(57)【要約】  本出願は、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の細菌増殖を阻害することができる標的および方法を記載する。細菌酵素の2-エピメラーゼは、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の両方に共通であり、しかもその酵素を破壊するために標的とすることができるアロステリック部位を含有する。アロステリック部位は細菌の2-エピメラーゼに存在しているが、類似の哺乳動物酵素はアロステリック部位を含有しておらず、そのため、哺乳動物酵素に影響を及ぼすことなく、細菌感染症を処置する手段が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬学的に許容される担体と細菌の2-エピメラーゼのアロステリック結合部位に結合する阻害剤分子とを含む有効量の組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の細菌感染症を治療する方法。
【請求項２】
細菌の2-エピメラーゼがグラム陽性細菌由来である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
細菌の2-エピメラーゼがグラム陰性細菌由来である、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
阻害剤分子が、細菌の2-エピメラーゼと哺乳動物の2-エピメラーゼの比が少なくとも10:1で、哺乳動物の2-エピメラーゼと比較して細菌の2-エピメラーゼに選択的に結合する、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
阻害剤分子が、アロステリック部位と活性部位の比が少なくとも2:1で、細菌の2-エピメラーゼの活性部位と比較してアロステリック部位に選択的に結合する、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
細菌の2-エピメラーゼの酵素活性が低減または除去される、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
細菌壁物質の形成が中断されるか、もしくは細菌細胞が溶解される、またはそれらの組み合わせである、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
阻害剤分子が細菌の2-エピメラーゼのアロステリック結合部位に少なくとも3アミノ酸残基を有する接触点を呈示し、ここで、アミノ酸残基が、複数の細菌の2-エピメラーゼのアロステリック結合部位に関するアラインメントコンセンサスの12アミノ酸残基の全部または一部を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
アラインメントコンセンサスがQ43、H44、Q46、M47、K67、R69、Q70、T102、E136、R210、E212およびH242からなる群から選択される配列番号1の細菌の2-エピメラーゼのアロステリック部位の少なくとも4アミノ酸残基に対応する、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
阻害剤分子が少なくとも6〜8アミノ酸残基を有する接触点を呈示する、請求項8に記載の方法。
【請求項１１】
薬学的に許容される担体と細菌の2-エピメラーゼのアロステリック結合部位に結合する阻害剤分子とを含む有効量の組成物を含む、哺乳動物の細菌感染症を治療するための組成物。
【請求項１２】
細菌の2-エピメラーゼがグラム陽性細菌由来である、請求項11に記載の組成物。
【請求項１３】
細菌の2-エピメラーゼがグラム陰性細菌由来である、請求項11に記載の組成物。
【請求項１４】
阻害剤分子が、細菌の2-エピメラーゼと哺乳動物の2-エピメラーゼの比が少なくとも10:1で、哺乳動物の2-エピメラーゼと比較して細菌の2-エピメラーゼに選択的に結合する、請求項11から13のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
阻害剤分子が、アロステリック部位と活性部位の比が少なくとも2:1で、細菌の2-エピメラーゼの活性部位と比較してアロステリック部位に選択的に結合する、請求項11から14のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
細菌の2-エピメラーゼの酵素活性が低減または除去される、請求項11から15のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
細菌壁物質の形成が中断されるか、もしくは細菌細胞が溶解される、またはそれらの組み合わせである、請求項11から16のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
阻害剤分子が細菌の2-エピメラーゼのアロステリック結合部位に少なくとも3アミノ酸残基を有する接触点を呈示し、ここで、アミノ酸残基が、複数の細菌の2-エピメラーゼのアロステリック結合部位に関するアラインメントコンセンサスの12アミノ酸残基の全部または一部を含む、請求項11から16のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
アラインメントコンセンサスがQ43、H44、Q46、M47、K67、R69、Q70、T102、E136、R210、E212およびH242からなる群から選択される配列番号1の細菌の2-エピメラーゼのアロステリック部位の少なくとも4アミノ酸残基に対応する、請求項18に記載の組成物。
【請求項２０】
阻害剤分子が少なくとも6〜8アミノ酸残基を有する接触点を呈示する、請求項18に記載の組成物。
【請求項２１】
細菌の2-エピメラーゼのアロステリック結合部位と結合する阻害剤分子と細菌の2-エピメラーゼを接触させることを含む、細菌の2-エピメラーゼを阻害する方法。
【請求項２２】
細菌の2-エピメラーゼがグラム陽性細菌由来である、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
細菌の2-エピメラーゼがグラム陰性細菌由来である、請求項21に記載の方法。
【請求項２４】
阻害剤分子が、細菌の2-エピメラーゼと哺乳動物の2-エピメラーゼの比が少なくとも10:1、少なくとも約25:1、少なくとも約50:1、少なくとも約100:1、少なくとも約250:1、少なくとも約500:1、または少なくとも約1000:1で、哺乳動物の2-エピメラーゼと比較して細菌の2-エピメラーゼに選択的に結合する、請求項21から23のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
阻害剤分子が、アロステリック部位と活性部位の比が少なくとも2:1で、細菌の2-エピメラーゼの活性部位と比較してアロステリック部位に選択的に結合する、請求項21から24のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
細菌の2-エピメラーゼの酵素活性が低減または除去される、請求項21から25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
細菌の2-エピメラーゼを阻害剤分子と接触させる工程が、生存細菌を阻害剤分子に暴露させること、および細菌壁物質の形成が中断されるか、もしくは細菌細胞が溶解される、またはそれらの組み合わせであること、を含む、請求項21から26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
阻害剤分子が細菌の2-エピメラーゼのアロステリック結合部位に少なくとも3アミノ酸残基を有する接触点を呈示し、ここで、アミノ酸残基が、複数の細菌の2-エピメラーゼのアロステリック結合部位に関するアラインメントコンセンサスの12アミノ酸残基の全部または一部を含む、請求項21から27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
アラインメントコンセンサスがQ43、H44、Q46、M47、K67、R69、Q70、T102、E136、R210、E212およびH242からなる群から選択される配列番号1の細菌の2-エピメラーゼのアロステリック部位の少なくとも4アミノ酸残基に対応する、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
阻害剤分子が少なくとも6〜8アミノ酸残基を有する接触点を呈示する、請求項28に記載の方法。
【請求項３１】
細菌の2-エピメラーゼのアロステリック結合部位に結合する阻害剤分子を含む、細菌の2-エピメラーゼを阻害するための組成物。
【請求項３２】
細菌の2-エピメラーゼがグラム陽性細菌由来である、請求項31に記載の組成物。
【請求項３３】
細菌の2-エピメラーゼがグラム陰性細菌由来である、請求項31に記載の組成物。
【請求項３４】
阻害剤分子が、細菌の2-エピメラーゼと哺乳動物の2-エピメラーゼの比が少なくとも10:1、少なくとも約25:1、少なくとも約50:1、少なくとも約100:1、少なくとも約250:1、少なくとも約500:1、または少なくとも約1000:1で、哺乳動物の2-エピメラーゼと比較して細菌の2-エピメラーゼに選択的に結合する、請求項31から33のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
阻害剤分子が、アロステリック部位と活性部位の比が少なくとも2:1で、細菌の2-エピメラーゼの活性部位と比較してアロステリック部位に選択的に結合する、請求項31から34のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３６】
細菌の2-エピメラーゼの酵素活性が低減または除去される、請求項31から35のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３７】
細菌の2-エピメラーゼを阻害剤分子と接触させる工程が、生存細菌を阻害剤分子に暴露させること、および細菌壁物質の形成が中断されるか、もしくは細菌細胞が溶解される、またはそれらの組み合わせであること、を含む、請求項31から36のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３８】
阻害剤分子が細菌の2-エピメラーゼのアロステリック結合部位に少なくとも3アミノ酸残基を有する接触点を呈示し、ここで、アミノ酸残基が、複数の細菌の2-エピメラーゼのアロステリック結合部位に関するアラインメントコンセンサスの12アミノ酸残基の全部または一部を含む、請求項31から37のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３９】
アラインメントコンセンサスがQ43、H44、Q46、M47、K67、R69、Q70、T102、E136、R210、E212およびH242からなる群から選択される配列番号1の細菌の2-エピメラーゼのアロステリック部位の少なくとも4アミノ酸残基に対応する、請求項38に記載の組成物。
【請求項４０】
阻害剤分子が少なくとも6〜8アミノ酸残基を有する接触点を呈示する、請求項38に記載の組成物。
【請求項４１】
a)細菌の2-エピメラーゼおよび化合物中でのアロステリック部位の計算上のモデリングを実施する工程と;
b)アロステリック部位内のアミノ酸と化合物との接触点の数およびタイプを決定する工程と;
c)接触点の数および特性に基づいてアロステリック部位における化合物の理論上の結合親和性を算出する工程と;
d)アッセイで化合物を試験し、モデル化した理論上の結合親和性を評価する工程
とを含む、細菌増殖阻害剤の結合親和力を評価する方法。
【請求項４２】
e)アロステリック部位内の好ましい接触点を評価するためのパラメーターのデータベースを作成する工程をさらに含む、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
化合物が式Iの化合物:
【化１】
2015530987.tif 000029
[式中、X、YおよびZは、各々独立してO、SまたはNR4であり;Aはアリールまたはヘタリールであり;または、Aはハロゲンであり;Bは単環アリール、ヘタリールまたはヘタシクリルであり;または、BはCH3であり;ここで、Aがハロゲンであり、かつBがCH3であることは同一化合物では起こり得ず;各場合におけるR1は、独立して、C0-4アルキルであり;各場合におけるR2は、独立して、C0-4アルキル、C1-4アルコキシ、ハロゲン、--CF2H、--CF3、--OCF3、--SCF3、--SF5であり;各場合におけるR3は、独立して、C0-4アルキルであり;各場合におけるR4は、独立して、C0-4アルキルであるか、単環アリール、ヘタリールまたはヘタシクリルであり;nは0、1、または2であり;mおよびmmは、各々独立して、0、1、2、3、4、または5である];
または式II:
【化２】
2015530987.tif 000030
[式中、Y、Zは、各々独立してO、SまたはNR4であり;Aはアリールまたはヘタリールであり;Bは単環アリール、ヘタリールまたはヘタシクリルであり;各場合におけるR2は、独立して、C0-4アルキル、C1-4アルコキシ、ハロゲン、--CF2H、--CF3、--OCF3、--SCF3、--SF5であり;各場合におけるR3は、独立して、C0-4アルキルであり;各場合におけるR4は、独立して、C0-4アルキルであるか、単環アリール、ヘタリールまたはヘタシクリルであり;nは0、1、または2であり;mおよびmmは各々独立して、0、1、2、3、4、または5である]
である、請求項41または42に記載の方法。
【請求項４４】
化合物がTable 7(表7)およびTable 8(表8)の化合物1〜92から選択される、請求項41から43のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
化合物が
【化３】
2015530987.tif 000031
である、請求項41から44のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2012年8月8日に出願した米国仮出願第61/680,791号の優先権を主張するものであり、その全体を参照により下記で十分に記載されているかのように本明細書に組み込むものとする。
【０００２】
本出願は、EFS-WebによりASCIIフォーマットで既に提出されている配列表を含んでおり、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。2013年8月8日に作成された前記ASCIIコピーはavacyn_ST25.txtの名称であり、119キロバイトのサイズである。
【０００３】
本発明は、耐性の可能性が低い抗微生物剤標的の発見と、これらの標的の阻害剤に関する。本標的は、細菌、特に感染性細菌の生存にとって必須の酵素である。本阻害剤は、例えば、その酵素に結合するリガンドとして作用することにより、標的酵素を阻害または抑制し、その本質的な機能を阻止し、細菌を死滅させる。これらの発見により、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌によって発症する細菌感染症の治療に有用な阻害剤を含む抗細菌剤が提供される。こうした抗細菌剤、ならびにそれらを含む医薬組成物および製剤は、他の抗微生物剤に耐性のある細菌に対して有効な薬剤である。さらに、本発明の薬剤は、細菌に耐性の進化が起こるよう誘導する傾向はない。
【０００４】
本発明の適切な標的酵素は、細菌増殖に必要とされる、細胞壁生合成必須酵素である。これらの細菌酵素は、溶解素を使用する間接的方法によって同定することができるが、その溶解素は、細菌に感染し、細菌細胞壁内の重要な受容体を認識する結合特性を有するウイルス(バクテリオファージ)によって発現される酵素である(1)。バクテリオファージ溶解素実験の使用により同定された経路の重要な細菌酵素の1つは、UDP-N-アセチルグルコサミン-2-エピメラーゼ(2-エピメラーゼ)と呼ばれる。この酵素は、Epimeroxと呼ばれる、化合物2-{4-[5-(4-ブロモフェニル)-チオフェン-2-イルメチレン]-5-オキソ-2-チオキソ-イミダゾリジン-1-イル}-3-フェニル-プロピオン酸を含む、小分子組成物によって阻害され得る(33)。2-エピメラーゼ標的およびEpimerox阻害剤は、本発明の抗微生物剤標的、阻害剤、医薬組成物、および治療方法の代表例である。
【背景技術】
【０００５】
抗生物質および合成抗微生物剤は共に、細菌の増殖を抑制し、または細菌および他の微生物を死滅させ、感染症の治療で使用されている。時間の経過とともに、また個体群における薬剤の使用の増加とともに、微生物は薬剤に対して適合するかまたは漸進的に変化し、薬剤への耐性を進化させることができる。その薬剤は、疾患の治療法として効果がほとんどなくなるか、さらには効果がなくなる場合があり、さらには、まだ効果的である他の薬剤も利用できなくなる可能性がある。したがって、耐性微生物は、抗生物質への暴露で生き残ることができる。薬剤耐性は、医学分野で大きくなっている問題である。このため、有効性を維持しつつ、耐性を誘導する可能性が低い抗微生物剤の必要性が高まっている。
【０００６】
耐性微生物は、例えば、自然発生的遺伝子変異または環境要因により誘導される変異が原因で、耐性はない微生物群から自然淘汰によって出現し得る。耐性を付与する遺伝子は、1つまたは複数の細菌のDNA、特に共通の祖先をもつものにコードされており、進化ストレスが原因で活性化され得る。耐性遺伝子は、自然工程を介して、例えば、転位遺伝因子による遺伝子水平伝播によって、1つの細菌から同じタイプの別の細菌へ、または異なる細菌の種へ移動することができる。したがって、自然淘汰によって進化または出現する抗生物質耐性に関する遺伝子は、微生物の様々な群に散在している場合がある。現代医学で使用されている抗生物質への暴露は、抗生物質耐性形質を発現する遺伝子を選択する進化ストレスとなり得る。細菌増殖にとって不可欠であるが、耐性対応物もしくは変異を有していない、または、耐性の形態をとるのが遅いかもしくはとることができない、遺伝子またはそれらの発現産物、例えば、タンパク質または酵素は、薬物療法の理想的な標的となることができる。抗生物質の使用によって細菌群における選択圧は高まり、耐性菌は繁殖し、感受性細菌は死滅に至ることになる。耐性がより一般的になるにつれて、代替治療法の必要性が高まる。様々なタイプの抗細菌剤に対する抗生物質耐性は、既に重要な公衆衛生問題である。
【０００７】
ヒト医薬および獣医薬で抗生物質を長期的かつ大規模に使用すると、特に、抗生物質耐性に関する強力な選択圧がもたらされ、ヒト病原性微生物群を生じ、最終的に勢力を拡大する(2)。ほとんどの抗生物質に対する自然発生的耐性は、一般的に≦10-8から10-9までの範囲の頻度で出現し、一連の連続変異によって、最終的には臨床的に有意な耐性を生じる。その後、こうした耐性は、トランスポゾン、プラスミド、インテグロンおよびゲノムアイランドをはじめとする遺伝因子によって、種内および種間的方法で拡大または伝播される可能性がある(3)。多剤耐性の進化および流行性クローンの国際的伝播はこの問題を悪化させており、耐性が漸進的に変化するこの問題に対処する新しい抗微生物剤の開発戦略の必要性が高まっている。
【０００８】
溶解素と呼ばれる、新しい分類の抗微生物剤が近年同定されており、これらの種特異性と、これらの活性に対する細菌の耐性欠如がいくつかの事例で明らかである(1、4)。溶解素酵素は、細菌感染後期にバクテリオファージにとって必要な、バクテリオファージにコードされている細胞壁加水分解酵素である。ペプチドグリカン(細菌細胞壁の構造成分)の特定の化学結合を加水分解または切断する溶解素の機能は、細菌宿主を溶解し(壊して開けることにより破壊し)、後代ウイルス粒子を放出する。また精製溶解素は、ウイルスコンテクストの外側での強力な細胞溶解剤となり、in vitroおよび実験的に感染させた動物の両方において標的細菌の「外側からの」溶解を駆動する(4-7)。治療用溶解素は、一般に、完全保存されたN末端ペプチドグリカン切断ドメインと種特異的細胞壁糖ポリマー(CWG)を認識し得るより相違したC末端細胞壁結合(CBD)ドメインによって定義されるモジュール構造を有する。ペプチドグリカン中の溶解素感応性切断部位に関する多くの普遍的特性は、細胞壁の完全性を維持するCWG機能についての理解の深まりとあわせて、特定の溶解素に対する耐性の欠如を説明するために引用されている(1)。
【０００９】
特定の溶解素は、それ自体、耐性が改善された抗生物質または耐性が存在しない抗生物質に対する候補として有望であるが、それらにはまた、特にそれらの薬物動態学的特性に関して著しい欠点も有している。溶解素は、動物に全身送達される他の外来タンパク質のように、速やかに分解される。したがって、溶解素を全身的に使用しようとする場合、半減期を延長するように溶解素を改変させる必要があるか、点滴注射により高頻度で送達される必要がある。溶解素の使用に関するさらなる懸念は、治療中のそれらのin vivoでの有効性を低減する可能性のある中和抗体の発生である。一般に免疫原性でない小分子である抗生物質とは異なり、酵素は免疫反応を刺激し得るタンパク質であって、in vivoでの溶解素活性に干渉する。したがって、安全性、有効性および安定性があり、耐性を刺激しない、さらなる抗微生物剤標的および対応する抗微生物剤、特に小分子に対する必要性が依然としてある。溶解素によって影響される細菌の生合成経路は、新規標的および新規治療的介入をもたらす可能性のある1つの根源である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許出願第12/454,062号(US 2009/0298900)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、医薬組成物、治療方法、ならびにそうした組成物および治療を調製および使用する方法につながる、耐性が進化する可能性の低い抗微生物剤標的を同定し阻害する組成物および方法を提供する。本発明は、薬剤耐性を誘導する可能性が低減された抗微生物剤と、こうした抗微生物剤を発見、設計、調製および使用する方法を包含する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本明細書の様々な例示的実施形態は、特異的抗微生物剤標的と相互作用する、ウイルスタンパク質、特にバクテリオファージタンパク質を使用することによって抗微生物剤標的を同定する方法を提供する。本明細書の様々な例示的実施形態はまた、抗微生物剤標的を標的とすることによって細菌感染症を治療する方法を提供する。さらに、例示的実施形態は、2-エピメラーゼまたはその変異体もしくは類似体を標的とすることにより、細菌感染症を治療する方法を提供する。2-エピメラーゼ酵素は、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌内で確認することができる。好ましい方法は、2-エピメラーゼを標的とすることによって、グラム陽性細菌の炭疸菌(Bacillus anthracis)が原因で発症する感染症を治療するものである。本発明の好ましい実施形態でもある、2-エピメラーゼを標的とする方法の1つは、酵素に結合し無機能化する小分子に酵素を導入することによって、例えば、その活性部位を遮断するか、またはアロステリック部位と相互作用させることによって、細菌の生活環におけるその本質的な機能を阻害し、その結果として、その機能が喪失または障害されるように酵素またはその活性部位の構造を変化させることである。この目的に適した化合物は、Bearss et al.の米国特許出願第12/454,062号(US 2009/0298900)(33)に開示されている。これらの化合物の1つは好ましい実施形態であり、Epimeroxと呼ばれている。
【００１３】
細菌および哺乳動物の2-エピメラーゼ酵素は、細菌酵素上のアロステリック部位の存在によって異なる。こうした細菌特異的酵素は、例えば、宿主動物に影響を及ぼすことなく、酵素を阻害することにより細菌を破壊する化合物によって標的化され得る(33)。細菌の2-エピメラーゼに関する特有の特徴は、活性化因子として作用する、基質(UDP-GlcNAc)によるそれらのアロステリック制御である。一見したところ、このアロステリック部位は、酵素が触媒的に有効である構造を取得するためにこの基質に結合するようである。この要件は、この酵素の哺乳動物の形態では確認されていない(34)。細菌特異的な2-エピメラーゼを限定的に標的化する方法の1つは、例えば、活性化因子基質へのその正常な結合を阻害することによって、アロステリック部位を標的とすることである。アロステリック部位を欠如している、ヒトの2-エピメラーゼをはじめとする哺乳動物の2-エピメラーゼは影響を受けないはずであり、一方、細菌の2-エピメラーゼは無効化または不活性化される-その結果、選択的抗微生物剤が得られる。驚いたことに、このように標的化された細菌は耐性を進化させることができない。
【００１４】
Epimeroxに加えて、2-エピメラーゼを標的とし、耐性の可能性が低いことを証明する適切な化合物は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第12/454,062号に挙げられている化合物を包含し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１ａ】本明細書の例示的実施形態により、溶解素酵素PlyGと炭疸菌中性多糖類(NPS)との相互作用を説明する図である。
【図１ｂ】本明細書の例示的実施形態により、溶解素酵素PlyGと炭疸菌中性多糖類(NPS)との相互作用を説明する図である。
【図１ｃ】本明細書の例示的実施形態により、溶解素酵素PlyGと炭疸菌中性多糖類(NPS)との相互作用を説明する図である。
【図１ｄ】本明細書の例示的実施形態により、溶解素酵素PlyGと炭疸菌中性多糖類(NPS)との相互作用を説明する図である。
【図１ｅ】本明細書の例示的実施形態により、溶解素酵素PlyGと炭疸菌中性多糖類(NPS)との相互作用を説明する図である。
【図２ａ】本明細書の例示的実施形態により、炭疸菌の2-エピメラーゼの同定および分析を説明する図である。
【図２ｂ】本明細書の例示的実施形態により、炭疸菌の2-エピメラーゼの同定および分析を説明する図である。
【図２ｃ】本明細書の例示的実施形態により、炭疸菌の2-エピメラーゼの同定および分析を説明する図である。
【図２ｄ】本明細書の例示的実施形態により、炭疸菌の2-エピメラーゼの同定および分析を説明する図である。
【図２ｅ】本明細書の例示的実施形態により、炭疸菌の2-エピメラーゼの同定および分析を説明する図である。
【図３】本明細書の例示的実施形態により、セレウス菌(B. cereus)系列のsps遺伝子座によってコードされているUDP-GlcNAc 2-エピメラーゼのタンパク質配列アラインメントを説明する図である。
【図４】本明細書の例示的実施形態により、異なるグラム陽性微生物によってコードされているUDP-GlcNAc 2-エピメラーゼのタンパク質配列アラインメントを説明する図である。
【図５】本明細書の例示的実施形態により、炭疸菌によってコードされているBA5509(配列番号10)およびBA5433(配列番号11)のUDP-GlcNAc 2-エピメラーゼのタンパク質配列アラインメントを説明する図である。
【図６】a〜bは、本明細書の例示的実施形態により、BA5509発現のRT-PCR分析を説明する図である。
【図７】a〜cは、本明細書の例示的実施形態により、BA5509またはBA5433にコードされている炭疸菌のUDP-GlcNAc 2-エピメラーゼ欠損株の表現型分析を説明する図である。
【図８】a〜bは、本明細書の例示的実施形態により、UDP-GlcNAc 2-エピメラーゼ活性の阻害または喪失に関連した超微細構造の変化を説明する図である。
【図９ａ】本明細書の例示的実施形態により、Epimeroxの抗微生物活性を説明する図である。
【図９ｂ】本明細書の例示的実施形態により、Epimeroxの抗微生物活性を説明する図である。
【図９ｃ】本明細書の例示的実施形態により、Epimeroxの抗微生物活性を説明する図である。
【図９ｄ】本明細書の例示的実施形態により、Epimeroxの抗微生物活性を説明する図である。
【図９ｅ】本明細書の例示的実施形態により、Epimeroxの抗微生物活性を説明する図である。
【図９ｆ】本明細書の例示的実施形態により、Epimeroxの抗微生物活性を説明する図である。
【図１０】a〜cは、本明細書の例示的実施形態により、Epimerox治療マウスまたは未治療マウスにおける細菌負荷を説明する図である。
【図１１】本明細書の例示的実施形態により、Epimerox連続継代実験を説明する図である。
【図１２】本明細書の例示的実施形態により、ダプトマイシン連続継代実験を説明する図である。
【図１３】本明細書の例示的実施形態により、一連のグラム陽性細菌の2-エピメラーゼのアロステリック部位におけるUDP-GlcNAcの12アミノ酸接触点のアラインメントを説明する図である。
【図１４】本明細書の例示的実施形態により、図13に示した炭疸菌の2-エピメラーゼと比較した、別の細菌由来の2-エピメラーゼのアロステリック部位におけるUDP-GlcNAcの12アミノ酸接触点間のアミノ酸アラインメント一致を説明する図である。
【図１５】本明細書の例示的実施形態により、グラム陽性炭疸菌の2-エピメラーゼを一連のグラム陰性細菌に関する2-エピメラーゼのゲノムと共に行ったBLAST分析を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、特定の実験、実施形態および実施例に関して下記に述べるが、これらは代表例であって、本発明を説明するためのものであり、その範囲を限定するものではない。特に技術用語を含む、本明細書全体にわたり使用されている用語は、文脈において、微生物学および医学の分野内の通常の意味を有する。明確にするために、特定の用語について以下に具体的に定義する。
【００１７】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、文脈が明確に指示しない限り、単数形の「a」、「an」および「the」は複数の言及を含む。例えば、成分への言及は、複数の成分を含む組成物を含むことも意図する。「1つの」成分を含有する組成物への言及は、指定されたものに加えて別の成分を含むことを意図する。
【００１８】
範囲は、本明細書では、「約」もしくは「およそ」で示されたある特定の値から、および/または「約」もしくは「およそ」で示された別の特定値までの値として表すことができる。こうした範囲が表される場合、他の例示的実施形態は、ある特定の値から、および/または別の特定値までを含む。
【００１９】
「含む(comprising)」または「含有する(containing)」または「包含する(including)」とは、少なくとも指定された化合物、元素、粒子または方法の工程が組成物または物品または方法中に存在するが、別の化合物、材料、粒子、方法の工程の存在を、別のかかる化合物、材料、粒子、方法の工程が指定されたものと同一の機能を有しているとしても、除外しないことを意味する。
【００２０】
「グラム陽性細菌」とは、タイコ酸および/または別の細胞壁関連糖ポリマー(CWG)を含むペプチドグリカン層を有し、ペプチドグリカン層外側の細胞膜が存在しない細菌を意味する。「グラム陰性細菌」とは、タイコ酸が存在しないペプチドグリカン層を有し、リポ多糖類を含有するペプチドグリカン層外側の細胞膜を有する細菌を意味する。グラム陽性細菌は、様々な適切な方法、例えば、限定するものではないが、増殖アッセイ、血清学試験、遺伝子検査および/または顕微鏡利用の分染法などを使用して、グラム陰性細菌と区別することができる。例えば、「グラム染色」技術を使用する場合、グラム陽性細菌はクリスタルバイオレット色素を保持するが、グラム陰性細菌はクリスタルバイオレット色素を保持しないので、顕微鏡を使用して色を区別することができる。
【００２１】
タンパク質、より詳細には酵素を言及する場合、「活性部位」とは、基質が結合し、化学反応を受けることができる酵素上の任意の領域を示す。「アロステリック部位」とは、活性化因子またはエフェクターが結合し、前記酵素の活性をもたらすことができる酵素上の任意の領域を示す。
【００２２】
「コンセンサス部位」、「コンセンサス配列」または「コンシークエンスモチーフ(consequence motif)」とは、それぞれ、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド内の特定の位置で少なくとも部分的に保存されている、ヌクレオチドまたはアミノ酸の任意のグループ配置を意味する。ヌクレオチドまたはアミノ酸のグループ配置は、単一のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド内の連続するグループ配置、または単一のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド内の非連続的なグループ配置、または複数の異なるポリヌクレオチドもしくはポリペプチド内の非連続的なグループ配置を表すことができる。
【００２３】
「イソメラーゼ」とは、その化合物または分子内の特定の原子での立体化学を変化させることによって、生物学的化合物または分子における関連化合物または関連分子への変換を触媒する任意の酵素を意味する。「2-エピメラーゼ」とは、炭水化物および炭水化物誘導体に作用するイソメラーゼファミリーに属する任意の酵素を意味する。
【００２４】
「治療する」または「治療」とは、例えば、任意の感染または病状、例えば、細菌感染症などを含む任意の態様または結果を予防、抑制、軽減、緩和またはケアすることを含む、任意の有益または有利な目的に向けての任意の化合物または薬剤の任意の用途または投与を意味する。
【００２５】
「2-エピメラーゼ」または「UDP-GlcNAc 2-エピメラーゼ」とは、UDP-N-アセチルグルコサミン(UDP-GlcNAc)からUDP-N-アセチルマンノサミン(UDP-ManNAc)への可逆的変換を少なくとも触媒する細菌酵素を意味する。「2-エピメラーゼの類似体」または「2-エピメラーゼの相同体」とは、細菌以外の2-エピメラーゼ酵素、例えば、動物の2-エピメラーゼを意味する。「2-エピメラーゼの変異体」とは、2-エピメラーゼとは構造上異なるが、同一の、または実質的に同一の反応を少なくとも触媒するイソメラーゼを意味する。好ましい変異体は、親の野性型2-エピメラーゼ、例えば、炭疸菌由来のBA5509に対して、少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有し、最も好ましくは少なくとも96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するものである。
【００２６】
配列同一性は、当技術分野で公知の任意の方法により、例えば、特に指定のない限り、デフォルトパラメーターを使用し、比較しようとする各配列の全長を考慮して(各配列の対応する整列比較部分の単なる長さではない)、アミノ酸配列または核酸配列を配列比較するためのコンピュータプログラム、例えば、BLAST、ALIGN、CLUSTALWなどを使用することにより判定することができる。
【００２７】
データ分析に有用であると本明細書に記載の任意のソフトウェアは、本開示の当業者によって通常利用されている手順に従って使用した。本明細書で使用したソフトウェアのデフォルトパラメーターは適切である。ソフトウェアの以前のバージョンおよびソフトウェアの新バージョンは適切であり、また、当業者によってデータ分析に使用され得る別のプログラムも本開示の中で確認される。
【００２８】
本明細書で記載および開示されているタンパク質の多くは、国立衛生研究所によって維持されているGenBankで確認される名称と登録番号により識別される。GenBankからの配列は、本明細書の登録番号と共に開示されている対応アミノ酸に関し、参照により組み込むものとする。
【００２９】
本発明は、細菌の感受性細胞壁タンパク質と、本質的な細胞壁機能を促進する酵素を標的とする。微生物の生存にとって不可欠であるこうした機能に干渉することによって、細菌を死滅させ、感染症を治療することができる。
【００３０】
本開示の実施形態は、2-エピメラーゼとして公知であるイソメラーゼのファミリーを包含する。特定酵素の1つである2-エピメラーゼは、細胞のアミノ糖、グルコサミンをその関連エピマーであるマンノサミンへと変換することにおいて重要となり得る。2-エピメラーゼ酵素は、動物細胞および細菌細胞の両方で確認することができる。しかし、細菌の2-エピメラーゼは、動物細胞によっては利用されず、その逆も同様である。
【００３１】
より詳しくは、細菌の2-エピメラーゼは、UDP-N-アセチルグルコサミン(UDP-GlcNAc)のUDP-N-アセチルマンノサミン(UDP-ManNAc)への可逆的変換を触媒する(35、36)。後者は、いくつかの細菌細胞表面多糖類の生合成における中間体、ならびに腸内細菌共通抗原(ECA)である。腸内球菌の共通抗原は、腸内細菌科のすべてのメンバーに共通の表面関連糖脂質である(37)。グラム陽性細菌の多糖類生合成における2-エピメラーゼの重要性は、黄色ブドウ球菌(Staphyloccocus aureus)および炭疸菌などの種におけるこれらの酵素の機能的に余剰な2つのコピーの存在によって明らかにされている。細菌の2-エピメラーゼは、UDP-GlcNAcをUDPおよびManAcに変換し、後者をManNAc 6リン酸へとリン酸化する加水分解酵素である、二機能性哺乳動物UDP-GlcNAc 2-エピメラーゼ/ManNAcキナーゼに関係している(38)。哺乳動物の酵素は、シアル酸生合成における律速段階を触媒し、ヒトにおける細胞表面シアリル化の重要な制御因子である(39)。
【００３２】
細菌の2-エピメラーゼに特有の特徴は、活性化因子として作用する、基質UDP-GlcNAcによるそれらのアロステリック制御である。この活性化因子が存在しない場合、実際には、UDP-ManNAcは逆反応でエピマー化されないが(34)、極微量のUDP-GlcNAcが添加されると、反応系はその正常な平衡に移行する。これは、この酵素にとって、触媒的に有効な構造を獲得するためにはUDP-GlcNAcが必要であることを示唆している。この要件は、この酵素の哺乳動物の形態では確認されていない。
【００３３】
タイコ酸および他の二次細胞壁多糖類を含む、細菌のペプチドグリカン結合型細胞壁糖ポリマー(CWG)は、微生物の生理機能およびビルレンスにおけるそれらの重要性から(9、11〜14)、抗微生物剤の標的として注目されている(9〜11)。本発明によれば、細菌の炭疸菌に感染するウイルスによってコードされている、PlyGと呼ばれる溶解素酵素を使用し、抗微生物剤開発の標的としてCWGを調査した。より詳しくは、炭疸菌のγバクテリオファージ(またはγファージ)は、細菌内で自己複製しながら、ファージの生活環の重要点でPlyG溶解素を発現する核酸配列(ウイルス遺伝子)を有する。PlyGは、ガラクトース(Gal)、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)およびN-アセチルマンノサミン(ManNAc)からなる細菌中性多糖類(NPS)へのPlyG結合にまず必要とされていることが提示されている(証明されてはいないが)プロセスで、構造上の完全性に不可欠な細菌細胞壁成分である、炭疸菌のペプチドグリカンを切断する(7、15)。
【００３４】
重要なことに、野生型炭疸菌(f<5×10-9/細胞)、または抗生物質耐性が1000倍強化された化学的突然変異誘発細胞のいずれにおいても、PlyGに対する自然発生的耐性は生じなかった(7)。このため、PlyGは、抗微生物剤開発の標的として有用である炭疸菌(およびその同系統の生合成経路)のCWGの発見に使用することができる。これは、炭疸病の治療におけるPlyGの明確な役割に加えて、またその役割とは独立して、抗微生物剤そのものである。PlyGに対する自然発生的細菌耐性が生じなかった場合、そのCWG受容体を合成する化学阻害剤は、耐性を漸進的に変化させる傾向が少ない可能性がある。
【００３５】
新規抗微生物剤を開発する際に、標的の選択は重要な検討事項である。生存能力に関するその要件にのみ基づいて標的を選択すること(すなわち、「古典的」方法)では、明らかに不十分である(24)。必要であるのは、まず、微生物の菌力または生存に直接的または間接的に不可欠であり得る標的を同定することであり、例えば、標的との干渉が治療的に成功するようにリガンド、アンタゴニスト、阻害剤、薬剤などと標的とを接触させることである。第2に、その標的が損傷または無効とされた場合に、できるだけ、その喪失機能に置き換わる代替手段を細菌が有さないように、または有することが限定されるように、標的は選択されなければならない。こうした標的を同定するため、細菌とそれらのファージとの間における10億年を超える共進化を活用し、ある炭疸菌特異的ファージの溶解素に基づいた生存方策を開発することによって、耐性の改変や漸進的変化がほとんど起こらない細胞壁標的を同定する。
【００３６】
細菌の2-エピメラーゼのアロステリック部位の同定および選択によって、これらの基準が活用可能な抗微生物剤の開発にいくつかの利点が得られる。細菌の2-エピメラーゼのアロステリック部位は、哺乳動物の2-エピメラーゼ内でコードされている哺乳動物アナログを有していないため、哺乳動物の2-エピメラーゼに対する潜在的効果はゼロである、化合物を開発することができる。好ましくは、哺乳動物の2-エピメラーゼへは結合せずに、細菌の2-エピメラーゼに特異的に結合する、2-エピメラーゼ阻害剤を設計し開発することができる。しかし、哺乳動物の2-エピメラーゼよりも優先して細菌の2-エピメラーゼに選択的に結合する化合物もまた本発明の概念の範囲内である。したがって、細菌の2-エピメラーゼ阻害剤では、細菌の2-エピメラーゼに、哺乳動物の2-エピメラーゼよりも選択的に結合することが可能であり、それは、少なくとも約10:1、少なくとも約25:1、少なくとも約50:1、少なくとも約100:1、少なくとも約250:1、少なくとも約500:1、または少なくとも約1000:1の適切な比を包含し得る。また阻害剤は、少なくとも約5000:1、10,000:1またはそれ以上の比で結合することができる。本阻害剤は、細菌の2-エピメラーゼにほぼ例外なく結合することができ、一方、哺乳動物の2-エピメラーゼに対する結合親和性はほとんど示すことはない。
【００３７】
さらに、細菌の2-エピメラーゼのアロステリック部位の同定および標的化は、非活性部位標的を介して細菌酵素を阻害することができ、しかも薬剤耐性の進化がないことに寄与し得る。標的化アロステリック部位を使用して、活性部位よりもアロステリック部位に選択的に結合する、細菌の2-エピメラーゼ阻害剤を設計し開発することができる。本阻害剤は、細菌の2-エピメラーゼのアロステリック部位にほぼ例外なく結合することができ、しかも、活性部位に対する結合親和性はほとんど示すことはない。あるいは、両部位に結合する阻害剤は、アロステリック部位に対する優先性をさらに示すことができる。好ましくは、本阻害剤は、細菌の2-エピメラーゼのアロステリック部位に特異的に結合し得る。しかし、2-エピメラーゼの活性部位よりもアロステリック部位を選択的に優先する化合物もまた、本開示の概念の範囲内にあり得る。例えば、阻害剤は、アロステリック部位が活性部位よりも、少なくとも2:1、少なくとも約3:1、少なくとも約5:1、少なくとも約10:1、少なくとも約20:1、少なくとも約25:1、少なくとも約33:1、少なくとも約50:1、少なくとも約66:1、少なくとも約75:1、または少なくとも約100:1の適切な比で選択的に結合し得る。また本阻害剤は、アロステリック部位が活性部位よりも、少なくとも約10:1、少なくとも約25:1、少なくとも約50:1、少なくとも約100:1、少なくとも約250:1、少なくとも約500:1、または少なくとも約1000:1の適切な比で選択的に結合し得る。また本阻害剤は、少なくとも約5000:1、10,000:1またはそれ以上の適切な比で結合することができる。
【００３８】
細菌の2-エピメラーゼのアロステリック部位と相互作用する化合物または阻害剤は、そのアロステリック部位を形成するアミノ酸との相互作用を有し得る。これらの相互作用に、化合物の成分または原子と、アミノ酸の成分または原子との間の分子レベルまたは原子レベルの相互作用が含まれることは、当業者には理解されよう。こうした相互作用としては、限定するものではないが、水素結合、極性相互作用、双極子-双極子相互作用、イオンまたは酸-塩基相互作用、非極性ファンデルワールス相互作用、π電子または芳香族π電子相互作用などが挙げられる。これらの相互作用を特徴付ける方法の1つは、アロステリック部位を化合物または阻害剤と共に示す接触点を記載することである。こうした接触点は、化合物または阻害剤と相互作用するアミノ酸ユニットの観点から記載することができる。非限定的な例として、UDP-N-アセチルグルコサミンは、炭疸菌BA-5509の細菌の2-エピメラーゼのアロステリック部位にあるアミノ酸と結合し、相互作用し得る。UDP-N-アセチルグルコサミンは、接触点に関してアミノ酸Q43、Q46、M47、K67、R69、Q70、T102、E136、R210、E212およびH242で、BA-5509の最高12の接触点を呈示することができる。UDP-N-アセチルグルコサミンはまた、他の細菌の2-エピメラーゼのアロステリック部位のコンセンサスアラインメントアミノ酸との最高12の接触点を呈示することができる。同様に、化合物または阻害剤は、細菌の2-エピメラーゼのアロステリック部位のこれら12の接触点の一部または全部と、例えば、少なくとも3接触点、少なくとも4接触点、少なくとも5接触点、少なくとも6接触点、少なくとも7接触点、少なくとも8接触点、少なくとも9接触点、少なくとも10接触点、少なくとも11接触点、または少なくとも12接触点と相互作用するように設計することができる。化合物または阻害剤は、少なくとも6〜8接触点、少なくとも8〜12接触点、および少なくとも6〜12接触点と相互作用し得る。
【００３９】
本明細書に記載されている標的化および構造に基づく技術によって、Epimeroxと呼ばれる例示化合物を含む、炭疽菌に有効な抗微生物剤化合物の種類が得られた。これらの化合物は、式I:
【００４０】
【化１】
2015530987.tif 000002
【００４１】
[式中、X、YおよびZは、各々独立してO、SまたはNR4であり;Aはアリールまたはヘタリールであり;または、Aはハロゲンであり;Bは単環アリール、ヘタリールまたはヘタシクリル(hetcyclyl)であり;または、BはCH3であり;ここで、Aがハロゲンであり、およびBがCH3であることは同一化合物では起こり得ず;各場合におけるR1は、独立して、C0-4アルキルであり;各場合におけるR2は、独立して、C0-4アルキル、C1-4アルコキシ、ハロゲン、--CF2H、--CF3、--OCF3、--SCF3、--SF5であり;各場合におけるR3は、独立して、C0-4アルキルであり;各場合におけるR4は、独立して、C0-4アルキルであるか、単環アリール、ヘタリールまたはヘタシクリルであり;nは0、1、または2であり;mおよびmmは、各々独立して、0、1、2、3、4、または5である];
または式II:
【００４２】
【化２】
2015530987.tif 000003
【００４３】
[式中、Y、Zは、各々独立してO、SまたはNR4であり;Aはアリールまたはヘタリールであり;Bは単環アリール、ヘタリールまたはヘタシクリルであり;各場合におけるR2は、独立して、C0-4アルキル、C1-4アルコキシ、ハロゲン、--CF2H、--CF3、--OCF3、--SCF3、--SF5であり;各場合におけるR3は、独立して、C0-4アルキルであり;各場合におけるR4は、独立して、C0-4アルキルであるか、単環アリール、ヘタリールまたはヘタシクリルであり;nは0、1、または2であり;mおよびmmは各々独立して、0、1、2、3、4、または5である]
を満たす。Bearssの米国特許出願第12/454,062号(US 2009/0298900)(33)を参照されたい。
【００４４】
ある好ましい化合物は、Epimeroxと明示され、化学名2-{4-[5-(4-ブロモフェニル)-チオフェン-2-イルメチレン]-5-オキソ-2-チオキソ-イミダゾリジン-1-イル}-3-フェニル-プロピオン酸を有する、式IIIである(33)。
【００４５】
【化３】
2015530987.tif 000004
【００４６】
これらの化合物、特にEpimeroxは、例えば、有効性に関して、リード最適化法のレパートリーを使用することによりさらに改善することができる(25)。細菌の2-エピメラーゼは、一般に、また溶解素受容体分子の生合成に必要な他の酵素であってもおそらく、抗生物質耐性が問題である、他の病原体、例えばグラム陽性細菌における生存薬標的となり得る。
【００４７】
一実施形態において、グラム陰性病原体もまた、細菌の2-エピメラーゼのアロステリック部位と相互作用し得る化合物で治療することにより標的化され得る。説明したように、グラム陽性細菌は、ペプチドグリカン層を含む細胞壁を有し得る。グラム陰性細菌も細胞壁関連のペプチドグリカン層を有するが、リポ多糖層はペプチドグリカン壁外側の細胞膜を形成する。グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の両方に存在する細菌の2-エピメラーゼは、それらのアロステリック部位内に保存配列を有している。したがって、グラム陽性の2-エピメラーゼ酵素のアロステリック部位と相互作用する化合物は、グラム陰性の2-エピメラーゼ酵素とも相互作用することができるため、それによって広域スペクトルの細菌をも網羅する細菌感染症の治療方法を提供する。
【００４８】
有効量の投与は、所望する結果、例えば、細菌の阻害、細菌細胞壁破壊などを達成するための量で、細菌の2-エピメラーゼに対して有効量の少なくとも1つの阻害剤を送達することを含む。有効量とは、所望の効果を生じさせるのに必要な量である。治療有効量とは、所定の対象における治療の効果の観点において有効な結果が得られる組成物の量である。この量(すなわち、用量)は、複数の要因、例えば、限定するものではないが、細菌の特性、送達方法、阻害しようとする細菌の量または重症度、対象の生理学的な状態(年齢、性別、疾患のタイプおよび段階、一般的身体状態、および所定用量への反応性を含む)、製剤中の薬学的に許容される担体または担体類の性質、ならびに投与経路に応じて変動し得る。
【００４９】
本開示の別の態様において、本発明の阻害剤は、哺乳動物、好ましくはヒトへの投与に適した医薬組成物である。ヒトまたは動物への阻害剤組成物の投与については、1つまたは複数の薬学的に許容される担体を含む組成物中で分子を製剤化することが好ましい。「薬学的にまたは薬理学的に許容される」という語句は、当技術分野で周知の経路を使用して投与した場合に、アレルギーまたは他の副作用を生じない分子実体および組成物を意味する。「薬学的に許容される担体」としては、任意のおよびすべての臨床的に有用な溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗微生物剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語には、医薬品投与に適合し得る、溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗微生物剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に許容される担体には、阻害剤の投与に関して当業者に公知である、例えば、固体形態または液体形態をはじめとする、任意の担体または組成物が含まれ、例えば、下記に適合したものが含まれる:経口投与、例えば、水薬(水性または非水性の溶液または懸濁液)、錠剤(例えば、口腔、舌下、および全身吸収を対象としたもの)、カプセル剤、ボーラス剤、粉末剤、顆粒剤、舌に適用するためのペースト剤;非経口投与、例えば、無菌液または懸濁液または徐放性製剤として、例えば、皮下、筋肉内、静脈内または硬膜外注射によるもの;局所適用、例えば、クリーム剤、軟膏剤または噴霧剤として;舌下投与;眼内投与;経皮投与;肺投与;または経鼻投与。
【００５１】
薬学的に許容される担体または添加剤の例としては、水、薬学的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルデンプンナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン(HSA)、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、薬学的に許容される界面活性剤などが挙げられる。使用する添加剤は、本発明の剤形に応じて、限定するものではないが、適宜、上記のものまたはそれらの組み合わせから選択する。
【００５２】
化合物、組成物、物品および方法を包含する、本発明の特定の態様をここで詳細に説明しているが、その具体例は、添付の実施例および図面に説明している。
【実施例】
【００５３】
(実施例1)
抗微生物剤標的としての2-エピメラーゼの同定。
A.  細菌株および増殖条件。
黄色ブドウ球菌RN4220(22)、炭疸菌ΔSterneおよび炭疸菌Sterne(13、26)を含むすべての株は、ブレインハートインフュージョン培地(BHI; Remel社)で増殖させた。コンディショナルBA5509変異を有する株(pSPAC-BA5509)は、1mMのIPTGの存在下で一晩増殖させ、洗浄し、IPTG含有および非含有のBHIで1:100に希釈し、分析のために示した期間増殖させた。増殖曲線は、1ウェル当たり200μlの培養物(IPTG含有または非含有)を含む96ウェルプレートで実施した;OD600は、SpectraMax Plus 96ウェルプレートリーダー(Molecular Devices社)で、27℃にて11〜20時間2分ごとに記録した(読み取りの間40秒撹拌)。
【００５４】
B.  顕微鏡検査法。
位相差および蛍光顕微鏡検査法(GFP-PlyGBDの使用を含む)は、Eclipse E400顕微鏡(Nikon社)およびQCapture Proバージョン5.1ソフトウェアを使用して、記載のようにして実施した(26)。EM試料は、0.5%酢酸ウラニルで染色し、Tecnai Spirit BT透過電子顕微鏡(FEI社)を用いて観察した。非透過性細胞では、DeltaVision画像復元顕微鏡(Applied Precision社)を記載のようにして使用した(31);画像は、3次元データの逆畳み込み投影である。次の染色液を使用した:NHS-ローダミン(Thermo Scientific社)に結合されているPlyGBD、1μg ml-1;BODIPY FLバンコマイシン(Invitrogen社)、2.5μg ml-1;DAPI、2μg ml-1;およびGFP-PlyGBD、1μg ml-1。表面タンパク質を消化するため、一晩、ΔSterne細胞をクロラムフェニコール(10μg ml-1)およびプロテイナーゼK(100μg ml-1)で2時間処理し、PBSで洗浄し、3.75%ホルマリンで固定した。固定細胞をポリ-L-リシンコーティングスライドにマウントし、GFP-PlyGBDまたは抗Sap抗血清および二次Alexa Fluor 647結合抗体(Invitrogen社、A21245)で記載のようにして染色した(31)。
【００５５】
C.  細菌細胞壁炭水化物の調製および分析。
炭疸菌ΔSterneの細胞壁の単離および精製と、SDSまたはフッ化水素酸(HF)のいずれかによるその後の抽出は、最初にEmulsiFlex C5ホモジナイザー(Avestin社)を使用して細菌細胞を破壊したことを除き、記載のようにして実施した(27)。グリコシル組成および結合の解析は、炭疽菌CWGで実施した(15)。化膿連鎖球菌(S. pyogenes)CWGは、記載のとおり精製した(28)。精製細胞壁物質へのPlyG結合に関する分析については、全細胞壁、SDS抽出細胞壁、およびHF抽出細胞壁ストックをPBS(5mg ml-1)中で調製し、希釈した;次いで、指示された濃度の70μlアリコートをドットブロット装置(Bio-Rad社)にロードし、ニトロセルロースに移し、HisタグPlyGBD(1mg ml-1)でプロービングした(26)。抗His抗体(Novagen社、70796)と共にインキュベーションした後、アルカリホスファターゼ結合二次抗体(Sigma社、A3563)を使用して結合を可視化した。
【００５６】
D.  溶解素阻害アッセイ。
PlyG(PBS pH7.2中の7.4μg ml-1ストック、70μl)および炭疽菌NPSまたは化膿連鎖球菌CWG(PBS中、指示された濃度で70μl)を96ウェルプレート中で30分間24℃にて混合した。溶解素および/または炭水化物は、対照についてはPBS単独と置き換えた。プレインキュベーション後、PBS中の対数期炭素菌ΔSterne細胞70μlを添加し、OD600はSpectraMax Plus 96ウェルプレートリーダーで70分間30秒ごとにモニターした(読み取りの間、10秒間撹拌)。PlyG処理培養物に対するOD600値は、阻害を評価するため、未処理培養物の対応値で割った。PlyGBD結合の阻害については、25μlのPlyGBD(1μg ml-1)および25μlの指示された濃度であるNPSを24℃で30分間混合し、その後、対数増殖期ΔSterne75μlを加えた。10分後、洗浄細胞ペレットをブラック96ウェルプレートに移し、SpectraMax M5プレートリーダー(Ex=485nm、Em=538nm)で相対蛍光ユニット(RFU)を判定した。NPS処理した試料に関するRFU値は、阻害を評価するため、未処理試料に関する対応値で割った。
【００５７】
E.  溶解素のNPSへの結合。
PlyGが炭疽菌NPSに結合するか否かを判定するため実験を行った。これに関し、炭疽菌ΔSterne株のCWGを精製し、グリコシル組成および結合の解析に供し、その構造を確認した。抽出物質は、炭疽菌NPSを定義する3:2:1の比率で(Table 1(表1))Gal、GlcNAcおよびManNAcから構成されていた(15)。メチル化分析もまた、炭疽菌と一致する、末端結合Gal残基を含むグリコシル結合(Table 2(表2))を示した(15)。次に、PlyGまたはGFP標識PlyG結合ドメイン(GFP-PlyGBD)のいずれかとNPSとのプレインキュベーションを試験し、エーテルプレインキュベーションがその後の細胞溶解または細胞表面結合をそれぞれ変化させるかどうかについて判定した。PlyGの炭疽菌NPSとの相互作用については、図1a〜図1eを参照されたい。(a)炭疽菌NPSとプレインキュベーションした後のPlyG溶解活性の用量依存的阻害。(b)化膿連鎖球菌からのCWG量の増加に伴うプレインキュベーション後のPlyG活性。(c)炭疽菌NPSとプレインキュベーションした後のPlyGBD表面結合性の用量依存的阻害。(d)プロテイナーゼK処理実施または未実施(+/-PK)の表面標識炭疽菌のDeltaVision画像。NPS(緑色)はGFP-PlyGBDで標識されており、S層Sapタンパク質(赤色)は、特異抗体およびAlexa Fluor 647結合二次抗体で標識されたものである。(e)総細胞壁物質とSDS処理およびHF処理の両細胞壁へのPlyGBD結合のドットブロット分析。用量依存的応答が、両事例において、PlyG指向性溶解および結合を阻止するNPSレベルの増加とともに観察された(図1aおよび図1c)。しかし、化膿連鎖球菌のCWG(炭疽菌NPSに無関係な構造)とPlyGのプレインキュベーションでは、溶解活性に効果はなかった(図1b)。PlyGがタンパク質受容体に結合しないという証拠として、GFP-PlyGBDが、表面タンパク質(S層タンパク質、Sapを含む)がほとんど存在しないプロテイナーゼK処理細菌を標識することも確認された(図1d)。さらに、HisタグPlyGBDは、精製炭疽菌の細胞壁物質およびSDS処理細胞壁(表面タンパク質がほとんど存在しない)に用量依存的に結合するが、CWGを除去するためにフッ化水素酸抽出した細胞壁には結合しなかった(図1e)。まとめると、これらの所見は、NPSがPlyG細胞壁受容体であることを示唆している。
【００５８】
【表１】
2015530987.tif 000005
【００５９】
【表２】
2015530987.tif 000006
【００６０】
F.  炭疽菌NPSに対するPlyG感受性およびPlyG非感受性の異なる生合成経路。
PlyG感受性炭疽菌Ames株と、遺伝学的に関連するがPlyG耐性であるセレウス菌10987(Bc ATCC 10987)(7、16)の直接ゲノム比較によって、CWG生合成経路として注釈されるAmes特異的遺伝子クラスターを明らかにした。炭疽菌の2-エピメラーゼの同定および分析については、図2a〜図2eを参照されたい。(a)セレウス菌細胞系のsps遺伝子座。変異性sps遺伝子のアイランドは灰色の領域により連結されており、異なる色で表示している。保存されている隣接配列を示す。赤斜線遺伝子座(Ames中にはない)は、Amesによってコードされている遺伝子に類似の細胞壁生合成遺伝子である。逆方向矢印はリピートエレメントである。PlyG溶解に対する感受性およびGFP-PlyGBD表面結合性を示す。略語:w/c、全細胞結合;p/s、極性/隔壁結合(polar/septal binding)。(b)2-エピメラーゼ二重変異体RS1205の遺伝的表現。(c)親の野生型ΔSterne株と比較した(提示IPTG濃度での)RS1205の増殖。標準偏差による平均を示している(n=3)。(d)IPTG非含有で5時間増殖させた後のRS1205の形態学的分析。位相差画像および対応する蛍光フィールドを、GFP-PlyGBD標識RS1205(5秒露出)および炭疽菌ΔSterne(30秒露出)に関して示す。Deltavision画像については、NPS(赤色)はローダミン-PlyGBDで標識し、分裂隔壁(緑色)はバンコマイシンBODIPY FLで標識し、DNA(青色)はDAPIで標識した。TEM画像はスケールバー(500nm)で示しており、矢印はいくつかの分裂隔壁を示している。(e)IPTG(5μM)含有および非含有で12時間増殖させたRS1205の位相差顕微鏡画像。炭疽菌の約16kbのBA5508-BA5519遺伝子座に対応し、この領域(表面多糖類合成に関して、spsと定義されている)のサイズと遺伝子含量は、密接に関連しているセレウス菌群微生物の広い範囲で著しく変化した(図2a;Table 3(表3)およびTable 4(表4))。sps遺伝子座はすべて、それらのバックグラウンドゲノムとは異なるG+C含量を有する遺伝的「アイランド」にコードされており、少なくとも5〜10kb延長されているほぼ同一のDNA配列に隣接している(Table 4(表4)およびTable 5(表5))。sps含量における変動によってCWGとの関連の理由を説明できるようであり、さらに異なるグリコシル組成がセレウス菌群の全体にわたって確認される(17)。興味深いことに、炭疽菌のsps遺伝子座と61%同一性のsps遺伝子座を有するセレウス菌株E33Lもまた、PlyGに感受性である(図2a)。これらの知見は、炭疽菌sps遺伝子座がNPSの産生を規定するという考えを支持するものである。
【００６１】
【表３】
2015530987.tif 000007
【００６２】
【表４】
2015530987.tif 000008
【００６３】
【表５】
2015530987.tif 000009
【００６４】
G.  抗微生物剤標的の同定。
推定上の非加水分解性UDP-N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼ(または2-エピメラーゼ)をコードしている、あるタンパク質は、セレウス菌群の他の異なるsps遺伝子座の中に保存されていた(図2a)。2-エピメラーゼは、セレウス菌群内での同一性は>98%であり、一連のグラム陽性微生物に対する同一性は>60%である。セレウス菌系統のsps遺伝子座によってコードされているUDP-GlcNAc 2-エピメラーゼのタンパク質配列アラインメントについては、図3を参照されたい。アラインメントはClustalWを使用して得た。シェーディングはBoxshadeにより作製した。黒色は100%同一の残基を示し、灰色は保存されているアミノ酸の変化を示す。含まれているタンパク質は以下のとおりである:炭疽菌AmesのBA5509(配列番号1)、セレウス菌E33LのMnaA(配列番号2)、セレウス菌ATCC 10987のBCE_5307(配列番号3)、セレウス菌ATCC 14579(Bc ATCC 14579
)のBC5201(配列番号4)、バチルス・チューリンゲンシス(B. thuringiensis)97-27のBT9727_4878(配列番号5)、およびセレウス菌Al Hakam(Bt Al Hakam)のBALH_4693(配列番号6)。図4は、異なるグラム陽性微生物によってコードされているUDP-GlcNAc 2-エピメラーゼのタンパク質配列アラインメントについてである。アラインメントはClustalWを使用して得た。シェーディングはBoxshadeにより作製した。黒色は100%同一の残基を示し、灰色は保存されているアミノ酸の変化を示す。含まれているタンパク質は以下のとおりである:炭疽菌AmesのBA5509(配列番号1)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)Conn15株のEFWG_00415(配列番号7)、エンテロコッカス・フェカリス(E.faecalis)TX0104株のMnaA(またはHMPREF0348_1199)(配列番号8)、および黄色ブドウ球菌Newman株のCap5P(またはNWMN_0110)(配列番号9)。細菌の2-エピメラーゼは、CWGサブユニットの重合前に、UDP-GlcNAcをUDP-ManNAcに変換する;異性化はCWG生合成における初期反応であり、増殖にとって重要、または不可欠であり得る(18、19)。細菌の生存能力、こうした酵素の広範囲分布、および炭疽菌の溶解素NPS阻害におけるManNAcの存在に関する2-エピメラーゼの重要性を考慮し、BA5509によってコードされている2-エピメラーゼをさらなる特徴付けのために選択した。
【００６５】
抗微生物剤標的としてBA5509を調査するため、炭疽菌の生存能力に対する2-エピメラーゼの重要性を評価した。しかし、変異体構築の注意点は、炭疽菌が、BA5509への同一性が99%である、第2の2-エピメラーゼBA5433をコードしているという事実に関係している。図5は、炭疽菌によってコードされているBA5509(配列番号10)およびBA5433(配列番号11)のUDP-GlcNAc 2-エピメラーゼのタンパク質配列アラインメントを説明している。アラインメントはClustalWを使用して得た。シェーディングはBoxshadeにより作製した。黒色は100%同一または保存されている残基を示す。BA5509プロモーターは、記載のようにしてIPTG誘導性PSPACプロモーターと置き換えた(29)。簡潔に説明すると、BA5509の最初の471塩基とその前のリボソーム結合部位は、BA5509突然変異誘発プライマーを用いてPCR増幅した(Table 6(表6))。プライマーがコードしているattB1およびattB2リコンビナーゼ認識部位は、GatewayベクターpDONRtet(Invitrogen社)へクローニングし、pNFd13へ導入することができる。BA5509へのΔSterneの形質転換および挿入は、5mMのIPTGの存在下で実施した。BA5433の破壊は、BA5433突然変異誘発プライマーで増幅された190bpの内部PCR断片を使用して記載のように(30)実施し、プラスミドpASD4のKpnl部位へクローニングした。RS1205のRT-PCR分析は、Table 6(表6)のプライマーを使用して、記載のようにして実施した(26)。定量PCR(qRT-PCR)分析は、Table 6(表6)のプライマーとBA5509用プローブ(5'-CCGTCGTGAAAACTT-3')(配列番号37)およびハウスキーピング遺伝子rpoB(5'-CTGCCGCTAAAATTT-5')(配列番号38)を使用して、記載のようにして実施した(31);rpoBは、遺伝子発現の内部制御としての機能を果たした。
【００６６】
【表６】
2015530987.tif 000010
【００６７】
機能多重性の可能性には、単一変異体に加えて、BA5509-BA5433二重変異体(RS1205株)(図2b)の構造が必要であった。コンディショナル2-エピメラーゼ変異体は、まず、IPTG誘導性SPACプロモーター制御下で、野性型単シストロン性BA5509遺伝子座を置くことによって生成された。次いで、BA5433を、野性型およびBA5509変異体バックグラウンドの両方において、組換えプラスミド染色体の導入により不活性化した。RS1205二重変異体については、RT-PCRにより、BA5509発現に関するIPTG依存性と、sps遺伝子が異なって転写される下流の発現にBA5509変異体は影響を及ぼさなかったという事実を確認した。図6aおよび図6bは、BA5509発現のRT-PCR分析を示す。RNAは、5mM IPTGを含有または非含有のBHI培地で5時間増殖させた後に調製した。次いで、cDNAを生成させ、示した遺伝子座に特異的なプライマーを用いてPCRにより分析した。(a)2-エピメラーゼ二重変異体RS1205株におけるBA5509(および下流の遺伝子座BA5510およびBA5511)の発現。(b)野生型炭疽菌ΔSterne株における遺伝子発現。DNAサイズの基準を示す。
【００６８】
図7a〜図7cは、炭疽菌のBA5509またはBA5433にコードされているUDP-GlcNAc 2-エピメラーゼを欠損している株の表現型分析を示す。BA5509変異体は、PSPAC-BA5509とも呼ばれ、特に明示しない限り、5mM IPTGで増殖させた。図7Aは、BHI培地における増殖曲線を示す。図7Bは、10時間増殖させた株の位相差/蛍光顕微鏡分析を示す。図7Cは、BHIで10時間増殖させた株の透過電子顕微鏡組織を示す。スケールバーは200nmであり、矢印はいくつかの分裂隔壁を示す。BA5509またはBA5433のいずれかの欠損は、炭疽菌増殖にわずかながら影響を及ぼした(図7a)。BA5509単一変異体は細胞壁の膨隆と不適切な部位での隔壁形成(分節形成(partitioning))を有していたが、表面NPSに結合しているGFP-PlyGBDはほとんど影響を受けなかった(図7bおよび図7c)。一方、RS1205二重変異体は、本質的な増殖の欠陥と形態学上の欠陥があった。IPTG濃度の減少を伴う補充培地では、RS1205の増殖は、0.01mM IPTGで阻害された(図2c)。RS1205の顕微鏡検査からは、隔壁異常と細胞表面NPSのPlyGBD標識がほとんど存在しないことが特徴的であるプロセスにおいて、IPTGの非存在下で5時間および12時間経過させた後に、典型的な桿状形態から球状細胞凝集体へ進行することが明らかとなった(図2dおよび図2e、図8a)。図8aおよび図8bは、UDP-GlcNAc 2-エピメラーゼ活性の阻害または喪失に関連した超微細構造の変化を示す。スケールバーを示し、矢印はいくつかの分裂隔壁を示す。(a)炭疽菌ΔSterneエピメラーゼ変異型誘導体RS1205(PSPAC-BA5509/BA5433::pASD4)をIPTGの非存在下で12時間増殖させた。(b)炭疸菌ΔSterneをEpimerox(5μM)で、通気しながら30℃にて5時間処理した。不安定な球状形態への変換は、CWG合成が欠損している変異体の特徴である(11、18、19)。これらの結果は、2-エピメラーゼがNPS合成に必要であり、しかも、炭疽菌の生存能力にとって、不可欠ではないにしても重要であることを示唆している。
【００６９】
(実施例2)
微生物標的用の阻害剤同定の説明
A.  仮想スクリーニングアッセイ。
第1段階のヒット確認は、約200万の小分子の仮想ライブラリーをドッキングさせ、計算した結合エネルギーに基づいて、ヒットのサブセットを生成させるモデルとして、BA5509 2-エピメラーゼ結晶構造のアロステリック部位を使用して開始した。第1段階のヒットの性能と薬理学的活性は、物理化学的およびADMET(吸収、分布、代謝、排出および毒性)予測アルゴリズムを使用して評価した。次いで、仮想スクリーニングセットから得た化合物100種について、生化学アッセイ20および炭疽菌増殖阻害アッセイの両方でスクリーニングした。30μMの濃度で(未処理の対照に比べて)50%以上炭疽菌の増殖を阻害する能力に基づいて、最終的に多数の化合物を同定した。これらの有力候補は、最適化に向けての出発点として有用であった。CLIMB(登録商標)誘導設計に基づいて、62種の化合物を合成し、炭疽菌増殖阻害に関して試験した。Epimeroxは最も強力な阻害剤であり、さらなる薬学的評価を実施するため選択した。
【００７０】
B.  増殖阻害アッセイ。
これまでに、BA5509の結晶構造は解明されており、また、活性部位とアロステリック部位両方の同一基質分子(この場合、UDP-GlcNAc)間の直接相互作用を必要とする新たな制御機構が同定されている(20)。抗微生物剤開発の標的としてBA5509を検証し、BA5509構造(特にアロステリック部位残基および活性部位残基が、細菌の2-エピメラーゼ、例えば、BA5509およびBA5433で確認されたものの中に保存されていたが、ヒトの同じ酵素には存在しなかった)は、阻害分子を同定するための基礎として使用した。まず、BA5509の活性部位およびアロステリック部位を、約2,000,000の小分子の仮想ライブラリーに対するドッキングモデルで使用した。
【００７１】
最初の化合物のサブセットについて、計算した結合エネルギーと適切な候補薬剤の予測モデルに基づき同定し、炭疽菌増殖阻害アッセイで試験するために合成した。30μMで活性のある30種の化合物を最適化のために選択し、最終的に、試験用のさらなる62種の化合物を取得した。化合物のアッセイは、文献10に開示されているように、標準技術を使用して実施した。Table 7(表7)は、最初の30種の化合物とアッセイ値を示す。Table 8(表8)は、さらなる62種の化合物と関連アッセイ値を示す。
【００７２】
C. Epimeroxによる増殖阻害。
Epimeroxと呼ばれる、これらの実験において最も強力な阻害剤は、オキソイミジゾリル(oxo-imidizolyl)化合物である。5mM DMSO中の1ミリモルEpimeroxストック溶液をアッセイの提示濃度に希釈した。最終DMSO濃度は常に3%であった。96ウェルプレートのウェルは、6μlの阻害剤(または対照としての6μlのDMSO)、94μlのBHI、およびBHI中の対数増殖期細胞(OD600 0.2)100μlを含んでいた。OD600は、28℃で2分毎に撹拌しながら、SpectraMax Plus 96ウェルプレートリーダーで記録した。増殖阻害は以下のように計算した:
【００７３】
【数１】
2015530987.tif 000011
【００７４】
終点は、定常期に入る時点として定義した。アッセイは3連で実施した。
【００７５】
Epimeroxは、炭疽菌Sterne株およびΔSterne株の両方に対して4.0μg ml-1(7.6μM)の最小阻止濃度(MIC)を示した(Table 9(表9))。すべての炭疽菌分離株について十分に記載されている遺伝学的均一性(21)と、セレウス菌微生物系統の30以上の異なるメンバーから得たBA5433およびBA5509のタンパク質配列の100%同一性を考慮すると、分離株はすべてEpimeroxに感受性であると思われる。図9a〜図9fは、Epimeroxの抗微生物活性を示す:(a)Epimeroxの化学構造。(b)Epimerox含有および非含有のBHI培地における炭疽菌ΔSterneの増殖曲線。(c)炭疽菌および黄色ブドウ球菌をEpimeroxに5時間暴露した後の形態(それぞれ、5μMおよび14μM)。Deltavision画像に関して、NPS(赤色)はローダミン-PlyGBDで標識し、分裂隔壁(緑色)はバンコマイシンBODIPY FLで標識し、DNA(青色)はDAPIで標識した。TEM画像に関して、矢印はいくつかの分裂隔壁を示す。スケールバーを示す。(d)グラム陽性微生物およびグラム陰性微生物に対する増殖阻害アッセイ。培養は、提示Epimerox濃度を含有および非含有するBHI培地で、11時間28℃で増殖させた。(e)Epimeroxを含有および非含有するBHI培地における黄色ブドウ球菌RN4220株の増殖曲線。(f)5×105 CFUの炭疽菌Sterneによる腹腔内感染、および感染3時間後に開始する(また7日間、6時間毎に継続する)緩衝液による腹腔内治療、または感染3時間もしくは24時間後に開始する(また7日間、6時間毎に継続する)Epimerox(13mg/kg)による腹腔内治療を行った後のC57BL/6マウスの生存プロット。
【００７６】
炭疽菌培養物に添加した場合、Epimeroxは、3μM以上の濃度で最大14時間増殖を効果的に阻害した(図9b)。2-エピメラーゼ二重変異体RS1205を用いた場合、顕微鏡分析では、5μMのEpimeroxを含有する培地へ接種した後、桿状形態から膨張し丸くなった細胞型への変換が明らかになった(図8bおよび図9c)。増殖阻害は、PlyGBD表面結合の著しい減少と、分裂隔壁形成異常に関連していた(図9c)。これらの知見は、炭疽菌における2-エピメラーゼ活性およびNPS生合成の阻害により静菌剤として作用するEpimeroxと一致しており、また、両2-エピメラーゼ遺伝子を欠損している細胞で確認された表現型と一致している。
【００７７】
【表７Ａ】
2015530987.tif 000012
【００７８】
【表７Ｂ】
2015530987.tif 000013
【００７９】
【表７Ｃ】
2015530987.tif 000014
【００８０】
【表７Ｄ】
2015530987.tif 000015
【００８１】
【表８Ａ】
2015530987.tif 000016
【００８２】
【表８Ｂ】
2015530987.tif 000017
【００８３】
【表８Ｃ】
2015530987.tif 000018
【００８４】
【表８Ｄ】
2015530987.tif 000019
【００８５】
【表８Ｅ】
2015530987.tif 000020
【００８６】
【表８Ｆ】
2015530987.tif 000021
【００８７】
【表８Ｇ】
2015530987.tif 000022
【００８８】
【表９】
2015530987.tif 000023
【００８９】
いくつかの証拠は、Epimeroxが2-エピメラーゼに特異的に結合し、阻害することを示唆している。第1に、Epimeroxは、BA5509の活性部位およびアロステリック部位とin vitroでドッキングすることにより同定された;炭疽菌の唯一の相同タンパク質はBA5433である。第2に、フィラメント膨隆、隔壁異常、GFP-PlyGBD結合の減少により定義される、RS1205 2-エピメラーゼ変異体とEpimerox処理細胞の間の表現型類似性は顕著である。第3に、BA5509変異体株またはBA5509 BA5433変異体株(それぞれPSPAC-BA5509を担持)の増殖培地においてIPTGの濃度を0.1mMから25mMまで上昇させると、Epimeroxに関するMIC(MIC=最小阻止濃度)は4.0μg ml-1から8μg ml-1まで上昇した(Table 10(表10))。EpimeroxのMICの2倍上昇は、BA5509 BA5433変異体およびBA5509変異体における2-エピメラーゼ発現の10倍増加と20倍増加にそれぞれ関係していた。これらの知見はEpimerox耐性の増加とBA5509発現の相関を示し、Epimerox阻害剤と2-エピメラーゼの間の直接的相互作用を強く示唆するものであるが、炭疽菌におけるEpimeroxに対する二次標的(すなわち、2-エピメラーゼ以外の標的)が除外されるものではない。
【００９０】
【表１０】
2015530987.tif 000024
【００９１】
Epimeroxは炭疽菌の2-エピメラーゼを標的とするように構築されたが、それにもかかわらず、2-エピメラーゼをコードする他の多くのグラム陽性微生物の増殖をも阻害した(図9d)。黄色ブドウ球菌RN4220株は、特に、7.5μg ml-1以上のEpimerox濃度の存在下で12時間以上増殖しなかった(図9e)。7.5μg ml-1(14μM)では、黄色ブドウ球菌は、増殖が極めて不完全で、細胞分裂の欠陥を示し、例えば、隔壁位置形成の異常および細胞壁物質の過剰などがあった(図9c)。これらの結果は、以前に黄色ブドウ球菌CWG変異体で観察された結果と同一であった(14)。黄色ブドウ球菌の2-エピメラーゼは、Epimeroxとの接触が予測されるアミノ酸の数が炭疽菌の数とは異なるので(黄色ブドウ球菌エピメラーゼでは、12の接触アミノ酸のうち5つが異なる)、炭疽菌に対するEpimeroxの優れた活性は驚くものではない。しかし、黄色ブドウ球菌に対する活性は、細菌の2-エピメラーゼを標的とし得る抗微生物分子の開発における可能性を示唆するものである。
【００９２】
(実施例3)
in vivoにおける抗微生物剤標的の検証。
炭疽菌に対するEpimeroxの有効なin vitroでの活性に基づき、その活性を、腹腔内(i.p.)投与により動物に細菌を感染させたマウスモデルで試験した。この感染経路は、炭疽菌による自然の生物学的感染経路(または臨床設定における抗生物質送達のための適切な経路)を示すものではないが、それにもかかわらず、これは、抗微生物剤としての溶解素の効果を評価する複数の研究において使用されきた、信頼性が高く十分に認識されているモデルである(7、8、22)。
【００９３】
一晩、炭疽菌Sterne培養物をBHIで1:100に希釈し、30℃で通気しながら3時間増殖させた。細胞を回収し、滅菌PBS(pH7.2)で洗浄し、1ml当たりのPBSに約1×106個の細胞密度で調整し、適切な希釈を行った後に栄養寒天培地のプレート上にプレーティングした。次いで、4〜6週齢年のメスのC57BL/6マウス(1群当たり15匹)に、5×105個の細菌で腹腔内感染させた(7)。感染の3時間または24時間後のいずれかで開始し、Epimeroxを20μg(1.3mg/kg)または200μg(13mg/kg)のいずれかの用量で、7日間、6時間毎に腹腔内投与した。生存について、14日間モニターした。また感染マウスの第2の組は、検死のため、示した時点で安楽死させた。心臓、肝臓、脾臓および腎臓を切除し、70%エタノールおよび滅菌PBS(pH7.2)で洗浄し、PBS中でホモジナイズし、プレーティングし、各種組織における生存細菌数を判定した。各臓器の無菌状態を確認するため、非感染マウスを使用した。
【００９４】
このモデル系において、またEpimerox処理の非存在下において、5×105個の増殖力の強い炭疽菌細菌で感染させた3時間後に、主要臓器にはコロニー化が生じ、5日目にすべての動物の死亡が確認され、50%生存率は約3日で確認された(図9f、図10aおよび図10b)。図10a〜図10cは、Epimerox治療マウスおよび未治療マウスにおける細菌負荷を示す。(a)細菌は、腹腔内感染の3時間後にマウスの臓器で検出された。3匹のマウスを3時間で安楽死させ、示した臓器を切除し、臓器当たりのコロニー形成の単位数を判定した。標準偏差による平均値を示す。(b)マウスにおける細菌負荷は、感染の3時間後に緩衝液で処理した。20時間の試料は安楽死させたマウスから得て、2〜4日目の試料は感染による死亡後に得た。(c)マウスにおける細菌負荷を、感染の3時間後にEpimeroxで処理した。動物は、感染の20時間後、2日後および14日後に安楽死させ、臓器回復および細菌力価を判定するために処理した。Epimeroxを感染の3時間後または24時間後のいずれかで腹腔内投与し(7日間、6時間毎に継続した)場合、それぞれ、100%および66%の動物が14日間生存した。マウスを感染の3時間後にEpimeroxで治療した場合、20時間で炭疸菌が主要臓器から検出されたが、しかし、2日後には観察されなかった(図10c)。これらの実験からは、Epimerox治療の経過によって炭疽菌に感染した動物を回復させることができることが示唆される。
【００９５】
(実施例4)
抗微生物剤標的が耐性を進化させる能力の試験。
抗生物質により攻撃された細菌が薬剤に対する耐性を進化させるかどうか、またそれがどの程度であるかを評価するため、Epimeroxを他の抗生物質化合物と比較した。最小阻止濃度(MIC)は、記載のようにマイクロブロス希釈法を使用して判定した(32)。Epimerox、リファンピン(Sigma-Aldrich社)、およびダプトマイシン(Tocris Bioscience社)によって誘導され得る薬剤耐性のレベルの分析については、各種細胞株を100mlのBHIで、(炭疽菌Sterneおよびその誘導体の場合には)30℃で、(黄色ブドウ球菌RN4220の場合には)37℃で撹拌しながら増殖させた。24時間後、培養物を洗浄し、培地中で10倍に濃縮し、ダプトマイシン(15ug ml-1)、リファンピン(50μg ml-1)、または一連のEpimerox濃度を含有または非含有する寒天培地での生存能力のためプレーティングした。示したところで、(様々な濃度の)IPTGを増殖培養物および寒天平板の両方に添加した。3〜5日後に出現するコロニーを耐性頻度の計算に使用した。
【００９６】
Epimerox耐性の誘導は、既に開示されている方法と同様の方法で、連続継代を使用して評価した(23)。簡潔に説明すると、炭疽菌ΔSterneおよび黄色ブドウ球菌RN4220の一晩培養物は、Epimerox(1μM刻みの増加で、1から15μMまでの濃度で変更)を含むBHI培地中でOD600 0.1に調整し、通気しながら30℃で18時間増殖させた。可視による増殖が生じた最も高いEpimerox濃度をPBSで洗浄し、OD600 0.1に調整し、アリコートは、その後の分析のために-80℃で凍結させるか、上記のような一連の増加のあるEpimerox濃度の範囲で一晩インキュベートした。6日後に耐性値の増加は認められなかったが、実験は、最終的に21日間継続した。21日後、すべての凍結媒介物を戻し、Epimeroxの非存在下で3回継代培養し、再度、EpimeroxのMICをマイクロブロス希釈法により判定した。同様の実験を、ダプトマイシンおよび黄色ブドウ球菌株RN4220を用いて実施した。
【００９７】
抗微生物剤を開発するための主要な分子としてのEpimeroxの有利性は、その活性(PlyGを有する場合)に対する耐性が、通常、検出可能なレベルよりも低いように思われるという知見によってさらに高まる。しかしながら、EpimeroxのMICに対するBA5509発現の増加の影響(Table 1(表1))と遺伝子量の変化の潜在的な影響を考慮し、Epimeroxに対する耐性の形式的分析を実施した。まず、Epimeroxに耐性のある自然発生的変異体の出現を、対照としてのリファンピン処理細菌およびダプトマイシン処理細胞を使用して分析した。リファンピンとダプトマイシンに対する耐性の誘導頻度は、炭疽菌と黄色ブドウ球菌において、それぞれ10-7から10-9の間にあることが確認された(Table 9(表11))。
【００９８】
【表１１】
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【００９９】
図11は、Epimerox連続継代実験を示す。増殖を生じるEpimerox(μg/ml)の最高濃度を継代の各日について示す。6日後以降に、さらなる増加は確認されなかった。四角形は炭疽菌Sterneを示し;三角形は黄色ブドウ球菌RN4220を示す。図12は、ダプトマイシン連続継代実験を示す。黄色ブドウ球菌RN4220の増殖を生じるダプトマイシン(μg/ml)の最高濃度を継代の各日について示す。これに対し、MIC値またはその周辺値のEpimeroxを補充した培地に各菌株を反復接種した場合、耐性のある誘導体は生じなかった。次いで、黄色ブドウ球菌について開示されている連続継代方法を使用し、Epimerox耐性を生成するように試みた(23)。6日後、Epimerox MICは、炭疽菌については8.0μg ml-1で、黄色ブドウ球菌については12μg ml-1で、それぞれ2.0μg ml-1および5.0μg ml-1のMICから開始した後に安定水準に達した(図11)。さらなる増加は観察されなかった(最高21日)。Epimerox MICにわずかな増加はあったものの(おそらく、炭疽菌のBA5509発現の増加によって生じた)、Palmer et al.(23)および本明細書(わずか11日間で0.5μg ml-1から18μg ml-1までの増加を含む;図12)によりダプトマイシンの使用で確認された耐性と同様の高レベルの耐性は確認されなかった。これらの結果は、耐性の可能性が低い新規の抗微生物剤標的を同定するための記載の方法、ならびに標的に有利に干渉する抗微生物剤を支持するものである。
【０１００】
(実施例5)
他の微生物の2-エピメラーゼ標的の比較。
A.  他のグラム陽性細菌の2-エピメラーゼの比較。
細菌の2-エピメラーゼは、UDP-N-アセチルグルコサミン(UDP-GlcNAc)およびUDP-N-アセチルマンノサミン(UDP-ManNAc)の可逆的な変換を触媒する。2-エピメラーゼは、グラム陽性細菌のペプチドグリカンにタイコ酸を付着させるよう機能する結合ユニットで確認されているManNAcの活性化形態を細菌にもたらす。ManNAc残基は、すべての腸内または消化管細菌で確認されている表面抗原である、腸内細菌の共通抗原(ECA)成分として確認されている。
【０１０１】
他のグラム陽性細菌のゲノムによる炭疽菌の2-エピメラーゼのBLAST分析を実施し、その結果を図13および図14に示す。図13は、炭疸菌Sterne:BA5509、BA5433;黄色ブドウ球菌Newman:NWMN_2015 (1)、NWMN_0110(2)、NWMN_0101 (3);黄色ブドウ球菌MW2:MW2GI-21283764 (1)、MW2GI-21281868 (2)、MW2GI-21281859 (3);黄色ブドウ球菌JH9:JH9GI-147741631(1)、JH9GI-148266590 (2)、JH9GI-148266581 (3);エンテロコッカス・フェシウムCom15:GI-257835979 (1)、GI-257835973 (2);エンテロコッカス・フェカリスTX0104:GI-227518216;肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae) TIGR4:SpneT_02000827 (1)、SpneT_02000827 (2);B群連鎖球菌(Streptococcus agalactiae) NEM316:gbs1235;ミュータンス連鎖球菌(Streptococcus mutans) U159:GI-24377810;ブタ連鎖球菌(Streptococcus suis) P1/7:GI-253753316;リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes):lmo2537におけるアロステリックポケットの12アミノ酸を示す。図14は、配列番号12〜30を含む、図13に記載したグラム陽性細菌に関する細菌の2-エピメラーゼのアミノ酸配列のアラインメントを示す。UDP-GlcNAcに接触することが既に明らかにされているアロステリック結合ポケットの12のアミノ酸のうち、複数の細菌の種が高い配列相同性を示した(図13)。ブドウ球菌、肺炎連鎖球菌、ミュータンス連鎖球菌、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウムおよびリステリア・モノサイトゲネスのすべての株は、炭疽菌の2-エピメラーゼと非常に高い相同性を有していた。複数の2-エピメラーゼを有するゲノムのうち、少なくとも1つが非常に高い相同性を有していた。アラインメントした配列の12の接触点のコンセンサス配列は次のとおりであった:QHXMXXQTEREH(図13および図14)。
【０１０２】
B.  グラム陰性細菌の2-エピメラーゼの比較。
グラム陰性細菌の2-エピメラーゼ(髄膜炎菌(Neisseria meningitis)、大腸菌、シュードモナス・シリンゲ(Pseudomonas syringae)、肺炎桿菌(Klebsiella pneumonia)、アシネトバクター・バウマニー(Acinetobacter baumanii))のゲノムによる炭疽菌の2-エピメラーゼのBLAST分析も実施した。図15は、大腸菌(配列番号31)、肺炎桿菌(配列番号32)、シュードモナス・シリンゲ(配列番号33)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)(配列番号34)、髄膜炎菌(配列番号35)、アシネトバクター・バウマニー(配列番号36)に関連するグラム陰性細菌の2-エピメラーゼと炭疽菌の2-エピメラーゼとのゲノムのアラインメントを示す。太字の相同性は、UDP-N-アセチルグルコサミンのアロステリック部位接触点で確認された12アミノ酸である。コンセンサス配列(緑膿菌が存在しない場合はQHXXXQTEREH、および緑膿菌が存在する場合はQHXXXXERXX)。グラム陽性の2-エピメラーゼと同様に、高い相同性が確認された。(UDP-GlcNAc)と接触されるアロステリック結合ポケットの12アミノ酸に関し、試験したすべてのグラム陰性の種は、炭疽菌の2-エピメラーゼとの相同性を有していた。12の接触点のコンセンサス配列は次のとおりであった:緑膿菌が含まれていなかった場合はQHXXXQTEREHであり、緑膿菌が比較に含まれている場合はQHXXXXERXXであった。
【０１０３】
本発明の趣旨および特徴についての理解を容易にするため、様々な例示の実施形態を本明細書に記載している。例示的な実施形態を詳細に説明しているが、他の実施形態が考えられることを理解されたい。したがって、本発明また添付の特許請求の範囲のいずれも、本明細書の特定の実施例もしくは実施形態に、または前述の説明に記載したか図面に提示した成分の構造および配置の詳細にその範囲が限定されるものではない。本発明は他の実施形態が可能であり、様々な方法で実行、実施され、請求され得る。
参考文献
【０１０４】
本明細書には以下の参考文献が引用されている。特に参照したすべての特許および特許出願を含む、引用の参考文献はすべて、参照によりその全体を本明細書に組み込むものとする。
(参考文献)
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ−ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１５】
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【図２Ａ】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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