(57)【要約】  脂質起源の精製幹細胞分画を調製する安全性の高い手順であって、特別に設計された単一回収装置の使用が、幹細胞含有材料が受ける搬送および操作の数を低減させ、汚染、材料損失、および試料の不注意による交換のリスクを最小まで低減させ、さらに、原料を回収する者と、幹細胞単離の熟練者との間の連絡および協力を簡略化する手順が本明細書において記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質組織起源の幹細胞分画を調製する方法であって、
（ａ）前記幹細胞を含有する脂質組織の試料を回収または受け取るステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の試料を、好適な水性緩衝液により洗浄するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の試料を、前記脂質組織を消化し、その組織から前記幹細胞を抽出し得る酵素とインキュベートするステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の生成物から水相を回収するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）において得られた水相を精製するステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）において得られた水相を力価測定し、必要な場合は、それを希釈して所望の濃度および容量を有する最終幹細胞分画を得るステップと
を含み、
前記幹細胞含有材料を、少なくとも前記ステップすなわち（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）全体にわたり単一回収装置（ＳＣＤ）内で処理し、前記ＳＣＤは、回収手段、相分離器およびプロセス反応器の機能を実施する、方法。
【請求項２】
前記ＳＣＤが、２０〜１００ｍＬに含まれる充填容量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＳＣＤがシリンジであり、任意選択的に、最適な充填容量を示すための１つ以上の標識、および／または記載もしくはラベリングのための領域が該シリンジに備わっている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記脂質材料が、吸引脂肪組織である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ステップ（ａ）および（ｂ〜ｄ）を、それぞれ、２人の異なる操作者により、相互に離れた位置において実施する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｂ）において、前記緩衝液が、酵素栄養素が補給されたＰＢＳ緩衝液である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
シリンジをＳＣＤとして使用し、前記ステップ（ｂ）および／または（ｃ）において、前記シリンジを下向き（針を下方）または上向き（針を上方）に配向し、次いで前記針に近位の相を排出することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｃ）において、前記酵素がリベラーゼであり、前記インキュベーションを３０〜４５℃の温度において２０〜８０分間実施する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｄ）において、インキュベートされた混合物を、アルブミン含有溶液と混合し、次いで脂質相を廃棄し、前記水相を後続のプロセスステップのために回収する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記幹細胞含有材料を、前記ステップ（ｄ）〜（ｅ）の１つ以上の間、前記ＳＣＤ内でさらに維持する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｅ）における精製を、遠心分離および／またはろ過により実施する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記最終幹細胞分画を、１〜５ｍｌの１つ以上の単位として配合し、総有核細胞濃度が、１０８〜１０４個に含まれる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法により得られた幹細胞分画。
【請求項１４】
組織充填、創傷治癒、組織または臓器再建のための成分として使用される、請求項１３に記載の幹細胞分画。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
幹細胞への関心は、美容および医薬業務において、種々の理由のために生体組織を損失した患者に適用可能な新たな生体組織の生成能またはそれらの再生能に関連して高まっている。
【０００２】
特に、成人幹細胞、例えば、脂質または骨髄起源のものは、それらのより制御可能な効力に起因して、およびさらには胚細胞に適用される倫理的規制の適用外であるために、特別な関心を集めている。
【０００３】
脂質起源の幹細胞のための使用の典型的な分野は、美容目的のための組織充填の分野である。すなわち、ここで、治療を要求する患者は、その患者自身の脂質組織の一部（吸引脂肪組織（lipoaspirate））を提供し、これは、精製細胞分画を回収する実験室により処理され、この分画は、充填が要求される身体領域に注射して患者に戻される。得られた細胞分画は、間質血管分画（ＳＶＦ）と呼ばれ、脂肪組織から抽出された有核細胞の総数を表す。典型的には、これらの細胞の１０〜２０％が幹細胞であり、間葉系幹細胞とも呼ばれる。これらは、多能性であり、いくつかのタイプのヒト組織を修復または再生し得る。自己脂質組織の使用により、免疫反応のリスクおよび組織の拒絶が回避される。さらに、次いでこれらの抽出細胞は、さらなる治療、例として、ヒト幹細胞療法における幹細胞の使用のためにドナーが使えるように液体窒素中で長期間冷凍貯蔵することができる。
【０００４】
脂質組織起源の精製細胞分画を調製する方法は、当分野において公知である。
【０００５】
これらは、一般に、元となる脂質原料の回収と、幹細胞構成成分の選択的抽出と、排出される脂質マトリックスの排除と、都合の良い（convenient)な濃度および容量における幹細胞分画の最終洗浄、精製および調製とを含む。これらの方法は、多数のピペット、チューブ、ベッカー（becker）などを介する幹細胞含有材料の搬送を含み、かなりの細菌汚染のリスクおよび／または材料損失を伴う。すなわち、これによって、それらには、環境および様々な使用材料の無菌性、接着が見込まれる材料を回収するための複数の洗浄に関して極めて厳密な手順が要求され、全てが合わさって本方法の全コストとなる。複数の容器による移送によっても、異なる患者からの試料の不注意による交換のリスクが増加し、最終幹細胞受取人が非自己輸液のリスクに曝される。
【０００６】
上記手順には、脂質原料を回収する操作者と、幹細胞を単離する実験室との間の厳密な協働および理解も要求される。原料は、最適でない容器（例えば、大型すぎる、適切に密封されていない、誤って包装されている、最適量でない、など）に入れられて送付されることもある。すなわち、これら全ての場合、実験室は、準最適な出発試料を取り扱うことを強いられ、そのことは最終生成物の品質に影響し得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、患者にとって安全で、本方法の操作者がより迅速かつ効率的に扱える脂質組織起源の幹細胞分画を調製する改善された方法を提供することである。
【０００８】
さらなる課題は、脂質原料を回収する操作者と、幹細胞単離を担当する者との間の連絡および協力を簡略化／標準化することである。
【０００９】
さらなる課題は、精製細胞分画を生成する方法に関与するステップおよび操作の数を低減させることである。
【００１０】
さらなる課題は、幹細胞の使用を含む医薬／美容手順をより迅速化および効率化することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、脂質起源の幹細胞分画を得る方法であって、本質的に、
（ａ）幹細胞を含有する脂質組織の試料を回収または受け取るステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）において得られた試料を、好適な水性緩衝液により洗浄するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）において得られた試料を、幹細胞を含有する脂質組織から幹細胞を抽出し得る酵素とインキュベートするステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）において得られた生成物から水相を回収するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）において得られた水相を精製するステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）において得られた水相を力価測定し、任意選択的に、それを希釈して所望の濃度および容量を有する最終幹細胞分画を得るステップと
に基づく方法に関する。
【００１２】
本発明の本質的な特徴の１つは、幹細胞含有材料を、本明細書に記載の方法の少なくともステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）全体にわたり同一の回収装置（本明細書において、「単一回収装置」または「ＳＣＤ」と称する）内で処理することにある。ＳＣＤの使用により、処理材料と外部雰囲気との接触が回避され、汚染のリスクおよび複数の容器移送に関連する活性材料の損失が最小まで低減され、精製幹細胞分画を得るために要求される全操作が簡略化される。
【００１３】
ＳＣＤは、液体を抜き取り、放出させ得る無菌容器である。それは、典型的には、排他的ではないが、シリンジである。ＳＣＤは、対応する脂質材料からの幹細胞の大規模収集を可能とするための大きい充填容量（例えば、２０〜１００ｍＬ）を有し得る。これは、好ましくは、透明または半透明であり、最適な充填容量を示す１つの標識、および／または試料資源を識別するための記載もしくはラベリングを目的とする領域を有する。
【００１４】
詳細な説明から明らかなとおり、ＳＣＤは、含まれる特定のプロセスステップに応じて回収装置（例えば、ピペット）、相分離器、およびプロセス反応器の機能を実行する。したがって、それら全ての機能は、有利には、試料をある容器から別の容器へ移送せずに、および／またはそれを外部雰囲気と接触させずに実施される。
【００１５】
ＳＣＤは、本質的には、本方法のステップ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）全体にわたり使用する。しかしながら、必要に応じ、ＳＣＤは、上記の同一の機能および利点でステップ（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）の１つ以上の全体にわたり維持することもできる。
【００１６】
上記前提に基づき、本発明の方法は、以下のステップ、すなわち、
（ａ）幹細胞を含有する脂質組織の試料をＳＣＤ中で回収または受け取るステップと、
（ｂ）前記ＳＣＤ中で、ステップ（ａ）の試料を、好適な水性緩衝液により洗浄するステップと、
（ｃ）前記ＳＣＤ中で、ステップ（ｂ）の試料を、脂質組織を消化し、その組織から幹細胞を抽出し得る酵素とインキュベートするステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の生成物から水相を回収するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）において得られた水相を精製するステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）において得られた水相を力価測定し、必要な場合は、それを所望の濃度および容量を有する最終幹細胞分画に希釈するステップと
を含む。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
ステップ（ａ）：
このステップにおいて、幹細胞を含有する脂質組織の試料を好適な資源からＳＣＤ中に抜き取る。
【００１８】
吸引脂肪組織は、典型的な脂質組織試料である。試料は、本方法の目的のために液体または少なくとも流体でなければならない。不十分に流体の材料は、さらなる均質化および／または液体培地、例えば、緩衝溶液の添加により、そのようにすることができる。
【００１９】
ステップ（ａ）において、ＳＣＤを脂質組織試料と接触させて差し込み、その好適な容量を抜き取るように操作する。抜き取りは、ＳＣＤの利用可能な容量を完全に充填する前に中止し、こうして下記の洗浄緩衝液および他の試薬のためのさらなる抜き取り性能（典型的には、ＳＣＤ容量の半分）を可能とする。
【００２０】
ステップ（ａ）における表現「回収または受け取ること」は、このステップを、他のステップ（ｂ）〜（ｆ）を実施する機関／操作者と同一または異なる機関／操作者により実施することができるという事実を説明する。すなわち、第１の任意選択においてステップ（ａ）において、操作者は、脂質試料を「回収」し、それをステップ（ｂ）〜（ｆ）により直接処理し、第２の場合、操作者は、ある者により回収された脂質試料を「受け取り」、それをステップ（ｂ）〜（ｆ）により処理する。典型的には、ステップ（ａ）は、病院または美容施設により実施することができ、ステップ（ｂ）〜（ｆ）は、幹細胞処理を専門とする実験室により実施する。
【００２１】
この第２の任意選択において、本方法は、特に、吸引脂肪組織を第１の容器中に回収し、貯蔵し、外部実験室に送付し、次いで好適な反応器中に移送する。すなわち、これらの全ての移送／操作は、試料と外部雰囲気との接触を含み、汚染のリスクとつながり、固有の割合の生成物損失を伴う公知の方法において生じる汚染についての主な原因を除去するという点で有利である。このような欠点およびリスクは、目下、本方法により最小化される。
【００２２】
ＳＣＤの使用は、初期操作者、すなわち、脂質試料を回収する者に、充填容量、空隙容量、気密性、包装材料などの観点からさらなる処理に好適に適合された標準化容器を提供するという点でさらに有利である。
【００２３】
以下のステップは、ステップ（ａ）直後に実施することができる。あるいは、部分的に充填されたＳＣＤを、ステップ（ｂ）〜（ｆ）によるさらなる処理の時刻まで幹細胞の生存を維持する条件においてある時間貯蔵する。
【００２４】
ステップ（ｂ）
このステップにおいて、ステップ（ａ）からの抜き取られた脂質試料を、ＳＣＤ内部で水性緩衝溶液により洗浄する。
【００２５】
洗浄を行うため、ステップ（ａ）からの部分的に充填されたＳＣＤを、ある容量の緩衝溶液を抜き取るように操作し、それをＳＣＤ内部に存在する脂質組織試料と混合する。２つの相の均質な混合は、例えば、ＳＣＤへの振動／振とうの適用により容易に行うことができる。使用される緩衝溶液は、幹細胞適合性の緩衝溶液であり、典型的には、酵素栄養素として有用なカルシウムおよび／またはマグネシウム塩が補給されたＰＢＳ緩衝液である。緩衝液と脂質組織との容量比は、例えば、約０．５：１．５〜約１．５：０．５であり、好ましくは、それは約１：１である。
【００２６】
前記混合／均質化後、２つの相（脂質および水相）が分離するまでＳＣＤを静置する。次いで、水相を排出する一方、脂質相を滞留させるようにＳＣＤを操作する。すなわち、特に、ＳＣＤがシリンジである場合、このことは、それを下向き（針が下方）位置に配向することにより行うことができる。このことにより、脂質相がシリンジの上方区画で、針から遠位に移動する一方、水相は針の近位に反対側の区画に凝集し、この位置において、シリンジプランジャに対する圧力により、水相を針から排出し、水／脂質界面が針に達するまで圧力を好適に維持し、この時点において、（廃棄すべき）水相を実質的に排除し、シリンジは脂質相のみを含有し、その場合に次のステップを実施すべきである。
【００２７】
上記の洗浄ステップは、脂質相の所望の洗浄度に達するまでより多くの回数、例えば、１回または２回繰り返すことができる。
【００２８】
ステップ（ｃ）
このステップにおいて、ステップ（ｂ）からの洗浄された脂質相を、ＳＣＤ中で、幹細胞を含有する脂質材料から幹細胞を抽出し得る酵素とインキュベートする。
【００２９】
このステップを実施するため、ＳＣＤを、前記酵素を含有する液体培地のアリコートをさらに抜き取るように操作する。酵素は、典型的には、リベラーゼであり、液体培地は、典型的には、緩衝液、好ましくは、特にカルシウムおよび／またはマグネシウム塩が補給された酵素活性に最適化されたＰＢＳ緩衝液である。液体培地は、既知の酵素力価を有し、それにより操作者が所望の再現可能な量の酵素を抜き取ることが可能となる。
【００３０】
こうして充填されたＳＣＤを、任意選択的に密封外被(envelope)内に挿入し、次いで、インキュベータ、典型的には、振動トレイが提供された温度制御オーブン中に配置する。インキュベーション前、ＳＣＤを、好ましくは、撹拌して含有物を均質化する。次いで、混合をトレイの振動移動によりインキュベータ内で継続する。
【００３１】
インキュベータは、以下の非排他的条件下で操作することができる。すなわち、インキュベーション時間２０〜８０分間、より好ましくは、３０〜６０分間、最も好ましくは、４５分間、３０〜４５℃の温度、好ましくは、３７℃、撹拌：１〜５ｒｐｍ、好ましくは、２または３ｒｐｍ。
【００３２】
ステップ（ｄ）
このステップにおいて、酵素反応を遮断し、脂質相を排除し、水相（酵素により遊離された幹細胞を含有）を、ステップ（ｅ）〜（ｆ）によるさらなる処理のために回収する。
【００３３】
このステップを実施するため、ＳＣＤをインキュベータから取り出し、（任意選択的に使用される）外被から出す。インキュベートされた懸濁液を、酵素不活化溶液、例えば、好適な濃度、例えば、１重量％の緩衝アルブミン溶液のアリコートと混合する。
【００３４】
２つの相を混合する好適なモードは、不活化溶液をＳＣＤ中に抜き取ることと、ＳＣＤを撹拌して完全な均質化を得ることと、脂質相および水相が分離するまでＳＣＤを静置することと、水相を回収することである。
【００３５】
水相の回収は、それをＳＣＤから排出すること（排出モード）により、またはそれをＳＣＤ中に滞留させること（滞留モード）により行うことができる。
【００３６】
「排出モード」は、シリンジを下向き（針が下方）位置に配向することにより実施することができる。このことにより、脂質相がシリンジの上方区画で、針から遠位に移動する一方、水相は針の近位に反対側の区画に凝集する。この位置において、シリンジプランジャに対する圧力により、水相を針から排出し、水／脂質界面が針に達するまで圧力を好適に維持し、この時点において、（ステップ（ｅ）〜（ｆ）によるさらなる処理のために回収すべき）水相をシリンジから実質的に排出する。シリンジは、目下、別個に排出し、排除することができる幹細胞枯渇脂質相を含有する。
【００３７】
排出モードに代えて、「滞留モード」は、シリンジを上向き（針が上方）位置に配向することにより実施することができる。このことにより、脂質相がシリンジの区画中で、針の近位に移動する一方、水相は針から遠位に反対側の区画に凝集する。この位置において、シリンジピストンに対する圧力により、脂質相を針から排出する。好適な手段を使用して上方に配向されたシリンジから排出された液体の分散を回避することができる。例えば、排出前、針をフラスコのラバーストッパに挿入することができ、次いでその中に排出液体を回収する。水／脂質界面が針に達するまで圧力を好適に維持する。この時点において、（廃棄すべき）脂質相を、シリンジから実質的に排出する。シリンジは、ステップ（ｅ）〜（ｆ）によるさらなる処理用の水相を含有する。
【００３８】
ステップ（ｄ）の終了時、水相をＳＣＤから回収し、ＳＣＤがその遠心分離を可能とする形状および硬度を有さない限り、別個に処理する。この場合、後続のプロセスステップは、ＳＣＤ中で実施することもでき、さらなる保護／簡略化を全プロセスに付加する。
【００３９】
空のＳＣＤは、遠心分離に適合されていない場合、好ましくは、適切な溶液（好ましくは、上記の不活化溶液）により１回以上洗浄してその表面に付着していると見込まれる幹細胞を回収し、全ての得られた水相をステップ（ｅ）〜（ｆ）によるさらなる処理のためにプールする。
【００４０】
ステップ（ｅ）
このステップにおいて、ステップ（ｄ）からの（プールされた）水相を、元となる脂質試料に由来すると見込まれる可溶性／不溶性不純物から精製する。精製は、一般に、遠心分離、上清の排除、ペレットの再懸濁、ろ過により得る。遠心分離は、一般に、３００〜５００Ｇの速度、好ましくは、３５０〜４５０Ｇ、より好ましくは、４００Ｇにおいて、１〜１０分間、好ましくは、３〜７分間、より好ましくは、５分間の時間実施することができる。
【００４１】
上清を排除した後、ペレットの再懸濁を、好適な緩衝液（例えば、ＰＢＳ緩衝液）または上記の不活化溶液を使用することにより実施することができる。
【００４２】
上記の遠心分離および再懸濁は、１回以上繰り返して水溶性不純物からの粒状物（幹細胞）分画の精製を増加させることができる。
【００４３】
次いで、（最終的に）再懸濁されたペレットを１回以上ろ過し、幹細胞分画に関して特大である粒状不純物を排除する。それを行うため、懸濁されたペレットを、適切な細孔サイズ、例えば、８０〜１２０μｍ、好ましくは、約１００μｍを有する膜に通してろ過し、特大の粒状物材料を滞留させ、（より小サイズの）幹細胞が濾液中に向かうことが可能となる。得られた液体を、徐々に微細となるフィルタ、例えば、６０〜８０μｍ、好ましくは、約４０μｍにより再度ろ過して特大粒状物のより微細な排除が可能となる。最終的にろ過された液体は、精製幹細胞を含有し、ステップ（ｆ）によりさらに処理する。
【００４４】
ステップ（ｆ）
このステップにおいて、ステップ（ｅ）からの精製された液体を力価測定し、次いで希釈して所望の濃度および容量を有する最終幹細胞分画を得る。
【００４５】
力価測定は、ステップ（ｅ）の液体の正確な容量（例えば、５０μｌ）を抜き出し、それを好適な計数機器、典型的には、ＦＡＣＳにより脂肪組織由来間葉系幹細胞計数を得るために最適化されたゲートで幹細胞計数に供することにより行うことができる。または、幹細胞含有物を、他の計器、例えば、血球計数器により間接的に評価することができる。この間接的評価は、本方法のこの段階において１０〜２０％だけ幹細胞であると見出される有核細胞の総数を計数する。好ましくは、より高い正確性のために２回以上の読取りを行い、平均化する。
【００４６】
既知の力価に基づき、ステップ（ｅ）からの液体は、必要な場合は、適切な濃度に希釈することができる。希釈は、好適な緩衝液（例えば、ＰＢＳ緩衝液）または上記の不活化溶液を使用することにより実施することができる。最終濃度値は、最終幹細胞分画の効力の所望のレベルに応じて選択する。有用な非限定的な幹細胞濃度値（総有核細胞として表現）は、１０８〜１０４個の細胞／ｍｌ、好ましくは、１０７〜１０５個の細胞／ｍｌ、より好ましくは、約１０６個の細胞／ｍｌである。
【００４７】
次いで、最終幹細胞分画を、適切な容量、例えば、１ｍＬを有する単位として好適な容器（例えば、ミニシリンジ）中で包装することができる。最終容量は、最終幹細胞分画の投与の部位（例えば、しわの充填、組織再建など）に適合性であり、簡便であるように選択する。
【００４８】
最終幹細胞分画は、好ましくは、可能な限り迅速に使用し、または無菌および温度の好適な条件において使用するときまで貯蔵する。
【００４９】
この分画は、脂質起源の幹細胞が有用である任意の用途に使用することができる。非限定的な例は、美容または再建治療、特に組織充填、創傷治癒、組織もしくは臓器再建の分野である。こうして得られた幹細胞分画およびその医薬的使用は、本発明の一部を形成する。
【００５０】
本発明による好適な非排他的手順を以下に記載する。
【実施例】
【００５１】
実施例１
１．１  ＰＢＳ  Ｃａ／Ｍｇ緩衝液による洗浄
５０ｍＬの吸引脂肪組織原料を含有する１００ｍＬのシリンジ（ＳＣＤ）に、カルシウムおよびマグネシウム塩を含有する５０ｍｌの標準ダルベッコＰＢＳ緩衝液を充填した。シリンジ（ＳＣＤ）を１０回反転させて含有物を均質化し、次いで垂直位置（針が下方）で約５分間静置し、水相および脂質相を分離させた。次いで、シリンジプランジャを押圧して下（水）相全体を排出し、脂質相をシリンジ中で滞留させた。洗浄手順を繰り返し、排出された水相を廃棄した。
【００５２】
１．２．リベラーゼとのインキュベーション
洗浄された脂質相を含有するステップ１．１から得たシリンジ（ＳＣＤ）を、酵素試薬を抜き取るように操作して０．２８Ｗｕｎｓｃｈユニット／ｍｌの濃度に到達させた。酵素試薬を、リベラーゼの０．０２８Ｗｕｎｓｃｈユニット／μＬの母液（カルシウムおよびマグネシウムを含有するダルベッコＰＢＳ中で希釈された「ＭＮＰ−Ｓ」）から、上記のＰＢＳ  Ｃａ／Ｍｇ緩衝液により１：５００ｖ／ｖに希釈して予め調製した。
【００５３】
こうして充填されたシリンジ（ＳＣＤ）を、２０ｍｌの無菌空気を抜き取るようにさらに操作し、１０回反転させて含有物を均質化する。外被中で密封し、３７℃において予熱された振動トレイを有するインキュベータ中に置いた。インキュベーションは、３ｒｐｍの振動で３７℃において４５分間実施した。
【００５４】
１．３．リベラーゼの不活化
インキュベーション時間の終了後、振動を中断し、シリンジ（ＳＣＤ）をインキュベータから取り出し、外被から解放し、それにダルベッコＰＢＳ中の等容量の１重量％アルブミン溶液を添加した。こうして充填されたシリンジ（ＳＣＤ）を、５ｍｌの無菌空気を抜き取るようにさらに操作し、１０回反転させて含有物を均質化した。次いで垂直位置（針が下方）に約５分間静置し、水相および脂質相を分離させた。
【００５５】
１．４．水相の回収
シリンジ（ＳＣＤ）のプランジャを押圧して下相（水相）全体を排出した。この相は、幹細胞を含有し、遠心分離チューブ（「第１の回収」と標識）中に回収した。シリンジ（ＳＣＤ）中で残留する脂質相を別々に排出し、廃棄した。次いで、空のシリンジ（ＳＣＤ）を、１．３項に記載の手順に従って１％アルブミン溶液により洗浄し、洗浄溶液をさらなる遠心分離チューブ（「第２の回収」と標識）中で回収した。
【００５６】
１．５．第１の遠心分離およびペレット再懸濁
１．４項において得られた２つのチューブ（第１および第２の回収）を、４００Ｇにおいて２０℃において５分間遠心分離した。全ての上清を除去し、第２の回収チューブ中のペレットを、２０ｍＬのＰＢＳ中１％アルブミンにより手動で再懸濁させ、得られた懸濁液を第１の回収チューブに添加し、それを使用してそこに存在するペレットを再懸濁させた。
【００５７】
１．６．ろ過、第２の遠心分離およびペレットの再懸濁
１．５項の終了時に得られた懸濁液を、それぞれ１００および４０μｍの細孔サイズを有するフィルタを使用する２つの後続のステップを介してろ過した。フィルタを排除した。最終的に得られた液体は、幹細胞を含有し、４００Ｇにおいて２０℃で５分間遠心分離した。上清を排除し、ペレットを５ｍｌのＰＢＳ中１％アルブミン溶液により再懸濁させた。
【００５８】
１．７．力価測定
１ｍＬのピペットを使用し、５０μＬの２つの試料を、１．６項において得られたろ過懸濁液から回収し（間質血管分画、ＳＶＦ）、血球計数器中に読取りのために挿入した。２回の読取り（総有核細胞、すなわち、ＷＢＣ／ｍＬとして表現）を平均化して溶液の正確な力価を得た。
【００５９】
１．６項において得られた溶液の１ｍＬの試料に対して幹細胞の直接計数も実施した。試料を１３００Ｇにおいて５分間遠心分離した。上清を排除し、ペレットを０．４４０μＬのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋１％ヒト血清）により再懸濁させた。溶液を好適な抗体と２０分間インキュベートし、それにＶｅｒｓａｌｙｓｅおよび幹細胞計数溶液を添加し、次いでＮａｖｉｏｓサイトフルオリメータ（cytofluorimeter）上で読み取り、試料中に存在する幹細胞の数、およびそれから関連幹細胞濃度を評価した。
【００６０】
１．８  標準濃度への希釈および包装
１．７項において計測された力価に基づき、１．６項において得られた溶液の残部を、ＰＢＳ中５％アルブミン溶液により、実際の幹細胞治療に都合の良い（convenient)な濃度および容量に希釈した。有用な濃度範囲は、０．５〜３×１０６個のＷＢＣ／ｍＬである。得られた溶液を、最終的に１ｍＬの無菌シリンジ中にさらに分割し、次いでそれらを最終使用者への発送および送達のため包装および密封した。
【手続補正書】
【提出日】平成27年5月21日(2015.5.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質組織起源の幹細胞分画を調製する方法であって、
（ａ）前記幹細胞を含有する脂質組織の試料を回収または受け取るステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の試料を、好適な水性緩衝液により洗浄するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の試料を、前記脂質組織を消化し、その組織から前記幹細胞を抽出し得る酵素とインキュベートするステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の生成物から水相を回収するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）において得られた水相を精製するステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）において得られた水相を力価測定し、必要な場合は、それを希釈して所望の濃度および容量を有する最終幹細胞分画を得るステップと
を含み、
前記幹細胞含有材料を、少なくとも前記ステップすなわち（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）全体にわたりシリンジ内で処理し、前記シリンジは、回収手段、相分離器およびプロセス反応器の機能を実施する、方法。
【請求項２】
前記ＳＣＤが、２０〜１００ｍＬに含まれる充填容量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記シリンジに、最適な充填容量を示すための１つ以上の標識、および／または記載もしくはラベリングのための領域が備わっている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記脂質材料が、吸引脂肪組織である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ステップ（ａ）および（ｂ〜ｄ）を、それぞれ、２人の異なる操作者により、相互に離れた位置において実施する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｂ）において、前記緩衝液が、酵素栄養素が補給されたＰＢＳ緩衝液である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ステップ（ｂ）および／または（ｃ）において、前記シリンジを下向き（針を下方）または上向き（針を上方）に配向し、次いで前記針に近位の相を排出することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｃ）において、前記酵素がリベラーゼであり、前記インキュベーションを３０〜４５℃の温度において２０〜８０分間実施する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｄ）において、インキュベートされた混合物を、アルブミン含有溶液と混合し、次いで脂質相を廃棄し、前記水相を後続のプロセスステップのために回収する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記幹細胞含有材料を、前記ステップ（ｄ）〜（ｅ）の１つ以上の間、前記ＳＣＤ内でさらに維持する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｅ）における精製を、遠心分離および／またはろ過により実施する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記最終幹細胞分画を、１〜５ｍｌの１つ以上の単位として配合し、総有核細胞濃度が、１０８〜１０４個細胞／ｍＬに含まれる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【国際調査報告】
2015530100.tif 000002
2015530100.tif 000003
2015530100.tif 000004