(57)【要約】本発明は、患者の乳房前駆病変が浸潤性乳癌に進行するリスク及び／又は再発性非浸潤性疾患のリスクを判定する方法であって、患者から得られた乳房組織サンプル中のＰＡＰＰＡ及び／又はＰＡＰＰＡ機能活性の存在及び／又はレベルを検出することを含み、ＰＡＰＰＡが存在しない又は対照より低いレベルで存在する場合、浸潤癌への進行リスク及び／又は再発性疾患のリスクがある、方法に関する。別の実施形態では、診断は、患者サンプル中の前期又は前中期にある有糸分裂細胞の割合を同定することにより行うことができ、前期又は前中期にある細胞の割合が３０％以上である場合、これは浸潤性乳癌への進行リスク及び／又は再発性疾患のリスクを示す。本発明は更に、有糸分裂の正常な進行を回復することにより抗増殖剤、好ましくは抗有糸分裂剤に対して有糸分裂遅延乳癌を感受性にすることができる。この実施形態では、第１の薬物を投与して乳癌細胞を有糸分裂ブロックから解除し、増殖細胞に影響を与える第２の薬物を逐次投与して癌細胞を殺す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の増殖性病変が浸潤性乳癌に進行するリスク及び／又は再発性非浸潤性疾患のリスクを判定する方法であって、前記患者から得られた乳房組織サンプル中のＰＡＰＰＡの存在及び／又はレベルを検出することを含み、ＰＡＰＰＡが存在しない又は対照より低いレベルで存在する場合、浸潤癌への進行リスク及び／又は再発性疾患のリスクがある、方法。
【請求項２】
患者の増殖性病変が浸潤性乳癌に進行するリスク及び／又は再発性非浸潤性疾患のリスクを判定する方法であって、前記患者から得られたサンプル中におけるＰＡＰＰＡ遺伝子又はその制御若しくはプロモーター配列中の機能喪失に関連する遺伝子変化の存在を検出することを含み、遺伝子変化が存在する場合、浸潤癌への進行リスク及び／又は再発性疾患のリスクがある、方法。
【請求項３】
前記ＰＡＰＰＡ遺伝子又はその制御若しくはプロモーター配列中の機能喪失に関連する遺伝子変化がメチル化である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＡＰＰＡの存在が、ＰＡＰＰＡ特異的抗体、又はＰＡＰＰＡの遺伝子、ｍＲＮＡ、若しくは特異的ＰＡＰＰＡ変異に対するプローブを用いて同定される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
患者の増殖性病変が浸潤性乳癌に進行するリスク及び／又は再発性非浸潤性疾患のリスクを判定する方法であって、前記患者から得られた乳房組織サンプル中の前期又は前中期にある有糸分裂細胞の割合を同定し、予め定められたカットオフ値と比較することを含み、前記前期又は前中期にある細胞の割合が前記カットオフ値より大きい場合、浸潤性乳癌への進行リスク及び／又は再発性疾患のリスクがある、方法。
【請求項６】
前記カットオフ値が、前記サンプル中の有糸分裂細胞の少なくとも３０％である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記組織サンプル中の細胞の少なくとも５個が有糸分裂中である、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記前期又は前中期にある細胞の割合が、免疫検出を用いて決定される、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記免疫検出が、Ｈ３Ｓ１０ｐｈ抗体を用いて行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記組織サンプルが、増殖性病変を示す乳房組織である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記増殖性病変が、乳管上皮内癌（ＤＣＩＳ）、小葉上皮内癌（ＬＣＩＳ）、及び乳首のパジェット病を含む前浸潤性病変、並びに小葉新生物、小葉上皮内新生物、異型小葉過形成（ＡＬＨ）、平坦型上皮異型（ＦＥＡ）、異型乳管過形成（ＡＤＨ）微小浸潤癌、乳管内乳頭新生物、及び葉状腫瘍を含む悪性度の不明な増殖性病変から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項５に従属する場合、前記患者から得られた乳房組織サンプル中のＰＡＰＰＡの存在及び／又はレベルを検出することを更に含み、ＰＡＰＰＡが存在しない又は対照より低いレベルで存在する場合、浸潤性乳癌への進行リスク及び／又は再発性疾患のリスクがあ
る、請求項５〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＰＡＰＰＡの存在が、ＰＡＰＰＡ特異的抗体を用いて同定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項５に従属する場合、前記患者から得られた乳房組織サンプル中のＰＡＰＰＡ遺伝子又はその制御若しくはプロモーター配列のメチル化の存在を検出することを更に含み、メチル化が存在する場合、浸潤性乳癌への進行リスク及び／又は再発性疾患のリスクがある、請求項５〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前駆病変から浸潤性乳癌への進行のリスク及び／又は再発性疾患のリスクを判定するためのＨ３Ｓ１０ｐｈ免疫検出の使用。
【請求項１６】
ｉ．有糸分裂遅延細胞を解除する第１の薬物を投与すること；及び
ｉｉ．化学療法剤である第２の薬物を逐次投与すること
を含む、患者の乳癌を処置又は防止するための治療レジメン。
【請求項１７】
前記第１の薬物が、ＰＡＰＰＡタンパク質、機能的ＰＡＰＰＡをコードする核酸、ＩＧＦ受容体アゴニスト（例えば、ＩＧＦ−１）、又は脱メチル化剤である、請求項１６に記載の治療レジメン。
【請求項１８】
前記第２の薬物が、タキサン及びビンカアルカロイドを含む群から選択される、請求項１６又は１７に記載の治療レジメン。
【請求項１９】
前記患者が、
ｉ．前記患者から得られた乳房組織サンプル中の前期又は前中期にある有糸分裂細胞の割合を同定すること；及び
ｉｉ．予め定められたカットオフ値と比較すること、
により前記有糸分裂遅延表現型を示すとして最初に同定され、
前記前期又は前中期にある細胞の割合が前記カットオフ値より大きい場合、前記有糸分裂遅延表現型が同定され、前記組織サンプルが少なくとも５個の有糸分裂細胞を含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の治療レジメン。
【請求項２０】
前記カットオフ値が、前記乳房組織サンプル内の有糸分裂細胞の少なくとも３０％である、請求項１９に記載の治療レジメン。
【請求項２１】
前記患者が、前記患者から得られたサンプル中におけるＰＡＰＰＡ消失又はＰＡＰＰＡ遺伝子若しくはその制御若しくはプロモーター配列中の機能喪失に関連する遺伝子変化の存在を検出することにより、治療レジメンに係る処置に好適な候補であるとして最初に同定され、ＰＡＰＰＡ消失又は遺伝子変化がある場合、前記患者は治療レジメンに係る処置に好適な候補であるとして同定される、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の治療レジメン。
【請求項２２】
ＰＡＰＰＡ消失又はＰＡＰＰ遺伝子若しくはその制御若しくはプロモーター配列中の機能喪失に関連する遺伝子変化がメチル化によるものである、請求項２１に記載の治療レジメン。
【請求項２３】
乳癌の処置又は防止に用いるための、細胞分裂中の分子イベントを標的とする化学療法剤であって、細胞を有糸分裂遅延から解除する分子で先に処置された患者に投与される、化学療法剤。
【請求項２４】
タキサン及びビンカアルカロイドを含む群から選択される、請求項２３に記載の使用のための化学療法剤。
【請求項２５】
前記分子が、脱メチル化剤、ＩＧＦ受容体アゴニスト、好ましくはＩＧＦ−１、又はＰＡＰＰＡタンパク質である、請求項２３又は２４に記載の使用のための化学療法剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳房組織における増殖性病変の予後評価のため並びに増殖性病変が浸潤性乳癌に進行するリスク及び／又は再発性疾患の発症リスクを同定するための特異的な生物学的マーカーの使用並びにその後の処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
新生物及び癌は細胞の異常な成長である。癌細胞は、空間の制約、他の細胞により共有される栄養素、又は体から送られる複製停止シグナルにも関わらず急速に複製する。癌細胞は、しばしば、健康な細胞とは異なる形状をし、適切に機能せず、体の多くの領域に広がり得る。腫瘍と呼ばれる組織の異常な成長は、調節不能に成長及び分裂できる細胞のクラスターである。腫瘍は良性（非癌性）又は悪性（癌性）であり得る。良性腫瘍は、ゆっくりと成長する傾向があり、広がらない。悪性腫瘍は急速に成長して近くの正常組織に浸潤してこれを破壊することができ、体全体に広がり得る。悪性度が不明な前浸潤病変又は増殖性病変等の前駆病変とは、良性様式の挙動をすることもあれば浸潤悪性癌へと進行することもある組織の異常な成長を意味する。悪性癌は局所的に浸潤性且つ転移性であり得る。
【０００３】
乳癌は一般的な癌の一例であり、その形態学的及び生物学的異質性のため、複雑な疾患であり、化学療法抵抗性を獲得し易いこと及び複数の分子機構が存在することがその病態形成を際立たせている。乳癌の局所領域処置を受ける女性の半分は再発がないが、残りの半分は最終的に転移性疾患により死亡する。したがって、最適な臨床管理にはこれら２グループの患者を明確に区別することが必須である。浸潤性乳癌へ進行するリスクが高い前駆病変を有する患者を同定するための予後マーカーを同定することも緊急に必要である。しかし、残念なことに、乳癌の予後マーカーは限られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
乳癌の処置は癌の進行段階に応じて異なり得る。乳癌はしばしば初期に検出され、この時、癌は、例えば乳管上皮内癌（ＤＣＩＳ）では、前浸潤性と言われ、癌細胞又は非癌性異常細胞は隣接する正常組織に浸潤していない。処置の複雑さは、例えばＤＣＩＳの場合のように、全ての前浸潤癌が進行して浸潤性（又は転移性）になるのではないので、全ての患者を同じように処置する必要がないことである。問題は、現在、前浸潤性のまま留まる癌（又は異常細胞）を有する患者と浸潤癌に進行する患者を区別することが困難なことである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、有糸分裂の正常な進行に妊娠関連血漿タンパク質Ａ（ＰＡＰＰＡ）が必要であること及びＰＡＰＰＡのサイレンシングが浸潤性乳癌中及び浸潤性になり易い前浸潤性病変中に非常に多いという発見に基づく。したがって、本発明により、乳癌の生物学的原因の非常に重要な理解がもたらされ、より焦点の合った効率的な方法でその後の乳癌を検出及び処置することが可能になる。有糸分裂の正常な進行にＰＡＰＰＡが必要であること及びその発現消失又は機能障害が有意に癌状態、特に前浸潤癌から浸潤癌への進行の一因となるという理解から、ＰＡＰＰＡレベルのモニタリングによる乳癌の検出が可能になり、内因性ＰＡＰＰＡレベルを上昇させるターゲティング療法による処置が可能になる。
【０００６】
乳房組織内の増殖性病変中、ＰＡＰＰＡのレベル又は活性がない又は低下しており且つ有糸分裂中で停止している細胞は浸潤性の性質を発生し易い。したがって、本発明は、Ｐ
ＡＰＰＡのレベル／機能活性に基づいて又は有糸分裂遅延の表現型を示す細胞を同定することにより浸潤性乳癌を発症し易い患者の同定を可能にする。したがって、乳房組織サンプル内の増殖性病変は、非浸潤性のままである可能性が高い又は浸潤性になり易いのいずれかとして分類することができる。
【０００７】
本発明の第１の態様は、患者の増殖性病変が浸潤性乳癌に進行するリスク及び／又は再発性非浸潤性疾患のリスクを判定する方法であって、患者から得られた乳房組織サンプル中のＰＡＰＰＡの存在及び／又はレベルを検出することを含み、ＰＡＰＰＡが存在しない又は対照より低いレベルで存在する場合、浸潤癌への進行リスク及び／又は再発性疾患のリスクがある、方法に関する。
【０００８】
本発明の第２の態様は、患者の増殖性疾患が浸潤性乳癌に進行するリスク及び／又は再発性非浸潤性疾患のリスクを判定する方法であって、患者から得られたサンプル中のＰＡＰＰＡ遺伝子中又はその制御配列若しくはプロモーター配列中の機能喪失に関連する遺伝子変化の存在を検出することを含み、遺伝子変化が存在する場合、浸潤癌への進行リスク及び／又は再発性疾患のリスクがある、方法に関する。
【０００９】
本発明の第３の態様は、患者の増殖性疾患が浸潤性乳癌に進行するリスク及び／又は再発性非浸潤性疾患のリスクを判定する方法であって、患者から得られた乳房組織サンプル中の前期又は前中期にある有糸分裂細胞の割合を同定することを含み、前期又は前中期にある細胞の割合が３０％以上である場合、これが浸潤性乳癌への進行リスク及び／又は再発性疾患のリスクを示す、方法に関する。
【００１０】
本発明の第４の態様は、患者の増殖性病変が浸潤性乳癌に進行するリスク及び／又は再発性疾患のリスクを判定するためのＨ３Ｓ１０ｐｈ免疫検出の利用に関する。
【００１１】
本発明の第５の態様は、患者の乳癌を処置又は防止するための治療レジメンであって、（ｉ）有糸分裂遅延細胞を解除する第１の薬物を投与すること；及び（ｉｉ）化学療法剤である第２の薬物を逐次投与すること、を含む治療レジメンに関する。
【００１２】
第６の態様では、本発明は、乳癌の処置又は防止に用いるための、細胞分裂中の分子イベントを標的とする化学療法剤であって、有糸分裂遅延から細胞を解除する治療剤で先に処置された患者に投与される、化学療法剤を提供する。
【００１３】
以下に添付の図を参照して本発明を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１ａ】ヒトの癌における有糸分裂期の分布を示す図である。１ａは、外科的生検標本の組織切片中でＨ３Ｓ１０ｐｈ免疫標識により別個の有糸分裂期を同定している代表的画像である（拡大率１０００倍）。
【図１ｂ】ヒトの癌における有糸分裂期の分布を示す図である。１ｂは、正常乳房（ｎ＝患者５例）、リンパ腫（ｎ＝患者２９例）、乳癌（ｎ＝患者１５６例）、肺癌（ｎ＝患者３０例）、膀胱癌（ｎ＝患者２７例）、及び結腸癌（ｎ＝患者４１例）の各有糸分裂期に割り当てられる有糸分裂細胞のパーセンテージを示す円グラフである。
【図１ｃ】ヒトの癌における有糸分裂期の分布を示す図である。１ｃは、膀胱癌（拡大率１０００倍；スケールバー２０μｍ）及び他の種類の癌（図示せず）と比べて初期分裂像が多い乳癌（拡大率４００倍；スケールバー５０μｍ）及び非浸潤性の乳管上皮内癌（ＤＣＩＳ；拡大率４００倍；スケールバー５０μｍ）の代表的症例を示す図である。
【図２】有糸分裂マーカーとしてのホスホヒストンＨ３（Ｈ３Ｓ１０ｐｈ）の特異性を示す図である。二重チミジンブロックによりＨｅＬａ  Ｋｙｏｔｏ細胞をＧ１／Ｓ移行期で同調させ、５μＭ  Ｐｌｋ−１阻害剤ＢＩ２５３６（セレックケム社（ＳｅｌｌｅｃｋＣｈｅｍ）社製）処理により前中期に同調させた。非同調的増殖（ＵＴ）、チミジン停止、及びＢＩ２５３６処理細胞をホスホヒストンＨ３（Ｈ３Ｓ１０ｐｈ）について免疫標識した。ホスホヒストンＨ３は、免疫蛍光法又は発色性染色によりチミジン停止細胞中に検出されなかったが、ＢＩ２５３６処理細胞は、Ｈ３Ｓ１０ｐｈに陽性の前中期細胞（矢印）の濃縮を示した。右のパネルはＤＮＡ含有量のフローサイトメトリー分析を示す。
【図３】有糸分裂細胞の最低数を５とした、前期／前中期フラクションの受信者動作特性曲線を示す図である。
【図４】乳癌、ＤＣＩＳ、及び他の癌（プール）における前期／前中期フラクションの分布を示す図である。
【図５ａ】乳癌における初期有糸分裂像の濃縮を示す図である。５ａは、様々なヒト癌の前期／前中期にある有糸分裂細胞のパーセンテージを示すボックスプロットである。乳癌は、他の腫瘍タイプと比べて前期／前中期の有糸分裂細胞の割合が高いことで特徴づけられる（Ｐ＜０．０００１）。中央値（黒い実線）、四分位範囲（ボックス）、範囲（線の範囲内）を示す。範囲外のケースを孤立した点として示す。
【図５ｂ】乳癌における初期有糸分裂像の濃縮を示す図である。５ｂは、ホスホヒストンＨ３（Ｈ３Ｓ１０ｐｈ）について免疫標識され、別個の有糸分裂期に割り当てられた、正常乳房、乳癌、及び他の種類の癌の代表例の顕微鏡写真を示す（下部の凡例参照；拡大率１０００倍、スケールバー２０μｍ）。
【図６ａ】有糸分裂遅延表現型の獲得が多段階の乳房腫瘍進行の初期に起こることを示す図である。６ａは、正常な有糸分裂期分布（左パネル）及び前期／前中期の有糸分裂細胞の高い割合（右パネル）を示す、ホスホヒストンＨ３（Ｈ３Ｓ１０ｐｈ）を免疫染色した非浸潤性の乳管上皮内癌（ＤＣＩＳ）の代表的症例の顕微鏡写真を示す（拡大率１０００倍；スケールバー２０μｍ）。
【図６ｂ】有糸分裂遅延表現型の獲得が多段階の乳房腫瘍進行の初期に起こることを示す図である。６ｂは、前期／前中期遅延を示す正常乳房、ＤＣＩＳ、及び乳癌の症例のパーセンテージを示す棒グラフである。症例は、前期／前中期の有糸分裂細胞の割合が少なくとも３分の１である場合に遅延と定義した。このカットポイントは、非遅延型（９４．１％）として適切に分類される他の悪性腫瘍を合わせたグループ中の標本の割合が、遅延型（９４．９％）として適切に分類される乳癌標本の割合とほぼ等しくなるように選択された。
【図６ｃ】有糸分裂遅延表現型の獲得が多段階の乳房腫瘍進行の初期に起こることを示す図である。６ｃは、正常乳房、ＤＣＩＳ、及び乳癌における前期／前中期にある有糸分裂細胞のパーセンテージを示すボックスプロットである。正常乳房から浸潤性乳癌への移行中に初期有糸分裂遅延が増大する傾向がある（Ｐ＜０．００１）。
【図７】更なる研究のためのＭｉｔｏＣｈｅｃｋ前期／前中期クラス遺伝子の選択を示す図である。蛍光染色体マーカー（ヒストン２Ｂ−ＧＦＰ）を安定に発現する生きたＨｅＬａ  Ｋｙｏｔｏ細胞の微速度蛍光顕微鏡法により、ゲノムワイドなＭｉｔｏＣｈｅｃｋ  ＲＮＡｉスクリーニングを行った（１）。ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞の自動蛍光イメージング後、デジタル画像から有糸分裂期及び有糸分裂異常をコンピューターにより表現型決定した（２）。時間分解フェノプリント（ｐｈｅｎｏｐｒｉｎｔ）を解析して候補遺伝子を表現型によりクラスター化した（３）。ＭｉｔｏＣｈｅｃｋ前期／前中期クラス遺伝子のデータマイニングにより、初期有糸分裂期進行に関連した４１個の遺伝子が明らかになった（４、５）。複数の除外基準（例えば、二次表現型として大規模な細胞死がない）を用いて候補のリストを７遺伝子まで絞り、これらのノックダウンは前期／前中期にある有糸分裂細胞のパーセンテージを急激に上昇させた（６、７）。
【図８ａ】図８ａは、一次表現型として前中期停止／遅延、次いで二次表現型（二核性、多葉性、ブドウ状、及び細胞死）を示す、ＨｅＬａ細胞でゲノムワイドなＭｉｔｏＣｈｅｃｋスクリーニングにより同定された７個の候補遺伝子の時間分解ヒートマップを示す図である。
【図８ｂ】図８ｂは、７個の候補遺伝子ノックダウンが全て、前期／前中期にある有糸分裂細胞のパーセンテージを有意に上昇させたことを示す。
【図９ａ】ＰＡＰＰＡのサイレンシングがプロモーターのメチル化を介して乳癌における有糸分裂遅延に関連付けられることを示す図である。９ａは、正常乳房（ｎ＝患者３０例）、低悪性度（ｎ＝患者３９例）及び高悪性度（ｎ＝患者３６例）の非浸潤性ＤＣＩＳ乳房病変、並びに浸潤性乳癌（ｎ＝患者１７３例）における７個のＭｉｔｏＣｈｅｃｋ候補遺伝子のプロモーターのメチル化状態（メチル化基準遺伝子に対するパーセンテージ［ＰＭＲ］としてＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイにより決定される）を示すヒートマップである。ＰＭＲ値は、パネルの下の凡例に示されるように色の付いたバーで表される。
【図９ｂ】ＰＡＰＰＡのサイレンシングがプロモーターのメチル化を介して乳癌における有糸分裂遅延に関連付けられることを示す図である。９ｂは、ＰＡＰＰＡプロモーターのメチル化レベルによりランク付けした正常乳房（ｎ＝患者３０例）、ＤＣＩＳ（ｎ＝患者７５例）、及び乳癌（ｎ＝患者１７３例）の症例を示す積み上げ棒グラフである。
【図９ｃ】ＰＡＰＰＡのサイレンシングがプロモーターのメチル化を介して乳癌における有糸分裂遅延に関連付けられることを示す図である。９ｃは、有糸分裂遅延表現型及びＰＡＰＰＡプロモーターメチル化状態に関連した、正常増殖（妊娠）乳房、ＤＣＩＳ、及び乳癌の症例におけるＰＡＰＰ−Ａタンパク質発現を示す図である（拡大率１０００倍；スケールバー１０μｍ）。ペプチドブロッキングによりＰＡＰＰＡ抗体の特異性を確認した（右下パネル）。
【図９ｄ】ＰＡＰＰＡのサイレンシングがプロモーターのメチル化を介して乳癌における有糸分裂遅延に関連付けられることを示す図である。９ｄは、培養初代乳房細胞、不死化乳房細胞、及び形質転換乳房細胞における７個のＭｉｔｏＣｈｅｃｋ候補遺伝子のプロモーターメチル化状態を示すヒートマップである。
【図９ｅ】ＰＡＰＰＡのサイレンシングがプロモーターのメチル化を介して乳癌における有糸分裂遅延に関連付けられることを示す図である。９ｅは、パネル（ｄ）に示した培養乳房細胞におけるウェスタンブロットによるＰＡＰＰＡタンパク質の検出を示す。
【図９ｆ】ＰＡＰＰＡのサイレンシングがプロモーターのメチル化を介して乳癌における有糸分裂遅延に関連付けられることを示す図である。９ｆは、別個の有糸分裂期に割り振ったパネル（ｄ）に示した培養乳房細胞における有糸分裂細胞のパーセンテージを示す積み上げ棒グラフである。
【図１０ａ】ＰＡＰＰＡに対して作製されたウサギポリクローナル抗体の特徴解析を示す図である。１０ａは、ＭＣＦ１０Ａ及びＢＴ５４９細胞から調製した全細胞抽出物中における内因性ＰＡＰＰＡのウェスタンブロット検出である。ブロッキングペプチドとのプレインキュベートによりＰＡＰＰＡ抗体の特異性が確認され、一方、免疫前血清では内因性ＰＡＰＰＡは検出されなかった。
【図１０ｂ】ＰＡＰＰＡに対して作製されたウサギポリクローナル抗体の特徴解析を示す図である。１０ｂは、非処理（ＵＴ）、ＺＭＰＳＴＥ２４過剰発現（ＣＯ）、及びＰＡＰＰＡ過剰発現（ＰＡＰＰＡ＋）Ｔ４７Ｄ細胞から調製した全細胞抽出物のＰＡＰＰＡ抗体を用いたウェスタンブロット分析である。特に、Ｔ４７Ｄ細胞は、ＰＡＰＰＡプロモーターのハイパーメチル化を示し、内因性タンパク質を発現しない。
【図１０ｃ】ＰＡＰＰＡに対して作製されたウサギポリクローナル抗体の特徴解析を示す図である。１０ｃは、トランスフェクション７２時間後のＰＡＰＰＡ過剰発現Ｔ４７Ｄ細胞集団（ＰＡＰＰＡ＋）から得られた細胞培養培地からのＰＡＰＰ−Ａタンパク質の免疫沈降を示す。市販のＰＡＰＰＡウサギポリクローナル抗体（ダコ社製）でＰＡＰＰＡタンパク質を免疫沈降し、研究室で作製したＰＡＰＰＡ抗体を用いたウェスタンブロットにより検出した。ＦＴ：抗体コートビーズと共に一晩インキュベートした後のフロースルー；溶出：ローディングバッファーでビーズから溶離した結合タンパク質。
【図１１ａ】ＰＡＰＰＡ発現の実験的操作により初期有糸分裂の移行が調節されることを示す図である。１１ａは、ＢＴ５４９細胞においてＲＮＡｉによりＰＡＰＰＡ転写産物レベルをノックダウン（ＫＤ）することにより、非処理（ＵＴ）及び対照トランスフェクト（ＣＯ）細胞と比べてＰＡＰＰＡタンパク質が枯渇されたことを示している。
【図１１ｂ】ＰＡＰＰＡ発現の実験的操作により初期有糸分裂の移行が調節されることを示す図である。１１ｂは、ＰＡＰＰＡ発現コンストラクト（ＰＡＰＰＡ＋）によるトランスフェクト後にＴ４７Ｄ細胞（プロモーターのメチル化によりＰＡＰＰＡ遺伝子がエピジェネティックにサイレンシングされている）中でＰＡＰＰ−Ａタンパク質レベルが回復したことを示している。Ｔ４７Ｄ細胞を、ＰＡＰＰＡと同様にメトジンシンファミリーのメンバーである無関係のメタロプロテイナーゼ（ＺＭＰＳＴＥ２４）の発現コンストラクトで対照トランスフェクトした（ＣＯ）。
【図１１ｃ】ＰＡＰＰＡ発現の実験的操作により初期有糸分裂の移行が調節されることを示す図である。１１ｃは、ＢＴ５４９細胞のＰＡＰＰＡに対するＲＮＡｉが、サイトスピン調製物のホスホヒストンＨ３（Ｈ３Ｓ１０ｐｈ）免疫標識による決定で、初期有糸分裂像の顕著な増加と関連しており、一方、外因的に発現させたＰＡＰＰＡがＴ４７Ｄ細胞において正常な有糸分裂期分布を回復させたことを示している。
【図１１ｄ】ＰＡＰＰＡ発現の実験的操作により初期有糸分裂の移行が調節されることを示す図である。１ｄは、ＵＴ、ＣＯ、及びＫＤのＢＴ５４９細胞で測定された、記載の時間における細胞数を示している。
【図１１ｅ】ＰＡＰＰＡ発現の実験的操作により初期有糸分裂の移行が調節されることを示す図である。１１ｅは、トランスフェクションの４８及び７２時間後におけるＵＴ、ＣＯ、及びＫＤのＢＴ５４９細胞のＤＮＡ含有量を示している。
【図１２ａ】ＢＴ５４９乳癌細胞におけるＲＮＡｉ特異性対照及びレスキュー実験を示す図である。１２ａは、ＺＭＰＳＴＥ２４発現コンストラクトでトランスフェクトされた細胞（ＣＯ）を基準とした、非処理（ＵＴ）細胞、ＰＡＰＰＡ−ｓｉＲＮＡ  １０４０２８（ＫＤ２８）、又はＰＡＰＰＡ−ｓｉＲＮＡ  １００４２（ＫＤ４２）トランスフェクト細胞における及びＰＡＰＰＡ  ｓｉＲＮＡ存在下にてＰＡＰＰＡ  ＲＮＡｉレスキューコンストラクトでトランスフェクトした細胞（ＰＡＰＰＡ＋ｍｕｔ／ＫＤ２８又はＰＡＰＰＡ＋ｍｕｔ／ＫＤ４２）におけるＰＡＰＰＡ転写産物レベルを示している。
【図１２ｂ】ＢＴ５４９乳癌細胞におけるＲＮＡｉ特異性対照及びレスキュー実験を示す図である。１２ｂは、トランスフェクションの７２時間後のＵＴ、ＣＯ、ＫＤ２８、ＫＤ４２、ＰＡＰＰＡ＋ｍｕｔ／ＫＤ２８、及びＰＡＰＰＡ＋ｍｕｔ／ＫＤ４２細胞から調製した全細胞抽出物におけるＰＡＰＰ−Ａタンパク質のウェスタンブロット分析である。
【図１２ｃ】ＢＴ５４９乳癌細胞におけるＲＮＡｉ特異性対照及びレスキュー実験を示す図である。１２ｃは、スライドガラス上にサイトスピンし、ホスホヒストンＨ３（Ｈ３Ｓ１０ｐｈ）免疫標識により有糸分裂細胞を検出したＵＴ、ＣＯ、ＫＤ２８、ＫＤ４２、ＰＡＰＰＡ＋ｍｕｔ／ＫＤ２８、及びＰＡＰＰＡ＋ｍｕｔ／ＫＤ４２細胞を示している。
【図１２ｄ】ＢＴ５４９乳癌細胞におけるＲＮＡｉ特異性対照及びレスキュー実験を示す図である。１２ｄは、別個の有糸分裂期にあるＵＴ、ＣＯ、ＫＤ２８、ＫＤ４２、ＰＡＰＰＡ＋ｍｕｔ／ＫＤ２８、及びＰＡＰＰＡ＋ｍｕｔ／ＫＤ４２細胞のパーセンテージを示す積み上げ棒グラフである。
【図１３ａ】ＰＡＰＰＡ発現レベルが乳癌細胞系の浸潤能に影響を与えることを示す図である。１３ａは、ＢＴ５４９及びＴ４７Ｄ細胞におけるＰＡＰＰＡ発現が図１１のレジェンドに記載されているように実験操作されたこと及びＢｏｙｄｅｎ  Ｃｈａｍｂｅｒアッセイで測定された細胞の浸潤性を示している。
【図１３ｂ】ＰＡＰＰＡ発現レベルが乳癌細胞系の浸潤能に影響を与えることを示す図である。１３ｂは、非処理（ＵＴ）及び対照トランスフェクト（ＣＯ）細胞と比べた、ＰＡＰＰＡ枯渇（ＫＤ）ＢＴ５４９細胞及びＰＡＰＰＡ過剰発現（ＰＡＰＰＡ＋）Ｔ４７Ｄ細胞のクリスタルバイオレット染色されたＢｏｙｄｅｎ  Ｃｈａｍｂｅｒインサートを示している。
【図１３ｃ】ＰＡＰＰＡ発現レベルが乳癌細胞系の浸潤能に影響を与えることを示す図である。１３ｃは、ＣＯ及びＫＤ  ＢＴ５４９細胞における表面β１−インテグリンレベルを示している。
【図１３ｄ】ＰＡＰＰＡ発現レベルが乳癌細胞系の浸潤能に影響を与えることを示す図である。１３ｄは、浸潤アッセイ期間中に培養培地に抗β１−インテグリンブロッキング抗体を添加することでＢＴ５４９細胞におけるＰＡＰＰＡ枯渇に関連する浸潤性増大が逆転されたことを示している。
【図１４（Ａ）】Ｔ４７Ｄ細胞における細胞成長特性及びＰＡＰＰＡ発現を示す図である。（Ａ）は、Ｔ４７Ｄ細胞のＢｒｉｇｈｔｆｉｅｌｄ画像である（対物レンズ２０倍）。Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（商標）自動細胞計数装置（ライフテクノロジーズ社製）を用いて算出された集団倍加時間は４４時間であった。
【図１４（Ｂ）】Ｔ４７Ｄ細胞における細胞成長特性及びＰＡＰＰＡ発現を示す図である。（Ｂ）は、ＰＩ染色後の非処理Ｔ４７Ｄ細胞のＤＮＡ含有量を示している。示されているデータは、Ｍｕｌｉｔｃｙｃｌｅ  ＡＶソフトウェアを用いて解析された。
【図１４（Ｃ）】Ｔ４７Ｄ細胞における細胞成長特性及びＰＡＰＰＡ発現を示す図である。（Ｃ）定量ＰＣＲを用いて、Ｔ４７Ｄ及びＢＴ５４９細胞中のＰＡＰＰＡをコードするｍＲＮＡの相対レベルを測定した。エキソン１４〜１５にまたがるプライマーを用いてＰＡＰＰＡを検出し、エキソン４〜５にまたがるプライマーを用いて内部対照ＲＰＬＰ０を検出した。
【図１４（Ｄ）】Ｔ４７Ｄ細胞における細胞成長特性及びＰＡＰＰＡ発現を示す図である。（Ｄ）（Ｃ）に記載の実験で得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動にかけた。
【図１４（Ｅ）】Ｔ４７Ｄ細胞における細胞成長特性及びＰＡＰＰＡ発現を示す図である。（Ｅ）は、ウサギポリクローナル抗ＰＡＰＰ−Ａ１抗体でプローブした、Ｔ４７Ｄ及びＢＴ５４９細胞質ゾル画分のウェスタンブロットを示す。β−アクチンローディング対照を下のパネルに示す。
【図１４（Ｆ）】Ｔ４７Ｄ細胞における細胞成長特性及びＰＡＰＰＡ発現を示す図である。（Ｆ）Ｔ４７Ｄ及びＢＴ５４９細胞から単離したゲノムＤＮＡサンプルでＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイを行った。ＰＭＲは、サンプルのＰＡＰＰＡ：ＣＯＬ２Ａ１比をＳｓｓＩ処理ヒト白血球細胞ＤＮＡのＰＡＰＰＡ：ＣＯＬ２Ａ１で割り、１００を乗じることで得られる、メチル化基準に対するパーセンテージを指す。
【図１５（Ａ）】外因性ＩＧＦ−１がＴ４７Ｄ細胞において観察される有糸分裂遅延表現型を逆転させることを示す図である。（Ａ）は、Ｈ３Ｓ１０ｐｈ抗体で免疫染色された対照及びＩＧＦ−１処理Ｔ４７Ｄ細胞の代表的な画像（原拡大率、２００倍）を示している。矢印で示されているのは前期／前中期にある有糸分裂細胞である。
【図１５（Ｂ）】外因性ＩＧＦ−１がＴ４７Ｄ細胞において観察される有糸分裂遅延表現型を逆転させることを示す図である。（Ｂ）は、Ｔ４７Ｄ対照及びＩＧＦ−１処理細胞における前期／前中期にある全有糸分裂細胞のパーセンテージを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
「患者」という用語は、診断の受け手となる任意の動物（例えば哺乳動物）、例えば、限定されるものではないが、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、齧歯類等を意味する。典型的には、「患者」という用語は本明細書中においてヒト対象を指して用いられる。
【００１６】
「癌」及び「癌性」という用語は、制御されない細胞成長により細胞の集団が特徴付けられる哺乳動物における生理学的状態を指す又は述べている。
【００１７】
「癌細胞」及び「腫瘍細胞」という用語は文法的に同等であり、腫瘍又は前癌病変に由来する細胞の全集団を意味する。
【００１８】
「乳癌」という用語は、浸潤性乳管癌、浸潤性小葉癌、管状癌、髄様癌、肺胞癌、固形異型癌（ｓｏｌｉｄ  ｖａｒｉａｎｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、印環細胞癌、化生性癌を含む全ての形態の原発性乳癌を含む。
【００１９】
「浸潤癌」という用語は、それが発生した原発性腫瘍を超えて広がり、周囲の健康な組織癌中で成長している癌を指す。浸潤癌は、侵襲性癌と呼ばれることもある。この用語は、特に指定のない浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）及びＩＤＣサブタイプ（例えば、混合型、多形性、破骨細胞型）、浸潤性小葉癌（ＩＬＣ）、管状癌、粘液性癌、髄様癌、神経内分泌腫瘍、浸潤性乳頭篩状癌、並びに浸潤性アポクリン、化生、及び膨大細胞サブタイプを含む全ての原発性浸潤性乳癌を含むことが意図される。
【００２０】
本発明において、「浸潤癌のリスク」という語句は、上皮内非浸潤性癌から浸潤癌への進行リスクを意味する。浸潤癌のリスクは、再発性上皮内非浸潤性癌のリスクを意味することもある。
【００２１】
本発明において、「再発性疾患のリスク」という語句は、患者の乳房組織内の異なる位置で起こる上皮内非浸潤性増殖性病変のリスクを意味する。
【００２２】
好ましくは、患者から得られ、本発明のインビトロの方法で使用される組織サンプルは、増殖性病変を示す乳房組織サンプルである。本発明において、「増殖性病変」という用語は異型性を示す病変を指す。異型性を示す増殖性病変とは、浸潤性乳癌の前駆病変を意味する。前駆病変は、大まかに２つのグループ、すなわち「前浸潤性病変」及び「悪性度不明の増殖性病変」に分類することができる。これら２グループの実体は、乳房実質構造内での異型又は悪性の細胞の増殖であるが、基底膜を超える浸潤の証拠はないものを意味する。前浸潤性病変は、乳管上皮内癌（ＤＣＩＳ）、小葉上皮内癌（ＬＣＩＳ）、及び乳頭のパジェット病を含む。悪性度不明の増殖性病変は、小葉新生物、小葉上皮内新生物、異型小葉過形成（ＡＬＨ）、平坦型上皮異型（ＦＥＡ）、異型乳管過形成（ＡＤＨ）微小浸潤癌、乳管内乳頭新生物、及び葉状腫瘍等の実体を含む。これらの実体は当該技術分野でよく特徴解析されており、ルーチンな臨床的病理学的実務で用いられている。
【００２３】
本明細書に記載の発明の方法はインビトロで行われる。誤解のないように、「インビトロ」という用語は、当該技術分野におけるその通常の意味を有し、組織サンプルを得た患者の体の外側の人工的環境中の組織中又は組織上で行われる方法を指す。
【００２４】
「イムノアッセイ」、「免疫検出（ｉｍｍｕｎｏ−ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）」、及び「免疫学的アッセイ」という用語は本明細書中で交換可能に用いられており、サンプル中のタンパク質の存在又はレベルを同定するための抗体に基づく技術を指す。
【００２５】
「抗体」という用語は、重鎖及び軽鎖の免疫グロブリン可変ドメイン（ＶＨＳ及びＶＬＳ）、より具体的には相補性決定領域（ＣＤＲ）の結合特性により決定されるように標的上のエピトープを特異的に認識する免疫グロブリンを指す。多くの潜在的な抗体形態が当該技術分野で知られており、それには、限定されるものではないが、複数のインタクトなモノクローナル抗体又はインタクトなモノクローナル抗体を含むポリクローナル混合物、抗体断片（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、及びＦｒ断片、線状抗体、単鎖抗体、及び抗体断片を含む多特異性抗体）、単鎖可変断片（ｓｃＦｖＳ）、多特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、及び標的上の所与のエピトープの認識に必要なドメインを含む融合タンパク質が含まれる。抗体はまた、診断効果のための種々の部分、例えば、限定されるものではないが、放射性核種、フルオロフォア、又は色素にコンジュゲートしていてよい。
【００２６】
抗体−エピトープ相互作用の文脈における、「特異的に認識する」という用語は、抗体とエピトープが、抗体又はエピトープのいずれかが別の物質、例えば無関係のタンパク質で代用された時よりも、頻繁に、急速に、長い期間、大きなアフィニティー、又は上記の任意の組合せで会合する相互作用を指す。必ずではないが、一般的に、結合への言及は特異的認識を意味する。
【００２７】
「有糸分裂」という用語は当該技術分野におけるその通常の意味を有する。有糸分裂は、真核細胞がその細胞核中で染色体を２つの別個の核中の２つの同一な対に分離するプロセスである。有糸分裂及び細胞質分裂は一緒に、細胞周期の有糸分裂（Ｍ）期を定義する。有糸分裂のプロセスは、１セットの活動の完了と次の活動の開始に対応するステージに特徴づけられる。これらのステージは、前期、前中期、中期、後期、及び終期である。
【００２８】
「前期」という用語は当該技術分野におけるその通常の意味を有する。前期は、核の中のクロマチンが密に巻きつけられ、別個の染色体へと凝縮するステージを指す。
【００２９】
「前中期」という用語は当該技術分野におけるその通常の意味を有する。前中期中、核膜が分解され、微小管が核のスペースに侵入する。
【００３０】
本発明は内因性ＰＡＰＰＡレベルの抑制が乳癌の発症に関わることを確認した。より具体的には、本発明は、ＰＡＰＰＡの抑制が乳癌の「浸潤性」に関わることを確認した。これは、「リスクのある」患者を同定すること及び標的化された様式で治療法を開発することを可能にするので、乳癌の検出及び処置における重要なブレークスルーである。
【００３１】
本発明は、妊娠関連血漿タンパク質Ａ（ＰＡＰＰＡ）の有無、遺伝子若しくはそのプロモーター配列のメチル化状態、又はＰＡＰＰＡの機能喪失の検出に基づいて患者の乳癌のリスクを判定する方法を開発することを可能にする。
【００３２】
ＰＡＰＰＡは、妊娠女性の体内で高濃度で循環している胎盤起源の４つのタンパク質の１つとして１９７４年に同定され、その後、ダウン症候群妊娠のバイオマーカーとして臨床的に有用であることが見出された。抑制性インスリン様成長因子結合タンパク質−４（ＩＧＦＢＰ−４）の切断を介してＩＧＦのバイオアベイラビリティを制御するプロテアーゼとして同定されるまでの四半世紀の間、その生物学的機能は謎のままであった。幅広い種類の細胞（例えば、線維芽細胞、骨芽細胞、及び血管平滑筋細胞）におけるＩＧＦＢＰ−４プロテアーゼとしてのその役割は、脊椎動物の高度に保存されたアミノ酸配列と共に、ＰＡＰＰＡが胎盤の生理機能を超えた基本的機能を果たすことを示していた。本発明者らは今回、乳房組織中で有糸分裂の正常な進行のためにＰＡＰＰＡが必要であることを示した。ＰＡＰＰＡの内因的抑制は、有糸分裂の初期段階における遅延又は停止を引き起こし、サイクル中の細胞を前期／前中期で止めた。これは、内因性ＰＡＰＰＡ遺伝子の発現を増大させることにより又はＰＡＰＰＡを発現する人工コンストラクトを導入することにより逆転させることができる。
【００３３】
乳癌細胞中でのＰＡＰＰＡ抑制による有糸分裂の遅れは一見、腫瘍の成長に不利に見える。しかし、付随する浸潤能獲得の増大により、有糸分裂の遅れた新生物性乳房細胞は大きな生物学的利点を得る。乳癌標本中、ＰＡＰＰＡのサイレンシングに関連付けられる有糸分裂の遅延は浸潤癌のほぼすべての症例及び一部の非浸潤性病変で検出することができる。したがって、ＰＡＰＰＡの消失による浸潤能の獲得は、非浸潤癌から浸潤癌への移行中、多段階の乳房腫瘍進行の初期に起こる。臨床的生検標本中におけるＰＡＰＰＡ調節解除及び有糸分裂遅延の検出は、浸潤性疾患を発症するリスクが高い、乳管上皮内癌、異型過形成、又は非浸潤性の小葉上皮内癌等の前浸潤性病変を有する乳癌患者の同定における重要な進歩をもたらす。したがって、本発明を用いて、前浸潤性病変を示す患者を、浸潤性表現型へと進行しないであろう病変を有する（追加的な治療を必要としないであろう）患者及び浸潤性表現型になり易い（したがって、追加的な治療が必要となり得る）患者に区別することができる。
【００３４】
本発明者らは、乳癌細胞（又は前癌細胞）中におけるＰＡＰＰＡ抑制の原因の１つがそ
のＤＮＡ、主にＰＡＰＰＡプロモーター領域のメチル化によるものであることを突き止めた。ＣｐＧジヌクレオチド内のシトシンへのメチル基の共有結合による付加により主に生じるＤＮＡのメチル化は、遺伝子のプロモーター領域中で主に起こり、これはそこに大部分のＣｐＧアイランドが見出されるからである。ハイパーメチル化は転写のサイレンシングを引き起こす。
【００３５】
特定の遺伝子のメチル化状態を決定することによる癌の有無の検出は公知であり（ただし、ＰＡＰＰＡとの関連ではない）、これを行うための従来の方法を本発明における使用に適応させことができる。例えば、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）が特異的遺伝子のメチル化状態を決定するために用いられてきた。この技術は、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔとも呼ばれ、それぞれの内容を参照により本明細書に援用するEads et al, Nucleic Acids Res.
2000; 28(8)及びWidschwendler et al, Cancer Res., 2004; 64:3807-3813に記載されている。代替的方法には、Combined Bisulphate Restriction Analysis法、Methylation-sensitive Single Nucleotide Primer Extension法、及びCpGアイランドマイクロアレイの使用が含まれる。ＤＮＡメチル化を調べるための市販のキットが利用可能である。したがって、本発明は、患者の浸潤性乳癌に進行するリスク又は乳癌を判定するための、ＰＡＰＰＡ遺伝子又はその制御プロモーター配列のメチル化状態を決定する従来の方法を用いる。
【００３６】
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔは、ＰＣＲステップ後に更なる操作を必要としない、蛍光に基づくリアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ（登録商標））技術を利用するハイスループットな定量的メチル化アッセイである。ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔは、１０，０００倍過剰の非メチル化アレルの存在下でメチル化アレルを検出できる高感度アッセイである。このアッセイは更に、非常に定量的であり、非常に少量の鋳型ＤＮＡを用いてＤＮＡメチル化の特定のパターンの相対的な頻度（ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ）を非常に正確に決定することができる。
【００３７】
本発明によれば、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔを用いて、患者のサンプルについて得られたゲノムＤＮＡサンプル中のＰＡＰＰＡ遺伝子又は制御若しくはプロモーター領域のメチル化状態を決定することができる。ＰＡＰＡ遺伝子のメチル化状態の決定は以下のステップを含み得る：
ｉ．乳房組織サンプルからゲノムＤＮＡを抽出し、重亜硫酸ナトリウムで処理して非メチル化シトシンをウラシル残基に変換するステップ（メチル化残基は保護されている）；
ｉｉ．表２に詳細に記載されているようなバイサルファイト改変ＤＮＡに特異的に設計されたプライマー及びプローブを用いてバイサルファイト標的化ＤＮＡサンプルを増幅するステップ：用いられるプライマー／プローブセットは、ＰＡＰＰＡ遺伝子に特異的なメチル化セット（例えば、表２の配列番号７〜９参照）及び参照遺伝子（ＣＯＬ２Ａ１）に特異的なセット（例えば、表２の配列番号３１〜３３参照）を含む：
ｉｉｉ．例えばＡＢＩ  Ｓｔｅｐ  ｏｎｅ  ｐｌｕｓソフトウェアを用いて、データを分析し、Ｃｔ値を計算するステップ；
ｉｖ．サンプルのＰＡＰＰＡ：ＣＯＬ２Ａ１比を陽性対照サンプル（例えば、ＳｓｓＩ処理ＨｅＬａゲノムＤＮＡ）のＰＡＰＰＡ：ＣＯＬ２Ａ１比で割り、１００を乗じることにより特異的座位における完全にメチル化されたＰＡＰＰＡ分子のパーセンテージを計算するステップ。
【００３８】
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ反応はバイサルファイト変換ＤＮＡに特異的であるので、偽陽性結果の発生が除かれる。
【００３９】
ＤＮＡメチル化（ハイパーメチル化）はＰＡＰＰＡ抑制の原因の１つであるが、他の原因もあり得る。例えば、ＰＡＰＰＡ遺伝子（又はその制御配列）が、転写サイレンシング
につながるように変異している可能性がある。点変異、欠失、ヘテロ接合性の消失、転座等は全てＰＡＰＰＡ遺伝子の転写活性を失わせ得る。遺伝子レベルでの改変がＰＡＰＰＡの発現を低減（又は消失）させ得るが、遺伝子レベルでの改変（変異）により機能的活性が低減又は消失したＰＡＰＰＡの発現が生じることもあり得る。したがって、本発明は、ＰＡＰＰＡ活性レベルが診断を助けるために用いられると予想する。活性消失の原因となる変異ホットスポットが同定されてもよく、患者サンプル中のそのようなホットスポットの同定も診断に寄与し得る。
【００４０】
ヘテロ接合性の消失は、種々の技術、例えば半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により測定することができる。ＰＡＰＰＡはヒト染色体９ｑ３２−３３．１に局在する。全ＲＮＡは市販のＲＮＡ抽出キットを用いて抽出することができ、逆転写は逆転写酵素を用いて行うことができる。ＰＡＰＰＡ遺伝子領域内で固有のプライマーを設計することができ、ＲＴ−ＰＣＲ反応をサーマルサイクラー中で行うことができる。ＰＡＰＰＡ遺伝子の発現レベルは、内部対照と比べたＰＡＰＰ−Ａ遺伝子のバンド強度の割合により決定することができる。
【００４１】
当業者に理解されるように、ＲＴ−ＰＣＲで得られた結果を定量的に確認するためにリアルタイムＰＣＲ反応を行うこともできる。固有プライマーをＰＡＰＰＡ及び内部対照用に設計することができる。リアルタイムＰＣＲを行って、調べる各遺伝子について標準曲線を作製することができる。ＰＡＰＰＡの低減倍率は、内部対照を基準に標準化して、各サンプル中のＲＮＡ量について補正し、更に逆転写反応の効率の差を考慮することができる。
【００４２】
ヘテロ接合性の消失の検出に用いられる他の方法は、キャピラリー電気泳動システムを用いた高分解能ＰＣＲに基づく蛍光定量法；放射標識ヌクレオチドを用いたＰＣＲによるマイクロサテライトの増幅後のオートラジオグラフィー、及び次世代シークエンシング（Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）、ライフテクノロジーズ社）である。
【００４３】
以前に述べたように、点変異がＰＡＰＰＡの消失又はＰＡＰＰＡの機能的活性消失の原因であり得る。分子診断において、点変異を検出する種々の方法が利用可能である。使用される方法の選択は、分析される標本、方法がどの程度信頼できるか、検出される変異が分析前に知られているかどうか、及び野生型と変異型のアレルの比率によって決まる。
【００４４】
変性グラジエントゲル電気泳動が、変異、特に点変異を検出するための更なる技術である。長時間（４８時間）プロテイナーゼＫ消化法又はＤＮＡ  ｅａｓｙキット（キアゲン社製）を用いてゲノムＤＮＡを抽出することができる。ＰＡＰＰＡコード領域全体をカバーするマルチプレックスＰＣＲ反応により二本鎖ＤＮＡ（１ｋｂのＰＣＲ断片）を作製することができる。検出効率を上げるために、ＧＣクランプをＰＣＲプライマーの一方に付加してよい。次いで、ＤＮＡは、ゲル電気泳動装置中の、尿素又はホルムアミド等の濃度勾配変性剤に供され得る。濃度勾配変性剤により、ＤＮＡ中のドメインがその融解温度（Ｔｍ）に従って解離する。１ｋｂのＤＮＡハイブリッドは通常約３〜４個のドメインを含み、それぞれは異なる温度で融解する。そのようなドメイン中における鎖の解離は電気泳動の移動性を低下させ、１ｂｐの差はＴｍを変化させるのに充分である。ヘテロ二本鎖中の塩基ミスマッチはドメインを著しく不安定化し、その結果、ホモ二本鎖分子とヘテロ二本鎖分子の間でＴｍに差が生じる。ホモ及びヘテロ二本鎖はゲル電気泳動後の銀染色により検出される。この方法には、センス鎖及びアンチセンス鎖からヘテロ二本鎖が生成された時に１００％の点変異を検出できるという利点がある（Cotton RG, Current methods of mutation detection, Mutat Res 1993; 285: 125-44）。
【００４５】
点変異の検出に利用可能な別の方法としては、ＰＣＲ−一本鎖コンホメーション多形、
ヘテロ二本鎖分析、タンパク質切断試験、ＲＮＡＳＥ  Ａ切断法、化学的／酵素ミスマッチ切断、ＤＮＡチップ上でのアレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、ブロッキング試薬を用いた（野生型アレルの増幅を抑制するため）アレル特異的ＰＣＲと続いてのリアルタイムＰＣＲ、ＰＣＲ産物の直接シークエンシング、パイロシークエンシング、及び次世代シークエンシングシステムが含まれる。
【００４６】
前述したように、ＰＡＰＰＡの消失及び／又はＰＡＰＰＡの機能的活性の消失は、挿入、欠失、及びフレームシフト変異によるものであり得る。パイロシークエンシングの技術を用いて挿入、欠失、フレームシフト変異を検出することができる。パイロシークエンシングは合成時読解（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）の原理に基づく。この方法では、一本鎖ＰＣＲ／ＲＴ−ＰＣＲ断片を反応の鋳型として用いる。ヌクレオチド取込み後のＤＮＡ複製プロセス中、放出されたＰＰｉ（無機リン酸）が酵素カスケード、ＡＰＳの存在下でＰＰｉをＡＴＰに変換するＡＴＰスルフリラーゼにより光に変換される。このＡＴＰは更に、ルシフェリンから可視光を生成するオキシルシフェリンへのルシフェラーゼにより仲介される変換を駆動させ、この可視光はＣＣＤセンサーで検出することができ、パイログラム中のピークとして見ることができる（Ronaghi, M., Uhlen, M., and Nyren, P, A sequencing method based on real-time pyrophosphate, Science; 1998b 281: 363-365）。生成した光シグナルは、取り込まれたヌクレオチドに直線的に比例する。
【００４７】
長時間（４８時間）プロテイナーゼＫ消化法又はＤＮＡ  ｅａｓｙキット（キアゲン社製）を用いて患者の組織サンプルからゲノムＤＮＡを抽出することができる。パイロシークエンシングで使用するために、ＰＡＰＰ−Ａ遺伝子用のＰＣＲプライマー及びシークエンシングプライマーを設計することができる。ＰＣＲ産物は、ストレプトアビジン−セファロースに結合させ、精製、洗浄され、ＮａｏＨ溶液を用いて変性され、再度洗浄され得る。次いで、パイロシークエンシングプライマーを一本鎖ＰＣＲ産物にアニーリングさせ、反応を、例えばＰｙｒｏｍａｒｋ  ＩＤシステム（キアゲン社製）をメーカーの取扱説明書に従って用いて行うことができる。
【００４８】
挿入／欠失及びフレームシフト変異を検出するために利用可能な他の方法としては、ｂｉｇ  ｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒシークエンシング、次世代シークエンシングシステム、及びキャピラリー／マイクロチップベースの電気泳動を用いたヘテロ二本鎖分析が挙げられる。
【００４９】
本発明の別の方法では、患者乳房組織サンプル中のＰＡＰＰＡの存在（又は非存在）又はレベルを決定する必要がある。これは、タンパク質レベルを決定することにより又はタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを調べることによりなされ得る。本発明において、「発現レベル」という用語は、乳房組織サンプル中の指定されたタンパク質（又はタンパク質をコードするｍＲＮＡ）の量を指す。その後、発現レベルは対照と比較される。対照は、癌を有さないことが知られている人の組織サンプルであってもよく、あるいは基準値であってもよい。対照と試験サンプルの発現レベルを比較することで、試験サンプル及び対照中の発現レベルが同様であるか異なっているか、したがって患者が浸潤性乳癌のリスクを有するかどうかを決定することができることは当業者には明白である。
【００５０】
生物学的サンプル由来のタンパク質の発現レベルを測定する方法は当該技術分野で周知であり、任意の好適な方法が用いられ得る。サンプル由来のタンパク質又は核酸を分析して発現レベルを決定することができ、好適な方法の例としては、半定量的方法、例えば組織又は細胞調製物中のｍＲＮＡを検出するためのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）蛍光法及びｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、並びにこれらの方法の変種；ノーザンブロッティング、並びに定量的ＰＣＲ反応が含まれる。遺伝子
発現レベルを検出するためのノーザンブロッティング技術又は定量的ＰＣＲの使用は当該技術分野で周知である。定量的ＰＣＲに基づく遺伝子発現解析用のキット、例えばキアゲン社製のＱｕａｎｔｉｔｅｃｔシステムが市販されている。ハイブリダイゼーションに基づく核酸アレイシステムを用いた複数のサンプル中の発現レベルの同時解析が当該技術分野で周知であり、これも本発明の範囲内である。当業者に理解されるように、変異特異的ＰＣＲを用いることもできる。
【００５１】
従来の抗ＰＡＰＰＡ抗体を用いて、従来の免疫学的検出技術を用いて、乳房組織サンプル中のＰＡＰＰＡレベルを決定することができる。ＰＡＰＰＡに対する特異性を有する抗体又はそのような抗体に結合する二次抗体は検出可能に標識され得る。好適な標識としては、限定されるものではないが、放射性核種（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ、３２Ｐ、又は１４Ｃ）、フルオロフォア（例えば、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、又はローダミン）、発光部分（例えば、カリフォルニア州パロアルトのクオンタムドット社（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から供給されているＱｄｏｔナノ粒子）、又は酵素（例えば、アルカリホスファターゼ又は西洋ワサビペルオキシダーゼ）が含まれる。
【００５２】
ＰＡＰＰＡを検出するための免疫学的アッセイは、サンドウィッチアッセイ、例えば、（ＥＬＩＳＡ）、競合アッセイ（競合ＲＩＡ）、ブリッジイムノアッセイ（ｂｒｉｄｇｅ
ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、及び免疫細胞化学（ＩＣＣ）を含む種々のアッセイフォーマットで行うことができる。ＰＡＰＰＡを検出する方法は、患者サンプルをＰＡＰＰＡに結合する抗体と接触させること及び結合を検出することを含む。ＰＡＰＰＡに対する特異性を有する抗体を従来の方法を用いて支持体材料上に固定することができる。表面プラズモン共鳴（ビアコア社、スウェーデン）を用いて支持体上の抗体へのＰＡＰＰＡの結合を検出することができる。抗ＰＡＰＰＡ抗体は市販されている（例えば、シグマ  アルドリッチ社のＨＰＡ００１６６７、サーモサイエンティフィック社のＭＡ１−４６４２５（５Ｈ９）、アビバシステムズバイオロジー社のＯＡＳＡＯ３２０８、及びダコ社のＡＯ２３０）。ＰＡＰＰＡの免疫検出は、その内容を参照により本明細書に援用する米国特許第６１７２１９８号にも開示されている。
【００５３】
乳房組織サンプル内のＰＡＰＰＡの免疫組織化学的検出を可能にするために、ホルマリン固定及びパラフィン包埋された乳房組織切片を調製し、ＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ＋＋帯電スライド上にマウントする。タンパク質消化によるエピトープ賦活化後、内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチし、切片を一次抗ＰＡＰＰＡ抗体（例えばダコ社から入手可能）とインキュベートする。次いで、切片を、ポリマー連結二次抗体と、ＤＡＢ添加後の発色シグナルの現像を可能にするペルオキシダーゼと共に更にインキュベートすることにより、ＰＡＰＰＡタンパク質への一次抗体の結合を視覚的に検出することが可能になる。上記の免疫組織化学的方法は市販の免疫染色装置を用いて完全に自動化することができる。
【００５４】
従来の方法を用いてＰＡＰＰＡタンパク質発現を分類することができ、例えば、以下のスコア化システムを用いて膜及び細胞質の染色強度を評価することができる：陰性（０）、染色が観察されない；弱い陽性（１＋）、２５％を超える細胞で膜／細胞質の知覚可能な染色がかすかに検出される／ほとんど検出されない；中程度陽性（２＋）、２５％を超える細胞で弱い染色が検出される；強い陽性（３＋）、２５％を超える細胞で強い膜／細胞質の染色が検出される。２５％未満の腫瘍細胞の局所的染色は１＋と見なす。
【００５５】
比較的少数のＰＡＰＰＡタンパク質の分析では、ウェスタンブロット又はＥＬＩＳＡ等の定量的イムノアッセイを用いて乳房組織サンプル中のタンパク質の量（したがって発現レベル）を検出することができる。ＩＨＣ及びＩＣＣ等の半定量的方法も用いることができる。
【００５６】
より多くのサンプルの同時分析にはタンパク質アレイが用いられ得る。タンパク質アレイは当該技術分野で周知であり、核酸アレイと同様に機能し、主に公知の固定化タンパク質（プローブ）を用いて目的のタンパク質を「捕捉」する。タンパク質アレイは複数の固定化されたプローブタンパク質を含む。アレイは、ＰＡＰＰＡに対する親和性を有するプローブタンパク質を含む。
【００５７】
あるいは、２次元ゲル電気泳動を用いてＰＡＰＰＡの発現レベルを同時に分析することができる。この方法は当該技術分野で周知であり、多数のタンパク質を含むサンプルは通常、等電点電気泳動で１次元目に、サイズで二次元目に分離される。各タンパク質は得られたゲル上の固有の位置（「スポット」）に存在する。各スポット中のタンパク質の量、したがって発現レベルは、複数の技術を用いて決定することができる。好適な技術の例としては、ゲルの銀染色後のバイオ・ラッド社製ＦＸスキャナーを用いたスキャニング及びＭＥＬＡＮＩＥ  ３．０ソフトウェア（ジーンバイオ社（ＧｅｎｅＢｉｏ）製）を用いたコンピューター支援解析が挙げられる。あるいは、ディファレンスゲル電気泳動（ＤＩＧＥ）を用いて発現レベルを定量化することができる（Von Eggeling et al; Int. J. Mol Med. 2001 Oct; 8(4):373-7参照。
【００５８】
典型的には、ＰＡＰＰＡが存在しない又は対照と比べて９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、又は２０％未満のレベルで存在する場合、浸潤性乳癌に進行するリスク及び／又は再発性非浸潤性疾患のリスクがある。より典型的には、患者が浸潤性乳癌への進行リスク及び／又は再発性非浸潤性疾患を有する場合、ＰＡＰＰＡは対照の４０〜８０％の量で存在する。最も典型的には、ＰＡＰＰＡは対照と比べて５０〜７０％、例えば約６０％のレベルで存在する。対照は正常乳房組織から得られた患者サンプル又は基準値であり得る。
【００５９】
本発明の第１の態様の方法は、典型的には、ＰＡＰＰＡが組織サンプル中に対照より低いレベルで存在するかどうかを確認するために行われる。ＰＡＰＰＡタンパク質は正常レベル又はそれに近いレベルで存在しているが、発現されるタンパク質が不活性である又は活性レベルが低減しているということも考えられる。したがって、本発明は、ＰＡＰＰＡの活性のモニタリングを包含する。この文脈において、ＰＡＰＰＡが対照と比べて存在する（又は低減したレベルで存在する）かどうかについての言及は、ＰＡＰＰＡの機能的活性を包含する。
【００６０】
ＰＡＰＰＡ活性は従来技術を用いて測定することができる。例えば、サンプル中のＩＧＦＢＰ−４タンパク質分解活性を調べることによりＰＡＰＰＡ活性を決定することができる。ＰＡＰＰＡ活性を検出する方法が、その内容を参照により本明細書に援用する米国特許出願公開第２００５／０２７２０３４号に開示されている。あるいは、変異特異的ＰＣＲ分析によりＰＡＰＰＡ活性の消失を決定することもできる。
【００６１】
一実施形態では、ＰＡＰＰＡ活性はイムノブロッティングを用いたその基質ＩＧＦＢＰ−４のタンパク質切断のスクリーニングにより検出することができる。培地中に分泌されたＰＡＰＰＡは、ＩＧＦＢＰ−４を補充した５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）等のバッファー中で培地サンプルをインキュベートすることにより検出することができる。次いで、サンプルをインキュベートし（例えば、３７℃で４時間）し、ＩＧＢＰ４タンパク質に対する市販の抗体を用いたイムノブロッティングによりタンパク質分解生成物を検出することができる。
【００６２】
あるいは、ＰＡＰＰＡに対する特異的抗体をマイクロタイタープレートのウェル中に固定化するＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）を用いてＰＡＰＰＡ活性を検出すること
ができる。非結合タンパク質を洗い流した後、ＰＡＰＰＡとその抗体との間での特異的一次反応が起こり且つ結合したＰＡＰＰＡが活性である場合にのみ発色性生成物を遊離する合成基質を用いてＰＡＰＰＡ活性を測定することができる。現像された色はマイクロプレートリーダーを用いて分光測定により定量化される。
【００６３】
あるいは、ＰＡＰＰＡとその基質ＩＧＦＢＰ−４との間の相互作用は、Ｂｉａｃｏｒｅ（表面プラズモン共鳴技術）又は蛍光偏光アッセイを用いて評価することもできる。これらの方法は、感度及び特異性が非常に高いという利点があり、ハイスループットアッセイに容易に適応させることができる。
【００６４】
上記方法の対照として、タンパク質分解的に不活性な変異ＰＡＰＰ−Ａタンパク質（Ｅ４８３Ｑ）が用いられ得る。
【００６５】
ＰＡＰＰＡ活性は、浸潤性乳癌のリスクがある患者の組織サンプル中で対照と比べて２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、又は９０％超低減していてよい。
【００６６】
本発明の別の態様は、乳房組織サンプル中の細胞が有糸分裂中で停止しているかどうかを決定することに関する。本発明は、有糸分裂遅延表現型を同定することによる、乳房細胞が有糸分裂中で停止しているかどうかを決定するためのインビトロの方法を提供する。この表現型の同定は、患者から得られた組織サンプル中の前期又は前中期にある有糸分裂細胞の割合を同定すること及び予め定められたカットオフ値と比較することを含む。
【００６７】
予め定められたカットオフ値は少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３３％である。したがって、組織サンプル中の有糸分裂細胞の少なくとも３０％が前期又は前中期にあるとして同定された場合、組織サンプル中に有糸分裂遅延表現型が同定される。予め定められたカットオフ値は、これより高く設定されてもよく、例えば少なくとも３５％、４０％、５０％、６０％、７０％以上に設定されてもよい。
【００６８】
分析が統計的に有意であるには、組織サンプル中の細胞の少なくとも５個が有糸分裂中でなければならない。これら５個の有糸分裂細胞の少なくとも３０％が前期又は前中期にあるとして同定された場合、組織サンプルは有糸分裂遅延表現型を示すとして同定される。
【００６９】
本発明の別の関連する態様では、患者から得られた乳房組織サンプル中の前期又は前中期にある有糸分裂細胞の割合を同定し、予め定められたカットオフ値と比較することにより、増殖性病変が浸潤性乳癌に進行するリスク及び／又は再発性非浸潤性疾患のリスクを判定するための診断を行うことができる。
【００７０】
予め定められたカットオフ値は少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３３％である。したがって、組織サンプル中の有糸分裂細胞の少なくとも３０％が前期又は前中期にあるとして同定された場合、浸潤癌への進行リスク及び／又は再発性非浸潤性疾患のリスクがある。
【００７１】
分析が統計的に有意であるためには、組織サンプル内の細胞の少なくとも５個が有糸分裂中でなければならない。これら少なくとも５個の有糸分裂細胞の少なくとも３０％が前期又は前中期にあるとして同定された場合、組織サンプルは有糸分裂遅延表現型であると見なされる。
【００７２】
本発明の一態様では、有糸分裂遅延表現型が同定された場合、これは、浸潤性乳癌に進
行する増殖性病変のリスク及び／又は再発性非浸潤性疾患のリスクがあることを示している。例えば、組織サンプル内の細胞の５個が有糸分裂中であるとして同定された場合、有糸分裂遅延表現型が同定されるため並びに／又は浸潤癌に進行する増殖性病変のリスク及び／若しくは再発性非浸潤性疾患のリスクが判定されるためには、これらの細胞の少なくとも２個が前期／前中期になければならない。より好ましくは、有糸分裂遅延表現型を示す患者に由来する乳房組織サンプル中の前期／前中期にある有糸分裂細胞の割合は３３％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％超である。典型的には、有糸分裂中の非浸潤性健康乳房組織細胞の「対照」値は前期／前中期にある約１０〜２５％、例えば２３％の細胞である。
【００７３】
組織サンプル中で有糸分裂中の細胞が５個より少なかった場合、前期／前中期にある有糸分裂細胞の割合の分析は、本発明の方法に従い有糸分裂遅延表現型の同定を可能にするのに充分な有意性がない。したがって、方法には、分析時に分析されている組織サンプル中に少なくとも５個の有糸分裂細胞があることが必要である。
【００７４】
組織サンプルの細胞が前期又は前中期にあるかどうかの検出は、当該技術分野の従来の技術を用いて行うことができる。例えば、特異的抗体を用いた免疫検出技術がしばしば細胞の有糸分裂期を特徴解析するために用いられる。免疫組織化学（ＩＨＣ）とは免疫検出技術であり、抗体−抗原相互作用を可視化することにより組織切片の細胞中の抗原を検出するプロセスを指す。これは、レポーター部分、好ましくはフルオロフォア等の視覚的レポーターで抗体をタグ化することにより（「免疫蛍光法」と命名されている）又は検出及び観察可能な発色反応を触媒できるペルオキシダーゼ等の酵素に抗体をコンジュゲートすることにより、達成される。
【００７５】
Ｈ３Ｓ１０リン酸化（Ｈ３Ｓ１０ｐｈ）が有糸分裂の開始に必須な有糸分裂特異的修飾であり、ヒストンＨ３のセリン１０のリン酸化は染色体の凝縮に重要である。Ｈ３Ｓ１０ｐｈに特異的な抗体は市販されており（例えば、ミリポア社及びアクティブモチーフ社（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ））、有糸分裂アッセイを行うためのキットも市販されている。
【００７６】
したがって、本発明の更なる態様では、浸潤性乳癌に進行する増殖性病変のリスク及び／又は再発性非浸潤性疾患のリスクを判定するために免疫検出が用いられる。好ましくは、免疫検出はＨ３Ｓ１０ｐｈ抗体を用いて行われる。
【００７７】
有糸分裂の代替的マーカーも市販されており、本発明の方法に用いられ得る。当業者に理解されるように、有糸分裂の異なる期の特徴解析は当該技術分野で周知である。
【００７８】
分析は、組織サンプルについて有糸分裂の種々の期の「スナップショット」が得られるように行うことができる。このようにすることで、有糸分裂期の分布分析が得られ、次いでこれを用いて前期又は前中期にある有糸分裂細胞の割合を特徴付けることができる。
【００７９】
有糸分裂マーカー（Ｈ３Ｓ１０ｐｈ等）の免疫組織化学的検出を可能にするために、ホルマリン固定及びパラフィン包埋した乳房組織切片を調製し、ＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ＋＋帯電スライド上にマウントする。熱を介したエピトープ賦活化後、内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチし、切片を、有糸分裂細胞内の有糸分裂マーカー（リン酸化Ｈ３Ｓ１０等）を特異的に認識する一次抗体（好適なＨ３Ｓ１０ｐｈ抗体が例えばミリポア社から入手可能）とインキュベートする。次いで、ポリマー連結二次抗体と、ＤＡＢ添加後の発色シグナルの現像を可能にするペルオキシダーゼと共に切片を更にインキュベートすることにより、有糸分裂マーカーへの一次抗体の結合が視覚的に検出できる。上記の免疫組織化学的方法は市販の免疫染色装置を用いて完全に自動化することができる。
【００８０】
乳房組織サンプル、他の患者サンプル（例えば、乳頭吸引液）、又は培養細胞系中の有糸分裂期分布を分析するために、各サンプルから得られた少なくとも２つの連続切片及び各細胞系又は体液（例えば、吸引液）について少なくとも２つのサイトスピン調製物を前述のように免疫標識し、高倍率（拡大率４００倍）の５〜２０個のフィールドの画像を取得し、各サンプルについて最低５個の有糸分裂細胞を用いて有糸分裂期分布を決定する。取得されたフィールド内の全ての有糸分裂細胞は、古典的形態基準に従い、染色体形態に基づいて前期／前中期、中期、後期、及び終期に分類することができる。有糸分裂細胞の少なくとも３０％が前期／前中期にある場合、細胞集団を「遅延」として分類する。
【００８１】
本明細書に記載の方法のいずれかにより分析される乳房組織サンプルは、増殖性病変を示す患者から採取される。組織サンプルは、前浸潤性病変、例えば乳管上皮内癌（ＤＣＩＳ）、小葉上皮内癌（ＬＣＩＳ）、及び乳頭のパジェット病、並びに悪性度が不明の増殖性病変、例えば小葉新生物、小葉上皮内新生物、異型小葉過形成（ＡＬＨ）、平坦型上皮異型（ＦＥＡ）、異型乳管過形成（ＡＤＨ）微小浸潤癌、乳管内乳頭新生物、及び葉状腫瘍等を含み得る。最も好ましくは、組織サンプルはＤＣＩＳを示す。患者からサンプルを採取する方法（生検）は当業者に明らかである。
【００８２】
本発明の診断方法に加え、本発明は、乳癌の処置に使用するための、細胞中のＰＡＰＰＡ活性レベル／機能を置換する又は増大させることができる分子を提供する。例えば、ＰＡＰＰＡタンパク質、ＰＡＰＰＡを発現できる核酸、又はＩＧＦ受容体のアゴニスト（例えば、ＩＧＦ−１）が、患者中のＰＡＰＰＡ抑制効果を相殺するために用いられ得る。生物中の部位にタンパク質又は核酸を送達する方法が周知であり、本発明中で用いられ得る。
【００８３】
ＤＮＡのメチル化はエピジェネティックな修飾であり、細胞のＰＡＰＰＡ発現及び正常な有糸分裂進行が可能になるように逆転させることができるので、脱メチル化薬が、有糸分裂細胞の分裂を促進するための魅力的な治療選択肢である。したがって、抑制がＰＡＰＰＡ  ＤＮＡのハイパーメチル化により生じている場合、治療薬は以下のものであり得る：
ｉ．ＰＡＰＰＡ遺伝子又は制御若しくはプロモーター配列のメチル化を逆転させることができる分子；
ｉｉ．メチル基に競合的に結合する及び／又はシトシンのメチル化を防止する部分を含む薬剤（すなわち、ＤＮＡメチル化の阻害剤）；
ｉｉｉ．ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＭＴ）のアンタゴニスト／阻害剤；又は
ｉｖ．CPGアイランドを含むＰＡＰＰＡ遺伝子プロモーター領域に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【００８４】
ＰＡＰＰＡプロモーター上のＣｐＧ部位のメチル化又は脱メチル化に関連する及び／又は影響を与えるこれらの薬剤の１つ、複数、又は全てが本発明に係る治療薬として用いられ得る。アンタゴニスト又は阻害剤は、標的生物活性に拮抗する又はこれを阻害することができる任意の分子であり得る。したがって、アンタゴニスト又は阻害剤は、例えば小分子、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、オリゴヌクレオチド、脂質、炭水化物、ポリマー等であり得る。
【００８５】
好適な脱メチル化薬としては、デシタビン（５−アザ−２’−デオキシシチジン）、ファラザビン、アザイチジン（５−アザシチジン）、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ヒドロキサム酸等（例えば、トリコスタチンＡ）、環状テトラペプチド（例えば、トラポキシンＢ）、デプシペプチド、ベンズアミド、求電子ケトン、脂肪族系酸化合物（例えば、フェニルブチラート及びバルプロ酸）、ヒドロキサム酸（例えば、ボリノスタット、ベリ
ノスタット、及びパノビノスタット）、及びベンズアミド）、及びフェニルブチラートが含まれる。
【００８６】
好適な脱メチル化薬をＰＡＰＰＡ遺伝子又はプロモーター配列にターゲティングすることが可能であり、そのための化合物は本発明の範囲に含まれる。
【００８７】
脱メチル化剤は、任意の送達方法、例えば全身投与により送達され得る。送達は患者の乳管への管内送達であってもよい。乳管への送達は、例えば、カテーテル又はカニューレ等の送達ツールを用いて、好適な溶媒又は溶液中の脱メチル化剤を注入して標的管上皮細胞に接触させることによりなされ得る。薬剤の量は異なり得るが、管中の全ての異型細胞を標的化するのに充分な量であり、標的管上皮細胞中で発現されるＰＡＰＰＡプロモーター上のＤＮＡメチル化を阻害又は逆転するのに充分な量である。
【００８８】
本発明は従来の化学療法薬の投与も可能とし、これらの有効性を増大させる。例えば、多くの化学療法薬が、有糸分裂中の細胞に作用し、前期／前中期に続く有糸分裂期にある細胞に特異的に作用する。これらは、癌細胞が有糸分裂中に停止している場合にはさほど有効でない。癌細胞の有糸分裂の進行を可能にすることができる薬剤を投与することにより、従来の化学療法薬が細胞に作用できるようになる。したがって、癌細胞は、有糸分裂不活性による薬物処置の回避ができない。有糸分裂ブロックを解除させた後に投与され得る好適な化学療法薬としては、タキサン（タキソール）及びビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、及びビノレルビン）が含まれる。
【００８９】
本発明の更なる態様は、患者の乳癌を処置又は防止する治療レジメン（又は治療方法）を提供する。レジメンは、２つの薬物、すなわち有糸分裂が遅延している癌細胞を解除し、前期、前中期、中期、後期、終期、及び細胞質分裂の正常な通過を促進する第１の薬物；及び化学療法剤、好ましくは前期／前中期より後の有糸分裂を標的とする化学療法剤である第２の薬物、の逐次投与を含む。
【００９０】
本発明のこの態様は、前期／前中期で停止した（本明細書中では「有糸分裂ブロック」と呼ぶ）有糸分裂中の乳房細胞が、前期／前中期より後の有糸分裂期の分裂細胞に対する活性を有する化学療法剤に対して感受性でないという観察結果に基づく。したがって、有糸分裂ブロックから有糸分裂細胞を解除する薬物を最初に患者に投与することにより、細胞は正常な有糸分裂サイクル（すなわち、前期／前中期から中期、後期、終期（及び細胞質分裂））を進行でき、それにより、その後／逐次投与される化学療法剤に感受性になる。
【００９１】
第１の薬物はＰＡＰＰＡタンパク質、機能的ＰＡＰＰＡをコードする核酸、ＩＧＦ受容体アゴニスト（例えば、ＩＧＦ−１）、又は脱メチル化剤であり得る。第２の薬物は、増殖中の細胞に影響を与える任意の薬物であり得、好ましくは、前中期より後の有糸分裂を標的とする抗有糸分裂化学療法剤である。好ましくは、第２の薬物はタキサン及びビンカアルカロイドを含む群から選択される。
【００９２】
「逐次」という用語は、第１及び第２の薬物がその特定の順序でそれらのそれぞれの生物学的効果を発揮しなければならないことを意味すると理解される。第１の薬物の投与の効果は、有糸分裂ブロックを解除することにより有糸分裂が前中期を超えて進行できるようにし、第２の薬物が前期／前中期後の有糸分裂を標的とするウィンドウ・オブ・オポチュニティを開くことである。第１及び第２の薬物は、第１の薬物が第２の薬物より前に効果を現せば、同時投与されても逐次投与されてもよい。例えば、一緒に投与される場合、第２の薬物は、有糸分裂ブロックが解除された後にだけ活性であるように遅延放出形態であり得る。
【００９３】
第１及び第２の薬物を投与する前に、本発明の治療レジメンに係る処置に患者が反応性でありそうかどうか決定することが好ましい。
【００９４】
一実施形態では、本発明の治療レジメンに係る処置の好適な患者候補は、患者から得られた乳房組織サンプル内の有糸分裂細胞の有糸分裂が遅延しているかどうかを決定する（すなわち、患者が有糸分裂遅延表現型を示すかどうかを決定する）ことにより同定される。したがって、一実施形態では、治療レジメンは、（ｉ）患者から得られた乳房組織サンプル中の前期又は前中期にある有糸分裂細胞の割合を同定すること；及び（ｉｉ）予め定められたカットオフ値と比較すること；により患者の有糸分裂表現型を同定する最初のステップを含む。前期又は前中期にある細胞の割合がカットオフ値より大きい場合、有糸分裂遅延表現型が同定される。カットオフ値は、好ましくは前述したように乳房組織サンプル内の有糸分裂細胞の少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも３３％である。これも前述したように、結果が統計的意義があるために組織サンプルは少なくとも５個の有糸分裂細胞を含まなければならない。
【００９５】
別の実施形態では、治療レジメンは、患者から得られた乳房組織サンプル中のＰＡＰＰＡ遺伝子又はその制御若しくはプロモーター配列中における機能喪失に関連する遺伝子変化あるいはＰＡＰＰＡの消失を検出することによる、患者が治療レジメンに係る処置に好適な候補であるかどうか同定する最初のステップを含む。遺伝子変化が存在する場合、患者は本発明の治療レジメンに係る処置の好適な候補であるとして同定される。好ましくは、ＰＡＰＰＡ遺伝子又はその制御若しくはプロモーター配列中の機能喪失に関連する遺伝子変化あるいはＰＡＰＰＡの消失はメチル化によるものである。
【００９６】
好ましい実施形態では、患者は、本発明の方法に従って浸潤性乳癌のリスクがあるとして同定され、その後、本明細書に記載の治療的適用又はレジメンの１又は複数を用いて処置される。
【００９７】
本発明は更に、乳癌の浸潤性を低減するための処置を想定する。前述したように、ＰＡＰＰＡ抑制により有糸分裂中に停止した癌細胞は浸潤能を獲得することができる。有糸分裂ブロックを解除することにより、細胞の浸潤能が低減した。これは患者に治療上の利点をもたらす。
【００９８】
更に別のアプローチでは、好適な発現技術を用いて内因性ＰＡＰＰＡをコードする遺伝子の発現をアップレギュレートすることができる。公知の技術としては、内因性遺伝子を人工的代替物で置換する遺伝子コンストラクトの使用が含まれる。あるいは、プロモーター又はコントロール配列を内因性遺伝子の上流に挿入してもよい。これは従来の方法を用いて行うことができる。
【００９９】
本発明は更に、ＰＡＰＰＡをアップレギュレートする化合物を検出するためのスクリーニング法で使用するための、メチル化ＰＡＰＰＡ遺伝子プロモーターを含む乳房細胞系を提供する。細胞は乳癌細胞又は非浸潤性異常乳房細胞であり得る。スクリーニング法は、細胞を潜在的治療剤と接触させること及び潜在的治療剤が細胞中のＰＡＰＰＡをアップレギュレートするかどうかを決定することを含み得る。潜在的治療剤は、例えば脱メチル化剤であり得、又は細胞内でＰＡＰＰＡを発現する核酸コンストラクトであり得る。
【０１００】
本発明は更に、制御配列に作動可能に連結された機能的ＰＡＰＰＡ発現核酸を含む、乳癌の処置で用いるための単離された遺伝子コンストラクトを提供する。そのようなコンストラクトは、当業者に理解されるように、従来の技術を用いて作製することができる。ＰＡＰＰＡ遺伝子及びプロモーター配列は公知であるので、当業者は好適なコンストラクト
の作製方法を容易に知ることができる。ＰＡＰＰＡ  ｍＲＮＡ配列はＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００２５８１．３で同定され、タンパク質配列はＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００２５７２．２で同定される。ＮＣＢＩデータベース上又はＭｉｔｏＣｈｅｃｋ  データベース（www.mitocheck.org）上でヒト又は他の種におけるホモログを見出すことができる。
【０１０１】
本発明に係る治療薬及び診断薬は乳癌の治療及び診断に有用である。
【０１０２】
ＰＡＰＰＡ又は他の治療活性薬剤は好適な医薬キャリアと組み合せて製剤化され得る。そのような製剤は、治療有効量のタンパク質（又は他の剤）、及び薬学的に許容されるキャリア又は補形剤を含む。そのようなキャリアとしては、限定されるものではないが、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及びこれらの組合せが含まれる。製剤は投与形態に適しているべきであり、当該技術分野の技能の範囲内である。本発明は更に、本明細書に記載の組成物の材料の１又は複数が詰められた１又は複数の容器を含む医薬パック及びキットに関する。
【０１０３】
本発明のタンパク質及び他の化合物は、単独で用いてもよく、治療化合物等のその他の化合物と併用してもよい。
【０１０４】
医薬組成物の全身投与の好ましい形態は、典型的には静脈内注射による、注射を含む。他の注射経路、例えば皮下、筋肉内、又は腹腔内を用いることもできる。全身投与のための別の手段としては、浸透剤、例えば胆汁酸塩、フシジン酸、又は他の界面活性剤を用いた経粘膜及び経皮投与が含まれる。更に、腸溶性又はカプセル化された製剤として適切に製剤化された場合、経口投与も可能であり得る。
【０１０５】
必要な投与量範囲は、タンパク質（又は他の活性物質）の選択、投与経路、製剤の性質、対象の状態の性質、及び主治医の判断によって決まる。しかし、好適な投与量は、対象１ｋｇ当たり０．１〜１００μｇである。しかし、様々な化合物が利用可能であり、種々の投与経路の効率が異なるため、必要な投与量の広い変動が予想される。例えば、経口投与は、静脈内注射による投与より多くの投与量が必要であると予想される。これらの投与量レベルの変動は、当該技術分野でよく理解されているように、最適化のための標準的な実験ルーチンにより調整することができる。
【０１０６】
前述したように「遺伝子治療」と呼ばれることの多い処置様式では、処置に用いられるタンパク質が対象の内部で生成してもよい。したがって、例えば、対象由来の細胞が、例えばレトロウイルスプラスミドベクターを用いて、タンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ等のポリヌクレオチドで生体外で改変され得る。その後、細胞は対象に導入される。
【０１０７】
医薬組成物は、ヒト医学及び獣医学においてヒト又は動物に使用されるものであり得、典型的には、薬学的に許容される希釈剤、キャリア、又は補形剤の１又は複数を含む。治療で使用するための許容可能なキャリア又は希釈剤は製薬分野で周知であり、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985)に記載されている。医薬的キャリア、補形剤、又は希釈剤は、意図する投与経路及び標準的な医薬実務に関連して選択することができる。医薬組成物は、キャリア、補形剤、又は希釈剤として、又はそれに加えて、任意の好適な結合剤、滑沢剤、懸濁化剤、コーティング剤、可溶化剤を含み得る。
【０１０８】
保存剤、安定化剤、色素、及び更には着香料が医薬組成物に付加され得る。保存剤の例としては、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、及びヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。抗酸化剤及び懸濁化剤も用いられ得る。
【０１０９】
種々の送達系に応じて組成物／製剤に対する要求は様々であり得る。
【０１１０】
適切な場合、医薬組成物は、非経口的に、例えば静脈内、筋肉内、又は皮下に注射され得る。非経口投与では、組成物は、他の物質、例えば溶液を血液と等張にするのに充分な塩又は単糖類を含んでよい無菌水溶液の形態で用いられ得る。
【０１１１】
以下に非限定的な例を用いて、添付の図面を参照して本発明を説明する。
【実施例】
【０１１２】
方法
組織標本
ホルマリン固定及びパラフィン包埋された組織を、ＵＣＬの病理学部（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）（ＵＣＬ病院、英国、ロンドン）のアーカイブから取得し、これには以下が含まれた：浸潤性乳癌（ｎ＝１８２、このうち１５６例を有糸分裂期分布の分析に含めた）；乳管上皮内癌（ＤＣＩＳ；ｎ＝８１、６９例が評価可能）；乳房縮小術標本に由来する正常乳房組織（ｎ＝３３、評価可能性、不適）；妊娠患者に由来する正常乳房組織（ｎ＝５、全て評価可能）；結腸腺癌（ｎ＝４１、全て評価可能）；膀胱移行上皮癌（ｎ＝２７、全て評価可能）；陰茎扁平細胞癌（ｎ＝３３、全て評価可能）；胃腺癌（ｎ＝２１、全て評価可能）；悪性黒色腫（ｎ＝２１、全て評価可能）；小細胞肺癌（ｎ＝３０、全て評価可能）；及び非ホジキンリンパ腫（ｎ＝２９、全て評価可能）。利用可能な組織学的材料及び臨床病理学的情報に基づいて症例を選択した。組織標本は、診断時に資格を有する病理学者に検査され、世界保健機関（ＷＨＯ）の基準に従って組織学的サブタイプ及び核異型度を評価されたものである。標本上に少なくとも５個の有糸分裂細胞が見られた場合、症例は有糸分裂期分布の分析に評価可能とした。Joint UCL/UCLH Committees on the Ethics of Human Researchから倫理的承認を得た。
【０１１３】
サイトスピン調製物
細胞単分子層を調製するために、０．５×１０６個の細胞を、Ｃｙｔｏｓｐｉｎ  ４  ｃｙｔｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（サーモサイエンティフィック社製）を用いて８００×ｇで５分間スライドガラス上にサイトスピンし、風乾し、４％中性緩衝ホルマリン中で一晩固定した。
【０１１４】
抗体
２８日間の免疫化プロトコール（ユーロジェンテック社（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ））に従ってＰＡＰＰ−Ａウサギポリクローナル抗体（ＰＡＰＰ−Ａ  ＰＡｂ）を合成ペプチド（ａａ１３８４〜１３９９）に対して産生させた。使用したその他の抗体には、ミリポア社のセリン１０でリン酸化されたヒストンＨ３（Ｈ３Ｓ１０ｐｈ；０６−５７０）、ダコ社のＰＡＰＰ−Ａ（Ａ０２３０）、シグマ社のβアクチン（ＡＣ−１５）、ＢＤファーミンゲン社のＣＤ２９（ＨＵＴＳ−２１）、ケミコン社のβ１−インテグリン（ＭＡＢ１９５９）、及びインビトロジェン社のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４が含まれる。
【０１１５】
免疫組織化学
切片の脱パラフィン、抗原賦活化、及び免疫染色はＢｏｎｄ  ＩＩＩ  Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ及びＢｏｎｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｒｅｆｉｎｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキット（ライカ社製）をメーカーの指示書に従って用いて行った。熱を介した抗原賦活化及びタンパク質消化をそれぞれＨ３Ｓ１０ｐｈ及びＰＡＰＰＡ抗原に用いた。以下の希釈で一次抗体を４０分間アプライした：ＰＡＰＰ−Ａ、１／２００；Ｈ３Ｓ１０ｐｈ、１／４０００。脱パラフィンステップのない同じプロトコールでサイトスピン調製物を免疫染色した。一次抗体なしのインキュベーションを陰性対照とし、扁桃腺及び胎盤の切片をそれぞれＨ３
Ｓ１０ｐｈ及びＰＡＰＰＡ抗体の陽性対照として用いた。
【０１１６】
有糸分裂期分布分析
各組織サンプルに由来する２つの連続切片及び各細胞系につき２つのサイトスピン調製物を、有糸分裂期分布を分析するためにＨ３Ｓ１０ｐｈについて免疫染色した。拡大率４００倍の５〜２０個のフィールドから得られた最低５個の有糸分裂細胞をＣＶ１２  ＣＣＤカメラ及びイメージキャプチャーソフトウェア（ｉｍａｇｅ  ｃａｐｔｕｒｉｎｇ  ｓｏｆｔｗａｒｅ：ＳＩＳ）を用いて取り込んだ。標本上の有糸分裂細胞が５個未満であった場合、症例を分析から除外した。従来の形態学的基準に従って有糸分裂細胞を前期／前中期、中期、後期、又は終期に分類した。
【０１１７】
組織解剖
組織切片を脱パラフィンし、マイヤーヘマトキシリンで５秒間染色し、風乾した。拡大率１００倍のフィールドを針顕微解剖（ｎｅｅｄｌｅ  ｍｉｃｒｏ−ｄｉｓｓｅｃｔ）し、１ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（シグマ  アルドリッチ社製）５５μｌ中、５５℃で４８時間インキュベートした後、ゲノムＤＮＡを抽出した。
【０１１８】
ＤＮＡメチル化分析
浸潤性乳癌（ｎ＝１８２）、ＤＣＩＳ（ｎ＝８１）、及び正常乳房（ｎ＝３４）の細胞系及び症例に由来するゲノムＤＮＡをＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ分析（Widschwendter, M. et
al. Cancer research (2004) 64, 3807-3813）に用いた。浸潤性乳癌の９例、ＤＣＩＳの６例、及び正常乳房の４例はＤＮＡ抽出に充分な材料が標本上に見られなかったため分析から除外した。ＮａｎｏＤｒｏｐ分光測定法によりＤＮＡ濃度を決定し、参照遺伝子を用いたｑＰＣＲによりＤＮＡの品質を検証した。全ての乳房サンプルの平均遺伝子増幅は３４．３９サイクル（ＳＤ＝２．０７）と算出された。全てのサンプルについて、ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｇｏｌｄキット（ザイモリサーチ社（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）製）をメーカーの指示書に従って用いて４００ｎｇのゲノムＤＮＡをバイサルファイトで改変した。非改変ＳｓｓＩ処理ゲノムＤＮＡ（ニュー・イングランド・バイオラボ社製）を陽性対照として用いた。バイサルファイト改変ＤＮＡは使用時まで−８０℃で保存した。ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔを用いた定量的ＰＣＲ分析を全てのサンプルに行った。ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔのプライマー及びプローブのヌクレオチド配列は、目的の遺伝子のプロモーター又は５’末端領域中に設計した。特異的座位での各ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ反応は平均５〜１０個のＣｐＧジヌクレオチドをカバーした。分析した全座位のプライマー及びプローブ（メタビオン社（Ｍｅｔａｂｉｏｎ）製）の詳細なリストを表１及び２に示す。バイサルファイト改変ＤＮＡに特異的に設計された２セット（目的の遺伝子用及びインプットＤＮＡを標準化するための参照遺伝子（ＣＯＬ２Ａ１）用のメチル化セット）のプライマー及びプローブを各座位に用いた。ＳｓｓＩ処置ヒト白血球細胞ＤＮＡ（高度にメチル化されている）を用いてメチル化ＤＮＡに対する反応の特異性を別個に確認した。サンプルの目的の遺伝子：ＣＯＬ２Ａ１比をＳｓｓＩ処理ヒト白血球細胞ＤＮＡの目的の遺伝子：ＣＯＬ２Ａ１比で割り、１００を乗じることにより、特異的座位で完全にメチル化されている分子のパーセンテージ（ＰＭＲ；メチル化基準に対するパーセンテージ）を計算した。
【０１１９】
細胞培養
ＢＴ５４９、Ｔ４７Ｄ、ＢＴ４７４、ＭＤＡＭＢ１５７、ＭＤＡＭＢ４５３、ＭＣＦ１０Ａ、ヒト乳房上皮細胞（ＨＭＥｐＣ）はRodriguez-Acebes et al, Am. J. Pathol, 2010; 177:2034-2045に記載されているように培養した。ＨｅＬａ  Ｋｙｏｔｏ細胞は、１０％ＦＣＳ（インビトロジェン社製）を補充したＤＭＥＭ（インビトロジェン社製）中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。
【０１２０】
細胞の同調
二重チミジンブロック（シグマ社）によりＨｅＬａ  Ｋｙｏｔｏ細胞をＳ期で同調させた。簡潔に述べると、終濃度３ｍＭのチミジンを培養培地に１８時間添加した後、新鮮な培養培地に９時間放出し、３ｍＭチミジンを用いて２回目のブロックを１７時間行った。終濃度５ｎｇ／ｍｌのＰｌｋ１阻害剤ＢＩ２５３６（セレックケム社製）で２４時間処理することによりＨｅＬａ  Ｋｙｏｔｏ細胞をＭ期で同調させた。細胞の同調をフローサイトメトリーで確認した。
【０１２１】
【表１】
2015509186.tif 000002
【０１２２】
【表２】
2015509186.tif 000003
【０１２３】
細胞集団増加評価及び細胞周期分析
細胞増殖評価及びフローサイトメトリーによる細胞周期分析はRodriguez-Acebes et al, Am. J. Pathol, 2010; 177:2034-2045に記載されている通りに行った。
【０１２４】
ＲＮＡ干渉
ＰＡＰＰＡ  ｍＲＮＡを標的とする特異的ＲＮＡ二本鎖（アンビオン社のｓ１００４２；センス５’−ＧＡＧＣＣＵＡＣＵＵＧＧＡＵＧＵＵＡＡｔｔ−３’（配列番号３７）及
びアンチセンス５’−ＵＵＡＡＣＡＵＣＣＡＡＧＵＡＧＧＣＵＣｔｇ−３’（配列番号３８）、あるいは二本鎖のプール（ＯＮ  ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ  ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製）を用いたＲＮＡｉによりＰＡＰＰＡのサイレンシングを行った。非標的化ｓｉＲＮＡ（Ｓｔｅａｌｔｈ  ＲＮＡｉ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｍｅｄ  ＧＣ、インビトロジェン社製）を陰性対照として用いた。全てのトランスフェクションはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（インビトロジェン社製）を用いて行った。終濃度１００ｎＭのＰＡＰＰＡ  ｓｉＲＮＡを用いて効率的なノックダウンを達成した。トランスフェクション後の記載の時点で細胞を回収した。ｑＲＴ−ＰＣＲ及び／又はウェスタンブロットによりノックダウン効率を評価した。
【０１２５】
リアルタイムＰＣＲ
Tudzarova et al, EMBO J., 2010; 29:3381-3394に記載されているように、細胞から全ＲＮＡを単離し、１００ｎｇの全ＲＮＡを用いてｑＲＴ−ＰＣＲを行った。プライマー配列は以下の通りである：ＰＡＰＰＡフォワード５’−ＡＣＡＧＧＣＴＡＣＧＴＧＣＴＣＣＡＧＡＴ−３’（配列番号３９）及びリバース５’−ＣＴＣＡＣＡＧＧＣＣＡＣＣＴＧＣＴＴＡＴ−３’配列番号４０）；ＲＰＬＰＯ（インバリアント対照として使用されるリボソームタンパク質）フォワード５’−ＣＣＴＣＡＴＡＴＣＣＧＧＧＧＧＡＡＴＧＴＧ−３’配列番号４１）及びリバース５’−ＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＧＣＡＣＣＴＴＡＴＴＧ−３’（配列番号４２）。
【０１２６】
免疫蛍光
免疫蛍光では、ＨｅＬａ  Ｋｙｏｔｏ細胞をカバースリップ（１２ｍｍ  ＃１  ＶＷＲインターナショナル社製）上で成長させ、前述したように同調させた。同調させた細胞をＰＢＳですすぎ、１％ＰＦＡ中で固定し、０．１％トリトンＸ−１００／０．０２％ＳＤＳを用いて透過処理し、２％ＢＳＡ中でブロッキングした。ブロッキングステップ後、ホスホヒストンＨ３（Ｈ３Ｓ１０ｐｈ）抗体を１／５００希釈で１時間アプライし、ＰＢＳで３回洗浄した後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４抗体を１／３００希釈で１時間添加した。カバースリップをＰＢＳで３回洗浄し、減衰しないＤＡＰＩの入ったＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（ベクターラボラトリーズ社製）を用いてマウントした。
【０１２７】
細胞集団増加評価及び細胞周期分析
細胞増殖評価及びフローサイトメトリーによる細胞周期分析は上記のRodriguez-Acebesに記載されているように行った。
【０１２８】
Ｔ４７Ｄ細胞中におけるＰＡＰＰＡ及びＺＭＰＳＴＥ２４過剰発現
ＰＡＰＰＡ及びＺＭＰＳＴＥ２４（対照）はメトジンシンスーパーファミリーの亜鉛依存性メタロプロテイナーゼである。全長ヒトＰＡＰＰＡ  ｃＤＮＡ（ＮＭ＿００２５８１．３）及びＺＭＰＳＴＥ２４  ｃＤＮＡ（ＮＭ＿００５８５７．２）をｐＣＭＶ６−ＸＬ５ベクター（オリジーン社製）にクローニングした。Ｔ７５フラスコ中で培養した約２×１０６のＴ４７Ｄ細胞を４０μｇのＰＡＰＰＡ又はＺＭＰＳＴＥ２４  ｃＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後及び７２時間後に細胞を回収した。ｑＲＴ−ＰＣＲ及びウェスタンブロットによりＰＡＰＰＡ及びＺＭＰＳＴＥ２４発現レベルを決定した。
【０１２９】
ＲＮＡｉレスキュー実験
２つの異なるＰＡＰＰ−Ａ  ｓｉＲＮＡ（アンビオン社のｓ１００４２及び１０４０２８）の標的となる領域内のヒトＰＡＰＰＡ  ｃＤＮＡ（ＮＭ＿００２５８１．３）の２つの別個の部位に８個のサイレント変異を導入した。変異ｃＤＮＡをｐＣＭＶ６−ＸＬ５ベクター（オリジーン社製）にクローニングし、ＢＴ５４９細胞を２０μｇのＰＡＰＰＡレスキュープラスミドでトランスフェクトした。ＰＡＰＰＡ＋ｍｕｔ過剰発現の２４時間後
に、１００ｎＭのＰＡＰＰＡ特異的ｓｉＲＮＡ（アンビオン社のｓ１００４２又は１０４０２８）を用いて内因性ｍＲＮＡをノックダウンした。内因性ｍＲＮＡノックダウンの４８時間後に細胞を回収した。
【０１３０】
浸潤アッセイ
細胞外マトリックス（ＥＣマトリックス）を介した浸潤をＢｏｙｄｅｎ  ｃｈａｍｂｅｒアッセイ（ＱＣＭ  Ｉｎｖａｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ、ミリポア社製）をメーカーの指示書に従って用いて測定した。簡潔に述べると、無血清培地中で２４時間、ＰＡＰＰＡ  ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ  ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ又は対照オリゴでＢＴ５４９細胞をトランスフェクトした。Ｔ４７Ｄ細胞をＰＡＰＰＡ又はＺＭＰＳＴＥ２４発現コンストラクトで２４時間トランスフェクトした後、無血清培地中で２４時間飢餓状態にした。５％ＢＳＡを含むＲＰＭＩ培地中にＢＴ５４９及びＴ４７Ｄ細胞を回収し、カウントし、２．５×１０５細胞を各浸潤チャンバー中に播種した。４８時間（ＢＴ５４９）又は７２時間（Ｔ４７Ｄ）インキュベートした後、浸潤チャンバーインサートをＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒド中で５分間固定し、０．１％クリスタルバイオレットで染色し、フィルター上のランダムな領域に由来する細胞をカウントした。アッセイは３連で行った。
【０１３１】
β１−インテグリンの細胞表面発現
（Rizki, A. et al., J. Cancer research (2007) 67, 11106-11110に記載されているように）生きた細胞を懸濁液中で免疫染色し、２％ＰＦＡ中で固定し、Rodriguez-Acebes
et al, Am. J. Pathol, 2010; 177:2034-2045に記載されているようにＦＡＣＳを行った。蛍光ピークを中央値の値で評価し、一次抗体（抗ＣＤ２９  ＨＵＴＳ−２１、ＢＤファーミンゲン社製）と一緒にインキュベートしなかったサンプルを用いて補正した。β１−インテグリンをマスキングするために、浸潤アッセイの間、２０μｇ／ｍｌのブロッキング抗体（抗β１−インテグリンＭＡＢ１９５９、ケミコン社製；Vincourt, J. B. et al.
(2010)Cancer research 70, 4739-4748）を培養培地に加えた。
【０１３２】
統計解析
前悪性及び悪性組織の各標本について前期／前中期にある有糸分裂細胞の割合を計算した。種々の最低数の有糸分裂細胞について、前期／前中期にある細胞の割合を用いて（プールされた）他の悪性腫瘍に由来する分化中の乳癌の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を作製した。最低必要数をたった５個の有糸分裂細胞とすることでＲＯＣ曲線が損なわれないことが明らかになった（図３）。可能な限り多くの標本を用いるために、有糸分裂遅延の分析の評価可能性閾値は、標本１個当たりに観察される有糸分裂細胞少なくとも５個に設定した。有糸分裂細胞の少なくとも３分の１が前期／前中期にあった場合、標本を「遅延」とした。この条件は、乳癌と他の悪性腫瘍との区別に関する感度と特異性のバランスをとることにより導かれた：評価可能な乳癌標本の９４．９％で有糸分裂細胞の少なくとも３分の１が前期／前中期にあり、評価可能な他の悪性腫瘍の９４．１％で前期／前中期にある有糸分裂細胞が３分の１未満であった（図４）。ピアソンのカイ二乗検定及びイェーツの連続補正を用いて、有糸分裂遅延のある評価可能な標本の割合を標本の出所（乳癌、ＤＣＩＳ、他の悪性腫瘍）間で比較した。マン・ホイットニー検定を用いて前期／前中期にある有糸分裂細胞の割合の中央値を標本の出所間で比較した。記載されている全ての有意性の確率は両側検定である。
【０１３３】
有糸分裂遅延と腫瘍分化及び結節転移の関係についてはノンパラメトリックなヨンクヒール・タプストラの傾向性検定を用いて、有糸分裂遅延と形態学的サブタイプ及び分子サブタイプの関係についてはクラサル・ワリスの分散分析検定を用いて、有糸分裂遅延とエストロゲン／プロゲステロン受容体状態及び異数性の関係についてはマン・ホイットニー検定を用いて評価した。
【０１３４】
結果
乳癌では初期有糸分裂像が多い
皮膚、肺、結腸、胃、膀胱、陰茎、及びリンパの癌を含む７つの一般的なヒト腫瘍タイプに由来する評価可能な組織標本（ｎ＝患者２０２例）において、有糸分裂細胞の大部分は中期にあった（図１ａ〜ｂ及び図５ａ〜ｂ）。顕著に対照的に、本発明者らは、他の悪性腫瘍を合わせた群のたった６％（２０２例中１２例）に対し、乳癌の９５％（評価可能患者１５６例のうち１４８例）で強い前期／前中期濃縮（前期／前中期にある少なくとも３分の１の有糸分裂細胞と定義される）を見出した（Ｐ＜０．０００１、ピアソン検定及びイェーツ補正）。有糸分裂細胞の割合の平均は乳癌では５８％（中央値５６％）であり、他の悪性腫瘍では２３％（中央値２３％）であった（Ｐ＜０．０００１、マン・ホィットニー検定）（図１ｂ〜ｃ及び図５ａ）。このことは、初期の有糸分裂の遅延又は停止が乳癌の特徴であることを示している。これは、正常に増殖している乳房組織は有糸分裂期分布が乱れておらず、有糸分裂細胞の２３％（中央値２４％）が前期／前中期にあったので、疾患組織に特異的であった（図１ｂ及び図５ｂ）。重要なことに、本発明者らは、非浸潤性の乳管上皮内癌（ＤＣＩＳ）病変の８０％（評価可能患者６９例のうち５５例）で既に明確な有糸分裂遅延表現型を検出できることを見出した（他の悪性腫瘍の群との比較でＰ＜０．０００１）、ＤＣＩＳ病変では、前期／前中期にある有糸分裂細胞の割合の平均が４８％（中央値４５％）であった（他の悪性腫瘍の群との比較でＰ＜０．０００１）（図１ｃ及び図６）。したがって、細胞培養モデルにおける遺伝子サイレンシングによって最初に観察された（Neumann, B. et al. Nature (2010) 464, 721-727）特定の有糸分裂表現型についての腫瘍スクリーニングにより、試験したほぼ全ての乳癌において予想外に高頻度な初期有糸分裂像（前期／前中期）が同定され、以前には認識されていなかったこの種の腫瘍における有糸分裂進行の遅延が明らかとなった。
【０１３５】
ＭｉｔｏＣｈｅｃｋでの乳癌様有糸分裂表現型のヒット
ＭｉｔｏＣｈｅｃｋスクリーニング（Neumann, B. et al.）において初期有糸分裂遅延は非常に特異的且つ比較的珍しい有糸分裂表現型であった。本発明者らが乳癌で観察したのと同様な初期有糸分裂表現型となる候補遺伝子を培養ヒト細胞におけるダウンレギュレーションにより同定するために、乳癌組織において本発明者らが観察した表現型に形態学的に最も似ている前期／前中期クラスに特にフォーカスしてＭｉｔｏＣｈｅｃｋデータベース（www.mitocheck.orgでアクセス可能）をサーチした（図７）。ゲノム全体のデータセット中、ＫＩＦ１１、ＰＬＫ１、ＴＵＢＢ２Ｃ、ＴＰＸ２、ＰＡＰＰＡ、ＳＧＯＬ１、及びＰＳＭＤ８が前期／前中期クラスの有意な増加を示し（図８）、これは乳癌で検出されたような前期／前中期における遅延又は停止を示している。これらの個々の遺伝子のノックダウンに対する時間分解的な表現型の応答を定量的にスコア化したところ、７つの遺伝子全てについて、一次表現型としての前中期停止、次いで二次表現型（例えば、細胞死又は多葉状の核形状）が示された（図８）。ＫＩＦ１１、ＰＬＫ１、ＴＵＢＢ２Ｃ、及びＴＰＸ２を標的としたＲＮＡｉ実験では、トランスフェクションの１２〜２５時間後には既に前中期にある細胞のパーセンテージが高く、一方、ＰＡＰＰＡ、ＳＧＯＬ１、及びＰＳＭＤ８のノックダウンは前中期表現型の浸透率がそれより低かったが、全体的に同様な表現型プロファイルを示した（図８）。有糸分裂表現型の結果としての細胞死がＰＡＰＰＡ及びＳＧＯＬ１を除く全ての遺伝子で有意であり（図８）、このことから、これらは有糸分裂異常が細胞死によりクリアされないと予想される腫瘍抑制遺伝子の最も有力な候補である。
【０１３６】
乳癌においてＰＡＰＰＡ消失が有糸分裂遅延と関連している
プロモーターのメチル化は、癌発生中の腫瘍抑制因子の機能喪失の一般的なメカニズムであるので、本発明者らは、７つのＭｉｔｏＣｈｅｃｋ候補遺伝子のいずれかのエピジェネティックなサイレンシングを、本発明者らが乳癌で発見した有糸分裂遅延表現型に関連付けられるという仮説を立てた。実際、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイ（Widschwendter,
M. et al. Cancer research (2004) 64, 3807-3813）により、７つの候補遺伝子のうち、ＰＡＰＰＡのみが浸潤性乳癌及び非浸潤性ＤＣＩＳ病変において遺伝子の５’制御領域が強くハイパーメチル化されていることが示された（図９ａ）。乳癌の４６％（メチル化を評価した患者１７３例中８０例）及びＤＣＩＳ病変の４５％（評価した患者７５例中３４例）がＰＡＰＰＡのハイパーメチル化を示した（ＰＭＲ＞１；メチル化基準遺伝子に対するパーセンテージ）。対照的に、ＰＡＰＰＡは正常乳房組織サンプルの大部分（評価した患者３０例中２７例）においてメチル化されていなかった（図９ｂ；乳癌９例、ＤＣＩＳ６例、及び正常乳房４例はＤＮＡの保存性が悪かったためＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ分析に利用可能でなかった）。このことから、ＰＡＰＰＡが乳癌に見られる強い前期／前中期遅延を説明する最も有力な候補となった。ＰＡＰＰＡプロモーターのメチル化が実際に遺伝子サイレンシングを引き起こしたかどうかを調べるために、本発明者らは、市販の抗ＰＡＰＰＡ抗体（ダコ社製）を用いて組織切片の免疫標識を行い、アフィニティー精製されたウサギ抗ＰＡＰＰＡ  ＰＡｂ（図１０）を用いてウェスタンブロッティングを行った。免疫発現分析により、メチル化ＰＡＰＰＡプロモーターを有し且つ有糸分裂遅延表現型を示す非浸潤性及び浸潤性の乳癌の実に９６％（患者８４例中８１例）がＰＡＰＰＡタンパク質を発現していないことが示された（図９ｃ）。対照的に、非遅延／ＰＡＰＰＡ非メチル化乳癌の大部分（７３％、患者１１例中７例）及び正常増殖妊娠乳房組織（ｎ＝患者５例）は、主に細胞膜で強いＰＡＰＰＡ免疫染色を示し、これは分泌型タンパク質と一致する（図９ｃ）。
【０１３７】
乳癌においてＰＡＰＰＡの発現消失が有糸分裂遅延を引き起こすという仮説を検証するために、実験で確認可能な系が必要である。したがって、本発明者らは、ＰＡＰＰ遺伝子サイレンシングと有糸分裂遅延表現型との間の関連が培養乳房細胞において維持されているかどうかを調べた。本発明者らのインビボでの知見と一致し、非メチル化ＰＡＰＰＡプロモーター及び検出可能なＰＡＰＰＡタンパク質を有する細胞、例えば一次ヒト乳腺上皮細胞（ＨＭＥｐＣ）、不死化ＭＣＦ１０Ａ細胞、並びにＢＴ５４９及びＭＤＡＭＢ１５７乳癌細胞系は、組織スクリーニング（図２）に用いたのと同じホスホヒストンＨ３（Ｈ３Ｓ１０ｐｈ）抗体で免疫標識したサイトスピン調製物の形態分析で、正常な有糸分裂期分布を示した（図９ｄ〜ｆ）。対照的に、高度にメチル化されたＰＡＰＰＡプロモーター（ＰＭＲ＞５０）を有しＰＡＰＰＡタンパク質が大きく低減した細胞系、例えばＢＴ４７４、ＭＤＡＭＢ４５３、及びＴ４７Ｄ乳癌細胞系は全て有糸分裂遅延表現型を示し、有糸分裂細胞の約８０％が前期／前中期にあった（図９ｄ〜ｆ）。
【０１３８】
乳癌細胞における初期有糸分裂進行にはＰＡＰＰＡが必要である
本発明者らは、患者組織で観察されたＰＡＰＰＡ発現消失と有糸分裂遅延との間の関連を再現した乳癌細胞系を入手し、ＲＮＡｉによるＰＡＰＰＡノックダウンが、プロモーターのメチル化により遺伝子がサイレンシングされていないＢＴ５４９中で前期／前中期の遅延を誘発するかどうかを最初に調べた（図９ｅ〜ｆ）。対照ｓｉＲＮＡと比べ、ＰＡＰＰＡ  ｍＲＮＡを標的とした４つのＲＮＡ二本鎖のプールによるＢＴ５４９細胞のトランスフェクションは、転写産物レベルを約７０％、ＰＡＰＰ−Ａタンパク質レベルを約６０％低下させた（図１１ａ）。ホスホヒストンＨ３（Ｈ３Ｓ１０ｐｈ）について免疫標識されたＢＴ５４９サイトスピン調製物の分析により、実際、ＰＡＰＰＡのノックダウンがこの細胞系において、強く前期／前中期遅延表現型を誘発することが明らかとなり（図１１ｃ）、これはＭｉｔｏＣｈｅｃｋスクリーニングにおいてＨｅＬａ細胞で観察された表現型と非常に似ていた（Neumann, B. et al. Nature (2010) 464, 721-727）。前期／前中期にある有糸分裂ＢＴ５４９細胞の割合増加と一致して、ＰＡＰＰＡノックダウンは、細胞集団倍加時間を顕著に長くし（図１１ｄ）、同時にＧ２／ＭのＤＮＡ含有量の細胞の割合が約２倍に増え（図１１ｅ）、有糸分裂指数が３倍上昇した。本発明者らは、転写産物の異なる領域を標的とする単一ｓｉＲＮＡ二本鎖（ｓｉＲＮＡ−２８及びｓｉＲＮＡ−４２）でＢＴ５４９細胞をトランスフェクトすることにより、ＰＡＰＰ−Ａ枯渇により生じ
る前期／前中期遅延表現型を検証した（図１２）。ＲＮＡｉ表現型がＰＡＰＰＡ枯渇による特異的なものであることを確認するために、本発明者らは、ｓｉＲＮＡ−２８及びｓｉＲＮＡ−４２に抵抗性のＰＡＰＰＡ  ｃＤＮＡバリアントを過剰発現させた。このコンストラクトの発現はＰＡＰＰＡタンパク質発現を回復させ、２つの単一ｓｉＲＮＡ二本鎖のいずれかにより生じた有糸分裂遅延表現型をレスキューした（図１２）。Ｔ４７Ｄ細胞等のハイパーメチル化ＰＡＰＰＡプロモーターを有する乳癌細胞における有糸分裂遅延表現型をＰＡＰＰＡ消失が引き起こす場合（図９ｄ〜ｅ）、本発明者らは、この実験系中、ＰＡＰＰＡ過剰発現が表現型をレスキューするはずであると考えた。実際、Ｔ４７Ｄ細胞をＰＡＰＰＡ  ｃＤＮＡ（ＰＡＰＰＡ＋）でトランスフェクトするとＰＡＰＰＡのｍＲＮＡ及びタンパク質のレベルが回復し（図１１ｂ）、有糸分裂遅延表現型が完全に逆転し、ＰＡＰＰＡの発現が正常なＢＴ５４９細胞と非常に似た有糸分裂期分布となった（図１１ｃ）。総合すると、これらの結果は、初期有糸分裂の進行にＰＡＰＰＡが必要であること及びエピジェネティックなサイレンシングを介したＰＡＰＰＡダウンレギュレーション（Ｔ４７Ｄ細胞）又はＲＮＡｉによる実験的ＰＡＰＰＡダウンレギュレーション（ＢＴ５４９細胞）が強い前期／前中期遅延表現型を引き起こすことを示している。
【０１３９】
ＰＡＰＰＡ消失は乳癌細胞の浸潤性を増大させる。
次に、本発明者らは、初期有糸分裂進行の混乱が新生物乳房細胞にどのような生物学的利点をもたらすのかと考えた。この疑問に取り組むために、通常の臨床調査中に各乳癌標本について決定された有糸分裂遅延表現型と臨床病理学的特徴との関連を探すことから始めた（ｎ＝評価可能患者１５６例）。この分析により、有糸分裂遅延と腫瘍分化（グレード）、形態学的サブタイプ（浸潤性管、小葉、混合型、粘液性、及び微小乳頭）、分子サブタイプ（ｌｕｍｉｎａｌ、Ｈｅｒ−２、又はトリプルネガティブ／ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ）、エストロゲン／プロゲステロン受容体状態、結節転移、又は異数性との間には関連がないことが明らかになった。しかし、特に、有糸分裂遅延表現型が、調べたほぼ全ての浸潤性乳癌標本に存在するが（９５％、評価可能患者１５６例中１４８例）、非浸潤性ＤＣＩＳ病変では一部にしか存在しない（８０％、６９例中５５例）ことから、この有糸分裂異常は浸潤性の獲得に関連している可能性が考えられる。この具体的な仮説を試験するために、本発明者らは、ＰＡＰＰＡノックダウンによりＢＴ５４９細胞中で有糸分裂遅延表現型を誘発し（あるいは、外因性ＰＡＰＰＡ発現によりＴ４７Ｄ細胞中で正常な有糸分裂進行を回復させ）、マトリゲルコートＢｏｙｄｅｎ  ｃｈａｍｂｅｒアッセイにより操作細胞の浸潤性を測定した。並行して、本発明者らは、フローサイトメトリーを用いて、よく特徴付けられている乳癌の浸潤マーカーであるβ１−インテグリンの細胞表面レベルを決定した。ＰＡＰＰＡのサイレンシングは、浸潤細胞数の顕著な（２倍）増加と関連した（図１３ａ〜ｂ）。ＰＡＰＰ−Ａ枯渇ＢＴ５４９細胞の浸潤性増大はβ１−インテグリン細胞表面レベルの増加にも反映されていた（図１３ｃ）。特に、ＰＡＰＰＡノックダウンに関連する浸潤性の増大は、細胞をＢｏｙｄｅｎ  ｃｈａｍｂｅｒに移す前にβ１−インテグリンブロッキング抗体でＢＴ５４９細胞を処理することで完全に逆転された（図１３ｄ）。逆に、外因性ＰＡＰＰＡ発現による正常有糸分裂期分布の再確立はＴ４７Ｄ細胞の浸潤性を強く低減した（図１３ａ〜ｂ）。これらの結果は、ＰＡＰＰＡ機能の消失が、初期有糸分裂の進行を遅らせ、乳癌細胞がより浸潤性になる能力を増大させることを示している。
【０１４０】
実施例２
外因的に添加されたＩＧＦ−１は、前期／前中期遅延表現型を示す乳癌細胞において有糸分裂の正常な進行を回復させる。
【０１４１】
ＰＡＰＰＡの知られている機能は、捕捉性抑制性結合タンパク質（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒｉｎｇ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）ＩＧＦＢＰ−４からホルモンＩＧＦ−１を放出させることである。細胞表面のＩＧＦ−１の局所的バイオアベ
イラビリティを増大させることにより、ＰＡＰＰＡ活性は、ＩＧＦ依存性シグナル伝達を増大させ、細胞成長及び増殖を促進する。したがって、ＰＡＰＰＡはＩＧＦ経路を介したシグナル伝達を調節することにより乳癌細胞中における有糸分裂進行に影響を与える可能性があるという仮説を立てることができる。このことから、生体内で腫瘍細胞と非常に似ている（すなわち、ＰＡＰＰＡプロモーターメチル化及び有糸分裂遅延表現型を示す；図１４）Ｔ４７Ｄ乳癌細胞を組換えＩＧＦ−１で処置することにより、この細胞系において有糸分裂の正常な進行が回復すると考えられる。これらの実験のために、Ｔ４７Ｄ細胞を４８時間血清飢餓にした。トリパンブルー生体染色を用いて細胞の生存率を確認した。終濃度１００μＭの組換えヒトＩＧＦ−１（Ｉｍｇｅｎｅｘ社製）で細胞を処理し、回収した。細胞は２４時間後に回収し、ＰＢＳに再度懸濁し、スライドガラス上にサイトスピンし、前述したようにＨ３Ｓ１０ｐｈ免疫染色を行った。実際、ＩＧＦ−１の添加は前期／前中期にある有糸分裂Ｔ４７Ｄ細胞の割合を約半分に低減し（図１５）、これはＰＡＰＰＡを発現するＢＴ５４９乳癌細胞で見られるレベルに近い。この発見から、当業者は、抗有糸分裂剤を用いた追跡処置が癌細胞殺作用を増強すると推論することができる。したがって、有糸分裂ブロックを取り除く第１の薬物及び前中期段階後の有糸分裂を標的とする第２の薬物を用いた逐次処置により、腫瘍細胞が第２の薬物に対して化学療法剤感受性になる。
【０１４２】
方法
細胞培養
Ｔ４７Ｄ細胞は、１０％ＦＣＳ及び１０μｇ／ｍｌインスリンを補充したＲＰＭＩ培地（ＡＴＣＣ）を用いて培養した。細胞は３７℃、５％ＣＯ２、湿度９５％以上で培養した。ＴｒｙｐＬＥ（商標）  Ｅｘｐｒｅｓｓ（ライフテクノロジーズ社製）とインキュベートした後、細胞を回収した。Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（ライフテクノロジーズ社製）を用いてトリパンブルー排除により細胞密度及び生存率を決定した。ＰＤＴ＝（ｔ２−ｔ１）／３．３２×（ｌｏｇ  ｎ２−ｌｏｇ  ｎ１）（式中、ｔはサンプリング時間、ｎはサンプリング時の細胞密度である）により集団倍加時間を計算した。図１４Ａに示す顕微鏡写真は、ライカ社製倒立顕微鏡に装着したパナソニック社製デジタルカメラを用いて撮影した。
【０１４３】
細胞周期分析
６０〜７０％のコンフルエンシーに達したＴ４７Ｄ細胞をトリプシン処理により回収した。培地上清を、トリプシン処理細胞と共にプールし、１９４×ｇで３分間遠心した（このステップは、全ての有糸分裂細胞の保持を確実にするため及び有糸分裂シェイクオフによるロスを回避するために含めた）。細胞ペレットを洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、濃度を２×１０６細胞／ｍｌとした。次いで、再懸濁した細胞をＣｏｕｌｔｅｒフローサイトメトリーチューブに移し、ボルテックスを用いて撹拌しながら１．５ｍｌの氷冷１００％エタノールを滴下することにより固定した。次いで、細胞を氷上に３０分間置いて固定した。エタノール固定後、１９４×ｇで５分間遠心することにより細胞をペレット化した。上清を注意深く除去し、細胞を２ｍｌのＰＢＳ（ボルテックスで撹拌しながら滴下）で洗浄した。細胞を最終的に３００μｌのＤＮＡ  Ｐｒｅｐ  ＰＩ溶液（ベックマン・コールター社製）に再懸濁し、暗黒下、室温で１０分間インキュベートした後、Ｎａｖｉｏｓ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを用いて細胞周期を分析した。Ｍｕｌｔｉｃｙｃｌｅ−ＡＶソフトウェアを用いてデータを分析した。
【０１４４】
ｑＲＴ−ＰＣＲ分析
Ａｍｂｉｏｎ  ＰｕｒｅＬｉｎｋ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉキット（ライフテクノロジーズ社製）をメーカーの指示書に従って用いて全細胞ＲＮＡを単離した。ｑＰＣＲ反応は、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ｑＲＴ−ＰＣＲキット（ライフテクノロジーズ社製）をメーカーの指示書に従って用
いて行った。ＰＣＲ反応はＳｔｅｐＯｎｅ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステム（ライフテクノロジーズ社製）を用いて行った。４００ｎｇの鋳型ＲＮＡ及び２００ｎＭの最終プライマー濃度を個々の各ＰＣＲ反応に用いた。ＰＣＲ産物を更に、図１４Ｄに示すようにアガロースゲル電気泳動にかけた。
【０１４５】
本研究に用いたプライマーを以下の表３に示す。
【０１４６】
【表３】
2015509186.tif 000004
【０１４７】
イムノブロッティング
Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイキット（ピアス社製）をメーカーのプロトコールに従って用いてタンパク質濃度を決定した。Ｎｏｖｅｘ（登録商標）  ４−２０％Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳ  ＰＡＧＥ（ライフテクノロジーズ社製）により、２０〜３０μｇの細胞質ゾルタンパク質及びＭａｇｉｃＭａｒｋ（商標）（ライフテクノロジーズ社製）を分離した。ｉＢｌｏｔ（登録商標）ドライエレクトロブロッティングシステム（ライフテクノロジーズ社製）を用いてタンパク質をポリアクリルアミドゲルからＰＶＤＦメンブレン上に転写した。簡潔に述べると、１０％ミルクを補充したＰＢＳ中でメンブレンを１時間ブロッキングした。ポリクローナル抗ＰＡＰＰ−Ａ抗体（アカデミックな協力者からの寄贈）を用いて更にメンブレンをプローブした。このステップは穏やかに撹拌しながら４℃で一晩行った。一次抗体とのインキュベート後、メンブレンをＰＢＳで１０分間、５回洗浄した。１０％ミルクの入ったＰＢＳ中のＨＲＰコンジュゲート二次ヤギ抗ウサギ抗体（ダコ社製）をメンブレンに加え、室温で１時間インキュベートした。ＥＣＬＳｅｌｅｃｔ（商標）キット（ＧＥヘルスケア社製）の等体積の試薬Ａ及びＢをメンブレンに加え、室温で３分間インキュベートした。図１４Ｅに示す画像はＧｅｎｅＧｎｏｍｅ化学発光検出システム（シンジーン社（Ｓｙｎｇｅｎｅ）製）を用いて取得した。メンブレンを抗βアクチン（シグマ  アルドリッチ社製）抗体で再度プローブして、各レーン中の全タンパク質のローディングが等しくなるようにした。
【０１４８】
Ｍｅｔｈｙｌｉｇｈｔアッセイ
ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡキット（キアゲン社製）をメーカーのプロトコールに従って用いてＴ４７Ｄ細胞からゲノムＤＮＡを抽出した。単離したＤＮＡを、ＮａｎｏＶｕｅ分光光度計を用いて定量化した。各反応についてＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｇｏｌｄ  ｋｉｔ（ザイモリサーチ社製）をメーカーの指示書に従って用いて４００〜５００ｎｇのゲノムＤＮＡをバイサルファイト改変した。バイサルファイト改変ＤＮＡは必要時まで−８０℃で保存した。非改変ＳｓｓＩ処理ゲノムＤＮＡ（ニュー・イングランド・バイオラボ社製）を陽性対照として用いた。バイサルファイト改変ＤＮＡ用に２セットのプライマー及びプローブを設計した：インプットＤＮＡについて標準化するためのＰＡＰＰ−Ａ及びコラーゲン２Ａ１用のメチル化セット。ＴａｑＭａｎ（登録商標）  Ｕｎｉｖｅ
ｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、Ｎｏ  ＡｍｐＥｒａｓｅ（登録商標）  ＵＮＧ（ライフテクノロジーズ社製）を２０ｎｇのＤＮＡ、０．３μＭのプローブ、並びに０．９μＭのフォワード及びリバース両方のプライマーと用いてｑＰＣＲ反応を行った。
【０１４９】
本研究に用いたプライマーを以下の表４に示す。
【０１５０】
【表４】
2015509186.tif 000005
【０１５１】
反応はＳｔｅｐＯｎｅ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステム（ライフテクノロジーズ社製）を用いて行った。サイクリング条件は、９５℃（１０分）；次いで９５℃（１５秒）、６０℃（１分）を５０サイクルとした。ｑＰＣＲ反応の結果はＳｔｅｐＯｎｅソフトウェアを用いて分析した（ＤＤＣＴ及びＲＱ計算値）。完全にメチル化されたＰＡＰＰ−Ａ分子のパーセンテージは、サンプルのＰＡＰＰ−Ａ：ＣＯＬ２Ａ１比をＳｓｓｌ処理ゲノムＤＮＡのＰＡＰＰ−Ａ：ＣＯＬ２Ａ１比で割ることにより算出した。
【０１５２】
Ｔ４７Ｄ細胞のＩＧＦ−１処理
Ｔ４７Ｄ細胞を実験前に４８時間血清飢餓状態にした。Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（商標）自動細胞計数装置（ライフテクノロジーズ社製）を用い、生体染色トリパンブルーを用いて細胞の生存率を決定した。細胞を終濃度１００μＭの組換えヒトＩＧＦ−１（ＩＭＲ−２３３、Ｉｍｇｅｎｅｘ社製）で処理した。２４時間後にＴｒｙｐｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）（ライフテクノロジーズ社製）を用いて細胞を回収し、ＰＢＳに再懸濁した。次いで、細胞をスライドガラス上にサイトスピンし、前述したようにＨ３Ｓ１０ｐｈ免疫染色した。
【０１５３】
結果
結果を図１４及び１５に示す。外因性ＩＧＦ−１はＴ４７Ｄ細胞において有糸分裂遅延表現型を逆転させることにより、細胞の有糸分裂を可能にする。したがって、有糸分裂中に作用する化学療法剤を細胞に標的化させて有効な治療法を提供することができる。
【図１ａ】
2015509186.tif 000006
【図１ｂ】
2015509186.tif 000007
【図１ｃ】
2015509186.tif 000008
【図２】
2015509186.tif 000009
【図３】
2015509186.tif 000010
【図４】
2015509186.tif 000011
【図５ａ】
2015509186.tif 000012
【図５ｂ】
2015509186.tif 000013
【図６ａ】
2015509186.tif 000014
【図６ｂ】
2015509186.tif 000015
【図６ｃ】
2015509186.tif 000016
【図７】
2015509186.tif 000017
【図８ａ】
2015509186.tif 000018
【図８ｂ】
2015509186.tif 000019
【図９ａ】
2015509186.tif 000020
【図９ｂ】
2015509186.tif 000021
【図９ｃ】
2015509186.tif 000022
【図９ｄ】
2015509186.tif 000023
【図９ｅ】
2015509186.tif 000024
【図９ｆ】
2015509186.tif 000025
【図１０ａ】
2015509186.tif 000026
【図１０ｂ】
2015509186.tif 000027
【図１０ｃ】
2015509186.tif 000028
【図１１ａ】
2015509186.tif 000029
【図１１ｂ】
2015509186.tif 000030
【図１１ｃ】
2015509186.tif 000031
【図１１ｄ】
2015509186.tif 000032
【図１１ｅ】
2015509186.tif 000033
【図１２ａ】
2015509186.tif 000034
【図１２ｂ】
2015509186.tif 000035
【図１２ｃ】
2015509186.tif 000036
【図１２ｄ】
2015509186.tif 000037
【図１３ａ】
2015509186.tif 000038
【図１３ｂ】
2015509186.tif 000039
【図１３ｃ】
2015509186.tif 000040
【図１３ｄ】
2015509186.tif 000041
【図１４（Ａ）】
2015509186.tif 000042
【図１４（Ｂ）】
2015509186.tif 000043
【図１４（Ｃ）】
2015509186.tif 000044
【図１４（Ｄ）】
2015509186.tif 000045
【図１４（Ｅ）】
2015509186.tif 000046
【図１４（Ｆ）】
2015509186.tif 000047
【図１５（Ａ）】
2015509186.tif 000048
【図１５（Ｂ）】
2015509186.tif 000049
【国際調査報告】
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2015509186.tif 000052
2015509186.tif 000053
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