＡＴが、高レベルのデオキシヘキソースグリコシル化を有することを特徴とする、組成物。
【請求項９】
ＡＡＴを含む組成物であって、前記ＡＡＴが、ＡＡＴ−糖モチーフでの高レベルのシアル化を有することを特徴とする、組成物。
【請求項１０】
ＡＡＴを含む組成物であって、前記ＡＡＴが、高レベルのデオキシヘキソースグリコシル化と、ＡＡＴ−糖モチーフでの高レベルのシアル化を有することを特徴とする、組成物。
【請求項１１】
さらに乳汁を含むことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＡＡＴを含む組成物。
【請求項１２】
さらに薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のＡＡＴを含む組成物。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物のＡＡＴを生成することを特徴とする、乳腺上皮細胞。
【請求項１４】
請求項１３に記載の乳腺上皮細胞を含むことを特徴とする、トラスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物を、それを必要とする被検体に投与することを含むことを特徴とする、方法。
【請求項１６】
前記被検体が、α１−抗トリプシン欠損を有することを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記被検体が、炎症性疾患を有することを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記炎症性疾患が、気腫であることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物を３０ｍｇ／ｋｇ〜約６０ｍｇ／ｋｇのＡＡＴの用量で投与することを特徴とする、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記組成物を静脈内投与することを特徴とする、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記組成物を吸入により投与することを特徴とする、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
肺におけるエラスターゼ活性を低減する方法であって、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物を、肺のエラスターゼ活性を低減するのに十分な量で被検体に投与することを含むことを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、２０１１年１２月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／５７７，２８９号明細書の米国法典第３５編第１１９条に基づく利益を主張する。尚、上記出願の全内容は、参照として本明細書に組み込むものとする。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、喘息、気腫、慢性閉塞性肺疾患及び慢性肉芽腫性肺疾患、すなわち類肉腫などの炎症性状態の治療に関する。特に、本発明は、組換えヒトα１−抗トリプシンを用いたこれらの状態の治療に関する。
【背景技術】
【０００３】
組換えタンパク質は、生命にかかわる多くの疾患の有効な治療薬を提供する。治療用タンパク質の生産のための細菌、酵母及び昆虫細胞などの高発現レベル系の使用は、多様な翻訳後修飾物がなく、小タンパク質に限定されている。哺乳動物細胞系は、必要な翻訳後修飾物の多くを生成するが、複雑であり、そのため精巧な培養系を必要とするために、より高価である。さらに、これらの複雑な培養方法では、タンパク質発現レベルの低減が認められることが多い。哺乳動物細胞培養系の制約のいくつかは、トランスジェニック哺乳動物又は鳥類における組換えタンパク質の発現によって解決されている。タンパク質は、年に数百キログラムのスケールでの費用効果的生産に好適な発現レベルで、様々なトランスジェニック動物の乳腺で生成されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一態様において、本開示は、組換えヒトα１−抗トリプシン（ＡＡＴ）を提供する。一態様では、組換えにより生成した組換えヒトα１−抗トリプシン（ＡＡＴ）を、ＡＡＴを必要とする患者に投与する。
【０００５】
思いがけないことに、組換えヒトα１−抗トリプシン（ＡＡＴ）を投与すると、同等用量の血漿由来のＡＡＴより高い効果が肺にもたらされることが判明した。特定の理論に束縛されるわけではないが、トランスジェニックヤギの乳汁に生成される組換えＡＡＴのグリコシル化プロフィールにより、血漿由来のＡＡＴと比較して、肺へのタンパク質の局在化が増大すると考えられる。
【０００６】
一態様において、本開示は、α１−抗トリプシン（ＡＡＴ）を含む組成物を提供し、このＡＡＴは、組換えにより生成される。ある実施形態において、ＡＡＴは、非ヒト哺乳動物の乳腺上皮細胞において生成される。ある実施形態では、ＡＡＴは、トランスジェニック非ヒト哺乳動物において生成される。ある実施形態では、非ヒト哺乳動物は、ヤギ、ヒツジ、バイソン、ラクダ、ウシ、ブタ、ウサギ、スイギュウ、ウマ、ラット、マウス又はラマである。ある実施形態では、非ヒト哺乳動物は、ヤギである。ある実施形態では、組換えにより生成されるＡＡＴは、血漿由来のＡＡＴと比較して、増大したデオキシヘキソースグリコシル化を有する。ある実施形態では、組換えにより生成されるＡＡＴは、ＡＡＴ−糖モチーフでのシアル化を増大するように修飾される。
【０００７】
一態様において、本開示は、ＡＡＴを含む組成物を提供し、ここで、ＡＡＴは、高レベルのデオキシヘキソースグリコシル化を有する。一態様では、本開示は、ＡＡＴを含む組成物を提供し、ここで、ＡＡＴは、ＡＡＴ−糖モチーフでの高レベルのシアル化を有する。一態様では、本開示は、ＡＡＴを含む組成物を提供し、ここで、ＡＡＴは、高レベルのデオキシヘキソースグリコシル化と、ＡＡＴ−糖モチーフでの高レベルのシアル化を有する。
【０００８】
本明細書に記載するＡＡＴの組成物のいずれかのある実施形態では、組成物は、さらに乳汁を含む。本明細書に記載するＡＡＴの組成物のいずれかのある実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
【０００９】
一態様において、本開示は、本明細書に開示するいずれかの組成物のＡＡＴを生成する乳腺上皮細胞を提供する。一態様において、本開示は、本明細書に開示する乳腺上皮細胞を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。
【００１０】
一態様において、本開示は、本明細書に開示するＡＡＴ組成物を、これを必要とする被検体に投与することを含む方法を提供する。ある実施形態では、被検体は、α１−抗トリプシン欠損を有する。ある実施形態では、被検体は、炎症性疾患を有する。ある実施形態では、炎症性疾患は気腫である。ある実施形態では、組成物を３０ｍｇ／ｋｇ〜約６０ｍｇ／ｋｇのＡＡＴの用量で投与する。ある実施形態では、組成物を静脈内経路で投与する。ある実施形態では、組成物を吸入により投与する。
【００１１】
一態様において、本開示は、肺におけるエラスターゼ活性を低減する方法を提供し、この方法は、本明細書に開示するＡＡＴ組成物を、肺のエラスターゼ活性を低減するのに十分な量で被検体に投与することを含む。
【００１２】
図面は、例示的であり、本発明の実施可能性に要求されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】ラット気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）サンプルのクーマシー染色を示す。
【図１Ｂ】ＢＡＬから回収したＡＡＴの染色の定量を示す。これらのサンプルは、ＢＡＬから回収したアルブミンに基づいて正規化されている。
【図１Ｃ】ＢＡＬから回収したＡＡＴの染色の定量を示す。これらのサンプルは、ＢＡＬから回収したアルブミンに基づいて正規化されている。
【図２】ＩＬ−８と相関するＧＲＯ／ＣＩＮＣ−１ＥＬＩＳＡ（増殖調節遺伝子産物／サイトカイン誘導好中球誘引物質）のレベル及びＡＡＴで処理したラットの気管支肺胞洗浄液サンプルの炎症のモデルを示す。
【図３】対照ＡＡＴ（レーン２〜５）及び気管支肺胞洗浄液から回収したＡＡＴ（レーン７〜１０）のエラスターゼ反応性を示す。エラスターゼとの結合は、ＡＡＴの分子量の増加により示される。
【図４Ａ】３０ｍｇ／ｋｇの用量でＡＡＴを投与したラットの気管支肺胞洗浄液から回収したＡＡＴの、ＳＤＳ  ｐａｇｅにより検定した量を示す。
【図４Ｂ】３０ｍｇ／ｋｇの用量でＡＡＴを投与したラットの気管支肺胞洗浄液から回収したＡＡＴの、ＳＤＳ  ｐａｇｅにより検定した量を示す。
【図５】３０ｍｇ／ｋｇの用量でＡＡＴを投与したラットの気管支肺胞洗浄液から回収したＡＡＴの、ＤＯＴブロット解析により検定した量を示す。
【図６】３０ｍｇ／ｋｇのＡＡＴに暴露したラットのＡＡＴの薬物動態を示す。
【図７Ａ】３ｍｇ／ｋｇ又は３０ｍｇ／ｋｇでＡＡＴを投与したラットの血液対肺中のＡＡＴの相対レベルを示す。
【図７Ｂ】３ｍｇ／ｋｇ又は３０ｍｇ／ｋｇでＡＡＴを投与したラットの血液対肺中のＡＡＴの相対レベルを示す。
【図８】組換えにより生成されたＡＡＴのグリコシル化パターンを示す。
【図９】血漿由来のＡＡＴのグリコシル化パターンを示す。
【図１０Ａ】３ｍｇ／ｋｇの用量でＡＡＴを投与したラットの気管支肺胞洗浄液から回収したＡＡＴの、ＳＤＳ  ｐａｇｅにより検定した量を示す。
【図１０Ｂ】３ｍｇ／ｋｇの用量でＡＡＴを投与したラットの気管支肺胞洗浄液から回収したＡＡＴの、ＳＤＳ  ｐａｇｅにより検定した量を示す。
【図１１】３ｍｇ／ｋｇの用量でＡＡＴを投与したラットの気管支肺胞洗浄液から回収したＡＡＴの、ＤＯＴブロット解析により検定した量を示す。
【図１２】ＩＬ−８と相関するＧＲＯ／ＣＩＮＣ−１ＥＬＩＳＡ（増殖調節遺伝子産物／サイトカイン誘導好中球誘引物質）のレベル及びＡＡＴで処理したラットの気管支肺胞洗浄液サンプルの炎症のモデルを示す。
【図１３】３０ｍｇ／ｋｇに暴露したラットのＢＡＬの解析を示す。
【図１４】３ｍｇ／ｋｇに暴露したラットのＢＡＬの解析を示す。
【図１５】３０ｍｇ／ｋｇラット肺試験の薬物動態を示す。
【図１６】３ｍｇ／ｋｇラット肺試験の薬物動態を示す。
【図１７】抗エラスターゼ活性、時間を示す。
【図１８】本明細書に記載の方法に従う実験の結果及び設計を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
一態様において、本開示は、組換えにより生成されたα１−抗トリプシン（ＡＡＴ）を含む組成物と、これを必要とする被検体に、組換え生成ＡＡＴを投与することを含む方法を提供する。
【００１５】
α１−抗トリプシンは、分子量が５３，０００の糖タンパク質であり、分子量は、沈降平衡遠心分離により決定される。糖タンパク質は、複数のオリゴ糖単位（糖モチーフ）が共有結合した一本鎖ポリペプチドから構成される。ヒトα１−プロテイナーゼ阻害剤は、内因性セリンプロテイナーゼによる組織破壊を制御する上で役割を果たす。ＡＡＴは、結合後に、酵素、主にエラスターゼと共に安定した４面体中間体を形成することによって作用する自殺阻害剤である。切断反応の完了は、Ｃ末端ペプチド（脱離基）と活性部位セリンの両方の加水分解に応じて変動する。ほとんどの場合、第１加水分解が起こると、酵素はβシートを通って移送され、「粉砕」されて、活性部位を破壊し、酵素を不活性にして、第２加水分解を完了することができなくなるが、これによって、酵素はＡＡＴに繋ぎ止められる。第２加水分解が起これば、ＡＡＴは、酵素から解放されるが、その３６アミノ酸ペプチドが欠けている。α１−プロテイナーゼ阻害剤は、ヒト膵エラスターゼ及び白血球エラスターゼを阻害する。例えば、以下の文献を参照されたい：Ｐａｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３，５３３９（１９７４）；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ，７２  ３３（１９７６）；Ｄｅｌ  Ｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，８８，３４６（１９７９）；及びＨｅｉｍｂｕｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｒｅｓ．Ｃｏｎｆ．Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  １ｓｔ，１−２１（１９７０）。
【００１６】
結晶中のトリプシン阻害能力の９０％を占めるα１−プロテイナーゼ阻害剤の遺伝性欠損症は、肺気腫の早期発症に関連していることが判明している。気腫に関連するエラスチンの分解は、恐らく、エラスチン分解酵素と、天然に存在する組織及び血漿プロテイナーゼ阻害剤との局部的不均衡によって起こる。現在、ＡＡＴが欠損する被検体は、血液ドナーの血漿から調製したα１−抗トリプシン（血漿由来のＡＡＴ）の濃縮製剤による治療を受けている。
【００１７】
一態様において、本開示は、組換えにより生成されたＡＡＴを含む組成物、これを必要とする患者に投与する方法を提供する。一態様において、本開示は、肺におけるエラスターゼ活性を低減する方法を提供し、この方法は、組換えにより生成されたＡＡＴ組成物を、肺のエラスターゼ活性を低減するのに十分な量で被検体に投与することを含む。
【００１８】
思いがけないことに、本発明において、組換えにより生成されたＡＡＴ（ｒｈＡＡＴ）、例えば、トランスジェニック動物において生成されるＡＡＴは、投与すると、同等用量の血漿由来ＡＡＴに比べ、高いレベルで肺に封鎖されることが判明した。本明細書に示すように、ラットに血漿由来のＡＡＴ、ｒｈＡＡＴ又はシアル化ｒｈＡＡＴを投与すると、これらにラットにおいて、ｒｈＡＡＴ及びシアル化ｒｈＡＡＴが、血漿由来のＡＡＴより高いレベルで、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液中に見出された。この肺への封鎖は、ｒｈＡＡＴ及びシアル化ｒｈＡＡＴの血中濃度は低かったために、一層意外なことであった。例えば、本明細書に示すように、投与から２時間後、組換えにより生成されたＡＡＴは、血漿由来ＡＡＴの濃度の約３倍高い濃度で、ＢＡＬ中に存在する。これは、同時に組換えにより生成されたＡＡＴの血中濃度が、血漿由来ＡＡＴの濃度の約６倍低いことを考慮に入れれば、さらに顕著である。血漿由来のＡＡＴと比較して、組換えにより生成されたＡＡＴの血液中のクリアランス速度が高いために、組換えにより生成されたＡＡＴの血中濃度は低いと考えられる。肺における封鎖の効果は、シアル化組換えＡＡＴを血漿由来のＡＡＴと比較すれば、一層はっきりとしている。シアル化ＡＡＴは、非シアル化ＡＡＴよりクリアランス速度が低いため、より高いレベルの組換えＡＡＴをこの器官系に維持することができる。
【００１９】
また、本明細書には、ＢＡＬから回収した組換えＡＡＴがエラスターゼと結合することができ、従って、肺疾患の治療に依然として有効であることも明らかにする。さらに、肺に封鎖された組換えＡＡＴは、対照実験で認められたものと比較して、それ以上の炎症を引き起こさない。従って、組換えにより生成されるＡＡＴは、肺疾患及び／又は炎症性疾患の治療に好適となるような予想外の特性を有する。
【００２０】
被検体に投与すべきＡＡＴが、一般に、種に適したものでなければならないことは理解すべきである。言い換えれば、ＡＡＴをヒトに投与する場合、ＡＡＴは、恐らくヒトＡＡＴであろう。しかし、異なる種由来のＡＡＴが、その生物学的役割（例えば、ヒトエラスターゼとの結合）を果たし、かつ不適切な免疫反応を引き起こさない限りにおいて、他の種由来のＡＡＴを投与してもよい（例えば、ブタＡＡＴをヒトに）。
【００２１】
一態様では、本開示は、組換えにより生成されたＡＡＴの組成物を提供し、ここで、組換えにより生成されたＡＡＴは、血漿由来のＡＡＴと比較して、増大したデオキシヘキソースグリコシル化を有する。一態様では、本開示は、本開示は、組換えにより生成されたＡＡＴの組成物を提供し、ここで、組換え生成ＡＡＴは、ＡＡＴ−糖モチーフでのシアル化を増大するように修飾されている。
【００２２】
組換えにより生成されたＡＡＴは、血漿由来のＡＡＴと同じアミノ酸配列を有する。しかし、組換え生成ＡＡＴは、実験の項で示すように、（ヒト）血漿由来のＡＡＴとは異なるグリコシル化パターンを有する。ある実施形態では、組換えＡＡＴは、非ヒト乳腺上皮細胞で生成される。非ヒト乳腺上皮細胞で生成される組換えＡＡＴは、中でも、これら乳腺上皮細胞中に存在するグリコシル化酵素の優勢及び相互作用により決定されるグリコシル化パターンを有する。
【００２３】
特定の機序に限定するわけではないが、肺に存在する糖受容体（ＡＡＴ糖タンパク質及び／又はＡＡＴ糖タンパク質の糖モチーフ）に対して、血漿由来のＡＡＴより高い親和性を有するために、組換えにより生成されるＡＡＴは、肺に封鎖されると想定される。やはり、特定の機序に限定するわけではないが、組換えＡＡＴ上に存在する少量の露出したＮ−アセチルグルコサミンは、肺に存在するマンノース受容体と結合することができ、これが肺における組換えＡＡＴの蓄積の原因であると考えられる。これ以外に、又はこれに加えて、血漿由来のＡＡＴに比して、組換え生成ＡＡＴの糖モチーフ中に多量に存在するデオキシヘキソースが、肺への封鎖の原因であるとも考えられる。
【００２４】
一態様において、本開示は、ＡＡＴを含む組成物を提供し、ここで、ＡＡＴは、高レベルのデオキシヘキソースグリコシル化を有する。一態様では、本開示は、ＡＡＴ−糖モチーフ上に高レベルのシアル化を有するＡＡＴを含む組成物を提供する。一態様において、本開示は、ＡＡＴを含む組成物を提供し、ここで、ＡＡＴは、高レベルのデオキシヘキソースグリコシル化と、ＡＡＴ−糖モチーフ上に高レベルのシアル化を有する。
【００２５】
さらに、組換え生成ＡＡＴのグリコシル化パターンと同じグリコシル化パターンを有するＡＡＴを本明細書に記載する方法に用いてもよいことは理解すべきである。従って、ある実施形態において、本開示は、組換えにより生成されていないが、組換えにより生成されるＡＡＴのグリコシル化パターンと同じグリコシル化パターンを有するＡＡＴの組成物及びその投与方法を提供する。従って、ある実施形態では、露出したＮ−アセチルグルコサミンを含むＡＡＴの組成物及びその投与方法を提供する。ある実施形態では、本開示は、高レベルのデオキシヘキソースグリコシル化を含むＡＡＴの組成物及びその投与方法を提供する。ある実施形態では、本明細書で用いる高レベルのデオキシヘキソースグリコシル化は、血漿由来のＡＡＴに認められるデオキシヘキソースグリコシル化レベルの１．１倍以上、１．２倍以上、１．３倍以上、１．５倍以上、２倍以上、５倍以上、１０倍以上、５０倍以上、又は１００倍以上のデオキシヘキソースグリコシル化レベルを指す。ある実施形態では、本明細書で用いる高レベルのデオキシヘキソースグリコシル化は、糖モチーフの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％から１００％までが、デオキシヘキソース部分を含むＡＡＴの集団を指す。ある実施形態では、本開示は、ＡＡＴ糖モチーフに高レベルのシアル化を含むＡＡＴの組成物及びその投与方法を提供する。ある実施形態では、本明細書で用いる、ＡＡＴ糖モチーフでの高レベルのシアル化は、ＡＡＴの集団中の糖モチーフの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％〜１００％までがシアル化されているＡＡＴの集団を指す。
【００２６】
ＡＡＴなどの糖タンパク質のグリコシル化モチーフを修飾する方法は、当分野では公知である。例えば、血漿由来又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が産生するＡＡＴを１つ以上のグリコシル化酵素による酵素処理に付すことにより、Ｎ−アセチルグルコサミン及び／又はデオキシヘキソースを増加することもできる。例えば、ＡＡＴをノイラミニダーゼ、次にβガラクトシダーゼで処理すると、露出したＮ−アセチルグルコサミンの量を増加し得る。
【００２７】
ＡＡＴ生成のための非ヒト乳腺上皮細胞
一態様において、本開示は、ＡＡＴを生成する乳腺上皮細胞を提供する。一態様では、本開示は、ＡＡＴを産生するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。一態様において、本開示は、ＡＡＴを生成する哺乳動物乳腺上皮細胞を提供する。本明細書では、哺乳動物乳腺上皮細胞においてグリコシル化ＡＡＴを生成する方法が提供される。これは、哺乳動物上皮細胞を培養する（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで）ことにより、細胞培養物において達成することができる。これは、トランスジェニック動物（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でも達成することができる。
【００２８】
ある実施形態において、哺乳動物乳腺上皮細胞は、トランスジェニック動物のものである。ある実施形態では、哺乳動物乳腺上皮細胞は、マウス又はヤギなどのトランスジェニック動物の乳汁中にＡＡＴを発現するように改変されている。これを達成するために、組換えタンパク質をコードする遺伝子の発現は、例えば、ヤギβカゼイン調節エレメントの制御下で行うことができる。マウス及びヤギ乳汁の両方での組換えタンパク質の発現は、すでに確立されている（例えば、米国特許出願公開第２００８０１１８５０１Ａ１号明細書を参照）。ある実施形態では、発現は、乳汁タンパク質を産生する個別の乳管上皮細胞のために最適化される。
【００２９】
組換えＡＡＴを産生することができるトランスジェニック動物は、当分野では公知の方法に従い作製することができ（例えば、米国特許第５９４５５７７号明細書及び米国特許出願公開第２００８０１１８５０１Ａ１号明細書を参照）、このような方法は本明細書に組み込まれる。トランスジェニック発現に適した動物として、限定するものではないが、ヤギ、ヒツジ、バイソン、ラクダ、ウシ、ブタ、ウサギ、スイギュウ、ウマ、ラット、マウス又はラマがある。好適な動物には、それぞれ、ウシ、ヤギ、ヒツジ及びブタ（又はブタ）の様々な種に近縁のウシ、ヤギ、ヒツジ及びブタも含まれる。また、好適な動物には、有蹄動物も含まれる。本明細書で用いる「有蹄動物」は、限定するものではないが、ヒツジ、ブタ、ヤギ、畜牛及びウマなど、有蹄の、典型的に草食性四足哺乳動物のものか、又はそれに近縁のものである。好適な動物には、ヤギ及び畜牛などの酪農動物、又はマウスも含まれる。ある実施形態では、トランスジェニック発現に好適な動物は、ヤギである。
【００３０】
一実施形態において、トランスジェニック動物は、目的の構築物を含む一次細胞を作製した後、除核した卵母細胞に一次細胞核を核移植することにより作製する。目的の構築物を含む一次細胞は、目的のタンパク質、例えば、ＡＡＴのコード配列を含む単一構築物を一次細胞に注射するか、又は構築物で一次細胞をトランスフェクトすることにより生成する。次に、これらの細胞を増殖させ、特性決定することにより、トランスジーンコピー数、トランスジーン構造統合性及び染色体組込み部位を評価する。その後に、所望のトランスジーンコピー数、トランスジーン構造統合性及び染色体組込み部位を有する細胞を、トランスジェニック動物への核移植のために用いる。本明細書で用いる「核移植」は、ドナー細胞からの核を、除核した卵母細胞に移植する、クローン化の方法を指す。
【００３１】
哺乳動物乳腺上皮細胞に発現させようとするＡＡＴのコード配列は、選択した動物（ヒト、畜牛若しくはマウスなど）由来の遺伝物質若しくは逆翻訳メッセンジャーＲＮＡのライブラリーをスクリーニングすることにより、ＮＣＢＩ、Ｇｅｎｂａｎｋなどの配列データベースから、又は当分野では公知の方法、例えば、ペプチドマッピングを用いて配列を得ることにより、取得することができる。配列は、適切なプラスミドベクターにクローン化した後、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの好適な宿主生物において増幅させることができる。本明細書で用いる「ベクター」は、異なる遺伝環境間の輸送、又は宿主細胞における発現のための制限及び連結によって所望の配列を挿入することができるいくつかの核酸のいずれであってもよい。ベクターは、典型的にＤＮＡから構成されるが、ＲＮＡベクターも利用可能である。ベクターとしては、限定するものではないが、プラスミド及びファージミドがある。クローン化ベクターは、宿主細胞において複製することができ、さらに、１つ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位を特徴とするベクターであり、この制限部位で、ベクターを限定可能に切断することができ、そこに所望のＤＮＡ配列を連結させることによって、新しい組換えベクターが、宿主細胞において複製するその能力を維持できるようにすることができる。発現ベクターは、調節配列に作動可能に結合するように、所望のＤＮＡ配列を制限及び連結によりそれに挿入することができ、また、ＲＮＡ転写物として発現させることができるベクターである。ベクターはさらに、このベクターで形質転換若しくはトランスフェクトされた、又はされていない細胞の同定に用いるのに好適な１つ以上のマーカー配列を含んでいてもよい。マーカーは、例えば、抗生物質又は他の化合物に対する耐性若しくは感受性のいずれかを増大又は低減するタンパク質をコードする遺伝子、当分野では公知の標準的アッセイにより活性が検出可能な酵素（例えば、βガラクトシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）をコードする遺伝子、形質転換若しくはトランスフェクトされた細胞、宿主、コロニー又はプラークの表現型に明らかに影響を与える遺伝子を含む。ベクターの増幅後、ＤＮＡ構築物をベクターの残り部分から切除し、精製した後、発現ベクターに導入することができ、これを用いて、トランスジェニック動物を作製することができる。トランスジェニック動物は、そのゲノムに組み込まれた所望のトランスジェニックタンパク質を有する。
【００３２】
トランスジェニック動物の乳汁への生成を指令するのに好適なＤＮＡ配列は、天然由来の乳汁タンパク質から得られる５’−プロモータ領域を保有することもできる。従って、このプロモータは、ホルモン及び組織特異的因子の制御下にあり、泌乳乳房組織において最も活性である。ある実施形態において、用いるプロモータは、乳汁特異的プロモータである。本明細書で用いる「乳汁特異的プロモータ」は、タンパク質を乳汁に分泌する細胞（例えば、乳腺上皮細胞）において遺伝子の発現を天然に指令するプロモータであり、例えば、以下のものが挙げられる：カゼインプロモータ、例えば、α−カゼインプロモータ（例えば、αＳ−１カゼインプロモータ及びαＳ２−カゼインプロモータ）、β−カゼインプロモータ（例えば、ヤギβカゼイン遺伝子プロモータ（ＤｉＴｕｌｌｉｏ，ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  １０：７４−７７、１９９２）、γ−カゼインプロモータ、κ−カゼインプロモータ、乳清酸性タンパク質（ＷＡＰ）プロモータ（Ｇｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  ５：１１８３−１１８７、１９８７）、β−ラクトグロブリンプロモータ（Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  ７：４８７−４９２、１９８９）及びα−ラクトアルブミンプロモータ（Ｓｏｕｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  ＬＥＴＴＳ．２９７：１３，１９９２）。また、この定義には、乳房組織において特異的に活性化されるプロモータ、例えば、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）の長末端反復（ＬＴＲ）プロモータも含まれる。ある実施形態では、プロモータは、ヤギβカゼインプロモータである。
【００３３】
プロモータは、タンパク質リーダー配列の生成を指令するＤＮＡ配列に作動可能に連結することができ、このタンパク質リーダー配列が、乳腺上皮細胞を介して乳汁へのトランスジェニックタンパク質の分泌を指令する。本明細書で用いるように、コード配列と調節配列（例えば、プロモータ）は、コード配列の発現又は転写を調節配列の影響若しくは制御下に置くように、これらが配置される場合、「作動可能に結合」又は「作動可能に連結」しているという。本明細書で用いる「リーダー配列」又は「シグナル配列」は、タンパク質分泌シグナルをコードする核酸配列であり、トランスジェニックタンパク質をコードする下流の核酸分子に作動可能に連結されると、分泌を指令する配列である。リーダー配列は、天然のヒトリーダー配列、人為的に得られたリーダー配列であってよいし、あるいは、トランスジェニックコード配列の転写を指令するのに用いられるプロモータと同じ遺伝子、又は通常、哺乳動物乳腺上皮細胞などの細胞から分泌される別のタンパク質から得られるものであってもよい。ある実施形態では、ｍＲＮＡの安定性を改善するために、天然に分泌される乳汁タンパク質から得ることができる３’−配列を付加することができる。
【００３４】
ある実施形態では、核移植によりトランスジェニックヤギを作製するのに使用するための構築物（例えば、ＡＡＴをコードする）を含む一次細胞株を生産するために、構築物を一次ヤギ皮膚上皮細胞に移植して、これを増殖させた後、十分に特性決定することにより、トランスジーンコピー数、トランスジーン構造統合性及び染色体組込み部位を評価する。本明細書で用いる「核移植」は、ドナー細胞からの核を、除核した卵母細胞に移植する、クローン化の方法を指す。
【００３５】
クローン化により、各々が、ＡＡＴ又は他の目的の遺伝子構築物を産生することができる多様なトランスジェニック動物が得られる。作製方法は、クローン化動物及びそれら動物の子孫の使用を含む。クローン化はまた、胎児の核移植、核移植、組織及び器官移植、並びにキメラ子孫の作出も含む。クローン化方法の１ステップは、目的のトランスジーンを含む細胞、例えば、一次細胞のゲノムを、除核した卵母細胞に移植することを含む。本明細書で用いる「トランスジーン」は、細胞又はその先祖に人工的に挿入されて、その細胞から発生する動物のゲノムの一部となる核酸分子のあらゆる構成要素を指す。このようなトランスジーンは、トランスジェニック動物に対して部分的又は完全に外因性（すなわち、外来性）である遺伝子を含んでもよいし、あるいは、動物の内因性遺伝子に対して同一性を有する遺伝子であってもよい。卵母細胞の好適な哺乳動物供給源として、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ウサギ、モルモット、マウス、ハムスター、ラット、非ヒト霊長類がある。好ましくは、卵母細胞は、有蹄動物、最も好ましくは、ヤギ又は畜牛から取得される。卵母細胞の単離は、当分野では公知である。主として、この方法は、哺乳動物、例えば、ヤギの卵巣又は生殖器系から卵母細胞を単離することを含む。容易に入手可能な有蹄動物卵母細胞の供給源は、ホルモンにより誘導される雌性動物からのものである。遺伝子改変、核移植及びクローン化などの技術の使用を成功させるために、好ましくは卵母細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで成熟させた後、これらの細胞を核移植の受容細胞として用いてよく、その後に、精細胞により受精させて、胚に発育させた。ｉｎ  ｖｉｖｏで成熟させた中期ＩＩ期卵母細胞を核移植技術に用いることに成功している。主として、発情期の開始から、又はヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）若しくは類似ホルモンの注射から数時間後に、非過排卵又は過排卵動物のいずれかから手術により、成熟中期ＩＩ卵母細胞を収集する。
【００３６】
従って、一態様において、本開示は、本明細書に開示するＡＡＴを生成する哺乳動物乳腺上皮細胞を提供する。ある実施形態では、上記の哺乳動物乳腺上皮細胞は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物のものである。ある実施形態では、トランスジェニック非ヒト哺乳動物はヤギである。
【００３７】
トランスジェニック動物
一態様において、本開示は、遺伝子改変又はトランスジェニック哺乳動物を作製する方法も提供し、この方法によって、所望の遺伝子を移植前胚の前核に挿入する。遺伝物質がゲノムに組み込まれると、これにより得られる動物は、そのゲノムに上記遺伝子を保有している。この場合、トランスジーンは、泌乳雌性の乳汁への組換えＡＡＴの発現のための遺伝情報を提供する。
【００３８】
一態様において、本開示は、遺伝子改変又はトランスジェニック哺乳動物をクローン化する方法も提供し、この方法により、哺乳動物分化細胞又は細胞核に、所望の遺伝子を挿入、除去又は改変した後、これらの哺乳動物分化細胞又は細胞核を、除核した卵母細胞に挿入する。
【００３９】
一態様において、本開示は、本明細書に記載する方法に従い得られる哺乳動物、及びこれら哺乳動物の子孫も提供する。ある実施形態では、本開示は、ヤギ又はウシを作製するのに用いられるが、本方法は、あらゆる非ヒト哺乳動物種に用いることができる。本開示はさらに、細胞、組織及び器官移植における、核移植胎児並びに核移植及びキメラ子孫の使用も提供する。
【００４０】
胚及び卵母細胞に好適な哺乳動物供給源としては、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ウサギ、モルモット、マウス、ハムスター、ラット、霊長類などが挙げられる。好ましくは、ある実施形態において、卵母細胞は、有蹄動物、最も好ましくは、ある実施形態において、ヤギ又は畜牛から取得される。卵母細胞の単離方法は、当分野では公知である。主として、哺乳動物、例えば、ヤギの卵巣又は生殖器系から卵母細胞を単離する。容易に入手可能な有蹄動物卵母細胞の供給源は、ホルモンにより誘導される雌性動物からのものである。
【００４１】
遺伝子改変、核移植及びクローン化などの技術の使用を成功させるために、卵母細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで成熟させた後、これらの細胞を核移植の受容細胞として用いてよく、その後に、これらを精細胞により受精させて、胚に発育させる。ｉｎ  ｖｉｖｏで成熟させた中期ＩＩ期卵母細胞を核移植技術に用いることに成功している。主として、発情期の開始から、又はヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）若しくは類似ホルモンの注射から数時間後に、非過排卵又は過排卵動物のいずれかから、手術により成熟中期ＩＩ卵母細胞を収集する。
【００４２】
さらに、トランスジェニック技術により動物ゲノムを改変する能力は、グリカンプロフィールに関して、ヒトの治療薬としての使用に最適化された組換えタンパク質を製造する新規の代替法を提供する。トランスジェニック酪農動物の乳汁にヒト組換え薬剤を生成することにより、微生物バイオリアクターに関連する問題（例えば、翻訳後修飾の欠如、不適切なタンパク質フォールディング、高い精製コスト）又は動物細胞バイオリアクターに関連する問題（例えば、高い資本コスト、高価な培地、低い収率）が解決される。本発明は、所望の遺伝子について形質転換したトランスジェニック動物の乳汁又はその他の体液（例えば、尿又は血液）において、生物製剤、トランスジェニックタンパク質、血漿タンパク質、及びその他の目的の分子のトランスジェニック生産の使用を可能にし、ここで、上記遺伝子は、これら分子のグリコシル化プロフィールを最適化する。
【００４３】
トランスジェニック動物の乳汁への生産を指令するのに好適なＤＮＡ配列は、天然由来の乳汁タンパク質から得られる５’−プロモータ領域を保有し、そのため、ホルモン及び組織特異的因子の制御下にある。従って、このようなプロモータは、泌乳乳房組織において最も活性である。本発明によれば、このようにプロモータを使用した後、ＤＮＡ配列がタンパク質リーダー配列の生成を指令し、このタンパク質リーダー配列が、乳腺上皮細胞を介した乳汁へのトランスジェニックタンパク質の分泌を指令する。ｍＲＮＡの安定性を改善するために、トランスジェニックタンパク質構築物の他方の末端に、好適な３’−配列（好ましくはやはり天然に分泌される乳汁タンパク質から得られる）を付加してもよい。トランスジェニック動物の乳汁での生成に好適な制御配列の例として、ヤギβカゼインプロモータ由来のものがある。
【００４４】
トランスジェニック動物の作製は、マイクロインジェクション及び核移植技術などの多様な方法を用いて実施することができる。
【００４５】
ＡＡＴの生成方法
一態様において、本開示は、ＡＡＴの生成方法を提供する。一態様では、本開示は、非ヒト哺乳動物の乳腺上皮細胞においてＡＡＴを発現することを含む、ＡＡＴの生成方法を提供する。ある実施形態において、乳腺上皮細胞は培養細胞であり、これを、ＡＡＴをコードする配列を含む核酸でトランスフェクトする。ある実施形態では、乳腺上皮細胞は、その乳腺にＡＡＴをコードする配列を含む核酸を発現するように改変された非ヒト哺乳動物におけるものである。ある実施形態では、乳腺上皮細胞は、ヤギ、ヒツジ、バイソン、ラクダ、ウシ、ブタ、ウサギ、スイギュウ、ウマ、ラット、マウス又はラマの乳腺上皮細胞である。ある実施形態では、乳腺上皮細胞は、ヤギの乳腺上皮細胞である。
【００４６】
一態様では、本開示は、本明細書に開示するようなＡＡＴを発現する乳腺上皮細胞を提供する。
【００４７】
一態様では、本開示は、本明細書に開示するようなＡＡＴを発現する乳腺上皮細胞を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。
【００４８】
別の態様において、本開示は、トランスジェニックＡＡＴの生成方法を提供し、この方法は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳汁に核酸構築物によりコードされるＡＡＴを発現させることを含む。ある実施形態では、ＡＡＴを生成する方法は、以下：
（ａ）ＡＡＴをコードするトランスジェニックＤＮＡ構築物で、非ヒト哺乳動物細胞をトランスフェクトするステップ；
（ｂ）前記ＡＡＴトランスジェニックＤＮＡ構築物を細胞のゲノムに挿入する細胞を選択するステップ；
（ｃ）第一核移植手順を実施することにより、ＡＡＴについてヘテロ接合型であり、かつその乳汁に発現することができる非ヒトトランスジェニック哺乳動物を作製するステップ；
を含む。
【００４９】
別の態様では、本開示は、以下：
（ａ）ＡＡＴを発現するように改変した非ヒトトランスジェニック哺乳動物を用意するステップ；
（ｂ）非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳汁にＡＡＴを発現させるステップ；
（ｃ）乳汁中のＡＡＴを単離するステップ；
からなる方法を提供する。
【００５０】
乳腺に発現した組換えタンパク質の量及び質を予測するのに用いることができるツールの１つは、泌乳の誘導によるものである（Ｅｂｅｒｔ  ＫＭ，１９９４）。誘導された泌乳は、妊娠によって起こる最初の自然泌乳（少なくとも１年後に起こる）からではなく、トランスジェニック生産の早期段階からタンパク質の発現及び解析を可能にする。泌乳の誘導は、ホルモン又は成熟のいずれかにより達成することができる。
【００５１】
ある実施形態では、本明細書に記載するＡＡＴの組成物は、さらに乳汁を含む。ある実施形態では、本明細書に記載する方法は、トランスジェニック動物の乳汁からＡＡＴを単離するステップを含む。トランスジェニック動物の乳汁からタンパク質を単離する方法は、当分野では公知であり、例えば、Ｐｏｌｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２３１，Ｉｓｓｕｅｓ  １−２，１０  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １９９９，Ｐａｇｅｓ  １４７−１５７に記載されている。ある実施形態では、本明細書に記載の方法は、発現されたＡＡＴを精製するステップを含む。
【００５２】
一態様において、本開示は、核酸構築物により、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳汁にＡＡＴを発現させることを含む、ＡＡＴの生成方法を提供する。一実施形態では、哺乳動物乳腺上皮細胞は、乳汁にＡＡＴを発現するように改変された非ヒト哺乳動物のものである。ある実施形態では、哺乳動物乳腺上皮細胞は、培養哺乳動物乳腺上皮細胞である。
【００５３】
別の実施形態において、本方法は、以下：
（ａ）ＡＡＴを発現するように改変した非ヒトトランスジェニック哺乳動物を用意するステップ；
（ｂ）非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳汁にＡＡＴを発現させるステップ；
（ｃ）乳汁に発現したＡＡＴを単離するステップ；
を含む。
【００５４】
また別の実施形態では、本方法は、ＡＡＴが高レベルのデオキシヘキソースを有するように、乳腺上皮細胞にＡＡＴを生成することを含む。ある実施形態では、本方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される。他の実施形態では、この方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば、トランスジェニックヤギの乳腺上皮細胞において実施される。
【００５５】
ある実施形態では、前述の方法は、泌乳を誘導するステップをさらに含む。ある実施形態では、本方法は、追加の単離及び／又は精製ステップをさらに含む。ある実施形態では、本方法は、組換えにより生成したＡＡＴのグリコシル化パターンを血漿由来のＡＡＴと比較するステップをさらに含む。別の実施形態では、本方法は、組換えにより生成したＡＡＴのグリコシル化パターンを血漿由来のＡＡＴと比較するステップをさらに含む。
【００５６】
ある実施形態では、本方法はさらに、ＡＡＴの糖ペプチドをシアル化するステップを含む。
【００５７】
ある実施形態では、本方法はさらに、組換えにより生成したＡＡＴの集団に存在するデオキシヘキソースグリコシル化のパーセンテージを血漿由来のＡＡＴの集団におけるデオキシヘキソースグリコシル化のパーセンテージと比較するステップを含む。ＡＡＴのグリコシル化パターンを評価する実験方法は、当分野では公知のもの、又は、以下の実施例にあるような本明細書に記載するもののいずれであってもよい。このような方法として、例えば、液体クロマトグラフィー質量分析、タンデム質量分析、及びウェスタンブロット分析が挙げられる。
【００５８】
組換えにより生成したＡＡＴは、ある実施形態において、本明細書に記載のように作製したトランスジェニック動物の乳汁から、又は前記トランスジェニック動物の子孫からＡＡＴを収集することにより、得ることができる。ある実施形態において、トランスジェニック動物により生成したＡＡＴは、生成される乳汁１リットル当たり少なくとも１グラムのレベルで生成される。ある実施形態では、ｒｈＡＡＴを発現するヤギをマイクロインジェクション法により作製する。
【００５９】
治療方法、医薬組成物、投薬量及び投与
一態様において、本開示は、ＡＡＴの組成物を、それが必要な被検体に投与する方法を提供する。ある実施形態では、ＡＡＴは、組換えにより生成される。ある実施形態では、ＡＡＴは、非ヒト乳腺上皮細胞において生成される。ある実施形態では、ＡＡＴは、高レベルのオキシヘキソースグリコシル化を有する。ある実施形態では、ＡＡＴは、ＡＡＴ−糖モチーフに高レベルのシアル化を有する。ある実施形態では、ＡＡＴは、高レベルのデオキシヘキソースグリコシル化と、ＡＡＴ−糖モチーフでの高レベルのシアル化を有する。
【００６０】
一態様において、本開示は、ＡＡＴの組成物を、それが必要な被検体に投与する方法を提供する。ある実施形態では、被検体は、α１−抗トリプシン欠損を有する。ある実施形態では、被検体は、炎症性疾患又は自己免疫疾患を有する。ある実施形態では、炎症性疾患は、気腫である。ある実施形態において、炎症性疾患又は自己免疫疾患としては、限定するものではないが、成人呼吸窮迫症候群、動脈硬化症、喘息、アテローム性動脈硬化症、胆嚢炎、硬変、クローン病、糖尿病、気腫、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜炎症、骨関節炎、骨粗鬆症、膵炎、リウマチ性関節炎、強皮症、大腸炎、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、糖尿病、炎症性腸疾患、セリアック病、自己免疫性甲状腺疾患、アディソン病、シェーグレン症候群、シデナム舞踏病、高安動脈炎、ウェゲナー肉芽腫、自己免疫性胃炎、自己免疫性肝炎、皮膚の自己免疫疾患、自己免疫性拡張型心筋症、多発性硬化症、心筋炎、重症筋無力症、悪性貧血、多発性筋痛、乾癬、急速進行性糸球体腎炎、リウマチ性関節炎、潰瘍性腸炎、脈管炎、筋肉の自己免疫疾患、精巣の自己免疫疾患、卵巣の自己免疫疾患及び目の自己免疫疾患、尋常性ざ瘡、喘息、自己免疫疾患、セリアック病、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、過敏症、炎症性腸疾患、骨盤炎症性疾患、潅流損傷、リウマチ性関節炎、サルコイドーシス、移植拒絶反応、脈管炎、及び間質性膀胱炎が挙げられる。
【００６１】
一態様において、本開示は、肺のエラスターゼ活性を低減する方法であって、肺のエラスターゼ活性を低減するのに十分な量でＡＡＴの組成物を被検体に投与する方法を提供する。
【００６２】
一態様において、本開示は、ＡＡＴと、薬学的に許容される媒体、希釈剤又は担体を含む医薬組成物を提供する。ある実施形態では、本明細書に記載する組成物は、乳汁を含む。
【００６３】
一態様において、本開示は、被検体を治療する方法を提供し、この方法は、被検体が罹患しているか、又は罹患する恐れがある疾患を治療するのに有効な量で提供される組成物を被検体に投与することを含む。別の実施形態では、被検体は、非ヒト動物、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ又は霊長類である。
【００６４】
本明細書に記載するＡＡＴの治療有効量を、治療が必要な被検体に投与することを含む実施形態によれば、「治療有効量」又は「治療するのに有効な量」は、病的状態を阻害又は逆転させる、並びにその症状を改善又は予防する（例えば、炎症を治療する）のに必要なＡＡＴ又は組成物の量を意味する。治療有効量の決定は、薬剤の毒性及び効力などの要因に応じて具体的に変動する。これらの要因は、力価、相対的生体利用可能性、患者の体重、有害な副作用の程度、及び優先される投与方法などの他の要因に応じて異なる。毒性は、当分野では公知の方法を用いて決定してよい。効力は、同じ指針を用いて決定してよい。効力は、例えば、炎症又はその症状の低減により測定することができる。従って、薬学的に有効な量は、臨床医によって、毒性学的に許容可能で、かつ効力があるとみなされる量である。
【００６５】
投薬量は、投与方法に応じて、局所又は全身での所望の薬剤（例えば、ＡＡＴ）レベルを達成するように適切に調節してよい。このような用量で被検体における応答が不十分である場合、患者の耐容性が許す限りにおいて、より高い用量（又は異なる、より局在化した送達経路により、有効なさらに高い用量）を使用してもよい。ＡＡＴの適切な全身レベルを達成するために、１日に複数回用量が考慮される。適切な全身レベルは、例えば、患者における薬剤のピーク又は持続的血漿レベルの測定により決定することができる。「用量」及び「投薬量」は、本明細書において交換可能に用いられる。
【００６６】
ある実施形態において、被検体に投与するＡＡＴ又は医薬組成物の量は、毎週５０〜５００ｍｇ／ｋｇ、１００〜４００ｍｇ／ｋｇ、又は２００〜３００ｍｇ／ｋｇである。一実施形態では、被検体に投与するＡＡＴ又は医薬組成物の量は、毎週２５０ｍｇ／ｋｇである。ある実施形態では、第１週に４００ｍｇ／ｋｇの初期用量を被検体に投与した後、後続の週には２５０ｍｇ／ｋｇを被検体に投与する。ある実施形態では、投与速度は、１０ｍｇ／分未満である。ある実施形態では、被検体へのＡＡＴ又は医薬組成物の投与は、別の治療薬による治療の少なくとも１時間前に行う。ある実施形態では、ＡＡＴの投与の前に、前治療薬を投与する。
【００６７】
ある実施形態において、ＡＡＴ又はその組成物は、３０ｍｇ／ｋｇ〜約６０ｍｇ／ｋｇの用量で投与する。
【００６８】
ある実施形態において、提供される組成物は、ｉｎ  ｖｉｖｏ適用のために使用する。ｉｎ  ｖｉｖｏでの意図する投与方法に応じて、用いる組成物は、例えば、錠剤、丸薬、粉末、カプセル、ジェル、軟膏、液体、懸濁液などの固体、半固体又は液体の投薬形態であってよい。好ましくは、組成物は、正確な投与量の単回投与に好適な単位剤形で投与する。組成物は、所望する製剤化に応じて、薬学的に許容される担体又は希釈剤を含んでもよく、これらは、動物又はヒトへの投与用に医薬組成物を製剤化するために一般に用いられる水性媒体として定義される。希釈剤は、目的のヒト又は組換えタンパク質の生物学的活性に影響を与えないように選択する。このような希釈剤の例としては、蒸留水、生理学的食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、ハンクス溶液がある。同じ希釈剤を用いて、凍結乾燥された目的の組換えタンパク質を再形成することもできる。さらに、医薬組成物は、他の薬剤、医薬品、担体、補助剤、非毒性、非治療的、非免疫原性安定剤なども含んでよい。このような希釈剤又は担体の有効量は、成分の溶解度、生物学的活性などに関して、薬学的に許容される製剤を得るのに有効な量である。ある実施形態では、本明細書に記載の組成物は、無菌である。
【００６９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ治療の場合の投与は、経口、非経口、筋内、鼻内、舌下、気管内、吸入、眼、膣、及び直腸など、任意の数の経路により実施してもよい。嚢内、静脈内、及び腹腔内投与経路も使用してよい。当業者であれば、投与経路が、治療しようとする疾患に応じて変わることを認識されよう。例えば、本明細書に記載するＡＡＴの組成物は、経口、非経口又は局所投与により被検体に投与してよい。一実施形態では、本明細書に記載の組成物又はＡＡＴは、静脈内注入により投与する。
【００７０】
全身送達が望ましい場合、組成物は、注射、例えば、ボーラス注射又は連続注入による非経口投与用に製剤化することができる。注射用製剤は、単位剤形、例えば、アンプル又は多用量容器に、添加される防腐剤と一緒に提供してもよい。組成物は、油性又は水性媒体中の懸濁液、溶液若しくは乳剤などの形態をしていてもよく、懸濁、安定及び／又は分散剤などの調合剤を含有してもよい。
【００７１】
非経口投与用の医薬製剤は、水溶性形態の活性組成物の水溶液を含む。さらに、活性組成物の懸濁液は、適切な油性注射液として調製してもよい。好適な親油性溶剤又は媒体としては、ゴマ油のような脂肪油、又はオレイン酸エチル若しくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、又はリポソームが挙げられる。水性注入懸濁液は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、又はデキストランなどの懸濁液の粘度を高める物質を含有してもよい。任意選択で、懸濁液はまた、高度濃縮溶液の調製を可能にするために、組成物の溶解度を高める好適な安定剤又は薬剤を含有してもよい。あるいは、活性組成物は、好適な媒体、例えば、使用前に、発熱原を含まない滅菌水で形成する粉末形態であってもよい。
【００７２】
経口投与の場合、医薬組成物は、例えば、結合剤（例えば、事前にゼラチン化したトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン若しくはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶セルロース若しくはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク若しくはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプン若しくはデンプングリコール酸ナトリウム）；又は湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容される賦形剤を用いて、常用の手段で調製した錠剤又はカプセルなどの形態をしていてもよい。錠剤は、当分野では公知の方法によりコーティングしてもよい。経口投与用の液体調製物は、例えば、溶液、シロップ若しくは懸濁液の形態をしていてもよいし、あるいは、使用前に水又は他の好適な媒体で形成するための乾燥製剤として提供してもよい。このような液体調製物は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体若しくは水素添加食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチン若しくはアラビアゴム）；非水性媒体（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール若しくは分別植物油）；及び防腐剤（例えば、メチル若しくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート又はソルビン酸）を用いて、常用の手段で調製することができる。調製物はさらに、必要に応じて、緩衝塩、香味料、着色料、及び甘味料を含んでもよい。ＡＡＴの経口送達が効果的であるように、１つ以上の成分を化学的に修飾してもよい。一般に、考慮される化学的修飾は、少なくとも１つの分子とＡＡＴの結合であり、ここで、前記分子は、（ａ）タンパク質分解の阻害；及び（ｂ）胃又は腸からの血流への取込みを可能にする。また、ＡＡＴの全体的安定性の増大及び身体での循環時間の増加も望ましい。このような分子の例として、ポリエチレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン及びポリプロリンが挙げられる。Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，１９８１，“Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｄｄｕｃｔｓ”  Ｉｎ：Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇｓ，Ｈｏｃｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ，ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ｐｐ．３６７−３８３；Ｎｅｗｍａｒｋ，ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４：１８５−１８９。用いることができる他のポリマーは、ポリ−１，３−ジオキソラン及びポリ−１，３，６−トリオキソカンである。前述したように、ポリエチレングリコール分子が製剤用途に好ましい。経口投与の場合、放出位置は、胃、小腸（十二指腸、空腸、若しくは回腸）、又は大腸であってよい。当業者であれば、胃で溶解せずに、物質を十二指腸、又は腸内の他所へ放出する製剤が入手可能である。好ましくは、放出は、ＡＡＴを保護するか、又は胃環境を越えて（例えば腸に）生物学的に活性の物質を放出するかのいずれかによって、胃環境の有害な作用を回避する。
【００７３】
口腔投与の場合、組成物は、従来の方法で製剤化された錠剤又はロゼンジの形態であってよい。
【００７４】
吸入による投与の場合、本開示に従い用いられる組成物は、加圧パックからのエアゾールスプレー又は噴霧器の形態で、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、又は他の好適な気体等の好適な噴霧剤を用いて、好都合に送達することができる。加圧エアゾールの場合、投薬単位は、計量された量を送達するための弁を備えることによって決定することができる。吸入器又は散布器に使用する、例えば、ゼラチン製のカプセル及びカートリッジは、組成物の混合物とラクトース又はデンプンなどの好適な粉末基材を含有させて製剤化してもよい。
【００７５】
本明細書では、肺への送達も考えられる。組成物を吸入中に哺乳動物の肺に送達し、肺上皮内層を通過して血流に送ることができる。治療製剤を肺に送達するために設計された多様な機械的装置が、本開示の実施に用いるために考慮され、例えば、限定するものではないが、噴霧器、計量吸入器、及び粉末吸入器が挙げられ、これらはすべて当業者には周知である。
【００７６】
本発明に開示する医薬組成物の経鼻送達も考慮される。経鼻送達により、薬剤が肺に沈着することを必要とせずに、治療製剤を鼻に投与した後、本開示の医薬組成物が直接血流へと通過することを可能にする。経鼻送達用の製剤としては、デキストラン又はシクロデキストランを含有するものがある。
【００７７】
組成物はまた、座薬又は保持浣腸、例えば、カカオバター、又は他のグリセリドなどの従来の座薬基材を含有する、直腸又は膣組成物に製剤化することもできる。
【００７８】
医薬組成物はまた、好適な固相若しくはゲル相担体又は賦形剤を含んでもよい。このような担体又は賦形剤の例として、限定するものではないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、各種糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、及びポリエチレングリコールなどのポリマーを含んでもよい。
【００７９】
好適な液体又は固体医薬剤形態としては、例えば、吸入のための水溶液又は食塩水、マイクロカプセル化、渦巻き型化（ｅｎｃｏｃｈｌｅａｔｅｄ）、微視的金粒子上への被覆、リポソーム中への含有、噴霧化、エアゾール、皮膚への移植のためのペレット、又は皮膚に擦過傷を付けるための鋭い物体上への乾燥形態などがある。医薬組成物はまた、顆粒、粉末、錠剤、被覆錠剤、（マイクロ）カプセル、座薬、シロップ、乳剤、懸濁液、クリーム、点滴剤、又は活性組成物を持続放出する製剤を含み、それらの製剤には、賦形剤及び添加剤並びに／又は崩壊剤、結合剤、被覆剤、膨張剤、潤滑剤、香味料、甘味料又は可溶化剤などの補助剤が、前述したように常用的に使用される。本発明の医薬組成物は、様々な薬剤送達システムにおける使用に適している。薬剤送達のための方法の簡単な概論については、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３，１９９０を参照されたい（尚、この文献は、参照として本明細書に組み込まれる）。ＡＡＴ及び任意選択による他の治療薬は、それ自体で（そのまま）又は薬学的に許容される塩の形態で投与してよい。薬剤に用いる場合、塩は、薬学的に許容されるものでなければならないが、薬学的に許容される塩ではない塩を用いて、薬学的に許容される塩を好適に調製することもできる。このような塩として、限定するものではないが、下記の酸から調製されるものが挙げられる：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サルチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸、及びベンゼンスルホン酸。また、このような塩は、カルボン酸基のナトリウム、カリウム若しくはカルシウム塩などのアルカリ金属又はアルカリ土類塩として調製することもできる。
【００８０】
好適な緩衝剤を以下に挙げる：酢酸及び塩（１〜２％ｗ／ｖ）；クエン酸及び塩（１〜３％ｗ／ｖ）；ホウ酸及び塩（０．５〜２．５％ｗ／ｖ）；並びにリン酸及び塩（０．８〜２％ｗ／ｖ）。好適な防腐剤としては、塩化ベンザルコニウム（０．００３〜０．０３％ｗ／ｖ）；クロロブタノール（０．３〜０．９％ｗ／ｖ）；パラベン（０．０１〜０．２５％ｗ／ｖ）及びチメロサール（０．００４〜０．０２％ｗ／ｖ）がある。
【００８１】
本開示の医薬組成物は、有効量のＡＡＴと、任意選択で、薬学的に許容される担体に含まれる他の治療薬を含む。薬学的に許容される担体という用語は、ヒト又は他の脊椎動物への投与に適した１種又は複数の適合性固体若しくは液体充填剤、希釈剤又はカプセル化物質を意味する。この用語は、天然又は合成の有機若しくは無機成分を意味し、これと活性成分を組み合わせて、適用を容易にする。医薬組成物の成分は、本開示の組成物と、所望の薬学的効果を実質的に損なうような相互作用が一切ないように、互いに混合することができる。
【００８２】
限定するものではないが、特にＡＡＴなどの治療薬は、粒子状で提供してもよい。本明細書において、粒子は、ナノ又はミクロ粒子（あるいは、場合によってはそれより大きい）を含み、これは、ＡＡＴ又はＡＡＴと一緒に投与される他の治療薬から全部又は一部が構成される。粒子は、治療薬の他に、薬学及び医学の分野で常用的に用いられる物質のいずれかを含んでもよく、限定するものではないが、例えば、腐食性、非腐食性、生分解性、若しくは非生分解性物質又はこれらの組合せが挙げられる。粒子は、溶液中に又は半固体状態でＡＡＴを含むマイクロカプセルであってもよい。粒子は、ほぼどんな形状であってもよい。
【００８３】
本明細書に別途定義しない限り、本開示と関連して用いられる科学及び専門用語は、当業者により一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文面で別途要請のない限り、単数形の用語は複数を含み、複数形の用語は、単数を含む。本開示の方法及び技術は、一般に、当分野では公知の従来の方法に従い実施される。一般に、関連して用いられる名称、並びに本明細書に記載する生化学、酵素学、分子及び細胞生物学、微生物学、遺伝子学並びにタンパク質及び核酸化学並びにハイブリダイゼーションの技術は、当分野において公知で、一般に使用されているものである。本開示の方法及び技術は、一般に、当分野において公知の従来の方法に従い、また、別途記載のない限り、本明細書全体を通して引用され、記述される様々な概略的及び具体的参照文献に記載されているように実施される。
【００８４】
以下の実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は、限定的なものとして解釈すべきではない。本出願全体を通して引用される参照文献（文献、交付済み特許、公開特許出願、及び同時係属出願を含む）は、特に、上に言及される教示について、参照として明示的に本明細書に組み込まれる。しかし、いずれの参照文献の引用も、その参照文献が先行技術であることの承認を意図するものではない。
【実施例】
【００８５】
ラットにおけるα１−抗トリプシン（ＡＡＴ）の薬物動態試験
血漿由来（ｐｄＡＡＴ）、組換え生成（ｒｈＡＡＴ）及びシアル化組換え生成ＡＡＴ（Ｎｅｏｓｅ）（ＡＡＴ）を赤外色素で標識した後、ラットに３及び３０ｍｇ／ｋｇで注射した。２時間にわたって採取したドット−ブロット及び赤外線走査解析により血中濃度を追跡した。その際、採取の時点で、動物を犠牲にし、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液を回収した。ＢＡＬサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動させ、ＡＡＴの濃度を赤外線解析により定量した後、やはりＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動させた出発材料の標準曲線と比較した。本明細書に示すデータから、組換えＡＡＴのレベルは、血漿由来のものと比較して血液中では低かったが、肺における濃度は同等であったことが明らかである（図４、５及び７を参照）。また、組換えＡＡＴ（「ｎｅｏｓｅ」）のシアル化は、ｒｈＡＡＴのＰＫプロフィールを大幅に改善した（図６を参照）。このシアル化は、生体利用可能性を改善するが、これは、タンパク質が肺に封鎖される能力を妨害しないと考えられる（例えば、図７を参照）。ｐｄＡＡＴ処理ラットのほぼ２倍のシアル化ｒｈＡＡＴがＢＡＬに認められた（図４、５及び７を参照）。ＢＡＬ  ＡＡＴの活性は、サンプルにヒト好中球エラスターゼを添加した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの複合（８２ｋＤ）及び切断（４７ｋＤ）型の両方におけるＡＡＴのＭＷのシフトを観察することにより評価した（図３を参照）。
【００８６】
また、組換えＡＡＴ又はシアル化組換えＡＡＴによる免疫系の活性化があったかどうかを決定するために、ヒトＩＬ−８の類似体であるラットＧＲＯ／ＣＩＮＣ−１についてのＥＬＩＳＡでもＢＡＬサンプルを泳動させた。希釈バッファー中にサンプルを１／１０希釈し、標準曲線と比較した。ＧＲＯ／ＣＩＮＣ−１アッセイを用いて、肺における炎症の程度を決定した（図２を参照）。すべてのサンプルについて、低レベルのＩＬ−８、従って、低レベルの炎症が観察された。
【００８７】
組換えＡＡＴ及びシアル化組換えＡＡＴを肺に封鎖する。２つのＡＡＴ用量、すなわち、３及び３０ｍｇ／ｋｇで、血漿由来、組換え及びシアル化組換えＡＡＴを用いて試験を実施した。非処理動物のＢＡＬ中のＡＡＴ活性を試験するために、２匹のラットをモック対照として含んだ。各群は２匹のラットを含んだ。注射はｉｖ尾静脈に行い、血液サンプルを０、５、３０、６０及び１２０分後に採取したが、その際、ラットを犠牲にし、５ｍｌのＰＢＳで肺を洗浄することにより、気管支肺胞洗浄液を回収した（図６及び７を参照）。
【００８８】
試験前に、組換えＡＡＴをＨＢＳに透析し、５ｍＭ  ＣＭＰ−Ｎａｎ中に５０ｍＵのシアルトランスフェラーゼ３（ＳＴ３ｇａｌ３）で１時間処理することにより、シアル化（Ｎｅｏｓｅ）組換えＡＡＴを作製した。末端ガラクトースのシアル化を、血漿由来ＡＡＴに非常に近い位置へのＩＥＦゲル上での酸性シフトにより評価した。すべてのサンプルを、８００ｎｍで吸収を有する赤外線色素のＩＲ８００ＤｙｅＣＷ．ａＮＨＳ誘導体で標識した。生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで、次に抗エラスターゼ活性アッセイにより評価した（図３を参照）。ＢＡＬ液中のＡＡＴが活性であるがどうかを決定するために、サンプルを１マイクログラムのヒト好中球エラスターゼ又はＡＡＴ活性バッファーと混合した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動させた。レーン１〜５は、ｒｈＡＡＴがｉｎ  ｖｉｔｒｏでエラスターゼと結合する能力を示し、レーン７〜１０は、ＢＡＬから回収後にエラスターゼと結合する能力を示す。
【００８９】
２マイクロリットルの血清を２００マイクロリットルのＰＢＳに希釈し、９６ウェルバキュームマニホールドを用いて、Ｐｒｏｔｒａｎ８３ニトロセルロースの一片にサンプルをロードすることにより、ラットサンプルを検定した。次に、フィルターを８００ｎｍのＯｄｙｓｓｅｙ赤外線スキャナで走査した。スキャンにグリッドを適用し、積分した。ＢＡＬサンプルもＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価した。モノマーとほぼ同じサイズ及びそれを超えるサイズのバンドの積分により、肺におけるＡＡＴの存在を定量した。より大きなバンドは、酵素との複合化を含む標識ＡＡＴの様々な形態である（図４及び５を参照）。
【００９０】
結果
薬物動態プロフィールから、ｐｄＡＡＴが最も遅いクリアランスを有し、組換えＡＡＴが最も早いクリアランスを有するのに対し、シアル化（Ｎｅｏｓｅ）は、ｒｈＡＡＴのクリアランス速度を大幅に低下させることが判明した（図６参照）。
【００９１】
３ｍｇ／ｋｇで、ラットは、そのＢＡＬ液サンプル中のＡＡＴの検出可能な量を有した。サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、全ての形態が肺に進入することができ、Ｎｅｏｓｅ処理ＡＡＴラットサンプルが、血漿由来のものより多量のＡＡＴを肺に有したことが証明された。ｒｈＡＡＴは、血液中では低レベルであっても、肺では検出可能であった（図６及び７を参照）。
【００９２】
３０ｍｇ／ｋｇの場合、ＢＡＬ中の組換えＡＡＴのレベルは、実際に、血漿由来のレベルの３倍高く、シアル化組換えＡＡＴは、ｐｄＡＡＴの濃度の１０倍超であった。
【００９３】
肺サンプル（すなわち、ＢＡＬ）に認められるＡＡＴが活性であるかどうかを決定するために、１マイクログラムのヒト好中球エラスターゼをラットサンプルと混合し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動させた。全てのモノマーが消失し、３つのバンド：やや小さい、やや大きい、及び約８０ｋＤ（ＡＡＴ：エラスターゼ複合体の予想サイズ）のうちの１つに移動した。また、出発材料をエラスターゼと混合した場合にも同じことが観察された。この実験の時間経過から、反応が１分までに完了し、３つのバンド各々の量は３６分にわたって変化しないことが判明した。
【００９４】
ラット肺サンプルの免疫学的状態をＧＲＯ／ＣＩＮＣ−１（ＩＬ−８のラット類似体）についての検定することにより調べた。やはり、約２倍の変動があったが、レベルは、７５〜１６０ｐｇ／ｍｌの範囲で低かった。
【００９５】
組換えＡＡＴ及び血漿ＡＡＴのグリコシル化パターンも評価した。主な違いは、血漿ＡＡＴのデオキシヘキソースのレベルが低いことである（結果を図８及び９に示す）。
【００９６】
本明細書に記載するｒｈＡＡＴを発現するトランスジェニック動物は、米国特許第７，０４５，６７６号明細書に記載の方法に従って作製したが、こうした方法は、参照として本明細書に組み込む。
【００９７】
同等物
上に記載した明細書は、当業者が本発明を実施することを可能にする上で十分であると考えられる。本発明は、実施例により範囲が限定されるわけではない。何故なら、これらの実施例は、本発明の特定の態様及び実施形態の例示として意図されるからである。他の機能的に同等な実施形態も本発明の範囲に含まれる。本明細書に示し、説明したもの以外に、本発明の様々な変更が、以上の説明から当業者には明らかになるであろう。そしてこれらの変更は、添付の特許請求の範囲に含まれる。本発明の利点及び目的が本発明の各実施形態に必ずしも含まれるわけではない。
【図１Ａ】
2015502370.tif 000003
【図１Ｂ】
2015502370.tif 000004
【図１Ｃ】
2015502370.tif 000005
【図７Ａ】
2015502370.tif 000006
【図７Ｂ】
2015502370.tif 000007
【図１８】
2015502370.tif 000008
【図２】
2015502370.tif 000009
【図３】
2015502370.tif 000010
【図４Ａ】
2015502370.tif 000011
【図４Ｂ】
2015502370.tif 000012
【図５】
2015502370.tif 000013
【図６】
2015502370.tif 000014
【図８】
2015502370.tif 000015
【図９】
2015502370.tif 000016
【図１０Ａ】
2015502370.tif 000017
【図１０Ｂ】
2015502370.tif 000018
【図１１】
2015502370.tif 000019
【図１２】
2015502370.tif 000020
【図１３】
2015502370.tif 000021
【図１４】
2015502370.tif 000022
【図１５】
2015502370.tif 000023
【図１６】
2015502370.tif 000024
【図１７】
2015502370.tif 000025
【国際調査報告】
2015502370.tif 000026
2015502370.tif 000027