(57)【要約】  広範な遺伝子発現レベルおよびスクロース濃度にわたって、細菌増殖を可能にするスクロース輸送ポリペプチド変種が記載される。さらに、これらのスクロース輸送ポリペプチド変種を含んでなる組換え細菌と、細菌を利用してグリセロールおよびグリセロール由来生成物などを生産する方法とが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づいて、配列番号２６に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、３００位におけるアルギニンからアラニンへのまたはアルギニンからロイシンへのアミノ酸変化を有し、
（ａ）（ｉ）３５３位におけるグルタミンからヒスチジン；
（ｉｉ）６１位におけるロイシンからプロリン；
（ｉｉｉ）１５９位におけるフェニルアラニンからロイシン；
（ｉｖ）１６２位におけるグリシンからシステイン；
（ｖ）１６９位におけるプロリンからヒスチジン；
（ｖｉ）６１位におけるロイシンからトリプトファン；
（ｖｉｉ）６１位におけるロイシンからヒスチジン；
（ｖｉｉｉ）６１位におけるロイシンからフェニルアラニン；および
（ｉｘ）６１位におけるロイシンからチロシン
からなる群から選択される、少なくとも１つの追加的なアミノ酸変化、または
（ｂ）Ｎ末端からの４０２〜４０７アミノ酸長；または
（ｃ）Ｎ末端からの４０２〜４０７アミノ酸長を含み、かつ（ａ）の少なくとも１つのアミノ酸変化を有する、
スクロース輸送ポリペプチド変種。
【請求項２】
Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づいて、配列番号６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、および９８からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号２６の参照アミノ酸配列と比較して相当する位置に、
（ａ）３００位に相当する位置のアラニン；および
（ｂ）３００位に相当する位置のロイシン
からなる群から選択されるアミノ酸を含んでなる、スクロース輸送ポリペプチド変種。
【請求項３】
（ａ）前記配列番号２６の参照アミノ酸配列と比較して相当する位置における、
（ｉ）３５３位に相当する位置のヒスチジン；
（ｉｉ）６１位に相当する位置のプロリン；
（ｉｉｉ）１５９位に相当する位置のロイシン；
（ｉｖ）１６２位に相当する位置のシステイン；
（ｖ）１６９位に相当する位置のヒスチジン；
（ｖｉ）６１位に相当する位置のトリプトファン；
（ｖｉｉ）６１位に相当する位置のヒスチジン；
（ｖｉｉｉ）６１位に相当する位置のフェニルアラニン；
（ｉｘ）６１位に相当する位置のチロシン
のアミノ酸の少なくとも１つ、および／または
（ｂ）前記配列番号２６の参照アミノ酸配列と比較して、４０７、４０６、４０５、４０４、４０３、または４０２位に相当する位置における末端切断、
をさらに含んでなる、請求項２に記載のスクロース輸送ポリペプチド変種。
【請求項４】
ゲノム中に、または少なくとも１つの組換え構築物上に、
（ａ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づいて、配列番号２６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、および９８からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号２６の参照アミノ酸配列と比較して相当する位置に、
（ｉ）３００位に相当する位置のアラニン；および
（ｉｉ）３００位に相当する位置のロイシン
からなる群から選択されるアミノ酸を有する、スクロース輸送ポリペプチド変種をコードするヌクレオチド配列、および
（ｂ）スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、
（ａ）および（ｂ）が、それぞれ同一または異なるプロモーターと作動可能に連結して、さらにスクロースを代謝できる、組換え細菌。
【請求項５】
スクロース輸送ポリペプチド変種が、
（ａ）前記配列番号２６の参照アミノ酸配列と比較して相当する位置における、
（ｉ）３５３位に相当する位置のヒスチジン；
（ｉｉ）６１位に相当する位置のプロリン；
（ｉｉｉ）１５９位に相当する位置のロイシン；
（ｉｖ）１６２位に相当する位置のシステイン；
（ｖ）１６９位に相当する位置のヒスチジン；
（ｖｉ）６１位に相当する位置のトリプトファン；
（ｖｉｉ）６１位に相当する位置のヒスチジン；
（ｖｉｉｉ）６１位に相当する位置のフェニルアラニン；
（ｉｘ）６１位に相当する位置のチロシン
のアミノ酸の少なくとも１つ、および／または
（ｂ）前記配列番号２６の参照アミノ酸配列と比較して、４０７、４０６、４０５、４０４、４０３、または４０２位に相当する位置における末端切断、
をさらに含んでなる、請求項４に記載の組換え細菌。
【請求項６】
スクロースヒドロラーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、ＥＣ  ３．２．１．２６またはＥＣ  ２．４．１．７に分類される、請求項４に記載の組換え細菌。
【請求項７】
ゲノム中に、または少なくとも１つの組換え構築物上に、フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含んでなる、請求項４に記載の組換え細菌。
【請求項８】
フルクトキナーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、ＥＣ  ２．７．１．４、ＥＣ  ２．７．１．３、またはＥＣ  ２．７．１．１に分類される、請求項７に記載の組換え細菌。
【請求項９】
エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、サイトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、およびアエロバクター属（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選択される、請求項４に記載の組換え細菌。
【請求項１０】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、請求項９に記載の組換え細菌。
【請求項１１】
１，３−プロパンジオール、グリセロール、および／または３−ヒドロキシプロピオン酸を産生する、請求項４に記載の組換え細菌。
【請求項１２】
ａ）スクロース存在下で、請求項１１に記載の組換え細菌を培養するステップと；
ｂ）任意選択的に、生成されたグリセロール、１，３−プロパンジオールおよび／または３−ヒドロキシプロピオン酸を回収するステップ、
とを含んでなる、スクロースからグリセロール、１，３−プロパンジオールおよび／または３−ヒドロキシプロピオン酸を生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物学および分子生物学分野に関する。より具体的には、広範な遺伝子発現レベルおよびスクロース濃度にわたって細菌増殖を可能にするスクロース輸送ポリペプチド変種と、これらのスクロース輸送ポリペプチド変種を含んでなる組換え細菌と、このような細菌を利用して、グリセロールおよびグリセロール由来生成物などの生成物を生産する方法とが提供される。
【背景技術】
【０００２】
多くの商業的に有用な微生物は、それらの主要炭水化物源としてグルコースを使用する。しかしながら、商業的に望ましい生成物の生産のために開発された微生物によるグルコース使用の不都合は、グルコースの高コストである。微生物生産系のための炭水化物源としてのスクロース、およびスクロースとその他の糖類を含有する混合原材料の使用は、これらの物質が、通常はより低コストで容易に入手できることから、商業的により望ましいであろう。
生産微生物は、それが混合原材料中に存在する任意のスクロースを利用し得る場合に、より効率的に機能し得る。したがって生産微生物が、主要炭素源としてスクロースを効率的に利用する能力を有しない場合、それは効率的に機能し得ない。例えば細菌細胞は、典型的に、優先的な糖使用を示し、グルコースが最も優先される。糖類混合物を含有する人工培地では、典型的に、その他の糖類に先だってグルコースが完全に代謝される。その上多くの細菌には、スクロースを利用する能力が欠如している。例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ））株の５０％未満しか、スクロースを利用する能力を有しない。したがって生産微生物が、炭水化物源としてスクロースを利用できない場合、それがスクロースを利用し得るように、微生物を遺伝子改変することが望ましい。
【０００３】
スクロース利用遺伝子の組み込みによって、スクロースを利用するように遺伝子操作された組換え細菌が、報告されている。例えばＬｉｖｓｈｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第６，９６０，４５５号明細書）は、スクロース利用のための代謝経路をコードする遺伝子を含有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株を使用した、アミノ酸の生産を記載する。さらに、Ｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：１０３１−１０４０，２００７）は、炭素源としてスクロースを使用して、Ｌ−チロシンまたはＬ−フェニルアラニンを産生する、スクロース分解に関与する遺伝子を保有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株を記載する。Ｅｌｉｏｔ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第号明細書出願第２０１１／０１３６１９０Ａ１号明細書）は、スクロースからグリセロールおよびグリセロール由来生成物を産生する組換え細菌を記載する。
しかし生産微生物が効果的にスクロースを利用できるようにする、遺伝子操作上の問題が残されている。具体的には、過剰なスクロース輸送は阻害性であることから、スクロース輸送遺伝子の高レベルの発現は、スクロース上における増殖不全をもたらす。他方、低レベルのスクロース輸送もまた、スクロース上における最適以下の増殖をもたらす。したがって、適切なスクロース輸送体遺伝子発現レベルを得ることは困難である。さらに、高スクロース濃度などのスクロース輸送過剰条件下における、スクロース輸送遺伝子の発現は、より低いスクロース濃度では増殖が抑制されない遺伝子発現レベルにおいてさえも、増殖を阻害することもある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、広範なスクロース濃度にわたり、スクロース上での増殖を可能にし得るスクロース輸送体に対する需要もまた、存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一実施形態は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づいて、配列番号２６に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、３００位におけるアルギニンからアラニンへのまたはアルギニンからロイシンへのアミノ酸変化を有し、
（ａ）（ｉ）３５３位におけるグルタミンからヒスチジン；
（ｉｉ）６１位におけるロイシンからプロリン；
（ｉｉｉ）１５９位におけるフェニルアラニンからロイシン；
（ｉｖ）１６２位におけるグリシンからシステイン；
（ｖ）１６９位におけるプロリンからヒスチジン；
（ｖｉ）６１位におけるロイシンからトリプトファン；
（ｖｉｉ）６１位におけるロイシンからヒスチジン；
（ｖｉｉｉ）６１位におけるロイシンからフェニルアラニン；および
（ｉｘ）６１位におけるロイシンからチロシン
からなる群から選択される、少なくとも１つの追加的なアミノ酸変化、または
（ｂ）Ｎ末端からの４０２〜４０７アミノ酸長；または
（ｃ）Ｎ末端からの４０２〜４０７アミノ酸長を含んでなり、（ａ）の少なくとも１つのアミノ酸変化を有する、スクロース輸送ポリペプチド変種を提供する。
【０００６】
別の実施形態は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づいて、配列番号６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、および９８からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号２６の参照アミノ酸配列と比較して相当する位置に、
（ａ）３００位に相当する位置のアラニン；および
（ｂ）３００位に相当する位置のロイシン
からなる群から選択されるアミノ酸を含んでなる、スクロース輸送ポリペプチド変種を提供する。
別の実施形態は、組換え細菌であって、そのゲノム中に、または少なくとも１つの組換え構築物上に、
（ａ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づいて、配列番号２６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、および９８からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号２６の参照アミノ酸配列と比較して相当する位置に、
（ｉ）３００位に相当する位置のアラニン；および
（ｉｉ）３００位に相当する位置のロイシン
からなる群から選択されるアミノ酸を有する、スクロース輸送ポリペプチド変種をコードするヌクレオチド、および
（ｂ）スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなり、、
（ａ）および（ｂ）が、それぞれ同一または異なるプロモーターと作動可能に連結して、さらにスクロースを代謝できる、組換え細菌を提供する。
【０００７】
一実施形態では、組換え細菌は、１，３−プロパンジオール、グリセロール、および／または３−ヒドロキシプロピオン酸を産生する。
別の実施形態は、
ａ）スクロース存在下で、本明細書で開示される、１，３−プロパンジオール、グリセロール、および／または３−ヒドロキシプロピオン酸を産生する組換え細菌を培養するステップと；
ｂ）任意選択的に、生成されたグリセロール、１，３−プロパンジオールおよび／または３−ヒドロキシプロピオン酸を回収するステップと
を含んでなる、スクロースからグリセロール、１，３−プロパンジオールおよび／または３−ヒドロキシプロピオン酸を生産する方法を提供する。
【０００８】
簡単な配列説明
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含有する特許出願の要件−配列規則」）に準拠して、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）基準ＳＴ．２５（２００９）およびＥＰＯおよびＰＣＴ（規則５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）、および実施細則の第２０８節および付録Ｃ）の配列表要件に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに使用される記号および形式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に記載される規則に従う。
【０００９】
表１
遺伝子配列番号およびタンパク質配列番号の要約
2015509378.tif 000002
2015509378.tif 000003
2015509378.tif 000004
【００１０】
配列番号６１は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ（登録商標）１３２８１からのｃｓｃＡＫＢ遺伝子クラスターのヌクレオチド配列である。
配列番号６２は、プラスミドｐＳＹＣＯ１０１のヌクレオチド配列である。
配列番号６３は、プラスミドｐＳＹＣＯ１０３のヌクレオチド配列である。
配列番号６４は、プラスミドｐＳＹＣＯ１０６のヌクレオチド配列である。
配列番号６５は、プラスミドｐＳＹＣＯ１０９のヌクレオチド配列である。
配列番号６６は、プラスミドｐＳＹＣＯ４００／ＡＧＲＯのヌクレオチド配列である。
配列番号１１３は、プラスミドｐＤＭＷＰ１のヌクレオチド配列である。
配列番号１１４は、プラスミドｐＤＭＷＰ３のヌクレオチド配列である。
配列番号１１９は、プラスミドｐＢＨＲ−ｃｓｃＢＫＡのヌクレオチド配列である。
配列番号１２４は、実施例２２〜２４に記載されるプロモーター／ＭＣＳ／二重ターミネーター挿入断片のヌクレオチド配列である。
配列番号１２５は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中における発現のためにコドン最適化された、ｓｃｒＴ１のコード領域のヌクレオチド配列である。
配列番号１３０は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中における発現のためにコドン最適化された、ｓｃｒＴ７のコード領域のヌクレオチド配列である。
配列番号１１５〜１１８、１２０〜１２３、１２６〜１２９、および１３１〜１３２は、実本明細書の施例で使用されるプライマーのヌクレオチド配列である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書に記載される各参考文献の開示は、参照によってその内容全体を援用する。
文脈上例外が明記されていない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲の用法では、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、複数形への言及を含む。したがって例えば、「ａ  ｃｅｌｌ（細胞）」への言及は、１つまたは複数の細胞、および当業者に知られているその同等物などを含む。
本開示との関係において、いくつかの用語および略称が使用される。以下の定義が提供される。
「オープンリーディングフレーム」は、「ＯＲＦ」と略記される。
「ポリメラーゼ連鎖反応」は、「ＰＣＲ」と略記される。
「アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）」は、「ＡＴＣＣ」と略記される。
「組換えグリセロール産生細菌」という用語は、グリセロールおよび／またはグリセロール由来生成物を産生できるように遺伝子操作された細菌を指す。
「スクロース輸送活性を有するポリペプチド」という用語は、微生物細胞中へのスクロース輸送を仲介できるポリペプチドを指す。
【００１２】
「フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチド」という用語は、Ｄ−果糖＋ＡＴＰから果糖−リン酸エステル＋ＡＤＰへの変換を触媒する能力を有するポリペプチドを指す。フルクトキナーゼの典型例は、ＥＣ  ２．７．１．４である。果糖をリン酸化するいくらかの能力を有する酵素は、この活性がそれらの優勢な活性か否かを問わず、フルクトキナーゼと称されてもよい。フルクトキナーゼと、フルクトキナーゼ活性を有するタンパク質とをコードする遺伝子に使用される略号としては、例えば「Ｆｒｋ」、「ｓｃｒＫ」、「ｃｓｃＫ」、「ＦＫ」、および「ＫＨＫ」が挙げられる。フルクトキナーゼは、アグロバクテリウム・ツメフアシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）およびストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）中のｓｃｒＫ遺伝子によって；および特定の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株中のｃｓｃＫ遺伝子によって、コードされる。
「スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド」という用語は、スクロースの加水分解を触媒して、グルコースおよび果糖を生成する能力を有するポリペプチドを指す。このようなポリペプチドは、「インベルターゼ」または「β−フルクトフラノシダーゼ」と称されることが多い。
「グリセロール誘導体」および「グリセロール由来生成物」という用語は、本明細書において同義的に使用され、グリセロールから、またはグリセロールを含む経路中で、合成される化合物を指す。このような生成物の例としては、３−ヒドロキシプロピオン酸、メチルグリオキサール、１，２−プロパンジオール、および１，３−プロパンジオールが挙げられる。
【００１３】
「微生物生成物」という用語は、微生物で生成された、すなわち微生物が物質を代謝した結果である生成物を指す。生成物は、微生物によって天然に産生されてもよく、または微生物は生成物を産生するように遺伝子操作されてもよい。
「ホスホエノールピルビン酸−糖ホスホトランスフェラーゼ系」、「ＰＴＳ系」、および「ＰＴＳ」という用語は、本明細書において同義的に使用されて、ホスホエノールピルビン酸依存性糖取り込み系を指す。
「リン酸運搬タンパク質ＨＰｒ」および「ＰｔｓＨ」という用語は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のｐｔｓＨによってコードされるリン酸運搬タンパク質を指す。「ホスホエノールピルビン酸−タンパク質ホスホトランスフェラーゼ」および「ＰｔｓＩ」という用語は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のｐｔｓＩによってコードされるホスホトランスフェラーゼであるＥＣ  ２．７．３．９を指す。「グルコース特異的ＩＩＡ成分」および「Ｃｒｒ」という用語は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のｃｒｒによってコードされる、ＥＣ  ２．７．１．６９と命名される酵素を指す。ＰｔｓＨ、ＰｔｓＩ、およびＣｒｒは、ＰＴＳ系を構成する。
「ＰＴＳ  ｍｉｎｕｓ」という用語は、その天然状態でＰＴＳ系を含有しない微生物、またはＰＴＳ遺伝子不活性化を通じて、その中でＰＴＳ系が不活性化されている微生物を指す。
【００１４】
「グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ」および「Ｇ３ＰＤＨ」という用語は、ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）からグリセロール３−リン酸（Ｇ３Ｐ）への変換を触媒する酵素活性に関与するポリペプチドを指す。生体内Ｇ３ＰＤＨは、ＮＡＤまたはＮＡＤＰ依存性であってもよい。補助因子特異的グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼに特に言及する場合、「ＮＡＤ依存性グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ」および「ＮＡＤＰ依存性グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ」という用語が使用される。一般的に、ＮＡＤ依存性およびＮＡＤＰ依存性グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼは、（例えばｇｐｓＡによってコードされる酵素によって）ＮＡＤおよびＮＡＤＰを区別なく使用できるので、ＮＡＤ依存性およびＮＡＤＰ依存性グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼという用語は、同義的に使用される。ＮＡＤ依存性酵素（ＥＣ  １．１．１．８）は、例えば本明細書でＤＡＲ１とも称されるＧＰＤ１（コード配列は配列番号１に記載され；コードされたタンパク質配列は配列番号２に記載される）、またはＧＰＤ２（コード配列は配列番号３に記載され；コードされたタンパク質配列は配列番号４に記載される）、またはＧＰＤ３をはじめとする、数種の遺伝子によってコードされる。ＮＡＤＰ依存性酵素（ＥＣ  １．１．１．９４）は、例えばｇｐｓＡによってコードされる。
【００１５】
「グリセロール３−ホスファターゼ」、「ｓｎ−グリセロール３−ホスファターゼ」、「Ｄ，Ｌ−グリセロールホスファターゼ」、および「Ｇ３Ｐホスファターゼ」という用語は、グリセロール３−リン酸と水から、グリセロールと無機リン酸への変換を触媒できる酵素活性を有する、ポリペプチドを指す。Ｇ３Ｐホスファターゼは、例えばＧＰＰ１（コード配列は配列番号５に記載され；コードされたタンパク質配列は配列番号６に記載される）、またはＧＰＰ２（コード配列は配列番号７に記載され；コードされたタンパク質配列は配列番号８に記載される）によってコードされる。
「グリセロールデヒドラターゼ」または「デヒドラターゼ酵素」という用語は、グリセロール分子からその生成物である３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（３−ＨＰＡ）への変換を触媒できる酵素活性を有する、ポリペプチドを指す。
【００１６】
本発明の目的では、デヒドラターゼ酵素は、それぞれ好ましい基質がグリセロールおよび１，２−プロパンジオールである、グリセロールデヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．３０）およびジオールデヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．２８）を含む。デヒドラターゼ酵素の遺伝子は、特にクレブシエラ・ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、シトロバクター・フロインディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、クロストリジウム・パステリアヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）、およびラクトバチルス・ロイテリー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）中で同定されている。いずれの場合にも、デヒドラターゼは、大型または「α」サブユニット、中型または「β」サブユニット、および小型または「γ」サブユニットの３つのサブユニットから構成される。遺伝子は、例えばＤａｎｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２２，５５３（１９９９））およびＴｏｒａｙａ  ａｎｄ  Ｍｏｒｉ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，３３７２（１９９９））にも記載される。グリセロールデヒドラターゼの大型または「α」（アルファ）サブユニットをコードする遺伝子としては、ｄｈａＢ１（コード配列は配列番号９に記載され、コードされたタンパク質配列は配列番号１０に記載される）、ｇｌｄＡ、およびｄｈａＢが挙げられ；中型または「β」（ベータ）サブユニットをコードする遺伝子としては、ｄｈａＢ２（コード配列は配列番号１１に記載され、コードされたタンパク質配列は配列番号１２に記載される）、ｇｌｄＢ、およびｄｈａＣが挙げられ；小型または「γ」（ガンマ）サブユニットをコードする遺伝子としては、ｄｈａＢ３（コード配列は配列番号１３に記載され、コードされたタンパク質配列は配列番号１４に記載される）、ｇｌｄＣ、およびｄｈａＥが挙げられる。ジオールデヒドラターゼの大型または「α」サブユニットをコードするその他の遺伝子としては、ｐｄｕＣおよびｐｄｄＡが挙げられ；中型または「β」サブユニットをコードするその他の遺伝子としては、ｐｄｕＤおよびｐｄｄＢが挙げられ；小型または「γ」サブユニットをコードするその他の遺伝子としては、ｐｄｕＥおよびｐｄｄＣが挙げられる。
【００１７】
グリセロールおよびジオールデヒドラターゼは、グリセロールおよびその他の基質によって、作用機序に基づいた自殺不活性化を被る（Ｄａｎｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２２，５５３（１９９９））。「デヒドラターゼ再活性化因子」という用語は、デヒドラターゼ活性の再活性化に関与するタンパク質を指す。「デヒドラターゼ再活性化活性」、「デヒドラターゼ活性の再活性化」、および「デヒドラターゼ活性の再生」という用語は同義的に使用されて、反応触媒作用ができないデヒドラターゼを反応触媒作用ができるものに変換する現象、またはデヒドラターゼの不活性化を阻害する現象、または生体内におけるデヒドラターゼ酵素の有効半減期を延長する現象を指す。デヒドラターゼ再活性化因子に関与する２つのタンパク質が同定されている（例えば米国特許第６，０１３，４９４号明細書およびその中の参考文献；Ｄａｎｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、前出；Ｔｏｒａｙａ  ａｎｄ  Ｍｏｒｉ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，３３７２（１９９９）；およびＴｏｂｉｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１，４１１０（１９９９）を参照されたい）。タンパク質の１つをコードする遺伝子としては、例えばｏｒｆＺ、ｄｈａＢ４、ｇｄｒＡ、ｐｄｕＧ、およびｄｄｒＡが挙げられる。２つのタンパク質の２つめをコードする遺伝子としては、例えばｏｒｆＸ、ｏｒｆ２ｂ、ｇｄｒＢ、ｐｄｕＨ、およびｄｄｒＢが挙げられる。
【００１８】
「１，３−プロパンジオール酸化還元酵素」、「１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ」、および「ＤｈａＴ」という用語は本明細書において同義的に使用され、３−ＨＰＡと１，３−プロパンジオールの相互変換を触媒できる酵素活性を有するポリペプチドを指すが、ただしこのような活性をコードする遺伝子は、その自然的（すなわち野生型）状況で、物理的にまたは転写的にデヒドラターゼ酵素に連結することが認められ、例えばクレブシエラ・ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からのｄｈａＴの場合のように、遺伝子はｄｈａレギュロン中に見られる。１，３−プロパンジオール酸化還元酵素をコードする遺伝子としては、クレブシエラ・ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、シトロバクター・フロインディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、およびクロストリジウム・パステリアヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）からのｄｈａＴが挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの遺伝子のそれぞれは、ＩＩＩ型アルコールデヒドロゲナーゼファミリーに属するポリペプチドをコードするが、それは保存的鉄結合モチーフを呈示して、３−ＨＰＡと１，３−プロパンジオールのＮＡＤ+／ＮＡＤＨ連鎖相互変換に対する選択性を有する（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｎ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９，２０５０（１９８７）；Ｄａｎｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７，２１５１（１９９５）；およびＬｅｕｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１５４，３３７（１９９７））。同様の物理的特性の酵素が、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）およびラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）から単離されている（Ｖｅｉｇａ  ｄａ  Ｄｕｎｈａ  ａｎｄ  Ｆｏｓｔｅｒ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８，２００５（１９９２））。
【００１９】
「ｄｈａレギュロン」という用語は、デヒドラターゼ活性、再活性化活性、および１，３−プロパンジオール酸化還元酵素をはじめとするが、これに限定されるものではない、様々な生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、一連の関連ポリヌクレオチドまたはオープンリーディングフレームを指す。典型的にｄｈａレギュロンは、米国特許第７，３７１，５５８号明細書に記載されるように、オープンリーディングフレームｄｈａＲ、ｏｒｆＹ、ｄｈａＴ、ｏｒｆＸ、ｏｒｆＷ、ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、ｄｈａＢ３、およびｏｒｆＺを含んでなる。
「アルデヒドデヒドロゲナーゼ」および「Ａｌｄ」という用語は、アルデヒドからカルボン酸への変換を触媒するポリペプチドを指す。アルデヒドデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ＦＡＤ、またはＰＱＱなどの酸化還元補助因子を使用してもよい。アルデヒドデヒドロゲナーゼの典型例は、ＥＣ  １．２．１．３（ＮＡＤ依存性）；ＥＣ  １．２．１．４（ＮＡＤＰ依存性）；ＥＣ  １．２．９９．３（ＰＱＱ依存性）；またはＥＣ  １．２．９９．７（ＦＡＤ依存性）である。ＮＡＤＰ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼの一例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子ａｌｄＢ（コード配列は配列番号１５に記載される）によってコードされるＡｌｄＢ（配列番号１６）である。ＮＡＤ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼの例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子ａｌｄＡ（コード配列は配列番号１７に記載される）によってコードされるＡｌｄＡ（配列番号１８）；および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子ａｌｄＨ（コード配列は配列番号１９に記載される）によってコードされるＡｌｄＨ（配列番号２０）が挙げられる。
【００２０】
「グルコキナーゼ」および「Ｇｌｋ」という用語は、本明細書において同義的に使用されて、Ｄ−グルコース＋ＡＴＰからグルコース６−リン酸エステル＋ＡＤＰへの変換を触媒するタンパク質を指す。グルコキナーゼの典型例は、ＥＣ  ２．７．１．２である。グルコキナーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のｇｌｋによってコードされる。
「ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ」および「Ｐｐｃ」という用語は、本明細書において同義的に使用されて、ホスホエノールピルビン酸＋Ｈ2Ｏ＋ＣＯ2からホスフェート＋オキザロ酢酸への変換を触媒する、タンパク質を指す。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの典型例は、ＥＣ  ４．１．１．３１である。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のｐｐｃによってコードされる。
「グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ」および「ＧａｐＡ」という用語は、本明細書において同義的に使用されて、グリセルアルデヒド−３−リン酸＋ホスフェート＋ＮＡＤ+から３−ホスホ−Ｄ−グリセロイル−ホスフェート＋ＮＡＤＨ＋Ｈ+への変換を触媒できる酵素活性を有する、タンパク質を指す。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの典型例は、ＥＣ  １．２．１．１２である。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のｇａｐＡによってコードされる。
【００２１】
「好気性呼吸制御タンパク質」および「ＡｒｃＡ」という用語は、本明細書において同義的に使用されて、包括的調節タンパク質を指す。好気性呼吸制御タンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のａｒｃＡによってコードされる。
「メチルグリオキサールシンターゼ」および「ＭｇｓＡ」という用語は、本明細書において同義的に使用されて、ジヒドロキシアセトンリン酸からメチルグリオキサール＋ホスフェートへの変換を触媒できる酵素活性を有する、タンパク質を指す。メチルグリオキサールシンターゼの典型例は、ＥＣ  ４．２．３．３である。メチルグリオキサールシンターゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のｍｇｓＡによってコードされる。
「ホスホグルコン酸デヒドラターゼ」および「Ｅｄｄ」という用語は、本明細書において同義的に使用されて、６−ホスホ−グルコン酸塩から２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホ−グルコン酸塩＋Ｈ2Ｏへの変換を触媒できる酵素活性を有する、タンパク質を指す。ホスホグルコン酸デヒドラターゼの典型例は、ＥＣ  ４．２．１．１２である。ホスホグルコン酸デヒドラターゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のｅｄｄによってコードされる。
【００２２】
「ＹｃｉＫ」という用語は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のコブ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子であるｂｔｕＲと翻訳共役するｙｃｉＫによってコードされる、推定上の酵素を指す。
「コブ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼ」という用語は、デオキシアデノシル部分をＡＴＰから還元コリノイドへ転移できる酵素を指す。コブ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼの典型例は、ＥＣ  ２．５．１．１７である。コブ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中の遺伝子「ｂｔｕＲ」、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）中の「ｃｏｂＡ」、およびシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）中の「ｃｏｂＯ」によってコードされる。
「ガラクトース−プロトン共輸送体」および「ＧａｌＰ」という用語は、本明細書において同義的に使用されて、糖およびプロトンをぺリプラズムから細胞質へ輸送できる酵素活性を有する、タンパク質を指す。Ｄ−グルコースが、ＧａｌＰの好ましい基質である。ガラクトース−プロトン共輸送体は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）中のｇａｌＰによってコードされる（コード配列は配列番号２１に記載され、コードされたタンパク質配列は配列番号２２に記載される）。
【００２３】
「非特異的触媒活性」という用語は、３−ＨＰＡと１，３−プロパンジオールとの相互変換を触媒できる酵素活性を有するポリペプチドを指し、１，３−プロパンジオール酸化還元酵素は明確に除外される。典型的にこれらの酵素は、アルコールデヒドロゲナーゼである。このような酵素は、ＦＡＤまたはＦＭＮなどのフラビン類をはじめとするが、これに限定されるものではない、ＮＡＤ+／ＮＡＤＨ以外の補助因子を利用してもよい。非特異的アルコールデヒドロゲナーゼ（ｙｑｈＤ）の遺伝子は、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株中で内因性にコードされて、機能的に発現されることが認められる。
「１．６  ｌｏｎｇ  ＧＩプロモーター」、「１．２０  ｓｈｏｒｔ／ｌｏｎｇ  ＧＩプロモーター」、「１．５  ｌｏｎｇ  ＧＩプロモーター」、「Ｐ１．６」、「Ｐ１．５」および「Ｐ１．２０」という用語は、米国特許第７，１３２，５２７号明細書に記載されるように、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）グルコースイソメラーゼ遺伝子からのプロモーターを含有する、ポリヌクレオチドまたは断片を指す。これらのプロモーター断片は、野生型ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）グルコースイソメラーゼ遺伝子プロモーターとの比較で、それらの活性を低下させる変異を含む。
「機能」および「酵素機能」という用語は、本明細書において同義的に使用されて、それ自体が反応によって消費されることなく、特定の化学反応が起きる速度を変化させる酵素の触媒活性を指す。このような活性は、生成物または基質のいずれかの生成が適切な条件下で達成されてもよい、平衡にある反応に適用されてもよいものと理解される。
【００２４】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書において同義的に使用される。
「炭素基質」および「炭素源」という用語は、本明細書において同義的に使用されて、本明細書で開示される組換え細菌によって代謝され得る炭素源を指し、具体的には炭素供給源はスクロースを含んでなる。炭素源は、その他の単糖類、二糖類、オリゴ糖類；または多糖類をさらに含んでなってもよい。
「宿主細胞」および「宿主細菌」という用語は、本明細書において同義的に使用されて、外来性または異種遺伝子を受け入れることができ、これらの遺伝子を発現して、活性遺伝子生成物を産生できる細菌を指す。
「生産微生物」という用語は、本明細書の用法では、１，３−プロパンジオール、グリセロール、３−ヒドロキシプロピオン酸、多価不飽和脂肪酸などの特定の生成物を生産するのに使用される組換え微生物をはじめとするが、これに限定されるものではない、微生物を指す。
【００２５】
本明細書の用法では、「核酸」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の単鎖または二本鎖ポリマーをはじめとする、ポリヌクレオチドを意味する。核酸としてはまた、断片および修飾ヌクレオチドも挙げられる。したがって「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」または「核酸断片」という用語は、本明細書において同義的に使用されて、合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を含有していてもよい、単鎖または二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡポリマーを指す。ヌクレオチド（通常それらの５’−一リン酸の形態で見られる）は、次のようなそれらの一文字名によって言及される。「Ａ」はアデニル酸またはデオキシアデニル酸（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡ）、「Ｃ」はシチジル酸またはデオキシシチジル酸、「Ｇ」はグアニル酸またはデオキシグアニル酸、「Ｕ」はウリジル酸、「Ｔ」はデオキシチミジル酸、「Ｒ」はプリン（ＡまたはＧ）、「Ｙ」はピリミジン（ＣまたはＴ）、「Ｋ」はＧまたはＴ、「Ｈ」はＡまたはＣまたはＴ、「Ｉ」はイノシン、および「Ｎ」は任意のヌクレオチドである。
【００２６】
ポリヌクレオチドは、合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を含有していてもよく、一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーであってもよい。ＤＮＡポリマーの形態のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはそれらの混合物の１つまたは複数のセグメントを含んでなってもよい。
「遺伝子」は特定のタンパク質を発現する核酸断片を指し、それはコード領域のみを指してもよく、またはコード配列に先行する（５’非コード配列）および後続の（３’非コード配列）制御配列を含んでもよい。「天然遺伝子」とは、それ自体の制御配列と共に天然に見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」とは、自然界では一緒に見られない調節およびコード配列を含んでなる、天然遺伝子でない任意の遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる起源に由来する制御配列とコード配列、または同一起源に由来するが、天然に見られるのと異なる様式で配置される制御配列とコード配列を含んでなってもよい。「内在性遺伝子」とは、生物のゲノム中のその自然な位置にある天然遺伝子を指す。「外来性」遺伝子とは、遺伝子移入によって宿主生物に導入された遺伝子を指す。外来性遺伝子は、非天然生物中に挿入された遺伝子、天然宿主内の新たな位置に導入された遺伝子、またはキメラ遺伝子を含んでなり得る。
【００２７】
「天然ヌクレオチド配列」という用語は、常態で宿主微生物中に見られるヌクレオチド配列を指す。
「非天然ヌクレオチド配列」という用語は、常態では宿主微生物中に見られないヌクレオチド配列を指す。
「天然ポリペプチド」という用語は、常態で宿主微生物中に見られるポリペプチドを指す。
「非天然ポリペプチド」という用語は、常態では宿主微生物中に見られないポリペプチドを指す。
「コードする」および「コーディング」という用語は、本明細書において同義的に使用されて、それによって遺伝子が、転写および翻訳機構を通じてアミノ酸配列を生成する過程を指す。
「コード配列」という用語は、特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を指す。
「適切な制御配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、配列中、または下流（３’非コード配列）に位置して、転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または結合コード配列の翻訳に影響を及ぼす、ヌクレオチド配列を指す。制御配列としては、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、５’非翻訳リーダー配列（例えば転写開始部位と翻訳開始コドンの間）、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、およびステムループ構造が挙げられる。
【００２８】
「発現カセット」という用語は、選択された遺伝子のコード配列と、選択された遺伝子生成物の発現に要する、コード配列に先行する（５’非コード配列）および後続の（３’非コード配列）制御配列とを含んでなる、ＤＮＡ断片を指す。したがって発現カセットは、典型的に１）プロモーター配列；２）コード配列（すなわちＯＲＦ）；および３）真核生物中では通常ポリアデニル化部位を含有する、３’非翻訳範囲（例えばターミネーター）から構成される。発現カセットは通常はベクター内に含まれて、クローニングおよび形質転換を容易にする。細菌、酵母、および真菌をはじめとする異なる生物は、各宿主に対して正しい制御配列を使用しさえすれば、異なる発現カセットを用いて形質転換し得る。
「形質転換」とは、遺伝的に安定した遺伝形質をもたらす、宿主生物への核酸分子の転移を指す。核酸分子は、例えば自律的に複製するプラスミドであってもよく、またはそれは宿主生物のゲノムに組み込まれてもよい。核酸断片によって形質転換された宿主生物は、「組換え」または「形質転換」生物、または「形質転換体」と称される。「安定した形質転換」とは、遺伝的に安定した遺伝形質がもたらされる、核および細胞小器官ゲノムの双方をはじめとする、宿主生物のゲノム中への核酸断片の移入を指す。対照的に、「一過性形質転換」は、組み込みなしのまたは安定遺伝形質なしの遺伝子発現がもたらされる、宿主生物の核、またはＤＮＡ含有細胞小器官への核酸断片の移入を指す。
【００２９】
「コドン縮重」とは、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に作用をもたらさないヌクレオチド配列のバリエーションを可能にする、遺伝子コードの性質を指す。当業者は、所定のアミノ酸を特定するヌクレオチドコドン使用における、特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」について良く知っている。したがって宿主細胞中の改善された発現のために遺伝子を合成する場合、そのコドン使用頻度が、宿主細胞の好むコドン使用頻度に近くなるように遺伝子をデザインすることが望ましい。
「機能的に同等である部分断片」および「機能的同等部分断片」という用語は、本明細書において同義的に使用される。これらの用語は、断片または部分断片が活性酵素をコードするか否かを問わず、その中で、遺伝子発現を変化させまたは一定の表現型を生じる能力が保持される、単離核酸断片の一部または部分配列を指す。キメラ遺伝子は、それが活性酵素をコードするか否かを問わず、核酸断片またはその部分断片をプロモーター配列に対してセンスまたはアンチセンス方向で連結することによる抑制で使用するために、デザインし得る。
「保存ドメイン」または「モチーフ」という用語は、進化的に関連したタンパク質の整合配列に沿った特定位置で保存される、一連のアミノ酸を意味する。その他の位置のアミノ酸が相同タンパク質間で変化し得るのに対し、特定位置で高度に保存されたアミノ酸は、タンパク質の構造、安定性、または活性において必須のアミノ酸を示唆する。
【００３０】
「実質的に同様」および「実質的に相当する」という用語は、本明細書において同義的に使用される。それらは、その中の１つまたは複数のヌクレオチド塩基の変化が、遺伝子発現を媒介する、または一定の表現型を生じる、核酸断片の能力に影響を及ぼさない、核酸断片を指す。これらの用語はまた、最初の未修飾断片と比較して、結果として生じる核酸断片の機能特性を実質的に変化させない、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失または挿入などの本発明の核酸断片の修飾を指す。したがって当業者は、本発明が特定の例示的な配列を包含するのにとどまらないことを理解するであろう。さらに当業者は、本発明に包含される実質的に同様の核酸配列がまた、（例えば０．５×ＳＳＣ（標準クエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、６０℃などの中程度にストリンジェントな条件下において）本明細書で例示される配列とハイブリダイズする、または本明細書で開示される核酸配列のいずれかと機能的に同等な本明細書で開示されるヌクレオチド配列の任意の部分とハイブリダイズする、それらの能力によって規定されることを認識する。ストリンジェンシー条件は、遠縁の生物からの相同的な配列などの中程度に類似した断片から、近縁関係にある生物からの機能酵素を複製する遺伝子などの類似性の高い断片までをスクリーニングするために、調節し得る。ハイブリダイゼーション後の洗浄が、ストリンジェンシー条件を決定する。
【００３１】
「選択的にハイブリダイズする」という用語は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下における、非標的核酸配列に対するハイブリダイゼーションよりも検出可能により大きな程度（例えば背景の少なくとも２倍）での、指定された核酸標的配列への核酸配列のハイブリダイゼーション、および非標的核酸の実質的排除への言及を含む。選択的にハイブリダイズする配列は、ヌクレオチド配列の１つの補体が、もう一方のヌクレオチド配列と、典型的に少なくとも約８０％の配列同一性、または９０％の配列同一性、最高１００％までの配列同一性（すなわち完全に相補的）を有する、２つのヌクレオチド配列である。
「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、その下でプローブがその標的配列と選択的にハイブリダイズする条件への言及を含む。プローブは典型的に、検出される核酸配列と相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは、検出する核酸配列と「ハイブリダイズ可能」である。一般に、プローブは長さが約１０００未満のヌクレオチドであり、長さが５００未満のヌクレオチドであってもよい。
【００３２】
ハイブリダイゼーション法については、十分定義されている。典型的にはプローブおよびサンプルは、核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で混合される。これは適切な濃度および温度条件下で、無機または有機塩存在下において、プローブとサンプルを接触させることを伴う。カオトロピック剤が添加されてもよい。核酸ハイブリダイゼーションは、多様なアッセイ形式に適合できる。最も適切なものの１つは、サンドイッチアッセイ形式である。サンドイッチタイプのアッセイの主要構成要素は、固体担体である。固体担体は、未標識で配列の一部と相補的である固定化核酸プローブをそれに吸着しており、またはそれと共有結合している。
ストリンジェントな条件は配列依存性であり、異なる状況において異なる。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件のストリンジェンシーを調節することで、プローブと１００％相補的な標的配列を同定し得る（相同プロービング）。代案としては、より低い程度の類似性が検出されるようにストリンジェンシー条件を調節して、配列中のいくらかのミスマッチを許容し得る（非相同プロービング）。
【００３３】
典型的に、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３において、約１．５Ｍ未満のＮａイオンの塩濃度が、典型的に約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（またはその他の塩）、および温度が、短いプローブ（例えば１０〜５０個のヌクレオチド）では少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば５０個を超えるヌクレオチド）では少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成できる。例示的な低ストリンジェンシー条件としては、３７℃で３０〜３５％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液によるハイブリダイゼーションと、５０〜５５℃で１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０ＭのＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）中の洗浄が挙げられる。例示的な中程度のストリンジェンシー条件としては、３７℃で４０〜４５％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ中のハイブリダイゼーションと、５５〜６０℃で０．５×〜１×ＳＳＣ中の洗浄が挙げられる。例示的な高ストリンジェンシー条件としては、３７℃で５０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ中のハイブリダイゼーションと、６０〜６５℃で０．１×ＳＳＣ中の洗浄が挙げられる。
【００３４】
特異性は典型的にハイブリダイゼーション後洗浄の関数であり、重要な要因は最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドでは、熱融点（Ｔm）は、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４（１９８４）の方程式から近似し得る。Ｔm＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ  Ｍ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌ；式中、Ｍは一価のカチオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドの百分率であり、％ｆｏｒｍはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの百分率であり、Ｌは塩基対中のハイブリッドの長さである。Ｔmは相補的標的配列の５０％が、完全にマッチするプローブにハイブリダイズする、（規定のイオン強度およびｐＨ下における）温度である。Ｔmは、１％のミスマッチにつき約１℃低下する；したがってＴm、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件は、所望の同一性の配列とハイブリダイズするように、調節し得る。例えば≧９０％同一の配列を求める場合、Ｔmを１０℃低下させ得る。一般にストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおいて、特定の配列およびその相補体のＴmよりも約５℃低くなるように選択される。しかし極度にストリンジェントな条件は、Ｔmよりも１、２、３、または４℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得る；中程度にストリンジェントな条件は、Ｔmよりも６、７、８、９、または１０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得る；低ストリンジェンシー条件は、Ｔmよりも１１、１２、１３、１４、１５、または２０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得る。数式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物、および所望のＴmを使用して、当業者は、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液のストリンジェンシーのバリエーションが、固有に記載されることを理解するであろう。所望のミスマッチ程度が、４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）未満のＴmをもたらす場合、より高い温度を使用できるように、ＳＳＣ濃度を増大させることが好ましい。核酸ハイブリダイゼーションの詳細なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９５）にある。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件は、少なくとも１０、３０、６０、９０、１２０または２４０分間適用できる。
【００３５】
核酸またはポリペプチド配列との関係において、「配列同一性」または「同一性」は、指定された比較ウィンドウにわたって最大対応関係で配列比較すると同一である、２つの配列核酸中の塩基またはアミノ酸残基を指す。
したがって「配列同一性の百分率」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適整列配列を比較することで判定される値を指し、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列部分は、２つの配列の最適アラインメントのために、（付加または欠失を含まない）参照配列との比較で、付加または欠失（すなわちギャップ）を含んでなってもよい。百分率は、双方の配列中で同一核酸塩基またはアミノ酸残基が起きる位置数を判定し、整合位置数を得て、整合位置数を比較ウィンドウ中の位置総数で除算し、結果に１００を乗じて配列同一性の百分率を得ることで、計算される。有用な配列同一性百分率の例としては、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％、または５０％〜１００％の任意の整数百分率が挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの同一性は、本明細書に記載されるプログラムのいずれかを使用して判定し得る。
配列アラインメントおよび％同一性または類似性の計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムをはじめとするが、これに限定されるものではない、相同配列を検出するようにデザインされた多様な比較方法を使用して、判定されてもよい。本出願との関係において、特に断りのない限り、分析のために配列分析ソフトウェアが使用される場合、分析結果は、言及されるプログラムの「デフォルト値」に基づくものと理解される。本明細書での用法では、「デフォルト値」とは、ソフトウェアを初期化した際に、初めからロードされる値またはパラメータの任意の組を意味する。
【００３６】
「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖアラインメント法」は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖとラベルされるアラインメント法（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９−１９１（１９９２）によって記載される）に相当し、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムにある。複数のアラインメントでは、デフォルト値は、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に相当する。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖ法を使用したペアワイズアラインメントおよびタンパク質配列の％同一性の計算のデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸では、これらのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖプログラムを使用した配列のアラインメント後、同プログラムの「配列距離」表を見ることで、「％同一性」を得ることが可能である。
【００３７】
「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法」は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗとラベルされるアラインメント法（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ、前出；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．、前出、によって記載される）に相当し、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラムにある。多重アラインメントのためのデフォルトパラメータは、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、Ｄｅｌａｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎ  Ｓｅｑｓ（％）＝３０、ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ  Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢに相当する。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラムを使用した配列のアラインメント後、同プログラムの「配列距離」表を見ることで、「％同一性」を得ることが可能である。
【００３８】
「ＢＬＡＳＴＮアラインメント法」は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）によって提供される、デフォルトパラメータを使用して、ヌクレオチド配列を比較するアルゴリズムである。「ＢＬＡＳＴＰアラインメント法」は、デフォルトパラメータを使用してタンパク質配列を比較するために、ＮＣＢＩによって提供されるアルゴリズムである。
【００３９】
その他の種からの同一または同様の機能または活性を有するポリペプチドを同定する上で、多くのレベルの配列同一性が有用であることを当業者は良く理解している。％同一性の有用な例としては、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％、または５０％〜１００％の任意の整数百分率が挙げられるが、これに限定されるものではない。確かに、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％などの５０％〜１００％の任意の整数アミノ酸同一性が、本発明について記載するのに有用であってもよい。またこの単離されたヌクレオチド断片の任意の全長または部分的補体も興味深い。
【００４０】
したがって本発明は、本明細書で開示される特定の例示的なヌクレオチド配列包含するだけにとどまらない。例えば遺伝コードの縮重を反映する遺伝子配列の改変が、検討される。また、所与の部位に化学的に等価なアミノ酸の生成をもたらすが、コードされたタンパク質の機能特性に影響しない、遺伝子の改変が一般的であることは、当該技術分野で周知である。本明細書における考察では、置換は、以下の５群の１つ内の交換として定義される。
１．小型脂肪族の非極性またはわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）；
２．負に帯電した極性残基およびそれらのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
３．正に帯電した極性残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；
４．大型脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ（Ｃｙｓ）；および
５．大型芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ。
したがって疎水性アミノ酸であるアミノ酸アラニンのコドンは、別のより疎水性の低い残基（グリシンなど）をコードするコドンで置換されてもよく、またはより疎水性の高い残留物（バリン、ロイシン、またはイソロイシンなど）をコードするコドンで置換されてもよい。同様に、１つの負に帯電した残基の別の負に帯電した残基による置換（アスパラギン酸によるグルタミン酸置換など）をもたらす変化、または１つの正に帯電した残基の別の正に帯電した残基による置換（アルギニンによるリジン置換など）もまた、機能的に同等の生成物を生じることが予期され得る。多くの場合、タンパク質分子のＮ末端とＣ末端部分の改変をもたらすヌクレオチドの変化もまた、タンパク質活性を変化させることは予期されない。
提案された修飾のそれぞれは、十分に当該技術分野の通例の技能範囲内であり、コードされた生成物の生物学的活性保持の判定についても同様である。さらに当業者は、本発明に包含される実質的に同様の配列が、上で定義されるようなストリンジェントな条件下でハイブリダイズするそれらの能力によっても定義されることを認識する。
【００４１】
本発明の好ましい実質的に同様の核酸断片は、そのヌクレオチド配列が、本明細書で報告される核酸断片のヌクレオチド配列と少なくとも７０％同一の核酸断片である。より望ましい核酸断片は、本明細書で報告される核酸断片のヌクレオチド配列と、少なくとも９０％同一である。最も望ましいのは、本明細書で報告される核酸断片のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一の核酸断片である。
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「実質的部分」は、当業者による配列の手動評価、またはＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９３））などのアルゴリズムを使用したコンピュータによる自動配列比較と同定のいずれかによって、ポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定するのに十分な、ポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなる部分である。一般に、ポリペプチドまたは核酸配列が、既知のタンパク質または遺伝子と相同的であると推定的に同定するためには、１０個以上の隣接するアミノ酸または３０個以上のヌクレオチドの配列が必要である。さらにヌクレオチド配列に関して、配列依存性の遺伝子同定法（例えばサザンハイブリダイゼーション）および単離法（例えば細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークの原位置ハイブリダイゼーション）において、２０〜３０個の隣接ヌクレオチドを含んでなる、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用してもよい。これに加えて、プライマーを含んでなる特定の核酸断片を得るために、１２〜１５個の塩基の短鎖オリゴヌクレオチドをＰＣＲ中で増幅プライマーとして使用してもよい。したがってヌクレオチド配列の「実質的部分」は、配列を構成する核酸断片を明確に同定および／または分離するのに十分な配列を含んでなる。本明細書は、特定のタンパク質をコードする、完全なアミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。当業者は、本明細書で報告される配列の便益を有して、当業者に知られている目的のために、開示される配列の全部または実質的部分を使用できる。
【００４２】
「相補的」という用語は、配列比較すると逆平行方向にワトソン・クリック塩基対合できる、２つのヌクレオチド塩基配列間の関係について記述する。例えばＤＮＡに関して、アデノシンはチミンと塩基対合でき、シトシンはグアニンと塩基対合できる。したがって本発明は、添付の配列表および明細書で報告される完全配列に相補的な単離核酸分子、ならびに実質的に同様の核酸配列を利用してもよい。
「単離された」という用語は、それが天然に結合している少なくとも１つの成分から取り出された、ポリペプチドまたはヌクレオチド配列を指す。
「プロモーター」という用語は、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列を指す。プロモーター配列は、隣接する要素と、より遠位の上流要素とからなり、後者の要素はエンハンサーと称されることが多い。したがって「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激し得るＤＮＡ配列であり、プロモーターの内在的要素であってもよく、またはプロモーターのレベルまたは組織特異性を向上させるために挿入された、異種要素であってもよい。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来してもよく、または自然界に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素から構成されてもよく、またはさらには合成ＤＮＡセグメントを含んでなってもよい。当業者は、異なる組織または細胞タイプ中で、または異なる発達段階で、または異なる環境条件に答えて、異なるプロモーターが遺伝子発現を方向付けてもよいことを理解する。ほとんどの場合、制御配列の正確な境界は完全に画定されていないので、いくらかの変動があるＤＮＡ断片が、同一のプロモーター活性を有してもよいこともさらに認識される。ほとんどの場合にほとんどの細胞型中で遺伝子が発現されるようにするプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。
【００４３】
「３’非コード配列」、「転写ターミネーター」、および「終止配列」は、本明細書において同義的に使用されて、ポリアデニル化認識配列や、ｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼし得る調節シグナルをコードするその他の配列をはじめとする、コード配列下流に位置するＤＮＡ配列を指す。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響を及ぼすことで特徴付けられる。
「作動的に結合する」という用語は、一方の機能が他方の機能によって影響される、単一核酸断片上の核酸配列のつながりを指す。例えばプロモーターは、コード配列の発現に影響できる場合、そのコード配列と作動的に結合する（すなわちコード配列は、プロモーターの転写調節下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で制御配列に作動的に結合し得る。別の例では、本発明の相補的ＲＮＡ領域は、標的ｍＲＮＡの５’側または標的ｍＲＮＡの３’側と、または標的ｍＲＮＡ中で、直接または間接的のいずれかで、作動可能に連結し得て、または第１の相補領域は標的ｍＲＮＡの５’側であり、その補体は３’側である。
【００４４】
本明細書で使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）により詳細に記載される。形質転換方法は当業者に良く知られており、後述する。
「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は、大量の特定のＤＮＡ断片を合成する技術であり、一連の反復サイクルからなる（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）。典型的に、二本鎖ＤＮＡは熱変性されて、標的断片の３’境界に相補的な２本のプライマーが低温でアニールされて、次に中間温度で伸長される。これらの３つの連続ステップの１組が、「サイクル」と称される。
「プラスミド」または「ベクター」は染色体外要素であり、それは細胞の中央代謝の一部ではない遺伝子を保有することが多く、通常は環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態である。このような要素は、いずれかの起源に由来する、単鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの、直線または環状、自己複製配列、ゲノム一体化配列、ファージまたはヌクレオチド配列であってもよく、その中ではいくつかのヌクレオチド配列が連結し、または組換えされて、細胞中に発現カセットを導入できるユニークな構造になっている。
【００４５】
「遺伝的に改変された」という用語は、遺伝子操作、形質転換および／または変異によって、遺伝物質を変化させる過程を指す。
「組換え」という用語は、例えば化学合成による、または遺伝子操作技術を通じた核酸の単離セグメントの操作による、さもなければ別々の２つの配列セグメントの人為的組み合わせを指す。「組換え」は、異種核酸の導入によって改変された細胞またはベクターへの、またはそのように改変された細胞に由来する細胞への言及もまた含むが、故意の人間の介入なしに起きるような天然事象（例えば自然突然変異、自然形質転換、自然形質導入、自然遺伝子転位）による細胞またはベクターの改変は包含しない。
「組換え構築物」、「発現構築物」、「キメラ構築物」、「構築物」、および「組換えＤＮＡ構築物」という用語は、本明細書において同義的に使用される。組換え構築物は、例えば自然界では一緒に見られない調節およびコード配列などの核酸断片の人工的組み合わせを含んでなる。例えば組換え構築物は、異なる起源に由来する制御配列とコード配列、または同一起源に由来するが、天然に見られるのと異なる様式で配置される制御配列とコード配列を含んでなってもよい。このような構築物は、単独で使用されてもよく、またはベクターと併せて使用されてもよい。ベクターが使用される場合、当業者に良く知られているように、ベクターの選択は、宿主細胞を形質転換するのに使用される方法に左右される。例えばプラスミドベクターを使用し得る。当業者は、本発明の単離核酸断片のいずれかを含んでなる宿主細胞を成功裏に形質転換し、選択して増殖するために、ベクター上に存在しなくてはならない遺伝要素を十分承知している。当業者はまた、異なる独立した形質転換事象が、発現の異なるレベルとパターンをもたらしてもよく（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．４：２４１１−２４１８（１９８５）；Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１８：７８−８６（１９８９））、したがって所望の発現レベルとパターンを提示する系統を得るために、複数事象をスクリーニングする必要があってもよいことを認識する。このようなスクリーニングは特に、ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、タンパク質発現の免疫ブロット分析、または表現型分析によって達成されてもよい。
【００４６】
「発現」という用語は、本明細書での用法では、機能性最終生成物（例えば［前駆または成熟いずれかの］ｍＲＮＡまたはタンパク質）の産生を指す。
「導入」という用語は、核酸（例えば発現構築物）またはタンパク質を細胞中に提供することを意味する。導入は、真核生物または原核細胞中への核酸の組み込みへの言及を含み、核酸は細胞ゲノムに組み込まれてもよく、細胞への核酸またはタンパク質の一過性の提供への言及を含む。導入は、安定したまたは一過性の形質転換法、ならびに有性交配への言及を含む。したがって核酸断片（例えば組換え構築物／発現構築物）を細胞中に挿入することとの関係において、「導入」は、「形質移入」または「形質転換」または「形質導入」を意味し、核酸断片の真核生物または原核細胞への組み込みへの言及を含み、核酸断片は、細胞ゲノム（例えば染色体、プラスミド、色素体またはミトコンドリアＤＮＡ）に組み込まれて、自律性レプリコンに変換されてもよく、または一過性に発現されてもよい（例えば形質移入ｍＲＮＡ）。
「相同的」という用語は、類似した触媒機能がある、共通の進化上の起源のタンパク質またはポリペプチドを指す。本発明は、組換え技術を通じて相同的なタンパク質を産生する細菌を含んでもよい。
【００４７】
本明細書で開示されるのは、広範な遺伝子発現レベルおよびスクロース濃度にわたって、細菌増殖を可能にするスクロース輸送ポリペプチド変種である。スクロース輸送ポリペプチドは、微生物細胞中へのスクロース輸送を仲介できるポリペプチドである。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのＣｓｃＢなどの当該技術分野で公知のスクロース輸送体は、輸送されるスクロース分子毎に１個のプロトンを輸送する、Ｈ+／スクロース共輸送体として機能し、それによってプロトン輸送力のエネルギーをスクロース輸送に共役させる。このような能動輸送は、濃度勾配に対して、スクロースを蓄積できるようにする。スクロースの能動的取り込みは触媒できないが、膜を越える平衡交換を触媒できるポリペプチドをもたらす、ＣｓｃＢ中の特定のアミノ酸を変化させる変異は、Ｖａｄｙｖａｌｏｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５８：１０５１−１０５９，２００６）によって記載される。本明細書で開示されるスクロース輸送ポリペプチドは、濃度勾配に対して、微生物細胞中にスクロースを能動的に輸送する能力が欠失しているが、拡散促進によってスクロースを輸送する能力を有する新規変異体である。これらのスクロース輸送ポリペプチド変種は、細菌中における、天然ＣｓｃＢ輸送体ポリペプチドよりもさらに迅速なスクロース利用もまた可能にする。拡散促進によるスクロース輸送は、細胞内でスクロースが細胞外レベルよりも高い濃度に蓄積しないことから、過剰なスクロース取り込みに付随する毒性を軽減する。したがって拡散促進によるスクロース輸送を有する微生物細胞は、能動的スクロース輸送を有する細胞よりも、さらに広いスクロース濃度範囲にわたって増殖できる。
【００４８】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるスクロース輸送ポリペプチドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ（登録商標）１３２８１からの野生型スクロース輸送ポリペプチドＣｓｃＢ（配列番号２６に記載され、ヌクレオチドコード配列は配列番号２５に記載される）の変異体である。これらのスクロース輸送ポリペプチドは、アミノ酸３００位におけるアルギニンからアラニンへのアミノ酸変化、すなわちＲ３００Ａ変異（配列番号１００、ヌクレオチドコード配列は配列番号９９に記載される）、またはアミノ酸３００位におけるアルギニンからロイシンへのアミノ酸変化、すなわちＲ３００Ｌ変異（配列番号１０２、ヌクレオチドコード配列は配列番号１０１に記載される）、およびＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許出願第１３／２１０４８８号明細書、２０１１年８月１６日出願）によって記載されるようなより迅速なスクロース利用をもたらす少なくとも１つのその他の変異、すなわちアミノ酸変化またはアミノ酸配列末端切断のいずれかを有する。したがってこれらの実施形態では、スクロース輸送ポリペプチド変種は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づいて、配列番号２６に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有し、３００位にアルギニンからアラニンへのまたはアルギニンからロイシンへのアミノ酸変化を有し、
（ａ）（ｉ）３５３位におけるグルタミンからヒスチジン；
（ｉｉ）６１位におけるロイシンからプロリン；
（ｉｉｉ）１５９位におけるフェニルアラニンからロイシン；
（ｉｖ）１６２位におけるグリシンからシステイン；
（ｖ）１６９位におけるプロリンからヒスチジン；
（ｖｉ）６１位におけるロイシンからトリプトファン；
（ｖｉｉ）６１位におけるロイシンからヒスチジン；
（ｖｉｉｉ）６１位におけるロイシンからフェニルアラニン；および
（ｉｘ）６１位におけるロイシンからチロシンからなる群から選択される、少なくとも１つのアミノ酸変化、または
（ｂ）Ｎ末端からの４０２〜４０７アミノ酸長；または
（ｃ）Ｎ末端からの４０２〜４０７アミノ酸長、および（ａ）の少なくとも１つのアミノ酸変化を含んでなる、アミノ酸配列を有する。
【００４９】
いくつかの実施形態では、スクロース輸送ポリペプチドは、様々な起源からのスクロース輸送ポリペプチドの変異体であり（表１を参照されたい）、参照アミノ酸配列ＣｓｃＢ（配列番号２６）と比較して、アミノ酸３００位に相当する位置におけるアラニンまたはロイシンのアミノ酸変化を有する。参照アミノ酸配列と比較した、様々なスクロース輸送ポリペプチド中の相当するアミノ酸位置は、上述したＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖ、およびＢＬＡＳＴＰなどの配列アラインメントアルゴリズムを使用して、当業者によって容易に判定され得る。したがってこれらの実施形態では、スクロース輸送ポリペプチド変種は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づいて、配列番号６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、および９８からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＣｓｃＢ（配列番号２６）の参照アミノ酸配列と比較して相当する位置に、
（ａ）３００位に相当する位置のアラニン；および
（ｂ）３００位に相当する位置のロイシン
からなる群から選択されるアミノ酸を有する。
【００５０】
いくつかの実施形態では、上述したように、スクロース輸送ポリペプチドは、様々な起源からのスクロース輸送ポリペプチドの変異体であり（表１を参照されたい）、参照アミノ酸配列ＣｓｃＢ（配列番号２６）と比較して、アミノ酸３００位に相当する位置におけるアラニンまたはロイシンのアミノ酸変化を有し、
（ａ）配列番号２６の参照アミノ酸配列と比較して相当する位置における、
（ｉ）３５３位に相当する位置のヒスチジン；
（ｉｉ）６１位に相当する位置のプロリン；
（ｉｉｉ）１５９位に相当する位置のロイシン；
（ｉｖ）１６２位に相当する位置のシステイン；
（ｖ）１６９位に相当する位置のヒスチジン；
（ｖｉ）６１位に相当する位置のトリプトファン；
（ｖｉｉ）６１位に相当する位置のヒスチジン；
（ｖｉｉｉ）６１位に相当する位置のフェニルアラニン；
（ｉｘ）６１位に相当する位置のチロシン
のアミノ酸の少なくとも１つ、および／または
（ｂ）配列番号２６の参照アミノ酸配列と比較して、４０７、４０６、４０５、４０４、４０３、または４０２位に相当する位置における末端切断をさらに含んでなる。
いくつかの実施形態では、スクロース輸送ポリペプチド変種は、配列番号１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、および１１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００５１】
本明細書では、それらのゲノム中に、または少なくとも１つの組換え構築物上に、スクロース輸送ポリペプチド変種をコードするヌクレオチド配列と、スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含んでなる細菌もまた開示される。ヌクレオチド配列は、それぞれ同一または異なるプロモーターと作動可能に連結する。
これらの細菌は、スクロースを能動的に輸送する天然スクロース輸送ポリペプチドを有する細菌よりも、さらに広い遺伝子発現レベルおよびスクロース濃度範囲にわたって増殖できる。したがってこれらの実施形態では、組換え細菌は、それらのゲノム中に、または少なくとも１つの組換え構築物上に、
（ａ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づいて、配列番号２６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、および９８からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号２６の参照アミノ酸配列と比較して相当する位置に、
（ｉ）３００位に相当する位置のアラニン；および
（ｉｉ）３００位に相当する位置のロイシン
からなる群から選択されるアミノ酸を有する、スクロース輸送ポリペプチド変種をコードするヌクレオチド、および
（ｂ）スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなり、
（ａ）および（ｂ）は、それぞれ同一または異なるプロモーターと作動可能に連結して、さらに組換え細菌は、スクロースを代謝できる。
【００５２】
いくつかの実施形態では、組換え細菌は、
（ａ）配列番号２６の参照アミノ酸配列と比較して相当する位置における、
（ｉ）３５３位に相当する位置のヒスチジン；
（ｉｉ）６１位に相当する位置のプロリン；
（ｉｉｉ）１５９位に相当する位置のロイシン；
（ｉｖ）１６２位に相当する位置のシステイン；
（ｖ）１６９位に相当する位置のヒスチジン；
（ｖｉ）６１位に相当する位置のトリプトファン；
（ｖｉｉ）６１位に相当する位置のヒスチジン；
（ｖｉｉｉ）６１位に相当する位置のフェニルアラニン；
（ｉｘ）６１位に相当する位置のチロシン
のアミノ酸の少なくとも１つ、および／または
（ｂ）配列番号２６の参照アミノ酸配列と比較して、４０７、４０６、４０５、４０４、４０３、または４０２位に相当する位置における末端切断、
をさらに含んでなる、スクロース輸送ポリペプチド変種を含んでなる。
【００５３】
上述したようなスクロース輸送ポリペプチド変種をコードするヌクレオチド配列と、スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含んでなる組換え細菌は、下述するような当該技術分野で公知の方法を使用して、ゲノム中に、または少なくとも１つの組換え構築物上のいずれかにおいて、ヌクレオチド配列を適切な宿主細菌に導入することで、構築してもよい。いくつかの実施形態では、組換え細菌は、スクロースを代謝して、グリセロールおよび／またはグリセロール由来生成物を産生できる。
【００５４】
本明細書で開示される組換え細菌の構築で使用される適切な宿主細菌としては、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、乳酸桿菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、サイトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、アエロバクター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、およびシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の生物が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００５５】
いくつかの実施形態では、宿主細菌は、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、サイトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、およびアエロバクター属（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）から選択される。
いくつかの実施形態では、宿主細菌は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。
いくつかの実施形態では、宿主細菌はＰＴＳマイナスである。これらの実施形態では、宿主細菌はその天然状態においてＰＴＳマイナスであり、または下述するようにＰＴＳ遺伝子の不活性化を通じてＰＴＳマイナスにされてもよい。
生産微生物中では、糖類輸送と、輸送された糖類リン酸化のためのホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）の使用とを連結解除することが、時に望ましい。
【００５６】
「下方制御」という用語は、野生型タンパク質の活性と比較した、活性タンパク質の活性の低下または無効化を指す。ＰＴＳは、このタイプの輸送に必要とされるタンパク質をコードする、内在性遺伝子の１つまたは複数の発現を下方制御することで、不活性化されてもよい（「ＰＴＳマイナス」生物がもたらされる）。下方制御は、これらの遺伝子の１つまたは複数が、その遺伝子の部分内の挿入、欠失、または標的変異に関して「中断」を有する場合に典型的に起きて、中断は、遺伝子がゲノムから欠失して、タンパク質が翻訳されない完全遺伝子ノックアウト、またはタンパク質が挿入、欠失、アミノ酸置換またはその他の標的変異を有するような翻訳のいずれかをもたらす。タンパク質中の中断位置は、例えばタンパク質のＮ末端部分内、またはタンパク質のＣ末端部分内であってもよい。中断されたタンパク質は、中断されていないタンパク質と比較して損なわれた活性を有し、非機能性であり得る。タンパク質の発現低下または欠如をもたらす下方制御はまた、制御配列、転写、および翻訳因子および／または情報伝達経路の操作を通じて、またはセンス、アンチセンスまたはＲＮＡｉ技術、または当業者に周知の同様の反応機構の使用によってもたらし得る。
【００５７】
本明細書で開示される組換え細菌は、それらのゲノム中に、または少なくとも１つの組換え構築物上に、スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる。スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、スクロースの加水分解を触媒して、果糖とグルコースを生成する能力を有する。スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、公知であり、遺伝子ｃｓｃＡ（コード配列は配列番号２７に記載される）によってコードされる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型株ＥＣ３１３２からのＣｓｃＡ（配列番号２８に記載される）；遺伝子ｃｓｃＡ（コード配列は配列番号２９に記載される）によってコードされる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ（登録商標）１３２８１からのＣｓｃＡ（配列番号３０に記載される）；遺伝子ｂｆｒＡ（コード配列は配列番号３１に記載される）によってコードされるビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）ＤＳＭ１０１４０T株からのＢｆｒＡ（配列番号３２に記載される）；遺伝子ＳＵＣ２（コード配列は配列番号３３に記載される）によってコードされるサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＳｕｃ２ｐ（配列番号３４に記載される）；遺伝子ｓｃｒＢ（コード配列は配列番号３５に記載される）によってコードされるコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）からのＳｃｒＢ（配列番号３６に記載される）；遺伝子ｓｃｒＢ（コード配列は配列番号１３３に記載される）によってコードされるシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）Ｐｆ５からのＳｃｒＢ（配列番号１３４に記載される）；遺伝子ｆｒｕＡ（コード配列は配列番号１３５に記載される）によってコードされるバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）１４５８０からのＦｒｕＰ（配列番号１３６に記載される）；コードする遺伝子のコード配列が配列番号３７に記載されるロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＤＳＭ  ２０１９３（配列番号３８に記載される）からのスクロースホスホリラーゼ；および遺伝子ｓｕｃＰ（コード配列は配列番号３９に記載される）によってコードされるビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）ＤＳＭ  ２００８３からのスクロースホスホリラーゼ（配列番号４０に記載される）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００５８】
いくつかの実施形態では、スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、ＥＣ  ３．２．１．２６またはＥＣ  ２．４．１．７に分類される。
いくつかの実施形態では、スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づいて、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号１３４、または配列番号１３６に記載のアミノ酸配列と、少なくとも９５％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、実質的に配列番号３０に記載されるアミノ酸配列に相当する。
【００５９】
本明細書で開示される組換え細菌は、それらのゲノム中に、または少なくとも１つの組換え構築物上に、フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含んで、細菌が、スクロースの加水分解によって生じるフルクトースを利用できるようにしてもよい。フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチドとしては、フルクトキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．４と命名される）および果糖リン酸化活性を有する様々なヘキソースキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．３およびＥＣ  ２．７．１．１）が挙げられる。果糖リン酸化活性は、ヘキソキナーゼおよびケトヘキソキナーゼによって示されてもよい。本明細書で開示される組換え細菌を構築するのに使用してもよい、多様な微生物からのポリペプチドをコードする代表的な遺伝子を表２に列挙する。当業者は、（表２に列挙される遺伝子によってコードされるような）果糖をリン酸化できるタンパク質と実質的に同様のタンパク質もまた、使用してもよいことを理解するであろう。
【００６０】
表２
フルクトキナーゼ活性がある酵素をコードする配列
2015509378.tif 000005
【００６１】
いくつかの実施形態では、フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチドは、ＥＣ  ２．７．１．４、ＥＣ  ２．７．１．３、またはＥＣ  ２．７．１．１に分類される。
いくつかの実施形態では、フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチドは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づいて、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、または配列番号５６に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号５０に記載されるアミノ酸配列を有する。
【００６２】
スクロース輸送体活性を有するポリペプチドおよびスクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のコード配列を使用して、同一またはその他の微生物種から、相同的なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を単離してもよい。例えば遺伝子の相同体は、公的に利用できる核酸配列データベースを検索するＢＬＡＳＴＮなどの配列分析ソフトウェアを使用して、特定されてもよい。さらに配列依存プロトコルを使用した相同遺伝子の単離は、技術分野で周知である。配列依存性プロトコルの例としては、核酸増幅技術の様々な使用（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第４，６８３，２０２号明細書；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｔａｂｏｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２，１０７４，１９８５）；または鎖置換増幅（ＳＤＡ）、Ｗａｌｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９：３９２，（１９９２））によって例示されるような、核酸ハイブリダイゼーション法、およびＤＮＡおよびＲＮＡ増幅法が挙げられるが、これに限定されるものではない。例えば上述のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、相同体を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして用いてもよい。
当業者は、その他の供給源から単離された、これらのポリペプチドをコードする遺伝子もまた、本明細書で開示される組換え細菌で使用されてもよいことを理解するであろう。さらにコドン縮重のために、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼすことなく、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に多様性を与えてもよく、実質的に同様のタンパク質を生成するアミノ酸の置換、欠失または付加が、コードされたタンパク質に含まれてもよい。
【００６３】
スクロース輸送活性を有するポリペプチド、およびスクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、所望の配列と結合するようにデザインされたプライマーを用いたＰＣＲを使用して、単離してもよい（例えば米国特許第４，６８３，２０２号明細書を参照されたい）。縮重プライマーまたは異種プローブハイブリダイゼーションなどを使用する、その他の遺伝子単離法が当業者に良く知られている。ヌクレオチド配列はまた、化学的に合成され、またはＤＮＡ２．０  Ｉｎｃ．（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ）、およびＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）などの供給業者から購入され得る。ヌクレオチド配列は、所望の宿主細胞中における発現のために、コドン最適化されてもよい。
【００６４】
ポリペプチドの発現は、当業者に知られている多数の方法の１つの使用によって、もたらされてもよい。例えば上述のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも１つのマルチコピープラスミド上における、または宿主ゲノム中への１つまたは複数のコード配列のコピーの組み込みによって、細菌に導入されてもよい。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、（例えば別々のプラスミド上で）別々に、または（例えば単一プラスミド上で）あらゆる組み合わせで、宿主細菌に導入されてもよい。
プラスミド上またはゲノム中のいずれかにある導入コード領域は、少なくとも１つの高度に活性のプロモーターから発現されてもよい。組み込まれたコード領域は、それ自身のプロモーターを有するキメラ遺伝子の一部として導入され、またはそれはゲノムに内在性の高度に活性のプロモーターに隣接して、または高度に発現されたオペロン中に、組み込まれてもよい。適切なプロモーターとしては、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、およびｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰL、ｌＰR、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃ（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）中での発現に有用）ならびにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）中における発現に有用なａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモーター、および様々なファージプロモーターが挙げられるが、これに限定されるものではない。プロモーターはまた、Ｐａｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第７，１３２，５２７号明細書）に記載されるように、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）グルコースイソメラーゼプロモーターまたはその変異体であってもよい。
【００６５】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される組換え細菌は、グリセロールを産生できる。炭水化物または糖類を使用した、グリセロール調製の生物学的過程は、酵母およびいくつかの細菌、その他の真菌、および藻類中で知られている。細菌および酵母のどちらも、解糖中の果糖−１，６−ビスホスフェート経路を通じて、グルコースまたはその他の炭水化物を変換することで、グリセロールを産生する。本明細書で開示されるグリセロールを生産する方法では、グリセロールを天然で産生する宿主細菌が使用されてもよい。これに加えて、グリセロールおよびグリセロール誘導体を生産するために、細菌を遺伝子操作してもよい。多様な基質からのグリセロール生成能力は、米国特許第７，００５，２９１号明細書に記載されるように、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）および／またはグリセロール−３−ホスファターゼの酵素活性発現を通じて提供されてもよい。宿主細菌中の酵素活性発現のために使用されてもよいタンパク質をコードする遺伝子は、米国特許第７，００５，２９１号明細書に記載される。グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の適切な例としては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＧＰＤ１（コード配列は配列番号１に記載され、コードされたタンパク質配列は配列番号２に記載される）、およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＧＰＤ２（コード配列は配列番号３に記載され、コードされたタンパク質配列は配列番号４に記載される）が挙げられるが、これに限定されるものではない。グリセロール−３−ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の適切な例としては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＧＰＰ１（コード配列は配列番号５に記載され、コードされたタンパク質配列は配列番号６に記載される）、およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＧＰＰ２（コード配列は配列番号７に記載され、コードされたタンパク質配列は配列番号８に記載される）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００６６】
グリセロールの生成増大は、標的内在性遺伝子の発現低下を通じて達成されてもよい。米国特許第７，００５，２９１号明細書に記載されるように、グリセロールキナーゼおよびグリセロールデヒドロゲナーゼ活性をコードする内在性遺伝子の下方制御は、グリセロール生成をさらに高める。炭素からグリセロールへのチャネリング増大は、米国特許第７，３７１，５５８号明細書に記載されるように、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする内在性遺伝子発現の低下によって達成されてもよい。下方制御は、例えばＰＴＳ系遺伝子を下方制御する上述の方法など、当該技術分野で公知の任意の方法を使用して達成されてもよい。
グリセロールは、有用生成物の微生物生産のための基質を提供する。このような生成物、すなわちグリセロール誘導体の例としては、３−ヒドロキシプロピオン酸、メチルグリオキサール、１，２−プロパンジオール、および１，３−プロパンジオールが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００６７】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される組換え細菌は、１，３−プロパンジオールを産生できる。グリセロール誘導体１，３−プロパンジオールは、ポリエステル繊維生産、およびポリウレタンと環状化合物の製造における可能な効用を有するモノマーである。１，３−プロパンジオールは、米国特許第５，６８６，２７６号明細書に記載されるように、グリセロールまたはジヒドロキシアセトン以外の炭素基質の生物変換により、単一微生物によって産生され得る。この生物変換では、上述したように、グリセロールが炭素基質から生成される。グリセロールは、宿主細菌によってコードされ得る、または組換えによって宿主に導入され得る、デヒドラターゼ酵素によって、中間体３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドに変換される。デヒドラターゼは、グリセロールデヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．３０）、ジオールデヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．２８）またはこの変換を触媒できる任意のその他の酵素であり得る。グリセロールデヒドラターゼの「α」（アルファ）、「β」（ベータ）、および「γ」（ガンマ）サブユニットをコードする遺伝子の適切な例としては、それぞれクレブシエラ・ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からのｄｈａＢ１（コード配列は配列番号９に記載される）、ｄｈａＢ２（コード配列は配列番号１１に記載される）、およびｄｈａＢ３（コード配列は配列番号１３に記載される）が挙げられるが、これに限定されるものではない。３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドから１，３−プロパンジオール（ｐｒｏｐａｎｄｅｉｏｌ）へのさらなる変換は、１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．２０２）またはその他のアルコールデヒドロゲナーゼによって触媒され得る。１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の適切な例は、クレブシエラ・ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からのｄｈａＴ（コード配列は配列番号５７に記載され、コードされたタンパク質配列は配列番号５８に記載される）である。
【００６８】
細菌を組換え遺伝子操作して、グリセロールおよびグリセロール誘導体１，３−プロパンジオールのより効率的な生成を提供し得る。例えば米国特許第７，００５，２９１号明細書は、グリセロールキナーゼおよびグリセロールデヒドロゲナーゼの内在性活性の片方または双方を中断しながら、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼおよびグリセロール−３−リン酸ホスファターゼの片方または双方の外来性活性を発現することから得られる利点がある、形質転換微生物と、グリセロールおよび１，３−プロパンジオールの生産方法とを開示する。
【００６９】
米国特許第６，０１３，４９４号明細書は、外来性グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、グリセロール−３−リン酸ホスファターゼ、デヒドラターゼ、および１，３−プロパンジオール酸化還元酵素（例えばｄｈａＴ）を含んでなる単一微生物を使用して、１，３−プロパンジオールを生産する方法を記載する。米国特許第６，１３６，５７６号明細書は、デヒドラターゼおよびタンパク質Ｘ（後にデヒドラターゼ再活性化因子ペプチドと同定された）をさらに含んでなる組換え微生物を含んでなる、１，３−プロパンジオールを生産する方法を開示する。
米国特許第６，５１４，７３３号明細書は、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを１，３−プロパンジオールに変換する、（ｄｈａＴによってコードされる１，３−プロパンジオール酸化還元酵素と区別される）非特異的触媒活性のおかげで、力価（１リットルあたりのグラム生成物）の顕著な増大が得られる、工程の改善を記載する。さらに米国特許第７，１３２，５２７号明細書は、１，３−プロパンジオールの生産に有用なベクターおよびプラスミドを開示する。
【００７０】
１，３−プロパンジオールの生成増大は、米国特許第７，３７１，５５８号明細書に記載されるように、いくつかの標的遺伝子発現の下方制御、およびその他の標的遺伝子の発現の上方制御をはじめとする宿主細菌のさらなる改変によって達成されてもよい。ＰＴＳマイナス宿主中におけるグルコースの炭素源としての利用のために、グルコキナーゼ活性の発現を増大させてもよい。
その発現の増大または上方制御が、１，３−プロパンジオール生成を増大させる追加的な遺伝子としては、以下をコードする遺伝子が挙げられる。
・  典型的にＥＣ  ４．１．１．３１として特徴付けられる、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
・  典型的にＥＣ  ２．５．１．１７として特徴付けられる、コブ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼ
・  ３−ＨＰＡと１，３−プロパンジオールの相互変換を触媒するのに十分な非特異的触媒活性、１，３−プロパンジオール酸化還元酵素は明確に除外され、典型的にこれらの酵素はアルコールデヒドロゲナーゼである。
【００７１】
その発現の低下または下方制御が、１，３−プロパンジオール生成を増大させる遺伝子としては、
・  好気性呼吸制御タンパク質
・  メチルグリオキサールシンターゼ
・  酢酸キナーゼ
・  ホスホトランスアセチラーゼ
・  アルデヒドデヒドロゲナーゼＡ
・  アルデヒドデヒドロゲナーゼＢ
・  トリオースリン酸イソメラーゼ
・  ホスホグルコン酸デヒドラターゼ
をコードする遺伝子が挙げられる。
【００７２】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される組換え細菌は、３−ヒドロキシプロピオン酸を産生できる。３−ヒドロキシプロピオン酸は、特殊合成のための効用を有して、例えば脱水によりアクリル酸、酸化によりマロン酸、アルコールとのエステル化反応によりエステル、および還元により１，３−プロパンジオールなど、既知の化学産業技術によって商業的に重要な中間体に変換され得る。３−ヒドロキシプロピオン酸は、所有者が共通の同時係属米国特許出願公開第２０１１／０１４４３７７  Ａ１号明細書に記載されるように、単一微生物によって発酵性炭素源から生物学的に生成されてもよい。１つの代表的な生合成経路中では、１，３−プロパンジオールの生成について上述したように、炭素基質が３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドに変換される。３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドは、アルデヒドデヒドロゲナーゼによって３−ヒドロキシプロピオン酸に変換される。アルデヒドデヒドロゲナーゼの適切な例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子ａｌｄＢ（コード配列は配列番号１５に記載される）によってコードされるＡｌｄＢ（配列番号１６）；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子ａｌｄＡ（コード配列は配列番号１７に記載される）によってコードされるＡｌｄＡ（配列番号１８）；および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子ａｌｄＨ（コード配列は配列番号１９に記載される（ａｓｓｅｔ  ｆｏｒｔｈ））によってコードされるＡｌｄＨ（配列番号２０）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００７３】
組換え細菌による１，３−プロパンジオール生成を改善する上述の改変の多くはまた、３−ヒドロキシプロピオン酸生成も改善し得る。例えばグリセロールキナーゼの除去は、Ｇ３Ｐホスファターゼの作用によってＧ３Ｐから生成されるグリセロールが、ＡＴＰを消費してＧ３Ｐに再変換されるのを妨げる。またグリセロールデヒドロゲナーゼ（例えばｇｌｄＡ）の除去は、ＮＡＤ依存性グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼの作用によってＤＨＡＰから生成されるグリセロールが、ジヒドロキシアセトンに変換されるのを妨げる。変異は、酵素活性の活性を損ないまたは改善するように、構造遺伝子を対象とし得て、または酵素活性の発現レベルを調節するように、プロモーター領域およびリボソーム結合部位をはじめとする調節遺伝子を対象とし得る。
【００７４】
上方制御または下方制御は、当業者に知られている多様な方法によって達成されてもよい。遺伝子の上方制御または下方制御は、例えば対応する（または非改変）野生型遺伝子によってコードされるタンパク質の活性などの対照の活性レベルと比較した、遺伝子によってコードされるタンパク質に由来する細胞中に存在する活性のレベル変化を指すことが、良く理解されている。
酵素経路に関与する特定の遺伝子を上方制御して、それらのコードされた機能の活性を増大させてもよい。例えばｐＢＲ３２２などのマルチコピープラスミド上で、選択された遺伝子の追加的なコピーが、宿主細胞に導入されてもよい。このような遺伝子はまた、それらのコードされた機能の活性増大をもたらす、適切な制御配列と共に染色体に組み込まれてもよい。標的遺伝子は、非天然プロモーターまたは改変天然プロモーターの制御下にあるように修飾されてもよい。内在性プロモーターは、変異、欠失、および／または置換によって生体内で改変され得る。
代案としては、それは所与の活性レベルに対する特定の遺伝子発現の低下、または排除に有用であってもよい。遺伝子を下方制御（中断）する方法は、当業者に知られている。
【００７５】
下方制御は、コード領域および／または調節（プロモーター）領域の欠失、挿入、または改変によって実施し得る。特定の下方制御は、ランダム変異と、それに続くスクリーニングまたは選択によって、または遺伝子配列が既知の場合は、当業者に知られている分子生物学的方法による直接介入によって、得られてもよい。下方制御をもたらす、特に有用でありながら排他的でない方法は、プロモーター強度を変化させることである。
さらに遺伝子発現の下方制御を使用して、対象タンパク質の発現を阻止し、または非機能性タンパク質発現をもたらしてもよい。これは、例えば１）コード領域および／または調節（プロモーター）領域を欠失させる、２）外来性核酸配列をコード領域および／調節（プロモーター）領域に挿入する、および３）（例えばＤＮＡ塩基対を変化させることで）コード領域および／または調節（プロモーター）領域を改変することで、達成されてもよい。特定の中断は、ランダム変異とそれに続くスクリーニングまたは選択によって得られてもよく、または遺伝子配列が既知の場合は、特定の中断は、当業者に知られている（ｋｎｏｗ  ｔｏ）分子生物学的方法を使用する直接介入によって得られてもよい。特に有用な方法は、大量のコード領域および／または調節（プロモーター）領域の欠失である。
【００７６】
組換えタンパク質発現を改変する方法は当業者に知られており、Ｂａｎｅｙｘ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９９）１０：４１１；Ｒｏｓｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９８）１８０：５３７５；ｄｅＨａｓｅｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９８）１８０：３０１９；Ｓｍｏｌｋｅ  ａｎｄ  Ｋｅａｓｌｉｎｇ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．（２００２）８０：７６２；Ｓｗａｒｔｚ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００１）１２：１９５；およびＭａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（２００２）１８４：５７３３である程度考察される。
上述したような、グリセロールおよびグリセロール誘導体をはじめとする微生物生成物の産生において、スクロースを代謝するための遺伝子発現に必要な変化を含有する組換え細菌は、当該技術分野で周知の技術を使用して構築されてもよい。
本明細書で開示される組換え細菌の構築は、適切な宿主微生物中でのグリセロールおよびその誘導体の生成において、スクロース利用能力をもたらす、コード領域のクローニング、形質転換、および発現に適する、多様なベクターおよび形質転換および発現カセットを使用して、達成されてもよい。適切なベクターは、用いられる細菌に適合するものである。適切なベクターは、例えば細菌、ウイルス（バクテリオファージＴ７、またはＭ−１３由来ファージなど）、コスミド、酵母または植物由来であり得る。このようなベクターを得て使用するためのプロトコルは、当業者に知られている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、前出）。
【００７７】
所望の宿主細菌中で本発明のコード領域の発現を駆動するのに有用な開始制御領域、またはプロモーターは多数あり、当業者に良く知られている。発現を駆動できる実質的にいずれのプロモーターも、本明細書での使用に適する。例えば上に列挙したプロモーターのいずれかを使用してもよい。
終結制御領域はまた、好ましい宿主に天然の様々な遺伝子に由来してもよい。終結部位は不要であってもよい；しかしそれが含まれることが最も望ましい。
当該ポリペプチドの効果的な発現のために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、発現が適切なメッセンジャーＲＮＡの形成をもたらすように、開始コドンを通じて、選択された発現調節領域と作動可能に連結する。
特に有用なのは、米国特許第７，３７１，５５８号明細書に記載されるベクターｐＳＹＣＯ１０１、ｐＳＹＣＯ１０３、ｐＳＹＣＯ１０６、およびｐＳＹＣＯ１０９と、米国特許第７，５２４，６６０号明細書に記載されるｐＳＹＣＯ４００／ＡＧＲＯである。これらのベクターの必須要素は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から単離されたｄｈａレギュロンに由来する。各ベクターは、読み取り枠ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、ｄｈａＢ３、ｄｈａＸ（コード配列は配列番号５９に記載され；コードされたポリペプチド配列は配列番号６０に記載される）、３つの別個のオペロン中に配列されたｏｒｆＸ、ＤＡＲ１、およびＧＰＰ２を含有する。ｐＳＹＣＯ１０１、ｐＳＹＣＯ１０３、ｐＳＹＣＯ１０６、ｐＳＹＣＯ１０９、およびｐＳＹＣＯ４００／ＡＧＲＯのヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、および配列番号６６に記載される。ベクター間の差異は、下のチャート内で図示される［接頭辞「ｐ−」は、プロモーターを示し；各「（）」内に入っている読み取り枠は、オペロンの組成を表す］：
ｐＳＹＣＯ１０１（配列番号６２）：ｐ−ｔｒｃ（Ｄａｒ１＿ＧＰＰ２）もう一方の２つの経路オペロンと比較して逆方向、
ｐ−１．６  ｌｏｎｇ  ＧＩ（ｄｈａＢ１＿ｄｈａＢ２＿ｄｈａＢ３＿ｄｈａＸ）、および
ｐ−１．６  ｌｏｎｇ  ＧＩ（ｏｒｆＹ＿ｏｒｆＸ＿ｏｒｆＷ）。
【００７８】
ｐＳＹＣＯ１０３（配列番号６３）：
ｐ−ｔｒｃ（Ｄａｒ１＿ＧＰＰ２）他の２つの経路オペロンと比較して同一方向、
ｐ−１．５  ｌｏｎｇ  ＧＩ（ｄｈａＢ１＿ｄｈａＢ２＿ｄｈａＢ３＿ｄｈａＸ）、および
ｐ−１．５  ｌｏｎｇ  ＧＩ（ｏｒｆＹ＿ｏｒｆＸ＿ｏｒｆＷ）。
【００７９】
ｐＳＹＣＯ１０６（配列番号６４）：
ｐ−ｔｒｃ（Ｄａｒ１＿ＧＰＰ２）他の２つの経路オペロンと比較して同一方向、ｐ−１．６  ｌｏｎｇ  ＧＩ（ｄｈａＢ１＿ｄｈａＢ２＿ｄｈａＢ３＿ｄｈａＸ）、およびｐ−１．６  ｌｏｎｇ  ＧＩ（ｏｒｆＹ＿ｏｒｆＸ＿ｏｒｆＷ）。
【００８０】
ｐＳＹＣＯ１０９（配列番号６５）：
ｐ−ｔｒｃ（Ｄａｒ１＿ＧＰＰ２）他の２つの経路オペロンと比較して同一方向、ｐ−１．６  ｌｏｎｇ  ＧＩ（ｄｈａＢ１＿ｄｈａＢ２＿ｄｈａＢ３＿ｄｈａＸ）、およびｐ−１．６  ｌｏｎｇ  ＧＩ（ｏｒｆＹ＿ｏｒｆＸ）。
【００８１】
ｐＳＹＣＯ４００／ＡＧＲＯ（配列番号６６）：
ｐ−ｔｒｃ（Ｄａｒ１＿ＧＰＰ２）他の２つの経路オペロンと比較して同一方向、ｐ−１．６  ｌｏｎｇ  ＧＩ（ｄｈａＢ１＿ｄｈａＢ２＿ｄｈａＢ３＿ｄｈａＸ）、およびｐ−１．６  ｌｏｎｇ  ＧＩ（ｏｒｆＹ＿ｏｒｆＸ）。
【００８２】
ｐ−１．２０  ｓｈｏｒｔ／ｌｏｎｇ  ＧＩ（ｓｃｒＫ）経路オペロンと比較して逆方向。
【００８３】
ひとたび適切な発現カセットが構築されたら、それらを使用して適切な宿主細菌を形質転換する。コード領域を含有するカセットの宿主細菌への導入は、（例えばカルシウム透過処理細胞、または電気穿孔を使用した）形質転換により、または組換えファージウイルスを使用した形質移入により、既知の手順によって達成されてもよい（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、前出）。発現カセットは、宿主細胞中の安定したプラスミド上で維持されてもよい。これに加えて、発現カセットは、当業者に良く知られているベクターおよび方法を使用して、相同的またはランダム組換えを通じて、宿主細菌のゲノムに組み込まれてもよい。発現カセットのゲノム組み込みのために、部位特異的組換え系もまた使用してもよい。
例示される細胞の他に、グリセロールおよび／またはその誘導体をはじめとする、微生物産物の生成を高めるように特にデザインされた、単一または複数の変異を有する細胞もまた使用してもよい。常態では炭素原材料を非生産的経路に転用し、または顕著な異化代謝産物抑制を示す細胞を変異させてこれらの表現型の欠陥を回避してもよい。
【００８４】
変異株を作り出す方法は技術分野で一般的であり、よく知られている。いくつかの方法の概要が、米国特許第７，３７１，５５８号明細書に報告される。照射または化学薬剤を使用して変異株を作り出す特定の方法は、当該技術分野の文献で十分に立証されている。例えばＴｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ．、またはＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６，２２７（１９９２）を参照されたい。
変異誘発が起きた後、所望の表現型を有する変異株は、多様な方法によって選択されてもよい。ランダムスクリーニングは、所望の産物または中間体を産生する能力について、変異誘発細胞を選択する場合に、最も一般的である。代案としては、変異株の選択的単離は、耐性コロニーのみが増殖し得る選択培地上で、変異誘発集団を培養することで実施し得る。変異株選択法は高度に発達しており、工業微生物学技術分野で周知である。例えば、Ｂｒｏｃｋ、前出；ＤｅＭａｎｃｉｌｈａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．１４，３１３（１９８４）を参照されたい。
【００８５】
本発明の発酵培地は、炭素基質としてスクロースを含んでなる。グルコースおよび果糖などのその他の炭素基質もまた、存在してもよい。
炭素基質に加えて、適切な発酵培地は、例えば培養物増殖と、グリセロールおよびその誘導体、例えば１，３−プロパンジオールの生成に必要な酵素経路促進とに適する、当業者に知られている、適切なミネラル、塩、補助因子、緩衝液およびその他の成分を含有する。１，３−プロパンジオールの生産では、Ｃｏ（ＩＩ）塩および／またはビタミンＢ12またはその前駆体に、特に注意が払われた。
アデノシル−コバラミン（補酵素Ｂ12）は、デヒドラターゼ活性の重要な補助因子である。補酵素Ｂ12の合成は原核生物中に見られ、例えばエシェリキア・ブラタエ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｂｌａｔｔａｅ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）種、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）種、およびクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種などのそのいくつかが、化合物を新規合成できる一方で、その他は部分反応ができる。例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、コリン環構造を作れないが、コビナミドからコリノイドへの変換を触媒でき、５’−デオキシアデノシル基を導入できる。したがってビタミンＢ12などの補酵素Ｂ12前駆体が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発酵中に提供されなくてはならないことは、当該技術分野で公知である。ビタミンＢ12は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発酵に、継続的に定速で、または細胞集団の発生と一致するように段階的に添加してもよく、または単回または複数回ボーラスで添加されてもよい。
本明細書に記載される形質転換大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）にはビタミンＢ12が添加されるが、ビタミンＢ12を新規生合成できるその他の細菌も適切な産生細胞であり、これらの細菌へのビタミンＢ12添加は不要であることが検討される。
【００８６】
典型的に細菌細胞は、スクロースを含有する適切な培地中で、２５〜４０℃で培養される。本明細書で使用される適切な増殖培地の例は、ルリア・ベルターニ（ＬＢ）ブロス、サブローデキストロース（ＳＤ）ブロスまたは酵母培地（ＹＭ）ブロスなど、一般的な商業的に調製された培地である。その他の規定培地または合成増殖培地もまた使用してよく、特定の細菌の増殖に適した培地は、微生物学または発酵科学当業者に知られている。例えば環状アデノシン2',3'-一リン酸など、異化代謝産物抑制を直接または間接的に調節することが知られている作用薬の使用もまた、反応培地中に組み込まれてもよい。同様に、１，３−プロパンジオール生成の増強をもたらす、酵素機能を調節することが知られている作用薬（例えばメチルビオロゲン）の使用も、１，３−プロパンジオール産生株の遺伝子操作と併用して、またはその代案として使用されてもよい。
発酵に適したｐＨ範囲はｐＨ５．０〜ｐＨ９．０であり、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０が初期条件として典型的である。
反応は、組換細菌の要件に応じて、好気性、無酸素、または嫌気性条件下で実施されてもよい。流加発酵は、例えば限定的または過剰な炭素基質などの炭素供給と共に、実施されてもよい。
【００８７】
バッチ発酵が、一般に使用される方法である。古典的なバッチ発酵は閉鎖系であり、そこでは培養液の組成が発酵の初めに設定され、発酵プロセス中に人為的変更を受けない。したがって発酵プロセス開始時に培養液に所望の細菌を接種して、システムには何も添加せずに発酵させる。しかし典型的に、「バッチ」発酵は、炭素源添加に関してバッチであり、ｐＨおよび酸素濃度などの要素を制御する試みが頻繁になされる。バッチ系では、システムの代謝産物およびバイオマス組成は、発酵を停止させる時点まで常に変化する。バッチ培養内では、細胞は、静的な遅滞期から高い対数増殖期へ、そして最後に増殖速度が減退または停止する静止期へ減速する。処置を施さない場合、静止期にある細胞はやがて死滅する。一般に対数期にある細胞が、最終生成物または中間体産生の大部分を担う。
標準バッチ系の変法が、流加系である。流加発酵工程もまた本明細書で使用するのに適し、発酵が進行するにつれて、基質が徐々に添加されることを除いては、典型的なバッチ系を含んでなる。流加バッチ系は、異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向があって、培地中に限定量の基材を有することが望ましい場合に有用である。流加バッチ系中の実際の基質濃度の測定は困難であるので、ｐＨ、溶存酸素、およびＣＯ2のような排ガス分圧などの測定可能因子の変化に基づいて推定される。バッチおよび流加発酵は一般的で、当該技術分野で周知であり、例は前出のＢｒｏｃｋに見出し得る。
【００８８】
連続発酵は、バイオリアクターに規定発酵培地が継続的に添加される開放系であり、同時に等量の馴化培地が、処理のために取り出される。連続発酵は、一般に、細胞が主に対数増殖期にある一定の高密度に培養を維持する。
連続発酵は、細胞増殖または最終生成物濃度に影響を及ぼす、１つの要素またはいくつもの要素の調節を可能にする。例えば１つの方法は、炭素源または窒素レベルなどの制限的栄養物質を定率に保ち、全てのその他のパラメータを加減する。その他のシステムでは、培地の濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、増殖に影響を及ぼすいくつかの要素を継続的に変更し得る。連続系は、定常状態増殖条件を維持するように努め、したがって培地の抜き取りに起因する細胞損失は、発酵中の細胞増殖速度と平衡状態になくてはならない。連続発酵工程のために栄養素と増殖因子を調節する方法、ならびに生成物生成速度を最大化する技術は、工業微生物学の技術分野で周知であり、多様な方法が前出のＢｒｏｃｋに詳述される。
【００８９】
本発明は、バッチ、流加または連続法を使用して実施されてもよく、任意の公知の発酵様式が適切であることが考察される。さらにホールセル触媒として、細胞を基質上に固定化し、１，３−プロパンジオールなどのグリセロールおよびグリセロール誘導体生成のための発酵条件に曝露してもよいことが、検討される。
いくつかの実施形態では、スクロースからグリセロール、１，３−プロパンジオール、および／または３−ヒドロキシプロピオン酸を生産する方法が提供される。方法は、上述したように、スクロース存在下で組換え細菌を培養するステップを含んでなり、生成されたグリセロール、１，３−プロパンジオール、および／または３−ヒドロキシプロピオン酸を回収するステップを含んでなってもよい。生成物は、当該技術分野で公知の方法を使用して回収されてもよい。例えば遠心分離、濾過、デカンテーションなどによって、固形物を発酵培地から除去してもよい。次に、上述したように固形物を除去するように処理された発酵培地から、蒸留、液液抽出、または膜ベース分離などの方法を使用して、生成物を単離してもよい。
【実施例】
【００９０】
本発明を以下の実施例でさらに定義する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しながら、例証としてのみ提供されるものと理解すべきである。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的特性を見極め得て、その精神と範囲を逸脱することなく、本発明に様々な変更と修飾を加えて、それを様々な用途と条件に適応させ得る。
【００９１】
一般方法
実施例に記載される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，（１９８９）（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、およびＴ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ，ａｎｄ  Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）、およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂ．ｂｙ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）に記載される。
【００９２】
略語の意味は、次の通りである。「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋｂｐ」はキロ塩基対を意味し、「ｒｐｍ」は毎分回転数を意味し、「ＡＴＣＣ」はＭａｎａｓｓａｓ，ＶＡの米国微生物系統保存機関を意味し、「ｄＨ2Ｏ」は蒸留水を意味する。
【００９３】
培養液および培養条件：
細菌培養の維持および増殖に適した材料および方法もまた、技術分野で周知である。以下の実施例で使用するのに適した技術は、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ，Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ，Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ，Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ  ａｎｄ  Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，ｅｄｓ），Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．（１９９４））、またはＴｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９）に記載される。細菌細胞の増殖および維持に関して記載される、全ての試薬、制限酵素および材料は、特に断りのない限り、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、またはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得られてもよい。
【００９４】
ＬＢ（ルリア・ベルターニ）培地は、１リットルの培地あたり以下を含有する：バクトトリプトン（１０ｇ）、バクトイースト抽出物（５ｇ）、およびＮａＣｌ（１０ｇ）。添加物は、下の実施例に記載されるように添加された。全ての添加物は、培地への添加前に滅菌された。
【００９５】
分子生物学技術：
制限酵素消化、ライゲーション、形質転換、およびアガロースゲル電気泳動法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されるように実施された。ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）技術は、Ｗｈｉｔｅ，Ｂ．，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  １５（１９９３），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．ＮＹにある。
【００９６】
実施例１および２
Ｒ３００Ａ変異を有する変異ＣｓｃＢスクロース輸送体を含んでなる組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株
これらの実施例の目的は、ＣｓｃＢのＲ３００Ａ変異体（配列番号１００）をコードする、変異ＣｓｃＢスクロース輸送遺伝子（コード配列は配列番号９９に記載される）を含有する、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を構築して、拡散促進によるスクロース輸送を実証することであった。変異スクロース輸送遺伝子によってコードされるタンパク質は、Ｈ+移行に必須な残基に変性され、したがってＨ+／スクロース共輸送（すなわちスクロースの能動輸送）が排除された。
【００９７】
発現ベクターの構築：
１つの発現ベクターではプロモーター要素Ｐ１．２０を使用して、２つ目ではプロモーター要素Ｐ１．５を使用して、２つの発現ベクターを構築した。Ｐ１．２０およびＰ１．５は、米国特許第７，１３２，５２７号明細書に記載される、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）グルコースイソメラーゼプロモーターに由来するプロモーター要素を指す。これらの２つのプロモーターは、Ｐ１．２０が、Ｐ１．５よりも低い発現をもたらすように、−３５領域の１つの塩基が互いに異なる。
【００９８】
Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ）によってプロモーター／多重クローニング部位／二重ターミネーター領域が合成され、それらのｐＩＤＴｓｍａｒｔベクターにクローン化されて、プラスミドの構築がもたらされ、ｐＤＭＷＰ１およびｐＤＭＷＰ３と命名された。ベクターｐＤＭＷＰ１およびｐＤＭＷＰ３の合成領域の配列（ｓｅｑｅｕｃｅｓ）は、それぞれ配列番号１１３および配列番号１１４に記載される。
【００９９】
本明細書でｐＤＭＷＰ４と称されるプラスミドは、引き続く構築物の主鎖として使用された。プラスミドｐＤＭＷＰ４は、以下のように制限酵素認識部位を修飾することで、プラスミドｐＢＲ３２２から構築した。ＴｅｔＲ遺伝子の５’末端上のＳｃａ１部位およびＫｐｎＩ部位、およびＴｅｔＲ遺伝子の３’末端の追加的なＫｐｎＩ部位をプラスミドｐＢＲ３２２に導入した。さらにまた、ＡｍｐＲ遺伝子の中央からＫｐｎＩ部位を除去した。全ての部位は、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）キット（Ｓｔｒａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して、製造会社のプロトコルに従って、付加または除去した。
【０１００】
プラスミドｐＤＭＷＰ１およびＤＭＷＰ３は、ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化した。各構築物から生じた４３８ｂｐの断片をｐＤＭＷＰ４に個別にクローン化して、それもまたＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化して、完全なプラスミドｐＤＭＷＰ１０およびｐＤＭＷＰ１２にして、これらは本明細書でそれぞれｐＢＲ*Ｐ１．５およびｐＢＲ*１．２０とも称される。
【０１０１】
ＣｓｃＢのＲ３００Ａ変異には、対立遺伝子名ｃｓｃＢ３が与えられた。ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的変異誘発キットを使用して、製造業者のプロトコルに従って、部位特異的変異誘発によって、この変異をプラスミドｐＢＨＲｃｓｃＢＫＡ（米国特許出願公開第  ２０１１／０１３６１９０号明細書、実施例１に記載される）に導入した。反応テンプレートとしてのプラスミドｐＢＨＲｃｓｃＢＫＡと共に、プライマーＯＤＭＷＰ２３（配列番号１１５）およびＯＤＭＷＰ２４（配列番号１１６）を使用して、プラスミドｐＤＭＷＰ５を作成した。引き続いてプライマーＯＤＭＷＰ３１（配列番号１１７）およびＯＤＭＷＰ３２（配列番号１１８）を使用して、ｃｓｃＢ３遺伝子をｐＤＭＷＰ５から増幅し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＣｌａＩ部位を付加した。得られた生成物をｐＢＡＤｔｏｐｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローン化して、プラスミドｐＤＭＷＰ２６を作成した。
【０１０２】
ｐＤＭＷＰ２６からのＨｉｎｄＩＩＩ／Ｃｌａ断片をＨｉｎｄＩＩＩ／ＣｌａＩ消化ｐＤＭＷＰ１２にクローン化して、プロモーターＰ１．２０を含有するプラスミドｐＤＭＷＰ３２を作成した。
ｐＤＭＷＰ３２からのＨｉｎｄＩＩＩ／Ｐａｃ断片をＨｉｎｄＩＩＩ／Ｐａｃ消化ｐＤＭＷＰ１０にクローン化して、プロモーターＰ１．５を含有するｐＤＭＷＰ７３を作成した。
【０１０３】
ｃｓｃＢ３の発現ありまたはなし大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の構築：
スクロース輸送体機能は有しないが、下流代謝のためのスクロースインベルターゼおよびフルクトキナーゼをコードする遺伝子を持つ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株［ＦＭ５ｙｉｈＰ：ｃｓｃＡ＋Ｋ＋Ｂ−（Δ６１−３５３、ｋａｎＲ）］である、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＤＯ３５１３株を宿主株として使用した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＤＯ３５１３株は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）  ＦＭ５株（ＡＴＣＣ（登録商標）Ｎｏ．５３９１１）中のｙｉｈＰ遺伝子に組み込まれた、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ（登録商標）１３２８１からの野性型ｃｓｃＡＫＢ遺伝子クラスターを含有する、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（本明細書でＰＤＯ３０８５と称される）から構築した。λ  Ｒｅｄ法によって、ｃｓｃＡＫＢ遺伝子クラスター（配列番号６１）を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦＭ５株（ＡＴＣＣ（登録商標）Ｎｏ．５３９１１）中のｙｉｈＰ位置に組み込んだ。ｙｉｈＰ遺伝子の側面に位置する配列を含有する、ｙｉｈＰ  ｃｓｃＡプライマー（配列番号１２０）およびｙｉｈＰ  ｃｓｃＢプライマー（配列番号１２１）を使用して、米国特許出願公開第２０１１／０１３６１９０Ａ１号明細書の実施例１に記載されるようにして構築されたプラスミドｐＢＨＲ−ｃｓｃＢＫＡ（配列番号１１９）から、ｃｓｃＡＫＢ遺伝子クラスターを増幅した。ＰｓｔＩ消化によって直線化されたプラスミドｐＢＨＲ−ｃｓｃＢＫＡをＰＣＲテンプレートとして使用した。ＰＣＲ反応では、Ｈｉｇｈ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰｆｕＵｌｔｒａ  （登録商標）ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用した。以下のサイクル条件を使用して、ＰＣＲを実施した：９５℃で２分間；９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で４分間を３５サイクル；次に７２℃で７分間。得られたＰＣＲ産物は、４℃で保存した。ＰＣＲ産物は、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して精製した。λ  ｒｅｄ組換え手順に続いて、λリコンビナーゼをコードするｐＫＤ４６プラスミド（Ｒｅｄリコンビナーゼプラスミド、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ０４８７４６）を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦＭ５株に、精製ＰＣＲ産物を電気穿孔した（Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．Ａ．ａｎｄ  Ｗａｎｎｅｒ，Ｂ．Ｌ．，２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７，６６４０−６６４５）。１０ｇ／Ｌのスクロースを含有するＭＯＰＳ最小プレート上に、形質転換混合物を播種した。ＭＯＰＳ最小プレートは、１×ＭＯＰＳ緩衝液（Ｔｅｃｈｎｏｖａ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）、１．３２ｍＭのＫＨ2ＰＯ4  （Ｔｅｃｈｎｏｖａ）、５０μｇ／Ｌのウラシル、および１．５ｇ／ＬのＢａｃｔｏ寒天を含有した。プレートを３７℃で２〜３日間培養した。最小スクロースプレート上で増殖したコロニーを選択して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＤＯ３０８５株を得た。
【０１０４】
次にカナマイシン耐性カセットによって置換することで、ＰＤＯ３０８５中のクラスター中のｃｓｃＢ遺伝子を部分的に欠失させた。カナマイシン耐性カセットは、ｃｓｃＢ６１  ｕｐ  ｋａｎプライマー（配列番号９１）およびｃｓｃＢ３５３  ｄｏｗｎ  ｋａｎプライマー（配列番号９２）を使用して、ｐＫＤ４テンプレートプラスミドから増幅された（Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ａｎｄ  Ｗａｎｎｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：６６４０−６６４５，２０００）。ＰＣＲ反応では、Ｈｉｇｈ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰｆｕＵｌｔｒａ（登録商標）ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用した。以下のサイクル条件を使用して、ＰＣＲを実施した：９５℃で２分間；９５℃で２０秒間、６０℃で２０秒間、および７２℃で１．５分間を３０サイクル；次に７２℃で３分間。得られたＰＣＲ産物は４℃で保存した。ＰＣＲ産物は、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。λ  ｒｅｄ組換え手順に続いて、λリコンビナーゼをコードするｐＫＤ４６プラスミドを含有するＰＤＯ３０８５株に、精製ＰＣＲ産物を電気穿孔した。２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＬＢプレート上に、形質転換混合物を播種した。ＭＯＰＳ＋１０ｇ／Ｌのスクロースプレート上でカナマイシン耐性コロニーをチェックして、それらがスクロース上で増殖できないことを確認した。ＣｓｃＢの残基６１と３５３の間へのカナマイシン耐性カセットの挿入は、ｃｓｃＢ５’プライマー（配列番号９３）およびｃｓｃＢ３’プライマー（配列番号９４）を使用して、ＰＣＲによって確認された。得られたＦＭ５  ｙｉｈＰ：ｃｓｃＡ＋Ｋ＋Ｂ−（Δ６１−３５３、ｋａｎＲ）株は、ＰＤＯ３５１３と命名された。
【０１０５】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＤＯ３５１３株に、プラスミドｐＤＭＷＰ１０（ベクターのみ）および変異ｃｓｃＢ３遺伝子を保有するｐＤＭＷＰ７３を独立して導入した。結果として得られた株は、それぞれＰＤＯ２７６８およびＰＤＯ２７７０と命名された。
【０１０６】
ｃｓｃＢ３の発現ありまたはなし大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の増殖特性解析：
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＤＯ２７６８株（例２、比較例）およびＰＤＯ２７７０株（実施例１）を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ（ルリア・ベルターニ）培地中において、３７℃で一晩培養した。翌日、２ｇ／Ｌのスクロースと２５μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＭＯＰＳ最少培地（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈａｌｆ  Ｍｏｏｎ  Ｂａｙ，ＣＡ）で、これらの培養物を１：５０に希釈した。これらの培養物を２５０ｒｐｍで振盪しながら、３７℃で４時間培養した。Ｂｉｏｓｃｒｅｅｎ−Ｃプレート（装置およびプレートはＧｒｏｗｔｈ  Ｃｕｒｖｅｓ  ＵＳＡ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪから購入された）のウェル内で、２ｇ／Ｌグルコースまたは１６ｇ／Ｌスクロースを含有する１５０μＬのＭＯＰＳ最少培地（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈａｌｆ  Ｍｏｏｎ  Ｂａｙ，ＣＡ）で、対数期培養物を１：１００に希釈した。三重反復試験において、培養物を連続振盪しながら３７℃で培養して、光学濃度をモニターした。接種の４０時間後における２つの培養物の光学濃度は、表３に示される。
【０１０７】
表３
グルコースまたはスクロース上で成長した培養物の４０時間目の光学濃度
2015509378.tif 000006
【０１０８】
表３のデータを見ても分かるように、どちらの株もグルコースを唯一の炭素源として良好に増殖した。対照的に、対照株（すなわちベクターのみの株）ＰＤＯ２７６８（例２、比較例）がスクロースを唯一の炭素源として増殖できなかった一方で、スクロース輸送体をコードする変異ｃｓｃＢ３遺伝子を発現して、Ｈ+イオンを移行できない株であるＰＤＯ２７７０（実施例１）は、スクロースを唯一の炭素源として増殖できた。したがって膜を超える正味のスクロース移行は、Ｈ+イオンの移行なしに起きたに違いない。
【０１０９】
実施例３
Ｒ３００ＡおよびＱ３５３Ｈ変異を有する変異ＣｓｃＢスクロース輸送体を含んでなる組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株
本実施例の目的は、Ｒ３００ＡおよびＱ３５３Ｈ変異を有するＣｓｃＢ（配列番号１０４）をコードする、変異ＣｓｃＢスクロース輸送遺伝子（コード配列は配列番号１０３に記載される）を含有する、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を構築して、ｃｓｃＢ３にＱ３５３Ｈ改変を与える追加的な変異による、拡散促進による改善されたスクロース輸送を実証することであった。
【０１１０】
発現ベクターの構築：
より小型のベクターへのクローニングを容易にするために、プラスミドをＰｓｔＩで消化して再連結することで、ｐＢＨＲｃｓｃＢＫＡｍｕｔＢからのＫａｎＲ遺伝子（米国特許出願公開第２０１１／０１３６１９０号明細書、実施例１に記載される）を除去し、プラスミドｐＤＭＷＰ６を作成した。新しいベクターは、親ベクターよりも１２４０ｂｐ小さかった。このベクター中の変異ｃｓｃＢ遺伝子は、野性型スクロース共輸送体と比較して、改善されたスクロース輸送があるＱ３５３Ｈ変異体を与える（Ｊａｈｒｅｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：５３０７−５３１６，２００２）。この変異が、拡散促進によってスクロース輸送を改善するかどうかは、分かっていなかった。
【０１１１】
Ｒ３００Ａ変異体を与える変異は、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的変異誘発キットを使用して、製造業者のプロトコルに従って、部位特異的変異誘発によってプラスミドｐＤＭＷＰ６に装入された。反応テンプレートとしてのプラスミドｐＤＭＷＰ６と共に、プライマーＯＤＭＷＰ２３（配列番号１１５）およびＯＤＭＷＰ２４（配列番号１１６）を使用して、プラスミドｐＤＭＷＰ１５を作成した。プライマーＯＤＭＷＰ３１（配列番号１１７）およびＯＤＭＷＰ３２（配列番号１１８）を使用して、ｃｓｃＢ５遺伝子（Ｒ３００ＡおよびＱ３５３Ｈ変異を含有する）を引き続いてｐＤＭＷＰ６から増幅し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＣｌａＩ部位を付加した。得られた生成物をｐＢＡＤｔｏｐｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローン化して、プラスミドｐＤＭＷＰ２７を作成した。
ｐＤＭＷＰ２７からのＨｉｎｄＩＩＩ／Ｃｌａ断片をＨｉｎｄＩＩＩ／ＣｌａＩ消化ｐＤＭＷＰ１２にクローン化して、Ｐ１．２０プロモーターを含有するｐＤＭＷＰ３３を作成した。
ｐＤＭＷＰ３３からのＨｉｎｄＩＩＩ／Ｐａｃ断片をＨｉｎｄＩＩＩ／Ｐａｃ消化ｐＤＭＷＰ１０にクローン化して、Ｐ１．５プロモーターを含有するｐＤＭＷＰ６６を作成した。
【０１１２】
ｃｓｃＢ５の発現がある大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の構築：
プラスミドｐＤＭＷＰ６６（ｐＢＲ*ｐ１．５ｃｓｃ５）をＰＤＯ３５１３株に形質転換して、ＰＤＯ２７７１株を得た。
ｃｓｃＢ３またはｃｓｃＢ５の発現がある大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の増殖特性解析：
（ｐＢＲ*ｐ１．５ｃｓｃ３があり、実施例１および２に記載される）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＤＯ２７７０株、および（ｐＢＲ*ｐ１．５ｃｓｃ５がある）ＰＤＯ２７７１株を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ（ルリア・ベルターニ）培地中において、３７℃で一晩培養した。翌日、２ｇ／Ｌのスクロースおよび２５μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＭＯＰＳ最少培地（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈａｌｆ  Ｍｏｏｎ  Ｂａｙ，ＣＡ）で、これらの培養物を１：５０に希釈した。これらの培養物を２５０ｒｐｍで振盪しながら、３７℃で４時間培養した。Ｂｉｏｓｃｒｅｅｎ−Ｃプレート（装置およびプレートはＧｒｏｗｔｈ  Ｃｕｒｖｅｓ  ＵＳＡ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪから購入された）のウェル内で、２ｇ／Ｌのグルコースまたは１６ｇ／Ｌのスクロースを含有する１５０μＬのＭＯＰＳ最少培地（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈａｌｆ  Ｍｏｏｎ  Ｂａｙ，ＣＡ）で、対数期培養物を１：１００に希釈した。三重反復試験において、培養物を連続振盪しながら３７℃で培養して、光学濃度をモニターした。スクロース上の増殖は、ＰＤＯ２７７０株培養物よりも、ＰＤＯ２７７１株培養物中ではるかにより迅速であった。接種の１４時間後に、１６ｇ／Ｌのスクロース上で増殖したＰＤＯ２７７０培養物の光学濃度が、０．０６０±０．０２４であった一方で、１６ｇ／Ｌのスクロース上で増殖したＰＤＯ２７７１培養物の光学濃度は、０．６４７±０．００９であった。種菌培養物の健康尺度として、グルコース上の増殖を測定した。どちらの株もグルコースを唯一の炭素源として、良好に増殖した。接種の１４時間後に、グルコース上で増殖したＰＤＯ２７７０培養物の光学濃度は０．６３９±０．０３７であり、グルコース上で増殖したＰＤＯ２７７１培養物の光学濃度は、ｓ０．６９３±０．０７０であった。これらの結果は、スクロースを唯一の炭素源として、Ｑ３５３ＨおよびＲ３００Ａ変異の双方があるスクロース輸送体であるＣｓｃＢ５を発現する株が、ＣｓｃＢ３（Ｒ３００Ａ）のみを発現する株よりも、はるかにより良く増殖できたことを実証する。ＣｓｃＢ５タンパク質は、Ｈ+移行に必須の残基中に変異をなおも保有するので、それはＨ+イオンの移行なしに、スクロースを輸送しなくてはならない。したがって二重変異のある遺伝子によってコードされる輸送体は、改善された拡散促進スクロース輸送体である。
【０１１３】
実施例４〜６
変異または野性型スクロース輸送体を含んでなる組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株のスクロース上の増殖
これらの実施例の目的は、Ｒ３００ＡおよびＱ３５３Ｈ変異を有するＣｓｃＢの変異体を含んでなる組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株が、野性型スクロース輸送体を含んでなる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株よりも、さらに広いスクロース濃度範囲で増殖できることを示すことであった。
【０１１４】
発現ベクターの構築：
野性型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｃｓｃＢ遺伝子は、最初にプライマーＯＤＭＷＰ３１（配列番号１１７）およびＯＤＭＷＰ３２（配列番号１１８）によって、米国特許出願公開第２０１１／０１３６１９０号明細書、実施例１に記載されるｐＢＨＲｃｓｃＢＫＡ（配列番号１１９）から増幅し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＣｌａＩ部位の双方を遺伝子の５’および３’末端にそれぞれ付加させた。ＰＣＲ断片をｐＢＡＤｔｏｐｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローン化して、プラスミドｐＤＭＷＰ２５を作成した。
ｐＤＭＷＰ２５からのＨｉｎｄＩＩＩ／Ｃｌａ断片をＨｉｎｄＩＩＩ／Ｃｌａ消化ｐＤＭＷＰ１２にクローン化して、プロモーターＰ１．２０を含有するプラスミドｐＤＭＷＰ３１を作成した。
ｐＤＭＷＰ３１からのＨｉｎｄＩＩＩ／Ｐａｃ消化断片をＨｉｎｄＩＩＩ／Ｐａｃ消化ｐＤＭＷＰ１０にクローン化して、プロモーターＰ１．５を含有するｐＤＭＷＰ７１を作成した。
【０１１５】
野性型スクロース輸送体ＣｓｃＢを含んでなる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の構築：
プラスミドｐＤＭＷＰ３１（ｐＢＲ*ｐ１．２０ｃｓｃＢ）およびｐＤＭＷＰ７１（ｐＢＲ*ｐ１．５ｃｓｃＢ）を独立してＰＤＯ３５１３株に形質転換し、ＰＤＯ２６２５およびＰＤＯ２７６９株をそれぞれ得た。
【０１１６】
ｃｓｃＢ５または野性型ｃｓｃＢの発現がある株の増殖特性解析：
野性型スクロース共輸送体をコードするプラスミドがある２つの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株である、ＰＤＯ２６２５株（例５、比較例）およびＰＤＯ２７６９株（例６、比較例）と、改善されたスクロース単輸送体を保有するプラスミドがあるＰＤＯ２７７１株（実施例４、ｐＢＲ*ｐ１．５ｃｓｃ５がある、実施例３に記載される）とを、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ（ルリア・ベルターニ）培地中において、３７℃で一晩培養した。翌日、２ｇ／Ｌのスクロースおよび２５μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＭＯＰＳ最少培地（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈａｌｆ  Ｍｏｏｎ  Ｂａｙ，ＣＡ）で、これらの培養物を１：５０に希釈した。これらの培養物を２５０ｒｐｍで振盪しながら、３７℃で４時間培養した。Ｂｉｏｓｃｒｅｅｎ−Ｃプレート（装置およびプレートはＧｒｏｗｔｈ  Ｃｕｒｖｅｓ  ＵＳＡ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪから購入された）のウェル内で、２ｇ／Ｌのグルコースまたは２、４、８、１６、または３２ｇ／Ｌのスクロースを含有する１５０μＬのＭＯＰＳ最少培地（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈａｌｆ  Ｍｏｏｎ  Ｂａｙ，ＣＡ）で、対数期培養物を１：１００に希釈した。三重反復試験において、培養物を連続振盪しながら３７℃で培養して、光学濃度をモニターした。様々な濃度のスクロース上における増殖が続いた。表４は、ＰＤＯ２７７１、ＰＤＯ２６２５、およびＰＤＯ２７６９の培養物の接種１４時間後の光学濃度を示す。
【０１１７】
表４
グルコースまたは様々な濃度のスクロース上で成長した培養物の１４時間目の光学濃度
2015509378.tif 000007
【０１１８】
表４の結果によって示されるように、全ての３つの株は２ｇ／Ｌのグルコース上で良好に増殖し、種菌培養物が生存可能であることが示唆された。ＰＤＯ２６２５株（例５、比較例）およびＰＤＯ２７６９株（例６、比較例）の増殖は、２または４ｇ／Ｌの低スクロース濃度において、ＰＤＯ２７７１株（実施例４）よりもさらに良い。しかし１６または３２ｇ／Ｌのより高いスクロース濃度では、ＰＤＯ２７７１が優れた増殖を維持した一方で、ＰＤＯ２５２５およびＰＤＯ２７６９の増殖は極度に阻害された。これらの結果は、スクロース拡散促進輸送体であるＣｓｃＢ５を発現する株が、野性型スクロース共輸送体を発現する株よりも、さらに広いスクロース濃度範囲で増殖できることを実証する。したがって拡散促進または単輸送は、共輸送体が増殖を可能にしない条件下で、増殖を可能にする利点を有する。
【０１１９】
例７〜１０
Ｒ３００ＡおよびＱ３５３Ｈ変異を有するＣｓｃＢスクロース輸送体変異を含んでなる株、および野性型スクロース輸送体ＣｓｃＢを含んでなる株による、スクロースからのＰＤＯ生成
これらの実施例の目的は、Ｒ３００ＡおよびＱ３５３Ｈ変異を有するＣｓｃＢ変異を含んでなる組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株が、スクロース上で増殖した際に、野性型スクロース輸送体ＣｓｃＢを含んでなる組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株よりも、さらに良いＰＤＯ生成を与えることを示すことであった。
【０１２０】
ＰＤＯ生成のためのスクロース輸送体機能を試験する株は、ＰＤＯ産生株ＴＴａｂ  ｐＳＹＣＯ４００／ＡＧＲＯを使用して構築した。ＰＴＳマイナス株である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＴａｂ  ｐＳＹＣＯ４００／ＡＧＲＯ株は、次のように構築した。米国特許第７，３７１，５５８号明細書（実施例１７）に記載されるＴＴ  ａｌｄＡ株からのａｌｄＢ遺伝子の欠失によって、ＴＴａｂ株を作り出した。簡単に述べると、最初にｐＫＤ３プラスミドのＦＲＴ−ＣｍＲ−ＦＲＴカセットで、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５株中のａｌｄＢコード領域の１．５ｋｂｐを置換して、ａｌｄＢ欠失を作成した（Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ａｎｄ  Ｗａｎｎｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：６６４０−６６４５，２０００）。テンプレートとしてｐＫＤ３を使用し、配列番号９９と配列番号１００のプライマー対によって、置換カセットを増幅した。プライマー配列番号９９は、ａｌｄＢの５’末端に対する８０ｂｐの相同性と、ｐＫＤ３に対する２０ｂｐの相同性を含有する。プライマー配列番号１００は、ａｌｄＢの３’末端に対する８０ｂｐの相同性と、ｐＫＤ３に対する２０ｂｐの相同性を含有する。ＰＣＲ産物をゲル精製して、ＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６コンピテント細胞に電気穿孔した（米国特許第７，３７１，５５８号明細書）。組換え株は、１２．５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを添加したＬＢ（ルリア・ベルターニ）プレート上で選択した。配列番号１０１および配列番号１０２のプライマー対を使用して、ａｌｄＢ遺伝子の欠失をＰＣＲによって確認した。野生型株が１．５ｋｂｐのＰＣＲ産物を与えた一方で、組換え株は特徴的な１．１ｋｂｐのＰＣＲ産物を与えた。Ｐ１溶解産物を調製して使用し、変異をＴＴ  ａｌｄＡ株に移して、ＴＴ  ａｌｄＡΔａｌｄＢ：：Ｃｍ株を形成した。配列番号１０１および配列番号１０２のプライマー対を用いたゲノムＰＣＲによって、クロラムフェニコール耐性クローンをチェックして、変異が存在することを確実にした。ＦＬＰリコンビナーゼ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ａｎｄ  Ｗａｎｎｅｒ、前出）を使用してクロラムフェニコール耐性マーカーを除去し、ＴＴａｂを作成した。次に米国特許第７，５２４，６６０号明細書（実施例４）に記載されるｐＳＹＣＯ４００／ＡＧＲＯ（配列番号８４に記載される）によって、ＴＴａｂ株を形質転換し、ＴＴａｂ  ｐＳＹＣＯ４００／ＡＧＲＯ株を作り出した。
【０１２１】
引用された参考文献に記載されるように、ＴＴａｂ株は、以下の改変を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦＭ５株（ＡＴＣＣ（登録商標）Ｎｏ．５３９１１）の誘導体である。
ｇｌｐＫ、ｇｌｄＡ、ｐｔｓＨＩ、ｃｒｒ、ｅｄｄ、ａｒｃＡ、ｍｇｓＡ、ｑｏｒ、ａｃｋＡ、ｐｔａ、ａｌｄＡ、およびａｌｄＢ遺伝子の欠失；
ｇａｌＰ、ｇｌｋ、ｂｔｕＲ、ｐｐｃ、およびｙｑｈＤ遺伝子の上方制御；および
ｇａｐＡ遺伝子の下方制御。
【０１２２】
プラスミドｐＳＹＣＯ４００／ＡＧＲＯは、グリセロール生成経路をコードする遺伝子（ＤＡＲ１およびＧＰＰ２）、およびグリセロールデヒドラターゼと付随する再活性化因子とをコードする遺伝子（ｄｈａＢ１２３、ｄｈａＸ、またはｆＸ、またはｆＹ）、ならびにフルクトキナーゼをコードする遺伝子（ｓｃｒＫ）を含有する。
【０１２３】
ＴＴａｂ  ｐＳＹＣＯ４００／ＡＧＲＯ株をＰ１形質導入受容体として使用した。供与株は、実施例１および２に記載されるようにして構築され、２５μｇ／ｍＬのカナマイシン添加ＬＢプレート上での増殖について選択されたＰＤＯ３５１３であった。カナマイシンおよびスペクチノマイシンに耐性を示すコロニーは純化されて、ＰＤＯ２７３７［ＴＴａｂ／ｐＳＹＣＯ４００ＡＧＲＯ  ｙｉｈＰ：：ｃｓｃＫＢΔ（６１−３５３）ＫａｎＲ＆Ａ］と命名された。
【０１２４】
ＰＤＯ２７３７株は、実施例４〜６に記載される、野性型スクロース輸送体ｐＤＭＷＰ３１（ｐＢＲ*ｐ１．２０ｃｓｃＢ）、およびｐＤＭＷＰ７１（ｐＢＲ*ｐ１．５ｃｓｃＢ）をコードするプラスミドで形質転換され、ＰＤＯ２８１５およびＰＤＯ２８１８株をそれぞれもたらしたさらにＰＤＯ２７３７株は、実施例３に記載される、拡散促進スクロース輸送体ｐＤＭＷＰ３３（ｐＢＲ*ｐ１．２０ｃｓｃ５）およびｐＤＭＷＰ６６（ｐＢＲ*ｐ１．５ｃｓｃ５）をコードするプラスミドで形質転換され、ＰＤＯ２９６５およびＰＤＯ２９６６株をそれぞれもたらした。
【０１２５】
ＰＤＯおよびグリセロールの生成を試験するために、これらの４つの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を１００ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンおよび１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンが添加された、Ｍｉｌｌｅｒの変法Ｌ−ブロス（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈａｌｆ  Ｍｏｏｎ  Ｂａｙ，ＣＡ）中において３３℃で一晩培養した。これらの培養物を使用して、１０ｇ／Ｌのスクロース添加ＭＯＰＳ最少培地（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈａｌｆ  Ｍｏｏｎ  Ｂａｙ，ＣＡ）中において５５０ｎｍで測定された光学濃度が０．０１単位になるように、振盪フラスコに接種した。ビタミンＢ１２を０．１ｍｇ／Ｌの濃度で培地に添加した。培養物を振盪しながら（２２５ｒｐｍ）、３４℃で４４時間培養した。次に培養物のサンプルを濾過して、高速液体クロマトグラフィーによる、ブロス中のスクロース、グリセロール、および１，３−プロパンジオール（ＰＤＯ）濃度の測定に使用した。
【０１２６】
流速０．５ｍＬ／分の蒸留脱イオン水の均一濃度移動相、およびカラム温度８５℃で、Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｐカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して、クロマトグラフ分離を達成した。ＭＯＰＳ最少培地に既知濃度で溶解された、市販の純粋化合物から作成された標準曲線を参照して、屈折率検出によって、溶出化合物を定量化した。滞留時間は、スクロースが１２．２分間、１，３−プロパンジオールが１７．９分間、グリセロールが２３．６分間であった。表５は、これらの４株の培養物中における、残留スクロースと、ＰＤＯおよびグリセロールのモル収率（ｍｏｌ  ＰＤＯ＋ｍｏｌグリセロール／ｍｏｌグルコース当量）とを示す。
【０１２７】
表５
スクロース利用とＰＤＯおよびグリセロール生成
2015509378.tif 000008
【０１２８】
表５の結果を見ても分かるように、拡散促進輸送体ＣｓｃＢ５（実施例９および１０）を発現する培養物よりも、野性型スクロース輸送体ＣｓｃＢ（比較例７および８）を発現する培養物中に、さらに多くのスクロース残留があり、これらの条件下における拡散促進輸送体による、より迅速なスクロース利用が示唆された。スクロースからのＰＤＯおよびグリセロールのモル収率は、拡散促進輸送体を発現する株で実質的により高かった。したがって拡散促進によるスクロース輸送は、ＰＤＯおよびグリセロール生成について、野性型輸送体よりもさらに良いことが示された。
【０１２９】
実施例１１〜１４
Ｒ３００Ａ、Ｑ３５３Ｈ、およびＬ６１Ｐ変異を有する、変異ＣｓｃＢスクロース輸送体を含んでなる組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株
これらの実施例の目的は、Ｒ３００Ａおよび／またはＱ３５３Ｈ変異に加えてＬ６１Ｐ変異を有するＣｓｃＢ変異（配列番号１０６、配列番号１０５によってコードされる）を含んでなる組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株が、拡散促進による改善されたスクロース輸送を有することを実証することであった。Ｌ６１Ｐ変異体は、同時係属同一譲受人の米国特許第１３／２１０４８８号明細書に記載されるように、ＣｓｃＢスクロース共輸送体に改善されたスクロース輸送を与えるが、この変異が、拡散促進による輸送を改善するかどうか、またはＬ６１ＰとＱ５３５Ｈとの組み合わせが、輸送をなおもさらに改善するかどうかは分かっていなかった。
【０１３０】
発現ベクターの構築：
２つの変異Ｌ６１ＰおよびＲ３００Ａを含有するｃｓｃＢ１６対立遺伝子Ｒ３００Ａ変異を含有するプラスミドｐＤＭＷＰ３２（実施例１および２に記載される）をさらに変異させ、Ｌ６１Ｐ変異を導入した。ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的変異誘発キット、およびオリゴヌクレオチドＯＤＭＷＰ３３（配列番号１２２）およびＯＤＭＷＰ３４（配列番号１２３）を使用して、製造業者のプロトコルに従って、部位特異的変異誘発によって変異をｐＤＭＷＰ３２に導入し、プラスミドｐＤＭＷＰ５４を作成した。
【０１３１】
ｃｓｃＢ１７対立遺伝子は、Ｌ６１Ｐ、Ｒ３００Ａ、およびＱ３５３Ｈの３つの変異を含有する。Ｒ３００ＡおよびＱ３５３Ｈ変異を含有するプラスミドｐＤＭＷＰ３３（実施例３に記載される）をさらに変異させてＬ６１Ｐ変異を導入する。ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的変異誘発キット、およびオリゴヌクレオチドＯＤＭＷＰ３３（配列番号１２２）およびＯＤＭＷＰ３４（配列番号１２３）を使用して、製造業者のプロトコルに従って、部位特異的変異誘発によって変異をｐＤＭＷＰ３３に導入し、プラスミドｐＤＭＷＰ５５を作成した。ｐＤＭＷＰ５５からのＨｉｎｄＩＩＩ／Ｐａｃ断片をＨｉｎｄＩＩＩ／Ｐａｃ消化ｐＤＭＷＰ１０にクローン化して、構築物のＰ１．５含有バージョンである、ラスミドｐＤＭＷＰ７９を作成した。
【０１３２】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の構築
上述のプラスミドの２つ、ｐＤＭＷＰ５４（ｐＢＲ*ｐ１．２０ｃｓｃＢ１６）およびｐＤＭＷＰ５５（ｐＢＲ*ｐ１．２０ｃｓｃＢ１７）を独立してＰＤＯ３５１３株に形質転換し、それぞれＰＤＯ２６３６およびＰＤＯ２６３７株を得た。さらにプラスミドｐＤＭＷＰ３２（ｐＢＲ*１．２０ｃｓｃＢ３、実施例１および２に記載される）およびｐＤＭＷＰ３３（ｐＢＲ*１．２０ｃｓｃＢ５、実施例３に記載される）をＰＤＯ３５１３株に形質転換して、それぞれＰＤＯ２６２６およびＰＤＯ２６２７株を得た。
【０１３３】
ｃｓｃＢ３、ｃｓｃＢ５、ｃｓｃＢ１６、またはｃｓｃＢ１７の発現がある株の増殖特性解析：
上述の４つの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ（ルリア・ベルターニ）培地中において、３７℃で一晩培養した。翌日、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ培地中でこれらの培養物を１：１００に希釈した。これらの培養物を２５０ｒｐｍで振盪しながら、３７℃で４時間培養した。Ｂｉｏｓｃｒｅｅｎ−Ｃプレート（装置およびプレートはＧｒｏｗｔｈ  Ｃｕｒｖｅｓ  ＵＳＡ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪから購入された）のウェル内で、２ｇ／Ｌグルコースまたは２ｇ／Ｌスクロースを含有する１５０μＬのＭＯＰＳ最少培地（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈａｌｆ  Ｍｏｏｎ  Ｂａｙ，ＣＡ）で、対数期培養物を１：１００に希釈した。三重反復試験において、培養物を連続振盪しながら３７℃で培養して、光学濃度をモニターした。表６は、接種１０時間後における光学濃度読み取りの平均値および標準偏差を示す。
【０１３４】
表６
１０時間目に光学濃度によって測定された、グルコースまたはスクロース中における、様々なスクロース単輸送体を発現する株の増殖
2015509378.tif 000009
【０１３５】
表６のデータを見ても分かるように、全ての４つの株はグルコース上で良好に増殖し、種菌培養物が健康であることが示唆された。これらの増殖条件下で、Ｒ３００Ａ変異がある拡散促進輸送体ＣｓｃＢ３を発現するＰＤＯ２６２６には、非常にわずかな増殖しかなかった。比較してみると、ＣｓｃＢ１６（Ｌ６１ＰおよびＲ３００Ａ）を発現するＰＤＯ２６３６株では、増殖が劇的に改善された。同じく、ＰＤＯ２６３７とＰＤＯ２６２７の増殖を比較すると分かるように、Ｒ３００Ａ  Ｑ３５３Ｈに付加されたＬ６１Ｐは、増殖を改善した。これらの結果は、Ｌ６１Ｐ変異がある変異スクロース拡散促進輸送体を発現する株が、スクロースを唯一の炭素源とする増殖を改善したことを実証する。変異ＣｓｃＢタンパク質のそれぞれは、Ｈ+移行に必須である残基中にＲ３００Ａ変異を保有し、したがってそれぞれＨ+イオンの移行なしに、スクロースを輸送しなくてはならない。したがって、Ｌ６１Ｐ変異体を与える遺伝子によってコードされる輸送体は、拡散促進スクロース輸送体を改善した。
【０１３６】
実施例１５〜１７
変異または野性型スクロース輸送体を含んでなる組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株のスクロース上の増殖
これらの実施例の目的は、Ｒ３００Ａ、Ｑ３５３Ｈ、およびＬ６１Ｐ変異を有するＣｓｃＢの変異体を含んでなる組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株が、野性型スクロース輸送体を含んでなる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株よりも、さらに広いスクロース濃度範囲で増殖できることを示すことであった。
【０１３７】
Ｒ３００Ａ、Ｑ３５３Ｈ、およびＬ６１Ｐ変異を有する変異ＣｓｃＢを含んでなる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の構築：
プラスミドｐＤＭＷＰ７９（ｐＢＲ*ｐ１．５ｃｓｃＢ１７、実施例１１〜１４に記載される）をＰＤＯ３５１３株に形質転換して、ＰＤＯ２７７３株を得た。
【０１３８】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の増殖特性解析：
ＰＤＯ２７７３株（実施例１５）と、どちらも実施例４〜６に記載される野性型スクロース共輸送体をコードするプラスミドがある２つの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株である、ＰＤＯ２６２５株（例１６、比較例）およびＰＤＯ２７６９株（例１７、比較例）とを、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ（ルリア・ベルターニ）培地中において、３７℃で一晩培養した。翌日、２ｇ／Ｌのスクロースおよび２５μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＭＯＰＳ最少培地（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈａｌｆ  Ｍｏｏｎ  Ｂａｙ，ＣＡ）で、これらの培養物を１：５０に希釈した。これらの培養物を２５０ｒｐｍで振盪しながら、３７℃で４時間培養した。Ｂｉｏｓｃｒｅｅｎ−Ｃプレート（装置およびプレートはＧｒｏｗｔｈ  Ｃｕｒｖｅｓ  ＵＳＡ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪから購入された）のウェル内で、２ｇ／Ｌのグルコースまたは２、４、８、１６、または３２ｇ／Ｌのスクロースを含有する１５０μＬのＭＯＰＳ最少培地（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈａｌｆ  Ｍｏｏｎ  Ｂａｙ，ＣＡ）で、対数期培養物を１：１００に希釈した。三重反復試験において、培養物を連続振盪しながら３７℃で培養して、光学濃度をモニターした。様々な濃度のスクロース上における増殖が続いた。表７は、ＰＤＯ２７７３、ＰＤＯ２６２５、およびＰＤＯ２７６９の培養物の接種１４時間後の光学濃度を示す。
【０１３９】
表７
グルコースまたは様々な濃度のスクロース上で成長した株の１４時間目の光学濃度
2015509378.tif 000010
【０１４０】
表７のデータを見ても分かるように、全ての３つの株は２ｇ／Ｌのグルコース上で良好に増殖し、種菌培養物が生存可能であることが示唆された。ＰＤＯ２６２５株（例１６、比較例）およびＰＤＯ２７６９株（例１７、比較例）の増殖は、２または４ｇ／Ｌの低スクロース濃度において、ＰＤＯ２７７１株（実施例４）の増殖と同様であった。しかし１６または３２ｇ／Ｌのより高いスクロース濃度では、ＰＤＯ２７７１が優れた増殖を維持した一方で、ＰＤＯ２５２５およびＰＤＯ２７６９の増殖は極度に阻害された。これらの結果は、Ｌ６１Ｐ、Ｒ３００Ａ、Ｑ３５３Ｈの３つの残基が変化している改善されたスクロース拡散促進輸送体であるＣｓｃＢ１７を発現する株が、野性型スクロース共輸送体を発現する株よりも、はるかにより広いスクロース濃度範囲で増殖できることを実証する。したがって、この改善された拡散促進輸送体は、共輸送機序によるスクロース輸送と比較して利点を有する。
【０１４１】
実施例１８〜２１
Ｒ３００Ａ、Ｑ３５３Ｈ、およびＬ６１Ｐ変異を有するＣｓｃＢスクロース輸送体変異を含んでなる株、および野性型スクロース輸送体ＣｓｃＢを含んでなる株による、スクロースからのＰＤＯ生成
これらの実施例の目的は、Ｒ３００Ａ、Ｑ３５３Ｈ、およびＬ６１Ｐ変異を有するＣｓｃＢ変異を含んでなる組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株が、スクロース上で増殖した際に、野性型スクロース輸送体ＣｓｃＢを含んでなる組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株よりも、さらに良いＰＤＯ生成を与えることを示すことであった。
【０１４２】
実施例７〜１０に記載される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＰＤＯ２７３７［ＴＴａｂ／ｐＳＹＣＯ４００ＡＧＲＯ  ｙｉｈＰ：：ｃｓｃＫＢΔ（６１−３５３）ＫａｎＲ＆Ａを独立して、プラスミドｐＤＭＷＰ５５（ｐＢＲ*Ｐ１．２０ｃｓｃＢ１７、実施例１１〜１４に記載される）およびｐＤＭＷＰ７９（ｐＢＲ*Ｐ１．５ｃｓｓｃＢ１７、実施例１１〜１４に記載される）で形質転換して、ＰＤＯ２８１６株およびＰＤＯ２８１９株をそれぞれ作成した。これらの２つの株と、野性型ｃｓｃＢ共輸送体を発現する２つの株であるＰＤＯ２８１５およびＰＤＯ２８１８（実施例７〜１０に記載される）を、１００ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンおよび１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンが添加された、Ｍｉｌｌｅｒの変法Ｌ−ブロス（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈａｌｆ  Ｍｏｏｎ  Ｂａｙ，ＣＡ）中において、３３℃で一晩培養した。これらの培養物を使用して、１０ｇ／Ｌのスクロース添加ＭＯＰＳ最少培地（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈａｌｆ  Ｍｏｏｎ  Ｂａｙ，ＣＡ）中において５５０ｎｍで測定された光学濃度が０．０１単位になるように、振盪フラスコに接種した。ビタミンＢ１２を０．１ｍｇ／Ｌの濃度で培地に添加した。培養物を振盪しながら（２２５ｒｐｍ）、３４℃で４８時間培養した。次に培養物のサンプルを濾過して、高速液体クロマトグラフィーによる、ブロス中のスクロース、グリセロール、および１，３−プロパンジオール（ＰＤＯ）濃度の測定で使用した。
【０１４３】
流速０．５ｍＬ／分の蒸留脱イオン水の均一濃度移動相、およびカラム温度８５℃で、Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｐカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して、クロマトグラフ分離を達成した。ＭＯＰＳ最少培地に既知濃度で溶解された、市販の純粋化合物から作成された標準曲線を参照して、屈折率検出によって、溶出化合物を定量化した。滞留時間は、スクロースが１２．２分間、１，３−プロパンジオールが１７．９分間、グリセロールが２３．６分間であった。表８は、これらの４株の培養物中における、残留スクロースと、ＰＤＯおよびグリセロールのモル収率（ｍｏｌ  ＰＤＯ＋ｍｏｌグリセロール／ｍｏｌグルコース当量）とを示す。
【０１４４】
表８
スクロース利用とＰＤＯおよびグリセロール生成
2015509378.tif 000011
【０１４５】
表８の結果を見ても分かるように、改善された拡散促進輸送体ＣｓｃＢ１７（実施例２０および２１）を発現する２つの培養物のみで、スクロースが４８時間以内に完全に利用された。さらに、ＰＤＯおよびグリセロールのモル収率は、野生型スクロース共輸送体ＣｓｃＢ（比較例１８および１９）を発現する培養物よりも、ＣｓｃＢ１７を発現する培養物中でより大きかった。したがって拡散促進によるスクロース輸送は、ＰＤＯおよびグリセロール生成に有利であることが示される。
【０１４６】
実施例２２〜２４
サイトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）ｓｐ．３０＿２からのスクロース輸送体遺伝子ｓｃｒＴ１の変異体を含んでなる組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株
これらの実施例の目的は、サイトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）ｓｐ．３０＿２からの変異輸送体遺伝子を含有する組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を構築して、拡散促進によるスクロース輸送を実証することであった。変異スクロース輸送遺伝子によってコードされるタンパク質は、Ｈ+移行に必須な残基に変性され、したがってＨ+／スクロース共輸送が排除された。
【０１４７】
発現ベクターの構築：
サイトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）ｓｐ．３０＿２からの輸送体タンパク質をコードする遺伝子を保有するプラスミドｐＤＭＷＰ１２−ｓｃｒＴ１を以下のように構築した。ベクターｐＤＭＷＰ３は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＯ）から得られた。Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．によって合成されたプロモーター／ＭＣＳ／二重ターミネーター領域を、ｐＩＤＴ−ＳＭＡＲＴベクター（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）にクローニングして、ｐＤＭＷＰ３ベクターを構築した（配列は配列番号１２４に記載される）。ベクターｐＤＭＷＰ４をプラスミドｐＢＲ３２２から構築した。ＴｅｔＲ遺伝子の５’末端上のｓｃａ１部位およびｋｐｎ１部位、およびＴｅｔＲ遺伝子の３’末端の追加的なｋｐｎ１部位をプラスミドｐＢＲ３２２に導入した。さらに、ＡｍｐＲ遺伝子の中央からｋｐｎ１部位を除去した。全ての制限酵素認識部位は、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して、製造会社のプロトコルに従って、付加または除去した。ベクターｐＤＭＷＰ３をＥｃｏＲ１およびＫｐｎ１で消化して、得られた４３８ｂｐ断片をベクターｐＤＭＷＰ４にクローン化し、それもまたＥｃｏＲ１およびＫｐｎ１で消化して、本明細書でｐＢＲ*Ｐ１．２０とも称されるベクターｐＤＭＷＰ１２を得た。ｓｃｒＴ１輸送体遺伝子からのサイトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）ｓｐ．３０＿２を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中における発現のためにコドン最適化した。配列番号１２５に記載されるコドン最適化された配列は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって合成された。合成遺伝子をＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｍａＩの制限酵素認識部位で、ベクターｐＤＭＷＰ１２にサブクローニングして、ｐＤＭＷＰ１２−ｓｃｒＴ１を得た。このサブクローニングは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔにおいて実施された。ｐＤＭＷＰ１２−ｓｃｒＴ１中の輸送体遺伝子の存在は、配列分析によって確認された。
【０１４８】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣｓｃＢのＲ３００に相当する残基は、多重配列アラインメントによって、３０５位のアルギニン残基であることが分かった。Ｒ３０５を２組のプライマーで独立して変異させ、Ｒ３０５Ａ変異（配列番号１０８、配列番号１０７によってコードされる）およびＲ３０５Ｌ変異（配列番号１１０、配列番号１０９によってコードされる）を導入した。ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的変異誘発キットを使用した、部位特異的変異誘発が用いられた。オリゴヌクレオチドＯＤＭＷＰ９７（配列番号１２６）およびＯＤＭＷＰ９８（配列番号１２７）を使用して、Ｒ３０５Ａ変異を導入して、プラスミドｐＤＭＷＰ１１２を作成した。オリゴヌクレオチドＯＤＭＷＰ９９（配列番号１２８）およびＯＤＭＷＰ１００（配列番号１２９）を使用して、Ｒ３０５Ｌ変異を導入し、ｐＤＭＷＰ１１３を作成した。
【０１４９】
変異サイトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）種スクロース輸送体を含んでなる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の構築：
プラスミドｐＤＭＷＰ１１２およびｐＤＭＷＰ１１３を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＰＤＯ３５１３（実施例１および２に記載される）に導入した。結果として得られた株は、それぞれＰＤＯ２８９６およびＰＤＯ２８９７と命名された。さらにベクターｐＤＭＷＰ１２（実施例１および２に記載される）をＰＤＯ３５１３株に導入して、ＰＤＯ２５７６株をもたらした。
【０１５０】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の増殖特性解析：
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＤＯ２５７６株（例２２、比較例）、ＰＤＯ２８９６株（実施例２３）、およびＰＤＯ２８９７株（実施例２４）を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ（ルリア・ベルターニ）培地中において、３７℃で一晩培養した。翌日、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ（ルリア・ベルターニ）培地中で、これらの培養物を１：５０に希釈した。これらの培養物を２５０ｒｐｍで振盪しながら、３７℃で４時間培養した。Ｂｉｏｓｃｒｅｅｎ−Ｃプレート（装置およびプレートはＧｒｏｗｔｈ  Ｃｕｒｖｅｓ  ＵＳＡ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪから購入された）のウェル内で、２ｇ／Ｌのグルコースまたは８ｇ／Ｌのスクロースを含有する１５０μＬのＭＯＰＳ最少培地（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈａｌｆ  Ｍｏｏｎ  Ｂａｙ，ＣＡ）で、対数期培養物を１：１００に希釈した。三重反復試験において、培養物を連続振盪しながら３７℃で培養して、光学濃度をモニターした。接種の６時間後に測定された培養物の光学濃度は、表９に示される。
【０１５１】
表９
グルコースまたはスクロース上で成長した培養物の６時間目の光学濃度
2015509378.tif 000012
【０１５２】
表９のデータを見ても分かるように、全ての株はグルコースを唯一の炭素源として良好に増殖し、種菌培養物が生存可能であることが示唆された。対照的に、対照株ＰＤＯ２５７６（例２２、比較例）は、スクロースを唯一の炭素源として増殖できない一方で、Ｈ+イオンを移行できない、スクロース輸送体をコードする遺伝子変異ｓｃｒＴ１を発現する株（実施例２３および２４）は、スクロースを唯一の炭素源として増殖できた。したがって膜を超える正味のスクロース移行は、Ｈ+イオンの移行なしに起きたに違いない。
【０１５３】
実施例２５および２６
ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）からのスクロース輸送体遺伝子ｓｃｒＴ７変異を含んでなる組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株
これらの実施例の目的は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＮＣＣ２７０５からの変異輸送体遺伝子を含有する組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を構築して、拡散促進によるスクロース輸送を実証することであった。変異スクロース輸送遺伝子によってコードされるタンパク質は、Ｈ+移行に必須な残基に変性され、したがってＨ+／スクロース共輸送が排除された。
【０１５４】
発現ベクターの構築：
プラスミドｐＤＭＷＰ１２（実施例１および２および実施例２２〜２４に記載される）を使用して、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＮＣＣ２７０５からの輸送体タンパク質をコードする遺伝子を保有する、プラスミドｐＤＭＷＰ１２−ｓｃｒＴ７を構築した。ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）からのｓｃｒＴ７スクロース輸送体遺伝子は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中における発現のためにコドン最適化された。配列番号１３０に記載されるコドン最適化された配列は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって合成された。合成遺伝子は、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｍａＩの制限酵素認識部位において、ベクターｐＤＭＷＰ１２にサブクローニングされた。このサブクローニングは、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔにおいて実施された。ベクター中の輸送体遺伝子の存在は、配列分析によって確認された。
【０１５５】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣｓｃＢのＲ３００に相当する残基は、多重配列アラインメントによって、３１２位のアルギニン残基であることが分かった。プラスミドｐＤＭＷＰ１２−ｓｃｒＴ７を変異させて、Ｒ３１２Ａ変異（配列番号１１２、配列番号１１１によってコードされる）を導入した。ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的変異誘発キットを使用した、部位特異的変異誘発が用いられた。オリゴヌクレオチドＯＤＭＷＰ１０１（配列番号１３１）およびＯＤＭＷＰ１０２（配列番号１３２）を使用して、Ｒ３１２Ａ変異を導入して、プラスミドｐＤＭＷＰ１１４を作成した。
【０１５６】
変異ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）スクロース輸送体を含んでなる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の構築：
プラスミドｐＤＭＷＰ１１４を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＤＯ３５１３株（実施例１および２に記載される）に導入した。結果として得られた株は、ＰＤＯ２８９８と命名された。さらにベクターｐＤＭＷＰ１２（実施例１および２に記載される）をＰＤＯ３５１３に導入して、ＰＤＯ２５７６株をもたらした。
【０１５７】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の増殖特性解析：
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＤＯ２５７６株（例２５、比較例）およびＰＤＯ２８９８株（実施例２６）を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ（ルリア・ベルターニ）培地中において、３７℃で一晩培養した。翌日、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ（ルリア・ベルターニ）培地中で、これらの培養物を１：５０に希釈した。これらの培養物を２５０ｒｐｍで振盪しながら、３７℃で４時間培養した。Ｂｉｏｓｃｒｅｅｎ−Ｃプレート（装置およびプレートはＧｒｏｗｔｈ  Ｃｕｒｖｅｓ  ＵＳＡ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪから購入された）のウェル内で、２ｇ／Ｌのグルコースまたは８ｇ／Ｌのスクロースを含有する１５０μＬのＭＯＰＳ最少培地（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈａｌｆ  Ｍｏｏｎ  Ｂａｙ，ＣＡ）で、対数期培養物を１：１００に希釈した。三重反復試験において、培養物を連続振盪しながら３７℃で培養して、光学濃度をモニターした。接種の６時間後に測定された培養物の光学濃度は、表１０に示される。
【０１５８】
表１０
グルコースまたはスクロース上で成長した培養物の６時間目の光学濃度
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【０１５９】
表１０のデータを見ても分かるように、どちらの株もグルコースを唯一の炭素源として良好に増殖し、種菌培養物が生存可能であることが示唆された。対照的に、対照株ＰＤＯ２５７６（例２５、比較例）は、スクロースを唯一の炭素源として増殖できない一方で、Ｈ+イオンを移行できない、スクロース輸送体をコードする遺伝子変異ｓｃｒＴ７を発現する株（実施例２６）は、クロースを唯一の炭素源として増殖できた。したがって膜を超える正味のスクロース移行は、Ｈ+イオンの移行なしに起きたに違いない。
【配列表】
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【国際調査報告】
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