(57)【要約】  本発明は、イソプレンを生産することのできる組み換え微生物、並びにこのような組み換え微生物を利用して、高効率でイソプレンを生産させることに関する。本発明では、ｉｓｐＡ遺伝子の機能活性を変更することにより、イソプレンを産生するよう遺伝子操作された組換え細胞における、あるいは本来であれば発酵中にイソプレノイドが蓄積し易い細胞における、イソプレノイド分子の産生が低減される。これによりｉｓｐＡ遺伝子の機能活性が低減されることで、宿主微生物におけるイソプレン合成を増強させることができる。
2015510392.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソプレンを産生することのできる組換え細胞であって、該細胞は低減された機能活性を有するｉｓｐＡ遺伝子と、
（ａ）異種核酸によりコードされるイソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている１種以上の核酸；及び
（ｂ）メバロン酸（ＭＶＡ）経路の１種以上のポリぺプチドをコードしている１種以上の核酸とを含み、
前記組み換え細胞を適切な培地で培養することで、前記ポリぺプチドの生産及びイソプレンの合成が提供される、組み換え細胞。
【請求項２】
前記ｉｓｐＡ遺伝子の機能活性が、
ａ．ｉｓｐＡ遺伝子を欠失させること；
ｂ．ｉｓｐＡ遺伝子の発現を低減させること；
ｃ．ｉｓｐＡタンパク質の活性を低減させること；
ｄ．ｉｓｐＡタンパク質の発現を低減させること；又は
ｅ．ｉｓｐＡの発現を一時的に調節すること、により低減される、請求項１に記載の組み換え細胞。
【請求項３】
ｉｓｐＡ遺伝子の発現が、弱いプロモーターの調節下にｉｓｐＡ遺伝子を配置することにより低減される、請求項２に記載の組み換え細胞。
【請求項４】
ｉｓｐＡ遺伝子の発現が、自己調節型プロモーターの調節下にｉｓｐＡ遺伝子を配置することにより低減される、請求項２に記載の組み換え細胞。
【請求項５】
ｉｓｐＡタンパク質活性が、翻訳によりｉｓｐＡタンパク質をタンパク質分解性のタグと融合させることにより低減される、請求項２に記載の組み換え細胞。
【請求項６】
ｉｓｐＡタンパク質活性が、アンチセンスＲＮＡを使用することにより低減される、請求項２に記載の組み換え細胞。
【請求項７】
ｉｓｐＡタンパク質活性が、ｉｓｐＡのｍＲＮＡ分子中に存在するリボソーム結合部位に１つ以上の変異を導入することにより低減される、請求項２に記載の組み換え細胞。
【請求項８】
ｉｓｐＡ遺伝子の発現が、転写抑制因子ＨｒｃＡにより低減される、請求項２に記載の組み換え細胞。
【請求項９】
ｉｓｐＡタンパク質活性が、内在性ｉｓｐＡ遺伝子が、内在性ｉｓｐＡ遺伝子によりコードされるポリペプチドのＫｍと比較してＤＭＡＰＰに関しＫｍが増加しているポリペプチドをコードしている遺伝子により置き換えられることにより低減される、請求項２に記載の組み換え細胞。
【請求項１０】
ｉｓｐＡタンパク質活性が、内在性ｉｓｐＡ遺伝子が、異なる最適温度を含む別の遺伝子により置き換えられることにより低減される、請求項２に記載の組み換え細胞。
【請求項１１】
イソプレン合成酵素ポリペプチドが、植物のイソプレン合成酵素ポリペプチド又はこれらの変異体である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組み換え細胞。
【請求項１２】
前記イソプレン合成酵素ポリペプチドが、クズ属（Pueraria）又はハコヤナギ属（Populus）由来のポリペプチド、又はウラジロハコヤナギ（Populus alba）ｘヤマナラシ（Populus tremula）などの交雑種由来のポリペプチド、又はそれらの変異体由来のポリペプチドである、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
前記イソプレン合成酵素ポリペプチドが、プエラリア・モンタナ（Pueraria montana）又はクズ（Pueraria lobata）、アメリカヤマナラシ（Populus tremuloides）、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）、セイヨウハコヤナギ（Populus nigra）、及びコットンウッド（Populus trichocarpa）、又はそれらの変異体からなる群から選択される、請求項１２に記載の組み換え細胞。
【請求項１４】
前記植物のイソプレン合成酵素ポリペプチドが、クズ（kudzu）イソプレン合成酵素ポリペプチド又はそれらの変異体である、請求項１１に記載の組み換え細胞。
【請求項１５】
前記植物のイソプレン合成酵素ポリペプチドが、ユーカリプタス（Eucalyptus）イソプレン合成酵素ポリペプチド又はそれらの変異体である、請求項１１に記載の組み換え細胞。
【請求項１６】
（ｂ）の、ＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドをコードしている前記１種以上の核酸が、異種核酸である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組み換え細胞。
【請求項１７】
前記細胞が含むＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸が、上流ＭＶＡ経路に由来するものであり、上流ＭＶＡ経路の核酸が、ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ又はアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素及びＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの核酸からなる群から選択される、請求項１６に記載の組み換え細胞。
【請求項１８】
前記細胞が含むＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸が、前記下流ＭＶＡ経路に由来するものであり、前記下流ＭＶＡ経路の核酸が、ＭＶＫ、ＰＭＫ及びＭＶＤ核酸からなる群から選択される、請求項１６に記載の組み換え細胞。
【請求項１９】
前記細胞が、完全なＭＶＡ経路の、ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸を含む、請求項１６に記載の組み換え細胞。
【請求項２０】
前記細胞が、イソペンテニル−ジホスフェートδ−イソメラーゼ（ＩＤＩ）のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸を更に含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項２１】
１−デオキシキシルロース−５−ホスフェート合成酵素（ＤＸＳ）ポリペプチドを更に含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組み換え細胞。
【請求項２２】
前記ＤＸＳポリペプチドをコードしている１種以上の核酸がＤＸＳポリペプチドをコードしている異種核酸である、請求項２１に記載の組み換え細胞。
【請求項２３】
前記ＤＸＳポリペプチドをコードしている１種以上の核酸が、ＤＸＳポリペプチドをコードしている内在性の核酸のコピーである、請求項２１に記載の組み換え細胞。
【請求項２４】
前記１種以上の異種核酸が、誘導型プロモーター又は常時発現型プロモーター下に配置される、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組み換え細胞。
【請求項２５】
前記１種以上の異種核酸が、マルチコピープラスミドにクローン化される、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組み換え細胞。
【請求項２６】
前記１種以上の異種核酸が、前記細胞の染色体に組み込まれる、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組み換え細胞。
【請求項２７】
前記細胞が細菌、藻類、真菌又は酵母細胞である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の組み換え細胞。
【請求項２８】
前記細胞が細菌細胞である、請求項２７に記載の組み換え細胞。
【請求項２９】
前記細菌細胞が、グラム陽性細菌細胞又はグラム陰性細菌細胞である、請求項２８に記載の細菌細胞。
【請求項３０】
前記細菌細胞が、大腸菌（E. coli）、パントエア・シトレア（P. citrea）、バチルス・スブチリス（B. subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（B. licheniformis）、バチルス・レンタス（B. lentus）、バチルス・ブレビス（B. brevis）、バチルス・ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィルス（B. alkalophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、バチルス・クラウシィ（B. clausii）、バチルス・ハロドュランス（B. halodurans）、バチルス・メガテリウム（B. megaterium）、バチルス・コアギュランス（B. coagulans）、バチルス・サーキュランス（B. circulans）、バチルス・ロータス（B. lautus）、バチルス・チューリンゲンシス（B. thuringiensis）、ストレプトマイセス・アルバス（S. albus）、ストレプトミセス・リビダンス（S. lividans）、ストレプトマイセス・セリカラー（S. coelicolor）、ストレプトマイセス・グリセウス（S. griseus）、シュードモナス（Pseudomonas sp.）、及びシュードモナス・アルカリゲネス（P. alcaligenes）細胞からなる群から選択される、請求項２９に記載の細菌細胞。
【請求項３１】
前記細菌細胞が大腸菌（E. coli）である、請求項３０に記載の細菌細胞。
【請求項３２】
前記細胞が藻類細胞である、請求項２７に記載の組み換え細胞。
【請求項３３】
前記藻類細胞が、緑藻類、紅藻類、灰色藻類、クロララクニオン藻類、ミドリムシ類、クロミスタ類、又は渦鞭毛藻類からなる群から選択される、請求項３２に記載の藻類細胞。
【請求項３４】
前記細胞が真菌細胞である、請求項２７に記載の組み換え細胞。
【請求項３５】
前記真菌細胞が糸状菌である、請求項３４に記載の真菌細胞。
【請求項３６】
前記細胞が酵母細胞である、請求項２７に記載の組み換え細胞。
【請求項３７】
前記酵母細胞が、酵母菌（Saccharomyces sp.）、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces sp.）、ピキア（Pichia sp.）、又はカンジダ（Candida sp.）からなる群から選択される、請求項３６に記載の酵母細胞。
【請求項３８】
前記酵母細胞がサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である、請求項３７に記載の酵母細胞。
【請求項３９】
請求項１〜３８のいずれか一項に記載の細胞を含む組成物。
【請求項４０】
（ａ）請求項１〜３８のいずれか一項の組み換え細胞を、イソプレン合成をもたらすのに好適な条件下で培養する工程；並びに（ｂ）イソプレンを産生させる工程、を含む、イソプレン産生方法。
【請求項４１】
前記組み換え細胞により産生された前記イソプレンを回収する工程を更に含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ｉｓｐＡ遺伝子の機能活性が、
ａ．ｉｓｐＡ遺伝子を欠失させること；
ｂ．ｉｓｐＡ遺伝子の発現を低減させること；
ｃ．ｉｓｐＡタンパク質の活性を低減させること；
ｄ．ｉｓｐＡタンパク質の発現を低減させること；又は
ｅ．ｉｓｐＡの発現を一時的に調節すること、により低減される、請求項４０又は４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記イソプレン合成酵素ポリペプチドが、植物のイソプレン合成酵素ポリペプチド又はこれらの変異体である、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記イソプレン合成酵素ポリペプチドが、クズ（Pueraria）又はハコヤナギ（Populus）由来のポリペプチド、又はウラジロハコヤナギ（Populus alba）ｘヤマナラシ（Populus tremula）などの交雑種由来のポリペプチド、又はそれらの変異体由来のポリペプチドである、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記イソプレン合成酵素ポリペプチドが、プエラリア・モンタナ（Pueraria montana）又はクズ（Pueraria lobata）、アメリカヤマナラシ（Populus tremuloides）、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）、セイヨウハコヤナギ（Populus nigra）、及びコットンウッド（Populus trichocarpa）、又はそれらの変異体からなる群から選択される、請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記植物のイソプレン合成酵素ポリペプチドが、クズ（kudzu）イソプレン合成酵素ポリペプチド又はそれらの変異体である、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記植物のイソプレン合成酵素ポリペプチドがユーカリプタス（Eucalyptus）イソプレン合成酵素ポリペプチド又はそれらの変異体である、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
（ｂ）の、ＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドをコードしている前記１つ以上の核酸が、異種核酸である、請求項４０〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞が含むＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸が、上流ＭＶＡ経路に由来するものであり、前記上流ＭＶＡ経路の核酸が、ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ又はアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素及びＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの核酸からなる群から選択される、請求項４０〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞が含むＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸が、前記下流ＭＶＡ経路に由来するものであり、前記下流ＭＶＡ経路の核酸が、ＭＶＫ、ＰＭＫ及びＭＶＤの核酸からなる群から選択される、請求項４０〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞が、前記完全なＭＶＡ経路のＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸を含む、請求項４０〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記細胞が、イソペンテニル−ジホスフェートδ−イソメラーゼ（ＩＤＩ）のポリペプチドをコードしている１種以上核酸を更に含む、請求項４０〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
１−デオキシキシルロース−５−ホスフェート合成酵素（ＤＸＳ）ポリペプチドを更に含む、請求項４０〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
ＤＸＳポリペプチドをコードしている前記１種以上の核酸が、ＤＸＳポリペプチドをコードしている異種核酸である、請求項４０〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
ＤＸＳポリペプチドをコードしている前記１種以上の核酸が、ＤＸＳポリペプチドをコードしている内在性の核酸のコピーである、請求項４０〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許仮出願番号第６１／５８０，１６３号（２０１１年１２月２３日出願）及び米国特許仮出願番号第６１／６３９，８５５号（２０１２年４月２７日出願）に対する優先権を主張する。これらの特許文献のそれぞれは、本明細書において参照によりその全体が組み込まれる。
【０００２】
（参考文献による組み込み）
次のＡＳＣＩＩテキストファイルの内容は、本明細書において参照によりその全体が組み込まれる：コンピュータ可読の形式の（ＣＲＦ）配列リスト（ファイル名：６４３８４２００４２４０．ｔｘｔ，記録日：２０１２年１２月２１日，ファイルサイズ：６５，５３６バイト）。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、一般的に、培養細胞からのイソプレンの産生方法及びこれらの培養細胞を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）は、各種合成ポリマー、特に合成ゴムの重要な出発物質である。イソプレンは、さまざまな微生物、植物、及び動物種によって天然に生成される。特に、イソプレンの生合成に関しては、メバロン酸（ＭＶＡ）経路と非メバロン酸（ＤＸＰ）経路の２つの経路が同定されている。しかしながら、天然に生じる生物から得られるイソプレンの収率は商業的には魅力的でない。イソプレンは石油の分留によって得ることもできるが、この材料の精製には費用及び時間がかかる。石油分解生成物中のＣ５留分から生成されるイソプレン量はほんの約１５％にすぎない。イソプレンの重合により、約７２５，７４８メートルトン（８００，０００トン）／年のｃｉｓ−ポリイソプレンが製造されており、このポリイソプレンのほとんどがタイヤ及びゴム産業で使用されている。また、履き物、機械製品、医療用品、スポーツ用品、及びラテックスなどのその他の製品では、共重合させたイソプレンが合成エラストマーとして使用されている。
【０００５】
微生物における代謝過程では、メバロン酸依存性生合成経路はアセチル−ＣｏＡをイソペンテニルジホスフェート（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）に変換する。ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰはイソプレン及びイソプレノイド類として知られるより高分子量の分子の前駆体である。イソプレノイドは、細胞膜の流動性及び電子輸送を維持する手だてとなるため、多くの生命体及び細胞にとって非常に重要である。
【０００６】
イソプレンの産生における近年の進歩により、ロバストな商業工程に必要とされる要求を十分に満たすことのできる速度、力価及び純度でのイソプレンの産生方法が開示されているものの（例えば、国際出願公開第２００９／０７６６７６（Ａ２）号を参照されたい）、尚もこれらの化合物の産生性及び収率を向上させる代替経路が必要とされている。
【０００７】
本明細書においては、組換え培養細胞、これらの細胞を含む組成物、並びにイソプレンの産生を向上させるためのこれらの細胞の使用方法が提供される。
【０００８】
本明細書を通じ、各種特許、特許出願及び他の種類の刊行物（例えば、学術論文）を参照する。本明細書に引用する、本開示に関係する全ての特許、特許出願及び刊行物は、すべての目的に関し、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本明細書で提供される発明は、とりわけ、内容物に組換え細胞を含む組成物、並びにイソプレンを産生する際のこれらの組み換え細胞の製造及び使用方法を開示する。一部の態様では、組換え微生物は、低減された機能活性を有するｉｓｐＡ遺伝子並びに１種以上のイソプレン合成酵素及び／又はＭＶＡ経路の１種以上の酵素をコードしている１種以上の核酸を含む。
【００１０】
したがって、一部の態様では、本明細書では、イソプレンを産生することのできる組換え細胞が提供され、この細胞は低減された機能活性を有するｉｓｐＡ遺伝子並びに次の：（ａ）イソプレン合成酵素ポリペプチド、ここで、イソプレン合成酵素ポリペプチドは異種核酸によりコードされている、及び（ｂ）メバロン酸（ＭＶＡ）経路の１種以上のポリペプチドをコードしている、１種以上の核酸を含み、好適な培地でこの組換え細胞を培養することにより、このポリペプチドの産生及びイソプレンの合成が提供される。他の態様では、ｉｓｐＡ遺伝子の機能活性は、ｉｓｐＡ遺伝子を欠失させること、ｉｓｐＡ遺伝子の発現を低減させること、ｉｓｐＡタンパク質の活性を低減させること、ｉｓｐＡタンパク質の発現を低減させること、又はｉｓｐＡの発現を一時的に調節することにより低減される。他の態様では、ｉｓｐＡ遺伝子の発現は、弱いプロモーターの調節下にｉｓｐＡ遺伝子を配置することにより低減される。一部の態様では、ｉｓｐＡ遺伝子の発現は、自己調節型プロモーターの調節下にｉｓｐＡ遺伝子を配置することにより低減される。更に他の態様では、ｉｓｐＡタンパク質活性は、翻訳によりｉｓｐＡタンパク質をタンパク質分解性のタグと融合させることにより低減される。他の態様では、ｉｓｐＡタンパク質の発現は、アンチセンスＲＮＡを使用することにより低減される。一部の態様では、ｉｓｐＡタンパク質の発現は、ｉｓｐＡのｍＲＮＡ分子中に存在するリボソーム結合部位に１つ以上の変異を導入することにより低減される。他の態様では、ｉｓｐＡ遺伝子の発現は、転写抑制因子ＨｒｃＡにより低減される。他の態様では、ｉｓｐＡタンパク質活性は、内在性ｉｓｐＡ遺伝子を、内在性ｉｓｐＡ遺伝子によりコードされるポリペプチドのＫｍと比較してＤＭＡＰＰに関し向上したＫｍを含むポリペプチドをコードしている遺伝子で置き換えることにより低減される。他の態様では、ｉｓｐＡタンパク質活性は、内在性ｉｓｐＡ遺伝子を、異なる温度最適化を伴う別の遺伝子で置き換えることにより低減される。
【００１１】
本明細書に記載の任意の細胞の他の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、植物のイソプレン合成酵素ポリペプチド又はこれらの変異体である。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、クズ属（Pueraria）又はハコヤナギ属（Populus）、ウラジロハコヤナギ（Populusalba）ｘヤマナラシ（Populus tremula）などの交雑種、又はこれらの変異体由来のポリペプチドである。他の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、プエラリア・モンタナ（Pueraria montana）又はプエラリア・ロバタ（Pueraria lobata）、アメリカヤマナラシ（Populus tremuloides）、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）、セイヨウハコヤナギ（Populus nigra）、コットンウッド（Populus trichocarpa）、又はこれらの変異体からなる群から選択される。更に他の態様では、植物のイソプレン合成酵素ポリペプチドはクズ（kudzu）イソプレン合成酵素ポリペプチド又はこれらの変異体である。更に他の態様では、植物のイソプレン合成酵素ポリペプチドはユーカリプタス（Eucalyptus）イソプレン合成酵素ポリペプチド又はこれらの変異体である。本明細書に記載の任意の細胞の一部の態様では、この（ｂ）の、ＭＶＡ経路のポリペプチドの１種以上をコードしている１種以上の核酸は、異種核酸である。一部の態様では、この細胞は、ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸は、上流ＭＶＡ経路に由来するものであり、上流ＭＶＡ経路の核酸は、ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ又はアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素及びＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの核酸からなる群から選択される。一部の態様では、この細胞が含む、ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸は、下流ＭＶＡ経路に由来するものであり、下流ＭＶＡ経路の核酸は、ＭＶＫ、ＰＭＫ及びＭＶＤの核酸からなる群から選択される。一部の態様では、この細胞は、完全なＭＶＡ経路の、ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸を含む。一部の態様では、この細胞は、イソペンテニル−ジホスフェートδ−イソメラーゼ（ＩＤＩ）のポリペプチドをコードしている核酸を更に１種以上含む。本明細書に記載の任意の細胞の他の態様では、細胞は１−デオキシキシルロース（Deoxyxlulose）−５−リン酸合成酵素（ＤＸＳ）ポリペプチドを更に含む。他の態様では、この（ｂ）の、ＤＸＳポリペプチドをコードしている１種以上の核酸は、ＤＸＳポリペプチドをコードしている異種核酸である。更に別の態様では、この（ｂ）の、ＤＸＳポリペプチドをコードしている１種以上の核酸は、ＤＸＳポリペプチドをコードしている内在性核酸のコピーである。本明細書に記載の任意の細胞の他の態様では、１種以上の異種核酸は、誘導型プロモーター又は常時発現型プロモーターの下に配置される。他の態様では、１つ以上の異種核酸は、マルチコピープラスミドにクローン化されている。他の態様では、１つ以上の異種核酸は、細胞の染色体に組み込まれる。
【００１２】
更に他の態様では、細胞は細菌、藻類、真菌、又は酵母細胞である。一態様では、細胞は、細菌細胞である。他の態様では、細菌細胞は、グラム陽性細菌細胞又はグラム陰性細菌細胞である。一部の態様では、細菌細胞は、大腸菌（E.coli）、パントエア・シトレア（P. citrea）、バチルス・スブチリス（B. subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（B. licheniformis）、バチルス・レンタス（B. lentus）、バチルス・ブレビス（B. brevis）、バチルス・ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィルス（B. alkalophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、バチルス・クラウシィ（B. clausii）、バチルス・ハロドュランス（B. halodurans）、バチルス・メガテリウム（B. megaterium）、バチルス・コアギュランス（B. coagulans）、バチルス・サーキュランス（B. circulans）、バチルス・ロータス（B. lautus）、バチルス・チューリンゲンシス（B. thuringiensis）、ストレプトマイセス・アルバス（S. albus）、ストレプトミセス・リビダンス（S. lividans）、ストレプトマイセス・セリカラー（S. coelicolor）、ストレプトマイセス・グリセウス（S. griseus）、シュードモナス（Pseudomonas sp.）、コリネバクテリウム（Corynebacteria sp.）、及びシュードモナス・アルカリゲネス（P. alcaligenes）細胞からなる群から選択される。一態様では、細菌細胞は大腸菌（E. coli）である。他の態様では、細胞は藻類細胞である。更に別の態様では、藻類細胞は緑藻類、紅藻類、灰色藻類、クロララクニオン藻類、ミドリムシ類、クロミスタ類、又は渦鞭毛藻類からなる群から選択される。他の態様では、細胞は真菌細胞である。一部の態様では、真菌細胞は糸状菌である。他の態様では、細胞は酵母細胞である。一態様では、酵母細胞は、サッカロマイセス属（Saccharomyces sp.）、シゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces sp.）、ピキア属（Pichia sp.）、又はカンジダ属（Candida sp.）からなる群から選択される。他の態様では、酵母細胞はサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である。
【００１３】
本明細書では、本明細書で開示されるいずれかの細胞を含む組成物が提供される。
【００１４】
本明細書では、（ａ）イソプレン合成に好適な条件下で、本明細書に記載のいずれかの組換え細胞を培養する工程、並びに（ｂ）イソプレンの産生工程を含むイソプレン産生方法も提供される。一部の態様では、方法は、この組換え細胞により産生されたイソプレンを回収する工程を更に含む。
【００１５】
本明細書では、イソプレン産生方法であって、（ａ）イソプレンを産生することのできる組換え細胞を培養する工程であって、この細胞が、低減された機能活性を有するｉｓｐＡ遺伝子と、（ｉ）イソプレン合成酵素ポリペプチド及び（ｉｉ）メバロン酸（ＭＶＡ）経路の１種以上のポリペプチドをコードしている、１種以上の核酸とを含み、ここで、イソプレン合成酵素ポリペプチドは異種核酸によりコードされ、好適な培地で組換え細胞を培養することにより、このポリペプチドの産生及びイソプレンの合成が提供される、培養工程、並びに（ｂ）イソプレンの産生工程を含む、方法が提供される。一部の態様では、方法は、この組換え細胞により産生されたイソプレンを回収する工程を更に含む。本明細書に記載の方法の他の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、植物のイソプレン合成酵素ポリペプチド又はこれらの変異体である。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、クズ属（Pueraria）又はハコヤナギ属（Populus）、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）ｘヤマナラシ（Populus tremula）などの交雑種、又はこれらの変異体由来のポリペプチドである。他の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、プエラリア・モンタナ（Pueraria montana）又はプエラリア・ロバタ（Pueraria lobata）、アメリカヤマナラシ（Populus tremuloides）、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）、セイヨウハコヤナギ（Populus nigra）、コットンウッド（Populus trichocarpa）、又はこれらの変異体からなる群から選択される。更に他の態様では、植物のイソプレン合成酵素ポリペプチドはクズ（kudzu）イソプレン合成酵素ポリペプチド又はこれらの変異体である。更に他の態様では、植物のイソプレン合成酵素ポリペプチドはユーカリプタス（Eucalyptus）イソプレン合成酵素ポリペプチド又はこれらの変異体である。本明細書に記載の任意の方法の一部の態様では、この（ｂ）の、ＭＶＡ経路のポリペプチドの１種以上をコードしている１種以上の核酸は、異種核酸である。一部の態様では、この細胞は、ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸は、上流ＭＶＡ経路に由来するものであり、上流ＭＶＡ経路の核酸は、ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ又はアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素及びＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの核酸からなる群から選択される。一部の態様では、この細胞が含む、ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸は、下流ＭＶＡ経路に由来するものであり、下流ＭＶＡ経路の核酸は、ＭＶＫ、ＰＭＫ及びＭＶＤの核酸からなる群から選択される。一部の態様では、この細胞は、完全なＭＶＡ経路の、ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸を含む。一部の態様では、この細胞は、イソペンテニル−ジホスフェートδ−イソメラーゼ（ＩＤＩ）ポリペプチドをコードしている核酸を更に１種以上含む。本明細書に記載の任意の細胞の他の態様では、細胞は１−デオキシキシルロース（Deoxyxlulose）−５−リン酸合成酵素（ＤＸＳ）ポリペプチドを更に含む。他の態様では、この（ｂ）の、ＤＸＳポリペプチドをコードしている１種以上の核酸は、ＤＸＳポリペプチドをコードしている異種核酸である。更に別の態様では、この（ｂ）の、ＤＸＳポリペプチドをコードしている１種以上の核酸は、ＤＸＳポリペプチドをコードしている内在性核酸のコピーである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１ａ】ＣＭＰ８８２及びＣＭＰ８８４の発酵中のメバロン酸供給濃度を示すグラフである。
【図１ｂ】株ＣＭＰ８８２及びＣＭＰ８８４の発酵中の培地へのメバロン酸の蓄積を示すグラフである。
【図２】ＣＭＰ８８２及びＣＭＰ８８４の発酵中のファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）濃度を示すグラフである。
【図３】発酵中のＣＭＰ８８２及びＣＭＰ８８４の細胞生存率を示すグラフである。
【図４】株ＣＭＰ８８２及びＣＭＰ８８４の発酵中の呼吸速度（ＣＥＲ）を示すグラフである。
【図５】発酵中のＭＶＡ経路株（ＣＭＰ４５７）におけるｙｄｄＶ発現を野生型対照株（ＭＣＭ１０２０）と比較して示すグラフである。
【図６】株ＣＭＰ４５７及びＭＣＭ１０２０の発酵中の呼吸速度（ＣＥＲ）を示すグラフである。
【図７ａ】遺伝子操作した様々なイソプレン産生株の増殖曲線を示す（内容を重複させた培養２つの平均）。
【図７ｂ】遺伝子操作した様々なイソプレン産生株の比産生性（任意単位）を示すグラフである（内容を重複させた培養２つの平均）。
【図８】ＩｓｐＡ合成遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１０）である。
【図９】ｐＭＣＭ１５３５のヌクレオチド配列（配列番号１１）である。
【図１０】ｐＭＣＭ１５３５のプラスミドコンストラクトである。
【図１１】トリファルネシル二リン酸合成酵素、Ａ１１６Ｗ変異体のヌクレオチド配列（配列番号１２）である。
【図１２】トリファルネシル二リン酸合成酵素、Ｎ１４４’Ｗ変異体のヌクレオチド配列（配列番号１３）である。
【図１３】１５Ｌ発酵において、ｙｄｄＶ−ｉｓｐＡ株ＣＭＰ１０８２（黒四角）により得られる、グルコースに対するイソプレン収率を、対照株ＣＭＰ１０４３（黒三角）と比較して経時的に示すグラフである。
【図１４】１５Ｌ発酵において、ｙｄｄＶ−ｉｓｐＡ株ＣＭＰ１０８２（黒四角及び白四角）により得られる、イソプレン力価を、対照株ＣＭＰ１０４３（黒三角）と比較して経時的に示すグラフである。
【図１５】１５Ｌ発酵において、ｙｄｄＶ−ｉｓｐＡ株ＣＭＰ１０８２（黒四角）により得られる、細胞産生性指数（ＣＰＩ）を、対照株ＣＭＰ１０４３（黒三角）と比較して経時的に示すグラフである。
【図１６】１５Ｌ発酵において、ｙｄｄＶ−ｉｓｐＡ株ＣＭＰ１０８２（黒四角）により得られる、容積産生量を、対照株ＣＭＰ１０４３（黒三角）と比較して経時的に示すグラフである。
【図１７】１５Ｌ発酵において、ｙｄｄＶ−ｉｓｐＡ株ＣＭＰ１０８２（黒四角）により得られる、比産生量を、対照株ＣＭＰ１０４３（黒三角）と比較して経時的に示すグラフである。
【図１８】大腸菌（E. coli）（配列番号１４）において発現させるためにコドン最適化したｈｒｃＡの対立遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
【図１９】各１５Ｌ規模での発酵により、経時的にグルコースに対して得られるイソプレン収率を示す。ＣＭＰ１０８２（ｐｇｌ＋）は白三角により示し、ＣＭＰ１１３６（ｐｇｌ−）は黒四角により示す。
【図２０】各１５Ｌ規模での発酵により得られた、グルコースに対するイソプレンの瞬間的な収率を経時的に示す。ＣＭＰ１０８２（ｐｇｌ＋）は白三角により示し、ＣＭＰ１１３６（ｐｇｌ−）は黒四角により示す。
【図２１】各１５Ｌ規模での発酵により得られた、細胞産生性指数（ＣＰＩ）を経時的に示す。ＣＭＰ１０８２（ｐｇｌ＋）は白三角により示し、ＣＭＰ１１３６（ｐｇｌ−）は黒四角により示す。
【図２２】各１５Ｌ規模での発酵により得られた、容積産生量を経時的に示す。ＣＭＰ１０８２（ｐｇｌ＋）は白三角により示し、ＣＭＰ１１３６（ｐｇｌ−）は黒四角により示す。
【図２３】各１５Ｌ規模での発酵により得られた、比産生量を経時的に示す。ＣＭＰ１０８２（ｐｇｌ＋）は白三角により示し、ＣＭＰ１１３６（ｐｇｌ−）は黒四角により示す。
【図２４】各１５Ｌ規模での発酵により、経時的にグルコースに対して得られるイソプレン収率を示す。エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）又はエンテロコッカス・カッセリフラバス（E. casseliflavus）（それぞれ三角形及び四角形）を使用して実施したすべての試験では、グルコースに対するイソプレン収率（％）は、エンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）の上流経路の酵素を使用して実施した２試験（白ひし形及び黒ひし形）よりも高かった。グルコースに対する収率（％）は、総イソプレン量（ｔ）／［（供給重量（０）−供給重量（ｔ）＋８３．５）＊０．５９）］として算出した。式中、０．５９はグルコース供給溶液中のグルコースの重量％であり、８３．５は、ｔ＝０の時点で発酵容器にバッチ供給（feed batched）したグラム重量である。各供給量は、独立して重量％として測定した。
【図２５】各１５Ｌ規模での発酵により得られた、容積産生量を経時的に示す。エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）又はエンテロコッカス・カッセリフラバス（E. casseliflavus）（それぞれ三角形及び四角形）を使用して実施したすべての試験では、総容積産生量は、エンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）の上流経路の酵素を使用して実施した２試験（白ひし形及び黒ひし形）よりも高かった。容積産生量は、次式を使用して算出した：容積産生量（ｇ／Ｌ／ｈｒ）＝［Σ（ＥＲ（ｔ）／１０００＊６８．１１７）］／［ｔ−ｔ０］。式中、総和はｔ０〜ｔである。タンクのターンアラウンド・タイム（turnaround time）は係数に含めなかった。
【図２６】各１５Ｌ規模での発酵により得られた、比産生量を経時的に示す。エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）又はエンテロコッカス・カッセリフラバス（E. casseliflavus）（それぞれ三角形及び四角形）を使用して実施したすべての試験では、最大比産生量は、エンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）の）上流経路の酵素を使用して実施した２試験（白ひし形及び黒ひし形）よりも高かった。比産生量は、次式を使用して算出した：比産生量（ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ）＝ＨｇＥＲ＊６８．１１７ｇ／ｍｏｌ／ＯＤ。ＨｇＥＲはイソプレンの放出速度（Evolution Rate）（ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ）である。ＯＤ＝吸光度＝５５０ｎｍでの吸光度＊水への希釈倍率。
【図２７】特定の株におけるＩｓｐＡ濃度を示すグラフである。
【図２８】各１５Ｌ規模での発酵により得られた、グルコースに対するイソプレンの収率を経時的に示す。ＲＢＳ部位の改変された株、すなわちＣＭＰ１２８６（ＲＢＳ９  ｙｄｄＶ）、ＣＭＰ１２８４（ＲＢＳ３  ｙｄｄＶ）、及びＣＭＰ１２７５（ＲＢＳ１／３  ｙｄｄＶ）（白丸、白四角、及び白三角それぞれ）により得られたグルコースに対する累積イソプレン収率（％）は、対照株（ＤＷ７１９、実施番号２０１２０５２６及び２０１２０５６５、それぞれ黒四角及び黒ひし形）と類似していた。グルコースに対して得られる収率（％）＝総イソプレン（ｔ）／［（供給重量（０）−供給重量（ｔ）＋８３．５）＊０．５９）］として算出される。式中、０．５９はグルコース供給溶液中のグルコースの割合（重量％）であり、及び８３．５はｔ＝０の時点で発酵槽に供給したバッチのグラム重量である。各供給量は、独立して重量％として測定した。
【図２９】各１５Ｌ規模での発酵により得られた、グルコースに対するイソプレンの瞬間的な収率を経時的に示す。ＲＢＳ部位の改変された株、すなわちＣＭＰ１２８６（ＲＢＳ９  ｙｄｄＶ）、ＣＭＰ１２８４（ＲＢＳ３  ｙｄｄＶ）、及びＣＭＰ１２７５（ＲＢＳ１／３  ｙｄｄＶ）（白丸、白四角、及び白三角それぞれ）により得られた、同様の、グルコースに対する最大瞬間イソプレン収率（％）は、対照株（ＤＷ７１９、実施番号２０１２０５２６及び２０１２０５６５、それぞれ黒四角及び黒ひし形）と類似していた。すべての改変株で、培養の早期に、より高い瞬間収率が得られ、培養の終了時には株ＣＭＰ１２８４が最もロバストな性能を有した（５６〜６４時間ＥＦＴ時点）。イソプレン瞬間収率（ｇ／ｇ％）は産生されたイソプレン量として算出した。  （ｔ１−ｔ０）／消費されたグルコース量（ｔ１−ｔ０）＊１００
【図３０】各１５Ｌ規模での発酵により得られた、容積生産量を経時的に示す。ＲＢＳ部位の改変された株、すなわちＣＭＰ１２８６（ＲＢＳ９  ｙｄｄＶ）、ＣＭＰ１２８４（ＲＢＳ３  ｙｄｄＶ）、及びＣＭＰ１２７５（ＲＢＳ１／３  ｙｄｄＶ）（白丸、白四角、及び白三角それぞれ）により得られたイソプレンの容積産生量は、対照株（ＤＷ７１９、実施番号２０１２０５２６及び２０１２０５６５、それぞれ黒四角及び黒ひし形）と類似していた。容積生産量は、次式を使用して算出した：容積生産量（ｇ／Ｌ／ｈｒ）＝［Σ（ＨＧＥＲ（ｔ）／１０００＊６８．１１７）］／［ｔ−ｔ０］。式中、総和はｔ０〜ｔである。タンクのターンアラウンド・タイム（turnaround time）は係数に含めなかった。
【図３１】各１５Ｌ規模での発酵により得られた、細胞産生性指数（ＣＰＩ）を経時的に示すグラフである。ＲＢＳ部位の改変された株、すなわちＣＭＰ１２８６（ＲＢＳ９  ｙｄｄＶ）、ＣＭＰ１２８４（ＲＢＳ３  ｙｄｄＶ）、及びＣＭＰ１２７５（ＲＢＳ１／３  ｙｄｄＶ）（白丸、白四角、及び白三角それぞれ）により得られたＣＰＩは、対照株（ＤＷ７１９、実施番号２０１２０５２６及び２０１２０５６５、それぞれ黒四角及び黒ひし形）と類似していた。細胞産生性指数（ＣＰＩ）は、次式を使用して算出した：ＣＰＩ＝イソプレン総重量（ｇ）／細胞の総乾燥重量。
【図３２】各１５Ｌ規模での発酵により得られた、比生産量を経時的に示す。ＲＢＳ部位の改変された株、すなわちＣＭＰ１２８６（ＲＢＳ９  ｙｄｄＶ）、ＣＭＰ１２８４（ＲＢＳ３  ｙｄｄＶ）、及びＣＭＰ１２７５（ＲＢＳ１／３  ｙｄｄＶ）（白丸、白四角、及び白三角それぞれ）により得られたイソプレンの比産生量は、対照株（ＤＷ７１９、実施番号２０１２０５２６及び２０１２０５６５、それぞれ黒四角及び黒ひし形）と類似していた。比産生量は、次式を使用して算出した：比産生量（ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ）＝ＨｇＥＲ＊６８．１１７ｇ／ｍｏｌ／ＯＤ。ＨｇＥＲはイソプレンの放出速度（Evolution Rate）（ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ）である。ＯＤ＝吸光度＝５５０ｎｍでの吸光度＊水への希釈倍率。
【図３３】発酵開始から３２及び４４時間後に測定されたＦＰＰ濃度を示すグラフである。
【図３４】発酵開始から３２及び４４時間後に測定されたＧＰＰ濃度を示すグラフである。
【図３５】発酵開始から３２及び４４時間後に測定されたＤＭＡＰＰ濃度を示すグラフである。
【図３６】発酵開始から３２及び４４時間後に測定されたＩＰＰ濃度を示すグラフである。
【図３７】ｐＣＨＬ４２６のプラスミドコンストラクトである。
【図３８】ｐＣＨＬ４２６のヌクレオチド配列（配列番号１０４）である。
【図３９】ｐＣＨＬ４２７のプラスミドコンストラクトである。
【図４０】ｐＣＨＬ４２７のヌクレオチド配列（配列番号１０５）である。
【図４１】常時発現型イソプレン合成酵素変異体を含む宿主細胞の増殖を、誘導型イソプレン合成酵素変異体を含む宿主細胞と比較して示すグラフである。
【図４２】常時発現型イソプレン合成酵素変異体を含む宿主細胞のイソプレン比産生性を、誘導型イソプレン合成酵素変異体を含む宿主細胞と比較して示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書で提供される発明は、とりわけ、発酵時の正確な期間中に、ｉｓｐＡ遺伝子の発現又は機能活性が下方調節されるよう遺伝子操作を施した組換え細胞においてイソプレンを産生するための組成物及び方法を開示する。本発明は、発酵時の組換え細胞のｉｓｐＡ遺伝子の発現を低減させることで、ｉｓｐＡ遺伝子の機能活性を低減させていない細胞と比較して高濃度のイソプレン産生が得られるという発見に基づくものである。理論に束縛されるものではないが、ｉｓｐＡ遺伝子の発現及び／又は機能活性を低減させることで高分子量イソプレノイド分子の産生及び蓄積が低減され、これによりイソプレン合成に利用可能な炭素量が増大し、並びに細胞生存率が向上すると考えられる。しかしながら、ｉｓｐＡ遺伝子は、細菌及びその他の微生物のロバストな増殖に必須である酵素を産生することから、遺伝子ノックアウトなどによりこの遺伝子をすべて除去することはイソプレン収率の向上に現実的な選択肢ではなく、遺伝子の完全な除去により細胞増殖の障害（Ｆｕｋｉｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３７（３）：３９５〜４００）又は細胞死（ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉｓｃ．ｅｄｕ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｅｓｓｅｎｔｉａｌ．ｈｔｍ；Ｂａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．，２００６．０００８）のいずれかが生じることが報告されている。本発明者らは、イソプレン産生（例えば、発酵の対数増殖期後）中のｉｓｐＡ遺伝子の発現及び／又は機能活性を特異的及び一時的に正確に低下させることで、組換え細胞による高イソプレン収率、高力価、高細胞産生性、高容積産生量、高比産生性、及び高細胞生存率が得られるという発見に基づき、この技術的課題を解決した。
【００１８】
一般的技術
本発明の実施においては、別途記載のない限り、当業者の技能の範囲内に含まれる従来の分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の技術を用いる。このような技術は、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、第３版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、２００１年）；「オリゴヌクレオチド合成（Oligonucleotide Synthesis）」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．、１９８４年）；「動物細胞培養法：実践的アプローチ（Animal Cell Culture: A practical approach）、第３版（Ｊ．Ｒ．Ｍａｓｔｅｒｓ，ｅｄ．，２０００年）；「酵素学的手法（Methods in Enzymology）」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「分子生物学最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，編．、１９８７年、周期的に改訂）；「ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応（PCR: The Polymerase Chain Reaction）」（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，編．、１９９４年）、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、「微生物学及び分子生物学辞典（Dictionary of Microbiology and Molecular Biology）第３版」Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．２００６年）、並びに「マーチ最新有機化学反応、機序及び構造（March's Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure）第６版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．２００７年）といった文献中に十分に説明されており、これらの文献は、当業者に対し、本開示に使用される多くの用語について一般的な指針を提供する。
【００１９】
用語の定義
用語「ｉｓｐＡ」は、任意の生物においてイソペンテニルジホスフェート（ＩＰＰ）と３，３−ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）又はゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）の縮合を触媒してＦＰＰを生成し得る、任意のゲラニルトランスフェラーゼ又はファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）合成酵素酵素又はプレニルトランスフェラーゼファミリーの任意の酵素を意味し得る。一部の実施形態では、ｉｓｐＡはｉｓｐＡ遺伝子によりコードされる。
【００２０】
用語「イソプレン」は、２−メチル−１，３−ブタジエン（ＣＡＳ＃  ７８−７９−５）を指す。ＤＭＡＰＰからピロリン酸を除去することで、揮発性のＣ５炭化水素を、直接的に及び最終的に生成することができる。ＩＰＰ分子をＤＭＡＰＰ分子に結合又は重合させることは包含しない場合がある。用語「イソプレン」は、概して、本明細書に別途記載のない限り、産生方法を限定されることを意図しない。
【００２１】
本明細書で使用するとき、用語「ポリペプチド」には、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド断片、及び融合ポリペプチドが含まれる。
【００２２】
本明細書で使用するとき、「単離ポリペプチド」は、２、５、１０、２０、又は５０個以上の異なるポリペプチドのライブラリなどといった、ポリペプチドのライブラリの一部を意味するものではなく、天然に生じる少なくとも１つの成分から分離されたポリペプチドを意味する。例えば、ポリペプチドをコードしている組み換え核酸を発現させることで単離ポリペプチドを得ることができる。
【００２３】
「異種ポリペプチド」は、宿主細胞と異なる生物、種、又は株由来の核酸配列によりコードされるポリペプチドを意味する。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、同様の宿主細胞に天然に見られる野生型ポリペプチドと同一ではない。
【００２４】
本明細書で使用するとき、「核酸」は、共有結合により単鎖又は二本鎖のいずれかの形態で連結している、２つ以上のデオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドを指す。
【００２５】
「組換え核酸」とは、対象とする核酸が由来する生物において自然に存在するゲノムにおいて、対象とする核酸に隣接する１つ以上の核酸（例えば遺伝子）を含まない、対象とする核酸のことを意味する。したがって、この用語には、例えば、ベクターに組み込まれた、プラスミド又はウィルスに自己複製的に組み込まれた、原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた、又は他の配列とは独立して別個の分子（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ断片、又はＰＣＲにより産生された若しくは制限エンドヌクレアーゼによる消化により産生されたｃＤＮＡ断片）として存在する、組み換えＤＮＡが包含される。
【００２６】
「異種核酸」は、宿主細胞と異なる生物、種又は株由来の核酸配列を意味する。一部の実施形態では、異種核酸は、同様の宿主細胞に天然に見られる野生型核酸と同一ではない。
【００２７】
本明細書において使用するところの「発現調節配列」とは、対象とする核酸の転写を指示する核酸配列のことを意味する。発現制御配列は、常時発現型若しくは誘導型のプロモーター、又はエンハンサーなどのプロモーターであり得る。発現制御配列は「ネイティブ」な配列又は異種の配列であり得る。ネイティブな発現制御配列は、遺伝子を発現させる生物、種又は株と同様の生物、種又は株に由来する配列である。異種の発現制御配列は、遺伝子を発現させる生物、種又は株とは異なる生物、種又は株に由来する配列である。「誘導型プロモーター」は、環境下、又は発育制限下で活性であるプロモーターである。
【００２８】
「調節可能に連結された」は、核酸の発現制御配列（プロモーターなど）及び第２の核酸配列間の機能的連結を意味し、発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写を指示する。
【００２９】
本明細書で使用するとき、用語「最少培地（minimal medium又はminimal media）」は、細胞の増殖に必要とされる最低限の栄養素を含有し、概してアミノ酸の存在していない増殖培地を指す。最少培地は、典型的には：（１）細菌を増殖させるための炭素源；（２）細菌種及び増殖条件によって異なる様々な塩；並びに（３）水；を含有する。炭素源は、グルコースなどの単糖から、本明細書で以下により詳細に記載されるような、他のバイオマスのより複雑な加水分解物、例えば、酵母エキスなどといった多様なものであり得る。塩は、概してマグネシウム、窒素、リン及びイオウなどの必須元素を提供し、細胞がタンパク質及び核酸を合成できるようにする。また、最少培地には、特定のプラスミド及び同様物を維持すべく選別するために、抗菌剤などの選択剤を添加することもできる。例えば、微生物が、例えばアンピシリン又はテトラサイクリンなどの特定の抗菌剤に耐性である場合、耐性を欠く細胞の増殖を阻害する目的で培地に抗菌剤を添加することができる。培地には、所望される生理学的又は生化学的特性について選別するのに必要とされる、例えば特定のアミノ酸などといった他の化合物を添加することができる。
【００３０】
本明細書で使用するとき、用語「イソプレノイド」は、２つ以上の炭化水素単位からなり、各単位は、特定の様式で配置された５つの炭素原子からなる、天然に生じる有機化合物類の、広範にわたるかつ多様な部類を指す。イソプレノイド類としては、限定するものではないが、テルペノイド（例えば、ヘミテルペノイド、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、ジテルペノイド、セステルテルペノイド、トリテルペノイド、テトラテルペノイド、及び／又はポリテルペノイド）が挙げられる。本明細書で使用するとき、「イソプレン」は、明らかに「イソプレノイド」の定義から除外される。
【００３１】
本明細書で使用するとき、用語「質量収率」は、組み換え（例えば、細菌）細胞により産生される産生物の質量を、組み換え細胞により消費されたグルコースの質量より除算し、１００を乗じたものを指す。
【００３２】
「比産生性」は、細菌細胞により産生される産生物の質量を、産生物の産生にかかった時間、細胞密度及び培養体積により除したものを意味する。
【００３３】
「力価」は、組み換え（例えば、細菌）細胞により産生される産生物の質量を、培養体積により除したものを意味する。
【００３４】
本明細書で使用するとき、用語「細胞産生性指数（cell productivity index）（ＣＰＩ）」は、組み換え（例えば、細菌）細胞により産生される産生物の質量を、培養により産生された組み換え細胞の質量により除したものを指す。
【００３５】
本明細書において別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術及び科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同様の意味を持つ。
【００３６】
本明細書で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈に明示されない限り、対象物が複数ある場合をも包含する。
【００３７】
本明細書を通じて与えられるあらゆる最大数の限定は、あらゆるより小さい数値の限定を、あたかもそのようなより小さい数値の限定が明確に書かれているかのように包含するものと理解されることが意図される。本明細書の全体を通じて与えられるすべての最小の数値的限定には、これよりも大きいすべての数値的限定が、あたかもこうしたより大きい数値的限定が本明細書に明確に記載されているものと同様に含まれる。本明細書の全体を通じて与えられるすべての数値的範囲には、これよりも狭い数値的範囲が、あたかもこうしたより狭い数値的範囲がすべて本明細書に明確に記載されているものと同様に含まれる。
【００３８】
イソプレン産生を増大させ得る組み換え微生物
イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）は、多様な用途で使用される重要な有機化合物である。例えば、イソプレンは、合成ゴムの製造時など、数多くの化学組成物及びポリマーの合成時に、中間体又は出発物質として使用される。イソプレンはまた、多くの植物及び動物により天然に合成される重要な生体物質でもある。メバロン酸依存性生合成経路（ＭＶＡ経路）は、全ての高等真核生物及び特定種の細菌に存在する、重要な代謝経路である。メバロン酸経路は、タンパク質のプレニル化、細胞膜の維持、タンパク質の固定及びＮ−グリコシル化などの、多様な工程において使用される分子の産生に重要であり、イソプレノイド及びイソプレンのいずれもの生合成時の主成分とし機能するジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）及びイソペンテニルジホスフェート（ＩＰＰ）の主要な供給源を提供する。
【００３９】
イソペンテニルｔＲＮＡ、イソプレノイドキノン、及び糖キャリア脂質などのイソプレノイド化合物は、大腸菌（E. coli）などの多くの微生物による通常の代謝産物の一部として合成される（Ｆｕｊｉｓａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：５６５４〜５６５８）。イソプレノイド化合物の産生に関する合成経路における分岐点は、ＩＰＰをＤＭＡＰＰ又はゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）と縮合させてＦＰＰを生成する酵素ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）合成酵素により触媒される反応を包含する。ＦＰＰ合成酵素（ＥＣ：２．５．１．１０）は、酵素のトランスフェラーゼファミリー、具体的には、代謝反応においてアリール又はメチル基以外のアルキル基を移動させることのできる酵素ファミリーに属する。ＦＰＰ合成酵素に対し一般的に使用されるその他の名称としては、ゲラニルトランスフェラーゼ、ゲラニルトランスフェラーゼＩ、プレニルトランスフェラーゼ、ファルネシルピロリン酸シンセターゼ、及びファルネシルピロホスフェートシンセターゼが挙げられる。
【００４０】
上記のように、ＤＭＡＰＰ及びＩＰＰは、イソプレノイド類及びイソプレンのいずれもの生合成に取り込まれる初期の炭素源を提供する。イソプレン合成酵素は、イソプレン産生の触媒としてこれらの分子を使用するのに対し、ＦＰＰ合成酵素はこれらの分子をＧＰＰ及びＦＰＰを産生するのに利用し、続いてＧＰＰ及びＦＰＰは、より高分子量のイソプレノイド分子の合成に使用される。したがって、理論に束縛されるものではないが、イソプレンを産生するよう遺伝子操作された組換え細胞に関しては、ＦＰＰ合成酵素の酵素活性により、イソプレン合成酵素によるイソプレンへの変換に利用可能なＤＭＡＰＰ及びＩＰＰ分子の生成量が低下し、イソプレン産生に関係する炭素利用能が低下することになると考えられる。更に、本来であればイソプレノイドを蓄積しやすい組換え細胞又は細胞におけるイソプレノイド産生の向上は、形態の貧弱さ並びに細胞生存率の低下に関連する。
【００４１】
大腸菌（E. coli）などの微生物において、ＦＰＰ合成酵素はｉｓｐＡ遺伝子によりコードされる（Ｆｕｋｉｓａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０），Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０８：９９５〜１０００）。ｉｓｐＡ遺伝子は、２つの他の遺伝子：デオキシキシルロース−５−リン酸合成酵素（ＤＸＳ）をコードするｄｘｓ遺伝子、並びにエキソヌクレアーゼＶＩＩ小サブユニットを産生するｘｓｅＢ遺伝子（Ｌｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｍａｒｃｈ  ３，１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５（５）：２１０５〜２１１０）のオペロン中に位置する。ｉｓｐＡ遺伝子を完全に除去することにより、細胞の増殖速度は野生型株と比較して低くなり（Ｆｕｋｉｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３７（３）：３９５〜４００）、あるいは細胞致死が生じる（ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉｓｃ．ｅｄｕ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｅｓｓｅｎｔｉａｌ．ｈｔｍ；Ｂａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．，２００６．０００８）ことから、ｉｓｐＡ遺伝子の発現は、微生物のロバストな増殖に必要とされるものと報告されている。
【００４２】
イソプレンを産生するよう遺伝子操作を施した組換え細胞は、培養時に２期、すなわち１）組換え細胞が対数的に細胞分裂する「増殖期」、並びに２）細胞が炭素源（例えば、グルコース）を利用してイソプレンを産生する「発酵期」を示す。したがって、一部の実施形態では、組換え細胞は、低減された機能活性を有するｉｓｐＡを含む。一態様では、ｉｓｐＡの機能活性は、細胞培養の発酵期中にのみ低減される。他の態様では、ｉｓｐＡの機能活性は、細胞培養時の対数増殖期中にのみ低減される。一部の態様では、ｉｓｐＡの機能活性は、細胞培養の増殖及び発酵期のいずれもにおいて低減される。更に別の態様では、ｉｓｐＡの機能活性は、細胞培養の増殖及び発酵期のいずれもにおいて低減されるものの、発酵期における低減のほうが大きい。
【００４３】
ｉｓｐＡの機能活性の低減には任意の方法を使用することができ、限定するものではないが、ｉｓｐＡ遺伝子を欠失させること、ｉｓｐＡ遺伝子の発現を低減させること、又はｉｓｐＡ遺伝子によりコードされるポリペプチドの活性又は利用能を低減させることが挙げられる。他の態様では、本発明の組換え細胞は、低減された機能活性を有するｉｓｐＡ及びイソプレンの生合成に関与し宿主微生物におけるイソプレン合成を可能にする遺伝子群のうちの１種以上を含む。他の態様では、本発明の組換え宿主細胞は、宿主細胞における発現のためコドンを最適化されている組換えｉｓｐＡ遺伝子を含む。一部の態様では、コドンを最適化したｉｓｐＡ遺伝子が宿主細胞のゲノムに組み込まれる。他の態様では、ｉｓｐＡ遺伝子は、染色体外ＤＮＡ（プラスミドなど）の断片上で発現される。他の態様では、コドンを最適化したｉｓｐＡ遺伝子を、宿主細胞のゲノムのｙｈｆＳ座に組み込み、内在性ｉｓｐＡ遺伝子を欠失させる。
【００４４】
一部の態様では、本発明の組換え宿主細胞は、内因的にコードされているＦＰＰ合成酵素によりＤＭＡＰＰに対し示されるＫｍ値と比較して、ＤＭＡＰＰに対し向上したＫｍ値を有するＦＰＰ合成酵素（例えば、トリＦＰＰ合成酵素）をコードしている組換えｉｓｐＡ遺伝子を含む。このような高Ｋｍ値のＦＰＰ合成酵素は、これまでに、例えば、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０００，３９（５０）：１５３１６〜２１において記載されている。他の態様では、本発明の組換え宿主細胞は、最適温度の異なるＦＰＰ合成酵素（限定するものではないが、Ｋｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１３（３）：３５５〜３６３に記載の好熱性ＦＰＰ合成酵素など）、好冷性ＦＰＰ合成酵素（Ｎｉｃｈｏｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｂａｃｔ．，１８６：８５０８〜８５１５に記載のＦＰＰ合成酵素など。この非特許文献は本明細書に参照によりその全体が組み込まれる。）、又は海洋原核生物由来のＦＰＰ合成酵素（Ｒａｎｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１１：６２〜７３に記載のＦＰＰ合成酵素など）を含み得る。一部の態様では、本明細書に記載のいずれかの組換え細胞において、内在性の宿主細胞ｉｓｐＡ遺伝子は、本明細書に記載のＦＰＰ合成酵素をコードしている別のいずれかの遺伝子により置き換えられる。他の態様では、組換えｉｓｐＡ遺伝子は、誘導型又は常時発現型プロモーターの調節下に配置される。他の態様では、組換えｉｓｐＡ遺伝子は多コピープラスミドで発現される。更に別の態様では、組換えｉｓｐＡ遺伝子が宿主細胞の染色体に組み込まれる。
【００４５】
一部の態様では、本発明の組換え宿主細胞は、弱いプロモーター（すなわち、ｉｓｐＡ遺伝子の発現を駆動するプロモーターであって、発現量が、内在性又は野生型ｉｓｐＡプロモーターにより観察されるものよりも少ないプロモーター）の調節下にｉｓｐＡ遺伝子を含む。一部の態様では、ｉｓｐＡ遺伝子の発現を調節するプロモーターは、細胞培養時の対数増殖期中に、発酵期中のｉｓｐＡ遺伝子の発現と比較して高レベルでｉｓｐＡ遺伝子を発現する。
【００４６】
ｉｓｐＡの機能活性の低減
一部の態様では、本明細書に記載の組換え細胞は、低減された機能活性を有するｉｓｐＡを含む。本文脈において、「機能活性の低減」は、ｉｓｐＡポリペプチド（例えば、ｉｓｐＡ遺伝子によりコードされるポリペプチド）がＩＰＰ及びＤＭＡＰＰをＧＰＰ及び／又はＦＰＰ（すなわち、以降のイソプレノイド類の産生に必要とされる分子）に変換する能力に関する。一部の態様では、本明細書で開示される任意の組換え細胞にはｉｓｐＡ遺伝子を含ませることができ、ｉｓｐＡの機能活性は、低減された機能活性を有するｉｓｐＡを含まない細胞におけるＧＰＰ及び／又はＦＰＰの分子濃度と比較して、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％並びにこれらの値間の任意の割合を包含した程度低減された濃度で、これらの分子を細胞に産生させる。他の態様では、イソプレンを産生するために遺伝子操作を施した組換え細胞は、イソプレン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸、ＭＶＡ経路の１種以上の構成酵素類をコードしている１種以上の異種核酸、並びに低減された機能活性を有するｉｓｐＡを含むものであり、ＭＶＡ経路の１種以上の構成酵素類をコードしている１種以上の異種核酸を含むものの低減された機能活性を有するｉｓｐＡは含まない組換え細胞におけるＧＰＰ及び／又はＦＰＰの分子濃度と比較して、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％未満並びにこれらの値間の任意の割合を包含した程度低減された濃度で、ＧＰＰ及び／又はＦＰＰ分子を産生する。
【００４７】
他の態様では、本明細書で開示される任意の組換え細胞はｉｓｐＡを含んでよく、ｉｓｐＡの機能活性は、細胞が、低減された機能活性を有するｉｓｐＡを含まない細胞におけるイソプレノイド類濃度と比較して約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％並びにこれらの値間の任意の割合を包含した程度低減された濃度でイソプレノイド類を産生するよう、低減されている。他の態様では、本明細書で開示される任意の組換え細胞はｉｓｐＡを含んでよく、ｉｓｐＡ遺伝子の機能活性は、細胞が、低減された機能活性を有するｉｓｐＡを含まない細胞の生存能と比較して約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％並びにこれらの値間の任意の割合を包含した程度向上した生存能を示すよう、低減されている。他の態様では、イソプレンを産生するよう遺伝子操作を施した組換え細胞はＭＶＡ経路の１種以上の構成酵素類及び低減された機能活性を有するｉｓｐＡをコードしている１種以上の異種核酸を含むものであり、ＭＶＡ経路の１種以上の構成酵素類をコードしている１種以上の異種核酸を含むものの低減された機能活性を有するｉｓｐＡは含まない細胞の生存能と比較して約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％並びにこれらの値間の任意の割合を包含した程度向上した生存能を示し得る。本明細書で使用するとき、「向上した生存能」は、発酵過程中の、死細胞、瀕死の細胞、又はさもなければ形態異常を示している細胞の出現が低減されていることを意味する。形態異常としては、限定するものではないが、伸長した細胞、及び／又は死細胞若しくは瀕死の細胞由来の細胞残渣が挙げられる。一部の実施形態では、「向上した生存能」は、当該技術分野において知られる細胞生物学的、分子生物学的、又は生化学的手法（例えば、限定するものではないが、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）又はＤｉＢＡＣ４（３）染色など）により生存しているものと判定される細胞数が大幅に増加していることを意味し得る。一部の態様では、ｉｓｐＡの機能活性は、発酵の最大イソプレン産生期中は低下している。他の態様では、ｉｓｐＡの機能活性は発酵の対数増殖期中には低下していない。
【００４８】
ｉｓｐＡの機能活性の低下を測定する方法は数多くあり、当業者に周知である。例えば、標準法を使用して、細胞全体から代謝産物を化学的に抽出し、質量分析法により同定を行うことにより、細胞における代謝産物（例えば、ＦＰＰ及びＧＰＰ）の産生量を測定することができる。同様にして、標準法を使用して、顕微鏡観察により又は膜電位の測定により形態解析するなどして、ｉｓｐＡの機能活性を低減させた細胞の生存能を評価することができる。正常な膜電位をもつ細胞は生細胞であり、代謝活性をもつと仮定し、それに対し、膜電位をもたない細胞は死細胞であり、代謝活性をもたないと仮定する。
【００４９】
ｉｓｐＡ遺伝子の発現の低減
一部の態様では、ｉｓｐＡ遺伝子の機能活性は、ｉｓｐＡ遺伝子の発現を低減させることにより低減される。この低減には、ｉｓｐＡ遺伝子そのものの全て又は一部を欠失させること、あるいは本明細書に記載の又は当業者に知られる通りの任意の数の手法により発現を低減させることを包含し得る。一部の態様では、遺伝子組み換えにより細胞にプロモーターを組み込み、ｉｓｐＡ遺伝子の発現を調節することもできる。一態様では、イソプレノイド化合物の蓄積が増加することから、ｉｓｐＡ遺伝子の発現を駆動するプロモーターを抑制することができる。このようなプロモーターを導入してｉｓｐＡの発現を調節する場合、イソプレノイド経路への取り込みに対応する期間中にｉｓｐＡを抑制することができる。しかしながら、取り込みが低下する期間には、プロモーターは誘導されたまま維持されるため、ｉｓｐＡを発現できる。
【００５０】
自己調節型プロモーターによる発現の一時的な下方調節
一部の態様では、ｉｓｐＡ遺伝子の発現は、自己調節型プロモーターの調節下にｉｓｐＡ遺伝子を配置することにより低減される。特定の実施形態では、イソプレンを多量に産生するよう遺伝子操作を施した組換え細胞の発酵後期中にのみ抑制されるプロモーターを使用することにより、ｉｓｐＡ遺伝子の機能活性を低減することができる。理論に束縛されるものではないが、このようなプロモーターは、発酵が進行するにつれイソプレノイド化合物の蓄積量が増加する期間中には、抑制されているものと予想される。したがって、これらのプロモーターの調節下にｉｓｐＡ遺伝子を配置することにより、イソプレノイド経路への取り込み増加に対応する期間にｉｓｐＡの抑制が生じるよう一時的にｉｓｐＡの発現を調節することができる。しかしながら、発酵の対数増殖期中など、イソプレノイド経路への取り込みが低い期間では、プロモーターは誘導されたまま維持され、ｉｓｐＡ遺伝子の発現が可能となる。この特徴的な活性プロファイルが、自己調節型ｉｓｐＡ発現調節系を構成する。
【００５１】
したがって、一部の態様では、本明細書に記載のいずれかの組換え細胞には、低減された機能活性を有するｉｓｐＡ遺伝子を含ませることができ、ｉｓｐＡ遺伝子の機能活性は、自己調節型プロモーターの調節下にｉｓｐＡ遺伝子を配置することにより低減される。一部の態様では、自己調節型プロモーターは、ｅｆｅＯ、ｋｐｓＣ、ｋｐｓＤ、ｋｐｓＤ、ｋｐｓＥ、ｋｐｓＦ、ｋｐｓＳ、ｋｐｓＵ、ｎｍｐＣ、ｓｏｄＡ、ｙｂｌ１２９、ｙｂｌ１３０、ｙｂｌ１３１、ｙｄｄＶ、及びｙｄｉＵからなる群から選択される。一態様では、ｉｓｐＡ遺伝子は、ｙｄｄＶプロモーターの調節下に配置される。他の態様では、内在性ｉｓｐＡ遺伝子を組み換え細胞（例えば、組換え型大腸菌（E. coli）細胞）のゲノムから欠失させて、かつゲノム上の異なる遺伝子座に新しいｉｓｐＡ遺伝子を組み込むことができる。一態様では、異種ｉｓｐＡ遺伝子は、組み換え細胞（例えば、組換え型大腸菌（E. coli）細胞）のゲノム上のｙｈｆＳ座に挿入される。異種ｉｓｐＡ遺伝子は、欠失させた内在性のｉｓｐＡ遺伝子と同一であっても、又は別の供給源由来のｉｓｐＡ遺伝子であってもよい。他の態様では、自己調節型プロモーターの調節下の異種ｉｓｐＡ遺伝子は染色体外で発現される。他の態様では、本発明の組換え宿主細胞は、宿主細胞における発現のためコドンを最適化されている組換えｉｓｐＡ遺伝子を含む。一部の態様では、コドンを最適化したｉｓｐＡ遺伝子が宿主細胞のゲノムに組み込まれる。他の態様では、コドンを最適化したｉｓｐＡ遺伝子は、ｅｆｅＯ、ｋｐｓＣ、ｋｐｓＤ、ｋｐｓＤ、ｋｐｓＥ、ｋｐｓＦ、ｋｐｓＳ、ｋｐｓＵ、ｎｍｐＣ、ｓｏｄＡ、ｙｂｌ１２９、ｙｂｌ１３０、ｙｂｌ１３１、ｙｄｄＶ、及びｙｄｉＵからなる群から選択される自己調節型プロモーターの調節下にある。一部の態様では、コドンを最適化したｉｓｐＡ遺伝子は、ｙｄｄＶプロモーターの調節下にある。更に別の態様では、本明細書に記載の任意の自己調節型プロモーターは、コドン最適化したｉｓｐＡ、微生物由来のｉｓｐＡによりコードされる酵素と比較して高Ｋｍを含む酵素をコードしているｉｓｐＡ対立遺伝子（例えば、トリｉｓｐＡ対立遺伝子）、並びに内在性のｉｓｐＡ対立遺伝子からなる群から選択されるｉｓｐＡ遺伝子の発現を駆動し得る。
【００５２】
一部の態様では、自己調節型プロモーターの調節下でｉｓｐＡ遺伝子を発現する組換え細胞（本明細書で開示される任意の組換え細胞など）は、自己調節型プロモーターの調節下にｉｓｐＡ遺伝子を含まない細胞におけるＧＰＰ及び／又はＦＰＰ分子の濃度と比較して約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％並びにこれらの値間の任意の割合を包含した程度低減された濃度で、これらの分子を産生する。他の態様では、イソプレンを産生するよう遺伝子操作を施した組換え細胞は、自己調節型プロモーターの調節下にＭＶＡ経路の１種以上の構成酵素類及びｉｓｐＡ遺伝子をコードしている１種以上の異種核酸を含むものであり、ＭＶＡ経路の１種以上の構成酵素類をコードしている１種以上の異種核酸を含むものの自己調節型プロモーターの調節下にｉｓｐＡ遺伝子を含まない組換え細胞におけるＧＰＰ及び／又はＦＰＰ分子の濃度と比較して、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％並びにこれらの値間の任意の割合を包含した程度低減された濃度で、これらの分子を産生する。一部の態様では、自己調節型プロモーターの調節下でｉｓｐＡ遺伝子を発現する組換え細胞（本明細書で開示される任意の組換え細胞など）は、自己調節型プロモーターの調節下にｉｓｐＡ遺伝子を含まない細胞におけるＧＰＰ及び／又はＦＰＰ分子の濃度と比較して、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％並びにこれらの値間の任意の割合を包含した程度低減された濃度で、これらの分子を産生する。他の態様では、自己調節型プロモーターの調節下でｉｓｐＡ遺伝子を発現する組換え細胞（本明細書で開示される任意の組換え細胞など）は、自己調節型プロモーターの調節下にｉｓｐＡ遺伝子を含まない細胞における生存能と比較して、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％並びにこれらの値間の任意の割合を包含した程度向上した生存能を示す。他の態様では、イソプレンを産生するよう遺伝子操作を施した組換え細胞は、自己調節型プロモーターの調節下にＭＶＡ経路の１種以上の構成酵素類及びｉｓｐＡ遺伝子をコードしている１種以上の異種核酸を含むものであり、ＭＶＡ経路の１種以上の構成酵素類をコードしている１種以上の異種核酸を含むものの自己調節型プロモーターの調節下にｉｓｐＡ遺伝子を含まない細胞の生存能と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％並びにこれらの値間の任意の割合を包含した程度向上した生存能を示し得る。
【００５３】
異種リプレッサータンパク質ＨｒｃＡによる一時的な発現下方調節
ｉｓｐＡの発現を調節する代替法としては、カウロバクター・クレセンタス（Caulobacter crescentus）の転写抑制因子ＨｒｃＡを利用するものが挙げられる（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７８（７）：１８２９〜１８４１；Ｓｕｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１８６（２０）：６７５９〜６７６７）。ＨｒｃＡをコードしている遺伝子は、大腸菌（E. coli）においては天然に見られず、ＨｒｃＡにより認識されるＣＩＲＣＥエレメントが大腸菌（E. coli）の遺伝子発現の管理に関与することを示す情報は知られていない。したがって、大腸菌（E. coli）のイソプレン産生系の、ｉｓｐＡ発現を管理する制御配列内に、ＣＩＲＣＥエレメントを組み込むことにより、ＨｒｃＡを介在させてｉｓｐＡを抑制することができる。厳密に調節される数多くの手段のうちの少なくとも１つにより発現が管理され得る大腸菌（E. coli）イソプレン産生宿主には、更に異種ｈｒｃＡ遺伝子を導入することができる。
【００５４】
したがって、一部の態様では、本明細書に記載のいずれかの組換え細胞には、低減された機能活性を有するｉｓｐＡ遺伝子を含ませることができ、ここで、ｉｓｐＡ遺伝子の機能活性は、ｈｒｃＡ遺伝子によりコードされるＨｒｃＡリプレッサータンパク質により低減され、ｉｓｐＡ発現を管理する制御配列には遺伝子操作によりＣＩＲＣＥエレメントが組み込まれる。一部の態様では、ｈｒｃＡ発現は、イソプレンを生成する大規模発酵間の細胞の転写プロファイルに関し特定された、対数増殖期に調節されるプロモーターにより調節される。一部の態様では、対数増殖期に調節されるプロモーターは、ｏｔｓＡ、ａｍｉＢ、及びｄｅｏＣからなる群から選択される。
【００５５】
他の態様では、ｈｒｃＡ発現は、即時的栄養制限又は温度の変更などの誘導シグナルにより、発酵の望ましい緩慢な増殖期の間中活性化される、正に制御されたループにより調節され得る。この態様では、トランス活性化因子Ｔなどのトランス活性化因子ペプチドが、特定のシグナルを検知するプロモーターと機能上関連付けられる。誘導シグナルの導入により、シグナルを検知するプロモーターの活性が誘導され、これによりトランス活性化因子Ｔの発現が上方調節される。トランス活性化因子Ｔ遺伝子のコピーを、更にトランス活性化因子Ｔ依存型プロモーターと連結することにより、誘導シグナルの除去に応じ、正のフィードバックループが開始され、維持される。他の態様では、ｈｒｃＡ遺伝子を、少なくとも１つのトランス活性化因子Ｔ依存型プロモーターと連結させることで、正の制御ループが活性化された後にＨｒｃＡが期間中持続的に発現されるようになる。特定の態様では、トランス活性化因子Ｔ依存型プロモーターにより駆動されるトランス活性化因子Ｔの遺伝子は、ｈｒｃＡ遺伝子として同一のオペロン上に位置する。他の態様では、トランス活性化因子Ｔ依存型プロモーターにより駆動されるトランス活性化因子Ｔ遺伝子は、ｈｒｃＡ遺伝子を含有しない独立した遺伝子座に位置する。
【００５６】
一部の態様では、ＨｒｃＡリプレッサータンパク質の調節下でｉｓｐＡ遺伝子を発現する組換え細胞（本明細書で開示される任意の組換え細胞など）は、ＨｒｃＡリプレッサータンパク質の調節下にｉｓｐＡ遺伝子を含まない細胞におけるこれらのＧＰＰ及び／又はＦＰＰ濃度と比較して、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％並びにこれらの値間の任意の割合を包含した程度低減された濃度で、これらの分子を細胞に産生させる。他の態様では、イソプレンを産生するよう遺伝子操作を施した組換え細胞は、ＨｒｃＡリプレッサータンパク質の調節下にＭＶＡ経路の１種以上の構成酵素類及びｉｓｐＡ遺伝子をコードしている１種以上の異種核酸を含むものであり、ＭＶＡ経路の１種以上の構成酵素類をコードしている１種以上の異種核酸を含むもののＨｒｃＡリプレッサータンパク質の調節下にｉｓｐＡ遺伝子を含まない組換え細胞におけるＧＰＰ及び／又はＦＰＰ濃度と比較して、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％並びにこれらの値間の任意の割合を包含した程度低減された濃度で、これらの分子を産生する。一部の態様では、ＨｒｃＡリプレッサータンパク質の調節下でｉｓｐＡ遺伝子を発現する組換え細胞（本明細書で開示される任意の組換え細胞など）は、ＨｒｃＡリプレッサータンパク質の調節下にｉｓｐＡ遺伝子を含まない細胞におけるイソプレノイド類の濃度と比較して、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％並びにこれらの値間の任意の割合を包含した程度低減された濃度で、これらの分子を産生する。他の態様では、ＨｒｃＡリプレッサータンパク質の調節下でｉｓｐＡ遺伝子を発現する組換え細胞（本明細書で開示される任意の組換え細胞など）は、ＨｒｃＡリプレッサータンパク質の調節下にｉｓｐＡ遺伝子を含まない細胞の生存能と比較して５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％並びにこれらの値間の任意の割合を包含した程度向上した生存能を示す。他の態様では、イソプレンを産生するよう遺伝子操作を施した組換え細胞は、ＨｒｃＡリプレッサータンパク質の調節下にＭＶＡ経路の１種以上の構成酵素類及びｉｓｐＡ遺伝子をコードしている１種以上の異種核酸を含むものであり、ＭＶＡ経路の１種以上の構成酵素類をコードしている１種以上の異種核酸を含むもののＨｒｃＡリプレッサータンパク質の調節下にｉｓｐＡ遺伝子を含まない細胞の生存能と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％並びにこれらの値間の任意の割合を包含した程度向上した生存能を示し得る。
【００５７】
キシロースによるｉｓｐＡの発現調節を介した一時的な発現の下方調節
炭素資源利用能により介在される遺伝子発現調節は、産生宿主（例えば、大腸菌（E. coli）産生宿主）内でｉｓｐＡ遺伝子の発現を制御する際の別のスケーラブルな代替法である。このような方法により、バイオマスの迅速な置換えを可能にする健康的でロバストで高速な細胞増殖に必要とされる、比較的正常なレベル及び／又は十分なレベルのｉｓｐＡ遺伝子の発現が提供され得る。加えて、ＦＰＰ合成酵素活性が細胞生存率に有害であるものとして考えられる場合、このような方法により、グルコースにより支持されるイソプレン産生中にｉｓｐＡを限定的に発現する能力がもたらされ、結果として、グルコースから産生されるイソプレンの収率が低下する。
【００５８】
これらを踏まえ、一部の態様では、本明細書に記載のいずれかの組換え細胞は、低減された機能活性を有するｉｓｐＡ遺伝子を含み得るものであり、ｉｓｐＡ遺伝子の機能活性は、ｉｓｐＡ遺伝子をキシロースにより制御されるプロモーターの調節下に配置することにより低減される。一部の態様では、組み換え細胞（組換え型大腸菌（E. coli）細胞など）におけるｉｓｐＡ発現は、組み換え細胞内で、内在性ｘｙｌＡ若しくはｘｙｌＦプロモーターの直接調節下又はＤ−キシロースにより正の影響を受け、グルコースにより負の影響を受ける任意のプロモーターの調節下におかれる。これは、内在性ｉｓｐＡ遺伝子を欠失させ、Ｄ−キシロース応答性プロモーターのｘｙｌＡ又はｘｙｌＦのいずれかの調節下に異種ｉｓｐＡを置換することにより実施される。大腸菌（E. coli）の多様なｘｙｌＡ−ｘｙｌＦプロモーター、並びにＤ−キシロース及び転写活性化因子ＸｙｌＲを介する正の制御、及びそれらのグルコース及び代謝産物による負の制御がこれまでに報告されている（Ｓ．Ｓｏｎｇ  ａｎｄ  Ｃ．Ｐａｒｋ，１９９７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．，１７９（２２）：７０２５〜７０３２）。一部の態様では、ｉｓｐＡ遺伝子の発現は、グルコースの非存在下でのキシロース利用能により正に管理され、並びにグルコースの存在により負に管理される。一部の態様では、キシロース誘導性のｉｓｐＡ座は、組み換え細胞（組換え型大腸菌（E. coli）細胞など）の染色体内に存在するものの、あるいは、プラスミドなどの染色体外のヌクレオチド配列によりコードされてもよい。キシロースにより誘導することのできるｉｓｐＡコンストラクトの構築、並びにイソプレンを産生する大腸菌（E. coli）宿主へのコンストラクトの導入は、標準的な分子生物学的及び微生物学的手法を使用し実施することができる（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ．１９８９）。
【００５９】
一部の態様では、キシロース誘導型プロモーターの調節下でｉｓｐＡ遺伝子を発現する組換え細胞（本明細書で開示される任意の組換え細胞など）は、キシロース誘導型プロモーターの調節下にｉｓｐＡ遺伝子を含まない細胞におけるＧＰＰ及び／又はＦＰＰの濃度と比較して、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％並びにこれらの値間の任意の割合を包含した程度低減された濃度で、これらの分子を産生する。他の態様では、イソプレンを産生するよう遺伝子操作を施した組換え細胞は、キシロース誘導型プロモーターの調節下にＭＶＡ経路の１種以上の構成酵素類及びｉｓｐＡ遺伝子をコードしている１種以上の異種核酸を含むものであり、ＭＶＡ経路の１種以上の構成酵素類をコードしている１種以上の異種核酸を含むもののキシロース誘導型プロモーターの調節下にｉｓｐＡ遺伝子を含まない組換え細胞におけるＧＰＰ及び／又はＦＰＰ分子の濃度と比較して、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％並びにこれらの値間の任意の割合を包含した程度低減された濃度で、これらの分子を産生する。一部の態様では、キシロース誘導型プロモーターの調節下でｉｓｐＡ遺伝子を発現する組換え細胞（本明細書で開示される任意の組換え細胞など）は、キシロース誘導型プロモーターの調節下にｉｓｐＡ遺伝子を含まない細胞におけるイソプレノイド類の濃度と比較して、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％並びにこれらの値間の任意の割合を包含した程度低減された濃度で、これらの分子を産生する。他の態様では、キシロース誘導型プロモーターの調節下でｉｓｐＡ遺伝子を発現する組換え細胞（本明細書で開示される任意の組換え細胞など）は、キシロース誘導型プロモーターの調節下にｉｓｐＡ遺伝子を含まない細胞における生存能と比較して、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％並びにこれらの値間の任意の割合を包含した程度向上した生存能を示す。他の態様では、イソプレンを産生するよう遺伝子操作を施した組換え細胞は、キシロース誘導型プロモーターの調節下にＭＶＡ経路の１種以上の構成酵素類及びｉｓｐＡ遺伝子をコードしている１種以上の異種核酸を含むものであり、ＭＶＡ経路の１種以上の構成酵素類をコードしている１種以上の異種核酸を含むもののキシロース誘導型プロモーターの調節下にｉｓｐＡ遺伝子を含まない細胞の生存能と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％並びにこれらの値間の任意の割合を包含した程度向上した生存能を示し得る。
【００６０】
ＦＰＰ合成酵素活性の低下
一部の態様では、ｉｓｐＡ遺伝子の機能活性は、ｉｓｐＡタンパク質であるＦＰＰ合成酵素の活性を低減させることにより低減される。この低減は、ＩｓｐＡのｍＲＮＡの翻訳を阻害すること、又は本明細書に記載されるような任意の種類の方法によりＦＰＰ合成酵素そのものを分解させることを包含し得る。
【００６１】
翻訳により、ｉｓｐＡタンパク質をタンパク質分解性のタグと融合させて、タンパク質活性を低減させる。
【００６２】
本明細書に記載のいずれかの組換え細胞の一部の態様では、遺伝子操作により、ＤＮＡ配列を、アミノ酸残基１１個分のタンパク質タグをコードするｉｓｐＡ遺伝子に組み込むことにより、ＦＰＰ合成酵素をタンパク質分解の標的とする（Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６４（６）：２２４０〜２２４６）。タンパク質分解性のｔｍＲＮＡタグは、次に宿主細胞における分解に際しＦＰＰ合成酵素を標的とし、したがってＦＰＰ合成酵素活性を低減させる。一部の態様では、タンパク質分解性のタグをＦＰＰ合成酵素タンパク質のＣ末端に融合させる。他の態様では、タンパク質分解性のタグをＦＰＰ合成酵素タンパク質のＮ末端に融合させる。
【００６３】
一部の態様では、タンパク質分解性のタグと融合させたＦＰＰ合成酵素タンパク質を発現する組換え細胞（本明細書で開示される任意の組換え細胞など）は、タンパク質分解性タグと融合させたＦＰＰ合成酵素タンパク質を含まない細胞におけるＧＰＰ及び／又はＦＰＰ濃度と比較して、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％並びにこれらの値間の任意の割合を包含した程度低減された濃度で、これらの分子を産生する。他の態様では、組換え細胞（本明細書で開示される任意の組換え細胞など）は、ＭＶＡ経路の１種以上の構成酵素類をコードしている１種以上の異種核酸を含み、イソプレンを産生するよう遺伝子操作されており、タンパク質分解性タグと融合させたＦＰＰ合成酵素タンパク質を発現するものであり、ＭＶＡ経路の１種以上の構成酵素類をコードしている１種以上の異種核酸を含むもののタンパク質分解性タグと融合させたＦＰＰ合成酵素タンパク質は含まない組換え細胞におけるＧＰＰ及び／又はＦＰＰの分子濃度と比較して、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％並びにこれらの値間の任意の割合を包含した程度低減された濃度で、これらの分子を細胞に産生させる。一部の態様では、タンパク質分解性タグと融合させたＦＰＰ合成酵素タンパク質を発現する組換え細胞（本明細書で開示される任意の組換え細胞など）は、タンパク質分解性タグと融合させたＦＰＰ合成酵素タンパク質を含まない細胞におけるイソプレノイド類の濃度と比較して約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％並びにこれらの値間の任意の割合を包含した程度低減された濃度で、これらの分子を産生する。他の態様では、タンパク質分解性タグと融合させたＦＰＰ合成酵素タンパク質を発現する組換え細胞（本明細書で開示される任意の組換え細胞など）は、タンパク質分解性タグと融合させたｉｓｐＡタンパク質を含まない細胞の生存能と比較して、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％並びにこれらの値間の任意の割合を包含した程度向上した生存能を示す。他の態様では、組換え細胞（本明細書で開示される任意の組換え細胞など）は、タンパク質分解性タグと融合させたＦＰＰ合成酵素タンパク質を発現しており、ＭＶＡ経路の１種以上の構成酵素類及びｉｓｐＡ遺伝子をコードしている１種以上の異種核酸を含むものであり、ＭＶＡ経路の１種以上の構成酵素類をコードしている１種以上の異種核酸を含むもののタンパク質分解性タグと融合させたＦＰＰ合成酵素タンパク質を含まない細胞の生存能と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％並びにこれらの値間の任意の割合を包含した程度向上した生存能を示す。
【００６４】
アンチセンスｍＲＮＡ及びリボソーム結合の変異を使用することによるｉｓｐＡタンパク質の発現の低減
一部の態様では、ｉｓｐＡのｍＲＮＡに対するアンチセンスｍＲＮＡを使用して、ｉｓｐＡのｍＲＮＡのｉｓｐＡタンパク質への翻訳を防ぎ、その結果として、ｉｓｐＡタンパク質の発現を低下させる。アンチセンス法は当業者に周知であり、酢酸などの分子の産生を低減させる際（Ｋｉｍ  Ｊ．ａｎｄ  Ｃｈａ  Ｈ．Ｊ．，２００３，Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｂｉｏｅｎｇ．，８３：８４１〜８５３）、又は遺伝子操作によりカタラーゼをノックアウトさせた表現型を作製する際（Ｃｈａｎ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４：１２７〜１３４）に大腸菌（E. coli）において使用されてきた。大腸菌（E. coli）のｉｓｐＡ遺伝子を標的としたアンチセンスコンストラクトの設計は、Ｓｈａｏ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３４：５６６０〜５６６９に報告される方法を使用し作製することができる。アンチセンスＲＮＡ分子は、対化した終端を使用し安定化することができる（Ｎａｋａｓｈｉｍａ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３４：ｅ１３８）。一部の態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは約１５０ｂｐである。アンチセンスｍＲＮＡ処理による、ｉｓｐＡのｍＲＮＡの翻訳の低減は、限定するものではないが、酵素活性アッセイ、ウェスタンブロット、ノーザンブロット、又はＲＴ−ＰＣＲなどの当該技術分野において知られる任意の手法により測定することができる。
【００６５】
他の態様では、ｉｓｐＡタンパク質の発現は、ｉｓｐＡのｍＲＮＡ分子に位置する１つ以上のリボソーム結合部位に１つ以上の変異を導入することにより低減される。リボソーム結合性に変異を導入することで、ＩｓｐＡのｍＲＮＡの翻訳が干渉され又は無効になり、ｉｓｐＡタンパク質の発現が低減する。ｉｓｐＡのｍＲＮＡ分子上に配置される１つ以上のリボソーム結合部位に、１つ以上の変異を導入することによる、ｉｓｐＡのｍＲＮＡの翻訳の低減は、当該技術分野において知られる、限定するものではないが、酵素活性評価法又はウェスタンブロットなどの任意の手段により測定することができる。
【００６６】
特定のｍＲＮＡ上のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）の配置は、当該技術分野において知られる最適化ソフトウェアを使用して同定することができる。例えば、ＲＮＡの熱力学的パラメーターを用いるＲＢＳ計算機の最適化ソフトウェアを、Ｖｉｅｎｎａ  ＲＮＡ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｖ．１．８．４（ｗｏｒｌｄ．ｗｉｄｅ．ｗｅｂ．ｔｂｉ．ｕｎｉｖｉｅ．ａｃ．ａｔ／〜ｉｖｏ／ＲＮＡ／，Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（ＮＡＲ，２００８で入手可能）並びにＲＢＳ計算機用Ｖｉｅｎｎａ  ＲＮＡモデルと組み合わせて使用することができる。このようなＲＢＳ計算機最適化ソフトウェアを使用して、タンパク質発現に対し予想される効果に関しＲＢＳを同定することができる。例えば、標的タンパク質（例えば、ｉｓｐＡ）の発現の低減をもたらすＲＢＳは、ＲＢＳ計算機最適化ソフトウェアを使用して同定することができる。
【００６７】
イソプレン合成酵素の核酸及びポリぺプチド
本発明の一部の態様では、本開示の組成物又は方法のいずれかに記載の組み換え細胞は、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている１種以上の核酸、又はイソプレン合成酵素活性を有するポリペプチドを更に含む。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは内在性ポリペプチドである。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている内在性核酸は、常時発現型プロモーターに調節可能なように連結される。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている内在性核酸は、誘導型プロモーターに調節可能なように連結される。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている内在性核酸は、高発現型プロモーターに調節可能なように連結される。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている内在性の核酸を１つ以上（例えば、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている内在性の核酸の２、３、又は４つ以上のコピー）を使用する。特定の態様では、野生型細胞と比べ、内在性イソプレン合成酵素経路のポリペプチドが過剰発現するよう細胞を遺伝子操作する。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている内在性核酸は、低発現型プロモーターに調節可能なように連結される。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、クズ属（Pueraria）又はハコヤナギ属（Populus）、又はウラジロハコヤナギ（Populus alba）ｘヤマナラシ（Populus tremula）などの交雑種由来のポリペプチドである。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドはユーカリプタス（Eucalyptus）に由来するものである。
【００６８】
一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは異種ポリペプチドである。一部の態様では、細胞は、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている異種核酸のコピーを１つ以上含む。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている異種核酸は、常時発現型プロモーターに調節可能なように連結される。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている異種核酸は、誘導型プロモーターに調節可能なように連結される。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている異種核酸は、高発現型プロモーターに調節可能なように連結される。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている異種核酸は、低発現型プロモーターに調節可能なように連結される。
【００６９】
イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、あるいは細胞で安定的に発現させることができる。イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている核酸は、更にベクターに組み込むこともできる。
【００７０】
代表的なイソプレン合成酵素の核酸としては、イソプレン合成酵素ポリペプチドの活性を少なくとも１種有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。イソプレン合成酵素ポリペプチドは、ジメチルアリールジホスフェート（ＤＭＡＰＰ）をイソプレンに変換する。代表的なイソプレン合成酵素ポリペプチドとしては、イソプレン合成酵素ポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、並びに融合ポリペプチドが挙げられる。イソプレン合成酵素ポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載されるような任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸が挙げられる。加えて、イソプレン合成酵素変異体は、酵素活性が向上しているなどして、活性が向上されていてよい。一部の態様では、イソプレン合成酵素変異体は、安定性（例えば、熱安定性）が改良されている、及び／又は溶解性が改良されているなどして、その他の特性が改良されている。
【００７１】
インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボで、ポリペプチドがＤＭＡＰＰをイソプレンへと変換する能力を測定して、ポリペプチドがイソプレン合成酵素ポリペプチド活性を有するか否かを判定する際には、標準法を使用できる。細胞抽出物中のイソプレン合成酵素ポリペプチド活性は、例えば、Ｓｉｌｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３０１０〜１３０１６に記載の通りに測定することができる。代表的なアッセイでは、ＤＭＡＰＰ（Ｓｉｇｍａ）は窒素流下で蒸発させ、乾燥させ、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ  ８．２）を用い１００ｍＭに再水和し、−２０℃で保存する。アッセイを実施するために、金属製スクリューキャップと、テフロンコーティングのなされたシリコン製隔壁（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とを取り付けた２０ｍＬのヘッドスペースバイアル内で、５μＬの１Ｍ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ（２５０μｇ／ｍＬ）ＤＭＡＰＰ、６５μＬの植物抽出緩衝液（ＰＥＢ）（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５％グリセロール、及び２ｍＭ  ＤＴＴ）に、２５μＬの細胞抽出物を加え、振とうさせながら３７℃で１５分間培養した。２００μＬの２５０ｍＭ  ＥＤＴＡを加えて反応をクエンチさせ、ＧＣ／ＭＳにより定量することができる。
【００７２】
一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、植物のイソプレン合成酵素ポリペプチド又はそれらの変異体である。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、プエラリア（Pueraria）に由来するイソプレン合成酵素又はそれらの変異体である。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、ハコヤナギ属（Populus）由来のイソプレン合成酵素又はそれらの変異体である。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、ポプラ（poplar）のイソプレン合成酵素ポリペプチド又はそれらの変異体である。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドはクズ（kudzu）のイソプレン合成酵素ポリペプチド又はそれらの変異体である。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、クズ属（Pueraria）又はハコヤナギ属（Populus）、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）ｘヤマナラシ（Populus tremula）などの交雑種、又はこれらの（変異体（variant））由来のポリペプチドである。
【００７３】
一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチド又は核酸は、マメ科、例えば、マメ亜科（Faboideae）由来のものである。特定の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチド又は核酸は、プエラリア・モンタナ（Pueraria montana）（クズ（kudzu））（Ｓｈａｒｋｅｙｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １３７：７００〜７１２）、プエラリア・ロバタ（Pueraria lobata）、ポプラ（ウラジロハコヤナギ（Populus alba）、セイヨウハコヤナギ（Populus nigra）、コットンウッド（Populus trichocarpa）、又はウラジロハコヤナギ（Populus alba）ｘトレムラ（tremula）（ＣＡＣ３５６９６）（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｐｌａｎｔａ  ２１３：４８３〜４８７）、アスペン（aspen）（アメリカヤマナラシ（Populus tremuloides）など）Ｓｉｌｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，ＪＢＣ  ２７０（２２）：１３０１０〜１３１６）、又はヨーロッパナラ（Quercus robur）（Ｚｉｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、国際特許出願公開第９８／０２５５０号）に由来するポリペプチド又は核酸である。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、タイワンクズ（Pueraria montana）、クズ（Pueraria lobata）、アメリカヤマナラシ（Populus tremuloides）、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）、セイヨウハコヤナギ（Populus nigra）又はコットンウッド（Populus trichocarpa）由来のイソプレン合成酵素、又はこれらの変異体である。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）由来のイソプレン合成酵素であるか、又はこれらの変異体である。一部の態様では、イソプレン合成酵素は、バルサムポプラ（Populus balsamifera）（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＪＮ１７３０３７）、アメリカクロヤマナラシ（Populus deltoides）（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＪＮ１７３０３９）、フレモントコットンウッド（Populus fremontii）（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＪＮ１７３０４０）、オオバギンドロ（Populus granididenta）（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＪＮ１７３０３８）、ヤナギ属（Salix）（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＪＮ１７３０４３）、ニセアカシア（Robinia pseudoacacia）（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＪＮ１７３０４１）、フジ属（Wisteria）（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＪＮ１７３０４２）、ユーカリ・グロブルス（Eucalyptus globulus）（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＢ２６６３９０）又はティーツリー（Melaleuca alterniflora）（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＹ２７９３７９）又はこれらの変異体である。一部の態様では、イソプレン合成酵素（例えば、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）又はこれらの変異体由来のイソプレン合成酵素）をコードしている核酸は、コドンを最適化されている。
【００７４】
一部の態様では、イソプレン合成酵素核酸又はポリペプチドは、天然に生じるポリペプチド又は核酸である（例えば、ハコヤナギ属（Populus）から天然に生じるポリペプチド又は核酸）。一部の態様では、イソプレン合成酵素核酸又はポリペプチドは、野生型又は天然に生じるポリペプチド又は核酸ではない。一部の態様では、イソプレン合成酵素核酸又はポリペプチドは、野生型又は天然に生じるポリペプチド又は核酸の変異体である（例えば、ハコヤナギ属（Populus）の野生型又は天然に生じるポリペプチド又は核酸の変異体）。
【００７５】
一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは変異体である。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、野生型又は天然型イソプレン合成酵素の変異体である。一部の態様では、変異体は、野生型又は天然型イソプレン合成酵素と比較して触媒活性が向上しているなど、活性が向上している。活性（例えば、触媒活性）の向上は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％のうちのいずれかの程度であり得る。一部の態様では、触媒活性などの活性の向上は、少なくとも約１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、又は１００倍のいずれかである。一部の態様では、触媒活性などの活性の向上は、約１０％〜約１００倍である（例えば、約２０％〜約１００倍、約５０％〜約５０倍、約１倍〜約２５倍、約２倍〜約２０倍、又は約５倍〜約２０倍）。一部の態様では、変異体は、野生型又は天然型イソプレン合成酵素と比較して可溶性が向上している。可溶性の向上は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％のうちのいずれかの程度であり得る。可溶性の向上は、少なくとも約１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、又は１００倍のうちのいずれかの程度であり得る。一部の態様では、溶解性の向上は、約１０％〜約１００倍のうちのいずれかの程度であり得る（例えば、約２０％〜約１００倍、約５０％〜約５０倍、約１倍〜約２５倍、約２倍〜約２０倍、又は約５倍〜約２０倍）。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、天然型イソプレン合成酵素変異体であり、かつ天然型イソプレン合成酵素と比較して安定性が向上している（熱安定性など）。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、ユーカリプタス（Eucalyptus）又はこれらの変異体に由来するものである。他の態様では、イソプレン合成酵素は、ハリエンジュ属（Robinia）、ヤナギ属（Salix）、若しくはコバノブラシノキ属（Melaleuca）、又はこれらの変異体に由来するものである。
【００７６】
一部の態様では、変異体は、野生型又は天然型イソプレン合成酵素の活性の、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％、少なくとも約２００％の活性を有する。変異体は、野生型又は天然型イソプレン合成酵素との配列類似性を保有し得る。一部の態様では、野生型又は天然型イソプレン合成酵素の変異体は、野生型又は天然型イソプレン合成酵素のアミノ酸配列と、少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％のうちのいずれかの程度で配列同一性を有する。一部の態様では、野生型又は天然型イソプレン合成酵素の変異体は、野生型又は天然型イソプレン合成酵素のアミノ酸配列と、約７０％〜約９９．９％、約７５％〜約９９％、約８０％〜約９８％、約８５％〜約９７％、又は約９０％〜約９５％のうちのいずれかの程度で配列同一性を有する。
【００７７】
一部の態様では、変異体は、野生型又は天然型イソプレン合成酵素内に変異を持つ。一部の態様では、変異体は、少なくとも１箇所にアミノ酸置換、少なくとも１箇所にアミノ酸挿入、及び／又は少なくとも１箇所にアミノ酸欠失を有する。一部の態様では、変異体は、少なくとも１箇所にアミノ酸置換を有する。一部の態様では、変異体と、野生型又は天然型イソプレン合成酵素との間で異なっているアミノ酸残基の数は、１以上であってよく、例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、又は５０以上のアミノ酸残基が異なっていてよい。天然型イソプレン合成酵素としては、植物由来の任意のイソプレン合成酵素を挙げることができ、例えば、クズ（kudzu）イソプレン合成酵素、ポプラ（poplar）イソプレン合成酵素、ヨーロッパナラ（English oak）イソプレン合成酵素、及びヤナギ（willow）イソプレン合成酵素が挙げられる。一部の態様では、変異体は、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）由来のイソプレン合成酵素の変異体である。一部の態様では、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）由来のイソプレン合成酵素変異体は、少なくとも１箇所にアミノ酸置換、少なくとも１箇所にアミノ酸挿入、及び／又は少なくとも１箇所にアミノ酸欠失を有する。一部の態様では、変異体は、トランケート型のウラジロハコヤナギ（Populus alba）イソプレン合成酵素である。一部の態様では、変異体（例えば、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）由来のイソプレン合成酵素の変異体）をコードしている核酸は、コドンを最適化させたものである（例えば、異種イソプレン合成酵素を発現させる宿主細胞に基づきコドンを最適化している）。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、ユーカリプタス（Eucalyptus）又はこれらの変異体に由来するものである。他の態様では、イソプレン合成酵素は、ハリエンジュ属（Robinia）、ヤナギ属（Salix）、若しくはコバノブラシノキ属（Melaleuca）、又はこれらの変異体に由来するものである。
【００７８】
本開示のイソプレン合成酵素ポリペプチドは、国際公開第２００９／１３２２２０号、同第２０１０／１２４１４６号、米国特許出願第２０１０／００８６９７８号に記載のいずれかのイソプレン合成酵素又はイソプレン合成酵素変異体であってよい。これらの文献に記載される、イソプレン合成酵素及びイソプレン合成酵素変異体に関係するすべての内容は、参照により本開示に明示的に組み込む。
【００７９】
本開示のプロモーターのうちのいずれか（例えば、本開示に記載され、本開示の実施例において識別される、誘導型プロモーター及び常時発現型プロモーターなどのプロモーター）を使用して、本開示のいずれかのイソプレン合成酵素の発現を駆動させることができる。
【００８０】
好適なイソプレン合成酵素としては、限定するものではないが、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ３４１４３１、ＡＹ３１６６９１、ＡＹ２７９３７９、ＡＪ４５７０７０、及びＡＹ１８２２４１として識別されるものが挙げられる。本明細書に記載のイソプレン合成酵素をコードしている微生物の製造法を含む組成物又は方法のいずれかにおいて使用することのできる種類のイソプレン合成酵素は、国際特許出願公開第２００９／０７６６７６号、同第２０１０／００３００７号、同第２００９／１３２２２０号、同第２０１０／０３１０６２号、同第２０１０／０３１０６８号、同第２０１０／０３１０７６号、同第２０１０／０１３０７７号、同第２０１０／０３１０７９号、同第２０１０／１４８１５０号、同第２０１０／１２４１４６号、同第２０１０／０７８４５７号、同第２０１０／１４８２５６号、並びにＳｈａｒｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，「イソプレン合成酵素の遺伝子はＴｐｓ−Ｂテルペン合成酵素ファミリーにおけるアクリル系テルペン合成酵素の単系統群を形成する（Isoprene Synthase Genes Form A Monophyletic Clade Of Acyclic Terpene Synthases In The Tps-B Terpene Synthase Family）」，Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（２０１２）（ＤＯＩ：１０．１１１１／ｅｖｏ．１２０１３においてオンライン利用可能である）にも開示されており、これらの文献の各々の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８１】
各種イソプレン合成酵素変異体には、表Ａに示す残基位置において置換をなすことができる。本発明の組成物及び方法には、本明細書に記載の任意の変異体（表Ａ、特許請求の範囲、又は実施例）を使用してよい。一部の態様では、変異体は、ウラジロハコヤナギ（P. alba）のアミノ酸配列に相当する表Ａ由来の変異を１つ以上（すなわち、２、３、４、５、６など）含む。
【００８２】
【表１】
2015510392.tif 000003
【００８３】
表Ａには、ＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）イソプレン合成酵素における具体的な置換を掲載する。他の親イソプレン合成酵素において、対応する残基を同様に変異させて、本発明のイソプレン合成酵素変異体を生成することもできる。
【００８４】
ＭＶＡ経路の核酸及びポリぺプチド
完全なＭＶＡ経路は、上流経路及び下流経路の２群に分けることができる。ＭＶＡ経路の上流部位では、細胞代謝中に産出されたアセチルＣｏ−Ａは、（ａ）（ｉ）チオラーゼ活性又は（ｉｉ）アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素活性、（ｂ）ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、及び（ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素酵素活性のいずれかを有するポリペプチド部位によりメバロン酸へと変換される。まず始めに、チオラーゼ又はアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素（アセチル−ＣｏＡ及びマロニル−ＣｏＡを利用する）の作用によりアセチルＣｏ−ＡをアセトアセチルＣｏＡに変換する。次に、アセトアセチル−ＣｏＡは、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素の酵素作用により、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）へと変換される。このＣｏ−Ａ誘導体をＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼにより還元してメバロン酸を生成する。この反応は、メバロン酸経路によるイソプレノイド産生の律速段階となる。下流ＭＶＡ経路では、メバロン酸塩は、次にメバロン酸キナーゼの作用により５−ホスホメバロン酸へと変換され、これは続いてホスホメバロン酸キナーゼの酵素活性により５−ジホスホメバロン酸へと転換される。最後に、酵素のメバロン酸−５−ピロリン酸塩デカルボキシラーゼの活性により、５−ジホスホメバロン酸からＩＰＰが形成される。
【００８５】
低減された機能活性を有するｉｓｐＡ遺伝子と合わせて使用することのできる代表的なＭＶＡ経路ポリペプチドとしては、限定するものではないが、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ合成酵素（ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素）ポリペプチド（例えば、ｍｖａＳによりコードされる酵素）、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ）ポリペプチド（例えば、ｍｖａＲによりコードされている酵素又はチオラーゼが欠損するよう改変されているもののレダクターゼ活性は保有しているｍｖａＥによりコードされている酵素）、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）ポリペプチド、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）ポリペプチド、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）ポリペプチド、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤＣ）ポリペプチド、イソペンテニルリン酸キナーゼ（ＩＰＫ）ポリペプチド、ＩＰＰイソメラーゼポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、及びＭＶＡ経路の２つ以上のポリペプチド活性を有するポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）が挙げられる。特に、ＭＶＡ経路ポリペプチドとしては、ＭＶＡ経路のポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド及び融合ポリペプチドが挙げられる。ＭＶＡ経路の代表的な核酸としては、ＭＶＡ経路に含まれるポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードしている核酸が挙げられる。ＭＶＡ経路に含まれる代表的なポリペプチド及び核酸としては、本明細書に記載されるような任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸が挙げられる。更に、イソプレンの産生を増大させるような、ＭＶＡ経路のポリペプチド変異体も、良好に使用することができる。
【００８６】
使用され得るＭＶＡ経路ポリペプチドの非限定例は、国際特許出願公開第２００９／０７６６７６号；同第２０１０／００３００７号及び同第２０１０／１４８１５０号に記載のものである。
【００８７】
アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素核酸及びポリペプチド
アセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子（ｎｐｈＴ７としても知られる）は、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する活性を有し、かつ２分子のアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する活性は最小限である（例えば、非活性である）酵素をコードしている遺伝子である。例えば、Ｏｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０７（２５）：１１２６５〜１１２７０を参照されたい。この非特許文献の内容は、ｎｐｈＴ７についての教示に関し明示的に本明細書に組み込まれる。ストレプトミセス（Streptomyces）属ＣＬ１９０株の放線菌（actinomycete）由来のアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子は、特許公開第２００８−６１５０６（Ａ）号及び米国特許出願公開第２０１０／０２８５５４９号に記載される。アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素も、アセチルＣｏＡ：マロニルＣｏＡアシル基転移酵素として参照され得る。使用することのできる代表的なアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素（又はアセチルＣｏＡ：マロニルＣｏＡアシル基転移酵素）としては、Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＢ５４０１３１．１が挙げられる。
【００８８】
一実施形態では、本発明のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素は、不可逆反応を介し、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する。アセトアセチルＣｏＡ合成酵素を使用してアセチルＣｏＡを生成することで、この作用は不可逆的なものであり、かつアセトアセチルＣｏＡチオラーゼ酵素の２分子のアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する作用は可逆的なものであるという、更なる利点が提供される。これらを踏まえると、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素を使用して、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成することで、チオラーゼを使用して同様の最終産物を産生した場合と比較して、イソプレンの産生量において著しい向上が得られる。
【００８９】
これに加え、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素を使用してイソプレンを生成した場合には、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素が、マロニルＣｏＡの脱炭酸によりマロニルＣｏＡをアセチルＣｏＡへと変換し得るという更なる利点も提供する。したがって、開始基質の貯蔵量は、アセチルＣｏＡの開始量により制限されない。アセトアセチルＣｏＡ合成酵素によるアセトアセチルＣｏＡの合成は、開始基質がマロニルＣｏＡのみである場合にのみ引き続き生じ得る。一実施形態では、開始時のマロニルＣｏＡのプール量は、よりマロニルＣｏＡを有する宿主株を使用することにより増加する。このようなプール量の増加は、天然に生じ得るものであり又は分子操作により設計され得るものである。例えば、Ｆｏｗｌｅｒ，ｅｔ．ａｌ，２００９，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，７５（１８）：５８３１〜５８３９を参照されたい。
【００９０】
本開示に記載の任意の態様又は実施例では、マロニル−ＣｏＡ及びアセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡを合成する能力を有する酵素を使用できる。このような酵素の非限定例を本明細書に記載する。本開示に記載の特定の実施形態では、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する能力を有する放線菌のストレプトマイセス（Streptomyces）属から誘導されるアセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子を使用できる。
【００９１】
このようなアセトアセチルＣｏＡ合成酵素の遺伝子の例としては、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしている遺伝子が挙げられる。このような、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質は、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する活性を有し、２分子のアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する活性は有さないアセトアセチルＣｏＡ合成酵素に相当する。
【００９２】
一実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしている遺伝子は、ストレプトミセス属（Streptomyces sp.）ＣＬ１９０株の放線菌（actinomycete）から得られるゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用し、日本国特許公開第２００８−６１５０６（Ａ）号を参照して設計することのできるプライマー対を使用して核酸増幅法（例えば、ＰＣＲ）により得ることができる。
【００９３】
本明細書に記載するとき、本発明での使用に関し、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子は、ストレプトミセス属（Streptomyces sp.）ＣＬ１９０株の放線菌（actinomycete）に由来する配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしている遺伝子に限定されない。マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成することができかつ２分子のアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成することはできないタンパク質をコードしている任意の遺伝子を本発明に記載の方法に使用することができる。特定の実施形態では、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列と類似性が高く又は実質的に同一であるアミノ酸配列を有し、かつマロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する機能を有するタンパク質をコードしている遺伝子であり得る。表現「類似性の高い」又は「実質的に同一」は、例えば、少なくとも約８０％同一性、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、及び少なくとも約９９％同一であることを意味する。上記で使用した通り、同一度の値は、異なるアミノ酸配列及び配列番号１のアミノ酸配列に含まれるアミノ酸残基間の同一度（％）に相当するものであり、配列類似性について検索するためのプログラムを使用し、配列番号１のアミノ酸配列と、異なるアミノ酸配列とを整列させることで算出される。
【００９４】
他の実施形態では、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子は、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、付加又は挿入により、配列番号１のアミノ酸配列由来のアミノ酸配列を有し、かつマロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する機能を有するタンパク質をコードしている遺伝子であってよい。本明細書において、表現「１つ以上のアミノ酸（more amino acids）」は、例えば、２〜３０個のアミノ酸、好ましくは２〜２０個のアミノ酸、より好ましくは２〜１０個のアミノ酸及び最も好ましくは２〜５個のアミノ酸を指す。
【００９５】
更に他の実施形態では、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子は、厳密な条件下で配列番号１のアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列と相補的であり、ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを一部又は完全に加水分解することのできる、並びにマロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する機能を有するタンパク質をコードすることのできる、ポリヌクレオチドからなる場合がある。本明細書において、厳密な条件下でのハイブリダイゼーションは、６０℃で２回ＳＳＣで洗浄する条件下で結合を維持させることに相当する。ハイブリダイゼーションは、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．「分子クローニング；標準実験法（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）第３版」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（２００１年））に記載の手法などの、既知の従来法により実施することができる。
【００９６】
本明細書に記載されるとおり、配列番号１のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するアセトアセチルＣｏＡ合成酵素をコードしている遺伝子は、任意の生物から単離できる可能性があり、例えば、ストレプトミセス属（Streptomyces sp.）ＣＬ１９０株から得られない放線菌（actinomycete）から得ることもできる。加えて、本明細書で用いるアセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列をコードしているポリヌクレオチドを、当該技術分野において既知の手法により改変することで得ることもできる。ヌクレオチド配列への変異導入は、Ｋｕｎｋｅｌ法又はｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法あるいはこれらのいずれかに類似の手法などの既知の手法により実施することができる。例えば、変異導入は、部位特異的変異導入については、変異導入キット（例えば、製品名；Ｍｕｔａｎｔ−Ｋ及びＭｕｔａｎｔ−Ｇ（タカラバイオ））及び製品名ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズのキット（タカラバイオ）などを使用することで実施できる。
【００９７】
配列番号１のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するアセトアセチルＣｏＡ合成酵素の活性は、以下に記載の通りに評価することができる。具体的には、評価されることになるタンパク質をコードしている遺伝子は、遺伝子を細胞中で発現させ、続いてクロマトグラフィーなどの手法によりタンパク質を精製することができるような様式で、まずは宿主細胞に導入される。得られた評価すべきタンパク質を含有させた緩衝液に、基質としてマロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡを加え、続いて例えば、所望の温度（例えば、１０℃〜６０℃）でインキュベートする。反応の完了後、基質の減少量及び／又は生成物量（アセトアセチルＣｏＡ）を測定する。したがって、試験したタンパク質がマロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する機能を有するか評価すること、並びに合成度を評価することができる。このような場合では、このタンパク質が、２分子のアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する活性を有しているか否かは、得られた評価すべきタンパク質を含有させた緩衝液に、アセチルＣｏＡのみを基質として加え、基質の減少量及び／又は同様の方法において産生された産生物量を測定することにより、試験することができる。
【００９８】
上流ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている核酸
ＭＶＡ経路の上流は、細胞内代謝中に産生されるアセチルＣｏ−Ａを、（ａ）（ｉ）チオラーゼ活性又は（ｉｉ）アセトアセチル−ＣｏＡ活性、（ｂ）ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、及び（ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素活性のいずれかの活性をもつポリペプチドの作用によりメバロン酸に変換する際の開始基質として利用する。まず始めに、チオラーゼ又はアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素（アセチル−ＣｏＡ及びマロニル−ＣｏＡを利用する）の作用によりアセチルＣｏ−ＡをアセトアセチルＣｏＡに変換する。次に、アセトアセチル−ＣｏＡは、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素の酵素作用により、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）へと変換される。このＣｏ−Ａ誘導体をＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼにより還元してメバロン酸を生成する。この反応は、メバロン酸経路によるイソプレノイド産生の律速段階となる。
【００９９】
低減された機能活性を有するｉｓｐＡ遺伝子と組み合わせて使用することのできる上流ＭＶＡ経路ポリペプチドの非限定例としては、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ）ポリペプチド、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素ポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ合成酵素（ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素）ポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ）ポリペプチドが挙げられる。上流ＭＶＡ経路のポリペプチドには、上流ＭＶＡ経路のポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド及び融合ポリペプチドが含まれる。上流ＭＶＡ経路の代表的な核酸としては、上流ＭＶＡ経路に関係するポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードしている核酸が挙げられる。ＭＶＡ経路の代表的なポリペプチド及び核酸としては、本明細書に記載されるような任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸が挙げられる。したがって、本開示では、上流ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている任意の遺伝子は、本発明において使用できることを企図する。
【０１００】
特定の実施形態では、リステリア・グレイ（L. grayi）、エンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）、エンテロコッカス・カッセリフラバス（E. casseliflavus）及び／又はエンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）由来の様々なｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子を、単独で、あるいは上流ＭＶＡ経路関連性タンパク質をコードしている１つ以上の他のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子と組み合わせて選択することが、本発明の範囲内のものとして企図される。他の実施形態では、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素の遺伝子は、（ｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ合成酵素（ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素）ポリペプチド及び３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ）ポリペプチドをコードしている１種以上の他の遺伝子との組み合わせで本発明の範囲内のものとして企図される。したがって、特定の態様では、本明細書に記載の任意の方法により、企図される任意の組み合わせの遺伝子を、低減された機能活性を有するｉｓｐＡ遺伝子と組み合わせて組換え細胞において発現させることができる。
【０１０１】
本明細書に使用することのできる上流ＭＶＡ経路ポリペプチドの更なる非限定例は、国際特許出願公開第２００９／０７６６７６号；同第２０１０／００３００７号及び同第２０１０／１４８１５０号に記載される。
【０１０２】
ｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている遺伝子
特定の実施形態では、様々なｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子の選択（限定するものではないが、リステリア・グレイ（L. grayi）、エンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）、エンテロコッカス・カッセリフラバス（E. casseliflavus）、及び／又はエンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子など）は、単独で又は上流ＭＶＡ経路のタンパク質をコードしている１つ以上の他のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子と組み合わせて、組換え細胞において低減された機能活性を有するｉｓｐＡを組み合わせた本発明の範囲内で企図される。多くの生物（例えば、リステリア・グレイ（L. grayi）、エンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）、エンテロコッカス・カッセリフラバス（E. casseliflavus）、及びエンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis））において、ｍｖａＥ遺伝子は、チオラーゼ及びＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ活性をいずれも保有するポリペプチドをコードする（Ｈｅｄｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｒｉｌ  ２００２，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４（８）：２１１６〜２１２２）。それに対しｍｖａＳ遺伝子は、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする。
【０１０３】
適宜に、組換え細胞（例えば、大腸菌（E. coli））は、１つ以上のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子（限定するものではないが、リステリア・グレイ（L. grayi）、エンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）、エンテロコッカス・カッセリフラバス（E. casseliflavus）及び／又はエンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子など）を発現し、低減された機能活性を有するｉｓｐＡ遺伝子と組み合わせてイソプレンを産生するよう遺伝子操作することができる。１つ以上のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子をマルチコピープラスミドで発現させることもできる。プラスミドは高コピー数プラスミド、低コピー数プラスミド又は中程度コピー数プラスミドであってよい。あるいは、１つ以上のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子を宿主細胞の染色体に組み込むことができる。プラスミド上の、あるいは宿主細胞染色体の一部に組み込まれた、１つ以上のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子のいずれもの異種発現に際し、遺伝子発現は、誘導型プロモーター又は常時発現型プロモーターのいずれかにより駆動できる。プロモーターは、１つ以上のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子の発現を強力に駆動することができ、弱く駆動することができ、あるいは中程度に駆動することができる。
【０１０４】
ｍｖａＥ遺伝子は、チオラーゼ活性及びＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ活性を両方保有しているポリペプチドをコードする。ｍｖａＥ遺伝子によりコードされているポリペプチドのチオラーゼ活性は、アセチルＣｏ−ＡをアセトアセチルＣｏＡに変換するのに対し、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼポリペプチドの酵素活性は、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡをメバロン酸に変換する。ｍｖａＥポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びにｍｖａＥポリペプチドの活性を少なくとも１つ有する、本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。
【０１０５】
変異型ｍｖａＥポリペプチドとしては、１つ以上のアミノ酸残基がアミノ酸置換を受けており、かつｍｖａＥポリペプチド活性（すなわち、アセチルＣｏ−ＡをアセトアセチルＣｏＡに変換する能力並びに３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡをメバロン酸に変換する能力）を保持しているものが挙げられる。アミノ酸置換は、保存的なものであっても非保存的なものであってもよく、アミノ酸残基の置換は遺伝子暗号によりコードされていてもコードされていなくてもよい。標準的な２０個のアミノ酸「記号（alphabet）」を、側鎖の類似性に基づき化学的なファミリーに分けた。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、極性無電荷側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を持つアミノ酸が挙げられる。「保存的アミノ酸置換」では、アミノ酸残基は、化学的に類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される（すなわち、塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸により置換される）。「非保存的アミノ酸置換」では、アミノ酸残基は、化学的に異なる側鎖を有するアミノ酸残基で置換される（すなわち、塩基性側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸により置換される）。
【０１０６】
ｍｖａＥポリペプチド中にアミノ酸置換を導入することで、分子の官能性を改良することができる。例えば、ｍｖａＥポリペプチドの、基質に対する結合親和性を増加させるアミノ酸置換、あるいはアセチルＣｏ−ＡをアセトアセチルＣｏＡに変換する能力及び／又は３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡをメバロン酸に変換する能力を改良するアミノ酸置換を、ｍｖａＥポリペプチドに導入することができる。一部の態様では、ｍｖａＥポリペプチド変異体は、１つ以上の保存的なアミノ酸置換を含有する。
【０１０７】
一態様では、イソプレン産生には、分解していない又は分解しにくいｍｖａＥタンパク質を使用することができる。使用することのできる、分解されていない又は分解しにくいｍｖａＥ遺伝子産物の例としては、限定するものではないが、エンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）、エンテロコッカス・カッセリフラバス（E. casseliflavus）、エンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）及びリステリア・グレイ（L. grayi）に由来するものが挙げられる。当業者は、大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）においてｍｖａＥタンパク質を発現させ、任意の標準的な分子生物学的手法により断片が存在していないか調べることができる。例えば、Ｈｉｓ−ｔａｇを利用して精製した後、すなわちメバロン酸、イソプレン又はイソプレノイドを産生する大腸菌（E. coli）ＢＬ２１において発現させた後、本明細書に記載の検出法を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをＳａｆｅｓｔａｉｎで染色することにより、断片が存在していないことを確認することができる。
【０１０８】
Ｈｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｈｅｄｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ａｐｒｉｌ  ２００２，１８４（８）：２１１６〜２１２２）に記載のものなどの標準法を使用して、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ活性並びにＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ活性を測定することにより、ポリペプチドがｍｖａＥ活性を有しているか評価することができる。代表的なアッセイでは、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ活性は、アセトアセチルＣｏＡの形成又はチオリシスに伴う吸光度の変化を分光光度計により３０２ｎｍにて監視することで測定できる。アセトアセチルＣｏＡ合成を判定するための各反応に関する標準的なアッセイ条件は、１ｍＭのアセチルＣｏＡ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのトリス（ｐＨ１０．５）というものであり、反応は酵素の添加により開始される。アッセイは最終用量２００μＬで実施できる。アッセイに関し、１酵素単位（ｅｕ）は、１分間で１μｍｏｌのアセトアセチルＣｏＡを合成又はチオリシスすることを意味する。他の代表的なアッセイでは、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ活性は、分光光度計により、３４０ｎｍでのＮＡＤＰ（Ｈ）の出現又は消失をもとに監視することもできる。ＨＭＧ−ＣｏＡのメバロン酸への還元的脱アシル化について測定した各反応の標準的なアッセイ条件は、０．４ｍＭのＮＡＤＰＨ、１．０ｍＭの（Ｒ，Ｓ）−ＨＭＧ−ＣｏＡ、１００ｍＭのＫＣｌ及び１００ｍＭのＫｘＰＯ４（ｐＨ  ６．５）というものである。アッセイは最終用量２００μＬで実施する。反応は酵素の添加により開始される。アッセイに関し、１ｅｕは、１分間で１μｍｏｌのＮＡＤＰ（Ｈ）が代謝回転されることを意味する。これは、０．５μｍｏｌのＨＭＧ−ＣｏＡ又はメバロン酸が代謝回転することに相当する。
【０１０９】
ｍｖａＥ核酸の例としては、ｍｖａＥポリペプチド活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又はポリペプチド融合物をコードしている核酸が挙げられる。ｍｖａＥポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。代表的なｍｖａＥ核酸としては、例えば、リステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ  ２０６０１、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、及び／又はエンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）から単離されたｍｖａＥ核酸が挙げられる。リステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ  ２０６０１  ｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号２に対して９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）ｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号３に対し、約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２  ｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号４に対し、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）ｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号５に対し、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）ｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥ核酸は、これまでにメバロン酸を産生するための大腸菌（E. coli）において開示されているｍｖａＥ遺伝子に対し９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％配列同一性を有し得る（米国特許第２００５／０２８７６５５（Ａ１）号；Ｔａｂａｔａ、Ｋ．ａｎｄ  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｓ．−Ｉ．２００４、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２６：１４８７〜１４９１を参照されたい）。
【０１１０】
ｍｖａＥ核酸は、組み換え細胞において、マルチコピープラスミド上で発現させることができる。プラスミドは高コピー数プラスミド、低コピー数プラスミド又は中程度コピー数プラスミドであってよい。あるいは、ｍｖａＥ核酸は、宿主細胞の染色体に組み込むこともできる。プラスミド上の、あるいは宿主細胞染色体の一部に組み込まれたｍｖａＥ核酸の異種発現に際し、核酸の発現は、誘導型プロモーター又は常時発現型プロモーターのいずれかにより駆動できる。プロモーターは、ｍｖａＥ核酸の発現を強力に駆動することができ、弱く駆動することができ、あるいは中程度に駆動することができる。
【０１１１】
ｍｖａＳ遺伝子は、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素活性を保有するポリペプチドをコードする。このポリペプチドは、アセトアセチルＣｏＡを、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）を変換させることができる。ｍｖａＳポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びにｍｖａＳポリペプチドの活性を少なくとも１つ有する、本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。
【０１１２】
変異型ｍｖａＳポリペプチドとしては、１つ以上のアミノ酸残基がアミノ酸置換を受けており、かつｍｖａＳポリペプチド活性（すなわち、アセトアセチルＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡに変換する能力）を保持しているものが挙げられる。ｍｖａＳポリペプチド中にアミノ酸置換を導入することで、分子の官能性を改良することができる。例えば、ｍｖａＳポリペプチドの、基質に対する結合親和性を増加させるアミノ酸置換、あるいはアセトアセチルＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡに変換する能力を増加させるアミノ酸置換を、ｍｖａＳポリペプチドに導入することができる。一部の態様では、ｍｖａＳポリペプチド変異体は、１つ以上の保存的なアミノ酸置換を含有する。
【０１１３】
Ｑｕａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，１９８９，２６２：１５９〜１６４）に記載のものなどの標準法を使用して、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素の活性を測定することにより、ポリペプチドがｍｖａＳ活性を有するか評価することもできる。代表的なアッセイでは、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素の活性は、３０３ｎｍでの吸光度の変化を監視し、エノール形態のアセトアセチルＣｏＡの消失を分光光度をもとに評価することで、検定できる。３０℃下で、５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２及び０．２ｍＭのジチオスレイトールを含有する標準的な１ｍＬのアッセイ系に、５ｍＭのアセチルリン酸、１０ｍＭ−アセトアセチルＣｏＡ及び５μＬの抽出試料を加え、続いてアセチルＣｏＡ（１００μＭ）及び１０ユニットのＰＴＡを同時に加えることができる。次に、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素の活性を、アセチルＣｏＡ添加前及び添加後の比率（rate）の差として測定する。使用した条件下（ｐＨ  ８．０、１０ｍＭ−ＭｇＣｌ２）での、アセトアセチルＣｏＡの吸光係数は、１２．２×１０３Ｍ−１ｃｍ−１である。定義によると、１ユニットの酵素活性により、１分あたり１μｍｏｌのアセトアセチルＣｏＡが変換されることになる。
【０１１４】
ｍｖａＳ核酸の例としては、ｍｖａＳポリペプチド活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又はポリペプチド融合物をコードしている核酸が挙げられる。ｍｖａＳポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。代表的なｍｖａＳ核酸としては、例えば、リステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ  ２０６０１、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、及び／又はエンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）から単離されたｍｖａＳ核酸が挙げられる。リステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ  ２０６０１  ｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳ核酸は、配列番号６に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcusfaecium）ｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳ核酸は、配列番号７に対し、約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２  ｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳ核酸は、配列番号８に対し、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）ｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳ核酸は、配列番号９に対し、約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）ｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳ核酸は、これまでにメバロン酸を産生するための大腸菌（E. coli）において開示されているｍｖａＥ遺伝子に対し９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％配列同一性を有し得る（米国特許第２００５／０２８７６５５（Ａ１）号；Ｔａｂａｔａ、Ｋ．ａｎｄ  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｓ．−Ｉ．２００４、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２６：１４８７〜１４９１を参照されたい）。
【０１１５】
ｍｖａＳ核酸は、組み換え細胞において多コピープラスミド上で発現させることができる。プラスミドは高コピー数プラスミド、低コピー数プラスミド又は中程度コピー数プラスミドであってよい。あるいは、ｍｖａＳ核酸は、宿主細胞の染色体に組み込むこともできる。プラスミド上での、あるいは宿主細胞染色体に組み込まれた一部としてのｍｖａＳ核酸の異種発現に際し、核酸の発現は、誘導型プロモーター又は常時発現型プロモーターのいずれかにより駆動できる。プロモーターは、ｍｖａＳ核酸の発現を強力に駆動することができ、弱く駆動することができ、あるいは中程度に駆動することができる。
【０１１６】
本開示に記載される通りの組み換え細胞の組成は、同様に本発明の範囲内で企図される。組み換え細胞には、同様に子孫細胞も包含されることは理解される。
【０１１７】
下流ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている核酸
本発明の一部の態様では、本明細書に記載の組成物又は方法の任意のものに記載の細胞は、下流メバロン酸（ＭＶＡ）経路のポリペプチドをコードしている核酸を更に１種以上含む。一部の態様では、下流ＭＶＡ経路のポリペプチドは内在性ポリペプチドである。一部の態様では、下流ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように常時発現型プロモーターに連結される。一部の態様では、下流ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように誘導型プロモーターに連結される。一部の態様では、下流ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように高発現型プロモーターに連結される。特定の態様では、細胞は、野生型細胞と比較して、内在性の下流ＭＶＡ経路のポリペプチドが過剰発現するよう設計する。一部の態様では、下流ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように低発現型プロモーターに連結される。
【０１１８】
下流メバロン酸生合成経路は、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）及びジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）を含む。一部の態様では、下流ＭＶＡ経路は、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）を更に含む。本明細書に提供される細胞は、イソプレン合成酵素、上流ＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチド及び／又は下流ＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドをコードしている核酸を含み得る。下流ＭＶＡ経路のポリペプチドは、（ａ）メバロン酸を５−ホスホメバロン酸ヘとリン酸化する酵素、（ｂ）５−ホスホメバロン酸を５−ジホスホメバロン酸へと変換する酵素、（ｃ）５−ジホスホメバロン酸をイソペンテニルピロリン酸へと変換する酵素、のうちの任意の酵素であり得る。より具体的には、メバロン酸を５−ホスホメバロン酸へとリン酸化する酵素は、メタノサルシナ・マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼ、メタノコッカシド・バートニイ（M. Burtonii）メバロン酸キナーゼ、ラクトバチルス（Lactobacillus）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス（Streptococcus）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトミセス（Streptomyces）メバロン酸キナーゼポリペプチド、及びストレプトミセス（Streptomyces）ＣＬ１９０メバロン酸キナーゼポリペプチドからなるに由来するものであり得る。他の態様では、メバロン酸を５−ホスホメバロン酸へとリン酸化する酵素はＭ．マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼである。
【０１１９】
一部の態様では、下流ＭＶＡ経路のポリペプチドは異種ポリペプチドである。一部の態様では、細胞は、下流ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている異種核酸のコピーを１つ以上含む。一部の態様では、下流ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように常時発現型プロモーターに連結される。一部の態様では、下流ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように誘導型プロモーターに連結される。一部の態様では、下流ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように高発現型プロモーターに連結される。一部の態様では、下流ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように低発現型プロモーターに連結される。一部の態様では、異種下流ＭＶＡ経路のポリペプチドは、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、メタノコッカシド・バートニイ（Methanococcoides burtonii）又はメタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）由来のポリペプチドである。
【０１２０】
下流ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている核酸は、細胞のゲノムに組み込むことができ、あるいは細胞で安定的に発現させることができる。下流ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている核酸は更に、ベクター上に存在させてもよい。
【０１２１】
下流ＭＶＡ経路のポリペプチドの例としては、次の（ｉ）メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）；（ｉｉ）ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）；（ｉｉｉ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）；及び（ｉｖ）イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）も挙げられる。詳細には、下流のＭＶＫポリペプチドは、メタノサルシナ（Methanosarcina）属由来のものであってよく、更に詳細には、下流のＭＶＫポリペプチドは、メタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）由来のものであってよい。加えて、下流ＭＶＫポリペプチドは、メタノコッカシド属（Methanococcoides）、より具体的には、メタノコッカシド・バートニイ（M. Burtonii）由来のものであってよい。下流ＭＶＡ経路のポリぺプチドのその他の例は、米国特許出願公開第２０１０／００８６９７８号に見出すことができ、この内容は、下流ＭＶＫ経路のポリペプチド及び下流ＭＶＫ経路のポリペプチド変異体に関し参照によりその全文が明示的に本明細書に組み込まれる。
【０１２２】
本明細書に記載の細胞のうち任意のものは、ＩＤＩ核酸（例えば、ＩＤＩをコードしている内在性又は異種核酸）を含み得る。イソペンテニルジホスフェートイソメラーゼポリペプチド（イソペンテニル−ジホスフェートδ−イソメラーゼ又はＩＤＩ）は、イソペンテニルジホスフェート（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）の相互変換を触媒する（例えば、ＩＰＰをＤＭＡＰＰへと変換し及び／又はＤＭＡＰＰをＩＰＰヘと変換する）。例示的なＩＤＩポリペプチドとしては、ＩＤＩポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドが挙げられる。標準法（本明細書に記載されるものなど）を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがＩＰＰ及びＤＭＡＰＰを相互変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＩＤＩポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。ＩＤＩ核酸の例としては、ＩＤＩポリペプチド活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又はポリペプチド融合物をコードしている核酸が挙げられる。ＩＤＩポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。
【０１２３】
特に、下流ＭＶＡ経路のポリペプチドとしては、下流ＭＶＡ経路のポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド及び融合ポリペプチドが挙げられる。下流ＭＶＡ経路の核酸の例としては、下流ＭＶＡ経路のポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードしている核酸が挙げられる。下流ＭＶＡ経路のポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載されるような任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸が挙げられる。更に、イソプレンの産生量を増加させるような、下流ＭＶＡ経路のポリペプチド変異体も、良好に使用することができる。
【０１２４】
一部の態様では、下流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、メタノコッカシド・バートニイ（Methanococcoides burtonii）、又はメタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）由来のポリペプチドである。一部の態様では、ＭＶＫポリペプチドは、ラクトバチルス（Lactobacillus）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母・メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス（Streptococcus）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Streptococcus pneumoniae）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトマイセス（Streptomyces）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトマイセス（Streptomyces）ＣＬ１９０・メバロン酸キナーゼポリペプチド及びメタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）メバロン酸キナーゼポリペプチド、からなる群から選択される。本開示のプロモーターのうちのいずれか（例えば、本開示に記載され、本開示の実施例において識別される、誘導型プロモーター及び常時発現型プロモーターなどのプロモーター）を使用して、本開示のいずれかのＭＶＡポリペプチドの発現を駆動させることができる。
【０１２５】
ＤＸＰ経路核酸及びポリペプチド
本発明の一部の態様では、本明細書に記載の任意の組成物又は方法に記載の組み換え細胞は、ＤＸＳポリペプチド又はＤＸＰ経路の他のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を更に含む。一部の態様では、細胞は更に、ＤＸＳポリペプチド又は他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードしている内在性の核酸の染色体コピーを含む。一部の態様では、大腸菌（E. coli）細胞は更に、ＩＤＩポリペプチド及びＤＸＳポリペプチド又は他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードしている核酸を１種以上含む。一部の態様では、１つの核酸は、イソプレン合成酵素、ＩＤＩポリペプチド及びＤＸＳポリペプチド又は他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードしている。一部の態様では、１つのプラスミドは、イソプレン合成酵素、ＩＤＩポリペプチド及びＤＸＳポリペプチド又は他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードしている。一部の態様では、複数のプラスミド（multiple plasmids）は、イソプレン合成酵素、ＩＤＩポリペプチド及びＤＸＳポリペプチド又は他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードしている。
【０１２６】
例示的なＤＸＳポリペプチドとしては、ＤＸＳポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドが挙げられる。標準法（本明細書に記載されるものなど）を用い、ポリペプチドが、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでピルビン酸及びＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸を１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸ヘと変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＤＸＳポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。ＤＸＳポリペプチド及び核酸の例並びにＤＸＳ活性の測定法は、国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際公開第２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際公開第２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号に、より詳細に記載される。
【０１２７】
ＤＸＰ経路に含まれるポリペプチドの例としては、限定するものではないが、次の任意のポリペプチド：ＤＸＳポリペプチド、ＤＸＲポリペプチド、ＭＣＴポリペプチド、ＣＭＫポリペプチド、ＭＣＳポリペプチド、ＨＤＳポリペプチド、ＨＤＲポリペプチド、及びＤＸＰ経路のポリペプチドの活性を１種、又は２種以上有するＤＸＰ経路ポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）、が挙げられる。特に、ＤＸＰ経路ポリペプチドとしては、ＤＸＰ経路のポリペプチドの活性を少なくとも１種有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド及び融合ポリペプチドが挙げられる。ＤＸＰ経路の核酸の例としては、ＤＸＰ経路のポリペプチドの活性を少なくとも１種有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードしている核酸が挙げられる。ＤＸＰ経路のポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。ＤＸＰ経路のポリペプチド及び核酸の例としては、並びにＤＸＰ経路のポリペプチド活性を測定する方法については、国際公開第２０１０／１４８１５０号に、より詳細に記載されている。
【０１２８】
例示的なＤＸＳポリペプチドとしては、ＤＸＳポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドが挙げられる。標準法（本明細書に記載されるものなど）を用い、ポリペプチドが、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでピルビン酸及びＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸を１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸ヘと変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＤＸＳポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。ＤＸＳポリペプチド及び核酸の例並びにＤＸＳ活性の測定法の例は、国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際公開第２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際公開第２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号に、より詳細に記載される。
【０１２９】
特に、ＤＸＳポリペプチドは、ピルビン酸及びＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸を１−デオキシ−ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）ヘと変換する。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがピルビン酸及びＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸を変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＤＸＳポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【０１３０】
ＤＸＲポリペプチドは、１−デオキシ−ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）を２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸（ＭＥＰ）ヘと変換する。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがＤＸＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＤＸＲポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【０１３１】
ＭＣＴポリペプチドは、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸（ＭＥＰ）を４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥ）ヘと変換する。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがＭＥＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＭＣＴポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【０１３２】
ＣＭＫポリペプチドは、４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥ）を２−ホスホ−４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥＰ）ヘと変換する。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがＣＤＰ−ＭＥを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＣＭＫポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【０１３３】
ＭＣＳポリペプチドは、２−ホスホ−４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥＰ）を２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロジホスフェート（ＭＥ−ＣＰＰ又はｃＭＥＰＰ）ヘと変換する。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがＣＤＰ−ＭＥＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＭＣＳポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【０１３４】
ＨＤＳポリペプチドは、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロジホスフェートを（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エン−１−イルジホスフェート（ＨＭＢＰＰ又はＨＤＭＡＰＰ）ヘと変換する。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがＭＥ−ＣＰＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＨＤＳポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【０１３５】
ＨＤＲポリペプチドは、（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エン−１−イルジホスフェートをイソペンテニルジホスフェート（ＩＰＰ）及びジメチルアリールジホスフェート（ＤＭＡＰＰ）ヘと変換する。一実施形態では、ＨＤＲポリペプチドのコードには、ｉｓｐＨ遺伝子を使用することができる。ＩｓｐＨは、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−ジホスフェートレダクターゼ、４Ｆｅ−４Ｓタンパク質、ＥＣＫ００３０、ＪＷ００２７、ｌｙｔＢ、ｙａａＥ、及びｂ００２９としても知られている。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがＨＭＢＰＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＨＤＲポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【０１３６】
ＭＶＡ経路、イソプレン合成酵素、ＩＤＩ及びＤＸＰ経路のポリペプチドに関する生物資源
イソプレン合成酵素、ＩＤＩ、ＤＸＰ経路及び／又は下流ＭＶＡ経路の核酸は、イソプレン合成酵素、ＩＤＩ、ＤＸＰ経路及び／又はＭＶＡ経路の核酸を天然に含有する任意の生物から得ることができる。イソプレンは、細菌、酵母、植物及び動物などの様々な生物により天然に生成される。一部の生物は、イソプレンの産生に関係するＭＶＡ経路を含有する。イソプレン合成酵素の核酸は、例えば、イソプレン合成酵素を含有する任意の生物から得ることができる。したがってＭＶＡ経路の核酸は、例えば、ＭＶＡ経路を含有する任意の生物から得ることができる。ＩＤＩ及びＤＸＰ経路の核酸は、例えば、ＩＤＩ及びＤＸＰ経路を含有する任意の生物から得ることができる。
【０１３７】
イソプレン合成酵素、ＤＸＰ経路、ＩＤＩ、及び／又はＭＶＡ経路の核酸の核酸配列は、細菌、真菌、植物、藻類、又はシアノ細菌から単離することができる。生物資源の例としては、例えば、酵母、例えばサッカロマイセス（Saccharomyces）（例えば、サッカロマイセス・セレヴィシエ（S.cerevisiae）、微生物、例えば、エシェリキア（Escherichia）（例えば、大腸菌（E. coli））、又はメタノサルシナ（Methanosarcina）（例えば、メタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei））又はメタノコッカシド（Methanococcoides）（例えば、メタノコッカシド・バートニイ（M. Burtonii））、植物、例えばクズ（kudzu）又はポプラ（poplar）（例えば、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）、又はウラジロハコヤナギ（Populus alba）ｘトレムラ（tremula）ＣＡＣ３５６９６））又はヤマナラシ（aspen）（例えば、アメリカヤマナラシ（Populus tremuloides））が挙げられる。使用することのできるイソプレン合成酵素、ＩＤＩ、及び／又はＭＶＡ経路ポリペプチドの資源例は、国際特許出願公開第２００９／０７６６７６号、同第２０１０／００３００７号、同第２００９／１３２２２０号、同第２０１０／０３１０６２号、同第２０１０／０３１０６８号、同第２０１０／０３１０７６号、同第２０１０／０１３０７７号、同第２０１０／０３１０７９号、同第２０１０／１４８１５０号、同第２０１０／０７８４５７号、及び同第２０１０／１４８２５６号にも記載される。
【０１３８】
一部の実施形態では、微生物源は、例えば、アスペルギルス・オリザエ（A. oryzae）及びアスペルギルス・ニガー（A. niger）などのアスペルギルス（aspergillus）種、サッカロマイセス・セレヴィシエ（S. cerevisiae）などのサッカロマイセス（Saccharomyces）種、シゾサッカロマイセス・ポンベ（S. pombe）などのシゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）種、及びトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）などのトリコデルマ（trichoderma）種の真菌である。一部の実施形態では、微生物源は糸状真菌細胞である。用語「糸状菌」は、真菌のうち糸状形態をとるものすべてを指す（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．Ｊ．（１９６２），Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい）。これらの真菌は、キチン、セルロース、及びその他の複合多糖からなる細胞壁を有する栄養菌糸を示すことを特徴とする。糸状菌は、酵母とは、形態学的に、生理学的に、及び遺伝学的に異なる。糸状菌の栄養生長は菌糸の伸展によるものであり、炭素の異化は絶対好気性である。糸状菌親細胞は、限定するものではないが、トリコデルマ（trichoderma）種（例えば、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、これまでＴ．ロンギブラキアタム（T. longibrachiatum）として分類されていたヒポクレア・ジェコリナ（Hypocrea jecorina）の無性形態、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）、トリコデルマ・コニンギ（Trichoderma koningii）、トリコデルマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum）（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４６〜５３；ＡＴＣＣ  Ｎｏ．５６７６５及びＡＴＣＣ  Ｎｏ．２６９２１）；ペニシリウム（Penicillium sp.）、ヒュミコラ（Humicola sp.）（例えば、ヒュミコラ・インソレンス（H. insolens）、ヒュミコラ・ラヌギノーサ（H. lanuginose）、又はヒュミコラ・グリセア（H. grisea））；クリソスポリウム（Chrysosporium sp.）（例えば、クリソスポリウム・ラックノウエンス（C. lucknowense）、グリオクラジウム（Gliocladium sp.）、アスペルギルス（Aspergillus sp.）（例えば、アスペルギルス・オリザエ（A. oryzae）、アスペルギルス・ニガー（A. niger）、ショウユコウジカビ（A sojae）、アスペルギルス・ジャポニクス（A. japonicus）、アスペルギルス・ニデュランス（A. nidulans）、又はアワモリコウジカビ（A. awamori））（Ｗａｒｄ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９：７３８〜７４３、及びＧｏｅｄｅｇｅｂｕｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｇｅｎｅｔ  ４１：８９〜９８）、フザリウム（Fusarium sp.）、（例えば、フザリウム・ロゼウム（F. roseum）、フザリウム・グラミナム（F. graminum）、フザリウム・セレアリス（F. cerealis）、フザリウム・オキシスポラム（F. oxysporuim）、又はフザリウム・ベネナタム（F. venenatum））、ニューロスポラ（Neurospora sp.）、（例えば、ニューロスポラ・クラッサ（N. crassa））、ヒポクレア（Hypocrea sp.）、ムコール（Mucor sp.）（例えば、ムコール・ミエヘイ（M. miehei））、リゾプス（Rhizopus sp.）及びエメリセラ（Emericella sp）（同様に、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉ．２２８：２１〜２６を参照されたい）の細胞であってよい。用語「トリコデルマ（Trichoderma）��又は「トリコデルマ（Trichoderma sp.）」又は「トリコデルマ（Trichoderma spp.）」は、従来又は現在リコデルマとして分類されている任意の真菌属を指す。
【０１３９】
一部の実施形態では、真菌は、アスペルギルス・ニデュランス（A. nidulans）、アワモリコウジカビ（A. awamori）、アスペルギルス・オリザエ（A. oryzae）、アスペルギルス・アクレタス（A. aculeatus）、アスペルギルス・ニガー（A. niger）、アスペルギルス・ジャポニクス（A. japonicus）、トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）、トリコデルマ・ビリデ（T. viride）、フザリウム・オキシスポラム（F. oxysporum）、又はフザリウム・ソラニ（F. solani）である。アスペルギルス（aspergillus）株は、Ｗａｒｄ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９：７３８〜７４３並びにＧｏｅｄｅｇｅｂｕｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  ４１：８９〜９８に開示されており、これらの非特許文献は、参照により、その全体が、特に真菌について本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、真菌は、トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）株などのトリコデルマ（trichoderma）株である。トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）株は既知であり、非限定的な例としては、受託番号１３６３１、受託番号２６９２１、受託番号５６７６４、受託番号５６７６５、受託番号５６７６７、及びＮＲＲＬ  １５７０９が挙げられる。これらの文献に記載される内容を、特にトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）株に関し、それぞれ参照により、本開示に明示的に援用する。一部の実施形態では、宿主株はＲＬ−Ｐ３７誘導体である。ＲＬ−Ｐ３７はＳｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：４６〜５３に報告されており、この非特許文献は、参照により、その全体が、特にトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）株について本明細書に組み込まれる。
【０１４０】
一部の態様では、生物資源は酵母であり、例えば、サッカロマイセス（Saccharomyces sp.）、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces sp.）、ピキア（Pichia sp.）又はカンジダ（Candida sp.）である。
【０１４１】
一部の態様では、宿主細胞は、バチルス・リケノフォルミス（B.lichenoformis）又はバチルス・スブチリス（B. subtilis）などのバチルス（Bacillus）株、パントエア・シトレア（P. citrea）などのパントエア（Pantoea）株、シュードモナス・アルカリゲネス（P. alcaligenes）などのシュードモナス（Pseudomonas）株、ストレプトマイセス・リビダンス（S. lividans）又はストレプトマイセス・ルビギノーサス（S. rubiginosus）などのストレプトマイセス（Streptomyces）株、大腸菌（E. coli）などのエシェリキア（Escherichia）株、エンテロバクター株（Enterobacter）、ストレプトコッカス（Streptococcus）株、又はメタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）などの古細菌株である。
【０１４２】
本明細書で使用するとき、「バチルス（Bacillus）」属としては、当業者に既知の「バチルス（Bacillus）属」のすべての種を包含し、限定するものではないが、例えば、バチルス・スブチリス（B. subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（B. licheniformis）、バチルス・レンタス（B. lentus）、バチルス・ブレビス（B. brevis）、バチルス・ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィルス（B. alkalophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、バチルス・クラウシイ（B. clausii）、バチルス・ハロデュランス（B. halodurans）、バチルス・メガテリウム（B. megaterium）、バチルス・コアギュランス（B. coagulans）、バチルス・サーキュランス（B. circulans）、バチルス・ロータス（B. lautus）、及びバチルス・チューリンゲンシス（B. thuringiensis）が挙げられる。バチルス属は分類上の再編成を受け続けるものと認識される。したがって、この属は、再分類された種を包含することを意図し、例えば、限定するものではないが、現在は「ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）」と命名されたバチルス・ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）のような生物を包含する。酸素存在下での耐性内生胞子の生成はバチルス属の決定的特徴と考えられるが、この特徴は最近命名されたアリシクロバチルス（Alicyclobacillus）、アンフィバチルス（Amphibacillus）、アネウリニバチルス（Aneurinibacillus）、アノキシバチルス（Anoxybacillus）、ブレビバチルス（Brevibacillus）、フィロバチルス（Filobacillus）、グラシリバチルス（Gracilibacillus）、ハロバチルス（Halobacillus）、パエニバチルス（Paenibacillus）、サリバチルス（Salibacillus）、サーモバチルス（Thermobacillus）、ウレイバチルス（Ureibacillus）、及びビルジバチルス（Virgibacillus）にも当てはまる。
【０１４３】
一部の態様では、生物資源はグラム陽性細菌である。非限定的な例としては、ストレプトマイセス（Streptomyces）株（例えば、ストレプトミセス・リビダンス（S. lividans）、ストレプトマイセス・セリカラー（S. coelicolor）、又はストレプトマイセス・グリセウス（S. griseus））及びバチルス株が挙げられる。一部の態様では、生物資源は、大腸菌（E. coli）又はシュードモナス属（Pseudomonas sp.）などのグラム陰性細菌である。一部の態様では、生物資源はラクトバチルス・アシドフィルス（L. acidophilus）である。
【０１４４】
一部の態様では、微生物源は植物であり、例えば、マメ科（Fabaceae）、例えばマメ亜科（Faboideae）などの植物である。一部の態様では、生物資源はクズ（kudzu）、ポプラ（poplar）（例えば、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）ｘトレムラ（tremula）ＣＡＣ３５６９６など）、アスペン（例えば、アメリカヤマナラシ（Populus tremuloides））、又はヨーロッパナラ（Quercus robur）である。
【０１４５】
一部の態様では、微生物源は、藻類、例えば緑藻、紅藻、灰色藻、クロララクニオン藻、ミドリムシ目、クロミスタ、又は渦鞭毛藻類である。
【０１４６】
一部の態様では、生物資源は、形態に基づき次の群：クロオコッカス（Chroococcales）、プレウロカプサ（Pleurocapsales）、ユレモ（Oscillatoriales）、ネンジュモ（Nostocales）、又はスティゴネマ（Stigonematales）のいずれかに分類される、ラン藻である。
【０１４７】
ホスホケトラーゼ核酸及びポリペプチド
本発明の一部の態様では、本開示の組成物又は方法のいずれかに記載の組み換え細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１種以上の核酸、又はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドを更に含む。一部の態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドは内在性ポリペプチドである。一部の態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように常時発現型プロモーターに連結される。一部の態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように誘導型プロモーターに連結される。一部の態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように高発現型プロモーターに連結される。一部の態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている内在性の核酸を１つ以上（例えば、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている内在性の核酸の２、３、又は４種以上のコピー）を使用する。特定の態様では、細胞は、野生型細胞と比べ、内在性のホスホケトラーゼポリペプチドが過剰発現するよう遺伝子操作される。一部の態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように低発現型プロモーターに連結される。
【０１４８】
ホスホケトラーゼ酵素は、キシルロース５−リン酸のグリセルアルデヒド３−リン酸及びアセチルリン酸への変換、並びに／又はフルクトース６−リン酸のエリトロース４−リン酸及びアセチルリン酸への変換を触媒する。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼ酵素は、キシルロース５−リン酸のグリセルアルデヒド３−リン酸及びアセチルリン酸への変換を触媒する。他の実施形態では、ホスホケトラーゼ酵素は、フルクトース６−リン酸のエリトロース４−リン酸及びアセチルリン酸への変換を触媒する。したがって、理論に束縛されるものではないが、本明細書で説明されるとおりホスホケトラーゼを発現させることにより、炭水化物資源から生成されるアセチルリン酸量を増加させることができる。このアセチルリン酸をアセチルＣｏＡへと変換させ、更にこれを利用して、ＭＶＡ経路に関係する酵素活性により、メバロン酸、イソプレノイド前駆体分子、イソプレン及び／又はイソプレノイドを生成させることができる。したがって、炭水化物基質より生成されるこれらの化合物量を増加させることができる。あるいは、細胞内濃度の上昇という形式で生成性の向上が反映されずとも、アセチル−Ｐ及びＡｃＣｏＡの生成量を増加させることができる。特定の実施形態では、細胞内アセチル−Ｐ又はアセチルＣｏＡ濃度は、ホスホケトラーゼによる反応が生じた場合でさえ変化せず一定であり、又は減少する場合すらある。
【０１４９】
ホスホケトラーゼの核酸の例としては、ホスホケトラーゼポリペプチドの活性を少なくとも１種有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又はポリペプチド融合物をコードしている核酸が挙げられる。ホスホケトラーゼのポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。
【０１５０】
標準法を使用し、ペプチドがＤ−フルクトース６−リン酸又はＤ−キシルロース５−リン酸をアセチル−Ｐへと変換する能力を測定することで、ポリペプチドがホスホケトラーゼペプチド活性を有するかを判断できる。次に、アセチル−Ｐはフェリルアセチルヒドロキサム酸（ferryl acetyl hydroxamate）に変換され得る。この変換は、分光測定により検出可能である（Ｍｅｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂａｃｔ．１８３：２９２９〜２９３６）。本発明での使用には、本明細書に記載されるとおりホスホケトラーゼペプチド活性を有するとして判定された任意のポリペプチドが好適である。
【０１５１】
他の態様では、ホスホケトラーゼの核酸の例としては、限定するものではないが、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、及び／又はノカルディオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）から単離したホスホケトラーゼが挙げられる。本明細書において使用することのできるホスホケトラーゼ酵素の更なる例は、米国特許第７，７８５，８５８号及び国際特許出願公開第２０１１／１５９８５３号に開示されており、これらの特許文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５２】
エントナー・ドゥドロフ経路に関与する経路
エントナー・ドゥドロフ（ＥＤ）経路は、エムデン・マイヤーホフ・パルナス（ＥＭＰ−解糖）経路とは異なる経路である。大腸菌（E. coli）などの一部の生物がＥＤ経路及びＥＭＰ経路の両方を内包するのに対し、その他の生物はいずれか１つの経路のみを有する。バチルス・スブチルス（Bacillus subtilis）はＥＭＰ経路のみを有するのに対し、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）はＥＤ経路のみを有する（Ｐｅｅｋｈａｕｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｗａｙ，１９９８，Ｊ．Ｂａｃｔ．１８０：３４９５〜３５０２；Ｓｔｕｌｋｅ  ａｎｄ  Ｈｉｌｌｅｎ，２０００，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：８４９〜８８０；Ｄａｗｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９６６．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．９８：７９５〜８０３）。
【０１５３】
ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（ｅｄｄ）は、６−ホスホ−Ｄ−グルコネートから一分子のＨ２Ｏを除去して２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコネート６−リン酸を生成するのに対し、２−ケト−３−デオキシグルコネート６−リン酸アルドラーゼ（ｅｄａ）はアルドールを開裂する（Ｅｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９２．Ｊ．Ｂａｃｔ．１７４：４６３８〜４６４６）。２つの遺伝子はオペロンの関係である。
【０１５４】
ホスホケトラーゼ経路に指向する代謝経路をＥＤ経路に迂回させることもできる。ＥＤ経路に取り込まれる代謝産物が損失することを回避するため、ホスホグルコン酸デヒドラターゼ遺伝子（例えば、内在性ホスホグルコン酸デヒドラターゼ遺伝子）及び／又は２−ケト−３−デオキシグルコナーゼ６−リン酸アルドラーゼ遺伝子（例えば、内在性２−ケト−３−デオキシグルコネート６−リン酸アルドラーゼ遺伝子）活性を減弱させる。１つの手法としては、ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（ｅｄｄ）及び／又は２−ケト−３−デオキシグルコネート６−リン酸アルドラーゼ（ｅｄａ）を欠失させることで減弱を行うことができる。この欠失は、クロラムフェニコール又はカナマイシンカセットにより片方又はいずれもの遺伝子を置き換え、その後カセットを除去することで導入される。これらの酵素活性を存在させずとも、ホスホケトラーゼ酵素によってより多くの炭素を取り込むことができ、ひいてはメバロン酸、イソプレン、又はイソプレノイドの収率を増加させることができる。
【０１５５】
ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（ｅｄｄ）及び／又は２−ケト−３−デオキシグルコネート６−リン酸アルドラーゼ（ｅｄａ）の活性は、酵素に関係する他の分子操作により減少させることもできる。酵素活性を低下させることで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して任意の量で低下させることができる。一部の例では、酵素活性を、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％低下させる。
【０１５６】
一部の場合では、内在性ホスホグルコン酸デヒドラターゼ遺伝子及び／又は内在性２−ケト−３−デオキシグルコネート６−リン酸アルドラーゼ遺伝子の活性を減弱させることにより、内在性ホスホグルコン酸デヒドラターゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ２−ケト−３−デオキシグルコネート６−リン酸アルドラーゼ遺伝子の発現を減弱させていない細胞と比較して、多量の炭素がメバロン酸依存性生合成経路に取り込まれることになる。
【０１５７】
ペントースリン酸経路の酸化経路に関与する経路
大腸菌（E. coli）は、ペントースリン酸経路を使用してヘキソース及びペントースを分解し、各種代謝経路に関係する中間体を細胞に提供する。この経路は、ＮＡＤＰＨの主要な生成経路でもある。ペントースリン酸経路は、酸化経路（グルコース６−リン酸１−デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ｐｇｌ）又は６−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼ（ｇｎｄ）などの酵素による）及び非酸化経路（トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡ）、トランスアルドラーゼ（ｔａｌＡ又はｔａｌＢ）、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼなどの酵素による）から構成される（Ｓｐｒｅｎｇｅｒ．１９９５．Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６４：３２４〜３３０）。
【０１５８】
ホスホケトラーゼ酵素に炭素を直接作用させる目的で、ペントースリン酸経路の非酸化的経路（トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ、及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼ）の発現を調節して（例えば、酵素活性を上昇させる）、より多くの炭素をフルクトース６−ホスフェート及びキシルロース５−ホスフェートとして取り込ませて、最終的なメバロン酸、イソプレン及びイソプレノイド類の産生を増加させることができる。トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼ活性を増加させることで、活性を操作しなかった場合と比較して比活性又は総活性を任意の量で増加させることができる。一部の例では、酵素活性は少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％上昇する。一部の態様では、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼの活性は、内在性トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼの活性を増強させることにより調節される。このような上昇は、内在性トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼ遺伝子のプロモーターを常時高発現型の合成プロモーターにより置き換えることで得られる。トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼをコードしている遺伝子を、プラスミド上の適切なプロモーターの後にクローン化させてもよい。トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼの活性を増加させることにより、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼの発現を増加させていない細胞と比較して多量の炭素をメバロン酸依存型の生合成経路に取り込ませることができる。
【０１５９】
ホスホフルクトキナーゼに関与する経路
ホスホフルクトキナーゼは、解糖系でフルクトース６−リン酸のリン酸化を触媒する重要な酵素である。大腸菌（E. coli）はｐｆｋＡ及びｐｆｋＢによりコードされる２種のイソ酵素を有する。細胞におけるホスホフルクトキナーゼ活性の大部分はｐｆｋＡによるものである（Ｋｏｔｌａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．１９７５，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，３８１：２５７〜２６８）。
【０１６０】
ホスホケトラーゼ酵素を炭素に直接作用させるために、ホスホフルクトキナーゼの発現を調節（例えば、酵素活性を低下させるなど）して、より多量の炭素をフルクトース６−リン酸及びキシルロース５−リン酸へと変換させ、以降に続くメバロン酸、イソプレン、及びイソプレノイドの産生量を増加させることもできる。ホスホフルクトキナーゼ活性を低下させることで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して任意の量で低下させることができる。場合によっては、酵素活性の低減は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％．又は１００％の低減である。一部の態様では、内在性ホスホフルクトキナーゼの活性を低下させることにより、ホスホフルクトキナーゼの活性を調節する。このような調節は、内在性ホスホフルクトキナーゼ遺伝子プロモーターを常時低発現型合成プロモーターと置き換えることにより行うことができる。ホスホフルクトキナーゼをコードしている遺伝子を欠失させてもよい。ホスホフルクトキナーゼの活性を低下させることで、メバロン酸依存性の生合成経路への炭素の取り込みを、ホスホフルクトキナーゼの発現を低下させていない細胞と比較して増加させることができる。
【０１６１】
その他の宿主細胞変異
本発明は、ＭＶＡ経路に取り込まれる炭素量を増大させる追加の宿主細胞変異も企図する。炭素取り込み量を増加させることにより、イソプレン産生量を増加させることができる。本明細書に記載の通りの異種発現した核酸（例えば、異種発現したアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素核酸）のいずれかを含む組換え細胞を、メバロン酸産生に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作することができ、（ａ）クエン酸合成酵素、（ｂ）ホスホトランスアセチラーゼ、（ｃ）酢酸キナーゼ、（ｄ）乳酸デヒドロゲナーゼ、（ｅ）ＮＡＤＰ依存型リンゴ酸酵素、並びに（ｆ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼからなる群の１種以上の酵素の活性が調節される。
【０１６２】
クエン酸合成酵素による経路
クエン酸合成酵素は、オキサロ酢酸とアセチルＣｏＡを縮合させることによるクエン酸（トリカルボン酸（ＴＣＡ）回路の代謝生成物）の生成を触媒する（Ｎｅｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．１９８３．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２，：５２４３〜５２４９；Ｂｈａｙａｎａ，Ｖ．ａｎｄ  Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ，Ｈ．１９８４．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３：２９００〜２９０５）（図５）。大腸菌（E. coli）では、ｇｌｔＡによりコードされたこの酵素は、二量体サブユニットからなる三量体様の挙動を示す。六量体の形成により、酵素はＮＡＤＨによりアロステリックに制御されるようになる。この酵素は、これまでに広く研究されている（Ｗｉｅｇａｎｄ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｓ．１９８６．Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１５：９７〜１１７；Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．１９８７．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｓｙｍｐ．５４：８３〜９２；Ｓｔｏｃｋｅｌｌ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３５４３５〜４３；Ｍａｕｒｕｓ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．４２：５５５５〜５５６５）。ＮＡＤＨによるアロステリック阻害を回避するにあたって、これまでに、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＮＡＤＨ感受性クエン酸合成酵素による置き換え、又はこの酵素の添加が検討されている（Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．２００２．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：１０７１〜１０８１；Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｍｅｔ．Ｅｎｇ．７：２２９〜２３９）。
【０１６３】
クエン酸合成酵素による触媒反応は、メバロン酸経路の第一工程を触媒し、同様にアセチルＣｏＡを基質として使用するチオラーゼと直接的に競合する（Ｈｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｊ．Ｂａｃｔ．１８４：２１１６〜２１２２）。したがって、当業者は、クエン酸合成酵素の発現を調節して（例えば、酵素活性を減少させて）、より多量の炭素がメバロン酸経路に取り込まれるようにすることで、メバロン酸及びイソプレンの最終的な産生量を増加させることができる。クエン酸合成酵素活性を低下させることで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して任意の量で低下させることができる。一部の例では、酵素活性を、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％低下させる。一部の態様では、クエン酸合成酵素に関係する内在性遺伝子の活性を減少させることにより、クエン酸合成酵素の活性を調節する。この調節は、ＮＡＤＨ非感受性クエン酸合成酵素をコードしている導入遺伝子により、あるいはバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）から誘導したＮＡＤＨ非感受性クエン酸合成酵素をコードしている導入遺伝子により、内在性クエン酸合成酵素遺伝子の染色体を置換することで実施できる。クエン酸合成酵素の活性は、内在性クエン酸合成酵素遺伝子のプロモーターを、常時低発現型の合成プロモーターと置き換えることによっても調節（例えば、低下させる）できる。クエン酸合成酵素の活性を低下させることで、メバロン酸依存性の生合成経路への炭素の取り込みを、クエン酸合成酵素の発現を低下させていない微生物と比較して増加させることができる。
【０１６４】
ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は酢酸キナーゼの関与する経路
ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）（Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．１９６９．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １９１：５５０〜５５８）は、アセチルＣｏＡとアセチルリン酸（アセチル−Ｐ）の可逆性の変換を触媒するのに対し、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）（Ｋａｋｕｄａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．１９９４．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１：９１６〜９２２）は、アセチル−Ｐを使用して酢酸を生成する。これらの遺伝子は、大腸菌においてオペロンとして転写され得る。これらの遺伝子は共に、ＡＴＰの放出により酢酸の異化を触媒する。したがって、当業者は、ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子（例えば、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子）及び／又は酢酸キナーゼ遺伝子（例えば、内在性酢酸キナーゼ遺伝子）の活性を減弱させて、利用可能なアセチルＣｏ−Ａを増加させることができる。減弱させる手法の一つとしては、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）及び／又は酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）の欠失が挙げられる。この欠失は、クロラムフェニコールカセットにより片方又はいずれもの遺伝子を置き換え、その後カセットを除去することで導入される。酢酸は多様な理由により大腸菌（E. coli）により生成される（Ｗｏｌｆｅ，Ａ．２００５．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６９：１２〜５０）。理論に束縛されるものではないが、ａｃｋＡ−ｐｔａはアセチル−ＣｏＡを使用することから、これらの遺伝子を欠失させることで、炭素は酢酸に転用されず、メバロン酸及び／又はイソプレンの収率が増加する。
【０１６５】
一部の態様では、組み換え微生物は、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子の発現を減弱させていない微生物と比較して、酢酸の生成量が減少している。酢酸生成量の減少は、当業者に既知の所定のアッセイ法により測定できる。酢酸の生成量は、分子的な操作を行なっていない場合と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％減少する。
【０１６６】
ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）及び／又は酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）の活性は、酵素に関係する他の分子的操作によっても低下させることができる。酵素活性を低下させることで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して任意の量で低下させることができる。一部の例では、酵素活性を、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％低下させる。
【０１６７】
一部の場合では、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子の活性を減弱させることで、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子発現を減弱させていない微生物と比較して、メバロン酸依存性生合成経路への炭素原子の取り込みが増加する。
【０１６８】
乳酸脱水素酵素の関与する経路
大腸菌（E. coli）では、Ｄ−乳酸は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ−図５）により、ピルビン酸から生成される（Ｂｕｎｃｈ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４３：１８７〜１９５）。乳酸の生成はＮＡＤＨの酸化によりなされるため、乳酸は、酸素制限下で、かつ還元当量のすべてを収容できない場合に生成されることになる。したがって、乳酸の生成は、炭素消費の原因となり得る。そのため、メバロン酸産生（及び必要に応じてイソプレン産生）に取り込まれる炭素量を増加させるにあたり、当業者は、酵素活性を低減することにより乳酸デヒドロゲナーゼの活性を調節することができる。
【０１６９】
したがって、一態様では、乳酸脱水素酵素の活性は、内在性乳酸脱水素酵素遺伝子の活性を減弱させることで調節できる。このような減弱は、内在性乳酸脱水素酵素遺伝子の欠失により実施できる。当業者に知られている、乳酸脱水素酵素遺伝子の活性を減弱させる他の手法も使用できる。乳酸脱水素酵素の関与する経路を操作することで、組み換え微生物の生成する乳酸量は、内在性乳酸脱水素酵素遺伝子の発現を減弱させていない微生物と比較して、減少することになる。乳酸の生成量の減少は、当業者に知られている所定のアッセイ法により測定できる。乳酸の生成量は、分子的な操作を行なっていない場合と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％減少する。
【０１７０】
乳酸脱水素酵素の活性は、酵素に関係するその他の分子操作により低下させることもできる。酵素活性を低下させることで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して任意の量で低下させることができる。一部の例では、酵素活性を、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％低下させる。
【０１７１】
したがって、一部の場合では、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を減弱させることで、内在性乳酸デヒドロゲナーゼの遺伝子発現を減弱させていない微生物と比較して、メバロン酸依存性の生合成経路への炭素の取り込みが増加する。
【０１７２】
リンゴ酸酵素の関与する経路
リンゴ酸酵素（大腸菌（E. coli）ではｓｆｃＡ及びｍａｅＢ）は、次式に従いリンゴ酸のピルビン酸への変換を触媒する（ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を用いる）アナプレロティックな酵素である：
【０１７３】
【数１】
2015510392.tif 000004
【０１７４】
したがって、この酵素の２種の基質は（Ｓ）−リンゴ酸及びＮＡＤ（Ｐ）＋であり、これらにより３種の生成物、すなわち、ピルビン酸、ＣＯ２、及びＮＡＤＰＨが生成される。
【０１７５】
ＮＡＤＰ依存型リンゴ酸酵素（ｍａｅＢ−図５）（Ｉｗｉｋｕｒａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．１９７９．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８５：１３５５〜１３６５）を発現させ、１）ＴＣＡサイクルの炭素を、それ自体がメバロン酸経路の直接的な前駆体であるアセチル−ＣｏＡの直接的な前駆体であるピルビン酸に戻し、２）ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼによる反応に使用され得る過剰なＮＡＤＰＨを産生することにより（Ｏｈ，ＭＫ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１３１７５〜１３１８３；Ｂｏｌｏｇｎａ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｂａｃｔ．１８９：５９３７〜５９４６）、メバロン酸及び／又はイソプレン収率の増加を助けることができる。
【０１７６】
そのため、リンゴ酸酵素の活性及び／又は発現を増加させるなどして調節することにより下流でのメバロン酸及び／又はイソプレン生産に関係する開始基質（ピルビン酸又はアセチル−ＣｏＡ）がより多く得られる。ＮＡＤＰ依存性のリンゴ酸酵素の遺伝子は、内在性遺伝子であってよい。非限定的な手法の１つとしては、ＮＡＤＰ依存性のリンゴ酸酵素の内在性遺伝子プロモーターを、常時発現型の合成発現プロモーターにより置き換えるというものが挙げられる。酵素活性を増加させる手法のその他の非限定例としては、ＮＡＤＰ依存性のリンゴ酸酵素ポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を用いるものが挙げられる。当業者は、容易に利用可能な分子生物学手技を用い発酵又は培養する際に、ｍａｅＢ  ＲＮＡの発現をモニターすることができる。
【０１７７】
したがって、一部の実施形態では、組み換え微生物は、ＮＡＤＰ依存性のリンゴ酸酵素遺伝子の発現を増加させていない微生物と比較して、ピルビン酸の産生量が増加する。一部の態様では、ＮＡＤＰ依存性のリンゴ酸酵素遺伝子の活性を増加させることで、ＮＡＤＰ依存性のリンゴ酸酵素遺伝子の発現を増加させていない微生物と比較して、メバロン酸依存性の生合成経路への炭素原子の取り込みが増加する。
【０１７８】
ピルビン酸生成量の増加は、当業者に既知の所定のアッセイ法により測定できる。ピルビン酸の生成量は、分子的な操作を行なっていない場合と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％増加する。
【０１７９】
リンゴ酸酵素の活性は、酵素に関係するその他の分子操作により増加させることもできる。酵素活性を増加させることで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して任意の量で増加させることができる。一部の例では、酵素活性を、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％増加させる。
【０１８０】
ピルビン酸脱水素酵素複合体の関与する経路
ピルビン酸のアセチル−ＣｏＡへの脱炭酸を触媒するピルビン酸脱水素酵素複合体は、遺伝子ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、及びｌｐｄＡによりコードされるタンパク質から構成される。これらの遺伝子の転写は、複数の制御因子により制御される。したがって、当業者は、ピルビン酸脱水素酵素複合体の活性を調節して、アセチル−ＣｏＡを増加することができる。調節により、ピルビン酸脱水素酵素複合体の活性及び／又は発現（例えば、常時発現）を増加させることができる。このような調節は、異なる手法により、例えば、ＰＬ．６（ａａｔｔｃａｔａｔａａａａａａｃａｔａｃａｇａｔａａｃｃａｔｃｔｇｃｇｇｔｇａｔａａａｔｔａｔｃｔｃｔｇｇｃｇｇｔｇｔｔｇａｃａｔａａａｔａｃｃａｃｔｇｇｃｇｇｔｇａｔａｃｔｇａｇｃａｃａｔｃａｇｃａｇｇａｃｇｃａｃｔｇａｃｃａｃｃａｔｇａａｇｇｔｇ−ラムダプロモーター、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＣ＿００１４１６（配列番号１５）などの強力な常時発現型プロモーターをオペロンの前に配置することにより、あるいは常時発現型合成プロモーターを１種以上用いることにより行うことができる。
【０１８１】
したがって、一態様では、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性は、（ａ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ１）、（ｂ）ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ、及び（ｃ）ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼから構成されるピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体に関係する、１種以上の遺伝子の活性を増加させることで調節される。これらの遺伝子のうちの任意の１つ、２つ、又は３つを操作して、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性を増加させることができることは理解される。他の態様では、以降に更に説明するように、ピルビン酸脱水素酵素複合体の活性は、内在性ピルビン酸脱水素酵素複合体のリプレッサー遺伝子の活性を減弱させることで調節できる。内在性ピルビン酸脱水素酵素複合体のリプレッサーの活性は、内在性ピルビン酸脱水素酵素複合体リプレッサー遺伝子を欠失させることにより減弱させることができる。
【０１８２】
一部の場合では、ピルビン酸脱水素酵素複合体に関係する遺伝子の１つ以上は内在性遺伝子である。ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性を増加させるその他の方法としては、微生物に、（ａ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ１）、（ｂ）ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ、及び（ｃ）ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼからなる群に由来するポリペプチを１つ以上コードしている異種核酸を１つ以上導入することによるものが挙げられる。
【０１８３】
これらの方法のうち任意のものを用いることで、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性の調節されていない微生物と比較して、組み換え微生物によるアセチルＣｏ−Ａの産生量を増加させることができる。ピルビン酸脱水素酵素の活性を調節することで、ピルビン酸脱水素酵素の発現を調節していない微生物と比較して、メバロン酸依存性の生合成経路への炭素原子の取り込みを増加させることができる。
【０１８４】
変異の組み合わせ
本開示の酵素及び／又は酵素経路の何れかに関し、本開示の酵素及び／又は酵素経路の任意の組み合わせ（これらのうち２、３、４、５、又は６の組み合わせ）を調節する分子的操作は、明確に企図されることは理解される。組み合わせの引用を容易にするために、クエン酸合成酵素（ｇｌｔＡ）はＡと記載し、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａＢ）はＢと記載し、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）はＣと記載し、乳酸脱水素酵素（ｌｄｈＡ）はＤと記載し、リンゴ酸酵素（ｓｆｃＡ又はｍａｅＢ）はＥと記載し、かつピルビン酸脱炭酸酵素（ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、及び／又はｌｐｄＡ）はＦと記載する。上記の通り、ピルビン酸脱炭酸酵素複合体のａｃｅＥ、ａｃｅＦ、及び／又はｌｐｄＡ酵素を単独で使用して、又は３つの酵素のうち２つを、又は３つ酵素のうち３つを使用して、ピルビン酸脱炭酸酵素の活性を増加させることができる。
【０１８５】
したがって、酵素Ａ〜Ｆのうちの任意の２つの組み合わせに関し、使用することのできる非限定的な組み合わせとしては：ＡＢ、ＡＣ、ＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＢＣ、ＢＤ、ＢＥ、ＢＦ、ＣＤ、ＣＥ、ＣＦ、ＤＥ、ＤＦ、及びＥＦが挙げられる。酵素Ａ〜Ｆのうちの任意の３つの組み合わせに関し、使用することのできる非限定的な組み合わせとしては：ＡＢＣ、ＡＢＤ、ＡＢＥ、ＡＢＦ、ＢＣＤ、ＢＣＥ、ＢＣＦ、ＣＤＥ、ＣＤＦ、ＤＥＦ、ＡＣＤ、ＡＣＥ、ＡＣＦ、ＡＤＥ、ＡＤＦ、ＡＥＦ、ＢＤＥ、ＢＤＦ、ＢＥＦ、及びＣＥＦが挙げられる。酵素Ａ〜Ｆのうちの任意の４つの組み合わせに関し、使用することのできる非限定的な組み合わせとしては：ＡＢＣＤ、ＡＢＣＥ、ＡＢＣＦ、ＡＢＤＥ、ＡＢＤＦ、ＡＢＥＦ、ＢＣＤＥ、ＢＣＤＦ、ＣＤＥＦ、ＡＣＤＥ、ＡＣＤＦ、ＡＣＥＦ、ＢＣＥＦ、ＢＤＥＦ、及びＡＤＥＦが挙げられる。酵素Ａ〜Ｆのうちの任意の５つの組み合わせに関し、使用することのできる非限定的な組み合わせとしては：ＡＢＣＤＥ、ＡＢＣＤＦ、ＡＢＤＥＦ、ＢＣＤＥＦ、ＡＣＤＥＦ、及びＡＢＣＥＦが挙げられる。他の態様では、６つの酵素の組み合わせ：ＡＢＣＤＥＦが使用される。
【０１８６】
したがって、本開示に記載する通りの組み換え微生物は、トリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルの活性条件下で増殖しない微生物と比較して、メバロン酸産生を増加させることができ、（ａ）クエン酸合成酵素、（ｂ）ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は酢酸キナーゼ、（ｃ）乳酸脱水素酵素、（ｄ）リンゴ酸酵素、並びに（ｅ）ピルビン酸脱炭酸酵素複合体からなる群の１つ以上の酵素の活性を調節することで、組み換え微生物における代謝性炭素の取り込みがメバロン酸の産生に指向する。
【０１８７】
イソプレン産生の増加に関係するその他の制御分子及び因子
他の分子的操作を使用して、イソプレン産生に指向する炭素取り込みを増加させることができる。このような方法のうちの１つは、メバロン酸経路に合流する経路に対する負の制御効果を減少させ、低下させるか、又は除去するものである。例えば、一部の場合では、遺伝子ａｃｅＥＦ−ｌｐｄＡはオペロンであり、ｐｄｈＲの上流に遺伝子を４つ有する。ｐｄｈＲは、このオペロンの転写に対する負の制御因子である。ｐｄｈＲは、ピルビン酸の非存在下で標的プロモーターに結合し、転写を抑制する。この制御因子は同様の手法でｎｄｈ及びｃｙｏＡＢＣＤも制御する（Ｏｇａｓａｗａｒａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．２００７．Ｊ．Ｂａｃｔ．１８９：５５３４〜５５４１）。一態様では、ｐｄｈＲ制御因子を欠失させることにより、ピルビン酸の供給及びそれに伴うメバロン酸及び／又はイソプレンの産生性を向上させることができる。
【０１８８】
他の態様では、メバロン酸及び／又はイソプレンの産生性を向上させるために、ＰＧＬを欠損している微生物（各種大腸菌（E. coli）株など）に６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）を導入し、使用することができる。ＰＧＬは、染色体への組み込み、又はプラスミドなどの染色体外のビヒクルを用い、導入することができる。他の態様では、内在性ＰＧＬを発現している微生物（各種大腸菌（E. coli）株など）のゲノムから、ＰＧＬを欠失させて、メバロン酸及び／又はイソプレンの生産を増大させることもできる。一部の態様では、ＰＧＬを欠失させることで、ＰＧＬを発現している微生物と比較して、包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）、イソプレンの収率が高くなる。他の態様では、ＰＧＬを欠失させることで、ＰＧＬを発現している微生物と比較して包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）、イソプレンの瞬間的な収率が高くなる。他の態様では、ＰＧＬを欠失させることで、ＰＧＬを発現している微生物と比較して、包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）、細胞産生性指数が高くなる。他の態様では、ＰＧＬを欠失させることで、ＰＧＬを発現している微生物と比較して、包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）、容積産生量が高くなる。他の態様では、ＰＧＬを欠失させることで、ＰＧＬを発現している微生物と比較して、包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）、最大比産生量が高くなる。一部の態様では、ＰＧＬを欠失させることで、ＰＧＬを発現している微生物と比較して、より長期間、最大比産生量が維持されることになる。
【０１８９】
例示的な宿主細胞
当業者であれば、具体的な宿主株における遺伝子発現を最適化する特定の配列を含有するよう、発現ベクターが設計されることを認識するであろう。このような最適化配列としては、限定するものではないが、複製起点、プロモーター、及びエンハンサーが挙げられる。本明細書で参照するベクター及び配列は例示目的で記載され、本発明の範囲を狭めることを意味するものではない。
【０１９０】
任意の微生物又はそれらの子孫微生物を使用して、本明細書に記載のいずれかの遺伝子（異種又は同種）を発現させすることができる。グラム陽性又はグラム陰性細菌などの細菌細胞を使用して、本開示に記載の遺伝子のうち任意のものを発現させることができる。具体的には、本明細書に記載の遺伝子は、大腸菌（E. coli）、パントエア・シトレア（P. citrea）、バチルス・スブチリス（B. subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（B. licheniformis）、バチルス・レンタス（B. lentus）、バチルス・ブレビス（B. brevis）、バチルス・ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィルス（B. alkalophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、バチルス・クラウシィ（B. clausii）、バチルス・ハロドュランス（B. halodurans）、バチルス・メガテリウム（B. megaterium）、バチルス・コアギュランス（B. coagulans）、バチルス・サーキュランス（B. circulans）、バチルス・ロータス（B. lautus）、バチルス・チューリンゲンシス（B. thuringiensis）、ストレプトマイセス・アルバス（S. albus）、ストレプトミセス・リビダンス（S. lividans）、ストレプトマイセス・セリカラー（S. coelicolor）、ストレプトマイセス・グリセウス（S. griseus）、シュードモナス属（Pseudomonas sp.）、シュードモナス・アルカリゲネス（P. alcaligenes）、及びラクトバチルス・アシドフィルス（L. acidophilus）細胞のうちのいずれかで発現させることができる。一部の態様では、本明細書に記載の本明細書に記載の任意の組成物又は方法に使用する細菌細胞はコリネバクテリウム（Corynebacterium spp.）由来のものである。一部の態様では、本明細書に記載の本明細書に記載の任意の組成物又は方法に使用する細菌細胞は、ラクトバチルス・ラクチス（Lactobacilus lactis）などのラクトバチルス（Lactobacilus spp.）由来のものである。
【０１９１】
本発明の組成物及び方法には、数多くの種類の嫌気生細胞を宿主細胞として使用することができる。本発明の一態様では、本明細書に記載の任意の組成物又は方法に関し記載される細胞は、絶対嫌気性細胞及びその子孫細胞である。絶対嫌気性菌は、典型的には、条件下に酸素が存在する場合には良好に増殖しない。絶対嫌気性菌が低濃度の酸素に対しある程度の耐性を示す場合には、少量の酸素が存在してもよいことは理解されるであろう。一態様では、イソプレンを産生するよう遺伝子操作した偏性嫌気性菌を、本明細書に記載のいずれかの方法及び／又は組成物のための宿主細胞として提供し、実質的に無酸素条件下で増殖させることができ、存在する酸素量は、嫌気性菌の増殖、維持、及び／又は発酵に有害な量ではない。
【０１９２】
本発明の他の態様では、本明細書に記載の組成物又は方法のいずれかにおいて記載され及び／又は使用される宿主細胞は、通性嫌気性細胞及びその子孫細胞である。酸素が存在する場合、通性嫌気性菌は、好気呼吸により（例えば、ＴＣＡサイクルを利用するなどして）細胞ＡＴＰを生成し得る。しかしながら、通性嫌気性菌も、酸素の非存在下で増殖させることができる。絶対嫌気性菌とは対照的に、通性嫌気性菌はより多量の酸素の存在下で死滅し、又は増殖性が乏しくなる。したがって、一態様では、通性嫌気性菌は、本明細書で提供される組成物及び／又は方法のいずれかにおいて、宿主細胞として使用でき、イソプレンを産生するよう遺伝子操作を行うことができる。通性嫌気性の宿主細胞は、実質的に無酸素（存在する酸素量が、増殖、嫌気性菌の維持、及び／又は発酵に有害なものではないことを意味する）条件下で増殖させることができ、あるいは酸素がより多量に存在している場合にも増殖することができる。
【０１９３】
宿主細胞は、糸状真菌細胞及びその子孫細胞であってもよい。（例えば、Ｂｅｒｋａ  ＆  Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｓ，（１９８９），７（２）：１２７〜１５４を参照されたい）。一部の態様では、糸状菌細胞はトリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・ビリデ（T. viride）、トリコデルマ・コニンギ（T. koningii）、トリコデルマ・ハルジアナム（T. harzianum）、ペニシリウム（Penicillium sp.）、ヒュミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、ヒュミコラ・ラヌギノス（H. lanuginose）、ヒュミコラ・グリセア（H. grisea）、クリソスポリウム（Chrysosporium sp.）、クリソスポリウム・ラックノウエンス（C. lucknowense）、グリオクラジウム（Gliocladium sp.）、アスペルギルス（Aspergillus sp.）、例えば、アスペルギルス・オリゼ（A. oryzae）、アスペルギルス・ニガー（A. niger）、ショウユコウジカビ（A sojae）、アスペルギルス・ジャポニクス（A. japonicus）、アスペルギルス・ニデュランス（A. nidulans）、又はアワモリコウジカビ（A. awamori）、フザリウム（Fusarium sp.）、例えばフザリウム・ロゼウム（F. roseum）、フザリウム・グラミニウム（F. graminum）、フザリウム・セレアリス（F. cerealis）、フザリウム・オキシスポラム（F. oxysporuim）、又はフザリウム・ベネナタム（F. venenatum）、ニューロスポラ（Neurospora sp.）、例えば、ニューロスポラ・クラッサ（N. crassa）、ヒポクレア（Hypocrea sp.）、ムコール（Mucor sp.）、例えば、ムコール・ミエヘイ（M. miehei）、リゾプス（Rhizopus sp.）又はエメリセラ（Emericella sp.）のいずれか由来のものであってよい。一部の態様では、真菌は、アスペルギルス・ニデュランス（A. nidulans）、アワモリコウジカビ（A. awamori）、アスペルギルス・オリゼ（A. oryzae）、アスペルギルス・アクレタス（A. aculeatus）、アスペルギルス・ニガー（A. niger）、アスペルギルス・ジャポニクス（A. japonicus）、トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）、トリコデルマ・ビリデ（T. viride）（T.viride）、フザリウム・オキシスポラム（F. oxysporum）又はフザリウム・ソラニ（F.solani）である。特定の実施形態では、本明細書で使用するためのプラスミド又はプラスミド配列には、米国特許出願公開第２０１１／００４５５６３号に記載のものが包含される。
【０１９４】
宿主細胞は、サッカロマイセス（Saccharomyces sp）、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces sp.）、ピキア（Pichia sp.）、又はカンジダ属（Candida sp.）などの酵母であってもよい。一部の態様では、サッカロマイセス（Saccharomyces sp.）は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｙｅａｓｔ，８（６）：４２３〜４８８を参照されたい）。特定の実施形態では、本明細書で使用するプラスミド又はプラスミド配列には、米国特許第７，６５９，０９７号、及び米国特許出願公開第２０１１／００４５５６３号に記載のものが包含される。
【０１９５】
宿主細胞は、緑藻類、紅藻類、灰色藻類、クロララクニオン藻類、ミドリムシ類、クロミスタ類、又は渦鞭毛藻類などの藻類であってもよい。（例えば、Ｓａｕｎｄｅｒｓ及びＷａｒｍｂｒｏｄｔ、「藻類及び酵母などの菌類における遺伝子発現（Gene Expression in Algae and Fungi, Including Yeast）」（１９９３年），Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ，Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＭＤを参照されたい）。特定の実施形態では、本明細書で使用するためのプラスミド又はプラスミド配列には、米国特許出願公開第２０１１／００４５５６３号に記載のものが包含される。一部の態様では、宿主細胞は、形態学に基づき次の群：クロオコッカス目（Chroococcales）、プレウロカプサ目（Pleurocapsales）、ユレモ目（Oscillatoriales）、ネンジュモ目（Nostocales）、又はスティゴネマ目（Stigonematales）（例えば、Ｌｉｎｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．１２（１）：７０〜７９を参照されたい）のいずれかに分類されるラン藻などのラン藻である。特定の実施形態では、本明細書で使用するプラスミド又はプラスミド配列には、米国特許出願公開第２０１０／０２９７７４９号、同第２００９／０２８２５４５号、及び国際公開第２０１１／０３４８６３号に記載のものが包含される。
【０１９６】
一部の態様では、大腸菌（E. coli）宿主細胞を使用して、本明細書に記載の組成物及び方法において、１種以上のＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、イソプレン合成酵素、ＭＶＡ経路（例えば、非チオラーゼＭＶＡ経路）、及び／又はＤＸＰ経路核酸を発現させることができる。一態様では、宿主細胞は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、イソプレン合成酵素、ＭＶＡ経路（例えば、非チオラーゼＭＶＡ経路など）、及び／又はＤＸＰ経路核酸をコードしている１種以上の核酸を発現し、メバロン酸又はイソプレンを産生することのできる大腸菌（E. coli）株又はこれらの前駆細胞の組み換え細胞である。大腸菌（E. coli）宿主細胞は、異種発現したＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコードしている核酸、イソプレン合成酵素をコードしている核酸、ＭＶＡ経路（例えば、チオラーゼ以外のＭＶＡ経路）の１つ以上をコードしている核酸、及び／又はＤＸＰ経路の１つ以上をコードしている核酸のうちの１種以上の異種発現を欠く同様の細胞よりも多量、高最大力価、及び高細胞生産性で、メバロン酸又はイソプレンを産生することができる。更に、大腸菌（E. coli）において異種発現させたＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコードしている核酸、イソプレン合成酵素をコードしている核酸、ＭＶＡ経路（例えば、チオラーゼ以外のＭＶＡ経路）の１つ以上をコードしている核酸、及び／又はＤＸＰ経路の１つ以上をコードしている核酸のうちの１種以上は染色体コピー（例えば、大腸菌（E. coli）染色体）であってよい。他の態様では、大腸菌（E. coli）細胞は培養物である。
【０１９７】
ベクター
本明細書に記載の任意の組成物及び方法には好適なベクターを使用することができる。例えば、適切なベクターを使用して、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、イソプレン合成酵素、及び／又はチオラーゼ以外の１つ以上のＭＶＡ経路ポリぺプチドをコードしている遺伝子の１つ以上のコピーの発現を最適化することができる。一部の態様では、ベクターには選択マーカーを含有させる。選択可能なマーカーの例としては、これらに限定されるものではないが、抗生物質耐性の核酸（例えば、カナマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、フレオマイシン、ブレオマイシン、ネオマイシン又はクロラムフェニコール）、及び／又は宿主細胞に栄養面での利点などの代謝上の利点を与える核酸が挙げられる。一部の態様では、選択マーカーは使用せずに、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、イソプレン合成酵素、及び／又はチオラーゼ以外のＭＶＡ経路ポリペプチドの核酸の１つ以上のコピーを宿主細胞のゲノムに組み込む。本開示の実施例において特徴づけられ又は使用される任意の１つのベクターを使用することができる。
【０１９８】
形質転換法
アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、マロニル−ＣｏＡ及びアセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素を生成する酵素、チオラーゼ以外のＭＶＡ経路のポリペプチド、完全なＭＶＡ経路のポリペプチド（アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ）、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ合成酵素（ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素）、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ）、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤＣ）及び／又はイソペンテニルリン酸キナーゼ（ＩＰＫ）など）、ＤＸＰ経路ポリペプチド、イソプレン合成酵素ポリペプチド、ＩＤＩ、並びにイソプレン産生に必要とされる任意の他の酵素をコードしている核酸を、当業者に知られる任意の手法により宿主細胞（例えば、植物細胞、真菌細胞、酵母細胞、又は細菌細胞）に導入することができる。
【０１９９】
宿主細胞へのＤＮＡコンストラクト又はベクターの導入に一般的な手法、例えば、形質転換、電気穿孔法、核酸のマイクロインジェクション、形質導入、形質移入（例えば、リポフェクションを利用した又はＤＥＡＥ−デキストリンを利用した遺伝子導入、あるいは組み換えファージウイルスを用いた遺伝子導入）、リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿法を用いるインキュベーション、ＤＮＡコートした微粒子銃による高速導入、及びプロトプラストの融合などの手法を使用することができる。一般的な形質転換法は、当該技術分野で既知である（例えば、分子生物学領域の現行のプロトコル（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｃｈａｐｔｅｒ  ９，１９８７；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，「分子クローニング：実験室マニュアル第３版（Molecular Cloning 3rd: A Laboratory Manual, ed）」，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，２００１；及びＣａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３〜５６を参照されたい）。導入された核酸は、染色体ＤＮＡに組み込むことができ、又は染色体外の複製配列として維持することができる。形質転換体は、当該技術分野において既知の任意の方法により選別することができる。形質転換体を選択するのに好適な手法としては、国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許公開第２００９／０２０３１０２号）、国際公開第２０１０／００３００７号、米国特許公開第２０１０／００４８９６４号、国際公開第２００９／１３２２２０号及び米国特許公開第２０１０／０００３７１６号が挙げられる。
【０２００】
一実施形態では、大腸菌（E. coli）などの細菌を宿主として使用する。この実施形態では、発現ベクターは、このような細菌において自己複製させることができるよう選択及び／又は遺伝子操作することができる。本開示に掲載する遺伝子に加え、プロモーター、リボソーム結合配列、転写終結配列も発現ベクターに含有させることができる。所望により、発現ベクターには、プロモーター活性を調節する遺伝子を含有させることもできる。
【０２０１】
大腸菌（E. coli）などの宿主で発現させることができるものであれば、任意のプロモーターを使用することができる。使用することのできるこのようなプロモーターの例としては、大腸菌（E. coli）由来のｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、及びＰＲプロモーター、並びにファージ由来のＴ７プロモーターなどが挙げられる。更に、ｔａｃプロモーターなどの人工的に設計又は改変したプロモーターを使用することもできる。
【０２０２】
その方法によりＤＮＡが細菌に導入されるのであれば、発現ベクターの導入方法は特に限定はされない。このような手法の例としては、カルシウムイオンを使用する方法（Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．，ｅｔ，ａｌ．，１９７２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９：２１１０〜２１１４）、及び電気穿孔法が挙げられる。
【０２０３】
酵母を宿主として使用する場合、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、又はピキア・パストリス（Pichia pastoris）を使用することができる。この場合、酵母で発現させることができるものであればプロモーターは特に限定はされない。このようなプロモーターの例としては、ｇａｌｌプロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、熱ショックタンパク質プロモーター、ＭＦ．ａｌｐｈａ．１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、及びＡＯＸ１プロモーターが挙げられる。
【０２０４】
その方法により酵母にＤＮＡが導入されるものであれば酵母への組み換えベクターの導入法は特に限定はされない。このような導入法の例としては、電気穿孔法（Ｂｅｃｋｅｒ，Ｄ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４：１８２〜１８７）、スフェロプラスト法（Ｈｉｎｎｅｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７５：１９２９〜１９３３）、及び酢酸リチウム法（Ｉｔｏｈ，Ｈ．：（１９７８）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３：１６３〜１６８）が挙げられる。
【０２０５】
例示的な細胞培養培地
本明細書で使用するとき、用語「最少培地（minimal medium又はminimal media））」は、概して細胞増殖に必要とされる最低限の栄養素を含有している増殖培地を指すが、常に１種以上のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０種以上のアミノ酸）が存在していないわけではない。最少培地は、典型的には：（１）細菌を増殖させるための炭素源；（２）細菌種及び増殖条件によって異なり得る様々な塩；並びに（３）水；を含有する。炭素源は、グルコースなどの単糖から、本明細書で以下により詳細に記載されるような、他のバイオマスのより複雑な加水分解物、例えば、酵母エキスなどといった多様なものであり得る。塩は、概してマグネシウム、窒素、リン及びイオウなどの必須元素を提供し、細胞がタンパク質及び核酸を合成できるようにする。また、最少培地には、特定のプラスミド及び同様物を維持すべく選別するために、抗菌剤などの選択剤を添加することもできる。例えば、微生物が、例えばアンピシリン又はテトラサイクリンなどの特定の抗菌剤に耐性である場合、耐性を欠く細胞の増殖を阻害する目的で培地に抗菌剤を添加することができる。培地には、所望される生理学的又は生化学的特性について選別するのに必要とされる、例えば特定のアミノ酸などといった他の化合物を添加することができる。
【０２０６】
宿主細胞を培養するにあたり、任意の最少培地処方を使用することができる。最少培地処方の例としては、例えば、Ｍ９最少培地及びＴＭ３最少培地が挙げられる。Ｍ９最少培地は、１Ｌにつき（１）２００ｍＬの滅菌Ｍ９塩類（１Ｌあたり６４ｇのＮａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ、１５ｇのＫＨ２ＰＯ４、２．５ｇのＮａＣｌ及び５．０ｇのＮＨ４Ｃｌ）；（２）２ｍＬの１ＭのＭｇＳＯ４（滅菌）；（３）２０ｍＬの２０％（重量／体積）グルコース（又は他の炭素源）；及び（４）１００μＬの１ＭのＣａＣｌ２（滅菌）を含有する。ＴＭ３最少培地は、１Ｌ中に（１）Ｋ２ＨＰＯ４（１３．６ｇ）；（２）ＫＨ２ＰＯ４（１３．６ｇ）；（３）ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２ｇ）；（４）クエン酸一水和物（２ｇ）；（５）クエン酸鉄アンモニウム（０．３ｇ）；（６）（ＮＨ４）２ＳＯ４（３．２ｇ）；（７）酵母エキス（０．２ｇ）；及び（８）１０００Ｘ微量元素溶液（１ｍＬ）を含有する。ｐＨは約６．８に調整し、溶液は濾過滅菌する。１０００Ｘ微量元素は、１Ｌ中に（１）クエン酸一水和物（４０ｇ）；（２）ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）；（３）ＮａＣｌ（１０ｇ）；（４）ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）；（４）ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）；（５）ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）；（６）ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）；（７）Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）；及び（８）ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）を含有する。ｐＨは約３．０に調節する。
【０２０７】
その他の最小培地の例は、（１）リン酸カリウムＫ２ＨＰＯ４、（２）硫酸マグネシウムＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、（３）クエン酸一水和物Ｃ６Ｈ８Ｏ７＊Ｈ２Ｏ、（４）クエン酸鉄アンモニウムＮＨ４ＦｅＣ６Ｈ５Ｏ７、（５）酵母エキス（ｂｉｏｓｐｒｉｎｇｅｒ）、（６）１０００Ｘ改変微量金属溶液、（７）硫酸５０％（重量／体積）、（８）ｆｏａｍｂｌａｓｔ  ８８２（Ｅｍｅｒａｌｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）及び（９）マクロ塩溶液３．３６ｍＬを含有する。成分のすべてを一緒に加え、脱イオン水に溶解させ、次に加熱滅菌する。続いて室温に冷却し、水酸化アンモニウム（２８％）によりｐＨを７．０に調節し、用量に調整する。滅菌後にビタミン溶液及びスペクチノマイシンを加え、ｐＨを調整する。
【０２０８】
宿主細胞を培養するにあたり任意の炭素源を使用することができる。用語「炭素源」は、宿主細胞又は微生物により代謝させることのできる、１つ以上の炭素を含有している化合物を指す。例えば、宿主細胞を培養するにあたり使用される細胞培地には、宿主細胞の生存能を維持させる又は宿主細胞を増殖させるのに好適な任意の炭素源を包含させることができる。一部の態様では、炭素源は炭水化物（例えば、単糖、二糖、オリゴ糖、又は多糖など）、又は転化糖（例えば、酵素により処理したスクロースシロップ）である。一態様では、最初に、発酵の対数増殖期中に、炭素源としてＤ−キシロースを含有させた培地（ＴＭ３培地など）で宿主細胞を培養する。他の態様では、宿主細胞が発酵のイソプレン産生期に達したら、炭素源は、Ｄ−キシロースからグルコースに変更される。
【０２０９】
一部の態様では、炭素源としては、酵母エキス又は酵母エキスの１つ以上の成分が挙げられる。一部の態様では、酵母エキスの濃度は、酵母エキスの０．１％（重量／体積）、０．０９％（重量／体積）、０．０８％（重量／体積）、０．０７％（重量／体積）、０．０６％（重量／体積）、０．０５％（重量／体積）、０．０４％（重量／体積）、０．０３％（重量／体積）、０．０２％（重量／体積）、又は０．０１％（重量／体積）である。一部の態様では、炭素源には、酵母エキス（又は酵母エキスの１つ以上の成分）及び他の炭素源、例えばグルコースの両方を含む。
【０２１０】
単糖の例としては、グルコース及びフルクトースが挙げられ、オリゴ糖の一例としては、ラクトース及びスクロースが挙げられ、並びに多糖の例としては、デンプン及びセルロースが挙げられる。炭水化物例としては、Ｃ６糖（例えば、フルクトース、マンノース、ガラクトース、又はグルコース）及びＣ５糖（例えば、キシロース又はアラビノース）が挙げられる。
【０２１１】
一部の態様では、本明細書に記載の細胞は、エネルギー及び／又は炭素源として合成ガスを使用することができる。一部の実施形態では、合成ガスは、少なくとも一酸化炭素及び水素を含有する。一部の実施形態では、合成ガスは、二酸化炭素、水、又は窒素のうちの１つ以上を更に含有する。一部の実施形態では、合成ガス中の一酸化炭素に対する水素のｍｏｌ比は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、３．０、４．０、５．０、又は１０．０である。一部の実施形態では、合成ガスは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０体積％の一酸化炭素を含む。一部の実施形態では、合成ガスは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０体積％の水素を含む。一部の実施形態では、合成ガスは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０体積％の二酸化炭素を含む。一部の実施形態では、合成ガスは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０体積％の水を含む。一部の実施形態では、合成ガスは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０体積％の窒素を含む。
【０２１２】
合成ガスは、天然又は合成資源に由来するものであり得る。合成ガスの由来する資源を「フィードストック」として参照する。一部の実施形態では、合成ガスは、バイオマス（例えば、木材、スイッチグラス、農業廃棄物、都市ごみ）又は炭水化物（例えば、糖類）に由来する。他の実施形態では、合成ガスは、石炭、石油、油母、タールサンド、オイルシェール、又は天然ガスに由来する。他の実施形態では、合成ガスは、ゴムタイヤなどのゴムに由来する。
【０２１３】
メタン改質、石炭液化、混焼、発酵反応、酵素反応、及びバイオマスのガス化などの多様な加工法により、フィードストックから合成ガスを得ることができる。バイオマスのガス化は、反応器中で、化学量論量未満の酸素の存在下、約７００℃を超える温度にて、バイオマスを部分的に酸価することにより実施される。空気、高純度酸素、又は蒸気の形態で酸素をバイオリアクタに導入する。ガス化は、主に、１）最初に加熱して、バイオマスに含有されている何らかの水分を乾燥させる工程、２）酸化剤の非存在下で、バイオマスを３００〜５００℃に加熱して、ガス、タール、油及び炭化固体残渣を生成する、熱分解工程、並びに３）炭化固体、タール、及びガスをガス化して、合成ガスの主成分を生成する工程、の３工程で生じ得る。混焼は、石炭／バイオマス混合物をガス化することにより実施される。合成ガス成分の同一性及びｍｏｌ比など、合成ガスの組成は、合成ガスの由来するフィードストック、並びにフィードストックを合成ガスに変換する方法に応じ変化し得る。
【０２１４】
合成ガスは不純物を含有してもよく、不純物の性質及び量は、産生に使用されたフィードストック及び加工法の両方によって異なる。発酵は、ある種の不純物に対し許容性を示し得るものの、発酵装置及び関連する設備を損傷させる恐れのあるタール及び微粒子などは、合成ガス材料から除去する必要がある。イソプレン産物に混入し得る、揮発性芳香族化合物、酸性気体、メタン、ベンゼン、トルエン、エチルベンゼン、キシレン、Ｈ２Ｓ、ＣＯＳ、ＣＳ２、ＨＣｌ、Ｏ３、有機硫黄化合物、アンモニア、酸化窒素、窒素含有有機化合物、及び重金属蒸気などの化合物を除去することも好ましい。合成ガスからの不純物の除去は、ガス洗浄、固相吸着剤による処置、及びガス透過性膜を用いる精製などの数種類の手法のいずれかにより実施することができる。
【０２１５】
細胞培養条件例
本発明の組み換え細胞を維持し及び増殖させるのに好適な材料及び方法は、以下、例えば、実施例の節に記載される。微生物培養物の維持及び増殖に好適な他の材料及び方法は当該技術分野において周知である。例示的な手法としては、国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（同第２００９／０２０３１０２号）、国際公開第２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際公開第２００９／１３２２２０号、米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号、Ｇｅｒｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，編の一般細菌学に関係する手法についてのマニュアル）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４）又はＢｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：テキスト「工業微生物学（Industrial Microbiology）」第２版（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ）が挙げられる。一部の態様では、細胞は、宿主細胞に挿入された核酸によりコードされるイソプレン合成酵素、ＤＸＰ経路の１つ以上のポリペプチド、ＭＶＡ経路の１つ以上ポリペプチド、ＩＤＩ、又はＰＧＬポリペプチドのうちの１つ以上を発現させる条件下で、培養培地で培養される。
【０２１６】
細胞を培養するにあたり、標準的な細胞培養条件を使用することができる（例えば、国際公開第２００４／０３３６４６号及び該当特許中に引用される参考文献を参照されたい）。一部の態様では、細胞は適切な温度、気体混合物、及びｐＨ（例えば、約２０℃〜約３７℃、約６％〜約８４％のＣＯ２、及び約５〜約９のｐＨ）で増殖し、維持される。一部の態様では、細胞は適切な細胞培地中で３５℃で増殖する。一部の態様では、発酵の際のｐＨ範囲は約ｐＨ  ５．０〜約ｐＨ  ９．０（例えば、約ｐＨ  ６．０〜約ｐＨ  ８．０、又は約６．５〜約７．０）である。細胞は、宿主細胞に必要とされる条件に基づき、好気性、無酸素性、又は嫌気性条件下で生育させることができる。加えて、細胞を培養するにあたり、より特異的な細胞培養条件を使用することができる。例えば一部の実施形態では、組換え型（例えば、細菌）細胞は、低〜中コピー数のプラスミドにおいて、高発現型プロモーターの調節下で、本明細書に記載のいずれかの核酸をコードしている１種以上の異種核酸（例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、イソプレン合成酵素、ＭＶＡ経路の酵素、及び／又はＤＸＰ経路の酵素）を発現し、３４℃にて培養される。
【０２１７】
使用することのできる標準的な培養条件、並びに回分式、流加式、又は連続式発酵などの発酵様式は、国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際公開第２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際公開第２００９／１３２２２０号、米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号に記載されている。回分式発酵及び流加式発酵は当該技術分野では一般的かつ周知のものであり、その例は、Ｂｒｏｃｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：テキスト「工業微生物学（Industrial Microbiology）」第２版（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．に見ることができる。
【０２１８】
一部の態様では、細胞はグルコース制限条件下で培養される。「グルコース制限条件」は、添加されるグルコースの量が、細胞により消費されるグルコース量の約１０５％以下（例えば、約１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、又は１０％）であることを意味する。特定の態様では、培養培地に添加されるグルコース量は、特定の期間中に細胞により消費されるグルコース量とほぼ同量である。一部の態様では、細胞の増殖速度は、細胞培地中のグルコースの量により維持することのできる速度で細胞が増殖するよう、添加するグルコース量を制限することで制御される。一部の態様では、グルコースは細胞培養時に蓄積しない。様々な態様で、細胞はグルコース制限条件下で、約１、２、３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、又は７０時間以上培養される。様々な態様で、細胞は、細胞を培養する合計時間の長さの約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５又は１００％以上の時間にわたって、グルコース制限条件下で培養される。任意の特定の理論に束縛されることを意図するものではないが、グルコース制限条件は、細胞をより都合よく制御し得るものであると考えられる。
【０２１９】
一部の態様では、組換え細胞（例えば、細菌細胞）は回分式培養で生育させる。組換え細胞は、流加式培養又は連続式培養により生育させることもできる。加えて、組換え細胞は、限定するものではないが、上記のいずれかの最少培地などの最少培地で培養することができる。最少培地には、更に１．０％（重量／体積）グルコース又は任意の他の６単糖以下の糖などを添加してもよい。具体的には、最少培地には１％（重量／体積）、０．９％（重量／体積）、０．８％（重量／体積）、０．７％（重量／体積）、０．６％（重量／体積）、０．５％（重量／体積）、０．４％（重量／体積）、０．３％（重量／体積）、０．２％（重量／体積）、又は０．１％（重量／体積）のグルコースが添加される。加えて、最少培地には０．１％（重量／体積）以下の酵母エキスを添加してもよい。具体的には、最少培地には０．１％（重量／体積）、０．０９％（重量／体積）、０．０８％（重量／体積）、０．０７％（重量／体積）、０．０６％（重量／体積）、０．０５％（重量／体積）、０．０４％（重量／体積）、０．０３％（重量／体積）、０．０２％（重量／体積）又は０．０１％（重量／体積）の酵母エキスを添加してもよい。あるいは、最少培地には１％（重量／体積）、０．９％（重量／体積）、０．８％（重量／体積）、０．７％（重量／体積）、０．６％（重量／体積）、０．５％（重量／体積）、０．４％（重量／体積）、０．３％（重量／体積）、０．２％（重量／体積）又は０．１％（重量／体積）のグルコース及び０．１％（重量／体積）、０．０９％（重量／体積）、０．０８％（重量／体積）、０．０７％（重量／体積）、０．０６％（重量／体積）、０．０５％（重量／体積）、０．０４％（重量／体積）、０．０３％（重量／体積）、０．０２％（重量／体積）又は０．０１％（重量／体積）の酵母エキスを添加してもよい。
【０２２０】
一部の態様では、組換え細胞は低酸素条件下で増殖させる。他の態様では、組換え（例えば、細菌）細胞は、約４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、又は１５％並びにこれらの値間の任意の割合を包含した程度酸素を含む大気条件下で増殖させる。他の態様では、組換え細胞は、約３〜８％、３．５〜８．５％、４〜９％、４．５〜９．５％、５〜１０％、５．５〜１０．５％、６〜１１％、又は６．５〜１１．５％の任意の濃度で酸素を含む大気条件下で増殖させる。
【０２２１】
組み換え細胞を使用してイソプレンを産生する方法
本明細書では、本明細書で開示される条件下で本明細書に記載のいずれかの組換え細胞を培養する工程によりイソプレンを産生する方法が提供される。一態様では、イソプレンは、低減された機能活性を有するｉｓｐＡ遺伝子と、（ａ）イソプレン合成酵素ポリペプチド（イソプレン合成酵素ポリペプチドは、異種核酸によりコードされる）及び（ｂ）メバロン酸（ＭＶＡ）経路の１種以上のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸とを含む組換え細胞を培養することにより産生され得る。一態様では、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、下流ＭＶＡ経路のポリペプチド、及びイソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を使用することができる。別の態様では、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ及びＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素、下流ＭＶＡ経路のポリペプチド、並びにイソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を含む組み換え細胞を培養することによりイソプレンを産生することができる。更に別の態様では、上流ＭＶＡ経路の１つ以上のポリペプチド、下流ＭＶＡ経路の１つ以上のポリペプチド、及び／又はＤＸＰ経路の１つ以上のポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を使用することができる。一部の態様では、本明細書に記載の組換え細胞は、低減された機能活性を有するｉｓｐＡを含まない細胞と比較して、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９５％、又は１００％並びにこれらの値間の任意の割合を包含した程度イソプレン産生の増加を示す。イソプレンは、本開示の任意の方法に従い、本明細書に記載の任意の細胞から産生することができる。六炭糖（グルコースなど）などの炭水化物からイソプレンを産生する目的に際し、任意の細胞を使用することができる。
【０２２２】
細胞は、上記の下流ＭＶＡ経路のポリペプチド（例えば、ＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤ及び／又はＩＤＩ）、上記の上流ＭＶＡ経路の任意のポリペプチド（例えば、チオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、及び／又はＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素）、及び／又は上記の任意のイソプレン合成酵素ポリペプチド（例えば、ウラジロハコヤナギ（P. alba）イソプレン合成酵素）をコードしている１種以上の核酸分子を更に含ませることができる。一部の態様では、組換え（例えば、細菌）細胞は、本明細書に記載の任意の細胞であってよい。本明細書に記載の任意のイソプレン合成酵素又はそれらの変異体、本明細書に記載の任意の細菌株、本明細書に記載の任意のプロモーター及び／又は本明細書に記載の任意のベクターも、本明細書に記載の任意のエネルギー源（例えば、グルコース又は任意のその他の六炭糖）を使用するイソプレンの産生に使用することができる。一部の態様では、イソプレンの産生方法は更に、イソプレンを回収する工程を含む。
【０２２３】
一部の態様では、産生されるイソプレン量は、各産生時点で測定されたものである。一部の態様では、細胞に関し産生量は、本開示の任意のおよそのイソプレン量を指していうものである。一部の態様では、産生されたイソプレンの総量は累積値として測定される。一部の態様では、細胞の累積産生量は、本明細書で開示される任意のおよそのイソプレン量を指していうものである。
【０２２４】
一部の態様では、本明細書に記載の、任意の細胞（例えば、培養物中の細胞）は、約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００又は５，０００以上のうちのいずれかのイソプレン（ｎｍｏｌ）／細胞湿潤重量（ｇ）／ｈｒ（ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈｒ）値でイソプレンを産生する。一部の態様では、イソプレンの量は約２〜約５，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈｒであり、例えば、約２〜約１００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約１００〜約５００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約１５０〜約５００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約５００〜約１，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約１，０００〜約２，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈｒ又は約２，０００〜約５，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈｒである。一部の態様では、イソプレンの量は約２０〜約５，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約１００〜約５，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約２００〜約２，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約２００〜約１，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約３００〜約１，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈｒ又は約４００〜約１，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈｒである。
【０２２５】
一部の態様では、細胞は、培養時に、約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００又は１００，０００以上のうちのいずれかのイソプレン（ｎｍｏｌ）／細胞湿潤重量（ｇ）／ｈｒ（ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈｒ）値でイソプレンを産生する。一部の態様では、イソプレンの量は、約２〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈｒであり、例えば、約２〜約１００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約１００〜約５００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約５００〜約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約１，０００〜約２，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈｒ又は約２，０００〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈｒである。一部の態様では、イソプレンの量は、約２０〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約１００〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約２００〜約２，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約２００〜約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約３００〜約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈｒ又は約４００〜約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈｒである。
【０２２６】
一部の態様では、細胞は、培養時に、約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００以上のうちのいずれかのイソプレン（ｍｇ）／ブロス（Ｌ）（ｍｇ／Ｌブロス、ブロス体積には、細胞及び細胞培地の体積を含む）値の累積力価（総量）でイソプレンを産生する。一部の態様では、イソプレンの量は、約２〜約５，０００ｍｇ／Ｌブロスであり、例えば、約２〜約１００ｍｇ／Ｌブロス、約１００〜約５００ｍｇ／Ｌブロス、約５００〜約１，０００ｍｇ／Ｌブロス、約１，０００〜約２，０００ｍｇ／Ｌブロス、又は約２，０００〜約５，０００ｍｇ／Ｌブロスなどである。一部の態様では、イソプレンの量は、約２０〜約５，０００ｍｇ／Ｌブロス、約１００〜約５，０００ｍｇ／Ｌブロス、約２００〜約２，０００ｍｇ／Ｌブロス、約２００〜約１，０００ｍｇ／Ｌブロス、約３００〜約１，０００ｍｇ／Ｌブロス、又は約４００〜約１，０００ｍｇ／Ｌブロスである。
【０２２７】
一部の態様では、培養において細胞により産生されるイソプレン（本明細書に記載のいずれかの組換え細胞など）は、少なくとも約１、２、５、１０、１５、２０、又は２５体積％の発酵時排出気体を含む。一部の態様では、イソプレンは、排出気体の体積の約１〜約２５％を構成し、例えば、約５〜約１５％、約１５〜約２５％、約１０〜約２０％又は約１〜約１０％を構成する。
【０２２８】
一部の態様では、培養における細胞（本明細書に記載のいずれかの組換え細胞など）は、低減したｉｓｐＡの機能活性を含まない細胞と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％並びにこれらの値間の任意の割合を包含した程度、グルコースに対する累積イソプレン収率が高い。他の態様では、培養における細胞（本明細書に記載のいずれかの組換え細胞など）は、低減したｉｓｐＡの機能活性を含まない細胞と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００並びにこれらの値間の任意の割合を包含した程度イソプレン産生性が増加している。他の態様では、培養における細胞（本明細書に記載のいずれかの組換え細胞など）は、低減したｉｓｐＡの機能活性を含まない細胞と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００並びにこれらの値間の任意の割合を包含した程度イソプレンの最大比産生性が増加している。一部の態様では、培養における細胞（本明細書に記載のいずれかの組換え細胞など）は、低減したｉｓｐＡの機能活性を含まない細胞と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００並びにこれらの値間の任意の割合を包含した程度、細胞イソプレン産生指数が増加している。
【０２２９】
精製方法例
一部の態様では、本開示の任意の方法は、本明細書で開示される任意の組換え細胞により産生されたイソプレンを回収する工程を更に含有する。一部の態様では、イソプレンは吸着脱離により回収される（例えば、米国特許出願公開第２０１１／０１７８２６１（Ａ１）号を参照されたい）。一部の態様では、本明細書に記載の任意の方法は更に異種ポリペプチドを回収する工程を包含する。
【０２３０】
好適な精製方法は、米国特許出願第２０１０／０１９６９７７（Ａ１）号においてより詳細に記載される。
【０２３１】
本明細書を通じ、各種特許、特許出願及び他の種類の刊行物（例えば、学術論文）を参照する。本明細書に引用する、本開示に関係する全ての特許、特許出願及び刊行物は、すべての目的に関し、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
【０２３２】
本発明は、実例として提供され、制限することを意味するものではない以降の実施例を参照することにより更に理解することができる。
【実施例】
【０２３３】
一般情報
【０２３４】
【表２−１】
2015510392.tif 000005
【０２３５】
【表２−２】
2015510392.tif 000006
【０２３６】
実施例１：イソプレノイド経路への炭素の取り込み増加は細胞生存能に効果を示す
大腸菌（E. coli）においてイソプレノイド経路に取り込まれる炭素量を増加させることによる効果を調査する目的で、染色体に下流ＭＶＡ経路を組み込まれ保有している２種の株、すなわち、ＣＭＰ８８２（ＨＭＢ  ｇｉ１．２  ｇｌｔＡ＋ｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ＋ｐＣＬ１９２０）並びにＣＭＰ８８４（ＨＭＢ  ＧＩ１．２  ｇｌｔＡ  ｅｖｏｌｖｅｄ，ｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ，ｐＣＬ１９２０（ｉｎａｃｔｉｖｅ  ＭＶＫ））を流加培養条件下で増殖させた。ＣＭＰ８８４株はメバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）遺伝子中に、酵素を不活性化させて下流ＭＶＡ経路への炭素の取り込みを妨げる点変異を含有している。メバロン酸を発酵槽に供給し、培地中のメバロン酸の濃度を測定した。
【０２３７】
方法
培地組成（発酵培地１Ｌ当たり）：Ｋ２ＨＰＯ４（７．５ｇ）、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２ｇ）、クエン酸一水和物（２ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（０．３ｇ）、酵母エキス（０．５ｇ）、５０％硫酸（１．６ｍＬ）、１０００Ｘ改変微量金属溶液（１ｍＬ）。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させた。この溶液を加熱滅菌した（１２３℃で２０分）。水酸化アンモニウム（２８％）によりｐＨを７．０に調整し、容量に合わせた。滅菌及びｐＨ調製後にグルコース１０ｇ、ビタミン溶液８ｍＬ、及び抗生物質を加えた。
【０２３８】
１０００Ｘ改変微量金属溶液（１Ｌ当たり）：クエン酸＊Ｈ２Ｏ（４０ｇ）、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）、ＮａＣｌ（１０ｇ）、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）、Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、０．２２μｍのフィルタを用いろ過滅菌した。
【０２３９】
ビタミン溶液（１Ｌ当たり）：塩酸チアミン（１．０ｇ）、Ｄ−（＋）−ビオチン（１．０ｇ）、ニコチン酸（１．０ｇ）、塩酸ピリドキシン（４．０ｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、孔径０．２２μｍのフィルタを用いろ過滅菌した。
【０２４０】
マクロ塩溶液（１Ｌ当たり）：ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２９６ｇ）、クエン酸一水和物（２９６ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（４９．６ｇ）。すべての成分を水に溶解させ、用量に調整し、０．２２μｍのフィルタを用い、ろ過滅菌した。
【０２４１】
供給溶液（１ｋｇ当たり）：グルコース（０．５９０ｋｇ）、脱イオン水（０．３９３ｋｇ）、Ｋ２ＨＰＯ４（７．４ｇ）、及び１００％  Ｆｏａｍｂｌａｓｔ８８２（８．９ｇ）。すべての成分を合わせて混合し、オートクレーブ処理した。供給溶液をオートクレーブ処理した後、滅菌フード内で、供給ボトルに栄養塩類を添加する。滅菌後に供給溶液に添加するものは（供給溶液１ｋｇ当たり）マクロ塩溶液５．５４ｍＬ、ビタミン溶液６．５５ｍＬ、１０００Ｘ改変微量金属溶液０．８２ｍＬである。
【０２４２】
メバロン酸フィード：精製及び濃縮したメバロン酸資源を脱イオン水で希釈して、最終濃度約６０ｇ／Ｌを得る。この溶液を口径０．２２μｍのフィルタによりろ過滅菌し、供給ボトルに注ぎ入れる。
【０２４３】
本実験は、所望の発酵ｐＨ（７．０）及び温度（３４℃）でのグルコースからのイソプレン発酵をモニターするために実施した。大腸菌（E. coli）株を凍結したバイアルを解凍し、トリプトン酵母エキス培地及び適切な抗生物質を入れたフラスコに接種した。５５０ｎｍ（ＯＤ５５０）での吸光度が１．０になるまで接種材料を生育させた後、培養物のうち５００ｍＬを１５Ｌのバイオリアクタに接種し、初期槽容量を５Ｌに調整した。
【０２４４】
各バッチの培地には、グルコースを９．７ｇ／Ｌ含有させた。誘導は、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し実施した。細胞のＯＤ５５０が６になったなら、２００μＭの濃度になるようＩＰＴＧを反応槽に添加した。メバロン酸供給液を、ＴＣＥＲ（総二酸化炭素発生速度，ｍｍｏｌ  ＣＯ２／ｈ）を３０００（供給液（ｇ）／分の最終単位）により除したものに相当する速度で、連続的に発酵槽に供給した。追加のグルコース溶液を供給する際には、ｐＨの上昇をグルコースの枯渇の目安とし、代謝に必要とされる１０ｇ／分以下の速度を満たすようにした。
【０２４５】
ｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ（インビトロジェン，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）及びｐＣＬ１９２０（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号を参照されたい）を電気穿孔法により同時にＣＭＰ４５１に導入し、ＣＭＰ８８２を構築した。ＬＢ＋カルベニシリン５０ｍｇ／Ｌ及びスペクチノマイシン５０ｍｇ／Ｌで生育したコロニーを選択し、ＣＭＰ８８２と名づけた。ＣＭＰ８７６は、染色体のメバロン酸キナーゼ座中の１箇所に酵素を不活性にする変異が存在することを除き、ＣＭＰ４５１と相同である。プラスミドｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ及びｐＣＬ１９２０を電気穿孔法により同時にＣＭＰ８７６に導入した。ＬＢ＋カルベニシリン５０ｍｇ／Ｌ及びスペクチノマイシン５０ｍｇ／Ｌで生育したコロニーを選択し、ＣＭＰ８８４と名づけた。
【０２４６】
膜電位解析を用い、発酵中の細菌の生存能を評価した。発酵槽からブロスを回収し、ＰＢＳ緩衝液を用い直ちに１５０倍希釈した。次に、１μＭビス−（１，３−ジブチルバルビツル酸）トリメチンオキソノール（ＤｉＢＡＣ４（３）、（インビトロジェン、カタログ番号Ｂ−４３８）を含有させたＰＢＳ緩衝液を用い細胞を更に１５０倍希釈した。試料を１０分間染色し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により単個細胞の緑色蛍光を定量した。４８８ｎｍの励起波長と、５３０ｎｍの発光波長を用いた。まず、対数増殖期の大腸菌（E. coli）ＢＬ２１の培養液及び加熱殺菌した大腸菌（E. coli）ＢＬ２１の培養液をＤｉＢＡＣ４（３）で染色し、生菌及び死菌の緑色蛍光強度をそれぞれ測定した。この情報を利用して、フローサイトメトリーデータを解析する際のゲーティングを行い、正常な膜電位をもつ細胞画分及び膜電位をもたない細胞画分を判別した。無傷な細菌のみを識別するために、適切な細胞の大きさ（４８８ｎｍにて前方散乱対側方散乱を測定）についてもゲーティングを行った。次に、これらの基準のもと、通過する細胞が発する緑色蛍光強度を利用し、発酵試料中に含まれる正常な膜電位をもつ細胞画分と、膜電位をもたない細胞画分とを判別した。正常な膜電位をもつ細胞は生細胞であり、かつ代謝活性をもつものであると仮定し、それに対し、膜電位をもたない細胞は死細胞であり、代謝活性をもたないものであると仮定する。
【０２４７】
結果
この実験の結果を図１〜図４に掲載する。メバロン酸を供給された細胞において、不活性型のＭＶＫ酵素が存在することで、生物の生存能に著しく影響が出ることが示された。図１ｂに見られる通り、メバロン酸は、活性型ＭＶＫを含有している細胞により首尾よく取り込まれたのに対し、ＭＶＫ不活性型の細胞株ＣＭＰ８８４では培地中へのメバロン酸の蓄積が生じた。この取り込みにより、結果として、図２に見られるファルネシルピロリン酸濃度の増加として示されるとおり、ＩｓｐＡからイソプレノイド経路への炭素の取り込みが増加する。不活性型メバロン酸キナーゼ酵素を備える株ではファルネシルピロリン酸は蓄積されなかった。膜電位解析により、ＭＶＫ不活性型細胞株はメバロン酸の供給中に高い割合で細胞生存率を維持したのに対し、ＭＶＫ活性型細胞では細胞生存率の低下が見られた（図３）。図４に見られる通り、２種類の細胞株の炭素放出速度（ＣＥＲ）にも変化が生じていた。発酵が定常相に達したとき、活性型ＭＶＫを有する株の呼吸速度（すなわち、ＣＯ２排出）は急速に低下した。対照的に、不活性型ＭＶＡ経路を有する株の呼吸速度は、大幅に緩徐に低下した。これらの結果から、イソプレノイドの取り込み増加は大腸菌（E. coli）に有害であることが示され、ｉｓｐＡの活性低下はＤＭＡＰＰ及びＩＰＰへの取り込みが増大している大腸菌（E. coli）株の生存能に有益であることが示唆される。
【０２４８】
実施例２：ｉｓｐＡタンパク質の活性を調節するためのタンパク質分解性タグの利用
イソプレン産生株におけるＦＰＰ及びＤＭＡＰＰの細胞内濃度を最適化するため、ＦＰＰ合成酵素（ＩｓｐＡ）及びタンパク質分解性タグを翻訳により融合させた。タンパク質分解性のｔｍＲＮＡタグ（Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６４（６），２２４０〜２２４６）は、宿主細胞におけるＩｓｐＡの分解を対象とする。
【０２４９】
方法
製造元（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ）の推奨するプロトコルに従って、Ｒｅｄ／ＥＴ組み換え系を使用し、アミノ酸１１個のｔｍＲＮＡタンパク質分解性タグをＩｓｐＡのＣ末端に融合させた。簡潔に述べると、プライマー「ＧＢＩｓｐＡＣｔｍＲＮＡ−ＡＳＶ−Ｆｏｒ」及び「ＧＢｉｓｐ２」を使用し、クロラムフェニコール耐性をコードしているＧｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅ挿入カセットをＰＣＲにより増幅させた（表２を参照されたい）。次にカセットを、製造元の推奨するプロトコルに従って大腸菌（E. coli）ＢＬ２１  ＤＥ３（インビトロジェン，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に導入し、検証のためクロラムフェニコールに耐性のコロニーを選別した。プライマー「ｉｓｐＴｅｓｔ１」及び「ＧＢｐｒｉｍｅｒ２」を使用し、挿入カセットが正しく組み込まれていることをＰＣＲにより確認した（表２を参照されたい）。更なる解析のため、適切な大きさのＰＣＲ産物を示した検証株ＭＤ０８−９７を選別した。
【０２５０】
標準的な分子生物学的実施を使用し、ベクターｐＴｒｃＫａｎＫＫＤＩｙ（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号を参照されたい）において下流メバロン酸経路によりＢＬ２１  ＤＥ３（対照）及びＭＤ０８−９７の両方を形質転換し、それぞれ株ＤＷ１４１及びＤＷ１４２を生成した。初期対数増殖相に向け、株をＴＭ３培地において適切な抗生物質下で増殖させ、次に５００μＭ  ＩＰＴＧで発現誘導を行い、５ｍＭメバロン酸で約２〜３時間処理した。培養物は、代謝解析前に当量の冷メタノールに回収した。以下に記載のものと類似する手法を用い代謝解析を実施した。表４に示す代謝値をＯＤ６００について補正する。２つの独立した同一の実験（実験１及び２、表４を参照されたい）を実施し、タンパク質分解性タグを付したＩｓｐＡ酵素が代謝分配に対し効果を示すことを確認した。
【０２５１】
結果
いずれの実験においても、タンパク質分解性タグを付したＩｓｐＡ酵素を含有しているＤＷ１４２株は、対照株ＤＷ１４１と比較して著しく高濃度のＤＭＡＰＰ、ＩＰＰ、及びＧＰＰを示した。また、ＤＷ１４２は、対照と比較してＦＰＰの細胞濃度の著しい低下を示した。これらの結果から、ｔｍＲＮＡタグは細胞内のＩｓｐＡの分解又は代謝回転を増加させ、これにより、これらの株内のＩｓｐＡの活性が低下することが示される。理論に束縛されるものではないが、ＦＰＰ合成酵素活性の低下により、イソプレン合成酵素がより多くの基質を利用でき、高分子量イソプレノイド類として失われる炭素がより少なくなる、イソプレン産生に良好に適した細胞内環境が生成され得るものと考えられる。
【０２５２】
【表３】
2015510392.tif 000007
【０２５３】
【表４】
2015510392.tif 000008
【０２５４】
【表５】
2015510392.tif 000009
【０２５５】
実施例３：ＩｓｐＡ発現を調節するための自己制御系
ＭＶＡ経路の酵素を過剰発現している株では発酵時にのみ一時的に抑制されるが、対照株、すなわちＤＸＰ経路の酵素を過剰発現している株又は野生株では抑制されないプロモーターを、遺伝子発現データを元に特定した。理論に束縛されるものではないが、このようなプロモーターは、イソプレノイド化合物の蓄積量の増加により抑制されているものと予想される。このようなプロモーターを導入してｉｓｐＡの発現を調節する場合、イソプレノイド経路への取り込みに対応する期間にｉｓｐＡを抑制することができる。しかしながら、取り込みが少ない期間ではプロモーターが誘導されたままになり、ｉｓｐＡが発現される。この特徴的な活性プロファイルが、自己調節型ｉｓｐＡ発現調節系を構成する。
【０２５６】
ＲＮＡ精製及び転写解析法：
このゲノム・ワイドな翻訳試験には、株ＣＭＰ４５７及びＭＣＭ１０２０を使用した。電気穿孔法によりプラスミドｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ（インビトロジェン，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）及びｐＣＬ１９２０（米国特許出願公開番号第２００９／０２０３１０２号を参照されたい。この出願の内容は参照により本明細書に組み込まれる。）を株ＣＭＰ２５８（国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０５８１８８号を参照されたい。この出願の内容は参照により本明細書に組み込まれる。）に導入し、ＬＢ＋５０ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシン＋５０ｍｇ／Ｌのカルベニシリンでコロニーを選択して、株ＭＣＭ１０２０を構築した。
【０２５７】
発酵試料をＲＮＡＬａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により手早く１：５希釈し、−２０℃で凍結させた。細胞を回収し、Ｔｒｉｚｏｌ（インビトロジェン）に溶解し、室温で５分インキュベートした。２０％氷冷クロロホルムを添加して抽出を行い、核酸を単離した。溶液を混合し、室温で５分インキュベートした後、４℃にて１３，０００ｒｐｍで１５分遠心分離した。頂部の水相を単離し、当量の氷冷エタノールを加えた。ＲＮＥａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、ＲＮＡを単離した。製造元の指示に従って、ＤＮａｓｅ溶液（１０μＬのＤＮａｓｅ  Ｉストック／７０μＬのＲＤＤ緩衝液）（Ｑｉａｇｅｎ）を添加し、室温で３０分インキュベートする手順を行い、ＤＮＡを分解した。ヌクレアーゼフリーの水により、ＲＮｅａｓｙカラムからＲＮＡを溶出した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ装置を使用し測定を行い、各試料から最低で２０μｇのＲＮＡを回収した。３Ｍの酢酸ナトリウムの場合には１／１０容量を添加して沈殿させ、ＲＮＡを更に精製した。最終濃度１ｕｇ／μＬとなるようグリコーゲン（発酵物由来のＲＮＡ等級）を添加した後、２．５倍量の氷冷エタノールを添加した。溶液を−８０℃で６０分インキュベートし、次に１０，０００ｒｐｍで１５分遠心分離した。上清を廃棄し、ＲＮＡペレットを氷冷７０％エタノールにより簡単に洗浄した。ＲＮＡペレットを２０分風乾させ、濃度１μｇ／μＬでヌクレアーゼフリー水に溶解した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ装置及びゲル電気泳動を使用し、品質及び濃度を測定した。大腸菌（E. coli）ＢＬ２１専用に設計した３８５Ｋ  ４−ｐｌｅｘマイクロアレイを使用して、Ｒｏｃｈｅ  ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ（Ｉｃｅｌａｎｄ）によるｃＤＮＡの合成、標識及び転写解析を実施した。得られたデータを、ＧｅｎｅｐｒｉｎｇＧＸ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １１（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して解析した。完全なＭＶＡ経路をもつ株ＣＭＰ４５７の発酵後期から解明された特定のプロモーター及びそれらの任意の発現レベルを表５に掲載する。
【０２５８】
【表６】
2015510392.tif 000010
【０２５９】
ｉｓｐＡ発現の調節に有用なプロモーターの一例は、ｙｄｄＶの発現を調節するものである。このプロモーターは、ＭＶＡ経路株の発酵後期に特に抑制される。対照的に、このプロモーターは、図５に示すとおり野生型の大腸菌（E. coli）株では抑制されない。ＹｄｄＶタンパク質は、イソプレノイドが多量に取り込まれる条件下で恐らく濃度変化する化合物のヘムに結合する。解析した発酵物の呼吸速度を図６に掲載する。
【０２６０】
実施例４：ｙｈｆＳ座へのＩｓｐＡの挿入
次の方法に従ってコロニーポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施した。１つの細菌コロニーを３０μＬのＨ２Ｏ中で攪拌し、５分間９５℃に加熱した。得られた溶液をスピン・ダウンし、テンプレートとして２μＬの上清を次のＰＣＲ反応液に使用した。ＰＣＲ反応液：２μＬコロニー水溶液、１０μＬ  Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ（登録商標）緩衝液、１μＬ  １００ｍＭ  ｄＮＴＰ、１．２５μＬ  １０μＭ順方向プライマー、１．２５μＬ  １０μＭ逆方向プライマー、１μＬ  Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ（登録商標）増強ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、並びに３３．５μＬ脱イオン水。９５℃／２分間；９５℃／３０秒間、ｘ℃／３０秒間、７２℃／６０秒間を３０サイクル；及び７２℃／（生成物１ｋｂにつき４０秒間）の通りにＰＣＲ反応をＰＣＲ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｈｙｂａｉｄ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭＡ）で実施した。次にこの反応物を４℃に冷却した。ｘ℃のアニーリング温度は、プライマー対の最低融解温度よりも３℃低くなるよう選択した。得られたＰＣＲフラグメントのサイズは、プレキャストした０．８％  Ｅ−ゲル（登録商標）（インビトロジェン，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）上でＤＮＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｘ（７５〜１２，２１６ｂｐ）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をサイズマーカーとして使用して測定した。
【０２６１】
ｙｈｆＳ座にＩｓｐＡを挿入するため、ＰＣＲにより３つのＤＮＡ片を生成した。断片１は、ｓｅａｍｌｅｓｓキット（インビトロジェン）によりＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ消化ベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ５（Ｋｏｖａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．１９９５，Ｇｅｎｅ  １６６：１７５〜１７６）に組み込むための１５ｂｐの配列、ＢＬ２１のｙｈｆＳ領域と相同な領域、カナマイシンマーカー、及びｘｓｅＢ−ｉｓｐＡ−ｄｘｓオペロンのプロモーターを組み込むための１５ｂｐの配列を含有する。断片を得るために使用したプライマーはＣＭＰ２４７（５’−ｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇｃｃｇｃｔｔｔｇｔｃａｔｃｇｇｔｔａａｃｇｃｔｇｇａａｃａｃｃｔｇｃｃｇｃｇｃｇｃａａｃｇｔｔｇｃｃａｇｃａｃｃｃｔｃｃｔｔａｇｔｔｃｃｔａｔｔｃｃｇａａｇｔｔｃ−３’（配列番号２０））及びＣＭＰ２４８（５’−ｇｃｔｇｇａｇｃｔｇｃｔｔｃｇａａｇｔｔｃｃ−３’（配列番号２１））であり、テンプレートはｐＫＤ４（Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ａｎｄ  Ｗａｎｎｅｒ，ＰＮＡＳ，２０００，９７（１２），６６４０〜６６４５）とした。断片２はｘｓｅＢ−ｉｓｐＡ−ｄｘｓオペロンのプロモーターを含有する。断片を得るために使用したプライマーはＣＭＰ２４９（５’−ｃｇａａｇｃａｇｃｔｃｃａｇｃｇａａｃａａｔｔｔａａｔｇａｔａａａｃｔｔｃａｔｇｇｃｇ−３’（配列番号２２））及びＣＭＰ２５０（５’−ＡＡＴＧＡＡＴＧＴＣＴＧＡＣＴＣＴＣＡＡＴＡＴＴＴＴＴＣＧＣ−３’（配列番号２３）であり、テンプレートはＢＬ２１の染色体ＤＮＡとし、あるいはこれらの誘導体とした。断片１及び断片３を継ぎ目なく組み立てられるようにプライマーを設計した。断片３は、大腸菌（E. coli）ｉｓｐＡ遺伝子と、断片２、並びにＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩにより消化したｐＢＢＲ１ＭＣＳ５とを組み込むための１５ｂｐの配列２組とを含有する。断片を得るために使用したプライマーはＣＭＰ２５５（５’−ａｇｔｃａｇａｃａｔｔｃａｔｔａｔｇｇａｃｔｔｔｃｃｇｃａｇｃａａｃｔｃｇ−３’（配列番号２４））及びＣＭＰ２５６（５’−ＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＴＡＴＣＧａｃｃｔｇｔｃｇｇｃａｃｔｇａａｇｃａｇｇｔｃｇｔｃｇａｃｇａｇｃａａｃａａｃｃｇｇａｔｇｃｇｇｃｇＴＴＡＴＴＴＡＴＴＡＣＧＣＴＧＧＡＴＧＡＴＧＴＡＧＴＣＣ−３’（配列番号２５））であり、テンプレートはＢＬ２１の染色体ＤＮＡとし、あるいはこれらの誘導体とした。
【０２６２】
すべてのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、製造元（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）により推奨されるプロトコルに従ってＨｅｒｃｕｌａｓｅ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎを使用して実施した。これらを、Ｑｉａｇｅｎ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ，ＵＳＡ）のＰＣＲ精製キットを使用し精製した。次に、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩにより消化したプラスミドｐＢＢＲ１−ＭＣＳ５を用い、製造元により推奨されるプロトコルに従ってＧｅｎｅＡｒｔ  ｓｅａｍｌｅｓｓ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙキット（インビトロジェン（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を使用して断片１、２及び３を組み立てた。反応液により大腸菌（E. coli）Ｔｏｐ１０細胞（インビトロジェン（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を形質転換させ、形質転換体をＬＢ＋カナマイシン２０ｍｇ／Ｌで選別した。これらのコロニーのうちの１つからプラスミドを単離し、ｐＣＭＰ９４４と命名した。プラスミド中に正しいコンストラクトが存在していることを配列決定（Ｑｕｉｎｔａｒａ  Ｂｉｏ（Ａｌｂａｎｙ，ＣＡ））により確認した。プライマーＣＭＰ２５７（５’−ｃａｔｔｃｇｃｇｃｃｇｃａｔｔｃａｃａｇｃｃｇａｔｔｃｇａｇｃｃａｃｃｔｔｃａｔｃａｃｃｇｃａｔａｇｔｔｇｔｃａｔｃｇｇｔｔａａｃｇｃｔｇｇａａｃａｃ−３’（配列番号２６））及びＣＭＰ２５８（５’−ＧＧＴＴＡＴＴＡＴＴＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＧＧＣＴＧＡＣＧＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＴＧＡＴＴＴＣＡＡＴＧＡＣＣＴＧＴＣＧＧ  ＣＡＣＴＧＡＡＧＣＡＧＧ−３’（配列番号２７））を使用するＰＣＲ反応には、プラスミドｐＣＭＰ９４４をテンプレートとして使用した。Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製キット（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ（ＭＤ，ＵＳＡ））を使用してＰＣＲ産物を精製し、制限酵素ＤｐｎＩにより消化した。更なる精製後、このＰＣＲ産物を、株ＣＭＰ４５１（米国特許出願第１３／２８３，５６４号を参照されたい）の組み換え反応（上掲Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒを参照されたい）に使用した。形質転換体を、ＬＢ＋１０ｍｇ／Ｌカナマイシンで選別した。ＰＣＲ（プライマーＣＭＰ２６７（５’−ｃｇａｔｔｃｇａｇｃｃａｃｃｔｔｃａｔｃａｃｃ−３’（配列番号２８））及びＣＭＰ２６８（５’−ＣＡＧ  ＣＧＴ  ＣＴＴ  ＣＴＧ  ＧＴＧ  ＣＡＴ  ＧＡＣ  Ｇ−３’（配列番号２９））を使用）により妥当な大きさであるものと判断されたコロニーをＣＭＰ９８１と命名した。ｐＣＰ２０（上掲Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ）によりカナマイシンマーカーを除去してＣＭＰ９９２を作製し、次に更なる改変のためこれを使用した。除去を行うため、ｐＣＰ２０（５０ｍｇ／Ｌカルベニシリンにより３０℃下で増殖）により形質転換させたコロニーをＬＢに画線し、４２℃で一晩増殖させた。１日後、コロニーを採取し、ＬＢ並びにＬＢ＋１０ｍｇ／Ｌカナマイシンに接種した。マーカーを除去したコロニーはＬＢでは増殖したもののＬＢ＋１０ｍｇ／Ｌカナマイシンでは増殖しなかった。
【０２６３】
実施例５：内在性ＩｓｐＡのノックアウト
この反応に関し、ＰＣＲにより３つのＤＮＡ断片を作製した。実施例４に記載の方法に従ってポリメラーゼ連鎖反応のプロトコルを実施した。断片１は、ＢＬ２１のｔｈｉＩ遺伝子２８９ｂｐ並びにｓｅａｍｌｅｓｓ  ａｓｓｅｍｂｌｙ（インビトロジェン，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によりＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ消化ベクターｐＢＢＲ１−ＭＣＳ５（上掲Ｋｏｖａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）に組み込むための１５ｂｐを隣接させたそのプロモーター、並び下記断片２を含有する。断片を得るためにはプライマーＣＭＰ２３６（５’−Ｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇｃｃｇｃｔｇａａｃｃａａｃｇｃｔｔｔｃｔｃｇａａａａｔａｔｃｇ−３’（配列番号３０））及びＣＭＰ２３７（５’−ｃａｇｃｃｔａｃａｃａａｔｃｇａｇｃｇａｔｇｔｔａｇｔｇｇｔａｔａｃｔｔｃｃｇｃ−３’（配列番号３１））を使用し、大腸菌（E. coli）ＢＬ２１の染色体ＤＮＡ又はそれらの誘導体をテンプレートとした。断片２は、ＦＲＴ部位に隣接させたクロラムフェニコールカセットを含有する。断片を得るためにはプライマーＣＭＰ２３４（５’−Ｃｇａｔｔｇｔｇｔａｇｇｃｔｇｇａｇｃｔｇｃｔｔｃ−３’（配列番号３２））及びＣＭＰ２３５（５’−ｇｔｃｃａｔａｔｇａａｔａｔｃｃｔｃｃｔｔａｇｔｔｃ−３’（配列番号３３））を使用し、ｐＫＤ３（上掲Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ）をテンプレートとした。断片３は、ｘｓｅＢ−ｉｓｐＡ−ｄｘｓオペロンのプロモーターと、その下流のｉｓｐＡ遺伝子のおよそ中程までのＤＮＡとを含有しているＤＮＡ断片を含有する。断片を得るためにはプライマーＣＭＰ２３８（５’−ｇａｔａｔｔｃａｔａｔｇｇａｃｔｔｇｃｔｇｃｇｃａｃａｔｃａｃｃｔｔａｃｃ−３’（配列番号３４））及びＣＭＰ２３９（５’−ＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＴＡＴＣＧ  ｃｃｔｔｃｃｇｃｇｔｃｔａａａｔｃｔａｇｔｇｃｃ−３’（配列番号３５））を使用し、大腸菌（E. coli）ＢＬ２１の染色体ＤＮＡ又は誘導体をテンプレートとした。
【０２６４】
次に、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩにより消化したプラスミドｐＢＢＲ１−ＭＣＳ５を用い、製造元により推奨されるプロトコルに従ってＧｅｎｅＡｒｔ  ｓｅａｍｌｅｓｓ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙキット（インビトロジェン，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して断片１、２及び３を組み立てた。反応液により大腸菌（E. coli）Ｔｏｐ１０細胞（インビトロジェン（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を形質転換させ、形質転換体をＬＢ＋クロラムフェニコール２５ｍｇ／Ｌで選別した。これらのコロニーのうちの１つからプラスミドを単離し、ｐＣＭＰ９３５と命名した。プラスミド中に正しいコンストラクトが存在していることを配列決定（Ｑｕｉｎｔａｒａ  Ｂｉｏ（Ａｌｂａｎｙ，ＣＡ））により確認した。
【０２６５】
プライマーＣＭＰ２４１（５’−ｇａａｃｃａａｃｇｃｔｔｔｃｔｃｇａａａａｔａｔｃｇ−３’（配列番号３６）及びＣＭＰ２４２（５’−ｃｃｔｔｃｃｇｃｇｔｃｔａａａｔｃｔａｇｔｇｃｃ−３’（配列番号３７）を使用するＰＣＲ反応には、プラスミドｐＣＭＰ９３５をテンプレートとして使用した。Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製キット（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用してＰＣＲ産物を精製し、制限酵素ＤｐｎＩにより消化した。更なる精製後、ＰＣＲ産物を株ＣＭＰ４５１（米国特許出願公開第１３／２８３，５６４号）の組み換え反応（上掲Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ）に使用した。形質転換体を、ＬＢ＋５ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールで選別した。ＰＣＲ（プライマーＣＭＰ２６５（５’−ｃａｃｇｃｇｔａｃｇｃａｇａａｇｇｔｔｔｔｇｃ−３’（配列番号３８））及びＣＭＰ２６６（５’−ＣＡＧＴＧＣＣＡＧＧＧＴＣＧＧＧＴＡＴＴＴＧＧ−３’（配列番号３９））を使用）により妥当な大きさであるものと判断されたコロニーをＣＭＰ９３９と命名した。ＣＭＰ９３９は、親であるＣＭＰ４５１と同様の増殖性を有した。
【０２６６】
製造元（Ａｇｉｌｅｎｔ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ））に従い、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ  ＄キットを使用して、プラスミドｐＣＭＰ９３５に対しＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ反応を行った。プライマーＣＭＰ２４５（５’−ｃｔｔｔｔａｃａｃｃｇｇａｃａａｔｇａｇｔａａｔｃｇｃｃｃｃａｃｔｇｃｃｃｔｔｔｃａｇ−３’（配列番号４０））及びＣＭＰ２４６（５’−ｃｔｇａａａｇｇｇｃａｇｔｇｇｇｇｃｇａｔｔａｃｔｃａｔｔｇｔｃｃｇｇｔｇｔａａａａｇ−３’（配列番号４１））を使用した。このようにして得られたプラスミドをｐＣＭＰ９４８と命名した。このプラスミドはＡＴＧとしてｉｓｐＡをコードしておらず、遺伝子の最初の２０残基のアミノ酸が除去されていた。プライマーＣＭＰ２４１（５’−ｇａａｃｃａａｃｇｃｔｔｔｃｔｃｇａａａａｔａｔｃｇ−３’（配列番号４２）及びＣＭＰ２４２（５’−ｃｃｔｔｃｃｇｃｇｔｃｔａａａｔｃｔａｇｔｇｃｃ−３’（配列番号４３）を使用するＰＣＲ反応には、プラスミドｐＣＭＰ９４８をテンプレートとして使用した。Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製キット（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ（ＭＤ，ＵＳＡ））を使用してＰＣＲ産物を精製し、制限酵素ＤｐｎＩにより消化した。更なる精製後、株ＣＭＰ９９２の組み換え反応（上掲Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ）にＰＣＲ産物を使用した。形質転換体を、ＬＢ＋５ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールで選別した。ＰＣＲ（プライマーＣＭＰ２６５（５’−ｃａｃｇｃｇｔａｃｇｃａｇａａｇｇｔｔｔｔｇｃ−３’（配列番号４４））及びＣＭＰ２６６（５’−ＣＡＧＴＧＣＣＡＧＧＧＴＣＧＧＧＴＡＴＴＴＧＧ−３’（配列番号４５））を使用）により妥当な大きさであるものと判断されたコロニーをＣＭＰ１０１８と命名した。ｐＣＰ２０（上掲Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ）からカナマイシンマーカーを除去してＣＭＰ１０３０を作製し、次に更なる改変のためこれを使用した。除去を行うため、ｐＣＰ２０（５０ｍｇ／Ｌカルベニシリンにより３０℃下で増殖）により形質転換させたコロニーをＬＢに画線し、４２℃で一晩増殖させた。１日後、コロニーを採取し、ＬＢ並びにＬＢ＋５ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールに接種した。マーカーを除去したコロニーはＬＢでは増殖するものの、ＬＢ＋５ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールでは増殖しない。ＣＭＰ１０３０に、プラスミドＭＣＭ８２（米国特許出願公開第２０１１／０１５９５５７号を参照されたい）及びｐＣＨＬ２４３（これまでに米国特許出願第１３／２８３，５６４号に記載）を電気穿孔法により同時に導入した。ＬＢ＋カルベニシリン５０ｍｇ／Ｌ及びスペクチノマイシン５０ｍｇ／Ｌで増殖したコロニーを選択し、ＣＭＰ１０６１と名づけた。
【０２６７】
実施例６：ｙｈｆＳ座へのＰｙｄｄＶ−ＩｓｐＡの導入
この反応に関し、ＰＣＲにより３つのＤＮＡ断片を作製した。実施例４に記載の方法に従ってポリメラーゼ連鎖反応のプロトコルを実施した。断片１は、ｓｅａｍｌｅｓｓキット（インビトロジェン）によりＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ消化ベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ５（上掲Ｋｏｖａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）に組み込むための１５ｂｐの配列、ＢＬ２１のｙｈｆＳ領域と相同な領域、カナマイシンマーカー、及びｘｓｅＢ−ｉｓｐＡ−ｄｘｓオペロンのプロモーターを組み込むための１５ｂｐの配列を含有する。断片を得るためにプライマーＣＭＰ２４７（５’−ｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇｃｃｇｃｔｔｔｇｔｃａｔｃｇｇｔｔａａｃｇｃｔｇｇａａｃａｃｃｔｇｃｃｇｃｇｃｇｃａａｃｇｔｔｇｃｃａｇｃａｃｃｃｔｃｃｔｔａｇｔｔｃｃｔａｔｔｃｃｇａａｇｔｔｃ−３’（配列番号４６））及びＣＭＰ２４８（５’−ｇｃｔｇｇａｇｃｔｇｃｔｔｃｇａａｇｔｔｃｃ−３’（配列番号４７））を使用し、ｐＫＤ４（上掲Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ）をテンプレートとする。断片２は、ｙｄｄＶ遺伝子のプロモーターを含有する。断片を得るためにプライマーＣＭＰ３３８（５’−ｃｇａａｇｃａｇｃｔｃｃａｇｃｇａａｃｔａｔｃｃｃａｃｔａｃｔａａｔｃａｔｇｃｔｔａｃ−３’（配列番号４８））及びＣＭＰ３３９（５’−ｃｔｇｃｇｇａａａｇｔｃｃａｔＡＡＴＴＣＡＣＡＣＣＣＴＴＡＴＡＡＧＧＣＴＧＧＧ−３’（配列番号４９））を使用し、ＢＬ２１の染色体ＤＮＡ又はそれらの誘導体をテンプレートとした。断片１及び断片３を継ぎ目なく組み立てられるようにプライマーを設計した。断片３は、ＧｅｎｅＯｒａｃｌｅにより予めコドンを変更されている大腸菌（E. coli）ｉｓｐＡ遺伝子（図８）、並びに断片２と、ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩにより消化されたｐＢＢＲ１−ＭＣＳ５との組み立てを可能にする１５ｂｐの配列２組とを含有する。断片を得るためにプライマーＣＭＰ３４０（５’−ａｔａａｇｇｇｔｇｔｇａａｔｔ  ＡＴＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣＡＧＣＡＡＣＴＣＧ−３’（配列番号５０））及びＣＭＰ２５６（５’−ＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＴＡＴＣＧａｃｃｔｇｔｃｇｇｃａｃｔｇａａｇｃａｇｇｔｃｇｔｃｇａｃｇａｇｃａａｃａａｃｃｇｇａｔｇｃｇｇｃｇＴＴＡＴＴＴＡＴＴＡＣＧＣＴＧＧＡＴＧＡＴＧＴＡＧＴＣＣ−３’（配列番号５１））を使用し、プラスミドｐＭＣＭ１５３５をテンプレートとする（図９〜１０）。
【０２６８】
すべてのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、製造元（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）により推奨されるプロトコルに従ってＨｅｒｃｕｌａｓｅ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎを使用して実施した。これらを、Ｑｉａｇｅｎ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ，ＵＳＡ）のＰＣＲ精製キットを使用し精製した。次に、製造元により推奨されるプロトコルに従ってＧｅｎｅＡｒｔ  ｓｅａｍｌｅｓｓ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙキット（インビトロジェン，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、断片１、２及び３を、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩにより消化したプラスミドｐＢＢＲ１−ＭＣＳ５に組み込んだ。反応液により大腸菌（E. coli）Ｔｏｐ１０細胞（インビトロジェン，Ｃａｒｌｓｂｄａｄ，ＣＡ）を形質転換させ、形質転換体をＬＢ＋カナマイシン２０ｍｇ／Ｌで選別した。これらのコロニーのうちの１つからプラスミドを単離し、ｐＣＭＰ１０４６と命名した。プラスミド中に正しいコンストラクトが存在していることを配列決定（Ｑｕｉｎｔａｒａ  Ｂｉｏ（Ａｌｂａｎｙ，ＣＡ））により確認した。プライマーＣＭＰ２５７（５’−ｃａｔｔｃｇｃｇｃｃｇｃａｔｔｃａｃａｇｃｃｇａｔｔｃｇａｇｃｃａｃｃｔｔｃａｔｃａｃｃｇｃａｔａｇｔｔｇｔｃａｔｃｇｇｔｔａａｃｇｃｔｇｇａａｃａｃ−３’（配列番号５２））及びＣＭＰ２５８（５’−ＧＧＴＴＡＴＴＡＴＴＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＧＧＣＴＧＡＣＧＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＴＧＡＴＴＴＣＡＡＴＧＡＣＣＴＧＴＣＧＧ  ＣＡＣＴＧＡＡＧＣＡＧＧ−３’（配列番号５３）を使用するＰＣＲ反応には、プラスミドｐＣＭＰ１０４６をテンプレートとして使用した。Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製キット（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ（ＭＤ，ＵＳＡ））を使用してＰＣＲ産物を精製し、制限酵素ＤｐｎＩにより消化した。更なる精製後、株ＣＭＰ１０１８の組み換え反応（上掲Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ）にＰＣＲ産物を使用した。形質転換体を、ＬＢ＋１０ｍｇ／Ｌカナマイシンで選別した。ＰＣＲ（プライマーＣＭＰ２６７（５’−ｃｇａｔｔｃｇａｇｃｃａｃｃｔｔｃａｔｃａｃｃ−３’（配列番号５４））及びＣＭＰ２６８（５’−ＣＡＧＣＧＴＣＴＴＣＴＧＧＴＧＣＡＴＧＡＣＧ−３’（配列番号５５）））により妥当な大きさであるものと判断されたコロニーをＣＭＰ１０６７と命名した。ｐＣＰ２０（上掲Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ）からカナマイシン及びクロラムフェニコールマーカーを除去し、ＣＭＰ１０７５を作製した。除去を行うため、ｐＣＰ２０（５０ｍｇ／Ｌカルベニシリンにより３０℃下で増殖）により形質転換させたコロニーをＬＢに画線し、４２℃で一晩増殖させた。１日後、コロニーを回収し、ＬＢ、ＬＢ＋１０ｍｇ／Ｌカナマイシン及びＬＢ＋５ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールに接種した。マーカーを除去したコロニーはＬＢでは増殖するものの、ＬＢ＋１０ｍｇ／Ｌカナマイシン又はＬＢ＋５ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールでは増殖しない。プラスミドＭＣＭ８２（既述）及びｐＣＨＬ２４３を電気穿孔法によりＣＭＰ１０７５に同時に導入した。ＬＢ＋カルベニシリン５０ｍｇ／Ｌ及びスペクチノマイシン５０ｍｇ／Ｌで増殖したコロニーを選択し、ＣＭＰ１０８２と名づけた。
【０２６９】
実施例７：株ＣＭＰ１０５９の構築（ｉｓｐＡにタンパク質分解性のタグを付加）
上記の方法を使用し、ｌｄｈＡの欠失を含むＫｅｉｏ株ＪＷ１３７５（Ｂａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｍｏｌ  Ｓｙｓｔ  Ｂｉｏｌ．，２：１〜１１）並びにプライマーｌｄｈＡｓｅｑＦ２（５’−ＣＴＡ  ＡＴＧ  ＣＡＡ  ＴＡＣ  ＧＴＧ  ＴＣＣ  ＣＧＡ  ＧＣ−３’（配列番号５６））及びｌｄｈＡｓｅｑＲ（５’−ｇｇｃｔｔａｃｃｇｔｔｔａｃｇｃｔｔｔｃｃａｇｃ−３’（配列番号５７））を使用し、ＦＲＴ部位並びにｌｄｈＡの上流及び下流と相同性の領域に隣接したカナマイシンカセットを含有しているＰＣＲ産物を得た。大腸菌（E. coli）ＢＬ２１の組み換え反応（上記のプロトコルを参照されたい）にこのＰＣＲ産物を使用し、ＢＬ２１  ｌｄｈＡ：Ｋａｎを作製した。後者の株からＰ１細胞溶解液を調製し、これを使用してＣＭＰ４５１に形質導入した。Ｐ１細胞溶解液を調製し、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，分子生物学標準プロトコル（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ）に記載の方法に従って使用した。コロニーをＬＢ＋カナマイシン１０ｍｇ／Ｌで選別し、ＣＭＰ５９６と命名した。製造元により推奨されるプロトコルを用い、株ＣＭＰ７２２からカナマイシンマーカーを除去した（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ））。
【０２７０】
実施例８：ｉｓｐＡに改変を含有する株におけるイソプレン産生
方法
ＴＭ３培地組成（発酵培地１Ｌ当たり）：Ｋ２ＨＰＯ４（１３．６ｇ）、ＫＨ２ＰＯ４（１３．６ｇ）、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２ｇ）、クエン酸一水和物（２ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（０．３ｇ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（３．２ｇ）、酵母エキス（０．２ｇ）、１０００Ｘ微量金属溶液（１ｍＬ）。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させる。水酸化アンモニウム（３０％）によりｐＨを６．８に調整し、及び容量を調整する。０．２２μｍフィルタで培地を濾過滅菌する。ｐＨ調整及び滅菌後にグルコース１０．０ｇ及び抗菌剤を添加する。
【０２７１】
１０００Ｘ微量金属溶液（発酵培地１Ｌ当たり）：クエン酸＊Ｈ２Ｏ（４０ｇ）、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）、ＮａＣｌ（１０ｇ）、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）、Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）。各成分を１成分ずつ脱イオン水に溶解する。ｐＨをＨＣｌ／ＮａＯＨで３．０に調整した後、溶液を用量に調整し、０．２２μｍフィルタでフィルタ滅菌する。
【０２７２】
ルリア・ベルターニブロス＋抗生物質で細胞を一晩増殖させる。翌日、ＯＤ６００が０．１になるよう、２５０ｍＬのバッフル付き三角フラスコにおいて細胞を２０ｍＬのＴＭ３培地（５０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシン及び５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有）により希釈し、３４℃かつ２００ｒｐｍでインキュベートする。２時間増殖させた後、ＯＤ６００を測定し、２００μＭのＩＰＴＧを加える。発酵工程の間、規則的に試料を採取する。各時点でＯＤ６００を測定する。また、ガスクロマトグラフ−質量分析器（ＧＣ−ＭＳ）（Ａｇｉｌｅｎｔ）によるヘッドスペースアッセイにより、イソプレンのオフガス解析を行った（米国特許出願公開番号第２００５／０２８７６５５号を参照されたい。この特許文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。１００μＬの全ブロスをＧＣバイアルに入れ密閉し、３４℃かつ２００ｒｐｍで３０分間インキュベートする。７０℃で７分のインキュベーションからなる熱殺菌工程後、試料をＧＣに装填する。ＧＣによるイソプレン量の読み取り値（μｇ／Ｌ）を、インキュベート時間（３０分）及びＯＤ６００測定値で除算し、比産生量として記録する。
【０２７３】
結果
野生型ｉｓｐＡ、ＤＷ４１５（米国特許出願第１３／２８３，５６４号に記載）又は再構成したｉｓｐＡ（ＣＭＰ１０６１）を有する株は、ｉｓｐＡの発現が改変された株よりもわずかに緩慢に増殖した（ＣＭＰ１０５９及びＣＭＰ１０８２）（図７ａ）。すべての株の比産生性は非常に類似していた（図７ｂ）。
【０２７４】
実施例９：ＣＭＰ１０８２の大規模発酵
対照株ＣＭＰ１０４３（ＨＭＢ  ＧＩ１．２ｇｌｔＡ，−ＭＣＭ８２，ｐＣＨＬ２４３）に対し、株ＣＭＰ１０８２（ＨＭＢ  ＧＩ１．２ｇｌｔＡ，ＰｙｄｄＶＩｓｐＡ＿ＧＯ，ｔｒｕｎｃＩｓｐＡ，ＭＣＭ８２，ｐＣＨＬ２４３）の特定の性能指数（グルコースに対する累積イソプレン収率、イソプレン産生性、最大比産生性、並びに細胞性能指数）を試験するため、次のプロトコルにしたがって発酵を実施した。
【０２７５】
培地組成（発酵培地１Ｌ当たり）：Ｋ２ＨＰＯ４（７．５ｇ）、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２ｇ）、クエン酸一水和物（２ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（０．３ｇ）、酵母エキス（０．５ｇ）、５０％硫酸（１．６ｍＬ）、１０００Ｘ改変微量金属溶液（１ｍＬ）。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させた。この溶液を加熱滅菌した（１２３℃で２０分）。水酸化アンモニウム（２８％）によりｐＨを７．０に調整し、容量に調整した。滅菌及びｐＨ調製後にグルコース１０ｇ、ビタミン溶液８ｍＬ、及び抗生物質を加えた。
【０２７６】
１０００Ｘ改変微量金属溶液（１Ｌ当たり）：クエン酸＊Ｈ２Ｏ（４０ｇ）、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）、ＮａＣｌ（１０ｇ）、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）、Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、０．２２μｍのフィルタを用いろ過滅菌した。
【０２７７】
ビタミン溶液（１Ｌ当たり）：塩酸チアミン（１．０ｇ）、Ｄ−（＋）−ビオチン（１．０ｇ）、ニコチン酸（１．０ｇ）、塩酸ピリドキシン（４．０ｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、孔径０．２２μｍのフィルタを用いろ過滅菌した。
【０２７８】
マクロ塩溶液（１Ｌ当たり）：ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２９６ｇ）、クエン酸一水和物（２９６ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（４９．６ｇ）。すべての成分を水に溶解させ、用量に調整し、０．２２μｍのフィルタを用い、ろ過滅菌した。
【０２７９】
供給溶液（１ｋｇ当たり）：グルコース（０．５９０ｋｇ）、脱イオン水（０．３９３ｋｇ）、Ｋ２ＨＰＯ４（７．４ｇ）、及び１００％  Ｆｏａｍｂｌａｓｔ８８２（８．９ｇ）。すべての成分を合わせて混合し、オートクレーブ処理した。供給溶液をオートクレーブ処理した後、滅菌フード内で、供給ボトルに栄養塩類を添加する。滅菌後に供給溶液に添加するものは（供給溶液１ｋｇ当たり）マクロ塩溶液５．５４ｍＬ、ビタミン溶液６．５５ｍＬ、１０００Ｘ改変微量金属溶液０．８２ｍＬである。
【０２８０】
代謝解析：ドライアイスにより冷却した９ｍＬのメタノールを入れたチューブに約３ｍＬの培養液を回収し、大腸菌（E. coli）からの代謝産物の抽出を実施した。得られた試料を計量し、試料としたブロス量を算出し、以降の解析に備え−８０℃で保管した。代謝産物の抽出並びに濃縮の際には、０．５ｍＬの細胞懸濁液アリコート（ＯＤ６００で測定した時の培養物の細胞密度が５０を下回る場合には１ｍＬのアリコートを使用する）を２．５ｍＬのメタノール／酢酸アンモニウム緩衝液（５ｍＭ，ｐＨ＝８．０）混合液（６：１、体積／体積）を使用して希釈し、５分間遠心分離し細胞片をペレット化させた。上清を回収し、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（３３μｍ  ３０ｍｇ／３ｍＬ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｗｅａｋ  Ａｎｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ）のＳｔｒａｔａ−Ｘ−ＡＷカラムに装填する。まず３ｍＬのメタノール／酢酸アンモニウム緩衝液（５ｍＭ，ｐＨ＝８．０）混合液（６：１体積／体積）を使用し、次に３ｍＬのメタノール／酢酸アンモニウム緩衝液（５ｍＭ，ｐＨ＝８．０）混合液（１：１体積／体積）を使用して、細胞ペレットを２回以上抽出した。いずれの場合にも、細胞は遠心分離によりペレット化し、得られた上清を、同一のＳｔｒａｔａ−Ｘ−ＡＷカラムに連続的に装填した。抽出−遠心分離中、細胞を含む試料は４℃未満に維持した。１ｍＬの水及び１ｍＬのメタノールによりカラムを洗浄した後、対象とする代謝産物を、最初に濃ＮＨ４ＯＨ／メタノール（１：１４、体積／体積）混合物０．３ｍＬを用い、次に０．３ｍＬの濃ＮＨ４ＯＨ／メタノール／水（１：１２：２、体積／体積／体積）混合物を用いカラムから溶出した。２０μＬ氷酢酸を加え、得られた溶離液を中和し、次に遠心分離により清澄化した。
【０２８１】
ＴＳＱ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ａｃｃｅｓｓ  ＴＳＱシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、質量分析法により代謝産物の解析を実施した。すべての系の制御、データ取得、及び質量スペクトルデータの評価は、ＸＣａｌｉｂｕｒ  ａｎｄ  ＬＣＱｕａｎソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実施した。ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ方法に関しては、ｃｈｉｒａｌ  Ｎｕｃｌｅｏｄｅｘ  β−ＯＨ  ５μＭ  ＨＰＬＣカラム（１００×２ｍｍ，Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ＣＣ  ８／４  Ｎｕｃｌｅｏｄｅｘ  β−ＯＨガードカートリッジとともに使用した。移動相Ａは１００ｍＭ酢酸アンモニウム（Ｓｉｇｍａウルトラ等級，Ｓｉｇｍａ）緩衝液（ｐＨ＝８）／ＭｉｌｌｉＱ−等級水とし、移動相ＢはＭｉｌｌｉＱ等級水とし、移動相ＣはＬＣ−ＭＳ等級アセトニトリル（Ｃｈｒｏｍａｓｏｌｖ，Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ  Ｈａｅｎ）とし、移動相の勾配を適用した。カラム及び試料のトレイ温度をそれぞれ５℃及び４℃に低下させた。注入容量は１０μＬとした。
【０２８２】
エレクトロスプレーイオン化法を用い、陰イオンモード（ＥＳＩスプレー電圧：３．０ｋＶ及びイオン送達管（ion transfer tube）温度３９０℃）で質量検出を実施した。前駆体イオンに関し次のｍ／ｚ値を選択して、ＳＲＭモードで対象とする代謝産物を検出した：ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰに関しては２４５．０、ＧＰＰに関しては３１３．１、ＦＰＰに関しては３８１．１、ＭＶＰに関しては２２７．０、及びＭＶＰＰに関しては３０７．１。ＰＯ３−生成イオン（ｍ／ｚ＝７９．０）により生成されたピークの積分強度を元に代謝産物の濃度を求めた。標準を注入することにより得た校正曲線を使用して、細胞抽出液中の代謝産物濃度を算出した。ＩＰＰ、ＤＭＡＰＰ、ＧＰＰ、及びＦＰＰ標準をＥｃｈｅｌｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．から購入し、ＭＶＰ及びＭＶＰＰ（Ｒ−ｆｏｒｍｓ）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ＯＤ６００＝２００の培養液１ｍＬ中の全細胞の総容積は５０μＬであるとする仮定を元に代謝産物の細胞内濃度を求めた。
【０２８３】
この実験をｐＨ  ７．０及び温度３４℃で実施した。大腸菌（E.coli）株を凍結したバイアルを解凍し、トリプトン酵母エキス培地及び適切な抗生物質を入れたフラスコに接種した。５５０ｎｍ（ＯＤ５５０）での吸光度が１．０になるまで接種材料を増殖させた後、５００ｍＬを１５Ｌのバイオリアクタに接種し、初期槽容量を５Ｌに調整した。各バッチの培地には、グルコースを９．７ｇ／Ｌ含有させた。細胞のＯＤ５５０が６に達したら、最終濃度２００μＭでイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加え誘導を実施した。培養によるグルコースの消費がｐＨの上昇により示されたなら、代謝に必要とされる量に足りるよう、１０ｇ／分以下の速度でグルコース供給溶液を供給した。グルコースに対するメバロン酸の最大質量収率を測定するのに十分な時間、すなわち発酵の開始から合計４８〜７２時間にわたって発酵を行った。
【０２８４】
イソプレンは揮発性であり、送入気体により槽から効率的に回収することができる。バイオリアクタ中のオフガスに含まれるイソプレン濃度を、ｉＳＣＡＮ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｓｕｎｄｓｔｒａｎｄ）質量分析計を用い測定した。送入気体は一般的な酸素及び窒素混合気体とした（それぞれ約９．３体積％及び９０．７体積％）。４時間間隔でブロス試料にＨＰＬＣ解析を行い、発酵ブロス中のクエン酸、グルコース、酢酸及びメバロン酸濃度を測定した。屈折率と、濃度既知の標準を使用して予め作成した検量線とを比較して、ブロス試料中の濃度を測定した。
【０２８５】
結果
【０２８６】
【表７】
2015510392.tif 000011
【０２８７】
グルコースに対する収率（重量％）＝総イソプレン量（ｔ）／［（供給重量（０）−供給重量（ｔ）＋８３．５）＊０．５９）］、
式中、０．５９はグルコース供給溶液中のグルコースの割合（重量％）であり、及び８３．５は、ｔ＝０の時点で発酵槽に供給したバッチのグラム重量である。各供給量は、独立して重量％として測定した。
イソプレン力価（ｇ／Ｌ）＝イソプレン放出速度（evolution Rate）の積分値（ｍｏｌ／Ｌ）＊イソプレン分子量（ｇ／ｍｏｌ）
ＣＰＩ＝イソプレン総重量（ｇ）／総乾燥細胞重量（ｇ）
比産生性（ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ）＝ＨｇＥＲ＊６８．１１７ｇ／ｍｏｌ／ＯＤ（ＨｇＥＲ＝イソプレン放出速度）。
ＨｇＥＲはイソプレンの放出速度（ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ）である。
ＯＤ＝吸光度＝５５０ｎｍでの吸光度＊水への希釈倍率。
【０２８８】
結論
図１３及び表６に見られるとおり、ｉｓｐＡプロモーターを改変した株（ＣＭＰ１０８２）を用いる発酵は、野生型ｉｓｐＡプロモーターを使用する対照株（ＣＭＰ１０４３）よりもグルコースに対するイソプレン収率が高い。ｉｓｐＡプロモーターを改変した株（ＣＭＰ１０８２）による発酵は、野生型ｉｓｐＡプロモーターを使用する対照株（ＣＭＰ１０４３）と比較して、より高いイソプレン力価（図１４及び表６を参照されたい）、より高い細胞産生性指数（図１５及び表６を参照されたい）、より高いイソプレン容積産生量（図１６及び表６を参照されたい）、並びにより高いイソプレンの最大比産生性（１２時間の範囲；図１７及び表６を参照されたい）を有する。
【０２８９】
実施例１０：ＣＭＰ１０５９の大規模発酵
実施例４に記載の方法に従ってポリメラーゼ連鎖反応のプロトコルを実施した。株ＭＤ０８−９７（上記）からＰ１細胞溶解液を作製し、ＣＭＰ７２２への形質導入に使用した。コロニーをＬＢ＋クロラムフェニコール５ｍｇ／Ｌで選別し、ＣＭＰ１０２４と名づけた。ＰＣＲによりＣＭＰ１０２４を確認し、配列決定を行い、タンパク質分解性のタグが存在していることを実証した。ｐＣＰ２０（上掲Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ）を使用してクロラムフェニコールマーカーを除去し、クロラムフェニコール感受性のコロニーを選別し、ＣＭＰ１０３４と命名した。電気穿孔法により、プラスミドＭＣＭ８２及びｐＣＨＬ２４３をＣＭＰ１０３４に同時に導入した。ＬＢ＋カルベニシリン５０ｍｇ／Ｌ及びスペクチノマイシン５０ｍｇ／Ｌで増殖させたコロニーを選択し、ＣＭＰ１０５と命名した。
【０２９０】
対照株ＣＭＰ１０４３（前述）に対し、株ＣＭＰ１０５９（ＨＭＢ  ＧＩ１．２ｇｌｔＡ，ｉｓｐＡ＿ｐｒｏｔ＿ｔａｇ，ＭＣＭ８２，ｐＣＨＬ２４３）の特定の性能指数（グルコースに対する累積イソプレン収率、イソプレン産生性、最大比産生性、並びに細胞性能指数）を試験するため、次のプロトコルにしたがって発酵を実施した。
【０２９１】
培地組成（発酵培地１Ｌ当たり）：Ｋ２ＨＰＯ４（７．５ｇ）、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２ｇ）、クエン酸一水和物（２ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（０．３ｇ）、酵母エキス（０．５ｇ）、５０％硫酸（１．６ｍＬ）、１０００Ｘ改変微量金属溶液（１ｍＬ）。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させた。この溶液を熱滅菌した（１２３℃、２０分）。水酸化アンモニウム（２８％）によりｐＨを７．０に調整し、容量に調整した。滅菌及びｐＨ調製後にグルコース１０ｇ、ビタミン溶液８ｍＬ、及び抗生物質を加えた。
【０２９２】
１０００Ｘ改変微量金属溶液（１Ｌ当たり）：クエン酸＊Ｈ２Ｏ（４０ｇ）、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）、ＮａＣｌ（１０ｇ）、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）、Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、０．２２μｍのフィルタを用いろ過滅菌した。
【０２９３】
ビタミン溶液（１Ｌ当たり）：塩酸チアミン（１．０ｇ）、Ｄ−（＋）−ビオチン（１．０ｇ）、ニコチン酸（１．０ｇ）、塩酸ピリドキシン（４．０ｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、孔径０．２２μｍのフィルタを用いろ過滅菌した。
【０２９４】
マクロ塩溶液（１Ｌ当たり）：ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２９６ｇ）、クエン酸一水和物（２９６ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（４９．６ｇ）。すべての成分を水に溶解させ、用量に調整し、０．２２μｍのフィルタを用い、ろ過滅菌した。
【０２９５】
供給溶液（１ｋｇ当たり）：グルコース（０．５９０ｋｇ）、脱イオン水（０．３９３ｋｇ）、Ｋ２ＨＰＯ４（７．４ｇ）、及び１００％  Ｆｏａｍｂｌａｓｔ８８２（８．９ｇ）。すべての成分を合わせて混合し、オートクレーブ処理した。供給溶液をオートクレーブ処理した後、滅菌フード内で、供給ボトルに栄養塩類を添加する。滅菌後に供給溶液に添加するものは（供給溶液１ｋｇ当たり）マクロ塩溶液５．５４ｍＬ、ビタミン溶液６．５５ｍＬ、１０００Ｘ改変微量金属溶液０．８２ｍＬである。
【０２９６】
この実験をｐＨ  ７．０及び温度３４℃で実施した。大腸菌（E. coli）株を凍結したバイアルを解凍し、トリプトン酵母エキス培地及び適切な抗生物質を入れたフラスコに接種した。５５０ｎｍ（ＯＤ５５０）での吸光度が１．０になるまで接種材料を増殖させた後、培養物のうち５００ｍＬを１５Ｌのバイオリアクタに接種し、初期槽容量を５Ｌに調整した。各バッチの培地には、グルコースを９．７ｇ／Ｌ含有させた。細胞のＯＤ５５０が６に達したら、最終濃度２００μＭでイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加え誘導を実施した。培養によるグルコースの消費がｐＨの上昇により示されたなら、代謝に必要とされる量に足りるよう、１０ｇ／分以下の速度でグルコース供給溶液を供給した。グルコースに対するメバロン酸の最大質量収率を測定するのに十分な時間、すなわち発酵の開始から合計４８〜７２時間にわたって発酵を行った。
【０２９７】
バイオリアクタ中のオフガスに含まれるイソプレン濃度を、ｉＳＣＡＮ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｓｕｎｄｓｔｒａｎｄ）質量分析計を用い測定した。送入気体は一般的な酸素及び窒素混合気体とした（それぞれ約９．３体積％及び９０．７体積％）。４時間間隔でブロス試料にＨＰＬＣ解析を行い、発酵ブロス中のクエン酸、グルコース、酢酸及びメバロン酸濃度を測定した。屈折率と、濃度既知の標準を使用して予め作成した検量線とを比較して、ブロス試料中の濃度を測定した。
【０２９８】
結果
ｉｓｐＡ株（ＣＭＰ１０５９）に対しタンパク質分解性タグを用いる発酵では、野生型ｉｓｐＡタンパク質を使用する対照株（ＣＭＰ１０４３）と比較して細胞産生性指数が１１％高かった。加えて、ｉｓｐＡ株（ＣＭＰ１０５９）に対しタンパク質分解性タグを用いる発酵では、イソプレンの最大比産生性（１６時間ＥＦＴ時点）は、野生型ｉｓｐＡタンパク質を使用する対照株（１６時間ＥＦＴ時点，ＣＭＰ１０４３）よりも１４％高かった。
【０２９９】
実施例１１：ｉｓｐＡの改変を含む株における代謝データ
実施例９及び１０に記載のプロトコルに従い、株ＣＭＰ１０５９及びＣＭＰ１０８２、並びに対照株ＣＭＰ１０４３において代謝産物の蓄積を試験するため、発酵を実施した。
【０３００】
代謝解析：ドライアイスにより冷却した９ｍＬのメタノールを入れたチューブに約３ｍＬの培養液を回収し、大腸菌（E. coli）からの代謝産物の抽出を実施した。得られた試料を計量し、試料としたブロス量を算出し、以降の解析に備え−８０℃で保管した。代謝産物の抽出並びに濃縮の際には、０．５ｍＬの細胞懸濁液アリコート（ＯＤ６００で測定した時の培養物の細胞密度が５０を下回る場合には１ｍＬのアリコートを使用する）を２．５ｍＬのメタノール／酢酸アンモニウム緩衝液（５ｍＭ，ｐＨ＝８．０）混合液（６：１、体積／体積）を使用して希釈し、５分間遠心分離し細胞片をペレット化させた。上清を回収し、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（３３μｍ  ３０ｍｇ／３ｍＬ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｗｅａｋ  Ａｎｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ）のＳｔｒａｔａ−Ｘ−ＡＷカラムに装填する。まず３ｍＬのメタノール／酢酸アンモニウム緩衝液（５ｍＭ，ｐＨ＝８．０）混合液（６：１体積／体積）を使用し、次に３ｍＬのメタノール／酢酸アンモニウム緩衝液（５ｍＭ、ｐＨ＝８．０）混合液（１：１体積／体積）を使用して、細胞ペレットを２回以上抽出した。いずれの場合にも、細胞は遠心分離によりペレット化し、得られた上清を、同一のＳｔｒａｔａ−Ｘ−ＡＷカラムに連続的に装填した。抽出−遠心分離中、細胞を含む試料は４℃未満に維持した。１ｍＬの水及び１ｍＬのメタノールによりカラムを洗浄した後、対象とする代謝産物を、最初に濃ＮＨ４ＯＨ／メタノール（１：１４、体積／体積）混合物０．３ｍＬを用い、次に０．３ｍＬの濃ＮＨ４ＯＨ／メタノール／水（１：１２：２、体積／体積／体積）混合物を用いカラムから溶出した。得られた溶離液に２０μＬ氷酢酸を加え中和し、次に遠心分離により清澄化した。
【０３０１】
ＴＳＱ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ａｃｃｅｓｓ  ＴＳＱシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、質量分析法により代謝産物の解析を実施した。すべての系の制御、データ取得、及び質量スペクトルデータの評価は、ＸＣａｌｉｂｕｒ  ａｎｄ  ＬＣＱｕａｎソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実施した。ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ方法に関しては、ｃｈｉｒａｌ  Ｎｕｃｌｅｏｄｅｘ  β−ＯＨ  ５μＭ  ＨＰＬＣカラム（１００×２ｍｍ，Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ＣＣ  ８／４  Ｎｕｃｌｅｏｄｅｘ  β−ＯＨガードカートリッジとともに使用した。移動相Ａは１００ｍＭ酢酸アンモニウム（Ｓｉｇｍａウルトラ等級，Ｓｉｇｍａ）緩衝液（ｐＨ＝８）／ＭｉｌｌｉＱ−等級水とし、移動相ＢはＭｉｌｌｉＱ等級水とし、移動相ＣはＬＣ−ＭＳ等級アセトニトリル（Ｃｈｒｏｍａｓｏｌｖ，Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ  Ｈａｅｎ）とし、移動相の勾配を適用した。カラム及び試料のトレイ温度をそれぞれ５℃及び４℃に低下させた。注入容量は１０μＬとした。
【０３０２】
エレクトロスプレーイオン化法を用い、陰イオンモード（ＥＳＩスプレー電圧：３．０ｋＶ及びイオン送達管（ion transfer tube）温度３９０℃）で質量検出を実施した。前駆体イオンに関し次のｍ／ｚ値を選択して、ＳＲＭモードで対象とする代謝産物を検出した：ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰに関しては２４５．０、ＧＰＰに関しては３１３．１、ＦＰＰに関しては３８１．１。ＰＯ３−生成イオン（ｍ／ｚ＝７９．０）により生成されたピークの積分強度を元に代謝産物の濃度を求めた。標準を注入することにより得た校正曲線を使用して、細胞抽出液中の代謝産物濃度を算出した。ＩＰＰ、ＤＭＡＰＰ、ＧＰＰ、及びＦＰＰ標準はＥｃｈｅｌｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．から購入した。ＯＤ６００＝２００の培養液１ｍＬ中の全細胞の総容積は５０μＬであるとする仮定を元に代謝産物の細胞内濃度を求めた。
【０３０３】
結果
【０３０４】
【表８】
2015510392.tif 000012
【０３０５】
実施例１２：トリ改変ファルネシル二リン酸合成酵素による大腸菌（E. coli）野生型ファルネシル二リン酸合成酵素の置き換え
ＤＭＡＰＰからの、低分子量イソプレノイド類よりもイソプレンへの炭素の分配を増加させる目的で、ＤＭＡＰＰに関しＫｍ値の増加しているファルネシル二リン酸合成酵素を使用することは有用である場合がある。このような酵素はＦｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３９（５０）：１５３１６〜１５３２１に記載される。したがって、野生型大腸菌（E. coli）ファルネシル二リン酸合成酵素を、Ａ１１６Ｗ又はＮ１４４’Ｗ変異を有するトリ酵素により置き換えた。
【０３０６】
このような株を作製するため、ＰＣＲにより３つのＤＮＡ断片を作製した。断片１は、ｓｅａｍｌｅｓｓキット（インビトロジェン）によりＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ消化ベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ５（Ｋｏｖａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．１９９５，Ｇｅｎｅ  １６６：１７５〜１７６）に組み込むための１５ｂｐの配列、ＢＬ２１のｙｈｆＳ領域と相同な領域、カナマイシンマーカー、及びｘｓｅＢ−ｉｓｐＡ−ｄｘｓオペロンのプロモーターを組み込むための１５ｂｐの配列を含有する。断片を得るためにプライマーＣＭＰ２４７（５’−ｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇｃｃｇｃｔｔｔｇｔｃａｔｃｇｇｔｔａａｃｇｃｔｇｇａａｃａｃｃｔｇｃｃｇｃｇｃｇｃａａｃｇｔｔｇｃｃａｇｃａｃｃｃｔｃｃｔｔａｇｔｔｃｃｔａｔｔｃｃｇａａｇｔｔｃ−３’（配列番号５８））及びＣＭＰ２４８（５’−ｇｃｔｇｇａｇｃｔｇｃｔｔｃｇａａｇｔｔｃｃ−３’（配列番号５９））を使用し、ｐＫＤ４（上掲Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ）をテンプレートとした。断片２はｘｓｅＢ−ｉｓｐＡ−ｄｘｓオペロンのプロモーターを含有する。断片を得るために使用したプライマーはＣＭＰ２４９（５’−ｃｇａａｇｃａｇｃｔｃｃａｇｃｇａａｃａａｔｔｔａａｔｇａｔａａａｃｔｔｃａｔｇｇｃｇ−３’（配列番号６０））及びＣＭＰ２５０（５’−ＡＡＴＧＡＡＴＧＴＣＴＧＡＣＴＣＴＣＡＡＴＡＴＴＴＴＴＣＧＣ−３’（配列番号６１）であり、テンプレートはＢＬ２１の染色体ＤＮＡとし、あるいはこれらの誘導体とする。断片１及び断片３を継ぎ目なく組み立てられるようにプライマーを設計した。断片３は、トリファルネシル二リン酸合成酵素遺伝子、対立遺伝子Ａ１６６Ｗ又はＮ１４４’Ｗ、並びに断片２とＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩにより消化したｐＢＢＲ１ＭＣＳ５とを組み込むための１５ｂｐの配列を２組含有する。断片を得るために、プライマーＣＭＰ３４３（５’−ＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＴＡＴＣＧａｃｃｔｇｔｃｇｇｃａｃｔｇａａｇｃａｇｇｔｃｇｔｃｇａｃｇａｇｃａａｃａａｃｃｇｇａｔｇｃｇｇｃｇＴＣＡＴＴＴＣＴＧＧＣＧＴＴＴＧＴＡＧＡＴＣＴＴＣ−３’（配列番号６２））及びＣＭＰ３４４（５’−ａｇｔｃａｇａｃａｔｔｃａｔｔａｔｇｃａｔａａａｔｔｔａｃｔｇｇｔｇｔｃａａｔｇ−３’（配列番号６３）を使用し、並びにＡ１６６Ｗ対立遺伝子に関してはプラスミドｐＡ１６６Ｗ及びＮ１４４’Ｗ対立遺伝子に関してはプラスミドｐＮ１４４’Ｗをテンプレートとした（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，上掲）。
【０３０７】
すべてのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、製造元（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）により推奨されるプロトコルに従ってＨｅｒｃｕｌａｓｅ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎを使用して実施した。これらを、Ｑｉａｇｅｎ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ，ＵＳＡ）のＰＣＲ精製キットを使用し精製した。
【０３０８】
次に、断片１、２及び３を、製造元により推奨されるプロトコルに従ってＧｅｎｅＡｒｔ  ｓｅａｍｌｅｓｓ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙキット（インビトロジェン，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用しＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩにより消化したプラスミドｐＢＢＲ１−ＭＣＳ５に組み込んだ。反応液により大腸菌（E. coli）Ｔｏｐ１０細胞（インビトロジェン，Ｃａｒｌｓｂｄａｄ，ＣＡ）を形質転換させ、形質転換体をＬＢ＋カナマイシン２０ｍｇ／Ｌで選別した。これらのコロニーのうちの１つからプラスミドを単離し、Ａ１６６Ｗ対立遺伝子に関してはｐＣＭＰ１０９３、及びＮ１４４’Ｗ対立遺伝子に関してはｐＣＭＰ１０９４と命名した。プラスミド中に正しいコンストラクトが存在していることを配列決定（Ｑｕｉｎｔａｒａ  Ｂｉｏ（Ａｌｂａｎｙ，ＣＡ））により確認した。プライマーＣＭＰ２５７（５’−ｃａｔｔｃｇｃｇｃｃｇｃａｔｔｃａｃａｇｃｃｇａｔｔｃｇａｇｃｃａｃｃｔｔｃａｔｃａｃｃｇｃａｔａｇｔｔｇｔｃａｔｃｇｇｔｔａａｃｇｃｔｇｇａａｃａｃ−３’（配列番号６４））及びＣＭＰ２５８（５’−ＧＧＴＴＡＴＴＡＴＴＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＧＧＣＴＧＡＣＧＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＴＧＡＴＴＴＣＡＡＴＧＡＣＣＴＧＴＣＧＧＣＡＣＴＧＡＡＧＣＡＧＧ−３’（配列番号６５））を使用するＰＣＲ反応には、プラスミドｐＣＭＰ１０９３及び１０９４をテンプレートとして使用した。Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製キット（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ（ＭＤ，ＵＳＡ））を使用してＰＣＲ産物を精製し、制限酵素ＤｐｎＩにより消化した。更なる精製後、株ＣＭＰ１０１８の組み換え反応（上掲Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ）にこれらのＰＣＲ産物を使用した。形質転換体を、ＬＢ＋１０ｍｇ／Ｌカナマイシンで選別した。ＰＣＲ（プライマーＣＭＰ２６７（５’−ｃｇａｔｔｃｇａｇｃｃａｃｃｔｔｃａｔｃａｃｃ−３’（配列番号６６））及びＣＭＰ２６８（５’−ＣＡＧＣＧＴＣＴＴＣＴＧＧＴＧＣＡＴＧＡＣＧ−３’（配列番号６７））を使用）により妥当な大きさであるものと判断されたコロニーをそれぞれＣＭＰ１１０１及びＣＭＰ１１０２と命名した。ｐＣＰ２０（上掲Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ）からカナマイシンマーカーを除去し、それぞれＣＭＰ１１０７及びＣＭＰ１１０８を作製した。除去を行うため、ｐＣＰ２０（５０ｍｇ／Ｌカルベニシリンにより３０℃下で増殖）により形質転換させたコロニーをＬＢに画線し、４２℃で一晩増殖させた。１日後、コロニーを採取し、ＬＢ並びにＬＢ＋１０ｍｇ／Ｌカナマイシンに接種した。マーカーを除去したコロニーはＬＢでは増殖するものの、ＬＢ＋１０ｍｇ／Ｌカナマイシンでは増殖しない。電気穿孔法により、プラスミドＭＣＭ８２及びｐＣＨＬ２４３をＣＭＰ１１０７及び１１０８に同時に導入した。それぞれに関し、ＬＢ＋カルベニシリン５０ｍｇ／Ｌ及びスペクチノマイシン５０ｍｇ／Ｌで増殖したコロニーを選別し、それぞれＣＭＰ１１１２及びＣＭＰ１１１３と命名した。
【０３０９】
実施例１３：ｉｓｐＡの後ろに収束性誘導プロモーター（convergent inducible promoter）を保有している株の構築
所与の時点でｉｓｐＡの発現を低下させるための代替法は、収束性誘導プロモーターを遺伝子の下流に配置するというものである。この方法は、これまでに、ｐｙｋＦの発現を低下させる際に良好に適用されている（Ｋｒｙｌｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１８：１〜１３）。
【０３１０】
一実施形態では、株ＣＭＰ１０１８において、ｉｓｐＡの下流にＴｒｃプロモーターを挿入する。プラスミドＭＣＭ８２（米国特許出願第２０１１／０１５９５５７号を参照されたい）及びｐＣＨＬ２４３を電気穿孔法により同時に株に導入した。ＬＢ＋カルベニシリン５０ｍｇ／Ｌ及びスペクチノマイシン５０ｍｇ／Ｌで増殖したコロニーを選別し、それぞれＣＭＰ１１１２及びＣＭＰ１１１３と命名する。ＩＰＴＧによる誘導時に、ＩｓｐＡの発現が低下することによりＴｒｃプロモーターが誘導される。
【０３１１】
実施例１４：ＩｓｐＡ発現を低下させるためのアンチセンスＲＮＡの利用
アンチセンスＲＮＡ法は、標的とする遺伝子の減弱を得るための手法を提示する。この手法は、酢酸の産生を低減させる際（Ｋｉｍ  Ｊ．ａｎｄ  Ｃｈａ  Ｈ．Ｊ．，２００３，Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｂｉｏｅｎｇ．，２８３：８４１〜８５３）、又は遺伝子操作によりカタラーゼをノックアウトさせて表現型を生成する際（Ｃｈａｎ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４：１２７〜１３４）に大腸菌（E. coli）において使用されてきた。
【０３１２】
大腸菌（E. coli）のｉｓｐＡ遺伝子を標的としたアンチセンスコンストラクトの設計は、Ｓｈａｏ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３４：５６６０〜５６６９に報告される方法を使用し作製することができる。アンチセンスＲＮＡ分子は、対化した終端を使用し安定化することができる（Ｎａｋａｓｈｉｍａ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３４：ｅ１３８）。ＭＣＭ８２又はｐＣＨＬ２４３においてオペロンの末端にこれらのコンストラクトを配置する。これらのアンチセンスＲＮＡコンストラクトを使用することで、結果としてイソプレンの収率が増加し得る。
【０３１３】
実施例１５：異種リプレッサータンパク質ＨｒｃＡによるｉｓｐＡ発現の低下
ｉｓｐＡの発現を調節するための代替法には、これまでに同定されているカウロバクター・クレセンタス（Caulobacter crescentus）の転写抑制因子ＨｒｃＡを利用するというものがある（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７８（７）：１８２９〜１８４１；Ｓｕｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１８６（２０）：６７５９〜６７６７）。ＨｒｃＡをコードしている遺伝子は、多くの微生物（例えば、大腸菌（E. coli））においては天然では見られず、ＨｒｃＡにより認識され、これらの微生物における遺伝子発現の管理に関係するＣＩＲＣＥエレメントであるとは考えられていない。したがって、ｉｓｐＡの発現を管理する制御配列内にＣＩＲＣＥエレメントを組み込むことで、ＨｒｃＡ介在性のｉｓｐＡ抑制が可能になる。更に、厳密に制御される数多くの手段のうちの少なくとも１つにより発現が管理され得る異種ｈｒｃＡ遺伝子を導入することができる。このように制御系の仕組みを遺伝子操作することで、結果として、発酵時の増殖が緩慢な期間又は高イソプレン産生期間中の所定の期間、ｈｒｃＡの発現が誘導されることになる。このような方法を例証するため、緊密に制御された遺伝子発現調節系の例を以降に記載する。
【０３１４】
下流の必須遺伝子ｄｘｓの発現に対する影響を排除するため、２段階法を利用した。最初に、ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）などの標準法を用い、内在性の遺伝子座からｉｓｐＡの５’側の半分を除去する。これにより、連結している遺伝子ｘｓｅＢ及びｄｘｓを通常発現させて、３つの遺伝子オペロン；ｘｓｅＢ−ｉｓｐＡ−ｄｘｓを形成する天然の遺伝子座に未変化のまま残すことができる（Ｅｃｏｃｙｃデータベースのｅｃｏｃｙｃ．ｏｒｇを参照されたい）。次に、オンラインのＳｏｆｔＢｅｒｒｙ  ｔｏｏｌ  ＢＰＲＯＭによる細菌プロモーターの予測（ｈｔｔｐ：／／ｌｉｎｕｘ１．ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ．ｃｏｍ／ｂｅｒｒｙ．ｐｈｔｍｌ？ｔｏｐｉｃ＝ｂｐｒｏｍ＆ｇｒｏｕｐ＝ｐｒｏｇｒａｍｓ＆ｓｕｂｇｒｏｕｐ＝ｇｆｉｎｄｂ）を使用するプロモーター検索により、ｄｘｓ発現を管理するσ−７０依存型プロモーターがｉｓｐＡ遺伝子の３’側の半分に存在するものと予想する。これにより、ｉｓｐＡを欠失させることで、続いて、直後に記載する、ランダム化したｉｓｐＡ  ＨｒｃＡにより管理される対立遺伝子の導入が生じる。
【０３１５】
ＨｒｃＡにより制御されているプロモーターにより管理されている、コドンをランダム化したｉｓｐＡをコードしている配列（図８を参照されたい）をＧｅｎｅ  Ｏｒａｃｌｅ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）から得て、標準的なＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ法を使用し、イソプレンを産生する大腸菌（E. coli）株の染色体に導入する。イソプレン産生を最適化するために、イソプレン産生の際の候補として２種類のプロモーターを試験することもできる。更なる使用に際し、増殖期中に野生型ｉｓｐＡの遺伝子座をもつ株と同程度ｉｓｐＡを産生する候補を選択した。候補とする２種類のプロモーターとしては：プロモーター候補１）予想される転写開始部位の３’側にＣＩＲＣＥエレメントを導入された３遺伝子オペロンの発現を推進するものと推測される、ｘｓｅＢ上流の制御配列部位；及びプロモーター候補２）ｘｓｅＢコード配列の一部を包含するｉｓｐＡの上流の制御領域部位が挙げられ、オンラインＳｏｆｔＢｅｒｒｙ  ｔｏｏｌ  ＢＰＲＯＭにより、予想される転写開始部位の３’側にＣＩＲＣＥエレメントを導入された細菌プロモーターが予想される。ＣＩＲＣＥエレメント配列、並びにｉｓｐＡの発現を管理するよう計画されたプロモーターの配置は、Ｂａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１８０（７）：１６３２〜１６４１の図１０において提供される情報から導き出される。
【０３１６】
プロモーター候補１）に関し、ボールド体のみの場合には推定される転写開始部位であり、下線を付した配列は参照（上掲Ｂａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．）に記載のＣＩＲＣＥエレメントであり、ボールド体で下線を付されたものはＣＩＲＣＥエレメントの左側及び右側の逆方向反復配列であり、ボールド体の小文字は予想されるＲＢＳであり、小文字のａｔｇは開始コドンである。
2015510392.tif 000013
【０３１７】
プロモーター候補２）に関し、ボールド体のみの場合には推定される転写開始部位であり、下線を付した配列は参照（上掲Ｂａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．）に記載のＣＩＲＣＥエレメントであり、ボールド体で下線を付されたものはＣＩＲＣＥエレメントの左及び右側の逆方向反復配列であり、ボールド体の小文字は予想されるＲＢＳであり、小文字のａｔｇは開始コドンである。
2015510392.tif 000014
【０３１８】
ｈｒｃＡの対立遺伝子を大腸菌（E. coli）において発現させるためのコドン最適化は、Ｇｅｎｅ  Ｏｒａｃｌｅ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）から得ることができる。ヌクレオチド配列については図１８を参照のこと。これまでに議論したとおり、ＨｒｃＡ制御因子の発現に関与する的確なプロモーターは、大腸菌（E. coli）のイソプレン産生系の数多くの生理学的に関連する特質に由来するものであり得る。このような例では、ＩＰＴＧにより制御されるＴａｃプロモーターを利用して、ｐＫ１８４由来のプラスミドベクターからＰＴａｃ−ｈｒｃＡを発現させることができる（Ｊｏｂｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８（１７）：５３１５〜５３１６）。標準的な電気穿孔法により、ＰＴａｃ−ｈｒｃＡコンストラクトを、ΔｉｓｐＡプロモーター候補１）ランダム化したｉｓｐＡバックグラウンド、並びにΔｉｓｐＡプロモーター候補２）ランダム化したｉｓｐＡバックグラウンド中に移動させ、５０ｕｇ／ｍＬカナマイシンＬＢ培地プレートなどといった、適切な抗生物質を付加したプレートで選別する。得られる一連のカナマイシン耐性コロニーを単離し、イソプレン産生の増強など得られ得る効果を評価するため、更に試験する。
【０３１９】
Ｔａｃプロモーターに関し、ボールド体の小文字は予想されるＲＢＳであり、小文字のａｔｇは開始コドンである。
2015510392.tif 000015
【０３２０】
抗ＩｓｐＡ抗体を使用して、液体培地内のＩｓｐＡの蓄積を監視することができる。所望により、抗ＨｒｃＡ抗体を使用して、宿主内でのこのタンパク質の機能性を検証する目的で、前駆体濃度を監視することもできる。設計されたプロモーター候補１）及び２）のＨｒｃＡ抑制性に加えて、イソプレン産生宿主細胞内での、ＨｒｃＡ制御因子の発現及び機能の成功は、ＩＰＴＧの付加後のＩｓｐＡ濃度に反映され得る。プロモーター候補１）及び２）は、ＣＩＲＣＥエレメントにＨｒｃＡを結合させることにより抑制することができ、その結果ＩｓｐＡの蓄積の減少が観察されることになる。この観察は、培養物に加えられる誘導物質ＩＰＴＧの濃度と逆相関する。
【０３２１】
ＩｓｐＡ濃度の低下と関連する任意の表現形について、顕微鏡観察により細胞を監視することができる。更に、増殖速度の測定のために細胞を監視することもできる。ＩｓｐＡ濃度の著しい低下により、結果として、増殖が緩慢になることが見込まれ、並びにＩｓｐＡの蓄積が不十分になり又は損なわれて増殖が停止し、及び細胞生存率が低下することが見込まれる。更に、ΔｉｓｐＡプロモーター候補１）ランダム化ｉｓｐＡ、並びにΔｉｓｐＡプロモーター候補２）ランダム化ｉｓｐＡバックグラウンドのｑＲＴ−ＰＣＲを実施して、ＨｒｃＡ発現の欠損下で、各プロモーター候補によりどの程度の量のＩｓｐＡ及びｉｓｐＡのｍＲＮＡが生成されるのか測定することができる。この情報に加え、株の増殖及び挙動は、最適な発現調節をもたらすプロモーターを決める際の指針として役立ち得る。
【０３２２】
実施例１６：キシロースによるｉｓｐＡ発現の制御
本明細書に記載されるとおり、ｉｓｐＡの発現を低下させることにより、イソプレンを産生するよう遺伝子操作した細胞がグルコースから産生するイソプレンの収率が大幅に増加し得る。炭素源利用能により介在される遺伝子発現制御は、産生宿主内でｉｓｐＡの発現を調節する際のスケーラブルな代替法である。このような方法により、バイオマスの迅速な置換えを可能にする健康的でロバストで高速な細胞増殖に必要とされる、比較的正常なレベル及び／又は十分なレベルのｉｓｐＡの発現が提供され得る。加えて、ｉｓｐＡ活性が細胞生存率に有害であるものとして考えられる場合、このような方法により、グルコースにより支持されるイソプレン産生の主要な期間中にｉｓｐＡを限定的に発現する能力がもたらされ、結果として、グルコースから産生されるイソプレンの収率が低下する。炭素源を制限した遺伝子発現を用いることで、ＩＰＴＧなどの化学的誘導剤の費用が高く付く場合のある大規模での遺伝子発現を経済的に実施することができる。
【０３２３】
一実施例では、イソプレン産生宿主株におけるｉｓｐＡ発現は、大腸菌（E. coli）に対して内在性のｘｙｌＡ又はｘｙｌＦプロモーターの直接的な調節下に置かれ、あるいはイソプレンを産生するよう遺伝子操作された大腸菌（E. coli）細胞内でＤ−キシロースにより正に影響し、かつグルコースにより負に影響する任意のプロモーターの調節下に置かれる。これは、内在性ｉｓｐＡ遺伝子を欠失させ、Ｄ−キシロース応答性プロモーターのｘｙｌＡ又はｘｙｌＦの何れかの調節下で異種ｉｓｐＡを置換することにより実施される。大腸菌（E. coli）の多様なｘｙｌＡ−ｘｙｌＦプロモーター、並びにＤ−キシロース及び転写活性化因子ＸｙｌＲを介するそれらのプロモーターの正の制御、及びグルコース及び代謝産物の抑制によるそれらのプロモーターの負の制御がこれまでに報告されている（Ｓ．Ｓｏｎｇ  ａｎｄ  Ｃ．Ｐａｒｋ，１９９７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．，１７９（２２）：７０２５〜７０３２）。これらの細胞では、ＩｓｐＡ活性は、グルコースの非存在下でのキシロース利用能により正に、並びにグルコースの存在により負に管理される。キシロース誘導性のｉｓｐＡ座は、宿主の染色体内に存在するものの、あるいは、プラスミドなどの染色体外のヌクレオチド配列によりコードされてもよい。キシロースにより誘導することのできるｉｓｐＡコンストラクトの構築、並びにイソプレンを産生する大腸菌（E. coli）宿主へのコンストラクトの導入は、標準的な分子生物学的及び微生物学的手法を使用し実施することができる（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ．１９８９）。
【０３２４】
最初に、Ｄ−キシロースを唯一の炭素源として存在させ、ＩｓｐＡ活性をコードしている唯一の遺伝子座としてｘｙｌＡプロモーター−ｉｓｐＡ又はｘｙｌＦプロモーター−ｉｓｐＡのいずれかを保有しているイソプレン産生株を増殖させる。所望の時点で、発酵を実施するために発酵槽にグルコースを送り込み、ｉｓｐＡの発現を効果的に抑制し、グルコース代謝により駆動される呼吸を迅速に移行させる。以降の発酵の間中、グルコースは、イソプレン産生に利用される炭素源となる。グルコース存在下では、ｘｙｌＡプロモーター−ｉｓｐＡ又はｘｙｌＦプロモーター−ｉｓｐＡ遺伝子座からの転写、並びにグルコースの非存在下でそれまでに発現された、コードされていたＩｓｐＡに固有の半減期は減少し、結果として、高濃度グルコースにより支持されるイソプレン産生中はＩｓｐＡ活性が著しく低下し、細胞生存率は増強され、イソプレン産生宿主株によりグルコースから生成されるイソプレンの収率が向上する。
【０３２５】
実施例１７：株ＣＭＰ１１３６（−ＰＧＬ）の構築
ｐｇｌ座にカナマイシンカセットを含有しているＫｅｉｏ株ＪＷ０７５０（Ｂａｂａ  ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．２：１〜１１）と、プライマーｐｇｌＡｍｐＦ（５’−ｃａｇｃａａａｔａｇｃａｇｇｔｇｔａｔｃｃａｇｃ−３’（配列番号７１）及びｐｇｌＡｍｐＲ（５’−ＧＣＡ  ＡＣＣ  ＧＡＣ  ＴＧＴ  ＴＧＡ  ＴＡＧ  ＡＡＣ  ＡＡＣ−３’（配列番号７２））とを使用し、実施例４に記載のＰＣＲ法により、ＦＲＴ部位並びにｐｇｌ（ｙｂｈＥ）の上流及び下流に対する相同領域と隣接させたカナマイシンカセットを含有しているＰＣＲ産物を得た。このＰＣＲ産物を使用して、大腸菌（E. coli）ＣＭＰ１０７５（上掲）の組み換え反応を行った（プロトコルについては上記を参照されたい）。コロニーをＬＢ＋カナマイシン１０ｍｇ／Ｌで選別し、ＣＭＰ１１２５と命名した。製造元により推奨されるプロトコルを用い、株ＣＭＰ１１３３からカナマイシンマーカーを除去した（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【０３２６】
プライマーｐｇｌＡｍｐＦ（上掲）及びｐｇｌＲｅｃＣｈｅｃｋ（５’−ＧＧＴ  ＴＡＣ  ＡＡＡ  ＡＴＧ  ＡＴＴ  ＧＧＣ  ＧＴＡ  ＣＧＣ−３’（配列番号７３））を使用してＰＣＲを行い、ＣＭＰ１１３３がｐｇｌ遺伝子を欠失していることを確認した。電気穿孔法により、プラスミドＭＣＭ８２及びｐＣＨＬ２４３をＣＭＰ１１３３に同時に導入した。ＬＢ＋カルベニシリン５０ｍｇ／Ｌ及びスペクチノマイシン５０ｍｇ／Ｌで増殖したコロニーを選別し、ＣＭＰ１１３６と命名した。
【０３２７】
実施例１８：ＣＭＰ１１３６の大規模発酵
本試験を実施して、導入したメバロン酸経路由来遺伝子を発現させかつ１５Ｌ規模の流加式培養で増殖させた大腸菌（E. coli）（ＢＬ２１）によるイソプレン産生を評価した。下記の通りイソプレン産生株ＣＭＰ１０８２（ＨＭＢ  ＧＩ１．２ｇｌｔＡ、ＰｙｄｄＶＩｓｐＡ＿ＧＯ、ｔｒｕｎｃＩｓｐＡ、ｐＭＣＭ８２、ｐＤＷ７２）を使用し、標準的なイソプレン産生工程を実施した。同一条件での試験株ＣＭＰ１１３６（ＨＭＢ  ＧＩ１．２ｇｌｔＡ、ＰｙｄｄＶＩｓｐＡ＿ＧＯ、ｔｒｕｎｃＩｓｐＡ，ｐｇｌ−、ｐＭＣＭ８２、ｐＤＷ７２）の生産指数（グルコースに対する累積イソプレン収率、グルコースに対する瞬間的なイソプレン収率、イソプレンの容積生産量、比生産量及び細胞産生性指数）を比較して、ＣＭＰ１１３６においてｐｇｌ遺伝子を欠失させたことによる収率の向上を確認した。
【０３２８】
培地組成（発酵培地１Ｌ当たり）：Ｋ２ＨＰＯ４（７．５ｇ）、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２ｇ）、クエン酸一水和物（２ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（０．３ｇ）、酵母エキス（０．５ｇ）、５０％硫酸（１．６ｍＬ）、１０００Ｘ改変微量金属溶液（１ｍＬ）。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させた。この溶液を加熱滅菌した（１２３℃で２０分）。水酸化アンモニウム（２８％）によりｐＨを７．０に調整し、容量に調整した。滅菌及びｐＨ調製後にグルコース１０ｇ、ビタミン溶液８ｍＬ、及び抗生物質を加えた。
【０３２９】
１０００Ｘ改変微量金属溶液（１Ｌ当たり）：クエン酸＊Ｈ２Ｏ（４０ｇ）、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）、ＮａＣｌ（１０ｇ）、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）、Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、０．２２μｍのフィルタを用いろ過滅菌した。
【０３３０】
ビタミン溶液（１Ｌ当たり）：塩酸チアミン（１．０ｇ）、Ｄ−（＋）−ビオチン（１．０ｇ）、ニコチン酸（１．０ｇ）、塩酸ピリドキシン（４．０ｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、孔径０．２２μｍのフィルタを用いろ過滅菌した。
【０３３１】
マクロ塩溶液（１Ｌ当たり）：ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２９６ｇ）、クエン酸一水和物（２９６ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（４９．６ｇ）。すべての成分を水に溶解させ、用量に調整し、０．２２μｍのフィルタを用い、ろ過滅菌した。
【０３３２】
供給溶液（１ｋｇ当たり）：グルコース（０．５９０ｋｇ）、脱イオン水（０．３９３ｋｇ）、Ｋ２ＨＰＯ４（７．４ｇ）、及び１００％  Ｆｏａｍｂｌａｓｔ８８２（８．９ｇ）。すべての成分を合わせて混合し、オートクレーブ処理した。供給溶液をオートクレーブ処理した後、滅菌フード内で、供給ボトルに栄養塩類を添加する。滅菌後に供給溶液に添加するものは（供給溶液１ｋｇ当たり）マクロ塩溶液５．５４ｍＬ、ビタミン溶液６．５５ｍＬ、１０００Ｘ改変微量金属溶液０．８２ｍＬである。
【０３３３】
本実験は、所望の発酵ｐＨ（７．０）及び温度（３４℃）でのグルコースからのイソプレン発酵をモニターするために実施した。大腸菌（E.coli）株を凍結したバイアルを解凍し、トリプトン酵母エキス培地及び適切な抗生物質を入れたフラスコに接種した。５５０ｎｍ（ＯＤ５５０）での吸光度が１．０になるまで接種材料を生育させた後、培養物のうち５００ｍＬを１５Ｌのバイオリアクタに接種し、初期槽容量を５Ｌに調整した。
【０３３４】
各バッチの培地には、グルコースを９．７ｇ／Ｌ含有させた。誘導は、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し実施した。細胞のＯＤ５５０が６になったなら、２００μＭの濃度になるようＩＰＴＧを反応槽に添加した。培養によるグルコースの消費がｐＨの上昇により示されたなら、代謝に必要とされる量に足りるよう、１０ｇ／分以下の速度でグルコース供給溶液を供給した。グルコースに対するメバロン酸の最大質量収率を測定するのに十分な時間、すなわち発酵の開始から合計６８〜７２時間にわたって発酵を行った。
【０３３５】
結果
ｐｇｌ−株（ＣＭＰ１１３６）は、ｐｇｌ＋株（ＣＭＰ１０８２）と比較して、グルコースに対するイソプレンの収率（％）が高かった。表８及び図１９を参照されたい。ｐｇｌ−株（ＣＭＰ１１３６）は、ｐｇｌ＋株（ＣＭＰ１０８２）と比較して、グルコースに対するイソプレンの瞬間的な収率（％）が高く、かつこの産生性の高さをより長時間維持した（ｐｇｌ−は最大約２４時間維持したのに対し、ｐｇｌ＋は最大約１２時間維持した）。表８及び図２０を参照されたい。ｐｇｌ−株（ＣＭＰ１１３６）の細胞産生性指数はｐｇｌ＋株（ＣＭＰ１０８２）よりも高かった。６８〜７２時間の発酵終了時に、ｐｇｌ−株はかなり高いＣＰＩを有していた。また、グルコースに対するイソプレンの累積産生性が最大となる時（ｐｇｌ＋株については４４時間及びｐｇｌ−株については５６時間）のＣＰＩはｐｇｌ−株の方が高かった。表８及び図２１を参照されたい。ｐｇｌ−株（ＣＭＰ１１３６）の総容積産生量はｐｇｌ＋株（ＣＭＰ１０８２）のものとおおよそ同程度であった。表８及び図２２を参照されたい。ｐｇｌ−株（ＣＭＰ１１３６）の最大比産生量はｐｇｌ＋株（ＣＭＰ１０８２）のものとおおよそ同程度であった。しかしながら、ｐｇｌ−株（ＣＭＰ１１３６）は、この産生性の高さをｐｇｌ＋株（ＣＭＰ１０８２）よりも長時間維持し、かつ発酵速度が顕著に良好であった。表８及び図２３を参照されたい。
【０３３６】
【表９】
2015510392.tif 000016
【０３３７】
実施例１９：メバロン酸経路上流の遺伝子を発現している大腸菌（E. coli）によるイソプレン産生
本実施例では、導入したメバロン酸経路由来の遺伝子を発現させ、１５Ｌ規模で流加式培養により生育させた大腸菌（E. coli）（ＢＬ２１）におけるイソプレン産生量を評価した。上流ＭＶＡ経路の酵素の遺伝子は、エンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）（ＤＷ７０９及びＤＷ７１７株）、エンテロコッカス・カッセリフラバス（E.casseliflavus）（ＤＷ７１８）又はエンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）のいずれかに由来した（ＤＷ７１９，ＭＣＭ２１５８（ＢＬ２１  ｔ  ｐｇｌ，ＧＩ１．２ｇｌｔＡ  ｐｇｌ−，ｙｈｆＳＦＲＴＰｙｄｄＶＩｓｐＡｙｈｆＳ  ｔｈｉＦＲＴｔｒｕｎｃＩｓｐＡ，ＦＲＴ−ＰＬ．２−２ｃｉｓ−ＲＢＳ１００００−ＭＶＫ（ｂｕｒｔｏｎｉｉ）−ＫＤｙＩ＋ｐＴｒｃＡｌｂａ−ＭＶＫｄｅｌ２＋ｐＣＬ−Ｐｔｒｃ−Ｕｐｐｅｒ＿Ｅｇａｌｌｉｎａｒｕｍ））。
【０３３８】
（ｉ）材料及び方法
株構築：産生宿主株として、大腸菌（Escherichia coli）を、イソプレン合成酵素（ＩｓｐＳ）変異体と、異なる４種の上流ＭＶＡ経路のうちの１種を含有させたプラスミドとにより同時形質転換させて、株ＤＷ７０９、ＤＷ７１７、ＤＷ７１８、及びＤＷ７１９を作製した。標準的な分子生物学的手法に従い、宿主株ＣＭＰ１１３３（ＢＬ２１  Δｐｇｌ  ＰＬ．２ｍＫＫＤｙＩ  ＧＩ１．２ｇｌｔＡ  ｙｈｆＳＦＲＴＰｙｄｄＶＩｓｐＡｙｈｆＳ  ｔｈｉＦＲＴｔｒｕｎｃＩｓｐＡ）に、電気穿孔法により、ＩｓｐＳ変異体を保持しているｐＤＷ２４０（ｐＴｒｃ  Ｐ．ａｌｂａ  ＩｓｐＳ  ＭＥＡ−ｍＭＶＫ（Ｃａｒｂ５０））、並びにｐＭＣＭ８２（米国特許出願公開番号：２００９／０２０３１０２）、ｐＣＨＬ２７６（ｐＣＬ＿ｐＴｒｃ−Ｕｐｐｅｒ（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）−ｌｅａｄｅｒｌｅｓｓ）、ｐＣＨＬ２７７（ｐＣＬ＿ｐＴｒｃ−Ｕｐｐｅｒ（Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）−ｌｅａｄｅｒｌｅｓｓ）、又はｐＭＣＭ１２２５（ｐＣＬ−Ｐｔｒｃ−Ｕｐｐｅｒ＿Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）のいずれかを導入する。細胞を回復させ、選択培地に播種したところ、それぞれスペクチノマイシン及びカルベニシリンに耐性を示す株ＤＷ７０９、ＤＷ７１７、ＤＷ７１８及びＤＷ７１９が得られた。これらのイソプレン産生株は、ＩｓｐＳ変異体と、それぞれエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）由来の上流ＭＶＡ経路、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）由来のｌｅａｄｅｒｌｅｓｓ上流ＭＶＡ経路、エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）由来の上流ＭＶＡ経路、又はエンテロコッカス・ガリラナラム（Enterococcus gallinarum）由来の上流ＭＶＡ経路のいずれかとを発現していた（表９を参照されたい）。株ＭＣＭ２０６５に、電気穿孔法によりプラスミドｐＭＣＭ２１４９を導入し、形質転換体を室温で３日間ＬＡ  ｃａｒｂ５０プレートで選別した。対数増殖期中期まで、単一のコロニーをＬＢ  ｃａｒｂ５０で増殖させ、ＭＣＭ２１５２として、−８０下で３３％グリセロール中で凍結及び保存した。株ＭＣＭ２１５２に、電気穿孔法によりプラスミドｐＭＣＭ１２２５を導入し、形質転換体をＬＡ  ｃａｒｂ５０  ｓｐｅｃ５０プレートで選別した。対数増殖期中期まで、単一のコロニーをＬＢ  ｃａｒｂ５０  ｓｐｅｃ５０で増殖させ、３３％グリセロールに入れ、ＭＣＭ２１５８として凍結した。
【０３３９】
【表１０】
2015510392.tif 000017
【０３４０】
培地組成（発酵培地１Ｌ当たり）：Ｋ２ＨＰＯ４（７．５ｇ）、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２ｇ）、クエン酸一水和物（２ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（０．３ｇ）、酵母エキス（０．５ｇ）、５０％硫酸（１．６ｍＬ）、１０００Ｘ改変微量金属溶液（１ｍＬ）。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させた。この溶液を加熱滅菌した（１２３℃で２０分）。水酸化アンモニウム（２８％）によりｐＨを７．０に調整し、容量に調整した。滅菌及びｐＨ調製後にグルコース１０ｇ、ビタミン溶液８ｍＬ、及び抗生物質を加えた。
【０３４１】
１０００Ｘ改変微量金属溶液（１Ｌ当たり）：クエン酸＊Ｈ２Ｏ（４０ｇ）、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）、ＮａＣｌ（１０ｇ）、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）、Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、０．２２μｍのフィルタを用いろ過滅菌した。
【０３４２】
ビタミン溶液（１Ｌ当たり）：塩酸チアミン（１．０ｇ）、Ｄ−（＋）−ビオチン（１．０ｇ）、ニコチン酸（１．０ｇ）、塩酸ピリドキシン（４．０ｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、孔径０．２２μｍのフィルタを用いろ過滅菌した。
【０３４３】
マクロ塩溶液（１Ｌ当たり）：ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２９６ｇ）、クエン酸一水和物（２９６ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（４９．６ｇ）。すべての成分を水に溶解させ、用量に調整し、０．２２μｍのフィルタを用い、ろ過滅菌した。
【０３４４】
供給溶液（１ｋｇ当たり）：グルコース（０．５９０ｋｇ）、脱イオン水（０．３９３ｋｇ）、Ｋ２ＨＰＯ４（７．４ｇ）、及び１００％  Ｆｏａｍｂｌａｓｔ８８２（８．９ｇ）。すべての成分を合わせて混合し、オートクレーブ処理した。供給溶液をオートクレーブ処理した後、滅菌フード内で、供給ボトルに栄養塩類を添加する。滅菌後に供給溶液に添加するものは（供給溶液１ｋｇ当たり）マクロ塩溶液５．５４ｍＬ、ビタミン溶液６．５５ｍＬ、１０００Ｘ改変微量金属溶液０．８２ｍＬである。
【０３４５】
本実験は、所望の発酵ｐＨ（７．０）及び温度（３４℃）でのグルコースからのイソプレン発酵をモニターするために実施した。大腸菌（E. coli）株を凍結したバイアルを解凍し、トリプトン酵母エキス培地及び適切な抗生物質を入れたフラスコに接種した。５５０ｎｍ（ＯＤ５５０）での吸光度が１．０になるまで接種材料を生育させた後、培養物のうち５００ｍＬを１５Ｌのバイオリアクタに接種し、初期槽容量を５Ｌに調整した。イソプレン産生株に流加培養工程を実施した。
【０３４６】
各バッチの培地には、グルコースを９．７ｇ／Ｌ含有させた。誘導は、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し実施した。細胞のＯＤ５５０が６になったなら、２００μＭの濃度になるようＩＰＴＧを反応槽に添加した。培養によるグルコースの消費がｐＨの上昇により示されたなら、代謝に必要とされる量に足りるよう、１０ｇ／分以下の速度でグルコース供給溶液を供給した。グルコースに対するメバロン酸の最大質量収率を測定するのに十分な時間、すなわち発酵の開始から合計６４〜６８時間にわたって発酵を行った。
【０３４７】
解析法：イソプレンは揮発性であり、吹きこみガスにより槽から効率的に回収することができる。バイオリアクタのオフガス中のイソプレン濃度は、２つの質量分析器ｉＳＣＡＮ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｓｕｎｄｓｔｒａｎｄ）及びＨｉｄｅｎ  ＨＰＲ２０（Ｈｉｄｅｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）質量分析器を使用して測定した。オフガス中の酸素、窒素及びＣＯ２濃度は、同様の質量分析ユニットにより測定した。発酵ブロス中の溶存酸素は、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙにより提供された光学センサーを備えた衛生的であり滅菌可能なプローブにより測定した。
【０３４８】
４時間間隔でブロス試料にＨＰＬＣ解析を行い、発酵ブロス中のクエン酸、グルコース、酢酸及びメバロン酸濃度を測定した。屈折率と、濃度既知の標準を使用して予め作成した検量線とを比較して、ブロス試料中の濃度を測定した。
【０３４９】
（ｉｉ）結果：
【０３５０】
【表１１】
2015510392.tif 000018
【０３５１】
表１０に要約するとおり、エンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）の上流ＭＶＡ経路を使用する発酵と比較して、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）又はエンテロコッカス・カッセリフラバス（E. casseliflavus）のいずれかの上流ＭＶＡ経路の酵素を使用する発酵の方が、合計質量収率が高く（図２４）、最大容積産生量が大きく（図２５）、最大比産生量が高かった（図２６）。加えて、細胞中アセチルＣｏ−Ａ濃度は、エンテロコッカス・カッセリフラバス（E. casseliflavus）又はエンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）の経路を含有させた株と比較して、低かった（表１１）。このアセチルＣｏＡ濃度の低下は、細胞中でＭＶＡ経路に取り込まれる炭素量が増加していることの指標となる。
【０３５２】
【表１２】
2015510392.tif 000019
【０３５３】
実施例２０：ＩｓｐＡの発現を改変するためのリボソーム結合部位の設計（ＲＢＳ）
Ｖｉｅｎｎａ  ＲＮＡパッケージｖ．１．８．４（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｂｉ．ｕｎｉｖｉｅ．ａｃ．ａｔ／〜ｉｖｏ／ＲＮＡ／、Ａｎｄｒｅａｓ  Ｒ．Ｇｒｕｂｅｒ、Ｒｏｎｎｙ  Ｌｏｒｅｎｚ、Ｓｔｅｐｈａｎ  Ｈ．Ｂｅｒｎｈａｒｔ、Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｎｅｕｂｏｃｋ及びＩｖｏ  Ｌ．Ｈｏｆａｃｋｅｒ（ＮＡＲ、２００８））により算出された、ＲＮＡの熱力学的パラメーターと、ＲＢＳ  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ用のＶｉｅｎｎａ  ＲＮＡモジュールを利用し、ＲＢＳ  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒの最適化ソフトウェアを使用した。ＲＢＳは、ＬｉｎｕｘサーバーでＰｙｔｈｏｎ  ｖ．２．４．３．を起動させ算出した。
【０３５４】
（ｉ）材料及び方法
ＰｙｄｄＶの転写開始部位は未知であることから、ＩｓｐＡ  ＯＲＦの上流４０、３０、又は２０ｎｔ及びＯＲＦの最初の５０ｎｔを含有するＰｙｄｄｖ−ＩｓｐＡコンストラクト由来の配列を、予想されるＲＢＳ強度に関し解析した（表１２を参照されたい）。
【０３５５】
【表１３】
2015510392.tif 000020
【０３５６】
実験系を設計するにあたり、７５を対象強度として選択した。ＲＢＳの５’ＵＴＲの上流（２７ｎｔ、ＯＲＦの４０ｎｔ上流から開始）及び５０ｎｔのＯＲＦ配列を使用し、新しいＲＢＳを設計した。対象とする所与の強度の複数のＲＢＳを算出した。上流の５’ＵＴＲ配列ｔｇａｔｔｃｃｇｔｃｔｇａｔｔｔｃｃｃａｇｃｃｔｔａｔ（配列番号７４）及び下流のＯＲＦ配列ａｔｇｇａｃｔｔｔｃｃｇｃａａｃａａｔｔｇｇａｇｇｃｇｔｇｃｇｔａａａｇｃａａｇｃａａａｔｃａａｇｃ（配列番号７５）を使用して、対象とする強度８、２５、２２５、及び６７５（内在性ＲＢＳスコア７５の１／９倍、１／３倍、３倍、及び９倍）のＲＢＳを設計した。
【０３５７】
（ｉｉ）結果：
計算による複数回の設計により、対象とする各スコアのために２〜３つのＲＢＳを設計した（表１３を参照されたい）。
【０３５８】
【表１４】
2015510392.tif 000021
【０３５９】
異なる長さのＵＴＲに関する文脈において、これらのＲＢＳに予想されるＲＢＳ強度の解析により、内在性ＲＢＳよりも低強度の依存性が示された。
【０３６０】
実施例２１：様々なＲＢＳ算出コンストラクトのクローニング／発現
製造元（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）のプロトコルに従い、プラスミドｐＣＭＰ１０４６に対しＱｕｉｋｃｈａｎｇｅによる反応を実施し、変更を加えた３種のＲＢＳを得た。表１４に掲載されるプライマーを使用した。ＤｐｎＩによる消化後、反応液により大腸菌（E. coli）Ｔｏｐ１０細胞（インビトロジェン，Ｃａｒｌｓｂｄａｄ，ＣＡ）を形質転換させ、形質転換体をＬＢ＋カナマイシン２０ｍｇ／Ｌで選別した。反応毎に６つのコロニーからプラスミドを単離し、配列決定を行った。所望のＲＢＳを含有するプラスミドを、それぞれｐＣＭＰ１２４９（ＲＢＳ  １／３）、ｐＣＭＰ１２５８（ＲＢＳ  ３）及びｐＣＭＰ１２５９（ＲＢＳ  ９）と命名した。
【０３６１】
プライマーＣＭＰ２５７（５’−ｃａｔｔｃｇｃｇｃｃｇｃａｔｔｃａｃａｇｃｃｇａｔｔｃｇａｇｃｃａｃｃｔｔｃａｔｃａｃｃｇｃａｔａｇｔｔｇｔｃａｔｃｇｇｔｔａａｃｇｃｔｇｇａａｃａｃ−３’（配列番号９０））及びＣＭＰ２５８（５’−ＧＧＴＴＡＴＴＡＴＴＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＧＧＣＴＧＡＣＧＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＴＧＡＴＴＴＣＡＡＴＧＡＣＣＴＧＴＣＧＧ  ＣＡＣＴＧＡＡＧＣＡＧＧ−３’（配列番号９１））を使用するＰＣＲ反応には、プラスミドｐＣＭＰ１２４９、１２５８及び１２５９をテンプレートとして使用した。Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製キット（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用してＰＣＲ産物を精製し、制限酵素ＤｐｎＩにより消化した。更なる精製後、株ＣＭＰ１１３３の組み換え反応（上掲Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ）にこれらのＰＣＲ産物を使用した。形質転換体を、ＬＢ＋１０ｍｇ／Ｌカナマイシンで選別した。各形質転換体のうち、ＰＣＲ（プライマーＣＭＰ２６７（５’−ｃｇａｔｔｃｇａｇｃｃａｃｃｔｔｃａｔｃａｃｃ−３’（配列番号９２））及びＣＭＰ２６８（５’−ＣＡＧＣＧＴＣＴＴＣＴＧＧＴＧＣＡＴＧＡＣＧ−３’（配列番号９３）））により妥当な大きさであるものと判断された１つのコロニーをＣＭＰ１０６７と命名した。ｐＣＰ２０（上掲Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ）からカナマイシンマーカーを除去し、それぞれＣＭＰ１２６２、ＣＭＰ１２６６及びＣＭＰ１２６７を作製した（表１５を参照されたい）。除去を行うため、ｐＣＰ２０（５０ｍｇ／Ｌカルベニシリンにより３０℃下で増殖）により形質転換させたコロニーをＬＢに画線し、４２℃で一晩増殖させた。１日後、コロニーを採取し、ＬＢ並びにＬＢ＋１０ｍｇ／Ｌカナマイシンに接種した。マーカーを除去したコロニーはＬＢでは増殖するもののＬＢ＋１０ｍｇ／Ｌカナマイシンでは増殖しない。電気穿孔法により、プラスミドｐＭＣＭ１２２５及びｐＤＷ２４０を、ＣＭＰ１２６５、１２６６及び１２６７に同時に導入した。各形質転換に関し、ＬＢ＋カルベニシリン５０ｍｇ／Ｌ及びスペクチノマイシン５０ｍｇ／Ｌで生育したコロニーを選択した。これらのコロニーは、それぞれＣＭＰ１２７５、ＣＭＰ１２８４、及びＣＭＰ１２８６と命名した（表１５を参照されたい）。
【０３６２】
【表１５】
2015510392.tif 000022
【０３６３】
【表１６】
2015510392.tif 000023
【０３６４】
実施例２２：ファルネシル二リン酸合成酵素（ＩｓｐＡ）の発現解析
大腸菌（E. coli）細胞溶解液中のファルネシル二リン酸合成酵素（ＩｓｐＡ）発現レベルを定量するため、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を開発した。この方法を用い、表１６に記載の株についてＩｓｐＡの濃度を解析した。
【０３６５】
【表１７】
2015510392.tif 000024
【０３６６】
（ｉ）材料及び方法
Ｈｉｓ−ＩｓｐＡ酵素を所内で精製した。ＰｒｏＳｃｉ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄにより、アフィニティ精製した抗ＩｓｐＡ抗体及びビオチン化抗ＩｓｐＡ抗体を準備した。高感度ストレプトアビジン−ＨＲＰ、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、黒色９６ウェルプレートｃｏｓｔａｒ  ３９１５、ＥＬＩＳＡプレートシール、及び１０Ｘ  ＰＢＳは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホン酸フルオリド塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）、ウシ膵臓由来デオキシリボヌクレアーゼ１、ＮａＣｌ、イミダゾール、ＨＥＰＥＳ、ＮａＨ２ＰＯ４、ＥＤＴＡ、ＤＴＴ、Ｔｗｅｅｎ−２０、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び２００ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）はＳｉｇｍａから購入した。ＩＭＡＣ  ＨＰトラップカラム及びＰｒｅｐ  ２６／１０脱塩カラムはＨＰから購入した。ＥＬＩＳＡプレート洗浄緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）は、１Ｘ  ＰＢＳと０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０から構成された。ブロッキング緩衝液は、５％  ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ｔ溶液から構成された。ニッケルカラム洗浄緩衝液（ｐＨ  ８）には、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４及び３００ｍＭ  ＮａＣｌを含有させた。ニッケルカラム溶出緩衝液（ｐＨ  ８）は、２０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ及び５００ｍＭイミダゾールから構成された。フレンチプレスはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙから購入した。
【０３６７】
ＩｓｐＡ精製：ＭＤ０８＿６７（ｉｓｐＡ−Ｄ２２７Ｄ−ｐＥＴ２００Ｄ  ｉｎ  ＢＬ２１（ＤＥ３））の一晩培養物を、３０℃にて一晩、ＬＢ培地で増殖させた。１０ｍＬの一晩培養した接種菌液を１Ｌの新鮮なＬＢ培地に加え、新鮮なＬＢ培地において３４℃にて培養を開始した。細胞に２００μＭ  ＩＰＴＧにより発現誘導を行い、誘導から４時間後に回収した。細胞ペレットを、１ｍｇ／ｍＬリゾチーム、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＤＮａｓｅ、及び０．５ｍＭ  ＡＥＢＳＦを添加したニッケル洗浄緩衝液に再懸濁した。フレンチプレスセルにより、細胞懸濁液を９６．５ＭＰａ（１４，０００ｐｓｉ）で可溶化した。細胞溶解液の上清を、ニッケルカラムに通過させ、ニッケル溶出緩衝液を用い溶出した。更にアフィニティ精製するため、精製した酵素画分を１Ｘ  ＰＢＳにより脱塩し、抗体製剤により標識した。精製した酵素濃度をＵＶ  ２８０ｎｍにより測定した。
【０３６８】
ＩｓｐＡの発現解析のための細胞溶解法：ＩｓｐＡの発現解析のため、０．１％  ＤＮａｓｅ及び０．５ｍＭ  ＡＥＢＳＦを添加した２ｍＬ  １Ｘ  ＰＢＳに発酵試料の細胞ペレットを再懸濁した。フレンチプレスセルにより、細胞懸濁液を９６．５ＭＰａ（１４，０００ｐｓｉ）で可溶化した。次に、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５８０４Ｒ遠心機により、細胞溶解液を４℃にて１５，０００ｒｐｍで１０分遠心分離した。上清及びペレットを分離し、この上清を使用して、ＩｓｐＡの発現レベルを定量した。
【０３６９】
サンドイッチＥＬＩＳＡ法：黒色９６ウェルプレートを、５μｇ／ｍＬ捕捉抗体により４℃で一晩コーティングした。約２４時間後、プレートをＰＢＳ−Ｔにより３回洗浄し、５％  ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔにより３７℃で２時間ブロッキングした。ＰＢＳ−Ｔにより３回洗浄後、プレートを未知の試料のＰＢＳ溶液１００μＬにより３７℃で１時間、２μｇ／ｍＬビオチン化抗ＩｓｐＡ抗体のＰＢＳ−Ｔ溶液により３４℃で１時間、並びに１μｇ／ｍＬのストレプトアビジン−ＨＲＰ複合体のＰＢＳ溶液により３４℃で１時間コーティングした。各コーティングに先立ち、プレートはＰＢＳ−Ｔにより３回洗浄した。続いて、１００μＬの発光基質を加え、終点の吸光度を４２５ｎｍで測定した。精製したＩｓｐＡを使用して検量線を作成し、試料中のＩｓｐＡ濃度を算出した（表１７及び図２７を参照されたい）。
【０３７０】
【表１８】
2015510392.tif 000025
【０３７１】
結果
表１７に見られる通り、低減したｉｓｐＡの発現レベルを有するよう遺伝子操作した各大腸菌（E. coli）株は、野生型ｉｓｐＡを保有している対照株（ＢＬ２１）と比較して、著しく低いｉｓｐＡ発現レベルを示した。
【０３７２】
実施例２３：大規模発酵の結果
この実験は、メバロン酸／イソプレン経路から導入した遺伝子を発現する、各種改変を施した大腸菌（E. coli）（ＢＬ２１）宿主（ＣＭＰ１２７５、ＣＭＰ１２８４、ＣＭＰ１２８６）からのイソプレン産生を評価するために実施し、これらの大腸菌を１５Ｌ規模での流加培養で増殖させた。これらの株に導入された宿主の改変は、ＩｓｐＡの前にあるｙｄｄＶプロモーターに対するものであり（表１８を参照されたい）、改変は、プロモーター強度、したがってＩｓｐＡ発現レベルを改変すべくＲＢＳ計算機に従って設計された。以下に記載のとおり、標準的な産生工程において、これらのイソプレン産生株の培養を実施した。ここでは、対照株（ＤＷ７１９）の性能指数を、実験株ＣＭＰ１２７５（ＲＢＳ１／３）、ＣＭＰ１２８４（ＲＢＳ３）及びＣＭＰ１２８６（ＲＢＳ９）と比較する。これらの実験の目標は、細胞生存率を最大化し、及びグルコース又はイソプレン産生性に対するイソプレン収率を増加させる目的で、このような方法においてＩｓｐＡ発現を改変することで、生成され得る毒性の中間体ＦＰＰ及びＧＰＰへの取り込みが最小限に抑えられるかを判定するというものである。対照（ＤＷ７１９）として、同一条件下で実験用「ＲＢＳ  ｌａｄｄｅｒ」株を培養し、ＩｓｐＡの発現を改変することで何らかの収率又は産生性の改善が得られるかを判断する。リボソーム結合強度（ＲＢＳ）１でモデルを開始し、異なるＲＢＳ配列により、１／３（３倍減）、３（３倍増）及び９（９倍増）の予想リボソーム結合強度を対象とする値が得られる。しかしながら、ＩｓｐＡの実際の発現レベルはこの実験では測定されなかった。
【０３７３】
【表１９】
2015510392.tif 000026
【０３７４】
本実験では、ＤＷ７１９（ＹｄｄＶプロモーター−ＩｓｐＡ）を基準株として使用した。ＲＥＭ  Ｂ７＿２６（ＣＭＰ１１９９（ＨＭＢ  ＧＩ１．２ｇｌｔＡ  ｐｇｌ−）＋ｐＤＷ２４０＋ｐＭＣＭ１２２５）を含有している野生型ＩｓｐＡ株を使用し、典型的な小規模条件下で実験を開始する際、株のイソプレン産生能をＤＷ７１９と比較して評価を行ったことに留意されたい。ＤＷ７１９は、ＲＥＭ  Ｂ７＿２６（比産生性は１０，１８４μｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤイソプレン）と比較してより良好な増殖性及び比産生性（１８，２７６μｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤイソプレン）を示した。したがって、株ＤＷ７１９の比産生性は、野生株のほとんど２倍超であった。ＲＥＭ  Ｂ７＿２６の小規模でのイソプレン産生をもとに、この株では１５Ｌ発酵は実施しなかった。
【０３７５】
（ｉ）材料及び方法
培地組成（発酵培地１Ｌ当たり）：Ｋ２ＨＰＯ４（７．５ｇ）、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２ｇ）、クエン酸一水和物（２ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（０．３ｇ）、酵母エキス（０．５ｇ）、５０％硫酸（１．６ｍＬ）、１０００Ｘ改変微量金属溶液（１ｍＬ）。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させた。この溶液を加熱滅菌した（１２３℃、２０分間）。水酸化アンモニウム（２８％）によりｐＨを７．０に調整し、容量に調整した。滅菌及びｐＨ調製後にグルコース１０ｇ、ビタミン溶液８ｍＬ、及び抗生物質を加えた。
【０３７６】
１０００Ｘ改変微量金属溶液（１Ｌ当たり）：クエン酸＊Ｈ２Ｏ（４０ｇ）、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）、ＮａＣｌ（１０ｇ）、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）、Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、０．２２μｍのフィルタを用いろ過滅菌した。
【０３７７】
ビタミン溶液（１Ｌ当たり）：塩酸チアミン（１．０ｇ）、Ｄ−（＋）−ビオチン（１．０ｇ）、ニコチン酸（１．０ｇ）、塩酸ピリドキシン（４．０ｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、孔径０．２２μｍのフィルタを用いろ過滅菌した。
【０３７８】
マクロ塩溶液（１Ｌ当たり）：ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２９６ｇ）、クエン酸一水和物（２９６ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（４９．６ｇ）。すべての成分を水に溶解させ、用量に調整し、０．２２μｍのフィルタを用い、ろ過滅菌した。
【０３７９】
供給溶液（１ｋｇ当たり）：グルコース（０．５９０ｋｇ）、脱イオン水（０．３９３ｋｇ）、Ｋ２ＨＰＯ４（７．４ｇ）、及び１００％  Ｆｏａｍｂｌａｓｔ８８２（８．９ｇ）。すべての成分を合わせて混合し、オートクレーブ処理した。供給溶液をオートクレーブ処理した後、滅菌フード内で、供給ボトルに栄養塩類を添加する。滅菌後に、供給溶液には、マクロ塩溶液５．５４ｍＬ、ビタミン溶液６．５５ｍＬ、１０００Ｘ改変微量金属溶液０．８２ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ  ＩＰＴＧ溶液（１．８６ｍＬ）を添加する（供給溶液１ｋｇ毎）。
【０３８０】
本実施例は、所望の発酵ｐＨ（７．０）及び温度（３４℃）でのグルコースからのイソプレン産生を監視するために実施した。各実験を開始する際、大腸菌（E. coli）（ＢＬ２１）株の適切な凍結バイアルを解凍し、トリプトン酵母エキスの培地（ＬＢ）並びに適切な抗生物質を入れたフラスコに接種した。５５０ｎｍ（ＯＤ５５０）での吸光度が約１．０になるまで接種材料を増殖させた後、５００ｍＬを１５Ｌのバイオリアクタに接種し、初期槽容量を５Ｌに調整した。
【０３８１】
バイオリアクタの内圧をゲージ圧で７０ｋＰａ（０．７ｂａｒ）に維持し、産生生物に酸素をもたらすために使用した吹きこみガスは、取り込み気体を既知の濃度（７．７〜９．５体積％酸素）に希釈する工場内設備により供給した。
【０３８２】
各バッチの培地には、グルコースを９．７ｇ／Ｌ含有させた。ＩＰＴＧを添加することで導入を実施した。細胞のＯＤ５５０が６になったなら、所定の濃度になるようＩＰＴＧを反応槽に添加した。培養によるグルコースの消費がｐＨの上昇により示されたなら、代謝に必要とされる量に足りるよう、１０ｇ／分以下の速度でグルコース供給溶液を供給した。グルコースに対するイソプレンの最大累積質量収率を測定するのに十分な時間、すなわち発酵の開始から合計５６〜６４時間にわたって発酵を行った。工程においては、培養を開始するために使用した株のみを可変要素とした。
【０３８３】
オフガス中の酸素、窒素、及び二酸化炭素濃度は、質量分析計ｉＳＣＡＮ（ハミルトン・サンドストランド）及びＨｉｄｅｎ  ＨＰＲ２０（ハイデン・アナリティカル）を使用して独立して求めた。発酵ブロス中の溶存酸素は、ハミルトン社により提供された光学センサーを備えた衛生的であり滅菌可能なプローブにより測定した。
【０３８４】
４時間間隔でブロス試料にＨＰＬＣ解析を行い、発酵ブロス中のクエン酸、グルコース、酢酸及びメバロン酸濃度を測定した。屈折率と、濃度既知の標準を使用して予め作成した検量線とを比較して、ブロス試料中の濃度を測定した。関連するＨＰＬＣ情報は次のとおりである：ａ）系：Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９５；ｂ）カラム：ＢｉｏＲａｄ−Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈイオン排除カラム、３００ｍｍ×７．８ｍｍ、カタログ番号１２５−０１４０；ｃ）カラム温度：５０℃；ｄ）ガードカラム：ＢｉｏＲａｄ−マイクロガードＣａｒｂｏ−Ｈ詰め替えカートリッジ、３０ｍｍ×４．６ｍｍ、カタログ番号１２５−０１２９；ｅ）溶離液：０．０１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４；ｆ）溶離液流速：０．６ｍＬ／分；ｇ）およその流圧：７５８４〜８２７４ＭＰａ（１１００〜１２００ｐｓｉ）；ｈ）注入容量：２０μＬ；ｉ）検出器：屈折率（Ｋｎａｕｅｒ  Ｋ−２３０１）；及びｊ）溶出時間：２６分間。
【０３８５】
（ｉｉ）結果：
イソプレン産生性指数を表１９に要約する。要約すると、改変されたＲＢＳ部位を有する株の性能は、対照株（ＤＷ７１９，実施番号２０１２０５２６及び２０１２０５６５）と類似していた。改変されたＲＢＳ部位を有する株で得られた、グルコースに対するイソプレンの累積収率（％）は対照株（ＤＷ７１９，実施番号２０１２０５２６及び２０１２０５６５）と類似していた（図２８を参照されたい）。改変されたＲＢＳ部位を有する株で得られた、グルコースに対するイソプレンの最大瞬間収率は対照株（ＤＷ７１９，実施番号２０１２０５２６及び２０１２０５６５）と類似していた（図２９を参照されたい）。改変株では、培養初期の瞬間収率がより高く、株ＣＭＰ１２８４は、培養終了時（５６〜６４時間ＥＦＴ）に最もロバストな性能と、最も低濃度のＦＰＰを有した。改変されたＲＢＳ部位を有する株で得られた、イソプレンの容積産生量は、対照株（ＤＷ７１９，実施番号２０１２０５２６及び２０１２０５６５）と類似していた（図３０を参照されたい）。改変されたＲＢＳ部位を有する株で得られた、イソプレンのＣＰＩは対照株（ＤＷ７１９，実施番号２０１２０５２６及び２０１２０５６５）と類似していた（図３１を参照されたい）。しかしながら、発酵開始から４０時間後、ＣＭＰ１２８６（ＲＢＳ９）株は持続的な細胞増殖を示し、かつグルコースに対するイソプレンの瞬間収率は低かった。ＩｓｐＡの発現を増加させることにより、イソプレノイド前駆体への取り込みが増加し、これにより増殖性が増した可能性がある。このＩｓｐＡ発現レベルにより、望ましい発現レベルの上限を表すことができる。対照的に、１／３倍ＲＢＳ株は、培養終了時の総細胞数が最も少なく、ＣＰＩが最も高かった。これは、望ましいＩｓｐＡ発現レベルの下限を表し得るものであり、また試験した３倍ＲＢＳ  ｌａｄｄｅｒ株の容積産生量は最も低かった。改変されたＲＢＳ部位を有する株で得られた、イソプレンの比産生量は対照株（ＤＷ７１９，実施番号２０１２０５２６及び２０１２０５６５）と類似していた（図３２を参照されたい）。
【０３８６】
【表２０】
2015510392.tif 000027
【０３８７】
実施例２４：ＩｓｐＡ変異体の代謝解析
この実施例では、大腸菌（E. coli）におけるＩｓｐＡ発現変異体由来の代謝産物を測定した。
【０３８８】
（ｉ）材料及び方法
大腸菌（E. coli）の代謝産物抽出物。９ｍＬのドライアイスにより冷却した無水メタノールを入れたチューブに約３ｍＬの培養物を加え、発酵槽で増殖させた細菌細胞の代謝を迅速に不活性化させた。得られた試料を計量し、試料としたブロス量を算出し、以降の解析に備え−８０℃で保管した。代謝産物の抽出並びに濃縮の際には、０．２５ｍＬの細胞懸濁液アリコート（ＯＤ６００で測定した時の培養物の細胞密度が５０を下回る場合には０．４ｍＬを使用する）を１．５ｍＬのメタノール／酢酸アンモニウム緩衝液（５ｍＭ，ｐＨ＝８．０）混合液（６：１、体積／体積）を使用して希釈し、４分間遠心分離し細胞片をペレット化させた。上清を回収し、ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘのＳｔｒａｔａ−Ｘ−ＡＷカラム（３３μｍ  ３０ｍｇ／ウェル、９６ウェル、弱アニオン交換ポリマー基材）に装填する。まず１．５ｍＬのメタノール／酢酸アンモニウム緩衝液（５ｍＭ，ｐＨ＝８．０）混合液（６：１体積／体積）を使用し、次に１．５ｍＬのメタノール／酢酸アンモニウム緩衝液（５ｍＭ，ｐＨ＝８．０）混合液（１：１体積／体積）を使用して、細胞ペレットを２回以上抽出した。いずれの場合にも、細胞は遠心分離によりペレット化し、得られた上清を、同一のＳｔｒａｔａ−Ｘ−ＡＷカラムに連続的に装填した。抽出−遠心分離中、細胞を含む試料は４℃未満に維持した。１ｍＬの水及び１ｍＬのメタノールによりカラムを洗浄した後、対象とする代謝産物を、最初に濃ＮＨ４ＯＨ／メタノール（１：１４、体積／体積）混合物０．３ｍＬを用い、次に０．３ｍＬの濃ＮＨ４ＯＨ／メタノール／水（１：１２：２、体積／体積／体積）混合物を用いカラムから溶出した。２０μＬ氷酢酸を加え、得られた溶離液を中和し、次に遠心分離により清澄化した。
【０３８９】
代謝産物の定量ＴＳＱ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ａｃｃｅｓｓシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、質量分析法により代謝産物の解析を実施した。すべての系の制御、データ取得、及び質量スペクトルデータの評価は、ＸＣａｌｉｂｕｒ  ａｎｄ  ＬＣＱｕａｎソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実施した。ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ方法に関しては、ｃｈｉｒａｌ  Ｎｕｃｌｅｏｄｅｘ  β−ＯＨ  ５μＭ  ＨＰＬＣカラム（１００×２ｍｍ，Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ＣＣ  ８／４  Ｎｕｃｌｅｏｄｅｘ  β−ＯＨガードカートリッジとともに使用した。移動相の勾配は表２０に記載のとおりに適用した。表中、移動相Ａは１００ｍＭアンモニウム重炭酸塩緩衝液（ＢｉｏＵｌｔｒａグレード，Ｆｌｕｋａ，ｐＨ  ７）／ＭｉｌｌｉＱ等級の水、移動相ＢはＭｉｌｌｉＱ等級の水、及び移動相Ｃはアセトニトリル（Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ  Ｂ＆Ｊ  Ｂｒａｎｄ，ＬＣ−ＭＳグレード）とした。カラム及び試料のトレイ温度はそれぞれ５℃及び４℃に低下させた。注入容量は１０μＬとした。
【０３９０】
【表２１】
2015510392.tif 000028
【０３９１】
エレクトロスプレーイオン化法を用い、陰イオンモード（ＥＳＩスプレー電圧：３．５ｋＶ及びイオン送達管（ion transfer tube）温度３５０℃）で質量検出を実施した。前駆体イオンに関し次のｍ／ｚ値を選択して、ＳＲＭモードで対象とする代謝産物を検出した：ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰに関しては２４５．１、ＧＰＰに関しては３１３．１、ＦＰＰに関しては３８１．０、ＭＶＰに関しては２２７．１、及びＭＶＰＰに関しては３０７．１。質量分析計での計測時の感度のわずかな変化を考慮するため、均一に標識した１３Ｃ１０−ＡＤＰも両方の試料並びに内部標準としての校正物に当量（最終濃度１９．６μＭ）加えた（１３Ｃ１０−ＡＤＰは、Ｉｓｏｔｅｃ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）より得た１３Ｃ１０−ＡＴＰから酵素反応により調製した；ｍ／ｚ＝４３６．１）。ＰＯ３−プロダクトイオン（ｍ／ｚ＝７９．０）により、あるいは標識したＡＤＰの場合には二リン酸プロダクトイオン（ｍ／ｚ＝１５９．０）により生成されるピークの積分強度の試料／内部標準の応答比をもとに代謝産物の濃度を求めた。標準を注入することにより得た校正曲線を使用して、細胞抽出液中の代謝産物濃度を算出した。ＩＰＰ、ＤＭＡＰＰ、ＧＰＰ、及びＦＰＰ標準はＥｃｈｅｌｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．から購入し、ＭＶＰ及びＭＶＰＰはＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【０３９２】
（ｉｉ）結果：
発酵開始から３２及び４４時間後のＩＰＰ、ＤＭＡＰＰ、ＧＰＰ、及びＦＰＰの濃度を表２１及び２２、並びに図３３〜３６に示す。
【０３９３】
【表２２】
2015510392.tif 000029
【０３９４】
【表２３】
2015510392.tif 000030
【０３９５】
実施例２５：ＩｓｐＡを再構成した宿主株における常時発現型イソプレン合成酵素
制御因子ｌａｃＩｑを除外して、イソプレン合成酵素、ＩｓｐＳ及びＩｓｐＳ＿ｍＭＶＫを持続的に発現させた。
【０３９６】
（ｉ）材料及び方法
ｐＣＨＬ４２６，ｐＴｒｃ（ｌａｃＩ  ｄｅｌｅｔｅｄ）＿ｐＴｒｃ−ＩｓｐＳ（ｖａｒｉａｎｔ）＿ｍＭＶＫの構築。次のプライマー：ＣＬ４４９Ｆ（５’−ａｔｔｃａｇｇｇｔｇｔｇａｇｃｇｃａａｃｇｃａａｔｔａａｔｇｔ−３’（配列番号１００））及びＣＬ４５０Ｒ（５’−ＧＴＴＧＣＧＣＴＣＡＣＡＣＣＣＴＧＡＡＴＴＧＡＣＴＣＴＣＴＴＣ−３’（配列番号１０１））を用いることにより、プラスミドｐＤＷ２４０から制御因子遺伝子ｌａｃＩｑを欠失させた。ＰＣＲ反応液の組成は、テンプレートＤＮＡのｐＤＷ２４０（１００ｎｇ）、５０μＭの各順方向（ＣＬ４４９Ｆ）及び逆方向プライマー（ＣＬ４５０Ｒ）、１μＬ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）、５μＬ  １０Ｘ  ｐｆｕＩＩ反応緩衝液（Ａｇｉｌｅｎｔ）、１μＬ  ｐｆｕ  ＩＩ融合酵素（Ａｇｉｌｅｎｔ）、及び４０μＬ水から構成された。Ｂｉｏ−Ｒａｄサーマルサイクラーにより、９５℃で５０秒、６０℃で５０秒及び６８℃で４分、更に６８℃で１０分の処理を行う温度プロファイルで、１８サイクルを実施した。ＰＣＲ反応を完了させた後、１μＬ  ＤｐｎＩを加え、混合物を３７℃で２時間インキュベートしてテンプレートＤＮＡを除去した。ＤｐｎＩを追加で１μＬ加え、混合物を３７℃で一晩インキュベートした。次に、２μＬの反応液によりＴＯＰ１０Ｆ’細胞（インビトロジェン）を形質転換させ、ＬＡ＋カルベニシリン５０ｍｇ／Ｌに播種した。代替的な実施形態では、２μＬの反応液によりＴＯＰ１０Ｆ’細胞（インビトロジェン）に形質導入し、ＬＢ＋カルベニシリン５０ｍｇ／Ｌに播種することができる。配列決定により適切なクローンであることが確認された。プラスミドマップ及び配列を図３７及び３８に示す。
【０３９７】
ｐＣＨＬ４２７コンストラクト，ｐＴｒｃ（ｌａｃＩ  ｄｅｌｅｔｅｄ）＿ｐＴｒｃ−ＩｓｐＳ（ｖａｒｉａｎｔ）。次のプライマー：ＣＬ４４９Ｆ（５’−ａｔｔｃａｇｇｇｔｇｔｇａｇｃｇｃａａｃｇｃａａｔｔａａｔｇｔ−３’（配列番号１０２））及びＣＬ４５０Ｒ（５’−ＧＴＴＧＣＧＣＴＣＡＣＡＣＣＣＴＧＡＡＴＴＧＡＣＴＣＴＣＴＴＣ−３’（配列番号１０３））を用いることにより、プラスミドｐＭＣＭ２１４９から制御因子の遺伝子ｌａｃＩｑを欠失させた。ＰＣＲ反応液の組成は、テンプレートＤＮＡのｐＭＣＭ２１４９（１００ｎｇ）、５０μＭの各順方向（ＣＬ４４９Ｆ）及び逆方向プライマー（ＣＬ４５０Ｒ）、１μＬ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）、５μＬ  １０Ｘ  ｐｆｕＩＩ反応緩衝液（Ａｇｉｌｅｎｔ）、１μＬ  ｐｆｕ  ＩＩ融合酵素（Ａｇｉｌｅｎｔ）、及び４０μＬ水から構成された。Ｂｉｏ−Ｒａｄサーマルサイクラーにより、９５℃で５０秒、６０℃で５０秒及び６８℃で４分、更に６８℃で１０分の処理を行う温度プロファイルで、１８サイクルを実施した。ＰＣＲ反応を完了させた後、１μＬ  ＤｐｎＩを加え、反応混合物を３７℃で２時間インキュベートしてテンプレートＤＮＡを除去した。ＤｐｎＩを追加で１μＬ加え、混合物を３７℃で一晩インキュベートした。次に、２μＬの反応液によりＴＯＰ１０Ｆ’細胞（インビトロジェン）を形質転換させ、ＬＡ＋カルベニシリン５０ｍｇ／Ｌに播種した。代替的な実施形態では、２μＬの反応液によりＴＯＰ１０Ｆ’細胞（インビトロジェン）に形質導入し、ＬＢ＋カルベニシリン５０ｍｇ／Ｌに播種することができる。配列決定により適切なクローンであることが確認された。プラスミドマップ及び配列を図３９及び４０に示す。
【０３９８】
常時発現型イソプレン産生株の構築表２３に掲載する株に、電気穿孔法によりｐＣＨＬ４２６及びｐＣＨＬ４２７を導入し、形質転換させた。各種ＲＢＳが異なるＩｓｐＡ発現レベルを有する宿主は、持続的に発現したＩｓｐＳ変異体を蓄積することができる。特に、ＣＭＰ１２８１宿主バックグラウンドにおいて持続的に発現させたイソプレン合成酵素変異体は、ＩＰＴＧ対照株と同様の、又は対照株よりも良好の細胞増殖及びイソプレン比産生性を示した（図４１及び４２）。
【０３９９】
【表２４】
2015510392.tif 000031
【０４００】
実施例２６：ファルネシルピロリン酸シンセターゼ（ＥＲＧ２０）をコードしている遺伝子を含有しているサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株の構築
Ａ．ＥＲＧ２０Ｐ又は代替プロモーターの挿入、並びに異なる遺伝子座におけるＥＲＧ２０の挿入
次の方法に従い、コロニーポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプロトコルを実施する。テンプレートはサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株の染色体ＤＮＡである。テンプレートを、次のＰＣＲ反応液：１００ｎｇテンプレートＤＮＡ  １μＬ、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ緩衝液１０μＬ、１００ｍＭ  ｄＮＴＰ  １μＬ、１０ｍＭ順方向プライマー１．２５μＬ、１０ｍＭ逆方向プライマー１．２５μＬ、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）１μＬ、及び脱イオン水３４．５μＬに使用する。ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｈｙｂａｉｄ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭＡ）で次の通り実施した：９５℃／２分間；９５℃／２０秒間、ｘ℃（アニーリング温度）／２０秒間、及び７２℃／（４０秒間／生成物１ｋｂ）、を３０サイクル。反応液を４℃に冷却する。ｘ℃のアニーリング温度は、プライマー対の最低融解温度よりも３℃低くなるよう選択する。得られたＰＣＲ断片の大きさを、プレキャスト０．８％  Ｅ−ゲル（登録商標）（インビトロジェン，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）上で、分子量マーカーとしてＤＮＡ分子量マーカーＸ（７５〜１２，２１６ｂｐ）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して測定した。
【０４０１】
外来性遺伝子座（例えば、ＰＤＣ６）へのＥＲＧ２０の挿入に関し、３種のＤＮＡ断片をＰＣＲにより生成した。断片１は、ｓｅａｍｌｅｓｓキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））によりＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ消化したベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ５（Ｋｏｖａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．１９９５．Ｇｅｎｅ  １６６：１７５〜１７６）に組み込むための１５ｂｐの配列、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＰＤＣ６と相同性の領域（約５０ｂｐ）、ＵＲＡ３マーカー及びｌｏｘＰ部位に隣接したそのプロモーター、並びにＥＲＧ２０又は選択された任意のその他のプロモーターを組み込むための１５ｂｐの配列を含有する（その他のプロモーターは、イソプレンを産生するサッカロマイセス・セレヴィシエ（S. cerevisiae）株のマイクロアレイ実験により評価される発現特性をもとに選択することができる）。その他に選択したプロモーターの目的は、常に、あるいは発酵時の産生期間中に（又はイソプレノイド分子が蓄積し始める際に）内在性ＥＲＧ２０プロモーターよりもＩｓｐＡ酵素を低発現するプロモーターを得るというものである。ｌｏｘＰ座間にＵＲＡ３遺伝子を含有しているプラスミドをテンプレートとした。断片２は、ＥＲＧ２０遺伝子のプロモーター又はその他の選択された１種のプロモーターを含有する。サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株の染色体ＤＮＡをこの断片用のテンプレートとした。断片１及び断片３を継ぎ目なく組み立てられるようにプライマーを設計する。断片３は、染色体ＤＮＡ、又はコドンを再設計した対立遺伝子、ＰＤＣ６座（約５０ｂｐ，プライマーに組み込まれる）にて組み換えるための相同性領域から増幅したサッカロマイセス・セレヴィシエ（S. cerevisiae）ＥＲＧ２０遺伝子、並びに断片２、及びＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩにより消化したｐＢＢＲ１ＭＣＳ５を組み込むための１５ｂｐの配列２組、含有する。この断片用には、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の染色体ＤＮＡ、又はＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）により設計及び合成された、コドンを変更された遺伝子を含有するプラスミドをテンプレートとする。
【０４０２】
すべてのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、製造元（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））の推奨するプロトコルに従って、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎを使用して行った。Ｑｉａｇｅｎ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ，ＵＳＡ）のＰＣＲ精製キットを使用し、反応産物を精製した。次に、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩにより消化したプラスミドｐＢＢＲ１−ＭＣＳ５を用い、製造元により推奨されるプロトコルに従ってＧｅｎｅＡｒｔ  ｓｅａｍｌｅｓｓ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を使用して断片１、２及び３を組み立てた。反応液により大腸菌（E. coli）Ｔｏｐ１０細胞（インビトロジェン（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を形質転換させ、形質転換体をＬＢ＋ゲンタマイシン５ｍｇ／Ｌで選別した。プラスミドは、これらのコロニーのうちの１つから単離し、ＥＲＧ２０プロモーターに関してはｐＣＰＮ１００、及び代替的な３種のプロモーターに関してはｐＣＰＮ１１０、１２０、１３０ＥＲＧ２０と命名した。プラスミド中に正しいコンストラクトが存在していることを配列決定（Ｑｕｉｎｔａｒａ  Ｂｉｏ（Ａｌｂａｎｙ，ＣＡ））により確認した。構築されたカセット全体を増幅するプライマーを使用するＰＣＲ反応には、プラスミドｐＣＰＮ１０１、ｐＣＮＰ１００、１１０、１２０及び１３０を使用した。Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製キット（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ（ＭＤ，ＵＳＡ））を使用しＰＣＲ産物を精製した。更なる精製後、製造元（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ（Ｍｏ，ＵＳＡ））のプロトコルに従いＳｉｇｍａ酵母形質転換キットを使用し、ＰＣＲ産物により、ＵＲＡ３すなわちサッカロマイセス・セレヴィシエ（S. cerevisiae）（−ＨＩＳ３）を形質転換させる。形質転換体を、Ｆｏｒｍｅｄｉｕｍ（登録商標）ｄｒｏｐ  ｏｕｔ（Ｋａｉｓｅｒ，ＤＳＣＫ１６２）、ヒスチジン及び１０ｇ／Ｌグルコース又はエタノールを添加したアミノ酸不含の酵母窒素源基材（Ｄｉｆｃｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ）で選別する。コロニーを同じプレートに一度以上再画線したあと、これらのプレートで増殖するコロニーの染色体ＤＮＡを用いるＰＣＲにより、正しい挿入が存在していることを確認した。ＵＲＡ３マーカーを、形質転換（Ｓｉｇｍａ形質転換キット）により導入された誘導型Ｃｒｅリコンビナーゼ及びＨＩＳ３遺伝子を発現しているプラスミドにより除去し、Ｆｏｒｍｅｄｉｕｍ（登録商標）ｄｒｏｐ  ｏｕｔ（Ｋａｉｓｅｒ，ＤＳＣＫ１６２）、ウラシル及び１０ｇ／Ｌグルコース又はエタノールを添加した、アミノ酸不含の酵母窒素基材（Ｄｉｆｃｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ）で選別した。このようにして得られたコロニーをそれぞれＣＰＮ１０１，１１１，１２１及び１３１として命名し、更なる改変に使用した。
【０４０３】
Ｂ．内在性ＩｓｐＡのノックアウト
この実施例に関しては、一片のＤＮＡをＰＣＲにより生成した。上記実施例２６（Ａ）に記載の方法に従ってポリメラーゼ連鎖反応のプロトコルを実施した。ＵＲＡ３遺伝子及びｌｏｘＰ部位に隣接したそのプライマーを含有しているプラスミドをテンプレートとする（上記実施例２６（Ａ）を参照されたい）。順方向プライマーには、ＥＲＧ２０の上流と５０ｂｐ相同性であり、これにｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰカセットとアニーリングさせるための２５ｂｐの配列が続いている配列を含有させ、これに対し、逆方向プライマーには、ＲＧ２０の下流（順方向プライマーと反対向き）５０ｂｐと相同性であり、これにｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰカセットとアニーリングさせるための２５ｂｐの配列が続いている配列を含有させた。
【０４０４】
製造元（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ，ＵＳＡ）のプロトコルに従いＳｉｇｍａ酵母形質転換キットを用い、このようにして得られたＰＣＲ産物によりＣＰＮ１０１、１１１、１２１及び１３１を形質転換させた。形質転換体を、Ｆｏｒｍｅｄｉｕｍ（登録商標）ｄｒｏｐ  ｏｕｔ（Ｋａｉｓｅｒ，ＤＳＣＫ１６２）、ヒスチジン及び１０ｇ／Ｌグルコース又はエタノールを添加したアミノ酸不含のＹｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ（Ｄｉｆｃｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ）で選別する。コロニーを同じプレートに一度以上再画線したあと、これらのプレートで増殖するコロニーの染色体ＤＮＡを用いるＰＣＲにより、正しい挿入が存在していることを確認した。上記実施例２６（Ａ）に記載のとおりにＵＲＡ３マーカーを除去し、ＣＰＮ１０１、１１１、１２１及び１３１のそれぞれからＰＣＲにより１つずつコロニーを確認し、適切なものであればＣＰＮ１０２、１１２、１２２、及び１３２と命名した。
【０４０５】
Ｃ．内在性プロモーター又は代替プロモーターの下流にＥＲＧ２０を含有し、イソプレンを産生し得るサッカロマイセス・セレヴィシエ（S. cerevisiae）ＣＰＮ１０３、１１３、１２３及び１３３の構築
Ｓｉｇｍａ酵母形質転換キットを使用し、２種のプラスミド、すなわちＵＲＡ３遺伝子を発現するプラスミド、並びにＨＩＳ３遺伝子とともに、アセチルＣｏＡからイソプレンを産生するのに必要とされるＭＶＡ経路ポリペプチドのうち１つ以上を一緒に発現する別のプラスミドにより、ＣＰＮ１０２、１１２、１２２及び１３２を形質転換した。コロニーを、Ｆｏｒｍｅｄｉｕｍ（登録商標）ｄｒｏｐ  ｏｕｔ（Ｋａｉｓｅｒ，ＤＳＣＫ１６２）、及び１０ｇ／Ｌグルコース又はエタノールを添加したアミノ酸不含のＹｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ（Ｄｉｆｃｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ）で選別する。各々からコロニーを１つずつ回収し、それぞれＣＰＮ１０３、１１３、１２３及び１３３と命名し、イソプレンの産生について試験した。
【０４０６】
配列
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【０４０７】
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【０４０８】
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【０４０９】
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【０４１０】
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【０４１１】
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【０４１２】
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【０４１３】
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【０４１４】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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