(57)【要約】  ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）ゲノム中でポリヌクレオチドホスホリラーゼをコードする内在性ｐｎｐ遺伝子が、エタノール生産のために改善されたキシロース利用細胞を提供する修飾の標的として、同定された。さらに細胞は遺伝子修飾され、この遺伝子修飾がない細胞との比較で、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ＲＰＩ）活性の発現が増大し、ｐｎｐ修飾の不在下で、キシロースイソメラーゼ活性が制限されない。
2015502178.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）キシロースイソメラーゼ活性を有する、少なくとも１つのポリペプチドを含んでなるキシロース代謝経路；
ｂ）遺伝子修飾を欠く宿主細胞中のリボース−５−リン酸イソメラーゼ活性と比較して、前記宿主細胞中のリボース−５−リン酸イソメラーゼ活性を増大させる少なくとも１つの遺伝子修飾；
ｃ）コード領域を短縮して、Ｃ末端トランケート型タンパク質の発現をもたらす、ポリヌクレオチドホスホリラーゼをコードする内在性遺伝子配列中の少なくとも１つの遺伝子修飾を含んでなる、組換え細菌宿主細胞であって、
前記細菌宿主細胞が、キシロースを利用してエタノールを産生し、前記キシロースイソメラーゼ活性が前記細菌宿主細胞中で制限的でない、組換え細菌宿主細胞。
【請求項２】
（ｃ）の前記Ｃ末端トランケート型タンパク質が、前記ポリヌクレオチドホスホリラーゼをコードする内在性遺伝子によってコードされるＮ末端アミノ酸配列の少なくとも約３５０個のアミノ酸を含んでなる、請求項１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３】
（ｃ）の前記Ｃ末端トランケート型タンパク質が、Ｃ末端に少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでなる融合タンパク質の一部である、請求項１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項４】
前記リボース−５−リン酸イソメラーゼ活性を増大させる少なくとも１つの前記遺伝子修飾が、リボース−５−リン酸イソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内在性遺伝子の過剰発現である、請求項１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５】
前記リボース−５−リン酸イソメラーゼ活性を増大させる少なくとも１つの遺伝子修飾が、リボース−５−リン酸イソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの非内在性遺伝子の発現である、請求項１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６】
前記リボース−５−リン酸イソメラーゼ活性を有するポリペプチドが、ＥＣ分類ＥＣ  ５．３．１．６を有する、請求項１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項７】
前記リボース−５−リン酸イソメラーゼ活性を有するポリペプチドが、リボース−５−リン酸イソメラーゼＡおよびリボース−５−リン酸イソメラーゼＢからなる群から選択される、請求項６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項８】
前記キシロースイソメラーゼ活性を有するポリペプチドが、約０．２５マイクロモル生成物／ｍｇタンパク質／分超のキシロースイソメラーゼ活性を提供する、請求項１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項９】
前記キシロースイソメラーゼ活性を有するポリペプチドが、ＥＣ分類ＥＣ  ５．３．１．５を有する、請求項１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１０】
キシロースイソメラーゼ活性が、複数遺伝子から、変異高度活性プロモーターから、グループＩキシロースイソメラーゼから、およびその組み合わせからなる群から選択される方法を使用して発現される、請求項１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１１】
前記遺伝子修飾を欠く宿主細胞中のリブロース−ホスフェート３−エピメラーゼ活性と比較して、リブロース−ホスフェート３−エピメラーゼの発現を増大させる少なくとも１つの遺伝子修飾が起きる、請求項１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１２】
前記リブロース−３−リン酸エピメラーゼ活性を有するポリペプチドが、ＥＣ分類ＥＣ  ５．１．３．１を有する、請求項１１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１３】
前記細胞が、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）およびザイモバクター属（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選択される、請求項１に記載の細菌宿主細胞。
【請求項１４】
ａ）請求項１または２に記載の組換え細菌宿主細胞を提供するステップと；
ｂ）（ａ）の宿主細胞を、キシロースを含んでなる培地中で培養し、それによってキシロースがエタノールに変換されるステップと
を含んでなる、エタノールを生産する方法。
【請求項１５】
請求項１（ｂ）に記載のリボース−５−リン酸イソメラーゼ活性を有するポリペプチドが、ＥＣ分類ＥＣ  ５．３．１．６を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記培地が、キシロースを含む糖類混合物、または唯一の糖としてのキシロースのいずれかを含んでなる、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その内容全体を参照によって援用する、２０１１年１２月２０日に出願された、米国仮特許出願第６１／５７７８７１号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府の権利に関する記載
本発明は、エネルギー省によって与えられた契約番号第ＤＥ−ＦＣ３６−０７ＧＯ１７０５６の下に、米国政府の支援によってなされたものである。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、微生物学および遺伝子工学分野に関する。より具体的には、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）ゲノム中のｐｎｐ遺伝子が、改善されたキシロース利用およびエタノール産生を提供するための改質の標的として同定された。
【背景技術】
【０００４】
微生物によるエタノール生産は、化石燃料の代替エネルギー源を提供し、したがって最近の重要な研究領域である。キシロースは加水分解リグノセルロース系バイオマス中の主要な五炭糖であることから、エタノール、ならびにその他の有用な生成物を産生する微生物が、炭素源としてキシロースを利用できることが望ましい。バイオマスは、豊富に入手できる低コストの炭素基質を提供し得る。１）キシロースのキシルロースへの変換を触媒するキシロースイソメラーゼ；２）キシルロースをリン酸化してキシルロース−５−リン酸を形成するキシルロキナーゼ；３）トランスケトラーゼ；および４）トランスアルドラーゼをコードする遺伝子の導入によって、キシロースを天然で利用しない、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）およびその他の細菌エタノロジェンが、キシロース利用のために遺伝子改変されている（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、非特許文献１、非特許文献２）。典型的に、使用されたコード領域は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子からのものであった。
【０００５】
このキシロース利用経路の発現があっても、典型的に、改変株は、キシロース上でもならびにグルコース上でも増殖せず、エタノールも産生しない。特許文献５および特許文献６に記載されるように、キシロース利用について改変された株が、キシロース培地上での連続継代培養によって適応され、キシロース利用が改善された株がもたらされている。後者はまた、キシロース利用を改善するための、グルコースフルクトース酸化還元酵素をコードするＧＦＯＲ遺伝子座の不活性化も開示する。特許文献７で開示されるのは、変異高活性ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（Ｐｇａｐ）からの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現による、改善されたキシロース利用のための改変である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５５１４５８３号明細書
【特許文献２】米国特許第５７１２１３３号明細書
【特許文献３】米国特許第６５６６１０７号明細書
【特許文献４】国際公開第９５／２８４７６号パンフレット
【特許文献５】米国特許第７，２２３，５７５号明細書
【特許文献６】米国特許第７，７４１，１１９号明細書
【特許文献７】米国特許第７，９９８，７２２号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｆｅｌｄｍａｎｎら（１９９２）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：３５４−３６１
【非特許文献２】Ｚｈａｎｇら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：２４０−２４３；Ｙａｎａｓｅら（２００７）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｒｏｂｉｏｌ．７３：２５９２−２５９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
キシロース含有培地中における改善されたキシロース利用とエタノール産生がある、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の改変株およびその他の細菌エタノロジェン、そしてこれらの株を使用してエタノールを生産する方法に対する必要性が依然としてある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、その中で内在性ｐｎｐをコードする遺伝子ポリヌクレオチドホスホリラーゼが修正されている、組換えキシロース利用ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター属（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）細胞を提供する。さらに、細胞は、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ＲＰＩ）活性増大、および非制限的キシロースイソメラーゼ活性を有する。キシロース含有培地中のキシロース利用およびエタノール生成は、これらの細胞において改善されている。
【００１０】
したがって本発明は、
ａ）キシロースイソメラーゼ活性を有する、少なくとも１つのポリペプチドを含んでなるキシロース代謝経路；
ｂ）前記遺伝子修飾を欠く宿主細胞中のリボース−５−リン酸イソメラーゼ活性と比較して、宿主細胞中のリボース−５−リン酸イソメラーゼ活性を増大させる少なくとも１つの遺伝子修飾；および
ｃ）コード領域を短縮して、Ｃ末端トランケート型タンパク質の発現をもたらす、ポリヌクレオチドホスホリラーゼをコードする内在性遺伝子配列中の少なくとも１つの遺伝子修飾を含んでなる、組換え細菌宿主細胞を提供し、
細菌宿主細胞は、キシロースを利用してエタノールを産生し、細菌宿主細胞中のキシロースイソメラーゼ活性は非制限的である。
【００１１】
別の実施形態では本発明は、
ａ）上述の組換え宿主細胞を提供するステップと；
ｂ）（ａ）の宿主細胞をキシロースを含んでなる培地中で培養し、それによってキシロースがエタノールに変換されるステップと
を含んでなる、エタノールを生産する方法を提供する。
【００１２】
配列説明
出願人らは、「特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約」の条項に従って、以下の生物学的寄託を行った。
【００１３】
【表１】
2015502178.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】キシロース代謝およびエタノール産生の経路の略図を示す。
【図２】ＭＯＤｌｉｎｋｅｒ−Ｓｐｅｃ−ＧａｐＲｐｉのプラスミドマップを示す。
【図３Ａ】それぞれＲＰＩ過剰発現があるＢ９、Ｂ１１、Ｉ株と、親株ＺＷ８０１−４とを示す：ｍＲＭ３−Ｘ１０（Ａ）中の増殖。
【図３Ｂ】それぞれＲＰＩ過剰発現があるＢ９、Ｂ１１、Ｉ株と、親株ＺＷ８０１−４とを示す：５４時間目のキシロース消費およびリブロース生成（Ｂ）。
【図３Ｃ】それぞれＲＰＩ過剰発現があるＢ９、Ｂ１１、Ｉ株と、親株ＺＷ８０１−４とを示す：ｍＲＭ３−Ｇ１０中の増殖（Ｃ）。
【図４Ａ】追加的なキシロースイソメラーゼ（Ｉ（ｃｍ１−５、８、９））がある７つのＩ株形質転換体、ならびにＩ株（Ｉ−１、２）およびＺＷ８０１（８０１−１、２）対照を示す：ｍＲＭ３−Ｘ１０中の増殖（Ａ）。
【図４Ｂ】追加的なキシロースイソメラーゼ（Ｉ（ｃｍ１−５、８、９））がある７つのＩ株形質転換体、ならびにＩ株（Ｉ−１、２）およびＺＷ８０１（８０１−１、２）対照を示す：ｍＲＭ３−Ｇ１０中の増殖（Ｂ）。
【図５】追加的なキシロースイソメラーゼ（Ｉ（ｃｍ１、９））がある２つのＩ株形質転換体、ならびにＩ株、およびＺＷ８０１−４対照について、ｐＨ制御条件下におけるｍＲＭ３−Ｘ１０中の増殖を示す。
【図６Ａ】Ｂ１１対照（Ｂ１１−１、２）と共に、追加的なキシロースイソメラーゼ（Ｂ１１（ｃｍ１〜１０））がある１０個のＢ１１株形質転換体について、ｍＲＭ３−Ｘ１０中の増殖を示す（Ａ）。
【図６Ｂ】Ｂ１１対照（Ｂ１１−１、２）と共に、追加的なキシロースイソメラーゼ（Ｂ１１（ｃｍ１〜１０））がある１０個のＢ１１株形質転換体について、Ｂ９対照（Ｂ９−１、２）と共に追加的なキシロースイソメラーゼ（Ｂ９（ｃｍ１〜１０））がある１０個のＢ９株形質転換体を示す（Ｂ）。
【図７】野性型Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＭ４株ｐｎｐがコードするポリヌクレオチドホスホリラーゼ（配列番号２）と、Ｉ株の修正ｐｎｐ遺伝子によってコードされる融合タンパク質（配列番号９）とのアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図８−１】ｐＺＸ２１（Ａ）、ｐＺＸ５２（Ｂ）のプラスミドマップを示す。
【図８−２】ｐＺＸ６（Ｃ）のプラスミドマップを示す。
【図９−１】ｍＲＭ３−Ｇ１０内で増殖させたＺＷ１−Ｘ１０９（Ａ）、ＺＷ１−Ｘ２１０（Ｂ）の培養について、増殖、グルコース消費、およびエタノール生成のグラフを示す。
【図９−２】ｍＲＭ３−Ｇ１０内で増殖させた対照ＺＷ１（Ｃ）の培養について、増殖、グルコース消費、およびエタノール生成のグラフを示す。
【図１０−１】ｍＲＭ３−Ｘ１０内で増殖させたＺＷ１−１０９（Ａ）、ＺＷ１−２１０（Ｂ）の培養について、増殖、グルコース消費、およびエタノール生成のグラフを示す。
【図１０−２】ｍＲＭ３−Ｘ１０内で増殖させた対照ＺＷ１（Ｃ）の培養について、増殖、グルコース消費、およびエタノール生成のグラフを示す。
【図１１−１】ｐＰＮＰ−Ｉ（Ａ）、ｐＰＮＰ−ＩＮ（Ｂ）のプラスミドマップを示す。
【図１１−２】ｐＰＮＰ−Ｃ（Ｃ）、ｐＰＮＰ−Ｍ（Ｄ）のプラスミドマップを示す。
【図１２−１】ｍＲＭ３−Ｇ１０中で増殖させた、ＺＷ１−Ｘ１０９−ＰＮＰｉ（Ａ）、ＺＷ１−Ｘ１０９−ＰＮＰｃ（Ｂ）の培養について、増殖、グルコース消費、およびエタノール生成のグラフを示す。
【図１２−２】ｍＲＭ３−Ｇ１０中で増殖させた、ＺＷ１−Ｘ１０９−ＰＮＰｍ（Ｃ）、ＺＷ１−Ｘ１０９−ＰＮＰｉｎ（Ｄ）の培養について、増殖、グルコース消費、およびエタノール生成のグラフを示す。
【図１２−３】ｍＲＭ３−Ｇ１０中で増殖させた、対照ＺＷ１−Ｘ１０９（Ｅ）の培養について、増殖、グルコース消費、およびエタノール生成のグラフを示す。
【図１３−１】ｍＲＭ３−Ｘ１０中で増殖させた、ＺＷ１−Ｘ１０９−ＰＮＰｉ（Ａ）、ＺＷ１−Ｘ１０９−ＰＮＰｃ（Ｂ）の培養について、増殖、グルコース消費、およびエタノール生成のグラフを示す。
【図１３−２】ｍＲＭ３−Ｘ１０中で増殖させた、ＺＷ１−Ｘ１０９−ＰＮＰｍ（Ｃ）、ＺＷ１−Ｘ１０９−ＰＮＰｉｎ（Ｄ）の培養について、増殖、グルコース消費、およびエタノール生成のグラフを示す。
【図１３−３】ｍＲＭ３−Ｘ１０中で増殖させた、対照ＺＷ１−Ｘ１０９（Ｅ）の培養について、増殖、グルコース消費、およびエタノール生成のグラフを示す。
【図１４−１】ｍＲＭ３−Ｘ１０内で増殖させたＺＷ８０１−ＰＮＰｉ（Ａ）、ＺＷ８０１−ＰＮＰｃ（Ｂ）の培養について、増殖、キシロース消費、およびエタノール生成のグラフを示す。
【図１４−２】ｍＲＭ３−Ｘ１０内で増殖させた対照ＺＷ８０１（Ｃ）の培養について、増殖、キシロース消費、およびエタノール生成のグラフを示す。
【００１５】
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１−１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含有する特許出願の要件−配列の規則」）に準拠し、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）基準ＳＴ．２５（２００９）、ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表の要件（規則５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）、ならびに実施細則の第２０８節および付録Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに使用される記号および形式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に示される規則に従う。
【００１６】
配列番号１は、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＭ４株からのｐｎｐコード領域のヌクレオチド配列である。
【００１７】
配列番号２は、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＭ４株からのｐｎｐがコードするポリヌクレオチドホスホリラーゼのアミノ酸配列である。
【００１８】
配列番号３は、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）ＮＣＩＭＢ  １１１６３株からのｐｎｐコード領域のヌクレオチド配列である。
【００１９】
配列番号４は、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）ＮＣＩＭＢ１１１６３株からのｐｎｐがコードするポリヌクレオチドホスホリラーゼのアミノ酸配列である。
【００２０】
配列番号５は、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ  １０９８８株からのｐｎｐコード領域のヌクレオチド配列である。
【００２１】
配列番号６は、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ  １０９８８株からのｐｎｐがコードするポリヌクレオチドホスホリラーゼのアミノ酸配列である。
【００２２】
配列番号７は、ザイモモナス・モビリス亜種ポマセアエ（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ  ｐｏｍａｃｅａｅ）ＡＴＣＣ  ２９１９２株からのｐｎｐコード領域のヌクレオチド配列である。
【００２３】
配列番号８は、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ  ２９１９２株からのｐｎｐがコードするポリヌクレオチドホスホリラーゼのアミノ酸配列である。
【００２４】
配列番号９は、７０９個の天然Ｎ末端アミノ酸および１４個の追加的なＣ末端アミノ酸を有する、Ｉ株の修飾ｐｎｐがコードする融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【００２５】
配列番号１０は、６９５個の天然Ｎ末端アミノ酸および２個の追加的なＣ末端アミノ酸を有する、修飾ｐｎｐがコードする融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【００２６】
配列番号１１は、３６８個の天然Ｎ末端アミノ酸および１０個の追加的なＣ末端アミノ酸を有する、修飾ｐｎｐがコードする融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【００２７】
配列番号１２は、３２個の天然Ｎ末端アミノ酸および１７個の追加的なＣ末端アミノ酸を有する、修飾ｐｎｐがコードする融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【００２８】
配列番号１３は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＲＰＩタンパク質のコード領域のヌクレオチド配列である。
【００２９】
配列番号１４は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＲＰＩタンパク質のアミノ酸配列である。
【００３０】
配列番号１５は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＰＩタンパク質のコード領域のヌクレオチド配列である。
【００３１】
配列番号１６は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＰＩタンパク質のアミノ酸配列である。
【００３２】
配列番号１７は、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）中の発現のためにコドン最適化された、アクチノプラネス・ミズーリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）キシロースイソメラーゼのコード領域のヌクレオチド配列である。
【００３３】
配列番号１８は、アクチノプラネス・ミズーリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）キシロースイソメラーゼのアミノ酸配列である。
【００３４】
配列番号１９は、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）リブロース−リン酸３−エピメラーゼのコード領域のヌクレオチド配列である。
【００３５】
配列番号２０は、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）リブロース−リン酸３−エピメラーゼのアミノ酸配列である。
【００３６】
配列番号２１は、ＰｇａｐＳ  （８０１ｇａｐとも称される）変異プロモーターのヌクレオチド配列である。
【００３７】
配列番号２２は、固有ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ部位間に位置する、プラスミドｐＺＢ１８８ａａｄＡ／Ｇａｐ／Ｚｙｍｏ  ＲＰＩ／ＥｃｏｌｉＳＬ中にあるＲＰＩ発現カセットのヌクレオチド配列である。
【００３８】
配列番号２３および２４は、プライマーＰＰＩ−ＦおよびＰＰＩ−Ｒ−ＳｂｆＩである。
【００３９】
配列番号２５は、プラスミドｐＺＸ２１のヌクレオチド配列である。
【００４０】
配列番号２６は、ＧＦＯ−Ｌ断片のヌクレオチド配列である。
【００４１】
配列番号２７は、ｇｆｏｒコード配列のヌクレオチド配列である。
【００４２】
配列番号２８は、ＧＦＯ−Ｒ断片のヌクレオチド配列である。
【００４３】
配列番号２９は、３０４ｂｐのＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）Ｓｕｐｅｒ  ＧＡＰプロモーター、１，１８５ｂｐのＡ．ミズーリエンシス（Ａ．ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）ｘｙｌＡコード配列、および１６６ｂｐの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ａｒａＤ  ３’ＵＴＲを含有し、５’ＸｂａＩ部位がある、１，６６１ｂｐのキメラｘｙｌＡ遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００４４】
配列番号３０は、１９１ｂｐのＰｅｎｏ、１，４５５ｂｐの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｘｙｌＢコード配列、および３１４ｂｐの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｘｙｌＢ  ３’ＵＴＲを含有する、１，９６０ｂｐのキメラｘｙｌＢ遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００４５】
配列番号３１は、ｌｏｘ部位と境を接する、１，０１４ｂｐのａａｄＡマーカー（スペクチノマイシン耐性；Ｓｐｅｃ−Ｒ）のヌクレオチド配列である。
【００４６】
配列番号３２は、シャトルベクターｐＺＸ５２のヌクレオチド配列である。
【００４７】
配列番号３３は、ＬＤＨ−Ｌ断片のヌクレオチド配列である。
【００４８】
配列番号３４は、ＬＤＨ−Ｒ断片のヌクレオチド配列である。
【００４９】
配列番号３５は、ｌｄｈＡコード配列のヌクレオチド配列である。
【００５０】
配列番号３６は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＧＡＰプロモーター（ＰｇａｐＴ）の３０４ｂｐのＴ変異、９５４ｂｐの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔａｌコード領域、１，９９２ｂｐの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｋｔコード領域、および６８ｂｐの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｋｔ  ３’ＵＴＲを含有する、３，３３９ｂｐのＰｇａｐＴ−Ｔａｌ−Ｔｋｔオペロンのヌクレオチド配列である。
【００５１】
配列番号３７は、ＰｇａｐＴプロモーターのヌクレオチド配列である。
【００５２】
配列番号３８は、１９１ｂｐのＰｅｎｏ、４７１ｂｐのＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）Ｒｐｉコード配列、６６３ｂｐのＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）Ｒｐｅコード配列、および３５ｂｐの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｘｙｌＡ  ３’ＵＴＲを含有する、１，４４３ｂｐのＰｅｎｏ−Ｒｐｉ−Ｒｐｅオペロンのヌクレオチド配列である。
【００５３】
配列番号３９は、ＤＣＯシャトルベクターｐＺＸ６のヌクレオチド配列である。
【００５４】
配列番号４０は、ＰＮＰ−Ｌ断片のヌクレオチド配列である。
【００５５】
配列番号４１は、ＰＮＰ−Ｒ断片のヌクレオチド配列である。
【００５６】
配列番号４２〜５４は、ＰＣＲプライマーである。
【００５７】
配列番号５５は、ＤＣＯ自殺ベクターｐＰＮＰ−Ｉのヌクレオチド配列である。
【００５８】
配列番号５６は、ｐｎｐ遺伝子に組み込むための上流フランキング配列のヌクレオチド配列である。
【００５９】
配列番号５７は、ｐｎｐ遺伝子に組み込むための下流フランキング配列のヌクレオチド配列である。
【００６０】
配列番号５８は、ＤＣＯ自殺ベクターｐＰＮＰ−ＩＮのヌクレオチド配列である。
【００６１】
配列番号５９は、ＰＮＰ−Ｕ断片のヌクレオチド配列である。
【００６２】
配列番号６０は、ＰＮＰ−Ｄ断片のヌクレオチド配列である。
【００６３】
配列番号６１は、ＤＣＯ自殺ベクターｐＰＮＰ−Ｃのヌクレオチド配列である。
【００６４】
配列番号６２は、ＤＣＯ自殺ベクターｐＰＮＰ−Ｍのヌクレオチド配列である。
【００６５】
配列番号６３は、ＰＮＰｍ−Ｌ断片のヌクレオチド配列である。
【００６６】
配列番号６４は、ＰＮＰｍ−Ｒ断片のヌクレオチド配列である。
【００６７】
配列番号６５は、開始コドンがＡＴＧに変異している、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＲＰＩタンパク質からのコード領域のヌクレオチド配列である。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
本明細書で開示されるのは、キシロース利用細菌細胞であり、具体的には内在性ｐｎｐ遺伝子の遺伝子修飾（ｐｎｐ修飾）を有する、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター属（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）細胞である。さらに細胞は、遺伝子修飾されて、この遺伝子修飾のない細胞との比較で、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ＲＰＩ）活性の発現増大を有する。さらに細胞は、ｐｎｐ改質不在下では、キシロースイソメラーゼ活性が制限されない。これらの特性がある細胞は、糖化バイオマスをはじめとするキシロースを含有する培地中での増殖のために所望される改善されたキシロース利用を有して、エタノール生産増大につながる。エタノールは、化石燃料の置き換えにおいて使用される、重要な化合物であり、糖化バイオマスは、発酵によるエタノール生産のための豊富に入手できる再生可能な炭素源を提供する。
【００６９】
特許請求の範囲および明細書の解釈のために、以下の定義を使用してもよい。
【００７０】
本明細書の用法では、「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ））」、「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語、またはそれらのあらゆるその他の変化形は、非排他的包含をカバーすることが意図される。例えば要素の一覧を含んでなる組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置は、必ずしもこれらの構成要件のみに限定されず、明示的に列挙されない、またはこのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置に固有のその他の要素を含んでもよい。さらに特に断りのない限り、「または（ｏｒ）」は排他的またはでなく包括的またはを指す。例えば条件ＡまたはＢは、以下のいずれかによって満たされる：Ａが真で（または存在し）Ｂが偽であり（または存在せず）、Ａが偽で（または存在せず）Ｂが真であり（または存在する）、ＡおよびＢの双方が真である（または存在する）。
【００７１】
さらに本発明の構成要件または構成要素に先立つ不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、構成要件または構成要素の事例数（すなわち発生率）に関して非制限的であることが意図される。したがって「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは少なくとも１つを含むものと解釈すべきであり、構成要件または構成要素の単数語形は、数が単数であることを明らかに意味する場合を除いて、複数もまた含む。
【００７２】
「発明」または「本発明」という用語は、本明細書の用法では非限定的用語であり、特定の発明のいずれかの単一の実施形態を指すことは意図されず、本明細書および特許請求の範囲に記載される全ての可能な実施形態を包含する。
【００７３】
本明細書の用法では、本発明で用いられる成分または反応物質の量を修飾する「約」という用語は、例えば実際の濃縮物または調製溶液の作成で使用される、典型的な測定および液体取り扱い手順を通じて；これらの手順における不注意による誤りを通じて；組成物作成または方法実施で用いられる成分の、製造、供給元または純度の差異などを通じて、生じ得る数量の変動を指す。「約」という用語はまた、特定の最初の混合物から生じる組成物の異なる平衡条件のために、異なる量も包含する。「約」という用語によって修飾されるか否かを問わず、特許請求の範囲には量の同等物が含まれる。一実施形態では、「約」という用語は、報告された数値の１０％以内、好ましくは報告された数値の５％以内を意味する。
【００７４】
「炭素基質」または「発酵性炭素基質」という用語は、本発明の宿主生物によって代謝される能力のある炭素源、特に単糖類、オリゴ糖類、および多糖類からなる群から選択される炭素源を指す。
【００７５】
「遺伝子」は、コード配列に先行する（５’非コード配列）および後続の（３’非コード配列）制御配列が任意選択的に含まれてもよい、特異的タンパク質または機能的ＲＮＡ分子を発現する、核酸断片を指す。「天然遺伝子」または「野性型遺伝子」とは、それ自体の制御配列と共に天然に見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」とは、自然界では一緒に見られない調節およびコード配列を含んでなる、天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる起源に由来する制御配列およびコード配列、または同一起源に由来するが、天然に見られるのと異なる様式で配列される制御配列およびコード配列を含んでなってもよい。「内在性遺伝子」とは、生物のゲノム中のその自然な位置にある天然遺伝子を指す。「外来」遺伝子とは、常態では宿主生物に見られないが、遺伝子移入によって宿主生物に導入された遺伝子を指す。外来遺伝子は、非天然生物中に挿入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含んでなり得る。「遺伝子座」は、遺伝子を含有するゲノム領域である。
【００７６】
「遺伝子コンストラクト」という用語は、１つまたは複数の特定タンパク質または機能性ＲＮＡ分子の発現をコードする、核酸断片を指す。遺伝子コンストラクト中では、遺伝子は天然、キメラ、または外来性であってもよい。典型的に遺伝子コンストラクトは、「コード配列」を含んでなる。「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。
【００７７】
「プロモーター」または「開始制御領域」という用語は、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列を指す。一般にコード配列は、プロモーター配列の３’に位置する。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来してもよく、または自然界に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素から構成されてもよく、または合成ＤＮＡセグメントを含んでなってさえよい。当業者は、異なる組織または細胞タイプ中で、または異なる発達段階で、または異なる環境条件に答えて、異なるプロモーターが遺伝子発現を指示してもよいことを理解する。ほとんどの場合にほとんどの細胞型中で遺伝子が発現されるようにするプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。
【００７８】
「遺伝子修飾」という用語は、それらが表現型の変化を生じるかどうかに関わりなく、あらゆる修飾、変異、塩基欠失、塩基付加、コドン修飾、遺伝子過剰発現、遺伝子抑制、プロモーター修飾または置換、遺伝子付加（単一またはマルチコピーのいずれか）、アンチセンス発現または抑制、あるいは宿主細胞または細菌系統の遺伝要素に対するあらゆるその他の変化を非包括的に指す。
【００７９】
「組換え細菌宿主細胞」という用語は、少なくとも１つの非相同遺伝子または遺伝子コンストラクトまたは核酸断片を含んでなる細菌細胞を指す。
【００８０】
「発現」という用語は、本明細書の用法では、遺伝子に由来する、コード（ｍＲＮＡ）または機能性ＲＮＡの転写と安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を指してもよい。「アンチセンス阻害」は、標的タンパク質の発現を抑制する能力のあるアンチセンスＲＮＡ転写物の生成を指す。「過剰発現」は、標準または非形質転換生物中の生成レベルを超える、遺伝子組換え生物中における遺伝子産物の生成を指す。「コサプレッション」は、同一または実質的に同様の外来性または内在性遺伝子の発現を抑制する能力のある、センスＲＮＡ転写物または断片の生成を指す（米国特許第５，２３１，０２０号明細書）。「形質転換」という用語は、本明細書の用法では、遺伝的に安定した遺伝形質がもたらされる、宿主生物への核酸断片の移入を指す。移入核酸は、宿主細胞中で維持されるプラスミドの形態であってもよく、またはいくつかの移入核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよい。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「遺伝子導入」または「組換え」または「形質転換」生物と称される。
【００８１】
「プラスミド」および「ベクター」という用語は、本明細書の用法では、細胞の中央代謝の一部ではない遺伝子を保有することが多く、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である染色体外要素を指す。このような要素は、あらゆる起源に由来する一本または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの、直鎖または環の、自己複製配列、ゲノム一体化配列、ファージまたはヌクレオチド配列であってもよく、その中でいくつかのヌクレオチド配列は連結または組換えされて、適切な３’非翻訳配列と共に、選択された遺伝子産物のためのプロモーター断片とＤＮＡ配列とを細胞に導入できる、独自の構造になる。
【００８２】
「作動的に結合する」という用語は、一方の機能が他方の機能によって影響される、単一核酸断片上の核酸配列のつながりを指す。例えばプロモーターは、コード配列の発現に影響できる場合、そのコード配列と作動的に結合する（すなわちコード配列は、プロモーターの転写調節下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンスオリエンテーションで、制御配列に作動的に結合し得る。
【００８３】
「選択可能なマーカー」という用語は、通常はマーカー遺伝子の効果、すなわち抗生物質耐性に基づいて選択できる、抗生物質または耐薬品性遺伝子である識別因子を意味し、効果は、対象核酸の遺伝形質を追跡し、および／または対象核酸を引き継いだ細胞または生物を同定するために使用される。
【００８４】
本明細書の用法では、「コドン縮重」とは、コードされるタンパク質のアミノ酸配列に影響を及ぼさないヌクレオチド配列の多様性を可能にする、遺伝子コードの性質を指す。当業者は、所定のアミノ酸を特定するヌクレオチドコドン使用における、特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」について良く知っている。したがって宿主細胞中の改善された発現のために遺伝子を合成する場合、そのコドン使用頻度が、宿主細胞の好むコドン使用頻度に近くなるように遺伝子をデザインすることが望ましい。
【００８５】
様々な宿主の形質転換のための、遺伝子または核酸分子のコード領域に言及する「コドン最適化」という用語は、ＤＮＡによってコードされるタンパク質を変更することなく、宿主生物の典型的なコドン使用頻度を反映する、遺伝子または核酸分子コード領域のコドンの変更を指す。
【００８６】
「リグノセルロース系」という用語は、リグニンとセルロースの双方を含んでなる組成物を指す。リグノセルロース系物質はまた、ヘミセルロースを含んでなってもよい。
【００８７】
「セルロース系」という用語は、セルロースと、ヘミセルロースを含む追加的な成分とを含んでなる、組成物を指す。
【００８８】
「糖化」という用語は、多糖類からの発酵性糖類生成を指す。
【００８９】
「前処理バイオマス」という用語は、糖化に先だって、物理的、化学的および／または熱的に前処理されて、バイオマス中の多糖類へのアクセスしやすさが増大されている、バイオマスを意味する。
【００９０】
「バイオマス」は、セルロースを含んでなり、任意選択的に、ヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖類および／または単糖類をさらに含んでなる材料をはじめとする、あらゆるセルロース系またはリグノセルロース系材料を指す。バイオマスはまた、タンパク質および／または脂質などの追加的な成分を含んでなってもよい。バイオマスは単一起源に由来してもよく、またはバイオマスは２種以上の原料に由来する混合物を含んでなり得る；例えばバイオマスは、トウモロコシ穂軸とトウモロコシ茎葉の混合物、または草と葉の混合物を含んでなることもあり得る。バイオマスとしては、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固形廃棄物、産業固形廃棄物、製紙業汚泥、庭ごみ、木材および林業廃棄物が挙げられるが、これに限定されるものではない。バイオマスの例としては、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ苞葉などの作物残渣、トウモロコシ茎葉、牧草、麦藁、大麦藁、乾草、稲藁、スイッチグラス、古紙、サトウキビバガス、ソルガム、大豆、穀物製粉から得られる成分、樹木、枝、根、葉、木片、おがくず、灌木および低木、野菜、果実、花卉、および家畜糞尿が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００９１】
「バイオマス加水分解物」は、バイオマスの糖化から得られる生成物を指す。バイオマスはまた、糖化に先だって前処理または予備加工されてもよい。
【００９２】
「キシロース代謝経路」または「キシロース利用経路」という用語は、フルクトース−６−リン酸および／またはグリセルアルデヒド−６−リン酸を経由してキシロースを代謝する一連の酵素（遺伝子によってコードされる）を指し、１）キシロースのキシルロースへの変換を触媒するキシロースイソメラーゼ；２）キシルロースをリン酸化してキシルロース−５−リン酸を形成するキシルロキナーゼ；３）トランスケトラーゼ；および４）トランスアルドラーゼを含む。
【００９３】
「キシロースイソメラーゼ」という用語は、Ｄ−キシロースとＤ−キシルロースの相互変換を触媒する酵素を指す。キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）は、ＥＣ  ５．３．１．５に分類される酵素群に属する。
【００９４】
「Ｅ値」という用語は、バイオインフォマティクス技術分野で公知のように、一致が偶発する確率を提供する「期待値」である。これは、配列一致の統計的有意性を提供する。Ｅ値が低いほど、ヒットはより有意性が高い。
【００９５】
「リボース−５−リン酸イソメラーゼ」または「ＲＰＩ」という用語は、リブロース−５−リン酸とリボース−５−リン酸の相互変換を触媒する酵素を指す。リボース−５−リン酸イソメラーゼは、ＥＣ  ５．３．１．６に分類される酵素群に属する。
【００９６】
「リブロース−リン酸３−エピメラーゼ」または「ＲＰＥ」という用語は、Ｄ−リブロース５−リン酸とＤ−キシルロース−５−リン酸の相互変換を触媒して、ＥＣ  ５．１．３．１に分類される酵素を指す。
【００９７】
「Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＲＰＩ−Ａ」という用語は、当該技術分野でＲＰＩ−ＡとラベルされるＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＲＰＩを指す。しかしＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＲＰＩタンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＰＩ−Ａタンパク質（２０％）よりも大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＰＩ−Ｂタンパク質（３６％）に近い配列同一性を有し、参照によって本明細書に援用する、国際公開第２０１２／００６０６１号パンフレットとして公開された、同一譲受人同時係属米国特許出願公開第１３／１６１７３４号明細書に記載されるＲＰＩのさらなる分析は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＲＰＩをＲＰＩ−Ｂ群に位置づける。しかし本明細書では、その公に知られている名称に添って、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＲＰＩをＲＰＩ−Ａと称する。
【００９８】
「ｐｎｐ遺伝子」という用語は、ポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼとも称される、ポリヌクレオチドホスホリラーゼをコードする遺伝子を指す。この酵素は二官能性であり、リン酸化的（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｉｔｉｃ）３’から５’へのエキソリボヌクレアーゼ活性および３’末端オリゴヌクレオチドポリメラーゼ活性がある。これはｍＲＮＡプロセッシングおよび分解に関与して、ＥＣ  ２．７．７．８に分類される。
【００９９】
「天然アミノ酸」という用語は、内在性遺伝子によってコードされるペプチド配列位置で発生するアミノ酸を指す。
【０１００】
「非天然アミノ酸」という用語は、内在性遺伝子によってコードされない位置にあるアミノ酸を指す。
【０１０１】
「Ｎ末端アミノ酸配列」という用語は、ポリペプチドのＮ末端に開始するアミノ酸配列を指す。第１のＮ末端アミノ酸は、「１」と数えられる。
【０１０２】
「異種」という用語は、天然では対象位置に見られないことを意味する。例えば異種遺伝子は、天然では宿主生物中に見られないが、遺伝子移入によって宿主生物に導入された遺伝子を指す。例えばキメラ遺伝子中に存在する異種核酸分子は、天然で互いに結合しないコード領域とプロモーター部分を有する核酸分子などの、天然ではキメラ遺伝子のその他の部分に結合して見られない核酸分子である。
【０１０３】
本明細書の用法では、「単離核酸分子」は、合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を任意選択的に含有する、一本または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡポリマーの形態の単離核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つまたは複数の部分を含んでなってもよい。
【０１０４】
核酸断片は、温度および溶液イオン強度の適切な条件下で、核酸断片の一本鎖形態が、その他の核酸断片とアニールし得る場合に、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ分子などの別の核酸断片と「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）、特にその中の第１１章および表１１．１（その内容全体を参照によって本明細書に援用する）で例示される。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。ストリンジェンシー条件を調節して、（遠縁の生物からの相同的な配列などの）中程度に類似した断片から、（近縁関係にある生物からの機能酵素を複製する遺伝子などの）類似性の高い断片までをスクリーニングし得る。ハイブリダイゼーション後の洗浄が、ストリンジェンシー条件を決定する。好ましい一組の条件では、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを室温で１５分間に始まり、次に２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを４５℃で３０分間を繰り返し、次に０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを５０℃で３０分間を２回繰り返す一連の洗浄が使用される。より望ましいストリンジェントな条件の組は、より高い温度を使用し、洗浄は、最後の０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中の２回の３０分間の洗浄温度が６０℃に増大されたことを除いて、上と同じである。別の好ましい高度にストリンジェントな条件の組は、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃の２回の最後の洗浄を使用する。追加的なストリンジェントな条件の組としては、例えば０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃のハイブリダイゼーションと、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳとそれに続く０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄が挙げられる。
【０１０５】
ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的配列を含有することを要するが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー次第で、塩基間のミスマッチが可能である。核酸をハイブリダイズするための適切なストリンジェンシーは、当該技術分野で周知の変数である核酸の長さと相補性の程度に左右される。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きいほど、これらの配列を有する核酸がハイブリダイズするためのＴｍ値は、より大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（より高いＴｍに相当する）は、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡの順で低下する。１００ヌクレオチド長を超えるハイブリッドでは、Ｔｍを計算する方程式が導かれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出，９．５０−９．５１を参照されたい）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションでは、ミスマッチの位置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出，１１．７−１１．８を参照されたい）。一実施形態では、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである。好ましくは、ハイブリダイズ可能な核酸の最小長さは、少なくとも約１５ヌクレオチドであり；より好ましくは、少なくとも約２０ヌクレオチドであり；最も好ましくは、長さは少なくとも約３０ヌクレオチドである。さらに当業者は、プローブ長などの要素次第で、必要に応じて温度および洗浄液塩濃度を調節してもよいことを認識する。
【０１０６】
「相補的」という用語は、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関係性を記述するために使用される。例えばＤＮＡに関しては、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。
【０１０７】
「％同一性」と言う用語は、当該技術分野で公知のように、配列を比較して判定される２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の関係である。当該技術分野では「同一性」はまた、場合によっては、このような一連の配列間の一致によって測定される、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」および「類似性」は、１．）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ（１９８８）；２．）Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ（１９９３）；３．）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編）Ｈｕｍａｎｉａ：ＮＪ（１９９４）；４．）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７）；および５．）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１）に記載されるものをはじめとするが、これに限定されるものではない公知の方法によって、容易に計算され得る。
【０１０８】
同一性を判定する好ましい方法は、試験される配列間に最良の整合を与えるようにデザインされる。同一性および類似性を判定する方法は、一般に入手できるコンピュータプログラムで体系化されている。配列アラインメントおよび％同一性の計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムを使用して実施してもよい。配列の多重アラインメントは、（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ら，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，８：１８９−１９１（１９９２））によって記載され、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ８．０プログラムにある、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖと標識されたアラインメント法に相当する「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｖ法」をはじめとする、アルゴリズムのいくつかの変種を包含する、「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ法」を使用して実施される。複数のアラインメントでは、デフォルト値は、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に相当する。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用したペアワイズアラインメントおよびタンパク質配列の％同一性の計算のデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸では、これらのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖプログラムを使用した配列のアラインメント後、同プログラムの「配列距離」表を見ることで、「％同一性」を得ることが可能である。さらに「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法」が利用でき、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗと標識されるアラインメント法に相当する（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇら．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９−１９１（１９９２））によって記載され、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎ  ｖ８．０プログラムにある。多重アラインメントのデフォルトパラメータ（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、Ｄｅｌａｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎ  Ｓｅｑｓ（％）＝３０、ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ  Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢ）。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラムを使用した配列のアラインメント後、同プログラムの「配列距離」表を見ることで、「％同一性」を得ることが可能である。
【０１０９】
その他の種からの同一または同様の機能または活性を有するポリペプチドを同定する上で、多くのレベルの配列同一性が有用であることを当業者は良く理解している。％同一性の有用な例としては、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％が挙げられ得るが、これに限定されるものではなく、または２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％などの２５％〜１００％の任意の整数百分率が、本発明を説明する上で有用なこともある。適切な核酸断片は、上の相同性を有するだけでなく、典型的に少なくとも５０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸、およびより好ましくは少なくとも１５０個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする。
【０１１０】
「配列分析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析に有用なあらゆるコンピュータアルゴリズム、またはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は市販されることもあり、または独立して開発されることもある。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、１．）プログラムのＧＣＧスイート（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；２．）ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））；３．）ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；４．）Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）；および５．）Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを組み込んだＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４），Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９９２，１１１−２０．Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。本出願の文脈内では、特に断りのない限り、分析のために配列分析ソフトウェアが使用される場合、分析結果は、言及されるプログラムの「デフォルト値」に基づくものと理解される。本明細書での用法では、「デフォルト値」とは、ソフトウェアを初期化した際に、初めからロードされる値またはパラメータのあらゆる組を意味する。
【０１１１】
本明細書で使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２００１）；およびＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ  Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）；およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈＥｄ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．，２００２に記載される。
【０１１２】
本発明は、キシロース含有培地中で発酵させると改善されたキシロース利用を有する、キシロース利用細菌、特にザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター属（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）の改変細胞に関する。典型的にバイオマスの前処理および糖化によって生成されるバイオマス加水分解産物を含む培地における、生体触媒発酵によるエタノール生産改善の難しい課題は、キシロースの最適な利用を得ることである。キシロースは、加水分解リグノセルロース系バイオマス中の主要な五炭糖の１つであり、もう１つはアラビノースである。出願人らは、リボース−５−リン酸イソメラーゼの発現増大と組み合わされた、非制限的キシロースイソメラーゼ活性の存在下における、内在性ｐｎｐ遺伝子の改質が、キシロース利用細胞中におけるキシロース利用の効率増大をもたらし、したがってキシロース含有培地中で発酵させた場合に、より高いエタノール収量をもたらすことを発見した。
【０１１３】
内在性ｐｎｐ遺伝子修飾
本発明は、修飾内在性ｐｎｐ遺伝子を有する、改変キシロース利用ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター属（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）細胞を対象とする。内在性ｐｎｐ遺伝子のコード領域は、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ活性があるタンパク質をコードする。コードされたタンパク質は、ポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼとも称される。内在性ｐｎｐ遺伝子のコード領域中の修飾は、下述するようにさらに改変された改変ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の細胞中で、キシロース利用を改善することが、本明細書で分かった。
【０１１４】
ポリヌクレオチドホスホリラーゼまたはポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性があるタンパク質をコードすると同定されたザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター属（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）のあらゆる遺伝子が、本明細書に記載されるような修飾のための標的内在性ｐｎｐ遺伝子を提供してもよい。ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＭ４株のｐｎｐコード領域は、配列番号１の配列を有する。ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）のその他の株からの既知の内在性ｐｎｐコード領域は、配列番号１と、９９％（Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＮＣＩＭＢ  １１１６３；配列番号３）、９８％（Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ  １０９８８；配列番号５）、および８３％（Ｚ．モビリス亜種ポマセアエ（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ  ｐｏｍａｃｅａｅ）ＡＴＣＣ  ２９１９２；配列番号７）の同一性がある配列を有する。これらの配列のいずれかを、またはこれらの配列のいずれか１つと少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性があり、ポリヌクレオチドホスホリラーゼまたはポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼをコードすると同定された任意の配列を、下述するような修飾のための標的として使用してもよい。ＢＬＡＳＴ分析または当業者に良く知られているその他の配列比較分析を使用して、追加的な標的内在性ｐｎｐ遺伝子配列を同定してもよい。
【０１１５】
本細胞中では、ｐｎｐコード領域が修飾されて３’末端コード領域が短縮され、天然にコードされたタンパク質との比較で、Ｃ末端トランケート型タンパク質発現がもたらされる。ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）の天然にコードされたポリヌクレオチドホスホリラーゼは、配列番号２、４、６、８のいずれかの約７４８個のアミノ酸のタンパク質であり、またはこれらの配列のいずれか１つと少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性があって、ポリヌクレオチドホスホリラーゼまたはポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼと同定された、あらゆる配列のタンパク質である。一実施形態では、修飾ｐｎｐコード領域から発現されたトランケート型タンパク質は、ポリヌクレオチドホスホリラーゼをコードする内在性遺伝子によってコードされる天然Ｎ末端アミノ酸である、Ｎ末端アミノ酸配列の少なくとも約３５０個のアミノ酸を保持する。トランケート型タンパク質は、少なくとも約３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０。５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、または７１０個の天然Ｎ末端アミノ酸を保持する。
【０１１６】
一実施形態では、内在性ｐｎｐコード領域に対する遺伝子修飾は、融合タンパク質が生じるように、トランケート型天然コード領域に隣接してその枠内に、非天然アミノ酸のコード配列を付加する。例えば在性遺伝子によってコードされない、追加的な約１〜約２０個のアミノ酸のコード領域を、トランケート型天然コード領域に隣接してその枠内に付加し、Ｃ末端に最高約２０個の非天然アミノ酸を有する融合タンパク質を生成してもよい。次にＣ末端トランケート型タンパク質は、融合タンパク質の一部となる。様々な実施形態において、Ｃ末端に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上の非天然アミノ酸があってもよい。ポリヌクレオチドホスホリラーゼをコードする内在性遺伝子の遺伝子修飾に起因してもよい融合タンパク質のいくつかの非制限的例としては、１）７０９個の天然Ｎ末端アミノ酸を保持して１４個の追加的なＣ末端アミノ酸を含む（配列番号９）；２）６９５個の天然Ｎ末端アミノ酸を保持して２個の追加的なＣ末端アミノ酸を含む（配列番号１０）；３）３６８個の天然Ｎ末端アミノ酸を保持して１０個の追加的なＣ末端アミノ酸を含む（配列番号１１）；および４）３２個の天然Ｎ末端アミノ酸を保持して１７個の追加的なＣ末端アミノ酸を含む（配列番号１２）タンパク質が挙げられる。
【０１１７】
内在性ｐｎｐコード領域は、当業者に知られている任意の方法によって、上述したように修飾されてもよい。典型的にコード領域は、ｐｎｐコード領域部分であり周囲の隣接ゲノムＤＮＡを含んでもよい、組換え標的化ＤＮＡ配列によって標的とされる。組換え標的化ＤＮＡ配列は、相同的組換えによって、それらと境を接するＤＮＡ配列の内在性ｐｎｐ遺伝子への挿入を誘導する。一実施形態では、境を接するＤＮＡ配列は、相同的組換えによる組み込みに続いて、上述したような天然ｐｎｐコード領域内の位置にある読み枠内にあるようデザインされた、最高約２０個のアミノ酸のコード配列を含む。代案としては、相同的組換えを使用して、上述したようなＣ末端トランケーションがあるタンパク質を生じるようにデザインされたコード領域で、天然ｐｎｐコード領域全体を置き換えてもよい。さらに、置換コード領域は、上述したようなタンパク質のＣ末端に追加的な非天然アミノ酸をコードして、融合タンパク質の生成をもたらしてもよい。
【０１１８】
改変キシロース利用ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター属（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）
キシロース代謝経路を含有するザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター属（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）細胞中で、内在性ｐｎｐ遺伝子を修飾して、エタノールの生産のためのキシロース利用能力を与える。ザイモバクター・パルマエ（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｌｍａｅ）は、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）について下述されるように、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼおよびエノラーゼプロモーターを使用して、キシロース利用のための遺伝子を発現させることにより、キシロース利用のために改変されたエタノール産生細菌である（Ｙａｎａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００７）７３：２５９２−２５９９）。
【０１１９】
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）などのザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株が、キシロースをエタノールに発酵するために改変されている。米国特許第５，５１４，５８３号明細書、米国特許第５，７１２，１３３号明細書、米国特許第６，５６６，１０７号明細書、国際公開第９５／２８４７６号パンフレット、Ｆｅｌｄｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（（１９９２）Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３８：３５４−３６１）、およびＺｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：２４０−２４３）に記載されるように、キシロース代謝に関与する４種の酵素の発現のために、典型的に４つの遺伝子がＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）に導入され、キシロース代謝経路（図１の太字）が形成される。これらとしては、キシロースのキシルロースへの変換を触媒するキシロースイソメラーゼと、キシルロースをリン酸化してキシルロース−５−リン酸を形成するキシルロキナーゼとをコードする、遺伝子が挙げられる。ペントースリン酸経路の２つの酵素であるトランスケトラーゼとトランスアルドラーゼもさらに発現され、これらはキシルロース−５−リン酸を中間体に変換し、それはペントース代謝を解糖エントナー・ドウドロフ（Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｅｒｏｆｆ）経路に連結して、キシロースのエタノールへの代謝を可能にする（図１を参照されたい）。これらの酵素をコードするＤＮＡ配列は、腸内細菌、およびある種の酵母や真菌などのキシロースを代謝できる多数の微生物のいずれかから得られてもよい。コード領域起源としては、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ）、およびザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）が挙げられる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のコード領域が、典型的に使用される。
【０１２０】
内在性遺伝子は、キシロース発酵経路の一部を提供してもよく、またはキシロース代謝に有用な酵素活性があるタンパク質を提供する、任意の公知の遺伝子操作技術によって改変されてもよい。例えば、内在性トランスケトラーゼは、キシロース利用経路の作成において、その他の導入された酵素活性を補足してもよい。
【０１２１】
天然基質でないキシロースのようなその他の糖類を利用するようにさらに改変されたザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター属（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）株もまた、検討中のプロセスで使用してもよい。例は、参照によって本明細書に援用する、米国特許第５８４３７６０号明細書に記載される、アラビノース利用について改変されたＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株である。株をその他の追加的な方法で修飾して、キシロース利用およびエタノール産生を改善してもよい。
【０１２２】
ＲＰＩの発現増大
リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ＲＰＩ）活性発現増大のために、本細胞をさらに改変する。ＲＰＩは、リブロース−５−リン酸とリボース−５−リン酸の相互変換を触媒する（図１を参照されたい）。ＲＰＩの発現増大は、参照によって本明細書に援用する、国際公開第２０１２／００６０６１号パンフレットとして公開された、同一譲受人同時係属米国特許出願公開第１３／１６１７３４号明細書で開示され、リブロースの生成低下に付随するキシロース利用の効率増大を与える、ＲＰＩの発現増大が開示されている。
【０１２３】
ＲＰＩの発現増大は、国際公開第２０１２００６０６１号パンフレットとして公開された、米国特許出願第１３／１６１７３４号明細書で開示されるように、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中においてリボース−５−リン酸イソメラーゼ活性があるあらゆるタンパク質またはポリペプチドを使用して、達成してもよい。リボース−５−リン酸イソメラーゼ活性を有するポリペプチドは、ＥＣ  ５．３．１．６のＥＣ分類を有する。ＲＰＩ−ＡおよびＲＰＩ−Ｂと称される、２群のリボース−５−リン酸イソメラーゼ酵素がある。ＲＰＩ−Ｂ酵素は、糖リン酸イソメラーゼのＲｐｉＢ／ＬａｃＡ／ＬａｃＢファミリーに属する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、双方の種類のＲＰＩタンパク質を有する。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）は、ＲＰＩ−Ａとアノテートされた単一ＲＰＩタンパク質を有する。しかしＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＲＰＩタンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＰＩ−Ａタンパク質（２０％）よりも大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＰＩ−Ｂタンパク質（３６％）に近い配列同一性を有する。国際公開第２０１２／００６０６１号パンフレットとして公開された、米国特許出願第１３／１６１７３４号明細書で開示されるＲＰＩのさらなる分析は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）をＲＰＩ−Ｂ群に分類する。
【０１２４】
本細胞中で使用してもよいＲＰＩタンパク質の配列は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＰＩタンパク質（それぞれ配列番号１４および１６；それぞれコード領域配列番号１３および１５）によって例示されるように、非常に多様である。本微生物で使用してもよいＲＰＩタンパク質は、バイオインフォマティクス解析を使用して同定してもよい。プロファイル隠れマルコフモデルに基づく構造／官能基バイオインフォマティクス解析を使用した同定（ＨＭＭＥＲソフトウェアパッケージのｈｍｍｓｅａｒｃｈアルゴリズム；Ｊａｎｅｌｉａ  Ｆａｒｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃａｍｐｕｓ，Ａｓｈｂｕｒｎ，ＶＡを使用する）、活性部位残基同定、および追加的なアミノ酸同定スクリーニングは、国際公開第２０１２／００６０６１号パンフレットとして公開された、米国特許出願第１３／１６１７３４号明細書の実施例８に記載される。
【０１２５】
これらの基準に適合して、本微生物で使用してもよいＲＰＩ−ＡおよびＲＰＩ−Ｂタンパク質の例は、参照によって本明細書に援用する、米国特許公開公報第２０１２０１５６７４６Ａ１号明細書として公開された、米国特許出願第１３／１６１７３４号明細書に記載される。追加的なＲＰＩは、当業者に周知であるように、および上述したように、文献内で、およびイオインフォマティクスデータベース内で、容易に同定されてもよい。バイオインフォマティクスを使用したタンパク質および／またはコード配列の同定は、典型的に、ＲＰＩアミノ酸配列または本明細書で提供されるようなコード配列による、公的に利用可能なデータベースのＢＬＡＳＴ（上述）検索の手段による。同一性は、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ  ２５０シリーズのタンパク質重量マトリックスのデフォルトパラメータを使用して、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法に基づく。
【０１２６】
本細胞中では、遺伝子修飾を欠く細胞中のリボース−５−リン酸イソメラーゼ活性との比較で、リボース−５−リン酸イソメラーゼ活性を増大させる、遺伝子修飾が起きる。ＲＰＩ活性の発現増大は、宿主細胞中で活性である、リボース−５−リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードする、単離ＤＮＡ分子を発現することで、得られてもよい。リボース−５−リン酸イソメラーゼ活性がある有用なタンパク質は、ＥＣ分類ＥＣ  ５．３．１．６に属し、上述のリボース−５−リン酸イソメラーゼＡおよびリボース−５−リン酸イソメラーゼＢタンパク質を含む。
【０１２７】
細胞中で酵素の活性を増大させる任意の方法を使用して、ＲＰＩ活性を増大させてもよい。このような方法は当業者に良く知られており、コード遺伝子コピー数の増大、および／または高度発現プロモーターを含有する遺伝子による発現の増大が挙げられる。内在性ＲＰＩコード領域の発現増大、および／または導入された異種ＲＰＩコード領域の発現増大のために、本株を改変して酵素活性の増大を与えてもよい。さらに、変異、そして発現した変異遺伝子のスクリーニングによって、活性増大を有する細胞を同定することで、ＲＰＩ活性を増大してもよい。
【０１２８】
典型的に、ＲＰＩの発現増大は、キメラ遺伝子またはオペロン中で、プロモーターと作動可能に連結するＲＰＩをコードするＤＮＡ分子による形質転換によって、達成される。使用してもよいＲＰＩのコード配列としては、上述のＲＰＩ−ＡおよびＲＰＩ−Ｂタンパク質をコードするあらゆる配列が挙げられる。
【０１２９】
異種コード領域を使用する場合、当業者に良く知られているように、標的宿主細胞中における最大の発現のために、配列をコドン最適化してもよい。天然開始コドンがＧＴＧであれば、タンパク質の発現増大のために、それをＡＴＧに変化させてもよい。細菌中における遺伝子発現方法は、当該技術分野で周知である。細菌中の遺伝子の発現は、典型的に、対象コード領域と作動可能に連結するプロモーターと、転写ターミネーターとを要求する。使用してもよいプロモーターは、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター（ＧＡＰプロモーター；Ｐｇａｐ）、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）エノラーゼ遺伝子のプロモーター（ＥＮＯプロモーター；Ｐｅｎｏ）、およびアクチノプラネス・ミズーリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）キシロースイソメラーゼをコードする遺伝子のプロモーター（ＧＩプロモーター、Ｐｇｉ）など、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター属（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）細胞中で発現されるプロモーターである。使用してもよい、特に高度発現されるプロモーターは、参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，９９８，７２２号明細書で開示されるような、高度発現を引き起こす変異がある、Ｐｇａｐプロモーターである。
【０１３０】
ＲＰＩ発現のためのキメラ遺伝子またはオペロンは、典型的にさらなる操作のために、ベクター中で構築され、またはそれに転移される。ベクターは、当該技術分野で周知である。特定のベクターは、広範な宿主細菌中で自己複製でき、接合によって転移され得る。ｐＲＫ４０４および３つの関連ベクター：ｐＲＫ４３７、ｐＲＫ４４２、およびｐＲＫ４４２（Ｈ）の完全なアノテートされた配列が入手できる。これらの誘導体は、グラム陰性細菌における遺伝子操作の有益なツールであることが判明している（Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ５０（１）：７４−７９（２００３））。
【０１３１】
ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中での発現に特に有用であるのは、参照によって本明細書に援用する、米国特許第５，５１４，５８３号明細書に記載されるｐＺＢ１８８などの、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）とザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の双方で自己複製し得るベクターである。ベクターは、細胞内自律複製のためのプラスミドと、細菌ゲノムに組み込まれるコンストラクトを保有するためのプラスミドとを含んでもよい。ＤＮＡ組み込みのためのプラスミドは、トランスポゾン、標的細菌ゲノムと相同的な核酸配列領域、または組み込みを支持するその他の配列を含んでもよい。追加的なタイプのベクターは、例えばＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）から市販される株を使用して生成された、トランスポソームであってもよい。所望の標的宿主と所望の機能に適するベクターを、どのように選択するかは良く知られている。
【０１３２】
凍結解凍形質転換、カルシウム媒介形質転換、電気穿孔、または接合を使用するなどの周知の方法によって、ＲＰＩコード領域を含んでなるキメラ遺伝子を有するベクターを導入することで、細菌細胞を改変してもよい。本明細書に記載されるように、ＲＰＩ酵素の発現を増大させることで、改善されたキシロース利用のために改変されるあらゆる細菌細胞は、株を改変するための形質転換の標的宿主細胞である。特に適切な宿主細胞は、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）およびザイモバクター属（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）である。導入されたキメラ遺伝子は、安定複製型プラスミド上で細胞中に維持されて、または導入に続いてゲノムに組み込まれてもよい。
【０１３３】
細菌細胞ゲノム中に組み込まれたＲＰＩキメラ遺伝子またはオペロンがある株を改変するために、相同的組換え、トランスポゾン挿入、またはトランスポゾーム挿入などの当該技術分野で周知の方法を使用してもよい。相同的組換えでは、標的組み込み部位側面に位置するＤＮＡ配列は、スペクチノマイシン耐性遺伝子またはその他の選択可能なマーカー、および発現のためのＲＰＩキメラ遺伝子と境を接して配置され、選択可能なマーカーおよびＲＰＩキメラ遺伝子の標的ゲノム部位への挿入をもたらす。さらに、選択可能なマーカーは、対応する部位特異的リコンビナーゼ発現後、耐性遺伝子がゲノムから切除されるように、部位特異的組換え部位と境を接してもよい。
【０１３４】
さらに、より高度に発現されるプロモーターで、内在性ＲＰＩ発現遺伝子のプロモーターを置換して、細胞中のＲＰＩ活性を増大させてもよい。これは、上述したようなベクターおよび方法を使用する、相同的組換えによって達成してもよい。
【０１３５】
キシロースイソメラーゼ活性
本細胞は、限定的でないキシロースイソメラーゼ活性レベルを有する。図１に示されるキシロース利用機能およびエタノール生成経路について、キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）活性が律速段階でない場合、それは制限的でない。キシロースイソメラーゼ活性の増大が、キシロース利用およびエタノール生成を改善しない場合、キシロースイソメラーゼ活性は制限的でない。この状況は、１つまたは複数のその他の経路段階が制限的であることを示唆する。本明細書で分かったように、本明細書の実施例１１に記載される、キシロース、ＮＡＤＨ、ＭｇＳＯ４、トリエタノールアミン、およびソルビトールデヒドロゲナーゼを含むアッセイを使用して評価されたＺＷ６５８細胞中のキシロースイソメラーゼ活性は、約０．２５μモルの生成物／ｍｇタンパク質／分である。本明細書の実施例３に記載されるように、このレベルのキシロースイソメラーゼ活性は、ＺＷ６５８株中で制限的でない。本明細書のザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）株の構築セクションに記載されるように、ＺＷ６５８株は、本明細書で使用されるＺＷ８０１−４株の前駆体である。一実施形態では、非制限的ＸＩ活性は、本明細書の実施例１１に記載されるアッセイを使用した、無細胞抽出物中の測定で、約０．２５μモルの生成物／ｍｇタンパク質／分を超える。非制限的ＸＩ活性は、約０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、または０．５μモルの生成物／ｍｇタンパク質／分を超えてもよい。
【０１３６】
ＸＩ活性が細胞中で制限的である場合、ＸＩ酵素の発現レベルを増大させることで、またはより高活性のＸＩ酵素の発現を導入することで、細胞を改変して非制限的ＸＩ活性を有するようにしてもよい。発現レベルの増大は、ＸＩをコードする遺伝子のコピー数を増大させ、またはより高活性のプロモーターを使用して、ＸＩ酵素を発現させるなど、当業者に知られているあらゆる方法によってもよい。
【０１３７】
例えばＸＩコード領域は、非変異ロモーターとの比較で発現レベルが増大している変異プロモーターを使用して、発現させてもよい。変異高度発現プロモーターの一例は、米国特許第７，９８９，２０６号明細書で開示され、本明細書でＳｕｐｅｒＧＡＰプロモーター（ＰｇａｐＳ）と称される、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の変異プロモーターである。
【０１３８】
複数コピーの、または変異高度発現プロモーターの発現によって、高活性を提供してもよいキシロースイソメラーゼ酵素は、参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，９９８，７２２号明細書に記載されるもののいずれかである。その中で開示されるように、キシロースイソメラーゼ酵素はＥＣ  ５．３．１．５に属し、（ＲＰＩについて上述された）プロファイルＨＭＭを使用して同定されてもよく、さらに４つの触媒部位アミノ酸が、キシロースイソメラーゼに特徴的であることが分かった。
【０１３９】
代案として、またはこれに加えて、一般に使用される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＩ中よりも、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞中でより高い活性を有するＸＩ酵素を発現することにより、高いＸＩ活性を得てもよい。参照によって本明細書に援用する、同一譲受人同時係属米国特許出願公開第２０１１０３１８８０１号明細書は、ＥＣ  ５．３．１．５と同定され、Ｉ群に属するキシロースイソメラーゼ酵素が、ＩＩ群に属する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＩよりも高い活性を有することを開示する。さらに、上述したような変異高度発現プロモーターからＩ群ＸＩを発現させて、宿主細胞中で高いＸＩ活性を得てもよい。
【０１４０】
米国特許出願第２０１１０３１８８０１号明細書で開示されるＩ群キシロースイソメラーゼは、以下の基準の少なくとも１つによって定義される、Ｉ群に属するキシロースイソメラーゼタンパク質を指す：ａ）それは、米国特許出願第２０１１０３１８８０１号明細書の実施例４の分子系統学的バイオインフォマティクス解析を使用して作成される、Ａ．ミズーリエンシス（Ａ．ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）ＸＩを含む５０％の配列一致度の閾値分類に含まれる；ｂ）それは、実質的に、米国特許出願第２０１１０３１８８０１号明細書の実施例４の分子系統学的解析から判定された、Ｉ群およびＩＩ群ＸＩセットのＧｒｏｕｐＳｉｍ解析を使用して同定された、特異性決定位置（ＳＤＰ）のＩ群のアミノ酸に適合する；および／またはｃ）それは、米国特許出願第２０１１０３１８８０１号明細書の実施例４に記載されるようにして作成されたプロファイル隠れマルコフモデルを使用してクエリーした際に、１Ｅ−１５以下のＥ値を有する。例えばアクチノプラネス・ミズーリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）からのＸＩ（例えば配列番号１８）は、Ｉ群に属すると同定され、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞中で発現させると、それは同様に発現された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＩよりも高い活性を提供する。
【０１４１】
キメラ遺伝子、ベクター、変換、組み込み、コドン最適化、およびＸＩ発現は、上でＲＰＩについて記載されるようであり、当業者によく知られている。
【０１４２】
ＲＰＥの発現増大
一実施形態では、リブロース−リン酸３−エピメラーゼ（ＲＰＥ）活性の発現増大のために、本細胞をさらに改変させる。ＲＰＥは、Ｄ−リブロース５−リン酸およびＤ−キシルロース−５−リン酸の相互変換を触媒して（図１を参照されたい）、ＥＣ  ５．１．３．１に分類される。遺伝子修飾を欠く細胞中のＲＰＥ活性との比較で、細胞中でＲＰＥ活性を増大させる少なくとも１つの遺伝子修飾が起きる。発現増大のための修飾は、ＲＰＩについて上述したとおりであり、ＲＰＥ活性があるＥＣ  ５．１．３．１に属するあらゆる酵素を使用してもよい。例えばＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＲＰＥ（配列番号２０；コード配列配列番号１９）の追加的なコピーを細胞中で発現させてもよく、またはＲＰＥコード領域を高度発現プロモーターから発現させてもよい。
【０１４３】
改善されたキシロース利用株の発酵
本改変キシロース利用ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター属（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）細胞を発酵で使用して、エタノールを生産しても良い。一例として、発明のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株によるエタノールの生産が記載される。
【０１４４】
エタノールの生産のために、ＲＰＩ活性増大、非限定的ＸＩ活性、および内在性ｐｎｐ遺伝子修飾を有する組換えキシロース−利用Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）を、キシロース含有培地に接触させる。キシロースは、唯一の糖であってもよいが、典型的に、培地は、キシロースおよびグルコースを含む糖類の混合物を含有する。培地は、加工セルロース性またはリグノセルロース性バイオマスに由来する糖を含む、バイオマス加水分解産物を含有してもよい。
【０１４５】
混合糖類濃度が、増殖を阻害するように高い場合、同一譲受人米国特許第７，６２９，１５６号明細書で開示されるように、培地は、ソルビトール、マンニトール、またはその混合物を含む。ガラクチトールまたはリビトールが、ソルビトールまたはマンニトールを置き換えてもよく、またはそれと組み合わせられてもよい。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞は培地中で増殖して発酵が起きて、エタノールが生産される。（嫌気性、微有酸素性、または微好気性発酵などの条件を含んでもよい）発酵は、空気、酸素、またはその他のガスの補足なしに、少なくとも約２４時間実施され、３０時間以上実施されてもよい。最大エタノール生産に達するタイミングは、発酵条件次第で変動する。典型的に、培地中に抑制物質が存在する場合、より長い発酵時間を要する。発酵は、約４．５〜約７．５のｐＨで、約３０℃〜約３７℃の温度で実施されてもよい。
【０１４６】
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞は、実験室規模発酵槽内において、および商業的量のエタノールが生産されるスケールアップ発酵中でキシロースを含む混合糖類を含む培養されてもよい。エタノールの商業生産が所望される場合、多様な培養手順が適用されてもよい。例えば本Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞からの大規模生産は、バッチおよび連続培養手順の双方で生産されてもよい。古典的バッチ培養法は、培地組成物が培養開始時に設定されて、培養工程において人為的変更を受けない閉鎖系である。したがって培養工程開始時に所望の生物を培地に接種して、系に何も添加せずに、増殖または代謝活性を生じさせる。しかし典型的に、「バッチ」培養は、炭素源添加に関してバッチであり、ｐＨおよび酸素濃度などの要素を制御する試みが頻繁になされる。バッチ系では、システムの代謝産物およびバイオマス組成は、培養を停止させる時点まで常に変化する。バッチ培養内では、細胞は、静的な遅滞期から高い対数増殖期へ、そして最後に、増殖速度が減退または停止する静止期へと減速する。処置を施さない場合、静止期にある細胞はやがて死滅する。いくつかのシステムでは、対数期にある細胞が、往々にして最終産物または中間体の生産の大半に関与する。その他のシステムでは、静止期または対数期後期の生産が得られ得る。
【０１４７】
標準バッチ系の変法は、流加系である。流加培養工程もまた、本Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞の増殖に適し、培養の進行と共に基材が徐々に添加されることを除いては、典型的なバッチ系を構成する。流加バッチ系は、異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向があって、培地中に限定量の基質を有することが望ましい場合に、有用である。流加バッチ系の実際の基質濃度の測定は困難であるので、ｐＨ、およびＣＯ２のような排ガスの分圧などの測定可能要素の変化に基づいて推定される。バッチおよび流加培養法は一般的で、当該技術分野で周知であり、例は、参照によって本明細書に援用する、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｒｕｅｇｅｒ，Ｃｒｕｅｇｅｒ，ａｎｄ  Ｂｒｏｃｋ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ、またはＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６，２２７，（１９９２）にある。
【０１４８】
エタノールの商業生産はまた、連続培養で達成されてもよい。連続培養は、バイオリアクターに定められた培養液が継続的に添加される開放系であり、同時に等量の馴化培地が、加工のために取り出される。連続培養は、概して細胞が主に対数増殖期にある、一定の高い液相密度に細胞を維持する。代案としては、固定化細胞を用いて連続培養を実施してもよく、その中では炭素および栄養素が継続的に添加されて、有価生成物、副産物または老廃物が細胞集団から継続的に取り出される。細胞固定化は、当業者に知られているように、天然および／または合成材料から構成される幅広い固体支持体を使用して、実施されてもよい。
【０１４９】
連続または半連続培養は、細胞増殖または最終産物濃度に影響を及ぼす、１つの要素またはいくつもの要素の調節を可能にする。例えば１つの方法は、炭素源または窒素レベルなどの制限的栄養物質を定率に保ち、全てのその他のパラメータを加減させる。その他の系では、培地濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、増殖に影響を及ぼすいくつかの要素を継続的に変更し得る。連続系は、定常状態増殖条件を維持するように努め、したがって培地の抜き取りに起因する細胞損失は、培養中の細胞増殖率と平衡状態になくてはならない。連続培養工程のために栄養素と増殖因子を調節する方法、ならびに産物生成率を最大化する技術は、工業微生物学の技術分野で周知であり、多様な方法が前出のＢｒｏｃｋに詳述される。
【０１５０】
エタノール生産に特に適するのは、以下のような発酵計画である。軌道振盪機内で約１５０ｒｐｍで振盪しながら、約３０℃〜約３７℃において、振盪フラスコ内の半天然培地中で、本発明の所望のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞を増殖させて、次に同様の培地を含有する１０Ｌの種発酵槽に移す。種培養は、ＯＤ６００が３〜６になるまで種発酵槽内で嫌気的に培養されて、発酵パラメータがエタノール生産のために最適化される生産発酵槽に移される。種培養タンクから生産タンクに移される典型的な種菌体積は、約２％〜約２０％ｖ／ｖの範囲である。典型的な発酵培地は、リン酸カリウム（１．０〜１０．０ｇ／Ｌ）、硫酸アンモニウム（０〜２．０ｇ／Ｌ）、硫酸マグネシウム（０〜５．０ｇ／Ｌ）などの最少培地成分と、酵母抽出物または大豆ベースの製品などの複合窒素源（０〜１０ｇ／Ｌ）とを含有する。ソルビトールまたはマンニトールが、約５ｍＭの最終濃度で培地中に存在する。バッチ添加された最初の炭素源（５０〜２００ｇ／Ｌ）の枯渇に際し、炭素源を提供する、キシロースと、グルコース（またはスクロース）などの少なくとも１つの追加的な糖とを含む混合糖類を、発酵容器に絶えず添加して、エタノールの割合と力価を最大化する。炭素源供給速度を動的に調節して、培養が、酢酸などの有毒副産物の蓄積をもたらし得る過剰なグルコースを蓄積していないことを確実にする。利用基質から生成するエタノール収量を最大化するために、最初にバッチ添加される、あるいは発酵工程において供給される、リン酸量によって、バイオマス成長を制限する。発酵は、（水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、または水酸化ナトリウムなどの）苛性溶液と、硫酸またはリン酸のいずれかを使用して、ｐＨ５．０〜６．０に制御される。発酵槽の温度は、３０℃〜３５℃に制御される。起泡を最小化するために、消泡剤（シリコーンベース、有機ベースなどの任意のクラス）を必要に応じて容器に添加する。それに対する抗生物質耐性マーカーが株中にある、カナマイシンなどの抗生物質を任意選択的に使用して、汚染を最小化してもよい。
【０１５１】
任意の上述の条件の組、およびさらに当該技術分野で周知の条件のバリエーションが、キシロース利用組換えザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞によるエタノール生産のための適切な条件である。
【実施例】
【０１５２】
本発明を以下の実施例でさらに定義する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しながら、例証としてのみ提供されるものと理解すべきである。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的特性を見極め得て、その精神と範囲を逸脱することなく、本発明に様々な変更と修正を加えて、それを様々な用途と条件に適応させ得る。
【０１５３】
一般方法
本明細書で使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）（以下「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；およびＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ  Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）；およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪによる出版（１９８７）に記載される。
【０１５４】
略称の意味は、次の通り。「ｋｂ」はキロベースを意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｎｔ」はヌクレオチドを意味し、「ｈｒ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「μＭ」はマイクロモル濃度を意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｐｍｏｌ」はピコモルを意味し、「Ｃｍ」はクロラムフェニコールを意味し、「Ｃｍｒ」または「Ｃｍ−Ｒ」はクロラムフェニコール耐性を意味し、「Ｃｍｓ」はクロラムフェニコール感受性を意味し、「Ｓｐｅｃｒ」または「Ｓｐｅｃ−Ｒ」はスペクチノマイシン耐性を意味し、「Ｓｐｓ」はスペクチノマイシン感受性を意味し「ＸＩ」はキシロースイソメラーゼであり、「ＸＫ」はキシルロキナーゼであり、「ＴＡＬ」はトランスアルドラーゼであり、「ＴＫＴ」はトランスケトラーゼであり、「ＯＤ６００」は６００ｎｍの波長で測定された光学濃度を意味し、「ＰＣＲ」はポリメラーゼ連鎖反応を意味し、「ｋＤａ」はキロダルトンを意味し、「ｇ」は重力定数を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋｂｐ」はキロ塩基対を意味し、「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィーを意味し、および「ＧＣ」はガスクロマトグラフィーを意味し、「ＲＭ」は１０ｇ／Ｌの酵母抽出物に加えて２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４を含有する富栄養培地を意味し、「ＭＭ」は１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、５ｇ／Ｌのトリプトン、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、および０．２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４を含有する接合培地を意味する。
【０１５５】
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の形質転換
本質的に米国特許第５，５１４，５８３号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載されるようにして、電気穿孔を使用して、自己複製型および非複製型プラスミドＤＮＡをＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）に導入した。簡単に述べると、５０μｌの形質転換反応は、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール中に、約１０１０個の細胞／ｍｌと、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＣＳ１１０から単離された約０．５〜２．０μｇの非メチル化プラスミドＤＮＡとを含有した。対照反応は同じように処理されたが、いかなるプラスミドＤＮＡも導入されなかった。電気穿孔装置の設定は、１６ｋｖ／ｃｍ、２００Ω、および２５μＦであり、キュベットのギャップ幅は０．１ｃｍであった。電気穿孔に続いて、ＭＭＧ培地（５０ｇ／Ｌのグルコース、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、５ｇ／Ｌのトリプトン、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）  ２ＳＯ４、０．２ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、および１ｍＭのＭｇＳＯ４）で希釈して、細胞を３０℃で回収してから、示されるように抗生物質添加または無添加の１．５％寒天（ＭＭＧ寒天プレート）を含有するＭＭＧ培地上に、形質転換反応を播種した。３０℃において嫌気性チャンバー内で、コロニーが出現するまでプレートを培養した。追加的な詳細は、以下の実施例に記載される。
【０１５６】
振盪フラスコ実験
特に断りのない限り、下述する全ての実験は、３０℃において、唯一の炭素源としてグルコースまたはキシロースを含有する合成培地を使用して、振盪フラスコ（１５ｍｌの緩く栓をした円錐型試験管）内で実施した。ｍＲＭ３−Ｇ１０培地は、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４  （７Ｈ２Ｏ）、および１００ｇ／Ｌのグルコースを含有する。ｍＲＭ３−Ｘ１０培地は同一であるが、それはグルコースの代わりに１００ｇ／Ｌのキシロースを含有する。細胞成長は、時間の関数として、６００ｎｍにおける光学濃度変化を追跡して分光光度法でモニターした。本文および図の説明で、「ＯＤ」または「ＯＤ６００」は、６００ｎｍにおける光学濃度を意味する。振盪フラスコ増殖調査中の表示される時点において、屈折率検出器を装着したＡｇｉｌｅｎｔ  １１００（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用したＨＰＬＣ分析のために、培養物の１．０ｍｌアリコートを取り出して、発酵ブロス中に存在するグルコース、キシロース、リブロース、およびエタノールの濃度を測定した。ＨＰＬＣ分析に先だって、遠心分離によって細胞を取り出し、０．２２μｍ酢酸セルロースＳｐｉｎ−Ｘ遠心管フィルター（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号８１６０）を通して上清を濾過し、小型粒子を除去した。０．６ｍｌ／分の流速、および移動相として０．０１ＮのＨ２ＳＯ４を使用して、均一濃度条件下、５５℃で稼働するＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で化合物を分離した。既知濃度の標品を使用して対象ピークを定量化し、全ての結果をｇ／Ｌで表した。
【０１５７】
ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）株の構築
野性型親株ＺＷ１から開始する、キシロース利用組換え株ＺＷ８０１−４の構築の詳細な説明は、参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，７４１，１１９号明細書に提供される。ＺＷ８０１−４株は、ＺＷ６５８株に由来するＺＷ８００株に由来し、全ての株は、参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，７４１，０８４号明細書に記載される。ＺＷ６５８は、キシロースイソメラーゼ（ｘｙｌＡ）、キシルロキナーゼ（ｘｙｌＢ）、トランスアルドラーゼ（ｔａｌ）、およびトランスケトラーゼ（ｔｋｔ）をコードする、４つのキシロース利用遺伝子を含有する、２つのオペロン、ＰｇａｐｘｙｌＡＢおよびＰｇａｐｔａｌｔｋｔを、逐次遺伝子転位事象を通じて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子からのコード領域と共に、ＺＷ１（ＺＭ４株の改名；ＡＴＣＣ３１８２１）のゲノムに組み込み、引き続いてキシロース含有選択培地上で適応させてＸ１３Ｌ３株を作成し、それをＺＷ６４１と改名することで構築した。キシロース含有増殖培地上におけるＺＷ６４１のさらなる適応からはＺＷ６５８が生じ、それはキシロース中ではるかにより良く増殖して、ブダペスト条約の下にＡＴＣＣＰＴＡ−７８５８として寄託された。参照によって本明細書に援用する、同一譲受人米国特許第７，９８９，２０６号明細書で開示されるように、ＺＷ６５８は、ｅｘｙｌＡコード領域を発現するプロモーター（Ｐｇａｐ）中の点変異が原因で、はるかにより高いキシロースイソメラーゼ活性を有する。本明細書で、８０１ＧＡＰプロモーターまたはＳｕｐｅｒ  ＧＡＰプロモーターまたはＰｇａｐＳのいずれかと称されるこのプロモーター（配列番号２１）は、ＺＷ６４１中の天然Ｐｇａｐ  （６４１ＧＡＰプロモーター）との比較で、配列番号２１中の位置１１６において「Ｇ」の代わりに「Ｔ」を有する。ＰｇａｐＳは、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中のＰｇａｐよりも３〜４倍高い発現強度を有する。
【０１５８】
ＺＷ６５８中で、宿主媒介二重交差相同的組換えを使用して、グルコースフルクトース酸化還元酵素をコードする遺伝子を挿入的に不活性化し、スペクチノマイシン耐性を選択可能なマーカーとして、ＺＷ８００株を作り出した。ｌｏｘＰ部位と境を接するスペクチノマイシン耐性マーカーは、Ｃｒｅリコンビナーゼを使用して部位特異的組換えによって除去され、ＺＷ８０１−４株が作成された。
【０１５９】
酵素分析法のためのザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の無細胞抽出物の調製
細胞を５０ｍｌのＲＭ＋２％グルコース中で、３０℃で一晩、１．０〜１．２のＯＤ６００に増殖させた。細胞を４℃において、４５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して収集した。上清を廃棄して、細胞ペレットを２５ｍｌの氷冷超音波処理緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ７．６、１０ｍＭのＭｇＣｌ２）で洗浄し、４５００ｒｐｍで１０分間の遠心分離がそれに続いた。１ｍＭのジチオスレイトールを添加した２．０〜２．５ｍｌの超音波処理緩衝液に、ペレットを再懸濁した。５００μＬのアリコートを４℃においてエッペンドルフ遠心分離機内で１分間遠心分離した。上清は大部分を廃棄し、約１０〜２０μＬを残してペレットが乾かないようにした。細胞を凍結し、アッセイするまで約−８０℃で保存した。アッセイに先だって、細胞を解凍して、１ｍＭのジチオスレイトールを添加した、５００μＬの超音波処理緩衝液に再懸濁した。Ｂｒａｎｓｏｎ  ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ４５０を使用して、４５秒間にわたり６２％の負荷サイクルおよび出力制御２で、混合物を２回超音波分解し、超音波処理の合間にサンプルを約３〜５分間放冷した。４℃において１４，０００ｒｐｍで６０分間にわたり、微量遠心管内でサンプルを遠心分離した。上清を新しい遠心管に移して、４℃で保存した。タンパク質濃度を測定するために、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡアッセイを使用した。
【０１６０】
実施例１
ｐＭＯＤｌｉｎｋｅｒ−Ｓｐｅｃ−ＧａｐＲＰｉの構築
ｐＭＯＤＬｉｎｋｅｒ−Ｓｐｅｃ−ＧａｐＲｐｉ（図２）は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＲＰＩ発現カセットと、ｌｏｘが側面に位置するＳｐｅｃ耐性カセットとを含有するトランスポゾンを作成するために使用し得るプラスミドである。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＲＰＩ発現カセットは、プラスミドｐＺＢ１８８ａａｄＡ／Ｇａｐ／Ｚｙｍｏ  ＲＰＩ／ＥｃｏｌｉＳＬをテンプレートとして使用して、ＰＣＲによって作成された。後者のプラスミドは、参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，９８９，２０６号明細書に記載される。それは、（５’から３’方向で）完全長６４１ＧＡＰプロモーター配列、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＲＰＩ遺伝子（配列番号１３）の読み取り枠全体、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸｙｌＡ／Ｂオペロンの遺伝子間領域に存在するＸｙｌＡステムループ領域からなる、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）リボース５−リン酸イソメラーゼ（ＲＰＩ）のための発現カセットを含有する。上述のＲＰＩ発現コンストラクト全体（配列番号２２）は、プラスミドｐＺＢ１８８ａａｄＡ／Ｇａｐ／Ｚｙｍｏ  ＲＰＩ／ＥｃｏｌｉＳＬの固有のＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ部位の間に位置する。
【０１６１】
これもまた米国特許第７，９８９，２０６号明細書に記載されるｐＭＯＤ−Ｌｉｎｋｅｒ−Ｓｐｅｃ中に、この発現カセットを含有するＰＣＲ生成ＤＮＡ断片を挿入した。ｐＭＯＤ−Ｌｉｎｋｅｒ−Ｓｐｅｃは、市販されるベクターｐＭＯＤ（商標）−２＜ＭＣＳ＞トランスポゾン構築ベクター（カタログ番号ＭＯＤ０６０２；ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から誘導された。元のマルチクローニング部位は、ＡｓｉＳｉ、ＦｓｅＩ、およびＳｂｆＩに対する固有の制限酵素認識部位によって置換した。スペクチノマイシン（Ｓｐｅｃｒ）耐性を与えて両端に野性型ｌｏｘＰ部位を有するＤＮＡ断片を、ＡｓｉＳＩおよびＦｓｅＩ部位の間に挿入して、ｐＭＯＤ−Ｌｉｎｋｅｒ−Ｓｐｅｃを作成した。
【０１６２】
ｐＭＯＤ−Ｌｉｎｋｅｒ−ＳｐｅｃをＳｂｆＩおよびＦｓｅＩで順次消化し、３．６ｋｂの大型ベクター断片を１％アガロースゲルから精製した。次にプライマーＰＰＩ−Ｆ（配列番号２３）およびプライマーＰＰＩ−Ｒ−ＳｂｆＩ（配列番号２４）を使用して、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｌｉｌｉｓ）ＲＰＩキメラ遺伝子を、その付随する６４１ＧＡＰプロモーターおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸｙｌＡターミネーターと共に、プラスミドｐＺＢ１８８ａａｄＡ／Ｇａｐ／Ｚｙｍｏ  ＲＰＩ／ＥｃｏｌｉＳＬからＰＣＲ増幅した。得られた０．９６ｋｂｐのＰＣＲ産物もまた、ＦｓｅＩおよびＳｂｆＩで切断して、次にＦｓｅＩ／ＳｂｆＩ−消化されたｐＭＯＤ−Ｌｉｎｋｅｒ−Ｓｐｅｃベクター断片に、精製ＤＮＡ断片をライゲートして、図２に示されるｐＭＯＤｌｉｎｋｅｒ−Ｓｐｅｃ−ＧａｐＲｐｉを得た。
【０１６３】
実施例２
ＺＷ８０１−４中のＲＰＩの過剰発現：Ｉ株の作成および特性解析
ｐＭＯＤｌｉｎｋｅｒ−Ｓｐｅｃ−ＧａｐＲｐｉから作成されたトランスポゾン（実施例１）をＺＷ８０１−４株（一般方法を参照されたい）に導入して、ＲＰＩ発現を増大させた。トランスポソームへの転換後に、ＤＮＡ中に無作為に組み込まれたこのプラスミド中の転位因子は、ベクター中の２つのモザイク末端（ＭＥ）に位置するＤＮＡ断片全体であり、それはＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＲＰＩ発現カセットとＳｐｅｃｒ−カセットの双方を含む。トランスポソームは、ＥＺ：：ＴＮ（商標）ｐＭＯＤ（商標）−２＜ＭＣＳ＞トランスポゾン構築ベクター（カタログ番号ＭＯＤ０６０２）のためのＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）取扱説明書に概説される一般プロトコルを使用して、本質的に米国特許第７、９８９，２０６号明細書に記載されるようにして、生体外で作成した。得られたトランスポソームをＺＷ８０１−４細胞に電気穿孔し、スペクチノマイシン（２００μｇ／ｍｌ）を含有するＭＭＧおよびＭＭＸ（５０ｇ／Ｌのグルコースの代わりに５０ｇ／Ｌのキシロースを添加した同一培地）寒天プレート上で、形質転換体を回収した。転位因子はＤＮＡに無作為に挿入され、それは、組み込まれたＲＰＩ遺伝子の発現レベルを変化させる有害な遺伝子破壊事象および／または位置効果をもたらし得るので、予備実験を実施して、どの形質転換体を探究するのが最適かを判断した。このようにして、試験培地としてｍＲＭ３−Ｘ１０を使用した振盪フラスコ実験（一般方法を参照されたい）で増殖させるために、ｍＲＭ３−Ｇ１０／Ｓｐｅｃプレートからの３０個のコロニーと、ｍＲＭ３−Ｘ１０／Ｓｐｅｃプレートからの６個のコロニーをスクリーニングし、最大最終ＯＤ値に増殖した３つの株（Ｂ９、Ｂ１１、およびＩ株）をさらなる特性解析のために選択した。Ｂ９およびＢ１１株はＭＭＧ／Ｓｐｅｃプレートから回収され、Ｉ株はＭＭＸ／Ｓｐｅｃプレートから回収された。
【０１６４】
参照によって本明細書に援用する、米国特許第２０１２０１５６７４６Ａ１号明細書として公開された、同一譲受人同時係属米国特許出願公開第１３／１６１７３４号明細書では、ＲＰＩがＺＷ８０１−４中におけるキシロース代謝の律速酵素であり、この株中でマルチコピープラスミドからＲＰＩを発現することが、ｍＲＭ３−Ｘ１０を用いた振盪フラスコ実験における、より良い増殖およびより迅速なキシロース利用をもたらしたことが開示されている。追加的なＲＰＩによって細胞はより高い最終ＯＤ値に増殖したが、対数増殖速度の変化はわずかまたは皆無であった。ＺＷ８０１−４中のＲＰＩのプラスミド過剰発現はまた、生成するリブロースの量を低下させ、これはキシロースからのエタノール生成に、より高い代謝収率をもたらした。
【０１６５】
図３に示されるように、ＺＷ８０１−４ゲノムに無作為に組み込まれたＲＰＩ発現トランスポゾンの単一コピーを有する試験株について、同様の結果が得られた。Ｂ９、Ｂ１１、およびＩ株の種培養をＺＷ８０１−４対照と共に、ｍＲＭ３−Ｘ１０中で増殖させ、振盪フラスコ内のｍＲＭ３−Ｘ１０に、各培養について約０．１の初期ＯＤ６００値で接種するのに使用した。培養物を３０℃で増殖させ、ＯＤ６００によって増殖について、そして一般方法に記載されるようにしてキシロース、リブロース、およびエタノールについて、経時的にアッセイした。図３Ａに示されるように、ＲＰＩ発現トランスポゾンを含有する３つの株は、親株ＺＷ８０１−４よりもほぼ５０％高いＯＤに増殖した。図３Ｂに示されるように、それらはまた、対照株よりもはるかに迅速にキシロースを消費して、より少ないリブロースを産生し、５４時間目には、Ｂ９、Ｂ１１、およびＩ株では、ほぼ全てのキシロースが消失した一方で、親株ＺＷ８０１−４は、約７５％のキシロースのみを消費した。７１時間目において、ＺＷ８０１−４では、なおも約８ｇ／Ｌの残留キシロースがあった。ＲＰＩ発現トランスポゾンがある３つの株はまた、より多くのキシロースを消費したにもかかわらず、ＺＷ８０１−４よりも少ないリブロースを産生し；７２時間目における増殖培地中のリブロースの最終濃度は、他の３つの株では３．２〜３．６ｇ／Ｌであったのに対して、ＺＷ８０１−４では５．３ｇ／Ｌであった。
【０１６６】
同じ４つの株をｍＲＭ３−Ｇ１０培地中で３０℃で増殖させて、ＯＤ６００によって増殖について経時的にアッセイした（図３Ｃ）。キシロースで得られた結果とは対照的に、グルコース上で増殖させた場合、４つの株は全て類似した増殖速度を示し、ＯＤ６００は、８時間目に約１、２０時間目には５．２〜５．５に達した。この結果は、Ｂ９、Ｂ１１、およびＩ株を用いたキシロース振盪フラスコ実験における増殖に対する、ＲＰ１過剰発現の促進作用が、炭素源依存性であることを示唆する。
【０１６７】
実施例３
Ｂ９、Ｂ１１、およびＩ株中における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼの過剰発現
上述したようなグルコースおよびキシロースを用いた振盪フラスコ実験において、Ｂ９、Ｂ１１、およびＩ株は、非常に同じ様に機能したが、引き続く実験は、Ｉ株と、組み込まれたＲＰＩ発現トランスポゾンのコピーもまた有する他の２株との違いが重要であることを明らかにした。この違いは、３つの株中におけるキシロースイソメラーゼのより高い発現が、改変キシロース経路を通じて、炭素流の速度にさらなる増大をもたらすかどうかを評価することで認められた。
【０１６８】
キシロースイソメラーゼは、ＺＷ６４１株中におけるキシロース代謝の律速酵素であったが、それは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸｙｌＡ／Ｂオペロンを駆動するＰｇａｐプロモーター中の点変異によってＺＷ６５８株中で克服され、それはキシロースイソメラーゼの発現増大をもたらした（一般方法の株構築を参照されたい）。米国特許第２０１２０１５６７４６Ａ１号明細書として公開された、同一譲受人同時係属米国特許出願公開第１３／１６１７３４号明細書で開示されるように、引き続く実験は、ＺＷ６５８およびＺＷ８０１−４（グルコースフルクトース酸化還元酵素遺伝子不活性化を有するＺＷ６５８誘導体）の双方におけるキシロース代謝の新しい律速段階が、ＲＰＩであることを確立した。
【０１６９】
これらの観察に基づいて、Ｂ９、Ｂ１１、およびＩ株中のＲＰＩの発現増大によって提供されるＲＰＩ支障の除去が、キシロースイソメラーゼのより高レベルの発現を可能にして、キシロース経路を通じて炭素流の速度にさらなる増大をもたらすかどうかを判定することが興味深かった。この仮説を検証するために、我々は、プラスミドｐＭＯＤｌｉｎｋｅｒ−Ｃｍ−８０１ＧａｐＸｙｌＡから作成されたトランスポゾンを使用した。このプラスミドは、２つのｌｏｘ部位の間に、Ｓｐｅｃ耐性カセットの代わりにＣｍ耐性カセットを有すること以外は、米国特許第７，９８９，２０６号明細書に記載される、ｐＭＯＤ−Ｌｉｎｋｅｒ−Ｓｐｅｃ−８０１ＧａｐＸｙｌＡと同一である。ｐＭＯＤ−Ｌｉｎｋｅｒ−Ｓｐｅｃ−８０１ＧａｐＸｙｌＡは、Ｐｇａｐ、ＸｙｌＡコード領域、およびＸｙｌＡとＸｙｌＢ読み取り枠間のステムループ領域を含有するＺＷ８０１−４から得られた、付加されたＤＮＡ断片がある、ｐＭＯＤ−Ｌｉｎｋｅｒ−Ｓｐｅｃである。したがってＸｙｌＡを駆動するプロモーターは、それをより高活性にするＧからＴへの点変異を位置１１６に有する８０１ｇａｐプロモーター（配列番号２１）であり、ＺＷ６５８中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸｙｌＡ／Ｂオペロンを駆動する変異プロモーターと同一である。
【０１７０】
米国特許第７，９８９，２０６号明細書に詳述されるように、Ｃｍ耐性カセットに加えて、ｐＭＯＤｌｉｎｋｅｒ−Ｃｍ−８０１ＧａｐＸｙｌＡ（下で「８０１ＧａｐＸｙｌＡ−Ｃｍトランスポゾン」と称される）から作成されたトランスポゾンは、８０１ＧＡＰプロモーター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸｙｌＡ読み取り枠、および停止コドンにすぐ続く安定化ＸｙｌＡステムループ領域からなる、上のキシロースイソメラーゼ発現カセットを含有する。８０１ＧａｐＸｙｌＡ−Ｃｍトランスポゾンを実施例２に記載されるようにトランスポソームに変換して、Ｉ株に電気穿孔した。クロラムフェニコール（１２０μｇ／ｍｌ）を含有するＭＭＧ寒天プレート上で、形質転換体を選択した。
【０１７１】
予備研究では、８０１ＧａｐＸｙｌＡ−Ｃｍトランスポゾンによる形質転換反応から回収された、１０個の無作為に選択されたＣｍｒコロニーを、３０℃におけるｍＲＭ３−Ｘ１０中での増殖について、ＯＤ６００を周期的に測定する振盪フラスコ実験で試験した。１０個の株は全て、キシロース上で、親株よりも良く増殖した（初期増殖速度および最終ＯＤ値に基づく）が、その中で、Ｉ（ｃｍ１）、Ｉ（ｃｍ２）、Ｉ（ｃｍ３）、Ｉ（ｃｍ４）、Ｉ（ｃｍ５）、Ｉ（ｃｍ８）、およびＩ（ｃｍ９）の７つのみが、さらなる特性解析のために選択された。これらの株をより詳細に調べるために、ｍＲＭ３−Ｘ１０中で増殖させた種培養を使用して、振盪フラスコ実験を繰り返し、ＺＷ８０１−４およびＩ株を対照として含めた。初期ＯＤは全例で０．０７５であり、２つの対照株は二連で試験した。
【０１７２】
先の実験と一致して、図４Ａに示されるように、ＲＰＩのより高い発現レベルを有するＩ株は、キシロース中で、ＺＷ８０１−４よりも良く増殖した。Ｉ株の複製の成長曲線は、重ねることができ、区別できないことに留意されたい。増殖培地中のリブロースの最終濃度は、５６時間目に、Ｉ株では１．８および１．９ｇ／Ｌであり、３．４および４．２ｇ／ＬであったＺＷ８０１−４よりも低かった。Ｉ株中のキシロースイソメラーゼの過剰発現は、キシロース上での増殖を大幅に改善した。８０１ＧａｐＸｙｌＡ−Ｃｍトランスポゾンを含有する７つの株は全て、ＺＷ８０１−４およびＩ株よりもはるかに迅速に増殖し、それらが異なるトランスポゾン挿入部位を有するという事実にもかかわらず、それらの成長曲線は実質的に同一であった。これは実際には、Ｉ（ｃｍ１）〜Ｉ（ｃｍ６）挿入部位のＤＮＡ配列決定によって確認された。トランスポゾン挿入部位は、他の４つの株では決定されなかったが、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の極めて低い形質転換頻度と、使用されたＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）処置のために、それらもまた恐らくは異なるゲノムの位置にある。
【０１７３】
Ｉ株中のキシロースイソメラーゼ酵素活性の発現増大はまた、対数増殖速度も増大させ、これは生体量のより迅速な蓄積と、より迅速なキシロース利用とをもたらした。８０１ＧａｐＸｙｌＡ−Ｃｍトランスポゾンを含有する７つの株のリブロース終点値は、２．９〜３．７ｇ／Ｌの範囲であった。これらの値は、ＺＷ８０１−４が産生したリブロース量と同様であったが、キシロースイソメラーゼを過剰発現した株が、５６時間目に培地中のキシロースを全て消費した一方で、ＺＷ８０１−４は８０％未満を消費したので、それらは実際には、消費糖基質ベースではより低かった。
【０１７４】
これらの結果は、キシロースイソメラーゼが、Ｉ株中におけるキシロース代謝の律速酵素であることを明らかに示す。それらは、Ｉ株が、キシロースイソメラーゼのはるかにより高い発現レベル維持するのに十分なＲＰＩ酵素活性を有することもまた、明らかにする。染色体中の異なる位置に、８０１ＧａｐＸｙｌＡ−Ｃｍトランスポゾンを含有する７つのＩ株誘導体が全て、キシロース含有培地中で同一の動態で増殖したという事実は、トランスポゾンによって引き起こされる遺伝子破壊事象および／または位置効果が、観察された表現型（すなわちキシロース中のより良い増殖）に顕著に寄与しないことを強く示唆する。この結論はまた、ｍＲＭ３−Ｇ１０を用いた３０℃での振盪フラスコ実験において、トランスポゾンを含有する７つの株が全て、ＺＷ８０１−４およびＩ株と全く同様に良く増殖している、図４Ｂに示される実験によっても支持される。
【０１７５】
上の観察は、次のようにして、ｐＨ制御条件を使用して確認された。振盪フラスコ実験中に、増殖培地のｐＨは、１ｐＨ単位を超えて低下し得て、特にキシロースが唯一の炭素源である場合、これはＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）増殖に対する阻害効果を有する。この問題を回避するために、図５に示されるｐＨ制御バイオリアクター実験を実施した。キシロースイソメラーゼを過剰発現するＩ株誘導体は全て、振盪フラスコ内で同じく挙動したので、その内のＩ（ｃｍ１）およびＩ（Ｃｍ９）の２つのみをこの実験で使用した。振盪フラスコ内で、３０℃において、ｍＲＭ３−Ｘ１０中で種培養を約０．５のＯＤに増殖させ、バイオリアクター内の開始ＯＤは０．０３５であった。バイオリアクターはｍＲＭ３−Ｘ１０もまた含有し、ｐＨ対照として２ＮのＫＯＨを使用して、温度およびｐＨは、それぞれ３０℃および５．８の一定に維持された。
【０１７６】
Ｉ株およびＺＷ８０１−４の成長曲線は、ｐＨ制御条件下では非常に良く似ていたが（図５）、実験の終わり頃にＩ株がわずかにより良く増殖したことが明らかであった。しかし興味深いことに、どちらの株も、これらの条件下では、より多量のリブロースを産生し；ＺＷ８０１−４およびＩ株の終点値は、それぞれ１．９２および１．１６ｇ／Ｌであった。これらの観察は、増殖ｐＨが５．８に維持される場合は、ＺＷ８０１−４中のキシロース代謝にとって、ＲＰＩが大きな支障でないことを示唆する。これらは、ＺＷ８０１−４中の天然ＲＰＩ遺伝子が、このような条件下で、既存のキシロースイソメラーゼ活性レベルと、ほぼ同じペースを保つこともまた示す。それでもなお、図５に示される成長曲線から、増殖培地のｐＨがｐＨ５．８で一定に保たれた場合でさえ、Ｉ株中で過剰発現されたキシロースイソメラーゼが、キシロース代謝を大幅に改善したことは明らかであった。
【０１７７】
８０１ＧａｐＸｙｌＡ−Ｃｍトランスポゾンはまた、Ｉ株に対して使用されたのと同じ処置を使用して、Ｂ９およびＢ１１株に電気穿孔され、３０℃におけるｍＲＭ３−Ｘ１０を用いた振盪フラスコ実験で、これらの各株の１０個の一次形質転換体をキシロース中での増殖について試験した（図６）。形質転換体のいくつかは、キシロース中で、親株よりも良く増殖したが、どちらの場合も、結果は、Ｉ株で得られたもの程には劇的でなかった。異なる形質転換体の間には高度の変動もあり、遺伝子破壊事象および／または挿入位置効果が、観察された表現型に寄与することが示唆された。これらの観察は、Ｉ株中のＲＰＩ発現トランスポゾンの染色体の位置に、ＲＰＩの発現レベル上昇に加えて、キシロース増殖および代謝にとって有益な、何か重大なものがあるかもしれないことを示唆した。
【０１７８】
Ｉ株中のＲＰＩ発現トランスポゾンの挿入部位は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＥ００８６９２）のｎｔｓ  ５４３５０６と５４３５０７の間であることが、ＤＮＡ配列決定によって判定された。挿入領域の配列決定は、トランスポゾンの組み込みが、ポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼをコードするｐｎｐ遺伝子の読み取り枠の３’末端に、フレームシフトを引き起こしたことを示した。野性型ｐｎｐ遺伝子産物と、Ｉ株について予測されたｐｎｐ遺伝子産物とのアラインメントを図７に示す。変異タンパク質が、天然タンパク質の最後の３９個のアミノ酸残基を欠損しており（Ｎ末端から開始して７０９個のアミノ酸を保持する）、そのＣ末端に１４個の新しいアミノ酸を有することに留意されたい（配列番号９）。この機能未知タンパク質が機能性であるのか、もしそうならば、それは、ＲＰＩ過剰発現に加えて、Ｉ株表現型にどの程度寄与し得るのかは分かっていない。この答えにかかわりなく、上の結果は、ｐｎｐコード領域内において、Ｉ株中と同一位置でＲＰＩを過剰発現することは、キシロース中におけるより良い増殖をもたらして、キシロースイソメラーゼのより高い発現レベルを可能にするのに効果的であることを示す。
【０１７９】
実施例４
標的組み込みを使用するキシロース利用Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株構築のためのベクターコンストラクト
ＺＷ１株に、キメラｘｙｌＡ、ｘｙｌＢ、ｔａｌ、およびｔｋｔ遺伝子を導入することによって、新しいキシロース利用Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株を構築した。ｘｙｌＢ、ｔａｌ、およびｔｋｔコード領域は、一般方法に記載されるＺＷ６５８株と同じく、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子からのものである。ｘｙｌＡコード領域は、アクチノプラネス・ミズーリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）からのものであり（ＡＭｘｙｌＡ）、それはＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼよりも高活性を有する酵素をコードするとして、参照によって本明細書に援用する、同一譲受人同時係属米国特許出願公開第２０１１０３１８８０１号明細書で開示される。ＡＭｘｙｌＡのコード領域は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中での発現のためにコドン最適化された（配列番号１７）。リボース−５−リン酸−イソメラーゼ（ＲＰＩ）およびリブロース−リン酸３−エピメラーゼ（ＲＰＥ）活性を増大させるために、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ｒｐｉおよびｒｐｅ遺伝子の追加的なコピーもまた導入された。二重乗換え（ＤＣＯ）変換ベクターをデザインして、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムの標的領域に、キメラ遺伝子を特異的に組み込んだ。
【０１８０】
標準分子組換え方法を使用して、ＤＣＯ（二重乗換え）自殺組み込みベクターを構築した。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中でキシロースイソメラーゼおよびキシルロースキナーゼを発現するために、１０，２５０ｂｐのＤＣＯ自殺ベクターｐＺＸ２１（配列番号２５；図８Ａ）を構築した。このベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の複製起点を含有するが、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）複製起点を含有しないｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ主鎖を有し、したがってそれはＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中で増殖し得ず、自殺ベクターとなる。それは、組み込まれる配列の側面に位置して、グルコースフルクトース酸化還元酵素をコードする、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）遺伝子からのＤＮＡ配列、ＧＦＯ−ＬおよびＧＦＯ−Ｒを含有する。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用して、ＰＣＲによって双方の断片を合成した。１，１８６ｂｐのＧＦＯ−Ｌ断片（配列番号２６）は、ｇｆｏｒコード配列（配列番号２７）の最初の６５４ｂｐ（ｎｔ−１〜ｎｔ−６５３）と、５３３ｂｐの上流ゲノム配列とを含む。１，４４６ｂｐのＧＦＯ−Ｒ断片（配列番号２８）は、ＧＦＯＲコード配列の最後の４８０ｂｐ（ｎｔ−８２３〜ｎｔ−１３０２）と、９６６ｂｐの下流ゲノム配列とを含む。ＧＦＯ−ＬおよびＧＦＯ−Ｒ配列は、ｇｆｏｒ位置への組み込みを誘導して、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノム中のｇｆｏｒコード配列の断片（ｎｔ−６５５〜ｎｔ−８２２）を置換する。参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，７４１，１１９号明細書で開示されるように、これはグルコースフルクトース酸化還元酵素の発現を妨害し、それはキシリトール生成を低下させてエタノール生成を増大させる。
【０１８１】
ＧＦＯ−ＬとＧＦＯ−Ｒの間のｐＺＸ２１中の領域は、３つのキメラ遺伝子を含む。１つは３０４ｂｐのＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＳｕｐｅｒＧＡＰプロモーター（ＰｇａｐＳ；米国特許第７，９８９，２０６号明細書に記載される）、１，１８５ｂｐのＡ．ミズーリエンシス（Ａ．ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）ｘｙｌＡコード配列（ＡＭｘｙｌＡ）、および５’ＸｂａＩ部位（ＥＣａｒａＤ  ３’ＵＴＲ）がある１６６ｂｐの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ａｒａＤ  ３’ＵＴＲを含有する、１，６６１ｂｐのキメラｘｙｌＡ遺伝子（配列番号２９）である。ＡＭｘｙｌＡコード領域は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＭ４（配列番号１７）のコドンバイアスに従って、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中での発現のために最適化された。ＥＣａｒａＤ  ３’ＵＴＲは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ａｒａＢＡＤオペロンからのものである。第２の遺伝子は、１９１ｂｐのＰｅｎｏ、１，４５５ｂｐの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｘｙｌＢコード配列（ＥＣｘｙｌＢ）、および３１４ｂｐの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｘｙｌＢ３’ＵＴＲ（ＥＣｘｙｌＢ  ３’ＵＴＲ）を含有する１，９６０ｂｐのキメラｘｙｌＢ遺伝子（配列番号３０）である。Ｐｅｎｏは、Ｐｇａｐのほぼ２８％の活性を有する、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムＤＮＡからの強力な構成的プロモーターである。第３の遺伝子は、ｌｏｘ部位と境を接する、１，０１４ｂｐのａａｄＡマーカー（スペクチノマイシン耐性に対する；Ｓｐｅｃ−Ｒ）  （配列番号３１）である。マーカーは、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現することで、組み込み後に除去し得る。
【０１８２】
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中でトランスアルドラーゼ、トランスケトラーゼ、リボース−５−Ｐ−イソメラーゼ、およびＤ−リブロース−Ｐ−３−エピメラーゼを発現するために、１２，１９８ｂｐのＤＣＯシャトルベクターｐＺＸ５２（配列番号３２；図８Ｂ）を構築した。このベクターは、ベクターｐＺＢ１８８に基づく、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シャトルベクター（Ｚｈａｎｇら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７：２４０−２４３；ＵＳ５，５１４，５８３）であり、それは、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞中でベクターが自己複製できるようにする複製起点を含有する２，５８２ｂｐのＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムＤＮＡ断片と、９０９ｂｐの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製起点（Ｏｒｉ）とを含む。それは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）形質転換体のいずれかの選択のための、９１１ｂｐのクロラムフェニコール耐性マーカー（Ｃｍ−Ｒ）を有する。ｐＺＸ５２は、組み込まれる配列の側面に位置する、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ｌｄｈＡ遺伝子、ＬＤＨ−Ｌ（８７５ｂｐ；配列番号３３）およびＬＤＨ−Ｒ（１，１４９ｂｐ；配列番号３４）からのＤＮＡ配列を含有する。これらの配列は、ヌクレオチド４９３と４９４の間で、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノム中のｌｄｈＡコード配列（配列番号３５）への組み込みを誘導し、したがって乳酸デヒドロゲナーゼの発現を妨害する。
【０１８３】
ＬＤＨ−ＬとＬＤＨ−Ｒの間のｐＺＸ５２中の領域は、２つのキメラオペロンを含む。第１のものは、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＧＡＰプロモーター（ＰｇａｐＴ）の３０４ｂｐのＴ−変異、９５４ｂｐの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔａｌコード領域（ＥＣＴａｌ）、１，９９２ｂｐの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｋｔコード領域、および６８ｂｐの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｋｔ  ３’ＵＴＲ（ＥＣＴｋｔ  ３’ＵＴＲ）を含有する、３，３３９ｂｐのＰｇａｐＴ−Ｔａｌ−Ｔｋｔオペロン（配列番号３６）である。このオペロンは、配列番号２１の位置８３の「Ｇ」から「Ａ」への変化と位置２８５の「Ｔ」欠損があるＰｇａｐであるＰｇａｐＴプロモーター（配列番号３７）以外は、天然の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔａｌ−Ｔｋｔオペロンと同一である。別のキメラオペロンは、１９１ｂｐのＰｅｎｏ、第１のコドンがＡＴＧに変化した４７１ｂｐのＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）Ｒｐｉコード配列（配列番号６５）（ＺＭＲｐｉ）、６６３ｂｐのＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）Ｒｐｅコード配列（ＺＭＲｐｅ）、および３５ｂｐの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｘｙｌＡ３’ＵＴＲ（ＥＣｘｙｌＡ  ３’ＵＴＲ）を含有する、１，４４３ｂｐのＰｅｎｏ−Ｒｐｉ−Ｒｐｅオペロン（配列番号３８）である。
【０１８４】
ｐＺＸ６と命名された別のＤＣＯシャトルベクター（配列番号３９；図８Ｃ）が、構築された。この１２，７０４ｂｐのベクターは、ポリヌクレオチドホスホリラーゼをコードするＺ．モビリス（Ｚ  ｍｏｂｉｌｉｓ）ｐｎｐ遺伝子からの配列で、ＬＤＨ−ＬおよびＬＤＨ−Ｒ配列が置換された、ｐＺＸ５２の修飾である。１，３１８ｂｐのＰＮＰ−Ｌ断片（配列番号４０）が、ｎｔ−７６７〜ｎｔ−２，０８４のｐｎｐコード配列（配列番号１）の断片である一方で、１，２２５ｂｐのＰＮＰ−Ｒ断片（配列番号４１）は、ｐｎｐコード配列の最後の５９ｂｐ（ｎｔ−２１８９〜ｎｔ−２２４７）と、１，１６６ｂｐの下流ゲノム配列とを含む。したがってｐＺＸ６は、ｐｎｐコード配列末端近くの内在性ｐｎｐ遺伝子へのＰｇａｐＴ−Ｔａｌ−ＴｋｔオペロンおよびＰｅｎｏ−Ｒｐｉ−Ｒｐｅオペロンの組み込みを誘導して、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノム中のｐｎｐコード配列（ｎｔ−２，０８４〜ｎｔ−２，１８８）断片を置き換えることができる。
【０１８５】
実施例５
キシロース利用Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株の開発
ＺＷ１株は、２つのプラスミドによって２段階で形質転換された。１５０ｒｐｍで振盪しながら、ｍＲＭ３−Ｇ５（１％酵母抽出物、１５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、４ｍＭのＭｇＳＯ４、および５０ｇ／Ｌのグルコース）中で、ＯＤ６００値が５に近くなるまで、種細胞を３０℃で一晩培養して、ＺＷ１のコンピテント細胞を作成した。細胞を収集して、新鮮培地に０．０５のＯＤ６００値に再懸濁した。初期から中期対数期（０．５に近いＯＤ６００）と同一条件下で、細胞を培養した。細胞を収集して、氷冷水で２回、次に氷冷１０％グリセロールで１回洗浄した。得られたコンピテント細胞を収集し、氷冷１０％グリセロールに、ＯＤ６００値が１００近くになるよう再懸濁した。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の形質転換には、非メチル化ＤＮＡが必要であるため、ＤＣＯプラスミドｐＺＸ２１、ｐＺＸ５２、およびｐＺＸ６を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＣＳ１１０コンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）にそれぞれ形質転換した。各形質転換では、１個の形質転換細胞コロニーを１０ｍＬのＬＢ−Ａｍｐ１００（１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含有するＬＢブロス）中で一晩３７℃で培養した。ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、１０ｍＬの培養物からＤＮＡを調製した。
【０１８６】
１ＭＭ電気穿孔キュベット（ＶＷＲ，Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）内で、およそ１μｇの非メチル化ｐＺＸ２１  ＤＮＡを５０μＬのＺＷ１コンピテント細胞と混合した。ＢＴ７２０  Ｔｒａｎｓｐｏｒａｔｅｒ  Ｐｌｕｓ（ＢＴＸ−Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、プラスミドＤＮＡを２．０ＫＶで細胞中に電気穿孔した。１ｍＬのＭＭＧ５培地（１０ｇ／Ｌのグルコース、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、５ｇ／Ｌのトリプトン、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）  ２ＳＯ４、２ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、および１ｍＭのＭｇＳＯ４）中で形質転換細胞を３０℃において４時間で回収し、ＡｎａｅｒｏＰａｃｋ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  Ｇａｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を入れた嫌気ジャー内で、ＭＭＧ５−Ｓｐｅｃ２５０プレート（２５０ｍｇ／Ｌスペクチノマイシンおよび１５ｇ／Ｌ寒天添加ＭＭＧ５）上で３日間、３０℃で増殖させた。
【０１８７】
ｐＺＸ２１はＤＣＯ自殺ベクターであるので、生き残ったＳｐｅｃＲコロニーは、ｇｆｏｒ遺伝子座に組み込まれたＰｇａｐＳ−ＡＭｘｙｌＡ：：Ｐｅｎｏ−ＥＣｘｙｌＢ：：Ｓｐｅｃ−Ｒ断片を有した。コロニーを新鮮ＭＭＧ５−Ｓｐｅｃ２５０プレート上に画線塗抹して増殖させ、次にＰＣＲを実施して、キメラ遺伝子の組み込みを検査した。第１のＰＣＲは、順方向プライマーａｒａ２８５（配列番号４２）と逆方向プライマーａｒａ１２０（配列番号４３）を使用して、ｐＺＸ２１中でＧＦＯ−Ｌ断片によって媒介される二重交差型組換えを調べた。ａｒａ２８５プライマーは、ゲノム中のＧＦＯ−Ｌ断片の４９４ｂｐ上流であるＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノム配列の断片に一致した一方で、ａｒａ１２０はｐＺＸ２１中のＰｇａｐＳの最後の１８ｂｐとＡＭｘｙｌＡの最初の１７ｂｐを補完した。組み込みが設計通りに起きたならば、ＰＣＲは、形質転換体からの１，９０３ｂｐの断片を増幅する。第２のＰＣＲは、順方向プライマーａｒａ４６（配列番号４４）と逆方向プライマーａｒａ２７４（配列番号４５）を使用して、ｐＺＸ２１中でＧＦＯ−Ｒ断片によって媒介される二重交差型組換えを調べた。ａｒａ４６プライマーは、ｐＺＸ２１中のＳｐｅｃＲ遺伝子の末端近くの配列である一方で、ａｒａ２７４は、ＧＦＯ−Ｒ断片の８３ｂｐ下流のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムＤＮＡ断片を補完する。このＰＣＲは、成功裏の組み込みを有するコロニーからの１，８６４ｂｐの断片を増幅する。どちらの検査も予測されたＰＣＲ産物を生じ、したがって正確な導入遺伝子組み込みが確認された。得られた株は、ＺＷ１−ｐＺＸ２１と命名された。
【０１８８】
第２のステップでは、ＺＷ１−ｐＺＸ２１をｐＺＸ５２で形質転換して、ＭＭＧ５−Ｓｐｅｃ２５０−ＣＭ１２０（１２０ｍｇ／Ｌクロラムフェニコール添加ＭＭＧ５−Ｓｐｅｃ２５０）プレート上で選択した。ｐＺＸ５２は、プラスミド選択のためのＣｍＲマーカーと、マーカーのない組み込み断片（ＰｇａｐＴ−ＥＣＴａｌ−ＥＣＴｋｔ：：Ｐｅｎｏ−ＺＭＲｐｉ−ＺＭＲｐｅ）とを有するＤＣＯシャトルベクターであるので、回収されたコロニーは、増殖したｐＺＸ５２プラスミド中に、先にモビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノム中に組み込まれたコンストラクトＰｇａｐＳ−ＡＭｘｙｌＡ：：Ｐｅｎｏ−ＥＣｘｙｌＢ：：Ｓｐｅｃ−ＲｉｎｔｈｅＺだけでなく、組み込まれないコンストラクトＰｇａｐＴ−ＥＣＴａｌ−ＥＣＴｋｔ：：Ｐｅｎｏ−ＺＭＲｐｉ−ＺＭＲｐｅもまた含有するはずである。これらの形質転換体は、キシロース利用経路に必要な全ての遺伝子を有するはずである。導入遺伝子が全てＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中で機能することを示すために、キシロース中で１０個の選択コロニーに４８時間増殖アッセイを実施した。アッセイでは、１４ｍＬのＦａｌｃｏｎポリプロピレン丸底管内の２ｍＬのｍＲＭ３−Ｇ５−Ｓｐｅｃ２００−ＣＭ１２０（２００ｍｇ／Ｌスペクチノマイシンおよび１２０ｍｇ／Ｌクロラムフェニコール添加ｍＲＭ３−Ｇ５）に、選択コロニーを接種して、１５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩培養した。管にはきっちり栓をしたが、細胞増殖および発酵中の圧力放出のために、２３Ｇ１針を使用して蓋の上部に孔を開けた。細胞を収集して、ＭＲＭ３Ｘ１０（１００ｇ／Ｌキシロース添加ＭＲＭ３）で洗浄し、ｍＲＭ３−Ｘ１０−Ｓｐｅｃ２００−ＣＭ１２０（２００ｍｇ／Ｌスペクチノマイシンおよび１２０ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールを含有するｍＲＭ３−Ｘ１０）に再懸濁して、０．１の開始ＯＤ６００にした。５ｍＬの懸濁液を新しい１４ｍＬのＦａｌｃｏｎポリプロピレン丸底管に入れた。管に栓をして、上部に孔を開けた。１５０ｒｐｍで振盪しながら、細胞を３０℃で４８時間増殖させ、島津ＵＶ−１２０１分光光度計上でＯＤ６００を測定した。次に、１ｍＬの培養物を１０，０００×ｇで遠心分離して、細胞を除去した。０．２２μｍのＣｏｓｔａｒＳｐｉｎ−Ｘ遠心管フィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）を通して上清を濾過し、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）上で、５５℃で速度０．６ｍＬ／分の０．０１ＮのＨ２ＳＯ４と共に、ＢｉｏＲａｄ  Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−Ａ７Ｈイオン排除カラム（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に通過させて、キシロースおよびエタノールについて分析した。結果は、１０個の形質転換体が全て、エタノール生成のためのキシロース利用経路を獲得したことを示唆した。新しい株は、ＺＷ１−ｐＺＸ２１−ｐＺＸ５２と命名され、培養物の１つをさらなる実験で使用した。
【０１８９】
次にＰｇａｐＴ−ＥＣＴａｌ−ＥＣＴｋｔ：：Ｐｅｎｏ−ＺＭＲｐｉ−ＺＭＲｐｅコンストラクト組み込みのために、ＺＷ１−ｐＺＸ２１−ｐＺＸ５２に３つの形質転換後手順を順次実施した。
【０１９０】
（１）株は、キシロース上で適応させた。この手順では、５ｍＬのｍＲＭ３−Ｇ１Ｘ９−Ｓｐｅｃ２００−ＣＭ１２０培地（１０ｇ／Ｌグルコース、９０ｇ／Ｌキシロース、２００ｍｇ／Ｌスペクチノマイシン、および１２０ｍｇ／Ｌクロラムフェニコール添加ＭＲＭ３）に、ＺＷ１−ｐＺＸ２１−ｐＺＸ５２を懸濁して、０．２のＯＤ６００値から開始して、３０℃で３〜４倍（０．２〜２のＯＤ６００値；１代の継代）に増殖させた。次に培養を開始ＯＤ６００値に希釈して、さらなる継代のために増殖させた。全部で４代の継代（約１５倍の増加）を完了した。
【０１９１】
（２）１０μＬの適応細胞プールを２ｍＬのｍＲＭ３−Ｇ５−Ｓｐｅｃ２００培地中において、より高温（３７℃）で一晩培養することにより、プラスミドキュアリングおよびＰｇａｐＴ−ＥＣＴａｌ−ＥＣＴｋｔ：：Ｐｅｎｏ−ＺＭＲｐｉ−ＺＭＲｐｅコンストラクトの組み込みを実施した。次に１０μＬの培養物を２ｍＬのｍＲＭ３−Ｇ５−Ｓｐｅｃ２００培地中で希釈して、さらなる継代のために増殖させた。３７℃でグルコース培地中において、全部で５代の継代を実施した。高温増殖の結果として、集団の大部分は、もはやｐＺＰ５２プラスミドを保有するはずはないが、ＰｇａｐＴ−ＥＣＴａｌ−ＥＣＴｋｔ：：Ｐｅｎｏ−ＺＭＲｐｉ−ＺＭＲｐｅコンストラクト（選択的マーカーを欠く）が、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムのｌｄｈＡ遺伝子に組み込まれたはずである。集団の少数が、ｐＺＸ５２を組み込まずに保持することもある。
【０１９２】
（３）集団は、２ｍＬのｍＲＭ３−Ｘ１０−Ｓｐｅｃ２００中で、５０μＬの細胞プールを３０℃で一晩培養して濃縮した。濃縮された集団は、ＭＭＧ５−Ｓｐｅｃ２５０プレート上で一晩３０℃で増殖させた。個々のコロニーを選択して、ＭＭＧ５プレートおよびＭＭＧ５−ＣＭ１２０プレート上に、複製で画線塗抹した。３０℃で一晩の培養後、ＭＭＧ５上で増殖したがＭＭＧ５−ＣＭ１２０上では増殖しなかったコロニーを、さらなるＰＣＲ検査のために選択した。第１のＰＣＲは、順方向プライマーａｒａ４５（配列番号４６）と逆方向プライマーａｒａ３５６（配列番号４７）を使用して、ｐＺＸ５２中でＬＤＨ−Ｌ断片によって媒介される二重交差型組換えを調べた。ａｒａ４５プライマーは、ゲノム中のＬＤＨ−Ｌ断片の８６ｂｐ上流のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムＤＮＡ断片と一致し、ａｒａ３５６はｐＺＸ５２中のＥＣＴａｌコード領域断片（ｎｔ−９１〜ｎｔ−１１２）を補完した。組み込みが設計通りに起きたならば、ＰＣＲは、コロニーからの１，３８３ｂｐの断片を増幅する。第２のＰＣＲは、順方向プライマーａｒａ３５４（配列番号４８）と逆方向プライマーａｒａ４３（配列番号４９）を使用して、ｐＺＸ５２中でＬＤＨ−Ｒ断片によって媒介される二重交差型組換えを調べた。ａｒａ３５４プライマーは、ｐＺＸ５２中のＺＭＲｐｅの３’末端近くの配列である。ａｒａ４３プライマーは、ＬＤＨ−Ｒ断片の１２２ｂｐ下流のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムＤＮＡ断片を補完する。組換えが予測されたようであれば、このＰＣＲは、コロニーからの１，４６８ｂｐ断片を増幅する。どちらのＰＣＲも予測されたサイズのＤＮＡ断片を生じ、それはＰｇａｐＴ−ＥＣＴａｌ−ＥＣＴｋｔ：：Ｐｅｎｏ−ＺＭＲｐｉ−ＺＭＲｐｅコンストラクトが、検査されたコロニーの全てに、設計通りに正確に組み込まれたことを立証した。得られたコロニーは、ＺＷ１−Ｘ１０９と命名された。
【０１９３】
第２のアプローチでは、ＺＷ１−ｐＺＸ２１株をｐＺＸ６ＤＣＯシャトルベクターによって形質転換し、適応が１０代でなく４代の継代であったこと以外は、ＺＷ１−Ｘ１０９について上述された、３つの形質転換後手順を実施した。したがってＰｇａｐＴ−ＥＣＴａｌ−ＥＣＴｋｔ：：Ｐｅｎｏ−ＺＭＲｐｉ−ＺＭＲｐｅコンストラクトは、内在性ｐｎｐ遺伝子の標的とされる。ＺＷ１−Ｘ１０９の構築で説明されるように、３つの形質転換後手順に先だって４８時間増殖アッセイを実施して、全ての導入遺伝子が予測されたように機能することを確実にした。３つの形質転換後手順の後、組み込みはまた、ＰＣＲによっても検査した。第１のＰＣＲは、順方向プライマーａｒａ３４０（配列番号５０）と逆方向プライマーａｒａ３５６（配列番号４７）を使用して、ｐＺＸ６中でＰＮＰ−Ｌ断片によって媒介される二重交差型組換えを調べた。ａｒａ３４０プライマーは、ＰＮＰ−Ｌ断片の７５ｂｐ上流であるＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムＤＮＡに一致する。本明細書で使用されるａｒａ３５６プライマーは、ｐＺＸ６中のＥＣＴａｌの断片（ｎｔ−９１〜ｎｔ−１１２）を補完する。ＰＣＲは、正確な組み込み事象に対して予測されたように、１，８１５ｂｐの断片を形質転換体から生じた。第２のＰＣＲは、順方向プライマーａｒａ３５４（配列番号４８）と逆方向プライマーａｒａ３３９（配列番号５１）を使用して、ｐＺＸ６中でＰＮＰ−Ｒ断片によって媒介される二重交差型組換えを調べた。この場合、ａｒａ３５４プライマーは、ｐＺＸ６中のＺＭＲｐｅの３’末端近くの配列に一致し、ａｒａ３３９プライマーは、ＰＮＰ−Ｒ断片配列の５９ｂｐ下流のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムＤＮＡ断片を補完する。このＰＣＲは、成功裏の組み込みに期待されるサイズである、１，５４９ｂｐの断片を形質転換体から増幅した。したがってＰＣＲ検査は、ＰｇａｐＴ−ＥＣＴａｌ−ＥＣＴｋｔ：：Ｐｅｎｏ−ＺＭＲｐｉ−ＺＭＲｐｅコンストラクトが、検査されたコロニーの全てに正確に組み込まれたことを立証した。この新しい株は、ＺＷ１−Ｘ２１０と命名された。
【０１９４】
要約すれば、２つのキシロース利用Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株が、野性型ＺＷ１から新規に再構築された。これらはどちらも、ｇｆｏｒ遺伝子座に組み込まれたＰｇａｐＳ−ＡＭｘｙｌＡ：：Ｐｅｎｏ−ＥＣｘｙｌＢ：：Ｓｐｅｃ−Ｒコンストラクトを有した。ＺＷ１−Ｘ１０９株が、ｌｄｈＡ遺伝子座に組み込まれたＰｇａｐＴ−ＥＣＴａｌ−ＥＣＴｋｔ：：Ｐｅｎｏ−ＺＭＲｐｉ−ＺＭＲｐｅコンストラクトを有した一方で、ＺＷ１−Ｘ２１０株は、内在性ｐｎｐ遺伝子に組み込まれた同一コンストラクトを有した。どちらの株も、組み込まれたＰｇａｐＳ−ＡＭｘｙｌＡ：：Ｐｅｎｏ−ＥＣｘｙｌＢ：：Ｓｐｅｃ−Ｒコンストラクト中に、１つのマーカー遺伝子を有し、それはＣｒｅリコンビナーゼの導入によって除去し得た。
【０１９５】
実施例６
新しいキシロース利用Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株の特性解析
実施例５に記載される標準増殖アッセイによって、ＺＷ１−Ｘ１０９およびＺＷ１−Ｘ２１０株がキシロースを発酵する能力を実証した。これらの新しい株の増殖および代謝プロファイルを定量的に判定して、それらをＺＷ１と比較するために、振盪フラスコ発酵アッセイ中でこれらの株を特性解析した。最初にそれらの基礎グルコース代謝を測定するために、ＭＲＭ３Ｇ１０を使用してそれらを振盪フラスコ発酵に供した。株を２ｍＬのｍＲＭ３−Ｇ５−Ｓｐｅｃ２５０中、１５０ｒｐｍで振盪しながら、一晩３０℃で増殖させた。細胞を収集してｍＲＭ３−Ｇ１０で洗浄し、ｍＲＭ３Ｇ１０に再懸濁して、開始ＯＤ６００を０．１とした。２０ｍＬの懸濁液を４５ｍＬのねじ蓋付きＶＷＲ遠心管に入れて、１５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で増殖させた。発酵中のエタノール蒸発に起因する圧力増大を防止するために、蓋をしっかり閉めて、次に１回転分緩めた。時間経過中、０、１０、および２４時間目に、島津ＵＶ−１２０１分光光度計上でＯＤ６００を測定した。各時点で、１ｍＬの培養物を１０，０００×ｇで遠心分離して、細胞を除去した。０．２２μｍのＣｏｓｔａｒ  Ｓｐｉｎ−Ｘ遠心管フィルターを通して上清を濾過し、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシステム上で、５５℃において０．６ｍＬ／分の速度で、０．０１ＮのＨ２ＳＯ４と共に、ＢｉｏＲａｄ  Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−Ａ７Ｈイオン排除カラムを通過させて分析した。野性型ＺＷ１を抗生物質なしで増殖させ、対照として分析した。図９に示される結果は、各株が、２４時間以内に利用可能グルコースを迅速に枯渇して；ＺＷ１−Ｘ１０９およびＺＷ１−Ｘ２１０株（それぞれ図８Ａ、８Ｂ）の双方が、ＺＷ１（図８Ｃ）と同様にグルコースを利用したことを示す。例えば１０時間の発酵後、ＺＷ１−Ｘ１０９はおよそ３４．８％のグルコース（１０２．７ｇ／Ｌから６６．９ｇ／Ｌへの低下）を利用して、１６．４ｇ／Ｌのエタノール力価と、４．８８のＯＤ６００値に至るバイオマス成長を維持し；ＺＷ１−Ｘ２１０は、およそ３２．１％のグルコース（１０２．７ｇ／Ｌから６９．７ｇ／Ｌへの低下）を利用して、１５．２ｇ／Ｌのエタノール力価と、４．６８のＯＤ６００値に至るバイオマス成長を維持し；ＺＷ１は、およそ３３．９％のグルコース（１０３．１ｇ／Ｌから６８．２／Ｌへの低下）を利用して、１６．４ｇ／Ｌのエタノール力価と、４．６のＯＤ６００値に至るバイオマス成長を維持した。したがってどちらの新しい株も、堅調な基礎グルコース代謝を有した。
【０１９６】
各株がキシロースを利用する能力を測定するために、２０ｍＬのｍＲＭ３−Ｘ１０中で振盪フラスコ発酵を実施した。ＯＤ６００値と、キシロースおよびエタノール双方の濃度とを０、２４、４８、および７２時間目に測定した。図１０は、ＺＷ１−Ｘ１０９（Ａ）、ＺＷ１−２１０（Ｂ）、およびＺＷ１（Ｃ）についての結果の要約である。結果はまた、新しい株が、どちらもキシロースを発酵できることを裏付ける。７２時間の発酵後、ＺＷ１−Ｘ１０９は、約６４．２％のキシロースを利用して（１０５．６ｇ／Ｌから３７．８ｇ／Ｌへの低下）、３１．５ｇ／Ｌのエタノール力価と、３．５１のＯＤ６００値へのバイオマス成長を維持し；ＺＷ１−Ｘ２１０は、ほぼ全ての利用可能キシロースを利用して（１０５．６ｇ／Ｌから１．６ｇ／Ｌへの低下）、４８．５ｇ／Ｌのエタノール力価と、５．２２のＯＤ６００値へのバイオマス成長を維持した。しかしＺＷ１は、キシロース代謝経路を欠くために、ｍＲＭ３−Ｘ１０中で増殖し得なかった。したがって新しい株の中では、ＺＷ１−Ｘ２１０は、キシロース含有単一糖培地中で、ＺＷ１−Ｘ１０９よりも迅速にキシロースを発酵し得た。ＺＷ１−Ｘ１０９とＺＷ１−Ｘ２１０の間の大きな違いは、ＰｇａｐＴ−ＥＣＴａｌ−ＥＣＴｋｔ：：Ｐｅｎｏ−ＺＭＲｐｉ−ＺＭＲｐｅコンストラクトが、ＺＷ１−Ｘ１０９ではｌｄｈＡ遺伝子座に挿入され、ＺＷ１−Ｘ２１０では内在性ｐｎｐ遺伝子に挿入されたことであった。この結果は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中のｐｎｐ遺伝子の中断が、キシロース代謝に利益をもたらし得ることを示唆する。
【０１９７】
実施例７
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株中の内在性ｐｎｐ遺伝子中断のためのベクターコンストラクト
内在性ｐｎｐ遺伝子の中断が、キシロース代謝に有利かどうかを直接試験するために、標準分子組換え方法によって、図４に示される４つのＤＣＯ自殺ベクターを構築した。
【０１９８】
ｐＰＮＰ−Ｉ（配列番号５５；図１１Ａ）は、５，５４８ｂｐのｐＵＣ１８ベースのＤＣＯベクターである。その主鎖は、６５３ｂｐの複製起点（ｐＵＣＯｒｉ）と１，１４４ｂｐのアンピシリン耐性マーカー（Ａｍｐ−Ｒ）とを含有して、ベクターが増殖して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で選択されるようにする。ｐＰＮＰ−Ｉは、９１１ｂｐのクロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｃｍ−Ｒ）と、内在性ｐｎｐ遺伝子へのこの遺伝子の組み込みを標的とする側面に位置する配列とを含有する。８９１ｂｐの上流フランキング配列（配列番号５６）は、７７５ｂｐのＰＮＰｉ−Ｌ配列（ｎｔ−１，３４５〜ｎｔ−２，１１９のｐｎｐコード領域（配列番号１））、９ｂｐの直接反転断片（ＤＲ）、１９ｂｐのＭＥ（モザイク末端）要素、および３４ｂｐのＬｏｘ要素からなる、１，０３０ｂｐの下流フランキング配列（配列番号５７）は、１９ｂｐのＭＥ要素、９ｂｐの直接反転断片（ＤＲ）、および９１６ｂｐのＰＮＰｉ−Ｒ配列からなる。ＰＮＰｉ−Ｒ配列は、ｐｎｐコード領域（ｎｔ−２，１２９〜ｎｔ−２，２４４）の最後の１１６ｂｐと、ｐｎｐコード配列下流の８００ｂｐのＤＮＡ配列を含む。ＰＮＰｉ−ＬおよびＰＮＰｉ−Ｒは、どちらもＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ１のゲノムＤＮＡから増幅された。ｐＰＮＰ−Ｉ中では、ＰＮＰｉ−ＬおよびＰＮＰｉ−Ｒ配列は、それらの配列間にあるＤＮＡ配列のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムへの組み込みを、二重乗換え相同的組換えを通じて、ｐｎｐコード領域のｎｔ−２，１１９とｎｔ−２，１２９の間で誘導する。組み込みは、内在性ｐｎｐ遺伝子を中断して、実施例３に記載されるＩ株の遺伝子型と同様であり、組み込まれた導入遺伝子は、Ｒｐｉ：：Ｓｐｅｃ−ＲでなくＣｍ−Ｒである。これは、野生型ｐｎｐタンパク質生成物（７４８個のアミノ酸ポリヌクレオチドホスホリラーゼ；配列番号２）よりもアミノ酸が２５個短い、実施例３に記載される７２３個のアミノ酸のトランケート型ｐｎｐ融合タンパク質産物をもたらす。トランケート型タンパク質は、最初の７０９個のアミノ酸残基を野生型と共有するが、Ｃ末端（配列番号９）に付着する新しい１４個のアミノ酸配列を有する。
【０１９９】
ｐＰＮＰ−ＩＮ（図１１Ｂ；配列番号５８）もまた、６，４７１ｂｐサイズのｐＵＣ１８ベースのＤＣＯベクターである。これは、ＰＮＰｉ−ＬをＰＮＰ−Ｕにより、そしてＰＮＰｉ−ＲをＰＮＰ−Ｄにより置換することで、ｐＰＮＰ−Ｉから直接誘導された。ＰＮＰ−Ｕ（配列番号５９）は、ｐｎｐコード領域の最初の９６ｂｐと、ｐｎｐコード領域上流の１，２７３ｂｐの配列とからなる、１，３６９ｂｐのＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムＤＮＡ断片である。ＰＮＰ−Ｄ（配列番号６０）は、ｎｔ−９７〜ｎｔ−１，３４７のｐｎｐコード配列の一部を含む１，２５１ｂｐのＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムＤＮＡ断片である。ベクターｐＰＮＰ−ＩＮ中では、ＰＮＰ−ＵおよびＰＮＰ−Ｄは相同的組換え断片であり、それらは、２つの９ｂｐのＤＲ要素間の配列のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムへの組み込みを、ｐｎｐコード領域のｎｔ−９６とｎｔ−９７の間で誘導する。組み込みは内在性ｐｎｐ遺伝子を中断して、野生型ｐｎｐタンパク質生成物よりもアミノ酸が６９９個短い、わずか４９個のアミノ酸残基があるトランケート型ｐｎｐタンパク質生成物（配列番号１２）をもたらす。この短いタンパク質は、最初の３２個のアミノ酸残基を野生型と共有して、次にＣ末端に付着する１７個の新しいアミノ酸残基を有する。
【０２００】
ｐＰＮＰ−Ｃ（配列番号６１、図１１Ｃ）は、６，３４２ｂｐのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベースのベクターである。その主鎖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での増殖および選択のための、ｆ１（＋）複製部位（ｆ１（＋）Ｏｒｉ）、アンピシリン耐性マーカー（Ａｍｐ−Ｒ）、およびｐＵＣ複製部位（ｐＵＣＯｒｉ）からなる。ベクター中では、９１１ｂｐのクロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｃｍ−Ｒ）は、１，３１８ｂｐのＰＮＰ−Ｌ断片と１，２２５ｂｐのＰＮＰ−Ｒ断片で挟まれるＰＮＰ−ＬおよびＰＮＰ−Ｒ断片は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ１ゲノムＤＮＡから増幅され、実施例４に記載されるｐＺＸ６中のものと同一である。ＰＮＰ−Ｌ断片は、ｎｔ−７６７〜ｎｔ−２，０８４のｐｎｐコード配列の断片である一方で、ＰＮＰ−Ｒ断片は、ｐｎｐコード配列の最後の５６ｂｐ（ｎｔ−２１８９〜ｎｔ−２２４４）、その停止コドン、および１，１６６ｂｐの下流配列を含む。したがってｐＰＮＰ−Ｃは、Ｃｍ−Ｒマーカーのｐｎｐコード領域への組み込みを、ｎｔ−２，０８５およびｎｔ−２，１８８の間で誘導する。この組み込み部位は、ｐｎｐコード配列の３’末端に近く、ｐＰＮＰ−Ｉの標的組み込み部位の３４ｂｐ上流である。トランケート型ｐｎｐコード領域は、６９７個のアミノ酸のタンパク質（配列番号１０）を生じ、それは野生型よりもアミノ酸残基が５１個短く、６９５アミノ酸残基を野生型と共有して、２個の新しいアミノ酸がＣ末端にある。
【０２０１】
ｐＰＮＰ−Ｃと同様、ｐＰＮＰ−Ｍ（配列番号６２；図１１Ｄ）は、６，３２２ｂｐのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベースのベクターであり、それはまた、ｆ１（＋）Ｏｒｉ、Ａｍｐ−Ｒ、およびｐＵＣ  Ｏｒｉからなる主鎖配列も有する。しかしｐＰＮＰ−Ｍ中では、９１１ｂｐのクロラムフェニコール耐性導入遺伝子（Ｃｍ−Ｒ）は、１，２００ｂｐのＰＮＰｍ−Ｌ断片と１，３２４ｂｐのＰＮＰｍ−Ｒ断片で挟まれる。側面に位置する断片は、どちらもＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ１ゲノムＤＮＡから増幅された。ＰＮＰｍ−Ｌ（配列番号６３）が、ｐｎｐコード配列上流の９６ｂｐのゲノム配列、およびｐｎｐコード配列の最初の１，１０４ｂｐ（ｎｔ−１〜ｎｔ−１１０４）を含む一方で、ＰＮＰｍ−Ｒ（配列番号６４）は、ｐｎｐコード配列の最後の１１４０ｂｐ（ｎｔ−１，１０５〜ｎｔ−２２４４）、その停止コドン、および１８１ｂｐの下流配列を含む。したがってｐＰＮＰ−Ｍは、Ｃｍ−Ｒマーカーの内在性ｐｎｐ遺伝子への組み込みを、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムのｎｔ−１，１０４とｎｔ−１，１０５の間で誘導できる。組み込み部位は、ｐｎｐコード配列の中央に近く、ｐＰＮＰ−Ｉ組み込み部位の１，０１５ｂｐ上流である。これは、野生型ｐｎｐタンパク質生成物よりもアミノ酸が３７０個短い、トランケート型の３７８個のアミノ酸のｐｎｐタンパク質生成物（配列番号１１）をもたらす。トランケート型タンパク質は、最初の３６８個のアミノ酸残基を野生型と共有するが、Ｃ末端に付着する新しい１０個のアミノ酸配列を有する。
【０２０２】
実施例８
ＺＷ１−Ｘ１０９株中の内在性ｐｎｐ遺伝子の中断
内在性ｐｎｐ遺伝子の中断が、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中のキシロース利用に有利かどうかを判定するために、実施例５に記載されるようにして、ｐＰＮＰ−Ｉ、ｐＰＮＰ−Ｃ、ｐＰＮＰ−Ｍ、およびｐＰＮＰ−ＩＮで、ＺＷ１−Ｘ１０９を別々に形質転換した。４つのベクターは全て自殺ベクターであるので、ＭＭＧ５−ＣＭ１２０プレート（１２０ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールおよび１５ｇ／Ｌ寒天添加ＭＭＧ５）上で、形質転換体を直接選択した。得られた株は、ＺＷ１−Ｘ１０９−ＰＮＰｉ、ＺＷ１−Ｘ１０９−ＰＮＰｃ、ＺＷ１−Ｘ１０９−ＰＮＰｍ、およびＺＷ１−Ｘ１０９−ＰＮＰｉｎと命名された。各株の数個のコロニーを新鮮ＭＭＧ５−ＣＭ１２０プレート上に画線塗抹して、増殖させた。導入遺伝子組み込みは、ＰＣＲ検査によって確認した。
【０２０３】
５個のプライマーをＰＣＲ検査で用いた。順方向プライマーａｒａ４４８（配列番号５２）は、全てのｐＰＮＰプラスミド中でＣｍ−Ｒマーカーの最初に位置する配列である。逆方向プライマーａｒａ３３９（配列番号５１）は、ｐｎｐ遺伝子下流のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノム配列断片を補完する。それらは、組換え断片であるｐＰＮＰ−Ｉ中のＰＮＰｉ−Ｒ、ｐＰＮＰ−Ｃ中のＰＮＰ−Ｒ、ｐＰＮＰ−Ｍ中のＰＮＰｍ−Ｒ、およびｐＰＮＰ−ＩＮ中のＰＮＰ−Ｄによって媒介される、二重交差型組換えを調べるために使用した。組み込みが成功すれば、これらの２つのプライマーは、ＺＷ１−Ｘ１０９−ＰＮＰｉ株からの２，３９３ｂｐ、ＺＷ１−Ｘ１０９−ＰＮＰｃ株からの２，２５６ｂｐ、ＺＷ１−Ｘ１０９−ＰＮＰｍ株からの３，３６１、およびＺＷ１−Ｘ１０９−ＰＮＰｉｎ株からの４，５６５ｂｐのＰＣＲ産物を増幅する。順方向プライマーａｒａ３４０または４Ｒ０（それぞれ配列番号５０および５３）および逆方向プライマーａｒａ４４９（配列番号５４）を使用して、組換え断片であるｐＰＮＰ−Ｉ中のＰＮＰｉ−Ｌ、ｐＰＮＰ−Ｃ中のＰＮＰ−Ｌ、ｐＰＮＰ−Ｍ中のＰＮＰｍ−Ｌ、およびｐＰＮＰ−ＩＮ中のＰＮＰ−Ｕによって媒介される、二重交差型組換えを調べた。ａｒａ３４０プライマーは、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムＤＮＡ中のＰＮＰｉ−ＬおよびＰＮＰ−Ｌ配列の上流に位置する、ｐｎｐコード配列の断片（ｎｔ−７０２〜ｎｔ−７２４）に一致する。４Ｒ０プライマーは、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノム配列の断片であり、ｐｎｐ遺伝子外部にあり、ＰＮＰｍ−ＬおよびＰＮＰ−Ｕ配列の上流にある。ａｒａ４４９プライマーは、ｐＰＮＰプラスミド中のＣｍ−Ｒマーカー末端の配列を補完する。したがって組み込みが成功した場合、ａｒａ３４０およびａｒａ４４９が、ＺＷ１−Ｘ１０９−ＰＮＰｉ株からの２，５５１ｂｐのＰＣＲ産物、およびＺＷ１−Ｘ１０９−ＰＮＰｃ株からの２，３０６ｂｐのＰＣＲ産物を増幅できる一方で、４Ｒ０およびａｒａ４４９は、ＺＷ１−Ｘ１０９−ＰＮＰｍ株からの３，４２４ｂｐのＰＣＲ産物、およびＺＷ１−Ｘ１０９−ＰＮＰｉｎ株からの２，４３０ｂｐのＰＣＲ産物を増幅できる。新鮮に増殖させ株に、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅのＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘを使用した標準ＰＣＲ反応を直接実施した。結果は、正確な組み込みを実証した。
【０２０４】
実施例９
ｐｎｐ組み込み株の特性解析
ＺＷ１−Ｘ１０９−ＰＮＰｉ、ＺＷ１−Ｘ１０９−ＰＮＰｃ、ＺＷ１−Ｘ１０９−ＰＮＰｍ、およびＺＷ１−Ｘ１０９−ＰＮＰｉｎ株を振盪フラスコ発酵中でさらに特性解析し、それらの増殖および代謝プロファイルを判定した。中断されていない内在性ｐｎｐ遺伝子を含有する親株ＺＷ１−Ｘ１０９を対照として使用した。発酵は、細胞培養の体積を２０ｍＬから１０ｍＬに減少させ、そのため４５ｍＬのＶＷＲ遠心管の代わりに、上部にパンチ穴がある１４ｍＬの蓋付きＦａｌｃｏｎ丸底管を使用したこと以外は、実施例６に記載される標準プロトコルに従った。最初の振盪フラスコ発酵は、ｍＲＭ３−Ｇ１０中で実施した。発酵の０、１０、および２４時間目に、島津ＵＶ−１２０１分光光度計上でＯＤ６００を測定した一方で、グルコースおよびエタノール濃度は、ＢｉｏＲａｄ  Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−Ａ７Ｈイオン排除カラムを使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシステムによって測定した。図１２でグラフ表示される結果は、４つのｐｎｐ−中断株が全て、親株ＺＷ１−Ｘ１０９と同様の基礎グルコース代謝を有したことを示す。例えば１０時間の発酵後、ＺＷ１−Ｘ１０９−ＰＮＰｉ（Ａ）は、およそ３７．７％のグルコース（１２０．８ｇ／Ｌから７５．３ｇ／Ｌへの低下）を利用して、２２．９ｇ／Ｌのエタノール力価と、５．３６のＯＤ６００値に至るバイオマス成長を維持し；ＺＷ１−Ｘ１０９−ＰＮＰｃ（Ｂ）は、およそ３７．７％のグルコース（１２０．８ｇ／Ｌから７５．３ｇ／Ｌへの低下）を利用して、２３．０ｇ／Ｌのエタノール力価と、４．９８のＯＤ６００値に至るバイオマス成長を維持し；ＺＷ１−Ｘ１０９−ＰＮＰｍ（Ｃ）は、およそ３９．１％のグルコース（１２０．８ｇ／Ｌから７３．６ｇ／Ｌへの低下）を利用して、２３．５ｇ／Ｌのエタノール力価と、５．１４のＯＤ６００値に至るバイオマス成長を維持し；ＺＷ１−Ｘ１０９−ＰＮＰｉｎ（Ｄ）は、およそ３６．８％のグルコース（１２０．８ｇ／Ｌから７６．４ｇ／Ｌへの低下）を利用して、２２．６ｇ／Ｌのエタノール力価と、５．３２のＯＤ６００値に至るバイオマス成長を維持した。親株ＺＷ１−Ｘ１０９（Ｅ）は、およそ３９．５％のグルコース（１２０．８ｇ／Ｌから７３．４ｇ／Ｌへの低下）を利用して、２４．０ｇ／Ｌのエタノール力価と、５．６２のＯＤ６００値に至るバイオマス成長を維持した。２４時間の発酵後、全てのｐｎｐ中断株はグルコースを枯渇させて、５８．１ｇ／Ｌ近くのエタノール力価と、約７．９０のＯＤ６００値に至るバイオマス成長を維持した一方で、ＺＷ１−Ｘ１０９もまたグルコースを枯渇させて、５７．３ｇ／Ｌのエタノール力価と、７．６４のＯＤ６００値に至るバイオマス成長を維持した。
【０２０５】
次に上述したように、１０ｍＬのｍＲＭ３−Ｘ１０中で振盪フラスコ発酵を実施した。０、２４、４８、および７２時間目に、ＯＤ６００値とキシロースおよびエタノール双方の濃度を測定した。図１３は、結果のグラフを示す。これは、４つのｐｎｐ中断株が全て、発酵中で、親株ＺＷ１−Ｘ１０９よりも良くキシロースを利用したことを示す。４８時間の発酵後、ＺＷ１−Ｘ１０９−ＰＮＰｉ（Ａ）は、およそ９５．５％のキシロース（１１７．９ｇ／Ｌから５．３ｇ／Ｌへの低下）を既に利用して、５４．７ｇ／Ｌのエタノール力価と、５．３４に至るＯＤ６００値のバイオマス成長を維持した。さらなる２４時間の発酵後、それは、１．４ｇ／Ｌのみを残してキシロースをほぼ使い切り、５６．０ｇ／Ｌのエタノール力価と、５．６２に至るＯＤ６００値のバイオマス成長を維持した。同じ７２時間内に、ＺＷ１−Ｘ１０９−ＰＮＰｃ（Ｂ）は、およそ９４．２％のキシロース（１１７．９ｇ／Ｌから６．８ｇ／Ｌへの低下）を利用して、５３．６ｇ／Ｌのエタノール力価と、４．６４のＯＤ６００値に至るバイオマス成長を維持し；ＺＷ１−Ｘ１０９−ＰＮＰｍ（Ｃ）は、およそ８３．３％のキシロース（１１７．９ｇ／Ｌから１９．７ｇ／Ｌへの低下）を利用して、４７．５ｇ／Ｌのエタノール力価と、４．２４のＯＤ６００値に至るバイオマス成長を維持し；ＺＷ１−Ｘ１０９−ＰＮＰｉｎ（Ｄ）は、およそ７９．８％のグルコース（１１７．９ｇ／Ｌから２３．８ｇ／Ｌへの低下）を利用して、４５．５ｇ／Ｌのエタノール力価と、４．０４のＯＤ６００値に至るバイオマス成長を維持した。親株ＺＷ１−Ｘ１０９（Ｅ）は、およそ６１．７％のキシロース（１１７．９ｇ／Ｌから４５．１ｇ／Ｌへの低下）を利用して、３４．８ｇ／Ｌのエタノール力価と、３．２６のＯＤ６００値に至るバイオマス成長を維持した。この結果もまた、ｐｎｐがコードするタンパク質のトランケーションがより少ない、ＺＷ１−Ｘ１０９−ＰＮＰｉおよびＺＷ１−Ｘ１０９−ＰＮＰｃなどの株が、ＺＷ１−Ｘ１０９−ＰＮＰｍおよびＺＷ１−Ｘ１０９−ＰＮＰｉｎなどのより大きなトランケーションがある株よりも効率的に、キシロースを利用することを示す。キシロース利用能力でこれらの株を格付けすると、最適を先頭にしてＺＷ１−Ｘ１０９−ＰＮＰｉ、ＺＷ１−Ｘ１０９−ＰＮＰｃ、ＺＷ１−Ｘ１０９−ＰＮＰｍ、ＺＷ１−Ｘ１０９−ＰＮＰｉｎ、最後にＺＷ１−Ｘ１０９の順となる。
【０２０６】
要約すると、本実施例は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の内在性ｐｎｐ遺伝子への組み込みが、グルコース代謝に影響しないが、発酵中のキシロース利用を改善することを実証する。
【０２０７】
実施例１０（比較例）
ＲＰＩ過剰発現不在下におけるＺＷ８０１−４中の内在性ｐｎｐ遺伝子中断
ＺＷ１−Ｘ１０９中のキシロース増殖および代謝に最大の影響を及ぼす２つの自殺コンストラクト（例えばｐＰＮＰ−ＩおよびｐＰＮＰ−Ｃ、実施例７に記載される）を使用して、ＺＷ８０１−４中で内在性ｐｎｐ遺伝子修飾の効果をアッセイした（一般方法を参照されたい）。実施例８に記載されるように、ＺＷ８０１−４をこれらの各自殺ベクターで別々に形質転換した。各コンストラクトについて２つの形質転換体を、キシロースを用いた振盪フラスコ実験において評価し、対照としてＺＷ８０１−４を含めた（これもまた二連で実施した）。増殖培地は、ｍＲＭ３−Ｘ１０であり温度は３３℃であった。既述のように、各培養サンプルをＯＤ６００、キシロース、およびエタノールについてアッセイした。本実験の結果は、図１４に示される。ｐＰＮＰ−Ｉコンストラクトを用いて調製された形質転換体のみが、対照との比較でわずかな改善を示した。ｐＰＮＰ−Ｉ自殺コンストラクトのＺＷ８０１−４染色体による二重交差相同的組換えは、Ｉ株中に存在するのと全く同じｐｎｐ遺伝子修飾をもたらすことに留意されたい。
【０２０８】
実施例１１
キシロースイソメラーゼ活性のアッセイ
３０℃において、２０μＬの無細胞抽出物（一般方法を参照されたい）、０．２５６ｍＭのＮＡＤＨ、５０ｍＭのキシロース、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、１０ｍＭのトリエタノールアミン、および１Ｕ／ｍｌのＳＤＨ（ソルビトールデヒドロゲナーゼ）を含有する反応中で、ＺＷ６５８中のキシロースイソメラーゼの活性（一般方法を参照されたい）を測定した。Ａ３４０は、プレートリーダー上で３〜５分間読み取った。ＸＩ活性は、以下のように計算された：
１単位のＸＩは、３０℃で毎分１μモルのＤ−キシルロース生成に相当する。
Ｕ（μモル／分）＝勾配（ｄＡ３４０／分）＊反応体積（μＬ）／６２２０／０．５５ｃｍ（ＮＡＤＨＰ−−＞ＮＡＤモル数は１ｃｍキュベット内の各Ｌあたり各モルあたりの６２２０Ａ３４０）（マイクロプレート内ウェルあたり２００μＬの経路長＝０．５５ｃｍ）
比活性（μモル／分−ｍｇ）＝μモル／分／タンパク質濃度（ｍｇ）
ＺＷ６５８で測定された活性は、０．２５＋／−０．０３３μモルの生成物／ｍｇタンパク質／分であった。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2015502178.tif 000032
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