(57)【要約】  本発明は、ユーグレナ属に属する新規な微細藻類の株に関し、当該株は、脂質、特にＥＰＡ及び／又はＡＲＡを、混合栄養モード下で高収量で取得することを可能とする。また、本発明は、そのような株を、可変的な及び／又は不連続な光源、特にフラッシュ照明を使用して、選択及び培養する方法にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）強度が変化し、その振幅は５〜１，０００であり、変化が１時間につき２〜３，６００回起こる、不連続な照明および／または時間変化する照明の条件下にて混合栄養モードでユーグレナ属の１つ以上の株を培養するステップを含む方法。
【請求項２】
前記照明の強度が変化し、その振幅は５マイクロモル／ｍ２秒〜４００マイクロモル／ｍ２秒であり、前記変化が１時間につき２〜２００回起こることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微細藻類がユーグレナ・グラシリス種に由来することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記培養を５ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは５０ｍＭ〜８００ｍＭ、より好ましくは７０ｍＭ〜６００ｍＭ、より一層好ましくは１００ｍＭ〜５００ｍＭの濃度の炭素含有基質の存在下で実施し、その有機炭素含有基質の選択を、デンプン、乳酸塩、ラクトース、蔗糖、酢酸塩、グリセロール、グルコース、セルロース誘導体、これら分子の混合物の中から行なうことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
培地の中に存在する前記有機炭素含有基質が少なくとも５ｍＭのグルコースを含むことを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記強度変化の振幅が３０〜４００マイクロモル／ｍ２秒、好ましくは７０〜３００マイクロモル／ｍ２秒、より好ましくは１００〜２００マイクロモル／ｍ２秒であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記照明がフラッシュの形態であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
フラッシュの持続時間が１／１０秒間〜１０分間、好ましくは５秒間〜１０分間、より好ましくは１０秒間〜２分間、より一層好ましくは２０秒間〜１分間であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
フラッシュの数が、１時間につき５〜３，６００回、好ましくは１０〜１５０回、より好ましくは１５〜１００回、より一層好ましくは２０〜５０回であることを特徴とする、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
１時間あたりの全光照射量が、フォトンのマイクロモル数を単位として２，０００〜６００，０００マイクロモル／ｍ２、好ましくは２，０００〜２００，０００マイクロモル／ｍ２であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ｂ）培地内の有機炭素含有基質の存在下で数世代にわたって前記培養物を維持するステップと、必要に応じて
ｃ）このように培養した微細藻類を回収するステップと、必要に応じて
ｄ）その微細藻類から脂質を回収するステップと、必要に応じて
ｅ）回収したその脂質からエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）および／またはアラキドン酸（ＡＲＡ）を抽出するステップ
をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法によって得ることができるユーグレナ・グラシリス種の微細藻類。
【請求項１３】
全脂質の中に、全脂質に対して１０％超、好ましくは２５％超、より好ましくは４０％超のＥＰＡおよび／またはＡＲＡが含まれることを特徴とする、請求項１２に記載のユーグレナ・グラシリス種の微細藻類。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ユーグレナ属、特にユーグレナ・グラシリス種の微細藻類を混合栄養モードで特に不連続な照明および／または変化する照明の存在下にて培養する方法に関する。この方法により、バイオマスを高収率にすることと、このようにして培養された微細藻類の脂質、より具体的にはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）および／またはアラキドン酸（ＡＲＡ）を豊富にすることが可能になる。例えばこの方法により、混合栄養性であって、脂質、より具体的には多不飽和脂肪酸の収率が高いユーグレナ・グラシリスの株を選択することができる。本発明は、ユーグレナ・グラシリス種に属する微細藻類の株のうちで特に脂肪酸の産生に適した新規な株にも関する。ユーグレナ・グラシリスのこの新規な株は、混合栄養モードでのＥＰＡ（エイコサペンタエン酸）とアラキドン酸（ＡＲＡ）の産生に有用である。
【背景技術】
【０００２】
微細藻類は、独立栄養性の光合成微生物、すなわち光合成によって自律的に増殖する傾向を有する光合成微生物である。
【０００３】
微細藻類は、海水環境や、淡水または塩水のほか、さまざまな地上環境でも増殖する。
【０００４】
淡水または海洋で見つかる微細藻類の大半の種は、一般に、独立栄養性である、すなわち光合成によってしか増殖することができない。それらの種にとって、環境中に炭素含有基質または有機材料が存在することは有利ではなく、増殖を向上させることはない。
【０００５】
しかし科と起源が非常に多彩な微細藻類のいくつかの種は、厳密には独立栄養性ではないことがわかっている。例えばそのうちの従属栄養性と呼ばれるいくつかは、光がまったくない状態で、発酵によって、すなわち有機材料を利用して増殖することができる。
【０００６】
増殖する上で光合成が不可欠な微細藻類の他の種は、光合成と、環境中に存在する有機材料の両方を利用することができる。混合栄養性と呼ばれるこれらの中間種は、光と有機材料の両方が存在する状態で培養することができる。
【０００７】
“混合栄養性”と呼ばれる藻類のこの特徴は代謝と結び付いていて、その代謝によってこの藻類が光合成と発酵を同時に実行することが可能になっているように思われる。これら２種類の代謝は、藻類の増殖に対するプラスの全体的効果と共存している［Ｙａｎｇ，  Ｃ．他（２０００年）；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｊｏｕｒｎａｌ、第６巻：８７〜１０２ページ］。
【０００８】
現在、微細藻類は多くの工業的プロジェクトの対象となっている。なぜならいくつかの種は、大量の脂質、特に多不飽和脂肪酸を蓄積または分泌することができるからである。
【０００９】
これら多不飽和脂肪酸のうちで、オメガ−３シリーズ（ＰＵＦＡ−ω３）からのいくつかの非常に不飽和な脂肪酸、特にエイコサペンタエン酸（ＥＰＡまたはＣ２０：５ω３）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡまたはＣ２２：６  ω３）と、オメガ−６シリーズ（ＰＵＦＡ−ω３）からのいくつかの非常に不飽和な脂肪酸、特にアラキドン酸（ＡＡまたはＡＲＡ、またはエイコサテトラエン酸Ｃ２０：４  ω６）が、栄養学的に重要であると認識されていて、治療の用途で大きな可能性がある。
【００１０】
現在のところ、水産業からの魚油が、市場においてこのようなタイプの脂肪酸の主な供給源になっている。しかしこれらの油には新たな用途（養殖における食品サプリメント、マーガリンへの組み込み）があるにもかかわらず、活発な漁獲活動が理由で海の漁獲資源が少なくなりつつある。
【００１１】
したがって、これらのタイプの多不飽和脂肪酸に対する将来における要求の増大に対処するため、ＥＰＡやＡＲＡといった脂肪酸の新たな供給源を探す必要がある。
【００１２】
微細藻類は、脂肪酸を新たに合成できることに加え、魚油と比べていくつかの利点を有する。微細藻類は、インビトロで制御された条件下において培養できるため、バイオマスを比較的一定の生化学的組成で産生することが可能であることに加え、魚油とは違って不快な臭いがなく、脂質にコレステロールがほとんど含まれないか、まったく含まれていない。
【００１３】
最後に、微細藻類によって産生される脂質は、魚油よりも脂肪酸のプロファイルが簡単であるため、興味の対象である脂肪酸を分離する工程の数が限られる。
【００１４】
現在のところ、藻類の分類は、主に、形態的基準と、細胞に含まれる光合成色素の性質とに相変わらず基づいている。そのため、藻類は種と形態が非常に多彩であるにもかかわらず、この分類では、藻類の種が、独立栄養性、従属栄養性、混合栄養性のどれであるかがほとんどわからない［Ｄｕｂｉｎｓｋｙ他（２０１０年）；Ｈｉｄｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ、第６３９巻：１５３〜１７１ページ］。真核性藻類の分類には１４の門が含まれる。脂肪酸を産生するこれらの門を構成するさまざまな綱の種の間で、微細藻類に含まれる多不飽和脂肪酸の含量が大きく異なっている。さらに、脂質プロファイル中の脂質、特にＥＰＡとＡＲＡの相対的な比率は、種と培養条件によって異なる。
【００１５】
ＥＰＡとＡＲＡを産生する興味の対象となる主な微細藻類は海洋種である。しかし何十万もの海洋性微細藻類の種のうちで、少数のものだけが、これら２種類の脂肪酸の両方を多く含むとともに、インビトロで培養するのに十分な能力を有する。興味の対象となる種は、海洋植物プランクトンからの珪藻綱（または珪藻植物）である。これらの種は、ＥＰＡの産生が活発であることを特徴とする。
【００１６】
淡水性微細藻類はα−リノレン酸（Ｃ１８：３  ω３）が豊富だが、一般にＥＰＡは含んでいない［Ｐｅｎｃｒｅａｃ’ｈ他（２００４年）「海洋性微細藻類：ＥＰＡとＤＨＡの代替供給源」、Ｌｉｐｉｄｅｓ、第１１巻（２）：１１８〜２２２ページ］。
【００１７】
それとは逆に、海洋性藻類がＡＲＡを産生することは非常に稀である。そのような微細藻類の非限定的なとして、ユーグレナ藻（例えばユーグレナ）、紅藻類（例えばチノリモ）、緑色植物（例えばパリエトクロリス）がある。
【００１８】
淡水性微細藻類のいくつかの株は、アラキドン酸を合成して蓄積することができる。特に、日本国の立山で単離された藻類である緑色植物パリエトクロリス・インシサのトリグリセリドは、自然の状態でアラキドン酸が豊富である。ＡＲＡは、主に、脂質の主要なクラスを構成するトリグリセリドの形で存在している［Ｂｉｇｏｇｎｏ  Ｃ．他（２００２年）；「油性緑藻パリエトクロリス・インシサの脂質と脂肪酸の組成」、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第６０巻（５）：４９７〜５０３ページ］。
【００１９】
微細藻類による脂肪酸の産生を工業的スケールで実現するには、複数の因子を考慮する必要がある。例えば培養は、株、温度、光の条件、発酵装置のサイズに応じ、独立栄養条件、混合栄養条件、従属栄養条件のいずれかで実施することができる。培養は、例えば１リットルの容器の中で、実験室で、光バイオリアクターの中で、１００，０００リットルの容器の中で実施することや、開放された（数ヘクタールの）池の中で実施することもできる。しかし理想的な培養条件を開発するには、エネルギーのコストやそれ以外の資源（例えば労力、培養状態の監視の容易さ）を考慮する必要がある。
【００２０】
いずれにせよ、微細藻類は、産生する脂肪酸の収率増大にとって最適な条件で培養することが望ましい。したがってできるだけ大きな収率が得られることが好ましい（例えば乾燥材料が３０ｇ／ｌを超えるバイオマスと、乾燥材料に対して１５重量％超の脂肪酸）。
【００２１】
国際特許出願ＷＯ  ０３／０７９８１０には、パリエトクロリス・インシサを培養し、動物の食料となるＡＲＡを産生させることが開示されている。この培養は、独立栄養条件下で実施され、ＡＲＡの収率は、これら細胞の重量に対して少なくとも１０重量％のＡＲＡであった。
【００２２】
また、日本国の特開平９−２５２７６４と特開昭６０−０８７７９８には、独立栄養モードで培養したモノドゥス・スブテラネウスの株が記載されている。これらの株は、乾燥重量の３．８％までの量でＥＰＡを蓄積することができる。これらの株は、連続的光源を備えていて体積が小さいフラスコまたはバイオリアクターの中で、実験室の条件、すなわち無機培地の中で培養された。
【００２３】
工業的生産の観点からすると、このような培養方法は不安定であることがわかっている。実際、収益性があるためには、バイオマスの産生を大きな閉鎖式の光バイオリアクターの中で実施できる必要がある。現在のところ、このような培養法を独立栄養モードで実現することは難しい。なぜなら、細胞が反応装置の外部からの光を捕獲することがますます難しくなるからである。したがって培地を激しく撹拌する必要があるが、そのためには大きなエネルギーが必要とされる。
【００２４】
工業的なより効率的かつより収益性のよい生産のためには、ＥＰＡとＡＲＡの収率をより大きくできることが望ましかろう。
【００２５】
ユーグレナは、鞭毛虫類の一般的な１つの属であり、移動にユーグルナ運動と呼ばれる運動中の特徴的な形態を与える堅固な壁を持たないユーグレナ藻の科の一部を形成している。ユーグレナは葉緑体を失うことができ、鞭毛虫類とあまり違わない従属栄養性で脱色素の個体を生み出す。ユーグレナは、スティグマ、すなわち光受容体の役割を果たしていてこの微生物が泳げるようにするオレンジ色の印を有する。ユーグレナには常に鞭毛が存在している。ユーグレナの代謝は多彩である。ユーグレナは、光の存在下では独立栄養性であり、光の不在下または葉緑体を喪失した後には従属栄養性になり、特に乳酸塩を代謝することができる［Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒ，  Ｈｕｂｅｒｔ  Ａ．（１９７７年）；「真菌、藻類、原生生物、ウイルス」、『微生物学のＣＲＣハンドブック』、第２版、第ＩＩ巻、８７４ページ、フロリダ、ラスキン、アレンＩ］。
【００２６】
学術論文「酸性条件でのユーグレナ・グラシリスの混合栄養培養におけるバイオマスの産生と、その増殖のエネルギー論」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、第２３巻、第１５号、１２２３〜１２２８ページにおいて、混合栄養条件で（連続光を用いて）培養したユーグレナ・グラシリスで得られたバイオマスの収率は、従属栄養条件での培養で得られた収率よりも１５〜１９％大きいことが証明された。さらに、３９．４ｇ／ｌという高レベルのクロロフィルと１３．８ｍｇ／ｌのカロテノイドが、混合栄養培養で得られた。
【００２７】
Ｈａｙａｓｈｉ  Ｍ．らの学術論文「ユーグレナの不飽和脂肪酸の富化」、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第５７巻、第２号、１９９３年１月１日、３５２〜３５３ページには、ユーグレナ・グラシリス種の微細藻類のＥＰＡの富化が記載されている。この微細藻類は、培地に０〜１％のＥＰＡまたはＤＨＡを添加した従属栄養条件で培養される。全脂質に対するＥＰＡのレベルが７５．６％の微細藻類を得るには、培地に０．５％のＥＰＡを添加する必要があった。これは高価な工程であり、工業的生産にとってコスト効率がよくない。
【発明の概要】
【００２８】
そこで出願人は、通常ではない光条件下での多数の実験と、さまざまな基質の添加により、混合栄養モードで培養できるユーグレナ・グラシリス種の微細藻類の株を単離することで、本発明の条件下における多不飽和脂肪酸、特にＥＰＡとＡＲＡの高収率での産生を可能にした。
【００２９】
このようにして単離されて選択されたユーグレナ・グラシリスの新規な株である１つの株（ＦＣＣ  ５４０）が、ブダペスト条約の規定に従ってＣＣＡＰ（藻類と原生生物の培養コレクション、スコットランド海洋科学協会、ダンスタッフネージ海洋研究所、オーバン、アルギル  ＰＡ３７１ＱＡ、スコットランド、イギリス国）に登録番号ＣＣＡＰ  １２２４／４９として寄託された。
【００３０】
培養と選択の方法は、より具体的には、光の強度と周波数がある範囲で特定の変化をする、変化する照明および／または不連続な照明（特にフラッシュの形態の照明）の存在下で微細藻類を有機炭素含有基質とともに混合栄養条件下で培養するというものであった。
【００３１】
微細藻類にとってストレスとなると一般に考えられる明相と暗相（または光の強度がより小さい相）の頻繁な交代により、驚くべきことに、ユーグレナ・グラシリスの株で、バイオマスと脂質と多不飽和脂肪酸の産生、その中でも特に多不飽和脂肪酸の産生を増大させることができた。本発明による株を用いることで、光の照射を少なくして多不飽和脂肪酸（特にＥＰＡとＡＲＡ）を発酵装置の中で工業的に産生させる展望が開け、したがって独立栄養モードでの培養と比べてエネルギーを節約することができるはずである。
【００３２】
本発明のさまざまな側面と利点を以下に詳細に記載する。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
したがって本発明は、ユーグレナ属、特にユーグレナ・グラシリス種の微細藻類を、不連続な照明および／または時間変化する照明の条件にて、混合栄養モードで培養する方法に関する。照明は強度が変化し、その振幅は一般に５マイクロモル／ｍ２秒〜１，０００マイクロモル／ｍ２秒だが、３０〜４００マイクロモル／ｍ２秒であることが好ましい。この変化は、一般に１時間につき２〜３，６００回にできるが、１時間につき２〜２００回であることが好ましい。これらの培養条件により、規定量の光を照射することができる。光のこの照射は、不連続な照明の段階および／または変化する照明の段階を含むことができ、強度の変化は、振幅が同じでも異なっていてもよい。照射は、特にフラッシュの形態で行なうことができる。
【００３４】
この方法の利点は、培養で得られるバイオマスの収率が増大することである。別の利点は、このようにして培養した微細藻類の多不飽和脂肪酸、より具体的にはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）および／またはアラキドン酸（ＡＲＡ）が豊富になることである。この方法は、混合栄養性で多不飽和脂肪酸、特にＥＰＡ（エイコサペンタエン酸）および／またはＡＲＡ（アラキドン酸）の収率が高いユーグレナ属の株、特にユーグレナ・グラシリス種の株を選択するのにも利用できる。
【００３５】
この微細藻類の混合栄養モードでの培養は、照明条件がどのようであれ、５ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは５０ｍＭ〜８００ｍＭ、より好ましくは７０ｍＭ〜６００ｍＭ、より一層好ましくは１００ｍＭ〜５００ｍＭの有機炭素含有基質の存在下でなされることが好ましい。細胞が高濃度の脂質を蓄積できるよう、基質は培養中を通じて連続的に添加される。培養中に追加の基質を培地に添加して一定の濃度を維持する。この有機炭素含有基質は、グルコース、および／またはセルロースの誘導体、および／または乳酸塩、および／またはデンプン、および／またはラクトース、および／または蔗糖、および／または酢酸塩、および／またはグリセロールを純粋な形態または混合物の形態で含んでいることが好ましい。
【００３６】
培地に含まれる有機炭素含有基質は、複合分子または基質混合物で構成することができる。例えばトウモロコシ、コムギ、ジャガイモに由来するデンプンの生体内変化による産物、特にデンプンのサイズが小さな分子からなる加水分解産物は、例えば、本発明に従って微細藻類を混合栄養モードで培養するのに適した炭素含有基質である。
【００３７】
この方法は、より具体的には、ユーグレナ属の微細藻類（門：ユーグレナ植物、目：ミドリムシ、科：ミドリムシ）［生命のＩＴＩＳカタログ、２０１０年］の株のうちで、混合栄養性であって、有機炭素含有基質を添加した無機培地、例えばユーグレナ培地［Ａｎｄｅｒｓｅｎ，  Ｒ．Ａ．；Ｊａｃｏｂｓｏｎ，  Ｄ．Ｍ．；Ｓｅｘｔｏｎ，  Ｊ．Ｐ．（１９９１年）−  海洋植物プランクトン培養のためのプロヴァソリ−ギラード・センター、株のカタログ、９８ページ、ウエスト・ブースベイ・ハーバー、メーン州、アメリカ合衆国］の中で特に１０μＥを超える光を照射して培養できる株を選択するためのものである。有機炭素含有基質は、グルコースおよび／または乳酸塩を５ｍＭ以上の濃度で含んでいることが好ましい。
【００３８】
ユーグレナ、より具体的にはユーグレナ・グラシリスのこの新規な株は、以下に記載する本発明の方法による選択と培養の方法によって単離し、選択することができる。
【００３９】
本発明によるユーグレナ・グラシリス株の代表的な１つの株は、出願人が単離したＦＣＣ  ５４０株であり、ＣＣＡＰに登録番号ＣＣＡＰ  １２２４／４９として寄託された。このような株は、本発明によれば、変化する光または不連続な光を照射して混合栄養モードで培養するとき、大量のバイオマスと脂質（より具体的にはＥＰＡとＡＲＡ）を産生することができる。
【００４０】
現在進行中の分類分析によれば、ＣＣＡＰ  １２２４／４９株は、ユーグレナ・グラシリス種に属する。本発明は、本願に記載したような混合栄養培養条件で増殖できて脂肪酸（例えばＥＰＡとＡＲＡ）の産生が可能なユーグレナ・グラシリス種のあらゆる株に関する。本発明は、本願に記載したような混合栄養培養条件で増殖できて脂肪酸（例えばＥＰＡとＡＲＡ）の産生が可能なユーグレナ属の微細藻類のあらゆる種にも関する。
【００４１】
本発明によって単離されたユーグレナ・グラシリス株により、混合栄養条件下で、大量のバイオマスと、ＥＰＡおよび／またはＡＲＡが豊富な脂質を産生させることができる。なおそのＥＰＡおよび／またはＡＲＡは、微細藻類に含まれる全脂質の１０％超、または２５％超、または４０％超を占めることができる。
【００４２】
本発明では、出願人が単離したＦＣＣ  ５４０株を用い、変化する照明および／または不連続な照明（特にフラッシュの形態の照明）の存在下にて混合栄養条件で培養することによって得られたバイオマスは、従属栄養モードで同じ株を培養した場合よりも１０〜６０％、より一般には２０〜５０％多い。従属栄養モードとは、照明がないことを除いて同じ培養条件を意味する。
【００４３】
したがって本発明は、ユーグレナ属、特にユーグレナ・グラシリス種の微細藻類を、時間変化する照明および／または不連続な照明（例えばフラッシュの形態の照明）の存在下にて混合栄養モードで培養し、多不飽和脂肪酸（例えばＥＰＡとＡＲＡ）を産生させる方法に関する。
【００４４】
したがって本発明は、混合栄養性であって多不飽和脂肪酸（例えばＥＰＡとＡＲＡ）の収率が大きいユーグレナ属、特にユーグレナ・グラシリス種の微細藻類を、時間とともに変化する照明および／または不連続な照明の存在下で選択する方法に関する。
【００４５】
特に混合栄養モードで培養するときに培養物に変化する照明および／または不連続な照明を照射すると、藻類の増殖に好ましい影響があり、特に脂質の産生に関して藻類の生産性を増大させうることがわかった。
【００４６】
発明者は、理論に囚われることなく、不連続な光および／または変化する光を微細藻類に照射すると、増殖と脂質合成にとって有利な“ストレス”を生じさせることができると考えている。この現象は、自然界において微細藻類は環境の制約に対抗するため予備の脂質を蓄積する傾向を有するという事実によって一部が説明できよう。
【００４７】
不連続な照明とは、複数の暗い期間によって区切られた照明を意味する。暗い期間は、１／４の時間、好ましくは半分以上の時間存在することができ、その間に藻類が培養される。
【００４８】
本発明の好ましい一実施態様によれば、照明は不連続であり、フラッシュの形態であることがより好ましい。フラッシュは、本発明の意味では、短時間の照明、すなわち３０分未満の照明である。フラッシュの持続時間は１５分未満が可能であり、５分未満が好ましく、１分未満がさらに好ましい。本発明のいくつかの実施態様によれば、フラッシュの持続時間は、１秒未満にすることができる。フラッシュの持続時間は、例えば１／１０秒、２／１０秒、３／１０秒、４／１０秒、５／１０秒、６／１０秒、７／１０秒、８／１０秒、９／１０秒のいずれかが可能である。光の照射またはフラッシュは、一般に１５秒よりも長い期間にわたる。フラッシュの持続時間は一般に５秒間〜１０分間だが、１０秒間〜２分間が好ましく、２０秒間〜１分間がより好ましい。
【００４９】
一般に、フラッシュの数は１時間につき約２〜３６００回である。この数は、例えば１時間につき１００〜３６００回にすることができる。この数は、１時間につき１２０〜３０００回、または４００〜２５００回、さらには６００〜２０００回、または８００〜１５００回にすることもできる。この数は、１時間につき２〜２００回にすることもできるが、１０〜１５０回が好ましく、１５〜１００回がより好ましく、２０〜５０回がさらに好ましい。フラッシュは、定期的な時間間隔で発生させること、または不定期な時間間隔で発生させることができる。定期的な時間間隔での発生の場合、１時間あたりのフラッシュの数は、時間間隔（Ｔ）を持つ頻度（Ｆ）に対応し、Ｆ＝１／Ｔになると考えられる。この時間間隔は１秒〜３０分、または１秒〜３６秒、または１．２秒〜３０秒、または１．４４秒〜９秒、または１．８秒〜６秒、または２．４秒〜４．５秒にすることができる。この時間間隔は１８秒〜３０分にすることもできるが、２４秒〜６分が好ましく、３６秒〜４分がより好ましく、７２秒〜３分がさらに好ましい。１時間あたりのフラッシュの数は、フラッシュの強度と持続時間の関数として選択される（下記参照）。一般に、フラッシュの形態で照射する光の強度は５〜１０００マイクロモル／ｍ２秒だが、５〜５００マイクロモル／ｍ２秒または５０〜４００マイクロモル／ｍ２秒が好ましく、１５０〜３００マイクロモル／ｍ２秒がより好ましい。定義により、１マイクロモル／ｍ２秒は、文献でしばしば用いられる単位である１μＥ／ｍ２秒に対応する（アインシュタイン）。
【００５０】
本発明の特別な一実施態様によれば、光の強度は５０〜２００マイクロモル／ｍ２秒であり、フラッシュの時間間隔は、フラッシュの持続時間が１秒間〜１分間だと１０秒〜６０分である。
【００５１】
本発明の別の一実施態様によれば、照明は変化させることができる。これは、照射が暗相によって中断されることはないが、光の強度が時間とともに変化することを意味する。光の強度のこの変化は規則的であり、周期的または循環式にすることができる。本発明によれば、連続した照明の段階と不連続な照明の段階を組み合わせた光照射にすることもできる。
【００５２】
本発明によれば、どのような照明条件であれ、培養している藻類に対する光の強度（１秒あたり、１平方メートルあたりのフォトンのマイクロモル数（マイクロモル／ｍ２秒）を単位として表示）が、１時間のうちに少なくとも１回は変化する。光の強度のこの変化の振幅は、一般に、５〜１，０００、または５０〜８００、または１００〜６００マイクロモル／ｍ２秒である。光の強度は、５〜４００マイクロモル／ｍ２秒で変化させることもできる。光の強度変化の振幅は７０〜３００マイクロモル／ｍ２秒が好ましく、１００〜２００マイクロモル／ｍ２秒がより好ましい。
【００５３】
光のこの強度は、変化する照明という条件では、１時間に数回、順番に、例えば５０と１００マイクロモル／ｍ２秒に、または５と４００マイクロモル／ｍ２秒に、または５０と８００マイクロモル／ｍ２秒にすることができる。光のこの強度は、順番に５０と２００マイクロモル／ｍ２秒にできることが好ましい。あるいは不連続な照明という条件では、光のこの強度は、１時間に数回、順番に、例えば０と５０マイクロモル／ｍ２秒に、または０と１００マイクロモル／ｍ２秒にすることができるが、順番に０と２００マイクロモル／ｍ２秒にできることがさらに好ましい。光のこの強度は、１時間に数回、順番に、例えば０と３００マイクロモル／ｍ２秒に、または０と６００マイクロモル／ｍ２秒に、または０と８００マイクロモル／ｍ２秒に、または０と１，０００マイクロモル／ｍ２秒にすることもできる。
【００５４】
本発明の一実施態様によれば、どのような照明条件であれ、培養している藻類に対する光の強度は、細胞密度の関数として変化する。細胞がより密になるほど、光を強くすることができる。細胞密度は１ｍｌあたりの細胞の数であり、当業者に知られている技術に従って測定される。
【００５５】
培養の初期段階において細胞密度が約１０５〜５×１０５細胞／ｍｌであるとき、光の強度を５〜１５マイクロモル／ｍ２秒、好ましくは５〜１０マイクロモル／ｍ２秒にすることができる。培養物が１０６〜１０７細胞／ｍｌに到達すると、光の強度を例えば１５〜２００マイクロモル／ｍ２秒まで大きくできるが、２０〜５０マイクロモル／ｍ２秒まで大きくすることが好ましい。培養物が最終段階で１０７〜１０８細胞／ｍｌの密度に到達すると、光の強度を例えば５０〜４００マイクロモル／ｍ２秒まで大きくできるが、５０〜１５０マイクロモル／ｍ２秒まで大きくすることが好ましい。
【００５６】
本発明のいくつかの実施態様によれば、フラッシュの持続時間が例えば１分未満または１秒未満であるとき、光の強度は上記の値よりも大きくすることができる。培養の初期段階において細胞の密度が１０５〜５×１０５細胞／ｍｌであるとき、光の強度を５〜２００マイクロモル／ｍ２秒、好ましくは５〜１００マイクロモル／ｍ２秒にすることができる。培養物が１０６〜１０７細胞／ｍｌに到達すると、光の強度を例えば３０〜５００マイクロモル／ｍ２秒まで大きくできるが、５０〜４００マイクロモル／ｍ２秒まで大きくすることが好ましい。培養物が最終段階で１０７〜１０８細胞／ｍｌの密度に到達すると、光の強度を例えば１００〜１，０００マイクロモル／ｍ２秒まで大きくできるが、２００〜５００マイクロモル／ｍ２秒まで大きくすることが好ましい。
【００５７】
本発明の一実施態様によれば、１時間に培養物に照射する光の量は所定の値に留まる。この量は、約２，０００〜６００，０００、好ましくは２，０００〜３００，０００マイクロモル／ｍ２である。この量は、１時間あたり約４，０００〜２００，０００マイクロモル／ｍ２にすることができる。
【００５８】
本発明の一実施態様によれば、培養物にフラッシュを１時間に３０回照射する。各フラッシュは持続時間が３０秒間であり、強度は１０マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が９，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。本発明の別の一実施態様によれば、培養物にフラッシュを１時間に２０回照射する。各フラッシュは持続時間が３０秒間であり、強度は２０マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が１２，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。本発明の別の一実施態様によれば、培養物にフラッシュを１時間に４５回照射する。各フラッシュは持続時間が１５秒間であり、強度は５マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が３，３７５マイクロモル／ｍ２であることを意味する。本発明の別の一実施態様によれば、培養物にフラッシュを１時間に１２０回照射する。各フラッシュは持続時間が１０秒間であり、強度は２００マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が２４０，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。
【００５９】
光の強度に関して上に説明したように、本発明の一実施態様によれば、培養物に照射する光の量は、細胞密度の関数として変化させることができる。培養の初期段階において細胞密度が約１０５〜５×１０５細胞／ｍｌであるとき、１時間あたりの光の全照射量は、一般に約１５００〜８０００マイクロモル／ｍ２だが、１５００〜６０００マイクロモル／ｍ２であることが好ましく、２０００〜５０００マイクロモル／ｍ２であることがさらに好ましい。培養物が１０６〜１０７細胞／ｍｌに到達すると、１時間あたりの光の全照射量を６０００〜６７，０００マイクロモル／ｍ２まで増大させることができるが、例えば６０００〜５０，０００マイクロモル／ｍ２まで増大させることが好ましく、１２，０００〜４５，０００マイクロモル／ｍ２まで増大させることがさらに好ましい。培養物が最終段階で１０７〜１０８細胞／ｍｌの密度に到達すると、１時間あたりの光の全照射量を例えば４５，０００〜３００，０００マイクロモル／ｍ２まで増大させることができるが、例えば４５，０００〜２００，０００マイクロモル／ｍ２まで増大させることが好ましく５０，０００〜１５０，０００マイクロモル／ｍ２まで増大させることがさらに好ましい。
【００６０】
本発明の一実施態様によれば、培養の初期段階において（細胞密度が約１０５〜５×１０５細胞／ｍｌ）、培養物にフラッシュを１時間に３０回照射する。各フラッシュは持続時間が３０秒間であり、強度は５〜１０マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が２２５０マイクロモル／ｍ２〜４５００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。次に、中間段階（細胞密度が１０６〜１０７細胞／ｍｌ）において、培養物にフラッシュを１時間に３０回照射する。各フラッシュは持続時間が３０秒間であり、強度は１５〜５０マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が１３，５００〜４５，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。次に培養物の最終段階（細胞密度が１０７〜１０８細胞／ｍｌ）において、培養物にフラッシュを１時間に３０回照射する。各フラッシュは持続時間が３０秒間であり、強度は５０〜１５０マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が４５，０００〜１３５，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。
【００６１】
本発明の一実施態様によれば、例えばフラッシュの持続時間が１分間未満または１秒間未満のとき、培養の初期段階において（細胞密度が約１０５〜５×１０５細胞／ｍｌ）、培養物にフラッシュを１時間に３０回照射する。各フラッシュは持続時間が１０秒間であり、強度は５０〜１００マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が１５，０００マイクロモル／ｍ２〜３０，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。次に、中間段階（細胞密度が１０６〜１０７細胞／ｍｌ）において、培養物にフラッシュを１時間に５０回照射する。各フラッシュは持続時間が１０秒間であり、強度は２００〜３００マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が１００，０００〜１５０，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。次に培養物の最終段階（細胞密度が１０７〜１０８細胞／ｍｌ）において、培養物にフラッシュを１時間に１２０回照射する。各フラッシュは持続時間が１０秒間であり、強度は３５０〜４５０マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が４２０，０００〜５４０，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。
【００６２】
培養物への光の照射は、発酵装置の外壁の周囲に配置した複数のランプによって実現できる。クロックが、これらのランプを決められた照射時間だけ稼働させる。発酵装置は、日光があたらない容器の中に位置している。その容器の周囲温度は制御できることが好ましい。
【００６３】
出願人が確認できたように、このようにして選択した株が混合栄養モードで不連続な光および／または変化する光の存在下においてうまく増殖できるという事実があるため、上記の株は多不飽和脂肪酸、特にＥＰＡとＡＲＡをより多く産生することができる。
【００６４】
したがって本発明の培養方法により、出願人が単離してＣＣＡＰにＣＣＡＰ  １２２４／４９という番号で寄託した株と同様、混合栄養性であって多不飽和脂肪酸の収率が高いユーグレナ属の特にユーグレナ・グラシリス種の株を選択することができる。この培養方法は、
ａ）強度が変化し、その変化の振幅は５〜１，０００マイクロモル／ｍ２秒、好ましくは５〜４００マイクロモル／ｍ２秒であり、その変化は１時間に２〜３，６００回、好ましくは５〜４００回である、不連続な照明および／または時間変化する照明という条件下でユーグレナ属の１種類以上の株を混合栄養モードで培養するステップと、
ｂ）培地の中で有機炭素含有基質の存在下にてこの培養物を数世代にわたって維持するステップと、必要に応じて
ｃ）このようにして培養した微細藻類を回収するステップ
を含むことを特徴とする。
【００６５】
“回収ステップ”とは、より具体的には、上記の継代の間に細胞の数が最も増加した株の単離を意味する。株を選択するため、ユーグレナ属の特にユーグレナ・グラシリス種のさまざまな株を同一の容器内の複数のマイクロプレート上で並列に培養し、そのさまざまな培養物の条件と変化をしっかりとモニタすることができる。したがってさまざまな株が、不連続な照明および／または変化する照明に対してと、場合によっては培地に添加した１種類または複数種類の炭素含有基質に対してどのように応答するかが容易にわかる。
【００６６】
不連続な照明および／または変化する照明と炭素含有基質の添加に対して好ましい応答をする株が、品質（脂質プロファイル中に多不飽和脂肪酸がより豊富に存在する）と量（脂質が、ＥＰＡとＡＲＡをより多い割合で含む）の面で脂質の産生に関して一般に最高の収率を提供する。
【００６７】
微細藻類は、発酵装置の中で不均一な集団から選択することができる。その集団から、本発明の選択法により、特定の範囲の光強度と特定の周波数を持つ不連続な光および／または変化する光を混合栄養という培養条件と組み合わせて有利な変異体を選択する。この場合、培養は、培養物の中で微細藻類を多くの世代にわたって維持しながら実施し、次いで培養が終わったとき、培地の中で過半を占めるようになった成分を単離する。
【００６８】
本発明の培養方法により、脂質も産生させることができる。
【００６９】
その場合、本発明の方法は、
ｄ）微細藻類から脂質を回収するステップと、必要に応じて
ｅ）回収した脂質からエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）および／またはアラキドン酸（ＡＲＡ）を抽出するステップ
をさらに含んでいる。
【００７０】
本発明の培養方法は、本発明の混合栄養条件において増殖できてＥＰＡおよび／またはＡＲＡの産生が可能なユーグレナ属のあらゆる種にも適用できる。
【００７１】
本発明の培養方法により、培養で得られるバイオマスの産生を最適化することができる。この方法により、このようにして培養された微細藻類の脂肪酸（特にエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）および／またはアラキドン酸（ＡＲＡ））を豊富にすることもできる。
【００７２】
したがって本発明は、上記の方法に従って培養または選択することが好ましい混合栄養性のユーグレナ属の微細藻類の培養を通じてバイオマスの産生と脂質（特に脂肪酸）の産生を最適化し、次いでこのようにして培養した微細藻類を回収してそこから脂質（特にＥＰＡおよび／またはＡＲＡ）を抽出することも目的とする。ユーグレナ・グラシリス種の株が特に関係する。
【００７３】
脂質（その中にＥＰＡとＡＲＡが含まれる）を選択的に抽出する方法は当業者に知られており、例えば［Ｂｌｉｇｈ，  Ｅ．Ｇ．とＤｙｅｒ，  Ｗ．Ｊ．（１９５９年）、「全脂質を抽出して精製する迅速な方法」、Ｃａｎ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、第３７巻：９１１〜９１７ページ］に記載されている。
【００７４】
本発明は、上記の本発明の方法に従って得ることのできるユーグレナ・グラシリス種の微細藻類にも関する。これら微細藻類は多不飽和脂肪酸が豊富である。このような微細藻類の全脂質には、一般に、その微細藻類に含まれる全脂質の１５％超または２０％超、しばしば３０％超、ときには４０％超のＥＰＡおよび／またはＡＲＡが含まれている。
【実施例１】
【００７５】
コンピュータで監視する専用の自動制御装置を備えた有効体積が２リットルの発酵装置（バイオリアクター）の中でユーグレナ・グラシリスＦＣＣ  ５４０を培養する。このシステムのｐＨは、塩基（１Ｎの水酸化ナトリウム溶液）および／または酸（１Ｎの硫酸溶液）を添加して調節する。培養温度は２２℃に設定する。ラッシュトンの配置（下方にポンピングする３枚刃のインペラ）に従ってシャフトに取り付けた２つの撹拌用ロータを利用して撹拌する。撹拌速度と換気量は、最小＝１００ｒｐｍ、最大＝２５０ｒｐｍ、Ｑ最小＝０．５ｖｖｍ、Ｑ最大＝２ｖｖｍにそれぞれ調節する。バイオリアクターには、透明な容器を取り囲む外部照射システムが取り付けられている。光の強度とサイクルは、コンピュータで監視する専用の自動制御装置によって制御する。
【００７６】
温度制御した容器（２２℃）内の撹拌台（１４０ｒｐｍ）の上で事前培養物を反応装置に接種し、８０〜１００μＥの光を照射した。事前培養とバイオリアクター内での培養は、ユーグレナ培地［Ｓｔａｒｒ，  Ｒ．Ｃ．とＺｅｉｋｕｓ，  Ｊ．Ａ．（１９９３年）−  ＵＴＥＸ  −  オースチンにあるテキサス大学の藻類培養物コレクション、Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｓｕｐｐｌ．、第２９巻］の中で実施する。バイオリアクター内で混合栄養培養に用いる有機炭素含有基質は、濃度が１００ｍＭ〜１５０ｍＭのグルコースである。
【００７７】
培養物のモニタ
【００７８】
乾燥重量を測定して全バイオマスの濃度をモニタする（ＧＦＣフィルタ（Ｗｈａｔｍａｎ社）で濾過し、次いで真空乾燥機の中で６５℃、−０．８バールにて少なくとも２４時間にわたって乾燥させた後、計量する）。
【００７９】
全脂質を定量するため、１０８細胞／ｍｌを抽出した。脂質の抽出法は当業者に知られている。
【００８０】
照明
【００８１】
培養物に１時間につき３０回のフラッシュを照射する。各フラッシュは持続時間が３０秒間であり、強度は８０マイクロモル／ｍ２秒である。
【００８２】
バイオリアクターの中での培養物に対する光の照射は、発光ダイオードの外壁の周囲に配置した複数のＬＥＤ（発光ダイオード）ランプによってなされた。クロックによって照射時間または照射パルスのためのＬＥＤを始動させる。
【００８３】
【表１】
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【国際調査報告】
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