(57)【要約】  活性化された免疫刺激細胞組成物を作製する方法、活性化された免疫刺激細胞組成物、および腫瘍に対する治療上免疫応答を刺激するために、これらの組成物を使用する方法が記載される。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性化された免疫刺激細胞組成物を作製するための方法であって、
ａ）ヒト白血球を活性化する時間および温度の条件下で、前記白血球をインキュベートすることと、
ｂ）前記活性化された白血球を低浸透圧ショックに供することと、
ｃ）等張を回復させるのに有効な量で塩溶液を前記白血球に添加することと、
ｄ）前記白血球を支持媒体と混合することと、
ｅ）樹状細胞の成熟を少なくとも誘発する時間、前記支持媒体中で前記白血球をインキュベートし、それにより、活性化された免疫刺激組成物を作製することと、を含む、方法。
【請求項２】
活性化された免疫刺激細胞組成物を作製する方法であって、樹状細胞の成熟を誘発する時間および温度の条件下、支持媒体中で非休止状態の白血球をインキュベートし、それによって、活性化された免疫刺激組成物を作製することを含む、方法。
【請求項３】
成熟樹状細胞（ＤＣ）を含む組成物を作製するための方法であって、
ａ）白血球を提供することと、
ｂ）前記白血球を室温で約８〜２０時間維持することによって、前記白血球を休止状態から活性状態に遷移させることと、
ｃ）前記白血球を低浸透圧ショックに供することと、
ｄ）支持媒体中で前記ショックさせた白血球を３６時間〜１４日間インキュベートし、それによって、成熟ＤＣを含む組成物を作製することと、を含む、方法。
【請求項４】
前記白血球が、前記支持媒体中で約３６〜８４時間インキュベートされる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記白血球が、前記支持媒体中で約４８〜７２時間インキュベートされる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記組成物では、成熟樹状細胞が濃縮されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記組成物が、活性化されたリンパ球をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記組成物が、Ｔｈ１表現型が濃縮されたＴヘルパー細胞をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物では、Ｔｈ１サイトカインが濃縮されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物が、Ｍ１表現型が濃縮された活性マクロファージをさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物では、Ｍ１サイトカインが濃縮されている、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記白血球が、末梢血、胎盤血、臍帯血、骨髄、またはリンパ系組織から単離される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記支持媒体が、血清または血漿である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記支持媒体が、外因的に添加されたサイトカインまたはインターフェロンを含まない血清または血漿である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも１つの腫瘍抗原を前記支持媒体に添加することをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記成熟ＤＣが、単球上でのレベルよりも高いレベルで、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６、ＣＤ５４、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、またはＣＣＲ７のうちの少なくとも１つを発現する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法が、前記支持媒体を除去することと、前記白血球を生理的に許容される担体中に再懸濁させることと、をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
無細胞組成物を作製する方法であって、前記白血球のインキュベーション後に、請求項１〜５のいずれか一項に記載の支持媒体を回収することと、前記細胞を除去することと、を含む、方法。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法によって生成された、組成物。
【請求項２０】
成熟樹状細胞、活性化ヘルパーＴ細胞、細胞溶解性Ｔ細胞、および少なくとも１つの他の白血球細胞型を含む、組成物。
【請求項２１】
前記樹状細胞のうちの少なくとも５０％が、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６、またはＣＤ５４のうちの少なくとも１つを発現する、請求項１９または２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記樹状細胞のうちの少なくとも５％が、ＣＣＲ７、ＣＤ４０、ＣＤ８０、またはＣＤ８３のうちの少なくとも１つを発現する、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記樹状細胞のうちの少なくとも５％が、ＣＤ８を発現する、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記組成物が、少なくとも約５ｐｇ／ｍＬのＩＬ−１２を含む、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記組成物が、少なくとも約１５００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−２を含む、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記組成物が、少なくとも約１００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ−ガンマを含む、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物では、細胞が枯渇している、請求項１９または２４〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
腫瘍を有する対象において、腫瘍細胞の数を減少させる方法であって、前記対象に、請求項１９〜２７のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含み、前記組成物が、前記腫瘍の少なくとも１つの抗原をさらに含む、方法。
【請求項２９】
患者において、腫瘍を安定化または退行させる方法であって、
ａ）前記腫瘍に罹患している患者から白血球を回収することと、
ｂ）前記患者の腫瘍からの抗原を含むが、外因的に添加されたサイトカインまたは成長因子を欠く支持媒体中で、約３７℃で前記白血球を培養して、成熟樹状細胞および活性化されたリンパ球を形成することと、
ｃ）前記患者に、治療上有効量の前記組成物を投与することと、を含む、方法。
【請求項３０】
前記投与が、全身注射、腫瘍内注射、または前記腫瘍のリンパを集めるリンパ節への局所注射によるものである、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記腫瘍が、黒色腫、転移性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、メルケル細胞癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、子宮頸癌、口腔癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、肉腫、頭頚部癌、食道癌、膀胱癌、前立腺癌、または腹膜内膜の癌（中皮腫）である、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記腫瘍が、黒色腫である、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１９〜２７のいずれか一項に記載の組成物、腫瘍抗原、およびアジュバントを含む、腫瘍ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年３月１５日に出願した米国仮特許出願第６１／６１１，２０２号の利益を主張するものであり、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の説明
本発明は、活性化された免疫刺激細胞組成物、これらの組成物を調製する方法、および癌等の免疫刺激から恩恵を受け得る状態を治療するためのこれらの組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
多くの腫瘍は、腫瘍特異性および腫瘍関連抗原を有する。腫瘍特異性抗原（ＴＳＡ）は、腫瘍上に独自に発現するが、正常細胞上には存在せず、一方、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、正常細胞上よりも腫瘍上でより高いレベルで発現する（Ｗａｎｇ，ＲＦ  ２００２）。腫瘍抗原は、腫瘍細胞内で小さなペプチドに切断され、ヒト白血球抗原（ＨＬＡクラスＩ、例えばＨＬＡ  Ａ、Ｂ、またはＣ）とも呼ばれるクラスＩの主要組織適合性分子（ＭＨＣクラスＩ）を有する複合体として免疫細胞に提示される。ＭＨＣクラスＩ−腫瘍ペプチド複合体は、ＣＤ８+Ｔ細胞である、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体によって認識される。ＴＣＲとＭＨＣ  Ｉ−腫瘍ペプチド複合体との相互作用は、腫瘍細胞を破壊するＣＴＬからの物質（パーフォリン、グランザイム、およびグラニュリシン）の放出を生じる（Ｍａｍｉ−Ｃｈｏｕａｉｂ  Ｆ，２００２）。ＣＴＬはまた、（ＦＡＳ受容体を通じて）死シグナルまたはアポトーシスシグナルを腫瘍細胞に送信する（Ｗｕ  ＪＹ  ２００６）。
【０００４】
初期ＣＴＬ応答は、存続時間が短く、継続するために、ＣＤ４+Ｔヘルパー（Ｔｈ）リンパ球からの増幅支持を必要とする。Ｔｈ細胞の分化および増殖は、マクロファージまたは間質樹状細胞（ＤＣ）等のプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）との相互作用を通して生じる（Ｗａｎｇ  ＲＦ．２００２）。ＡＰＣは、腫瘍抗原またはアポトーシス腫瘍細胞を取り込み、それらを小さなペプチドに切断することによって、これらの抗原を処理し、次いで、ナイーブＴ細胞に対してペプチドを提示する。この処理は、ＭＨＣクラスＩ＋ペプチドによるＣＴＬの刺激と同様であるが、ＣＤ４+Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ）に関連して提示されるペプチドを認識する。ＴＣＲによるＭＨＣクラスＩＩ−ペプチド複合体を認識すると、Ｔ細胞は、Ｔｈ機能を得、持続した免疫のために、ＣＴＬ応答を増幅し、Ｔ記憶細胞の成長を次に誘発するサイトカインのＩＬ−２を産生する（Ｋｅｅｎｅ  ＪＡ，１９８２、Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｈ，１９８６）。
【０００５】
Ｔ細胞の刺激は、少なくとも２つのステップで生じると考えられる（Ｍａｒｅｌｌｉ−Ｂｅｒｇ  ＦＭ，２００７、Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ＣＡ  ２００１）。第１のステップ（シグナル１）では、ＭＨＣ／ペプチド複合体が、ＴＣＲと相互作用する。このステップは、Ｔ細胞を完全に刺激するのに十分ではない。それどころか、ＡＰＣが発現している共刺激分子（ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ８０、およびＣＤ４０等）のうちの１つとＴ細胞上の対応するリガンド（シグナル２）との第２の相互作用が必要とされる。シグナル２の不在下で、シグナル１を受容するＴ細胞は、ヘルパー機能を得ることができない（Ｃｈａｐｐｅｒｔ  ＆  Ｓｃｈｗａｒｔｚ，２０１０）。
【０００６】
ナイーブＴヘルパー細胞とＤＣ等のＡＰＣとの相互作用は、Ｔｈ細胞をＴｈ１およびＴｈ２サブセットに分極し、これらのサブセットは、それらが生成するサイトカインのパターンによって異なる。Ｔｈ１細胞は、ＣＴＬの増殖を活性化し、腫瘍拒絶を引き起こすインターフェロンおよびＩＬ−２等のサイトカインを産生する。Ｔｈ２細胞は、サイトカインであるＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３を産生する。Ｔｈ２サイトカインのレベルの増加は、不良な臨床予後を有する癌患者の血清中に見出される。
【０００７】
Ｔｈ細胞と同様に、単球／マクロファージの表現型は、Ｔｈ１／Ｔｈ２サイトカイン間の平衡によって異なるプロセスにおいて分極する。これらの分極した細胞に対する術語は、Ｔｈ１およびＴｈ２の術語によく似ており、Ｔｈ１およびＴｈ２  Ｔ細胞と同様に、Ｍ１およびＭ２マクロファージは、異なるパターンのサイトカインを産生する。Ｍ１マクロファージは、主に、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＴＮＦα、ＩＬ−１、ＩＬ−６を産生し、一方、Ｍ２マクロファージは、高いレベルのＩＬ−１０およびＩＬ−１３を産生する（Ｃａｓｓｅｔｔａ  Ｌ，２０１１）。Ｍ１マクロファージはまた、高いレベルのＨＬＡ−ＤＲを発現し、一方、Ｍ２マクロファージは、高いレベルのＣＤ１６３抗原を発現する。完全に分極したＭ１およびＭ２マクロファージは、一連の機能的状態の両極端である。とりわけ、腫瘍組織を浸潤させるマクロファージは、腫瘍環境によって引き起こされ、腫瘍成長および進行を促進するために、適応免疫および炎症性回路の破壊において重要な役割を担う分極したＭ２表現型を得る。対照的に、Ｍ１マクロファージは、抗腫瘍効果を引き起こす。
【０００８】
末梢血単球から分化するとも考えられる別のＡＰＣが、骨髄樹状細胞（ＤＣ）である。成熟した活性化されたＤＣは、非常に効力の強いＡＰＣである。ＤＣの成熟は、ＭＨＣ分子、共刺激分子（ＣＤ８６、ＣＤ８３  ＣＤ８０、ＣＤ４０）（Ｔｕｙａｅｒｔｓ  Ｓ，２００７）、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、およびＣＤ５４等の接着分子、ならびにケモカイン受容体ＣＣＲ７（Ａｌｖａｒｅｚ  Ｄ，２００８）の上方調節と関連がある。後者は、血管壁を通って末梢組織からＴ細胞領域にＤＣを移動させることができる（Ｆｏｒｓｔｅｒ  Ｒ，２００８）。ＤＣの成熟は、Ｔ細胞の刺激に関連する分子の発現を確実にするだけでなく、ＤＣがナイーブＴ細胞に対して抗原を提示することができるように、二次リンパ器官中の適切な解剖学的なコンパートメントに達することが可能である。Ｔ細胞からの同族シグナルは、ＤＣをさらに活性化する（Ｃａｖａｎａｇｈ  ＬＬ，２００２）。
【０００９】
成熟骨髄ＤＣは、ＩＬ−１２を作製するそれらの能力を特徴とする（Ｍａｒｉｏｔｔｉ  Ｓ，２００８）。ＩＬ−１２がＴｈ１分極を促進するため、ＩＬ−１２を産生するＤＣが癌ワクチン開発に使用される（Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ  Ｇ：２００３）。
【００１０】
上記の適応できる抗原特異的な免疫応答を刺激することに加えて、ＤＣはまた、いくつかの抗腫瘍細胞型を刺激することを含む、先天性（ＭＨＣ無制限の）免疫を刺激することにも関与する。これらの細胞は、ＴＣＲ（ＣＤ３−／ＣＤ５６＋細胞）およびサイトカインで誘発されたキラーＴ細胞（ＣＤ３＋／ＣＤ５６＋）を発現しない、古典的なナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）を含む。ＮＫ細胞は、パーフォリン−グランザイム経路を介して、またはＦａｓリガンド等の死受容体リガンドを発現することによって、腫瘍細胞のアポトーシスを直接誘発することができる（Ｂｒｙｃｅｓｏｎ  ＹＴ，２０１１）。ＩＬ−１２を産生するＤＣは、ＮＫ細胞の増殖を誘発させることができる（Ｗａｌｚｅｒ  Ｔ，２００５）。ＮＫ細胞はまた、ＤＣの分化を促進するサイトカインを放出する（Ｆｅｒｌａｚｚｏ  Ｇ，２００９）。
【００１１】
それ故に、成熟ＤＣは、有効な適応できる（Ｔ細胞）および先天性（ＮＫ、ＮＫＴ細胞）の両方の抗腫瘍の免疫応答を生じるのに重要な細胞型である。実際には、多くの研究が、様々な腫瘍型のための治療法としてＤＣ系ワクチンの適用に着目し、一部の臨床試験が、進行中である。活性化されたサイトカイン、抗原パルスＤＣを使用した転移性黒色腫のためのＤＣ系ワクチンは、特に、期待できる結果を示している（例えば、Ｃｏｒｎｆｏｒｔｈ，Ｌｅｅ  ＆  Ｄｉｌｌｍａｎ，２０１１）。それにもかかわらず、免疫系の複雑性により、細胞療法が腫瘍細胞溶解をもたらす機能的特性を有することを確認することが重要になる。例えば、未成熟ＤＣは、インビボで腫瘍免疫を刺激するというよりむしろ阻害する可能性がある。したがって、癌療法等の免疫刺激から恩恵を受け得る状態の治療のために、完全に成熟した樹状細胞および他の活性化された免疫細胞を含む組成物の大いなる必要性がある。
【発明の概要】
【００１２】
ある特定の実施形態の概要
本発明は、活性化された免疫刺激細胞組成物、これらの組成物を調製する方法、および癌等の免疫刺激から恩恵を受け得る状態を治療するためのこれらの組成物の使用に関する。
【００１３】
したがって、一態様において、本発明は、活性化された免疫刺激細胞組成物を作製するための方法に関し、本方法は、（ａ）ヒト白血球を活性化する時間および温度の条件下で、この白血球をインキュベートすることと、（ｂ）活性化された白血球を低浸透圧ショックに供することと、（ｃ）等張を回復させるのに有効な量で塩溶液を白血球に添加することと、（ｄ）白血球を支持媒体と混合することと、（ｅ）樹状細胞の成熟を少なくとも誘発する時間、支持媒体中で白血球をインキュベートし、それにより、活性化された免疫刺激組成物を作製することと、を含む。
【００１４】
さらに別の態様において、本発明は、活性化された免疫刺激細胞組成物を作製する方法に関し、本方法は、樹状細胞の成熟を誘発する時間および温度の条件下、支持媒体中で非休止状態の（すなわち、少なくとも部分的に活性化された）白血球をインキュベートし、それによって、活性化された免疫刺激組成物を作製することを含む。
【００１５】
なお別の態様において、本発明は、成熟樹状細胞（ＤＣ）を含む組成物を作製するための方法に関し、本方法は、（ａ）白血球を提供することと、（ｂ）白血球を室温で約８〜２０時間維持することによって、白血球を休止状態から活性状態に遷移させることと、（ｃ）白血球を低浸透圧ショックに供することと、（ｄ）支持媒体中でショックさせた白血球を３６時間〜１４日間インキュベートし、それによって、成熟ＤＣを含む組成物を作製することと、を含む。
【００１６】
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、白血球は、支持媒体中で約３６〜８４時間インキュベートされる。
【００１７】
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、白血球は、支持媒体中で約４８〜７２時間インキュベートされる。
【００１８】
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、組成物では、成熟樹状細胞が濃縮されている。
【００１９】
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、組成物は、活性化されたリンパ球をさらに含む。
【００２０】
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、組成物は、Ｔｈ１表現型が濃縮されたＴヘルパー細胞をさらに含む。
【００２１】
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、組成物では、Ｔｈ１サイトカインが濃縮されている。
【００２２】
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、組成物は、Ｍ１表現型が濃縮された活性マクロファージをさらに含む。
【００２３】
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、組成物では、Ｍ１サイトカインが濃縮されている。
【００２４】
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、白血球は、末梢血、胎盤血、臍帯血、骨髄、またはリンパ系組織から単離される。
【００２５】
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、支持媒体は、血清または血漿である。
【００２６】
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、支持媒体は、外因的に添加されたサイトカインまたはインターフェロンを含まない血清または血漿である。
【００２７】
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、本方法は、少なくとも１つの腫瘍抗原を支持媒体に添加することをさらに含む。
【００２８】
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、成熟ＤＣは、単球上でのレベルよりも高いレベルで、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６、ＣＤ５４、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、またはＣＣＲ７のうちの少なくとも１つを発現する。
【００２９】
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、本方法は、支持媒体を除去することと、白血球を生理的に許容される担体中に再懸濁させることと、をさらに含む。
【００３０】
別の態様において、本発明は、無細胞組成物を作製する方法に関し、本方法は、白血球のインキュベーション後に、活性化された免疫刺激組成物を生成するために様々な態様のうちのいずれかに使用される支持媒体を回収し、細胞を除去するステップ、をさらに含む。
【００３１】
別の態様において、本発明は、活性化された免疫刺激組成物を調製する方法のうちのいずれかによって生成された組成物に関し、これには、免疫刺激組成物の無細胞部分が含まれる。
【００３２】
さらに別の態様において、本発明は、成熟樹状細胞、活性化ヘルパーＴ細胞、細胞溶解性Ｔ細胞、および少なくとも１つの他の白血球細胞型を含む、組成物に関する。
【００３３】
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、樹状細胞のうちの少なくとも５０％は、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６、またはＣＤ５４のうちの少なくとも１つを発現する。
【００３４】
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、樹状細胞のうちの少なくとも５％は、ＣＣＲ７、ＣＤ４０、ＣＤ８０、またはＣＤ８３のうちの少なくとも１つを発現する。
【００３５】
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、樹状細胞のうちの少なくとも５％は、ＣＤ８を発現する。
【００３６】
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、本組成物は、少なくとも約５ｐｇ／ｍＬのＩＬ−１２を含む。
【００３７】
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、本組成物は、少なくとも約１５００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−２を含む。
【００３８】
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、本組成物は、少なくとも約１００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ−ガンマを含む。
【００３９】
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、本組成物では、細胞が枯渇している。
【００４０】
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、本組成物（無細胞組成物を含む）は、少なくとも約５ｐｇ／ｍＬのＩＬ−１２、少なくとも約１５００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−２、少なくとも約１００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ−ガンマ、またはこれらのサイトカインのいずれか２つまたは３つの組み合わせを含む。
【００４１】
一態様において、本発明は、腫瘍を有する対象において、腫瘍細胞の数を減少させる方法に関し、本方法は、この対象に、本発明の組成物を投与することを含み、本組成物は、腫瘍の少なくとも１つの抗原をさらに含む。
【００４２】
同様の態様において、本発明は、腫瘍を有する対象において、腫瘍細胞の数を減少させるために使用する医薬の調製において、本発明の組成物のうちのいずれかの使用に関し、この組成物は、腫瘍の少なくとも１つの抗原をさらに含む。
【００４３】
同様の態様において、本発明は、腫瘍を有する対象において、腫瘍細胞の数を減少させるための本発明の組成物に関し、この組成物は、腫瘍の少なくとも１つの抗原をさらに含む。
【００４４】
別の態様において、本発明は、患者において、腫瘍を安定化または退行させる方法に関し、本方法は、（ａ）腫瘍に罹患している患者から白血球を回収することと、（ｂ）患者の腫瘍からの抗原を含むが、外因的に添加されたサイトカインまたは成長因子を欠く支持媒体中で、約３７℃で白血球を培養して、成熟樹状細胞および活性化されたリンパ球を形成することと、（ｃ）この患者に、治療上有効量の組成物を投与することと、を含む。
【００４５】
同様の態様において、本発明は、患者において、腫瘍を安定化または退行させるための医薬の調製において、本発明の組成物のうちのいずれかの使用に関する。
【００４６】
別の同様の態様において、本発明は、患者において、腫瘍を安定化または退行させるための本発明の組成物のうちのいずれかに関する。
【００４７】
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、投与は、全身注射、腫瘍内注射、または腫瘍のリンパを集めるリンパ節への局所注射によるものである。
【００４８】
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、腫瘍は、黒色腫、転移性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、メルケル細胞癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、子宮頸癌、口腔癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、肉腫、頭頚部癌、食道癌、膀胱癌、前立腺癌、または腹膜内膜の癌（中皮腫）である。
【００４９】
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、腫瘍は、黒色腫である。
【００５０】
さらに別の態様において、本発明は、本発明の組成物、腫瘍抗原、およびアジュバントを含む、腫瘍ワクチンに関する。
【００５１】
本出願の実施形態の追加の目的および利点は、部分的には以下の説明で述べられ、部分的にはその説明から明らかになるか、またはそれらは実践によって学習することができる。本実施形態の目的および利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘される要素および組み合わせを用いて明らかになるであろう。
【００５２】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明が属する当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料が、本発明の実践または試験で使用することができるが、好適な方法および材料が以下に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、特許明細書が優先する。加えて、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【００５３】
本明細書では、本発明は、単に例示し添付の図面を参照して説明する。ここで特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示としてであり、例示考察することだけを目的としていることを強調するものである。この点について、本発明の基本的理解に必要である以上に本発明の構造的な詳細を示す試みはなされておらず、図面とともに行われる説明は、本発明の様々な形態が実際にどのように具現化され得るかを当業者に対して明らかにするものである。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】３７℃で４８時間のインキュベーション後の倍率の増加として表される単球上の樹状細胞（ＤＣ）マーカーを示す。
【図２】付着性および非付着性培養条件での、３７℃で４８時間のインキュベーション前およびその後のＤＣマーカーの発現を比較する。
【図３】３７℃で４８時間のインキュベーション前およびその後の単球上のＣＤ８の発現を比較する。図３Ａは、ＣＤ８陽性細胞％を表す。図３Ｂは、ＣＤ８の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を表す。
【図４】超抗原である黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢの存在または不在下での、３７℃で４８時間のインキュベーション前およびその後のリンパ球サブセットにおける活性化マーカーＣＤ６９の発現を示す。図４Ａは、すべてのリンパ球、Ｔ細胞、またはＣＤ３陰性細胞の中の陽性細胞％を表す。図４Ｂは、それぞれの集団における陽性細胞におけるＣＤ６９の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を表す。
【図５】超抗原である黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢの不在（４８時間）および存在（４８時間ＳＡ）下での、３７℃で４８時間のインキュベーション前およびその後のリンパ球サブセットにおけるＩＬ−２受容体（ＣＤ２５）の発現を示す。
【図６】超抗原である黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢの不在および存在下での、３７℃で４８時間のインキュベーション前およびその後の単球上のＣＤ４０の発現を示す。図６Ａは、ＣＤ４０陽性細胞％を表す。図６Ｂは、平均蛍光強度を表す。図６Ｃは、４８時間のインキュベーション後の倍率の増加を示す。
【図７】図７Ａは、３７℃で４８時間のインキュベーション前およびその後のＩＬ−１２産生を示す。図７Ｂは、超抗原である黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢの不在および存在下での、室温（ＲＴ）でまたは３７℃で４８時間のインキュベーション前およびその後のＩＬ−１２産生を示す。
【図８】超抗原である黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢの不在および存在下での、３７℃で４８時間のインキュベーション後の、ＡＩＣＣ中のＩＬ−２内容物、および新鮮血清中に再懸濁させたＡＩＣＣの洗浄細胞によるＩＬ−２産生を示す。
【図９】超抗原である黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢの存在下での、３７℃で４８時間のインキュベーション後のＩＦＮ−ガンマ産生、およびエンテロトキシンＢの存在下での、３７℃で４８時間のインキュベーション後の新鮮血清中に再懸濁させた洗浄細胞によるＩＦＮ−ガンマ産生を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
以下に更に詳細に記載されるように、本発明は、活性化された免疫刺激細胞組成物（ＡＩＣＣ）、ＡＩＣＣを調製する方法、およびＡＩＣＣを使用する方法に関する。
【００５６】
本発明のＡＩＣＣは、成熟ＤＣに分化される機能的に活性な単球を含み、これはそれらの細胞表面マーカーのプロファイル、Ｔ細胞への超抗原等の抗原を提示するそれらの能力、および優先的なＴｈ１極性を促進する主な要因であるＩＬ−１２の放出によって示される。ＡＩＣＣ中のＴ細胞もまた、活性化される。抗原の存在下で、ＡＩＣＣ中で成熟ＤＣとＴ細胞の相互作用は、Ｔ細胞のＩＬ−２受容体の上方調節ならびにＩＬ−２およびＩＦＮ−ｇの放出を生じる。ＡＩＣＣ中でＤＣが抗原に曝露されるとき、ＩＬ−１２の産生が急激に増加する。したがって、本発明のＡＩＣＣは、免疫刺激のための強力なツールである。例えば、インビボで投与されるとき、ＡＩＣＣは、腫瘍環境において、ＣＴＬの増殖を活性化し、腫瘍拒絶を引き起こす、Ｔｈ１サイトカイン（例えば、インターフェロン、ＩＬ−２）を好むようにサイトカイン平衡を変化させることができる。
【００５７】
理論により拘束されることなく、本発明のＡＩＣＣは、単球／マクロファージをＭ１表現型に分極する。実施例に示されるように、ＡＩＣＣ中の単球／マクロファージの大部分は、高レベルのＨＬＡ−ＤＲを発現し、ＩＬ−１２およびその他のＭ１サイトカインを産生する。Ｍ１サイトカインは、細胞性免疫に対する腫瘍環境の阻害作用を克服し、腫瘍拒絶を促進することが知られている。したがって、ＡＩＣＣ中のサイトカインはまた、腫瘍治療に有用である。
【００５８】
本発明の原理および実施は、図面および添付の説明を参照して、よりよく理解され得る。本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用が、以下の説明に記載されているか、または実施例によって例示されている詳細に限定されないことを理解すべきである。本発明は、他の実施形態も可能であるし、または様々な方法で実践または実施することができる。
【００５９】
本明細書に採用されている表現および用語は、説明を目的としており、限定的なものと見なすべきでないことも理解すべきである。さらに、任意およびすべての値（数値範囲の下限および上限を含む）に関連して使用される「約」という用語は、＋／−０．５％〜＋／−２０％（ならびにそれらの間の値、例えば、±１％、±１．５％、±２％、±２．５％、±３％、±３．５％、±４％、±４．５％、±５％、±５．５％、±６％、±６．５％、±７％、±７．５％、±８％、±８．５％、±９％、±９．５％、±１０％、±１０．５％、±１１％、±１１．５％、±１２％、±１２．５％、±１３、±１３．５％、±１４％、±１４．５％、±１５％、±１５．５％、±１６％、±１６．５％、±１７％、±１７．５％、±１８％、±１８．５％、±１９％、±１９．５％、および±２０％）の様々な範囲の偏差を含む。
【００６０】
Ｉ．活性化された免疫刺激細胞組成物を作製する方法
白血球は、免疫応答を介在するために活性化を必要とする。ここで使用される、活性化された免疫刺激細胞組成物とは、少なくとも１つの型の活性化された白血球を含む組成物を指す。この文脈において、「活性化された」とは、細胞が活性化された細胞の１つ以上の機能的または表現型の特性を得ていることを意味する。活性化された（または「成熟した」）樹状細胞の特性の例としては、ＩＬ−１２の産生；ＩＬ−１０の不在または低レベルの産生、共刺激分子ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ４０、またはＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ１）のうちの１つ以上の、ＣＤ５６、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、もしくはＩＧＳＦ４（ＳｙｎＣａｍおよびネクチン様２）等の１つ以上の接着分子の、ＣＬＥＣ９Ａ（ＤＮＧＲ−１）等の１つ以上のレクチン受容体の、ＣＣＲ７等の１つ以上のケモカイン受容体の、ＴＬＲ１、ＴＬＲ３、もしくはＴＬＲ６等の１つ以上のトール受容体の、ＤＣ−ＬＡＭＰ等の１つ以上のｅｎｄｏｃｏｍａｌタンパク質の、またはＩｄ２、ＩＲＦ８、もしくはＩＣＳＢＰ等の１つ以上の転写因子の、発現；抗原提示を介してナイーブＴ細胞を活性化する能力；ならびに抗体分泌（血漿）細胞へのＢ細胞の分化を誘発する能力が挙げられるが、これらに限定されない。活性化されたＴ細胞の特性の例としては、ＩＬ−２、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＦＮ−アルファ、またはＩＦＮ−ベータのうちの１つ以上の産生；ＩＬ−２Ｒの発現；ＣＤ６９、ＣＤ７１（トランスフェリン受容体１）、ＣＤ２８、またはＣＤ４０Ｌのうちの１つ以上等のＴ細胞活性化マーカーの上方調節；ならびに抗原、細胞毒性機能、またはヘルパー機能への曝露後の増殖が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
一実施形態において、ＡＩＣＣは、末梢血から調製される。末梢血には、一般に、赤血球（ＲＢＣ）および血小板だけでなく、白血球も含有する。「白血球細胞」としても知られている白血球には、単球（様々な組織および樹状細胞のマクロファージに分化する「前駆」細胞）、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）を含む）、ならびに顆粒球（好中球、好塩基球、および好酸球を含む）が含まれる。
【００６２】
代替の実施形態において、全末梢血が、便利な白血球の供給源であるが、ＡＩＣＣは、中心線からの血液から単離された白血球、臍帯血、胎盤血、リンパ液、骨髄、またはリンパ節もしくは膵臓等のリンパ系組織から単離された白血球を用いて調製される。白血球は、白血球除去によって調製され得る。したがって、白血球の供給源は、重要であるとは考えられない。
【００６３】
全血が使用されるとき、白血球は、異なる細胞型の密度勾配分離法を使用して、「軟膜」を調製することによって、赤血球および血小板から部分的に分離することができる。したがって、いくつかの実施形態において、ＡＩＣＣ中に存在する血小板および赤血球の量は、全血中のものよりも低い。
【００６４】
ＡＩＣＣを産生するための出発材料は、自家供給源または同種異系供給源から得られ得る。一実施形態において、ＡＩＣＣは、ＡＩＣＣにより最終的に治療されるであろう患者から調製される、すなわち、この供給源は、自家である。他の実施形態において、ＡＩＣＣは、意図されたＡＩＣＣ受容者以外の個人から調製される。この場合は、この供給源は、同種異系である。
【００６５】
同種出発材料を含む、これらの実施形態において、これらは、血液銀行から好都合に得られ得る。試料は、血液型（ＡＢＯ、Ｒｈ）、またはＡ２、Ｂ１２、およびＣ３等であるが、これらに限定されない、特定のヒト白血球抗原の対立遺伝子、赤血球抗原に対する不規則な抗体、ならびに輸血感染症について、血液バンクによってスクリーニングされ得る。より具体的には、スクリーニングは、Ａｂｂｏｔｔ  ＰＲＩＳＭ機器を用いて、抗体でＢ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＩＶ１／２、ＨＴＬＶ、および梅毒（−ＨＣＶ；ＨｂｓＡｇ；抗ＨＩＶ  １／２  Ｏ＋；および抗ＨＴＬＶ  Ｉ／ＩＩ）について実行することができる。試料はまた、分子方法（ＮＡＴ−核酸試験）によってＨＩＶ、ＨＣＶ、およびＨＢＶに対してもスクリーニングすることができる。分子スクリーニングは、市販の機器、例えば、ＣｈｉｒｏｎのＴＩＧＲＩＳシステムを用いて、またはこのような疾患について試験する好適な形態であり得る任意の他の方法を用いて達成することができる。
【００６６】
同種異系の供給源に関与する一実施形態において、試料は、意図されたＡＩＣＣ受容者と同じ血液型を有するドナーから得られる。一実施形態において、ドナー（複数可）および受容者である患者は、１つ以上のＨＬＡ対立遺伝子型に基づいて、適合させることができる。代替として、血漿試料は、ＡＢ＋血液型を有するドナーから得ることができ、白血球は、Ｏ−血液型を有するドナーから得ることができる。ＡＢ＋血液型を有するドナーは、血漿の万能ドナーであり、Ｏ−血液型を有するドナーは、白血球の万能ドナーである。この血漿は、新鮮な、保存された（例えば、２４時間未満１〜６℃で）、乾燥させたか、またはそうでなければ前処理された（例えば、病原体減少血漿および溶媒／浄化剤（ＳＤ）処理された血漿）状態であり得る。供給源に関わらず、試料（複数可）の必要な処理はすべて、高度に特殊な装置を必要とせずに実行することができる。
【００６７】
いくつかの実施形態において、活性化された免疫刺激細胞の組成物は、すべての溶液の体積を同量減らし、より小さなバッグまたは他のインキュベーション容器を使用して、低体積の血液試料から調製し得る。さらに、これらの異なるサイズのインキュベーション容器の使用により、同様の組成物を有するＡＩＣＣが得られる。低体積の使用により、臨床医に、外部の血液銀行を用いずに自己に血液採血を行う能力を提供する。これは、他の点では健常な免疫系を有するが、ある型の小さな癌の病変に罹患している患者を治療するとき、有用であり得る。
【００６８】
いくつかの実施形態において、ＡＩＣＣを調製する方法は、ａ）ヒト白血球を活性化することと、ｂ）樹状細胞（ＤＣ）の分化および成熟を誘発する時間および温度の条件下、インキュベーション組成物中の活性化された白血球をインキュベートし、それにより、ＡＩＣＣを産生することと、を含む。一実施形態において、ステップ（ｂ）はまた、リンパ球の活性化を誘発する。
【００６９】
一実施形態において、本方法は、ＤＣを抗原または抗原ペプチドと接触させることをさらに含む。一実施形態において、抗原または抗原ペプチドが、インキュベーション組成物中で分化および成熟するとき、ＤＣと接触させる。つまり、抗原または抗原ペプチドは、ステップ（ｂ）のインキュベーションの一部またはすべての期間添加される。一実施形態において、インキュベーション組成物中でインキュベーションが完了した後、抗原または抗原ペプチドを、ＤＣと接触させる。つまり、本方法は、抗原または抗原ペプチドを、抗原ペプチドを用いてＤＣを負荷するのに十分な期間にわたってＡＩＣＣに添加するステップ（ｃ）をさらに含む。
【００７０】
一実施形態において、国際公開第２０１０／１００５７０号の方法を使用して産生された活性化白血球組成物は、ＡＩＣＣを調製する際に使用される。この実施形態において、活性化白血球組成物は、上記の実施形態の方法のステップ（ａ）に相当する。
【００７１】
いくつかの実施形態において、ＡＩＣＣを調製する方法は、ａ）ヒト白血球を単離することと、ｂ）任意に、白血球を低浸透圧ショックに供することと、ｃ）樹状細胞（ＤＣ）の分化および成熟を誘発する時間および温度の条件下で、インキュベーション組成物中のショックさせた白血球をインキュベートし、それにより、ＡＩＣＣを産生することと、を含む。一実施形態において、ステップ（ｃ）はまた、リンパ球の活性化を誘発する。
【００７２】
一実施形態において、本方法は、ＤＣを抗原または抗原ペプチドと接触させることをさらに含む。一実施形態において、抗原または抗原ペプチドが、インキュベーション組成物中で分化および成熟するとき、ＤＣと接触させる。つまり、抗原または抗原ペプチドは、ステップ（ｃ）のインキュベーションの一部またはすべての期間添加される。一実施形態において、インキュベーション組成物中のインキュベーションが完了した後、抗原または抗原ペプチドを、ＤＣと接触させる。つまり、本方法は、抗原または抗原ペプチドを、抗原ペプチドを用いてＤＣを負荷するのに十分な期間にわたってＡＩＣＣに添加するステップ（ｄ）をさらに含む。
【００７３】
一実施形態において、国際公開第２０１０／１００５７０号の方法を使用して産生された活性化白血球組成物は、ＡＩＣＣを調製する際に使用される。この実施形態において、活性化白血球組成物は、上記の実施形態の方法のステップ（ａ）および（ｂ）に相当する。
【００７４】
いくつかの実施形態において、本方法は、ａ）白血球を活性化する時間および温度の条件下で、ヒト白血球をインキュベートすることと、ｂ）任意に、白血球を低浸透圧ショックに供することと、ｃ）等張を回復させるのに有効な量で生理学的に許容される塩溶液をステップｂの白血球に添加することと、ｄ）ステップｃの白血球を媒体と混合して、第２のインキュベーション組成物を形成することと、ｅ）樹状細胞（ＤＣ）の分化および成熟を誘発する時間および温度の条件下、第２のインキュベーション組成物をインキュベートし、それにより、ＡＩＣＣを産生することと、を含む。一実施形態において、ステップ（ｅ）はまた、リンパ球のさらなる活性化を誘発する。
【００７５】
一実施形態において、本方法は、ステップ（ｅ）の樹状細胞（ＤＣ）を抗原または抗原ペプチドと接触させることをさらに含む。一実施形態において、抗原または抗原ペプチドが、インキュベーション組成物中で分化および成熟するとき、ＤＣと接触させる。つまり、抗原または抗原ペプチドは、ステップ（ｅ）のインキュベーションの一部またはすべての期間添加される。一実施形態において、インキュベーション組成物中のインキュベーションが完了した後、抗原または抗原ペプチドを、ＤＣと接触させる。つまり、本方法は、抗原または抗原ペプチドを、抗原ペプチドを用いてＤＣを負荷するのに十分な期間にわたってＡＩＣＣに添加するステップ（ｆ）をさらに含む。
【００７６】
一実施形態において、国際公開第２０１０／１００５７０号の方法を使用して産生された活性化白血球組成物は、ＡＩＣＣを調製する際に使用される。この実施形態において、活性化白血球組成物は、上記の実施形態の方法のステップ（ａ）〜（ｄ）に相当する。
【００７７】
いくつかの実施形態において、本方法は、ａ）白血球を活性化するために、室温で最長約２０時間ヒト白血球をインキュベートすることと、ｂ）白血球を低浸透圧ショックに供することと、ｃ）等張を回復させるのに有効な量で生理学的に許容される塩溶液をステップｂの白血球に添加することと、ｄ）ステップｃの白血球を媒体と混合して、第２のインキュベーション組成物を形成することと、ｅ）樹状細胞（ＤＣ）の分化および成熟を誘発する時間および温度の条件下、第２のインキュベーション組成物をインキュベートし、それにより、ＡＩＣＣを産生することと、を含む。一実施形態において、ステップ（ｅ）はまた、リンパ球のさらなる活性化を誘発する。
【００７８】
一実施形態において、本方法は、ステップ（ｅ）の樹状細胞（ＤＣ）を抗原または抗原ペプチドと接触させることをさらに含む。一実施形態において、抗原または抗原ペプチドが、インキュベーション組成物中で分化および成熟するとき、ＤＣと接触させる。つまり、抗原または抗原ペプチドは、ステップ（ｅ）のインキュベーションの一部またはすべての期間添加される。一実施形態において、インキュベーション組成物中でインキュベーションが完了した後、抗原または抗原ペプチドを、ＤＣと接触させる。つまり、本方法は、抗原または抗原ペプチドを、抗原ペプチドを用いてＤＣを負荷するのに十分な期間にわたってＡＩＣＣに添加するステップ（ｆ）をさらに含む。
【００７９】
一実施形態において、国際公開第２０１０／１００５７０号の方法を使用して産生された活性化白血球組成物は、ＡＩＣＣを調製する際に使用される。この実施形態において、活性化白血球組成物は、上記の実施形態の方法のステップ（ａ）〜（ｄ）に相当する。
【００８０】
いくつかの実施形態において、本方法は、ａ）ヒト白血球を活性化することと、ｂ）ステップａの白血球を媒体と混合して、第２のインキュベーション組成物を形成することと、ｃ）樹状細胞（ＤＣ）の分化および成熟を誘発する時間および温度の条件下、第２のインキュベーション組成物をインキュベートし、それにより、ＡＩＣＣを産生することと、を含む。白血球の活性化は、ＣＤ１１ｂおよび／またはＣＤ６２Ｌ等の白血球の活性化マーカーを表す白血球の発現レベルまたはその数の変化によって示される。したがって、一実施形態において、白血球の活性化は、白血球集団におけるＣＤ１１ｂの発現の増加によって示される。ＣＤ１１ｂの発現の増加は、例えば、フローサイトメトリーによって検出することができる。ＣＤ１１ｂの発現の増加は、白血球におけるＣＤ１１ｂに対する平均蛍光強度の増加を包含し、例えば、平均蛍光強度は、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％増加し得る。ＣＤ１１ｂの発現の増加はまた、ＣＤ１１ｂを発現する白血球のパーセンテージの増加を包含する（例えば、アイソタイプ対照を使用して、背景染色に対して補正された後）。例えば、ＣＤ１１ｂを発現する白血球のパーセンテージは、軟膜中の白血球におけるＣＤ１１ｂ発現の発現と比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％増加し得る。一実施形態において、白血球の活性化は、白血球集団におけるＣＤ６２Ｌの発現の減少によって示される。ＣＤ６２Ｌの発現の減少は、例えば、フローサイトメトリーによって検出することができる。ＣＤ６２Ｌの発現の減少は、白血球におけるＣＤ６２Ｌに対する平均蛍光強度の減少を包含し、例えば、平均蛍光強度は、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％減少し得る。ＣＤ６２Ｌの発現の減少はまた、ＣＤ６２Ｌを発現する白血球のパーセンテージの減少を包含する（例えば、アイソタイプ対照を使用して、背景染色に対して補正された後）。例えば、ＣＤ６２Ｌを発現する白血球のパーセンテージは、軟膜中の白血球におけるＣＤ６２Ｌ発現の発現と比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％減少し得る。一実施形態において、ＣＤ６２Ｌおよび／またはＣＤ１１ｂは、顆粒球である白血球において測定される。一実施形態において、ＣＤ６２Ｌおよび／またはＣＤ１１ｂは、単球である白血球において測定される。一実施形態において、ステップ（ｃ）はまた、リンパ球のさらなる活性化を誘発する。
【００８１】
加えて、白血球の活性化に関与する他の実施形態のいずれかでは、上で論じられる、ＣＤ１１ｂおよび／またはＣＤ６２Ｌの発現の変化は、白血球の活性化の指標として、単独で、一緒に、または本出願中の他の箇所で論じられる、さらなるマーカーおよびアッセイと組み合わせて、使用され得る。
【００８２】
一実施形態において、本方法は、ステップ（ｃ）の樹状細胞（ＤＣ）を抗原または抗原ペプチドと接触させることをさらに含む。一実施形態において、抗原または抗原ペプチドが、インキュベーション組成物中で分化および成熟するとき、ＤＣと接触させる。つまり、抗原または抗原ペプチドは、ステップ（ｃ）のインキュベーションの一部またはすべての期間添加される。一実施形態において、インキュベーション組成物中のインキュベーションが完了した後、抗原または抗原ペプチドを、ＤＣと接触させる。つまり、本方法は、抗原または抗原ペプチドを、抗原ペプチドを用いてＤＣを負荷するのに十分な期間にわたってＡＩＣＣに添加するステップ（ｄ）をさらに含む。
【００８３】
一実施形態において、国際公開第２０１０／１００５７０号の方法を使用して産生された活性化白血球組成物は、ＡＩＣＣを調製する際に使用される。この実施形態において、活性化白血球組成物は、上記の実施形態の方法のステップ（ａ）および（ｂ）に相当する。
【００８４】
一般に、ＡＩＣＣを調製する方法のうちのいずれかでは、白血球が休止状態から機能的に活性な状態に遷移した任意の組成物は、低浸透圧ショックステップのために使用され得る。例えば、国際公開第２０１０／１００５７０号に記載されるように、白血球は、それらを室温で最長約２０時間インキュベートすることによって、休止状態から機能的に活性な状態に遷移させることができる。一実施形態において、この遷移は、白血球を室温で約９０分間〜約２０時間インキュベートすることによって生じる。一実施形態において、この遷移は、白血球を室温で約８時間〜約２０時間インキュベートすることによって生じる。一実施形態において、この遷移は、白血球を室温で一晩インキュベートすることによって生じる。他の実施形態において、温度は、約３７℃であり得る。上述のように、この「遷移する」ステップの詳細は、不可欠なものではなく、白血球は、ＡＩＣＣを調製するために使用される任意の方法によって得られ得る。
【００８５】
さらに、低浸透圧ショックは、一種の応力であるため、低浸透圧ショックのステップを含む方法のこれらの実施形態において、他の方法が、細胞に応力を与えるために採用され得る。つまり、様々な種類の応力が、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化をもたらすタンパク質キナーゼカスケードからなる同じ高度に保存されたシグナル伝達経路を通って細胞応答を引き起こすため、低浸透圧ショックを言及する実施形態のいずれかにおいて、低浸透圧ショックの代わりに、他のストレス要因が使用され得る。例えば、いくつかの実施形態において、ＡＩＣＣを調製する方法は、熱ショック、低酸素症、クロルプロマジン、カフェイン、バナジウム酸塩、ザイモリアーゼ（ｚｙｍｏｌｙｓｅ）、コンゴレッド、カルコフロール、ラパマイシン、もしくは接合フェロモンのうちのいずれかの１つ以上による処理から選択されるストレス要因に、白血球を曝露する、あるいはアクチン脱重合の誘発による、任意のステップを（低浸透圧ショックの代わりに、またはそれに加えて）含む。白血球の活性化はまた、細胞内のカルシウムの増加を生じ、この応答を模倣する多くの作動薬が存在する。したがって、さらに他の実施形態において、ＡＩＣＣを調製する方法は、低浸透圧ショックの代わりに、またはそれに加えて、ＦＭＬＰまたはＰＭＡ等のカルシウムイオノフォアに、白血球を曝露する任意のステップを含む。
【００８６】
ＡＩＣＣを産生する様々な方法の実施形態のいずれかにおいて、「樹状細胞（ＤＣ）の分化および成熟を誘発する時間および温度の条件」下でのインキュベーション（任意に、リンパ球および他の細胞を活性化し得る）は、一般に、ほぼ室温〜約３７℃で約２４時間〜約１４日間のインキュベーションである。
【００８７】
いくつかの実施形態において、樹状細胞（ＤＣ）の分化および成熟を誘発するインキュベーションは、ほぼ室温の温度で、すなわち、約１２℃〜約２８℃の範囲内である。一実施形態において、インキュベーションは、約１６℃〜約２５℃の温度である。一実施形態において、インキュベーションは、約１８〜２５℃の温度である。なお別の実施形態において、インキュベーションは、約２０〜２５℃の温度である。
【００８８】
いくつかの実施形態において、樹状細胞（ＤＣ）の分化および成熟を誘発するインキュベーションは、約３７℃の温度である。一実施形態において、インキュベーションは、約３５℃〜約３８℃である。一実施形態において、インキュベーションは、３７℃＋／−０．５℃である。
【００８９】
いくつかの実施形態において、樹状細胞（ＤＣ）の分化および成熟を誘発するためのインキュベーション期間は、約２４時間〜１４日間である。したがって、いくつかの実施形態において、インキュベーションは、約２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、７２、８４、９６、１０８、１２０、１３２、１４４、１５６、１６８、１９２、２１６、２４０、２６４、２８８、３１２、または約３３６時間、あるいは、これらの値の間でほぼ任意の時間範囲内である。
【００９０】
いくつかの実施形態において、樹状細胞（ＤＣ）の分化および成熟を誘発するためのインキュベーション期間は、約４８〜約７２時間の範囲である。一実施形態において、インキュベーションは、約３７℃で約４８〜約７２時間の範囲である。一実施形態において、インキュベーションは、約３７℃で約４８時間行う。一実施形態において、インキュベーションは、約３７℃で約７２時間行う。一実施形態において、インキュベーションは、室温で約２４〜約７２時間行う。
【００９１】
いくつかの実施形態において、インキュベーションは、５％  ＣＯ２を含有する雰囲気中、１００％の湿度で、細胞インキュベーター中である。いくつかの実施形態において、インキュベーションは、ガス透過性バッグ中で行われ、これらのバッグは、５％  ＣＯ2を含有する雰囲気中、１００％の湿度で、細胞インキュベーター中に入れる。他の実施形態において、組織培養フラスコまたは皿が、本方法で使用される。さらに他の実施形態において、バッグシステムおよび培養皿またはフラスコの組み合わせが、本方法で使用される。バッグシステム中でのインキュベーションを含むこれらの実施形態において、このバッグシステムは、国際公開第２０１０／１００５７０号に記載されるもののうちの１つであり得るか、あるいは、フッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）またはエチルビニルアセテート（ＥＶＡ）等であるが、これらに限定されない異なる材料から作製されるバッグであり得るか、または組織培養容器もしくは任意の容器内であり得る。
【００９２】
インキュベーションに使用される任意の容器はまた、白血球に付着するように、処理され得るか、またはそうでなければ改質され得、このことは、白血球の活性化、単球の分化、およびリンパ球の活性化／プライミングに対して有益であり得る。一実施形態において、ＡＩＣＣを調製する方法に使用される培養容器のうちの１つ以上は、樹状細胞に対して非付着性である。別の実施形態において、ＡＩＣＣを調製する方法で使用される培養容器は、細胞付着を軽減するように処理される。さらに別の実施形態において、ＡＩＣＣを調製する方法で使用される１つ以上の培養容器は、細胞の付着を増大させるように処理される。
【００９３】
インキュベーションに使用される任意の容器はまた、足場を含有し得る。足場は、異なる形状であり得、特に、これらは、例えば、コラーゲンで作られている、またはＰＬＡ、ＰＧＡ（ポリ乳酸、ポリグリコール酸）、もしくは同様の合成ポリマーで作られている、マイクロビーズ、生分解性、または非生分解性であり得るか、ゼラチン、ヒアルロン酸、アルギン酸、フィブリン接着剤で作られているヒドロゲル足場であり得る。足場またはバッグは、付着受容体、フィブロネクチンもしくはラミニン等の細胞外マトリックスタンパク質、またはＲＧＤ等の細胞外マトリックスからの活性結合ペプチドでコーティングされ得る。足場またはマイクロビーズはまた、ＣＤ３、ＣＤ２８、もしくはＣＤ４０に対する活性化抗体等であるが、これらに限定されない、活性化刺激物または刺激抗体でコーティングされ得る。しかしながら、少なくとも１つの実施形態において、本方法は、１つ以上の活性化刺激物で、またはＣＤ３、ＣＤ２８、もしくはＣＤ４０に対する１つ以上の抗体でコーティングされたマイクロビーズまたは足場を含まない。
【００９４】
いくつかの実施形態において、ＡＩＣＣを産生するためにインキュベーションに使用される媒体は、血漿または血清である。血清を利用するこれらの実施形態において、血清は、血漿試料から得ることができ、これは、約３７℃で凝固剤と接触させた白血球と同一または異なる全血試料から（すなわち、同一または異なるヒトから）得ることができる。いくつかの実施形態において、血清または血漿は、商業的または非営利の供給源から得られ、新鮮な、または冷凍等の保存に適合した形態のいずれかであり得る。
【００９５】
加えて、血清（特に、ヒト血清）がしばしば、支持的媒体としてインキュベーション組成物に使用されるが、サイトカインの放出、成長因子、および／または活性化白血球からの他の可溶性構成要素を支持する生理的媒体である限り、他の支持的媒体も、使用され得る。例えば、血漿は、血清の代わりに使用され得る。支持媒体としても使用され得る他のインキュベーション媒体には、培養培地、生理食塩水、またはアミノ酸等の細胞の生存および機能に不可欠である糖および他の構成要素の任意の添加を有する緩衝生理食塩溶液（例えば、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、アール平衡塩溶液（ＥＢＳＳ）、標準クエン酸生理食塩水液（ＳＳＣ）、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）、ゲイ平衡塩溶液（ＧＢＳＳ））が含まれる。生理食塩溶液および培養培地はまた、ヒト血清または臨床的グレードの動物血清、または血清代替物が補充され得る。インキュベーション組成物は、代替的にまたは加えて、血清タンパク質、例えば、ヒトまたはウシアルブミン、ガンマ−グロブリン、トランスフェリン、または異なる組織由来のタンパク質、植物性タンパク質、もしくは植物エキスを含有し得る。
【００９６】
ある特定の実施形態において、補体タンパク質、ケモカイン、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ガンマ、サイトカイン、例えば、インターロイキン−４、顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、またはインターロイキン−１２等の白血球作動薬をインキュベーションに添加する。インビトロでのＤＣへの単球分化は、特定のサイトカインカクテルを用いて誘発され得る（Ｊｅｎｓｅｎ  ＳＳ，Ｇａｄ  Ｍ．２０１０）。したがって、一実施形態において、インキュベーションは、インターロイキン−４またはＧＭ−ＣＳＦ等のサイトカインの存在下で行われ得る。他の実施形態において、インキュベーションは、樹状細胞の分化および成熟ならびにリンパ球およびＮＫ細胞の活性化を増大する他の物質を用いて行われ得る。例えば、単球上のＣＤ４０共刺激受容体は、サイトカインの不在下で、ＣＤ４０への抗体によって、またはＣＤ４０リガンド（ＣＤ５４）によって連結され得る（Ｂｒｏｓｓａｒｔ  Ｐ，１９９８）。ＤＣの成熟に対するＣＤ４０の独立した活性化は、活性化されたＣＤ８陽性Ｔ細胞との相互作用によって誘発され得る（Ｒｕｅｄｌ  Ｃ．，１９９９、Ｗｉｒｔｈｓ，２００２）。したがって、一実施形態において、外因性の活性化されたＣＤ８陽性Ｔ細胞を、インキュベーションに加えてもよい。インビトロでの単球からのＤＣの分化はまた、ＮＫＴ細胞とのＤＣの相互作用によって誘発され得る。ＤＣの分化は、単球による活性化の際に、ＮＫＴ細胞により産生されたサイトカインであるＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１３のＮＫＴ細胞分泌によって生じる（Ｈｅｇｄｅ，２００７）。したがって、一実施形態において、外因性の活性化されたＮＫＴ細胞を、インキュベーションに加えてもよい。他の実施形態において、ＤＣの分化および成熟は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−２、ＩＦＮ−アルファ、およびＴＮＦ−アルファのうちの１つ以上の添加によって、ならびに／またはリポ多糖類（ＬＰＳ）、ペプチドグリカン（ムレイン）、二本鎖ＲＮＡもしくはその合成類似体のポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）、レジキモド（Ｒ−８４８）、およびピシバニル（ＯＫ−４３２）等であるが、これらに限定されない、ＤＣ上のトール受容体と相互作用する１つ以上の細菌産物の添加によって促進され得る。
【００９７】
また、本方法の１つ以上の実施形態において、ＤＣの成熟に関与する、上記の外因的に添加された因子（複数可）のうちの１つ以上の不在下で、インキュベーションが生じることも明確に企図される。一実施形態において、ＤＣの成熟に必要とされる構成要素のすべては、内因的に提供され、さらなる刺激をインキュベーション組成物に加えない。それにもかかわらず、様々なサイトカインが、インキュベーション中、白血球の活性化の際に放出されるため、それらは、インキュベーション組成物中に存在し得る。例えば、ＣＤ４０リガンドは、血清中、およびインキュベーション組成物の一部である血小板上に見出され得る。同様に、インキュベーション組成物中に内因的に存在する活性化されたＣＤ８+Ｔ細胞およびＮＫＴ細胞は、単球と相互作用して、樹状細胞の分化および成熟を支持し得る。
【００９８】
したがって、一実施形態において、（ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ、またはインターフェロンのうちの１つ以上が、インキュベーション中に内因的に産生され得るが）ＡＩＣＣを産生するためのインキュベーション組成物は、外因性ＧＭ−ＣＳＦ、外因性ＩＬ−４、外因性ＴＮＦ、または外因性インターフェロンを含まない。それ故に、一実施形態において、ＡＩＣＣを調製する方法は、１つ以上の外因性サイトカインもしくはインターフェロンの添加、ＣＤ３および／もしくはＣＤ２８を架橋する試薬（複数可）の添加、ＣＤ４０を架橋する試薬（複数可）の添加、ならびに／またはＡＩＣＣの産生中、樹状細胞の成熟を促進する他の外因性薬剤の添加を除外する。本方法の実践から除外され得る外因的に添加されたサイトカインおよび外因的に添加されたインターフェロンの例には、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−２、ＩＦＮ−アルファ、またはＩＬ−２のうちのいずれかの１つ以上が含まれる。本方法の実践から除外され得る外因的に添加された細菌産物の例には、リポ多糖類（ＬＰＳ）、ペプチドグリカン（ムレイン）、二本鎖ＲＮＡもしくはその合成類似体のポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）、レジキモド（Ｒ−８４８）、およびピシバニル（ＯＫ−４３２）等であるが、これらに限定されない、ＤＣ上のトール受容体と相互作用することが知られているものが含まれる。
【００９９】
いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦシグナル伝達を標的とする血管新生阻害剤を、インキュベーション組成物に添加する。これらには、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ベバシズマブ、ラニビズマブ）、ＶＥＧＦ受容体に対する抗体（例えば、ＶＥＧＦＲ−２およびＦＧＦＲを標的とするブリバニブ）、ＶＥＧＦ受容体のチロシンキナーゼ活性の阻害剤（例えば、ソラフェニブ、セジラニブ、スニチニブ）、可溶性受容体デコイ（例えば、アフリベルセプトとも呼ばれる、ＶＥＧＦトラップ）、または血管破壊剤（例えば、ＺＤ６１２６）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１００】
いくつかの実施形態において、アジュバントを、インキュベーション組成物に添加する。アジュバントの例には、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、およびリン酸カルシウム、油乳剤系のアジュバント（フロイント乳化油アジュバント（完全および不完全）、Ａｒｌａｃｅｌ  Ａ、鉱油、乳化落花生油アジュバント（アジュバント６５）、細菌（それらの合成誘導体、ならびにリポソーム）またはグラム陰性細菌からの生成物、エンドトキシン、コレステロール、脂肪酸、脂肪族アミン、パラフィン系オイルおよび植物油、モノホスホリルリピドＡ、Ｑｕｉｌ−Ａ付きＩＳＣＯＭ、およびシンテックスアジュバント製剤（ＳＡＦ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、他の部分で論じられるように、本方法のいずれかには、１つ以上の抗原または抗原ペプチドを導入する接触ステップをさらに含み得る。抗原の例には、腫瘍特異性および腫瘍関連抗原、幹細胞／癌幹細胞抗原、ならびに超抗原（例えば、ブドウ球菌エンテロトキシン）が含まれる。一般的に言えば、抗原または抗原ペプチドは、樹状細胞への単球、およびその抗原に特異的な主なリンパ球の分化を増強するであろう。さらに、細胞レベル上の抗原提示は、クラスＩまたはクラスＩＩ分子に関連して提示される抗原ペプチドを含み、「抗原」、「抗原ペプチド（ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）」、および「抗原ペプチド（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ）」という用語は、無傷抗原または特定のペプチドとの接触を必要とするものとして解釈されるべきではない。その代わり、これらの用語は、抗原提示細胞が、直接またはさらなる処理後のいずれかで、クラスＩまたはクラスＩＩ分子に関連して存在し得る、抗原材料と接触させることを示すために、広範に使用される。
【０１０２】
細胞溶解物から調製されるか、またはタンパク質もしくはペプチドの組み換え発現によって調製されるかにかかわらず、抗原および抗原ペプチドは、ＡＩＣＣを用いて、または様々な濃度でＡＩＣＣの産生中、室温〜約３７℃で約１時間〜約２４時間インキュベートされる。抗原／ペプチドの例には、以下に記載されるものおよび実施例の項で使用される任意の抗原／ペプチドが含まれる。
【０１０３】
近年、ハイスループット技術により、癌において、突然変異遺伝子の特定が可能になっている。これらの遺伝子の数は多く、以前考えられていたよりも広範囲に機能的な異種性を有する（Ｓｔｒａｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４５８：７１９−２４（２００９）、Ｐｌｅａｓａｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４６３：１９１−９６（２０１０））。これらの研究は、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、および肺癌、ならびに膠芽腫において行われており、全部で約４００の候補癌遺伝子（ＣＡＮ遺伝子）を特定している。
【０１０４】
通常、精巣、胎盤、および卵巣の精母細胞または精原細胞と関連する共通抗原のいくつかの例には、癌−精巣（ＣＴ）抗原であるＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＭＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、およびＳＳＸが含まれる。これらの抗原は、黒色腫、リンパ腫、肺、膀胱、結腸、および乳癌に見られる。メラニン細胞、上皮組織、前立腺、および結腸に通常見られる共通抗原はまた、分化抗原Ｇｐ１００、Ｍｅｌａｎ−Ａ／Ｍａｒｔ−１、Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ、ＰＳＡ、ＣＥＡ、およびＭａｍｍａｇｌｏｂｉｎ−Ａを含む。これらの抗原は、黒色腫、前立腺癌、結腸、および乳癌に見られる。低いレベルで普遍的に発現する共通抗原は、癌において過剰発現され得る。過剰発現した抗原の例には、食道、肝臓、膵臓、結腸、乳房、卵巣、膀胱、および前立腺癌に見られる、ｐ５３、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、リビン、およびスルビビンが含まれる。β−カテニン−ｍ、β−アクチン／４／ｍ、ミオシン／ｍ、ＨＳＰ７０−２／ｍ、およびＨＬＡ−Ａ２−Ｒ１７０Ｊ等の他の抗原は、独特であり、これらは、黒色腫、非小細胞肺癌、および腎臓癌のうちの１つ以上と関連する。さらに他の抗原は、通常、腎臓、腸、および結腸直腸組織等の上皮組織に通常見られる腫瘍関連糖鎖抗原である。これらの抗原には、ＧＭ２、ＧＤ２、ＧＤ３、ＭＵＣ−１、ｓＴｎ、ａｂｄ  ｇｌｏｂｏ−Ｈが含まれ、これらは、黒色腫、神経芽細胞腫、結腸直腸、肺、乳房、卵巣、および前立腺癌に見られ得る。
【０１０５】
本発明の様々な態様において使用され得るいくつかのさらなる例示的な抗原／ペプチドには、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＴＹＲ、および、転移性黒色腫と関連するｇｐ１００抗原／ペプチド（例えば、Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ２００８；３１：２９４−３０９、Ｍａｒｋｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２７：１５ｓ，２００９（別冊；要約９０３９）に記載される）；ＴＡＤＧ−１２、ＣＡ１２５、ヘプシン、および卵巣癌と関連する他の抗原／ペプチド（例えば、米国特許第８，０９７，２４２号および同第７，９３５，５３１号に記載される）；結腸直腸、胃、および膵臓癌、いくつかの乳癌、および多くの非小細胞肺癌と関連する癌胎児性抗原（ＣＥＡ）（例えば、米国特許第８，０１２，４６８号に記載される）；神経系癌（例えば、多形性膠芽腫および星状細胞腫）と関連する抗原、例えば、米国特許第８，０９７，２５６号に記載される抗原チロシン関連タンパク質（ＴＲＰ）、黒色腫関連抗原−１（ＭＡＧＥ−１）、ＨＥＲ−２、ＡＩＭ−２、ＩＬ−１３受容体アルファ２等、またはｇｐ１００抗原およびそれらのペプチドエピトープ；米国特許第８，００３，７７３号に記載されるペプチドを含むｈＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素；前立腺癌と関連する、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）、および前立腺酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）抗原（例えば、Ｔａｒｔｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ２０００；７４（１）：１−３）；ＨＰＶ（ヒトパピローマウイルス）抗原（子宮頸癌と関連する）；米国特許第７，９０６，６２０号に前立腺および結腸癌と関連すると記載される前立腺特異Ｇタンパク質結合受容体（ＰＳＧＲ）および前立腺ＳＴＥＡＰの６回膜貫通型上皮抗原；ならびに／または例えば、前立腺、子宮、および精巣癌等の生殖癌と関連するＰＡＧＥ４（米国特許第７，９１０，６９２号に記載される）が含まれる。いくつかの実施形態において、無傷抗原が使用され、一方、他の実施形態において、（タンパク質分解または組換えのいずれかによって調製された）抗原のペプチドエピトープが使用される。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、ＡＩＣＣ中の樹状細胞は、例えば、指数衰減波または方形波エレクトロポレーターまたは他のＲＮＡパルス装置を用いる、エレクトロポレーションによって、腫瘍特異性抗原に対して既知のＲＮＡ配列を有する腫瘍または幹細胞から単離されたｍＲＮＡによりトランスフェクトされる。別の実施形態において、１つ以上の抗原または抗原ペプチドは、例えば、米国特許第８，０９７，２４３号に記載される、微小粒子に基づいたトランスフェクションを使用して、ＡＩＣＣ中の樹状細胞等の抗原提示細胞に導入される。さらに他の実施形態において、１つ以上の抗原または抗原ペプチドは、例えば、米国特許第８，０１２，４６８号、およびＢｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ２００８；３１：２９４−３０９に記載される、アデノウイルスに基づいた変換を使用して、あるいは、米国特許第８，００３，７７３号に記載される、レトロウイルスベクターを使用して導入される。
【０１０７】
実施形態のいずれかにおいて、本方法は、成熟ＤＣへの単球の分化、リンパ球の活性化、ＮＫ細胞の活性化および／もしくは増殖、またはＮＫＴ細胞の活性化および／もしくは増殖のうちの１つ以上をもたらし得る。
【０１０８】
一実施形態において、ＡＩＣＣが、抗原の存在下で、ナイーブＴ細胞の活性化（プライミング）を刺激し（Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ６９、ＩＬ−２Ｒ、ＣＤ２８、ＣＤ７１、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４０Ｌのうちの１つ以上の発現によって、および／またはＩＬ−２、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、もしくはＩＦＮ−ガンマの産生によって示される）、Ｔヘルパーおよび細胞毒性Ｔ細胞を分化および増殖することができる細胞を含む場合、ＡＩＣＣは、「成熟」ＤＣを含む。別の実施形態において、ＩＬ−１２の産生の増加がある場合、ＡＩＣＣは、成熟ＤＣを含む。別の実施形態において、ＡＩＣＣ中の単球上のマーカーＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ４０、ＣＤ１ｃ、ＣＤ５６、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＩＧＳＦ４、ＣＬＥＣ９Ａ、ＣＣＲ７、ＴＬＲ１、ＴＬＲ３、ＴＬＲ６、ＤＣ−ＬＡＭＰ、Ｉｄ２、ＩＲＦ８、またはＩＣＳＢＰのうちの１つ以上の発現の増加がある場合、ＡＩＣＣは、成熟ＤＣを含む。一実施形態において、発現の増加は、ＡＩＣＣ中のＤＣの表面上の１つ以上の分子の数の増加（例えば、フローサイトメトリーによって決定される、平均蛍光強度（ＭＦＩ）の増加）である。分子の数の増加は、成熟していると考えられるＡＩＣＣ中のＤＣ上の特定のマーカーについてＭＦＩを比較することによって決定される。一実施形態において、マーカーのうちの１つ以上を発現する単球のパーセンテージの増加がある場合、ＡＩＣＣは、「成熟」ＤＣを含む。一実施形態において、単球は、特徴的な側方散乱光［ＳＳＣ］、およびフローサイトメトリーによる汎白血球マーカーであるＣＤ４５に対するポジティブ染色法、または単球に特異的ＣＤ１４染色法によって特定される。一実施形態において、本方法は、ＭＦＩならびに細胞表面マーカーＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ５４、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＤ４０、およびＣＣＲ７のうちの少なくとも１つを発現する、単球のパーセンテージがともに増加するＡＩＣＣをもたらす。一実施形態において、本方法は、ＭＦＩならびに細胞表面マーカーＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ５４、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＤ４０、およびＣＣＲ７のいずれかの組み合わせまたはすべてを発現する、単球のパーセンテージがともに増加するＡＩＣＣをもたらす。一実施形態において、増加は、ＡＩＣＣを産生するために使用される開始の白血球組成物（例えば、軟膜中の白血球）と比較して評価される。一実施形態において、増加は、ＤＣの分化および成熟を誘発する時間および温度の条件下でのインキュベーションに使用される細胞組成物と比較して評価される。
【０１０９】
一実施形態において、ＡＩＣＣは、ナイーブＴ細胞に対する抗原を提示し、これによりナイーブＴ細胞がＣＤ４陽性およびＣＤ８陽性細胞に分化し、増殖し、ＩＬ−２を産生し、ＩＬ−２受容体を発現し、インターフェロンおよび他のＴｈ１サイトカインを産生するであろう。
【０１１０】
別の態様において、本方法は、１つ以上の細胞集団に関して本発明のＡＩＣＣを濃縮することをさらに含み得る。樹状細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、または他の細胞型に関して濃縮される組成物は、既知の方法に従って、陽性または陰性マーカー選択のいずれかを使用して、細胞分類、パニング、ＭＡＣＳ等によって調製され得る。
【０１１１】
さらなる実施形態において、本方法は、液体部分からＡＩＣＣの細胞部分を分離することをさらに含み得る。一実施形態において、細胞および液体（上清）部分の両方が、回収される。これは、例えば、ＡＩＣＣを遠心分離し、上清を別の容器に移すことによって達成され得る。実施例に記載される、上清は、それが含有するサイトカインおよび他の可溶性因子のため、細胞の不在下でさえ、療法に有用である。次いで、遠心分離後形成するペレット中の細胞は、任意の所望の担体中で再懸濁され得る。他の実施形態において、細胞は、例えば、濾過によって、細胞を回収することなく、液体部分から除去される。さらに他の実施形態において、細胞は、例えば、細胞をペレット化し、上清を吸引することによって、上清を回収することなく回収される。
【０１１２】
実施形態のいずれかにおいて、ＡＩＣＣが産生されると、ＡＩＣＣ中の細胞は、さらなる濃縮を伴うかまたは伴わずに単離され、（受容者に対して自家であっても、同種異系であってもよい）血清等の担体、または細胞の保存および投与に好適な一部の他の生理学的に許容される等張の正常な液体中で再懸濁され得る。このような溶液の例が以下に記載され、これには、等張を回復させるために使用される溶液、細胞培養培地、緩衝食塩水、または任意の他の生体適合性流体、あるいは特別に製剤化された臨床的に許容される細胞保存もしくは細胞低温保存培地が含まれる。
【０１１３】
ＩＩ．  活性化された免疫刺激細胞組成物
別の態様において、本発明は、活性化された免疫刺激細胞組成物（ＡＩＣＣ）に関し、これは、上記のＡＩＣＣを作製する方法によって生成された組成物のいずれかを指す。したがって、「ＡＩＣＣ」はしばしば、上記のインキュベーションに使用される同じ担体中の細胞組成物を指すが、ＡＩＣＣはまた、任意の担体または賦形剤、ならびに細胞成分から分離された液体成分中の細胞成分も包含する。
【０１１４】
ＡＩＣＣ中の白血球は、概して、個々の白血球細胞型または組成物を区別するために使用され得るある特定の特徴を有する。例えば、ＡＩＣＣ中の単球は、新鮮分離した単球と比較して、より高いレベルのＣＤ５４、ＨＬＡ−ＤＲ、および／またはＣＤ８６を発現し得る。さらに、ＡＩＣＣ中の単球は、新鮮分離した単球と比較して、例えば、ＣＤ８−アルファ、ＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＣＲ７、および／またはＣＤ４０のうちの１つ以上のさらなる活性化マーカーを発現し得る。ＡＩＣＣ組成物は、例えば、末梢血白血球の新鮮に調製された試料中よりもＤＣに分化され、および成熟した単球のより高いパーセンテージまたは数を含み得る。同様に、ＡＩＣＣは、例えば、末梢血白血球の新鮮に調製された試料中よりもナイーブリンパ球を活性化／プライミングすることができるより多くの数またはパーセンテージの細胞を含み得る。ＡＩＣＣ中のリンパ球は、例えば、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ１５４、ＣＤ１０７ａ、および／またはＣＤ４２ｄのうちの１つ以上の新鮮分離したリンパ球と比較して、より高い表面レベルのさらなるマーカーを発現し得る。加えて、ＡＩＣＣ中の白血球は、新鮮分離した白血球と比較して、例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮガンマ、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＴＮＦアルファ、ＴＮＦベータ、および／またはＩＬ−１２のうちの１つ以上のサイトカインを産生する増加した能力を示し得る。
【０１１５】
上述のように、本方法のいくつかの実施形態において、国際公開第２０１０／１００５７０号の方法を使用して生成された活性化白血球組成物（ＡＬＣ）は、活性化された免疫刺激細胞組成物（ＡＩＣＣ）を調製する方法で使用される。実施例に記載されるように、ＡＬＣ中の白血球が、少なくとも部分的に活性化され得るが、ＡＩＣＣ中の白血球が、ＡＬＣ中よりも高いレベルの活性化を達成し得る。ＡＬＣ中の白血球と比較して、ＡＩＣＣ中の白血球のより高いレベルの活性化は、比較としてＡＬＣを使用して、ＡＩＣＣに関する上述の特性のうちのいずれか１つ以上によって示され得る。
【０１１６】
実施例に示されるように、ＡＩＣＣはまた、例えば、単球上のＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＤ４０、ＣＤ５４、およびＣＣＲ７の表面発現によって示される、ＤＣの最小活性化レベル；例えば、ＣＤ６９、ＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒ）、ＣＤ２８、ＣＤ１５４／ＣＤ４０Ｌ、およびＣＤ４９ｄの表面発現によって示される、リンパ球の最小活性化レベル；ならびに、例えば、ＣＤ５６、ＣＤ５７、およびＣＤ１０７ａの表面発現によって示される、ＮＫおよびＮＫＴ細胞の最小活性化レベル、の観点から特徴付けられ、既知の組成物と区別され得る。マーカーの表面発現は、マーカーを発現する細胞のパーセンテージとして、または１つの細胞当たりのマーカーのレベルとして評価され得る。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、活性化された免疫刺激細胞組成物（ＡＩＣＣ）の最終含有物には、存在する白血球の集団に関して、顆粒球、単球、およびリンパ球が含まれる。細胞の特定の量および相対的パーセンテージは、採用される分析技術および試料間の変動に基づいて異なり得る。例えば、分析がＣｅｌｌ  Ｄｙｎ分析器を使用して行われるとき、ＡＩＣＣは、一般に、約４５％〜約７２％の顆粒球（好中球、好酸球、および好塩基球を含む）、約３％〜約１０％の単球、および約２５％〜約５０％のリンパ球を含む。分析がＦＡＣＳを使用して（例えば、側方散乱対前方散乱ドットプロット分析または対ＣＤ４５および／またはＣＤ１４蛍光を使用して）行われるとき、ＡＩＣＣは、一般に、約５０％〜約７０％の顆粒球、約５％〜約１５％の単球、および約１５％〜約３５％のリンパ球を含む。
【０１１８】
顆粒球には、好中球、好酸球、および好塩基球が含まれる。いくつかの実施形態において、ＡＩＣＣは、ＡＩＣＣ中の白血球の総数に基づき、約２５％〜約８５％の好中球、約０〜約９％の好酸球、約１．５〜約４％の好塩基球、約２％〜約４０％の単球（樹状細胞を含む）、および約４％〜約７０％のリンパ球を含む。
【０１１９】
実施形態のいずれかにおいて、ＡＩＣＣは、一般に、約０．０５〜約０．２×１０6／マイクロリットルの量で残存レベルの赤血球を、および／または一般に、約１〜約１００×１０3／マイクロリットルの量で残存レベルの血小板をさらに含み得る。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、ＡＩＣＣ中のリンパ球の亜集団は、以下の一般的な範囲内である：約２０％〜約８０％のＴ細胞（ＣＤ３＋）、約５％〜約４０％のＢ細胞（ＣＤ１９＋）、約５％〜約３５％のＮＫ細胞（ＣＤ３−／ＣＤ５６＋）、および／または約０．１％〜約３５％のＮＫＴ細胞（ＣＤ３＋／ＣＤ５６＋）。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞中では、約５％〜約６５％のＴヘルパー細胞（ＣＤ４＋／ＣＤ３＋）および約５％〜約７５％の細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ、ＣＤ８＋／ＣＤ３＋）が存在する。
【０１２１】
他の実施形態において、約４０％〜約６０％のＴ細胞（ＣＤ３＋）、約１５％〜約３０％のＢ細胞（ＣＤ１９＋）、約１５％〜約３０％のＮＫ細胞（ＣＤ３−／ＣＤ５６＋）、約２％〜約２０％のＮＫＴ細胞（ＣＤ３＋／ＣＤ５６＋）が存在する。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞では、約１５％〜約４０％のＴヘルパー細胞（ＣＤ４＋／ＣＤ３＋）および約２５％〜約５０％のＣＴＬ（ＣＤ８＋／ＣＤ３＋）が存在する。
【０１２２】
Ｔｈ細胞とＣＴＬの比率は、通常、約０．５〜１．５である。
【０１２３】
実施形態のいずれかにおいて、ＤＣ、リンパ球、ＮＫ、およびＮＫＴ細胞マーカーのレベル、ならびにこれらのマーカーを発現する細胞のパーセンテージが、ＡＩＣＣを調製する方法に記載される、または実施例に記載されるように決定され得る。
【０１２４】
一実施形態において、ＡＩＣＣは、ＤＣを含み、アイソタイプ対照と比較して、フローサイトメトリーによって検出される、ＤＣの少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、または３０％は、ＣＤ８を発現する。
【０１２５】
一実施形態において、アイソタイプ対照と比較して、フローサイトメトリーによって検出される、ＡＩＣＣ中の単球の少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、または６０％は、マーカーＣＣＲ７に対して陽性である。
【０１２６】
一実施形態において、アイソタイプ対照と比較して、フローサイトメトリーによって検出される、ＡＩＣＣ中の単球の少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、または６０％は、マーカーＣＤ４０に対して陽性である。
【０１２７】
一実施形態において、アイソタイプ対照と比較して、フローサイトメトリーによって検出される、ＡＩＣＣ中の単球の少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、または６０％の単球は、マーカーＣＤ８０に対して陽性である。
【０１２８】
一実施形態において、アイソタイプ対照と比較して、フローサイトメトリーによって検出される、ＡＩＣＣ中の単球の少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、または６０％は、マーカーＣＤ８３に対して陽性である。
【０１２９】
一実施形態において、マーカーＣＤ８６に対する総単球の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、末梢血単球上よりも、少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０倍高く新鮮である。一実施形態において、マーカーＣＤ８６に対する単球の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、国際公開第２０１０／１００５７０号に従って調製されるＡＬＣ中の単球上よりも少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０倍高い。これらの実施形態において、総単球は、汎白血球マーカーに対するＳＳＣおよび染色によって決定される。
【０１３０】
一実施形態において、マーカーＣＤ８３に対する総単球の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、末梢血単球上よりも少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０倍高く新鮮である。一実施形態において、マーカーＣＤ８３に対する単球の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、国際公開第２０１０／１００５７０号に従って調製されるＡＬＣ中の単球上よりも少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０倍高い。これらの実施形態において、総単球は、汎白血球マーカーに対するＳＳＣおよび染色によって決定される。
【０１３１】
一実施形態において、マーカーＣＤ８０に対する総単球の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、末梢血単球上よりも少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０倍高く新鮮である。一実施形態において、マーカーＣＤ８０に対する単球の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、国際公開第２０１０／１００５７０号に従って調製されるＡＬＣ中の単球上よりも少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０倍高い。これらの実施形態において、総単球は、汎白血球マーカーに対するＳＳＣおよび染色によって決定される。
【０１３２】
一実施形態において、マーカーＣＤ４０に対する総単球の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、末梢血単球上よりも少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０倍高く新鮮である。一実施形態において、マーカーＣＤ４０に対する単球の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、国際公開第２０１０／１００５７０号に従って調製されるＡＬＣ中の単球上よりも少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０倍高い。これらの実施形態において、総単球は、汎白血球マーカーに対するＳＳＣおよび染色によって決定される。
【０１３３】
一実施形態において、マーカーＣＣＲ７に対する総単球の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、末梢血単球上よりも少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０倍高く新鮮である。一実施形態において、マーカーＣＣＲ７に対する単球の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、国際公開第２０１０／１００５７０号に従って調製されるＡＬＣ中の単球上よりも少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０倍高い。これらの実施形態において、総単球は、汎白血球マーカーに対するＳＳＣおよび染色によって決定される。
【０１３４】
一実施形態において、マーカーＣＤ５４に対する総単球の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、末梢血単球上よりも少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０倍高く新鮮である。一実施形態において、マーカーＣＤ５４に対する単球の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、国際公開第２０１０／１００５７０号に従って調製されるＡＬＣ中の単球上よりも少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０倍高い。これらの実施形態において、総単球は、汎白血球マーカーに対するＳＳＣおよび染色によって決定される。
【０１３５】
一実施形態において、マーカーＣＤ８に対する総単球の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、末梢血単球上よりも少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０倍高く新鮮である。一実施形態において、マーカーＣＤ８に対する単球の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、国際公開第２０１０／１００５７０号に従って調製されるＡＬＣ中の単球上よりも少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０倍高い。これらの実施形態において、総単球は、汎白血球マーカーに対するＳＳＣおよび染色によって決定される。
【０１３６】
一実施形態において、ＡＩＣＣが超抗原の存在下で調製されるとき、アイソタイプ対照と比較して、フローサイトメトリーによって検出される、ＡＩＣＣ中のＣＤ３陽性リンパ球の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、または３５％は、マーカーＣＤ６９に対して陽性である。一実施形態において、超抗原は、１００ｎｇ／ｍＬでブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）である。
【０１３７】
一実施形態において、ＡＩＣＣがＴ細胞−ＡＰＣの相互作用を媒介する超抗原の存在下で調製されるとき、マーカーＣＤ６９に対してＣＤ３陽性リンパ球の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、または５．０倍高い。一実施形態において、超抗原は、１００ｎｇ／ｍＬでブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）である。
【０１３８】
一実施形態において、ＡＩＣＣが超抗原の存在下で調製されるとき、アイソタイプ対照と比較して、フローサイトメトリーによって検出される、ＡＩＣＣ中のＣＤ３陰性リンパ球の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、または４５％は、マーカーＣＤ６９に対して陽性である。一実施形態において、超抗原は、１００ｎｇ／ｍＬでブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）である。
【０１３９】
一実施形態において、ＡＩＣＣがＴ細胞−ＡＰＣの相互作用を媒介する超抗原の存在下で調製されるとき、マーカーＣＤ６９に対してＣＤ３陰性リンパ球の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、または５．０倍高い。一実施形態において、超抗原は、１００ｎｇ／ｍＬでブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）である。
【０１４０】
一実施形態において、ＡＩＣＣが超抗原の存在下で調製されるとき、アイソタイプ対照と比較して、フローサイトメトリーによって検出される、ＡＩＣＣ中のＣＤ３陽性リンパ球の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、または３５％は、マーカーＣＤ２５に対して陽性である。一実施形態において、超抗原は、１００ｎｇ／ｍＬでブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）である。
【０１４１】
一実施形態において、ＡＩＣＣがＴ細胞−ＡＰＣの相互作用を媒介する超抗原の存在下で調製されるとき、マーカーＣＤ２５に対してＣＤ３陽性リンパ球の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、プレインキュベーション組成物中または超抗原を用いずにインキュベートされたＡＩＣＣ中よりも少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、または６．０倍高い。一実施形態において、超抗原は、１００ｎｇ／ｍＬでブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）である。
【０１４２】
一実施形態において、ＡＩＣＣが超抗原の存在下で調製されるとき、アイソタイプ対照と比較して、フローサイトメトリーによって検出される、ＣＤ３陰性リンパ球の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、または３５％は、マーカーＣＤ２５に対して陽性である。一実施形態において、超抗原は、１００ｎｇ／ｍＬでブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）である。
【０１４３】
一実施形態において、ＡＩＣＣが超抗原の存在下で調製されるとき、マーカーＣＤ２５に対してＣＤ３陰性リンパ球の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、プレインキュベーション組成物中またはＡＩＣＣが超抗原の不在下で調製されるときよりも少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、または５．０倍高い。一実施形態において、超抗原は、１００ｎｇ／ｍＬでブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）である。
【０１４４】
一実施形態において、ＡＩＣＣが超抗原の存在下で調製されるとき、アイソタイプ対照と比較して、フローサイトメトリーによって検出される、超抗原でインキュベートされたＡＩＣＣ中の単球の少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％は、マーカーＣＤ４０に対して陽性である。一実施形態において、超抗原は、１００ｎｇ／ｍＬでブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）である。
【０１４５】
一実施形態において、マーカーＣＤ４０に対する単球の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、プレインキュベーション組成物中またはＡＩＣＣが超抗原の不在下で調製されるときよりも少なくとも約１．０、２．０、３．０、４．０、４．５、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、または１０倍高い。一実施形態において、Ｔ細胞−ＡＰＣ超抗原は、１００ｎｇ／ｍＬでブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）である。
【０１４６】
一実施形態において、ＥＬＩＳＡによって決定される、ＡＩＣＣ中のＩＬ−１２の濃度は、少なくとも約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ピコグラム／ミリリットルである。一実施形態において、ＡＩＣＣがＴ細胞−ＡＰＣの相互作用を媒介する超抗原の存在下で調製されるとき、超抗原でインキュベートされたＡＩＣＣ中のＩＬ−１２の濃度は、ＡＩＣＣが超抗原の不在下で調製されるときよりも少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、または５．０倍高い。一実施形態において、超抗原は、１００ｎｇ／ｍＬでブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）である。
【０１４７】
一実施形態において、ＥＬＩＳＡによって決定される、ＡＩＣＣ中のＩＬ−２の濃度は、少なくとも約１００、５００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、またはそれ以上のピコグラム／ミリリットルである。一実施形態において、ＩＬ−２の濃度は、Ｔ細胞−ＡＰＣの相互作用を媒介する超抗原でインキュベートされたＡＩＣＣ中で決定される。一実施形態において、超抗原は、１００ｎｇ／ｍＬでブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）である。一実施形態において、超抗原が、ＡＩＣＣを生成するために使用される３７℃で４８時間のインキュベーション中に存在する。
【０１４８】
一実施形態において、ＥＬＩＳＡによって決定される、ＡＩＣＣ中のＩＦＮ−ガンマ（ＩＦＮ−ｇ）の濃度は、少なくとも約８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、または３００ピコグラム／ミリリットルである。一実施形態において、ＡＩＣＣがＴ細胞−ＡＰＣの相互作用を媒介する超抗原の存在下で調製されるとき、超抗原でインキュベートされたＡＩＣＣ中のＩＦＮ−ｇの濃度は、ＡＩＣＣが超抗原の不在下で調製されるときよりも少なくとも約２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、または７．０倍高い。一実施形態において、超抗原は、１００ｎｇ／ｍＬでブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）である。
【０１４９】
一実施形態において、ＡＩＣＣは、ナイーブＣＤ４  Ｔ細胞に対する抗原提示を支持し、これは抗原の存在下、ＡＩＣＣで共培養されるとき、Ｔ細胞の増殖によって示される。一実施形態において、ＡＩＣＣは、Ｔｈ１表現型によるＴ細胞の生成を支持し、これはＡＩＣＣによる共培養後、Ｔ細胞によるＩＬ−２およびＩＦＮ−ガンマの分泌によって示される。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、ＡＩＣＣは、末梢血中のこれらの同一のＴ細胞サブセットの比と比較して改変される比でＴ細胞サブセットを含む。一実施形態において、ＡＩＣＣは、約１：１未満のＣＤ４  Ｔ細胞対ＣＤ８  Ｔ細胞の比（ＣＤ４／ＣＤ８の比）を含む。
【０１５１】
一実施形態において、ＡＩＣＣは、１つ以上の細胞表面マーカーおよび／またはサイトカインに関して実施例に記載されるＡＩＣＣの特徴を有する。一実施形態において、ＡＩＣＣは、表中に示される「平均」ＡＩＣＣの特徴のうちの１つ以上を有する（つまり、特徴は、表中に示された平均＋／−任意の標準偏差を反映する）。一実施形態において、ＡＩＣＣは、図中の任意の数がその数の「約」として解釈されるべきであるが、図中に示される、代表的なＡＩＣＣの１つ以上の特徴を有する。一実施形態において、ＡＩＣＣは、ＡＩＣＣが超抗原により刺激された後、実施例に記載される特徴を有する。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、本発明のＡＩＣＣは、１つ以上の細胞集団に関して濃縮され得る。一実施形態において、ＡＩＣＣは、例えば、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ１９抗体を使用して、リンパ球の陰性選択によって樹状細胞に関して濃縮される。一実施形態において、ＡＩＣＣは、例えば、細胞付着を用いて、または抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体もしくは抗ＣＤ４０抗体もしくは抗ＣＤ１４抗体、またはこれらの組み合わせを用いて、単球および樹状細胞の陰性選択によってリンパ球に関して濃縮される。一実施形態において、ＡＩＣＣは、例えば、ＭＡＣＳ中のコーティングされたビーズ上の抗ＣＤ３抗体またはＦＡＣＳ中の抗ＣＤ２抗体を用いて、陽性選択によってＴ細胞に関して濃縮される。
【０１５３】
ＡＩＣＣのいずれかは、本発明の方法で治療上使用され得る。しかし、他の箇所で詳細に記載されるように、いくつかの実施形態において、ＡＩＣＣは、患者の腫瘍組織または腫瘍細胞株から産生される、あるいは組み換え方法または腫瘍から抗原または抗原ペプチドを抽出するまたは単離する任意の他の手段によって、例えば、腫瘍細胞からペプチドを溶出することによって産生される、腫瘍細胞からの抗原でインキュベートされる。いくつかの実施形態において、ＡＩＣＣまたはＡＩＣＣ内のＤＣは、癌幹細胞には一般的な抗原でインキュベートされる。いくつかの実施形態において、ＡＩＣＣまたはＡＩＣＣ内のＤＣは、細菌産物等の超抗原でインキュベートされる。抗原／ペプチドの添加は、単球からのＤＣのさらなる成熟、より具体的には、ＡＩＣＣ中に存在するＴ細胞のより特定の活性化／プライミングをもたらすであろう。
【０１５４】
ＡＩＣＣは、細胞成分および液体成分に分離され得る。したがって、一実施形態において、ＡＩＣＣは、本方法のいずれかから直接得られる細胞成分および液体成分を含む。一実施形態において、細胞成分が１つ以上の担体または賦形剤中に（再）製剤化され得るが、ＡＩＣＣは、液体成分から分離された細胞成分を含む。一実施形態において、ＡＩＣＣは、細胞成分から分離された液体成分を含む。細胞成分および液体成分はともに、治療上有益な特性を有すると考えられる。例えば、細胞成分は、成熟したＤＣおよび他の細胞型を含み、液体成分は、ＩＬ−２およびＩＬ−１２等の様々なサイトカインを含む。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、アジュバントを、ＡＩＣＣに添加して、腫瘍ワクチンを作製する。一実施形態において、ワクチンは、少なくとも１つの腫瘍抗原／ペプチドをさらに含む。アジュバントの例としては、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、Ａｒｌａｃｅｌ  Ａ、鉱油、乳化落花生油アジュバント（アジュバント６５）、リポ多糖類（ＬＰＳ）、リポソーム、エンドトキシン、コレステロール、脂肪酸、脂肪族アミン、パラフィン系オイルおよび植物油、モノホスホリルリピドＡ、Ｑｕｉｌ−Ａ付きＩＳＣＯＭ、およびシンテックスアジュバント製剤（ＳＡＦ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、ワクチンは、血管形成阻害剤をさらに含み得る。これらには、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ベバシズマブ、ラニビズマブ）、ＶＥＧＦ受容体に対する抗体（例えば、ＶＥＧＦＲ−２およびＦＧＦＲを標的とするブリバニブ）、ＶＥＧＦ受容体のチロシンキナーゼ活性の阻害剤（例えば、ソラフェニブ、セジラニブ、スニチニブ）、可溶性受容体デコイ（例えば、アフリベルセプトとも呼ばれる、ＶＥＧＦトラップ）、または血管破壊剤（例えば、ＺＤ６１２６）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５７】
ＡＩＣＣ組成物は、必要に応じて、ＦＤＡで認可されたキット等のパックまたはディスペンサー装置中で提供され得、活性成分を含有する１つ以上の単位剤形を含み得る。例えば、このパックは、ブリスターパック等の金属またはプラスチック箔を含むことができる。このパックまたはディスペンサー装置には、投与のための説明書を添付することができる。また、それは、医薬品の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって処方される形式で、容器に関連する通知を伴い、この組成物の形態またはヒトもしくは獣医学的投与に関して政府機関による承認を反映し得る。このような通知は、例えば、処方薬のための米国食品医薬品局によって承認されたラベル、または承認された製品挿入物のものであり得る。
【０１５８】
さらなる態様において、本発明は、腫瘍を治療するためのワクチンとして製剤化されたＡＩＣＣを提供する。一実施形態において、ワクチンは、上記の少なくとも１つのアジュバントをさらに含む。一実施形態において、ワクチンは、上記の腫瘍抗原のうちの少なくとも１つを用いて製剤化されたＡＩＣＣを含む。一実施形態において、ワクチンは、成熟樹状細胞、活性化されたリンパ球、少なくとも５ｐｇ／ｍＬのＩＬ−１２、少なくとも１５００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−２、および少なくとも１００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ−ガンマを含むＡＩＣＣを含む。
【０１５９】
別の態様において、本発明は、免疫応答を刺激するためのＡＩＣＣを提供する。この態様の実施形態は、ＡＩＣＣ自体に関して記載されたものと、ＡＩＣＣの治療上の使用に関して記載されたものと、を含む。例えば、この態様はまた、腫瘍を治療する、あるいは腫瘍に対して免疫応答を刺激するためのＡＩＣＣに関する。
【０１６０】
さらなる態様において、本発明は、免疫応答を刺激するための医薬の調製において、任意のＡＩＣＣの使用を提供する。この態様の実施形態は、ＡＩＣＣ自体に関して記載されたものと、ＡＩＣＣの治療上の使用に関して記載されたものと、を含む。例えば、この態様はまた、腫瘍を治療する、あるいは腫瘍に対して免疫応答を刺激するための医薬を調製するためのＡＩＣＣの使用に関する。
【０１６１】
ＩＩＩ．治療上の使用
別の態様において、本発明は、ＡＩＣＣが免疫刺激組成物として使用される方法を提供する。したがって、本発明は少なくとも１つの腫瘍抗原に対して免疫応答を刺激する方法を包含し、本法は、対象に、本発明のＡＩＣＣを投与することを含む。対象には、ヒトおよび獣医学的対象の両方が含まれる。
【０１６２】
一態様において、本発明は、腫瘍に対する免疫応答を刺激することに関する。「腫瘍」とは、悪性または良性に関わらず、すべての新生細胞成長および増殖、ならびにすべての前癌性および癌性の細胞および組織を指す。
【０１６３】
ＡＩＣＣは、あらゆる種類の腫瘍を治療するために投与され得る。治療可能である悪性腫瘍の例としては、黒色腫等の皮膚癌、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、メルケル細胞癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、子宮頸癌、口腔癌、肝臓癌、膵臓癌、ホジキンリンパ腫および様々な種類の非ホジキンリンパ腫等の限局性リンパ腫、肉腫、頭頚部癌、食道癌、膀胱癌、前立腺癌、胃癌、上咽頭癌、Ｓ状結腸癌、直腸癌、乳癌、骨盤内癌、子宮内膜癌、および腹膜内膜の癌（中皮腫）が挙げられるが、これらに限定されない。治療される腫瘍は、それぞれ、ＴＮＭ（対癌米国合同委員会（ＡＪＣＣ）病期分類システム）および組織学的分類に従って、様々な病期（第Ｉ〜ＩＶ期）およびグレード（グレード１〜４）であり得る。例えば、皮膚癌は、局所リンパ節への転移の有無に関わらず、表皮、真皮、または皮下組織を貫通し得る。それは、高分化型、中分化型、低分化型、および未分化型（高グレード）であり得る。
【０１６４】
ＡＩＣＣは、原発腫瘍、腫瘍転移、ならびにカポジ肉腫と関連する良性皮膚病変等の様々な悪性病状で発生する潰瘍／病変を治療するために使用され得る。一実施形態において、ＡＩＣＣは、腫瘍摘出術後の残留する悪性細胞を阻害する。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、ＡＩＣＣは、さらなる操作を行わずに、腫瘍への免疫応答を刺激する方法に直接使用される。他の実施形態において、投与前に、ＡＩＣＣは、患者の腫瘍組織から生成された腫瘍細胞からまたは関連腫瘍細胞株からの抗原、ＣＤ１６６、ＣＤ１３３、ネスチン、ＣＤ４４、ＣＤ２４、およびＡＬＤＨ１等の癌幹細胞には一般的な抗原、または患者の腫瘍型と関連することが知られているペプチド抗原を用いて、インキュベートされる（パルスされる）。特定の腫瘍型の腫瘍抗原およびペプチド抗原の他の例は、ＡＩＣＣを調製する方法において記載される。さらに他の実施形態において、ＡＩＣＣは、投与前に、細菌産物等の１つ以上の「超抗原」でインキュベートされる。投与前に、ＡＩＣＣと抗原または超抗原との接触は、ＡＩＣＣ中に存在するＴ細胞のさらなるおよびより特定の活性化／プライミングをもたらす。
【０１６６】
抗原および抗原ペプチドの添加に関するさらなる実施例および詳細は、ＡＩＣＣを調製する方法の説明に示される。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、投与前に、アジュバントをＡＩＣＣに添加する。アジュバントの例としては、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、Ａｒｌａｃｅｌ  Ａ、鉱油、乳化落花生油アジュバント（アジュバント６５）、リポ多糖類（ＬＰＳ）、リポソーム、エンドトキシン、コレステロール、脂肪酸、脂肪族アミン、パラフィン系オイルおよび植物油、モノホスホリルリピドＡ、Ｑｕｉｌ−Ａ付きＩＳＣＯＭ、およびシンテックスアジュバント製剤（ＳＡＦ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、血管形成阻害剤を、投与前に、ＡＩＣＣに添加する。これらには、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ベバシズマブ、ラニビズマブ）、ＶＥＧＦ受容体に対する抗体（例えば、ＶＥＧＦＲ−２およびＦＧＦＲを標的とするブリバニブ）、ＶＥＧＦ受容体のチロシンキナーゼ活性の阻害剤（例えば、ソラフェニブ、セジラニブ、スニチニブ）、可溶性受容体デコイ（例えば、アフリベルセプトとも呼ばれる、ＶＥＧＦトラップ）、または血管破壊剤（例えば、ＺＤ６１２６）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６９】
一般に、活性化された免疫刺激細胞組成物の適用は、ＡＩＣＣの１つ以上の投与によって達成される。一実施形態において、ＡＩＣＣは、全身投与される。全身投与の例には、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、および皮内注射が含まれる。一実施形態において、ＡＩＣＣは、局部的に、例えば、腫瘍またはリンパ節周辺に、腫瘍内、経皮、または皮下に投与される。一実施形態において、ＡＩＣＣは、結節内に投与される、すなわち、ＡＩＣＣは、腫瘍（例えば、このリンパを集めること）と関連する１つ以上のリンパ節に注入される。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、ＡＩＣＣは、単一部位で投与される。他の実施形態において、ＡＩＣＣは、複数の部位で投与される。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、ＡＩＣＣは、好適な注射器および針（例えば、１８Ｇまたは２５Ｇの針を装着した２ｍＬの注射器）を用いた注射によって投与される。ＡＩＣＣを腫瘍および／または腫瘍周辺の組織および／または局所的にリンパを集めるリンパ節に直接注射するこれらの実施形態において、ＡＩＣＣの投与は、超音波、Ｘ線、および他の同様の技術の監視下、カテーテルまたは内視鏡装置を通して行われ得る。いくつかの実施形態において、注射は、腫瘍の全長に対してほぼ１センチメートルからほぼ３センチメートル間隔で行われる。別の実施形態において、注射は、腫瘍周辺の健常な組織、例えば、腫瘍のリンパを集めるリンパ節と関連する組織に行われる。一実施形態において、注射は、腫瘍のリンパを集めるリンパ節と関連する健常な組織領域でほぼ１センチメートルからほぼ３センチメートル間隔で行われる。
【０１７２】
注射のために、ＡＩＣＣは直接使用され得る。この実施形態において、腫瘍致死免疫応答を刺激するのに役立ち得るサイトカインを含有し得るインキュベーション組成物は、ＡＩＣＣの細胞部分とともに投与される。代替の実施形態において、ＡＩＣＣの液体部分は、例えば、遠心分離によって除去され得、次いで、ＡＩＣＣの細胞部分は、水溶液中（任意に、ＡＩＣＣよりも更に濃縮された）、例えば、ハンクス溶液、リンガー溶液、または他の生理的食塩緩衝液等の生理的に相溶性のある緩衝液中、あるいは患者からの血清または血漿を含む血清または血漿中で製剤化され得る。
【０１７３】
別の実施形態において、ＡＩＣＣは、生理的に不活性および／または吸収性マトリックスもしくは足場（例えば、コラーゲン）に吸収され、この損傷への圧入によって挿入される。これにより、細胞がより長い期間を原位置で有するという点において、患者のためになる部位へのＡＩＣＣの持続送達を可能にする。
【０１７４】
治療されるべき状態の重篤度および応答性に応じて、数日から数週間続く治療過程で、あるいは病状の減退が達成されるまで、投薬は、単回または複数回の投与であり得る。したがって、一実施形態において、ＡＩＣＣは、１回だけ投与される。別の実施形態において、ＡＩＣＣは、少なくとも２回、３回、４回、５回、または最高１０回、もしくはそれ以上投与される。投与が、少なくとも２回の投与を含むとき、それぞれの投与は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０日あけて行われ得る。代替として、それぞれの投与は、約１、２、３、４、５、または６ヶ月あけて行われ得る。
【０１７５】
ＡＩＣＣは、臨床医が別の投入が必要であると判断する場合、１回以上投与され得る。考慮され得る要因には、腫瘍の大きさ、周辺組織または流入領域リンパ節への腫瘍の広がり、潰瘍化、化膿、発熱、または感染を示す任意の他の兆候もしくは症状、または再治療するのが当然であることを示唆する任意の臨床試験（複数可）が含まれる。再治療に加えて、外科治療のための照会は、臨床医が適切であると考える任意の時点で示され得る。
【０１７６】
複数回の投与の場合、個々の投与はすべて、同じ経路を介して行われ得るか、または治療過程中、異なる投与に対して異なる投与経路が利用され得る。
【０１７７】
投与されるＡＩＣＣの量は、もちろん、治療される個人、苦痛の重症度、投与様式、処方する医師の判断等に応じて異なる。投与の用量およびタイミングは、個人の変化する状態の慎重かつ継続的なモニタリングに応答するであろう。さらに、治療アルゴリズムは、ＡＩＣＣが進行期および低分化の癌を有することを示す患者において、より有効であり得るため、悪性腫瘍の重症度または種類によって限定されるべきではない。
【０１７８】
一実施形態において、ＡＩＣＣは、単回の治療法として使用されるが、１回または１回より多く投与され得る。しかしながら、他の実施形態において、ＡＩＣＣは、併用治療アプローチの一部として投与される。併用療法を含むこれらの実施形態において、ＡＩＣＣは、他の治療法前、その後、またはそれと組み合わせて投与される。ＡＩＣＣは、単独で、または特定の種類の癌に対して任意の他の従来の治療と組み合わせて使用され得る。従来の治療の例としては、放射線、化学療法、外科的腫瘍摘出術、レーザー療法および光線力学的療法等の電気生理学的方法による腫瘍焼灼法（ｔｕｍｏｒ  ｏｂｌａｔｉｏｎ）、局部、局在的、および全身温熱療法、 HYPERLINK "http://www.cancer.gov/cancertopics/factsheet/Therapy/angiogenesis-inhibitors" 血管形成阻害剤（抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ベバシズマブ、ラニビズマブ）、ＶＥＧＦ受容体に対する抗体（例えば、ＶＥＧＦＲ−２およびＦＧＦＲを標的とするブリバニブ）、ＶＥＧＦ受容体のチロシンキナーゼ活性の阻害剤（例えば、ソラフェニブ、セジラニブ、スニチニブ）、可溶性受容体デコイ（例えば、アフリベルセプトとも呼ばれる、ＶＥＧＦトラップ）、または血管破壊剤（例えば、ＺＤ６１２６）等）による治療法、ＩＬ−２およびインターフェロンアルファ等のサイトカインによる治療法、ＢＣＧ等のアジュバントによる治療法、リツキサン（非ホジキンリンパ腫の治療用）またはトラスツズマブ（乳癌の治療用）等の抗体による治療法、白血球、赤血球、および血小板の細胞計数をそれぞれ増加させるためのＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）、エリスロポエチン（Ｅｐｏｇｅｎ）、およびＩＬ−１１による治療法、骨髄もしくは造血幹細胞移植、遺伝子治療法、ならびに分子標的薬物による治療法が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７９】
ＡＩＣＣによる腫瘍に対する免疫応答の刺激は、様々な方法で実証され得る。例えば、一実施形態において、対象へのＡＩＣＣの投与は、腫瘍の大きさの低下を生じる。腫瘍は、長さ、幅、および高さの測定に対して評価され得、測定する生成物の合計の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、またはそれ以上の減少は腫瘍の大きさの減少を示す。代替的にまたはさらに、一実施形態において、対象へのＡＩＣＣの投与は、腫瘍が局所的に残留しているか、または転移することなくカプセル化されるよう、任意の既存の病変の進行を阻害する。さらに他の実施形態において、Ｘ線、ＣＴスキャン、ＭＲＩ、ＰＥＴ、およびＰＥＴ／ＣＴ、超音波、ＬＤＨ試験、光音響検出、または腫瘍バイオマーカーレベル（前立腺癌についてのＰＳＡ等）等の、特定の腫瘍の状態および／または進行をモニタリングするために通常使用される臨床試験が、改善または回復を示す場合、ＡＩＣＣは、腫瘍への免疫応答を刺激する。
【０１８０】
腫瘍治療に関連する実施形態のいずれかにおいて、腫瘍治療に対する応答性は、腫瘍に特異的なマーカーの血清濃度の低下によって測定される。ある特定の実施形態において、腫瘍治療に対する応答性は、全生存時間の増加、無進行生存率の増加、腫瘍の大きさの減少、骨代謝回転の転移マーカーの減少、最小限の残存疾患に対する影響の増加、増殖不能の状態になった癌細胞に対する抗体応答の誘発の増加、自己腫瘍の注射に対する遅延型過敏症（ＤＴＨ）の応答の誘発の増加、または自己腫瘍もしくは候補の腫瘍関連抗原に対するＴ細胞応答の誘発の増加のうちの１つ以上によって測定される。
【０１８１】
治療の性質に関係なく、ＡＩＣＣは、患者における疾患の転帰を改善するのに有用であり得る。加えて、ＡＩＣＣはまた、鎮痛効果を提供し得る。
【実施例】
【０１８２】
次に、下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
【０１８３】
別途記載されない限り、使用される術語と、利用される実験方法には、標準的な技術が含まれる。例えば、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）、“Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）、Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），“Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）、“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｌ，ｅｄ．（１９８６）、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”  Ｖｏｌ．１−３１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、およびＭａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ”  ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照のこと。
【０１８４】
［実施例１：例示的な活性化された免疫刺激細胞組成物（ＡＩＣＣ）の調製］
例示的なＡＩＣＣが、以下の通りに調製された。
【０１８５】
最初のステップとして、活性化された白血球組成物が、国際公開第２０１０／１００５７０号に記載される方法に従って調製された。簡潔に述べると、単一単位の血液から得られる軟膜を、室温で８〜１２時間インキュベートした。次いで、細胞を４０〜４５秒間水を添加することによって低浸透圧ショック（「ＨＯＳ」）に供し、ＮａＣｌ溶液を添加することによって等張を回復させた。遠心分離によって、細胞をペレット化し、細胞ペレットを、同一の血液単位から得られた血漿分画から得られた５０ｍＬの血清中に再懸濁させた。次いで、血清中の白血球懸濁液を、３７℃で９０分間インキュベートした。次いで、血清を廃棄し、新鮮血清を白血球に添加して、３〜４×１０6／ｍＬの最終濃度を作製した。この初期組成物は、本実施例では、「プレインキュベーション組成物」（ＰＣ）と称される。
【０１８６】
本実施例は、血清中で、３７℃で９０分間インキュベートしたＰＣを使用するが、低浸透圧ショック後、ペレット化された白血球もまた、例えば、血清中に再懸濁させ、一定期間、例えば、４８時間直接インキュベートして、ＡＩＣＣを形成し得ることが明確に企図される。
【０１８７】
本実施例において、穏やかな遠心分離、過剰な血清の除去、および白血球濃度が約１０×１０6／ｍＬであるように、多量の血清中での白血球ペレットの穏やかな再懸濁によって、ＰＣを濃縮した。次いで、この組成物を、３７℃、５％  ＣＯ2および１００％の湿度で、細胞インキュベーター中で、４８または７２時間（特定の実施例において示される）インキュベートした。このインキュベーションは、ガス透過性ＦＥＰバッグ中で行われた。
【０１８８】
本実施例は、得られたＡＩＣＣもまた、濃縮されるように、濃縮されたＰＣを使用して調製されたＡＩＣＣの結果を示す。細胞が濃縮されるほど、十分な量の細胞を投与するのに必要とされる注入量が少なくなるため、濃縮されたＡＩＣＣが、臨床的応用によく適し得る。しかし、非濃縮ＰＣを使用する比較は、細胞型のパーセンテージまたは特定のマーカーの発現レベルのいずれかによって評価されるように、白血球濃度がＡＩＣＣ中の白血球組成物に影響を及ぼさなかったことを示した。したがって、非濃縮ＰＣを使用することも可能であり、本実施例は、濃縮ＰＣを使用して調製されたＡＩＣＣに限定されるものとしていかようにも読み取られるべきではない。
【０１８９】
続く実施例において、別途実施例に明示されない限り、プレインキュベートした組成物（ＰＣ）中の白血球は、濃縮ＰＣから調製されたＡＩＣＣ中の白血球と比較された。
【０１９０】
［実施例２：活性化された免疫刺激細胞組成物（ＡＩＣＣ）の細胞集団分析］
ＡＩＣＣの細胞組成物は、２つの異なる細胞を計数する方法：Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ  Ｒｕｂｙ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）上の示差細胞計数およびＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上のフローサイトメトリー分析を使用して、ＰＣの細胞組成物と比較された。Ｃｅｌｌ  Ｄｙｎ計数は、ＰＣ（「インキュベーション前」）中および３７℃で４８時間のインキュベーション後のＡＩＣＣ中に存在する細胞集団を比較する。表中では、ＷＢＣは、白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）または白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）を意味する。ＷＢＣ総数およびＷＢＣ中の白血球型のパーセンテージの両方が、決定された。試料中の赤血球（ＲＢＣ）および血小板の数もまた、決定された。Ｃｅｌｌ  Ｄｙｎ計数の結果を表１中に要約する。
【０１９１】
【表１】
2015516374.tif 000003
【０１９２】
提示されたデータは、異なる献血からの血液試料を用いて行われた５つの実験のそれぞれの平均±標準偏差である。それぞれのＣｅｌｌ  Ｄｙｎ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒ測定を、三重で行い、平均計数を計算した。
【０１９３】
ＰＣ（「インキュベーション前」）中、および３７℃で４８時間のインキュベーション後のＡＩＣＣ中に存在する白血球のサブタイプのパーセンテージもまた、フローサイトメトリーによって決定した。ペリジニンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）に共役された汎白血球抗原ＣＤ４５を用いて、標本細胞を染色した。ＣＤ４５染色により、白血球集団の良好な解像が可能となった。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してフローサイトメトリーを行い、ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して集団およびマーカー分析を行った。ＳＳＣおよびＦＬ３（ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ）シグナルに基づいて、白血球集団を、ゲートにかけた。
【０１９４】
次いで、白血球集団における顆粒球、リンパ球、および単球のパーセンテージを決定した。白血球集団のフローサイトメトリー分析の結果を、５つの実験の平均＋標準偏差として、表２中に示す。
【０１９５】
【表２】
2015516374.tif 000004
【０１９６】
２つの計数方法は、若干異なる結果を生じる。それにもかかわらず、それぞれの方法は、白血球サブセットの許容される尺度を提供する。Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎシステムは、しばしば、臨床的応用で使用される。しかし、下記に記載されるように、フローサイトメトリーは、個々の細胞の表面上の個々の分子の発現レベルを決定するために、有利に使用され得る。一般に、ＡＩＣＣは、白血球サブセットのパーセンテージの観点からＰＣとあまり変わらない。しかしながら、Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ計数は、ＡＩＣＣを調製するためのインキュベーション中、白血球の総数が減少することを示す。
【０１９７】
ＳＳＣおよびＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ蛍光に基づいて、上記のゲートにかけられた白血球サブセットを、フローサイトメトリーによってさらに分析した。Ｔリンパ球およびＢリンパ球を分離するために、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）に共役された抗ＣＤ３抗体およびアロフィコシアニン（ＡＰＣ）に共役された抗ＣＤ１９抗体を用いて、試料を染色した。ＣＤ３+／ＣＤ１９-であるリンパ球を、Ｔ細胞として計数し、一方、ＣＤ３-／ＣＤ１９+である細胞をＢ細胞として計数した。抗ＣＤ４−ＡＰＣ、抗ＣＤ８−フィコエリトリン（ＰＥ）、および抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ抗体を用いて、試料を三重に染色した。次いで、ＣＤ３+リンパ球を、ＣＤ４+Ｔヘルパー細胞およびＣＤ８+細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）に分離した。抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ、ならびにＰＥ（（ＣＤ５６＋ＣＤ１６）−ＰＥ抗体）に共役された抗ＣＤ５６抗体および抗ＣＤ１６抗体の混合物を用いて、二重染色によって、ＮＫおよびＮＫＴ細胞を、特定した。ＮＫ細胞を、ＣＤ３-／（ＣＤ５６＋ＣＤ１６）+細胞として特定し、ＮＫＴ細胞を、ＣＤ３+／（ＣＤ５６＋ＣＤ１６）+細胞として特定した。異なる献血から生成されたＡＩＣＣで行われた４〜７つの実験の結果を、表３中に要約し、平均±標準偏差として示す。
【０１９８】
【表３】
2015516374.tif 000005
【０１９９】
これらの結果は、出発組成物中のＴ細胞のパーセンテージと比較して、ＡＩＣＣ中のＴ細胞（ＣＤ３陽性）のパーセンテージで３８．８％から４８．４％（ｐ＝０．１８）の統計的に有意な増加を示す。
【０２００】
［実施例３：単球における樹状細胞マーカーの樹状細胞（ＤＣ）の活性化および分化の分析］
活性化および分化の分析
樹状細胞（ＤＣ）への単球の分化を、単球上のＤＣ特異的マーカーＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ５４、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＤ４０、およびＣＣＲ７の発現のフローサイトメトリー分析によって評価した。まず、プレインキュベートした組成物（ＰＣ）中の単球を分析し、次いで、ガス透過性ＦＥＰバッグ中で４８または７２時間のインキュベーションを用いて生成したＡＩＣＣ中の単球を分析した。ＤＣ特異的マーカーのそれぞれに対する抗体を用いて、およびペリジニンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）に共役された汎白血球抗原ＣＤ４５に対する抗体を用いて、標本細胞を、二重染色した。後者は、白血球集団のより良好な解像のために使用された。抗ＨＬＡ−ＤＲおよび抗ＣＣＲ７抗体を、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）に共役した。ＤＣ特異的抗体の残りを、フィコエリトリン（ＰＥ）に共役した。
【０２０１】
それぞれの時点からの細胞を、ＦＡＣＳ染色溶液（ＰＢＳ、２％  正常マウス血清、０．０２％  アジ化ナトリウム）で洗浄し、０．５×１０6／管でアリコートし、暗室で、４℃で３０分間適切なモノクローナル抗体でインキュベートした。二次抗体（抗ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ）を、暗室で、４℃で１５分間添加した。インキュベーション後、細胞を洗浄し、ＰＢＳ中で再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で分析した。同一条件下、無関係であるが、アイソタイプが一致した抗体を用いて染色された細胞を、陰性対照として使用した。これらの結果を、ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって分析した。ＳＳＣおよびＦＬ３（ＣＤ４５陽性、赤色蛍光）シグナルに基づいて、白血球集団を、区別した。
【０２０２】
単球上のＤＣマーカーのフローサイトメトリー分析の結果を表４中に要約し、代表的な実験を、図１中に示す。
【０２０３】
【表４】
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【０２０４】
マーカー発現を特徴付けるために使用され得る２つのパラメーター：１）マーカーを発現する細胞のパーセンテージ（陽性細胞の％）、および２）１個の細胞当たりのマーカー分子の数によって異なるマーカーの平均蛍光強度（ＭＦＩ）がある。表４中のデータは、７〜８つの実験の平均＋標準偏差として示されるそれぞれのマーカーに対するすべての単球のＭＦＩを示す。それぞれの実験におけるそれぞれのマーカーに対して倍率の増加を計算し、次いで、平均＋標準偏差を計算した。標準偏差によって示されるように、実験間で変動がある。それでもなお、ＭＦＩは、ＤＣの分化および成熟と関連したマーカーのほとんどにおいて、ＰＣと比較して、（４８時間インキュベートされるか、または７２時間インキュベートされるにかかわらず）ＡＩＣＣ中で数倍高く、これにより、３７℃で４８時間のＰＣのインキュベーション中、ＤＣへの単球を確認する。
【０２０５】
図１は、代表的な実験における、ＰＣを出発する組成物と比較して、４８時間のインキュベーションを使用して調製されたＡＩＣＣに対する倍率の増加を示す。倍率の増加を、それぞれのマーカーにおける３つのパラメーター：１）ある特定のマーカーを発現する細胞の数（陽性細胞の％、第１の棒）、２）すべての単球のＭＦＩ（中間の棒）、および３）「陽性」単球のＭＦＩ（第３の棒）において示す。ＭＦＩは、単球集団中の蛍光分布を表す。総単球のごく一部である細胞の一集団中のＭＦＩの任意の増加を、なおも検出することができるように、陽性単球に対するある程度のＭＦＩが含まれる。ＡＩＣＣを調製するために使用されたプレインキュベーション組成物（ＰＣ）中のＨＬＡ−ＤＲ発現は、すでに高かった。ＰＣ中では、９４＋３％の単球がＨＬＡ−ＤＲ陽性であり、ＭＦＩも高かった。ＨＬＡ−ＤＲの発現は、ＡＩＣＣ中でさらに増加しなかった。マーカーＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ４０、およびＣＤ５４については、「陽性細胞の％」は、インキュベーション時のＣＤ８３の場合とほぼ同一であるか、またはさらに低下した（約０．２〜１倍の増加）が、陽性細胞のＭＦＩが多くの倍率を増加したため、すべての単球のＭＦＩは、主に、２〜５倍増加した。マーカーＣＤ８０およびＣＣＲ７については、陽性細胞の％およびＭＦＩはともに、数倍増加した。
【０２０６】
これらの結果は、ＡＩＣＣが、出発組成物と比較して、成熟ＤＣに関して濃縮されることを示す。
【０２０７】
細胞付着を促進する条件下、細胞をインキュベートする効果も研究された。ＡＩＣＣは、１つの種類は、普通の表面を有するものであり、他方の種類は、細胞付着を促進するように処理された表面を有するものの２つの異なる種類のバッグを用いて調製された。次いで、ＤＣ特異的マーカーの発現は、粘着性および非粘着性バッグを使用して調製されたＡＩＣＣと比較された。この実験の結果を図２中に示す。驚いたことには、非粘着性バッグ中のインキュベーションは、粘着性バッグ中のインキュベーションと比較して、ＤＣマーカーに対して高いＭＦＩをもたらした。この効果は、特に、ＣＤ８３、ＣＤ４０、およびＣＣＲ７に対して著しかった。この効果は、特に、ＣＤ８３、ＣＤ４０、およびＣＣＲ７に対して著しい。
【０２０８】
単球上のＣＤ８−アルファ発現の分析
単球が低レベルのＣＤ８−アルファを発現する一方、分化したＤＣの亜集団は、高いレベルのこのマーカーを発現する（Ｍｅｒａｄ  Ｍ，２０００）。ＣＤ８α（＋）樹状細胞（ＤＣ）は、高いレベルのＩＬ−１２を分泌し（Ｍａｓｈａｙｅｋｈｉ  Ｍ，２０１１）、Ｔヘルパー細胞のＴｈ１表現型を促進する（Ｍａｌｄｏｎａｄｏ−Ｌoｐｅｚ  Ｒ，１９９９、Ｍａｌｄｏｎａｄｏ−Ｌoｐｅｚ  Ｒ，２００１）ため、細胞内病原体および腫瘍由来の抗原の交差提示においては、インビボで重要である。
【０２０９】
単球上のＣＤ８発現は、フローサイトメトリーによって測定された。プレインキュベートした組成物（ＰＣ）中で、およびガス透過性ＦＥＰバッグ中で４８時間のインキュベーションを用いて生成したＡＩＣＣ中で単球を分析した。ＰＥに共役されたＣＤ８に対する抗体を用いて、およびＰｅｒＣＰに共役された汎白血球抗原ＣＤ４５に対する抗体を用いて、標本細胞を、二重染色した。単球集団中のＣＤ８発現が分析され得るように、ＳＳＣおよびＦＬ３（ＣＤ４５）シグナルに基づいて、白血球集団を、区別した。
【０２１０】
表５は、３つの実験の結果を要約する。図３は、代表的な実験を表す。
【０２１１】
【表５】
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【０２１２】
３７℃で４８時間のプレインキュベーション組成物（ＰＣ）のインキュベーションによって調製されたＡＩＣＣは、ＰＣ中のＣＤ８+細胞のパーセンテージと比較して、ＣＤ８を発現する単球のパーセンテージが増加した（表５および図３Ａ）。ＣＤ８のＭＦＩもまた、増加した（表５および図３Ｂ）。
【０２１３】
［実施例４：ＡＩＣＣ中のＴ細胞に対するＤＣによる超抗原提示の効果］
ＡＩＣＣを生成するための、ＰＣのインキュベーション中、単球から産生されるＤＣの機能性を確認するために、超抗原（ＳＡ）であるブドウ球菌エンテロトキシンＢを、インキュベーション混合物に添加した。超抗原（ＳＡ）も、抗原提示細胞上のＭＨＣクラスＩＩ分子およびＴリンパ球上のＴ細胞受容体に結合するため、処理された抗原ペプチドに類似する。しかしながら、ＳＡは、他の抗原と異なり、細胞内処理を必要としないため、有利である。加えて、ＳＡは、ある特定のファミリーのＴ細胞受容体を持つ約２０％のＴ細胞を刺激し、その一方、ほとんどの抗原ペプチドは、抗原に特異的なＴ細胞のみを刺激するため、約０．００１％のＴ細胞のみを刺激する（Ｂｈａｒｄｗａｊ  Ｎ，１９９３）。それ故に、ＳＡは、Ｔ細胞を刺激する、ＤＣ等の抗原提示細胞の能力を試験するためのペプチド抗原に対する代替物として使用することができる。
【０２１４】
Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒ）の分析
ＳＡの存在下、ＡＩＣＣ中のリンパ球の活性化を、公知のリンパ球活性化マーカーＣＤ６９の発現のフローサイトメトリー分析によって評価した。ＣＤ６９の発現は、活性化されたＴ細胞上で急速に増加し、刺激してから１８〜４８時間後にピーク発現が生じる。（Ｓｉｍｍｓ  ＆  Ｅｌｌｉｓ  １９９６）。まず、プレインキュベートした組成物（ＰＣ）中のリンパ球を分析し、次いで、異なる用量のＳＡブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）の不在または存在下、細胞インキュベーター（３７℃、５％  ＣＯ２、および１００％  湿度で）中で血清中の４８または７２時間のインキュベーション後のＡＩＣＣ中のリンパ球を分析した。実施例１で記載されたようにＰＣを産生し、濃縮した。ＤＣ等の抗原提示細胞との相互作用を必要としないポリクローナルＴ細胞刺激剤であるフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）を、対照として使用した。
【０２１５】
まず、リンパ球が、抗ＣＤ６９−ＦＩＴＣ抗体および抗ＣＤ３−ＡＰＣ抗体（ともに、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅからの）を用いて二重染色され、次に、抗ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ抗体を用いて二重染色された。細胞は、フローサイトメトリーによって分析された。４つの実験の平均＋標準偏差を、表６中に示す。図４は、代表的な実験を表す。
【０２１６】
【表６】
2015516374.tif 000008
【０２１７】
４８時間でＡＩＣＣは、ＳＡの不在下、数が減少したＣＤ６９陽性Ｔ細胞（ＣＤ３+）および非Ｔ細胞（ＣＤ３-）を含んだ。ＳＡの添加により、リンパ球の両方のサブセットを刺激し、ＣＤ６９陽性細胞のパーセンテージ（表６および図４Ａ）ならびにこれらの細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）（表６および図４Ｂ）の用量依存的な増加を引き起こした。ＭＦＩの増加は、それぞれの活性化された細胞上のＣＤ６９分子数の増加に反映する。ＤＣによる抗原提示とは独立して作用するリンパ球の活性剤のフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）が同様の効果を生じることができなかったため、ＳＡの効果は、ＤＣ依存性機構によるものであり、これは、ＤＣ依存性機構によるＳＡの特異的効果を示唆した（表６）。
【０２１８】
ＩＬ−２受容体（ＣＤ２５）の発現におけるＳＡの効果もまた、研究された。抗原提示は、リンパ球からのＩＬ−２の放出およびそれらの表面上にＩＬ−２受容体の上方調節を生じ、これにより免疫応答の増幅をもたらす。プレインキュベーション組成物は、１００ｎｇ／ｍＬのＳＡの存在下、血清中で、３７℃で４８時間インキュベートされた。得られたＡＩＣＣが、抗ＣＤ２５−ＰＥ抗体および抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ抗体（ともに、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅからの）を用いて二重染色され、次に、抗ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ抗体を用いて二重染色された。４つの実験の結果を、表７中に要約し、代表的な実験を図５中に示す。
【０２１９】
【表７】
2015516374.tif 000009
【０２２０】
リンパ球へのＤＣによるＳＡの提示は、ＩＬ−２Ｒを発現するリンパ球のパーセンテージ（表７、図５Ａ）およびそれぞれの細胞上のＩＬ−２Ｒの数（ＭＦＩ）（表７、図５Ｂ）を増加する。この効果は、Ｔ細胞およびＣＤ３陰性細胞の両方に見られた。
【０２２１】
単球分化マーカーＣＤ４０の分析
ＡＩＣＣを作製するために使用された４８時間のインキュベーション中、超抗原（ＳＡ）の添加は、リンパ球の活性化を促進するだけでなく、ＤＣのさらなる成熟をも刺激した。ＣＤ４０は、Ｔ細胞上のＣＤ４０Ｌと相互作用するＤＣ上の重要な共刺激分子であり、ＤＣからのＩＬ−１２の産生を誘発する。したがって、ＣＤ４０の発現は、ＤＣが機能的に成熟していることの指標である。ＤＣの成熟状態を評価するために、プレインキュベーション組成物中、および異なる量の超抗原の不在または存在下のいずれかで調製されたＡＩＣＣ中の単球上で、このマーカーのレベルを測定した。表８および図６は、異なる献血からのＡＩＣＣで行われた３つの独立した実験の結果を要約する。
【０２２２】
【表８】
2015516374.tif 000010
【０２２３】
ＡＩＣＣ中のＣＤ４０陽性細胞のパーセンテージは、増加する量のＳＡに伴って増加した（表８および図６Ａ）。ＣＤ４０の発現レベル（ＭＦＩ）はまた、用量依存的な様式で、ＳＡの添加によって増強された（表８および図６Ｂ）。ＭＦＩの結果に示されるように、ＣＤ４０のレベルが、プレインキュベーション組成物と比較して、ＡＩＣＣにおいて高かったが、ＳＡの存在により、細胞上のＣＤ４０レベルのさらに大きな増強をもたらした（表８、「ＭＦＩ」および図６Ｃ）。ＤＣによる抗原提示とは独立して作用するリンパ球の活性剤であるフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）は、この効果を生じることができなかった。
【０２２４】
ＡＩＣＣ中のＩＬ−１２含量の分析
完全に成熟したＤＣがＴ細胞と相互作用するとき、ＤＣは、ＩＬ−１２を産生する。したがって、ＩＬ−１２のレベルもまた、決定された。
【０２２５】
第１の実験において、ＩＬ−１２濃度は、ＰＣ中、およびＦＥＰバッグ中で、３７℃で４８時間のインキュベーションを用いて調製されたＡＩＣＣ中で測定された。１０ｍＬの濃縮ＰＣをバッグに入れて、ＡＩＣＣを調製するために、細胞を４８時間インキュベートした。ＰＣおよびＡＩＣＣ組成物を、３，５００ｘｇで、１５℃で３０分間遠心分離し、製造業者の取扱説明書に従って、ＩＬ１２ｐ７０に対してＤｉａｃｌｏｎｅ（商標）−ＥＬＩＳＡ（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ，Ｉｎｃ）を用いて、上清中で、ＩＬ−１２濃度を測定した。ＰＣを産生した日に得られたか、または３７℃で４８時間ＡＩＣＣを用いて同時にインキュベートされた血清は、細胞を添加することなく、同じ方法で遠心分離した。血清のＯＤ値を、バックグラウンドとして使用し、ＰＣおよびＡＩＣＣ試料のそれぞれのＯＤ値から減算した。
【０２２６】
図７Ａに示されるように、ＩＬ−１２濃度は、ＡＩＣＣ中で増加した。したがって、これらの結果は、ＤＣに分化された単球が、ＡＩＣＣ中でＩＬ−１２を産生することが可能であることのさらなる証拠を提供する。単球がＡＩＣＣ中で白血球全体のわずか約１０％から成ることを考えると、これらの結果は、極めて有意である。
【０２２７】
第２の実験（図７Ｂ）では、ＰＣを、１００ｎｇ／ｍＬのＳＡの不在および存在下、３７℃で４８時間インキュベートし、ＡＩＣＣを生成した。平行培地を、室温（ＲＴ）でインキュベートした。再度、ＩＬ−１２含量は、３７℃で４８時間のインキュベーション中、増加した。しかしながら、ＳＡの存在下、ＩＬ−１２濃度は、２倍超増加した。これらの結果は、ＤＣのさらなる成熟が、ＳＡの存在下で生じることを示唆している。インキュベーションが室温で行われたとき、ＳＡの効果は見られず、これにより、ＩＬ−１２放出が細胞機能に依存する生物学的過程であったことを確認した（図７Ｂ）。
【０２２８】
ＡＩＣＣリンパ球によるＩＬ−２産生の分析
抗原提示を介してＤＣにより活性化されたナイーブＴ細胞は、ＣＤ４陽性Ｔｈ１表現型を得、多量のＴ細胞マイトジェンサイトカインＩＬ−２を産生する。したがって、ＡＩＣＣが活性化されたＴ細胞を含んだ場合、それらのＴ細胞は、ＡＩＣＣが成熟ＤＣを含有するため、抗原の存在下、ＩＬ−２を放出すべきである。
【０２２９】
ＩＬ−２の放出を検出するために、ＩＬ−２濃度を、プレインキュベーション組成物（ＰＣ）中、および１００ｎｇ／ｍＬのＳＡの存在および不在下、３７℃で４８時間のインキュベーションの終了時、ＡＩＣＣ中で測定した。試料は、ＩＬ−１２について記載されるように、調製された。細胞をペレット化した後、ＩＬ−２濃度を、ＩＬ−２ＥＬＩＳＡキット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、上清中で測定した。上記のように、プレインキュベートされたおよびインキュベートされた血清試料を対照として使用した。加えて、インキュベートされた細胞（＋／−ＳＡ）を、ペレット化し、培養培地で洗浄し、５×１０6／ｍＬで添加剤を含まない新鮮血清中に再懸濁させて、３時間インキュベーター中に入れた。次いで、新鮮血清へのＩＬ−２の放出を測定した。出発組成物として異なるバッチのＰＣを使用した３つの実験の結果を表９中に要約する。
【０２３０】
【表９】
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【０２３１】
表９中のデータは、ＡＩＣＣ中のＤＣが機能的に活性であり、Ｔ細胞へのＳＡを提示し、ＩＬ−２の強固な放出を生じることを示す。表９中の結果はまた、活性化されたリンパ球がＳＡ後にＩＬ−２放出を継続し、ＡＩＣＣ中の他の生物学的に活性な薬剤が洗い落とされたことも示す。図８に示されるように、ＳＡの存在下で生成されたＡＩＣＣ中のＩＬ−２濃度は、異なる対象から得られた３つすべての試料において高かった。インキュベートされた試料中でのＩＬ−２濃度と、新鮮血清にＩＬ−２を放出するリンパ球の能力との間に相関関係があった。ＳＡをインキュベーション媒体に添加しなかった場合（すなわち、抗原提示の不在下）、ごく少量のＩＬ−２を産生した。
【０２３２】
ＡＩＣＣリンパ球によるＩＦＮ−ガンマ産生の分析
抗原提示を介してＤＣによって活性化されたＣＤ４  Ｔヘルパー細胞およびＣＤ８  細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エフェクターＴ細胞は、多量のインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ｇ）を産生する。ＩＦＮ−ｇは、先天性および適応免疫、ならびに腫瘍制御に重要なサイトカインである。したがって、ＡＩＣＣが活性化されたＴ細胞を含んだ場合、ＡＩＣＣは、ＩＦＮ−ｇを含有するはずである。
【０２３３】
ＳＡの存在下、４８時間のインキュベーション中、ＩＦＮ−ｇ放出は、プレインキュベーション組成物（ＰＣ）中、および１００ｎｇ／ｍＬのＳＡの存在および不在下、３７°Ｃで４８時間のインキュベーションの終了時にＡＩＣＣ中で測定された。試料は、ＩＬ−１２について記載されるように、調製された。ＩＦＮ−ｇの濃度を、ＩＦＮ−ｇ  ＥＬＩＳＡキット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、細胞をペレット化した後の上清中で測定した。プレインキュベートされたおよびインキュベートされた血清試料を対照として使用した。血清中に自然に存在するＩＦＮ−ｇの量は、１．５〜５ｐｇ／ｍＬの範囲であった。これらのバックグラウンドの血清濃度を、実験試料に対して得られた値から減算した。加えて、インキュベートした細胞（＋／−ＳＡ）を、ペレット化し、培養培地で洗浄し、５×１０6／ｍＬで添加剤を含まない新鮮血清中に再懸濁させた。細胞を３時間インキュベートし、新鮮血清へのＩＦＮ−ｇの放出を測定した。異なるバッチのＰＣを用いた４つの実験の結果を、表１０に要約する。
【０２３４】
【表１０】
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【０２３５】
表１０中のデータは、ＡＩＣＣ中のＤＣが機能的に活性であり、Ｔ細胞へのＳＡを提示し、ＩＦＮ−ｇの強固な放出を生じることを示す。表１０中の結果はまた、活性化されたリンパ球がＳＡ後にＩＦＮ−ｇの放出を継続し、ＡＩＣＣ中の他の生物学的に活性な薬剤が洗い落とされたことも示す。図９に示されるように、インキュベートされた試料中のＩＦＮ−ｇの濃度と、新鮮血清にＩＦＮ−ｇを放出するリンパ球の能力との間に相関関係があった。ＳＡをインキュベーション媒体に添加しない場合には、ごく少量のＩＦＮ−ｇを産生し、抗原提示を生じない。
【０２３６】
［実施例５：ＮＫ細胞に特異的な活性化マーカーの発現］
２つの公知のＮＫ細胞活性化マーカー、ＣＤ５７およびＣＤ１０７ａの発現はまた、プレインキュベーション組成物中、およびＳＡの不在および存在下、３７℃で４８時間インキュベートすることによって調製されたＡＩＣＣ中で評価された。白血球を、ＡＰＣに共役されたＣＤ５７に対する抗体およびＰＥに共役されたＣＤ１０７ａに対する抗体で染色した。ＦＩＴＣまたはＡＰＣのそれぞれ共役された単球上のＣＤ１４マーカーに対する第２の抗体を、白血球集団間のより良好な解像を達成するために添加した。リンパ球ゲート内の細胞を分析した。２つの実験の結果を表１１に示す。
【表１１】
2015516374.tif 000013
【０２３７】
いずれのマーカーに対するＭＦＩにおいて有意な差異は認められなかった。インキュベーションがＳＡの存在下で行われたとき、ＣＤ１０７ａ陽性細胞のパーセンテージは増加した（６６．４％対４７．５％）。
【０２３８】
［実施例６：動物モデルにおける固形腫瘍に対する免疫応答の刺激］
ＡＩＣＣは、動物モデルにおいて、ＡＩＣＣの可溶性部分が腫瘍に対する免疫応答を刺激することを示すために、評価され得る。このアッセイで使用する動物モデルには、同系腫瘍細胞が移植された無傷免疫系を有する健常なマウスが含まれる。あるモデルは、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）マウス株と同系であるマウスＢ１６黒色腫細胞株を使用する。使用され得る別のモデルは、４Ｔ１細胞の同所または異所移植であり、これらは、元来、ＢＡＬＢ／ｃマウスの自然発生乳腺腫瘍に由来した。
【０２３９】
簡潔に言えば、ＡＩＣＣは、例えば、健常なヒト対象の献血から上述のように調製される。ＡＩＣＣは、１００ｎｇ／ｍＬの黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  Ｅｎｔｅｒｔｏｘｉｎ  Ｂ）等の超抗原の存在下、３７℃で約４８〜７２時間のインキュベーションによって生成される。インキュベーションの終了時、ＡＩＣＣ中の細胞を、例えば、遠心分離によって除去し、上清（すなわち、ＡＩＣＣの無細胞画分）を、同系腫瘍を保持するマウスへの注射のために使用する。移植後、無細胞ＡＩＣＣを１回以上動物に投与する。マウスのある群において、投与は、全身投与であるが、一方、別の群において、投与は、腫瘍周辺の領域への注射によるものである。腫瘍を保持するマウスのさらなる群には、超抗原を用いずに生成されたＡＩＣＣを投与する。さらなる群には、ＡＩＣＣの生成中、活性化された白血球のインキュベーションのために使用されたヒト血清を投与する。未治療群は、対照群としての役割を果たす。
【０２４０】
腫瘍の大きさおよび動物生存率を測定する。体重の変化および他の細胞毒性効果もモニタリングする。マウス活性化Ｔ細胞を産生するＩＦＮ−ガンマの頻度を、マウスＩＦＮ−ガンマ酵素連結免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイによって測定する。生存が長期に及ぶ場合、腫瘍成長が阻害される場合、またはＡＩＣＣを投与した動物が、腫瘍を移植したがＡＩＣＣを投与しなかった、もしくはヒト血清を単独で投与した動物と比較して免疫応答の増加を示す場合、無細胞ＡＩＣＣは、腫瘍に対して免疫応答を刺激することが実証される。
【０２４１】
［実施例７：悪性黒色腫の治療］
活性化された免疫刺激細胞組成物は、特に、皮膚癌、具体的には、黒色腫の治療に対して有用である。黒色腫は、メラニン細胞の悪性腫瘍である。メラニン細胞は、皮膚の色に関与する濃い色素であるメラニンを生成する細胞である。それらは、主に、皮膚で発生するが、腸および眼を含む体の他の部分にも見出される。黒色腫は皮膚癌の症例のうちの５％未満を占めるが、皮膚癌による死亡のうちの７５％が黒色腫によるものである。黒色腫の発生率は、過去３０年間、着実に増加している（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ．２００９  Ｃａｎｃｅｒ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｆｉｇｕｒｅｓ）。２０１０年には、１１４，９００例の黒色腫の新しい症例が、米国内で診断された（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ．Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｆａｃｔ  Ｓｈｅｅｔ．Ａｃｃｅｓｓｅｄ  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １，２０１０）。
【０２４２】
黒色腫を治療するために、ＡＩＣＣは、黒色腫であると診断された患者から調製される。代替として、ＡＩＣＣは、血液型（ＡＢＯ、Ｒｈ）、ならびにＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ１２、およびＨＬＡ−Ｃｗ７等の特定のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）対立遺伝子が適合する健常な同種ドナーの末梢血から調製される。これらは、黒色腫患者の中で最も頻度の高い対立遺伝子である（Ｆｅｎｓｔｅｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｍｅｄ．２００６，１３；４：５）。
【０２４３】
ＡＩＣＣは、患者の黒色腫生検または腫瘍の外科的切除術から得られた組織からの腫瘍抗原で刺激される（調製中またはその後の別々のインキュベーション中のいずれかで）。腫瘍細胞溶解物が調製される。代替として、生検材料から得られた原発性黒色腫細胞株を、Ｎａｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２００９  Ｊａｎ  ２７；１００（２）：３２２−３３に記載されるプロトコルに従って、ダカルバジンおよびテモゾロミド等の黒色腫の化学療法剤に供する。処理細胞のアポトーシスを、例えば、Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００５  Ｓｅｐ；３０４（１−２）：４３−５９）に記載されるアッセイを使用して、カスパーゼ３活性に対するフローサイトメトリーによって確認する。次いで、黒色腫溶解物またはアポトーシス細胞を、ＡＩＣＣ中のＤＣに負荷する。
【０２４４】
ＡＩＣＣはまた、公知の黒色腫抗原で刺激され得る。例示的な黒色腫抗原には、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＴＹＲ、およびｇｐ１００抗原が含まれる。
【０２４５】
黒色腫抗原で負荷されたＡＩＣＣ中の細胞毒性Ｔ細胞の機能的活性は、生体外細胞毒性アッセイ中で評価される。このアッセイのために、原発性黒色腫細胞株が、同じ生検または外科的材料から構築される。細胞は、コラゲナーゼおよびＤＮａｓｅによる酵素解離によって単離され、細胞懸濁液は、ダルベッコ変法イーグル培地１０％のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、ＨＥＰＥＳ（１：５００）、ペニシリン−ストレプトマイシン（１：１００）、およびグルタミン（１：１００）中で培養される。付着培養された黒色腫細胞は、様々な比率のＡＩＣＣで、３７℃で６時間インキュベートする。次いで、黒色腫細胞を洗浄し、アポトーシスの証拠についてカスパーゼ３活性を使用して、フローサイトメトリーによって分析される。
【０２４６】
次いで、ＡＩＣＣ組成物を、１８ゲージ（１８Ｇ）の針を使用して、任意のサイズの滅菌注射器に吸引する。細胞に対する損傷を最小限に抑えるように、ゆっくりと吸引を行う。注射器および針のサイズは、決して限定されるものではないが、大きいゲージの針が吸引には好ましい。これは、移動を促進し、細胞損傷を低減する。
【０２４７】
ＡＩＣＣは、組成物を腫瘍中におよび／または腫瘍周辺の皮内的に注射することによって投与される。ＡＩＣＣはまた、全身的な効果のために局所リンパ節に注射され得る。代替的に、全注射器が、腫瘍内の単一部位に一度で注射され得る。臨床医は、ＡＩＣＣが臨床的パラメーターに基づいて必要であると判断される場合、さらなるＡＩＣＣを投与することを選択し得る。
【０２４８】
患者は、モニタリングされ、腫瘍の大きさ、転移の数、無進行生存率、腫瘍抗原に対する免疫応答等のパラメーターへのＡＩＣＣの効果が判定される。患者の末梢血中の黒色腫特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を、例えば、ＩＦＮ−ガンマ酵素連結免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイを用いてモニタリングされる。
【０２４９】
［実施例８：癌患者における抗腫瘍免疫応答を刺激するためのペプチドパルスしたＡＩＣＣの調製］
末梢血の試料とともに、腫瘍生検は、腫瘍に罹患している患者から得られる。代替として、末梢血は、特に、ドナーが患者と１つ以上のＨＬＡ抗原が適合する場合、患者以外のドナーから得られ得る。末梢血は、白血球除去を含む標準的な静脈切開術／血液貯蔵技術によって得られ得る。同種の出発材料を含むこれらの実施形態において、これらは、便宜上血液銀行から得られ得る。試料は、血液型（ＡＢＯ、Ｒｈ）、またはＡ２、Ｂ１２、およびＣ３等であるが、これらに限定されない、特定のヒト白血球抗原対立遺伝子に関して血液銀行によってスクリーニングされ得る。
【０２５０】
腫瘍組織は、無菌処理条件下、腫瘍細胞を得るために、破壊される。次いで、腫瘍細胞は、腫瘍抗原を調製するために直ちに使用されるか、培養（継代培養）されるか、あるいは後で使用するために凍結保存される。所望されるならば、特定の腫瘍型と関連する１つ以上の腫瘍抗原の発現は、フローサイトメトリー、ＰＣＲ、または他の標準技術によって確認することができる。
【０２５１】
ＡＩＣＣは、上述のように、患者の末梢血試料から調製される。抗原は、ＡＩＣＣを調製するためのインキュベーションの一部の間、またはＡＩＣＣの調製後に添加される。ＡＩＣＣは、患者の腫瘍細胞から調製された腫瘍細胞抗原を用いて、少なくとも１時間パルスされる。腫瘍細胞抗原がＡＩＣＣの調製中添加される場合、パルスは、ＡＩＣＣのインキュベーション期間継続する。腫瘍細胞抗原の代替物として、特定の腫瘍型と関連する１つ以上のペプチド抗原が、例えば、約１０マイクログラム／ｍＬ（１ペプチド抗原当たり）の濃度で使用され得る。腫瘍抗原調製物または１つ以上のペプチド抗原がＡＩＣＣの生成後に添加される場合、ＡＩＣＣは、一般に、抗原またはペプチド抗原で、３７℃で約１６〜２０時間パルスされるべきである。ＡＩＣＣが樹状細胞だけでなく、活性化されたＴリンパ球等の他の細胞型、ならびにサイトカインおよび他の成長因子を含むため、ＡＩＣＣは、３７℃でインキュベートされ、ＤＣがＡＩＣＣ中のＴ細胞に対して腫瘍抗原（複数可）または腫瘍ペプチド抗原（複数可）を提示し、サイトカインが細胞の活性化をさらに促進するように作用することを可能にし得る。
【０２５２】
インキュベーション後、ＡＩＣＣが患者に投与される。抗原パルスしたＡＩＣＣが注入され得るか、またはそれは腫瘍への局所部位で注射することによって投与され得る。抗原パルスしたＡＩＣＣが注射される場合、ＡＩＣＣが約１０7〜１０8のＤＣを含有するように、ＡＩＣＣを、任意に濃縮して、体積を減少させ得る。ＡＩＣＣの体積が、注射のために減少される場合、別々の注射または注入によって、ＡＩＣＣ上清を投与することが望ましくあり得る。
【０２５３】
ＡＩＣＣの投与後、患者は、腫瘍応答についてモニタリングされる。
【０２５４】
特許公開および非特許刊行物を含む、本出願で言及されるすべての刊行物は、本発明が属する技術の当業者のスキルレベルを指標する。これらの刊行物のすべては、あたかも各個々の刊行物が参照により組み込まれるように具体的におよび個別に示されるのと同じ程度に参照により本明細書に組み込まれる。
【０２５５】
本発明の他の実施形態は、本明細書の考慮および本明細書に開示される実践から、当業者に明らかとなろう。本明細書および実施例は、例示的なものにすぎないと見なされることが意図され、本発明の真の範囲および精神は、次の特許請求の範囲によって示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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2015516374.tif 000024
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