(57)【要約】  本発明は、式（Ｉ）Ｈ3Ｃ−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＲ（Ｉ）［式中、Ｒは、Ｈ、メチル、エチル、プロピル及びブチルを含む群から選択されており、ｎは、０〜３０、好ましくは６〜２４である］の脂肪酸若しくはそのエステルの酸化法において、この脂肪酸若しくはそのエステルを、分子酸素及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下でのＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼとの接触により酸化する工程を含むことを特徴とする方法、ＣＹＰ１５３ファミリーの組換えシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ、組換えアルコールデヒドロゲナーゼ、組換えトランスアミナーゼ、並びに任意にアラニンデヒドロゲナーゼ、フェレドキシン及びフェレドキシンレダクターゼを含む群からの１種以上の組換え酵素を発現する全細胞触媒、並びに脂肪酸若しくはそのエステルを酸化するためのこの全細胞触媒の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
Ｈ3Ｃ−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＲ（Ｉ）
［式中、
Ｒは、Ｈ、メチル、エチル、プロピル及びブチルを含む群から選択されており、
ｎは、０〜３０、好ましくは６〜２４である］
の脂肪酸若しくはそのエステルの酸化法において、以下の工程：
ａ）この脂肪酸若しくはそのエステルを、分子酸素及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下でのＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼとの接触により酸化する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
さらに以下の工程：
ｂ）工程ａ）からの酸化された脂肪酸若しくはそのエステルを、アルコールデヒドロゲナーゼとの接触によりさらに酸化する工程、
ｃ）工程ｂ）からのさらに酸化された脂肪酸若しくはそのエステルを、アミンドナー、好ましくはアラニンの存在下でのトランスアミナーゼとの接触によりアミノ化する工程
を含み、ここで、この工程ｃ）を任意にアラニンデヒドロゲナーゼ、アンモニウム及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下に行うものとする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼがペプチド配列ＬＬ（Ｉ／Ｌ）（Ｖ／Ｉ）ＧＧＮＤＴＴＲＮを有しており、好ましくはアルカニボラックス・ボルクメンシスＳＫ２由来のＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（データベースコードYP_691921）若しくはその変異体である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
アルコールデヒドロゲナーゼが、ＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼ、好ましくはエシェリキア・コリ  ＭＳ  １８７−１由来のＮＡＤ依存性アルコールデヒドロゲナーゼ（データベースコードZP_07145023）若しくはその変異体、又はグルコース−メタノール−コリン−オキシドレダクターゼファミリーのオキシドレダクターゼ、好ましくはシュードモナス・プチダＧＢ−１由来のオキシドレダクターゼ（データベースコードCAB54054.1）若しくはその変異体、又はフラビン含有アルコールデヒドロゲナーゼ、好ましくはカンジダ・トロピカリス由来のフラビン含有アルコールデヒドロゲナーゼ（データベースコードAAS46878.1）若しくはその変異体である、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程ａ）において、さらに、フェレドキシンレダクターゼ、好ましくはアルカニボラックス・ボルクメンシスＳＫ２由来のフェレドキシンレダクターゼ（データベースコードYP_691923）若しくはその変異体、及び／又は、フェレドキシン、好ましくはアルカニボラックス・ボルクメンシスＳＫ２由来のフェレドキシン（データベースコードYP_691920）若しくはその変異体が存在している、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程ｃ）をアラニンデヒドロゲナーゼ、アンモニウム及びＮＡＤＨの存在下に行い、このアラニンデヒドロゲナーゼが、バシラス・サチリス・サブスピーシーズ・サチリスstr.１６８由来のアラニンデヒドロゲナーゼ（データベースコードNP_391071）若しくはその変異体である、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、トランスアミナーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼ、フェレドキシン及びフェレドキシンレダクターゼを含む群からの少なくとも１種の酵素を、組換えによって全細胞触媒の形態で準備する、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
工程ａ）、ｂ）又はｃ）のうち少なくとも１つにおいて、存在しているか、又は、脂肪酸若しくはそのエステル、工程ｂ）からのさらに酸化された脂肪酸若しくはそのエステル、又は工程ｃ）からのさらに酸化及びアミノ化された脂肪酸若しくはそのエステルと接触させる、ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、トランスアミナーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼ、フェレドキシン及びフェレドキシンレダクターゼを含む群からの全ての酵素を、組換えによって１つ以上の全細胞触媒の形態で準備する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
全細胞触媒がさらに、ＡｌｋＬファミリーのポリペプチド、好ましくはシュードモナス・プチダ由来（データベースコードCAB69081）の、マリノバクター・アクアエオレイＶＴ８由来（データベースコードYP_957722）の、オセアニカウリス・アレクサンドリイＨＴＣＣ２６３３由来（データベースコードZP_00953584）の、マリノバクター・マンガンオキシダンスＭｎＩ７−９由来（データベースコードZP_09158756）の、カウロバクター・スピーシーズＫ３１由来（データベースコードYP_001672217）の、シュードモナス・オレオボランス由来（データベースコードQ00595）のＡｌｋＬを含む群からのＡｌｋＬ若しくはそれらの変異体を発現する、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
全細胞触媒が、脂肪酸のβ酸化の反応の１つを触媒する少なくとも１種の酵素の、その野生型よりも低い活性を有する細胞であって、ここで、この酵素は好ましくは、脂肪酸インポーター、脂肪酸−ＣｏＡ−リガーゼ、アシル−ＣｏＡ−デヒドロゲナーゼ、２，４−ジエノイル−ＣｏＡ−レダクターゼ、エノイル−ＣｏＡ−ヒドラターゼ及び３−ケトアシル−ＣｏＡ−チオラーゼを含む群から選択されているものとする、請求項７から９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
工程ｃ）におけるアラニンデヒドロゲナーゼが、このアラニンデヒドロゲナーゼがアルコールデヒドロゲナーゼにより工程ｂ）において酸化されたレドックス補因子、好ましくはＮＡＤ+又はＮＡＤＰ+を還元するように選択されている、請求項６から１０までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ＣＹＰ１５３ファミリーの組換えシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ、組換えアルコールデヒドロゲナーゼ、組換えトランスアミナーゼ、並びに任意にアラニンデヒドロゲナーゼ、フェレドキシン及びフェレドキシンレダクターゼを含む群からの１種以上の組換え酵素を発現する全細胞触媒。
【請求項１３】
さらに、ＡｌｋＬファミリーのポリペプチド、好ましくはシュードモナス・プチダ由来（データベースコードCAB69081）の、マリノバクター・アクアエオレイＶＴ８由来（データベースコードYP_957722）の、オセアニカウリス・アレクサンドリイＨＴＣＣ２６３３由来（データベースコードZP_00953584）の、マリノバクター・マンガンオキシダンスＭｎＩ７−９由来（データベースコードZP_09158756）の、カウロバクター・スピーシーズＫ３１由来（データベースコードYP_001672217）の、シュードモナス・オレオボランス由来（データベースコードQ00595）のＡｌｋＬを含む群からのＡｌｋＬ若しくはそれらの変異体を発現する、請求項１２に記載の全細胞触媒。
【請求項１４】
脂肪酸のβ酸化の反応の１つを触媒する少なくとも１種の酵素の、その野生型よりも低い活性を有する細胞であって、ここで、この酵素は好ましくは、脂肪酸インポーター、脂肪酸−ＣｏＡ−リガーゼ、アシル−ＣｏＡ−デヒドロゲナーゼ、２，４−ジエノイル−ＣｏＡ−レダクターゼ、エノイル−ＣｏＡ−ヒドラターゼ及び３−ケトアシル−ＣｏＡ−チオラーゼを含む群から選択されているものとする、請求項１２又は１３に記載の全細胞触媒。
【請求項１５】
フェレドキシンレダクターゼ及びフェレドキシンを発現する、請求項１２から１４までのいずれか１項に記載の全細胞触媒。
【請求項１６】
アラニンデヒドロゲナーゼを発現し、ここで、このアラニンデヒドロゲナーゼは、バシラス・サチリス・サブスピーシーズ・サチリスstr.１６８由来のアラニンデヒドロゲナーゼ（データベースコードNP_391071）若しくはその変異体であるものとする、請求項１２から１５までのいずれか１項に記載の全細胞触媒。
【請求項１７】
ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼがペプチド配列ＬＬ（Ｉ／Ｌ）（Ｖ／Ｉ）ＧＧＮＤＴＴＲＮを有しており、かつ／又は、アルカニボラックス・ボルクメンシスＳＫ２由来のＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（データベースコードYP_691921）若しくはその変異体であり、かつ、フェレドキシンレダクターゼが、アルカニボラックス・ボルクメンシスＳＫ２由来のフェレドキシンレダクターゼ（データベースコードYP_691923）若しくはその変異体であり、かつ、フェレドキシンが、アルカニボラックス・ボルクメンシスＳＫ２由来のフェレドキシン（データベースコードYP_691920）若しくはその変異体である、請求項１２から１６までのいずれか１項に記載の全細胞触媒。
【請求項１８】
アルコールデヒドロゲナーゼが、ＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼ、グルコース−メタノール−コリン−オキシドレダクターゼファミリーのオキシドレダクターゼ、又はフラビン含有アルコールオキシダーゼであり、好ましくはＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼであり、最も好ましくはエシェリキア・コリ  ＭＳ  １８７−１由来のＮＡＤ依存性アルコールデヒドロゲナーゼ（データベースコードZP_07145023）若しくはその変異体である、請求項１から１７までのいずれか１項に記載の全細胞触媒又は方法。
【請求項１９】
トランスアミナーゼが、シュードモナス・プチダＧＢ−１由来のトランスアミナーゼ（データベースコードYP_001668026.1）若しくはその変異体である、請求項１から１８までのいずれか１項に記載の全細胞触媒又は方法。
【請求項２０】
脂肪酸が不飽和若しくは分岐状の脂肪酸である、請求項１から１９までのいずれか１項に記載の全細胞触媒又は方法。
【請求項２１】
ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、トランスアミナーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼ、フェレドキシン及びフェレドキシンレダクターゼを含む群からの少なくとも１種の酵素を組換えによって全細胞触媒の形態で準備するか、又は、少なくとも１種の内因性アルデヒドデヒドロゲナーゼの細胞の野生型よりも低い活性を有する細胞である全細胞触媒により課題を解決する、請求項１から２０までのいずれか１項に記載の全細胞触媒又は方法。
【請求項２２】
脂肪酸若しくはそのエステルを酸化及び／又はアミノ化するための、請求項１２から２１までのいずれか１項に記載の全細胞触媒の使用であって、ここで、この脂肪酸若しくはそのエステルは、好ましくは式（Ｉ）
Ｈ3Ｃ−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＲ（Ｉ）
［式中、
Ｒは、Ｈ、メチル、エチル、プロピル及びブチルを含む群から選択されており、
ｎは、０〜３０、好ましくは６〜２４である］
を有しているものとする、使用。
【請求項２３】
酸化によって、反応した脂肪酸若しくはそのエステルの物質量に対して少なくとも９０％の相応のアルコールと、１％未満の相応のアルデヒドと、１０％未満の相応の酸とを含有する酸化生成物の混合物が生成される、請求項２２に記載の全細胞触媒の使用。
【請求項２４】
脂肪酸が不飽和若しくは分岐状の脂肪酸である、請求項２２又は２３に記載の全細胞触媒の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪酸若しくはそのエステルの酸化法において、この脂肪酸若しくはそのエステルを、分子酸素及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下でのＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼとの接触により酸化する工程を含むことを特徴とする方法、ＣＹＰ１５３ファミリーの組換えシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ、組換えアルコールデヒドロゲナーゼ、組換えトランスアミナーゼ、並びに任意にアラニンデヒドロゲナーゼ、フェレドキシン及びフェレドキシンレダクターゼを含む群からの１種以上の組換え酵素を発現する全細胞触媒（Ganzzellkatalysator）、並びに脂肪酸若しくはそのエステルを酸化するためのこの全細胞触媒の使用に関し、ここで、この脂肪酸若しくはそのエステルは、好ましくは式（Ｉ）
Ｈ3Ｃ−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＲ（Ｉ）
［式中、
Ｒは、Ｈ、メチル、エチル、プロピル及びブチルを含む群から選択されており、
ｎは、０〜３０、好ましくは６〜２４である］
を有しているものとする。
【背景技術】
【０００２】
ポリアミドは、アミド基の繰返しが特徴的なポリマー種である。「ポリアミド」という概念は、化学的に近しいタンパク質とは異なり、一般には市販の合成熱可塑性プラスチックを指す。ポリアミドは、慣例的には炭化水素のクラッキングの際に得られる第一級アミン若しくは第二級アミンから誘導されている。しかしながら、誘導体、より具体的にはアミノカルボン酸やラクタム、そしてジアミンもポリマー製造に使用可能である。さらに、再生可能原料から出発して生物工学的方法により得られる短鎖ガス状アルカンも、出発材料として重要である。
【０００３】
商業的に需要の高いポリアミドの多くは、ラクタムから出発して製造されている。例えば「ポリアミド６」はε−カプロラクタムの重合により得られ、「ポリアミド１２」はラウロラクタムの重合により得られる。その他の商業的に重要な製品には、ラクタムのコポリマー、例えばε−カプロラクタムとラウロラクタムとのコポリマーが含まれる。
【０００４】
アミンの慣用の化学工業製品は化石原料の供給に依存しており、低効率であって、その際には望ましくない副生成物が多量に生成され、これは多くの合成ステップにおいて８０％にものぼる。そのようなプロセスの一例はラウロラクタムの製造であり、これは慣例的にはブタジエンの三量体化により取得される。三量体化生成物であるシクロドデカトリエンを水素化し、これから生じるシクロドデカンを酸化してシクロドデカノンとし、次いでこれをヒドロキシルアミンと反応させてシクロドデカンオキシムとし、最終的にこれをベックマン転位によりラウロラクタムへと転化させる。
【０００５】
前記欠点を考慮して、再生可能原料から出発して生体触媒を用いてアミンを得る方法が開発されている。再生可能原料としては、特にナタネ油、アザミ油、パーム核油、ココナッツ油、ヒマワリ種子油や、多数の生物源、特に植物からの類似の天然物の形態で得られる脂肪酸源が考慮される。
【０００６】
ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６７４４７には、化学的に近しい生成物、より具体的にはω−アミノカルボン酸を、一連の好適な酵素活性を有しかつカルボン酸を相応のω−アミノカルボン酸へと転化させ得る細胞を用いて生産するための、生物学的な系が記載されている。
【０００７】
しかしながら、そこで用いられているシュードモナス・プチダＧＰＯ１由来のＡｌｋＢＧＴオキシダーゼ系は、脂肪族アルカンから第一級アルコールへの選択的酸化を達成し得ないという公知の欠点を有している。そればかりか多数の酸化生成物が生成され、特に反応時間の経過に伴って例えば相応のアルデヒドやケトン、また相応のカルボン酸といったより酸化の進んだ生成物の割合が増加し(C. Grant, J. M. Woodley and F. Baganz (2011), Enzyme and Microbial Technology 48, 480-486)、それに応じて所望のアミンの収率が低下してしまう。
【０００８】
こうした比較的選択性の低い酸化の問題点は、生成される酸化生成物が構造的に極めて類似していることによって、さらに深刻なものとなっている。これにより、生成される酸化生成物と所望の酸化生成物とを、効率的にかつ顕著な収率低下が生じることなく分離することが極めて困難となっている。
【０００９】
従って、酵素による触媒反応が選択的に進行し、かつ不可逆的に生産される副生成物の形成が最小化されるような方法が求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
このような背景に鑑み、本発明は、生体触媒を使用して脂肪酸を酸化及びアミノ化するための改善された方法を提供することを課題としている。
【００１１】
本発明のもう一つの課題は、前記方法を、脂肪酸基質やその他の基質の量、生物工学的合成に用いられる細胞のための炭素基質の量に対する収率が向上し、かつ／又は、副生成物の濃度や所望の生成物に対する副生成物の比が低減するように改善することである。
【００１２】
本発明のもう一つの課題は、前記方法を、使用する生体触媒、特に脂肪酸オキシダーゼの選択率が向上し、かつ／又は、反応開始時に、つまり時間が経過して生成物濃度がプラトーに達するよりも前に、又は平衡に達した後、つまりプラトーに達した後に継続するように改善することである。
【００１３】
本発明のもう一つの課題は、脂肪酸の生物工学的酸化及びアミノ化の際に生じる反応混合物の後処理性を、特に親水性物質と疎水性物質との相分離の効率及び速度に関して改善することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記及び他の課題は、本願の対象により、またさらに添付の独立請求項に記載の対象により解決され、その際、実施形態は従属請求項から明らかである。
【００１５】
本発明の課題は、第一の態様において、以下の工程：
ａ）脂肪酸若しくはそのエステルを、分子酸素及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下でのＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼとの接触により酸化する工程
を含む脂肪酸若しくはそのエステルの酸化法により解決され、ここで、この脂肪酸若しくはそのエステルは、好ましくは式（Ｉ）
Ｈ3Ｃ−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＲ（Ｉ）
［式中、
Ｒは、Ｈ、メチル、エチル、プロピル及びブチルを含む群から選択されており、
ｎは、０〜３０、好ましくは６〜２４である］
を有しているものとする。
【００１６】
この第一の態様の第一の実施形態においては、前記課題は、さらに以下の工程：
ｂ）工程ａ）からの酸化された脂肪酸若しくはそのエステルを、アルコールデヒドロゲナーゼとの接触によりさらに酸化する工程、
ｃ）工程ｂ）からのさらに酸化された脂肪酸若しくはそのエステルを、アミンドナー、好ましくはアラニンの存在下でのトランスアミナーゼとの接触によりアミノ化する工程
を含み、ここで、この工程ｃ）を任意にアラニンデヒドロゲナーゼ、アンモニウム及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下に行うものとする方法により解決される。
【００１７】
前記の第一の実施形態の一実施形態でもある第二の実施形態においては、前記課題は、ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼがペプチド配列ＬＬ（Ｉ／Ｌ）（Ｖ／Ｉ）ＧＧＮＤＴＴＲＮを有しており、好ましくはアルカニボラックス・ボルクメンシスＳＫ２（Alcanivorax borkumensis SK2）由来のＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（データベースコードYP_691921）若しくはその変異体である方法により解決される。
【００１８】
前記及び他の本願明細書中で用いられるデータベースコードは、いずれもＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋタンパク質データベースの２０１２年３月９日にオンライン取得可能であったバージョンによるものである。
【００１９】
前記の第一乃至第二の実施形態の一実施形態でもある第三の実施形態においては、前記課題は、アルコールデヒドロゲナーゼが、ＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼ、好ましくはエシェリキア・コリ（Escherichia coli）ＭＳ  １８７−１由来のＮＡＤ依存性アルコールデヒドロゲナーゼ（データベースコードZP_07145023）若しくはその変異体、又はバシラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（データベースコードP42328）若しくはその変異体、又はグルコース−メタノール−コリン−オキシドレダクターゼファミリーのオキシドレダクターゼ、好ましくはシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のオキシドレダクターゼ（データベースコードCAB54054.1）若しくはその変異体、又はフラビン含有アルコールデヒドロゲナーゼ、好ましくはカンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）由来のフラビン含有アルコールデヒドロゲナーゼ（データベースコードAAS46878.1）若しくはその変異体である方法により解決される。
【００２０】
前記の第一乃至第三の実施形態の一実施形態でもある第四の実施形態においては、前記課題は、工程ａ）において、さらに、フェレドキシンレダクターゼ、好ましくはアルカニボラックス・ボルクメンシスＳＫ２由来のフェレドキシンレダクターゼ（データベースコードYP_691923）若しくはその変異体、及び／又は、フェレドキシン、好ましくはアルカニボラックス・ボルクメンシスＳＫ２由来のフェレドキシン（データベースコードYP_691920）若しくはその変異体が存在している方法により解決される。
【００２１】
前記の第一乃至第四の実施形態の一実施形態でもある第五の実施形態においては、前記課題は、工程ｃ）を、アラニンデヒドロゲナーゼ、アンモニウム及びＮＡＤＨの存在下に行い、このアラニンデヒドロゲナーゼが、バシラス・サチリス・サブスピーシーズ・サチリス（Bacillus subtilis subsp. subtilis）str.１６８由来のアラニンデヒドロゲナーゼ（データベースコードNP_391071）若しくはその変異体である方法により解決される。
【００２２】
前記の第一乃至第五の実施形態の一実施形態でもある第六の実施形態においては、前記課題は、ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、トランスアミナーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼ、フェレドキシン及びフェレドキシンレダクターゼを含む群からの少なくとも１種の酵素を、組換えによって全細胞触媒の形態で準備する方法により解決される。
【００２３】
前記の第六の実施形態の一実施形態でもある第七の実施形態においては、前記課題は、工程ａ）、ｂ）又はｃ）のうち少なくとも１つにおいて、存在しているか、又は、脂肪酸若しくはそのエステル、工程ｂ）からのさらに酸化された脂肪酸若しくはそのエステル、又は工程ｃ）からのさらに酸化及びアミノ化された脂肪酸若しくはそのエステルと接触させる、ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、トランスアミナーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼ、フェレドキシン及びフェレドキシンレダクターゼを含む群からの全ての酵素を、組換えによって１つ以上の全細胞触媒の形態で準備する方法により解決される。
【００２４】
前記の第六乃至第七の実施形態の一実施形態でもある第八の実施形態においては、前記課題は、全細胞触媒がさらに、ＡｌｋＬファミリーのポリペプチド、好ましくはシュードモナス・プチダ由来（データベースコードCAB69081）の、マリノバクター・アクアエオレイ（Marinobacter aquaeolei）ＶＴ８由来（データベースコードYP_957722）の、オセアニカウリス・アレクサンドリイ（Oceanicaulis alexandrii）ＨＴＣＣ２６３３由来（データベースコードZP_00953584）の、マリノバクター・マンガンオキシダンス（Marinobacter manganoxydans）ＭｎＩ７−９由来（データベースコードZP_09158756）の、カウロバクター・スピーシーズ（Caulobacter sp.）Ｋ３１由来（データベースコードYP_001672217）の、シュードモナス・オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）由来（データベースコードQ00595）のＡｌｋＬを含む群からのＡｌｋＬ若しくはそれらの変異体を発現する方法により解決される。
【００２５】
前記の第一乃至第八の実施形態の一実施形態でもある第九の実施形態においては、前記課題は、全細胞触媒が、脂肪酸のβ酸化の反応の１つを触媒する少なくとも１種の酵素の、その野生型よりも低い活性を有する細胞であって、ここで、この酵素は好ましくは、脂肪酸インポーター、脂肪酸−ＣｏＡ−リガーゼ、アシル−ＣｏＡ−デヒドロゲナーゼ、２，４−ジエノイル−ＣｏＡ−レダクターゼ、エノイル−ＣｏＡ−ヒドラターゼ及び３−ケトアシル−ＣｏＡ−チオラーゼを含む群から選択されているものとする方法により解決される。
【００２６】
前記の第一乃至第九の実施形態の一実施形態でもある第十の実施形態においては、前記課題は、工程ｃ）におけるアラニンデヒドロゲナーゼが、このアラニンデヒドロゲナーゼがアルコールデヒドロゲナーゼにより工程ｂ）において酸化されたレドックス補因子、好ましくはＮＡＤ+又はＮＡＤＰ+を還元するように選択されている方法により解決される。
【００２７】
第二の態様において、前記課題は、ＣＹＰ１５３ファミリーの組換えシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ、組換えアルコールデヒドロゲナーゼ、組換えトランスアミナーゼ、並びに任意にアラニンデヒドロゲナーゼ、フェレドキシン及びフェレドキシンレダクターゼを含む群からの１種以上の組換え酵素を発現する全細胞触媒により解決される。
【００２８】
第一の態様の第一の実施形態においては、前記課題は、さらに、ＡｌｋＬファミリーのポリペプチド、好ましくはシュードモナス・プチダ由来（データベースコードCAB69081）の、マリノバクター・アクアエオレイＶＴ８由来（データベースコードYP_957722）の、オセアニカウリス・アレクサンドリイＨＴＣＣ２６３３由来（データベースコードZP_00953584）の、マリノバクター・マンガンオキシダンスＭｎＩ７−９由来（データベースコードZP_09158756）の、カウロバクター・スピーシーズＫ３１由来（データベースコードYP_001672217）の、シュードモナス・オレオボランス由来（データベースコードQ00595）のＡｌｋＬを含む群からのＡｌｋＬ若しくはそれらの変異体を発現する全細胞触媒により解決される。
【００２９】
前記の第一の実施形態の一実施形態でもある第二の実施形態においては、前記課題は、脂肪酸のβ酸化の反応の１つを触媒する少なくとも１種の酵素の、その野生型よりも低い活性を有する細胞であって、ここで、この酵素は好ましくは、脂肪酸インポーター、脂肪酸−ＣｏＡ−リガーゼ、アシル−ＣｏＡ−デヒドロゲナーゼ、２，４−ジエノイル−ＣｏＡ−レダクターゼ、エノイル−ＣｏＡ−ヒドラターゼ及び３−ケトアシル−ＣｏＡ−チオラーゼを含む群から選択されているものとする全細胞触媒により解決される。
【００３０】
前記の第一乃至第二の実施形態の一実施形態でもある第三の実施形態においては、前記課題は、フェレドキシンレダクターゼ及びフェレドキシンを発現する全細胞触媒により解決される。
【００３１】
前記の第一乃至第三の実施形態の一実施形態でもある第四の実施形態においては、前記課題は、アラニンデヒドロゲナーゼを発現し、ここで、このアラニンデヒドロゲナーゼは、バシラス・サチリス・サブスピーシーズ・サチリスstr.１６８由来のアラニンデヒドロゲナーゼ（データベースコードNP_391071）若しくはその変異体であるものとする全細胞触媒により解決される。
【００３２】
前記の第一乃至第四の実施形態の一実施形態でもある第五の実施形態においては、前記課題は、ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼがペプチド配列ＬＬ（Ｉ／Ｌ）（Ｖ／Ｉ）ＧＧＮＤＴＴＲＮを有しており、かつ／又は、アルカニボラックス・ボルクメンシスＳＫ２由来のＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（データベースコードYP_691921）若しくはその変異体であり、かつ、フェレドキシンレダクターゼが、アルカニボラックス・ボルクメンシスＳＫ２由来のフェレドキシンレダクターゼ（データベースコードYP_691923）若しくはその変異体であり、かつ、フェレドキシンが、アルカニボラックス・ボルクメンシスＳＫ２由来のフェレドキシン（データベースコードYP_691920）若しくはその変異体である全細胞触媒により解決される。
【００３３】
前記の第一乃至第五の実施形態の一実施形態でもある第六の実施形態においては、前記課題は、アルコールデヒドロゲナーゼが、ＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼ、グルコース−メタノール−コリン−オキシドレダクターゼファミリーのオキシドレダクターゼ、又はフラビン含有アルコールオキシダーゼであり、好ましくはＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼであり、最も好ましくはエシェリキア・コリ  ＭＳ  １８７−１由来のＮＡＤ依存性アルコールデヒドロゲナーゼ（データベースコードZP_07145023）若しくはその変異体である全細胞触媒により解決される。
【００３４】
第一若しくは第二の態様及びその実施形態のもう一つの実施形態でもある第七の実施形態においては、前記課題は、トランスアミナーゼがシュードモナス・プチダＧＢ−１由来のトランスアミナーゼ（データベースコードYP_001668026.1）若しくはその変異体である、第二の態様若しくは第二の態様の一実施形態による全細胞触媒、又は第一の態様若しくは第一の態様の一実施形態による方法により解決される。
【００３５】
第一若しくは第二の態様のもう一つの実施形態でもある第八の実施形態においては、脂肪酸若しくはそのエステルは、不飽和若しくは分岐状の脂肪酸若しくはそのエステルである。
【００３６】
第一若しくは第二の態様のもう一つの実施形態でもある第九の実施形態においては、前記課題は、ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、トランスアミナーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼ、フェレドキシン及びフェレドキシンレダクターゼを含む群からの少なくとも１種の酵素を組換えによって全細胞触媒の形態で準備する方法により解決されるか、又は前記課題は、少なくとも１種の内因性アルデヒドデヒドロゲナーゼの細胞の野生型よりも低い活性を有する細胞である全細胞触媒により解決される。
【００３７】
第三の態様において、本発明の課題は、脂肪酸若しくはそのエステルを酸化及び／又はアミノ化するための、本発明の第二の態様若しくはその一実施形態による全細胞触媒の使用により解決され、ここで、この脂肪酸若しくはそのエステルは、好ましくは式（Ｉ）
Ｈ3Ｃ−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＲ（Ｉ）
［式中、
Ｒは、Ｈ、メチル、エチル、プロピル及びブチルを含む群から選択されており、
ｎは、０〜３０、好ましくは６〜２４である］
を有しているものとする。
【００３８】
第三の態様の第一の実施形態においては、前記課題は、酸化によって、反応した脂肪酸若しくはそのエステルの物質量に対して少なくとも９０％の相応のアルコールと、１％未満の相応のアルデヒドと、１０％未満の相応の酸とを含有する酸化生成物の混合物が生成される使用により解決される。
【００３９】
第三の態様の実施形態のもう一つの実施形態でもある第三の態様の第二の実施形態においては、脂肪酸は不飽和若しくは分岐状の脂肪酸若しくはそのエステルである。
【００４０】
本発明は、特定のモノオキシゲナーゼ、より具体的にはＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼやそのようなモノオキシゲナーゼを発現する全細胞触媒を脂肪酸の酸化及び／又はアミノ化に使用することで、意想外にも所望の生成物がより高い選択率でかつ改善された相対収率で形成されるという本発明者の知見に基づくものである。
【００４１】
如何なる理論にもとらわれることなく、本発明者は、このモノオキシゲナーゼの活性触媒中心は、すでにヒドロキシル化されている生成物が、従来技術から公知である同等のモノオキシゲナーゼよりも低い親和性で以て結合し、かつさらに酸化されてアルデヒドのみならず酸にまで酸化された生成物をもたらすような性質を有しているものと推測している。
【００４２】
本発明による方法は、工程ａ）において、ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼによる脂肪酸の酸化を予定している。一実施形態においては、「脂肪酸若しくはそのエステル」という概念は、式Ｈ3Ｃ−（ＣＨ2）x−ＣＯＯＲ［式中、ｘは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０であり、Ｒは、水素、メチル、エチル又はプロピル、好ましくは水素である］の化合物である。特に好ましい一実施形態においては、ｘは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４であり、Ｒは水素である。極めて好ましい一実施形態においては、これはラウリン酸若しくはラウリン酸メチルエステルである。好ましい一実施形態においては、これはミリストレイン酸、パルミトレイン酸、ペトロセリン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、ガドレイン酸、イコセン酸又はエルカ酸を含む群からの不飽和脂肪酸である。同様に、種々の脂肪酸の混合物、例えばアザミ油、ココナッツ油、クフェア油又はパーム核油の加水分解及び場合によりエステル化により得られる脂肪酸若しくは脂肪酸エステルの混合物も考えられる。全ての脂肪酸が室温で顕著な可溶性を示すわけではないため、この脂肪酸が水相になじむようにするためには、例えば昇温や好ましくは有機溶剤の添加といったさらなる措置が必要な場合もある。特に好ましい一実施形態においては、脂肪酸若しくはそのエステル、極めて好ましくはラウリン酸メチルエステル又はオレイン酸を、そのようなさらなる溶剤として使用する。
【００４３】
本願明細書中で挙げられている全ての化合物の場合と同様に、脂肪酸には、脂肪酸のプロトン化された形態のみならず、水溶液中で解離している全ての形態、調製物又は塩が含まれる。例えば、ラウリン酸という概念には、ラウリン酸塩又はラウリン酸ナトリウムも含まれる。他の例として、アミノ酸アラニンには、水中でカルボキシル基が脱プロトン化若しくはプロトン化されている形態や、アミノ基がプロトン化若しくは脱プロトン化されている形態が含まれる。
【００４４】
本発明による方法は、ヒドロキシル化脂肪酸への酸化を予定しているばかりでなく、ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、トランスアミナーゼ及び任意にアミノ酸デヒドロゲナーゼを含む酵素系を用いた、脂肪酸から相応のω−アミノカルボン酸への効率的な転化を可能にするものである。このような酵素の使用は、その酵素活性と相容れる条件下に行われる。これには、まずもって、好適なｐＨ値で、少なくとも１種のｐＨ安定化作用を有するバッファー、例えばリン酸ナトリウム、任意に少なくとも１種の塩、例えば塩化ナトリウムを含む好適な水性バッファー系を選択することが必要である。極めて好ましい一実施形態においては、このｐＨ値は、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９又は１０、好ましくは２．５〜７．５、特に好ましくは５．５〜７．５である。温度も、使用すべき１種以上の酵素の活性に適合していなければならない。好ましい一実施形態においては、温度は１〜４５℃、さらに好ましくは２０〜４５℃、極めて好ましくは２８〜４２℃である。当業者は、標準的な方法をもとに、好適なバッファー系の選択と活性の安定化を行うことができる。例えばA Cornish-Bowden (1995), Fundamentals of Enzym Kinetics, Portland Press Limited, 1995を参照のこと。フェレドキシンやフェレドキシンレダクターゼなしでの、又はフェレドキシンやフェレドキシンレダクターゼと組み合わせたＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼの活性は、Scheps, D., Malca, H., Hoffmann, B., Nestl, B. M, und Hauer, B. (2011) Org. Biomol. Chem., 9, 6727に記載のアッセイにより測定可能である。当業者は、フェレドキシン及び／又はフェレドキシンレダクターゼが活性を示すかどうかを、これら２つの活性酵素の不在下に対するこれら２つの活性酵素の存在下でのモノオキシゲナーゼの顕著な活性増大により判別することができる。
【００４５】
トランスアミナーゼの活性についての酵素試験体は、Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MIより市販されている（"Alanine Transaminase Activity Assay Kit, Item No. 700260"）。アミノ酸デヒドロゲナーゼの活性は、Germano, H. J., und Anderson, K. E. (1968), J. Bact. 96 (1), p.55-60の記載に従って測定可能である。
【００４６】
さらに、酵素の使用には、必要な基質が全て存在していることが求められる。従って、ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼの活性には、本発明により転化させるべき脂肪酸若しくはそのエステルの他に、酸素や電子供与体の存在が必要である。好ましくは、酸素は、酵素又は細胞と基質とを含む反応混合物と、大気や純酸素や酸素リッチな大気との接触により利用可能となり、特に好ましくは、この反応混合物を大気や純酸素や酸素リッチな大気と接触させながら撹拌することにより利用可能となる。
【００４７】
還元剤、好ましくはＮＡＤＨからＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼへと電子を最適に供給するためには、このモノオキシゲナーゼを、機能的にこのモノオキシゲナーゼと相互作用するフェレドキシンレダクターゼや機能的にこのモノオキシゲナーゼと相互作用するフェレドキシンと一緒に用いることが好ましい。その際、これは単離ポリペプチドであってもよいし、全細胞触媒を使用する場合には共発現したポリペプチドであってもよく、またＮ末端若しくはＣ末端でＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼと融合しているポリペプチドであってもよい。当業者は、フェレドキシンレダクターゼやフェレドキシンと所定のＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼとが互いに機能的に相互作用するかどうかを、この還元剤がアルカン基質とこれら３つのポリペプチドの存在下に酸化されるかどうかによって容易に確認することができる。また、Scheps, D., Malca, H., Hoffmann, B., Nestl, B. M, und Hauer, B. (2011) Org. Biomol. Chem., 9, 6727に記載の酵素試験を用いることもできる。この試験は、機能的に相互作用するポリペプチドである場合に反応速度の明らかな上昇を示すものである。特に好ましい一実施形態においては、ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼとフェレドキシンとフェレドキシンレダクターゼとは同一の生物に由来する。特に好ましい一実施形態においては、これは、アルカニボラックス・ボルクメンシスＳＫ２由来のフェレドキシンレダクターゼ（データベースコードYP_691923）若しくはその変異体、アルカニボラックス・ボルクメンシスＳＫ２由来のフェレドキシン（データベースコードYP_691920）若しくはその変異体、及びアルカニボラックス・ボルクメンシスＳＫ２由来のＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（データベースコードYP_691921）若しくはその変異体である。
【００４８】
本発明により使用される酵素はいずれも、相応の酵素活性ポリペプチド若しくはその溶解産物を含む細胞や、粗溶解産物から純ポリペプチドに至るまでのいずれの精製レベルのポリペプチド調製物であってもよく、また全細胞触媒であってもよい。当業者には、酵素活性ポリペプチドを好適な細胞中で過剰発現させて精製ないし単離できる方法が数多く知られている。ポリペプチドの発現には、当業者に利用可能な全ての発現系を使用することができる。精製には、クロマトグラフィーによる方法、例えば固定化配位子を用いた、例えばヒスチジンタグの場合にはニッケルイオン、標的タンパク質に融合したグルタチオンＳ−トランスフェラーゼの場合には固定化グルタチオン、またマルトース結合タンパク質を含むタグの場合には固定化マルトースを用いた、タグ付き組換えタンパク質のアフィニティークロマトグラフィーによる精製が考えられる。生物工学的に重要な多くの細胞種、例えばＥ．コリについて、核酸分子の発現若しくは過剰発現に使用可能な好適な方法やベクターが知られており、例えばｐＥＴ又はｐＧＥＸの種類のベクターとその発現に好適な細胞が知られている（B A Moffatt, and F W Studier (1986) J. Mol. Biol. 189, 113-130、A H Rosenberg, B N Lade, D Chui, S Lin, J J Dunn, and F W Studier (1987) Gene 56, 125-135、及びF W Studier, A H Rosenberg, J J Dunn, and J W Dubendorff (1990) Meth. Enzymol. 185, 60-89）。
【００４９】
精製された酵素は、溶解形でも固定化しても使用可能である。当業者には、ポリペプチドを有機若しくは無機固定相に共有結合により又は共有結合によらずに、例えばスルフヒドリルカップリングケミストリー（例えばPierce社製キット）により固定化できる好適な方法が知られている。細胞膜結合型酵素や細胞膜埋込酵素は、膜調製物の形でも可溶化しても使用可能である。
【００５０】
少なくとも１種の全細胞触媒を使用する場合、反応時間が比較的長いケースでは、条件が、全細胞触媒として使用する細胞のうちの少なくとも１種のバイアビリティに適合するように留意すべきである。当業者は、例えばFuchs/Schlegel (2007) Allgemeine Mikrobiologie, 2008, Georg Thieme Verlagのような標準的な研究から、このような細胞のバイアビリティの保持を可能にする条件や解決策を得ることができる。
【００５１】
好ましい一実施形態においては、本願で用いられる「全細胞触媒」という概念は、所望の酵素活性を提供する、生存しておりかつ代謝活性を示す完全な細胞を表す。全細胞触媒は、代謝すべき基質（本発明の場合にはアルコール若しくはそれから生成される酸化生成物）を細胞内に輸送し、そこでこの基質を細胞質ゾル性酵素により代謝させることもできるし、また、当該酵素をその表面上で発現し、そこでこの酵素を媒体中の基質に直接曝すこともできる。当業者には、例えばＤＥ６０２１６２４５号から、全細胞触媒を生産するための系が数多く知られている。
【００５２】
全細胞触媒を使用する場合には、基質を細胞内に局在化している酵素と接触させて所望の反応を引き起こさねばならないという問題が生じ得る。長鎖アルカンやその誘導体の場合には、全細胞触媒がＡｌｋＬファミリーのポリペプチドを有していることが好ましい。好ましい一実施形態においては、本願で用いられる「ＡｌｋＬファミリーのポリペプチド」とは、２３０の連続したアミノ酸長にわたって、シュードモナス・プチダ由来のＡｌｋＬ（データベースコードCAB69081）に対して少なくとも８０％の、好ましくは９０％の、さらに好ましくは９０％の配列同一性を有し、かつ好ましくは長鎖アルカンを細胞内部へとインポートすることを促す能力を有するポリペプチドである。さらなる一実施形態においては、本願で用いられる「ＡｌｋＬファミリーのポリペプチド」とは、配列モチーフＤＸＷＡＰＡＸＱ（Ｖ／Ａ）ＧＸＲを有するグラム陰性菌の外膜に局在化しているポリペプチドであり、その際、Ｘはタンパク質原性アミノ酸を表すものとし、さらにシュードモナス・プチダ由来のＡｌｋＬ（データベースコードCAB69081）若しくはその変異体が好ましい。ＡｌｋＬファミリーの例示される構成員には、好ましくはシュードモナス・プチダ由来（データベースコードCAB69081）の、マリノバクター・アクアエオレイＶＴ８由来（データベースコードYP_957722）の、オセアニカウリス・アレクサンドリイＨＴＣＣ２６３３由来（データベースコードZP_00953584）の、マリノバクター・マンガンオキシダンスＭｎＩ７−９由来（データベースコードZP_09158756）の、カウロバクター・スピーシーズＫ３１由来（データベースコードYP_001672217）の、シュードモナス・オレオボランス由来（データベースコードQ00595）のＡｌｋＬ及びそれらの変異体が含まれる。
【００５３】
一連の用途のためには、単離された酵素の使用が望ましい。好ましい一実施形態においては、本願で用いられる「単離」という概念は、酵素がその天然源よりも純粋及び／又は濃縮された形で存在していることを意味する。好ましい一実施形態においては、酵素が相応の調製物のタンパク質質量分率の６０％、７０％、８０％、９０％又は好ましくは９５％を占めている場合、この酵素は単離されているものと見なされる。当業者には、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル上の相応のタンパク質バンドの厚さに基づく目測やＮＭＲ分光法、また質量分析に基づく方法といった、溶液中のタンパク質の質量測定法が数多く知られている。
【００５４】
本発明により使用される酵素は、好ましくは組換え酵素である。好ましい一実施形態においては、本願で用いられる「組換え」という概念は、相応の核酸分子が本来存在しておらず、かつ／又は遺伝子工学的方法により生産されたことを意味する。好ましい一実施形態においては、相応のポリペプチドが組換え核酸によってコードされている場合に、これを組換えタンパク質と称する。好ましい一実施形態においては、本願で用いられる組換え細胞とは、少なくとも１つの組換え核酸又は組換えポリペプチドを有する細胞を表す。当業者には、組換え分子又は細胞の生産に適した方法が知られており、例えば該方法はSambrook/Fritsch/Maniatis (1989): Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第二版に記載されている。
【００５５】
好ましい一実施形態においては、全細胞触媒として、又は発現系として使用される細胞は、原核細胞、好ましくは細菌細胞である。本発明によれば、良好な遺伝的アクセシビリティに基づき、細菌の群から選択された微生物、特に以下のものを含む群、好ましくは以下のものからなる群から選択された微生物を使用することが好ましい：マグネトコッカス（Magnetococcus）、マリプロフンドゥス（Mariprofundus）、アセトバクター（Acetobacter）、アシジフィリウム（Acidiphilium）、アフィピア（Afipia）、アーレンシア（Ahrensia）、アスチッカコーリス（Asticcacaulis）、アウランチモナス（Aurantimonas）、アゾリゾビウム（Azorhizobium）、アゾスピリルム（Azospirillum）、バシラス（Bacillus）、バルトネラ（Bartonella）、トリボコルム（tribocorum）、ベイジェリンキア（Beijerinckia）、ブラジリゾビウム（Bradyrhizobium）、ブレブンジモナス（Brevundimonas）、スブビブリオイデス（subvibrioides）、ブルセラ（Brucella）、カウロバクター（Caulobacter）、ケラチボランス（Chelativorans）、シトレイセラ（Citreicella）、シトロミクロビウム（Citromicrobium）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、ディノロセオバクター（Dinoroseobacter）、エリスロバクター（Erythrobacter）、フルビマリーナ（Fulvimarina）、グルコンアセトバクター（Gluconacetobacter）、グラニュリバクター（Granulibacter）、ヒルシア（Hirschia）、ホエフレア（Hoeflea）、ハイフォミクロビウム（Hyphomicrobium）、ハイフォモナス（Hyphomonas）、ケトグロニシゲニウム（Ketogulonicigenium）、ラブレンジア（Labrenzia）、ロクタネラ（Loktanella）、マグネトスピリルム（Magnetospirillum）、マリカウリス（Maricaulis）、マリチミバクター（Maritimibacter）、メソリゾビウム（Mesorhizobium）、メチロバクテリウム（Methylobacterium）、メチロシスティス（Methylocystis）、メチロシヌス（Methylosinus）、ニトロバクター（Nitrobacter）、ノボスフィンゴビウム（Novosphingobium）、オセアニブルブス（Oceanibulbus）、オセアニカウリス（Oceanicaulis）、オセアニコラ（Oceanicola）、オクロバクトルム（Ochrobactrum）、オクタデカバクター（Octadecabacter）、オリゴトロファ（Oligotropha）、パラコッカス（Paracoccus）、パルビバキュルム（Parvibaculum）、パルブラルキュラ（Parvularcula）、ペラギバカ（Pelagibaca）、ファエオバクター（Phaeobacter）、フェニロバクテリウム（Phenylobacterium）、ポリモルフム（Polymorphum）、シュードビブリオ（Pseudovibrio）、ロドバクター（Rhodobacter）、ロドミクロビウム（Rhodomicrobium）、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）、ロドスピリルム（Rhodospirillum）、ロセイビウム（Roseibium）、ロセオバクター（Roseobacter）、ロセオモナス（Roseomonas）、ロセオバリウス（Roseovarius）、ルエゲリア（Ruegeria）、サジツーラ（Sagittula）、シリシバクター（Silicibacter）、スフィンゴビウム（Sphingobium）、スフィンゴモナス（Sphingomonas）、スフィンゴフィキシス（Sphingopyxis）、スタルケヤ（Starkeya）、スルフィトバクター（Sulfitobacter）、タラシオビウム（Thalassiobium）、キサントバクター（Xanthobacter）、ザイモモナス（Zymomonas）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）、リゾビウム（Rhizobium）、シノリゾビウム（Sinorhizobium）、アナプラズマ（Anaplasma）、エールリキア（Ehrlichia）、ネオリケッチア（Neorickettsia）、オリエンティア（Orientia）、リケッチア（Rickettsia）、ボルバキア（Wolbachia）、ボルデテラ（Bordetella）、ブルクホルデリア（Burkholderia）、クプリアビダス（Cupriavidus）、タイワネンシス（Taiwanensis）、ラウトロピア（Lautropia）、リムノバクター（Limnobacter）、ポリヌクレオバクター（Polynucleobacter）、ラルストニア（Ralstonia）、クロモバクテリウム（Chromobacterium）、エイケネラ（Eikenella）、コロデンス（corrodens）、バスフィア（Basfia）、キンゲラ（Kingella）、ラリバクター（Laribacter）、ルチエラ（Lutiella）、ネイセリア（Neisseria）、シモンシエラ（Simonsiella）、アクロモバクター（Achromobacter）、アシドボラックス（Acidovorax）、アリシクリフィルス（Alicycliphilus）、アロマトレウム（Aromatoleum）、アゾアルクス（Azoarcus）、コマモナス（Comamonas）、デクロロモナス（Dechloromonas）、デルフチア（Delftia）、ガリオネラ（Gallionella）、ヘルバスピリルム（Herbaspirillum）、ヘルミニイモナス（Herminiimonas）、ヒレモネラ（Hylemonella）、ヤンチノバクテリウム（Janthinobacterium）、レプトトリックス（Leptothrix）、メチリビウム（Methylibium）、メチロバシラス（Methylobacillus）、メチロフィラレス（Methylophilales）、メチロベルサチリス（Methyloversatilis）、メチロボルス（Methylovorus）、ニトロソモナス（Nitrosomonas）、ニトロソスピラ（Nitrosospira）、オキサロバクター（Oxalobacter）、パラステレラ（Parasutterella）、ポラロモナス（Polaromonas）、ポラロモナス（Polaromonas）、プシリモナス（Pusillimonas）、ロドフェラックス（Rhodoferax）、ルブリビバックス（Rubrivivax）、シデロキシダンス（Sideroxydans）、ステレラ（Sutterella）、ワドスウォルテンシス（wadsworthensis）、テイロレラ（Taylorella）、タウエラ（Thauera）、チオバシラス（Thiobacillus）、チオモナス（Thiomonas）、バリオボラックス（Variovorax）、ベルミネフロバクター（Verminephrobacter）、アナエロミクソバクター（Anaeromyxobacter）、ブデロビブリオ（Bdellovibrio）、バクテリオボルス（bacteriovorus）、ビロフィラ（Bilophila）、デスルファルクルス（Desulfarculus）、デスルファチバシルム（Desulfatibacillum）、デスルフォバッカ（Desulfobacca）、デスルフォバクテリウム（Desulfobacterium）、デスルフォブルブス（Desulfobulbus）、デスルフォコッカス（Desulfococcus）、デスルフォハロビウム（Desulfohalobium）、デスルフィトバクテリウム（Desulfitobacterium）、
デスルフォミクロビウム（Desulfomicrobium）、デスルフォナトロノスピラ（Desulfonatronospira）、デスルフォタレア（Desulfotalea）、デスルフォビブリオ（Desulfovibrio）、デスルフロモナス（Desulfuromonas）、ゲオバクター（Geobacter）、ハリアンギウム（Haliangium）、ヒッペア（Hippea）、ローソニア（Lawsonia）、ミクソコッカス（Myxococcus）、ペロバクター（Pelobacter）、プレシオシスティス（Plesiocystis）、ソランギウム（Sorangium）、スティグマテラ（Stigmatella）、シントロフォバクター（Syntrophobacter）、シントロファス（Syntrophus）、アルコバクター（Arcobacter）、カミニバクター（Caminibacter）、カンピロバクター（Campylobacter）、ヘリコバクター（Helicobacter）、ニトラチフラクター（Nitratifractor）、ニトラチルプター（Nitratiruptor）、スルフリクルブム（Sulfuricurvum）、スルフリモナス（Sulfurimonas）、スルフロスピリルム（Sulfurospirillum）、スルフロブム（Sulfurovum）、ウォリネラ（Wolinella）、ブフネラ（Buchnera）、ブロクマニア（Blochmannia）、ハミルトネラ（Hamiltonella）、レギエラ（Regiella）、リエシア（Riesia）、シトロバクター（Citrobacter）、クロノバクター（Cronobacter）、ディケヤ（Dickeya）、エドワードシエラ（Edwardsiella）、エンテロバクター（Enterobacter）、エルウィニア（Erwinia）、エシェリキア（Escherichia）、クレブシエラ（Klebsiella）、パントエア（Pantoea）、ペクトバクテリウム（Pectobacterium）、プロテウス（Proteus）、プロビデンシア（Providencia）、ラーネラ（Rahnella）、サルモネラ（Salmonella）、セラチア（Serratia）、シゲラ（Shigella）、ソダリス（Sodalis）、ウィグレスウォルチア（Wigglesworthia）、グロシナ（Glossina）、キセノラブダス（Xenorhabdus）、エルシニア（Yersinia）、アシジチオバシラス（Acidithiobacillus）、アシネトバクター（Acinetobacter）、アエロモナス（Aeromonas）、アルカニボラックス（Alcanivorax）、アルカリリムニコラ（Alkalilimnicola）、アロクロマチウム（Allochromatium）、アルテロモナダレス（Alteromonadales）、アルテロモナス（Alteromonas）、バウマニア（Baumannia）、ベギアトア（Beggiatoa）、ベルマネラ（Bermanella）、カルソネラ（Carsonella）、ルチア（Ruthia）、ベシコミオソシウス（Vesicomyosocius）、カルジオバクテリウム（Cardiobacterium）、クロモハロバクター（Chromohalobacter）、コルウェリア（Colwellia）、コングレギバクター（Congregibacter）、コキシエラ（Coxiella）、ジケロバクター（Dichelobacter）、エンドリフチア（Endoriftia）、エンヒドロバクター（Enhydrobacter）、フェリモナス（Ferrimonas）、フランシセラ（Francisella）、グラシエコラ（Glaciecola）、ハヘラ（Hahella）、ハロモナス（Halomonas）、ハロロドスピラ（Halorhodospira）、ハロチオバシラス（Halothiobacillus）、イディオマリーナ（Idiomarina）、カンギエラ（Kangiella）、レジオネラ（Legionella）、マリノバクター（Marinobacter）、マリノモナス（Marinomonas）、メチロバクター（Methylobacter）、メチロコッカス（Methylococcus）、メチロミクロビウム（Methylomicrobium）、メチロファガ（Methylophaga）、モラキセラ（Moraxella）、モリテラ（Moritella）、ネプツニイバクター（Neptuniibacter）、ニトロコッカス（Nitrococcus）、シュードアルテロモナス（Pseudoalteromonas）、サイクロバクター（Psychrobacter）、サイクロモナス（Psychromonas）、レイネケア（Reinekea）、リケッチエラ（Rickettsiella）、サッカロファグス（Saccharophagus）、シェワネ���（Shewanella）、スクシナチモナス（Succinatimonas）、テレジニバクター（Teredinibacter）、チオアルカリミクロビウム（Thioalkalimicrobium）、チオアルカリビブリオ（Thioalkalivibrio）、チオミクロスピラ（Thiomicrospira）、トルモナス（Tolumonas）、ビブリオナレス（Vibrionales）、アクチノバシラス（Actinobacillus）、アグレガチバクター（Aggregatibacter）、ガリバクテリウム（Gallibacterium）、ヘモフィルス（Haemophilus）、ヒストフィルス（Histophilus）、マンハイミア（Mannheimia）、パスツレラ（Pasteurella）、アゾトバクター（Azotobacter）、セルビブリオ（Cellvibrio）、シュードモナス（Pseudomonas）、アリイビブリオ（Aliivibrio）、グリモンチア（Grimontia）、フォトバクテリウム（Photobacterium）、フォトバクテリウム（Photobacterium）、ビブリオ（Vibrio）、シュードキサントモナス（Pseudoxanthomonas）、ステノトロフォモナス（Stenotrophomonas）、キサントモナス（Xanthomonas）、キシレラ（Xylella）、ボレリア（Borrelia）、ブラキスピラ（Brachyspira）、レプトスピラ（Leptospira）、スピロヘータ（Spirochaeta）、トレポネマ（Treponema）、ホジキニア（Hodgkinia）、プニセイスピリルム（Puniceispirillum）、リベリバクター（Liberibacter）、ペラギバクター（Pelagibacter）、オデッセラ（Odyssella）、アキュムリバクター（Accumulibacter）、特にＢ．サチリス（B. subtilis）、Ｂ．メガテリウム（B. megaterium）、Ｃ．グルタミクム（C. glutamicum）、Ｅ．コリ（E. coli）、シュードモナス・スピーシーズ（Pseudomonas sp.）、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナス・スタッツェリ（Pseudomonas stutzeri）、アシネトバクター・スピーシーズ（Acinetobacter sp.）、ブルクホルデリア・スピーシーズ（Burkholderia sp.）、ブルクホルデリア・タイランデンシス（Burkholderia thailandensis）、藍藻（Cyanobakterien）、クレブシエラ・スピーシーズ（Klebsiella sp.）、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）、サルモネラ・スピーシーズ（Salmonella sp.）、リゾビウム・スピーシーズ（Rhizobium sp.）及びリゾビウム・メリロチ（Rhizobium meliloti）。ここでは、Ｅ．コリが特に好ましい。
【００５６】
好ましい一実施形態においては、「ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ」という概念は、細胞質ゾル性オキシダーゼであって、さらにフェレドキシンとフェレドキシンレダクターゼを含む３成分系の一部であり、アルカン結合部位とアルカンのヒドロキシル化能力とを有するオキシダーゼを表す。特に好ましい一実施形態においては、これは、アルカニボラックス・ボルクメンシスＳＫ２由来のＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（データベースコードYP_691921）に対して少なくとも８０％の、好ましくは９０％の、最も好ましくは９５％若しくは９９％の配列同一性を有している酵素であるか、又はアルカニボラックス・ボルクメンシスＳＫ２由来のＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（データベースコードYP_691921）に対して少なくとも８０％の、好ましくは９０％の、最も好ましくは９５％若しくは９９％の配列同一性を有しておりさらにアルカンヒドロキシラーゼ活性を有している酵素である。好ましい一実施形態においては、本願で用いられる「アルカンヒドロキシラーゼ活性」という概念は、アルカンか、又は少なくとも５個の、好ましくは１２個の炭素基を含む非置換の直鎖状のアルキル基のヒドロキシル化を触媒する能力を表す。さらなる好ましい一実施形態においては、「ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ」という概念は、非膜結合型のオキシダーゼであって、アルカンか、少なくとも５個の、好ましくは１２個の炭素基を含む非置換の直鎖状のアルキル基か、又は一回ヒドロキシル化されたアルカンに対する結合部位とそのポリペプチド鎖モチーフＬＬ（Ｉ／Ｌ）（Ｖ／Ｉ）ＧＧＮＤＴＴＲＮを含む前記オキシダーゼを表す。好ましい一実施形態においては、本願で用いられる「ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ」という概念は、好ましくはアルカンヒドロキシラーゼ活性を有する、アルカニボラックス・ボルクメンシスＳＫ２由来のＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（データベースコードYP_691921）若しくはその変異体である。
【００５７】
アルカンのヒドロキシル化へのＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼの使用、酵素活性を測定するための酵素試験、並びに発現及び精製のための方法は、従来技術において記載されている（Scheps, D., Malca, H., Hoffmann, B., Nestl, B. M, und Hauer, B. (2011) Org. Biomol. Chem., 9, 6727）。酸化すべきアルカン、又は酸化すべき少なくとも５個の、好ましくは１２個の炭素基を含む非置換の直鎖状のアルキル基の他に、酵素の反応のために含まれる基質は酸素と電子を含んでおり、電子はＮＡＤＨの形で好ましくはその他の２つの成分であるフェレドキシン及びフェレドキシンレダクターゼを介してオキシダーゼへ伝達される。Scheps et al. (2011)及びRoome, P. W., Jr., Philley, J. C., und Peterson (1983) J. Biol. Chem. 258, 2593、Roome, P. W., and Peterson, J. A. (1988), Arch. Biochem. Biophys., 266, 41、及びPeterson, J. A., Lorence, M. C, und Amarneh, B. (1990) J. Biol. Chem, 265, 6066には、機能形のフェレドキシン及びフェレドキシンレダクターゼを取得するための方法も開示されている。
【００５８】
本発明によれば、工程ｂ）において、工程ａ）で生じた脂肪酸アルコールを酸化するのにアルコールデヒドロゲナーゼが使用される。アルコールデヒドロゲナーゼは、数十年来にわたって生化学において醸造技術による発酵法に関連して高い注目を集めている生物工学的に重要性の高い酵素群の一つであり、種々のアイソフォーム群を含んでいる。例えば、シュードモナス・プチダＧＰＯ１  ＡｌｋＪタイプの膜結合性、フラビン依存性のアルコールデヒドロゲナーゼが存在しており、これらはＮＡＤ+の代わりにフラボ補因子を用いる。もう一つの群には、細菌内に、また不活性型で酵母内に見られる、酸素に敏感な含鉄のアルコールデヒドロゲナーゼが含まれる。もう一つの群にはＮＡＤ+依存性アルコールデヒドロゲナーゼが含まれ、その中でも、活性中心がシステイン配位した亜鉛原子を有する亜鉛含有アルコールデヒドロゲナーゼであって、このシステイン配位した亜鉛原子がアルコール基質を固定化するアルコールデヒドロゲナーゼが含まれる。好ましい一実施形態においては、本願で用いられる「アルコールデヒドロゲナーゼ」とは、第一級若しくは第二級アルコールを、相応のアルデヒド若しくはケトンへと酸化する酵素を表す。好ましくは、本発明による方法におけるアルコールデヒドロゲナーゼはＮＡＤ+依存性アルコールデヒドロゲナーゼであり、つまりＮＡＤ+をアルコール酸化のための補因子として用い、ＮＡＤＨを相応のアルデヒド若しくはケトンの還元のための補因子として用いるアルコールデヒドロゲナーゼである。最も好ましい実施形態においては、アルコールデヒドロゲナーゼは、亜鉛含有ＮＡＤ+依存性アルコールデヒドロゲナーゼである。
【００５９】
さらなる好ましい一実施形態においては、アルコールデヒドロゲナーゼは、グルコース−メタノール−コリン−オキシドレダクターゼファミリーのオキシドレダクターゼである。好ましい一実施形態においては、本願で用いられる「グルコース−メタノール−コリン−オキシドレダクターゼファミリーのオキシドレダクターゼ」という概念は、ＦＡＤを補因子として含むものであって、かつ好ましくはシュードモナス・プチダ由来の酵素であるアルコールデヒドロゲナーゼ（データベースコードCAB69081）若しくはその変異体を表す。これには例えば、配列番号２６、２７、２８及び２９、並びにシュードモナス・プチダ由来の酵素（データベースコードCAB69081）が含まれる。
【００６０】
さらなる好ましい一実施形態においては、アルコールデヒドロゲナーゼは、フラビン含有アルコールデヒドロゲナーゼのファミリーのアルコールデヒドロゲナーゼである。好ましい一実施形態においては、本願で用いられる「フラビン含有アルコールデヒドロゲナーゼのファミリー」という概念は、ｃ型ヘムタンパク質であって、ＦＡＤを補因子として含み、かつ好ましくはさらに、データベースコードAAS46878.1を有する酵素群及びその変異体に属するアルコールオキシダーゼの群を表す。例示的なフラビン含有アルコールデヒドロゲナーゼには、カンジダ・トロピカリス由来のデータベースコードAAS46878.1、AAS46880.1を有する酵素や、カンジダ・クロアカエ（Candida cloacae）由来のデータベースコードCAB75351.1を有する酵素が含まれる。
【００６１】
本発明によれば、工程ｃ）においてトランスアミナーゼが使用される。好ましい一実施形態においては、本願で用いられる「トランスアミナーゼ」という概念は、α−アミノ基を、ドナー分子から、好ましくはアミノ酸から、アクセプター分子へと、好ましくはα−ケトカルボン酸へと転移させることを触媒する酵素を表す。好ましい一実施形態においては、本願で用いられる「アミンドナー」という概念は、Ｌ−アミノ酸であって、そのアミノ基がトランスアミナーゼからα−ケトカルボン酸へとアミノ酸を形成しながら転移され得るＬ−アミノ酸を表す。特に好ましい一実施形態においては、アミンドナーはＬ−アラニンである。好ましい一実施形態においては、トランスアミナーゼは、シュードモナス・プチダＧＢ−１由来のトランスアミナーゼ（データベースコードYP_001668026.1）からのVal224に相当するアミノ酸配列の位置に、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、メチオニン及びロイシンを含む群から選択されたアミノ酸を有し、かつ、シュードモナス・プチダＧＢ−１由来のトランスアミナーゼ（データベースコードYP_001668026.1）からのGly230に相当するアミノ酸配列の位置に、トレオニン以外のアミノ酸、好ましくは、セリン、システイン、グリシン及びアラニンを含む群からのアミノ酸を有していることを特徴とするトランスアミナーゼとその変異体の群から選択されている。特に好ましい一実施形態においては、トランスアミナーゼは、クロモバクテリウムビオラセウム（Chromobacterium violaceum）ＤＳＭ３０１９１由来のω−トランスアミナーゼ、シュードモナス・プチダＧＢ−１由来の、シュードモナス・プチダＷ６１９由来の、緑膿菌ＰＡ０１由来の、ストレプトミセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）Ａ３（２）由来の、シュードモナス・プチダ由来（データベースコードYP_001668026）の、シュードモナス・プチダ由来（データベースコードYP_001668026.1又はYP_001671460）の；ロドバクター・スフェロイデス由来（ATCC 17023株；データベースコードYP_353455）の、及びストレプトミセス・アベルミチリス（Streptomyces avermitilis）ＭＡ  ４６８０由来のトランスアミナーゼ並びにそれらの変異体を含む群から選択されている。
【００６２】
好ましい一実施形態においては、本願で用いられる「アラニンデヒドロゲナーゼ」という概念は、Ｌ−アラニンを水とＮＡＤ（Ｐ）+とを消費してピルベート、アンモニア及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換することを触媒する酵素を表す。好ましくは、アラニンデヒドロゲナーゼは細胞内アラニンデヒドロゲナーゼであり、さらに好ましくは細菌全細胞触媒の組換え細胞内アラニンデヒドロゲナーゼである。例には、リゾビウム・レグミノサルム（Rhizobium leguminosarum）由来（データベースコードYP_002975437）の、バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）由来（データベースコードYP_003565624）の、ロドバクター・カプスラタス（Rhodobacter capsulatus）由来（データベースコードADE84249.1）の、及びバシラス・サチリス（Bacillus subtilis）由来（データベースコードNP_391071）の酵素が含まれる。
【００６３】
工程ｂ）におけるアルコールデヒドロゲナーゼがＮＡＤ（Ｐ）依存性である場合、このアルコールデヒドロゲナーゼは未反応の基質１分子につき１分子のレドックス補因子ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを消費するが、一方でアミノデヒドロゲナーゼはＮＡＤ（Ｐ）Ｈを酸化する。従って、アルコールデヒドロゲナーゼとアミノ酸デヒドロゲナーゼとが同じレドックス補因子を変換する系を使用することが特に好ましい。ＮＡＤＰ依存性アルコールデヒドロゲナーゼには、Ｅ・コリ由来の酵素（YjgB, データベースコードZP_07117674）と、Ｅ・コリ由来のもう１種の酵素（YahK, データベースコードBAE76108.1）が含まれる。ＮＡＤ依存性アルコールデヒドロゲナーゼには、Ｅ・コリ由来の酵素（AdhP, データベースコードZP_07145023）、バシラス・サチリス由来の酵素（データベースコードNP_391071）、バシラス・ステアロサーモフィラス由来の酵素（データベースコードP42328.1）及びリゾビウム・レグミノサルム由来の酵素（データベースコードYP_002975437）が含まれる。ＮＡＤＰ依存性アラニンデヒドロゲナーゼには、ロドバクター・カプスラタス由来の酵素（データベースコードADE84249.1）が含まれる。ＮＡＤ依存性アラニンデヒドロゲナーゼには、バシラス・サチリス・サブスピーシーズ・サチリスstr.１６８由来のアラニンデヒドロゲナーゼ（データベースコードNP_391071）が含まれる。
【００６４】
本発明の教示は、厳密に本願明細書中に記載されている通りの生物巨大分子のアミノ酸配列若しくは核酸配列を用いて実施でき、またこのようなアミノ酸配列若しくは核酸配列に適用できるばかりでなく、このような巨大分子の、１つ以上のアミノ酸又は核酸の欠損、付加若しくは置換によって得られる変異体を用いて実施することもでき、またこのような変異体に適用することもできる。好ましい一実施形態においては、本願で用いられる核酸配列若しくはアミノ酸配列の「変異体」という概念は、以下で「ホモログ」という概念と同義かつ互換的に用いられ、これは、相応の本来の野生型の核酸配列若しくは野生型のアミノ酸配列に対して７０％の、７５％の、８０％の、８５％の、９０％の、９２％の、９４％の、９６％の、９８％の、９９％の又はそれより高いパーセンテージのホモロジー（本願では同一性と同義で用いられる）を有する別の核酸配列若しくはアミノ酸配列を意味し、その際、好ましくは、触媒活性中心を形成するアミノ酸や構造若しくはフォールディングに必須のアミノ酸とは別のアミノ酸が欠失若しくは置換されているか、又はそのようなアミノ酸が保存的にのみ置換されており、例えばアスパラギン酸の代わりにグルタミン酸に、またバリンの代わりにロイシンに置換されている。従来技術では、例えばArthur Lesk (2008), Introduction to bioinformatics, 第三版に、２つの配列の相同性の程度の算出に利用可能なアルゴリズムが記載されている。本発明のさらなる好ましい一実施形態においては、アミノ酸配列若しくは核酸配列の変異体は、好ましくは上述の配列相同性に加えて、野生型分子若しくは本来の分子と本質的に同じ酵素活性を有する。例えば、プロテアーゼとして酵素的に活性なポリペプチドの変異体は、前記ポリペプチド酵素と同じか若しくは本質的に同じタンパク質分解活性、つまりペプチド結合の加水分解を触媒する能力を有している。特別な一実施形態においては、「本質的に同じ酵素活性」という概念は、野生型のポリペプチドの基質に対する活性であって、明らかにバックグラウンド活性を上回り、かつ／又は、野生型ポリペプチドが同じ基質に対して有するＫM値及び／又はｋcat値と三桁未満、好ましくは二桁、さらに好ましくは一桁異なる活性を意味する。さらなる好ましい一実施形態においては、核酸配列若しくはアミノ酸配列の「変異体」という概念には、核酸配列若しくはアミノ酸配列の少なくとも１つの活性部分若しくは活性断片が含まれる。さらなる好ましい一実施形態においては、本願で用いられる「活性部分」という概念は、アミノ酸配列の全長よりも短い配列を有するか、あるいはアミノ酸配列の全長より短い配列をコードしているアミノ酸配列若しくは核酸配列を意味し、その際、前記のアミノ酸配列又はコードされたアミノ酸配列は、野生型のアミノ酸配列よりも短い長さをもって、野生型ポリペプチド若しくはその変異体と本質的に同じ酵素活性、例えばプロテアーゼとしての活性を有する。特別な一実施形態においては、核酸の「変異体」という概念には、相補鎖が好ましくはストリンジェントな条件下に野生型の核酸に結合する核酸が含まれる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーは、当業者には容易に決定でき、一般にプローブの長さ、���浄時の温度及び塩濃度に依存している。一般に、プローブが長いほどハイブリダイゼーションに必要な温度は高くなり、一方でプローブが短いほどより低い温度でもうまくいく。ハイブリダイゼーションが起こるかどうかは、一般に、変性されたＤＮＡが、その周囲に存在する相補鎖に特に融解温度未満でアニーリングする能力に依存する。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシー及び相応の条件は、F M Ausubel (1995), Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc.に、より詳細に記載されている。当業者は、ハイブリダイゼーションによるＤＮＡ配列の同定の手引きを、とりわけBoehringer Mannheim GmbH社のハンドブック"The DIG System Users Guide for Filter Hybridization"（ドイツ・マンハイム在、１９９３年）及びLiebl et al.（International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991)）で入手できる。前記のハイブリダイゼーションは、好ましい一実施形態においてはストリンジェントな条件下に行われ、つまり、プローブと標的配列、つまりこのプローブで処理されるポリヌクレオチドとが少なくとも７０％同一である場合にのみハイブリッドが形成される。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、洗浄工程を含めて、バッファー組成、温度及び塩濃度のバリエーションによって影響を受けるか若しくは決定されることが知られている。ハイブリダイゼーション反応は、一般に、洗浄工程と比較して相対的に低いストリンジェンシーの場合に起こる（Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited、英国テディントン在、1996）。ハイブリダイゼーション反応のためには、例えば５×ＳＳＣバッファーに相当するバッファーを約５０℃〜６８℃の温度で使用できる。その際、プローブは、このプローブの配列に対して７０％未満の同一性を有するポリヌクレオチドともハイブリダイゼーションできる。このようなハイブリッドはより安定性が低く、ストリンジェントな条件下での洗浄によって除去される。これは、例えば２×ＳＳＣへと塩濃度を下げ、任意に引き続き０．５×ＳＳＣへと下げることによって（The DIG System User's Guide for Filter Hybridization、Boehringer Mannheim、ドイツ・マンハイム在、１９９５年）達成でき、その際、次第に好ましさの程度が増す順序で、約５０℃〜６８℃、約５２℃〜６８℃、約５４℃〜６８℃、約５６℃〜６８℃、約５８℃〜６８℃、約６０℃〜６８℃、約６２℃〜６８℃、約６４℃〜６８℃、約６６℃〜６８℃の温度に調整される。約６４℃〜６８℃又は約６６℃〜６８℃の温度範囲が好ましい。場合により、塩濃度を、０．２×ＳＳＣ又は０．１×ＳＳＣに相当する濃度にまで下げることも可能である。ハイブリダイゼーション温度を５０℃から６８℃まで段階的に約１〜２℃ずつ高めることによって、例えば、次第に好ましさの程度が増す順序で、使用される核酸分子の配列に対して少なくとも７０％の、若しくは少なくとも８０％の、若しくは少なくとも９０％の、少なくとも９１％の、少なくとも９２％の、少なくとも９３％の、少なくとも９４％の、少なくとも９５％の、少なくとも９６％の、少なくとも９７％の、少なくとも９８％の、若しくは少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチド断片を単離することができる。ハイブリダイゼーションのためのさらなる手引きは、いわゆるキットの形で市販���れている（例えばドイツ・マンハイム在のRoche Diagnostics GmbH社製DIG Easy Hyb、カタログ番号1603558）。好ましい一実施形態においては、本願で用いられる核酸の「変異体」という概念には、本来の核酸と同じアミノ酸配列か又はこのアミノ酸配列の変異体を遺伝子コードの縮重の範囲内でコードする任意の核酸配列が含まれる。
【００６５】
本発明により全細胞触媒が使用される場合には、これが脂肪酸のβ酸化の反応の１つを触媒する少なくとも１種の酵素の、その野生型よりも低い活性を有する細胞であって、この酵素が好ましくは、脂肪酸インポーター、脂肪酸−ＣｏＡ−リガーゼ、アシル−ＣｏＡ−デヒドロゲナーゼ、２，４−ジエノイル−ＣｏＡ−レダクターゼ、エノイル−ＣｏＡ−ヒドラターゼ及び３−ケトアシル−ＣｏＡ−チオラーゼを含む群から選択されていることが好ましい。脂肪酸のβ酸化は、原核生物と真核生物が等しく脂肪酸を酸化することを可能にし、かつそこに含まれる化学的エネルギーを物質代謝に利用可能にする、広く知られた物質代謝経路である（Y Fujita, H Matsuoka, and K Hirooka (2007) Mol. Microbiology 66(4), 829-839）。さらなる意味では、β酸化は、脂肪酸の細胞への取り込みを以て開始され、Ｅ．コリの場合には、それをグラム陰性菌細胞の外膜若しくは内膜に通過させるトランスポーターであるＦａｄＬ（P N Black (1991) J. Bacteriol. 173, 435-442）と、脂肪酸をＣｏＡエステルの形で細胞質ゾルに遊離するＦａｄＤ遺伝子産物（P N Black, C C DiRusso, A K Metzger, and T L Heimert (1992) J. Biol. Chem. 267, 25513-25520）とによる取り込みを以て開始される。そこでは、脂肪酸は、条件によって必要となる場合に、まずＣｏＡ脂肪酸エステルのβ位でアシル−ＣｏＡ−デヒドロゲナーゼ（Ｅ．コリの場合にはＦａｄＥ）によって酸化される（J. W. Campbell & J. E. Cronan (200) J. Bacteriol. 184, 3759-3764）。また、二重不飽和脂肪酸から、２，４−ジエノイル−ＣｏＡ−レダクターゼ（Ｅ．コリの場合にはＦａｄＨ）による還元によっても類似の分子が形成され得る。多機能酵素であるエノイル−ＣｏＡ−ヒドラターゼ／３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ−デヒドロゲナーゼ（Ｅ．コリの場合にはＦａｄＢ）は、引き続き水和を触媒して第二級アルコールを形成し、それを引き続き酸化してケトンにする。最終工程で３−ケトアシル−ＣｏＡ−チオラーゼ（Ｅ．コリの場合にはＦａｄＡ）は、ケトアシル−ＣｏＡの分解を触媒し、その結果、アセチル−ＣｏＡと、出発分子よりも炭素原子２つ分だけ短い脂肪酸のＣｏＡ−エステルとが遊離される。同様にそれがアセチル−ＣｏＡではない限り、それは再度β酸化サイクルに供給され、酸化されつつ短縮されうる。脂肪酸のβ酸化の調節には、脂肪酸の分解に必要な遺伝子を含むＦａｄオペロンのレギュレーターであるＦａｄＲも関与するものの、ＦａｄＲがβ酸化の反応を触媒することなく関与する。好ましい一実施形態においては、「脂肪酸のβ酸化の反応の１つを触媒する酵素」という概念は、脂肪酸基質と若しくはアセチル−ＣｏＡへの経路でそこから生ずる分子と直接的に相互作用する、好ましくは基質として認識し、かつそれをこの分解経路でよりアセチル−ＣｏＡの近くにある物質代謝産物へと変換することを触媒するあらゆる酵素を表し、好ましくは脂肪酸を細胞に取り込むことを行う脂肪酸インポーターを含む。例えば、前出の定義による前記酵素にはアシル−ＣｏＡ−デヒドロゲナーゼが含まれる。それというのも、該酵素は脂肪酸−ＣｏＡ−エステルと相互作用し、かつその、β酸化の物質代謝経路で脂肪酸−ＣｏＡ−エステルよりもアセチル−ＣｏＡの近くに位置するエノイル−ＣｏＡへの変換を触媒するからである。特に好ましい一実施形態においては、本願で使用される「脂肪酸のβ酸化の反応の１つを触媒する酵素」という概念は、Ｅ．コリ由来の遺伝子産物であるＦａｄＡ、ＦａｄＢ、ＦａｄＤ、ＦａｄＬ及びＦａｄＥ及び／又は他の生物由来のその変異体若しくはホモログを含む群からのあらゆる酵素を表す。Ｅ．コリ由来の遺伝子産物であるＦａｄＡ、ＦａｄＢ、ＦａｄＤ、ＦａｄＬ及びＦａｄＥと同様に、数多くの他の生物工学的に有用な生物に由来する変異体及びホモログ並びにそれらの核酸配列及びポリペプチド配列は、先行技術において、例えばＦａｄＡはアクセッション番号AP009048.1として、ＦａｄＢはアクセッション番号BAE77457.1として、ＦａｄＤはアクセッション番号BAA15609.1として、ＦａｄＥはアクセッション番号BAA77891.2として、またＦａｄＬはアクセッション番号BAA16205.1として示されている。
【００６６】
近年の遺伝学的な微生物的及び分子生物学的手法の発展に伴い、生存細胞中に存在する酵素の活性をルーチン的に測定しかつ影響を与えることのできる多数のツールが当業者に利用可能となっている。懸濁液、ペレットの形で存在しているか、若しくは処理された形で細胞培養物から取り出すことのできる酵素の活性を測定するために、教則本、例えばA Cornish-Bowden (1995), Fundamentals of Enzym Kinetics, Portland Press Limitedに記載されているような酵素標準試験を用いて評価することができる。従来技術では、脂肪酸のβ酸化の反応の１つを触媒する酵素の活性の測定に特に好適な試験が数多く開示されており、例えばK Kameda & W D Nunn (1981) J. Biol. Chem. 256, 5702-5707、Hi Marrakchi, W E DeWolf, C Quinn, J West, B J Polizzi, C Y So et al. (2003) Biochem. J. 370, 1055-1062、S Lobo, G Florova, and K A Reynolds (2001) Biochemistry 40 (39), 1 1955-64、及びX Yu, T Liu, F Zhu, and C Khosla (2011) PNAS（印刷前の電子刊行物）に開示されている。また、細胞内の酵素の活性を低下させるためのルーチン的に使用可能な方法、例えば放射線に対する曝露による細胞のランダム突然変異誘発に続いて突然変異体を濃縮若しくはスクリーニングすることによる方法、点突然変異の部位特異的導入による方法、又は細胞の染色体に組み込まれた活性酵素をコードする遺伝子のノックアウトによる方法は、先行技術に、例えばSambrook/Fritsch/Maniatis (1989): Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第二版、又はFuchs/Schlegel (2007) Allgemeine Mikrobiologie, 2008, Georg Thieme Verlagに記載されている。Ｆａｄ遺伝子産物の特別なケースでは、例えばＦａｄＲの転写レプレッサの過剰発現も活性の低下に好適である（Y Fujita, H Matsuoka, and K Hirooka (2007) Mol. Microbiology 66(4), 829-839）。また、ＲＮＡ干渉（T Tuschl (2001) ChemBioChem 2: 239-145）をベースとする活性低下や特定のインヒビターを用いた活性低下も可能である。好ましい一実施形態においては、本願で使用される「細胞が酵素のその野生型よりも低い活性を有する」という表現は、改変された細胞中の酵素の活性が、野生型細胞中の同じ酵素の活性よりも低いことを意味する。好ましい一実施形態においては、その相対的な低下は、次第に好ましさの程度が増す順序で、活性の５％、１０％、２０％、４０％、５０％、７５％、９０％、９５％、９９％又はそれより高いパーセンテージである。特に好ましい一実施形態においては、酵素の活性はバックグラウンドに対してもはや検出できない。
【００６７】
本発明により全細胞触媒が使用される場合、この全細胞触媒が、少なくとも１種の内因性アルデヒドデヒドロゲナーゼの細胞の野生型よりも低い活性を有する細胞であるケースはさらに好ましい。好ましい一実施形態においては、本願で使用される「内因性アルデヒドデヒドロゲナーゼ」という概念は、アルデヒドから相応のカルボン酸への酸化を触媒することができ、かつ当然のことながら使用される細胞の野生型のゲノム中に存在している酵素を表す。Ｅ．コリについての内因性アルコールデヒドロゲナーゼの一例は、データベースコードBAA15032.1(AldA)を有する酵素及びその変異体である。
【００６８】
本願は、以下のポリペプチド（Polyp）配列及びヌクレオチド（ＤＮＡ）配列を有する配列プロトコルを含む：
【表１】
2015509730.tif 000002
【００６９】
【表２】
2015509730.tif 000003
【００７０】
【表３】
2015509730.tif 000004
【００７１】
【表４】
2015509730.tif 000005
【００７２】
本発明をさらに以下の図及び非限定例により詳説する。これにより、本発明のさらなる特徴、実施形態、態様及び利点が明らかとなる。
【実施例】
【００７３】
実施例１
アルカニボラックス・ボルクメンシスＳＫ２由来の遺伝子ＣＹＰ１５３、Ｆｄ及びＦｄＯＲ、並びにシュードモナス・オレオボランス由来のａｌｋＬのための発現ベクターの作製
アルカニボラックス・ボルクメンシス由来の遺伝子ＣＹＰ１５３（配列番号２０）、Ｆｄ（配列番号１６）及びＦｄＯＲ（配列番号１４）、並びにシュードモナス・オレオボランス由来の遺伝子ａｌｋＬ（配列番号２）のためのＥ．コリ発現ベクターを作製するために、遺伝子をプラスミドｐＣＯＭ１０においてａｌｋＢプロモーター（配列番号５０）の制御下にクローニングした。組換えクローニングのために、相同領域を挿入して種々のＤＮＡ断片を増幅した。テンプレートとしてそれぞれの染色体ＤＮＡを使用した。
【００７４】
それぞれの断片の増幅のために、以下のオリゴヌクレオチドを使用した：
【化１】
2015509730.tif 000006
【００７５】
ＰＣＲのために以下のパラメータを使用した：
【化２】
2015509730.tif 000007
【００７６】
増幅のために、New England Biolabs社（フランクフルト在）製Phusion(R) High-Fidelity Master Mixを製造元の推奨に従って使用した。それぞれのケースで、ＰＣＲ反応産物５０μｌを引き続き１％ＴＡＥアガロースゲル上で分離させた。ＰＣＲ、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡのエチジウムブロミド染色及びＰＣＲ断片サイズの測定の実施を、当業者に公知の様式で行った。全てのケースで、期待通りのサイズのＰＣＲ断片を増幅することができた（Ｆｄ−ＣＹＰ１５３：１８００ｂｐ；ＦｄＯＲ：１２７６ｂｐ；ａｌｋＬ：７４５ｂｐ）。ＤＮＡの単離及び精製のために、ＰＣＲ産物をメスを用いてプレパラティブゲルから切り出し、QiaQuick Gel extraction Kitを製造元（Qiagen, ヒルデン在）の手引きに従って用いて精製した。精製したＰＣＲ産物を、Geneart(R) Seamless Cloning and Assembly Kitを製造元（Life Technologies, 米国・ＣＡ・カールスバッド在）の手引きに従って用いて、ａｌｋＢプロモーター（配列番号５０）の後にＥｃｏＲＩ−ＨＦ及びＳａｌ  Ｉで開裂したｐＣＯＭ１０ベクター（配列番号５７）へクローニングした。化学的にコンピテントなＥ．コリ１０β細胞（New England Biolabs, フランクフルト在）の形質転換を、当業者に公知の様式で行った。標的遺伝子の正確な挿入を制限分析により調べ、挿入した遺伝子の確実性をＤＮＡ配列により確認した。生じた発現ベクターをｐＣＯＭ［Ａｂ＿Ｆｄ／ＣＹＰ１５３−２／ＦｄＯＲ／ａｌｋＬ］（配列番号５８）と称した。
【００７７】
実施例２
カンジダ・トロピカリス由来の遺伝子ＣＹＰ５２Ａ１２及びＯＲ、並びにシュードモナス・オレオボランス由来のａｌｋＬのための発現ベクターの作製
カンジダ・トロピカリス由来の遺伝子ＣＹＰ５２Ａ１２（配列番号６０）及びＯＲ（配列番号６４）、並びにシュードモナス・オレオボランス由来の遺伝子ａｌｋＬ（配列番号２）のためのＥ．コリ発現ベクターを作製するために、遺伝子ＣＹＰ５２Ａ１２及びＯＲをin silicoでのエシェリキア・コリにおける発現用にコドン最適化し、オペロンとしての遺伝子ａｌｋＬと一緒に合成した。この合成の間に、Ａｓｃｌ及びＳａｌ  Ｉのための開裂部位を、ＣＹＰ５２Ａ１２遺伝子の上流及びａｌｋＬ遺伝子の下流に挿入した。合成したＤＮＡ断片ＣＹＰ５２Ａ１２＿ＯＲ＿ａｌｋＬを制限エンドヌクレアーゼＡｓｃｌ及びＳａｌ  Ｉで消化し、相応の開裂ベクターｐＣＯＭ１０にライゲーションし、この産物を化学的にコンピテントなＥ．コリ１０β細胞（New England Biolabs, フランクフルト在）へ形質転換した。完成したベクターをｐＣＯＭ１０−Ｃｔ  ＣＹＰ５２Ａ１２＿ｃｏ＋ＯＲ＿ｃｏ（配列番号６５）と称した。
【００７８】
実施例３
カンジダ・トロピカリス由来の遺伝子ＣＹＰ５２Ａ１７及びＯＲ、並びにシュードモナス・オレオボランス由来のａｌｋＬのための発現ベクターの作製
カンジダ・トロピカリス由来の遺伝子ＣＹＰ５２Ａ１７（配列番号６２）及びＯＲ（配列番号６４）、並びにシュードモナス・オレオボランス由来の遺伝子ａｌｋＬ（配列番号２）のためのＥ．コリ発現ベクターを作製するために、遺伝子ＣＹＰ５２Ａ１７及びＯＲをin silicoでのエシェリキア・コリにおける発現用にコドン最適化し、オペロンとしての遺伝子ａｌｋＬと一緒に合成した。この合成の間に、Ａｓｃｌ及びＳａｌ  Ｉのための開裂部位を、ＣＹＰ５２Ａ１７遺伝子の上流及びａｌｋＬ遺伝子の下流に挿入した。合成したＤＮＡ断片ＣＹＰ５２Ａ１２＿ＯＲ＿ａｌｋＬを制限エンドヌクレアーゼＡｓｃｌ及びＳａｌ  Ｉで消化し、相応の開裂ベクターｐＣＯＭ１０にライゲーションし、この産物を化学的にコンピテントなＥ．コリ１０β細胞（New England Biolabs, フランクフルト在）へ形質転換した。完成したベクターをｐＣＯＭ１０−Ｃｔ  ＣＹＰ５２Ａ１７＿ｃｏ＋ＯＲ＿ｃｏ（配列番号６６）と称した。
【００７９】
実施例４
アルカニボラックス・ボルクメンシスＳＫ２由来の遺伝子ＣＹＰ１５３、Ｆｄ及びＦｄＯＲ、並びにシュードモナス・オレオボランス由来のａｌｋＬのための、又は、カンジダ・トロピカリス由来の遺伝子ＣＹＰ５２Ａ１７及びＯＲ、並びにシュードモナス・オレオボランス由来のａｌｋＬのための発現ベクターを有するＥ．コリ菌株によるヒドロキシ−ラウリン酸メチルエステルの生産
発現ベクターｐＣＯＭ［Ａｂ＿Ｆｄ／ＣＹＰ１５３−２／ＦｄＯＲ／ａｌｋＬ］又はｐＣＯＭ１０−Ｃｔ  ＣＹＰ５２Ａ１７＿ｃｏ＋ＯＲ＿ｃｏを有するＥ．コリ菌株の作製のために、Ｅ．コリＷ３１１０エレクトロコンピテント細胞を作製した。これを、当業者に公知の様式で行った。Ｅ．コリＷ３１１０をそれぞれ挙げた２つのプラスミドのうち一方で形質転換し、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を有するＬＢアガープレート上にプレーティングした。形質転換体を、プラスミド調製と分析的な制限分析によって正確なプラスミドの存在について調べた。このようにして以下の菌株を作製した：
【化３】
2015509730.tif 000008
【００８０】
これらの菌株に流加培養を行って、ラウリン酸メチルエステルからの、ヒドロキシ−ラウリン酸メチルエステル、オキソ−ラウリン酸メチルエステル及びカルボキシ−ラウリン酸メチルエステルの生産能力を分析した。これを、DASGIP社製の８連の並列発酵システム（8-fach Parallelfermentationssystem）において行った。
【００８１】
発酵のために、オーバーヘッドスターラーとインペラタービンを備えた１Ｌのリアクターを使用した。プロセスをモニタリングするため、ｐＨ及びｐＯ2をオンラインで測定した。ＯＴＲ／ＣＴＲ測定を、特に細胞の代謝活性及び代謝力の評価に利用した。
【００８２】
ｐＨプローブを、DASGIP社の技術リファレンスに従ってｐＨ４．０とｐＨ７．０の基準溶液で二点校正法によって校正した。このリアクターは、前述の技術リファレンスに従って必要なセンサと接続部を備えており、スターラーシャフトが設置されていた。次いで、このリアクターに３００ｍｌの水を満たし、滅菌性を保証するために１２１℃で２０分にわたりオートクレーブにかけた。ｐＯ2プローブを、測定増幅器への連結後に一晩（少なくとも６時間）にわたり分極させた。その後、水をクリーンベンチのもとで取り除き、炭素源としての１５ｇ／ｌのグルコース（以下のものからなる滅菌供給溶液３０ｍｌ／ｌを計量添加により添加したもの：５００ｇ／ｌのグルコース、１％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、及び２．２％（ｗ／ｖ）ＮＨ4Ｃｌ）と、５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む、以下のものからなる高細胞密度培地に置き換えた：１．７６ｇ／ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4、１９．０８ｇ／ｌのＫ2ＨＰＯ4、１２．５ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4、６．６６ｇ／ｌの酵母抽出物、１１．２ｇ／ｌのクエン酸三ナトリウム二水和物、１７ｍｌ／ｌのフィルター滅菌１％クエン酸鉄アンモニウム溶液、及び５ｍｌ／ｌのフィルター滅菌微量元素ストック溶液（以下のものからなる：３６．５０ｇ／ｌのＨＣｌ（３７％）、１．９１ｇ／ｌのＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ、１．８７ｇ／ｌのＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．８４ｇ／ｌのエチレンジアミン四酢酸二水和物、０．３０ｇ／ｌのＨ3ＢＯ3、０．２５ｇ／ｌのＮａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、４．７０ｇ／ｌのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、１７．８０ｇ／ｌのＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１５ｇ／ｌのＣｕＣｌ2・２Ｈ2Ｏ）。
【００８３】
次に、ｐＯ2プローブを一点校正法（スターラー：６００ｒｐｍ／給気：１０ｓｌ／ｈ空気）により１００％に校正し、供給区間、校正剤区間及び誘導剤区間を技術リファレンスに従って定置洗浄（Cleaning-in-Place）で洗浄した。そのために、これらのチューブをまず７０％エタノールで、次いで１ＭのＮａＯＨで、次いで滅菌完全脱塩水ですすぎ、最後にそれぞれの培地で満たした。
【００８４】
上述のＥ．コリ菌株の全てをまずＬＢ培地中で凍結培養物から（１００ｍｌシケイン付きフラスコ中で２５ｍｌ）５０ｍｇ／ｌのカナマイシンと共に３７℃で一晩、２００ｒｐｍで約１８時間培養した。次いで、この培養物２ｍｌを第二の前培養工程のために、１００ｍｌ振とうフラスコにおいて、炭素源としての１５ｇ／ｌのグルコース（以下のものからなる滅菌供給溶液３０ｍｌ／ｌを計量添加により添加したもの：５００ｇ／ｌのグルコース、１％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、及び２．２％（ｗ／ｖ）ＮＨ4Ｃｌ）と、すでに記載した抗生物質を含む、以下のものからなる２５ｍｌの高細胞密度培地へ移し、３７℃／２００ｒｐｍでさらに６時間インキュベートした：１．７６ｇ／ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4、１９．０８ｇ／ｌのＫ2ＨＰＯ4、１２．５ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4、６．６６ｇ／ｌの酵母抽出物、１１．２ｇ／ｌのクエン酸三ナトリウム二水和物、１７ｍｌ／ｌのフィルター滅菌１％クエン酸鉄アンモニウム溶液、及び５ｍｌ／ｌのフィルター滅菌微量元素ストック溶液（以下のものからなる：３６．５０ｇ／ｌのＨＣｌ（３７％）、１．９１ｇ／ｌのＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ、１．８７ｇ／ｌのＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．８４ｇ／ｌのエチレンジアミン四酢酸二水和物、０．３０ｇ／ｌのＨ3ＢＯ3、０．２５ｇ／ｌのＮａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、４．７０ｇ／ｌのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、１７．８０ｇ／ｌのＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１５ｇ／ｌのＣｕＣｌ2・２Ｈ2Ｏ）。
【００８５】
リアクターに光学密度０．１で接種するために、第二の前培養工程のＯＤ600を測定し、接種に必要な培養物の量を算出した。必要な量の培養物を、５ｍｌのシリンジを用いて隔膜を介して、調温しかつ通気したリアクターに添加した。
【００８６】
以下の標準プログラムを使用した：
【表５】
2015509730.tif 000009
【００８７】
ｐＨ値を、一方だけ１２．５％のアンモニア溶液でｐＨ６．８に調節した。培養と生体内変換の間に、スターラー回転数とガス供給速度により、培養物中の溶存酸素（ｐＯ2若しくはＤＯ）が少なくとも３０％となるように調節した。接種後、ＤＯは１００％からこの３０％に低下し、発酵の残りの間にＤＯをこの３０％で安定的に保持した。
【００８８】
発酵は流過培養法として行い、その際、５ｇ／ｌ・ｈのグルコースフィード（以下のものからなる：５００ｇ／ｌのグルコース、１％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、及び２．２％（ｗ／ｖ）ＮＨ4Ｃｌ）を用いた供給フェーズへの進入としての供給開始は、バッチフェーズの終了を示すＤＯピークをトリガとした。供給開始に伴い、温度を３７℃から３０℃に下げた。供給開始の１０時間後に、酸化遺伝子の発現を０．０２５％（ｖ／ｖ）ＤＣＰＫで誘導した。供給開始の１４時間後に、ヒドロキシラウリン酸メチルエステル生産の開始（＝生体内変換の開始）を行った。このために、ラウリン酸メチルエステルとオレイン酸とからの混合物１５０ｍｌ（工業用グレード９０％）をバッチとして発酵ブロスに添加した。
【００８９】
発酵試料におけるＬＳＭＥ及びＨＬＳの定量化のために、生体内変換開始の１、２、４、２０、２２時間後に試料を採取した。これらの試料を分析のために準備した（ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ2に基づく生成物の定量化を参照のこと）。
【００９０】
ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ2に基づく生成物の定量化
発酵試料におけるＬＳＭＥ及びＨＣＬの定量化を、ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ2によって、全ての分析物についての外部校正（０．１〜５０ｍｇ／ｌ）をもとに、かつアミノウンデカン酸（ＡＵＤ、これはＨＬＳＭＥのため）やｄ３−ＬＳＭＥ（ＬＳＭＥのため）といった内部標準を用いて行った。
【００９１】
その際に以下の機器を使用した：
・オートサンプラー（G1367E）、バイナリポンプ（G1312B）及びカラムオーブン（G1316A）を備えたＨＰＬＣシステム１２６０（Agilent社；ベーブリンゲン在）
・ＥＳＩ源を備えた質量分析計TripelQuad 6410（Agilent社；ベーブリンゲン在）
・ＨＰＬＣカラム：Kinetex C18、１００×２．１ｍｍ、粒径：２．６μｍ、細孔径１００Å（Phenomenex社；アシャッフェンブルク在）
・プレカラム：KrudKatcher Ultra HPLC In-Line Filter；０．５μｍの濾層厚及び０．００４ｍｍの内径（Phenomenex社；アシャッフェンブルク在）
【００９２】
１９００μｌの溶剤（８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、２０％の二回蒸留Ｈ2Ｏ（ｖ／ｖ）＋０．１％のギ酸）及び１００μｌの試料を２ｍｌの反応容器にピペット導入することによって試料を準備した。この混合物を約１０秒間にわたりボルテックスにかけ、引き続き約１３０００ｒｐｍで５分間にわたり遠心分離した。澄明な上清をピペットで取り出し、希釈剤（８０％（ｖ／ｖ）のＡＣＮ、２０％の二回蒸留Ｈ2Ｏ（ｖ／ｖ）＋０．１％のギ酸）での相応の希釈の後に分析した。それぞれ９００μｌの試料に対して１００μｌのＩＳＴＤをピペット導入した（試料容量９０μｌの場合には１０μｌ）。
【００９３】
ＨＰＬＣ分離を、上述のカラム若しくはプレカラムで行った。注入容量は０．７μｌであり、カラム温度は５０℃であり、流量は０．６ｍｌ／分であった。移動相は、溶離液Ａ（０．１％（ｖ／ｖ）の水性ギ酸）と溶離液Ｂ（アセトニトリルと０．１％（ｖ／ｖ）のギ酸）とからなっていた。以下のグラジエントプロフィールを用いた：
【化４】
2015509730.tif 000010
【００９４】
ＥＳＩ−ＭＳ2分析を、ポジティブモードで、以下のＥＳＩ源パラメータを用いて実施した：
・ガス温度  ２８０℃
・ガス流量  １１Ｌ／ｍｉｎ
・ネブライザー圧力  ５０ｐｓｉ
・キャピラリー電圧  ４０００Ｖ
【００９５】
化合物ＤＤＳ、ＤＤＳＭＥ、ＨＬＳ、ＨＬＳＭＥ、ＯＬＳ、ＯＬＳＭＥの検出及び定量化を、以下のＭＲＭパラメータで行った。その際、それぞれ１つのプロダクトイオンをクオリファイアとして用い、１つをクオンティファイアとして用いた：
【化５】
2015509730.tif 000011
【００９６】
分析物ＬＳＭＥを、ＳＩＭモードで検出した（ｍ／ｚ  ２０１及び２１５）。
【００９７】
菌株Ｅ．コリＷ３１１０ｐＣＯＭ［Ａｂ＿Ｆｄ／ＣＹＰ１５３−２／ＦｄＯＲ／ａｌｋＬ］がラウリン酸メチルエステルからω−ヒドロキシ−ラウリン酸メチルエステルを形成し得ることが判明した。菌株Ｅ．コリＷ３１１０ｐＣＯＭ１０−Ｃｔ  ＣＹＰ５２Ａ１７＿ｃｏ＋ＯＲ＿ｃｏは、ラウリン酸メチルエステルを、明らかにより低い程度でしかω−ヒドロキシ−ラウリン酸メチルエステル又はさらなる酸化生成物へと変換することができなかった。
【００９８】
発酵時間２２時間後のラウリン酸メチルエステル及びω−ヒドロキシ−ラウリン酸メチルエステルの濃度を示す。
【００９９】
【表６】
2015509730.tif 000012
【０１００】
実施例５（データの裏付けなし）
アルカニボラックス・ボルクメンシスＳＫ２由来の遺伝子ＣＹＰ１５３、Ｆｄ及びＦｄＯＲ、並びにシュードモナス・オレオボランス由来のａｌｋＬのための、又は、カンジダ・トロピカリス由来の遺伝子ＣＹＰ５２Ａ１２及びＯＲ、並びにシュードモナス・オレオボランス由来のａｌｋＬのための発現ベクターを有するＥ．コリ菌株によるヒドロキシ−ラウリン酸メチルエステルの生産
発現ベクターｐＣＯＭ［Ａｂ＿Ｆｄ／ＣＹＰ１５３−２／ＦｄＯＲ／ａｌｋＬ］又はｐＣＯＭ１０−Ｃｔ  ＣＹＰ５２Ａ１２＿ｃｏ＋ＯＲ＿ｃｏを有するＥ．コリ菌株の作製のために、Ｅ．コリＷ３１１０エレクトロコンピテント細胞を作製する。これを、当業者に公知の様式で行う。Ｅ．コリＷ３１１０をそれぞれ挙げた２つのプラスミドのうち一方で形質転換し、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を有するＬＢアガープレート上にプレーティングする。形質転換体を、プラスミド調製と分析的な制限分析によって正確なプラスミドの存在について調べる。このようにして以下の菌株を作製する：
【化６】
2015509730.tif 000013
【０１０１】
これらの菌株に流加培養を行って、ＨＬＳＭＥの生産能力を分析する。これを、DASGIP社製の８連の並列発酵システムにおいて行う。
【０１０２】
発酵のために、オーバーヘッドスターラーとインペラタービンを備えた１Ｌのリアクターを使用する。プロセスをモニタリングするため、ｐＨ及びｐＯ2をオンラインで測定する。ＯＴＲ／ＣＴＲ測定を、特に細胞の代謝活性及び代謝力の評価に利用する。
【０１０３】
ｐＨプローブを、DASGIP社の技術リファレンスに従ってｐＨ４．０とｐＨ７．０の基準溶液で二点校正法によって校正する。このリアクターは、前述の技術リファレンスに従って必要なセンサと接続部を備えており、スターラーシャフトが設置されている。次いで、このリアクターに３００ｍｌの水を満たし、滅菌性を保証するために１２１℃で２０分にわたりオートクレーブにかける。ｐＯ2プローブを、測定増幅器への連結後に一晩（少なくとも６時間）にわたり分極させる。次いで、水をクリーンベンチのもとで取り除き、炭素源としての１５ｇ／ｌのグルコース（以下のものからなる滅菌供給溶液３０ｍｌ／ｌを計量添加により添加したもの：５００ｇ／ｌのグルコース、１％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、及び２．２％（ｗ／ｖ）ＮＨ4Ｃｌ）と、５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む、以下のものからなる高細胞密度培地に置き換える：１．７６ｇ／ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4、１９．０８ｇ／ｌのＫ2ＨＰＯ4、１２．５ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4、６．６６ｇ／ｌの酵母抽出物、１１．２ｇ／ｌのクエン酸三ナトリウム二水和物、１７ｍｌ／ｌのフィルター滅菌１％クエン酸鉄アンモニウム溶液、及び５ｍｌ／ｌのフィルター滅菌微量元素ストック溶液（以下のものからなる：３６．５０ｇ／ｌのＨＣｌ（３７％）、１．９１ｇ／ｌのＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ、１．８７ｇ／ｌのＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．８４ｇ／ｌのエチレンジアミン四酢酸二水和物、０．３０ｇ／ｌのＨ3ＢＯ3、０．２５ｇ／ｌのＮａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、４．７０ｇ／ｌのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、１７．８０ｇ／ｌのＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１５ｇ／ｌのＣｕＣｌ2・２Ｈ2Ｏ）。
【０１０４】
次に、ｐＯ2プローブを一点校正法（スターラー：６００ｒｐｍ／給気：１０ｓｌ／ｈ空気）により１００％に校正し、供給区間、校正剤区間及び誘導剤区間を技術リファレンスに従って定置洗浄で洗浄する。そのために、これらのチューブをまず７０％エタノールで、次いで１ＭのＮａＯＨで、次いで滅菌完全脱塩水ですすぎ、最後にそれぞれの培地で満たす。
【０１０５】
上述のＥ．コリ菌株の全てをまずＬＢ培地中で凍結培養物から（１００ｍｌシケイン付きフラスコ中で２５ｍｌ）５０ｍｇ／ｌのカナマイシンと共に３７℃で一晩、２００ｒｐｍで約１８時間培養する。次いで、この培養物２ｍｌを第二の前培養工程のために、１００ｍｌ振とうフラスコにおいて、炭素源としての１５ｇ／ｌのグルコース（以下のものからなる滅菌供給溶液３０ｍｌ／ｌを計量添加により添加したもの：５００ｇ／ｌのグルコース、１％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、及び２．２％（ｗ／ｖ）ＮＨ4Ｃｌ）と、すでに記載した抗生物質を含む、以下のものからなる２５ｍｌの高細胞密度培地へ移し、３７℃／２００ｒｐｍでさらに６時間インキュベートする：１．７６ｇ／ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4、１９．０８ｇ／ｌのＫ2ＨＰＯ4、１２．５ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4、６．６６ｇ／ｌの酵母抽出物、１１．２ｇ／ｌのクエン酸三ナトリウム二水和物、１７ｍｌ／ｌのフィルター滅菌１％クエン酸鉄アンモニウム溶液、及び５ｍｌ／ｌのフィルター滅菌微量元素ストック溶液（以下のものからなる：３６．５０ｇ／ｌのＨＣｌ（３７％）、１．９１ｇ／ｌのＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ、１．８７ｇ／ｌのＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．８４ｇ／ｌのエチレンジアミン四酢酸二水和物、０．３０ｇ／ｌのＨ3ＢＯ3、０．２５ｇ／ｌのＮａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、４．７０ｇ／ｌのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、１７．８０ｇ／ｌのＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１５ｇ／ｌのＣｕＣｌ2・２Ｈ2Ｏ）。
【０１０６】
リアクターに光学密度０．１で接種するために、第二の前培養工程のＯＤ600を測定し、接種に必要な培養物の量を算出する。必要な量の培養物を、５ｍｌのシリンジを用いて隔膜を介して、調温しかつ通気したリアクターに添加する。
【０１０７】
以下の標準プログラムを使用する：
【表７】
2015509730.tif 000014
【０１０８】
ｐＨ値を、一方だけ１２．５％のアンモニア溶液でｐＨ６．８に調節する。培養と生体内変換の間に、スターラー回転数とガス供給速度により、培養物中の溶存酸素（ｐＯ2若しくはＤＯ）が少なくとも３０％となるように調節する。接種後、ＤＯは１００％からこの３０％に低下し、発酵の残りの間にＤＯをこの３０％で安定的に保持する。
【０１０９】
発酵を流過培養法として行い、その際、５ｇ／ｌ・ｈのグルコースフィード（以下のものからなる：５００ｇ／ｌのグルコース、１％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、及び２．２％（ｗ／ｖ）ＮＨ4Ｃｌ）を用いた供給フェーズへの進入としての供給開始は、バッチフェーズの終了を示すＤＯピークをトリガとする。供給開始に伴い、温度を３７℃から３０℃に下げる。供給開始の１０時間後に、酸化遺伝子の発現を０．０２５％（ｖ／ｖ）ＤＣＰＫで誘導する。供給開始の１４時間後に、ヒドロキシ−ラウリン酸メチルエステル生産の開始（＝生体内変換の開始）を行う。このために、ラウリン酸メチルエステルとオレイン酸とからの混合物１５０ｍｌ（工業用グレード９０％）をバッチとして発酵ブロスに添加する。
【０１１０】
ＬＳＭＥ及びＨＬＳＭＥの定量化のために、生体内変換開始の１、２、４、２０、２２時間後に発酵試料を採取する。これらの試料を分析のために準備する（ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ2に基づく生成物の定量化を参照のこと）。
【０１１１】
ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ2に基づく生成物の定量化
発酵試料におけるＬＳＭＥ及びＨＬＳＭＥの定量化を、ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ2によって、全ての分析物についての外部校正（０．１〜５０ｍｇ／Ｌ）をもとに、かつアミノウンデカン酸（ＡＵＤ、これはＨＬＳＭＥのため）やｄ３−ＬＳＭＥ（ＬＳＭＥのため）といった内部標準を用いて行う。
【０１１２】
その際に以下の機器を使用する：
・オートサンプラー（G1367E）、バイナリポンプ（G1312B）及びカラムオーブン（G1316A）を備えたＨＰＬＣシステム１２６０（Agilent社；ベーブリンゲン在）
・ＥＳＩ源を備えた質量分析計TripelQuad 6410（Agilent社；ベーブリンゲン在）
・ＨＰＬＣカラム：Kinetex C18、１００×２．１ｍｍ、粒径：２．６μｍ、細孔径１００Å（Phenomenex社；アシャッフェンブルク在）
・プレカラム：KrudKatcher Ultra HPLC In-Line Filter；０．５μｍの濾層厚及び０．００４ｍｍの内径（Phenomenex社；アシャッフェンブルク在）
【０１１３】
１９００μｌの溶剤（８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、２０％の二回蒸留Ｈ2Ｏ（ｖ／ｖ）＋０．１％のギ酸）及び１００μｌの試料を２ｍｌの反応容器にピペット導入することによって試料を準備する。この混合物を約１０秒間にわたりボルテックスにかけ、引き続き約１３０００ｒｐｍで５分間にわたり遠心分離する。澄明な上清をピペットで取り出し、希釈剤（８０％（ｖ／ｖ）のＡＣＮ、２０％の二回蒸留Ｈ2Ｏ（ｖ／ｖ）＋０．１％のギ酸）での相応の希釈の後に分析する。それぞれ９００μｌの試料に対して１００μｌのＩＳＴＤをピペット導入する（試料容量９０μｌの場合には１０μｌ）。
【０１１４】
ＨＰＬＣ分離を、上述のカラム若しくはプレカラムで行う。注入容量は０．７μｌであり、カラム温度は５０℃であり、流量は０．６ｍｌ／分である。移動相は、溶離液Ａ（０．１％（ｖ／ｖ）の水性ギ酸）と溶離液Ｂ（アセトニトリルと０．１％（ｖ／ｖ）のギ酸）とからなる。以下のグラジエントプロフィールを用いる：
【化７】
2015509730.tif 000015
【０１１５】
ＥＳＩ−ＭＳ2分析を、ポジティブモードで、以下のＥＳＩ源パラメータを用いて実施する：
・ガス温度  ２８０℃
・ガス流量  １１Ｌ／ｍｉｎ
・ネブライザー圧力  ５０ｐｓｉ
・キャピラリー電圧  ４０００Ｖ
【０１１６】
化合物ＨＬＳＭＥの検出及び定量化を、以下のＭＲＭパラメータで行う。その際、それぞれ１つのプロダクトイオンをクオリファイアとして用い、１つをクオンティファイアとして用いる：
【化８】
2015509730.tif 000016
【０１１７】
分析物をＳＩＭモードで検出する（ｍ／ｚ  ２０１及び２１５）。
【０１１８】
菌株Ｅ．コリＷ３１１０ｐＣＯＭ［Ａｂ＿Ｆｄ／ＣＹＰ１５３−２／ＦｄＯＲ／ａｌｋＬ］がラウリン酸メチルエステルからω−ヒドロキシ−ラウリン酸メチルエステルを形成し得ることが判明した。菌株Ｅ．コリＷ３１１０ｐＣＯＭ１０−Ｃｔ  ＣＹＰ５２Ａ１２＿ｃｏ＋ＯＲ＿ｃｏは、ラウリン酸メチルエステルをより低い程度でしかω−ヒドロキシ−ラウリン酸メチルエステル又はさらなる酸化生成物へと変換することができない。
【０１１９】
前出の発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び実施例に開示されている本願の特徴は、単独でも、また任意に組み合わせても、本発明をその種々の実施形態で実施するにあたっての本質である。
【配列表】
2015509730000001.app
【国際調査報告】
2015509730.tif 000017
2015509730.tif 000018
2015509730.tif 000019
2015509730.tif 000020
2015509730.tif 000021
2015509730.tif 000022