(57)【要約】その代謝過程において二酸化炭素を生成するまたは二酸化炭素を必要とする遺伝子改変された生物学的培養物を使用して生物学的生成物を製造するための、制御されない環境において作動され得る、排気気体を再循環させる単回使用閉鎖バイオリアクタが報告される。一局面において、本発明の制御されない環境における使用に適した閉鎖バイオリアクタは、ａ．栄養培地と生物学的培養物とを含むコンテナ；ｂ．少なくとも１つの気体出口；ｃ．前記コンテナ内の気体を再循環させるためにチューブを介して前記気体出口に接続され、かつ気体の供給源にさらに接続された、少なくとも１つの気体入口；ｄ．少なくとも１つの液体ポート；ｅ．気体の前記供給源と前記気体入口との間に取り付けられた滅菌フィルタなどを備える。
2015500030.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
制御されない環境における使用に適した閉鎖バイオリアクタであって、
ａ．栄養培地と生物学的培養物とを含むコンテナ；
ｂ．少なくとも１つの気体出口；
ｃ．前記コンテナ内の気体を再循環させるためにチューブを介して前記気体出口に接続され、かつ気体の供給源にさらに接続された、少なくとも１つの気体入口；
ｄ．少なくとも１つの液体ポート；
ｅ．気体の前記供給源と前記気体入口との間に取り付けられた滅菌フィルタ；
ｆ．前記滅菌フィルタ（ｅ）と前記気体入口との間に取り付けられた止め栓；
ｇ．前記液体ポートにおいて取り付けられた滅菌フィルタ；
ｈ．滅菌フィルタ（ｇ）と前記液体ポートとの間に取り付けられた止め栓；
ｉ．前記気体出口と前記気体入口との間で接続された前記チューブ中に取り付けられた蠕動ポンプ；および
ｊ．前記気体入口に接続され、かつ前記コンテナ中に設置された、少なくとも１つのスパージングフィルタ
を含む、閉鎖バイオリアクタ。
【請求項２】
ＩＳＯ  １４６４４  Ｃｌａｓｓ  ９以上の制御されない環境中に存在する、請求項１に記載の閉鎖バイオリアクタ。
【請求項３】
前記コンテナに支持を提供する外部支持ハウジングをさらに含む、請求項１に記載の閉鎖バイオリアクタ。
【請求項４】
前記栄養培地が、気化、撹拌、揺動、振盪、振動および／または前記コンテナに対する圧縮によって混合される、請求項１に記載の閉鎖バイオリアクタ。
【請求項５】
５μよりも大きい粒子を保持することが可能なフィルタ排出管をさらに含む、請求項１に記載の閉鎖バイオリアクタ。
【請求項６】
前記生物学的培養物が、ヒト細胞、動物細胞、細菌、植物細胞、昆虫細胞、酵母または真菌である、請求項１に記載の閉鎖バイオリアクタ。
【請求項７】
前記生物学的培養物が、前記生物学的培養物の代謝過程において二酸化炭素を生成する、請求項１に記載のバイオリアクタ。
【請求項８】
前記生物学的培養物が、前記生物学的培養物の代謝過程のために二酸化炭素を必要とする、請求項１に記載のバイオリアクタ。
【請求項９】
複数の遠隔操作されるセンサをさらに含む、請求項１に記載の閉鎖バイオリアクタ。
【請求項１０】
前記遠隔操作されるセンサが、酸素センサおよび二酸化炭素センサを含む、請求項９に記載の閉鎖バイオリアクタ。
【請求項１１】
前記栄養培地のための温度コントローラをさらに含む、請求項１に記載の閉鎖バイオリアクタ。
【請求項１２】
前記コンテナが無菌である、請求項１に記載の閉鎖バイオリアクタ。
【請求項１３】
前記コンテナが使い捨てである、請求項１に記載の閉鎖バイオリアクタ。
【請求項１４】
前記コンテナが可撓性である、請求項１に記載の閉鎖バイオリアクタ。
【請求項１５】
前記コンテナが、生体適合性ポリマーを含む、請求項１に記載の閉鎖バイオリアクタ。
【請求項１６】
前記スパージングフィルタが、前記閉鎖バイオリアクタの作動の間に前記栄養培地中に浸漬される、請求項１に記載の閉鎖バイオリアクタ。
【請求項１７】
ソーダ石灰、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、ケイ酸リチウム、ジルコニウム酸リチウム（lithium zirconate）、酸化リチウム、活性炭、ゼオライトおよびイオン交換樹脂を含む吸収剤材料の群から選択される二酸化炭素吸収剤材料を含む、前記気体出口に接続されたインラインカートリッジをさらに含む、請求項１に記載の閉鎖バイオリアクタ。
【請求項１８】
生物学的生成物を生成するための方法であって、前記方法は：
ａ．コンテナを含む閉鎖バイオリアクタを提供するステップであって、前記閉鎖バイオリアクタが、
ｉ．少なくとも１つの気体出口；
ｉｉ．前記コンテナ内の気体を再循環させるためにチューブを介して前記気体出口に接続された、少なくとも１つの気体入口；
ｉｉｉ．少なくとも１つの液体ポート；
ｉｖ．前記気体入口において取り付けられた滅菌フィルタ；
ｖ．前記滅菌フィルタ（ｉｖ）と前記気体入口との間に取り付けられた止め栓；
ｖｉ．前記液体ポートにおいて取り付けられた滅菌フィルタ；
ｖｉｉ．前記滅菌フィルタ（ｖｉ）と前記液体ポートとの間に取り付けられた止め栓；
ｖｉｉｉ．前記気体出口と前記気体入口との間の前記チューブ中に取り付けられた蠕動ポンプ；
ｉｘ．前記気体入口に接続され、かつ前記コンテナ中に設置された、少なくとも１つのスパージングフィルタ；および
ｘ．温度コントローラ
を含む、ステップ；
ｂ．前記コンテナに栄養培地を添加するステップ；
ｃ．５％〜１００％の二酸化炭素を含む新鮮な気体の、前記気体入口への供給を接続し、前記供給をオンにするステップであって、前記新鮮な気体は、前記（ａ）（ｉｘ）のスパージングフィルタを通過して栄養培地中に入る、ステップ；
ｄ．前記栄養培地において所定の濃度の二酸化炭素に達したときに、新鮮な気体の前記供給をオフに切り替えるステップ；
ｅ．前記（ａ）（ｖｉｉｉ）の蠕動ポンプを始動させて、前記（ａ）（ｉｉ）の気体入口を介して、前記コンテナ中の気体を再循環させるステップ；
ｆ．前記温度コントローラを起動させるステップ；
ｇ．十分な量の生物学的培養物を前記栄養培地に添加するステップ；
ｈ．時間間隔で、前記コンテナ中の前記栄養培地における前記生物学的培養物の密度を検出するステップ；
ｉ．前記栄養培地中の二酸化炭素の濃度が所定のレベルより下に低下したときに新鮮な気体の流れを間欠的に始動させ、前記新鮮な気体の前記流れを、前記栄養培地中の二酸化炭素の濃度が所定のレベルに上がるまで継続させるステップ；ならびに
ｊ．前記生物学的培養物および前記生物学的培養物により生成された生物学的生成物を、前記コンテナから取り出すステップ
を含む、方法。
【請求項１９】
生物学的生成物を生成するための方法であって、前記方法は：
ａ．コンテナを含む閉鎖バイオリアクタを提供するステップであって、前記閉鎖バイオリアクタが、
ｉ．少なくとも１つの気体出口；
ｉｉ．前記コンテナ内の気体を再循環させるためにチューブを介して前記気体出口に接続された、少なくとも１つの気体入口；
ｉｉｉ．少なくとも１つの液体ポート；
ｉｖ．前記気体入口において取り付けられた滅菌フィルタ；
ｖ．前記（ｉｖ）の滅菌フィルタと前記気体入口との間に取り付けられた止め栓；
ｖｉ．前記液体ポートにおいて取り付けられた滅菌フィルタ；
ｖｉｉ．前記（ｖｉ）の滅菌フィルタと前記液体ポートとの間に取り付けられた止め栓；
ｖｉｉｉ．前記気体出口と前記気体入口との間の前記チューブ中に取り付けられた蠕動ポンプ；
ｉｘ．前記気体入口に接続され、かつ前記コンテナ中に設置された、少なくとも１つのスパージングフィルタ；
ｘ．温度コントローラ；および
ｘｉ．前記気体出口と前記気体入口との間に取り付けられた、二酸化炭素吸収剤材料を含むインラインカートリッジ、
を含む、ステップ；
ｂ．前記コンテナに栄養培地を添加するステップ；
ｃ．５％〜１００％の酸素を含む新鮮な気体の供給を接続し、前記供給をオンにするステップであって、前記新鮮な気体は、前記（ａ）（ｉｘ）のスパージングフィルタを通過して前記栄養培地中に入る、ステップ；
ｄ．前記栄養培地において所定の濃度の酸素に達したときに、新鮮な気体の前記供給をオフに切り替えるステップ；
ｅ．前記（ａ）（ｖｉｉｉ）の蠕動ポンプを始動させて、前記（ａ）（ｉｉ）の気体入口を介して、前記コンテナ中の気体を再循環させるステップ；
ｆ．前記温度コントローラを起動させるステップ；
ｇ．十分な量の生物学的培養物を前記栄養培地に添加するステップ；
ｈ．時間間隔で、前記コンテナ中の前記栄養培地における前記生物学的培養物の密度を検出するステップ；
ｉ．前記栄養培地中の二酸化炭素の濃度が所定のレベルより下に低下したときに新鮮な気体の流れを間欠的に始動させ、前記新鮮な気体の前記流れを、前記栄養培地中の二酸化炭素の濃度が所定のレベルに上がるまで継続させるステップ；ならびに
ｊ．前記生物学的培養物および前記生物学的培養物により生成された生物学的生成物を、前記コンテナから取り出すステップ
を含む、方法。
【請求項２０】
前記コンテナの内側の圧力が、前記新鮮な気体の間欠的な前記流れによって所定の範囲内に維持される、請求項１８または１９に記載の生物学的生成物を生成するための方法。
【請求項２１】
前記生物学的培養物が哺乳動物細胞である、請求項１８に記載の生物学的生成物を生成するための方法。
【請求項２２】
前記生物学的培養物が細菌である、請求項１９に記載の生物学的生成物を生成するための方法。
【請求項２３】
前記コンテナが、フィルタ排出管をさらに含む、請求項１８または１９に記載の生物学的生成物を生成するための方法。
【請求項２４】
前記栄養培地中の前記生物学的生成物を捕捉することが可能な樹脂が、前記液体ポートを介して添加され、そして前記生物学的生成物が前記樹脂によって捕捉された後に、前記栄養培地が前記フィルタ排出管を介して排出される、請求項２３に記載の生物学的生成物を生成するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＳＯ  １４６４４  Ｃｌａｓｓ  ９以上の制御されない環境において使用され得る、バイオリアクタ作動のコストを実質的に低減させるバイオリアクタの設計に関する；本発明は、完全に閉鎖されたシステムを報告し、このシステムでは、排気気体は、バイオリアクタ内を再循環し、過剰な二酸化炭素は、化学吸収によって除去され、酸素または二酸化炭素の必要とされる圧力は、新鮮な気体供給を提供することによって、栄養培地において維持される。
【背景技術】
【０００２】
活性な薬物実体は、ヒト細胞および動物細胞、細菌、酵母、植物細胞、ハイブリドーマ、および複製し、かつ代謝を生じることが可能な任意のかかる生物学的組成物を含む、生物学的培養物から誘導される場合が多い。さらに、生物学的実体は、器官ならびに細胞治療および遺伝子治療の生成物へと増殖される。これらの生物学的実体は、従来のバイオリアクタおよびより最近では使い捨てバイオリアクタを使用して、慣用的に増殖される。
【０００３】
バイオリアクタは、例えばヒトおよび動物の組織細胞、微生物、バキュロウイルスならびに昆虫細胞などの生物学的触媒（生物学的培養物）を使用して、栄養性要素を有用な生成物へと変換するデバイスである。バイオリアクタの主要な機能は、所望の生成物を取得するために、生物学的触媒の増殖のための制御された環境を提供することである。バイオリアクタの特定の設計要素に対して発行された数百の特許から明らかなように、バイオリアクタの多数の設計が利用可能である。種々の容器および方法が、化学的、生化学的および／または生物学的処理を実施するために、数年間にわたって開発されてきた。
【０００４】
バイオリアクタシステムおよび関連のプロセスは周知であるが、かかるシステムおよびプロセスに対する改善は、生物学的供給源から生成される種々の生成物の調製において有用である。１つのかかる改善は、バイオリアクタが作動される環境である。薬物およびワクチンの製造では、ＩＳＯ  １４６４４  Ｃｌａｓｓ  ８または１平方フィート当たり０．５ｕｍの粒子１００，０００個以下のＣｌａｓｓ  Ａｒｅａ分類が要求される。この空気品質を維持するために、空気は、ＨＥＰＡフィルタを継続的に通過させられ、１時間当たり約２０回の空気交換が要求される。この空気品質標準を維持するために、必要とされるＨＶＡＣシステム、ＨＥＰＡフィルタおよび継続的な空気クリーニングが、かなりの資本およびエネルギーコストに付け加わり、これにより、小さな企業または研究組織が、ヒトでの使用のための薬物およびワクチンを生成することが不可能になっている場合が多い。１年中１日２４時間作動する、０．１３５ドル／ｋＷ／ｈの使用料金（２０１１年８月について、労働統計局、米国政府）の、１時間当たり１００万立方メートルのエアフローを必要とする製造施設を例にとると、ファンのみを作動させるコストは、５０万ドルを超えることになる。他の顕著なコストは、定期的に取り替えが必要なＨＥＰＡフィルタであり、総コストに対してもう５０万ドルを付け加える。ＨＶＡＣシステムの資本コストも非常に高い；１平方フィート当たりおよそ２００ドルが、ＨＶＡＣシステムのために付け加わる。１００，０００平方フィートの施設では、これは、事業のコストに約２０００万ドルを付け加える。これらのコストは、大きな製薬企業およびバイオテクノロジー企業にとってはあまり深刻ではないが、これらのコストを賄う余裕がないより小さい企業および研究機関による薬物の開発にとって、重要な障壁を形成している。
【０００５】
薬物またはワクチンが緊急に製造される必要があり得る場合もまた存在し、その場合には、クリーンルーム環境の必要性が、開発および製造を妨げる。
【０００６】
高価なＨＶＡＣシステムの必要性がない、合理的にクリーンな環境において作動され得るバイオリアクタシステムを創出する、緊急の満たされない必要性が存在する。大気は、１平方フィート当たり約２５０万個の粒子を有しており、室内空気は、サイズ０．５ｕｍ以上の粒子約１００万個を有している。室内空気は、ＩＳＯ  １４６４４  Ｃｌａｓｓ  ９または世界保健機関によって提供されるｃＧＭＰガイドラインに従うレベル１として分類される；室内空気はまた、制御されないエリア分類としてラベルされる。制御された環境を必要とする理由には、環境から生成物を保護すること、およびまた生成物から人を保護することが含まれる。ＨＶＡＣシステムはまた、交差汚染を防止し、製造された薬物の安全性を保証する際の最も重要なステップの１つと一般にみなされる。
【０００７】
ＩＳＯ  １４６４４  Ｃｌａｓｓ  ９環境においてバイオリアクタを作動させるために、バイオリアクタは、このバイオリアクタの作動の全てのステップにわたり環境からバイオリアクタを完全に密封する重要な特徴を有するべきである。一旦これが検証でき、従って、環境とバイオリアクタの内容物との間のいかなる接触も存在し得ないことが保証できると、ＩＳＯ  １４６４４  Ｃｌａｓｓ  ９環境でこれらのバイオリアクタを作動させることが可能になる。しかし、バイオリアクタは、酸素および二酸化炭素を含む栄養の供給を必要とし、環境による汚染なしにバイオリアクタの内側の流れを維持することは、満足いくようには満たされていない挑戦である。
【０００８】
先行技術は、交差汚染の危険性を最小化する使い捨てベースのユニット作動から構成される、特許権で守られた一連のＦｌｅｘＦａｃｔｏｒｙプロセスを使用することを目的とする、Ｘｃｅｌｌｅｒｅｘ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｘｃｅｌｌｅｒｅｘ．ｃｏｍ／ｆｌｅｘｆａｃｔｏｒｙ−ｄｅｓｉｇｎ．ｈｔｍ）によって提供されるシステムに注意を向けている。各ユニット作動は、一般的な制御された製造空間において共局在化された、制御された環境モジュール（ＣＥＭ）中に囲まれている。このＣＥＭは、部屋に対する陽圧を用いて、設備の周りに局限させたクリーン環境を提供する。ＦｌｅｘＦａｃｔｏｒｙ  ＣＥＭについての環境標準は、従来のクリーンルーム標準に基づく。操作者は、ＣＥＭの外側に立ち、光彩ポートを介して設備アクセスにアクセスする。複数のエアロックならびに更衣室および再更衣室の必要性が排除される。このシステムは、作動の隔離を提供するが、システムにおいて欠陥が起こらないことを確実にするための明確な方法が存在せず、欠陥が起こる場合には、その欠陥が生成物を直ぐに汚染するので、このプランには不備がある。この概念は、いくつかの適用を有するが、監督官庁が生物学的薬物の商業的生成のためにＦｌｅｘＦａｃｔｏｒｙの使用を許可する可能性は低い。
【０００９】
本発明は、完全に閉鎖されたバイオリアクタを提供し、このバイオリアクタでは、全ての入口は、０．２２ミクロンのフィルタを介して提供され、排気は再循環し、栄養培地出口は、バイオリアクタに排出の準備ができるまで、密封して維持される。さらに、生物学的培養物の導入および製造された生成物の取り扱いなどの、クリーンルーム曝露が必要とされる全ての接触は、制御された環境において実施される。
【００１０】
本発明の閉鎖バイオリアクタは、それを設置すべきＦｌｅｘＦａｃｔｏｒｙの物理的空間の制限なしに作動され得、任意のサイズのものであり得、ＦｌｅｘＦａｃｔｏｒｙの制限、環境からの生成物の継続的な保護および生成物からの環境の継続的な保護を提供する。ＦｌｅｘＦａｃｔｏｒｙと本発明との間の主要な差異は、本発明は生成物を直接保護するが、ＦｌｅｘＦａｃｔｏｒｙは、生成物を保持するコンテナの周囲の保護を提供することである。
【００１１】
本発明はまた、単回使用または使い捨てのバイオリアクタを報告する。バイオリアクタの設計における従来の欠点が、使い捨てバイオリアクタの開発につながっている。過去１０年間の間に、交差汚染を回避し、バッチ間の検証（クリーニング）のコストを低減させるために、使い捨てバイオリアクタまたは単回使用バイオリアクタ（ＳＵＢ）を使用することに向けた顕著な進展があった；ウイルス汚染のリスクは、これらの単回使用バイオリアクタの開発をさらに急がせた。単回使用バイオリアクタの設計は、撹拌タンクを模倣し得るが、これは、埋め込まれたまたは磁気により駆動される撹拌子を有する使い捨てライナーが使用される一方、揺動運動型のバイオリアクタは、内部撹拌なしに使用されるからである。この分野における顕著な発展にもかかわらず、これらの型のバイオリアクタの利用は、高速の酸素化を必要とする細胞または生物についてはあまり成功しておらず、これは、酸素化が、使い捨てシステムでは容易に可能でない強い撹拌を必要とするからである。ＳＵＢの例は、波動かき混ぜに基づくシステムである。例えば、米国特許第６，５４４，７８８号；ＰＣＴ公開ＷＯ００／６６７０６号を参照のこと。この型のバイオリアクタは、単一の使い捨てコンテナにおいて、比較的感受性の細胞、例えば、ＣＨＯ細胞（例えば、Pierce、Bioprocessing J. ３巻：５１〜５６頁（２００４年））、ハイブリドーマ細胞（例えば、Lingら、Biotech. Prog.、１９巻：１５８〜１６２頁（２００３年））、昆虫細胞（例えば、Weberら、Cytotech. ３８巻：７７〜８５頁（２００２年））および足場依存的細胞（例えば、Singh、Cytotech. ３０巻：１４９〜１５８頁（１９９９年））を培養するために使用され得る。かかる使い捨てユニットは、比較的安価であり、その単回使用に起因して感染のリスクを減少させ、気体交換を促進する内部撹拌部品を必要としない。栄養培地を混合するためのより一般的な技術には、揺動、振盪、振動、コンテナ壁の圧縮、および気泡リアクタにおける気体を使用した液体の撹拌が含まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第６，５４４，７８８号明細書
【特許文献２】国際公開第００／６６７０６号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明のバイオリアクタコンテナは、制御されない環境（ＩＳＯ  １４６４４  Ｃｌａｓｓ  ９）において、全ての型の細胞および生物を増殖させるために設計される。酸素および二酸化炭素などの必要とされる気体があれば適切な量の栄養素が利用可能になる、閉鎖システムが提供される。薬物製造において大抵遭遇する２つの型の反応、細胞または生物が、例えば細菌の場合にはその増殖の過程において二酸化炭素を生成する反応、または例えば哺乳動物細胞の場合には炭素の供給源として細胞が二酸化炭素を必要とする反応が存在する。
【００１４】
生物が酸素を必要とする場合、最終生成物はしばしば二酸化炭素であり、細菌発酵のための使い捨てバイオリアクタの設計に対する重要な課題を提示するが、それは、これが、非常に大きい容量の空気または酸素を栄養培地を介して通過させて、酸素を部分的に提供し、細菌の増殖にとって有害な二酸化炭素（栄養培地中に溶解している）を部分的に除去することを必要とするからである。高レベルの二酸化炭素生成物は、細菌の増殖にさらに有害である低ｐＨを生じる。室内空気は一般に、約０．０３５％の二酸化炭素を含むが、呼気のヒト空気は約５％の二酸化炭素を有する。長期にわたる１．５パーセントの二酸化炭素への健康な個体の曝露は、軽度の問題を引き起こすが、７パーセント〜１０パーセントの二酸化炭素への曝露は、数分以内に意識不明を生じる。これは、より高い濃度では、二酸化炭素は、空気中の酸素を駆逐し得るからである。このために、二酸化炭素は、製造施設の必要な換気についての規制基準を必要とする「単純な窒息剤」と呼ばれる。例えば、ＡＳＨＲＡＥ  ６２は、床面積１平方フィート当たり少なくとも０．１２ＣＦＭの新鮮な空気入口を必要とする。
【００１５】
我々が呼吸する空気は、主に４種の気体から構成される：窒素（７８％）、酸素（２１％）、アルゴン（０．９４％）、二酸化炭素（０．０４％）。我々が空気中で呼吸する場合、我々の身体は、その酸素を消費し、酸素を二酸化炭素に変換する。呼気の空気は、約４．５パーセントの二酸化炭素を含む。我々の身体は、窒素またはアルゴンには何もしない。同じことは、代謝のために酸素を利用する生物学的生物についてもあてはまる。重要な２種の気体、酸素および二酸化炭素のみが存在するので、バイオリアクタの排気から出てくる窒素およびアルゴンを再使用できない理由は見当たらない。このことが進歩的であり、完全に閉鎖されたシステムの使用を可能にしつつ、空気中の有用な構成要素だけが利用される。
【００１６】
標準的なバイオリアクタ作動は、環境へと流出気体を排気するが、排気の開放端は、バイオリアクタの内容物の汚染の恒久的なリスクを生み出す；使い捨て可撓性コンテナをバイオリアクタとして使用する場合には、部屋からの空気がコンテナ中に吸い込まれ得る高い可能性があることを認識することが重要である；バイオリアクタから気体を排気することは、制御された環境の使用を必要とし得る汚染の可能性をもたらす。この問題を解決するための１つの解法は、バイオリアクタにおける全ての排気を排除することである；その代わり、バイオリアクタ中の空気が再循環されるが、二酸化炭素が栄養培地中で生成される場合、再循環する空気から二酸化炭素を除去する必要性が生じる。空気からの二酸化炭素の除去または空気からの二酸化炭素のスクラビングのための方法については、多数の先行技術が存在する。これらは通常、Ｋｒａｆｔプロセスの変法を使用することを含む。スクラビングプロセスは、水酸化ナトリウムに基づき得る。まず、二酸化炭素は、アルカリ性ＮａＯＨ溶液によって吸収されて、溶解した炭酸ナトリウムを生成する。炭酸イオンは、方解石（ＣａＣＯ３）の沈殿を生じる水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）２）との反応によって、溶液から除去される。スペースシャトルオービター上の再生式二酸化炭素除去システム（ＲＣＲＳ）は、再利用されない生成物のない、二酸化炭素の継続的な除去を提供するツーベッド（ｔｗｏ−ｂｅｄ）システムを使用する。再生可能なシステムは、その吸着剤キャニスターを補給する必要なしに、宇宙空間におけるシャトル任務のより長い滞在を可能にする。再生不能な古い水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）ベースのシステムは、再生可能な金属酸化物ベースのシステムによって置き換えられつつある。金属酸化物に基づくシステムは、金属酸化物吸着剤キャニスターおよび再生器アセンブリから主になる。このシステムは、吸着剤材料を使用して二酸化炭素を除去し、次いで吸着剤材料を再生させることによって機能する。金属酸化物吸着剤は、そのキャニスターを介して、約４００°Ｆに加熱した空気を７．５ｓｃｆｍで１０時間にわたりポンピングすることによって再生される。本発明は、完全に閉鎖されたシステムに基づくので、再生可能なシステムは使用できず、一般にはバイオリアクタに戻すことのできる水である副生成物を保持するためのスクラバーデバイスの設計において対策がなされる。
【００１７】
活性炭は、二酸化炭素スクラバーとして使用され得る。ソーダ石灰、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムおよび水酸化リチウムなどの種々の強塩基は、二酸化炭素との化学反応によって二酸化炭素を除去することが可能である。特に、水酸化リチウムは、大気から二酸化炭素を除去するために、宇宙船に乗せて使用される。水酸化リチウムは、二酸化炭素と反応して炭酸リチウムを生成する。
【００１８】
本発明は、ソーダ石灰などの化学物質を含有するカートリッジを取り付けることによって、バイオリアクタ中で生成された流出気体から二酸化炭素を除去する方法を含む；二酸化炭素が一旦除去されると、気体はバイオリアクタ中に戻され得る（必要とされる場合、溶液をかき混ぜる目的のためおよび酸素化のため）。生体反応に関わる空気の構成要素は酸素および二酸化炭素だけであり、従って、それらのレベルを操作する能力は、これらが新鮮な気体の導入によって補充される場合、閉鎖システム中の空気の再循環を可能にすることに注目すべきである。
【００１９】
特定の量の二酸化炭素が必要とされる生体反応（例えば、哺乳動物細胞）では、流出気体から二酸化炭素を除去する手段は必要とされない。
【００２０】
栄養培地中の酸素圧力は、多くの生体反応に重要であり、これは、必要に応じて滅菌フィルタを介して酸素気体（または酸素と空気もしくは窒素との混合物）を添加する手段を提供することによって、本発明において制御される。遠隔制御される栄養培地中のセンサは、必要に応じた栄養培地の酸素化を可能にする。哺乳動物細胞の場合などの、より高いレベルの二酸化炭素が必要とされる場合、投入気体は、空気と二酸化炭素との混合物または純粋二酸化炭素であり得る；やはりまた、入口気体の目的は、栄養培地中のこれらの気体の必要とされるレベルを提供することだけであり、一方でバイオリアクタ内の気体の再循環は、混合機能を提供し、再循環サイクルの間の化学的スクラビングを介して、気体、より具体的には二酸化炭素の排出を促進する手段としても機能する。
【００２１】
本発明は、可撓性または半可撓性の防水材料、好ましくはプラスチックから構築され得るコンテナからなる。プラスチックは、光透過性の性質のために選択され得る。特定の細胞は、明るい白色光または紫外線の照射に対して感受性であり得、これらの細胞について、コンテナは、これらの波長を吸収するプラスチックから製造され得る。同様に、他の種類の細胞、例えば植物細胞は、光の分光品質によって発生的に調節され得、これらの細胞について、培養コンテナは、所望の波長の光を選択的に透過するプラスチックから製造され得る。コンテナの製造に使用される材料の他の特徴は、種々の型の細胞または微生物を培養する際に重要であり得る。コンテナの内側は、所望の培養条件および細胞の種類に依存して、細胞接着を増加または減少させる物質で処理され得る。
【００２２】
好ましい実施形態では、このコンテナは、低密度ポリエチレンの内部層、エチレンビニルアルコールの気体障壁、低密度ポリエチレンの外部層およびポリエチレン製のポートから製造される；このコンテナは、３２５μｍのフィルム厚、ヘイズ５％（ＡＳＴＭ  Ｄ−１０３３）、０．４ｇ／ｍ２．日の水蒸気透過速度（ＡＳＴＭ  Ｆ−１２４９）、０．１ｃｍ３／ｍ２．日．バールの酸素透過率（ＡＳＴＭ  Ｄ−３９８５（２３℃、０％ＲＨ））、０．２ｃｍ３／ｍ２．日．バールの二酸化炭素透過率（Ｍｏｃｏｎ  Ｐｅｒｍａｔｒａｎ  Ｃ−ＩＶ（２３℃、０％ＲＨ））を有し、５０ＫＧｙの最大ガンマ放射線量によって滅菌される。このバッグは、４℃〜４０℃で使用される。
【００２３】
このコンテナは、気体または液体のための入口または出口として機能する１つまたは複数のポートを含む。これらのポートは、コンテナの構築に使用される材料と適合性の、剛性または半剛性材料から構築される。好ましい実施形態では、任意の標準的なプラスチックチュービングまたは成形プラスチックが、ポートを構築するために使用され得、これらは、標準的な技術に従ってコンテナの継ぎ目へと溶接される。種々のかかるポートは、例えば、医療用バッグまたは類似のコンテナにおける使用のために、市販されている。ポートを形成する構造もまた、例えば、異なる容量の培地、オートクレーブ技術およびポート機能を受け入れるために、変えられ得る。
【００２４】
本発明の使い捨てバイオリアクタは、好ましくは、使用前に予め滅菌される。種々の滅菌技術が使用され得る。技術の選択は、選択されるプラスチックの型に部分的に依存する（Leeら、１９９５年、Handbook of PolymericBiomaterials、CRC Press、BocaRaton、５８１〜５９７頁）。当該分野で一般的な滅菌技術には、乾式加熱、オートクレーブ、放射線照射およびエチレンオキシドガスが含まれるが、これらに限定されない。
【００２５】
本発明のバイオリアクタは、いくつかの手段によって物理的に支持され得る。このコンテナは、継ぎ目の外側のコンテナの上部の穴によって、またはコンテナの上部に付着したフックによって、吊り下げられ得る。あるいは、可撓性プラスチックコンテナは、市販の５５ガロンのプラスチックドラムなどの単純なシステムを含む剛性外部コンテナ中に置かれ得る。最後に、このコンテナは、それ自体を支持できる半可撓性プラスチックから構築され得る。
【００２６】
このバイオリアクタは、培養細胞および微生物の増殖を補助するために、任意選択のデバイスを備え得る。これらのデバイスには、温度計、気体評価システム（即ち、二酸化炭素または酸素）、ならびに細胞密度を評価するための手段および容量校正マーキングが含まれるが、これらに限定されない。
【００２７】
空気または他の気体は、気体入口ポートを介してコンテナ中に導入される。ポートを気体ポンプに接続するチュービングには、気体をバイオリアクタに導入する前に気流から微生物を濾過するために、少なくとも１つのフィルタが装着される。培養物が増殖し始め、培地の密度が増加すると高まる背圧に関わらず、バイオリアクタの内側の一定量の空気をポンピングすることを条件として、このチューブは、市販の空気ポンプと共に使用するために適合されることが好ましい。
【００２８】
スパージャは、コンテナ中に拡散される空気の量に依存して適切な直径のチューブまたはディスクを含む；このスパージャは、セラミックもしくは酸化アルミニウム材料、プラスチック、ケイ素または金属から一般に構築される。スパージング機能は、混合目的のためにコンテナを振盪または揺動する必要性を除去することが想定される。しかし、いくつかの例では、栄養培地を振盪する外部手段が必要であり得る。これは、揺動する、振盪する、回転させる、またはコンテナの壁を押すなどの、種々の既存の方法によって提供され得る。
【００２９】
本発明は、バイオリアクタを最初に増殖培地で満たすための入口ポート、または灌流システム中では、リサイクルされた培地または接種材料をさらに含む。
【００３０】
コンテナの上部における液体ポートは、このポート中への排気気体の進入を防止するために、培地の作業レベルより下に達するのに十分な長さのディップチューブに典型的に接続される。このポートはまた、発酵のプロセスの間に栄養素を添加するため（例えば、流加培養（ｆｅｄ−ｃｕｌｔｕｒｅ）技術を使用する場合）または灌流バイオリアクタ作動のプロセスにおいて取り出される任意の培地の置き換えを提供するために使用され得る。
【００３１】
生物学的培養物を添加するために使用されるポートが、サイクルの最後に栄養培地を取り出すこと、および栄養性供給の添加が、他端においてクリーン環境中に開放したチューブを介して行われることに、注目すべきである。これは容易に、バイオリアクタに隣接して取り付けられた層流フードであり得る。
【００３２】
本発明において提供されるバイオリアクタは、植物細胞、細菌、酵母、哺乳動物細胞および昆虫細胞が含まれるがこれらに限定されない広範な種々の細胞を増殖させるために使用され得る。さらなる適用は、器官を増殖させることおよび個別化医薬に基づく治療的介入を創出することにおいて見出され得る。培地および接種材料の組成が、広範な種々の細胞および生物を好気的に培養するために選択され得ることは、当業者に理解される。増殖の温度、空気の流れおよび培養の持続時間もまた、特定の細胞に適合するように調整され得る。他の調整には、異なる気体、例えば、植物細胞の場合には二酸化炭素もしくは硫黄細菌の場合には硫化水素による通気；または哺乳動物細胞の場合には細胞接着を促進するためのバイオリアクタ壁の処理が含まれ得る。
【００３３】
本発明は、上に記載され例示された実施形態に限定されず、添付された特許請求の範囲からの逸脱なしに、バリエーションおよび改変が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、二酸化炭素の除去を必要としない反応において使用するための単回使用閉鎖バイオリアクタの側面図である。
【図２】図２は、二酸化炭素の除去を必要とする反応において使用するための単回使用閉鎖バイオリアクタの側面図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
発明の詳細な説明
これらのバイオリアクタは、構築および作動が高価なＩＳＯ  １４６６４  Ｃｌａｓｓ  ８環境において一般に作動させられる。栄養培地を支持する容器内で全ての作動が実施される閉鎖バイオリアクタは、建設および維持がかなり安価な、あまり制御されていない環境またはＩＳＯ  １４６４４  Ｃｌａｓｓ  ９環境で使用され得る。本発明は、バイオリアクタの使用を拡大するためおよびバイオリアクタをより手頃な価格にするための理想的な解法を提供する。これは、薬物およびワクチンを緊急に製造する場合、新しい薬物を開発する場合、臨床試験供給物を製造する場合、およびより低いコストで市販用の生物学的薬物を一般に生成する場合に、特に有用である。最後の考慮事項は、これらの薬物に対する革新的特許の満了後に市場に現れ始めたジェネリックの生物学的薬物として、近年非常に重要になっている。ジェネリック製造業者は、競合するためにより安価なコストでこれらの分子を製造することができなければならず、本発明はこの要求を満たす。
【００３６】
一態様では、本発明は、ＩＳＯ  １４６６４  Ｃｌａｓｓ  ９環境において作動しつつ、所定の容量の栄養培地から生物学的生成物を調製するのに適したバイオリアクタ、および関連の使用方法を提供する。より具体的には、本発明は、装置および方法を提供し、これは、この装置が、生物学的培養物の性質に関わらず生物学的生成物を調製するために使用され得るという意味において汎用的である。
【００３７】
最初に図１を参照すると、本発明のバイオリアクタの好ましい実施形態が例示される。この実施形態では、好ましいコンテナ１、栄養培地２を含むこのコンテナの内部、少なくとも１つのスパージング手段４に接続された新鮮な空気入口１８、新鮮な空気入口８を介した新鮮な気体の供給源、気体入口１８と新鮮な空気入口８との間に配置された気体滅菌フィルタ７、および気体入口１８と滅菌フィルタ７との間の止め栓１２、入口５を介して栄養培地の供給源に接続された液体ポート１７、入口５と液体ポート１７との間に配置された液体培地滅菌フィルタ６、ならびに滅菌フィルタ６と液体ポート１７との間に配置された止め栓１２が例示される。排気空気は、気体出口１１を介して脱出し、蠕動ポンプ９を使用することにより、気体入口１８およびスパージャ４を介した再循環のために止め栓１２を介して移動される。二酸化炭素または酸素をモニタリングするためのセンサ３および１０のセットは、コンテナ１中および気体出口１１中に配置される；このコンテナは、スタンド１４上に次に支持される支持体表面１５を有する。加熱手段１３は、支持体表面１５の下部表面に付着されて提供される。
【００３８】
図２は、図１中の全ての特徴の詳細を示す図であり、気体出口１１と気体入口１８との間に取り付けられた二酸化炭素スクラバー１９を含むさらなる特徴を伴う。
【００３９】
上述のように、これらのコンテナは、例えば、細胞密度、温度、圧力、ｐＨ、溶存酸素（ＤＯ）、溶存二酸化炭素（ＤＣＯ２）、混合速度および気体流量などの、コンテナ内部の１つまたは複数のプロセスパラメータをモニタリングするための１つまたは複数のセンサまたはプローブを含むことが望ましい。ＤＯ、ｐＨおよびＤＣＯ２のためのセンサは、望ましくは光学センサであり、最初の２つは、より望ましくは使い捨てである（例えば、ＴｒｕＦｌｕｏｒセンサ、Ｆｉｎｅｓｓｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ＬＬＣ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣａｌｉｆｏｒｎｉａまたはＣｅｌｌＰｈａｓｅセンサ、Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｔｏｗ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  ０１７７５）。各センサは、種々のパラメータの計算および制御のため、ならびにディスプレイおよびユーザインターフェースのための、コンピュータにより実行される制御システム（例えば、コンピュータ）と連通していることが意図される。かかる制御システムは、パラメータを安定化または制御するために必要とされるので（例えば、ｐＨは、ＣＯ２またはアンモニアの添加によって調整され得る）、上記処理パラメータを制御するために、電子的、機械的および／または空気式システムの組合せもまた含み得る。この制御システムが他の機能を実施し得ること、および、本発明が、任意の特定の機能または機能のセットを有することに限定されないことを、理解すべきである。
【００４０】
本明細書に記載される１つまたは複数の制御システムは、上に列挙した機能または上述の任意の適切な組合せを実施するために、マイクロコードまたはソフトウェアを使用してプログラムされたプロセッサを使用して、専用のハードウェアおよび／またはファームウェアなどの多数の方法で、実行され得る。
【００４１】
処理デバイスは、例えば、ヒーターを起動させる、気体入口弁を起動させて、酸素またはＣＯ２のレベルを調整する、気体出口弁を起動させて、ヘッドスペース中の気体圧力を低減させる、など、所定の許容可能なレベルに向かってプロセスパラメータを調整し得る種々のデバイスとも連通し得る。
【００４２】
あるいは、本発明は、あらゆるセンサを欠き得、培養培地の特徴の測定は、ポート１６を介して回収される試料に対して行われ、このポート１６は、コンテナ１中に生物学的培養物を導入するため、および生体反応サイクルの最後に栄養培地を取り出すためにも使用される。ポート１６が、おそらくＩＳＯ  １４６４４  Ｃｌａｓｓ  ７以下の制御された環境への、試験するまたはさらに処理するための栄養培地の送達を可能にするのに十分に長い延長部を必要とすることに注目すべきである。
【００４３】
本明細書に記載されるバイオリアクタは、所定の容量の栄養培地からの生物学的生成物の生成において有用である。関連の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるようにバイオリアクタを提供するステップ、各コンテナを栄養培地で満たすステップ；選択的スパージングフィルタおよび加熱要素もしくは冷却要素を起動させるステップ、生物学的培養物を添加するステップ、ならびに特定の時間にわたってバイオリアクタを静置させるステップ、所定の時間間隔で、コンテナ中の栄養培地における細胞の密度を検出するステップ；ならびにコンテナ中の栄養培地における細胞の密度が、所定の値に達した時点で、栄養培地およびそれにより生成された生物学的生成物をバイオリアクタから取り出すステップを企図する方法を提供する。排気気体は、適切な量の酸素または二酸化炭素を補給しながら、コンテナを介して再循環される；二酸化炭素が生体反応において生成される場合、二酸化炭素スクラバーが、排気気体から二酸化炭素を除去するために提供される。
【００４４】
本発明のバイオリアクタおよび関連方法の利点の１つは、バイオリアクタを作動させるために必要とされる環境制御のコストの低減である。本発明は、これらの作動のために一般に必要とされるＣｌａｓｓ  ８環境とは対照的に、ＩＳＯ  １４６４４  Ｃｌａｓｓ  ９環境において作動され得る。
【００４５】
比較的少量の導入気体（既知のプロセスと比較して）は、コンテナのヘッドスペースにおける乱流および泡の発生が少ないというさらなる利点を有する。
【００４６】
各コンテナには、導入される栄養培地および気体の滅菌性を維持することを補助するサブミクロンフィルタが提供される。このフィルタは、任意の適切なサイズおよび多孔度のものであり得るが、好ましくは、約０．３μｍ〜約０．１μｍの、より好ましくは約０．２２μｍの平均多孔度を有する、ＨＥＰＡフィルタである。
【００４７】
一般に、本発明は、本発明が、生物学的構成要素および非生物学的構成要素の両方を含む種々の組成物を処理するのに適切かつ適合性であるという意味において汎用的である、バイオリアクタおよび方法を提供する。実際、例えば哺乳動物細胞での使用のために設計された本発明のバイオリアクタは、細菌を培養するために使用され得、製造の容易さを可能にする。
【００４８】
歴史的に、栄養培地において発現される生物学的生成物は、遠心分離または濾過のプロセスによって、生物学的培養物を最初に取り出すことによって、培地から分離される。このステップの後には、精製カラム上に合理的な時間内で栄養培地をロードすることを可能にするために、培地の容量を約１／１０〜１／２０に低減するステップが行われる。これらのプロセスステップは、広く検証されており、非常に良好に機能するが、これらのステップを使用することの実用性は、より大きい容量の培地を取り扱う場合には非常に困難になる。今日、数千リットルおよびさらには数十万リットルの培地を同時に処理するバイオリアクタを見かけることが一般的でないわけではない。これに対応するために、企業は、取り付けるのに数百万ドルのコストがかかり、作動させるおよび維持するのにさらに数百万ドルのコストがかかる、非常に大規模な濾過および容量低減方法を使用している。これらのプロセスを単純化する、生成のコストを低減させる、ならびにこの技術を、かかる巨額の投資の余裕がない数千の研究者およびより小さい企業にとってアクセス可能なものにする、満たされていない非常に大きな必要性が存在する。これらのプロセスのハードルを回避することは、製造がより安価なこれらの生物学的薬物に基づく薬物を生成すること、従って、これらの薬物を購入する余裕がない世界中の数十億の人々にとっての、かかる薬物の値ごろ感を増加させることもまた可能にする。
【００４９】
本発明に重要なものは、コントラリアンの教示にしたがって存在する。全ての製造業者は、精製の準備ができたブロスからの構成要素の取り出しを含む上記経路に従うが、現在実施されるように、必要とされないものを段階的に除去する代わりに、標的生物学的生成物を最初に取り出すことおよび必要とされないもの廃棄することの有用性を試験することには慎重である。
【００５０】
本発明は、生物学的生成物を大量に結合することが可能な多くの樹脂の最近の利用可能性を利用する。最新の樹脂は、樹脂１ｍＬ当たり２０〜１２５ｍｇの間の生物学的生成物を結合する。これらの樹脂の多くは、生物学的生成物に対して高度に特異的であり、その多くは、樹脂に付着された生物学的生成物を保有するのに十分に強い物理化学的結合の単純なプロセスによって任意の型および量の生物学的生成物を溶液から取り出すために組み合わされ得、一方で、栄養培地はバイオリアクタから取り出される。当該分野は、生物学的生成物精製の分野においても顕著に進歩しており、この分野において、本発明者らは現在、樹脂と生物学的生成物との間の結合を破壊する溶出緩衝液のｐＨ、イオン強度または他の特徴を調整することによって、これらの結合した生物学的生成物を樹脂から溶出させるかなり良い能力を有している。これは、さらなる精製のための準備ができた高度に濃縮された溶液としての、バイオリアクタからの生物学的生成物の取り出しを可能にし、ある場合には、この溶液は、使用のための最終生成物でさえあり得る。
【００５１】
アフィニティークロマトグラフィーは、適用特異的な樹脂を頻繁に利用する、分子コンフォメーションに基づく分離技術である。これらの樹脂は、分離される化合物に対して特異的な、その表面に付着したリガンドを有する。最も頻繁には、これらのリガンドは、抗体−抗原相互作用と類似の様式で機能する。リガンドとその標的化合物との間のこの「鍵と鍵穴」フィットにより、樹脂は高度に特異的になる。
【００５２】
多くの膜タンパク質は、糖鎖生物学的生成物であり、レクチンアフィニティークロマトグラフィーによって精製され得る。界面活性剤により可溶化されたタンパク質は、共有結合したレクチンを有するように改変されたクロマトグラフィー樹脂に結合するようになり得る。
【００５３】
免疫アフィニティークロマトグラフィー樹脂は、生物学的生成物を選択的に精製するために、標的生物学的生成物に対する抗体の特異的結合を使用する。この手順は、他の全てが流れて通り抜ける一方、生物学的生成物をその後選択的に結合するカラム材料に、抗体を固定化することを含む。
【００５４】
可溶化の際に、封入体は疎水性基を曝露させるが、樹脂に結合することが可能な変性タンパク質上の化学基は存在したままであり（SinghおよびPanda、２００５年）、未変性状態への再折り畳み段階の間のこれらのタンパク質の分離を可能にする。
【００５５】
最先端の樹脂結合技術の一部には、以下が含まれる：
ａ．Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓの新たに特許されたＤｕａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ技術プラットフォームは、プロテインＡプロセスステップを、類似ではあるが使い捨ての技術で置き換える。
【００５６】
ｂ．刺激応答性ポリマーは、生物学的生成物の複合体形成および操作を可能にし、ポリマーと生物学的生成物との複合体の溶解度の制御を可能にして、遠心分離もＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＣｏｒｐのプロテインＡ媒体もなしに、生成物の直接的な捕捉をもたらす。
【００５７】
ｃ．より短い滞留時間と共に改善された選択性および能力のために、従来のプロテインＡおよびイオン交換を置き換える混合様式吸着剤。新規化学を用いたこれらの媒体は、Ｐａｌｌ  ＣｏｒｐのＭＥＰならびにＱおよびＳ  ＨｙｐｅｒＣｅｌなどの、疎水性電荷誘導クロマトグラフィーを含む。
【００５８】
ｄ．ＢＩＡ  ＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓのＣｏｎｖｅｃｔｉｖｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ一体型カラムなどの一体成型均質カラムとしてクロマトグラフィー媒体を含むＭｏｎｏｌｉｔｈｓ。
【００５９】
ｅ．Ｔａｒｐｏｎ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＢｉｏＳＭＢなどの、マルチカラム向流クロマトグラフィーを含む疑似移動層。
【００６０】
ｆ．プロテインＧ（複数の販売会社）。
【００６１】
ｇ．ＢＡＣのＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔなどの、ＩｇＧに対する単一ドメインラクダ由来（ラクダ科動物）抗体。
【００６２】
ｈ．Ｐｒｏｍｅｔｉｃ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＭａｂｓｏｒｂｅｎｔ  Ａ１ＰおよびＡ２Ｐなどの、合成色素を含む新規無機リガンド。
【００６３】
ｉ．Ｕｐｆｒｏｎｔ  ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙのＲｈｏｂｕｓｔプラットフォームなどの、拡張床吸着（Ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｂｅｄ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）クロマトグラフィーシステム。
【００６４】
ｊ．ＺｉｒＣｈｒｏｍ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓの超耐久性酸化ジルコニア結合型アフィニティーリガンドクロマトグラフィー媒体。
【００６５】
ｋ．ＴｅｃｎｏｇｅのＦｃ受容体模倣リガンド。
【００６６】
ｌ．Ｎｙｓａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＡＤＳＥＰＴ（ＡＤｖａｎｃｅｄ  ＳＥＰａｒａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。
【００６７】
ｍ．ＰｕｒｅＰｈａｒｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの膜アフィニティー精製システム。
【００６８】
ｎ．Ｐｒｏｍｅｔｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｄｙａｘなどの、アフィニティークロマトグラフィーのための特注設計のペプチド性リガンド。
【００６９】
ｏ．Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｄｙｎａｌのものなどの、プロテインＡで被覆された磁気ビーズおよびプロテインＧで被覆された磁気ビーズ。
【００７０】
ｐ．クロマトグラフィー媒体に対する親和性を有する除去可能な部分（タグ）、例えば、Ｒｏｃｈｅ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）によって使用許可が与えられたヒスチジンタグとの融合生物学的生成物としての、生物学的生成物またはＭＡｂの発現に基づく新規アフィニティー精製法。
【００７１】
ｑ．逆ミセル（リポソーム）、液体−栄養培地抽出システム、結晶化、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーおよび新規膜クロマトグラフィーシステムを含む、開発中のプロテインＡ代替法。
【００７２】
ｒ．ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅの、使い捨て構成要素（例えば、ＲｅａｄｙＴｏＰｒｏｃｅｓｓ）を伴うプラグアンドプレイソリューション、実験能力の設計を伴うプロセス開発ＡＫＴＡ、およびマルチカラム連続捕捉。
【００７３】
生物学的生成物を捕捉するために利用可能な樹脂の設計において大きな進歩があったものの、これらが精製の下流の処理にしか使用されてこなかったことは、驚くべきことである。生物学的生成物と宿主細胞との粗製混合物に樹脂を添加することは、同じ培地を単に濃縮し、その培地をその中の不純物の全てと共にカラム上にロードする現行のプロセスと何ら変わりはない。唯一の差異は、生体反応サイクルの最後に実施する場合に、これが、生物学的生成物のほぼ全体を結合するのに十分な樹脂を必要とすることである。１ｍｇ／ｍＬのタンパク質を生成する細胞株を目的とし、使用される樹脂の結合能が５０ｍｇ／ｍＬである場合、１０００Ｌのバイオリアクタを作動させたとき、２０Ｌの樹脂を必要とすることになる。モノクローナル抗体の製造に適した樹脂のコストは、プロテインＡなど、１リットル当たり１５ドル〜２０，０００ドルの範囲であり得る。結果として、殆どの製造業者はむしろ、より少量の樹脂を使用して、いくつかのサブバッチの精製を行う。しかし、これらが数百回にわたって使用され得ることを考慮すると、このコストは、使用のために容易に償却され、サブバッチを調製する際の単調さおよび規制のハードルを回避する。
【００７４】
より多い量の樹脂が、プロセス処理の最後に添加されるが、これらの添加は、古典的な灌流方法が樹脂捕捉によって置き換えられた本発明が使用される場合、時間と共に広がる。生体反応が進行するにつれて種々の量の樹脂を添加することによって、発現されたタンパク質は、栄養培地から取り出される。栄養培地中の他の構成要素が、使用される樹脂が非特異的結合特徴を有する場合と同様に、樹脂に結合して失われることは避けられないので、任意の所与の時点において必要とされるよりも多い量の樹脂を添加しないことが重要である。これは、プロテインＡなどの免疫アフィニティー樹脂または特異的構造の樹脂が使用される場合には当てはまらない。栄養素が樹脂に結合して失われることが避けられない場合、これらは、バイオリアクタへの樹脂の添加と共に置き換えられるべきである。それらは適切に滅菌される必要があるので、生体反応のプロセスの間にタンパク質を結合する樹脂を使用する場合、いくらかの注意が必要である。この理由のために、ガンマ線照射によるコンテナの滅菌の間に添加され得る、より特異的に結合する樹脂を使用することが有利であり得る。
【００７５】
さらに、本発明の一実施形態は、全ての可溶性有機構成要素に一般に結合し、次いで、これらの構成要素を分離するための溶出のプロファイルを全く配慮せずに、緩衝液を使用してかかる構成要素を即座に溶出する、最も安価な樹脂を使用することによって実施され得る。かかる一般的な樹脂は、非常に安価であり、再使用する必要さえもない場合がある。
【００７６】
本発明は、生物学的生成物が生成される同じバイオリアクタ中での、生物学的生成物の収集および精製の方法を提供する。
【００７７】
適用
本発明では、非生物学的構成要素を含む組成物には、マイクロキャリア（例えば、多孔性または非多孔性であり得る、ポリマー球体、固体球体、ゼラチン質粒子、マイクロビーズおよびマイクロディスク）、特定の化学基（例えば、第３級アミン基）により帯電した架橋ビーズ（例えば、デキストラン）、非多孔性ポリマー繊維中に捕捉された細胞を含む２Ｄマイクロキャリア、３Ｄキャリア（例えば、多孔性繊維を含み得る、キャリア繊維、中空繊維、マルチカートリッジリアクタおよび半浸透性膜）、低減されたイオン交換能を有するマイクロキャリア、細胞、キャピラリーおよび凝集体（例えば、細胞の凝集体）を含む組成物が含まれるが、これらに限定されない。
【００７８】
本発明に従って処理され得る生物学的構成要素は、以下の段落において記載され、動物（例えば、ハムスター、マウス、ブタ、ウサギ、イヌ、魚、エビ、線虫およびヒト）、昆虫（例えば、ガおよびチョウ）、植物（例えば、藻類、トウモロコシ、トマト、イネ、コムギ、オオムギ、アルファルファ、サトウキビ、ダイズ、ジャガイモ、レタス、ルピナス、タバコ、ナタネ（キャノーラ）、ヒマワリ、カブ、テンサイ（ｂｅｅｔ  ｃａｎｅ）糖蜜、種子、ベニバナおよびラッカセイ）、細菌、真菌および酵母などの供給源から誘導された細胞培養物が含まれるが、これらに限定されない。
【００７９】
例示的な動物細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、マウス骨髄腫、Ｍ００３５（ＮＳＯ細胞株）、ハイブリドーマ（例えば、骨髄腫腫瘍細胞と融合したＢリンパ球細胞）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、サルＣＯＳ、アフリカミドリザル腎臓上皮（ＶＥＲＯ）、マウス胚線維芽細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３）、マウス結合組織線維芽細胞（Ｌ９２９）、ウシ大動脈内皮（ＢＡＥ−１）、マウス骨髄腫リンパ芽球様（ＮＳＯ）、マウスＢ細胞リンパ腫リンパ芽球様（ＷＥＨＩ２３１）、マウスリンパ腫リンパ芽球様（ＹＡＣ１）、マウス線維芽細胞（ＬＳ）、肝マウス（例えば、ＭＣ／９、ＮＣＴＣクローン１４６９）および肝ラット細胞（例えば、ＡＲＬ−６、ＢＲＬ３Ａ、Ｈ４Ｓ、Ｐｈｉ１（Ｆｕ５細胞由来））が含まれる。
【００８０】
例示的なヒト細胞には、網膜細胞（ＰＥＲ−Ｃ６）、胚性腎臓細胞（ＨＥＫ−２９３）、肺線維芽細胞（ＭＲＣ−５）、子宮頸部上皮細胞（ＨＥＬＡ）、二倍体線維芽細胞（ＷＩ３８）、腎臓上皮細胞（ＨＥＫ２９３）、肝臓上皮細胞（ＨＥＰＧ２）、リンパ腫リンパ芽球様細胞（Ｎａｍａｌｗａ）、白血病リンパ芽球様細胞（ＨＬ６０）、骨髄腫リンパ芽球様細胞（Ｕ２６６Ｂ１）、神経芽腫神経芽細胞（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）、二倍体細胞株細胞（例えば、ポリオウイルスの増殖）、膵島細胞、胚性幹細胞（ｈＥＳ）、ヒト間葉系幹細胞（例えば、骨原性、軟骨形成性、腱形成性（ｔｅｎｏｇｅｎｉｃ）、筋原性、脂肪生成性および骨髄間質性系列に分化し得るＭＳＣ）、ヒト神経幹細胞（ＮＳＣ）、ヒト細網肉腫リンパ芽球様細胞（Ｕ９３７）、ならびにヒト肝細胞、例えば、ＷＲＬ６８（胚細胞由来）、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５（即ち、Ｂ型肝炎配列を含む）、Ｈｅｐ３Ｂ（即ち、血漿タンパク質：フィブリノーゲン、アルファ−フェトプロテイン、トランスフェリン、アルブミン、補体Ｃ３および／またはアルファ−２−マクログロブリンを生成する）およびＨｅｐＧ２（即ち、血漿タンパク質：プロトロンビン、アンチトロンビンＩＩＩ、アルファ−フェトプロテイン、補体Ｃ３および／またはフィブリノーゲンを生成する）が含まれる。
【００８１】
昆虫由来の細胞（例えば、バキュロウイルスおよびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ卵巣（Ｓｆ２１細胞はＳｆ９系統を生成する））および植物もしくは食物由来の細胞もまた、本発明に従って培養され得る。イネ（例えば、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ｃｖ  Ｂｅｎｇａｌカルス培養物およびＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ｃｖ  Ｔａｉｐｅｉ  ３０９）、ダイズ（例えば、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ  ｃｖ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ８２）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ  ｃｖ  Ｓｅｏｋｗａｎｇ）、およびタバコ葉（例えば、Ｂｒｉｇｈｔ  Ｙｅｌｌｏｗ  ２（ＢＹ−２）を含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ  ＮＴ−１、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ  ＢＹ−２およびＮ．ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ  Ｐｅｔｉｔｅ  Ｈａｖａｎａ  ＳＲ−１）などの供給源由来の細胞が、例示的な例である。
【００８２】
細菌、真菌または酵母もまた、本発明に従って培養され得る。例示的な細菌には、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐおよびＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐが含まれる。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒおよびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉなどの種由来の真菌細胞が培養され得、酵母細胞には、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｂａｙａｎｕｓと交雑したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ由来のＬＡＣ４遺伝子およびＬＡＣ１−２遺伝子と交雑したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｈｉｒｏｕｓａｍｉｉと交雑したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｓｉｃｕｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ由来の遺伝子を有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅならびにＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ由来の細胞が含まれ得る。
【００８３】
生成物
種々の異なる生成物もまた、本発明に従って生成され得る。例示的な生成物には、タンパク質（例えば、抗体および酵素）、ワクチン、ウイルス生成物、ホルモン、免疫調節剤、代謝産物、脂肪酸、ビタミン、薬物、抗生物質、細胞および組織が含まれる。タンパク質の非限定的な例には、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、血液凝固因子、増殖因子（例えば、インターフェロンおよびケモカインを含むサイトカイン）、接着分子、Ｂｃｌ−２ファミリーのタンパク質、ポリヘドリン（polyhedrin）タンパク質、ヒト血清アルブミン、ｓｃＦｖ抗体断片、ヒトエリスロポエチン、マウスモノクローナル重鎖７、マウスＩｇＧ２ｂ／ｋ、マウスＩｇＧ１、重鎖ｍＡｂ、ブリオンジン（Ｂｒｙｏｎｄｉｎ）１、ヒトインターロイキン−２、ヒトインターロイキン−４、リシン、ヒトα１−アンチトリプシン、ｂｉｓｃＦｖ抗体断片、免疫グロブリン、ヒト顆粒球、刺激因子（ｈＧＭ−ＣＳＦ）、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、ヒトリゾチーム、ＩＬ−１２、およびＨＢｓＡｇに対するｍＡｂが含まれる。血漿タンパク質の例には、フィブリノーゲン、アルファ−フェトプロテイン、トランスフェリン、アルブミン、補体Ｃ３およびアルファ−２−マクログロブリン、プロトロンビン、アンチトロンビンＩＩＩ、アルファ−フェトプロテイン、補体Ｃ３およびフィブリノーゲン、インスリン、Ｂ型肝炎表面抗原、尿酸オキシダーゼ、グルカゴン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ヒルジン／デシルジン、アンジオスタチン、エラスターゼインヒビター、エンドスタチン、上皮増殖因子アナログ、インスリン様増殖因子−１、カリクレインインヒビター、α１−アンチトリプシン、腫瘍壊死因子、コラーゲンタンパク質のドメイン（コラーゲン糖タンパク質全体ではなく）、代謝副生成物を伴わないタンパク質、ヒトアルブミン、ウシアルブミン、トロンボモジュリン、トランスフェリン、血友病Ａに関する第ＶＩＩＩ因子（即ち、ＣＨＯ細胞またはＢＨＫ細胞由来）、第ＶＩＩａ因子（即ち、ＢＨＫ由来）、血友病Ｂに関する第ＩＸ因子（即ち、ＣＨＯ由来）、ヒト分泌型アルカリホスファターゼ、アプロチニン、ヒスタミン、ロイコトリエン、ＩｇＥ受容体、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−ＩＩＩおよび抗血友病第ＶＩＩＩ因子が含まれる。
【００８４】
酵素は、本発明を使用して、種々の供給源から生成され得る。かかる酵素の非限定的な例には、酵母由来のＹｅｐＡＣＴ−ＡＭＹ−ＡＣＴ−Ｘ２４ハイブリッド酵素、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  α−アミラーゼ、キシラナーゼ、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｒｔ−ＰＡ）、ウシキモシン、グルコセレブロシダーゼ（ゴーシェ病のための治療的酵素、ＣＨＯ由来）、ラクターゼ、トリプシン、アプロチニン、ヒトラクトフェリン、リゾチームおよびオレオシン（ｏｌｅｏｓｉｎｅ）が含まれる。
【００８５】
ワクチンもまた、本発明を使用して生成され得る。非限定的な例には、前立腺がん、ヒトパピローマウイルス、ウイルス性インフルエンザ、３価ヘマグルチニンインフルエンザ、ＡＩＤＳ、ＨＩＶ、マラリア、炭疽病、細菌性髄膜炎、水疱、コレラ、ジフテリア、ヘモフィルスインフルエンザタイプb、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、百日咳、ペスト、肺炎球菌肺炎、ポリオ、狂犬病、ヒト−狂犬病、破傷風、腸チフス、黄熱病、獣医学的ＦＭＤ、ニューカッスル病、口蹄疫、ＤＮＡ、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、がん（結腸がん）ワクチン（即ち、予防的または治療的）、ＭＭＲ（麻疹、ムンプス、風疹）、黄熱病、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（Ｈｉｂ）、ＤＴＰ（ジフテリアおよび破傷風ワクチン、百日咳サブユニットを含む）、多糖に結合されたワクチン（例えば、Ｈｉｂ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、ニコチン、多発性硬化症、ウシ海綿状脳症（狂牛病）、ＩｇＧ１（ホスホネートエステル）、ＩｇＭ（ニューロペプチドハプテン）、ＳＩｇＡ／Ｇ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓアドヘシン）、ｓｃＦｖ−ブリオジン（ｂｒｙｏｄｉｎ）１免疫毒素（ＣＤ−４０）、ＩｇＧ（ＨＳＶ）、ＬＳＣ（ＨＳＶ）、ノーウォークウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ロタウイルス、RSウイルスＦ、インスリン依存的自己免疫性糖尿病、下痢、ライノウイルス、単純ヘルペスウイルスに対するワクチン、ならびに例えばリンパ腫処置のための（即ち、注射可能形態、経口形態または食用形態の）個別化がんワクチンが含まれる。Ｂ型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質、狂犬病ウイルス糖タンパク質、Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシン、ノーウォークウイルスカプシドタンパク質、糖尿病自己抗原、コレラ毒素Ｂサブユニット、コレラ毒素ＢおよびＡ２サブユニット、ロタウイルスエンテロトキシンおよび腸内毒素原性Ｅ．ｃｏｌｉ、線毛抗原融合物、ならびにブタ伝染性胃腸炎ウイルス糖タンパク質Ｓなどの、組換えサブユニットワクチンもまた生成され得る。
【００８６】
ウイルス生成物もまた生成され得る。ウイルス生成物の非限定的な例には、シンドビス、ＶＳＶ、オンコーマ（ｏｎｃｏｍａ）、Ａ型肝炎、アメリカナマズウイルス、ＲＳＶ、コロナウイルス、ＦＭＤＶ、狂犬病、ポリオ、レオウイルス、麻疹およびムンプスが含まれる。
【００８７】
ホルモンもまた、本発明を使用して生成され得る。ホルモンの非限定的な例には、成長ホルモン（例えば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）およびウシ成長ホルモン）、増殖因子、ベータおよびガンマインターフェロン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ソマトスタチン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン、ヒト絨毛性ホルモンおよびエリスロポエチンが含まれる。
【００８８】
免疫調節剤もまた生成され得る。免疫調節剤の非限定的な例には、インターフェロン（例えば、ベータ−インターフェロン（多発性硬化症について）、アルファ−インターフェロンおよびガンマ−インターフェロン）およびインターロイキン（例えば、ＩＬ−２）が含まれる。
【００８９】
代謝産物（例えば、シコニンおよびパクリタキセル）および脂肪酸（即ち、直鎖（例えば、アジピン酸、アゼライン酸、２−ヒドロキシ酸）、分岐鎖（例えば、１０−メチルオクタデカン酸およびレチノイン酸）、環含有脂肪酸（例えば、コロナリン酸（coronaric acid）およびリポ酸）ならびに複合脂肪酸（例えば、脂肪酸アシル−ＣｏＡ）が含まれる）もまた、生成され得る。
【００９０】
器官増殖、細胞治療および遺伝子治療
バイオリアクタアセンブリ
本発明の種々の実施形態において有用なコンテナは、栄養培地を含むのに適した任意のサイズのものであり得る。例えば、このコンテナは、１〜４０Ｌの間、４０〜１００Ｌの間、１００〜２００Ｌの間、２００〜３００Ｌの間、３００〜５００Ｌの間、５００〜７５０Ｌの間、７５０〜１，０００Ｌの間、１，０００〜２，０００Ｌの間、２，０００〜５，０００Ｌの間または５，０００〜１０，０００Ｌの間の容量を有し得る。いくつかの例では、このコンテナは、１Ｌより大きい容量、または他の場合には、１０Ｌ、２０Ｌ、４０Ｌ、１００Ｌ、２００Ｌ、５００Ｌまたは１，０００Ｌより大きい容量を有する。１０，０００Ｌより大きい容量もまた可能である。好ましくは、コンテナ容量は、約１Ｌから１０００Ｌの間の範囲、より好ましくは、約５Ｌから５００Ｌの間の範囲、なおより好ましくは５Ｌから２００Ｌの間の範囲である。
【００９１】
栄養培地またはそれにより提供される生成物と接触する、本明細書に記載されるバイオリアクタおよび他のデバイスの構成要素は、望ましくは生体適合性材料を含み、より望ましくは生体適合性ポリマーを含み、好ましくは滅菌可能である。
【００９２】
本明細書に記載される構成要素の多くもまた、望ましくは可撓性であり、例えば、これらのコンテナは、望ましくは可撓性生体適合性ポリマーコンテナ（例えば、折り畳み式バッグ）を含み、導管もまたかかる生体適合性ポリマーを望ましくは含むこともまた、理解すべきである。この可撓性材料は、ＵＳＰ  Ｃｌａｓｓ  ＶＩ認定された材料、例えば、シリコーン、ポリカーボネート、ポリエチレンおよびポリプロピレンであることがさらに望ましい。可撓性材料の非限定的な例には、ポリマー、例えば、ポリエチレン（例えば、線形低密度ポリエチレンおよび超低密度ポリエチレン）、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリ二塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、エチレン酢酸ビニル、ポリカーボネート、ポリメタクリレート、ポリビニルアルコール、ナイロン、シリコーンゴム、他の合成ゴムおよび／またはプラスチックが含まれる。所望の場合、可撓性コンテナの一部分は、剛性ポリマー（例えば、高密度ポリエチレン）、金属および／またはガラスなどの実質的に剛性の材料を含み得る。
【００９３】
望ましくは、これらのコンテナは、生体適合性材料を含み、より望ましくは生体適合性ポリマーを含む。折り畳み式コンテナが使用のために選択される場合、このコンテナは、支持構造の内部表面によって支持され得るまたは支持構造の内部表面を裏打ちし得、例えば、外部支持ハウジングは、コンテナ保持側壁を有する。しかし、本発明は、非折り畳み式または剛性のコンテナまたは導管を使用して実施され得る。
【００９４】
これらのコンテナは、中に栄養培地を保持するのに適した任意の厚さを有し得、作動の間または取扱いの間の貫通に対する特定の耐性を有するように設計され得る。例えば、コンテナの壁は、２５０ミル以下（１ミルは、２５．４マイクロメートルである）、２００ミル以下、１００ミル以下、７０ミル以下（１ミルは、２５．４マイクロメートルである）、５０ミル以下、２５ミル以下、１５ミル以下または１０ミル以下の総厚さを有し得る。特定の実施形態では、このコンテナは、コンテナに特定の特性を付与するために、一緒に積層され得るまたは他の方法で互いに付着され得る材料の１つより多い層を含み得る。例えば、１つの層は、実質的に酸素不浸透性である材料から形成され得る。別の層は、コンテナに強度を付与するための材料から形成され得る。なお別の層が、コンテナ中に含まれ得る流体に対する化学的な耐性を付与するために含まれ得る。
【００９５】
従って、コンテナは、層の任意の適切な組合せから形成され得ると理解すべきである。このコンテナ（例えば、折り畳み式バッグ）は、例えば、１層、２層以上、３層以上または５層以上の材料（複数可）を含み得る。各層は、例えば、２００ミル以下、１００ミル以下、５０ミル以下、２５ミル以下、１５ミル以下、１０ミル以下、５ミル以下または３ミル以下、またはそれらの組合せの厚さを有し得る。
【００９６】
さらに、このコンテナは、その強度を改善するためおよび培地中で増殖している細胞の堆積を回避するために、継ぎ目がないことが好ましい。
【００９７】
さらに、このコンテナは、スパージングフィルタとコンテナの外部壁との間の距離を維持するために、円筒形であることが好ましい。
【００９８】
コンテナの全てまたは一部分はまた、コンテナの内側の内容物を見ることができるように、望ましくは半透明であるか、またはより望ましくは透明である。後者は、コンテナ内の栄養培地に照射することが望ましい場合に好ましい。
【００９９】
本明細書で引用される刊行物、特許出願および特許を含む全ての引用文献は、各引用文献が、個々にかつ具体的に参照によって組み込まれることが示され、その全体が本明細書中に示されるのと同じ程度まで、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１００】
本発明を説明する文脈における（特に、以下の特許請求の範囲の文脈における）用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」ならびに類似の指示対象の使用は、本明細書に特に示さない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、単数形および複数形の両方をカバーすると解釈すべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特に示さない限り、オープンエンドの用語（即ち、「含むがこれらに限定されない」を意味する）と解釈すべきである。本明細書の値の範囲の列挙は、本明細書に特に示さない限り、その範囲内に入る各別々の値を個々に参照する省略法としてのみ機能することを意図し、各別々の値は、それが本明細書中で個々に列挙されるかのように、本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に特に示さない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書に提供される任意の例および全ての例または例示的語句（例えば、「例えば／など」）の使用は、本発明をより良く説明することのみを意図しており、特に特許請求されない限り、本発明の範囲に対して限定を課すものではない。本明細書中の語句は、任意の特許請求されていない要素を本発明の実施に必須のものとして示すと解釈すべきではない。
【０１０１】
本発明者らが知る本発明を実施するための最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載される。これらの好ましい実施形態のバリエーションは、上記説明を読めば当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、必要に応じて当業者がかかるバリエーションを使用することを予期しており、本発明者らは、本明細書に具体的に記載されているのとは異なる方法で本発明が実施されることを意図している。従って、本発明は、適用法によって許容される場合には、本明細書に添付される特許請求の範囲において列挙される主題の全ての改変および等価物を含む。さらに、その全ての可能なバリエーションにおける上記要素の任意の組合せは、本明細書に特に示さない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、本発明によって包含される。
【０１０２】
本発明は、特定の実施形態および適用に関して記載されてきたが、当業者は、本教示の下で、特許請求された本発明の範囲を超えることもその精神から逸脱することもなしに、さらなる実施形態を生み出すことができる。例えば、灌流バイオリアクタシステムの種々の要素の特定の組成は、限定因子とみなすべきではない。従って、本開示中の図面および説明は、本発明の理解を促進するために提供され、その範囲を限定すると解釈すべきでないことを理解すべきである。
【図１】
2015500030.tif 000003
【図２】
2015500030.tif 000004
【国際調査報告】
2015500030.tif 000005