(57)【要約】免疫修飾に使用するための、妊娠中の免疫寛容の発現に関連づけられるヒトｍｉＲＮＡならびにそれらの断片、誘導体および変異体を提供する。ｍｉＲＮＡは、脱調節化免疫応答に関連づけられる障害、自己免疫障害、妊娠関連疾患、胎盤形成の不全または問題、および同種移植に起因する合併症の診断および処置に使用することができる。加えて、障害の診断および治療に使用するための新規医薬組成物および診断組成物を記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫修飾に使用するためのｍｉＲＮＡであって、Ｃ１９ＭＣクラスタまたはｍｉＲ−３７１−３７３クラスタに含まれる転写ユニットのいずれか１つによってコードされているｍｉＲＮＡから選択されるものであるｍｉＲＮＡ。
【請求項２】
配列番号１から６６を有する、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１７ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１７ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１７ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｄ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｅ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｆ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｅ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｄ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｆ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｇ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｈ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２６ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７１ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７１ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７１ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７３−５ｐから成る群より選択される、請求項１に記載のマイクロＲＮＡ。
【請求項３】
クラスタＣ１９ＭＣまたはｍｉＲ−３７１−３７３からコードされるｍｉＲＮＡと共有のシード配列を有するマイクロＲＮＡであって、
ａ）配列番号６７から７８を有する、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｄ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｄ−５ｐから成る群より選択される；および／または
ｂ）コンセンサスシード配列ＡＡＧＴＧＣを特徴とする、
請求項１または２に記載のマイクロＲＮＡ。
【請求項４】
免疫修飾に使用するための、請求項１から３のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡの核酸配列を含むｍｉＲＮＡ前駆体。
【請求項５】
免疫修飾に使用するための、請求項１から４のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ分子の標的遺伝子の遺伝子発現に干渉することができる結合分子であって、免疫修飾に使用するための合成ｍｉＲＮＡミミック、ＲＮＡ−分子、抗体、アプタマー、スピーゲルマーを含む分子の群から選択されるものである結合分子。
【請求項６】
請求項１から４のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ前駆体または請求項５に記載の結合分子の核酸配列を含む二本鎖核酸。
【請求項７】
請求項６に記載の二本鎖核酸を含むベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項９】
ヒト細胞である宿主細胞であって、好ましくは患者の自家細胞の群から選択される、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１から３のいずれか一項に記載の少なくとも１つのｍｉＲＮＡ、請求項４に記載のｍｉＲＮＡ前駆体、請求項５に記載の結合分子、請求項６に記載の二本鎖核酸、請求項７に記載のベクターおよび／または請求項８もしくは９に記載の宿主細胞を薬剤として含む、医薬組成物または診断薬。
【請求項１１】
活性薬剤が、人工エキソソームに包埋される、請求項１０に記載の医薬組成物または診断薬。
【請求項１２】
自己免疫疾患の処置に使用するための、請求項１から３のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ、請求項４に記載のｍｉＲＮＡ前駆体、請求項５に記載の結合分子または請求項１０もしくは１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記自己免疫疾患が、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性心筋症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性末梢神経障害、自己免疫性膵炎、多腺性自己免疫症候群、自己免疫性プロゲステロン皮膚炎、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性蕁麻疹、自己免疫性ブドウ膜炎、セリアック病、寒冷凝集素症、クローン病、皮膚筋炎、Ｉ型糖尿病、子宮内膜症、好酸球性筋膜炎、胃腸類天疱瘡、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、橋本脳症、橋本甲状腺炎、特発性血小板減少性紫斑病（自己免疫性血小板減少性紫斑病）、エリテマトーデス、ミラー・フィッシャー症候群（ギラン・バレー症候群）、混合性結合組織病、重力筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、再発性多発性軟骨炎、関節リウマチ、シェーグレン症候群、側頭動脈炎（「巨細胞性動脈炎」）、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病（混合性結合組織病）、血管炎、ウェゲナー肉芽腫症を含む疾患の群から選択される、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
妊娠関連疾患の処置または診断に使用するための、請求項１から３のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ、請求項４に記載のｍｉＲＮＡ前駆体、請求項５に記載の結合分子、請求項１０もしくは１１に記載の医薬組成物または請求項１０もしくは１１に記載の診断薬。
【請求項１５】
前記妊娠関連疾患が、子癇、子癇前症、ＨＥＬＬＰ症候群、および胎盤形成または着床の不全または問題から成る疾患の群より選択される、請求項１４に記載の、請求項１から３のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ、請求項４に記載のｍｉＲＮＡ前駆体、請求項５に記載の結合分子、請求項１０もしくは１１に記載の医薬組成物または請求項請求項１０もしくは１１に記載の診断薬。
【請求項１６】
同種移植片拒絶の予防または処置に使用するための、請求項１から３のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ、請求項４に記載のｍｉＲＮＡ前駆体、請求項５に記載の結合分子、請求項１０もしくは１１に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
移植片対宿主反応の予防または処置に使用するための、請求項１から３のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ、請求項４に記載のｍｉＲＮＡ前駆体、請求項５に記載の結合分子、請求項１０もしくは１１に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
局所投与用に設計される、請求項１から３のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ、請求項４に記載のｍｉＲＮＡ前駆体、請求項５に記載の結合分子、請求項１０もしくは１１に記載の医薬組成物または請求項１０に記載の診断薬。
【請求項１９】
全身投与用に設計される、請求項１から３のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ、請求項４に記載のｍｉＲＮＡ前駆体、請求項５に記載の結合分子、請求項１０もしくは１１に記載の医薬組成物または請求項１０に記載の診断薬。
【請求項２０】
同種移植片のｅｘ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏ処置に使用するための、請求項１から３のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ、請求項４に記載のｍｉＲＮＡ前駆体、請求項５に記載の結合分子、請求項７に記載のベクター、請求項１０もしくは１１に記載の医薬組成物または請求項請求項１０もしくは１１に記載の診断薬。
【請求項２１】
自家細胞または組織のｅｘ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏ処置に使用するための、請求項１から３のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ、請求項４に記載のｍｉＲＮＡ前駆体、請求項５に記載の結合分子、請求項７に記載のベクター、請求項１０もしくは１１に記載の医薬組成物または請求項請求項１０もしくは１１に記載の診断薬。
【請求項２２】
自己免疫疾患により攻撃された細胞または組織のｅｘ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏ処置に使用するための、請求項１から３のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ、請求項４に記載のｍｉＲＮＡ前駆体、請求項５に記載の結合分子、請求項７に記載のベクター、請求項１０もしくは１１に記載の医薬組成物または請求項請求項１０もしくは１１に記載の診断薬。
【請求項２３】
甲状腺腫瘍、乳癌、結腸癌、肺癌、卵巣癌、生殖細胞腫瘍、肝細胞癌、白血病およびリンパ腫を含む群から選択される良性および悪性腫瘍の処置に使用するための、合成ｍｉＲＮＡミミック、ＲＮＡ−分子、抗体、アプタマー、スピーゲルマーおよび小分子を含む分子の群から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡに対するおよび／または請求項４に記載のｍｉＲＮＡ前駆体に対するアンタゴニスト。
【請求項２４】
免疫修飾に使用するためのエキソソームを得るための方法であって、請求項１から３のいずれか一項に記載のＣ１９ＭＣ、ｍｉＲ−３７１−３７３および／またはｍｉＲ３０２−３６７クラスタのｍｉＲＮＡを発現する胚または胎児細胞の細胞培養物の上清からのエキソソームの単離および精製を含む方法。
【請求項２５】
前記細胞培養物が、臍帯、羊膜、胎盤および絨毛膜からの細胞を含む細胞の群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
免疫修飾に使用するためのエキソソームを生体試料から得るための方法であって、生体試料から細胞培養物を準備する段階、前記細胞培養物の上清を回収する段階、およびそのエキソソームを単離および精製する段階を含む方法。
【請求項２７】
前記生体試料が、自家細胞、組織試料または吸引液を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記生体試料が、同種（ａｌｌｏｌｏｇｏｕｓ）細胞、組織試料または吸引液を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
免疫修飾に使用するための、請求項１から３、５および６のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ、結合分子および／または二本鎖核酸を含むエキソソーム、ならびに請求項２４から２８のいずれか一項に従って得られるエキソソームの、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生方法。
【請求項３０】
自己免疫疾患の処置に使用するための、請求項２４から２９のいずれか一項に記載の方法に従って得られるエキソソーム。
【請求項３１】
局所投与による自己免疫疾患の処置に使用するための、請求項２４から２９のいずれか一項に記載の方法に従って得られるエキソソーム。
【請求項３２】
関節注射、好ましくは関節内注射、または鼻腔内適用を用いて投与される、請求項３１に記載のエキソソーム。
【請求項３３】
全身投与による自己免疫疾患の処置に使用するための、請求項２４から２９のいずれか一項に記載の方法に従って得られるエキソソーム。
【請求項３４】
請求項２４から２８のいずれか一項に記載の方法において細胞培養物をそれらの細胞のエキソソーム分泌能力を強化するように処置するための、アザシチジンまたは他のＤＮＡ脱メチル化剤の使用。
【請求項３５】
組織を、請求項１から３のいずれか一項に記載のＣ１９ＭＣ、ｍｉＲ−３７１−３７３および／またはｍｉＲ３０２−３６７クラスタのｍｉＲＮＡが増されたエキソソームを分泌するそれらの能力を強化するようにｉｎ  ｖｉｖｏで処置する際に使用するための、アザシチジンまたは他のＤＮＡ脱メチル化剤。
【請求項３６】
胚の着床能力または精子試料の受精能力を診断する方法であって、胚盤胞もしくは胚の細胞培養培地または精液それぞれにおける請求項１から３のいずれか一項に記載のＣ１９ＭＣクラスタおよび／またはｍｉＲ−３７１−３７３クラスタの少なくとも１つのｍｉＲＮＡの同定を含む方法。
【請求項３７】
対照試料と比較して前記Ｃ１９ＭＣクラスタおよび／またはｍｉＲ−３７１−３７３クラスタの少なくとも１つのｍｉＲＮＡの同等のまたは増加したレベルが、正常なまたは増加した胚着床能力または精子試料受精能力を示し、ならびに対照試料と比較して前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡの減少したレベルが、低下した胚着床能力または精子試料受精能力を示す、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記Ｃ１９ＭＣクラスタおよび／またはｍｉＲ−３７１−３７３クラスタの少なくとも１つのｍｉＲＮＡの存在が、正常なまたは増加した胚着床能力または精子試料受精能力を示し、ならびに前記クラスタの少なくとも１つのｍｉＲＮＡの不在が、低下した胚着床能力または精子試料受精能力を示す、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、免疫修飾に有用な結合分子、特に、免疫系の修飾に関与するまたは使用できるヒトｍｉＲＮＡならびにそれらの前駆体、誘導体、変異体およびミミックに関する。加えて、本発明は、かかる結合分子、それらの前駆体およびミミックを含む、医薬組成物および診断組成物であって、妊娠中の母体免疫系の修飾に関与する転写ユニットにおける突然変異を同定するための診断ツールとしても、およびまた誤調節された免疫系もしくは過活動免疫系に関連した障害、例えば、妊娠関連疾患、胎盤形成の不全もしくは問題、自己免疫疾患を処置するための戦略にも、または移植片対宿主反応の予防もしくは処置においても役立つものである組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
妊娠成功には、母体免疫系の修飾が必要である。胎盤の胚／胎児部および特にその栄養膜が、母体免疫系と局所的に、すなわち、脱落膜内はもちろんその周辺でも相互作用することにより胚の拒絶を防止することができる因子を生産できることは、公知である。しかし、免疫修飾は、既に妊娠初期に効率的に作用しなければならない。妊娠第１三半期には、脱落膜の３０〜４０％以上が母体免疫細胞から成り、それらの大部分（約７０％）はＮＫ細胞であるが、マクロファージおよびＴ細胞が少なからぬ割合で存在することも公知である（Ｗａｒｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【０００３】
免疫修飾を媒介するこれらの因子の一部は公知であるが、他のものは、まだ同定されていないままである。母体免疫系を修飾する能力は栄養膜に限定されず、胎児間質細胞も母体の免疫系の細胞との効率的なクロストークを実行することができる（Ｒｏｅｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。母体免疫系の修飾に責任を負うメカニズムの同定を目的とした実験は、可溶性因子はもちろん、このプロセスにおいて重要な役割を果たす粒子も示しているようである。後者には、エキソソーム、すなわち、様々な細胞タイプから放出され得る小さい膜小胞であって、タンパク質、脂質ならびにｍＲＮＡおよびマイクロＲＮＡから成る多様なカーゴを含有することができるものである膜小胞がある（Ｖａｌａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。妊娠中、栄養膜の細胞はエキソソームを分泌することができ、それらのエキソソームが母体免疫系を抑制するようである（Ｓｏｕｔｈｃｏｍｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。しかし、どのようにしてこの抑制が実際に果たされるのか、およびどの因子が正確にそれに関与するのかは不明である。かかる因子の同定は、妊娠関連障害または妊娠中の合併症の分野内の治療および診断戦略に新たな手段をもたらすことになり、ならびに脱調節化または過活動免疫系に関連づけられる幾つかの疾患の処置にも有用であり得る。
【０００４】
この技術的問題を、請求項に特徴を記載するおよび下でさらに説明するような実施形態によって解決した。
【発明の概要】
【０００５】
本明細書に、妊娠初期におけるおよび胎盤間質細胞におけるＣ１９ＭＣ  ｍｉＲＮＡの初期機能を有意に特定するデータを提示する。このデータは、Ｃ１９ＭＣのｍｉＲＮＡはもちろん、ｍｉＲ−３７１−３クラスタのｍｉＲＮＡも、重要な免疫修飾因子であることを含意する。両方のクラスタをコードする遺伝子は、染色体１９のロングアーム上に互いに極めて近接して割り当てられている（図１）。本明細書に提供するデータについては、本発明は、概して、免疫修飾に使用するためのＣ１９ＭＣのｍｉＲＮＡ、それらの前駆体、ならびにｍｉＲ−３７１−３クラスタのｍｉＲＮＡ、それらの前駆体の提供に関する。さらに、共通シード配列ＡＡＧＴＧＣを共有するｍｉＲＮＡ、およびこれらのｍｉＲＮＡの標的遺伝子の遺伝子発現に干渉することができる結合分子も、これに関連して提供する。さらに、本発明は、上文にて定義したおよび下で定義するとおりのｍｉＲＮＡ分子の核酸配列を含む核酸、ベクターおよび宿主細胞であって、前記核酸配列が、前記宿主細胞おけるおよび／または患者における上述のｍｉＲＮＡ分子、それらの前駆体またはさらに本発明の結合分子の発現の誘導および制御のために使用される調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサーに作動可能に連結されているものである、核酸、ベクターおよび宿主細胞を提供する。これに関連して、本発明は、自己免疫疾患、妊娠関連疾患、胎盤形成または着床の不全または問題の場合のような、脱調節化免疫系に一般に結びつけられる障害の処置または診断、および同種移植片（移植物）の拒絶反応または移植片対宿主反応に起因する拒絶反応の処置または予防に有用な医薬組成物および診断組成物をさらに提供する。さらに、本発明は、例えば、自己免疫疾患に冒された細胞の処置、または自己免疫疾患の場合の自家組織の破壊の予防もしくは処置に有用な薬剤も提供する。本発明によって提供されるおよび上述の組成物に使用される薬剤は、種々の投与形態、例えば、局所または全身投与用に設計される。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、２つのマイクロＲＮＡクラスタ、Ｃ１９ＭＣおよびｍｉＲ−３７１−３、を有する染色体領域１９ｑ１３の模式図である。
【図２】図２は、妊娠週に関連して５２の胎盤組織におけるｍｉＲＮＡ  ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐの相対発現を示す図である。
【図３】図３は、絨毛膜絨毛のマイクロダイセクションを示す図である。絨毛膜絨毛（Ａ）から第一の間質コア、次に栄養膜層（Ｃ）を切り出した。
【図４】図４は、間質および栄養膜細胞におけるｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ−３７１−３ｐ、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−３７３およびｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐの相対発現を示す図である。
【図５】図５は、脱落膜および栄養膜細胞におけるｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐおよびｍｉＲ−５１７ａ−３ｐの相対発現を示す図である。
【図６】図６は、Ｆａｓ−ＦａｓＬ誘導アポトーシスの阻害剤として作用する遺伝子の転写産物を標的にするｍｉＲＮＡを図示する模式図である。標的はｍｉＲＢａｓｅ（リリース１８）にしたがって同定された。
【図７】図７は、ＢｒｄＵアッセイによって測定した、ＪＥＧ−３細胞およびｂＡＭＣと共培養したＰＢＭＣにおける９６時間および１２０時間の時点での細胞増殖をそれぞれ示す図である。
【図８】図８は、ＢｒｄＵアッセイによって測定した、単独でのＰＢＭＣ、混合リンパ球反応でのＰＢＭＣ、およびＣｏｎ  Ａで刺激したＰＢＭＣにおける９６時間および１２０時間の時点での細胞増殖をそれぞれ示す図である。
【図９】図９は、ＢＣ２８０７２３のゲノム上の位置を示す図である。
【図１０】図１０は、トランスフェクション後２４時間、４８時間および６日の時点での、モックトランスフェクト細胞と比較した、Ｃ１９ＭＣをコードするＢＡＣベクターをトランスフェクトしたウシ羊膜由来細胞におけるｍｉＲ−５７１ａ−３ｐの相対発現を示す図である。
【図１１】図１１（Ａ）は、ＨＣＴ−１１６およびＪＥＧ−３細胞におけるｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐの相対発現を示す図である（定量的ＲＴ−ＰＣＲの説明については、実施例１を参照）。図１１（Ｂ）は、ＪＥＧ−３細胞およびＨＣＴ−１１６細胞の上清でそれぞれ処置したジャーカット細胞におけるｃ−ＦＬＩＰの相対発現を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
ｍｉＲ−３７１−３７３（３７１−３）クラスタは、７つのマイクロＲＮＡしか含有しないが、Ｃ１９ＭＣは、ともかく現在分かっている最大のヒトｍｉＲＮＡクラスタであり、おおよそ６０の異なるｍｉＲＮＡを有する（表１）。Ｃ１９ＭＣのメンバーは、栄養膜において豊富に発現されるが、胎盤の間質部においてはされないと、および妊娠中に発現増加があると報告されている（Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。胎盤におけるｍｉＲ３７１−３７３クラスタの発現に関しては、詳細はまだ不明である。
【０００８】
しかし、両方のクラスタのマイクロＲＮＡは、母体免疫系を修飾できる候補としてはまだ論じられていない。母体免疫修飾へのそれらの関与に対して語る強い主張は、既存の文献に基づく。第一に、Ｃ１９ＭＣクラスタのメンバーの発現は、栄養膜に限定されるようである（Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）が、胎盤間質細胞は免疫抑制機能を有するとも記載されている（Ｒｏｅｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。第二に、Ｃ１９ＭＣクラスタのｍｉＲＮＡメンバーの発現の増加（Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）は、これらのｍｉＲＮＡが、むしろ妊娠後期に関連した機能を有するという結論につながる。
【０００９】
しかし、本発明の中で提示するデータは、上記のこととは対照的に、妊娠初期におけるおよび胎盤間質細胞におけるＣ１９ＭＣ  ｍｉＲＮＡの初期機能を的確に指摘する（実施例１から４を参照）。下でさらに詳細に説明するこれらの実験結果に関連して、Ｃ１９ＭＣのｍｉＲＮＡはもちろん、ｍｉＲ−３７１−３クラスタのｍｉＲＮＡも、本明細書にて母体免疫系の重要な修飾因子として提供する。
【００１０】
１つより多くの標的と相互作用する単一のｍｉＲＮＡの能力のため、ならびにｍｉＲ−３７１−３クラスタ内のおよび−さらにいっそう大きな程度に−Ｃ１９ＭＣクラスタ内の様々なｍｉＲＮＡについての多様性のため、ｍｉＲＮＡの免疫修飾機能は、様々なメカニズムに基づき得る。理論により拘束されることを望まないが、単に一例として、アポトーシス促進機能を実施例８において叙述し、それによって、Ｃ１９ＭＣクラスタのメンバーが、Ｆａｓ−ＦａｓＬ誘導アポトーシスに拮抗する様々なｍＲＮＡと相互作用することを証明する。しかし、細胞老化の誘導ならびに可逆的な細胞周期停止およびアネルギーを含む他の関連メカニズムもｍｉＲＮＡによる影響を受ける場合がある。したがって、これらの所見の治療との関連については、本発明の１つの実施形態において、本明細書に記載する両方のクラスタの単一ｍｉＲＮＡ、単一クラスタごとのｍｉＲＮＡ、ならびにそれらの様々な組み合わせを、所期の治療目的に合うように使用する。
【００１１】
表１：染色体バンド１９ｑ１３に割り当てられるＣ１９ＭＣおよびｍｉＲ−３７１−３クラスタのマイクロＲＮＡ（図１参照）。ｍｉＲＢａｓｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １８（２０１１年１１月）における記載事項によるＩＤ番号；Ｂｅｎｔｗｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ３７（２００５），７６６−７７０およびＬａｎｄｇｒａｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １２９（２００７），１４０１−１４１４も参照。この表に収載するｍｉＲＮＡの前駆体の配列は、それぞれのｍｉＲＮＡについてのｍｉＲＢａｓｅ記載事項から得ることができる。
【表１−１】
2015500013.tif 000002
【表１−２】
2015500013.tif 000003
【表１−３】
2015500013.tif 000004
【表１−４】
2015500013.tif 000005
【００１２】
この実験データに基づき、本発明は、一般に、免疫修飾に使用するためのｍｉＲＮＡであって、上の表１に収載したようなＣ１９ＭＣクラスタまたはｍｉＲ−３７１−３７３クラスタに含まれる転写ユニットのいずれか１つによってコードされているｍｉＲＮＡから選択されるものであるｍｉＲＮＡに関する。
【００１３】
本発明の１つの実施形態において、上述のマイクロＲＮＡは、配列番号１から６６を有する、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１７ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１７ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１７ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｄ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｅ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｆ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｅ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｄ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｆ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｇ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｈ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２６ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７１ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７１ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７１ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７３−５ｐから成る群より選択される。
【００１４】
シード配列は、ｍｉＲＮＡのｍＲＮＡへの結合に不可欠である。本発明の中で言及する場合の「シード配列」または「シード領域」は、ｍｉＲＮＡ  ５’末端から２〜７番目の位置に主として位置する保存ヘプタマー配列である。ｍｉＲＮＡとその標的ｍＲＮＡの塩基対合が、完全にマッチしなかったとしても、「シード配列」は、完全に相補的でなければならない。したがって、本発明は、クラスタＣ１９ＭＣまたはｍｉＲ−３７１−３からコードされるｍｉＲＮＡと共有のシード配列を有するｍｉＲＮＡであって、
ａ）配列番号６７から７８を有するｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｄ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｄ−５ｐから成る群より選択される；および／または
ｂ）コンセンサスシード配列ＡＡＧＴＧＣを特徴とする、
マイクロＲＮＡに、さらに関する。
ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｄ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｄ−５ｐから成る上述の群のｍｉＲＮＡおよびそれらの前駆体は、クラスタｍｉＲ−３０２−３６７からコードされ、それらの配列およびアクセッション番号を下の表２に収載する。
【００１５】
表２．：クラスタＣ１９ＭＣまたはｍｉＲ−３７１−３からコードされるｍｉＲＮＡのシード配列と共通のシード配列ＡＡＧＴＧＣを有するクラスタｍｉＲ−３０２−３６７のｍｉＲＮＡおよびそれらの前駆体；Ｌａｎｄｇｒａｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １２９（２００７），１４０１−１４１４およびＳｕｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．２７０（２００４），４８８−４９８も参照。
【表２】
2015500013.tif 000006
【００１６】
さらに下でより詳細に説明するように、ｍｉＲＮＡは、幾つかの成熟ｍｉＲＮＡの配列を含み得るより長い一次転写産物、前駆体ＲＮＡ分子、から細胞内で生産される（Ｋｉｍ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６（２００５），３７６−３８５）。したがって、一実施形態において、本発明は、免疫修飾に使用するための、上文にて定義したとおりのｍｉＲＮＡの核酸配列を含むｍｉＲＮＡ前駆体を提供する。表１および２に示したｍｉＲＮＡのそれぞれのｍｉＲＮＡ前駆体の配列は、ここに既に示されていない場合には、ｍｉＲＢａｓｅにおけるそれぞれの記載事項から得ることができる。
【００１７】
ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの標的遺伝子への結合により遺伝子発現を調節する。この領域が、通常の場合はｍｉＲＮＡによって誘導される調節効果を果たすために、他の結合分子の標的にされることもあることは、公知である。したがって、一実施形態において、本発明は、免疫修飾に使用するための、上文にて定義したとおりのｍｉＲＮＡの標的遺伝子の遺伝子発現に干渉することができる結合分子であって、免疫修飾に使用するための合成ｍｉＲＮＡミミック、ＲＮＡ−分子、抗体、アプタマー、スピーゲルマーを含む分子の群から選択されるものである結合分子に関する。
【００１８】
一部の実施形態において、本発明は、前記ｍｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ前駆体の核酸配列または上文にて定義したとおりの結合分子の核酸配列を含む、二本鎖核酸をさらに提供する。
【００１９】
さらに、一実施形態において、本発明は、核酸配列をコードする本発明のｍｉＲＮＡ、前駆体ｍｉＲＮＡおよび／または他の結合分子が、少なくとも１つの発現制御配列に作動的に連結されている、上文にて定義したとおりの配列の、上で定義したとおりの二本鎖核酸のうちの１つ以上を提供する。かかる発現制御配列の例は、本発明のｍｉＲＮＡ、前駆体ｍｉＲＮＡおよび／または他の結合分子の発現に用いることができる、当該技術分野において公知のプロモーター、オペレーター、エンハンサー、サイレンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位および他の核酸配列である。
【００２０】
前記発現制御配列は、作動的に連結されている核酸配列をコードするｍｉＲＮＡの発現レベルを向上させることもあり、またはダウンレギュレートすることもある。ヌクレオチド配列をコードする本発明のｍｉＲＮＡ、前駆体ｍｉＲＮＡおよび／または他の結合分子の発現のために使用する細胞タイプ（例えば、原核細胞もしくは真核細胞）または生物に依存して、１つまたは幾つかの発現制御配列を、互いに併用、ならびに／または本発明の中で定義するとおりの二本鎖核酸（ヌクレオチド配列）をコードする本発明のｍｉＲＮＡ、前駆体ｍｉＲＮＡおよび／もしくは他の結合分子のうちの１つ以上と併用することができる。前記発現調節配列を時期（すなわち、発達段階）、細胞タイプ、ならびに／または一般的状況、例えば、１つ以上の特異的物質の存在および／もしくは不在（上文にて定義したとおりのヌクレオチド配列によってコードされるｍｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡ前駆体分子は、ヌクレオチド配列をコードするポリペプチドおよび／またはペプチドに作動可能に連結された前記調節配列がそれらの発現を可能にするときには前述の状況の１つ以上状況に対応するので、発現され、発現を可能にする状況に対応しないときには発現されない）の点で選択することもできる。
【００２１】
使用する発現制御配列は、上文にて定義したとおりの本発明のヌクレオチド配列をコードする本発明のｍｉＲＮＡ、前駆体ｍｉＲＮＡおよび／もしくは他の結合分子と同じ生物に由来することもあり、またはそれらは、異質であることもある、すなわち、生物分類学または系統発生学上異なるという意味で別の生物に由来することもある。一実施形態において、本発明は、ヌクレオチド配列をコードするポリペプチドおよび／またはペプチドを含む核酸分子であって、少なくとも１つの発現制御配列が、ヌクレオチド配列をコードする前記ポリペプチドおよび／またはペプチドとは異質である核酸分子を提供する。
【００２２】
本発明に従って用いる場合のポリヌクレオチドであって、本発明の上記ｍｉＲＮＡ、前駆体ｍｉＲＮＡおよび／または他の結合分子をコードするポリヌクレオチドは、例えば、それらのポリヌクレオチドのいずれかを単独で含むか、組み合わせで含むＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたは合成生産ＤＮＡもしくはＲＮＡまたは組換え生産キメラ核酸分子であり得る。好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、原核または真核細胞における発現を可能にする発現制御配列に作動的に連結されている。前記ポリヌクレオチドの発現は、翻訳可能なｍＲＮＡへの前記ポリヌクレオチドの転写を含む。本発明のポリヌクレオチドの発現を説明する詳細は、本明細書において下でさらに説明することにする。
【００２３】
これに関連して、本発明は、一実施形態において上文にて定義したとおりの二本鎖核酸を含むベクターを提供する。さらに、本発明の一実施形態では、前記ベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明の一実施形態において、上文にて定義したおよび下で定義するとおりの宿主細胞は、ヒト細胞であり、好ましくは、該細胞は、患者の自家細胞の群から選択される。
【００２４】
もう１つの実施形態において、本発明は、上文にて定義したおよび下で定義するとおりの少なくとも１つのｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ前駆体、結合分子、二本鎖核酸、ベクターおよび／または宿主細胞を薬剤として含む、医薬組成物または診断薬に関する。
【００２５】
前記医薬組成物または診断薬の１つの実施形態において、活性薬剤は、人工エキソソームに包埋される（実施例４も参照）。
【００２６】
一実施形態において、本発明は、自己免疫疾患の処置に使用するための、上文にて定義したとおりのｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ前駆体、結合分子または医薬組成物を提供する。
【００２７】
１つの実施形態において、本発明は、前記自己免疫疾患が、急性散在性脳脊髄炎（Ａｃｕｔｅ  ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ：ＡＤＥＭ）、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群（Ａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＡＰＳ）、自己免疫性心筋症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖症候群（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＡＬＰＳ）、自己免疫性末梢神経障害、自己免疫性膵炎、自己免疫性多内分泌腺症候群、自己免疫性プロゲステロン皮膚炎、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性蕁麻疹、自己免疫性ブドウ膜炎、セリアック病、寒冷凝集素症、クローン病、皮膚筋炎、Ｉ型糖尿病、子宮内膜症、好酸球性筋膜炎、胃腸類天疱瘡、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群（Ｇｕｉｌｌａｉｎ−Ｂａｒｒｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＧＢＳ）、橋本脳症、橋本甲状腺炎、特発性血小板減少性紫斑病（自己免疫性血小板減少性紫斑病）、エリテマトーデス、ミラー・フィッシャー症候群（ギラン・バレー症候群）、混合性結合組織病、重力筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、再発性多発性軟骨炎、関節リウマチ、シェーグレン症候群、側頭動脈炎（「巨細胞性動脈炎」）、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病（混合性結合組織病）、血管炎、ウェゲナー肉芽腫症を含む疾患の群から選択される、上文にて定義したとおりの使用に関する。
【００２８】
もう１つの実施形態において、本発明は、妊娠関連疾患の処置または診断に使用するための、上文にて定義したとおりのｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ前駆体、結合分子、医薬組成物または診断薬を提供する。
【００２９】
上文にて定義したとおりの妊娠関連疾患の処置または診断における使用の一実施形態において、前記妊娠関連疾患は、子癇、子癇前症、ＨＥＬＬＰ症候群、および胎盤形成または着床の不全または問題から成る疾患の群より選択される。子癇、子癇前症およびＨＥＬＬＰ症候群がすべて、胎盤機能不全に関連づけられることは当該技術分野において公知である；例えば、Ｂｅｎｅｄｅｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ５３（２０１１），８５−１０４を参照。
【００３０】
「同種移植片」は、ある個体から異なる遺伝子型を有する同じ種の別の個体への器官、組織または細胞の移植物と本明細書では定義する。かかる移植の場合、宿主の免疫系による異物としての移植物の認識およびそれに対する免疫反応の開始のため、拒絶反応を非常によく認めることができる。それ故、急性拒絶の低減のために同種移植片の移植後に免疫抑制処置が必要とされる。これに関連して、１つの実施形態において、本発明は、同種移植片の拒絶の予防または処置に使用するための、上文にて定義したとおりのｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ前駆体、結合分子、医薬組成物を提供する。同種移植片の拒絶反応の予防および／または処置、両方またはいずれか、を、本発明の分子または組成物を使用して行うことができるので、これらの分子／組成物を使用して、実際の移植の前および／もしくは後に、または生きている生物、例えばヒト患者、体内およびまた体外の処置位置に関して、前記拒絶反応を未然に防ぐことおよび／または緩和することができる。したがって、１つの実施形態において、本発明は、同種移植片のｅｘ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏ処置に使用するための、上文にて定義したおよび下で定義するとおりのｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ前駆体、結合分子、ベクター、医薬組成物または診断分子を提供する。
【００３１】
拒絶反応の特異的形態、「移植片対宿主反応」は、例えば、骨髄、幹細胞移植または輸血の場合のように、免疫担当細胞が異なる遺伝子型の患者間で移植されたときに発生する。宿主が、ドナー移植片に欠けている重要な同種抗原を保有する場合、その宿主は、その移植片とは異質であるとすぐ分かり、したがって、それを抗原的に刺激し得る。したがって、１つの実施形態において、本発明は、移植片対宿主反応の予防または処置に使用するための、上文にて定義したとおりの、請求項に記載の、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ前駆体、結合分子、医薬組成物を提供する。
【００３２】
もう１つの実施形態において、本発明は、自己免疫疾患に冒された細胞または組織のｅｘ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏ処置に使用するための、上文にて定義したおよび下で定義するとおりのｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ前駆体、結合分子、ベクター、医薬組成物または診断薬を提供する。さらに、１つの実施形態において、本発明は、自家細胞または組織のｅｘ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏ処置に使用するための、上文にて定義したおよび下で定義するとおりのｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ前駆体、結合分子、ベクター、医薬組成物または診断薬も提供する。
【００３３】
本発明は、被定義細胞および／または組織に対する生物の免疫応答を増加させるおよび／または免疫寛容を低下させることによる免疫系の修飾に有用な方法、分子および組成物にさらに関する。特に、本発明は、癌療法のための新規方法、分子および組成物にも関する。腫瘍抗原の遺伝学的および生化学的特性評価は、大部分の癌患者が、発生中の新生物に対して何らかの形態の免疫応答を開始させるという発見をもたらした。しかし、臨床的に明らかな疾患の形成および進行は、内因性反応が典型的に無効であることを含意する。腫瘍細胞生物学の幾つかの特徴は、比較的に弱い抗腫瘍応答の一因となる。第一に、腫瘍細胞は、正常な非異質細胞に由来するので、免疫系は腫瘍細胞を危険または異質と認識することができない。第二に、腫瘍細胞は、免疫応答を活性化するために身体が依存する受容体および分子の補体を少なく発現する傾向がある。本発明は、第三のメカニズム、すなわち、癌細胞によるそれら自体を保護するための特定のｍｉＲＮＡの使用に関する。
【００３４】
抗腫瘍免疫を刺激および強化するための幾つかのアプローチ、例えば、特異的腫瘍細胞抗原または全腫瘍細胞に対する癌ワクチン、モノクローナル抗体、組換えサイトカインおよび適応細胞注入（Ｐａｎｄｏｌｆｉ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）があるが、これに関しては新たな方法がなお求められている。本発明の中で提示するデータは、上文にて定義したとおりの特定のｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ前駆体分子についての免疫系の修飾における重要な役割を的確に指摘し、腫瘍療法における標的としてのそれらの可能性も示す。
【００３５】
したがって、１つの実施形態において、本発明は、甲状腺腫瘍、乳癌、結腸癌、肺癌、卵巣癌、生殖細胞腫瘍、肝細胞癌、白血病およびリンパ腫を含む群から選択される良性および悪性腫瘍の処置に使用するための、合成ｍｉＲＮＡミミック、ＲＮＡ−分子、抗体、アプタマー、スピーゲルマーおよび小分子を含む分子の群から選択される、上文にて定義したとおりのｍｉＲＮＡに対するおよび／またはｍｉＲＮＡ前駆体に対するアンタゴニストを提供する。
【００３６】
上文にて定義したとおりのｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ前駆体、結合分子、医薬組成物または診断薬を、当該技術分野において公知の様々な形態で適用することができ、および様々な投与形態のために設計することができる。本発明の１つの実施形態では、上文にて定義したとおりのｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ前駆体、結合分子、医薬組成物または診断薬を局所投与用に設計する。しかし、別の実施形態では、それらを全身投与用に設計する。
【００３７】
本発明は、生体試料、例えば、細胞、組織、血液、吸引液、羊水および、例えば細胞または細胞培養物の、上清からエキソソームを得る、産生する、単離するおよび／または精製するための新規方法および材料にさらに関する。エキソソームおよびそれらの内容物、例えばｍｉＲＮＡ、の一般的単離および精製方法は、当該技術分野において公知である。加えて、さらに下のセクション「エキソソーム」において言及するならびに例えば国際公開第９９／０３４９９号、同第００／４４３８９号および同第９７／０５９００号パンフレットに記載されている方法に類似してまたはそれらの代替として、エキソソームを生体試料から超遠心分離法によって単離してもよく、およびそれらの内容物、すなわちｍｉＲＮＡを、ＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）をその製造業者によって提供されたプロトコルに従って用いて精製することができ、そしてＧａｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２），ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．；７（３）：ｅ３０６７９の４から５頁のサブセクション「Ｅｘｏｓｏｍｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ」および「ＲＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｒｉｐｔｉｏｎ」に記載されているように特異的ｍｉＲＮＡプライマーを使用するＰＣＲによるｃＤＮＡへの逆転写後に同定することができる（前記参照資料の開示内容は、参照により本明細書に援用されている）。ｍｉＲＮＡ定量は、Ｇａｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）の５頁のサブセクション「ｍｉＲＮＡ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ」に記載されているように行うことができる（前記参照資料の開示内容は、参照により本明細書に援用されている）。あるいは、数社の製造業者、例えばＮｏｒｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｋ  Ｃｏｒｐ（カナダ国ソロルド）、によって提供されているエキソソームＲＮＡ単離キット、例えば、尿および組織培養培地からのエキソソームの単離および濃縮のためのＮｏｒｇｅｎのＵｒｉｎｅ  Ｅｘｏｓｏｍｅ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｎｏｒｇｅｎ；カタログ番号４７２００）、または血漿、血清および腹水からのエキソソームＲＮＡの単離および濃縮のためのＰｌａｓｍａ／Ｓｅｒｕｍ  Ｅｘｏｓｏｍｅ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｎｏｒｇｅｎ；カタログ番号４９２００）によりその供給業者のマニュアルに従ってｍｉＲＮＡを単離することができる。さらに、超遠心分離法の代わりに、Ｇｅｎｔａｕｒ（ベルギー国カンペンホウト）からのＥｘｏＱｕｉｃｋ−ＴＣ（登録商標）などのさらなるキットをその供給業者のマニュアルに従って使用することにより、エキソソームを単離することができる。
【００３８】
これらの濃縮試料を使用して、特定のタイプのエキソソームの存在もしくは不在を判定すること、または哺乳動物（例えば、ヒト）体内に存在する特定のタイプのエキソソームの量を決定することができる。エキソソーム含有試料の中の特定のタイプの別個の産物、例えばｍｉＲＮＡ、の量は、その哺乳動物が特定の疾患または障害を有することを示すことができる。上文にて示したように、妊娠成功には、母体免疫系の修飾が必要である。さらに下で詳細に説明する実験結果は、特異的のｍｉＲＮＡ、例えば、Ｃ１９ＭＣのｍｉＲＮＡはもちろん、ｍｉＲ−３７１−３クラスタのｍｉＲＮＡも、母体免疫系のかかる重要な修飾因子であることを示す。それ故、エキソソーム含有試料の中の特定のタイプのこれらのｍｉＲＮＡの量は、それらのエキソソームを胚盤胞または胚の細胞培養培地の上清から単離した場合、胚の着床能力または精子試料の受精能力の推定に用いることができる。したがって、本発明は、免疫修飾に使用するためのエキソソームを得るための方法であって、上文にて定義したおよび下で定義するとおりのならびに上の表１および２に収載したようなＣ１９ＭＣ、ｍｉＲ−３７１−３７３および／またはｍｉＲ３０２−３６７クラスタのｍｉＲＮＡを発現する胚または胎児細胞の細胞培養物の上清からのエキソソームの単離および精製を含む方法にも関する。
【００３９】
本発明の方法により、胚の着床および発育に関連した細胞タイプを含む様々な細胞タイプの細胞培養物からエキソソームを単離することができる。生体試料からの臍帯、羊膜、胎盤および絨毛膜細胞の単離、精製および培養方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、国際出願・国際公開第２００５／００１０８１号、同第２０００／０７３４２１号、同第２００２／０４６３７３号および同第２００３／０４２４０５号パンフレット（これらの開示内容は、参照により本明細書に援用されている）に記載されており、ならびにエキソソームの単離のための対象となる細胞培養物を得るためにそれらの方法を用いることができる。本発明の１つの実施形態では、エキソソームを得るための上述の方法であって、前記細胞培養物が、臍帯、羊膜、胎盤および絨毛膜からの細胞を含む細胞の群から選択される方法を提供する。
【００４０】
さらに、本発明は、免疫修飾に使用するためのエキソソームを生体試料から得るための方法であって、生体試料から細胞培養物を準備する段階、前記細胞培養物の上清を回収する段階、およびそのエキソソームを単離および精製する段階を含む方法に関する。
【００４１】
エキソソームを得るための前記生体試料は、得られるエキソソームもしくはそれらの内容物での免疫修飾処置が考えられるものと同じ遺伝的背景を有する細胞、細胞培養物、組織、動物またはヒト患者から単離してもよいし、または前記処置が考えられるものとは異なる遺伝的背景を有する細胞、細胞培養物、組織、動物またはヒト患者から単離してもよい。これに関連して、１つの実施形態では、生体試料からの免疫修飾に使用するためのエキソソームの単離方法であって、前記生体試料が、自家細胞、組織試料または吸引液を含む方法を提供する。もう１つの実施形態では、生体試料からの免疫修飾に使用するためのエキソソームの単離方法であって、前記生体試料が、同種（ａｌｌｏｌｏｇｏｕｓ）細胞、組織試料または吸引液を含む方法を提供する。
【００４２】
本発明は、免疫修飾に使用するための、上文にて定義したおよび下で定義するとおりのｍｉＲＮＡ、結合分子および／または二本鎖核酸を含むエキソソームならびに上述の方法に従って得られるエキソソームのｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生方法にさらに関する。人工エキソソームの生産方法も当該技術分野において公知である。かかる人工エキソソームを、Ｄｅ  Ｌａ  Ｐｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．３４４（２００９），１２１−１３２に記載されているような被覆リポソームから誘導することができる。
【００４３】
本発明の方法に従って得られるエキソソームを、幾つかの疾患および疾患タイプに罹患している患者における免疫修飾に使用することができる。本発明の１つの実施形態では、上述の方法に従って得られるエキソソームを、自己免疫疾患の処置に使用するために提供する。
【００４４】
特定の疾患の処置に関しては、本発明のエキソソームを、別個の投与経路で、その効果が局所的であるのか（「局所」投与で）または全身的であるのかに依存して（「腸管」もしくは「非経口」投与で）、投与することができ、およびその具体的な投与経路要件に従って調合することができる。したがって、本発明の１つの実施形態では、上述の方法に従って得られるエキソソームであって、局所投与による自己免疫疾患の処置に使用するために調製されるエキソソームを提供する。本発明のもう１つの実施形態では、自己免疫疾患の処置に使用するために調製されたエキソソームを、関節注射、好ましくは関節内注射、または鼻腔内適用を用いて投与する。本発明のさらなる実施形態では、上述の方法に従って得られるエキソソームを、全身投与による自己免疫疾患の処置に使用するために調製する。
【００４５】
エキソソームの単離前に、それらのエキソソームを単離する細胞、組織、器官または動物を、上述のｍｉＲＮＡなどの特異的ｍｉＲＮＡを発現するようにもしくは過発現するように遺伝子操作することができ、および／または細胞のエキソソーム分泌能力を強化することもできる１つ以上の薬剤、例えばアザシチジン（５−アザ−２’−デオキシシチジン）もしくは他のＤＮＡ脱メチル化剤、に曝露してもよい（例えば、Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）“Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ５−ａｚａ−２’−ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ  ｏｎ  ｉｍｍｕｎｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｅｘｏｓｏｍｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｅｐａｔｏｍａ．”．Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１６，２３７１−２３７７を参照）。かかる薬剤への曝露は、アザシチジンについてはＸｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）の２３７２頁、セクション「Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」のサブセクション「Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ」に記載されているように行うことができる（前記参照資料の開示内容は、参照により本明細書に援用されている）。
【００４６】
したがって、本発明は、エキソソームを得るまたは産生するための上述の方法において細胞培養物をそれらの細胞のエキソソーム分泌能力を強化するように処置するための、アザシチジンまたは他のＤＮＡ脱メチル化剤の使用にさらに関する。
【００４７】
さらに、本発明は、組織を、上文にて定義したおよび下で定義するとおりのならびに上の表１および２に収載したようなＣ１９ＭＣ、ｍｉＲ−３７１−３７３および／またはｍｉＲ３０２−３６７クラスタのｍｉＲＮＡが増されたエキソソームを分泌するそれらの能力を強化するようにｉｎ  ｖｉｖｏで処置する際に使用するための、アザシチジンまたは他のＤＮＡ脱メチル化剤にも関する。
【００４８】
上に示したように、エキソソーム含有試料の中の特定のタイプのこれらのｍｉＲＮＡの存在または量を、胚の着床能力の推定に用いることができる。これに関連して、例えば、それぞれの細胞培養培地の上清を単離し、上の表１において定義したとおりのｍｉＲ−３７１−３およびＣ１９ＭＣクラスタのｍｉＲＮＡの存在および量について分析することができる。その後、この分析結果を使用して、胚の着床確率を推定することができる。
【００４９】
したがって、本発明は、胚の着床能力または精子試料の受精能力を診断する方法であって、胚盤胞もしくは胚の細胞培養培地または精液それぞれにおける上文にて定義したおよび下で定義するとおりのならびに上の表１に収載したようなＣ１９ＭＣクラスタおよび／またはｍｉＲ−３７１−３７３クラスタの少なくとも１つのｍｉＲＮＡの同定を含む方法にさらに関する。
【００５０】
本発明の１つの実施形態では、上で定義したとおりの診断方法であって、対照試料と比較して本明細書中で定義するとおりのおよび表１に収載したようなＣ１９ＭＣクラスタおよび／またはｍｉＲ−３７１−３７３クラスタの少なくとも１つのｍｉＲＮＡの同等のまたは増加したレベルが、正常なまたは増加した胚着床能力または精子試料受精能力を示し、ならびに対照試料と比較して前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡの減少したレベルが、低下した胚着床能力または精子試料受精能力を示すものである方法を提供する。
【００５１】
本明細書中で定義するとおりのおよび表１に収載したようなＣ１９ＭＣクラスタおよび／またはｍｉＲ−３７１−３７３クラスタの少なくとも１つのｍｉＲＮＡの存在が、正常なまたは増加した胚着床能力または精子試料受精能力を示し、ならびに前記クラスタの少なくとも１つのｍｉＲＮＡの不在が、低下した胚着床能力または精子試料受精能力を示す、上で定義したとおりの診断方法。
【００５２】
定義および実施形態：
用語「ａ」または「ａｎ」エンティティーは、そのエンティティーの１つ以上を指す；例えば、「ポリペプチド（ａｎ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」は、１つ以上のポリペプチド（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）を表すと解されることに留意しなければならない。したがって、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上の（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」および「少なくとも１つの（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」を本明細書では交換可能に用いることができる。
【００５３】
別段の記述がない限り、用語「障害」および「疾患」を本明細書では交換可能に用いている。「被検体」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」は、診断、予後判定、予防または治療が望まれる任意の被検体、特に哺乳動物被検体、例えばヒト患者を意味する。
【００５４】
本明細書において用いる場合の用語「マイクロＲＮＡ」（ｍｉＲＮＡ）は、１３〜３５、１８〜２５または２１〜２４ヌクレオチドを含み得る、一般には約１９ヌクレオチドと約２５ヌクレオチドの間の、好ましくは殆どの天然に存在するｍｉＲＮＡのように約２２ヌクレオチドの、非タンパク質コーディングＲＮＡであって、標的転写産物のｔｒａｎｓでの切断を導き、その結果、様々な調節および発生経路に関与する遺伝子の発現を負に調節するものであるＲＮＡ（Ｂａｒｔｅｌ  ＤＰ．，Ｃｅｌｌ  １１６（２００４），２８１−２９７；Ｈｅ  ａｎｄ  Ｈａｎｎｏｎ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．５（２００４），５２２−５３１；Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４（２００１），８５３−８５８；Ａｍｂｒｏｓ  Ｖ．，Ｃｅｌｌ，１１３（２００３），６７３−６７６）に関する。成熟ｍｉＲＮＡの塩基２−８を本明細書では「ｍｉＲＮＡシード配列」と定義する。標的ＲＮＡ配列とｍｉＲＮＡシード配列間の６から８ｂｐの完全相補性は、ｍｉＲＮＡ標的認識の主要決定因子である。Ｙｏｕｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｃｏｒｅｙ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３９（２０１１），５６８２−５６９１。認識部位への成熟ｍｉＲＮＡ結合のための配列要件、および所与の配列へのｍｉＲＮＡ結合の予測方法は、例えば、Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １１５（２００３），７８７−７９８；Ｊｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ  ２（１１）：ｅ３６３（２００４）において論じられている。
【００５５】
一部のｍｉＲＮＡ遺伝子（ＭＩＲ遺伝子）は、同定されており、データベース（オンライン上でｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓにて利用できる、「ｍｉＲＢａｓｅ」）において公的に利用できるようにされている。さらなるＭＩＲ遺伝子および成熟ｍｉＲＮＡが米国特許出願公開第２００５／０１２０４１５号明細書にも記載されている。ＭＩＲ遺伝子は、遺伝子間領域に、そのゲノム内で孤立した状態およびクラスタの状態両方で現れるが、他の遺伝子（タンパク質コーディング遺伝子と非タンパク質コーディング遺伝子の両方）のイントロン内に完全にまたは部分的に位置する場合もあると報告されている（Ｓａｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０４（２００７），１７７１９−１７７２４）。ｍｉＲＮＡ生物発生の最近のレビューについては、Ｋｉｍ  ＶＮ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６（２００５），３７６−３８５を参照。ＭＩＲ遺伝子の転写は、少なくとも一部のケースでは、ＭＩＲ遺伝子自体のプロモーターの促進的制御下にある場合がある。その場合、転写は、おそらく一般にはＲＮＡポリメラーゼＩＩによって媒介される（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｂｏ  Ｊ  ２３（２００４），４０５１−４０６０）。「ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ」と呼ばれる一次転写産物（これは、多シストロン性であることがある）、すなわち、相当大きい（数キロ塩基）ことがあるｍｉＲＮＡ前駆体分子であって、１つ以上の局所二本鎖または「ヘアピン」領域ならびにｍＲＮＡの通常の５’「キャップ」およびポリアデニル化されたテールを含有するものであるｍｉＲＮＡ前駆体分子。例えば、Ｋｉｍ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６（２００５），３７６−３８５における図１を参照。このｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、「ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ」として公知のより短い（≒７０ヌクレオチド）ｍｉＲＮＡ前駆体分子を生じさせるように核内ＲＮａｓｅ  ＩＩＩドローシャ（Ｄｒｏｓｈａ）によって「クロッピングされる」と考えられている。ドローシャによる核内プロセッシング後、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは核に曝露され、そこで酵素ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）が短い、成熟ｍｉＲＮＡを生成する。例えば、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２１（２００２），４６６３−４６７０；Ｒｅｉｎｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．，１６（２００２）：１６１６−１６２６；Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ    ３０３（２００４），９５−９８；およびＭｉｌｌａｒ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ，Ｆｕｎｃｔ．Ｉｎｔｅｇｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５  （２００５），１２９−１３５を参照。このようにマイクロＲＮＡを、ＲＮＡ（例えば、成熟ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ前駆体ＲＮＡ分子のＲＮＡ配列）の点から説明することができ、またはＤＮＡ（例えば、成熟ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ配列、またはＭＩＲ遺伝子もしくはＭＩＲ遺伝子の断片もしくはｍｉＲＮＡ前駆体をコードするＤＮＡ配列）の点から説明することができる。
【００５６】
ＭＩＲ遺伝子ファミリーは、かなり大きいようであり、少なくとも一部のゲノムの１％を占めると推定されるようであり、すべての遺伝子の約３分の１の発現に影響することまたはそれらを調節することができるようである（例えば、Ｔｏｍａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，１５（２００５），Ｒ６１−６４；Ｔａｎｇ  Ｇ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，３０（２００５），１０６−１４；Ｋｉｍ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６（２００５），３７６−３８５を参照。）。ｍｉＲＮＡは、例えば、細胞の分化、増殖およびアポトーシスに関与し、ならびにｍｉＲＮＡが癌遺伝子としてまたは腫瘍サプレッサーとして様々に機能することができる、癌をはじめとする、少なくとも一部の疾患の病状におそらく関与する。例えば、Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４３５（２００５），８３９−８４３；Ｃａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０２（２００５），５５７０−５５７５；Ｍｏｒｒｉｓ  ａｎｄ  ＭｃＭａｎｕｓ（２００５）Ｓｃｉ．ＳＴＫＥ，ｐｅ４１（オンライン上でｓｔｋｅ．ｓｃｉｅｎｃｅｍａｇ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｒｅｐｒｉｎｔ／ｓｉｇｔｒａｎｓ；２００５／２９７／ｐｅ４１．ｐｄｆにて入手可能）を参照。マイクロＲＮＡ（ＭＩＲ）遺伝子は、植物種間での保存、安定な折り畳み構造、およびダイサー様酵素による特異的ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊二重鎖のプロセッシングをはじめとする、同定特性を有する（Ａｍｂｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）ＲＮＡ，９：２７７−２７９）。これらの特性を用いて、後生動物ｍｉＲＮＡヘアピン前駆体に特有である配列および二次構造保存のパターンについて検索することにより進化的に保存されるｍｉＲＮＡを同定する系統的な計算論的アプローチによって分子クローニングを補足することにより、ｍｉＲＮＡおよびそれらの対応する遺伝子を同定することができる（Ａｍｂｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，１３（２００３），８０７−８１８；Ｇｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １１（２００３），１２５３−１２６３；Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１３（２００３），Ｒ９２５−Ｒ９３６；Ｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９（２００３），１５４０およびＬｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１７（２００３），９９１−１００８。公的に利用できるマイクロＲＮＡ遺伝子は、ｍｉＲＢａｓｅに目録が作成されている（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３１：４３９−４４１）。本発明によると、用語「ｍｉＲＮＡ前駆体」は、成熟ｍｉＲＮＡのすべての前駆形態、すなわち、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡおよびｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、を交換可能に指す。
【００５７】
ｍｉＲＮＡの認識部位は、５’非翻訳領域、コーディング領域および３’非翻訳領域をはじめとするｍＲＮＡのすべての領域において検証されており、これは、コーディング配列に対するｍｉＲＮＡ標的部位の位置が、抑制に必ずしも影響を及ぼさないことを示す（例えば、Ｒｈｏａｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｅｌｌ，１１０：５１３−５２０；Ｙｅｋｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０４（２００４），ｐｐ．５９４−５９６；Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，１５（２００５），７４３−７４９；Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １１５（２００３），７８７−７９８；Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １２０（２００５），１５−２０；Ｂａｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４５５（２００８），６４−７１  ａｎｄ  Ｓｅｌｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ    ４５５  （２００８），５８−６３を参照）。
【００５８】
ｍＲＮＡとｍｉＲＮＡ間の結合は完璧である必要はなく、多少のミスマッチが、ｍｉＲＮＡ効率に対して一切影響なく観察されている。これに関連して、実験により検証され，このｍｉＲＮＡのその５’端を示すｍｉＲＮＡ標的部位は、その標的に対して相補的な塩基をその３’末端より多く有する傾向があることを示す（Ｍｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ８８（１９９７），６３７−６４６；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ａｎｄ  Ｈｏｂｅｒｔ，Ｎａｔｕｒｅ  ４２６（２００３），８４５−８４９；Ｊｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ  ２（１１）：ｅ３６３（２００４））。したがって、配列番号１から６６および６８、６９、７１、７２、７４、７５、７７および７８のいずれか１つのヌクレオチド配列との８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列から成るマイクロＲＮＡ、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列から成るマイクロＲＮＡを、本発明のマイクロＲＮＡとして挙げることもあり、その変異体と呼ぶこともある。
【００５９】
表１に示した本発明のそれぞれのｍｉＲＮＡ分子の中でｍｉＲＢａｓｅに示されているような配列番号１から６６の、および配列番号６７、７０、７３または７６の、いずれか１つの前駆体ｍｉＲＮＡヌクレオチド配列との８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列から成る前駆体マイクロＲＮＡ、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列から成るマイクロＲＮＡを、本発明の前駆体マイクロＲＮＡとして挙げることもあり、その変異体と呼ぶこともある。
【００６０】
前記変異体は、ストリンジェントな条件下で参照ヌクレオチド配列に、その補体に、またはそれと実質的に同一のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列であることもある。当業者には理解されるであろうが、一本鎖の描写は、相補鎖の配列も規定する。したがって、核酸は、描写する一本鎖の相補鎖も包含する。当業者には同じく理解されるであろうが、核酸の多くの変異体を、所与の核酸と同じ目的で使用することができる。したがって、核酸は、実質的に同一の核酸およびその補体を包含する。当業者には同じく理解されるであろうが、一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズすることができるプローブのためのプローブを提供する。したがって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。
【００６１】
本明細書において用いる場合の「プローブ」は、１つ以上のタイプの化学結合によって、通常は相補塩基対合によって、通常は水素結合形成によって、相補配列の標的核酸に結合できるオリゴヌクレオチドを意味し得る。プローブは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存して、プローブ配列との完全相補性を欠く標的配列を結合することができる。標的配列と本発明の一本鎖核酸間のハイブリダイゼーションに干渉することになる任意の数の塩基対ミスマッチがあってよい。しかし、ストリンジェンシーが最も低いハイブリダイゼーション条件下でさえハイブリダイゼーションが起こることができないほど突然変異の数が多い場合、その配列は、相補標的配列ではない。
【００６２】
本明細書において用いる「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、第一の核酸配列（例えば、プローブ）が、核酸混合物中のものなどの、第二の核酸配列（例えば、標的）にハイブリダイズすることになるが、他の配列にはハイブリダイズすることにならない条件を意味し得る。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、状況が異なれば異なることになる。一般に、ストリンジェントな条件は、被定義イオン強度ｐＨでのその具体的な配列の融点（ｔｈｅｒｍａｌ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ：Ｔｍ）より約５〜１０℃低いように選択される。前記Ｔｍは、（被定義イオン強度、ｐＨ、および核酸濃度（ｎｕｃｌｅｉｃ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）下で）標的に相補的なプローブの５０％が平衡時にその標的配列にハイブリダイズする（標的配列が過剰に存在する場合、Ｔｍで、前記プローブの５０％が平衡時に占有される）温度であり得る。ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０から８．３で約１．０Ｍナトリウムイオン未満、典型的には０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、ならびに温度が、短いプローブ（例えば、約１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、および長いプローブ（例えば、約５０ヌクレオチドより大きいもの）については少なくとも約６０℃である条件であり得る。ストリンジェントな条件をホルムアミドなどの不安定化剤の添加で達成することもできる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションについての陽性シグナルは、バックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも２から１０倍であり得る。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては次のものが挙げられる：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でのインキュベーション、または５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でのインキュベーションと、６５℃で０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中での洗浄。
【００６３】
本明細書において用いる「実質的に相補的」は、第一の配列が、第二の配列の補体と８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド以上の領域にわたって少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％同一であること、または前記２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味し得る。
【００６４】
本明細書において用いる「実質的に同一の」は、第一および第二の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチドもしくはアミノ酸以上の領域にわたって、または第一の配列が第二の配列の補体と実質的に相補的である場合には核酸に対して、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であることを意味し得る。
【００６５】
本明細書において用いる場合、用語「結合分子」は、対象となる標的に特異的に結合する任意の薬剤（例えば、ペプチド、タンパク質、核酸ポリマー、アプタマー、スピーゲルマーまたは小分子）を指す。特定の好ましい実施形態において、本発明の意味での用語「結合分子」は、合成ｍｉＲＮＡミミック、ＲＮＡ−分子、抗体、アプタマー、スピーゲルマー、およびｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはそれらの変異体の修飾変異体を含む。かかる変異体を化学合成することができ、およびかかる変異体は、ＲＮＡサイレンシング関連プロセスに有利な点を有し得る。これらの修飾の一部、例えば、２’−ｏ−メチル、２’−ｏ−アリル、２’−デオキシ−フルオロウリジン修飾、またはホスホチオエートは、ｍｉＲＮＡ関連分子を分解しないように保護するのに役立ち得る。他の修飾、例えば、メチレン架橋をリボース環の４’−炭素で２’−酸素と連結させるロックト核酸修飾は、ｍｉＲＮＡ関連分子のその標識に対する親和性を増加させることまたはそのオフターゲット効果を低減させることにも役立つ。他の修飾は、アルゴノート（Ａｒｇｏｎａｕｔｅ）複合体（Ｈａｍｍｅｌｌ  ＣＭ．，ＲＮＡ  Ｂｉｏｌ．５（２００８），１２３−１２７）へのｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの正確な鎖の負荷を、例えば５’リン酸またはメチルを二本鎖ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊複合体（ｍｉＲＮＡ＊は、その前駆体の反対側のアームから生ずるｍｉＲＮＡのパートナー鎖である）の一方の鎖に付加させることにより、増進することができる。
【００６６】
対象となる標的を、本明細書では、上文にて定義したとおりの本発明のｍｉＲＮＡ分子の、好ましくは核酸内の、最も好ましくはｐｒｅ−ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ−分子の認識部位と定義する。標的核酸の機能へのかかる干渉の総合効果は、前記遺伝子の発現の特異的修飾である。本発明に関連して、「修飾」は、遺伝子の発現の増加（刺激）または減少（阻害）のいずれかを意味する。本発明に関連して、特に「免疫修飾」に関して、阻害は、遺伝子発現の好ましい修飾形態である。マイクロＲＮＡの５’末端側のヌクレオチド２から８（シード配列）に相補的なヌクレオチド配列を有するｍＲＮＡは、該マイクロＲＮＡによるその翻訳の抑制を受ける（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１５，Ｒ４５８−Ｒ４６０（２００５））ので、本発明のマイクロ−ＲＮＡのシード配列に相補的なヌクレオチド配列を、本発明のマイクロ−ＲＮＡまたは結合分子の標的ヌクレオチド配列として挙げることもある。
【００６７】
「ｍｉＲＮＡミミック」は、非天然二本鎖ｍｉＲＮＡ様ＲＮＡ断片である。それらは、標的遺伝子に特有の３’ＵＴＲにおける選択配列に対して部分的に相補的なモチーフを保有する５’末端を有するように設計される。細胞に導入されると、ｍｉＲＮＡミミックは、その標的遺伝子に特異的に結合することができ、その遺伝子の転写後抑制、より具体的にはその遺伝子の翻訳阻害を生じさせることができる。幾つかの遺伝子を一度に標的にすることができる内因性ｍｉＲＮＡとは異なり、ｍｉＲ−ミミックは、遺伝子特異的様式で作用する（Ｗａｎｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．６７６（２０１１），２１１−２２３；Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２１２（２００７），２８５−２９２）。
【００６８】
本明細書において用いる場合、用語「アプタマー」は、標的分子との非ワトソン・クリック相互作用に基づく高い親和性特異性で他の分子を結合するそれらの能力に基づいてランダムプールから選択されたＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す（例えば、Ｃｏｘ  ａｎｄ  Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．９（２００１），２５２５−２５３１；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２（２００４），Ｄ９５−Ｄ１００を参照）。核酸、タンパク質、小有機化合物、ビタミン、無機化合物、細胞およびさらには生物全体を結合するアプタマーを選択することができる。
【００６９】
本発明のペプチドおよびアプタマーは、任意の適する方法によって合成される。例えば、本発明の標的指向性ペプチドおよびアプタマーを固相ペプチド合成によって化学合成することができる。固相合成のための技法は、例えばＢａｒａｎｙ  ａｎｄ  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９７９）Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；ｐｐ．１−２８４  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｇｒｏｓｓ．  ａｎｄ  Ｍｅｉｎｅｈｏｆｅｒ，  ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．２，Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐａｒｔ  Ａ．；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，８５（１９６３），２１４９−２１５４；およびＳｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ  （１９８４）  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄ．Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓによって記載されている。
【００７０】
スピーゲルマーは、標的またはその一部分に対して結合活性を示す多数のＬ−ヌクレオチドを含む核酸である。基本的なスピーゲルマー産生方法は、国際特許出願・国際公開第１９９８／００８８５６号パンフレットに従い、前記特許出願の開示は参照により本明細書に援用されている。基本的に、この方法は、例えば米国特許第５，４７５，０９６号明細書に記載されているような、いわゆるＳＥＬＥＸ法に依存する。前記方法は、５’および３’末端における２つのプライマー結合領域が隣接する約１０から約１００ヌクレオチドのランダム化ストレッチを含むコンビナトリアルＤＮＡまたはＲＮＡライブラリーを使用する。かかるコンビナトリアルライブラリの産生は、例えば、Ｃｏｎｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２６７（１９９６），３３６−３６７に記載されている。かかる化学合成一本鎖ＤＮＡライブラリーをポリメラーゼ連鎖反応によって二本鎖ライブラリーに変換することができる。
【００７１】
かかるライブラリーを既に選択のために使用することができる。この選択は、ライブラリー、典型的には一本鎖ライブラリーを標的分子と接触させ、その後、そのライブラリーの結合要素を増幅させるようにして行われる。これらの段階を数回繰り返すことにより、使用する標的に対して有意な結合活性を有するオリゴヌクレオチド分子を産生することができる。
【００７２】
「抗体」は、例えばＴｉｊｓｓｅｎ（Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐ．，Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，１１，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ｔｈｅ  ｗｈｏｌｅ  ｂｏｏｋ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ  ｐａｇｅｓ  ４３−７８）に記載されているような、従来技術の手順によって産生される。本発明の抗体は、完全な抗体に加えて、例えばＦ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ）断片およびＦ（ａｂ’）２断片、または任意の他の抗原結合断片をはじめとする様々な形態で存在することがあることはもちろん、一本鎖で存在することもある；例えば、国際出願・国際公開８８／０９３４４号、同第２００５／００３１６９号、同第２００５／００３１７０号および同第２００５／００３１７１号パンフレットを参照。
【００７３】
本発明に従って使用することができる抗体は、免疫グロブリン分子、すなわち、抗原を特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子、および免疫グロブリン分子の免疫活性部分を含む。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子のいずれのクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤもしくはＩｇＡ）またはサブクラスのものであってもよい。
【００７４】
ポリヌクレオチド：
用語「ポリヌクレオチド」は、単数の核酸はもちろん複数の核酸も包含することを意図したものであり、単離された核酸分子または構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、従来的ホスホジエステル結合または非従来的結合（例えば、アミド結合、例えば、ペプチド核酸（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ：ＰＮＡ）において見いだされるもの）を含むことがある。用語「核酸」または「二本鎖核酸」は、本発明の少なくとも１つのｍｉＲＮＡ分子をコードする配列を好ましくは含む、ポリヌクレオチド中に存在する任意の１つ以上の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡまたはＮＲＡ断片を指す。「単離された」核酸またはポリヌクレオチドは、その天然の環境から除去された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを意図したものである。例えば、ベクターに含有される少なくとも１つのｍｉＲＮＡまたは抗体をコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的では単離されていると見なされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例としては、異種宿主細胞内に維持されている組み換えポリヌクレオチド、または溶解状態の（部分的にもしくは実質的に）精製されたポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたＲＮＡ分子は、本発明のポリヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡ転写産物を含む。本発明による単離されたポリヌクレオチドまたは核酸は、さらに、合成生産されたかかる分子を含む。加えて、ポリヌクレオチドまたは核酸は、調節要素、例えばプロモーター、リボース結合部位、または転写ターミネーターでありうるか、またはそれらを含みうる。
【００７５】
本明細書において用いる場合、「コーディング領域」は、アミノ酸に翻訳されたコドンから成る、または機能性ＲＮＡ、例えばｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ分子の前駆体、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡの配列を含む、核酸の一部分である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡまたはＴＡＡ）は、アミノ酸に翻訳されないが、コーディング領域の一部とみなすことができ、しかし、いずれの隣接配列も、例えば、プロモーター、リボース結合部位、転写ターミネーター、イントロンおよびこれらに類するものは、コーディング領域の一部ではない。もちろん、この区別は、ｍｉＲＮＡをコードする配列であって、かかる種類の配列、例えばタンパク質コーディング遺伝子のイントロンの配列、内のそれらの元の遺伝子座から抽出されたものである配列を指すのではなく、本発明のポリヌクレオチド構築物内の配列の機能を指す。コーディング領域は、それらに連結された５’または３’非翻訳配列を場合によっては含むコーディング配列（例えば、エキソンおよびｍｉＲＮＡ）に対応するｍＲＮＡまたはｃＤＮＡであってもよい。コーディング領域は、コーディング領域のすべてもしくは一部および／またはそれに連結された５’もしくは３’非翻訳配列を含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生産された増幅核酸分子であってもよい。
【００７６】
本発明の２つ以上のコーディング領域が単一のポリヌクレオチド構築物中に、例えば単一のベクター上に、存在する場合もあり、または別々のポリヌクレオチド構築物中に、例えば別々の（異なる）ベクター上に、存在する場合もある。さらに、いずれのベクターも、単一のコーディング領域を含有することがあり、または２つ以上のコーディング領域を含むこともある、例えば、単一のベクターが、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を別々にコードすることもある。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチドまたは核酸は、結合分子、抗体、またはその断片、変異体もしくは誘導体をコードする核酸に融合している、または融合していない、異種コーディング領域をコードすることがある。異種コーディング領域としては、限定ではないが、特殊要素またはモチーフ、例えば、分泌シグナルペプチドまたは異種機能性ドメインが挙げられる。
【００７７】
いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドまたは核酸は、ＤＮＡである。ＤＮＡの場合、ｍｉＲＮＡまたはポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、１つ以上のコーディング領域と作動可能に会合しているプロモーターおよび／または他の転写もしくは翻訳制御要素を通常は含むであろう。作動可能な会合は、遺伝子産物、例えばポリペプチド、についてのコーディング領域が、１つ以上の調節配列と、その（それらの）調節配列の影響または制御下でその遺伝子産物の発現が起こるように会合しているときに存在する。２つのＤＮＡ断片（例えば、ｍｉＲＮＡ／ポリペプチドコーディング領域およびそれと会合しているプロモーター）は、プロモーター機能の誘導が、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写を生じさせる結果となる場合、および２つのＤＮＡ断片間の連結が、遺伝子産物の発現を命令する発現調節配列の能力に干渉しない、またはＤＮＡテンプレートの被転写能力に干渉しない場合、「作動可能に会合している」または「作動可能に連結されている」。したがって、プロモーター領域は、ｍｉＲＮＡ／ポリペプチドをコードする核酸と、そのプロモーターがその核酸の転写に影響を及ぼすことができる場合、作動可能に会合していることになる。前記プロモーターは、所定の細胞内のみでのＤＮＡの実質的転写を命令する細胞特異的プロモーターであってよい。プロモーターに加えて、他の転写制御要素、例えば、エンハンサー、オペレーター、レプレッサーおよび転写終結シグナルをポリヌクレオチドと動作可能に会合させて、細胞特異的転写を命令することができる。適するプロモーターおよび他の転写制御領域をここで説明する。
【００７８】
様々な転写制御領域が当業者には公知である。これらとしては、限定ではないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、サイトメガロウイルスからのプロモーターおよびエンハンサーセグメント（イントロン−Ａとともに、最初期プロモーター）、シミアンウイルス−４０からのプロモーターおよびエンハンサーセグメント（初期プロモーター）、ならびにレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス）からのプロモーターおよびエンハンサーセグメント（しかしこれらに限定されない）が挙げられる。他の転写制御領域としては、脊椎動物遺伝子に由来するもの、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモンおよびウサギβ−グロブリン、ならびに真核細胞における遺伝子発現を制御することができる他の配列が挙げられる。さらなる適する転写制御領域としては、組織特異的プロモーターおよびエンハンサー、ならびにリンホカイン誘導性プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘導され得るプロモーター）が挙げられる。
【００７９】
同様に、様々な翻訳制御要素が通常の当業者には公知である。これらとしては、リボース結合部位、翻訳開始および終結コドン、ならびにピコナウイルスに由来する要素（特に、配列内リボソーム進入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）、すなわちＩＲＥＳ；ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
特に好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ前駆体、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または任意の他のＲＮＡ産物の形態でのＲＮＡである。
【００８１】
分子の類似性および／または同一性の決定：
２ペプチド間の「類似性」は、あるペプチドのアミノ酸配列を第二のペプチドの配列と比較することによって決定する。あるペプチドのアミノ酸は、第二のペプチドの対応するアミノ酸と、それが同一または保存的アミノ酸置換である場合、類似している。保存的置換は、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，ｅｄ．，Ｔｈｅ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９７８）に、およびＡｒｇｏｓ，ＥＭＢＯ  Ｊ．８（１９８９），７７９−７８５に記載されているものを含む。例えば、次の群のうちの１つに属するアミノ酸が保存的変化または置換の代表である：−Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；−Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ；−Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ；−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ；および−Ａｓｐ、Ｇｌｕ。
【００８２】
２配列間の同一性または類似性パーセントの決定は、好ましくは、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７の数学的アルゴリズムを用いて果たす。かかるアルゴリズムは、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｅ）で入手できるＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０のＢＬＡＳＴｎおよびＢＬＡＳＴｐプログラムに組み込まれている。
【００８３】
同一性または類似性パーセントの決定は、ＢＬＡＳＴｎおよびＢＬＡＳＴｐプログラムの標準パラメータを用いて、具体的な長さおよび組成の配列に関してＮＣＢＩウェブページ上でおよび「ＢＬＡＳＴ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｇｕｉｄｅ」の中で推奨されているとおりに行う。
【００８４】
ＢＬＡＳＴポリヌクレオチド検索は、ＢＬＡＳＴｎプログラムを用いて行う。一般パラメータについては、「Ｍａｘ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ボックスを１００に設定してよく、「Ｓｈｏｒｔ  ｑｕｅｒｉｅｓ」ボックスにチェックマークを付けてよく、ＮＣＢＩウェブページ上で短い配列（２０塩基未満）について推奨されているように、「Ｅｘｐｅｃｔ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ」ボックスを１０００に設定してよく、および「Ｗｏｒｄ  Ｓｉｚｅ」ボックスを７に設定してもよい。より長い配列については、「Ｅｘｐｅｃｔ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ」ボックスを１０に設定してよく、および「Ｗｏｒｄ  Ｓｉｚｅ」ボックスを１１に設定してよい。スコアリングパラメータについては、「Ｍａｔｃｈ／ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｓｃｏｒｅｓ」を１、−２に設定してよく、および「Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ」ボックスを線形に設定してよい。フィルターおよびマスキングパラメータについては、「Ｌｏｗ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｒｅｇｉｏｎｓ」ボックスにチェックマークを付けなくてよく、「Ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ」ボックスにチェックマークを付けなくてよく、「Ｍａｓｋ  ｆｏｒ  ｌｏｏｋｕｐ  ｔａｂｌｅ  ｏｎｌｙ」ボックスにチェックマークを付けてよく、「ＤＵＳＴ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｓｅｔｔｉｎｇｓ」にチェックマークを付けてよく、および「Ｍａｓｋ  Ｌｏｗｅｒ  ｃａｓｅ  ｌｅｔｔｅｒｓ」ボックスにチェックマークを付けなくてよい。一般に、これに関しては、上に示した設定の大部分を規定する「Ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｓｈｏｒｔ  ｎｅａｒｌｙ  ｅｘａｃｔ  ｍａｔｃｈｅｓ」を用いてもよい。これについてのさらなる情報は、ＮＣＢＩウェブページ上で公開されている「ＢＬＡＳＴ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｇｕｉｄｅ」の中で見つけることができる。
【００８５】
ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＢＬＡＳＴｐプログラムを用いて行う。一般パラメータについては、「Ｍａｘ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ボックスを１００に設定してよく、「Ｓｈｏｒｔ  ｑｕｅｒｉｅｓ」ボックスにチェックマークを付けてよく、「Ｅｘｐｅｃｔ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ」ボックスを１０に設定してよく、および「Ｗｏｒｄ  Ｓｉｚｅ」ボックスを「３」に設定してもよい。スコアリングパラメータについては、「Ｍａｔｒｉｘ」ボックスを「ＢＬＯＳＵＭ６２」に設定してよく、「Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ」ボックスを「Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ：１１  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：１」に設定してよく、「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ」ボックスを「Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｓｃｏｒｅ  ｍａｔｒｉｘ  ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ」に設定してよい。フィルターおよびマスキングパラメータについては、「Ｌｏｗ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｒｅｇｉｏｎｓ」ボックスにチェックマークを付けなくてよく、「Ｍａｓｋ  ｆｏｒ  ｌｏｏｋｕｐ  ｔａｂｌｅ  ｏｎｌｙ」ボックスにチェックマークを付けなくてよく、および「Ｍａｓｋ  Ｌｏｗｅｒ  ｃａｓｅ  ｌｅｔｔｅｒｓ」ボックスにチェックマークを付けなくてよい。
【００８６】
両方のプログラムの、例えば検索配列の長さに関しての、変更は、ＮＣＢＩウェブページ上にＨＴＭＬおよびＰＤＦ版で公開されている「ＢＬＡＳＴ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｇｕｉｄｅ」における推奨に従って行う。
【００８７】
疾患および障害
別段の記述がない限り、用語「障害」および「疾患」を本明細書では交換可能に用いる。本明細書において用いる場合の用語「自己免疫障害」は、個体自体の組織もしくは器官もしくは共分離系から生ずるもしくはそれらに対する疾患もしくは障害、またはその症状発現、またはその結果として生ずる病態である。自己免疫疾患は、主として、適応免疫応答の調節不全によって引き起こされ、自己構造に対する自己抗体または自己反応性Ｔ細胞が形成される。ほぼすべての自己免疫疾患は、炎症性成分も有する。自己炎症性疾患は、主として炎症性であり、一部の古典的自己炎症性疾患は、先天的炎症経路の遺伝的欠陥によって引き起こされる。自己炎症性疾患では、自己反応性Ｔ細胞または自己抗体は形成されない。これらの自己免疫および自己炎症性障害の多くに、高ガンマグロブリン血症、高い自己抗体レベル、組織内の抗原−抗体複合体沈着、コルチコステロイドまたは免疫抑制処置からの恩恵、および罹患組織内のリンパ球様細胞凝集体をはじめとする（しかしこれらに限定されない）、多数の臨床および検査マーカーが存在し得る。理論に限定されないが、Ｂ細胞媒介自己免疫障害に関して、Ｂ細胞は、自己抗体生産、免疫複合体形成、樹状およびＴ細胞活性化、サイトカイン合成、直接ケモカイン放出および異所新生リンパ球産生巣の提供を含む多数のメカニズムの経路によって、ヒト自己免疫疾患において病原効果を明示すると考えられる。これらの経路の各々が、様々な程度に、自己免疫疾患の病状に関与し得る。
【００８８】
本明細書において用いる場合、「自己免疫障害」は、器官特異的疾患である（すなわち、免疫応答が、特異的に器官系、例えば内分泌系、造血系、皮膚、心肺系、胃腸および肝臓系、腎臓系、甲状腺、耳、筋神経系、中枢神経系など、に向けられる）こともあり、または多数の器官系を罹患させ得る全身疾患（例えば、全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ：ＳＬＥ）、関節リウマチ、多発性筋炎、自己免疫性多腺性内分泌不全症候群など）であることもある。好ましいそのような疾患としては、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性心筋症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性末梢神経障害、自己免疫性膵炎、多腺性自己免疫症候群、自己免疫性プロゲステロン皮膚炎、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性蕁麻疹、自己免疫性ブドウ膜炎、セリアック病、寒冷凝集素症、クローン病、皮膚筋炎、Ｉ型糖尿病、子宮内膜症、好酸球性筋膜炎、胃腸類天疱瘡、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、橋本脳症、橋本甲状腺炎、特発性血小板減少性紫斑病（自己免疫性血小板減少性紫斑病）、エリテマトーデス、ミラー・フィッシャー症候群（ギラン・バレー症候群）、混合性結合組織病、重力筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、再発性多発性軟骨炎、関節リウマチ、シェーグレン症候群、側頭動脈炎（「巨細胞性動脈炎」）、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病（混合性結合組織病）、血管炎、ウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。
【００８９】
処置および薬：
本明細書において用いる場合、用語「処置する」または「処置」は、治療的処置と予防または防止措置の両方を指し、その目的は、望ましくない生理変化または障害、例えば自己免疫および／または自己炎症性疾患の発現、を予防するまたは減速する（減らす）ことである。有益なまたは望ましい臨床結果としては、検出可能であるにせよ、検出不能であるにせよ、症状の緩和、疾病度の減少、安定化された（すなわち、悪化しない）疾病状態、疾患進行の遅延または減速、疾病状態の改善または一時的緩和、および（部分的であるにせよ、全体的であるにせよ）寛解が挙げられるが、これらに限定されない。「処置」は、処置を受けていない場合に予想される生存と比較したときの生存の延長も意味する。処置を必要とする者は、既に前記病態もしくは障害を有する者はもちろん、前記病態もしくは障害を有しやすい者、または前記病態または障害の症状発現を予防すべき者も含む。
【００９０】
別段の記述がない場合、用語「薬」、「医薬」または「薬物」は、本明細書では交換可能に用いており、これらに限定されるものではないが（Ａ）内用または外用の物品、医薬および調製物、ならびに人間または他の動物いずれかの疾患の診断、治癒、軽減、処置または予防に使用することを意図した任意の物質または物質の混合物；および（Ｂ）人間または他の動物の身体の構造または任意の機能に作用することを意図した物品、医薬および調製物（食品以外）；および（Ｃ）条項（Ａ）および（Ｂ）にて指定した任意の物品の成分として使用することを意図した物品、すべてを含むものとする。用語「薬」、「医薬」または「薬物」は、人間または他の動物に使用することを意図した完全処方の調製物であって、１つ以上の「薬剤」、「化合物」、「物質」または「（化学）組成物」をそのまま含有する、ならびに一部の他の状況では、フィラー、崩壊剤、滑沢剤、滑剤、結合剤のような、または人間もしくは他の動物の体内の所期の標的位置での、例えば皮膚、胃もしくは腸内での、「薬」、「医薬」もしくは「薬物」の容易な輸送、崩壊、解凝集、溶解および生物学的利用能を確実なものにする、他の医薬的に不活性な賦形剤も含有するものである調製物を含むものとする。用語「薬剤」、「化合物」または「物質」を本明細書では交換可能に用いており、これらの用語は、より特別な状況では、医薬活性薬剤、すなわち、所望の生物学的もしくは薬理学的効果を誘導する薬剤、または本発明の方法によるそのような可能な薬理学的効果の誘導能力について調査または試験される薬剤を含むものとする（しかしこれらに限定されない）。
【００９１】
本明細書に従って用いる場合の用語「免疫修飾」は、抗体または感作細胞であって、それらの生産を開始させる抗原を認識し、該抗原と反応するものである抗体または感作細胞を生産する免疫系の能力を増強すること（免疫強化）または低下させること（免疫抑制）による、免疫応答の改変を指す。免疫修飾に適する幾つかの物質、例えば、細胞傷害剤、チモシンおよび免疫グロブリンは、当該技術分野において公知である。
【００９２】
医薬担体：
医薬的に許容され得る担体および投与経路は、当業者に公知の対応する文献から得ることができる。本発明の医薬組成物を、当該技術分野において周知の方法に従って調合することができる；例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０００）ｂｙ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＩＳＢＮ  ０−６８３−３０６４７２，Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ，２００３；Ｂａｎｇａ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ．２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｃｉｓ．（２００６），ＩＳＢＮ：０−８４９３−１６３０−８を参照。適する医薬担体の例は、当該技術分野において周知であり、それらとしては、リン酸緩衝食塩液、水、エマルジョン、例えば油／水型エマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、無菌液などが挙げられる。かかる担体を含む組成物を、周知の従来的方法によって調合することができる。これらの医薬組成物を被検体に適する用量で投与することができる。適する組成物の投与を様々な経路で果たすことができる。例としては、医薬的に許容され得る担体を含有する組成物の経口、鼻腔内、直腸内、局所、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、真皮下、経皮、クモ膜下および頭蓋内法による投与が挙げられる。鼻腔スプレー製剤などのエアロゾル製剤は、保存薬および等張剤を伴う活性薬剤の精製水溶液または他の溶液を含む。かかる製剤を、好ましくは、鼻粘膜と適合性のｐＨおよび等張状態に調整する。経口投与のための医薬組成物、例えば、単一ドメイン抗体（例えば、「ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）」）なども、本発明の中で構想される。かかる経口製剤は、例えば、錠剤、カプセル、粉末、液体または半固体形態であり得る。錠剤は、固体担体、例えばゼラチン、またはアジュバントを含むことがある。直腸内または膣内投与用の製剤は、適する担体を用いて坐剤として提供することができる；Ｏ’Ｈａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２（９）（２００３），７２７−７３５も参照。様々なタイプの投与に適している製剤に関するさらなるガイダンスは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，１７ｔｈ  ｅｄ．（１９８５）および対応する最新版において見つけることができる。薬物送達方法の簡潔なレビューについては、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９（１９９０），１５２７−１５３３を参照。
【００９３】
修飾されていない裸のアンチセンス分子は、それらが負の電荷を有していようと、いまいと、細胞によってあまり内在化されないと報告されている（Ｇｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５３（１９９７）．１４６５−１４７６，Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２（１９９３），４８５５−４８６１．Ｂｅｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４１  （１９９２），１０２３−１０３３）。したがって、他の薬剤、例えば、脂質担体（Ｆａｔｔａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５６（２００４），９３１−９４６）、微粒子（Ｋｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ  １２（２００４），３９３−４０４）、小胞、例えばエキソソーム（実施例４を参照）を用いて、または細胞膜を通してアンチセンス分子を転座させる細胞貫通ペプチド（ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ＣＰＰ）への共有結合コンジュゲーションによって、オリゴヌクレオチドを修飾し、組成物に使用することができる；レビューについては、Ｌｙｓｉｋ  ａｎｄ  Ｗｕ−Ｐｏｎｇ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９２（２００３），１５５９−１５７３を参照。
【００９４】
エキソソーム：
これに関連して、小胞またはエキソソームも使用することができる。「エキソソーム」は、後期エンドソーム多胞体と形質膜の融合後に細胞外環境に分泌される約３０〜１００ｎｍのエンドソーム由来の小胞である（Ｇａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５２（２００１），１６５−１８０）。様々な組織タイプからの細胞、例えば、樹状細胞、Ｂリンパ球、腫瘍細胞および肥満細胞などが、エキソソームを分泌することは証明されている。異なる起源からのエキソソームは、別個のセットのタンパク質および脂質部分を呈示する（Ｊ  Ｔｈｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４７（１９９９），５９９−６１０；Ｔｈｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６６（２００１），７３０９−７３１８）。それらは、抗原提示および免疫修飾に関与するタンパク質を著しく含有し、これは、エキソソームが細胞間コミュニケーションに一定の役割を果たし（Ｓｉｍｏｎｓ  ａｎｄ  Ｒａｐｏｓｏ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２１（２００９），５７５−５８１；Ｔｈｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９（２００９），５８１−５９３）、それによって免疫応答の修飾をもたらすことを示唆する。治療目的でのまたは研究ツールとしてのエキソソームの生産、精製または使用方法は、例えば、国際公開第９９／０３４９９号、同第００／４４３８９号および同第９７／０５９００号パンフレットに記載されており、これらの開示内容は、参照により本明細書に援用されている。さらに、人工エキソソームの生産方法も当該技術分野において公知である。かかる人工エンドソームは、Ｄｅ  Ｌａ  Ｐｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．３４４（２００９），１２１−１３２に記載されているように、被覆リポソームから誘導することができる。
【００９５】
それらの免疫原特性および治療特性を考えると、エキソソームの内容物を、それらの特性を変えるように修飾できることは、特に有用であるだろう。これに関しては、組換えタンパク質をコードするプラスミドがトランスフェクトされた細胞に由来する組換えエキソソームが当該技術分野において記載されている。かかる組換えエキソソームは、プラスミドにコードされた組換えタンパク質を含有する（国際公開第００／２８００１号パンフレット）。
【００９６】
発現：
本明細書において用いる場合の用語「発現」は、遺伝子が生化学物質、例えばＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはポリペプチド、を生産するプロセスを指す。このプロセスは、限定ではないが、遺伝子ノックダウンならびに一過的発現と安定した発現の両方を含めて、細胞内での遺伝子の機能的存在の一切の顕在化を含む。それは、限定ではないが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または任意の他のＲＮＡ産物への遺伝子の転写、およびかかるｍＲＮＡのポリペプチド（単数または複数）への翻訳を含む。最終的に望まれる産物が生化学物質である場合、発現は、その生化学物質および任意の前駆体の生成を含む。遺伝子の発現は、「遺伝子産物」を生産する。本明細書において用いる場合、遺伝子産物は、核酸、例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、遺伝子の転写によって生産されるメッセンジャーＲＮＡ、または転写産物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであり得る。本明細書に記載する遺伝子産物は、転写後修飾、例えばポリアデニル化、を有する核酸、または翻訳後修飾、例えばメチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、タンパク質分解性切断およびこれらに類するもの、を有するポリペプチドをさらに含む。
【００９７】
ポリヌクレオチド配列を含有するおよび発現させるために、様々な発現ベクター／宿主系を利用することができる。これらとしては、微生物、例えば、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターがトランスフェクトされた細菌；酵母発現ベクターがトランスフェクトされた酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス（ｔｏｂａｃｃｏ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）、ＴＭＶ）がまたは細菌発現ベクター（例えば、ＴｉもしくはｐＢＲ３２２プラスミド）がトランスフェクトされた植物細胞系；動物またはヒト細胞系が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９８】
宿主細胞においてｍｉＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチドまたは融合タンパク質（本明細書では以後「産物」と呼ぶ）を発現させるために、次のものなどの手順を用いることができる。前記産物をコードするＤＮＡ配列を含有する制限断片を、宿主細胞において機能する複製起点を含有する適切な組換えプラスミド、および適切な選択マーカーにクローニングすることができる。前記プラスミドは、前記産物の誘導性発現のためのプロモーター（例えば、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  ６９（１９８８），３０１  ３１５）およびｐＥＴｌ  Ｉｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０），６０  ８９）を含むことができる。前記組換えプラスミドを例えばエレクトロポレーションによって宿主細胞に導入することができ、その組換えプラスミドを含有する細胞を、そのプラスミド上のマーカーについての選択によって同定することができる。その産物に特異的なアッセイを使用して、その産物の発現をその宿主細胞において誘導し、検出することができる。
【００９９】
一部の実施形態では、前記産物／ｍｉＲＮＡ／ポリペプチドをコードするＤＮＡを前記宿主細胞における発現について最適化することができる。例えば、前記ＤＮＡは、前記宿主細胞内のプレドメインである１つ以上のアミノ酸についてのコドンを、同じアミノ酸についての他のコドンに相対して含むことができる。
【０１００】
誘導性プロモーターの一例は、最小プロモーター、例えば、上流エンハンサー配列（原ＣＭＶプロモーターからの＋７５から−５３の配列）がないＣＭＶプロモーター（Ｇｏｓｓｅｎ  ａｎｄ  Ｂｕｊａｒｄ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．８９（１９９２），５５４７−５５５１を参照）と、様々なテトラサイクリン／ドキシサイクリン濃度の存在下で濃度依存性活性を示すテトラサイクリン耐性オペロン配列プロモーターとの組み合わせである。非変性ＣＭＶプロモーターが構成的発現に使用されうる。
【０１０１】
誘導性プロモーターの使用は、ｍｉＲＮＡ発現細胞におけるＲＮＡ蓄積または過飽和の細胞毒性低減をもたらすことができる。あるいは、本発明に従って、一定の期間、所期のｍｉＲＮＡエフェクターを一貫して発現することができる構成的発現系を使用することができる。好ましくは、ｍｉＲＮＡまたはそれらの類似体の発現をＣＭＶプロモーターによって駆動し、これは、多くの場合、ヒト細胞内で約１ヶ月の活性化後、ＤＮＡメチル化のため発現停止される。かかる１ヶ月活性化メカニズムは、処置細胞におけるＲＮＡ蓄積または過飽和を防止する点で有益であり得る。
【０１０２】
ヒト細胞へのｍｉＲＮＡ発現核酸組成物の送達は、リポソーム／ポリソーム／化学的トランスフェクション、ＤＮＡ組換え、エレクトロポレーション、遺伝子銃貫通、トランスポゾン／レトロトランスポゾン挿入、ジャンピング遺伝子組み込み、マイクロインジェクション、ウイルス感染、レトロウイルス／レンチウイルス感染、およびこれらの組み合わせから選択される非遺伝子導入または遺伝子導入法を用いて果たすことができる。ランダムな導入遺伝子挿入および細胞突然変異の危険を防ぐために、リポソームまたはポリソームトランスフェクションを用いて、ｍｉＲＮＡ配列含有ベクターを標的ヒト細胞（例えば、患者の自己細胞）に送達することができる。特に好ましい実施形態では、人工エキソソームを使用することができる；これに関しては実施例４も参照。選ばれた少なくとも１つのｍｉＲＮＡ、その前駆体、変異体または類似体の発現は、選ばれたプロモーターに依存し、例えば、構成的であることもあり、誘導性であることもあり、または一時的であることもある。
【０１０３】
本発明は、本発明の核酸を次のもののいずれかまたはすべてと一緒に含むキットにも関する：アッセイ試薬、緩衝液、プローブおよび／またはプライマー、ならびに無菌食塩水または別の医薬的に許容され得る担体。加えて、前記キットは、本発明の方法の実施のための用法（例えば、プロトコル）を含む説明書を含むことがある。
【０１０４】
これらおよび他の実施形態を本発明の記載および実施例によって開示し、包含する。本発明に従って用いる材料、方法、使用および化合物のいずれか１つに関するさらなる文献を、例えば電子デバイスを使用して、公的ライブラリーおよびデータベースから検索することができる。例えば、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）の国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）および／または国立医学図書館（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）主催の公的データベース「Ｍｅｄｌｉｎｅ」を利用することができる。さらなるデータベースおよびウェブアドレス、例えば、欧州分子生物学研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：ＥＭＢＬ）の一部門である欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ）のものは、当業者に公知であり、インターネット検索エンジンを用いてそれらを得ることもできる。生物工学に関する特許情報の概観、ならびに遡及検索におよび文献速報に有用な適切な特許情報源の通覧は、Ｂｅｒｋｓ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １２（１９９４），３５２−３６４に与えられている。
【０１０５】
上の開示は、本発明を一般に説明するものである。別段の記述がない限り、本明細書において用いる場合の用語には、２０００年に改訂され、２００３年に再版された、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７，ＩＳＢＮ  ０  １９  ８５０６７３  ２に提供されているとおりの定義が与えられている。本明細書の本文全体を通して、幾つかの文書を引用している。全書誌的引用は、特許請求の範囲の直前の本明細書の最後に見つけることができる。すべての引用した参照資料（本願全体を通して引用している文献参照資料、発行特許、公開特許出願、および製造業者の仕様書、説明書など）は、参照により本明細書に特別に援用されている；しかし、引用したいずれかの文書が実際に本発明についての先行技術であるという承認ではない。
【０１０６】
以下の具体的な実施例を参照することによって、より完全な理解を得ることができる。これらの実施例は、単に例証を目的として本明細書に提供するものであり、本発明の範囲を制限することを意図したものではない。
【０１０７】
実施例
続く実施例は、本発明のさらなる例証となるが、いかなる点においても本発明の範囲を制限するとみなしてはならない。以下の実施例１から１２における実験は、ｍｉＲＮＡ−遺伝子クラスタ；胎盤試料において同定されるような個々のｍｉＲＮＡ遺伝子；ならびに例えば妊娠中の、脱調節化免疫に関連づけられる幾つかの疾患の処置および診断におけるこれらのｍｉＲＮＡ、それらの前駆体、変異体および類似体の新規使用に関して、例証し、説明する。これに関連して図および表１から３も参照。
【実施例１】
【０１０８】
妊娠週との関連での胎盤組織におけるｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐの相対発現
【０１０９】
材料および方法
ＲＮＡ単離
妊娠第７週と第３３週の間で起きた自然流産および人工流産からの５２のホルマリン固体・パラフィン包埋（ｆｏｒｍａｌｉｎ  ｆｉｘｅｄ  ａｎｄ  ｐａｒａｆｆｉｎ  ｅｍｂｅｄｄｅｄ：ＦＦＰＥ）胎盤組織から、全ＲＮＡを単離した。ｉｎｎｕＰＲＥＰ  Ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（Ａｎａｌｙｔｉｋ  Ｊｅｎａ  ＡＧ、ドイツ国イェーナ）を、ＦＦＰＥ組織について次の変更を加えてその製造業者の説明書に従って使用して、ＲＮＡ単離を行った：パラフィン切片の溶解を、ｉｎｎｕＰＲＥＰ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  ＫｉｔからのＴＬＳ溶解溶液（ＴＬＳ−Ｌｙｓｉｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）およびプロテイナーゼＫ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ）中でそれらの切片を６０℃で１時間および８０℃で１５分間インキュベートすることによって行った。
【０１１０】
逆転写およびリアルタイムＰＣＲ
ＴａｑＭａｎ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州フォスターシティー）からのＴａｑＭａｎ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＫｉｔおよびＲＴプライマーをその製造業者の説明書に従って用いて、２００ｎｇの全ＲＮＡを使用してｍｉＲ−５２０ｃおよびＲＮＵ６Ｂ（これは、相対定量のための内部対照として役立つ；ＣＧＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＡＣＧＣＡＡＡＴＴＣＧＴＧＡＡＧＣＧＴＴＣＣＡＴＡＴＴＴＴＴ  配列番号７９）に対して特異的なｃＮＤＡを産生させた。反応物をサーマルサイクラーにおいて１６℃で３０分間、４２℃で３０分間、および８５℃で５分間インキュベートした。ＴａｑＭａｎ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓに含まれているｍｉＲＮＡ特異的プローブおよびプライマーとＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州フォスターシティー）とを使用して、リアルタイムＰＣＲ反応を準備した。反応物を９６ウェルプレートにおいて９５℃で１０分間インキュベートし、続いて、９５℃で１５秒そして６０℃で１分というサイクルのインキュベーションを４０サイクル行った。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステムを用いて、すべての反応を３反復で実行した。ΔΔＣｔ法（Ｌｉｖａｋ  ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ，２００１）を用いて、相対定量（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＲＱ）を計算した。ＲＮＵ６Ｂを正規化のための内因性対照として役立てた。
【０１１１】
結果
ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐの相対発現を妊娠週に対してプロットした（図２）。データは、妊娠の進行に伴ってｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐの発現のわずかな減少を示し、これは、妊娠の進行に伴う染色体１９  ｍｉＲＮＡの発現の増加を述べたＬｕｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）とは対照的である。
【０１１２】
参考文献
Livak, K. J. and T. D. Schmittgen (2001). "Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method." Methods 25(4): 402-408.
Luo, S. S., O. Ishibashi, et al. (2009). "Human villous trophoblasts express and secrete placenta-specific microRNAs into maternal circulation via exosomes." Biol Reprod 81(4): 717-729.
【実施例２】
【０１１３】
胎盤組織におけるｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐとｍｉＲ−３７１−３ｐ、ｍｉＲ−３７２およびｍｉＲ−３７３の相対発現の相関関係
【０１１４】
材料および方法
ＲＮＡ単離
自然流産および人工流産からの５２のホルマリン固体・パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）胎盤組織から、全ＲＮＡを単離した。ｉｎｎｕＰＲＥＰ  Ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（Ａｎａｌｙｔｉｋ  Ｊｅｎａ  ＡＧ、ドイツ国イェーナ）を、ＦＦＰＥ組織について次の変更を加えてその製造業者の説明書に従って使用して、ＲＮＡ単離を行った：パラフィン切片の溶解を、ｉｎｎｕＰＲＥＰ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（Ａｎａｌｙｔｉｋ  Ｊｅｎａ）からのＴＬＳ溶解溶液およびプロテイナーゼＫ中でそれらの切片を６０℃で１時間および８０℃で１５分間インキュベートすることによって行った。
【０１１５】
逆転写およびリアルタイムＰＣＲ
ＴａｑＭａｎ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州フォスターシティー）からのＴａｑＭａｎ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＫｉｔおよびＲＴプライマーをその製造業者の説明書に従って用いて、２００ｎｇの全ＲＮＡを使用してｍｉＲ−５２０ｃ、ｍｉＲ−３７１−３ｐ、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−３７３およびＲＮＵ６Ｂ（これは、相対定量のための内部対照として役立つ）に対して特異的なｃＮＤＡを産生させた。反応物をサーマルサイクラーにおいて１６℃で３０分間、４２℃で３０分間、および８５℃で５分間インキュベートした。ＴａｑＭａｎ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓに含まれているｍｉＲＮＡ特異的プローブおよびプライマーとＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州フォスターシティー）とを使用して、リアルタイムＰＣＲ反応を準備した。反応物を９６ウェルプレートにおいて９５℃で１０分間インキュベートし、続いて、９５℃で１５秒そして６０℃で１分というサイクルのインキュベーションを４０サイクル行った。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステムを用いて、すべての反応を３反復で実行した。ΔΔＣｔ法（Ｌｉｖａｋ  ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ，２００１）を用いて、相対定量（ＲＱ）を計算した。ＲＮＵ６Ｂを正規化のための内因性対照として役立てた。
【０１１６】
統計分析
線形回帰ｔ検定を用いて、発現データの回帰分析を行った。
【０１１７】
結果
回帰分析の結果を表３に要約する。ｍｉＲ−３７１−３ｐ、ｍｉＲ−３７２およびｍｉＲ−３７３の相対発現は、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐの発現とそれぞれ非常に相関した。この相関関係は、これらのｍｉＲＮＡの協調発現を示し、したがって、それらが類似した機能を共有することを示唆する。
【０１１８】
表３：ｍｉＲ−３７１−３ｐ、ｍｉＲ−３７２およびｍｉＲ−３７３の発現とｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐの発現の間の非常に有意な相関関係
【表３】
2015500013.tif 000007
【０１１９】
参考文献
Livak, K. J. and T. D. Schmittgen (2001). "Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method." Methods 25(4): 402-408.
【実施例３】
【０１２０】
間質および栄養膜細胞におけるｍｉＲ−３７１−３ｐ、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−３７３およびｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐの相対発現の比較
【０１２１】
材料および方法
マイクロダイセクション
正常に見える第１三半期胎盤（妊娠第８週）のホルマリン固定・パラフィン包埋試料の１つを間質および栄養膜区画についての別々の分析に使用した。
【０１２２】
製造業者による記載（２０１１年１１月１７日にアクセスしたｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｅｉｃａ−ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｌｉｇｈｔ−ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｓ／ｌｉｆｅ−ｓｃｉｅｎｃｅ−ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｌａｓｅｒ−ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ／ｄｅｔａｉｌｓ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｌｅｉｃａ−ｌｍｄ７０００／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／）のとおりのレーザーマイクロダイセクションについての標準的手順を用いて、間質コアと栄養膜層を分離した（図３）。ちなみに、レーザーマイクロダイセクションをＧｒｕｎｄｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３６（２００８），ｅ３８に、特にセクション「ＵＶ−Ｌａｓｅｒ−ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ」の３頁に記載されているように行うこともでき、前記参考資料の開示内容は、参照により本明細書に援用されている。
【０１２３】
ＲＮＡ単離
ＱＩＡＧＥＮ  ｍｉＲＮＥａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、ドイツ国ヒルデン）をその製造業者の説明書に従って使用して、間質および栄養膜細胞から全ＲＮＡを単離した。
【０１２４】
逆転写およびリアルタイムＰＣＲ
ＴａｑＭａｎ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州フォスターシティー）からのＴａｑＭａｎ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＫｉｔおよびＲＴプライマーをその製造業者の説明書に従って用いて、１０ｎｇの全ＲＮＡを使用してｍｉＲ−５２０ｃ、ｍｉＲ−３７１−３ｐ、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−３７３およびＲＮＵ６Ｂ（これは、相対定量のための内部対照として役立つ）に対して特異的なｃＮＤＡを産生させた。反応物をサーマルサイクラーにおいて１６℃で３０分間、４２℃で３０分間、および８５℃で５分間インキュベートした。ＴａｑＭａｎ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓに含まれているｍｉＲＮＡ特異的プローブおよびプライマーとＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州フォスターシティー）とを使用して、リアルタイムＰＣＲ反応を準備した。反応物を９６ウェルプレートにおいて９５℃で１０分間インキュベートし、続いて、９５℃で１５秒そして６０℃で１分というサイクルのインキュベーションを４０サイクル行った。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステムを用いて、すべての反応を３反復で実行した。ΔΔＣｔ法（Ｌｉｖａｋ  ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ，２００１）を用いて、相対定量（ＲＱ）を計算した。ＲＮＵ６Ｂを正規化のための内因性対照として役立てた。
【０１２５】
結果
栄養膜層でのみＣ１９ＭＣ  ｍｉＲＮＡを検出し、間質細胞では検出しなかったＬｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）によって以前に得られた結果とは対照的に、本明細書に提示する結果は、間質細胞におけるｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐの発現が、栄養膜細胞におけるもと比較できるほどに高いことを示す。ｍｉＲ−３７１−３ｐおよびｍｉＲ−３７２についても同じことが言える。ｍｉＲ−３７３は、栄養膜細胞におけるより間質細胞におけるほうがよりいっそう高度に発現される（図４）。
【実施例４】
【０１２６】
本発明のｍｉＲＮＡおよび結合分子の免疫修飾特性の試験
【０１２７】
本明細書において上で定義したとおりの本発明のマイクロＲＮＡまたは結合分子の免疫系を抑制する能力を、間葉幹細胞または栄養膜細胞へのマイクロＲＮＡのトランスフェクション、およびこれらの細胞によって放出されたエキソソームの単離により、これらのエキソソームの標的細胞の免疫修飾を目的とした実験で使用するために試験した。エキソソームの抽出方法は、例えば、Ｈｅｄｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）におけるＭａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｐａｒｔに、特に、３４２から３４３頁、セクション「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｏｓｏｍｅｓ  ｆｒｏｍ  ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ  ｏｆ  ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｅｘｐｌａｎｔ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ」に記載されているように、またはＴａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）における１５３５頁、セクション「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｅｘｏｓｏｍｅｓ」に記載されているように、当該技術分野において公知であり、用いられている（両方の開示内容は参照により本明細書に援用されている）。あるいは、Ｈｅｌａ細胞および線維芽細胞についてと類似に、例えばＭａｒａｓａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）により、３４０頁、セクション「Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ，  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｂ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ」に概説されているような常例的方法に従ってマイクロＲＮＡを直接使用して、例えばリンパ球または樹状細胞であり得る標的細胞をトランスフェクトする（前記参照資料の開示内容は、参照により本明細書に援用されている）。レシピエント細胞レベルでマイクロＲＮＡの免疫修飾能力を試験する幾つかの方法がある。マイクロＲＮＡの免疫抑制能を評価するために用いる適切な標的細胞、トランスフェクション方法およびパラメータは、例えば、Ｓａｂａｐａｔｈａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｈｅｇｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｈｅｄｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１により、特に、それぞれの「Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」セクションに記載されているように、当該技術分野において公知であり、用いられてる（前記参照資料の開示内容は、参照により本明細書に援用されている）。
【実施例５】
【０１２８】
Ｔ細胞活性を抑制するためのｍｉＲＮＡミミックの使用
【０１２９】
エレクトロポレーションを用いて、Ｔ細胞およびＴ細胞由来細胞系にＣ１９ＭＣのｍｉＲＮＡのミミック（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ国ヒルデン）を適切な濃度でトランスフェクトして、それらの増殖能力およびサイトカイン発現を試験した。陰性対照としてスクランブルｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用する。ＡｌｌＳｔａｒｓ  Ｈｓ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、トランスフェクション効率を試験する。
【実施例６】
【０１３０】
妊娠末期胎盤および羊膜組織におけるｍｉＲ−５１７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５１９ａ−３ｐおよびｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐの相対発現
【０１３１】
羊膜からの間葉細胞は、例えば同種抗原によって誘導されるＴ細胞増殖の能動的抑制による、強い免疫修飾特性を有するようである（Ｗｏｌｂａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。それ故、ｍｉＲ−５１７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５１９ａ−３ｐおよびｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐの発現を妊娠末期羊膜において測定し、対応する胎盤組織の発現レベルと比較した。
【０１３２】
材料および方法
ＲＮＡ単離
出産直後に得たホルマリン固定・パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）妊娠末期胎盤組織および隣接羊膜組織から全ＲＮＡを単離した。ｉｎｎｕＰＲＥＰ  Ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（Ａｎａｌｙｔｉｋ  Ｊｅｎａ  ＡＧ、ドイツ国イェーナ）を、ＦＦＰＥ組織について次の変更を加えてその製造業者の説明書に従って使用して、ＲＮＡ単離を行った：パラフィン切片の溶解を、ｉｎｎｕＰＲＥＰ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（Ａｎａｌｙｔｉｋ  Ｊｅｎａ）からのＴＬＳ溶解溶液およびプロテイナーゼＫ中でそれらの切片を６０℃で１時間および８０℃で１５分間インキュベートすることによって行った。
【０１３３】
逆転写およびリアルタイムＰＣＲ
ＴａｑＭａｎ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州フォスターシティー）からのＴａｑＭａｎ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＫｉｔおよびＲＴプライマーをその製造業者の説明書に従って用いて、２００ｎｇの全ＲＮＡを使用してｍｉＲ−５１７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５１９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐおよびＲＮＵ６Ｂ（これは、相対定量のための内部対照として役立つ）に対して特異的なｃＮＤＡを産生させた。反応物をサーマルサイクラーにおいて１６℃で３０分間、４２℃で３０分間、および８５℃で５分間インキュベートした。ＴａｑＭａｎ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓに含まれているｍｉＲＮＡ特異的プローブおよびプライマーとＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州フォスターシティー）とを使用して、リアルタイムＰＣＲ反応を準備した。反応物を９６ウェルプレートにおいて９５℃で１０分間インキュベートし、続いて、９５℃で１５秒そして６０℃で１分というサイクルのインキュベーションを４０サイクル行った。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステムを用いて、すべての反応を３反復で実行した。ΔΔＣｔ法（Ｌｉｖａｋ  ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ，２００１）を用いて、相対定量（ＲＱ）を計算した。ＲＮＵ６Ｂを正規化のための内因性対照として役立てた。
【０１３４】
結果
ｍｉＲ−５１７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５１９ａ−３ｐおよびｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐの相対発現を妊娠末期羊膜組織において測定し、対応する胎盤組織と比較した。得られたＲＱ（相対定量）値を下の表４に与える。
【０１３５】
表４：胎盤および羊膜組織において得たｍｉＲ−５１７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５１９ａ−３ｐおよびｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐの相対定量（ＲＱ）値
【表４】
2015500013.tif 000008
【０１３６】
これらのデータは、羊膜におけるｍｉＲ−５１７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５１９ａ−３ｐおよびｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐの発現が、胎盤組織におけるもと比較できるほどに高いことを示す。
【０１３７】
参考文献
Hedlund, M., A. C. Stenqvist, et al. (2009). "Human placenta expresses and secretes NKG2D ligands via exosomes that down-modulate the cognate receptor expression: evidence for immunosuppressive function." J Immunol 183(1): 340-351.
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Taylor, D. D., S. Akyol, et al. (2006). "Pregnancy-associated exosomes and their modulation of T cell signaling." J Immunol 176(3): 1534-1542.
Wolbank, S., A. Peterbauer, et al. (2007). "Dose-dependent immunomodulatory effect of human stem cells from amniotic membrane: a comparison with human mesenchymal stem cells from adipose tissue." Tissue Engineering 13(6): 1173-1183.
Zhang, H., Y. Xie, et al. (2011). "CD4(+) T cell-released exosomes inhibit CD8(+) cytotoxic T-lymphocyte responses and antitumor immunity." Cell Mol Immunol 8(1): 23-30.
【実施例７】
【０１３８】
脱落膜および栄養膜細胞におけるｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐおよびｍｉＲ−５１７ａ−３ｐの相対発現の比較
【０１３９】
材料および方法
マイクロダイセクション
正常に見える第１三半期胎盤（妊娠第９週）のホルマリン固定・パラフィン包埋試料を栄養膜および脱落膜についての別々の分析に使用した。
【０１４０】
製造業者による記載（２０１１年１１月１７日にアクセスしたｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｅｉｃａ−ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｌｉｇｈｔ−ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｓ／ｌｉｆｅ−ｓｃｉｅｎｃｅ−ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｌａｓｅｒ−ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ／ｄｅｔａｉｌｓ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｌｅｉｃａ−ｌｍｄ７０００／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／；またはＡｓｚｔａｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）の３０３頁における左欄のセクション「Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ」、サブセクション「Ｌａｓｅｒ  ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ」；これらの開示内容は参照により本明細書に援用されている）のとおりのレーザーマイクロダイセクションについての標準的手順を用いて、栄養膜および脱落膜組織を分離し、間質コアと栄養膜層を分離した（図３）。ちなみに、レーザーマイクロダイセクションをＧｒｕｎｄｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３６（２００８），ｅ３８に、特にセクション「ＵＶ−Ｌａｓｅｒ−ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ」の３頁に記載されているように行うこともでき、前記参考資料の開示内容は、参照により本明細書に援用されている。
【０１４１】
ＲＮＡ単離
ＱＩＡＧＥＮ  ｍｉＲＮＥａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、ドイツ国ヒルデン）をその製造業者の説明書に従って使用して、脱落膜および栄養膜細胞から全ＲＮＡを単離した。
【０１４２】
逆転写およびリアルタイムＰＣＲ
ＴａｑＭａｎ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州フォスターシティー）からのＴａｑＭａｎ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＫｉｔおよびＲＴプライマーをその製造業者の説明書に従って用いて、１０ｎｇの全ＲＮＡを使用してｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−５１７ａ−３ｐおよびＲＮＵ６Ｂ（これは、相対定量のための内部対照として役立つ）に対して特異的なｃＤＮＡを産生させた。反応物をサーマルサイクラーにおいて１６℃で３０分間、４２℃で３０分間、および８５℃で５分間インキュベートした。ＴａｑＭａｎ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓに含まれているｍｉＲＮＡ特異的プローブおよびプライマーとＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州フォスターシティー）とを使用して、リアルタイムＰＣＲ反応を準備した。反応物を９６ウェルプレートにおいて９５℃で１０分間インキュベートし、続いて、９５℃で１５秒そして６０℃で１分というサイクルのインキュベーションを４０サイクル行った。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステムを用いて、すべての反応を３反復で実行した。ΔΔＣｔ法（Ｌｉｖａｋ  ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ，２００１）を用いて、相対定量（ＲＱ）を計算した。ＲＮＵ６Ｂを正規化のための内因性対照として役立てた。その発現を、低レベルでｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐおよびｍｉＲ−５１７ａ−３ｐを発現する甲状腺腫瘍と比較した。
【０１４３】
結果
本明細書に提示する結果は、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐおよびｍｉＲ−５１７ａ−３ｐが栄養膜細胞に存在するばかりでなく脱落膜細胞にも存在することを示す（図５）。脱落膜は、Ｃ１９ＭＣマイクロＲＮＡを発現しない母体メチル化パターンを有する母体細胞から成る。したがって、本明細書に提示するデータは、これらの組織におけるｍｉＲ−５１７ａ−３ｐおよびｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ細胞の存在が、脱落膜細胞または、より具体的には、脱落膜免疫細胞による（元々、胎盤細胞によりエキソソーム経由で放出された）ｍｉＲＮＡの取り込みに起因することを示す。
【実施例８】
【０１４４】
Ｃ１９ＭＣ  マイクロＲＮＡ、それらの検証済み標的および免疫修飾における潜在的役割についてのインシリコ解析
【０１４５】
材料および方法
マイクロＲＮＡレジストリーｍｉＲＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／）をＣ１９ＭＣのマイクロＲＮＡの検証済み標的について検索した。その後、関連文献をこれらの検証済み標的の公知の機能について検索した。
【０１４６】
結果
本明細書に提示する結果は、Ｃ１９ＭＣ標的遺伝子のマイクロＲＮＡの大部分がアポトーシスおよび免疫修飾に関連づけられることを示す。一例として、Ｆａｓ−ＦａｓＬ誘導アポトーシスの阻害剤として作用する検証済み標的がある。これらの標的およびＣ１９ＭＣクラスタの対応するｍｉＲＮＡを図６に図示する。
【０１４７】
参考文献
"miRBase (Release 18)." from http://www.mirbase.org.
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【実施例９】
【０１４８】
ウシ羊膜からの細胞は、混合リンパ球反応を阻害することができない
【０１４９】
ヒト羊膜細胞が混合リンパ球反応（ｍｉｘｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ：ＭＬＲ）に対する阻害効果を誘導することは公知である（Ｍａｇａｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。本発明の中で提供する実験は、これらの細胞もＣ１９ＭＣマイクロＲＮＡを豊富に発現することを実証する（実施例６参照）。Ｃ１９ＭＣ  マイクロＲＮＡを発現しないウシ羊膜細胞（ｂＡＭＣ）は、阻害効果を発揮しない、またはあまり顕著でない効果を発揮するはずである。それ故、ｂＡＭＣの存在下およびＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ：末梢血単核細胞）の増殖下で果たされるＭＬＲをＢｒｄＵアッセイによって測定した。
【０１５０】
材料および方法
細胞培養
ウシ羊膜由来細胞（ｂＡＭＣ）をＲＰＭＩ完全培地中で次のもののいずれかと共培養した：
・あるドナー（ドナーＡ）からのＰＢＭＣ
・別のドナー（ドナーＢ）からのＰＢＭＣ
・両方のドナー（ドナーＡ＋ドナーＢ）からのＰＢＭＣ（混合リンパ球反応（ＭＬＲ））
・ドナーＡからのＰＢＭＣ＋Ｔ細胞刺激物質ｃｏｎＡ（コンカナバリンＡ）；または
・ドナーＢからのＰＢＭＣ＋Ｔ細胞刺激物質ｃｏｎＡ。
【０１５１】
陽性対照として、ｂＡＭＣの代わりにＪＥＧ−３細胞を用いて同じ実験準備を行った。絨毛癌由来細胞系ＪＥＧ−３は、Ｃ１９ＭＣマイクロＲＮＡを豊富に発現する（Ｍｏｒａｌｅｓ−Ｐｒｉｅｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。さらに、この細胞系がＴ細胞に対して阻害効果を発揮することは公知である（Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。細胞系Ｓ４０．２は甲状腺腺腫に由来し、この細胞系がクラスタＣ１９ＭＣおよびｍｉＲ−３７１−３７３のマイクロＲＮＡを過発現することは公知である（Ｒｉｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【０１５２】
ＪＥＧ−３およびｂＡＭＣに３０００Ｇｙを照射して、観察される増殖がリンパ球によるものであることを確実にした。ＰＢＭＣの刺激能を制御するために、二人の異なるドナーからのＰＢＭＣを使用してｂＡＭＣまたはＪＥＧ−３細胞を添加せずに混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を準備した。すべての実験を９６時間および１２０時間行い、すべての培養を３反復で行った。
【０１５３】
ＢｒｄＵアッセイ
実験終了２４時間前に、ＢｒｄＵを細胞培養物に添加した。９６時間および７２時間後それぞれに、上清（浮遊状態のＰＢＭＣを含有）を回収し、ＰＢＭＣの増殖をＢｒｄＵアッセイ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ドイツ国マンハイム）によって測定した。
【０１５４】
結果
ｂＡＭＣは、Ｃｏｎ  Ａで刺激されたＭＬＲまたはＰＢＭＣに対して阻害効果を誘導できなかったが、ＪＥＧ−３細胞は、ＰＢＭＣ活性化を有効に抑制した（図７）。本発明の中で使用したＰＢＭＣは、ＭＬＲにおいておよびＣｏｎ  Ａでの刺激によって十分に活性化された（図８）。同様に、甲状腺腺腫細胞系Ｓ４０．２の細胞をＪＥＧ−３細胞の代わりに使用して、混合リンパ球反応を抑制するそれらの能力を実証することができる。
【０１５５】
参考文献
Hammer, A., M. Hartmann, et al. (2002). "Expression of functional Fas ligand in choriocarcinoma." American Journal of Reproductive Immunology 48(4): 226-234.
Magatti, M., S. De Munari, et al. (2008). "Human amnion mesenchyme harbors cells with allogeneic T-cell suppression and stimulation capabilities." Stem Cells 26(1): 182-192.
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Rippe, V., L. Dittberner, et al. (2010). "The two stem cell microRNA gene clusters C19MC and miR-371-3 are activated by specific chromosomal rearrangements in a subgroup of thyroid adenomas." PLoS One 5(3): e9485.
【実施例１０】
【０１５６】
クラスタＣ１９ＭＣを含有するＢＡＣクローン
【０１５７】
ＢＡＣクローンＢＣ２８０２７３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ａｃ０１１４５３）は、隣接ＣｐＧアイランド、すなわちその推定プロモーター領域、を含むＣ１９ＭＣの全染色体領域にわたる（ＢＣ２８０７２３）（図９）。この配列をｐＢＡＣｅ３．６ベクターに挿入する。
【実施例１１】
【０１５８】
ウシ羊膜からの細胞にトランスフェクトされた全Ｃ１９ＭＣクラスタを含有するＢＡＣクローンからのＣ１９ＭＣ  ｍｉＲＮＡの発現
【０１５９】
材料および方法
トランスフェクション
標準的な細胞培養技術／手順を用いて、ウシ羊膜に由来する細胞培養物に、クラスタＣ１９ＭＣを挿入物として含有するＢＡＣベクターをトランスフェクトした（上の実施例１０を参照）。ＱＩＡＧＥＮ（ドイツ国ヒルデン）のＡｔｔｒａｃｔｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔをその製造業者の説明書に従って使用して、トランスフェクションを行った。陰性対照として、ＢＡＣベクターＤＮＡを含有しないトランスフェクション複合体を細胞にモックトランスフェクトした。トランスフェクション後２４時間、４８時間および６日（１４４時間）の時点で細胞を採取した。
【０１６０】
逆転写およびリアルタイムＰＣＲ
ＴａｑＭａｎ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州フォスターシティー）からのＴａｑＭａｎ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＫｉｔおよびＲＴプライマーをその製造業者の説明書に従って用いて、２００ｎｇの全ＲＮＡを使用してｍｉＲ−５１７ａ−３ｐおよびＲＮＵ６Ｂ（これは、相対定量のための内部対照として役立つ）に対して特異的なｃＤＮＡを産生させた。反応物をサーマルサイクラーにおいて１６℃で３０分間、４２℃で３０分間、および８５℃で５分間インキュベートした。ＴａｑＭａｎ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓに含まれているｍｉＲＮＡ特異的プローブおよびプライマーとＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州フォスターシティー）とを使用して、リアルタイムＰＣＲ反応を準備した。反応物を９６ウェルプレートにおいて９５℃で１０分間インキュベートし、続いて、９５℃で１５秒そして６０℃で１分というサイクルのインキュベーションを４０サイクル行った。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステムを用いて、すべての反応を３反復で実行した。ΔΔＣｔ法（Ｌｉｖａｋ  ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ，２００１）を用いて、相対定量（ＲＱ）を計算した。ＲＮＵ６Ｂを正規化のための内因性対照として役立てた。
【０１６１】
結果
マイクロＲＮＡクラスタＣ１９ＭＣは霊長類特異的であるので、ウシ細胞では発現されない。ウシ羊膜由来細胞へのＢＡＣベクターのトランスフェクションは、モックトランスフェクト細胞と比較して高いｍｉＲ−５１７ａ−３ｐ発現をもたらし、これは、少なくとも６日まで続く；図１０も参照。
【０１６２】
これらの結果は、Ｃ１９ＭＣマクロＲＮＡの発現を、これらのマイクロＲＮＡを発現しない細胞において達成できること、および利用可能なＢＡＣベクターがこの目的に適するベクターの一例であることを示す。
【実施例１２】
【０１６３】
ＪＥＧ−３細胞培養物からの上清とともにインキュベートしたジャーカット細胞におけるｃＦＬＩＰ  ｍＲＮＡのダウンレギュレーション
【０１６４】
多数のＣ１９ＭＣマイクロＲＮＡが、Ｆａｓ−ＦａｓＬ誘導アポトーシスに関与する抗アポトーシス遺伝子を標的にするようである（上の実施例８を参照）。その標的の１つがｃ−ＦＬＩＰ（ＣＦＬＡＲ）である。Ｃ１９ＭＣマイクロＲＮＡは、多くの場合、エキソソームに封入され、それらのエキソソームが細胞によって分泌される。細胞培養の場合、これらのエキソソームは、培養培地中に蓄積される。
【０１６５】
材料および方法
細胞培養
ＪＥＧ−３は、Ｃ１９ＭＣマイクロＲＮＡを高度に発現する絨毛癌由来細胞系である。ＨＣＴ−１１６は、Ｃ１９ＭＣマイクロＲＮＡを有意に発現しない結腸癌腫由来細胞系である（図１１Ａを参照）。ジャーカットは、Ｔ細胞白血病由来細胞系であり、これもまたＣ１９ＭＣマイクロＲＮＡを有意に発現しない。用いた３つの細胞系すべてが市販されている。１０％ウシ胎仔血清と抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン）とを補足したＲＰＭＩですべての細胞系を成長させた。
【０１６６】
ＪＥＧ−３およびＨＣＴ−１１６細胞の細胞培養物からの上清を、培養中、３日後に回収した。その後、その回収したＪＥＧ−３上清の４ｍＬを、３ｍＬの培地で成長させたジャーカット細胞に添加した。ＨＣＴ−１１６細胞の上清とともにインキュベートしたジャーカット細胞培養物を対照として役立てた。両方の調製物のジャーカット細胞を、前記上清添加の２４時間後に採取した。
【０１６７】
ＲＮＡ単離
ＱＩＡＧＥＮ  ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、ドイツ国ヒルデン）をその製造業者の説明書に従って使用して、ジャーカット細胞から全ＲＮＡを単離した。
【０１６８】
逆転写およびリアルタイムＰＣＲ
Ｍ−ＭＬＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ドイツ国カールスルーエ）と１５０ｎｇのランダムヘキサマーおよびＲＮａｓｅＯＵＴ（登録商標）組換えリボヌクレアーゼ阻害剤を製造業者の説明書に従って使用して、２５０ｎｇの全ＲＮＡを用いて逆転写を行った。
【０１６９】
ｃ−ＦＬＩＰ（ＣＦＬＡＲ）についてのリアルタイムＰＣＲは、ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  ＣＦＬＡＲ（Ｈｓ００１５３４３９＿ｍ１）  （Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ドイツ国ダルムシュタット；Ｃａｔ＃４３３１１８２）およびＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ドイツ国ダルムシュタット）を製造業者の指示書に従って使用して行った。反応物を９６ウェルプレートにおいて９５℃で１０分間インキュベートし、続いて、９５℃で１５秒そして６０℃で１分というサイクルのインキュベーションを４０サイクル行った。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステムを用いて、すべての反応を３反復で実行した。ΔΔＣｔ法（Ｌｉｖａｋ  ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ，２００１）を用いて、相対定量（ＲＱ）を計算した。ＨＰＲＴを正規化のための内因性対照として役立てた。
【０１７０】
結果
ＪＥＧ−３細胞の上清で処置したジャーカット細胞は、ＨＣＴ−１１６上清で処置したジャーカット細胞と比較してｃ−ＦＬＩＰの発現減少を示した（図１１Ｂ）。ＪＥＧ−３細胞は、Ｃ１９ＭＣ  ｍｉＲＮＡを過発現し、その上清は、本実施例ではジャーカット細胞に由来するこれらのマイクロＲＮＡを有するエキソソームを含有する。したがって、ｃ−ＦＬＩＰ  ｍＲＮＡは、ダウンレギュレートされる。
【０１７１】
参考文献
Livak, K. J. and T. D. Schmittgen (2001). "Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method." Methods 25(4): 402-408.
Wolbank, S., A. Peterbauer, et al. (2007). "Dose-dependent immunomodulatory effect of human stem cells from amniotic membrane: a comparison with human mesenchymal stem cells from adipose tissue." Tissue Engineering 13(6): 1173-1183.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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