(57)【要約】  間葉系幹細胞（ＭＳＣ）集団を認定する方法が開示される。前記方法は、（ａ）対象に起源を有する間葉系幹細胞の集団を第１の系譜特異的細胞に向かってエクスビボ分化させること、ただし、前記第１の系譜特異的細胞は脳疾患に関連する；（ｂ）健常者対象に起源を有する間葉系幹細胞の集団を前記第１の系譜特異的細胞に向かってエクスビボ分化させること；（ｃ）前記脳疾患に関連する第２の系譜特異的細胞に対して、前記対象に由来する前記第１の系譜特異的細胞の影響を、前記健常者対象に由来する前記第１の系譜特異的細胞の影響と比較することを含み、所定のレベルを超えるか、または所定のレベルに達しない前記影響における違いにより、間葉系幹細胞集団が認定されることが示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）集団を認定する方法であって、
（ａ）対象に起源を有する間葉系幹細胞の集団を第１の系譜特異的細胞に向かってエクスビボ分化させること、ただし、前記第１の系譜特異的細胞は脳疾患に関連する；
（ｂ）健常者対象に起源を有する間葉系幹細胞の集団を前記第１の系譜特異的細胞に向かってエクスビボ分化させること；
（ｃ）前記脳疾患に関連する第２の系譜特異的細胞に対して、前記対象に由来する前記第１の系譜特異的細胞の影響を、前記健常者対象に由来する前記第１の系譜特異的細胞の影響と比較すること、ただし、所定のレベルを超えるか、または所定のレベルに達しない前記影響における違いにより、間葉系幹細胞集団が認定されることが示される、
を含む方法。
【請求項２】
前記認定することは、前記ＭＳＣ集団が、対象の前記脳疾患を処置するための自己細胞置換療法のために好適であるかどうかを確認することである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１および／または前記第２の系譜特異的細胞に対する、前記対象に由来する第３の系譜特異的細胞の影響と前記健常者対象に由来する前記第３の系譜特異的細胞の影響とを比較することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第２の系譜特異的細胞は間葉系幹細胞の集団からエクスビボ分化させられている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記脳疾患は、神経変性障害、神経炎症障害およびプリオン媒介障害からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病およびレット症候群からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記脳疾患は、多発性硬化症、ＡＬＳ、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、レット症候群、自閉症スペクトラム障害、アスペルガー症候群、認知症および大脳萎縮、多系統萎縮症、クロイツフェルト・ヤコブ病、橋小脳形成不全、皮質基底核変性、進行性核上性麻痺、脊髄小脳萎縮症、脊髄＆延髄性筋萎縮、シャルコー・マリー・トゥース病、巨大軸索ニューロパチー、カナバン病、フリードライヒ運動失調および他の運動失調、てんかん、早期乳児脳症、遺伝性痙性対麻痺、中枢神経系のアミロイドーシス、トゥレット症候群、シャイ・ドレーガー症候群、メニエール症候群、アルパース病、家族性自律神経異常症、失読症、ウェルドニッヒ・ホフマン病、結節性硬化症ならびに神経線維腫症である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記脳疾患は精神医学的疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記方法は前記対象に起源を有する前記ＭＳＣの遺伝子異常について分析することをさらに含み、前記遺伝子異常は脳疾患に関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）集団を認定する方法であって、前記ＭＳＣの前記集団から分化させられる系譜特異的細胞の機能および／または形態学を分析することを含み、ただし、対照の系譜特異的細胞と比較される前記系譜特異的細胞の前記機能または形態学における変化により、前記ＭＳＣが認定されることが示される、方法。
【請求項１１】
ＭＳＣの前記集団は、脳疾患を有する対象に由来する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記認定することは、前記ＭＳＣが、対象の脳疾患を自己処置するために好適であるかどうかを確認することである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法は前記ＭＳＣの遺伝子異常について分析することをさらに含み、前記遺伝子異常は脳疾患に関連する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記系譜特異的細胞の前記機能は、ミクログリア細胞に対する応答を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記脳疾患は神経変性障害である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病およびレット症候群からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記脳疾患は精神医学的疾患である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記脳疾患が筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）であり、前記系譜特異的細胞が、運動ニューロン、骨格筋および星状膠細胞からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
前記脳疾患がパーキンソン病であるとき、前記系譜特異的細胞が、星状膠細胞およびドーパミン作動性ニューロンからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
前記脳疾患がレット症候群であるとき、前記系譜特異的細胞が、星状膠細胞およびニューロンからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項２１】
脳疾患を処置するための作用因を選択する方法であって、脳障害の患者から単離されるＭＳＣの集団が、前記脳障害に関連する系譜特異的細胞に向かって分化する能力を前記作用因の存在下および非存在下において分析することを含み、ただし、前記作用因の存在下におけるＭＳＣの対照集団に由来する同一の系譜特異的細胞と比較して、前記系譜特異的細胞の機能または形態学の改善により、前記作用因が前記脳疾患の処置のために使用され得ることが示される、方法。
【請求項２２】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）バンクを製造する方法であって、未分化間葉系幹細胞を、脳障害を有する複数の対象から採取して、複数の別個の細胞集団を得ること；前記間葉系幹細胞を系譜特異的細胞に向かって分化させること；前記未分化間葉系幹細胞および前記系譜特異的細胞を貯蔵し、それにより、間葉系幹細胞バンクを製造すること、を含む方法。
【請求項２３】
前記未分化細胞集団を、少なくとも１つの所定の特徴を前記未分化細胞集団のそれぞれについて得るために特徴づけること、および前記未分化細胞集団のカタログを前記少なくとも１つの所定の特徴に従って作成することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記分化細胞集団を、少なくとも１つの所定の特徴をそれぞれの分化細胞集団について得るために特徴づけること、および前記分化細胞集団のカタログを前記少なくとも１つの所定の特徴に従って作成することをさらに含む、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記特徴づけることは、前記疾患に関連する系譜特異的細胞に向かって分化する前記ＭＳＣの能力を分析することを含む、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記特徴づけることは、前記ＭＳＣの遺伝子異常について分析することを含み、ただし、前記遺伝子異常は前記疾患に関連する、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記貯蔵することは、前記細胞集団を凍結条件のもとで別個の容器に配置することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記カタログを作成することは、所与の細胞集団の前記所定の特徴に関する情報をデータベースコンピューターに入力することを含む、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記所定の特徴は前記対象の疾患状態情報を含む、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項３０】
脳障害の患者から単離される多数のＭＳＣ集団を含む幹細胞バンクであって、それぞれが個々に、別個の容器に配置される幹細胞バンク。
【請求項３１】
前記ＭＳＣ集団から分化させられる系譜特異的細胞であって、前記脳障害に関連する系譜特異的細胞をさらに含む、請求項３０に記載の幹細胞バンク。
【請求項３２】
前記ＭＳＣ集団の所定の特徴に関する情報を含むカタログをさらに含む、請求項３０に記載の幹細胞バンク。
【請求項３３】
前記所定の特徴は前記ＭＳＣ集団の分化能を含む、請求項３２に記載の幹細胞バンク。
【請求項３４】
前記所定の特徴は遺伝的特徴を含む、請求項３２に記載の幹細胞バンク。
【請求項３５】
前記カタログは、少なくとも１つの処理モジュールと、前記多数の細胞集団の所定の特徴情報が入力される少なくとも１つのメモリデバイスと、所定の特徴情報を、前記データベースコンピューターに通信接続されるディスプレーに要求時に表示させるための少なくとも１つのプログラムコードモジュールとを含む少なくとも１つのデータベースコンピューターユニットである、請求項３２に記載の幹細胞バンク。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１２年２月２２日に出願した米国特許仮出願第６１／６０１６１９号、２０１２年２月２２日に出願した米国特許仮出願第６１／６０１５９６号、及び２０１２年２月２２日に出願した米国特許仮出願第６１／６０１６２４号（参照として本明細書中にそれらの全体が援用される）の優先権の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、ヒト疾患のインビトロモデル化のための間葉系幹細胞集団、およびそのような疾患を処置するための好適な間葉系幹細胞集団を選択する方法に関連する。
【背景技術】
【０００３】
標的主導の薬物発見に対する現在の取り組みは典型的には、大きい化合物ライブラリーを単一の酵素または受容体に対してスクリーニングすること、その後、ヒットしたものを化学的取り扱いやすさに基づいて優先順位づけし、効力および選択性を達成するために医薬品化学により最適化することを伴う。典型的には、前臨床開発での後期段階において、候補化合物が、関連性のある初代細胞系または動物モデルにおいて試験されるが、これらは期待はずれの結果であることが多い。標的指向の生化学的スクリーニングとは対照的に、細胞に基づく表現型アッセイの使用が、ハイコンテント画像処理における進歩、ならびに、細胞に基づくスクリーニングがハイスループットスクリーニングおよびリード物質最適化のためのより生理学的な系を表すという認識によって押し進められるので増大している。
【０００４】
細胞に基づくアッセイは、細胞透過性および許容可能な毒性が同時に確認されるため、単一標的の生化学的アッセイを上回る様々な利点を有しているが、付随した制限が多くある。細胞に基づくスクリーニングでは既知の標的を欠くために、生物学的活性に関わる化学的群を構造活性相関研究により求めることができず、また、純粋に経験的な試みが、薬物様の性質を試行錯誤により最適化するために要求される。薬物スクリーニング、リード物質発見およびリード物質最適化のためにヒト初代細胞（好ましくは、疾患を有する細胞）を使用するための理論的根拠は説得力があるにもかかわらず、ほとんどの初代細胞は利用困難であり、かつ、有限の寿命を培養において有する。培養において不死成長するようにヒト初代細胞を適合化することは、細胞に基づくスクリーニングにおけるその使用のためには必要不可欠なことであり、典型的には、薬物に対する細胞の応答に影響を及ぼし得る、したがって、薬物スクリーニングおよび対比スクリーニングの忠実度を損ない得る遺伝子変化についての選択を必然的に伴う。
【０００５】
疾患患者由来のｉＰＳを首尾よく作製し、様々な系譜特異的細胞に分化させることが可能となっている（例えば、ＡＬＳ患者由来のｉＰＳ細胞が運動ニューロンに分化させられている）にもかかわらず、ｉＰＳ細胞を使用するための様々な制限には、誤った遺伝子型特徴および表現型特徴を持ち込み得る胚性遺伝子の発現、ならびに、分化させたｉＰＳは未だに臨床使用することができないので、これらの研究の結果を臨床にそのまま適用することができないことが含まれる。
【０００６】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨髄、脂肪、臍帯、胎盤、羊水および血管周囲の組織を含むほとんどの結合組織に存在する、多数の種から単離される間質細胞の不均一な集団である。ＭＳＣは間葉系譜の細胞（例えば、骨、軟骨および脂肪など）に分化することができ、しかし、ある種の環境のもとでは、内胚葉系譜および神経外胚葉系譜の細胞の表現型を獲得することが報告されており、このことは「分化転換」のための何らかの潜在的能力を示唆している。骨髄内において、これらの細胞がしっかりと混じり合い、造血および造血幹細胞の生存を黙従的状態において支援する（Ｍｅｕｌｅｍａｎ  Ｎ他、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ、１８（９）：１２４７〜５２、２００９）。
【０００７】
近年の報告では、ＭＳＣはまた、ニューロン、星状膠細胞および乏突起膠細胞を含む中枢神経系の機能的細胞に分化する潜在的能力を有することが明らかにされている。ＭＳＣは、様々な神経学的な疾患および機能不全における治療効果を実験的動物モデルにおいて、また、より近年には試験的な臨床試験において発揮することが示されている。それらの効果は主として、免疫抑制機能および神経保護機能に起因すると考えられている。しかしながら、いくつかの研究は、これらの細胞の分化がそれらの治療効果を様々な場合において増大させたことを明らかにした。したがって、ＭＳＣ由来細胞は、疾患活性の細胞媒介抑制と、同様にまた、損傷した機能または失われた機能の再生との両方を目指す、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、レット症候群、多発性硬化症およびパーキンソン病を含む炎症性障害および神経変性障害の処置のための細胞の容易に利用可能な供給源としての大きい潜在的能力を有する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）集団を認定する（ｑｕａｌｉｆｙｉｎｇ）方法であって、
（ａ）対象に起源を有する間葉系幹細胞の集団を第１の系譜特異的細胞に向かってエクスビボ分化させること（ただし、第１の系譜特異的細胞は脳疾患に関連する）；
（ｂ）健常者対象に起源を有する間葉系幹細胞の集団を前記第１の系譜特異的細胞に向かってエクスビボ分化させること；
（ｃ）前記脳疾患に関連する第２の系譜特異的細胞に対して、前記対象に由来する前記第１の系譜特異的細胞の影響を、前記健常者対象に由来する前記第１の系譜特異的細胞の影響と比較すること（ただし、所定のレベルを超えるか、または所定のレベルに達しない前記影響における違いにより、間葉系幹細胞集団が認定されることが示される）
を含む方法が提供される。
【０００９】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）集団を認定する方法であって、前記ＭＳＣの前記集団から分化させられる系譜特異的細胞の機能および／または形態学を分析することを含み、ただし、対照の系譜特異的細胞と比較される前記系譜特異的細胞の前記機能または形態学における変化により、前記ＭＳＣが認定されることが示される、方法が提供される。
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、脳疾患を処置するための作用因を選択する方法であって、脳障害の患者から単離されるＭＳＣの集団が、前記脳障害に関連する系譜特異的細胞に向かって分化する能力を前記作用因の存在下および非存在下において分析することを含み、ただし、前記作用因の存在下におけるＭＳＣの対照集団に由来する同一の系譜特異的細胞と比較して、前記系譜特異的細胞の機能または形態学の改善により、前記作用因が前記脳疾患の処置のために使用され得ることが示される、方法が提供される。
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）バンクを製造する方法であって、未分化間葉系幹細胞を、脳障害を有する複数の対象から採取して、複数の別個の細胞集団を得ること；前記間葉系幹細胞を系譜特異的細胞に向かって分化させること；前記未分化間葉系幹細胞および前記系譜特異的細胞を貯蔵し、それにより、間葉系幹細胞バンクを製造すること、を含む方法が提供される。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、脳障害の患者から単離される多数のＭＳＣ集団を含む幹細胞バンクであって、それぞれが個々に、別個の容器に配置される幹細胞バンクが提供される。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記認定することは、上記ＭＳＣ集団が、対象の上記脳疾患を処置するための自己細胞置換療法のために好適であるかどうかを確認することである。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、上記第１および／または上記第２の系譜特異的細胞に対する、上記対象に由来する第３の系譜特異的細胞の影響と上記健常者対象に由来する前記第３の系譜特異的細胞の影響とを比較することを含む。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記第２の系譜特異的細胞は間葉系幹細胞の集団からエクスビボ分化させられている。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記脳疾患は、神経変性障害、神経炎症障害およびプリオン媒介障害からなる群から選択される。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病およびレット症候群からなる群から選択される。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記脳疾患は、多発性硬化症、ＡＬＳ、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、レット症候群、自閉症スペクトラム障害、アスペルガー症候群、認知症および大脳萎縮、多系統萎縮症、クロイツフェルト・ヤコブ病、橋小脳形成不全、皮質基底核変性、進行性核上性麻痺、脊髄小脳萎縮症、脊髄＆延髄性筋萎縮、シャルコー・マリー・トゥース病、巨大軸索ニューロパチー、カナバン病、フリードライヒ運動失調および他の運動失調、てんかん、早期乳児脳症、遺伝性痙性対麻痺、中枢神経系のアミロイドーシス、トゥレット症候群、シャイ・ドレーガー症候群、メニエール症候群、アルパース病、家族性自律神経異常症、失読症、ウェルドニッヒ・ホフマン病、結節性硬化症ならびに神経線維腫症である。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記脳疾患は精神医学的疾患である。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、上記対象に起源を有する上記ＭＳＣの遺伝子異常について分析することを含み、ただし、前記遺伝子異常は脳疾患に関連する。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＭＳＣの上記集団は、脳疾患を有する対象に由来する。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記認定することは、上記ＭＳＣが、対象の脳疾患を自己処置するために好適であるかどうかを確認することである。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、上記ＭＳＣの遺伝子異常について分析することを含み、ただし、前記遺伝子異常は脳疾患に関連する。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記系譜特異的細胞の上記機能は、ミクログリア細胞に対する応答を含む。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記脳疾患は神経変性障害である。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病およびレット症候群からなる群から選択される。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記脳疾患は精神医学的疾患である。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記脳疾患が筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）であり、上記系譜特異的細胞が、運動ニューロン、骨格筋および星状膠細胞からなる群から選択される。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記脳疾患がパーキンソン病であるとき、上記系譜特異的細胞が、星状膠細胞およびドーパミン作動性ニューロンからなる群から選択される。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記脳疾患がレット症候群であるとき、上記系譜特異的細胞が、星状膠細胞およびニューロンからなる群から選択される。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、上記未分化細胞集団を、少なくとも１つの所定の特徴を上記未分化細胞集団のそれぞれについて得るために特徴づけること、および上記未分化細胞集団のカタログを前記少なくとも１つの所定の特徴に従って作成することを含む。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、上記分化細胞集団を、少なくとも１つの所定の特徴をそれぞれの分化細胞集団について得るために特徴づけること、および上記分化細胞集団のカタログを前記少なくとも１つの所定の特徴に従って作成することを含む。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記特徴づけることは、上記疾患に関連する系譜特異的細胞に向かって分化する上記ＭＳＣの能力を分析することを含む。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記特徴づけることは、上記ＭＳＣの遺伝子異常について分析することを含み、ただし、前記遺伝子異常は上記疾患に関連する。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記貯蔵することは、上記細胞集団を凍結条件のもとで別個の容器に配置することを含む。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記カタログを作成することは、所与の細胞集団の上記所定の特徴に関する情報をデータベースコンピューターに入力することを含む。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記所定の特徴は上記対象の疾患状態情報を含む。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記バンクは、上記ＭＳＣ集団から分化させられる系譜特異的細胞であって、上記脳障害に関連する系譜特異的細胞を含む。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記バンクはさらに、上記ＭＳＣ集団の所定の特徴に関する情報を含むカタログを含む。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記所定の特徴は上記ＭＳＣ集団の分化能を含む。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記所定の特徴は遺伝的特徴を含む。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記カタログは、少なくとも１つの処理モジュールと、多数の細胞集団の所定の特徴情報が入力される少なくとも１つのメモリデバイスと、所定の特徴情報を、当該データベースコンピューターに通信接続されるディスプレーに要求時に表示させるための少なくとも１つのプログラムコードモジュールとを含む少なくとも１つのデータベースコンピューターユニットである。
【００４３】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および／または科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
本明細書では本発明のいくつかの実施形態を単に例示し添付の図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の実施形態を例示考察することだけを目的としていることを強調するものである。この点について、図面について行う説明によって、本発明の実施形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【００４５】
【図１】図１は、本発明の例示的アッセイにおいて使用される細胞を絵で表す図である。この図は図２〜図４のための凡例として役立つ。
【００４６】
【図２】図２は、間葉系幹細胞集団が、ＡＬＳを処置するために好適であるかを求めるための例示的アッセイを絵で表す図である。
【００４７】
【図３】図３は、間葉系幹細胞集団が、パーキンソン病を処置するために好適であるかを求めるための例示的アッセイを絵で表す図である。
【００４８】
【図４】図４は、間葉系幹細胞集団が、レット症候群を処置するために好適であるかを求めるための例示的アッセイを絵で表す図である。
【００４９】
【図５】図５は、本発明の特定の実施形態のＡＬＳモデルを絵で表す図である。ＭＳＣを神経幹細胞様のグリア始原体および星状膠細胞に、同様にまた、運動ニューロン始原体および運動ニューロン様細胞に分化させることができることにより、健常者ドナーおよびＡＬＳドナーに由来する星状膠細胞の機能、ならびに、同じドナーに由来する運動ニューロンとのそれらの相互作用を分析するために使用することができる新規なＡＬＳインビトロモデルを開発することが可能になる。これらの細胞はさらに、ニューロンの細胞死、神経毒性および神経保護の新規な機構を特定するために、新規な治療標的を特定するため、および薬物スクリーニングのための特異な系として役立たせるために用いることができる。そのうえ、これらの細胞はＡＬＳの細胞療法において用いることができるので、これらの研究の結果は解釈および臨床での直接的な意味合いを有する。
【００５０】
【図６】図６は、本発明の特定の実施形態のＡＬＳモデルを絵で表す図である。インビボ研究の結果は、インビトロ研究を補完し、分化ＭＳＣの種々のタイプが非改変細胞を上回る治療的利点を有するかどうかを明らかにするであろう。
【００５１】
【図７】図７は、本発明の特定の実施形態のＡＬＳモデルを絵で表す図である。インビトロ研究および前臨床研究に基づいて、ＭＳＣの種々のタイプおよび供給源の治療上の可能性を評価することができる。自己細胞、ハプロタイプ一致細胞または「在庫」細胞（胎盤または臍帯に由来するＭＳＣ）を非改変細胞または分化細胞のどちらかとして使用することができる。
【００５２】
【図８Ａ−８Ｂ】図８Ａは、健常者対照に由来するＭＳＣの馴化培地が運動ニューロン培養物の細胞死をもたらさなかったことを例示する棒グラフである。図８Ｂは、ＡＬＳ患者に由来するＭＳＣから分化させられる星状膠細胞の馴化培地が運動ニューロン培養物の細胞死をもたらしたことを例示する棒グラフである。
【００５３】
【図９】図９は、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ変異体を発現するＭＳＣ由来の星状膠細胞様細胞が運動ニューロンの細胞死を誘導し、これに対して、非改変のＭＳＣは運動ニューロンに対する有意な影響を有しなかったことを例示する棒グラフである。野生型ＳＯＤ１を有するＭＳＣ由来の星状膠細胞様細胞は運動ニューロンの細胞死を誘導しなかった。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、ヒト疾患のインビトロモデル化のための間葉系幹細胞集団、およびそのような疾患を処置するための好適な間葉系幹細胞集団を選択する方法に関連する。
【００５５】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示される細部、または、実施例によって例示される細部に必ずしも限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、あるいは、様々な方法で実施、または、実行される。
【００５６】
ヒトでの神経発達疾患および神経変性疾患における細胞の表現型に関する我々の現在の知識のほとんどが、死後の脳組織における研究から推測されている。これらのサンプルは疾患の末期段階を表していることが多く、したがって、その疾患がどのように発達したかを必ずしも正しく表すものではない。そのうえ、これらの状況のもとでは、認められた病理は、真の疾患の細胞の表現型というよりは、むしろ、二次的な影響であり得る。同様に、利用可能な齧歯類モデルはヒト疾患からの病理を必ずしも再現していない。
【００５７】
したがって、ヒト疾患の病態生理学的機構の研究と、標的療法の開発との両方が、インビトロにおいて実験的に操作することができる予測的疾患モデルがないことによって妨げられている。
【００５８】
例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を研究するための実験的モデルとして使用されるＳＯＤマウスは、家族性ＡＬＳ（ｆＡＬＳ）に対するＳＯＤマウスの関連性がたとえ、疑わしいままであるとしても、ＡＬＳを処置するための新規な取り組みを研究するための受け入れられ得る実験的モデルを表す。そのうえ、実験的動物モデルが、ＡＬＳの症例の大多数を表す散発性ＡＬＳ（ｓＡＬＳ）を研究するためには何ら存在していない。
【００５９】
同様に、遺伝型形態のヒトＰＤによく似る遺伝的病変（例えば、パーキンにおけるホモ接合性欠失またはα−シヌクレインの過剰発現など）を有する動物モデルは、ドーパミン作動性ニューロンの喪失を再現することができていない。
【００６０】
最適な取り組みは、細胞変性の機構を、神経変性疾患の患者に由来する細胞を使用して調べることであると考えられる。しかしながら、関連性のある細胞タイプのすべてをこれらの患者から単離することは事実上不可能である。
【００６１】
疾患患者由来のｉＰＳを首尾よく作製し、様々な系譜特異的細胞に分化させることが可能となっている（例えば、ＡＬＳ患者由来のｉＰＳ細胞が運動ニューロンに分化させられている）にもかかわらず、ｉＰＳ細胞の使用のための様々な制限には、誤った遺伝子型特徴および表現型特徴を持ち込み得る胚性遺伝子の発現、ならびに、分化させたｉＰＳは未だに臨床使用することができないので、これらの研究の結果を実施にそのまま適用することができないことが含まれる。
【００６２】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を、例えば、運動ニューロン、乏突起膠細胞および星状膠細胞を含めて、神経変性疾患に関連する様々な細胞に分化させることができることにより、本発明者らは、疾患を有する対象に由来する間葉系幹細胞を、神経変性疾患をモデル化するために使用することを提案する。そのようなモデルは疾患の基本的理解を高め、特定の疾患を処置するための間葉系幹細胞集団の選択を可能にし、ならびに薬物スクリーニングおよび最適化におけるそれらの適用のための道を開くであろう。病的ＭＳＣに由来するモデルから集められる知識は、健常者ＭＳＣに由来するモデルの作製を可能にするであろう。例えば、特定の遺伝子が、病的ＭＳＣから作製されるニューロンタイプの細胞においてダウンレギュレーションされることが見出されたならば、その同じ遺伝子は、健常者ＭＳＣにおいて（遺伝子ノックアウト、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどによって）ダウンレギュレーションされ得るかもしれず、また、ニューロン細胞タイプに分化させた後で、当該疾患のためのモデルとして役立つであろう。
【００６３】
加えて、既知の遺伝子型に由来するＭＳＣは、薬物に対する応答における変動性を評価するために、または遺伝性疾患の根底にある分子的機構を調べるために使用することができる。
【００６４】
本発明の第１局面によれば、間葉系幹細胞集団を認定する方法であって、
（ａ）対象に起源を有する間葉系幹細胞の集団を第１の系譜特異的細胞に向かってエクスビボ分化させること（ただし、第１の系譜特異的細胞は脳疾患に関連する）；
（ｂ）健常者対象に起源を有する間葉系幹細胞の集団を前記第１の系譜特異的細胞に向かってエクスビボ分化させること；
（ｃ）前記脳疾患に関連する第２の系譜特異的細胞に対して、前記対象に由来する前記第１の系譜特異的細胞の影響を、前記健常者対象に由来する前記第１の系譜特異的細胞の影響と比較すること（ただし、所定のレベルを超えるか、または所定のレベルに達しない前記影響における違いにより、間葉系幹細胞集団が認定されることが示される）
を含む方法が提供される。
【００６５】
用語「間葉系幹細胞」または用語「ＭＳＣ」は、最終分化していない、いずれかの幹細胞である細胞をもたらすために分裂することができる、または生物活性因子（例えば、サイトカインなど）からの様々な影響に依存して不可逆的に分化して間葉細胞系譜の細胞（例えば、脂肪組織、骨組織、軟骨組織、弾性結合組織および繊維性結合組織、筋芽細胞）および胚の中胚葉に起源を有する組織とは異なる組織（例えば、神経系細胞）を生じさせる、成体細胞に対して交換可能に使用される。
【００６６】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を単離し、精製し、拡大する様々な方法が当技術分野では知られており、これらには、例えば、ＣａｐｌａｎおよびＨａｙｎｅｓｗｏｒｔｈによって米国特許第５４８６３５９号に開示される方法、ならびに、Ｊｏｎｅｓ  Ｅ．Ａ．他、２００２、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ、４６（１２）：３３４９〜６０に開示される方法が含まれる。
【００６７】
間葉系幹細胞は、骨髄、末梢血、血液、胎盤（絨毛膜および／または羊膜の両方）、臍帯血、臍帯、羊水（これらに限定されない）を含む様々な組織、および脂肪組織から単離される場合がある。
【００６８】
間葉系幹細胞を末梢血から単離する方法が、Ｋａｓｓｉｓ他［Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、２００６  Ｍａｙ；３７（１０）：９６７〜７６］によって記載される。間葉系幹細胞を胎盤組織から単離する方法が、Ｚｈａｎｇ他［Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２００４、１１７（６）：８８２〜８８７］によって記載される。脂肪組織、胎盤および臍帯血の間葉系幹細胞を単離し、培養する方法が、Ｋｅｒｎ他［Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２００６；２４：１２９４〜１３０１］によって記載される。
【００６９】
本発明のこの局面の好ましい実施形態によれば、間葉系幹細胞はヒト由来である。
【００７０】
本発明のこの局面の別の実施形態によれば、間葉系幹細胞はヒトの新生児から単離される。
【００７１】
骨髄を吸引によって個体の腸骨稜から単離することができる。低密度ＢＭ単核細胞（ＢＭＭＮＣ）が、ＦＩＣＯＬ−ＰＡＱＵＥ密度勾配によって、またはＨｅｔａｓｔａｒｃｈ（ヒドロキシエチルデンプン）を使用する赤血球の除去によって分離される場合がある。好ましくは、間葉系幹細胞の培養物が、ＢＭ吸引物（通常的には２０ｍｌ）を等体積のハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ；ＧＩＢＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎａｄ、ＮＹ、米国）により希釈し、希釈された細胞を約１０ｍｌのＦｉｃｏｌｌカラム（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、米国）の上に重層することによって作製される。２５００×ｇでの遠心分離を３０分間行った後、単核細胞層が境界から取り出され、ＨＢＳＳに懸濁される。その後、細胞が１５００×ｇで１５分間遠心分離され、完全培地（ＭＥＭ、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含まないα培地；ＧＩＢＣＯ）、ＭＳＣの迅速成長のために選択されたロットに由来する２０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ）、１００ユニット／ｍｌのペニシリン（ＧＩＢＣＯ）、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）、および２ｍＭのＬ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ）に再懸濁される。再懸濁された細胞が１０ｃｍの培養ディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｇｌａｓｓ  Ｗｏｒｋｓ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）において約２５ｍｌの培地に置床され、５％の加湿ＣＯ２とともに３７℃でインキュベーションされる。培養で２４時間の後、非接着性細胞が捨てられ、接着性細胞がリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）により２回徹底的に洗浄される。培地が、３日毎または４日毎に約１４日間、新鮮な完全培地により取り換えられる。その後、接着性細胞が、０．２５％のトリプシンおよび１ｍＭのＥＤＴＡ（トリプシン／ＥＤＴＡ、ＧＩＢＣＯ）を３７℃で５分間用いて集められ、６ｃｍのプレートに再置床され、さらに１４日間培養される。その後、細胞がトリプシン処理され、細胞計数デバイス、例えば、血球計（Ｈａｕｓｓｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈｏｒｓｈａｍ、ＰＡ）などを使用して計数される。培養細胞が遠心分離によって回収され、５％ＤＭＳＯおよび３０％ＦＣＳとともに、１ｍｌあたり１〜２×１０６細胞の濃度で再懸濁される。それぞれが約１ｍｌのアリコートが緩速凍結され、液体窒素において貯蔵される。
【００７２】
脂肪組織由来のＭＳＣを脂肪吸引によって得ることができ、また、単核細胞を、脂肪および脂肪細胞を除くことによって手作業で、またはＣｅｌｕｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｙｔｏｒｉ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）をＭＳＣの調製のために上記で記載されるのと同じ手順に従って使用して単離することができる。
【００７３】
１つの実施形態によれば、集団が（例えば、フラスコにおいて）ポリスチレンプラスチック表面に置床され、間葉系幹細胞が、非接着性細胞を除くことによって単離される。代替では、間葉系幹細胞が、間葉系幹細胞のマーカーを使用してＦＡＣＳによって単離される場合がある。
【００７４】
好ましくは、ＭＳＣは少なくとも５０％精製され、より好ましくは少なくとも７５％精製され、一層より好ましくは少なくとも９０％精製される。
【００７５】
間葉系幹細胞画分を拡大するために、凍結された細胞が３７℃で解凍され、完全培地により希釈され、ＤＭＳＯを除くために遠心分離によって回収される。細胞が完全培地に再懸濁され、約５０００細胞／ｃｍ２の濃度で置床される。培養で２４時間の後、非接着性細胞が除かれ、接着性細胞が、トリプシン／ＥＤＴＡを使用して集められ、狭くしたパスツールピペットに通すことによって解離させられ、好ましくは、約１．５〜約３．０細胞／ｃｍ２の密度で再置床される。これらの条件のもとで、ＭＳＣ培養物は約５０回の集団倍加にわたって成長することができ、約２０００倍にわたって拡大させることができる［Ｃｏｌｔｅｒ  ＤＣ他、Ｒａｐｉｄ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｐｌａｓｔｉｃ−ａｄｈｅｒｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９７：３２１３〜３２１８、２０００］。
【００７６】
本発明のいくつかの実施形態によって利用されるＭＳＣ培養物には好ましくは、それらの形態学的特徴によって定義される３つの群の細胞、すなわち、小さい無顆粒細胞（これらは本明細書中下記ではＲＳ−１として示される）、小さい顆粒細胞（これらは本明細書中下記ではＲＳ−２として示される）、および大きい適度な顆粒細胞（これらは本明細書中下記では成熟ＭＳＣとして示される）が含まれる。培養におけるそのような細胞の存在および濃度を、例えば、免疫蛍光、インサイチューハイブリダイゼーションおよび活性アッセイを使用することにより、様々な細胞表面マーカーの存在の有無を特定することによってアッセイすることができる。
【００７７】
ＭＳＣが本発明のいくつかの実施形態の培養条件のもとで培養されるとき、ＭＳＣは、造血幹細胞マーカーであるＣＤ３４、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ４３およびＣＤ４５については陰性の染色を示す。小さい割合の細胞（１０％未満）がＣＤ３１および／またはＣＤ３８のマーカーについてかすかに陽性である。加えて、成熟ＭＳＣは、造血幹細胞マーカーであるＣＤ１１７（ｃ−Ｋｉｔ）についてかすかに陽性であり、骨形成ＭＳＣのマーカーであるＳｔｒｏ−１について中程度に陽性であり［Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｐ．Ｊ．＆Ｔｏｒｏｋ−Ｓｔｏｒｂ，Ｂ．（１９９１）、Ｂｌｏｏｄ、７８、５５６２］、かつ、胸腺細胞および末梢Ｔリンパ球のマーカーであるＣＤ９０（Ｔｈｙ−１）について陽性である。他方で、ＲＳ−１細胞はＣＤ１１７およびＳｔｒｏ１のマーカーについて陰性であり、かつ、ＣＤ９０のマーカーについてかすかに陽性であり、ＲＳ−２細胞はこれらのマーカーのすべてについて陰性である。
【００７８】
本明細書中で使用される場合、表現「脳疾患」は、神経変性障害および精神医学的障害を含む、中枢神経系の任意の障害、疾患または状態をも示す。
【００７９】
脳疾患または脳障害のさらなる代表的な例には、疼痛性障害、運動障害、解離性障害、気分障害、情動障害、神経変性疾患または神経変性障害および痙攣性障害が含まれるが、これらに限定されない。
【００８０】
そのような状態のより具体的な例には、パーキンソン病、ＡＬＳ、多発性硬化症、ハンチントン病、自己免疫性脳脊髄炎、糖尿病性神経障害、緑内障性（ｇｌａｕｃａｔｏｍｕｓ）神経障害、黄斑変性、動作時振戦および遅発性ジスキネジー、パニック、不安、うつ病、アルコール依存症、不眠症、躁病的行動、アルツハイマー病、てんかん、レット症候群ならびに自閉症が含まれるが、これらに限定されない。
【００８１】
特定の実施形態によれば、疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病またはレット症候群である。
【００８２】
１つの実施形態によれば、認定することは、ＭＳＣ集団が、対象の脳疾患を処置するための自己細胞置換療法のために好適であるかどうかを確認するためである。
【００８３】
別の実施形態によれば、認定することは、ＭＳＣ集団を特定の様式で遺伝的に改変することまたは分化させることが有益であるかどうかを確認するためである。
【００８４】
「細胞置換療法」は、本明細書中で使用される場合、未分化のまたは分化させた間葉系幹細胞を疾患の処置のために患者に移植することを示す。脳疾患を処置するために、細胞は典型的には、当該対象の脳に移植される。
【００８５】
細胞置換療法が、埋め込み部位に性質が依存する様々な移植取り組みを使用して行われる場合がある。
【００８６】
特定の実施形態によれば、細胞が鼻腔内投与される。
【００８７】
「移植」、「細胞置換」または「移植する」の用語または表現は本明細書中では交換可能に使用され、本発明の細胞を標的組織に導入することを示す。上述のように、細胞はレシピエントに、あるいは、同種ドナー、半同種ドナーまたは異種ドナーに由来することができる。
【００８８】
細胞は全身的には循環に注入するか、クモ膜下腔内に投与するかまたは中枢神経系、脊髄もしくは脳室腔の中に移植するか、あるいは、硬膜下において宿主の脳の表面に移植することができる。成功する移植のための条件には、（ｉ）埋め込み物の生存性、（ｉｉ）移植部位における移植片の保持、および（ｉｉｉ）移植部位における最少量の病理学的反応が含まれる。様々な神経組織（例えば、胚性脳組織）を宿主の脳に移植するための様々な方法が、“Ｎｅｕｒａｌ  ｇｒａｆｔｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＣＮＳ”、ＢｊｏｒｋｌｕｎｄおよびＳｔｅｎｅｖｉ編（１９８５）；Ｆｒｅｅｄ他（２００１）；Ｏｌａｎｏｗ他（２００３）に記載されている。これらの手順には、実質内移植、すなわち、組織を移植時に脳の実質に注入するか、または置くことによって達成される、（脳外または実質外移植と比較されるような）宿主の脳の内部における実質内移植が含まれる。
【００８９】
実質内移植を、２つの取り組みを使用して行うことができる：（ｉ）細胞を宿主の脳の実質に注入すること、または（ｉｉ）宿主の脳の実質を露出させるために外科的手段によって腔を準備し、その後、移植片をこの腔の中に置くこと。両方の方法が、移植片と宿主脳組織との間における実質での設置を移植時にもたらし、また、ともに、移植片と宿主脳組織との間における解剖学的一体化を容易にする。移植片が宿主の脳の不可欠な部分となり、かつ、宿主の生涯にわたって生存することが要求されるならば、このことは重要である。
【００９０】
代替では、移植片が、室（例えば、脳室）に、あるいは、硬膜下に、すなわち、介在する軟膜またはクモ膜および軟膜によって宿主の脳の実質から隔てられる宿主の脳の表面に置かれる場合がある。脳室に移植することが、ドナー細胞の注入によって、または細胞を基体（例えば、３％コラーゲンなど）において成長させて、その後、移植片のずれを防止するために脳室内に埋め込まれることがある充実組織のプラグを形成することによって達成される場合がある。硬膜下移植のために、細胞が、隙間を硬膜に作製した後で脳の表面の周りに注入される場合がある。宿主の脳の選択された領域への注入が、ドリルで穴を開け、硬膜を突き通して、マイクロシリンジの針が挿入されることを可能にすることによって行われる場合がある。マイクロシリンジは好ましくは、定位フレームに取り付けられ、三次元定位座標が、針を脳または脊髄の所望される場所に設置するために選択される。細胞はまた、脳の被殻、基底核、海馬皮質、線条体、黒質または尾状領域に、同様にまた、脊髄に導入される場合がある。
【００９１】
細胞はまた、組織の健康な領域に移植される場合がある。場合により、損傷した組織区域の正確な場所が不明である場合があり、細胞が、健康な領域に気付かずに移植される場合がある。他の場合には、細胞を健康な領域に投与して、それにより、その領域に対する何らかのさらなる損傷を回避することが好ましい場合がある。どのような場合であれ、移植後、細胞は好ましくは、損傷区域に遊走する。
【００９２】
移植のために、細胞懸濁物がシリンジに引き入れられ、麻酔された移植レシピエントに投与される。複数の注入が、この手順を使用して行われる場合がある。
【００９３】
細胞を、脳または脊髄における任意の所定の部位に移植することをこのように可能にする細胞懸濁物手順は、比較的非外傷性であり、複数の移植を、同じ細胞懸濁物を使用していくつかの異なる部位または同じ部位において同時に可能にし、また、異なる解剖学的領域から得られる細胞の混合物を可能にする。複数の移植片が、細胞タイプの混合物、および／または細胞に挿入される導入遺伝子の混合物からなる場合がある。好ましくは、およそ１０４〜およそ１０９個の細胞が移植片あたり導入される。細胞は、冒された区域への標的化の機会を最大にするために、異なる場所に同時に投与することができる（例えば、クモ膜下腔内および静脈内の組み合わされた投与など）。
【００９４】
脊髄移植に好ましい場合がある腔内への移植のために、組織が中枢神経系（ＣＮＳ）の外側表面に近い領域から取り出され、例えば、Ｓｔｅｎｅｖｉ他（Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ、１１４：１〜２０、１９７６）によって記載されるように、脳の上にある骨を除き、出血をゲルフォームなどの材料により止めることによって移植腔を形成する。吸引が、腔を作り出すために使用される場合がある。その後、移植片が腔に置かれる。２つ以上の移植片が、細胞または充実組織埋め込み物の注入を使用して同じ腔に置かれる場合がある。好ましくは、埋め込み部位が、処置されるＣＮＳ障害によって決定される。脱髄したＭＳ病変が、ＭＳの効果的な処置が適切な標的部位への細胞の遊走能により依拠し得るように、ＣＮＳの至るところ、多数の場所にわたって分布する。
【００９５】
上述のように、本発明のこの局面の方法は、対象に起源を有する間葉系幹細胞の集団を第１の系譜特異的細胞に向かってエクスビボ分化させること（ただし、第１の系譜特異的細胞は脳疾患に関連する）を含む。
【００９６】
用語「系譜特異的細胞」は、もはや多能性ではなく、特定の細胞タイプに向かって拘束される細胞を示す。系譜特異的細胞は始原体細胞（例えば、神経幹細胞）または完全に分化した細胞（例えば、運動ニューロン）である場合がある。
【００９７】
本発明によって意図される系譜特異的細胞には、運動ニューロン、神経幹細胞、骨格筋細胞、ドーパミン分泌ニューロン、コリン作動性ニューロン、星状膠細胞、乏突起膠細胞およびそれらの始原体が含まれる。
【００９８】
ＭＳＣが分化させられる特定の系譜特異的細胞の選択は、要求される認定に依存している。
【００９９】
したがって、例えば、ＭＳＣが、脳疾患の自己処置のために好適であるとして認定されるならば、系譜特異的細胞は、ＭＳＣが処置のために意図される脳疾患に従って選択される。
【０１００】
したがって、例えば、疾患がＡＬＳである場合、意図される系譜特異的細胞には、星状膠細胞、骨格筋細胞、および運動ニューロンの始原体または完全に分化した細胞が含まれる。
【０１０１】
したがって、例えば、疾患がパーキンソン病である場合、意図される系譜特異的細胞には、ドーパミン作動性ニューロン、星状膠細胞、および乏突起膠細胞の始原体または完全に分化した細胞が含まれる。
【０１０２】
したがって、例えば、疾患がアルツハイマー病である場合、意図される系譜特異的細胞には、ニューロン、および星状膠細胞の始原体または完全に分化した細胞が含まれる。
【０１０３】
したがって、例えば、疾患がレット症候群である場合、意図される系譜特異的細胞には、ニューロン、および星状膠細胞の始原体または完全に分化した細胞が含まれる。
【０１０４】
ＭＳＣを上述の系譜特異的細胞に向かって分化させる様々な方法が当技術分野では知られており、これらの方法は遺伝子改変および／または分化培地における培養を含む。
【０１０５】
遺伝子改変
ＭＳＣが、その分化を誘導するタンパク質を発現するように遺伝子改変される場合がある。代替では、ＭＳＣが、分化を誘導するために特定のタンパク質作用因またはポリヌクレオチド作用因の発現をダウンレギュレーションするポリヌクレオチド作用因（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡなど）を発現するように遺伝子改変される場合がある。
【０１０６】
そのような作用因を間葉系幹細胞において発現させるために、この作用因をコードするポリヌクレオチド配列が好ましくは、間葉系幹細胞での発現のために好適である核酸構築物に連結される。そのような核酸構築物は、細胞におけるポリヌクレオチド配列の転写を構成的様式または誘導可能な様式で行わせるためのプロモーター配列を含む。
【０１０７】
本発明のいくつかの実施形態との使用のために好適である構成的プロモーターが、ほとんどの環境条件およびほとんどのタイプの細胞のもとで活性であるプロモーター配列であり、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）などである。本発明のいくつかの実施形態との使用のために好適である誘導可能なプロモーターには、例えば、テトラサイクリン誘導プロモーター（Ｚａｂａｌａ  Ｍ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００４、６４（８）：２７９９〜８０４）が含まれる。
【０１０８】
真核生物プロモーターは典型的には、２つのタイプの認識配列、すなわち、ＴＡＴＡボックスおよび上流プロモーターエレメントを含有する。ＴＡＴＡボックスは、転写開始部位から２５塩基対〜３０塩基対上流に位置しており、ＲＮＡポリメラーゼにＲＮＡ合成を開始させることに関与すると考えられている。もう一方の上流プロモーターエレメントにより、転写が開始される速度が決定される。
【０１０９】
好ましくは、本発明のいくつかの実施形態の核酸構築物によって利用されるプロモーターは、形質転換された特定の細胞集団において、すなわち、間葉系幹細胞において活性である。
【０１１０】
エンハンサーエレメントは、連結されている同種または異種プロモーターから転写を１０００倍にまで刺激することができる。エンハンサーは、転写開始部位の下流側または上流側に置かれたときに活性である。ウイルスに由来する多くのエンハンサーエレメントは幅広い宿主範囲を有しており、様々な組織において活性である。例えば、ＳＶ４０の初期遺伝子エンハンサーが多くの細胞タイプのために好適である。本発明のいくつかの実施形態のために好適である他のエンハンサー／プロモーター組合せには、ポリオーマウイルス、ヒトまたはマウスのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、様々なレトロウイルス（例えば、マウス白血病ウイルス、マウス肉腫ウイルスまたはラウス肉腫ウイルス、およびＨＩＶなど）から得られる長末端反復に由来する組合せが含まれる。Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ  ａｎｄ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８３）を参照のこと（これは参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【０１１１】
発現ベクターの構築において、プロモーターは好ましくは、異種の転写開始部位からの距離がその天然の環境における転写開始部位からの距離とおよそ同じで配置される。しかしながら、当技術分野では公知のように、この距離におけるいくらかの変動が、プロモーター機能を失うことなく受け入れられ得る。
【０１１２】
既に記載されたエレメントに加えて、本発明のいくつかの実施形態の発現ベクターは典型的には、クローン化された核酸の発現レベルを増大させるために、または組換えＤＮＡを有する細胞の特定を容易にするために意図される他の特化したエレメントを含有する場合がある。例えば、いくつかの動物ウイルスは、許容細胞タイプにおけるウイルスゲノムの染色体外での複製を促進させるＤＮＡ配列を含有する。これらのウイルスレプリコンを有するプラスミドは、適切な因子が、プラスミドで運ばれる遺伝子または宿主細胞のゲノムとともに運ばれる遺伝子のどちらかによって提供される限り、エピソームとして複製される。
【０１１３】
ベクターは真核生物レプリコンを含む場合があり、または含まない場合がある。真核生物レプリコンが存在するならば、ベクターは、適切な選択マーカーを使用して真核生物細胞において増幅可能である。ベクターが真核生物レプリコンを含まないならば、エピソーム増幅を行うことができない。代わりに、組換えＤＮＡが、操作された細胞のゲノムに一体化し、この場合、その細胞において、プロモーターにより、所望される核酸の発現が導かれる。
【０１１４】
哺乳動物発現ベクターの例には、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１（これらはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能である）、ｐＣＩ（これはＰｒｏｍｅｇａから入手可能である）、ｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ−ＲＳＶおよびｐＢＫ−ＣＭＶ（これらはＳｔｒａｔｅｇｅｎｅから入手可能である）、ｐＴＲＥＳ（これはＣｌｏｎｔｅｃｈから入手可能である）、ならびに、それらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１５】
真核生物ウイルス（例えば、レトロウイルスなど）から得られる調節エレメントを含有する発現ベクターもまた使用することができる。ＳＶ４０系ベクターには、ｐＳＶＴ７およびｐＭＴ２が含まれる。ウシパピローマウイルスに由来するベクターには、ｐＢＶ−１ＭＴＨＡが含まれ、エプスタイン・バールウイルスに由来するベクターには、ｐＨＥＢＯおよびｐ２Ｏ５が含まれる。他の例示的なベクターには、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、および任意の、真核生物細胞における発現のために効果的であることが示されるＳＶ−４０初期プロモーター、ＳＶ−４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳ガンウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーターまたは他のプロモーターの指示のもとでのタンパク質の発現を可能にする他のベクターが含まれる。
【０１１６】
上記で記載されるように、ウイルスは、多くの場合には宿主の防御機構を逃れるために進化してきた非常に特殊化された感染性作用因である。典型的には、ウイルスは特定の細胞タイプにおいて感染し、伝播する。ウイルスベクターの標的化特異性では、その天然の特異性が、所定の細胞タイプを特異的に標的とし、かつ、それにより、組換え遺伝子を感染細胞に導入するために利用される。したがって、本発明のいくつかの実施形態によって使用されるベクターのタイプは、形質転換された細胞タイプに依存するであろう。好適なベクターを形質転換された細胞タイプに従って選択できることは、十分に当業者の能力の範囲内であり、そのようなものとして、選択での考慮の一般的記載は本明細書中には提供されない。例えば、骨髄細胞を、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）を使用して標的化することができ、また、腎臓細胞が、Ｌｉａｎｇ  ＣＹ他（２００４）（Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ、１４９：５１〜６０）に記載されるようなバキュロウイルスのオートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）に存在する異種プロモーターを使用して標的化される場合がある。
【０１１７】
１つの実施形態によれば、レンチウイルスベクターが、間葉系幹細胞をトランスフェクションするために使用される。
【０１１８】
様々な方法を、本発明のいくつかの実施形態の発現ベクターを間葉系幹細胞に導入するために使用することができる。そのような方法が、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９、１９９２）、Ａｕｓｕｂｅｌ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄ．（１９８９）、Ｃｈａｎｇ他、Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈ．（１９９５）、Ｖｅｇａ他、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈ．（１９９５）、Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｍａｓｓ．（１９８８）、およびＧｉｌｂｏａ他［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４（６）：５０４〜５１２、１９８６］において一般的に記載されており、また、そのような方法には、例えば、組換えウイルスベクターを用いた安定的または一過性のトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションおよび感染が含まれる。加えて、陽性−陰性の選抜方法については米国特許第５４６４７６４号および同第５４８７９９２号を参照のこと。
【０１１９】
ウイルス感染による核酸の導入は、より大きいトランスフェクション効率をウイルスの感染性のために得ることができるので、他の方法（例えば、リポフェクションおよびエレクトロポレーションなど）を上回るいくつかの利点を提供する。
【０１２０】
非ウイルス性である他のベクター、例えば、カチオン性脂質、ポリリシンおよびデンドリマーなどを使用することができる。ナノ粒子もまた意図される。
【０１２１】
組込みを伴わないトランスフェクションの他の様式には、小環状ＤＮＡベクターの使用、またはゲノムから後で除くことができる遺伝子のトランスフェクションを可能にするＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの使用が含まれる。
【０１２２】
特定の実施形態によれば、間葉系幹細胞は、分化を誘導するために、ｍｉＲＮＡ（または一群のｍｉＲＮＡ）を発現するように遺伝子改変される。代替において、または加えて、間葉系幹細胞は、分化を誘導するために、ｍｉＲＮＡ（または一群のｍｉＲＮＡ）をダウンレギュレーションするポリヌクレオチド作用因を発現するように遺伝子改変される。
【０１２３】
用語「ミクロＲＮＡ」、用語「ｍｉＲＮＡ」および用語「ｍｉＲ」は同義的であり、遺伝子発現を調節する、長さが約１９〜２８ヌクレオチドである非コードの一本鎖ＲＮＡ分子の集まりを示す。様々なｍｉＲＮＡが広範囲の生物において見出され、発達、恒常性および疾患原因において役割を果たすことが示されている。
【０１２４】
下記はｍｉＲＮＡ活性の機構の簡単な記載である。
【０１２５】
ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子が転写され、これにより、プリ−ｍｉＲＮＡとして公知のｍｉＲＮＡ前駆体の産生がもたらされる。プリ−ｍｉＲＮＡは典型的には、多数のプリ−ｍｉＲＮＡを含む多シストロン性ＲＮＡの一部である。プリ−ｍｉＲＮＡは、ステム／ループを有するヘアピンを形成する場合がある。ステムはミスマッチの塩基を含む場合がある。
【０１２６】
プリ−ｍｉＲＮＡのヘアピン構造が、ＲＮａｓｅＩＩＩエンドヌクレアーゼであるＤｒｏｓｈａによって認識される。Ｄｒｏｓｈａは典型的には、プリ−ｍｉＲＮＡにおける末端のループを認識し、およそ２回のらせん状ターンをステムに切断して、プレ−ｍｉＲＮＡとして公知の６０〜７０ｎｔの前駆体を生じさせる。Ｄｒｏｓｈａは、ＲＮａｓｅＩＩＩエンドヌクレアーゼに典型的な互い違いの切れ目を伴ってプリ−ｍｉＲＮＡを切断し、これにより、５’ホスファートおよび約２ヌクレオチドの３’突出を有するプレ−ｍｉＲＮＡのステム・ループをもたらす。ステムのおよそ１回のらせん状ターン（約１０ヌクレオチド）がＤｒｏｓｈａ切断部位を越えて伸びることが、効率的なプロセシングのために必須であることが推定されている。その後、プレ−ｍｉＲＮＡが、Ｒａｎ−ＧＴＰおよび輸出受容体エクスポーチン−５によって核から細胞質に能動輸送される。
【０１２７】
その後、プレ−ｍｉＲＮＡの二本鎖ステムがＤｉｃｅｒによって認識される（Ｄｉｃｅｒもまた、ＲＮａｓｅＩＩＩエンドヌクレアーゼである）。Ｄｉｃｅｒはまた、ステム・ループの塩基において５’ホスファートおよび３’突出を認識する場合がある。その場合、Ｄｉｃｅｒは末端ループをステム・ループの塩基から２回のらせん状ターン離れて切断し、これにより、さらなる５’ホスファートおよび約２ヌクレオチドの３’突出を残す。生じたｓｉＲＮＡ様二重鎖はミスマッチを含む場合があり、成熟ｍｉＲＮＡと、ｍｉＲＮＡ＊として公知の類似サイズの断片とを含む。ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ＊が、プリ−ｍｉＲＮＡおよびプレ−ｍｉＲＮＡの相対するアームに由来する場合がある。ｍｉＲＮＡ＊配列が、典型的にはｍｉＲＮＡよりも低い頻度ではあるが、クローン化されたｍｉＲＮＡのライブラリーにおいて見出される場合がある。
【０１２８】
最初はｍｉＲＮＡ＊との二本鎖の種として存在するにもかかわらず、ｍｉＲＮＡは最終的には、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として公知のリボ核タンパク質複合体の中に一本鎖ＲＮＡとして取り込まれる。様々なタンパク質がＲＩＳＣを形成することができ、このことは、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊二重鎖に対する特異性、標的遺伝子の結合部位、ｍｉＲＮＡの活性（抑制するか、または活性化する）、およびｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊二重鎖のどの鎖がＲＩＳＣに入るかにおける変動性をもたらすことができる。
【０１２９】
ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊二重鎖のｍｉＲＮＡ鎖がＲＩＳＣに入るとき、ｍｉＲＮＡ＊は除かれ、分解される。ＲＩＳＣに入るｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊二重鎖の鎖は、５’末端がそれほど強固に対形成しない方の鎖である。ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊の両末端がほぼ同等な５’対形成を有する場合には、ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ＊の両方が遺伝子サイレンシング活性を有する場合がある。
【０１３０】
ＲＩＳＣは、標的核酸を、ｍｉＲＮＡとｍＲＮＡとの間における大きいレベルの相補性に基づいて、とりわけ、ｍｉＲＮＡの２〜７番目のヌクレオチドによる相補性に基づいて特定する。
【０１３１】
数多くの研究が、翻訳の効率的な阻害を達成するための、ｍｉＲＮＡとそのｍＲＮＡ標的との間における塩基対形成要件を調べている（これらがＢａｒｔｅｌ（２００４、Ｃｅｌｌ、１１６−２８１）によって総説される）。哺乳動物細胞では、ｍｉＲＮＡの最初の８ヌクレオチドが重要であり得る（Ｄｏｅｎｃｈ＆Ｓｈａｒｐ、２００４、ＧｅｎｅｓＤｅｖ、２００４−５０４）。しかしながら、ミクロＲＮＡの他の部分もまた、ｍＲＮＡ結合に関与する場合がある。そのうえ、３’における十分な塩基対形成は５’における不十分な対形成を補うことができる（Ｂｒｅｎｎｅｃｋｅ他、２００５、ＰＬｏＳ、３−ｅ８５）。コンピューター計算研究では、ゲノム全体に対するｍｉＲＮＡ結合が分析された場合、標的結合におけるｍｉＲＮＡの５’での２〜７番目の塩基に特異的な役割が示唆されており、しかし、通常では「Ａ」であることが見出される最初のヌクレオチドの役割もまた認められた（Ｌｅｗｉｓ他、２００５、Ｃｅｌｌ、１２０−１５）。同様に、１〜７番目のヌクレオチドまたは２〜８番目のヌクレオチドが、Ｋｒｅｋ他（２００５、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ、３７−４９５）によって、標的を特定し、検証するために使用された。
【０１３２】
ｍＲＮＡにおける標的部位が、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲまたはコード領域に存在する場合がある。興味深いことに、多数のｍｉＲＮＡが、同じ部位または多数の部位を認識することによって同じｍＲＮＡ標的を調節する場合がある。多数のｍｉＲＮＡ結合部位がほとんどの遺伝子的に特定された標的に存在することは、多数のＲＩＳＣの協同作用により、最も効率的な翻訳阻害がもたらされることを示し得る。
【０１３３】
ｍｉＲＮＡが、ＲＩＳＣに、遺伝子発現を２つの機構、すなわち、ｍＲＮＡ切断または翻訳抑制のどちらかによってダウンレギュレーションさせる場合がある。ｍＲＮＡが、ある特定の程度の相補性をｍｉＲＮＡに対して有するならば、ｍｉＲＮＡにより、ｍＲＮＡの切断が規定される場合がある。ｍｉＲＮＡが切断を導くとき、切れ目は典型的には、ｍｉＲＮＡの１０番目および１１番目の残基に対するヌクレオチド対形成の間である。代替では、ｍｉＲＮＡが、必要な程度の相補性をｍｉＲＮＡに対して有していないならば、ｍｉＲＮＡにより、翻訳が抑制される場合がある。翻訳抑制が動物においてより多く見られる場合がある。これは、動物は、より低い程度の相補性をｍｉＲＮＡと結合部位との間に有する場合があるからである。
【０１３４】
どのｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ＊の対の５’末端および３’末端にも、変動性が存在し得ることに留意しなければならない。この変動性は、切断部位に関するＤｒｏｓｈａおよびＤｉｃｅｒの酵素プロセシングにおける変動性に起因する場合がある。ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ＊の５’末端および３’末端における変動性はまた、プリ−ｍｉＲＮＡおよびプレ−ｍｉＲＮＡのステム構造におけるミスマッチに起因する場合がある。ステム鎖のミスマッチにより、異なるヘアピン構造の集団がもたらされる場合がある。ステム構造における変動性はまた、ＤｒｏｓｈａおよびＤｉｃｅｒによる切断の生成物における変動性をもたらす場合がある。
【０１３５】
用語「ミクロＲＮＡ模倣体」は、ＲＮＡｉ経路に入り、遺伝子発現を調節することができる合成された非コードＲＮＡを示す。ｍｉＲＮＡ模倣体は内因性ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の機能を模倣しており、成熟型二本鎖分子または模倣体前駆体（例えば、またはプレ−ｍｉＲＮＡ）として設計することができる。ｍｉＲＮＡ模倣体は、修飾された、または修飾されていないＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドまたは代替となり得る核酸化学（例えば、ＬＮＡまたは２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ））から構成され得る。他の修飾体が本明細書中下記に記載される。成熟型二本鎖ｍｉＲＮＡ模倣体については、二重鎖領域の長さが、１３〜３３ヌクレオチドの間、１８２４ヌクレオチドの間、または２１〜２３ヌクレオチドの間で変化し得る。ｍｉＲＮＡはまた、合計で少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０個のヌクレオチドを含む場合がある。ｍｉＲＮＡの配列はプレ−ｍｉＲＮＡの最初の１３〜３３ヌクレオチドである場合がある。ｍｉＲＮＡの配列はまた、プレ−ｍｉＲＮＡの最後の１３ヌクレオチド〜３３ヌクレオチドである場合がある。
【０１３６】
ｍｉＲＮＡを発現させるために間葉系幹細胞を遺伝子改変することが下記のいくつかの方法で実行される場合があることが、本明細書中に提供される説明から理解されるであろう：
１．間葉系幹細胞を成熟型ｍｉＲＮＡ（または本明細書中下記で記載されるように改変形態）により一過性にトランスフェクションすること。本発明の教示に従って設計されるｍｉＲＮＡは、酵素的合成および固相合成の両方を含めて、当技術分野で公知の任意のオリゴヌクレオチド合成法に従って作製することができる。固相合成を実行するための様々な設備および試薬が、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されている。そのような合成のための任意の他の手段もまた用いることができる；オリゴヌクレオチドの実際の合成は十分に当業者の能力の範囲内であり、固相化学（例えば、シアノエチルホスホルアミダイト）、その後、脱保護、脱塩および精製（例えば、自動トリチル・オン法またはＨＰＬＣによる精製）を利用して、例えば、下記において詳しく記載されるような確立された方法論により達成することができる：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．およびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．（２００１）、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．他編（１９９４、１９８９）、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”、第Ｉ巻〜第ＩＩＩ巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ；Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８８）、“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；およびＧａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）、“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”。
２．間葉系幹細胞を、成熟型ｍｉＲＮＡをコードする発現ベクターにより安定的または一過性にトランスフェクションすること。
３．間葉系幹細胞を、プレ−ｍｉＲＮＡをコードする発現ベクターにより安定的または一過性にトランスフェクションすること。プレ−ｍｉＲＮＡ配列は、４５〜９０ヌクレオチド、６０〜８０ヌクレオチド、または６０〜７０ヌクレオチドを含む場合がある。プレ−ｍｉＲＮＡの配列は、本明細書中に示されるようなｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ＊を含む場合がある。プレ−ｍｉＲＮＡの配列はまた、プリ−ｍｉＲＮＡの５’末端および３’末端から０〜１６０個のヌクレオチドを除外するプリ−ｍｉＲＮＡの配列である場合がある。
４．間葉系幹細胞を、プリ−ｍｉＲＮＡをコードする発現ベクターにより安定的または一過性にトランスフェクションすること。プリ−ｍｉＲＮＡ配列は、４５〜３００００ヌクレオチド、５０〜２５０００ヌクレオチド、１００〜２００００ヌクレオチド、１０００〜１５００ヌクレオチド、または８０〜１００ヌクレオチドを含む場合がある。プリ−ｍｉＲＮＡの配列は、本明細書中に示されるようにプレ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ＊、ならびに、それらの変化体を含む場合がある。ｍｉＲＮＡ模倣体の調製を化学的合成法によって、または、組換え法によって行うことができる。
【０１３７】
分化培地における培養：
ＭＳＣを分化作用因と接触させることを、例えば、分化作用因を、当該作用因が細胞と直接に接触しているように対象由来の細胞に加えることを含む任意のインビトロ条件のもとで行うことができる。本発明のいくつかの実施形態によれば、対象の細胞が分化作用因とともにインキュベーションされる。細胞をインキュベーションするために使用される条件は、作用因が、分化を促進させる細胞変化（例えば、特異的な遺伝子の転写速度および／または翻訳速度における変化など）を誘導することを可能にする期間／細胞の濃度／作用因の濃度／細胞と作用因との比率などについて選択される。
【０１３８】
典型的には、培地は、特定の系譜特異的細胞の分化を促進させる増殖因子および／またはサイトカインを含む。
【０１３９】
分化用培地の例には、Ｇ５、神経基礎培地、ＤＭＥＭまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＯｐｔｉＭＥＭ（商標）、あるいは、系譜特異的細胞の成長を支援する他の任意の培地が含まれる。
【０１４０】
分化作用因の例には、ヒトニューレグリン１−β１、Ｎ２補充物、ＩＢＭＸ、ｃＡＭＰ、神経栄養因子（例えば、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＧＤＮＦ、ＮＴＮ、ＮＴ３またはＬＩＦ）、ホルモン、増殖因子（例えば、ＧＧＦ２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−α、ＦＧＦ（ＦＧＦ−８、ＦＧＦ４およびｂＦＧＦを含む）、ＥＧＦ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ））、ビタミン、ホルモン（例えば、インスリン、プロゲステロン）および他の因子（例えば、ソニックヘッジホッグ、骨形態形成タンパク質、フォルスコリン、レチノイン酸、アスコルビン酸、プトレシン、セレンおよびトランスフェリンなど）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４１】
下記は、系譜特異的細胞を作製するために使用され得る例示的な分化プロトコルのまとめである。ＭＳＣ分化のためのさらにより多くのプロトコルが当技術分野では公知であり、本発明はすべてのそのようなプロトコルを意図することが理解されるであろう。
【０１４２】
星状膠細胞様細胞：
本発明者らは、その星状膠細胞分化を特定の一組のｍｉＲＮＡのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションによって誘導するためにＭＳＣの遺伝子改変を意図する。
【０１４３】
したがって、１つの実施形態によれば、星状膠細胞表現型に向かう分化は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）において、ｍｉＲ−１８，ｍｉＲ−１７−５ｐ，ｍｉＲ−１４１，ｍｉＲ−３０２ｂ，ｍｉＲ−２０ｂ，ｍｉＲ−１０１，ｍｉＲ−１２６，ｍｉＲ−１４６ａ，ｍｉＲ−１４６ｂ，ｍｉＲ−３ａ，ｍｉＲ−２６，ｍｉＲ−２９，ｍｉＲ−１３２，ｍｉＲ−９２ａｐ，ｍｉＲ−２１，ｍｉＲ−２６ａ，ｍｉＲ−１８ａ，ｍｉＲ−１２４，ｍｉＲ−９９ａ，ｍｉＲ−３０ｃ，ｍｉＲ−３０１ａ，ｍｉＲ−１４５−５０，ｍｉＲ−１４３−３ｐ，ｍｉＲ−３７３，ｍｉＲ−２０ｂ，ｍｉＲ−２９ｃ，ｍｉＲ−２９ｂ，ｍｉＲ−１４３，ｌｅｔ−７ｇ，ｌｅｔ−７ａ，ｌｅｔ−７ｂ，ｍｉＲ−９８，ｍｉＲ−３０ａ＊，ｍｉＲ−１７，ｍｉＲ−１，ｍｉＲ−１９２，ｍｉＲ−１５５，ｍｉＲ−５１６−ａｐ，ｍｉＲ−３１，ｍｉＲ−１８１ａ，ｍｉＲ−１８１ｂ，ｍｉＲ−１８１ｃ，ｍｉＲ−３４−ｃ，ｍｉＲ−３４ｂ＊，ｍｉＲ−１０３ａ，ｍｉＲ−２１０，ｍｉＲ−１６，ｍｉＲ−３０ａ，ｍｉＲ−３１，ｍｉＲ−２２２，ｍｉＲ−１７，ｍｉＲ−１７＊，ｍｉＲ−２００ｂ，ｍｉＲ−２００ｃ，ｍｉＲ−１２８，ｍｉＲ−５０３，ｍｉＲ−４２４，ｍｉＲ−１９５，ｍｉＲ−１２５６，ｍｉＲ−２０３ａ，ｍｉＲ−１９９，ｍｉＲ−９３，ｍｉＲ−９８，ｍｉＲ−１２５−ａ，ｍｉＲ−１３３ａ，ｍｉＲ−１３３ｂ，ｍｉＲ−１２６，ｍｉＲ−１９４，ｍｉＲ−３４６，ｍｉＲ−１５ｂ，ｍｉＲ−３３８−３ｐ，ｍｉＲ−３７３，ｍｉＲ−２０５，ｍｉＲ−２１０，ｍｉＲ−１２５，ｍｉＲ−１２２６，ｍｉＲ−７０８，ｍｉＲ−４４９，ｍｉＲ−４２２，ｍｉＲ−３４０，ｍｉＲ−６０５，ｍｉＲ−５２２，ｍｉＲ−６６３，ｍｉＲ−１３０ａ，ｍｉＲ−１３０ｂ，ｍｉＲ−９４２，ｍｉＲ−５７２，ｍｉＲ−５２０，ｍｉＲ−６３９，ｍｉＲ−６５４，ｍｉＲ−５１９，ｍｉｒ−２０２，ｍｉｒ−７６７−５ｐ，ｍｉｒ−２９ａ，ｍｉｒ−２９ｂ，ｍｉｒ−２９ｃ，ｌｅｔ−７ａ，ｌｅｔ−７ｂ，ｌｅｔ−７ｃ，ｌｅｔ−７ｄ，ｌｅｔ−７ｅ，ｌｅｔ−７ｆ，ｌｅｔ−７ｇ，ｌｅｔ−７ｉ，ｍｉｒ−４４５８，ｍｉｒ−４５００，ｍｉｒ−９８，ｍｉｒ−１４８ａ，ｍｉｒ−１４８ｂ，ｍｉｒ−１５２，ｍｉｒ−４６５８，ｍｉｒ−３６６２，ｍｉｒ−２５，ｍｉｒ−３２，ｍｉｒ−３６３，ｍｉｒ−３６７，ｍｉｒ−９２ａ，ｍｉｒ−９２ｂ，ｍｉｒ−５２０ｄ−５ｐ，ｍｉｒ−５２４−５ｐ，ｍｉｒ−４７２４−３ｐ，ｍｉｒ−１２９４，ｍｉｒ−１４３，ｍｉｒ−４７７０，ｍｉｒ−３６５９，ｍｉｒ−１４５，ｍｉｒ−３１６３，ｍｉｒ−１８１ａ，ｍｉｒ−１８１ｂ，ｍｉｒ−１８１ｃ，ｍｉｒ−１８１ｄ，ｍｉｒ−４２６２，ｍｉｒ−４２７９，ｍｉｒ−１４４，ｍｉｒ−６４２ｂ，ｍｉｒ−４７４２−３ｐ，ｍｉｒ−３１７７−５ｐ，ｍｉｒ−６５６，ｍｉｒ−３１２１−３ｐ，ｍｉｒ−１０６ａ，ｍｉｒ−１０６ｂ，ｍｉｒ−１７，ｍｉｒ−２０ａ，ｍｉｒ−２０ｂ，ｍｉｒ−５１９ｄ，ｍｉｒ−９３，ｍｉｒ−１２９７，ｍｉｒ−２６ａ，ｍｉｒ−２６ｂ，ｍｉｒ−４４６５，ｍｉｒ−３２６，ｍｉｒ−３３０−５ｐ，ｍｉｒ−３９２７，ｍｉｒ−２１１３，ｍｉｒ−３７２，ｍｉｒ−３７３，ｍｉｒ−５２０ａ−３ｐ，ｍｉｒ−５２０ｂ，ｍｉｒ−５２０ｃ−３ｐ，ｍｉｒ−５２０ｄ−３ｐ，ｍｉｒ−５２０ｅ，ｍｉｒ−１９９ａ−３ｐ，ｍｉｒ−１９９ｂ−３ｐおよびｍｉｒ−３１２９−５ｐからなる群から選択される少なくとも１種の外因性ｍｉＲＮＡのレベルをアップレギュレーションすることによって行われることができる。
【０１４４】
別の実施形態によれば、星状膠細胞表現型に向かう分化は、ｍｉ−Ｒ−１９３ｂ，ｍｉ−Ｒ−２２１，ｍｉ−Ｒ−１３５ａ，ｍｉ−Ｒ−１４９，ｍｉ−Ｒ−２２２，ｍｉ−Ｒ−１９９ａ，ｍｉ−Ｒ−３０２ａ，ｍｉ−Ｒ−３０２ｃ，ｍｉ−Ｒ−３０２ｄ，ｍｉ−Ｒ−３６９−３ｐ，ｍｉ−Ｒ−３７０，ｍｉ−Ｒ−ｌｅｔ７ａ，ｍｉ−Ｒ−ｌｅｔ７ｂ，ｍｉ−Ｒ−１０ｂ，ｍｉ−Ｒ−２３ａ，ｍｉ−Ｒ−２３ｂ  ａｎｄ  ｍｉ−Ｒ−３２，ｍｉＲ−２０４，ｍｉＲ−２２４，ｍｉＲ−６１６，ｍｉＲ−１２２，ｍｉＲ−２９９，ｍｉＲ−１００，ｍｉＲ−１３８，ｍｉＲ−１４０，ｍｉＲ−３７５，ｍｉＲ−２１７，ｍｉＲ−３０２，ｍｉＲ−３７２，ｍｉＲ−９６，ｍｉＲ−１２７−３ｐ，ｍｉＲ−４４９，ｍｉＲ−１３５ｂ，ｍｉＲ−１０１，ｍｉＲ−３２６，ｍｉＲ−３２４，ｍｉＲ−３３５，ｍｉＲ−１４，ｍｉＲ−１６，ｍｉｒ−４１０，ｍｉｒ−３１６３，ｍｉｒ−１４８ａ，ｍｉｒ−１４８ｂ，ｍｉｒ−１５２，ｍｉｒ−３１２１−３ｐ，ｍｉｒ−４９５，ｍｉｒ−２０３およびｍｉｒ−４６８０−３ｐからなる群から選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡの発現をダウンレギュレーションすることによって行われることができ、ダウンレギュレーションすることは、少なくとも１種のｍｉＲＮＡにハイブリダイズしてその機能を阻害する少なくとも１種のポリヌクレオチド作用因のレベルをアップレギュレーションすることによって行われる。
【０１４５】
特定の組合せもまた本発明者らによって意図され、これらには、ＭＳＣにおいて、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−１０１およびｍｉＲ−１４６ａのそれぞれをアップレギュレーションすること、ならびに、ｍｉＲ−９および外因性ｍｉＲ−２０ｂのそれぞれをアップレギュレーションすること（これらに限定されない）が含まれる。
【０１４６】
外因性ｍｉＲ−９、外因性ｍｉＲ−１４６および外因性ｍｉＲ−１０１のレベルをＭＳＣの集団においてアップレギュレーションし、かつ、ｍｉＲ−１０ｂおよびｍｉＲ−３０２の発現をＭＳＣの当該集団においてダウンレギュレーションすることが、本発明者らによって意図される別の組合せである。
【０１４７】
ＭＳＣを星状膠細胞の系譜に向かって分化させる方法が下記において開示される：Ｋｏｐｅｎ，Ｇ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  ＵＳＡ．９６（１９）：１０７１１−６，１９９９；Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒａｍｏｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ．１６４（２）：２４７−５６．２０００；Ｗｏｏｄｂｕｒｙ，Ｄ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ．６１（４）：３６４−７０，２０００；Ｗｏｏｄｂｕｒｙ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ．６９（６）：９０８−１７，２００２；Ｂｌａｃｋ，Ｉ．Ｂ．，Ｗｏｏｄｂｕｒｙ，Ｄ．Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍｏｌ  Ｄｉｓ．２７（３）：６３２−６，２００１；Ｋｏｈｙａｍａ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．６８（４−５）：２３５−４４，２００１；Ｌｅｖｙ，Ｙ．Ｓ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１（２）：１２１−３２，２００３；ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２００９００１０８９５；ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２０１２０００９６７３，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，５２８，２４；Ｒｅｙｅｓ  ａｎｄ  Ｖｅｒｆａｔｉｌｅ（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．９３８：２３１−２３５，２００１）ａｎｄ  Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：４７−４９，２００２）。これらの内容は本明細書中に参照として援用される。
【０１４８】
神経幹細胞：
本発明者らは、その神経幹細胞分化を特定の一組のｍｉＲＮＡのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションによって誘導するためにＭＳＣの遺伝子改変を意図する。
【０１４９】
したがって、１つの実施形態によれば、神経幹細胞表現型に向かう分化は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）において、ｍｉＲ３０２ｂ，ｍｉＲ−３７１，ｍｉＲ−１３４，ｍｉＲ−２１９，ｍｉＲ−１５４，ｍｉＲ−１５５，ｍｉＲ−３２，ｍｉＲ−３３，ｍｉＲ−１２６，ｍｉＲ−１２７，ｍｉＲ−１３２，ｍｉＲ−１３７，ｍｉＲ−５７２，ｍｉＲ−９３５ａ，ｍｉＲ−８９１ａ，ｍｉＲ−１２０２，ｍｉＲ−１２７５，ｌｅｔ−７ｃ，ｍｉＲ−６６５，ｍｉＲ−４２５８，ｍｉＲ−３６１−３ｐ，ｍｉＲ−３７４ａ−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−８９２ｂ  ｍｉＲ−３６１−５ｐ，ｍｉＲ−１８１ａ，ｍｉＲ−１６，ｍｉＲ−６３６，ｍｉＲ−４２８４，ｍｉＲ−１２０８，ｍｉＲ−１２７４ｂ，ｍｉＲ−３０ｃ−２−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−５０１−３ｐ，ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ，ｍｉＲ−３７８ｂ，ｍｉＲ−１２８７，ｍｉＲ−４２５−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−３２４−５ｐ，ｍｉＲ−３１７８，ｍｉＲ−２１９−１−３ｐ，ｍｉＲ−１９７，ｍｉＲ−１８１ｂ，ｍｉＲ−５００−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−１０６ｂ，ｍｉＲ−５０２−３ｐ，ｍｉＲ−３０ｃ，ｍｉＲ−１２７５，ｍｉＲ−４２２ａ，ｍｉＲ−９３，ｍｉＲ−１８１ｄ，ｍｉＲ−１３０７，ｍｉＲ−１３０１，ｍｉＲ−９９ａ，ｍｉＲ−５０５−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−１２０２，ｍｉＲ−１２，ｍｉＲ−５３２−５ｐ，ｍｉＲ−１９５，ｍｉＲ−５３２−３ｐ，ｍｉＲ−１０６ａ，ｍｉＲ−１７，ｍｉＲ−１２７１，ｍｉＲ−７６９−３ｐ，ｍｉＲ−１５ｂ，ｍｉＲ−３２４−３ｐ，ｍｉＲ−２０ａ，ｍｉＲ−５０１−５ｐ，ｍｉＲ−３３０−３ｐ，ｍｉＲ−８７４，ｍｉＲ−５００，ｍｉＲ−２５，ｍｉＲ−７６９−５ｐ，ｍｉＲ−１２５ｂ−２−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−１３０ｂ，ｍｉＲ−５０４，ｍｉＲ−１８１ａ−２−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−８８５−３ｐ，ｍｉＲ−１２４６，ｍｉＲ−９２ｂ，ｍｉＲ−３６２−５ｐ，ｍｉＲ−５７２，ｍｉＲ−４２７０，ｍｉＲ−３７８ｃ，ｍｉＲ−９３−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−１４９，ｍｉＲ−３６３，ｍｉＲ−１８ａ，ｍｉＲ−８９１ａ，ｍｉＲ−３４６，ｍｉＲ−４９７，ｍｉＲ−３７８，ｍｉＲ−１２３１，ｍｉＲ−１３９−５ｐ，ｍｉＲ−３１８０−３ｐ，ｍｉＲ−９３５およびｍｉＲ−２０ｂからなる群から選択される少なくとも１種の外因性ｍｉＲＮＡのレベルをアップレギュレーションすることによって行われることができる。
【０１５０】
したがって、別の実施形態によれば、神経幹細胞表現型に向かう分化は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）において、ｍｉＲ−１０ｂ，ｍｉＲ−１４２−３ｐ，ｍｉＲ−１３１ａ，ｍｉＲ−１２５ｂ，ｍｉＲ−１５３，ｍｉＲ−１８１ａ，ｍｉＲ−４０９−５ｐ，ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ，ｍｉＲ−４３１７，ｍｉＲ−４２８８，ｍｉＲ−１４５，ｍｉＲ−１４３，ｍｉＲ−２１４，ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ，ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ，ｍｉＲ−１９９ｂ−３ｐ，ｍｉＲ−１３８，ｍｉＲ−３１，ｍｉＲ−２１，ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ，ｍｉＲ−２２４−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−１９６ａ，ｍｉＲ−４８７ｂ，ｍｉＲ−４０９−５ｐ，ｍｉＲ−１９３ｂ−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−３７９，ｍｉＲ−２１−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−２７ａ−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−２７ａ，ｍｉＲ−４３１７，ｍｉＲ−１９３ｂ，ｍｉＲ−２７ｂ，ｍｉＲ−２２，５７４−３ｐ，ｍｉＲ−４２８８，ｍｉＲ−２３ａ，ｍｉＲ−２２１−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−２１１３，ｌｅｔ−７ｉ，ｍｉＲ−２４，ｍｉＲ−２３ｂ，ｍｉＲ−２９９−３ｐ，ｍｉＲ−５１８ｃ−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−２２１，ｍｉＲ−４３１−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−５２３，ｍｉＲ−４３１３，ｍｉＲ−５５９，ｍｉＲ−６１４，ｍｉＲ−６５３，ｍｉＲ−２２７８，ｍｉＲ−７６８−５ｐ，ｍｉＲ−１５４−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−３０２ａ−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−３１９９およびｍｉＲ−３１３７からなる群から選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡの発現をダウンレギュレーションすることによって行われることができ、ダウンレギュレーションすることは、少なくとも１種のｍｉＲＮＡにハイブリダイズしてその機能を阻害する少なくとも１種のポリヌクレオチド作用因のレベルをアップレギュレーションすることによって行われる。
【０１５１】
さらに別の実施形態によれば、神経幹細胞表現型に向かう分化が、外因性ｍｉＲ−１２４のレベルを間葉系幹細胞（ＭＳＣ）においてアップレギュレーションし、かつ、ｍｉＲ−ｌｅｔ−７のレベルを当該ＭＳＣにおいてダウンレギュレーションすることによって達成される場合がある。
【０１５２】
神経幹細胞をＭＳＣから作製する別の方法が、Ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｔｅｓｔｉｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ｖｅｓｐｉｄ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓタンパク質１（ＲＴＶＰ−１）の量および／または活性をダウンレギュレーションすることによるものである。
【０１５３】
神経幹細胞を作製するさらなる方法が当技術分野では知られており、本発明はすべてのそのような方法を意図する。
【０１５４】
運動ニューロン：
本発明者らは、その運動ニューロン分化を特定の一組のｍｉＲＮＡのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションによって誘導するために神経幹細胞の作製を介するＭＳＣの遺伝子改変を意図する。
【０１５５】
したがって、１つの実施形態によれば、運動ニューロン表現型に向かう分化は、神経幹細胞（ＮＳＣ）において、ｍｉＲ−３６８，ｍｉＲ−３０２ｂ，ｍｉＲ−３６５−３ｐ，ｍｉＲ−３６５−５ｐ，ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ，ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ｂ，ｍｉＲ−２１８，ｍｉＲ−１３４，ｍｉＲ−１２４，ｍｉＲ−１２５ａ，ｍｉＲ−９，ｍｉＲ−１５４，ｍｉＲ−２０ａおよびｍｉＲ−１３０ａからなる群から選択される少なくとも１種の外因性ｍｉＲＮＡのレベルをアップレギュレーションすることによって行われることができる。
【０１５６】
なお別の実施形態によれば、運動ニューロン表現型に向かう分化は、ＮＳＣにおいて、ｍｉＲ−３７２，ｍｉＲ−３７３，ｍｉＲ−１４１，ｍｉＲ−１９９ａ，ｍｉＲ−３２，ｍｉＲ−３３，ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−２２３からなる群から選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡの発現をダウンレギュレーションすることによって行われることができ、ダウンレギュレーションすることは、少なくとも１種のｍｉＲＮＡにハイブリダイズしてその機能を阻害する少なくとも１種のポリヌクレオチド作用因のレベルをアップレギュレーションすることによって行われる。
【０１５７】
ｍｉＲＮＡの特定の組合せもまた本発明者らによって意図され、これらには、例えば、神経幹細胞において、ｍｉＲ  Ｌｅｔ−７ａ、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−３６８およびｍｉＲ−１５４のそれぞれをアップレギュレーションすること、またはｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１３０ａのそれぞれをアップレギュレーションすること、またはｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−１３４およびｍｉＲ−２０ａのそれぞれをアップレギュレーションすることが含まれる。
【０１５８】
加えて、または代替において、本発明者らはさらに、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−３３、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２３およびｍｉＲ−３７３のそれぞれを神経幹細胞においてダウンレギュレーションすることを意図する。
【０１５９】
加えて、運動ニューロンの作製が、下記の外因性ｍｉＲＮＡのレベルを間葉系幹細胞においてアップレギュレーションすることによって達成される場合がある：ｍｉＲ−３６８，ｍｉＲ−３６５，ｍｉＲ−５００，ｍｉＲ−６４８，ｍｉＲ−４９１，ｍｉＲ−２１８，ｍｉＲ−１５５，ｍｉＲ−１９２，ｌｅｔ−７ｂ，ｍｉＲ−１６，ｍｉＲ−２１０，ｍｉＲ−１９７，ｍｉＲ−２１，ｍｉＲ−３７３，ｍｉＲ−２７ａ，ｍｉＲ−１２２，ｍｉＲ−１７，ｍｉＲ−４９４，ｍｉＲ−４４９，ｍｉＲ−５０３，ｍｉＲ−３０ａ，ｍｉＲ−１９６ａ，ｍｉＲ−１２２，ｍｉＲ−７，ｍｉＲ−１５１−５ｐ，ｍｉＲ−１６，ｍｉＲ−２２，ｍｉＲ−３１，ｍｉＲ−４２４，ｍｉＲ−１，ｍｉＲ−２９ｃ，ｍｉＲ−９４２，ｍｉＲ−１００，ｍｉＲ−５２０，ｍｉＲ−６６３ａ，ｍｉＲ−５６２，ｍｉＲ−４４９ａ，ｍｉＲ−４４９ｂ−５ｐ，ｍｉＲ−５２０ｂ，ｍｉＲ−４５１，ｍｉＲ−５３２−５９，ｍｉＲ−６０５，ｍｉＲ−５０４，ｍｉＲ−５０３，ｍｉＲ−１５５，ｍｉＲ−３４ａ，ｍｉＲ−１６，ｍｉＲ−７ｂ，ｍｉＲ−１０３，ｍｉＲ−１２４，ｍｉＲ−１３８５ｐ，ｍｉＲ−１６，ｍｉＲ−３３０，ｍｉＲ−５２０，ｍｉＲ−６０８，ｍｉＲ−７０８，ｍｉＲ−１０７，ｍｉＲ−１３７，ｍｉＲ−１３２，ｍｉＲ−１４５，ｍｉＲ−２０４，ｍｉＲ−１２５ｂ，ｍｉＲ−２２４，ｍｉＲ−３０ａ，ｍｉＲ−３７５，ｍｉＲ−１０１，ｍｉＲ−１０６ｂ，ｍｉＲ−１２８，ｍｉＲ−１２９−５ｐ，ｍｉＲ−１５３，ｍｉＲ−２０３，ｍｉＲ−２１４，ｍｉＲ−３３８−３ｐ，ｍｉＲ−３４６，ｍｉＲ−９８，ｍｉＲ−１０７，ｍｉＲ−１４１，ｍｉＲ−２１７，ｍｉＲ−４２４，ｍｉＲ−４４９，ｍｉＲ−７，ｍｉＲ−９，ｍｉＲ−９３，ｍｉＲ−９９ａ，ｍｉＲ−１００，ｍｉＲ−１２２８，ｍｉＲ−１８３，ｍｉＲ−１８５，ｍｉＲ−１９０，ｍｉＲ−５２２，ｍｉＲ−６５０，ｍｉＲ−６７５，ｍｉＲ−３４２−３ｐ，ｍｉＲ−３１。
【０１６０】
加えて、運動ニューロンの作製が、下記ｍｉＲＮＡの少なくとも１つとハイブリダイゼーションし、かつ、その活性を阻害する少なくとも１つのポリヌクレオチド作用因のレベルをＭＳＣにおいてアップレギュレーションすることによって達成される場合がある：ｍｉＲ−１９９ａ，ｍｉＲ−３７２，ｍｉＲ−３７３，ｍｉＲ−９４２，ｍｉＲ−２１１３，ｍｉＲ−３０１ａ−３ｐ，ｍｉＲ−３０２ｃ，ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ，ｍｉＲ−３０ｃ，ｍｉＲ−３２６，ｍｉＲ−３２８，ｍｉＲ−３３１−３ｐ，ｍｉＲ−３４０，ｍｉＲ−３４５，ｍｉＲ−３６１−５ｐ，ｍｉＲ−３６３，ｍｉＲ−３６５ａ−３ｐ，ｍｉＲ−３７１ａ−３ｐ，ｍｉＲ−３７３−３ｐ，ｍｉＲ−３７４ａ，ｍｉＲ−４２３−３ｐ，ｍｉＲ−４４９ｂ−５ｐ，ｍｉＲ−４５１ａ，ｍｉＲ−４９４，ｍｉＲ−５０４，ｍｉＲ−５１５−３ｐ，ｍｉＲ−５１６ａ−３ｐ，ｍｉＲ−５１９ｅ，ｍｉＲ−５２０ａ−３ｐ，ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ，ｍｉＲ−５２０ｇ，ｍｉＲ−５３２−５ｐ，ｍｉＲ−５５９，ｍｉＲ−５６２，ｍｉＲ−５７２，ｍｉＲ−５９０−５ｐ，ｍｉＲ−６０５，ｍｉＲ−６０８，ｍｉＲ−６２６，ｍｉＲ−６３９，ｍｉＲ−６５４−３ｐ，ｍｉＲ−６５７，ｍｉＲ−６６１，ｍｉＲ−７０８−５ｐ，ｍｉＲ−９４２，ｍｉＲ−９６，ｍｉＲ−９９ａｒｎｏ  ａｎｄ  ｍｉＲ−１９４。
【０１６１】
Ｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００５［Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ．２００５；１９６：２２４−２３４］；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６［Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２００６；２４：４３４−４４２］；Ｂｏｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００８［Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２００８；２６：２５６４−２５７５］；ａｎｄ  Ｄｉｍｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８［Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００８；３２１：１２１８−１２２１］。参照によって本明細書中に組み入れられるこれらの内容は、運動ニューロンへの分化を誘導するための様々な異なる幹細胞の遺伝的改変を教示する。当業者は、かかるプロトコールを間葉系幹細胞治療のためにどのようにして適合するかを知っているだろう。
【０１６２】
Ｒｅｎｏｎｃｏｕｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８［Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ．１９９８；７９：１８５−１９７］；Ｗｉｃｈｔｅｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２  Ｃｅｌｌ．２００２；１１０：３８５−３９７；Ｂａｒｂｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３［Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３；２１：１２００−１２０７］；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５［Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５；２３：２１５−２２１］；Ｓｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５［Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．２００５；１４：２６６−２６９］，Ｓｏｕｎｄａｒａｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６［Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００６；２６：３２５６−３２６８］，Ｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００６［Ｃｕｒｒ  Ｎｅｕｒｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ．２００６；３：２８１−２８８］；Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６［Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ．２００６；６０：３２−４４］；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７［Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２００７；２５：１９３１−１９３９］；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８［Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２００８；２６：８８６−８９３］；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００２［Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００２；５：１２７１−１２７８］；Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５［Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．２００５；１３１：２５７−２６２］；ＭａｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００３［Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．２００３；９８：１０９４−１１０３］；Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５  ［Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．２００５；２７８：６０−７０］；Ｃｏｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６［Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．２００６；１５：１６７−１８７］；Ｃｏｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７［Ｂｒａｉｎ．２００７；１３０：１２８９−１３０５］。参照によって本明細書中に組み入れられるこれらの内容は、運動ニューロンへの分化を誘導するための様々な異なる幹細胞の分化培地における培養を教示する。当業者は、かかるプロトコールを間葉系幹細胞治療のためにどのようにして適合するかを知っているだろう。
【０１６３】
骨格筋細胞
ＭＳＣを骨格筋に向かって分化させるための意図されるプロトコルには、下記によって開示されるプロトコルが含まれる：Ｔａｙｌｏｒ  ＳＭ、Ｊｏｎｅｓ  ＰＡ、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、１９８２、１１１：１８７〜９４；Ｌｅｅ  ＪＨ、Ｋｏｓｉｎｓｋｉ  ＰＡ、Ｋｅｍｐ  ＤＭ、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ、２００５、３０７：１７４〜８２（それらの内容は参照によって組み込まれる）。
【０１６４】
ニューロン
本発明者らの国際出願公開番号ＷＯ２０１０／１４４６９８（これは参照によって本明細書中に組み込まれる）は、そのニューロン分化を誘導するためにＭＳＣの遺伝子改変を教示する。この特許出願は、分化を促進させるために特定の一組のｍｉＲＮＡのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを教示する。
【０１６５】
米国特許出願公開２００５０２６５９８３は、ドーパミン分泌細胞に向かうＭＳＣの分化を教示する。
【０１６６】
ＭＳＣは、ニューロン様細胞へと分化することも示されている。かかるニューロン様細胞は、ニューロンマーカーを示し（Ａｚｉｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：３９０８−３９１３；Ｄｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２８２：１４８−１５２；Ｋｏｐｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  ＵＳＡ  ９６：１０７１１−１０７１６  １９９９；Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００３  Ｊ  Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１：１２７−１３８；Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒａｍｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  １６４：２４７−２５６．；Ｓｃｈｗａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １０：２５３９−２５４９；Ｗｏｏｄｂｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ  ６１：３６４−３７０）、いくつかの電気生理学的機能を示す（Ｋｏｈｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ６８：２３５−２４４）。ＭＳＣは、ドーパミン作動性マーカーを発現して、脱分極後にドーパミンを分泌することも示されている（Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：３５３−３８６）。
【０１６７】
乏突起膠細胞：
意図されるプロトコルには、Ｌｉｕ他［Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ、３０２：６８３〜６９３、２００７］によって開示されるプロトコルが含まれ、また、米国特許出願公開第２０１０００２１４３４号は、Ｎ２補充物および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）におけるインキュベーションによる骨髄由来間葉細胞の乏突起膠細胞分化を教示する（両者の内容は参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【０１６８】
本発明者らのＩＬ２０１１／０００６６０（これは参照によって本明細書中に組み込まれる）は、そのニューロン分化を誘導するためのＭＳＣの遺伝子改変を教示する。この特許出願は、分化を促進させるための特定の一組のｍｉＲＮＡのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを教示する。
【０１６９】
間葉系幹細胞集団が自己移植に好適であるかどうかを立証するために、（患者のＭＳＣから分化させられる）系譜特異的細胞が、当該疾患に関連する別の系譜特異的細胞と接触させられ、当該疾患に対する影響が分析される。
【０１７０】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）−図２を参照のこと：
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、患者の上位および下位運動ニューロンを冒す原因不明の致死的な神経変性疾患である。合衆国ではおよそ５６００人が毎年、ＡＬＳと診断される。ＡＬＳの発生率は１０００００人あたり２人であり、３００００人もの多くのアメリカ人がある時点でこの疾患に罹り得ると推定されている。８０％の患者が診断後５年以内に死亡し、この場合、通常、死亡は呼吸不全のためである。今日に至るまで、ＡＬＳのための効果的な治療法は何もなく、ＦＤＡによって現在承認されている唯一の薬物が、生存率を６ヶ月増大させるＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト（リルゾール）である。
【０１７１】
間葉系幹細胞集団が、ＡＬＳを処置するための自己移植のために好適であるかどうかを立証するために、患者から分化させられた星状膠細胞および／または骨格筋細胞が運動ニューロンと接触させられる（例えば、共培養される）場合がある。運動ニューロンは初代運動ニューロンまたは運動ニューロンの細胞株である場合がある。特定の実施形態によれば、運動ニューロンが、星状膠細胞が分化させられた間葉系幹細胞集団から分化させられる。
【０１７２】
好ましくは、運動ニューロンに対する系譜特異的細胞の細胞毒性影響が分析される。
【０１７３】
薬物によって誘導される細胞変化をモニターする様々な方法が当技術分野では公知であり、これらには、例えば、黄色塩のＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾリル−２）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物）（Ｓｉｇｍａ，Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）を青紫色の不溶性ホルマザン沈殿物に還元する生細胞の選択的能力に基づくＭＴＴ試験；ＢｒＤｕアッセイ［Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ  ＢｒｄＵ比色キット（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）］；ＴＵＮＥＬアッセイ［Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ］；アネキシンＶアッセイ［ＡｐｏＡｌｅｒｔ（登録商標）アネキシンＶアポトーシスキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ＣＡ、米国］；細胞老化関連β−ガラクトシダーゼアッセイ、同様にまた、（発現および／または活性のレベルを検出する）様々なＲＮＡおよびタンパク質の検出方法が含まれる。
【０１７４】
ＡＬＳ患者に由来する系譜特異的細胞が、対照の対象に由来する同一の系譜特異的細胞よりも大きい細胞毒性を運動ニューロンに対して有するならば、当該系譜特異的細胞が由来するＭＳＣ集団は、ＡＬＳを処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる場合がある。
【０１７５】
１つの実施形態によれば、自己ＭＳＣ集団が、対照のＭＳＣ集団よりも１０％を超えて細胞毒性であるならば、患者細胞集団は、ＡＬＳを処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる。
【０１７６】
１つの実施形態によれば、自己ＭＳＣ集団が、対照のＭＳＣ集団よりも２０％を超えて細胞毒性であるならば、患者細胞集団は、ＡＬＳを処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる。
【０１７７】
１つの実施形態によれば、自己ＭＳＣ集団が、対照のＭＳＣ集団よりも３０％を超えて細胞毒性であるならば、患者細胞集団は、ＡＬＳを処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる。
【０１７８】
１つの実施形態によれば、自己ＭＳＣ集団が、対照のＭＳＣ集団よりも４０％を超えて細胞毒性であるならば、患者細胞集団は、ＡＬＳを処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる。
【０１７９】
１つの実施形態によれば、自己ＭＳＣ集団が、対照のＭＳＣ集団よりも５０％を超えて細胞毒性であるならば、患者細胞集団は、ＡＬＳを処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる。
【０１８０】
対照のＭＳＣ集団は典型的には、ＡＬＳを有しない対象に由来し、好ましくは健常者対象に由来する。ＭＳＣ集団の年齢一致および性別一致もまた意図される。
【０１８１】
好ましくは、対照のＭＳＣ集団は、患者のＭＳＣ集団の分化と同時に系譜特異的細胞に向かって分化させられ、その結果、これら２つの細胞集団が同一の実験条件（例えば、温度および時間など）を受けることを保証するようにされる。
【０１８２】
細胞死に加えて、運動ニューロンは、患者のＭＳＣ集団から分化させられる系譜特異的細胞との共培養の後で、酸化ストレスに対する感受性、プロテアソーム阻害、ミトコンドリアの機能およびＥＲのストレス応答について調べられる場合がある。
【０１８３】
本明細書中上記で記載される共培養アッセイと同様に、本発明ではさらに、対象に起源を有するＭＳＣの遺伝子異常について分析することが意図される。遺伝子異常が検出されるならば、そのＭＳＣ集団は細胞治療のための供給源として選択されない。したがって、例えば、本発明では、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ−１）遺伝子における変異の存在について分析することが意図される。
【０１８４】
ＳＯＤ−１遺伝子は染色体２１ｑ２２．１に局在する。ＳＯＤ−１の配列はＰＣＴ公開ＷＯ９４／１９４９３に開示されている。ヒトＳＯＤ−１遺伝子の核酸配列をＧｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＭ．０００４５４において見出すことができる。
【０１８５】
ＡＬＳに伴う他の遺伝子異常には、アルシン（Ａｌｓｉｎ）、すなわち、ＡＬＳの若年性劣性型に関わる潜在的なグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）に存在する遺伝子異常が含まれる。別のものが、若年性ＡＬＳの常染色体優性型に連鎖することが確認されるセナタキシン（Ｓｅｎａｔａｘｉｎ）と呼ばれるＤＮＡ／ＲＮＡヘリカーゼドメイン含有タンパク質をコードするＡＬＳ４である。最も近年には、ＡＬＳ８と呼ばれる新しい遺伝子座での小胞結合膜タンパク質／シナプトブレビン結合膜タンパク質Ｂ（ＶＡＰＢ）における変異が、ＡＬＳの非定型形態に関連すると報告された。
【０１８６】
別の実施形態によれば、遺伝子異常はＴＡＲＤＢＰ遺伝子においてである。
【０１８７】
遺伝子異常について分析する様々な方法が当技術分野では知られており、これらはタンパク質レベルまたはポリヌクレオチドレベルで行われる場合がある。
【０１８８】
遺伝子異常について分析するための例示的な方法には、染色体染色法およびＤＮＡ染色法（例えば、ＦＩＳＨ分析、ＰＲＩＮＳ分析、間期染色体に対する高分解能多色バンディング（ＭＣＢ）、および定量的ＦＩＳＨ（Ｑ−ＦＩＳＨ））が含まれる。
【０１８９】
本発明のいくつかの実施形態の配列変化（またはＳＮＰ）を、様々なさらなる方法を使用して特定することができる。１つの選択肢が、ＰＣＲ反応産物の完全な遺伝子配列を決定することである。代替では、核酸の所与部分がいくつかの他のレベルで特徴づけられる場合がある。最も低い分解能では、分子のサイズを同じゲルでの既知標準物の泳動との比較により電気泳動によって求めることができる。分子のより詳細な写真が、整然としたマップの構築を可能にするための、電気泳動に先立つ制限酵素の組合せによる切断によって達成される場合がある。断片内における特異的配列の存在を標識されたプローブのハイブリダイゼーションによって検出することができ、あるいは、正確なヌクレオチド配列を部分的な化学的分解によって、または鎖停止ヌクレオチドアナログの存在下におけるプライマー伸張によって求めることができる。
【０１９０】
さらなる例示的な技術には、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、配列決定分析、ミクロ配列決定、ポリメラーゼおよびリガーゼに基づくミスマッチ検出アッセイ、リガーゼ／ポリメラーゼにより媒介されるＧｅｎｅｔｉｃ  Ｂｉｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（商標）ハイブリダイゼーションアッセイ法（オリゴヌクレオチドアレイに対するハイブリダイゼーションを含む）、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、変性勾配ゲル電気泳動／温度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ）、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）、ジデオキシフィンガープリンティング（ｄｄＦ）、ピロシークエンシング（商標）分析（Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ、米国）、Ａｃｙｃｌｏｐｒｉｍｅ（商標）分析（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、米国）ならびにリバースドットブロットが含まれる。
【０１９１】
配列変化はまた、タンパク質レベルで求めることができる。クロマトグラフィーおよび電気泳動法が好ましくは、ＳＯＤ−１の分子量における大きい変動を検出するために使用されるが、ＳＯＤ−１の配列変化に対して特異的である抗体を使用して行われる場合がある免疫検出アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット分析ならびに免疫組織化学など）が好ましくは、点変異および分子量におけるかすかな変化を検出するために使用される。
【０１９２】
したがって、本発明では、そのいくつかの実施形態によれば、血清免疫グロブリン、ポリクローナル抗体またはそのフラグメント（すなわち、その免疫反応性誘導体）、あるいは、モノクローナル抗体またはそのフラグメントの使用もまた、遺伝子異常を検出するために想定される。モノクローナル抗体、または抗原結合領域の少なくとも一部分を有する当該モノクローナル抗体の精製断片（本明細書中下記で記載される断片を含む）、キメラ抗体またはヒト化抗体、および相補性決定領域（ＣＤＲ）。
【０１９３】
パーキンソン病−図３を参照のこと：
パーキンソン病（ＰＤ）は、強直、動作緩慢および静止時振戦によって特徴づけられる進行性の神経変性疾患である。この疾患の病理学的な際立った特徴が、中脳における黒質緻密部（ＳＮｃ）でのドーパミン作動性ニューロンの選択的喪失である。ＰＤの症例のほとんどが、未だに不明な原因および病理発生により散発的に発生する。可能性のある機構には、ミトコンドリア機能不全、酸化ストレス、小胞体ストレス、ユビキチン−プロテアソーム系の不全、いくつかの環境的要因、および遺伝的素因が含まれる。
【０１９４】
星状膠細胞が、その進行において、また、星状膠細胞における早期のニューロン機能不全およびα−シヌクレイン蓄積を開始し、これにより、ＰＤの臨床的症状の原因となる限られた脳領域における特異的ニューロン集団の細胞死を引き起こすことにおいて役割を果たすことが近年には報告されている。最近の研究では、軸索を鞘で覆う乏突起膠細胞におけるａ−シヌクレインの蓄積もまた、関連したニューロンの神経変性を誘導し得ることが示される。最後に、ミクログリア細胞がＰＤの早期段階において星状膠細胞による活性化を受け、その後、この活性化がドーパミン作動性ニューロンに対する毒性影響を及ぼすことが示されている。したがって、他の神経変性障害と類似して、ＰＤの病理発生が病理学的な細胞・細胞相互作用によって媒介される。
【０１９５】
間葉系幹細胞集団が、パーキンソン病を処置するための自己移植のために好適であるかどうかを立証するために、患者から分化させられた星状膠細胞がドーパミン作動性ニューロンと接触させられる（例えば、共培養される）場合がある。ドーパミン作動性ニューロンは初代ドーパミン作動性ニューロンまたはドーパミン作動性ニューロンの細胞株である場合がある。特定の実施形態によれば、ドーパミン作動性ニューロンが、星状膠細胞が分化させられた間葉系幹細胞集団から分化させられる。
【０１９６】
好ましくは、ドーパミン作動性ニューロンに対する系譜特異的細胞の細胞毒性影響が分析される。
【０１９７】
特定の実施形態によれば、ＣＤ３４＋細胞（すなわち、患者に由来する骨髄または全血から得られる造血始原体）から分化させられるミクログリア細胞が、間葉細胞由来の星状膠細胞性細胞の存在下または非存在下のどちらかでドーパミン作動性ニューロンと共培養される。細胞は、ＣＤ３４＋細胞の富化集団を含むように事前に選別される場合がある。
【０１９８】
ＣＤ３４＋細胞または全骨髄をミクログリア表現型に分化させる様々な方法が当技術分野では知られており、これらには、例えば、培養培地（例えば、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ）において１０〜１５日間（例えば、１１日間）にわたって培養することが含まれる。非接着性細胞がさらに、５〜１０日（例えば、６日）の期間にわたって培養される。その後、細胞が吸引され、新しい培養ディッシュに移され、５０％の星状膠細胞馴化培地（これは、培地（例えば、ＤＭＥＭ、約２４時間）および２０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦにおいて培養される初代ヒト星状膠細胞から調製される）が補充される培地（例えば、ＤＭＥＭ／１０％ＦＳＣ）において培養される。細胞はその後、ミクログリアマーカーおよびミクログリア細胞と類似する機能を発現する。
【０１９９】
細胞毒性を分析する様々な方法が本明細書中上記で記載されている。
【０２００】
患者に由来する系譜特異的細胞が、対照の対象に由来する同一の系譜特異的細胞よりも大きい細胞毒性をドーパミン作動性ニューロンに対して有するならば、当該系譜特異的細胞が由来するＭＳＣ集団は、ＰＤを処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる場合がある。
【０２０１】
１つの実施形態によれば、自己ＭＳＣ集団が、対照のＭＳＣ集団よりも１０％を超えて細胞毒性であるならば、患者細胞集団は、ＰＤを処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる。
【０２０２】
１つの実施形態によれば、自己ＭＳＣ集団が、対照のＭＳＣ集団よりも２０％を超えて細胞毒性であるならば、患者細胞集団は、ＰＤを処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる。
【０２０３】
１つの実施形態によれば、自己ＭＳＣ集団が、対照のＭＳＣ集団よりも３０％を超えて細胞毒性であるならば、患者細胞集団は、ＰＤを処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる。
【０２０４】
１つの実施形態によれば、自己ＭＳＣ集団が、対照のＭＳＣ集団よりも４０％を超えて細胞毒性であるならば、患者細胞集団は、ＰＤを処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる。
【０２０５】
１つの実施形態によれば、自己ＭＳＣ集団が、対照のＭＳＣ集団よりも５０％を超えて細胞毒性であるならば、患者細胞集団は、ＰＤを処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる。
【０２０６】
対照のＭＳＣ集団は典型的には、パーキンソン病を有しない対象に由来し、好ましくは健常者対象に由来する。ＭＳＣ集団の年齢一致および性別一致もまた意図される。
【０２０７】
細胞死に加えて、ドーパミン作動性ニューロンは、患者のＭＳＣ集団から分化させられる系譜特異的細胞との共培養の後で、酸化ストレスに対する感受性、プロテアソーム阻害、不溶解性アルファ−シヌクレインタンパク質の外観、ミトコンドリアの機能およびＥＲのストレス応答について調べられる場合がある。
【０２０８】
本明細書中上記で記載される共培養アッセイと同様に、本発明ではさらに、対象に起源を有するＭＳＣの遺伝子異常について分析することが意図される。遺伝子異常が検出されるならば、そのＭＳＣ集団は細胞治療のための供給源として選択されない。したがって、例えば、本発明では、アルファ−シヌクレイン遺伝子における変異（例えば、アラニン３０からプロリンへの変異（Ａ３０Ｐ）、およびアラニン５３からトレオニンへの変異（Ａ５３Ｔ））の存在、または正常なａ−シヌクレインの増大した合成について分析することが意図される。家族性ＰＤについての以下のさらなる遺伝子が今日までに特定されている：常染色体劣性パーキンソン症候群の家族性型でのパーキン（ＰＡＲＫ２）、ＤＪ−１（ＰＡＲＫ７）またはＰＩＮＫ１（ＰＡＲＫ６）における変異、ならびに、常染色体優性パーキンソン症候群の家族性型でのＵＣＨ−Ｌ１（ＰＡＲＫ５）およびＬＲＲＫ２／ダルダリン（ｄａｒｄａｒｉｎ）（ＰＡＲＫ８）における変異またはα−シヌクレイン（ＰＡＲＫ４）のゲノム三重化。
【０２０９】
遺伝子異常を分析するための方法が本明細書中上記で記載されている。
【０２１０】
アルツハイマー病：
アルツハイマー病（ＡＤ）は一般的な慢性神経変性疾患であり、認知症の最も一般的な原因である。この疾患の２つの際立った特徴が、老人斑（これは主に、アミロイドβの細胞外沈着から構成される）および神経原線維変化（これは、異常にリン酸化されたタウタンパク質の細胞間凝集物からなる）である。老人斑の存在はまた、ＡＤにおける顕著な初期の役割を果たすと考えられる炎症性応答に関連する。
【０２１１】
ＡＤの両方のタイプにおいて、様々な細胞タイプ（例えば、星状膠細胞、ニューロンおよびミクログリアなど）がこの疾患の病理発生に関係づけられている。
【０２１２】
間葉系幹細胞集団が、ＡＤを処置するための自己移植のために好適であるかどうかを立証するために、患者から分化させられた星状膠細胞がニューロン細胞と接触させられる（例えば、共培養される）場合がある。ニューロンは初代ニューロンまたはニューロンの細胞株である場合がある。特定の実施形態によれば、ニューロンが、星状膠細胞が分化させられた間葉系幹細胞集団から分化させられる。
【０２１３】
好ましくは、ニューロンに対する系譜特異的細胞の細胞毒性影響が分析される。
【０２１４】
特定の実施形態によれば、患者に由来するＣＤ３４＋細胞から分化させられるミクログリア細胞が、間葉細胞由来の星状膠細胞性細胞の存在下または非存在下のどちらかでニューロンと共培養される。
【０２１５】
ＣＤ３４＋細胞を分化する方法が本明細書中上記で記載されている。
【０２１６】
細胞毒性を分析する様々な方法が本明細書中上記で記載されている。
【０２１７】
細胞死に加えて、ニューロンは、患者のＭＳＣ集団から分化させられる系譜特異的細胞との共培養の後で、酸化ストレスに対する感受性、プロテアソーム阻害、ミトコンドリアの機能およびＥＲのストレス応答について調べられる場合がある。
【０２１８】
患者に由来する系譜特異的細胞が、対照の対象に由来する同一の系譜特異的細胞よりも大きい細胞毒性をニューロンに対して有するならば、当該系譜特異的細胞が由来するＭＳＣ集団は、ＡＤを処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる場合がある。
【０２１９】
１つの実施形態によれば、自己ＭＳＣ集団が、対照のＭＳＣ集団よりも１０％を超えて細胞毒性であるならば、患者細胞集団は、ＡＤを処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる。
【０２２０】
１つの実施形態によれば、自己ＭＳＣ集団が、対照のＭＳＣ集団よりも２０％を超えて細胞毒性であるならば、患者細胞集団は、ＡＤを処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる。
【０２２１】
１つの実施形態によれば、自己ＭＳＣ集団が、対照のＭＳＣ集団よりも３０％を超えて細胞毒性であるならば、患者細胞集団は、ＡＤを処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる。
【０２２２】
１つの実施形態によれば、自己ＭＳＣ集団が、対照のＭＳＣ集団よりも４０％を超えて細胞毒性であるならば、患者細胞集団は、ＡＤを処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる。
【０２２３】
１つの実施形態によれば、自己ＭＳＣ集団が、対照のＭＳＣ集団よりも５０％を超えて細胞毒性であるならば、患者細胞集団は、ＡＤを処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる。
【０２２４】
対照のＭＳＣ集団は典型的には、アルツハイマー病を有しない対象に由来し、好ましくは健常者対象に由来する。ＭＳＣ集団の年齢一致および性別一致もまた意図される。
【０２２５】
本明細書中上記で記載される共培養アッセイと同様に、本発明ではさらに、対象に起源を有するＭＳＣの遺伝子異常について分析することが意図される。遺伝子異常が検出されるならば、そのＭＳＣ集団は細胞治療のための供給源として選択されない。したがって、例えば、本発明では、変異の存在について分析することが意図される。
【０２２６】
アルツハイマー病の症例の大多数が散発性であり、しかしながら、ＡＰＰ（これはアミロイド−β前駆体タンパク質をコードする）の変異または重複化、あるいは、プレセニリン遺伝子（これは、ＡＰＰをアミロイド−βに切断するタンパク質分解酵素をコードする）における変異を有するアルツハイマー病の優性遺伝性家族性型の希な症例が存在する。
【０２２７】
遺伝子異常を分析するための方法が本明細書中上記で記載されている。
【０２２８】
レット症候群−図４を参照のこと
レット症候群（ＲＴＴ）は、メチルｃｐＧ結合タンパク質２（ＭｓＣＰ２）の機能の喪失によって引き起こされるＸ染色体連鎖の自閉症スペクトラム障害である。より初期の研究では、この疾患はニューロンにおけるＭｅＣＰ２機能の喪失に起因すると結論されたにもかかわらず、近年の研究では、グリア細胞におけるＭｅＣＰ２の喪失が負の影響を細胞非自律的様式でニューロンに及ぼすことが明瞭に明らかにされた。そのうえ、ＭｅＣＰ２完全欠損マウスでの星状膠細胞におけるＭｅＣＰ２の再発現は、ヌルマウスと比較して、運動レベルおよび不安レベルを著しく改善し、呼吸の異常を正常なパターンにまで回復させ、かつ、寿命を大きく延ばした。加えて、変異型星状膠細胞に対するＭｅＣＰ２の修復は、インビボにおける変異型ニューロンに対する細胞非自律的な陽性の影響を及ぼし、これにより、正常な樹状突起形態学を回復させ、また、興奮性グルタミン酸輸送体のレベルを増大させた。したがって、グリア細胞が、ニューロンと類似して、ＲＴＴの神経病理学の不可欠な構成要素であり、また、この疾患の随伴症状を改善するための１つの方策としての、正常なＭｅＣＰ２レベルを有するグリア細胞を投与するという考えを裏づけているようである。
【０２２９】
星状膠細胞に加えて、ミクログリア細胞もまた、神経毒性である高レベルのグルタミン酸を分泌することによってこの疾患の病理発生に関係づけられている。
【０２３０】
間葉系幹細胞集団が、レット症候群を処置するための自己移植のために好適であるかどうかを立証するために、患者から分化させられた星状膠細胞がニューロンと接触させられる（例えば、共培養される）場合がある。ニューロンは初代ニューロンまたはニューロンの細胞株である場合がある。特定の実施形態によれば、ニューロンが、星状膠細胞が分化させられた間葉系幹細胞集団から分化させられる。
【０２３１】
好ましくは、ニューロンに対する系譜特異的細胞の細胞毒性影響が分析される。
【０２３２】
特定の実施形態によれば、患者に由来するＣＤ３４＋細胞から分化させられるミクログリア細胞が、間葉細胞由来の星状膠細胞性細胞の存在下または非存在下のどちらかでニューロンと共培養される。
【０２３３】
ＣＤ３４＋細胞をミクログリア表現型に分化させる様々な方法が当技術分野では知られており、本明細書中上記で記載されている。
【０２３４】
細胞毒性を分析する方法が本明細書中上記で記載されている。
【０２３５】
細胞死に加えて、ニューロンは、患者のＭＳＣ集団から分化させられる系譜特異的細胞との共培養の後で、酸化ストレスに対する感受性、プロテアソーム阻害、ミトコンドリアの機能およびＥＲのストレス応答について調べられる場合がある。
【０２３６】
患者に由来する系譜特異的細胞が、対照の対象に由来する同一の系譜特異的細胞よりも大きい細胞毒性をニューロンに対して有するならば、当該系譜特異的細胞が由来するＭＳＣ集団は、レット症候群を処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる場合がある。
【０２３７】
１つの実施形態によれば、自己ＭＳＣ集団が、対照のＭＳＣ集団よりも１０％を超えて細胞毒性であるならば、患者細胞集団は、レット症候群を処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる。
【０２３８】
１つの実施形態によれば、自己ＭＳＣ集団が、対照のＭＳＣ集団よりも２０％を超えて細胞毒性であるならば、患者細胞集団は、レット症候群を処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる。
【０２３９】
１つの実施形態によれば、自己ＭＳＣ集団が、対照のＭＳＣ集団よりも３０％を超えて細胞毒性であるならば、患者細胞集団は、レット症候群を処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる。
【０２４０】
１つの実施形態によれば、自己ＭＳＣ集団が、対照のＭＳＣ集団よりも４０％を超えて細胞毒性であるならば、患者細胞集団は、レット症候群を処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる。
【０２４１】
１つの実施形態によれば、自己ＭＳＣ集団が、対照のＭＳＣ集団よりも５０％を超えて細胞毒性であるならば、患者細胞集団は、レット症候群を処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる。
【０２４２】
対照のＭＳＣ集団は典型的には、レット症候群を有しない対象に由来し、好ましくは健常者対象に由来する。ＭＳＣ集団の年齢一致および性別一致もまた意図される。
【０２４３】
本発明ではさらに、遺伝子改変されたＭＳＣ集団を分化させることが、そのような細胞集団が自己細胞治療のために有益であるかどうかを明らかにするために意図される。したがって、例えば、ＡＬＳについては、細胞が、ＩＧＦ−１、ＶＥＧＦ、ＧＤＮＦおよび／またはＳＯＤ１のｓｉＲＮＡを発現するように遺伝子改変される場合がある。パーキンソン病については、細胞が、ＶＥＧＦおよびＧＤＮＦを発現するように遺伝子改変される場合がある。レット症候群については、細胞が、ＩＧＦ−１および／またはＢＤＮＦを発現するように遺伝子改変される場合がある。ＭＳＣを遺伝子改変する様々な方法が本明細書中上記に提供される。
【０２４４】
患者のＭＳＣから作製される系譜特異的細胞の、別の細胞タイプに対する影響を分析することと同様に、他のパラメーターもまた、ＭＳＣ集団を分類および／または認定するために分析される場合があることが理解されるであろう。
【０２４５】
本発明の別の局面によれば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）集団を認定する方法であって、前記ＭＳＣの前記集団から分化させられる系譜特異的細胞の機能および／または形態学を分析することを含み、ただし、対照の系譜特異的細胞と比較される前記系譜特異的細胞の前記機能または形態学における変化により、前記ＭＳＣが認定されることが示される、方法が提供される。
【０２４６】
分化した細胞タイプが比較されることがある対照の系譜特異的細胞には、星状膠細胞、運動ニューロン、乏突起膠細胞およびドーパミン作動性ニューロンが含まれるが、これらに限定されない。対照細胞は、細胞株または初代細胞から得られる培養細胞または非培養細胞である場合がある。対照細胞は、本明細書中上記で記載されるように、健常者対象のＭＳＣ集団からエクスビボで分化させられる場合がある。そのような対照系譜特異的細胞の機能および／または形態学の知識が実際の測定から集められる場合があり、あるいは、これらの細胞に関連する文献から得られる場合がある。
【０２４７】
１つの実施形態によれば、細胞は、対象における脳疾患の自己細胞治療のために好適であるかを調べるために認定される。
【０２４８】
機能または形態学の変化の程度が典型的には、好ましくは量的レベルで実施者によって求められ、ただし、この場合、対照の系譜特異的細胞と比較して、測定されているパラメーターのどちらかの方向で１０％を超える変化、どちらかの方向で２０％を超える変化、どちらかの方向で３０％を超える変化、どちらかの方向で４０％を超える変化、どちらかの方向で５０％を超える変化は、当該ＭＳＣ細胞集団が自己細胞移植のために推奨されないことを示すものである。
【０２４９】
細胞形態学が、顕微鏡技術（例えば、走査型電子顕微鏡法）を使用して分析される場合がある。抗体または色素が、分析を助けるための識別特徴を強調するために使用される場合がある。
【０２５０】
分析され得る例示的な細胞機能には、例えば、特定のタンパク質または特定の一組のタンパク質の発現（発現の相対的量を含む）、特定のｍｉＲＮＡまたは特定の一組のｍｉＲＮＡの発現、特定の因子（例えば、神経栄養因子）の分泌、特定の因子（例えば、神経栄養因子）に応答する能力、および（本明細書中上記で記載されるように）別の細胞タイプに影響を与える能力が含まれる。
【０２５１】
特定の実施形態によれば、細胞機能がＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルで分析される。
【０２５２】
ＲＮＡの発現レベルを検出する方法
本発明のいくつかの実施形態の細胞におけるＲＮＡの発現レベルを、当技術分野において公知の方法を使用して求めることができる。
【０２５３】
ノーザンブロット分析：この方法は、ＲＮＡの混合物における特定のＲＮＡの検出を伴う。塩基対の間の水素結合を妨げてＲＮＡ分子のすべてが折り畳まれていない線状の立体配座を有することを保証する薬剤（例えば、ホルムアルデヒド）による処理によって、ＲＮＡサンプルを変性させる。個々のＲＮＡ分子をその後、ゲル電気泳動によってサイズに従って分離し、変性したＲＮＡが付着するニトロセルロース膜またはナイロン系膜に移す。その後、膜を標識されたＤＮＡプローブにさらす。プローブを、放射性同位体または酵素連結ヌクレオチドを使用して標識される場合がある。検出では、オートラジオグラフィー、比色反応または化学発光を使用される場合がある。この方法は、特定のＲＮＡ分子の量の定量化と、電気泳動期間中のゲルにおける移動距離を示す膜上の相対的位置によるその正体の決定との両方を可能にする。
【０２５４】
ＲＴ−ＰＣＲ分析：この方法では、相対的に希なＲＮＡ分子のＰＣＲ増幅を使用する。最初に、ＲＮＡ分子を細胞から精製し、逆転写酵素（例えば、ＭＭＬＶ−ＲＴなど）およびプライマー（例えば、オリゴｄＴ、ランダムヘキサマーまたは遺伝子特異的プライマーなど）を使用して相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換する。その後、遺伝子特異的プライマーおよびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを加えることによって、ＰＣＲ増幅反応をＰＣＲ装置において行う。当業者は、特異的なＲＮＡ分子を検出するために好適である遺伝子特異的プライマーの長さおよび配列ならびにＰＣＲ条件（すなわち、アニーリング温度およびサイクル回数など）を選択することができる。半定量的ＲＴ−ＰＣＲ反応を、ＰＣＲサイクルの回数を調節し、増幅産物を既知対照に対して比較することによって用い得ることが理解されるであろう。
【０２５５】
ＲＮＡインサイチューハイブリダイゼーション染色：この方法では、ＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブをが、細胞内に存在するＲＮＡ分子に結合させる。一般に、細胞を最初に、細胞構造を保つために、また、ＲＮＡ分子が分解されないようにするために顕微鏡用スライドに固定処理し、その後、標識されたプローブを含有するハイブリダイゼーション緩衝液に供する。ハイブリダイゼーション緩衝液は、ＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブを原位置においてそれらの標的ｍＲＮＡ分子と特異的にハイブリダイゼーションすることを可能にし、一方で、プローブが非特異的に結合することを回避する、ホルムアミドおよび各種塩（例えば、塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム）などの試薬を含む。当業者は、ハイブリダイゼーション条件（すなわち、温度、塩およびホルムアミドの濃度など）を特異的プローブおよび特異的タイプの細胞に対して調節することができる。ハイブリダイゼーション後、結合していないプローブをすべて洗い流し、結合したプローブを公知の方法を使用して検出する。例えば、放射能標識したプローブを使用するならば、スライドを、放射能標識されたプローブを使用して生じるシグナルを明らかにする写真乳剤に供する；プローブを酵素により標識した場合は、酵素特異的基質を比色反応の形成のために加える；プローブを、蛍光標識を使用して標識した場合は、結合したプローブを、蛍光顕微鏡を使用して明らかにする；プローブをタグ（例えば、ジゴキシゲニンおよびビオチンなど）を使用して標識した場合は、結合したプローブを公知の方法を使用して検出できるタグ特異的抗体との反応に従って検出することができる。
【０２５６】
インサイチューＲＴ−ＰＣＲ染色：この方法が、Ｎｕｏｖｏ  ＧＪ他［Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）−ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｃＤＮＡ、Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｐａｔｈｏｌ、１９９３、１７：６８３〜９０］およびＫｏｍｍｉｎｏｔｈ  Ｐ他［Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｒｃｈｉｖａｌ  ｌｉｖｅｒ  ｂｉｏｐｓｉｅｓ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ，ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ−ＰＣＲ）  ａｎｄ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲ、Ｐａｔｈｏｌ  Ｒｅｓ  Ｐｒａｃｔ、１９９４、１９０：１０１７〜２５］に記載される。簡単に記載すると、ＲＴ−ＰＣＲ反応が、標識されたヌクレオチドをＰＣＲ反応に取り込むことによって、固定処理された細胞に対して行われる。反応は、特異的なインサイチューＲＴ−ＰＣＲ装置を使用して行い、例えば、Ａｒｃｔｕｒｕｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ、ＣＡ）から入手可能なレーザー・キャプチャー・マイクロダイセクションＰｉｘＣｅｌｌ  Ｉ  ＬＣＭシステムなどを使用して行う。
【０２５７】
ＤＮＡマイクロアレイ／ＤＮＡチップ：
数千個の遺伝子の発現が、ＤＮＡマイクロアレイを使用して同時に分析される場合があり、これにより、特異的な発達プロセスまたは生理学的応答の期間における生物の完全な転写プログラムの分析が可能になる。ＤＮＡマイクロアレイは、支持体（例えば、ガラス製の顕微鏡スライドなど）の表面の密に詰められた領域に結合する数千の個々の遺伝子配列からなる。様々な方法が、ＤＮＡマイクロアレイを調製するために開発されている。１つの方法では、分析のための各遺伝子のコード領域のおよそ１キロベースの部分を個々にＰＣＲ増幅する。ロボット装置を使用して、それぞれの増幅されたＤＮＡサンプルを、ガラス製顕微鏡用スライドの表面の密に一定間隔で配置された区域に適用し、続いてサンプルを、ＤＮＡ配列を支持体の表面に結合させ、変性させるために熱的および化学的な処理によって処理する。典型的には、そのようなアレイは約２×２ｃｍであり、個々の核酸の約６０００個のスポットを含有する。この技術の変形において、多数のＤＮＡオリゴヌクレオチド（通常、長さにおいて２０ヌクレオチド）を、支持体の表面に共有結合される最初のヌクレオチドから合成し、その結果、数万の同一オリゴヌクレオチドを支持体の表面の小さい正方形区域において合成する。単一の遺伝子からの多数のオリゴヌクレオチド配列を、その遺伝子の発現を分析するためにスライドの近接領域において合成する。したがって、数千の遺伝子を１枚のガラス製スライドの上に表すことができる。合成オリゴヌクレオチドのそのようなアレイは、上記で記載されるような「ＤＮＡマイクロアレイ」とは対照的に、当技術分野では「ＤＮＡチップ」と呼ばれることがある［Ｌｏｄｉｓｈ他（編）、第７．８章：ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  Ｇｅｎｏｍｅ−Ｗｉｄｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０００）］。
【０２５８】
オリゴヌクレオチドマイクロアレイ−この方法では、本発明のいくつかの実施形態のポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイゼーションすることができるオリゴヌクレオチドプローブを固体表面（例えば、ガラス製ウエハー）に結合させる。それぞれのオリゴヌクレオチドプローブが長さにおいておよそ２０〜２５個の核酸からなる。特定の細胞サンプル（例えば、血液細胞）における本発明のいくつかの実施形態のポリヌクレオチドの発現パターンを検出するために、ＲＮＡを、当技術分野で公知の方法（例えば、ＴＲＩＺＯＬ溶液（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、米国））を使用して細胞サンプルから抽出する。ハイブリダイゼーションを、標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、５’−ビオチン化プローブ）または相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）もしくはＲＮＡ（ｃＲＮＡ）の標識された断片のどちらかを使用して行うことができる。簡単に記載すると、二本鎖ｃＤＮＡを、逆転写酵素（ＲＴ）（例えば、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＲＴ）、ＤＮＡリガーゼおよびＤＮＡポリメラーゼＩをすべて製造者の説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ、米国）に従って使用してＲＮＡから調製する。標識されたｃＲＮＡを調製するために、二本鎖ｃＤＮＡを、例えば、ＢｉｏＡｒｒａｙ  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  ＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｅｎｚｏ，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用するビオチン化ヌクレオチドの存在下でのインビトロ転写反応に供する。効率的なハイブリダイゼーションのために、標識されたｃＲＮＡは、ＲＮＡを９４℃で３５分間、４０ｍＭのＴｒｉｓ酢酸塩（ｐＨ８．１）、１００ｍＭ酢酸カリウムおよび３０ｍＭ酢酸マグネシウムにおいてインキュベーションすることによって断片化することができる。ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイを洗浄し、ハイブリダイゼーションシグナルを、プローブアレイに結合する標識されたｃＲＮＡによって放射される蛍光強度を測定する共焦点レーザー蛍光スキャナーを使用して走査する。
【０２５９】
例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）では、アレイ上のそれぞれの遺伝子が一連の異なるオリゴヌクレオチドプローブによって表され、ただし、この場合、これらのオリゴヌクレオチドプローブの各プローブ対が、完全一致のオリゴヌクレオチドと、ミスマッチのオリゴヌクレオチドとからなる。完全一致のプローブは、特定の遺伝子に対して正確に相補的である配列を有しており、したがって、当該特定の遺伝子の発現レベルの測定を可能にするが、ミスマッチのプローブは中央塩基位置における一塩基置換によって完全一致のプローブと異なる。ハイブリダイゼーションシグナルを、Ａｇｉｌｅｎｔスキャナーを使用して走査し、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅソフトウエアにより、ミスマッチのプローブから生じる非特異的シグナルを、完全一致のプローブから生じるシグナルから引く。
【０２６０】
タンパク質の発現および／または活性を検出する方法
本発明のいくつかの実施形態の培養物の細胞において発現されるタンパク質の発現レベルおよび／または活性レベルを、当技術分野において公知の方法を使用して求めることができる。
【０２６１】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）：この方法は、タンパク質基質を含有するサンプル（例えば、固定処理された細胞またはタンパク質性溶液）を表面（例えば、マイクロタイタープレートのウエルなど）に固定処理することを伴う。酵素にカップリングされた基質特異的抗体を適用し、基質に結合させる。抗体の存在をその後、抗体にカップリングされた酵素を用いる比色反応によって検出し、定量する。この方法において一般に用いられる酵素には、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼが含まれる。十分に校正され、かつ、応答の直線範囲の範囲内であるならば、サンプルに存在する基質の量は、生じる色の量に比例する。基質標準物が、定量精度を改善するために一般に用いられる。
【０２６２】
ウエスタンブロット：この方法は、基質をアクリルアミドゲルによって他のタンパク質から分離し、続いて、基質を膜（例えば、ナイロンまたはＰＶＤＦ）に転写することを伴う。その後、基質の存在を、基質に特異的な抗体によって検出し、今度は、この抗体を抗体結合試薬によって検出する。抗体結合試薬は、例えば、プロテインＡまたは他の抗体である場合がある。抗体結合試薬は、本明細書中上記で記載されるように、放射能標識されるかまたは酵素に連結される場合がある。検出が、オートラジオグラフィー、比色反応または化学発光によって行われる場合がある。この方法は、基質の量の定量化と、電気泳動期間中のアクリルアミドゲルにおける移動距離を示す膜上の相対的位置によるその正体の決定との両方を可能にする。
【０２６３】
放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）：１つの形式において、この方法は、所望されるタンパク質（すなわち、基質）を、特異的な抗体と、沈殿可能な担体（例えば、アガロースビーズなど）に固定化される放射能標識された抗体結合タンパク質（例えば、Ｉ１２５により標識されるプロテインＡ）とともに沈殿させることを伴う。沈殿したペレットにおけるカウント数は基質の量に比例する。
【０２６４】
ＲＩＡの代替形式において、標識された基質と、標識されていない抗体結合タンパク質とが用いられる。未知量の基質を含有するサンプルを様々な量で加える。標識された基質から得られる沈殿したカウント数における低下は添加サンプルにおける基質の量に比例する。
【０２６５】
蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）：この方法は、基質を基質特異的抗体によって細胞における原位置において検出することを伴う。基質特異的抗体を蛍光団に連結させる。検出は、細胞が光ビームを通過する際にそれぞれの細胞から放射される光の波長を読み取る細胞分取装置によって行う。この方法では、２つ以上の抗体が同時に用いてもよい。
【０２６６】
免疫組織化学的分析：この方法は、基質を基質特異的抗体によって固定処理細胞における原位置において検出することを伴う。基質特異的抗体が酵素に連結される場合があり、または蛍光団に連結される場合がある。検出は、顕微鏡法および主観的評価または自動的評価によって行う。酵素連結された抗体を用いるならば、比色反応が要求される場合がある。免疫組織化学は多くの場合、続いて、細胞の核を、例えば、ヘマトキシリンまたはギムザ染色液を使用して対比染色することが理解されるであろう。
【０２６７】
インサイチュー活性アッセイ：この方法によれば、発色性基質が、活性な酵素を含有する細胞に加えられ、当該酵素により、基質が分解されて、光学顕微鏡または蛍光顕微鏡によって視認される発色性生成物をもたらす反応が触媒される。
【０２６８】
各種のインビトロ活性アッセイ：これらの方法では、特定の酵素の活性が、細胞から抽出されるタンパク質混合物において測定する。活性を、比色法を使用して分光光度計ウエルにおいて測定することができ、または非変性アクリルアミドゲル（すなわち、活性ゲル）において測定することができる。電気泳動後、ゲルを、基質および比色試薬を含有する溶液に浸す。生じた染色バンドが、目的とするタンパク質の酵素活性に対応する。十分に校正され、かつ、応答の直線範囲の範囲内であるならば、サンプルに存在する酵素の量は、生じる色の量に比例する。酵素標準物が、定量精度を改善するために一般に用いられる。
【０２６９】
星状膠細胞性細胞に分化させた後で、下記の例示的パラメーターが分析される場合がある：
１．神経栄養因子の発現および／または分泌。
本明細書中で使用される場合、表現「神経栄養因子」は、ニューロンに対する成長、分化、機能維持および／または生存の影響を含む脳神経系に作用する細胞因子を示す。神経栄養因子の例には、下記のものが含まれるが、それらに限定されない：グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｌ１９０６３、同Ｌ１５３０６；神経成長因子（ＮＧＦ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＣＡＡ３７７０３；ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｍ３７７６３；ニューロトロフィン−４／５；ニュールツリン（ＮＴＮ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿００４５４９；ニューロトロフィン−４、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｍ８６５２８；パーセフィン、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＡＣ３９６４０；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＣＡＡ４２７６１；アルテミン（ＡＲＴ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＡＤ１３１１０；毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿０００６０５；インスリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−１）、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿０００６０９；およびニューブラスチン（Ｎｅｕｂｌａｓｔｉｎ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＡＤ２１０７５。
２．ＩＬ−１ｂｅｔａおよびカベルゴリンを加えた後における神経栄養因子の発現および／または分泌の増強。
３．グルタミン酸輸送体の活性。そのようなグルタミン酸輸送体の活性が、細胞の培養培地からの標識アスパラギン酸（例えば、［３Ｈ］−ｄ−アスパラギン酸）の取り込みを測定することによって分析される場合がある。
４．星状膠細胞の構造的表現型、これには、丸い核、「星型形状」体、およびＣＮＳの小さい血管における脈管足板として終わる多くの長い突起の存在が含まれる。構造的な星状膠細胞表現型のさらなる例が下記の資料に見出される場合がある：ＲｅｙｎｏｌｄｓおよびＷｅｉｓｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）、２５５：１７０７〜１７１０；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，ＴｅｔｚｌａｆｆおよびＷｅｉｓｓ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ（１９９２）、１２：４５６５〜４５７４；ならびに、Ｋａｎｄｅｌ他、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、第３版（１９９１）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、Ｃｏｎｎ。
５．星状膠細胞マーカーの発現。
【０２７０】
本明細書中で使用される場合、表現「星状膠細胞マーカー」は、星状膠細胞において選択的または非選択的のどちらでも発現されるポリペプチドを示す。星状膠細胞マーカーが細胞表面または内部で発現される場合がある。星状膠細胞マーカーの例には、Ｓ１００ｂｅｔａ、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、グルタミンシンセターゼ、ＧＬＡＳＴおよびＧＬＴ１が含まれる。
【０２７１】
ニューロン細胞に分化させた後で、下記のパラメーターが分析される場合がある：
１．神経伝達物質の放出；
本発明の教示による神経伝達物質は、中枢神経系または末梢神経系のシナプス前ニューロンの軸索終末から興奮時に放出され、かつ、シナプス間隙を越えて伝わり、標的細胞の興奮または阻害のどちらかを生じさせる任意の物質であり得る。神経伝達物質は、例えば、ドーパミン、ノルエピネフリン、エピネフリン、ガンマアミノ酪酸、セロトニン、アセチルコリン、グリシン、ヒスタミン、バソプレシン、オキシトシン、タキキニン、コレシストキニン（ＣＣＫ）、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、ニューロテンシン、ソマトスタチン、オピオイドペプチド、プリン系化合物またはグルタミン酸であり得る。
２．ニューロンマーカーの発現
ニューロンマーカー、例えば、神経タンパク質（例えば、グリピカン−４（ＧＰＣ４）、ネクジン（Ｎｅｃｄｉｎ）、ネスチン、神経突起成長促進因子２（ＮＥＧＦ−２）、ニューロフィラメント−ｈｅａｖｙ、ニューロフィラメント−ｌｉｇｈｔ、ニューロフィラメント−ｍｅｄｉｕｍ、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、神経栄養性チロシンキナーゼ受容体２型（ＴＲＫ−２）、ニューロン核（ＮｅｕＮ）、ＲＥＴチロシンキナーゼまたはレチノイン酸受容体アルファ型（ＲＡＲＡ）など）、および乏突起膠細胞タンパク質（例えば、２’，３’−環状ヌクレオチド３’−ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰアーゼ）など）など。代替として、ニューロンマーカーは、ニューロン活性な転写因子、例えば、アリール炭化水素受容体／アリール炭化水素受容体核トランスロケーター結合エレメント（ＡｈＲ／Ａｍｔ）、エコトロピックウイルス組み込み部位１（ＥＶＩ−１）、フォークヘッドボックスＯ１Ａヒト（ＦＫＨＲｈｕ）、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、肝細胞核因子３．ｂｅｔａ．（ＨＮＦ−３．ｂｅｔａ．）、ミエリン遺伝子発現因子２  ＭＥＦ２（２）、核Ｙボックス因子（ＮＦ−Ｙ）、神経ジンクフィンガー３（ＮＺＦ−３）、ペアードボックス遺伝子３（Ｐａｘ−３）、ペアードボックス遺伝子６（Ｐａｘ−６）または生体異物応答エレメント（ＸＲＥ）などであり得る。好ましくは、細胞が、パーキンソン病を処置するために要求されるならば、細胞はまた、ドーパミン作動性マーカー、例えば、ドーパミン作動性転写因子（例えば、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１（Ａｌｄｈ１）、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ１（Ｅｎ−１）、Ｎｕｒｒ−１またはＰａｉｒｅｄ様ホメオドメイン転写因子３（ＰＩＴＸ−３）など）またはドーパミン作動性タンパク質（例えば、芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、カテコール−ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）、ドーパミン輸送体（ＤＡＴ）、ドーパミン受容体Ｄ２（ＤＲＤ２）、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ−１（ＧＣＨ）、モノアミンオキシダーゼＢ（ＭＡＯ−Ｂ）、トリプトファンヒドロキシラーゼ（ＴＰＨ）、小胞モノアミン輸送体２（ＶＭＡＴ２）、Ｐａｔｃｈｅｄホモログ（ＰＴＣＨ）、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（ＳＭＯ）またはチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）など）を発現しなければならない。
２．細胞形態学（例えば、樹状突起を有すること）。
【０２７２】
乏突起膠細胞に分化させた後で、下記のパラメーターが分析される場合がある：
１．乏突起膠細胞マーカーの発現：
ＧａＡＢＣ２／ＡＢＣＡ２：ミエリン鞘ではなく、乏突起膠細胞についての特異的マーカー。特異的に乏突起膠細胞に突き止められつつあるリソソーム結合膜タンパク質として。乏突起膠細胞の細胞体においてのみ検出される。電子顕微鏡法によって、ほとんどがリソソームの周りに、一部がゴルジ装置において検出される。
アンホテリン（Ｐ３０、ＨＭＧ−１）およびＲＩＰ：発達中のラット脊髄における乏突起膠細胞の初期マーカー。
炭酸脱水酵素ＩＩ（ＣＡＩＩ）：乏突起膠細胞に局在化する、乏突起膠細胞についてのマーカー。
ＣＮＰアーゼ：乏突起膠細胞についてのマーカー。
ガラクトセレブロシド：乏突起膠細胞についてのマーカー；培養中の乏突起膠細胞についての特異的な細胞表面抗原性マーカー。
微小管結合タンパク質４（ＭＡＰ−４）：アストログリアおよびオリゴデンドログリアについてのマーカー。
ミエリン−乏突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）：乏突起膠細胞成熟化の表面マーカー。
ＮＢ３Ｃ４：乏突起膠細胞に特異的である新規なモノクローナル抗体。
ネスチン：乏突起膠細胞系譜細胞のマーカー。
Ｏｌｉｇ２：このオリゴデンドログリア系譜マーカーは神経始原体およびオリゴデンドログリアにおいて発現され、乏突起膠細胞の発達のために必須である。ＰＭＩＤ：１５１９８１２８。
ＰＯＰ６６：腫瘍随伴性脳脊髄炎関連抗原であり、成体の乏突起膠細胞のマーカーである。
ＳｕｌｐｈＩ：これにより、乏突起膠細胞始原体細胞が特定される。
トランスフェリン結合タンパク質（ＴｆＢＰ）：鳥類の乏突起膠細胞についてのマーカー。
トランスフェリン：ガラクトセレブロシドよりも早期に発現される乏突起膠細胞特異的マーカー。
２．ミエリンを産生する能力；および
３．細胞形態学（分岐および分枝した表現型ならびにミエリン膜の形成）。
【０２７３】
本明細書中に記載される患者由来の分化細胞集団および非分化細胞集団は、脳障害の処置のために使用され得る作用因についてスクリーニングするために使用され得ることが理解されるであろう。
【０２７４】
したがって、本発明のさらに別の局面によれば、脳疾患を処置するための作用因を選択する方法であって、脳障害の患者から単離されるＭＳＣの集団が、前記脳障害に関連する系譜特異的細胞に向かって分化する能力を前記作用因の存在下および非存在下において分析することを含み、ただし、前記作用因の存在下におけるＭＳＣの対照集団に由来する同一の系譜特異的細胞と比較して、前記系譜特異的細胞の機能または形態学の改善により、前記作用因が前記脳疾患の処置のために使用され得ることが示される、方法が提供される。
【０２７５】
作用因はさらに、患者由来のＭＳＣを系譜特異的細胞に分化させた後でスクリーニングされ得る。第２の系譜特異的細胞に対する上記系譜特異的細胞の影響が上記作用因の存在下および非存在下で分析され得る。例えば、ＡＬＳ患者由来のＭＳＣを星状膠細胞に分化し得る。この星状膠細胞を、推定される作用因の存在下および非存在下においてニューロン細胞（例えば、運動ニューロン）と共培養し得る。ニューロン細胞に対する星状膠細胞の細胞毒性を低下させる作用因が、ＡＬＳを処置するために好都合である場合がある。
【０２７６】
スクリーニングされ得る例示的な作用因には、核酸、例えば、ポリヌクレオチド、リボザイム、ｓｉＲＮＡおよびアンチセンス分子（限定されないが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド、ペプチド核酸、ならびに、変化させた骨格構造および／または塩基構造あるいは他の化学的修飾を有するポリヌクレオチドアナログを含む）；タンパク質、ポリペプチド（例えば、ペプチド）、炭水化物、脂質および「小分子」薬物候補物が含まれる。「小分子」は、例えば、天然に存在する化合物（例えば、植物抽出物または微生物ブロスなどに由来する化合物）あるいは合成された有機化合物または有機金属化合物であって、分子量が約１００００ダルトン未満であるもの、好ましくは約５０００ダルトン未満であるもの、最も好ましくは約１５００ダルトン未満であるものであり得る。
【０２７７】
作用因が、患者ＭＳＣを分化させている期間中に培養培地に加えられる場合がある。作用因がポリペプチドまたはポリヌクレオチド（例えば、ｍｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡとハイブリダイゼーションし、その機能をダウンレギュレーションするポリヌクレオチド作用因）であるとき、患者ＭＳＣは、当該作用因を発現するように遺伝子改変される場合があることが理解されるであろう。細胞を遺伝子改変する様々な方法が本明細書中上記で記載される。
【０２７８】
特定の細胞タイプについて分析され得る例示的な形態学、およびそのような分析を行う様々な方法が本明細書中上記で記載される。
【０２７９】
分析され得る例示的な細胞機能には、例えば、特定のタンパク質または特定の一組のタンパク質の発現（発現の相対的量を含む）、特定のｍｉＲＮＡまたは特定の一組のｍｉＲＮＡの発現、特定の因子（例えば、神経栄養因子）の分泌、特定の因子（例えば、神経栄養因子）に応答する能力、および（本明細書中上記で記載されるように）別の細胞タイプに影響を与える能力が含まれる。
【０２８０】
本発明者らは、患者に由来するＭＳＣ集団が、特定の疾患に関連する変異を含む場合があることを示している（実施例１（本明細書中下記）を参照のこと）。本発明では、これらの疾患に関連する変異を正常なＭＳＣ集団に導入すること（または遺伝子サイレンシングを行うこと）、およびこれらの変異させた集団を系譜特異的細胞に分化させることが意図される。そのような系譜特異的細胞は、疾患モデルとして、または新しい薬物についてスクリーニングするために、患者ＭＳＣに由来する系譜特異的細胞の代替または並行で使用することができる。
【０２８１】
本明細書中に記載される患者間葉系幹細胞集団は個々に貯蔵される場合があり、またはバンクに含まれる場合があり、この場合、それぞれの集団が特定のパラメーターに従って分類される。
【０２８２】
したがって、本発明のさらなる別の局面によれば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）バンクを作製する方法であって、未分化間葉系幹細胞を、脳障害を有する複数の対象から採取して、複数の別個の細胞集団を得ること；前記間葉系幹細胞を系譜特異的細胞に向かって分化させること；前記未分化間葉系幹細胞および前記系譜特異的細胞を貯蔵し、それにより、間葉系幹細胞バンクを作製することを含む方法が提供される。
【０２８３】
本発明のこの局面の間葉系幹細胞バンクは、脳障害の患者に由来する１つまたは複数のＭＳＣ集団（分化ＭＳＣ集団および未分化ＭＳＣ集団の両方）の物理的収集物である。そのようなバンクは好ましくは、それぞれのＭＳＣ集団の２つ以上のサンプル（すなわち、アリコート）を含有する。未分化間葉系幹細胞を採取することが本明細書中上記で記載される。ＭＳＣ集団は、骨髄、脂肪組織、臍帯血および胎盤を含む様々な供給源に由来する場合がある。分化ＭＳＣ集団が、本明細書中に記載される方法に従って作製される場合がある。上記バンクはまた、ＭＳＣ集団を拡大および／または分化させるために使用されるヒトフィーダー細胞および／またはヒト血清の１つまたは複数のサンプルを含有する場合がある。
【０２８４】
ＭＳＣ集団は、幹細胞を生存したままで、かつ、機能を有したままで保つために（典型的には凍結によって）適切な条件のもとで貯蔵される。１つの実施形態によれば、ＭＳＣ集団は、凍結保存された集団として貯蔵される。他の保存方法が、米国特許第５６５６４９８号、同第５００４６８１号、同第５１９２５５３号、同第５９５５２５７号および同第６４６１６４５号に記載される。幹細胞のバンクを作製するための方法が、例えば、米国特許出願公開第２００３／０２１５９４２号に記載される。
【０２８５】
１つの実施形態によれば、バンクに貯蔵される未分化の細胞集団は、少なくとも１つの所定の特徴に従って特徴づけられる。
【０２８６】
加えて、バンクに貯蔵される分化した細胞集団はまた、少なくとも１つの所定の特徴に従って特徴づけられる場合がある。
【０２８７】
所定の特徴には、形態学的特徴、分化プロフィル、血液型、主要組織適合遺伝子複合体、ドナーの疾患状態、あるいは、疾患に関連または関連しない遺伝子型情報（例えば、遺伝子あるいはゲノムＤＮＡまたはミトコンドリアＤＮＡに関連する特異的な核酸配列の一塩基多型、すなわち、「ＳＮＰ」）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２８８】
１つの具体的な実施形態によれば、分化細胞の所定の特徴は、（本明細書中上記で記載されるような）系譜特異的細胞の第２の集団に対する影響を含む。
【０２８９】
カタログ作成は、それぞれの細胞集団について得られる特徴の集中記録、例えば、集められた文書記録、または情報が入力されるコンピューターデータベース（これらに限定されない）などを新たに作ることの一部となる場合がある。幹細胞バンクは、研究者または臨床医の要求のために好適である特定の間葉系幹細胞サンプルを複数のサンプルから選択することを容易にする。
【０２９０】
１つの実施形態によれば、本明細書中に記載される間葉系幹細胞バンクは幹細胞データベースコンピューターユニットによって維持される。それぞれのコンピューターユニットが、情報を処理するためにそれぞれ、少なくとも１つの処理モジュールを含む。コンピューターユニットが、ディスプレーに通信接続される場合がある。間葉系幹細胞集団に関する情報がデータベースコンピューターに記憶される場合があり、この場合、情報は使用者にネットワーク接続によって伝えられる。そのようなシステムは、間葉系幹細胞集団を評価して、どれが進行中の研究および使用のために好適であるかを決定することができることを顧客に提供し、また、幹細胞を購入するという取引および適正な輸送を容易にするために役立つ場合もある。
【０２９１】
当業者によって理解されるであろうように、本発明の様々な実施形態が、処理モジュール、および／または少なくとも１つのプログラムコードモジュールを含むコンピュータープログラム製造物を含むデバイスまたはシステムとして具体化される場合がある。したがって、本発明は、完全にハードウエアの実施形態の形態、またはソフトウエア側面およびハードウエア側面を組み合わせる実施形態の形態を取る場合がある。さらに、本発明は、コンピューター使用可能なプログラムコード手段が当該媒体において具体化されているコンピューター使用可能な記憶媒体におけるコンピュータープログラム製造物を含む場合がある。好適なコンピューター読み取り可能な媒体はどれも利用される場合があり、これには、ハードディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、光学的記憶デバイスまたは磁気記憶デバイスが含まれる。
【０２９２】
用語「処理モジュール」は、単一の処理デバイスまたは複数の処理デバイスを含む場合がある。そのような処理デバイスは、マイクロプロセッサー、マイクロコントローラー、デジタルシグナルプロセッサー、マイクロコンピューター、中央処理ユニット、現場でプログラム可能なゲートアレイ、プログラム可能論理デバイス、ステートマシン、論理回路、アナログ回路、デジタル回路、および／またはシグナル（アナログおよび／またはデジタル）を操作命令に基づいて扱う任意のデバイスであり得る。処理モジュールは、メモリデバイスを、運用において処理モジュールにつながれて、または処理モジュールと一体化されて有する場合がある。メモリデバイスは、単一のメモリデバイスまたは複数のメモリデバイスである場合がある。そのようなメモリデバイスは、リード・オンリー・メモリ、ランダム・アクセス・メモリ、揮発性モメリ、不揮発性メモリ、スタティックメモリ、ダイナミックメモリ、フラッシュメモリ、および／またはデジタル情報を記憶する任意のデバイスであり得る。コンピューターは、本明細書中で使用される場合、少なくとも１つの処理モジュールおよび必要な場合には少なくとも１つのメモリデバイスを含むデバイスである。
【０２９３】
コンピューター使用可能またはコンピューター読み取り可能な媒体は、例えば、電子的、磁気的、光学的、電磁的、赤外線または半導体のシステム、装置、デバイスまたは伝搬媒体であり得、またはそれらを含み得るが、これらに限定されない。コンピューター読み取り可能な媒体のより具体的な例（非網羅的リスト）には、下記のものが含まれるであろう：１つまたは複数のワイヤを有する電気的接続物、携帯可能なコンピューターディスケット、ランダム・アクセス・メモリ（ＲＡＭ）、リード・オンリー・メモリ（ＲＯＭ）、消去可能なプログラム可能リード・オンリー・メモリ（ＥＰＲＯＭまたはフラッシュメモリ）、光ファイバー、および携帯可能なコンパクトディスク・リード・オンリー・メモリ（ＣＤ−ＲＯＭ）、ＣＤ  ＲＯＭ、ＤＶＤ（デジタルビデオディスク）あるいは他の電子的記憶媒体。コンピューター使用可能またはコンピューター読み取り可能な媒体は、プログラムが印刷される紙または別の好適な媒体でさえあり得ることには留意されたい。これは、プログラムは、例えば、紙または他の媒体の光学的走査により電子的に取り込むことができ、その後、必要ならば、好適な様式でコンパイルし、または解釈し、または他の場合には処理することができ、その後、コンピューターメモリに記憶することができるからである。
【０２９４】
本発明のある特定の実施形態を実施するためのコンピュータープログラムコードは、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｓｍａｌｌｔａｌｋ、Ｐｅｒｌ、Ｐｙｔｈｏｎ、Ｒｕｂｙ、Ｌｉｓｐ、ＰＨＰ、“Ｃ”、ＦＯＲＴＲＡＮまたはＣ＋＋（これらに限定されない）を含めて、オブジェクト指向プログラミング言語および／または従来の手続き型プログラミング言語で書かれる場合がある。プログラムコードは、スタンドアロン型ソフトウエアパッケージとして、全体が使用者のコンピューターで、または一部が使用者のコンピューターで実行される場合があり、あるいは、一部が使用者のコンピューターで、かつ、一部がリモートコンピューターで実行される場合があり、あるいは、全体がリモートコンピューターで実行される場合がある。後者の状況では、リモートコンピューターがローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）または広域ネットワーク（ＷＡＮ）を介して使用者のコンピューターに接続される場合があり、あるいは、接続が、（例えば、インターネット・サービス・プロバイダーを使用してインターネットを介して）外部コンピューターに対してなされる場合がある。
【０２９５】
本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を示す。
【０２９６】
用語「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの同根語は、「含むが、それらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。
【０２９７】
用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、「含み、それらに限定される（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。
【０２９８】
表現「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、さらなる成分、工程および／または部分が、主張される組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にだけ、組成物、方法または構造がさらなる成分、工程および／または部分を含み得ることを意味する。
【０２９９】
本明細書中で使用される場合、単数形態（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照物を包含する。例えば、用語「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または用語「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含めて、複数の化合物を包含し得る。
【０３００】
本開示を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解しなければならない。従って、範囲の記載は、具体的に開示された可能なすべての部分範囲、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値を有すると見なさなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、具体的に開示された部分範囲（例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など）、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値（例えば、１、２、３、４、５および６）を有すると見なさなければならない。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。
【０３０１】
数値範囲が本明細書中で示される場合には常に、示された範囲に含まれる任意の言及された数字（分数または整数）を含むことが意味される。第１の示された数字および第２の示された数字「の範囲である／の間の範囲」という表現、および、第１の示された数字「から」第２の示された数「まで及ぶ／までの範囲」という表現は、交換可能に使用され、第１の示された数字と、第２の示された数字と、その間のすべての分数および整数とを含むことが意味される。
【０３０２】
本明細書中で使用される用語「方法（ｍｅｔｈｏｄ）」は、所与の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を示し、これには、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者に知られているそのような様式、手段、技術および手順、または、知られている様式、手段、技術および手順から、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者によって容易に開発されるそのような様式、手段、技術および手順が含まれるが、それらに限定されない。
【０３０３】
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供されることもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで、あるいは本発明の他の記載される実施形態において好適なように提供することもできる。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。
【０３０４】
本明細書中に記載されるそれぞれのｍｉＲＮＡについて、対応する配列（成熟型配列およびプレ配列）が、明細書の一部として見なされなければならない配列表において提供されることには留意される。
【０３０５】
本明細書中上記に描かれるような、および、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【実施例】
【０３０６】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。
【０３０７】
本明細書で挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、個々の刊行物、特許および特許出願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。節の見出しが使用されている程度まで、それらは必ずしも限定であると解釈されるべきではない。
【０３０８】
実施例１
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、患者の上位および下位運動ニューロンを冒す原因不明の致死的な神経変性疾患である。合衆国ではおよそ５６００人が毎年、ＡＬＳと診断される。ＡＬＳの発生率は１０００００人あたり２人であり、３００００人もの多くのアメリカ人がある時点でこの疾患に罹り得ると推定されている。８０％の患者が診断後５年以内に死亡し、この場合、通常、死亡は呼吸不全のためである。今日に至るまで、ＡＬＳのための効果的な治療法は何もなく、ＦＤＡによって現在承認されている唯一の薬物が、生存率を６ヶ月増大させるＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト（リルゾール）である。この疾患のための新しい薬物を見出し、また、依然として大部分が不明であるが、その原因および作用機構をよりよく理解しようと努めることは避けられない。
【０３０９】
ＡＬＳの病理発生に関与する３つの細胞タイプが、運動ニューロン、骨格筋細胞および星状膠細胞である。これらの細胞が、家族性ＡＬＳ（ｆＡＬＳ）および散発性ＡＬＳ（ｓＡＬＳ）の両方の病理発生に関与している。しかしながら、ＳＯＤ１遺伝子における変異が、少なくともｆＡＬＳ患者の一部において役割を果たし得ることが知られているにもかかわらず、ｓＡＬＳにおいて、およびｆＡＬＳ患者の残りにおいて役割を果たす分子的機構が何であるかは現在、知られていない。ＳＯＤ−マウスが、ＡＬＳを処置するための新規な取り組みを研究するための受け入れられ得る実験モデルを表すにもかかわらず、ｆＡＬＳに対するＳＯＤ−マウスの関連性は依然として疑問のままである。そのうえ、実験的動物モデルが、ＡＬＳの症例の大多数を表すｓＡＬＳを研究するために何ら存在していない。最適な取り組みは、運動ニューロン変性の機構を、ｆＡＬＳ患者およびｓＡＬＳ患者に由来する細胞を使用して調べることであると考えられる。しかしながら、関連性のある細胞タイプのすべてをこれらの患者から単離することは事実上不可能である。可能性のある解決策が、ｉＰＳを作製し、ｉＰＳを関連性のある細胞タイプに分化させることである。ＡＬＳ由来のｉＰＳを首尾よく作製し、それらを運動ニューロンに分化させることが可能となっているにもかかわらず、これらの技術のための様々な制限には、誤った遺伝子型特徴および表現型特徴を持ち込み得る胚性遺伝子の発現、ならびに、分化させたｉＰＳは未だに臨床使用することができないので、これらの研究の結果を臨床にそのまま適用することができないことが挙げられる。
【０３１０】
本発明者らは近年、骨髄および脂肪組織に由来する間葉系間質幹細胞（ＭＳＣ）を星状膠細胞、骨格筋細胞および運動ニューロン始原体に分化させるための新規な取り組みを開発しており、ＡＬＳ由来のＭＳＣを下記の状況において用いることを提案する：
【０３１１】
１．全ゲノム分析およびｍｉＲＮＡ分析。
全ゲノム分析およびｍｉＲＮＡ分析を、未分化のＭＳＣと、運動ニューロン、星状膠細胞および骨格筋細胞に分化させられるＭＳＣとの両方のマイクロアレイを使用して行って、これらの細胞における違いを、正常な個体に由来する類似した細胞と比較して特定する。これらの結果はその後、この疾患の病理発生において役割を果たし得る新規な機構を特定するために、同様にまた、新規な治療標的を特定するために使用することができる。そのうえ、分化ＭＳＣによる置換療法はＡＬＳ患者のための最も合理的な治療的取り組みを表し得るので、これらの結果は、どの細胞タイプがＡＬＳ患者の処置のために臨床使用されなければならないかを決定することにおいて臨床的意味合いを有する場合がある。実際、ｍｉＲＮＡマイクロアレイ分析を使用する本発明者らの予備的研究では、特異的ｍｉＲＮＡの発現におけるいくつかの変化が、ＡＬＳ個体および正常な個体に由来するＢＭ−ＭＳＣにおいて特定されている。
【０３１２】
２．星状膠細胞、骨格筋細胞および運動ニューロンへのＭＳＣの分化。骨髄由来ＭＳＣおよび脂肪由来ＭＳＣの両方を正常者およびＡＬＳ患者から得られるＡＬＳに関連性のある細胞のすべてに分化させるための新規な取り組みは、本発明者らに、この疾患のインビトロモデルを独自に作製することができることがもたらす。ｆＡＬＳおよびｓＡＬＳの両方のこのモデルは、分子的機構（遺伝子アレイおよびｍｉＲＮＡアレイ）、表現型変化および種々の機能的アッセイを明確化するために使用される場合がある。このモデルはまた、本発明者らがそれぞれの特異的な細胞タイプの役割を単独または組合せでこの疾患の病理発生において明確化することを可能にすることができる。加えて、このモデルは、運動ニューロンの生存を促進させること（ｍＳＯＤ１の影響を中和するか、または神経栄養性支持を提供すること）、骨格筋の萎縮を妨げること、または損なわれた星状膠細胞の機能を変化させることをＡＬＳ患者においてもたらし得る小分子についてスクリーニングするためのハイスループット細胞型アッセイを開発するために使用することができる。
【０３１３】
加えて、ＡＬＳ由来のＭＳＣは、特定のＳＯＤ変異体または他の関連変異体あるいはサイレンス変異ＳＯＤまたは他の関連遺伝子を導入し、そのような種々の分化細胞の機能を分析することによって改変することができる。
【０３１４】
したがって、ＭＳＣを、ＡＬＳの病理発生において役割を果たし得るすべての関連細胞タイプに分化できることは、患者自身のＭＳＣ、健康な家族の誰かのＭＳＣ、または処置のために臍帯もしくは胎盤に由来するＭＳＣのいずれかを使用して、すべてのＡＬＳ患者の関連性のある分子的異常および細胞異常を完全な個別化に基づいて特異的に特定するための実用的取り組みをもたらすことができ、また、最適な治療的取り組みのための手がかりをもたらすことができる。
【０３１５】
３．ＡＬＳ患者におけるＭＳＣの臨床適用。
いくつかの研究により、患者由来のＭＳＣを神経変性疾患（例えば、多発性硬化症およびＡＬＳなど）において使用することの安全性が明らかにされた。しかしながら、これらの細胞の治療効率は限定される。したがって、特異的細胞集団に取って代わることができるか、または、患者の細胞の異常な機能を改善し得る特異的な神経栄養因子を提供することができる分化ＭＳＣの使用が、より効率的な取り組みであり得る。インビトロモデルの研究は、疾患の病理発生と、必要としている患者の効率的処置のために使用され得る自己または同種の分化細胞によって達成され得る治療標的とに関する重要な情報を臨床医に提供することができる。実際、ＡＬＳの病理発生がよりよく理解された時点で考慮するべき非常に重要な点が、患者由来のＭＳＣが治療的に使用されるべきか否か、あるいは、ＡＬＳの最適な処置が、正常なドナーから得られるＭＳＣ、しかもおそらくは、適応されるやいなや既製の治療用細胞として在庫から使用することができ、これにより患者自身または家族の誰かのＭＳＣを分化させるために要求され得る時間の浪費を回避できる、非血縁者の胎盤または臍帯に由来するＭＳＣの万能的集団から得られるＭＳＣの使用に依存し得るかどうかである。近年の研究では、ｆＡＬＳおよびｓＡＬＳの両方に由来する星状膠細胞が、運動ニューロンに対する神経毒性影響を及ぼし得ることが明らかにされた。このことは、分化ＭＳＣを含めて、患者に由来する細胞が、それらの治療的利益を損なう可能性がある表現型を示し得ることを示唆する。したがって、非改変ＭＳＣおよび分化ＭＳＣの機能を、正常な個体から得られる類似した細胞と比較して、疾患に関連性のある細胞の状況において分析することにより、患者を処置するための最適な細胞供給源に関して直接的な臨床的意味合いを有するであろう重要な情報がもたらされる場合がある。
【０３１６】
分化させた自己ＭＳＣがＡＬＳ患者の処置に適さない可能性がある場合には、正常な家族の誰かから得られるＭＨＣ完全一致のＭＳＣまたはハプロタイプ一致のＭＳＣが、より良好な代替を表す場合がある。実際には、上記で示されるように、ＭＳＣの細胞表面におけるＭＨＣ（特にＭＨＣクラスＩＩ）の低い発現を考慮すると、また、それらの拒絶を防止することができるそれらの免疫抑制性を考慮すると、胎盤および臍帯ワルトンゼリーから調製される分化ＭＳＣの使用により、ＡＬＳ、同様にまた、他の神経変性障害を有する患者のための理想的な「在庫」処置がもたらされる場合がある。これに関連して、胎盤および臍帯に由来するＭＳＣは、関連性のあるすべての細胞タイプに等しく申し分なく分化させることができることには言及しなければならない。
【０３１７】
非血縁者の同種ＭＳＣの潜在的使用を、同系かつＨ−２同一のハプロタイプ一致ドナーまたはＭＨＣ完全不一致ドナーに由来する非改変ＭＳＣおよび分化ＭＳＣを使用して、同様にまた、ＡＬＳ患者に由来するＭＳＣによりマウスを処置することの治療的利益を胎盤または臍帯に由来する正常なＭＳＣとの比較で比較することによって、ｆＡＬＳの動物モデルを現在表すＳＯＤ−マウスにおいて調べることができる。
【０３１８】
４．ＡＬＳにおける送達ツールとしてのＭＳＣ。
ＭＳＣは、様々な因子を隣接細胞に送達することが示されている（例えば、増殖因子、ウイルス、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡなど）。重要な概念が、組織の神経支配が、神経支配された組織によって分泌されるシグナル伝達インプット（例えば、神経栄養因子など）に依存しているということである。したがって、本発明者らの仮説は、ＭＳＣ由来の骨格筋細胞が、栄養性因子および関連性のあるｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを、とりわけＡＬＳの早期段階において、すなわち、運動ニューロンが依然として機能的であるときにおいて、変性した運動ニューロンに送達するための最適な細胞であり得るということである。骨格筋に加えて、星状膠細胞が、神経栄養性の支援を提供すること、および神経毒性因子または過剰な興奮性神経伝達物質（例えば、グルタミン酸など）をニューロンの微小環境から除くことにおいて重要な役割を果たす別の細胞タイプである。したがって、本発明者らは、ＭＳＣ由来の骨格筋細胞または星状膠細胞が、運動ニューロンの機能および生存のために重要である特異的な神経栄養因子（例えば、ＧＤＮＦ、ＶＥＧＦおよびＩＧＦ−１など）を送達することができ、かつ、神経毒性因子を除くことができるかを分析するために本発明者らのＡＬＳインビトロモデルを使用することを提案する。
【０３１９】
加えて、近年の研究では、ＳＯＤ１のサイレンシングがＡＬＳ患者における治療的利益をもたらし得ることが示唆される。しかしながら、このタイプの治療に対する制限が送達様式である。近年、ＭＳＣはｓｉＲＮＡおよび合成ｍｉＲＮＡ模倣体の両方を隣接細胞に効率的に送達することができることが明らかにされている。したがって、ＳＯＤ１または関連性のある他のｓｉＲＮＡ、同様にまた、ＡＬＳの病理発生に関係づけられている関連性のあるｍｉＲＮＡ（例えば、筋形成においてもまた重要であるｍｉＲ−２０６およびｍｉＲ−１など）の両方の治療的可能性をスクリーニングするために本インビトロモデルを使用することが示唆される。特異的な神経栄養因子およびｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡの組合せもまた、同様に試験される場合がある。
【０３２０】
５．さらなる神経変性障害に対する類似したインビトロモデルの開発。
ＡＬＳについて提案されるものと類似したモデルを、さらなる神経変性障害についての病理発生および望ましい治療的取り組みを研究するために開発することができる。例えば、本発明者らはドーパミン作動性ニューロンをＭＳＣから作製することができた。これらのニューロンは、パーキンソン病の病理発生の一因である新規な分子的機構を特定するために、また、薬物スクリーニングのための、または細胞に基づくパーキンソン病の最適な処置を設計するためのハイスループットシステムを提供するために用いられる場合がある。
【０３２１】
類似したインビトロモデルを、異なる不明の病理発生によってそれぞれが引き起こされる一群の障害をおそらくは表す自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、レット症候群、アルツハイマー病、ハンチントン病、および原因が不明であり、かつ、用いることができる効果的な処置がないさらなる神経変性障害の病理発生を、疾患特異的な異常または患者特異的な欠如に注目して研究するために開発することができる。まとめると、所与の疾患の損傷した組織または異常な組織に似ている細胞を作製することが実行可能であることは、新しい薬物設計に向けた関連性のある疾患特異的モデルに基づいて、または最適な細胞処置に向けた道を開いて、不治であると現時点では見なされる多くの疾患のより良い診断および最適な処置のための新しい疾患特異的な取り組み、またはさらに個別化された取り組みをもたらす場合がある。
【０３２２】
ＡＬＳ患者に由来するＭＳＣは、健常者対照に由来するＭＳＣとは異なる遺伝子およびｍｉＲＮＡを発現する：
ＡＬＳ患者に由来するＭＳＣが、健常者対照に由来するＭＳＣと異なるかどうかを調べるために、本発明者らは、ＡＬＳ患者から得られる７つのＭＳＣ培養物と、健常者対照から得られる７つのＭＳＣ培養物とを比較した。
【０３２３】
最初に、これらのＭＳＣから得られるＤＮＡサンプルを、ＳＯＤ１、およびさらなる遺伝子ＴＡＲＤＢＰ（すなわち一部の散発性ＡＬＳ患者において変異し、これらの患者の病理発生において役割を果たすことが報告されているタンパク質）における変異について調べた。
【０３２４】
調べられた７つのＭＳＣはどれも、ＳＯＤ１の変異を有していなかった。対照的に、ＡＬＳ患者の１名がＴＡＲＤＢＰ遺伝子における変異を有していた。
【０３２５】
次に、遺伝子アレイおよびｍｉＲＮＡアレイを、それらの遺伝子発現およびｍｉＲＮＡ発現における違いを特定するために、ＡＬＳおよび正常者対照から得られるＭＳＣに対して行った。遺伝子アレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ａｒｒａｙ  ４×４４Ｋ）を使用した場合、ＡＬＳ由来ＭＳＣおよび対照由来ＭＳＣにおいて示差的に発現した１６４個の遺伝子が特定された。
【０３２６】
部分的なリストが下記に示される。
【０３２７】
ダウンレギュレーションを受ける遺伝子
１．ＢＭＰ６−運動ニューロンの生存において役割を果たす（−２．８）。
２．メラノコルチン２−脊髄において神経栄養効果を及ぼす（−３．５）。
３．ＭＡＲＫＳＬ１−アクチン安定性およびニューロン遊走を決定する（−３．８）。
４．フィブリリン２−ＴＧＦ−ｂｅｔａシグナル伝達および筋機能において役割を果たす（−４．３）。
５．ＣＯＬ５Ａ３−筋萎縮において低下した（−４．４）。
６．ＤＡＰ１２−炎症を伴うことなく、死んだニューロンの除去のために要求され、ミエリン形成およびシナプス活性のために重要である（−５．２）。
【０３２８】
アップレギュレーションを受ける遺伝子
１．細胞質アルファアクチン（＋２．９）
２．ヒトアルド−ケトレダクターゼ（＋６．８）
３．ＤＹＮＬＴ１ダイニン、軽鎖、Ｔｃｔｅｘタイプ１（＋８．９）
【０３２９】
ｍｉＲＮＡ分析を使用した場合、これら２つの群のＭＳＣにおいて示差的に発現した１４個のｍｉＲＮＡが特定された。この場合、それらのいくつかが脳筋に特異的であり、あるいは、ＲＯＳの生成またはＢＮＤＡ受容体の機能不全に関連する。
ｍｉＲ−１７−５ｐ
ｍｉＲ−３７２
ｍｉＲ−３７３
ｍｉＲ−１４６ｂ
ｍｉＲ−１８１ａ
ｍｉＲ−１８１ｄ
ｍｉＲ−１２４ａ−脳特異的であり、ニューロン分化を誘導する
ｍｉＲ−１２８ａ−ＲＯＳ生成を調節する
ｍｉＲ−１２８ｂ−脳特異的である
ｍｉＲ−１３５ｂ
ｍｉＲ−１８３
ｍｉＲ−２１９−ＮＭＤＡ受容体の機能不全に関連する
ｍｉＲ−１３３ａ−筋特異的である
ｍｉＲ−１３３ｂ
【０３３０】
まとめると、これらの結果はさらに、ＡＬＳ患者に由来するＭＳＣはそれらの遺伝子およびｍｉＲＮＡの発現において異なること、また、これらの違いのいくつかがＡＬＳの病理発生に関連し得ることを明らかにする。
【０３３１】
星状膠細胞に分化させられるＡＬＳ由来ＭＳＣの馴化培地は運動ニューロンの細胞死を誘導する。
近年の研究では、星状膠細胞がＡＬＳの病理発生に関係づけられた。これらの研究は、ＡＬＳ患者に由来する星状膠細胞を健常者個体に由来する運動ニューロンと共培養することにより、これらの細胞の細胞死が誘導されたことを明らかにした。類似した結果が、星状膠細胞に分化させられたＡＬＳ由来ＭＳＣに由来する馴化培地に関して得られた（Ｄｉａｚ−Ａｍａｒｉｌｌａ  Ｐ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、２０１１（Ｎｏｖ  １）、１０８（４４）：１８１２６〜３１、およびＨａｉｄｅｔ−Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＡＭ．、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２０１１（Ａｕｇ  １０）、２９（９）：８２４〜８）。
【０３３２】
分化させたＭＳＣ由来の神経細胞がＡＬＳのためのインビトロモデルとして役立ち得ることを調べるために、ＡＬＳ患者に由来する５つのＭＳＣ集団を星状膠細胞に分化させ、また、健常者対象に由来する５つのＭＳＣ集団を星状膠細胞に分化させた。培養された運動ニューロンの細胞死に対するそれらの馴化培地の影響を調べた。運動ニューロンを神経幹細胞から作製し、特異的マーカー（例えば、ＨＢ９、ｉｓｌｅｔ１およびＣｈＡＴなど）の発現によって特徴づけた。
【０３３３】
図８Ａ〜図８Ｂに例示されるように、健常者対照またはＡＬＳ患者に由来する非改変ＭＳＣの馴化培地は運動ニューロン培養物の細胞死を及ぼさなかった。対照的に、星状膠細胞に分化させられたとき、５つのＡＬＳ由来ＭＳＣのうちの３つが運動ニューロンの著しい細胞死を誘導し、これに対して、対照のＭＳＣはどれも、有意な細胞死を誘導しなかった。これらの結果は、ＡＬＳ由来星状膠細胞の神経毒性影響と類似して、星状膠細胞に分化したＭＳＣは運動ニューロンの細胞死を誘導することができ、したがって、この障害における疾患機構を研究およびハイスループット薬物スクリーニングのための効率的なインビトロ系として用いることができることを示している。
【０３３４】
これらの結果は、この疾患におけるＭＳＣの治療的使用のための重要かつ即時的な意味合いもまた有しており、また、同種ＭＳＣがこれらの患者の処置のためのより良い選択であり得ることを示唆している。
【０３３５】
ＭＳＣ由来の星状膠細胞をＡＬＳにおけるインビトロモデルとして使用することの実現可能性をさらに調べるために、ｗｔ型ＳＯＤ１または変異型ＳＯＤ１（ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ）のどちらかを有する骨髄ＭＳＣを星状膠細胞様の細胞に分化させ、それらの影響を非改変ＭＳＣおよび運動ニューロンに分化させられるＭＳＣの細胞毒性影響に関して調べた。
【０３３６】
図９に示されるように、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ変異体を発現するＭＳＣ由来の星状膠細胞様細胞は運動ニューロンの細胞死を誘導し、これに対して、非改変ＭＳＣは有意な影響を有していなかった。これらの結果は、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ変異体を有するＭＳＣに由来する星状膠細胞様の細胞は、ＡＬＳ由来の星状膠細胞と類似する特徴を示すことを示しており、さらに、これらの細胞をこの疾患のためのインビトロモデルとして使用することの実現可能性を明らかにする。
【０３３７】
実施例２
パーキンソン病
パーキンソン病（ＰＤ）は、強直、動作緩慢および静止時振戦によって特徴づけられる進行性の神経変性疾患である。この疾患の病理学的な際立った特徴が、中脳における黒質緻密部（ＳＮｃ）でのドーパミン作動性ニューロンの選択的喪失である。ＰＤの症例のほとんどが、未だに不明な原因および病理発生により散発的に発生する。可能性のある機構には、ミトコンドリア機能不全、酸化ストレス、小胞体ストレス、ユビキチン−プロテアソーム系の不全、いくつかの環境的要因、および遺伝的素因が含まれる。
【０３３８】
ＰＤの散発性型に加えて、すべてのＰＤ患者の約５％に認められる家族性型もまた存在する。ＰＤ症例のほとんどが散発性であるにもかかわらず、多数の遺伝的原因が知られており、これらには、アルファ−シヌクレイン遺伝子における優性変異、アラニン３０のプロリンへの変異（Ａ３０Ｐ）およびアラニン５３のトレオニンへの変異（Ａ５３Ｔ）、または正常なａ−シヌクレインの増大した合成が含まれる。そのうえ、α−シヌクレインタンパク質が散発性ＰＤにおけるレビー小体において特定された。このことは、ＰＤの病理発生におけるこのタンパク質についての役割をさらに裏付けている。
【０３３９】
家族性ＰＤについてのさらなる遺伝子が今日までに特定されている：常染色体劣性パーキンソン症候群の家族性型でのパーキン（ＰＡＲＫ２）、ＤＪ−１（ＰＡＲＫ７）またはＰＩＮＫ１（ＰＡＲＫ６）における変異、ならびに、常染色体優性パーキンソン症候群の家族性型でのＵＣＨ−Ｌ１（ＰＡＲＫ５）およびＬＲＲＫ２／ダルダリン（ＰＡＲＫ８）における変異またはα−シヌクレイン（ＰＡＲＫ４）のゲノム三重化。
【０３４０】
近年の研究では、上記遺伝子の遺伝子産物による機能の喪失または毒性機能の増加が家族性ＰＤおよび散発性ＰＤの両方の病理発生に関わっていることが示唆される。
【０３４１】
加えて、星状膠細胞がその進行および早期のニューロン機能不全の開始において役割を果たし、星状膠細胞におけるα−シヌクレイン蓄積が、ＰＤの臨床的症状の原因となる限られた脳領域における特異的ニューロン集団の細胞死を引き起こすことが近年には報告されている。最近の研究では、軸索を鞘で覆う乏突起膠細胞におけるａ−シヌクレインの蓄積もまた、関連したニューロンの神経変性を誘導し得ることが示される。最後に、ミクログリア細胞がＰＤの早期段階において星状膠細胞による活性化を受け、その後、この活性化がドーパミン作動性ニューロンに対する毒性影響を及ぼすことが示されている。したがって、他の神経変性障害と類似して、ＰＤの病理発生が病理学的な細胞・細胞相互作用によって媒介される。
【０３４２】
遺伝型形態のヒトＰＤによく似る遺伝的病変（例えば、パーキンにおけるホモ接合性欠失またはα−シヌクレインの過剰発現など）を有する動物モデルは、ドーパミン作動性ニューロンの喪失を再現することができていない。対照的に、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞に由来するドーパミン作動性ニューロン、またはパーキンソン病患者の線維芽細胞のｉＰＳによって得られるドーパミン作動性ニューロンが、ＰＤの病態生理学を研究するためのより良好なモデルを表すことが示されている。
【０３４３】
このモデルの欠点が、このモデルは臨床応用に移すことができないことにある。ＥＳＣおよびｉＰＳとは対照的に、骨髄、脂肪組織または胎盤に由来する成体間葉系間質細胞（ＭＳＣ）、あるいは、臍帯細胞に由来するＭＳＣは神経細胞に分化させることができ、また、ＰＤ患者の細胞治療に対して用いることができる。
【０３４４】
新規な取り組みが、ＭＳＣをドーパミン作動性ニューロンおよび星状膠細胞に分化させ、また、ＣＤ３４＋細胞をミクログリア細胞に分化させるために開発されている。したがって、ＰＤ患者から得られる骨髄由来幹細胞を、ドーパミン作動性ニューロンの細胞死に関与する分子的機構を理解するために使用することができる。具体的には、種々のタイプのＰＤの患者から得られるＭＳＣがドーパミン作動性ニューロンおよび星状膠細胞に分化させられ、ＣＤ３４＋細胞がミクログリア細胞に分化させられる。ＭＳＣおよびＣＤ３４＋細胞がα−シヌクレインにおける変異について調べられ、遺伝子アレイについて分析される。分化細胞が、１ヶ月の経過にわたって細胞死について調べられる。
【０３４５】
同様に、ＰＤ患者から得られる星状膠細胞の影響が、同じ患者から得られるＣＤ３４＋細胞から作製されるミクログリア細胞の存在下および非存在下での共培養において、正常者およびＰＤ患者から得られるドーパミン作動性ニューロンの細胞死に関して調べられる。細胞死に加えて、ニューロンは、酸化ストレスに対する感受性、プロテアソーム阻害、不溶性α−シヌクレインタンパク質の出現、ミトコンドリアの機能およびＥＲのストレス応答について調べられる。
【０３４６】
ドーパミン作動性ニューロン、星状膠細胞およびミクログリアはすべて、潜在的な細胞標的であるので、そのようなモデルは、この疾患のための可能性のある処置を開発するための重要な情報をもたらすことができる。加えて、非改変のＭＳＣ、ならびに、ＮＳＣ、ニューロンおよび星状膠細胞への分化ＭＳＣは、この疾患のための可能性のある細胞治療処置として示唆されているので、このインビトロモデルは、どの細胞タイプが、すなわち、自己の、改変されたまたは分化させた、あるいは、同種の、ＭＨＣ一致または「在庫」の臍帯由来ＭＳＣおよび胎盤由来ＭＳＣが、置換療法のためのより良好な供給源を提供し得るかという重要な情報をもたらすことができる。
【０３４７】
最後に、ドーパミン作動性ニューロンおよび星状膠細胞に分化させられる種々のＰＤ患者由来ＭＳＣ、およびミクログリア細胞に分化させられるＣＤ３４＋細胞の作製は、小分子、薬物または遺伝子治療取り組みおよびサイレンシング取り組みを分析するためのスクリーニングツールをもたらす場合がある。
【０３４８】
実施例３
アルツハイマー病
アルツハイマー病（ＡＤ）は一般的な慢性神経変性疾患であり、認知症の最も一般的な原因である。この疾患の２つの際立った特徴が、老人斑（これは主に、アミロイドβの細胞外沈着から構成される）および神経原線維変化（これは、異常にリン酸化されたタウタンパク質の細胞間凝集物からなる）である。
【０３４９】
老人斑の存在はまた、ＡＤにおける顕著な初期の役割を果たすと考えられる炎症性応答に関連する。
【０３５０】
アルツハイマー病の症例の大多数が散発性であり、しかしながら、ＡＰＰ（これはアミロイド−β前駆体タンパク質をコードする）の変異または重複化、あるいは、プレセニリン遺伝子（これは、ＡＰＰをアミロイド−βに切断するタンパク質分解酵素をコードする）における変異を有するアルツハイマー病の優性遺伝性家族性型の希な症例が存在する。ＡＤの両方のタイプにおいて、さらなる細胞タイプ（例えば、星状膠細胞およびミクログリアなど）がこの疾患の病理発生に関係づけられている。このモデルでは、家族性ＡＤ患者および散発性ＡＤ患者の両方から得られるＭＳＣがニューロンおよび星状膠細胞に分化させられ、ＣＤ３４＋細胞がミクログリア細胞に分化させられる。細胞が、アミロイド−β、リン酸化タウ、ａＧＳＫ−３βおよびシナプシン１のレベルについて分析される。ＡＤ患者および対照から得られる星状膠細胞およびミクログリアの役割により、これらの細胞の役割が、この疾患の病理発生において、また、可能な治療標的として明確化されるであろう。実際、星状膠細胞は、ＡＤについて典型的な神経毒性β−アミロイド（Ａβ）沈着物をインビトロおよびインビボの両方で分解することができ、このことは、ＭＳＣ由来の星状膠細胞を移植することが治療的に有益であり得ることを示唆している。
【０３５１】
実施例４
レット症候群
レット症候群（ＲＴＴ）は、メチルｃｐＧ結合タンパク質２（ＭｓＣＰ２）の機能の喪失によって引き起こされるＸ染色体連鎖の自閉症スペクトラム障害である。より初期の研究では、この疾患はニューロンにおけるＭｅＣＰ２機能の喪失に起因すると結論されたにもかかわらず、近年の研究では、グリア細胞におけるＭｅＣＰ２の喪失が負の影響を細胞非自律的様式でニューロンに及ぼすことが明瞭に明らかにされた。そのうえ、ＭｅＣＰ２完全欠損マウスでの星状膠細胞におけるＭｅＣＰ２の再発現は、ヌルマウスと比較して、運動レベルおよび不安レベルを著しく改善し、呼吸の異常を正常なパターンにまで回復させ、かつ、寿命を大きく延ばした。加えて、変異型星状膠細胞に対するＭｅＣＰ２の修復は、インビボにおける変異型ニューロンに対する細胞非自律的な陽性の影響を及ぼし、これにより、正常な樹状突起形態学を回復させ、また、興奮性グルタミン酸輸送体のレベルを増大させた。したがって、グリア細胞が、ニューロンと類似して、ＲＴＴの神経病理学の不可欠な構成要素であり、また、この疾患の随伴症状を改善するための１つの方策としての、正常なＭｅＣＰ２レベルを有するグリア細胞を投与するという考えを裏づけているようである。
【０３５２】
星状膠細胞に加えて、ミクログリア細胞もまた、神経毒性である高レベルのグルタミン酸を分泌することによってこの疾患の病理発生に関係づけられている。
【０３５３】
このインビトロモデルは、ＭＳＣ由来のニューロンおよび星状膠細胞ならびにＣＤ３４＋細胞由来のミクログリア細胞からなる。レット症候群ニューロンおよび正常なニューロンの生存がミクログリア細胞および星状膠細胞の存在下および非存在下での長期培養において求められる。このモデルは、新規薬物のハイスループット分析のために、また、新規薬物および細胞治療（自己、同種、万能的ドナー、分化細胞および増殖因子分泌性）の組合せのために使用することができる。
【０３５４】
要約
近年の研究は、様々な神経変性障害（例えば、ＡＬＳ、パーキンソン病、レット症候群およびアルツハイマー病など）の病理発生に対する、また、精神医学的疾患（例えば、統合失調症など）に対する細胞非自律的な成分を明瞭に示唆している。したがって、細胞・細胞相互作用をこれらの疾患において研究することは、分子的機構を明確化するために、また、効率的な薬物に基づく治療法および細胞に基づく治療法を設計するために非常に重要である。
【０３５５】
関連性のある細胞タイプを使用するヒトのインビトロモデルが、下等生物種の系を補足するために、そして、それにより、ヒト疾患に対する直接の関連性があるさらなる機構および標的を確認し、評価し、同様にまた、発見するために必要である。
【０３５６】
さらなる疾患特異的モデル：
近年の研究は、ほとんどの神経変性障害の病理発生の一因である２つの共通する要因、すなわち、細胞非自律的な成分と、細胞・細胞相互作用および神経炎症とが存在することを示している。
【０３５７】
したがって、ＭＳＣ由来のニューロン細胞、星状膠細胞、ならびに、ＣＤ３４＋由来のミクログリア細胞から構成されるインビトロモデルが、神経変性障害の多くに共通し得るヒト疾患関連モデルの「基本的」成分を表す。そのうえ、これらの疾患の多くにおいて、それらの病理発生に関与するさらなる機構または二次的な機構が存在するので、対照細胞および分化細胞の全ゲノム分析により、新規な治療標的が明らかにされ得る。
【０３５８】
具体的な例：
１．ハンチントン病−グリア細胞における変異型ＨＤ遺伝子の発現がＨＤの神経学的症状を悪化させることが示されている。ＨＤ遺伝子のコード領域内におけるＣＡＧ反復の拡大に加えて、様々な異常が、例えば、主に星状膠細胞において現れる低下した脳のコレステロール生合成およびＡｐｏＥ、同様にまた、グルタミン酸輸送体１の低下した機能などが認められる。ミクログリアの活性化もまた、種々の経路を介するＨＤの病理発生に関係づけられている。
２．精神医学的障害−統合失調症は、多数の特定された危険因子による複雑な遺伝的障害であり、最も研究されているものが、Ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ  ｉｎ  Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ１（ＤＩＳＣ１）である。増え続ける多数の証拠は、統合失調症においてもまた神経炎症および免疫遺伝学の重要性を、ミクログリアおよび星状膠細胞をこの疾患の病理発生に関係づけて示している。
【０３５９】
インビトロＭＳＣモデルの利点：
１．個別化された疾患モデルの開発−「個別的」な患者疾患状態をインビトロにおいてモデル化すること
２．研究、薬物スクリーニング、毒性学スクリーニングおよび治療的試験のための新規な神経変性疾患モデルの作製
３．再生医療の個別化−自己対同種、非改変型対分化型、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは増殖因子分泌性
４．ハイスループット薬物スクリーニングのための、関連性のある細胞タイプに分化させられる患者特異的な特徴づけられたＭＳＣのコレクションの開発
【０３６０】
実施例５
配列
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【０３６１】
明確にするため別個の実施形態で説明されている本発明の特定の特徴は単一の実施形態に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
【０３６２】
本発明はその特定の実施形態によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。本明細書中で言及した刊行物、特許および特許願並びにＧｅｎｅＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号はすべて、個々の刊行物、特許または特許願またはＧｅｎｅＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ−８Ｂ】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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