(57)【要約】非対称人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を含む組成物及び方法が開示されている。非球体ａＡＰＣは、内在性細胞間相互作用をより厳密に模倣するので、抗原特異的免疫療法に用いることができる。
2015500296.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）細胞又は微生物の形状を模倣する非対称形状を有する３次元のマイクロ粒子又はナノ粒子、及び
（ｂ）Ｔ細胞の１つ又は複数のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と相互作用することができる１つ又は複数の分子
を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）。
【請求項２】
前記細胞又は微生物が、細菌、古細菌、原生動物、真菌、藻類及びウイルスからなる群から選択される、請求項１に記載のａＡＰＣ。
【請求項３】
前記細胞又は微生物が、スパイラル、立方体、棒、コンマ、星、正方形、柱、多面体、らせん、２０面体、円柱、４面体及びピラミッドからなる群から選択される形状を有する、請求項２に記載のａＡＰＣ。
【請求項４】
（ａ）非対称形状であって、（ａ）約１ｎｍから約１０ｎｍまで、（ｂ）約１１ｎｍから約１００ｎｍまで、（ｃ）約１０１ｎｍから約４００ｎｍまで、（ｄ）約４０１ｎｍから約１μｍまで、（ｅ）約１０μｍから約２０μｍまで、（ｆ）約２０μｍから約１００μｍまで、及び（ｇ）約１０１μｍから約１ｍｍまでの範囲のうちの１つから選択される少なくとも１つの軸に沿った曲率半径を有する少なくとも１つの表面を有する非対称形状を有する３次元のマイクロ粒子又はナノ粒子、及び
（ｂ）Ｔ細胞の１つ又は複数のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と相互作用することができる１つ又は複数の分子
を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）。
【請求項５】
（ａ）ｘ軸に沿った寸法（ａ）、ｙ軸に沿った寸法（ｂ）及びｚ軸に沿った寸法（ｃ）により定義される非対称形状であって、（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の少なくとも１つが少なくとも１つの他の寸法（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に等しくない非対称形状を有する３次元のマイクロ粒子又はナノ粒子、並びに
（ｂ）Ｔ細胞の１つ又は複数のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と相互作用することができる１つ又は複数の分子
を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）。
【請求項６】
前記３次元のマイクロ粒子又はナノ粒子が、
ｘ軸に沿った寸法（ａ）がｙ軸に沿った寸法（ｂ）より大きく、ｙ軸に沿った寸法（ｂ）がｚ軸に沿った寸法（ｃ）に等しい、方程式ａ＞ｂ＝ｃにより記述することができるような偏長楕円体、
ｘ軸に沿った寸法（ａ）がｙ軸に沿った寸法（ｂ）より大きく、ｙ軸に沿った寸法（ｂ）がｚ軸に沿った寸法（ｃ）より大きい、方程式ａ＞ｂ＞ｃにより記述することができるような３軸楕円体、及び
ｘ軸に沿った寸法（ａ）がｙ軸に沿った寸法（ｂ）に等しく、ｙ軸に沿った寸法（ｂ）がｚ軸に沿った寸法（ｃ）より大きい、方程式ａ＝ｂ＞ｃにより記述することができるような扁平楕円体
からなる群から選択される楕円体を構成する、請求項５に記載のａＡＰＣ。
【請求項７】
ｘ軸に沿った寸法（ａ）がｙ軸に沿った寸法（ｂ）に等しく、その両方がｚ軸に沿った寸法（ｃ）よりはるかに小さい、前記３次元のマイクロ粒子又はナノ粒子が棒を構成することができるような請求項５に記載のａＡＰＣ。
【請求項８】
前記３次元のマイクロ粒子又はナノ粒子が、以下の特性
（ｉ）１つ又は複数の分解性結合、
（ｉｉ）延伸性係数、並びに
（ｉｉｉ）前記３次元のマイクロ粒子又はナノ粒子を構成する材料が室温及び／又は体温で固体であるようなガラス転移温度
の１つ以上を有する材料を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
【請求項９】
前記分解性結合が、エステル結合、ジスルフィド結合、アミド結合、酸無水物結合及び酵素分解を受けやすい結合からなる群から選択される、請求項８に記載のａＡＰＣ。
【請求項１０】
前記マイクロ粒子又はナノ粒子が、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ベータ−アミノエステル）（ＰＢＡＥ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、ポリ−３−ヒドロキシブチラート（Ｐ３ＨＢ）及びポリ（ヒドロキシブチラート−ｃｏ−ヒドロキシバレラート）からなる群から選択される生分解性のポリマー又はポリマーの混合物を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
【請求項１１】
前記マイクロ粒子又はナノ粒子が、非分解性ポリマーと混合された生分解性のポリマー又はポリマーの混合物をさらに含む、請求項１０に記載のａＡＰＣ。
【請求項１２】
前記マイクロ粒子又はナノ粒子が、約１．１から約５までの範囲のアスペクト比を有する、請求項１から１１のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
【請求項１３】
Ｔ細胞上のＴＣＲ以外の受容体と相互作用することができる分子をさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
【請求項１４】
前記ＴＣＲと相互作用することができる分子がペプチドである、請求項１から７のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
【請求項１５】
前記ペプチドが、ＴＣＲと相互作用する前にＭＨＣ−Ｉｇ分子又はＨＬＡ：Ｉｇ分子上に負荷される、請求項１４に記載のａＡＰＣ。
【請求項１６】
前記Ｔ細胞上のＴＣＲ以外の受容体が、ＣＤ２８、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ４４、ＯＸ４０、４−１ＢＢＬ、ＩＣＡＭ−１及びＬＦＡ−１からなる群から選択される、請求項１３に記載のａＡＰＣ。
【請求項１７】
前記Ｔ細胞上のＴＣＲ以外の受容体がＣＤ２８である、請求項１６に記載のａＡＰＣ。
【請求項１８】
前記ＣＤ２８の受容体が抗ＣＤ２８抗体又はＢ７タンパク質と相互作用する、請求項１７に記載のａＡＰＣ。
【請求項１９】
薬物又は治療剤をさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
【請求項２０】
前記薬物又は治療剤がタンパク質である、請求項１９に記載のａＡＰＣ。
【請求項２１】
前記ａＡＰＣの１つ若しくは複数の表面上及び／又は前記ａＡＰＣ内に少なくとも１つのペプチド又はタンパク質をさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
【請求項２２】
請求項１に記載のａＡＰＣを含むキット。
【請求項２３】
Ｔ細胞を調節する方法であって、
（ａ）
（ｉ）ｘ軸に沿った寸法（ａ）、ｙ軸に沿った寸法（ｂ）及びｚ軸に沿った寸法（ｃ）により定義される非対称形状であって、（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の少なくとも１つが少なくとも１つの他の寸法（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に等しくない非対称形状を有する３次元のマイクロ粒子又はナノ粒子、並びに
（ｉｉ）Ｔ細胞の１つ又は複数のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と相互作用することができる１つ又は複数の分子、及び前記Ｔ細胞を共刺激するための前記Ｔ細胞上のＴＣＲ以外の受容体と相互作用することができる１つ又は複数の分子
を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を準備するステップと、
（ｂ）前記Ｔ細胞を前記ａＡＰＣと接触させるステップと、
（ｃ）前記Ｔ細胞が調節されることを可能にするステップと
を含む、方法。
【請求項２４】
前記ＴＣＲと相互作用することができる分子がペプチドである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ペプチドが、ＴＣＲと相互作用する前にＭＨＣ−Ｉｇ分子又はＨＬＡ：Ｉｇ分子上に負荷される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記Ｔ細胞上のＴＣＲ以外の受容体が、ＣＤ２８、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ４４、ＯＸ４０、４−１ＢＢＬ、ＩＣＡＭ−１及びＬＦＡ−１からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記Ｔ細胞上のＴＣＲ以外の受容体がＣＤ２８である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＣＤ２８の受容体が抗ＣＤ２８抗体又はＢ７タンパク質と相互作用する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏである、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記Ｔ細胞がナイーブＴ細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
前記Ｔ細胞の調節が前記Ｔ細胞の増殖をもたらす、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
前記接触させるステップが被験体において行われる、請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
前記被験体がヒトである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記被験体が非ヒト動物である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記接触させるステップが、疾患、障害又は機能不全を治療するのに十分な量の１又は複数用量のａＡＰＣを被験体に投与するステップを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記投与するステップが、経口摂取、注射、注入、局所投与、吸入、舌下吸収、直腸又は膣送達、皮下及びそれらの組合せによる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記疾患、障害又は機能不全が、癌又は感染性疾患である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
ｅｘ  ｖｉｖｏのの方法が、前記被験体から少なくとも１つのＴ細胞を除去するステップと、前記少なくとも１つのＴ細胞を少なくとも１つのａＡＰＣと接触させるステップと、前記Ｔ細胞を前記被験体に戻すステップとを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３９】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法が細胞培養において行われる、請求項２９に記載の方法。
【請求項４０】
ｘ軸に沿った寸法（ａ）、ｙ軸に沿った寸法（ｂ）及びｚ軸に沿った寸法（ｃ）により定義される非対称形状であって、（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の少なくとも１つが少なくとも１つの他の寸法（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に等しくない非対称形状を有する３次元のマイクロ粒子又はナノ粒子、並びにＴ細胞の１つ又は複数のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と相互作用することができる１つ又は複数の分子を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を調製する方法であって、
（ａ）複数のマイクロ粒子又はナノ粒子を準備又は調製するステップと、
（ｂ）前記複数のマイクロ粒子又はナノ粒子を含むフィルムを調製するステップと、
（ｃ）前記複数のマイクロ粒子又はナノ粒子を含むフィルムを延伸して、非対称形状を有する複数の３次元のマイクロ粒子又はナノ粒子を形成するステップと、
（ｄ）前記非対称形状を有する複数の３次元のマイクロ粒子又はナノ粒子を収集するステップと、
（ｅ）前記非対称形状を有する複数の３次元のマイクロ粒子又はナノ粒子に、Ｔ細胞の１つ又は複数のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と相互作用することができる１つ又は複数の分子を結合させるステップと
を含む、方法。
【請求項４１】
前記フィルムを、延伸される前に加熱する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記非対称形状を有する複数の３次元のマイクロ粒子又はナノ粒子を緩和させて部分的又は完全に球体又はほぼ球体の形状に戻す、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記非対称形状を有する複数の３次元のマイクロ粒子又はナノ粒子を加熱して、前記マイクロ粒子又はナノ粒子を、前記非対称の粒子の元の形状と類似した形状に緩和させるステップをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
フィルムを延伸するための装置であって、
フィルムの少なくとも２つの端を固定するように構成され、前記フィルムと接触する１つ又は複数の表面を含む少なくとも第１及び第２のブロックを含み、前記少なくとも第１及び第２のブロックは、互いに平行に、また少なくとも２つの平行ロッドと垂直に且つ操作上連通するように配置され、少なくとも前記第２のブロックは、前記第１のブロックに比べて選択的に前記少なくとも２つの平行ロッドに沿って位置決めされるように構成されており、
前記装置は、（ｉ）前記第２のブロックに取り付けられたコード及び（ｉｉ）前記コードに取り付けられたネジの１つ以上をさらに含み、それらのそれぞれが、前記第２のブロックを、前記第１のブロックに比べて選択的に前記少なくとも２つの平行ロッドに沿って位置決めするように構成されている、装置。
【請求項４５】
前記少なくとも２つの平行ロッドと操作上連通する１つ又は複数のクッシングをさらに含む、請求項４４に記載の装置。
【請求項４６】
前記第１及び第２のブロックが、前記フィルムの少なくとも２つの端を固定することを容易にするための少なくとも１つの模様面を含む、請求項４４に記載の装置。
【請求項４７】
前記少なくとも第１及び第２のブロックが、前記フィルムと接触する１つ又は複数の表面と操作上連通する１つ又は複数のゴムパッドをさらに含む、請求項４４に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体として本明細書に組み込まれている、２０１１年１２月９日に出願した米国仮出願第６１／５６８，７５１号の恩典を主張するものとする。
【背景技術】
【０００２】
幾何学的形態及び空間的構成は、多くの生体系における重要な要素である。幾何学的形態及び空間的構成の重要性は、Ｔ細胞の運命及びエフェクター機能の重要な決定因子である、Ｔ細胞と抗原提示細胞（ＡＰＣ）との相互作用時の状態を含む様々な状態で免疫系内に確認することができる。活性化により、樹状細胞（ＤＣ）のようなＡＰＣは、それらの全細胞表面積の著しい増加をもたらす、それらの細胞形態の大きな変化を示す。そのような細胞形態の変化は、ナイーブＴ細胞との相互作用を促進し、最終的にはＴ細胞の運命及び転帰に影響を及ぼす。Ｔ細胞の活性化は、「免疫シナプス」と呼ばれるＤＣとＴ細胞膜との間の密接な膜接触の大表面積の形成によってさらに調節される（Ｇｒａｋｏｕｉ  Ａ．ら、Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｙｎａｐｓｅ：  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍａｃｈｉｎｅ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８５巻、２２１〜２２７頁（１９９９）、Ｍｏｎｋｓ  Ｃ．Ｒ．ら、Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｃｌｕｓｔｅｒｓ  ｉｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ、Ｎａｔｕｒｅ、３９５巻、８２〜８６（１９９８）、Ｌｅｅ  Ｋ．Ｈ．ら、Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐｒｅｃｅｄｅｓ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｙｎａｐｓｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９５巻、１５３９〜１５４２頁（２００２））。したがって、幾何学的形態及び空間的構成を考慮に入れることは、生物学的反応を研究する際に重要である。
【０００３】
還元主義者のシステムも有効な免疫応答の研究を促進した。１つのそのようなシステムは、無細胞人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）の開発であった。これらのシステムは、Ｔ細胞の活性化に必要なタンパク質を粒子に結合させることにより調製された。最小限、Ｔ細胞の活性化には、細胞間の２組の受容体−受容体相互作用が必要である。第１の相互作用であるシグナル１は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）又は抗ＣＤ３などの代用物のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）への結合である。第２の相互作用であるシグナル２は、Ｂ７．１などのＡＰＣ上の共刺激受容体のＣＤ２８などのＴ細胞上のリガンドへの結合である。したがって、ａＡＰＣは、磁気マイクロ粒子（Ｏｅｌｋｅ  Ｍ．ら、Ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ＨＬＡ−Ｉｇ−ｃｏａｔｅｄ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、９巻、６１９〜６２５頁、ＰＭＩＤ：１２０７４３８５（２００３）、Ｕｇｅｌ  Ｓ．ら、Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｌｏｗ−ａｖｉｄｉｔｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６９巻、９３７６〜９３８４頁（２００９））、ポリスチレン粒子（Ｍｅｓｃｈｅｒ  Ｍ．Ｆ．、Ｓｕｒｆａｃｅ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４９巻、２４０２〜２４０５頁（１９９２））及びＰＬＧＡマイクロ粒子（Ｈａｎ  Ｈ．ら、Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  Ｆｌｕ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ、４１１巻、５３０〜５３５頁（２０１１）、Ｓｔｅｅｎｂｌｏｃｋ  Ｅ．Ｒ．ら、Ａｎ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｗｉｔｈ  ｐａｒａｃｒｉｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ＩＬ−２  ｉｍｐａｃｔｓ  ｔｈｅ  ｍａｇｎｉｔｕｄｅ  ａｎｄ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２８６巻、３４８８３〜３４８９２頁（２０１１）、Ｓｔｅｅｎｂｌｏｃｋ  Ｅ．Ｒ．及びＦａｈｍｙ  Ｔ．Ｍ．、Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ、１６巻、７６５〜７７２頁、ＰＭＩＤ：１８３３４９９０（２００８））を含む、一連の材料製のマイクロビーズ（図２ａ）の表面にシグナル１及びシグナル２を送るタンパク質を結合させることによって作製された。
【０００４】
そのようなシステムは、腫瘍免疫療法、ワクチン接種及び免疫抑制に広く適用されており、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏでのＴ細胞刺激に適し、免疫療法への新規の変換アプローチを提供する（Ｕｇｅｌ  Ｓ．ら、Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｌｏｗ−ａｖｉｄｉｔｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６９巻、９３７６〜９３８４頁（２００９）、Ｎｄｈｌｏｖｕ  Ｚ．Ｍ．ら、Ｄｙｎａｍｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０７巻、３６６９〜３６７４頁（２０１０）、Ｉｔｏ  Ｆ．ら、Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＣＤ３／ａｎｔｉ−ＣＤ２８  ｂｅａｄ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、２６巻、２２２〜２３３頁（２００３）、Ｌｕｍ  Ｌ．Ｇ．ら、Ｉｍｍｕｎｅ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ａｆｔｅｒ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＣＤ３／ａｎｔｉ−ＣＤ２８−ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ−ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、２４巻、４０８〜４１９頁（２００１）、Ｔａｙｌｏｒ  Ｐ．Ａ．ら、Ｔｈｅ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ａｎｄ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ＣＤ４（＋）ＣＤ２５（＋）ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｌｅｔｈａｌｉｔｙ、Ｂｌｏｏｄ、９９巻、３４９３〜３４９９頁（２００２）、Ｂａｌｍｅｒｔ  Ｓ．Ｃ．及びＬｉｔｔｌｅ  Ｓ．Ｒ．、Ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｗｉｔｈ  ｍｉｃｒｏ−  ａｎｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ、Ａｄｖ  Ｍａｔｅｒ、２４巻、３７５７〜３７７８頁（２０１２））。
【０００５】
有用であるが、シグナル１及びシグナル２パラダイムは、単独で、相互作用の空間的構成及び幾何学的形態の態様を捕らえない。有効なｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでのＴ細胞応答の刺激のための人工システムを開発する以前の研究は、ＡＰＣの挙動のこれらの態様を再現することを試みなかった。結果として、これまでに研究されたすべての粒子システムは、それらのａＡＰＣプラットフォームに、ＤＣと異なり、所定の体積についての表面積を最小限にする球体粒子を用いたものであった（図２ｂ）。
【０００６】
粒子の形状は、ごく最近、薬物送達のための材料の設計の分野における対象の設計パラメーターになった。形状は、細胞取込みの速度及びメカニズムの調節における一定の役割を果たすことができ（Ｗａｎｇ  Ｊ．ら、Ｍｏｒｅ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｄｅｓｉｇｎ、Ｓｍａｌｌ、７巻、１９１９〜１９３１頁（２０１１））、マクロファージなどの食細胞によるインターナリゼーションを劇的に減少することができ（Ｃｈａｍｐｉｏｎ  Ｊ．Ａ．及びＭｉｔｒａｇｏｔｒｉ  Ｓ．、Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０３巻、４９３０〜４９３４頁（２００６）、Ｓｈａｒｍａ  Ｇ．ら、Ｐｏｌｙｍｅｒ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｈａｐｅ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ、Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ、１４７巻、４０８〜４１２頁（２０１０））、薬物送達媒体の生体内分布を変化させることができ（Ｃｈａｍｐｉｏｎ  Ｊ．Ａ．ら、Ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｈａｐｅ：ａ  ｎｅｗ  ｄｅｓｉｇｎ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏ−  ａｎｄ  ｎａｎｏｓｃａｌｅ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｃａｒｒｉｅｒｓ、Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｋｅａｓｅ、１２１巻、３〜９頁（２００７）、Ｄｅｖａｒａｊａｎ  Ｐ．Ｖ．ら、Ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｈａｐｅ：ａ  ｎｅｗ  ｄｅｓｉｇｎ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ  ｆｏｒ  ｐａｓｓｉｖｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎ  ｓｐｌｅｎｏｔｒｏｐｉｃ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ、９９巻、２５７６〜２５８１頁（２０１０））、一部、相互作用のための表面積を増加させることにより細胞に結合する粒子の能力に影響を及ぼすことができる（Ｃｈａｍｐｉｏｎ  Ｊ．Ａ．ら、Ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｈａｐｅ：ａ  ｎｅｗ  ｄｅｓｉｇｎ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏ−  ａｎｄ  ｎａｎｏｓｃａｌｅ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｃａｒｒｉｅｒｓ、Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｋｅａｓｅ、１２１巻、３〜９頁（２００７）、Ｈａｒｒｉｓ  Ｂ．Ｊ．及びＤａｌｈａｉｍｅｒ  Ｐ．、Ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｈａｐｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ、Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ（Ｓｃｈｏｌ  Ｅｄ）４巻、１３４４〜１３５３頁（２０１２）、Ｙｏｏ  Ｊ．Ｗ．及びＭｉｔｒａｇｏｔｒｉ  Ｓ．、Ｐｏｌｙｍｅｒ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｔｈａｔ  ｓｗｉｔｃｈ  ｓｈａｐｅ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ａ  ｓｔｉｍｕｌｕｓ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０７巻、１１２０５〜１１２１０頁（２０１０））。
【特許文献１】米国仮出願第６１／５６８，７５１号
【非特許文献１】Ｇｒａｋｏｕｉ  Ａ．ら、Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｙｎａｐｓｅ：  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍａｃｈｉｎｅ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８５巻、２２１〜２２７頁（１９９９）
【非特許文献２】Ｍｏｎｋｓ  Ｃ．Ｒ．ら、Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｃｌｕｓｔｅｒｓ  ｉｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ、Ｎａｔｕｒｅ、３９５巻、８２〜８６（１９９８）
【非特許文献３】Ｌｅｅ  Ｋ．Ｈ．ら、Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐｒｅｃｅｄｅｓ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｙｎａｐｓｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９５巻、１５３９〜１５４２頁（２００２）
【非特許文献４】Ｏｅｌｋｅ  Ｍ．ら、Ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ＨＬＡ−Ｉｇ−ｃｏａｔｅｄ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、９巻、６１９〜６２５頁、ＰＭＩＤ：１２０７４３８５（２００３）
【非特許文献５】Ｕｇｅｌ  Ｓ．ら、Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｌｏｗ−ａｖｉｄｉｔｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６９巻、９３７６〜９３８４頁（２００９）
【非特許文献６】Ｍｅｓｃｈｅｒ  Ｍ．Ｆ．、Ｓｕｒｆａｃｅ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４９巻、２４０２〜２４０５頁（１９９２）
【非特許文献７】Ｈａｎ  Ｈ．ら、Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  Ｆｌｕ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ、４１１巻、５３０〜５３５頁（２０１１）
【非特許文献８】Ｓｔｅｅｎｂｌｏｃｋ  Ｅ．Ｒ．ら、Ａｎ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｗｉｔｈ  ｐａｒａｃｒｉｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ＩＬ−２  ｉｍｐａｃｔｓ  ｔｈｅ  ｍａｇｎｉｔｕｄｅ  ａｎｄ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２８６巻、３４８８３〜３４８９２頁（２０１１）
【非特許文献９】Ｓｔｅｅｎｂｌｏｃｋ  Ｅ．Ｒ．及びＦａｈｍｙ  Ｔ．Ｍ．、Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ、１６巻、７６５〜７７２頁、ＰＭＩＤ：１８３３４９９０（２００８）
【非特許文献１０】Ｎｄｈｌｏｖｕ  Ｚ．Ｍ．ら、Ｄｙｎａｍｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０７巻、３６６９〜３６７４頁（２０１０）
【非特許文献１１】Ｉｔｏ  Ｆ．ら、Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＣＤ３／ａｎｔｉ−ＣＤ２８  ｂｅａｄ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、２６巻、２２２〜２３３頁（２００３）
【非特許文献１２】Ｌｕｍ  Ｌ．Ｇ．ら、Ｉｍｍｕｎｅ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ａｆｔｅｒ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＣＤ３／ａｎｔｉ−ＣＤ２８−ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ−ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、２４巻、４０８〜４１９頁（２００１）
【非特許文献１３】Ｔａｙｌｏｒ  Ｐ．Ａ．ら、Ｔｈｅ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ａｎｄ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ＣＤ４（＋）ＣＤ２５（＋）ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｌｅｔｈａｌｉｔｙ、Ｂｌｏｏｄ、９９巻、３４９３〜３４９９頁（２００２）
【非特許文献１４】Ｂａｌｍｅｒｔ  Ｓ．Ｃ．及びＬｉｔｔｌｅ  Ｓ．Ｒ．、Ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｗｉｔｈ  ｍｉｃｒｏ−  ａｎｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ、Ａｄｖ  Ｍａｔｅｒ、２４巻、３７５７〜３７７８頁（２０１２）
【非特許文献１５】Ｗａｎｇ  Ｊ．ら、Ｍｏｒｅ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｄｅｓｉｇｎ、Ｓｍａｌｌ、７巻、１９１９〜１９３１頁（２０１１）
【非特許文献１６】Ｃｈａｍｐｉｏｎ  Ｊ．Ａ．及びＭｉｔｒａｇｏｔｒｉ  Ｓ．、Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０３巻、４９３０〜４９３４頁（２００６）
【非特許文献１７】Ｓｈａｒｍａ  Ｇ．ら、Ｐｏｌｙｍｅｒ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｈａｐｅ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ、Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ、１４７巻、４０８〜４１２頁（２０１０）
【非特許文献１８】Ｃｈａｍｐｉｏｎ  Ｊ．Ａ．ら、Ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｈａｐｅ：ａ  ｎｅｗ  ｄｅｓｉｇｎ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏ−  ａｎｄ  ｎａｎｏｓｃａｌｅ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｃａｒｒｉｅｒｓ、Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｋｅａｓｅ、１２１巻、３〜９頁（２００７）
【非特許文献１９】Ｄｅｖａｒａｊａｎ  Ｐ．Ｖ．ら、Ｐａｒｔｉｃｕｌｅ  ｓｈａｐｅ：ａ  ｎｅｗ  ｄｅｓｉｇｎ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ  ｆｏｒ  ｐａｓｓｉｖｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎ  ｓｐｌｅｎｏｔｒｏｐｉｃ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ、９９巻、２５７６〜２５８１頁（２０１０）
【非特許文献２０】Ｈａｒｒｉｓ  Ｂ．Ｊ．及びＤａｌｈａｉｍｅｒ  Ｐ．、Ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｈａｐｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ、Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ（Ｓｃｈｏｌ  Ｅｄ）４巻、１３４４〜１３５３頁（２０１２）
【非特許文献２１】Ｙｏｏ  Ｊ．Ｗ．及びＭｉｔｒａｇｏｔｒｉ  Ｓ．、Ｐｏｌｙｍｅｒ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｔｈａｔ  ｓｗｉｔｃｈ  ｓｈａｐｅ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ａ  ｓｔｉｍｕｌｕｓ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０７巻、１１２０５〜１１２１０頁（２０１０）
【特許文献２】国際ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ／２０１０／１３２８７９
【非特許文献２２】Ｓｃｈｎｅｃｋ  Ｊ．Ｐ．、Ｊ．Ｅ．  Ｓｌａｎｓｋｙ、Ｓ．Ｍ．  Ｏ’Ｈｅｒｒｉｎ及びＴ．Ｆ．  Ｇｒｅｔｅｎ、２００１、Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ＭＨＣ−Ｉｇ  ｄｉｍｅｒｓ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｊｏｈｎ  Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎ．．．［ｅｔ  ａｌ．］、Ｃｈａｐｔｅｒ  １７：Ｕｎｉｔ  １７．２
【非特許文献２３】Ｄｕｒａｉ  Ｍ．ら、Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｕｓｉｎｇ  ＨＬＡ−Ｉｇ  ｂａｓｅｄ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ（ａＡＰＣ）、Ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：ＣＩＩ．５８：２０９〜２０頁（２００９）
【非特許文献２４】Ｗｅｉｓｓｔｅｉｎ  Ｅ．Ｗ．、Ｐｒｏｌａｔｅ  Ｓｐｈｅｒｉｏｄ  ｉｎ  ＭａｔｈＷｏｒｌｄ−Ａ  Ｗｏｌｆｒａｍ  Ｗｅｂ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（２０１２）
【非特許文献２５】Ｗｅｉｓｓｔｅｉｎ  Ｅ．Ｗ．、Ｒａｄｉｕｓ  ｏｆ  Ｃｕｒｖａｔｕｒｅ  ｉｎ  ＭａｔｈＷｏｒｌｄ−Ａ  Ｗｏｌｆｒａｍ  Ｗｅｂ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（２０１２）
【非特許文献２６】Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ  Ｓ．Ｎ．ら、Ａ  ｕｎｉｆｉｅｄ  ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｄ  ｂｕｌｋ  ｅｒｏｄｉｎｇ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｍａｔｒｉｃｅｓ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、３０巻、１６５７〜１６６４頁（２００９）
【非特許文献２７】Ｂａｔｙｃｋｙ  Ｒ．Ｐ．ら、Ａ  ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｒｏｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｒｕｇ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ、８６巻、１４６４〜１４７７頁（１９９７）
【非特許文献２８】ｖｏｎ  Ｂｕｒｋｅｒｓｒｏｄａ  Ｆ．ら、Ｗｈｙ  ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｕｎｄｅｒｇｏ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｒｏｓｉｏｎ  ｏｒ  ｂｕｌｋ  ｅｒｏｓｉｏｎ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２３巻、４２２１〜４２３１頁（２００２）
【非特許文献２９】Ｂｕｌｌｏｃｋ  Ｔ．Ｎ．Ｊ．ら、Ａｎｔｉｇｅｎ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ  ｂｙ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｔｈｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ａｎｄ  ａｖｉｄｙｔｙ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ、ｍｅｍｏｒｙ  ａｎｄ  ｒｅｃａｌｌ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１７０巻、１８２２〜９頁（２００３）
【非特許文献３０】Ｓｅｄｅｒ  Ｒ．Ａ．ら、Ｔ  ｃｅｌｌ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｍｅｍｏｒｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｓｉｇｎ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、８巻、２４７〜２５８頁（２００８）
【非特許文献３１】Ｋｒｏｇｅｒ  Ｃ．Ｊ．及びＡｌｅｘａｎｄｅｒ−Ｍｉｌｌｅｒ  Ｍ．Ａ．、Ｃｕｔｔｉｎｇ  ｅｄｇｅ：  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｃｌｏｎｅｓ  ｐｏｓｓｅｓｓ  ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ  ｉｎｔｏ  ｂｏｔｈ  ｈｉｇｈ−  ａｎｄ  ｌｏｗ−ａｖｉｄｉｔｙ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１７９巻、７４８〜７５１頁（２００７）
【非特許文献３２】Ｃｕｒｔｓｉｎｇｅｒ  Ｊ．ら、Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ  ｆｏｒ  ｓｔｕｄｙｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｇａｎｄ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０９巻、４７〜５７頁（１９９７）
【非特許文献３３】Ｍａｕｓ  Ｍ．Ｖ．ら、Ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｄ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ＡＰＣｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＣＤ２８  ａｎｄ  ４−１ＢＢ、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２０巻、１４３〜１４８頁（２００２）
【非特許文献３４】Ｓｔｅｅｎｂｌｏｃｋ  Ｅ．Ｒ．ら、Ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｎ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ：  ｍｏｄｕｌａｒ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ、ａｄａｐｔａｂｌｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ、９巻、４５１〜４６４頁、ＰＭＩＤ：１９３４４２８２（２００９）
【非特許文献３５】Ｌｅｖｉｎｅ  Ｂ．Ｌ．ら、Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＣＤ２８  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ＋４  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｆｅｅｄｅｒ  ｃｅｌｌｓ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５９巻、５９２１〜５９３０頁（１９９７）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
いくつかの態様において、今回の開示内容は、（ａ）細胞又は微生物の形状を模倣する非対称形状を有する３次元のマイクロ粒子又はナノ粒子、及び（ｂ）Ｔ細胞の１つ又は複数のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と相互作用することができる１つ又は複数の分子を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を提供するものである。特定の態様において、細胞又は微生物は、細菌、古細菌、原生動物、真菌、藻類及びウイルスからなる群から選択される。いくつかの態様において、細胞又は微生物は、スパイラル、立方体、棒、コンマ、星、正方形、柱、多面体、らせん、２０面体、円柱、４面体及びピラミッドからなる群から選択される形状を有する。
【０００８】
他の態様において、今回の開示内容は、（ａ）非対称形状であって、（ａ）約１ｎｍから約１０ｎｍまで、（ｂ）約１１ｎｍから約１００ｎｍまで、（ｃ）約１０１ｎｍから約４００ｎｍまで、（ｄ）約４０１ｎｍから約１μｍまで、（ｅ）約１０μｍから約２０μｍまで、（ｆ）約２０μｍから約１００μｍまで、及び（ｇ）約１０１μｍから約１ｍｍまでの範囲のうちの１つの範囲にある少なくとも１つの軸に沿った曲率半径を有する少なくとも１つの表面を有する非対称形状を有する３次元のマイクロ粒子又はナノ粒子、及び（ｂ）Ｔ細胞の１つ又は複数のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と相互作用することができる１つ又は複数の分子を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を提供するものである。
【０００９】
他の態様において、今回の開示内容は、（ａ）ｘ軸に沿った寸法（ａ）、ｙ軸に沿った寸法（ｂ）及びｚ軸に沿った寸法（ｃ）により定義される非対称形状であって、（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の少なくとも１つが少なくとも１つの他の寸法（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に等しくない非対称形状を有する３次元のマイクロ粒子又はナノ粒子、並びに（ｂ）Ｔ細胞の１つ又は複数のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と相互作用することができる１つ又は複数の分子を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を提供するものである。特定の態様において、非対称形状は、楕円体を含み、これは、次の式、ａ＞ｂ＝ｃ（偏長楕円体）、ａ＞ｂ＞ｃ（３軸楕円体）及びａ＝ｂ＞ｃ（扁平楕円体）のうちの１つにより記述することができる。
【００１０】
他の態様において、今回の開示内容は、Ｔ細胞を調節する方法であって、（ａ）（ｉ）ｘ軸に沿った寸法（ａ）、ｙ軸に沿った寸法（ｂ）及びｚ軸に沿った寸法（ｃ）により定義される非対称形状であって、（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の少なくとも１つが他の寸法（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の少なくとも１つに等しくない非対称形状を有する３次元のマイクロ粒子又はナノ粒子、並びに（ｉｉ）Ｔ細胞の１つ又は複数のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と相互作用することができる１つ又は複数の分子及びＴ細胞を共刺激するためのＴ細胞上のＴＣＲ以外の受容体と相互作用することができる１つ又は複数の分子を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を準備するステップと、（ｂ）Ｔ細胞をａＡＰＣと接触させるステップと、（ｃ）Ｔ細胞が調節されることを可能にするステップとを含む、方法を提供するものである。
【００１１】
他の態様において、今回の開示内容は、ｘ軸に沿った寸法（ａ）、ｙ軸に沿った寸法（ｂ）及びｚ軸に沿った寸法（ｃ）により定義される非対称形状であって、（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の少なくとも１つが他の寸法（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の少なくとも１つに等しくない、非対称形状を有する３次元のマイクロ粒子又はナノ粒子、並びにＴ細胞の１つ又は複数のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と相互作用することができる１つ又は複数の分子を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を調製する方法であって、（ａ）複数のマイクロ粒子又はナノ粒子を準備又は調製するステップと、（ｂ）複数のマイクロ粒子又はナノ粒子を含むフィルムを調製するステップと、（ｃ）複数のマイクロ粒子又はナノ粒子を含むフィルムを延伸して、非対称形状を有する複数の３次元のマイクロ粒子又はナノ粒子を形成するステップと、（ｄ）非対称形状を有する複数の３次元のマイクロ粒子又はナノ粒子を収集するステップと、（ｅ）非対称形状を有する複数の３次元のマイクロ粒子又はナノ粒子にＴ細胞の１つ又は複数のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と相互作用することができる１つ又は複数の分子を結合させるステップとを含む、方法を提供するものである。
【００１２】
さらなる態様において、今回の開示内容は、フィルムを延伸するための装置を提供するものである。
【００１３】
今回の開示内容により全部又は一部扱われる、今回の開示内容の特定の態様を上文で述べたが、他の態様は、下文で最も十分に述べる添付の実施例及び図面との関連で考慮するとき、説明が進むにつれて明らかになる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
今回の開示内容を、本発明の一部であるが、すべてではない実施形態が示されている、添付図面を参照しながら下文でより十分に記述するものとする。同様な番号は、終始同様な要素を指す。今回の開示内容は、多くの異なる形で具体化することができ、本明細書に示す実施形態に限定されると解釈すべきでなく、それどころか、これらの実施形態は、本開示が適用される法的必要条件を満たすように記載する。実際、本明細書に示す今回の開示内容の多くの変更形態及び他の実施形態は、先の説明及び関連図に示された教示の恩恵を受ける今回の開示内容が関連する分野の技術者に思い浮かぶであろう。したがって、今回の開示内容は、開示した特定の実施形態に限定されるものでなく、変更形態及び他の実施形態は、添付の特許請求の範囲内に含まれるものであると理解すべきである。
【００１５】
Ｉ．人工抗原提示細胞
生体細胞の制御は、多くの疾患の研究及び治療に不可欠である。今回の開示内容は、標的細胞の機能を模倣する革新的なクラスの合成マイクロ及びナノサイズの粒子を構築することによって細胞の制御を達成する。これらの人工／合成細胞は、以下のパラメーターを独立に調節することができるように新たな方法で設計されている。すなわち、人工細胞のサイズ、人工細胞の形状、細胞表面に固定化されるタンパク質の組成及び位置、人工細胞から放出される可溶性因子の組成、この薬物の放出の時間的経過、並びに人工細胞自体の生物分解の時間スケール（図１）。これらの合成マイクロ及びナノ粒子は、生分解性ポリマーから構成されており、細胞工学から顕著に先進的な生物医科学に至るまでの多くの分野で使用できることがあり得る。
【００１６】
人工細胞の特定の用途は、人工抗原提示細胞としてのそれらの使用を含む。人工抗原提示細胞は、感染性疾患及び癌の新たな治療を可能にし得る。標的細胞の機能（単数又は複数）を模倣する新たな生体材料クラスの合成マイクロ及びナノ粒子の創製は、科学上及び解釈上（translational）の影響を有する可能性がある。
【００１７】
無細胞性人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を構築した以前の研究は、球体プラットフォームにもっぱら焦点を合わせたものであった。しかし、活性化抗原提示細胞とＴ細胞との間の相互作用の幾何学的性質は、２つの相互作用性球体のそれとかなり異なっている。この過程における形状の役割を探究するために、今回の開示内容は、マイクロ粒子又はナノ粒子、例えば、いくつかの実施形態において、ＰＬＧＡマイクロ粒子の形状を変化させるアプローチを採用して、可変長軸長及びアスペクト比（ＡＲ）を有する楕円体マイクロ粒子を得るものである。今回開示の高ＡＲを有する「延伸」生体模倣非球体ａＡＰＣは、粒子の体積及び抗原の含量を一定に保持した球体ａＡＰＣで認められたものを上回る有意に高い活性を示した。
【００１８】
１つの特定の理論に拘束されることを望むものではないが、共焦点撮像により、この効果が延伸ａＡＰＣの長軸に沿った相互作用の改善に起因する可能性があり、Ｔ細胞が粒子の長軸に選択的に移動し、それとの相互作用により活性化されることが示されている。非球体高アスペクト比ａＡＰＣの高い活性は、代表的な実施例において、非同種ａＡＰＣ（ｐ＝０．００４）並びに同種球体ａＡＰＣ（ｐ＝０．０５）と比較して黒色腫生存率を改善した、高アスペクト比ａＡＰＣでｉｎ  ｖｉｖｏでも認められた。今回の開示内容は、粒子の幾何学的形態がａＡＰＣの作製における重要な設計基準であることを示すものであり、Ｔ細胞と生体ＡＰＣとの間の相互作用に関与する幾何学的形態の本質的な役割への洞察を与えるものである。
【００１９】
したがって、いくつかの実施形態において、今回の開示内容は、（ａ）細胞又は微生物の形状を模倣する非対称形状を有する３次元のマイクロ粒子又はナノ粒子、及び（ｂ）Ｔ細胞の１つ又は複数のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と相互作用することができる１つ又は複数の分子を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を提供するものである。特定の実施形態において、細胞又は微生物は、細胞、細菌及びウイルスからなる群から選択される。
【００２０】
本明細書で用いているように、「微生物」という用語は、細菌及び古細菌、単細胞原生動物、単細胞真菌、単細胞藻類並びにウイルスを含む、原核生物などの単細胞生物を意味する。
【００２１】
細胞又は微生物の形状の例は、スパイラル、立方体様、棒、コンマ形、星形、正方形、柱、多面体、らせん、２０面体、円柱、４面体及びピラミッドを含むが、これらに限定されない。
【００２２】
他の実施形態において、今回の開示内容は、（ａ）（ａ）１ｎｍ〜１０ｎｍ、（ｂ）１１ｎｍ〜１００ｎｍ、（ｂ）１０１ｎｍ〜４００ｎｍ、（ｃ）４０１ｎｍ〜１μｍ、（ｄ）１０μｍ〜２０μｍ、（ｅ）２０μｍ〜１００μｍ、（ｆ）１０１μｍ〜１ｍｍのうちの１つの範囲にある少なくとも１つの軸に沿った曲率半径を有する少なくとも１つの表面を有する、非対称形状を有する３次元のマイクロ粒子又はナノ粒子、及び（ｂ）Ｔ細胞の１つ又は複数のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と相互作用することができる１つ又は複数の分子を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を提供するものである。
【００２３】
他の実施形態において、今回の開示内容は、（ａ）ｘ軸に沿った寸法（ａ）、ｙ軸に沿った寸法（ｂ）及びｚ軸に沿った寸法（ｃ）により定義される非対称形状を有し、（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の少なくとも１つが少なくとも１つの他の寸法（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に等しくない、３次元のマイクロ粒子又はナノ粒子、並びに（ｂ）Ｔ細胞の１つ又は複数のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と相互作用することができる１つ又は複数の分子を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を提供するものである。
【００２４】
粒子がより扁平になるにつれて、曲率半径がより大きくなる。逆に、粒子の表面がより湾曲した状態になるにつれて、曲率半径がより小さくなる。いくつかの実施形態において、粒子は、約１μｍから約１０μｍまでの範囲を含まない曲率半径を有する少なくとも１つの表面を有する。
【００２５】
いくつかの実施形態において、非球体形状は、式ａ＞ｂ＝ｃにより定義される偏長楕円体を構成する。他の実施形態において、非球体形状は、式ａ＞ｂ＞ｃにより記述することができる３軸楕円体を構成する。他の実施形態において、非球体形状は、式ａ＝ｂ＞ｃにより記述することができる扁平楕円体を構成する。他の実施形態において、非球体形状は、ｘ軸に沿った寸法（ａ）がｙ軸に沿った寸法（ｂ）に等しく、その両方が、ａ＝ｂ＜＜ｃであるような、ｚ軸に沿った寸法（ｃ）よりはるかに小さく、３次元のマイクロ粒子又はナノ粒子が棒を構成する。
【００２６】
本明細書で用いているように、「ナノ粒子」という用語は、１ｎｍから１０００ｎｍまでの整数値（約１、２、５、１０、２０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００及び１０００ｎｍ並びに間のすべての整数及び分数を含む）を含む、１ｎｍから１０００ｎｍまでの範囲内の少なくとも１つの寸法を有する粒子を意味する。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、約１００ｎｍの少なくとも１つの寸法、例えば、直径を有する。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、約２００ｎｍの直径を有する。他の実施形態において、ナノ粒子は、約５００ｎｍの直径を有する。他の実施形態において、ナノ粒子は、約１０００ｎｍ（１μｍ）の直径を有する。そのような実施形態において、粒子は、「マイクロ粒子」と呼ぶこともできる。したがって、「マイクロ粒子」という用語は、約１マイクロメートル（μｍ）、すなわち、１×１０−６メートルから約１０００μｍまでの範囲にある少なくとも１つの寸法を有する粒子を含む。「粒子」という用語は、本明細書で用いているようにナノ粒子及びマイクロ粒子を含むことを意味する。
【００２７】
本明細書で用いているように、「人工抗原提示細胞」（ａＡＰＣ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製され、身体により天然で調製されなかった人工的生体模倣粒子ベースのプラットフォームである。
【００２８】
本明細書で用いているように、「抗原提示細胞」は、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合することができる分子を含み、Ｔ細胞の応答を誘導する他の因子を有する細胞である。本明細書で用いているように、「ことができる」という用語は、潜在的能力又は実際になし得る能力を有することを意味し、例えば、受容体に結合する「ことができる」分子は、受容体と相互作用し、且つ／又は結合する潜在的能力又は実際の能力を有する３次元構造を有する分子である。
【００２９】
本明細書で用いているように、「分子」という用語は、一般的に、共有結合によりまとまっている２つ以上の原子を意味する。したがって、分子は、ペプチドのサイズのような比較的に小さなものであり得、又は数個のポリペプチドを含むタンパク質のサイズのような比較的に大きなものであり得る。本明細書で用いているように、分子は、サイズによって制限されない。
【００３０】
本明細書で用いているように、「抗原」は、ＭＨＣが結合することができ、Ｔ細胞受容体に提示される分子又は分子の一部である。抗原の例は、細菌及び真菌細胞壁、原生動物細胞膜、細菌及び真菌莢膜、ウイルスカプシドなどの微生物構造、ウイルス糖タンパク質、微生物毒素、ダストマイト、花粉、毛髪、鱗屑、ハチ毒、薬物及びアレルギー反応を引き起こす他の物質などのアレルゲン、外来組織又は細胞、及び、癌細胞、感染細胞及び自己免疫疾患に関与する細胞などの、身体が正常と認識しない身体自体の細胞を含むが、これらに限定されない。
【００３１】
いくつかの実施形態において、分子は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）によって提示される抗原である。いくつかの実施形態において、主要組織適合性複合体は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）である。一般的に、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、抗原に対する特異的免疫を媒介し、クラスＩ分子は、当抗原を示す宿主細胞の破壊を媒介する。他の実施形態において、抗原提示細胞はまた、Ｔ細胞上の他の受容体と結合又は相互作用する分子を含む。
【００３２】
特定の実施形態において、３次元のマイクロ粒子又はナノ粒子は、ｘ軸に沿った寸法（ａ）がｙ軸に沿った寸法（ｂ）より大きく、ｙ軸に沿った寸法（ｂ）がｚ軸に沿った寸法（ｃ）に等しい、式ａ＞ｂ＝ｃにより記述することができるような偏長楕円体を構成する。他の実施形態において、楕円体は、ｘ軸に沿った寸法（ａ）がｙ軸に沿った寸法（ｂ）より大きく、ｙ軸に沿った寸法（ｂ）がｚ軸に沿った寸法（ｃ）より大きい、式ａ＞ｂ＞ｃにより記述することができるような３軸楕円体である。他の実施形態において、楕円体は、ｘ軸に沿った寸法（ａ）がｙ軸に沿った寸法（ｂ）に等しく、ｙ軸に沿った寸法（ｂ）がｚ軸に沿った寸法（ｃ）より大きい、式ａ＝ｂ＞ｃにより記述することができるような扁平楕円体である。しかし、今回開示の非対称粒子は、ａ＝ｂ＝ｃである実施形態を含まない。
【００３３】
他の実施形態において、マイクロ粒子又はナノ粒子は、約１．１から約５までの範囲のアスペクト比を有する。他の実施形態において、アスペクト比は、約５から約１０までの範囲を有する。いくつかの実施形態において、アスペクト比は、１．５、２、２．５、３及び３．５を含む、約１．５から約３．５までの範囲を有する。
【００３４】
一般的に、３次元のマイクロ粒子又はナノ粒子は、以下の１つ又は複数の特性を有する材料を含む。（ｉ）１つ又は複数の分解性結合、（ｉｉ）１０６〜１０１０Ｎ／ｍ２、いくつかの実施形態において１０７〜１０９Ｎ／ｍ２の範囲の伸長性ヤング率並びに（ｉｉｉ）３次元のマイクロ粒子又はナノ粒子を構成する材料が室温及び／又は体温で固体であるようなガラス転移温度。粒子はまた、上のように定義される１つ又は複数の成分を有するコポリマーで構成され得る。
【００３５】
本明細書で用いているように、「ガラス転移温度」は、非晶質ポリマーがゴム状粘性非晶質液体からもろいガラス状非晶質固体への転移を受ける温度を意味する。本明細書で用いているように、「弾性のヤング率」は、ポリマーの弾性を定量化する。それは、小さなひずみについて、応力の変化の率とひずみとの比と定義される。
【００３６】
本明細書で用いているように、「生分解性」化合物は、細胞に導入されたとき、細胞機構により、又は加水分解により、細胞に対する顕著な毒性影響を伴うことなく（すなわち、成分をｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞に加えるとき、約２０％より少数の細胞が殺滅される）細胞が再使用又は処分することができる成分に分解されるものである。成分は、好ましくはｉｎ  ｖｉｖｏで炎症又は他の有害な影響をもたらさない。特定の好ましい実施形態において、化学反応は、生分解性化合物が触媒されない状態でそれを分解することに依拠していた。
【００３７】
一般的に、生分解性であるためには、今回開示の材料、例えば、マイクロ粒子及び／又はナノ粒子は、分解性結合を含む。代表的な分解性結合は、以下のものを含むが、それらに限定されない。
【００３８】
【化１】
2015500296.tif 000003
【００３９】
いくつかの実施形態において、３次元のマイクロ粒子又はナノ粒子は、以下の１つ又は複数の特性を有する材料を含む。（ｉ）１つ又は複数の分解性結合、（ｉｉ）延伸性係数（stretchable modulus）並びに（ｉｉｉ）３次元のマイクロ粒子又はナノ粒子を構成する材料が室温及び／又は体温で固体であるようなガラス転移温度。他の実施形態において、分解性結合は、エステル結合、ジスルフィド結合、アミド結合、酸無水物結合及び酵素分解を受けやすい結合からなる群から選択される。特定の実施形態において、３次元のマイクロ粒子又はナノ粒子は、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ベータ−アミノエステル）（ＰＢＡＥ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、ポリ−３−ヒドロキシブチラート（Ｐ３ＨＢ）及びポリ（ヒドロキシブチラート−ｃｏ−ヒドロキシバレラート）からなる群から選択される生分解性ポリマー又はポリマーの混合物を含む。他の実施形態において、ポリスチレンなどの当技術分野で用いられる非分解性ポリマーを上述の分解性ポリマー又は複数の分解性ポリマーと混合して、コポリマーシステムを調製する。したがって、いくつかの実施形態において、非分解性ポリマーを生分解性ポリマーと混合する。
【００４０】
今回の開示内容により用いるのに適する他の生分解性ポリマーは、参照によりその全体として本明細書に組み込まれている、２０１０年１１月１８日に公開されたＧｒｅｅｎらへの「多成分分解性カチオンポリマー」に関する国際ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ／２０１０／１３２８７９に記載されている。
【００４１】
Ｔ細胞又はＴリンパ球は、リンパ球として公知の白血球の群に属する細胞であり、細胞性免疫において中心的な役割を果たしている。異なる種類のＴ細胞は、Ｔヘルパー細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、記憶Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞（サプレッサー細胞としても公知）及びナチュラルキラーＴ細胞を含むが、これらに限定されない。Ｔ細胞は、その細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在によって他のリンパ球と区別することができる。Ｔ細胞受容体は、Ｔ細胞の表面に見いだされるタンパク質であり、ＭＨＣ分子に結合した抗原を認識することに関与する。この認識は、特定の抗原に特異的なＴＣＲを有するＴ細胞のみが活性化されることを保証する。いくつかの実施形態において、ＴＣＲとＭＨＣ：抗原複合体との相互作用は、Ｔ細胞の活性化又は調節の最初のシグナルである。抗原は、ＭＨＣ二量体又は四量体分子によってＴ細胞に提示され得る。ＭＨＣ二量体又は四量体分子は、対象のＭＨＣ制限ペプチドを容易に負荷させることができる。負荷とは、共有結合性相互作用によるか又は非共有結合性相互作用によるか又は両方によるかを問わず、ペプチドを何らかの方法でＭＨＣ二量体又は四量体に結合させることを意味する。
【００４２】
いくつかの実施形態において、ＴＣＲと相互作用することができる分子は、ペプチドである。本明細書で用いているように、「ペプチド」は、アミノ酸単量体のより短いポリマーである。ある場合には、ペプチドは、少数のアミノ酸のみを含む、他の実施形態において、ペプチドは、数百のアミノ酸を含む。「ポリペプチド」は、一般的に約５０アミノ酸からより大きなタンパク質に至る、アミノ酸のより長いポリマーを意味する。一般的に、ペプチドのサイズとポリペプチドのサイズとの間に重複がある。いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩＩ分子と相互作用するペプチドは、一般的に長さが１３〜１７アミノ酸であり、他の実施形態において、より短い又はより長いペプチドが一般的であり、許容される。他の実施形態において、ＭＨＣクラスＩ分子と相互作用するペプチドは、一般的に１５個未満のアミノ酸長というより緊縮な要件を有する。
【００４３】
他の実施形態において、ペプチドを、ＴＣＲと相互作用する前にＭＨＣ−Ｉｇ分子又はＨＬＡ：Ｉｇ分子上に負荷する。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ：Ｉｇ分子は、ＨＬＡ：Ａ２：Ｉｇである。
【００４４】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞の活性化又は調節のために第２のシグナルが必要である。この第２のシグナルは、Ｔ細胞を共刺激するように作用するＴ細胞上の他の受容体であり得る。受容体の例は、例えば、ＣＤ２８（寄託番号ＮＰ＿００６１３０、ＮＰ＿００１２３０００６、ＮＰ＿００１２３０００７）、ＣＤ２（寄託番号ＮＰ＿００１７５８）、ＣＤ５（寄託番号ＮＰ＿０５５０２２）、ＣＤ３０（寄託番号ＮＰ＿００１２３５）、ＯＸ４０（ＮＰ＿００３３１８）、４−１ＢＢＬ（寄託番号ＮＰ＿００１０７０９７７）、ＩＣＡＭ−１（寄託番号ＮＰ＿０００１９２）及びＬＦＡ−１（ＮＰ＿００２２００）を含むが、これらに限定されない。寄託番号は、例及び類似タンパク質としてのみ示し、今回の開示内容において他の寄託番号を用いることもあり得る。
【００４５】
「ＣＤ２８受容体」は、Ｔ細胞の表面上に見いだされるタンパク質である。それは、Ｂ７タンパク質を介して、病原体の産物及び細胞の分解産物などの刺激により活性化又は誘導される。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８受容体は、Ｔ細胞の活性化又は調節に必要な第２のシグナルに関与する。
【００４６】
「Ｂ７タンパク質」は、Ｔ細胞上のＣＤ２８受容体と対になるとき、Ｔ細胞上のＴＣＲとＭＨＣ：抗原複合体との相互作用からのシグナルを増大又は低下させる末梢膜タンパク質である。Ｂ７タンパク質は、ＣＤ８０（又はＢ７．１）タンパク質及びＣＤ８６タンパク質（又はＢ７．２）を含む。
【００４７】
本明細書で用いているように、ａＡＰＣを構成するＭＨＣ：抗原複合体、Ｉｇ分子、Ｂ７タンパク質、抗ＣＤ３分子及び他の分子は、全分子、タンパク質若しくは複合体を構成し得る。又はそれは、Ｔ細胞との結合又は相互作用に関与する分子、タンパク質若しくは複合体のドメインを構成し得る。言い換えれば、いくつかの実施形態において、今回の開示内容のａＡＰＣは、Ｔ細胞と相互作用する分子、タンパク質又は複合体の部分のみを含み得る。例えば、Ｂ７タンパク質を含むａＡＰＣは、全長Ｂ７タンパク質、Ｂ７タンパク質の１つのペプチドのみ又はＢ７タンパク質のＣ２８受容体結合ドメインのみを含み得る。
【００４８】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、Ｔ細胞上のＴＣＲ及び他の受容体の１つの両方の共刺激により調節される。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ及び他の受容体の１つの両方の共刺激は、Ｔ細胞の活性化をもたらすが、他の実施形態において、ＴＣＲ及び他の受容体の１つの両方の共刺激は、Ｔ細胞の活性化の低下をもたらす。調節は、活性化、不活性化及び他の形の細胞機能の変化を含み得る。
【００４９】
したがって、いくつかの実施形態において、ａＡＰＣは、Ｔ細胞上のＴＣＲ以外の受容体と相互作用することができる分子をさらに含む。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞上のＴＣＲ以外の受容体は、ＣＤ２８、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ４４、ＯＸ４０、４−１ＢＢＬ、ＩＣＡＭ−１及びＬＦＡ−１からなる群から選択される。特定の実施形態において、Ｔ細胞上のＴＣＲ以外の受容体は、ＣＤ２８である。ある場合には、ＣＤ２８受容体は、抗ＣＤ２８抗体又はＢ７タンパク質と相互作用する。
【００５０】
ａＡＰＣは、薬物又は治療剤をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、薬物又は治療剤は、タンパク質である。本明細書で用いているように、「薬物」は、被験体に導入されたときに生理作用を有する物質である。薬物はまた、細胞に対するその作用を判断するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えば、細胞培養中で試験することができる。「タンパク質薬物」は、ペプチド（単数若しくは複数）又はポリペプチド（単数若しくは複数）を含む薬物である。
【００５１】
他の実施形態において、ａＡＰＣは、ａＡＰＣの１つ若しくは複数の表面上及び／又はａＡＰＣ内の少なくとも１つのペプチド若しくはタンパク質をさらに含む。
【００５２】
今回の開示内容は、ａＡＰＣを含むキットも提供する。一般的に、キットは、患者におけるＴ細胞を調節するために少なくとも１例の患者を少なくとも１回治療するのに十分な量のａＡＰＣを含む。一般的に、キットのａＡＰＣは、１つ又は複数の容器入りで供給され、各容器は、患者への少なくとも１回の投与に十分な量の粒子を含む。
【００５３】
他の実施形態において、今回の開示内容は、今回開示のａＡＰＣを調製するための原料及び粒子を延伸するための今回開示の装置（図１８Ａ及び１８Ｂ）を含むキットを含む。
【００５４】
今回の開示内容のａＡＰＣは、多くの各種応用例においてＴ細胞を調節するために用いることができる。例えば、ａＡＰＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのインフルエンザエピトープに対するＣＤ８＋Ｔ細胞の応答を試験するために用いることができ（Ｌｅｅら、２０１１年）、ｉｎ  ｖｉｖｏでインフルエンザを予防し且つ／又は患者を治療する方法にも用いることができる。他の例として、ＨＬＡ−Ａ２−ＩｇベースのａＡＰＣなどの、これらのａＡＰＣは、インフルエンザ及び麻疹に特異的な抗原（Ｎｄｈｌｏｖｕら、２０１０年）を用いてＣＤ８（＋）Ｔ細胞を刺激するために用いることができる。
【００５５】
さらなる例として、今回の開示内容の組成物及び方法は、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）などの自己免疫疾患を研究、予防又は治療するためにａＡＰＣを使用することができる。Ｔ１Ｄの場合、１つの可能な標的は、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）である（Ｘｉａｏら、２０１１年）。
【００５６】
他の例として、ａＡＰＣベースのシステムは、養子免疫療法のためのヒトサイトメガロウイルス特異的細胞傷害性Ｔリンパ球のｅｘ  ｖｉｖｏ増幅に用いることができる（Ｃｈｉｕら、２０１１年）。
【００５７】
他の例として、ａＡＰＣベースのシステムは、同種Ｔ細胞受容体に対する複合体のはるかにより高い濃度を得ると同時に二量体複合体の分子の柔軟性を保存することによってペプチド−ＨＬＡ結合の結合活性を最適化する可溶性ペプチド負荷ＨＬＡ−Ａ２−Ｉｇ二量体複合体を用いる新規細胞マイクロアレイアッセイに用いることができる。この高処理ブロードベース（high-throughput broad-based）のアッセイは、集団内及び横断の抗原特異的Ｔ細胞応答の安定性及びフラックスを測定するために細胞マイクロアレイの使用を可能にする（Ｌｉら、２０１１年）。
【００５８】
さらに、ａＡＰＣは、標的Ｔ細胞における抗原提示細胞媒介性アポトーシスを効率的に誘導するためのＦａｓ／Ｆａｓリガンドシグナル伝達経路を利用することなどによりアロ又は抗原特異的Ｔ細胞を枯渇させるために用いることができる（Ｓｃｈｅｕｔｚら、２０１０年）。
【００５９】
また、磁気ビーズに（ｐｅｐ）ＭＨＣ−Ｉｇ二量体及びＢ７．１−Ｉｇ分子を共有結合させることにより調製したａＡＰＣは、低結合活性の腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞の抗腫瘍活性を救助することにより免疫療法有効性を改善するために用いることができる（Ｕｇｅｌら、２００９年）。
【００６０】
さらに、アポトーシス誘導性アルファ−Ｆａｓ（ＣＤ９５）ＩｇＭ  ｍＡｂをＨＬＡ−Ａ２  Ｉｇとともにビーズ上に結合させることにより、キラー人工ＡＰＣ（カッパａＡＰＣ）を作製することができる。これらのカッパａＡＰＣは、標的抗原特異的Ｔ細胞をＦａｓ／Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）依存的に枯渇させ、したがって、自己免疫疾患及び同種異系移植片拒絶反応の治療に使用できる可能性がある（Ｓｃｈｕｅｔｚら、２００８年）。
【００６１】
他の例として、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞は、免疫恒常性の維持に極めて重要な役割を果たす。それらは、ＣＤ１ｄ分子との関連において脂質抗原を認識し、その後、先天性及び適応的免疫応答の両方の細胞を活性化するサイトカインを産生する。自己免疫疾患又は癌を有する患者を検討した多くの研究で、ＮＫＴ細胞数及び機能の両方の低下が存在することが示された。ａＡＰＣシステムは、ＣＤ１ｄ発現ａＡＰＣの使用によりＮＫＴ細胞の増殖及び解析を促進し得る。ＣＤ１ｄベースのａＡＰＣは、カノニカル（ｉＮＫＴ細胞）及び非カノニカル（Ｖａｌｐｈａｌ４（−））ＮＫＴ細胞の両方を効果的に増殖させることができる。重要なことに、ＣＤ１ｄ−Ｉｇ  ａＡＰＣは、癌患者からのＮＫＴ細胞を増幅することができ、養子免疫療法戦略における新規ツールとして用いることができる（Ｗｅｂｂら、２００９年）。
【００６２】
ａＡＰＣはまた、免疫応答の評価のための感度が高く、特異的なアッセイを提供するのに用いることができる。細胞性免疫応答は、技術的ハードル及び必要な血液の量のため、しばしば解析されない。したがって、少量の血液を用いる抗原特異的Ｔ細胞の感度が高く、特異的なアッセイは、新たなワクチンの評価を容易にするものと思われる。ウイルス特異的ＣＤ８（＋）Ｔ細胞を定量するためのアッセイは、全血中の抗原特異的ＣＤ８（＋）Ｔ細胞の刺激のためのＨＬＡ−Ａ２免疫グロブリンベースのａＡＰＣの使用をガンマインターフェロン（ＩＦＮ−ガンマ）ｍＲＮＡを検出するための定量的実時間逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）と組み合せることができる（Ｎｄｈｌｏｖｕら、２００９年）。このアッセイは、多種多様な抗原に対するＣＤ８（＋）Ｔ細胞の応答を解析することができる。
【００６３】
他の例として、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞は、ＣＤ１分子により提示された脂質抗原を認識する。ＮＫＴ細胞は、細胞傷害性により直接的に、また他のエフェクター細胞の活性化により間接的に抗腫瘍免疫を媒介することができる。しかし、腫瘍関連脂質がしばしば腫瘍微小環境に流入し、これが免疫抑制活性を媒介し得ることが示された。例えば、卵巣癌関連腹水がガングリオシドのレベルの増加を有すると報告されたことを考慮すると、ＮＫＴ細胞へのＣＤ１ｄ媒介性抗原提示に対する腫瘍関連及び他の腹水の影響は、ａＡＰＣを用いて検討することができる（Ｗｅｂｂら、２００８年）。
【００６４】
さらなる例として、癌及び感染性疾患の治療のための養子免疫療法は、最終Ｔ細胞産物並びにｅｘ  ｖｉｖｏ増幅抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞の限られたｉｎ  ｖｉｖｏ機能及び生存の高度の変動によってしばしば阻まれる。ヒト末梢血Ｔリンパ球からのＨＬＡ−ＩｇベースのａＡＰＣ刺激腫瘍特異的ＣＴＬが、ヒト／ＳＣＩＤマウス黒色腫モデルなどにおいて頑健な増幅及び機能活性を示したことが見いだされた（Ｄｕｒａｉら、２００８年）。したがって、ＨＬＡ−ＩｇベースのａＡＰＣ増幅ＣＴＬの治療的ｉｎ  ｖｉｖｏ活性は、腫瘍の成長を制御するために用いることができる。
【００６５】
他の例として、代謝障害に関連する、脂質過剰負荷は、脂肪酸が非脂肪組織に蓄積する場合に起こる。これらの組織の細胞は、病原体を除去するために主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子を用いてＴ細胞に抗原を提示する。肥満は免疫応答の障害に関連するので、高脂肪西欧食に多く含まれる飽和パルミチン酸（ＰＡ）又は例えば、地中海食の成分である一価不飽和オレイン酸（ＯＡ）によりａＡＰＣを処理し、ＭＨＣＩ媒介性抗原提示に対する影響により免疫を調べることによって、脂質過負荷及び抗原提示の初期段階を研究するのにａＡＰＣを用いることができる（Ｓｈａｉｋｈら、２００８年）。
【００６６】
ＩＩ．人工抗原提示細胞を用いる方法
いくつかの実施形態において、今回の開示内容は、Ｔ細胞を調節する方法であって、（ａ）（ｉ）ｘ軸に沿った寸法（ａ）、ｙ軸に沿った寸法（ｂ）及びｚ軸に沿った寸法（ｃ）により定義され、（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の少なくとも１つが他の寸法（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の少なくとも１つに等しくない、非対称形状を有する３次元のマイクロ粒子又はナノ粒子、並びに（ｉｉ）Ｔ細胞の１つ又は複数のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と相互作用することができる１つ又は複数の分子及びＴ細胞を共刺激するためのＴ細胞上のＴＣＲ以外の受容体と相互作用することができる１つ又は複数の分子を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を準備するステップと、（ｂ）Ｔ細胞をａＡＰＣと接触させるステップと、（ｃ）Ｔ細胞が調節されることを可能にするステップとを含む、方法を提供するものである。
【００６７】
本明細書で用いているように、「接触させるステップ」又は「相互作用するステップ」は、物理的に接触させることにより、又は１つの分子が他の分子の作用に影響を及ぼすのに十分に近くに近接することにより、少なくとも１つの分子が他の分子に影響を及ぼすことをもたらす作用を意味する。例えば、Ｔ細胞のＴＣＲは、ＭＨＣ：抗原複合体の抗原がＴＣＲに物理的に結合することなくＴ細胞を活性化するような方法でＭＨＣ：抗原複合体と相互作用し得る。他の例において、抗原は、ＴＣＲと物理的に接触する。
【００６８】
方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏで実施することができ、この場合、接触させるステップは、被験体における少なくとも１つのＴ細胞を少なくとも１つのａＡＰＣに曝露することを意味する。今回の開示内容によれば、接触させステップは、例えば、被験体に適切な経路により少なくとも１用量のａＡＰＣを投与することなどにより、少なくとも１つのＴ細胞を少なくとも１つのａＡＰＣに曝露するステップを含む。それはまた、細胞培養皿又は管中などの制御された環境に少なくとも１つのａＡＰＣ及び少なくとも１つのＴ細胞を導入し、好ましくは混合することによって細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで曝露するステップを含み得る。今回の開示内容によれば、接触させステップは、接触させる細胞から遠い場所における少なくとも１つのａＡＰＣを導入し、曝露するなどのステップと、被験体の身体機能、又は流体の自然（例えば、拡散）若しくはヒト誘発性（例えば、旋回）運動がａＡＰＣ（単数又は複数）とＴ細胞（単数又は複数）との接触をもたらすことを可能にするステップを含む。ｅｘ  ｖｉｖｏで実施する場合、被験体、好ましくはそれらが得られた被験体に細胞を再導入することもできる。
【００６９】
ａＡＰＣは、Ｔ細胞の活性化及びＴ細胞の不活性化／阻害を含む複数の様態のＴ細胞の調節のために用いることができる。
【００７０】
Ｔ細胞の活性化及び／又は調節は、Ｔ細胞受容体及びＴ細胞上の他の受容体の両方の関与を意味する。他の受容体による共刺激がない場合、Ｔ細胞受容体のシグナル伝達のみでは、Ｔ細胞が有効な免疫応答を活性化することができない状態である、アネルギーがもたらされる。しかし、アネルギーは、治療への使用のために利用することができる。例えば、移植組織及び臓器の移植に対する免疫応答は、免疫系全体を弱めずに最小限にすることができる。他の例として、アネルギーは、活性化リンパ球が、糖尿病、多発性硬化症及び慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患と反応しない状態になることを誘導するために用いることができる。
【００７１】
ＴＣＲ及び共刺激をもたらす他の受容体の両方が刺激されることを意味する、有効Ｔ細胞活性化は、特異抗原に結合することができるＴ細胞の数を増加させる、Ｔ細胞のクローンの増大又は増殖をもたらす事象のカスケードをもたらす。「クローンの増大」、「Ｔ細胞の増殖」及び「Ｔ細胞の増幅」は、本明細書で同義で用いる。
【００７２】
いくつかの実施形態において、ＴＣＲと相互作用することができる分子は、ペプチドである。他の実施形態において、ペプチドは、ＴＣＲと相互作用する前にＭＨＣ−Ｉｇ分子又はＨＬＡ：Ｉｇ分子上に負荷する。
【００７３】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞上のＴＣＲ以外の受容体は、ＣＤ２８、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ４４、ＯＸ４０、４−１ＢＢＬ、ＩＣＡＭ−１及びＬＦＡ−１からなる群から選択される。他の実施形態において、Ｔ細胞上のＴＣＲ以外の受容体は、ＣＤ２８である。他の実施形態において、ＣＤ２８受容体は、抗ＣＤ２８抗体又はＢ７タンパク質と相互作用する。
【００７４】
いくつかの実施形態において、方法に用いるＴ細胞は、ナイーブＴ細胞である。「ナイーブＴ細胞」は、免疫系がまだ遭遇したことがない新たな病原体に対して応答することができるＴ細胞である。その同種抗原のナイーブＴ細胞による認識は、免疫応答の開始をもたらす。他の実施形態において、Ｔ細胞の調節は、Ｔ細胞の増殖をもたらす。
【００７５】
今回の開示内容のａＡＰＣを用いる方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏであり得る。いくつかの実施形態において、接触させるステップは、ヒト又は非ヒト動物などの被験体において起こる。他の実施形態において、接触させるステップは、疾患、障害又は機能不全を治療するのに十分な量の１又は複数用量のａＡＰＣを被験体に投与するステップを含む。疾患、障害又は機能不全は、被験体の健康に影響を及ぼす状態を意味する。今回の開示内容が免疫応答の極めて重要な部分であるＴ細胞に作用するので、今回の開示内容の方法及び組成物は、多種多様の疾患、障害又は機能不全に作用する。例は、免疫の増大により治療することができる癌及び感染性疾患などである。他の例は、免疫応答の減弱により治療することができる自己免疫疾患、アレルギー及び移植組織などである。今回の開示対象の方法及び組成物は、特定の疾患、障害又は機能不全を治療するように修正することができる。
【００７６】
投与は、経口摂取、注射、注入、局所投与、吸入、舌下吸収、直腸又は膣送達、皮下及びそれらの組合せによるものであり得る。いくつかの実施形態において、疾患、障害又は機能不全は、癌又は感染性疾患である。他の実施形態において、方法は、被験体から少なくとも１つのＴ細胞を除去するステップと、少なくとも１つのＴ細胞を少なくとも１つのａＡＰＣと接触させるステップと、Ｔ細胞を被験体に戻すステップとを含むｅｘ  ｖｉｖｏの方法である。他の実施形態において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法は、細胞培養において行われる。
【００７７】
一般的に、活性薬又は薬物送達デバイスの「有効量」は、所望の生物学的反応を引き起こすのに必要な量を意味する。当業者により十分に理解されるように、薬剤又はデバイスの有効量は、所望の生物学的エンドポイント、送達される薬剤、封入マトリックスの組成、標的組織等のような因子によって異なり得る。本明細書で用いているように、「用量」は、疾患、障害又は機能不全について被験体を治療するのに十分である被験体に投与されるａＡＰＣの量を意味する。
【００７８】
本明細書で述べる方法が「被験体」という用語に含まれるものとするすべての脊椎動物種に対して有効であることを理解すべきであるが、それらの多くの実施形態において今回開示の方法により治療される被験体は、望ましくはヒトの被験体である。したがって、「被験体」は、既存の状態若しくは疾患の治療又は状態若しくは疾患の発症を予防するための予防的治療のためなどの医療目的のためのヒトの被験体、或いは医療、獣医学目的、又は開発目的のための動物の被験体を含む。適切な動物の被験体は、霊長類、例えば、ヒト、サル、類人猿など、ウシ科、例えば、畜牛、雄牛など、ヒツジ、例えば、羊など、ヤギ、例えば、山羊など、ブタ、例えば、子豚、食肉用成体豚など、ウマ科、例えば、ウマ、ロバ、シマウマなど、野生及び家畜ネコを含む、ネコ科、イヌを含む、イヌ科、ウサギ、野ウサギを含む、ウサギ目、及びマウス、ラットなどを含む、げっ歯類を含むが、これらに限定されない。動物は、トランスジェニック動物であり得る。いくつかの実施形態において、被験体は、胎児、新生児、乳児、若年及び成人の被験体を含むが、これらに限定されないヒトである。さらに、「被験体」は、状態若しくは疾患に苦しんでいる又は苦しんでいると疑われる患者を含み得る。したがって、「被験体」と「患者」は、本明細書で同義で用いる。
【００７９】
ＩＩＩ．人工抗原提示細胞を調製する方法
今回の開示内容は、ａＡＰＣを調製する方法も提供するものである。いくつかの実施形態において、方法は、ｘ軸に沿った寸法（ａ）、ｙ軸に沿った寸法（ｂ）及びｚ軸に沿った寸法（ｃ）により定義され、（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の少なくとも１つが他の寸法（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の少なくとも１つに等しくない、非対称形状を有する３次元のマイクロ粒子又はナノ粒子、並びにＴ細胞の１つ又は複数のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と相互作用することができる１つ又は複数の分子を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を調製する方法であって、（ａ）複数のマイクロ粒子又はナノ粒子を準備又は調製するステップと、（ｂ）複数のマイクロ粒子又はナノ粒子を含むフィルムを調製するステップと、（ｃ）複数のマイクロ粒子又はナノ粒子を含むフィルムを延伸して、非対称形状を有する複数の３次元のマイクロ粒子又はナノ粒子を形成するステップと、（ｄ）非対称形状を有する複数の３次元のマイクロ粒子又はナノ粒子を収集するステップと、（ｅ）非対称形状を有する複数の３次元のマイクロ粒子又はナノ粒子にＴ細胞の１つ又は複数のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と相互作用することができる１つ又は複数の分子を結合させるステップとを含む方法である。いくつかの実施形態において、フィルムは、延伸される前に加熱する。
【００８０】
他の実施形態において、現在のところ達成されているものより大きい表面密度を有する超高密度リガンド被覆粒子を形成することができる。これらの粒子は、マイクロ粒子又はナノ粒子を非対称形状に延伸し、機能性リガンドを粒子に加え、粒子を緩和させて部分的又は完全に元の球体の形状に戻すことによって形成することができる。例えば、複数の３次元のマイクロ粒子又はナノ粒子を緩和させて部分的又は完全に球体又はほぼ球体の形状に戻すことができる。楕円体の場合、パラメーター（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）は、「ほぼ球体の形状」にほぼ等しい。
【００８１】
これらの方法の１つの実施形態の反応スキームを図１７に示す。ステップ（１）において、ＳＨ−ＰＥＧ−ＮＨ２分子をマレイミド活性化ストレプトアビジンに加えて、ストレプトアビジン−ＰＥＧ−ＮＨ２分子を形成する。ステップ（２）は、ストレプトアビジン−ＰＥＧ−ＮＨ２へのビオチニル化ペプチド／抗体／ＨＬＡ−Ｉｇ二量体の添加を含む。ステップ（３）において、分子のＰＥＧ部分をＥＤＣを用いて楕円形ディスクＰＬＧＡ又は他のＣＯＯＨ末端ポリマーにコンジュゲートさせる。最後に、温度を上昇させて、楕円形ディスクのアスペクト比を低くしてそれを緩和させて部分的又は完全に球体の形状に戻す。この「超高密度」リガンド被覆粒子は、粒子を延伸している間に官能基化されたため、その表面上により多くのリガンドを有する。この方法は、多種多様の粒子及びリガンドについて実施することができる。延伸の後に球体の状態に変化させて戻す又は部分的に戻すことは、粒子を以前の状態に緩和させる熱、化学物質又は他の方法を用いて行うことができる。
【００８２】
したがって、いくつかの実施形態において、今回開示の方法は、複数の３次元のマイクロ粒子又はナノ粒子を緩和させて部分的又は完全に球体の形状に戻す方法を含む。いくつかの実施形態において、緩和は、熱を加えることによって起こる。他の実施形態において、化学物質を複数の粒子に加えて、粒子にそれらの部分的又は完全な元の形状を取り戻させることができる。
【００８３】
ＩＶ．フィルムを延伸するための装置
他の実施形態において、今回の開示内容は、フィルムを延伸するための装置を提供するものであり、装置は、フィルムの少なくとも２つの端を固定するように構成され、フィルムと接触する１つ又は複数の表面を有する少なくとも第１及び第２のブロックを含み、少なくとも第１及び第２のブロックは、互いに平行に、また少なくとも２つの平行ロッドと垂直に且つ操作上連通するように配置され、少なくとも第２のブロックは、第１のブロックに比べて選択的に少なくとも２つの平行ロッドに沿って位置決めされるように構成されており、装置は、（ｉ）第２のブロックに取り付けられたコード及び（ｉｉ）コードに取り付けられたネジの１つ以上をさらに含み、それらのそれぞれが、第２のブロックを、第１のブロックに比べて選択的に少なくとも２つの平行ロッドに沿って位置決めするように構成されている。
【００８４】
いくつかの実施形態において、装置は、少なくとも２つの平行ロッドと操作上連通する１つ又は複数のクッシング（cushing）をさらに含む。今回開示の装置の他の実施形態において、第１及び第２のブロックは、フィルムの少なくとも２つの端を固定することを容易にするための少なくとも１つの模様面を含む。他の実施形態において、少なくとも第１及び第２のブロックは、フィルムと接触する１つ又は複数の表面と操作上連通する１つ又は複数のゴムパッドをさらに含む。
【００８５】
Ｖ．定義
特定の用語を本明細書で用いているが、それらは、一般的及び説明的な意味でのみ用いるものであり、限定の目的のためではない。特に定義しない限り、本明細書で用いるすべての技術及び科学用語は、この今回の開示内容が属する技術分野の技術者により一般的に理解されているのと同じ意味を有する。
【００８６】
長年にわたる特許法条約に従って、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という語は、特許請求の範囲を含む、本明細書において用いられる場合、「１つ又は複数」を意味する。したがって、例えば、「被験体（ａ  ｓｕｂｊｅｃｔ）」への言及は、文脈が明確にそれと反対（例えば、複数の被験体）であるなどでない限り、複数の被験体を含む。
【００８７】
本明細書及び特許請求の範囲を通して、「包含する」、「を包含する」という用語は、文脈上他の状態が要求される場合を除いて、非排他的意味で用いる。同様に、「含む」という用語及びその文法上の変形形態は、一覧における事項の列挙が示された事項に置き替え又は加えることができる他の同様の事項の除外に至らないように、非限定的であるものとする。
【００８８】
本明細書及び添付の特許請求の範囲の目的のために、特に示さない限り、量、サイズ、寸法、割合、形状、処方、パラメーター、百分率、パラメーター、数量、特性を表すすべての数並びに本明細書及び特許請求の範囲で用いる他の数値は、「約」という用語が値、量又は範囲とともに明示的に出現しないことがあるとしても、すべての例において「約」という用語により修飾されていると理解すべきである。したがって、それに反するものとして示されない限り、以下の明細及び添付の特許請求の範囲に示される数値パラメーターは、正確でなく、また正確である必要はないが、許容誤差、換算計数、丸め、測定誤差など、並びに今回の開示内容により得ようとする所望の特性によって決まる当業者に公知の他の因子を反映して、近似であり、且つ／又は所望のようにより大きく若しくはより小さいことがあり得る。例えば、値に言及する場合の「約」という用語は、指定される量から、いくつかの実施形態において±１００％、いくつかの実施形態において±５０％、いくつかの実施形態において±２０％、いくつかの実施形態において±１０％、いくつかの実施形態において±５％、いくつかの実施形態において±１％、いくつかの実施形態において±０．５％、いくつかの実施形態において±０．１％の変動を含むことを意味し得るが、それらの変動は開示の方法を実施する、及び、開示の組成物を用いるのに適切である。
【００８９】
さらに、「約」という用語は、１つ若しくは複数の数又は数値範囲に関して用いる場合、ある範囲内及び示される数値の上下の境界を拡大することにより当範囲を変更するすべての数を含む、すべてのそのような数を意味すると理解すべきである。端点による数値範囲の列挙は、範囲内のすべての数、例えば、当範囲内に含まれる、その端数を含む、全整数（例えば、１〜５の列挙は、１、２、３、４及び５並びにその端数、例えば、１．５、２．２５、３．７５、４．１などを含む）及び当範囲内のあらゆる範囲を含む。
【００９０】
実施例
以下の実施例は、今回の開示内容の代表的な実施形態を実施するための手引きを当業者に提供するために含めた。本開示及び当分野の技術の一般的水準に照らして、当業者は、以下の実施例が例示的なものにすぎず、今回の開示内容の範囲から逸脱することなく多くの変更形態、修正形態及び改変形態を用いることができることを十分に理解することができる。以下の実施例は、例示の目的で提示するものであって、限定の目的のためではない。
【実施例１】
【００９１】
マイクロ粒子の製造
ポリ（ラクチド−グリコリド）（ＰＬＧＡ）マイクロ粒子は、２００ｍｇの酸末端ＰＬＧＡ（５０：５０ＬＡ／ＧＡ、ＭＷ３８，０００〜５４，０００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を５ｍｌのジクロロメタン（ＡＣＳグレード、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に溶解することにより調製した。次いで、溶解ＰＬＧＡを５０ｍＬの氷冷１％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）に１滴ずつ加え、これを５，０００ｒｐｍでホモジネートした。１滴ずつ加えた後、溶液をさらに１分間ホモジネートし、次いで、１００ｍＬの０．５％ＰＶＡの溶液に加え、これを低温室（４℃）内で５００ｒｐｍで撹拌した。溶媒の蒸発を可能にするために４時間撹拌した後、粒子を遠心分離し（４０００ｒｐｍで５分間）、３回洗浄し、０．５ｍＬの脱イオン水に再懸濁し、凍結乾燥した。
【実施例２】
【００９２】
フィルムの形成及び粒子の延伸
凍結乾燥マイクロ粒子を、１０重量％のＰＶＡ及び２重量％のグリセロールを含む溶液に５ｍｇ／ｍＬ（粒子／ｍＬ溶液）で加えた。次いで、フィルムを平準台上に移し、化学フード内で一夜乾燥した。室温で一夜乾燥後、フィルムのストリップを切り取り、ロッド上を摺動させるか又はコードを引くことによって分離することができる２つのブロックからなる延伸装置にのせた（図１８Ａ〜１８Ｄ）。
【００９３】
図１８Ａ〜１８Ｄを参照すると、これらは、代表的な延伸装置１８００である。フィルム１８４０に成型した粒子（直前に述べた）を、フィルム１８４０を加熱し、ブロック１８１０ａ及び１８１０ｂを分離することによって延伸する。延伸装置１８００は、ブロック１８１５も含む。いくつかの実施形態において、ブロック１８１０ａ、１８１０ｂ及び１８１５は、アルミニウム製である。ブロック１８１０ａ及び１８１０ｂは、それらを物理的に引き離すか又はコード１８３０を引くか又はひいてはコード１８３０を引くこととなる、ネジ１８３５をねじることによって、ロッド１８２０上を摺動する。いくつかの実施形態において、ロッド１８２０は、アルミニウム製である。
【００９４】
いくつかの実施形態において、延伸装置１８００は、ブロック１８１０ｂをロッド１８２０に沿って円滑に摺動させ、摩擦を減少させるためのクッシング（図１８Ｃにおける要素Ａ）を含む。いくつかの実施形態において、クッシングは、プラスチック製である。いくつかの実施形態において、延伸装置１８００は、フィルム１８４０上の把持を改善し、滑りを低減するための模様クランプ面（図１８Ｃにおける要素Ｂ）を含む。いくつかの実施形態において、延伸装置１８００は、フィルム１８４０の圧力を分散させ、裂けを防ぐためのゴムパッド（図１８Ｃにおける要素Ｃ）を含む。
【００９５】
図１８Ｃに示す追加の要素Ａ〜Ｃを用いて完全に組み立てられたときの延伸装置１８００は、図１８Ｄに見ることができる。
【００９６】
図１８Ａ〜１８Ｄに示す延伸装置１８００は、フィルムを一方向に延伸するために用いることができる。当業者は、他の方向へのフィルムの延伸を可能にするために追加のブロック及びロッドを延伸装置１８００に加えることができることを認識するであろう。
【００９７】
代表的な実施形態において、フィルム及び特別注文延伸装置を９０℃のオーブンに１０分間入れ、次いで、オーブン内で２つのブロックを分離させることによってフィルムを所望の延伸比までゆっくりと延伸した。延伸後、フィルムを室温に冷却した。フィルムから延伸片を切り取り、１０ｍＬの脱イオン水に溶解し、次いで、遠心分離し（４０００ｒｐｍで５分間）、３回洗浄し、最後に２００μＬの脱イオン水に再懸濁し、凍結乾燥した。「非延伸」粒子も同じ方法で、すなわち、延伸粒子と一緒に加熱したが、単に延伸せずに調製した。
【実施例３】
【００９８】
ＭＨＣ−Ｉｇ二量体の調製
述べたように、可溶性ＭＨＣ−Ｉｇ二量体を調製し、ペプチドを負荷した（Ｓｃｈｎｅｃｋ  Ｊ．Ｐ．、Ｊ．Ｅ．  Ｓｌａｎｓｋｙ、Ｓ．Ｍ．  Ｏ’Ｈｅｒｒｉｎ及びＴ．Ｆ．  Ｇｒｅｔｅｎ、２００１、Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ＭＨＣ−Ｉｇ  ｄｉｍｅｒｓ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｊｏｈｎ  Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎ．．．［ｅｔ  ａｌ．］、Ｃｈａｐｔｅｒ  １７：Ｕｎｉｔ  １７．２）。
【００９９】
手短に述べると、Ｄｂ−Ｉｇ分子を温和な酸性（ｐＨ＝６．５）条件下でストリップし、４０倍モル過剰のペプチド及び２倍モル過剰のヒトβ２ミクログロブリンの存在下でリフォールディングさせた。ペプチドＧＰ１００（ＫＶＰＲＮＱＤＷＬ；「同種」ペプチド）及びＡＳＮ（ＡＳＮＥＮＭＥＴＨ；「非同種」ペプチド）は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）から購入した。タンパク質濃度は、ラベリングの後にサイズ排除高速液体クロマトグラフィーにより測定した。
【実施例４】
【０１００】
ａＡＰＣの合成
延伸及び非延伸マイクロ粒子をカップリング緩衝液（０．１Ｍ  ＭＥＳ  ｐＨ６．０）に再懸濁し、ＥＤＣ（１−エチル−３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及びスルホ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド）により活性化した。代表的な例として、５ｍｇのマイクロ粒子を１ｍＬのカップリング緩衝液に再懸濁し、マルチチューブボルテックスミキサー（ＶＷＲ）で１０００ｒｐｍで１５分間にわたり１０ｍｇのＥＤＣ及び１３ｍｇのスルホ−ＮＨＳにより活性化した。次いで、活性化マイクロ粒子を遠心分離し、上清を除去し、ａＡＰＣを１ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に再懸濁し、カップリングのために５ｍＬガラスシンチレーションバイアルに移した。タンパク質（ＭＨＣ中二価同種（＋）又は非同種（−）ペプチド及び抗ＣＤ２８抗体）の添加後、反応を低温室（４℃）内で４時間進行させた。４時間後に、ａＡＰＣを遠心分離し、ＰＢＳで２回洗浄し、次いで、再び遠心分離し、２００μＬの０．２μｍろ過滅菌済み９０ｍｇ／ｍＬエンドトキシン不含有スクロース溶液に再懸濁し、一夜凍結乾燥した。
【実施例５】
【０１０１】
ａＡＰＣの特徴付け
ＳＥＭによるサイズ及びアスペクト比の測定
凍結乾燥粒子試料を、ＳＥＭアルミニウム試料台上に装着した導電性カーボンテープ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ）上に広げた。試料をクロムスパッターコーターでスパッターコーティングし、Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｃｏｒｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ施設におけるＬｅｏ／Ｚｅｉｓｓ電界放射型ＳＥＭで撮像した。粒子径及びアスペクト比をＩｍａｇｅＪソフトウエアを用いて定量化した。球形粒子については、各粒子について単一直径を測定した。非球形粒子については、２つの直径（長軸及び短軸）を測定し、２つの値の除算によりアスペクト比を計算した。
【０１０２】
表面タンパク質の定量及び放出
表面タンパク質の定量は、予め活性化された２倍延伸又は球体ＰＬＧＡマイクロ粒子の表面への非標識抗ＣＤ２８ｍＡｂ及び蛍光標識ＭＨＣ−ＩｇＧ二量体の４℃で４時間にわたるコンジュゲーションにより実施した。これらのａＡＰＣを遠心分離し、３回洗浄し、次いで、Ｓｙｎｅｒｇｙ  ２プレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）でそれらの蛍光の特徴付けを行った。表面からの放出は、１０ｍｇのａＡＰＣ（延伸、非延伸）を５００μＬのＰＢＳ中で標識二量体とともに３７℃で１週間インキュベートすることによって特徴付けた。３日目及び７日目に、粒子を遠心分離し、上清を除去し、後の分析のために保存した。７日目に、上清を除去し、粒子を再懸濁し、蛍光の特徴付けを行った。
【０１０３】
細胞内サイトカイン染色
ａＡＰＣによる一次刺激後６日目に、ペプチドパルスＣ５７Ｂ１／６ｊ脾細胞による再惹起により、Ｔ細胞の機能活性を評価した。脾細胞に表示濃度のペプチドを３７℃で２時間にわたりパルスし、次いで洗浄した。０．２μＬのＧｏｌｇｉＰｌｕｇ、０．２μＬのＧｏｌｇｉＳｔｏｐ及び抗ＣＤ１０７ａ−ｆｉｔＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）の存在下で丸底９６ウエルプレートで２００，０００個のａＡＰＣ活性化Ｔ細胞を完全ＲＰＭＩ中で２００，０００個の脾細胞とともに４時間インキュベートした。細胞を洗浄し、製造業者の指示に従ってＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて固定し、次いで、抗ＩＦＮγＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色した。フローサイトメトリーによりサイトカイン染色を評価し、ＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ）で非刺激対照との比較によりサイトカイン機能性細胞の頻度を評価した。
【０１０４】
ａＡＰＣ−Ｔ細胞コンジュゲートの形成の評価
封入５（６）−カルボキシ−テトラメチルローダミン色素（ＴＡＭＲＡ、Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を含むＰＬＧＡマイクロ粒子を共焦点撮像のために合成した。ＴＡＭＲＡをジクロロメタンに１ｍｇ／ｍＬで溶解した。２００ｍｇの酸末端ＰＬＧＡを４．９ｍＬのＤＣＭに溶解し、１００μＬのＴＡＭＲＡ溶液をＰＬＧＡ  ＤＣＭ相に加えた。粒子の合成は、他の点では上記のシングルエマルジョン粒子と同じプロトコールに従った。これらの標識粒子を次にフィルムに成型したが、フィルムの延伸並びにその後の延伸及び非延伸ＴＡＭＲＡ負荷粒子からのａＡＰＣの合成は、前の通りに遂行した。１×１０６個のＣＦＳＥ標識Ｔ細胞を１ｍｇの延伸又は非延伸ａＡＰＣとともにＮｏ．１．５ガラス底皿（ＭａｔＴｅｋ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＭＡ）中で３７℃で６０分間インキュベートした。画像は、Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ＦａｃｉｌｉｔｙにおいてＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０ＭＥＴＡ（Ｚｅｉｓｓ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）レーザー走査型顕微鏡で４０倍で取得した。
【０１０５】
ａＡＰＣのｉｎ  ｖｉｖｏ活性
皮下Ｂ１６黒色腫腫瘍予防マウスモデル（図９ａ）を作製した。動物にナイーブＴ細胞（−１日目、２×１０６個細胞／動物）を静脈内（ｉ．ｖ．）に、粒子（０日目、２ｍｇ粒子／動物）を側腹部の皮下（ｓ．ｃ．）に前注射し、次いで２００，０００個の腫瘍細胞を後肢（３日目）に注射した。第２の粒子バッチ（６日目、２ｍｇ粒子／動物）のその後のｓ．ｃ．注射により応答を増強させ、実験中の腫瘍の成長を外側キャリパーで測定することにより追跡した。腫瘍サイズが２００ｃｍ２に達したならば、マウスを屠殺した。治療群は、延伸及び非延伸同種ａＡＰＣ（ｎ＝８）からなっており、対照群は、延伸非同種（ｎ＝８）及びＴ細胞単独群（ｎ＝５）からなっていた。図９ｂに示す腫瘍サイズの統計処理をＴｕｋｅｙ事後検定を伴う１元配置ＡＶＯＶＡにより実施した。図９ｃに示す生存解析のための統計処理を対数順位（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定を用いて実施した。
【実施例６】
【０１０６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＣＴＬ誘導及びＣＦＳＥ希釈
用いたＴ細胞は、低張性溶解によるＲＢＣの枯渇の後にホモジナイズしたマウス脾臓から得た。細胞傷害性リンパ球は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ（Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）製のＣＤ８陰性単離キット及び磁気濃縮カラムを用いて単離し、必要な場合、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で３７℃で１５分間標識し、次いで、広範に洗浄した。指示量及び用量の細胞及び粒子を混合し、ヒト血漿から収集したＴ細胞因子、サイトカインカクテルを添加した完全ＲＰＭＩ培地中で４〜７日間培養した（Ｄｕｒａｉ  Ｍ．ら、Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｕｓｉｎｇ  ＨＬＡ−Ｉｇ  ｂａｓｅｄ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ（ａＡＰＣ）、Ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：ＣＩＩ．５８：２０９〜２０頁（２００９））。細胞増殖を手作業による細胞の計数により定量化し、倍率変化データを得るために最終Ｔ細胞数を初期Ｔ細胞数で割った。
【実施例７】
【０１０７】
補足計算
長さａ、ｂ、ｃの決定
一方向に延伸した楕円体について、全体積は球体から保存されるので、短軸の長さは、
【０１０８】
【数１】
2015500296.tif 000004
により長軸の長さに関連付けられる。ａ、ｂ、ｃ、１及び２の同一性を図１６に示す。
【０１０９】
偏長楕円体の表面積
幾何学的形状は偏長楕円体（ａ＞ｂ＝ｃ）に相当するので、楕円体の表面積は、以下の式（Ｗｅｉｓｓｔｅｉｎ  Ｅ．Ｗ．、Ｐｒｏｌａｔｅ  Ｓｐｈｅｒｉｏｄ  ｉｎ  ＭａｔｈＷｏｒｌｄ−Ａ  Ｗｏｌｆｒａｍ  Ｗｅｂ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（２０１２））：
【０１１０】
【数２】
2015500296.tif 000005
ここで
【０１１１】
【数３】
2015500296.tif 000006
により求めることができる。次に、この表面積を半径１を有する球体の表面積により標準化した。
【０１１２】
等価タンパク質密度
総タンパク質含量が一定に保持された状態の等価タンパク質密度は、標準化表面積の逆数（密度＝１／ＳＡ）である。
【０１１３】
曲率半径
曲率半径は、当該点において観察される曲線と同じ曲率を有する円の半径である。したがって、より平坦な曲線については、その平坦性がそれを記述するためにより大きな円を必要とするので、曲率半径は増加する。
【０１１４】
偏球とも呼ばれる扁平楕円体の半径極限（radius extremes）は、赤道半径又は半長軸ａ及び極半径又は半短軸ｂである。楕円は、
【０１１５】
【数４】
2015500296.tif 000007
によりパラメーター的に記述することができる。
【０１１６】
【数５】
2015500296.tif 000008
の形のパラメーター化方程式については、曲率半径は、
【０１１７】
【数６】
2015500296.tif 000009
により計算することができる。ここで、
【０１１８】
【数７】
2015500296.tif 000010
及び 
2015500296.tif 000011
である。したがって、楕円については、次の通りである：
【０１１９】
【数８】
2015500296.tif 000012
Ｗｅｉｓｓｔｅｉｎ  Ｅ．Ｗ．、Ｒａｄｉｕｓ  ｏｆ  Ｃｕｒｖａｔｕｒｅ  ｉｎ  ＭａｔｈＷｏｒｌｄ−Ａ  Ｗｏｌｆｒａｍ  Ｗｅｂ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（２０１２）を参照のこと。
【０１２０】
先端部における曲率半径を計算するには、ｔ＝０が点１（図１６）に対応するので、Ｒａは、楕円の２つの軸としてのａ及びｂを用いて計算することができる。先端部における曲率半径を計算するには、ｔ＝π／２が点２（図１６）に対応するので、Ｒｂは、楕円の２つの軸としてのａ及びｂを用い、変数ｔ＝π／２を代入して計算することができる。したがって、次の通りである。
【０１２１】
【数９】
2015500296.tif 000013
２におけるｂｃ面が既に円によって記述されているので、Ｒｃ＝ｂ＝ｃである。
【実施例８】
【０１２２】
結果及び考察
非球体ａＡＰＣの合成及び特徴付け
図２ａに球体粒子を含むａＡＰＣの概略図を示す。代表的な非限定的実施形態において、ＰＬＧＡマイクロ粒子を最初に製造し、これを次にフィルム延伸法を用いて楕円体に延伸することによって非球体生分解性ａＡＰＣを合成した（図２ｂ及び２ｃ）（Ｙｏｏ  Ｊ．Ｗ．及びＭｉｔｒａｇｏｔｒｉ  Ｓ．、Ｐｏｌｙｍｅｒ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｔｈａｔ  ｓｗｉｔｃｈ  ｓｈａｐｅ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ａ  ｓｔｉｍｕｌｕｓ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０７巻、１１２０５〜１１２１０頁（２０１０））。この方法は、同等の体積を保持しながら、粒子の形状及び表面積の直接的な比較が可能であるという利点がある。図２ｄにＴ細胞と抗原提示細胞との相互作用を示す。
【０１２３】
シングルエマルジョンＰＬＧＡ（５０：５０ＬＡ／ＧＡ、ＭＷ３８，０００〜５４，０００）マイクロ粒子の合成により、４．３μｍの数加重平均直径及び６．７μｍの体積加重平均直径（図２ｆ）を有する球体マイクロ粒子（図２ｅ）が得られた。楕円体マイクロ粒子のアスペクト比（ＡＲ）は、フィルム上に異なる程度の延伸（ＳＴＲ）をかけることによって高度の正確度で制御することができた。この技術は、一方向に引き延ばされた一定の体積の楕円体について予測されたＡＲと経験的に測定されたＡＲ（ＳＥＭにより）との間の高い相関を示す（ＡＲ＝ＳＴＲ１．５）（図２ｇ）。この所見により、粒子の延伸が、得られる粒子の形状を指定する際に柔軟性をもたせることが可能となる実現可能で、制御可能な工程であることがわかる。
【０１２４】
非球体ａＡＰＣ粒子の形状の安定性は、より安定な球体の形状へのそれらの緩和速度を解析することにより特徴付けた。以前の研究で、緩和速度が表面の特性、分子量、ポリマー組成及び温度に依存することが示された（Ｙｏｏ  Ｊ．Ｗ．及びＭｉｔｒａｇｏｔｒｉ  Ｓ．、Ｐｏｌｙｍｅｒ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｔｈａｔ  ｓｗｉｔｃｈ  ｓｈａｐｅ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ａ  ｓｔｉｍｕｌｕｓ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０７巻、１１２０５〜１１２１０頁（２０１０））。高アスペクト比の粒子から製造されたａＡＰＣ粒子についてＰＢＳ中３７℃で１週間にわたる非常にわずかな形状緩和が認められ、選択されたラクチド対グリコリド比を有する非球体ａＡＰＣについて形状の変化が非常に遅いことがわかる（図１０）。この所見は、ここで開示したような親水性表面を有する高アスペクト比のＰＬＧＡの公表された緩和の時間尺度と一致している（Ｙｏｏ  Ｊ．Ｗ．及びＭｉｔｒａｇｏｔｒｉ  Ｓ．、Ｐｏｌｙｍｅｒ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｔｈａｔ  ｓｗｉｔｃｈ  ｓｈａｐｅ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ａ  ｓｔｉｍｕｌｕｓ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０７巻、１１２０５〜１１２１０頁（２０１０））。
【０１２５】
非延伸及び延伸マイクロ粒子を、粒子表面上の遊離カルボキシル基への二量体ＭＨＣ−Ｉｇ融合タンパク質（Ｓｃｈｎｅｃｋ  Ｊ．Ｐ．、Ｊ．Ｅ．  Ｓｌａｎｓｋｙ、Ｓ．Ｍ．  Ｏ’Ｈｅｒｒｉｎ及びＴ．Ｆ．  Ｇｒｅｔｅｎ、２００１、Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ＭＨＣ−Ｉｇ  ｄｉｍｅｒｓ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｊｏｈｎ  Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎ．．．［ｅｔ  ａｌ．］、Ｃｈａｐｔｅｒ  １７：Ｕｎｉｔ  １７．２）及びＣＤ２８に対する活性化（an activating against CD28）のＥＤＣ−スルホ−ＮＨＳ媒介性共有結合によりａＡＰＣに調製した。特徴付け実験については、蛍光標識ＭＨＣ−Ｉｇを用い、蛍光定量法により所定の量のＰＬＧＡの総タンパク質含量を評価した（図２ｈ）。ＰＬＧＡマイクロ粒子は、自己蛍光を発せず、また色素の発光の妨害もしなかった（図１１）。合成時に用いたＭＨＣ−Ｉｇの量を増加させることにより、最大８μｇＭＨＣ−Ｉｇ／ｍｇＰＬＧＡのタンパク質結合が達成された。タンパク質滴定のたびに、約２０％の結合効率が達成され、最終タンパク質含量は、合成時に用いたＭＨＣ−Ｉｇの量に直線的に依存していた（図２ｈ）。さらに、表面上の総タンパク質に関して、非延伸マイクロ粒子と延伸マイクロ粒子との間に有意な差は認められなかった。
【０１２６】
ＰＬＧＡマイクロ粒子のバルクポリマーの分解は薬物送達分野で十分に検討された（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ  Ｓ．Ｎ．ら、Ａ  ｕｎｉｆｉｅｄ  ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｄ  ｂｕｌｋ  ｅｒｏｄｉｎｇ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｍａｔｒｉｃｅｓ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、３０巻、１６５７〜１６６４頁（２００９）、Ｂａｔｙｃｋｙ  Ｒ．Ｐ．ら、Ａ  ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｒｏｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｒｕｇ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ、８６巻、１４６４〜１４７７頁（１９９７）、ｖｏｎ  Ｂｕｒｋｅｒｓｒｏｄａ  Ｆ．ら、Ｗｈｙ  ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｕｎｄｅｒｇｏ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｒｏｓｉｏｎ  ｏｒ  ｂｕｌｋ  ｅｒｏｓｉｏｎ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２３巻、４２２１〜４２３１頁（２００２））が、表面結合タンパク質の放出に対する分解の影響は、十分に研究されていない。ａＡＰＣについては、固定化タンパク質の提示は、Ｔ細胞の活性化のために極めて重要であり、したがって、表面固定化タンパク質の放出を研究することは、重要である（Ｍｅｓｃｈｅｒ  Ｍ．Ｆ．、Ｓｕｒｆａｃｅ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４９巻、２４０２〜２４０５頁（１９９２））。表面分解を明らかにするために、蛍光標識ＭＨＣ−Ｉｇを有する粒子を３７℃で様々な時間インキュベートした。マイクロ粒子の遠心分離により上清を回収し、タンパク質の蛍光により放出されたタンパク質を定量した。球体ａＡＰＣ及び非球体ａＡＰＣの両方について、表面にコンジュゲートされたタンパク質の６０〜７０％が放出され、３０〜４０％がａＡＰＣの表面に残存していた（図２ｉ）。放出プロファイルは、延伸ａＡＰＣと非延伸ａＡＰＣとで有意に異なっていなかった。
【０１２７】
高アスペクト比ａＡＰＣはＴ細胞の増殖を効率的に誘発する
粒子の伸長の影響を評価するために、ｐＭＥＬ  ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞の抗原特異的Ｔ細胞の増幅を誘発するａＡＰＣの能力を測定した。非延伸及び２倍延伸（ＡＲ＝２．８）ａＡＰＣを３種の同種ＭＨＣ−ペプチド密度（４μｇ、１μｇ及び０．５μｇのＤｂ−Ｉｇ  ＧＰ１００／ｍｇＰＬＧＡ）で合成した。最高のタンパク質密度の非同種Ｄｂ−Ｉｇ  ＡＳＮを有する非延伸ａＡＰＣを陰性対照として用いた。ａＡＰＣをｐＭＥＬ  ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞に３種のａＡＰＣ対細胞比（１ｍｇ、０．１ｍｇ及び０．０１ｍｇ  ａＡＰＣ／１００，０００細胞）で加え、４日目にＣＦＳＥ希釈により、７日目に細胞数により増殖を評価した。代表的なＤｂ−Ｉｇ密度（４μｇ  Ｄｂ−Ｉｇ／ｍｇ  ＰＬＧＡ）の４日目のＣＦＳＥ希釈は、各ａＡＰＣ：細胞比について示されている（図３上）が、７日目の増殖倍率データは、ａＡＰＣの形状、ａＡＰＣ：細胞比及びＤｂ−Ｉｇ密度という３つのパラメーターすべてについて示されている（図３下）。
【０１２８】
ａＡＰＣの低い亜飽和用量０．０１ｍｇ／１００，０００細胞において、非球体ａＡＰＣは、ＣＦＳＥ希釈により測定したときＴ細胞の増殖を誘発したが、球体は誘発しなかった（図３上）。この特性は、７日目の細胞数に反映されており、４μｇ又は１μｇ  Ｄｂ−Ｉｇ／ｍｇ  ＰＬＧＡを有する非球体ａＡＰＣのみがそれぞれ２２倍及び１１倍のＴ細胞増幅を誘発した（図３下）。中間ａＡＰＣ：細胞比においては、延伸ａＡＰＣはまた、球体ａＡＰＣより高いレベルのＣＦＳＥ希釈を誘発した（図４ｃ１）。細胞数は、非球体ａＡＰＣが球体粒子と比較して７日目までに総Ｔ細胞増幅の約３倍の増加をもたらしたことを示した（図３ｃ２）。飽和高ａＡＰＣ：細胞比（１ｍｇ  ａＡＰＣ／１００，０００細胞）及び最高Ｄｂ−Ｉｇ密度（４μｇ  Ｄｂ−Ｉｇ／ｍｇ  ＰＬＧＡ）においては、非球体ａＡＰＣと球体ａＡＰＣとの間の差はもはや認められなかった（図３ｄ１及び図３ｄ２）。ａＡＰＣ上のＤｂ−Ｉｇ密度を１μｇ  Ｄｂ−Ｉｇ／ｍｇ  ＰＬＧＡに調節した場合、非球体ａＡＰＣは、しかし、それらの優位を回復し、球体ａＡＰＣより有意に大きなＴ細胞増幅を刺激した。非同種ＭＨＣ−ペプチドを有するａＡＰＣは、ＣＦＳＥ希釈もＴ細胞増殖も誘発しなかった（図３ａ）。したがって、亜飽和用量では、非球体ａＡＰＣは、同等の体積及びＭＨＣ−Ｉｇの量を有する球体ａＡＰＣよりもＴ細胞増幅を誘発するのにより有効であった。
【０１２９】
Ｔ細胞の増幅及び生存率に対する粒子の伸長の効果を評価するために、前述のようにａＡＰＣを調製し、ａＡＰＣをｐＭＥＬ  ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞に４種のａＡＰＣ対細胞比（１．５ｍｇ、１ｍｇ、０．５ｍｇ及び０．１ｍｇ  ａＡＰＣ／１００，０００細胞）で加えた。生存率は、色素排除アッセイ（例えば、トリパンブルー）を用いて測定した。非延伸（図５、上）及び延伸粒子（図５、下）の走査型電子顕微鏡写真を撮影した。培養５日後に増幅（図６Ａ）及び生存率（図６Ｂ）を評価した。結果は、延伸粒子について非延伸粒子と比較して有意により大きい増幅及び生存率を示すものであった。培養７日後に増幅及び生存率を測定した他の実験で、同様な結果が示された（図７Ａ及び７Ｂ）。
【０１３０】
１つの特定の理論に拘束されることを望むものではないが、ａＡＰＣの伸長に起因する増殖活性の増大は、粒子表面上に提示されたＭＨＣの密度の変化並びに粒子の長軸上の細胞の接触のための表面積の増加の結果であると考えられる。しかし、延伸ａＡＰＣの存在が非延伸ａＡＰＣと比較してタンパク質密度を低下させた（表１）たが、Ｔ細胞の活性化の増大が密度の低下に関連している（Ｂｕｌｌｏｃｋ  Ｔ．Ｎ．Ｊ．ら、Ａｎｔｉｇｅｎ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ  ｂｙ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｔｈｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ａｎｄ  ａｖｉｄｙｔｙ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ、ｍｅｍｏｒｙ  ａｎｄ  ｒｅｃａｌｌ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１７０巻、１８２２〜９頁（２００３））。この所見は、延伸粒子が１μｇ／ｍｇ延伸ａＡＰＣについて１１倍の増幅を誘発する、ａＡＰＣの０．０１ｍｇ用量での増殖、それらがより低い（０．５μｇＭＨＣ−Ｉｇ／ｍｇ非延伸ａＡＰＣの１．７倍の増幅）又はより高い（４μｇＭＨＣ−Ｉｇ／ｍｇ非延伸ａＡＰＣの１．３倍）密度のタンパク質を提示するかどうか問わず非延伸粒子と比べて明らかな増殖の優位を検討することによって確認される。再び、１つの特定の理論に拘束されることを望むものではないが、延伸ａＡＰＣにより媒介された増殖の増大は、表面タンパク質の密度よりもむしろ粒子の幾何学的形態に起因すると考えられる。
【０１３１】
【表１】
2015500296.tif 000014
【０１３２】
アスペクト比の増加及びＴ細胞の増幅
Ｔ細胞の刺激に対する延伸の重要性をさらに検討するために、ＰＬＧＡ粒子を合成し、様々な量を延伸し、ａＡＰＣに調製した。形状ＡＲの増加とＴ細胞の増殖との間の相関（図４）が認められた。Ｔ細胞数の最大の増加は、アスペクト比を１．５倍延伸ａＡＰＣから２倍延伸ａＡＰＣに増加させることにより、約２倍の増幅から約２０倍のＴ細胞の増幅まで認められた（図４ａ）。しかし、ＡＲをさらに３．５倍まで増加させることにより、ＣＦＳＥ希釈によって明らかなようにより大きな百分率の細胞が有意により多くの回数の分裂を経験したという結果となった（図４ａ及び図４ｂ）。細胞世代の数によって分類した場合（図４ｂ）、非レスポンダー（世代０〜１）の割合がＡＲの増加とともに漸進的に低下し、３．５倍延伸ａＡＰＣで１１％にすぎなかった。４〜５又は６〜７回の分裂を受けた細胞の数も加えられたフィルムの延伸の０．５倍の増加のたびごとに増加している。この効果もａＡＰＣの非常に高い用量で飽和性であった（図１２）。したがって、亜飽和用量において、ａＡＰＣのアスペクト比の増加により、３．５倍延伸ａＡＰＣ（ＡＲ６．６）まで一貫してＴ細胞増幅が増加し、印加延伸が１．５倍から２倍になったときに総Ｔ細胞増幅数の最大の改善が認められた。
【０１３３】
活性化Ｔ細胞の特徴付け
Ｔ細胞が抗原により再惹起された場合に産生されるサイトカイン及び細胞傷害性マーカーの量及び送達により反映される、Ｔ細胞の質は、応答を評価するための重要なパラメーターである（Ｓｅｄｅｒ  Ｒ．Ａ．ら、Ｔ  ｃｅｌｌ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｍｅｍｏｒｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｓｉｇｎ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、８巻、２４７〜２５８頁（２００８））。増幅Ｔ細胞集団の機能状態を判定するために、ペプチドパルス脾細胞を用いてａＡＰＣ活性化Ｔ細胞を再惹起し、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイにおいて脱顆粒マーカーであるＣＤ１０７ａを測定することに加えて、重要なサイトカインであるＩＮＦγの産生を測定した。増殖により機能を追跡したところ、ＩＮＦγ又はＣＤ１０７ａ発現（図１３）により判定されたように、球体又は非球体ａＡＰＣにより発生したＴ細胞の質の有意な差は認められなかった。さらに、ａＡＰＣの等しい用量（非球体ａＡＰＣでより高い増殖をもたらした）の後のＴ細胞の質を比較した場合又は等しい増殖（非球体ａＡＰＣのより低い用量による）を比較した場合、有意な差は認められなかった。
【０１３４】
高アスペクト比の非球体ａＡＰＣはＴ細胞コンジュゲート形成を増大させる
ＡＰＣ上の抗原認識は、Ｔ細胞とＡＰＣｓの両方の協調的な細胞骨格再配列を誘発し、これが、それらの細胞膜の密接な接触をもたらすことが公知である。結果として生ずる相互作用は、Ｔ細胞の活性化を媒介し、撮像又はフローサイトメトリーにより視覚化するとき、細胞−細胞コンジュゲートと呼ばれる（Ｋｒｏｇｅｒ  Ｃ．Ｊ．及びＡｌｅｘａｎｄｅｒ−Ｍｉｌｌｅｒ  Ｍ．Ａ．、Ｃｕｔｔｉｎｇ  ｅｄｇｅ：  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｃｌｏｎｅｓ  ｐｏｓｓｅｓｓ  ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ  ｉｎｔｏ  ｂｏｔｈ  ｈｉｇｈ−  ａｎｄ  ｌｏｗ−ａｖｉｄｉｔｙ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１７９巻、７４８〜７５１頁（２００７））。
【０１３５】
Ｔ細胞−ａＡＰＣコンジュゲートの形成を評価するために、ナイーブＴ細胞を球体又は非球体ａＡＰＣとともに３７℃でインキュベートした。１時間のインキュベーションの後に共焦点撮像により細胞−粒子相互作用を視覚化した。同種ＭＨＣ／ペプチドを有する延伸ａＡＰＣの存在下では、Ｔ細胞膜は、粒子の長軸（短軸でない）と密接に接触した状態となり、コンジュゲート形成の特徴を示す、Ｔ細胞の「キャップ」Ｔ細胞の外観をもたらすことが認められた（図８ａ）。コンジュゲート形成は、非延伸（図８ｂ）又は延伸（図８ｃ）ａＡＰＣの存在下でインキュベートしたＴ細胞について認められた。重要なことに、非同種ＭＨＣ／ペプチドを有する球体ａＡＰＣも非球体ａＡＰＣもキャップ形成を誘発しなかった（図８ｃ、ｄ）ので、コンジュゲート形成は、同種抗原の認識によって推進される過程であった。定量化した場合、コンジュゲート形成は、延伸ａＡＰＣで約２．５倍頻度が高く、延伸ａＡＰＣで４．６±０．９％であったのに対して非延伸ａＡＰＣで１．８±０．４３％であった（ｐ＝０．０１）。
【０１３６】
低速度撮像により、ａＡＰＣ長軸に対するＴ細胞の表面の顕著な再配向及び再配列が明らかになった。最初に、Ｔ細胞は、短軸に沿ってａＡＰＣ粒子と接触するように見えるが、時間とともに長軸に沿って移動し、非球体ａＡＰＣの長軸に対してその膜を再配置する（図８ｆ）。非球体ａＡＰＣの長軸に対する膜の再配向と整合は、非球体ａＡＰＣによって提示される平坦な表面に対する選好を強く示唆するものとなっている。したがって、非球体ａＡＰＣが球体ａＡＰＣと比較してＴ細胞との生体模倣相互作用の増大をもたらすことが観察される。
【０１３７】
高アスペクト比の非球体ａＡＰＣはｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍の殺滅を促進する
皮下Ｂ１６黒色腫腫瘍予防モデルを用いて、高アスペクト比のａＡＰＣのｉｎ  ｖｉｖｏでの活性を試験した。この場合、粒子の皮下注射を腫瘍の注射の３日前に行い、３日後に２回目の投与を行った（図９ａ、概略図参照）。延伸又は非延伸同種粒子による治療は、対照非同種粒子又はＴ細胞単独の投与を受けた対照と比較して腫瘍サイズの有意な低下をもたらした（図９ｂ）。１９日目までに、延伸同種粒子投与の腫瘍は、４２．５±１４．９ｍｍ２のサイズに達したのに対して、同種非延伸では９０．５±３３．８ｍｍ２、非同種延伸では１６４．５±２８．６ｍｍ２、Ｔ細胞単独投与マウスでは１５４．４±３５．４ｍｍ２であった。このように、延伸同種粒子投与は、非延伸同種粒子よりも腫瘍のサイズを大きく低下させたが、この効果は、統計的有意性を達成しなかった（ｐ＝０．１３）。全実験の期間にわたる腫瘍成長の曲線下面積（ＡＵＣ）は、同様なパターンを示し、腫瘍成長が全体で４４．３±１５．６ｍｍ２であったのに対して、同種非延伸では１０５．５±３４．７ｍｍ２、非同種延伸では２５１．０±４６．６ｍｍ２、Ｔ細胞単独投与マウスでは２３８．０±４６．６ｍｍ２であった。
【０１３８】
しかし、延伸同種ａＡＰＣは、非延伸同種ａＡＰＣ（図９ｃ）（ｐ＝０．０５）並びに延伸非同種対照ａＡＰＣ（ｐ＝０．００４）と比べて生存率の有意な増加をもたらした。同種延伸群の２匹のマウス（２５％）は、１９日目までに腫瘍を完全に除去し、実験期間中生存していた。このことは、他の治療又は対照群のいずれにおいても起こらなかった。さらに、延伸ａＡＰＣ治療は、腫瘍の成長のかなりの遅延をもたらし、他の３群の１９日と比較して、どのマウスも腫瘍の注射の２２日後まで屠殺を必要とする実質的な腫瘍負荷に達しなかった。
【０１３９】
これらの結果により、球体対照と比較して形状のみが異なる（且つ体積もタンパク質含量は異ならない）、高いアスペクト比の無細胞性ａＡＰＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏだけでなく、ｉｎ  ｖｉｖｏでも抗原特異的活性化の増大を引き起こし、この活性化の増大は、腫瘍負荷の低減及び生存率の増加につながる、機能的意義を有することが示された。
【０１４０】
ポリマーマトリックスからのタンパク質薬物の放出
今回開示の人工細胞は、それらがポリマーマトリックス内からタンパク質薬物を放出することができるように設計することもできる。原理の証明として、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）負荷球体マイクロ粒子をダブルエマルジョン法を用いて合成した。これらのＢＳＡ負荷粒子をフィルムに埋め込み、延伸した。非延伸及び延伸粒子からのＢＳＡ（ジェネリックタンパク質薬物のモデル）の放出を図１４に示す。
【０１４１】
ナノサイズの人工細胞
原理上は、ナノサイズの人工細胞を得るためにナノサイズの粒子の形状を変化させることができる。より大きな程度のナノサイズである粒子への移行の１つの可能な便益は、ミクロンサイズの人工細胞と比較して、ｉｎ  ｖｉｖｏでの静脈内投与の有用性の改善であろう。原理の証明として、シングルエマルジョン法を用いてＰＬＧＡナノ粒子を合成した。この場合。最初のエマルジョンは、油水溶液の１分間の超音波処理により達成された。得られたナノ粒子は、２４０ｎｍの数平均流体力学的直径を有していた（図１５ａ）。今回開示のフィルム延伸法は、ＳＥＭ（図１５ｃ）により像を取得できる、延伸ＰＬＧＡナノ粒子を得るために用いることができる。人工細胞は、ミクロンサイズの非球体粒子について行われるように、様々なタンパク質を表面に結合させることによって得ることができる。
【０１４２】
要約
癌免疫療法における考慮すべき重要な事項は、依然として、抗原（Ａｇ）特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の効率的な刺激である。活性化エフェクターＡｇ特異的ＣＴＬの発生のためのｉｎ  ｖｉｖｏでの重要な相互作用は、樹状細胞又はマクロファージなどの抗原提示細胞とナイーブＴ細胞との相互作用である。ＣＴＬの刺激のための無細胞システムの開発に際して、以前の研究は、ＡＰＣとＴ細胞との間の相互作用に関与する重要なタンパク質に主として重点をおいたものであり（Ｏｅｌｋｅ  Ｍ．ら、Ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ＨＬＡ−Ｉｇ−ｃｏａｔｅｄ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、９巻、６１９〜６２５頁、ＰＭＩＤ：１２０７４３８５（２００３）、Ｕｇｅｌ  Ｓ．ら、Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｌｏｗ−ａｖｉｄｉｔｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６９巻、９３７６〜９３８４頁（２００９）、Ｓｔｅｅｎｂｌｏｃｋ  Ｅ．Ｒ．及びＦａｈｍｙ  Ｔ．Ｍ．、Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ、１６巻、７６５〜７７２頁、ＰＭＩＤ：１８３３４９９０（２００８）、Ｃｕｒｔｓｉｎｇｅｒ  Ｊ．ら、Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ  ｆｏｒ  ｓｔｕｄｙｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｇａｎｄ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０９巻、４７〜５７頁（１９９７）、Ｍａｕｓ  Ｍ．Ｖ．ら、Ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｄ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ＡＰＣｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＣＤ２８  ａｎｄ  ４−１ＢＢ、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２０巻、１４３〜１４８頁（２００２）、Ｓｔｅｅｎｂｌｏｃｋ  Ｅ．Ｒ．ら、Ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｎ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ：  ｍｏｄｕｌａｒ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ、ａｄａｐｔａｂｌｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ、９巻、４５１〜４６４頁、ＰＭＩＤ：１９３４４２８２（２００９）、最近の研究は、この重点をサイトカインの傍分泌放出に拡大したものであった（Ｓｔｅｅｎｂｌｏｃｋ  Ｅ．Ｒ．ら、Ａｎ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｗｉｔｈ  ｐａｒａｃｒｉｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ＩＬ−２  ｉｍｐａｃｔｓ  ｔｈｅ  ｍａｇｎｉｔｕｄｅ  ａｎｄ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２８６巻、３４８８３〜３４８９２頁（２０１１））。発明者らの知る限りでは、すべての以前のシステムは、それらのシステムとしての球体ａＡＰＣの使用を検討したものであった。
【０１４３】
しかし、活性化樹状細胞とナイーブＴ細胞との間の生物学的相互作用は、明らかに、相互作用する２つの球体によって最も適切にモデル化される相互作用ではない。今回の開示内容は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴ細胞の増殖及びｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍殺滅を誘発するこれらの無細胞性の生分解性ａＡＰＣの能力に対するａＡＰＣの一方向延伸の効果を評価するものであった。亜飽和ａＡＰＣ用量で、高アスペクト比の非球体ａＡＰＣは、球体ａＡＰＣよりも有意に高い活性を示し、非球体ａＡＰＣのアスペクト比を増加させた場合、ＡＲ６．６まで活性の増大があることが示されている。この活性の増大は、延伸粒子が延伸非同種ａＡＰＣ（ｐ＝０．００４）並びに同種球体ａＡＰＣ（ｐ＝０．０５）と比較してマウスの生存率の増加を示した、ｉｎ  ｖｉｖｏにも反映されていた。
【０１４４】
粒子の延伸により、各延伸及び非延伸粒子がより高い表面積をもたらす粒子の延伸を有していた（表１ｂ）ので、同等の総タンパク質含量を有する延伸粒子は、タンパク質密度の低下を有していた（表１ｃ）。しかし、延伸及び非延伸粒子の両方について総タンパク質含量とひいてはタンパク質密度の低下は、同等の用量における増殖の低下をもたらした（図３ｂ２〜ｄ２）が、これは、延伸粒子の有利性が表面タンパク質密度の低下に起因しないことを示している。しかし、３．５倍延伸粒子で最大５０％粒子の正味表面積が増加するが、粒子を延伸することにより、粒子の長軸に沿った表面の平坦性も増加し、曲率半径が同じ範囲にわたって２３倍増加する（表１ｃ）。１つの特定の理論に拘束されることを望むものでないが、共焦点撮像により、Ｔ細胞の活性化の観察された改善が生体模倣非球体ａＡＰＣのこのより平坦な長軸に沿った相互作用の改善に起因することが示唆される。
【０１４５】
粒子の延伸によって変化した重要なパラメーターは、（ａ）アスペクト比（ＡＲ）、（ｂ）非延伸球体と比べた、延伸粒子の表面積（ＳＡ）、（ｃ）非延伸球体と比べて同等の総タンパク質含量を有するａＡＰＣの表面上のタンパク質密度並びに（ｄ〜ｆ）楕円体の先端部（Ｒａ）及びいずれかの方向の楕円体の平坦な面（Ｒｂ、Ｒｃ）の曲率半径Ｒである。用いた方程式及び導出の説明については、実施例７、補足計算を参照のこと。
【実施例９】
【０１４６】
「超高密度」リガンド被覆粒子
今回の開示内容の粒子は、現在達成されているものより大きな表面密度を有する、超高密度リガンド被覆粒子を形成するために用いることができる。
【０１４７】
これらの方法の一実施形態を示すスキームを図１７に示す。ステップ（１）において、ＳＨ−ＰＥＧ−ＮＨ２分子をマレイミド活性化ストレプトアビジンに加えて、ストレプトアビジン−ＰＥＧ−ＮＨ２分子を形成する。ステップ（２）は、ストレプトアビジン−ＰＥＧ−ＮＨ２へのビオチニル化ペプチド／抗体／ＨＬＡ−Ｉｇ二量体の添加を含む。ステップ（３）において、ＥＤＣを用いて分子のＰＥＧ部分を楕円形ディスクＰＬＧＡ又はＣＯＯＨ末端ポリマーにコンジュゲートする。最後に、温度を上昇させて、楕円形ディスクのアスペクト比を低下させて、それを緩和させて部分的又は完全に球体の形状に戻す。この「超高密度」リガンド被覆粒子は、粒子が延伸されている間に粒子が官能基化されたため、その表面上により多くのリガンドを有する。この方法は、多種多様の粒子及びリガンドについて実施することができる。延伸の後に球体の状態に変化させて戻すか又は部分的に戻すことは、粒子を前の状態に緩和させる熱、化学物質及び他の方法を用いて行うことができる。
【０１４８】
したがって、いくつかの実施形態において、今回開示の方法は、複数の３次元のマイクロ粒子又はナノ粒子を緩和させて球体の形状に部分的又は完全に戻す方法を含む。いくつかの実施形態において、緩和は、熱を加えることによって起こる。
【０１４９】
今回の開示内容は、形状要素及び粒子の幾何学的形態が、生体模倣無細胞性ａＡＰＣシステムの合成に際して考慮すべき重要な設計基準であることを示している。粒子ベースのＴ細胞刺激システムは、初期の活性化事象に関する極めて重要な洞察をもたらした（Ｃｕｒｔｓｉｎｇｅｒ  Ｊ．ら、Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ  ｆｏｒ  ｓｔｕｄｙｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｇａｎｄ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０９巻、４７〜５７頁（１９９７）、Ｌｅｖｉｎｅ  Ｂ．Ｌ．ら、Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＣＤ２８  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ＋４  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｆｅｅｄｅｒ  ｃｅｌｌｓ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５９巻、５９２１〜５９３０頁（１９９７））が、内在性細胞間相互作用をより厳密に模倣するａＡＰＣは、ＡＰＣ／Ｔ細胞相互作用における密接な膜接触及び接触部のより大きな表面積の役割などの基礎をなす過程のより完全な理解をもたらす可能性がある。ａＡＰＣは、したがって、抗原特異的免疫療法の実現ツールであるだけでなく、Ｔ細胞の生物学の基本的な側面を研究するためのものでもあり得る。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
今回の開示内容を一般論として述べたが、必ずしも縮尺どおりに描かれていない、添付図面について言及するものとする。
【図１】変更することができる今回開示する人工細胞パラメーターの実施形態及び変更を実現するための方法を示す図である。
【図２Ａ】ａＡＰＣの概略図である。
【図２Ｂ】球体と相互作用する球体としてモデル化されたＴ細胞との相互作用の概略図である。
【図２Ｃ】楕円体（ＡＲ２．８３；延伸比２）と相互作用する球体としてモデル化されたＴ細胞との相互作用の概略図である。
【図２Ｄ】抗原提示細胞（ＡＰＣ）と相互作用する球体としてモデル化されたＴ細胞との相互作用の概略図である。
【図２Ｅ】球体及び楕円体ＰＬＧＡマイクロ粒子のＳＥＭ（倍率２０００×）による特徴付けを示す図である（スケールバーは１０μｍに相当する）。
【図２Ｆ】マイクロ粒子の粒径分布を示す図である。
【図２Ｇ】フィルム（ＳＴＲ）にかけられた延伸の程度と得られた楕円体マイクロ粒子のアスペクト比（ＡＲ）との比較を示す図である（予測ＡＲ＝ＳＴＲ３／２）。
【図２Ｈ】球体及び楕円体マイクロ粒子からのａＡＰＣの合成時のタンパク質のカップリング効率（ｎ＝２）を示す図である。
【図２Ｉ】１週間にわたるＰＢＳ（ｐＨ７．４）中での３７℃におけるマイクロ粒子の表面からのタンパク質の放出を示す図である。
【図３】指定のａＡＰＣの用量、ａＡＰＣのタンパク質密度及び形状に反応した特有のＴ細胞増殖を示す図である。（上）タンパク質の最高用量（コンジュゲーション中、４μｇ二量体／ｍｇ  ＰＬＧＡ）で、非同属（Ａ）と比較した粒子（Ｂ１〜Ｄ１）の３用量における延伸（Ｓｔｒ、実線）及び非延伸（ＮＳ、破線）粒子に関するＣＦＳＥ希釈データ；（Ｂ２〜Ｄ２）示した用量、形状（黒で示す延伸／非球体、白で示す非延伸／球体）及びタンパク質密度でＴ細胞に粒子を加えてから７日後のＴ細胞の増殖（増幅倍率（fold expansion）／１００，０００細胞）。
【図４Ａ】異なる量延伸した粒子に対するＴ細胞の応答を示す図であって、異なる印加延伸を有するａＡＰＣの０．０１ｍｇ粒子／１００，０００細胞用量に反応した特有のＴ細胞増殖について、差別的に延伸させたａＡＰＣへの曝露後のＣＦＳＥ希釈を示す図である。
【図４Ｂ】異なる量延伸させた粒子に対するＴ細胞の応答を示す図であって、異なる印加延伸を有するａＡＰＣの０．０１ｍｇ粒子／１００，０００細胞用量に反応した特有のＴ細胞増殖について、差別的に延伸させたａＡＰＣに対する０〜１、２〜３、４〜５、６〜７ラウンドの増殖を受けた細胞の割合を示す図である。
【図４Ｃ】異なる量延伸させた粒子に対するＴ細胞の応答を示す図であって、異なる印加延伸を有するａＡＰＣの０．０１ｍｇ粒子／１００，０００細胞用量に反応した特有のＴ細胞増殖について、Ｔ細胞にａＡＰＣを加えてから７日後のＴ細胞の増殖（増幅倍率／１００，０００細胞）を示す図である。
【図５】非延伸（上）又は延伸（下）ＰＬＧＡマイクロ粒子の走査型電子顕微鏡写真である。
【図６Ａ】Ｔ細胞にａＡＰＣを加えてから５日後のＴ細胞の増殖（増幅倍率／１００，０００細胞）を示す図である（Ｓｔｒ＝延伸、Ｎｏｎｓｔｒ＝非延伸）。
【図６Ｂ】Ｔ細胞にａＡＰＣを加えてから５日後のＴ細胞の生存率を示す図である（Ｓｔｒ＝延伸、Ｎｏｎｓｔｒ＝非延伸）。
【図７Ａ】Ｔ細胞にａＡＰＣを加えてから７日後のＴ細胞の増殖（増幅倍率／１００，０００細胞）を示す図である（Ｓｔｒ＝延伸、Ｎｏｎｓｔｒ＝非延伸）。
【図７Ｂ】Ｔ細胞にａＡＰＣを加えてから７日後のＴ細胞の生存率を示す図である（Ｓｔｒ＝延伸、Ｎｏｎｓｔｒ＝非延伸）。
【図８】Ｔ細胞（赤）へのａＡＰＣ（緑）コンジュゲート形成の共焦点画像を示す図である。（Ａ）コンジュゲートが細胞と粒子との間の密接な膜接触の部分として現れ、Ｔ細胞の形態の独特のキャップへの再配列を伴っており、（Ｂ）非延伸及び（Ｃ）延伸ａＡＰＣが細胞−ビーズコンジュゲートを形成しており、これが延伸ａＡＰＣでより頻繁に認められ、（Ｄ〜Ｅ）非同種ＭＨＣ−ペプチドを有する粒子ではコンジュゲート形成が認められず、（Ｆ）延伸ａＡＰＣとともにインキュベートしたＴ細胞の４．６３４±０．９％がコンジュゲートを形成したことが認められたのに対して非延伸では１．７８±０．４３％であり（ｐ＝０．０１）、（Ｅ）画像を２秒間隔で取得した、１つの延伸非球体同種ａＡＰＣと相互作用する１つのＴ細胞の低速度撮影画像。
【図９】ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍予防モデルを示す図である。（Ａ）実験プロトコール及びスケジュール；（Ｂ）癌及びＴ細胞単独を注射し、又は非同種延伸（非同種）、同種非延伸（非延伸）及び同種延伸粒子（延伸）も注射したマウスにおける腫瘍サイズの測定。ＡＵＣ＝曲線下面積。＊Ｐ＝０．０２対比非同種；＊＊ｐ＝０．０００９対比非同種。延伸同種と非延伸同種の比較について、ｐ＝０．１３；（Ｃ）生存曲線−腫瘍サイズが２００ｍｍ２に達した場合にマウスを屠殺し、「死亡」と宣言した。延伸粒子の皮下注射は、非延伸同種粒子（ｐ＝０．０５）、延伸非同種粒子（ｐ＝０．００４）及びＴ細胞単独（ｐ＝０．０５）と対比して生存率の増加をもたらした。
【図１０】ａＡＰＣが生理的条件下で１週間にわたりそれらの形状を変化しないことを示す、新たに調製したａＡＰＣ（ａ）並びにＰＢＳ中で３７℃で（ｂ）１日間、（ｃ）３日間、（ｄ）７日間インキュベートしたａＡＰＣの走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）である。計算アスペクト比：（ａ）３．７１、（ｂ）（ｃ）（ｄ）
【図１１】蛍光標識ＭＨＣ二量体又は二量体＋ウエル当たり２ｍｇマイクロ粒子の標準曲線を示す図である。
【図１２】示したように（Ａ）０．０１ｍｇ／１００，０００細胞、（Ｂ）０．１ｍｇ／１００，０００細胞、及び（Ｃ）１ｍｇ／１００，０００細胞の別個に延伸したａＡＰＣとのインキュベーションの後のＰＭＥＬ  Ｔ細胞の増幅倍率を示す図である。ＭＨＣに非同種ペプチドを含む陰性対照は、増幅を示さなかった。
【図１３】ａＡＰＣ活性化Ｔ細胞の刺激の後の細胞内サイトカイン染色（（Ａ）ＣＤ１０７ａ及び（Ｂ）ＩＦＮ−ガンマ）を示す図である。ＣＤ８＋単離脾細胞を０．１ｍｇの非延伸球体ａＡＰＣ（黒丸）、０．１ｍｇの延伸非球体ａＡＰＣ（黒四角）又は０．０１ｍｇの延伸非球体ａＡＰＣ（白四角）により活性化した。７日後に、表示用量の同種ＧＰ１００ペプチドをパルス投与したＣ５７ＢＬＡＣＫ６マウスからの脾細胞によりＴ細胞を再刺激した。非パルス投与脾細胞（無ペプチド）又は無脾細胞（無刺激）を対照として用いた。サイトカインの産生は、表示したサイトカインを産生するＴ細胞の百分率として報告する。
【図１４】表示日数にわたりＰＢＳ中３７℃でインキュベートした非延伸（ＮＳ）及び２倍延伸（Ｓｔｒ；アスペクト比＝２．８）マイクロ粒子からのＢＳＡ放出を示す図である。示したデータは、ＢＣＡアッセイにより測定したマイクロ粒子からの累積放出を表す。
【図１５Ａ】ＮａｎｏＳｉｇｈｔによる分布によるＰＬＧＡナノ粒子のサイズを示す図である。
【図１５Ｂ】非延伸ＰＬＧＡナノ粒子の走査型電子顕微鏡写真である。
【図１５Ｃ】延伸ＰＬＧＡナノ粒子の走査型電子顕微鏡写真である。
【図１６】軸を表示し、重要点に番号付けした偏長楕円体（ａ＞ｂ＝ｃ）を示す図である。
【図１７】「超高密度」リガンド被覆粒子の形成の実施形態を示す図である。
【図１８】今回開示のａＡＰＣの作製に用いる代表的な装置の実施形態を示す図である。
【０１５１】
参考文献
本明細書に記載したすべての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、今回の開示内容が関連する分野の技術者の水準を示すものである。すべての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、各個別の刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献が参照により組み込まれていることがあたかも具体的且つ個別に示されたのと同じ程度に参照により本明細書に組み込まれている。多くの特許出願、特許及び他の参考文献が本明細書で参照されているが、そのような参照は、これらの文書のいずれかが当技術分野における共通の一般的知識の一部を構成するという承認を構成しないと理解されよう。
Schneck, J.P., J.E. Slansky, S.M. O’Herrin, and T.F. Greten. 2001. Monitoring antigen-specific T cells using MHC-Ig dimers. Current protocols in immunology / edited by John E. Coligan ... [et al.]. Chapter 17: Unit 17.2.
Bullock, T.N.J., D.W. Mullins, and V.H. Engelhard. 2003. Antigen density presented by dendritic cells in vivo differentially affects the number and avidity of primary, memory, and recall CD8+ T cells. Journal of Immunology. 170: 1822-9.
Durai, M., C. Krueger, Z. Ye, L. Cheng, A. Mackensen, et al. 2009. In vivo functional efficacy of tumor-specific T cells expanded using HLA-Ig based artificial antigen presenting cells (aAPC). Cancer immunology, immunotherapy: CII. 58: 209-20. 
Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science 285, 221-227 (1999).
Monks, C.R., Freiberg, B.A., Kupfer, H., Sciaky, N. & Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature 395, 82-86 (1998).
Lee, K.H., et al. T cell receptor signaling precedes immunological synapse formation. Science 295, 1539-1542. (2002).
Oelke, M., et al.Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells. Nat Med 9, 619-625.  PMID: 12074385 (2003).
Ugel, S., et al. In vivo administration of artificial antigen-presenting cells activates low-avidity T cells for treatment of cancer. Cancer Res 69, 9376-9384 (2009).
Mescher, M.F. Surface contact requirements for activation of cytotoxic T lymphocytes. J Immunol 149, 2402-2405 (1992).
Han, H., et al. A novel system of artificial antigen-presenting cells efficiently stimulates Flu peptide-specific cytotoxic T cells in vitro. Biochem Biophys Res Commun 411, 530-535 (2011).
Steenblock, E.R., Fadel, T., Labowsky, M., Pober, J.S. & Fahmy, T.M. An artificial antigen-presenting cell with paracrine delivery of IL-2 impacts the magnitude and direction of the T cell response. J Biol Chem 286, 34883-34892 (2011).
Steenblock, E.R. & Fahmy, T.M. A comprehensive platform for ex vivo T cell expansion based on biodegradable polymeric artificial antigen-presenting cells. Mol Ther 16, 765-772. PMID: 18334990 (2008).
Ndhlovu, Z.M., Oelke, M., Schneck, J.P. & Griffin, D.E. Dynamic regulation of functionally distinct virus-specific T cells. Proc Natl Acad Sci U S A 107, 3669-3674 (2010).
Ito, F., et al.Antitumor reactivity of anti-CD3/anti-CD28 bead-activated lymphoid cells: implications for cell therapy in a murine model. J Immunother 26, 222-233 (2003).
Lum, L.G., LeFever, A.V., Treisman, J.S., Garlie, N.K. & Hanson, J.P., Jr. Immune modulation in cancer patients after adoptive transfer of anti-CD3/anti-CD28-costimulated T cells-phase I clinical trial. J Immunother 24, 408-419 (2001).
Taylor, P.A., Lees, C.J. & Blazar, B.R. The infusion of ex vivo activated and expanded CD4(+)CD25(+) immune regulatory cells inhibits graft-versus-host disease lethality. Blood99, 3493-3499 (2002).
Balmert, S.C. & Little, S.R. Biomimetic delivery with micro- and nanoparticles. Adv Mater 24, 3757-3778 (2012).
Wang, J., Byrne, J.D., Napier, M.E. & DeSimone, J.M. More effective nanomedicines through particle design. Small 7, 1919-1931 (2011).
Champion, J.A. & Mitragotri, S. Role of target geometry in phagocytosis. Proc Natl Acad Sci U S A103, 4930-4934 (2006).
Sharma, G., et al.Polymer particle shape independently influences binding and internalization by macrophages. J Control Release 147, 408-412 (2010).
Champion, J.A., Katare, Y.K. & Mitragotri, S. Particle shape: a new design parameter for micro- and nanoscale drug delivery carriers. J Control Release 121, 3-9 (2007).
Devarajan, P.V., et al.Particle shape: a new design parameter for passive targeting in splenotropic drug delivery. J Pharm Sci 99, 2576-2581 (2010).
Harris, B.J. & Dalhaimer, P. Particle shape effects in vitro and in vivo. Front Biosci (Schol Ed) 4, 1344-1353 (2012).
Yoo, J.W. & Mitragotri, S. Polymer particles that switch shape in response to a stimulus. Proc Natl Acad Sci U S A 107, 11205-11210 (2010).
Rothstein, S.N., Federspiel, W.J. & Little, S.R. A unified mathematical model for the prediction of controlled release from surface and bulk eroding polymer matrices. Biomaterials30, 1657-1664 (2009).
Batycky, R.P., Hanes, J., Langer, R. & Edwards, D.A. A theoretical model of erosion and macromolecular drug release from biodegrading microspheres. J Pharm Sci 86, 1464-1477 (1997).
von Burkersroda, F., Schedl, L. & Gopferich, A. Why degradable polymers undergo surface erosion or bulk erosion. Biomaterials 23, 4221-4231 (2002).
Seder, R.A., Darrah, P.A. & Roederer, M. T cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nat Rev Immunol 8, 247-258 (2008).
Kroger, C.J. & Alexander-Miller, M.A. Cutting edge: CD8+ T cell clones possess the potential to differentiate into both high- and low-avidity effector cells. J Immunol179, 748-751 (2007).
Curtsinger, J., Deeths, M.J., Pease, P. & Mescher, M.F. Artificial cell surface constructs for studying receptor-ligand contributions to lymphocyte activation. J Immunol Methods 209, 47-57 (1997).
Maus, M.V., et al.Ex vivo expansion of polyclonal and antigen-specific cytotoxic T lymphocytes by artificial APCs expressing ligands for the T cell receptor, CD28 and 4-1BB. Nat Biotechnol 20, 143-148. (2002).
Steenblock, E.R., Wrzesinski, S.H., Flavell, R.A. & Fahmy, T.M. Antigen presentation on artificial acellular substrates: modular systems for flexible, adaptable immunotherapy. Expert Opin Biol Ther 9, 451-464. PMID: 19344282 (2009).
Levine, B.L., et al.Effects of CD28 costimulation on long-term proliferation of CD4+ T cells in the absence of exogenous feeder cells. J Immunol 159, 5921-5930. (1997).
Weisstein, E.W. Prolate Spheroid. in MathWorld - A Wolfram Web Resource (2012).
Weisstein, E.W. Radius of Curvature. in MathWorld - A Wolfram Web Resource (2012).
Lee JB, Oelke M, Ramachandra L, Canaday, and Schneck JP. Decline of influenza-specific CD8+ T cell repertoire in healthy geriatric donors. ImmunAgeing. 2011 Aug 16, 8:6.
Xiao Z, Mohamood AS, Uddin S, Gutfreund R, Nakata C, Marshall A, Kimura H, Caturegli P, Womer KL, Huang Y, Jie C, Chakravarti S, Schneck JP, Yagita H, and Hamad AR. Inhibition of Fas ligand in NOD mice unmasks a protective role for IL-10 against insulitisdevelopment. Am J Pathol. 2011 Aug;179(2):725-32.
Chiu YL, Schneck JP, and Oelke M. HLA-Ig based artificial antigen presenting cells for efficient ex vivo expansion of human CTL.J Vis Exp. 2011 Apr 11;(50). Pii:2801:do1: 10.3791/2801.
Li Y, Tao SC, Zhu H, and Schneck JP. High-throughput lectin microarray-based analysis of live cell surface glycosylation. Curr ProtocProtein Sci. 2011 Feb;Chapter 12:Unit 12/9.
Schuetz C, Oelke M, Schneck JP, Mackensen A, and Fleck, M. Killer artificial antigen-presenting cells: The synthetic embodiment of a "guided missile." Immunotherapy 2010 Jul;2(4):539-50.
Schuetz C, Fleck M, MackensenA, Zoso A, Halbritter D, Schneck JP, and Oelke M. Killer artificial antigen-presenting cells: A novel strategy to delete specific T cells. Blood 2008. Apr 1;111(7):3546-52. Epub 2007 Dec 20.
Webb, T, Bieler, J, Schneck, JP, Oelke, M. Ex vivo induction and expansion of Natural Killer T cells be CD1d1-Ig coated artificial antigen presenting cells. J ImmunolMethods 2009. May 14.
Ndhlovu, Z, Angenendt M, Heckel D, Schneck, JP, Griffin DE and Oelke M. Development of artificial antigen- presenting cell (aAPC)- based assay for the detection of low frequency virus- specific CD8+4 Tcells in whole blood with application to measles virus. ClinVaccine Immunol. 2009.
Webb T, Giuntoli R, Rogers O, Schneck J.P. Oelke M. Ascites Specific Inhibition of CD1d-Mediated Activation of NKT cells. Clinical Cancer Research. 2008.
Shaikh SR, Mitchell D, Carroll E, Li M, Schneck J.P., and Edidin M. Differential effects of a saturated and a monounsaturated fatty acid on MHC&gt; class I antigen presentation. Scand. J. Immunol. 2008 Jul;68(1):30-42.
【０１５２】
先の内容は、理解の明確さを目的とするために、例示や例として多少詳しく記述されてきたが、特定の変更や修正は、添付の特許請求の範囲内で実施することができると関連する分野の技術者には理解されよう。
【図１】
2015500296.tif 000015
【図２】
2015500296.tif 000016
【図３】
2015500296.tif 000017
【図４Ａ】
2015500296.tif 000018
【図５】
2015500296.tif 000019
【図６】
2015500296.tif 000020
【図７】
2015500296.tif 000021
【図８】
2015500296.tif 000022
【図９】
2015500296.tif 000023
【図１０】
2015500296.tif 000024
【図１１】
2015500296.tif 000025
【図１２】
2015500296.tif 000026
【図１３】
2015500296.tif 000027
【図１４】
2015500296.tif 000028
【図１５】
2015500296.tif 000029
【図１６】
2015500296.tif 000030
【図１７】
2015500296.tif 000031
【図１８Ａ】
2015500296.tif 000032
【図１８Ｂ】
2015500296.tif 000033
【図１８Ｃ】
2015500296.tif 000034
【図１８Ｄ】
2015500296.tif 000035
【国際調査報告】
2015500296.tif 000036
2015500296.tif 000037
2015500296.tif 000038
2015500296.tif 000039