(57)【要約】本発明は、少なくとも１つの非ペプチド性ポリマーと、一般式：Ｚ−（Ｘ）ｍ−（Ｙ）ｎ−Ｚ’ｐ（式中、Ｚは、Ｎ末端保護基であり；Ｘは、出現毎に、脂肪族アミノ酸、脂肪族アミノ酸誘導体及びグリシンから独立して選択され；Ｙは、出現毎に、極性アミノ酸及び極性アミノ酸誘導体から独立して選択され；Ｚ’は、Ｃ末端保護基であり；ｍは、２〜６から選択される整数であり；ｎは、１又は２から選択され；ｐは、０又は１から選択される）を有する少なくとも１つのペプチドとを含む複合ヒドロゲルに関する。本発明はさらに、複合ヒドロゲルを生産する方法、組織再生を促進するインプラント又は注射用剤として、また創傷治癒用の局所薬として、医薬品及び他の生物活性剤／成分を送達するための複合ヒドロゲルの使用に関する。本発明はさらに、複合ヒドロゲルを含むデバイス及び医薬用組成物又は美容用組成物、並びに複合ヒドロゲルの医療における使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの非ペプチド性ポリマーと、
一般式：
Ｚ−（Ｘ）ｍ−（Ｙ）ｎ−Ｚ’ｐ
（式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｘは、出現毎に、脂肪族アミノ酸、脂肪族アミノ酸誘導体及びグリシンから独立して選択され；
Ｙは、出現毎に、極性アミノ酸及び極性アミノ酸誘導体から独立して選択され；
Ｚ’は、Ｃ末端保護基であり；
ｍは、２〜６から選択される整数であり；
ｎは、１又は２から選択され；
ｐは、０又は１から選択される）
を有する少なくとも１つのペプチドと
を含む複合ヒドロゲル。
【請求項２】
疎水性が前記ペプチドのＮ末端からＣ末端へ低下する、請求項１に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項３】
前記脂肪族アミノ酸及び脂肪族アミノ酸誘導体が、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、ホモアリルグリシン、ホモプロパルギルグリシン、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ノルロイシン、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）及びバリン（Ｖａｌ、Ｖ）からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項４】
前記脂肪族アミノ酸が、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）及びバリン（Ｖａｌ、Ｖ）からなる群から選択される、請求項３に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項５】
前記極性アミノ酸及び極性アミノ酸誘導体が、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、５−Ｎ−エチル−グルタミン（テアニン）、シトルリン、チオ−シトルリン、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、ホモシステイン、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、エチオニン、セレノメチオニン、テルロメチオニン、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、ホモセリン、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、ホモアルギニン、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、アロ−トレオニン、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、ヒドロキシリシン、Ｎ（６）−カルボキシメチルリシン、オルニチン（Ｏｒｎ）、２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、２，４−ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）及びヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項６】
前記極性アミノ酸及び極性アミノ酸誘導体が、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、及び２，４−ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）からなる群から選択される、請求項５に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項７】
前記極性アミノ酸及び極性アミノ酸誘導体が、酸性極性アミノ酸及び酸性極性アミノ酸誘導体から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項８】
前記酸性極性アミノ酸が、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）及びグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）から選択される、請求項７に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項９】
前記極性アミノ酸及び極性アミノ酸誘導体が、塩基性極性アミノ酸及び塩基性極性アミノ酸誘導体から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項１０】
前記塩基性極性アミノ酸及び塩基性極性アミノ酸誘導体が、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、２，４−ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）及びヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）からなる群から選択される、請求項９に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項１１】
ｍが２〜５から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項１２】
ｍ＋ｎは≦７であるか、ｍ＋ｎは≦６である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項１３】
前記ペプチドが、Ｚ−ＬＩＶＡＧＤＤ−Ｚ’ｐ（配列番号１）、Ｚ−ＬＩＶＡＧＤＥ−Ｚ’ｐ（配列番号２）、Ｚ−ＬＩＶＡＧＥＤ−Ｚ’ｐ（配列番号３）、Ｚ−ＬＩＶＡＧＥＥ−Ｚ’ｐ（配列番号４）、Ｚ−ＬＩＶＡＧＫＣ−Ｚ’ｐ（配列番号５）、Ｚ−ＬＩＶＡＧＳＣ−Ｚ’ｐ（配列番号６）、Ｚ−ＡＩＶＡＧＫＣ−Ｚ’ｐ（配列番号７）、Ｚ−ＡＩＶＡＧＳＣ−Ｚ’ｐ（配列番号８）、Ｚ−ＬＩＶＡＧＣ−Ｚ’ｐ（配列番号９）、Ｚ−ＬＩＶＡＧＤ−Ｚ’ｐ（配列番号１０）、Ｚ−ＩＬＶＡＧＤ−Ｚ’ｐ（配列番号１１）、Ｚ−ＬＩＶＡＡＤ−Ｚ’ｐ（配列番号１２）、Ｚ−ＬＡＶＡＧＤ−Ｚ’ｐ（配列番号１３）、Ｚ−ＡＩＶＡＧＤ−Ｚ’ｐ（配列番号１４）、Ｚ−ＬＩＶＡＧＥ−Ｚ’ｐ（配列番号１５）、Ｚ−ＬＩＶＡＧＫ−Ｚ’ｐ（配列番号１６）、Ｚ−ＬＩＶＡＧＳ−Ｚ’ｐ（配列番号１７）、Ｚ−ＩＬＶＡＧＳ−Ｚ’ｐ（配列番号１８）、Ｚ−ＡＩＶＡＧＳ−Ｚ’ｐ（配列番号１９）、Ｚ−ＬＩＶＡＧＴ−Ｚ’ｐ（配列番号２０）、Ｚ−ＡＩＶＡＧＴ−Ｚ’ｐ（配列番号２１）、Ｚ−ＬＩＶＡＤ−Ｚ’ｐ（配列番号２２）、Ｚ−ＬＩＶＧＤ−Ｚ’ｐ（配列番号２３）、Ｚ−ＩＶＡＤ−Ｚ’ｐ（配列番号２４）、Ｚ−ＩＩＩＤ−Ｚ’ｐ（配列番号２５）、Ｚ−ＩＩＩＫ−Ｚ’ｐ（配列番号２６）、Ｚ−ＩＶＤ−Ｚ’ｐ（配列番号２７）、Ｚ−ＩＩＤ−Ｚ’ｐ（配列番号２８）、Ｚ−ＬＶＥ−Ｚ’ｐ（配列番号２９）、Ｚ−ＩＶＥ−Ｚ’ｐ（配列番号３０）、Ｚ−ＬＶＤ−Ｚ’ｐ（配列番号３１）、Ｚ−ＶＩＥ−Ｚ’ｐ（配列番号３２）、Ｚ−ＶＩＤ−Ｚ’ｐ（配列番号３３）、Ｚ−ＶＬＤ−Ｚ’ｐ（配列番号３４）、Ｚ−ＶＬＥ−Ｚ’ｐ（配列番号３５）、Ｚ−ＬＬＥ−Ｚ’ｐ（配列番号３６）、Ｚ−ＬＬＤ−Ｚ’ｐ（配列番号３７）、Ｚ−ＩＩＥ−Ｚ’ｐ（配列番号３８）、Ｚ−ＩＶＫ−Ｚ’ｐ（配列番号３９）、Ｚ−ＩＶ（Ｏｒｎ）−Ｚ’ｐ（配列番号４０）、Ｚ−ＩＶ（Ｄａｂ）−Ｚ’ｐ（配列番号４１）、Ｚ−ＩＶ（Ｄａｐ）−Ｚ’ｐ（配列番号４２）、Ｚ−ＩＶＳ−Ｚ’ｐ（配列番号４３）、Ｚ−ＬＶＳ−Ｚ’ｐ（配列番号４４）、Ｚ−ＬＶＫ−Ｚ’ｐ（配列番号４５）、Ｚ−ＬＶ（Ｏｒｎ）−Ｚ’ｐ（配列番号４６）、Ｚ−ＬＶ（Ｄａｂ）−Ｚ’ｐ（配列番号４７）、Ｚ−ＬＶ（Ｄａｐ）−Ｚ’ｐ（配列番号４８）、Ｚ−ＩＬＶＡＧＫ−Ｚ’ｐ（配列番号４９）、Ｚ−ＩＬＶＡＧ（Ｏｒｎ）−Ｚ’ｐ（配列番号５０）、Ｚ−ＩＬＶＡＧ（Ｄａｂ）−Ｚ’ｐ（配列番号５１）、Ｚ−ＩＬＶＡＧ（Ｄａｐ）−Ｚ’ｐ（配列番号５２）、Ｚ−ＩＬＶＡＧＳ−Ｚ’ｐ（配列番号５３）、Ｚ−ＩＬＶＡＧＫＣ−Ｚ’ｐ（配列番号５４）、Ｚ−ＡＩＶＡＧＫ−Ｚ’ｐ（配列番号５５）、Ｚ−ＡＩＶＡＧ（Ｏｒｎ）−Ｚ’ｐ（配列番号５６）、Ｚ−ＡＩＶＡＧ（Ｄａｂ）−Ｚ’ｐ（配列番号５７）、Ｚ−ＡＩＶＡＧ（Ｄａｐ）−Ｚ’ｐ（配列番号５８）、Ｚ−ＬＩＶＡＧ（Ｏｒｎ）−Ｚ’ｐ（配列番号５９）、Ｚ−ＬＩＶＡＧ（Ｄａｂ）−Ｚ’ｐ（配列番号６０）、Ｚ−ＬＩＶＡＧ（Ｄａｐ）−Ｚ’ｐ（配列番号６１）、Ｚ−ＩＩＩ（Ｏｒｎ）−Ｚ’ｐ（配列番号６２）、Ｚ−ＩＩＩ（Ｄａｂ）−Ｚ’ｐ（配列番号６３）及びＺ−ＩＩＩ（Ｄａｐ）−Ｚ’ｐ（配列番号６４）からなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項１４】
前記非ペプチド性ポリマーが、親水性又は両親媒性のポリマーである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項１５】
前記非ペプチド性ポリマーが、線状又は分枝状のポリマーである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項１６】
前記分枝状ポリマーがデンドリマーである、請求項１５に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項１７】
前記非ペプチド性ポリマーが、カチオン性ポリマー、アニオン性ポリマー、中性ポリマー又は前述のいずれかの組み合わせである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項１８】
前記カチオン性ポリマーが、キトサン、キチン、ポリ（アミドアミン）デンドリマー、ポリホスホアミダート、ポリエチレンイミン、スペルミン、スペルミジン、プトレッシン及びポリオルニチンからなる群から選択される、請求項１７に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項１９】
前記アニオン性ポリマーが、アルギン酸、ヘパリン硫酸、アニオン性デンドリマー、ポリカーボネート、ポリスルホン酸、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、デキストラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸、硫酸化多糖類、シアロプロテイン、フコイダン、アシアロフェチュイン、アシアロムチン及び核酸、例えばＲＮＡ及びＤＮＡからなる群から選択される、請求項１７に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項２０】
前記中性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、シクロデキストリン、ポリビニルアルコール、ポリ（ビニルピロリドン）、多糖類、ポリエステル、中性デンドリマー、ポリオキシエチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、ポリ（リン酸）、ポリ（ケイ酸）、ポリホスファゼン及びポリウレタンからなる群から選択される、請求項１７に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項２１】
複合ヒドロゲルが、少なくとも１つの生物活性剤をさらに含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの生物活性剤が、核酸、（ポリ）ペプチド、ウイルス粒子、オリゴ糖類、多糖類、ビタミン、シアル酸、抗原、抗生物質、抗炎症性分子、ワクチン、医薬品、プロドラッグ、ナノ粒子及び他の有機又は無機の化合物からなる群から選択される、請求項２１に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項２３】
前記少なくとも１つの生物活性剤が、増殖因子若しくは細胞接着分子、又は増殖因子若しくは細胞接着分子をコードしている核酸である、請求項２１又は２２に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項２４】
前記増殖因子がサイトカインを含むか、又は前記核酸がサイトカインをコードしている、請求項２３に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項２５】
前記少なくとも１つの生物活性剤が、前記複合ヒドロゲルによって封入されている、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項２６】
前記少なくとも１つの生物活性剤が、前記複合ヒドロゲルにコンジュゲートされている、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項２７】
前記少なくとも１つの生物活性剤が、前記非ペプチド性ポリマーに存在する少なくとも１つの官能基に結合されている、請求項２６に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項２８】
前記少なくとも１つの生物活性剤が、前記ペプチドに存在する少なくとも１つの官能基に結合されている、請求項２６に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項２９】
前記少なくとも１つの官能基が、アミン、カルボン酸、チオール、アルコール、炭水化物、アミド、イミン、イミド、アジド、ニトリル、ペルオキシド、エステル、チオエステル、リン酸塩、アリール、アルデヒド、ケトン、硫酸塩、亜硫酸塩、硝酸塩、亜硝酸塩、ホスホン酸塩、シラン、アルカン、アルケン及びアルキンからなる群から選択される、請求項２７又は２８に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項３０】
前記少なくとも１つの生物活性剤が負荷電生物活性剤、例えば核酸であり、前記非ペプチド性ポリマーがカチオン性ポリマーである、請求項２１〜２９のいずれか一項に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項３１】
前記少なくとも１つの生物活性剤が正荷電生物活性剤であり、前記非ペプチド性ポリマーがアニオン性ポリマーである、請求項２１〜２９のいずれか一項に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項３２】
前記少なくとも１つの生物活性剤が中性生物活性剤であり、前記非ペプチド性ポリマーが中性ポリマーである、請求項２１〜２９のいずれか一項に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項３３】
前記非ペプチド性ポリマーが複素環ポリマーである、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項３４】
前記複素環ポリマーが、核酸又はオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドである、請求項３３に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項３５】
前記核酸、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾核酸及び人工核酸及び核酸類似体、或いはその組み合わせを含む、請求項３４に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項３６】
前記核酸、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが、プラスミドＤＮＡ、アプタマー、ｍＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及び短ヘアピンＲＮＡからなる群から選択される、請求項３４又は３５に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項３７】
前記核酸、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが、生物活性剤であるか又は生物活性剤をコードしている、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項３８】
前記核酸、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが増殖因子、例えばサイトカインをコードしている、請求項３７に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項３９】
前記核酸、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが、細胞接着分子をコードしている、請求項３７に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項４０】
前記核酸、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが、請求項２２で定義した生物活性剤にコンジュゲートしている、請求項３４〜３９のいずれか一項に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項４１】
前記Ｎ末端保護基が一般式−Ｃ（Ｏ）−Ｒを有し、ＲがＨ、アルキル及び置換アルキルからなる群から選択される、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項４２】
前記Ｎ末端保護基がアセチル基である、請求項４１に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項４３】
前記Ｃ末端保護基がアミド基である、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項４４】
前記少なくとも１つのペプチドのＣ末端が式−ＣＯＮＨＲ又は−ＣＯＮＲＲ’を有し、Ｒ及びＲ’がＨ、アルキル及び置換アルキルからなる群から選択される、請求項４３に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項４５】
前記Ｃ末端保護基がエステル基である、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項４６】
前記少なくとも１つのペプチドのＣ末端が式−ＣＯ２Ｒを有し、ＲがＨ、アルキル及び置換アルキルからなる群から選択される、請求項４５に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項４７】
前記Ｃ末端保護基が、天然及び合成のアミノ酸誘導体を含むペプチド擬似体分子であり、前記ペプチド擬似体分子のＣ末端がカルボン酸、アミド、アルコール、アルデヒド、アミン、イミン、ニトリル、尿素類似体、チオール、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩及び硝酸塩からなる群から選択される官能基で修飾されていてもよい、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項４８】
前記少なくとも１つの非ペプチド性ポリマーが、前記複合ヒドロゲルの全重量に対して５０％（ｗ／ｗ）以下の濃度で存在する、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項４９】
前記少なくとも１つの非ペプチド性ポリマーが、前記複合ヒドロゲルの全重量に対して４０％（ｗ／ｗ）以下の濃度で存在する、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項５０】
前記複合ヒドロゲルの核酸全含有量が投入比の５０％以下である、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項５１】
前記少なくとも１つの非ペプチド性ポリマーと前記少なくとも１つのペプチドとの混合物の水溶液を調製するステップ、又は、
前記少なくとも１つのペプチドを含む予備調製したヒドロゲルを、前記少なくとも１つの非ペプチド性ポリマーの溶液で処理するステップ
を含む、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の複合ヒドロゲルを生産する方法。
【請求項５２】
少なくとも１つの生物活性剤を添加するステップ；
前記水溶液に紫外線（ＵＶ）光開始剤を添加し、ＵＶ照射に前記水溶液を曝露するステップ；
少なくとも１つのカップリング剤を添加して、共有結合の形成を促進するステップ；
ゲル化促進剤として作用する少なくとも１つの化合物を添加するステップ；
少なくとも１つのバッファー、好ましくは少なくとも１つの生理学上許容可能なバッファーを添加するステップ
の少なくとも１つをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
細胞培養用の３次元足場としての請求項１〜５０のいずれか一項に記載の複合ヒドロゲルの使用。
【請求項５４】
前記細胞が、胚性幹細胞、ヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、前駆細胞及び成体幹細胞、臍帯血幹細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来幹細胞、造血幹細胞を含む、幹細胞である、請求項５３に記載の使用。
【請求項５５】
薬剤送達用の、好ましくは持続放出性若しくは制御放出性の薬剤送達用のデバイスとして、又はインプラントとして、又はインサイチュでゲル化する注射用剤としての、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の複合ヒドロゲルの使用。
【請求項５６】
請求項１〜５０のいずれか一項に記載の複合ヒドロゲルを含む、細胞培養用の３次元足場。
【請求項５７】
前記細胞が、胚性幹細胞、ヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、前駆細胞及び成体幹細胞、臍帯血幹細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来幹細胞、造血幹細胞を含む、幹細胞である、請求項５６に記載の３次元足場。
【請求項５８】
請求項１〜５０のいずれか一項に記載の複合ヒドロゲルを含む、薬剤送達用のデバイス、好ましくは持続放出性又は制御放出性製剤送達用のデバイス。
【請求項５９】
デバイスが電気的構成要素をさらに含む、請求項５８に記載のデバイス。
【請求項６０】
請求項１〜５０のいずれか一項に記載の複合ヒドロゲルを含む、インプラント又は注射用剤。
【請求項６１】
請求項１〜５０のいずれか一項に記載の複合ヒドロゲルを含む、医薬用又は美容用組成物。
【請求項６２】
再生医療で使用するための、又は組織工学及び組織再生、例えば、脂肪組織及び軟骨組織の再生で使用するための請求項１〜５０のいずれか一項に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項６３】
創傷又は骨格系変性疾患、例えば変性円板疾患又は尿失禁の治療で使用するための請求項１〜５０のいずれか一項に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項６４】
美容品として使用するための請求項１〜５０のいずれか一項に記載の複合ヒドロゲル。
【請求項６５】
請求項１〜５０のいずれか一項に記載の複合ヒドロゲルを含む電子デバイス。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、少なくとも１つの非ペプチド性ポリマーと、一般式：Ｚ−（Ｘ）ｍ−（Ｙ）ｎ−Ｚ’ｐ（式中、Ｚは、Ｎ末端保護基であり；Ｘは、出現毎に、脂肪族アミノ酸、脂肪族アミノ酸誘導体及びグリシンから独立して選択され；Ｙは、出現毎に、極性アミノ酸及び極性アミノ酸誘導体から独立して選択され；Ｚ’は、Ｃ末端保護基であり；ｍは、２〜６から選択される整数であり；ｎは、１又は２から選択され；ｐは、０又は１から選択される）を有する少なくとも１つのペプチドとを含む複合ヒドロゲルに関する。本発明はさらに、複合ヒドロゲルを生産する方法、組織再生を促進するインプラント又は注射用剤として、また創傷治癒用の局所薬として、医薬品及び他の生物活性剤／成分を送達するための複合ヒドロゲルの使用に関する。本発明はさらに、複合ヒドロゲルを含むデバイス及び医薬用組成物又は美容用組成物、並びに複合ヒドロゲルの医療における使用に関する。
【０００２】
［発明の背景］
十分に特性決定され、明確に規定された再生医療用の３次元足場に対する、未だ対処されていないニーズがある。細胞治療への幹細胞の使用における進歩は、フィーダー細胞層又はコーティング、例えばマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（商標）コーティングの必要性によって阻まれている。これらのコーティングは、基本的に２次元（２Ｄ）の支持体しか提供しない。理想的な合成細胞培養基材は、胚性及び誘導性の多能性幹細胞の幹細胞性を維持しながら、高増殖率を維持しなければならない。また、特定の細胞系統へ確実に幹細胞を分化させる足場のニーズもある。
【０００３】
さらに、整形外科及び美容整形においてインビボで移植し組織損傷を再生することができる同様の生理活性足場に対する臨床上のニーズもある。理想的には、このような構築物は、暫定的な支持体を提供し、しかも回復中に損傷から細胞を保護するために、機械的な剛性がなければならない。生理活性治療薬を組み入れることによって、生来の組織との一体化が促進され、移植拒絶を予防することができる。組織が再生するにつれて、足場が生体適合性の副生成物へ生物分解されれば、インプラントとしての構築物の魅力がさらに高まる。
【０００４】
変性円板疾患には５０歳以上の人々の８５％が罹患しており、現在の治療では、変性した円板を除去し、脊椎骨又は人工円板移植片を結合させる外科的介入が必要である。手術には常に事故の危険がある。
【０００５】
さらに、足場は、様々なタイプの創傷用の包帯として外用できることが望ましく、この場合、生物活性剤／成分、例えば、生体接着剤、鎮痛剤、抗炎症剤及び抗生物質を組み込むと創傷治癒及び組織再生が促進される。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、上記で言及した問題の少なくとも１つを改善することである。
【０００７】
当技術分野においては、例えば、培養細胞、インプラント及び薬剤送達を含む、再生医療用の足場に対する手段及び方法の改善が必要とされている。
【０００８】
［発明の概要］
本発明によれば、この目的は、
少なくとも１つの非ペプチド性ポリマーと、
一般式：Ｚ−（Ｘ）ｍ−（Ｙ）ｎ−Ｚ’ｐ
（式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｘは、出現毎に、脂肪族アミノ酸、脂肪族アミノ酸誘導体及びグリシンから独立して選択され；
Ｙは、出現毎に、極性アミノ酸及び極性アミノ酸誘導体から独立して選択され；
Ｚ’は、Ｃ末端保護基であり；
ｍは、２〜６から選択される整数であり；
ｎは、１又は２から選択され；
ｐは、０又は１から選択される）
を有する少なくとも１つのペプチドと
を含む複合ヒドロゲルによって解決される。
【０００９】
本発明によれば、この目的は、
前記少なくとも１つの非ペプチド性ポリマーと前記少なくとも１つのペプチドとの混合物の水溶液を調製するステップ、又は、
前記少なくとも１つのペプチドを含む予備調製したヒドロゲルを、前記少なくとも１つの非ペプチド性ポリマーの溶液で処理するステップ
を含む、本発明による複合ヒドロゲルを生産する方法により解決される。
【００１０】
本発明によれば、この目的は、細胞培養用の３次元（３Ｄ）足場としての本発明による複合ヒドロゲルの使用によって解決される。
【００１１】
本発明によれば、この目的は、薬剤送達用の、好ましくは持続放出性若しくは制御放出性の薬剤送達用のデバイスとして、又はインプラントとして、又はインサイチュでゲル化する注射用剤としての本発明による複合ヒドロゲルの使用によって解決される。
【００１２】
本発明によれば、この目的は、本発明による複合ヒドロゲルを含む細胞培養用の３Ｄ足場によって解決される。
【００１３】
本発明によれば、この目的は、本発明による複合ヒドロゲルを含む、薬剤送達用の、好ましくは持続放出性又は制御放出性の薬剤送達用のデバイスによって解決される。
【００１４】
本発明によれば、この目的は、本発明による複合ヒドロゲルを含む、インプラント又は注射用剤によって解決される。
【００１５】
本発明によれば、この目的は、本発明による複合ヒドロゲルを含む、医薬用又は美容用組成物によって解決される。
【００１６】
本発明によれば、この目的は、医療で使用するための本発明による複合ヒドロゲルによって解決される。
【００１７】
本発明によれば、この目的は、再生医療で使用するための、又は組織工学及び組織再生で使用するための本発明による複合ヒドロゲルによって解決される。
【００１８】
本発明によれば、この目的は、創傷又は骨格系変性疾患、例えば変性円板疾患又は尿失禁の治療で使用するための本発明による複合ヒドロゲルによって解決される。
【００１９】
本発明によれば、この目的は、美容品として使用するための本発明による複合ヒドロゲルによって解決される。
【００２０】
本発明によれば、この目的は、本発明による複合ヒドロゲルを含む、電子デバイスによって解決される。
【００２１】
［発明の好ましい実施形態の説明］
本発明を以下でより詳細に説明する前に、本発明は、本明細書に記載の特定の方法、プロトコル及び試薬に限定されず、これらは変更され得るということを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するために限るものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものではない。特段の定義がない限り、本明細書で使用されているすべての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本発明の目的において、本明細書で引用されているすべての参考文献は、参照によりその全体を援用するものとする。
【００２２】
アミノ酸、ヌクレオチド、成分、部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）の数、又は他の数値データは、範囲形式で本明細書に表示又は提示することがある。このような範囲形式は、便宜的に及び簡潔化のために用いられ、したがって、明示的範囲の限界として列挙した数値を含むだけでなく、すべての個々の数値又は各数値及びサブ範囲が明確に列挙されているかのようにその範囲内に包含される部分範囲も含むよう柔軟に解釈されるものと理解されたい。例として、「３〜８個のアミノ酸」の数値範囲は、明示的に挙げた３、８の値だけではなく、示した範囲内の個々の値及びサブ範囲も含むと解釈するものとする。したがって、この数値の範囲内の個々の値、例えば３、４、５、６、７、８、及びサブ範囲、例えば３〜６、３〜７なども含まれる。これと同じ原理が、１つの数値のみを挙げている範囲に適用される。さらに、このような解釈は、記載されている範囲の幅又は特性に関係なく適用されるものとする。
【００２３】
超小型ペプチドポリマー複合体ヒドロゲル
上記のように、本発明は、少なくとも１つの非ペプチド性ポリマーと、少なくとも１つのペプチドとを含む複合ヒドロゲルを提供する。
【００２４】
少なくとも１つのペプチドは、一般式：
Ｚ−（Ｘ）ｍ−（Ｙ）ｎ−Ｚ’ｐ
（式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｘは、出現毎に、脂肪族アミノ酸、脂肪族アミノ酸誘導体及びグリシンから独立して選択され；
Ｙは、出現毎に、極性アミノ酸及び極性アミノ酸誘導体から独立して選択され；
Ｚ’は、Ｃ末端保護基であり；
ｍは、２〜６から選択される整数であり；
ｎは、１又は２から選択され；
ｐは、０又は１から選択される）
を有する。
【００２５】
本発明は、例えばコンジュゲーション又は封入によって生理活性治療薬／薬剤（例えば、増殖因子及びプロドラッグなど）を添加することができる、自己組織性超小型ペプチドとポリマーとを組み合わせる多用途の複合ヒドロゲルを提供する。
【００２６】
疎水性は、本発明の複合ヒドロゲルの前記ペプチドのＮ末端からＣ末端へ低下するのが好ましい。
【００２７】
本発明の複合ヒドロゲルは、２つ以上のペプチド、例えば２つ、３つ又は４つ以上のペプチドを含むことができ、それらのペプチドは、アミノ酸配列、Ｎ末端及び／又はＣ末端保護基が異なっていてもよい。
【００２８】
前記脂肪族アミノ酸及び脂肪族アミノ酸誘導体は、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、ホモアリルグリシン、ホモプロパルギルグリシン、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ノルロイシン、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）及びバリン（Ｖａｌ、Ｖ）からなる群から選択され、前記脂肪族アミノ酸は、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）及びバリン（Ｖａｌ、Ｖ）からなる群から選択されるのが好ましい。
【００２９】
前記極性アミノ酸及び極性アミノ酸誘導体は、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、５−Ｎ−エチル−グルタミン（テアニン）、シトルリン、チオ−シトルリン、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、ホモシステイン、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、エチオニン、セレノメチオニン、テルロメチオニン、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、ホモセリン、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、ホモアルギニン、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、アロ−トレオニン、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、ヒドロキシリシン、Ｎ（６）−カルボキシメチルリシン、オルニチン（Ｏｒｎ）、２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ又はＤｂｕ）、２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ又はＤｐｒ）及びヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）からなる群から選択されるのが好ましく、
前記極性アミノ酸及び極性アミノ酸誘導体は、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ又はＤｂｕ）、及び２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ又はＤｐｒ）からなる群から選択されるのがさらに好ましい。
【００３０】
一実施形態では、前記極性アミノ酸及び極性アミノ酸誘導体は、酸性極性アミノ酸及び酸性極性アミノ酸誘導体から選択される。本発明による好ましい酸性極性アミノ酸は、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）及びグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）である。
【００３１】
一実施形態では、前記極性アミノ酸及び極性アミノ酸誘導体は、塩基性極性アミノ酸及び塩基性極性アミノ酸誘導体から選択される。本発明による好ましい塩基性極性アミノ酸及び塩基性極性アミノ酸誘導体は、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ又はＤｂｕ）、２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ又はＤｐｒ）及びヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）である。
【００３２】
ｍは２〜５から選択されるのが好ましい。
【００３３】
ｍ＋ｎは≦７であるか、ｍ＋ｎは≦６であるのが好ましい。
【００３４】
例えば、ｍは５であり、ｎは２である；又は、ｍは５であり、ｎは１である；又は、ｍは４であり、ｎは１である；又は、ｍは３であり、ｎは１である；又は、ｍは２であり、ｎは１である。
【００３５】
例えば、ｍ＋ｎは３、４、５、６又は７である。
【００３６】
前記ペプチドは、Ｚ−ＬＩＶＡＧＤＤ−Ｚ’ｐ（配列番号１）、Ｚ−ＬＩＶＡＧＤＥ−Ｚ’ｐ（配列番号２）、Ｚ−ＬＩＶＡＧＥＤ−Ｚ’ｐ（配列番号３）、Ｚ−ＬＩＶＡＧＥＥ−Ｚ’ｐ（配列番号４）、Ｚ−ＬＩＶＡＧＫＣ−Ｚ’ｐ（配列番号５）、Ｚ−ＬＩＶＡＧＳＣ−Ｚ’ｐ（配列番号６）、Ｚ−ＡＩＶＡＧＫＣ−Ｚ’ｐ（配列番号７）、Ｚ−ＡＩＶＡＧＳＣ−Ｚ’ｐ（配列番号８）、Ｚ−ＬＩＶＡＧＣ−Ｚ’ｐ（配列番号９）、Ｚ−ＬＩＶＡＧＤ−Ｚ’ｐ（配列番号１０）、Ｚ−ＩＬＶＡＧＤ−Ｚ’ｐ（配列番号１１）、Ｚ−ＬＩＶＡＡＤ−Ｚ’ｐ（配列番号１２）、Ｚ−ＬＡＶＡＧＤ−Ｚ’ｐ（配列番号１３）、Ｚ−ＡＩＶＡＧＤ−Ｚ’ｐ（配列番号１４）、Ｚ−ＬＩＶＡＧＥ−Ｚ’ｐ（配列番号１５）、Ｚ−ＬＩＶＡＧＫ−Ｚ’ｐ（配列番号１６）、Ｚ−ＬＩＶＡＧＳ−Ｚ’ｐ（配列番号１７）、Ｚ−ＩＬＶＡＧＳ−Ｚ’ｐ（配列番号１８）、Ｚ−ＡＩＶＡＧＳ−Ｚ’ｐ（配列番号１９）、Ｚ−ＬＩＶＡＧＴ−Ｚ’ｐ（配列番号２０）、Ｚ−ＡＩＶＡＧＴ−Ｚ’ｐ（配列番号２１）、Ｚ−ＬＩＶＡＤ−Ｚ’ｐ（配列番号２２）、Ｚ−ＬＩＶＧＤ−Ｚ’ｐ（配列番号２３）、Ｚ−ＩＶＡＤ−Ｚ’ｐ（配列番号２４）、Ｚ−ＩＩＩＤ−Ｚ’ｐ（配列番号２５）、Ｚ−ＩＩＩＫ−Ｚ’ｐ（配列番号２６）、Ｚ−ＩＶＤ−Ｚ’ｐ（配列番号２７）、Ｚ−ＩＩＤ−Ｚ’ｐ（配列番号２８）、Ｚ−ＬＶＥ−Ｚ’ｐ（配列番号２９）、Ｚ−ＩＶＥ−Ｚ’ｐ（配列番号３０）、Ｚ−ＬＶＤ−Ｚ’ｐ（配列番号３１）、Ｚ−ＶＩＥ−Ｚ’ｐ（配列番号３２）、Ｚ−ＶＩＤ−Ｚ’ｐ（配列番号３３）、Ｚ−ＶＬＤ−Ｚ’ｐ（配列番号３４）、Ｚ−ＶＬＥ−Ｚ’ｐ（配列番号３５）、Ｚ−ＬＬＥ−Ｚ’ｐ（配列番号３６）、Ｚ−ＬＬＤ−Ｚ’ｐ（配列番号３７）、Ｚ−ＩＩＥ−Ｚ’ｐ（配列番号３８）、Ｚ−ＩＶＫ−Ｚ’ｐ（配列番号３９）、Ｚ−ＩＶ（Ｏｒｎ）−Ｚ’ｐ（配列番号４０）、Ｚ−ＩＶ（Ｄａｂ）−Ｚ’ｐ（配列番号４１）、Ｚ−ＩＶ（Ｄａｐ）−Ｚ’ｐ（配列番号４２）、Ｚ−ＩＶＳ−Ｚ’ｐ（配列番号４３）、Ｚ−ＬＶＳ−Ｚ’ｐ（配列番号４４）、Ｚ−ＬＶＫ−Ｚ’ｐ（配列番号４５）、Ｚ−ＬＶ（Ｏｒｎ）−Ｚ’ｐ（配列番号４６）、Ｚ−ＬＶ（Ｄａｂ）−Ｚ’ｐ（配列番号４７）、Ｚ−ＬＶ（Ｄａｐ）−Ｚ’ｐ（配列番号４８）、Ｚ−ＩＬＶＡＧＫ−Ｚ’ｐ（配列番号４９）、Ｚ−ＩＬＶＡＧ（Ｏｒｎ）−Ｚ’ｐ（配列番号５０）、Ｚ−ＩＬＶＡＧ（Ｄａｂ）−Ｚ’ｐ（配列番号５１）、Ｚ−ＩＬＶＡＧ（Ｄａｐ）−Ｚ’ｐ（配列番号５２）、Ｚ−ＩＬＶＡＧＳ−Ｚ’ｐ（配列番号５３）、Ｚ−ＩＬＶＡＧＫＣ−Ｚ’ｐ（配列番号５４）、Ｚ−ＡＩＶＡＧＫ−Ｚ’ｐ（配列番号５５）、Ｚ−ＡＩＶＡＧ（Ｏｒｎ）−Ｚ’ｐ（配列番号５６）、Ｚ−ＡＩＶＡＧ（Ｄａｂ）−Ｚ’ｐ（配列番号５７）、Ｚ−ＡＩＶＡＧ（Ｄａｐ）−Ｚ’ｐ（配列番号５８）、Ｚ−ＬＩＶＡＧ（Ｏｒｎ）−Ｚ’ｐ（配列番号５９）、Ｚ−ＬＩＶＡＧ（Ｄａｂ）−Ｚ’ｐ（配列番号６０）、Ｚ−ＬＩＶＡＧ（Ｄａｐ）−Ｚ’ｐ（配列番号６１）、Ｚ−ＩＩＩ（Ｏｒｎ）−Ｚ’ｐ（配列番号６２）、Ｚ−ＩＩＩ（Ｄａｂ）−Ｚ’ｐ（配列番号６３）及びＺ−ＩＩＩ（Ｄａｐ）−Ｚ’ｐ（配列番号６４）からなる群から選択されるのが好ましい。
【００３７】
Ｎ末端保護基としてアセチル基を有し、Ｃ末端保護基を欠如している例示のペプチドは、配列番号６５〜７６に示す。
【００３８】
本発明の複合ヒドロゲルは、２つ以上の非ペプチド性ポリマー、例えば２つ、３つ又は４つ以上の非ペプチド性ポリマー、例えば、線状ポリマーと分枝状ポリマーの混合物などを含んでいてもよい。
【００３９】
前記非ペプチド性ポリマーは、親水性又は両親媒性のポリマーであるのが好ましい。
【００４０】
前記非ペプチド性ポリマーは、線状又は分枝状のポリマーであるのが好ましい。
【００４１】
一実施形態では、前記分枝状ポリマーはデンドリマーである。例示のデンドリマーは、ポリ（アミドアミン）デンドリマー、デンドロン、ポリリシンデンドリマー及びポリプロピレンイミンデンドリマーである。
【００４２】
一実施形態では、前記非ペプチド性ポリマーは、カチオン性ポリマー又はアニオン性ポリマー又は中性ポリマー、又は前述のいずれかの組み合わせである。
【００４３】
カチオン性ポリマーは、キトサン、キチン、ポリ（アミドアミン）デンドリマー、ポリホスホアミダート、ポリエチレンイミン、スペルミン、スペルミジン、プトレッシン及びポリオルニチンからなる群から選択されるのが好ましい。特に好ましい実施形態では、カチオン性ポリマーはキトサンである。
【００４４】
アニオン性ポリマーは、アルギン酸、ヘパリン硫酸、アニオン性デンドリマー、ポリカ−ボネート、ポリスルホン酸、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、デキストラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸、硫酸化多糖類、シアロプロテイン、フコイダン、アシアロフェチュイン、アシアロムチン及び核酸、例えば、ＲＮＡ及びＤＮＡからなる群から選択されるのが好ましい。
【００４５】
中性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、シクロデキストリン、ポリビニルアルコール、ポリ（ビニルピロリドン）、多糖類、ポリエステル、中性デンドリマー、ポリオキシエチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、ポリ（リン酸）、ポリ（ケイ酸）、ポリホスファゼン及びポリウレタンからなる群から選択されるのが好ましい。中性ポリマーは、線状又は分枝状のＰＥＧであるのが好ましい。
【００４６】
一実施形態では、前記非ペプチド性ポリマーはカチオン性ポリマーであり、前記極性アミノ酸及び極性アミノ酸誘導体は、酸性極性アミノ酸及び酸性極性アミノ酸誘導体から選択される。
【００４７】
別の実施形態では、前記非ペプチド性ポリマーは、アニオン性ポリマー、例えば、核酸、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドであり、前記極性アミノ酸及び極性アミノ酸誘導体は、塩基性極性アミノ酸及び塩基性極性アミノ酸誘導体から選択される。
【００４８】
さらに別の実施形態では、前記非ペプチド性ポリマーは中性ポリマーであり、前記極性アミノ酸及び極性アミノ酸誘導体は、中性極性アミノ酸及び中性極性アミノ酸誘導体（すなわち、電荷を持たない極性アミノ酸又は極性アミノ酸誘導体）から選択される。
【００４９】
さらに別の実施形態では、前記非ペプチド性ポリマーは中性ポリマーであり、前記極性アミノ酸及び極性アミノ酸誘導体は、酸性極性アミノ酸及び酸性極性アミノ酸誘導体から選択される。
【００５０】
さらに別の実施形態では、前記非ペプチド性ポリマーは中性ポリマーであり、前記極性アミノ酸及び極性アミノ酸誘導体は、塩基性極性アミノ酸及び塩基性極性アミノ酸誘導体から選択される。
【００５１】
一実施形態では、前記非ペプチド性ポリマーは、生体適合性ポリマーである。
【００５２】
一実施形態では、複合ヒドロゲルは、少なくとも１つの生物活性剤をさらに含む。
【００５３】
本発明の複合ヒドロゲルは、２つ以上の生物活性剤、例えば、２つ、３つ又は４つ以上の生物活性剤を含むことができる。
【００５４】
前記少なくとも１つの生物活性剤は、
核酸、
（ポリ）ペプチド、
ウイルス粒子、
オリゴ糖類、
多糖類、
ビタミン、
シアル酸、
抗原、
抗生物質、
抗炎症性分子、
ワクチン、
医薬品、
プロドラッグ、
ナノ粒子
及び他の有機又は無機の化合物
からなる群から選択されるのが好ましい。
【００５５】
一実施形態では、前記少なくとも１つの生物活性剤は、増殖因子又は増殖因子をコードしている核酸である。
【００５６】
例えば、増殖因子はサイトカインを含むか、又は核酸はサイトカインをコードしている。
【００５７】
一実施形態では、前記少なくとも１つの生物活性剤は、細胞接着分子、又は細胞接着分子をコードしている核酸である。
【００５８】
一実施形態では、前記少なくとも１つの生物活性剤は、複合ヒドロゲルによって封入されている。
【００５９】
一実施形態では、前記少なくとも１つの生物活性剤は、複合ヒドロゲルにコンジュゲートされている。
【００６０】
一実施形態では、前記少なくとも１つの生物活性剤は、非ペプチド性ポリマーに存在する少なくとも１つの官能基に結合されている。
【００６１】
別の実施形態では、前記少なくとも１つの生物活性剤は、前記ペプチドに存在する少なくとも１つの官能基に結合されている。
【００６２】
前記少なくとも１つの官能基は、アミン、カルボン酸、チオール、アルコール、炭水化物、アミド、イミン、イミド、アジド、ニトリル、ペルオキシド、エステル、チオエステル、リン酸塩、アリール、アルデヒド、ケトン、硫酸塩、亜硫酸塩、硝酸塩、亜硝酸塩、ホスホン酸塩、シラン、アルカン、アルケン及びアルキンからなる群から選択されるのが好ましい。
【００６３】
一実施形態では、少なくとも１つの生物活性剤は負荷電生物活性剤、例えば核酸であり、非ペプチド性ポリマーはカチオン性ポリマーである。
【００６４】
一実施形態では、少なくとも１つの生物活性剤は正荷電生物活性剤であり、非ペプチド性ポリマーはアニオン性ポリマーである。
【００６５】
一実施形態では、少なくとも１つの生物活性剤は中性生物活性剤であり、非ペプチド性ポリマーは中性ポリマーである。
【００６６】
一実施形態では、非ペプチド性ポリマーは複素環ポリマーである。
【００６７】
複素環ポリマーは、核酸又はオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドであるのが好ましい。
【００６８】
核酸、オリゴヌクレオチド及び／又はポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾核酸及び人工核酸及び核酸類似体（例えば、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＧＮＡ、ＴＮＡ）、又はその組み合わせを含むか、それらであるのが好ましい。
【００６９】
一実施形態では、前記核酸、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、プラスミドＤＮＡ、アプタマー、ｍＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及び短ヘアピンＲＮＡからなる群から選択される。
【００７０】
本発明の一実施形態では、前記核酸、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、生物活性剤であるか、又は生物活性剤をコードしている。一実施形態では、核酸は、複合ヒドロゲルの非ペプチド性ポリマーだけでなく生物活性剤である。
【００７１】
一実施形態では、前記核酸、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、増殖因子、例えばサイトカインをコードしている。
【００７２】
一実施形態では、前記核酸、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、細胞接着分子をコードしている。
【００７３】
一実施形態では、前記核酸、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、分泌型分子、例えばインスリンをコードしている。
【００７４】
一実施形態では、前記核酸、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、細胞挙動に影響を及ぼし得るよりも細胞内分子をコードしている。
【００７５】
一実施形態では、前記核酸、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、細胞挙動に影響を及ぼし得る膜結合型分子をコードしている。
【００７６】
本発明の一実施形態では、核酸は、上記で定義した（さらなる）生物活性剤にコンジュゲートされる。この実施形態では、核酸は複合ヒドロゲルの非ペプチド性ポリマーであり、複合ヒドロゲルは生物活性剤として別の成分を含む。
【００７７】
前記Ｎ末端保護基は一般式−Ｃ（Ｏ）−Ｒを有し、式中、Ｒは、Ｈ、アルキル及び置換アルキル、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル及びイソブチルからなる群から選択されるのが好ましい。
【００７８】
一実施形態では、前記Ｎ末端保護基はアセチル基である。
【００７９】
一実施形態では、Ｃ末端保護基はアミド基であり、ここで、前記少なくとも１つのペプチドのＣ末端は式−ＣＯＮＨＲ又は−ＣＯＮＲＲ’を有し、式中、Ｒ及びＲ’はＨ、アルキル及び置換アルキルからなる群から選択されるのが好ましい。
【００８０】
一実施形態では、Ｃ末端保護基はエステル基であり、ここで、Ｃ末端は式−ＣＯ２Ｒを有し、式中、ＲはＨ、アルキル及び置換アルキルからなる群から選択されるのが好ましい。
【００８１】
一実施形態では、前記Ｃ末端保護基は、天然及び合成のアミノ酸誘導体をはじめとするペプチド擬似体分子であり、ここで、前記ペプチド擬似体分子のＣ末端は、カルボン酸、アミド、アルコール、アルデヒド、アミン、イミン、ニトリル、尿素類似体、チオール、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩及び硝酸塩からなる群から選択される官能基で修飾されていてもよい。
【００８２】
少なくとも１つの非ペプチド性ポリマーは、前記複合ヒドロゲルの全重量に対して５０％（ｗ／ｗ）以下の濃度で存在するのが好ましい。
【００８３】
少なくとも１つの非ペプチド性ポリマーは、前記複合ヒドロゲルの全重量に対して４０％（ｗ／ｗ）以下の濃度で存在するのが好ましい。
【００８４】
前記複合ヒドロゲルの核酸全含有量は、投入比の５０％以下であるのが好ましい。
【００８５】
複合ヒドロゲルを生産する方法
上記のように、本発明は、本発明の複合ヒドロゲルを生産する方法を提供する。
【００８６】
前記方法は、
前記少なくとも１つの非ペプチド性ポリマーと前記少なくとも１つのペプチドとの混合物の水溶液を調製するステップ、又は、
前記少なくとも１つのペプチドを含む予備調製したヒドロゲルを、前記少なくとも１つの非ペプチド性ポリマーの溶液で処理するステップ
を含む。
【００８７】
本発明の方法は、（１種又は複数の）ペプチドの自己組織化を含む。
【００８８】
本発明の方法では、
２つ以上のペプチド、
例えば２つ、３つ又は４つ以上ペプチド、
及び／又は、
２つ以上の非ペプチド性ポリマー、
例えば２つ、３つ又は４つ以上の非ペプチド性ポリマー、例えば、線状及び分枝状の（カチオン性）ポリマーの混合物
を使用することができる。
【００８９】
本方法は、
少なくとも１つの生物活性剤、例えば上記で定義した少なくとも１つの生物活性剤を添加するステップ；
前記水溶液に紫外線（ＵＶ）光開始剤を添加し、ＵＶ照射に前記水溶液を曝露するステップ；
少なくとも１つのカップリング剤を添加して、（例えば、ポリマーとペプチドの間の）共有結合の形成を促進するステップ；
ゲル化促進剤として作用する少なくとも１つの化合物（すなわち、酸性、中性、塩基性の化合物及び／又は荷電化合物）を添加するステップ；
少なくとも１つのバッファー、好ましくは少なくとも１つの生理学上許容可能なバッファーを添加するステップ
の少なくとも１つをさらに含む。
【００９０】
前記少なくとも１つの生物活性剤は、複合ヒドロゲルの自己組織化の前に、又は複合ヒドロゲルの組織化の後にポリマーに添加されるのが好ましい。
【００９１】
それにより、２つ以上の生物活性剤、例えば２つ、３つ又は４つ以上を利用することができる。
【００９２】
反応条件、例えば、成分の選択、成分の濃度、成分の化学構造などを変更及び選択することによって、本明細書で論じているように、得られる複合ヒドロゲル及びその特性（例えば、機械的強度、弾性、放出動態、形状）を所望する適用に応じて調整することができる。
【００９３】
複合ヒドロゲル、３Ｄ足場、デバイス及びインプラントの使用
上記のように、本発明は、細胞培養用の３Ｄ足場としての本発明による複合ヒドロゲルの使用を提供する。
【００９４】
細胞は、胚性幹細胞、ヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、前駆細胞及び成体幹細胞、臍帯血幹細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来幹細胞、造血幹細胞を含む、幹細胞であるのが好ましい。
【００９５】
上記のように、本発明は、薬剤送達用の、好ましくは持続放出性若しくは制御放出性の薬剤送達用のデバイスとして、又はインプラントとして、又はインサイチュでゲル化する注射用剤としての本発明による複合ヒドロゲルの使用を提供する。注射用剤は、ゲル形成の速度を調節／変更することにより、インサイチュでゲル化する（すなわち、複合ヒドロゲルの形成が注射プロセスの間又は後に生じる）ような方法で調製される。
【００９６】
上記のように、本発明は、本発明による複合ヒドロゲルを含む、細胞培養用の３Ｄ足場を提供する。
【００９７】
３Ｄ足場は、胚性幹細胞、ヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、前駆細胞及び成体幹細胞、臍帯血幹細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来幹細胞、造血幹細胞を含む、幹細胞を培養するためのものであるのが好ましい。
【００９８】
上記のように、本発明は、本発明による複合ヒドロゲルを含む、薬剤送達用のデバイス、好ましくは持続放出性又は制御放出性製剤送達用のデバイスを提供する。
【００９９】
例えば、デバイスは、特定の増殖因子及び核酸、例えば、ｍＲＮＡ又はＤＮＡ用の送達デバイスであってもよい。
【０１００】
一実施形態では、デバイスは電気的構成要素をさらに含む。
【０１０１】
上記のように、本発明は、本発明による複合ヒドロゲルを含むインプラント又は注射用剤を提供する。
【０１０２】
インプラントは、様々な形態、形状及びサイズ、例えば、ゾルヒドロゲル、乾燥膜及び粘着性ゲル剤をとることができる。さらに、ヒドロゲルは、様々な形状、例えばシート状、円盤状、膜状、球体状、及び他の３次元構造に成型することができる。
【０１０３】
上記のように、本発明は、本発明による複合ヒドロゲルを含む医薬用又は美容用組成物を提供する。
【０１０４】
（１種又は複数の）医薬用又は美容用組成物は、さらなる成分、例えば（１種又は複数の）添加剤を含むことができる。
【０１０５】
上記のように、本発明はさらに、本発明による複合ヒドロゲルを含む、電子デバイスを提供する。
【０１０６】
複合ヒドロゲルの医療及び美容品における使用
上記のように、本発明は、医療で使用するための本発明による複合ヒドロゲルを提供する。
【０１０７】
上記のように、本発明は、再生医療で使用するための、又は組織工学及び組織再生で使用するための本発明による複合ヒドロゲルを提供する。例えば、本発明による複合ヒドロゲルは、脂肪組織及び軟骨組織の再生に使用することができる。
【０１０８】
さらに、本発明は、創傷又は骨格系変性疾患、例えば変性円板疾患又は尿失禁の治療で使用するための本発明による複合ヒドロゲルを提供する。本発明による複合ヒドロゲルは、経皮注入剤及び３Ｄ足場の形態で提供することができる。
【０１０９】
上記のように、本発明は、美容品として使用するための、好ましくは局所使用による美容品として使用するための本発明による複合ヒドロゲルを提供する。
【０１１０】
定義
本明細書で使用される用語「複合ヒドロゲル」とは、本明細書で定義した非ペプチド性ポリマーと超小型ペプチドの３次元ネットワークを含むヒドロゲル（すなわち、水を含有するが、水不溶性のゲル）を指すことを意味する。非ペプチド性ポリマーは、ペプチドと静電的に、又はファンデルワールス相互作用、水素結合又は共有結合を介して相互作用する。少なくとも１つの非ペプチド性ポリマー及び少なくとも１つのペプチドは、共有結合的に架橋されているか又はコンジュゲートされているのが好ましい。
【０１１１】
本明細書で使用される用語「超小型」ペプチドとは、３〜８個のアミノ酸、好ましくは３〜７個のアミノ酸、さらに好ましくは３〜６個のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するペプチドを意味する。本発明で利用されるペプチドは自己組織性ペプチドであるのが好ましく、すなわち、本ペプチドは高次超分子構造、例えば、繊維状足場又はネットワークとして機能し得るペプチド線維など（図１も参照されたい）に自己組織化する。さらに本発明で利用されるペプチドは、細胞透過特性を有していてもよく、ここで、複合ヒドロゲル中に存在する（１つ又は複数の）生物活性剤はこの固有のペプチド特性をさらに促進することができる。さらに、本発明で利用するペプチドは、刺激応答性ペプチド、すなわち、光、ｐＨ及び塩への応答性であってもよく、ここで、非ペプチド性ポリマー及び／又は（１つ又は複数の）生物活性剤はこの特性を増幅又は付与することができる。
【０１１２】
本明細書で使用される用語「アミノ酸」及び「アミノ酸誘導体」は、天然及び非天然に存在するＬ型及びＤ型アミノ酸及びアミノ酸誘導体、ペプチド模倣アミノ酸、及び標準の細胞機序により作製されないか、翻訳後修飾の後のタンパク質中でしか確認されないか、又は代謝中間体としてしか確認されない非標準アミノ酸を含むことを意味する。例えば、特定のアミノ酸、例えばロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）を言及する場合には、この特定のアミノ酸のＬ型及びＤ型鏡像異性体の両方、例えばＬ−ロイシン及びＤ−ロイシンを言及するものとする。本発明のペプチドは、Ｌ型のアミノ酸及び／又はアミノ酸誘導体から構成され得るか、Ｄ型のアミノ酸及び／又はアミノ酸誘導体からのみ構成され得る。代替として、本ペプチドは、Ｌ型及びＤ型両方のアミノ酸及び／又はアミノ酸誘導体から構成されていてもよい。
【０１１３】
本明細書で用いられる用語「ポリマー」とは、少なくとも２つの反復単位を含む任意のポリマー分子を指し、２つの反復単位のみを含む分子、例えば、ジ（エチレングリコール）ジアクリレート（ＤＥＧＤＡ）が例として含まれ得る。また本用語は、反復性のカチオン性／アニオン性／中性のビルディングブロックを含む多量体の構造、並びに生物学的に関連性のあるポリマー、例えば、オリゴヌクレオチド、多糖類、脂質様ポリマーなどを包含する。
【０１１４】
本明細書で使用される用語「アニオン性ポリマー」とは、負に帯電又は負帯電性の高分子からなるポリマーを指すことを意味する。
【０１１５】
本明細書で使用される用語「カチオン性ポリマー」とは、正に荷電又は正荷電性の高分子からなるポリマーを指すことを意味する。
【０１１６】
本明細書で使用される用語「中性ポリマー」とは、電気的電荷又はイオン化可能な基を有していないポリマーを指すことを意味する。
【０１１７】
本明細書で使用される用語「生物活性剤」又は「生理活性成分」とは、動物の身体、臓器、細胞組織、細胞、細胞区画又は前述のいずれかの実体内の特定の分子と相互作用する薬剤（すなわち、分子又は化合物）、特に治療用分子を指すことを意味する。また本用語は、診断マーカー、例えば、フルオロフォア、色素、無機及び有機のナノドット及び量子ドットなどを含む。
【０１１８】
本明細書で使用される用語「増殖因子」とは、細胞の成長、増殖及び細胞分化を刺激することができる合成又は天然の物質を指すことを意味する。増殖因子は、通常、細胞間のシグナル伝達分子として作用する。例としては、それらの標的細胞表面の特異的受容体に結合するサイトカイン及びホルモンである。特に好ましい例としては、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、肉腫細胞増殖因子（ＳＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、増殖分化因子（ＧＤＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、マクロファージ減速因子（ＭＳＦ）、造血増殖因子、例えば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、黒色腫阻害活性（ＭＩＡ）、成長ホルモン（ＧＨ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、エリスロポエチン、インスリン、プロラクチン、ミオスタチン、レプチン、ニューロトロフィン、抗炎症性サイトカイン及びインターロイキンが含まれる。
【０１１９】
本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド」とは、典型的には５０個以下の塩基を有する、短い核酸ポリマーを指すことを意味する。
【０１２０】
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、２０個以上の塩基、好ましくは５０個以上の塩基、さらに好ましくは１００個以上の塩基を含む、核酸ポリマーを指すことを意味する。
【０１２１】
本明細書で使用される用語「細胞培養用の３Ｄ足場」とは、細胞の包埋及び増殖、好ましくは、包埋細胞の分化を可能にする３次元の足場を指すことを意味する。用語「足場」、「マトリックス」及び「基材」は互換的に使用することができる。
【０１２２】
本明細書で使用される用語「インプラント」とは、欠損している生物学的構造を交換し、損傷している生物学的構造を支持し、又は既存の生物学的構造を強化するために製造された医療用デバイスを指すことを意味する。
【０１２３】
用語「再生医療」とは、ヒトの細胞、組織又は臓器を交換又は再生して正常な機能を復元するか、又は確立するプロセスを意味する。この分野は、損傷を受けた組織を交換すること及び／又はこれまで回復不能であった組織又は臓器を治癒するために身体自身の修復機構を刺激することによって、体内の損傷を受けた組織及び臓器を再生させる可能性を有している。さらに再生医療は、科学者に研究室で組織及び臓器を増殖させる権限を付与し、身体が自分自身を治癒することができない場合に、安全に移植する。再生医療は、救命臓器移植を必要とする患者の数と比べて、ドナーとして利用され得る臓器不足の問題を解決する可能性を有していることが重要である。臓器細胞は、患者自身の組織又は細胞に由来する場合、細胞の供給源に応じて、臓器移植拒絶反応の問題を潜在的に解決することができる。再生医療は、臨床治療に対する一連の生物医学的アプローチを指す。例としては、幹細胞又は前駆細胞の注射（細胞治療）；単独で投与される又は注入細胞による分泌物として投与される生物学的活性分子による再生の誘導（免疫修飾治療）；及びインビトロで増殖させた細胞、臓器及び組織の移植（組織工学）が含まれる。
【０１２４】
本発明は、多用途の新規生体材料及び多用途な新規技術、すなわち、製剤が変性され最適化され、フィーダー細胞を必要とすることのない、臨床応用のためのニッチな細胞培養基材及び組織工学用足場を作製することができる、３次元（３Ｄ）超小型複合ペプチド−ポリマーヒドロゲルの開発を開示している。超小型ペプチド（すなわち、（３〜６（又は７又は８）個のアミノ酸長）は、水中で超分子会合体に自己組織化し、それが３次元繊維性メッシュに縮合し、９９．９％以下の水を封入する。静電的に、又はファンデルワールス相互作用、水素結合又は共有結合によりペプチドと相互作用するポリマーの混合は、機械的特性を増強し、すなわち、ヒドロゲルの高い機械的剛性を維持しながら、弾性（歪みに対する抵抗性）を増加させる。得られる複合ヒドロゲルは、耐熱性であり、高塩条件において安定しており、ゲル化プロセス中に特定の幾何学的形状に成形することができる。さらに、ポリマーの官能基の存在は、生物活性治療薬、例えば、増殖因子及びプロドラッグなどのコンジュゲーションを促進する。これは、封入に加えて、別の送達方法を提供する。固定化され、封入された治療薬の放出動態は、ペプチド−ポリマー組成、濃度及び分解特性を含む様々な方法によって制御することができる。要約すれば、本発明は、コンジュゲーション又は封入などによって、生理活性治療薬（例えば、増殖因子及びプロドラッグ）を添加することができる、自己組織化超小型ペプチド及びポリマーを組み合わせた多用途の複合ヒドロゲルを提供する。
【０１２５】
本発明の利点としては、少なくとも下記の事項が含まれる：
本発明の複合ヒドロゲルは、合成ポリマーの弾性特性と超小型のペプチドヒドロゲルの高い機械的剛性を兼ね備えている。
ペプチドヒドロゲルの安定性は、ポリマー成分の添加で改善される。特に、本発明の複合ヒドロゲルは、高塩環境において有意に安定している。
刺激応答性ポリマー成分は、特定の環境における架橋を可能にし、ヒドロゲルの安定性をさらに高める。
本発明の複合ヒドロゲルの製剤は、非常に多用途である。ゲル化、分解／クリアランス及び治療における放出動態は、ポリマーとペプチドの特性を調整することによって制御することができる。
生物活性治療薬／薬剤、例えば、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、アプタマー）、オリゴヌクレオチド、ウイルス、タンパク質、ペプチド、例えば、増殖因子、プロドラッグ及び他の小化合物などは、本発明のヒドロゲルに固定化することができる。
ヒドロゲルの含水量は、親水性の高いポリマーを混合することによって大幅に増加させることができる。
複合ヒドロゲルは、組織工学を用いて、治療に対する要求に応じて患者用のパッケージ溶液、すなわち、患者に合わせた細胞治療用のパッケージ溶液を提供する。本発明の自己組織化複合超小型ペプチド−ポリマーヒドロゲルは、線維芽細胞などの患者の健康な組織を採取することから開始し、治療に必要とされる細胞型に変化させる、総合溶液を提供する。
【０１２６】
本発明の複合超小型ペプチド−ポリマーヒドロゲルは生物医学的用途を有し、例えば、幹細胞を維持し分化させるための細胞培養基材、薬剤送達及び再生医療用のマトリックス／足場、及び生物医学的なデバイスにおける膜である。これらはまた、電子デバイスの開発における無機材料に関する封入マトリックス及び膜として適用することができる。様々な官能基を使用することによって、材料の特性を微調整する付加的な機会が得られる。さらに、線状構造から分枝状構造へのポリマーの変形とさらに３Ｄ構造によって、様々な生物学的に重要な分子と化合物の結合が可能になる。これには、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、アプタマー）、オリゴヌクレオチド、ウイルス、タンパク質、ペプチド、例えば増殖因子、プロドラッグ、及び他の小化合物、並びに無機及び有機化合物、例えばフルオロフォア及び色素などが含まれる。無機及び有機のナノドット及び量子ドットを用いることもできる。
【０１２７】
新規な生体材料及びそれに関連する技術の使用を包含する本発明によって、次のものを開発することができる。
１．幹細胞用の細胞培養基材、特にそれらの多能性を維持又は特定の系統への分化を促進するための特定の増殖因子の固定化を介するもの；
２．組織工学用の注射療法、特に整形外科や美容外科用途におけるもの；
３．欠損の大きさに正確にフィットするように患者に合わせた「オーダーメイド（‘ｍａｄｅ−ｔｏ−ｍｅａｓｕｒｅ’）」の組織工学足場；
４．回復プロセスの間、暫定的な機械的支持を提供するための再生医療用の生分解性足場；
５．細胞療法のための自己幹細胞又はエクスビボで分化させた細胞を含有する組織工学構築物であって、移植部位で損傷した組織を再生するために理想的な微小環境を提供するもの；
６．封入又は固定化したバイオ医薬品（例えば、薬／遺伝子／増殖因子）の制御放出及び持続放出用の生体適合性送達系。
【０１２８】
上記のように、十分に特性決定され、明確に規定された再生医療用の３次元足場に対する、未だ対処されていないニーズがある。細胞治療への幹細胞の使用における進歩は、フィーダー層又はコーティング、例えばマトリゲル（商標）コーティングの必要性によって阻まれている。これらの先行技術のコーティングは、基本的に２次元の支持体しか提供しない。理想的な合成細胞培養基材は、胚性及び誘導性の多能性幹細胞の幹細胞性を維持しながら、高増殖率を維持しなければならない。さらに、特定の系統へ確実に幹細胞を分化させる足場のニーズもある。同様の生物活性足場は、整形外科及び美容整形においてインビボで移植されて組織損傷を再生することができる。
【０１２９】
本明細書に記載のように、本発明は、複合超小型ペプチド−ポリマーヒドロゲル、新規生体材料及び有効な多用途の技術を開示しており、先行技術の手段及び方法を改善する。
【０１３０】
本発明の技術は樹立され、幹細胞、例えば多能性幹細胞の大規模で、フィーダーフリーの培養用の低コストで、化学的に明確に規定され、十分に特性決定された基材の基礎を形成する。これによって、足場の固定化増殖因子は、幹細胞の幹細胞性及び増殖を維持するか、又は特定の系統への分化を推進する。また複合ヒドロゲルの調整可能な特性は、酵素の使用を省き、細胞を都合よく回収することができる。特定の生物活性剤、例えば、増殖因子及びサイトカインの細胞外環境への持続放出及び制御放出も、ヒドロゲル内に封入することによって達成することができる。
【０１３１】
高い機械的強度とインサイチュでのゲル化能力は、整形外科及び美容外科処置後の天然組織の再生を促進する移植可能な足場としての魅力を本技術に提供する。本構築物の剛性は暫定的に支持体を提供し、しかも回復中に細胞を損傷から保護する。天然組織との一体化を促進し、移植拒絶を予防するための生理活性治療薬を組み入れることによって、臨床結果の成功が保証される。組織が再生するにつれて、足場が生体適合性副生成物へ生物分解されれば、インプラントとしての構築物の魅力度がさらに高まる。
【０１３２】
薬剤持続放出及び制御放出デバイスは、複合ヒドロゲルを用いて開発することができる。固定化され、封入された治療薬の放出動態は、ペプチド−ポリマーの組成、濃度及び分解特性をはじめとする様々な方法によって調節することができる。
【０１３３】
水溶液中に分散された超小型ペプチドとポリマーの混合物が大量の水を封入する足場へ自己組織化されたとき、本発明の複合ヒドロゲルは生ずる。超小型ペプチド−ポリマー複合体ヒドロゲル形成の概略図を図１に示す。ペプチドがまずペプチド線維へと自己組織化し、続いてこれがポリマーと相互作用し、それにより線維ネットワークを強化すると仮定される。得られるマクロ構造は、特に選択したポリマーが親水性の場合、水を封入する。
【０１３４】
本発明の他の態様及び利点は、以下の説明の検討から当業者には明らかであろう。
【０１３５】
以下の実施例及び図面は本発明を説明するが、本発明に関して限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】超小型ペプチド−ポリマー複合体ヒドロゲル形成の概略図である。  複合ヒドロゲルは、自己組織化する超短ペプチドを線状及び分枝状のポリマーと混合することにより形成される。ポリマー成分は、ペプチドの自己組織化プロセスの間、又は組織化後に、混合物へ混合することができる。ポリマー成分は、静電的に、又はファンデルワールス相互作用、水素結合又は共有結合形成によって、ペプチドと相互作用することができ、それによりペプチドとファイバー間に架橋を形成すること、及び／又は目的の生理活性成分に対して接着させるための手段を供給することができる。
【図２】超短ペプチド−カチオン性ポリマー複合ヒドロゲルを示す図である。  酸性極性頭部基を有する超短ペプチドは、カチオン性ポリマーと混合したときに安定した複合ヒドロゲルを形成する。概念実証として、低ｐＨで可溶性の生体適合性天然多糖類であるキトサン（Ａ）をカチオン性ポリマー成分として使用した。ポリマーに第一アミン基が存在することによって、潜在的に酸性極性頭部基上のカルボン酸基と反応することができ、生物活性部分の結合のコンジュゲーション化学を容易にする。（Ｂ）複合ＡｃＬＤ６−キトサンヒドロゲル（右側）は、ＡｃＬＤ６（Ｌ）ペプチド（Ａｃ−ＬＩＶＡＧＤ；配列番号６５；水酸化ナトリウムに溶解させたもの）を１ｋＤａの水溶性キトサンと混合することによって形成される。同一濃度において、水酸化ナトリウム中に溶解させたペプチド成分（左側の対照サンプル）は、ヒドロゲルを形成しない。（Ｃ）様々な組成のペプチドとキトサンを使用するヒドロゲル形成。
【図３】複合ヒドロゲルは、電界放出走査顕微鏡で観察した場合、純粋なペプチドヒドロゲルのナノファイバー微細構造を保持することを示す図である。  複合ヒドロゲルは多孔性ハニカム構造を保持するが、ナノ繊維はあまり明確ではない。それに対し、ポリマー成分はいかなる繊維構造も示さなかった。
【図４】複合ヒドロゲルの機械的特性を示す図である。  （Ａ、Ｂ）キトサン濃度の増加は歪みに耐える能力の増加（弾性）をもたらし、機械的強度の低下はわずかである。（Ｃ）ポリマーの長さの増加は、ここではＷ３００はＷ５よりも長いが、機械的強度にわずかな低下をもたらし、歪みに耐える能力が高まる。
【図５】複合ヒドロゲルの機械的特性の髄核（ＮＰ）の特性との比較を示す図である。  複合ペプチド−ポリマーヒドロゲル（Ａ）は、ヒトＮＰ（Ｃ）と同等の機械的剛性を有している。ペプチドヒドロゲルはかなり強いが、弾性ではない。したがって、本ポリマー成分を使用して、天然組織の機械的特性と一致するように機械的特性を調節することができる。ブタＮＰ（Ｂ）は、ヒト（Ｃ）よりも２０倍弱い。これは測定と実験技法で使用される機器の違いに起因する可能性がある。
【図６】光開始架橋の修正可能な超短ペプチド−中性ポリマー複合ヒドロゲルの図である。  中性ポリマーと混合したときに中性の極性頭部基を有する超短ペプチドは、安定した複合ヒドロゲルを形成する。概念実証として、ＡｃＡＳ６（Ｌ；Ａｃ−ＡＩＶＡＧＳ；配列番号６９）と混合したジエチレングリコールジアクリレート（ＤＥＧＤＡ）は、様々な組成でヒドロゲルを形成した。光開始架橋を刺激するために、イルガキュア（Ｉｒｇａｃｕｒｅ）２９５９（Ｂ）などの光開始剤を混合物に加えた。極めて強い光の存在下で、光開始剤はフリーラジカル反応を開始し、隣接種に対して反応性であるＤＥＧＤＡのビニル基に結びつく。
【図７】光開始による架橋の有無による、複合ペプチド−ＤＥＧＤＡヒドロゲルの機械的特性を示す図である。  ＤＥＧＤＡの添加（光開始架橋の有無による）は、ＡｃＡＳ６の機械的特性、特に剛性を高めた。
【図８】共有結合で架橋結合することができる超短ペプチド中性ポリマー複合ヒドロゲルを示す図である。  塩基性極性頭部基を含む超短ペプチドは、中性ポリマーと混合した時、安定した複合ヒドロゲルを形成する。概念実証として、線状の二官能性ＰＥＧと分枝状の多官能性ＰＥＧをＡｃＬＫ６（Ｌ；Ａｃ−ＬＩＶＡＧＫ；配列番号６６）ペプチド（Ａ）と混合し、様々な組成の複合ペプチド−ポリマーヒドロゲル（Ｂ）を形成した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）官能基はＡｃＬＫ６の一級アミン基と作用する。ペプチド間の架橋結合が観察され、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析は架橋結合された種のペプチド−ＰＥＧ５ペプチド（Ｃ）の存在を明らかにした。
【図９】複合ペプチド−ＰＥＧヒドロゲルの機械的特性を示す図である。  複合ペプチド−ポリマー（ＮＨＳ−ＰＥＧ）ヒドロゲルの機械的特性は、ペプチド単独の特性と同等である（２５ｍｇ／ｍＬ  ＡｃＬＫ６、すなわち、Ａｃ−ＬＩＶＡＧＫ；配列番号６６）。
【図１０】生理活性成分、例えば増殖因子の固定化用のコンジュゲーション戦略を示す図である。  生理活性成分は、予備コンジュゲートしたポリマーを自己組織性超短ペプチドと混合すること（Ａ）によるか、或いはゲル化後に生理活性成分を添加すること（Ｂ）のいずれかによって、複合ペプチド−ポリマーヒドロゲル上に固定化することができ、ここで、その成分はポリマーの関係する官能基と作用する。概念実証として、マレイミド及び一級アミン基などの官能基は、マレイミド−チオール及びＮＨＳアミンの化学的反応を使用するコンジュゲーションに活用することができる。
【図１１】官能性ポリマーを超短ペプチドと混合することにより形成された官能性複合ヒドロゲルを示す図である。  概念実証として、生理活性成分（ここではＬ−ＤＯＰＡ）を、ＮＨＳ−アミンの化学的反応を使用して、線状の二官能性ＰＥＧポリマー、ビス（スクシンイミジル）ＰＥＧ（ＢＳ−ＰＥＧ）にコンジュゲートさせた（Ａ）。二官能性ＢＳ−ＰＥＧの代わりに、ＣＯＯＨ−ＰＥＧｎ−ＣＯＯＨを１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）などのカルボジイミドを使用して活性化することもできる。本実施例では、ＤＯＰＡ−ＰＥＧ５−ＤＯＰＡ（Ｃ）が官能性ポリマーであり、遠心分離後に透析、ＨＰＬＣ、又はゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって精製することができる。反応系の終了は、ＨＰＬＣ−ＭＳを使用して決定した。官能性ポリマーは、様々な組成でＡｃＬＫ６（Ｌ；Ａｃ−ＬＩＶＡＧＫ；配列番号６６）と複合ヒドロゲルを形成した（Ｂ）。
【図１２】組織化後に増殖因子と官能化された複合ペプチドポリマーヒドロゲルを示す図である。  概念実証として、増殖因子βＦＧＦ（定義の必要性あり？）の形態の生理活性成分を用いて、組織化後に複合（Ａｃ−ＬＩＶＡＧＫ）−ＰＥＧ複合ヒドロゲルを官能化した。ＮＨＳ−ＰＥＧ−マレイミド（Ａ）の形態のヘテロ二官能性ＰＥＧを使用し、ヒドロゲル化中の混合又はＡｃ−ＬＩＶＡＧＫ（配列番号６６）ヒドロゲルへの添加のいずれかによって、複合ペプチド−ポリマーヒドロゲルを形成した。次いで、βＦＧＦなどの表面チオール基（生物活性に必要ではない）を含有する増殖因子を複合ヒドロゲルに添加する。生じた官能性複合ヒドロゲルを、合成細胞培養基材として評価した。βＦＧＦによる官能化は、多能性胚幹細胞（Ｂ）の接着を促進した。未修飾のＡｃ−ＬＩＶＡＧＫヒドロゲルと比べると、小さいがより多くのコロニーがβＦＧＦ官能化複合ヒドロゲルに接着した。さらに、ｈＯｃｔ４−ＧＦＰ（ＧＦＰは定義する必要あり？）高発現（ｈＯｃｔ４は多分化能に対するマーカー）によって示されたように、多くの細胞がそれらの多分化能を維持した。さらにこのような官能性複合ヒドロゲルを使用して、制御型の持続放出を行うために生理活性小分子を封入することができる。適用には、特に幹細胞の大規模培養又は立体培養用の合成細胞培養基材としての使用が含まれる（Ｃ）。これらの多重官能性ヒドロゲル足場は、固定化され封入された生理活性成分に応じて、幹細胞多分化能（又は多能）を維持すること、又は特定の細胞系統に分化させるために使用することができる可能性がある。
【図１３】（純粋）ペプチド及び複合ペプチド−ポリマーヒドロゲルは様々な形態（ゾルヒドロゲル、粘着性ゲル及び乾燥膜）をとることができ、様々な３次元の形状及びサイズに成型することができることを示す図である。  溶液混合物を鋳型に注入する場合、色素のような小分子を複合ヒドロゲルに加えることができる。ゲル化プロセスの後に、ゾルヒドロゲルが得られる。鋳型を使用して、ヒドロゲルを特定の３次元の形状及びサイズに成型することができる。１枚（又は１ディスク）のヒドロゲルを乾燥させると、膜が得られる。
【図１４】ペプチド安定性試験を示す図である。  ＴＧＡ試験は、塩の存在下でさえも（Ｂ）、ペプチドが高い熱安定性をもつことを示す（Ａ）。１Ｈ−ＮＭＲによる測定は、ＡｃＩＤ３、すなわちＡｃ−ＩＶＤ（配列番号７２）（Ｃ）及びＡｃＬＤ６、すなわちＡｃ−ＬＩＶＡＧＤ（配列番号６５）（Ｄ）によって例証されたペプチドが、ＵＶで処理された場合（２時間、２５４ｎｍ）又はオートクレーブ処理された場合（３０分間、１２０℃）に分解されないことを示す。ＨＰＬＣ−ＭＳ分析は、ＵＶ処理及びオートクレーブ処理後のＡｃＩＤ３、すなわちＡｃ−ＩＶＤ（配列番号７２）（Ｅ）及びＡｃＬＤ６、すなわちＡｃ−ＬＩＶＡＧＤ（配列番号６５）（Ｆ）の分解が最小であったことを示した。
【図１５】ペプチドのインビボにおける生体適合性を示す図である。  インビボにおける生体適合性を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、２カ月以内に様々なヒドロゲルを皮下移植することによって評価した（Ａ）。骨格筋層下の無定形のエオシン好性（ピンク）の異物物質により示されるとおり、ヒドロゲルインプラントは安定しており、２カ月後も依然として検出することができる（Ｂ、Ｃ）。皮下ヒドロゲルインプラントに対する最小〜軽度の炎症反応がインプラントの周辺で確認されたいくつかの多核巨細胞の形態で観察された（Ｄ）。しかし、これは外科手術に起因するものである。
【図１６】脂肪組織再生用のインビボにおける足場を示す図である。  脂肪体は、移植後４５日間、ヒト脂肪幹細胞（ｈＡＳＣ）インプラント領域の骨格筋層下で観察した（Ａ〜Ｃ）。移植細胞は正常な成熟した脂肪組織の外観（Ｄ）であり、縁に暗い核を有する脂肪細胞を有し、細胞は脂肪に満ちていた。
【図１７】複合ペプチド−オリゴヌクレオチドヒドロゲルを示す図である。  様々なペプチド（ＡｃＬＤ６、すなわちＡｃ−ＬＩＶＡＧＤ、配列番号６５；ＡｃＬＫ６、すなわちＡｃ−ＬＩＶＡＧＫ、配列番号６６；ＡｃＬＳ６、すなわちＡｃ−ＬＩＶＡＧＳ、配列番号６７）を用いてプラスミドＤＮＡを封入し、複合ペプチドＤＮＡヒドロゲルを形成させた（Ａ）。特に、ペプチドＡｃＬＫ６は、おそらく静電相互作用を介して、ＤＮＡの封入とトラップに非常に効率的であった。数日間かけて観察したところ、ＤＮＡの放出は最小であった。またＡｃＬＫ６は、ヌクレアーゼ分解に対してＤＮＡを効果的に保護した（Ｂ）。複合ヒドロゲルがＤＮＡｓｅとインキュベートされた場合、裸のＤＮＡ対照と比較して、消化されたＤＮＡ断片は観察されなかった。複合ヒドロゲルを形成するために使用される本来のＤＮＡ断片と比べて、複合ヒドロゲル断片は電気泳動時にウェルからの移動はなく、これは、ペプチドがオリゴヌクレオチドと強く相互作用し、質量が大きくなり、その結果、アガロースゲルを介した移動が抑制されることを示唆している。有望な適用には、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及び短ヘアピンＲＮＡの持続型送達を介在させる合成細胞培養基材が含まれる（Ｃ）。
【０１３７】
［実施例］
本発明者らの研究の過程において、様々な超小型ペプチドとポリマーの組み合わせを使用して、複合ヒドロゲルの実現可能性と特性を実証した。各組み合わせの製剤は、様々な用途における物理的特性を変更するために最適化することができる。
【０１３８】
実施例１．超小型ペプチド−カチオン性ポリマー複合体ヒドロゲル
酸性極性頭部基を含む超小型ペプチド、例えば、ＡｃＬＤ６（Ｌ）（すなわち、Ａｃ−ＬＩＶＡＧＤ；配列番号６５）、ＡｃＡＤ６（Ｌ）（すなわち、Ａｃ−ＡＩＶＡＧＤ；配列番号７６）及びＡｃＩＤ３（Ｌ）（すなわち、Ａｃ−ＩＶＤ；配列番号７２）は、（線状及び分枝状の）カチオン性ポリマー、例えば、キトサン及びポリ（アミドアミン）デンドリマーと混合した場合、特に安定した複合ヒドロゲルを形成する（より詳細については実施例２を参照）。ゲル形成は、ペプチド単独のヒドロゲルと比べてより高いｐＨで観察される。高塩条件下での質量損失によって判定される、これらの複合ヒドロゲルの安定性もまた、有意に改善される。この知見は、カチオン性ポリマーがヒドロゲルを安定化させることを示唆する。
【０１３９】
１．製剤
概念実証として、線状カチオン性ポリマーキトサンを使用して、超小型ペプチドＡｃＬＤ６（Ｌ）（すなわち、Ａｃ−ＬＩＶＡＧＤ；配列番号６５）と複合ヒドロゲルを形成する実現可能性を証明する。複合ヒドロゲルの形成は、多くの因子−ペプチド濃度、ポリマー濃度、ポリマーの分子量及び電荷、他の塩及び溶媒の存在に依存する。
【０１４０】
ペプチド及びキトサン濃度を増加させることによって、ゲル形成の容易性が高まる（図２）。またキトサンは、低ペプチド濃度でゲル形成を安定化させる。さらに、キトサンの分子量及び濃度が増加すると、より安定した複合ヒドロゲルが多く形成される。これらのゲルは、完全に分離させるために撹拌下の高塩条件で「洗浄」を繰り返すことが必要である。
【０１４１】
２．複合足場の微細構造
凍結乾燥した複合ヒドロゲルの微細構造は、図３に示すように、電界放出型走査顕微鏡（ＦＥＳＥＭ）で観察される。複合ヒドロゲルは多孔性ハニカム微細構造を有するが、ナノスケールの繊維はペプチド単独のヒドロゲルに比べてあまり十分には明確でない。
【０１４２】
３．複合足場の機械的特性
複合ヒドロゲルの機械的特性を図４に示す。複合ヒドロゲルは、貯蔵弾性率が低いのを反映して、ペプチドヒドロゲルよりもわずかに弱い。しかし、これは０．５％歪みを５％へと弾性を劇的に増加させることによって補われる。ゲル強度は、キトサン濃度の増加とともに減少する。ポリマーの長さが長くなると、複合ヒドロゲルの弾性はさらに増加する。
【０１４３】
複合ヒドロゲルの機械的特性は、組成を変更することにより調整することができる。これは、修復しようとする組織の機械的特性（例えば、変性円板疾患用のインプラント又は注射用治療薬又は皮内注入される皮膚充填剤を設計するため髄核の特性（図５））と一致するようにゲル強度を変更させるができる臨床応用にとって魅力的である。
【０１４４】
４．３次元微細形状への成型と膜成型
複合体混合物は、液相である間に、ゲル化が起こる前に型に注入することができる。得られる複合ヒドロゲルは、図１３に示すように、３次元のマクロ構造、例えば、ディスク及びキューブなどを可能にする、鋳型の形状を採用する。鋳型の表面は処理されているので、複合ヒドロゲルは、微細形状を損なうことなく、容易に鋳型からはずすことができる。複合ヒドロゲルのディスクを乾燥すれと、膜が得られる。
【０１４５】
５．生理活性治療薬の組み入れ
増殖因子、細胞接着分子及びプロドラッグなどの生理活性治療薬を、封入（凝集相内）又はコンジュゲーションにより、複合ヒドロゲルへ組み入れることができる。カチオン性ポリマーは、オリゴヌクレオチドのような負に荷電した分子（プラスミドＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ）の封入を向上させ、それによりヒドロゲルの担持容量が増大する。ポリマーに生物活性分子をコンジュゲートするために、ポリマーの官能基、例えば、一級アミンを活用することができる。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）架橋剤、例えば、二官能性又は多官能性のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、ペプチド又はポリマーのいずれかに対して目的の生物活性部分をコンジュゲートさせるのに使用することができる。このようなリンカーの使用は、コンジュゲートした部分の柔軟な動き、細胞認識の促進、又は成分の治療効果にとっての理想的なコンフォメーションの採用を可能にする。図１０は、複合ヒドロゲルへの増殖因子の固定化に関する概略図を示す。これらのゲルは、続いて、組織再生用の薬剤送達デバイス、細胞培養基材及びインプラントとして配置することができる。
【０１４６】
実施例２．分枝鎖状ポリマーを混合している超小型ペプチド−官能性ポリマー複合ヒドロゲル
分枝鎖状ポリマーはまた、様々な超小型ペプチドと混合した場合に安定な複合ヒドロゲルを調製するために使用することができる。特に、合成した官能性水溶性ポリマー、例えばデンドリマーは、官能基の変形、分子量、極性、及び構造の多様性に関して、特有の特性と利点を提供する。異なる官能性末端基、例えば、アミン、カルボン酸、チオール、アルコール、及び炭水化物などの付加によって、魅力的な材料及び化学的特性、並びに生物活性分子を固定するためのコンジュゲーション戦略を提供することができる。官能基の数は容易に調節することができるため、ゲル内の目的とする治療用分子の濃度も容易に変更され、微調整することができる。
【０１４７】
デンドリマーは、特定のデンドリマー世代により特徴付けられる、個別の構造多様性を有する大規模なクラスの分子に属する。この多様性は、いくつかの世代を網羅した範囲とすることができ、世代当たりで増加する官能基の量によって確認される。それぞれの世代は、その反応開始剤コアによって特性決定される。官能基の量は、開始剤コアの構造によって決定される。第一世代の２つの官能基で開始され、官能基の数は２ｎずつ増加する。ここで、ｎは世代のタイプに対応する。したがって、第二世代は４つの官能基等を有する。デンドリマーの特性的な分枝は、治療分子がゲルから浸出する速度を制限し、それによって制御放出及び持続放出を可能にする。
【０１４８】
実施例３．超小型ペプチド−中性ポリマー複合ヒドロゲル
様々な（酸性、塩基性、中性）極性頭部基を有する超小型ペプチドは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非荷電性ポリマーと混合した場合に、安定した複合ヒドロゲルを形成した。
【０１４９】
１．製剤
概念実証として、ジ（エチレングリコール）ジアクリレート（ＤＥＧＤＡ）は、超小型ペプチドＡｃＡＳ６（Ｌ）（すなわち、Ａｃ−ＡＩＶＡＧＳ；配列番号６９）、ＡｃＬＳ６（Ｌ）（すなわち、Ａｃ−ＬＩＶＡＧＳ；配列番号６７）、ＡｃＬＴ６（Ｌ）（すなわち、Ａｃ−ＬＩＶＡＧＴ；配列番号６８）、及びＡｃＬＤ６（Ｌ）（すなわち、Ａｃ−ＬＩＶＡＧＤ；配列番号６５）と複合ヒドロゲルを形成する。これらの複合ヒドロゲルの形成は、ペプチド濃度、ＰＥＧ濃度及び分子量、及び他の溶媒の存在に依存する。
【０１５０】
光開始剤、例えば、イルガキュア２９５９及び３６９（ＢＡＳＦ社製）を複合ＡｃＡＳ６−ＤＥＧＤＡ（すなわち、Ａｃ−ＡＩＶＡＧＳ；配列番号６９）ヒドロゲルへ加えることができる（図６）。ＵＶ照射後、ゲルは外観が透明／半透明から不透明に変化する。
【０１５１】
ＡｃＡＳ６−ＤＥＧＤＡ（すわなち、Ａｃ−ＡＩＶＡＧＳ；配列番号６９）、複合ヒドロゲルの機械的特性は、ＡｃＡＳ６（すなわち、Ａｃ−ＡＩＶＡＧＳ；配列番号６９）ペプチドヒドロゲルの特性と同等である（図７）。
【０１５２】
ペプチド及びＰＥＧの液体混合物をゲル化前に鋳型に注ぎ入れることにより、３次元の複合ヒドロゲルを得ることができる。
【０１５３】
複合足場は、ＵＶ透過が可能な鋳型を使用し、光開始剤を含有するペプチドＤＥＧＤＡ複合ゲルに照射することにより形成することができる。得られる構造は、その形状を保持し、さらには、蒸発によって水を除去した後に、膜の崩壊はない。
【０１５４】
２．化学的／共有結合的に架橋された複合ヒドロゲルの製剤
概念実証として、２つの（末端）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基を含む二官能性ＰＥＧは、超小型ペプチドＡｃＬＫ６（Ｌ）（すなわち、Ａｃ−ＬＩＶＡＧＫ；配列番号６６）、ＡｃＩＫ６（Ｌ）（すなわち、Ａｃ−ＩＬＶＡＧＫ；配列番号７１）、ＡｃＡＫ６（Ｌ）（すなわち、Ａｃ−ＡＩＶＡＧＫ；配列番号７０）、ＡｃＩＫ３（Ｌ）（すなわち、Ａｃ−ＩＶＫ；配列番号７３）、ＡｃＬＫ３（Ｌ）（すなわち、Ａｃ−ＬＶＫ；配列番号７４）及びＡｃＡＫ３（Ｌ）（すなわち、Ａｃ−ＡＶＫ；配列番号：７５）と複合ヒドロゲルを形成する。架橋の程度は、ペプチドに対するポリマーの割合、並びに反応に利用可能な官能基の数に依存する。架橋の程度は、質量分析法を用いて、検出され、定量化され得る。
【０１５５】
３．固定化増殖因子を含む複合ヒドロゲルの製剤
概念実証として、ヘテロ二官能性のＮＨＳ−ＰＥＧ−マレイミドポリマーの溶液を、予成形したＡｃ−ＬＩＶＡＧＫ（Ｌ）（配列番号６６）ヒドロゲルに加えた（図８〜１０）。ポリマーをゲルに拡散させ、ＮＨＳ官能基をＡｃ−ＬＩＶＡＧＫ（Ｌ）の一級基と反応させた後、β−ＦＧＦを添加した（図１２）。その後、ポリマーのマレイミドは、増殖因子表面の遊離スルフヒドリル基と反応する。得られるヒドロゲルは、改善された細胞接着特性を実証し、より多くの胚性幹細胞コロニーの接着を生じた。
【０１５６】
実施例４．超小型ペプチド−オリゴヌクレオチド複合ヒドロゲル
様々なアミノ酸配列及び（酸性、塩基性、中性）極性頭部基の超小型ペプチドは、アプタマー及びオリゴヌクレオチド、例えば、プラスミドＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などと混合した場合、安定した複合ヒドロゲルを形成した。この「ポリマー」が目的とする生物活性分子でもあるという点で、これらの複合ヒドロゲルは特有である。
【０１５７】
１．製剤
プラスミドＤＮＡを使用して、様々なペプチド配列を含む複合ヒドロゲルを形成する可能性を実証する。ペプチドの配列（特に、極性頭部基）及び濃度は、複合ヒドロゲルに混合することができるＤＮＡの最大量を決定する上で重要な役割を果たす。塩基性（Ｃ末端）頭部基を含むペプチドＡｃＬＫ６（Ｌ）（すなわち、Ａｃ−ＬＩＶＡＧＫ；配列番号６６）は、最も高濃度のＤＮＡを混合することができる。酸性の頭部基を有するペプチド、例えばＡｃＬＤ６（Ｌ）（すなわち、Ａｃ−ＬＩＶＡＧＤ；配列番号６５）は、ＤＮＡ充填に関する閾値が最も低く、さらに、ＤＮＡ濃度の増加は不完全ゲル化又は非ゲル化を招く。
【０１５８】
２．オリゴヌクレオチドの放出
図１７に示すように、ＤＮＡの同時放出を伴う複合ヒドロゲルの分解は最小であった。１０日後であっても、充填したＤＮＡの少なくとも８０％が複合ヒドロゲル中に残存していた。特に、Ａｃ−ＬＩＶＡＧＫ（Ｌ）−ＤＮＡヒドロゲルは、添加したＤＮＡの９５％を保持した。核酸の放出は、ペプチド組成により調整することができる。またＤＮＡは分解から保護されたが、これはより不安定なメッセンジャーＲＮＡの混合にとっては良好な結果を示すものである。ＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ及びｓｉＲＮＡの物理的及び化学的特性は同等であるため、混合効率及び分解特性が似ていると結論するのが合理的である。
【０１５９】
３．適用
本発明は、組織工学を使用する、治療の必要のある患者にパッケージ溶液、すなわち、患者に合わせた細胞治療用のパッケージ溶液を提供する。本発明の自己組織化複合超小型ペプチド−ポリマーヒドロゲルは、線維芽細胞などの患者の健康な組織を採取することから開始し、治療に必要とされる細胞型に変化させる、総合溶液を提供する。
【０１６０】
複合ヒドロゲル中のＹａｍａｎａｋａ因子をコードしているメッセンジャーＲＮＡを使用することにより、体細胞の再プログラミングは、ウイルスベクター又は反復型トランスフェクションを使用することなく達成することができる。増殖因子及び転写因子をコードするメッセンジャーＲＮＡを使用して、複合ヒドロゲルで培養された幹細胞を分化させることができる。
【０１６１】
臨床応用に関して、（組織の再生を促進する）増殖因子又は（炎症を軽減する）サイトカインをコードするメッセンジャーＲＮＡは、回復を促進し、治療効果を局所化し、不適当な全身性副作用を低減する。
【０１６２】
ヒドロゲル形成の仮説を示す図１によれば、酸性ペプチドヒドロゲル、例えば、ＡｃＬＤ６（すなわち、Ａｃ−ＬＩＶＡＧＤ；配列番号６５）をベースとするヒドロゲルのｐＨが上昇した場合、一部のペプチドはイオン化し、広く拡散する。したがって、複合ヒドロゲル生成の理論的根拠は、カチオン性ポリマーでイオン化ペプチドを「捕捉」し、それによってヒドロゲルを安定化させることである。概念実証として、本発明者らはキトサンを選択した。本発明者らは、ゲル化が多くの要因に依存し、その最も重要なものは使用するキトサンの種類であることを見い出した。７つの異なるキトサンをスクリーニングし、本発明者らは、さらにレオロジー評価のため３つの候補を同定した。第１番目は、分子量が約１ｋＤａの水溶性キトサンであった。後の２つの候補は、中間分子量のキトサンと高分子量のキトサンであった。これらの３つのキトサンはＰＢＳ中でより安定した複合ヒドロゲルを形成したが、洗浄を繰り返すステップを行うとそれらは分解した。これは、ヒドロゲルで培養した細胞の回収にイオン系環境の変化を適用することができ、酵素の使用を省略できることを示唆する。
【０１６３】
図４によれば、複合ヒドロゲルはペプチドヒドロゲルよりわずかに弱く、貯蔵弾性率はキトサン濃度の上昇とともに低下した。しかし、弾性歪みでは０．５％歪み〜５％歪みの劇的な増加があり、インビボでの適用にとってより好ましいものとなった。ポリマーの長さが長くなると、複合ヒドロゲルの弾性はさらに増加した。
【０１６４】
ペプチドヒドロゲルの特性を天然組織の特性に調整するために、本発明者らはまず、髄核の機械的特性を測定した。大型動物モデルとしてブタを使用し、本発明者らは、ブタの髄核の貯蔵弾性率がヒトに関して公表されているデータよりも２０倍弱いことを確認した（図５）。これは、ヒトが直立しており、それ故に、ヒトの脊柱がより大きな圧縮力を経験することに起因しているからであろう。また本発明者らは、動物の年齢は、ヒトとは異なり、その弾性特性に対して大きな違いをもたらさないことを確認した。本発明のヒドロゲルは有意に強固であったが、ブタ組織に関する２％と比べた場合、降伏点は０．５％歪みで弾性はずっと低い。
【０１６５】
実施例５．注射療法とインプラント。
複合重合体ペプチド−ヒドロゲルは、注射用療法の基剤を形成することができ、ここで、液剤として注射される混合物は、身体に注射された場合インサイチュでゲル化する。例えば、変性円板疾患では、治療は髄核に適用されるが、尿失禁に対しては、注射剤は尿道壁に適用される。このような治療は、（手術を必要としない）最低限の侵襲性であり、変性組織に機械的支持体を提供する。
【０１６６】
ヌードマウスへのヒト由来脂肪幹細胞を接種したＡｃＬＫ６（すなわち、Ａｃ−ＬＩＶＡＧＫ；配列番号６６）ヒドロゲルの皮下移植によって、４５日後に、移植部位下に脂肪体が形成された（図１６）。これは、ヒドロゲルが脂肪組織移植／再生のための皮膚充填剤及び足場として適用することができることを示唆するものである。
【０１６７】
マウスにおける様々なペプチドヒドロゲルの皮下インプラントは、いかなる著しい免疫原性又は生理的な反応も引き起こさなかった。移植後２カ月間以内の挙動変化又は体重損失は認められず、ヒドロゲルを移植したマウスと偽手術マウスの間の赤血球数又は白血球数又は血液化学（肝臓及び腎機能）に有意な差はなかった。
【０１６８】
モルモットモデルを使用し、キリグマン（Ｋｌｉｇｍａｎ）マキシミゼーションアッセイを１２種の超短ペプチド候補について期日まで（受託試験機関によって）実施した。種々のペプチドヒドロゲルの局所適用及び皮内注射は、２４時間後に何らかの刺激やアレルギー反応を刺激しなかった。その後の２７日目の免疫学的攻撃は、免疫反応やアレルギー反応を誘発しなかった。同様に、全身毒性も観察されなかった。これは、試験したペプチドが非免疫原性であり、反復使用によってアレルギー反応を刺激する可能性が低いことを示唆した。
【０１６９】
【表１】
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【０１７０】
【表２】
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【０１７１】
本明細書に記載の発明は、具体的に記載されているもの以外の変形及び修正が可能であることは当業者には理解されよう。本発明は、このような変形及び修正のすべてを含む。また本発明は、個別に又は集合的に、本明細書に言及又は表示されているすべてのステップ、態様、製剤及び化合物を包含するとともに、ステップ又は態様の任意且つすべての組み合わせ又は任意の２つ以上を包含する。
【０１７２】
本明細書に引用されているそれぞれの文書、文献、特許出願又は特許は、参照によりその全体が本明細書に正確に組み込まれ、これは読者によって本明細書の一部として読まれ、考慮されるものとする。本明細書で引用された文書、文献、特許出願又は特許が本明細書で繰り返されていないのは、単に簡潔性上の理由によるものである。
【０１７３】
本明細書又は参照により本明細書に組み込まれる任意の文書に記載されている任意の製品に関する任意の製造者の指示書、説明書、製品仕様書及び製品シートは、参照により本明細書に組み込まれ、本発明の実施において使用することができる。
【０１７４】
本発明は、本明細書に記載した特定の実施形態のいずれかによって範囲が限定されるものではない。これらの実施形態は単なる例示を目的としている。機能的に均等である製品、製剤及び方法は、明らかに本明細書に記載した本発明の範囲内である。
【０１７５】
本明細書に記載した本発明は、１つ又は複数の数値の範囲（例えばサイズ、濃度など）を含むことができる。数値の範囲は、範囲内のすべての値が含まれることは理解されよう。例えば、範囲を定義している数値、範囲の境界を定める数値に間近に隣接する数値と同一又は実質的に同じ結果をもたらす範囲に隣接した数値を含む。
【０１７６】
本明細書を通して、文脈が特に定めない限り、単語の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記述した整数又は整数の群を包含するが、別の任意の整数又は整数の群を排除しないことを意味するものと理解されたい。また、本開示、特に特許請求の範囲及び／又は段落において、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含まれた（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの用語は、米国特許法においてそれに帰属する意味を有し得ることに留意されたい。例えば、これらの用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含まれた（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得る。「〜から本質的になっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」、「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」などの用語は、米国特許法でそれらに帰する意味を有する。例えば、これらの用語は、明示的に列挙されていない要素を認めるが、先行技術で確認されるか、本発明の基本的若しくは新規な特徴に影響を及ぼす要素は除外する。
【０１７７】
本明細書で使用される選択された用語の他の定義は、本発明の詳細な説明で確認することができ、全体を通して適用することができる。特に定義しない限り、本明細書で使用される他のすべての科学用語及び技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解される同じ意味を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2015502991.tif 000034
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