(57)【要約】ＨＣＶ阻害剤に対するＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）集団の感受性を効率的かつ正確に決定するための方法および組成物を提供する。特定の態様において、本方法は、細胞に患者由来セグメントを導入する工程（ここで前記細胞または前記患者由来セグメントは、ＨＣＶ依存性の検出可能なシグナルを生産する指標核酸を含む）；様々な濃度のＨＣＶ阻害剤の存在下で指標遺伝子の発現を測定する工程：感受性の標準曲線を決定する工程：ＨＣＶ集団のＩＣ９５倍率変化、傾き、または最大阻害百分率を対照ＨＣＶ集団のそれらと比較する工程を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）集団のＨＣＶ阻害剤に対する感受性を決定するための方法であって、
（ａ）細胞に、前記ＨＣＶウイルス集団からの患者由来セグメントを含む耐性テストベクターを導入する工程であって、前記細胞または前記耐性テストベクターは、ＨＣＶ依存性の検出可能なシグナルを生産する指標核酸を含む、工程；
（ｂ）前記ＨＣＶ阻害剤の非存在下で、または前記ＨＣＶ阻害剤の濃度を高めながら、前記細胞中の前記指標遺伝子の発現を測定する工程；
（ｃ）前記ＨＣＶ阻害剤に関する薬物感受性の標準曲線を作成する工程であって、ＩＣ９５倍率変化値が、前記標準曲線で検出される、工程；
（ｄ）前記ＨＣＶ集団の前記ＩＣ９５倍率変化値を、対照ＨＣＶ集団のＩＣ９５倍率変化値と比較する工程；および
（ｅ）前記ＨＣＶ集団の前記ＩＣ９５倍率変化が、前記対照ＨＣＶ集団の前記ＩＣ９５倍率変化よりも大きい場合、前記ＨＣＶ集団は、前記ＨＣＶ阻害剤に対して感受性が減少したＨＣＶ粒子を含むと決定する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記ＨＣＶ集団が、部分集団を含み、前記方法が、前記ＨＣＶ集団のうち少数種の部分集団における感受性の減少を検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＨＣＶ集団の約２０％〜約６０％である部分集団における感受性の減少を検出する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＨＣＶ阻害剤が、ＨＣＶポリメラーゼを標的とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＨＣＶ阻害剤が、ヌクレオシド阻害剤（ＮＩ）である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＨＣＶ阻害剤が、非ヌクレオシド阻害剤（ＮＮＩ）である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ＨＣＶ阻害剤が、前記ＨＣＶポリメラーゼの部位Ａ、Ｂ、Ｃ、またはＤを標的とする、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記対照ＨＣＶ集団が、ＨＣＶ遺伝子型１を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記対照ＨＣＶ集団が、ＨＣＶ遺伝子型１ａを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記対照ＨＣＶ集団が、Ｃｏｎ１  ＨＣＶを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記対照ＨＣＶ集団が、ＨＣＶ遺伝子型１ｂを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記対照ＨＣＶ集団が、Ｈ７７  ＨＣＶを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記対照ＨＣＶ集団が、前記ＨＣＶ阻害剤で処置する前の前記患者のＨＣＶ集団を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記耐性テストベクターが、前記患者由来セグメントと前記指標遺伝子とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記患者由来セグメントが、ＨＣＶのＮＳ５Ｂ領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記指標遺伝子が、ルシフェラーゼ遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞が、Ｈｕｈ７細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｅ）の感受性の決定に基づいて、前記患者にとって適切な処置レジメンを決定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）集団のＨＣＶ阻害剤に対する感受性を決定するための方法であって、
（ａ）細胞に、前記ＨＣＶウイルス集団からの患者由来セグメントを含む耐性テストベクターを導入する工程であって、前記細胞または前記耐性テストベクターは、ＨＣＶ依存性の検出可能なシグナルを生産する指標核酸を含む、工程；
（ｂ）前記ＨＣＶ阻害剤の非存在下で、または前記ＨＣＶ阻害剤の濃度を高めながら、前記細胞中の前記指標遺伝子の発現を測定する工程；
（ｃ）前記ＨＣＶ阻害剤に対する前記ＨＣＶ集団の薬物感受性の標準曲線を決定する工程；
（ｄ）前記ＨＣＶ集団の前記標準曲線の傾きを、対照ＨＣＶ集団の標準曲線の傾きと比較する工程；および
（ｅ）前記ＨＣＶ集団の前記標準曲線の前記傾きが、前記対照集団の前記標準曲線と比較して減少している場合、前記ＨＣＶ集団は、前記ＨＣＶ阻害剤に対して感受性が減少したＨＣＶ粒子を含むと決定する工程
を含む、方法。
【請求項２０】
前記ＨＣＶ集団が、部分集団を含み、前記方法が、前記ＨＣＶ集団のうち少数種の部分集団における感受性の減少を検出する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＨＣＶ集団の約２０％〜約６０％である部分集団における感受性の減少を検出する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＨＣＶ阻害剤が、ＨＣＶポリメラーゼを標的とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＨＣＶ阻害剤が、ヌクレオシド阻害剤（ＮＩ）である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＨＣＶ阻害剤が、非ヌクレオシド阻害剤（ＮＮＩ）である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＨＣＶ阻害剤が、前記ＨＣＶポリメラーゼの部位Ａ、Ｂ、Ｃ、またはＤを標的とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記対照ＨＣＶ集団が、ＨＣＶ遺伝子型１を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記対照ＨＣＶ集団が、ＨＣＶ遺伝子型１ａを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記対照ＨＣＶ集団が、Ｃｏｎ１  ＨＣＶを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記対照ＨＣＶ集団が、ＨＣＶ遺伝子型１ｂを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記対照ＨＣＶ集団が、Ｈ７７  ＨＣＶを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記対照ＨＣＶ集団が、前記ＨＣＶ阻害剤で処置する前の前記患者のＨＣＶ集団を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３２】
宿主細胞への耐性テストベクターが、前記患者由来セグメントと前記指標遺伝子とを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３３】
前記患者由来セグメントが、ＨＣＶのＮＳ５Ｂ領域を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３４】
前記指標遺伝子が、ルシフェラーゼ遺伝子を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３５】
宿主細胞が、Ｈｕｈ７細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３６】
工程（ｅ）の感受性の決定に基づいて、前記患者にとって適切な処置レジメンをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３７】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）集団のＨＣＶ阻害剤に対する感受性を決定するための方法であって、
（ａ）細胞に、前記ＨＣＶウイルス集団からの患者由来セグメントを含む耐性テストベクターを導入する工程であって、前記細胞または前記耐性テストベクターは、ＨＣＶ依存性の検出可能なシグナルを生産する指標核酸を含む、工程；
（ｂ）前記ＨＣＶ阻害剤の非存在下で、または前記ＨＣＶ阻害剤の濃度を高めながら、前記細胞中の前記指標遺伝子の発現を測定する工程；
（ｃ）前記ＨＣＶ阻害剤に対する前記ＨＣＶ集団の薬物感受性の標準曲線を決定する工程；
（ｄ）前記ＨＣＶ集団の最大阻害百分率と、対照ＨＣＶ集団の最大阻害百分率とを比較する工程；および
（ｅ）前記ＨＣＶ集団の前記最大阻害百分率が、前記対照集団の前記最大阻害百分率と比較して減少している場合、前記ＨＣＶ集団は、前記ＨＣＶ阻害剤に対して感受性が減少したＨＣＶ粒子を含むと決定する工程
を含む、方法。
【請求項３８】
前記ＨＣＶ集団が、部分集団を含み、前記方法が、前記ＨＣＶ集団のうち少数種の部分集団における感受性の減少を検出する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＨＣＶ集団の約２０％〜約６０％である部分集団における感受性の減少を検出する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＨＣＶ阻害剤が、ＨＣＶポリメラーゼを標的とする、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＨＣＶ阻害剤が、ヌクレオシド阻害剤（ＮＩ）である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＨＣＶ阻害剤が、非ヌクレオシド阻害剤（ＮＮＩ）である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＨＣＶ阻害剤が、前記ＨＣＶポリメラーゼの部位Ａ、Ｂ、Ｃ、またはＤを標的とする、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記対照ＨＣＶ集団が、ＨＣＶ遺伝子型１を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４５】
前記対照ＨＣＶ集団が、ＨＣＶ遺伝子型１ａを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記対照ＨＣＶ集団が、Ｃｏｎ１  ＨＣＶを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記対照ＨＣＶ集団が、ＨＣＶ遺伝子型１ｂを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記対照ＨＣＶ集団が、Ｈ７７  ＨＣＶを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記対照ＨＣＶ集団が、前記ＨＣＶ阻害剤で処置する前の前記患者のＨＣＶ集団を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項５０】
前記耐性テストベクターが、前記患者由来セグメントと前記指標遺伝子とを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項５１】
前記患者由来セグメントが、ＨＣＶのＮＳ５Ｂ領域を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項５２】
前記指標遺伝子が、ルシフェラーゼ遺伝子を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項５３】
宿主細胞が、Ｈｕｈ７細胞である、請求項３７に記載の方法。
【請求項５４】
工程（ｅ）の感受性の決定に基づいて、前記患者にとって適切な処置レジメンを決定する工程をさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１１年１２月２日に出願された米国仮出願第６１／５６６，５９５号に対する優先権を主張する。上記出願の全体の内容は、参考として本明細書に援用される。
【０００２】
分野
本発明の実施形態は、ＨＣＶ阻害剤に対するＣ型肝炎ウイルス（「ＨＣＶ」）またはＨＣＶ集団の感受性を決定するための方法に関する。ＨＣＶまたはＨＣＶ集団の複製能を決定するための方法も提供される。
【背景技術】
【０００３】
世界的に、ＨＣＶは、４００万人の米国人または米国の人口のおよそ１％を含む推定１億７千万人の人に影響を与えていることから、最も一般的な血液媒介性疾患となっている。ＨＣＶ感染は、患者のおよそ５５〜８５％が慢性的な状態になる。慢性ＨＣＶ感染の後期合併症としては、肝硬変、肝細胞癌、および死亡が挙げられる。ＨＣＶ感染を予防する有効なワクチンはない。
【０００４】
ＨＣＶは、およそ９，０００ヌクレオチド（９ｋｂ）の、ポジティブセンスの、線形の一本鎖ＲＮＡゲノムを含有するエンベロープを持つウイルスである。ＨＣＶは、フラビウイルスおよびペスチウイルスと共にフラビウイルス科に分類される。ＨＣＶゲノムの単一のオープンリーディングフレームが翻訳されて、単一のタンパク質産物が生産され、続いてこれがさらにプロセシングされて、３つの構造タンパク質（ヌクレオキャプシド（Ｃ）ならびに２つのエンベロープ糖タンパク質（Ｅ１およびＥ２））および７つの非構造タンパク質（なかでもセリンプロテアーゼ（非構造タンパク質３（ＮＳ３）が挙げられる）、補因子（非構造タンパク質４Ａ（ＮＳ４Ａ））、非構造タンパク質５Ａ（ＮＳ５Ａ）、ならびにＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（非構造タンパク質５Ｂ（ＮＳ５Ｂ））を包含するより小さい活性タンパク質を生産する。
【０００５】
ＨＣＶ株は、系統発生（遺伝子配列）に基づく「遺伝子型」によって６つ遺伝子型（すなわち１〜６）のうち１つにグループ分けされ、これらはさらに、１つの遺伝子型内で数種の異なるサブタイプ（例えば１ａ、１ｂ、１ｃ）に特徴付けられる。１種のＨＣＶ遺伝子型に感染しても、その遺伝子型またはそれ以外のいずれかの遺伝子型のＨＣＶに対する免疫が必ずしも患者に付与されるわけではないため、１種より多くのＨＣＶ遺伝子型分離株での同時感染の可能性がある。主に、ＨＣＶ遺伝子型は、地理的に異なっている。北米、欧州、および日本では、ＨＣＶ遺伝子型１が最も蔓延している。遺伝子型１ＨＣＶの中で、サブタイプ１ａおよび１ｂがより蔓延しており、サブタイプ１ｃはわずかな比率でしかない。
【０００６】
ＨＣＶ感染のための現在の標準的な医療は、ＰＥＧ化インターフェロンアルファ（ＰＥＧ−ＩＦＮ）とリバビリン（ＲＢＶ）とを併用した２４〜４８週の処置に応答する免疫調節によるウイルス複製の間接的な抑制に頼っている。処置への応答は患者によって様々であり、およそ４０〜６０％の患者がウイルス複製の持続的な抑制（持続性ウイルス陰性化（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｖｉｒｏｌｏｇｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）、ＳＶＲ）を達成する。血漿中で検出可能なＨＣＶのＲＮＡのレベルが上昇することから明らかなように、標準的なＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法に対して初期応答を示す全てのＨＣＶ感染患者がその応答を維持するとは限らない。ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法の一定しない有効性と低い忍容性のために、前臨床開発プログラムおよび臨床試験で、ＨＣＶ複製を直接標的化する多数の新しい抗ウイルス剤（例えば、ボセプレビル、テラプレビル）が評価されつつある。それぞれＨＣＶゲノムのＮＳ３、ＮＳ５Ａ、およびＮＳ５Ｂ領域によってコードされるウイルス性プロテアーゼ、非構造タンパク質５Ａ、またはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）を標的化する阻害剤の開発が最も進んでいる。
【０００７】
ＨＣＶのＮＳ５Ｂ領域は、長さが１，７７３ヌクレオチドであり、ＨＣＶのＲｄＲｐ酵素をコードする。ＨＣＶのＲｄＲｐ酵素は、ＨＣＶのＲＮＡゲノムを「コピー」して、ＨＣＶのポジティブおよびネガティブセンスＲＮＡの両方を生産するため、ＲｄＲｐは、ウイルス複製に必須である。現在、多数のヌクレオシド阻害剤（ＮＩ）および低分子非ヌクレオシド阻害剤（ＮＮＩ）が開発中である。ＮＩは、活性部位での結合についてＲｄＲｐの天然の基質（リボヌクレオシド三リン酸）と競合することにより作用する。非競合メカニズムによって、ＮＮＩはアロステリックに結合してＲｄＲｐ活性を阻害する。ＮＮＩは、その化学構造と標的の結合部位に基づいて区別される数種のサブクラスにさらにグループ分けすることもできる。特定のＲｄＲｐ阻害剤への耐性は、ＲｄＲｐ構造を変更すること（例えばＮＮＩ）、または阻害剤と天然の基質とを識別するＲｄＲｐの能力を改善すること（例えばＮＩ）のどちらかによって阻害剤の結合を制限する酵素中に生じる所定のアミノ酸変異と関連すると報告されている。
【０００８】
現在利用可能な阻害剤のうちいくつかは、ウイルス複製阻害に関して有効であることが示されているが、変異速度が急速であり、このような薬物を感染個体に投与した場合に抗ウイルス療法に対して感受性が減少した変異体ＨＣＶが急速に出現するために、このような阻害剤はウイルスの耐性を発現させやすい。この特定の薬物に対する感受性の減少のために、その薬物での処置は感染個体にとって効果のないものになる。この理由のために、ＨＣＶ感染個体それぞれに対して最適な処置レジメンを決定するために、薬物感受性のモニターを可能にすることが医師にとって重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
それゆえに、ＨＣＶポリペプチドを標的化する薬物に対する感受性を効率的かつ正確に決定するための方法および組成物への必要性がある。望ましい方法および組成物は、（ａ）ＨＣＶ阻害剤感受性における自然の変動、および／または（ｂ）ＨＣＶ阻害剤耐性集団の出現および存続または衰退の指標となる処置前、処置中、および処置後の阻害剤感受性の差の評価を容易にすると予想される。また、ＨＣＶ集団の相対的な複製能（ＲＣ）を評価するのに使用できる方法も必要である。これらおよびその他の必要は、本発明によって満たされる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本出願は、ＨＣＶ阻害剤に対する混成型のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）集団の感受性を効率的かつ正確に決定するための方法および組成物を提供する。
【００１１】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）集団のＨＣＶ阻害剤に対する感受性を決定するための方法であって、細胞に、ＨＣＶウイルス集団からの患者由来セグメントを含む耐性テストベクターを導入する工程であって、前記細胞または前記耐性テストベクターは、ＨＣＶ依存性の検出可能なシグナルを生産する指標核酸を含む、工程；ＨＣＶ阻害剤の非存在下で、またはＨＣＶ阻害剤の濃度を高めながら、細胞中の指標遺伝子の発現を測定する工程；ＨＣＶ阻害剤に関する薬物感受性の標準曲線を作成する工程であって、ＩＣ９５倍率変化値は、標準曲線で検出される工程；ＨＣＶ集団のＩＣ９５倍率変化値を、対照ＨＣＶ集団のＩＣ９５倍率変化値と比較する工程；およびＨＣＶ集団のＩＣ９５倍率変化が、対照ＨＣＶ集団のＩＣ９５倍率変化よりも大きい場合、前記ＨＣＶ集団は、前記ＨＣＶ阻害剤に対して感受性が減少したＨＣＶ粒子を含むと決定する工程を含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、ＨＣＶ集団は、部分集団を含み、開示された方法は、ＨＣＶ集団のうち少数種の部分集団における感受性の減少を検出する。特定の実施形態において、本方法は、ＨＣＶ集団の約２０％〜約６０％である部分集団における感受性の減少を検出する。特定の態様において、ＨＣＶ阻害剤は、ＨＣＶポリメラーゼを標的とする。ＨＣＶ阻害剤は、例えば、ヌクレオシド阻害剤（ＮＩ）または非ヌクレオシド阻害剤（ＮＮＩ）であってもよい。いくつかの実施形態において、ＨＣＶは、ポリメラーゼの部位Ａ、Ｂ、Ｃ、またはＤを標的とする非ヌクレオシド阻害剤（ＮＮＩ−Ａ、ＮＮＩ−Ｂ、ＮＮＩ−Ｃ、またはＮＮＩ−Ｄ）である。特定の態様において、ＨＣＶ阻害剤は、ＮＳ５Ａを標的とする。いくつかの実施形態において、ＨＣＶ集団および対照ＨＣＶ集団は、ＨＣＶ遺伝子型１を含む。特定の実施形態において、ＨＣＶ集団および対照ＨＣＶ集団は、ＨＣＶ遺伝子型１ａまたは１ｂを含んでいてもよい。特定の具体的な実施形態において、対照ＨＣＶ集団は、Ｃｏｎ１  ＨＣＶまたはＨ７７  ＨＣＶを含む。特定のその他の具体的な実施形態において、対照ＨＣＶ集団は、ＨＣＶ阻害剤で処置する前の患者に由来するＨＣＶ集団である。特定の実施形態において、耐性テストベクターは、患者由来セグメントと指標核酸とを含む。いくつかの実施形態において、患者由来セグメントは、ＨＣＶのＮＳ５Ｂ領域を含む。特定の実施形態において、指標遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子を含む。これらの方法の特定の実施形態において、宿主細胞は、Ｈｕｈ７細胞である。特定の実施形態において、本方法は、患者にとって適切な処置レジメンの決定を容易にするために使用される。特定の実施形態において、本方法はさらに、ＩＣ５０倍率変化値を決定すること、および検出されたＩＣ５０倍率変化値に対するＩＣ９５倍率変化値の比率を決定することを含み、ここで上記比率の変化は、阻害剤に対するＨＣＶの感受性の変化の指標である。
【００１２】
また、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）集団のＨＣＶ阻害剤に対する感受性を決定するための方法であって、細胞に、ＨＣＶウイルス集団からの患者由来セグメントを含む耐性テストベクターを導入する工程であって、前記細胞または前記耐性テストベクターは、ＨＣＶ依存性の検出可能なシグナルを生産する指標核酸を含む、工程；ＨＣＶ阻害剤の非存在下で、またはＨＣＶ阻害剤の濃度を高めながら、細胞中の指標遺伝子の発現を測定する工程；ＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶ集団の薬物感受性の標準曲線を決定する工程；ＨＣＶ集団の標準曲線の傾きを、対照ＨＣＶ集団の標準曲線の傾きと比較する工程；およびＨＣＶ集団の標準曲線の傾きが、対照集団の標準曲線と比較して減少している場合、前記ＨＣＶ集団は、前記ＨＣＶ阻害剤に対して感受性が減少したＨＣＶ粒子を含むと決定する工程を含む、方法も提供される。いくつかの実施形態において、ＨＣＶ集団は、部分集団を含み、開示された方法は、ＨＣＶ集団のうち少数種の部分集団における感受性の減少を検出する。特定の実施形態において、本方法は、ＨＣＶ集団の約２０％〜約６０％である部分集団における感受性の減少を検出する。特定の態様において、ＨＣＶ阻害剤は、ＨＣＶポリメラーゼを標的とする。ＨＣＶ阻害剤は、例えば、ヌクレオシド阻害剤（ＮＩ）または非ヌクレオシド阻害剤（ＮＮＩ）であってもよい。いくつかの実施形態において、ＨＣＶは、ＨＣＶポリメラーゼの部位Ａ、Ｂ、Ｃ、またはＤを標的とする非ヌクレオシド阻害剤（ＮＮＩ−Ａ、ＮＮＩ−Ｂ、ＮＮＩ−Ｃ、またはＮＮＩ−Ｄ）である。特定の態様において、ＨＣＶ阻害剤は、ＮＳ５Ａを標的とする。いくつかの実施形態において、ＨＣＶ集団および対照ＨＣＶ集団は、ＨＣＶ遺伝子型１を含む。特定の実施形態において、ＨＣＶ集団および対照ＨＣＶ集団は、ＨＣＶ遺伝子型１ａまたは１ｂを含んでいてもよい。特定の具体的な実施形態において、対照ＨＣＶ集団は、Ｃｏｎ１  ＨＣＶまたはＨ７７  ＨＣＶを含む。特定のその他の具体的な実施形態において、対照ＨＣＶ集団は、ＨＣＶ阻害剤で処置する前の患者に由来するＨＣＶ集団である。特定の実施形態において、耐性テストベクターは、患者由来セグメントと指標遺伝子とを含む。いくつかの実施形態において、患者由来セグメントは、ＨＣＶのＮＳ５Ｂ領域を含む。特定の実施形態において、指標遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子を含む。これらの方法の特定の実施形態において、宿主細胞は、Ｈｕｈ７細胞である。特定の実施形態において、本方法は、患者にとって適切な処置レジメンの決定を容易にするために使用される。
【００１３】
また、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）集団のＨＣＶ阻害剤に対する感受性を決定するための方法であって、細胞に、ＨＣＶウイルス集団からの患者由来セグメントを含む耐性テストベクターを導入する工程であって、前記細胞または前記耐性テストベクターは、ＨＣＶ依存性の検出可能なシグナルを生産する指標核酸を含む、工程；ＨＣＶ阻害剤の非存在下で、またはＨＣＶ阻害剤の濃度を高めながら、細胞中の指標遺伝子の発現を測定する工程；ＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶ集団の薬物感受性の標準曲線を決定する工程；ＨＣＶ集団の最大阻害百分率と、対照ＨＣＶ集団の最大阻害百分率とを比較する工程；およびＨＣＶ集団の最大阻害百分率が、対照集団の最大阻害百分率と比較して減少している場合、前記ＨＣＶ集団は、前記ＨＣＶ阻害剤に対して感受性が減少したＨＣＶ粒子を含むと決定する工程を含む、方法も提供される。いくつかの実施形態において、ＨＣＶ集団は、部分集団を含み、開示された方法は、ＨＣＶ集団のうち少数種の部分集団における感受性の減少を検出する。特定の実施形態において、本方法は、ＨＣＶ集団の約２０％〜約６０％である部分集団における感受性の減少を検出する。特定の態様において、ＨＣＶ阻害剤は、ＨＣＶポリメラーゼを標的とする。ＨＣＶ阻害剤は、例えば、ヌクレオシド阻害剤（ＮＩ）または非ヌクレオシド阻害剤（ＮＮＩ）であってもよい。いくつかの実施形態において、ＨＣＶは、ＨＣＶポリメラーゼの部位Ａ、Ｂ、Ｃ、またはＤを標的とする非ヌクレオシド阻害剤（ＮＮＩ−Ａ、ＮＮＩ−Ｂ、ＮＮＩ−Ｃ、またはＮＮＩ−Ｄ）である。特定の態様において、ＨＣＶ阻害剤は、ＮＳ５Ａを標的とする。いくつかの実施形態において、ＨＣＶ集団および対照ＨＣＶ集団は、ＨＣＶ遺伝子型１を含む。特定の実施形態において、ＨＣＶ集団および対照ＨＣＶ集団は、ＨＣＶ遺伝子型１ａまたは１ｂを含んでいてもよい。特定の具体的な実施形態において、対照ＨＣＶ集団は、Ｃｏｎ１  ＨＣＶまたはＨ７７  ＨＣＶを含む。特定のその他の具体的な実施形態において、対照ＨＣＶ集団は、ＨＣＶ阻害剤で処置する前の患者に由来するＨＣＶ集団である。特定の実施形態において、耐性テストベクターは、患者由来セグメントと指標遺伝子とを含む。いくつかの実施形態において、患者由来セグメントは、ＨＣＶのＮＳ５Ｂ領域を含む。特定の実施形態において、指標遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子を含む。これらの方法の特定の実施形態において、宿主細胞は、Ｈｕｈ７細胞である。特定の実施形態において、本方法は、患者にとって適切な処置レジメンの決定を容易にするために使用される。
【００１４】
以下の図で本発明の方法の非限定的な実施形態を例示する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ＨＣＶ阻害剤感受性を決定するための表現型アッセイの概略図である。この図表は、一例として、ＨＣＶ阻害剤がＨＣＶポリメラーゼＮＳ５Ｂを標的とすることを利用している。それゆえに、この例において、テスト集団のＮＳ５Ｂ領域は、レプリコンテストベクター中に包含される。
【図２】図２は、代表的なＨＣＶ阻害剤感受性曲線を示すグラフであり、このグラフにおいて、ｘ軸にＨＣＶ阻害剤の濃度がプロットされ、ｙ軸に感受性の倍率変化が阻害パーセントとしてプロットされる。ＩＣ５０およびＩＣ９５が提示される。傾きは、対数シグモイド関数に基づくカーブフィッティングによって計算することもできる。例えば、阻害は、最高値−（最高値＋基準値）を（１＋濃度／中心）＾傾き）で割った値に等しい。簡易化すると、傾きは、対数（９５／１００−９５）／Δｘに等しい。Δｘは、対数（ＩＣ９５）−対数（ＩＣ５０）に等しい。
【図３】図３は、ＨＣＶ遺伝子型１ｂ対照（Ｃｏｎ１）およびＨＣＶ遺伝子型１ａ対照（Ｈ７７）のＩＣ５０倍率変化を、ＨＣＶ阻害剤に対する感受性の変化に関連することが公知のＮＳ５Ｂにおいて特異的なアミノ酸置換を有する変異体ＨＣＶと比較した表である。
【図４】図４Ａ〜４Ｆは、代表的な精度データ（図４Ａ（１つのサンプルおよび異なる阻害剤に関するＩＣ５０倍率変化）および４Ｂ（３つのサンプルに関する複製能））、再現性データ（図４Ｃ（２つのアッセイにおけるＮＮＩ−ＡのＩＣ５０倍率変化）および４Ｄ（２つのアッセイにおける複製能））、ならびに直線性のデータ（図４Ｅ（４種の阻害剤に関するＩＣ５０倍率変化）および４Ｆ（６つのサンプルに関する複製能））を示すグラフである。
【図５】図５は、ＨＣＶ遺伝子型１ｂ対照（Ｃｏｎ１）およびＨＣＶ遺伝子型１ａ対照（Ｈ７７）、加えて阻害剤に対する感受性の変化に関連することが公知のＮＳ５Ｂにおいて特異的なアミノ酸置換を有する変異体ＨＣＶを使用して作製された表現型データの結果を示す表である。検出された変異体パーセントの列は、２０、４０、６０、８０、または１００パーセントの変異体を含有するサンプルを解析して、ＩＣＦＣ値が２以上となった場合を提示する。この表は、ＩＣ５０倍率変化と比較してＩＣ９５倍率変化を測定した場合、少数種の感度が増加することを示す。
【図６】図６Ａ〜６Ｗは、阻害剤耐性ＨＣＶを含む集団の検出の感度を示すグラフであり、正規化した傾き（図６Ａ、６Ｈ、６Ｌ、６Ｐ、もしくは６Ｔ）、ＩＣ５０（図６Ｂ、６Ｅ、６Ｉ、６Ｍ、６Ｑ、もしくは６Ｕ）、またはＩＣ９５（図６Ｃ、６Ｆ、６Ｊ、６Ｎ、６Ｒ、もしくは６Ｖ）（全て、ｘ軸には集団中の阻害剤（ＮＮＩ−Ａ、ＮＮＩ−Ｂ、またはＮＮＩ−Ｃ）耐性ウイルスの百分率としてプロットされ、それに対してｙ軸には正規化した傾きまたはＩＣ倍率変化としてプロットされた）、加えてｘ軸における集団中の耐性ウイルスの百分率に対してｙ軸にプロットされた混成集団の複製能（図６Ｄ、６Ｇ、６Ｋ、６Ｏ、６Ｓ、および６Ｗ）を検討している。
【図７】図７Ａ〜７Ｄは、より高い倍率変化値を使用することにより集団中の少数の改変体の検出の改善を示すグラフである。図７Ａおよび７Ｃは、ｙ軸に阻害濃度（ＩＣ）の倍率変化、それに対してｘ軸に少数の改変体集団のパーセントを示すグラフである。これらの実験における少数の改変体は、ポリメラーゼの４９５位でプロリンがアラニンに置換されたＨＣＶ（Ｐ４９５Ａ）（図７Ａ）およびポリメラーゼの３９２位でロイシンがイソロイシンに置換されたＨＣＶ（Ｌ３９２Ｉ）（図７Ｂ）である。少数の改変体集団の様々な百分率でＩＣ５０、ＩＣ８０、ＩＣ９０、およびＩＣ９５倍率変化を測定し、それらを、それぞれ丸、四角、三角形、およびひし形を用いたラインで示す。図７Ａおよび７Ｃは、ＨＣＶポリメラーゼの部位Ａを標的とする非ヌクレオシド阻害剤（ＮＮＩ−Ａ）への応答に関して作製されたデータを示し、図７Ｂおよび７Ｄは、対照阻害剤としてインターフェロンへの応答に関して作製されたデータを示す。これらのデータから、ＩＣ９５倍率変化の測定が、ＨＣＶ集団中で、ＨＣＶ阻害剤に対して感受性が減少した少数の改変体を最も良く検出することができることが実証される。
【図８】図８Ａ〜８Ｘは、混成型のＨＣＶ集団中で、感受性が減少した改変体が増えるにつれて感受性曲線の傾きが小さくなることを実証するグラフである。図８Ａ〜８Ｆおよび８Ｍ〜８Ｒは、２種の異なるＨＣＶ集団（それぞれＰ４９５ＡおよびＬ３９２Ｉ）について、ＨＣＶポリメラーゼの部位Ａを標的とする非ヌクレオシド阻害剤（ＮＮＩ−Ａ）に対する応答を用いて作製したデータを示し、図８Ｇ〜８Ｌおよび８Ｓ〜８Ｘは、２種の異なるＨＣＶ集団（それぞれＰ４９５ＡおよびＬ３９２Ｉ）について、対照阻害剤としてインターフェロンに対する応答を用いて作製したデータを示す。それぞれのグラフにおいて、ｘ軸に阻害剤の濃度がプロットされ、ｙ軸に阻害パーセントがプロットされる。ＨＣＶ集団中の感受性が減少したＨＣＶ改変体の濃度は、０％（図８Ａ、８Ｇ、８Ｍ、８Ｓ）、２０％（図８Ｂ、８Ｈ、８Ｎ、８Ｔ）、４０％（図８Ｃ、８Ｉ、８Ｏ、８Ｕ）、６０％（図８Ｄ、８Ｊ、８Ｐ、８Ｖ）、８０％（図８Ｅ、８Ｋ、８Ｑ、８Ｗ）、または１００％（図８Ｆ、８Ｌ、８Ｒ、８Ｘ）である。図８Ａ〜８Ｆにおける感受性曲線の傾きは、ＨＣＶ改変体が８０％未満の濃度で存在する場合、感受性が減少したＨＣＶ改変体の濃度が増すにつれて小さくなる。
【図９】図９は、ＮＳ５Ａヌクレオチド配列の系統樹を示しており、ＨＣＶ遺伝子型１ａ（丸）および遺伝子型１ｂ（四角）からの、野生型ＮＳ５Ａ配列（白抜きの形態）と少なくとも１つの耐性関連変異（ＲＡＭ）を有する配列（塗りつぶしの形態）との両方を示す。
【図１０】図１０は、８つの異なるＨＣＶサンプルにおけるＮＳ５Ａ変異を示す表である。ＮＳ５Ａにおける野生型アミノ酸残基およびその位置番号は表の上に提示され、各サンプルに存在するアミノ酸残基（複数可）は表中に提示される。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｊは、インターフェロン（各パネルにおいて左のグラフ）、第一のＮＳ５Ａ阻害剤（各パネルにおいて中央のグラフ）、および第二のＮＳ５Ａ阻害剤（各パネルにおいて右のグラフ）に関する、図１０に示される数種のＨＣＶサンプルの感受性曲線を示すグラフである。図１１Ａ〜１１Ｊは、サンプル２３、クローン１（パネルＡ）；サンプル２３、クローン２（パネルＢ）；サンプル２３、クローン３（パネルＣ）；サンプル５０、クローン１（パネルＤ）；サンプル５０、クローン２（パネルＥ）；サンプル７８、クローン１（パネルＦ）；サンプル７８、クローン２（パネルＧ）；サンプル１０９、クローン１（パネルＨ）；サンプル１０９、クローン２（パネルＩ）；およびＣｏｎ１野生型対照（パネルＪ、それぞれの阻害剤に対する感受性を示す）に関する結果を示す。各パネルの上に、各クローンの遺伝子型と、そのサンプルに関する全クローンのうちその遺伝子型を有するクローンの数とが示される。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、特に、抗ＨＣＶ薬に対するＨＣＶ集団の感受性を決定するための方法または患者に感染しているＨＣＶの複製能を決定するための方法を提供する。本方法、および本方法の実行において有用な組成物を以下でさらに説明する。
【００１７】
定義および略語
以下の用語は、本明細書では、本出願においてそれらが使用されている通りに定義される。
【００１８】
「ＰＣＲ」は、「ポリメラーゼ連鎖反応」の略語である。
【００１９】
「ＨＣＶ」は、Ｃ型肝炎ウイルスの略語である。特定の実施形態において、ＨＣＶは、ＨＣＶ遺伝子型１を指す。特定の実施形態において、ＨＣＶは、ＨＣＶ遺伝子型１ａまたは１ｂを指す。
【００２０】
２０種の遺伝学的にコードされたＬ−アミノ酸についての本明細書で使用されるアミノ酸の表記法は慣例的なものであり、以下の通りである。
【００２１】
【表１】
2015500021.tif 000002
特に他の既定がない限り、ポリペプチド配列が一連の１文字および／または３文字略記として示される場合、その配列は、一般的な実施に従ってＮからＣ方向で表記される。配列中の個々のアミノ酸は、本明細書ではＡＮのように表示され、この場合、Ａは、配列中のアミノ酸の標準的な１文字記号であり、Ｎは、配列中の位置である。変異は、本明細書ではＡ１ＮＡ２のように表示され、この場合、Ａ１は、参照タンパク質配列中のアミノ酸の標準的な１文字記号であり、Ａ２は、変異タンパク質配列中のアミノ酸の標準的な１文字記号であり、Ｎは、アミノ酸配列中の位置である。例えば、Ｇ２５Ｍ変異は、アミノ酸２５位におけるグリシンからメチオニンへの変化を表す。また変異は、本明細書では、ＮＡ２のように表示されることもあり、この場合、Ｎは、アミノ酸配列中の位置であり、Ａ２は、変異タンパク質配列中のアミノ酸の標準的な１文字記号である（例えば、アミノ酸２５位において野生型アミノ酸からメチオニンに変化している場合、２５Ｍである）。加えて、変異はまた、本明細書では、Ａ１ＮＸのように表示され、この場合、Ａ１は、参照タンパク質配列中のアミノ酸の標準的な１文字記号であり、Ｎは、アミノ酸配列中の位置であり、Ｘは、変異したアミノ酸がどのようなアミノ酸であってもよいことを示す（例えば、Ｇ２５Ｘは、アミノ酸２５位におけるグリシンからあらゆるアミノ酸への変化を表す）。この表記法は、典型的には、変異タンパク質配列中のアミノ酸が未知のときに使用されるか、変異タンパク質配列中のアミノ酸が、参照タンパク質配列中で見出されるものを除くあらゆるアミノ酸であり得る場合に使用されるか、または変異した位置のアミノ酸が、その位置で２つ以上のアミノ酸の混成であることが観察されている場合に使用される。アミノ酸の位置は、変異を包含する領域が誘導されるタンパク質の全長配列に基づいて番号付けされる。ＤＮＡ配列中のヌクレオチドおよび点変異の表示も同様である。加えて、変異はまた、本明細書では、例えばＡ１ＮＡ２Ａ３Ａ４のように表示され、例えば、Ａ１は、参照タンパク質配列中のアミノ酸の標準的な１文字記号であり、Ｎは、アミノ酸配列中の位置であり、Ａ２、Ａ３、およびＡ４は、変異タンパク質配列中に存在する可能性があるアミノ酸の標準的な１文字記号である。
【００２２】
特定の核酸塩基配列を含む核酸を指し示すために明細書全体で使用される略語は、慣例的な１文字略語である。従って、天然に存在するコーディング核酸塩基は、核酸中に包含される場合、以下のように、すなわちアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）と略記される。特に他の規定がない限り、一連の１文字略語として表示される一本鎖核酸配列、および二本鎖配列の上の鎖は、５’から３’方向で表記される。
【００２３】
成句「表現型アッセイ」は、本明細書で使用される場合、例えばＨＣＶなどの特定のウイルスの表現型、または例えば被検体に感染しているＨＣＶ集団などのウイルス集団を測定するテストである。測定することができる表現型としては、これらに限定されないが、特異的な化学物質または生物学的な抗ウイルス剤に対するウイルスもしくはウイルス集団の耐性もしくは感受性が挙げられ、またはウイルスの複製能を測定することも挙げられる。
【００２４】
「遺伝子型アッセイ」は、本明細書で使用される場合、生物、生物の一部、生物集団、遺伝子、遺伝子の一部、または遺伝子集団の遺伝子型を決定するアッセイである。典型的には、遺伝子型アッセイは、１種または複数の関連遺伝子の核酸配列の決定を含む。このようなアッセイは、ＨＣＶにおいて、例えば、所定の変異が、減少した薬物感受性（耐性）もしくは感受性過度の減少と関連があるかどうか、または変更された複製能が存在するかどうかを確定するためによく行われている。
【００２５】
用語「変異」は、本明細書で使用される場合、参照核酸またはポリペプチドと比べて、アミノ酸配列またはそれに対応する核酸配列における変化を指す。本発明の特定の実施形態について、参照核酸は、ＨＣＶ遺伝子型１ｂ集団と比較する場合はＣｏｎ１  ＨＣＶの核酸、またはＨＣＶ遺伝子型１ａ集団と比較する場合はＨ７７  ＨＣＶの核酸である。同様に、参照ポリペプチドは、Ｃｏｎ１またはＨ７７  ＨＣＶ核酸配列によってコードされたポリペプチドである。あるいは、参照核酸またはポリペプチドは、ＨＣＶ阻害剤で処置する前の患者集団由来であってもよい。ペプチドのアミノ酸配列は、例えばエドマン分解または質量分析によって直接決定することができるが、より典型的には、ペプチドのアミノ配列は、そのペプチドをコードする核酸のヌクレオチド配列から推測される。当該分野において公知のあらゆる核酸配列の決定方法を使用することができ、例えば、マクサム−ギルバートの配列決定法（Ｍａｘａｍら、１９８０年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ６５巻：４９９号）、ジデオキシ配列決定法（Ｓａｎｇｅｒら、１９７７年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７４巻：５４６３号）またはハイブリダイゼーションベースのアプローチ（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、第３版、ＮＹ；およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９８９年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ＡｓｓｏｃｉａｔｅｓおよびＷｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹを参照）。用語「位置」および「コドン」は、本明細書で使用される場合、交換可能に用いられ、配列中の特定のアミノ酸を指す。特定の実施形態において、変異は、薬物感受性の変化に関連することがわかっている。例えば、所定のＮＳ５Ｂ変異は、部位Ａ（ＮＮＩ−Ａ；例えばＬ３９２Ｉ、およびＰ４９５Ａ／Ｌ変異体）、部位Ｂ（ＮＮＩ−Ｂ；例えばＭ４２３Ｔ）、部位Ｃ（ＮＮＩ−Ｃ；例えばＣ３１６ＹおよびＹ４４８Ｈ）または部位Ｄ（ＮＮＩ−Ｄ；例えばＣ３１６Ｙ）を標的とする、ヌクレオシド阻害剤（ＮＩ；例えばＳ２８２Ｔ変異体）または非ヌクレオシドポリメラーゼ阻害剤に対する感受性の減少と関連する。
【００２６】
用語「変異体」は、本明細書で使用される場合、参照ウイルス、遺伝子、またはタンパク質と比べて１つまたは複数の変化を有する配列を有するウイルス、遺伝子、またはタンパク質を指す。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は、全体を通して交換可能に使用される。同様に、用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」も全体を通して交換可能に使用される。
【００２７】
用語「野生型」は、本明細書では、薬物感受性の変化（減少または増加）に関連することが公知の変異を含まないウイルスの遺伝子型を指すものとして使用される。用語「薬物感受性」および「阻害剤感受性」は、本明細書で使用される場合、交換可能に使用される。
【００２８】
用語「感受性」は、本明細書で使用される場合、特定の薬物に対するウイルスの応答を指す。薬物に対して感受性が低減または減少したウイルスは、その薬物に対して耐性を有する場合もあるし、またはその薬物による処置の作用を受けにくい場合もある。それに対して、薬物に対して増加したまたは増強された感受性（感受性過度）を有するウイルスは、その薬物による処置の作用を受けやすい。特定の実施形態において、開示された感受性決定方法は、医療提供者によって患者にとって適切な処置レジメンの決定を容易にするために使用することができる。
【００２９】
用語「ＩＣ９５」は、疾患の原因となる微生物（例えばＨＣＶ）の繁殖を９５％抑制するのに必要なサンプル中の薬物濃度を指す。用語「ＩＣ５０」は、疾患の原因となる微生物の繁殖を５０％抑制するのに必要なサンプル中の薬物濃度を指す。
【００３０】
用語「倍率変化」は、本明細書で使用される場合、患者のウイルスの薬物感受性と参照ウイルスの薬物感受性との数値的な比較である。例えば、薬物感受性参照ＨＣＶのＩＣ５０に対する変異体ＨＣＶのＩＣ５０の比率が、倍率変化である。１．０の倍率変化は、患者のウイルスが、薬物感受性参照ウイルスと同程度の薬物感受性を示すことを表す。１未満の倍率変化は、患者のウイルスが、薬物感受性参照ウイルスよりも感受性が高いことを表す。１より大きい倍率変化は、患者のウイルスが、薬物感受性参照ウイルスよりも感受性が低いことを表す。臨床上のカットオフ値に等しいかまたはそれより大きい倍率変化は、患者のウイルスが、その薬物に対して応答する確率が低いことを意味する。臨床上のカットオフ値よりも小さい倍率変化は、患者のウイルスが、その薬物に対して感受性を有することを意味する。
【００３１】
成句「臨床上のカットオフ値」は、薬物感受性がなくなる特異的なポイントを指す。これは、特定の薬物を用いた患者の処置が失敗する確率が有意に増加する薬物感受性レベルと定義される。臨床研究で決定される場合、カットオフ値は抗ウイルス剤ごとに異なる。臨床上のカットオフ値は、臨床試験で耐性および転帰のデータを評価することにより決定される。表現型の薬物感受性は、処置開始時に測定される。処置の経過全体にわたり予め決められた時点でウイルス量の変化などの処置応答をモニターする。薬物感受性と処置応答とは相関していることから、臨床上のカットオフ値は、処置の失敗に関連する感受性レベルによって決定される（試験結果全体の統計的分析）。
【００３２】
抗ウイルス処置に対する感受性の減少と相関している特性、例えば変異をウイルスが有する場合に、そのウイルスは、抗ウイルス処置に対する「感受性が減少する尤度の増加」を示し得る。ある特性を有するウイルス集団が、平均して、その特性は有さないが他の点では類似したウイルス集団と比べて抗ウイルス処置の作用を受けにくい場合、そのウイルスの特性は、感受性の減少と相関している。従って、特性の存在と感受性の減少との相関は絶対である必要はないし、感受性の減少を付与するのにその特性が必須である（すなわちその特性が、感受性の減少を引き起こす役割を果たす）または十分である（すなわちその特性が存在するだけで十分である）という要件もない。
【００３３】
用語「％配列相同性」は、本明細書では、用語「％相同性」、「％配列同一性」、および「％同一性」と交換可能に使用され、配列アライメントプログラムを使用して並べた場合、２つ以上のペプチド配列間におけるアミノ酸配列の同一性のレベルを指す。例えば、８０％の相同性は、本明細書で用いられる場合、定義されたアルゴリズムによって決定された８０％配列同一性と同じことを意味し、従って所定の配列のホモログは、その所定の配列の長さにわたり８０％より高い配列同一性を有する。配列同一性の例示的なレベルとしては、これらに限定されないが、所定の配列に対して、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８％またはそれより高い配列同一性が挙げられる。
【００３４】
２つの配列間の同一性を決定するのに使用可能なコンピュータプログラムの例としては、これらに限定されないが、インターネットでｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／において公共的に利用可能な一連のＢＬＡＳＴプログラム、例えばＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、ならびにＴＢＬＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴＰ、およびＴＢＬＡＳＴＮが挙げられる。また、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５巻：４０３〜１０頁（特に、公開されたデフォルト設定、すなわちパラメーターｗ＝４、ｔ＝１７に関連する）およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５巻：３３８９〜３４０２頁も参照されたい。典型的には、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質配列およびその他の公開データベースのアミノ酸配列と比べて所定のアミノ酸配列を評価する場合、配列の検索はＢＬＡＳＴＰプログラムを使用して実行される。ＧｅｎＢａｎｋタンパク質配列およびその他の公開データベースのアミノ酸配列に対して、全てのリーディングフレームですでに翻訳された核酸配列を検索する場合には、ＢＬＡＳＴＸプログラムが好ましい。ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＸはいずれも、１１．０のオープンギャップペナルティー、および１．０の伸長ギャップペナルティーのデフォルトパラメーターを使用して実行され、さらにＢＬＯＳＵＭ−６２マトリックスを利用する。Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７年を参照されたい。
【００３５】
２つ以上の配列間の「％同一性」を決定するための、選択された配列の好ましいアライメントは、例えばＭａｃＶｅｃｔｏｒバージョン６．５のＣＬＵＳＴＡＬ−Ｗプログラムを使用して行われ、１０．０のオープンギャップペナルティー、０．１の伸長ギャップペナルティー、およびＢＬＯＳＵＭ３０類似マトリックスを含むデフォルトパラメーターで操作される。
【００３６】
用語「極性アミノ酸」は、生理学的なｐＨで電荷を有さない側鎖を有するが、２つの原子が共有する電子対が、それら原子のうち一方により近接して保持される結合を少なくとも１つ有する親水性アミノ酸を指す。遺伝学的にコードされた極性アミノ酸としては、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、およびＴｈｒ（Ｔ）が挙げられる。
【００３７】
「非極性アミノ酸」は、生理学的なｐＨで電荷を有さない側鎖を有し、２つの原子が共有する電子対が、通常２つの原子それぞれによって等しく保持される結合を有する（すなわち側鎖が極性ではない）疎水性アミノ酸を指す。遺伝学的にコードされた無極性アミノ酸としては、Ａｌａ（Ａ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、およびＶａｌ（Ｖ）が挙げられる。
【００３８】
「親水性アミノ酸」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら、１９８４年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １７９巻：１２５〜１４２頁の正規化コンセンサス疎水性尺度（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ  ｓｃａｌｅ）に従ってゼロ未満の疎水性を示すアミノ酸を指す。遺伝学的にコードされた親水性アミノ酸としては、Ａｒｇ（Ｒ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、およびＴｈｒ（Ｔ）が挙げられる。
【００３９】
「疎水性アミノ酸」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら、１９８４年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １７９巻：１２５〜１４２頁の正規化コンセンサス疎水性尺度に従ってゼロより大きい疎水性を示すアミノ酸を指す。遺伝学的にコードされた疎水性アミノ酸としては、Ａｌａ（Ａ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、およびＶａｌ（Ｖ）が挙げられる。
【００４０】
「酸性アミノ酸」は、７未満の側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸を指す。酸性アミノ酸は、典型的には、水素イオンの損失により生理学的なｐＨで負電荷を有する側鎖を有する。遺伝学的にコードされた酸性アミノ酸としては、Ａｓｐ（Ｄ）およびＧｌｕ（Ｅ）が挙げられる。
【００４１】
「塩基性アミノ酸」は、７より大きい側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸を指す。塩基性アミノ酸は、典型的には、ヒドロニウムイオンとの会合により生理学的なｐＨで正電荷を有する側鎖を有する。遺伝学的にコードされた塩基性アミノ酸としては、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、およびＬｙｓ（Ｋ）が挙げられる。
【００４２】
用語「耐性テストベクター」は、本明細書で用いられる場合、患者由来セグメントと指標遺伝子とを含有する１つまたは複数の核酸を指す。耐性テストベクターが１個より多くの核酸を含む場合では、患者由来セグメントが１つの核酸に含有され、指標遺伝子が異なる核酸に含有されていてもよい。例えば、指標遺伝子および患者由来セグメントは、単一のベクター中に存在していてもよいし、または別のベクター中に存在していてもよい。従って耐性テストベクターのＤＮＡまたはＲＮＡは、１つまたは複数のＤＮＡまたはＲＮＡ分子に含有されていてもよいし、１つまたは複数のＤＮＡまたはＲＮＡ分子として宿主細胞に導入されてもよい。用語「患者由来セグメント」は、本明細書で用いられる場合、患者に感染しているＨＣＶの核酸配列に相当するＨＣＶ核酸配列を含む１つまたは複数の核酸であって、その核酸配列が、抗ＨＣＶ薬の標的であるＨＣＶの遺伝子産物をコードする上記核酸を指す。「患者由来セグメント」は、例えば、感染患者の細胞（例えば末梢血単核細胞、ＰＢＭＣ）、血清、またはその他の体液中に存在する、ウイルスＤＮＡまたはウイルスＲＮＡから調製された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）からの分子クローニングまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅などの当業者に公知の適切な技術によって調製することができる。「患者由来セグメント」は、好ましくは、患者から単離された後、患者に感染しているＨＣＶを培養しない技術を使用して単離されるか、またはウイルスが培養される場合、培養中の変異の選択を低減させるかまたは本質的になくすようにするために継代を最小限にした技術を使用して単離される。用語「指標」、「指標核酸」、または「指標遺伝子」は、本明細書で用いられる場合、直接的にまたは反応を介して、測定可能なもしくは顕著な側面、例えば測定可能な波長の色または光を発生させるか、またはＤＮＡまたはＲＮＡが指標として使用されるケースでは、特異的なＤＮＡまたはＲＮＡ構造の変化もしくは発生を引き起こす、タンパク質、ＤＮＡ構造、またはＲＮＡ構造をコードする核酸を指す。好ましい指標遺伝子は、ルシフェラーゼである。例えばβ−ガラクトシダーゼなどのその他の指標遺伝子が当該分野において周知である。
【００４３】
ＨＣＶ阻害剤に対する感受性を決定するための方法
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）集団のＨＣＶ阻害剤に対する感受性を決定するための方法であって、細胞に、ＨＣＶウイルス集団からの患者由来セグメントを含む耐性テストベクターを導入する工程であって、前記細胞または前記耐性テストベクターは、ＨＣＶ依存性の検出可能なシグナルを生産する指標核酸を含む、工程；ＨＣＶ阻害剤の非存在下で、またはＨＣＶ阻害剤の濃度を高めながら、細胞中の指標遺伝子の発現を測定する工程；ＨＣＶ阻害剤に関する薬物感受性の標準曲線を作成する工程であって、ＩＣ９５倍率変化値は、標準曲線で検出される工程；ＨＣＶ集団のＩＣ９５倍率変化値を、対照ＨＣＶ集団のＩＣ９５倍率変化値と比較する工程；およびＨＣＶ集団のＩＣ９５倍率変化が、対照ＨＣＶ集団のＩＣ９５倍率変化よりも大きい場合、前記ＨＣＶ集団は、前記ＨＣＶ阻害剤に対して感受性が減少したＨＣＶ粒子を含むと決定する工程を含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、ＨＣＶ集団は、部分集団を含み、開示された方法は、ＨＣＶ集団のうち少数種の部分集団における感受性の減少を検出する。特定の実施形態において、本方法は、ＨＣＶ集団の約２０％〜約６０％である部分集団における感受性の減少を検出する。特定の態様において、ＨＣＶ阻害剤は、ＨＣＶポリメラーゼを標的とする。ＨＣＶ阻害剤は、例えば、ヌクレオシド阻害剤（ＮＩ）または非ヌクレオシド阻害剤（ＮＮＩ）であってもよい。いくつかの実施形態において、ＨＣＶは、ポリメラーゼの部位Ａ、Ｂ、Ｃ、またはＤを標的とする非ヌクレオシド阻害剤（ＮＮＩ−Ａ、ＮＮＩ−Ｂ、ＮＮＩ−Ｃ、またはＮＮＩ−Ｄ）である。特定の態様において、ＨＣＶ阻害剤は、ＮＳ５Ａを標的とする。いくつかの実施形態において、ＨＣＶ集団および対照ＨＣＶ集団は、ＨＣＶ遺伝子型１を含む。特定の実施形態において、ＨＣＶ集団および対照ＨＣＶ集団は、ＨＣＶ遺伝子型１ａまたは１ｂを含んでいてもよい。特定の具体的な実施形態において、対照ＨＣＶ集団は、Ｃｏｎ１  ＨＣＶまたはＨ７７  ＨＣＶを含む。特定のその他の具体的な実施形態において、対照ＨＣＶ集団は、ＨＣＶ阻害剤で処置する前の患者に由来するＨＣＶ集団である。特定の実施形態において、耐性テストベクターは、患者由来セグメントと指標核酸とを含む。いくつかの実施形態において、患者由来セグメントは、ＨＣＶのＮＳ５Ｂ領域を含む。特定の実施形態において、指標遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子を含む。これらの方法の特定の実施形態において、宿主細胞は、Ｈｕｈ７細胞である。特定の実施形態において、本方法は、患者にとって適切な処置レジメンの決定を容易にするために使用される。特定の実施形態において、本方法はさらに、ＩＣ５０倍率変化値を決定すること、および検出されたＩＣ５０倍率変化値に対するＩＣ９５倍率変化値の比率を決定することを含み、ここで上記比率の変化は、阻害剤に対するＨＣＶの感受性の変化の指標である。
【００４４】
また、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）集団のＨＣＶ阻害剤に対する感受性を決定するための方法であって、細胞に、ＨＣＶウイルス集団からの患者由来セグメントを含む耐性テストベクターを導入する工程であって、前記細胞または前記耐性テストベクターは、ＨＣＶ依存性の検出可能なシグナルを生産する指標核酸を含む、工程；ＨＣＶ阻害剤の非存在下で、またはＨＣＶ阻害剤の濃度を高めながら、細胞中の指標遺伝子の発現を測定する工程；ＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶ集団の薬物感受性の標準曲線を決定する工程；ＨＣＶ集団の標準曲線の傾きを、対照ＨＣＶ集団の標準曲線の傾きと比較する工程；およびＨＣＶ集団の標準曲線の傾きが、対照集団の標準曲線と比較して減少している場合、前記ＨＣＶ集団は、前記ＨＣＶ阻害剤に対して感受性が減少したＨＣＶ粒子を含むと決定する工程を含む、方法も提供される。いくつかの実施形態において、ＨＣＶ集団は、部分集団を含み、開示された方法は、ＨＣＶ集団のうち少数種の部分集団における感受性の減少を検出する。特定の実施形態において、本方法は、ＨＣＶ集団の約２０％〜約６０％である部分集団における感受性の減少を検出する。特定の態様において、ＨＣＶ阻害剤は、ＨＣＶポリメラーゼを標的とする。ＨＣＶ阻害剤は、例えば、ヌクレオシド阻害剤（ＮＩ）または非ヌクレオシド阻害剤（ＮＮＩ）であってもよい。いくつかの実施形態において、ＨＣＶは、ＨＣＶポリメラーゼの部位Ａ、Ｂ、Ｃ、またはＤを標的とする非ヌクレオシド阻害剤（ＮＮＩ−Ａ、ＮＮＩ−Ｂ、ＮＮＩ−Ｃ、またはＮＮＩ−Ｄ）である。特定の態様において、ＨＣＶ阻害剤は、ＮＳ５Ａを標的とする。いくつかの実施形態において、ＨＣＶ集団および対照ＨＣＶ集団は、ＨＣＶ遺伝子型１を含む。特定の実施形態において、ＨＣＶ集団および対照ＨＣＶ集団は、ＨＣＶ遺伝子型１ａまたは１ｂを含んでいてもよい。特定の具体的な実施形態において、対照ＨＣＶ集団は、Ｃｏｎ１  ＨＣＶまたはＨ７７  ＨＣＶを含む。特定のその他の具体的な実施形態において、対照ＨＣＶ集団は、ＨＣＶ阻害剤で処置する前の患者に由来するＨＣＶ集団である。特定の実施形態において、耐性テストベクターは、患者由来セグメントと指標遺伝子とを含む。いくつかの実施形態において、患者由来セグメントは、ＨＣＶのＮＳ５Ｂ領域を含む。特定の実施形態において、指標遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子を含む。これらの方法の特定の実施形態において、宿主細胞は、Ｈｕｈ７細胞である。特定の実施形態において、本方法は、患者にとって適切な処置レジメンの決定を容易にするために使用される。
【００４５】
また、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）集団のＨＣＶ阻害剤に対する感受性を決定するための方法であって、細胞に、ＨＣＶウイルス集団からの患者由来セグメントを含む耐性テストベクターを導入する工程であって、前記細胞または前記耐性テストベクターは、ＨＣＶ依存性の検出可能なシグナルを生産する指標核酸を含む、工程；ＨＣＶ阻害剤の非存在下で、またはＨＣＶ阻害剤の濃度を高めながら、細胞中の指標遺伝子の発現を測定する工程；ＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶ集団の薬物感受性の標準曲線を決定する工程；ＨＣＶ集団の最大阻害百分率と、対照ＨＣＶ集団の最大阻害百分率とを比較する工程；およびＨＣＶ集団の最大阻害百分率が、対照集団の最大阻害百分率と比較して減少している場合、前記ＨＣＶ集団は、前記ＨＣＶ阻害剤に対して感受性が減少したＨＣＶ粒子を含むと決定する工程を含む、方法も提供される。いくつかの実施形態において、ＨＣＶ集団は、部分集団を含み、開示された方法は、ＨＣＶ集団のうち少数種の部分集団における感受性の減少を検出する。特定の実施形態において、本方法は、ＨＣＶ集団の約２０％〜約６０％である部分集団における感受性の減少を検出する。特定の態様において、ＨＣＶ阻害剤は、ＨＣＶポリメラーゼを標的とする。ＨＣＶ阻害剤は、例えば、ヌクレオシド阻害剤（ＮＩ）または非ヌクレオシド阻害剤（ＮＮＩ）であってもよい。いくつかの実施形態において、ＨＣＶは、ＨＣＶポリメラーゼの部位Ａ、Ｂ、Ｃ、またはＤを標的とする非ヌクレオシド阻害剤（ＮＮＩ−Ａ、ＮＮＩ−Ｂ、ＮＮＩ−Ｃ、またはＮＮＩ−Ｄ）である。特定の態様において、ＨＣＶ阻害剤は、ＮＳ５Ａを標的とする。特定の態様において、ＨＣＶ阻害剤は、ＮＳ３を標的とする。いくつかの実施形態において、ＨＣＶ集団および対照ＨＣＶ集団は、ＨＣＶ遺伝子型１を含む。特定の実施形態において、ＨＣＶ集団および対照ＨＣＶ集団は、ＨＣＶ遺伝子型１ａまたは１ｂを含んでいてもよい。特定の具体的な実施形態において、対照ＨＣＶ集団は、Ｃｏｎ１  ＨＣＶまたはＨ７７  ＨＣＶを含む。特定のその他の具体的な実施形態において、対照ＨＣＶ集団は、ＨＣＶ阻害剤で処置する前の患者に由来するＨＣＶ集団である。特定の実施形態において、耐性テストベクターは、患者由来セグメントと指標遺伝子とを含む。いくつかの実施形態において、患者由来セグメントは、ＨＣＶのＮＳ５Ｂ領域を含む。特定の実施形態において、指標遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子を含む。これらの方法の特定の実施形態において、宿主細胞は、Ｈｕｈ７細胞である。特定の実施形態において、本方法は、患者にとって適切な処置レジメンの決定を容易にするために使用される。
【００４６】
表現型の感受性解析
特定の実施形態において、特定のウイルスのＨＣＶ阻害剤感受性を決定するための方法は、ＨＣＶ阻害剤の存在下で、患者由来セグメントと指標遺伝子とを含有する宿主細胞を培養する工程、宿主細胞中の指標遺伝子の活性を測定する工程；および測定された指標遺伝子の活性を、指標遺伝子の参照活性と比較する工程を含み、ここで、測定された指標遺伝子の活性が参照活性に比べて異なっていることが、そのＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶの感受性と相関するため、ＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶの感受性が決定される。特定の実施形態において、指標遺伝子の活性は、患者由来セグメントによってコードされたポリペプチドの活性に依存する。好ましい実施形態において、患者由来セグメントは、ＮＳ５Ｂをコードする核酸配列を含む。その他の実施形態において、患者由来セグメントは、ＨＣＶプロテアーゼＮＳ３またはＮＳ５Ａタンパク質をコードする。特定の実施形態において、患者由来セグメントは、ＨＣＶから得られる。
【００４７】
特定の実施形態において、指標遺伝子の参照活性は、ＨＣＶ阻害剤の非存在下で指標遺伝子の活性を決定することによって決定される。特定の実施形態において、指標遺伝子の参照活性は、ＮＩまたはＮＮＩに対する参照ＨＣＶの感受性を決定することによって決定される。特定の実施形態において、参照活性は、標準的な実験用ウイルスのセグメントを用いて本発明の方法を行うことによって決定される。特定の実施形態において、標準的な実験用ウイルスのセグメントは、ＨＣＶ株Ｃｏｎ１またはＨ７７由来の核酸配列を含む。
【００４８】
特定の実施形態において、ＨＣＶは、ＨＣＶ阻害剤に対して感受性が減少していると決定される。特定の実施形態において、ＨＣＶは、ＨＣＶ阻害剤に対して感受性が増加していると決定される。特定の実施形態において、患者由来セグメントは、逆転写とポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）反応とで、またはＰＣＲ反応単独で調製されたものである。
【００４９】
特定の実施形態において、本方法は、宿主細胞を培養する前に、患者由来セグメントと指標遺伝子とを含有するウイルス粒子で宿主細胞を感染させる工程をさらに含む。
【００５０】
特定の実施形態において、指標遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子である。特定の実施形態において、指標遺伝子は、ｌａｃＺ遺伝子である。特定の実施形態において、宿主細胞は、ヒト細胞である。特定の実施形態において、宿主細胞は、ヒト肝細胞癌細胞である。特定の実施形態において、宿主細胞は、Ｈｕｈ７細胞である。その他の実施形態において、宿主細胞は、Ｈｕｈ７誘導体（例えばＨｕｈ７．５、Ｈｕｈ７．５．１）である。Ｈｕｈ７．５細胞、すなわちヒト肝細胞の細胞株は、安定して選択されるＨＣＶレプリコン含有細胞株をＩＦＮで矯正することにより作製された。（Ｂｌｉｇｈｔ  ＫＪら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７６巻：１３００１〜１３０１４頁、２００２年）。所定のその他の実施形態において、宿主細胞は、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、またはそれらの誘導体である。特定の実施形態において、宿主細胞は、ヒト肝癌細胞株から誘導される。特定の実施形態において、宿主細胞は、初代肝細胞（例えば、胎児、成人、または再生肝由来）である。さらにその他の実施形態において、宿主細胞は、リンパ球（例えば、Ｂ細胞、Ｂ細胞リンパ腫）である。
【００５１】
その他の態様において、本発明は、患者由来セグメントと指標遺伝子とを含有するベクターを提供する。特定の実施形態において、患者由来セグメントは、ＨＣＶ  ＮＳ３、ＮＳ５Ａ、またはＮＳ５Ｂをコードする核酸配列を含む。所定の好ましい実施形態において、患者由来セグメントは、ＨＣＶ  ＮＳ５Ｂをコードする核酸配列を含む。特定の実施形態において、指標遺伝子の活性は、ＨＣＶ  ＮＳ５Ｂの活性に依存する。
【００５２】
特定の実施形態において、指標遺伝子は、機能的な指標遺伝子である。特定の実施形態において、指標遺伝子は、非機能的な指標遺伝子である。特定の実施形態において、指標遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子である。
【００５３】
その他の態様において、本発明は、本発明のベクターを含むパッケージング宿主細胞を提供する。特定の実施形態において、パッケージング宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞である。特定の実施形態において、パッケージング宿主細胞は、ヒト宿主細胞である。特定の実施形態において、宿主細胞は、Ｈｕｈ７細胞である。その他の実施形態において、宿主細胞は、Ｈｕｈ７誘導体（例えばＨｕｈ７．５、Ｈｕｈ７．５．１）である。Ｈｕｈ７．５細胞、すなわちヒト肝細胞の細胞株は、安定して選択されるＨＣＶレプリコン含有細胞株をＩＦＮで矯正することによりによって作製された。（Ｂｌｉｇｈｔ  ＫＪら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７６巻：１３００１〜１３０１４頁、２００２年）。所定のその他の実施形態において、宿主細胞は、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、またはそれらの誘導体である。特定の実施形態において、宿主細胞は、ヒト肝癌細胞株から誘導される。特定の実施形態において、宿主細胞は、初代肝細胞（例えば、胎児、成人、または再生肝由来）である。さらにその他の実施形態において、宿主細胞は、リンパ球（例えば、Ｂ細胞、Ｂ細胞リンパ腫）である。
【００５４】
その他の態様において、本発明は、患者に感染しているＨＣＶが、ＨＣＶ阻害剤に対して感受性であるかまたは耐性であるかを決定するための方法を提供する。特定の実施形態において、本方法は、本発明の方法に従ってＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶの感受性を決定する工程、および決定されたＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶの感受性を、ＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶの感受性の標準曲線と比較する工程を含む。特定の実施形態において、標準曲線と比べてＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶの感受性が低減していることは、そのＨＣＶが、そのＨＣＶ阻害剤に対して耐性であることの指標である。特定の実施形態において、ＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶの感受性の低減量は、そのＨＣＶがＨＣＶ阻害剤に対して感受性が低いことの指標である。特定の実施形態において、ＨＣＶ阻害剤は、ヌクレオシド阻害剤（ＮＩ）である。その他の実施形態において、ＨＣＶ阻害剤は、ポリメラーゼの部位Ａ、Ｂ、Ｃ、またはＤを標的とする非ヌクレオシド阻害剤（ＮＮＩ）である（ＮＮＩ−Ａ、ＮＮＩ−Ｂ、ＮＮＩ−Ｃ、またはＮＮＩ−Ｄ）。所定のその他の態様において、ＨＣＶ阻害剤は、ＮＳ５Ａを標的とする。所定のその他の態様において、ＨＣＶ阻害剤は、ＮＳ３を標的とする。いくつかの実施態様において、ＨＣＶ阻害剤は、以下に示すもののうち１つまたは以下に示すもののうち１つもしくは複数の組み合わせであってもよい：
ＮＳ３：
ＢＩＬＮ−２０６１、ＶＸ−９５０、ＳＣＨ−５０３，０３４、ＳＣＨ−９００，５１８、ＴＭＣ−４３５，３５０、Ｒ−７２２７  （ＩＴＭＮ−１９１）、ＭＫ−５１７２、ＭＫ−７００９、ＢＩ−２０１，３３５、ＢＭＳ−６５０，０３２、ＢＭＳ−８２４，３９３、ＰＨＸ−１７６６、ＡＣＨ−１６２５、ＡＣＨ−２６８４、ＶＸ−９８５、ＢＭＳ−７９１，３２５、ＩＤＸ−３２０、ＧＳ−９２５６、ＧＳ−９４５１、ＡＢＴ−４５０、ＶＸ−５００、ＢＩＴ−２２５
ＮＳ５Ａ：
ＢＭＳ−７９０，０５２、ＧＳＫ−２３３６８０５、ＰＰＩ−４６１、ＡＢＴ−２６７、ＧＳ−５８８５、ＡＣＨ−２９２８、ＡＺＤ−７２９５
ＮＳ５Ｂ：
ＮＭ−２８３、ＲＧ−７１２８、Ｒ−１６２６、ＰＳＩ−７８５１、ＩＤＸ−１８４、ＭＫ−０６０８、ＰＳＩ−７９７７、ＰＳＩ−９３８、ＧＳ−６６２０、ＴＭＣ−６４９，１２８、ＩＮＸ−１８９、ＶＸ−７５９、ＶＣＨ−９１６、ＶＸ−２２２、ＡＮＡ−５９８、ＨＣＶ−７９６、ＧＳ−９１９０、ＧＳ−９６６９、ＡＢＴ−３３３、ＰＦ−４８７８６９１、ＩＤＸ−３７５、ＡＢＴ−８３７，０９３、ＧＳＫ−６２５，４４３、ＡＢＴ−０７２。
【００５５】
その他の態様において、本発明は、ＨＣＶ阻害剤に対する患者に感染しているＨＣＶの耐性の進行または発生を決定するための方法を提供する。特定の実施形態において、本方法は、本発明の方法に従って、第一の時点でＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶの感受性を決定する工程；その後の第二の時点で、本発明の方法に従って、ＨＣＶ阻害剤の有効性を評価する工程；および第一および第二の時点で評価されたＨＣＶ阻害剤の有効性を比較する工程を含む。特定の実施形態において、患者由来セグメントは、およそ第一の時点で患者から得られる。特定の実施形態において、第一の時点と比較して、その後の第二の時点におけるＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶの感受性が減少していることは、患者に感染しているＨＣＶにおいてＨＣＶ阻害剤耐性が発生または進行していることの指標である。
【００５６】
その他の態様において、本発明は、ＨＣＶ阻害剤に対する患者に感染しているＨＣＶの感受性を決定するための方法を提供する。特定の実施形態において、本方法は、様々な濃度のＨＣＶ阻害剤の存在下で、ＨＣＶから得られた患者由来セグメントと指標遺伝子とを含有する宿主細胞を培養する工程、様々な濃度のＨＣＶ阻害剤について宿主細胞中の指標遺伝子の活性を測定する工程；およびＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶのＩＣ５０、ＩＣ９５、またはそれらの比率を決定する工程を含み、ここで、ＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶのＩＣ５０、ＩＣ９５、またはそれらの比率は、ＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶの感受性の指標である。特定の実施形態において、指標遺伝子の活性は、患者由来セグメントによってコードされたポリペプチドの活性に依存する。特定の実施形態において、患者由来セグメントは、ＮＳ５Ｂ、ＮＳ５Ａ、および／またはＮＳ３をコードする核酸配列を含む。特定の実施形態において、ＨＣＶのＩＣ５０、ＩＣ９５、またはそれらの比率は、抗ＨＣＶ薬濃度の対数に対して観察された指標遺伝子の活性をプロットすることによって決定することができる。あるいは、ＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶの感受性は、曲線で確認されたＨＣＶの傾きまたは最大阻害を、参照ウイルスの曲線と比較することによって決定される。
【００５７】
さらにその他の態様において、本発明は、ＨＣＶ阻害剤に対する患者に感染しているＨＣＶ集団の感受性を決定するための方法を提供する。特定の実施形態において、本方法は、ＨＣＶ阻害剤の存在下で、ＨＣＶ集団から得られた複数の患者由来セグメントと指標遺伝子とを含有する宿主細胞を培養して、宿主細胞中の指標遺伝子の活性を測定する工程；および測定された指標遺伝子の活性を、指標遺伝子の参照活性と（ＩＣ５０、ＩＣ９５、もしくはそれらの比率、または傾きもしくは最大阻害百分率によって）比較する工程を含み、ここで、測定された指標遺伝子の活性が参照活性に比べて異なっていることが、そのＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶの感受性と相関するため、ＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶの感受性が決定される。特定の実施形態において、指標遺伝子の活性は、複数の患者由来セグメントによってコードされた複数のポリペプチドの活性に依存する。特定の実施形態において、患者由来セグメントは、ＮＳ５Ｂ、ＮＳ５Ａ、またはＮＳ３をコードする核酸配列を含む。特定の実施形態において、複数の患者由来セグメントは、患者からのサンプルから得られた複数の核酸から、患者由来セグメントを増幅することによって調製される。
【００５８】
さらにその他の態様において、本発明は、ＨＣＶ阻害剤に対する患者に感染しているＨＣＶ集団の感受性を決定するための方法を提供する。特定の実施形態において、本方法は、様々な濃度のＨＣＶ阻害剤の存在下で、ＨＣＶ集団から得られた複数の患者由来セグメントと指標遺伝子とを含有する宿主細胞を培養して、様々な濃度のＨＣＶ阻害剤について宿主細胞中の指標遺伝子の活性を測定する工程；および抗ウイルス薬に対するＨＣＶ集団のＩＣ５０、ＩＣ９５、またはそれらの比率を決定する工程を含み、ここで、ＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶ集団のＩＣ５０、ＩＣ９５、またはそれらの比率は、ＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶ集団の感受性の指標である。特定の実施形態において、宿主細胞は、患者由来セグメントと指標遺伝子とを含む。特定の実施形態において、指標遺伝子の活性は、複数の患者由来セグメントによってコードされた複数のポリペプチドの活性に依存する。特定の実施形態において、複数の患者由来セグメントは、ＮＳ５Ｂ、ＮＳ５Ａ、またはＮＳ３をコードする核酸配列を含む。特定の実施形態において、ＨＣＶ集団のＩＣ５０、ＩＣ９５、またはそれらの比率は、抗ＨＣＶ薬濃度の対数に対して観察された指標遺伝子の活性をプロットすることによって決定することができる。特定の実施形態において、複数の患者由来セグメントは、患者からのサンプルから得られた複数の核酸から、患者由来セグメントを増幅することによって調製される。所定のその他の実施形態において、ＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶの感受性は、曲線で確認されたＨＣＶの傾きまたは最大阻害を、参照ウイルスの曲線と比較することによって決定される。
【００５９】
耐性テストベクターの構築
特定の実施形態において、耐性テストベクターは、患者由来セグメントを指標遺伝子ウイルスベクターに挿入することによって作製することができる。一般的に、このような実施形態において、耐性テストベクターは、完全な感染性ウイルス粒子を生産するのに必要な全ての遺伝子を含まない。特定の実施形態において、耐性テストベクターは、患者由来セグメントをパッケージングベクターに挿入することによって作製することができ、一方で指標遺伝子は、第二のベクター、例えば指標遺伝子ウイルスベクターに含有される。特定の実施形態において、耐性テストベクターは、患者由来セグメントをパッケージングベクターに挿入することによって作製することができ、一方で指標遺伝子は、耐性テストベクターで感染させようとする宿主細胞のゲノムに組み込まれる。
【００６０】
薬物が、１種より多くの機能的なウイルス配列またはウイルス遺伝子産物を標的とするような場合、機能的なウイルス配列またはウイルス遺伝子産物それぞれを含有する患者由来セグメントは、耐性テストベクターに導入されてもよい。同じまたは２つ以上の異なる機能的なウイルス配列またはウイルス遺伝子産物を標的とする２つ以上の抗ＨＣＶ薬が評価される併用療法の場合では、このような機能的なウイルスコード配列またはウイルス遺伝子産物それぞれを含有する患者由来セグメントは、耐性テストベクターに挿入されてもよい。患者由来セグメントは、選択された特定の構築に応じて指標遺伝子ウイルスベクターまたは例えばパッケージングベクター中の、特有の制限部位または患者配列アクセプター部位（ｐａｔｉｅｎｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｃｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｔｅ）と称される特定の場所に挿入されてもよい。
【００６１】
患者由来セグメントは、制限なく当業者に公知の適切なクローニング技術のいずれかを使用して耐性テストベクターに取り込ませることもできる。例えば、プラスミド主鎖と患者由来セグメントの両方にクラスＩＩ制限部位を導入することによるクローニングが好ましく、またはウラシルＤＮＡグリコシラーゼプライマーによるクローニングによってなされる。
【００６２】
患者由来セグメントは、あらゆる分子クローニングまたは遺伝子増幅方法、またはそれらの改変法によって得てもよいし、以下で説明されるように、耐性テストベクターに導入しようとする患者由来セグメントの端部に患者配列アクセプター部位を導入することによって得てもよい。好ましい実施形態において、ＰＣＲなどの遺伝子増幅方法を使用して、ＰＣＲ反応で使用されるプライマーの端部に患者配列アクセプター部位に対応する制限部位を取り入れることもできる。同様に、ｃＤＮＡクローニングなどの分子クローニング方法では、第一または第二鎖のｃＤＮＡ合成に使用されるプライマーの端部に制限部位を取り入れることもでき、またはＤＮＡのプライマー修復などの方法では、クローニングされたＤＮＡかまたはクローニングされていないＤＮＡかにかかわらず、修復反応に使用されるプライマーに制限部位を取り入れることもできる。患者配列アクセプター部位およびプライマーは、患者由来セグメントの提示が改善されるように設計することができる。設計された患者配列アクセプター部位を有する耐性テストベクターのセットにより、１つの耐性テストベクター単独では過少に提示される可能性がある患者由来セグメントの提示が可能になる。
【００６３】
耐性テストベクターは、指標遺伝子ウイルスベクターに患者配列アクセプター部位を導入して、患者由来セグメントを増幅またはクローニングして、増幅またはクローニングされた配列を、患者配列アクセプター部位で指標遺伝子ウイルスベクターに正確に導入することによって指標遺伝子ウイルスベクターを改変することによって調製することができる。特定の実施形態において、耐性テストベクターは、指標遺伝子ウイルスベクターから構築することができ、この指標遺伝子ウイルスベクターは、ゲノムウイルスベクターまたはサブゲノムウイルスベクターおよび指標遺伝子カセットから誘導することができ、これらはそれぞれ以下で説明される。耐性テストベクターは続いて、宿主細胞に導入することができる。あるいは、特定の実施形態において、耐性テストベクターは、パッケージングベクターに患者配列アクセプター部位を導入して、患者由来セグメントを増幅またはクローニングして、増幅またはクローニングされた配列を、患者配列アクセプター部位でパッケージングベクターに正確に挿入して、このパッケージングベクターと指標遺伝子ウイルスベクターとを共にトランスフェクトすることによって調製することもできる。
【００６４】
１つの好ましい実施形態において、耐性テストベクターを、以下で定義されるようなパッケージング発現ベクターと共にパッケージング宿主細胞に導入して、本明細書では「粒子ベースのテスト」と称される薬物耐性および感受性テストで使用される耐性テストベクターのウイルス粒子を生産することもできる。その代わりの実施形態において、耐性テストベクターを、パッケージング発現ベクターの非存在下で宿主細胞に導入して、本明細書では「非粒子ベースのテスト」と称される薬物耐性および感受性テストを実行してもよい。「パッケージング発現ベクター」は、本明細書で用いられる場合、例えばパッケージングタンパク質（例えば、コアおよびエンベロープポリペプチドなどの構造タンパク質）、トランス作用因子、または複製欠損型ＨＣＶに必要な遺伝子などの因子を提供する。このような状況では、複製能のあるウイルスのゲノムは、それ自体で複製できないような方式で弱体化される。これは、パッケージング発現ベクターは、弱体化したゲノムを含有する細胞に存在する欠陥ウイルスゲノムをレスキューするのに必要なトランス作用性または失われた（ｍｉｓｓｉｎｇ）遺伝子を生産することが可能であるが、弱体化したゲノムは、それ自体をレスキューすることはできないことを意味する。このような実施形態は、完全な感染性ウイルス粒子を生産するのに必要な全てのウイルス遺伝子を含まない耐性テストベクターを含むウイルス粒子を調製するのに特に有用である。
【００６５】
特定の実施形態において、耐性テストベクターは、指標遺伝子を含むが、上述したように、指標遺伝子は、耐性テストベクター中に必ずしも存在していなくてもよい。指標遺伝子の例としては、これらに限定されないが、ベータ−ガラクトシダーゼをコードするＥ．ｃｏｌｉのｌａｃＺ遺伝子、例えばＰｈｏｔｏｎｉｓ  ｐｙｒａｌｉｓ（ホタル）またはＲｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ウミシイタケ）のいずれか由来のルシフェラーゼをコードするｌｕｃ遺伝子、アルカリホスファターゼをコードするＥ．ｃｏｌｉのｐｈｏＡ遺伝子、緑色蛍光タンパク質、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする細菌のＣＡＴ遺伝子が挙げられる。好ましい指標遺伝子は、ホタルルシフェラーゼである。指標遺伝子のさらなる例としては、これらに限定されないが、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）などのアッセイによって容易に測定される分泌タンパク質または細胞表面タンパク質、例えば増殖因子、サイトカイン、および細胞表面抗原（例えば、それぞれ成長ホルモン、Ｉｌ−２またはＣＤ４）が挙げられる。さらにその他の例示的な指標遺伝子としては、選択マーカーとも称される選択遺伝子が挙げられる。哺乳動物細胞に適した選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシン、ネオマイシン、ゼオシンまたはＥ．ｃｏｌｉのｇｐｔである。前述した指標遺伝子の例のケースでは、指標遺伝子と患者由来セグメントとは分かれており、すなわち異なる別個の遺伝子である。いくつかのケースでは、患者由来セグメントは、指標遺伝子として使用されることもある。患者由来セグメントが、抗ＨＣＶ剤の標的である１つまたは複数のＨＣＶ遺伝子に相当するこのような１つの実施形態において、ＨＣＶ遺伝子の１つが、指標遺伝子として役立つものであってもよい。例えば、ウイルス性プロテアーゼ遺伝子は、発色性基質を切断し、呈色反応を起こす能力、または不活性な酵素原を活性化し、この酵素原が発色性基質を切断し、呈色反応を起こす能力により、指標遺伝子として役立つ可能性がある。
【００６６】
上記で考察したように、耐性テストベクターは、指標遺伝子ウイルスベクターから組み立てることもできる。本明細書で用いられる場合、「指標遺伝子ウイルスベクター」は、指標遺伝子およびその制御エレメント、ならびに１つまたは複数のウイルス遺伝子またはコード領域を含有するベクター（複数可）を指す。指標遺伝子ウイルスベクターは、以下で定義される指標遺伝子カセットおよび「ウイルスベクター」から組み立てることができる。指標遺伝子ウイルスベクターはさらに、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリアデニル化配列、転写ターミネーター、またはその他の調節配列を包含していてもよい。加えて指標遺伝子ウイルスベクター中の指標遺伝子は、機能的であってもよいし、または非機能的であってもよい。抗ウイルス薬の標的であるウイルスセグメントが指標遺伝子ウイルスベクター中に包含されない場合、このようなウイルスセグメントは、第二のベクターに提供されてもよい。「指標遺伝子カセット」は、指標遺伝子と制御エレメントとを含み、任意選択で、ウイルスベクターへのカセットの導入が容易になるようにその端部に制限酵素切断部位とともに構成されてもよい。「ウイルスベクター」は、以下：遺伝子産物をコードするウイルス遺伝子、制御配列、ウイルスのパッケージング配列、およびレトロウイルスのケースでは組み込み配列（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のいくつかまたは全部を含有するベクターを指す。ウイルスベクターはさらに、１つまたは複数のウイルスセグメントを包含していてもよく、そのうち１つまたは複数は、抗ウイルス薬の標的であってもよい。ウイルス遺伝子を含むウイルスベクターの２つの例は、本明細書では、「ゲノムウイルスベクター」および「サブゲノムウイルスベクター」と称する。「ゲノムウイルスベクター」は、ウイルス複製を不能にする、例えば完全な感染性ウイルス粒子を生産するのに必要な全てのタンパク質の発現を不可能にするような１つまたは複数のウイルス遺伝子の欠失を含み得るが、その他の点では完全なウイルスのｍＲＮＡ発現およびプロセシング特性は保持しているベクターである。ＨＣＶ薬物感受性および耐性テストに関する一実施形態において、ゲノムウイルスベクターは、ＮＳ５Ｂ、ＮＳ５Ａ、およびＮＳ３コード領域を含む。「サブゲノムウイルスベクター」は、抗ウイルス薬の標的（複数可）であるタンパク質をコードする可能性がある１つまたは複数のウイルス遺伝子のコード領域を含有するベクターを指す。好ましい実施形態において、サブゲノムウイルスベクターは、ＨＣＶポリメラーゼのコード領域、またはそれらの一部を含む。特定の実施形態において、ウイルスのコード遺伝子は、天然型のエンハンサー／プロモーターの制御下にあってもよい。特定の実施形態において、ウイルスのコード領域は、外来ウイルスまたは細胞のエンハンサー／プロモーターの制御下にあってもよい。好ましい実施形態において、ゲノムまたはサブゲノムウイルスのコード領域は、天然型のエンハンサー／プロモーター領域またはＣＭＶ前初期（ＩＥ）エンハンサー／プロモーターの制御下にあってもよい。１つまたは複数の抗ウイルス薬の標的であるか、または１つまたは複数の抗ウイルス薬の標���であるタンパク質コードする１つまたは複数のウイルス遺伝子を含む指標遺伝子ウイルスベクターの特定の実施形態において、ベクターは、患者配列アクセプター部位を含んでいてもよい。患者由来セグメントは、指標遺伝子ウイルスベクター中の患者配列アクセプター部位に挿入されてもよく、この場合、このようなベクターは、上述したように耐性テストベクターと称される。
【００６７】
「患者配列アクセプター部位」は、患者由来セグメントの挿入のためのベクター中の部位である。特定の実施形態において、このような部位は、１）部位特異的変異誘発によってベクターに導入される特有の制限部位；２）ベクター中の天然に存在する特有の制限部位；または３）オルタナティブクローニング法（例えばＵＤＧクローニング）を使用して患者由来セグメントを挿入することができる、選択された部位であってもよい。特定の実施形態において、患者配列アクセプター部位は、部位特異的変異誘発によって指標遺伝子ウイルスベクターに導入される。患者配列アクセプター部位は、抗ウイルス薬の標的であるウイルスタンパク質のコード領域内またはその近傍に配置してもよい。患者配列アクセプター部位の導入に使用されたウイルス配列は、好ましくはその位置で見出されるアミノ酸コード配列に変化が生じないように選ばれる。その位置でアミノ酸コード配列に変化が生じる場合、その変化は、好ましくは保存的変化である。好ましくは、患者配列アクセプター部位は、患者由来セグメントの導入を容易にするために、ウイルスゲノムの比較的保存された領域内に配置されてもよい。あるいは、患者配列アクセプター部位は、機能的に重要な遺伝子または調節配列の間に配置されてもよい。患者配列アクセプター部位は、対応する制限部位を患者由来セグメントに導入するために使用されるプライマーによるプライミングを可能とするように、比較的保存されたウイルスゲノム中の領域に、またはその近傍に配置されてもよい。患者由来セグメントの提示をさらに改善するために、このようなプライマーは、ウイルス配列の不均質さを順応させるために縮重プールとして設計されてもよいし、または多重塩基対形成能を有するデオキシイノシン（Ｉ）などの残基を取り入れてもよい。薬物耐性および感受性テストにおいて、同じまたは重複する制限部位間の間隔を決める患者配列アクセプター部位を有する耐性テストベクターのセットを共に使用することにより、所定の患者配列アクセプター部位と同一の内部制限部位を含み、そのためどちらかの耐性テストベクター単独では過少に提示され得る患者由来セグメントの提示をもたらすことができる。
【００６８】
本発明のベクターの構築は、当該分野でよく理解されている標準的なライゲーションおよび制限技術を使用する。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、２００５年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｗｉｌｅｙ−−ＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅおよびＳａｍｂｒｏｏｋら、２００１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎ．Ｙ．を参照されたい。単離されたプラスミド、ＤＮＡ配列、または合成されたオリゴヌクレオチドは、所望の形態で切断し、調整させ、分類する（ｒｅｌｅｇａｔｅｄ）ことができる。合成ＤＮＡを取り込んだ全てのＤＮＡコンストラクトの配列は、ＤＮＡ配列解析によって確認することができる。例えば、Ｓａｎｇｅｒら、１９７７年、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．  ＵＳＡ  ７４巻：５４６３〜５４６７頁を参照されたい。
【００６９】
上記で考察されたエレメントに加えて、本明細書において使用されるベクターはまた、選択マーカーとも称される選択遺伝子を含んでいてもよい。特定の実施形態において、選択遺伝子は、ベクターで形質転換した宿主細胞の生存または成長に必要なタンパク質をコードする。哺乳動物細胞に適した選択マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ＤＨＦＲ）、オルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子、多剤耐性遺伝子（ｍｄｒ）、アデノシン−デアミナーゼ遺伝子、およびグルタミン合成酵素遺伝子が挙げられる。このような選択マーカーが成功裏に哺乳動物宿主細胞に移行する場合、形質転換した哺乳動物宿主細胞は、選択圧力下に置かれた場合に生存することができる。選択レジメンには２つの広く使用されている別個のカテゴリーがある。第一のカテゴリーは、細胞の代謝と、補充された培地に依存せずに成長する能力を欠く変異体細胞株の使用とに基づくものである。第二のカテゴリーは、優性選択と称されるものであり、これは、あらゆる細胞型で使用される選択スキームを指し、変異体細胞株の使用を必要としない。これらのスキームは、典型的には、宿主細胞の成長を阻止するために薬物を使用する。新規の遺伝子を有する細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を発現し得、選択を生き抜き得る。このような優性選択の例は、ネオマイシン（ＳｏｕｔｈｅｒｎおよびＢｅｒｇ、１９８２年、Ｊ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  １巻：３２７頁を参照）、マイコフェノール酸（ＭｕｌｌｉｇａｎおよびＢｅｒｇ、１９８０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０９巻：１４２２頁を参照）、またはハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎら、１９８５年、Ｍｏｌ．  ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５巻：４１０〜４１３頁を参照）という薬物を使用する。上記で示した３つの例は、真核性の制御下で細菌遺伝子を使用することにより、それぞれ適切な薬物ネオマイシン（Ｇ４１８またはジェネティシン（ｇｅｎｔｉｃｉｎ））、ｘｇｐｔ（マイコフェノール酸）またはハイグロマイシンに対する耐性を付与する。
【００７０】
宿主細胞
特定の実施形態において、本発明の方法は、患者由来セグメントと指標遺伝子とを含む宿主細胞を培養することを含む。特定の実施形態において、宿主細胞は、哺乳動物細胞であってもよい。特定の実施形態において、宿主細胞は、ウイルス感染の主要な標的であるヒト組織および細胞から誘導することができる。ヒト由来の宿主細胞は、抗ウイルス薬を細胞に効率的に侵入させ、細胞の酵素機構によって抗ウイルス阻害剤の代謝的に関連する形態に変換される。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、本明細書では、「パッケージング宿主細胞」、「耐性テストベクター宿主細胞」、または「標的宿主細胞」とも称される。「パッケージング宿主細胞」は、耐性テストベクターのウイルス粒子を生産するために、例えば耐性テストベクターなどの本明細書において使用される複製欠損型ウイルスベクターが必要とするトランス作用因子およびウイルスのパッケージングタンパク質を提供する宿主細胞を指す。パッケージングタンパク質は、耐性テストベクターそれ自体、パッケージング発現ベクター（複数可）、またはその両方に含有されるウイルス遺伝子の発現を提供し得る。パッケージング宿主細胞は、１つまたは複数のパッケージング発現ベクターでトランスフェクトされる宿主細胞であってもよく、耐性テストベクターでトランスフェクトされた場合は、本明細書では、「耐性テストベクター宿主細胞」と称され、場合によってはパッケージング宿主細胞／耐性テストベクター宿主細胞とも称される。
【００７１】
特定の実施形態において、宿主細胞は、Ｈｕｈ７細胞である。その他の実施形態において、宿主細胞は、Ｈｕｈ７誘導体（例えばＨｕｈ７．５、Ｈｕｈ７．５．１）である。Ｈｕｈ７．５細胞、すなわちヒト肝細胞の細胞株は、安定して選択されるＨＣＶレプリコン含有細胞株をＩＦＮで矯正することにより作製された。（Ｂｌｉｇｈｔ  ＫＪら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７６巻：１３００１〜１３０１４頁、２００２年）。所定のその他の実施形態において、宿主細胞は、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、またはそれらの誘導体である。特定の実施形態において、宿主細胞は、ヒト肝癌細胞株から誘導される。特定の実施形態において、宿主細胞は、初代肝細胞（例えば、胎児、成人、または再生肝由来）である。さらにその他の実施形態において、宿主細胞は、リンパ球（例えば、Ｂ細胞、Ｂ細胞リンパ腫）である。
【００７２】
他に示されない限り、本発明において宿主細胞の形質転換に使用される方法は、Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ、１９７３年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２巻：４５６〜４５７頁のリン酸カルシウム共沈法である。トランスフェクションの代替法としては、これらに限定されないが、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リポフェクション、および遺伝子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）が挙げられる。例えば、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、１９９０年、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。
【００７３】
宿主細胞を本発明の発現ベクターでトランスフェクトして、プロモーターの誘導、形質転換体の選択または遺伝子の増幅に適するように改変された従来の栄養培地で培養してもよい。宿主細胞は、グルタミン添加および抗生物質非含有の５０：５０のＦ１２：ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で培養される。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現用に選択された宿主細胞でこれまでに使用された条件であり、通常の当業者には明らかであると予想される。
【００７４】
薬物感受性および耐性テスト
薬物感受性および耐性テストは、１つまたは複数の宿主細胞で行うことができる。ウイルスの薬物感受性は、指標遺伝子発現の所定の百分率が阻害される抗ウイルス剤の濃度として決定される（例えば、抗ウイルス剤のＩＣ５０は、指標遺伝子発現の５０％が阻害される濃度である）。所定の抗ウイルス薬の薬物感受性の標準曲線は、標準的な実験用ウイルスのセグメントであるか、または薬物にナイーブな患者（すなわち、いかなる抗ウイルス薬も投与されていない患者）由来のウイルスセグメントに関して本発明の方法を使用して開発してもよい。それに対して、ウイルスの薬物耐性は、薬物感受性とこのような所定の標準とを比較することか、または指標遺伝子発現阻害の増加（すなわち指標遺伝子発現の減少）によって決定されるような、同じ患者で時間をわたって逐次的な測定を行うことのいずれかによって、所定の患者についてウイルスの薬物感受性の低減を検出することにより決定することができる。
【００７５】
特定の実施形態において、耐性テストベクターのウイルス粒子は、パッケージング宿主細胞を耐性テストベクターおよびパッケージング発現ベクター（複数可）でトランスフェクトすることによって調製される第一の宿主細胞（耐性テストベクター宿主細胞）によって生産される。耐性テストベクターのウイルス粒子は、指標遺伝子の発現が測定される第二の宿主細胞（標的宿主細胞）を感染させるのに使用することができる。従って耐性テストベクターでトランスフェクトされるパッケージング宿主細胞（したがって耐性テストベクター宿主細胞と称される）を含有するこのような２つの細胞系および標的細胞が、機能的または非機能的な指標遺伝子のどちらかのケースで用いられる。機能的な指標遺伝子は、パッケージング宿主細胞がトランスフェクトされると効率的に発現されるため、薬物感受性を正確に決定するには耐性テストベクター宿主細胞上清を用いた標的宿主細胞の感染が必要である。並べ替えられたプロモーター、並べ替えられたコード領域、または逆転したイントロンを有する非機能的な指標遺伝子は、パッケージング宿主細胞がトランスフェクトされても効率的に発現されないため、標的宿主細胞の感染は、耐性テストベクター宿主細胞と標的宿主細胞とによる共培養、または耐性テストベクター宿主細胞上清を使用した標的宿主細胞の感染どちらかによって達成してもよい。
【００７６】
第二のタイプの薬物感受性および耐性テストでは、単一の宿主細胞（耐性テストベクター宿主細胞）も、標的宿主細胞として役立つ。パッケージング宿主細胞がトランスフェクトされると、耐性テストベクターのウイルス粒子を生産し、そのパッケージング宿主細胞のうち一部がさらに耐性テストベクター粒子による感染の標的になる。単一の宿主細胞型を使用する薬物感受性および耐性テストは、並べ替えられたプロモーター、並べ替えられたコード領域、または逆転したイントロンを有する非機能的な指標遺伝子を含有するウイルスの耐性テストベクターを用いて可能となる。このような指標遺伝子は、第一の細胞がトランスフェクトされても効率的に発現されないが、第二の細胞に感染したときだけ効率的に発現されるため、評価対象の抗ウイルス剤の作用を測定する機会を提供する。機能的な指標遺伝子を含有する耐性テストベクターを使用する薬物感受性および耐性テストのケースでは、共培養手順も単一の細胞型を使用する耐性および感受性テストも、標的細胞の感染に使用することができない。機能的な指標遺伝子を含有する耐性テストベクターは、耐性テストベクター宿主細胞からの濾過された上清を使用する２つの細胞系を使用して、標的宿主細胞を感染させることができる。
【００７７】
特定の実施形態において、粒子ベースの耐性テストは、ゲノムウイルスベクターから誘導された耐性テストベクターを用いて実行することができ、このゲノムウイルスベクターは、パッケージング発現ベクターで共にトランスフェクトされていてもよい。あるいは、粒子ベースの耐性テストは、パッケージング発現ベクターで共にトランスフェクトされたサブゲノムウイルスベクターから誘導された耐性テストベクターを用いて実行することができる。本発明のその他の実施形態において、非粒子ベースの耐性テストは、上述した耐性テストベクターそれぞれを使用して、パッケージング発現ベクターの非存在下で選択された宿主細胞をトランスフェクトすることにより実行することができる。
【００７８】
粒子ベースの感受性および耐性テストのケースでは、耐性テストベクターのウイルス粒子は、パッケージング宿主細胞を上述のような耐性テストベクターおよびパッケージング発現ベクター（複数可）でトランスフェクトすることによって調製することができる第一の宿主細胞（耐性テストベクター宿主細胞）によって生産することができる。耐性テストベクターのウイルス粒子は、次に指標遺伝子の発現が測定される第二の宿主細胞（標的宿主細胞）を感染させるのに使用することができる。第二のタイプの粒子ベースの感受性および耐性テストでは、単一の宿主細胞型（耐性テストベクター宿主細胞）が両方の目的に役立つ：すなわち、所定の培養物中のパッケージング宿主細胞のうち一部がトランスフェクトされて、耐性テストベクターのウイルス粒子を生産することができ、加えて、同じ培養物中の宿主細胞のうち一部が、このようにして生産された耐性テストベクター粒子による感染の標的となることが可能である。単一の宿主細胞型を使用する耐性テストは、並べ替えられたプロモーターを有する非機能的な指標遺伝子を含有する耐性テストベクターを用いることにより可能となる。なぜなら、これは、このような指標遺伝子は許容宿主細胞に感染すると効率的に発現される可能性があるが、同じ宿主細胞型のトランスフェクションでは効率的に発現されず、従って、評価対象の抗ウイルス剤の作用を測定する機会を提供するからである。同様の理由で、２つの細胞型を使用する耐性テストは、第一の細胞型の上清から得られたウイルス粒子で第二の細胞型を感染させる代わりに２つの細胞型を共培養することによって実行することができる。
【００７９】
非粒子ベースの感受性および耐性テストのケースでは、耐性テストは、パッケージング発現ベクターの非存在下で単一の宿主細胞を耐性テストベクターでトランスフェクトすることによって行うことができる。非粒子ベースの耐性テストは、並べ替えられたプロモーター、並べ替えられたコード領域または逆転したイントロンのいずれかを有する非機能的な指標遺伝子を含有する耐性テストベクターを使用して実行することができる。これらの非粒子ベースの耐性テストは、パッケージング発現ベクターの非存在下で単一の宿主細胞型を各耐性テストベクターでトランスフェクトすることにより行う。これらの耐性テストベクター内に含有される非機能的な指標遺伝子は、宿主細胞でトランスフェクトされても効率的に発現されないが、検出可能な指標遺伝子発現が、非ウイルス粒子ベースの逆転写により生じる。逆転写および鎖転移（ｓｔｒａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）により、並べ替えられた非機能的な指標遺伝子の、並べ替えられていない機能的な指標遺伝子への変換が起こる。逆転写は、各耐性テストベクター内に含有されるポリメラーゼ遺伝子の発現に完全に依存するため、抗ウイルス剤を、耐性テストベクターに含有される患者由来セグメントによってコードされたポリメラーゼ遺伝子産物を阻害するその能力についてテストすることができる。
【００８０】
パッケージング宿主細胞を、耐性テストベクターおよび適切なパッケージング発現ベクター（複数可）でトランスフェクトして、耐性テストベクター宿主細胞を生産することができる。特定の実施形態において、個々の抗ウイルス剤は、それらのトランスフェクション時にパッケージング宿主細胞の個々のプレートに適切な範囲の濃度で添加されてもよい。トランスフェクションから２４〜４８時間後に、耐性テストベクター宿主細胞または濾過した耐性テストベクター宿主細胞の上清から得られた耐性テストベクターのウイルス粒子との共培養により、標的宿主細胞を感染させてもよい。各抗ウイルス剤またはそれらの組み合わせを、感染前または感染時に標的宿主細胞に添加して、トランスフェクション中に存在する、同じ最終濃度の１種または複数の所定の薬剤を達成してもよい。その他の実施形態において、抗ウイルス剤（複数可）をパッケージング宿主細胞の培養物から省き、標的宿主細胞にだけ感染前または感染時に添加してもよい。
【００８１】
共培養により、または濾過されたウイルス上清を用いて感染された標的宿主細胞中の指標遺伝子の発現または阻害の決定は、指標遺伝子の発現または活性を測定することで行うことができる。例えば、指標遺伝子がホタルｌｕｃ遺伝子であるケースでは、ルシフェラーゼ活性を測定することができる。抗ウイルス剤の非存在下での対照試行と比較した、１種または複数の所定の抗ウイルス剤の存在下で、所定の耐性テストベクターのウイルス粒子調合物で感染させた標的宿主細胞で観察されたルシフェラーゼ活性の減少は、一般的に、抗ウイルス剤濃度の対数とＳ字曲線様の関連を示す。この阻害曲線を使用して、耐性テストベクター中に存在する患者由来セグメントによってコードされたウイルス標的産物に関するその薬剤または薬剤の組み合わせの見かけの阻害濃度（ＩＣ）を計算することができる。
【００８２】
１種の細胞の感受性および耐性テストのケースでは、宿主細胞を耐性テストベクターおよび適切なパッケージング発現ベクター（複数可）でトランスフェクトして、耐性テストベクター宿主細胞を生産することができる。個々の抗ウイルス剤、またはそれらの組み合わせは、それらのトランスフェクション時に、トランスフェクトされた細胞の個々のプレートに適切な範囲の濃度で添加されてもよい。トランスフェクションから２４〜７２時間後に、細胞を回収して、指標遺伝子、例えばホタルルシフェラーゼの活性に関してアッセイしてもよい。培養中のトランスフェクトされた細胞は指標遺伝子を効率的に発現しないため、培養中のトランスフェクトされた細胞、加えて培養中の重複感染した細胞は、指標遺伝子発現のための標的宿主細胞として役立つ可能性がある。抗ウイルス剤（複数可）の非存在下で行われた対照試行と比較した、１種または複数の所定の抗ウイルス剤の存在下でトランスフェクトされた細胞で観察されたルシフェラーゼ活性の減少は、一般的に、抗ウイルス剤の濃度の対数とＳ字曲線様の関連を示す。この阻害曲線を使用して、耐性テストベクター中に存在する患者由来セグメントによってコードされたウイルス標的産物に関する薬剤または薬剤の組み合わせの見かけの阻害濃度（ＩＣ）、傾き、および／または最大阻害百分率を計算することができる。
【００８３】
抗ウイルス薬／薬物候補
テスト系に添加される抗ウイルス薬は、抗ウイルス薬の標的に応じて選択された時期に添加することができる。特定の実施形態において、ＨＣＶ阻害剤は、ヌクレオシド阻害剤（ＮＩ）である。その他の実施形態において、ＨＣＶ阻害剤は、非ヌクレオシド阻害剤（ＮＮＩ）である。いくつかの実施形態において、ＨＣＶ阻害剤は、ＨＣＶポリメラーゼの部位Ａ、Ｂ、Ｃ、またはＤを標的とするＮＮＩ（ＮＮＩ−Ａ、ＮＮＩ−Ｂ、ＮＮＩ−Ｃ、またはＮＮＩ−Ｄ）である。ＨＣＶ阻害剤は、いくつかの実施態様において、ＮＳ３を標的とするもの（例えば、ＢＩＬＮ−２０６１、ＶＸ−９５０、ＳＣＨ−５０３，０３４、ＳＣＨ−９００，５１８、ＴＭＣ−４３５，３５０、Ｒ−７２２７（ＩＴＭＮ−１９１）、ＭＫ−５１７２、ＭＫ−７００９、ＢＩ−２０１，３３５、ＢＭＳ−６５０，０３２、ＢＭＳ−８２４，３９３、ＰＨＸ−１７６６、ＡＣＨ−１６２５、ＡＣＨ−２６８４、ＶＸ−９８５、ＢＭＳ−７９１，３２５、ＩＤＸ−３２０、ＧＳ−９２５６、ＧＳ−９４５１、ＡＢＴ−４５０、ＶＸ−５００、ＢＩＴ−２２５）、ＮＳ５Ａを標的とするもの（例えば、ＢＭＳ−７９０，０５２、ＧＳＫ−２３３６８０５、ＰＰＩ−４６１、ＡＢＴ−２６７、ＧＳ−５８８５、ＡＣＨ−２９２８、ＡＺＤ−７２９５）、またはＮＳ５Ｂを標的とするもの（例えば、ＮＭ−２８３、ＲＧ−７１２８、Ｒ−１６２６、ＰＳＩ−７８５１、ＩＤＸ−１８４、ＭＫ−０６０８、ＰＳＩ−７９７７、ＰＳＩ−９３８、ＧＳ−６６２０、ＴＭＣ−６４９，１２８、ＩＮＸ−１８９、ＶＸ−７５９、ＶＣＨ−９１６、ＶＸ−２２２、ＡＮＡ−５９８、ＨＣＶ−７９６、ＧＳ−９１９０、ＧＳ−９６６９、ＡＢＴ−３３３、ＰＦ−４８７８６９１、ＩＤＸ−３７５、ＡＢＴ−８３７，０９３、ＧＳＫ−６２５，４４３、ＡＢＴ−０７２）、ならびにそれらの組み合わせであってもよく、これらは、耐性テストベクターのウイルス粒子での感染時に標的宿主細胞の個々のプレートにテスト濃度で添加されてもよい。あるいは、抗ウイルス薬は、アッセイを通して存在していてもよい。テスト濃度は、典型的には約０．１ｎＭ〜約１００μＭ、約１ｎＭ〜約１００μＭ、約１０ｎＭ〜約１００μＭ、約０．１ｎＭ〜約１０μＭ、約１ｎＭ〜約１０μＭ、約１０ｎＭ〜約１００μＭ、約０．１ｎＭ〜約１μＭ、約１ｎＭ〜約１μＭ、または約０．０１ｎＭ〜約０．１μＭの濃度範囲から選択される。
【００８４】
特定の実施形態において、本発明の薬物感受性テストで候補の抗ウイルス性化合物をテストすることができる。候補の抗ウイルス性化合物は、候補の抗ウイルス剤のタンパク質標的に応じて適切な濃度で、選択された時期にテスト系に添加することができる。あるいは、１種より多くの候補の抗ウイルス性化合物をテストしてもよいし、または候補の抗ウイルス性化合物を抗ウイルス薬と組み合わせてテストしてもよい。候補の抗ウイルス性化合物の有効性は、指標遺伝子の活性を測定することによって評価することができる。候補化合物がウイルスのポリペプチド活性を阻害するのに効果的である場合、指標遺伝子の活性は、その候補化合物の非存在下で観察された活性と比べて、その候補化合物の存在下で減少する。この実施形態のその他の態様において、薬物感受性および耐性テストを使用して、ウイルスの変異体に関してスクリーニングすることができる。公知の抗ウイルス薬または候補の抗ウイルス薬のどちらかに耐性の変異体を同定した後、その耐性変異体を単離してＤＮＡを解析することができる。このようにしてウイルスの耐性変異体ライブラリーを構築することができ、それにより候補の抗ウイルス剤を、単独で、またはその他の公知のまたは推定の抗ウイルス剤と組み合わせてスクリーニングすることが可能になる。
【００８５】
ＨＣＶの複製能を決定するための方法
その他の態様において、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の複製能を決定するための方法を提供する。特定の実施形態において、本方法は、患者由来セグメントと指標遺伝子とを含有する宿主細胞を培養する工程、宿主細胞中の指標遺伝子の活性を測定する工程を含み、この場合、参照活性と比較した、測定された指標遺伝子の活性間の指標遺伝子の活性は、ＨＣＶの複製能の指標であるため、ＨＣＶの複製能が決定される。特定の実施形態において、指標遺伝子の活性は、患者由来セグメントによってコードされたポリペプチドの活性に依存する。特定の実施形態において、患者由来セグメントは、ＮＳ５Ｂ、ＮＳ３、および／またはＮＳ５Ａをコードする核酸配列を含む。
【００８６】
特定の実施形態において、指標遺伝子の参照活性は、標準的な実験用ウイルスのセグメントを用いて本発明の方法を行うことによって決定された活性の量である。特定の実施形態において、標準的な実験用ウイルスのセグメントは、ＨＣＶ株Ｃｏｎ１またはＨ７７由来の核酸配列を含む。その他の実施形態において、参照ウイルスセグメントは、阻害剤で処置する前の患者のＨＣＶ由来の核酸配列である。
【００８７】
特定の実施形態において、ＨＣＶは、参照と比べて複製能が増加したと決定される。特定の実施形態において、ＨＣＶは、参照と比べて複製能が減少したと決定される。特定の実施形態において、宿主細胞は、Ｈｕｈ７細胞である。特定の実施形態において、患者由来セグメントは、ＮＳ５Ｂ、ＮＳ３、および／またはＮＳ５Ａをコードする。
【００８８】
特定の実施形態において、表現型解析は、組換えウイルスアッセイ（「ＲＶＡ」）を使用して行うことができる。特定の実施形態において、ＲＶＡは、相同組換えによって、またはウイルスベクターと患者のウイルスから増幅したウイルス遺伝子配列とで作製したウイルスストックを使用する。特定の実施形態において、ＲＶＡウイルスストックは、患者のウイルスから増幅したウイルス遺伝子配列をウイルスベクターにライゲーションすることによって作製される。特定の実施形態において、患者由来セグメントは、ＮＳ５Ｂ、ＮＳ３、および／またはＮＳ５Ａをコードする。
【００８９】
複製能を決定する方法は、例えば、増幅したウイルス遺伝子配列からの核酸と共に使用することができる。以下で考察されるように、このような核酸は、これらに制限されないが、ウイルス遺伝子配列を含むことが当業者に公知のあらゆるサンプルから増幅することができる。例えば、サンプルは、ウイルスに感染したヒトまたは動物からのサンプル、またはウイルス細胞の培養物からのサンプルであってもよい。特定の実施形態において、ウイルスのサンプルは、遺伝学的に改変された実験用の株を含む。特定の実施形態において、遺伝学的に改変された実験用の株は、部位特異的変異を含む。その他の実施形態において、ウイルスのサンプルは、野生型の分離株を含む。特定の実施形態において、野生型の分離株は、処置にナイーブな患者から得られる。特定の実施形態において、野生型の分離株は、処置を経験した患者から得られる。
【００９０】
続いて耐性テストベクター（「ＲＴＶ」）は、遺伝子配列をベクターに取り込む当該分野において公知のあらゆる方法により、増幅したウイルス遺伝子配列を複製欠損型ウイルスベクターに取り込むことにより構築することができる。一実施形態において、制限酵素および従来のクローニング法が使用される。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、第３版、ＮＹ；およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９８９年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ＡｓｓｏｃｉａｔｅｓおよびＷｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹを参照されたい。好ましい実施形態において、ＡｐａＩ、ＰｉｎＡＩ、およびＸｈｏＩ制限酵素が使用される。好ましくは、複製欠損型ウイルスベクターは、指標遺伝子ウイルスベクター（「ＩＧＶＶ」）である。好ましい実施形態において、このようなウイルスベクターは、ＲＴＶ複製を検出する手段を含む。好ましくは、このようなウイルスベクターは、ルシフェラーゼ遺伝子を含む。
【００９１】
上記アッセイは、まず、宿主細胞を、ＲＴＶのＤＮＡおよびその他のウイルス、例えば両栄養性マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）のエンベロープタンパク質を発現するプラスミドと共にトランスフェクトすることによって行うことができる。トランスフェクション後、ウイルス粒子を細胞培養物から回収して、様々な量の抗ウイルス薬（複数可）の存在下で新しい標的細胞を感染させるのに使用することができる。新しい標的細胞での単回のウイルス複製の完了は、ベクターに含有される複製を検出するための手段によって検出することができる。好ましい実施形態において、複製を検出するための手段は、指標遺伝子である。好ましい実施形態において、指標遺伝子は、ホタルルシフェラーゼである。このような好ましい実施形態において、単回のウイルス複製が完了すると、ルシフェラーゼの生産が起こる。
【００９２】
特定の実施形態において、評価されるＨＣＶ株は、ＨＣＶの野生型の分離株である。その他の実施形態において、評価されるＨＣＶ株は、ＨＣＶの変異体株である。特定の実施形態において、このような変異体は、患者から単離されてもよい。その他の実施形態において、変異体は、部位特異的変異誘発または他の等価な当業者に公知のその他の技術によって構築されてもよい。さらにその他の実施形態において、変異体は、細胞培養物から単離されてもよい。培養は、細胞培養の間中、抗ウイルス性化合物の存在下で複数回継代して、このような化合物の存在下での培養で蓄積する変異について選択することを含んでいてもよい。
【００９３】
一実施形態において、ウイルス核酸、例えばＨＣＶのＲＮＡは、血漿サンプルから抽出され、ウイルスのコード領域の断片またはウイルスのコード領域の全体が、これに限定されないがＰＣＲなどの方法によって増幅されてもよい。例えば、Ｈｅｒｔｏｇｓら、１９９８年、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ４２巻（２号）：２６９〜７６頁を参照されたい。一例において、患者由来セグメントを逆転写ＰＣＲで増幅して、宿主細胞にその配列の大部分が欠失したプラスミドと共にトランスフェクトしてもよい。次に相同組換えにより、キメラウイルスの生成が起こる。キメラウイルスの複製能を当該分野において公知のあらゆる細胞生存度アッセイで決定し、参照の複製能と比較することにより、ウイルスが変更された複製能を有するか、または抗ウイルス薬に対して耐性もしくは感受性過度であるかを評価することができる。特定の実施形態において、参照は、統計学的に有意な数の個別のウイルス分離株の複製能であってもよい。その他の実施形態において、参照は、Ｃｏｎ１またはＨ７７などの参照ウイルスの複製能であってもよい。例えば、ＭＴ４細胞−３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミドベースの細胞生存度アッセイは、サンプルの高スループットを可能とする自動式システムで使用することができる。
【００９４】
当業者に公知の抗ウイルス薬に対するウイルス表現型の感受性を評価するための他のアッセイを、複製能を決定するか、または抗ウイルス薬の感受性または耐性を決定するように適合させることもできる。
【００９５】
当業者であれば、上述のＨＣＶの複製能を決定するための方法を、ＨＣＶ阻害剤感受性を決定するための方法を行うように容易に適合させ得ることを理解しているであろう。同様に当業者であれば、上述の阻害剤感受性を決定するための方法を、ＨＣＶの複製能を決定するための方法を行うように容易に適合させ得ることを理解しているであろう。複製能を決定するための方法の適合は、一般的に、様々な濃度の抗ウイルス薬の存在下で本発明の方法を行うことを含んでいてもよい。そのようにすることによって、薬物に対するＨＣＶの感受性を決定することができる。同様に、いかなる抗ウイルス薬も存在しない下で阻害剤感受性を決定するための方法を行うことにより、その方法で使用されたＨＣＶの複製能の尺度を得ることができる。
【００９６】
ウイルス中の変異の存在または非存在の検出
ウイルス中の変異の存在または非存在は、当該分野において公知の変異を検出するあらゆる手段によって決定することができる。変異は、特定のタンパク質をコードするウイルスのコード領域中、またはそのタンパク質それ自体の中、すなわちそのタンパク質のアミノ酸配列中で検出することができる。
【００９７】
一実施形態において、変異は、ウイルスゲノム中に存在する。このような変異は、例えば、ウイルスタンパク質をコードする遺伝子中に存在していてもよいし、ウイルスタンパク質をコードする遺伝子のシスまたはトランス作用性調節配列、遺伝子間配列、またはイントロン配列などの遺伝学的エレメント中に存在していてもよい。変異は、その抗ウイルス処置に対する感受性および／またはその複製能を変化させる、ウイルスの構造、機能、複製または環境のあらゆる面に影響を与える可能性がある。一実施形態において、変異は、目下利用可能な抗ウイルス処置の標的であるウイルスタンパク質をコードする遺伝子中に存在する。その他の実施形態において、変異は、目下利用可能な抗ウイルス処置の標的ではない遺伝子またはその他の遺伝学的エレメント中に存在する。
【００９８】
ウイルス遺伝子内の変異は、制限なく当業者に公知のあらゆる適切な技術によって検出することができる。ウイルスのＤＮＡまたはＲＮＡは、このようなアッセイ技術のための開始点として使用することができ、当業者周知の標準的手法に従って単離することもできる。
【００９９】
特異的な核酸配列中、例えばウイルスのコード領域の特定の領域中の変異の検出は、様々な方法によって達成することができ、このような方法としては、これらに限定されないが、対立遺伝子特異的な制限エンドヌクレアーゼ切断に基づく制限断片長多型検出（ＫａｎおよびＤｏｚｙ、１９７８年、Ｌａｎｃｅｔ  ｉｉ巻：９１０〜９１２頁）、ミスマッチ修復検出（ＦａｈａｍおよびＣｏｘ、１９９５年、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ５巻：４７４〜４８２頁）、ＭｕｔＳタンパク質の結合（Ｗａｇｎｅｒら、１９９５年、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２３巻：３９４４〜３９４８頁）、変性濃度勾配ゲル電気泳動（Ｆｉｓｈｅｒら、１９８３年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８０巻：１５７９〜８３頁）、一本鎖コンフォメーション多型検出（Ｏｒｉｔａら、１９８３年、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５巻：８７４〜８７９頁）、ミスマッチした塩基対におけるＲＮアーゼ切断（Ｍｙｅｒｓら、１９８５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０巻：１２４２頁）、ヘテロ二本鎖ＤＮＡの化学的な（Ｃｏｔｔｏｎら、１９８８年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８５巻：４３９７〜４４０１頁）または酵素的な（Ｙｏｕｉｌら、１９９５年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９２巻：８７〜９１頁）切断、オリゴヌクレオチド特異的なプライマー伸長に基づく方法（Ｓｙｖａｎｅｎら、１９９０年、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ８巻：６８４〜６９２頁）、遺伝学的ビット解析（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｂｉｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）（Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖら、１９９４年、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２２巻：４１６７〜４１７５頁）、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１巻：１０７７頁）、オリゴヌクレオチド特異的なライゲーション連鎖反応（「ＬＣＲ」）（Ｂａｒｒａｎｙ、１９９１年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８８巻：１８９〜１９３頁）、ギャップ−ＬＣＲ（Ａｂｒａｖａｙａら、１９９５年、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２３巻：６７５〜６８２頁）、当該分野周知の標準的手法を使用した放射性または蛍光性のＤＮＡ配列決定法、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）アッセイ（Ｏｒｕｍら、１９９３年、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２１巻：５３３２〜５３５６頁；Ｔｈｉｅｄｅら、１９９６年、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２４巻：９８３〜９８４頁）が挙げられる。
【０１００】
加えて、ウイルスのＤＮＡまたはＲＮＡをハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイで使用することにより、点変異、挿入、欠失、およびゲノム再配列などの遺伝子構造に関する異常を検出することができる。このようなアッセイとしては、これらに限定されないが、サザン解析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、１９７５年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ９８巻：５０３〜５１７頁）、一本鎖コンフォメーション多型解析（ＳＳＣＰ）（Ｏｒｉｔａら、１９８９年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６巻：２７６６〜２７７０頁）、およびＰＣＲ解析（米国特許第４，６８３，２０２号；４，６８３，１９５号；４，８００，１５９号；および４，９６５，１８８号；  ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、１９９５年、Ｉｎｎｉｓら（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）が挙げられる。
【０１０１】
このような遺伝子特異的な変異を検出するための診断方法は、例えば、ウイルス核酸を、組換えＤＮＡ分子、クローニングしたコード領域、またはそれらの縮重改変体を含む１つまたは複数の標識された核酸試薬と、これらの試薬がそれらの相補的配列に特異的にアニールするのに好都合な条件下で接触させてインキュベートすることを含んでいてもよい。好ましくは、これらの核酸試薬の長さは、少なくとも１５〜３０ヌクレオチドである。インキュベート後、核酸分子ハイブリッドからアニールしなかった全ての核酸を除去する。続いて、このような分子のいずれかが存在する場合、ハイブリダイズした核酸の存在が検出される。このような検出スキームを使用する場合、ウイルスからの核酸は、例えば、メンブレンなどの固体支持体、またはマイクロタイタープレートもしくはポリスチレンビーズ上の表面などのプラスチック表面に固定してもよい。このケースでは、インキュベート後、上述したタイプのアニールしない標識核酸試薬は容易に除去される。その残りのアニールした標識核酸試薬の検出は、当業者周知の標準的な技術を使用して達成される。核酸試薬がアニールしたコード領域配列と、正常な遺伝子配列から予測されるアニールパターンとを比較して、遺伝子の変異が存在するかどうかを決定することができる。
【０１０２】
これらの技術は、ウイルスゲノム中の変異を検出するためのハイスループット法になるように容易に適合することができる。例えば、アフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、Ｃａｌｉｆ．）からの遺伝子アレイを使用して、多数の個別のウイルスの遺伝子型を迅速に同定することができる。アフィメトリックス遺伝子アレイ、ならびにこのようなアレイの作製および使用方法は、例えば、米国特許第６，５５１，７８４号、６，５４８，２５７号、６，５０５，１２５号、６，４８９，１１４号、６，４５１，５３６号、６，４１０，２２９号、６，３９１，５５０号、６，３７９，８９５号、６，３５５，４３２号、６，３４２，３５５号、６，３３３，１５５号、６，３０８，１７０号、６，２９１，１８３号、６，２８７，８５０号、６，２６１，７７６号、６，２２５，６２５号、６，１９７，５０６号、６，１６８，９４８号、６，１５６，５０１号、６，１４１，０９６号、６，０４０，１３８号、６，０２２，９６３号、５，９１９，５２３号、５，８３７，８３２号、５，７４４，３０５号、５，８３４，７５８号、および５，６３１，７３４号で説明されており、これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１０３】
加えて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＡｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００２年、４巻、ユニット２５Ｂ、２２章は、多数のウイルスの分離株の遺伝子型を決定するための遺伝子アレイの構築および使用についてさらなる指針を示している。最終的に、それぞれその全体が参照により組み込まれる米国特許第６，６７０，１２４号；６，６１７，１１２号；６，３０９，８２３号；６，２８４，４６５号；および５，７２３，３２０号は、当業者により多数のウイルス遺伝子型を迅速に同定するために容易に適合させることができる関連するアレイ技術を説明している。
【０１０４】
遺伝子特異的な核酸分子を検出する代替の診断方法は、例えばＰＣＲによるそれらの増幅（米国特許第４，６８３，２０２号；４，６８３，１９５号；４，８００，１５９号；および４，９６５，１８８号；ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、１９９５年、Ｉｎｎｉｓら（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）、続いて当業者に周知の技術を使用した増幅分子の検出を含んでいてもよい。得られた増幅配列を、増幅されている核酸が各遺伝子の正常なコピーのみを含有する場合に予測される配列と比較して、遺伝子の変異が存在するかどうかを決定することができる。
【０１０５】
加えて、核酸は、当該分野において公知のあらゆる配列決定法によって配列決定することができる。例えば、ウイルスＤＮＡは、Ｓａｎｇｅｒら、１９７７年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７４巻：５４６３頁のジデオキシ法（この方法は、Ｍｅｓｓｉｎｇら、１９８１年、Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ９巻：３０９頁でさらに説明されている）によって、またはＭａｘａｍら、１９８０年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ６５巻：４９９頁の方法によって配列決定することができる。また、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、第３版、ＮＹ；およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９８９年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ＡｓｓｏｃｉａｔｅｓおよびＷｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹで説明されている技術も参照されたい。
【０１０６】
ウイルス遺伝子産物、すなわちウイルスタンパク質またはウイルスのペプチド断片に対して向けられた抗体を使用して、ウイルスタンパク質中の変異を検出することもできる。あるいは、目的のタンパク質のアミノ酸配列を得るために、当該分野において公知のあらゆる配列決定法によって目的のウイルスタンパク質またはペプチド断片を配列決定することができる。このような方法の例は、小型のタンパク質またはポリペプチドを配列決定するのに使用することができるエドマン分解法である。より大型のタンパク質は、最初に当該分野において公知の化学試薬または酵素試薬、例えば臭化シアン、ヒドロキシルアミン、トリプシンまたはキモトリプシンによって切断してから、エドマン分解法で配列決定してもよい。
【０１０７】
感受性または複製能の決定するためのコンピュータにより実装される方法
その他の態様において、本発明は、コンピュータにより実装される、ＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶの感受性の決定方法またはＨＣＶの複製能の決定方法を提供する。このような実施形態において、本発明の方法は、現代のコンピュータの処理能力を利用できるように適合される。当業者であれば、このような方式において本方法を容易に適合することができる。
【０１０８】
特定の実施形態において、本発明は、コンピュータにより実装されるＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶの感受性の決定方法を提供する。特定の実施形態において、本方法は、コンピュータメモリに、本発明の方法に従って決定された指標遺伝子の活性および指標遺伝子の参照活性に関する情報と、本発明の方法に従って決定された指標遺伝子の活性を指標遺伝子の参照活性と比較するためのインストラクションとを入力する工程；およびコンピュータメモリで、本発明の方法に従って決定された指標遺伝子の活性を指標遺伝子の参照活性と比較する工程を含み、ここで、測定された指標遺伝子の活性が参照活性に比べて異なっていることが、そのＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶの感受性と相関するため、ＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶの感受性が決定される。
【０１０９】
特定の実施形態において、本方法は、コンピュータのディスプレイにＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶの感受性を表示する工程をさらに含む。特定の実施形態において、本方法は、紙に、ＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶの感受性を印刷する工程をさらに含む。
【０１１０】
その他の態様において、本発明は、本発明の方法に従って決定されたＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶの感受性を表示する印刷物を提供する。さらにその他の態様において、本発明は、本発明の方法に従って決定されたＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶの感受性を表示するデータを含有する、コンピュータで読取り可能な媒体を提供する。
【０１１１】
その他の態様において、本発明は、コンピュータにより実装されるＨＣＶの複製能の決定方法を提供する。特定の実施形態において、本方法は、コンピュータメモリに、本発明の方法に従って決定された指標遺伝子の活性および指標遺伝子の参照活性に関する情報と、本発明の方法に従って決定された指標遺伝子の活性を指標遺伝子の参照活性と比較するためのインストラクションとを入力する工程；およびコンピュータメモリで、本発明の方法に従って決定された指標遺伝子の活性を指標遺伝子の参照活性と比較する工程を含み、ここで、測定された指標遺伝子の活性と参照活性との比較は、ＨＣＶの複製能の指標であるため、ＨＣＶの複製能が決定される。
【０１１２】
特定の実施形態において、本方法は、コンピュータのディスプレイにＨＣＶの複製能を表示する工程をさらに含む。特定の実施形態において、本方法は、紙に、ＨＣＶの複製能を印刷する工程をさらに含む。
【０１１３】
その他の態様において、本発明は、ＨＣＶの複製能を表示する印刷物を提供し、この場合、複製能は、本発明の方法に従って決定される。さらにその他の態様において、本発明は、ＨＣＶの複製能を表示するデータを含有するコンピュータで読取り可能な媒体を提供し、この場合、複製能は、本発明の方法に従って決定される。
【０１１４】
さらにその他の態様において、本発明は、本発明の方法を行うためのコンピュータで読取り可能なインストラクションを含む製品を提供する。
【０１１５】
さらにその他の態様において、本発明は、本発明の方法を行うことができるように構成されたコンピュータシステムを提供する。
【０１１６】
ウイルスおよびウイルスサンプル
本発明の方法で使用するための患者由来セグメントまたはウイルス配列の供給源として、制限なく当業者に公知のあらゆるウイルスを使用することができる。特定の実施形態において、ウイルスは、ＨＣＶであり、遺伝子型１、遺伝子型２、遺伝子型３、遺伝子型４、遺伝子型５、または遺伝子型６であってもよい。本発明の一実施形態において、ウイルスは、ＨＣＶ遺伝子型１である。特定の実施形態において、ウイルスは、ＨＣＶ遺伝子型１ａまたは１ｂである。
【０１１７】
患者由来セグメントまたはウイルス遺伝子配列が得られるウイルスは、ウイルスサンプルを得るための当該分野において公知のあらゆる手段により得られたウイルスサンプル中に見出されるものでもよい。このような方法は、これらに限定されないが、ウイルスに感染した個体からウイルスサンプルを得る工程、またはウイルス培養物からウイルスサンプルを得る工程を含む。一実施形態において、ウイルスサンプルは、ウイルスに感染したヒト個体から得られる。ウイルスサンプルは、感染個体の体のあらゆる部分、またはウイルスを含むと予測されるあらゆる分泌物から得てもよい。このような部分および分泌物の例としては、これらに限定されないが、血液、血清、血漿、痰、リンパ液、精液、膣粘液、肝臓生検材料、およびその他の体液サンプルが挙げられる。好ましい実施形態において、サンプルは、血液、血清、または血漿サンプルである。
【０１１８】
その他の実施形態において、患者由来セグメントまたはウイルスのコード領域の配列は、培養物から得ることができるウイルスから得ることができる。いくつかの実施形態において、培養物は、実験室から得ることができる。その他の実施形態において、培養物は、例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）などの収集物から得ることができる。
【０１１９】
その他の実施形態において、患者由来セグメントまたはウイルスのコード領域の配列は、遺伝学的に改変されたウイルスから得ることができる。このようなウイルスは、ウイルスを遺伝学的に改変するための当該分野において公知のあらゆる方法を使用して遺伝学的に改変することができる。例えば、ウイルスは、実験室での培養において望ましい世代数にわたり増殖させてもよい。一実施形態において、選択圧力は適用されず（すなわち、ウイルスは、所定の特徴を有するウイルスの複製に有利な処理を受けない）、ランダムな遺伝的浮動により新しい変異が蓄積する。その他の実施形態において、培養物中でウイルスが増殖するときに、ウイルスに選択圧力が適用される（すなわち、ウイルスは、１つまたは複数の特徴を有するウイルスの複製に有利な条件下で増殖する）。一実施形態において、選択圧力は、抗ウイルス処理である。選択圧力として、あらゆる公知の抗ウイルス処理を使用することができる。
【０１２０】
その他の態様において、患者由来セグメントまたはウイルスのコード領域の配列は、ウイルス、ウイルスゲノム、またはウイルスゲノムの一部に変異を誘発することにより作製することができる。この目的のために、当該分野において公知のあらゆる変異誘発方法を使用することができる。特定の実施形態において、変異誘発は、本質的にランダムである。特定の実施形態において、本質的にランダムな変異誘発は、ウイルス、ウイルスゲノムまたはウイルスゲノムの一部を変異誘発処理に晒すことによって行われる。その他の実施形態において、抗ウイルス療法の標的であるウイルスタンパク質をコードするコード領域または遺伝子に変異を誘発する。本質的にランダムな変異誘発処理の例としては、例えば、変異誘発物質（例えば、エチジウムブロマイド、エチルメタンスルホネート、エチルニトロソ尿素（ＥＮＵ）など）への曝露、放射線（例えば紫外光）、転移因子（例えば、Ｔｎ５、Ｔｎ１０）の挿入および／または除去、または高い変異誘発率を有する細胞、細胞抽出物、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏの複製系での複製が挙げられる。例えば、Ｒｕｓｓｅｌｌら、１９７９年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７６巻：５９１８〜５９２２頁；Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｗ．、１９８２年、Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｕｔａｇｅｎｓ  ａｎｄ  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｓ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｈｉｒｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｕｔａｇｅｎｓを参照されたい。当業者であれば、これらの変異誘発法はそれぞれ、分子レベルで本質的にランダムであるが、それぞれ独自の好ましい標的を有することを理解しているであろう。
【０１２１】
その他の態様において、患者由来セグメントまたはウイルスのコード領域の配列は、部位特異的変異誘発を使用して作製することができる。当該分野において公知のあらゆる部位特異的変異誘発法を使用することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、第３版、ＮＹ；およびＡｕｓｕｂｅｌら、２００５年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ＡｓｓｏｃｉａｔｅｓおよびＷｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹ、ならびにＳａｒｋａｒおよびＳｏｍｍｅｒ、１９９０年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、８巻：４０４〜４０７頁を参照）。部位特異的変異誘発は、例えば、特定のコード領域、遺伝子、もしくはゲノム領域、コード領域、遺伝子、もしくはゲノム領域の特定の一部、またはコード領域、遺伝子、もしくはゲノム領域内の１つまたは数個の特定のヌクレオチドを対象にすることができる。一実施形態において、部位特異的変異誘発は、１つまたは複数の基準に基づくウイルスのゲノム領域、コード領域、遺伝子、遺伝子断片、またはヌクレオチドを対象とする。一実施形態において、コード領域もしくは遺伝子、またはコード領域もしくは遺伝子の部分が、抗ウイルス療法の標的であることが公知であるかまたは標的であると疑われるタンパク質をコードする（例えばＨＣＶのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその部分をコードするＮＳ５Ｂコード領域）ので、それらは部位特異的変異誘発に供される。その他の実施形態において、部位特異的変異誘発のために、コード領域もしくは遺伝子の部分、またはコード領域もしくは遺伝子内の１つまたは数個のヌクレオチドが選択される。一実施形態において、変異誘発されるヌクレオチドは、抗ウイルス性化合物と相互作用することが公知であるかまたは相互作用すると疑われるアミノ酸残基をコードする。その他の実施形態において、変異誘発されるヌクレオチドは、１つまたは複数の抗ウイルス剤に対して耐性であるか、または感受性であるか、または感受性過度であるウイルス株で変異されていることが公知であるかまたは変異されていると疑われるアミノ酸残基をコードする。その他の実施形態において、変異誘発されるヌクレオチドは、抗ウイルス性化合物と相互作用することが公知であるかまたは相互作用すると疑われる、または１つまたは複数の抗ウイルス剤に対して耐性であるか、または感受性であるか、または感受性過度であるウイルス株で変異されていることが公知であるかまたは変異されていると疑われるタンパク質残基の一次配列に隣接するかまたはその近傍にあるアミノ酸残基をコードする。その他の実施形態において、変異誘発されるヌクレオチドは、抗ウイルス性化合物と相互作用することが公知であるかまたは相互作用すると疑われる、または複製能が変更されたウイルス株で変異されていることが公知であるかまたは変異されていると疑われるタンパク質残基の二次、三次、または四次構造に隣接するかまたはその近傍にあるアミノ酸残基をコードする。その他の実施形態��おいて、変異誘発されるヌクレオチドは、抗ウイルス性化合物に結合することが公知であるか結合すると疑われるタンパク質の活性部位中またはその近傍のアミノ酸残基をコードする。
【実施例】
【０１２２】
（実施例１）
表現型解析のためのサンプルの調製
サンプルの調製および増幅
ほとんどのサンプルを冷凍血漿として受け取り、それらにはＨＣＶサブタイプ（すなわち、１ａまたは１ｂ）およびウイルス量などの情報が添付されていた。サンプルを解凍させ、必要に応じて冷凍したアリコートとして保存し、２００μＬのアリコートを処理した。カオトロピック剤を含有する溶解緩衝液の添加によりウイルス粒子を壊した。オリゴヌクレオチドが連結した磁気ビーズを使用して、ゲノムウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）をウイルス溶解産物から抽出した。精製したｖＲＮＡを、逆転写酵素（ＲＴ）反応での第一の鎖のｃＤＮＡ合成用のテンプレートとして使用した。得られたｃＤＮＡを、全ＮＳ５Ｂ領域の増幅が起こる１回目のネステッドポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用のテンプレートとして使用した。サブタイプ１ａおよび１ｂ間の配列の変動のために、特異的な１ａおよび１ｂのＲＴおよび１回目および２回目のためのＰＣＲプライマーを使用した。サブタイプ情報が得られない場合、両方のプライマーセットを、逐次的に、または並行して使用してもよい。
【０１２３】
耐性テストベクターへの患者由来セグメントのクローニング
２回目の（ネステッド）ＰＣＲ増幅用プライマーセットは、表現型の薬物感受性解析のためのＮＳ５Ｂ増幅産物のＨＣＶレプリコン耐性テストベクター（ＲＴＶ）へのクローニングを可能にする制限エンドヌクレアーゼ認識／切断部位を含んだ。アガロースゲル電気泳動、続いてカラムクロマトグラフィーによりＰＣＲ産物を精製し、残ったプライマー、プライマー二量体、および非特異的な反応生成物を除去し、次に制限エンドヌクレアーゼ消化に供した。カラムクロマトグラフィーを用いて消化反応物を精製し、次に、増幅産物をルシフェラーゼレポーターレプリコンＲＴＶにライゲートした。ライゲーション反応を使用して、コンピテントＥ．ｃｏｌｉを形質転換した。シリカカラムクロマトグラフィーを使用して細菌培養物からプラスミドＤＮＡを精製し、分光測光法で定量した。
【０１２４】
ＲＴＶのＲＮＡの調製
ＲＴＶをｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写する前に、プラスミドＤＮＡのテンプレートを制限エンドヌクレアーゼ消化で線形にし、カラムで精製した。ＲＴＶは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写後にレプリコンＲＮＡを適切に停止させるための肝炎デルタウイルスのリボザイム配列を含む。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡをカラムで精製し、定量し、電気泳動分離を使用して完全性を評価した。
【０１２５】
（実施例２）
ＨＣＶ阻害剤感受性を決定するための表現型アッセイ
ＲＴＶのＲＮＡをＨｕｈ７細胞株にエレクトロポレーションし、エレクトロポレーションした細胞を連続希釈した阻害剤の非存在および存在下でインキュベートした。エレクトロポレーションの４時間後にエレクトロポレーションした細胞で生産されたルシフェラーゼ活性の量を測定することによってＲＮＡのインプットをモニターした。ルシフェラーゼ活性は、相対光単位（ＲＬＵ）として示される。阻害剤の非存在下でのエレクトロポレーションの７２〜９６時間後のルシフェラーゼ活性を、ＲＮＡのインプットおよび対照参照レプリコンＲＴＶ（Ｃｏｎ１）と比較して評価することによって複製能（ＲＣ）を決定した。複製欠損型Ｃｏｎ１レプリコン（欠損型Ｃｏｎ１ポリメラーゼ）を利用して、アッセイバックグラウンドを決定した（データ示さず）。エレクトロポレーションの７２〜９６時間後における、阻害剤の非存在および存在下におけるＲＴＶの複製能力を評価することによって、阻害剤感受性を決定した。阻害剤の各連続希釈濃度における％阻害を以下のようにして得た：
［１−（阻害剤の存在下におけるルシフェラーゼ活性÷阻害剤の非存在下におけるルシフェラーゼ活性）］×１００。
【０１２６】
これらの値から阻害剤感受性プロファイル（曲線）を得て、阻害データ（例えば、ＩＣ５０、ウイルス複製を５０％減少させるのに必要な阻害剤濃度；およびＩＣ９５、ウイルス複製を９５％減少させるのに必要な阻害剤濃度）をフィットさせた曲線から外挿した。阻害データは、同じアッセイバッチで処理された参照ＲＴＶの阻害データ（例えば、参照からのＩＣ５０倍率変化（ＦＣ））と比べて倍率変化として報告される（例えば、ＩＣ５０（サンプル）／ＩＣ５０（参照））。図１に、ＰｈｅｎｏＳｅｎｓｅ（登録商標）ＨＣＶ  ＮＳ５Ｂアッセイのワークフローの例を示し、図２に、代表的な阻害剤感受性曲線を示す。
【０１２７】
よく特徴付けられたサブタイプ１ａ（Ｈ７７）および１ｂ（Ｃｏｎ１）参照配列、ならびにＨＣＶのＲｄＲｐの阻害剤に対して減少した感受性を付与する変異が含まれるように部位特異的変異誘発（ＳＤＭ）によって操作されたサブタイプ１ａおよび１ｂ参照配列のＮＳ５Ｂ領域を含有するＲＴＶのＨＣＶポリメラーゼ阻害剤感受性を評価することによって、アッセイ精度を評価した（図３）。科学文献で報告された表現型データに従って、阻害剤感受性データ（ＩＣ５０−ＦＣおよびＩＣ９５−ＦＣ）を解析した。目標とする承認基準によれば、ＳＤＭのＲＴＶは、参照ＲＴＶと比べて、テストした阻害剤に対して、ＩＣ５０−ＦＣについては多くとも２．５分の１になった感受性を示し、ＩＣ９５−ＦＣについては３分の１になった感受性を示すべきであると規定されていた。評価した全てのＳＤＭで、各ポリメラーゼ阻害剤に対する感受性における適切な減少が観察されたことから、このアッセイはアッセイ精度についてのバリデーションに合格した。ＮＳ５Ｂ変異を含有するレプリコンは、部位Ａ（ＮＮＩ−Ａ；Ｌ３９２ＩおよびＰ４９５Ａ／Ｌ変異体）、部位Ｂ（ＮＮＩ−Ｂ；Ｍ４２３Ｔ）、部位Ｃ（ＮＮＩ−Ｃ；Ｃ３１６ＹおよびＹ４４８Ｈ）および部位Ｄ（ＮＮＩ−Ｄ；Ｃ３１６Ｙ）を標的とするヌクレオシド（ＮＩ；Ｓ２８２Ｔ変異体）および非ヌクレオシドポリメラーゼ阻害剤に対する感受性の予測された減少を示したことから、アッセイ精度が実証された（図３）。
【０１２８】
阻害剤感受性測定におけるアッセイ内変動（ｉｎｔｒａ−ａｓｓａｙ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）の解析によれば、５３２個のペアワイズ比較より、再現性のＩＣ５０ＦＣ値およびＩＣ９５ＦＣ値の９５％は、それぞれ１．３２および１．４倍以内であった。再現性のＲＣ値の９５％は、１０８個のペアワイズ比較に基づき、０．２２ｌｏｇ１０だけ異なっていた（図４）。阻害剤感受性測定におけるアッセイ内変動の解析によれば、それぞれ２８５個および２６０個のペアワイズ比較より、再現性のＩＣ５０ＦＣ値およびＩＣ９５ＦＣ値の９５％は、１．７５および１．７倍以内であった。再現性のＲＣ値の９５％は、５５個のペアワイズ比較に基づき、０．２７ｌｏｇ１０だけ異なっていた（図４）。３ｌｏｇ１０の範囲にわたるウイルス量におけるアッセイの直線性の評価によれば、それぞれ２４３個のペアワイズ比較より、ＩＣ５０ＦＣ値およびＩＣ９５ＦＣ値の９５％は、１．６２以下および１．７５倍の変動を示したことが実証された。ＲＣ値の９５％は、連続希釈した血漿サンプルの５６個のペアワイズ比較に基づき、０．３ｌｏｇ１０だけ異なっていた（図４）。
【０１２９】
（実施例３）
ＩＣ９５ＦＣの測定により阻害剤感受性検出に対する感度が増加した
薬物耐性改変体の部分集団を検出するＰｈｅｎｏＳｅｎｓｅ（登録商標）ＨＣＶ  ＮＳ５Ｂアッセイの感度を評価するために、Ｃｏｎ１またはＨ７７参照ウイルス（野生型、ＷＴ）、および１つまたは複数のＮＳ５Ｂ阻害剤に対して減少した感受性を付与する特異的なＳＤＭを含有するＣｏｎ１またはＨ７７（変異体、ＭＴ）のＮＳ５Ｂ領域を含有するＲＴＶからのＲＮＡを利用した。ＷＴおよびＭＴのＲＴＶを、別々に（１００％ＷＴまたは１００％ＭＴ）評価するか、または所定のＭＴ：ＷＴ混合物（２０：８０、４０：６０、６０：４０、および８０：２０％）として評価した。特定のＮＳ５Ｂ阻害剤（複数可）、加えて対照としてＩＮＦに対する感受性についてサンプルを評価した（ＳＤＭは、ＩＮＦ感受性に影響を与えると予測されなかった）。テストした全てのサンプルについての阻害剤感受性データを得た。ＩＣ５０−ＦＣ値およびＩＣ９５−ＦＣ値で観察された差を評価して、混合物中の各ＭＴのＲＴＶのパーセントと、ＩＣ−ＦＣ感受性パラメーターとの関係を明らかにした。予想した通りに、ＩＮＦ感受性は、混合物中のＭＴのＲＴＶの割合の影響を受けなかった（図６）。それに対して、混合物中のＭＴのＲＴＶの百分率が、感受性減少の検出に必要な変異と評価される薬物とに応じて２０％のＭＴのＲＴＶから８０％以上に増加するにつれ、ＮＳ５Ｂ阻害剤感受性（ＩＣ５０−ＦＣおよびＩＣ９５−ＦＣ）は減少した（図６、データ示さず）。最大８０％のＳ２８２Ｔ  ＳＤＭでも、ＩＣ５０−ＦＣ値の減少を観察できないことは、公開された観察（Ｐｏｇａｍら、ＪＩＤ  ２０１０年：２０２巻、１５１０頁）と一致している（図６Ａ）。ＩＣ９５−ＦＣ値は、ＩＣ５０−ＦＣ値と比べて、Ｓ２８２Ｔを含むＭＴのＲＴＶ改変体の検出感度を改善した（図６および７）。薬物耐性改変体の部分集団の検出は、ＳＤＭによって付与された特定の阻害剤に対する感受性減少の規模およびＲＣへのＳＤＭの作用などの要因に可変的に依存していた。
【０１３０】
（実施例４）
傾きの測定は、阻害剤感受性検出に対する感度の増加をもたらす
上述したように、Ｃｏｎ１またはＨ７７参照ウイルス（野生型、ＷＴ）、および１つまたは複数のＮＳ５Ｂ阻害剤に対して減少した感受性を付与する特定のＳＤＭを含有するＣｏｎ１またはＨ７７（変異体、ＭＴ）のＮＳ５Ｂ領域を含有するＲＴＶからのＲＮＡを使用して、薬物耐性変異体の部分集団を検出するＰｈｅｎｏＳｅｎｓｅ（登録商標）ＨＣＶ  ＮＳ５Ｂアッセイの感度を試験した。ＷＴおよびＭＴのＲＴＶを、別々に（１００％ＷＴまたは１００％ＭＴ）評価するか、または所定のＭＴ：ＷＴ混合物（２０：８０、４０：６０、６０：４０、および８０：２０％）として評価した。特定のＮＳ５Ｂ阻害剤（複数可）（図８は、阻害剤としてＮＮＩ−Ａを示す）、加えて対照としてＩＮＦに対する感受性についてサンプルを評価した（ＳＤＭは、ＩＮＦ感受性に影響を与えると予測されなかった）。テストした全てのサンプルについての阻害剤感受性データを得た。図８に、ＷＴのＣｏｎ１ウイルスまたはＰ４９５ＡまたはＬ３９２Ｉ変異ＳＤＭを有するＣｏｎ１の集団（それぞれ図８Ａ〜Ｌおよび図８Ｍ〜８Ｘ）に関するＮＮＩ−ＡおよびＩＦＮに関するデータを示す。一連のグラフから、変異体ウイルスの部分集団の百分率が増加するにつれ、混成型の集団において、変異体ウイルスの部分集団の８０％まで、感受性曲線の傾きが平坦になることが示される。
【０１３１】
（実施例５）
ＮＳ５Ａ阻害剤感受性の検出に対する感度の増加
前の実施例で説明したような方法は、その他のＨＣＶコード領域に対して有用であった。図９は、耐性関連変異（ＲＡＭ）を有する、および有さない遺伝子型１ａ分離株と１ｂ分離株とのＮＳ５Ａコード領域の配列の変動性を示す系統樹である。図１０は、遺伝子型１ａ分離株（５、１５、１８、２３、４９、および５０）および遺伝子型１ｂ分離株（７８および１０９）の８つの異なるＨＣＶサンプルにおけるＮＳ５Ａコード領域中に存在するアミノ酸置換を示す。
【０１３２】
前の実施例で説明したようにしてＮＳ５Ｂコード領域について表現型アッセイを行った（サンプル２３、５０、７８、および１０９については、図１１Ａ〜１１Ｊ、サンプル５、１５、１８、２３、４９、５０、７８、および１０９については、追加のデータは示さず）。これらのデータから総合して、開示された方法は、ＨＣＶ阻害剤に対するＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）集団の感受性の効率的で正確な決定を提供することが実証される。
【０１３３】
本発明の特定の実施形態を参照しながら本発明を説明して例示したが、当業者であれば、本発明の本質および範囲から逸脱することなくそれらに様々な変化、改変、および置換をなすことができることを理解しているであろう。本明細書に記載された全ての特許、公開された特許出願、およびその他の非特許文献は、参照によりそれらの全体が取り込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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