(57)【要約】  本発明は、ＴＳＬＰアンタゴニストによる処置のバイオマーカーとしてのＩＬ−１９の使用に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
必要がある被検体においてアレルギー性疾患を処置する方法であって、
前記被検体由来のサンプルにおけるＩＬ−１９の発現を測定する工程、および、前記サンプル中のＩＬ−１９レベルが対照よりも高かった場合、前記被検体に治療有効量のＴＳＬＰアンタゴニストを投与する工程を含む、方法。
【請求項２】
被検体をＴＳＬＰアンタゴニストによって処置するための方法であって、
（ａ）ＴＳＬＰアンタゴニストの用量の投与の前に前記被検体から第１生物学的サンプルを得る工程；
（ｂ）基線生物学的サンプルにおけるＩＬ−１９の発現を測定する工程；
（ｃ）前記被検体にＴＳＬＰアンタゴニストを投与する工程；
（ｄ）前記被検体から第２生物学的サンプルを得る工程；
（ｅ）前記第２サンプルにおけるＩＬ−１９の発現を測定する工程；
（ｆ）前記第２生物学的サンプルにおけるＩＬ−１９の発現を前記第１生物学的サンプルにおけるＩＬ−１９の発現のレベルと比較し、ここで、前記第２生物学的サンプルにおいてＩＬ−１９レベルが第１生物学的サンプルと比較して低下している場合、前記被検体に治療有効量のＴＳＬＰアンタゴニストを投与する工程
を含む、方法。
【請求項３】
被検体をＴＳＬＰアンタゴニストによる処置のために選択する方法であって、
前記被検体由来のサンプルにおけるＩＬ−１９の発現を測定する工程、および、前記サンプル中のＩＬ−１９レベルが対照のレベルよりも高かった場合、前記被検体に治療有効量のＴＳＬＰアンタゴニストを投与する工程を含む、方法。
【請求項４】
ＴＳＬＰアンタゴニストによる被検体の処置の進行をモニタリングするための方法であって、
（ａ）前記被検体由来のサンプルにおけるＩＬ−１９の発現を測定する工程、および、前記サンプル中のＩＬ−１９レベルが対照のレベルよりも高かった場合、前記被検体に治療有効量のＴＳＬＰアンタゴニストを投与する工程を含む、方法。
【請求項５】
前記ＴＳＬＰアンタゴニストは、抗ＴＳＬＰ抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記被検体は、アレルギー性疾患を罹患するヒト被検体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記アレルギー性疾患は、アトピー性皮膚炎である、請求項６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記アレルギー性疾患は、喘息である、請求項６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記サンプルは、組織サンプルである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記サンプルは、皮膚生検である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記サンプルは、血液サンプルである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記サンプルは、血清である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記サンプルは、痰である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ＩＬ−１９の発現は、遺伝子発現分析またはイムノアッセイによって決定される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ＩＬ−１９の発現は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウェスタンブロット、発光イムノアッセイ、蛍光イムノアッセイからなる群より選択されるイムノアッセイによって決定される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ＩＬ−１９の発現は、ノーザンブロッティング、ＰＣＲベース、ＳＡＧＥ、フローサイトメトリベース、およびＤＮＡマイクロアレイからなる群より選択される遺伝子発現分析によって決定される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記対照は、アレルギー性疾患を罹患していない被検体由来のサンプルからの１つ以上のサンプルである、いずれかの請求項１〜４に記載の方法。
【請求項１８】
前記対照は、アレルギー性疾患を罹患しておらず、ＴＳＬＰアンタゴニストによって処置されていない被検体由来のサンプルからの１つ以上のサンプルである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＳＬＰアンタゴニストによる処置のバイオマーカーとしてのＩＬ−１９の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＳＬＰは、プロアロジェニックな（ｐｒｏａｌｌｏｇｅｎｉｃ）表現型を有する樹状細胞媒介型ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘導する免疫サイトカインである。ＴＳＬＰによって活性化された樹状細胞は、無感作Ｔ細胞を、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３を産生するＴｈ２細胞に指向させる、アレルギー促進性（ｐｒｏａｌｌｅｒｇｅｎｉｃ）のサイトカイン、ケモカインおよび同時刺激分子の産生によるアレルギー性炎症性Ｔｈ２の誘導および維持において重要な役割を果たす。アトピー性皮膚炎（ＡｔＤ）、ネザートン症候群および喘息におけるＴＳＬＰの過剰発現は、これらのアレルギー性炎症疾患の病因におけるこのサイトカインの重要な役割を示す。アレルギー性疾患の処置のためのＴＳＬＰアンタゴニストの使用は、臨床的検討中である。ＴＳＬＰアンタゴニストによる処置の効能のモニタリングのための方法についての需要が、存在する。このような方法は、好ましくは、被検体の疾患状態および／またはＴＳＬＰアンタゴニストによる処置に対する応答の客観的決定を可能にする。
【０００３】
「バイオマーカー」は、特定の状態の存在、進行または首尾よい処置を反映する、客観的に測定される指示薬である。バイオマーカーは、薬物開発において長く使用されており、新規な効果のあるバイオマーカーの発見および評価は、予測的な疾患モデルを改善し、薬物開発に関連する時間および費用を削減し、そして実験薬物から臨床治療薬へ変換することの成功率を上げることが期待される。さらに、バイオマーカーは、疾患発症、疾患状態における変化ならびに疾患制御における行動変容および治療薬の有効性の初期検出において価値がある。
【０００４】
ＩＬ−１９は、サイトカインのＩＬ−１０ファミリーに属し、このファミリーはまた、ＩＬ２０、ＭＤＡ７およびＩＬ２２も含む。ＩＬ１０をプローブとして用いてＥＳＴデータベースを検索し、その後、エプスタイン・バーウイルス形質転換Ｂ細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、Ｇａｌｌａｇｈｅｒらは、ＩＬ１９をコードするｃＤＮＡを入手した。Ｇａｌｌａｇｈｅｒら、Ｇｅｎｅｓ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １：４４２−４５０、（２０００年）。米国特許第７，０５６，６８１号も参照されたい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第７，０５６，６８１号明細書−
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｇａｌｌａｇｈｅｒら、Ｇｅｎｅｓ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １：４４２−４５０、（２０００年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、そのレベルがＴＳＬＰアンタゴニストによる処置に対する応答を反映するバイオマーカーとしてＩＬ−１９の使用を提供することにより、当分野におけるこれらの需要を満たす。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
１つの実施形態において、本発明は、治療剤によるＴＳＬＰ遮断（すなわち、標的会合）をモニタリングする方法に関する。このような方法は、臨床試験における使用ならびに規制上の承認後の診療所における使用を見出し得る。この治療剤は、ＴＳＬＰのアンタゴニストであっても、またはＴＳＬＰレセプターのアンタゴニストであっても（例えば、抗ＴＳＬＰアンタゴニスト抗体であってもまたは抗ＴＳＬＰＲアンタゴニスト抗体であっても）よい。臨床試験において、ＴＳＬＰ遮断のモニタリングは、治療効果を達成するための何らかの欠陥が観察される場合、これは、治療効果に影響を及ぼす標的経路において干渉できないことではなく、ＴＳＬＰ経路に会合することができないことによって起こるか否かを決定する際に有効である。診療所において、ＴＳＬＰ遮断の検証は、治療剤が活性であるか否か、例えば、薬物が、例えば明らかな効果または軽減の徴候を示さない被検体において、その所望の生物学的活性を保持するか否かを決定する際に有用である。
【０００９】
１つの実施形態において、本発明は、ＴＳＬＰアンタゴニストによって処置された哺乳動物被検体におけるＴＳＬＰ遮断をモニタリングするための方法を提供し、この方法は：上記被検体由来のサンプルにおけるＩＬ−１９の発現を測定する工程を含み；ここで、対照と比較して低下したＩＬ−１９の発現は、上記被検体におけるＴＳＬＰ遮断および上記被検体のＴＳＬＰアンタゴニストによる処置に対する好適性の指標であるか；または、対照と比較して変化が無いかまたはより高いＩＬ−１９の発現は、上記被検体においてＴＳＬＰアンタゴニストに対する応答におけるＴＳＬＰ遮断の欠如、および上記被検体のＴＳＬＰアンタゴニストによる処置に対する好適性の欠如の指標である。
【００１０】
１つの実施形態において、本発明は、ＴＳＬＰアンタゴニストによって処置された哺乳動物被検体においてＴＳＬＰ遮断をモニタリングするための方法を提供し、上記方法は：（ａ）上記被検体由来のサンプルにおけるＩＬ−１９の発現を測定する工程；および（ｂ）工程（ａ）のＩＬ−１９の発現を対照と比較する工程を含み、ここで、対照と比較して低下したＩＬ−１９の発現は、上記被検体におけるＴＳＬＰ遮断および上記被検体のＴＳＬＰアンタゴニストによる処置に対する好適性の指標であるか；または、対照と比較して変化が無いかまたはより高いＩＬ−１９の発現は、上記被検体においてＴＳＬＰアンタゴニストに対する応答におけるＴＳＬＰ遮断の欠如、および上記被検体のＴＳＬＰアンタゴニストによる処置に対する好適性の欠如の指標である。
【００１１】
別の実施形態において、本発明は、ＴＳＬＰアンタゴニストによって処置された哺乳動物被検体においてＴＳＬＰ遮断をモニタリングするための方法を提供し、上記方法は：（ａ）ＴＳＬＰアンタゴニストの用量の投与の前に上記被検体から基線生物学的サンプルを得る工程；（ｂ）上記基線生物学的サンプルにおけるＩＬ−１９の発現を測定する工程；（ｃ）上記被検体がＴＳＬＰアンタゴニストを投与された後に、上記被検体から少なくとも１つの後続の生物学的サンプルを得る工程；（ｄ）上記後続のサンプルにおけるＩＬ−１９の発現を測定する工程；（ｅ）上記後続の生物学的サンプルにおけるＩＬ−１９の発現を上記基線生物学的サンプルにおけるＩＬ−１９の発現のレベルと比較する工程を含み、ここで、上記後続の生物学的サンプルにおける低下したＩＬ−１９の発現は、ＴＳＬＰ遮断を示す。
【００１２】
別の実施形態において、本発明は、ＴＳＬＰアンタゴニストによって処置された哺乳動物被検体においてＴＳＬＰ遮断をモニタリングするための方法を提供し、上記方法は：（ａ）ＴＳＬＰアンタゴニストの用量の投与の前に上記被検体から基線生物学的サンプルを得る工程；（ｂ）上記基線生物学的サンプルにおけるＩＬ−１９の発現を測定する工程；（ｃ）上記被検体にＴＳＬＰアンタゴニストを投与する工程；（ｄ）上記被検体から少なくとも１つの後続の生物学的サンプルを得る工程；（ｅ）上記後続のサンプルにおけるＩＬ−１９の発現を測定する工程；（ｆ）上記後続の生物学的サンプルにおけるＩＬ−１９の発現を上記基線生物学的サンプルにおけるＩＬ−１９の発現のレベルと比較する工程を含み、ここで、上記後続の生物学的サンプルにおける低下したＩＬ−１９の発現は、ＴＳＬＰ遮断を示す。
【００１３】
本発明の別の態様において、ＩＬ−１９は、ＴＳＬＰアンタゴニストによる処置を受けている被検体において疾患進行を追跡するために使用される。この疾患は、アレルギー性疾患、例えば喘息またはアトピー性皮膚炎であってもよい。用量、投薬頻度（間隔）または他の治療パラメータは、患者が満足な結果を達成することを確実にするために、ＩＬ−１９の発現に少なくとも部分的に基づいて変更され得る。このような方法は、患者による徴候の主観的評価よりもむしろ、客観的に、研究室試験の結果に基づく。患者は、例えば、臨床試験の被検体であってもよく、または、認可された処置を受ける患者であってもよい。
【００１４】
本発明は、ＴＳＬＰアンタゴニストによって処置された被検体由来のサンプルにおけるＩＬ−１９の発現レベルを検出するための方法を含み、上記方法は：被検体由来のサンプルにおけるＩＬ−１９の発現を測定する工程を含み；ここで、対照と比較して低下したＩＬ−１９の発現は、患者における有益応答の存在の指標であるか；または、対照と比較して変化が無いかまたはより高いＩＬ−１９の発現は、患者における有益応答の非存在の指標である。
【００１５】
本発明はまた、ＴＳＬＰアンタゴニストによって処置された被検体におけるＴＳＬＰ遮断をモニタリングするための方法を含み、上記方法は：上記被検体由来のサンプルにおけるＩＬ−１９の発現を測定する工程を含み；ここで、対照と比較して低下したＩＬ−１９の発現は、上記被検体におけるＴＳＬＰ遮断の指標であるか；または、対照と比較して変化が無いかまたはより高いＩＬ−１９の発現は、上記被検体におけるＴＳＬＰアンタゴニストに対する応答におけるＴＳＬＰ遮断の欠如の指標である。
【００１６】
１つの実施形態において、本発明は、ＴＳＬＰアンタゴニストの投与後の被検体における有益応答の有無を検出するための方法を提供し、上記方法は：（ａ）上記被検体由来のサンプルにおけるＩＬ−１９の発現を測定する工程；および（ｂ）工程（ａ）のＩＬ−１９の発現を対照と比較する工程を含み、ここで、対照と比較して低下したＩＬ−１９の発現は、患者における有益応答の存在の指標であるか；または、対照と比較して変化が無いかまたはより高いＩＬ−１９の発現は、患者における有益応答の非存在の指標である。
【００１７】
別の実施形態において、本発明は、必要とする哺乳動物被検体においてアレルギー性疾患を処置する方法を提供し、上記方法は、第１の時点でアレルギー性疾患を罹患する被検体におけるＩＬ−１９の発現を測定する工程、ＴＳＬＰアンタゴニストを投与する工程、第２の時点でＩＬ−１９の発現を再測定する工程、上記第１および第２の時点の結果を比較する工程、ならびに、上記比較に基づいて処置レジメンを変更する工程を含む。１つの実施形態において、上記第１の時点は、ＴＳＬＰアンタゴニストの投与の前であり、上記第２の時点は、ＴＳＬＰアンタゴニストの上記投与の後である。１つの実施形態において、上記第１の時点は、上記被検体への最初のＴＳＬＰアンタゴニストの投与の前である。１つの実施形態において、用量（任意の１回の投与において投与されるＴＳＬＰアンタゴニスト剤の量として定義される）は、上記比較に応じて増やされるかまたは減らされる。別の実施形態において、投薬間隔（連続する投与の間の時間として定義される）は、処置の全中止を含めて、上記比較に応じて増やされるかまたは減らされる。投薬間隔は、投薬頻度と反比例する。１つの実施形態において、上記アレルギー性疾患は、アトピー性皮膚炎である。別の実施形態において、上記アレルギー性疾患は、喘息である。
【００１８】
本発明はまた、必要がある哺乳動物被検体においてアレルギー性疾患を処置する方法を含み、上記方法は以下の工程：（ａ）上記被検体に有効量のＴＳＬＰアンタゴニストを投与する工程；（ｂ）ＩＬ−１９の発現を対照と比較する工程；および（ｃ）そして、サンプル中のＩＬ−１９レベルが対照よりも高かった場合、上記被検体に治療有効量のＴＳＬＰアンタゴニストを投与する工程を含む。１つの実施形態において、上記アレルギー性疾患は、アトピー性皮膚炎である。別の実施形態において、上記アレルギー性疾患は、喘息である。
【００１９】
本発明はまた、アレルギー性疾患を処置する方法を含み、上記方法は、以下の工程：必要がある被検体に有効量のＴＳＬＰアンタゴニストを投与する工程を含み；ここで、上記被検体は、ＴＳＬＰアンタゴニストの投与前に、ＩＬ−１９の発現について試験されており；ここで、対照に対するＩＬ−１９の発現レベルが、ＴＳＬＰアンタゴニストによる処置を継続するべきか、中止するべきか、または変更するべきかの決定を導く。１つの実施形態において、上記アレルギー性疾患は、アトピー性皮膚炎である。別の実施形態において、上記アレルギー性疾患は、喘息である。
【００２０】
１つの実施形態において、本発明は、必要がある被検体においてアレルギー性疾患を処置する方法を提供し、上記方法は、以下の工程：（ａ）有効量のＴＳＬＰアンタゴニストを投与する工程；（ｂ）上記被検体由来のサンプルにおけるＩＬ−１９の発現を測定する工程；および（ｃ）工程（ｂ）のＩＬ−１９の発現を対照と比較する工程；そして、上記サンプル中のＩＬ−１９レベルが対照よりも高かった場合、上記被検体に治療有効量のＴＳＬＰアンタゴニストを投与する工程を含む。１つの実施形態において、上記アレルギー性疾患は、アトピー性皮膚炎である。別の実施形態において、上記アレルギー性疾患は、喘息である。
【００２１】
１つの実施形態において、本発明は、必要がある被検体においてアレルギー性疾患を処置する方法を提供し、上記方法は、以下の工程：上記被検体由来のサンプルにおけるＩＬ−１９の発現を測定する工程、および、上記サンプル中のＩＬ−１９レベルが対照よりも高かった場合、上記被検体に治療有効量のＴＳＬＰアンタゴニストを投与する工程を含む。１つの実施形態において、上記アレルギー性疾患は、アトピー性皮膚炎である。別の実施形態において、上記アレルギー性疾患は、喘息である。
【００２２】
本発明はまた、被検体をＴＳＬＰアンタゴニストによって処置するための方法を含み、上記方法は：（ａ）ＴＳＬＰアンタゴニストの用量の投与の前に上記被検体から第１生物学的サンプルを得る工程；（ｂ）基線生物学的サンプルにおけるＩＬ−１９の発現を測定する工程；（ｃ）上記被検体にＴＳＬＰアンタゴニストを投与する工程；（ｄ）上記被検体から第２生物学的サンプルを得る工程；（ｅ）上記第２サンプルにおけるＩＬ−１９の発現を測定する工程；（ｆ）上記第２生物学的サンプルにおけるＩＬ−１９の発現を上記第１生物学的サンプルにおけるＩＬ−１９の発現のレベルと比較し、ここで、上記第２生物学的サンプルにおいてＩＬ−１９の発現が第１生物学的サンプルと比較して低下している場合、上記被検体に治療有効量のＴＳＬＰアンタゴニストを投与する工程を含む。
【００２３】
別の態様において、本発明は、被検体、例えばアレルギー性疾患患者を、ＴＳＬＰアンタゴニストによる処置のために選択する方法に関する。１つの実施形態において、本発明は、被検体をＴＳＬＰアンタゴニストによる処置のために選択する方法を含み、上記方法は：（ａ）上記被検体由来のサンプルにおけるＩＬ−１９の発現を測定する工程、および、上記サンプル中のＩＬ−１９レベルが対照のレベルよりも高かった場合、上記被検体に治療有効量のＴＳＬＰアンタゴニストを投与する工程を含む。１つの実施形態において、上記被験体は、アレルギー性疾患を有する。１つの実施形態において、アレルギー性疾患は、アトピー性皮膚炎である。別の実施形態において、上記アレルギー性疾患は、喘息である。
【００２４】
別の実施形態において、本発明は、被検体をＴＳＬＰアンタゴニストによる処置のために選択する方法を含み、上記方法は：（ａ）上記被検体由来のサンプルにおけるＩＬ−１９の発現を測定する工程；および（ｂ）被検体がＴＳＬＰアンタゴニストによって処置されるべきか否かを決定する工程を含む。１つの実施形態において、上記被検体は、喘息を有する。別の実施形態において、上記被検体は、アトピー性皮膚炎を有する。上記サンプルにおける（対照と比較した）ＩＬ−１９の高いレベルは、上記被検体が、ＴＳＬＰアンタゴニスト、例えば、抗ＴＳＬＰ抗体または抗ＴＳＬＰＲ抗体による処置のための良い候補であることを示唆し得る。
【００２５】
本発明はまた、ＴＳＬＰアンタゴニストによる処置の進行をモニタリングするための方法を含み、上記方法は：（ａ）上記被検体由来のサンプルにおけるＩＬ−１９の発現を測定する工程、および、上記サンプル中のＩＬ−１９レベルが対照のレベルよりも高かった場合、上記被検体に治療有効量のＴＳＬＰアンタゴニストを投与し続ける工程を含む。１つの実施形態において、上記被検体は、アレルギー性疾患を有する。１つの実施形態において、アレルギー性疾患は、アトピー性皮膚炎である。別の実施形態において、上記アレルギー性疾患は、喘息である。
【００２６】
本発明はまた、アレルギー性疾患のためのバイオマーカーとしてＩＬ−１９の使用も提供する。１つの態様において、本発明は、アレルギー性疾患の進行または疾患状態を評価するためのバイオマーカーとしてのＩＬ−１９の使用を提供する。
【００２７】
本発明はまた、アトピー性皮膚炎のためのバイオマーカーとしてのＩＬ−１９の使用も提供する。１つの態様において、本発明は、アトピー性皮膚炎の進行または疾患状態を評価するためのバイオマーカーとしてのＩＬ−１９の使用を提供する。
【００２８】
本発明はまた、喘息のためのバイオマーカーとしてのＩＬ−１９の使用も提供する。１つの態様において、本発明は、喘息の進行または疾患状態を評価するためのバイオマーカーとしてのＩＬ−１９の使用を提供する。
【００２９】
種々の実施形態において、ＴＳＬＰアンタゴニストは、ＴＳＬＰもしくはＴＳＬＰのレセプター（またはＴＳＬＰレセプターの任意のサブユニット）に対して結合する抗体またはその抗原結合断片である。種々の実施形態において、抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体である。他の実施形態において、ＴＳＬＰアンタゴニストは、核酸分子、例えばアンチセンス核酸もしくはｓｉＲＮＡ、ターゲティングＴＳＬＰもしくはそのレセプター、またはどちらかの任意のサブユニットである。なおさらなる実施形態において、ＴＳＬＰアンタゴニストは、低分子化合物である。
【００３０】
１つの実施形態において、ＩＬ−１９の発現は、血液（血漿または血清を含む）中で検出される。
【００３１】
別の実施形態において、ＩＬ−１９の発現は、組織サンプル中で検出される。
【００３２】
別の実施形態において、ＩＬ−１９の発現は、皮膚生検中で検出される。
【００３３】
別の実施形態において、ＩＬ−１９の発現は、痰中で検出される。
【００３４】
いくつかの実施形態において、上記方法は、免疫学的検出手段、例えばＥＬＩＳＡ、免疫組織化学（ＩＨＣ）、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ（登録商標））、ウェスタンブロットまたは他の免疫学ベースのタンパク質検出方法によるバイオマーカーのタンパク質レベルの検出を含む。他の実施形態において、バイオマーカータンパク質は、非免疫学的検出手段、例えば、質量分光手段もしくはクロマトグラフィー手段によって、検出される。なお他の実施形態において、バイオマーカーは、例えば、例えば核酸ハイブリダイゼーションベースの技術（例えば、アレイまたはチップ）または増幅ベースの技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、ＴａｑＭａｎ（登録商標）実時間定量的ＰＣＲ分析）によってｍＲＮＡのレベルを検出することにより、遺伝子発現検出手段によって遺伝子発現レベルで測定される。
【００３５】
他の実施形態において、ＩＬ−１９のレベルは、所定の参照サンプルもしくは対照（例えば、炎症性疾患（アトピー性皮膚炎もしくは喘息など）を有さない被検体由来、またはＴＳＬＰアンタゴニストによる処置を受ける前の被検体由来）におけるレベルよりも、高いかまたは低いかを、特定の倍率、例えば１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、７倍、１０倍、１５倍、２０倍、５０倍、１００倍以上で異なることを判定する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、カルシポトリオール誘導型皮膚炎症が、抗ＴＳＬＰ抗体によって処置されたＩＬ−１９ＫＯマウスにおいて低下することを示す。
【図２】図２は、ＩＬ−１９がカルシポトリオール処置マウスの血清において高レベルで検出されること、および抗ＴＳＬＰ抗体は、ＩＬ−１９の分泌を抑制するが、ＩＬ−２０の分泌を抑制しないことを示す。
【図３】図３は、僅かなＩＬ−１９しか含有されていないか、または全くＩＬ−１９が含有されていないカルシポトリオールによって処置されたＴＳＬＰＫＯマウスの血清を示す。
【図４】図４は、カルシポトリオール処置マウス皮膚の血清におけるＩＬ−１９の阻害は、投与された抗ＴＳＬＰ抗体の用量に依存することを示す。
【図５】図５は、カルシポトリオール処置マウスの血清におけるＩＬ−１９分泌の動態学を示し、そして抗ＴＳＬＰ抗体によるＩＬ−１９の時間および用量依存的阻害を示す。
【図６】図６は、カルシポトリオール処置マウス由来の皮膚の実時間ｑＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ）分析を示し、これは、ＩＬ−１９およびそのレセプター（ＩＬ２０Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２）の両方のｍＲＮＡが、カルシポトリオール処置の４日目に誘導されることを示す。
【図７】図７は、ＴＳＬＰを分泌するように誘導されたヒト皮膚組織培養上清中のＩＬ−１９の発現を示す。
【図７】図７は、ヒト皮膚組織培養上清中のＩＬ−１９の発現に対する中性化抗ＴＳＬＰ抗体の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本明細書で使用される場合、添付の特許請求の範囲を含めて、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」などの単語の単数形は、文脈が明らかにそうでないことを述べているのでなければ、その対応する複数の言及を含む。
【００３８】
本明細書で引用される全ての参考文献は、個々の刊行物、データベースエントリ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ配列またはＧｅｎｅＩＤエントリ）、特許出願または特許のそれぞれが具体的かつ個別に参考によって組み込まれるよう示されているのと同程度に、参考として組み込まれる。本明細書で引用される核酸配列およびタンパク質配列についてのＧｅｎＢａｎｋ登録番号は、本出願の出願日のデータベースの内容をいう。これらのデータベースエントリは、その後改変され得るが、ＧｅｎＢａｎｋは、日付の機能として全ての以前のバージョンの配列の公式記録を維持し、このようなデータベースエントリを、特定の配列に対して明確な参照にしている。
【００３９】
この参考による組み込みの宣言は、出願人により、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５７（ｂ）（１）に従い、各々および全ての個々の刊行物、データベースエントリ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ配列またはＧｅｎｅＩＤエントリ）、特許出願または特許に関することが企図され、これらのそれぞれは、これらの引用が専用的な参考による組み込みの宣言に直ちに隣接していない場合であっても、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５７（ｂ）（２）に従って明らかに特定される。専用的な参考による組み込みの宣言の包含が本明細書中の範囲内に存在する場合であっても、この全体的な参考による組み込みの宣言を多少なりとも弱めるものではない。本明細書での参考文献の引用は、この参考文献が適切な先行技術であることを承認することを企図せず、これらの刊行物または文書の内容および日付についてのいかなる承認も構成しない。
【００４０】
Ｉ．定義
「投与」および「処置」は、動物、ヒト、実験被検体、細胞、組織、器官または生体液に適用される場合、その動物、ヒト、被検体、細胞、組織、器官または生体液に対する、外来性の医薬、治療剤、診断剤または組成物の接触をいう。「投与」および「処置」は、例えば、治療方法、薬物動態学方法、診断方法、研究方法および実験方法をいってもよい。細胞の処置は、この細胞に対する試薬の接触、ならびに細胞と接触している液体に対する試薬の接触を含む。「投与」および「処置」はまた、例えば、細胞の、試薬、診断組成物、結合組成物または別の細胞による、インビトロおよびエキソビボの処置も意味する。「処置」は、ヒト対象、獣医学対象または研究対象に適用される場合、研究用途および診断用途の、治療的処置、回避的すなわち予防的手段をいってもよい。ＩＢＤのような再発性／寛解型疾患について、再発を予防するか、遅延するかまたはその重症度を軽減する処置は、疾患全体を「処置する」といっても、または再発を回避的に「予防する」といってもよく、このように、処置と予防との間の区別は、困難である。本明細書で使用される場合、「処置」は、治療の開始の間に活性であるＩＢＤエピソードの徴候および症候の軽減、または持続期間もしくは重症度の軽減をいい、ここで、「予防」は、治療の開始後に始まるＩＢＤエピソードの予防、遅延または重症度の軽減をいうが、本明細書で使用される場合、任意の所定の治療レジメンが、処置および予防の両方を構成し得る。「処置」は、ヒト対象、獣医学対象もしくは研究対象、または細胞、組織もしくは器官に適用される場合、動物被検体、細胞、組織、生理学的区画または生理学的液体との薬剤の接触を含む。「細胞の処置」は、薬剤が、ＴＳＬＰまたはそのレセプターに、例えば、液体相もしくはコロイド相で接触する状況を含む。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「被検体」は、対象の特定の個体、通常は、ヒトをいう。「被検体」は、疾患もしくは障害と診断されたか、または疾患もしくは障害を有することを疑われるヒト被検体であっても、そして／または、疾患もしくは障害についての処置を受けているヒト被検体であってもよい。用語「被検体」および「患者」は、この適用において、相互交換可能に使用される。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「生物学的サンプル」は、被検体から得られる任意のサンプルを含み得、全血、血漿、血清、組織生検（例えば、肺もしくは皮膚）、痰、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）細胞、鼻浸出液、鼻掻き取り物（ｎａｓａｌ  ｓｃｒａｐｅ）または尿が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
本明細書で使用される場合、ＩＬ−１９の「発現」または「レベル」は、サンプル中に存在するＩＬ−１９ポリペプチドの量またはサンプル中に存在するＩＬ−１９をコードするｍＲＮＡの量に関する。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「モニタリング」は、変動するパラメータにおける変化を測定しそして／または記録することをいう。
【００４５】
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、所望の生物学的活性を示す任意の形態の抗体をいってもよい。従って、これは、最も広い意味で使用され、具体的には、所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、抗体断片などを含む。
【００４６】
抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、およびＦｖ断片；ディアボディ；直鎖抗体；一本鎖抗体分子、例えばｓｃ−Ｆｖ；ドメイン抗体；および抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。概して、抗体断片または誘導体は、その標的に対する親和性を少なくとも１０％保持し、例えば、解離平衡結合定数（Ｋｄ）における１０倍を超えない変化を保持する。好ましくは、抗体断片または誘導体は、少なくとも、その結合親和性の２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％もしくは１００％（以上）を保持するが、所望の生物学的効果を発揮するために充分な親和性を有する任意の結合断片が、有用である。また、特定される場合、抗体断片は、その生物学的活性を実質的に改変しない保存的アミノ酸置換を有する配列改変体を含み得ることも意図される。
【００４７】
「ＴＳＬＰアンタゴニスト」は、何らかの方法でＴＳＬＰの活性を阻害する分子である。いくつかの実施形態において、ＴＳＬＰアンタゴニストは、ＴＳＬＰレセプターを介したＴＳＬＰシグナル伝達を、例えばＴＳＬＰまたはそのレセプターに結合することによって阻害する、抗体または抗原結合断片である。他の実施形態において、ＴＳＬＰアンタゴニストは、低分子またはポリヌクレオチド、例えばアンチセンス核酸もしくはｓｉＲＮＡである。別の実施形態において、ＴＳＬＰアンタゴニストは、可溶性ＴＳＬＰレセプターまたはＴＳＬＰ−ＩｇＧ融合タンパク質である。
【００４８】
モノクローナル抗体は、具体的に、所望の生物学的活性を示す限り、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種由来の抗体における対応の配列と同一であるかもしくは相同であるか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属し、鎖の残部は、別の種由来の抗体における対応の配列と同一であるかもしくは相同であるか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびにこのような抗体の断片を含む。米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５。
【００４９】
「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含む、免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片である。いくつかの場合、２種以上のＶＨ領域は、ペプチドリンカーと共有結合して、二価ドメイン抗体を作る。二価ドメイン抗体の２つのＶＨ領域は、同一または異なる抗原を標的し得る。
【００５０】
「二価抗体」は、２つの抗原結合部位を含む。いくつかの場合、２つの結合部位は、同じ抗原特異性を有する。しかし、二価抗体は、二重特異性であってもよい。
【００５１】
本明細書で使用される場合、用語「単鎖Ｆｖ」もしくは「ｓｃＦｖ」抗体は、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む抗体断片をいい、ここで、これらのドメインは、１つのポリペプチド鎖内に存在する。一般的に、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含み、これは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９４年）ＴＨＥ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ  ＯＦ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ、ｖｏｌ．１１３、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐｐ．２６９−３１５を参照されたい。
【００５２】
本明細書で、モノクローナル抗体はまた、ラクダ化（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）一ドメイン抗体も含む。Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら（２００１年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２６：２３０；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら（１９９９年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：２５；ＷＯ９４／０４６７８；ＷＯ９４／２５５９１；米国特許第６，００５，０７９号を参照されたい。１つの実施形態において、本発明は、一ドメイン抗体が形成されるように改変された２つのＶＨドメインを含む一ドメイン抗体を提供する。
【００５３】
本明細書で使用される場合、用語「ディアボディ」は、２つの抗原結合部位を有する小抗体断片をいい、この断片は、同一のポリペプチド鎖において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ）。同じ鎖上で２つのドメインの間を対にすることが可能な短さのリンカーを用いることにより、ドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対になることを強いられて、２つの抗原結合部位を作る。ディアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８においてより完全に記載される。操作された抗体改変体の概説については、一般に、ＨｏｌｌｉｇｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ（２００５年）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１１２６−１１３６を参照されたい。
【００５４】
本明細書で使用される場合、用語「ヒト化抗体」は、非ヒト（例えば、マウス）抗体ならびにヒト抗体に由来の配列を含む抗体の形態をいう。このような抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含む。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、概して２つの可変ドメインの、実質的に全てを含み、ここで、これらの非ヒト免疫グロブリンに対応する超可変ループの全てまたは実質的に全て、およびＦＲ領域の全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン、概して、ヒト免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含んでいてもよい。接頭語「ｈｕｍ」、「ｈｕ」または「ｈ」は、親げっ歯類抗体からヒト化抗体を識別するために必要な場合に、抗体クローン命名に加えられる（これらの同じ命名はまた、文脈に依存して、特定のタンパク質のヒト形態を示し得る）。げっ歯類抗体のヒト化形態は、一般に、親げっ歯類抗体の同じＣＤＲ配列を含むが、ヒト化抗体の親和性を増大させるため、安定性を増大させるため、または他の理由で、特定のアミノ酸置換が含まれてもよい。
【００５５】
抗体はまた、変更されたエフェクター機能を提供するために改変された（またはブロックされた）、Ｆｃ領域を有する抗体を含む。例えば、米国特許第５，６２４，８２１号；ＷＯ２００３／０８６３１０；ＷＯ２００５／１２０５７１；ＷＯ２００６／００５７７０２；Ｐｒｅｓｔａ（２００６年）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．５８：６４０−６５６を参照されたい。このような改変は、診断および治療において有益であり得る効果を有する、免疫系の種々の反応を増大するかまたは抑制するために使用され得る。Ｆｃ領域の改変は、アミノ酸変更（置換、欠失および挿入）、グリコシル化または脱グリコシル化、および複数のＦｃの追加を含む。Ｆｃに対する変更はまた、治療抗体における抗体の半減期を変え得る。より長い半減期は、より少ない頻度の投薬をもたらし得、利便性の増大および材料の使用の削減を同時にもたらし得る。Ｐｒｅｓｔａ（２００５年）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１６：７３ｌ、７３４−３５を参照されたい。
【００５６】
抗体はまた、完全なエフェクター機能を提供するインタクトなＦｃ領域を有する抗体を含み、例えば、標的細胞において補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）を誘導する、ヒトイソ型ＩｇＧ１の抗体である。
【００５７】
本発明の抗体はまた、細胞障害性ペイロード、例えば細胞障害性薬剤または放射性核種にコンジュゲートした抗体も含む。例示的な細胞障害性薬剤としては、リシン、ビンカアルカロイド、メトトレキサート、シュードモナス外毒素、サポリン、ジフテリア毒素、シスプラチン、ドキソルビシン、アブリン毒素、ゲロニンおよびヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質が挙げられる。本発明の抗体による免疫治療における使用のための例示的な放射性核種としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、２１１Ａｔ、１７７Ｌｕ、１４３Ｐｒおよび２１３Ｂｉが挙げられる。例えば、米国特許出願第２００６／００１４２２５号を参照されたい。
【００５８】
用語「完全ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体をいう。完全ヒト抗体は、マウス、マウス細胞またはマウス細胞由来のハイブリドーマにおいて産生される場合、マウス炭水化物鎖を含み得る。同様に、「マウス抗体」または「ラット抗体」は、それぞれ、マウスまたはラットの免疫グロブリン配列のみを含む抗体をいう。完全ヒト抗体は、ヒトにおいて、ヒト免疫グロブリン生殖細胞系配列を有するトランスジェニック動物において、ファージディスプレイまたは他の分子生物学的方法によって、作製され得る。
【００５９】
「有効量」は、医学的条件の症候または徴候を寛解させるかまたは予防するために充分な量を含む。このような有効量は、必ずしも、このような症候または徴候を完全に寛解させるかまたは予防しなくてもよい。有効量はまた、診断を可能にするかまたは容易にするために充分な量も意味する。特定の患者または獣医学被検体のための有効量は、処置される状態、患者の全体的健康状態、投与の方法、経路および用量ならびに副作用の重篤度などの因子に依存して変動し得る。例えば、米国特許第５，８８８，５３０号を参照されたい。有効量は、最大用量であってもよく、または重要な副作用または毒性効果を避ける用量プロトコールであってもよい。有効量は、概して、１００％が正常被検体によって示される診断パラメータとして規定される場合、少なくとも５％、通常、少なくとも１０％、より通常には、少なくとも２０％、最も通常には、少なくとも３０％、好ましくは、少なくとも４０％、より好ましくは、少なくとも５０％、最も好ましくは、少なくとも６０％、理想的には、少なくとも７０％、より理想的には、少なくとも８０％、ならびに最も理想的には、少なくとも９０％、診断測定値またはパラメータの改善をもたらす。例えば、Ｍａｙｎａｒｄら（１９９６年）Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ＳＯＰｓ  ｆｏｒ  Ｇｏｏｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ；Ｄｅｎｔ（２００１年）Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｇｏｏｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｕｒｃｈ  Ｐｕｂｌ．，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫを参照されたい。
【００６０】
「アレルギー性疾患」は、免疫系の過敏性障害によって引き起こされる任意の疾患をいう。これは、限定しないが、例えば、喘息、アトピー性皮膚炎、魚鱗癬早産症候群（Ｉｃｈｔｙｏｓｉｓ  Ｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、アレルギー性鼻炎、好酸球性食道炎およびネザートン症候群が挙げられる。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」は、微量な、核酸、例えばＲＮＡおよび／またはＤＮＡの特定の部分が、増幅される手順または技術をいい、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号に記載される。一般的に、目的の領域の末端からの配列情報またはそれ以上が、オリゴヌクレオチドプライマーが設計可能であるように、利用可能でなければならない；これらのプライマーは、増幅されるテンプレートの反対の鎖に対し、配列において同一であるか、または類似である。２つのプライマーの５’末端ヌクレオチドは、増幅される材料の末端と一致し得る。ＰＣＲは、全ゲノムＤＮＡおよび全細胞性ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡ、バクテリオファージまたはプラスミド配列などから、特異的ＲＮＡ配列、特異的ＤＮＡ配列を増幅するために使用され得る。一般的に、Ｍｕｌｌｉｓら（１９８７年）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３；Ｅｒｌｉｃｈ編（１９８９年）ＰＣＲ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．）を参照されたい。本明細書で使用される場合、ＰＣＲは、核酸の特定の部分を増幅または作製するためのプライマーおよび核酸ポリメラーゼとして既知の核酸の使用を含む、核酸試験サンプルを増幅するための、唯一ではないが、１つの核酸ポリメラーゼ反応方法の例であると考えられる。
【００６２】
「特異的に」または「選択的に」結合する、は、リガンド／レセプター、抗体／抗原または他の結合対に対していう場合、タンパク質の異種集団および他の生物におけるタンパク質の存在において限定的である結合反応を示す。従って、指定の条件下で、特異的リガンドは、特定のレセプターに結合し、サンプル中に存在する他のタンパク質には有意な量で結合しない。本明細書で使用される場合、抗体は、所定の配列を含むポリペプチド配列を含むポリペプチドに結合する場合に所定の配列を含むポリペプチドに特異的に結合し、このポリペプチド配列を含まないタンパク質には結合しないといえる。
【００６３】
企図される方法の抗体、または抗体の抗原結合部位由来の結合組成物は、無関係の抗原に対する親和性よりも、少なくとも２倍大きく、好ましくは少なくとも１０倍大きく、より好ましくは少なくとも２０倍大きく、そして最も好ましくは少なくとも１００倍大きい親和性で、その抗原に結合する。好ましい実施形態において、抗体は、例えば、スキャチャード解析によって決定される場合、約１０９リットル／ｍｏｌより大きな親和性を有する。Ｍｕｎｓｅｎら（１９８０年）Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０−２３９。
【００６４】
ＩＩ．概論
本発明は、ＴＳＬＰ処置のためのバイオマーカー、またはアレルギー性疾患（例えば、アトピー性皮膚炎または喘息）のバイオマーカーとしての、ＩＬ−１９の使用を提供する。ＩＬ−１９は、ＩＬ−１０サイトカインサブファミリーに属する周知のサイトカインである。ヒトにおいて、２つの異なるスプライス改変体が、同定されている（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿１５３７５８．２およびＮＭ＿０１３３７１．３）。本明細書で使用される場合、用語「ＩＬ−１９」は、ＩＬ−１９のいずれかのイソ型をいう。
【００６５】
ＩＬ−１９は、いくつかの文脈においてバイオマーカーとしての使用を見出され得る。これは、アレルギー性疾患（例えば、アトピー性皮膚炎または喘息）を診断する際、または疾患の重症度について被検体をステージ分類する際に使用され得る。
【００６６】
ＩＬ−１９は、ＴＳＬＰアンタゴニストによる処置に応答しやすい患者下位集団を選択するためのバイオマーカーとしての使用を見出され得る。本発明は、動物がＴＳＬＰアンタゴニスト抗体によって処置された場合に、ＩＬ−１９レベルが非疾患レベルに戻ることを示す。従って、高いレベルのＩＬ−１９を有するアレルギーの被検体は、ＴＳＬＰアンタゴニストにより非疾患レベルにバイオマーカーのレベルを戻すための治療のための候補となりやすいと考えられ得る。逆に、高いレベルのＩＬ−１９を有さないアレルギーの被検体は、ＴＳＬＰアンタゴニストによる処置のための候補になりにくい場合がある。
【００６７】
ＩＬ−１９はまた、例えばＴＳＬＰアンタゴニストによる、処置を受ける被検体におけるバイオマーカーとして、ＴＳＬＰ経路の遮断を確認するため、処置の効力（および必要な場合治療レジメンの変更）を評価するため、および一般的に患者の進行をモニタリングするための、使用を見出され得る。結果が、所定の治療レジメンが患者における標的経路に効果的に結合していることを示し、治療効果をまだ提供できていない場合、ＴＳＬＰシグナル伝達経路は、この患者において実際的有用性は比較的小さい場合がある。
【００６８】
ＩＬ−１９はまた、診療所における患者の管理におけるバイオマーカーとして、例えば、必要な場合に治療レジメンの変更を告げるための使用を見出され得る。臨床医は、ＩＬ−１９のレベルをモニタリングし、ＴＳＬＰアンタゴニストによる投薬を増量すべきか、減量すべきか、またはより多いもしくは少ない頻度にすべきか、現行の治療に対する患者の応答の程度に応じて決定することを助け得る。投与の頻度の低下は、時間枠が１回の投薬間隔よりも長い場合、所定の期間にわたって被検体が受ける薬物の低減した「用量」を構成し得ることに留意されたい。ＩＬ−１９のレベルの測定は、標準的臨床的疾患手段（これらのうちのいくつかは、少なくとも部分的に、症候の緩和に依存する）を用い得るよりも初期の（すなわち、処置の後の早い）時点で、ＴＳＬＰアンタゴニストによる処置に対して、被検体が好ましく応答することを決定し得るという利点を有する。非応答者からの応答者の初期の識別は、より初期の投薬の変更または中断を可能にする。治療レジメンの初期の変更は、処置の成功までの時間を短縮し得るか、または効果の無い薬物への不必要な曝露の危険を低減し得る（同時に、費用および副作用も低減し得る）。
【００６９】
所定の治療レジメンの効力の評価は、患者のケアの管理のために重要であり、臨床試験の場合、潜在的な治療剤の評価に不可欠である。
【００７０】
ＩＩＩ．ＴＳＬＰアンタゴニスト
アレルギー性疾患は、ＴＳＬＰのアンタゴニストを用いて処置され得る。ＴＳＬＰのアンタゴニストとしては、薬剤、例えば、ＴＳＬＰもしくはそのレセプターに結合する抗体またはその断片が挙げられる。ヒトＴＳＬＰの配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＢＸ７４３６１において見出される。
【００７１】
ＴＳＬＰレセプターは、ＴＳＬＰＲ（ＣＲＬＦ２）およびＩＬ７Ｒαサブユニットの２つのサブユニットからなる。Ｒｅｃｈｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１６７：３３６−３４３（２００１年）。
【００７２】
１つの実施形態において、ＴＳＬＰアンタゴニストは、本発明の譲受人に譲渡された国際特許出願公開番号ＷＯ２００８／０７６３２１またはＷＯ２０１１／０５６７７２において開示されたヒト化抗体の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、抗ヒトＴＳＬＰ抗体である。
【００７３】
種々の実施形態において、本発明のＴＳＬＰアンタゴニストは、抗体の抗原結合断片、例えば本明細書で挙げた任意のＴＳＬＰアンタゴニスト抗体の断片を含む。このような断片としては、限定しないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、ナノボディ、およびディアボディが挙げられる。
【００７４】
別の実施形態において、ＴＳＬＰアンタゴニストは、可溶性ＴＳＬＰＲレセプターである。例えば、Ａｌ−Ｓｈａｍｉら、ＪＥＭ  ２０２：８２９−８３９（２００５年）を参照されたい。
【００７５】
別の実施形態において、ＴＳＬＰアンタゴニストは、ＴＳＬＰＲ−Ｆｃ融合タンパク質である。例えば、Ｚｈａｎｇら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：２５６−２６４（２０１１年）を参照されたい。
【００７６】
ＩＶ．バイオマーカーの発現レベルの決定
本明細書で記載される方法は、一般に、バイオマーカーの発現レベルを決定するために適用可能であり、ＩＬ−１９の発現レベルを測定するために使用され得る。
【００７７】
１つの態様において、本発明は、被検体由来のサンプルが対照のレベルと比較してバイオマーカーの増加したレベルを示すかまたは低下したレベルを示すかを決定することを含む。バイオマーカーレベルは、当分野で公知の任意の方法によって定量され得る。この方法としては、質量分析、ウェスタンブロット、ＩＨＣまたはＥＬＩＳＡが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のバイオマーカーのレベルを決定するための方法としては、本明細書で開示された方法およびその均等物が挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質レベルでのバイオマーカーのレベルの決定は、遺伝子発現レベルに対し、簡便である。何故なら、タンパク質は、例えば、血漿中および糞便中のように、非侵襲的に検出され得るか、または最小の侵襲手順によって検出され得るからである。
【００７８】
１つの実施形態において、バイオマーカータンパク質レベルは、例えば、以下のようなウェスタンブロット（イムノブロット）によって決定される。生物学的サンプルは、１０％  ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル上で電気泳動され（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ニトロセルロースまたはポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）、何らかの他の好適な膜の上に移される（例えば、電気ブロッティングされる）。次いで、この膜は、評価されるバイオマーカータンパク質に結合する一次抗体と共にインキュベートされ、洗浄され、そして、一次抗体に結合する検出可能に標識された二次抗体と共にインキュベートされていてもよく、そして再び洗浄されていてもよい。その後、二次抗体の存在（または、検出可能に標識されている場合は一次抗体）が、例えば、放射活性、蛍光、発光、酵素活性（例えば、アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ）または当業者に公知の他の検出技術もしくは可視化技術によって検出される。１つの実施形態において、検出可能な標識は、オートラジオグラフを生成するために使用され、これは、スキャンされ、分析される。他の実施形態において、ゲルは、オートラジオグラフの使用なしで、直接画像化される。観察されたバイオマーカーバンド強度は、サンプル中に存在する対照タンパク質、例えばアクチンまたはチューブリンに対して正規化されていてもよい。
【００７９】
なお別の実施形態において、バイオマーカーレベルは、ＥＬＩＳＡによって決定される。１つの実施形態であるサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、目的のバイオマーカーに特異的な一次抗体（「捕捉抗体」）を、プレート（例えば、９６ウェルマイクロタイタープレート）のウェル内にコートし、次いで、このプレートを、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはカゼインによってブロックする。サンプル中に存在するバイオマーカーポリペプチドが固定された抗体に結合できるように、標準またはサンプルを、ウェル中にピペットで入れる。ウェルを洗浄し、そして（二次）ビオチン化抗バイオマーカー抗体を添加する。二次抗バイオマーカー抗体は、バイオマーカーが一次抗体に結合している間にも、バイオマーカーに結合可能でなければならない。他の実施形態において、二次抗体は、例えば、バイオマーカーがマルチマーを形成する場合、一次抗体と同じである。いくつかの実施形態において、二次抗体は、別個の、架橋反応しない抗体である。なお他の実施形態において、二次抗体は、例えば、検出されるバイオマーカーがヘテロダイマー複合体として存在する場合（例えば、カルプロテクチン）、完全に別個のポリペプチド鎖に結合する。未結合のビオチン化抗体を洗い流した後、ＨＲＰ−コンジュゲートしたストレプトアビジン（または何らかの機能的に同等の検出試薬）を、ウェルにピペットで入れる。あるいは、ビオチン化抗体を、ストレプトアビジン工程の必要性を取り除く、直接検出可能な標識を有する抗体と置き換えてもよい。ウェルを再び洗浄し、ＴＭＢ基質溶液をウェルに添加して、結合したバイオマーカーの量に比例して発色させる。停止溶液を反応物に加え（反応物の色が青から黄に代わる）、色の強度を４５０ｎｍで測定する。例えば、Ｈｕｍａｎ  ＩＧＦ−ＢＰ−２  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ  ｆｒｏｍ  ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．；Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ，ＵＳＡ；およびＡｎｇｅｒｖｏら（１９９２年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１８９：１１７７；Ｋｒａｔｚら（１９９２年）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２０２：３８１；およびＦｒｏｓｔら（１９９１年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１８０８２を参照されたい。既知の濃度のバイオマーカーを用いた標準曲線が、サンプル中のバイオマーカーの濃度の決定のために使用され得る。
【００８０】
当業者に周知の他のＥＬＩＳＡフォーマット、例えば、マイクロタイターウェル内にバイオマーカーを固定するために捕捉抗体ではなくプレートに対する直接吸着を用いるフォーマットもまた、使用され得る。サンプル中のバイオマーカーが、プレートに結合するためのアッセイ溶液中に存在する標識バイオマーカー分子と競合するその能力によって検出される、競合的ＥＬＩＳＡもまた、使用され得る。目的のサンプル中にバイオマーカーポリペプチドの濃度が高いほど、標識されたバイオマーカーの結合をより多く遮断するので、観察されるシグナルは低下する。
【００８１】
水性サンプルが毛管作用によって表面上を流される、ラテラルフローフォーマットイムノアッセイ（イムノクロマトグラフィックアッセイ）もまた、使用され得る。この表面は、検出試薬（例えば、検出可能標識抗体）が配置された第１ゾーンおよび固定した捕捉試薬（例えば、抗体）を含む第２ゾーンを有する。捕捉試薬と検出試薬との両方は、目的のバイオマーカーに特異的に結合する。第１ゾーンを横切ってサンプルが流れる際、検出試薬は可溶化され、サンプル中に存在する任意の分析物（バイオマーカー）に結合し、複合体を形成する。サンプルは流れ続けて、任意の複合体が捕捉試薬に結合し濃縮する、第２ゾーンに接触する。有色粒子が検出可能標識として使用される場合、第２ゾーンにおける粒子の濃度は、可視の有色シグナルを生じる。次いで、分析物（バイオマーカー）のレベルが、第２ゾーンのシグナルの強度によって、定性的または定量的に評価される。
【００８２】
バイオマーカーレベルはまた、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によっても決定され得る。ＲＩＡは、既知の量の放射活性の（例えば、１３１Ｉおよび１２５Ｉ−チロシンで標識された）分析物を、目的のサンプル由来の未標識すなわち「冷」分析物の存在下または非存在下でこの分析物に対する抗体と混合すること、および置いた標識分析物の量を測定することを含む。この場合、この分析物は、本発明のバイオマーカーである。サンプル中の分析物は、標識分析物と競合し、その抗体への結合を低下する。未結合の分析物を除去し、標識結合分析物を定量する。未結合分析物は、例えば、分析物−抗体複合体の、一次抗体を指向する二次抗体によって沈殿させることにより、除去できる。別の実施形態において、分析物特異的抗体が、試験管もしくはマイクロタイターウェルの壁または何らかの他の固相基板に固定化され得るので、未結合分析物は、単純に洗い流せる。
【００８３】
任意の他の好適なアッセイフォーマット、例えばネフェロメトリー／比濁分析、具体的には、浮遊する不溶性の抗原（バイオマーカー）／抗体複合体によって生じる光拡散の測定を含む免疫比濁分液が、目的のバイオマーカーを検出するために使用され得る。例えば、米国特許第４，６０５，３０５号を参照されたい。他の方法としては、放射免疫拡散（ＲＩＤ）が挙げられ、これは、例えば、アガー／アガローススワブにおける抗原（バイオマーカー）と抗体との間の複合体の形成によって作られる沈降素の輪の観察である。例えば、米国特許第３，９４７，２５０号を参照されたい。このようなフォーマットは、一般に、臨床的アッセイによって使用される。
【００８４】
他の実施形態において、バイオマーカーは、質量分析法によって検出されてもよい。質量分析法としては、飛行時間、磁気セクタ、クワドラポールフィルタ、イオントラップ、イオンサイクロトロン共鳴、静電セクタ分析機およびこれらの混成が挙げられる。このような実施形態において、サンプル中のバイオマーカーは、同定され得、そして、サンプル中に添加したアイソトープ標識された同一の合成ペプチドを用いて、定量され得る。１つの実施形態において、質量分析機は、レーザー脱離／イオン化質量分析機である。レーザー脱離／イオン化質量分析において、分析物は、質量分析プローブの表面上に置かれ、これは、分析物をイオン化させる。レーザー脱離質量分析機は、概して、紫外線レーザーまたは赤外線レーザーからのレーザーエネルギーを用いて、イオン光学アセンブリによる検出のために、分析物を揮発させてイオン化させる。別の質量分析実施形態において、サンプルは、クロマトグラフィー分画されていてもよく、次いでバイオマーカーは、生物親和性樹脂、例えば、抗体によって誘導体化された樹脂上に捕捉される。次いで、バイオマーカーは、樹脂から溶出され、ＭＡＬＤＩ、エレクトロスプレー、または質量分析のための別のイオン化方法によって分析される。なお別の実施形態において、サンプルは、アニオン交換樹脂上で分画されて、ＭＡＬＤＩまたはエレクトロスプレー質量分析によって直接検出される。
【００８５】
他の実施形態において、バイオマーカー遺伝子の遺伝子発現のレベルが、決定されてもよい。核酸レベルの遺伝子発現は、当分野で公知の任意の方法によって定量され得、これらとしては、ノーザンブロット分析、遺伝子チップ発現分析またはＲＴ−ＰＣＲ（実時間ポリメラーゼ連鎖反応）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｓｍｉｔｈら（１９９３年）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．Ｍｅｔａｂ．７７（５）：１２９４；Ｃｏｈｅｎら（１９９３年）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．Ｍｅｔａｂ．７６（４）：１０３１；Ｄａｗｃｚｙｎｓｋｉら（２００６年）Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．３７：５８９；およびＣｌｅｍｍｏｎｓら（１９９１年）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．Ｍｅｔａｂ．７３：７２７を参照されたい。
【００８６】
ノーザンブロット分析は、ｍＲＮＡの検出および定量の標準的方法である。ＲＮＡは、サンプルから単離されて、アッセイされる（例えば、結腸粘膜）。ＲＮＡは、変性条件下でアガロースゲル中の電気泳動によって大きさで分離され、膜に移され、架橋され、そして標識プローブとハイブリダイズする。本発明の１つの実施形態において、ノーザンブロット分析は、ハイブリダイゼーションプローブとして、放射性標識された核酸または非同位体的に検出可能に標識された核酸を含む。本発明の１つの実施形態において、ＲＮＡサンプルを保持した膜は、非特異的バックグラウンドを低減するために、プローブハイブリダイゼーションの前に、プレハイブリダイズされる、すなわち「ブロック」される。ハイブリダイズしなかったプローブは、洗浄によって除去する。洗浄のストリンジェンシーは、当分野で周知なように調整され得る。放射性標識された（または発光）プローブが使用される場合、ブロットは、オートラジオグラフィーのフィルムに、例えば、シンチラントの存在下で、曝露され得る。非同位体的プローブが使用される場合、ブロットは、概して、非同位体的検出試薬によって処理されて、フィルム曝露の前に、検出可能プローブシグナルを現像しなければならない。アッセイされる遺伝子の発現の相対レベルは、例えば、濃度測定法または目測を用いて定量され得る。観察された発現レベルは、大量に発現される対照遺伝子（例えば、ユビキチン）の発現レベルに対して正規化され得る。
【００８７】
別の実施形態において、バイオマーカー発現は、遺伝子チップ（プローブアレイ）を用いて決定される。目的の生物学的サンプルが調製されて、チップにハイブリダイズされ、これは、その後、洗浄され、染色されてスキャンされる。次いで、データは、処理される。標的調製物は、試験されるサンプル由来のビオチン化標的ＲＮＡの調製を必要とし得る。標的ハイブリダイゼーション工程は、断片化した標的、プローブアレイ対照、ＢＳＡおよびニシン精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーションカクテルの調製を含み得る。１つの実施形態において、標的は、１６時間にわたってプローブアレイにハイブリダイズされ、このプローブは洗浄され、ストレプトアビジン・フィコエリトリンコンジュゲートによって染色され、そして５７０ｎｍでの光の放射についてスキャンされる。５７０ｎｍで放出された光の量は、プローブアレイ上の各位置において結合した標的に比例する。市販の装置およびソフトウェアを用いたコンピューター分析が、可能である（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）。
【００８８】
異なる実施形態において、バイオマーカー発現は、実時間ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて決定される。本発明のバイオマーカーのＲＴ−ＰＣＲに必要なプライマーおよびプローブの設計は、本明細書で提供される配列に照らして、当分野の技術範囲内である。１つの実施形態において、当分野で周知であるように、ＲＮＡは、ＲＮＡｓｅ非含有条件下で単離され、逆転写酵素を用いてＤＮＡに変換される。ＲＴ−ＰＣＲプローブは、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ）の５’−３’ヌクレアーゼ活性に依存し、標的アンプリコン（バイオマーカー遺伝子）にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを加水分解する。ＲＴ−ＰＣＲプローブオリゴヌクレオチドは、５’末端に付着した蛍光レポーター染料および３’末端に結合したクエンチャー部分（またはその逆）を有する。これらのプローブは、ＰＣＲ産物の内部領域にハイブリダイズするように設計される。増幅の間、ポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性は、プローブを開裂し、クエンチャー部分から蛍光染料を切り離す。蛍光は、各サイクルにおいて、多くのプローブが開裂するほど増大する。得られた蛍光シグナルを、標準的な市販の装置における増幅の間、実時間でモニタリングする。評価されるサンプル中のバイオマーカーＲＮＡの量が、既知の量の増幅可能なＲＮＡを含む標準と比較することによって、決定され得る。
【００８９】
バイオマーカーまたはバイオマーカー遺伝子発現は、市販のキットを用いて、または当分野で周知の供給業者から得た市販の抗バイオマーカー抗体によるカスタムアッセイを用いて、またはカスタムアッセイおよび本研究社によって惹起された抗体を用いて、検出され得る。
【００９０】
当業者は、本明細書で開示された検出手段が、１つの状態から別の状態への物品の変換を生来含むことを認識する。概して、本明細書で開示される検出手段は、分析物（すなわち、検出される物質、例えばバイオマーカーポリペプチドまたはこのポリペプチドをコードするｍＲＮＡ）の検出試薬（例えば、抗体または相補的核酸）との複合体に変換することを含む。例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットなどの免疫学的検出手段は、バイオマーカーポリペプチドの、抗原−抗体複合体への変換を含み、この複合体形成は、検出に不可欠である。別の例において、増幅（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標））、サザン／ノーザンブロッティングおよびジーンチップベースの方法などのハイブリダイゼーションベースの検出手段は、一本鎖状態から２本鎖状態への、バイオマーカーをコードするｍＲＮＡの変換を含み、この複合体形成は、検出に不可欠である。
【００９１】
本発明のいくつかの実施形態において、比較されるサンプルは、同じ被検体から得られ、従って、同程度「内部制御」される。このような実施形態において、タンパク質レベルまたは遺伝子発現レベルにおける変化を認める能力は、アッセイの生来の精度によってのみ限定され、個対個の変動性を含まない。従って、一被検体由来のサンプル間の僅かな相違は、個対個の変動性を含む類似のデータは有為でない場合であっても、統計学的に有為であり得る。
【００９２】
Ｖ．データ分析
本発明のバイオマーカー（ＩＬ−１９）の発現レベルは、比較されるサンプルに依存して、種々の目的のために使用され得る。この目的としては、疾患の診断、患者のステージ分類、疾患状態のモニタリング、ＴＳＬＰアンタゴニストによる処置のための患者の選択、標的結合の確認、ならびに治療効力のモニタリングが挙げられるが、これらに限定されない。概して、このような方法は、目的の被検体（「被験体」）から得られるサンプルにおけるＩＬ−１９のレベルを「対照」におけるレベルと比較することを含む。本発明のバイオマーカーについて、より高いレベルは、疾患に関連するか、またはより重症な疾患状態に関連する。本明細書で使用される場合、「被検体におけるバイオマーカーのレベル」および類似の句は、被検体から得られたサンプル、例えば、皮膚、組織、血清、血液、尿、糞便などにおいて決定されたレベルをいう。
【００９３】
本明細書で提供されたバイオマーカーの同定に関して、臨床医が、アレルギー性疾患を有する者と有さない者の両方の多くのヒト被検体の中で、ＩＬ−１９のレベルを決定することは、当分野の技術範囲内である。このようなデータは、問題の薬物（例えば、ＴＳＬＰアンタゴニスト抗体）の安全性および効力を評価する臨床試験の過程で蓄積される可能性が高い。このようなバイオマーカーデータは、多くの場合、臨床試験の経過において集められ、当分野において費やされた努力の通常レベル以下を表す。これらの基線データはまた、問題のアッセイの精度を決定する標準的な統計学的アプローチを用いる変動性について分析される。バイオマーカーレベルにおける相違、およびバイオマーカーを測定するために使用されるアッセイにおける統計学的変動性により、熟練の臨床医は、所定のサンプルにおけるバイオマーカーのレベルがＴＳＬＰ遮断と一致しているか否かを判定可能である。
【００９４】
本発明の広い範囲は、以下の実施例を参照して最もよく理解される。この実施例は、本発明を特定の実施形態に限定することを企図しない。
【実施例】
【００９５】
実施例１
一般的方法
分子生物学における標準的方法が、記載される。Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ｗｕ（１９９３年）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｖｏｌ．２１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ。標準的方法はまた、Ａｕｓｂｅｌら（２００１年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１−４、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹにおいても見出され、これは、細菌細胞におけるクローニングおよびＤＮＡ突然変異誘発（Ｖｏｌ．１）、哺乳動物細胞および酵母におけるクローニング（Ｖｏｌ．２）、複合多糖およびタンパク質発現（Ｖｏｌ．３）、およびバイオインフォマティクス（Ｖｏｌ．４）を記載する。
【００９６】
免疫沈降、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離および結晶化を含むタンパク質精製のための方法が、記載される。Ｃｏｌｉｇａｎら（２０００年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ。化学分析、化学的修飾、転写後修飾、融合タンパク質の産生、タンパク質の糖化が、記載される。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら（２０００年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌら（２００１年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ，ｐｐ．１６．０．５−１６．２２．１７；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃｏ．（２００１年）Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｏｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；ｐｐ．４５−８９；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００１年）ＢｉｏＤｉｒｅｃｔｏｒｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，ｐｐ．３８４−３９１を参照されたい。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の産生、精製および断片化が、記載される。Ｃｏｌｉｇａｎら（２００１年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９９９年）Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出。リガンド／レセプター相互作用を性質決定するための標準的技術が、利用可能である。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら（２００１年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。
【００９７】
フローサイトメトリの方法は、蛍光活性化細胞選別検出システム（ＦＡＣＳ（登録商標））を含めて、利用可能である。例えば、Ｏｗｅｎｓら（１９９４年）Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ；Ｇｉｖａｎ（２００１年）Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，第２版；Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ；Ｓｈａｐｉｒｏ（２００３年）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪを参照されたい。核酸を修飾するために好適な蛍光試薬は、核酸プライマーおよびプローブ、ポリペプチド、および抗体を含めて、例えば、診断試薬としての使用のために、利用可能である。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（２００３年）Ｃａｔａｌｏｇ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（２００３年）Ｃａｔａｌｏｇ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ。
【００９８】
免疫系の組織学の標準的方法が、記載される。例えば、Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈａｒｍｅｌｉｎｋ（編）（１９８６年）Ｈｕｍａｎ  Ｔｈｙｍｕｓ：Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｈｉａｔｔら（２０００年）Ｃｏｌｏｒ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ，ＰＡ；Ｌｏｕｉｓら（２００２年）Ｂａｓｉｃ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ：Ｔｅｘｔ  ａｎｄ  Ａｔｌａｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ。
【００９９】
統計学的分析は、市販のソフトウェアを用いて実施され得、これらとしては、ＪＭＰ（登録商標）Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ，ＵＳＡが挙げられるが、これに限定されない。
【０１００】
バイオマーカーレベル（例えば、ＩＬ−１９のレベル）は、市販のキットまたは市販の抗体を用いて、以下の実施例に説明されるように決定され得る。他に示されない限り、市販のキット（例えば、ＥＬＩＳＡキット）は、実質的に、製造業者に示唆されるように使用される。あるいは、ＥＬＩＳＡおよび他の免疫学的アッセイは、市販の抗体を使用して展開されてもよく、または、抗体は、好適な抗体が市販されていないバイオマーカーに対して惹起されてもよい。バイオマーカー遺伝子発現は、市販のプローブもしくはプライマーを用いてモニタリングされてもよく、またはこのようなプローブもしくはプライマーは、本明細書で開示される核酸配列（配列表におけるもの、または登録番号として開示され、参考として組み込まれるもの）をベースにカスタム合成されてもよい。
【０１０１】
実施例２
カルシポトリオール誘導型皮膚炎症は、抗ＴＳＬＰ抗体によって処置されたＩＬ−１９ノックアウトマウスにおいて軽減される
前に示された通り、ＴＳＬＰは、カルシポトリオール（Ｖｉｔ  Ｄ３アナログ）の皮膚への投与後のケラチノサイトにおいて誘導され、アトピー性皮膚炎（ＡＤ）に相当する疾患をもたらす。Ｌｉ  Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０３：１１７３６（２００６年）；Ｌｉ  Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１２９：４９８（２００９年）を参照されたい。
【０１０２】
ＩＬ−１９がＡＤの進行において役割を果たすか否かを決定するために、カルシポトリオール誘導型皮膚炎症を、野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）およびＩＬ−１９ノックアウト（ＩＬ１９ＫＯ）マウスにおいて比較した。マウスの群に、単回用量の中性化ＴＳＬＰ抗体またはイソ型対照（４０ｍｐｋの２２Ｅ５（ラット抗マウスＴＳＬＰ）または５Ｇ５（ラットＩｇＧ２ａイソ型対照抗体））を、カルシポトリオール処理を行う１日前に与えた。カルシポトリオールを、毎日与え、耳の膨張を、炎症の測定値として評価した。この研究において使用される抗ＴＳＬＰ抗体（２２Ｅ５）は、標準的手順を用いて自ら開発したラット抗マウスＴＳＬＰ抗体（ＩｇＧ２ａ／κ）であった。
【０１０３】
図１に示されるように、ＩＬ１９ＫＯマウスは、ｗｔマウスと比較して、耳の膨張の軽減を示した。ＴＳＬＰ  ｍＡｂによって処置された動物もまた、ｗｔマウスと比較して膨張における軽減を示したが、耳の膨張における最も大きな軽減は、やはりＴＳＬＰ抗体を受けたＩＬ１９ＫＯマウスにおいて見られた（図１、右側パネル）。
【０１０４】
材料および方法
マウス
Ｃ５７ＢＬ／６およびＢａｌｂ／ｃマウス（６〜８週齢）を、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｕｒ，ＭＥ）から購入した。ＩＬ−１９  ＫＯマウスを、以前に記載されたように作製し（Ｃｈａｎ  Ｊ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０３：２５７７（２００３年））そしてさらにＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドに対し１０世代にわたって戻し交配した。全ての実験を、制度上のガイドラインに沿って、ＩＡＣＵＣ承認プロトコールの下で実施した。
【０１０５】
ビタミンＤ誘導型皮膚炎症
ビタミンＤアナログカルシポトリオール（Ｔｏｃｒｉｓ，Ｅｌｌｉｓｖｉｌｌｅ，ＭＯ）を、エタノール中に溶解し、終濃度２ｎｍｏｌ／耳で、両側の耳に毎日投与した。対照動物は、エタノールのみを与えた。耳の膨張を、技術者用圧力計（Ｐｅａｃｏｃｋ，Ｊａｐａｎ）を用いて毎日測定し、そして血液を、４日目および８日目に採集した。この血液を、１０，０００ｒｐｍで５分間にわたって遠心分離して血清を分離し、これをＥＬＩＳＡによって分析するまで−８０℃で凍結させた。カルシポトリオール投与を、８日目（Ｂａｌｂ／ｃマウス）または１１日目（Ｃ５７ＢＬ／６マウス）に停止し、耳を回収して、病理学的評価のために１０％ホルマリン中で保存するか、またはｍＲＮＡ抽出のために液体窒素中で直接凍らせた。
【０１０６】
実施例３
ＩＬ−１９血清レベルは、ＴＳＬＰの非存在下で低下する
実施例２において記載された動物由来の血清を、カルシポトリオール処理の４日目および８日目において採集し、特異的ＥＬＩＳＡによって評価した。ＩＬ−１９を、カルシポトリオール処理マウスの血清において高レベルで検出した。興味深いことに、ＴＳＬＰ抗体で処置されたマウスは、対照群と比較して、ＩＬ−１９血清レベルにおいて有為な低下を示した（図２）。さらに、ＩＬ−１９と同じファミリーのサイトカインでありＩＬ−１９と同じレセプター複合体に結合するＩＬ−２０は、同じ低下を示さなかった。実際に、ＩＬ−２０の血清レベルは、異なる処置群の間で同じであり、このことは、ＩＬ−２０は、ＴＳＬＰとは独立して調節されることを示唆した。
【０１０７】
ＩＬ−１９はまた、ＴＳＬＰ−Ｒ  ＫＯマウス由来の血清においても測定された。ＴＳＬＰ−Ｒ  ＫＯマウス（Ｂａｌｂ／ｃバックグラウンド）を、Ｄｒ．Ｗ．Ｌｅｏｎａｒｄ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤから得た（Ａｌ−Ｓｈａｍｉ  Ａ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００：１５９−１６８（２００４年））。図３は、ＴＳＬＰＲ  ＫＯマウスが、４０ｍｐｋの中性化ＴＳＬＰ抗体（ＩＣ８、標準的手順を使用して自ら作製したラットＩｇＧ１抗マウスＴＳＬＰ中性化抗体）で処置したカルシポトリオール処理マウスよりもなお低いＩＬ−１９の血清レベルを有したことを示す。カルシポトリオールで処理されたがイソ型対照（自ら作製し２５Ｄ２と名付けたラットＩｇＧ１対照抗体）を与えられたマウスは、ＩＬ−１９のレベルにおいて低下を示さない。エタノールおよびイソ型対照（２５Ｄ２）で処理された対照群は、何ら炎症を示さず、従って、低いレベルのＩＬ−１９であった。「希釈剤」とラベルされたレーンは、抗体処方緩衝液（２０ｍＭ  酢酸Ｎａ、７％ショ糖、ｐＨ５．５）中の０．１ｍｇ／ｍｌの低過酸化物Ｔｗｅｅｎ  ２０からなる対照を示す。
【０１０８】
マウスの群に、カルシポトリオール処理の１日前に、中性化ＴＳＬＰ抗体（２２Ｅ５）の単回注射を、種々の用量（０．１ｍｐｋ〜１２０ｍｐｋ）で与え、血清ＩＬ−１９レベルを評価した。図４は、遮断ＴＳＬＰ  Ａｂの濃度の増大におけるＩＬ−１９の明らかな阻害を示すが、イソ型対照ｍＡｂ（５Ｇ５）で処理されたマウスからの血清は、カルシポトリオール処理対照マウスと類似のＩＬ−１９レベルを有した。図４は、カルシポトリオール処理マウスの血清におけるＩＬ−１９の遮断ＴＳＬＰ  Ａｂによる阻害は、用量依存的であることを示す。
【０１０９】
ＴＳＬＰの血清レベルは、カルシポトリオール処理の４日目にピークを迎え、そしてゆっくりと下がる。ＩＬ−１９とＴＳＬＰとの間の相互関係をさらに決定するために、用量および動態学研究を、増大した用量のＴＳＬＰ  Ａｂ（０．１ｍｐｋ〜４ｍｐｋの２２Ｅ５）を用い、および３０分、３時間、１日から９日目まで毎日の異なる時点で血清を採集して、実施した。図５に示されるように、ＴＳＬＰの非存在下では、僅かなＩＬ−１９しか血清中に分泌されない。しかし、ＴＳＬＰ濃度が４日目にそのピークに達すると、ＩＬ−１９分泌が誘導され、さらに９日目まで増大する。同様に、処理マウスの耳皮膚におけるｍＲＮＡレベルは、ＩＬ−１９と同じ傾向を示し、およびそのレセプターＩＬ−２０Ｒ１／ＩＬ−２０Ｒ２はカルシポトリオール処理後４日目において誘導される。図６。
【０１１０】
材料および方法
ＥＬＩＳＡ
マウスＩＬ−１９についてのＥＬＩＳＡを、プレート（Ｎｕｎｃ，Ｍａｘｉ−Ｓｏｒｐ  Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を１００μｌ  ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌのラット抗マウスＩＬ−１９  ｍＡｂ（１１５５，ＩｇＧ２ａ，自ら作製）で室温で一晩コーティングすることによって実施した。１時間にわたって１％  ＢＳＡでブロッキングした後、プレートを洗浄し、マウスｒＩＬ−１９（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を標準として用いた。血清サンプルを、ＰＢＳ  ０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０中に希釈し、プレートを、２時間にわたって室温にてシェーカー上でさらにインキュベートした。洗浄後、ポリクローナルヤギ抗マウスＩＬ−１９ビオチン（ｅＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で１μｇ／ｍｌにて添加した。プレートを、さらに２時間インキュベートし、洗浄し、そしてｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ−ペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、５００倍希釈にて添加した。３０分間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、ＴＭＢ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，ＭＤ）を加えた。反応を、１Ｍリン酸を用いて停止し、吸光度を、Ｖｍａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて４５０〜５７０ｎｍにて読み取り、データを、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏソフトウェアを用いて分析した。マウスＩＬ−２０、マウスＴＳＬＰおよびヒトＩＬ−１９を検出するＥＬＩＳＡを、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓからのキットを用いて評価した。ＥＬＩＳＡを、製造業者の指示に従って実施した。
【０１１１】
ｍＲＮＡ抽出および実時間定量的ＰＣＲ
ＲＮＡ抽出を、標準的技術を用いて実施し、そして遺伝子発現を、Δ−ΔＣｔ方法を用いて計算した。（ユビキチン−Ｃｔ目的の遺伝子についての平均サイクル閾値）×ｌ０＾４を使用して、値を正規化した。
【０１１２】
実施例４
カニクイザル皮膚における皮膚病変はＩＬ−１９を含む
ＩＬ−１９は、マウス以外の種においても検出され得るか否かを決定するために、カニクイザル由来の皮膚を試験した。これらのサルは、チリダニによって引き起こされる喘息における研究の一部であり（Ａｙａｎｏｇｌｕ  Ｇ．ら、Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．３７：５４１（２０１１年））、研究の過程の後期の間には、同時にアトピー性皮膚炎皮膚病変の発症も見出された。試験した遺伝子の他に、３６の遺伝子（ＩＬ−１９を含む）を、少なくとも１つの病変において情報制御した（データ示さず）。次いで、カニクイザル病変皮膚由来のｍＲＮＡを、カルシポトリオール処理マウス耳から単離されたｍＲＮＡと比較した。ＩＬ−１９を含む数個の遺伝子が、両種において誘導されることが見出された。
【０１１３】
材料および方法
カニクイザル皮膚
皮膚サンプルを、チリダニ（ＨＤＭ）誘導型喘息における研究（Ａｙａｎｏｇｌｕ  Ｇ．ら、Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．３７：５４１（２０１１年）に参加しているカニクイザルであるマカクから得た。（２年を超える）経時的に、この動物は、アトピー性皮膚炎に似た同時の病変を発症した。病変生検をとり、即時に液体窒素中で冷凍した。サンプルを、−８０℃で、処理まで保存し、ＴａｑｍａｎによるｍＲＮＡ発現について分析した。
【０１１４】
実施例５
ヒト組織培養物におけるＩＬ−１９
ヒトサンプルにおいてＩＬ−１９を評価するために、形成手術を受けた患者由来の皮膚を、２〜３ｍｍ３の小片に切り、培地のみ、またはＴＳＬＰの最適な分泌を促進することが示されているサイトカイン混合物（ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＴＮＦ−α）含有培地の中で、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ組織培養インサート（組織培養物）上に置いた。種々の時点で上清を回収し、特異的ＥＬＩＳＡを用いて分析した。図７に示されるように、ＩＬ−１９は、これらの上清から、培養の４８時間と７２時間との間で、ＩＬ−１９濃度において閾値のほぼ３倍近くの増大が容易に検出可能であった。データは、これらの培養物におけるＩＬ−１９の時間依存的誘導を明らかにする。
【０１１５】
次の工程において、増大する濃度（５ｎｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌ）の中性化ＴＳＬＰ抗体を、サイトカイン混合物を含有する培養物に添加し、種々の時点で上清を収集した。図８は、より高い濃度のＴＳＬＰ抗体（ｌμｇ／ｍｌを超える）が、これらの皮膚培養物中で、ＩＬ−１９のレベルを有意に低下させたことを示す。
【０１１６】
材料および方法
ヒト皮膚および組織培養物
ヒト皮膚を、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｈｏｓｐｉｔａｌにおいて形成手術（腹壁形成）を受ける承諾を得たドナーから得た。皮膚サンプルを、メス刃を用いて２〜３ｍｍ３の小片に切り、０．４μｍ  Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ培養インサート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）上に置いた。皮膚組織片を、抗生物質、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１０％ウシ胎仔血清を補足したＲＰＭＩ  １６４０中、培地のみの中、またはＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１３（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＴＮＦ−α（１００ｎｇ／ｍｌ）を補足した培地中で、培養した。組織を、空気−液体間期において保存した。上清を、示された時点で回収し、特異的ＥＬＩＳＡを用いて解析するまで凍結し続けた。いくつかの研究において、ＴＳＬＰ抗体（クローン２３Ｂ１２、ヒト化ＩｇＧｌ、自ら作製したロット８７ＡＣＶ）またはイソ型対照抗体（Ｘｏｌａｉｒ，ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ＩｇＧ１，ロット７６ＡＢＷ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｓｉｓｃｏ，ＣＡ）を、サイトカインと共に加えた。
【０１１７】
実施例６
アトピーパッチ試験を受ける患者におけるＩＬ−１９およびＴＳＬＰの発現
アトピー性皮膚炎患者を、プロトコールに含め、ここで、病変皮膚および非病変皮膚の生検を得、そして生検読み出しによるアトピーパッチ試験（ＡＰＴ）を実施した。各生検を、２つの部分に分けた：１つを包埋して免疫組織化学のために使用し、そして他方を凍結して、遺伝子発現分析のために用いた。アトピー性皮膚炎患者は、上皮においてＩｇＥを保有するランゲルハンス細胞を有するので、非病変皮膚におけるアレルゲンの適用（ＡＰＴ）は、アレルゲン適用の場所において、４８〜７２時間以内に、概して、巨視的に視認可能な湿疹性の反応を誘発する。この反応は、炎症細胞、主にＴｈ２型の細胞の流入により、顕微鏡によって性質決定される。湿疹性の反応は、７２〜９６時間後に自然に消える。
【０１１８】
表１は、この研究に組み込まれた１０人の患者由来の、ｑＰＣＴによって決定されるＩＬ−１９  ｍＲＮＡ発現データを示す。患者１、２、３、４、９および１０において、ＩＬ−１９  ｍＲＮＡ発現を、病変皮膚由来の生検およびＡＰＴ試験に曝された皮膚由来の生検において、有意に情報制御した。さらに、ＴＳＬＰは、同じ生検において、免疫組織化学によって検出可能であった（データは示さず）。患者５、６、７および８は、ＡＰＴ試験に対する非応答者であると考えられ、２４時間目に採取したその生検は、ＩＬ−１９の高いレベルを示さない。興味深いことに、これらの患者（５、６、７および８）の同じ生検において、これらの生検サンプル中で、ＴＳＬＰの発現は、免疫組織化学によって検出されなかった。
【０１１９】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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