(57)【要約】  本発明は、表面にトランスフェリンターゲティング部分を含むエキソソーム、それを製造する方法、並びにｉｎ  ｖｉｖｏで遺伝物質及び／又はバイオセラピューティックタンパク質若しくはペプチド又は化学療法薬を送達するためのそのようなエキソソームの使用、特に、遺伝子治療若しくは遺伝子サイレンシングの方法又は他の治療剤の送達におけるそのようなエキソソームの使用に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
エキソソームを含む組成物であって、エキソソームは、該エキソソームの表面で発現したターゲティング部分を含み、ターゲティング部分はトランスフェリン（Ｔｆ）ポリペプチド又はペプチドである、組成物。
【請求項２】
Ｔｆポリペプチドは、配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、あるいはＴｆペプチドは前記ポリペプチドに由来する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｔｆペプチドは、配列番号１のポリペプチド配列に由来する少なくとも１０の連続したアミノ酸残基を含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ペプチドは、ＣＲＴＩＧＰＳＶＣ（配列番号３）又はＰＳＤＧＰＳＶ（配列番号４）から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記ターゲティング部分は、標的となる細胞上に存在する部分に結合するペプチドを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
標的となる細胞上に存在する前記部分はトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
エキソソームは、前記ペプチドターゲティング部分を組み込むように修飾されたエキソソーム膜貫通タンパク質を含む、請求項５又は６に記載の組成物。
【請求項８】
エキソソーム膜貫通タンパク質は、Ｌａｍｐ−１、Ｌａｍｐ−２、ＣＤ１３、ＣＤ８６、フロチリン、及びシンタキシン−３から選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
エキソソーム膜貫通タンパク質はＬａｍｐ−２ｂである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ターゲティング部分はＬａｍｐ−２ｂのＮ末端又はその近傍に存在し、リンカー配列でＬａｍｐ−２ｂから分離されている、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
エキソソームは樹状細胞に由来する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
エキソソームには、外因性遺伝物質、タンパク質及び／又はペプチド、又は化学療法薬搭載されている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
外因性遺伝物質は、治療用タンパク質又は免疫原をコードするＤＮＡプラスミドである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
外因性遺伝物質はｓｉＲＮＡである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
遺伝子治療の方法における使用のための、請求項１３に記載の組成物であって、プラスミドは治療用タンパク質をコードする、組成物。
【請求項１６】
免疫原に対する免疫応答を惹起する方法における使用のための、請求項１３に記載の組成物であって、プラスミドは免疫原をコードする、組成物。
【請求項１７】
ｉｎ  ｖｉｖｏで遺伝物質、タンパク質及び／又はペプチド、又は化学療法薬を送達する方法における使用のための、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の組成物であって、エキソソームは未熟樹状細胞に由来する、組成物。
【請求項１８】
エキソソームの表面で発現するＴｆポリペプチド又はＴｆペプチドターゲティング部分を含むエキソソームを製造する方法であって、前記ターゲティング部分とエキソソーム膜貫通タンパク質とを含む融合タンパク質を、エキソソームを生成するために使用される細胞内で発現させるステップを含み、発現した融合タンパク質は、前記細胞により生成されるとエキソソーム中に組み込まれる、方法。
【請求項１９】
前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド構築物は前記細胞にトランスフェクトされ、ポリヌクレオチド構築物はプロモーター及びシグナルペプチド配列をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞は樹状細胞である、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
エキソソーム膜貫通タンパク質と、異種のターゲティングＴｆポリペプチド又はＴｆペプチドと、を含むポリペプチドであって、ターゲティングＴｆポリペプチド又はＴｆペプチドは、標的となる細胞の表面に存在するＴｆ受容体（ＴｆＲ）に結合し、該ポリペプチドがエキソソーム中に存在する場合、ターゲティングＴｆポリペプチド又はＴｆペプチドは該エキソソームの表面に存在する、ポリペプチド。
【請求項２２】
請求項２２に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド構築物であって、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、５’エキソソーム膜貫通シグナル配列をコードするポリヌクレオチドを含む、構築物。
【請求項２３】
エキソソーム膜貫通シグナル配列は小胞体ターゲティングシグナルペプチドである、請求項２２に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項２４】
選択された組織又は細胞型にエキソソームをターゲティングする方法であって、請求項２２又は２３に記載のポリヌクレオチド構築物を宿主細胞にトランスフェクトするステップと、宿主細胞において構築物を発現させるステップと、構築物が発現している宿主細胞からエキソソームを得るステップと、を含む方法。
【請求項２５】
非ヒト動物モデルにおける遺伝子サイレンシングの方法であって、請求項１４に記載のエキソソームを動物に投与するステップを含み、ｓｉＲＮＡは、サイレンシングされる遺伝子を対象とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、所望の細胞型又は組織へのエキソソームのターゲティングに関する。特に、本発明は、エキソソームの表面で発現するターゲティング部分を含むエキソソーム、及びそれを製造する方法に関する。
【発明の背景】
【０００２】
核酸は、機能しない遺伝子の置換［１］のために、また、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）エフェクター分子（例えば、ｍｉＲＮＡ［２］、ｓｈＲＮＡ［３］、ｓｉＲＮＡ［４］）を介する病原性変異の中和のために、遺伝子治療において日常的に使用される。裸のＤＮＡ及びＲＮＡは、急速なクリアランス［５］、ヌクレアーゼ［６］、臓器特異的な分布の欠如及び細胞の取り込みの低効率によりｉｎ  ｖｉｖｏでの送達が困難であることから、通常、特殊化した遺伝子送達ビヒクルが送達に使用される。
【０００３】
ウイルスベクター及びカチオン性リポソームは最先端の送達ビヒクル技術であり、既に臨床試験が行われているこれらの送達ビヒクルの多くが比較的成功している［７］。これらの成功にもかかわらず、多くの用途を制限する重大な制約が残っており、中でも最も重要なのは、ほとんどのウイルスベクターでの免疫認識［８、９、１０］、及びレンチウイルスなどのウイルスでの変異誘発的な組み込み［１１］；並びにリポソームでの炎症毒性及び急速なクリアランス［１２、１３、１４、１５］である。自然免疫系による認識は急性炎症応答をもたらす。そのことにより、現在の戦略の取り込み及び再投与問題［１６、１７、１８］を克服するために免疫抑制戦略の使用が必要となり、患者が潜在的に日和見感染の不当なリスクに曝される可能性がある。送達ビヒクルに対して産生された抗体は、その後の投与の際の導入遺伝子発現も劇的に減少させる［１９］。
【０００４】
現在の戦略は、その固有のリスク及び制約により、概して、治療の利益がリスクを明らかに上回る重篤な疾患（例えば重症複合免疫不全［２０］）、特殊環境（例えば、眼のような免疫特権部位［１］）における疾患、又は遺伝子ワクチン［２１］に限定されている。しかし、筋緊張性ジストロフィーのように、慢性的かつ衰弱性であるが致死的ではない遺伝性疾患の場合、治癒的な介入には、極めて低いリスクプロファイルと、数年ではなく何十年もの間、矯正的な遺伝子治療を維持する能力と、が必要とされる。この種の疾患についての、許容されないと思われるリスクの例は上記の免疫抑制戦略であり、これは、近年の関節リウマチのためのＡＡＶ遺伝子治療試験において、試験管理者に知られずに被験者によって服用された免疫抑制薬によって引き起こされた日和見感染による健常患者の死亡［２２］によって明らかにされている。遺伝的要素を有することが示される疾患（例えば、肥満、心疾患、精神疾患）の数の増加と共に、早期の遺伝的解決のための感受性遺伝子の修飾には大きな可能性があるが、これは、リスクがさらに低減され、長期の持続性が実現される場合に限定される。このように、致死疾患以外にも遺伝子治療の使用を拡大させるためには、良好な送達効率を維持すると同時に、免疫認識及び炎症を回避することができる技術を開発することが必須である。
【０００５】
解決手段のうちの１つは、治療対象の細胞型又は組織に対して特異的にターゲティングされたエキソソームを遺伝子送達に使用することにあり得る。エキソソームは、多胞体と細胞膜との融合後に細胞外環境に放出される、エンドサイトーシス由来の膜結合小胞（３０〜１００ｎｍ）である。エキソソームの生成は、Ｂ細胞、Ｔ細胞及び樹状細胞（ＤＣ）などの多くの免疫細胞について記載されている。Ｂリンパ球及び成熟ＤＣに由来するエキソソームは、ＭＨＣ−ＩＩ、ＭＨＣ−Ｉ、ＣＤ８６及びＩＣＡＭ−１を発現し［２３、２４］、実験モデル及び臨床試験において、特異的な抗腫瘍性の細胞傷害性Ｔ応答及び抗腫瘍性免疫を誘導するために使用されてきた［２４、２５］。エキソソーム媒介遺伝子送達の可能性は、ヒト肥満細胞に対するマウスｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの送達［２６］で示されており、神経膠腫に由来するエキソソーム［２７］は、外因性ＤＮＡプラスミドによって生成されるｍＲＮＡを異種の細胞に移入することが実証されている。外因性ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ及び他の修飾オリゴヌクレオチドを有するエキソソームも開示されている［２８］。
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らはまた、選択された組織にエキソソームをターゲティングできるように、エキソソーム中にターゲティング部分を導入することにも成功している。特に、本発明者らは、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）を発現する組織又は細胞にエキソソームをターゲティングできるように、エキソソーム中にトランスフェリン（Ｔｆ）ペプチドのターゲティング部分を導入することに成功している。本発明者らは、Ｔｆペプチドターゲティング部分を発現するエキソソームが、リポフェクトアミン及びＲＮＡｉ  ｍａｘなどの従来の市販のトランスフェクション試薬の取り込み効率に匹敵する取り込み効率を有することを示している。すなわち、本発明は、表面にＴｆペプチドターゲティング部分を含むエキソソーム、エキソソーム膜貫通タンパク質とターゲティング部分とを含む融合タンパク質、及びそのような融合タンパク質をコードする核酸構築物に関する。Ｔｆターゲティングエキソソームは、外因性遺伝物質又はバイオセラピューティック（ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）タンパク質及び／又はペプチド及び／又は化学療法薬などの積荷を搭載し、積荷の送達、特に遺伝子治療及び遺伝子サイレンシングのための核酸の送達並びに治療のためのバイオセラピューティックタンパク質及びペプチド及び化学療法薬の送達に使用され得る。
【０００７】
本発明の一態様によれば、エキソソームを含む組成物であって、エキソソームは、該エキソソームの表面で発現するターゲティング部分を含み、ターゲティング部分は、トランスフェリン（Ｔｆ）ポリペプチド又はペプチドである、組成物が提供される。Ｔｆポリペプチド又はＴｆペプチドターゲティング部分は、ＴｆＲに結合する能力を保持する任意のＴｆポリペプチド又はＴｆペプチドであり得る。
【０００８】
他の態様において、本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏで遺伝物質、タンパク質及び／又はペプチドを送達する方法における使用のための組成物であって、エキソソームの表面で発現するＴｆポリペプチド又はＴｆペプチドターゲティング部分を含むエキソソームを含み、エキソソームは未熟樹状細胞に由来する、組成物を提供する。
【０００９】
他の態様において、本発明は、エキソソームの表面で発現するＴｆポリペプチド又はＴｆペプチドターゲティング部分を含むエキソソームを製造する方法であって、ターゲティング部分とエキソソーム膜貫通タンパク質とを含む融合タンパク質を、エキソソームを生成するために使用される細胞内で発現させるステップを含み、発現した融合タンパク質は、細胞により生成されるとエキソソーム中に組み込まれる、方法を提供する。
【００１０】
他の態様において、本発明は、エキソソーム膜貫通タンパク質と、異種のターゲティングタンパク質、ターゲティングポリペプチド又はターゲティングペプチドと、を含むポリペプチドであって、ターゲティングタンパク質、ターゲティングポリペプチド又はターゲティングペプチドは、標的となる細胞の表面に存在するＴｆＲに結合するＴｆポリペプチド又はＴｆペプチドであり、該ポリペプチドがエキソソーム中に存在する場合、Ｔｆターゲティングポリペプチド又はＴｆターゲティングペプチドは該エキソソームの表面に存在する、ポリペプチドを提供する。
【００１１】
他の実施形態において、本発明は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド構築物であって、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、５’エキソソーム膜貫通シグナル配列（例えば小胞体ターゲティングシグナルペプチド）をコードするポリヌクレオチドを含む、構築物を提供する。
【００１２】
他の実施形態において、本発明は、選択された組織又は細胞型にエキソソームをターゲティングする方法であって、本発明のポリヌクレオチド構築物を宿主細胞にトランスフェクトするステップと、宿主細胞において構築物を発現させるステップと、構築物が発現している宿主細胞からエキソソームを得るステップと、を含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】Ｆｉｇｕｒｅ１：  エキソソーム媒介ｓｉＲＮＡ送達を用いたＧＡＰＤＨのノックダウン。（ａ、ｂ）エレクトロポレートされた（Ｅ）非ターゲティング（Ｅｘｏ非ターゲティング）、Ｔｆターゲティング（Ｅｘｏ  Ｔｆ）又はＲＶＧ（Ｅｘｏ  ＲＶＧ）ターゲティングエキソソームと共にＨＥＫ細胞に対して適用されたＣｙ５標識ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡの代表画像。エレクトロポレートされていないエキソソーム及びｓｉＲＮＡ（ＮＥ）を陰性対照として加え、ｓｉＲＮＡ及び従来のトランスフェクション試薬（ＬＩＰＯ及びＲＮＡｉ  ｍａｘ）を陽性対照として加えた。
【図２】Ｆｉｇｕｒｅ２：  エキソソーム媒介ｓｉＲＮＡ送達を用いたＧＡＰＤＨのノックダウン。（ａ、ｂ）エレクトロポレートされた（Ｅ）非ターゲティング（Ｅｘｏ非ターゲティング）、Ｔｆターゲティング（Ｅｘｏ  Ｔｆ）又はＲＶＧ（Ｅｘｏ  ＲＶＧ）ターゲティングエキソソームと共にＢ２Ｍ１７細胞に対して適用されたＣｙ５標識ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡの代表画像。エレクトロポレートされていないエキソソーム及びｓｉＲＮＡ（ＮＥ）を陰性対照として加え、ｓｉＲＮＡ及び従来のトランスフェクション試薬（ＬＩＰＯ及びＲＮＡｉ  ｍａｘ）を陽性対照として加えた。
【図３】Ｆｉｇｕｒｅ３：  エキソソーム媒介ｓｉＲＮＡ送達を用いたＧＡＰＤＨのノックダウン。（ａ、ｂ）エレクトロポレートされた（Ｅ）非ターゲティング（Ｅｘｏ非ターゲティング）、Ｔｆターゲティング（Ｅｘｏ  Ｔｆ）又はＲＶＧ（Ｅｘｏ  ＲＶＧ）ターゲティングエキソソームと共にＮｅｕｒｏ２ａ細胞に対して適用されたＣｙ５標識ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡの代表画像。エレクトロポレートされていないエキソソーム及びｓｉＲＮＡ（ＮＥ）を陰性対照として加え、ｓｉＲＮＡ及び従来のトランスフェクション試薬（ＬＩＰＯ及びＲＮＡｉ  ｍａｘ）を陽性対照として加えた。
【図４】Ｆｉｇｕｒｅ４：  エキソソーム媒介ｓｉＲＮＡ送達を用いたＧＡＰＤＨのノックダウン。（ａ、ｂ）エレクトロポレートされた（Ｅ）非ターゲティング（Ｅｘｏ非ターゲティング）、Ｔｆターゲティング（Ｅｘｏ  Ｔｆ）又はＲＶＧ（Ｅｘｏ  ＲＶＧ）ターゲティングエキソソームと共にマウス骨髄樹状細胞に対して適用されたＣｙ５標識ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡの代表画像。エレクトロポレートされていないエキソソーム及びｓｉＲＮＡ（ＮＥ）を陰性対照として加え、ｓｉＲＮＡ及び従来のトランスフェクション試薬（ＬＩＰＯ及びＲＮＡｉ  ｍａｘ）を陽性対照として加えた。
【発明の詳細な説明】
【００１４】
本発明は、エキソソーム、及び送達ビヒクルとしてのその使用を目的とする。エキソソームは、多胞体と細胞膜との融合後に細胞外環境に放出される、エンドサイトーシス由来の膜結合小胞である。したがって、本出願は、そのようなエキソソームを含む組成物を目的とする。典型的には、エキソソームは直径が３０〜１００ｎｍであるが、２００ｎｍまでの同様の由来の膜粒子を含み得る。本明細書において、エキソソームとは、多胞体から分泌される、エンドソーム由来のナノ粒子を指す。
【００１５】
エキソソームは、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、樹状細胞（ＤＣ）及び肥満細胞などの免疫細胞を含む多様な型の細胞によって生成される。エキソソームは、例えば、神経膠腫細胞、血小板、網状赤血球、ニューロン、腸上皮細胞、腫瘍細胞、ＨＥＬＡ細胞、ヒト胎児由来腎臓細胞（ＨＥＫ細胞）、Ｂ２Ｍ１７細胞、Ｂｅｎｄ３細胞、一次骨髄由来樹状細胞、ＢＶ−２小神経膠細胞、及びＮＥＵＲＯ２Ａ細胞によっても産生される。本出願に従って使用されるエキソソームは、上述の細胞を含む任意の適切な細胞から得ることができる。エキソソームは、生理学的な液体（例えば、血漿、尿、羊水、悪性浸出液）からも単離されている。
【００１６】
本発明の好ましい態様において、エキソソームは、ＤＣ、好ましくは未熟ＤＣ由来である。未熟ＤＣから生成されるエキソソームは、ＭＨＣ−ＩＩ、ＭＨＣ−Ｉ又はＣＤ８６を発現しない。したがって、そのようなエキソソームは未感作Ｔ細胞を有意な程度まで刺激せず、混合リンパ球反応において応答を誘導することができない。したがって、未熟樹状細胞から生成されるエキソソームは、遺伝物質などの積荷の送達における使用、特に（例えば遺伝子治療における）ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用に理想的な候補である。
【００１７】
すなわち、本発明の一態様によれば、遺伝物質及びタンパク質性及び／又はペプチド性バイオ医薬（ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）又は化学療法薬などの積荷のｉｎ  ｖｉｖｏでのターゲティング送達における使用のためのエキソソームであって、樹状細胞に由来するエキソソームが提供される。好ましい実施形態において、本発明のエキソソームは樹状細胞に由来し、遺伝物質、タンパク質性若しくはペプチド性バイオ医薬、又は化学療法薬のｉｎ  ｖｉｖｏでのターゲティング送達における使用に供される。
【００１８】
前述のように、エキソソームは多様な型の細胞によって生成され、生理学的な液体からも単離されている。したがって、本発明によれば、エキソソームは、上述のように、任意の適切な細胞型から、又は生理学的な液体からの単離によって得ることができる。典型的には、本発明の方法は、細胞培養培地又は組織上清からのエキソソームの単離を含む。
【００１９】
細胞から生成されたエキソソームは、任意の適切な方法によって培地から回収することができる。典型的には、エキソソームの調製物は、細胞培養物又は組織上清から、遠心分離、濾過、又はこれらの方法の組み合わせによって調製することができる。例えば、エキソソームは、分画遠心分離、すなわち低速（＜２００００ｇ）遠心分離（より大きな粒子をペレット化）とそれに続く高速（＞１０００００ｇ）遠心分離（エキソソームをペレット化）、適切なフィルター（例えば、０．２２μｍのフィルター）を用いたサイズ濾過、（例えば、スクロース勾配での）勾配超遠心分離、又はこれらの方法の組み合わせによって調製することができる。
【００２０】
本発明によれば、本発明のエキソソームには、外因性遺伝物質、タンパク質若しくはペプチド、又は化学療法薬が搭載され得る。特に、本発明によれば、エキソソームを調製し、次いで、所望のターゲティング送達用遺伝物質、タンパク質若しくはペプチド又は化学療法薬をエキソソームに搭載することができる。また、外因性遺伝物質又はバイオセラピューティックタンパク質若しくはペプチドがエキソソーム中に搭載されるように、該物質をコードする適切な構築物を細胞内で過剰発現させることによって、遺伝物質又はタンパク質若しくはペプチドをエキソソームに搭載することもできる。
【００２１】
外因性遺伝物質、タンパク質又はペプチドを送達するためのＴｆターゲティングエキソソームの使用は、そのような分子の従来の送達手段に比べて多数の利点をもたらす。例えば、化合物がエキソソームを用いて送達される場合、化合物は分解から保護されており、より安定である；化合物は、エキソソーム内に封入されていない場合よりも効率的及び／又は特異的に標的組織（例えば、特定の型の癌）に送達することができる；及び／又は、積荷はエキソソーム内に含有され、そのため免疫細胞による検出及び／又は抗体への結合に自由に利用できないことから、積荷が免疫応答を惹起する可能性が低い。外因性遺伝物質、タンパク質若しくはペプチド又は化学療法薬を送達するためのＴｆターゲティングエキソソームの使用の他の潜在的利点としては、例えば、エキソソームが全身送達された後、肝細胞を迂回すること、及び／又は薬剤耐性（例えば、ＡＢＣトランスポーターなどの薬物トランスポーターの上方制御）を回避することが挙げられる。
【００２２】
適切な送達用遺伝物質としては、例えば、外因性ＤＮＡプラスミド及びｓｉＲＮＡが挙げられる。適切な遺伝物質としては、例えば、修飾オリゴヌクレオチド及び他のＲＮＡ干渉エフェクター部分（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）も挙げられる。本発明の一態様によれば、エキソソーム中に搭載される遺伝物質は、エキソソームに通常随伴している遺伝物質ではなく、例えば、核酸は、好ましくは、細胞からの生成の際にエキソソーム中に組み込まれるｍＲＮＡ又はｍｉＲＮＡではない。特に、遺伝物質は、既に細胞から単離されているエキソソーム調製物中に搭載され得る。あるいは、遺伝物質は、例えば適切な構築物を細胞に導入することによって細胞内で過剰発現させて、その後エキソソーム中に搭載されてもよい。このように、外因性遺伝物質とは、通常はエキソソームに随伴していない遺伝物質（例えば核酸）を指す。特に好ましい実施形態において、核酸物質は、プラスミドＤＮＡ、又はエキソソーム中に通常は見出されない他の核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、修飾オリゴヌクレオチド）である。
【００２３】
同様に、好ましくは、エキソソーム中に搭載されるタンパク質又はペプチドは、エキソソームに通常随伴しているタンパク質又はペプチドではなく、例えば、タンパク質又はペプチドは、好ましくは、細胞（例えば非修飾細胞）からの生成の際にエキソソーム中に組み込まれるタンパク質又はペプチドではない。外因性タンパク質又はペプチドとは、通常はエキソソームに随伴していないタンパク質又はペプチドを含むタンパク質又はペプチドを指す。そのような外因性タンパク質又はペプチドは、細胞から単離されたエキソソーム中に搭載されてもよいし、あるいはタンパク質又はペプチドがエキソソーム中に搭載されるように適切な構築物を宿主細胞で過剰発現させることによってエキソソーム中に搭載されてもよい。特に好ましい実施形態において、エキソソーム中に搭載されるタンパク質又はペプチドは抗体又は抗体フラグメントであり、より好ましくはモノクローナル抗体又はそのフラグメントである。
【００２４】
エキソソーム中に組み込むための核酸は一本鎖又は二本鎖であり得る。一本鎖核酸としては、例えば、ホスホジエステル、２’Ｏ−メチル、２’メトキシ−エチル、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、及び／又はホスホロチオエート骨格化学を有するものが挙げられる。典型的には、二本鎖核酸（例えば、プラスミドＤＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ））が導入される。
【００２５】
本発明のエキソソームには、状態、疾患又は障害の治療及び／又は予防において有用性がある任意のバイオセラピューティックタンパク質及び／又はペプチドが組み込まれていてもよい。好ましい実施形態において、エキソソームに組み込むためのタンパク質又はペプチドは抗体又は抗体フラグメントである。より好ましい実施形態において、抗体はモノクローナル抗体又はそのフラグメントである。
【００２６】
エキソソームにはまた、化学療法薬（例えば治療用医薬）を送達するために該化学療法薬が搭載されていてもよい。適切な化学療法薬の例としては、例えば癌の治療における使用のための細胞毒性薬が挙げられる。
【００２７】
エキソソーム中に搭載される遺伝物質、タンパク質又はペプチドは、それを送達しようとする細胞内での該遺伝物質、タンパク質又はペプチドの所望の効果及び該効果が達成される機構に基づいて選択される。例えば、核酸は、遺伝子治療において、例えば、細胞又は細胞群において所望の遺伝子を発現させるために有用であり得る。そのような核酸は、典型的には、所望の遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡ又はウイルスベクターの形態であり、治療対象の細胞に送達されるとプラスミドＤＮＡが発現するように、プロモーター、エンハンサーなどの適切な制御配列に作動可能に連結される。遺伝子治療の影響を受けやすい疾患としては、例えば、血友病Ｂ（第ＩＸ因子）、嚢胞性線維症（ＣＴＦＲ）、及び脊髄性筋萎縮症（ＳＭＮ−１）が挙げられる。
【００２８】
核酸は、例えば、免疫において、免疫応答を惹起することが望まれる１種又は複数種の抗原を発現させるためにも使用することができる。すなわち、エキソソーム中に搭載される核酸は、免疫応答を惹起することが望まれる１種又は複数種の抗原（例えば、腫瘍抗原、病原体（例えば、ウイルス、細菌又は真菌の病原体）からの抗原（これらに限定されない。））をコードしていてもよい。
【００２９】
核酸は遺伝子サイレンシングにおいても使用することができる。そのような遺伝子サイレンシングは、治療において異常な遺伝子発現のスイッチを切るために、あるいは動物モデル研究において単一又は複数の遺伝的なノックアウトを作製するために有用であり得る。典型的には、そのような核酸はｓｉＲＮＡの形態で提供される。例えば、ｓｉＲＮＡなどのＲＮＡｉ分子を使用して、筋緊張性ジストロフィーの治療のために筋肉細胞において複数のＣＵＧリピートでＤＭＰＫをノックダウンすることができる。他の例では、ハンチントン病の原因となる変異ハンチントン遺伝子（ｈｔｔ）を低下させるｓｈＲＮＡを発現するプラスミドをニューロン特異的エキソソームで送達することができる。他の標的遺伝子としては、例えば、アルツハイマー病の治療のためのＢＡＣＥ−１が挙げられる。いくつかの癌遺伝子（例えば、ｒａｓ、ｃ−ｍｙｃ、ＶＥＧＦＲ−２）もｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡで標的となり得る。脳を標的とするｓｉＲＮＡが搭載されたエキソソームは、アルツハイマー病におけるＢＡＣＥ−１のサイレンシング、パーキンソン病におけるアルファ−シヌクレインのサイレンシング、ハンチントン病におけるｈｔｔのサイレンシング、及び脳卒中の治療において虚血性損傷を減少させるために使用されるニューロンのカスパーゼ−３のサイレンシングにおいて特に有用であり得る。
【００３０】
アンチセンス修飾オリゴヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−Ｍｅ化合物、ＰＮＡ）を使用することができる。例えば、そのようなオリゴヌクレオチドを、エキソンスキッピングを誘導するように設計することができ、例えば、変異ジストロフィン遺伝子をデュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療のために、また、ヘアピンループを阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドを例えば筋緊張性ジストロフィーの治療において、また、トランススプライシングオリゴヌクレオチドを例えば脊髄性筋萎縮症の治療のために筋肉細胞に送達することができる。
【００３１】
本発明のエキソソームに遺伝物質を搭載する代わりに、タンパク質又はペプチドが搭載されてもよい。本発明のエキソソームには、状態、疾患又は障害の治療及び／又は予防において有用性がある任意のバイオセラピューティックタンパク質及び／又はペプチドが組み込まれていてもよい。好ましい実施形態において、エキソソームに組み込むためのタンパク質又はペプチドは抗体又は抗体フラグメントである。エキソソームには１種のタンパク質又はペプチドが組み込まれていてもよい。あるいは、エキソソームには１種より多くのタンパク質及び／又はペプチドが組み込まれていてもよい。１種より多くのタンパク質及び／又はペプチドが同一又は異なる標的に作用して、それらの治療及び／又は予防効果が生じてもよい。
【００３２】
エキソソームに組み込まれるタンパク質及び／又はペプチドは、例えば、癌の治療及び／又は予防において有用であり得る。タンパク質性又はペプチド性バイオ医薬を用いて治療される可能性がある癌としては、例えば、白血病、結腸直腸癌、頭頸部癌、非ホジキンリンパ腫、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膵臓癌、腺癌、及び固形腫瘍が挙げられる。そのようなバイオセラピューティックタンパク質及び／又はペプチドは、典型的には抗体又はそのフラグメントであり、特にモノクローナル抗体又はそのフラグメントである。
【００３３】
タンパク質性及び／又はペプチド性バイオ医薬は自己免疫状態の治療及び／又は予防においても使用することができる。自己免疫状態は、体内に通常存在する物質、組織、及び臓器に対する身体の過剰な免疫応答に起因する。
【００３４】
本発明のエキソソーム中に搭載されるバイオセラピューティックタンパク質及び／又はペプチドは、心臓血管疾患、血友病、敗血症、脳卒中、筋ジストロフィー（例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ））、黄斑変性、及びアルツハイマー病などの他の状態を治療及び／又は予防するためにも使用することができる。
【００３５】
好ましい実施形態において、本発明のエキソソーム中に搭載されるバイオ医薬は治療用抗体である。より好ましい実施形態において、治療用抗体は、Ｂａｃｅ−１及びβ−アミロイドの活性部位をブロックするためのモノクローナル抗体、神経膠芽細胞腫のキナーゼに対するモノクローナル抗体、及びＭＳ治療のためのα４−インテグリンに対する抗体（例えばナタリズマブ）から選択される。
【００３６】
好ましい実施形態において、本発明のエキソソーム中に搭載されるバイオ医薬はペプチドである。より好ましい実施形態において、ペプチドは、ウイルス及び／又は腫瘍抗原に対する免疫応答を惹起するための免疫優性ペプチド；δ−オピオイド受容体リガンド（例えばビファリン）などの神経保護ペプチド；神経炎症のための免疫抑制性ペプチド（例えばアドレノメデュリン）；及びＮｆＫＢに結合してそのシグナル伝達を阻害するＮＢＤペプチドから選択される。
【００３７】
外因性遺伝物質、タンパク質若しくはペプチド、又は化学療法薬は、いくつかの異なる技術によってエキソソーム中に導入することができる。例えば、エレクトロポレーション又はトランスフェクション試薬の使用によってエキソソームに搭載することができる。エキソソームは、サイズが小さいにもかかわらず、エレクトロポレーションを用いてエキソソームに外因性遺伝物質を搭載することが可能である（国際公開第２０１０／１１９２５６号）。これは、エキソソームのサイズが細胞と比較して小さいことからみて驚くべきことである。エキソソームのサイズを考慮に入れるための、細胞のエレクトロポレーションに使用される電圧の外挿は、エキソソームのエレクトロポレーションに過度に高い電圧が必要とされるであろうことを示唆していた。しかし、驚くべきことに、エレクトロポレーションを用いてエキソソームにプラスミドＤＮＡ及びｓｉＲＮＡを搭載することが可能である。エレクトロポレーション条件は、積荷の電荷及びサイズによって変化し得る。典型的な電圧は、２０〜１０００Ｖ／ｃｍ、例えば２０〜１００Ｖ／ｃｍであり、キャパシタンスは、典型的には２５〜２５０μＦ、例えば２５〜１２５μＦである。本発明のエキソソームに抗体を搭載するためには、１５０〜２５０ｍＶの電圧、特に２００ｍＶの電圧が好ましい。
【００３８】
エキソソームへのローディングはトランスフェクション剤を用いて行ってもよい。エキソソームはサイズが小さいにもかかわらず、従来のトランスフェクション剤を、遺伝物質でのエキソソームのトランスフェクションに使用することができる。本発明に従って使用される好ましいトランスフェクション試薬としては例えばカチオン性リポソームが挙げられる。
【００３９】
エキソソームが細胞で生成される際に目的の遺伝物質又はバイオセラピューティックタンパク質若しくはペプチドがエキソソームに取り込まれるように、該遺伝物質又はバイオセラピューティックタンパク質若しくはペプチドを発現する核酸構築物で宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトすることによって、エキソソームへのローディングを行ってもよい。
【００４０】
ターゲティング：
本発明によれば、エキソソームは所望の細胞型又は組織に対してターゲティングされる。このターゲティングは、標的となる細胞の表面で発現する細胞表面部分に結合するターゲティング部分をエキソソームの表面で発現させることによって達成される。本発明において、ターゲティング部分はトランスフェリン（Ｔｆ）ポリペプチド又はペプチドである。好ましい実施形態において、ターゲティング部分はＴｆペプチドである。典型的には、Ｔｆポリペプチド又はＴｆペプチドターゲティング部分は、エキソソームの表面で通常発現する膜貫通タンパク質との融合タンパク質として発現する。
【００４１】
Ｔｆは、高親和性で鉄に可逆的に結合する糖タンパク質である。ヒトトランスフェリン（Ｔｆ−ｈ）は、６９８アミノ酸残基及びおよそ８０ｋＤａの分子量を有する単一のポリペプチド鎖からなる。配列番号１にＴｆ−ｈのポリペプチド配列を示す。配列番号２にヒトＴｆ遺伝子のポリヌクレオチド配列を示す。Ｔｆ−ｈは、高親和性で２つのＦｅ３＋イオンと結合する。血漿中には、鉄含有量が異なる４種の別個のＴｆのアイソフォーム：（１）アポ−トランスフェリン（ＡＰＯＴｆ；鉄イオンなし）；（２）一鉄トランスフェリン（Ｃ末端ドメインに鉄を含む）；（３）一鉄トランスフェリン（Ｎ末端ドメインに鉄を含む）、及び（４）二鉄トランスフェリン（２つの結合部位に鉄を含む）が共存している。本発明において、Ｔｆには、これらの４種のアイソタイプのいずれかが単独で又は互いに組み合わされて包含される。
【００４２】
Ｔｆ受容体（ＴｆＲ）は、多くの腫瘍の細胞表面で高度に発現する、ジスルフィド結合したホモ二量体糖タンパク質である。好ましい本発明の実施形態において、本発明のエキソソームの標的となる細胞上に存在する部分（ｍｏｉｅｔｙ）であって、エキソソームの表面で発現するＴｆポリペプチド又はＴｆペプチドターゲティング部分に結合する部分はＴｆＲである。
【００４３】
より詳細には、本発明のエキソソームは、Ｔｆポリペプチドターゲティング部分又はＴｆペプチドターゲティング部分をその表面で発現させることによって、特定の細胞型又は組織に対してターゲティングされ得る。適切なペプチドは、受容体のような細胞表面部分又は標的となる細胞の細胞表面に見出されるそのリガンドに結合するものである。好ましい実施形態において、Ｔｆポリペプチド又はＴｆペプチドターゲティング部分は、標的となる細胞の細胞表面上のＴｆＲに結合する。適切なターゲティング部分の例は、ターゲティング部分がエキソソームの表面で発現可能であり、エキソソーム中への膜タンパク質の挿入を阻害しない限り、短いペプチド、及び完全なＴｆタンパク質である。典型的には、ターゲティングペプチドは膜貫通エキソソームタンパク質に対して異種のものである。ペプチドターゲティング部分は、典型的には長さが１００アミノ酸未満、例えば、５０アミノ酸未満、３０アミノ酸未満で、少なくとも１０、５又は４アミノ酸であり得る。
【００４４】
好ましい実施形態において、最小のＴｆターゲティング部分は、配列番号１のＴｆタンパク質のアミノ酸５０〜５６のアミノ酸配列、すなわちアミノ酸配列：ＰＳＤＧＰＳＶ（配列番号４）を有する。
【００４５】
特に好ましい実施形態において、Ｔｆターゲティングポリペプチド又はペプチドは、アミノ酸配列：ＣＲＴＩＧＰＳＶＣ（配列番号３）、及び／又は配列番号１のＴｆタンパク質のアミノ酸５０〜５６、すなわちアミノ酸配列：ＰＳＤＧＰＳＶ（配列番号４）からなるか又はそれを含む。
【００４６】
本発明では、配列番号３又は４のアミノ酸配列を含むペプチドフラグメントをターゲティング部分として使用することができる。そのようなフラグメントは、長さが１０アミノ酸以下、２０アミノ酸以下、３０アミノ酸以下、５０アミノ酸以下、１００アミノ酸以下であり得、又はそれより長くてもよい。好ましい実施形態において、フラグメントは長さが１０アミノ酸以下である。フラグメントは、配列番号１のＴｆタンパク質のフラグメントであることが好ましい。全長Ｔｆタンパク質も、本発明のエキソソームにおけるターゲティング部分として使用することができる。
【００４７】
ＴｆＲは、未熟な赤血球系細胞、胎盤組織、並びに正常な及び悪性の急速に分裂する細胞で高度に発現する。したがって、Ｔｆタンパク質、ポリペプチド及びペプチドターゲティング部分は、例えば、特定の組織型に対してターゲティングするために、又は腫瘍などの病変組織に対してターゲティングするために使用され得る。特に好ましい本発明の実施形態において、エキソソームは腫瘍に対してターゲティングされる。
【００４８】
本発明のＴｆターゲティングエキソソームは、あらゆる細胞型への及び異種間での積荷の送達を可能にするという点で特に有利であり得る。これは、Ｔｆは異種間で高度に保存されており、ＴｆＲは多くの細胞型の表面で普遍的に発現するためである。したがって、例えば、本発明のマウスエキソソームはヒト細胞によって取り込まれ得、本発明のヒトエキソソームはマウス細胞によって取り込まれ得る。したがって、Ｔｆターゲティングエキソソームは、汎用性のあるｉｎ  ｖｉｔｒｏのトランスフェクション試薬と考えられる。加えて、ｉｎ  ｖｉｖｏのＴｆターゲティングエキソソームは、高いＴｆＲ発現を示すターゲティング組織（例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）の内皮細胞、腫瘍細胞、及び（例えば、心臓虚血時又は脳卒中後の）局所的な低酸素部位）にとって理想的であると思われる。
【００４９】
したがって、本発明のＴｆターゲティングエキソソームの潜在的な用途としては、ＢＢＢを通過する遺伝学的及び非遺伝学的な積荷のターゲティング；腫瘍に対する癌治療のターゲティング（これは、腫瘍細胞は周囲組織に対して有意に高いレベルのＴｆＲを発現することによる）；及び虚血を伴う疾患（例えば、虚血性心疾患、脳卒中）（このような疾患ではＴｆＲ発現レベルの上昇も起こる。）に対する治療のターゲティングが挙げられる。
【００５０】
本発明のエキソソームの表面上でのＴｆターゲティング部分の発現は、標的細胞によるエキソソーム及びその積荷の取り込みを、非ターゲティングエキソソームと比較して少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、又は少なくとも２０倍増加させ得る。本発明のエキソソームの表面上でのＴｆターゲティング部分の発現は、リポフェクトアミン又はＲＮＡｉ  ｍａｘなどの従来の市販のトランスフェクション試薬を用いて送達される同じ積荷の取り込みレベルに匹敵するレベルの、標的細胞によるエキソソームの積荷の取り込みを生じる可能性がある。あるいは、本発明のエキソソームの表面上でのＴｆターゲティング部分の発現は、標的細胞によるエキソソームの積荷の取り込みを、従来の市販のトランスフェクション試薬を用いて送達される同じ積荷の取り込みレベルと比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、又は少なくとも２０倍増加させ得る。
【００５１】
Ｔｆポリペプチドターゲティング部分又はＴｆペプチドターゲティング部分は、エキソソーム膜貫通タンパク質との融合タンパク質として発現させることによってエキソソームの表面で発現する。いくつかのタンパク質はエキソソームに随伴していることが知られている。すなわち、それらは、形成されるとエキソソーム中に組み込まれる。本発明に従って使用される好ましいタンパク質は膜貫通型のものである。例としては、Ｌａｍｐ−１、Ｌａｍｐ−２、ＣＤ１３、ＣＤ８６、フロチリン、シンタキシン−３、ＣＤ２、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４１ａ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＩＣＡＭ−１、インテグリンアルファ４、ＬｉＣＡＭ、ＬＦＡ−１、Ｍａｃ−１アルファ、Ｍａｃ−１ベータ、Ｖｔｉ−１Ａ、Ｖｔｉ−１Ｂ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ９、ＣＤ１８、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＸＣＲ４、ＦｃＲ、ＧｌｕＲ２／３、ＨＬＡ−ＤＭ（ＭＨＣ  ＩＩ）、免疫グロブリン、ＭＨＣ−Ｉ若しくはＭＨＣ−ＩＩの構成要素、ＴＣＲベータ、及びテトラスパニンが挙げられる（それらに限定されない）。本発明の特に好ましい実施形態において、膜貫通タンパク質は、Ｌａｍｐ−１、Ｌａｍｐ−２、ＣＤ１３、ＣＤ８６、フロチリン、及びシンタキシン−３から選択される。特に好ましい一実施形態において、膜貫通タンパク質はＬａｍｐ−２である。Ｌａｍｐ−２の配列は配列番号５に記載されている。
【００５２】
以下の節は、本発明のすべてのポリペプチドの一般的な特徴に関し、特に、本発明のポリペプチドの範囲内に含まれるアミノ酸配列の変異、改変、修飾又は誘導体化に関する。本明細書に記載のポリペプチドのそのような変異、改変、修飾又は誘導体化は、さらに必要な活性又は特徴（場合により後節に記載される。）を該ポリペプチドが保持することを条件とすることは理解されるであろう。
【００５３】
本発明のポリペプチドのバリアントは、本開示の後節でより詳細に記載されている特定のレベルのアミノ酸同一性によって規定され得る。アミノ酸同一性は、任意の適切なアルゴリズムを用いて算出することができる。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．（１９９３）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ  ３６：２９０〜３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ，Ｆら（１９９０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３〜１０に記載されているように、例えば、ＰＩＬＥＵＰ及びＢＬＡＳＴのアルゴリズムを使用して、（典型的には、これらの初期設定に基づいて）相同性を算出すること又は配列を並べること（例えば、同等の又は対応する配列を特定すること）ができる。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて一般公開されている。このアルゴリズムでは、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインした場合に一致するか又はある正の値の閾値スコアＴを満たす、問い合わせ配列中の長さＷの短いワードを特定することによって、高スコア配列対（ＨＳＰ）をまず特定する。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，前掲）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むＨＳＰの検索を開始するシードとして機能する。ワードヒットは、累積アライメントスコアが増大し得る限り、各配列に沿って両方向に拡張される。各方向におけるワードヒットの拡張は次の場合に終了する：累積アライメントスコアがその最大達成値から数量Ｘだけ低下した場合；１つ又は複数の負のスコアの残基アライメントが蓄積したために、累積スコアがゼロ又はゼロ未満になった場合；あるいは、いずれかの配列の末端に到達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータのＷ、Ｔ及びＸはアライメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、初期設定として、ワードの長さ（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５〜１０９１９参照）アライメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較を使用する。
【００５４】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２つの配列間の類似性の統計解析を行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５７８７参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。Ｐ（Ｎ）は、２種のポリヌクレオチド配列間又はアミノ酸配列間で偶然に一致が生じる確率の指標を提供する。例えば、ある配列が他の配列と類似していると考えられるのは、第１の配列と第２の配列との比較における最小合計確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満の場合である。他方、ＵＷＧＣＧパッケージは、相同性を算出するために使用できるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（例えば、その初期設定に基づいて使用される）（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２，  ３８７〜３９５）。
【００５５】
本発明のポリペプチドのバリアントが置換バリアントも含むことは理解されるであろう。置換バリアントは、好ましくは、１個又は複数のアミノ酸を同数のアミノ酸で置換して、保存的なアミノ酸置換を行う置換を含む。例えば、アミノ酸は、同様の特性を有する別のアミノ酸、例えば、他の塩基性アミノ酸、他の酸性アミノ酸、他の中性アミノ酸、他の荷電アミノ酸、他の親水性アミノ酸、他の疎水性アミノ酸、他の極性アミノ酸、他の芳香族アミノ酸又は他の脂肪族アミノ酸で置換されてもよい。適切な置換基を選択するために使用できる２０種の主要アミノ酸のいくつかの性質は下表の通りである。
【００５６】
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【００５７】
本発明において使用されるポリペプチドのアミノ酸配列は、天然に存在しない化学的性質を含むように、あるいは化合物の安定性及びターゲティング特異性を増大させるように修飾され得る。合成の方法によってポリペプチドを製造する場合には、そのようなアミノ酸を製造中に導入してもよい。また、合成又は組換えによる製造後にポリペプチドを修飾してもよい。
【００５８】
いくつかの側鎖修飾は当技術分野において知られており、さらに必要な活性又は特徴（場合により本明細書に記載される。）をポリペプチドが保持することを条件にポリペプチドの側鎖に対して行われ得る。
【００５９】
本節に記載のバリアントポリペプチドは、アミノ酸配列は配列番号１中の配列及び配列番号１からのペプチドとは異なるか、あるいは配列番号３及び／又は４並びにこれらの配列の一方若しくは両方を含むペプチド及びポリペプチドとは異なるが、ＴｆＲに結合する能力を保持するものである。あるいは、本節に記載のバリアントポリペプチドは、アミノ酸配列は配列番号５中の配列とは異なるが、エキソソームの膜内に挿入される能力を保持するものであり得る。
【００６０】
バリアント配列は、典型的には、少なくとも１、２、３、５、１０、２０、３０、５０、１００個、又はそれより多くの変異（アミノ酸の置換、欠失又は挿入であり得る。）によって異なる。例えば、修飾ポリペプチドがエキソソームの膜内に挿入されるのであれば、１〜１００、２〜５０、３〜３０、又は５〜２０アミノ酸の置換、欠失又は挿入が行われ得る。
【００６１】
Ｔｆポリペプチド又はＴｆペプチドのバリアントであるポリペプチド又はペプチドは、配列番号１、３若しくは４のアミノ酸配列又は配列番号１、３若しくは４からの対応Ｔｆペプチド配列と、典型的には約５０％、５５％又は６５％より高い同一性を有し、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の同一性を有する。
【００６２】
典型的には、Ｌａｍｐ−２のバリアントであるポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列と、約５０％、５５％又は６５％を超える同一性、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の同一性を有する。
【００６３】
配列番号１、３、４又は５のバリアントの同一性は、配列番号１又は５のシグナル配列を除き、それぞれ、配列番号１、３、４又は５に示される配列の少なくとも５、１０、２０、３０、５０、１００、２００、２５０、３００、３５０、又はそれ以上の連続したアミノ酸の領域にわたって、あるいはより好ましくは配列番号１、３、４又は５の全長にわたって評価され得る。
【００６４】
本発明で使用されるＴｆペプチドターゲティング部分は、典型的には、長さが１００アミノ酸未満、例えば５０アミノ酸未満、３０アミノ酸未満であり、少なくとも１０、５又は３アミノ酸長である。
【００６５】
本発明において使用されるＬａｍｐ−２ポリペプチドのフラグメントは、典型的には、少なくとも５５アミノ酸長、１００、１５０、２００又は２５０アミノ酸長である。
【００６６】
エキソソーム膜貫通タンパク質はＴｆターゲティング部分を組み込むように修飾される。したがって、エキソソーム膜貫通タンパク質は、Ｔｆターゲティング部分を含む融合タンパク質として発現する。Ｔｆターゲティング部分は、エキソソームの表面に存在する膜貫通タンパク質の部分に配置されるように膜貫通タンパク質中に組み込まれる。本発明の好ましい態様において、エキソソーム膜貫通タンパク質はＬａｍｐ−２であり、Ｔｆターゲティング部分は融合タンパク質として発現し、ここで、Ｔｆターゲティング部分はＬａｍｐ−２タンパク質のＮ末端の近傍に存在し（例えば、Ｌａｍｐ−２のＮ末端アミノ酸から３０又は２０アミノ酸の範囲内にあり）、シグナル配列を含まない。
【００６７】
Ｔｆターゲティング部分と膜貫通タンパク質の残部との間には、例えば、膜貫通タンパク質のフォールディングの際にＴｆターゲティング部分からの干渉を回避するために、スペーサー配列又はリンカー配列が備えられていてもよい。
【００６８】
リンカー配列又はスペーサー配列は、典型的には１〜１０アミノ酸長であり、典型的には１〜８アミノ酸長であり、例えば２、３又は４アミノ酸長である。リンカー中に組み込むための適切なアミノ酸は、アラニン、アルギニン、セリン又はグリシンである。適切なリンカーとしては、例えば、Ａｌａ−Ａｒｇ、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙが挙げられる。
【００６９】
本発明の特に好ましい態様において、膜貫通タンパク質はＬａｍｐ−２であり、Ｔｆターゲティング部分はタンパク質のＮ末端又はその近傍に存在し、リンカー配列でＬａｍｐ−２から分離される。
【００７０】
本発明の実施において、Ｔｆターゲティング部分は、Ｔｆターゲティング部分とエキソソーム膜貫通タンパク質とを含む融合タンパク質を、エキソソームを生成するために使用される細胞内で発現させることによってエキソソーム中に導入される。細胞内でのこの融合タンパク質の発現は、融合タンパク質が細胞から生成されるとエキソソーム中に組み込まれることを可能にする。
【００７１】
例えば、融合タンパク質を発現するポリヌクレオチド構築物（例えばＤＮＡプラスミド）が細胞内にトランスフェクトされる。細胞内へのポリヌクレオチド構築物の導入には任意の適切な方法が使用できる。ポリヌクレオチド構築物は、コードする融合タンパク質が細胞内で発現するように適切なプロモーター配列を含む。タンパク質が生成されると小胞体の膜内に組み込まれるようにシグナルペプチド配列も含まれる。次いで、膜タンパク質は、エキソソーム中に組み込まれる前にエキソソーム／リソソーム区画に輸送される。シグナル配列は、典型的には、エキソソーム膜貫通タンパク質のシグナルペプチド配列である。例えば、シグナルペプチド配列は好ましくはＬａｍｐ−２由来である。
【００７２】
エキソソームの生成のための好適な細胞については上でより詳細に説明されている。典型的には、本発明の融合タンパク質が細胞内で発現するように、好適な細胞（例えば未熟樹状細胞）が上記ポリヌクレオチド構築物でトランスフェクトされる。細胞によって生成されるエキソソームはその後回収できる。そのようなエキソソームでは、融合タンパク質は、エキソソームがターゲティング部分を通じて所望の組織又は細胞型に対してターゲティングされるように膜内に挿入されている。
【００７３】
細胞から生成されたエキソソームは、任意の適切な方法によって培地から回収することができる。典型的には、エキソソームの調製物は、細胞培養物又は組織上清から、遠心分離、濾過、又はこれらの方法の組み合わせによって調製することができる。例えば、エキソソームは、分画遠心分離、すなわち低速（＜２００００ｇ）遠心分離（より大きな粒子をペレット化）とそれに続く高速（＞１０００００ｇ）遠心分離（エキソソームをペレット化）、適切なフィルター（例えば、０．２２μｍのフィルター）を用いたサイズ濾過、（例えば、スクロース勾配での）勾配超遠心分離、又はこれらの方法の組み合わせによって調製することができる。
【００７４】
本発明の好ましい一態様によれば、ターゲティングされたエキソソームに外因性遺伝物質が搭載される。特に、本発明によれば、エキソソームが、本明細書に記載のターゲティング部分を用いて調製され、次いで、所望の送達用又は上記遺伝物質がエキソソームに搭載される。
【００７５】
本発明のいくつかの実施形態では、エキソソームは、特定の組織型への標的指向性がより高いものが選択される。例えば、異なる細胞由来のエキソソームは、その生理学的機能によって必要とされる特定の細胞サブタイプに対する天然の親和性（例えば、成熟樹状細胞由来のエキソソームのＴ細胞に対する十分に確立した親和性）を有してもよい。この親和性は、上記積荷の組織への特異的な送達を促進するために利用され得る。
【００７６】
送達／投与：
本発明の構築物は任意の適切な方法によって投与され得る。ヒト又は動物の対象に対する投与は、非経口、筋肉内、脳内、血管内（例えば静脈内）、皮下、鼻腔内、心臓内、脳室内、腹膜内又は経皮投与から選択され得る。典型的には、送達の方法は注射によるものである。好ましくは、注射は筋肉内又は血管内（例えば静脈内）注射である。医師は、個々の患者ごとに必要とされる投与経路を決定することができる。
【００７７】
構築物は、好ましくは組成物として送達される。組成物は、非経口、筋肉内、脳内、血管内（例えば静脈内）、心臓内、脳室内、腹膜内、皮下、鼻腔内又は経皮投与を含む任意の適切な投与経路用に製剤化することができる。非経口投与用の組成物は、緩衝液、希釈剤及び他の適切な添加物を含有してもよい無菌水溶液を含み得る。本発明の構築物は、薬学的に許容される担体、増粘剤、希釈剤、緩衝液、保存剤、及び他の薬学的に許容される担体又は賦形剤などをエキソソームに加えて含んでもよい医薬組成物中に製剤化され得る。
【００７８】
「薬学的に許容される担体」（添加剤）とは、対象に１種又は複数種の核酸を送達するための薬学的に許容される溶剤、懸濁化剤又は他の任意の薬理学的に不活性なビヒクルである。典型的な薬学的に許容される担体としては、結合剤（例えば、予めゼラチン化されたトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース及び他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、リン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、水素化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム）；崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウム）；又は湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）が挙げられる（それらに限定されない）。
【００７９】
本明細書に記載の組成物は、医薬組成物中に従来見出される他の添加成分をさらに含有してもよい。したがって、例えば、組成物は、さらなる適合可能な薬学的に活性な物質を含有してもよく、あるいは、本発明の組成物の多様な剤形を物理的に調製する際に有用なさらなる物質、例えば、色素、香味剤、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤及び安定剤などを含有してもよい。しかし、そのような物質は、添加する場合、本明細書に記載の組成物の成分の生物学的活性を不当に阻害すべきではない。
【００８０】
治療有効量の組成物が投与される。用量は、多様なパラメータによって、特に、治療する患者の状態の重症度、年齢及び体重；投与の経路；及び必要とされるレジメンによって決定することができる。医師は、どのような患者であっても、必要とされる投与の経路及び用量を決定することができるであろう。最適用量は、個々の構築物の相対的な効力によって変動し得、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの動物モデルにおいて有効であることが判明しているＥＣ５０に基づいて一般的に推定できる。概して、用量は０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重である。典型的な日用量は、特定の構築物の効力、治療対象の年齢、体重及び状態、疾患の重症度、並びに投与の頻度及び経路により、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重である。投与が筋肉内注射又は全身（静脈内又は皮下）注射によるものであるかどうかによって、異なる用量の構築物が投与され得る。好ましくは、単回筋肉内注射の用量は約５〜２０μｇである。好ましくは、単回又は複数回の全身注射の用量は１０〜１００ｍｇ／ｋｇ体重である。
【００８１】
構築物のクリアランス（及びいずれかの標的分子の分解）のために、患者は、繰り返し、例えば、１日１回若しくはそれ以上、週１回、月１回又は年１回、治療を受けることが必要な場合もある。当業者は、体液又は体組織における測定された構築物の滞留時間及び濃度に基づいて繰り返し投与のペースを容易に推測することができる。成功した治療の後に、患者に維持療法を受けさせることが望ましい場合があり、この場合、構築物は、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の維持用量で、１日１回若しくは複数回から２０年毎に１回まで投与される。
【００８２】
本発明は、以下の実施例を参照してより詳細に説明される。
【実施例】
【００８３】
実施例１（Ｔｆターゲティング部分をコードする構築物の生成）：
Ｌａｍｐ２ｂは、エキソソームの外に突出すると予測されるＮ末端を有するＩ型膜タンパク質であることから、Ｔｆターゲティングリガンドをシグナルペプチドの後のＮ末端に結合させた。Ｔｆターゲティングペプチドがエキソソームの外表面上に位置し、それによりエキソソームにターゲティング能力が与えられるように、ＴｆターゲティングペプチドをＬａｍｐ２ｂ配列内に挿入した。
【００８４】
ポリヌクレオチド配列：ＴＧＴＣＧＴＡＣＣＡＴＣＧＧＡＣＣＡＡＧＴＧＴＴＴＧＴ（配列番号７）によってコードされたＴｆ由来ペプチド：ＣＲＴＩＧＰＳＶＣ（配列番号３）を、国際公開第２０１０／１１９２５６号に記載されたＬａｍｐ２ｂ発現ベクター内に挿入した。
【００８５】
この発現ベクターは、ｅＧＦＰ遺伝子が除去されたｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクター（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）をベースとする。Ｌａｍｐ２ｂをＣ２Ｃ１２細胞からのｃＤＮＡでクローニングし、シグナルペプチド配列の後にＸｈｏＩ及びＢｓｐＥＩ制限部位をグリシンリンカー（Ａｌａ−Ａｒｇ−｛ターゲティングペプチド｝−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）と共に挿入した。Ｌａｍｐ２ｂのシグナルペプチドは膜内挿入に必要であるが、成熟タンパク質中では切り離される。次いで、完全な構築物を、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクター中にＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩ制限部位でＣＭＶプロモーターの下流にクローニングし、この過程でｅＧＦＰを取り除いた。
【００８６】
Ｌａｍｐ２ｂのＮ末端部分でのＴＦコード配列の挿入を可能にするＸｈｏＩ及びＢｓｐＥＩ部位を有するシグナルペプチドの後に追加の配列を付加した。
【００８７】
Ｔｆターゲティングペプチドの端にあるグリシンリンカーは、ＴｆターゲティングペプチドがＬａｍｐ２ｂタンパク質のフォールディングに影響を与えることを防ぐ。最終的に、Ｔｆターゲティングペプチドは、エキソソームの外表面上に位置し、それによりエキソソームにターゲティング能力が与えられる必要がある。
【００８８】
ポリヌクレオチド配列：ＴＧＴＣＧＴＡＣＣＡＴＣＧＧＡＣＣＡＡＧＴＧＴＴＴＧＴ（配列番号７）によってコードされたＴｆターゲティングペプチド：ＣＲＴＩＧＰＳＶＣ（配列番号３）をＬａｍｐ２ｂ内にクローニングし、エキソソーム精製の４日前に樹状細胞内にトランスフェクトした。エキソソームの表面でターゲティングリガンドを発現させる能力に対する主な障害は、初代培養樹状細胞はトランスフェクトするのが困難であり、トランスフェクション後に差異が生じる可能性があることである。樹状細胞は、ウイルスによって活性化される可能性が高く［３０］、そのため、得られるエキソソーム中に組み込まれる免疫賦活性分子を生成するので、ウイルスベクターでの感染も理想的ではない。Ｍｉｒｕｓ  ＢｉｏのＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１試薬は、樹状細胞を有意に活性化することなく効率よく樹状細胞を形質導入するようであったので、これを選択した。採取後４日目に、１０６細胞を含む６ウェルプレートで、ｐＬａｍｐ２ｂ−Ｔｆペプチド発現ベクター５μｇ及びＴｒａｎｓＩＴ  ＬＴ１トランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ）５μｌを用いて樹状細胞のトランスフェクションを行い、８日目にエキソソームの単離を行った。
【００８９】
マウスリソソーム膜糖タンパク質２（Ｌａｍｐ  ２）アイソフォーム２：
非修飾アミノ酸配列（配列番号５）：
2015500826.tif 000004
【００９０】
修飾アミノ酸配列（付加配列は下線付き）（配列番号８及び９）：
2015500826.tif 000005
【００９１】
非修飾ヌクレオチド配列（配列番号６）：
2015500826.tif 000006
【００９２】
修飾アミノ酸配列（付加配列はイタリック体、クローニングに使用される制限部位は下線付き）（配列番号１０）：
2015500826.tif 000007
【００９３】
細胞培養：
樹状細胞は、ＤＣ培地（ＤＭＥＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ、１０％ＦＢＳ、非必須アミノ酸＃、及び抗生物質）で培養した。Ｃ２Ｃ１２細胞は、２０％ＦＢＳ及び抗生物質を添加したＤＭＥＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘで培養した。
【００９４】
実施例２（Ｔｆターゲティング部分を発現するエキソソームを用いて送達されたｓｉＲＮＡによる遺伝子ノックダウン）：
本発明者らは、表面上にＴｆターゲティング部分を有するエキソソームを用いて送達されたｓｉＲＮＡによる標的遺伝子のノックダウンと、非ターゲティングエキソソームを用いて送達されたｓｉＲＮＡ、ＲＶＧペプチドによってターゲティングされたエキソソームを用いて送達されたｓｉＲＮＡ、及び従来のｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬を用いて送達されたｓｉＲＮＡによって達成されたノックダウンと、を比較した。
【００９５】
Ｔｆターゲティングエキソソーム、ＲＶＧターゲティングエキソソーム、非ターゲティングエキソソーム、及び２種の市販のｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬（リポフェクトアミン（ＬＩＰＯ）及びＲＮＡｉ  ｍａｘ）を使用して、ＧＡＰＤＨを阻害するためのｓｉＲＮＡをヒト細胞株（ＨＥＫ及びＢ２Ｍ１７）及びマウス細胞（Ｎ２Ａ及び骨髄樹状細胞）に送達した。エキソソームが使用された場合、それらは樹状細胞由来であった。各エキソソーム処理について、エレクトロポレートされたエキソソーム（Ｅ）に加えて、ｓｉＲＮＡと混合したが、エレクトロポレートされていないエキソソーム（ＮＥ）からなる陰性対照を入れた。Ｆｉｇｕｒｅ１〜４に見られるように、Ｔｆ−エキソソームは、すべての細胞型において、ＧＡＤＰＨ発現の低下という点で非ターゲティング及びＲＶＧエキソソームより良好であり、さらに効率の点でも市販のトランスフェクション試薬のリポフェクトアミン及びＲＮＡｉ  ｍａｘに匹敵する程度であった。
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【００９６】
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１４  Ｉｓｈｉｄａ  Ｔ，  Ｉｃｈｉｈａｒａ  Ｍ，  Ｗａｎｇ  Ｘ，  Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｋ，  Ｋｉｍｕｒａ  Ｊ，  Ｍａｊｉｍａ  Ｅ，  Ｋｉｗａｄａ  Ｈ  （２００６），  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＥＧｙｌａｔｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｒａｔｓ  ｅｌｉｃｉｔｓ  ＰＥＧ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＩｇＭ，  ｗｈｉｃｈ  ｉｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｅｃｏｎｄ  ｄｏｓｅ  ｏｆ  ＰＥＧｙｌａｔｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １１２：１５−２５．
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２４  Ｚｉｔｖｏｇｅｌ  Ｌ，  Ｒｅｇｎａｕｌｔ  Ａ，  Ｌｏｚｉｅｒ  Ａ，  Ｗｏｌｆｅｒｓ  Ｊ，  Ｆｌａｍｅｎｔ  Ｃ，  Ｔｅｎｚａ  Ｄ，  Ｒｉｃｃｉａｒｄｉ−Ｃａｓｔａｇｎｏｌｉ  Ｐ，  Ｒａｐｏｓｏ  Ｇ，  Ａｍｉｇｏｒｅｎａ  Ｓ  （１９９８），  Ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｍｕｒｉｎｅ  ｔｕｍｏｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｖａｃｃｉｎｅ：  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｅｘｏｓｏｍｅｓ，  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ４：５９４−６００．
２５  Ｈａｏ  Ｓ，  Ｍｏｙａｎａ  Ｔ，  Ｘｉａｎｇ  Ｊ  （２００７），  Ｒｅｖｉｅｗ：  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｂｙ  ｅｘｏｓｏｍｅ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ  ２２：６９２−７０３．
２６  Ｖａｌａｄｉ  Ｈ，  Ｅｋｓｔｒｏｍ  Ｋ，  Ｂｏｓｓｉｏｓ  Ａ，  Ｓｊｏｓｔｒａｎｄ  Ｍ，  Ｌｅｅ  ＪＪ，  Ｌｏｔｖａｌｌ  ＪＯ  （２００７），  Ｅｘｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｍＲＮＡｓ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｉｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｃｅｌｌｓ，  Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９（６）：６５４−９．
２７  Ｓｋｏｇ  Ｊ，  Ｗｕｒｄｉｎｇｅｒ  Ｔ，  ｖａｎ  Ｒｉｊｎ  Ｓ，  Ｍｅｉｊｅｒ  ＤＨ，  Ｇａｉｎｃｈｅ  Ｌ，  Ｓｅｎａ−Ｅｓｔｅｖｅｓ  Ｍ，  Ｃｕｒｒｙ  ＷＴ  Ｊｒ，  Ｃａｒｔｅｒ  ＢＳ，  Ｋｒｉｃｈｅｖｓｋｙ  ＡＭ，  Ｂｒｅａｋｅｆｉｅｌｄ  ＸＯ  （２００８），  Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｈａｔ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｔｕｍｏｕｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｐｒｏｖｉｄｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ，  Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １０（１２）：１４７０−６．
２８  ＷＯ２０１０／１１９２５６．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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