(57)【要約】  本発明は、有効成分として治療上有効量のカロフィルム種に属する植物の抽出物、および所望により薬学的に許容可能な担体を含む、薬草組成物に関する。本発明は、さらにカロフィルム・イノフィルム植物から得られる抽出物を含む薬草組成物に関する。本発明は、さらに抽出物の調製方法に関する。本発明は、前記組成物を用いる代謝障害の処置のための方法に関する。本発明は、代謝障害の処置に使用するための、治療上有効量のカロフィルム種の植物由来の抽出物を、既知の治療上有効な活性剤と組み合わせて含む組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分として治療上有効量のカロフィルム種の植物由来の抽出物を、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体と共に含む、組成物。
【請求項２】
５〜１００％のカロフィルム種の植物由来の抽出物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
カロフィルム種の抽出物が、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体と共に、生理活性マーカーを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
有効成分として治療上有効量のカロフィルム・イノフィルム植物から得られた抽出物を、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体と共に含む、組成物。
【請求項５】
５〜１００％のカロフィルム・イノフィルム植物の抽出物を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
抽出物が、カロフィルム・イノフィルム植物の樹皮から得られる、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
カロフィルム・イノフィルムの抽出物が、生理活性マーカーを含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
代謝障害のための処置が必要な対象に経口投与される、請求項１または請求項４に記載の組成物。
【請求項９】
錠剤、カプセル剤または顆粒の形態にある経口投与のために処方される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
代謝障害の処置における使用のための、請求項１または請求項４に記載の組成物。
【請求項１１】
代謝障害が、インシュリン耐性、高血糖症、ＩＩ型糖尿病、肥満、耐糖能低下、高コレステロール血症、脂質異常症、高インスリン血症、アテローム性動脈硬化、多嚢胞性卵巣症候群、冠動脈疾患、メタボリック症候群、高血圧、または異常な血漿リポタンパク質、トリグリセリド類との関連障害もしくはグルコースレベルとの関連障害から選択される、請求項１０に記載の使用のための組成物。
【請求項１２】
代謝障害が、ＩＩ型糖尿病である、請求項１１に記載の使用のための組成物。
【請求項１３】
代謝障害が肥満である、請求項１１に記載の使用のための組成物。
【請求項１４】
請求項１または請求項４に記載の治療上有効量の組成物を対象に投与することを含む、対象における代謝障害を治療する方法。
【請求項１５】
請求項１または請求項４に記載の組成物が経口投与される、請求項１４に記載方法。
【請求項１６】
代謝障害が、インシュリン耐性、高血糖症、ＩＩ型糖尿病、肥満、耐糖能低下、高コレステロール血症、脂質異常症、高インスリン血症、アテローム性動脈硬化、多嚢胞性卵巣症候群、冠動脈疾患、メタボリック症候群、高血圧、または異常な血漿リポタンパク質、トリグリセリドとの関連障害もしくはグルコースレベルとの関連障害から選択される、請求項１４に記載方法。
【請求項１７】
代謝障害がＩＩ型糖尿病である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
代謝障害が肥満である、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、有効成分として、治療上有効量のカロフィルム（Calophyllum）種に属する植物の抽出物を、単独で、または薬学的に許容可能な担体と共に含む薬草組成物に関する。本発明の組成物は、代謝障害の処置に有用である。本発明は、該薬草組成物の製造方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
代謝障害とは、身体が炭水化物、脂質、タンパク質または核酸を適切に代謝することができない場合におこる障害または異常である。殆どの代謝障害は、細胞が代謝過程を行なうに必要な酵素を、欠失または機能不全へと至らしめる遺伝子の突然変異によって引き起こされる。代謝障害の例示は、肥満、過度の体脂肪、高脂血症、高リポタンパク質血症、高血糖症、高コレステロール血症、高インスリン血症、インシュリン耐性、耐糖能低下および糖尿病（特に、ＩＩ型糖尿病）を含む。
【０００３】
糖尿病は、個体においてインシュリンを産生する能力または使用する能力に影響を及ぼす代謝障害である。糖尿病に罹患した個体では、血中グルコースレベルは正常よりも高い。無制御な糖尿病は、失明、腎不全、非外傷性手足切断および早期の心血管死亡の主な原因である。糖尿病患者は、またさらに脂質異常症、肥満、高血圧および耐糖能低下のような危険因子により心疾患事象を発生させるリスクも高い。
【０００４】
ＩＩ型糖尿病患者は、血中グルコースレベルを規則的にモニタリングすること、そして血中グルコースレベルを正常または正常付近に維持するように処置を維持することが必要である。ＮＩＤＤＭの治療には、ライフスタイルの適応、自己測定および医薬が含まれ、これらにより糖尿病および糖尿病に関連した心血管合併症に関するリスクを最小限にすることができる。多くの医薬は、ＮＩＤＤＭを治療するのに利用可能であり、これらにはメトホルミン；グリピジドのようなスルホニル尿素；エキセナチドおよびリラグルチドのようなＧＬＰ拮抗薬；ピオグリタゾンおよびロシグリタゾンのようなチアゾリジンジオン類；シタグリピジン、サキサグリプチンおよびビルダグリプチンのようなＤＰＰ−ＩＶ阻害剤；ならびに、アカルボースおよびミグリトールのようなα−グルコシダーゼ阻害剤が挙げられる。
【０００５】
別の一般的な代謝障害は、肥満であり、これはエネルギー摂取と消費との間の不均衡を主たる原因とする。エネルギー摂取と消費との間の慢性的な不均衡に起因するプラスのエネルギー収支により、体重増加、ひいては肥満に至る。肥満は、一般に生死にかかわる病気ではないが、世界的な健康上の大きな問題になってきている。肥満は、高血圧、脂質異常症、ＩＩ型糖尿病、心疾患、睡眠時無呼吸症候群、変形性関節症および幾つかの癌種のリスクを増幅する。肥満を克服する最も一般的なアプローチは、ライフスタイル、特に食事および運動において変化をもたらすことである。しかし、有意な体重減少を達成して、より低い体重を長期間維持することは困難である。また、肥満は、薬剤によってコントロールすることもできる。体重減少および幾つかの心臓病リスク因子に関する有望な結果にもかかわらず、これまで開発された殆どの抗肥満薬は、副作用を理由に、承認されていないか、または市場から撤退せねばならなかった。シブトラミンがもはや利用可能でないために、オルリスタットは、現在長期的使用のために承認された唯一の抗肥満薬である。従って、ＮＩＤＤＭおよび／または肥満のような代謝障害を処置するための、安全かつ有効な治療方法を開発する必要性が、依然として存在している。
【０００６】
代謝障害を処置するための新しい医薬候補を選抜および開発するために、２つの新しい酵素の標的物、即ちジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１（ＤＧＡＴ−１）およびステアロイルＣｏＡデサチュラーゼ−１（ＳＣＤ−１）を利用することができる。これらの酵素は、トリグリセリドの合成（エネルギーが体内で貯蔵される主な形態）に重要な役割を果たす。
【０００７】
ＤＧＡＴ−１は、トリグリセリドの生合成を触媒する内部原形質(endoplasmic)の膜結合酵素であって、該生合成過程の最終段階でジアシルグリセロール（ＤＡＧ）および脂肪酸アシル-コエンザイムＡ（ＣｏＡ）をトリグリセリドに変換する酵素である。該酵素活性は、細胞が必要とするトリグリセリドを産生する必要があるために、全ての細胞型に存在している。ＤＧＡＴ−１は、腸および脂肪組織において高度に発現しており、肝臓および筋肉においてはより低いレベルを有する。これらの各組織（腸、脂肪組織、肝臓および筋肉）におけるＤＧＡＴ−１を阻害することにより、トリアシルグリセロール合成を阻害して、ヒトの代謝障害における過度な脂質蓄積の病態生理を阻止することができる［Expert. Opin. Ther. Patents 17(11), 1331-1339(2007)]。
【０００８】
ステアロイルＣｏＡデサチュラーゼ−１（ＳＣＤ−１）は、脂質代謝の制御における主要酵素のうちの１つとして述べられており、可能性のある新規治療標的として提示できる。ＳＣＤ−１は、飽和脂肪酸から一価不飽和脂肪酸の生合成を触媒する律速酵素である。ＳＣＤ−１の好ましい基質であるステアリン酸（Ｃ１８：０）およびパルミチン酸（Ｃ１６：０）各々は、オレイン酸（Ｃ１８：１）およびパルミトイル酸（Ｃ１６：１）に各々変換される。これらの一価不飽和脂肪酸は、トリグリセリド、コレステロールエステル、リン脂質およびワックスエステルを含めた様々な脂質の主要成分と考えられる。実験動物における試験から、これらの酵素の活性を阻害または低下することにより、肥満、糖尿病および関連合併症の発症に対して抵抗性となることが示唆された[Pharmacol. Res., 618, 28-36, (2009); Pharmacol. Res., 650, 663-672(2011)]。
【０００９】
現代の医学分野において、薬草材料および植物は、創薬および開発において重要な役割を担い続けている。天然物は、広範な構造多様性を示す。分離、構造解析、スクリーニングおよびコンビナトリアル合成に対する現行技術を利用して、新規薬物の起源として植物製品を再び活性化させてきた。栄養補給食品および栄養補助食品形態における薬草成分の導入により、植物を基にした薬品市場が変わりつつある。天然物およびそれらのアナログは、有用な薬剤候補へと開発されることが可能である[Pharmacol. 60(3):195-206, (2008);Drug Discov. Today, 13(3-4), 161-71(2009)]。植物からの粗生成物または加工生成物は、合成低分子と比較して最小の副作用を有するか、または副作用がないと考えられるため、植物を基にした医薬に対する需要は増大し続けている。
【００１０】
カロフィルムは、熱帯性常緑樹の約１８０〜２００の種の顕花植物属である。カロフィルム種は、カロフィルム・ブラシリエンス（Calophyllum brasiliense）、カロフィルム・カレドニクム（Calophyllum caledonicum）、カロフィルム・イノフィルム（Calophyllum inophyllum）およびカロフィルム・ソウラットリ（Calophyllum soulattri）を含む４つの下位カテゴリーから成る。
【００１１】
カロフィルム・イノフィルムは、中〜大型の常緑樹であり、平均２５〜６５フィートの高さであり、不規則な枝の広がりがある植冠を備えている。これは、東アフリカ、インド、南東アジア、オーストラリア、南太平洋およびハワイ諸島に自生している。この植物の様々な医薬用途は文献で報告されており、例えば、この植物の樹皮の煎出物(decoction)は、内出血に使用され、また無痛潰瘍の洗液としても使用されることが報告されている。さらに、この植物の堅果から得た油は、医薬および化粧品に慣習的に使用される。カロフィルム・イノフィルムの種子から抽出した油は、関節リウマチまたは関節障害；掻痒；湿疹；頭部に現われるざ瘡；眼疾患；および腎不全に使用される(Dravyaguna-Vijneana. Chaukhambha Bharati Academy, Publisher and distributor of monumental treatise of the east, Varanasi, India, Vol. II, 787, (2003); Chakradatta of Sri Chakrapanidatta. Dwivedy R. (ed.) Chaukhambha sanskrit sansthan, Publishers and distributors of oriental cultural literature, Varanasi, India, pages 280, 354 and 499, (2002))。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ＩＩ型糖尿病および肥満のような代謝障害が一般化する時流を考えれば、代謝障害の有効な処置のための新規組成物および方法を求める必要性が引き続き存在することは、本明細書の上記に示した。実際、これらの問題の解決策を見出だす事を目的とした本発明の発明者らの努力により、ＤＧＡＴ−１およびＳＣＤ−１阻害活性を持つ薬草組成物、即ち代謝障害の処置に有用であるカロフィルム種に属する植物の抽出物を含む薬草組成物を得た。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明の一態様に従い、代謝障害の処置において使用するための、有効成分として治療上有効量のカロフィルム種に属する植物の抽出物、および所望により少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を含む組成物が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の一態様に従い、代謝障害の処置において使用するための、有効成分として治療上有効量のカロフィルム・ブラシリエンス、カロフィルム・カレドニクム、カロフィルム・イノフィルムおよびカロフィルム・ソウラットリから選択される植物の抽出物、ならびに所望により少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を含む組成物が提供される。
【００１５】
本発明の別の態様に従い、代謝障害を処置するために、治療上有効な薬剤と組み合わせて使用するための、治療上有効量のカロフィルム種の植物由来の抽出物および少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を含む組成物が提供される。
【００１６】
本発明のさらなる別の態様に従い、代謝障害の処置において使用するための、有効成分として治療上有効量のカロフィルム・イノフィルム植物の抽出物および少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を含む組成物が提供される。
【００１７】
別のさらなる態様において、本発明は、有効成分として治療上有効量のカロフィルム種に属する植物の抽出物および所望により少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を含む組成物を、対象に投与することを含む、対象における代謝性疾患の治療方法に関する。
【００１８】
本発明の別の態様に従い、治療上有効量のカロフィルム種からの植物の抽出物を含む組成物の製造方法が提供される。
【００１９】
発明の詳細な記載
発明の範囲内での様々な変更および修飾は当業者には明白であるため、発明の実施態様を示す一方で詳細な説明および特定の例示は、単に説明する目的でのみ提供されることを理解されたい。本明細書の記載に基づいて、当業者は、本発明を全ての範囲まで利用してもよい。以下の特定の実施態様は、本開示内容の単なる説明として理解されるものであり、いかなることがあっても開示内容以外の部分を制限するものではない。
【００２０】
別途定義されなければ、本明細書において使用される全ての技術および化学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。
【００２１】
明細書および添付の特許請求の範囲に使用されるように、単数の形態には、内容が別のものとして明確に記述されなければ、複数の形態を包含する。
【００２２】
用語「代謝障害」とは、身体が炭水化物、脂質、タンパク質または核酸を適切に代謝することができない場合におこる障害あるいは異常をいう。代謝障害には、インシュリン耐性、高血糖症、ＩＩ型糖尿病、肥満、耐糖能低下、高コレステロール血症、脂質異常症、高インスリン血症、アテローム性動脈硬化、多嚢胞性卵巣症候群、冠動脈疾患、メタボリック症候群、高血圧、または異常な血漿リポタンパク質、トリグリセリドとの関連疾患あるいはグルコースレベルとの関連疾患、例えば膵臓のβ細胞再生が挙げられる。
【００２３】
本明細書に使用される用語「処置すること」、「処置する」または「処置」は、予防的(予防薬)および待機的処置を含む。
【００２４】
本明細書に使用される用語「薬学的に許容可能な」は、組成物中に使用される担体、希釈剤および/または賦形剤が、該製剤中の他の成分と相溶性であって、その受容者に有害ではないことを意味する。
【００２５】
カロフィルムは、熱帯常緑樹の約１８０〜２００種の顕花植物属である。カロフィルム種は、カロフィルム・ブラシリエンス、カロフィルム・カレドニクム、カロフィルム・イノフィルムおよびカロフィルム・ソウラットリを含む４つの下位群からなる。用語「カロフィルム」とは、その異名全てを包含することが意図される。
【００２６】
用語「薬草組成物」または「組成物」は、互換的に使用され、治療上有効量のカロフィルム種に属する植物の抽出物を、単独で、あるいは少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体または賦形剤と共に含む組成物を示すことができる。用語「単独で」とは、該組成物が、その中に添加された任意の薬学的に許容可能な担体も含まずに、カロフィルム種に属する植物の抽出物のみを含むことを示すことができる。
【００２７】
用語「組成物」とは、広義に解釈されるべきであって、例えば、目的とする適応症に関する表示を伴う医薬製品として販売されていてもいなくも、店舗販売されていてもいなくても、植物性医薬(phytopharmaceutical)として販売されていてもいなくても、治療効果を達成するという目的を意図するあらゆる組成物を包含することに留意されたい。
【００２８】
本明細書に使用されるような用語「薬学的に許容可能な担体」とは、無毒かつ不活性な固体、半固形、希釈剤、封入材またはあらゆるタイプの製剤用賦形剤を意味する。薬学的に許容可能な担体として役割を果たす材料の幾つかの例には、以下のものが挙げられる：ラクトース、グルコースおよびスクロースのような糖類；トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンのようなデンプン類；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体；麦芽；ゼラチン；他の無毒な相溶性の、滑沢剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム）、ならびに着色料、解離剤、コーティング剤、甘味剤、風味剤および芳香剤；保存剤および酸化防止剤も、製剤者の判断によって組成物に使用できる。
【００２９】
本明細書に使用されるような用語「治療上有効な量」とは、抽出物（例えば、カロフィルム・イノフィルム抽出物）または該抽出物を含有する組成物の量を意味し、これは妥当な医学的判断の範囲内において、規定または処置される条件下で、正の変化を有意に誘導するために十分であって、もしあったとしても副作用を回避するのに十分低い（合理的利益/リスク比にて）量である。抽出物または組成物の治療上有効量は、処置される特定の症状、例えばＩＩ型糖尿病または肥満、エンドユーザの年齢および身体状態、処置/治療される症状の重篤度、治療期間、併用療法の性質、利用される特定の薬学的に許容可能な担体ならびに因子類に拠って変化する。本明細書に使用されるような、全ての％は、特段の記載がなければ重量である。
【００３０】
本明細書に使用されるような用語「カロフィルム・イノフィルム抽出物」または「カロフィルム・イノフィルムの抽出物」は、カロフィルム・イノフィルム植物の任意の部分に存在する化合物の混合物を意味する。かかる化合物は、植物のあらゆる部分（例えば、植物の樹皮、小枝、茎および木質部など）から、当分野では十分知られた抽出方法、例えば、低級アルコール(例えば、メタノールまたはエタノール）、アルキルエステル（例えば、酢酸エチル）、アルキルエーテル（例えば、ジエチルエーテル）、アルキルケトン（例えば、アセトン、クロロホルム、石油エーテル、ヘキサン）のような有機溶媒を使用する抽出方法ならびに／または水のような水性溶剤を使用する抽出方法を実施して抽出できる。植物材もまた、好適な比率の溶剤混合物、例えばヘキサン−エチルアセトン（１：１）、クロロホルム−メタノール（１：１）またはメタノール−水（３：１）を用いて抽出することができる。
【００３１】
本明細書に使用されるような用語「対象」とは、動物、特に哺乳動物、より特別にはヒトをいう。
【００３２】
本明細書に使用される用語「哺乳動物」とは、皮膚が毛に覆われており、子供を育てるために乳を出す雌の乳腺を特徴とする、ヒトを含めた哺乳類の温血脊椎動物をいう。用語「哺乳動物」とは、ネコ、イヌ、ウサギ、クマ、キツネ、オオカミ、サル、シカ、マウス、ブタおよびヒトのような動物を含む。
【００３３】
実施態様において、「カロフィルム・イノフィルム抽出物」の調製方法は、溶剤としてメタノールの使用を含む。例えば、該抽出物を、溶剤としてメタノールを使用して、カロフィルム・イノフィルム植物の粉砕樹皮を抽出することによって得ることができる。
【００３４】
実施態様において、カロフィルム・イノフィルム植物の粉砕樹皮を、様々な比率のメタノール−水の混合液、例えばメタノール−水（９：１）混合液、メタノール−水（３：１）混合液またはメタノール−水（１：１）混合液を使用して抽出できる。
【００３５】
カロフィルム・イノフィルム植物の抽出物の調製方法は、大規模な製造のために容易にスケールアップできる。
【００３６】
「カロフィルム・イノフィルム抽出物」は、高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)または高性能薄層クロマトグラフィー(ＨＰＴＬＣ)のような従来技術を使用して標準化することができる。用語「標準化抽出物」とは、抽出物中に存在する特有の生理活性成分または生理活性マーカー類を同定することにより標準化された抽出物をいう。
【００３７】
本明細書に使用されるような用語「有効成分」または「生理活性成分」は、１つ以上の生理活性化合物(生理活性マーカー)を含んでいる「カロフィルム・イノフィルム抽出物」をいう。生理活性成分は、高性能薄層クロマトグラフィー(ＨＰＴＬＣ)または高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)のような様々な技術を使用して同定することができる。生理活性マーカーは、カラムクロマトグラフィー精製および分取高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)によって、生理活性によりカロフィルム・イノフィルム植物の抽出物から単離することができる。化合物を、スペクトルのデータの分析により特徴付けることもできる。
【００３８】
用語「生理活性マーカー」とは、許容可能な程度の医薬活性と関連がある活性化合物の特徴(あるいは、植物化学プロファイル)を規定するために、本明細書において使用される。活性化合物である「生理活性マーカー」は、生理活性によるクロマトグラフィー精製および分取ＨＰＬＣにより、カロフィルム・イノフィルム植物から得た抽出物から単離できる。単離化合物(生理活性マーカー)を、スペクトルデータの分析により特徴付けることができる。
【００３９】
抽出物の生理活性の測定は、種々の十分に知られた生体外・生体内アッセイを用いて実施することができる。例えば、予備的に抽出物の生体外活性の測定は、ジアシルグリセロアシルトランスフェラーゼ−１（ＤＧＡＴ−１）、ステアロイル-ＣｏＡデサチュラーゼ−１（ＳＣＤ−１）アッセイまたはトリグリセリド合成アッセイを使用して実施することができる。生体内活性は、高脂肪食（ＨＦＤ）誘導性肥満モデルのようなアッセイを用いて測定することができる。
【００４０】
実施態様において、本発明は、治療上有効量のカロフィルム・イノフィルム植物の抽出物および所望により少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を含む薬草組成物を提供する。
【００４１】
別の実施態様において、本発明は、カロフィルム・イノフィルム植物の標準化抽出物および所望により少なくとも一つの薬学的に許容可能な担体を含む薬草組成物に関する。
【００４２】
本発明の薬草組成物は、５〜１００％のカロフィルム・イノフィルム植物の抽出物を含む。
【００４３】
本発明の薬草組成物は、少なくとも１つの生理活性マーカーを含んでいるカロフィルム・イノフィルム植物から得られる抽出物の５〜１００％を含む。
【００４４】
実施態様において、本発明は、代謝障害を処置するための医薬製造における、治療上有効量のカロフィルム・イノフィルム植物の抽出物を含む組成物の使用を提供する。
【００４５】
「カロフィルム・イノフィルム抽出物」は、薬学的に許容可能な担体と混合して、治療用投薬形態へと製剤される。
【００４６】
治療上有効量のカロフィルム・イノフィルム植物の抽出物を含む組成物は、例えば、丸剤、錠剤、糖衣錠、カプセル剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤あるいはシロップの形態で経口投与することができる。
【００４７】
「カロフィルム・イノフィルム抽出物」を５〜１００重量％を含んでいる経口組成物は、常法を使用して、この抽出物を薬学的に許容可能な担体と完全に混合することにより製造できる。
【００４８】
実施態様において、前記組成物は、代謝障害の処置のために提供される。
【００４９】
実施態様において、前記組成物は、ＩＩ型糖尿病、肥満、耐糖能低下、高コレステロール血症、脂質異常症、高インスリン血症、アテローム性動脈硬化、多嚢胞性卵巣症候群、冠動脈疾患、メタボリック症候群あるいは高血圧から選択される代謝障害の処置のために提供される。
【００５０】
実施態様において、前記組成物は、ＩＩ型糖尿病の処置のために提供される。
【００５１】
実施態様において、前記組成物は、肥満の処置のために提供される。
【００５２】
実施態様において、前記組成物は、脂質異常症の処置のために提供される。 
【００５３】
実施態様において、前記組成物は、異常な血漿リポタンパク質、トリグリセリドとの関連疾患に関係する代謝障害の処置のために提供される。
【００５４】
実施態様において、前記組成物は、グルコースレベルに関係のある代謝障害、例えば膵臓のβ細胞再生の処置のために提供される。
【００５５】
また別の実施態様において、本発明は、代謝障害の処置において使用するための、治療上有効な薬剤と組み合わせて使用するために、治療上有効量のカロフィルム種からの植物の抽出物および少なくとも薬学的に許容可能な担体を含む組成物に関する。
【００５６】
また別の実施態様において、本発明は、代謝障害の治療において使用するための、治療上有効な薬剤と組み合わせて使用するために、治療上有効量のカロフィルム・イノフィルム植物の抽出物および所望により少なくとも薬学的に許容可能な担体を含む組成物に関する。
【００５７】
治療上有効量のカロフィルム・イノフィルム植物の抽出物を含む本発明の組成物を、代謝障害の処置において使用するために、所望により治療上有効な薬剤と組み合わせて使用してもよい。
【００５８】
治療上有効な薬剤は、オルリスタット、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、グリベンクラミド、グリピジド、グリメピリド、リパグリニド、またはメトホルミンのような既知の生理活性物質から選択されてもよい。
【００５９】
本発明はまた、治療上有効量のカロフィルム・イノフィルム植物の抽出物、および所望により少なくとも一つの薬学的に許容可能な担体を含む組成物を、経口経路によって選択的に投与することを含む代謝障害を処置する方法に関する。
【００６０】
本発明の薬草組成物は、有効成分（即ち、抽出物）を、通常、無毒な薬学的に許容可能な担体と共に配合して、粉末剤、丸剤、錠剤、糖衣錠、残渣、顆粒剤、カプセル剤、溶液、乳剤、懸濁、エリキシル剤、シロップおよび使用に好適な他の形態として、経口投与のために製剤されてもよい。本発明の製剤は、タルク、水、グルコース、ラクトース、スクロース、アカシアガム、ゼラチン、マンニトール、スターチ、三ケイ酸マグネシウム、トウモロコシデンプン、ケラチン、コロイド様シリカ、ジャガイモデンプン、尿素およびセルロース、ならびにそれらの派生物（例えば、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース）；麦芽；ゼラチン；ならびに、その他の無毒な相溶性滑沢剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム）、放出剤、コーティング剤、および固体、半固体または液体の形態の製剤を製造する際に使用するのに好適なその他の賦形剤を含むものを包含し、さらに助剤、安定化剤、増粘剤および着色料を使用してもよい。錠剤またはカプセル剤のような固体組成物を製造するために、該抽出物を、薬学的担体(例えば、トウモロコシデンプン、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸カルシウムあるいはゴムのような従来の錠剤化成分)ならびに他の薬学的希釈剤(例えば、水)と混合して、固体組成物を形成してもよい。その後、この固体組成物は、有効量の本発明の組成物を含有する単位投薬形態へと分割される。抽出物を含有する錠剤または丸剤を、持続作用の利点を提供する投薬形態を提供するように被覆または配合することができる。
【００６１】
液体形態（該抽出物は、経口投与として、または注射により導入できる）には、水溶液、好適に風味付けしたシロップ剤、水性懸濁液または油性懸濁液、エリキシル剤および食用油を含む風味付けされたエマルジョン、ならびにエリキシル剤および類似の薬学用賦形剤が挙げられる。水性懸濁液に好適な分散剤または懸濁化剤は、トラガント、アカシアガム、アルギン酸塩、デキストラン、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンまたはゼラチンのような合成の天然ゴムを含む。経口投与用の液体製剤は、例えば、溶液、シロップ剤または懸濁液の形式をとることができるか、あるいは、それらは、使用前に水または他の適切な賦形剤を用いて再構成するために乾燥生成物として存在してもよい。かかる液体製剤は、常法により、懸濁化剤(例えば、ソルビトールシロップ、メチルセルロースまたは水素化食用脂)；乳化剤(例えば、レシチンまたはアカシアガム)；非水性賦形剤(例えば、アーモンド油、油性エステルまたはエチルアルコール);保存剤(例えば、メチルまたはｐ-オキシ安息香酸プロピルまたはソルビン酸)；ならびに人工または天然色素および/または甘味料などの薬学的に許容可能な添加剤と共に製造できる。
【００６２】
選択された投薬レベルは、用いた本発明の特定の抽出物の活性、投与経路、投与時間、用いた特定組成物の排出速度、処置の期間、その他の抽出物との併用、年齢、性別、重量、条件、患者の一般的な健康状態および処置される患者の先の病歴、医薬分野において十分に知られた要因に依存するであろう。しかし、一般的には、成人の処置に用いられる投薬量は、１日あたり０.０２〜５０００ｍｇまたは１日あたり１〜１５００ｍｇの範囲内である。所望の投薬量は、単回用量にて、または好適な間隔で投与される分割用量として、例えば１日あたり２、３あるいは４つ以上の分割用量にて存在する。
本発明は、以下の実施例を参照してより容易に理解されるであろうが、これは発明を説明するために提供されるが、発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００６３】
実施例
以下の用語/略語を実施例において用いる：
【表１】
2015509976.tif 000002
【００６４】
植物の抽出物
カロフィルム・イノフィルムの植物材料（樹皮、木質部、茎および小枝）を、インドのマハーラーシュトラ州のムンバイ（Mumbai, Maharashtra, India）で収集した。証明のために顕微鏡試験および肉眼試験を、各植物材料について行った。カロフィルム・イノフィルム植物の各部分の試験片は、ピラマル・ヘルスケア・リミテッド(Goregaon, Mumbai, Maharashtra, Indi)の植物部門で保持される。
【００６５】
カロフィルム・イノフィルムの植物材料（樹皮、木質部、茎および小枝）を、小片に切断して、除湿機により乾燥させた。完全に乾燥した試料を、その後粉砕機を使用して粗く挽いた。
【００６６】
実施例１
乾燥したカロフィルム・イノフィルム（樹皮）（５００ｇ）の粉砕植物材料を、メタノール（４Ｌ）を使用して４５℃で３時間攪拌することにより抽出した。この抽出過程を、メタノール（３.５Ｌ）を用いて２回繰り返した。抽出物を合わせて、乾燥状態まで濃縮した。収量：１１５ｇ（２３％）。
実施例１において得られた抽出物を、「実施例１の抽出物」として本明細書において示す。
【００６７】
実施例２
乾燥したカロフィルム・イノフィルム（樹皮）（１００ｇ）の粉砕植物材料を、メタノール：水（９：１）（９００ｍＬ）を使用して、４５℃で３時間攪拌することにより抽出した。この抽出過程を、メタノール：水（９：１）（７００ｍＬ）を用いて２回繰り返した。抽出物を、合わせて濃縮した。濃縮した試料を、凍結乾燥器（Edwards）を使用して凍結乾燥した。収量：１７.７２ｇ（１７.７％）。
実施例２において得られた抽出物は、本明細書において「実施例２の抽出物」として示す。
【００６８】
実施例３
乾燥したカロフィルム・イノフィルム（樹皮）（５０ｇ）の粉砕植物材料を、メタノール：水（３：１）（５００ｍＬ）を使用して、４５℃で３時間攪拌することにより抽出した。この抽出過程を、メタノール：水（３：１）（４００ｍＬ）を用いて２回繰り返した。この抽出物を、合わせて濃縮した。濃縮した試料を、凍結乾燥器（Edwards）を使用して凍結乾燥した。収量：８.２ｇ（１６.４％）。
実施例３において得られた抽出物は、本明細書において「実施例３の抽出物」として示す。
【００６９】
実施例４
乾燥したカロフィルム・イノフィルム（樹皮）（５０ｇ）の粉砕植物材料を、メタノール：水（１：１）（５００ｍＬ）を使用して、４５℃で３時間攪拌することにより抽出した。この抽出過程を、メタノール：水（１：１）（４００ｍＬ）を用いて２回繰り返した。この抽出物を、合わせて濃縮した。濃縮した試料を、凍結乾燥器（Edwards）を使用して凍結乾燥した。収量：６.３ｇ（１２.６％）。
実施例４において得られた抽出物は、本明細書において「実施例４の抽出物」として示す。
【００７０】
実施例５
乾燥したカロフィルム・イノフィルム（茎）の粉砕植物材料を、メタノールを使用して、４５℃で３時間攪拌することにより抽出した。該抽出物を濾過した。この抽出過程を、メタノール（１：８ ｗ／ｖ）を用いて２回繰り返した。この抽出物を、合わせて濃縮した。収量：６.５％。
実施例５において得られた抽出物は、本明細書において「実施例５の抽出物」として示す。
【００７１】
実施例６
乾燥したカロフィルム・イノフィルム（小枝）の粉砕植物材料を、メタノール（１：１０ ｗ／ｖ）を使用して、４５℃で３時間攪拌することにより抽出した。この抽出過程を、メタノール（１：８ ｗ／ｖ）を用いて、２回繰り返した。この抽出物を合わせて、乾燥状態まで濃縮した。収率：１０％。
実施例６において得られた抽出物は、本明細書において「実施例６の抽出物」として示す。
【００７２】
実施例７
乾燥したカロフィルム・イノフィルム（木質部）の粉砕植物材料を、メタノール（１：１０ｗ／ｖ）を使用して、４５℃で３時間攪拌することにより抽出した。この抽出過程を、メタノール（１：８ｗ／ｖ）を用いて２回繰り返した。この抽出物を合わせて、乾燥状態まで濃縮した。収率：１０.６％。
実施例７において得られた抽出物は、本明細書において「実施例７の抽出物」として示す。
【００７３】
実施例１〜７の抽出物を、４℃〜８℃の冷蔵室内でポリプロピレンバイアルに保存した。
【００７４】
薬理学的アッセイ
ＤＧＡＴ−１およびＳＣＤ−１酵素の活性阻害における、カロフィルム・イノフィルム植物の抽出物の効力を、当業者には既知の下記に示した多くの薬理学的アッセイによって決定した。
以下の用語／略語を実施例において使用する：
【表２】
2015509976.tif 000003
【００７５】
生体外アッセイ
実施例８
ｈＤＧＡＴ−１分析
ＤＧＡＴ−１アッセイを、文献（Pharmacol. Res., 650, 663-672(2011)）に記載されたようにＳｆ９細胞系において過剰発現したヒトのＤＧＡＴ−１酵素を用いて設計した。文献の開示内容を、アッセイ技術の教示のために参照により本明細書に組み込む。
【００７６】
ヒトＤＧＡＴ−１（ｈＤＧＡＴ−１）クローンのクローニングおよび発現
ｈＤＧＡＴ−１ＯＲＦ発現クローン（ｐＤＥＳＴベクター中ＲＺＰＤ０８３９Ｃ０９１４６）を、ＲＺＰＤ(Germany)から入手した。ｈＤＧＡＴ−１遺伝子（ＮＭ＿０１２０７９）を、アンピシリン耐性マーカーと共にキンウワバ科（Autographa californica）の核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモーターのもとでｐＤＥＳＴ８ベクターにクローニングした。この組み換えプラスミドを、トランスフェクションによりバキュロウイルス・シャトルベクター（バクミド：bacmid）を含有するＤＨ１０ＢＡＣコンピテントセルに移入して、得られる細胞を、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現系(Invitrogen, USA)に従い、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）およびゲンタマイシン（１０μｇ／ｍＬ）を含むルリアブロス（ＬＢ）寒天平板上へ筋状に塗布した。白色コロニーを摘み取り、上記抗生物質を含むＬＢ寒天培地上に再度塗布して、３７℃で一晩インキュベートした。翌日に、ｈＤＧＡＴ−１遺伝子を含有する組み換えバクミドを有する単離白色コロニーを、抗生物質（アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）およびゲンタマイシン（１０μｇ／ｍＬ））を含むルリア培地（１０ｍＬ）中に植菌して、オービタルシェーカー（New Brunswick）上で、３７℃、２００ｒｐｍにて終夜インキュベートした。ルリア培地（10ｍＬ）を取り出し、組み換えバクミドＤＮＡ（ｈＤＧＡＴ−１遺伝子を有する）を、Qiagen Mini prep kitを用いて調製して、ナノドロップ(Nanodrop)を用いて定量した。ｈＤＧＡＴ−１遺伝子を含むバクミドＤＮＡの濃度は、およそ９７ｎｇ／μＬであった。
【００７７】
Ｓｆ９細胞を使用するトランスフェクションおよびウイルス増幅
１〜３μｇのｈＤＧＡＴ−１バクミドＤＮＡを、６ウェル組織培養プレート中で仕様説明書に従って、Cellfectin(Invitrogen, USA)を使用して、Ｓｆ９細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトされたＳｆ９細胞を、子ウシ血清およびAntibiotic-Antimycotic(100ユニット/mL)のペニシリン(100μg/mL)、ストレプトマイシン硫酸塩(0.25μg/mL)およびアンホテリシンＢを含まない不完全グレース昆虫培地(Gibco R)中で、２７℃で５時間培養した。インキュベーション完了後に、この培地を増殖培地（グレース昆虫培地；(Gibco(登録商標)）子ウシ血清およびAntibiotic-Antimycotic(100ユニット/mL)、ペニシリン(100μg/mL)、ストレプトマイシン硫酸塩(0.25μg/mL)およびアンホテリシンＢを含有する)に置換して、細胞を、２７℃で１２０時間、インキュベーター内でさらに培養した。
【００７８】
この培養中に、ウイルス粒子は、昆虫内で形成され、分泌された。このウイルスを含有する上清を、１２０時間終了時に収集して、Biofuge statos遠心分離機(Heraeus 400)を使用して、５分間、１５００Ｘｇで遠心分離を行い、０.２２のμｍフィルター(Millipore)を通して濾過した。それをＰ１の組み換えバキュロウイルスとして４℃で保存した。含有量＞１０５ｐｆｕ（プラーク形成単位）／ｍＬを、製造社指示書(Invitrogen Kit)に従い行なったプラークアッセイにより決定した。
【００７９】
Ｐ１組み換えバキュロウイルスを、０.０５〜０.１のＭＯＩ（感染多重度）にてさらに増幅させて、グレース昆虫完全培地（５ｍＬ）中に５ｘ１０６Ｓｆ９細胞を含有するＴ−２５フラスコ(Nunc)内で１２０時間、Ｐ２を生成させて、その後５分間、１５００Ｘｇの遠心分離に供し、０.２２μｍのフィルター(Millipore)による濾過を行い、Ｐ２／（＞１０６ｐｆｕ／ｍＬ）組換えバキュロウイルスとして４℃で保存した。同様に、Ｐ３およびＰ４組換えバキュロウイルスを、０.０５〜０.１のＭＯＩの再感染によりさらに増幅させて、Ｐ３とＰ４の組換えバキュロウイルスを各々生成させて、次回使用時まで４℃で保存した。Ｐ４の組換えバキュロウイルスについてのウイルス価を決定し、それが１ｘ１０８ｐｆｕ／ｍＬであることが判った。Ｐ４（＞１０８ｐｆｕ／ｍＬ）組み換えバキュロウイルスを、最終的に用いて、５〜１０のＭＯＩにてｓｆ９細胞を感染させた。
【００８０】
ミクロソーム調製
Ｓｆ９細胞（２ｘ１０６細胞／ｍＬ）を、５００ｍＬのスピナーフラスコ内のAntibiotic-Antimycotic(GibcoR)を含むグレース昆虫細胞培地(Gibco)（２５０ｍＬ）中で増殖させて、５のＭＯＩにて、ｈＤＧＡＴ−１の組換えバキュロウイルス（２５ｍＬ）に感染させた。感染細胞を、２８℃で４８時間維持して、細胞残渣を、室温で１０００Ｘｇにて、培地を遠心分離機にかけて回収した。残渣を、ＰＢＳ（ｐＨ７.４）により洗浄して、残留培地を除去した。
【００８１】
次いで、該残渣をプロテアーゼカクテル錠(Roche)の１Ｘ量および社内調製したプロテアーゼ阻害混合物を含むミクロソーム調製緩衝液（１５ｍＬ）に懸濁し、溶解物を２７Ｇのニードルに通して、その後４℃で超音波処理を穏やかに行うことにより、細胞を破砕した。細胞破片を分離して、核上清（ＰＮＳ）である溶解物を、Biofuge statos遠心分離機(Heraeus 400)を用いて、４℃で１０分間１０００Ｘｇにて遠心分離を行なった。その後に、得られたＰＮＳを、Biofuge statos 遠心分離機(Heraeus)を用いて、４℃で３０分間１５０００Ｘｇにて遠心分離を行ない、ミトコンドリア上清（ＰＭＳ）(the post mitochondrial supernatant)を分離した。最終的に、超遠心分離を、BeckmaTi-rotorを用いて４℃で１時間１００,０００Ｘｇにて行い、ミクロソームペレットを得た。精製度を高めるために、このペレットを、プロテアーゼ阻害剤混合物[アプロチニン（０.８μＭ）、ペプスタチンＡ（１０μＭ）およびロイペプチン（２０μＭ）-Sigma]の社内調製物を含有するミクロソーム調製緩衝液で２回洗浄した。
最後に、ミクロソーム残渣を、ミクロソーム調製緩衝液（１.５ｍＬ）に懸濁して、タンパク濃度をブラッドフォード法によって決定した。
ミクロソームを、生体外アッセイのために−７０℃で各々１００μｌのアリコートとして保存した。
【００８２】
緩衝液および試薬調製
ストック溶液
ｈＤＧＡＴ−１アッセイ緩衝液ストック：アッセイ緩衝液（ｐＨ７.４）を、０.２５Ｍのスクロース(Sigma)および１ｍＭ ＥＤＴＡ(Sigma)を１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ(Sigma)に溶解することにより調製した。
停止液：１０ｍＬの停止液を作成するために、イソプロパノール（Qualigens）（７.８４ｍＬ）およびｎ−ヘプタン（Qualigens）（１.９６ｍＬ）を、脱イオン化水（０.２ｍＬ）に添加した。
Ａ.Ｅ.Ｓ.Ｓ.Ｍ（アルカリ性エタノール停止混合液）：Ａ.Ｅ.Ｓ.Ｓ.Ｍ溶液（１０ｍＬ）を作るために、変性エタノール（１.２５ｍＬ）、脱イオン水（１.０ｍＬ）および１Ｎ ＮａＯＨ（Qualigens）（０.２５ｍＬ）を、停止液（７.５ｍＬ）に添加した。
シンチレーション溶液：２.５Ｌのシンチレーション溶液を作るために、トルエン（Merck）（１６６７ｍＬ）、トライトンＸ−１００(Sigma)（８３３ｍＬ）、２,５−ジフェニルオキサゾール（ＰＰＯ；Sigma）（１２.５ｇ）および（１,４−ビス（５−フェニル−２−オキサゾリル）ベンゼン（ＰＯＰＯＰ；Sigma）（５００ｍｇ）を混合した。
【００８３】
処理用ストック(Working stock)
ｈＤＧＡＴ−１分析緩衝液：０.１２５％ＢＳＡ（遊離脂肪酸, Sigma)を含むｈＤＧＡＴ−１分析緩衝液を使用前に新たに調製した。
基質混合物の調製：基質混合物を、２０４７.５μＭの１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロール（１９.５ｍＭ；Sigma）および２８０ ｎＣｉ／ｍＬの［１４Ｃ］オレオイル基−ＣｏＡ（０.１ｍＣｉ／ｍＬ America Radiolabelled Chemicals)を添加して新たに調製し、ｈＤＧＡＴ−１アッセイ緩衝液を使用して最終容量を１０００μＬとした。
ｈＤＧＡＴ−１酵素調製物：酵素をｈＤＧＡＴ−１アッセイ緩衝液中で１ｍｇ／ｍＬの処理濃度に希釈し、この処理用酵素ストックの２.５μＬを、ｈＤＧＡＴ−１アッセイ（終濃度２５μｇ／ｍＬ）に使用した。
【００８４】
試験サンプルの調製
試験サンプルを、以下のように調製した。２０ｍｇ／ｍＬのストック溶液を、１００％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の各抽出物（実施例１の抽出物〜実施例７の抽出物）のために調製した。処理用ストックを、ｈＤＧＡＴ−１アッセイ緩衝液で調製した。処理用ストック（１０μL）を、抽出物の最終濃度が５０μｇ／ｍＬとなるように、アッセイ混合物（１００μＬ）に添加した。
用量応答のための３つの異なる濃度（つまり、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬ）を、ストック溶液の連続希釈により、実施例１の抽出物のために調製した。
【００８５】
アッセイ
基質混合液（６０μＬ）（上記のとおり）を、１００μＬのアッセイ全量に添加した。反応を、ｈＤＧＡＴ−１含有ミクロソームタンパク質(２.５μｇ)を添加することにより開始して、１０分間３７℃で培養した。該反応を、アルカリ性エタノール停止混合液（ＡＥＳＳＭ）（３００μＬ）を添加して停止させた。該反応は、放射活性を有するトリグリセリド（［１４Ｃ］トリグリセリド）を、１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロールの３位の水酸基（ＯＨ）へ導入して、放射活性を有する［１４Ｃ］オレオイル基−ＣｏＡを形成させることを含んでおり、これは後に上部のヘプタン相中に抽出される。このように形成した放射活性トリグリセリド生成物を、ｎ−ヘプタン（６００μＬ）を添加して、有機相へ移行させる。この上相のヘプタン（２５０μＬ）を、シンチレーション溶液（４ｍＬ）に添加して、液体シンチレーション計測器(Packard;1600CA)を用いて、１分当たりの壊変数（ｄｐｍ）計測値として測定した。％阻害を、ビヒクルに関して計算した。結果を表１に示した。
【００８６】
用量応答を、実施例１の抽出物のストック溶液をｈＤＧＡＴ−１アッセイ緩衝液で連続希釈して、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬの濃度で決定した。結果を表２に示した。
【００８７】
表１：抽出物のｈＤＧＡＴ−１阻害
【表３】
2015509976.tif 000004
＊ＩＮ５５３０：社内標準化合物（２−（（１ｓ,４ｓ）−４−（４−（７,７−ジメチル−７Ｈ−ピリミド［４,５−ｂ］［１,４］オキサジン−６−イル）フェニル）シクロヘキシル）酢酸
結論：カロフィルム・イノフィルム植物の抽出物（実施例１−５の抽出物および実施例７の抽出）は、ｈＤＧＴＡ−１阻害アッセイにおいて活性であることが判った。
【００８８】
表２：ｈＤＧＡＴ−１阻害アッセイにおける実施例１の抽出物の用量応答
【表４】
2015509976.tif 000005
＊ＩＮ５５３０：社内標準化合物（２−（（１ｓ,４ｓ）−４−（４−（７,７−ジメチル−７Ｈ−ピリミド［４,５−ｂ］［１,４］オキサジン−６−イル）フェニル）シクロヘキシル）酢酸
結論：実施例１の抽出物は、ｈＤＧＡＴ−１阻害アッセイにおいて用量相関性の活性を示した。
【００８９】
実施例９
ＳＣＤ−１アッセイ
文献[Pharmacol. Res., 618, 28-36(2009)]に記載された方法に従って、アッセイを実施した。この開示内容をアッセイの教示として参照により本明細書に組み込む。
【００９０】
ＳＣＤ−１酵素の調製
ＳＣＤ−１酵素を、ＰＣＴ出願公開公報ＷＯ２００８／０７４８３５Ａ１に記述したラット肝臓ミクロソームから調製した。この開示内容をアッセイの教示として参照により本明細書に組み込む。
雄のスプラーグドーリーラット（１５０−１７５ｇ）を、２日間絶食させて、次いで３日間低脂肪食餌を与え、ＳＣＤ−１活性を誘導した。次いで、ラットを屠殺し、ラットの肝臓を摘出して、氷上に静置した。肝臓を、最終的に鋏で細かく切断して、ポリトロンホモジナイザーを使用して、４℃で均質化緩衝液（１５０ｍＭ ＫＣｌ,２５０ｍＭ スクロース、５０ｍＭ トリスＨＣｌ（ｐＨ７.５）、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび１.５ｍＭ 還元グルタチオン）中で均質化した。均質化物を、４℃、２０分間、１５００Ｘｇにて遠心分離を行なった。上清を、４℃、２０分間、１０,０００Ｘｇにて２回遠心分離機を行い、収集した。得られた上清を集めて、４℃、６０分間、１００,０００Ｘｇにて遠心分離を行なった。この上清を廃棄し、ミクロソーム残渣を均質化緩衝液に再懸濁して、等分割して−８０℃で保存した。再懸濁した残渣のタンパク質含有量を、ブラッドフォード分析によって同定した。
【００９１】
緩衝液および試薬の調製
ＳＣＤ−１分析緩衝液の調製：緩衝液は、１００ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４（Qualigens）および１００ｍＭ Ｎａ２Ｈ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ（Qualigens）（ｐＨ７.４）から構成される。
リン酸カリウム緩衝液の調製：緩衝液は、２００ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４（Qualigens）および２００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（Qualigens）（ｐＨ７.０）から成る。
【００９２】
ＳＣＤ−１抽出緩衝液の調製：緩衝液は、２５０ｍＭ スクロース(Sigma)、１５ｍＭＮ−アセチルシステイン(Sigma)、５ｍＭ ＭｇＣｌ２(Sigma)、０.１ｍＭ ＥＤＴＡ(Sigma)、０.１５Ｍ ＫＣｌ(Sigma)および６２ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７.０）から成る。
β−ＮＡＤＨの調製：β−ＮＡＤＨ(Sigma)の２０ｍＭ ストック溶液を、ＳＣＤ−１アッセイ緩衝液中で調製して、−７０℃で保存した。β−ＮＡＤＨの処理用ストックを、使用直前にアッセイ緩衝液を用いて、該ストックを８ｍＭに希釈して調製した。
ステアロイルｃｏ−Ａの調製：ステアロイルｃｏ−Ａ(Sigma)の１.６５ｍＭストック溶液を、ＳＣＤ−１アッセイ緩衝液において調製して、−７０℃で保存した。
放射性カクテルの調製：１μＣｉ／ｍＬ ステアロイル（９,１０３Ｈ）ＣｏＡ(American Radiolabeled Chemicals)（１００μＬ）および１.６５ｍＭ ステアロイルｃｏ−Ａ（１４４μＬ）を、ＳＣＤ−１アッセイ緩衝液（５５１６μＬ）に添加した。
【００９３】
マルチスクリーンプレート内の活性炭ベッドの調製
３３％の活性炭(Sigma)溶液を、アッセイ緩衝液中で作成した。該溶液（２５０μＬ）を、マルチスクリーンプレートの各ウェルに添加した。この炭ベッドを、真空マニホールドにより、該プレートを真空にして形成させた。プレートを使用まで保存した。
【００９４】
試験サンプルの調製
試験サンプルを、以下のように調製した。２０ｍｇ／ｍＬのストック溶液を、１００％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）において各抽出物（実施例１の抽出物から実施例４の抽出物）のために調製した。処理用ストックを、ＳＣＤ−１アッセイ緩衝液中で調製した。この処理用ストック（１０μＬ）を、アッセイ混合物（１００μＬ）に加えて、５０μｇ／ｍＬの抽出物の最終濃度を得た。
【００９５】
アッセイ
ミクロソーム（６２.５μｇ）を、試験サンプルにより１５分間処理した。β−ＮＡＤＨストック溶液（２５μＬ）および９,１０−３ＨステアロイルＣｏＡを含有する放射性カクテル（２０μＬ）を添加して、該混合物を、２５℃で３０分間インキュベートした。この反応を、過塩素酸の添加により停止させた。次いで、該プレートを遠心分離に供して、各ウェルからの上清を、真空マニホールドを用いて、炭ベッドから保存プレートへと送出した。３Ｈ２Ｏを含有する濾液を、シンチレーション溶液（４ｍＬ）を入れたシンチレーションバイアルに移して、ｃｐｍ計測値を、液体シンチレーション計数器を使用して測定した。％阻害を、ビヒクルコントロールを対照として計算した。陽性コントロールを、各実験にてアッセイした。結果を表３に示した。
【００９６】
表３：カロフィルム・イノフィルムの抽出のＳＣＤ−１阻害
【表５】
2015509976.tif 000006
＊ＭＦ１５２：標準化合物［Bioorganic & Medical Chemistry Letters, 19, 5214-5217(2009)]。
結論：カロフィルム・イノフィルムの抽出物（実施例４の抽出物から実施例１の抽出物）は、ＳＣＤ−１阻害アッセイにおいて活性であることが判った。
【００９７】
実施例１０
細胞を基にしたトリグリセリド（ＴＧ）合成分析
最初のアッセイより選択された実施例１の抽出物を、文献[Pharmacol. Res., 618, 28-36((2009)]に報告された方法により、ＨｅｐＧ２細胞中のトリグリセリド合成を阻害するその能力について評価した。この開示内容を、アッセイの教示として参照により本明細書に組み込む。
【００９８】
緩衝液、試薬および培地の調製
イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）：粉末ＥＭＥＭ(Sigma)の１つの小袋を、１Ｌの三角フラスコに添加した。空の小袋を、蒸留水（１０ｍＬ）で濯いだ。粉末を、マグネチックスターラーを使用して、蒸留水（９００のｍＬ）に溶解した。炭酸水素ナトリウム(Sigma)（１.５ｇ）、ピルビン酸ナトリウム(Sigma)（１０ｍＬ）およびペニシリンストレプトマイシン(Gibco)を加えた。適切に混合した後に、ｐＨを７.２に調整して、容量を１Ｌとした。該培地をフィルター滅菌して４℃で保存した。
【００９９】
不活性化ウシ胎児血清(ＦＢＳ)：ウシ胎児血清(Hyclone)を、３０分間５６℃に予め設定した温浴中に置いた。ＦＢＳを、５０ｍＬのポリプロピレンチューブに等分（４５ｍＬ）して、−８０℃で保存した。
【０１００】
リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）：ＰＢＳ(Sigma)の１つ小袋の含量を、蒸留水（９００ｍＬ）に溶解した。ｐＨを、７.２に調整して、容量を１Ｌとした。次いで、フィルター殺菌して、−２０℃で保存した。
【０１０１】
トリプシン−ＥＤＴＡ溶液：トリプシン−ＥＤＴＡ溶液(Sigma)を溶かして、ポリプロピレンチューブ（５０ｍＬ）に無菌的に等分して（４５ｍＬ）、−２０℃で保存した。
【０１０２】
試験サンプルの調製
試験サンプルを、以下のように調製した。２０ｍｇ／ｍＬのストック溶液を、１００％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）において実施例１の抽出物のために調製した。５０μｇ／ｍＬで抽出物の最終濃度を得るために、処理用ストック（１０μＬ）を、アッセイ混合物（１００μＬ）に添加した。
用量応答のための異なる３つの濃度（即ち、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬ）を、ストック溶液の連続希釈により実施例１の抽出物のために調製した。
【０１０３】
ＨｅｐＧ２細胞の培養
ＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−８０６５）の凍結バイアルを、３７℃で水に溶かした。バイアルの全内容物を、ＥＭＥＭ（９ｍＬ）および不活性化ウシ胎児血清（１ｍＬ）を有するＴ−７５組織培養フラスコへ移した。フラスコを、３７℃で５％ＣＯ２に湿度制御されたインキュベータ内でインキュベートした。フラスコを、細胞増殖のために観察した。細胞が〜７０％コンフルエントとなった場合に、使用した培地を廃棄して、細胞単層を、ＰＢＳ（５ｍＬ）で洗浄した。全細胞層が覆われるように、トリプシンＥＤＴＡ溶液（１.５〜２ｍＬ）をフラスコに添加した。フラスコから全ての細胞が剥離した時に、１０％のウシ胎児血清を加えたＥＭＥＭ（６ｍＬ）を添加して、混合し、均一な細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液を、５分間、１０００ｒｐｍで遠心分離を行ない、細胞残渣を得た。細胞残渣を、１０％のウシ胎児血清を含むＥＭＥＭ（６ｍＬ）中に穏やかに分散させた。６つのＴ−７５フラスコを上記のとおりに調製して、細胞懸濁液（１ｍＬ）を、各フラスコに添加した。フラスコを、湿度制御されたインキュベータ内で、５％ＣＯ２、３７℃で２４時間培養した。培地を、４８時間毎に換えた。７２時間までに、フラスコは〜７０％のコンフルエントとなり、播種する準備が整った。
【０１０４】
アッセイ
ＨｅｐＧ２細胞の懸濁液を、１０％のウシ胎児血清を含有するＥＭＥＭ培地中で調製した。細胞数を、血球計を用いて測定して、計測値を、２４ウェルプレートについて４ｘ１０５／ｍＬ／ウェルに調整した。該プレートを、湿度制御されたインキュベータ内で５％ＣＯ２にて３７℃で、細胞がコンフルエントとなるまでインキュベートした。細胞が７０〜８０％コンフルエントとなった場合に、該培地を廃棄して、１０μＭの標準化合物（ＭＦ−１５２）または５０μｇ／ｍＬの実施例１の抽出物を含有する新規培地に置きかえた。ＤＭＳＯを０.１％の最終濃度にて賦形剤ウェルに添加した。該プレートを、〜１８時間、終夜インキュベートした。翌日、培地を廃棄して、０.１％のＢＳＡ（脂肪酸不含）を加えた標準化合物／抽出物／ＤＭＳＯを含有するものと置換した。
【０１０５】
２μＣｉの１４Ｃ標識された酢酸を、ウェルあたりに添加して、プレートを、３７℃で６時間インキュベートして、その後に培地を廃棄して、脂質を抽出した。
【０１０６】
植物抽出物の細胞毒性効果を評価するために、細胞生存試験を、インキュベーション２時間後に、ＭＴＳ（３−（４,５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホニル）−２Ｈ−テトラゾリウム試薬を使用してパラレルプレート上で実施した。
【０１０７】
脂質抽出
抽出を以下のプロトコルのとおりに実行した：
実験終了時に、細胞を、氷冷ＰＢＳにより２回洗浄した。細胞を、１ｍＬの氷冷ＰＢＳ中にこそぎ落とし、４ｍＬのメタノール：クロロホルム（２：１）を含む１５ｍＬガラス管へピペットで移して、ボルテックス・ミキサーを用いて攪拌した。該チューブを４０００ｒｐｍで５分間回して、上清を新しい管に移した。大部分のタンパク質を含有するペレットを廃棄した。５０ｍＭ クエン酸（１ｍＬ）、水（２ｍＬ）およびクロロホルム（１ｍＬ）を、上記上清に添加して、ボルテックス・ミキサーを使用して撹拌した。混濁した２相の混合物を得た。該チューブを、冷却されていない遠心分離器において、１５分間、３５００ｒｐｍで回転させた。低部にクロロホルム相および上部に水／メタノール相を得た。大部分の沈殿タンパク質からなる２相の間に境界部分が存在する。上部の水／メタノール相を、相境界には触れずに廃棄した。脂質を含有する下部クロロホルム相を、新規チューブに移して、加熱ブロック上で蒸発させた。脂質を、クロロホルム：メタノール（２：１）（２００μＬ）に再溶解した。トリグリセリドを、ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸（８５：１５：０.５）の溶媒系を使用して、ＴＬＣシリカプレート上で単離した。放射性同位体で識別されていないトリグリセリド標準物も同時に行い、さらに全てのスポットをトリグリセリド標準物と同時にスポットした。ＴＬＣプレートを、ヨード蒸気に暴露して、トリグリセリドスポットを掻き取って、シンチレーション液（４ｍｌ）を含むシンチレーションバイアルに入れた。放射活性を、ｃｐｍにて液体シンチレーション計数器で計測し、該阻害を、ビヒクルを基準として計算した。結果を表４に示した。
【０１０８】
用量応答を、実施例１の抽出物のストック溶液を連続希釈することにより、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬの濃度で決定した。結果を表５に示した。
【０１０９】
表４：実施例１の抽出物によるトリグリセリド合成の阻害
【表６】
2015509976.tif 000007
＊ＭＦ１５２：標準化合物
(Bioorganic & Medical Chemistry Letters, 19, 5214-5217(2009))。
結論：実施例１の抽出物は、細胞を基にしたトリグリセリド合成アッセイにおいて活性であることが判った。
【０１１０】
表５：実施例１の抽出物によるトリグリセリド合成の阻害
【表７】
2015509976.tif 000008
* ＭＦ１５２：標準化合物(Bioorganic & Medical Chemistry Letters, 19, 5214-5217(2009))
結論：実施例１の抽出物が、細胞に基づくトリグリセリド合成アッセイにおいて活性であることが判った。
【０１１１】
生体内試験
生体内試験を、動物実験統制管理委員会（ＣＰＣＳＥＡ）および動物倫理委員会（ＩＡＥＣ）承認のガイドラインに従って行なった。
【０１１２】
実施例１１
高脂肪食（ＨＦＤ）誘導性の体重増加への実施例１の抽出物の効果
げっ歯類動物の高脂肪食（ＨＦＤ）誘導性肥満モデルは、抗肥満剤の効果を評価するために有用なモデルであることが報告されている[Obesity, 17(12), 2127-2133(2009)]。５８％ｋｃａｌの脂肪を含有する高脂肪食はマウスの肥満の原因となることが報告されている(Metabolism, 47 , 1354-1359(1998))。さらに、高脂肪食で飼育されたマウスは、普通食で飼育されたマウスよりも、有意に高い体重および有意に重い内臓脂肪組織（例えば、精巣上体の脂肪組織、腹膜後方の脂肪組織および腸間膜の脂肪組織）を示す[Life Sciences, 77, 194-204(2005)]。
【０１１３】
ＨＦＤ誘導性体重増加モデルは、様々な天然生成物による抗肥満効果の評価について報告されている(BMC Complementary and Alternative Medicine, 5:9, 1-10, (2005);BMC Complementary and Alternative Medicine, 6:9, 1-9(2006))。
【０１１４】
マウスにおけるＨＦＤ誘導性体重増加試験を行い、実施例１の抽出物の効果を評価した。
【０１１５】
オスのＣ５７ＢＬ／６ｊマウス（社内；Central Animal Facility, Piramal Healthcare Limited, Goregaon, Mumbai, Maharashtra, India)を、ＨＦＤ(60% kcal，D12492，Research Diets, USA)を用いて２週間馴化させた。体重増加を示すマウスを、試験のために選抜して、各々１０匹のマウスからなる処置群へ無作為に分けた。
【０１１６】
試験サンプルの調製
実施例１の抽出物の懸濁液を、ポリエチレングリコール４００（３０％）(PEG 400, Fisher Scientific, India)および０.５％カルボキシメチルセルロース（７０％）(CMC, Sigma, America)中で調製した。
【０１１７】
アッセイ
実施例１の抽出物を、５００ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量で、１日１回経口投与した。オルリスタット(Biocon, India)を、標準薬として使用して、１５ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量で、１日に２回経口投与した。別の群の１０匹のマウスに、正常なコントロールとして低脂肪食(LFD, 10% kcal, D12450B, Research Diet, USA)を与えた。賦形剤を、１０ｍＬ／ｋｇ体重の投薬量で、ＨＦＤおよびＬＦＤ対照群に投与した。
【０１１８】
この処置を６０日間継続した。体重および食餌摂取を、毎日モニターした。体重の％変化（１日目からの体重の％増加）および累積的な食餌摂取データを計算した。６１日目に、血液サンプル（〜２００μＬ／マウス）を、イソフルラン麻酔下にて、ヘパリン処理済（５０ＩＵ／ｍＬ）の微小遠心管に収集した。種々の血漿生化学パラメーターを評価するために、血漿を、４℃で１００００ｒｐｍの遠心分離により分離した。生化学分析を、ＢＳ−４００自動分析装置(Mindray, China)で行った。その後、マウスを屠殺して、器官/組織を解剖して、肝臓、心臓、腎臓、精巣上体の脂肪および腹膜後方の脂肪を秤量した。データを、一元配置分散分析、その後、ダンネットのポストホックテストにより統計学的有意差を分析し、Ｐ＜０.０５値を有意差とみなした。全ての分析を、Windows(GraphPad Software, San Diego(CA), USA)用のGraphPad Prism version 4.00を用いて行なった。結果を、表６、表７および表８に示した。
【０１１９】
表６：マウスにおけるＨＦＤ誘導性の体重増加に対する実施例１の抽出物の効果
【表８】
2015509976.tif 000009
* p<0.05、** p<0.01、HFD+賦形剤に対する;平均±S.E.M.
ＨＦＤ＋賦形剤群と比較して、実施例１の抽出物は、体重増加量の有意な阻害を示した。
【０１２０】
表７：累積的食餌摂取に対する実施例１の抽出物の効果
【表９】
2015509976.tif 000010
平均±Ｓ.Ｅ.Ｍ.
ＨＦＤ＋賦形剤群と比較した場合に、実施例１の抽出物においては累積的食餌摂取における有意な低下を観察しなかった。
【０１２１】
表８：脂肪組織重量に対する実施例１の抽出物の効果
【表１０】
2015509976.tif 000011
＃全脂肪＝精巣上体の脂肪＋腹膜後方の脂肪
＊ｐ＜０.０５、＊＊ｐ＜０.０１、ＨＦＤ＋賦形剤に対する；平均±Ｓ.Ｅ.Ｍ.
実施例１の抽出物は、ＨＦＤ＋賦形剤群と比較した場合に、脂肪組織重量が減少する傾向を示した。
【０１２２】
グルコース、トリグリセリド、コレステロール、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アルブミン、クレアチニンおよび尿素のようなパラメーターに対する血漿生化学分析は、実施例１の抽出物および賦形剤の群間の有意差を示さなかった。臓器重量（心臓、肝臓および腎臓）は、何ら有意差を示さなかった。
【０１２３】
結論：ＨＦＤのマウスに対する実施例１の抽出物の処置により、体重増加における有意な低下が生じた。体重増加におけるこの低下は、食餌摂取量における有意な低下なしに達成され、さらに歴然とした脂肪組織重量（脂肪量）の低下があった。実施例１の抽出物は、高脂肪食（ＨＦＤ）誘導性肥満モデルにおいて抗肥満活性を示した。
【国際調査報告】
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