【手続補正書】
【提出日】平成22年1月6日(2010.1.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項６】
以下の(a)〜(c)の工程：
(a)本培養開始後3日目以降、培地にコハク酸、フマル酸、ピルビン酸、乳酸及びリンゴ酸から選択される1以上の有機酸を、0.2〜5w/v%培地に添加する工程；
(b)本培養開始後3日目以降、培地のpHをpH6.6〜7.5の範囲内で高めるよう制御する工程；及び
(c) 本培養培地に、MgSO4、CaSO4、Na2SO4、K2SO4、FeSO4、及びMnSO4等から選択される1以上を0.01〜0.25w/w%添加する工程；
の1以上を含む方法によって、液体培地中で通気攪拌培養したモルティエレラ・アルピナの菌体を、さらに乾燥工程に供して得られる、請求項5の乾燥菌体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
すなわち、本発明は、アラキドン酸(ARA)及び／又はジホモ-γ-リノレン酸(DGLA)生産能を有する微生物、好ましくは、モルティエレラ属に属する微生物、より好ましくは、モルティエレラ・アルピナを培養する、好ましくは液体培地中で通気攪拌培養することを伴う、高度不飽和脂肪酸(PUFA)及びこれを含有する脂質の製造方法において、以下の(a)〜(c)の工程：
(a) 本培養開始後、好ましくは脂肪酸蓄積期、より好ましくは本培養開始後24時間以降、さらに好ましくは本培養開始後3日目以降、特に好ましくは本培養開始後4日目以降に、培地に有機酸、好ましくは解糖系とその枝経路、またはTCA回路に含まれる有機酸から選択される1以上の有機酸、より好ましくは、コハク酸、フマル酸、ピルビン酸、乳酸及びリンゴ酸から選択される1以上の有機酸、さらに好ましくはコハク酸を、0.01〜5w/v%、好ましくは0.2〜5w/v%、より好ましくは0.22〜5w/v%、さらに好ましくは0.3〜5w/v%、特に0.44〜5w/v%添加する工程；
(b) 本培養開始後、好ましくは脂肪酸蓄積期、より好ましくは本培養開始後24時間以降、さらに好ましくは本培養開始後3日目以降、特に好ましくは本培養開始後4日目以降に、培地のpHを培養有効範囲内、好ましくはpH6〜8の範囲内、より好ましくはpH6.3〜7.5の範囲内、さらに好ましくはpH6.6〜7.5の範囲内、特に好ましくはpH6.9〜7.2の範囲内で高めるよう制御する工程；及び
(c) 本培養培地に、金属イオンの硫酸塩、好ましくは、MgSO4、CaSO4、Na2SO4、K2SO4、FeSO4、及びMnSO4等から選択される1以上、より好ましくはMgSO4及び／又はCaSO4を、0.01〜0.5w/w%、好ましくは0.01〜0.25w/w%、より好ましくは0.05〜0.2w/w%、特に好ましくは0.06〜0.1w/w%添加する工程、そして好適には、培地中の金属塩化物の代わりに、対応するこれらの硫酸塩を添加する工程；
の1以上を含む、PUFA、好ましくは、ARA及び／又はDGLA、より好ましくはDGLA又はこれを含有する脂質、好ましくはトリグリセリドの製造方法を提供する。
本発明はまた、前記工程(a)及び工程(b)を含み、工程(a)及び工程(b)が、好ましくは同日、より好ましくは同時であって、炭素源、例えばグルコースの培地への添加と異なるとき、好ましくは異なる日に行われる、前記の製造方法を提供する。
本発明はまた、前記工程(c)を含み、工程(c)が本培養開始前に行われる、前記の製造方法を提供する。
本発明はまた、前記PUFA又はこれを含有する脂質において、前記総脂肪酸中のDGLAが35w/w%以上、好ましくは37w/w%以上、特に好ましくは40w/w%以上である、前記の製造方法を提供する。
本発明はまた、乾燥菌体1g当たりのDGLAが、190mg以上、好ましくは195mg以上、より好ましくは200mg以上、特に好ましくは220mg以上である、モルティエレラ・アルピナの乾燥菌体を提供する。
本発明はまた、以下の(a)〜(c)の工程：
(a)本培養開始後3日目以降、好ましくは本培養開始後4日目以降に、培地にコハク酸、フマル酸、ピルビン酸、乳酸及びリンゴ酸から選択される1以上の有機酸、好ましくはコハク酸を、0.2〜5w/v%、好ましくは0.22〜5w/v%、より好ましくは0.3〜5w/v%、さらに好ましくは0.44〜5w/v%、添加する工程；
(b)本培養開始後3日目以降、好ましくは本培養開始後4日目以降、培地のpHをpH6.6〜7.5の範囲内、好ましくはpH6.9〜7.2の範囲内に高めるよう制御する工程；及び
(c) 本培養培地に、MgSO4、CaSO4、Na2SO4、K2SO4、FeSO4、及びMnSO4等から選択される1以上、好ましくはMgSO4及び／又はCaSO4を、0.05〜0.2w/w%、好ましくは0.06〜0.1w/w%添加する工程、そして好適には、培地中の金属塩化物の代わりに、対応するこれらの硫酸塩を添加する工程；
の1以上を含む方法によって、液体培地中で通気攪拌培養したモルティエレラ・アルピナの菌体を、さらに乾燥工程に供して得られる、前記の乾燥菌体を提供する。
本発明はまた、前記の乾燥菌体若しくは前記の乾燥菌体由来のARA及び／又はDGLAを含む、飲食品、好ましくは、サプリメント、飲料、動物用飼料、より好ましくは、動物用飼料(特にペットフード)を提供する。
さらに本発明は、上記の製造方法で得られた、PUFA、好ましくは、ARA及び／又はDGLA、又はこれを含有する脂質、好ましくはトリグリセリドを提供する。
さらに本発明は、工程(a)〜(c)を含まない製造方法と比較して、得られる微生物乾燥菌体1g当たりのDGLAが3%以上、好ましくは5%以上、より好ましくは10%以上増加した、前記の製造方法を提供する。
さらに本発明は、工程(a)〜(c)を含まない製造方法と比較して、得られる微生物乾燥菌体1g当たりのARAが増加した、前記の製造方法を提供する。
さらに本発明は、培養終了後の培地1ml当たりのDGLA量が5.5mg以上、好ましくは6.5mg以上、より好ましくは7.0mg以上、さらに好ましくは7.5mg以上である、前記の製造方法を提供する。
さらに本発明は、工程(a)〜(c)を含まない製造方法と比較して、培養終了後の培地1ml当たりのDGLA量が5%以上、好ましくは10%以上、より好ましくは15%以上増加した、前記の製造方法を提供する。
さらに本発明は、工程(a)〜(c)を含まない製造方法と比較して、培養終了後の培地1ml当たりのARA量が増加した、前記の製造方法を提供する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
[微生物]
本発明の製造方法において用いることができる微生物としては、ARA及び／又はDGLA生産能を有する微生物が挙げられ、モルティエレラ属糸状菌であることが好ましく、モルティエレラ亜属糸状菌であることがより好ましく、モルティエレラ・アルピナであることがさらに好ましい。例えば、アラキドン酸を構成脂肪酸として含んで成る脂質(トリグリセリド)の生産能を有する微生物として、モルティエレラ(Mortierella)属、コニディオボラス(Conidiobolus)属、フィチウム(Pythium)属、フィトフトラ(Phytophthora)属、ペニシリューム(Penicillium)属、クラドスポリューム(Cladosporium)属、ムコール(Mucor)属、フザリューム(Fusarium)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、ロードトルラ(Rhodotorula)属、エントモフトラ(Entomophthora)属、エキノスポランジウム(Echinosporangium)属、サプロレグニア(Saprolegnia)属に属する微生物を挙げることができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
モルティエレラ(Mortierella)属モルティエレラ(Mortierella)亜属に属する微生物では、例えばモルティエレラ・エロンガタ(Mortierella elongata)、モルティエレラ・エキシグア(Mortierella exigua)、モルティエレラ・フィグロフィラ(Mortierella hygrophila)、モルティエレラ・アルピナ(Mortierella alpina)等を挙げることができる。具体的にはモルティエレラ・エロンガタ(Mortierella elongata)IFO8570、モルティエレラ・エキシグア(Mortierella exigua)IFO8571、モルティエレラ・フィグロフィラ(Mortierella hygrophila)IFO5941、モルティエレラ・アルピナ(Mortierella alpina)IFO8568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS529.72、CBS608.70、CBS754.68等の菌株を挙げることができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
通気攪拌培養においては、例えば空気等の酸素を含有するガスや、アルゴン及び窒素等の酸素を含有しないガスのいずれを通気してもよく、このようなガスは培養系の条件に合わせて当業者により適宜選択される。例えば後述の実施例に記載の方法(本発明の一態様であるモルティエレラ・アルピナ(Mortierella alpina)の場合)では、空気等の酸素を含有するガスを培地に通気する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
前記微生物を試験管やフラスコ中で培養する場合(前培養の段階)における培養期間は、通常1〜10日間、好ましくは1〜5日間、より好ましくは1〜3日間である。続く本培養の培養期間は、通常2〜30日間、好ましくは5〜20日間、より好ましくは5〜15日間である。所望のPUFAの含有量や脂肪酸組成を、本培養終了時の判断基準とすることができる。本培養は、大きく、微生物の対数増殖期、すなわち微生物の乾燥菌体重量から菌体内総脂肪酸重量を引いた脂質フリー菌体量が増加する時期と、それに続くPUFA等の脂肪酸蓄積期、すなわち脂質フリー菌大量の変化が小さい時期とに分けられる。10kL培養タンクでのMortierella alpina 1S-4の培養において、培養開始から2日目までの増殖期(脂質フリー菌体量が増加する)
と、それ以降の脂肪酸蓄積期(脂質フリー菌体量がほとんど変化しない)があることを非特許文献4は記載する。対数増殖期及び脂肪酸蓄積期の判断方法は、非特許文献4の記載を参照して行うことができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
前記金属イオンの硫酸塩としては、例えばMgSO4、CaSO4、Na2SO4、K2SO4、FeSO4、MnSO4等、好ましくは、MgSO4及びCaSO4を、単独で又は組み合わせて添加することができる。より好ましくは、培地中の金属塩化物、例えば、MgCl2、CaCl2の代わりに、対応するこれらの硫酸塩、例えばMgSO4、CaSO4を添加する。添加に際し、これらの水和物を用いることができる。これらの金属イオンの硫酸塩は、水和物の場合、水分子を除いた重量で換算し、合計で、培地に対して0.01〜0.5w/w%、好ましくは0.01〜0.25w/w%、より好ましくは0.05〜0.2w/w%、特に好ましくは0.06〜0.1w/w%、添加することができる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
以下、本発明について、実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例中、Mortierella alpina 1S-4株はARA含有脂質を産生する。Mortierella alpina S14株は本発明者らがMortierella alpina 1S-4株から得た突然変異株であり、ARAの直接の前駆体であるDGLAをARAに変換するΔ5不飽和化酵素の活性がほぼ完全に欠失した株である。すなわち、ARAをほとんど産生せず、代わりに著量のDGLAを含有する脂質を産生する(非特許文献1参照)。Mortierella alpina Iz3株も、S14株と同様に、ARAをほとんど産生せず、代わりに著量のDGLAを含有する脂質を産生する。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
〔実施例1  試験管培養における有機酸の添加効果〕
試験管に入った10mlの大豆粉液体培地(3w/w% グルコース、1.5w/w% 大豆粉、0.3w/w% K2HPO4、0.1w/w% Na2SO4、0.05w/w% MgCl2・6H2O、0.05w/w% CaCl2・2H2O、pH6.3)にモルティエレラ・アルピナ(Mortierella alpina)S14株を1白金耳程度植菌し、28℃で3日間振盪培養した。培養開始4日目に、滅菌した50w/w%グルコース溶液を0.6ml培地に添加するとともに、NaOHでpHを6.0に調整した5w/v%濃度の各種有機酸水溶液を0.6ml添加して、さらに培養(振盪培養)を続けた。有機酸の培地全体に対する濃度は0.3w/v%に相当する。ここで、有機酸としては、コハク酸、フマル酸、ピルビン酸、乳酸、クエン酸、酒石酸及び酢酸を使用した。なお、有機酸水溶液を添加しないこと以外は同様に培養したものを対照とした。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
〔実施例10  他の菌株のDGLA生産におけるコハク酸の効果〕
Mortierella alpina Iz3株を1白金耳程度、種培地100ml(2w/w% グルコース、1w/w% 酵母エキス、pH6.3)に接種し、往復振盪100rpm、28℃、の条件にて3日間前培養し、種培養液を調製した。Iz3株は、S14株と同じく、ARA生産菌Mortierella alpina 1S-4株をニトロソグアニジンによる常法の変異処理によって得たDGLA生産菌である。次に、容積10Lの通気攪拌培養槽に5Lの本培地(2w/w% グルコース、1.5w/w% 大豆粉、0.02w/w% グリセロール、0.2w/w% 大豆油、0.3w/w% K2HPO4、0.1w/w% Na2SO4、0.05w/w% MgCl2・6H2O、0.05w/w% CaCl2・2H2O、pH6.3)を仕込んで滅菌し、そこへ上記種培養液を全量添加した。その後、26℃、通気量1vvm、攪拌回転数300rpmで、9日間通気攪拌培養(本培養)した。グルコース消費に応じて、グルコースがなくならないように適宜グルコース流加を行った。本培養開始4日目に、コハク酸水溶液を終濃度0.44w/v%になるようにナトリウム塩水溶液として添加した。なお、いずれも本培養開始4日目にNaOH水溶液を用いて培地のpHを約6.9に調整した。本培養開始9日目に、実施例1と同様の手法により、乾燥菌体を得て、DGLAの量を求めた。結果を表8に示す。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
〔実施例12  ジャーファーメンター培養における硫酸塩の効果〕
Mortierella alpina S14株を1白金耳程度、種培地100ml(2w/w% グルコース、1%w/w% 酵母エキス、pH6.3)に接種し、往復振盪100rpm、28℃、の条件にて3日間前培養した。次に、容積10Lの通気攪拌培養槽に5Lの本培地を仕込んで滅菌し、そこへ上記種培養液を全量接種し、26℃、通気量1vvm、攪拌回転数300rpmで、11日間培養した。本培地の組成は、以下の3通りであった：
(i) クロル塩＋硫酸Na(対照)：
2w/w% グルコース、1.5w/w% 大豆粉、0.02w/w% グリセロール、0.2w/w% 大豆油、0.3w/w% K2HPO4、0.1w/w% Na2SO4、0.05w/w% MgCl2・6H2O、0.05w/w% CaCl2・2H2O、pH6.3
(ii) 硫酸塩 + 硫酸Na：
2w/w% グルコース、1.5w/w% 大豆粉、0.02w/w% グリセロール、0.2w/w% 大豆油、0.3w/w% K2HPO4、0.1w/w% Na2SO4、0.05w/w% MgSO4・7H2O、0.05w/w% CaSO4・2H2O、pH6.3
(iii) 硫酸塩 - 硫酸Na：
2w/w% グルコース、1.5w/w% 大豆粉、0.02w/w% グリセロール、0.2w/w% 大豆油、0.3w/w% K2HPO4、0.05w/w% MgSO4・7H2O、0.05w/w% CaSO4・2H2O、pH6.3
グルコース消費に応じて、グルコースがなくならないように適宜グルコース流加を行った。本培養開始4日目に、コハク酸水溶液を終濃度0.44w/v%になるようにナトリウム塩水溶液として添加した。なお、いずれも本培養開始4日目にNaOH水溶液を用いて培地のpHを約6.9に調整した。本培養開始11日目に、実施例1と同様の手法により、乾燥菌体を得て、DGLAの量を求めた。結果を表10に示す。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９９】
〔実施例13  ジャーファーメンター培養における硫酸塩の量〕
本培地の組成が、2w/w% グルコース、1.5w/w% 大豆粉、0.02w/w% グリセロール、0.2w/w% 大豆油、0.3w/w% K2HPO4、0.01w/w% MgSO4・7H2O、0.01w/w% CaSO4・2H2O、pH6.3である以外は、実施例12と同様の手法により、Mortierella alpina S14株を培養した(前培養:3日間、本培養:11日間)。本培養開始11日目に、実施例1と同様の手法により、乾燥菌体を得て、DGLAの量を求めた。得られた乾燥菌体重量は33.7mg/mL培地、乾燥菌体重量当たりのDGLA量は209mg/g乾燥菌体、培地体積当たりのDGLA量は7.03g/L培地であった。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１００】
〔実施例14  アラキドン酸生産に対する硫酸塩の効果〕
Mortierella alpina 1S-4株を1白金耳程度、種培地100ml(2w/w% グルコース、1w/w% 酵母エキス、pH6.3)に接種し、往復振盪100rpm、28℃、の条件にて3日間前培養した。次に、容積50Lの通気攪拌培養槽に25Lの本培地を仕込んで滅菌し、そこへ上記種培養液を全量接種し、26℃、通気量1vvm、攪拌回転数300rpmで、8日間培養した。本培地の組成は、以下の2通りであった。
(i) クロル塩(対照)：
2w/w% グルコース、3.1w/w% 大豆粉、0.02w/w% グリセロール、0.1w/w% 大豆油、0.3w/w% K2HPO4、0.1w/w% Na2SO4、0.05w/w% MgCl2・6H2O、0.05w/w% CaCl2・2H2O、pH6.3
(ii) 硫酸塩：
2w/w% グルコース、3.1w/w% 大豆粉、0.02w/w% グリセロール、0.1w/w% 大豆油、0.3w/w% K2HPO4、0.06w/w% MgSO4・7H2O、0.06w/w% CaSO4・2H2O、pH6.3
グルコース消費に応じて、グルコースがなくならないように適宜グルコース流加を行った。本培養開始4日目に、コハク酸水溶液を終濃度0.44w/v%になるようにナトリウム塩水溶液として添加した。なお、いずれも本培養開始4日目にNaOH水溶液を用いて培地のpHを約6.9に調整した。本培養開始8日目に、実施例1と同様の手法により、乾燥菌体を得て、ARAの量を求めた。結果を表11に示す。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０２】
〔比較例2  クロル塩を用いた10kL培養槽でのDGLA培養法〕
本培養培地として2w/w% グルコース、4w/w% 大豆粉、0.02w/w% グリセロール、0.3w/w% K2HPO4、0.1w/w% Na2SO4、0.05w/w% MgCl2・6H2O、0.05w/w% CaCl2・2H2O、0.1w/w% 大豆油、0.01w/w% アデカネート、pH6.3を用いた以外は、比較例1と同様の手法を用いて、計6000Lの初発培養液量でMortierella alpina S14株の培養を開始した。培養1，2，3，6日目にグルコースの流加を行い、培地中のグルコースがなくならないようにしながら10日間培養した。本培養４日目に1w/v% コハク酸二ナトリウム六水和物水溶液(60kg、コハク酸として0.44w/v% 相当)とNaOH(1.26kg)を添加し、pHを6.9にした。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０４】
〔実施例15  硫酸塩を用いた10kL培養槽でのDGLA培養法〕
本培養培地として2w/w% グルコース、4w/w% 大豆粉、0.02w/w% グリセロール、0.3w/w% K2HPO4、0.06w/w% MgSO4・7H2O、0.06w/w% CaSO4・2H2O、0.1w/w% 大豆油、0.01w/w% アデカネート、pH6.3を用いた以外は、比較例2と同様の手法により、Mortierella alpina S14株を培養した。