(57)【要約】  シリカ被覆ナノダイヤモンド及びシリカ被覆ナノダイヤモンドの調製方法が開示される。この方法は、リポソーム中に封入されたナノダイヤモンドをシリカ前駆体と接触させるステップと、シリカ前駆体を反応させてナノダイヤモンド上にシリカのコーティングを形成させるステップとを含む。【選択図】図１
2015530962.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シリカ被覆ナノダイヤモンドの調製方法であって、
リポソーム中に封入されたナノダイヤモンドをシリカ前駆体と接触させるステップと、
シリカ前駆体を反応させてナノダイヤモンド上にシリカのコーティングを形成させるステップと
を含む、方法。
【請求項２】
シリカ被覆ナノダイヤモンドのシリカ層を官能化させるステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
シリカ層を標識物質、治療薬、又は標的化剤で官能化させるステップを含む、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
リポソーム中に封入されたナノダイヤモンドをシリカ前駆体と接触させるステップが、
リン脂質フィルムをナノダイヤモンド及びシリカ前駆体の水溶液と接触させて脂質懸濁液を得るステップと、
脂質懸濁液を超音波処理してナノダイヤモンド及びシリカ前駆体が封入された単ラメラリポソームを得るステップと
を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
リン脂質が1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC)である、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
単ラメラリポソームが、10〜1マイクロメートル未満の範囲の流体力学直径を有する、請求項4又は5に記載の方法。
【請求項７】
触媒をシリカ前駆体の反応に加えるステップをさらに含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
シリカ被覆ナノダイヤモンドを精製するステップをさらに含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
シリカ前駆体がオルトケイ酸テトラアルキルであり、前記方法が、
複数のナノダイヤモンド及びオルトケイ酸テトラアルキルを接触させるステップと、
ナノダイヤモンド及びオルトケイ酸テトラアルキルをリポソーム中に捕捉するステップと、
オルトケイ酸テトラアルキルを反応させてリポソーム中でナノダイヤモンド上にシリカコーティングを形成させるステップと、
シリカ被覆ナノダイヤモンドをリポソームから精製するステップと
を含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
シリカ前駆体がオルトケイ酸テトラエチル(TEOS)である、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ナノダイヤモンド及びオルトケイ酸テトラアルキルをリポソーム中に捕捉するステップが、
リン脂質フィルムをナノダイヤモンド及びオルトケイ酸テトラアルキルの水溶液と接触させて脂質懸濁液を得るステップと、
脂質懸濁液を超音波処理して、ナノダイヤモンド及びオルトケイ酸テトラアルキルが封入された単ラメラリポソームの集団を得るステップと
を含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１２】
シリカ被覆ナノダイヤモンドを精製するステップが、
リポソーム破壊化合物をリポソーム懸濁液へ加えるステップと、
未反応成分及びリン脂質をシリカ被覆ナノダイヤモンドから透析して除去するステップと
を含む、請求項9から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
リポソーム破壊化合物が酢酸又は界面活性剤である、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム(SDS)又はTriton X-100である、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
ナノダイヤモンドコアと、
ダイヤモンドコア上に少なくとも部分的に配置されているシリカコーティングと
を含み、界面活性剤を実質的に含まない、シリカ被覆ナノダイヤモンド。
【請求項１６】
シリカ被覆ナノダイヤモンドが0.2以下の多分散指数を有する、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
請求項1から14のいずれか一項に記載の方法により作られる、シリカ被覆ナノダイヤモンド。
【請求項１８】
実質的に本明細書に添付の図面に関連して記載されている、シリカ被覆ナノダイヤモンドの調製方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ナノ粒子は、生体医学、光学、及び電子機器を含めた広範囲の分野において潜在的用途がある。ナノ粒子はおよそ100ナノメートル(nm)以下の1つ以上の寸法を有する粒子であり、そのため新規の特性がナノ粒子をバルク材料と差別化する。
【０００２】
医薬におけるナノテクノロジーは、薬物送達システム、新しい治療法、インビボ撮像、ナノエレクトロニクスに基づくセンサー、及び神経電気的インターフェースなどの領域において影響を与えている。現在、これらの様々な用途に応用されるように修飾及び官能化されているコアナノ粒子は比較的わずかな(10未満)種類しかない。ナノダイヤモンドは独特な光学的及び磁気的性質を有する一種のナノ粒子である。しかし、それらの内部表面を官能化又は被覆することが難しいためにそれらの利用はこれまで限られてきた。それらが水溶液中で凝集する傾向は、それらの利用又は利用のための官能化をさらに限定する。
【０００３】
SiH4飽和吸着及びin situ分解の逐次反応によって、ガス状モノシラン(SiH4)からの原子層堆積を用いてケイ素で被覆されたナノダイヤモンドが報告されている(Lu, J.ら, 2007, Applied Surface Science, 253(7): 3485〜3488)。
【０００４】
米国特許第7,648,765号は、アンモニアの存在下でナノダイヤモンドの水性コロイド溶液を有機溶媒中の界面活性剤の逆ミセル溶液へ加えることにより、単分散ナノダイヤモンドの逆ミセル溶液を作る方法を開示している。次いで、ヘプタン中の金属アルコキシドを加えることにより、逆ミセル溶液中のナノダイヤモンドをシリカで被覆してシリカ被覆ナノダイヤモンドを得る。次いで、水を有機溶媒へ加え、有機溶媒を蒸発させ、凍結乾燥により水を除去することにより、逆ミセル溶液中のシリカ被覆ナノダイヤモンドを乾燥及び粉末化させる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第7,648,765号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】2007, Applied Surface Science, 253(7): 3485〜3488
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
それでもなお、シリカ被覆ナノダイヤモンドの改善された調製方法が当技術分野において依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
シリカ被覆ナノダイヤモンド及びシリカ被覆ナノダイヤモンドの調製方法が本明細書で開示される。
【０００９】
一実施形態において、この方法は、リポソーム中に封入されたナノダイヤモンドをシリカ前駆体と接触させるステップと、シリカ前駆体を反応させてナノダイヤモンド上にシリカのコーティングを形成させるステップとを含む。
【００１０】
シリカ被覆ナノダイヤモンドは、ナノダイヤモンドコアと、ダイヤモンドコア上に少なくとも部分的に配置されているシリカコーティングとを含み、シリカ被覆ナノダイヤモンドは界面活性剤を実質的に含まない。
【００１１】
これらの利点及び他の利点、並びにさらなる本発明の特徴は、以下の図面、発明を実施するための形態、実施例、及び特許請求の範囲から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本明細書で開示されるプロセスにおいて出発物質として使用されるナノダイヤモンドの試料の透過電子顕微鏡写真(上図)、及びこのプロセスによって得られるシリカ被覆ナノダイヤモンドの顕微鏡写真(下図)である。
【図２】図２Ａは、水中のナノダイヤモンドの2本のバイアルの写真である。左のバイアルは被覆無しのナノダイヤモンドを含有し、右のバイアルは開示されるプロセスから得られるシリカ被覆ナノダイヤモンドを含有する。図２Ｂは、光散乱により測定される、被覆無しのダイヤモンド(下側の点線)及びシリカ被覆ダイヤモンド(上側の実線)の沈殿を示す、時間の関数としての光散乱のグラフである。
【図３】図３は、pHの関数として水溶液中の動的光散乱によって測定される、被覆無しのND出発物質(丸)及びシリカ被覆後の同じND(四角)の流体力学直径（hydrodynamic diameter）(A)及びゼータ電位(B)のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
シリカ被覆ナノダイヤモンド及びシリカ被覆ナノダイヤモンドの調製方法が本明細書で開示される。この方法は、水溶液中で安定であり容易に官能化される生体適合性表面を有する単分散粒径（monodisperse particle size）のシリカ被覆ナノダイヤモンドをもたらす。そのような単分散性で容易に修飾可能なナノダイヤモンドは、薬物送達、細胞標的化、及びイメージング法などの生体医学用途を含めた、様々なナノテクノロジー用途で使用できる。特に有利な特徴において、この方法は多量の有機溶媒を必要とせず、そのため容易に商業生産へ大規模化できる。
【００１４】
一態様において、シリカ被覆ナノダイヤモンドの調製方法が開示される。一実施形態において、この方法はリポソーム中に封入されたナノダイヤモンドをシリカ前駆体と接触させるステップと、シリカ前駆体を反応させてナノダイヤモンド上にシリカのコーティングを形成させるステップとを含む。例えば、特定の実施形態において、この方法は複数のナノダイヤモンドとオルトケイ酸テトラエチルなどのテトラアルコキシシランとを接触させるステップと、ナノダイヤモンド及びテトラアルコキシシランをリポソーム内に捕捉するステップと、テトラアルコキシシランを加水分解させてリポソーム中でナノダイヤモンド上にシリカコーティングを形成させるステップと、シリカ被覆ナノダイヤモンドをリポソームから精製するステップとを含む。
【００１５】
「ナノダイヤモンド」とはナノ寸法のダイヤモンド粒子を指す。本明細書において使用される「ダイヤモンド」は、天然ダイヤモンド及び様々な合成プロセスによる合成ダイヤモンドの両方、並びに微粒子状の「ダイヤモンドライクカーボン」(DLC)を含む。ダイヤモンド粒子は、少なくとも1つの1マイクロメートル未満の寸法、800nm未満、500nm未満、又は100nm未満、例えば1nm〜約100nm又は1〜500nmの寸法を有する。粒子は、少なくとも1つの寸法がナノサイズであるならば、すなわち1マイクロメートル未満、800nm未満、500nm未満、又は未満100nmであるならば、任意の形状、例えば長方形、球形、円筒形、立方体、又は不規則形であってもよい。
【００１６】
当技術分野において知られるように、ナノメートル範囲の粒子寸法の正確な測定は困難である場合がある。一実施形態において、ナノダイヤモンドの寸法はそれらの流体力学直径を使用して測定される。ナノダイヤモンド又はナノダイヤモンドの凝集体の流体力学直径は、水溶液などの適切な溶媒系で測定できる。流体力学直径は、沈殿、動的光散乱法、又は当技術分野において既知の他の方法によって測定できる。一実施形態において、流体力学直径は分画遠心沈殿法によって測定される。分画遠心沈殿法は、例えばディスク型遠心分離機において行うことができる。一実施形態において、流体力学直径は動的光散乱法により測定されるZ平均直径である。Z平均直径は、測定される相関曲線の累積率解析から得られる平均強度直径(mean intensity diameter)であり、ここでは単一の粒径が仮定され単一指数関数近似が自己相関関数に適用される。Z平均直径は、例えば脱イオン水中に分散させた試料を用いて動的光散乱法により測定できる。動的光散乱法により粒径及び/又は多分散指数を測定するための適切な装置の例は、Malvern Zetasizer Nanoである。
【００１７】
ナノダイヤモンドは市販されている。あるいは、ナノダイヤモンドは当技術分野において既知の方法により調製できる。ナノダイヤモンドは、例えば密閉容器中における特定の爆発物の爆発、レーザーアブレーション、ダイヤモンド微結晶の高エネルギーボールミリング、プラズマ支援化学蒸着、又は超臨界流体からのオートクレーブ合成によって調製できる。
【００１８】
シリカコーティングを形成させるために、ナノダイヤモンドを下記のようにリポソーム中に分配し、シリカ前駆体と接触させる。シリカ前駆体はリポソームと相溶性であるように選択され、ナノダイヤモンドがリポソーム内に封入されている条件下で反応性である。例示的なシリカ前駆体としては、式Si(OR)4(式中、各Rは同一又は異なっていてもよく、エーテル基(-O-)で場合により置換された1〜16個の炭素原子を有するアルキル基である)のテトラアルコキシシランが挙げられる。「アルキル」は、指定数の炭素原子、特定すると1〜12個の炭素原子、より特定すると1〜6個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖の飽和脂肪族基を意味する。テトラアルコキシシランは、分子中に存在する上記のように定義される少なくとも2つの異なるR基を有する混合アルコキシドであってもよい。一実施形態において、テトラアルコキシシランは、オルトケイ酸テトラエチル(TEOS)としても知られるテトラエトキシシラン、又はテトラメトキシシラン(TMOS)である。
【００１９】
他のシリカ前駆体、例えばシリカコーティングに官能基を提供する官能化シリカ前駆体を使用してもよい。そのような前駆体としては、式R11+xSi(X2)3-xのオルガノシラン(式中、各R1は同一又は異なっていてもよく、1〜32個の炭素原子を有する置換又は非置換の炭化水素基であり、各Xは同一又は異なっていてもよく、脱離基であり、xは0、1、又は2である)が挙げられる。本明細書で使用する「炭化水素基」は、炭素及び水素及び場合により1〜3個のヘテロ原子(S、O、P、Si、N)を含有する分岐又は非分岐、環状又は非環式、飽和、不飽和、又は芳香族基を含む。この基は、3個までの官能基、例えばハロゲン化物(F、Cl、Br、I)、シアノ、ニトロ、カルボン酸、カルボン酸塩、カルボン酸エステル、無水カルボン酸、アクリロイル、メタクリロイル、ヒドロキシ、チオール、エポキシ、トリアルコキシシリル(各アルキル基は同一又は異なっており、1〜6個の炭素原子を有する)、アミノ(-NRR'、式中R及びR'は水素又はC1〜C6アルキル基である)、アミジノ(-C(=NH)NH2)、ヒドラジノ(-NHNH2)、ヒドラゾノ(=N(NH2))、アルデヒド(-C(=O)H)、カルバモイル(-C(O)NH2)、C2〜C16アルケニル、C2〜C16アルキニル、C6〜C30アリール、C7〜C30アルキルアリーレン、C7〜C30アリールアルキレン、C1〜C30アルコキシ、又はイミダゾイル、フラニルなどのC2〜C6ヘテロ環などで場合により置換されていてもよい。脱離基Xとしては、ハロゲン化物、及び上記で定義されるような式-ORのアルコキシ基が挙げられる。
【００２０】
官能化シリカ前駆体の具体例としては、6-アジドスルホニルヘキシルトリエトキシシラン、ビス[(3-エトキシシリル)プロピル]エチレンジアミン、N-[3-トリエトキシシリルプロピル]-4,5-ジヒドロイミダゾール、3-アミノプロピルトリエトキシシラン、3-イソシアネートプロピルトリエトキシシラン、ジエトキシホスフェートエチルトリエトキシシラン、5,6-エポキシヘキシルトリエトキシシラン、ビス-[3-(トリエトキシシリル)プロピル]アミン、3-アミノプロピルメチルジエトキシシラン、N-(2-アミノエチル)-3-アミノプロピル-トリメトキシシラン、N-(2-アミノエチル)-3-アミノプロピル-メチルジメトキシシラン、ビス-[3-(トリエトキシシリル)プロピル]ジスルフィド、ビス-[3-(トリエトキシシリル)プロピル]テトラスルフィド、3-メルカプトプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルメチルジエトキシシラン、クロロプロピルトリエトキシシラン、クロロプロピルトリメトキシシラン、グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、3-メルカプトプロピルトリメトキシシラン、3-メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、メチルトリアセトキシシラン(MTAS)、メチルトリメトキシシラン(MTMS)、メチルトリス-(ブタノンオキシム)シラン(MOS)、メチルオキシミノシラン(MOS)、メチルトリス-(メチルエチルケトキシモ)シラン(MOS)、ビニルトリエトキシシラン、ビニルトリメトキシシラン、ビニルトリス-(ブタノンオキシム)シラン(VOS)、ビニルオキシミノシラン(VOS)、及びビニルトリス-(メチルエチルケトキシモ)シラン(VOS)3-アクリロキシプロピルトリメトキシシラン(AcPTMS)、2-シアノエチルトリエトキシシラン(CETES)、3-アミノプロピルトリエトキシシラン(APS)、3-アルデヒドプロピルトリメトキシシラン(APMS)、3-グリシジルプロピルシラン、及びN-(3-トリエトキシシリルプロピル)-4,5-ジヒドロイミダゾール(NTPDI)が挙げられる。ビスシリル化化合物(例えば、xが0であり、各XがORであり、R1がトリアルコキシシリル基で置換されているもの)が挙げられ、例えばビス(トリメトキシシリルエチル)ベンゼン(BTEB)、ビス(トリエトキシシリル)エチレン(BTESE)、1,6-ビス(トリメトキシシリル)ヘキサン(BTMH)を使用できる。
【００２１】
官能化シリカ前駆体とリポソームとのいかなる有害な相互作用も改善する又は最小限にするために、官能化シリカ前駆体の選択には注意を払う。シリカ被覆粒子のいかなる望ましくない交差反応も改善する又は最小限にするために、それが共有結合によるものであれそうでない場合であれ(すなわち例えばゲル形成を避けるため)、やはり官能化前駆体の選択に注意を払う。一実施形態において、テトラアルコキシシランと官能化シリカ前駆体の組み合わせが使用される。有害な副反応を最小限にするため、所望の度合いの官能性を得るため、又はその両方のために、テトラアルコキシシラン及び官能化シリカ前駆体の相対量を選択してもよい。
【００２２】
「リポソーム」は、脂質二重層で構成された人工的に調製される小胞を指す。リポソームは多重ラメラ小胞(multilamellar vesicle)(MLV)又は単ラメラ小胞(unilamellar vesicle)(UV)であってもよい。リポソームは単一の脂質又は脂質の混合物で構成されていてもよい。リポソームの特性は脂質の組成に応じて変化し得る。脂質含量は、10nm〜2000nm、特定すると10〜1000nm、より特定すると10〜500nm、さらにより特定すると10〜100nmの流体力学直径を有する単ラメラリポソームの製造を可能にするように選択される。一実施形態において、脂質含量は、約10nm〜約100nmの流体力学直径を有する単ラメラリポソームの製造を可能にするように選択される。例示的なリポソームは天然リン脂質を含む組成を有する。リン脂質の例としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、及びリンスフィンゴ脂質が挙げられる。一実施形態において、リン脂質はホスファチジルコリンである。より特定すると、ホスファチジルコリンは1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC)であってもよい。
【００２３】
リポソームの調製方法は当技術分野において知られている。リポソームを調製するための手順の一般的要素には、水和させるための脂質の調製、撹拌による脂質の水和、及びリポソームの分粒が含まれる。
【００２４】
例えば、脂質を有機溶媒中に溶解させることにより脂質を調製できる。有機溶媒の例としては、クロロホルム、クロロホルム:メタノール混合物、第3級ブタノール、及びシクロヘキサンが挙げられる。脂質溶液の濃度は約10ミリグラム/ミリリットル(mg/mL)〜約20mg/mL、又は脂質の溶解性に応じてそれを超えてもよい。溶解させるとすぐに、溶媒を除去して脂質フィルムを得る。少量の有機溶媒については、乾燥窒素流又はアルゴン流を使用して溶媒を蒸発させることができる。多量の場合、溶媒は例えばロータリーエバポレーターにより除去できる。脂質フィルムを、例えば真空ポンプ下で完全に乾燥させて残留有機溶媒を除去する。乾燥させた脂質フィルムは、水和させる準備ができるまで冷凍保存できる。乾燥脂質フィルムの水和は、水性媒体を乾燥脂質の容器へ加え、撹拌することにより行うことができる。水和媒体の温度は脂質のゲル-液晶遷移温度(Tc)を超えているべきであり、水和の間はTcを超えて維持されるべきである。水和はMLVの懸濁液を生じさせ、MLVは超音波処理又は押出を含めた様々な技術によりサイズを小さくすることができる。
【００２５】
リポソームは脂質を水中で超音波処理することにより作り出すことができる。低せん断速度はMLVを作り出すが、一方高せん断の超音波処理は小さい単ラメラリポソーム(SUV)を形成させる傾向がある。例えばシリンジ若しくは膜を通して脂質懸濁液を押出することによって、又はMozafari法(WO2005084641)によっても、リポソームを調製できる。
【００２６】
分子又は粒子をリポソームの内部に封入する方法は当技術分野において知られている。例えば、リポソーム中に封入しようとする粒子を、乾燥させた脂質フィルムに加える水和媒体中に含有させてもよい。一実施形態において、ナノダイヤモンド及びシリカ前駆体(例えばテトラアルコキシシラン)の水性懸濁液を、乾燥させた脂質フィルムに加える水和媒体として使用する。撹拌によって(例えば超音波処理により)脂質を水和及び再懸濁させると、大きい多重ラメラリポソームの形成を引き起こし、これはナノダイヤモンド及びシリカ前駆体が封入された小さい単ラメラ小胞へと分解される。あるいは、ナノダイヤモンドの封入後にシリカ前駆体を加えることができる。MLVは、例えば長時間の超音波処理又はシリンジ若しくは膜を通した押出によってSUVへと分解することができる。非常に有利な特徴において、被覆無しのナノダイヤモンドの大粒子又は凝集物が懸濁液から析出し、除去することができ、シリカ被覆ナノダイヤモンドの単分散組成物が得られる。シリカ被覆ナノダイヤモンドの平均サイズは、リポソームのサイズを選択することによって及び/又はシリカ前駆体との反応条件を変えることによって、例えば添加するシリカ前駆体のパーセンテージを変化させることによって、調整できる。リポソームのサイズは、脂質組成、脂質濃度、温度、並びに超音波処理の時間及び強さを選択することによって変化させることができる。
【００２７】
テトラアルコキシシランなどのシリカ前駆体の加水分解は、ナノダイヤモンドの表面上又は表面近傍でシリカ形成を引き起こす。シリカは層の形態であり、連続又は不連続であってもよく、すなわち完全に又は部分的にナノダイヤモンドコアを覆っていてもよく、ナノダイヤモンドコアに共有結合若しくはイオン結合しているか又はしていなくてもよい。便宜上、このように形成されるシリカ層を本明細書において「コーティング」と呼ぶ。一実施形態において、コーティングは連続でありナノダイヤモンドを完全に覆って、ナノダイヤモンドコア及びシリカシェルを有するコアシェル構造をもたらす。シリカ前駆体を加水分解する方法は、選択される特定の前駆体によって決まることになる。例えば、テトラアルコキシシランは水にさらされると加水分解し、これはさらに完了するまで進行するだけでなく、触媒の存在下で促進させることができる。加水分解は酸又は塩基により触媒することができる。触媒の例としては、有機及び無機の酸及び塩基、例えばHF、HCl、HNO、H2SO4、酢酸、アンモニア、NH4OH、KOH、トリエチルアミンなどの様々なアミン、及びKFなどが挙げられる。一実施形態において、テトラアルコキシシランからシリカへの加水分解を触媒するためにトリエチルアミンを水和媒体へ加える。触媒は、水和媒体へ加えられる場合、脂質の水和及び再懸濁の前又は後に加えることができる。一実施形態において、触媒は脂質の再懸濁後に媒体へ加えられる。SUVの中に捕捉されていない、シリカ前駆体、例えば、テトラアルコキシシラン及び触媒は、例えば水性溶媒を複数回換えてSUVを透析することにより、SUV溶液から除去できる。
【００２８】
リポソームからのシリカ被覆ナノダイヤモンドの精製は、様々な方法で行うことができる。一実施形態において、未反応の反応成分はシリカ被覆ナノダイヤモンドが封入されたリポソームから洗い流され、次いでリポソームは当技術分野において既知の手段によって、例えば酢酸又は界面活性剤などのリポソーム破壊化合物の添加によって壊される。「リポソーム破壊化合物(liposome-disrupting compound)」は、リポソームの水性懸濁液に加えられるとリポソームの破壊を引き起こして成分の脂質にする化合物である。
【００２９】
界面活性剤は、アニオン性、カチオン性、非イオン性、又は両性イオン性界面活性剤であってもよい。例示的な界面活性剤としては、ケノデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸ナトリウム塩、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、デオキシコール酸メチルエステル、ジギトニン、ジギトキシゲニン、N,N-ジメチルドデシルアミンオキシド、ドキュセートナトリウム塩、グリコケノデオキシコール酸ナトリウム塩、グリココール酸水和物、グリココール酸ナトリウム塩水和物、グリコデオキシコール酸一水和物、グリコデオキシコール酸ナトリウム塩、グリコリトコール酸3-スルファート二ナトリウム塩、グリコリトコール酸エチルエステル、N-ラウロイルサルコシンナトリウム塩、N-ラウロイルサルコシン、リチウムドデシルスルファート、ルゴール溶液、Niaproof 4、Type 4(すなわち、7-エチル-2-メチル-4-ウンデシルスルファートナトリウム塩、ナトリウム7-エチル-2-メチル-4-ウンデシルスルファート)、1-オクタンスルホン酸ナトリウム塩、ナトリウム1-ブタンスルホナート、ナトリウム1-デカンスルホナート、ナトリウム1-ドデカンスルホナート、ナトリウム1-ヘプタンスルホナート無水物、ナトリウム1-ノナンスルホナート、ナトリウム1-プロパンスルホナート一水和物、ナトリウム2-ブロモエタンスルホナート、ナトリウムコラート水和物、ナトリウムコレアート、ナトリウムデオキシコラート、ナトリウムデオキシコラート一水和物、ドデシル硫酸ナトリウム、ナトリウムヘキサンスルホナート無水物、ナトリウムオクチルスルファート、ナトリウムペンタンスルホナート無水物、ナトリウムタウロコラート、ナトリウムタウロデオキシコラート、タウロケノデオキシコール酸(saurochenodeoxycholic acid)ナトリウム塩、タウロデオキシコール酸ナトリウム塩一水和物、タウロヒオデオキシコール酸ナトリウム塩水和物、タウロリトコール酸3-スルファート二ナトリウム塩、タウロウルソデオキシコール酸ナトリウム塩、Trizma(登録商標)ドデシルスルファート(すなわち、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンラウリルスルファート)、ウルソデオキシコール酸、アルキルトリメチルアンモニウムブロミド、ベンザルコニウムクロリド、ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウムクロリド、ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウムクロリド、ベンジルドデシルジメチルアンモニウムブロミド、ベンジルトリメチルアンモニウムテトラクロヨーダート、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、ドデシルエチルジメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、エチルヘキサデシルジメチルアンモニウムブロミド、ジラード試薬T、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、N,N',N'-ポリオキシエチレン(10)-N-タロー-1,3-ジアミノプロパン、トンゾニウムブロミド、トリメチル(テトラデシル)アンモニウムブロミド、BigCHAP(すなわち、N,N-ビス[3-(D-グルコンアミド)プロピル]コラミド)、ビス(ポリエチレングリコールビス[イミダゾイルカルボニル])、ポリオキシエチレンアルコール、例えばBrij(登録商標)30(ポリオキシエチレン(4)ラウリルエーテル)、Brij(登録商標)35(ポリオキシエチレン(23)ラウリルエーテル)、Brij(登録商標)35P、Brij(登録商標)52(ポリオキシエチレン2セチルエーテル)、Brij(登録商標)56(ポリオキシエチレン10セチルエーテル)、Brij(登録商標)58(ポリオキシエチレン20セチルエーテル)、Brij(登録商標)72(ポリオキシエチレン2ステアリルエーテル)、Brij(登録商標)76(ポリオキシエチレン10ステアリルエーテル)、Brij(登録商標)78(ポリオキシエチレン20ステアリルエーテル)、Brij(登録商標)78P、Brij(登録商標)92(ポリオキシエチレン2オレイルエーテル)、Brij(登録商標)92V(ポリオキシエチレン2オレイルエーテル)、Brij(登録商標)96V、Brij(登録商標)97(ポリオキシエチレン10オレイルエーテル)、Brij(登録商標)98(ポリオキシエチレン(20)オレイルエーテル)、Brij(登録商標)58P、及びBrij(登録商標)700(ポリオキシエチレン(100)ステアリルエーテル)など、Cremophor(登録商標)EL(すなわち、ポリオキシエチレングリセロールトリリシノレアート35、ポリオキシル35ヒマシ油)、デカエチレングリコールモノドデシルエーテル、デカエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、デカエチレングリコールモノトリデシルエーテル、N-デカノイル-N-メチルグルカミン、n-デシルα-D-グルコピラノシド、デシルβ-D-マルトピラノシド、ジギトニン、n-ドデカノイル-N-メチルグルカミド、n-ドデシルα-D-マルトシド、n-ドデシルβ-D-マルトシド、ヘプタエチレングリコールモノデシルエーテル、ヘプタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ヘプタエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、n-ヘキサデシルβ-D-マルトシド、ヘキサエチレングリコールモノドデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、Igepal(登録商標)CA-630(すなわち、ノニルフェニル-ポリエチレングリコール、(オクチルフェノキシ)ポリエトキシエタノール、オクチルフェニル-ポリエチレングリコール)、メチル-6-O--(N-ヘプチルカルバモイル)-α-D-グルコピラノシド、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル、N-ノナノイル-N-メチルグルカミン、オクタエチレングリコールモノデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、オクチル-β-D-グルコピラノシド、ペンタエチレングリコールモノデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノヘキシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノオクチルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールエーテルW-1、ポリオキシエチレン10トリデシルエーテル、ポリオキシエチレン100ステアラート、ポリオキシエチレン20イソヘキサデシルエーテル、ポリオキシエチレン20オレイルエーテル、ポリオキシエチレン40ステアラート、ポリオキシエチレン50ステアラート、ポリオキシエチレン8ステアラート、ポリオキシエチレンビス(イミダゾリルカルボニル)、ポリオキシエチレン25プロピレングリコールステアラート、キラヤ樹皮由来のサポニン、ソルビタン脂肪酸エステル、例えばSpan(登録商標)20(ソルビタンモノラウラート)、Span(登録商標)40(ソルビタンモノパルミタート)、Span(登録商標)60(ソルビタンモノステアラート)、Span(登録商標)65(ソルビタントリステアラート)、Span(登録商標)80(ソルビタンモノオレアート)、及びSpan(登録商標)85(ソルビタントリオレアート)など、ポリエチレングリコールの様々なアルキルエーテル、
例えばTergitol(登録商標)Type 15-S-12、Tergitol(登録商標)Type 15-S-30、Tergitol(登録商標)Type 15-S-5、Tergitol(登録商標)Type 15-S-7、Tergitol(登録商標)Type 15-S-9、Tergitol(登録商標)Type NP-10 (ノニフェノールエトキシラート)、Tergitol(登録商標)Type NP-4、Tergitol(登録商標)Type NP-40、Tergitol(登録商標)Type NP-7、Tergitol(登録商標)Type NP-9(ノニルフェノールポリエチレングリコールエーテル)、Tergitol(登録商標)MIN FOAM Ix、Tergitol(登録商標)MIN FOAM 2x、Tergitol(登録商標)Type TMN-10 (ポリエチレングリコールトリメチルノニルエーテル)、Tergitor Type TMN-6(ポリエチレングリコールトリメチルノニルエーテル)、Triton(登録商標) 770、Triton(登録商標)CF-10(ベンジル-ポリエチレングリコールtert-オクチルフェニルエーテル)、Triton(登録商標)CF-21、Triton(登録商標)CF-32、Triton(登録商標)DF-12、Triton(登録商標)DF-16、Triton(登録商標)GR-5M、Triton(登録商標)N-42、Triton(登録商標)N-57、Triton(登録商標)N-60、Triton(登録商標)N-101(すなわち、ポリエチレングリコールノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン分岐ノニルフェニルエーテル)、Triton(登録商標)QS-15、Triton(登録商標)QS-44、Triton(登録商標)RW-75(すなわち、ポリエチレングリコール260モノ(ヘキサデシル/オクタデシル)エーテル及び1-オクタデカノール)、Triton(登録商標)SP-135、Triton(登録商標)SP-190、Triton(登録商標)W-30、Triton(登録商標)X-15、Triton(登録商標)X-45(すなわち、ポリエチレングリコール4-tert-オクチルフェニルエーテル、4-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェニル-ポリエチレングリコール)、Triton(登録商標)X-100(t-オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリエチレングリコールtert-オクチルフェニルエーテル、4-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェニル-ポリエチレングリコール)、Triton(登録商標)X-102、Triton(登録商標)X-114(ポリエチレングリコールtert-オクチルフェニルエーテル、(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェニル-ポリエチレングリコール)、Triton(登録商標)X-165、Triton(登録商標)X-305、Triton(登録商標)X-405(すなわち、ポリオキシエチレン(40)イソオクチルシクロヘキシルエーテル、ポリエチレングリコールtert-オクチルフェニルエーテル)、Triton(登録商標)X-705-70、Triton(登録商標)X-151、Triton(登録商標)X-200、Triton(登録商標)X-207、Triton(登録商標)X-301、Triton(登録商標)XL-80N、及びTriton(登録商標)XQS-20など、テトラデシル-β-D-マルトシド、テトラエチレングリコールモノデシルエーテル、テトラエチレングリコールモノドデシルエーテル、テトラエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、トリエチレングリコールモノデシルエーテル、トリエチレングリコールモノドデシルエーテル、トリエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、トリエチレングリコールモノオクチルエーテル、トリエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、例えばTWEEN(登録商標)20(ポリエチレングリコールソルビタンモノラウラート)、TWEEN(登録商標)20(ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウラート)、TWEEN(登録商標)21(ポリオキシエチレン(4)ソルビタンモノラウラート)、TWEEN(登録商標)40(ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノパルミタート)、TWEEN(登録商標)60(ポリエチレングリコールソルビタンモノステアラート、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノステアラート)、TWEEN(登録商標)61(ポリオキシエチレン(4)ソルビタンモノステアラート)、TWEEN(登録商標)65(ポリオキシエチレン(20)ソルビタントリステアラート)、TWEEN(登録商標)80(ポリエチレングリコールソルビタンモノオレアート、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレアート)、TWEEN(登録商標)81(ポリオキシエチレン(5)ソルビタンモノオレアート)、及びTWEEN(登録商標)85(ポリオキシエチレン(20)ソルビタントリオレアート)など、チロキサポール、n-ウンデシル-β-D-グルコピラノシド、CHAPS(すなわち、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホナート)、CHAPSO (すなわち、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホナート)、N-ドデシルマルトシド、α-ドデシル-マルトシド、β-ドデシル-マルトシド、3-(デシルジメチルアンモニオ)プロパンスルホナート分子内塩(すなわち、SB3-10)、3-(ドデシルジメチルアンモニオ)プロパンスルホナート分子内塩(すなわち、SB3-12)、3-(N,N-ジメチルオクタデシルアンモニオ)プロパンスルホナート(すなわち、SB3-18)、3-(N,N-ジメチルオクチルアンモニオ)プロパンスルホナート分子内塩(すなわち、SB3-8)、3-(N,N-ジメチルパルミチルアンモニオ)プロパンスルホナート(すなわち、SB3-16)、MEGA-8、MEGA-9、MEGA-10、メチルヘプチルカルバモイルグルコピラノシド、N-ノナノイルN-メチルグルカミン、オクチル-グルコピラノシド、オクチル-チオグルコピラノシド、オクチル-β-チオグルコピラノシド、3-[N,N-ジメチル(3-ミリストイルアミノプロピル)アンモニオ]プロパンスルホナート、デオキシコール酸(deoxycholatic acid)、並びに様々なそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態において、界面活性剤はドデシル硫酸ナトリウム(SDS)又はTriton X-100である。
【００３０】
一実施形態において、シリカ被覆ナノダイヤモンド及び脂質の溶液を次いで水に対して透析してシリカ被覆ナノダイヤモンドの水溶液を得る。一実施形態において、シリカ被覆ナノダイヤモンドは遠心分離によりシリカ被覆ナノダイヤモンド及び脂質の溶液から単離される。
【００３１】
製造されるシリカ被覆ナノダイヤモンドは単分散であり(例えば多分散指数が0.4以下、0.3以下、又は0.2以下である比較的狭い単峰性対数正規粒径分布を示す)、水溶液中で室温において長期間、例えば少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも7日間、又は少なくとも1か月間、安定である。そのような安定性は、水溶液のpHが2.5を上回って、3.0を上回って、例えば3.0〜9.0で維持される場合に改善される。
【００３２】
分散度は、所与の試料における分子又は粒子のサイズの不均一性の指標である。「単分散(monodisperse)」とは、同じ又は類似のサイズの粒子を指し、一方「多分散性(polydisperse)」とは、不均一な(例えば多峰性の)サイズ分布を有する粒子を指す。「多分散指数」は、サイズ分布の不均一性の指標である。動的光散乱法により測定されるサイズ分布において、多分散指数(PDI)は相関関数から決定されるサイズ分布の幅である。本明細書において、PDIは0.4以下、特定すると0.35以下、より特定すると0.3以下、さらに特定すると0.2以下である水性試料は単分散であると考えられる。
【００３３】
別の特に有利な特徴において、シリカ被覆ナノダイヤモンドは界面活性剤を実質的に含まない。「界面活性剤を実質的に含まない」とは、ナノダイヤモンドが、シリカ被覆ナノダイヤモンドの重量を基準として百万分率(「ppm」)で1000未満の界面活性剤、500ppm未満の界面活性剤、100ppm未満の界面活性剤、50ppm未満の界面活性剤、10ppm未満の界面活性剤、1ppm未満の界面活性剤、又は0.5ppm未満の界面活性剤を含有することを意味する。一実施形態において、例えばガスクロマトグラフィー-質量分析法(GC-MS)又は高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により測定する場合に、界面活性剤がシリカ被覆ナノダイヤモンドにおいて検出されない。
【００３４】
シリカ被覆ナノダイヤモンドのシリカコーティングは、それらの物理特性又は化学特性を変えるために物理的又は化学的処理により改変することができる。例えば、シリカ被覆ナノダイヤモンドは、プラズマ処理を行ってシリカ表面上のヒドロキシル基の数を増加させることができる。
【００３５】
他の実施形態において、シリカ被覆ナノダイヤモンドはシリカの誘導体化で知られる方法を使用して容易に誘導体化できる。そのような誘導体化は、シリカ被覆ナノダイヤモンドの物理特性を変えるため又はさらなる誘導体化若しくは使用のための官能基を提供するために使用できる。シリカ表面を共有結合により誘導体化する1つの方法は、上記のような有機官能性トリアルコキシシラン又はクリクロロシラン、例えばアミノアルキルトリアルコキシシラン、アミノアルキルトリクロロシラン、ヒドロキシアルキルトリアルコキシシラン、ヒドロキシアルキルトリクロロシラン、カルボキシアルキルトリアルコキシシラン、ポリエチレングリコール、エポキシアルキルトリアルコキシシランなどによるシラン処理である。上記で挙げた特定の化合物のうち、具体例としては、3-アミノプロピルトリエトキシシラン(APTES)、(3-アミノプロピル)-ジメチルエトキシシラン(APDMES)、N-(2-アミノエチル)-3-アミノプロピルトリメトキシシラン(AEAPS)、3-アルデヒドプロピルトリメトキシシラン(APMS)、メルカプトプロピルトリメトキシシラン(MPTMS)、及びメルカプトプロピルトリエトキシシラン(MPTES)、及びその他、例えばアミノトリエトキシシランなどが挙げられる。シリカ被覆ナノ粒子の物理特性(例えば親水性)を改変するのに特に適した誘導体化剤の他の具体例としては、2-[メトキシ(ポリエチレンオキシ)プロピル]トリメトキシシラン、2-[メトキシ(ポリエチレンオキシ-プロピレンオキシ)プロピル]トリメトキシシラン、(C1-32アルキル)トリクロロシラン、例えばオクタデシルトリクロロシランなどが挙げられる。
【００３６】
誘導体化剤が官能基を含む場合、官能基をさらに誘導体化できる。したがって、シリカ表面とモノマー又は親水性ポリマー(例えばメチルセルロース、ポリ(ビニルアルコール)、デキストラン、デンプン、又はグルコース)などの別の分子との連結基として官能化トリアルコキシシラン又はトリクロロシランを使用することも可能である。トリアルコキシシラン又はトリクロロシランの官能基は、他の分子と反応するように選択され、上記の官能基の任意のもの、例えばビニル、アリル、エポキシ、アクリロイル、メタクリロイル、スルフヒドリル、アミノ、ヒドロキシなどであってもよい。官能化は同時又は段階的であってもよい。
【００３７】
シリカ表面の非共有結合的官能化は、約pH3.5を超えるシリカの負の性質に起因する静電的相互作用に基づき得る。例えば、正に帯電したポリマーはシリカ表面に静電的に吸着できる。
【００３８】
特定の実施形態において、シリカ被覆ナノダイヤモンドは、標識物質、治療薬、及び/又は標的化剤を取り込むように化学的又は物理的に官能化される。官能化は直接、又は上記のようなリンカーを介していてもよい。
【００３９】
「標識物質(labeling material)」という用語は、シリカ被覆ナノダイヤモンドの位置又は量の特定を可能にする物理的又は化学的方法によって検出可能である材料を指す。検出可能な物質としては、蛍光物質、色素、発光物質、放射性物質、酵素、及び補欠分子団が挙げられる。蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアン酸、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、又はフィコエリトリンが挙げられる。発光物質の例としてはルミノールが挙げられ、放射性物質の例としては、125I、131I、35S、及び3Hが挙げられる。酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。補欠分子団の例としては、ストレプトアビジン/ビオチン及びアビジン/ビオチンが挙げられる。標識物質の検出は、当技術分野において知られている方法により行うことができる。
【００４０】
治療薬は当技術分野において知られている任意のものであってもよい。一実施形態において、治療薬は抗炎症性剤、抗糖尿病薬、化学療法剤、又は抗血管形成剤である。
【００４１】
標的化剤は、ナノダイヤモンドを特定の細胞型へ誘導する分子であってもよい。例えば、標的化剤は、特定の目的とする細胞型の表面で見いだされる受容体又は特定の目的とする細胞型の中で選択的に運ばれる分子と特異的に結合する配位子であってもよい。
【００４２】
本発明の他の実施形態は以下の非限定的な例において説明される。
【実施例】
【００４３】
[実施例１]
シリカ被覆ナノダイヤモンドの調製
リン脂質16:0-18:1 1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC)は、直径が100nmであるリポソームを形成することで知られている。ガラスバイアル中のクロロホルム(25mg/mL)中に溶解させたPOPC(10mg、Avanti Polar Lipids, Inc.)を、室温にて窒素気流下で脱水してガラスバイアルの壁の上に薄層を形成させ、次いで45分間さらに真空乾燥させた。
【００４４】
分量(1.25グラム(g))の約30nmナノダイヤモンド(ND、Microdiamant AG)を11mLの脱イオン(DI)水中に溶解させ、水浴中で室温にて30分(min)間超音波処理した。2.5mLのND溶液へ、エタノール中1%(v/v)テトラエチルオルトシリカート(TEOS)を2.5mL加えた。次いでND/TEOS溶液をただちにPOPCの薄層のついたガラスバイアルへ移した。ガラスバイアルを室温の水浴超音波処理器で10分間超音波処理することにより、リン脂質を再懸濁させた。TEOSアルコキシシランは加水分解及び縮合されてエタノール及び水と共にシリカを形成する。シラン化(silinization)を触媒するために7.5マイクロリットル(μL)の容量のトリエチルアミン(TEA)を反応物へ加えた。多重ラメラリン脂質小胞(MLV)を壊してND及びTEOSが封入された所望のリポソーム直径の小さい単ラメラ小胞(SUV)とするために、次いで溶液を40分間超音波処理した。これらのSUVはこうして、封入されたNDをシリカで被覆するためのミニ工場となった。超音波処理後、SUV内に捕捉されていないTEOS及びTEAを、水を複数回換えて48時間(hr)にわたって透析することにより洗い流した。
【００４５】
リポソームを溶解させシリカ被覆NDを単離するために、500μLの10%(w/v)ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を溶液へ加え、水浴中で室温にて2時間超音波処理した。次いで、水に対する透析を再度繰り返してPOPC及びSDSをシリカ被覆NDの溶液から除去した。シリカ被覆NDの最終溶液を室温で保存した。
【００４６】
シリカ被覆NDは被覆無しの出発NDとは異なる特性を示した。図1は、2つの透過電子顕微鏡像を示し、それぞれバーは100nmを示す。上図は初期の出発ナノダイヤモンドの顕微鏡像であり、一方で下図は得られるシリカ被覆ナノダイヤモンドの顕微鏡像である。被覆無しのナノダイヤモンドは凝集して大きい構造体となっているが、シリカ被覆ナノダイヤモンドは単分散である。
【００４７】
さらに、シリカ被覆ナノダイヤモンドはコロイド安定性を示す。図2が示すように、被覆無しのNDは溶液からすぐに析出するが、被覆されたものはこれまでのところ数カ月間溶液中に残っている。
【００４８】
図2Aは水中のナノダイヤモンドが入った2本のバイアルの写真を示す。左のバイアルは被覆無しのND出発物質を含有し、一方右のバイアルはシリカ被覆NDを含有する。図2Bは、光散乱により測定される、被覆無しのナノダイヤモンド(下側の線)及びシリカ被覆ナノダイヤモンド(上側の線)の沈殿の経時変化を示す。試料は635nmで励起され、散乱は90°で測定された。シリカ被覆ナノダイヤモンドは水溶液中で安定のままであるが、被覆無しのナノダイヤモンドは3時間の実験の間に水溶液からすぐに析出する。水中の被覆無しのナノダイヤモンドの試料の散乱は二重指数関数により最も良くフィッティングされたのに対し、被覆ナノダイヤモンドの散乱は単一指数関数により最も良くフィッティングされた。
【００４９】
[実施例２]
シリカ被覆ナノダイヤモンドの特性決定
動的光散乱法及びゼータ電位を使用し電気泳動的光散乱を使用して粒径を測定するMalvern Zetasizer Nano Series装置を使用し、被覆ND及び被覆無しのNDの両方のZ-平均流体力学直径及びゼータ電位をpHの関数として水中で分析した。pHの調整はHCl及びNaOHを使用して行った。試料は635nmで励起され、散乱は90°で測定された。
【００５０】
図3は、シリカ被覆の前(丸)及び後(四角)のNDにおける流体力学直径(A)及びゼータ電位(B)のグラフを示す。特に、強い負のゼータ電位(-35mV)によって粒子が流体力学直径が約45nmであるコロイド懸濁液中にとどまることが可能となるpH3を上回る場合、シリカ被覆NDは0.2未満のPDI値を有する単分散であることが分かった。
【００５１】
被覆無しのNDと比較して、シリカによる被覆は作業pH範囲にわたってNDをアニオン性、安定、及び単分散とした。6〜7の生理的pH範囲における被覆NDの負電荷は多くの生体医学用途に望ましく、なぜならこれはこのpH範囲にある大部分の生体分子の負電荷と似ているからである。
【００５２】
図3は被覆無しのNDの流体力学直径(A)及びゼータ電位(B)も示す。被覆無しのNDは大きい流体力学直径を有する傾向があり、一方ゼータ電位の絶対値は20mV未満であった。理論に拘束されないが、粒子の表面電荷が低い場合、静電反発力はもはや粒子が凝集する及び綿状の塊になるのを防ぐほど強くはなく、そのため記録される流体力学直径及び多分散指数(PDI)の測定値も増加する。被覆無しのNDの場合、示されるZ-平均流体力学直径におけるPDI値は0.66を超え、pH10未満のpH測定値においては最大の1にさえも達し、ダイヤモンドが多分散性であり凝集が起こっていることを示す。
【００５３】
[実施例３]
シリカ被覆ナノダイヤモンドの官能化
アミン基が色素と反応しStober反応により3つのエトキシシラン基がシリカ-コーティングのシラノール基と反応する、3-アミノプロピルトリエトキシシラン(APTES)を中間リンカーとして使用して、アミン反応性Alexa Flour(登録商標)647(Life Technologies, Inc.)をシリカ被覆NDへ接合させた。
【００５４】
本明細書で開示されるシリカ被覆ナノダイヤモンドを作る方法、及びそれにより作られるシリカ被覆ナノダイヤモンドのいくつかの実施形態を以下に示す。
【００５５】
したがって、シリカ被覆ナノダイヤモンドの調製方法は、リポソーム中に封入されたナノダイヤモンドをシリカ前駆体、例えば、オルトケイ酸テトラアルキル、特定するとオルトケイ酸テトラエチル(TEOS)と接触させ、シリカ前駆体を反応させてナノダイヤモンド上にシリカのコーティングを形成させるステップと、場合により触媒をシリカ前駆体の反応へ加えるステップと、場合によりシリカ被覆ナノダイヤモンドを精製するステップと、場合によりシリカ被覆ナノダイヤモンドのシリカ層を標識物質、治療薬、又は標的化剤などで官能化させるステップとを含み、リポソーム中に封入されたナノダイヤモンドをシリカ前駆体と接触させるステップは、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC)フィルムなどのリン脂質フィルムをナノダイヤモンド及びシリカ前駆体、例えば、オルトケイ酸テトラアルキル、特定するとオルトケイ酸テトラエチル(TEOS)の水溶液と接触させて脂質懸濁液を得るステップと、脂質懸濁液を超音波処理してナノダイヤモンド及びシリカ前駆体が封入された単ラメラリポソームを得るステップとを含み、単ラメラリポソームは場合により10〜1マイクロメートル未満の範囲の流体力学直径を有する、又はシリカ前駆体はオルトケイ酸テトラアルキルであり、この方法は複数のナノダイヤモンド及びオルトケイ酸テトラアルキルを接触させるステップと、ナノダイヤモンド及びオルトケイ酸テトラアルキルをリポソーム中に捕捉するステップと、オルトケイ酸テトラアルキルを反応させてリポソーム中でナノダイヤモンド上にシリカコーティングを形成させるステップと、シリカ被覆ナノダイヤモンドをリポソームから精製するステップとを含み、ナノダイヤモンド及びオルトケイ酸テトラアルキルをリポソーム中に捕捉するステップは、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC)フィルムなどのリン脂質フィルムをナノダイヤモンド及びオルトケイ酸テトラアルキルの水溶液と接触させて脂質懸濁液を得るステップと、脂質懸濁液を超音波処理して、10〜1未満マイクロメートルの範囲の流体力学直径を有しナノダイヤモンド及びオルトケイ酸テトラアルキルが封入された単ラメラリポソームなどの単ラメラリポソームの集団を得るステップとを含み、シリカ被覆ナノダイヤモンドを精製するステップは、酢酸又は界面活性剤(ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)又はTriton X-100など)などのリポソーム破壊化合物をリポソーム懸濁液へ加えるステップと、未反応成分及びリン脂質をシリカ被覆ナノダイヤモンドから透析して除去するステップとを含む。
【００５６】
場合により、前述の方法のいずれかは触媒をシリカ前駆体の反応へ加えるステップをさらに含んでいてもよい。前述の方法のいずれかは、場合によりシリカ被覆ナノダイヤモンドを精製するステップをさらに含んでいてもよい。場合により、前述の方法のいずれかは、シリカ被覆ナノダイヤモンドのシリカ層を標識物質、治療薬、又は標的化剤などで官能化させるステップをさらに含んでいてもよい。
【００５７】
シリカ被覆ナノダイヤモンドは、ナノダイヤモンドコアと、ダイヤモンドコア上に少なくとも部分的に配置されているシリカコーティングとを含み、シリカ被覆ナノダイヤモンドは界面活性剤を実質的に含まず、シリカ被覆ナノダイヤモンドは0.2以下の多分散指数を有する。
【００５８】
「a」及び「an」という用語は、量の限定を表すのではなく、むしろ少なくとも1つの言及される品目の存在を表す。「又は」という用語は「及び/又は」を意味する。「含んでいる(comprising)」、「有している」、「含んでいる(including)」、及び「含有している」という用語は、制約がない用語(すなわち、「含んでいるが、限定はされない」を意味する)と解釈されるべきである。量に関連して使用される修飾語「約」は、指定の値を含めており、文脈により決定される意味を有する(例えば、特定の量の測定に関連した誤差の度合いを含む)。
【００５９】
値の範囲の列挙は、本明細書において別段の指定がない限り、単に範囲内に含まれるそれぞれの別個の値を個々に指す簡略的な方法として機能することを意図しており、それぞれの別個の値は本明細書において個々に列挙されるかのように指定の中に組み込まれる。あらゆる範囲の終点は範囲内に含まれ、独立に組み合わせ可能である。
【００６０】
別段の規定がない限り、本明細書において使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。
【００６１】
すべての参考文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【００６２】
本発明の実施形態は、本発明を実施するための発明者らに既知の最良の様式を含め、本明細書に記載されている。本明細書全体にわたって、「一実施形態」、「別の実施形態」、「一実施形態」などへの言及は、実施形態に関連して説明される特定の要素(例えば特徴、構造、及び/又は特性)が本明細書に記載の少なくとも1つの実施形態に含まれ、他の実施形態において存在してもよく、又は存在しなくてもよいことを意味する。これらの実施形態の変形形態は前述の説明を読めば当業者に明らかとなり得る。発明者らは、当業者がそのような変形形態を適切に用いることを予期しており、発明者らは、本発明が本明細書に明確に記載されたのとは異なる方法で実施されることを意図している。したがって、適用法によって認められるように、本発明は本明細書に添付の特許請求の範囲に列挙される主題のあらゆる変更形態及び均等形態を含む。さらに、本明細書において別段の指定がない限り又は文脈によって明確に否定されない限り、あらゆる考えられる変形形態における上記の要素の任意の組み合わせが本発明に包含される。
【図１】
2015530962.tif 000003
【図２】
2015530962.tif 000004
【図３】
2015530962.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成27年3月20日(2015.3.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノダイヤモンドコア、及び
ナノダイヤモンドコア上又はナノダイヤモンド近傍に配置されているシリカ層
を含む、シリカ被覆ナノダイヤモンド。
【請求項２】
シリカ層がナノダイヤモンドコア上に少なくとも部分的に配置されている、請求項1に記載のシリカ被覆ナノダイヤモンド。
【請求項３】
シリカ層が連続であり、ナノダイヤモンドコアを完全に覆ってコアシェル構造をもたらす、請求項1に記載のシリカ被覆ナノダイヤモンド。
【請求項４】
シリカ被覆ナノダイヤモンドが室温の水溶液中で少なくとも24時間安定である、請求項1に記載のシリカ被覆ナノダイヤモンド。
【請求項５】
シリカ層が官能化されている、請求項1に記載のシリカ被覆ナノダイヤモンド。
【請求項６】
シリカ層が、標識物質、治療薬、標的化剤、連結基、又は前述の任意のものの組み合わせで官能化されている、請求項1に記載のシリカ被覆ナノダイヤモンド。
【請求項７】
シリカ層が、オルトケイ酸テトラエチルを含むシリカ前駆体に由来する、請求項1に記載のシリカ被覆ナノダイヤモンド。
【請求項８】
それぞれが
ナノダイヤモンドコア、及び
ナノダイヤモンドコア上又はナノダイヤモンド近傍に配置されているシリカ層
を含む、複数のシリカ被覆ナノダイヤモンド。
【請求項９】
0.4以下の多分散指数を特徴とする、請求項8に記載の複数のシリカ被覆ナノダイヤモンド。
【請求項１０】
シリカ被覆ナノダイヤモンドの調製方法であって、
リポソーム中に封入されたナノダイヤモンドをシリカ前駆体と接触させるステップと、
シリカ前駆体を反応させてナノダイヤモンド上又はナノダイヤモンド近傍にシリカ層を形成させるステップと
を含む、方法。
【請求項１１】
シリカ被覆ナノダイヤモンドのシリカ層を官能化させるステップをさらに含む、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
リポソーム中に封入されたナノダイヤモンドをシリカ前駆体と接触させるステップが、
リン脂質フィルムをナノダイヤモンド及びシリカ前駆体の水溶液と接触させて脂質懸濁液を得るステップと、
脂質懸濁液を超音波処理してナノダイヤモンド及びシリカ前駆体が封入された単ラメラリポソームを得るステップと
を含む、請求項10に記載の方法。
【請求項１３】
単層リポソームが、10nm〜1,000nmの流体力学直径を特徴とする、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
シリカ前駆体がオルトケイ酸テトラアルキルを含み、前記方法が、
複数のナノダイヤモンド及びオルトケイ酸テトラアルキルを接触させるステップと、
複数のナノダイヤモンド及びオルトケイ酸テトラアルキルをリポソーム中に捕捉するステップと、
オルトケイ酸テトラアルキルを反応させてリポソーム中で複数のナノダイヤモンド上又はナノダイヤモンド近傍にシリカ層を形成させて、シリカ被覆ナノダイヤモンドを含む懸濁液を得るステップと、
シリカ被覆ナノダイヤモンドを精製するステップと
を含む、請求項10に記載の方法。
【請求項１５】
請求項10に記載の方法により作られる、シリカ被覆ナノダイヤモンド。
【国際調査報告】
2015530962.tif 000006
2015530962.tif 000007
2015530962.tif 000008
2015530962.tif 000009