(57)【要約】  治療剤が、免疫活性を強化するために免疫調節性白血球膜タンパク質（ＩＬＭＰ）を標的とするものである場合、患者における抗腫瘍免疫を強化するための治療剤の有効性が予測される。患者からの末梢血液サンプルは、処置前に、特異的な細胞表面マーカー（ＣＤ１４＋、ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗ）を含む単球のレベルに関して検査される。このタイプの単球（ＰＢＭ１４＋ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗ）のレベルが低いことは、より大きい治療効果の可能性を示す。本発明の具体的な代表的な実施形態において、治療剤は、例えばイピリムマブ又はトレメリムマブなどのＣＴＬＡ４に対する抗体である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における抗腫瘍免疫を強化するための治療剤の有効性を予測する方法であって、治療剤は、免疫活性を強化するために免疫調節性白血球膜タンパク質（ＩＬＭＰ）を標的とするものであり、患者からの血液サンプル中のＣＤ１４＋及びＨＬＡ−ＤＲｌｏｗ（ＰＢＭ１４＋ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗ）である末梢血単球の処置前のレベルを決定するステップ、及び決定された処置前のレベルを、識別閾値と比較するステップを含み、ここで識別閾値未満のＰＢＭ１４＋ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗのレベルは、治療効果の可能性を示す、上記方法。
【請求項２】
血液サンプル中の処置前のリンパ球絶対数（ＡＬＣ）を決定するステップ、及び決定されたＡＬＣを、ＡＬＣ−識別閾値と比較するステップをさらに含み、ここでＡＬＣ−識別閾値より大きいＡＬＣ値は、より大きい治療効果の可能性を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
血液サンプル中の処置前のＬＤＨレベルを決定するステップ、及び決定されたＬＤＨレベルを、ＬＤＨ−識別閾値と比較するステップをさらに含み、ここでＬＤＨ−識別閾値より低いＬＤＨレベルは、より大きい治療効果の可能性を示す、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
治療剤が、抗体である、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ＩＬＭＰが、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＩＬＭＰが、ＣＴＬＡ４である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
治療剤が、イピリムマブである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＩＬＭＰが、ＰＤ−１である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
ＩＬＭＰが、ＬＡＧ−３である、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
ＩＬＭＰが、ＴＩＭ３である、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
ＩＬＭＰが、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーである、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ＩＬＭＰが、４−１ＢＢである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＩＬＭＰが、ＧＩＴＲである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ＩＬＭＰが、ＯＸ４０である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
ＩＬＭＰが、ＣＤ４０である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
患者が、ヒトである、請求項１から１５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
治療剤に応答する腫瘍を有する患者を処置する方法であって、請求項１から１６までのいずれか一項に従って検査を行い、患者における抗腫瘍免疫を強化する治療剤の有効性を予測するステップ、及び検査により治療効果の可能性が示される場合、患者に治療剤を投与するステップを含む、上記方法。
【請求項１８】
放射線療法と組み合わせて、ＩＬＭＰを標的とする治療剤を用いた処置の治療の進行をモニターする方法であって、治療剤と放射線とを用いた処置の後に、患者のＰＢＭ１４＋ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗのレベルをモニターするステップを含み、ここでＰＢＭ１４＋ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗの減少は、治療の進行が開始したこと、又は開始しようとしていることを示す、上記方法。
【請求項１９】
治療剤が、抗体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＩＬＭＰが、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＩＬＭＰが、ＣＴＬＡ４である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
治療剤が、イピリムマブである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＩＬＭＰが、ＰＤ−１である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
ＩＬＭＰが、ＬＡＧ−３である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
ＩＬＭＰが、ＴＩＭ３である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
ＩＬＭＰが、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーである、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２７】
ＩＬＭＰが、４−１ＢＢ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０又はＣＤ４０である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
患者が、ヒトである、請求項１８から２６までのいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、例えばイピリムマブなどの免疫調節治療剤を用いた処置に対する患者の反応性を予測する方法に関し、並びにアブスコパル効果を起こすために例えば放射線治療などと組み合わせた場合のこのような処置の進行及び有効性をモニターすることに関する。
【背景技術】
【０００２】
イピリムマブは、免疫阻害分子の細胞傷害性Ｔ細胞抗原４（ＣＴＬＡ−４）の機能をブロックする抗体であり、転移性黒色腫を有する患者の生存を有意に延長させる。しかしながら、療法から臨床上の利益を得られる患者はわずか３０％である。それゆえに、イピリムマブ療法に応答する可能性がより高い患者の選択を可能にするバイオマーカーを定義することが、臨床医と臨床試験の設計の両方にとって有意義である。
【０００３】
加えて、応答する患者数を増やす目的で、イピリムマブと、化学療法、標的療法、他の免疫療法、及び放射線治療との組み合わせが評価されているところである。療法の免疫効果を追跡することを可能にする薬力学的マーカーは、臨床的な意思決定に利用可能な他のツールをいっそう強化できる。
【０００４】
イピリムマブ及び放射線治療の組み合わせは、アブスコパル効果を起こすことができる。アブスコパル効果は、最初の放射線治療（ＲＴ）部位から離れた部位で腫瘍退縮が起こるというまれな現象を指す。（Ｍｏｌｅ  ＲＨ．、Ｔｈｅ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  １９５３；２６：２３４〜４１）。局所ＲＴは、例えば黒色腫、リンパ腫、及び腎細胞癌などの数種の悪性腫瘍においてアブスコパル効果を誘導することが示されている。（Ｋｉｎｇｓｌｅｙ  ＤＰ．、Ｔｈｅ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  １９７５；４８：８６３〜６；Ｒｏｂｉｎら、Ｍｅｄｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １９８１；９：４７３〜６；Ｗｅｒｓａｌｌら、Ａｃｔａ  Ｏｎｃｏｌ  ２００６；４５：４９３−７．２−４）。この効果の基礎をなす生物学は完全に明確になっていないが、免疫学的なメカニズムが介在する可能性がある。（Ｄｒａｋｅ  Ｃ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ；Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、２０１１．２５１〜２６３）。
【０００５】
イピリムマブで処置した切除不能な黒色腫を有する５１人の患者の近年なされた臨床試験において、３３％が臨床上の利益を達成した。臨床上の利益は、２回投与後にリンパ球絶対数（ＡＬＣ）が１０００／ｍＬより高く上昇したことと、ＮＹ−ＥＳＯ１に対する免疫性との相関を示した１、２。ＮＹ−ＥＳＯ−１は、進行中の黒色腫を有する患者の３０〜４０％で発現される抗原であるが、精巣胚細胞及び胎盤を除き正常な成人組織には存在しない。（Ｊｕｎｇｂｌｕｔｈら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ／Ｊｏｕｒｎａｌ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｕ  ｃａｎｃｅｒ  ２００１；９２：８５６〜６０）。イピリムマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）は、ＮＹ−ＥＳＯ−１に対する免疫性を強化することが示されており、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗体がすでに存在する患者は、イピリムマブから利益を得る可能性が高い。（Ｙｕａｎら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ２０１１；１０８：１６７２３〜８）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、イピリムマブと関連する作用機序を有する他の治療剤との治療効果を予測し、及び放射線照射後のアブスコパル効果の状況下で起こるような免疫が介在する腫瘍除去のインジケーターの提供も可能にする代替マーカーを提供する。
【０００７】
本発明は、患者における抗腫瘍免疫を強化するための治療剤の有効性を予測する方法を提供し、ここで治療剤は、免疫活性を強化するために免疫調節性白血球膜タンパク質（ＩＬＭＰ）を標的とするものである。本方法によれば、患者からの末梢血液サンプルは、処置前に、特異的な細胞表面マーカー（ＣＤ１４＋、ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗ）を含む単球のレベルに関して検査される。このタイプの単球（ＰＢＭ１４＋ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗ）のレベルが低いことは、より大きい治療効果の可能性を示す。本発明の具体的な代表的な実施態様において、治療剤は、例えばイピリムマブ又はトレメリムマブなどのＣＴＬＡ４に対する抗体である。
【０００８】
本発明はまた、例えば放射線治療などの他の処置様式と組み合わせて、ＩＬＭＰを標的とする治療剤を用いた処置の治療の進行をモニターする方法も提供する。例えば、治療剤と放射線とを用いた処置の後に、患者のＰＢＭ１４＋ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗのレベルが決定される。ＰＢＭ１４＋ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗの減少は、治療の進行の指標である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＰＢＭ１４＋ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗの量の値
【図２】全生存の改善の予測（ＰＢＭ１４＋ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗの処置前の量）
【図３】誘導性共刺激因子（ＩＣＯＳ）発現に基づくＣＤ４＋Ｔ細胞活性化（ＣＤ４＋／ＩＣＯＳｈｉ）の測定と、ＣＤ１４＋単球でのＭＤＳＣの量及びＨＬＡ−ＤＲ発現に基づく骨髄細胞系列の活性化（ＰＢＭ１４＋ＨＬＡ−Ｄｌｏｗ）の測定。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
第一の態様において、本発明は、患者における抗腫瘍免疫を強化するための、免疫調節性分子を標的とする治療剤の有効性を予測する方法に関する。
【００１１】
当業界周知のように、所定の疾患を有する全ての患者が所定の療法で同程度の利益を受けるとは限らず、いくつかの場合において、ある患者は、治療的有用性を示さない可能性があるが、他の患者は同じ処置により実質的な利益を享受する。本出願で使用される場合、用語「有効性を予測する」は、総じて、同じ疾患に罹った患者の集団よりも特定の患者において、治療剤が治療上の有益な効果をもたらす可能性がより高いという決定をなすことを意味する。処置後の治療的有用性の確実性又は実際の治療的有用性の実証は必要ない。
【００１２】
本出願で使用される場合、用語「免疫調節性白血球膜タンパク質」又は「ＩＬＭＰ」は、免疫反応を調節する白血球で発現される膜タンパク質を指す。ＩＬＭＰは、白血球でのみ発現されるとは限らない。本発明の実施形態において、ＩＬＭＰは、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリー又は腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーのメンバーである。
【００１３】
Ｉｇスーパーファミリー内で、ＩＬＭＰの具体例の一つは、ＣＴＬＡ４である。ＣＴＬＡ４（細胞毒性Ｔリンパ球抗原４）はまた、ＣＤ１５２（分類１５２のクラスター）としても知られている。アンタゴニストで、例えばイピリムマブなどのＣＴＬＡ４に対する抗体を使用してＣＴＬＡ４をブロックすると、免疫反応が強化され、腫瘍に対する免疫寛容が低下することから、がんを有する患者のための免疫療法の戦略が得られる。
【００１４】
ＩＬＭＰの他の例は、プログラム細胞死１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ  １）、又はＰＤ−１であり、これは、Ｔ細胞調節因子の拡張されたＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４ファミリーのメンバーであり、及びＩｇスーパーファミリーのメンバーである。またＰＤ−１は、ＣＤ２７９及びＰＤＣＤ１としても知られている。Ｚｈａｎｇらは、ＰＤ−１及びそのリガンドＰＤ−Ｌ１は、マウス急性骨髄性白血病モデルにおいて抗腫瘍免疫反応を阻害することを示し、したがって血液悪性腫瘍による免疫回避におけるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路の重要性を示している３。その上、Ｃｕｒｒａｎらは、マウス黒色腫モデルにおいてＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の遮断はＣＴＬＡ−４遮断と相乗作用することを示しており、それにより両方の免疫回避経路を含むコンビナトリアルな戦略の例がもたらされる１。
【００１５】
ＩｇスーパーファミリーのメンバーであるＩＬＭＰの他の例は、リンパ球活性化遺伝子３又はＬＡＧ３である。ＬＡＧ３はまた、ＣＤ２２３としても知られている。末梢ＣＤ８Ｔ細胞におけるＬＡＧ３の誘発により末梢寛容が起こり、抗体によるＬＡＧ３の遮断によりＣＤ８依存性の抗腫瘍免疫が強化される２。
【００１６】
ＩｇスーパーファミリーのメンバーであるＩＬＭＰの他の例は、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン３又はＴＩＭ３である。ＴＩＭ３はまた、ＫＩＭ−３、ＴＩＭＤ３、及びＨＡＶｃｒ−２としても知られている。ＴＩＭ３の遮断は、マウス肉腫モデルにおいて腫瘍の成長を抑制することが示されており、これは、免疫監視においてこの受容体が役割を担っていることを示唆している３。
【００１７】
ＴＮＦスーパーファミリーの範囲内で、ＩＬＭＰの具体例の一つは４−１ＢＢであり、これもヒトにおいてＩＬＡ（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ（リンパ球活性化により誘導された）の頭字語）として公知である。４−１ＢＢはまた、ＣＤ１３７及びＴＮＦＲＳＦ９とも称される。Ｍｅｌｅｒｏらは、４−１ＢＢ抗原に対するモノクローナル抗体を使用して、この抗体の投与は、マウスにおいて、低免疫原性及び高免疫原性の大きな腫瘍の確立を根絶できることを実証した４。さらに、Ｃｕｒｒａｎらは、ＣＴＬＡ−４の遮断は、４−１ＢＢの活性化と相乗作用する可能性があることを示しており、これは、ＣＴＬＡ−４の遮断は、他の免疫ベースの処置アプローチと組み合わせると、改良された結果をもたらす可能性がある他の例を示すものである５。
【００１８】
ＴＮＦスーパーファミリーの範囲内のＩＬＭＰの他の例は、ＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体ファミリー関連遺伝子）であり、これは、ヒトにおいて、ＡＩＴＲ（活性化誘導性ＴＮＦＲ）と称されることが多い。ＧＩＴＲの他の名称は、ＴＮＦＲＳＦ１８及びＣＤ３５７である。ＧＩＴＲの活性化を強化する治療剤は、メラニン細胞抗原に対する免疫反応を増加させ、腫瘍拒絶を促進する９〜１１。
【００１９】
ＴＮＦスーパーファミリーの範囲内のＩＬＭＰの他の例は、ＯＸ４０であり、これはＣＤ１３４又はＴＮＦＲＳＦ４としても知られている。ヒトにおいて、このタンパク質に与えられた名称は、一般的にはＡＣＴ３５（活性化抗原−３５）である。ＯＸ４０を標的とする治療剤は、単一の薬剤として使用する場合、免疫原性の腫瘍を根絶させることができ、及び免疫原性が比較的低い腫瘍を根絶するには、例えばシクロホスファミドなどの化学療法と組み合わせることが効果的な場合がある６、７。
【００２０】
ＴＮＦスーパーファミリーの範囲内のＩＬＭＰの他の例は、ＣＤ４０であり、これはＢｐ５０、ＣＤＷ４０、Ｐ５０、又はＴＮＦＲＳＦ５としても知られている。この受容体を介して陽性シグナルを送る治療剤（アゴニスト）は、マウス及びヒトにおいて膵臓がんの退縮に有利なように腫瘍間質を変更する１４。
【００２１】
本発明を適用できるＩＬＭＰを標的とする治療剤は、ＩＬＭＰと特異的に相互作用して、免疫系を強化又は刺激するものである。これらの治療剤は、一般的には抗体であり、例えば、特に、モノクローナル抗体、天然のリガンド（この場合、天然リガンドが免疫系の刺激を引き起こす）又は天然リガンドの免疫刺激性の類似体などである。表１に、望ましい様々なＩＬＭＰ及び活性のタイプ（アゴニスト又はアンタゴニスト）について公知の具体的な薬剤を列挙する。
【表１】
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【００２２】
この本発明の態様によれば、患者からの末梢血液サンプルを得て評価することにより、細胞表面上におけるＣＤ１４の存在と低いレベルのＨＬＡ−ＤＲとによって同定される末梢血単球の量を決定する。これらの細胞は、本明細書ではＰＢＭ１４＋ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗと称され、本発明者らにより治療効果予測との関連性を有すると同定された骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）のサブセットである。ＭＤＳＣは、一般的に、未熟顆粒球、マクロファージ、樹状細胞、及び骨髄性前駆細胞などを含む骨髄細胞の混成群である。Ｆｉｌｉｐａｚｚｉら１５により、ＭＤＳＣのＰＢＭ１４＋ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗサブセットは、リンパ球機能を高度に抑制し、あらゆる転移性黒色腫患者に著しく蔓延しているが、これらは健康なドナーでは検出できないことが確認された。
【００２３】
以下で論じられる同じタイプの分析を使用して、他のがんにおける治療効果の予測変数であるＭＳＣのサブセットをさらに同定する追加のマーカーを見出すことができる。
【００２４】
個々の患者が処置によって利益を得る可能性があるという決定は、例えば細胞総数の％として示されるサンプル中のＰＢＭ１４＋ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗの量と、個体の種（例えばヒト）、治療剤、及びがんのタイプに応じて様々であり得る経験的に決定される「識別閾値」との比較に基づく。以下、このような決定の１つを、ヒトにおいてイピリムマブで処置される転移性黒色腫を用いた具体的な実験の状況で例示する。このケースでは、識別閾値は、サンプル中のＰＢＭ１４＋ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗである末梢血単球の２０．５％と決定された。この数値は、２つのグループ（応答する可能性があるグループと応答する可能性がないグループ）へのデータの統計的分離の根拠となるより大きいデータセットの開発に伴い変えることができる。一般的事項として、ＰＢＭ１４＋ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗ細胞の処置前の量が閾値よりも高い患者における最大２年間での全生存は、ＰＢＭ１４＋ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗ細胞の処置前の量が閾値よりも低い患者における全生存と統計学的に同じである（帰無仮説）という統計学的な結論（確率）を特徴付けるｐ値が最大で０．１０になり、好ましくは０．０５未満になるように、識別閾値が選択される。以下に示す実施例において、この比較がなされた場合、ｐ＝０．００２である。
【００２５】
他の説明された予測変数を考慮に入れたとしても、より少ない量のＰＢＭ１４＋ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗ細胞は、より優れた生存の最も強い予測変数を維持した。例えば、診断時又は７週目にリンパ球絶対数に合わせてＰＢＭ１４＋ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗ細胞の量を修正した場合、ＰＢＭ１４＋ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗ細胞の量はそれでもなお高度な予測能を維持した（ＨＲ１．１０；９５％ＣＩ１．０４、１．１７  ｐ＝０．０００６）。乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）に合わせてＰＢＭ１４＋ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗ細胞の量を修正した場合でも、ＰＢＭ１４＋ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗ細胞の量は全生存の高度な予測能を維持した（それぞれＨＲ１．０６；９５％ＣＩ１．０１、１．１１  ｐ＝０．０１３）。これは、ＰＢＭ１４＋ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗ細胞の量が、免疫調節治療剤で処置される患者において全生存の最も強い予測変数であることを示唆する。したがって、予測能力は、ＰＢＭ１４＋ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗ細胞ではないものの量によって特定される。しかしながら、組み合わされた予測アッセイの一環として、例えばＡＬＣ又はＬＤＨレベルなどの他のインジケーターを組み合わせて使用してもよい。したがって、本発明はさらに、（ＰＢＭ１４＋ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗ細胞の決定に加えて）血液サンプル中の処置前のリンパ球絶対数（ＡＬＣ）を決定すること、及び決定されたＡＬＣを、ＡＬＣ−識別閾値（例えば１０００／ｍｃｌ）と比較することを含む方法を提供し、ここでＡＬＣ−識別閾値より大きいＡＬＣ値は、より大きい治療効果の可能性を示し、及び／又は、血液サンプル中の処置前のＬＤＨレベルを決定すること、及び決定されたＬＤＨレベルを、ＬＤＨ−識別閾値（例えば２７６Ｕ／ｌ）と比較することを含む方法を提供し、ここでＬＤＨ−識別閾値より低いＬＤＨレベルは、より大きい治療効果の可能性を示す。ＬＤＨは、一般的に、慣例的な血液パネルの一部として評価される。ＬＤＨは、ＮＡＤＨ濃度の変化を反映する３４０ｎｍでの吸光度によって酵素活性をモニターすることによって決定できる。
【００２６】
ＰＢＭ１４＋ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗの量を決定するのに採用される方法は重要ではなく、様々な方法を採用できる。以下に示す実施例では、ＣＤ１４及びＨＬＡ−ＤＲに特異的な公知のマーカーを用いたフローサイトメトリーが採用される。またＰＢＭ１４＋ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗ細胞の量は、免疫組織化学的な技術及び免疫染色細胞計数法（ｉｍｍｕｎｏｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ）などの他の技術によって決定してもよい。
【００２７】
本発明の方法は、検討される治療剤で処置可能な様々ながんのタイプに適用可能であり、いかなる特定のがんにも限定されない。例えば、ＣＴＬＡ４を標的とする治療剤は、黒色腫、前立腺がん、並びに小細胞肺がん及び非小細胞肺がんに適応性を有する。ＰＤ−１を標的とする治療剤の場合、臨床試験において、樹状細胞ＡＭＬワクチンとＰＤ−１をブロックする抗体のＣＴ−０１１とを用いた処置のために、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を有する参加者を募集する。（Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１１年６月；３４（５）：４０９〜１８）。またＣＴ−０１１は、例えばびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫などの他の血液悪性腫瘍の状況でも研究中である。本発明が適用可能なＩＬＭＰ治療剤での処置によって利益を得る可能性がある他の具体的ながんとしては、これらに限定されないが、乳がん、結腸がん、腎臓がん、及び骨髄腫が挙げられる。
【００２８】
本発明の更なる態様において、本発明者らはさらに、ＭＤＳＣの同じサブセットを使用して、放射線療法と組み合わせて、ＩＬＭＰを標的とする治療剤を用いた処置の治療の進行をモニターできることも見出した。この場合、アブスコパルな腫瘍低下の兆候を予測又は観察するために、治療剤と放射線治療との両方が患者に送達された後、好ましくは放射線治療の１〜２カ月後、ＰＢＭ１４＋ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗに関して検査がなされる。
【００２９】
実験結果：
（例１）
拡大アクセスプログラム（ＢＭＳ  ＣＡ１８４−０４５）の一環として、イピリムマブ１０ｍｇ／ｋｇを３週間毎に４回の投与で処置したステージＩＶの黒色腫を有する患者２６人からの末梢血液を、７週目、１２週目、及び２４週目に、ＣＤ１４＋、ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗ／−細胞の処置前の量（パーセンテージ）についてフローサイトメトリーで査定した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抑制アッセイを使用して、Ｔ細胞の増殖を阻害するＭＤＳＣの能力を検査した。
【００３０】
処置前と７週目に、リンパ球絶対数（ＡＬＣ）を慣例的な全血球計算を使用して測定した。さらに処置前で末梢血液中のＬＤＨレベルも測定した。
【００３１】
本発明者らは、ＰＢＭ１４＋ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗの処置前の量がより低いことは、２４週目のイメージングで測定された臨床上の利益を提示し（ｐ＝０．０９）、全生存の改善の予測となる（ハザード比１．０７（１．０３、１．１１）、ｐ＝０．００２）ことを見出した。（図１及び２）図１からわかるように、ＰＢＭ１４＋ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗの量の値はある程度の散乱を示したが、２０．５％未満の値は、臨床上の利益を示す傾向があり、２０．５％を超える値は、臨床上の利益を示さない傾向があった。この値を識別閾値として使用したところ、図２で表されるように、全生存と高い相関を示した。したがって、ＰＢＭ１４＋ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗの処置前の量は、イピリムマブ療法後の臨床的な応答及び全生存を予測する。
【００３２】
観察された関係は、処置前又は７週目のリンパ球絶対数（ＡＬＣ）及び処置前のＬＤＨと無関係であった。ＡＬＣの量とＰＢＭ１４＋ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗの量とを一緒に評価した場合、ＰＢＭ１４＋ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗの量の予測値は変わらなかった（ＨＲ１．１０；９５％ＣＩ１．０４、１．１７  ｐ＝０．０００６）。ＬＤＨとＰＢＭ１４＋ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗとを一緒に分析した場合でも、ＰＢＭ１４＋ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗの量はなお全生存の予測能を示した（ＨＲ１．０６；９５％ＣＩ１．０１、１．１１  ｐ＝０．０１３であった）。さらに、２４週目までに処置前のベースラインからＰＢＭ１４＋ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗの数が増加する全般的な傾向は、臨床上の利益が得られなかった患者と相関していた。抗ＣＤ３抗体刺激に応答するＣＦＳＥ希釈で測定したところ、ＰＢＭ１４＋ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗは末梢血Ｔ細胞の増殖を抑制した。
【００３３】
方法：（１６の改変）
フローサイトメトリー：黒色腫患者からの５×１０５個のＰＢＭＣを、２ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液（２％ウシ血清アルブミン及び０．０５μＭのＥＤＴＡを含有するリン酸緩衝食塩水）で洗浄した。次に、以下の抗体：Ｌｉｎｅａｇｅ（ＣＤ３／ＣＤ１６／ＣＤ１９／ＣＤ２０／ＣＤ５６）カクテルＦＩＴＣ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎで特注）、ＣＤ１４−ＰｅｒＣＰ  Ｃｙ５．５、ＣＤ１１ｂ−ＡＰＣ  Ｃｙ７、ＣＤ３３−ＰＥ−Ｃｙ７（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、及びＨＬＡ−ＤＲ−ＥＣＤ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を、４℃で２０分添加した。アイソタイプ対照は、適切な蛍光色素がコンジュゲートしたマウスＩｇＧ１、ＩｇＧｋ、ＩｇＧ２ａ、又はＩｇＧ２ｂｋ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含んだ。ＣｙＡｎフローサイトメーターを使用して染色細胞を検出した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を使用して全ての分析を行った。
【００３４】
抑制アッセイ：２×１０５個のＣＦＳＥ標識ＣＤ１４−ＰＢＭＣを、ＣＤ１４＋細胞存在下又は非存在下で、９６ウェルの平底α−ＣＤ３特異的Ａｂコーティングプレートで、１０％のＦＢＳ及びＩＬ−２（１０ＩＵ／ｍＬ；Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が補充されたＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した（ＯＫＴ３、０．５μｇ／ｍＬで１００ｍｃｌ、３７℃で２時間）。５日後、細胞を回収し、ＣＤ３−ＰＥＣｙ７、ＣＤ４−ＥＣＤ、ＣＤ８−ＡＰＣＣｙ７（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色し、ゲーティングしたＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４−）のＣＦＳＥシグナルをフローサイトメトリーによって測定した。
【００３５】
（例２）
２００４年４月に、女性患者を３３歳で皮膚黒色腫と診断した。患者の上背の１モルの生検から、潰瘍化しいていない、ブレスロー厚さが１．５３ｍｍの黒色腫が見つかった。患者は、原発病変の広範囲局所切除を受け、それと共に左腋窩のセンチネルリンパ節生検を受けた。原発部位に残存した黒色腫はなく、除去された５つの腋窩リンパ節は浸潤されていなかった。その後患者は無病であったが、２００８年に慣例的な胸部Ｘ線を撮ったところ左下肺葉に新しい２．０ｃｍの肺結節が見つかった。標準的な５．９の取り込み値を用いたポジトロンエミッショントモグラフィー（ＰＥＴ）から、結節は代謝亢進性であった。代謝亢進性の増殖巣の更なる部位はなかった。肺結節のコンピューター断層撮影（ＣＴ）ガイド下の経皮的生検からの細胞学から、転移性黒色腫が見つかった。Ｓｅｑｕｅｎｏｍ質量分析による遺伝子型解析から、例えばＢＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異などのＢＲＡＦ遺伝子に影響を与える未知の突然変異が明らかになった。
【００３６】
標準的なシスプラチン、ビンブラスチン、及びテモゾロマイド（ＣＶＴ）による化学療法を開始し、２サイクル後に、ＣＴスキャンにより患者の肺結節の安定性と更なる転移の証拠がないことを実証した。転移性黒色腫が病理学的に確認された２００９年２月に、孤立肺結節を左肺下葉切除術により切除した。
【００３７】
２００９年８月に、サーベイランスＣＴスキャンにより、新しい胸膜上の傍脊椎腫瘤と右肺門リンパ節症とを伴う再発性の疾患が検出された。２００９年９月に、患者は、本発明者らの施設で臨床試験に登録し（ＣＡ−１８４−０８７、ＮＣＴ００９２０９０７）、無作為化非盲検試験で、２種の別個の方法のうち一方で製造されたイピリムマブの安全性と薬物動態学を比較した。患者は、導入療法の一環として、用量１０ｍｇ／ｋｇのイピリムマブを３週間毎に４回の投与を受けた。２００９年１２月（イピリムマブ開始の１２週間後）の経過観察ＣＴスキャンでは、全体的な病勢安定が実証されたが、胸膜の腫瘤がわずかに肥大した（示さず）。イピリムマブに対する応答は、処置開始から１２週後の初期のＣＴスキャンでは必ずしも観察されるとは限らず１２、患者は、維持療法として１２週毎のイピリムマブ投与を続けることに同意した。
【００３８】
２０１０年を通して、患者の疾患の悪化を示す放射線写真の証拠はわずかであったが、臨床的には良好であったため維持的なイピリムマブを続けた。患者は、甲状腺ホルモンの補充を必要とする軽度の無症状甲状腺機能低下症を発症したが、他の有意な処置関連の毒性はなかった。しかしながら、２０１０年１１月までに、患者は、胸膜上の傍脊椎腫瘤の進行性肥大と新しい脾性病変を示した。傍脊椎腫瘤によって引き起こされた右側の背痛に対処するために、姑息的ＲＴを始めた。２０１０年１２月に、一般的に使用される許容できる用量の分割スキームの範囲内で、計画標的体積を包含する１００％等線量のラインに合わせて規定された共平面６視野の強度変調画像誘導技術を使用して、患者の傍脊柱の腫瘤に６ＭＶの光子で２８５０ｃＧｙを７日にわたり３分割で照射した。２０１１年１月に、ＲＴの１カ月後に、ＣＴスキャンで、放射線照射した原発部位、右肺門リンパ節、及び脾臓での応答はまだ示されていなかった。２０１１年２月に、患者は１回追加のイピリムマブ用量を受けた。２０１１年４月までに、標的とする患者の傍脊椎の病変は、有意に退縮した（Ｄ）。意外なことに、ＲＴの非標的領域における病変も退縮した［右肺門リンパ節症及び脾臓］。２０１１年１０月（ＲＴの１０カ月後）に撮られたそれに続くＣＴスキャンから、最低限の疾患の存在が継続しつつも安定性が示された。
【００３９】
分析に使用可能な転移性病巣、すなわちイピリムマブ処置の前に除去された肺結節においてのみ、均一で強い陽性を示す免疫組織化学（ＩＨＣ）、及び逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応によって、ＮＹ−ＥＳＯ−１発現が確認された。
【００４０】
１回目のイピリムマブ処置の前、並びにＲＴの前及び後に回収された血清サンプルを使用して、本発明者らは、ＮＹ−ＥＳＯ−１組換えタンパク質全体に対する抗体力価、及びＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質の特異的な合成部分に対する抗体力価をＥＬＩＳＡで測定した。全ての療法の前に、患者は、ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質全体に関して血清陽性であり、反応性は、主としてタンパク質のＮ末端（アミノ酸１〜６８）部分内に含まれるエピトープ（単数又は複数）に限定された。イピリムマブ処置中、疾患の重さが増すのと平行して、ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質全体とＮ末端部分とに対する抗体力価は増加した。力価は高いままであったが、患者の疾患の重さが減少するにつれ力価も低下する傾向があった。
【００４１】
ＲＴの完了後、患者は、疾患が消散する時間と相関して、中央部分（アミノ酸７１〜１３０）内のエピトープ（単数又は複数）に対する抗体力価は、３０倍より多く増加した。最終的に、患者は、疾患が増加する時間と一致して、ＲＴ前のイピリムマブでの処置中にＣ末端部分（アミノ酸１１９〜１８０）中のエピトープ（単数又は複数）に対するセロコンバージョンを示した。２つのタイムポイント間で力価の変化が５倍を超える場合、結果は有意とみなされた。陰性対照としてジヒドロ葉酸レダクターゼに対する血清反応性を使用した。
【００４２】
誘導性共刺激因子（ＩＣＯＳ）発現に基づくＣＤ４＋Ｔ細胞活性化（ＣＤ４＋／ＩＣＯＳｈｉ）の測定と、ＣＤ１４＋単球でのＭＤＳＣの量及びＨＬＡ−ＤＲ発現に基づく骨髄細胞系列の活性化（ＰＢＭ１４＋ＨＬＡ−Ｄｌｏｗ）の測定を、末梢血単核細胞中でのフローサイトメトリーによって、ＮＹ−ＥＳＯ−１の力価測定と同時の連続タイムポイントで行った。ＲＴ前に、ＣＤ４＋／ＩＣＯＳｈｉＴ細胞（図３Ａ）はイピリムマブ誘導中に増加し、次いで減少した。ＰＢＭ１４＋ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗの量の明確な傾向は、この期間中でははっきりしなかった。ＲＴ後、ＣＤ４＋／ＩＣＯＳｈｉ細胞の２回目の増加とＣＤ１４＋単球におけるＨＬＡ−ＤＲ発現の増加が起こり（図３Ｂ）、それと相関してＰＢＭ１４＋ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗの量が著しく減退した後、２０１１年４月まではっきり示されなかった疾患の退縮が放射線写真で示された。
【００４３】
患者は、事前にイピリムマブで疾患が進行しているという設定で、局所ＲＴ後における全身性の疾患応答を実証した。非治療的な低い放射線量（それぞれ１３３ｃＧｙ及び２．３ｃＧｙ）を受けた標的ではない右肺門リンパ節の腫瘤及び脾臓はさらに、これらの離れた部位における疾患の退縮は全身性の応答の強化に起因するということを裏付ける。イピリムマブ後、遅延型の応答が１８〜２０週間で起こることは周知であるが、本発明者らの意見では、イピリムマブ開始から疾患応答の間の１９カ月の間隔が、比較的近くになされたＲＴの状況下でアブスコパル効果をより促進する。
【００４４】
ＲＴは、腫瘍間質内の骨髄細胞による抗原提示を増加させることによって、腫瘍細胞のＴ細胞の死滅を強化することが示されている。末梢血液ＣＤ１４＋細胞内区画の分析から、ＲＴ後のＨＬＡ−ＤＲ発現の増加及びＰＢＭ１４＋ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗ量の低下などの、骨髄細胞系列の活性化のいくつかの徴候が明らかになった。これらの変化は、ＣＴスキャンによって決定されるような腫瘍量の低下の前に起こるため、これらの変化は、免疫回避から免疫が介在する腫瘍の除去への免疫表現型におけるシフトの初期シグナルをもたらし、したがって、治療の進行／利点が患者に与えられていることをモニターするのに有用である。
【００４５】
本明細書において引用された全ての参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００４６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年12月10日(2014.12.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における抗腫瘍免疫を強化するための治療剤の有効性を予測するのを助ける方法であって、治療剤は、免疫活性を強化するために免疫調節性白血球膜タンパク質（ＩＬＭＰ）を標的とするものであり、患者から得られた血液サンプル中のＣＤ１４＋及びＨＬＡ−ＤＲｌｏｗ（ＰＢＭ１４＋ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗ）である末梢血単球の処置前のレベルを決定するステップ、及び決定された処置前のレベルを、識別閾値と比較するステップを含む、上記方法。
【請求項２】
血液サンプル中の処置前のリンパ球絶対数（ＡＬＣ）を決定するステップ、及び決定されたＡＬＣを、ＡＬＣ−識別閾値と比較するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
血液サンプル中の処置前のＬＤＨレベルを決定するステップ、及び決定されたＬＤＨレベルを、ＬＤＨ−識別閾値と比較するステップをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
治療剤が、抗体である、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ＩＬＭＰが、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＩＬＭＰが、ＣＴＬＡ４である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
治療剤が、イピリムマブである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＩＬＭＰが、ＰＤ−１である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
ＩＬＭＰが、ＬＡＧ−３である、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
ＩＬＭＰが、ＴＩＭ３である、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
ＩＬＭＰが、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーである、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ＩＬＭＰが、４−１ＢＢである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＩＬＭＰが、ＧＩＴＲである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ＩＬＭＰが、ＯＸ４０である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
ＩＬＭＰが、ＣＤ４０である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
患者が、ヒトである、請求項１から１５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
放射線療法と組み合わせて、ＩＬＭＰを標的とする治療剤を用いた処置の治療の進行をモニターするのを助ける方法であって、治療剤と放射線とを用いた処置の後に、患者から得られた血液サンプル中のＰＢＭ１４＋ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗのレベルをモニターするステップを含む、上記方法。
【請求項１８】
治療剤が、抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＩＬＭＰが、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＩＬＭＰが、ＣＴＬＡ４である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
治療剤が、イピリムマブである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＩＬＭＰが、ＰＤ−１である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
ＩＬＭＰが、ＬＡＧ−３である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
ＩＬＭＰが、ＴＩＭ３である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
ＩＬＭＰが、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーである、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２６】
ＩＬＭＰが、４−１ＢＢ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０又はＣＤ４０である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
患者が、ヒトである、請求項１７から２６までのいずれか一項に記載の方法。
【国際調査報告】
2015509592.tif 000007