(57)【要約】本発明は、新規のＪＮＫ阻害剤分子の使用および治療によりヒトまたは動物の身体を処置する方法におけるそれらの使用に関する。一局面において、本発明は、治療によりヒトまたは動物の身体を処置する方法における使用のためのＪＮＫ阻害剤を提供し、このＪＮＫ阻害剤は、一般式：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｒ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｌ−Ｘ７−Ｌ−Ｘ８（配列番号１）に従う阻害性（ポリ）ペプチド配列などを含むＪＮＫ阻害剤を含み、式中、各Ｘ１〜Ｘ８は、本明細書で規定される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療によりヒトまたは動物の身体を処置する方法における使用のためのＪＮＫ阻害剤であって、前記ＪＮＫ阻害剤は、以下：
ａ）以下の一般式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｒ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｌ−Ｘ７−Ｌ−Ｘ８（配列番号１）
に従う阻害性（ポリ）ペプチド配列を含むＪＮＫ阻害剤であって、式中、
Ｘ１は、アミノ酸Ｒ、Ｐ、Ｑ、およびｒから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ２は、アミノ酸Ｒ、Ｐ、Ｇ、およびｒから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ３は、アミノ酸Ｋ、Ｒ、ｋ、およびｒから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ４は、アミノ酸ＰおよびＫから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ５は、アミノ酸Ｔ、ａ、ｓ、ｑ、ｋから選択されるアミノ酸であるか、または存在せず、
Ｘ６は、アミノ酸Ｔ、Ｄ、およびＡから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７は、アミノ酸Ｎ、ｎ、ｒ、およびＫから選択されるアミノ酸であり、かつ
Ｘ８は、Ｆ、ｆ、およびｗから選択されるアミノ酸であり、
大文字で記されるアミノ酸残基が、Ｌ−アミノ酸を示すのに対し、小文字で記されるアミノ酸残基は、Ｄアミノ酸残基を示し、
ただし、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７およびＸ８からなる群より選択される前記アミノ酸のうちの少なくとも１つが、Ｄ−アミノ酸（複数可）であることを条件とする、ＪＮＫ阻害剤；ならびに
ｂ）ａ）で規定された配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を共有する阻害性（ポリ）ペプチド配列を含むＪＮＫ阻害剤であって、ただし、配列番号１に関して、配列番号１と配列同一性を共有するこのような阻害性（ポリ）ペプチド配列が、配列番号１の４位におけるＬ−アルギニン（Ｒ）残基、ならびに配列番号１の８位および１０位における２つのＬ−ロイシン（Ｌ）残基を維持し、かつ配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を共有する前記配列中の残りのアミノ酸のうちの少なくとも１つがＤ−アミノ酸であることを条件とする、ＪＮＫ阻害剤
からなる群より選択される、ＪＮＫ阻害剤。
【請求項２】
Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７、およびＸ８からなる群より選択される前記アミノ酸のうちの少なくとも１つが、Ｄ−アミノ酸（複数可）である、請求項１に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項３】
配列番号２〜２７のうちのいずれか１つから選択される配列と少なくとも８０％の配列同一性を共有する阻害性（ポリ）ペプチド配列を含む、請求項１または２に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項４】
前記阻害性（ポリ）ペプチド配列が、配列番号２〜２７のうちのいずれか１つから選択される、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項５】
配列番号８または配列番号８と少なくとも８０％の配列同一性を共有する阻害性（ポリ）ペプチド配列を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項６】
輸送体配列を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項７】
前記阻害性（ポリ）ペプチド配列と前記輸送体配列とが重複する、請求項６に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項８】
前記輸送体配列が、配列番号２８〜３０のうちのいずれか１つに従う、Ｄ−アミノ酸とＬ−アミノ酸とが交互になった配列を含む、請求項６または７に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項９】
前記輸送体配列が、配列番号３１〜１７０のうちのいずれか１つから選択される、請求項６から８のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項１０】
前記輸送体配列が、配列番号３１〜３４、４６、４７、および５２〜１５１のうちのいずれか１つから選択される、請求項６から９のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項１１】
前記輸送体配列が、前記阻害性（ポリ）ペプチド配列のちょうどＮ末端またはちょうどＣ末端に位置する、請求項６から１０のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項１２】
ａ）配列番号１７１〜１９０のうちのいずれか１つに従う配列、または
ｂ）配列番号１７１〜１９０のうちの少なくとも１つと少なくとも５０％の配列同一性を共有する配列であって、配列番号１７１〜１９０のうちの少なくとも１つと配列同一性を共有する前記配列が、以下：
ｉ）配列番号１に対応するその配列の連なりの中の４位において、前記Ｌ−アルギニン（Ｒ）残基を維持し、
ｉｉ）配列番号１に対応するその配列の連なりにおいて、前記２つのＬ−ロイシン（Ｌ）を維持し、かつ
ｉｉｉ）配列番号１に対応するその配列の連なりの中のＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７、もしくはＸ８位において、少なくとも１つのＤ−アミノ酸を呈示する
ことを条件とする、配列
を含む、請求項６から１１のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項１３】
ａ）配列番号１７２の配列、または
ｂ）配列番号１７２と５０％の配列同一性を共有する配列であって、配列番号１７２と５０％の配列同一性を共有する前記配列が、以下：
ｉ）配列番号１に対応するその配列の連なりの中の４位において、前記Ｌ−アルギニン（Ｒ）残基を維持し、
ｉｉ）配列番号１に対応するその配列の連なりにおいて、前記２つのＬ−ロイシン（Ｌ）を維持し、かつ
ｉｉｉ）配列番号１に対応するその配列の連なりの中のＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７、もしくはＸ８位において、少なくとも１つのＤ−アミノ酸を呈示する
ことを条件とする、配列
を含む、請求項６から１２のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項１４】
治療によりヒトまたは動物の身体を処置するための方法における使用のためのＪＮＫ阻害剤であって、
ａ）ＲＰＴＴＬＮＬＦ（配列番号１９１）、ＫＲＰＴＴＬＮＬＦ（配列番号１９２）、ＲＲＰＴＴＬＮＬＦ、および／またはＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦ（配列番号１９３）からなる配列の群より選択される配列を含む阻害性（ポリ）ペプチド、ならびに
ｂ）配列番号３１〜３４および４６〜１５１から選択される輸送体配列
を含む、ＪＮＫ阻害剤。
【請求項１５】
治療によりヒトまたは動物の身体を処置するための方法における使用のための、配列番号１９４または１９５の配列を含むＪＮＫ阻害剤。
【請求項１６】
前記方法が、治療によりヒト身体を処置するための方法である、請求項１から６１のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項１７】
静脈内投与、筋内投与、皮下投与、皮内投与、経皮投与、腸内投与、経口投与、直腸内投与、外用投与、経鼻投与、局所投与、鼻腔内投与、表皮投与、パッチ送達によって投与、滴下によって投与、硝子体内投与、結膜下投与、および／または鼓室内投与される、請求項１から６１のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項１８】
前記方法が、炎症性疾患、眼疾患、骨疾患、神経疾患、ニューロン疾患、神経変性疾患、皮膚疾患、免疫および／もしくは自己免疫疾患、眼疾患、口腔疾患、代謝病、心血管疾患、増殖性疾患、耳疾患、腸疾患、ならびに／または呼吸器系疾患から選択される疾患および／または障害を処置するための方法である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項１９】
前記方法が、炎症性疾患、急性炎症、慢性炎症、眼内の炎症、口腔内の炎症、呼吸器系の炎症、肺の炎症、皮膚の炎症、心血管系内の炎症、脳の炎症、耳内の炎症、粘膜炎、口内炎、インプラント周囲炎、網膜炎、脈絡膜炎、乾性角結膜炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、ブドウ膜炎、前部ブドウ膜炎、中間部ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎、歯周炎、ＣＯＰＤ、喘息、歯髄炎、関節リウマチ、変形性関節症、クローン病、乾癬性関節炎、血管炎、間質性膀胱炎；感染部位または創傷部位における急性炎症、髄膜炎、脳炎、肺炎、咽頭炎、扁桃炎、耳炎、中耳炎、血管炎、滑膜炎、腸炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、および移植片拒絶から選択される疾患および／または障害を処置するための方法である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項２０】
前記方法が、耳疾患、内耳疾患、聴力損失、急性聴力損失、損傷した有毛細胞の不動毛、有毛細胞のアポトーシス、騒音外傷、耳炎および中耳炎から選択される疾患および／または障害を処置するための方法である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項２１】
前記方法が、代謝性障害、糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病、ファブリー病、ゴーシェ病、低体温症、高体温症、低酸素症、脂質性組織球増殖症、リピドーシス、異染性白質萎縮症、ムコ多糖症、ニーマン−ピック病、肥満、およびウォルマン病から選択される疾患および／または障害を処置するための方法である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項２２】
前記方法が、アレクサンダー病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、卒中、毛細血管拡張性運動失調症、切断または他の形で破断された軸索、軸索切断術、脳病変、ＣＭＴ（シャルコー−マリー−トゥース病）、大脳皮質基底核変性症、認知症、神経系の疾患または障害、ジストニア、てんかん、ファーバー病、フリードライヒ失調症（ＳＣＡ）、ガングリオシドーシス、ギラン−バレー症候群、遺伝性痙性対麻痺、ヒルシュプルング病、ヒト免疫不全ウイルス性認知症、ハンチントン病、脳梗塞、虚血性脳卒中、クラッベ病、レノックス−ガストー症候群、脳回欠損、多発性硬化症、骨髄異形成症候群、脊髄症、ＡＩＤＳ関連神経変性疾患、２型神経線維腫症（ＮＦ−２）、ラチリズム、ニューロンアポトーシス、ニューロン死、神経障害性疼痛、神経障害、化学療法誘導性神経障害、糖尿病誘導性神経障害、ＮＭＤＡ誘導性神経毒性、疼痛、パーキンソン病、パーキンソニズム、ピック病、多発性神経障害、進行性核上性麻痺、サンドホフ病、脊椎披裂、脳卒中、テイ−サックス病、ＴＢＩ（びまん性軸索損傷）、例えば、炎症性疼痛により誘導されるダークニューロン、ウェスト症候群、および脊髄性筋萎縮症から選択される疾患および／または障害を処置するための方法である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項２３】
前記方法が、ＣＮＳの自己免疫疾患、自己炎症性疾患、セリアック病、シェーグレン症候群、および全身性エリテマトーデスから選択される疾患および／または障害を処置するための方法である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項２４】
前記方法が、関節炎、椎間板ヘルニア、進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）、変形性関節症、大理石骨病、骨粗鬆症、糖尿病誘導性骨粗鬆症、ページェット病、および関節リウマチから選択される疾患および／または障害を処置するための方法である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項２５】
前記方法が、乾癬およびエリテマトーデスから選択される疾患および／または障害を処置するための方法である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項２６】
前記方法が、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）；網膜色素線条；前部虚血性視神経症；前部ブドウ膜炎；白内障、特に、加齢性白内障；中心性滲出性脈絡網膜症；中心性漿液性脈絡網膜症；霰粒腫；脈絡膜欠如；脈絡膜炎；脈絡膜硬化症；結膜炎；毛様体炎；糖尿病網膜症；眼乾燥症候群；眼内炎；上強膜炎；眼感染症；白点眼底；脳回転状網膜脈絡膜萎縮；麦粒腫；眼瞼腺の炎症性疾患；脈絡膜の炎症性疾患；毛様体の炎症性疾患；結膜の炎症性疾患；角膜の炎症性疾患；虹彩の炎症性疾患；涙腺の炎症性疾患；眼窩骨の炎症性疾患；強膜の炎症性疾患；硝子体の炎症性疾患；ブドウ膜の炎症性疾患；網膜の炎症性疾患；中間部ブドウ膜炎；虹彩炎；角膜炎；レーバー病；多病巣性脈絡膜炎；眼筋の筋炎；新生血管黄斑症（例えば、高度近視、傾斜乳頭症候群、脈絡膜骨腫などにより引き起こされる）；ＮＭＤＡ誘導性網膜毒性；非慢性または慢性の炎症性眼疾患；小口病；視神経疾患；眼窩蜂巣炎；全眼球炎；全ブドウ膜炎；嚢後混濁；後嚢混濁（ＰＣＯ）（白内障の術後合併症）；後部ブドウ膜炎；増殖性硝子体網膜症；  網膜動脈閉塞症；網膜剥離、網膜疾患；網膜傷害；網膜動脈瘤；網膜色素上皮剥離；網膜静脈閉塞症；網膜炎；色素性網膜炎；点状網膜炎；網膜症、特に、未熟児網膜症および糖尿病網膜症；強膜炎；スタルガルト病；炎症性眼創傷および／または眼創縁；眼手術後または眼外傷後における眼内炎症；ブドウ膜炎；ならびに卵黄状黄斑変性から選択される疾患および／または障害を処置するための方法である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項２７】
前記方法が、歯周炎、特に、慢性歯周炎；粘膜炎、口腔剥離性障害、口腔扁平苔癬、尋常性天疱瘡、インプラント周囲炎、歯髄炎；口内炎；および顎関節障害から選択される疾患および／または障害を処置するための方法である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項２８】
前記方法が、がんおよび腫瘍性疾患、聴神経腫瘍、肺癌腫；急性リンパ球性白血病（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）；急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；腺癌腫；肛門癌腫；気管支癌腫；子宮頸癌腫；子宮頸部がん；星状細胞腫；基底細胞腫；Ｂｃｒ−Ａｂｌ形質転換を伴うがん；膀胱がん；芽細胞腫；骨がん；脳転移；脳腫瘍；乳がん；バーキットリンパ腫；カルチノイド；子宮頸部がん；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；結腸がん；結腸癌腫；身体の癌腫；頭蓋咽頭腫；ＣＵＰ症候群；ウイルス誘導性腫瘍；ＥＢＶ誘導性Ｂ細胞リンパ腫；子宮内膜癌腫；赤白血病（Ｍ６）；食道がん（ｅｓｏｐｈａｇｕｓ  ｃａｎｃｅｒ）；胆嚢がん；消化器がん；消化管間質腫瘍；消化器腫瘍；尿生殖器がん；緑内障；神経膠芽腫；神経膠腫；頭頸部腫瘍；Ｂ型肝炎誘導性腫瘍；肝細胞癌腫；肝細胞腫；  ヘルペスウイルス誘導性腫瘍；ホジキン症候群；ＨＴＬＶ−１誘導性リンパ腫；ＨＴＬＶ−２誘導性リンパ腫；インスリノーマ；腸がん；カポジ肉腫；腎がん；腎臓癌腫；喉頭がん；白血病；眼瞼腫瘍；肝がん；肝転移；肺がん；リンパ球がん；リンパ腫；悪性黒色腫；乳癌腫；マントル細胞リンパ腫；髄芽腫；巨核芽球性白血病（Ｍ７）；黒色腫、特に、悪性黒色腫；髄膜腫；中皮腫；単球性白血病（ＭＳ）；多発性骨髄腫；菌状息肉腫；骨髄芽球性白血病（Ｍ１）；骨髄芽球性白血病（Ｍ２）；骨髄単球性白血病（Ｍ４）；神経鞘腫；非ホジキンリンパ腫；非小細胞癌腫；肺の非小細胞癌腫；食道がん（ｏｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  ｃａｎｃｅｒ）；食道癌腫；希突起神経膠腫；卵巣がん；卵巣癌腫；膵臓がん；膵臓癌腫；パピローマウイルス誘導性癌腫；陰茎がん；脳下垂体腫瘍；形質細胞腫；前骨髄球性白血病（Ｍ３）；前立腺がん；前立腺腫瘍；直腸腫瘍；直腸癌腫；腎細胞癌腫；網膜芽細胞腫；肉腫；シュネーベルガー病；小細胞肺癌腫；小腸がん；小腸腫瘍；軟組織腫瘍；棘細胞腫；扁平上皮癌；胃がん；精巣がん；咽頭がん；胸腺腫；甲状腺がん；甲状腺癌腫；舌がん；未分化ＡＭＬ（ＭＯ）；尿道がん；子宮がん；膣がん；フォンヒッペルリンダウ病；外陰がん；ウィルムス腫瘍；ならびに色素性乾皮症から選択される疾患および／または障害を処置するための方法である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項２９】
前記方法が、動脈性高血圧症；動脈硬化症；動脈硬化性病変；ベーチェット症候群；血管分岐；心肥大；心血管肥大；心筋症、特に、化学療法誘導性心筋症；脳虚血症；冠動脈性心疾患；腹部大動脈の拡張；限局性脳虚血症；全脳虚血症；心臓肥大；腎臓下動脈瘤性高血圧症；虚血症；心筋梗塞、特に、急性心筋梗塞；心筋炎；再灌流；再狭窄；血管炎；およびウェゲナー肉芽腫症から選択される疾患および／または障害を処置するための方法である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項３０】
冠動脈バイパスグラフト術（ＣＡＢＧ術）、経皮的経管的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）、および／またはステント処置に対して補完的に用いられる、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項３１】
前記方法が、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）；喘息；呼吸器系を侵す慢性疾病；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；嚢胞性線維症；肺疾患；炎症性肺疾患；肺炎；肺線維症などから選択される疾患および／または障害を処置するための方法である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項３２】
前記方法が、大腸炎、非定型大腸炎、化学物質性大腸炎；コラーゲン蓄積大腸炎、遠位性大腸炎、空置大腸炎；劇症性大腸炎、分類不能大腸炎、感染性大腸炎、虚血性大腸炎、リンパ球性大腸炎、顕微鏡的大腸炎、クローン病、胃腸炎、ヒルシュプルング病、炎症性消化器疾患；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、モルブスクローン病、非慢性または慢性消化器疾患、非慢性または慢性炎症性消化器疾患；限局性腸炎および潰瘍性大腸炎から選択される疾患および／または障害を処置するための方法である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項３３】
前記方法が、細菌性感染性疾患、ウイルス性感染性疾患、ウイルス性脳炎；ウイルス誘導性がんおよびウイルス誘導性腫瘍、ヒト免疫不全ウイルス性認知症、髄膜炎、髄膜脳炎、脳脊髄炎、ならびに扁桃炎から選択される疾患および／または障害を処置するための方法である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項３４】
前記方法が、アールスコグ症候群、アセトアミノフェンによる肝毒性；アルダー−レイリー異常症；円形脱毛症；アルファ−１−アンチトリプシン欠損症；アナフィラキシー；アポトーシス；アポトーシス性細胞死；非定型溶血性尿毒症症候群；好塩基球減少症；好塩基球増加症；双極性障害；火傷；細胞へのせん断応力；チェディアック−東症候群；化学療法薬に起因するＤＮＡ損傷；胆汁うっ滞；第１１染色体（１１ｑ）の部分的モノソミー；第２２染色体のモザイク型トリソミー；慢性肉芽腫症；慢性肝炎または劇症性肝炎などの肝炎；臨床的うつ病；分類不能型低ガンマグロブリン血症；先天性Ｃ３欠損症；活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）からのＣＴＬの保護；難聴；うつ病およびうつ性障害（特に、サイトカイン誘導疾病挙動のバックグラウンドにおいて発症するうつ性障害の防止）、ディジョージ症候群；アポトーシスの欠陥により引き起こされる疾患；肝疾患；脊椎疾患；子宮疾患；ＤＮＡ損傷剤および／またはイオン化放射線への曝露に起因する疾患状態および症状、ならびに結果として生じる細胞へのストレス；ダウン症候群；デュシェンヌ筋ジストロフィー；外胚葉性形成異常；子宮内膜症；好酸球減少症；好酸球増加症；興奮毒性性細胞死；胎児性アルコール症候群；線維症；線維性疾患；線維性組織の形成；フリーラジカル（細胞へのストレスをもたらす）；移植片拒絶；移植片対宿主病；脱毛；溶血性尿毒症症候群；肝毒性；糖尿病誘導性痛覚過敏などの痛覚過敏；高体温症；低血糖症；甲状腺機能低下症；特発性好酸球増加症候群；ＩｇＡ腎症；小児性Ｘ染色体性ガンマグロブリン欠乏血症；炎症性疼痛；腎臓下動脈瘤；膵島細胞再生；膵島細胞移植；ヨブ症候群（高ＩｇＥ症候群）；走化性欠損白血球症候群；白血球グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ欠損症；白質萎縮症；白血球減少症；リンパ球性白血球増加症；リンパ球減少症；リンパ球増加症；大うつ病；躁病；躁うつ病；マルファン症候群；肥満細胞症；メイ−ヘグリン異常症；ＩＩ型膜性増殖性子球体腎炎；単球減少症；単球増加症；良性ミエロペルオキシダーゼ欠損症；ミオパシー；好中球減少症；好中球増加症；ネゼロフ症候群；臓器移植；酸化ストレスによる傷害；ペルゲル−フェット核異常；多嚢胞性腎疾患；透析後症候群；放射線症候群；放射線治療；腎疾患；腎不全；活性化誘導性細胞死からのＣＴＬのレスキュー；重度の複合型免疫不全疾患；移植拒絶反応；移植；トリソミー；単極性うつ病；ＵＶ誘導性傷害；ウィスコット−アルドリッチ症候群、ならびに創傷の治癒から選択される疾患および／または障害を処置するための方法である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項３５】
前記方法が、顎関節障害を処置するための方法である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項３６】
前記方法が、粘膜炎を処置するための方法である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項３７】
前記方法が、口内炎を処置するための方法である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項３８】
前記方法が、インプラント周囲炎を処置するための方法である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項３９】
前記方法が、口腔扁平苔癬を処置するための方法である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項４０】
前記方法が、尋常性天疱瘡を処置するための方法である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項４１】
前記方法が、歯周炎を処置するための方法である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項４２】
前記方法が、慢性歯周炎を処置するための方法である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項４３】
前記方法が、歯髄炎を処置するための方法である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項４４】
前記方法が、ブドウ膜炎、特に、前部ブドウ膜炎、中間部ブドウ膜炎、および／または後部ブドウ膜炎を処置するための方法である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項４５】
前記方法が、眼乾燥症候群を処置するための方法である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項４６】
冠動脈バイパスグラフト術との関連で投与される、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項４７】
経皮的経管的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）との関連で投与される、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項４８】
ステント留置との関連で投与される、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項４９】
前記方法が、急性心筋梗塞を処置するための方法である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項５０】
前記方法が、アテローム性動脈硬化を処置するための方法である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項５１】
前記方法が、ＣＯＰＤを処置するための方法である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項５２】
前記方法が、喘息を処置するための方法である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項５３】
前記方法が、関節リウマチを処置するための方法である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項５４】
前記方法が、変形性関節症を処置するための方法である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項５５】
前記方法が、クローン病を処置するための方法である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項５６】
前記方法が、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を処置するための方法である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項５７】
前記方法が、乾癬を処置するための方法である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項５８】
前記方法が、糖尿病、特に、１型糖尿病を処置するための方法である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項５９】
前記方法が、脳卒中を処置するための方法である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項６０】
前記方法が、パーキンソン病を処置するための方法である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項６１】
前記方法が、アルツハイマー病を処置するための方法である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項６２】
前記方法が、全身性エリテマトーデスを処置するための方法である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項６３】
前記方法が、血管炎、特に、ウェゲナー肉芽腫症を処置するための方法である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項６４】
前記方法が、急性聴力損失を処置するための方法である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項６５】
配列番号１７２の配列からなる、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用のためのＪＮＫ阻害剤。
【請求項６６】
請求項１から１５のいずれかに記載のＪＮＫ阻害剤と薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素阻害の分野、特に、ｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）の（ポリ）ペプチド阻害剤に関する。特に、本発明は、これらのＪＮＫ阻害剤を、多様な疾患の処置において用いることに関する。
【背景技術】
【０００２】
ｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）とは、マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼのストレス活性化群のメンバーである。これらのキナーゼは、細胞成長および細胞分化の制御に関与し、より一般には、環境からの刺激に対する細胞の応答に関与している。ＪＮＫシグナル伝達経路は、環境ストレスに応答して、かつ、いくつかのクラスの細胞表面受容体の仲介により活性化する。これらの受容体には、サイトカイン受容体、セルペンチン受容体、および受容体チロシンキナーゼが含まれうる。哺乳動物細胞では、ＪＮＫが、発がん性形質転換および環境ストレスに対する適応応答の媒介などの生物学的過程に関与している。ＪＮＫはまた、免疫細胞の成熟および分化を含めた免疫反応の調節のほか、免疫系による破壊のために同定された細胞におけるプログラム細胞死の実行とも関連している。この固有の特性により、ＪＮＫシグナル伝達は、薬理学的介入を開発するための有望な標的となっている。いくつかの神経障害のうちで、ＪＮＫシグナル伝達は特に、虚血性脳卒中およびパーキンソン病に関与しているが、また、下記でさらに言及される他の疾患にも関与している。さらに、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）ｐ３８アルファは、ＪＮＫ−ｃ−Ｊｕｎ経路をアンタゴナイズすることにより、細胞増殖を負に調節することも示された。したがって、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）ｐ３８アルファは、正常細胞およびがん細胞の増殖の抑制において活性であると考えられ、がん疾患におけるＪＮＫの関与もさらに裏付けている（例えば、Ｈｕｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、３９巻、６号、２００７年６月を参照されたい）。また、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）が、脊髄神経結紮（ＳＮＬ）によりもたらされる神経障害性疼痛であって、ＳＮＬによりＪＮＫ、特に、ＪＮＫ１の緩徐で遷延性の活性化が誘導される疼痛に関与するのに対し、ｐ３８マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ活性化は、ＳＮＬ後の脊髄ミクログリアにおいて見出されたが、２１日間で基底レベル近傍まで降下したことも示された（Ｚｈｕａｎｇら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２００６年３月２９日、２６巻（１３号）：３５５１〜３５６０頁））。２００７年（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、１３４１〜１３４８頁）において、Ｊｏｈｎｓｏｎらは、ｃ−Ｊｕｎキナーゼ／ストレス活性化経路についての総説で、海馬ニューロンの興奮毒性、肝虚血症、再灌流、神経変性疾患、聴力損失、難聴、出生時神経管欠損症、がん、慢性炎症性疾患、肥満、糖尿病、特に、インスリン抵抗性糖尿病への関与など、ＪＮＫシグナル伝達の疾患への関与について論じ、選択的ＪＮＫ阻害剤が、高度の特異性および毒性の欠如を伴う多様な疾患の処置に必要とされる可能性が高いことを提起した。
【０００３】
したがって、ＪＮＫシグナル伝達経路の阻害または遮断は、ＪＮＫシグナル伝達と強く関連する障害に対抗するのに有望な手法である。しかしこれまでのところ、公知のＪＮＫシグナル伝達経路阻害剤は少数であるに過ぎない。
【０００４】
先行技術において既に公知のＪＮＫシグナル伝達経路阻害剤には、例えば、上流のキナーゼ阻害剤（例えば、ＣＥＰ−１３４７）、例えば、タンパク質キナーゼのＡＴＰ結合部位と競合することによりキナーゼ活性に直接影響を及ぼす低分子の化学的ＪＮＫ阻害剤（ＳＰ６００１２５およびＡＳ６０１２４５）、およびＪＮＫとその基質との間の相互作用に対するペプチド阻害剤（例えば、全てが参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｕａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  −  ＣＮＳ  ＆  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、２００５年２月、４巻、１号、６３〜６７頁；ＷＯ２００７／０３１２８０を参照されたい）が含まれる。ＷＯ２００７／０３１２８０は、ＨＩＶ−ＴＡＴタンパク質の塩基性トラフィキング配列に由来する、いわゆるＴＡＴ輸送体配列およびＩＢ１のアミノ酸阻害性配列を含む、低分子の細胞透過性融合ペプチドについて開示している。
【０００５】
ＷＯ２００７／０３１２８０は、特に、２つの特定の配列であるＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ、本明細書における配列番号１９６）およびＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｄｑｓｒｐｖｑｐｆｌｎｌｔｔｐｒｋｐｒｐｐｒｒｒｑｒｒｋｋｒｇ；本明細書における配列番号１９７）（後者はＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１のレトロインベルソ配列である）について開示している。ＨＩＶ  ＴＡＴに由来する輸送体配列に起因して、これらの融合ペプチドは、標的細胞へとより効率的に輸送され、標的細胞では、タンパク質分解がなされるまで有効性を保持する。
【０００６】
ＪＮＫに対するＡＴＰ非依存性のペプチド阻害剤は通例、より特異的な阻害剤であるので、ＪＮＫを阻害するとなると、第１選択となることが多い。しかし、ＷＯ２００７／０３１２８０で開示されているペプチド阻害剤でもなお、全ての目的に最適というわけではない。例えば、Ｌアミノ酸だけからなる化合物Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（本明細書における配列番号１９６）は、急速にタンパク質分解される。この問題を克服するために、ＷＯ２００７／０３１２８０の発明者らはまた、Ｄアミノ酸を含むＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１（本明細書における配列番号１９７）も示唆した。より正確に述べると、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１は、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１のレトロインベルソ配列を呈示する。Ｄ−アミノ酸の組込みは、立体化学の変化は、機能の喪失をもたらしうるという事実により困難となる。ｉ）Ｄ−アミノ酸だけであるが、ｉｉ）逆のペプチド配列にあるアミノ酸の使用は、１つまたは複数のＤ−アミノ酸を元の配列へと組み込むより、元のペプチドの許容可能なコンフォメーション類似体をもたらす可能性が高いため、レトロインベルソ法を使用して、前記危険性を低減することができる。にもかかわらず、ＷＯ２００７／０３１２８０の場合は、この手法が、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１と比較して、阻害能の著明な減殺を結果としてもたらした（図４を参照されたい）。加えて、レトロインベルソペプチドがタンパク質分解性消化に対してきわめて安定的である結果として、例えば、時間的制約のある実験における制御消化もほとんど不可能である。
【０００７】
当技術分野では、多様な疾患状態のための処置として、ＪＮＫ阻害剤が論じられ、提起され、調べられて成功してもいる。既に、１９９７年に、Ｄｉｃｋｅｎｓらは、ｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ阻害剤であるＪＩＰ−１について記載し、ＪＩＰ−１を、例えば、特に、Ｂｃｒ−Ａｂｌにより引き起こされるプレＢ細胞の形質転換の文脈における慢性骨髄性白血病を処置する治療戦略のための候補化合物として提起した（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９７年、２７７巻（５３２６号）：６９３〜６９６頁）。
【０００８】
２００１年には、Ｂｏｎｎｙおよび共同研究者らが、ＪＮＫの細胞透過性ペプチド阻害剤が、膵臓β細胞に対する、ＩＬ−１β誘導性アポトーシスからの、長期にわたる保護を確保し、したがって、糖尿病の経過における自己免疫性破壊にあってもβ細胞を温存しうることを公表した（Ｄｉａｂｅｔｅｓ、５０巻、２００１年、７７〜８２頁）。
【０００９】
Ｂｏｎｎｙら（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、２００５年、５７〜６７頁における総説）はまた、興奮毒性、ニューロンの細胞死、低酸素症、虚血症、外傷性脳損傷、てんかん、神経変性疾患、ニューロンおよび内耳感覚聴細胞のアポトーシスなどの文脈で、ＪＮＫ阻害剤であるＤ−ＪＮＫＩ−１および他のＪＮＫ阻害剤の阻害性作用についても論じた。
【００１０】
ＷＯ９８／４９１８８では、パーキンソン病またはアルツハイマー病などの神経変性疾患；脳卒中およびこれに付随する記憶喪失、関節炎などの自己免疫疾患；炎症によって特徴付けられる他の状態；白血病、例えば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）などの悪性腫瘍；肝臓および腎臓などの器官に対する酸化的損傷；心疾患；ならびに移植片拒絶を処置するために、ＪＩＰ−１に由来する、ＪＮＫシグナル伝達の阻害剤が提起されている。
【００１１】
Ｂｏｒｓｅｌｌｏら（Ｎａｔ  Ｍｅｄ、２００３年、（９巻）、１１８０〜１１８６頁）は、ｃ−Ｊｕｎ−Ｎ末端キナーゼのペプチド阻害剤が、興奮毒性および脳虚血症に対して保護的であることを公表した。
【００１２】
Ａｓｓｉらは、別の特定のＪＮＫ阻害剤であるＳＰ６００１２５が、マウス急性大腸炎における腫瘍壊死因子αの産生および上皮細胞のアポトーシスを標的化することを公表した。著者らは、ヒト炎症性腸疾患の処置におけるＪＮＫの阻害が役立つことを結論付けた（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００６年、１１８巻（１号）：１１２〜１２１頁）。
【００１３】
Ｋｅｎｎｅｄｙら（Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ、２００３年、２巻（３号）、１９９〜２０１頁）では、ＪＮＫシグナル伝達の腫瘍の発症における役割が、より詳細に論じられている。
【００１４】
Ｌｅｅ  Ｙｏｎｇ  Ｈｅｅら（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２００３年、２７８巻（５号）、２８９６〜２９０２頁）は、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）が、インスリンシグナル伝達カスケードのフィードバック阻害を媒介することを示し、ＪＮＫシグナル伝達の阻害が、糖尿病患者におけるインスリン抵抗性を軽減するための良好な治療法であることを提起した。
【００１５】
Ｍｉｌａｎｏら（Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、２００７年、１９２巻（４号）：Ｈ１８２８〜Ｈ１８３５頁）は、ｃ−ＪｕｎのＮＨ２末端キナーゼのペプチド阻害剤が、心筋虚血症−再灌流傷害を軽減し、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける梗塞サイズを低減することを発見した。前記研究の著者らは、細胞内移動を媒介するヒト免疫不全ウイルスＴＡＴタンパク質の１０アミノ酸のＴＡＴ配列へと連結された、膵島−脳１／ＪＮＫ相互作用タンパク質１の最小限のＪＮＫ結合ドメインの２０アミノ酸の配列を含有する、２つのドメインペプチドによるペプチド阻害剤であるＤ−ＪＮＫＩ−Ｉを用いた。著者らは、前記阻害剤の存在に起因するＪＮＫの活性およびリン酸化の低減が、虚血症およびアポトーシスの段階にあるラットにおける心機能の温存に重要であることを結論付けた。
【００１６】
さらなる研究グループは、ＪＮＫの低分子ペプチド阻害剤が、ＪＮＫシグナル伝達経路の阻害を介して、ＭＰＴＰ誘導黒質ドーパミン作動性傷害に対して保護的であることを公表している（Ｐａｎら、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、２０１０年、９０巻、１５６〜１６７頁）。著者らは、ＴＡＴペプチドへと融合させたマウスＪＩＰ−１の残基１５３〜１６３を含むペプチドが、ＪＮＫシグナル伝達経路の阻害を介して、ＭＰＴＰによる傷害に対する神経保護をもたらし、パーキンソン病のための治療法をもたらすことを結論付けた。
【００１７】
聴力損傷については、Ｐｉｒｖｏｌａら（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２０００年、２０巻（１号）、４３〜５０頁）が、ｃ−Ｊｕｎ−Ｎ末端キナーゼ活性化の阻害剤であるＣＥＰ−１３４７／ＫＴ７５１５による、聴覚、聴覚有毛細胞、およびニューロンのレスキューについて記載した。著者らは一般に、ＪＮＫシグナル伝達カスケードへの治療的介入が、内耳傷害を処置する機会をもたらしうることを示唆した。ＪＮＫ阻害性ペプチドを投与することによる聴力損失の処置はまた、例えば、ＷＯ０３／１０３６９８においても開示されている。
【００１８】
特に、網膜疾患および加齢性黄斑変性については、Ｒｏｄｕｉｔら（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ、２００８年、１３巻（３号）、３４３〜３５３頁）が、ＪＮＫ阻害を治療法として用いることを同様に示唆した。例えば、ＷＯ２０１０／１１３７５３では、加齢性黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病網膜症、中心性滲出性脈絡網膜症、網膜色素線条、網膜色素上皮剥離、多病巣性脈絡膜炎、新生血管黄斑症（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｍａｃｕｌｏｐａｔｈｙ）、未熟児網膜症、色素性網膜炎、レーバー病、網膜動脈閉塞症、網膜静脈閉塞症、中心性漿液性脈絡網膜症、網膜動脈瘤、網膜剥離、増殖性硝子体網膜症、スタルガルト病、脈絡膜硬化症、脈絡膜欠如（ｃｈｏｒｉｏｄｅｒｅｍｉａ）、卵黄状黄斑変性、小口病、白点眼底、点状網膜炎、ならびに脳回転状網膜脈絡膜萎縮を処置するための、ＪＮＫ阻害に依拠する同様の考慮が開示されている。
【００１９】
Ｚｏｕｋｈｒｉら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００６年、９６巻、１２６〜１３５頁）は、ｃ−Ｊｕｎ  ＮＨ２末端キナーゼが、涙腺分泌のインターロイキン１β誘導性阻害を媒介することを同定した。Ｚｏｕｋｈｒｉらは、ＪＮＫが、涙腺分泌のＩＬ−１β介在性阻害および後続するドライアイにおいて、枢要な役割を果たすことを結論付けた。
【００２０】
ブドウ膜炎については、Ｔｏｕｃｈａｒｄら（Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ、２０１０年、５１巻（９号）、４６８３〜４６９３頁）が、Ｄ−ＪＮＫＩ１を、有効な処置として用いることを示唆した。
【００２１】
ＩＢＤ（炎症性腸疾患）については、Ｒｏｙら（Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ、２００８年、１４巻（２号）、２００〜２０２頁）は、ＩＢＤにおけるＪＮＫシグナル伝達経路の役割を強調し、ペプチドによるＪＮＫ阻害剤を、前記疾患状態の処置に用いることを提起した。
【００２２】
Ｂｅｃｋｈａｍら（Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．、２００７年７月、８１巻（１３号）：６９８４〜６９９２頁）は、ＪＮＫ阻害剤であるＤ−ＪＮＫＩ−１が、マウスをウイルス性脳炎から保護するのに有効であることを示し、このために、ＪＮＫの阻害をウイルス性脳炎のための有望で新規の処置戦略として示唆した。
【００２３】
Ｐａｌｉｎら（Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  （Ｂｅｒｌ）、２００８年５月、１９７巻（４号）：６２９〜６３５頁）は、同じＪＮＫ阻害剤であるＤ−ＪＮＫＩ−１を用い、Ｄ−ＪＮＫＩ−１による前処置（マウス１匹当たり１０ｎｇ）が、中枢ＴＮＦアルファにより誘導される３つの疾病の徴候全てを著明に阻害するが、Ｄ−ＴＡＴはそれほど阻害しないことを見出し、ＪＮＫの阻害を、サイトカイン誘導性疾病挙動のバックグラウンドにおいて発症する大うつ病性障害を処置するための手段として示唆した。
【００２４】
ＷＯ２０１０／１５１６３８では、神経変性疾患である脊髄性筋萎縮症のＪＮＫ阻害による処置が提起された。
【００２５】
上記の段落では、既に、一部の選択された刊行物だけに基づいて、多様な疾患の処置におけるＪＮＫ阻害剤の有用性について強調している。したがって、当技術分野では、ヒト（および動物）疾患の処置における使用のためのＪＮＫ阻害剤が絶えず必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２６】
【特許文献１】国際公開第２００７／０３１２８０号
【特許文献２】国際公開第９８／４９１８８号
【特許文献３】国際公開第０３／１０３６９８号
【特許文献４】国際公開第２０１０／１１３７５３号
【特許文献５】国際公開第２０１０／１５１６３８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
したがって、本発明が解決しようとする課題は、ＪＮＫのさらなる（ペプチド）阻害剤を提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
ＪＮＫ阻害剤
第１の態様では、本発明は、治療によりヒトまたは動物の身体を処置するための方法における使用のためのＪＮＫ阻害剤であって、以下の一般式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｒ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｌ−Ｘ７−Ｌ−Ｘ８（配列番号１）
［式中、Ｘ１は、アミノ酸Ｒ、Ｐ、Ｑ、およびｒから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ２は、アミノ酸Ｒ、Ｐ、Ｇ、およびｒから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ３は、アミノ酸Ｋ、Ｒ、ｋ、およびｒから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ４は、アミノ酸ＰおよびＫから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ５は、アミノ酸Ｔ、ａ、ｓ、ｑ、ｋから選択されるアミノ酸であるか、または存在せず、
Ｘ６は、アミノ酸Ｔ、Ｄ、およびＡから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７は、アミノ酸Ｎ、ｎ、ｒ、およびＫから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ８は、Ｆ、ｆ、およびｗから選択されるアミノ酸である］
に従う阻害性（ポリ）ペプチド配列であり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７、およびＸ８からなる群より選択されるアミノ酸のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または６つが、Ｄ−アミノ酸であるという条件を伴う配列、好ましくは、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７、およびＸ８からなる群より選択されるアミノ酸のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つが、Ｄ−アミノ酸であるという条件を伴う配列を含むＪＮＫ阻害剤に関する。
【００２９】
本発明者は、本発明の目的を、下記および付属の特許請求の範囲で示される対象物により解決する。
【００３０】
以下では、付属の図面について、簡単な説明を施す。図面は、本発明をより詳細に例示することを意図する。しかし、図面は、いかなる形であれ、本発明の対象物を限定することを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１ａ】図１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ−Ｓｃｒｅｅｎ  Ａｓｓａｙ）により探索された、本発明に従ういくつかのＪＮＫ阻害剤の阻害有効性を例示する図である。図１Ａは、配列番号１９３、２、３、５、６、および７によるＪＮＫ１の阻害を示す図である。
【図１ｂ】図１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ−Ｓｃｒｅｅｎ  Ａｓｓａｙ）により探索された、本発明に従ういくつかのＪＮＫ阻害剤の阻害有効性を例示する図である。図１Ｂは、配列番号１９３、２、３、５、６、および７によるＪＮＫ２の阻害を示す図である。
【図１ｃ】図１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ−Ｓｃｒｅｅｎ  Ａｓｓａｙ）により探索された、本発明に従ういくつかのＪＮＫ阻害剤の阻害有効性を例示する図である。図１Ｃは、配列番号１９３、２、３、５、６、および７によるＪＮＫ３の阻害を示す図である。
【図２】図２は、本発明に従ういくつかのＪＮＫ阻害剤（配列番号１９３、２、３、５、６、および７）の阻害有効性を例示する表である。ｎＭ範囲のＩＣ５０値、平均のそれぞれの標準誤差、および実施された実験回数（ｎ）が示される。
【図３ａ】図３は、ＪＮＫ阻害性（ポリ）ペプチド配列と輸送体配列との融合タンパク質である、本発明に従ういくつかのＪＮＫ阻害剤の阻害有効性を例示する図である。阻害有効性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ−Ｓｃｒｅｅｎ  Ａｓｓａｙ）により決定した。図３Ａは、配列番号１９４、１９５、１７２、２００、４６、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、および１９７によるＪＮＫ１の阻害を示す図である。
【図３ｂ】図３は、ＪＮＫ阻害性（ポリ）ペプチド配列と輸送体配列との融合タンパク質である、本発明に従ういくつかのＪＮＫ阻害剤の阻害有効性を例示する図である。阻害有効性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ−Ｓｃｒｅｅｎ  Ａｓｓａｙ）により決定した。図３Ｂは、配列番号１９４、１９５、１７２、２００、４６、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、および１９７によるＪＮＫ２の阻害を示す図である。
【図３ｃ】図３は、ＪＮＫ阻害性（ポリ）ペプチド配列と輸送体配列との融合タンパク質である、本発明に従ういくつかのＪＮＫ阻害剤の阻害有効性を例示する図である。阻害有効性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ−Ｓｃｒｅｅｎ  Ａｓｓａｙ）により決定した。図３Ｃは、配列番号１９４、１９５、１７２、２００、４６、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、および１９７によるＪＮＫ３の阻害を示す図である。
【図３ｄ】図３は、ＪＮＫ阻害性（ポリ）ペプチド配列と輸送体配列との融合タンパク質である、本発明に従ういくつかのＪＮＫ阻害剤の阻害有効性を例示する図である。阻害有効性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ−Ｓｃｒｅｅｎ  Ａｓｓａｙ）により決定した。図３Ｄは、配列番号１９４、１９５、１７２、２００、４６、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、および１９７によるＪＮＫ１の阻害を示す図である。
【図３ｅ】図３は、ＪＮＫ阻害性（ポリ）ペプチド配列と輸送体配列との融合タンパク質である、本発明に従ういくつかのＪＮＫ阻害剤の阻害有効性を例示する図である。阻害有効性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ−Ｓｃｒｅｅｎ  Ａｓｓａｙ）により決定した。図３Ｅは、配列番号１９４、１９５、１７２、２００、４６、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、および１９７によるＪＮＫ２の阻害を示す図である。
【図３ｆ】図３は、ＪＮＫ阻害性（ポリ）ペプチド配列と輸送体配列との融合タンパク質である、本発明に従ういくつかのＪＮＫ阻害剤の阻害有効性を例示する図である。阻害有効性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ−Ｓｃｒｅｅｎ  Ａｓｓａｙ）により決定した。図３Ｆは、配列番号１９４、１９５、１７２、２００、４６、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、および１９７によるＪＮＫ３の阻害を示す図である。
【図４】図４は、ＪＮＫ阻害性（ポリ）ペプチド配列と輸送体配列との融合タンパク質である、本発明に従ういくつか   のＪＮＫ阻害剤の阻害有効性を例示する表である。ｎＭ範囲のＩＣ５０値、平均のそれぞれの標準誤差（ＳＥＭ）、および実施された実験回数（ｎ）を示す。
【図５】図５は、配列番号１７２、１９６、および１９７を伴うＪＮＫ阻害剤の、５０％のヒト血清における安定性を示す図である。配列番号１９６を伴うＪＮＫ阻害剤は、６時間以内に、アミノ酸残基へと十全に分解された（Ａ）。配列番号１７２を伴うＪＮＫ阻害剤が完全に分解されたのは、１４日後であるに過ぎなかった（Ｂ）。配列番号１９７を伴うＪＮＫ阻害剤は、少なくとも３０日後までは安定であった（Ｂ）。
【図６ａ】図６は、配列番号３０に表示されるＤ−アミノ酸／Ｌ−アミノ酸パターンを伴う、ＴＡＴに由来する輸送体構築物を用いる内部化実験を示す図である。解析された輸送体配列は、配列番号５２〜９４に加えて、配列番号４５、４７、４６、４３、および９９（図６ａ）および配列番号１００〜１４７（図６ｂ）に対応する。見られる通り、コンセンサス配列ｒＸＸＸｒＸＸＸｒ（配列番号３１）を伴う全ての輸送体は、Ｌ−ＴＡＴ輸送体（配列番号４３）より高い内部化能を示した。Ｈｅｌａ細胞を、９６ウェルプレート内で、１０ｍＭのそれぞれの輸送体と共に、２４時間にわたりインキュベートした。次いで、細胞を、酸性緩衝液（０．２Ｍのグリシン、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ３．０）で２回にわたり洗浄し、ＰＢＳで２回にわたり洗浄した。細胞を、ＲＩＰＡ溶解緩衝液を添加することにより破壊した。次いで、各抽出物の蛍光強度（Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｌｐｈａ  ｐｌａｔｅリーダー；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を読み取った後でバックグラウンドを除去することにより、内部化したペプチドの相対量を決定した。
【図６ｂ】図６は、配列番号３０に表示されるＤ−アミノ酸／Ｌ−アミノ酸パターンを伴う、ＴＡＴに由来する輸送体構築物を用いる内部化実験を示す図である。解析された輸送体配列は、配列番号５２〜９４に加えて、配列番号４５、４７、４６、４３、および９９（図６ａ）および配列番号１００〜１４７（図６ｂ）に対応する。見られる通り、コンセンサス配列ｒＸＸＸｒＸＸＸｒ（配列番号３１）を伴う全ての輸送体は、Ｌ−ＴＡＴ輸送体（配列番号４３）より高い内部化能を示した。Ｈｅｌａ細胞を、９６ウェルプレート内で、１０ｍＭのそれぞれの輸送体と共に、２４時間にわたりインキュベートした。次いで、細胞を、酸性緩衝液（０．２Ｍのグリシン、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ３．０）で２回にわたり洗浄し、ＰＢＳで２回にわたり洗浄した。細胞を、ＲＩＰＡ溶解緩衝液を添加することにより破壊した。次いで、各抽出物の蛍光強度（Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｌｐｈａ  ｐｌａｔｅリーダー；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を読み取った後でバックグラウンドを除去することにより、内部化したペプチドの相対量を決定した。
【図７】図７は、配列番号１７２の配列を伴うＪＮＫ阻害剤が、ＴＨＰ１細胞をＰＭＡにより分化させたマクロファージにおいて、ＬＰＳに誘導されるサイトカインおよびケモカインの放出を遮断することを示す図である。図７Ａは、ＴＮＦαの放出（ＴＨＰ１細胞を、３ｎｇ／ｍＬのＬＰＳを伴うＰＭＡで６時間にわたり処理する）を示す図であり、図７Ｂは、ＴＮＦａの放出（ＴＨＰ１細胞を、１０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳを伴うＰＭＡで６時間にわたり処理する）を示す図であり、図７Ｃは、ＩＬ６の放出（ＴＨＰ１細胞を、１０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳを伴うＰＭＡで６時間にわたり処理する）を示す図であり、図７Ｄは、ＭＣＰ１の放出（ＴＨＰ１細胞を、３ｎｇ／ｍＬのＬＰＳを伴うＰＭＡで６時間にわたり処理する）を示す図である。
【図８】図８は、配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤が、ＴＨＰ１を分化させたマクロファージにおいて、ＬＰＳに誘導されるＩＬ６の放出を、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（配列番号１９７）、ｄＴＡＴ（配列番号４５）、およびＳＰ６００１２５より大きな効力で遮断することを示す図である。ＬＰＳは、６時間にわたり添加した（１０ｎｇ／ｍＬ）。
【図９】図９は、配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤が、ＴＨＰ１を分化させたマクロファージにおいて、ＬＰＳに誘導されるＴＮＦαの放出を、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（配列番号１９７）、ｄＴＡＴ（配列番号４５）、およびＳＰ６００１２５より大きな効力で遮断することを示す図である。ＬＰＳは、６時間にわたり添加した（１０ｎｇ／ｍＬ）。
【図１０】図１０は、配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤が、ＰＭＡを分化させたマクロファージにおいて、ＬＰＳに誘導されるＩＬ−６の放出を、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（配列番号１９７）、およびＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（配列番号１９６）より大きな効力で遮断することを示す図である。ＬＰＳは、６時間にわたり添加した。
【図１１】図１１は、配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤が、ＰＭＡを分化させたマクロファージにおいて、ＬＰＳに誘導されるＴＮＦαの放出を、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（配列番号１９７）、およびＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（配列番号１９６）より大きな効力で遮断することを示す図である。
【図１２】図１２は、配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤が、初代ラット全血液細胞において、ＬＰＳに誘導されるＴＮＦα放出を、３ｎｇ／ｍＬで遮断することを示す図である。ＬＰＳのレベル（ｎｇ／ｍＬ）が異なるときの、対照、１μＭの配列番号１７２、３μＭの配列番号１７２、および１０μＭの配列番号１７２についての結果が示される。
【図１３】図１３は、配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤が、ＰＭＡ／イオノマイシンに応答する、初代ヒトＴ細胞によるＩＬ２の分泌を遮断することを示す図である。
【図１４】図１４は、配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤が、ＣＤ３／ＣＤ２８による刺激に応答する、初代ヒトＴ細胞によるＩＬ２の分泌を遮断することを示す図である。用いられたＪＮＫ阻害剤は、それらの配列番号１７２および１９７により示される。
【図１５】図１５は、初代ラットリンパ節の精製Ｔ細胞において、ＣＤ３／ＣＤ２８により誘導されるＩＬ−２の放出に対する、配列番号１７２を伴うＪＮＫ阻害剤による用量依存的な阻害を示す図である。対照ラットを屠殺し、リンパ節を採取した。さらに、Ｔ細胞を精製し（磁気による陰性選択を用いて）、９６ウェルプレートへと、ウェル１つ当たり２００，０００個の細胞で播種した。細胞を、抗ラットＣＤ３抗体および抗ラットＣＤ２８抗体（２μｇ／ｍＬ）で処理した。配列番号１７２を伴うＪＮＫ阻害剤を、培養物へと、ＣＤ３／ＣＤ２８による処理の１時間前に添加し、ＩＬ−２の放出を、上清中で、処理の２４時間後に評価した。
【図１６】図１６は、初代ラットリンパ節の精製Ｔ細胞において、ＣＤ３／ＣＤ２８により誘導されるＩＬ−２の放出に対する用量依存的な阻害：いくつかのＪＮＫ阻害剤、すなわち、配列番号１７２、１９７、およびＳＰ６００１２５の比較を示す図である。
【図１７】図１７は、ＰＭＡ＋イオノマイシンで刺激されたラット全血液における、ＩＬ−２放出の用量依存的な阻害を示す図である。配列番号１７２を伴うＪＮＫ阻害剤は、ＰＭＡ＋イオノマイシンによる刺激の１時間前に、３つの異なる濃度、すなわち、１、３、および１０μＭで添加した。３つの用量（２５／５００ｎｇ／ｍＬ、５０／７５０ｎｇ／ｍＬ、および５０／１０００ｎｇ／ｍＬ）の活性化剤を４時間にわたり添加した。ＩＬ−２の放出を上清中で評価した。配列番号１７２を伴うＪＮＫ阻害剤は、３つの被験活性化剤濃度のＰＭＡ−イオノマイシンに誘導されるＩＬ−２の放出を、１０μＭで効率的に低減した。
【図１８】図１８は、ヒト全血液におけるＪＮＫの阻害およびＩＬ−６の放出を示す図である。配列番号１７２を伴うＪＮＫ阻害剤は、全血液の、ＬＰＳ（０．０２ｎｇ／ｍＬ）による、４時間にわたる刺激の１時間前に、３つの異なる濃度、すなわち、１、３、および１０μＭで添加した。配列番号１７２を伴うＪＮＫ阻害剤は、ＬＰＳに誘導されるＩＬ−６の放出を用量依存的な形で低減した。
【図１９】図１９は、ヒト全血液におけるＪＮＫの阻害およびＩＬ−２の放出を示す図である。配列番号１７２を伴うＪＮＫ阻害剤は、全血液の、ＰＭＡ＋イオノマイシン（２５／７００ｎｇ／ｍＬ、５０／８００ｎｇ／ｍＬ、および５０／１０００ｎｇ／ｍＬ）による、４時間にわたる刺激の１時間前に、３つの異なる濃度、すなわち、１、３、および１０μＭで添加した。配列番号１７２を伴うＪＮＫ阻害剤は、ＰＭＡ＋イオノマイシンに誘導されるＩＬ−２の放出を用量依存的な形で低減した。
【図２０】図２０は、ヒト全血液におけるＪＮＫの阻害およびＩＦＮ−γの放出を示す図である。配列番号１７２を伴うＪＮＫ阻害剤は、全血液の、ＰＭＡ＋イオノマイシン（２５／７００ｎｇ／ｍＬ、５０／８００ｎｇ／ｍＬ、および５０／１０００ｎｇ／ｍＬ）による、４時間にわたる刺激の１時間前に、３つの異なる濃度、すなわち、１、３、および１０μＭで添加した。配列番号１７２を伴うＪＮＫ阻害剤は、ＰＭＡ＋イオノマイシンに誘導されるＩＦＮ−γの放出を用量依存的な形で低減した。
【図２１】図２１は、ヒト全血液におけるＪＮＫの阻害およびＴＮＦ−αの放出を示す図である。配列番号１７２を伴うＪＮＫ阻害剤は、全血液の、ＰＭＡ＋イオノマイシン（２５／７００ｎｇ／ｍＬ、５０／８００ｎｇ／ｍＬ、および５０／１０００ｎｇ／ｍＬ）による、４時間にわたる刺激の１時間前に、３つの異なる濃度、すなわち、１、３、および１０μＭで添加した。配列番号１７２を伴うＪＮＫ阻害剤は、ＰＭＡ＋イオノマイシンに誘導されるＴＮＦ−αの放出を用量依存的な形で低減した。
【図２２】図２２は、ヒト全血液におけるＪＮＫの阻害およびＴＮＦ−αの放出を示す図である。配列番号１７２を伴うＪＮＫ阻害剤は、全血液の、ＰＨＡ−Ｌ（５μｇ／ｍＬ）による、３日間にわたる刺激の１時間前に、３つの異なる濃度、すなわち、１、３、および１０μＭで添加した。配列番号１７２を伴うＪＮＫ阻害剤は、ＰＨＡ−Ｌに誘導されるＴＮＦ−αの放出を用量依存的な形で低減した。
【図２３】図２３は、ヒト全血液におけるＪＮＫの阻害およびＩＬ−２の放出を示す図である。配列番号１７２を伴うＪＮＫ阻害剤は、全血液の、ＰＨＡ−Ｌ（５μｇ／ｍＬ）による、３日間にわたる刺激の１時間前に、３つの異なる濃度、すなわち、１、３、および１０μＭで添加した。配列番号１７２を伴うＪＮＫ阻害剤は、ＰＨＡ−Ｌに誘導されるＩＬ−２の放出を用量依存的な形で低減した。
【図２４】図２４は、ヒト全血液におけるＪＮＫの阻害およびＴＮＦ−αの放出を示す図である。配列番号１７２を伴うＪＮＫ阻害剤は、全血液の、ＣＤ３±ＣＤ２８抗体（２μｇ／ｍＬ）による、３日間にわたる刺激の１時間前に、３つの異なる濃度、すなわち、１、３、および１０μＭで添加した。配列番号１７２を伴うＪＮＫ阻害剤は、ＣＤ３／ＣＤ２８に誘導されるＴＮＦ−αの放出を用量依存的な形で低減した。
【図２５】図２５は、ＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）により誘導される足部の腫脹の後における、配列番号１９７（１０μｇ／ｋｇ）および配列番号１７２（１０μｇ／ｋｇ）を伴うＪＮＫ阻害剤のｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗炎症特性についての写真による例示を示す図である。足部の腫脹は、左後足において誘導し、右後足は処理しなかった。
【図２６】図２６は、ＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）により誘導される足部の腫脹の後における、配列番号１９７（１０μｇ／ｋｇ、ｎ＝４）および配列番号１７２（１０μｇ／ｋｇ、ｎ＝３）を伴うＪＮＫ阻害剤のｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗炎症特性についてのグラフ表示である。処理後において測定された左後足の外周が示される。
【図２７】図２７は、ＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）により誘導される足部の腫脹の後における、配列番号１９７（１０μｇ／ｋｇ）および配列番号１７２（１０μｇ／ｋｇ）を伴うＪＮＫ阻害剤のｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗炎症特性についてのグラフ表示である。ＣＦＡにより誘導された足部の腫脹の１時間後において測定された、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるサイトカインの放出が示される。
【図２８】図２８は、静脈内投与（内毒素誘導ブドウ膜炎モデル）後のアルビノラットにおける、配列番号１７２に従う異なる量のＪＮＫ阻害剤の投与についての臨床的評定を示す図である。左から右へ：ビヒクル；０．０１５ｍｇ／ｋｇ（静脈内）の配列番号１７２；０．１８ｍｇ／ｋｇ（静脈内）の配列番号１７２；１．８ｍｇ／ｋｇ（静脈内）の配列番号１７２；２ｍｇ／ｋｇ（静脈内）の配列番号１９７；および２０μｇのデキサメタゾン（結膜下注射により眼へと直接投与する）である。臨床スコア（平均およびＳＥＭ）が示される。
【図２９】図２９は、１４日間にわたり確立されたラット慢性ＩＩ型コラーゲン関節炎（ＲＴＴＣ／ＳＯＬ−１）における、毎日の静脈内投与後の、配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤の応答効果を示す図である。０日目〜１４日目における体重の変化が示される。左から右へ：正常対照＋ビヒクル（ＮａＣｌ）；疾患対照＋ビヒクル（ＮａＣｌ）；５ｍｇ／ｋｇ（静脈内）の配列番号１７２；１ｍｇ／ｋｇ（静脈内）の配列番号１７２；０．１ｍｇ／ｋｇ（静脈内）の配列番号１７２；０．０１ｍｇ／ｋｇ（静脈内）の配列番号１７２；０．０５ｍｇ／ｋｇ（静脈内）のデキサメタゾンである。臨床スコア（平均およびＳＥＭ）が示される。正常群１つ当たりのｎ＝４、処置群１つ当たりのｎ＝８；＊疾患対照＋ビヒクル（ＮａＣｌ）に照らした一元ＡＮＯＶＡによるｐ≦０．０５。
【図３０】図３０は、１４日間にわたり確立されたラット慢性ＩＩ型コラーゲン関節炎（ＲＴＴＣ／ＳＯＬ−１）における、毎日の静脈内投与後の、配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤の応答効果を示す図である。時間経過に伴う足首直径（インチ）が示される。正常群１つ当たりのｎ＝４、処置群１つ当たりのｎ＝８；＊疾患対照＋ビヒクル（ＮａＣｌ）に照らした二元ＲＭ  ＡＮＯＶＡによるｐ≦０．０５。
【図３１】図３１は、１４日間にわたり確立されたラット慢性ＩＩ型コラーゲン関節炎（ＲＴＴＣ／ＳＯＬ−１）における、毎日の静脈内投与後の、配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤の応答効果を示す図である。炎症、パンヌス、軟骨損傷、および骨吸収に関する足首の組織病理学スコアが例示される。処置群のｎ＝８。＊疾患対照＋ビヒクル（ＮａＣｌ）に照らしたマン−ホイットニーのＵ検定によるｐ≦０．０５。
【図３２】図３２は、１４日間にわたり確立されたラット慢性ＩＩ型コラーゲン関節炎（ＲＴＴＣ／ＳＯＬ−１）における、毎日の静脈内投与後の、配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤の応答効果を示す図である。炎症、パンヌス、軟骨損傷、および骨吸収に関する膝の組織病理学スコアが例示される。処置群のｎ＝８。＊疾患対照＋ビヒクル（ＮａＣｌ）に照らしたマン−ホイットニーのＵ検定によるｐ≦０．０５。
【図３３】図３３は、ＥＩＵを誘導した２４時間後における細隙灯による臨床スコア付け、およびＥＩＵを誘導する前の異なる時点における、配列番号１７２に従うＪＮＫ阻害剤（静脈内で１ｍｇ／ｋｇ）の投与を示す図である。左から右へ：ビヒクル（０時間）；ＥＩＵ誘導の４週間前における配列番号１７２；ＥＩＵ誘導の２週間前における配列番号１７２；ＥＩＵ誘導の１週間前における配列番号１７２；ＥＩＵ誘導の４８時間前における配列番号１７２；ＥＩＵ誘導の２４時間前における配列番号１７２；ＥＩＵ誘導の０時間前における配列番号１７２；ＥＩＵ誘導の０時間前におけるデキサメタゾン（静脈内で２ｍｇ／ｋｇ）である。平均±ＳＥＭ。＊ビヒクルと対比したＰ＜０．０５、＊＊ビヒクルと対比したＰ＜０．０１。
【図３４】図３４は、ＥＩＵを誘導した２４時間後に定量化した、切片１つ当たりのＰＭＮ細胞の数、およびＥＩＵを誘導する前の異なる時点における、配列番号１７２に従うＪＮＫ阻害剤（静脈内で１ｍｇ／ｋｇ）の投与を示す図である。左から右へ：ビヒクル（０時間）；ＥＩＵ誘導の４週間前における配列番号１７２；ＥＩＵ誘導の２週間前における配列番号１７２；ＥＩＵ誘導の１週間前における配列番号１７２；ＥＩＵ誘導の４８時間前における配列番号１７２；ＥＩＵ誘導の２４時間前における配列番号１７２；ＥＩＵ誘導の０時間前における配列番号１７２；ＥＩＵ誘導の０時間前におけるデキサメタゾン（静脈内で２ｍｇ／ｋｇ）である。平均±ＳＥＭ。＊ビヒクルと対比したＰ＜０．０５、＊＊ビヒクルと対比したＰ＜０．０１。
【図３５】図３５は、スコポラミン誘導眼乾燥症候群を伴う動物について計算された、平均ＴＢＵＴ  ＡＵＣ値を示す図である。ビヒクル、３つの異なる濃度の、配列番号１９７の配列を伴うａｌｌ−Ｄ−レトロインベルソＪＮＫ阻害剤（ポリ）ペプチド、および３つの異なる濃度の、配列番号１７２の配列を伴うＪＮＫ阻害剤（ポリ）ペプチドで処置された動物についての結果、ならびにシクロスポリンで処置された動物についての結果が示される。
【図３６】図３６は、スコポラミン誘導ドライアイを伴う動物について計算された平均ＰＲＴＴ  ＡＵＣ（７〜２１日目）を示す図である。ビヒクル、３つの異なる濃度の、配列番号１９７の配列を伴うａｌｌ−Ｄ−レトロインベルソＪＮＫ阻害剤（ポリ）ペプチド、および３つの異なる濃度の、配列番号１７２の配列を伴うＪＮＫ阻害剤（ポリ）ペプチドで処置された動物についての結果、ならびにシクロスポリンで処置された動物についての結果が示される。
【図３７】図３７は、スコポラミン誘導眼乾燥症候群を伴う動物の、組織学的角膜病変スコアの平均を示す図である。ビヒクル、３つの異なる濃度の、配列番号１９７の配列を伴うａｌｌ−Ｄ−レトロインベルソＪＮＫ阻害剤（ポリ）ペプチド、および３つの異なる濃度の、配列番号１７２の配列を伴うＪＮＫ阻害剤（ポリ）ペプチドで処置された動物についての結果、ならびにシクロスポリンで処置された動物についての結果が示される。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明に従うＪＮＫ阻害剤による阻害性（ポリ）ペプチド配列は、Ｌ−アミノ酸を含み、大半の実施形態では、Ｄ−アミノ酸を含む。別段に指定しない限り、本明細書では、Ｌ−アミノ酸残基を大文字で示す一方、Ｄアミノ酸残基は小文字で示す。グリシンは、大文字で示すこともでき、小文字で示すこともできる（Ｄ−グリシンもＬ−グリシンも存在しないので）。別段に指定しない限り、本明細書で開示されるアミノ酸配列は常に、Ｎ末端からＣ末端へと（左から右へと）示す。所与のアミノ酸配列は、Ｃ末端および／またはＮ末端において修飾（例えば、Ｃ末端におけるアセチル化および／またはＮ末端におけるアミド化もしくはシステアミン（ｃｙｓｔｅａｍｉｄｅ）による修飾）することもでき、修飾しないでおくこともできる。明確さのために述べると、本明細書で開示されるアミノ酸配列のＣ末端および／またはＮ末端における、このような可能であるが全く任意選択の修飾を、とりわけ示すことはしない。
【００３３】
本発明のＪＮＫ阻害剤は、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）の（ポリ）ペプチド阻害剤である。前記阻害剤は、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）のキナーゼ活性を阻害する、すなわち、ｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２、および／またはＥｌｋ−１などのＪＮＫ基質のリン酸化を防止するか、またはリン酸化の程度を低減する。当業者は、本明細書で用いられる「阻害剤」という用語が、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）分子および／またはキナーゼ活性を不可逆的に破壊する化合物を含まないことを理解するであろう。さらに、本明細書で用いられる「ＪＮＫ活性の阻害」という用語は、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）のキナーゼ活性の阻害を指す。
【００３４】
さらに、本明細書で用いられるＪＮＫ阻害剤は、アミノ酸ポリマーの少なくとも１つの機能的単位、すなわち、（ポリ）ペプチド配列を含む。さらに、この少なくとも１つの機能的なアミノ酸ポリマーは、ＪＮＫ活性の阻害をもたらす。前記阻害性（ポリ）ペプチド配列のアミノ酸単量体は通例、ペプチド結合を介して互いと連結されているが、阻害活性（ＪＮＫ活性の阻害）が、完全には失われていない、すなわち、結果として得られる化学的実体が、本明細書で機能的に規定されるＪＮＫ阻害剤としてやはり機能する条件で、前記ペプチド結合（複数可）または側鎖残基の（化学）修飾も許容されうる。「（ポリ）ペプチド」という用語は、（ポリ）ペプチド単位の長さを限定するとはみなさないものとする。本発明のＪＮＫ阻害剤の阻害性（ポリ）ペプチド配列は、５００、４９０、４８０、４７０、４６０、４５０、４４０、４３０、４２０、４１０、４００、３９０、３８０、３７０、３６０、３５０、３４０、３３０、３２０、３１０、３００、２９０、２８０、２７０、２６０、２５０、２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３アミノ酸未満、または１２アミノ酸未満の長さであることが好ましい。阻害性（ポリ）ペプチド配列は、１０アミノ酸残基以上を有することが好ましく、１１アミノ酸残基以上を有することがより好ましい。
【００３５】
さらに、本発明の「ＪＮＫ阻害剤」は、ＪＮＫ活性を阻害する、例えば、ヒトＪＮＫを媒介するｃ−Ｊｕｎ基質（配列番号１９８）のリン酸化の阻害に関して、
ａ）ヒトＪＮＫ１の阻害に関して、３０００ｎＭ未満、より好ましくは２０００ｎＭ未満、なおより好ましくは１０００ｎＭ未満、なおより好ましくは５００ｎＭ未満、なおより好ましくは２５０ｎＭ未満、なおより好ましくは２００ｎＭ未満、なおより好ましくは１５０ｎＭ未満、最も好ましくは１００ｎＭ未満、
ｂ）ヒトＪＮＫ２の阻害に関して、３０００ｎＭ未満、より好ましくは２０００ｎＭ未満、なおより好ましくは１０００ｎＭ未満、なおより好ましくは５００ｎＭ未満、なおより好ましくは２５０ｎＭ未満、なおより好ましくは２００ｎＭ未満、なおより好ましくは１５０ｎＭ未満、最も好ましくは１００ｎＭ未満、および／または
ｃ）ヒトＪＮＫ３の阻害に関して、３０００ｎＭ未満、より好ましくは２０００ｎＭ未満、なおより好ましくは１０００ｎＭ未満、なおより好ましくは５００ｎＭ未満、なおより好ましくは２５０ｎＭ未満、なおより好ましくは２００ｎＭ未満、なおより好ましくは１５０ｎＭ未満、最も好ましくは１００ｎＭ未満
のＩＣ５０値を呈示する。
【００３６】
一部の適用には、阻害剤が、上記の規定に従うヒトＪＮＫ２および／またはヒトＪＮＫ３は阻害するが、上記の規定に従うＪＮＫ１は阻害しないことが好ましい。
【００３７】
当業者は、ＪＮＫ活性が阻害されたのかどうかを、容易に評価することができる。当技術分野では、複数の方法が公知である。一例は、放射性キナーゼアッセイまたは非放射性キナーゼアッセイ（例えば、Ａｌｐｈａスクリーン試験；例えば、Ｇｕｅｎａｔら、Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ、２００６年、１１巻：１０１５〜１０２６頁を参照されたい）である。
【００３８】
したがって、本発明に従うＪＮＫ阻害剤は、例えば、配列番号２〜２７のうちのいずれかに従う阻害性（ポリ）ペプチド配列を含みうる（表１を参照されたい）。
【００３９】
【表１】
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【００４０】
本発明に従うＪＮＫ阻害剤はまた、配列番号１〜２７から選択される配列、特に、配列番号８との、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を共有する阻害性（ポリ）ペプチド配列であって、
配列番号１〜２７から選択されるそれぞれの配列に照らして、このような配列同一性を共有する阻害性（ポリ）ペプチド配列が、
ａ）４位におけるＬ−アルギニン（Ｒ）残基を維持し、
ｂ）８位および１０位（配列番号２５〜２７については、７位および９位）における２つのＬ−ロイシン（Ｌ）残基を維持し、
ｃ）配列番号１のＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７、およびＸ８からなる群より選択されるアミノ酸に対応するそれぞれの位置、ならびに配列番号２〜２７内のそれぞれの位置において、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＤ−アミノ酸を呈示し、より好ましくは、配列番号１のＸ３、Ｘ５、Ｘ７、およびＸ８からなる群より選択されるアミノ酸に対応する位置、ならびに配列番号２〜２７内のそれぞれの位置において、１つ、２つ、３つ、または４つのＤ−アミノ酸を呈示し、
ｄ）ＪＮＫ活性をやはり阻害する（すなわち、本明細書で規定されるＪＮＫ阻害剤である）
という条件を伴う配列を含むＪＮＫ阻害剤（変異体）でもありうる。
【００４１】
当然ながら、本明細書で開示される変異体（特に、配列番号１〜２７から選択される配列とある程度の配列同一性を共有する（上記の規定内で）阻害性（ポリ）ペプチド配列を含むＪＮＫ阻害剤の変異体）は、それぞれの基準配列との、好ましくは１００％未満の配列同一性を共有する。
【００４２】
前記規定を考慮して、明確さのために、表１では、配列番号１〜２７を含むＪＮＫ阻害剤の変異体（上記の規定におけるａ）およびｂ）を参照されたい）において変化させることのできない残基に下線を付す。
【００４３】
同一でないアミノ酸は、保存的アミノ酸置換の結果であることが好ましい。
【００４４】
本明細書で用いられる保存的アミノ酸置換では、群のメンバー間の置換が分子の生物学的活性を温存するように、十分に類似した物理化学的特性を有するアミノ酸残基を、群内に組み入れることができる（例えば、Ｇｒａｎｔｈａｍ，  Ｒ．（１９７４年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１８５巻、８６２〜８６４頁を参照されたい）。特に、保存的アミノ酸置換は、アミノ酸が同じクラスのアミノ酸（例えば、塩基性アミノ酸、酸性アミノ酸、極性アミノ酸、脂肪族側鎖を伴うアミノ酸、正または負に帯電した側鎖を伴うアミノ酸、側鎖内に芳香族基を伴うアミノ酸、その側鎖が水素架橋をなすアミノ酸、例えば、ヒドロキシル官能基を有する側鎖などを伴うアミノ酸）に由来する置換であることが好ましい。本発明の場合には、保存的置換が、例えば、塩基性アミノ酸残基（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）の、別の塩基性アミノ酸残基（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）への置換、脂肪族アミノ酸残基（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ）の、別の脂肪族アミノ酸残基への置換、芳香族アミノ酸残基（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）の、別の芳香族アミノ酸残基への置換、トレオニンのセリンによる置換またはロイシンのイソロイシンによる置換である。当業者には、さらなる保存的アミノ酸交換が公知であろう。異性体形態は、維持することが好ましいものとし、例えば、Ｋは、ＲまたはＨへと置換することが好ましいのに対し、ｋは、ｒおよびｈへと置換することが好ましい。
【００４５】
ＪＮＫ阻害剤の変異体についての上記の規定内で可能なさらなる置換は、例えば、
ａ）配列番号１のＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、および／もしくはＸ８、または配列番号２〜２７から選択されるそれぞれの配列内の対応する位置のうちの１つ、２つ以上を、Ａまたはａへと置換する場合、
ｂ）配列番号１のＸ１もしくはＸ８、または配列番号２〜２７から選択されるそれぞれの配列内の対応する位置を欠失させる場合、
ｃ）配列番号１のＸ５、または配列番号２〜２７から選択されるそれぞれの配列内の対応する位置が、Ｅ、Ｙ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、またはＫである場合、
ｄ）配列番号１のＸ５、または配列番号２〜２７から選択されるそれぞれの配列内の対応する位置が、Ｅ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、またはＫである場合、あるいは
ｅ）配列番号１のＸ１、Ｘ２、Ｘ３、または配列番号２〜２７から選択されるそれぞれの配列内の対応する位置のうちの１つ、２つ、または３つが、中性アミノ酸である場合
である。
【００４６】
本明細書で用いられる、「配列同一性％」という用語は、以下の通りに理解しなければならない。配列の間の最大の相関をもたらすように、比較されるこれらの２つの配列を配列決定する。これは、一方または両方の配列に「ギャップ」を挿入して、アライメントの程度を増大させることを包含しうる。次いで、比較される配列の各々の全長にわたり同一性％を決定する（いわゆる、グローバルアライメント）こともでき（これは、同じであるかまたは類似した長さの配列に特に適する）、規定された短い長さにわたり、同一性％を決定する（いわゆる、ローカルアライメント）こともできる（これは、長さが等しくない配列により適する）。上記の文脈では、クエリーアミノ酸配列に対して、少なくとも、例えば、９５％の「配列同一性」を有するアミノ酸配列が、対象アミノ酸配列に、クエリーアミノ酸配列の各１００アミノ酸当たり最大で５カ所のアミノ酸変化を組み入れうることを除き、対象アミノ酸の配列が、クエリー配列と同一であることを意味することを意図する。言い換えれば、クエリーアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一な配列を有するアミノ酸配列を得るには、対象配列内のアミノ酸残基のうちの最大で５％（１００残基のうちの５残基）を、挿入することもでき、別のアミノ酸で置換することもでき、欠失させることもできる。配列同一性を決定する目的では、Ｌ−アミノ酸のＤ−アミノ酸への置換（および逆も成り立つ）が、そのまさに同じアミノ酸のＤ−（またはＬ−）異性体だけであっても、同一でない残基をもたらすと考えられる。
【００４７】
当技術分野では、２つ以上の配列の同一性および相同性を比較するための方法が周知である。例えば、数学的アルゴリズムを用いることにより、２つの配列が同一である百分率を決定することができる。用いうる数学的アルゴリズムの、好ましいがそれらに限定されない例は、Ｋａｒｌｉｎら（１９９３年）、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、９０巻：５８７３〜５８７７頁によるアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、インターネットのサイトであるｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおける、ＮＣＢＩのホームページを介してアクセス可能な、ＢＬＡＳＴファミリーのプログラム、例えば、ＢＬＡＳＴプログラムまたはＮＢＬＡＳＴプログラム（また、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２１５巻、４０３〜４１０頁；またはＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２５巻：３３８９〜３４０２頁も参照されたい）、およびＦＡＳＴＡファミリーのプログラム（Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９０年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１８３巻、６３〜９８頁；ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ、８５巻、２４４４〜２４４８頁）に組み込まれている。他の配列とある程度同一な配列は、これらのプログラムにより同定することができる。さらに、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．１（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１２巻、３８７〜３９５頁）において利用可能なプログラム、例えば、プログラムであるＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰを用いて、２つのポリペプチド配列の間の同一性％を決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴでは、（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１年）、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、１４７巻、１９５〜１９７頁）による「局所相同性」アルゴリズムが用いられ、２つの配列の間の最良で単一の類似性領域が見出される。
【００４８】
当然ながら、本発明に従うＪＮＫ阻害剤は、本明細書で規定されるＪＮＫ活性を阻害する能力が失われない限りにおいて、（上記で言及した阻害性（ポリ）ペプチド配列とは別に）、さらなる配列、ドメイン、標識（例えば、蛍光標識または放射性標識）、エピトープなどを含みうる。例えば、本発明に従うＪＮＫ阻害剤はまた、輸送体配列も含みうる。本明細書で用いられる「輸送体配列」とは、それが接合された分子の、生物学的膜を越える移動をもたらす（ポリ）ペプチド配列である。したがって、輸送体配列を含む、本発明に従うＪＮＫ阻害剤は、生物学的膜を越えて移動することが可能であると好ましい。したがって、本発明のこのようなＪＮＫ阻害剤は、細胞、細胞内のサブコンパートメント、および／または細胞核に入ることがいっそう容易でありうる。
【００４９】
前記輸送体配列は、例えば、ＪＮＫ阻害剤の阻害性（ポリ）ペプチド配列のＮ末端へと（例えば、直接）接合することもでき、Ｃ末端へと（例えば、直接）接合することもできる。輸送体配列と、阻害性（ポリ）ペプチド配列とはまた、間隔を置く、例えば、介在配列により隔てることもできる。特に、ＪＮＫ阻害剤が、より複合的な分子である（例えば、いくつかのドメインを含む、多量体のコンジュゲートであるなどの）場合はまた、輸送体配列を、ＪＮＫ阻害剤分子内の、阻害性（ポリ）ペプチド配列とは全く別の場所に位置させうることも想定される。また、ＪＮＫ阻害活性を維持する限りにおいて、輸送体配列と、阻害性（ポリ）ペプチド配列とが重複しうることも想定される。下記では、このような重複の例をさらに示す。
【００５０】
本発明のＪＮＫ阻害剤と共に用いられる輸送体配列は、それらに限定せずに述べると、ＨＩＶ  ＴＡＴ（ＨＩＶ）に由来する輸送体配列、例えば、ＴＡＴタンパク質（例えば、米国特許第５，８０４，６０４号、および同第５，６７４，９８０号において記載され、これらの参考文献の各々は、参照により本明細書に組み込まれる）、ＨＳＶ（Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ）ＶＰ２２（例えば、ＷＯ９７／０５２６５；ＥｌｌｉｏｔｔおよびＯ’Ｈａｒｅ、Ｃｅｌｌ、８８巻：２２３〜２３３頁（１９９７年）において記載されている）、非ウイルス性タンパク質（Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８９巻：１０６９１〜１０６９５頁（１９９２年））、アンテナペディアに由来する輸送体配列、特に、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ属のアンテナペディア（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ属のアンテナペディアの担体配列）に由来する輸送体配列、ＦＧＦ、ラクトフェリンなどに由来する輸送体配列、または塩基性ペプチド、例えば、５〜１５アミノ酸、好ましくは１０〜１２アミノ酸の長さを有し、少なくとも８０％、より好ましくは８５％、なおもしくは９０％の、例えば、アルギニン、リシン、および／もしくはヒスチジンなどの塩基性アミノ酸を含むペプチドに由来する輸送体配列などの、例えば、天然タンパク質から選択することもでき、ＶＰ２２に由来するか、ＰＴＤ−４タンパク質またはＰＴＤ−４ペプチドに由来するか、ＲＧＤ−Ｋ１６に由来するか、ＰＥＰＴ１／２またはＰＥＰＴ１／２タンパク質もしくはＰＥＰＴ１／２ペプチドに由来するか、ＳｙｎＢ３またはＳｙｎＢ３タンパク質もしくはＳｙｎＢ３ペプチドに由来するか、ＰＣ阻害剤に由来するか、Ｐ２１由来タンパク質またはＰ２１由来ペプチドに由来するか、あるいはＪＮＫＩタンパク質またはＪＮＫＩペプチドに由来する、例えば、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（Ｒ９；配列番号１５２）、ＲＲＲＲＲＲＲＲ（Ｒ８；配列番号１５３）、ＲＲＲＲＲＲＲ（Ｒ７；配列番号１５４）、ＲＲＲＲＲＲ（Ｒ６、配列番号１５５）、ＲＲＲＲＲ（Ｒ５、配列番号１５６）など、アルギニンに富むペプチド配列から選択することもできる。
【００５１】
本発明のＪＮＫ阻害剤における使用のための輸送体配列の例は、それらに限定せずに述べると、特に、ＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質に由来する塩基性輸送体配列である。ＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質の塩基性輸送体配列には、例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８０４，６０４号、および同第５，６７４，９８０号において記載されるヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質に由来する配列が含まれうることが好ましい。この文脈では、全長ＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質が、ＨＩＶ  ＴＡＴ遺伝子の２つのエクソンによりコードされる８６アミノ酸残基を有する。ＴＡＴのアミノ酸１〜７２が、エクソン１によりコードされるのに対し、アミノ酸７３〜８６は、エクソン２によりコードされる。全長ＴＡＴタンパク質は、２つのリシンおよび６つのアルギニンを含有する塩基性領域（アミノ酸４９〜５７）ならびに７つのシステイン残基を含有するシステインに富む領域（アミノ酸２２〜３７）によって特徴付けられる。塩基性領域（すなわち、アミノ酸４９〜５７）は、核局在化に重要であると考えられた（Ｒｕｂｅｎ，  Ｓ．ら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６３巻：１〜８頁（１９８９年）；Ｈａｕｂｅｒ，  Ｊ．ら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６３巻：１１８１〜１１８７頁（１９８９年））。システインに富む領域は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、金属により連結された二量体の形成を媒介し（Ｆｒａｎｋｅｌ，  Ａ．  Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０巻：７０〜７３頁（１９８８年）；Ｆｒａｎｋｅｌ，  Ａ．  Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８５巻：６２９７〜６３００頁（１９８８年））、トランス活性化因子としてのその活性に不可欠である（Ｇａｒｃｉａ，  Ｊ．  Ａ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、７巻：３１４３頁（１９８８年）；Ｓａｄａｉｅ，  Ｍ．  Ｒ．ら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６３巻：１頁（１９８９年））。他の調節タンパク質における場合の通り、Ｎ末端領域は、細胞内プロテアーゼに対する保護に関与しうる（Ｂａｃｈｍａｉｒ，  Ａ．ら、Ｃｅｌｌ、５６巻：１０１９〜１０３２頁（１９８９年））。本発明のＪＮＫ阻害剤における使用のための好ましいＴＡＴ輸送体配列は、ＴＡＴの塩基性領域のアミノ酸配列（自然発生ＴＡＴタンパク質のアミノ酸４９〜５７）の存在；ＴＡＴのシステインに富む領域のアミノ酸配列（自然発生ＴＡＴタンパク質のアミノ酸２２〜３６）の非存在；およびＴＡＴのエクソン２によりコードされるカルボキシ末端ドメイン（自然発生ＴＡＴタンパク質のアミノ酸７３〜８６）の非存在によって特徴付けられることが好ましい。本発明のＪＮＫ阻害剤中の輸送体配列は、ＴＡＴの残基４８〜５７もしくは４９〜５７またはこれらの変異体を含有するアミノ酸配列から選択しうることがより好ましい。
【００５２】
所与の、本発明のＪＮＫ阻害剤中の輸送体配列はまた、例えば、プロテアーゼに対する安定性を改善するために、Ｄ−アミノ酸も呈示することが好ましい。特に、特定の序列で交互になったＤ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸を呈示する輸送体配列が好ましい。交互になったＤ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸のこのような序列（モチーフ）は、それらに限定せずに述べると、配列番号２８〜３０：
ｄｌＬＬＬｘｄｍＬＬＬｙｄｎ（配列番号２８）、
ｄＬＬＬｄ（ＬＬＬｄ）ａ（配列番号２９）、および／または
ｄＬＬＬｄＬＬＬｄ（配列番号３０）
［式中、ｄは、Ｄ−アミノ酸であり、
Ｌは、Ｌ−アミノ酸であり、
ａは、０〜３、好ましくは０〜２、より好ましくは０、１、２、または３、なおより好ましくは０、１、または２であり、最も好ましくは１であり、
ｌ、ｍ、およびｎは、互いから独立に、１または２、好ましくは１であり、
ｘおよびｙは、互いから独立に、０、１、または２、好ましくは１である］
のうちのいずれか１つのパターンに従いうる。
【００５３】
Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸の前記序列（モチーフ）は、輸送体配列を合成する場合、すなわち、アミノ酸配列（すなわち、側鎖残基の種類）は変化させずに保持する一方で、それぞれの異性体を交互に生起させる場合に関与性となる。例えば、ＨＩＶ  ＴＡＴに由来する公知の輸送体配列は、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号４３）である。配列番号３０のＤ−アミノ酸／Ｌアミノ酸序列をこれに適用すれば、ｒＫＫＲｒＱＲＲｒ（配列番号４６）がもたらされるであろう。
【００５４】
特定の実施形態では、本発明のＪＮＫ阻害剤の輸送体配列が、ｒＸＸＸｒＸＸＸｒ（配列番号３１）［式中、
ｒは、Ｄ−光学異性体のアルギニンを表し、
Ｘは、任意のＬ−アミノ酸（グリシンを含めた）であり、
各Ｘは、個別に、かつ、配列番号３１内の他の任意のＸとは独立に選択することができる］に従う少なくとも１つの配列を含みうる。配列番号３１内の前記６つのＬ−アミノ酸であるＸのうちの少なくとも４つは、ＫまたはＲであることが好ましい。別の実施形態では、本発明に従うＪＮＫ阻害剤が、輸送体配列ｒＸ１Ｘ２Ｘ３ｒＸ４Ｘ５Ｘ６ｒ（配列番号３２）［式中、Ｘ１は、Ｋであり、Ｘ２は、Ｋであり、Ｘ３は、Ｒであり、Ｘ４、Ｘ５、およびＸ６は、互いから独立に選択された任意のＬ−アミノ酸（グリシンを含めた）である］を含む。同様に、本発明に従うＪＮＫ阻害剤の輸送体配列は、配列ｒＸ１Ｘ２Ｘ３ｒＸ４Ｘ５Ｘ６ｒ（配列番号３３）［式中、Ｘ４は、Ｑであり、Ｘ５は、Ｒであり、Ｘ６は、Ｒであり、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３は、互いから独立に選択された任意のＬ−アミノ酸（グリシンを含めた）である］を含みうる。本発明のＪＮＫ阻害剤はまた、配列ｒＸ１Ｘ２Ｘ３ｒＸ４Ｘ５Ｘ６ｒ（配列番号３４）［式中、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのアミノ酸残基Ｘは、｛Ｘ１は、Ｋであり、Ｘ２は、Ｋであり、Ｘ３は、Ｒであり、Ｘ４は、Ｑであり、Ｘ５は、Ｒであり、Ｘ６は、Ｒである｝からなる群から選び出される一方で、上記の群より選択されない残りのアミノ酸残基Ｘは、任意のＬ−アミノ酸（グリシンを含めた）であることが可能であり、互いから独立に選択される］も含みうる。この場合、Ｘ１は、Ｙであることが好ましく、かつ／またはＸ４は、ＫもしくはＲであることが好ましい。
【００５５】
本発明のＪＮＫ阻害剤分子における使用のための輸送体配列の例は、それらに限定せずに述べると、下記の表２に示される配列（配列番号３１〜１７０）から選択することもでき、任意の断片もしくは変異体またはそれらの化学修飾された誘導体から選択することもできる（生物学的膜を越えて移動する機能を保持することが好ましい）。
【００５６】
【表２−１】
2015502372.tif 000003
【００５７】
【表２−２】
2015502372.tif 000004
【００５８】
【表２−３】
2015502372.tif 000005
【００５９】
【表２−４】
2015502372.tif 000006
【００６０】
上記で言及した通り、輸送体配列はまた、上記の表２の配列の断片または変異体からも選択することができる（このような断片または変異体が、好ましくは、生物学的膜を越える移動をもたらす機能を保持するという条件を伴う）。この特定の文脈では、これらの輸送体配列の変異体および／または断片が、表２で規定されるこのような輸送体配列の全長にわたり、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有し、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を共有するペプチド配列を含むことが好ましい。この特定の文脈では、表２で規定される輸送体配列の「断片」が、その切断型配列、すなわち、元の配列のアミノ酸配列と比較してＮ末端において、Ｃ末端において、かつ／または配列内において切断されたアミノ酸配列として理解されることが好ましい。
【００６１】
さらに、上記で規定した輸送体配列またはその断片の「変異体」は、本明細書で規定される元の輸送体配列またはその断片と、１つまたは複数の置換アミノ酸（または、必要な場合、挿入アミノ酸および／または欠失アミノ酸）など、１つまたは複数の突然変異において異なる変異体のアミノ酸配列として理解することが好ましい。上記で規定したこのような輸送体配列の変異体は、それぞれの元の配列と比較して同じ生物学的機能または特定の活性を有する、すなわち、例えば、細胞または核への輸送をもたらすことが好ましい。この文脈では、上記で規定したこのような輸送体配列の変異体が、例えば、約１〜５０カ所、１〜２０カ所、より好ましくは１〜１０カ所のアミノ酸変化を含むことが可能であり、最も好ましくは１〜５カ所、４、３、２、または１カ所のアミノ酸変化を含みうる。上記で規定したこのような輸送体配列の変異体は、保存的アミノ酸置換を含みうることが好ましい。当技術分野では、保存的アミノ酸置換の概念が公知であり、ＪＮＫ阻害性（ポリ）ペプチド配列については上記で既に示されており、したがってここでも適用される。
【００６２】
本発明のＪＮＫ阻害剤中に組み込まれる輸送体配列の長さは変化しうる。一部の実施形態では、本発明に従うＪＮＫ阻害剤の輸送体配列が、１５０アミノ酸未満、１４０アミノ酸未満、１３０アミノ酸未満、１２０アミノ酸未満、１１０アミノ酸未満、１００アミノ酸未満、９０アミノ酸未満、８０アミノ酸未満、７０アミノ酸未満、６０アミノ酸未満、５０アミノ酸未満、４０アミノ酸未満、３０アミノ酸未満、２０アミノ酸未満、および／または１０アミノ酸未満の長さであることが想定される。
【００６３】
当業者は、特定の輸送体配列が、本発明に従うＪＮＫ阻害剤の文脈において、やはり機能的であるのかどうかを容易に決定することができる。例えば、輸送体ドメインを含むＪＮＫ阻害剤は、例えば、細胞内で容易に検出されうる、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質、放射性標識、酵素、フルオロフォア、エピトープなどの標識へと融合させることができる。次いで、輸送体配列を含むＪＮＫ阻害剤および標識を、細胞へとトランスフェクトするか、または培養物上清へと添加して、生物物理的および生化学的な標準的方法（例えば、フローサイトメトリー、（免疫）蛍光顕微鏡法など）を用いることにより、細胞膜への透過をモニタリングすることができる。
【００６４】
輸送体配列を含む、本発明に従うＪＮＫ阻害剤の特定の例を、表３に示す。
【００６５】
【表３】
2015502372.tif 000007
【００６６】
上記で言及した通り、本発明の特定の実施形態では、輸送体配列と、阻害性（ポリ）ペプチド配列とが重複しうる。言い換えれば、輸送体配列のＮ末端が、阻害性（ポリ）ペプチド配列のＣ末端と重複する場合もあり、輸送体配列のＣ末端が、阻害性（ポリ）ペプチド配列のＮ末端と重複する場合もある。後者の実施形態が、特に好ましい。輸送体配列は、１つ、２つ、または３つのアミノ酸残基により、阻害性（ポリ）ペプチド配列と重複することが好ましい。このような状況では、所与の輸送体配列が、配列番号１またはそのそれぞれの変異体と、１位（Ｘ１）、１および２位（Ｘ１、Ｘ２）、１、２、および３位（Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３）において重複しうる。
【００６７】
配列番号１７４、１７５、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８８、１８９、および１９０は、本発明に従うＪＮＫ阻害剤の良い例であって、輸送体配列と、阻害性（ポリ）ペプチド配列とが重複する、例えば、ｒＫＫＲｒＱＲＲｒＲＰＴＴＬＮＬｆ（配列番号１７４）が、配列番号４６（下線を付す）および配列番号１１（イタリック体）と重複する良い例である。
【００６８】
当然ながら、本発明に従うＪＮＫ阻害剤はまた、配列番号１７１〜１９０に従うＪＮＫ阻害剤のうちのいずれか１つの変異体であるＪＮＫ阻害剤からも選択することができる。このような変異体は、配列番号１７１〜１９０の配列、特に、配列番号１７２との、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有し、
前記の配列番号１７１〜１９０の配列内の阻害性（ポリ）ペプチド配列に照らして（基準の阻害性（ポリ）ペプチドについては、配列番号１の配列および配列番号２〜２７の特定の例を参照されたい）、配列同一性を共有するこのような配列が、
ａ）阻害性（ポリ）ペプチド配列内の４位におけるＬ−アルギニン（Ｒ）残基を維持し、
ｂ）阻害性（ポリ）ペプチド配列内の８位および１０位（配列番号２５〜２７については、７位および９位）における２つのＬ−ロイシン（Ｌ）残基を維持し、
ｃ）配列番号１のＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７、および／またはＸ８からなる群より選択されるアミノ酸に対応するそれぞれの位置、ならびに配列番号２〜２７内のそれぞれの位置において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または６つのＤ−アミノ酸を呈示し、より好ましくは、配列番号１のＸ３、Ｘ５、Ｘ７、およびＸ８からなる群より選択されるアミノ酸に対応する位置、ならびに配列番号２〜２７内のそれぞれの位置において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つのＤ−アミノ酸を呈示し、
ｄ）ＪＮＫ活性をやはり阻害する（すなわち、本明細書で規定されるＪＮＫ阻害剤である）
という条件を伴うことが好ましい。
【００６９】
前記規定を考慮して、明確さのために、表３では、配列番号１７１〜１９０を含むＪＮＫ阻害剤の変異体（上記の規定におけるａ）およびｂ）を参照されたい）において変化させることのできない残基に下線を付す。
【００７０】
配列番号１７１〜１９０を含むＪＮＫ阻害剤の変異体における同一でないアミノ酸は、保存的アミノ酸置換の結果であることが好ましい（上記を参照されたい）。当然ながら、配列番号１７１〜１９０を含むＪＮＫ阻害剤の変異体についてはまた、上記で言及したさらなる可能な置換も想定される。同様に、本発明は、当然ながらまた、配列番号１７１〜１９０に従うＪＮＫ阻害剤のうちのいずれか１つの変異体であって、元の配列から逸脱するわけでもなく、もっぱら阻害性（ポリ）ペプチド配列内にあるわけでもないが、輸送体配列内に変異体残基を呈示する変異体も想定する。輸送体配列の変異体および断片については、特に、上記のそれぞれの開示を参照されたい。
【００７１】
既に言及した通り、本発明に従うＪＮＫ阻害剤の輸送体配列とＪＮＫ阻害性（ポリ）ペプチド配列とを、必ずしも互いと直接接合する必要はない。それらはまた、例えば、介在（ポリ）ペプチド配列により間隔を置くこともできる。阻害性（ポリ）ペプチド配列と、輸送体配列など、他の（機能的）配列とを隔てる好ましい介在配列は、六量体（ｈｅｘａａｍｅｒ）、五量体、四量体、トリペプチド、なおまたはジペプチドもしくは単一のアミノ酸残基だけなど、１０アミノ酸未満の長さの短いペプチド配列からなる。特に好ましい介在配列は、全てがＬ−アミノ酸形態だけもしくはＤ−アミノ酸形態だけであるジプロリン、ジグリシン、ジアルギニン、および／もしくはジリシン、またはＤ−アミノ酸とＬ−アミノ酸とを混合したジプロリン、ジグリシン、ジアルギニン、および／もしくはジリシンの１つ、２つ以上のコピーである。当然ながら、他の公知のペプチドスペーサー配列も同様に使用することができる。
【００７２】
本発明に従う特に好ましいＪＮＫ阻害剤は、配列番号８（または配列番号８と、上記でさらに規定した範囲および限界を伴って、配列同一性を共有する配列）および輸送体配列を含む。輸送体配列は、配列番号３１〜１７０のうちのいずれか１つまたは本明細書で規定されるこれらの変異体から選択されることが好ましく、配列番号３１〜３４および４６〜１５１のうちのいずれか１つから選択されることがなおより好ましい。本発明に従うＪＮＫ阻害剤の特に好ましい実施形態は、配列番号８および配列番号４６（または上記でさらに規定した範囲および限界内で、それらとのそれぞれの配列同一性を共有する配列）を含むＪＮＫ阻害剤である。好ましい例は、配列番号１７２の配列または、その、本明細書で規定される輸送体配列および／もしくは阻害性（ポリ）ペプチド配列において異なる、それぞれの変異体を含むＪＮＫ阻害剤である。
【００７３】
さらなる態様では、本発明は、
ａ）ＲＰＴＴＬＮＬＦ（配列番号１９１）、ＫＲＰＴＴＬＮＬＦ（配列番号１９２）、ＲＲＰＴＴＬＮＬＦ、および／またはＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦ（配列番号１９３）からなる配列の群に由来する配列を含む阻害性（ポリ）ペプチド、ならびに
ｂ）輸送体配列、好ましくは、表２において開示されている輸送体配列またはそれらの変異体／断片から選択される輸送体配列、なおより好ましくは、配列番号３１〜３４および４６〜１５１またはそのそれぞれの変異体もしくは断片から選択される輸送体配列
を含むＪＮＫ阻害剤に関する。
【００７４】
輸送体配列と、阻害性（ポリ）ペプチド配列とは、重複しうる。本発明の前記実施形態に好ましい輸送体配列は特に、配列番号４６の輸送体配列、好ましくは阻害性（ポリ）ペプチド配列のＮ末端へと接合される（例えば、直接）配列番号４６の輸送体配列である。
【００７５】
本発明のＪＮＫ阻害剤はまた、配列ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ（配列番号１９４）、または配列ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ（配列番号１９５）を含むかまたはこれからなるＪＮＫ阻害剤でもありうる。
【００７６】
さらなる態様では、本発明は、ｒＫＫＲｒＱＲｒ（配列番号１４８）、ｒＫＫＲｒＱＲｒＫ（配列番号１４９）、および／またはｒＫＫＲｒＱＲｒＲ（配列番号１５０）からなる配列の群より選択される輸送体配列を含む（ポリ）ペプチドに関する。
【００７７】
本明細書で用いられる、特定の配列または特定の配列番号を含むこととは通例、（少なくとも）１コピーの前記配列が、例えば、ＪＮＫ阻害剤分子内に存在することを含意する。例えば通例、１つの阻害性（ポリ）ペプチド配列で、十分なＪＮＫ活性の阻害を達成するのに十分である。しかし、本発明者は、当然ながらまた、結果として得られる分子が、ＪＮＫ活性を阻害する全体的な能力を消失させない（すなわち、それぞれの分子が、やはり本明細書で規定されるＪＮＫ阻害剤である）限りにおいて、それぞれの配列の２つ以上のコピー（例えば、異なるかもしくは同じ種類の阻害性（ポリ）ペプチド配列の２つ以上のコピー、および／または異なるかもしくは同じ種類の輸送体配列の２つ以上のコピー）も使用しうることを想定する。
【００７８】
本発明のＪＮＫ阻害剤は、当技術分野で周知の方法により、例えば、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）戦略を用いる固相ペプチド合成を介する化学合成により、すなわち、Ｆｍｏｃ脱保護とＦｍｏｃ−アミノ酸カップリングとによるサイクルの逐次的ラウンドにより得るかまたはもたらすことができる。このようなペプチド合成をもたらす市販のサービスは、多くの企業、例えば、ＰｏｌｙＰｅｐｔｉｄｅ社（Ｓｔｒａｓｓｂｏｕｒｇ、Ｆｒａｎｃｅ）により提供されている。
【００７９】
本発明に従う使用のためのＪＮＫ阻害剤は場合によって、特に、阻害性（ポリペプチド）配列のアミノ酸残基においてさらに修飾することもできる。可能な修飾は、例えば、
（ｉ）放射性標識、すなわち、放射性リン酸化、または硫黄、水素、炭素、窒素などを伴う放射性標識；
（ｉｉ）着色染料（例えば、ジゴキシゲニンなど）；
（ｉｉｉ）蛍光基（例えば、フルオレセインなど）；
（ｉｖ）化学発光基；
（ｖ）固相において固定化するための基  （例えば、Ｈｉｓタグ、ビオチン、ストレップタグ、フラッグタグ、抗体、エピトープなど）；
（ｖｉ）ＰＥＧ化；
（ｖｉｉ）グリコシル化；
（ｖｉｉｉ）ＨＥＳ化；
（ｉｘ）プロテアーゼ切断部位（例えば、ＪＮＫ阻害剤を制御放出するための）；
（ｘ）ペプチド骨格の修飾（例えば、（ΨＣＨ２−ＮＨ）結合）；
（ｘｉ）アミノ酸側鎖残基の保護；
（ｘｉｉ）Ｎ末端および／またはＣ末端の保護（例えば、Ｎ末端のアミド化またはＣ末端のアセチル化）；
（ｘｉｉｉ）（ｉ）〜（ｘｉｉ）の下で言及した要素のうちの２つ以上の要素の組合せ
からなる群より選択することができる。
【００８０】
（ｉ）〜（ｘｉ）および（ｉ）〜（ｘｉ）の下で言及した要素のうちの２つ以上の要素の組合せから選択される修飾が特に好ましい。この文脈におけるさらなる態様では、本発明は、（ｉ）〜（ｘｉ）から選択される修飾で修飾されるか、または（ｉ）〜（ｘｉ）の下で言及した要素のうちの２つ以上の組合せで修飾された、本明細書で開示されるＪＮＫ阻害剤、およびこのような修飾ＪＮＫ阻害剤を含む医薬組成物（下記を参照されたい）に関する。
【００８１】
医薬組成物
本発明に従い規定されるＪＮＫ阻害剤は、本明細書で規定される疾患のうちのいずれかを防止または処置するのに適用しうる医薬組成物中に調合することができる。本発明に従い用いられるこのような医薬組成物には、活性成分として、本明細書で規定されるＪＮＫ阻害剤、特に、本明細書で規定される、配列番号１に従う阻害性（ポリ）ペプチド配列を含むかまたはこれからなるＪＮＫ阻害剤を組み入れうることが典型的である。活性化合物は、配列番号２〜２７のうちのいずれか１つに従うか、または、輸送体配列を接合する場合は、配列番号１７１〜１９０のうちのいずれか１つに従う阻害性（ポリ）ペプチド配列を含むかまたはこれからなるＪＮＫ阻害剤であることが好ましい。
【００８２】
本発明の発明者らは加えて、本明細書で規定されるＪＮＫ阻害剤が、特に、輸送体配列へと融合させる場合、本発明の疾患に関与する細胞への、特に良好な取込み率を呈示することも見出した。したがって、対象に投与される医薬組成物中のＪＮＫ阻害剤の量は、（それに限定せずに述べると）きわめて低用量でありうる。したがって、用量は、ＤＴＳ−１０８など、当技術分野で公知のペプチド薬の場合（Ｆｌｏｒｅｎｃｅ  Ｍｅｙｅｒ−Ｌｏｓｉｃら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００８年、２１４５〜５３頁）よりはるかに低量でありうる。これは、いくつかの肯定的な側面、例えば、潜在的な副反応の軽減および費用の低減を有する。
【００８３】
用量（体重１ｋｇ当たりの）は、最大で約１０ｍｍｏｌ／ｋｇ、好ましくは最大で約１ｍｍｏｌ／ｋｇ、より好ましくは最大で約１００μｍｏｌ／ｋｇ、なおより好ましくは最大で約１０μｍｏｌ／ｋｇ、なおより好ましくは最大で約１μｍｏｌ／ｋｇ、なおより好ましくは最大で約１００ｎｍｏｌ／ｋｇ、最も好ましくは最大で約５０ｎｍｏｌ／ｋｇの範囲内にあることが好ましい。
【００８４】
したがって、用量範囲は、約１ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約１ｍｍｏｌ／ｋｇ、約１０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約０．１ｍｍｏｌ／ｋｇ、約１０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約０．０１ｍｍｏｌ／ｋｇ、約５０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約１μｍｏｌ／ｋｇ、約１００ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約５００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約２００ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約３００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約３００ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約１００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約５００ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約５０ｎｍｏｌ／ｋｇ、約７５０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約３０ｎｍｏｌ／ｋｇ、約２５０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約５ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約１０ｎｍｏｌ／ｋｇ、または前記値のうちのいずれか２つの組合せでありうることが好ましい。
【００８５】
この文脈では、上記の医薬組成物を用いる場合の処置の処方、例えば、投与量などについての決定は、医療従事者および他の医師の責任の範囲内にあることが典型的であり、処置される障害、個別の患者の状態、送達部位、投与法、および医療従事者に公知の他の因子を考慮に入れることが典型的である。上記で言及した技法およびプロトコールの例は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、１６版、Ｏｓｏｌ，  Ａ．（編）、１９８０年において見出すことができる。したがって、本発明に従い用いられる医薬組成物の成分についての「安全有効量」とは、本明細書で規定される、ＪＮＫシグナル伝達と強く関連する疾患または障害の肯定的な変容を著明に誘導するのに十分なこれらの成分の各々または全ての量を意味する。しかし、同時に、「安全有効量」は、重篤な副作用を回避する、すなわち、利点と危険性との間の妥当な関係を可能とするのに十分な少量でもある。これらの限界の決定は、妥当な治療的判断の範囲内にあることが典型的である。このような成分の「安全有効量」は、処置される特定の状態との関連で変化するであろうし、また、処置される患者の年齢および健康状態、状態の重症度、処置の持続期間、随伴する治療の性質、用いられる特定の薬学的に許容される担体の性質、ならびに主治医の知識および経験の範囲内にある類似した因子との関連でも変化するであろう。本発明に従う医薬組成物は、本発明に従い、ヒトのために用いることができ、また、獣医療目的のためにも用いることができる。
【００８６】
本発明に従い用いられる医薬組成物は、ＪＮＫ阻害剤のうちの１つまたは複数に加えて、（適合性の）薬学的に許容される担体、賦形剤、緩衝剤、安定化剤、または当業者に周知の他の材料をさらに含みうる。
【００８７】
この文脈では、「（適合性の）薬学的に許容される担体」という表現が、組成物の液体基剤または非液体基剤を包含することが好ましい。「適合性の」という用語は、本明細書で用いられる医薬組成物の構成物質を、上記で規定した医薬活性成分および別の成分と、通例の使用条件下で組成物の医薬としての有効性を実質的に減殺する相互作用が起こらない形で混合することが可能なことを意味する。薬学的に許容される担体は、当然ながら、それらを、処置される患者への投与に適するものとするのに十分な程度に純度が高く、十分な程度に毒性が低くなければならない。
【００８８】
本明細書で用いられる医薬組成物を、液体形態で提供する場合、薬学的に許容される担体は、１つまたは複数の（適合性の）薬学的に許容される液体の担体を含むことが典型的である。組成物は、（適合性の）薬学的に許容される液体の担体として、例えば、発熱物質非含有水；等張性食塩水または、例えば、リン酸緩衝溶液、クエン酸緩衝溶液などの（水性）緩衝溶液；例えば、ラッカセイ油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、およびカカオに由来する油などの植物油；例えば、ポリプロピレングリコール、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなどのポリオール；アルギン酸などを含みうる。特に、本明細書で用いられる医薬組成物を注射するには、緩衝液、好ましくは水性緩衝液を用いることができる。
【００８９】
本明細書で用いられる医薬組成物を固体形態で提供する場合、薬学的に許容される担体は、１つまたは複数の（適合性の）薬学的に許容される固体担体を含むことが典型的であろう。組成物は、（適合性の）薬学的に許容される固体担体として、例えば、１つまたは複数の適合性の固体または液体の充填剤または希釈剤を含む場合もあり、また、人への投与に適する封入化合物を用いる場合もある。このような（適合性の）薬学的に許容される固体担体のいくつかの例は、例えば、ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの糖；例えば、トウモロコシデンプンまたはバレイショデンプンなどのデンプン；セルロースおよび、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロースなど、その誘導体；粉末化されたトラガント；麦芽；ゼラチン；獣脂；例えば、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムなど、固体の流動促進剤；硫酸カルシウムなどである。
【００９０】
（適合性の）薬学的に許容される担体または他の材料の正確な性質は、投与経路に依存しうる。したがって、（適合性の）薬学的に許容される担体の選び出しは、原則として、本発明に従い用いられる医薬組成物を投与する方式により決定することができる。本発明に従い用いられる医薬組成物は、例えば、全身投与することができる。投与経路には、例えば、静脈内経路、筋内経路、皮下経路、皮内経路、もしくは経皮経路などの非経口経路（例えば、注射を介する）、経口経路もしくは直腸内経路などの腸内経路、経鼻経路もしくは鼻腔内経路などの外用経路、または表皮経路もしくはパッチ送達などの他の経路が含まれる。また、滴下、硝子体内投与、および結膜下投与も（特に、眼関連疾患用に）想定される。例えば、耳関連疾患を処置する場合は、同様の投与を、鼓室内に施すことができる。
【００９１】
用いられる医薬組成物の適量は、動物モデルを伴う日常的な実験により決定することができる。このようなモデルには、限定を含意することなく述べると、ウサギモデル、ヒツジモデル、マウスモデル、ラットモデル、イヌモデル、および非ヒト霊長動物モデルが含まれる。注射に好ましい単位用量形態には、滅菌水溶液、食塩水、またはそれらの混合物が含まれる。このような溶液のｐＨは、約７．４へと調整されるものとする。注射に適する担体には、ハイドロゲル、制御放出または遅延放出のためのデバイス、ポリ乳酸マトリックスおよびコラーゲンマトリックスが含まれる。外用適用に適する、薬学的に許容される担体には、ローション、クリーム、ゲルなどにおいて用いるのに適する、薬学的に許容される担体が含まれる。化合物を経口投与する場合は、錠剤、カプセルなどが、好ましい単位用量形態である。先行技術では、経口投与に用いうる単位用量形態を調製するための、薬学的に許容される担体が周知である。それらの選び出しは、本発明の目的にはそれほど重要ではなく、当業者が困難を伴わずに行いうる、風味、費用、および保存可能性などの副次的検討に依存する。
【００９２】
経口投与用の医薬組成物は、錠剤形態、カプセル形態、粉末形態、または液体形態でありうる。錠剤には、ゼラチンなど、上記で規定した固体担体が含まれる可能性があり、場合によって、アジュバントが含まれる可能性もある。液体の経口投与用の医薬組成物には一般に、水、石油、動物油または植物油、鉱物油または合成油など、上記で規定した液体の担体が含まれうる。生理食塩溶液、デキストロース、もしくは他の糖溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコールなどグリコールも含まれうる。
【００９３】
静脈内注射、皮膚注射、もしくは皮下注射、または罹患部位における注射のために、有効成分は、発熱物質非含有であり、適切なｐＨ、等張性、および安定性を有する、非経口的に許容される水溶液の形態にあることが好ましいであろう。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸加リンゲル注射液などの等張性ビヒクルを用いて、適切な溶液を調製することが十分に可能である。防腐剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤、および／または他の添加剤も要請に応じて組み入れることができる。それがポリペプチドであれ、ペプチドであれ、核酸分子であれ、個体へと施される、本発明に従う、他の薬学的に有用な化合物であれ、投与は、「予防有効量」または「治療有効量」（場合に応じて）であることが好ましく、これは、個体への利益を示すのに十分である。投与される実際の量、ならびに投与速度および投与の時間経過は、処置されつつある状態の性質および重症度に依存する。
【００９４】
本明細書で規定される疾患の処置は、上記で規定した医薬組成物の投与を包含することが典型的である。本発明のＪＮＫ阻害剤は、対象におけるＪＮＫ活性を調節するであろう。「〜を調節する」という用語は、例えば、さらなる輸送体配列を潜在的に含む、配列番号２〜２７の配列のうちのいずれかに従う阻害性（ポリ）ペプチド配列を含むかまたはこれからなる、少なくとも１つのＪＮＫ阻害剤を、細胞内の天然のｃ−ｊｕｎ結合部位、ＡＴＦ２結合部位、およびＮＦＡＴ４結合部位に対する競合的阻害剤として用いることによる、上記の疾患のうちのいずれかにおける、特に、ｃ−ｊｕｎ、ＡＴＦ２、またはＮＦＡＴ４のリン酸化の抑制も包含する。「〜を調節する」という用語はまた、それに限定することなく述べると、ｃ−ｊｕｎ、ＡＴＦ２、またはＮＦＡＴ４、ならびに、例えば、ｃ−ｊｕｎ、ＡＦＴ２、およびｃ−ｆｏｓから構成されるＡＰ−１複合体など、それらの類縁のパートナーから構成される転写因子のヘテロマー複合体およびホモマー複合体の抑制も包含する。
【００９５】
上記で開示した医薬組成物による対象の処置は、（「治療有効」）量の、前記医薬組成物を、対象に投与する（ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて）ことにより達成しうることが典型的であり、ここで、対象は、例えば、ヒト対象または動物でありえる。動物は、非ヒト哺乳動物、例えば、非ヒト霊長動物、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、またはブタであることが好ましい。「治療的に有効な」という用語は、医薬組成物の活性成分が、本明細書で論じられる疾患および障害を改善するのに十分な量であることを意味する。
【００９６】
疾患および障害
本発明の趣旨は、上記で開示したＪＮＫ阻害剤および医薬組成物を、治療によりヒトまたは動物の身体、特に、ヒト身体を処置するための方法において用いることである。上記で言及した通り、ＪＮＫシグナル伝達は、多種多様な疾患状態および障害に関与し、これらのうちの多くについて、前記シグナル伝達の阻害が提起され、調べられて成功してもいる。本発明の発明者らは、本明細書で開示されるＪＮＫ阻害剤が有効なＪＮＫ阻害剤であり、したがって、当技術分野において開示されている疾患の処置にも同様に適することを見出した。
【００９７】
本明細書で用いられる、治療によるヒトまたは動物の身体の処置とは、それぞれの対象に対する任意の種類の治療的処置を指す。治療によるヒトまたは動物の身体の処置は、例えば、疾患または症状の発症の防止（予防）、すなわち、典型的には、患者において疾患が顕在化する前における防止（予防）を包含する。この用語はまた、所与の疾患の症状の処置「だけ」も包含する、すなわち、処置は、疾患および症状の根底をなす原因を必ずしも治癒させることなく、疾患に関連する症状を軽減することにより、病原性を改善する。当然ながら、この用語にはまた、疾患の根底をなす原因を治癒させることも包摂される。この用語はまた、それぞれの疾患の進行を遅延させるか、なおまたは停止させる処置も包摂する。
【００９８】
一実施形態では、本発明に従うＪＮＫ阻害剤を、例えば、予見可能な障害の潜在的な発症の前に、例えば、予定される手術による介入または予定されるストレスの多い刺激への曝露の前に予防的に投与することもできる。手術による介入であれば、例えば、それぞれの創傷または近傍の組織の炎症（例えば、手術による眼の処置の後における眼乾燥症候群、歯科によるインプラント処置の後におけるインプラント周囲炎、移植の後における移植片拒絶など）の危険性を有しうるであろう。放射線など、ストレスの多い刺激への曝露であれば、影響を受ける組織および細胞のアポトーシスをもたらしうるであろう。このような状況では、本発明に従うＪＮＫ阻害剤は、例えば、最大で約４週間前に少なくとも１回投与することができる。ＪＮＫ阻害剤は、例えば、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、または４週間前に投与することができる。
【００９９】
本明細書で開示されるＪＮＫ阻害剤により処置される疾患および障害は、急性の場合もあり、慢性の場合もある。
【０１００】
ＪＮＫシグナル伝達の多種多様な病理学的状態における関与に起因して、本発明のＪＮＫ阻害剤は、例えば、眼疾患、骨疾患、神経疾患、ニューロン疾患、神経変性疾患、皮膚疾患、免疫および／または自己免疫疾患、眼疾患、口腔疾患、炎症性疾患、代謝病、心血管疾患、増殖性疾患（特に、がんおよび腫瘍）、耳疾患、腸疾患、呼吸器系疾患（例えば、肺疾患）、感染性疾患、ならびに他の多様な疾患など、多様な器官の疾患を処置するために用いることができる。
【０１０１】
本発明のＪＮＫ阻害剤は、例えば、例えば、急性炎症のほか、慢性炎症を含めた炎症性疾患を処置するために用いることができる。本発明のＪＮＫ阻害剤を用いて、例えば、眼内の炎症、口腔内の炎症、特に肺を含めた呼吸器系の炎症、皮膚の炎症、心血管系内の炎症、脳の炎症、耳内の炎症など任意の種類の組織炎症を処置することができる。このような炎症性疾患状態の一部の非限定的な例は、粘膜炎（ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ）、口内炎、インプラント周囲炎（ｐｅｒｉ−ｉｍｐｌａｎｔｉｔｉｓ）、網膜炎、脈絡膜炎（ｃｈｏｒｉｏｉｄｉｔｉｓ）、乾性角結膜炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、ブドウ膜炎（例えば、前部ブドウ膜炎、中間部ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎）、歯周炎、ＣＯＰＤ、喘息、歯髄炎、関節リウマチ、変形性関節症、クローン病、乾癬性関節炎、血管炎、間質性膀胱炎；感染部位または創傷部位における急性炎症、髄膜炎、脳炎、肺炎、咽頭炎、扁桃炎、耳炎（中耳炎を含めた）、血管炎、滑膜炎、腸炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、移植片拒絶などである。
【０１０２】
本明細書で開示されるＪＮＫ阻害剤は、例えば、耳疾患（特に、内耳疾患）、聴力損失（特に、急性聴力損失）、損傷した有毛細胞の不動毛（ｄａｍａｇｅｄ  ｈａｉｒ  ｃｅｌｌ  ｓｔｅｒｅｏｃｉｌｉａ）、有毛細胞のアポトーシス、騒音外傷（ｎｏｉｓｅ  ｔｒａｕｍａ）、耳炎、中耳炎などを処置する方法において用いることができる。聴力損失および関連する有毛細胞のアポトーシスは、細胞に対するストレス状況から結果として生じる障害であって、ＪＮＫ阻害により、ストレス応答を調節しうる、例えば、アポトーシスを遮断しうる障害の非限定的な例である。
【０１０３】
本発明のＪＮＫ阻害剤はまた、代謝性障害を処置するためにも用いることができ、例えば、糖尿病（１型または２型、特に、１型）、ファブリー病、ゴーシェ病、低体温症、高体温症、低酸素症、脂質性組織球増殖症、リピドーシス（ｌｉｐｉｄｏｓｅｓ）、異染性白質萎縮症、ムコ多糖症、ニーマン−ピック病、肥満、およびウォルマン病を処置するためにも用いることができる。また、低体温症、高体温症、および低酸素症も、細胞に対するストレス状況であって、ＪＮＫ阻害により、ストレス応答を調節しうる、例えば、アポトーシスを遮断しうる状況の非限定的な例である。
【０１０４】
同様に、本発明のＪＮＫ阻害剤は、神経疾患、ニューロン疾患、および／または神経変性疾患のそれぞれを処置するためにも用いることができる。このような疾患の例は、例えば、アレクサンダー病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、卒中、毛細血管拡張性運動失調症、切断または他の形で破断された軸索、軸索切断術、脳病変、ＣＭＴ（シャルコー−マリー−トゥース病）、大脳皮質基底核変性症、認知症、神経系の疾患または障害、ジストニア、てんかん、ファーバー病、フリードライヒ失調症（ＳＣＡ）、ガングリオシドーシス（ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｅｓ）、ギラン−バレー症候群、遺伝性痙性対麻痺、ヒルシュプルング病、ヒト免疫不全ウイルス性認知症、ハンチントン病、脳梗塞、虚血性脳卒中、クラッベ病、レノックス−ガストー症候群、脳回欠損、多発性硬化症、骨髄異形成症候群、脊髄症、ＡＩＤＳ関連神経変性疾患、２型神経線維腫症（ＮＦ−２）、ラチリズム（ｎｅｕｒｏｌａｔｙｅｒｉｓｍ）、ニューロンアポトーシス、ニューロン死、神経障害性疼痛、神経障害、化学療法誘導性神経障害、糖尿病誘導性神経障害、ＮＭＤＡ誘導性神経毒性、疼痛、パーキンソン病、パーキンソニズム、ピック病、多発性神経障害、進行性核上性麻痺、サンドホフ病、脊椎披裂、脳卒中、テイ−サックス病、ＴＢＩ（びまん性軸索傷害）、例えば、炎症性疼痛により誘導されるダークニューロン（ｄａｒｋ  ｎｅｕｒｏｎｅ）、ウェスト症候群、脊髄性筋萎縮症などである。
【０１０５】
自己免疫障害に関して述べると、本発明のＪＮＫ阻害剤ペプチドは、例えば、ＣＮＳの自己免疫疾患、自己炎症性疾患、セリアック病、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデスなどを処置する方法において用いることができる。
【０１０６】
本発明のＪＮＫ阻害剤により処置しうる骨疾患の例は、例えば、関節炎、椎間板ヘルニア、進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）、変形性関節症、大理石骨病、骨粗鬆症、特に、糖尿病誘導性骨粗鬆症、ページェット病、関節リウマチなどである。
【０１０７】
本発明のＪＮＫ阻害剤により処置しうる皮膚疾患の例は、例えば、乾癬およびエリテマトーデスである。
【０１０８】
本発明のＪＮＫ阻害剤により処置しうる眼疾患は、例えば、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）；網膜色素線条；前部虚血性視神経症；前部ブドウ膜炎；白内障、特に、加齢性白内障；中心性滲出性脈絡網膜症（ｃｅｎｔｒａｌ  ｅｘｕｄａｔｉｖｅ  ｃｈｏｒｉｏｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）；中心性漿液性脈絡網膜症（ｃｅｎｔｒａｌ  ｓｅｒｏｕｓ  ｃｈｏｒｉｏｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）；霰粒腫；脈絡膜欠如；脈絡膜炎；脈絡膜硬化症（ｃｈｏｒｏｉｄａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）；結膜炎；毛様体炎；糖尿病網膜症；眼乾燥症候群；眼内炎；上強膜炎；眼感染症；白点眼底；脳回転状網膜脈絡膜萎縮；麦粒腫；眼瞼腺（ｂｌｅｐｈａｒａ）の炎症性疾患；脈絡膜の炎症性疾患；毛様体の炎症性疾患；結膜の炎症性疾患；角膜の炎症性疾患；虹彩の炎症性疾患；涙腺の炎症性疾患；眼窩骨の炎症性疾患；強膜の炎症性疾患；硝子体の炎症性疾患；ブドウ膜の炎症性疾患；網膜の炎症性疾患；中間部ブドウ膜炎；虹彩炎（ｉｒｉｔｉｔｉｓ）；角膜炎；レーバー病；多病巣性脈絡膜炎；眼筋の筋炎；新生血管黄斑症（例えば、高度近視、傾斜乳頭症候群、脈絡膜骨腫などにより引き起こされる）；ＮＭＤＡ誘導性網膜毒性（ＮＭＤＡ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｒｅｔｉｎｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）；非慢性または慢性の炎症性眼疾患；小口病；視神経疾患；眼窩蜂巣炎；全眼球炎（ｐａｎｏｐｈｔａｌｍｉｔｉｓ）；全ブドウ膜炎；嚢後混濁（ｐｏｓｔ  ｃａｓｐｕｌｅ  ｏｐａｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）；後嚢混濁（ＰＣＯ）（白内障の術後合併症）；後部ブドウ膜炎；増殖性硝子体網膜症；  網膜動脈閉塞症；網膜剥離、網膜疾患；網膜傷害；網膜動脈瘤；網膜色素上皮剥離；網膜静脈閉塞症；網膜炎；色素性網膜炎；点状網膜炎；網膜症、特に、未熟児網膜症および糖尿病網膜症；強膜炎；スタルガルト病；炎症性眼創傷および／または眼創縁；眼手術後または眼外傷後における眼内炎症；ブドウ膜炎；卵黄状黄斑変性などを伴う。
【０１０９】
本明細書で開示されるＪＮＫ阻害剤により処置しうる例示的な口腔疾患は、歯周炎、特に、慢性歯周炎；粘膜炎、口腔剥離性障害（ｏｒａｌ  ｄｅｓｑｕａｍａｔｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、口腔扁平苔癬（ｏｒａｌ  ｌｉｑｕｅｎ  ｐｌａｎｕｓ）、尋常性天疱瘡、歯髄炎；口内炎；顎関節障害、インプラント周囲炎などである。
【０１１０】
同様に（他のＪＮＫ阻害剤について既にかつて提起されているのと）、本発明のＪＮＫ阻害剤も、聴神経腫瘍（ａｃｕｓｔｉｃｕｓ  ｎｅｕｒｉｎｏｍａ）、肺癌腫；急性リンパ球性白血病（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）；急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；腺癌腫；肛門癌腫；気管支癌腫；子宮頸癌腫；子宮頸部がん；星状細胞腫；基底細胞腫；Ｂｃｒ−Ａｂｌ形質転換を伴うがん；膀胱がん；芽細胞腫；骨がん；脳転移；脳腫瘍；乳がん；バーキットリンパ腫；カルチノイド；子宮頸部がん；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；結腸がん；結腸癌腫；身体の癌腫（ｃｏｒｐｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）；頭蓋咽頭腫；ＣＵＰ症候群；ウイルス誘導性腫瘍；ＥＢＶ誘導性Ｂ細胞リンパ腫；子宮内膜癌腫；赤白血病（Ｍ６）；食道がん（ｅｓｏｐｈａｇｕｓ  ｃａｎｃｅｒ）；胆嚢がん；消化器がん；消化管間質腫瘍；消化器腫瘍；尿生殖器がん；緑内障；神経膠芽腫；神経膠腫；頭頸部腫瘍；Ｂ型肝炎誘導性腫瘍；肝細胞癌腫；肝細胞腫；ヘルペスウイルス誘導性腫瘍；ホジキン症候群；ＨＴＬＶ−１誘導性リンパ腫；ＨＴＬＶ−２誘導性リンパ腫；インスリノーマ；腸がん；カポジ肉腫；腎がん；腎臓癌腫；喉頭がん；白血病；眼瞼腫瘍；肝がん；肝転移；肺がん；リンパ球がん；リンパ腫；悪性黒色腫；乳癌腫；マントル細胞リンパ腫；髄芽腫；巨核芽球性白血病（Ｍ７）；黒色腫、特に、悪性黒色腫；髄膜腫；中皮腫；単球性白血病（ＭＳ）；多発性骨髄腫；菌状息肉腫；骨髄芽球性白血病（Ｍ１）；骨髄芽球性白血病（Ｍ２）；骨髄単球性白血病（Ｍ４）；神経鞘腫（ｎｅｕｒｉｎｏｍａ）；非ホジキンリンパ腫；非小細胞癌腫；肺の非小細胞癌腫；食道がん（ｏｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  ｃａｎｃｅｒ）；食道癌腫；希突起神経膠腫；卵巣がん；卵巣癌腫；膵臓がん；膵臓癌腫；パピローマウイルス誘導性癌腫；陰茎がん；脳下垂体腫瘍；形質細胞腫；前骨髄球性白血病（Ｍ３）；前立腺がん；前立腺腫瘍；直腸腫瘍；直腸癌腫；腎細胞癌腫；網膜芽細胞腫；肉腫；シュネーベルガー病；小細胞肺癌腫；小腸がん；小腸腫瘍；軟組織腫瘍；棘細胞腫（ｓｐｉｎａｌｉｏｍａ）；扁平上皮癌；胃がん；精巣がん；咽頭がん；胸腺腫；甲状腺がん；甲状腺癌腫；舌がん；未分化ＡＭＬ（ＭＯ）；尿道がん；子宮がん；膣がん；フォンヒッペルリンダウ病；外陰がん；ウィルムス腫瘍；色素性乾皮症など、がんおよび腫瘍性疾患などの増殖性疾患を処置するために用いることができる。
【０１１１】
ＪＮＫシグナル伝達はまた、多くの心血管疾患および障害にも関与するので、このような疾患の処置におけるＪＮＫ阻害剤の使用は、既にかつて示唆されている。したがって、本発明の阻害剤は、例えば、動脈性高血圧症；動脈硬化症；動脈硬化性病変；ベーチェット症候群；血管分岐；心肥大；心血管肥大；心筋症、特に、化学療法誘導性心筋症；脳虚血症；冠動脈性心疾患；腹部大動脈の拡張；限局性脳虚血症；全脳虚血症；心臓肥大；腎臓下動脈瘤性高血圧症（ｉｎｆｒａｒｅｎａｌ  ａｎｅｕｒｉｓｍ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）；虚血症；心筋梗塞、特に、急性心筋梗塞；心筋炎；再灌流；再狭窄；血管炎；ウェゲナー肉芽腫症などの心血管疾患を処置するためにも用いることができる。
【０１１２】
心血管疾患の文脈において、本発明のＪＮＫ阻害剤はまた、冠動脈バイパスグラフト術（ＣＡＢＧ術）、経皮的経管的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）、および／またはステント処置に対する補完物として、例えば、前記（手術による）処置から結果として生じる内膜過形成を防止または処置するためにも用いることができる。
【０１１３】
本発明のＪＮＫ阻害剤により有効に処置しうる呼吸器系疾患であり、特に、本発明のＪＮＫ阻害剤により有効に処置しうる肺疾患は、例えば、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）；喘息；呼吸器系を侵す慢性疾病；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；嚢胞性線維症；炎症性肺疾患；肺炎；肺線維症などである。
【０１１４】
先行技術における阻害剤と同様に、本発明の阻害剤はまた、腸管の疾患、例えば、大腸炎（例えば、非定型大腸炎、化学物質性大腸炎；コラーゲン蓄積大腸炎、遠位性大腸炎（ｄｉｓｔａｌ  ｃｏｌｉｔｉｓ）、空置大腸炎（ｄｉｖｅｒｓｉｏｎ  ｃｏｌｉｔｉｓ）；劇症性大腸炎（ｆｕｌｍｉｎａｎｔ  ｃｏｌｉｔｉｓ）、分類不能大腸炎（ｉｎｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ）、感染性大腸炎、虚血性大腸炎（ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｃｏｌｉｔｉｓ）、リンパ球性大腸炎（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｃｏｌｉｔｉｓ）、または顕微鏡的大腸炎）、クローン病、胃腸炎、ヒルシュプルング病、炎症性消化器疾患；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、モルブスクローン病（Ｍｏｒｂｕｓ  Ｃｒｏｈｎ）、非慢性または慢性消化器疾患、非慢性または慢性炎症性消化器疾患；限局性腸炎；潰瘍性大腸炎などを処置するのにも用いることができる。
【０１１５】
本発明のＪＮＫ阻害剤はまた、例えば、細菌性感染またはウイルス性感染から結果として生じる感染性疾患を処置するための治療剤としても用いられうる。本明細書で開示されるＪＮＫ阻害剤は、例えば、前記感染により引き起こされる炎症性反応を防止または改善しうる。限定的であると考えられるものではない、このような疾患状態の例は、ウイルス性脳炎；ウイルス誘導性がん（例えば、上記で言及した）、ヒト免疫不全ウイルス性認知症、髄膜炎、髄膜脳炎、脳脊髄炎、扁桃炎などである。
【０１１６】
本発明のＪＮＫ阻害剤を処置として用いうる、他の多くの疾患、疾患状態、および障害、例えば、アールスコグ症候群、アセトアミノフェンによる肝毒性；アルダー−レイリー異常症；円形脱毛症；アルファ−１−アンチトリプシン欠損症；アナフィラキシー；アポトーシス；アポトーシス性細胞死；非定型溶血性尿毒症症候群；好塩基球減少症；好塩基球増加症；双極性障害；火傷；細胞へのせん断応力；チェディアック−東症候群（Ｃｈｅｄｉａｌ−Ｈｉｇａｓｈｉ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）；化学療法薬に起因するＤＮＡ損傷；胆汁うっ滞；第１１染色体（１１ｑ）の部分的モノソミー；第２２染色体のモザイク型トリソミー；慢性肉芽腫症；慢性肝炎または劇症性肝炎などの肝炎；臨床的うつ病；分類不能型低ガンマグロブリン血症（ｃｏｍｍｏｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｙｐｏｇａｍｍａｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ）；先天性Ｃ３欠損症；活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）からのＣＴＬの保護；難聴；うつ病およびうつ性障害（特に、サイトカイン誘導疾病挙動のバックグラウンドにおいて発症するうつ性障害の防止）、ディジョージ症候群；アポトーシスの欠陥により引き起こされる疾患；肝疾患；脊椎疾患；子宮疾患；ＤＮＡ損傷剤および／またはイオン化放射線への曝露に起因する疾患状態および症状、ならびに結果として生じる細胞へのストレス；ダウン症候群；デュシェンヌ筋ジストロフィー；外胚葉性形成異常；子宮内膜症；好酸球減少症；好酸球増加症；興奮毒性性細胞死（ｅｘｏｃｉｔｏｘｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ）；胎児性アルコール症候群；線維症；線維性疾患；線維性組織の形成；フリーラジカル（細胞へのストレスをもたらす）；移植片拒絶；移植片対宿主病；脱毛；溶血性尿毒症症候群；肝毒性；糖尿病誘導性痛覚過敏などの痛覚過敏；高体温症；低血糖症；甲状腺機能低下症；特発性好酸球増加症候群；ＩｇＡ腎症；小児性Ｘ染色体性ガンマグロブリン欠乏血症（ｉｎｆａｎｔｉｌｅ  ｓｅｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ａｇａｍｍａｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ）；炎症性疼痛；腎臓下動脈瘤（ａｎｅｙｒｉｓｍ）；膵島細胞再生；膵島細胞移植；ヨブ症候群（高ＩｇＥ症候群）；走化性欠損白血球症候群（ｌａｚｙ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）；白血球グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ欠損症；白質萎縮症；白血球減少症；リンパ球性白血球増加症；リンパ球減少症；リンパ球増加症；大うつ病；躁病；躁うつ病；マルファン症候群；肥満細胞症；メイ−ヘグリン異常症；ＩＩ型膜性増殖性子球体腎炎；単球減少症；単球増加症；良性ミエロペルオキシダーゼ欠損症；ミオパシー；好中球減少症；好中球増加症；ネゼロフ症候群；臓器移植；酸化ストレスによる傷害；ペルゲル−フェット核異常；多嚢胞性腎疾患；透析後症候群；放射線症候群；放射線治療；腎疾患；腎不全；活性化誘導性細胞死からのＣＴＬのレスキュー；  重度の複合型免疫不全疾患；移植拒絶反応；移植；トリソミー；単極性うつ病；ＵＶ誘導性傷害；ウィスコット−アルドリッチ症候群、創傷の治癒などが存在する。
【０１１７】
本発明の発明者らは、本発明のＪＮＫ阻害剤による処置が、顎関節障害、粘膜炎、口内炎、口腔扁平苔癬（剥離性障害）、尋常性天疱瘡（剥離性障害）、歯周炎、慢性歯周炎、歯髄炎、インプラント周囲炎、ブドウ膜炎（前部ブドウ膜炎、中間部ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎）、乾性角結膜炎（眼乾燥症候群）、冠動脈バイパスグラフト術（ＣＡＢＧ術）、急性心筋梗塞、経皮的経管的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）の後における内膜過形成の防止、ステント留置の後における内膜過形成の防止、アテローム性動脈硬化、ＣＯＰＤ、喘息、関節リウマチ、変形性関節症、クローン病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、乾癬、糖尿病、脳卒中、パーキンソン病、アルツハイマー病、全身性エリテマトーデス、および血管炎、特に、ウェゲナー肉芽腫症に対して、特に有用であると考える。
【０１１８】
当業者は、上記で言及した疾患状態および障害が、上記で言及した疾患クラスのうちの複数に属しうることを容易に認識するであろう。例えば、気管支癌腫は当然ながら、増殖性疾患であるだけでなく、また、肺疾患を含めた呼吸器系疾患の群にも属するであろう。したがって、上記で言及した個別の疾患の分類が、限定的なものであるとか、結論的なものであるとは考えられず、例示的な性質のものに過ぎないと考えられる。１つのクラスにおいて列挙された個別の疾患状態がまた実際には、本発明のＪＮＫ阻害剤を、疾患状態の別のクラスにおける処置として適用するのに適する例でもあることを除外するものではない。当業者は、異なる疾患状態および障害を、合致する分類へと割り当てることが容易に可能であろう。
【０１１９】
最後に、上記で言及した通り、本発明は、多様な疾患状態および障害を処置するための、本明細書で規定されるＪＮＫ阻害剤の使用を想定する。本発明は、本明細書で規定されるＪＮＫ阻害剤を、非ヒト動物を免疫化するために、例えば、モノクローナル抗体を作製するために用いることを想定するものではない。本明細書では、このような方法を、治療により動物の身体を処置するための方法とは考えない。
【０１２０】
本明細書で引用される全ての参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１２１】
以下では、本発明の多様な実施形態および態様を例示する特定の例を提示する。しかし、本発明は、本明細書で記載される特定の実施形態により範囲を限定されないものとする。実際、当業者には、前出の記載、付属の図面、および下記の例から、本明細書で記載される改変に加えた本発明の多様な改変が容易に明らかとなろう。全てのこのような改変は、付属の特許請求の範囲内に収まる。
【０１２２】
実施例１：配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤の合成
例示的な例として、配列番号１７２を伴うＪＮＫ阻害剤の合成を下記に示す。当業者は、前記合成がまた、本発明に従う他の任意のＪＮＫ阻害剤の合成にも用いることができ、容易に適合させうることを知るであろう。
【０１２３】
配列番号１７２を伴うＪＮＫ阻害剤は、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）戦略を用いる固相ペプチド合成により作製した。ペプチドと樹脂との間のリンカーは、Ｒｉｎｋアミドリンカー（ｐ−［Ｆｍｏｃ−２，３−ジメトキシベンジル］−フェノキシ酢酸）であった。ペプチドは、Ｆｍｏｃ脱保護とＦｍｏｃ−アミノ酸カップリングとによる逐次的サイクルにより合成した。合成の終了時には、完成したペプチドを、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）により直接切断して、粗Ｃ末端アミドをもたらし、次いで、これを、分取逆相ＨＰＬＣにより精製した。精製された画分は、均質なバッチ内にプールし、これをイオン交換クロマトグラフィーにより処理して、その酢酸塩を得た。次いで、ペプチドを凍結し乾燥させた。
【０１２４】
１．１固相におけるペプチドの合成
言及される場合を除き、作製は、空気清浄環境内の室温（２２℃±７℃）で行った。合成のスケールは、精製ペプチド約１ｇの予測収量に対して、樹脂上の出発アミノ酸０．７ｍｍｏｌであった。合成は、機械的撹拌および／または窒素バブリングを伴うガラス濾板を装備した３０〜５０ｍＬの反応器内で手作業により実施した。
【０１２５】
１．２樹脂の調製
ｐ−メチルベンズヒドリルアミド樹脂（ＭＢＨＡ樹脂）をまず、窒素下でジクロロメタン／ジメチルホルムアミド／ジイソプロピルエチルアミン（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｌｙｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）により洗浄した。次いで、洗浄された樹脂を、ＰｙＢＯＢ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）／ジイソプロピル−エチルアミン／１−ヒドロキシベンゾトリアゾール中で、Ｒｉｎｋアミドリンカー（ｐ−［Ｆｍｏｘ−２，４−ジメトキシベンジル］−フェノキシ酢酸）へとカップリングして、Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド−ＭＢＨＡ樹脂をもたらした。
【０１２６】
１．３アミノ酸のカップリング
アミノ酸は、以下のサイクルを用いて樹脂へとカップリングした。
【０１２７】
Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド−ＭＢＨＡ樹脂を、３５％（ｖ／ｖ）のピペリジン／ジメチルホルムアミド中で洗浄した後、ジメチルホルムアミド中で洗浄することにより脱保護した。脱保護反応は、約１６分間を要した。ジメチルホルムアミド／ジクロロメタン（５０／５０）中のＦｍｏｃ保護されたアミノ酸（例えば、２等量のアミノ酸およびＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）を、樹脂へと添加した後、２等量のカップリング剤であるジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を添加した。カップリング反応には、添加されるそれぞれのアミノ酸に応じて１時間〜一晩を要した。容量は、ペプチド樹脂１００ｍｇ当たり０．５ｍＬのベースで計算し、各サイクル後に調整した。カップリングの後、樹脂を、ＤＭＦで３回にわたり洗浄した。カップリングの完全性は、一級アミンについてはニンヒドリン試験（またはカイザー試験１）により調べ、二級アミンについてはクロラニル（ｃｈｌｏｒａｎｙｌ）試験２により調べた。場合によっては、クロラニル試験を、確実性対照として、ニンヒドリン試験と併合することもできる。万一、カップリング試験が不完全性反応を示した場合は、ジメチルホルムアミド／ジクロロメタンおよびジイソプロピルエチルアミン中により低度な過剰量（０．５〜１等量）のアミノ酸、ＰＹＢＯＰ、ＨＯＢＴによりカップリングを繰り返した。樹脂の機能性を測定したところ、元の樹脂の投入量に応じて、一般に０．６〜０．２ｍｅｑ／ｇであった。最後のアミノ酸がカップリングされた後で、ペプチド樹脂を通例通りに脱保護し、次いで、ＤＣＭで５回にわたり洗浄してから、オーブン内、真空下、３０℃で乾燥させた。ペプチド樹脂が乾燥した後で、固相合成の収率を、ペプチド樹脂の、初期の樹脂の投入量から計算された理論上の重量の増大と比較した重量増大の比として計算した。収率は、１００％に近いとすることができる。
【０１２８】
１．４切断および脱保護
ペプチドを、また、ＴＦＡ／Ｋ試薬とも呼ばれる、トリフルオロ酢酸／１，２−エタンジチオール（１，２−ｅｔｈａｎｅｄｔｈｉｏｌ）／チオアニソール／水／フェノール（ｖ／ｖで８８／２．２／４．４／４．４／７）の混合物中、室温で４時間にわたり、樹脂から切断した。反応容量は、ペプチド樹脂１００ｍｇ当たり１ｍＬであった。樹脂を試薬へと添加する間、混合物の温度を、３０℃を下回ったままであるように調節した。
【０１２９】
１．５ペプチドの樹脂からの抽出：
ペプチドは、ガラス濾板を介する濾過により樹脂から抽出した。Ｒｏｔａｖａｐｏｒ上でその容量の１／３へと濃縮した後、低温のｔ−ブチルメチルエーテルによりペプチドを沈殿させ、濾過した。次いで、粗ペプチドを、真空下、３０℃で乾燥させた。
【０１３０】
１．６  分取ＨＰＬＣによる精製：
次いで、粗ペプチドを、逆相ＨＰＬＣにより、≧９５％の純度まで精製した。精製画分を、Ｒｏｔａｖａｐｏｒ上で濃縮し、凍結乾燥させた。
【０１３１】
１．７イオン交換クロマトグラフィー
濃縮して凍結乾燥させた配列番号１７２の配列を伴う精製ペプチドのプールを、水中に溶存させ、Ｄｏｗｅｘアセテートによる５０〜１００メッシュの樹脂上におけるイオン交換クロマトグラフィーで精製した。
【０１３２】
合成に要請される出発試薬は、以下の通りであった。
【０１３３】
【化１】
2015502372.tif 000008
【０１３４】
本発明の他のＪＮＫ阻害剤も、同様の形で調製することができる。
【０１３５】
実施例２：本発明に従い選択されたＪＮＫ阻害剤の阻害有効性
以下では、本発明に従うＪＮＫ阻害剤の阻害有効性をどのようにして測定したのかについて記載する基準操作手順を示す。本方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの非放射性標準化アッセイにおいて、ＪＮＫによるｃ−Ｊｕｎ特異的基質のリン酸化を候補化合物が減殺する能力の測定を可能とする。さらに、選び出された化合物のＪＮＫに対する阻害効果（ＩＣ５０）およびＫｉをいかにして決定するのかも例示されるであろう。本方法は、候補化合物がＪＮＫ活性を阻害するのか否かを検証するのに適し、当業者は、当然ながら、下記の方法をその特定の目的および必要にいかにして適合させるのかを理解するであろう。
【０１３６】
２．１材料
ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ試薬およびプレート：
・最終濃度５ｎＭのＨｉｓ−ＪＮＫ１（参照番号１４−３２７、Ｕｐｓｔａｔｅ、１００μｌ中１０μｇ：濃度：２．２μＭ）
・最終濃度５ｎＭのＨｉｓ−ＪＮＫ２（参照番号１４−３２９、Ｕｐｓｔａｔｅ、１００μｌ中１０μｇ：濃度：２μＭ）
・最終濃度５ｎＭのＨｉｓ−ＪＮＫ３（参照番号１４−５０１、Ｕｐｓｔａｔｅ、１００μｌ中１０μｇ：濃度：１．８８μＭ）
・最終濃度１０ｎＭの抗ホスホ−ｃＪｕｎ（参照番号０６−８２８、Ｕｐｓｔａｔｅ、ロット番号ＤＡＭ１５０３３５６、濃度：４４．５μＭ）
・最終濃度３０ｎＭのビオチン−ｃＪｕｎ（２９〜６７）：
配列：ビオチン−ＳＮＰＫＩＬＫＱＳＭＴＬＮＬＡＤＰＶＧＳＬＫＰＨＬＲＡＫＮＳＤＬＬＴＳＰＤＶＧ（配列番号１９８）、ロット番号１００５０９（分子量４３８２．１１、Ｐ  ９９．２８％）（Ｈ２Ｏ中に溶存させる；濃度：１０ｍＭ）
・最終濃度５μＭのＡＴＰ（参照番号ＡＳ００１Ａ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ロット番号５０８６０Ｂ、濃度：１００ｍＭ）
・最終濃度２０μｇ／ｍＬのＳＡＤビーズ（参照番号６７６０６１７Ｍ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ロット番号５４０−４６０−Ａ、濃度：５ｍｇ／ｍＬ）
・最終濃度２０μｇ／ｍＬのＡｐｒｏｔＡビーズ（参照番号６７６０６１７Ｍ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ロット番号５４０−４６０−Ａ、濃度：５ｍｇ／ｍＬ）
・３８４ウェル白色プレートであるＯｐｔｉｐｌａｔｅ（参照番号６００７２９９、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ロット番号６５４２８０／２００８）
・ペプチド希釈用の９６ウェルプレート（参照番号８２．１５８１、Ｓａｒｓｔｅｄｔ）
・ＴｏｐＳｅａｌｓ−Ａ（参照番号６００５１８５、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ロット番号６５６７３）
・生物発光エネルギー移動の読取り
・生物発光エネルギー移動は、Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｌｐｈａ  Ｐｌａｔｅリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）上で読み取った。
【０１３７】
ピペット：
・電子式ＥＤＰ３ピペット２０−３００（参照番号１７００７２４３；Ｒａｉｎｉｎ）を用いて、プレートを、酵素（Ｅｎｚｍｅ）−抗体ミックス、基質−ＡＴＰミックス、およびビーズで充填した
・ＰＩＰＥＴＭＡＮ（登録商標）Ｕｌｔｒａマルチチャネル８Ｘ２０（参照番号２１０４０；Ｇｉｌｓｏｎ）を用いて、プレートを、阻害性化合物で充填した。
【０１３８】
緩衝液および溶液
・キナーゼ緩衝液：ｐＨ７．４の２０ｍＭトリス塩基、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、１００μＭのＮａ３ＶＯ４、０．０１％のＴｗｅｅｎ、（１％のＤＭＳＯ）
・停止緩衝液：ｐＨ７．４の２０ｍＭトリス塩基、２００ｍＭのＮａＣｌ、８０ｍＭのＥＤＴＡ−Ｋ（ＮａＯＨの代わりに、ＫＯＨによりｐＨ８）、０．３％のＢＳＡ
・ＪＮＫ希釈キナーゼ緩衝液：ｐＨ７．４の５０ｍＭトリス塩基、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＥＧＴＡ、０．０３％のＢｒｉｊ−３５、２７０ｍＭのスクロース、０．１％のβ−メルカプトエタノール。
【０１３９】
２．２方法
ペプチドの阻害効果を評価するため、標準的なＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイ（例えば、Ｇｕｅｎａｔら、Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ、２００６年、１１巻：１０１５〜１０２６頁を参照されたい）を実施した。異なる成分を調製し、その後、表示される通りに混合した。プレートは密封し、以下の通りにインキュベートした。
【０１４０】
５μｌのＪＮＫ＋抗体
５μｌのＴＰキナーゼ±阻害剤  ３０分間にわたるプレインキュベーション
５μｌのビオチン−ｃＪｕｎ＋ＡＴＰ  ２４℃で６０分間にわたるインキュベーション
１０μｌのＳＡＤビーズ＋Ａ  ｐｒｏｔＡ  暗所、２４℃で６０分間にわたるインキュベーション  。
【０１４１】
夾雑を回避するため、ミックスは、ピペットで、ウェルの異なるへりに添加した。プレートを各ミックスで充填した後、プレートをタッピングして（一方の面を固定して保ち、反対側の面でテーブルをタッピングして）、ミックスにウェルの壁面を流下させる。
【０１４２】
生物発光エネルギー移動は、Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｌｐｈａ  Ｐｌａｔｅリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）上で読み取った。
【０１４３】
全ての化合物は、ＪＮＫの各アイソフォームについて少なくとも３回の独立の実験により３連で調べるものとする。被験化合物の濃度は、場合によって、０、０．０３ｎＭ、０．１ｎＭ、０．３ｎＭ、１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭ、および１００μＭであった。対照は、ＪＮＫを伴わないか、または基質（ｃ−Ｊｕｎ）を伴わない試料であった。
【０１４４】
ミックスの調製
ＪＮＫ１、ＪＮＫ２、およびＪＮＫ３  ５ｎＭ
ビオチン−ｃＪｕｎ  ３０ｎＭ
ＡＴＰ  ５μＭ；抗ホスホ−ｃＪｕｎ（Ｓ６３）  １０ｎＭ
Ｂｉｌｌｅ  ＳＡＤ／ＡｐｒｏｔＡ  ２０μｇ／ｍＬ  。
【０１４５】
抗体［最終］＝１０ｎＭ（抗ホスホｃＪｕｎ（Ｓ６３））
検出部分：［ミックス］の５倍濃度（２５μｌの最終容量中５μｌ）
［原液］＝４４．５μＭ（参照番号０６−８２８、Ｕｐｓｔａｔｅ、ロット番号ＤＡＭ１５０３３５６）
１０ｎＭ→キナーゼ緩衝液中５０ｎＭ  。
【０１４６】
ＪＮＫ１、ＪＮＫ２、およびＪＮＫ３の［最終］＝５ｎＭ
反応部分：［ミックス］の３倍濃度（１５μｌの最終容量中５μｌ）
［原液］＝ＪＮＫ１（参照番号１４−３２７、Ｕｐｓｔａｔｅ、ロット番号Ｄ７ＫＮ０２２ＣＵ）について２．２μＭ
ＪＮＫ２（参照番号１４−３２９、Ｕｐｓｔａｔｅ、ロット番号３３２２１ＣＵ）について２．０μＭ
ＪＮＫ３（参照番号１４−５０１、Ｕｐｓｔａｔｅ、ロット番号Ｄ７ＣＮ０４１ＣＵ）について１．８８μＭ
５ｎＭ→抗体緩衝液中１５ｎＭ  。
【０１４７】
阻害剤：
反応部分：［ミックス］の３倍濃度（１５μｌの最終容量中５μｌ）
［原液］＝１０ｍＭ
１００μＭ→キナーゼ緩衝液中３００μＭ
３０μＭ→キナーゼ緩衝液中９０μＭ
１０μＭ→キナーゼ緩衝液中３０μＭ
・・・
０．０３ｎＭ→キナーゼ緩衝液中０．０９ｎＭ
および０ｎＭ→キナーゼ緩衝液  。
【０１４８】
２系列にわたる１０倍の系列希釈を９６ウェルプレート内で実施した。１系列目は３００μＭで始めて０ｎＭまでとし、２系列目は９０μＭで始めて０．０３ｎＭまでとした。ペプチドは、３８４プレート内に８チャネル型マルチピペット（参照番号Ｆ１４４０１、Ｇｉｌｓｏｎ、８Ｘ２０）で添加する。
ＡＴＰの［最終］＝５μＭ
反応部分：［ミックス］の３倍濃度（１５μｌの最終容量中５μｌ）
［原液］＝１００ｍＭ（参照番号ＡＳ００１Ａ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ロット番号５０８６０Ｂ）
５μＭ→キナーゼ緩衝液中１５μＭ  。
【０１４９】
ビオチンｃ−Ｊｕｎ［最終］＝３０ｎＭ
反応部分：［ミックス］の３倍濃度（１５μｌの最終容量中５μｌ）
［原液］＝１０ｍＭ
３０ｎＭ→ＡＴＰ緩衝液中３０ｎＭ  。
【０１５０】
ＳＡＤビーズ／Ａ  ＰｒｏｔＡ［最終］＝２０μｇ／ｍＬ（感光型）
検出部分：［ミックス］の２．５倍濃度（２５μｌの最終容量中１０μｌ）
［原液］＝５ｍｇ／ｍＬ→２０μｇ／ｍＬ  停止緩衝液中５０μｇ／ｍＬ
暗室（緑色光）内または暗所内のミックス  。
【０１５１】
ＩＣ５０曲線の解析：
解析は、Ｓ字型用量反応曲線（制限なし）についての以下の式：
Ｙ＝ボトム＋（トップ−ボトム）／（１＋１０＾（（ＬｏｇＥＣ５０−Ｘ）））
を伴うＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４ソフトウェアにより実施した
外れ値データは、グラブス検定を用いて除外した。
【０１５２】
ＩＣ５０の比較：
解析は、以下の検定を伴うＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４ソフトウェアにより実施した。一元ＡＮＯＶＡ検定に続くテューキーの多重比較検定。Ｐ＜０．０５を有意であると考えた。
【０１５３】
ＪＮＫに対するＡＴＰのＫｍおよびビオチン−ｃＪｕｎ特異的ペプチドのＫｍは、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ標準化アッセイにより決定した。
【０１５４】
ＫｉとＩＣ５０（Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋（［基質］／基質のＫｍ））との間の数学的関係を用いて、Ｋｉ値を計算することができる。
【０１５５】
実施例３：内部化実験および解析
３．１取込み実験のための材料および方法
ａ）細胞系：
この実験のために用いた細胞系は、ＨＬ−６０（参照番号ＣＣＬ−２４０、ＡＴＣＣ、ロット番号１１６５２３）であった。
【０１５６】
ｂ）培養培地およびプレート
２００８年５月５日に：
１０％のＦＢＳ（参照番号Ａ６４９０６−００９８、ＰＡＡ、ロット番号Ａ１５−１５１）：２００８年４月４日に、５６℃で３０分間にわたり補充した
１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（参照番号Ｓ８６３６、Ｓｉｇｍａ、ロット番号５６Ｋ２３８６）
ペニシリン（１００単位／ｍＬ）／ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）（参照番号Ｐ４３３３、Ｓｉｇｍａ、ロット番号１０６Ｋ２３２１）
を補充した、ＲＰＭＩ（参照番号２１８７５−０９１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ロット番号８２９６）またはＤＭＥＭ（参照番号４１９６５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ロット番号１３４８１）  。
【０１５７】
１０倍濃度のＰＢＳ（参照番号７００１１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ロット番号８２７７）：滅菌Ｈ２Ｏで１倍濃度まで希釈した。
【０１５８】
トリプシン−０．０５％  ＥＤＴＡ（参照番号Ｌ−１１６６０、ＰＡＡ、ロット番号Ｌ６６００７−１１９４）。
６ウェル培養プレート（参照番号１４０６７５、Ｎｕｎｃ、ロット番号１０２６１３）
２４ウェル培養プレート（参照番号１４２４７５、Ｎｕｎｃ、ロット番号０９５８４９）
９６ウェル培養プレート（参照番号１６７００８、Ｎｕｎｃ、ロット番号０８３３１０）
タンパク質投与用の９６ウェルプレート（参照番号８２．１５８１、Ｓａｒｓｔｅｄｔ）
蛍光測定用９６ウェルプレート（参照番号６００５２７９、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）。
【０１５９】
ｃ）溶液
ポリＤ−リシンコーティング溶液（Ｓｉｇｍａ：Ｐ９０１１；ロット番号０９５Ｋ５１０４）：１倍濃度のＰＢＳ中で２５μｇ／ｍＬの最終濃度に希釈した。
【０１６０】
酸性洗浄緩衝液：０．２Ｍのグリシン、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ３．０  。
【０１６１】
Ｒｉｐａ溶解緩衝液：ｐＨ７．２の１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ８．０の１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２００μＭのＮａ３ＶＯ２、０．１％のＳＤＳ、１倍濃度のプロテアーゼ阻害剤カクテル（参照番号１１８７３５８０００１、Ｒｏｃｈｅ、ロット番号１３７３２７００）  。
【０１６２】
ｄ）顕微鏡法および蛍光プレートリーダー
倒立顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ４０  ＣＦＬ；Ｚｅｉｓｓ；２０倍）を用いて、細胞を観察およびカウントした
蛍光は、Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｌｐｈａ  Ｐｌａｔｅリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で読み取った。
【０１６３】
ｅ）方法
懸濁細胞について、ＦＩＴＣ顕著なペプチドの内部化を研究した。細胞を、ポリＤＬ−リシンでコーティングしたディッシュへと、１ｍＬ当たりの細胞１×１０６個の濃度で播種した。次いで、プレートを、３７℃、５％のＣＯ２、および１００％の相対湿度で２４時間にわたりインキュベートしてから、公知の濃度のペプチドを添加した。ペプチドを添加した後で、細胞を、３７℃、５％のＣＯ２、および１００％の相対湿度で３０分間、１、６、または２４時間にわたりインキュベートした。次いで、細胞表面吸着ペプチド（Ｋａｍｅｙａｍａら、（２００７年）、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、８８巻、９８〜１０７頁を参照されたい）を除去するために、細胞を、酸性緩衝液（０．２Ｍのグリシン、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ３．０）で２回にわたり洗浄した。塩基性アミノ酸に富むペプチドは、細胞表面に強く吸着し、これは、内部化したペプチドの過大評価を結果としてもたらすことが多いので、酸性緩衝液を用いた。したがって、酸性緩衝液を用いる細胞洗浄を使用して、細胞表面吸着ペプチドを除去した。Ｆａｂ／細胞透過ペプチドコンジュゲートの細胞内への取込みを決定するときには、酸による洗浄を実行した後で、２回にわたりＰＢＳによる洗浄を行った。細胞は、ＲＩＰＡ溶解緩衝液を添加することにより破壊した。次いで、内部化したペプチドの相対量は、バックグラウンドを除去し、タンパク質含量を標準化した後の蛍光により決定した。
【０１６４】
ステップは、この通りである。
【０１６５】
１．細胞の培養
２．酸性洗浄および細胞抽出物
３．蛍光プレートリーダーによるペプチド内部化の解析
ｆ）細胞の培養およびペプチドの処理  。
【０１６６】
６ウェルの培養プレートを、３ｍＬのポリＤ−Ｌｙｓ（Ｓｉｇｍａ；Ｐ９０１１；ＰＢＳ中に２５μｇ／ｍＬ）でコーティングし、２４ウェルプレートを６００μｌのポリＤ−Ｌｙｓでコーティングし、９６ウェルプレートを１２５μｌのポリＤ−Ｌｙｓでコーティングし、３７℃、５％のＣＯ２、および１００％の相対湿度で４時間にわたりインキュベートする。
【０１６７】
４時間後、６ウェルプレート、２４ウェルプレート、または９６ウェルプレートのそれぞれについて、３．５ｍＬのＰＢＳ、７００μｌまたは１５０μｌのＰＢＳで２回にわたり、ディッシュを洗浄した。
【０１６８】
細胞を、ディッシュ内の２．４ｍＬの培地（ＲＰＭＩ）中に、懸濁細胞の場合、１ｍＬ当たりの細胞１，０００，０００個の播種密度で播種した。接種後、プレートを、３７℃、５％のＣＯ２、および１００％の相対湿度で２４時間にわたりインキュベートしてから、ペプチドを添加した。接着細胞は、処置日までに９０〜９５％の密度であるものとし、ＤＭＥＭ中に播種した。
【０１６９】
【化２】
2015502372.tif 000009
【０１７０】
細胞を、所望の濃度のＦＩＴＣで標識されたペプチド（Ｈ２Ｏ中１０ｍＭの濃度の原液）で処置した。
【０１７１】
ペプチドの添加後、細胞を、３７℃、５％のＣＯ２、および１００％の相対湿度で、０〜２４時間（例えば、３０分間、１、６、または２４時間）にわたりインキュベートした。
【０１７２】
酸性洗浄および細胞抽出物：
抽出物は、氷上で冷却した。
【０１７３】
懸濁細胞（またはディッシュへと十分に付着する細胞）：
細胞を《１５ｍＬのＦａｌｃｏｎ》内に移す。最大量の細胞を回収するために、ディッシュを１ｍＬのＰＢＳで洗浄する
最大２４００ｒｐｍで２分間にわたり細胞を採取する
細胞を１ｍＬの低温のＰＢＳ中に懸濁させる
細胞をコーティングされた「エッペンドルフ管」（１ｍＬのポリＤ−Ｌｙｓで４時間にわたりコーティングされ、１ｍＬのＰＢＳで２回にわたり洗浄された）へと移す
１ｍＬの低温の酸性洗浄緩衝液で３回にわたり洗浄し、最大２４００ｒｐｍで２分間にわたり遠心分離する。「エッペンドルフ」内の細胞の広がりに注意する
１ｍＬの低温のＰＢＳで２回にわたり洗浄して中和する
５０μｌの溶解ＲＩＰＡ緩衝液を添加する
氷上でのかき混ぜを伴って３０分間〜１時間にわたりインキュベートする。
【０１７４】
接着細胞：
低温の酸性洗浄緩衝液３ｍＬ、１ｍＬ、または２００μｌ（６ウェルプレート、２４ウェルプレート、または９６ウェルプレートのそれぞれについて）で３回にわたり洗浄する。ディッシュから剥離する細胞に注意する
１ｍＬの低温のＰＢＳで２回にわたり洗浄して（６ウェルプレート、２４ウェルプレート、または９６ウェルプレートのそれぞれについて）、中和する
５０μｌの溶解ＲＩＰＡ緩衝液を添加する
氷上でのかき混ぜを伴って３０分間〜１時間にわたりインキュベートする
細胞を低温のスクレーパーでスクレーピングする。２４ウェルプレートおよび９６ウェルプレートを、４℃、４０００ｒｐｍで１５分間にわたり直接遠心分離して、細胞破砕物を除去した。次いで、上清（２４ウェルプレートまたは９６ウェルプレートのそれぞれについて１００または５０ｍＬ）を、暗色の９６ウェルプレートに直接移した。プレートを蛍光プレートリーダー（Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｌｐｈａ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）により読み取った
溶解物をコーティングされた「エッペンドルフ」（１ｍＬのポリＤ−Ｌｙｓで４時間にわたりコーティングされ、１ｍＬのＰＢＳで２回にわたり洗浄された）に移す
次いで、溶解した細胞を、４℃、１００００ｇで３０分間にわたり遠心分離して、細胞破砕物を除去した
上清を除去し、コーティングされた「エッペンドルフ管」（１ｍＬのポリＤ−Ｌｙｓで４時間にわたりコーティングされ、１ｍＬのＰＢＳで２回にわたり洗浄された）内、−８０℃で保存する。
【０１７５】
蛍光プレートリーダーによるペプチド内部化の解析：
製造元の指示書に従い、各タンパク質抽出物の含量を、基準物質ＢＣＡアッセイ（キット型番２３２２５、Ｐｉｅｒｃｅ）により決定した。
【０１７６】
各試料１０μｌずつを蛍光プレートリーダー（Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｌｐｈａ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で読み取り、バックグラウンドを除去し、タンパク質濃度により標準化した後に、各試料の相対蛍光を決定する。
【０１７７】
３．２取込み実験
ＦＩＴＣで標識したＴＡＴに由来する輸送体構築物の、ＨＬ−６０細胞系の細胞への、時間依存的な内部化（取込み）を、上記の通りに、配列番号５２〜９６、４３、および４５〜４７の輸送体ペプチド配列を用いて実行した。これらの配列を、下記の表４に列挙する。
【０１７８】
【表４−１】
2015502372.tif 000010
【０１７９】
【表４−２】
2015502372.tif 000011
【０１８０】
上記の表において、Ｄアミノ酸は、それぞれのアミノ酸残基（例えば、ｄＲ＝Ｄ−Ａｒｇ）の前の小文字の「ｄ」により示される。
【０１８１】
少数の配列では、残念ながら、技術的な理由に起因して、第１の手法による合成に失敗した。これらの配列を、図６では１、２、３、４、５、６、７、８、４３、５２、５３、５４、５５、５６、５７、８５、８６、８７、８８、８９、および９０と略記する。しかし、残りの配列は、内部化実験で用いた。
【０１８２】
結果を図６に示す。
【０１８３】
図６に見られる通り、２４時間にわたるインキュベーションの後、コンセンサス配列ｒＸＸＸｒＸＸＸｒ（配列番号３１）を伴う全ての輸送体は、Ｌ−ＴＡＴ輸送体（配列番号４３）より高い内部化能を示した。Ｈｅｌａ細胞を、９６ウェルプレート内で２４時間にわたり、１０ｍＭのｒ３−Ｌ−ＴＡＴに由来する輸送体と共にインキュベートした。次いで、細胞を、酸性緩衝液（０．２Ｍのグリシン、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ３．０）で２回にわたり洗浄し、ＰＢＳで２回にわたり洗浄した。細胞を、ＲＩＰＡ溶解緩衝液を添加することにより破壊した。次いで、各抽出物の蛍光強度（Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｌｐｈａ  ｐｌａｔｅリーダー；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を読み取った後でバックグラウンドを除去することにより、内部化したペプチドの相対量を決定した。
【０１８４】
図６に見られる通り、１つの位置：２位におけるＹ（配列番号１４２に対応するペプチド番号９１）が、最高の輸送体活性および輸送活性の動態の改善にきわめて重要であると考えられる。
【０１８５】
この実験の結論は、以下の通りである。
【０１８６】
・２４時間にわたるインキュベーションの後、コンセンサス配列ｒＸＸＸｒＸＸＸｒ（配列番号３１）を伴う全ての輸送体（可能な配列の選択については、表２を参照されたい）は、Ｌ−ＴＡＴ輸送体（配列番号４３）より高い内部化能を示した（図６）。これらの結果により、コンセンサス配列ｒＸＸＸｒＸＸＸｒ（配列番号３１）の妥当性が十分に確認される。
【０１８７】
・１つの位置：２位におけるＹ（配列番号１４２に対応する配列９１）が、最高の輸送体活性にきわめて重要である（図６）。
【０１８８】
したがって、表４において示される通り、特に、配列が９アミノ酸を呈示し、コンセンサス配列ｒＸＸＸｒＸＸＸｒ（配列番号３１）を有する場合は、２位におけるＹを呈示するこのようなＴＡＴ由来配列が好ましい。
【０１８９】
実施例４：サイトカイン放出およびケモカイン放出の測定
以下では、リガンドによりヒト細胞（血液、ＷＢＣ、ＰＢＭＣ、精製初代リンパ球、細胞系、・・・）からの分泌を誘導した後における、いくつかのヒトサイトカインの放出量を、いかにして測定したのかについて説明する手順を示す。
【０１９０】
用いた技法は、抗体の２つの層（すなわち、捕捉抗体および検出抗体）の間の抗原量の測定を可能とする、サンドウィッチＥＬＩＳＡである。少なくとも２つの抗体がサンドウィッチ内で作用するので、測定される抗原は、抗体への結合が可能な少なくとも２つの抗原部位を含有しなければならない。サンドウィッチＥＬＩＳＡ系では、捕捉抗体および検出抗体として、モノクローナル抗体を用いることもでき、ポリクローナル抗体を用いることもできる。モノクローナル抗体は、抗原のわずかな差異の微細な検出および定量化を可能とする、単一のエピトープを認識する。捕捉抗体としては、ポリクローナルを用いて、可能な限り多量の抗原をプルダウンすることが多い。サンドウィッチＥＬＩＳＡの利点は、解析の前に試料を精製しなくともよく、アッセイがきわめて高感度（直接的ＥＬＩＳＡまたは間接的ＥＬＩＳＡの、最大で２〜５倍高感度）でありうることである。
【０１９１】
本方法を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ／細胞の培養物における、本発明のＪＮＫ阻害剤の効果を決定することができる。非毒性用量では、化合物の有効性が、非処置試料と比較したサイトカインレベルの低下（光学濃度（４５０ｎｍにおける吸光度）の変化）により示され、ＥＬＩＳＡによりモニタリングされる。結果は、ｎｇ／ｍＬ単位で表す。
【０１９２】
４．１材料
・９６ウェルプレート：
上清収集用の９６ウェルプレート（参照番号８２．１５８１、Ｓａｒｓｔｅｄｔ）
ＥＬＩＳＡ用の９６ウェルプレート（Ｆ９６  ＭａｘｉＳｏｒｐ、参照番号４４２４０４、Ｎｕｎｃ）
・ＴｏｐＳｅａＬ−Ａ：９６ウェルマイクロプレートシール（参照番号６００５８５、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）。
・ＥＬＩＳＡ試薬
ＥＬＩＳＡ用コーティング緩衝液：１リットルのＨ２Ｏ中にｐＨ９．５の０．１Ｍ炭酸Ｎａ（＝７．１３ｇのＮａＨＣＯ３（参照番号７１６２７、Ｆｌｕｋａ）＋１．５９ｇのＮａ２ＣＯ３（参照番号７１３４５、Ｆｌｕｋａ）とし、濃縮ＮａＯＨによりｐＨを９．５とした）
ＥＬＩＳＡ用洗浄緩衝液：１倍濃度のＰＢＳ＋０．０１％のＴｗｅｅｎ２０（１倍濃度のＰＢＳ  １リットルを調製し（１０倍濃度のＰＢＳ：参照番号７００１１、ＧＩＢＣＯ）、磁気かき混ぜ機によりゆっくりと混合しながら、１００ｕｌのＴｗｅｅｎ２０（参照番号Ｐ１３７９、Ｓｉｇｍａ）を添加する）。
【０１９３】
アッセイ用希釈剤：１倍濃度のＰＢＳ＋１０％のＦＢＳ（参照番号Ａ１５−１５１、ＰＡＡ；５６℃で３０分間にわたり補充した）。
【０１９４】
ＤＡＫＯ  ＴＭＢ（参照番号Ｓ１５９９、ＤＡＫＯ）：市販の基質溶液
停止溶液：１ＭのＨ３ＰＯ４（→２００ｍＬの場合＝１７７ｍＬのＨ２Ｏ＋２３ｍＬの８５％Ｈ３ＰＯ４（参照番号３４５２４５、Ａｌｄｒｉｃｈ）。
・ＥＬＩＳＡキット（２０のプレートのための試薬）
ＩＦＮ−γ：ヒトＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡセット、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ（商標）（参照番号５５５１４２、ＢＤ）。
【０１９５】
ＩＬ−１β：ヒトＩＬ−１β  ＥＬＩＳＡセットＩＩ、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ（商標）（参照番号５５７９５３、ＢＤ）
ＩＬ−１０：ヒトＩＬ−１０  ＥＬＩＳＡセットＩＩ、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ（商標）（参照番号５５５１５７、ＢＤ）。
【０１９６】
ＩＬ−１２：ヒトＩＬ−１２（ｐ７０）  ＥＬＩＳＡセット、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ（商標）（参照番号５５５１８３、ＢＤ）。
【０１９７】
ＩＬ−１５：ヒトＩＬ−１５  ＥＬＩＳＡセット、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ（商標）（参照番号５５９２６８、ＢＤ）。
【０１９８】
ＩＬ−２：ヒトＩＬ−２  ＥＬＩＳＡセット、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ（商標）（参照番号５５５１９０、ＢＤ）。
【０１９９】
ＩＬ−４：ヒトＩＬ−４  ＥＬＩＳＡセット、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ（商標）（参照番号５５５１９４、ＢＤ）。
【０２００】
ＩＬ−５：ヒトＩＬ−５  ＥＬＩＳＡセット、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ（商標）（参照番号５５５２０２、ＢＤ）。
【０２０１】
ＩＬ−６：ヒトＩＬ−６  ＥＬＩＳＡセットＩ、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ（商標）（参照番号５５５２２０、ＢＤ）。
【０２０２】
ＩＬ−８：ヒトＩＬ−８  ＥＬＩＳＡセット、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ（商標）（参照番号５５５２４４、ＢＤ）。
【０２０３】
ＭＣＰ−１：ヒトＭＣＰ−１  ＥＬＩＳＡセット、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ（商標）（参照番号５５５１７９、ＢＤ）
ＴＮＦ−α：ヒトＴＮＦ  ＥＬＩＳＡセット、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ（商標）（参照番号５５５２１２、ＢＤ）。
・吸光度の読取り：吸光度は、Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｌｐｈａ  Ｐｌａｔｅリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）上で読み取った。
・リピーティングピペット、デジタル式ピペット、またはマルチチャネルピペット。
【０２０４】
４．２方法
試料の調製
試料は、培養ヒト細胞（典型的には、全血液、ＷＢＣ、ＰＢＭＣ、精製ＷＢＣ亜型、がん性細胞系）に由来する培養培地上清である。遠心分離（４℃、４００ｇで５分間にわたる）により任意の粒子状物質を除去し、速やかにアッセイするか、または試料を−２０℃で保存する。凍結−融解サイクルの反復を回避する。用いる１時間前に、試料を氷上で解凍し、遠心分離する。ステップ１１では、アッセイ用希釈剤中で試料を、プレートへと直接希釈する（まずアッセイ用希釈剤を添加し、次いで、試料を添加し上下にピペティングする）。
【０２０５】
基準物質の調製
凍結乾燥させた基準物質を室温まで温めた後、材料の逸失を回避するために、バイアルを注意深く開栓する。凍結乾燥させた基準物質を、提起された容量の脱塩水で再構成して、基準物質原液を得る。希釈液を作製する前に、少なくとも１５分間にわたり、基準物質を平衡化させる。静かにボルテックスして、混合する。再構成の後、基準物質原液を、ポリプロピレン製バイアルに、バイアル１本当たり５０μｌずつ速やかにアリコート分割し、最長６カ月間にわたり、−２０℃で凍結させる。必要な場合は、アリコート分割／凍結前の最長８時間にわたり、２〜８℃で保存する。再構成した基準物質を室温で放置しない。
【０２０６】
使用の直前に、試薬希釈剤中２倍の系列希釈を用いて１０点の検量線を作成する。４０００ｐｇ／ｍＬの高濃度の基準物質が推奨される。
【０２０７】
検出抗体ミックスの調製
ビオチン／ＳＡｖ試薬の１ステップインキュベーション。要求容量の検出抗体を、アッセイ用希釈剤へと添加する。使用前の１５分以内に、要求量の酵素試薬を添加し、十分にボルテックスまたは混合する。推奨される希釈液については、ロットごとに指定された指示書／解析証明書を参照されたい。任意の残存する作業用検出抗体は、使用後に廃棄する。
【０２０８】
捕捉抗体によるコーティング
１．ＰＶＣ製マイクロ滴定プレートのウェルを、コーティング緩衝液中で希釈したウェル１つ当たり１００μｌの捕捉抗体でコーティングする。推奨される抗体コーティング用希釈液については、ロットごとに指定された指示書／解析証明書を参照されたい。
【０２０９】
２．プレートを、プラスチック製粘着テープで覆い、４℃で一晩にわたりインキュベートする。
【０２１０】
３．コーティング溶液を除去し、ウェルを１５０μｌの洗浄緩衝液で満たすことにより、プレートを洗浄する。
【０２１１】
４．シンクの上でプレートをフリッキングすることにより、溶液または洗浄液を除去する。
【０２１２】
５．合計３回の洗浄について、これらの過程を２回ずつ繰り返す。
【０２１３】
６．最後の洗浄後、プレートをペーパータオル上でパッティングすることにより、任意の残存する洗浄緩衝液を除去する。
ブロッキング
７．ウェル１つ当たり１００μｌの試薬希釈剤を添加することにより、コーティングしたウェル内の残りのタンパク質結合部位をブロッキングする。
【０２１４】
８．プレートを、プラスチック製粘着テープで覆い、室温で１時間にわたりインキュベートする。
【０２１５】
９．インキュベーションの間に、基準物質の調製を開始する。
【０２１６】
試料の添加
１０．ステップ３における場合と同様に、１５０μｌの洗浄緩衝液により、洗浄を１回行う。これで、プレートには、試料を添加する準備ができている。
【０２１７】
１１．アッセイ用希釈剤中で適切に希釈した５０μｌの試料を各ウェルへと添加する。正確な定量結果のためには、未知の試料のシグナルを、検量線のシグナルに照らして常に比較する。精度を確保するためには、基準物質（３連）およびブランクを、各サイトカインについて試行しなければならない。
【０２１８】
１２．プレートを、プラスチック製粘着テープで覆い、室温で２時間にわたりインキュベートする。
【０２１９】
検出抗体および二次抗体を伴うインキュベーション
１３．ステップ３と同様に、プレートを、１５０μｌの洗浄緩衝液で、４回にわたり洗浄する。
【０２２０】
１４．１４．５０μｌの検出抗体ミックス（アッセイ用希釈剤中の検出抗体＋ストレプトアビジン−ＨＲＰ二次抗体）を、各ウェルへと、推奨される希釈率（ロットごとに指定された指示書／解析証明書を参照されたい）で添加する。
【０２２１】
１５．プレートを、プラスチック製粘着テープで覆い、光保護下の室温で１時間にわたりインキュベートする。
【０２２２】
１６．ステップ３における場合と同様に、プレートを、１５０μｌの洗浄緩衝液で、６回にわたり洗浄する。
【０２２３】
１７．５０μｌのＤＡＫＯ  ＴＭＢ溶液を、各ウェルへと添加して、暗所、室温で密封せずに、１５〜２０分間にわたりインキュベートする。
【０２２４】
１８．１８．５０μｌの停止溶液を、各ウェルへと添加する。プレートを静かにタッピングして、完全な混合を確保する。
【０２２５】
１９．プレートを、プレートミキサー上、５００ｒｐｍで５分間にわたりミキサーにかける。
【０２２６】
２０．４５０ｎｍにおける光学濃度を読み取る（プログラム：Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｌｐｈａ  Ｐｌａｔｅリーダー上のＣｙｔｏｋｉｎｅ＿ＥＬＩＳＡ）。
【０２２７】
データ解析
各基準物質対照および各試料についての３連の読取りの平均。ゼロ基準の平均光学濃度（Ｏ．Ｄ）を減じる。サイトカイン濃度の対数値を、Ｏ．Ｄの対数値と対比してプロットする検量線を作出し、最良の近似直線を回帰分析により決定することができる。試料を希釈した場合は、検量線から読み取られる濃度に、希釈係数を乗じなければならない。検量線は、アッセイされる各試料セットについて創出するものとする。外れ値データは、グラブス検定を用いて除外した。次いで、ＳＤの２倍の区間に入らないデータを棄却した。陽性対照が、既に観察されたデータを示す場合は、独立の実験を考慮する。独立の実験をプールする（Ｎ＞３）。
【０２２８】
データは、ｐｇ／ｍＬ単位のサイトカイン放出または阻害剤による処置を伴わずに誘導される状態と比較した％を提示する。
【０２２９】
実施例５：ＴＨＰ１の分化：サイトカインを放出させるための刺激
以下では、本発明のＪＮＫ阻害剤、特に、配列番号１７２を伴うＪＮＫ阻害剤が、刺激により誘導されたサイトカイン放出を低減する能力を調べるために、ＰＭＡにより分化させて、ＬＰＳにより６時間にわたり感作した、ヒトＴＨＰ１細胞からのサイトカイン産生をどのようにして誘導したのかについて説明する手順を示す。サイトカイン放出を読み取るために、ＴＨＰ１細胞を、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、異なるリガンドで刺激した。非毒性用量では、ＪＮＫ阻害剤の有効性が、非処置試料と比較したサイトカインレベルの低下により示され、ＥＬＩＳＡによりモニタリングされる。化合物の毒性は、紫色を呈するトリアゾリウム（ｔｒｅｔａｚｏｌｉｕｍ）塩（ＭＴＳ）のホルマザンへの還元により評価する。
【０２３０】
手順：
ａ．材料
・細胞系：ＴＨＰ−１（参照番号ＴＩＢ−２０２、ＡＴＣＣ、ロット番号５７７３１４７５）
・培養培地、試薬およびプレート  。
【０２３１】
１０％のＦＢＳ（参照番号Ａ１５−１５１、ＰＡＡ）：５６℃で３０分間にわたり補充した
１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（参照番号Ｈ０８８７、Ｓｉｇｍａ）
５０μＭのβ−メルカプトエタノール（参照番号６３６９０、Ｆｌｕｋａ：１４．３Ｍの原液）：５０ｍＭのアリコート５６０μｌを、−２０℃で貯蔵されたＰＢＳに添加する
１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（参照番号Ｓ８６３６、Ｓｉｇｍａ）
ペニシリン（１００単位／ｍＬ）／ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）（参照番号Ｐ４３３３、Ｓｉｇｍａ）
を補充したＲＰＭＩ（参照番号２１８７５−０９１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。
【０２３２】
次いで、ＲＰＭＩ培地を、０．２２μｍのフィルター（参照番号ＳＣＧＰＵ０５ＲＥ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過する。
【０２３３】
１０倍濃度のＰＢＳ（参照番号７００１１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）：滅菌Ｈ２Ｏで１倍濃度まで希釈した
ＤＭＳＯ：参照番号４１４４４、Ｆｌｕｋａ
ＰＭＡ（ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート、参照番号Ｐ１５８５、Ｓｉｇｍａ、濃度：１ｍＭ＝−２０℃のＤＭＳＯ中６１６．８ｕｇ／ｍＬ）。ＲＰＭＩ中に１００ｎＭの最終濃度で直接用いる（１０ｍＬの培地中に１ｕｌ）。
【０２３４】
超高純度ＬＰＳ（リポ多糖、参照番号ｔｌｒｌ−ｅｋｌｐｓ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、濃度：５ｍｇ／ｍＬ）：ＬＰＳの原液：４℃のＰＢＳ中３μｇ／ｍＬ。直接用いて、ＲＰＭＩ培地中に４０ｎｇ／ｍＬである、４倍濃度の濃縮溶液を調製する（プレート１枚当たり最小で１８００μｌ；プレート５枚で：３μｇ／ｍＬのＬＰＳ  １２５μｌ＋９２５０μｌのＲＰＭＩ）。
【０２３５】
９６ウェルプレート：
接着細胞培養用の９６ウェルプレート（参照番号１６７００８、Ｎｕｎｃ）
上清収集用の９６ウェルプレート（参照番号８２．１５８１、Ｓａｒｓｔｅｄｔ）
ＥＬＩＳＡ用の９６ウェルプレート（Ｆ９６  ＭａｘｉＳｏｒｐ、参照番号４４２４０４、Ｎｕｎｃ）
コーティング溶液：ポリＤ−リシン（参照番号Ｐ９０１１、Ｓｉｇｍａ）：２５μｇ／ｍＬの１倍濃度のＰＢＳ中での最終濃度に希釈した
・ＥＬＩＳＡ試薬およびキット
ＥＬＩＳＡ用コーティング緩衝液：１リットルのＨ２Ｏ中にｐＨ９．５の０．１Ｍ炭酸Ｎａ（＝７．１３ｇのＮａＨＣＯ３（参照番号７１６２７、Ｆｌｕｋａ）＋１．５９ｇのＮａ２ＣＯ３（参照番号７１３４５、Ｆｌｕｋａ）、濃縮ＮａＯＨによりｐＨを９．５とした）
ＥＬＩＳＡ用洗浄緩衝液：１倍濃度のＰＢＳ＋０．０１％のＴｗｅｅｎ２０（参照番号Ｐ１３７９、Ｓｉｇｍａ、ロット番号０９４Ｋ００５２）（＝１倍濃度のＰＢＳ  １リットルを調製し、磁気かき混ぜ機によりゆっくりと混合しながら、１００ｕｌのＴｗｅｅｎ２０を添加する）。
【０２３６】
アッセイ用希釈剤：１倍濃度のＰＢＳ＋１０％のＦＢＳ（参照番号Ａ１５−１５１、ＰＡＡ；５６℃で３０分間にわたり補充した）。
【０２３７】
ＤＡＫＯ  ＴＭＢ（参照番号Ｓ１５９９、ＤＡＫＯ）：市販の基質溶液
停止溶液：１ＭのＨ３ＰＯ４（→２００ｍＬの場合＝１７７ｍＬのＨ２Ｏ＋２３ｍＬの８５％Ｈ３ＰＯ４（参照番号３４５２４５、Ａｌｄｒｉｃｈ）。
【０２３８】
ＴＮＦ−α：ヒトＴＮＦ  ＥＬＩＳＡセット、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ（参照番号５５５２１２、ＢＤ）。
・細胞傷害作用の測定：ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６試薬（参照番号Ｇ３５８１、Ｐｒｏｍｅｇａ）
・対照化合物：ＳＰ６００１２５（参照番号ＡＬＸ−２７０−３３９−Ｍ０２５、Ａｌｅｘｉｓ、濃度：２０ｍＭのＤＭＳＯ）
・吸光度の読取り：吸光度は、Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｌｐｈａ  Ｐｌａｔｅリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）上で読み取った。
・リピーティングピペット、デジタル式ピペット、またはマルチチャネルピペット。
・ＴｏｐＳｅａｌ−Ａ：９６ウェルマイクロプレートシール（参照番号６００５８５、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）。
【０２３９】
ｂ．方法
ウェルのコーティング
プレートを、２００μｌのポリＤ−リシン（１倍濃度）でコーティングし、３７℃、５％のＣＯ２、および１００％の相対湿度で２時間にわたりインキュベートした。
【０２４０】
細胞の播種
２時間後、ウェルを、１倍濃度のＰＢＳ  ２００μｌで２回にわたり洗浄した（速やかに用いるか、または使用まで１倍濃度のＰＢＳ  ２００μｌと共に３７℃で放置するが、３日間以内とする）。
【０２４１】
細胞をカウントした。所望数の細胞を採取し、１ｍＬ当たりの細胞１，０００，０００個の希釈液を得るのに必要な量の培地中に再懸濁させた。１００ｎＭのＰＭＡを添加して、ＴＨＰ１の、懸濁単球から付着マクロファージへの分化を誘導した。細胞を、ウェル内の１００μｌの培地中に、ウェル１つ当たりの細胞１００，０００個の播種密度で播種した。接種後、プレートを、３７℃、５％のＣＯ２、および１００％の相対湿度で３日間にわたりインキュベートして、それらを分化させてから、被験薬を添加した。
【０２４２】
細胞の処置
３日後、接着細胞を顕微鏡で観察した。ＰＭＡを含有する培地を吸引し、ＰＭＡを伴わない１００μｌの新鮮なＲＰＭＩ培地で置きかえた（１倍濃度のＰＢＳによる洗浄ステップを伴わない）。
【０２４３】
被験薬をＨ２Ｏ中またはＤＭＳＯ中１０ｍＭの濃度で調製し、−８０℃で保存した。各日の使用前に、１アリコートのＪＮＫ阻害剤を解凍し、ＲＰＭＩ培地中に４倍濃度の濃縮溶液（１２０μＭ）に到達するように希釈し、次いで、ＲＰＭＩ中に所望の濃度まで希釈した。ＳＰ６００１２５を、ＲＰＭＩ培地中に４倍濃度の濃縮溶液（４０μＭ）に到達するように希釈し、次いで、０．８％のＤＭＳＯを含有するＲＰＭＩ中に所望の濃度まで希釈した。
【０２４４】
プレートを、５０μｌの培地または所望の最終薬物濃度（ＪＮＫ化合物については、０、１００ｎＭ、１、３、１０、もしくは３０μＭの最終濃度、またはＳＰ６００１２５陽性対照については、０、１０、１００ｎＭ、１、３、もしくは１０μＭの最終濃度）の４倍濃度の溶液で処置した。薬物を添加した後、プレートを、３７℃、５％のＣＯ２、および１００％の相対湿度でさらに１時間にわたりインキュベートした。
【０２４５】
１時間後、超高純度ＬＰＳ（３ｎｇ／ｍＬの最終濃度）の４倍濃度の濃縮希釈液５０μｌを添加することにより、ＴＮＦαの分泌を誘導した。
【０２４６】
アッセイ
６時間後、１００μｌの上清を、新たな９６ウェルプレートへと移した。これらのプレートを密封し、サイトカインの分泌についてＥＬＩＳＡにより解析するまで−２０℃で保存した（例えば、実施例４を参照されたい）。
【０２４７】
化合物の細胞傷害効果を、ＭＴＳ吸光度により評価し（例えば、実施例４を参照されたい）、倒立顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ４０  ＣＦＬ；Ｚｅｉｓｓ；１０倍）を用いて細胞を観察した。
【０２４８】
データ解析
データの解析は、ＥＬＩＳＡ（実施例４を参照されたい）において示される通りに実施する。略述すると、ＥＬＩＳＡでは以下の通りである。各基準物質対照および各試料についての３連の読取りの平均。ゼロ基準の平均光学濃度（Ｏ．Ｄ）を減じる。サイトカイン濃度の対数値を、Ｏ．Ｄの対数値と対比してプロットする検量線を作出し、最良の近似直線を回帰分析により決定することができる。試料を希釈した場合は、検量線から読み取られる濃度に、希釈係数を乗じなければならない。検量線は、アッセイされる各試料セットについて創出するものとする。外れ値データは、グラブス検定を用いて除外した。次いで、ＳＤの２倍の区間に入らないデータを棄却した。陽性対照が、既に観察されたデータを示す場合は、独立の実験を考慮する。独立の実験をプールする（Ｎ＞３）。
【０２４９】
細胞傷害効果の評定では以下の通りである：サイトカイン放出実験の解析を考慮した各独立の実験の各プレートでは、培地単独の吸光度の平均を、バックグラウンドと考え、これを減じて各吸光度値とした。各化合物により処置されない細胞の３連の平均を、１００％の生存率と考えた。各化合物による３連の平均は、この１００％により標準化した。外れ値データは、グラブス検定を用いて除外した。次いで、ＳＤの２倍の区間に入らないデータを棄却した。独立の実験をプールする（Ｎ＞３）。
【０２５０】
状態についての全ての統計学的比較は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４ソフトウェアにより実施した。以下の検定を伴う：一元ＡＮＯＶＡ検定に続くテューキーの多重比較検定。Ｐ＜０．０５を有意であると考えた。
【０２５１】
実施例６：配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤および初代ラット細胞またはヒト全血液細胞におけるＴＮＦαの放出
全血液は、クエン酸ナトリウムを含有する、あらかじめラベル付けした真空チューブへと接合した静脈穿刺を用いて、麻酔をかけたラットまたはヒト健常ボランティアから収集する。チューブを、７〜８回にわたる静かな反転によるミキサーにかけ、次いで、刺激するまで室温で保持する。配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤は、ＰＢＳ中６倍濃度に濃縮して調製し、ウェル１つ当たり３０μｌのミックスを、９６ウェルプレートへと添加する。全血液をＰＢＳ中１：２で希釈し、希釈された血液１２０μｌを、ＰＢＳ単独または配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤をあらかじめ添加してある各ウェルに添加する。全血液を、３７℃、８５ｒｐｍ（Ｓｔｕａｒｔ  Ｏｒｂｉｔａｌインキュベータ；ＳＩ５００）で６０分間にわたりインキュベートする。活性化剤（ＬＰＳ）は、調製された、ウェル１つ当たり３０μｌの６倍濃縮されたＬＰＳである。６０分間にわたるインキュベーションの後、ＬＰＳを、血液へと添加し、上下にピペティングすることにより血液を混合し、次いで、３７℃で４時間にわたるかき混ぜ（８５ｒｐｍ）下に置く。４時間にわたるインキュベーション後、プレートを、あらかじめ冷却した遠心分離機により、４℃、約７７０ｇで１５分間にわたり遠心分離する。最後に上清を収集し、サイトカインを測定するまで−２０℃で保持する。次いで、標準的なＥｌｉｓａキット（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製のＤｕｏＳｅｔ  Ｅｌｉｓａｓ；またはＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＢＤ  Ｏｐｔｅｉａ  Ｓｅｔ  Ｅｌｉｓａ）を用いて、サイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、およびＴＮＦα）を測定した。結果を、上清１ｍＬ当たりの測定されたサイトカインｐｇとして表す。
【０２５２】
活性化剤／刺激剤としてのＬＰＳの代わりにＰＭＡ＋イオノマイシンにより、同様の実験を行った。
【０２５３】
実施例７：本明細書で開示される特異的ＪＮＫ阻害剤の半減期
配列番号１９６、１９７、および１７２の配列を伴うＪＮＫ阻害剤（０．１ｍＭの最終濃度）を、ヒト血清（１倍濃度のＰＢＳ中で１０および５０％）中で消化した。実験は、Ｔｕｇｙｉら（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、２００５年、４１３〜４１８頁）により記載される通りに実施した。残りのインタクトなペプチドは、ＵＰＬＣ−ＭＳにより定量化した。配列番号１９６、１９７、および１７２について、同一の方法であるが２回の個別のアッセイにより安定性を評価した。配列番号１９６を伴うＪＮＫ阻害剤が、６時間以内に、アミノ酸残基へと十全に分解されたのに対し、配列番号１７２を伴うＪＮＫ阻害剤が完全に分解されたのは、１４日後であるに過ぎなかった。配列番号１９７を伴うＪＮＫ阻害剤は、３０日後においてもやはり安定であった。
【０２５４】
実施例８：配列番号１７２の配列を伴うＪＮＫ阻害剤による、ラット初代Ｔ細胞におけるＣＤ３／ＣＤ２８誘導ＩＬ−２放出の用量依存的な阻害
対照動物を屠殺し、リンパ節（ＬＮ）を採取し、完全ＲＰＭＩ培地中に保持した。ＬＮを、５ｍＬのピストンを用いて７０μｍのフィルター上の完全ＲＰＭＩにより細切れにした。培地の液滴少量を添加して、ストレイナーを湿潤に保った。細胞を、４５０ｇおよび４℃で７分間にわたり遠心分離した。ペレットを５ｍＬの新鮮な培地中に再懸濁させた。細胞に、再度、細胞ストレイナーを通過させた。１アリコートの細胞をカウントする一方で、４℃および１４００ｒｐｍで１０分間にわたり、細胞を再度遠心分離した。細胞を、ＭＡＣＳ緩衝液（１０７個の細胞当たり８０μｌのＭＡＣＳ緩衝液）中に再懸濁させた。細胞１千万個当たり１０μｌの抗ラットＭＨＣマイクロビーズを添加し、細胞を、４〜８℃で１５分間にわたりインキュベートした。細胞を、１５ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液で洗浄し、４℃および７００ｇで７分間にわたり遠心分離した。ペレットを、細胞１０８個当たり５００μｌのＭＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させた。動物１匹当たり１本のＬＳカラムを、ＭＡＣＳ分離器の磁場に置いた。カラムは、３ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液でまずすすいだ。１本のチューブをカラムの下方の氷中に置き、細胞＝Ｔ細胞を収集した（陰性選択であるので、溶出される細胞を収集する）。細胞懸濁液を添加し、溶出物を氷上で収集した。カラムを、３ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液で３回にわたり洗浄した。溶出されるＴ細胞を、４℃および７００ｇで７分間にわたり遠心分離した。再懸濁させた細胞をカウントし、１００μｌの完全培地中にウェル１つ当たりの細胞２０００００個の密度で播種した。プレートは、実験の前日に、２μｇ／ｍＬのＣＤ３抗体であらかじめコーティングし、実験日に、プレートをＰＢＳで３回にわたり洗浄した。細胞を、１００μｌの（ポリ）ペプチドＪＮＫ阻害剤（配列番号１７２）で処置し、リガンドによる活性化の前に、１時間にわたり２倍に濃縮した。（ポリ）ペプチドＪＮＫ阻害剤（配列番号１７２）による前処置の１時間後、次いで、細胞を、２μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８抗体で２４時間にわたり刺激した。刺激の２４時間後、上清を収集し、解析するまで、−２０℃で保存した。次いで、標準的なＥｌｉｓａキットを用いてサイトカインを測定した。結果を、上清１ｍＬ当たりの測定されたサイトカインｐｇとして表す。
【０２５５】
さらなる実験でも、上記で示したプロトコールと本質的に同じプロトコールを用いたが、配列番号１７２を伴う（ポリ）ペプチドＪＮＫ阻害剤に加えてまた、配列番号１９７の配列を伴うＪＮＫ阻害剤および薬物分子であるＳＰ６００１２５も調べ、これにより、これらの阻害剤の、ＣＤ３／ＣＤ２８誘導ＩＬ−２放出の阻害に対する効果の比較を可能とした。
【０２５６】
実施例９：ＪＮＫ阻害剤およびヒト全血液におけるＴＮＦα／ＩＬ−２の放出：
クエン酸ナトリウムを含有する、あらかじめラベル付けした真空チューブへと接合した静脈穿刺を用いて、ヒト健常ボランティアに由来する全血液を収集した。チューブを、７〜８回にわたる静かな反転によるミキサーにかけ、次いで、刺激するまで室温で保持する。３５０μｌのＲＰＭＩ＋Ｐ／Ｓを、１．２ｍＬの９６ウェルプレートへと添加した。配列番号１７２の１０倍濃縮物を、ＲＰＭＩ＋Ｐ／Ｓ中で調製した（ウェル１つ当たり５０μｌ）。５０μｌは、１．２ｍＬの９６ウェルプレートへと添加した。次いで、５０μｌの全血液を、培地単独またはＪＮＫ阻害剤をあらかじめ添加してある各ウェルに添加した。全血液を、３７℃、５％のＣＯ２で、６０分間にわたりインキュベートした。ＲＰＭＩ＋Ｐ／Ｓ中で希釈された、ウェル１つ当たり５０μｌのリガンドを調製したところ、最終希釈率の１０倍濃縮に対応した。６０分間にわたるインキュベーションの後、リガンドを添加し、次いで、血液を上下にピペティングすることにより、ウェルをミキシングにかけた。全血液を３７℃で３日間にわたりインキュベートした（毎日１回各ウェルを上下にピペティングすることにより、ウェルをミキシングにかけた）。インキュベーションの終了時には、プレートをミキサーにかけ、次いで、あらかじめ冷却した遠心分離機により、４℃、２５００ｒｐｍで１５分間にわたり遠心分離した。次いで、標準的なＥｌｉｓａキットを用いてサイトカインを測定した。結果を、上清１ｍＬ当たりの測定されたサイトカインｐｇとして表す。
【０２５７】
同様の実験を、わずかな改変を伴って実行した。ＣＤ３／ＣＤ８刺激の場合、ＣＤ３抗体を、ＰＢＳ中に２μｇ／ｍＬ、４℃で一晩にわたりコーティングした。実験日において、ＰＢＳで３回にわたりウェルを洗浄し、使用まで、３７℃でＰＢＳ中に放置した。ＣＤ２８抗体は、配列番号１７２の１時間後に、２μｇ／ｍＬの最終濃度で添加し、上清は、３日間にわたる刺激の後に収集した。
【０２５８】
実施例１０：内毒素誘導ブドウ膜炎（ＥＩＵ）のラットモデルにおける抗炎症性効力
配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤の抗炎症性効力を、静脈内投与後のアルビノラット（ＥＩＵ／ＬＰＳモデル）において調べた。本研究の目的は、配列番号１７２の単回の静脈内注射（０．０１５、０．１８、および１．８０ｍｇ／ｋｇ）の、内毒素誘導ブドウ膜炎アルビノラットモデルにおける炎症性応答に対する効果を決定し、これらの効果を、先行技術による配列番号１９７のＪＮＫ阻害剤（２ｍｇ／ｋｇ）で得られる効果と比較することであった。さらなる対照としては、リン酸デキサメタゾンナトリウム（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｏｄｉｃ  ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）が用いられた。
【０２５９】
６０匹の雄Ｌｅｗｉｓラットを、各群の動物１０匹ずつの６つの群へと無作為に分けた。リポ多糖（ＬＰＳ、１ｍｇ／ｋｇ）の足蹠注射によりＥＩＵを誘導した。ＮａＣｌ（０．９％）、２ｍｇ／ｋｇの配列番号１９７、および３つの濃度（１．８０ｍｇ／ｋｇ、０．１８ｍｇ／ｋｇ、および０．０１５ｍｇ／ｋｇ）の配列番号１７２を、静脈内注射により投与した。リン酸デキサメタゾンナトリウム（眼１つ当たり２０μｇ）を、両眼における結膜下注射により投与した。ＬＰＳ注射の２４時間後、臨床スコア付けにより炎症応答を評定した。
【０２６０】
臨床眼炎症の強度を、各眼について０〜４のスケールでスコア付けした。
【０２６１】
グレード０  炎症なし
グレード１  虹彩および結膜における微弱な血管拡張
グレード２  虹彩および結膜におけるフレアを伴う中程度の血管拡張  
グレード３  虹彩および結膜におけるフレアを伴う強度の血管拡張
グレード４  強度の炎症性反応
（＋１）フィブリンの形成および瞳孔閉鎖  。
【０２６２】
ＬＰＳによる誘導の２４時間後、ビヒクルで処置されたラットの臨床スコアは、中央値を４（範囲：２〜５）として、３．６±０．２（平均±ＳＥＭ、ｎ＝２０）であった。誘導および配列番号１９７（２ｍｇ／ｋｇ）による静脈内処置の２４時間後には、眼炎症の重症度の有意な軽減（ｐ＜０．００１）が検出され（平均スコア：２．２±０．３、中央値：２）、ビヒクル群において観察されるスコアと比較した、ＥＩＵスコアの４０％の低下に対応した。また、ほぼ同じ用量（１．８０ｍｇ／ｋｇ）の配列番号１７２による静脈内処置も、眼炎症の重症度を有意に軽減し、４２％（平均スコア：２．１±０．３、中央値：２、ｐ＝０．００１）の軽減であった。低用量（０．１８および０．０１５ｍｇ／ｋｇ）でも、炎症は、それぞれ、３３％（平均スコア：２．４±０．３、中央値：２）および３６％（平均スコア：２．３±０．３、中央値：２）軽減された。軽減は、ｐ＜０．００１により有意であった。
【０２６３】
また、陽性対照薬として用いたデキサメタゾン（眼１つ当たり２０μｇ）による結膜下処置も、臨床スコアを有意に低減し、７９％（平均スコア：０．８±０．２、中央値：０．５、ｐ＜０．００１）の低減であった。
【０２６４】
これらの実験条件下では、配列番号１９７の２ｍｇ／ｋｇの単回の静脈内注射により、前房において観察される内毒素誘導炎症が部分的に防止されると明言することができる。これに対してまた、０．０１５、０．１８、１．８０ｍｇ／ｋｇで静脈内注射された配列番号１７２も、前房における内毒素誘導炎症を軽減した。
【０２６５】
実施例１１：ラットモデルにおいて慢性ＩＩ型コラーゲン関節炎が確立された１４日後にＪＮＫ阻害剤を静脈内投与した後の用量反応効果
ラットコラーゲン関節炎とは、前臨床研究下もしくは臨床研究下にあるか、または関節炎における治療剤として現在用いられている多数の抗関節炎剤に対する前臨床試験のために広く用いられている、多発性関節炎の実験モデルである。このモデルのホールマークは、頑健で容易に測定可能な多発性関節炎症、パンヌス形成と関連する顕著な軟骨破壊、ならびに軽度〜中程度の骨吸収および骨膜における骨増殖を、確実に発症および進行させることである。
【０２６６】
前記実験モデルでは、ラットにおいて確立されたＩＩ型コラーゲン関節炎において発生する炎症（足部の腫脹）、軟骨の破壊、および骨吸収を阻害するために、１４日間（関節炎ｄ１〜１４）にわたり毎日（ＱＤ）投与される、配列番号１７２によるＪＮＫ阻害剤の静脈内（ＩＶ）における有効性を決定した。
【０２６７】
０および６日目において、動物（関節炎について、１群当たり８匹）にイソフルランで麻酔をかけ、２ｍｇ／ｍＬのウシＩＩ型コラーゲン（Ｅｌａｓｔｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｏｗｅｎｓｖｉｌｌｅ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）を含有する３００μｌのフロイント不完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）を、尾の基部および背部の２つの部位に注射した。研究の１０日目（関節炎ｄ０）に関節炎を発症させ、ラットを処置群へと無作為化した。各群への無作為化は、少なくとも一方の後足において足首関節の腫脹が明らかに確立された後で行った。
【０２６８】
確立されたＩＩ型コラーゲン関節炎を伴う雌のＬｅｗｉｓラットを、関節炎の１〜１４日目において毎日（ＱＤ）、静脈内（ＩＶ）経路を介して、ビヒクル（ＮａＣｌ）、配列番号１７２（０．０１、０．１、１、または５ｍｇ／ｋｇ）、または基準化合物であるデキサメタゾン（Ｄｅｘ、０．０５ｍｇ／ｋｇ）で処置した。動物は、関節炎の１４日目に屠殺した。有効性の評定は、動物の体重、キャリパーによる毎日の足首の測定、曲線下面積（ＡＵＣ）として表される足首の直径、後足末端部の重量、ならびに選択された群の足首および膝についての組織病理学的評定に基づいた。
【０２６９】
関節のスコア付け：以下の基準に従い、炎症、パンヌス形成、および骨吸収について、コラーゲン関節炎性の足首および膝に０〜５のスコアを施す。
【０２７０】
膝および／または足首の炎症
０  正常
０．５  最小限の限局性炎症
１  滑膜／関節周囲組織における炎症細胞の最小限の浸潤
２  軽度の浸潤
３  中程度の浮腫を伴う中程度の浸潤
４  顕著な浮腫を伴う顕著な浸潤
５  重度の浮腫を伴う重度の浸潤  。
【０２７１】
足首のパンヌス
０  正常
０．５  軟骨および軟骨下骨における最小限の浸潤パンヌスが、辺縁帯だけを侵し、少数の関節だけを侵している
１  軟骨および軟骨下骨における最小限の浸潤パンヌスが、主に辺縁帯を侵している
２  軽度の浸潤（辺縁帯における脛骨または足根骨のうちの＜４分の１）
３  中程度の浸潤（辺縁帯における脛骨または小足根骨のうちの４分の１〜３分の１が侵されている）
４  顕著な浸潤（辺縁帯における脛骨または足根骨のうちの２分の１〜４分の３が侵されている）
５  重度の浸潤（辺縁帯における脛骨または足根骨のうちの＞４分の３が侵されており、全体的な構造が重度の変形を来している）。
【０２７２】
膝のパンヌス
０  正常
０．５  軟骨および軟骨下骨における最小限の浸潤パンヌスが、辺縁帯だけを侵し、少数の関節だけを侵している
１  軟骨および軟骨下骨における最小限の浸潤パンヌスであり、軟骨表面または軟骨下骨のうちの約１〜１０％が侵されている
２  軽度の浸潤（脛骨または大腿骨の表面領域または軟骨下領域のうちの最大で１／４にわたり広がる）であり、軟骨表面または軟骨下骨のうちの約１１〜２５％が侵されている
３  中程度の浸潤（＞１／４にわたり広がるが、脛骨または大腿骨の表面領域または軟骨下領域のうちの＜１／２である）であり、軟骨表面または軟骨下骨のうちの約２６〜５０％が侵されている
４  顕著な浸潤（脛骨表面または大腿骨表面のうちの２分の１〜４分の３にわたり広がる）であり、軟骨表面または軟骨下骨のうちの約５１〜７５％が侵されている
５  重度の浸潤であり、軟骨表面または軟骨下骨のうちの約７６〜１００％が侵されている。
【０２７３】
足首軟骨の損傷（小足根骨に重点を置く）
０  正常
０．５  トルイジンブルー染色の減殺は最小限であり、辺縁帯だけを侵し、少数の関節だけを侵している
１  最小限＝明らかな軟骨細胞の喪失またはコラーゲンの破壊を伴わない、トルイジンブルー染色の最小限〜軽度の減失
２  軽度＝軽度の限局性（表在性）の軟骨細胞の喪失および／またはコラーゲンの破壊を伴う、軽度のトルイジンブルー染色の減失
３  中程度＝中程度の多巣性（中程度の深部帯までの深さ）の軟骨細胞の喪失および／またはコラーゲンの破壊を伴う、中程度のトルイジンブルー染色の減失であり、小足根骨が１／２〜３／４の深さまで侵されているが、全層を喪失した領域は希少である
４  顕著＝顕著な多巣性（深部帯までの深さ）の軟骨細胞の喪失および／またはコラーゲンの破壊を伴う、顕著なトルイジンブルー染色の減失であり、１つまたは２つの小足根骨の表面において、軟骨の全層が喪失している
５  重度＝重度の多巣性（石灰化前線までの深さ）の軟骨細胞の喪失および／またはコラーゲンの破壊を伴う、重度のびまん性のトルイジンブルー染色の減失が、２つを超える軟骨表面を侵している。
【０２７４】
膝軟骨の損傷
０  正常
０．５  トルイジンブルー染色の減殺は最小限であり、辺縁帯だけを侵している
１  最小限＝明らかな軟骨細胞の喪失またはコラーゲンの破壊を伴わない、最小限〜軽度のトルイジンブルー染色の減失
２  軽度＝軽度の限局性（表在性）の軟骨細胞の喪失および／またはコラーゲンの破壊を伴う、軽度のトルイジンブルー染色の減失であり、軟骨が５０％の深さまで侵された小領域はほとんどない可能性がある
３  中程度＝中程度の多巣性〜びまん性（深部帯〜中程度の深部帯）の軟骨細胞の喪失および／またはコラーゲンの破壊を伴う、中程度のトルイジンブルー染色の減失であり、全層を喪失した１つ〜２つの小領域が、一表面の全幅員のうちの４分の１未満であり、かつ、全表面の全幅員のうちの２５％以下を侵している可能性がある
４  顕著＝顕著な多巣性〜びまん性（深部帯までの深さ）の軟骨細胞の喪失、ならびに／またはコラーゲンの破壊、もしくは１つの表面におけるほぼ完全な喪失および他の表面における部分的な喪失を伴う、顕著なトルイジンブルー染色の減失であり、完全な全体的喪失が、全表面のべ幅員で５０％未満である
５  重度＝大腿骨および／または脛骨の両方において重度の多巣性（石灰化前線までの深さ）の軟骨細胞の喪失および／またはコラーゲンの破壊を伴う、重度のびまん性のトルイジンブルー染色の減失であり、完全な全体的喪失が、全表面のべ幅員で５０％を超える。
【０２７５】
足首骨の吸収
０  正常
０．５  最小限の吸収が、辺縁帯だけを侵し、少数の関節だけを侵している
１  最小限＝低倍率では容易に明らかとならない小さな吸収領域であり、破骨細胞は希少である
２  軽度＝低倍率では容易に明らかとならないより多数の吸収領域であり、破骨細胞はより多数であり、辺縁帯における脛骨または足根骨のうちの＜４分の１が吸収されている
３  中程度＝皮質における全層欠損を伴わない骨髄小柱骨および骨髄皮質骨の明らかな吸収、一部の骨髄小柱の喪失、低倍率でも明らかな病変が見られ、破骨細胞はより多数であり、辺縁帯における脛骨または足根骨のうちの４分の１〜３分の１が侵されている
４  顕著＝残存する皮質表面のプロファイルの変形、顕著な骨髄骨の喪失、多数の破骨細胞を伴うことが多い皮質骨の全層欠損であり、辺縁帯における脛骨または足根骨のうちの２分の１〜４分の３が侵されている
５  重度＝残存する皮質表面のプロファイルの変形、顕著な骨髄骨の喪失、多数の破骨細胞を伴うことが多い皮質骨の全層欠損であり、辺縁帯における脛骨または足根骨のうちの＞４分の３が侵されており、全体的な構造が重度の変形を来している。
【０２７６】
膝骨の吸収
０  正常
０．５  最小限の吸収が、辺縁帯だけを侵している
１  最小限＝低倍率では容易に明らかとならない小さな吸収領域であり、軟骨下骨の全関節幅員のうちの約１〜１０％が侵されている
２  軽度＝より多数の吸収領域、軟骨下骨の限定的な喪失が見られ、軟骨下骨の全関節幅員のうちの約１１〜２５％が侵されている
３  中程度＝軟骨下骨の明らかな吸収が見られ、軟骨下骨の全関節幅員のうちの約２６〜５０％が侵されている
４  顕著＝軟骨下骨の明らかな吸収が見られ、軟骨下骨の全関節幅員のうちの約５１〜７５％が侵されている
５  重度＝破壊に起因する関節全体の変形が見られ、軟骨下骨の全関節幅員のうちの約７６〜１００％が侵されている
結果：
疾患対照群における疾患重症度は、１〜５日目において増大し、４〜５日目に１日当たりの増大が最大となった。次いで、増大の増分が小さくなり、７日目にピークに至った。この時点以降、急性腫脹は一般に減殺され、キャリパーによる  測定値も低下した。処置群も同様に、この全般的パターンに従った。
【０２７７】
全ての疾患群で、体重の減少が観察されたのに対し、正常対照群では、体重が増大した。５ｍｇ／ｋｇの配列番号１７２で処置されたラットでは、ビヒクルで処置された疾患対照と比較して、体重の減少が有意に（２５％、ＡＮＯＶＡによるｐ＜０．０５）阻害された。スチューデントのｔ検定を用いて疾患対照と比較したところ、体重の減少の阻害はまた、１ｍｇ／ｋｇの配列番号１７２で処置されたラット（２１％、ｐ＜０．０５）またはＤｅｘで処置されたラット（２１％、ｐ＜０．０５）についても有意であった。配列番号１７２による処置の結果は、このパラメータについて、用量応答的であった。
【０２７８】
５ｍｇ／ｋｇの配列番号１７２で処置されたラット（ｐ＜０．０５；４〜１２日目）またはＤｅｘで処置されたラット（ｐ＜０．０５；ｄ３〜１４）については、毎日の足首直径の測定値が、正常に向けて、疾患対照と比較して有意に（二元ＲＭ  ＡＮＯＶＡによるｐ＜０．０５）低減された。
【０２７９】
５ｍｇ／ｋｇの配列番号１７２で処置されたラット（４３％の低減）、１ｍｇ／ｋｇの配列番号１７２で処置されたラット（２７％）、またはＤｅｘで処置されたラット（９７％）では、足首直径のＡＵＣが、正常に向けて、疾患対照と比較して有意に（ＡＮＯＶＡによるｐ＜０．０５）低減された。配列番号１７２による処置の結果は、このパラメータについて、用量応答的であった。
【０２８０】
５ｍｇ／ｋｇの配列番号１７２で処置されたラット（２６％の低減）またはＤｅｘ（１１４％）では、最終的な足重量が、正常に向けて、疾患対照と比較して有意に（ＡＮＯＶＡによるｐ＜０．０５）低減された。配列番号１７２による処置の結果は、このパラメータについて、用量応答的であった。
【０２８１】
いずれの処置群におけるラットについても、相対肝臓重量は、疾患対照と比較して有意な（ＡＮＯＶＡによる）影響を受けなかった。
【０２８２】
Ｄｅｘで処置されたラットでは、体重に照らした脾臓重量が、疾患対照と比較して有意に（ＡＮＯＶＡによるｐ＜０．０５）低減された。Ｄｅｘで処置されたラットの相対脾臓重量はまた、正常対照と比較しても有意に低減された。配列番号１７２で処置されたラットでは、相対脾臓重量が、有意な影響を受けなかった。
【０２８３】
Ｄｅｘで処置されたラットでは、体重に照らした胸腺重量が、疾患対照と比較して有意に（ＡＮＯＶＡによるｐ＜０．０５）低減された。Ｄｅｘで処置されたラットの相対胸腺重量はまた、正常対照と比較しても有意に低減された。配列番号１７２で処置されたラットでは、相対胸腺重量が、有意な影響を受けなかった。
【０２８４】
５ｍｇ／ｋｇの配列番号１７２で処置されたラットでは、全ての足首の組織病理学パラメータが、正常に向けて、疾患対照と比較して有意に（マン−ホイットニーのＵ検定による）低減された（合計スコアの２５％の低減）。
【０２８５】
５ｍｇ／ｋｇの配列番号１７２で処置されたラットでは、全ての膝の組織病理学パラメータが、正常に向けて、疾患対照と比較して有意に（マン−ホイットニーのＵ検定による）低減された（合計スコアの７３％の低減）。
【０２８６】
本研究の結果は、配列番号１７２（５ｍｇ／ｋｇ）による毎日の静脈内処置が、ラットにおいて確立されたＩＩ型コラーゲン関節炎と関連する、臨床パラメータおよび組織病理学パラメータに対して有意に有益な効果を及ぼすことを示した。配列番号１７２（１ｍｇ／ｋｇ）による処置は、足首直径のＡＵＣを、結果として有意に低減した。足首直径に対する有益な効果は、疾患対照動物では７日目以後に腫脹が低減されたにもかかわらず、１２日目まで観察された。配列番号１７２による処置の結果は、用量応答的であった。
【０２８７】
配列番号１７２による処置は、デキサメタゾンと異なり、器官重量に対して有害作用を及ぼさなかった。
【０２８８】
実施例１２：スコポラミン誘導マウスドライアイモデルにおける３つの用量による、配列番号１９７のａｌｌ−Ｄ−レトロインベルソＪＮＫ阻害剤（ポリ）ペプチドおよび配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤（ポリ）ペプチドの効果
研究概念
本研究の目的は、２つの異なる化合物である配列番号１９７のａｌｌ−Ｄ−レトロインベルソＪＮＫ阻害剤（ポリ）ペプチドおよび配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤（ポリ）ペプチドの効果を、スコポラミン誘導ドライアイのマウスモデルにおける３つの用量レベルで評価することであった。
【０２８９】
配列番号１９７のペプチドおよび配列番号１７２のペプチドを、このドライアイのマウスモデルにおける有効性について調べた。ペプチドは、両方とも低用量、中程度用量、および高用量で調べた。配列番号１９７のペプチドの低用量レベル、中程度用量レベル、および高用量レベルについて、処方物試料中で測定された濃度は、それぞれ、０．０６％（ｗ／ｖ）、０．２５％（ｗ／ｖ）、および０．６％（ｗ／ｖ）であり、配列番号１７２のペプチドの低用量レベル、中程度用量レベル、および高用量レベルについて、処方物試料中で測定された濃度は、それぞれ、０．０５％（ｗ／ｖ）、０．２％（ｗ／ｖ）、および０．６％（ｗ／ｖ）であった。陰性対照としてもまた用いられるビヒクルは、０．９％のＵＳＰグレード注射用塩化ナトリウムであった。
【０２９０】
本研究は、各群マウス１２匹ずつの８群と、マウス４匹のさらなる群とを含む、合計９群の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスからなった。臭化水素酸スコポラミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）注射（皮下（ＳＣ）、１日４回、投薬１回当たり０．５ｍｇ、０〜２１日目）と、定常的な気流による乾燥環境へのマウスの曝露との組合せにより、両眼の短期ドライアイを誘導した。１日目に開始して、群１〜８のマウスを、１日３回（ＴＩＤ）ずつ２１日間にわたり、ビヒクル（０．９％の滅菌食塩水；陰性対照薬）、配列番号１９７のペプチド（０．０６％、０．２５％、および０．６％）、配列番号１７２のペプチド（０．０５％、０．２％、および０．６％）、またはシクロスポリン（０．０５％；免疫系の活性を低減するのに用いられる免疫抑制薬としての陽性対照）の両眼（ｂｉｌａｔｅｒａｌ  ｏｃｕｌａｒ（ｏｃｕｌｕｓ  ｕｔｅｒｑｕｅ；ＯＵ））外用（ｔｏｐｉｃａｌ）投与（投薬１回当たり眼１つ当たり５μｌ）により処置した。群９のマウスは、非誘導の（ドライアイを来さない）非処置対照として維持した。
【０２９１】
存命（処置）期間中は、臨床的観察を１日１回記録し、角膜フルオレセイン染色、涙液層破壊時間試験（ＴＢＵＴ）、およびフェノールレッド綿糸検査（ＰＲＴＴ）を伴う細隙灯顕微鏡検査（ＳＬＥ）を毎週３回実施した。２２日目に剖検を実施し、眼、眼瞼、結膜、および涙腺を、各動物の両眼から採取した。右眼（ｒｉｇｈｔ  ｅｙｅｓ（ｏｃｕｌｕｓ  ｄｅｘｔｅｒ、ＯＤ））に由来する組織を固定し、次いで、顕微鏡により評定した。左眼（ｌｅｆｔ  ｅｙｅｓ（ｏｃｕｌｕｓ  ｓｉｎｉｓｔｅｒ；ＯＳ））に由来する組織を、液体窒素中で瞬時凍結させ、その後の可能な解析のために−８０℃で凍結保存した。
【０２９２】
【表５】
2015502372.tif 000012
【０２９３】
方法
１．投薬のための調製
配列番号１９７の（ポリ）ペプチドは、３００．６５ｍｇの乾燥粉末を含有する１．５ｍＬの透明プラスチック製微量遠心用バイアルとして、Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｆｒａｎｃｅ）から得た。
【０２９４】
配列番号１７２の（ポリ）ペプチドは、３０２．７ｍｇの乾燥粉末を含有する１．５ｍＬの透明プラスチック製微量遠心用バイアルとして、Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｆｒａｎｃｅ）から得た。
【０２９５】
研究を開始する前に、配列番号１７２の（ポリ）ペプチドおよび配列番号１９７の（ポリ）ペプチドを、滅菌食塩水（ビヒクル）中で調合した。各濃度の投薬用溶液を、０．２μｍのフィルターを用いて滅菌し、複数のあらかじめラベル付けされたバイアルへとアリコート分割し、−２０℃で凍結させた。配列番号１９７のペプチドについて、処方物試料中で測定された濃度は、０．０６％、０．２５％、および０．６％へと四捨五入される０．０５８％、０．２５％、および０．６２４％であった。配列番号１７２のペプチドについて、処方物試料中で測定された濃度は、０．０５、０．２％、および０．６％へと四捨五入される０．０５３％、０．２１７％、および０．５６２％であった。
【０２９６】
投薬の各日において、１セットの投薬用溶液を融解させ、その日の投薬の実施のために用いた。対照（ビヒクル；シクロスポリン）は、投薬準備ができた状態で用意され、投薬のための調製は不要であった。
【０２９７】
２．細隙灯顕微鏡検査（ＳＬＥ）
研究への登録の前に、各動物には、ＳＬＥおよび外用適用されたフルオレセインを用いる間接的眼検査を施した。ドレイズ眼評価スケールを用いて、眼についての所見を記録した。ＳＬＥおよびドレイズ評価は、存命期間中毎週３回繰り返した。
【０２９８】
３．涙液層破壊時間（ＴＢＵＴ）試験およびその後の角膜検査
ＴＢＵＴ試験は、角膜へのフルオレセインの適用後における完全な瞬きと、涙液層における最初のランダムな乾燥スポットの出現との間の経過時間を秒単位で測定することにより、毎週３回実行した。ＴＢＵＴを実施するために、０．１％の液体フルオレセインナトリウムを結膜嚢へと滴下し、眼瞼を手指で３回にわたり閉止し、次いで、眼瞼を開放させたまま保持し、連続的なフルオレセイン含有涙液層が角膜を覆うことを明らかにし、涙液層が破壊される（乾燥スポットまたは乾燥ストリークが出現する）のに要する時間（秒単位の）を記録した。少なくとも９０秒後、０．１％のフルオレセインのさらなる滴下を角膜へと再適用した後で、角膜上皮の損傷を、コバルトブルーフィルターを伴う細隙灯を用いてグレード付けし、次いで、ドレイズ眼スケールに従い、角膜をスコア付けした。
【０２９９】
４．フェノールレッド綿糸涙液試験（ＰＲＴＴ）
涙液の産生は、ＰＲＴＴ検査ストリップ（Ｚｏｎｅ−Ｑｕｉｃｋ；日本、名古屋、株式会社メニコン）を用いて、両眼において毎週３回測定した。１日の１回目の処置の前に、細隙灯生体顕微鏡法下で３０秒間にわたり、糸を、各眼の結膜円蓋の外眼角へと適用した。涙液の糸に沿った移動（すなわち、湿潤した綿糸の長さ）を、ミリメートル単位の定規を用いて測定した。
【０３００】
５．剖検および病理学的解析
２２日目の剖検では、眼球、涙腺、眼瞼、および結膜を含めた、各動物に由来する両眼を摘出した。右眼および関連組織を、一晩にわたり改変ダビッドソン液中に浸漬することにより固定した後、１０％の中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）へと移した。固定された右眼の組織を脱水し、パラフィン中に包埋し、３〜５μｍの厚さで切片化し、スライドガラス処理された組織を、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。染色されたスライドガラスを、光学顕微鏡法により評定した。各右眼について少なくとも２つの切片レベルを組織病理学的に検討して、眼の全ての部分に対する詳細で完全な組織病理学的評価を実行した。角膜、結膜および角膜の上皮（杯細胞を含めた）のほか、涙腺に対して特別の注意を払った。これらの組織は、傷害について、０を正常とし、１を最小限の傷害とし、２を軽度の傷害とし、３を中等度の傷害とし、４を重度の傷害とする０〜４のスケールに基づきスコア付けした。各角膜についてのスコアは、角膜上皮の厚さおよび角膜炎症に基づいた。結膜は、浸食および炎症のほか、杯細胞の存在または非存在についてスコア付けした。
【０３０１】
結果
１日４回のスコポラミンのＳＣ投与（投薬１回当たり０．５ｍｇ）により、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、眼を効果的に潤滑化および保護することが可能な、安定的な涙液層を維持する能力を低下させる、水性涙液産生容量の減少および涙液の生理化学的特性の変化によって特徴付けられる眼乾燥症候群を誘導した。
【０３０２】
１．涙液層破壊時間（ＴＢＵＴ）試験および角膜検査
ドライアイを誘導する前に、涙液層破壊時間試験（ＴＢＵＴ）を実施し、ドライアイの誘導後２、４、７、９、１１、１４、１６、１８、および２１日目にもまた実施した。スコポラミンの投薬開始（ドライアイの誘導）後、全ての動物において、ＴＢＵＴの平均値が減少し始めたが、群６（中程度用量の配列番号１７２）では、減少が緩徐であると考えられた。群５、６、７（低用量、中程度用量、および高用量の配列番号１７２のペプチド）、および群８（シクロスポリン）では、ＴＢＵＴの平均の最低値が７日目に生じ、同様の値（それぞれ、６．６±０．４、６．７±０．４、６．７±０．３、および６．４±０．４秒間）に到達した。その後、これらの群のＴＢＵＴの平均は増大して、９日目にピークに至った。群６および７（配列番号１７２の中程度用量群および高用量群）におけるＴＢＵＴの平均が、群８、シクロスポリン群（８．５±０．３秒間）より高い値（それぞれ、１０．０±０．７秒間および９．９±０．８秒間）へと上昇したのに対し、低用量の配列番号１７２である群５のＴＢＵＴの平均のピーク（８．０±０．４秒間）は、群８（シクロスポリン）のＴＢＵＴの平均のピークをわずかに下回った。群３および４の、中程度用量および高用量の配列番号１９７で処置された動物のＴＢＵＴの平均が、投薬の開始後に低下し続けて、９日目には最低値に達したのに対し、低用量の群２では９日目に増大した。低用量、中程度用量、および高用量の配列番号１７２で処置された動物（それぞれ、群２、３、および４）のＴＢＵＴの平均は、ビヒクル群を上回ったが、低用量、中程度用量、および高用量の配列番号１７２で処置された動物の群の平均を一般に下回った。
【０３０３】
７日目〜２１日目におけるＴＢＵＴ値の曲線下面積（ＡＵＣ）を用いて、多様な処置を、ビヒクル対照、中程度用量、低用量、および高用量（それぞれ、０．０５％、０．２％、および０．６％）の配列番号１７２のペプチドによる処置である群５、６、および７のほか、シクロスポリン（０．０５％）で処置された動物である群８と比較したところ、ＴＢＵＴ  ＡＵＣの有意な（クルスカル−ワリスのノンパラメトリックＡＮＯＶＡ）増大が示された。配列番号１７２のペプチドは、ＴＢＵＴの用量依存的な増大をもたらし、中程度用量と高用量とでは同様の効果をもたらすことが多いと考えられた。さらに、シクロスポリン処置群と、３つの用量レベルの配列番号１７２で処置された群と、非誘導群（群５、６、７、８、および９）との間では、ＴＢＵＴ  ＡＵＣに有意差が見られなかった。この知見は、配列番号１７２のペプチドの３つの用量全てとシクロスポリンとが、このドライアイモデルにおけるＴＢＵＴ変化の根底をなす眼科的変化の改善または逆転においてほぼ同等に有効であったことを示唆する。
【０３０４】
低用量レベル、中程度用量レベル、および高用量レベルの配列番号１９７のペプチドで処置された群（群２〜４）は一般に、ＴＢＵＴのわずかな用量依存的増大を示したが、この増大は、配列番号１７２またはシクロスポリンで処置された動物よりも約２日遅く始まった。
【０３０５】
【表６】
2015502372.tif 000013
【０３０６】
２．フェノールレッド綿糸涙液試験（ＰＲＴＴ）
ドライアイを誘導する前に、ＰＲＴＴ試験を実施し、２、４、７、９、１１、１４、１６、１８、および２１日目にもまた実施した。０日目〜４日目のＰＲＴＴ値が、ドライアイを誘導された全てのマウスにおいて減少したことから、スコポラミンの投与および送風機により作り出される、気流を増大させた乾燥環境への曝露後における涙液産生の減少が示された。大半の群におけるＰＲＴＴの最低値は、ほぼ７日目に生じた。ビヒクル対照群（群１）では、ＰＲＴＴが減少を続け、１４日目に最低値に達した。全てのドライアイ群では、最低値の後で、増大が見られた。これらの所見は、スコポラミンによる処置の開始が、化合物による処置の開始より１日早ければ、眼乾燥症候群と関連する眼の生理学的変化を誘発するのに十分であったことを示す。シクロスポリン処置群でもなお、約７日目までは他の群と同様のＰＲＴＴの減少を示し、次いで、１１〜１４日目においてピークへと増大した後、わずかに減少した。最後のＰＲＴＴ試験（２１日目）では、シクロスポリン（群８）、ならびに群６および７の全てが、同様のＰＲＴＴ値を示したことから、中程度用量および高用量の両方の配列番号１７２のペプチドによる処置が、このマウスドライアイモデルにおける涙液産生の増大において、シクロスポリンと同様の治療効果を及ぼすことが示唆される。
【０３０７】
低用量、中程度用量、および高用量の配列番号１７２のペプチドで処置された動物は、ビヒクルで処置された動物と比較して、著明により多くの涙液を産生した。したがって、配列番号１７２のペプチドは一般に、このモデルにおいてもＴＢＵＴと同様に、用量に関連する涙液産生の有意な増大をもたらした。
【０３０８】
低用量レベル、中程度用量レベル、および高用量レベル（０．０６％、０．２５％、および０．６％；それぞれ、群２、３、および４）の配列番号１９７のペプチドで処置された群は一般に、ＰＲＴＴの用量依存的増大を示した。
【０３０９】
【表７】
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【０３１０】
３．組織病理学的解析
本研究では、組織学的変化が一般に、角膜に限定された。角膜における所見は、角膜上皮表面の角質化の増大、角膜上皮の厚さの増大、角膜上皮の細胞充実度の増大、上皮細胞回転の増大と符合する、上皮基底層の有糸分裂発生の微弱な増大からなった。これらの所見は、角膜の乾燥および角膜表面の刺激に対する生理学的適応応答を示唆する。本研究では、表面の潰瘍化、角膜間質の浮腫、および角膜への炎症性浸潤物が見られなかった。非処置群（正常マウス、スコポラミンによる処置を伴わない）である群９における眼は、正常限界内にあった。眼瞼の何らかの最小限の非化膿性炎症が、全ての群にわたり散見されたが、結膜、網膜、涙腺、および眼の他の部分は、正常限界内にあった。杯細胞は、全ての群において、限界内にあると考えられた。杯細胞とは、涙液がより強力でより付着性の涙液層を形成する一助となるムチンの主要な産生細胞である。
【０３１１】
軽度〜中程度の角膜変化が、非処置正常眼群（群９）を除く全ての群において注意され、ビヒクル処置群である群１、および低用量の配列番号１９７のペプチドである群２では、他の処置群と比較して僅かにより重度であった。これらの所見は、涙液産生増大の角膜に対する肯定的で有益な効果と符合した。
【０３１２】
多様な処置群の組織学的スコアを、シクロスポリン群における組織学的スコアと比較して、他の任意の処置も、シクロスポリンと「同様のスコアの低減」をもたらすのかどうかを決定したところ、群４、６、および７は、シクロスポリン群のスコアと著明には異ならないことが見出された。したがって、これらの３つの処置である中程度用量および高用量の配列番号１７２のペプチドならびに高用量の配列番号１９７のペプチドは、シクロスポリンに次いで、このマウスドライアイモデルと関連する角膜変化を軽減／改善するのに最も有効であった。
【図１４】
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【図２７】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図３ｆ】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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