【手続補正書】
【提出日】平成22年2月19日(2010.2.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
本発明の分子分析光検出装置は、試料として予め蛍光標識された被分析物質を含む試料を用いた場合、励起光照射光学系として蛍光を励起する波長の励起光を照射するものとし、信号検出部として蛍光を検出するものとすれば、分子蛍光検出装置として用いることができる。また、本発明の分子分析光検出装置は、励起光照射光学系として被分析物質のラマン散乱を生じさせる波長の励起光を照射するものとし、信号検出部としてラマン散乱光を検出するものとすれば、ラマン分光分析装置として用いることができる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
また、前記増強部材は、前記所定領域上に備えられた、前記所定の励起光の波長よりも小さい周期の凹凸を表面に有する金属微細構造体により構成されていてもよいし、前記所定領域上に配置された、前記所定の励起光の波長よりも小さいサイズの複数の金属ナノロッドにより構成されていてもよい。「励起光の波長よりも小さい凹凸構造」とは、凹凸構造をなす凸部及び凹部の平均的な大きさと平均的なピッチが励起光の波長よりも小さいことを意味する。凹部に金属はあってもなくてもよい。また、「金属ナノロッド」とは、短軸長さと長軸長さが異なる棒状の金属ナノ粒子のことである。金属微細構造体および金属ナノロッドは、上記金属膜と同様に、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、およびこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属を主成分とすることが望ましい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
サンプルプレート１０は、ガラス等の板状の誘電体プレート１１と、誘電体プレート１１上の所定の微小な領域に形成された増強部材１２とからなる。所定の微小な領域は、増強部材１２が設けられたのとは反対側から試料接触面１０ａと増強部材１２との界面に入射される励起光Ｌ０の照射領域よりも小さい領域である。この微小な領域の面積は、励起光が照射された際にその領域上に生じる増強場の有効な体積で定められる測定体積が数フェムトリットル程度となる面積である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
なお、誘電体プレート１１上に形成される金属膜および／または金属薄膜層は、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、およびこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属を主成分とするものであれば、表面プラズモンを誘起することができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
誘電体多層膜１９を備えるサンプルプレート１０Ｆに、プレート１０下面側から、誘電体プレート１１とスペーサ層１９ａの界面に対して全反射する角度で励起光が入射することにより、生じたエバネッセント電界がスペーサ層を透過し、キャビティー層において導波モードが励起される。この導波モードにより、表面プラズモンの場合と同様に、キャビティー層の表面に電界分布が生じ、多層膜表面近傍の電場がその他の領域と比較して増強される。この電場増強領域において蛍光強度は増強されるものであり、この誘電多層膜１９が増強部材１２Ｆを構成している。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
図５（Ｂ）に示すサンプルプレート１０Ｈは、ガラス板などの誘電体プレート１１の一表面上に互いに同じ大きさの所定領域に増強部材１２Ｉ、１２Ｊを設けたものである。さらに、一方の増強部材１２Ｉ上には被分析物質と特異的に結合する結合膜４０が固定されている。このサンプルプレート１０Ｈを用いれば、増強部材１２Ｉを測定領域、他方の増強部材１２Ｊをリファレンス測定領域として用いることができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
光源２１から出射された励起光Ｌ０はプリズム２２を介してサンプルプレート１０の試料接触面１０ａとは反対の面側から試料接触面１０ａ（界面）に全反射角で入射され、全反射される。この励起光Ｌ０の照射により界面においてエバネッセント波Ｅｗ（図中破線で示す）が生じ、金属膜１３表面に表面プラズモンが励起される。この表面プラズモンにより金属膜１３上には、電界分布Ｄ（図中実線で模式的に示す）が生じ、電場増強領域が形成される。一方、エバネッセント波Ｅｗの滲み出し領域においては蛍光標識ｆが励起されて蛍光が発生する。このとき、電場増強領域にある蛍光標識ｆ1からの蛍光Ｌｆ1の強度は増強されるが、電場増強領域外にある蛍光標識ｆ2からの蛍光Ｌｆ2強度は増強されない。また、エバネッセント波Ｅｗの滲み出し領域以外の蛍光標識ｆは励起されず蛍光を発しない。信号検出部３０においては、図示しない集光レンズにより蛍光を集光し、光検出器により蛍光検出を行う。この際には電場増強領域を含む広範囲の蛍光標識からの蛍光が集光され得るが、例えば、該蛍光を減衰させるフィルタを集光レンズと光検出器との間に備えることにより、蛍光強度が増強され強度の大きいものを検出することが可能となる。また、受光する蛍光を減衰させるためには、その他、受光素子のゲインを変更する、あるいは照明光の光量を変えるなどの方法がある。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
図７（Ｃ）に示す例では、マッシュルーム状の金属７５ａの頭部が粒子状であり、サンプルプレート表面から見れば、金属微粒子が配列されたような構造になっている。かかる構成では、マッシュルーム状の金属７５ａの頭部が凸部であり、その平均的な径およびピッチが励起光Ｌ０の波長よりも小さく設計される。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
信号検出部３０は、蛍光増強領域からの蛍光Ｌｆを集光する集光レンズ３１と、励起光Ｌ０の散乱光、漏れ光を除去するフィルタ３２と、蛍光を検出器に導光するレンズ３３と、レンズ３３の焦点位置に配置されたピンホール３４と、ピンホール３４を透過した蛍光を受光する光検出器であるアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）３５と、光検出器からの信号を自己相関法により処理する自己相関器３６を備えるものである。測定体積における光軸方向（ｚ軸方向）の深さはエバネッセント波の滲み出し領域により規定することができるため、本来ピンホールはなくてもよい。しかしながら、励起光の散乱光、漏れ光などによりエバネッセント波の滲み出し領域以外の箇所において蛍光が励起されてしまうことも考えられ、ピンホールを備えてｚ軸方向の検出領域の制限を二重にすることがより望ましい。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
上記構成の分子蛍光検出装置３を用いた分子蛍光検出方法の原理は第１の実施形態と同様であるため詳細は省略する。本実施形態においても、第１の実施形態の場合と同様の効果を得ることができ、非常に精度の高い測定を行うことができ、かつ装置を安価に構成することができる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９９】
このように、血液を注入口から注入し、抗原が一次抗体と結合するまでのstep1からstep8までの間、図９のように励起光照射光学系２０と信号検出部３０は、第１の測定エリア５７からの蛍光信号を検出する位置に配置されて、蛍光信号のゆらぎ測定を行っている。血漿の流れに従い蛍光標識が第１の測定エリア５７上に入出し、一部は固定される。これに伴い検出される蛍光信号のゆらぎは徐々に減少する。蛍光信号のゆらぎが治まった後、この第１の測定エリア５７からの蛍光強度を検出することにより、抗原の濃度を得ることができる。その後、試料セル５０を第２の測定エリアからの蛍光信号を検出できるようにＸ方向に移動させ、第２の測定エリアからの蛍光信号を検出する。第２の測定エリアからの蛍光信号は試料セル５０内部で浮遊する、抗原とは結合していない蛍光色素からの信号であると考えられ、この信号をリファレンスとして、第１の測定エリアからの信号を補正することにより、より精度の高い検出結果を得ることができる。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０８】
信号検出部１３０は、ラマン散乱光ＬＡを集光する集光レンズと、ラマン散乱光ＬＡを検出する光検出器および光検出器からの信号を自己相関法により処理する自己相関器などを備えるものである。光検出器は、受光した光を分光してラマン散乱光を検出し、ラマンスペクトルを得る分光検出器である。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
本実施形態のラマン分光分析装置１０１による分光分析方法は次の通りである。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１１】
光源１２１から出射された励起光Ｌ０はプリズム２２を介してサンプルプレート１０の試料接触面１０ａとは反対の面側から試料接触面１０ａ（界面）に全反射角で入射され、全反射される。この励起光Ｌ０の照射により界面においてエバネッセント波Ｅｗ（図中破線で示す）が生じ、金属膜１３表面に表面プラズモンが励起される。この表面プラズモンにより金属膜１３上には、電界分布Ｄ（図中実線で模式的に示す）が生じ、電場増強領域が形成される。一方、エバネッセント波Ｅｗの滲み出し領域においては被分析物質が励起されてラマン散乱光が発生する。このとき、電場増強領域にある被分析物質Ａ1からの散乱光ＬA1の強度は増強されるが、電場増強領域外にある被分析物質Ａ2からの散乱光ＬA2の強度は増強されない。また、エバネッセント波Ｅｗの滲み出し領域以外の被分析物質は励起されず散乱光を発しない。信号検出部１３０においては、図示しない集光レンズにより散乱光を集光し、光検出器によりラマン散乱光の検出を行う。ラマン散乱光は非常に微弱な光であるため、増強された光のみが効果的に検出される。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１９】
【図１】本発明の第１実施形態による分子蛍光検出装置を示す概略構成図
【図２】（Ａ）サンプルプレートの好適な例を示す斜視図、（Ｂ）（Ａ）に示すサンプルプレートの側断面図、（Ｃ）（Ａ）に示すサンプルプレートの上面図
【図３】（Ａ）〜（Ｃ）はサンプルプレートの好適な例を示す側断面図
【図４】（Ａ）、（Ｂ）はサンプルプレートの好適な例を示す側断面図
【図５】（Ａ）、（Ｂ）はサンプルプレートの好適な例を示す斜視図
【図６】本発明の第２実施形態による分子蛍光検出装置を示す概略構成図
【図７】（Ａ）、（Ｂ）は増強部材の一部を示す斜視図、（Ｃ）は増強部材の一部を示す側断面図
【図８】増強部材の一部を示す平面図
【図９】本発明の第３実施形態による分子蛍光検出装置を示す概略構成図
【図１０】（Ａ）図９の装置に用いられるサンプルプレートの上面図、（Ｂ）図９の装置に用いられるサンプルプレートの側断面図
【図１１】試料セル５０の注入口から試料を注入し、抗原が一次抗体と結合するまでの流れを示す図
【図１２】本発明の第３実施形態の変更例１
【図１３】本発明の第３実施形態の変更例２
【図１４】本発明の第４実施形態によるラマン分光分析装置を示す概略構成図
【図１５】本発明の第５実施形態によるラマン分光分析装置を示す概略構成図