(57)【要約】  脱細胞化胎盤の脈管足場を含む、又は、脱細胞化胎盤の脈管足場からなるオルガノイド、並びにその製造及び使用方法を提供する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
1以上の型の細胞を含み、かつ、脱細胞された胎盤の脈管足場を含む、オルガノイドであって、前記オルガノイドは、臓器又は臓器由来組織の少なくとも１の機能を達成し、前記臓器又は臓器由来組織の少なくとも１の機能は、該臓器又は組織由来の少なくとも１の細胞型に特徴的な、タンパク質、成長増殖因子、サイトカイン、インターロイキン、又は小分子を産生することであり、かつ前記脱細胞された胎盤の脈管足場は、実質的に損傷がない胎盤の脈管構造マトリックスを含む、前記オルガノイド。
【請求項２】
約1012細胞を含む請求項1記載のオルガノイド。
【請求項３】
約1011細胞を含む請求項1記載のオルガノイド。
【請求項４】
約1010細胞を含む請求項1記載のオルガノイド。
【請求項５】
約109細胞を含む請求項1記載のオルガノイド。
【請求項６】
更に合成マトリックスを含む、請求項1〜5いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項７】
前記合成マトリックスは、前記胎盤の脈管足場の三次元構造を安定化させる、請求項6記載のオルガノイド。
【請求項８】
前記合成マトリックスはポリマー又は熱可塑性物質を含む、請求項6又は7記載のオルガノイド。
【請求項９】
前記合成マトリックスはポリマー又は熱可塑性物質である、請求項6又は7記載のオルガノイド。
【請求項１０】
前記熱可塑性物質は、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレン、ポリエステル、ポリ酢酸ビニル、又はポリ塩化ビニルである、請求項8又は9記載のオルガノイド。
【請求項１１】
前記ポリマーは、ポリ塩化ビニリジン、ポリ(o-カルボキシフェノキシ)-p-キシレン)(ポリ(o-CPX))、ポリ(無水ラクチド)(PLAA)、n-イソプロピルアクリルアミド、アクリルアミド、pentエリスリトールジアクリレート、ポリメチルアクリレート、カルボキシメチルセルロース、又はポリ(乳酸-グリコール酸共重合体)(PLGA)である、請求項8又は9記載のオルガノイド。
【請求項１２】
前記ポリマーはポリアクリルアミドである、請求項8又は9記載のオルガノイド。
【請求項１３】
前記1以上の型の細胞はナチュラルキラー(NK)細胞を含む、請求項1〜12いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１４】
前記NK細胞はCD56+CD16-胎盤中間ナチュラルキラー(PiNK)細胞を含む、請求項13記載のオルガノイド。
【請求項１５】
樹状細胞を含む、請求項1〜14いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１６】
胸腺細胞を含む、請求項1〜15いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１７】
胸腺細胞、リンパ球様細胞、上皮性網状細胞、及び胸腺間質細胞を含む、請求項16いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１８】
濾胞細胞を含む、請求項1〜17いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１９】
チログロブリンを発現する細胞を含む、請求項18記載のオルガノイド。
【請求項２０】
更に甲状腺上皮細胞及び傍濾胞細胞を含む、請求項18又は19記載のオルガノイド。
【請求項２１】
幹細胞又は前駆細胞を含む、請求項1〜20いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項２２】
前記幹細胞又は前駆細胞は、胚性幹細胞(ES細胞)、胚性生殖細胞(EG細胞)、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系間質細胞、組織プラスチック接着性胎盤幹細胞(PDAC(登録商標))、臍帯幹細胞、羊水幹細胞、羊膜由来接着性細胞(AMDAC)、骨形成性の胎盤接着性細胞(OPAC)、脂肪組織幹細胞、角膜幹細胞、歯髄幹細胞、筋芽細胞、内皮前駆細胞、神経幹細胞、脱落歯由来幹細胞、毛嚢幹細胞、真皮幹細胞、単為生殖由来幹細胞、リプログラムされた幹細胞、羊膜由来接着性細胞、又はサイドポピュレーション幹細胞である、請求項21記載のオルガノイド。
【請求項２３】
造血幹細胞又は造血前駆細胞を含む、請求項1〜22いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項２４】
組織培養プラスチック接着性CD34-、CD10+、CD105+、及びCD200+胎盤幹細胞を含む、請求項1〜23いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項２５】
前記胎盤幹細胞は更に、CD45-、CD80-、CD86-、又はCD90+の1以上である、請求項24記載のオルガノイド。
【請求項２６】
前記胎盤幹細胞は更に、CD45-、CD80-、CD86-、及びCD90+である、請求項25記載のオルガノイド。
【請求項２７】
前記オルガノイドがレシピエントへ移植される場合には、前記胎盤幹細胞は前記レシピエント体内の免疫応答を抑制する、請求項24〜26いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項２８】
前記胎盤幹細胞が、前記レシピエント内で免疫応答を局部的に抑制する、請求項27記載のオルガノイド。
【請求項２９】
分化した細胞を含む、請求項1〜28いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項３０】
前記分化した細胞は、内皮細胞、上皮細胞、真皮細胞、内胚葉細胞、中胚葉細胞、線維芽細胞、骨細胞、軟骨細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、肝細胞、膵臓細胞、又は間質細胞を含む、請求項29記載のオルガノイド。
【請求項３１】
前記分化した細胞は、唾液腺粘液性細胞、唾液腺漿液性細胞、エブネル腺細胞、乳腺細胞、涙腺細胞、耳道腺細胞、エクリン汗腺暗調細胞、エクリン汗腺明調細胞、アポクリン汗腺細胞、モル腺細胞、脂腺細胞、ボウマン腺細胞、ブルンネル腺細胞、精嚢細胞、前立腺細胞、尿道球腺細胞、バルトリン腺細胞、尿道腺細胞、子宮内膜細胞、単離された杯細胞、胃壁の粘液性細胞、胃腺酵素原細胞、胃腺酸分泌細胞、膵腺房細胞、パネート細胞、II型肺胞上皮細胞、クララ細胞
成長ホルモン産生細胞、乳腺刺激ホルモン産生細胞、甲状腺刺激ホルモン産生細胞、性腺刺激ホルモン産生細胞、副腎皮質刺激ホルモン産生細胞、下垂体中葉由来の細胞、巨大細胞神経分泌細胞、腸管細胞、気道細胞、甲状腺上皮細胞、傍濾胞細胞、副甲状腺細胞、副甲状腺主細胞、好酸性細胞、副腎腺細胞、クロム親和性細胞、ライディッヒ細胞、内卵胞膜細胞、黄体細胞、顆粒膜黄体細胞、卵胞膜黄体細胞、傍糸球体細胞、緻密斑細胞、極周囲細胞、メサンギウム細胞、
血管及びリンパ管内皮有窓型細胞、血管及びリンパ管内皮連続型細胞、血管及びリンパ管内皮脾細胞、滑膜細胞、漿膜細胞(腹膜の、胸膜の、及び心膜腔の内壁)、扁平上皮細胞、円柱細胞、暗調細胞、前庭膜細胞(耳の内リンパ腔内壁)、血管条基底細胞、血管条周辺細胞(耳の内リンパ腔内壁)、クラウディウス細胞、ベッチェル細胞、脈絡叢細胞、軟膜クモ膜扁平上皮細胞、色素毛様体上皮細胞、非色素毛様体上皮細胞、角膜内皮細胞、栓細胞、
気道繊毛細胞、卵管繊毛細胞、子宮内膜繊毛細胞、精巣網繊毛細胞、精巣輸出管繊毛細胞、繊毛性上衣細胞、
表皮角化細胞、表皮基底細胞、指爪及び足指爪の角化細胞、爪床基底細胞、毛幹の毛髄質細胞、毛幹の毛皮質細胞、毛幹の毛小皮細胞、毛根の毛小皮鞘細胞、毛根ハックスレー層の鞘細胞、毛根ヘンレ層の鞘細胞、外毛根鞘細胞、毛母細胞、
重層扁平上皮の表面上皮細胞、上皮基底細胞、泌尿器上皮細胞、
耳のコルチ器官の内有毛細胞、耳のコルチ器官の外有毛細胞、嗅上皮基底細胞、冷感受性一次感覚ニューロン、熱感受性一次感覚ニューロン、表皮のメルケル細胞、嗅覚受容体神経、痛み感受性一次感覚ニューロン、光受容体桿体細胞、光受容体青色感受性錐体細胞、光受容体緑色感受性錐体細胞、光受容体赤色感受性錐体細胞、固有受容性一次感覚ニューロン、触覚感受性一次感覚ニューロン、I型頸動脈小体細胞、II型頸動脈小体細胞(血液pHセンサ)、内耳前庭器官のI型有毛細胞(加速度及び重力)、内耳前庭器官のII型有毛細胞、I型味蕾細胞、
コリン作動性神経細胞、アドレナリン作動性神経細胞、ペプチド作動性神経細胞、
コルチ器官の内柱細胞、コルチ器官の外柱細胞、コルチ器官の内指骨細胞、コルチ器官の外指骨細胞、コルチ器官の境界細胞、コルチ器官のヘンゼン細胞、前庭器支持細胞、味蕾支持細胞、嗅上皮支持細胞、シュワン細胞、サテライト細胞、腸内グリア細胞、
星状細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、紡錘形ニューロン、
前水晶体上皮細胞、クリスタリン含有水晶体線維細胞、
肝細胞、含脂肪細胞、白色脂肪細胞、褐色脂肪細胞、肝臓脂肪細胞、
腎臓糸球体壁細胞、腎臓糸球体有足細胞、腎臓近位尿細管刷子縁細胞、ヘンレ係蹄の細い部分の細胞、腎臓遠位尿細管細胞、腎臓集合管細胞、I型肺胞上皮細胞、膵管細胞、非線条導管細胞、導管細胞、腸刷子縁細胞、外分泌腺線条導管細胞、胆嚢上皮細胞、精巣輸出管非繊毛細胞、精巣上体主細胞、精巣上体基底細胞、
エナメル芽細胞上皮細胞、半月面上皮細胞、コルチ器官歯間上皮細胞、疎性結合組織線維芽細胞、角膜実質細胞、腱線維芽細胞、骨髄網状組織線維芽細胞、非上皮性線維芽細胞、周細胞、髄核細胞、セメント芽細胞/セメント細胞、造歯細胞、象牙芽細胞、ヒアリン軟骨細胞、線維軟骨細胞、弾性軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、骨前駆細胞、硝子体細胞、星細胞(耳)、肝星細胞(伊東細胞)、膵星細胞、
赤色骨格筋細胞、白色骨格筋細胞、中間体骨格筋細胞、筋紡錘の核袋細胞、筋紡錘の核鎖細胞、サテライト細胞、通常の心筋細胞、結節性心筋細胞、プルキンエ線維細胞、平滑筋細胞、虹彩の筋上皮細胞、外分泌腺の筋上皮細胞、
網状赤血球、巨核球、単球、結合組織マクロファージ、表皮ランゲルハンス細胞、樹状細胞、ミクログリア細胞、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、ヘルパーT細胞、サプレッサーT細胞、細胞傷害性T細胞、ナチュラルキラーT細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、
メラニン形成細胞、網膜色素上皮細胞、
卵原細胞/卵母細胞、精子細胞、精母細胞、精原細胞、精子、卵胞細胞、セルトリ細胞、胸腺上皮細胞、及び/又は間質性腎臓細胞を含む、請求項29記載のオルガノイド。
【請求項３２】
前記細胞組成物中の細胞は初代培養細胞である、請求項1〜31いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項３３】
前記細胞組成物中の細胞はイン・ビトロで培養された細胞である、請求項1〜31いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項３４】
前記細胞は、細胞によって天然に産生されたものではないタンパク質若しくはポリペプチドを産生するように遺伝子工学によって設計されている、又は、細胞によって天然に産生される場合よりも多くの量のタンパク質若しくはポリペプチドを産生するように遺伝子工学によって設計されており、前記細胞組成物は分化した細胞を含む、請求項1〜33いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項３５】
前記タンパク質又はポリペプチドは、その活性部分を含むサイトカイン又はペプチドである、請求項34記載のオルガノイド。
【請求項３６】
前記サイトカインは、アドレノメデュリン(AM)、アンジオポエチン(Ang)、骨形成タンパク質(BMP)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、上皮増殖因子(EGF)、エリスロポイエチン(Epo)、線維芽細胞増殖因子(FGF)、グリア細胞系由来神経栄養因子(GNDF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、増殖分化因子(GDF-9)、肝細胞増殖因子(HGF)、肝癌由来増殖因子(HDGF)、インスリン様成長因子(IGF)、遊走刺激因子、ミオスタチン(GDF-8)、骨髄単球性増殖因子(MGF)、神経成長因子(NGF)、胎盤増殖因子(PlGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、トロンボポエチン(Tpo)、トランスフォーミング増殖因子α(TGF-α)、TGF-β、腫瘍壊死因子α(TNF-α)、血管内皮増殖因子(VEGF)、又はWntタンパク質である、請求項35記載のオルガノイド。
【請求項３７】
1x108細胞を含み、イン・ビトロ培養により増殖培地中で24時間で少なくとも1.0〜10μMの前記サイトカインを産生する、請求項35又は36記載のオルガノイド。
【請求項３８】
前記タンパク質又はポリペプチドは、AM、Ang、BMP、BDNF、EGF、Epo、FGF、GNDF、G-CSF、GM-CSF、GDF-9、HGF、HDGF、IGF、遊走刺激因子、GDF-8、MGF、NGF、PlGF、PDGF、Tpo、TGF-α、TGF-β、TNF-α、VEGF、又はWntタンパク質の可溶性受容体である、請求項35記載のオルガノイド。
【請求項３９】
1x108細胞を含み、イン・ビトロ培養により増殖培地中で24時間で少なくとも1.0〜10μMの前記可溶性受容体を産生する、請求項38記載のオルガノイド。
【請求項４０】
前記タンパク質はインターロイキンである請求項35記載のオルガノイド。
【請求項４１】
前記インターロイキンは、インターロイキン-1α(IL-1α)、IL-1β、IL-1F1、IL-1F2、IL-1F3、IL-1F4、IL-1F5、IL-1F6、IL-1F7、IL-1F8、IL-1F9、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12 35kDa αサブユニット、IL-12 40kDa βサブユニット、IL-12α及びβサブユニットの両方、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E、IL-17Fアイソフォーム1、IL-17Fアイソフォーム2、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23p19サブユニット、IL-23p40サブユニット、IL-23p19サブユニット及びIL-23p40サブユニットの両方、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27B、IL-27-p28、IL-27B及びIL-27-p28の両方、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、IL-36β、IL-36γである、請求項40記載のオルガノイド。
【請求項４２】
1x108細胞を含み、増殖培地中、イン・ビトロ培養で24時間で少なくとも1.0〜10μMのインターロイキンを産生する、請求項40又は請求項41記載のオルガノイド。
【請求項４３】
前記タンパク質又はポリペプチドは、IL-1α、IL-1β、IL-1F1、IL-1F2、IL-1F3、IL-1F4、IL-1F5、IL-1F6、IL-1F7、IL-1F8、IL-1F9、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12 35kDa αサブユニット、IL-12 40kDa βサブユニット、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E、IL-17Fアイソフォーム1、IL-17Fアイソフォーム2、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23p19サブユニット、IL-23p40サブユニット、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27B、IL-27-p28、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、IL-36β、IL-36γのための可溶性受容体である、請求項35記載のオルガノイド。
【請求項４４】
1x108細胞を含み、イン・ビトロ培養により増殖培地中で24時間で少なくとも1.0〜10μMの前記可溶性受容体を産生する、請求項43記載のオルガノイド。
【請求項４５】
前記タンパク質はインターフェロン(IFN)である、請求項35記載のオルガノイド。
【請求項４６】
前記インターフェロンは、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3、IFN-K、IFN-ε、IFN-κ、IFN-τ、IFN-δ、IFN-ζ、IFN-ω、又はIFN-vである、請求項45記載のオルガノイド。
【請求項４７】
1x108細胞を含み、イン・ビトロ培養により増殖培地中で24時間で少なくとも1.0〜10μMの前記インターフェロンを産生する、請求項45又は請求項46記載のオルガノイド。
【請求項４８】
前記タンパク質又はポリペプチドは、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3、IFN-K、IFN-ε、IFN-κ、IFN-τ、IFN-δ、IFN-ζ、IFN-ω、又はIFN-vのための可溶性受容体である、請求項35記載のオルガノイド。
【請求項４９】
1x108細胞を含み、イン・ビトロ培養により増殖培地中で24時間で少なくとも1.0〜10μMの前記可溶性受容体を産生する、請求項48記載のオルガノイド。
【請求項５０】
前記タンパク質はインスリン又はプロインスリンである、請求項35記載のオルガノイド。
【請求項５１】
1x108細胞を含み、イン・ビトロ培養により増殖培地中で24時間で少なくとも1.0〜10μMの前記インスリンを産生する、請求項50記載のオルガノイド。
【請求項５２】
前記タンパク質はインスリン受容体である、請求項35記載のオルガノイド。
【請求項５３】
前記細胞は更に、1以上のプロホルモン転換酵素1、プロホルモン転換酵素2、又はカルボキシペプチダーゼEを産生するように遺伝子工学によって設計されている、請求項50又は請求項51記載のオルガノイド。
【請求項５４】
前記タンパク質はレプチン(LEP)である、請求項35記載のオルガノイド。
【請求項５５】
1x108細胞を含み、イン・ビトロ培養により増殖培地中で24時間で少なくとも1.0〜10μMの前記レプチンを産生する、請求項54記載のオルガノイド。
【請求項５６】
前記タンパク質はエリスロポイエチンである、請求項35記載のオルガノイド。
【請求項５７】
1x108細胞を含み、イン・ビトロ培養により増殖培地中で24時間で少なくとも1.0〜10μMの前記可溶性受容体を産生する、請求項56記載のオルガノイド。
【請求項５８】
前記タンパク質はトロンボポエチンである、請求項35記載のオルガノイド。
【請求項５９】
1x108細胞を含み、イン・ビトロ培養により増殖培地中で24時間で少なくとも1.0〜10μMの前記可溶性受容体を産生する、請求項58記載のオルガノイド。
【請求項６０】
前記タンパク質はチロシン3-モノオキシゲナーゼである、請求項35記載のオルガノイド。
【請求項６１】
1x108細胞を含み、イン・ビトロ培養により増殖培地中で24時間で少なくとも1.0〜10μMのL-DOPAを産生する、請求項60記載のオルガノイド。
【請求項６２】
前記細胞は更に、芳香族L-アミノ酸デカルボキシラーゼを発現するように設計されている、請求項60又は請求項61記載のオルガノイド。
【請求項６３】
1x108細胞を含み、イン・ビトロ培養により増殖培地中で24時間で少なくとも1.0〜10μMのドーパミンを産生する、請求項62記載のオルガノイド。
【請求項６４】
前記タンパク質はホルモン又はプロホルモンである、請求項63記載のオルガノイド。
【請求項６５】
前記ホルモンは、抗ミュラー管ホルモン(AMH)、アディポネクチン(Acrp30)、副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)、アンジオテンシン(AGT)、アンギオテンシノーゲン(AGT)、抗利尿ホルモン(ADH)、バソプレッシン、心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)、カルシトニン(CT)、コレシストキニン(CCK)、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン(CRH)、エリスロポイエチン(Epo)、卵胞刺激ホルモン(FSH)、テストステロン、エストロゲン、ガストリン(GRP)、グレリン、グルカゴン(GCG)、性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)、成長ホルモン(GH)、成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン(hCG)、ヒト胎盤ラクトゲン(HPL)、インヒビン、黄体形成ホルモン(LH)、メラニン形成細胞刺激ホルモン(MSH)、オレキシン、オキシトシン(OXT)、副甲状腺ホルモン(PTH)、プロラクチン(PRL)、リラキシン(RLN)、セクレチン(SCT)、ソマトスタチン(SRIF)、トロンボポエチン(Tpo)、甲状腺刺激ホルモン(Tsh)、及び/又は甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン(TRH)である、請求項64記載のオルガノイド。
【請求項６６】
前記タンパク質は、シトクロムP450側鎖切断酵素(P450SCC)である、請求項35記載のオルガノイド。
【請求項６７】
前記タンパク質は、遺伝子的障害若しくは病気を患っている個体中で欠如又は機能不全となっているタンパク質である、請求項35記載のオルガノイド。
【請求項６８】
前記遺伝子的障害若しくは病気は家族性高コレステロール血病であって、前記タンパク質は低比重リポタンパク質受容体(LDLR)であるか、
前記遺伝子的障害若しくは病気は多発性嚢胞腎疾患であって、前記タンパク質はポリシスチン1(PKD1)、PKD-2若しくはPKD3であるか、又は、
前記遺伝子的障害若しくは病気はフェニルケトン尿症であって、前記タンパク質はフェニルアラニンヒドロキシラーゼである、請求項67記載のオルガノイド。
【請求項６９】
免疫抑制化合物又は抗炎症化合物を含む、請求項1〜68いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項７０】
前記化合物は、非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)、アセトアミノフェン、ナプロキセン、イブプロフェン、アセチルサリチル酸、ステロイド、抗T細胞受容体抗体、抗-IL-2受容体抗体、バシリキシマブ、ダクリズマブ(ZENAPAX(登録商標))、抗T細胞受容体抗体(例えば、ムロモナブ-CD3)、アザチオプリン、コルチコステロイド、シクロスポリン、タクロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、シロリムス、カルシニューリン阻害剤等であり、特に、該免疫抑制化合物はマクロファージ炎症性タンパク質(MIP)-1α又はMIP-1βを中和する抗体である、請求項69記載のオルガノイド。
【請求項７１】
肝臓、腎臓、膵臓、甲状腺又は肺の少なくとも１の機能を達成する、請求項1〜70いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項７２】
下垂体の好酸性細胞を含む、請求項1〜71いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項７３】
下垂体の好塩基球細胞を含む、請求項1〜72いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項７４】
下垂体の好酸性細胞及び好塩基球細胞の両方を含む、請求項72又は請求項73記載のオルガノイド。
【請求項７５】
下垂体の成長ホルモン産生細胞を含む、請求項72〜74いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項７６】
下垂体の乳腺刺激ホルモン産生細胞を含む、請求項72〜74いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項７７】
下垂体の副腎皮質刺激ホルモン産生細胞を含む、請求項72〜74いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項７８】
下垂体の甲状腺刺激ホルモン産生細胞を含む、請求項72〜74いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項７９】
下垂体の性腺刺激ホルモン産生細胞を含む、請求項72〜74いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項８０】
２以上の下垂体の成長ホルモン産生細胞、下垂体の乳腺刺激ホルモン産生細胞、下垂体の副腎皮質刺激ホルモン産生細胞、下垂体の甲状腺刺激ホルモン産生細胞、及び/又は下垂体の性腺刺激ホルモン産生細胞を含む、請求項72〜79いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項８１】
イン・ビトロ培養において測定可能な量の成長ホルモン(GH)を産生する、請求項72〜79いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項８２】
イン・ビトロ培養において測定可能な量の成長ホルモン(STH)を産生する、請求項72〜79いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項８３】
イン・ビトロ培養において測定可能な量のプロラクチン(PRL)を産生する、請求項72〜79いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項８４】
イン・ビトロ培養において測定可能な量の副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)を産生する、請求項72〜79いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項８５】
イン・ビトロ培養において測定可能な量のメラニン形成細胞-刺激ホルモン(MSH)を産生する、請求項72〜79いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項８６】
イン・ビトロ培養において測定可能な量の甲状腺刺激ホルモン(TSH)を産生する、請求項72〜79いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項８７】
イン・ビトロ培養において測定可能な量の卵胞刺激ホルモン(FSH)を産生する、請求項72〜79いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項８８】
イン・ビトロ培養において測定可能な量の黄体形成ホルモン(LH)を産生する、請求項72〜79いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項８９】
1以上のGH、STH、PRL、ACTH、MSH、TSH、FSH、ADH及び/又はLHを産生する細胞を含む、請求項1〜88いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項９０】
前記細胞は、1以上のGH、STH、PRL、ACTH、MSH、TSH、FSH、ADH及び/又はLHを産生するように遺伝子工学によって設計されている、請求項1〜88いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項９１】
視床下部ニューロンを含む、請求項1〜90いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項９２】
下垂体細胞を含む、請求項1〜90いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項９３】
視床下部ニューロン及び下垂体細胞の両方を含む、請求項91又は請求項92記載のオルガノイド。
【請求項９４】
イン・ビトロ培養において測定可能な量の抗利尿ホルモン(ADH)を産生する、請求項91〜93いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項９５】
イン・ビトロ培養において測定可能な量のオキシトシンを産生する、請求項91〜93いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項９６】
ADH及び/若しくはオキシトシンのいずれか一方又は両方を産生する細胞を含む請求項1〜95いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項９７】
ADH及び/又はオキシトシンのいずれか一方又は両方を産生するように遺伝子工学によって設計されている細胞を含む、請求項96記載のオルガノイド。
【請求項９８】
内皮性血管形成細胞を含む請求項1〜97いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項９９】
甲状腺上皮細胞を含む請求項1〜98いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１００】
甲状腺傍濾胞細胞を含む請求項1〜99いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１０１】
チログロブリン産生細胞を含む請求項1〜100いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１０２】
２以上の甲状腺上皮細胞、甲状腺傍濾胞細胞、及びチログロブリン産生細胞を含む、請求項99〜101いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１０３】
イン・ビトロ培養において測定可能な量のチロキシン(T4)を産生する、請求項1〜102いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１０４】
イン・ビトロ培養において測定可能な量のトリヨードチロニン(T3)を産生する、請求項1〜102いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１０５】
測定可能な量のカルシトニンを産生する、請求項99〜104いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１０６】
1以上のT3、T4及び/又はカルシトニンを産生する細胞を含む、請求項99〜105いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１０７】
1以上のT3、T4及び/又はカルシトニンを産生するように遺伝子工学によって設計されている細胞を含む請求項99〜106いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１０８】
副甲状腺主細胞を含む、請求項1〜107いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１０９】
副甲状腺好酸性細胞を含む、請求項1〜108いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１１０】
副甲状腺主細胞及び副甲状腺好酸性細胞の両方を含む、請求項108又は109記載のオルガノイド。
【請求項１１１】
イン・ビトロ培養において測定可能な量の副甲状腺ホルモン(PTH)を産生する、請求項108〜111いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１１２】
PTHを産生する細胞を含む、請求項108〜111いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１１３】
前記PTHを産生するように遺伝子工学によって設計されている細胞を含む、請求項111又は112記載のオルガノイド。
【請求項１１４】
副腎腺球状帯細胞を含む、請求項1〜113いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１１５】
副腎腺束状帯細胞を含む、請求項1〜114いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１１６】
副腎腺網状帯細胞を含む、請求項1〜115いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１１７】
副腎腺クロム親和性細胞を含む、請求項1〜116いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１１８】
イン・ビトロ培養において測定可能な量のアルドステロンを産生する、請求項114〜117いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１１９】
イン・ビトロ培養において測定可能な量の18-ヒドロキシ-11-デオキシコルチコステロンを産生する、請求項114〜117いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１２０】
イン・ビトロ培養において測定可能な量のフルドロコルチゾンを産生する、請求項114〜117いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１２１】
測定可能な量のコルチゾールを産生する、請求項114〜117いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１２２】
測定可能な量の非コルチゾール糖質コルチコイドを産生する、請求項114〜117いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１２３】
測定可能な量のエピネフリンを産生する、請求項114〜117いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１２４】
測定可能な量のアドレノステロンを産生する、請求項114〜117いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１２５】
測定可能な量のデヒドロエピアンドロステロンを産生する、請求項114〜117いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１２６】
1以上の、アルドステロン、18-ヒドロキシ-11-デオキシコルチコステロン、コルチゾール、フルドロコルチゾン、非コルチゾール糖質コルチコイド、エピネフリン、アドレノステロン、及び/又はデヒドロエピアンドロステロンを産生する細胞を含む、請求項114〜125いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１２７】
1以上の、アルドステロン、18-ヒドロキシ-11-デオキシコルチコステロン、コルチゾール、フルドロコルチゾン、非コルチゾール糖質コルチコイド、エピネフリン、アドレノステロン、及び/又はデヒドロエピアンドロステロンを産生するように遺伝子工学によって設計されている細胞を含む、請求項126記載のオルガノイド。
【請求項１２８】
肝細胞を含む、請求項1〜127いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１２９】
測定可能な量の、1以上の、凝固第I因子(フィブリノーゲン)、凝固第II因子(プロトロンビン)、凝固第V因子(第V因子)、凝固第VII因子(プロコンベルチン)、凝固第IX因子(クリスマス因子)、凝固第X因子(スチュアート・ブラウアー因子、プロトロンビナーゼ)、凝固第XI因子(血漿トロンボプラスチン前駆体)、タンパク質C(オートプロトロンビンIIA、血液凝固第XIV因子)、タンパク質S及び/又はアンチトロンビンを産生する、請求項128記載のオルガノイド。
【請求項１３０】
アミノ酸、ラクテート、グリセロール又はグリコーゲンから、検出可能な量のグルコースを産生する、請求項128記載のオルガノイド。
【請求項１３１】
検出可能な量のインスリン様成長因子(IGF-1)又はトロンボポエチンを産生する、請求項128記載のオルガノイド。
【請求項１３２】
胆汁を産生する、請求項128記載のオルガノイド。
【請求項１３３】
1以上の、凝固第I因子(フィブリノーゲン)、凝固第II因子(プロトロンビン)、凝固第V因子(第V因子)、凝固第VII因子(プロコンベルチン)、凝固第IX因子(クリスマス因子)、凝固第X因子(スチュアート・ブラウアー因子、プロトロンビナーゼ)、凝固第XI因子(血漿トロンボプラスチン前駆体)、タンパク質C(オートプロトロンビンIIA、血液凝固第XIV因子)、タンパク質S、アンチトロンビン、IGF-1又はトロンボポエチンを産生する細胞を含む、請求項1〜132いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１３４】
肝管内皮細胞を含む、請求項1〜133いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１３５】
膵臓α細胞を含む、請求項1〜134いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１３６】
膵臓β細胞を含む、請求項1〜135いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１３７】
膵臓デルタ細胞を含む、請求項1〜136いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１３８】
膵臓ポリペプチド(PP)細胞を含む、請求項1〜137いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１３９】
膵臓イプシロン細胞を含む、請求項1〜138いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１４０】
２以上の、膵臓α細胞、膵臓β細胞、膵臓デルタ細胞、膵臓ポリペプチド(PP)細胞、及び/又は膵臓イプシロン細胞を含む、請求項1〜139いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１４１】
検出可能な量のグルカゴンを産生する、請求項135〜140いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１４２】
検出可能な量のインスリンを産生する、請求項135〜140いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１４３】
検出可能な量のアミリンを産生する、請求項135〜140いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１４４】
検出可能な量のインスリン及び検出可能な量のアミリンを産生する、請求項135〜140いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１４５】
前記インスリン及び前記アミリンを約50:1〜約200:1の割合で産生する、請求項144記載のオルガノイド。
【請求項１４６】
検出可能な量のソマトスタチンを産生する、請求項128〜140いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１４７】
検出可能な量のグレリン(grehlin)を産生する、請求項128〜140いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１４８】
検出可能な量の膵臓ポリペプチドを産生する、請求項128〜140いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１４９】
検出可能な量の、1以上の、インスリン、グルカゴン、アミリン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド、及び/又はグレリン(grehlin)を産生する細胞を含む、請求項128〜140いずれか1項記載のオルガノイド。
【請求項１５０】
ヒト成長ホルモン(hGH)が必要な個体の治療方法であって、前記個体へ請求項72〜81いずれか1項記載のオルガノイドを投与することを含む、前記治療方法。
【請求項１５１】
成長ホルモン(STH)が必要な個体の治療方法であって、前記個体へ請求項72〜80又は82いずれか1項記載のオルガノイドを投与することを含む、前記治療方法。
【請求項１５２】
プロラクチン(PRL)が必要な個体の治療方法であって、前記個体へ請求項72〜80又は83いずれか1項記載のオルガノイドを投与することを含む、前記治療方法。
【請求項１５３】
前記個体は、1以上の、代謝症候群、動脈性勃起不全、早漏、乏精子症、精子無力症、精嚢の機能低下、又は性腺機能低下症を患っている請求項152記載の方法。
【請求項１５４】
副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)が必要な個体の治療方法であって、前記個体へ請求項72〜80又は84いずれか1項記載のオルガノイドを投与することを含む、前記治療方法。
【請求項１５５】
前記個体はアジソン病を患っている請求項154記載の方法。
【請求項１５６】
メラニン形成細胞-刺激ホルモン(MSH)が必要な個体の治療方法であって、前記個体へ請求項72〜80又は85いずれか1項記載のオルガノイドを投与することを含む、前記治療方法。
【請求項１５７】
前記個体は、アルツハイマー病を患っている請求項156記載の方法。
【請求項１５８】
甲状腺刺激ホルモン(TSH)が必要な個体の治療方法であって、前記個体へ請求項72〜80又は86いずれか1項記載のオルガノイドを投与することを含む、前記治療方法。
【請求項１５９】
前記個体は、クレチン病を患っているか、又は明らかに発症している請求項158記載の方法。
【請求項１６０】
卵胞刺激ホルモン(FSH)が必要な個体の治療方法であって、前記個体へ請求項72〜80又は87いずれか1項記載のオルガノイドを投与することを含む、前記治療方法。
【請求項１６１】
前記個体は、生殖不能(不妊)症又は無精子症を患っているか、又は明らかに発症している請求項160記載の方法。
【請求項１６２】
黄体形成ホルモン(LH)が必要な個体の治療方法であって、前記個体へ請求項72〜80又は88いずれか1項記載のオルガノイドを投与することを含む、前記治療方法。
【請求項１６３】
前記個体は、低テストステロン、精子数減少症又は生殖不能(不妊)症を患っているか、又は明らかに発症している請求項162記載の方法。
【請求項１６４】
抗利尿ホルモン(ADH)が必要な個体の治療方法であって、前記個体へ請求項91〜94いずれか1項記載のオルガノイドを投与することを含む、前記治療方法。
【請求項１６５】
前記個体は視床下部性尿崩症を患っている請求項164記載の方法。
【請求項１６６】
オキシトシンが必要な個体の治療方法であって、前記個体へ請求項91〜93又は95〜97いずれか1項記載のオルガノイドを投与することを含む、前記治療方法。
【請求項１６７】
チロキシン(T4)が必要な個体の治療方法であって、前記個体へ請求項99〜103、106又は107いずれか1項記載のオルガノイドを投与することを含む、前記治療方法。
【請求項１６８】
前記個体は、精神遅滞、小人症、低筋力(weakness)、嗜眠、低温不耐性、又は満月様顔貌を患っているか、又は明らかに発症している請求項167記載の方法。
【請求項１６９】
トリヨードチロニン(T3)が必要な個体の治療方法であって、前記個体へ請求項99〜102、104、106又は107いずれか1項記載のオルガノイドを投与することを含む、前記治療方法。
【請求項１７０】
前記個体は心臓病を患っている請求項169記載の方法。
【請求項１７１】
前記個体は、T3の血清濃度が3.1pmol/L未満である、請求項170記載の方法。
【請求項１７２】
カルシトニンが必要な個体の治療方法であって、前記個体へ請求項99〜102、又は105〜107いずれか1項記載のオルガノイドを投与することを含む、前記治療方法。
【請求項１７３】
前記個体は、骨粗鬆症又は慢性自己免疫甲状腺機能低下症を患っている請求項172記載の方法。
【請求項１７４】
副甲状腺ホルモン(PTH)が必要な個体の治療方法であって、前記個体へ請求項108〜113いずれか1項記載のオルガノイドを投与することを含む、前記治療方法。
【請求項１７５】
アルドステロンが必要な個体の治療方法であって、前記個体へ請求項114〜118、126又は127いずれか1項記載のオルガノイドを投与することを含む、前記治療方法。
【請求項１７６】
前記個体は、特発性低アルドステロン症、高レニン血症性低アルドステロン症、又は低レニン血症性低アルドステロン症を患っている、請求項175記載の方法。
【請求項１７７】
前記個体は慢性腎不全を患っている請求項175記載の方法。
【請求項１７８】
18-ヒドロキシ-11-デオキシコルチコステロンが必要な個体の治療方法であって、前記個体へ請求項114〜117、119、126又は127いずれか1項記載のオルガノイドを投与することを含む、前記治療方法。
【請求項１７９】
フルドロコルチゾンが必要な個体の治療方法であって、前記個体へ請求項114〜117、120、126又は127いずれか1項記載のオルガノイドを投与することを含む、前記治療方法。
【請求項１８０】
コルチゾールが必要な個体の治療方法であって、前記個体へ請求項114〜117、121、126又は127いずれか1項記載のオルガノイドを投与することを含む、前記治療方法。
【請求項１８１】
前記個体は、急性副腎不全、アジソン病、又は低血糖症を患っている請求項180記載の方法。
【請求項１８２】
非コルチゾール糖質コルチコイドが必要な個体の治療方法であって、前記個体へ請求項114〜117、122、126又は127いずれか1項記載のオルガノイドを投与することを含む、前記治療方法。
【請求項１８３】
エピネフリンが必要な個体の治療方法であって、前記個体へ請求項114〜117、123、126又は127いずれか1項記載のオルガノイドを投与することを含む、前記治療方法。
【請求項１８４】
アドレノステロンが必要な個体の治療方法であって、前記個体へ請求項114〜117、124、126又は127いずれか1項記載のオルガノイドを投与することを含む、前記治療方法。
【請求項１８５】
デヒドロエピアンドロステロンが必要な個体の治療方法であって、前記個体へ請求項114〜117、又は125〜127いずれか1項記載のオルガノイドを投与することを含む、前記治療方法。
【請求項１８６】
ある化合物が必要な個体の治療方法であって、前記化合物は、凝固第I因子(フィブリノーゲン)、凝固第II因子(プロトロンビン)、凝固第V因子(第V因子)、凝固第VII因子(プロコンベルチン)、凝固第IX因子(クリスマス因子)、凝固第X因子(スチュアート・ブラウアー因子、プロトロンビナーゼ)、凝固第XI因子(血漿トロンボプラスチン前駆体)、タンパク質C(オートプロトロンビンIIA、血液凝固第XIV因子)、タンパク質S及び/又はアンチトロンビンであり、前記個体へ請求項139又は請求項143記載のオルガノイドを投与することを含む、前記治療方法。
【請求項１８７】
IGF-1が必要な個体の治療方法であって、前記個体へ請求項128又は請求項131記載のオルガノイドを投与することを含む、前記治療方法。
【請求項１８８】
トロンボポエチンが必要な個体の治療方法であって、前記個体へ請求項128又は請求項131記載のオルガノイドを投与することを含む、前記治療方法。
【請求項１８９】
グルカゴンが必要な個体の治療方法であって、前記個体へ請求項135〜141いずれか1項記載のオルガノイドを投与することを含む、前記治療方法。
【請求項１９０】
インスリンが必要な個体の治療方法であって、前記個体へ請求項135〜140、142、144又は145いずれか1項記載のオルガノイドを投与することを含む、前記治療方法。
【請求項１９１】
前記個体は真性糖尿病を患っている、請求項190記載の方法。
【請求項１９２】
アミリンが必要な個体の治療方法であって、前記個体へ請求項135〜140、又は143〜145いずれか1項記載のオルガノイドを投与することを含む、前記治療方法。
【請求項１９３】
グレリン(grehlin)が必要な個体の治療方法であって、前記個体へ請求項135〜140、又は147いずれか1項記載のオルガノイドを投与することを含む、前記治療方法。
【請求項１９４】
膵臓ポリペプチドが必要な個体の治療方法であって、前記個体へ請求項135〜140、又は148いずれか1項記載のオルガノイドを投与することを含む、前記治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2011年12月23日出願の米国仮特許出願番号61/579942、2012年1月30日出願の米国仮特許出願番号61/592350、及び2012年9月4日出願の米国仮特許出願番号61/696527に基づく優先権を主張し、それぞれの出願書類開示の全ては本明細書に引用して組み込まれる。
【０００２】
1  分野
本出願は、脱細胞化胎盤の脈管足場(scaffold)を含む、又は、脱細胞化胎盤の脈管足場からなる、オルガノイド、並びにその製造及び使用方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
2  背景技術
生理機能的に、病気となるか、損傷するか、又は外科的に切除された組織の代替に対する、大きな医学的要求がある。そこで本出願は、脱細胞化胎盤の脈管足場を含むオルガノイド、及びその製造使用方法を提供し、その要求に答えることとする。
【発明の概要】
【０００４】
3  概要
本発明は、1以上の型の細胞を含み、かつ、脱細胞化胎盤の脈管足場を含む、オルガノイドを提供するものであり、前記オルガノイドは、臓器又は臓器由来組織の少なくとも1の機能を達成し、前記臓器又は臓器由来組織の少なくとも1の機能は、該臓器又は組織由来の少なくとも1の細胞型に特徴的な、タンパク質、成長増殖因子、サイトカイン、インターロイキン、又は小分子を産生することであり、前記脱細胞化胎盤の脈管(vascular)足場は、実質的に損傷がない胎盤の脈管構造マトリックスを含む、オルガノイドを提供するが、その場合、胎盤からマトリックスが得られ、胎盤の脈管構造は、脱細胞処理及びその次に続くオルガノイドの製造中で実質的に保存される。
【０００５】
種々の態様において、前記オルガノイドは、約、多くとも、又は、少なくとも1012細胞、1011細胞、1010細胞、109細胞、108細胞、107細胞、106細胞、105細胞、104細胞、103細胞、又は102細胞を含む。
【０００６】
本発明のいずれかの態様の特別な例において、前記オルガノイドは更に合成マトリックスを含む。更に特別な態様において、前記合成マトリックスは、前記オルガノイドの三次元構造を安定化させる。ある特別な態様において、前記合成マトリックスはポリマー又は熱可塑性物質を含む。ある特別な態様において、前記合成マトリックスはポリマー又は熱可塑性物質である。更に特別な態様において、前記熱可塑性物質は、ポリカプロラクトン(PCL)、ポリ乳酸、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレン、ポリエステル、ポリ酢酸ビニル、又はポリ塩化ビニルである。特別な態様において、前記熱可塑性物質は、合成ポリマーPCLである。更に別の特別な態様において、前記ポリマーは、ポリ塩化ビニリジン(polyvinylidine chloride)、ポリ(o-カルボキシフェノキシ)-p-キシレン)(ポリ(o-CPX))、ポリ(無水ラクチド)(PLAA)、n-イソプロピルアクリルアミド、アクリルアミド、pentエリスリトールジアクリレート、ポリメチルアクリレート、カルボキシメチルセルロース、又はポリ(乳酸-グリコール酸共重合体)(PLGA)である。更に別の特別な態様において、前記ポリマーはポリアクリルアミドである。
【０００７】
ある特別な態様において、前記オルガノイド中の前記1以上の型の細胞は、ナチュラルキラー(NK)細胞、例えば、CD56+CD16-胎盤中間ナチュラルキラー(PiNK)細胞を含む。更に別の特別な態様において、前記オルガノイドは樹状細胞を含む。
【０００８】
ある特別な態様において、前記オルガノイドは胸腺細胞を含む。他のある態様において、前記オルガノイドは、胸腺細胞、リンパ球様細胞、上皮性(epithelial)網状細胞、及び胸腺間質細胞を含む。
【０００９】
更に別の特別な態様において、前記オルガノイドは甲状腺濾胞細胞を含む。他のある態様において、前記オルガノイドはチログロブリン(thyroglobulin)を産生する細胞を含む。
更に別の特別な態様において、前記オルガノイドは更に甲状腺上皮細胞及び傍濾胞細胞を含む。
【００１０】
ある特別な態様において、前記オルガノイドは幹細胞又は前駆細胞を含む。特別な態様において、前記幹細胞又は前駆細胞は、胚性幹細胞(ES細胞)、胚性生殖細胞(EG細胞)、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系間質細胞、CD34-、CD10+、CD105+、及びCD200+胎盤由来組織プラスチック接着性胎盤幹細胞(PDAC(登録商標))、臍帯幹細胞、羊水幹細胞、羊膜由来接着性細胞(AMDAC)、骨形成性の胎盤接着性細胞(OPAC)、脂肪組織(adipose)幹細胞、角膜(limbal)幹細胞、歯髄幹細胞、筋芽細胞、内皮前駆細胞、神経幹細胞、脱落歯由来幹細胞、毛嚢幹細胞、真皮幹細胞、単為生殖由来幹細胞、リプログラムされた幹細胞、羊膜由来接着性細胞、又はサイドポピュレーション幹細胞である。更に別の特別な態様において、前記オルガノイドは造血幹細胞又は造血前駆細胞を含む。更に別の特別な態様において、前記オルガノイドは、組織培養プラスチック接着性CD34-、CD10+、CD105+、及びCD200+胎盤幹細胞を含む。更に特別な態様において、前記胎盤幹細胞は更に、1又はそれ以上のCD45-、CD80-、CD86-、又はCD90+である。更に特別な態様において、前記胎盤幹細胞は更に、CD45-、CD80-、CD86-、及びCD90+である。別の更に特別な態様において、前記オルガノイドがレシピエントへ移植される場合には、前記胎盤幹細胞は前記レシピエント体内で、例えば該レシピエント内で局部的に、免疫応答を抑制する。
【００１１】
更に別の特別な態様において、本発明のオルガノイドのいずれかは、分化した(differentiated)細胞を含む。更に特別な態様において、前記分化した細胞は、以下の1又はそれ以上を含む；
内皮細胞、上皮細胞、真皮細胞、内胚葉細胞、中胚葉細胞、線維芽細胞、骨細胞、軟骨細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、肝細胞(hepatic cell)、膵臓細胞、又は間質細胞；
唾液腺粘液性細胞、唾液腺漿液性細胞、エブネル腺細胞、乳腺細胞、涙腺細胞、耳道腺細胞、エクリン汗腺暗調細胞、エクリン汗腺明調細胞、アポクリン汗腺細胞、モル腺細胞、脂腺細胞、ボウマン腺細胞、ブルンネル腺細胞、精嚢細胞、前立腺細胞、尿道球腺細胞、バルトリン腺細胞、尿道腺細胞、子宮内膜細胞、単離された杯細胞、胃壁の粘液性細胞、胃腺酵素原細胞、胃腺酸分泌細胞、膵腺房細胞、パネート細胞、II型肺胞上皮細胞、クララ細胞;
成長ホルモン(ソマトトロピン)産生細胞、乳腺刺激ホルモン(プロラクチン)産生細胞、甲状腺刺激ホルモン産生細胞、性腺刺激ホルモン(ゴナドトロピン)産生細胞、副腎皮質刺激ホルモン産生細胞(corticotropes)、下垂体中葉細胞、巨大細胞神経分泌細胞、腸管細胞、気道細胞、甲状腺上皮細胞、傍濾胞細胞、副甲状腺細胞、副甲状腺主細胞、好酸性細胞;
副腎腺細胞、クロム親和性細胞、ライディッヒ細胞、内卵胞膜細胞、黄体細胞、顆粒膜黄体細胞、卵胞膜黄体細胞、傍糸球体細胞、緻密斑細胞、極周囲細胞、メサンギウム細胞、
血管及びリンパ管(lymphatic vascular)内皮有窓型細胞、血管及びリンパ管内皮連続型細胞、血管及びリンパ管内皮脾(splenic)細胞、滑膜細胞、漿膜細胞(腹膜の、胸膜の、及び心膜腔の内壁(lining))、扁平上皮細胞、円柱細胞、暗調細胞、前庭膜細胞(耳の内リンパ腔内壁)、血管条基底細胞、血管条周辺細胞(耳の内リンパ腔内壁)、クラウディウス細胞、ベッチェル細胞、脈絡叢細胞、軟膜クモ膜扁平上皮細胞、色素毛様体上皮細胞、非色素毛様体上皮細胞、角膜内皮細胞、栓細胞(peg cell)、
気道繊毛細胞、卵管繊毛細胞、子宮内膜繊毛細胞、精巣網繊毛細胞、精巣輸出管繊毛細胞、繊毛性上衣細胞、
表皮(epidermal)角化細胞、表皮基底細胞、指爪及び足指爪の角化細胞、爪床基底細胞、毛幹の毛髄質細胞、毛幹の毛皮質細胞、毛幹の毛小皮細胞、毛根の毛小皮鞘細胞、毛根ハックスレー層の鞘細胞、毛根ヘンレ層の鞘細胞、外毛根鞘細胞、毛母細胞、
重層扁平上皮の表面上皮細胞、上皮基底細胞、泌尿器上皮細胞、
耳のコルチ器官の内有毛細胞、耳のコルチ器官の外有毛細胞、嗅上皮基底細胞、冷感受性一次感覚ニューロン、熱感受性一次感覚ニューロン、表皮のメルケル細胞、嗅覚受容体神経、痛み感受性一次感覚ニューロン、光受容体桿体細胞、光受容体青色感受性錐体細胞、光受容体緑色感受性錐体細胞、光受容体赤色感受性錐体細胞、自己(固有)受容性一次感覚ニューロン、触覚感受性一次感覚ニューロン、I型頸動脈小体細胞、II型頸動脈小体細胞(血液pHセンサ)、内耳前庭器官のI型有毛細胞(加速度及び重力)、内耳前庭器官のII型有毛細胞、I型味蕾細胞、
コリン作動性神経細胞、アドレナリン作動性神経細胞、ペプチド作動性神経細胞、
コルチ器官の内柱細胞、コルチ器官の外柱細胞、コルチ器官の内指骨細胞、コルチ器官の外指骨細胞、コルチ器官の境界細胞、コルチ器官のヘンゼン細胞、前庭器支持細胞、味蕾支持細胞、嗅上皮支持細胞、シュワン細胞、サテライト細胞、腸内グリア細胞、
星状細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、紡錘形ニューロン、
前水晶体上皮細胞、クリスタリン含有水晶体線維細胞、
肝細胞、含脂肪細胞、白色脂肪細胞、褐色脂肪細胞、肝臓脂肪細胞(lipocyte)、
腎臓糸球体壁細胞、腎臓糸球体有足細胞、腎臓近位尿細管刷子縁細胞、ヘンレ係蹄の細い部分の細胞、腎臓遠位尿細管細胞、腎臓集合管細胞、I型肺胞上皮細胞、膵管細胞、非線条(nonstriated)導管細胞、導管細胞、腸刷子縁細胞、外分泌腺線条導管細胞、胆嚢上皮細胞、精巣輸出管非繊毛細胞、精巣上体主細胞、精巣上体基底細胞、
エナメル芽細胞上皮細胞、半月面上皮細胞、コルチ器官歯間上皮細胞、疎性結合組織線維芽細胞、角膜実質細胞(keratocyte)、腱線維芽細胞、骨髄網状組織線維芽細胞、非上皮性線維芽細胞、周細胞、髄核細胞、セメント芽細胞/セメント細胞、造歯細胞、象牙芽細胞、ヒアリン軟骨細胞、線維軟骨細胞、弾性軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、骨前駆細胞、硝子体細胞、星細胞(耳)、肝星細胞(伊東細胞)、膵星細胞、
赤色骨格筋細胞、白色骨格筋細胞、中間体骨格筋細胞、筋紡錘の核袋細胞、筋紡錘の核鎖細胞、サテライト細胞、通常の心筋細胞、結節性(nodal)心筋細胞、プルキンエ線維細胞、平滑筋細胞、虹彩の筋上皮細胞、外分泌腺の筋上皮細胞、
網状赤血球、巨核球、単球、結合組織マクロファージ、表皮ランゲルハンス細胞、樹状細胞、ミクログリア細胞、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、ヘルパーT細胞、サプレッサーT細胞、細胞傷害性T細胞、ナチュラルキラーT細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、
メラニン形成細胞、網膜色素上皮細胞、
卵原細胞/卵母細胞、精子細胞、精母細胞、精原細胞、精子、卵胞細胞、セルトリ細胞、胸腺上皮細胞、及び/又は間質性腎臓細胞。
【００１２】
更に別の特別な態様において、前記細胞は初代培養細胞である。別の特別な態様において、前記細胞はイン・ビトロで培養された細胞である。更に別の特別な態様において、前記細胞は、該細胞によって天然には産生されないタンパク質若しくはポリペプチドを産生するように遺伝子工学的に設計されている、又は、該細胞によって天然に産生される場合よりも多くの量のタンパク質若しくはポリペプチドを産生するように遺伝子工学的に設計されている。特別な態様において、前記タンパク質又はポリペプチドは、その活性部分を含むサイトカイン又はペプチドである。更に特別な態様において、前記サイトカインは、1又はそれ以上の、アドレノメデュリン(AM)、アンジオポエチン(Ang)、骨形成タンパク質(BMP)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、上皮増殖因子(EGF)、エリスロポイエチン(Epo)、線維芽細胞増殖因子(FGF)、グリア細胞系由来神経栄養因子(GNDF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、増殖分化因子(GDF-9)、肝細胞増殖因子(HGF)、肝癌由来増殖因子(HDGF)、インスリン様成長因子(IGF)、遊走刺激因子、ミオスタチン(GDF-8)、骨髄単球性増殖因子(MGF)、神経成長因子(NGF)、胎盤増殖因子(PlGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、トロンボポエチン(Tpo)、トランスフォーミング増殖因子α(TGF-α)、TGF-β、腫瘍壊死因子α(TNF-α)、血管内皮増殖因子(VEGF)、又はWntタンパク質である。上記態様のいずれかにおいて、個々の前記オルガノイドは、例えば1x108細胞を含むオルガノイドは、イン・ビトロ培養での増殖培地中で24時間で少なくとも1.0〜10μMの前記サイトカインを産生する。
【００１３】
他の更に特別な態様において、前記タンパク質又はポリペプチドは、AM、Ang、BMP、BDNF、EGF、Epo、FGF、GNDF、G-CSF、GM-CSF、GDF-9、HGF、HDGF、IGF、遊走刺激因子、GDF-8、MGF、NGF、PlGF、PDGF、Tpo、TGF-α、TGF-β、TNF-α、VEGF、又はWntタンパク質のための可溶性受容体である。他の特別な態様において、個々の前記オルガノイドは、例えば1x108細胞を含むオルガノイドは、イン・ビトロ培養での増殖培地中で24時間で少なくとも1.0〜10μMの前記可溶性受容体を産生する。
【００１４】
他の特別な態様において、前記タンパク質又はポリペプチドは、インターロイキン又はその活性部分である。種々の更に特別な態様において、前記インターロイキンは、インターロイキン-1α(IL-1α)、IL-1β、IL-1F1、IL-1F2、IL-1F3、IL-1F4、IL-1F5、IL-1F6、IL-1F7、IL-1F8、IL-1F9、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12 35kDaαサブユニット、IL-12 40kDaβサブユニット、IL-12α及びβサブユニットの両方、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E、IL-17Fアイソフォーム1、IL-17Fアイソフォーム2、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23p19サブユニット、IL-23p40サブユニット、IL-23p19サブユニット及びIL-23p40サブユニットの両方、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27B、IL-27-p28、IL-27B及びIL-27-p28の両方、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、IL-36β、又はIL-36γである。他の更に特別な態様において、個々の前記オルガノイドは、例えば1x108細胞を含むオルガノイドは、イン・ビトロ培養での増殖培地中で24時間で少なくとも1.0〜10μMの前記インターロイキン又はその活性部分を産生する。
【００１５】
更に特別なある態様において、前記タンパク質又はポリペプチドは、IL-1α、IL-1β、IL-1F1、IL-1F2、IL-1F3、IL-1F4、IL-1F5、IL-1F6、IL-1F7、IL-1F8、IL-1F9、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12 35kDa αサブユニット、IL-12 40kDa βサブユニット、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E、IL-17Fアイソフォーム1、IL-17Fアイソフォーム2、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23p19サブユニット、IL-23p40サブユニット、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27B、IL-27-p28、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、IL-36β、又は、IL-36γのための可溶性受容体である。更に特別な態様において、個々の前記オルガノイドは、例えば1x108細胞を含むオルガノイドは、イン・ビトロ培養での増殖培地中で24時間で少なくとも1.0〜10μMの前記可溶性受容体を産生する。
【００１６】
別の更に特別な態様において、前記タンパク質はインターフェロン(IFN)である。特別な態様において、前記インターフェロンは、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3、IFN-K、IFN-ε、IFN-κ、IFN-τ、IFN-δ、IFN-ζ、IFN-ω、又はIFN-vである。他の特別な態様において、個々の前記オルガノイドは、例えば1x108細胞を含むオルガノイドは、イン・ビトロ培養での増殖培地中で24時間で少なくとも1.0〜10μMの前記インターフェロンを産生する。
【００１７】
他の更に特別な態様において、前記タンパク質又はポリペプチドは、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3、IFN-K、IFN-ε、IFN-κ、IFN-τ、IFN-δ、IFN-ζ、IFN-ω、又はIFN-vのための可溶性受容体である。ある特別な態様において、個々の前記オルガノイドは、例えば1x108細胞を含むオルガノイドは、イン・ビトロ培養での増殖培地中で24時間で少なくとも1.0〜10μMの前記可溶性受容体を産生する。
【００１８】
別の特別な態様において、前記タンパク質はインスリン又はプロインスリンである。特別な態様において、個々の前記オルガノイドは、例えば1x108細胞を含むオルガノイドは、イン・ビトロ培養での増殖培地中で24時間で少なくとも1.0〜10μMの前記インスリンを産生する。別の特別な態様において、前記タンパク質はインスリン受容体である。更に特別なある態様において、インスリン又はプロインスリンを産生する前記細胞は更に、1又はそれ以上のプロホルモン転換酵素1、プロホルモン転換酵素2、又はカルボキシペプチダーゼEを産生するように遺伝子工学的に設計されている。
【００１９】
別の特別な態様において、前記タンパク質はレプチン(LEP)である。別の特別な態様において、個々の前記オルガノイドは、例えば1x10*細胞を含むオルガノイドは、イン・ビトロ培養での増殖培地中で24時間で少なくとも1.0〜10μMの前記レプチンを産生する。
【００２０】
別の特別な態様において、前記タンパク質はエリスロポイエチンである。別の特別な態様において、別の特別な態様において、個々の前記オルガノイドは、例えば1x10*細胞を含むオルガノイドは、イン・ビトロ培養での増殖培地中で24時間で少なくとも1.0〜10μMの前記エリスロポイエチンを産生する。別の特別な態様において、前記タンパク質はトロンボポエチンである。別の特別な態様において、前記オルガノイドは、例えば1x108細胞を含むオルガノイドは、イン・ビトロ培養での増殖培地中で24時間で少なくとも1.0〜10μMの前記トロンボポエチンを産生する。
【００２１】
別の特別な態様において、前記タンパク質はチロシン3-モノオキシゲナーゼである。ある特別な態様において、チロシン3-モノオキシゲナーゼを発現するように設計されている細胞を含むオルガノイド、例えば、1x108の前記細胞を含むオルガノイドは、イン・ビトロ培養での増殖培地中で24時間で少なくとも1.0〜10μMのL-DOPAを産生する。更に特別な態様において、前記チロシン3-モノオキシゲナーゼを発現する前記細胞は、更に芳香族L-アミノ酸デカルボキシラーゼを発現するように設計されている。更に特別な態様において、個々の前記オルガノイドは、例えば1x108細胞を含むオルガノイドは、イン・ビトロ培養での増殖培地中で24時間で少なくとも1.0〜10μMのドーパミンを産生する。
【００２２】
更に別の特別な態様において、前記タンパク質はホルモン又はプロホルモンである。種々の特別な態様において、前記ホルモンは、抗ミュラー管ホルモン(AMH)、アディポネクチン(Acrp30)、副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)、アンジオテンシン(AGT)、アンギオテンシノーゲン(AGT)、抗利尿ホルモン(ADH)、バソプレッシン、心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)、カルシトニン(CT)、コレシストキニン(CCK)、副腎皮質刺激ホルモン(コルチコトロピン)放出ホルモン(CRH)、エリスロポイエチン(Epo)、卵胞刺激ホルモン(FSH)、テストステロン、エストロゲン、ガストリン(GRP)、グレリン、グルカゴン(GCG)、性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)、成長ホルモン(GH)、成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン(gonadotropin)(hCG)、ヒト胎盤ラクトゲン(HPL)、インヒビン、黄体形成ホルモン(LH)、メラニン形成細胞刺激ホルモン(MSH)、オレキシン、オキシトシン(OXT)、副甲状腺ホルモン(PTH)、プロラクチン(PRL)、リラキシン(relaxin)(RLN)、セクレチン(SCT)、ソマトスタチン(SRIF)、トロンボポエチン(Tpo)、甲状腺刺激ホルモン(Tsh)、及び/又は甲状腺刺激ホルモン放出刺激ホルモン(TRH)である。
【００２３】
別の特別な態様において、タンパク質は、シトクロムP450側鎖切断酵素(P450SCC)である。
【００２４】
別の特別な態様において、前記タンパク質は、遺伝子的障害若しくは病気を患っている個体中で欠如又は機能不全となっているタンパク質である。ある特別な態様において、前記遺伝子的病気は家族性高コレステロール血病であって、前記タンパク質は低比重リポタンパク質受容体(LDLR)であるか、前記遺伝子的病気は多発性嚢胞腎疾患であって、前記タンパク質はポリシスチン1(PKD1)、PKD-2若しくはPKD3であるか、又は、前記遺伝子的病気はフェニルケトン尿症であって、前記タンパク質はフェニルアラニンヒドロキシラーゼである。
【００２５】
本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの特別な態様において、前記オルガノイドは、免疫抑制化合物又は抗炎症化合物を含む。特別な態様において、前記免疫抑制又は抗炎症化合物は、非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)、アセトアミノフェン、ナプロキセン、イブプロフェン、アセチルサリチル酸、ステロイド、抗T細胞受容体抗体、抗-IL-2受容体抗体、バシリキシマブ、ダクリズマブ(ZENAPAX(登録商標))、抗細胞受容体抗体(例えば、ムロモナブ-CD3)、アザチオプリン、コルチコステロイド、シクロスポリン、タクロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、シロリムス、カルシニューリン阻害剤等である。特別な態様において、該免疫抑制剤は、マクロファージ炎症性タンパク質(MIP)-1α又はMIP-1βを中和する抗体である。
【００２６】
本発明で開示されたいずれかのオルガノイドのある態様において、前記オルガノイドは、個体への投与後、1、2、3、4、5、6、又は7日間、又は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれ以上の週の間、前記少なくとも1の生理的機能を維持する。
【００２７】
ある本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの特別な態様において、前記オルガノイドは肝臓、腎臓、膵臓、甲状腺又は肺の少なくとも1の機能を果たす。
【００２８】
オルガノイドは、下垂体特異的細胞、及び/又は、下垂体に特異な機能を果たす細胞を含むことができる。ある態様において、本発明で開示されたいずれかのオルガノイドは、下垂体の(pituitary)好酸性細胞を含む。他のある態様において、本発明で開示されたいずれかのオルガノイドは、下垂体の好塩基球細胞を含む。他のある態様において、本発明で開示されたいずれかのオルガノイドは、下垂体の好酸性細胞及び好塩基球細胞の両方を含む。別の態様において、本発明で開示されたいずれかのオルガノイドは、下垂体の成長ホルモン産生細胞を含む。別の態様において、本発明で開示されたいずれかのオルガノイドは、下垂体の乳腺刺激ホルモン産生細胞を含む。別の態様において、本発明で開示されたいずれかのオルガノイドは、下垂体の副腎皮質刺激ホルモン産生細胞を含む。別の態様において、本発明で開示されたいずれかのオルガノイドは、下垂体の甲状腺刺激ホルモン産生細胞を含む。別の態様において、本発明で開示されたいずれかのオルガノイドは、下垂体の性腺刺激ホルモン産生細胞を含む。別の態様において、本発明で開示されたいずれかのオルガノイドは、前記オルガノイドを含み、そのオルガノイドは2又はそれ以上の下垂体の成長ホルモン産生細胞、下垂体の乳腺刺激ホルモン産生細胞、下垂体の副腎皮質刺激ホルモン産生細胞、下垂体の甲状腺刺激ホルモン産生細胞、及び/又は下垂体の性腺刺激ホルモン産生細胞を含む。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの別の態様において、前記オルガノイドはイン・ビトロ培養において測定可能な量の成長ホルモン(GH)を産生する。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの別の態様において、前記オルガノイドはイン・ビトロ培養において測定可能な量の成長ホルモン(STH)を産生する。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの別の態様において、前記オルガノイドはイン・ビトロ培養において測定可能な量のプロラクチン(PRL)を産生する。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの別の態様において、前記オルガノイドはイン・ビトロ培養において測定可能な量の副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)を産生する。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの別の態様において、前記オルガノイドはイン・ビトロ培養において測定可能な量のメラニン形成細胞刺激ホルモン(MSH)を産生する。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの別の態様において、前記オルガノイドはイン・ビトロ培養において測定可能な量の甲状腺刺激ホルモン(TSH)を産生する。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの別の態様において、前記オルガノイドはイン・ビトロ培養において測定可能な量の卵胞刺激ホルモン(FSH)を産生する。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの別の態様において、前記オルガノイドはイン・ビトロ培養において測定可能な量の黄体形成ホルモン(LH)を産生する。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの別の態様において、前記オルガノイドは前記オルガノイドは、1又はそれ以上のGH、STH、PRL、ACTH、MSH、TSH、FSH及び/又はLHを産生する細胞を含む。特別な態様において、前記細胞は1以上のGH、STH、PRL、ACTH、MSH、TSH、FSH及び/又はLHを産生するように遺伝子工学的に設計されている。
【００２９】
本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの別の態様において、前記オルガノイドは視床下部ニューロン及び/又は下垂体細胞を含む。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの別の態様において、前記オルガノイドはイン・ビトロ培養において測定可能な量の抗利尿ホルモン(ADH)を産生する。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの別の態様において、前記オルガノイドはイン・ビトロ培養において測定可能な量のオキシトシンを産生する。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの別の態様において、前記オルガノイドはADH及び/若しくはオキシトシンのいずれか又は両方を産生する細胞を含む。特別な態様において、前記オルガノイドはADH及び/又はオキシトシンのいずれか又は両方を産生するように遺伝子工学的に設計されている細胞を含む。
【００３０】
特別な態様において、本発明で開示されたいずれかのオルガノイドは内皮性血管形成細胞を含む。
【００３１】
本発明のオルガノイドは、甲状腺特異的細胞、及び/又は、甲状腺特異的機能を達成する細胞を含むことができる。ある態様において、本発明で開示されたいずれかのオルガノイドは甲状腺上皮細胞を含む。ある態様において、本発明で開示されたいずれかのオルガノイドは甲状腺傍濾胞細胞を含む。ある態様において、本発明で開示されたいずれかのオルガノイドは、チログロブリン産生細胞を含む。ある態様において、本発明で開示されたいずれかのオルガノイドは、2又はそれ以上の甲状腺上皮細胞、甲状腺傍濾胞細胞、及びチログロブリン産生細胞を含む。特別な態様において、本発明で開示されたいずれかのオルガノイドは内皮性血管形成細胞を含む。他の特別な態様において、前記オルガノイドは複数の脈管、例えば血管及び/又はリンパ管を含む。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドのある態様において、前記オルガノイドはイン・ビトロ培養において測定可能な量のチロキシン(T4)を産生する。他の本発明で開示されたいずれかのオルガノイドのある態様において、前記オルガノイドはイン・ビトロ培養において測定可能な量のトリヨードチロニン(T3)を産生する。他の本発明で開示されたいずれかのオルガノイドのある態様において、前記オルガノイドは測定可能な量のカルシトニンを産生する。他の本発明で開示されたいずれかのオルガノイドのある態様において、前記オルガノイドは1又はそれ以上のT3、T4及び/又はカルシトニンを産生する細胞を含む。更に特別な態様において、前記オルガノイドは、1以上のT3、T4及び/又はカルシトニンを産生するように遺伝子工学的に設計されている細胞を含む。
【００３２】
本発明のオルガノイドは、副甲状腺特異的細胞、又は副甲状腺特異的機能を達成する細胞を含むことができる。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドのある態様において、前記オルガノイドは副甲状腺主細胞を含む。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの別の態様において、前記オルガノイドは副甲状腺好酸性細胞を含む。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの別の態様において、前記オルガノイドは、副甲状腺主細胞及び副甲状腺好酸性細胞の両方を含む。ある態様において、本発明で開示されたいずれかのオルガノイドは内皮性血管形成細胞を含む。他の特別な態様において、前記オルガノイドは、複数の脈管、例えば、血管及び/又はリンパ管を含む。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドのある態様において、前記オルガノイドはイン・ビトロ培養において測定可能な量の副甲状腺ホルモン(PTH)を産生する。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの別の態様において、前記オルガノイドはPTHを産生する細胞を含む。更に特別な態様において、前記オルガノイドは、前記PTHを産生するように遺伝子工学的に設計されている細胞を含む。
【００３３】
本発明のオルガノイドは、副腎腺特異的細胞、及び/又は副腎腺特異的機能を達成する細胞を含むことができる。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドのある態様において、前記オルガノイドは副腎腺球状帯細胞を含む。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの別の態様において、前記オルガノイドは副腎腺束状帯細胞を含む。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの別の態様において、前記オルガノイドは副腎腺網状帯細胞を含む。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの別の態様において、前記オルガノイドは副腎腺クロム親和性細胞を含む。ある態様において、本発明で開示されたいずれかのオルガノイドは内皮性血管形成細胞を含む。他の特別な態様において、前記オルガノイドは複数の脈管、例えば、血管及び/又はリンパ管を含む。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドのある態様において、前記オルガノイドはイン・ビトロ培養において測定可能な量のアルドステロンを産生する。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの別の態様において、前記オルガノイドはイン・ビトロ培養において測定可能な量の18-ヒドロキシ-11-デオキシコルチコステロンを産生する。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの別の態様において、前記オルガノイドはイン・ビトロ培養において測定可能な量のフルドロコルチゾンを産生する。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの別の態様において、前記オルガノイドは測定可能な量のコルチゾールを産生する。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの別の態様において、前記オルガノイドは測定可能な量の非コルチゾール糖質コルチコイドを産生する。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの別の態様において、前記オルガノイドは測定可能な量のエピネフリンを産生する。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの別の態様において、前記オルガノイドは測定可能な量のアドレノステロンを産生する。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの別の態様において、前記オルガノイドは測定可能な量のデヒドロエピアンドロステロンを産生する。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの別の態様において、前記オルガノイドは、1又はそれ以上の、アルドステロン、18-ヒドロキシ-11-デオキシコルチコステロン、コルチゾール、フルドロコルチゾン、非コルチゾール糖質コルチコイド、エピネフリン、アドレノステロン、及び/又はデヒドロエピアンドロステロンを産生する細胞を含む。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの別の態様において、前記オルガノイドは、2又はそれ以上の、アルドステロン、18-ヒドロキシ-11-デオキシコルチコステロン、コルチゾール、フルドロコルチゾン、非コルチゾール糖質コルチコイド、エピネフリン、アドレノステロン、及び/又はデヒドロエピアンドロステロンを産生する。更に特別な態様において、前記オルガノイドは1以上の、アルドステロン、18-ヒドロキシ-11-デオキシコルチコステロン、コルチゾール、フルドロコルチゾン、非コルチゾール糖質コルチコイド、エピネフリン、アドレノステロン、及び/又はデヒドロエピアンドロステロンを産生するように遺伝子工学的に設計されている細胞を含む。
【００３４】
本発明のオルガノイドは、肝臓特異的細胞、又は、1又はそれ以上の肝臓特異的機能を達成する細胞を含むことができる。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドのある態様において、前記オルガノイドは肝細胞を含む。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの種々の態様において、前記オルガノイドは、測定可能な量の1又はそれ以上の、凝固第I因子(フィブリノーゲン)、凝固第II因子(プロトロンビン)、凝固第V因子(第V因子)、凝固第VII因子(プロコンベルチン)、凝固第IX因子(クリスマス因子)、凝固第X因子(スチュアート・ブラウアー因子、プロトロンビナーゼ)、凝固第XI因子(血漿トロンボプラスチン前駆体)、若しくはタンパク質C(オートプロトロンビンIIA、血液凝固第XIV因子)、タンパク質S及び/又はアンチトロンビンを産生する。種々の本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの別の態様において、前記オルガノイドは、アミノ酸、ラクテート、グリセロール又はグリコーゲンから、検出可能な量のグルコースを産生する。他の態様において、前記オルガノイドは検出可能な量のインスリン様成長因子(IGF-1)又はトロンボポエチンを産生する。他の態様において、前記オルガノイドは胆汁を産生する。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドのある態様において、前記オルガノイドは1以上の凝固第I因子(フィブリノーゲン)、凝固第II因子(プロトロンビン)、凝固第V因子(第V因子)、凝固第VII因子(プロコンベルチン)、凝固第IX因子(クリスマス因子)、凝固第X因子(スチュアート・ブラウアー因子、プロトロンビナーゼ)、凝固第XI因子(血漿トロンボプラスチン前駆体)、若しくはタンパク質C(オートプロトロンビンIIA、血液凝固第XIV因子)、タンパク質S、アンチトロンビン、IGF-1又はトロンボポエチンを産生する細胞を含む。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドのある態様において、前記オルガノイドは肝管内皮細胞を含む。特別な態様において、前記肝管内皮細胞は、1又はそれ以上の脈管を特定するために、前記オルガノイド内に配置される。更に特別な態様において、前記肝細胞は前記脈管に沿って実質的に平行に配置される。
【００３５】
本発明で提供されるオルガノイドは、膵臓細胞、又は、少なくとも1の膵臓細胞特異的機能を達成する細胞を含むことができる。ある態様において、前記膵臓細胞は膵臓α細胞である。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドのある態様において、前記オルガノイドは膵臓β細胞を含む。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの別の態様において、前記オルガノイドは膵臓デルタ細胞を含む。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの別の態様において、前記オルガノイドは膵臓ポリペプチド(PP)細胞を含む。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの別の態様において、前記オルガノイドは膵臓イプシロン細胞を含む。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの別の態様において、前記オルガノイドは、2又はそれ以上の、膵臓α細胞、膵臓β細胞、膵臓デルタ細胞、膵臓ポリペプチド(PP)細胞、及び/又は膵臓イプシロン細胞を含む。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの別の態様において、前記オルガノイドは検出可能な量のグルカゴンを産生する。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの別の態様において、前記オルガノイドは検出可能な量のインスリンを産生する。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの別の態様において、前記オルガノイドは検出可能な量のアミリンを産生する。更に特別な態様において、前記オルガノイドは、検出可能な量のインスリン及び検出可能な量のアミリンを産生する。更に特別な態様において、前記インスリン及び前記アミリンを約50:1〜約200:1の割合で産生する。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの別の態様において、前記オルガノイドは検出可能な量のソマトスタチンを産生する。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの別の態様において、前記オルガノイドは検出可能な量のグレリン(grehlin)を産生する。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの別の態様において、前記オルガノイドは検出可能な量の膵臓ポリペプチドを産生する。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの別の態様において、前記オルガノイドは、検出可能な量の1又はそれ以上のインスリン、グルカゴン、アミリン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド、及び/又はグレリンを産生する細胞を含む。
【００３６】
別の態様において、本発明では、個体、例えば、臓器器官又は組織の1又はそれ以上の生体分子又は生理的機能における欠乏(deficiency)に悩んでいる個体、の治療方法において、本発明で提供されるオルガノイドを使用する方法が提供される。ある態様においては、例えば、本発明では、ヒト成長ホルモン(hGH)が必要な個体の治療方法であって、前記個体へ、例えば治療的有効量の、hGHを産生するオルガノイド、又はhGHを産生する細胞を含むオルガノイドを投与するステップを含む治療方法が提供される。他のある態様において、本発明では、成長ホルモン(STH)が必要な個体の治療方法であって、前記個体へ、例えば治療的有効量の、STHを産生するオルガノイド、又はSTHを産生する細胞を含むオルガノイドを投与するステップを含む治療方法が提供される。
【００３７】
別の態様において、本発明では、プロラクチン(PRL)が必要な個体の治療方法であって、前記個体へ、例えば治療的有効量の、PRLを産生するオルガノイド、又はPRLを産生する細胞を含むオルガノイドを投与するステップを含む治療方法が提供される。特別な態様において、前記個体は、1又はそれ以上の、代謝症候群、動脈性勃起不全、早漏、乏精子症、精子無力症、精嚢の機能低下、又は性腺機能低下症を患っている。
【００３８】
別の態様において、本発明では、副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)が必要な個体の治療方法であって、前記個体へ、例えば治療的有効量の、ACTHを産生するオルガノイド、又はACTHを産生する細胞を含むオルガノイドを投与するステップを含む治療方法が提供される。特別な態様において、前記個体はアジソン病を患っている。
【００３９】
別の態様において、本発明では、メラニン形成細胞刺激ホルモン(MSH)が必要な個体の治療方法であって、前記個体へ、例えば治療的有効量の、MSHを産生するオルガノイド、又はMSHを産生する細胞を含むオルガノイドを投与するステップを含む治療方法が提供される。特別な態様において、前記個体はアルツハイマー病を患っている。
【００４０】
別の態様において、本発明では、甲状腺刺激ホルモン(TSH)が必要な個体の治療方法であって、前記個体へ、例えば治療的有効量の、TSHを産生するオルガノイド、又はTSHを産生する細胞を含むオルガノイドを投与するステップを含む治療方法が提供される。特別な態様において、前記個体は、クレチン病を患っているか明らかに発症している
【００４１】
別の態様において、本発明では、卵胞刺激ホルモン(FSH)が必要な個体の治療方法であって、前記個体へ、例えば治療的有効量の、FSHを産生するオルガノイド、又はFSHを産生する細胞を含むオルガノイドを投与するステップを含む治療方法が提供される。特別な態様において、前記個体は、生殖不能(不妊)症又は無精子症を患っているか明らかに発症している
【００４２】
別の態様において、本発明では、黄体形成ホルモン(LH)が必要な個体の治療方法であって、前記個体へ、例えば治療的有効量の、LHを産生するオルガノイド、又はLHを産生する細胞を含むオルガノイドを投与するステップを含む治療方法が提供される。特別な態様において、前記個体は、低テストステロン、精子数減少症又は生殖不能(不妊)症を患っているか明らかに発症している。
【００４３】
更に、本発明では、抗利尿ホルモン(ADH)が必要な個体の治療方法であって、前記個体へ、例えば治療的有効量の、ADHを産生するオルガノイド、又はADHを産生する細胞を含むオルガノイドを投与するステップを含む治療方法が提供される。特別な態様において、前記個体は、視床下部性尿崩症を患っている。
【００４４】
別の態様において、本発明では、オキシトシンが必要な個体の治療方法であって、前記個体へ、例えば治療的有効量の、オキシトシンを産生するオルガノイド、又はオキシトシンを産生する細胞を含むオルガノイドを投与するステップを含む治療方法が提供される。
【００４５】
別の態様において、本発明では、チロキシン(T4)が必要な個体の治療方法であって、前記個体へ、例えば治療的有効量の、T4を産生するオルガノイド、又はT4を産生する細胞を含むオルガノイドを投与するステップを含む治療方法が提供される。特別な態様において、前記個体は、精神遅滞、小人症、低筋力(weakness)、嗜眠、低温不耐性、又は満月様顔貌を患っているか明らかに発症している。
【００４６】
別の態様において、本発明では、トリヨードチロニン(T3)が必要な個体の治療方法であって、前記個体へ、例えば治療的有効量の、T3を産生するオルガノイド、又はT3を産生する細胞を含むオルガノイドを投与するステップを含む治療方法が提供される。特別な態様において、前記個体は心臓病を患っている。更に特別な態様において、前記個体は前記オルガノイド投与前に、T3の血清濃度が3.1pmol/L未満である。
【００４７】
別の態様において、本発明では、カルシトニンが必要な個体の治療方法であって、前記個体へ、例えば治療的有効量の、カルシトニンを産生するオルガノイド、又はカルシトニンを産生する細胞を含むオルガノイドを投与するステップを含む治療方法が提供される。特別な態様において、前記個体は、骨粗鬆症又は慢性自己免疫甲状腺機能低下症を患っている。
【００４８】
更に、本発明では、副甲状腺ホルモン(PTH)が必要な個体の治療方法であって、前記個体へ、例えば治療的有効量の、PTHを産生するオルガノイド、又はPTHを産生する細胞を含むオルガノイドを投与するステップを含む治療方法が提供される。
【００４９】
別の態様において、更に、本発明では、アルドステロンが必要な個体の治療方法であって、前記個体へ、例えば治療的有効量の、アルドステロンを産生するオルガノイド、又はアルドステロンを産生する細胞を含むオルガノイドを投与するステップを含む治療方法が提供される。特別な態様において、前記個体は、特発性低アルドステロン症、高レニン血症性低アルドステロン症、又は低レニン血症性低アルドステロン症を患っている。別の特別な態様において、前記個体は、慢性腎不全を患っている。
【００５０】
別の態様において、本発明では、18-ヒドロキシ-11-デオキシコルチコステロンが必要な個体の治療方法であって、前記個体へ、例えば治療的有効量の、18-ヒドロキシ-11-デオキシコルチコステロンを産生するオルガノイド、又は18-ヒドロキシ-11-デオキシコルチコステロンを産生する細胞を含むオルガノイドを投与するステップを含む治療方法が提供される。
【００５１】
更に、本発明では、フルドロコルチゾンが必要な個体の治療方法であって、前記個体へ、例えば治療的有効量の、フルドロコルチゾンを産生するオルガノイド、又はフルドロコルチゾンを産生する細胞を含むオルガノイドを投与するステップを含む治療方法が提供される。
【００５２】
別の態様において、更に、本発明では、コルチゾールが必要な個体の治療方法であって、前記個体へ、例えば治療的有効量の、コルチゾールを産生するオルガノイド、又はコルチゾールを産生する細胞を含むオルガノイドを投与するステップを含む治療方法が提供される。特別な態様において、前記個体は、急性副腎不全、アジソン病、又は低血糖症を患っている。
【００５３】
別の態様において、本発明では、非コルチゾール糖質コルチコイドが必要な個体の治療方法であって、前記個体へ、例えば治療的有効量の、非コルチゾール糖質コルチコイドを産生するオルガノイド、又は非コルチゾール糖質コルチコイドを産生する細胞を含むオルガノイドを投与するステップを含む治療方法が提供される。
【００５４】
更に、本発明では、エピネフリンが必要な個体の治療方法であって、前記個体へ、例えば治療的有効量の、エピネフリンを産生するオルガノイド、又はエピネフリンを産生する細胞を含むオルガノイドを投与するステップを含む治療方法が提供される。
【００５５】
別の態様において、本発明では、アドレノステロンが必要な個体の治療方法であって、前記個体へ、例えば治療的有効量の、アドレノステロンを産生するオルガノイド、又はアドレノステロンを産生する細胞を含むオルガノイドを投与するステップを含む治療方法が提供される。
【００５６】
別の態様において、本発明では、デヒドロエピアンドロステロンが必要な個体の治療方法であって、前記個体へ、複数の、例えば、治療的有効量の、デヒドロエピアンドロステロンを産生するオルガノイド、又はデヒドロエピアンドロステロンを産生する細胞を含むオルガノイドを投与するステップを含む治療方法が提供される。
【００５７】
別の態様において、本発明では、ある化合物が必要な個体の治療方法であって、前記個体へ、例えば、治療的有効量の、該化合物を産生するオルガノイド、又は該化合物を産生する細胞を含むオルガノイドを投与するステップを含み、前記化合物は、凝固第I因子(フィブリノーゲン)、凝固第II因子(プロトロンビン)、凝固第V因子(第V因子)、凝固第VII因子(プロコンベルチン)、凝固第IX因子(クリスマス因子)、凝固第X因子(スチュアート・ブラウアー因子、プロトロンビナーゼ)、凝固第XI因子(血漿トロンボプラスチン前駆体)、若しくはタンパク質C(オートプロトロンビンIIA、血液凝固第XIV因子)、タンパク質S及び/又はアンチトロンビンである、治療方法が提供される。
【００５８】
別の態様において、本発明では、IGF-1が必要な個体の治療方法であって、前記個体へ、例えば治療的有効量の、IGF-1を産生するオルガノイド、又はIGF-1を産生する細胞を含むオルガノイドを投与するステップを含む治療方法が提供される。
【００５９】
別の態様において、本発明では、トロンボポエチンが必要な個体の治療方法であって、前記個体へ、例えば治療的有効量の、トロンボポエチンを産生するオルガノイド、又はトロンボポエチンを産生する細胞を含むオルガノイドを投与するステップを含む治療方法が提供される。
【００６０】
別の態様において、本発明では、グルカゴンが必要な個体の治療方法であって、前記個体へ、例えば治療的有効量の、グルカゴンを産生するオルガノイド、又はグルカゴンを産生する細胞を含むオルガノイドを投与するステップを含む治療方法が提供される。
【００６１】
別の態様において、本発明では、インスリンが必要な個体の治療方法であって、前記個体へ、例えば治療的有効量の、インスリンを産生するオルガノイド、又はインスリンを産生する細胞を含むオルガノイドを投与するステップを含む治療方法が提供される。特別な態様において、前記個体は真性糖尿病を患っている。
【００６２】
別の態様において、本発明では、アミリンが必要な個体の治療方法であって、前記個体へ、例えば治療的有効量の、アミリンを産生するオルガノイド、又はアミリンを産生する細胞を含むオルガノイドを投与するステップを含む治療方法が提供される。
【００６３】
別の態様において、本発明では、グレリン(grehlin)が必要な個体の治療方法であって、前記個体へ、例えば治療的有効量の、グレリンを産生するオルガノイド、又はグレリンを産生する細胞を含むオルガノイドを投与するステップを含む治療方法が提供される。
【００６４】
更に、本発明では、膵臓ポリペプチドが必要な個体の治療方法であって、前記個体へ、例えば治療的有効量の、膵臓ポリペプチドを産生するオルガノイド、又は膵臓ポリペプチドを産生する細胞を含むオルガノイドを投与するステップを含む治療方法が提供される。
【００６５】
本明細書における「オルガノイド」は、少なくとも1の、細胞型及び胎盤の脈管足場又はその部分の組み合わせを意味し、その組み合わせは、組織、腺又は臓器器官の少なくとも1の生理的機能を達成する。ある態様において、本発明のオルガノイドの胎盤の脈管足場は、脱細胞化ヒト胎盤の脈管足場(DHPVS)を含む。ある態様において、本発明のオルガノイドは、完全なDHPVS、即ち、ここに記載された方法に従い脱細胞化されている胎盤の脈管構造を含む完全なヒト胎盤を含む。ある態様において、本発明のオルガノイドは、胎盤の部分、例えばDHPVSの一部を含む。特別な態様において、本発明のオルガノイドは、例えばDHPVSの部分である、胎盤の部分を含み、前記部分は、脈管構造、例えば明らかな脈管領域を含む胎盤の基底脱落膜の剥離物である1又はそれ以上の胎盤葉(cotyledon)、を含む、1又はそれ以上の領域の胎盤を含む。別の特別な態様において、本発明のオルガノイドは、例えばDHPVSの部分である、胎盤の部分を含み、前記部分は、ここに記載された方法に従い胎盤の残部から取り出され、胎盤の残部からの取り出しに先立ってかその後に脱細胞化されている胎盤の部分を含む。例えば、該部分は、胎盤(例えばDHPVS)から取り出された(例えば、切除されるか打ち抜かれた)所望のサイズ及び形状(例えば立方体)のものである。
【００６６】
ある態様において、本発明のオルガノイドの調製方法は、1以上の細胞型の脱細胞化胎盤の脈管足場上又は内へのバイオプリンティングを含む。本明細書における「バイオプリンティング」は、一般的に、生細胞等の材料及び、任意で他の構成要素(例えば、細胞間マトリックス、合成マトリックス)を、表面上に、インクジェットプリント技術等の標準的又は修正されたプリント技術を使用する沈着(deposition)をいう。表面上への細胞沈着及び細胞バイオプリンティングの基本的方法は、ヒドロゲルと組み合わせた細胞を含み、Warrenらの米国特許6986739、Bolandらの米国特許7051654、Yooらの米国特許出願2009/0208466及びXuらの米国特許出願2009/0208577に記載されており、これら文献の開示は参照により完全に本明細書へ組み込まれる。更に、本明細書で提供されるオルガノイドの製造に有用なバイオプリンターは、例えばEnvisiontec社(Gladbeck、ドイツ国)製3D-Bioplotter(登録商標)、及びOrganovo社(San Diego、CA)製NovoGen MMXバイオプリンター(登録商標)等市販されている。
3.1図面の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図1は、脱細胞化ヒト胎盤の脈管足場上で培養された293/GFP細胞の増殖(DHPVS、Pl＋細胞)を、コントロール培地のその細胞の増殖(細胞)と比較した図を示す。
【００６８】
【図２】図2は、DHPVS上の胎盤幹細胞の増殖(マトリックス有り)を、コントロール培地のその細胞の増殖(マトリックス無し)と比較した図を示す。
【００６９】
【図３】図3は、DHPVS内の肝細胞細胞の経時的増殖を示す。
【００７０】
【図４】図4は、アルブミン分泌アッセイの結果を示す。DHPVS内で培養された肝細胞細胞によるアルブミンの分泌(T＋C)を、培地単独(Med)、DHPVS単独(組織T)、及び培養内で増殖された肝細胞細胞(細胞C)でのアルブミンレベルと比較した。
【００７１】
【図５】図5は、様々な角度で、様々な孔径の足場が生成されるようにバイオプリントされたポリカプロラクトン(PCL)を含む足場を示す。
【００７２】
【図６】図6は、細胞間マトリックス(ECM)が足場の両側に適用され、次に脱水されたその上にバイオプリントされた足場の複数の図を示す。
【００７３】
【図７】図7は、細胞増殖アッセイの結果を示す。バイオプリントされたPCL及び脱水されたECMを含むハイブリッド足場上で培養された胎盤幹細胞は、8日培養期間中増殖する。
【００７４】
【図８】図8は、細胞生存度アッセイの結果を示す。バイオプリントされたPCL及び脱水されたECMを含むハイブリッド足場上で培養された胎盤幹細胞は、8日培養期間中増殖して、生存を維持した。
【００７５】
【図９】図9は、PCL、ECM、及び胎盤幹細胞を含み、そのそれぞれは、層(PCL及びECM/細胞の層)としてバイオプリントされている損傷がない三次元ハイブリッド足場を示す。
【００７６】
【図１０】図10は、胎盤幹細胞が、7日培養期間中、三次元バイオプリントされた足場内に分散することを示す。
【００７７】
【図１１】図11は、細胞生存度アッセイの結果を示す。ECM及びPCLにバイオプリントされて三次元ハイブリッド足場を形成する胎盤幹細胞は、7日培養期間中、増殖して生存を維持する。
【００７８】
【図１２】図12は、ECM及びPCLにバイオプリントされて三次元ハイブリッド足場を形成する幹細胞が、7日培養期間中、ハイブリッド足場内のECM内に広がることを示す。
【００７９】
【図１３】図13は、細胞増殖アッセイの結果を示す。PCL、ECM、及び胎盤幹細胞のバイオプリンティングにより調製された三次元ハイブリッド足場内で培養された胎盤幹細胞は、7日培養期間中増殖する。
【００８０】
【図１４】図14は、脱細胞化胎盤の脈管足場の存在下又は非存在下での共培養後の、及び脱細胞化胎盤の脈管足場の存在下又は非存在下での単独培養後の、TT細胞及びHUVECの生存度を示す。
【００８１】
【図１５】図15は、脱細胞化胎盤の脈管足場の存在下又は非存在下でのHUVECとの共培養後の、及び脱細胞化胎盤の脈管足場の存在下又は非存在下で単独培養後の、TT細胞によるカルシトニン産生を示す。脱細胞化胎盤の脈管足場の存在下又は非存在下で単独培養されたHUVECによるカルシトニン産生もまた示された。
【００８２】
【図１６】図16は、脱細胞化胎盤の脈管足場の存在下又は非存在下で共培養後の、及び脱細胞化胎盤の脈管足場の存在下又は非存在下で単独培養後の、TT細胞及びPDAC(登録商標)の生存度を示す。
【００８３】
【図１７】図17は、脱細胞化胎盤の脈管足場の存在下又は非存在下でPDAC(登録商標)と共培養後の、及び脱細胞化胎盤の脈管足場の存在下又は非存在下で単独培養後の、TT細胞によるカルシトニン産生の時間的経過を示す。脱細胞化胎盤の脈管足場の存在下又は非存在下で単独培養されたPDAC(登録商標)によるカルシトニン産生の時間的経過もまた示される。
【００８４】
【図１８】図18は、脱細胞化胎盤の脈管足場の存在下又は非存在下でTT細胞との共培養後の、及び脱細胞化胎盤の脈管足場の存在下又は非存在下で単独培養後の、PDAC(登録商標)によるHGF産生の時間的経過を示す。脱細胞化胎盤の脈管足場の存在下又は非存在下で単独培養された、TT細胞によるHGF産生の時間的経過もまた示された。
【００８５】
【図１９】図19は、脱細胞化胎盤の脈管足場の脈管構造内への注入後のHCT116細胞の分散パターンを示す。
【００８６】
【図２０】図20は、含脂肪細胞分化培地(adipocyte differentiation medium)の存在下又は非存在下であって、単独又は脱細胞化胎盤の脈管足場上で培養されたPDAC(登録商標)によるアディポネクチン産生を示す。
【００８７】
【図２１】図21は、脱細胞化胎盤の脈管足場上で培養されたHepaRGの代謝を示す。(A)PDAC(登録商標)単独又は脱細胞化胎盤の脈管足場上での培養の時間的経過に続く培養培地内のグルコース及びラクテートレベル。(B-D)単独又は脱細胞化胎盤の脈管足場上で培養された、培養の第3週、第2週、及び第4週それぞれでのPDAC(登録商標)のΔL/ΔG値。
【発明を実施するための形態】
【００８８】
4詳細な説明
本発明は、1以上の型の細胞を含み、かつ、脱細胞化胎盤の脈管足場を含む、オルガノイドを提供するものであり、前記オルガノイドは、臓器又は臓器由来組織の少なくとも1の機能を達成し、前記臓器又は臓器由来組織の少なくとも1の機能は、該臓器又は組織由来の少なくとも1の細胞型に特徴的な、タンパク質、成長増殖因子、サイトカイン、インターロイキン、又は小分子を産生することであり、前記脱細胞化胎盤の脈管(vascular)足場は、実質的に損傷がない胎盤の脈管構造マトリックスを含む、オルガノイドを提供するが、その場合、胎盤からマトリックスが得られ、胎盤の脈管構造は、脱細胞処理及びその次に続くオルガノイドの製造中で実質的に保存される。ある態様において、オルガノイドが完成すると、血液又は他の栄養液は前記胎盤の脈管構造を通過する。
【００８９】
4.1胎盤取得方法
一般的に、ヒト胎盤は正常な出産後の娩出後直ぐに回収されるか、又は帝王切開後に回収される。好ましい態様においては、胎盤は、インフォームドコンセント後であって、患者の完全で胎盤に関連する病理記録が得られた後、患者から回収される。好ましくは、病理記録は分娩後も継続される。このような病理記録は、胎盤やそれから採取された幹細胞の次の使用に整合するように使用できる。例えば、ヒト胎盤幹細胞は、病理記録に照らして、胎盤に関連する幼児、又は幼児の両親、兄弟姉妹若しくは他の親戚のための個別化医療に使用できる。
【００９０】
臍帯血及び胎盤由来血液は除去されて、他の目的に使用できるが廃棄されてもよい。ある態様において、分娩後、胎盤中の臍帯血が回収される。胎盤は、従来の臍帯血回収プロセスにかけられてもよい。典型的には、針またはカニューレを用い、重力の助けを受けて、胎盤を放血させる(参照、例えばAndersonの米国特許5372581、Hesselらの米国特許5415665)。針またはカニューレは、通常、臍静脈中に配置され、胎盤は、胎盤からの臍帯血の排出を助けるために優しくマッサージされてもよい。そのような臍帯血回収は、例えば、LifeBank USA社(Cedar Knolls、N.J.)により商業的に行われている。好ましくは、胎盤は、臍帯血回収中の組織破壊を最小限にするために更なる操作なしに重力排出される
【００９１】
典型的には、胎盤は、例えば、灌流または組織解離による、臍帯血の回収及び幹細胞の収集のために、分娩室または出産室から別の場所、例えば、実験室へ輸送される。胎盤は、好ましくは、例えば、無菌のジプロック(商標)プラスチックバッグ内に近位臍帯をクランプして胎盤を置き、その後、そのプラスチックバッグを断熱容器内に置くことによって、（胎盤の温度を約20〜約28℃の間で維持する）無菌の断熱輸送装置内で輸送される。別の態様において、胎盤は、実質的には、米国特許7147626に記載されているような臍帯血収集キット中で輸送される。好ましくは、胎盤は、分娩から4〜24時間後に、実験室へ送達される。ある態様において、近位臍帯が、臍帯血回収前に、好ましくは、胎盤ディスクへの挿入部から4〜5cm(センチメートル)内の所でクランプされる。他の態様において、近位臍帯は、臍帯血回収後であるが、胎盤の更なる処理の前に、クランプされる。
【００９２】
胎盤は、無菌条件下で、室温又は5〜25℃の温度で保存できる。胎盤は、残留臍帯血を取り出すために胎盤を灌流する前に、4〜24時間、最長48時間まで、又は48時間より長い期間で保存してもよい。ある態様においては、胎盤は、娩出後約0時間から約2時間までの間に採取される。胎盤は、好ましくは5℃〜25℃の温度で抗凝固溶液中で保存される。適切な抗凝固溶液は当分野で公知の、例えばヘパリン又はワルファリンナトリウム溶液である。好ましい態様においては、抗凝固溶液は、ヘパリン溶液(例えば、1:1000溶液中1%w/w)を含む。放血した胎盤は、好ましくは、胎盤幹細胞を収集する前に、最長36時間保存される。
【００９３】
胎盤は又、例えば、胎盤幹細胞及び/又は胎盤由来潅流液細胞を収集するために、例えば米国特許7468276に記載のように潅流されてもよく、この文献の開示は参照により完全に本明細書へ組み込まれる。
【００９４】
ある態様において、本発明のオルガノイドは、上記記載の方法に従い得られた脱細胞化胎盤の部分のみを含む。例えば、胎盤は、胎盤の部分が更に処理(例えば、ここに記載された脱細胞化等の処理)される前に、所望の部分を得るために、例えば所望の胎盤由来循環系ユニット(例えば、胎盤葉)を得るために、操作されてもよい。ある態様において、胎盤の部分のみが本発明のオルガノイドの産生に使用される場合、完全な胎盤は目的に応じて処理(例えば、下記脱細胞化)されて、次に、胎盤の使用される特定部分が単離される(例えば、処理された胎盤全体から胎盤の目的部分を切除又は打ち抜く)。
【００９５】
4.2胎盤の脱細胞方法
胎盤が、上記のとおり用意され、任意で潅流されると、それは、胎盤の脈管構造の本来の構造を保存するように、例えば胎盤の脈管構造を実質的に損傷なく残すように脱細胞化される。本明細書における「実質的に損傷がない」は、脱細胞処理後に残る胎盤の脈管構造が、脱細胞処理前の胎盤の脈管構造の、全て又はほとんどの全体構造を維持していることを意味する。ある態様において、胎盤の脈管構造は、胎盤の脈管構造を再生するために、例えば脈管内皮細胞又は他の細胞で再播種されることができる。
【００９６】
胎盤組織は、例えば、移植組織に適合性のある抗菌剤、抗真菌剤及び/又は滅菌剤等の抗微生物剤を含有する無菌の緩衝栄養液内でのインキュベーションにより滅菌されてもよい。滅菌された胎盤組織は、次に、後の更なる処理のために低温保存されてもよく、このプロセスの組織マトリックス又は他の組織生成物の後の低温保存を含むこのプロセスの次の工程に従い、直ちに更に処理されても良い。
【００９７】
物理的、化学的、及び生化学的方法を含む、組織及び臓器内の本来の細胞の生存度の低減手段はいくつか知られている。例えば、本明細書に引用して組み込まれる米国特許5192312(Orton)を参照されたい。これらの方法は、ここに記載されたプロセスに従い適用できる。しかし、好ましく採用される脱細胞処理技術は、胎盤組織の解剖学的構造の全体的破壊を生じず、その構成要素の生体力学的性質を実質的に変化させず、好ましくは胎盤の脈管構造を実質的に損傷なく維持する。ある態様において、脱細胞化組織マトリックスを調製するための胎盤組織の処理は、マトリックスが、次に、レシピエントに同種異系又は自己由来である細胞で再構築(repopulate)されることを軽減するような細胞傷害性環境を残さない。本明細書において、レシピエントへ「同種異系な」細胞及び組織は、胎盤の脈管足場のレシピエントと同じ種のドナーが源となるものであるか、それ由来のものであり、「自己由来の」細胞又は組織は、胎盤の脈管足場のレシピエントが源となるものであるか、それ由来のものである。
【００９８】
物理的力、例えば細胞内氷晶の形成は、移植組織の脱細胞に使用できる。このように、ある態様においては、胎盤は脱細胞処理の一部として最初に低温保存される。例えば、胎盤組織の蒸気相凍結(vapor phase freezing)(低い温度下り勾配率)が実施できる。任意で、胎盤組織は、1以上の凍結防止剤の存在下で低温保存される。コロイド形成材料が、組織内の氷晶形成パターンを変えるために、凍結解凍サイクル中に添加されてもよい。例えば、ポリビニルピロリドン(10%w/v)及び透析されたヒドロキシエチルデンプン(10%w/v)を標準的低温保存溶液(DMEM、10%DMSO、10%胎児ウシ血清)へ添加し、細胞外氷晶形成を減少させ、同時に細胞内氷晶の形成は維持することができる。
【００９９】
ある態様において、様々な酵素的又は他の化学的処理が、移植組織又は臓器から本来の生細胞を除去するために使用できる。例えば、細胞を、トリプシン等のプロテアーゼへ過度に暴露すると、細胞死に至る。
【０１００】
他のある態様において、胎盤組織は、洗浄剤又はその組み合わせを使用して脱細胞化される。例えば、TritonX-100等の非イオン性洗浄剤、及びドデシル硫酸ナトリウム等のアニオン性洗浄剤は、細胞膜を破壊して、組織からの細胞断片の除去を補助する。好ましくは、脱細胞化組織マトリックス中に残存する洗浄剤は、後に組織マトリックスが生細胞で再構築されることを妨害しないように、緩衝液で洗浄する等して除去される。
【０１０１】
胎盤組織の脱細胞処理は、好ましくは、本来の胎盤由来細胞を溶解させるのに有効な溶液の投与により達成される。好ましくは、この溶液は細胞を有効に溶解するように調剤された水性低張溶液又は低イオン強度溶液である。ある態様において、水性低張溶液は、例えば脱イオン水又は水性低張緩衝液である。特別な態様において、水性低張緩衝液は、コラゲナーゼ等のプロテアーゼの活性のためには次善の条件を提供する1以上の添加物であって、細胞溶解の結果として放出され得るものを更に含む。1,10-フェナントロリン及びエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)等の金属イオンキレート剤等の添加物は、多くのタンパク質分解酵素に不都合な環境を生じる。他の態様において、低張溶解溶液が調剤され、溶液中に存在するカルシウム及び/又は亜鉛イオン等の二価のカチオン量を無くすかまたは限定し、その結果、それらイオンに依存するプロテアーゼの活性が低下する。
【０１０２】
好ましくは、低張溶解溶液は、根源的な組織マトリックスをタンパク質分解から保護する一方で、溶液が本来の細胞を最適に分解するように、pH条件、カルシウム及び亜鉛イオンの低減した利用可能性、金属イオンキレート剤の存在並びに、コラゲナーゼに特異的なタンパク質分解阻害剤の使用を選択して調製される。ある態様において、低張溶解溶液は、pH5.5〜8、好ましくはpH7〜8で、カルシウム及び亜鉛イオン無しか実質的に含まず、並びに/又はEDTA等の金属イオンキレート剤を含む、水の緩衝化溶液を含み得る。更に、低張溶解溶液で組織マトリックスを処理する間の温度および時間パラメーターの制御も、プロテアーゼの活性を限定するために採用できる。
【０１０３】
いくつかの態様において、胎盤組織の脱細胞処理は、1以上のヌクレアーゼ、例えば、根源的なコラーゲンマトリックスの分解無しに、細胞代謝、タンパク質産生、および細胞分裂を阻害するのに有効な酵素による組織の処理を含む。本来の細胞DNA及びRNAの消化に使用できるヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼの一方又は両方を含む。脱細胞処理に適切なヌクレアーゼは市販されている。例えば、DNAアーゼI(SIGMA Chemical Company、St. Louis、Mo.)及びRNAアーゼA(SIGMA Chemical Company、St. Louis、Mo.)等の細胞活性を有効に阻害するエキソヌクレアーゼ及びEcoRI(SIGMA Chemical Company、St. Louis、Mo.)及びHind III(SIGMA Chemical Company、St. Louis、Mo.)等の細胞活性を有効に阻害するエンドヌクレアーゼが挙げられる。
【０１０４】
又、選択されるヌクレアーゼは、マグネシウム塩、カルシウム塩等の、ヌクレアーゼの活性に最適なイオンを含む生理学的緩衝溶液に含有されることが好ましい。緩衝化溶液のイオン濃度、処理温度、及び処理の長さは、所望レベルのヌクレアーゼ活性を確実に得るように選択されることが好ましい。緩衝液は、ヌクレアーゼが細胞内部に到達するのを促すように低張であることが好ましい。ある態様において、1以上のヌクレアーゼはDNAアーゼI及びRNAアーゼAを含む。好ましくは、ヌクレアーゼ分解溶液は約0.1μg/mL〜約50μg/mL、又は約10μg/mLのヌクレアーゼDNAアーゼI、及び約0.1μg/mL〜約10μg/mL、好ましくは約1.0μg/mLのRNAアーゼAを含む。胎盤組織は、上述の酵素を、温度約20℃〜38℃、好ましくは約37℃で、例えば約30分間〜6時間適用して脱細胞化できる。
【０１０５】
他の態様において、脱細胞処理溶液は、ホスホリパーゼA及び/又はホスホリパーゼC等の、1以上のホスホリパーゼを例えば緩衝液中に含む。好ましくは、使用されるホスホリパーゼは、組織マトリックスタンパク質へ有害な作用を示さない。ビヒクルの、及びビヒクルの組成物のpHも又、使用のため選択された酵素のpH活性プロファイルに合わせて調整される。更に、酵素が組織に適用される間の温度は、種々の態様において酵素的活性を最適化させるように調整される。
【０１０６】
脱細胞処理に続き、ある態様における組織マトリックスは、細胞タンパク質、細胞脂質、及び細胞核酸、並びに細胞外断片を含む可能性のある細胞断片の除去を確実にするために、洗浄液内で洗浄される。この細胞及び細胞外断片の除去は、移植組織マトリックスが移植されたレシピエントから不都合な免疫応答を誘引する可能性を減少させる。例えば、組織は、洗浄液で1以上の回数洗浄されてもよく、洗浄液は、例えばPBS又はHanks平衡塩溶液(HBSS)でもよい。平衡塩溶液洗浄の組成物、及びそれが移植組織マトリックスへ適用されるための条件は、脱細胞処理プロセス中に使用されるプロテアーゼ又はヌクレアーゼの活性を低下させ又は消滅させるために選択されることができる。特別な態様において、洗浄液は、マグネシウム塩又はカルシウム塩等のマグネシウム又はカルシウムを含まず、洗浄プロセスは約2℃〜42℃、例えば最も好ましくは4℃の温度で行われる。移植組織マトリックスは、例えば平衡塩洗浄液中で1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11又は12日までの間インキュベートしながら、13日以下の日毎に洗浄液を交換する等して、洗浄されることができる。任意で、抗菌剤、抗真菌剤又は滅菌剤又はそれらの組み合わせが、洗浄液中に含有され、周囲環境の病原体による汚染から移植組織マトリックスを保護することができる。洗浄は、胎盤組織を浸漬して弱い攪拌付き又は無しで行うことができる。
【０１０７】
脱細胞化された組織マトリックスは、低温保存により保存できる。組織の低温保存技術は、当分野で公知である。例えばBrockbank、K. G. M.「Basic Principles of Viable Tissue Preservation」を参照されたい。「Transplantation Techniques and Use of Cryopreserved Allograft Cardiac Valves and Vascular Tissue」D. R. Clarke(編)、Adams Publishing Group Ltd.,Boston、pp9-23には、組織及び臓器の低温保存が記載されている。
【０１０８】
低温保存されたか否かによらず、ある態様において組織マトリックスは、同種異系の又は自己由来の細胞の、イン・ビトロでの接着性及び内向き遊走性を増強するように処理され、そして移植組織を再構築するために使用される。
【０１０９】
ある態様において、自己由来の又は同種異系の細胞の脱細胞化胎盤の脈管足場への付着は、胎盤の脈管足場を血清(ヒト又は胎児ウシ、最大結合1%血清)及び/又は精製フィブロネクチンと接触させる等により増加する。接触例としては、その中に脱細胞化胎盤の脈管足場が配置された培養培地内等で、同種異系の又は自己由来の細胞での再構築の準備等が挙げられる。フィブロネクチンの２個のホモログサブユニットはそれぞれ、２個の細胞認識領域を有し、その内の１個はArg-Gly-Asp(RGD)配列を含む。グリコサミノグリカン結合する第２のサイトは、相乗作用的に作用し、RGD配列により仲介されるフィブロネクチン−細胞相互作用を安定化するようである。
【０１１０】
このように、特別な態様において、脱細胞化胎盤の脈管足場を、フィブロネクチン及び、ヘパリン等のグリコサミノグリカンの両方と、フィブロネクチンが胎盤の脈管足場表面へ結合して同種異系の又は自己由来の細胞で再構築するために有効な時間接触させる。フィブロネクチン、及び任意でグリコサミノグリカンは、リン酸ナトリウム/グリセリン/ウシ血清アルブミン及びDulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)(例えばGIBCO)等の、生理学的に許容される緩衝又は培養培地に含有されてもよい。緩衝又は培養培地は好ましくは、生理学的に許容されるpH、例えば約6.8〜7.6に維持される。フィブロネクチンは、ウィルス汚染を制限するために処理されてヒト血液から得ても、商業的な販売元から入手しても良い。フィブロネクチン及び/又は糖タンパク質の濃度は、約1μg/mL〜約100μg/mLの範囲でもよく、例えば約10μg/mLでもよい。フィブロネクチンのヘパリンに対する好ましい重量割合は、約100:1〜約1:100、又は約10:1〜約1:10、例えば10:1のフィブロネクチン:ヘパリン等のグリコサミノグリカンである。
【０１１１】
脱細胞化胎盤の脈管足場は、1以上の組成物と処理等により接触させ、溶液中の物質の濃度勾配に沿って方向運動性の割合を増大させ、例えば細胞走化性を増強してもよい。線維芽細胞細胞に関しては、線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、トランスフォーミング増殖因子-β(TGF-β)、微少線維コラーゲン、コラーゲン断片、及びフィブロネクチンが、走化性である。
【０１１２】
特に好ましい態様においては、胎盤が下記のように脱細胞化される。そこから血液が取り出される、胎盤全体又は胎盤小葉(胎盤葉)等の胎盤組織は、最初に−20℃〜−180℃、例えば約−80℃で、例えば約24時間凍結される。組織は次に約4℃で一晩の間解凍される。解凍された組織は次に、0.1%トリプシンにより室温で2時間〜24時間消化され、25℃〜約37℃で消化された胎盤組織が調製される。この消化工程及び次の工程中、溶液が胎盤の脈管構造内に通される(潅流脱細胞)。消化された組織は次に引き続いて、1%、2%及び3%Triton-X100で24時間、それぞれ室温又は約25℃で処理される。Triton-X100処理の次に、0.1%SDS-PBSで24時間、室温又は約25℃での組織処理が続き、それにより細胞の材料は実質的に除去される。組織は次に、リン酸緩衝食塩水(PBS)で1〜10回交換して充分に洗浄され、次にDNase I(150U/mL)で1時間室温で処理される。それぞれの工程は室温又は約25℃で行われる。最後に、残っている脱細胞化胎盤の脈管足場は、室温又は約25℃でPBS＋1%抗生物質(ペニシリン＋ストレプトマイシン)により再度充分に洗浄され、任意で乾燥され、4℃で保存される。
【０１１３】
脱細胞処理に続き、得られた胎盤の脈管足場は、1以上の、合成ポリマー等の合成マトリックスと組合すことができる。特別な態様において、合成マトリックスは、例えばオルガノイドの製造を容易にするために、胎盤の脈管足場三次元構造を安定化できる。別の特別な態様において、前記合成マトリックスは、ポリマー又は熱可塑性物質を含む。更に特別な態様において、前記合成マトリックスはポリマー又は熱可塑性物質である。更に特別な態様において、前記熱可塑性物質は、ポリカプロラクトン(PCL)、ポリ乳酸、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレン、ポリエステル、ポリ酢酸ビニル、又はポリ塩化ビニルである。他の更に特別な態様において、前記ポリマーは、ポリ塩化ビニリジン(polyvinylidine chloride)、ポリ(o-カルボキシフェノキシ)-p-キシレン)(ポリ(o-CPX))、ポリ(無水ラクチド)(PLAA)、n-イソプロピルアクリルアミド、アクリルアミド、pentエリスリトールジアクリレート、ポリメチルアクリレート、カルボキシメチルセルロース、又はポリ(乳酸-グリコール酸共重合体)(PLGA)である。更に別の特別な態様において、前記ポリマーはポリアクリルアミドである。
【０１１４】
上記態様のいずれかにおいて、胎盤の脈管足場は、前記脱細胞成分及び/又は洗浄成分のいずれかを、胎盤由来動脈及び/又は胎盤由来静脈等の胎盤の脈管構造に通過させることにより、脱細胞化できる。胎盤の脈管構造を通過する潅流方法は、例えば米国特許8057788に記載されており、この文献の開示は参照により完全に本明細書へ組み込まれる。
【０１１５】
4.3マトリックス上への細胞担持方法
細胞は、生理学的に許容されるいずれかの方法により、脱細胞化胎盤の脈管足場上に担持できる。ある態様において、細胞は、液体培養培地、塩溶液又は緩衝溶液等の中で懸濁され、細胞含有液体は胎盤の脈管足場内へ1以上の脈管マトリックスを通じで潅流される。胎盤の脈管足場は又、細胞を含有する液体培養培地、塩溶液又は緩衝溶液内で、複数の細胞が前記胎盤の脈管足場へ付着するために充分な時間の間培養されてもよい。細胞は又、足場の表面上への播種によるか、針又は注入ポンプ等を使用して脈管内へ細胞を注入することにより、胎盤の脈管マトリックス上へ担持できる。ある態様において、細胞は、バイオプリンティングにより、脱細胞化胎盤の脈管足場上へ担持される。
【０１１６】
ある態様において、細胞が脱細胞化胎盤の脈管足場上に担持された後、細胞及び足場は、所望の期間培養される。特別な態様において、細胞及び足場は、ローラーバイオリアクター内で培養される。
【０１１７】
4.4使用される細胞
生理的機能に応じて、オルガノイドは、増加又は交換するために設計される。本発明のオルガノイドは、1以上の関連する細胞型を含むことができる。
【０１１８】
本発明で開示されたいずれかのオルガノイドのある態様において、例えば、1以上の型の細胞は、T細胞、B細胞、樹状細胞、及び/又はナチュラルキラー(NK)細胞等の免疫系細胞を含む。特別な態様において、前記NK細胞は、米国特許出願2009/0252710に記載された胎盤由来NK細胞等の、CD56+CD16-胎盤中間ナチュラルキラー(PiNK)細胞を含むか、そのものである。なお、前記文献の開示は参照により完全に本明細書へ組み込まれる。
【０１１９】
本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの、他のある態様において、1以上の型の細胞は、単離された幹細胞又は前駆細胞であるか、それらを含む。特別な態様において、前記単離された幹細胞又は前駆細胞は、単離された、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系間質細胞、組織プラスチック接着性胎盤幹細胞(PDAC(登録商標))、臍帯幹細胞、羊水幹細胞、羊膜由来接着性細胞(AMDAC)、骨形成性の胎盤接着性細胞(OPAC)、脂肪組織幹細胞、角膜幹細胞、歯髄幹細胞、筋芽細胞、内皮前駆細胞、神経幹細胞、脱落歯由来幹細胞、毛嚢幹細胞、真皮幹細胞、単為生殖由来幹細胞、リプログラムされた幹細胞、羊膜由来接着性細胞、又はサイドポピュレーション幹細胞である。他の特別な態様において、オルガノイド内に含まれる1以上の型の細胞は、単離された造血幹細胞又は造血前駆細胞であるか、それらを含む。他の特別な態様において、オルガノイド内に含まれる1以上の型の細胞は、米国特許7468276及び米国特許8057788に記載された胎盤幹細胞等の、組織培養プラスチック接着性CD34-、CD10+、CD105+、及びCD200+胎盤幹細胞である。なお、前記文献の開示は参照により完全に本明細書へ組み込まれる。特別な態様において、前記胎盤幹細胞は、更に1以上のCD45-、CD80-、CD86-、又はCD90+である。更に特別な態様において、前記胎盤幹細胞は更に、CD45-、CD80-、CD86-、及びCD90+である。
【０１２０】
これら胎盤幹細胞は、免疫調節剤である。例えば米国特許7682803及び米国特許出願2008/0226595を参照されたい。なお、これら文献の開示は参照により完全に本明細書へ組み込まれる。別の特別な態様において、従って、前記胎盤幹細胞又は前記胎盤幹細胞を含む前記オルガノイドは、前記オルガノイドがレシピエントへ移植された時に、前記レシピエント体内での免疫応答を抑制する。別の特別な態様において、前記単離された幹細胞のいずれか又は前記オルガノイドは、前記単離された幹細胞を含み、前記単離された幹細胞は免疫調節剤であって、前記オルガノイドが前記レシピエントへ移植される時にレシピエント体内での免疫応答を抑制する。特別な態様において、前記オルガノイド又はそれに含まれる免疫調節性幹細胞は、レシピエント体内での、例えば投与又は移植箇所又はその周辺の局部的免疫応答を抑制する。別の特別な態様において、前記オルガノイド又はそれに含まれる免疫調節性幹細胞は、レシピエントの全身的免疫応答を抑制する。
【０１２１】
種々の他の特別な態様において、オルガノイドは1以上の細胞型を含み、その前記1以上の細胞型は、分化した細胞、例えば、1以上の、内皮細胞、上皮細胞、真皮細胞、内胚葉細胞、中胚葉細胞、線維芽細胞、骨細胞、軟骨細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、肝細胞、膵臓細胞、又は間質細胞であるか、それらを含む。種々の更に特別な態様において、前記分化した細胞は、唾液腺粘液性細胞、唾液腺漿液性細胞、エブネル腺細胞、乳腺細胞、涙腺細胞、耳道腺細胞、エクリン汗腺暗調細胞、エクリン汗腺明調細胞、アポクリン汗腺細胞、モル腺細胞、脂腺細胞であるか、これらを含む。又、ボウマン腺細胞、ブルンネル腺細胞、精嚢細胞、前立腺細胞、尿道球腺細胞、バルトリン腺細胞、尿道腺細胞、子宮内膜細胞、単離された杯細胞、胃壁の粘液性細胞、胃腺酵素原細胞、胃腺酸分泌細胞、膵腺房細胞、パネート細胞、II型肺胞上皮細胞、クララ細胞、成長ホルモン産生細胞、乳腺刺激ホルモン産生細胞、甲状腺刺激ホルモン産生細胞、性腺刺激ホルモン産生細胞、副腎皮質刺激ホルモン産生細胞、下垂体中葉細胞、巨大細胞神経分泌細胞、腸管細胞、気道細胞、甲状腺上皮細胞、傍濾胞細胞、副甲状腺細胞、副甲状腺主細胞、好酸性細胞、副腎腺細胞、クロム親和性細胞、ライディッヒ細胞、内卵胞膜細胞、黄体細胞、顆粒膜黄体細胞、卵胞膜黄体細胞、傍糸球体細胞、緻密斑細胞、極周囲細胞、メサンギウム細胞、血管及びリンパ管内皮有窓型細胞、血管及びリンパ管内皮連続型細胞、血管及びリンパ管内皮脾細胞、滑膜細胞、漿膜細胞(腹膜の、胸膜の、及び心膜腔の内壁)、扁平上皮細胞、円柱細胞、暗調細胞、前庭膜細胞(耳の内リンパ腔内壁)、血管条基底細胞、血管条周辺細胞(耳の内リンパ腔内壁)、クラウディウス細胞、ベッチェル細胞、脈絡叢細胞、軟膜クモ膜扁平上皮細胞、色素毛様体上皮細胞、非色素毛様体上皮細胞、角膜内皮細胞、栓細胞、気道繊毛細胞、卵管繊毛細胞、子宮内膜繊毛細胞、精巣網繊毛細胞、精巣輸出管繊毛細胞、繊毛性上衣細胞、表皮角化細胞、表皮基底細胞、指爪及び足指爪の角化細胞、爪床基底細胞、毛幹の毛髄質細胞、毛幹の毛皮質細胞、毛幹の毛小皮細胞、毛根の毛小皮鞘細胞、毛根ハックスレー層の鞘細胞、毛根ヘンレ層の鞘細胞、外毛根鞘細胞、毛母細胞、重層扁平上皮の表面上皮細胞、上皮基底細胞、泌尿器上皮細胞、耳のコルチ器官の内有毛細胞、耳のコルチ器官の外有毛細胞、嗅上皮基底細胞、冷感受性一次感覚ニューロン、熱感受性一次感覚ニューロン、表皮のメルケル細胞、嗅覚受容体神経、痛み感受性一次感覚ニューロン、光受容体桿体細胞、光受容体青色感受性錐体細胞、光受容体緑色感受性錐体細胞、光受容体赤色感受性錐体細胞、自己(固有)受容性一次感覚ニューロン、触覚感受性一次感覚ニューロン、I型頸動脈小体細胞、II型頸動脈小体細胞(血液pHセンサ)、内耳前庭器官のI型有毛細胞(加速度及び重力)、内耳前庭器官のII型有毛細胞、I型味蕾細胞、コリン作動性神経細胞、アドレナリン作動性神経細胞、ペプチド作動性神経細胞、コルチ器官の内柱細胞、コルチ器官の外柱細胞、コルチ器官の内指骨細胞、コルチ器官の外指骨細胞、コルチ器官の境界細胞、コルチ器官のヘンゼン細胞、前庭器支持細胞、味蕾支持細胞、嗅上皮支持細胞、シュワン細胞���サテライト細胞、腸内グリア細胞、星状細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、紡錘形ニューロン、前水晶体上皮細胞、クリスタリン含有水晶体線維細胞、肝細胞、含脂肪細胞、白色脂肪細胞、褐色脂肪細胞、肝臓脂肪細胞、腎臓糸球体壁細胞、腎臓糸球体有足細胞、腎臓近位尿細管刷子縁細胞、ヘンレ係蹄の細い部分の細胞、腎臓遠位尿細管細胞、腎臓集合管細胞、I型肺胞上皮細胞、膵管細胞、非線条導管細胞、導管細胞、腸刷子縁細胞、外分泌腺線条導管細胞、胆嚢上皮細胞、精巣輸出管非繊毛細胞、精巣上体主細胞、精巣上体基底細胞、エナメル芽細胞上皮細胞、半月面上皮細胞、コルチ器官歯間上皮細胞、疎性結合組織線維芽細胞、角膜実質細胞、腱線維芽細胞、骨髄網状組織線維芽細胞、非上皮性線維芽細胞、周細胞、髄核細胞、セメント芽細胞/セメント細胞、造歯細胞、象牙芽細胞、ヒアリン軟骨細胞、線維軟骨細胞、弾性軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、骨前駆細胞、硝子体細胞、星細胞(耳)、肝星細胞(伊東細胞)、膵星細胞、赤色骨格筋細胞、白色骨格筋細胞、中間体骨格筋細胞、筋紡錘の核袋細胞、筋紡錘の核鎖細胞、サテライト細胞、通常の心筋細胞、結節性心筋細胞、プルキンエ線維細胞、平滑筋細胞、虹彩の筋上皮細胞、外分泌腺の筋上皮細胞、網状赤血球、巨核球、単球、結合組織マクロファージであるか、これらを含む。又は、表皮ランゲルハンス細胞、樹状細胞、ミクログリア細胞、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、ヘルパーT細胞、サプレッサーT細胞、細胞傷害性T細胞、ナチュラルキラーT細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、メラニン形成細胞、網膜色素上皮細胞、卵原細胞/卵母細胞、精子細胞、精母細胞、精原細胞、精子、卵胞細胞、セルトリ細胞、胸腺上皮細胞、及び/又は間質性腎臓細胞であるか、これらを含む。
【０１２２】
ここに列挙されたいずれかの細胞型を含むいずれかのオルガノイドの特別な態様においては、少なくとも1の細胞種は、初代培養細胞、培養無しに組織又は臓器から直接得られた細胞、イン・ビトロで培養された細胞、又は細胞系の細胞、例えば、部分的に、条件付きで、又は完全に不死化された細胞である。
【０１２３】
本明細書で提供されるオルガノイドの製造に有用な細胞は、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、トリプシン、LIBERASE等の1以上の当分野で公知のプロテアーゼを使用して、特別な腺等の関連する組織又は臓器から単離できる。臓器器官、例えば、腺組織は、組織をプロテアーゼで処理する前、その間、又はその後、例えば、さいの目に切る、浸解する(macerating)、ろ過する等により物理的に分散できる。細胞は、オルガノイドの製造前に、例えば、均一な又は実質的に均一な細胞母集団を製造するため、特別な細胞型を選ぶため等に、標準的な当分野で公知の細胞培養技術を使用して培養できる。
【０１２４】
下垂体細胞の単離、培養、及び同定は、当分野で公知の操作に従って実施できる。例えば、Christianらの「Characterization and localization of lipocortin 1-binding sites on rat anterior pituitary cells by fluorescence-activated cell analysis/sorting and electron microscopy」Endocrinology 138(12):5341-5351(1997)に開示された操作のようにリポコルチン1(LC1)をマーカーとして使用する。同様にKimらの「Isolation, culture and cell-type identification of adult human pituitary cells, Acta Neuropathol. 68(3):205-208(1985)」や、Baranowskaらの「Direct effect of cortistatin on GH release from cultured pituitary cells in the rat」Neuro Endocrinol Lett. 27(1-2):153-156(2006)を参照されたい。
【０１２５】
甲状腺細胞の単離、培養、及び同定は、当分野で公知の操作に従って実施できる。例えば、Pavlovらの「Isolation of cells for cytological and cytogenetic studies of the thyroid epithelium」Morfologiia 130(6):81-83(2006)や、Fayetらの「Isolation of a normal human thyroid cell line:hormonal requirement for thyroglobulin regulation」Thyroid 12(7):539-546(2002)を参照されたい。
【０１２６】
副腎腺細胞の単離、培養、及び同定は、当分野で公知の操作に従って実施できる。例えば、Creutz、「Isolation of chromaffin granules」Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3:Unit 3.39.1-10(Sept. 2010)、Carocciaらの「Isolation of human adrenocortical aldosterone-producing cells by a novel immunomagnetic beads method」Endocrinology 151(3):1375-80(2010)、Fawcettらの「Isolation and properties in culture of human adrenal capillary endothelial cells」Biochem Biophys Res Commun. 174(2):903-8(1991)、Notterらの「Rodent and primate adrenal medullary cells in vitro:phenotypic plasticity in response to coculture with C6 glioma cells or NGF」Exp Brain Res. 76(1):38-46(1989)を参照されたい。
【０１２７】
4.5オルガノイドにより複製された生理的機能
本発明で提供されるオルガノイドの主要な機能は、その中にそれが含まれている細胞により、オルガノイドが、その増加又は交換が必要な個体内の1以上の生理的機能等の、1以上の生理的機能を達成することである。更に具体的には、オルガノイド及び/又はそれが含まれる細胞は、前記オルガノイドのレシピエントである個体内の臓器又は組織の1以上の生理的機能を、複製又は増加させる。ある態様において、前記のとおり、オルガノイドは1以上の生理的機能を達成する単離された主要な又は培養された細胞を含む。他の態様において、オルガノイドは、生理的機能を達成するように遺伝子工学的に設計された細胞を含む。特別な態様において、前記遺伝子工学的に設計された細胞は、対応する非設計細胞により天然に産生されたものではないタンパク質又はポリペプチドを産生するか、又は、対応する非設計細胞により天然に産生されるよりも多くの量でタンパク質又はポリペプチドを産生するように遺伝子工学的に設計されており、前記細胞組成物は分化した細胞を含むものである。
【０１２８】
前記生理的機能がタンパク質又はポリペプチドの産生である態様において、特別な態様では、前記タンパク質又はポリペプチドは、その活性部分を含むサイトカイン又はペプチドである。更に特別な態様において、前記サイトカインは、アドレノメデュリン(AM)、アンジオポエチン(Ang)、骨形成タンパク質(BMP)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、上皮増殖因子(EGF)、エリスロポイエチン(Epo)、線維芽細胞増殖因子(FGF)、グリア細胞系由来神経栄養因子(GNDF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、増殖分化因子(GDF-9)、肝細胞増殖因子(HGF)、肝癌由来増殖因子(HDGF)、インスリン様成長因子(IGF)、遊走刺激因子、ミオスタチン(GDF-8)、骨髄単球性増殖因子(MGF)、神経成長因子(NGF)、胎盤増殖因子(PlGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、トロンボポエチン(Tpo)、トランスフォーミング増殖因子α(TGF-α)、TGF-β、腫瘍壊死因子α(TNF-α)、血管内皮増殖因子(VEGF)、又はWntタンパク質である。前記オルガノイドの更に特別な態様において、個々の前記オルガノイドは、例えば1x108細胞を含むオルガノイドは、イン・ビトロ培養での増殖培地中で24時間で少なくとも1.0〜10μMの前記サイトカインを産生する。
【０１２９】
他の特別な態様において、前記タンパク質又はポリペプチドは、AM、Ang、BMP、BDNF、EGF、Epo、FGF、GNDF、G-CSF、GM-CSF、GDF-9、HGF、HDGF、IGF、遊走刺激因子、GDF-8、MGF、NGF、PlGF、PDGF、Tpo、TGF-α、TGF-β、TNF-α、VEGF、又はWntタンパク質のためのための可溶性受容体である。前記オルガノイドの更に特別な態様において、個々のオルガノイドは、例えば1x10*細胞を含むオルガノイドは、イン・ビトロ培養での増殖培地中で24時間で少なくとも1.0〜10μMの前記可溶性受容体を産生する。
【０１３０】
他の特別な態様において、前記タンパク質又はポリペプチドは、インターロイキン、例えば、インターロイキン-1α(IL-1α)、IL-1β、IL-1F1、IL-1F2、IL-1F3、IL-1F4、IL-1F5、IL-1F6、IL-1F7、IL-1F8、IL-1F9、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12 35 kDa αサブユニット、IL-12 40 kDaβサブユニット、IL-12 α及びβサブユニットの両方、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E、IL-17Fアイソフォーム 1、IL-17Fアイソフォーム 2、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23 p19サブユニット、IL-23 p40サブユニット、IL-23 p19サブユニット及びIL-23 p40サブユニットの両方、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27B、IL-27-p28、IL-27B及びIL-27-p28の両方、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、IL-36β、IL-36γである。前記オルガノイドの更に特別な態様において、個々の前記オルガノイドは、例えば1x108細胞を含むオルガノイドは、イン・ビトロ培養での増殖培地中で24時間で少なくとも1.0〜10μMの前記インターロイキンを産生する。
【０１３１】
他の特別な態様において、前記タンパク質又はポリペプチドは、IL-1α、IL-1β、IL-1F1、IL-1F2、IL-1F3、IL-1F4、IL-1F5、IL-1F6、IL-1F7、IL-1F8、IL-1F9、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12 35 kDa αサブユニット、IL-12 40kDaβサブユニット、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E、IL-17Fアイソフォーム 1、IL-17Fアイソフォーム 2、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23 p19サブユニット、IL-23 p40サブユニット、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27B、IL-27-p28、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、IL-36β、IL-36γのための可溶性受容体である。前記オルガノイドの更に特別な態様において、個々の前記オルガノイドは、例えば1x108細胞を含むオルガノイドは、イン・ビトロ培養での増殖培地中で24時間で少なくとも1.0〜10μMの前記可溶性受容体を産生する。
【０１３２】
他の特別な態様において、前記タンパク質又はポリペプチドは、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3、IFN-K、IFN-ε、IFN-κ、IFN-τ、IFN-δ、IFN-ζ、IFN-ω、又はIFN-v等のインターフェロン(IFN)である。前記オルガノイドの更に特別な態様において、個々の前記オルガノイドは、例えば1x108細胞を含むオルガノイドは、イン・ビトロ培養での増殖培地中で24時間で少なくとも1.0〜10μMの前記インターフェロンを産生する。
【０１３３】
他の特別な態様において、前記タンパク質又はポリペプチドは、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3、IFN-K、IFN-ε、IFN-κ、IFN-τ、IFN-δ、IFN-ζ、IFN-ω、又はIFN-vのための可溶性受容体である。前記オルガノイドの更に特別な態様において、個々の前記オルガノイドは、例えば1x108細胞を含むオルガノイドは、イン・ビトロ培養での増殖培地中で24時間で少なくとも1.0〜10μMの前記可溶性受容体を産生する。
【０１３４】
他の特別な態様において、前記タンパク質又はポリペプチドは、インスリン又はプロインスリンである。前記オルガノイドの更に特別な態様において、個々の前記オルガノイドは、例えば1x108細胞を含むオルガノイドは、イン・ビトロ培養での増殖培地中で24時間で少なくとも1.0〜10μMの前記インスリンを産生する。他の特別な態様において、前記タンパク質はインスリンの受容体である。更に特別な態様において、前記細胞は更に、1以上のプロホルモン転換酵素1、プロホルモン転換酵素2、又はカルボキシペプチダーゼEを産生するように遺伝子工学的に設計されている。
【０１３５】
別の特別な態様において、前記タンパク質又はポリペプチドは、レプチン(LEP)である。前記オルガノイドの更に特別な態様において、個々の前記オルガノイドは、例えば1x108細胞を含むオルガノイドは、イン・ビトロ培養での増殖培地中で24時間で少なくとも1.0〜10μMの前記レプチンを産生する。
【０１３６】
他の特別な態様において、前記タンパク質はエリスロポイエチン(Epo)である。前記オルガノイドの更に特別な態様において、個々の前記オルガノイドは、例えば1x108細胞を含むオルガノイドは、イン・ビトロ培養での増殖培地中で24時間で少なくとも1.0〜10μMの前記Epoを産生する。
【０１３７】
別の特別な態様において、前記タンパク質はトロンボポエチン(Tpo)である。前記オルガノイドの更に特別な態様において、個々の前記オルガノイドは、例えば1x108細胞を含むオルガノイドは、イン・ビトロ培養での増殖培地中で24時間で少なくとも1.0〜10μMの前記Tpoを産生する。
【０１３８】
オルガノイドは、ある態様において、ドーパミン又はドーパミンの前駆体を産生するように設計された細胞を含む。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの特別な態様において、前記タンパク質は、例えばチロシン3-モノオキシゲナーゼである。前記オルガノイドの更に特別な態様において、個々のオルガノイド、例えば、1x108の前記細胞を含むオルガノイドは、イン・ビトロ培養での増殖培地中で24時間で少なくとも1.0〜10μMのL-DOPAを産生する。更に特別な態様において、前記オルガノイドに関する前記細胞は、更に芳香族L-アミノ酸デカルボキシラーゼを発現するように設計されている。前記オルガノイドの更に特別な態様において、個々の前記オルガノイドは、例えば1x108細胞を含むオルガノイドは、イン・ビトロ培養での増殖培地中で24時間で少なくとも1.0〜10μMのドーパミンを産生する。
【０１３９】
前記オルガノイドの別の特別な態様において、前記タンパク質又はポリペプチドは、ホルモン又はプロホルモンである。更に特別な態様において、前記ホルモンは、抗ミュラー管ホルモン(AMH)、アディポネクチン(Acrp30)、副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)、アンジオテンシン(AGT)、アンギオテンシノーゲン(AGT)、抗利尿ホルモン(ADH)、バソプレッシン、心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)、カルシトニン(CT)、コレシストキニン(CCK)、副腎皮質刺激ホルモン(コルチコトロピン)放出ホルモン(CRH)、エリスロポイエチン(Epo)、卵胞刺激ホルモン(FSH)、テストステロン、エストロゲン、ガストリン(GRP)、グレリン、グルカゴン(GCG)、性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)、成長ホルモン(GH)、成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン(hCG)、ヒト胎盤ラクトゲン(HPL)、インヒビン、黄体形成ホルモン(LH)、メラニン形成細胞刺激ホルモン(MSH)、オレキシン、オキシトシン(OXT)、副甲状腺ホルモン(PTH)、プロラクチン(PRL)、リラキシン(RLN)、セクレチン(SCT)、ソマトスタチン(SRIF)、トロンボポエチン(Tpo)、甲状腺刺激ホルモン(Tsh)、及び/又は甲状腺刺激ホルモン放出刺激ホルモン(TRH)である。
【０１４０】
別の特別な態様において、前記タンパク質又はポリペプチドは、シトクロムP450側鎖切断酵素(P450SCC)である。
【０１４１】
他の特別な態様において、前記タンパク質は、遺伝子的障害若しくは病気を患っている個体中で欠如又は機能不全となっているタンパク質である。特別な態様において、前記遺伝子的病気は家族性高コレステロール血病であって、前記タンパク質は低比重リポタンパク質受容体(LDLR)であるか、前記遺伝子的病気は多発性嚢胞腎疾患であって、前記タンパク質はポリシスチン1(PKD1)、PKD-2若しくはPKD3であるか、又は、前記遺伝子的病気はフェニルケトン尿症であって、前記タンパク質はフェニルアラニンヒドロキシラーゼである。
【０１４２】
本明細書に記載されたオルガノイドが免疫調節性細胞を含む態様において、前記オルガノイドは更に、1以上の免疫抑制化合物を含むことができ、前記化合物として例えば、非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)、アセトアミノフェン、ナプロキセン、イブプロフェン、アセチルサリチル酸、ステロイド、抗T細胞受容体抗体、抗-IL-2受容体抗体、バシリキシマブ、ダクリズマブ(ZENAPAX(登録商標))、抗細胞受容体抗体(例えば、ムロモナブ-CD3)、アザチオプリン、コルチコステロイド、シクロスポリン、タクロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、シロリムス、カルシニューリン阻害剤等が挙げられる。特別な態様において、前記免疫抑制剤は、マクロファージ炎症性タンパク質(MIP)-1α又はMIP-1βを中和する抗体である。
【０１４３】
4.6オルガノイドの特別な例
腺特異的オルガノイドの特別な態様が、下記4.6.1〜4.6.6項のそれぞれに提示される。
【０１４４】
4.6.1 下垂体
下垂体は、接合している血管網に囲まれている、下垂体前葉内の細胞、好酸性細胞及びクロム親和性細胞(chromophils)、並びに下垂体後葉内の神経分泌細胞のボディを含む。従って、ある態様において、本発明では、下垂体の少なくとも1の生理的機能を達成するオルガノイドを提供し、例えば、本発明は下垂体の(pituitary)オルガノイドを提供する。特別な態様において、前記下垂体又は前記下垂体のオルガノイドの少なくとも1の生理的機能は、検出可能な量の1以上の、例えば、1以上のヒト成長ホルモン(hGH)、プロラクチン(PRL)、副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)(コルチコトロピン)、メラニン形成細胞刺激ホルモン(MSH)、甲状腺刺激ホルモン(TSH)(サイロトロピンthyrotrophin)、卵胞刺激ホルモン(FSH)、黄体形成ホルモン(LH)、抗利尿ホルモン(ADH)、及び/又はオキシトシン等の下垂体特異性ホルモンを産生することである。ある態様において、前記オルガノイドは、検出可能な量の1以上の、例えば、1以上のヒト成長ホルモン(hGH)、プロラクチン(PRL)、副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)(コルチコトロピン)、メラニン形成細胞刺激ホルモン(MSH)、甲状腺刺激ホルモン(TSH)(サイロトロピン)、卵胞刺激ホルモン(FSH)、黄体形成ホルモン(LH)、抗利尿ホルモン(ADH)、及び/又はオキシトシン等の下垂体特異性ホルモンを産生するように遺伝子工学的に設計されている細胞を含む(例えば、追加的に含む)。
【０１４５】
前記1以上の下垂体特異性ホルモンの前記オルガノイドによる産生は、例えば商業的に入手可能なキット及びアッセイにより評価分析できる。例えば、hGH産生は、ヒトGH ELISA kit(AbFrontier Co.、Ltd.、韓国、ソウル)を使用してイン・ビトロ評価分析でき、ACTH産生は、ACTH(1-39)EIA Kit(Bachem、Torrance、CA)を使用してイン・ビトロ評価分析でき、MSH産生は、ヒト/マウス/ラットMSH EIA Kit(Raybiotech、Inc.、Norcross GA)を使用してイン・ビトロ評価分析でき、TSH産生は、ヒトTSH ELISA Kit(Calbiotech、Inc.、Spring Valley、CA)を使用してイン・ビトロ評価分析でき、FSH産生は、ヒトFSH ELISA Kit(Anogen、Mississauga、Ontario、Canada)を使用してイン・ビトロ評価分析でき、LH産生は、黄体形成ホルモン用ELISA(Kit(Uscn Life Science、Wuhan、中国)を使用してイン・ビトロ評価分析でき、ADH産生は、抗利尿ホルモン(ADH)用CLIA Kit(Uscn Life Science、Wuhan、中国)を使用してイン・ビトロ評価分析でき、前記オルガノイドによるプロラクチン産生は、プロラクチンELISA(Immuno-Biological Laboratories America)を使用してイン・ビトロ評価分析でき、オキシトシン産生は、オキシトシンOT ELISA Kit(MyBiosource、San Diego、CA)を使用してイン・ビトロ評価分析できる。上述の評価分析のそれぞれでは、ある態様において、オルガノイドが培養された培養培地が、前記オルガノイドによる特別なホルモンの産生のために評価分析される。
【０１４６】
特別な態様において、前記下垂体のオルガノイドは、1以上の下垂体の成長ホルモン産生細胞、下垂体の乳腺刺激ホルモン産生細胞、下垂体の副腎皮質刺激ホルモン産生細胞、下垂体の甲状腺刺激ホルモン産生細胞、下垂体の性腺刺激ホルモン産生細胞、及び/又は下垂体の神経分泌細胞を含む。更に別の特別な態様において、下垂体のオルガノイドは、1以上の下垂体特異性ホルモンを産生するように遺伝子工学的に設計されている細胞を含む(例えば、更に含む)ことができる。ある特別な態様において、前記オルガノイドは更に、脈管内皮細胞を含み、その脈管内皮細胞は前記オルガノイド内に、例えば、前記胎盤の脈管足場内の1以上の脈管に沿って、配置される。他の更に特別な態様において、前記オルガノイドは、前記1以上の下垂体の成長ホルモン産生細胞、下垂体の乳腺刺激ホルモン産生細胞、下垂体の副腎皮質刺激ホルモン産生細胞、下垂体の甲状腺刺激ホルモン産生細胞、下垂体の性腺刺激ホルモン産生細胞、及び/又は下垂体の神経分泌細胞が、1以上の前記脈管に隣接して配置されるように、構成される。
【０１４７】
他のある態様において、前記1以上の下垂体の成長ホルモン産生細胞、下垂体の乳腺刺激ホルモン産生細胞、下垂体の副腎皮質刺激ホルモン産生細胞、下垂体の甲状腺刺激ホルモン産生細胞、下垂体の性腺刺激ホルモン産生細胞、及び/又は下垂体の神経分泌細胞は、前記オルガノイドの外側表面に、又は表面に隣接して配置され、細胞がオルガノイドの外側からの拡散により栄養物を獲得でき、前記1以上の下垂体特異性ホルモンが前記オルガノイドから周囲の環境、例えば、培養培地又は前記オルガノイドが移植された個体の体内へ拡散する。
【０１４８】
4.6.2 甲状腺
甲状腺は、コロイドを分泌する甲状腺濾胞細胞、T3及びT4を産生する甲状腺上皮細胞、及びカルシトニンを産生する甲状腺傍濾胞細胞を含む。ある態様において、従って、本発明では、甲状腺の少なくとも1の生理的機能を達成するオルガノイドを提供し、例えば、本発明は甲状腺の(thyroid)オルガノイドを提供する。特別な態様において、前記甲状腺又は前記甲状腺のオルガノイドの少なくとも1の生理的機能は、検出可能な量の1以上の、例えば、1以上のトリヨードチロニン(T3)、チロキシン(T4)及び/又はカルシトニン等の甲状腺特異性ホルモンを産生することである。前記1以上の甲状腺特異性ホルモンの前記オルガノイドによる産生は、例えば、商業的に入手可能なキット及びアッセイにより評価分析できる。例えば、T3産生は、Total T3 ELISA Kit(MyBiosource、San Diego、CA)を使用してイン・ビトロ評価分析でき、T4産生は、Total T4ELISA Kit(MyBiosource、San Diego、CA)を使用してイン・ビトロ評価分析でき、カルシトニン産生は、カルシトニンELISA Kit(MyBiosource、San Diego、CA)を使用してイン・ビトロ評価分析できる。ある態様において、前記オルガノイドは、検出可能な量の1以上の、例えば、1以上のT3、T4及び/又はカルシトニン等の甲状腺特異性ホルモンを産生するように遺伝子工学的に設計されている細胞を含む(例えば、追加的に含む)。上述の評価分析のそれぞれでは、ある態様において、オルガノイドが培養された培養培地が、前記オルガノイドによる特別なホルモンの産生のために評価分析される。
【０１４９】
特別な態様において、前記甲状腺オルガノイドは、1以上の甲状腺濾胞細胞、甲状腺上皮細胞、及び/又は甲状腺傍濾胞細胞を含む。ある特別な態様において、甲状腺オルガノイドは更に、脈管内皮細胞を含み、前記脈管内皮細胞は、例えば前記胎盤の脈管足場内の1以上の脈管内に配置される。
【０１５０】
4.6.3 副甲状腺
副甲状腺は主に、副甲状腺ホルモンの産生に寄与する副甲状腺主細胞及び副甲状腺好酸性細胞の2種類の細胞を含む。ある態様において、従って、本発明では、副甲状腺の少なくとも1の生理的機能を達成するオルガノイドを提供し、例えば、本発明は副甲状腺の(parathyroid)オルガノイドを提供する。特別な態様において、前記副甲状腺又は副甲状腺のオルガノイドの少なくとも1の生理的機能は、検出可能な量の副甲状腺ホルモン(PTH)を産生することである。PTHの産生は、例えば、Intact-PTH ELISA Kit(Immuno-Biological Laboratories、Minneapolis、MN)を使用して、前記オルガノイドが培養された培養培地のPTHの存在を試験することによりイン・ビトロ評価分析できる。ある態様において、副甲状腺オルガノイドは、副甲状腺主細胞を含む。更に特別な態様において、副甲状腺オルガノイドは、副甲状腺主細胞及び副甲状腺好酸性細胞の両方を含む。ある態様において、前記オルガノイドは、検出可能な量のPTHを産生するように遺伝子工学的に設計されている細胞を含む(例えば、追加的に含む)。上述の評価分析のそれぞれでは、ある態様において、オルガノイドが培養された培養培地が、前記オルガノイドによる特別なホルモン又はタンパク質の産生のために評価分析される。
【０１５１】
ある特別な態様において、副甲状腺オルガノイドは更に、脈管内皮細胞を含み、その脈管内皮細胞は、前記胎盤の脈管足場内の1以上の脈管内に配置される。他の更に特別な態様において、前記オルガノイドは、前記副甲状腺主細胞及び/又は前記副甲状腺好酸性細胞が1以上の前記脈管に隣接して配置されるように構成される。
【０１５２】
4.6.4 副腎腺
副腎腺は、主にエピネフリンの産生に寄与する副腎クロム親和性細胞、ミネラルコルチコイド(主にアルドステロン)を産生する副腎球状帯細胞、糖質コルチコイド(例えば、11-デオキシコルチコステロン、コルチコステロン、及び/又はコルチゾール)を産生する副腎束状帯細胞、及びアンドロゲン(例えば、デヒドロエピアンドロステロン(DHEA)及び/又はアンドロステンジオン)を産生する副腎網状帯細胞を含む。ある態様において、従って、本発明では、副腎腺の少なくとも1の生理的機能を達成するオルガノイドを提供し、例えば、本発明は副腎の(adrenal)オルガノイドを提供する。特別な態様において、前記副腎腺又は副腎腺のオルガノイドの少なくとも1の生理的機能は、検出可能な量の1以上の副腎特異性(adrenal-specific)ホルモン、例えば、1以上のアルドステロン、フルドロコルチゾン、デヒドロエピアンドロステロン、18-ヒドロキシ-11-デオキシコルチコステロン、コルチコステロン、コルチゾール、DHEA及び/又はアンドロステンジオンを産生することである。ある態様において、前記オルガノイドは、検出可能な量の1以上の、例えば、アルドステロン、11-デオキシコルチコステロン、コルチコステロン、コルチゾール、フルドロコルチゾン、DHEA及び/又はアンドロステンジオンを産生するように遺伝子工学的に設計されている細胞を含む(例えば、更に含む)ことができる。
【０１５３】
前記1以上の副腎腺特異性ホルモンの産生は、例えば、発表され、商業的に入手可能なキット及びアッセイにより評価分析できる。例えば、フルドロコルチゾンの前記副腎オルガノイドによる産生は、液体クロマトグラフィーアッセイを使用して評価分析でき、AstらのJ. Pharm. Sci. 68(4):421-423(1979)が参考にできる。アルドステロンの前記副腎オルガノイドによる産生は、ヒトアルドステロンELISA Kit(BioVendor Laboratory Medicine、Inc.、Candler、NC)を使用して評価分析できる。コルチゾールの前記副腎オルガノイドによる産生は、コルチゾールELISA Kit(Enzo Life Sciences、Inc.、Farmingdale、NY)を使用して評価分析できる。18-ヒドロキシ-11-デオキシコルチコステロンの前記副腎オルガノイドによる産生は、放射線免疫アッセイを使用して評価分析でき、ChandlerらのSteroids 27(2):235-246(1976)が参考にできる。エピネフリンの前記副腎オルガノイドによる産生は、エピネフリンRIA(Alpco Diagnostics、Salem、NH)により評価分析できる。アンドロステンジオンの前記副腎オルガノイドによる産生は、質量分析法により評価分析でき、BookerらのDrug Testing及びAnalysis 1(11-12):587-595(2009)が参考にできる。DHEAの前記副腎オルガノイドによる産生は、DHEA ELISA kit(Abnova Corporation、台湾、台北)により評価分析できる。上述の評価分析のそれぞれでは、ある態様において、オルガノイドが培養された培養培地が、前記オルガノイドによる特別なホルモン又はタンパク質の産生のために評価分析される。
【０１５４】
ある特別な態様において、副腎オルガノイドは、副腎クロム親和性細胞、副腎束状帯細胞、副腎球状帯細胞、及び/又は副腎網状帯細胞を含む。特別な態様において、前記副腎オルガノイドは、2又はそれ以上の副腎束状帯細胞、副腎球状帯細胞、及び/又は副腎網状帯細胞を含む。ある特別な態様において、前記副腎クロム親和性細胞、副腎束状帯細胞、副腎球状帯細胞、及び/又は副腎網状帯細胞は、前記副腎オルガノイド内にランダムに又は規則正しく配置される。更に別の特別な態様において、前記副腎クロム親和性細胞は、前記オルガノイド内で一団とされ、前記副腎束状帯細胞は、前記オルガノイド内で一団とされ、前記副腎球状帯細胞は、前記オルガノイド内で一団とされ、及び/又は副腎網状帯細胞は、前記オルガノイド内で一団とされる。別の特別な態様において、前記副腎オルガノイドは球状帯細胞及び束状帯細胞を含み、前記球状帯細胞及び束状帯細胞は前記副腎オルガノイド内で互いに分離している。別の特別な態様において、前記副腎オルガノイドは、球状帯細胞及び網状帯細胞を含み、前記球状帯細胞及び網状帯細胞は前記副腎オルガノイド内で互いに分離している。別の前記副腎オルガノイドは、網状帯細胞及び束状帯細胞を含み、前記網状帯細胞及び束状帯細胞は前記副腎オルガノイド内で互いに分離している。別の特別な態様において、副腎オルガノイドは、球状帯細胞、束状帯細胞及び網状帯細胞を含み、前記球状帯細胞、束状帯細胞、及び網状帯細胞のそれぞれは、前記副腎オルガノイド内でその他の細胞型から分離している。
【０１５５】
ある特別な態様において、副腎オルガノイドは更に、脈管内皮細胞を含み、その脈管内皮細胞は、前記胎盤の脈管足場内の1以上の脈管に沿って、配置される。
【０１５６】
4.6.5 膵臓
膵臓は、膵臓α細胞、膵臓β細胞、膵臓デルタ細胞、膵臓ポリペプチド(PP)細胞、及び膵臓イプシロン細胞を含む。ある態様において、従って、本発明では、膵臓の少なくとも1の生理的機能を達成するオルガノイドを提供し、例えば、本発明は膵臓の(pancreatic)オルガノイドを提供する。特別な態様において、前記膵臓又は膵臓のオルガノイドの少なくとも1の生理的機能は、検出可能な量の1以上の膵臓特異性ホルモン又はタンパク質、例えば、アミリン(膵島アミロイドポリペプチド、又はIAPP)、インスリン、ソマトスタチン、グレリン(grehlin)、膵臓ポリペプチド、及び/又はグルカゴンを、例えばイン・ビトロで産生することである。更に特別な態様において、前記オルガノイドはインスリン及びアミリンを、約10:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、110:1、120:1、130:1、140:1、150:1、160:1、170:1、180:1、190:1又は200:1の割合で、イン・ビトロで産生する。ある態様において、前記オルガノイドは、検出可能な量の1以上のアミリン、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、グレリン、及び/又は膵臓ポリペプチドを産生するように遺伝子工学的に設計されている細胞を含む(例えば、更に含む)ことができる。
【０１５７】
前記1以上の膵臓特異性ホルモンの前記膵臓オルガノイドによる産生は、商業的に入手可能なアッセイ又はキットにより評価分析できる。例えば、インスリンの前記膵臓オルガノイドによる産生は、いずれかの普通のインスリン試験キットによりイン・ビトロで評価分析でき、グルカゴンの前記膵臓オルガノイドによる産生は、グルカゴン用ELISA Kit(Uscn Life Science、Inc.、Wuhan、中国)によりイン・ビトロで評価分析でき、ソマトスタチンの前記膵臓オルガノイドによる産生は、ヒトソマトスタチン(SST)ELISA(Kamiya Biomedical Company、Seattle、WA)によりイン・ビトロで評価分析でき、グレリン(grehlin)の前記膵臓オルガノイドによる産生は、グレリン(ヒト、マウス、ラット)ELISA Kit(Abnova、台湾、台北)によりイン・ビトロで評価分析でき、膵臓ポリペプチドの前記膵臓オルガノイドによる産生は、ヒト膵臓ポリペプチド(PP)ELISA Kit(EMD Millipore、Billerica、ME)によりイン・ビトロで評価分析でき、アミリンの前記膵臓オルガノイドによる産生は、IAPP(ヒト)ELISA Kit(Abnova、台湾、台北)により評価分析できる。上述の評価分析のそれぞれでは、ある態様において、オルガノイドが培養された培養培地が、前記オルガノイドによる特別なホルモン又はタンパク質の産生のために評価分析される。
【０１５８】
ある特別な態様において、副腎オルガノイドは更に、脈管内皮細胞を含み、その脈管内皮細胞は、前記胎盤の脈管足場内の1以上の脈管に沿って、配置される。
【０１５９】
4.6.6肝臓
肝臓は、主に、肝臓質量の70%〜80%を構成する実質性肝細胞と、それに伴う脈管内皮細胞及びKupffer細胞を含む。ある態様において、従って、本発明では、肝臓の少なくとも1の生理的機能を達成するオルガノイドを提供し、例えば、本発明は肝臓の(liver)オルガノイドを提供する。
【０１６０】
ある特別な態様において、前記オルガノイドは、測定可能な量の1以上の凝固第I因子(フィブリノーゲン)、凝固第II因子(プロトロンビン)、凝固第V因子(第V因子)、凝固第VII因子(プロコンベルチン)、凝固第IX因子(クリスマス因子)、凝固第X因子(スチュアート・ブラウアー因子、プロトロンビナーゼ)、凝固第XI因子(血漿トロンボプラスチン前駆体)、若しくはタンパク質C(オートプロトロンビンIIA、血液凝固第XIV因子)、タンパク質S及び/又はアンチトロンビンを産生する。種々の本発明で開示されたいずれかのオルガノイドの別の態様において、前記オルガノイドは、アミノ酸、ラクテート、グリセロール又はグリコーゲンから、検出可能な量のグルコースを産生する。他の態様において、前記オルガノイドは、検出可能な量のインスリン様成長因子(IGF-1)又はトロンボポエチンを産生する。他の態様において、前記オルガノイドは胆汁を産生する。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドのある態様において、前記オルガノイドは、1以上の凝固第I因子(フィブリノーゲン)、凝固第II因子(プロトロンビン)、凝固第V因子(第V因子)、凝固第VII因子(プロコンベルチン)、凝固第IX因子(クリスマス因子)、凝固第X因子(スチュアート・ブラウアー因子、プロトロンビナーゼ)、凝固第XI因子(血漿トロンボプラスチン前駆体)、若しくはタンパク質C(オートプロトロンビンIIA、血液凝固第XIV因子)、タンパク質S、アンチトロンビン、IGF-1又はトロンボポエチンを産生する細胞を含む。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドのある態様において、前記オルガノイドは、例えば前記胎盤の脈管足場内の脈管に沿って配置される肝管内皮細胞を含む。更に特別な態様において、前記肝細胞は前記脈管に沿って実質的に平行に配置される。
【０１６１】
前記1以上の肝臓特異性ホルモンの前記肝臓オルガノイドによる産生は、公表され、商業的に入手可能なアッセイ又はキットにより評価分析できる。例えば、フィブリノーゲンの前記肝臓オルガノイドによる産生は、ヒトフィブリノーゲンELISA Kit(AbFrontier Co.、Ltd.、韓国、ソウル)により評価分析でき、プロトロンビンの前記肝臓オルガノイドによる産生は、プロトロンビン(ヒト)ELISA kit(Abnova、台湾、台北)により評価分析でき、第V因子の前記肝臓特異的オルガノイドによる産生は、Zymutest Factor V ELISA(Aniara、Mason、OH)により評価分析でき、プロコンベルチンの前記肝臓オルガノイドによる産生は、因子VII(プロコンベルチン)活性アッセイ(Gentaur Molecular Products、Whetstone、London、UK)により評価分析でき、凝固第XI因子の前記肝臓オルガノイドによる産生は、完全ヒト凝固第XI因子抗原アッセイ(Molecular Innovations、Novi、MI)により評価分析でき、プロトロンビナーゼの前記肝臓オルガノイドによる産生は、凝固第X因子用ELISA Kit(Uscn Life Science、Wuhan、中国)により評価分析でき、凝固第XI因子の前記肝臓オルガノイドによる産生は、因子XIヒトELISA Kit(ab 108834)(Abcam、Cambridge、MA)により評価分析でき、タンパク質Cの前記肝臓オルガノイドによる産生は、血漿タンパク質C用クロモゲニックアッセイキット(American Diagnostica、Pfungstadt、ドイツ)により評価分析でき、タンパク質Sの前記肝臓オルガノイドによる産生は、ヒトフリータンパク質S DLISA Kit(American Diagnostica、Pfungstadt、ドイツ)により評価分析でき、アンチトロンビンの前記肝臓オルガノイドによる産生は、ACTICHROME(登録商標)アンチトロンビンIIIクロモゲニック活性キット(American Diagnostica、Pfungstadt、ドイツ)により評価分析でき、IGF-1の前記肝臓オルガノイドによる産生は、ヒトIGF-1ELISA Kit(AbFrontier、Co.、Ltd.、韓国、ソウル)により評価分析でき、トロンボポエチンの前記肝臓オルガノイドによる産生は、ヒトTPO/トロンボポエチンELISA Kit(Cell Sciences、Canton、MA)により評価分析できる。上述の評価分析のそれぞれでは、ある態様において、オルガノイドが培養された培養培地が、前記オルガノイドによる特別なホルモン又はタンパク質の産生のために評価分析される。
【０１６２】
4.7オルガノイドの使用方法
本発明で提供されるオルガノイドは、特別な病気又は障害を患い、例えばタンパク質又はポリペプチド、ホルモン、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、上記いずれかの受容体等の生体分子の産生等の、生理的機能の交換又は増加により治療可能な個体へ、これら生体分子を産生するオルガノイドを投与する等して、投与された場合に個体内で天然の生体分子を交換又は増加させるような、治療する方法に使用できる。本発明で開示されたいずれかのオルガノイドは、当業者により適切と判断されるような治療的目的に使用できる。
【０１６３】
他の態様において、オルガノイドにより産生された生体分子は、例えば、その中でオルガノイドが培養されるか保持されている培養培地又は緩衝液から単離できる。他の態様において、1又は複数のオルガノイドであってそれぞれ少なくとも1の生体分子を産生するものは、前記少なくとも1の生体分子を必要とする患者の外部にある容器内に包含され、例えば、オルガノイドが保持されている培養培地又は緩衝液と個体とをチューブで導通する等して、個体及び容器間を物理的に連結し、生体分子を前記個体へ提供可能とする。
【０１６４】
上述の下垂体のオルガノイドは、そのオルガノイドが投与された個体内で1以上の下垂体ホルモンを産生し、個体が下垂体ホルモン産生の欠乏または減少のため障害を持っている場合の治療に有効である。このような障害は、種々の態様において、成長、血圧障害、母乳産生、性機能、甲状腺機能、水分調整、及び/又は温度調整の異常な低下に関連する。
【０１６５】
ある態様においては、本発明では、ヒト成長ホルモン(hGH)が必要な個体の治療方法を提供し、その方法は、hGHを産生するオルガノイド、又はhGHを産生する細胞を含むオルガノイド、又は上記4.6.1項に記載されたオルガノイド等のオルガノイドにより産生された、治療的有効量のhGH等のhGHを前記個体へ投与することを含む。前記個体内のhGHの産生は、例えばヒトGH ELISA kit(AbFrontier Co.、Ltd.、韓国、ソウル)を使用して、投与後の個体の血清サンプルに対して評価分析できる。
【０１６６】
別の態様において、本発明では、プロラクチン(PRL)が必要な個体の治療方法を提供し、その方法は、PRLを産生するオルガノイド、又はPRLを産生する細胞を含むオルガノイド、又は上記4.6.1項に記載されたオルガノイド等のオルガノイドにより産生された、治療的有効量のPRL等のPRLを前記個体へ投与することを含む。前記個体内のPRLの産生は、例えばプロラクチンELISA(Immuno-Biological Laboratories America)を使用して、投与後の個体の血清サンプルに対して評価分析できる。特別な態様において、前記個体は、1以上の代謝症候群、動脈性勃起不全、早漏、乏精子症、精子無力症、精嚢の機能低下、又は性腺機能低下症を患っている。
【０１６７】
別の態様において、本発明では、副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)が必要な個体の治療方法を提供し、その方法は、ACTHを産生するオルガノイド、又はACTHを産生する細胞を含むオルガノイド、又は上記4.6.1項に記載されたオルガノイド等のオルガノイドにより産生された、治療的有効量のACTH等のACTHを前記個体へ投与することを含む。前記個体内のACTHの産生は、例えばACTH(1-39)EIA Kit(Bachem、Torrance、CA)を使用して、投与後の個体の血清サンプルに対して評価分析できる。特別な態様において、前記個体は、アジソン病を患っている。
【０１６８】
別の態様において、本発明では、メラニン形成細胞刺激ホルモン(MSH)が必要な個体の治療方法を提供し、その方法は、MSHを産生するオルガノイド、又はMSHを産生する細胞を含むオルガノイド、又は上記4.6.1項に記載されたオルガノイド等のオルガノイドにより産生された、治療的有効量のMSH等のMSHを前記個体へ投与することを含む。前記個体内のMSHの産生は、例えばヒト/マウス/ラットMSH EIA Kit(Raybiotech、Inc.、Norcross GA)を使用して、投与後の個体の血清サンプルに対して評価分析できる。特別な態様において、前記個体は、アルツハイマー病を患っている。
【０１６９】
別の態様において、本発明では、甲状腺刺激ホルモン(TSH)が必要な個体の治療方法を提供し、その方法は、TSHを産生するオルガノイド、又はTSHを産生する細胞を含むオルガノイド、又は上記4.6.1項に記載されたオルガノイド等のオルガノイドにより産生された、治療的有効量のTSH等のTSHを前記個体へ投与することを含む。前記個体内のTSHの産生は、例えばヒトTSH ELISA Kit(Calbiotech、Inc.、Spring Valley、CA)を使用して、投与後の個体の血清サンプルに対して評価分析できる。特別な態様において、前記個体は、クレチン病を患っているか明らかに発症している。
【０１７０】
別の態様において、本発明では、卵胞刺激ホルモン(FSH)が必要な個体の治療方法を提供し、その方法は、FSHを産生するオルガノイド、又はFSHを産生する細胞を含むオルガノイド、又は上記4.6.1項に記載されたオルガノイド等のオルガノイドにより産生された、治療的有効量のFSH等のFSHを前記個体へ投与することを含む。前記個体内のFSHの産生は、例えばヒトFSH ELISA Kit(Anogen、Mississauga、Ontario、Canada)を使用して、投与後の個体の血清サンプルに対して評価分析できる。特別な態様において、前記個体は、生殖不能(不妊)症又は無精子症を患っているか明らかに発症している。
【０１７１】
別の態様において、本発明では、黄体形成ホルモン(LH)が必要な個体の治療方法を提供し、その方法は、LHを産生するオルガノイド、又はLHを産生する細胞を含むオルガノイド、又は上記4.6.1項に記載されたオルガノイド等のオルガノイドにより産生された、治療的有効量のLH等のLHを前記個体へ投与することを含む。前記個体内のLHの産生は、例えば黄体形成ホルモン用ELISA Kit(Uscn Life Science、Wuhan、中国)を使用して、投与後の個体の血清サンプルに対して評価分析できる。特別な態様において、前記個体は、低テストステロン、精子数減少症又は生殖不能(不妊)症を患っているか明らかに発症している。
【０１７２】
別の態様において、本発明では、抗利尿ホルモン(ADH)が必要な個体の治療方法を提供し、その方法は、ADHを産生するオルガノイド、又はADHを産生する細胞を含むオルガノイド、又は上記4.6.1項に記載されたオルガノイド等のオルガノイドにより産生された、治療的有効量のADH等のADHを前記個体へ投与することを含む。前記個体内のADHの産生は、例えば抗利尿ホルモン用CLIA Kit(ADH)(Uscn Life Science、Wuhan、中国)を使用して、投与後の個体の血清サンプルに対して評価分析できる。特別な態様において、前記個体は、視床下部性尿崩症を患っている。
【０１７３】
別の態様において、本発明では、オキシトシンが必要な個体の治療方法を提供し、その方法は、オキシトシンを産生するオルガノイド、又はオキシトシンを産生する細胞を含むオルガノイド、又は上記4.6.1項に記載されたオルガノイド等のオルガノイドにより産生された、治療的有効量のオキシトシン等のオキシトシンを前記個体へ投与することを含む。前記個体内のオキシトシンの産生は、例えばオキシトシンOT ELISA Kit(MyBiosource、San Diego、CA)を使用して、投与後の個体の血清サンプルに対して評価分析できる。
【０１７４】
上述の甲状腺のオルガノイドは、そのオルガノイドが投与された個体内で1以上の甲状腺ホルモンを産生し、個体が甲状腺ホルモン産生の欠乏または減少のため障害を持っている場合の治療に有効である。このような障害は、種々の態様において、代謝低下、甲状腺機能低下症、グレーブス病、ハシモト病(慢性甲状腺炎)等に関連する。
【０１７５】
別の態様において、本発明では、チロキシン(T4)が必要な個体の治療方法を提供し、その方法は、T4を産生するオルガノイド、又はT4を産生する細胞を含むオルガノイド、又は上記4.6.2項に記載されたオルガノイド等のオルガノイドにより産生された、治療的有効量のT4等のT4を前記個体へ投与することを含む。前記個体内のT4の産生は、例えばTotal T4ELISA Kit(MyBiosource、San Diego、CA)を使用して、投与後の個体の血清サンプルに対して評価分析できる。特別な態様において、前記個体は、T4欠乏に関連する、精神遅滞、小人症、低筋力、嗜眠、低温不耐性、又は満月様顔貌を患っているか明らかに発症している。
【０１７６】
別の態様において、本発明では、トリヨードチロニン(T3)が必要な個体の治療方法を提供し、その方法は、T3を産生するオルガノイド、又はT3を産生する細胞を含むオルガノイド、又は上記4.6.2項に記載されたオルガノイド等のオルガノイドにより産生された、治療的有効量のT3等のT3を前記個体へ投与することを含む。前記個体内のT3の産生は、例えばTotal T3 ELISA Kit(MyBiosource、San Diego、CA)を使用して、投与後の個体の血清サンプルに対して評価分析できる。特別な態様において、前記個体は心臓病を患っている。更に特別な態様において、前記個体は、T3の血清濃度が3.1pmol/L未満である。
【０１７７】
別の態様において、本発明では、カルシトニンが必要な個体の治療方法を提供し、その方法は、カルシトニンを産生するオルガノイド、又はカルシトニンを産生する細胞を含むオルガノイド、又は上記4.6.2項に記載されたオルガノイド等のオルガノイドにより産生された、治療的有効量のカルシトニン等のカルシトニンを前記個体へ投与することを含む。前記個体内のカルシトニンの産生は、例えばカルシトニンELISA Kit(MyBiosource、San Diego、CA)を使用して、投与後の個体の血清サンプルに対して評価分析できる。特別な態様において、前記個体は、骨粗鬆症又は慢性自己免疫甲状腺機能低下症を患っている。
【０１７８】
別の態様において、副甲状腺ホルモン(PTH)が必要な個体の治療方法を提供し、その方法は、PTHを産生するオルガノイド、又はPTHを産生する細胞を含むオルガノイド、又は上記4.6.3項に記載されたオルガノイド等のオルガノイドにより産生された、治療的有効量のPTH等のPTHを前記個体へ投与することを含む。前記個体内のPTHの産生は、例えばIntact-PTH ELISA Kit(Immuno-Biological Laboratories、Minneapolis、MN)を使用して、投与後の個体の血清サンプルに対して評価分析できる。
【０１７９】
上述の副腎腺のオルガノイドは、そのオルガノイドが投与された個体内で1以上の副腎腺ホルモンを産生し、個体が副腎腺ホルモン産生の欠乏または減少のため障害を持っている場合の治療に有効である。このような障害は、種々の態様において、代謝活性、脂肪燃焼又は炭水化物の利用、炎症、クッシング症候群、及び/又は塩及び水分平衡の調整障害に関連する。
【０１８０】
別の態様において、本発明では、アルドステロンが必要な個体の治療方法を提供し、その方法は、アルドステロンを産生するオルガノイド、又はアルドステロンを産生する細胞を含むオルガノイド、又は上記4.6.4項に記載されたオルガノイド等のオルガノイドにより産生された、治療的有効量のアルドステロン等のアルドステロンを前記個体へ投与することを含む。前記個体内のアルドステロンの産生は、例えばヒトアルドステロンELISA Kit(BioVendor Laboratory Medicine、Inc.、Candler、NC)を使用して、投与後の個体の血清サンプルに対して評価分析できる。特別な態様において、前記個体は、特発性低アルドステロン症、高レニン血症性低アルドステロン症、又は低レニン血症性低アルドステロン症を患っている。別の態様において、前記個体は、慢性腎不全を患っている。
【０１８１】
別の態様において、本発明では、18-ヒドロキシ-11-デオキシコルチコステロンが必要な個体の治療方法を提供し、その方法は、18-ヒドロキシ-11-デオキシコルチコステロンを産生するオルガノイド、又は18-ヒドロキシ-11-デオキシコルチコステロンを産生する細胞を含むオルガノイド、又は上記4.6.4項に記載されたオルガノイド等のオルガノイドにより産生された、治療的有効量の18-ヒドロキシ-11-デオキシコルチコステロン等の18-ヒドロキシ-11-デオキシコルチコステロンを前記個体へ投与することを含む。前記個体内の18-ヒドロキシ-11-デオキシコルチコステロンの産生は、例えば放射線免疫アッセイを使用して、ChandlerらのSteroids, 27(2):235-246(1976)を参考にして投与後の個体の血清サンプルに対して評価分析できる。
【０１８２】
別の態様において、本発明では、フルドロコルチゾンが必要な個体の治療方法を提供し、その方法は、フルドロコルチゾンを産生するオルガノイド、又はフルドロコルチゾンを産生する細胞を含むオルガノイド、又は上記4.6.4項に記載されたオルガノイド等のオルガノイドにより産生された、治療的有効量のフルドロコルチゾン等のフルドロコルチゾンを前記個体へ投与することを含む。前記個体内のフルドロコルチゾンの産生は、例えば液体クロマトグラフィーアッセイを使用して、AstらのJ. Pharm. Sci. 68(4):421-423(1979)を参考にして投与後の個体の血清サンプルに対して評価分析できる。
【０１８３】
別の態様において、本発明では、コルチゾールが必要な個体の治療方法を提供し、その方法は、コルチゾールを産生するオルガノイド、又はコルチゾールを産生する細胞を含むオルガノイド、又は上記4.6.4項に記載されたオルガノイド等のオルガノイドにより産生された、治療的有効量のコルチゾール等のコルチゾールを前記個体へ投与することを含む。前記個体内のコルチゾールの産生は、例えばコルチゾール ELISA Kit(Enzo Life Sciences、Inc.、Farmingdale、NY)を使用して、個体の血清サンプルに対して評価分析できる。特別な態様において、前記個体は、急性副腎不全、アジソン病、又は低血糖症を患っている。
【０１８４】
別の態様において、本発明では、エピネフリンが必要な個体の治療方法を提供し、その方法は、エピネフリンを産生するオルガノイド、又はエピネフリンを産生する細胞を含むオルガノイド、又は上記4.6.4項に記載されたオルガノイド等のオルガノイドにより産生された、治療的有効量のエピネフリン等のエピネフリンを前記個体へ投与することを含む。前記個体内のエピネフリンの産生は、例えばエピネフリンRIA(Alpco Diagnostics、Salem、NH)を使用して、投与後の個体の血清サンプルに対して評価分析できる。
【０１８５】
別の態様において、本発明では、アンドロステンジオンが必要な個体の治療方法を提供し、その方法は、アンドロステンジオンを産生するオルガノイド、又はアンドロステンジオンを産生する細胞を含むオルガノイド、又は上記4.6.4項に記載されたオルガノイド等のオルガノイドにより産生された、治療的有効量のアンドロステンジオン等のアンドロステンジオンを前記個体へ投与することを含む。前記個体内のアンドロステンジオンの産生は、例えば質量分析法を使用して、BookerらのDrug Testing and Analysis 1(11-12):587-595(2009)を参考にして、投与後の個体の血清サンプルに対して評価分析できる。
【０１８６】
別の態様において、本発明では、デヒドロエピアンドロステロン(DHEA)が必要な個体の治療方法を提供し、その方法は、DHEAを産生するオルガノイド、又はDHEAを産生する細胞を含むオルガノイド、又は上記4.6.4項に記載されたオルガノイド等のオルガノイドにより産生された、治療的有効量のDHEA等のDHEAを前記個体へ投与することを含む。前記個体内のDHEAの産生は、例えばDHEA ELISA kit(Abnova Corporation、台湾、台北)を使用して、投与後の個体の血清サンプルに対して評価分析できる。
【０１８７】
更に、本発明では、ある化合物が必要な個体の治療方法であって、前記化合物を産生するオルガノイド、又は前記化合物を産生する細胞を含むオルガノイド、又は上記4.6.6項に記載されたオルガノイド等のオルガノイドにより産生された、治療的有効量の前記化合物等の化合物を前記個体へ投与することを含み、前記化合物は、凝固第I因子(フィブリノーゲン)、凝固第II因子(プロトロンビン)、凝固第V因子(第V因子)、凝固第VII因子(プロコンベルチン)、凝固第IX因子(クリスマス因子)、凝固第X因子(スチュアート・ブラウアー因子、プロトロンビナーゼ)、凝固第XI因子(血漿トロンボプラスチン前駆体)、若しくはタンパク質C(オートプロトロンビンIIA、血液凝固第XIV因子)、タンパク質S及び/又はアンチトロンビンである、治療方法が提供される。前記個体内のこれら化合物の存在は、当分野で公知のアッセイを使用して、投与後の個体の血清サンプルに対して評価分析できる。
【０１８８】
別の態様において、本発明では、IGF-1が必要な個体の治療方法を提供し、その方法は、IGF-1を産生するオルガノイド、又はIGF-1を産生する細胞を含むオルガノイド、又は上記4.6.6項に記載されたオルガノイド等のオルガノイドにより産生された、治療的有効量のIGF-1等のIGF-1を前記個体へ投与することを含む。前記個体内のIGF-1の産生は、例えばヒトIGF-1ELISA Kit(AbFrontier、Co.、Ltd.、韓国、ソウル)を使用して、前記個体の血清サンプルに対して評価分析できる。
【０１８９】
別の態様において、本発明では、トロンボポエチン(Tpo)が必要な個体の治療方法を提供し、その方法は、Tpoを産生するオルガノイド、又はTpoを産生する細胞を含むオルガノイド、又は上記4.6.6項に記載されたオルガノイド等のオルガノイドにより産生された、治療的有効量のTpo等のTpoを前記個体へ投与することを含む。前記個体内のTpoの産生は、例えばヒトTPO/トロンボポエチンELISA Kit(Cell Sciences、Canton、MA)を使用して、前記個体の血清サンプルに対して評価分析できる。
【０１９０】
別の態様において、本発明では、グルカゴンが必要な個体の治療方法を提供し、その方法は、グルカゴンを産生するオルガノイド、又はグルカゴンを産生する細胞を含むオルガノイド、又は上記4.6.5項に記載されたオルガノイド等のオルガノイドにより産生された、治療的有効量のグルカゴン等のグルカゴンを前記個体へ投与することを含む。前記個体内のグルカゴンの産生は、当分野で公知のアッセイを使用して、前記個体の血清サンプルに対して評価分析できる。
【０１９１】
別の態様において、本発明では、インスリンが必要な個体の治療方法を提供し、その方法は、インスリンを産生するオルガノイド、又はインスリンを産生する細胞を含むオルガノイド、又は上記4.6.5項に記載されたオルガノイド等のオルガノイドにより産生された、治療的有効量のインスリン等のインスリンを前記個体へ投与することを含む。前記個体内のインスリンの産生は、当分野で公知の血糖値試験を使用して、前記個体の血液サンプルに対して評価分析できる。特別な態様において、前記個体は、真性糖尿病を患っている。
【０１９２】
別の態様において、本発明では、アミリンが必要な個体の治療方法を提供し、その方法は、アミリンを産生するオルガノイド、又はアミリンを産生する細胞を含むオルガノイド、又は上記4.6.5項に記載されたオルガノイド等のオルガノイドにより産生された、治療的有効量のアミリン等のアミリンを前記個体へ投与することを含む。前記個体内のアミリンの産生は、例えばIAPP(ヒト)ELISA Kit(Abnova、台湾、台北)を使用して、前記個体の血清サンプルに対して評価分析できる。
【０１９３】
別の態様において、本発明では、グレリン(grehlin)が必要な個体の治療方法を提供し、その方法は、グレリンを産生するオルガノイド、又はグレリンを産生する細胞を含むオルガノイド、又は上記4.6.5項に記載されたオルガノイド等のオルガノイドにより産生された、治療的有効量のグレリン等のグレリンを前記個体へ投与することを含む。前記個体内のグレリンの産生は、例えばグレリン(ヒト、マウス、ラット)ELISA Kit(Abnova、台湾、台北)を使用して、前記個体の血清サンプルに対して評価分析できる。
【０１９４】
別の態様において、本発明では、膵臓ポリペプチド(PP)が必要な個体の治療方法を提供し、その方法は、PPを産生するオルガノイド、又はPPを産生する細胞を含むオルガノイド、又は上記4.6.5項に記載されたオルガノイド等のオルガノイドにより産生された、治療的有効量のPP等のPPを前記個体へ投与することを含む。前記個体内の膵臓ポリペプチドの産生は、例えばヒト膵臓ポリペプチド(PP)ELISA Kit(EMD Millipore、Billerica、ME)を使用して、前記個体の血清サンプルに対して評価分析できる。
【０１９５】
ある態様において、脱細胞化胎盤が、ここに記載の1以上のいずれかの細胞型を培養するために使用できる。1以上の型の細胞を、例えば、胎盤由来マトリックス上に播種し、胎盤由来マトリックス内に注入し、及び/又は実質的に損傷がない胎盤の脈管足場に、少なくとも複数の該細胞が胎盤由来マトリックスへ付着するのに充分な時間で通過させることができる。細胞培養は、例えば細胞培養培地内で、例えば標準的細胞培養条件下で、温度約37℃＋5%CO2大気中等の条件で実施できる。
【実施例１】
【０１９６】
5.1 実施例1:脱細胞化胎盤の脈管構造の透過性(Conductivity)
本実施例は、胎盤の脈管マトリックスを実質的に損傷がないように保存するような、胎盤の効率的で優しい脱細胞方法、及び、非胎盤由来細胞による脈管マトリックスの有効な再構築を示す。
【０１９７】
材料及び方法
【０１９８】
胎盤:使用された全ての胎盤は、予め潅流して胎盤由来血及び臍帯血を除去した。2個の臍帯動脈内の潅流管を、潅流脱細胞処理のために維持して使用した。胎盤は、潅流後直ちに脱細胞処理して使用するか、密封したプラスチック包装で-80℃フリーザーに凍結保存してから使用した。
【０１９９】
潅流脱細胞処理:脱細胞処理溶液は、リン酸-緩衝食塩水(PBS)及び1%TritonX-100、0.5%SDS、及びPBSをそれぞれ含み、次々に臍帯の動脈を通して胎盤中に注入した。脱細胞処理に続いて、残存する洗浄剤を、PBS溶液を使用してリンス除去した。脱細胞処理の進行を、胎盤の形態変化を目視検査により、DNA含有量分析により、及び脱細胞化組織のH&E染色によりモニターした。
【０２００】
潅流脱細胞処理を、蠕動ポンプ(VWR)を使用して流量を8〜16mL/minの間に制御し、第二の結合した蠕動ポンプで溶液の貫流を廃棄物容器へ排出するように構成した。それぞれの潅流ステップは、8〜24時間のコースの間、約10〜20Lの培地を使用した。最後のPBS潅流完了後、脱細胞化胎盤の脈管足場を、抗生物質(1%ペニシリン＋ストレプトマイシン)を含むPBS中で、例えばステンレス平皿又はデシケーター(VWR)内に4℃で保存した。プロトコルを修正する場合、胎盤は−80℃で24時間を超えて凍結し、室温で24時間、前記脱細胞処理前に解凍した。
【０２０１】
DNA含有量分析:胎盤組織中のDNA含有量を、組織DNA単離キット(OMEGA Bio-Tek、Cat#D3396-01)を使用して、処理中の組織のDNA量(μg DNA/mg湿潤組織重量として表示)を抽出して測定して評価分析した。それぞれの処理ステップのために、4〜6の異なる個体サンプルをDNA抽出のために使用した。
【０２０２】
潅流溶液:10%TritonX-100、20%SDS、及び10X  PBSのストック溶液を、それぞれAMRESCO社、VWR社、又はSigma社から購入し、蒸留水で所望の濃度まで希釈した。
【０２０３】
流体透過性:表面脈管流体透過性(SVFC)アッセイを、脱細胞化胎盤の脈管足場の流体透過性を評価するために確立した。簡潔には、0.4%トリパンブルー(100mL〜200mL)溶液を、2個の臍帯動脈へ注入した。胎盤由来ディスクの位置上の染料の距離、及び胎盤由来ディスクの半径を測定した。透過性は、移動した染料の距離(D)及び同じ位置の胎盤由来ディスクの半径(R)を決定し、式(D/R)x100%を計算して決定する。それぞれの胎盤において、8個の異なるデータ点を採集して平均を得た。
【０２０４】
細胞透過性:脱細胞化胎盤脈管足場の細胞透過性を、ルシフェラーゼ標識された細胞を注入後のルシフェラーゼ発現細胞の分散性により調査した。細胞分散は、Xenogen IVISスペクトラムを使用してイメージ化し、デジタル生物発光データをLiving Image 3.0ソフトウェアで分析した。
【０２０５】
結果
【０２０６】
潅流脱細胞処理:方法の開発
【０２０７】
上記記載の潅流脱細胞処理において、脱細胞化脈管樹は、半透光性又は透明な外観を示し、脱細胞処理が実質的に完了したことを示した。この半透光性又は透明な外観は、数個の異なる胎盤において再現可能であり、脱細胞処理前の胎盤の凍結による悪い影響は無かった。
【０２０８】
脱細胞処理方法は、上述の複数のステップ及び複数の洗浄剤の代わりに、洗浄剤‐潅流(1%TritonX-100の次に0.5%SDS)の二工程により単純化できた。形態検査において、脱細胞化ヒト胎盤は、胎盤ディスクの頂上部から底部まで白色及び不透明の組織が現れた。DNA含有量分析により、単純化された二工程方法は、顕著なDNA削減及び脱細胞処理を効率的に充分に達成するために使用できることが確認された。
【０２０９】
脱細胞化胎盤の脈管足場の特性評価:DNA含有量分析
【０２１０】
組織のDNA含有量を、5個の実施例の胎盤の脱細胞処理の限度を試験するために使用した。最初のTritonX-100潅流が、組織内のDNA含有量を、TritonX-100(P=0.02)で処理されていない胎盤組織に比べて顕著に増大させることが明らかになり、これは多分TritonX-100が組織からのDNAの回収を改良したためだと思われる。次の0.5%SDS潅流は、平均合計DNA含有量を69%(N=5、範囲81%〜50%)と減少させ、TritonX-100処理ステップ(p=0.01)と比較して顕著に異なった。TritonX-100及びSDS潅流の第二のサイクルでは、DNA含有量が増加し、組織から更にDNAを更に開放するようだった。最後のPBS洗浄も又、胎盤組織内のDNA量を減少させた。DAPI及びH&E染色により、二回の潅流脱細胞処理工程後、脱細胞化胎盤マトリックス内には損傷がない細胞核はほとんど残っていないことを確認した。残存するDNAは、脱細胞処理中に放出されたゲノムDNAがほとんどらしく、それらは例えばDNAseI処理により除去可能である。脱細胞化胎盤マトリックスから単離された脈管のDNA含有量は、ほとんど無かったことから、残存するDNAは、脈管システムではなく脱細胞化マトリックス内に存在することに注目すべきである。
【０２１１】
脱細胞化胎盤の脈管足場の特性評価：流体透過性
【０２１２】
脱細胞処理後の胎盤の脈管システムのインタクト性を示すため、トリパンブルー染料を脱細胞処理後の脈管システム内へ注入した。トリパンブルー染料は、静脈中心から胎盤ディスクの端へ分散し、主脈管及び細脈管システムの両方が脱細胞処理後も透過性を維持したことを示した。流体透過性の定量的評価のために、「表面脈管流体透過性」(SVFC)なる方法が、上記「方法」として確立された。トリパンブルー染料注入後のそれぞれの胎盤のSVFCを、胎盤周囲をだいたい同一部分となるように放射状に胎盤を分割した8カ所で測定した。胎盤3個の平均表面脈管流体透過性は、93%であった。
【０２１３】
脱細胞化胎盤の脈管足場の特性評価:細胞透過性及び分散
【０２１４】
脱細胞化ヒト胎盤の脈管足場の細胞透過性を調査するため、ルシフェラーゼ標識された細胞を、脱細胞化胎盤の脈管構造内へ潅流し、脱細胞化マトリックス内の細胞分散を発光画像デジタル分析により測定した。4個の個体実験(試験1〜試験4)を行った。
【０２１５】
試験1は、注入された細胞母集団として3億個の4T1-lucマウス乳癌細胞を使用した方法を確立するための実施可能性試験である。胎盤を-80℃で一晩凍結し、解凍した。胎盤を0.1X  PBSを使用して脱細胞化した。細胞注入前に、胎盤を500mLの5%FCS-PBSで潅流して予め調整した。300mLの細胞培養培地内に再懸濁した細胞を、最初に注入し、次にルシフェリンを1.2mg/mL注入した。画像を、異なる3種の設定で、細胞注入後0時間及び2時間の時点で得た。細胞分散のための定量的画像分析を実施した(円形領域及びパイ型領域)。結果は、胎盤由来足場内へ注入されたルシフェラーゼ標識された細胞は、この新規な試験方法で画像化及び可視化できることを示した。細胞は、ほとんどの胎盤の脈管構造にわたる主脈管及び細脈管の両方で分散していることが確認された。
【０２１６】
試験2で、洗浄剤脱細胞処理によるヒト胎盤の脈管足場を使用して、試験1の結果を確認した。特別には、ルシフェラーゼ活性及び細胞分散シグナルに対する残存する洗浄剤の影響を、注入された細胞母集団として3億個の4T1-lucマウス乳癌細胞を使用して評価した。脱細胞処理を、上述のとおり凍結し解凍し、次に、1%TritonX-100及び0.5%SDSを使用した二回の連続した脱細胞処理により脱細胞処理し、その次にPBS洗浄を行い達成した。胎盤マトリックスも又、細胞注入前にPBS中の5%FCSで予め調整した。この試験では、細胞及びルシフェリンを一緒にプレミックスし、注入した。試験1の結果の確認として、細胞のルシフェラーゼ活性は注入2時間後でも残っており、胎盤足場の洗浄剤ベースによる脱細胞処理は、細胞に毒性を示さなかったことを示した。
【０２１７】
試験3は、脱細胞化胎盤の脈管足場内のヒト細胞の分散を示すように設計した。試験1及び試験2とは対照的に、300mLの増殖培地内で内で再懸濁した3億個のヒト乳癌MDA-231-Luc細胞を、試験1及び試験2で調製した脱細胞化胎盤内へ注入した。ヒト細胞は、マウス細胞と同様に効率的に胎盤の脈管構造全体に分散した。
【０２１８】
試験4を、脱細胞化ヒト胎盤の脈管足場は、細胞再構築による組織エンジニアリングのために、細胞の培養に使用できることを示すために設計した。バイオリアクターシステムのプロトタイプを、無菌のステンレス平皿(9x2インチ=22.9x5.1センチ)内で、損傷がない胎盤の脈管構造マトリックスを培養することにより構成した。マトリックスを通過する循環を、2個の臍帯動脈マトリックス内へ流入管を挿入し、胎盤静脈マトリックス内へ排出管を挿入して、培地/細胞の通過流を収集するようにして確立した。胎盤を、37℃インキュベーター内で細胞潅流しながら培養した。循環を、蠕動ポンプにより流量を約6〜12mL/minに制御して維持した。2億個のヒト乳癌MDA-231-Luc細胞を、500mLの増殖培地内で再懸濁し、前記システムを使用して、脱細胞化ヒト胎盤の脈管構造内へ連続的に注入/再注入した。循環を一晩維持し、その後培養を中断し、胎盤の脈管構造へ、試験1〜3のとおりにルシフェリンを注入した。
【０２１９】
このシステム内で一晩のインキュベーション後、培養物内に汚染は無かった。平皿内の培地中の流れを分析しても細胞は発見できず、これは実質的に全ての注入された細胞が胎盤の脈管足場内に保持されたことを示し、その理由は循環の繰り返しであると考えられる。画像分析は、脈管システム内の細胞分散は、先の試験結果に類似することを示した。パイ分析(pie-analysis)に示される通り、均一分散は改良された。強いシグナルも又胎盤材料表面上に見られ、細胞は、胎盤の胎児性表面(即ち、臍帯側)から材料表面(即ち、反対側)の、胎盤の厚み全体に分散したことを示した。
【０２２０】
結論
【０２２１】
この実験セットは、実質的に損傷がない脈管足場を維持しながら、その脈管足場は、流体効率的に最小の損失で透過させることができるヒト胎盤全体を脱細胞する方法を示した。これらの結果は、胎盤足場は組織及び臓器器官エンジニアリングのプラットフォームとして使用できるとする思想をサポートする。脱細胞化ヒト胎盤の脈管足場の一つ可能な応用は、それを体外のオルガノイドシステムを設計するために利用することである。
【実施例２】
【０２２２】
5.2. 実施例2:脱細胞化胎盤の脈管足場を使用した細胞培養
本実施例は、追加的ヒト細胞型が、脱細胞化胎盤の脈管足場に注入可能であり、かつ、その中で培養可能であることを示す。
【０２２３】
材料及び方法
【０２２４】
上記実施例1記載のとおり準備されたヒト脱細胞化胎盤足場を、この試験で使用した。
【０２２５】
胎盤足場滅菌:脱細胞化胎盤足場を、0.1%過酢酸(PAA)のPBS中3時間で、1時間ごとに溶液交換して室温で滅菌した。攪拌洗浄を、同じ量のPBSで6回、それぞれ1時間実施した。
【０２２６】
微細足場組織調製:脱細胞化胎盤組織を、〜2から3mm3の微細ブロックへ、外科ブレードを使用して滅菌条件下で切り分けた。次にブロックを、細胞培養培地でリンスした。
【０２２７】
培養中の再細胞化用細胞:GFP-PDAC(登録商標)、HUVEC、293/GFP細胞(Cell Biolabs、Inc.社)、及びHepaRG細胞を、再細胞化試験で使用した。293/GFP細胞は、ヒトアデノウィルスタイプ5  DNAで形質転換された一次胚ヒト腎臓から確立された永久細胞系であり、緑色蛍光タンパク質を安定して発現するように設計されている。
【０２２８】
胎盤接着性細胞(PDAC(登録商標))の量子ドット標識:量子ドット(QD)は、蛍光発光する半導体ナノ粒子であり、近年イン・ビトロ及びイン・ビボのバイオイメージングでの使用に採用されている。この試験では、Q605量子ドット(Invitrogen社)を、PDAC(登録商標)を標識するために販売者のプロトコルに従い使用した。
【０２２９】
細胞増殖アッセイ:細胞の増殖を、Promega社MTSのプロトコルに基づくアッセイを使用して、CellTiter 96(登録商標)水性アッセイキットを使用して測定した。簡単には、20μlのMTS溶液を、ウェル当たり100μlの培養培地中の細胞を含む96ウェルアッセイプレートのそれぞれのウェルへ添加した。プレートを、1時間37℃で給湿した、5%CO2大気内でインキュベートし、次にELISAプレートリーダーを使用して490nm吸光度を記録した。
【０２３０】
GFP 定量的アッセイ:293/GFP細胞を脱細胞化胎盤の脈管足場(〜2x2x2mm3)上に96ウェル当たり2x104で播種した。細胞付着を、販売者のプロトコルに従いGFP ELISA Kit(AKR-121)(Cell Biolabs、Inc.社)を使用して、定量的にGFP ELISAアッセイ測定した。
【０２３１】
生存/死亡細胞測定:生存及び死亡細胞を、CytoSelect 96-well Anoikis Assay染色キット(CBA-081)(Cell Biolabs、Inc.社)を使用して測定した。
【０２３２】
組織学的評価:脱細胞処理及び再細胞化の組織学的評価を、H&E染色及びMassonトリクロム染色(Histoserv)を使用して行った。組織断片を、顕微鏡下で分析して記録した。
【０２３３】
肝細胞機能性アッセイ:肝細胞機能を、アルブミン産生(アルブミン青色蛍光アッセイキット、Active Motif、Carlsbad、CA)、尿素アッセイ(Quantichrom Urea Assay NC9283832 Bioassay Systems No. DIUR-500, Fisher Scientific Co.)及びP450アッセイ(P450-Glo(登録商標)CYP3A4アッセイ(ルシフェリン-PFBE)細胞ベース/生化学的アッセイ、Promega)の測定手段により、測定した。
【０２３４】
結果:
【０２３５】
脱細胞化ヒト胎盤の脈管足場(DHPVS)は、構造及びECM構成要素を維持する。
【０２３６】
脱細胞化胎盤マトリックスは、天然足場を表し、その上に細胞を再構築し、組織又はオルガノイドを再構成(regenerate)する可能性のある幹細胞を試験する。脱細胞化胎盤は、マイクロ脈管樹伸長を有する通過性のある組織として表され、それはリッチな綿状マトリックスを有する。
【０２３７】
胎盤の形態及び構造に対する脱細胞処理プロセスの効果を測定するために、脱細胞化脈管足場を4%パラホルムアルデヒド内に固定(fix)し、ヘマトキシリン及びエオシン染色(H&E)後に組織学的分析用に薄片化した。脱細胞処理は、実質的に全ての細胞を除去したことは、細胞核のヘマトキシリン染色が見られないことにより証明された。絨毛組織に囲まれた大脈管、及び胎盤の特徴的なスポンジ状のマトリックス、絨毛膜絨毛の最も小さな枝を含む胎盤構造は、H&E染色後に顕微鏡下で容易に見える。脱細胞処理後に得られた画像とは対照的に、非脱細胞化のコントロール胎盤組織は、ヘマトキシリンの陽性染色(青色染色された細胞細胞核)によりリッチな細胞分散を示した。
【０２３８】
脱細胞処理プロセスが、細胞間マトリックス(ECM)構成成分及びその配置に対し悪影響を与えるか否かを評価するために、脱細胞化胎盤の同じ組織ブロックを固定し、H&E又はMassonのトリクロムにより染色した。顕微鏡下の目視検査により、脱細胞化胎盤組織は実際に無細胞であり、胎盤マトリックスは損傷がないことが明らかになった。マトリックス構造及びコラーゲン(ECM)(Masson染色による緑色)が、残っていた。
【０２３９】
脱細胞化ヒト胎盤の脈管足場(DHPVS)は、培養中の細胞により再細胞化できる。
【０２４０】
脱細胞化胎盤足場が培養中で細胞増殖をサポートできるかどうかを測定するために、PDAC(登録商標)及びヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)を、DHPVSブロック上に播種し、ブロック中に注入し、37℃で、給湿した5%CO2大気中で14日間培養した。得られたDHPVS組織ブロックを、再細胞化分析のために、薄片化してH&Eで染色した。顕微鏡下の目視検査では、PDAC(登録商標)は脱細胞化足場表面に沿って成長でき、かつ、足場空間中の生細胞を示す形態を維持し、HUVECは少なくとも脈管足場の部分を再構築したことを確認した。
【０２４１】
脱細胞化ヒト胎盤の脈管足場(DHPVS)上の細胞付着及び増殖の定量的評価
【０２４２】
培養中でのDHPVS上の細胞付着を評価するために、緑色蛍光タンパク質(GFP)量子化アッセイを使用した。通常のELISAベースのアッセイは、培養中の30pg/mlのGFPと同じ程度に微量な検出を可能にする。DHPVS上に播種した293/GFP細胞は、ELISAによると、96ウェルプレート内で24時間後に同一細胞の増殖よりも〜1.4倍(p=0.004)良い増殖を示した。
【０２４３】
図1は、DHPVS上に播種した293/GFP細胞の増殖が、培養中の同一の細胞の増殖と比較して増大したことを表す、代表的実験の結果を示す。
【０２４４】
PDAC(登録商標)は、脱細胞化ヒト胎盤の脈管足場(DHPVS)上に接着し、増殖できる。
【０２４５】
DHPVSが細胞の増殖をサポートできるかどうかを測定するために、PDAC(登録商標)-GFP細胞を、DHPVSブロック上に播種して培養した。細胞は、蛍光画像化による可視化により示されたが、培養中に増殖(proliferated)し、増殖成長(growth)のためにDHPVSと好適に一体化した。DHPVS内のPDAC(登録商標)-GFP細胞の増殖も又、MTSアッセイにより示された。PDAC(登録商標)-GFPを、増殖培地中に96ウェル当たり2x104となるDHPVSブロック(〜2x2x2mm3)上に播種した。第1日及び第3日に、足場を新しい96ウェルへ移動させて細胞増殖評価のためのMTSアッセイを行った。結果は、DHPVSは、PDAC(登録商標)の接着及び増殖に適した足場であることを示した。
【０２４６】
次の実験は上記に類似の手法を使用し、2週間にわたる培養期間で、DHPVS上に培養されたPDAC(登録商標)-GFP細胞は、単独培養で成長した同一の細胞に比べて約2.5倍増加したことを示した(図2)。
【０２４７】
PDAC(登録商標)-GFPは、脱細胞化された、大きな、小さな、及び微細な、胎盤脈管上へ接着して増殖する。
【０２４８】
脱細胞化脈管上の細胞付着及び増殖は、オルガノイド再構成(regeneration)には必須のステップである。単離された胎盤脱細胞化脈管上へのPDAC(登録商標)の付着及び増殖を評価するために、脱細胞化臍帯(〜2mm厚み)へ、上記方法と同様に、PDAC(登録商標)-GFP(0.5x106個、2ml培地中)を播種し、3日間培養し、可視化した。得られた蛍光画像は、PDAC(登録商標)-GFP細胞は、脱細胞化脈管へ優先的に接着し、その周囲で増殖したことを示した。
【０２４９】
脱細胞化胎盤小脈管内の細胞付着及び増殖を評価する追加的アプローチとして、PDAC(登録商標)-GFP細胞及びQ605標識化PDAC(登録商標)を、平等に混合して合計1x106/mLとし、DHPVM内の小脈管内へ注入し、37℃で増殖培地中3日間培養した。蛍光顕微鏡を使用して、同一の脈管エリア内の2個の細胞母集団の写真を撮った。GFP発現している細胞及びQdot標識化細胞の両方の代表的蛍光画像は、PDAC(登録商標)が脱細胞化胎盤小脈管へ付着して、その内部で増殖できることを示す。
【０２５０】
組織特異的細胞の細胞付着及び増殖も又、脱細胞化胎盤微細脈管中で示された。この目標を達成するために、濃度1x106/mLで300μlの293/GFP細胞を、DHPVMブロック(〜3x3x5mm3)内に注入し、24ウェルプレート中で培養した。7日間後、細胞を可視化して写真を撮った。その結果、293/GFP細胞は、7日間のコースの間に容易に増殖して、DHPVS内で良く分散したことが示された。
【０２５１】
肝細胞は、脱細胞化ヒト胎盤の脈管足場内で機能性増殖成長を維持できる。
【０２５２】
DHPVS上で肝細胞増殖を確立するために、HepaRG細胞を2x104/96ウェル内のDHPVS上に播種し、又はDHPVS内へ注入し、620培地内で培養した。第4日及び第7日に、位相差顕微鏡により細胞を可視化して写真を撮った。結果は、HepaRG細胞が、DHPVSの存在下で、統合的な増殖パターン及び肝細胞増殖形態を示すことを示した。DHPVS上の肝細胞増殖を評価する代表的実験の結果は、図3に示される。
【０２５３】
アルブミン分泌アッセイを使用した肝細胞の機能性分析を、第3日、第6日、及び第8日の培養において行った。培養培地サンプルを採取し、アルブミン青色蛍光アッセイキット(Active Motif社)により試験した。標準曲線は、精製ヒトアルブミンを使用して作成した。単独培養された肝細胞を、コントロールとして使用した。DHPVS上で培養した肝細胞は、DHPVS(P＜0.02)無しで増殖成長した細胞よりも、顕著に更なるアルブミンを産生することが発見され、このことは、DHPVS内で培養した時に、肝細胞は重要な機能を維持することを示す。DHPVS上で増殖成長した肝細胞によるアルブミン産生を評価する代表的実験の結果は、図4に示される。
【実施例３】
【０２５４】
5.3.実施例3:バイオプリントされた足場は、胎盤幹細胞の付着及び増殖をサポートする。
本実施例は、合成材料はバイオプリントされて、制御された線維直径及び孔径の足場を製造できること、これら足場は細胞間マトリックス(ECM)の応用のための適切な基体(substrate)を提供できること、を示す。本実施例は更に、バイオプリントされた合成材料を含む足場及びECM(ハイブリッド足場)は、胎盤幹細胞等の胎盤細胞を含む、付着及び細胞の増殖に適した基体を示す。
【０２５５】
方法
【０２５６】
合成材料及びECMを含むハイブリッド足場を製造するために、ポリカプロラクトン(PCL)(Mn45,000、Sigma社)を、最初にバイオプリンター(EnvisionTEC、Gladbeck、ドイツ)を使用して、足場(54x54x0.64mm)内にプリントする。プリント条件は、次の通り、温度90℃、プリント圧3〜5.5bar、プリント速度2〜6mm/sで、適したサイズの針を使用する。ECMを、前記のとおりヒト胎盤から単離する(参照、例えばBhatia MB, Wounds 20, 29, 2008)。単離されたECMを、バイオプリントされたPCL足場の両側に適用し、乾燥(脱水)して、PCL及びECMを含むハイブリッド足場を製造する。結果として得られるハイブリッドPCL-ECM足場を、10mm直径の円盤体に打ち抜き、媒体で一晩予備湿潤し、ここに記載された方法に従い準備した胎盤幹細胞(参照、例えば4.4項)を12,500細胞/cm2で播種した。細胞を8日の期間培養した。カルセイン染色及びMTS増殖アッセイを、標準的プロトコルに従い、異なる時間点(n=3)で細胞生存度及び増殖を測定して実施した。
【０２５７】
結果
【０２５８】
プリント条件の最適化により、異なる線維サイズ、孔径及び孔構造のPCL足場を製造した(図5)。印刷された線維は、PCL及びECMを含むハイブリッド足場の製造のための安定なネットワークを形成した。更に、異なる線維サイズ及び孔構造をプリントすることにより、様々な性質を有するハイブリッド足場の製造が可能となった。
【０２５９】
バイオプリントされたPCL足場の両側でのECMの脱水により、ハイブリッド足場が製造できる。好ましい統合はPCL及びECMとの組み合わせであり、ハイブリッド足場が操作、即ち、再水和を含む足場の処理又は培養された際にも(図6)、PCL及びECM間には分離部分が発見されなかった。
胎盤幹細胞は、ハイブリッド足場の表面全体に培養期間中、増殖して拡張していき、培養第6日には、ハイブリッド足場の主な表面を覆った。MTS細胞増殖アッセイは、細胞数は、期間中は顕著に増加したことを示した(図7)。更に、ハイブリッド足場上に播種された胎盤幹細胞は、カルセイン染色(図8)に示されるように、第8日培養期間中良い生存度を示した。それと共に、これらデータは、PCL-ECMハイブリッド足場は細胞の付着、生存、及び増殖をサポートすることを示す。
【０２６０】
結論
【０２６１】
本実施例は、ECM及び合成材料(PCL)を含むハイブリッド足場は、バイオプリンティングを含む方法により製造でき、細胞は、このような足場へ付着するだけではなく、このような足場上で培養された場合に、生存及び増殖することを示す。
【実施例４】
【０２６２】
5.4. 実施例4:バイオプリントされた足場は、胎盤幹細胞の付着及び増殖をサポートする。
【０２６３】
本実施例は、胎盤由来細胞等(例えば胎盤幹細胞)の細胞を含む合成材料及びECMを、同時にバイオプリントしてハイブリッド足場を製造できることを示す。本実施例により示されるように、バイオプリントされた細胞は、バイオプリンティング処理で生存するだけでなく、ハイブリッド足場と一緒の培養で期間中に増殖する。
【０２６４】
方法
【０２６５】
ECMを実施例3記載のとおりに準備し、100万個/ml胎盤幹細胞を含む、0.5%アルギン酸塩ヒドロゲルと混合した。次に、PCL及び細胞含有ECMを、複数の層としてバイオプリントし、PCL及びECMを含むハイブリッド足場を製造した。足場のそれぞれの層では、PCLを最初にプリントし、次にECM/細胞成分をプリントして、PCLライン間の隙間を充填した。2又は5のこのような層をプリントし、CaCl2溶液で架橋してハイブリッド足場を製造した。バイオプリントされた、細胞含有足場(細胞/ECM/PCL)を、7日間培養し、細胞増殖及び生存を、カルセイン染色及びMTS細胞増殖アッセイを行いながら様々な時点で評価した。
【０２６６】
結果
【０２６７】
バイオプリントされた足場は、細胞培養期間中、損傷がない構造を維持した(図9)。PCLは、ECMヒドロゲルのための良い構造的サポートであって、三次元構造の形成を可能とするものを提供した。バイオプリンティングに続き培養の全期間中、細胞は三次元構造全体に良く分散し、細胞は、培養中、足場の深さ全体にわたり発見された(図10)。
【０２６８】
胎盤幹細胞は、バイオプリンティング処理後も生存し、培養の間、三次元バイオプリントされたハイブリッド足場内で増殖し続けたことは、カルセイン染色で証明される(図11)。図12に示されるとおり、ほとんどの細胞は、ハイブリッド足場内のECM全体に拡がったことが確認され、それはECMが細胞付着及びECMヒドロゲル内の増殖拡張を増強することを示した。これは、アルギン酸塩単独内の細胞の位置と、足場内の細胞の位置とを比較することにより確認された。更に、図13に示されるとおり、MTS細胞増殖アッセイは、2層及び5層両方の足場で、細胞数を増加させることを示し、これらハイブリッド足場は細胞増殖をサポートしたことが示された。
【０２６９】
結論
【０２７０】
本実施例は、ECM及び合成材料(PCL)を含むハイブリッド足場は、ECM及びPCLの同時バイオプリンティングを含む方法で製造できることを示す。同様に、この実施例は、細胞は、ハイブリッド足場(ECM及びPCL)の成分と共にバイオプリントできる事実を示し、細胞はバイオプリンティング処理後も生存すること、そのことにより、胎盤幹細胞等の細胞は、脱細胞化胎盤の脈管足場等の表面にバイオプリントできることが示された。更に、ハイブリッド足場の成分と共にバイオプリントされた細胞は、このような足場上に培養されて、足場全体に分散した場合に、細胞のマトリックス(アルギン酸塩)単独内で培養された場合よりも、より一層増殖する。本実施例は更に、細胞はバイオプリンティング処理でも生存することを示す。
【実施例５】
【０２７１】
5.5.実施例5:脱細胞化胎盤の脈管足場を使用して調製された機能的オルガノイド
本実施例は、機能的オルガノイドは、脱細胞化胎盤の脈管足場(DPVS)を使用して設計できることを示す。
【０２７２】
方法
【０２７３】
ヒト甲状腺組織由来細胞系CRL1803-TT(「TT」、米国微生物系統保存機関(ATCC)から入手可能)及びヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)を、前記のとおり調製したDPVS上で、単独培養又は共培養した。比較の見地から、HUVEC及びTTを、基体としてのDPVS無しに共培養し、基体としてのDPVS無しに単独培養した。
【０２７４】
それぞれの細胞型を、DPVSブロック上に播種した。生細胞の量子化を、MTTアッセイ(Promega)を使用して測定した。TT細胞の機能を、TT細胞による培養上澄みへのカルシトニン分泌を測定することにより評価した(カルシトニンレベルは、ELISAにより測定した)。
【０２７５】
結果
【０２７６】
MTTアッセイは、HUVEC及びTTをDPVS上で共培養した時に、生細胞の合計数は、組織培養フラスコ内の通常の培養条件(DPVS無し)で観測されたものと同じ程度だったことを示し、これからTT細胞及びHUVECを共培養した時に、DPVS上の培養は、細胞生存度に対して負の効果は示さないことが明らかとなった(図14)。DPVS上で単独培養されたTT細胞は、組織培養フラスコ内で培養されたTT細胞よりも、少し低い生細胞数を示し、一方、DPVS上で単独培養されたHUVECは、組織培養フラスコ内で培養されたHUVECよりもかなりの数の生細胞を生じた(図14)。
【０２７７】
TT細胞をDPVS上で培養した時の、TT細胞によるカルシトニン産生を検出した。培養フラスコ内で単独培養されたTT細胞によるカルシトニン産生に比べ、そのレベルはやや減少したが、HUVECと共培養したTT細胞によるカルシトニン産生は、細胞がDPVSと共に培養されたか否かの比較では同等であった。このことから、TT細胞の機能性は、DPVS上の培養を維持したことが示される(図15)。
【０２７８】
結論
【０２７９】
複数の種類の細胞をDPVS上で培養した。それらは生存し、かつその機能を維持していたので、DPVSはオルガノイドの調製に適した基体であることが示された。
【実施例６】
【０２８０】
5.6.実施例6:脱細胞化胎盤の脈管足場を使用して調製された機能的オルガノイド
本実施例は更に、機能的オルガノイドは、脱細胞化胎盤の脈管足場(DPVS)を使用して設計できることを示す。
【０２８１】
方法
【０２８２】
ヒト甲状腺組織由来細胞系で、上記記載のCRL1803-TT(TT)及びヒト胎盤接着性細胞(PDAC(登録商標))を、前記のとおり調製したDPVS上で単独培養又は共培養した。比較の見地から、PDAC(登録商標)及びTTを、基体としてのDPVS無しに共培養し、基体としてのDPVS無しに単独培養した。
【０２８３】
それぞれの細胞型を、DPVSブロック上に播種した。生細胞の定量化を、MTTアッセイ(Promega)を使用して測定した。TT細胞の機能を、TT細胞による培養上澄みへのカルシトニン分泌を測定することにより評価した(カルシトニンレベルは、ELISAにより測定した)。PDAC(登録商標)の機能を、PDAC(登録商標)による培養上澄みへのHGF(肝細胞成長(増殖)因子)分泌を測定することにより評価した(HGFレベルは、ELISAにより測定した)。
【０２８４】
結果
【０２８５】
MTTアッセイは、PDAC(登録商標)及びTTをDPVS上で共培養した時に、生細胞の合計数は、組織培養フラスコ内の通常の培養条件(DPVS無し)で観測されたものと同じ程度だったことを示し、これからTT細胞及びPDAC(登録商標)を共培養した時に、DPVS上の培養は、細胞生存度に対して負の効果は示さないことが明らかとなった(図16)。この実験では、DPVS上で単独培養されたTT細胞及びDPVS上で単独培養されたPDAC(登録商標)は、組織培養フラスコ単独内で培養されたTT細胞及びPDAC(登録商標)よりも、かなりの数の生細胞を生じた(図16)。
【０２８６】
実施例5で示したように、TT細胞をDPVS上で培養した時の、TT細胞によるカルシトニン産生を検出した(図17)。PDAC(登録商標)と共培養したTT細胞によるカルシトニン産生は、細胞がDPVSと共に培養されたか否かでは、検出可能だったが、レベルは培養期間中変化した(図17)。TT細胞と一緒の場合、PDAC(登録商標)は、DPVS上で培養した場合に、HGFを分泌するその機能を指標とすると、その機能性を維持した(図18)。
【０２８７】
結論
【０２８８】
本実施例は、胎盤幹細胞を含む複数の種類の細胞は、DPVS上で培養できることを示し、細胞の生存度及び機能性は、培養期間中維持され、更にDPVSはオルガノイド調製に適した基体であることが確認された。
【実施例７】
【０２８９】
5.7.実施例7:DPVS上で培養された細胞は、代謝活性を維持する。
本実施例は、DPVS上で培養された細胞は、生存して代謝活性を維持することを示す。
【０２９０】
培養培地中のHCT116細胞(ATCCから入手可能である)を、臍帯動脈を経由して脱細胞化胎盤(DPVS)内へ注入し、インキュベーター内に設置した。DPVS内の細胞の循環は、ポンプを使用して維持した。培養を、インキュベーター内で48時間維持し、組織の部分を、培養されたDPVSの異なる解剖学的位置から、細胞生存度試験のために切り取った。培養された胎盤のそれぞれの解剖学的位置(DPVSの頭部、中央及び底)からの20の異なる組織片を分析した。細胞生存度を、MTSアッセイ(Promega社)で測定した。
【０２９１】
培養の48時間後、細胞は、全ての胎盤の3部分内で比較的均一に局在化し、それぞれの0.5cm3組織部分は、約40,000〜60,000細胞を含むと推定された(図19)。
【０２９２】
DPVS内のHCT116細胞活性を、異なる時間点で培養培地から採取し、培養培地の栄養条件をコントロール培地(HCT116細胞無し以外は同一の培地)の栄養条件と、同一の時間コースで分析して、評価した。栄養条件を、自動培地分析機を使用して評価した。下記表1に示されるとおり、cGlu(グルコース)を、DPVS内で培養時間5時間〜24時間で培養されたHCT116細胞により消化し、これは細胞が代謝的に活性であり、更に生き残っていることを示す。
【表１】
2015510391.tif 000003
【実施例８】
【０２９３】
5.8.実施例8:DPVS上で培養された幹細胞は分化する
本実施例は、幹細胞の分化をサポートするDPVSの能力を基礎として、脱細胞化ヒト胎盤脈管足場(DPVS)は、組織エンジニアリングのためのプラットフォームとして使用できることを示す。
【０２９４】
PDACをDPVSブロック上に播種し、Mesenchymal Stem Cell Adipogenesis Kit(Chemicon International)を製造者のプロトコルに従い、使用して24ウェルプレート内で非分化条件又は分化条件で培養した。この細胞を含脂肪細胞へ分化させるキットアッセイは、アディポネクチンを産生する。ELISAアッセイを使用して、DPVSと共に又は無しで培養されたPDAC(登録商標)からのアディポネクチン産生を測定した。培養培地を、培養から第0日〜第18日の間採取した。分化誘導無しに、PDAC(登録商標)単独及び、DPVS上で培養されたPDAC(登録商標)は、アディポネクチンを産生しなかった(図20)。しかし、DPVS上で培養されたPDAC(登録商標)が、分化培地内で培養されると、アディポネクチンが培養培地内で第11日から検出され始め、一方、単独培地内で培養されたPDAC(登録商標)は、第18日までアディポネクチンを産生しなかった(図20)。更に、DPVS上で培養されたPDAC(登録商標)は、単独培地内で培養されたPDAC(登録商標)よりも高いレベルのアディポネクチンを産生した(図20)。PDAC(登録商標)と同様に、ヒト骨髄由来間葉系細胞も、DPVS上で培養された場合に含脂肪細胞へ分化することができた。
【実施例９】
【０２９５】
5.9. 実施例9:DPVSは、イン・ビボ環境を模倣する。
本実施例は、脱細胞化ヒト胎盤脈管足場(DPVS)は、理想的な細胞培養環境であり、イン・ビボ培養条件を模倣できることを示す。
【０２９６】
HepaRG細胞を、DPVS上、又は組織培養フラスコ内のいずれかで、通常の培養条件下で培養した。培養培地を1月の間、週2回、分離された培養体から採取した。採取された培養媒体中のグルコース及びラクテートのレベルを線量計(radiometer)を使用して測定した。ラクテートのグルコースに対する化学量論的割合(ΔL/ΔG)は、細胞により産生されたラクテートのモル数を細胞により消費されたグルコースのモル数と比較した値を表し、2種の培養条件のために評価した。
【０２９７】
図21で示したとおり、HepaRG/DPVS培養グループのためのΔL/ΔG値は、HepaRGコントロールグループの値よりも一貫して小さい(図21B-D)。この低いΔL/ΔG値は、DPVS上で培養されたHepaRG細胞は、更に効率の良い状態で代謝を受けることを示し、細胞により産生されるラクテートの量の顕著な減少に特徴付けられることを示す。この低いΔL/ΔG状態は、最小の廃棄物形成をする生理学的状態、即ちイン・ビボ環境に匹敵する。
【実施例１０】
【０２９８】
5.10.実施例10:胎盤葉は、DPVSとして使用できる。
本実施例は、胎盤葉はDPVSとして使用できることを示す。
【０２９９】
胎盤葉を胎盤から単離し、上述の脱細胞化処理をした。全体胎盤の約10%を表すために、一の胎盤葉の平均面積を測定した。脱細胞化胎盤胎盤葉は、脈管構造を含み、流体を循環できることが示された。7個の異なる胎盤から単離された一の胎盤葉の流体循環速度(流出量/流入量)を、測定して、平均で28.92%であると評価した。従って、胎盤葉は、前記実施例に記載された使用法に従い、DPVSとして使用できる、より小さい物理的ユニットを表す。
【０３００】
単離された一の胎盤葉は、組織エンジニアリングのために使用できることを示すために、胎盤葉の細胞増殖をサポートする能力を評価した。一の単離された胎盤葉の脈管構造へ、ルシフェラーゼ発現細胞(MDA-MB231/Luc;Cell Biolabs Inc.社)を、ルシフェラーゼ基質ルシフェリン(Sigma社、100ng/mL)を含む培地中で注入した。一の胎盤葉を、ペトリ皿上に配置し、Xenogen IVIS画像化システムを使用して画像化した。細胞は、胎盤葉の脈管構造内に局在化することが確認され、これは脈管構造が損傷なく残されたためであり、胎盤葉が組織エンジニアリングのために適したDPVSであることを示す。
【０３０１】
均等物:
本発明の組成物及び方法は、本明細書に記載された特別な態様の範囲に限定されない。実際、本明細書記載の組成物及び方法の様々な修正も更に、当業者には前記記載から明らかである。このような修正も、添付された特許請求の範囲内となることを意図されている。
【０３０２】
様々な出版物、特許及び特許出願が本明細書に挙げられており、これら文献の開示は参照により完全に本明細書へ組み込まれる。
【図１】
2015510391.tif 000004
【図２】
2015510391.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
2015510391.tif 000008
【図６】
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【図７】
2015510391.tif 000010
【図８】
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【図９】
2015510391.tif 000012
【図１０】
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【図１１】
2015510391.tif 000014
【図１２】
2015510391.tif 000015
【図１３】
2015510391.tif 000016
【図１４】
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【図１５】
2015510391.tif 000018
【図１６】
2015510391.tif 000019
【図１７】
2015510391.tif 000020
【図１８】
2015510391.tif 000021
【図１９】
2015510391.tif 000022
【図２０】
2015510391.tif 000023
【図２１Ａ−Ｂ】
2015510391.tif 000024
【図２１Ｃ−Ｄ】
2015510391.tif 000025
【国際調査報告】
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2015510391.tif 000027