(57)【要約】抗体のヒンジ領域のジスルフィド結合によって異なるいくつかのＩｇＧ２構造アイソフォームのうちの１つが濃縮されたＩｇＧ２抗体製剤を生成する方法を開示する。例えば、抗体のヒンジ領域のジスルフィド結合によって異なるいくつかのＩｇＧ２構造アイソフォームのうちの１つが濃縮されたＩｇＧ２抗体製剤を生成する方法であって、ＶκＩ、ＶκＩＩＩ、またはＶκＩＶサブクラスのκ軽鎖を有するＩｇＧ２抗体を含む製剤を、プロテインＬ樹脂に供することを含み、前記製剤中の前記ＩｇＧ２抗体は、前記プロテインＬ樹脂から２つ以上の構造的ＩｇＧ２アイソフォームとして溶出する、方法が提供される。【選択図】図１６
2015502959.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体のヒンジ領域のジスルフィド結合によって異なるいくつかのＩｇＧ２構造アイソフォームのうちの１つが濃縮されたＩｇＧ２抗体製剤を生成する方法であって、
（Ａ）組み換えによって生成されたＩｇＧ２抗体を含有する溶液を、強陽イオン交換（ＳＣＸ）マトリックス、抗ヒトＩｇＧ２親和性マトリックス、およびプロテインＬマトリックスからなる群から選択される第１のマトリックスと接触させることと、
（Ｂ）前記第１のマトリックスから２つ以上の第１の溶出画分を溶出することと、を含み、
前記方法に供されるＩｇＧ２抗体溶液は、前記第１のマトリックスを２つ以上のＩｇＧ２構造アイソフォームに対応する２つ以上の別個の形態として溶出し、２つ以上の第１の溶出画分のうちの少なくとも１つは、前記ヒンジ領域のジスルフィド結合によって異なるＩｇＧ２構造アイソフォームのうちの少なくとも１つが濃縮されている、方法。
【請求項２】
前記抗ヒトＩｇＧ２親和性マトリックスは、ＨＰ−６０１４親和性マトリックスであり、前記２つ以上の第１の溶出画分のうちの少なくとも１つを、ＳＣＸマトリックス、ＨＰ−６０１４親和性マトリックス、およびプロテインＬマトリックスからなる群から選択される第２のマトリックスと接触させることと、前記第２のマトリックスから２つ以上の第２の溶出画分を溶出することと、をさらに含み、
前記２つ以上の第２の溶出画分のうちの少なくとも１つは、ＩｇＧ２構造アイソフォームのうちの少なくとも１つがさらに濃縮されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１のマトリックスはＳＣＸマトリックスであり、前記第２のマトリックスはＨＰ−６０１４親和性マトリックスである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１のマトリックスはＳＣＸマトリックスであり、前記第２のマトリックスはプロテインＬマトリックスである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１のマトリックスはＨＰ−６０１４親和性マトリックスであり、前記第２のマトリックスはＳＣＸマトリックスである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＳＣＸ樹脂はカラムに含まれ、前記構造アイソフォームは、前記カラムからの溶出液の画分中に単離される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記構造アイソフォームは、前記画分を逆相アッセイに供することによって同定される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記ＳＣＸマトリックスは、高容量ＹＭＣ  ＳＣＸ樹脂である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記構造アイソフォームは、ＩｇＧ２−Ａ、ＩｇＧ２−Ａ／Ｂ、およびＩｇＧ２−Ｂからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記第１または第２のマトリックスからの溶出は、低ｐＨ緩衝液を使用して行われる、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記緩衝液は、２〜３、３〜４、４〜５、５〜６、および６〜７からなる群から選択されるｐＨを有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記溶出ステップ（複数可）は、ｐＨ段階溶出を用いて行われる、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記溶出ステップ（複数可）は、ｐＨ勾配溶出を用いて行われる、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記ｐＨ勾配は、ｐＨ７〜７．５からｐＨ２．５〜３まで変化する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１５】
前記溶出ステップ（複数可）は、塩段階溶出を用いて行われる、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記溶出ステップ（複数可）は、塩勾配溶出を用いて行われる、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記塩勾配は、塩濃度を約１００ｍＭから約２５０ｍＭに上昇させる、請求項１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記塩は、ＮａＣｌである、請求項１５〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記ＩｇＧ２抗体製剤は、前記ＩｇＧ２構造アイソフォームのうちの少なくとも１つが、所望のＩｇＧ２構造アイソフォームの少なくとも２０％〜５０％のレベルの純度まで濃縮される、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記ＩｇＧ２抗体製剤は、分取スケールで生成される、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記ＳＣＸマトリックスは、１カラム体積当たり１〜２ｍＭの塩の塩勾配を利用する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
抗体のヒンジ領域のジスルフィド結合によって異なるいくつかのＩｇＧ２構造アイソフォームのうちの１つが濃縮されたＩｇＧ２抗体製剤を生成する方法であって、
ＶκＩ、ＶκＩＩＩ、またはＶκＩＶサブクラスのκ軽鎖を有するＩｇＧ２抗体を含む製剤を、プロテインＬ樹脂に供することを含み、
前記製剤中の前記ＩｇＧ２抗体は、前記プロテインＬ樹脂から２つ以上の構造的ＩｇＧ２アイソフォームとして溶出する、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ヒトＩｇＧ２抗体は、ＩｇＧ２−Ａ、ＩｇＧ２−Ｂ、およびＩｇＧ２−Ａ／Ｂの３つの主要な構造アイソフォームからなることが分かっている（Ｗｙｐｙｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００８（非特許文献１）；Ｄｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８ｂ（非特許文献２））。この構造上の不均一性は、各アイソフォームにおける軽鎖と重鎖の結合性が異なることに起因する。これらの構造アイソフォームは、組み換えＩｇＧ２モノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびヒトの体に自然に存在するＩｇＧ２に固有のものである。ＩｇＧ２ジスルフィドアイソフォームの発見以来、個々のアイソフォームが、力価、またはＦｃγ受容体結合、粘性、安定性、および粒子形成を含む他の品質属性の違いを含む、特有かつ異なる構造特性および機能特性を有し得ることは明白である（Ｄｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８ｂ（非特許文献２））。規制当局からの現在の要件は、ＩｇＧ２ジスルフィドアイソフォームが異なる力価（または他の重要な属性）を有する場合、それらの相対存在量を監視および管理する必要があり得ることを示唆している（Ｃｈｅｒｎｅｙ，２０１０（非特許文献３））。したがって、ジスルフィドアイソフォームが治療用ｍＡｂにとって重要な品質属性であるとみなされた場合、プロセス監視制御が必要となり得る。逆相ＨＰＬＣ分析は、ＩｇＧ２ジスルフィドアイソフォームを監視する方法の１つとして記載された（Ｄｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８ａ）。ＩｇＧ２アイソフォームの品質属性に違いが存在し得るため、臨床開発の早い段階で個々のアイソフォームの各々を特徴付けることがさらに重要となっている。個々のＩｇＧ２アイソフォームの濃縮は、そのような特徴付けに必須である。以前は、酸化還元処理（Ｄｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６ｂ；Ｄｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６ｂ；Ｄｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８ｂ（非特許文献２））または弱陽イオン交換クロマトグラフィー（Ｗｙｐｙｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００８（非特許文献１））によってＩｇＧ２ジスルフィドアイソフォームを濃縮し、わずかな量のある程度純粋な画分を生成していた。しかしながら、アイソフォームの効率的な特徴付けおよび製造は、より高い純度およびより高い生産収率から恩恵を受ける。したがって、上に要約した方法によって生成されるものよりも純度の高いアイソフォームの画分を生成することができる分離技術の必要性が依然として存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００２】
【非特許文献１】Wypych,J.,  Li,M.,  Guo,A.,  Zhang,Z.,  Martinez,T.,  Allen,M.,  Fodor,S.,  Kelner,D.,  Flynn,G.C.,  Liu,Y.D.,  Bondarenko,P.V.,  Speed-Ricci,M.,  Dillon,T.M.,  and  Balland,A.(2008).Human  IgG2  antibodies  display  disulfide  mediated  structural  isoforms.J.  Biol.  Chem.283,  16194-16205.
【非特許文献２】Dillon,T.M.,  Speed-Ricci,M.,  Vezina,C.,  Flynn,G.C.,  Liu,Y.D.,  Rehder,D.S.,  Plant,M.,  Henkle,B.,  Li,Y.,  Varnum,B.,  Wypych,J.,  Balland,A.,  and  Bondarenko,P.V.  (2008b).Structural  and  functional  characterization  of  disulfide  isoforms  of  the  human  IgG2  subclass.J.  Biol.  Chem.283,  16206-16215.
【非特許文献３】Cherney,B.(2010).Comparability  of  biotechnology  derived  protein  products:  lessons  from  the  U.S  experience.WCBP  A  presentation  from  a  Deputy  Director  of  FDA
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
一態様において、本発明は、ヒンジ領域のジスルフィド結合によって異なるいくつかのＩｇＧ２構造変異体のうちの少なくとも１つが濃縮されたＩｇＧ２抗体製剤を生成する方法であって、（Ａ）組み換えによって生成されたＩｇＧ２抗体を含有する溶液を、強陽イオン交換（ＳＣＸ）マトリックス、ＩｇＧ２（例えば、ＨＰ−６０１４）親和性マトリックス、およびプロテインＬマトリックスからなる群から選択される第１のマトリックスと接触させることと、（Ｂ）第１のマトリックスから２つ以上の第１の溶出画分を溶出することと、を含み、（ｉ）本方法に供されるＩｇＧ２抗体溶液は、第１のマトリックスを２つ以上のＩｇＧ２構造変異体に対応する２つ以上の別個の形態として溶出し、（ｉｉ）２つ以上の第１の溶出画分のうちの少なくとも１つは、ヒンジ領域のジスルフィド結合によって異なるＩｇＧ２構造変異体のうちの少なくとも１つが濃縮されている、方法を含む。一実施形態において、本方法は、２つ以上の第１の溶出画分のうちの少なくとも１つを、ＳＣＸマトリックス、ＩｇＧ２（例えば、ＨＰ−６０１４）親和性マトリックス、およびプロテインＬマトリックスからなる群から選択される第２のマトリックスと接触させることと、第２のマトリックスから２つ以上の第２の溶出画分を溶出することとをさらに含み、２つ以上の第２の溶出画分のうちの少なくとも１つは、ＩｇＧ２構造変異体のうちの１つ以上がさらに濃縮される。一実施形態において、第１のマトリックスは、ＳＣＸマトリックスおよびＩｇＧ２（例えば、ＨＰ−６０１４）親和性マトリックスからなる群から選択される。別の実施形態において、第１のマトリックスはＳＣＸマトリックスである。別の実施形態において、第１のマトリックスはＩｇＧ２（例えば、ＨＰ−６０１４）親和性マトリックスである。より具体的な実施形態において、第１のマトリックスはＳＣＸマトリックスであり、第２のマトリックスはＩｇＧ２（例えば、ＨＰ−６０１４）親和性マトリックスである。別のより具体的な実施形態において、第１のマトリックスはＳＣＸマトリックスであり、第２のマトリックスはプロテインＬマトリックスである。別のより具体的な実施形態において、第１のマトリックスはＩｇＧ２（例えば、ＨＰ−６０１４）親和性マトリックスであり、第２のマトリックスはＳＣＸマトリックスである。
【０００４】
上記実施形態のいずれにおいても、ＳＣＸマトリックスはＹＭＣ−ＳＣＸを含み得る。上記実施形態のいずれにおいても、第１または第２のマトリックスからの溶出は、低ｐＨ緩衝液、例えば、約２〜３、約３〜４、約４〜５、および約５〜６のｐＨを有する緩衝液を使用して行うことができる。具体的な実施形態において、溶出緩衝液は、５、約４．２、約３．８、または約２．８以下のｐＨを有する。上記態様および実施形態のいずれにおいても、ｐＨ段階溶出またはｐＨ勾配溶出を用いることができ、例えば、約ｐＨ７．２から約ｐＨ２．８へのｐＨ勾配を用いることができる。上記態様および実施形態のいずれにおいても、塩段階溶出または塩勾配溶出を用いることができ、例えば、塩濃度を約１００ｍＭから約２５０ｍＭ（例えば、ＮａＣｌ）に増加させる勾配溶出を用いることができる。上記態様または実施形態のいずれにおいても、ＩｇＧ２抗体製剤は、ＩｇＧ２構造変異体のうちの少なくとも１つが、所望のＩｇＧ２構造変異体の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％のレベルの純度まで濃縮されてもよい。
【０００５】
上記実施形態のいずれにおいても、マトリックスは、例えば、分析スケールカラム、半分取スケールカラム、または分取スケールカラム等のタンパク質精製カラムに充填することができる。カラムは、例えば、１ｍＬ以上、２ｍＬ以上、３ｍＬ以上、４ｍＬ以上、５ｍＬ以上、６ｍＬ以上、７ｍＬ以上、８ｍＬ以上、９ｍＬ以上、１０ｍＬ以上、１５ｍＬ以上、２５ｍＬ以上、５０ｍＬ以上、１００ｍＬ以上、２００ｍＬ以上、５００ｍＬ以上、１Ｌ以上、１０Ｌ以上、１００Ｌ以上、１０００Ｌ以上の体積を有することができる。カラムは、５ミクロン以上、１０ミクロン以上、１５ミクロン以上、２０ミクロン以上、２５ミクロン以上、２６ミクロン以上、２７ミクロン以上、２８ミクロン以上、２９ミクロン以上、３０ミクロン以上、３５ミクロン以上、または４０ミクロン以上の直径を有する樹脂ビーズを用いることができる。カラムの直径は、例えば、１ｃｍ以上、２ｃｍ以上、３ｃｍ以上、４ｃｍ以上、５ｃｍ以上、６ｃｍ以上、７ｃｍ以上、８ｃｍ以上、９ｃｍ以上、１０ｃｍ以上、２０ｃｍ以上、３０ｃｍ以上、４０ｃｍ以上、５０ｃｍ以上、または１００ｃｍ以上であってもよい。カラムは、例えば、１０ｃｍ／時以上、２５ｃｍ／時以上、５０ｃｍ／時以上、１００ｃｍ／時以上、１２５ｃｍ／時以上、１５０ｃｍ／時以上、１７５ｃｍ／時以上、２００ｃｍ／時以上、４００ｃｍ／時以上、６００ｃｍ／時以上、８００ｃｍ／時以上、または１０００ｃｍ／時以上の流速を用いることができる。カラムに負荷されるｍＡｂの量は、０．１ｇ／Ｌ以上、０．５ｇ／Ｌ以上、１ｇ／Ｌ以上、２ｇ／Ｌ以上、４ｇ／Ｌ以上、５ｇ／Ｌ以上、６ｇ／Ｌ以上、７ｇ／Ｌ以上、８ｇ／Ｌ以上、９ｇ／Ｌ以上、１０ｇ／Ｌ以上、１１ｇ／Ｌ以上、１２ｇ／Ｌ以上、１３ｇ／Ｌ以上、１４ｇ／Ｌ以上、１５ｇ／Ｌ以上、２０ｇ／Ｌ以上、２５ｇ／Ｌ以上、または３０ｇ／Ｌ以上であってもよい。カラムは、例えば、２０以下のカラム体積（ＣＶ）、１５以下のＣＶ、１４以下のＣＶ、１３下のＣＶ、１２下のＣＶ、１１下のＣＶ、１０下のＣＶ、９下のＣＶ、８下のＣＶ、７下のＣＶ、６下のＣＶ、５下のＣＶ、４下のＣＶ、または３以下のＣＶで、ピーク溶出のために単一の増加する塩の勾配を用いることができる。塩勾配は、例えば、約０．５ｍＭ塩／カラム体積未満、約０．５ｍＭ塩／カラム体積〜約５ｍＭ塩／カラム体積、約０．５ｍＭ塩／カラム体積、０．６ｍＭ塩／カラム体積、０．７ｍＭ塩／カラム体積、０．８ｍＭ塩／カラム体積、０．９ｍＭ塩／カラム体積、１ｍＭ塩／カラム体積、１．２ｍＭ塩／カラム体積、１．４ｍＭ塩／カラム体積、１．６ｍＭ塩／カラム体積、１．８ｍＭ塩／カラム体積、２ｍＭ塩／カラム体積、３ｍＭ塩／カラム体積、４ｍＭ塩／カラム体積、５ｍＭ塩／カラム体積、または５ｍＭ塩／カラム体積超であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、標準的な方法（Ｄｉｏｎｅｘ  ＷＣＸ、図１Ａ）および本明細書に記載されるＳＣＸ法（図１Ｂ）を用いたｍＡｂ１ジスルフィドアイソフォームの低ｐＨ（５以下）ＣＥＸ分離の比較を示す。この比較は、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣとともに操作される分析サイズカラム（Ｄｉｏｎｅｘは４．６×３００ｍｍ、ＹＭＣ  ＳＣＸは４．６×１００ｍｍ）を使用して行われた。図示されるように、ＹＭＣ  ＳＣＸカラムは、Ｄｉｏｎｅｘ  ＷＣＸカラムと比較してさらなるアイソフォームの分解能を提供することが可能であった。
【図２】５００ｍＬ  ＹＭＣ−ＳＣＸカラムから回収された陽イオン交換画分（Ｘ軸に沿った画分数）中のｍＡｂ１ジスルフィドアイソフォームのパーセントを示す（アイソフォーム種は凡例に示す）。ｍＡｂ１材料の１グラム注入および塩／ｐＨ勾配（画分数の増加に伴って、塩は増加し、ｐＨは減少した）後に画分を回収した。図示されるように、ＩｇＧ２−Ｂの含有量は最初の画分中で最も高かったのに対し、ＩｇＧ２−Ａ／ＢおよびＩｇＧ２−Ａは、より後期の画分中に最も多かった。初期から後期への溶出順序は、ＩｇＧ２−Ｂ、ＩｇＧ−Ａ／Ｂ、およびＩｇＧ２−Ａであった。Ｙアイソフォームのパーセントは、逆相ＨＰＬＣによって決定した。
【図３】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、および３Ｄは、ＹＭＣ  ＢｉｏＰｒｏ  ＳＰ−Ｆ  ＳＣＸカラムを使用して分離したｍＡｂ１  ＣＥＸ画分の逆相クロマトグラムを示す（図２）。ｍＡｂ１バルクを図３Ａに示す。より初期に溶出されたＣＥＸ画分（図３Ｂおよび３Ｃ）は、それぞれ高度に濃縮されたピーク−１および２を（それぞれ、ＩｇＧ２−ＢおよびＩｇＧ２−Ａ／Ｂ）を含有していたのに対し、より後期に溶出された画分（図３Ｄ）は、高度に濃縮されたピーク−３および４（ＩｇＧ２−Ａ種）を含有していた。
【図４】ｍＡｂ１バルク（実線）およびプロテインＬ（破線）の溶出画分の逆相クロマトグラムを示す。ｍＡｂ１バルク材料をＰｉｅｒｃｅ社製５ｍＬ半分取クロマトグラフィーカラム（ＰＮ−８９９２９）に負荷し、１００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ２．８）で溶出した。回収された画分を逆相カラムに注入した。プロテインＬ親和性カラム法を用いて、ＩｇＧ２−Ａ／ＢおよびＩｇＧ２−Ａ種の著しい濃縮を達成した。
【図５】結合および溶出法を用いて、プロテインＬカラムを装備したＡＫＴＡシステム上で記録した、ｍＡｂ１の高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）による精製図を示す。ｍＡｂ１材料を２４ｍＬプロテインＬ分取カラムに負荷した。ｍＡｂ１をｐＨ７．２のＰＢＳ中に希釈し（１：１）、カラムに負荷した。泳動用緩衝液はｐＨ７．２のＰＢＳであり、溶出緩衝液はｐＨ２．８の１００ｍＭグリシンであった。ｐＨはグレーの線で示され、Ｙ軸に沿ったｐＨ単位に対応する。データは、大部分のｍＡｂ１がカラムによって保持されずに、洗浄によって除去されたことを示す。保持されたｍＡｂ１材料を低ｐＨ（約４．２）で溶出し、分析のために回収した。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、ｍＡｂ１バルク（グレーの実線）、ならびにプロテインＬを素通りした材料（図６Ａ破線）、および溶出材料（図６Ｂ破線、ｍＡｂ１バルクは図６Ｂ中の黒い実線として示される）の逆相クロマトグラムを示す。ｍＡｂ１バルク材料を２４ｍＬプロテインＬ分取ＦＰＬＣカラムに負荷し、１００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ２．８）で溶出した。回収された画分の緩衝液を交換し、逆相カラムに注入した。プロテインＬ親和性カラム法を用いて、ＩｇＧ２−ＢおよびＩｇＧ２−Ａ種の著しい濃縮を達成した。
【図７】図７Ａ、７Ｂ、および７Ｃは、別のＩｇＧ２抗体ｍＡｂ２のＦＰＬＣ（ＡＫＴＡ）精製および分画によって作製されたプロテインＬ画分の逆相クロマトグラムを示す。ｍＡｂ２材料をｐＨ７．２のＰＢＳ中に希釈した（１：１）後、２４ｍＬプロテインＬ分取カラムに負荷した。泳動用緩衝液はｐＨ７．２のＰＢＳであり、溶出緩衝液はｐＨ２．８の１００ｍＭグリシンであった。ｍＡｂ１の場合とは異なり、素通り画分中にタンパク質が検出されなかったことから、全てのｍＡｂ２ジスルフィドアイソフォームが保持されたことが示唆される。逆相ＨＰＬＣにより溶出画分を分析した。ｍＡｂ２のバルク材料は、Ｂ、Ａ／Ｂ、Ａ１、およびＡ２アイソフォームを含有していた（図７Ａ）。ＩｇＧ２−ＢおよびＡ／Ｂは、ｐＨを低下させると最初に溶出された（図７Ｂ）。ＩｇＧ２−Ａ種（Ａ１およびＡ２）は、ｐＨが約３に達した時に溶出された（図７Ｃ）。
【図８】図８Ａ、８Ｂ、および８Ｃは、ｍＡｂ３のＦＰＬＣ（ＡＫＴＡ）精製および分画後のプロテインＬ画分の逆相クロマトグラムを示す。ｍＡｂ３材料を２７５ｍＬプロテインＬカラムに負荷した。泳動用緩衝液はｐＨ６．５の２５ｍＭ  ＭＯＰＳであり、溶出緩衝液はｐＨ２．８の１００ｍＭグリシンであった。素通り画分中にタンパク質が検出されなかったことから、全てのｍＡｂ３ジスルフィドアイソフォームが保持されたことが示される。逆相分析により溶出画分を分析した。ｍＡｂ２のバルク材料は、Ｂ、Ａ／Ｂ、Ａ１、およびＡ２アイソフォームを含有していた（図８Ａ）。ＩｇＧ２−ＢおよびＡ／Ｂは、ｐＨを低下させると最初に溶出された（図８Ｂ）。ＩｇＧ２−Ａ種（Ａ１およびＡ２）は、ｐＨが約３に達した時に溶出された（図８Ｃ）。
【図９】図９Ａ、９Ｂ、および９Ｃは、図８Ａ、８Ｂ、および８Ｃに示される実験に使用したものとは異なる緩衝液を使用してｍＡｂ３のＦＰＬＣ（ＡＫＴＡ）精製および分画した後のプロテインＬ画分の逆相クロマトグラムを示す。ｍＡｂ３材料を２７５ｍＬプロテインＬ大規模分取カラムに負荷した。泳動用緩衝液はＧｅｎｔｌｅ  Ａｇ／Ａｂ  Ｂｉｎｄｉｎｇであり、溶出緩衝液により、ほぼ中性のｐＨで溶出が可能であった。素通り画分中にタンパク質が検出されなかったことから、全てのｍＡｂ３ジスルフィドアイソフォームが保持されたことが示される。逆相ＨＰＬＣにより溶出画分を分析した。ｍＡｂ３のバルク材料は、Ｂ、Ａ／Ｂ、Ａ１、およびＡ２アイソフォームを含有していた（図９Ａ）。ＩｇＧ２−ＢおよびＩｇＧ２−Ａ／Ｂは、ｐＨを弱酸性ｐＨに低下させると最初に溶出された（図９Ｂ）。ＩｇＧ２−Ａ種（Ａ１およびＡ２）は、ｐＨが約３に達した時に溶出された（図９Ｃ）。
【図１０】ｍＡｂ１−ＢおよびｍＡｂ１−Ａの濃縮画分ならびに抗ヒトＩｇＧ２  ＨＰ−６０１４対照材料のサイズ排除クロマトグラフィー結合アッセイを示す。ｍＡｂ１−ＢおよびｍＡｂ１−Ａ材料は、各アイソフォームと比較して約６５％純粋である。図示されるように、ＩｇＧ２−Ａアイソフォーム中の濃縮された材料がほぼ完全な結合を有するのに対し、ＩｇＧ２−Ｂの濃縮材料は主に未結合のままであった。
【図１１】ｍＡｂ２−ＢおよびｍＡｂ２−Ａの濃縮画分ならびに抗ヒトＩｇＧ２  ＨＰ−６０１４対照材料のサイズ排除クロマトグラフィー結合アッセイを示す。ｍＡｂ２−ＢおよびｍＡｂ２−Ａ材料は、各アイソフォームと比較して約６５％純粋である。図示されるように、ＩｇＧ２−Ａアイソフォーム中の濃縮された材料がほぼ完全な結合を有するのに対し、ＩｇＧ２−Ｂの濃縮材料は主に未結合のままであった。
【図１２】ｍＡｂ７−ＢおよびｍＡｂ７−Ａの濃縮画分ならびに抗ヒトＩｇＧ２  ＨＰ−６０１４対照材料のサイズ排除クロマトグラフィー結合アッセイを示す。ｍＡｂ７−ＢおよびｍＡｂ７−Ａ材料は、各アイソフォームと比較して約６５％純粋である。図示されるように、ＩｇＧ２−Ａアイソフォーム中の濃縮された材料がほぼ完全な結合を有するのに対し、ＩｇＧ２−Ｂの濃縮材料は主に未結合のままであった。
【図１３】ｍＡｂ１−Ｂアイソフォーム、ｍＡｂ１−Ａアイソフォーム、および抗ＩｇＧ２  ＨＰ−６００２のサイズ排除クロマトグラフィー結合アッセイを示す。ｍＡｂ１−ＢおよびｍＡｂ１−Ａ材料は、各アイソフォームと比較して約６５％純粋である。図示されるように、全てのアイソフォームは、抗ヒトＩｇＧ２クローンＨＰ−６００２に対して同様の結合を示した。
【図１４】ｍＡｂ７−Ｂアイソフォーム、ｍＡｂ７−Ａアイソフォーム、および抗ＩｇＧ２  ＨＰ−６００２のサイズ排除クロマトグラフィー結合アッセイを示す。ｍＡｂ７−ＢおよびｍＡｂ７−Ａ材料は、各アイソフォームと比較して約６５％純粋である。図示されるように、全てのアイソフォームは、抗ヒトＩｇＧ２クローンＨＰ−６００２に対して同様の結合を示した。
【図１５】図１５Ａ、１５Ｂ、および１５Ｃは、固定化した抗Ｈｕ  ＩｇＧ２  ＨＰ−６０１４によるＦＰＬＣ（ＡＫＴＡ）精製および分画後のｍＡｂ３画分の逆相クロマトグラムを示す。ｍＡｂ３材料を抗Ｈｕ  ＩｇＧ２親和性カラムに負荷した。泳動用緩衝液はｐＨ７．２のＰＢＳであり、溶出緩衝液はｐＨ２．８の１００ｍＭグリシンであった。逆相ＨＰＬＣにより溶出画分を分析した。ｍＡｂ２のバルク材料は、Ｂ、Ａ／Ｂ、Ａ１、およびＡ２アイソフォームを含有していた（図１５Ｂ）。大部分のｍＡｂ３が、カラムによって保持されずに、Ｆ／Ｔ中に溶出された（図１５Ａ）。保持されたｍＡｂ３材料を低ｐＨ（約３．８）で溶出し、分析のために回収した。ＩｇＧ２−Ａ種（Ａ１およびＡ２）は、ｐＨが約３．８に達した時に溶出され、保持された主な成分であった（図１５Ｃ）。
【図１６】ｍＡｂ１  ＩｇＧ２ジスルフィドアイソフォームＢ、Ａ／Ｂ、Ａ１、およびＡ２の濃縮のフロー図を示す。
【図１７】ｍＡｂ７  ＩｇＧ２  ジスルフィドアイソフォームＢ、Ａ／Ｂ、およびＡの濃縮のフロー図を示す。
【図１８】７ｃｍ分取陽イオン交換カラム（樹脂負荷１２ｇ／Ｌ、２８０ｎｍで検出）からのＩｇＧ２の溶出のクロマトグラムを示す。
【図１９】分取ＣＥＸによるＩｇＧ２ジスルフィドアイソフォームの分離を示す。実線は、溶出画分中のＩｇＧ２の濃度に対応し、破線および点線は、各画分中で測定されたジスルフィドアイソフォームのピーク面積のパーセントに対応する。
【図２０】１０ｃｍ分取陽イオン交換カラム（樹脂負荷２．１ｇ／Ｌ、２８０ｎｍで検出）からのＩｇＧ２の溶出のクロマトグラムを示す。
【図２１】分取ＣＥＸによるＩｇＧ２ジスルフィドアイソフォームの分離を示す。実線は、溶出画分中のＩｇＧ２の濃度に対応し、破線および点線は、各画分中で測定されたジスルフィドアイソフォームのピーク面積の割合に対応する。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
定義
「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書において同義に使用される。この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の類似体または模倣体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーにも適用される。この用語は、例えば、糖タンパク質を形成するための炭水化物残基の付加、またはリン酸化によって修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。ポリペプチドおよびタンパク質は、天然に存在するおよび非組み換え型の細胞によって生成することができるか、あるいは遺伝子操作されたまたは組換え型の細胞によって生成され、天然タンパク質のアミノ酸配列を有する分子、または天然配列の１つ以上のアミノ酸からの欠失、該アミノ酸への付加、および／もしくは該アミノ酸の置換を有する分子を含む。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、ぺプチボディ、ドメインベースのタンパク質、および抗原結合タンパク質、例えば、その抗体および断片、ならびに前述のいずれかの１つ以上のアミノ酸からの欠失、該アミノ酸への付加、および／または該アミノ酸の置換を特に包含する。
【０００８】
「抗体」という用語は、任意のアイソタイプの無傷の免疫グロブリン、または標的抗原への特異的結合について無傷の抗体と競合することができるその抗原結合断片を指し、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、および二重特異性抗体を含む。「抗体」自体は、抗原結合タンパク質の一種である。無傷の抗体は、一般に、少なくとも２つの完全長重鎖および２つの完全長軽鎖を含む。抗体は、単一の源だけに由来してもよいか、または「キメラ」であってもよく、すなわち、抗体の異なる部分が２つの異なる抗体に由来してもよい。抗原結合タンパク質、抗体、または結合断片は、組換えＤＮＡ技術によって、または無傷の抗体の酵素的切断もしくは化学的切断によって、ハイブリドーマとして生成されてもよい。
【０００９】
「陽イオン交換材料」または「陽イオン交換マトリックス」という用語は、負に荷電した固相を指し、固相の上または中を通過する水溶液中の陽イオンと交換される遊離陽イオンを有する。電荷は、例えば共有結合によって、固相に１つ以上の荷電リガンドを付着させることによって提供されてもよい。代替として、または加えて、電荷は、固相に固有の特性であってもよい。陽イオン交換材料、マトリックス、または樹脂は、タンパク質の精製に有用なカラム内に設置または充填することができる。
【００１０】
「緩衝液」または「緩衝溶液」という用語は、その共役酸〜共役塩基の範囲の作用によってｐＨの変化に抵抗する溶液を指す。
【００１１】
「負荷緩衝液」または「平衡緩衝液」という用語は、タンパク質調製物をクロマトグラフィーマトリックスまたはカラムに負荷するためにタンパク質調製物と混合された塩（単数または複数）を含有する緩衝液を指す。この緩衝液はまた、負荷の前にマトリックスまたはカラムを平衡化するため、およびタンパク質を負荷した後にマトリックスまたはカラムを洗浄するためにも使用される。
【００１２】
「洗浄緩衝液」という用語は、組成物または溶液の負荷後、かつ対象となるタンパク質またはアイソフォームの溶出前に、クロマトグラフィーマトリックスまたはカラム上を通過させる緩衝液を指すために本明細書において使用される。洗浄緩衝液は、所望のタンパク質またはアイソフォームを実質的に溶出することなく、クロマトグラフィーマトリックスまたはカラムから１つ以上の汚染物質または望ましくないアイソフォームを除去する役割を果たし得る。
【００１３】
「溶出緩衝液」という用語は、クロマトグラフィーマトリックスまたはカラムから所望のタンパク質またはアイソフォームを溶出するために使用される緩衝液を指す。溶出緩衝液のｐＨおよび／または塩濃度は、カラムから所望のタンパク質を溶出できるように、典型的には、特定のカラムを充填または洗浄するために使用される負荷緩衝液および／または洗浄緩衝液のｐＨおよび／または塩濃度とは異なる。
【００１４】
本明細書において使用される場合、「溶液」という用語は、水を含む、緩衝された溶液または緩衝されていない溶液のいずれかを指す。
【００１５】
クロマトグラフィーマトリックスを「洗浄する」という用語は、クロマトグラフィーマトリックスの中または上に適切な緩衝液を通過させることを意味する。
【００１６】
クロマトグラフィーマトリックスから分子（例えば、特定のタンパク質、アイソフォーム、または汚染物質）を「溶出する」という用語は、典型的にはクロマトグラフィーマトリックス上に溶出緩衝液を通過させることによって、そのような物質から分子を除去することを意味する。物質は、典型的には、それがマトリックスから溶出された時にアリコートまたは画分として回収される。
【００１７】
「中性ｐＨ」という用語は、本明細書において別途定義されない限り、６．０〜８．０、好ましくは約６．５〜約７．５のｐＨを指す。
【００１８】
「弱酸性」という用語は、緩衝液、溶液等に関連して使用される場合、かつ本明細書において別途定義されない限り、約４．５〜約６．５のｐＨを有する緩衝液または溶液を指す。
【００１９】
「酸性」または「低ｐＨ」という用語は、ｐＨ、緩衝液、溶液等に関連して使用される場合、かつ本明細書において別途定義されない限り、約１〜約６．５のｐＨを有するｐＨまたは緩衝液または溶液を指す。
【００２０】
「汚染物質」または「不純物」という用語は、精製されるタンパク質の試料中に存在する精製されるタンパク質以外の、任意の外来性または好ましくない分子、特に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質等の生物学的巨大分子を指す。汚染物質は、例えば、精製されるタンパク質およびタンパク質を分泌する細胞からの他のタンパク質を含む。
【００２１】
タンパク質の精製に関連して使用される場合の「分離する」または「単離する」という用語は、第２のタンパク質またはアイソフォームまたは汚染物質の少なくとも大部分の分子を含む混合物の一部から、所望のタンパク質またはアイソフォームの少なくとも大部分の分子が除去されるように、所望のタンパク質またはアイソフォームと、第２のタンパク質またはアイソフォームまたは汚染物質との両方を含む混合物中の、第２のタンパク質またはアイソフォームまたは汚染物質からの所望のタンパク質またはアイソフォームの分離を指す。より具体的には、「分離する」または「単離する」という用語は、本明細書において、ＩｇＧ２抗体の異なる構造アイソフォームの分離を指すために、タンパク質の精製に関連しても使用され、異なる構造アイソフォームは、異なるジスルフィド結合パターンによって特徴付けられる。
【００２２】
所望のタンパク質またはアイソフォームと、１つ以上の汚染物質または望ましくないアイソフォーム（複数可）とを含む組成物または溶液から、所望のタンパク質またはアイソフォームを「精製する」または「精製すること」という用語は、組成物または溶液から少なくとも１つの汚染物質（例えば、望ましくないアイソフォーム）を（完全にまたは部分的に）除去することによって、組成物または溶液中の所望のタンパク質またはアイソフォームの純度を増加させることを意味する。
【００２３】
イオン交換材料に分子を「結合させる」または「結合させること」という用語は、分子と、荷電基またはイオン交換材料もしくはマトリックス荷電基との間のイオン相互作用によってイオン交換材料またはマトリックスの中もしくは上で分子が可逆的に固定化されるように、適切な条件下（例えば、ｐＨおよび選択された塩／緩衝液濃度）でイオン交換材料またはマトリックスに分子を曝露することを意味する。
【００２４】
陽イオン交換クロマトグラフィー
イオン交換クロマトグラフィーは、それらの正味電荷に基づいて化合物を分離する。イオン分子は、陰イオン（負の電荷を有する）または陽イオン（正の電荷を有する）のいずれかとして分類される。いくつかの分子（例えば、タンパク質）は、陰イオン基および陽イオン基の両方を有し得る。正に帯電する支持体（陰イオン交換体）は、全体として負電荷を帯びた化合物に結合する。反対に、負に帯電する支持体（陽イオン交換体）は、全体として正電荷を帯びた化合物に結合する。陽イオン交換媒体は、当業者に既知である。例示的な陽イオン交換媒体は、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅｄ．Ｈａｒｒｉｓ  ＥＬＶ，Ａｎｇａｌ  Ｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｊａｎｓｏｎ  Ｊ  Ｃ，Ｒｙｄｅｎ  Ｌ，ＶＣＨ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ（１９８９）；Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｓｃａｌｅ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｅｄ．Ｓｈｕｋｌａ  Ａ  Ａ，Ｅｔｚｅｌ  Ｍ  Ｒ，Ｇａｄａｍ  Ｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｇｒｏｕｐ（２００７），ｐａｇｅｓ  １８８−１９６；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ２００７（１８−１１３２−２９）およびＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（２．ｓｕｐ．ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  １９９８），Ｅｄ．Ｊａｎｓｏｎ  Ｊ−Ｃ  ａｎｄ  Ｒｙｄｅｎ  Ｌに記載されており、これらの開示は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
【００２５】
イオン交換マトリックスは、強い交換体または弱い交換体のいずれかとしてさらに分類することができる。弱イオン交換マトリックスは、弱酸（例えば、カルボン酸（Ｒ−ＣＯＯ−に由来するカルボキシメチル基等）を含有するかまたはそれに由来し、ｐＨが４または５未満になると徐々にその電荷を損失する。交換カラムのイオン基は、ゲルマトリックスに共有結合し、緩衝液中に存在する低濃度の対イオンによって補償される。ＷＣＸカラム中の官能基の非限定的な例は、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２−である。
【００２６】
強イオン交換マトリックスは、ｐＨ１〜１４から電荷を帯びた状態に留まる強酸（スルホプロピル基等）を含有するため、幅広い範囲のｐＨレベルにわたって電荷を帯びている（イオン化される）。したがって、強陽イオン交換（ＳＣＸ）クロマトグラフィーは、スルホン酸（Ｒ−ＳＯ３Ｈ）等の強酸に由来する官能基を含む樹脂を使用する。ＳＣＸカラム中の官能基の非限定的な例は、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−である。
【００２７】
陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）は、ＩｇＧ精製のための好ましい方法となっている。ＣＥＸの比較的弱い緩衝溶液条件は、宿主細胞タンパク質およびＩｇＧ変異体からＩｇＧを精製する一方で、ＩｇＧの天然構造を保存するのに役立つ（Ｓｈｕｋｌａ，ｅｔ  ａｌ．，２００６）。タンパク質のイオン交換クロマトグラフィーの最適な条件は、溶出緩衝液のｐＨがタンパク質のｐＩの１ｐＨ単位内である場合に達成される。ＩｇＧ分子の平均ｐＩ値が７〜８．５の範囲である場合に、比較的弱い緩衝液（弱酸性から中性のｐＨ）が、正に帯電する（陽イオン）ＩｇＧ分子のＣＥＸに最適な条件を提供する。ＣＥＸは、宿主細胞タンパク質（チャイニーズハムスター卵巣細胞）汚染物質（Ｓｈｕｋｌａ，ｅｔ  ａｌ．，２００６）、ＩｇＧ分子の脱アミド化された種（Ｈａｒｒｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｂａｓｅｙ，ｅｔ  ａｌ．米国特許第７，０７４，４０４号）、および他のタンパク質変異体を除去することにより、組み換えＩｇＧ分子の下流精製ステップの１つとして用いられる。ＣＥＸは、バイオテクノロジー産業においてＩｇＧ  ｍＡｂの精製のための一般的な方法となっているが、とりわけ分析レベルでは、ＣＥＸによるＩｇＧ２ジスルフィドアイソフォームの精製は、わずかな成功を収めているに過ぎない。
【００２８】
ＩｇＧ２ジスルフィドアイソフォームは、生化学的および生物物理学的な特徴付けのために、低ｐＨ（約５）弱陽イオン交換を用いて以前に濃縮された（Ｗｙｐｙｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，２００８）。一般に、ＣＥＸクロマトグラフィーは、分子の全体的な表面電荷の違いに基づいて、タンパク質における比較的微妙な化学的および構造的な違いを検出する分解能を有する。ＩｇＧ２ジスルフィドアイソフォームの場合、各アイソフォームの３次元構造が特有の表面電荷を生成し、ＷＣＸクロマトグラフィーによる部分的な分解を可能にする。ジスルフィドアイソフォームの濃縮のためにこの技術を使用する際の課題の１つは、他の翻訳後修飾体またはタンパク質変異体（脱アミド化、凝縮、糖化、ＣおよびＮ末端修飾等）が、ジスルフィドアイソフォームと同じ回収画分中で分離および濃縮されることが多いということである。初期の研究は、半分取スケールでＩｇＧ２ジスルフィドアイソフォームを分離することが可能な唯一の非変性クロマトグラフィー技術としてＷＣＸを特定した。ＷＣＸは、「Ａ」および「Ｂ」アイソフォームのある程度純粋な画分の生成にわずかに良好に機能することが示されているが、この技術は一般に、ジスルフィドアイソフォームの「Ａ／Ｂ」および他の亜種を分解する際にはうまく機能しない。例えば、ＩｇＧ２λ抗体は、主に「Ａ／Ｂ」および「Ａ」アイソフォームからなる（９５％超）ことが分かっており（Ｗｙｐｙｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｄｉｌｌｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，２００８）、そのため、ＷＣＸを使用して低存在量の「Ｂ」種を分解することを特に困難にしている。
【００２９】
本明細書に詳述する実験は、結果として高純度のＩｇＧ２ジスルフィドアイソフォームの収率を増加させる、ＳＣＸに基づく新しいプロセスの開発を実証する。次いで、ＳＣＸプロセスを、下流精製プロセスを強化するためのさらなる新規分離技術と組み合わせた。本発明の方法に有用な市販の強陽イオン交換（ＳＣＸ）媒体の例として、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ：ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＢＢ、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ、Ｍｉｎｉ  Ｓ、Ｍｏｎｏ  Ｓ、Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｓ、Ｓｏｕｒｃｅ  ３０Ｓ、Ｃａｐｔｏ  Ｓ、ＭａｃｒｏＣａｐ  ＳＰ、Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ  ＳＰ−ＸＬ、Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ  ＣＳＴ−１（多様式樹脂であるが、強力なＣＥＸ構成要素を含む）；Ｔｏｓｏｈａａｓ樹脂：Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｍｅｇａ  Ｃａｐ  ＴＩ  ＳＰ−５５０  ＥＣ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｇｉｇａ  Ｃａｐ  Ｓ−６５０Ｍ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｓ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳＰ６５０Ｓ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳＰ５５０Ｃ；ＪＴ  Ｂａｋｅｒ樹脂：Ｃａｒｂｏｘｙ−Ｓｕｌｐｈｏｎ−５、１５  および  ４０  ｕｍ、Ｓｕｌｆｏｎｉｃ−５，１５，および  ４０  ｕｍ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ：Ｐｏｒｏｓ  ＨＳ  ２０および５０  ｕｍ、Ｐｏｒｏｓ  Ｓ  １０および２０  ｕｍ；Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ：Ｓ  Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｐｅｒ  Ｄ；Ｍｅｒｃｋ  ＫＧｇＡ樹脂：Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＯ３、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＥ  Ｈｉｃａｐ、Ｆｒａｃｔｏ  Ｐｒｅｐ  ＳＯ３；Ｂｉｏｒａｄ樹脂：Ｕｎｏｓｐｈｅｒｅ  Ｓが挙げられる。強陽イオン交換クロマトグラフィー材料のさらなる供給源は、例えば、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｓ（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡから入手可能）、Ｐａｒｔｉｓｐｈｅｒｅ  ＳＣＸ（Ｗｈａｔｍａｎ  ｐｌｃ，Ｂｒｅｎｔｆｏｒｄ，ＵＫから入手可能）、ＹＭＣ−ＳＣＸ  ３０  μｍ樹脂（ＹＭＣ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ，ＰＡから）、および上述のＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＯ３等のＳＯ３基で修飾した任意の架橋メタクリル酸を含む。
【００３０】
プロテインＬ
プロテインＬは、ＩｇＧに特異性を示す、天然に存在する細菌細胞壁タンパク質であり（Ｋａｓｔｅｒｎ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０），Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８，１２１７−１２２２）、プロテインＡ（Ｆｏｒｓｇｒｅｎ，Ａ．ａｎｄ  Ｓｊｏｑｕｉｓｔ，Ｊ．（１９６６））およびプロテインＧ（Ｂｊｏｒｃｋ，Ｌ．ａｎｄ  Ｋｒｏｎｖａｌｌ，Ｇ．（１９８４））に類似する。これらのタンパク質は、ＩｇＧ分子に高い親和性で結合することが示されているが、プロテインＬは、Ｆａｂ−Ｆｃ（ヒンジ）インターフェースに近接するＩｇＧの軽鎖（ＬＣ）に特異的に結合するという点で特有である。これは、ＣＨ２−ＣＨ３インターフェースにおいて重鎖のより低いＦｃ部分に結合するプロテインＡおよびＧとは異なる。プロテインＬの主な結合部位は、ＩｇＧ  ＬＣの可変ドメイン内に含まれることが研究によって示されている（Ｎｉｌｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。より具体的には、プロテインＬは、ＶκＩ、ＶκＩＩＩ、およびＶκＩＶサブグループのκＬＣのみに結合することが示されている。本明細書に詳述する実験は、プロテインＬが個々のＩｇＧ２ジスルフィドアイソフォームに差次的に結合できることを示唆している。
【００３１】
本明細書に詳述する方法を実施する際には、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）社製のＰｉｅｒｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ親和性樹脂を含む、多くの異なるプロテインＬカラムのうちのいずれが使用されてもよい。
【００３２】
ＩｇＧ２  親和性マトリックス
抗体は、一般に、免疫試薬として使用するために新たに発見されたタンパク質に対して開発される。複数のＩｇＧ２特異的クローンを作製し、ドメイン特異性について調べた。本発明を裏付けるために行われた実験は、抗体ＨＰ−６０１４（Ｈａｒａｄａ，ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｈａｒａｄａ，ｅｔ  ａｌ．，１９９２）および類似するエピトープを有する抗体は、ＩｇＧ２抗体の精製に関連してＩｇＧ２ジスルフィドアイソフォームを区別するために使用され得ることを示唆している。
【００３３】
組み込み
本明細書に記載される方法は、ＩｇＧ２ジスルフィドアイソフォームを分離することが可能なＳＣＸクロマトグラフィー、プロテインＬカラム、および／または新規抗ヒトＩｇＧ２アイソフォーム親和性カラムを用いた、ＩｇＧ２ジスルフィドアイソフォームの効率的な分離のために開発された。これらの技術は、個々のアイソフォームの純度における著しい改善および収率の大幅な増加をもたらした。多くの特性試験の場合、必要な変異体のほぼ１００％の純度を有することが望ましい。本明細書に記載される試験において、単一の精製技術を使用した場合、所望のアイソフォームの約７５〜８５％の純度を得ることができた。２つまたは３つの技術を組み合わせた場合、アイソフォームの９０〜１００％の純度を得ることができた。本明細書に詳述するような方法は、任意のＩｇＧ２  ｍＡｂアイソフォームを同様に精製するために当業者によって用いられ得る。例として、図１６のフロー図は、ｍＡｂ１ジスルフィドアイソフォームの高純度画分を生成するためにこれらの技術を組み合わせた適用を説明している。所望のＩｇＧ２アイソフォームの純度を向上させるために、いくつかの異なる組み合わせの３つのカラムを実装した（図１６）。これらの個々の分離技術およびカラムの組み合わせは、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ３、ｍＡｂ４、ｍＡｂ５、ｍＡｂ７、ｍＡｂ９、ｍＡｂ１０、およびｍＡｂ１１を含む、多くのｍＡｂに成功裡に適用されてきた。
【００３４】
さらに、そのような組み合わせは、当業者によっていずれのＩｇＧ２  ｍＡｂに適用されてもよい。例えば、プロテインＬは、ｍＡｂを含有するＶｋＩＩ軽鎖に結合することができたため、ｍＡｂ７の場合にはいくらか異なる手法が用いられた。下の表１に示すように、ｍＡｂ７には、ＢおよびＡ／Ｂアイソフォーム精製のための出発カラムとして陽イオン交換を使用し、Ａアイソフォームのためには抗ｈｕ  ＩｇＧ２親和性カラムを使用した。各カラムの異なる結合特性を利用することにより、比較的大規模で非常に高純度な材料（９５〜１００％）の調製が可能となった。要約すると、本明細書に記載される複数カラムの方法は、調べた全てのＩｇＧ２  ｍＡｂに対して良好に作用したが、本方法を他のＩｇＧ２  ｍＡｂに適用する場合、当業者によって何らかの方法の最適化が行われてもよい。
【表１】
2015502959.tif 000003
【００３５】
下の表２は、本明細書に記載されるデータの定性的概要を、一般的なＩｇＧ２ジスルフィドアイソフォームの結合特性について参照することができる形式で示す。
【表２】
2015502959.tif 000004
【００３６】
記載される技術の用途または使用法の１つは、最も高純度のアイソフォームをそれらの力価および他のパラメータの評価のために得ることである。別の用途または使用法は、所定の定義されたパーセンテージのアイソフォームを有するバルク材料を得ることである。これは、臨床試験、商業用途、および異なる生成プロセスに対するバルク材料の比較可能性をより良好にするために有用である。例えば、本明細書に記載される方法は、ＩｇＧ２ジスルフィドアイソフォームの相対的な存在量を制御するという目的で、ｍＡｂの生成中に下流プロセスにおいて大規模分取陽イオン交換カラムに関連して使用されてもよい（Ｓｈｕｋｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｓｈｕｋｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。定義されたパーセンテージのアイソフォームを有するバルク材料を生成するために、精製プロセスは、限定されたＣＥＸ画分を回収する結果となり得る。例えば、ＲＰ−ＨＰＬＣアッセイによるアイソフォーム存在量のオンライン測定後に、カットオフ時間またはカットオフ溶出体積が調節されてもよい。下流精製プロセスの間に、例えば、迅速なＲＰ−ＨＰＬＣアッセイ（例えば、２〜３分で送液）とＣＥＸを組み合わせて用いることは、ＩｇＧ２アイソフォームの製造管理を行うための１つの方法である。
【００３７】
本発明の方法は、生成中に個々のＩｇＧ２−ＡおよびＩｇＧ２−Ｂジスルフィドアイソフォームを、例えば、グラムおよびキログラム規模で、分離および精製するために用いることができる。本方法はまた、診断目的のために、例えば患者の血液中の、個々のＩｇＧ２アイソフォームの存在量をナノグラムおよびマイクログラム規模で認識および測定するためにも用いることができる。さらに、例えばタンパク質の生成中に、ジスルフィドアイソフォームの力価、安定性、凝縮傾向、他の特徴を評価することができるように、異なるジスルフィドアイソフォーム（例えば、Ｂ、Ａ／Ｂ、Ａ１、Ａ２）が単離されてもよい。
【００３８】
ｍＡｂ（例えば、原体）の全体的なジスルフィドアイソフォームの比率は、例えば、以下のように変更することができる：（ａ）Ｂ型がより少なく、Ａ１、Ａ２型＋Ａ／Ｂ型がより多くなるように比率を変化させるために、陽イオン交換溶出ピークのより後期に回収を開始する；（ｂ）Ａ１、Ａ２型がより少なく、Ｂ型＋Ａ／Ｂ型がより多くなるように比率を変化させるために、陽イオン交換溶出ピークのより初期に回収を停止する；（ｃ）より後期に回収を開始してより早く回収を停止し、より多くのＡ／Ｂ型ならびにより少ないＢ、Ａ１、およびＡ２型を有するように陽イオン交換溶出ピークの中央部分を回収し、かつ／またはより少ないＡ／Ｂ型ならびにより多くのＢ、Ａ１、およびＡ２型を有するように、陽イオン交換溶出ピークの前画分および後画分を回収およびプールする。
【００３９】
溶液中のｍＡｂに加えられる酸化還元試薬はまた、ｍＡｂを陽イオン交換樹脂に結合させ、残留する未結合の酸化還元試薬を除去するために洗浄し、次いで溶出することにより、ジスルフィドアイソフォームの比率を変更するように除去されてもよい。代替として、または加えて、ｍＡｂを陽イオン交換樹脂に結合させ、ジスルフィドアイソフォームの変化を可能にする緩衝液条件下で酸化還元試薬で洗浄し、次いで酸化還元試薬を除去するために洗浄し、最終的に溶出することもできる。
【００４０】
分取スケールのＳＣＸ法を異なる抗体に適合させる
分取スケールの生成は、例えば、５ｍｌよりも大きい体積を有するカラム、より大きな樹脂ビーズ径（例えば、３０マイクロンビーズ）、より大きな直径のカラム（例えば、７ｃｍ以上）、より高い流速（例えば、約１００ｃｍ／時）、より大きな負荷量（例えば、２ｇ／Ｌ超、１２ｇ／Ｌ超）、単一の比較的短い（例えば、１０ＣＶ以下）かつ／または緩やか〜非常に緩やかな（例えば、１〜２ｍＭ塩／カラム体積）ピーク溶出のための増加する塩の勾配を含み得る。いくつかの実施形態において、分取スケールの生成は、単一の比較的短い、増加する塩の緩やかな勾配、およびより高い樹脂負荷量（例えば、２ｇ  ｍＡｂ／Ｌ超、４ｇ  ｍＡｂ／Ｌ超、６ｇ  ｍＡｂ／Ｌ超、８ｇ  ｍＡｂ／Ｌ超、１０ｇ  ｍＡｂ／Ｌ超、１２ｇ  ｍＡｂ／Ｌ超、１５ｇ  ｍＡｂ／Ｌ超、または３０ｇ  ｍＡｂ／Ｌ超）によって特徴付けられる。
【００４１】
実施例１０および１１において提案されるように、本発明の分取スケール用途に用いられる溶出勾配は、異なるｍＡｂについて最適化することができる。これを達成することができる方法について以下に説明する。勾配は、緩衝液Ａとして塩を加えていないｐＨ５．０〜５．２の緩衝液と、緩衝液Ｂとして２５０ｍＭまたは４００ｍＭ以上のＮａＣｌを加えたｐＨ５．２〜ｐＨ４．５の緩衝液とを使用して、最初にベンチスケールの（例えば、直径１ｃｍ以下、分取カラムと同様の床高を有する）陽イオン交換カラムでスカウンティングされてもよい。緩衝液ＡのｐＨは、負荷されたモノクローナル抗体（原体または初期インプロセスプール）のｐＨに類似することが意図され、必要な場合または望ましい場合、ｐＨ５よりも幾分高いかまたは低くてもよい。緩衝液Ａを用いて平衡化した後、スカウトカラムに充填樹脂床１ｍＬ当たり０．５〜２ｍｇのｍＡｂを負荷してもよい。ｍＡｂは、必要に応じて、負荷するのに都合のよい体積、例えば、１カラム体積（ＣＶ）まで、緩衝液Ａを用いて希釈してもよいか、または必要に応じて、陽イオン交換樹脂への結合を可能にするために、伝導率を減少させるように希釈してもよい。負荷後、緩衝液Ａを用いてスカウトカラムを短時間で洗浄してもよく（１〜３ＣＶ）、次いで、０％〜１００％のＢ（または１０％〜９０％のＢもしくは２０％〜８０％のＢ）からの長い勾配（２０〜５０ＣＶ）をカラムに適用してもよい。０％よりも大きなＢの％で長い勾配が始まる場合、先行ステップにおける負荷後の洗浄は、典型的には、０％のＢから長い勾配に望ましいＢの開始％までの短い勾配（１〜３ＣＶ）として、例えば、１０％のＢで開始する長い勾配の場合、２ＣＶにわたって０％のＢから１０％のＢまで、実行される。
【００４２】
ｍＡｂのピーク溶出の検出は、２８０ｎｍの吸光度によるものである。ｍＡｂが溶出し始める緩衝液Ｂの％を、分取カラムのための溶出勾配の開始点として設定する。ほとんどまたは全てのｍＡｂが溶出した緩衝液Ｂの％（ピークのテール側）を、分取カラム溶出勾配のＢの終了％として設定する。目的は、分取カラムの溶出のために１ＣＶ当たり約１〜２ｍＭ  ＮａＣｌの緩やかな勾配を決定することである。所望の場合、長い溶出スカウティングの実行後、上述の第１のスカウティング実行と同じ緩衝液および負荷量を用いて、スカウトカラム上で分取溶出勾配の試験的実行を行ってもよい。試験的実行において、負荷後、０％のＢから標的開始％のＢまでの短時間（１〜３ＣＶ）の洗浄を行い、続いて、ｍＡｂの溶出のために開始％のＢから終了％のＢまでの１０ＣＶ勾配（必要に応じてより短くてもまたはより長くてもよい）の洗浄を行って、１ＣＶ当たり約１〜２ｍＭ  ＮａＣｌの勾配を得る。均一濃度の溶出が所望される場合、スカウティング勾配からその溶出緩衝液の強度も決定することができる。いくつかのｍＡｂおよび条件の場合、より急な勾配（１ＣＶ当たり２  ｍＭ  ＮａＣｌ超）もジスルフィドアイソフォームの所望の分解能を提供することが可能である。
【００４３】
分取カラムには、例えば、ｍＡｂの特徴または必要とされるジスルフィドアイソフォームの分解能に応じて、充填樹脂１Ｌ当たり約２ｇのｍＡｂ〜充填樹脂１Ｌ当たり１２ｇのｍＡｂまたはそれ以上を負荷することができ、カラムにより多くの量のｍＡｂ（３０ｇ／Ｌ以上等）を負荷することができるか、またはカラムを循環することができる。分取カラムを平衡化し、長い勾配のスカウティングおよび試験勾配の実行に使用したのと同じ緩衝液Ａ組成物および緩衝液Ｂの組成物を流す。一般に、カラムは、最初にいくらかの体積の１００％のＢ緩衝液で予め平衡化し、次いで、十分な１００％の緩衝液Ａで平衡化する。液体処理に都合のよい体積になるまで、または陽イオン交換樹脂に結合するための十分に低い伝導率になるまで、緩衝液ＡでｍＡｂ負荷量を希釈する。ｍＡｂ負荷量はまた、必要な場合または好ましい場合、限外濾過／緩衝液交換のためのダイアフィルトレーション等の他の手段による負荷のために調製することもできる。負荷後、０％の緩衝液Ｂから標的開始％の緩衝液Ｂまでの１〜３ＣＶの勾配で、溶出のためにカラムを洗浄する。次いで、長い勾配スカウティングまたは試験的実行で決定された溶出勾配をカラムに適用してもよい。この勾配は、通常、１カラム体積当たり約１〜２ｍＭのＮａＣｌである。ｍＡｂの溶出は、２８０ｎｍの吸光度によって検出される。後のアッセイのために、ジスルフィドアイソフォームのＲＰＨＰＬＣによって画分を回収してもよいか、または回収の開始および終了をＡ２８０ｎｍによってもしくはＰＡＴによって制御してもよい。所望の場合、緩衝液Ａで特定の画分を希釈し、特定のジスルフィドアイソフォームのさらなる濃縮のために、陽イオン交換カラムに再度適用してもよい。
【００４４】
引用した参考文献
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【００４５】
実施した実験および達成した結果を含む以下の実施例は、例示目的のみのために提供されるのであって、添付の特許請求の範囲の範囲を限定するものと見なされるべきではない。
【実施例１】
【００４６】
分析カラムを使用したｍＡｂ１  ＩｇＧ２アイソフォームの濃縮のためのＷＣＸ樹脂およびＳＣＸ樹脂の比較
Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣ分析システム上に流した低ｐＨ（約５）緩衝液を使用して、標準的なＷＣＸカラム（ＰｒｏＰａｃ  ＷＣＸ−１０、２５０×４．６ｍｍ、Ｐ／Ｎ  ５４９９３、Ｄｉｏｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ））とＳＣＸカラム（ＢｉｏＰｒｏ−ＳＰ、１００×４．６ｍｍ、５ｕｍ、Ｐ／Ｎ  ＳＦ００Ｓ０５−１０４６ＷＰ、ＹＭＣ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ，ＰＡ））との比較を行った。タンパク質を約ｐＨ５で負荷し、塩およびｐＨ勾配を用いて溶出した。ＳＣＸ樹脂は、これらの分析スケールカラムを使用して、ｍＡｂ１ジスルフィドアイソフォームの分解能の向上を提供することができた（図１）。実際に、１０μｍ樹脂を含む４．６×２５０ｍｍ  Ｄｉｏｎｅｘカラムに対して、５μｍ樹脂を含む４．６×１００ｍｍ  ＹＭＣ−ＳＣＸカラムを使用して、ＩｇＧ２ジスルフィドアイソフォームの優れた分離を達成した。典型的には、より長いカラムが生体分子のクロマトグラフィー分解能を向上させることが予想されるため、これは驚くべき意外な結果であった。この実施例では、ＷＣＸ樹脂を含むより長いカラム（２５０ｍｍ）と比較して、ＳＣＸ樹脂を含むより短いカラム（１００ｍｍ）が優れた結果を示した。これは、以前に記載したＷＣＸ樹脂と比較して、ＳＣＸカラムＹＭＣ  ＢｉｏＰｒｏ  ＳＰ−Ｆのより大きな許容量およびより高い分離能力によるものであった。
【実施例２】
【００４７】
分取カラムを使用したＣＥＸによるＩｇＧ２ジスルフィドアイソフォームの認識および分離
ＳＣＸ樹脂が分取スケールでＩｇＧ２ジスルフィドアイソフォームの同様の分解能を提供することができるかどうかを評価するために、ＹＭＣ−ＳＣＸ  ３０μｍ樹脂（ＹＭＣ−ＢｉｏＰｒｏ  Ｓ３０、Ｐ／Ｎ  ＳＰＡ０Ｓ３０、ＹＭＣ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ，ＰＡ））を用いてより大きな５００ｍＬのＦＰＬＣカラムを充填した。適切な塩濃度の１００ｍＭ  ＮａＣｌおよびｐＨ５．２を用いてタンパク質を負荷した。次いで、勾配溶出を用い、これは、塩濃度を約２５０ｍＭに上昇させ、ｐＨを約４．５に低下させた。保持されたｍＡｂ１のＩｇＧ２−Ｂアイソフォームは最も少なく、最初にカラムから溶出された（図２）。塩濃度が上昇し、ｐＨが低下するにつれて、ＩｇＧ２−Ａ／Ｂ、続いてＩｇＧ２−Ａが溶出し始めた。回収した陽イオン交換画分を逆相ＨＰＬＣアッセイにより分析したところ、ＹＭＣ−ＳＣＸ樹脂を含むＦＰＬＣカラムによるジスルフィドアイソフォームの有意な濃縮を示した（図３）。逆相分析は、ＩｇＧ２ジスルフィドアイソフォームをそれらの疎水特性に基づいて分解することが示された。通常、ＩｇＧ２の逆相では４つの顕著なピークが観察される。逆相からのジスルフィドアイソフォームの溶出順序は、ＩｇＧ２−Ｂ（ピーク１）、ＩｇＧ２−Ａ／Ｂ（ピーク２）、ならびにＩｇＧ２−Ａ（ピーク３および４）である。ピーク３および４は、同じ鎖間ジスルフィド結合を含有することが示されたが、逆相による２つの種の存在は、コアヒンジ構造におけるわずかな違いの結果であると考えられる。この記述において、２つのＩｇＧ−Ａ種を、それらのＮＲ−ＲＰ溶出順序に対してＡ１およびＡ２と表記することによって区別した（図３）。これは、分取スケールのＣＥＸおよびグラムレベルのＩｇＧ２負荷量を用いて、ＩｇＧ２ジスルフィドアイソフォームが５０％を超える純度まで濃縮された最初の例であると考えられる。
【実施例３】
【００４８】
プロテインＬによるＩｇＧ２ジスルフィドアイソフォームの認識および分離（５ｍｌ半分取カラム）
５ｍＬ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（ＰＮ−８９９２９）を購入し、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣに設置した。泳動用緩衝液は、ｐＨ７．２のＰＢＳ（負荷）およびｐＨ  ２．８の１００ｍＭグリシンで（溶出）あった。試料をＰＢＳ中に希釈し（１：１）、カラム上に注入した。タンパク質をｐＨ７．２で負荷し、ｐＨ勾配を用いて溶出した。５ｍＬプロテインＬカラムは、逆相ＨＰＬＣによって監視されたように、ｍＡｂ１ジスルフィドアイソフォームの濃縮を提供することができた（図４）。ＩｇＧ２−Ａ種は、プロテインＬによってより強力に保持されたため、溶出のためにｐＨのより低い緩衝液を必要とした。
【実施例４】
【００４９】
プロテインＬによるＩｇＧ２ジスルフィドアイソフォームの認識および分離：２４ｍｌ分取カラム
Ｐｉｅｒｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ親和性樹脂（２４ｍＬ）を購入し（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ  Ａｇａｒｏｓｅ、Ｐ／Ｎ  ２０５１２、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ））、ＸＫ１６／２０カラム（Ｂｉｏ  ＬＣ  ｃｏｌｕｍｎ、Ｐ／Ｎ１９−０３１５−０１、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ））に充填した。カラムをＡＫＴＡ  ＦＰＬＣシステムに設置し、上に挙げた緩衝液を使用することにより利用した。１つの用途において、ｍＡｂ１材料を２４ｍＬプロテインＬカラムに負荷し、２１４および２８０ｎｍでの紫外線検出により監視しながら溶出した。材料の大半は保持されず、泳動用緩衝液で洗い流された。ｍＡｂ１材料のごく一部が保持され、後にｐＨ７．２から２．８へのｐＨ勾配を用いて溶出された。プロテインＬの分離全体にわたって画分を回収し、逆相によって分析した（図６）。５ｍＬプロテインＬカラムで以前に観察されたように、ＩｇＧ２−Ａ種が保持され、後に２４ｍＬカラムを使用してｐＨを低下させると溶出された（図６Ｂ）。同様に、素通り（Ｆ／Ｔ）画分は、ｍＡｂ１  ＩｇＧ２−Ａ種の枯渇、したがってＩｇＧ２−Ｂ材料の濃縮を示した（図６Ａ）。ＩｇＧ２−Ａ／Ｂアイソフォームは、Ｆ／Ｔ画分および溶出画分の両方に見られ、中程度の結合特性を示した。
【００５０】
ｍＡｂ１について上述したのと同じ分離手順を用いてｍＡｂ２も調べた。ｍＡｂ２はプロテインＬへの結合を示したが、ｍＡｂ１とは異なり、全てのアイソフォームが保持された。ｍＡｂ２材料は、約ｐＨ４でプロテインＬカラムから溶出し始め（図７Ｂ）、約ｐＨ３で後期画分が溶出した（図７Ｂ）。逆相ＨＰＬＣにより画分を分析したところ、ｍＡｂ１と同じ溶出の傾向を示した。保持されたＩｇＧ２−Ｂは最も少なく、その後にＩｇＧ２−Ａ／Ｂが続き、ＩｇＧ２−Ａ種がプロテインＬに対する最も高い親和性を示した。
【実施例５】
【００５１】
プロテインＬによるＩｇＧ２ジスルフィドアイソフォームの認識および分離：３００ｍｌ大容量分取カラム
より大規模なプロテインＬカラム（約３００ｍＬ）を充填し、ｍＡｂ１およびｍＡｂ２を用いて再度調べたところ、同等の結果を示した。このより大規模なカラムフォーマットは、負荷１００ｍｇ超のより大きな負荷容量を提供する一方で、ＩｇＧ２ジスルフィドアイソフォームを効率的に分離した。ｍＡｂ３（ＩｇＧ２−ＶκＩ）は、より大規模なプロテインＬカラムを調べるために使用した別のＩｇＧ２分子であった。
【実施例６】
【００５２】
プロテインＬによる精製に最適な緩衝液の選択
この実施例は、上述のプロテインＬによる方法に関連して、所望のジスルフィドアイソフォームを精製および溶出するための緩衝液を選択するための手法を実証する。例えば、１つの目標は、素通り画分中で回収することができるように、ｍＡｂ２のＩｇＧ２−Ｂ型を結合させないことであった。別の目標は、ｍＡｂ１で観察されたように、より高いｐＨでＩｇＧ２−Ａ種を溶出することであった。
【００５３】
個々のアイソフォームの結合特性および溶出特性を調節し、ピークのテーリングをもたらす非特異的タンパク質のカラムマトリックスとの相互反応を減少させる試みにおいて、異なる泳動用緩衝液を評価した。例えば、ｍＡｂ２のＩｇＧ２−ＢアイソフォームがプロテインＬカラムに保持されず、したがって素通り画分中で回収されることが望ましい。これにより、溶出材料からこのアイソフォームを部分的に除去することが可能となった。さらに、長時間ｐＨが低いとタンパク質の不可逆的な変性を引き起こす可能性があるため、ＩｇＧ２−Ａ種にはより高いｐＨでの溶出を用いることが望ましかった。ｍＡｂ３のための最適な緩衝液の選択は、Ａ）２５ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ６．５）、Ｂ）１００ｍＭグリシン（ｐＨ２．８）であった。これらの緩衝液を使用することにより、ｍＡｂ３に良好なアイソフォームの分解が観察された（図８）が、より低いｐＨでの溶出はなおも最適ではなかった。したがって、独自の組成物を含むＧｅｎｔｌｅ  Ａｇ／Ａｂ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  ＢｕｆｆｅｒをＰｉｅｒｃｅ社から購入し、ｍＡｂ３を用いて検査した。この緩衝液は、プロテインＬカラムからほぼ中性のｐＨで溶出を提供すると記載されていた。図９に示されるように、Ｇｅｎｔｌｅ  Ａｇ／Ａｂ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒは、より高いｐＨでの結合およびプロテインＬカラムからの溶出を提供することができ、アイソフォーム画分の純度は良好であった。Ｇｅｎｔｌｅ  Ａｇ／Ａｂ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒの短所は、ＦＰＬＣシステムの背圧が高めであることであった。
【実施例７】
【００５４】
ＩｇＧ２ジスルフィドアイソフォームに特異的な抗体とＳＥＣを用いた親和性認識および分離
マウス抗ヒトＩｇＧ２  ｍＡｂクローンＨＰ−６００２（Ｆｃ特異的、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ））およびＨＰ−６０１４（Ｆ（ａｂ）２特異的、Ａｃｒｉｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））を、ｍＡｂ７、ｍＡｂ２、およびｍＡｂ１の特異的なＩｇＧ２ジスルフィドアイソフォームに結合する能力について調べた。
【００５５】
米国特許第７，９２８，２０５号による酸化還元リフォールディング方法を用いて得られた、濃縮されたＩｇＧ２ジスルフィドアイソフォーム（ＩｇＧ２−Ａ（約６５％）およびＩｇＧ２−Ｂ（約６５％））の画分と、濃縮されていない対照ＩｇＧ２材料とを比較した。ＩｇＧ２試料をＰＢＳ中に希釈し、約１：２．５のモル比で抗ヒトＩｇＧ２  ｍＡｂと混合した。この比率は、単一のＩｇＧ２分子に対して少なくとも２つの抗ヒトｍＡｂを提供するように選択された。
【００５６】
分析の前に、少なくとも１時間試料を反応させた。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて試料を分析した。ＳＥＣでは、より大きな種は固定相の細孔との相互作用が弱いため、より早い時期にカラムから溶出する。したがって、ＩｇＧ２分子とマウス抗ヒトＩｇＧ２の複合体が、マウス抗体と相互作用しなかった単量体ＩｇＧ２分子よりも早く溶出した。クローンＨＰ−６０１４を用いたＳＥＣ結合実験により、このクローンのＩｇＧ２−Ａ種に対する特異性が明らかになり（図１０〜１２）、ＩｇＧ２−Ｂ種が結合していないことが示唆された。その一方で、クローンＨＰ−６００２は、ＩｇＧ２−ＡおよびＩｇＧ２−Ｂ濃縮材料をＨＰ−６００２とともにインキュベートした時に、同様のＳＥＣプロファイルによって示されるようにジスルフィドアイソフォームを区別することができなかった（図１３〜１４）。ＳＥＣは、初期に溶出した複合種を、後期に溶出したＩｇＧ単量体から次のように分離した。ｍＡｂ２、ｍＡｂ７、およびｍＡｂ１のＩｇＧ２−Ａ材料をＨＰ−６０１４とともにインキュベートした時、対照ＩｇＧ２材料を用いたＨＰ−６０１４のインキュベーションと比較して、複合種の量（図１０〜１４、３０〜４０分で溶出）が増加した。ＩｇＧ２−Ｂ材料をＨＰ−６０１４とともにインキュベートした時、対照ＩｇＧ２材を用いたＨＰ−６０１４のインキュベーションと比較して、複合種に有意な減少が観察された。
【００５７】
これらの結果は、ＨＰ−６０１４に対するＩｇＧ２−Ｂの結合がほとんど存在しないことと、ＨＰ−６０１４に対するＩｇＧ２−Ａの強力な結合を示唆するものであった。ＩｇＧ２−Ａ／Ｂの結合特性は、これらのデータからは解明されなかった。このＩｇＧ２アイソフォームは、以前に酸化還元手順によって濃縮されたことがないため（Ｄｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６ｂ；Ｄｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８ｂ）、濃縮したＩｇＧ２−Ａ／Ｂ画分を調べることはできなかった。ＨＰ−６００２を用いた全ての試料のインキュベーションは同等の結合を示し、したがってＩｇＧ２ジスルフィドアイソフォームに対する特異性を示さなかった（図１３〜１４）。
【実施例８】
【００５８】
ＨＰ−６０１４親和性カラムによる精製
ＨＰ−６０１４抗ヒトＩｇＧ２がＩｇＧ２ジスルフィドアイソフォームを分離する能力をさらに調べるために、次のように製造業者のプロトコルを使用して親和性カラムを調製した。固定化したＨＰで活性化した１８ｍＬのＡｆｆｉｎｉｔｙ−Ｇｅｌ  １５（Ａｃｔｉｖｅ  Ｅｓｔｅｒ  Ａｇａｒｏｓｅ  ２５ｍＬ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｓカタログ番号１５３−６０５１）を５０ｍｌチューブ内に配置し、冷脱イオン水と３回交換してあらゆる潜在的な残留保存剤を除去した。３２ｍＬの２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）でカラムマトリックスを２回洗浄し、１５ｍＬの２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）で再懸濁（十分に混合）した。
【００５９】
抗Ｈｕ  ＩｇＧ２−ＵＮＬＢ（クローンＨＰ６０１４、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈカタログ番号９０８０−０１）を用いて、１セットのカラムを０．５ｍｇ／ｍＬ×各２０＝合計１０ｍｇ／２０ｍＬに調製した。Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＨＰ６０１４Ｐ（マウスＩｇＧ１  ｍＡｂ抗ヒトＩｇＧ２  Ｆａｂ）を用いて、別のセットを２ｍｇ／ｍＬ×１８バイアル＝合計３６ｍｇ／１８ｍＬとして調製した。
【００６０】
１８ｍＬのＡｆｆｉ−１５Ｇｅｌ＋１５ｍＬの２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）＋３６ｍｇ／１８ｍｌ抗Ｈｕ  ＩｇＧ２を含む全部で５１ｍＬ中で反応を行い、４℃で２時間（時々混合しながら）インキュベートした。混合物を周囲温度でさらに２時間（時々混合しながら）放置した。迅速な（勾配時間１０分）ハイスループットＲＰ−ＨＰＬＣにより、各段階でカップリング効率を監視した。次いで、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）で反応を停止した。代表的なデータを次に示す。
【００６１】
【表３】
2015502959.tif 000005
次いで、カラムを充填し、使用する前にＤＰＢＳ（ｐＨ７．２）で約１時間すすいだ。
【００６２】
マウスモノクローナル抗ヒトＩｇＧ２（クローンＨＰ−６０１４、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ｉ５６３５）を上述のようにＡｆｆｉ−Ｇｅｌクロマトグラフィー媒体に結合させ、ＸＫ１６／２０カラム（Ｂｉｏ  ＬＣ  ｃｏｌｕｍｎ、Ｐ／Ｎ１９−０３１５−０１、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ））に充填した。ＡＫＴＡ  ＦＰＬＣシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ））にカラムを設置し、室温で送液した。試料をｐＨ７．２のＰＢＳ中に希釈し（１：１）、カラム上に注入し、安定したベースラインに達するまでＰＢＳを用いて洗浄した。ｐＨ段階勾配（１００  ｍＭグリシン、ｐＨ２．８）を用いてタンパク質を溶出した。溶出後直ちに、適切な緩衝液を用いて、回収された画分のｐＨを５．０以上に上昇させた。逆相ＨＰＬＣ分析を用いて画分の純度を調べた（Ｄｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８ａ；Ｄｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６ａ）。
【実施例９】
【００６３】
ＩｇＧ２ジスルフィドアイソフォームに特異的な固定化した抗体を用いた親和性認識および分離：２４ｍＬ分取カラム
１つの用途において、ｍＡｂ３材料を２４ｍＬＨＰ−６０１４親和性カラムに負荷し、２１４および２８０ｎｍでの紫外線検出により監視しながら溶出した（図１５）。材料の大半は保持されず、泳動用緩衝液で洗い流された（図１５Ａ）。ｍＡｂ３材料のごく一部が保持され、ｐＨ７．２から２．８ｐＨへのｐＨ勾配を用いて後に溶出された（図１５Ｃ）。抗ｈｕ  ＩｇＧ２親和性分離全体を通して画分を回収し、逆相分析によって分析した図（１５Ａおよび１５Ｃ）。プロテインＬによるｍＡｂ１の分離（図５）と同様に、ＩｇＧ２−Ａ種が保持され、後に、２４  ｍＬカラムを使用して、ｐＨを低下させて溶出した（図１５Ｃ）。濃縮ＩｇＧ２−Ａ画分中に検出可能な量のＩｇＧ２−Ｂが観察されなかったことから、ＨＰ−６０１４はＩｇＧ２−Ｂ種に結合しなかったかまたは結合が弱いことが示唆された。プロテインＬと同様に、抗ヒトＩｇＧ２のＦ／Ｔ画分は、ｍＡｂ３  ＩｇＧ２−Ａ種の枯渇、したがってＩｇＧ２−Ｂ材料の濃縮を示した（図１５Ａ）。ＩｇＧ２−Ａ／Ｂアイソフォームは、Ｆ／Ｔ画分中に最も多く観察され、ＩｇＧ２−Ａと比較して弱い結合を示した。
【００６４】
このカラムのさらなる開発により、２つのＩｇＧ２−Ａ種（Ａ１およびＡ２）が抗ｈｕ  ＩｇＧ２親和性カラムに対して有意に異なる結合を有することが示された。これは、（カラム容量未満の）高純度ＩｇＧ２−Ａ材料（６０〜９０％のＡ１を含有）を抗ｈｕ  ＩｇＧ２親和性カラムに注入し、Ｆ／Ｔ画分および低ｐＨ溶出画分を回収することによって明らかになった。逆相による分析により、高レベルのＩｇＧ２−Ａ１が存在する場合、ＩｇＧ２−Ａ２は著しく保持されないことが示された。上記抗ｈｕ  ＩｇＧ２親和性カラムは、ＩｇＧ２−Ａの亜種Ａ１およびＡ２を効率的に分離することができる唯一の技法であると考えられる。
【実施例１０】
【００６５】
分取スケール陽イオン交換クロマトグラフィー：充填樹脂１２ｇ／ＬでｍＡｂ７を負荷、カラム７ｃｍ直径
モノクローナル抗体ｍＡｂ７を、次のように分取スケールで生成した。陽イオン交換樹脂ＹＭＣ  ＢｉｏＰｒｏ  Ｓ３０を、直径７ｃｍのカラムに床高２１．５ｃｍまで充填した（０．８３Ｌカラム体積）。３カラム体積の２５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）（緩衝液Ｂ）、続いて４カラムの１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）（緩衝液Ａ）でカラムを平衡化した。約１カラム体積の緩衝液Ａ中の約１０．２ｇのＩｇＧ２をカラムに負荷した。負荷後、０％緩衝液Ｂから３３％緩衝液Ｂへの２カラム体積の勾配をカラムに適用した。
【００６６】
１カラム体積当たり２ｍＭの塩化ナトリウムの勾配に対応する、３３％緩衝液Ｂから４１％緩衝液Ｂへの１０カラム体積の勾配でＩｇＧ２を溶出した。０．３カラム体積の画分を回収した。図１８は、結果のクロマトグラムを示す。
【００６７】
各画分の負荷および試料を、２８０ｎｍでの吸光度の測定によりタンパク質含量について、また非還元ＲＰＨＰＬＣによりジスルフィドアイソフォームについてアッセイした。負荷物は、約３１％のＢ、３６％のＡ／Ｂ、２２％のＡ１、および１１％のＡ２ジスルフィドアイソフォームを含有していた。図１９は、各画分ごとにジスルフィドアイソフォームＢ、Ａ／Ｂ、Ａ１、およびＡ２のＩｇＧ２の総濃度およびピーク面積のパーセントのオーバーレイを示す。Ｂアイソフォームは、ピークの前の画分（画分１０〜１５）中で濃縮されており、Ａ１およびＡ２型は、ピークのテーリング画分（画分１８〜２６）中で濃縮されていることに留意されたい。Ｂ、Ａ／Ｂ、Ａ１、およびＡ２の全体的な比率は、どの画分をプールするかを選択することによって、または溶出の回収開始および回収終了基準によって、溶出プール中で調節することができる。特定のアイソフォームが濃縮された画分は、上記で用いたような陽イオン交換カラム上での再クロマトグラフィーによって、または親和性クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、もしくは逆相クロマトグラフィー等の他の様式によるさらなるクロマトグラフィーによって、さらなる濃縮のために選択することができる。
【実施例１１】
【００６８】
分取スケール陽イオン交換クロマトグラフィー：充填樹脂２．１ｇ／ＬでｍＡｂを負荷、カラム直径１０ｃｍ
モノクローナル抗体を、次のように分取スケールで生成した。陽イオン交換樹脂ＹＭＣ  ＢｉｏＰｒｏ  Ｓ３０を、直径１０ｃｍのカラムに床高２７ｃｍまで充填した（２．１２Ｌカラム体積）。３カラム体積の４００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）（緩衝液Ｂ）、続いて４カラムの１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）（緩衝液Ａ）でカラムを平衡化した。約１カラム体積の緩衝液Ａ中の約４．５ｇのＩｇＧ２をカラムに負荷した。負荷後、０％緩衝液Ｂから５５．５％緩衝液Ｂへの２カラム体積の勾配をカラムに適用した。
【００６９】
５５．５％緩衝液Ｂから５８．７％緩衝液Ｂへの７カラム体積の勾配でＩｇＧ２を溶出した。これは、１カラム体積当たり１．８ｍＭの塩化ナトリウムの勾配に対応する。主なピークで溶出した後、８３％緩衝液Ｂまでの短い１．８ＣＶ勾配が伸び、続いて１００％緩衝液Ｂまで急上昇した。０．１カラム体積の画分を回収した。図２０は、分取陽イオン交換クロマトグラムを示す。
【００７０】
各画分の負荷および試料を、２８０ｎｍでの吸光度の測定によりタンパク質含量について、また非還元ＲＰＨＰＬＣによりジスルフィドアイソフォームについてアッセイした。負荷物は、約３２％のＢ、３３％のＡ／Ｂ、２０％のＡ１、および１５％のＡ２ジスルフィドアイソフォームを含有していた。図２１は、各画分ごとにジスルフィドアイソフォームＢ、Ａ／Ｂ、Ａ１、およびＡ２のＩｇＧ２の総濃度およびピーク面積のパーセントのオーバーレイを示す。図２１から、Ｂアイソフォームは、ピークの前の画分（画分３〜１５）中で濃縮されており、Ａ１およびＡ２型は、ピークのテーリング画分（画分２５〜５０）中で濃縮されていることが分かる。溶出プール中のＢ、Ａ／Ｂ、Ａ１、およびＡ２の全体的な比率は、どの画分をプールするかによって、または溶出の回収開始および回収終了基準によって調節することができる。特定のアイソフォームが濃縮された画分は、陽イオン交換カラム上での再クロマトグラフィーによって、または親和性クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、もしくは逆相クロマトグラフィー等の他の様式によるさらなるクロマトグラフィーによって、さらなる濃縮のために選択することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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