(57)【要約】  本発明は、支持部分と前記支持部分と共有結合的に連結され延在する少なくとも三つのブロックコポリマー鎖とを含有する分岐ポリマーであって、  （ｉ）前記少なくとも三つのブロックコポリマー鎖のそれぞれが、（ａ）親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロック、または、（ｂ）親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された疎水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロックを含有し、  （ｉｉ）前記ブロックコポリマー鎖それぞれの前記共有結合の少なくとも１つが生分解性である分岐ポリマーに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持部分と前記支持部分と共有結合的に連結され延在する少なくとも三つのブロックコポリマー鎖とを含有する分岐ポリマーであって、
（ｉ）前記少なくとも三つのブロックコポリマー鎖のそれぞれが、（ａ）親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロック、または、（ｂ）親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された疎水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロックを含有し、
（ｉｉ）前記ブロックコポリマー鎖それぞれの前記共有結合の少なくとも１つが生分解性であることを特徴とする分岐ポリマー。
【請求項２】
前記少なくとも三つのブロックコポリマー鎖はそれぞれ、親水性ポリマーブロックに共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロックを含有することを特徴とする請求項１に記載の分岐ポリマー。
【請求項３】
前記少なくとも三つのブロックコポリマー鎖のそれぞれは、２つの親水性ポリマーブロック、及び、陽イオン性ポリマーブロックとを含んでおり、前記陽イオン性ポリマーブロックは（ｉ）前記２つの親水性ポリマーブロックの間に位置しており、（ｉｉ）前記２つの親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結されていることを特徴とする請求項１に記載の分岐ポリマー。
【請求項４】
前記少なくとも三つのブロックコポリマー鎖のそれぞれは、親水性ポリマーブロックと２つの陽イオン性ポリマーブロックとを含有し、前記親水性ポリマーブロックが（ｉ）前記２つの陽イオン性ポリマーブロックの間に位置し、（ｉｉ）前記２つの陽イオン性ポリマーブロックと共有結合的に連結されていることを特徴とする請求項１に記載の分岐ポリマー。
【請求項５】
前記少なくとも三つのブロックコポリマー鎖のそれぞれは、疎水性ポリマーブロックに共有結合的に連結される陽イオン性ポリマーブロックを含有しており、前記疎水性ポリマーブロック自体は親水性ポリマーブロックに連結されていることを特徴とする請求項１に記載の分岐ポリマー。
【請求項６】
前記少なくとも三つのブロックコポリマー鎖のそれぞれは、生分解性の共有結合により前記支持部分と連結されていることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の分岐ポリマー。
【請求項７】
（ｉ）前記ブロックコポリマー鎖のそれぞれに伴う共有結合の前記少なくとも１つの生分解性共有結合は、エステル、無水物、炭酸塩、過酸化物、過オキシエステル、リン酸塩、チオエステル、尿素、チオウレタン、エーテル、二硫化物、カルバミン酸塩（ウレタン）、及び、ボロン酸エステルから選択される１以上の官能基を含む生分解性の連結部分であり、（ｉｉ）前記１以上の官能基の生分解により共有結合が切断されることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の分岐ポリマー。
【請求項８】
式（Ａ７）または（Ａ８）で表される構造を有することを特徴とする請求項１に記載の分岐ポリマー。
【化１８】
2015509129.tif 000023
上記式で、ＳＭは前記支持部分、ＬＭは連結部分、Ａは親水性ポリマーブロック、Ｂは陽イオン性ポリマーブロック、各ｘは独立に０または１、ｖは３以上の整数を表し、（ｉ）任意でＬＭ及びＣが伴うＡ、Ｂは、前記分岐ポリマーのブロックコポリマーアームを表し、（ｉｉ）前記少なくとも３つのブロックコポリマーアームのそれぞれにおいて、少なくとも一つがｘ＝１であり、当該ｘ＝１に関するＬＭは、前記Ａおよび前記Ｂを共有結合的に連結する生分解性の連結部分である。
【請求項９】
支持部分と前記支持部分と共有結合的に連結され延在する少なくとも三つのブロックコポリマー鎖とを含有する分岐ポリマーと、核酸分子とを有する複合体であって、
（ｉ）前記少なくとも三つのブロックコポリマー鎖のそれぞれが、（ａ）親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロック、または、（ｂ）親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された疎水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロックを含有し、
（ｉｉ）前記ブロックコポリマー鎖それぞれの前記共有結合の少なくとも１つが生分解性であることを特徴とする複合体。
【請求項１０】
前記陽イオン性ポリマーブロックは、正電荷を有するモノマー残存物ユニットを約５〜約２００含有することを特徴とする請求項９に記載の複合体。
【請求項１１】
前記親水性ポリマーブロックは、約５〜約２００の親水性モノマー残存物ユニットを含有することを特徴とする請求項９または１０に記載の複合体。
【請求項１２】
約１０ｍＶ〜約４０ｍＶの範囲のゼータ電位を有する請求項９〜１１のいずれか１項に記載の複合体
【請求項１３】
前記核酸分子は、ＤＮＡおよびＲＮＡから選択される。別の実施形態において、前記ＤＮＡおよびＲＮＡは、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、一本鎖または二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、センスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、小／短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ＰｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ／小分子ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ／ｓｔＲＮＡ）、小核小体ＲＮＡ（ＳｎｏＲＮＡ）、低分子核（ＳｎＲＮＡ）リボザイム、アプタマー、ＤＮＡザイム、リボヌクレアーゼ−型複合体、ヘアピン二本鎖ＲＮＡ（ヘアピンｄｓＲＮＡ）、空間的発達を媒介するｍｉＲＮＡ（ｓｄＲＮＡ）、応力応答型ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）、細胞周期ＲＮＡ（ｃｃＲＮＡ）および一本鎖または二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドから選択されることを特徴とする請求項９〜１２のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１４】
細胞への核酸分子送達方法であって、
（ａ）分岐ポリマーと核酸分子とを含有する複合体を提供する工程であって、前記分岐ポリマーは支持部分と前記支持部分と共有結合的に連結され延在する少なくとも三つのブロックコポリマー鎖とを含有し、
（ｉ）前記少なくとも三つのブロックコポリマー鎖のそれぞれが、（ａ）親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロック、または、（ｂ）親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された疎水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロックを含有し、
（ｉｉ）前記ブロックコポリマー鎖それぞれの前記共有結合の少なくとも１つが生分解性である、前記複合体を提供する工程と、
（ｂ）前記細胞へ前記複合体を送達する工程とを備えたことを特徴とする細胞への核酸分子送達方法。
【請求項１５】
遺伝子発現のサイレンシング方法であって、支持部分と前記支持部分と共有結合的に連結され延在する少なくとも三つのブロックコポリマー鎖とを含有する分岐ポリマーと、核酸分子とを有する複合体を細胞に形質移入する工程を備え、
（ｉ）前記少なくとも三つのブロックコポリマー鎖のそれぞれが、（ａ）親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロック、または、（ｂ）親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された疎水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロックを含有し、
（ｉｉ）前記ブロックコポリマー鎖それぞれの前記共有結合の少なくとも１つが生分解性であることを特徴とする遺伝子発現のサイレンシング方法。
【請求項１６】
生体内で行われる請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記支持部分に付随する前記少なくとも三つのポリマー鎖は、直鎖状ポリマー鎖であることを特徴とする請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記核酸分子がタンパク質配位子と複合化されることにより、受容体介在性の細胞標的化を行うことを特徴とする請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記複合体を被験体に投与することを特徴とする請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記核酸分子は、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、一本鎖または二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、センスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、小／短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ＰｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ／小分子ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ／ｓｔＲＮＡ）、小核小体ＲＮＡ（ＳｎｏＲＮＡ）、低分子核（ＳｎＲＮＡ）リボザイム、アプタマー、ＤＮＡザイム、リボヌクレアーゼ−型複合体、ヘアピン二本鎖ＲＮＡ（ヘアピンｄｓＲＮＡ）、空間的発達を媒介するｍｉＲＮＡ（ｓｄＲＮＡ）、応力応答型ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）、細胞周期ＲＮＡ（ｃｃＲＮＡ）および一本鎖または二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドから選択されることを特徴とする請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分岐ポリマー全般に関する。具体的には、本発明は少なくとも三つのブロックコポリマーアームを有するポリマーに関する。前記ポリマーは、核酸分子を含む複合体の形成に特に適しており、従って便宜上、このような応用を強調しつつ本発明を説明する。但し、前記ポリマーの適用範囲はその他の各種応用を含むものとする。従って本発明は、核酸分子の複合体とポリマーとに関し、前記複合体を用いて核酸分子を細胞へ送り届けること、及び、遺伝子発現のサイレンシング方法に関する。また、本発明は、核酸分子を酵素的分解から保護する方法における前記ポリマーの使用、及び、前記ポリマーの製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
分岐ポリマーとは、少なくとも三つのポリマー鎖が接合された原子や分子等の支持部分を有する公知のポリマーである。前記少なくとも三つのポリマー鎖を、分岐ポリマーの「アーム」と称す。分岐ポリマーの具体的な種類としては、星型ポリマー、櫛型ポリマー、ブラシ型ポリマー、デンドリマーが挙げられる。前記ポリマーの構造は、直鎖状ポリマーとは異なる物理的及び化学的特性を付与するため、学術的及び実際的関心が持たれている。
【０００３】
分岐ポリマーの特性は、分子アーキテクチャ及び分子の組成により大きく影響される。分岐ポリマーは、分子構造を操作することにより種々の固有特性を示すことがわかっており、例えばエラストマーとしては、界面活性剤、潤滑剤等として機能する幅広い応用で使用されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、更に幅広い用途に適した特性を示す新しい分岐ポリマー構造の発展の余地がまだ残されている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、従って支持部分と前記支持部分と共有結合的に連結され延在する少なくとも三つのブロックコポリマー鎖とを含有する分岐ポリマーであって、
（ｉ）前記少なくとも三つのブロックコポリマー鎖のそれぞれが、（ａ）親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロック、または、（ｂ）親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された疎水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロックを含有し、
（ｉｉ）前記ブロックコポリマー鎖それぞれの前記共有結合の少なくとも１つが生分解性である分岐ポリマーを提供する。
【０００６】
以上から、本発明の分岐ポリマーが、少なくとも陽イオン生、親水性、および、生分解環境下におかれると実質的な構造変態が可能となる生分解性といった特徴の独特の組合せを有することがわかる。前記構造変態は、（ｉ）ブロックコポリマー鎖全体、（ｉｉ）ブロックコポリマー鎖の一部、または、（iii）これらの組合せの（前記少なくとも三つのブロックコポリマー鎖それぞれの生分解性共有結合における）開裂を伴う。
【０００７】
ブロックコポリマー鎖が部分的に開裂される場合、前記分岐ポリマーは、親水性ポリマーブロック、陽イオン性ポリマーブロック、または、疎水性ポリマーブロック（含有される場合）、或いは、３つのポリマーブロックの全てが鎖に存在する場合、これらポリマーブロックのうちの２つが損なわれる場合がある。
【０００８】
前記分岐ポリマーからの鎖またはその一部の損失が、ポリマーの親水性、疎水性、および／または、陽イオン性等の特性の変化を促すので有利である。勿論、前記分岐ポリマーの分子量も減少する。
【０００９】
一実施形態において、前記少なくとも三つのブロックコポリマー鎖を前記支持部分に連結する前記共有結合のそれぞれは、生分解性である。
【００１０】
生分解性共有結合を適切に選択することにより、特定の生分解環境下において前記分岐ポリマーに特定の構造変態が起こるように設計することが可能となる。例えば、前記分岐ポリマーは、核酸分子との複合体を形成し、複合体の形質移入時に生分解性共有結合にて前記分岐ポリマー鎖全体、または、一部が開裂されるよう設計されていてもよい。細胞内での前記分岐ポリマーの構造変態により、前記核酸分子が利用されやすくなり、また新陳代謝が促され、前記分岐ポリマー（または、その残余物）が排除されやすくなる。
【００１１】
前記鎖のブロックの性質により、本発明の前記分岐ポリマーは各種応用に合わせた適切な設計が可能となるので有利である。前記鎖を形成する際に、少なくとも陽イオン性および親水性ブロックを適切に選択することにより、前記分岐ポリマーは例えば核酸分子との複合体が効率的に且つ有効に形成されるように設計することが可能となる。
【００１２】
本発明は従って、支持部分と前記支持部分と共有結合的に連結され延在する少なくとも三つのブロックコポリマー鎖とを含有する分岐ポリマーと、核酸分子とを有する複合体であって、
（ｉ）前記少なくとも三つのブロックコポリマー鎖のそれぞれが、（ａ）親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロック、または、（ｂ）親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された疎水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロックを含有し、
（ｉｉ）前記ブロックコポリマー鎖それぞれの前記共有結合の少なくとも１つが生分解性である複合体を提供する。
【００１３】
これに関連して、複合体そのものは前記分岐ポリマーと前記核酸分子との間からのものである事が理解できるであろう。
【００１４】
前記分岐ポリマーは、各種核酸分子との安定した複合体を形成可能であり、得られた複合体は様々なタイプの細胞への核酸分子の形質移入を向上させることが可能である。また、前記分岐ポリマーが前記複合体の状態では、酵素的分解から核酸分子を良好に保護することがわかっている。
【００１５】
これらのブロック特性により、前記分岐ポリマーの各アームは、任意の核酸分子との効率的な複合体形成、および／または、任意のタイプの細胞への前記核酸分子の効率的な形質移入が可能となるように設計することが可能となるので有利である。また、前記分岐ポリマーは、前記複合体を選択された標的細胞タイプに仕向ける標的配位子を盛り込むように有利に設計することも可能である。
【００１６】
一実施形態において、前記少なくとも三つのブロックコポリマー鎖はそれぞれ、親水性ポリマーブロックに共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロックを含有する。この場合前記ブロックコポリマー鎖は、Ａ−Ｂジブロック構造を有すると表現してもよい。ここでＡは、親水性ポリマーブロック、Ｂは前記陽イオン性ポリマーブロックを表す。疎水性ポリマーブロック等の別のポリマーブロックは、前記陽イオン性ポリマーブロックまたは前記親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結されていてもよい。この場合、前記ブロックコポリマー鎖は、Ａ−Ｂ−Ｃ、または、Ｃ−Ａ−Ｂトリブロック構造を有すると表現してもよい。ここでＡは、親水性ポリマーブロック、Ｂは前記陽イオン性ポリマーブロック、Ｃは疎水性ポリマーブロック等の別のポリマーブロックを表している。
【００１７】
別の実施形態において、前記少なくとも三つのブロックコポリマー鎖のそれぞれは、２つの親水性ポリマーブロック、及び、陽イオン性ポリマーブロックとを含んでおり、前記陽イオン性ポリマーブロックは（ｉ）前記２つの親水性ポリマーブロックの間に位置しており、（ｉｉ）前記２つの親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結されている。この場合、前記ブロックコポリマー鎖は、Ａ−Ｂ−Ａトリブロック構造を有すると表現してもよい。ここで、Ａは同じであっても異なっていてもよく、親水性ポリマーブロックを表し、Ｂは前記陽イオン性ポリマーブロックを表す。
【００１８】
さらに別の実施形態において、前記少なくとも三つのブロックコポリマー鎖のそれぞれは、親水性ポリマーブロックと２つの陽イオン性ポリマーブロックとを含有し、前記親水性ポリマーブロックが（ｉ）前記２つの陽イオン性ポリマーブロックの間に位置し、（ｉｉ）前記２つの陽イオン性ポリマーブロックと共有結合的に連結されている。この場合、前記ブロックコポリマー鎖は、Ｂ−Ａ−Ｂトリブロック構造を有すると表現してもよい。ここで各Ｂは同じであっても異なっていてもよく、陽イオン性ポリマーブロックを表し、Ａは前記親水性ポリマーブロックを表す。
【００１９】
さらに別の実施形態において、前記少なくとも三つのブロックコポリマー鎖のそれぞれは、疎水性ポリマーブロックに共有結合的に連結される陽イオン性ポリマーブロックを含有しており、前記疎水性ポリマーブロック自体は親水性ポリマーブロックに連結されている。この場合、前記ブロックコポリマーアームは、Ｂ−Ｃ−Ａトリブロック構造を有すると表現してもよい。ここで、Ｂは前記陽イオン性ポリマーブロック、Ｃは前記疎水性ポリマーブロック、Ａは親水性ポリマーブロックを表す。
【００２０】
また、本発明は、細胞への核酸分子送達方法であって、
（ａ）分岐ポリマーと核酸分子とを含有する複合体を提供する工程であって、前記分岐ポリマーは支持部分と前記支持部分と共有結合的に連結され延在する少なくとも三つのブロックコポリマー鎖とを含有し、
（ｉ）前記少なくとも三つのブロックコポリマー鎖のそれぞれが、（ａ）親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロック、または、（ｂ）親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された疎水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロックを含有し、
（ｉｉ）前記ブロックコポリマー鎖それぞれの前記共有結合の少なくとも１つが生分解性である、前記複合体を提供する工程と、
（ｂ）前記細胞へ前記複合体を送達する工程とを備えた細胞への核酸分子送達方法を提供する。
【００２１】
一実施形態において、遺伝子発現のサイレンシング用に、前記核酸分子は細胞に送達される。
【００２２】
本発明は従って、遺伝子発現のサイレンシング方法であって、支持部分と前記支持部分と共有結合的に連結され延在する少なくとも三つのブロックコポリマー鎖とを含有する分岐ポリマーと、核酸分子とを有する複合体を細胞に形質移入する工程を備え、
（ｉ）前記少なくとも三つのブロックコポリマー鎖のそれぞれが、（ａ）親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロック、または、（ｂ）親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された疎水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロックを含有し、
（ｉｉ）前記ブロックコポリマー鎖それぞれの前記共有結合の少なくとも１つが生分解性である遺伝子発現のサイレンシング方法も提供する。
【００２３】
本発明のこの側面または別の側面の一実施形態において、前記核酸分子はＤＮＡおよびＲＮＡから選択される。
【００２４】
さらに別の実施形態において、前記ＤＮＡおよびＲＮＡは、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、一本鎖または二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、センスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、小／短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ＰｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ／小分子ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ／ｓｔＲＮＡ）、小核小体ＲＮＡ（ＳｎｏＲＮＡ）、低分子核（ＳｎＲＮＡ）リボザイム、アプタマー、ＤＮＡザイム、リボヌクレアーゼ−型複合体、ヘアピン二本鎖ＲＮＡ（ヘアピンｄｓＲＮＡ）、空間的発達を媒介するｍｉＲＮＡ（ｓｄＲＮＡ）、応力応答型ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）、細胞周期ＲＮＡ（ｃｃＲＮＡ）および一本鎖または二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドから選択される。
【００２５】
本発明の分岐ポリマーは、酵素的分解から核酸分子を保護することがわかっている。
【００２６】
本発明は、酵素的分解からの核酸分子保護方法であって、前記方法は、支持部分と前記支持部分と共有結合的に連結され延在する少なくとも三つのブロックコポリマー鎖とを含む分岐ポリマーで前記核酸分子を複合化させる工程を備え、
（ｉ）前記少なくとも三つのブロックコポリマー鎖のそれぞれは、（ａ）親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロック、または、（ｂ）親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された疎水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロックを含み、
（ｉｉ）前記ブロックコポリマー鎖に伴う共有結合の少なくとも一つが生分解性である核酸分子保護方法を提供する。
【００２７】
また、細胞に核酸分子を送達する複合体の用途であって、前記複合体は、分岐ポリマーと核酸分子とを含み、前記分岐ポリマーは支持部分と前記支持部分と共有結合的に連結され延在する少なくとも三つのブロックコポリマー鎖とを含んでおり、
（ｉ）前記少なくとも三つのブロックコポリマー鎖のそれぞれは、（ａ）親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロック、または、（ｂ）親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された疎水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロックを含んでおり、
（ｉｉ）前記ブロックコポリマー鎖に伴う共有結合の少なくとも一つが生分解性である、細胞に核酸分子を送達する複合体の用途を提供する。
【００２８】
本発明はまた遺伝子発現をサイレンシングする複合体の用途であって、前記複合体は分岐ポリマーと核酸分子とを含み、前記分岐ポリマーは支持部分と前記支持部分と共有結合的に連結され延在する少なくとも三つのブロックコポリマー鎖とを含み、
（ｉ）前記少なくとも三つのブロックコポリマー鎖のそれぞれは、（ａ）親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロック、または、（ｂ）親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された疎水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロックを含んでおり、
（ｉｉ）前記ブロックコポリマー鎖に伴う共有結合の少なくとも一つが生分解性である複合体の用途を提供する。
【００２９】
本発明はさらに、酵素的分解から核酸分子を保護する分岐ポリマーの用途であって、前記分岐ポリマーは、支持部分と前記支持部分と共有結合的に連結し、前記支持部分から延在する少なくとも三つのブロックコポリマー鎖とを含み、
（ｉ）前記少なくとも三つのブロックコポリマー鎖のそれぞれは、（ａ）親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロック、または、（ｂ）親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された疎水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロックを含んでおり、
（ｉｉ）前記ブロックコポリマー鎖に伴う共有結合の少なくとも一つが生分解性である分岐ポリマーの用途を提供する。
【００３０】
本発明の更なる側面および実施形態は、以下の本発明の詳細な説明に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
本発明を以下に説明するに際し、以下の非限定的な図面を参照する。
図１は、本発明で形成される様々な分岐ポリマー構造を示す図であり、丸は支持部分、直線は一般的な共有結合、楕円は生分解性共有結合又は連結部分、波線は、陽イオン性ポリマーブロック、太い曲線は親水性ポリマーブロックを表す。
図２は、実施例１、２において生成され、段階希釈されたマルチアーム星型コポリマー（ｓｉＲＮＡ無し）にさらされた、ＣＨＯ−ＧＦＰ及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞の生存能力を示す図である。
図３は、実施例１、２において生成されるマルチアーム星型コポリマー（ｓｉＲＮＡ有り）にさらされたＣＨＯ−ＧＦＰ、ＨＥＫ２９３Ｔ、Ｈｕｈ７−ＧＦＰ細胞の生存能力を示す図である。
図４は、マルチアーム星型コポリマーに対する官能基としてのｓｉＲＮＡとの関係、即ち実施例１において生成された一連のポリマーに対するｓｉＲＮＡ比（ｗ／ｗ）を示す図である。また、同図に対応するＮ／Ｐ比も示す。
図５は、ＣＨＯ−ＧＦＰ、ＨＥＫ−ＧＦＰ、及び、Ｈｕｈ７−ＧＦＰ細胞における異なるｓｉＲＮＡの遺伝子のサイレンシングを示し、Ｌ２０００ｄｉ２２サンプルとして提示される（実施例５で生成された）ＲＡＦＴポリマーの組み合わせ、又は、ポリマー／ｄｉ２２複合体の平均ＥＧＦＰ蛍光強度のパーセンテージを示す図である。
図６は、ＣＨＯ−ＧＦＰ細胞における、蛍光ラベリングされたｓｉ２２／ＴｏＴｏ−３ポリマー複合体の収量を示す図である．ＣＨＯ−ＧＦＰ細胞は、ポジティブコントロールとして、ＴｏＴｏ−３でラベリングされた５０ｐｍｏｌｅのｓｉＲＮＡがリポフェクタミン２０００と共に形質移入されたもの、又は、ポリマーとＴｏＴｏ−３でラベリングしたｓｉＲＮＡとをモル比４：１で６時間又は２４時間添加したもの。ＴｏＴｏ−３でラベリングされた剥き出しのｓｉ２２もまた添加された。細胞は、その後流動細胞計測法で評価・分析された。値は、ＴｏＴｏ−３でラベリングされた剥き出しのｓｉ２２と比較した収量インデックスとして示す。三通りの実験を３回行った結果を±標準偏差とともにグラフに示す。
図７は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）におけるｓｉＲＮＡ／ポリマー複合体の安定性を示す図であり、（ａ）は剥き出しのｓｉＲＮＡの安定性を示し、（ｂ）はＡＢＡ−Ｂ４Ｓ−１６／２４を示し、（Ｃ）はＢＡＢ−Ｂ４Ｓ−１１／１０を示し、（ｄ）は、処理済み複合体のＣＨＯ−ＧＦＰ細胞に対する抑制能力を示す。
図８は、雛胚のＡＢＡ−Ｂ４Ｓ−１６／２４に対する干渉反応を示す図であり、（Ａ）は干渉アルファ（ＩＦＮα）、（Ｂ）は干渉ベータ（ＩＦＮβ）である。２４時間後の肝臓の組織部分も示す（Ｃ、Ｄ、及び、Ｅ）
図９は、雛胚に対する２４時間後のＡＢＡ−Ｂ４Ｓ−１６／２４ｄｉ２２−ＦＡＭ複合体の収量を示す図（Ａ及びＢ）であり、雛胚がインフルエンザウィルスにより抑制された場合を（Ｃ）に示す。
図面にはカラーのものも含まれる。要望があればカラー版の図面も提供可能である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本明細書及びそれに続く請求項において、特に文脈上指定が無い限り、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」や『ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ』、『ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ』等の変化形は供述される整数又はステップ、或いは、複数の整数又はステップを暗示的に範囲に含み、それ以外の整数又はステップ、或いは、その他の複数の整数又はステップを除外するものでは無い。
【００３３】
本明細書において引用される先行公表物（又は、それらから得られる情報）、或いは、公知事項は全て、これら先行公表物（又は、それらから得られる情報）、或いは、公知事項が本明細書の関連する分野において共通の一般知識を形成することを自認、承認、或いは、示唆するものではなく、そのように解釈されるべきではない。
【００３４】
ここで使用される単数形、「ａ」、「ａｎｄ」、「ｔｈｅ」は、特に明確に言及されない限り複数の場合も含むものとする。従って例えば、「ａ  ｃｅｌｌ」とは、単一の細胞、或いは、２つ以上の細胞を示唆し、「ａｎ  ａｇｅｎｔ」とは単一の薬剤、及び、２つ以上の薬剤を示唆する。
【００３５】
ここで使用される『分岐ポリマー』は、少なくとも三つのポリマー鎖が付随する支持部分を有するポリマーを意味する。前記ポリマーは、前記支持部分を複数備えていてもよい。便宜上、前記分岐ポリマーの『アーム』は前記少なくとも三つのポリマー鎖を指すものとする。分岐ポリマーのアームは、三つ以上であってもよい。例えば、分岐ポリマーは前記支持部分に付随するポリマー鎖の数が４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上であってもよい。
【００３６】
分岐ポリマーとは具体的に星型ポリマー、櫛型ポリマー、ブラシ型ポリマー、デンドリマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３７】
前記支持部分に付随する少なくとも三つのポリマー鎖又はアームは、分岐していてもよく直鎖状ポリマー鎖であってもよい。
【００３８】
一実施形態において、前記支持部分に付随する少なくとも三つのポリマー鎖は、直鎖状ポリマー鎖である。
【００３９】
本発明の別の実施形態において、前記分岐ポリマーは星型ポリマーである。
【００４０】
ここで、「星型ポリマー」とは、少なくとも三つの直鎖状ポリマー鎖、又は、アームが共有結合的に伸びる単一の分岐部をする高分子のことである。この場合、前記分岐部は支持部分であり、前記支持部分はここで記載されるとおり適切な原子又は分子であってもよい。
【００４１】
また「支持部分」とは、前記分岐ポリマーのアームが共有結合的に連結する原子又は分子等の部分である。従って、前記支持部分は共有結合的に連結するアームの支持部として機能する。
【００４２】
「分岐ポリマー」及び「支持部分」といった表現の意図を理解するために下記一般式（Ａ）を参照されたい。
【化１】
2015509129.tif 000002
ここで、ＳＭは、支持部分、ＢｃＰＡはブロックコポリマーアーム、ｖは３以上の整数である。
【００４３】
一般式（Ａ）からわかる通り、前記支持部分（ＳＭ）は、少なくとも三つのブロックコポリマーアーム（ＢｃＰＡ）が共有結合的に連結されている。つまり、ＳＭは分岐が起こる構造的特徴としてみることができる。本発明の分岐ポリマーは、このような分岐の起こる構造的特徴を更に多く有していてもよい。
【００４４】
前記支持部分が原子の場合、前記支持部分は一般的にＣ、Ｓｉ、Ｎである。前記原子がＣ又はＳｉである場合、前記原子に共有結合的に連結する４番目のブロックコポリマー鎖があってもよい。
【００４５】
前記支持部分が分子の場合、少なくとも三つのブロックコポリマーアームが共有結合的に連結可能であれば、当該部分の性質について特に限定は無い。つまり、前記分子は少なくとも三価でなければならない（即ち、共有結合的な連結が起こる少なくとも三つの点を有している必要がある）。例えば、前記分子は、少なくとも三価の、任意選択の置換がなされた、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、カルボシクリル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アルキルオキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アリーロキシ、カルボシクリルオキシ、ヘテロシクリルオキシ、ヘテロアリーロキシ、アルキルチオ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、アリールチオ、カルボシクリルチオ、ヘテロシクリルチオ、ヘテロアリールチオ、アルキルアルケニル、アルキルアルキニル、アルキルアリール、アルキルアシル、アルキルカルボシクリル、アルキルヘテロシクリル、アルキルヘテロアリール、アルキルオキシアルキル、アルケニルオキシアルキル、アルキニルオキシアルキル、アリーロキシアルキル、アルキルアシルオキシ、アルキルオキシアシルアルキル、アルキルカルボシクリルオキシ、アルキルヘテロシクリルオキシ、アルキルヘテロアリーロキシ、アルキルチオアルキル、アルケニルチオアルキル、アルキニルチオアルキル、アリールチオアルキル、アルキルアシルチオ、アルキルカルボシクリルチオ、アルキルヘテロシクリルチオ、アルキルヘテロアリールチオ、アルキルアルケニルアルキル、アルキルアルキニルアルキル、アルキルアリールアルキル、アルキルアシルアルキル、アリールアルキルアリール、アリールアルケニルアリール、アリールアルキニルアリール、アリールアシルアリール、アリールアシル、アリールカルボシクリル、アリールヘテロシクリル、アリールヘテロアリール、アルケニルオキシアリール、アルキニルオキシアリール、アリーロキシアリール、アリールアシルオキシ、アリールカルボシクリルオキシ、アリールヘテロシクリルオキシ、アリールヘテロアリーロキシ、アルキルチオアリール、アルケニルチオアリール、アルキニルチオアリール、アリールチオアリール、アリールアシルチオ、アリールカルボシクリルチオ、アリールヘテロシクリルチオ、アリールヘテロアリールチオ、配位化合物、及び、ポリマー鎖から選択可能であり、アルキル鎖における−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−ＯＰ（Ｏ）２−、−ＯＰ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｎ＝Ｎ−、−ＯＳｉ（ＯＲａ）２Ｏ−、−Ｓｉ（ＯＲａ）２Ｏ−、−ＯＢ（ＯＲａ）Ｏ−、−Ｂ（ＯＲａ）Ｏ−、−ＮＲａ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲａ−ａｎｄ−Ｃ（Ｏ）ＮＲａ−から独立に選択される二価基で置換されていてもよく、各Ｒａは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、カルボシクリル、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリールアルキル、及び、アシルから独立に選択すればよい。各Ｒａは、また水素、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ１−１８アルケニル、Ｃ１−１８アルキニル、Ｃ６−１８アリール、Ｃ３−１８カルボシクリル、Ｃ３−１８ヘテロアリール、Ｃ３−１８ヘテロシクリル、及びＣ７−１８アリールアルキルから独立に選択されてもよい。
【００４６】
前記分岐ポリマーが支持部分を一つだけ有しており少なくとも三つのブロックコポリマーアームが直線上である場合でも、便宜上前記分岐ポリマーを星型ポリマーと称する場合がある。
【００４７】
前記支持部分を定義する場合、前記部分が由来する化合物を参照するのがよい場合がある。例えば、前記支持部分は、ブロックコポリマーアームが共有結合的に連結する反応部位を提供する官能基が３以上含まれる化合物に由来してもよい。この場合、前記支持部分は、例えば、ハロゲン、アルコール、チオール、カルボン酸、アミン、エポキシ化合物、及び、酸塩化物から選択される３以上の官能基を有する化合物に由来していてもよい。
【００４８】
支持部分が由来するアルコール官能基を３つ以上有する化合物の非限定的な例としては、グリセロ−ル、ペンタエリスリトール、ジペンタエリスリトール、トリペンタエリスリトール、１、２、３−トリヒドロキシヘキサン、トリメチロールプロパン、ミオイノシトール、ブドウ糖及びその異性体（例ｄ−ガラクトース、ｄ−マンノース、果糖）、麦芽糖、ショ糖、及び、マニトールが挙げられる。
【００４９】
前記少なくとも三つのブロックコポリマー鎖は、前記支持部分にそれぞれ共有結合的に連結する。各ブロックコポリマー鎖は、直接的に又は間接的に前記支持部分に共有結合的に連結する。ここで、「直接的に」結合するとは、ブロックコポリマー鎖と支持部分との間のみに共有結合が存在するということである。また、「間接的に」結合するとは、ブロックコポリマー鎖と支持部分との間に原子又は分子の共有結合が１つ以上存在するという意味である。前記ブロックコポリマー鎖が支持部分と間接的に結合する場合、便宜上、前記ブロックコポリマー鎖が連結部分を介して支持部分と共有結合的に連結すると記載する場合もある。
【００５０】
一実施形態において、前記少なくとも三つのブロックコポリマー鎖は、それぞれ連結部分を介して前記支持部分と共有結合的に連結する。
【００５１】
前記連結部分は、前記支持部分に前記少なくとも三つのブロックコポリマー鎖を結合させることが可能であれば、その性質について特に限定はない。
【００５２】
連結部位の好適な例としては、任意選択の置換がなされた二価のオキシ（−Ｏ−）、二硫化物（−Ｓ−Ｓ−）、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アシル（−Ｃ（Ｏ）−を含む）、カルボシクリル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アルキルオキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アリーロキシ、アシルオキシ、カルボシクリルオキシ、ヘテロシクリルオキシ、ヘテロアリーロキシ、アルキルチオ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、アリールチオ、アシルチオ、カルボシクリルチオ、ヘテロシクリルチオ、ヘテロアリールチオ、アルキルアルケニル、アルキルアルキニル、アルキルアリール、アルキルアシル、アルキルカルボシクリル、アルキルヘテロシクリル、アルキルヘテロアリール、アルキルオキシアルキル、アルケニルオキシアルキル、アルキニルオキシアルキル、アリーロキシアルキル、アルキルアシルオキシ、アルキルオキシアシルアルキル、アルキルカルボシクリルオキシ、アルキルヘテロシクリルオキシ、アルキルヘテロアリーロキシ、アルキルチオアルキル、アルケニルチオアルキル、アルキニルチオアルキル、アリールチオアルキル、アルキルアシルチオ、アルキルカルボシクリルチオ、アルキルヘテロシクリルチオ、アルキルヘテロアリールチオ、アルキルアルケニルアルキル、アルキルアルキニルアルキル、アルキルアリールアルキル、アルキルアシルアルキル、アリールアルキルアリール、アリールアルケニルアリール、アリールアルキニルアリール、アリールアシルアリール、アリールアシル、アリールカルボシクリル、アリールヘテロシクリル、アリールヘテロアリール、アルケニルオキシアリール、アルキニルオキシアリール、アリーロキシアリール、アリールアシルオキシ、アリールカルボシクリルオキシ、アリールヘテロシクリルオキシ、アリールヘテロアリーロキシ、アルキルチオアリール、アルケニルチオアリール、アルキニルチオアリール、アリールチオアリール、アリールアシルチオ、アリールカルボシクリルチオ、アリールヘテロシクリルチオ、及び、アリールヘテロアリールチオが挙げられ、アルキル鎖における−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−ＯＰ（Ｏ）２−、−ＯＰ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、
−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｎ＝Ｎ−、−ＯＳｉ（ＯＲａ）２Ｏ−、−Ｓｉ（ＯＲａ）２Ｏ−、−ＯＢ（ＯＲａ）Ｏ−、−Ｂ（ＯＲａ）Ｏ−、
−ＮＲａ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲａ−ａｎｄ−Ｃ（Ｏ）ＮＲａ−、から独立に選択される二価基で置換されていてもよく、各Ｒａは水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、カルボシクリル、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリールアルキル、及び、アシルから独立に選択される。各Ｒａはまた水素、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ１−１８アルケニル、Ｃ１−１８アルキニル、Ｃ６−１８アリール、Ｃ３−１８カルボシクリル、Ｃ３−１８ヘテロアリール、Ｃ３−１８ヘテロシクリル、及び、Ｃ７−１８アリールアルキルから選択されてもよい．
【００５３】
本明細書において、一つの基に２つ以上のサブ基が含まれる場合（例：［基Ａ］、［基Ｂ］）、当該サブ基は提示された順番に限定されない。従って、［基Ａ］［基Ｂ］（例：アルキルアリール）の２つのサブ基は、［基Ｂ］［基Ａ］（例：アリールアルキル）を指す場合もある。
【００５４】
本発明の重要な特徴は、各ブロックコポリマー鎖との共有結合的な連結のうちの少なくとも一つは生分解性であることである。
【００５５】
一実施形態において、前記少なくとも三つのブロックコポリマー鎖は前記支持部分に連結部分を介して、共有結合的に連結する。
【００５６】
「生分解性である」共有結合的な連結、共有結合、又は、連結部分とは、生物学的環境（例：血液、組織等の生物物質内で、又は、これらに接触すること）にさらされると、化学反応による分解（即ち、結合開裂）に影響されやすく、共有結合（例：支持部分とブロックコポリマー鎖との間）が切断される分子構造を有しているということである。このような化学分解は、加水分解、酸化、還元を経ておこることもある。従って、生分解性共有結合的な連結、共有結合、又は、連結部位は一般的に加水分解性、酸化性、又は、還元性の開裂に影響されやすい。生分解の速度は外因的又内因的な要素（例えば、光、熱、放射線、ｐＨ，酵素的な、又は、非酵素的な媒介等）の数によって異なる。
【００５７】
生分解性の連結部分が、ブロックコポリマー鎖を支持部分に共有結合的に連結させている場合、当該生分解性の連結部分が生分解されると、連結されているブロックコポリマー鎖自身も分岐ポリマー構造から開裂することになる。
【００５８】
当業者であれば、生分解に影響されやすい連結部分を少なくとも部分的に構成する官能基の種類を理解できるであろう。上記官能基は例えば、エステル、無水物、炭酸塩、過酸化物、過オキシエステル、リン酸塩、チオエステル、尿素、チオウレタン、エーテル、二硫化物、カルバミン酸塩（ウレタン）、及び、ボロン酸エステルであってもよい。
【００５９】
一実施形態において、前記生分解性の連結部分は、エステル、無水物、炭酸塩、過酸化物、過オキシエステル、リン酸塩、チオエステル、尿素、チオウレタン、エーテル、二硫化物、カルバミン酸塩（ウレタン）、及び、ボロン酸エステルから選択される官能基を１以上含有する。
【００６０】
前記官能基は、生分解により関連する共有結合が開裂する前記連結部分に位置する。従って、前記官能基は前記共有結合を提供する一連の原子の一部を直接的に形成する。つまり、前記官能基の原子の少なくとも１つは、ポリマーの関連部分（例：前記支持部分とブロックコポリマー鎖）を共有結合的に連結する一連の原子に直接存在する。
【００６１】
従って、前記連結部分は、エステル、無水物、炭酸塩、過酸化物、過オキシエステル、リン酸塩、チオエステル、尿素、チオウレタン、エーテル、二硫化物、カルバミン酸塩（ウレタン）、及び、ボロン酸エステルから選択された１以上の官能基を介して生分解される。
【００６２】
生分解性の連結部分は、酸、塩基、酵素、および／または、結合開裂工程を少なくとも補助可能な別の内因性の生物学的化合物によって生分解されやすくなる。例えば、エステルは加水分解的に開裂し、カルボン酸基及びアルコール性基を生産してもよく、アミドは加水分解的に開裂して、カルボン酸基、及び、アミン基を生産し、二硫化物は還元的に開裂しチオール基を生産してもよい。
【００６３】
生分解は、血液、血漿、血清、尿、唾液、乳汁、精液、腟液、骨液、リンパ液、羊水、汗、及び、涙等の生物流体、及び、木部、師部、樹脂、花蜜の滲出液および溢液流体等の植物によって生成される水溶液によって引き起こされる 。
【００６４】
また、細胞、又は、核内体や細胞質といった細胞組成によっても生分解が引き起こされる。
【００６５】
生分解性連結部位は、特定の生物学的環境にさらされることにより生分解が起こることを条件に選択される。例えば、酸化還元電位勾配は、通常及び病態生理的な状態の細胞外及び細胞内環境に存在する。生分解性の連結部分に存在するジスフィルド結合は、還元性の細胞内環境では容易に還元される一方、酸化性の細胞外空間では無処置の状態で残る。ジスフィルド結合の細胞内還元は、グルタチオン（ＧＳＨ）及びチオレドキシン等の小さな酸化還元分子を単体で、或いは、酵素的組織に補助されて起こる。
【００６６】
生分解性の連結部分は生分解に影響されやすい官能基を２つ以上含んでいてもよい。しかし、これら官能基の性質と前記生分解の環境によって、望ましい結合開裂が官能基の一つのみに起きる場合がある。例えば、生分解性の連結部分はエステルと二硫化物官能基とを含んでいてもよい。還元性の環境では、生分解が二硫化物官能基だけで起こる場合がある。加水分解性の環境では、生分解が前記エステル官能基のみに起きる場合がある。還元性及び加水分解性の環境では、生分解が前記二硫化物とエステル官能基との両方に起きる場合がある。
【００６７】
前記支持部分に共有結合的に連結される少なくとも三つのブロックコポリマー鎖のそれぞれは、（ａ）親水性ポリマーブロックに共有結合的に連結される陽イオン性ポリマーブロック、又は、（ｂ）疎水性ポリマーブロックに共有結合的に連結される陽イオン性ポリマーブロックを含み、前記疎水性ポリマーブロック自体は親水性ポリマーブロックに連結されている。
【００６８】
一実施形態において、少なくとも三つのブロックコポリマー鎖はそれぞれ、親水性ポリマーブロックに共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロックを含有する。この場合、前記ブロックコポリマー鎖は、便宜上Ａ−Ｂジブロック構造を有すると表現する場合もある。ここで、Ａは、親水性ポリマーブロックを表しており、Ｂは前記陽イオン性ポリマーブロックを表している。疎水性ポリマーブロック等のさらに別のポリマーブロックが、前記陽イオン性ポリマーブロック、又は、親水性ポリマーブロックに共有結合的に連結されていてもよい。この場合、前記ブロックコポリマー鎖は、便宜上、Ａ−Ｂ−Ｃ又はＣ−Ａ−Ｂトリブロック構造を有すると表現する場合もある。ここで、Ａは、親水性ポリマーブロックを表わしており、Ｂは陽イオン性ポリマーブロック、Ｃは疎水性ポリマーブロック等の別のポリマーブロックを表している。
【００６９】
前記少なくとも三つのブロックコポリマー鎖が親水性ポリマーブロックに共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロックを含む場合、各アームの陽イオン性ポリマーブロックが前記支持部分に共有結合的に連結されるか、各アームの前記親水性ポリマーブロックが前記支持部分に共有結合的に連結されていてもよい。疎水性ポリマーブロック等のさらに別のポリマーブロックが陽イオン性ポリマーブロック、又は、親水性ポリマーブロックに共有結合的に連結されている場合、各アームの前記陽イオン性ポリマーブロック、前記親水性ポリマーブロック、又は、前記疎水性ポリマーブロックは前記支持部分に共有結合的に連結されていてもよい。
【００７０】
前記親水性ポリマーブロック、陽イオン性ポリマーブロック、また疎水性ポリマーブロック等の別のポリマーブロックがあれば当該別のポリマーブロックは互いに直接的に又は間接的に所望の順番で共有結合的に連結されてもよい。
【００７１】
ブロックコポリマー鎖と前記支持部分との前記共有結合について概略的に上で説明したことと同様に、前記ブロックコポリマー鎖内の少なくとも２つのブロックにおいて「直接的に」連結されるとは、ポリマーブロックの間に共有結合のみが存在しているという意味である。また、前記ブロックコポリマー鎖内の少なくとも２つのブロックにおいて「間接的に」連結されているとは、各ブロックの間に共有結合された原子又は分子が１以上存在するという意味である。前記ブロックコポリマー鎖において２つ以上のブロックが間接的に連結されている場合、各ブロックが連結部分を介して共有結合的に連結されていると表現する場合もある。
【００７２】
例えば、前記少なくとも三つのブロックコポリマー鎖は連結部分を介して親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロックを含んでいてもよい。また、疎水性ポリマーブロック等の別のポリマーブロックは、連結部分を介して陽イオン性ポリマーブロック又は親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結されていてもよい。
【００７３】
ブロックコポリマー鎖のいずれかのポリマーブロックが連結部分を介して別のポリマーブロックと共有結合的に連結されている場合、当業者であれば各ポリマーブロック間の連結部分の存在に関係なく、全体的な構造がブロックコポリマー鎖と記載されると解釈できるであろう。例えば、前記少なくとも三つのブロックコポリマー鎖のそれぞれが、連結部分を介して親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロックを含んでいてもよい。この場合、前記ブロックコポリマー鎖はＡ−ＬＭ−Ｂ構造を有するものとして示されていてもよく、便宜上Ａ−Ｂジブロック構造を有すると表現されてもよい。ここで、Ａは親水性ポリマーブロックを表し、ＬＭは連結部分、Ｂは陽イオン性ポリマーブロックを表す。
【００７４】
一実施形態において、前記少なくとも三つのブロックコポリマー鎖はそれぞれ、連結部分を介して親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロックを含有する。
【００７５】
また、別の実施形態において、前記少なくとも三つのブロックコポリマー鎖は、連結部分を介して陽イオン性ポリマーブロックまたは親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された疎水性ポリマーブロック等の別のポリマーブロックを含有する。
【００７６】
ここに記載される連結部位は、各ブロックコポリマー鎖内のポリマーブロックを共有結合的に連結させるのに適している。
【００７７】
一実施形態において、前記少なくとも三つのブロックコポリマー鎖はそれぞれ、生分解性の連結部分を介して親水性ポリマーブロックに共有結合的に連結される陽イオン性ポリマーブロックを含有する。
【００７８】
また別の実施形態において、前記少なくとも三つのブロックコポリマー鎖はそれぞれ、生分解性の連結部分を介して陽イオン性ポリマーブロックまたは親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結される疎水性ポリマーブロック等の別のポリマーブロックを含有する。
【００７９】
これら実施形態における前記分岐ポリマーは下記式（Ａ１）〜（Ａ６）で表される。
【化２】
2015509129.tif 000003
上記式で、ＳＭは前記支持部分、ＬＭは連結部分、Ａは親水性ポリマーブロック、Ｂは陽イオン性ポリマーブロック、Ｃはポリマーブロック（疎水性ポリマーブロック等）、各ｘは独立に０または１、ｖは３以上の整数を表し、（ｉ）任意でＬＭ及びＣが伴うＡ、Ｂは、前記分岐ポリマーのブロックコポリマーアームを表し、（ｉｉ）前記少なくとも３つのブロックコポリマーアームのそれぞれにおいて、少なくとも一つがｘ＝１であり、当該ｘ＝１に関するＬＭは生分解性の連結部分である。
【００８０】
上記構造Ａ１〜Ａ６において、いずれかのブロックコポリマーアームでｘ＝０の場合、前記連結部分（ＬＭ）は存在せず、前記分岐ポリマーの関連部位は互いに直接共有結合的に連結されている。
【００８１】
上記構造Ａ１〜Ａ６において、いずれかのブロックコポリマーアームでｘ＝１の場合、前記連結部分（ＬＭ）が存在し、前記分岐ポリマーの関連部位は間接的に連結部分（ＬＭ）を介して互いに共有結合的に連結されている。前記分岐ポリマーの少なくとも３つのブロックコポリマーアームのそれぞれには、少なくとも１つの生分解性連結部分（即ち、生分解性の連結部分）が無ければならない。
【００８２】
別の実施形態において、前記少なくとも三つのブロックコポリマー鎖のそれぞれは、２つの親水性ポリマーブロック、及び、陽イオン性ポリマーブロックとを含有する。前記陽イオン性ポリマーブロックは、（ｉ）前記２つの親水性ポリマーブロックの間に位置しており、（ｉｉ）前記２つの親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結されている。この場合、ブロックコポリマー鎖は、便宜上、Ａ−Ｂ−Ａトリブロック構造を有していると表現する場合もある。ここで、前記ブロックコポリマー鎖の各Ａは親水性ポリマーブロックであり、同一のものであっても異なるものであってもよい。Ｂは、陽イオン性ポリマーブロックを表している。
【００８３】
また、少なくとも三つのブロックコポリマー鎖のそれぞれは、親水性ポリマーブロックと２つの陽イオン性ポリマーブロックとを含有し、前記親水性ポリマーブロックが（ｉ）前記２つの陽イオン性ポリマーブロックの間に位置し、（ｉｉ）前記２つの陽イオン性ポリマーブロックと共有結合的に連結されていてもよい。この場合、前記ブロックコポリマー鎖は、便宜上Ｂ−Ａ−Ｂトリブロック構造を有していると表現する場合もある。ここで、前記ブロックコポリマー鎖の各Ｂは陽イオン性ポリマーブロックであり、同一のものであっても異なるものであってもよい。Ａは、親水性ポリマーブロックを表している。
【００８４】
一実施形態において、前記少なくとも三つのブロックコポリマーアームのそれぞれは、２つの親水性ポリマーブロック、及び、陽イオン性ポリマーブロックを含有する。前記陽イオン性ポリマーブロックは（ｉ）前記２つの親水性ポリマーブロックの間に位置しており、（ｉｉ）前記２つの親水性ポリマーブロックと連結部分を介して共有結合的に連結されている。
【００８５】
また、前記少なくとも三つのブロックコポリマーアームのそれぞれは、親水性ポリマーブロックと２つの陽イオン性ポリマーブロックとを含んでいてもよい。前記親水性ポリマーブロックは、（ｉ）前記２つの陽イオン性ポリマーブロックの間に位置しており、（ｉｉ）前記２つの陽イオン性ポリマーブロックと連結部分を介して共有結合的に連結されている。
【００８６】
また別の実施形態において、前記少なくとも三つのブロックコポリマーアームは、２つの親水性ポリマーブロック、及び、陽イオン性ポリマーブロックを含有する。前記陽イオン性ポリマーブロックは、（ｉ）親水性ポリマーブロックの間に位置しており、（ｉｉ）親水性ポリマーブロックと生分解性の連結部分を介して共有結合的に連結されている。
【００８７】
また、前記少なくとも三つのブロックコポリマーアームのそれぞれは、親水性ポリマーブロックと２つの陽イオン性ポリマーブロックとを含んでいてもよい。前記親水性ポリマーブロックは、（ｉ）前記２つの陽イオン性ポリマーブロックの間に位置しており、（ｉｉ）前記２つの陽イオン性ポリマーブロックと生分解性の連結部分を介して共有結合的に連結されている。
【００８８】
これらの実施形態によれば、前記分岐ポリマーは下記式（Ａ７）及び（Ａ８）で表される。
【化３】
2015509129.tif 000004
上記式で、ＳＭは前記支持部分、ＬＭは連結部分、Ａは親水性ポリマーブロック、Ｂは陽イオン性ポリマーブロック、各ｘは独立に０または１、ｖは３以上の整数を表し、（ｉ）任意でＬＭ及びＣが伴うＡ、Ｂは、前記分岐ポリマーのブロックコポリマーアームを表し、（ｉｉ）前記少なくとも３つのブロックコポリマーアームのそれぞれにおいて、少なくとも一つがｘ＝１であり、当該ｘ＝１に関するＬＭは生分解性の連結部分である。
【００８９】
上記構造Ａ７及びＡ８において、いずれかのブロックコポリマーアームでｘ＝０の場合、前記連結部分（ＬＭ）は存在せず、前記分岐ポリマーの関連部位は互いに直接共有結合的に連結されている。
【００９０】
上記構造Ａ７及びＡ８において、いずれかのブロックコポリマーアームがｘ＝１の場合、前記連結部分（ＬＭ）が存在し前記分岐ポリマーの関連部位は間接的に連結部分（ＬＭ）を介して互いに共有結合的に連結されている。前記分岐ポリマーの少なくとも３つのブロックコポリマーアームのそれぞれには、少なくとも１つの生分解性連結部分（即ち、生分解性の連結部分）が無ければならない。
【００９１】
ブロックコポリマーアームが、２つの親水性ポリマーブロック、または、２つの陽イオン性ポリマーブロックを含有する場合、前記アームの親水性ポリマーブロックは同一のものでも異なるものであってもよく、前記アーム内の各陽イオン性ポリマーブロックは同一のものであっても異なるものであってもよい。
【００９２】
別の実施形態において、前記少なくとも三つのブロックコポリマー鎖のそれぞれは、疎水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロック含んでおり、前記疎水性ポリマーブロックそのものは親水性ポリマーブロックと連結されている。この場合、前記ブロックコポリマー鎖はＢ−Ｃ−Ａトリブロック構造を有しているとも表現される。ここで、Ｂは陽イオン性ポリマーブロックを表しており、Ｃは疎水性ポリマーブロック、Ａは親水性ポリマーブロックを表している。
【００９３】
前記少なくとも三つのブロックコポリマーアームのそれぞれが、疎水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロックを含む場合、前記疎水性ポリマーブロックそのものは親水性ポリマーブロックと連結されており、前記各鎖の陽イオン性ポリマーブロックは前記支持部分と共有結合的に連結されていてもよい、または、前記各鎖の前記親水性ポリマーブロックが前記支持部分と共有結合的に連結されていてもよい。
【００９４】
前記ブロックコポリマー鎖の連結部位の少なくとも１つは生分解性の連結部分である。
【００９５】
上記実施形態によれば、前記分岐ポリマーは下記式（Ａ９）及び（Ａ１０）で表される。
【化４】
2015509129.tif 000005
上記式で、ＳＭは前記支持部分、ＬＭは連結部分、Ａは親水性ポリマーブロック、Ｂは陽イオン性ポリマーブロック、Ｃは疎水性ポリマーブロック等のポリマーブロック、各ｘは独立に０または１、ｖは３以上の整数を表し、（ｉ）任意でＬＭ及びＣが伴うＡ、Ｂは、前記分岐ポリマーのブロックコポリマーアームを表し、（ｉｉ）前記少なくとも３つのブロックコポリマーアームのそれぞれにおいて、少なくとも一つがｘ＝１であり、当該ｘ＝１に関するＬＭは生分解性の連結部分である。
【００９６】
当業者であれば、ここで教示される分岐ポリマーを形成するＡ、Ｂ、Ｃ、及びＬＭのその他の順列や組合せがあることを理解し得るであろう。例えば、ブロックコポリマー鎖は、テトラー、ペンター、ヘクサー、或いはそれ以上のブロックコポリマー鎖であってもよい。
【００９７】
前記ブロックコポリマー鎖のそれぞれが、２つ以上の連結部位を有する場合、各連結部分は同一のものであっても異なるものであってもよい。
【００９８】
前記ブロックコポリマー鎖が「陽イオン性ポリマーブロック」を含有するとは、前記ブロックコポリマー鎖が、正味の正電荷を呈示するまたは呈示可能なコポリマー鎖構造内において識別可能なブロックを有していることを意味する。
【００９９】
前記ブロックコポリマー鎖が「親水性ポリマーブロック」を含有するとは、前記ブロックコポリマー鎖が、正味の親水性を呈示するまたは呈示可能なコポリマー鎖構造内において識別可能なブロックを有していることを意味する。
【０１００】
前記ブロックコポリマー鎖が「別のポリマーブロック」を含有するとは、前記ブロックコポリマー鎖が、陽イオン性ポリマーブロックでも親水性ポリマーブロックでもないコポリマー鎖構造内において識別可能なブロックを有していることを意味する。
【０１０１】
前記別のポリマーブロックは、疎水性ポリマーブロックであってもよい。前記ブロックコポリマー鎖が「疎水性ポリマーブロック」を有しているとは、正味の疎水特性を呈示するまたは呈示可能なコポリマー鎖構造内において識別可能なブロックを有することを意味する。
【０１０２】
「陽イオン性ポリマーブロック」、「親水性ポリマーブロック」、及び、「疎水性ポリマーブロック」という表現の意味について更に詳しく以下に説明する。
【０１０３】
本発明において、前記分岐ポリマーのアームを形成するブロックコポリマーは線状ブロックコポリマーであってもよい。
【０１０４】
前記分岐ポリマーのブロックコポリマーアーム内の各ポリマーブロックは、ホモポリマーブロック、または、コポリマーブロックであってもよい。ポリマーブロックがコポリマーである場合、前記コポリマーはグラジエント、ランダム、または、統計コポリマーであってもよい。
【０１０５】
陽イオン性ポリマーブロック、及び、親水性ポリマーブロック、及びもしあれば疎水性ポリマーブロック等の別のポリマーブロックは一般的にそれぞれ、複数のモノマーユニットの重合化の残存物を含有する。以下に、上記ブロックを形成するために使用されるモノマーに関して更に詳述する。
【０１０６】
陽イオン性ポリマーブロックは、約５〜約２００、約４０〜約２００、或いは、約８０〜約２００のモノマー残存物ユニットを含有する場合がある。ブロックコポリマーアームが２つの陽イオン性ポリマーブロックを含有する場合、前記アームの各陽イオン性ポリマーブロックはそれぞれ、約５〜約１００、約２０〜約１００、または、約４０〜約１００のモノマー残存物ユニットを含有する。陽イオン性ポリマーブロックは個別にまたは全体で正味の正電荷を呈示する。一般的に、陽イオン性ポリマーブロックを構成するモノマー残存物ユニットの少なくとも約１０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、または全てが正電荷を有している。
【０１０７】
一実施形態において、陽イオン性ポリマーブロックは、約５〜約２００、約４０〜約２００、または、約８０〜約２００の正電荷を有するモノマー残存物ユニットを有している。
【０１０８】
ブロックコポリマー鎖が２つの陽イオン性ブロクを有している場合、各陽イオン性ブロクはそれぞれ約５〜約１００、約２０〜約１００、または、約４０〜約１００の正電荷を有するモノマー残存物ユニットを有している。
【０１０９】
本発明の分岐ポリマーが核酸分子での複合体形成に利用される場合、陽イオン性ブロクが、個別にまたは包括的に前記核酸分子での複合体形成を促進するために充分な正電荷密度を有していると認識されるであろう。以下に、このような複合体形成の実施形態について詳述する。
【０１１０】
親水性ポリマーブロックは、約５〜約２００、約３０〜約２００、約４０〜約１８０、約５０〜約１８０、または、約６０〜約１８０のモノマー残存物ユニットを有している場合がある。ブロックコポリマーアームが親水性ブロックを揺する場合、各親水性ブロックは個別にまたは全体で、約５〜約１００、約１５〜約１００、約２０〜約９０、約２５〜約９０、または、約３０〜約９０の親水性モノマー残存物ユニットを有している。親水性ポリマーブロックは個別に、または、全体的に正味の親水特性を呈示する。一般的に、前記親水性ポリマーブロックを形成するモノマー残存物ユニットは、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約９０％、または、約１００％が親水性モノマー残存物ユニットである。
【０１１１】
一実施形態において、親水性ポリマーブロックは約５〜約２００、約３０〜約２００、約４０〜約１８０、約５０〜約１８０、または約６０〜約１８０の親水性モノマー残存物ユニットを有する。
【０１１２】
ブロックコポリマー鎖が２つの親水性ポリマーブロックを有する場合、各親水性ポリマーブロックが個別にまたは全体で約５〜約１００、約１５〜約１００、約２０〜約９０、約２５〜約９０、または、約３０〜約９０の親水性モノマー残存物ユニットを有している。
【０１１３】
ブロックコポリマー鎖が別のポリマーブロックを有する場合、前記別のポリマーブロックは約５〜約２００、約３０〜約２００、約４０〜約１８０、約５０〜約１８０、または、約６０〜約１８０のモノマー残存物ユニットを含有する。
【０１１４】
前記別のポリマーブロックが疎水性ポリマーブロックである場合、前記疎水性ポリマーブロックは約５〜約２００、約３０〜約２００、約４０〜約１８０、約５０〜約１８０、または、約６０〜約１８０のモノマー残存物ユニットを含有する。前記疎水性ポリマーブロックは、正味の疎水特性を呈示している。一般的に、疎水性ポリマーブロックを形成するモノマー残存物ユニットは、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約９０％、または約１００％が疎水性モノマー残存物ユニットである。
【０１１５】
一実施形態において、疎水性ポリマーブロックは約５〜約２００、約３０〜約２００、約４０〜約１８０、約５０〜約１８０、または、約６０〜約１８０の疎水性モノマー残存物ユニットを含む。
【０１１６】
親水性、疎水性等の用語は一般的にある成分と別の成分との相互作用について伝えるために用いられるものであり（例：吸引相互作用、反発相互作用、または、溶解特性）、特定の成分と別の成分の特性を定量的に定義づけるものではない。
【０１１７】
例えば、親水性成分は、水等の水性媒体で濡れたり、溶媒和されたりしやすく、疎水性成分は水等の水性媒体に濡れにくく、溶媒和されにくい。
【０１１８】
本発明において、親水性ポリマーブロックとは、血液、血漿、血清、尿、唾液、乳汁、精液、腟液、骨液、リンパ液、羊水、汗、及び、涙等の生物流体、及び、木部、師部、樹脂、花蜜の滲出液及び溢液流体等の植物によって生成される水溶液を含む水性媒体に対し溶解性または混和性であるポリマーブロックを意味する。
【０１１９】
これに対し疎水性ポリマーブロックとは、血液、血漿、血清、尿、唾液、乳汁、精液、腟液、骨液、リンパ液、羊水、汗、及び、涙等の生物流体、及び、木部、師部、樹脂、花蜜の滲出液及び溢液流体等の植物によって生成される水溶液を含む水性媒体に対し殆ど溶解性または混和性を示さないポリマーブロックを意味する。
【０１２０】
前記親水性ポリマーブロックは、一般的に前記分岐ポリマーが水性媒体に対し溶解可能または混和可能となるように選択される。
【０１２１】
前記陽イオン性ポリマーブロックもまた、水性媒体に対し溶解可能または混和可能である親水特性を示しても良い。
【０１２２】
一実施形態において、分岐ポリマーは負電荷を有する重合化されたモノマー残存物ユニットを含まない。換言すると、一実施形態において分岐ポリマーは両性電解質の分岐ポリマーである。
【０１２３】
陽イオン性ポリマーブロックまたは核酸分子に伴う「正」電荷または「負」電荷とは、それぞれ前記陽イオン性ポリマーブロックまたは核酸分子が、正電荷または負電荷を呈示する、または、呈示可能である１以上の官能基または部位を有することを意味する。
【０１２４】
従って、官能基または部位は本質的に電荷を有していてもよく、例えば、求電子剤の添加または除去により帯電状態に変換可能であってもよい。つまり、正電荷の場合、官能基または部位は四級アンモニウム官能基または部位等の本質的な電荷を有していてもよい。または、官能基または部位そのものが中性であるものの、例えばｐＨ依存性の三級アンモニウムの陽イオン形成処理、または、三級アミン基の四級化処理などにより帯電させて陽イオン形成可能であってもよい。負電荷の場合、官能基または部位は、例えば負電荷を提供する有機酸塩を含んでいてもよく、または官能基または部位が中性の有機酸を含有するものの、例えばｐＨ依存性の酸性プロトン除去処理により帯電可能であってもよい。
【０１２５】
一実施形態において、陽イオン性ポリマーブロックは、中性状態で後に正電荷状態へ変換可能な官能基または部位を含むモノマーを用いて製造されている。例えば、前記モノマーは、重合化により陽イオン性ポリマーブロックを形成後、四級化されて正電荷状態になる三級アミン官能基を含んでいてもよい。
【０１２６】
当業者であれば帯電状態において、陽イオン性ポリマーブロックに伴う陽イオンそのもの、または、例えば核酸分子に伴う陰イオンそのものが、適した対イオンを伴うことを理解するであろう。
【０１２７】
各ブロックコポリマー鎖を構成するモノマー残存物ユニットの数は、一般的に約５〜約５００、約１０〜約３００、または、約２０〜約１５０の範囲である。
【０１２８】
前記分岐ポリマーは、少なくとも三つのブロックコポリマー鎖を有する。一実施形態において、前記分岐ポリマーは、３〜１２のブロックコポリマー鎖、３〜９のブロックコポリマー鎖、または、３〜６のブロックコポリマー鎖を有している。
【０１２９】
疑義を避けるために、本発明による分岐ポリマー内の各ブロックコポリマー鎖は、分子組成が略同じである。
【０１３０】
本発明による分岐ポリマーの例としては、下記一般式Ａ１１〜Ａ１３で表される。
【化５】
2015509129.tif 000006
上記式においてＳＭは支持部分、ＬＭは生分解性の連結部分、ＤＭＡＥＭＡは２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）メタクリレートエチルの重合化残余物、ＯＥＧＭＡはオリゴ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレートの重合化残余物、ＢＭＡはｎ−メタクリレートブチルの重合化残余物。
【０１３１】
一実施形態において、前記分岐ポリマーはさらに標的配位子および／またはイメージング剤を有している。この場合、標的配位子またはイメージング剤は、一般的に前記分岐ポリマーに共有結合的に連結されている。標的配位子またはイメージング剤は、前記支持部分、前記分岐ポリマーの前記ブロックコポリマー鎖、または、これらの組合せと共有結合的に連結されていてもよい。
【０１３２】
一実施形態において、前記分岐ポリマーは下記式（Ａ１４）〜（Ａ１６）によって表される。
【化６】
2015509129.tif 000007
上記式において、ＳＭは支持部分、ＢｃＰＡはブロックコポリマー鎖、Ｘは標的配位子またはイメージング剤を表しており、（Ａ１６）の場合各Ｘは同一であっても異なっていてもよい。またｖは３以上の整数を表す。
【０１３３】
前記分岐ポリマーと連結する適切な標的配位子の例としては、糖類および前記糖類由来のオリゴ糖、ペプチド類、タンパク質、アプタマー、および、コレステロールが挙げられる。適切な糖類の例としては、ガラクトース、マンノース、および、グルコサミンが挙げられる。適切なペプチド類の例としては、ボンベシン、黄体化ホルモン放出ペプチド、細胞貫通型ペプチド類（ＣＰＰ’ｓ）、ＧＡＬＡペプチド、インフルエンザ由来の融合性ペプチド類、ＲＧＤペプチド、ポリ（アルギニン）、ポリ（リシン）、ペネトラチン、ｔａｔ−ペプチド、およびトランスポータンが挙げられる。癌細胞を標的とする葉酸等の他の配位子を前記分岐ポリマーに連結してもよい。適切なタンパク質としては、転移プロタミン、抗ＥＧＦＲ抗体および抗Ｋ−ｒａｓ抗体等の抗体が挙げられる。
【０１３４】
前記分岐ポリマーと連結する適切なイメージング剤の例としては、ＰｏｌｙｆｌｕｏｒＴＭ（メタクリルオキシエチルチオカルバモイルローダミンＢ）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、および、ＢＯＰＩＤＹ染料が挙げられる。
【０１３５】
以下に、図１を参照して本発明の分岐ポリマーの性質をさらに説明する。図中、丸は支持部分、直線は一般的な共有結合、楕円は生分解性共有結合または連結部分、波線は陽イオン性ポリマーブロック、太い曲線は親水性ポリマーブロックを表す。構造（Ａ）は、分岐ポリマーを示しており、それぞれが親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結する陽イオン性ポリマーブロックを有する６つの線状ブロックコポリマー鎖が生分解性の共有結合により支持部分に連結されている。この場合、前記陽イオン性ポリマーブロックは直接的に生分解性の共有結合により連結されている。構造（Ｂ）は、分岐ポリマーを示しており、それぞれが親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結する陽イオン性ポリマーブロックを有する６つの線状ブロックコポリマー鎖が生分解性の共有結合により支持部分に連結されている。この場合、前記親水性ポリマーブロックは直接的に生分解性の共有結合により連結されている。構造（Ｃ）は、分岐ポリマーを示しており、それぞれが親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結する陽イオン性ポリマーブロックを有する６つの線状ブロックコポリマー鎖が支持部分に連結されている。この場合、各鎖は（ｉ）前記支持部位に直接連結された陽イオン性ポリマーブロックと、（ｉｉ）生分解性の共有結合により直接連結された２つの陽イオン性ポリマーブロックとを有する。構造（Ｄ）は、分岐ポリマーを示しており、それぞれが親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結する陽イオン性ポリマーブロックを有する６つの分岐ブロックコポリマー鎖が、生分解性の共有結合により支持部分に連結されている。この場合、前記陽イオン性ポリマーブロックは直接生分解性の共有結合より連結されている。構造（Ｅ）は、分岐ポリマーを示しており、それぞれが親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結する陽イオン性ポリマーブロックを有する６つの分岐ブロックコポリマー鎖が生分解性の共有結合により支持部分に連結されている。この場合、前記陽イオン性ポリマーブロックは直接生分解性の共有結合により連結されている。
【０１３６】
前記分岐ポリマーは適切な手段を用いて生成すればよい。
【０１３７】
一実施形態において、前記分岐ポリマーを生成する工程は、エチレン性不飽和モノマーの重合工程を含む。前記エチレン性不飽和モノマーの重合工程には、リビング重合技術が用いられることが好ましい。
【０１３８】
リビング重合は一般的に、本技術分野では一般的に不可逆な連鎖停止が略存在しない連鎖重合の一形態と考えられている。リビング重合の重要な特徴は、モノマーと重合化の反応条件が提供される限りポリマー鎖が成長し続けることである。リビング重合により生成されたポリマー鎖は、明確な分子構築、所定の分子量、狭い分子量分布、および、低多分散性というメリットがある。
【０１３９】
リビング重合の例としては、イオン重合および制御ラジカル重合（ＣＲＰ）が挙げられる。ＣＲＰの非限定的な例としては、イニファーター重合、安定ラジカル媒介重合（ＳＦＲＰ）、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、および、可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合が挙げられる。
【０１４０】
リビング重合を行うための装置、条件、薬剤は当業者に周知のものである。
【０１４１】
エチレン性不飽和モノマーがリビング重合技術により重合化される場合、一般的に所謂リビング重合剤の使用が必要となる。「リビング重合剤」とは、１以上のエチレン性不飽和モノマーのリビング重合を補助、制御、媒介しリビングポリマー鎖（即ち、リビング重合技術によって形成されたポリマー鎖）を形成することできる化合物である。
【０１４２】
リビング重合剤の非限定的な例としては、イオン重合とＣＲＰのうち選択されたリビング重合を促進する薬剤が挙げられる。
【０１４３】
本発明の一実施形態において、前記分岐ポリマーはイオン重合により生成されている。
【０１４４】
本発明の一実施形態において、前記分岐ポリマーはＣＲＰにより生成されている。
【０１４５】
本発明の別の実施形態において、前記分岐ポリマーはイニファーター重合により生成されている。
【０１４６】
また本発明の別の実施形態において、前記分岐ポリマーはＳＦＲＰにより生成されている。
【０１４７】
本発明の別の実施形態において、前記分岐ポリマーはＡＴＲＰにより生成されている。
【０１４８】
本発明のさらに別の実施形態において、前記分岐ポリマーはＲＡＦＴ重合により生成されている。
【０１４９】
ＲＡＦＴ重合により形成されたポリマーは、以下ＲＡＦＴポリマーと称す。重合メカニズムにより、前記ポリマーは前記モノマーの重合を促進するＲＡＦＴ剤の残余物を有している。
【０１５０】
本発明での使用に適したＲＡＦＴ剤は、チオカルボニルチオ基（−Ｃ（Ｓ）Ｓ−で表される二価の部位）を含有する。ＲＡＦＴ重合およびＲＡＦＴ剤については、多くの刊行物が存在する。例えば、ＷＯ９８／０１４７８、ＭｏａｄＧ．、Ｒｉｚｚａｒｄｏ、Ｅ、ＴｈａｎｇＳ、Ｈ．Ｐｏｌｙｍｅｒ２００８、４９、１０７９−１１３１ａｎｄＡｕｓｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．、２００５、５８、３７９−４１０、Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．、２００６、５９、６６９−６９２、および、Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．、２００９、６２、１４０２−１４７２（全内容をここに引用して参照する）。前記分岐ポリマーの生成に適したＲＡＦＴ剤としては、キサンテート、ジチオエステル、ジチオカルバミン酸塩、及び、トリチオ炭酸塩化合物が挙げられる。
【０１５１】
本発明に適したＲＡＦＴ剤には、下記一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるものも含まれている。
【化７】
2015509129.tif 000008
【化８】
2015509129.tif 000009
上記式において、ＺおよびＲは基であり、Ｒ＊およびＺ＊はそれぞれ、１以上のエチレン性不飽和モノマーの重合において薬剤がＲＡＦＴ剤として機能するように独立に選択されたＸ価およびＹ価の基であり、ｘは１以上の整数であり、ｙは２以上の整数である。
【０１５２】
一実施形態において、整数ｘは３以上の整数であり、ｙは３以上の整数である。この場合、Ｒ＊およびＺ＊は支持部分（ＳＭ）を表す。
【０１５３】
１以上のエチレン性不飽和モノマーの重合においてＲＡＦＴ剤として機能させるために、一般的にＲおよびＲ＊が採用された重合条件下でフリーラジカル脱離基として機能する任意選択の置換がなされた有機基であり、さらにフリーラジカル脱離基として重合を再開させる機能を維持するものであることを、当業者であれば理解し得るであろう。また、一般的にＺおよびＺ＊が、ＲＡＦＴ−添加ラジカルの断片化速度を鈍化させて重合が過渡に遅延することのない程度に、ＲＡＦＴ剤におけるＣ＝Ｓ部位のフリーラジカル添加に対する反応性適度に高くする任意選択の置換がなされた有機基であることを当業者であれば理解し得るであろう。
【０１５４】
式（Ｉ）において、Ｒ＊はＸ価の基であり、ｘは１以上の整数である。従って、Ｒ＊は一価、二価、三価、またはそれ以上の原子価である。例えば、Ｒ＊は、Ｃ２０アルキル鎖であり、鎖に付随する複数の置換基群として式（Ｉ）に示されるＲＡＦＴ剤の残余物を伴うものであってもよい。一般的に、ｘは１〜約２０の範囲の整数であり、例えば、約２〜約１０、１〜約５の整数である。一実施形態においてｘは２である。
【０１５５】
同様に、式（ＩＩ）において、Ｚ＊はＹ価の基であり、ｙは２以上の整数である。従って、Ｚ＊は二価、三価、またはそれ以上の原子価である。一般的に、ｙは２〜約２０の範囲の整数であり、例えば、約２〜約１０、または、２〜約５の整数である。
【０１５６】
本発明で使用されるＲＡＦＴ剤におけるＲの例としては、任意選択の置換がされた（Ｒ＊の場合には、Ｘ価の任意選択の置換がされた）アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アシル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アルキルチオ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、アリールチオ、アシルチオ、カルボシクリルチオ、ヘテロシクリルチオ、ヘテロアリールチオ、アルキルアルケニル、アルキルアルキニル、アルキルアリール、アルキルアシル、アルキルカルボシクリル、アルキルヘテロシクリル、アルキルヘテロアリール、アルキルオキシアルキル、アルケニルオキシアルキル、アルキニルオキシアルキル、アリーロキシアルキル、アルキルアシルオキシ、アルキルカルボシクリルオキシ、アルキルヘテロシクリルオキシ、アルキルヘテロアリーロキシ、アルキルチオアルキル、アルケニルチオアルキル、アルキニルチオアルキル、アリールチオアルキル、アルキルアシルチオ、アルキルカルボシクリルチオ、アルキルヘテロシクリルチオ、アルキルヘテロアリールチオ、アルキルアルケニルアルキル、アルキルアルキニルアルキル、アルキルアリールアルキル、アルキルアシルアルキル、アリールアルキルアリール、アリールアルケニルアリール、アリールアルキニルアリール、アリールアシルアリール、アリールアシル、アリールカルボシクリル、アリールヘテロシクリル、アリールヘテロアリール、アルケニルオキシアリール、アルキニルオキシアリール、アリーロキシアリール、アルキルチオアリール、アルケニルチオアリール、アルキニルチオアリール、アリールチオアリール、アリールアシルチオ、アリールカルボシクリルチオ、アリールヘテロシクリルチオ、アリールヘテロアリールチオ、及び、ポリマー鎖が挙げられる。
【０１５７】
疑義をさけるために、ここでいう「任意選択の置換がされた」アルキル、アルケニル等とは、アルキル、アルケニル基等の各基が任意選択の置換をされているということである。
【０１５８】
本発明で使用されるＲＡＦＴ剤におけるＲの例としては、任意選択の置換がされた（Ｒ＊の場合には、Ｘ価の任意選択の置換がされた）アルキル、飽和、不飽和または芳香族の炭酸環または複素環、アルキルチオ、ジアルキルアミノ、有機金属種、及び、ポリマー鎖が挙げられる。
【０１５９】
ポリマー鎖を含むリビング重合剤は、通常本技術分野においては「マクロ」リビング重合剤と称される。「マクロ」リビング重合剤は、いずれかのリビング重合剤の制御下で１以上のエチレン性不飽和モノマーを重合することにより生成可能である。
【０１６０】
一実施形態において、上記ポリマー鎖はＲＡＦＴ剤の制御下でエチレン性不飽和モノマーを重合することにより形成される。
【０１６１】
本発明で使用されるＲＡＦＴ剤におけるＺの例としては、任意選択の置換がされた（Ｚ＊の場合には、ｙ価の任意選択の置換がされた）Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、アルキル、アリール、アシル、アミノ、カルボシクリル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アルキルオキシ、アリーロキシ、アシルオキシ、アシルアミノ、カルボシクリルオキシ、ヘテロシクリルオキシ、ヘテロアリーロキシ、アルキルチオ、アリールチオ、アシルチオ、カルボシクリルチオ、ヘテロシクリルチオ、ヘテロアリールチオ、アルキルアリール、アルキルアシル、アルキルカルボシクリル、アルキルヘテロシクリル、アルキルヘテロアリール、アルキルオキシアルキル、アリーロキシアルキル、アルキルアシルオキシ、アルキルカルボシクリルオキシ、アルキルヘテロシクリルオキシ、アルキルヘテロアリーロキシ、アルキルチオアルキル、アリールチオアルキル、アルキルアシルチオ、アルキルカルボシクリルチオ、アルキルヘテロシクリルチオ、アルキルヘテロアリールチオ、アルキルアリールアルキル、アルキルアシルアルキル、アリールアルキルアリール、アリールアシルアリール、アリールアシル、アリールカルボシクリル、アリールヘテロシクリル、アリールヘテロアリール、アリーロキシアリール、アリールアシルオキシ、アリールカルボシクリルオキシ、アリールヘテロシクリルオキシ、アリールヘテロアリーロキシ、アルキルチオアリール、アリールチオアリール、アリールアシルチオ、アリールカルボシクリルチオ、アリールヘテロシクリルチオ、アリールヘテロアリールチオ、ジアルキルオキシ−、ジヘテロシクリルオキシ−ｏｒジアリーロキシ−ホスフィニル、ジアルキル−、ジヘテロシクリル−、または、ジアリール−ホスフィニル、シアノ（即ち、−ＣＮ）、及び、−Ｓ−Ｒが挙げられ、Ｒは式（ＩＩ）に関して決定される。
【０１６２】
一実施形態において、本発明で使用されるＲＡＦＴ剤はトリチオ炭酸塩ＲＡＦＴ剤であり、ＺまたはＺ＊が任意選択の置換がなされたアルキルチオ基である。
【０１６３】
本発明での使用に適したマクロＲＡＦＴ剤は、例えばシグマアルドリッチ社のカタログ（ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ）に記載されたものがある．
【０１６４】
本発明で使用可能なその他のＲＡＦＴ剤としては、ＷＯ２０１０／０８３５６９、及び、Ｂｅｎａｇｌｉａ  ｅｔ  ａｌ、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．（４２）、９３８４−９３８６、２００９に記載のものがある（全内容をここに引用して参照する）．
【０１６５】
一実施形態において、前記分岐ポリマーの少なくとも三つのブロックコポリマーアームはＲＡＦＴ重合によって形成される。
【０１６６】
Ｚ、Ｚ＊、Ｒ、及び、Ｒ＊として選択可能な基を定義する本明細書のリストにおいて、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、カルボシクリル、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及び、ポリマー鎖部位は任意選択の置換がなされていてもよい。
【０１６７】
Ｚ、Ｚ＊、Ｒ、及び、Ｒ＊として選択可能な基を定義する本明細書のリストにおいて、Ｚ、Ｚ＊、Ｒ、または、Ｒ＊は２つ以上のサブ基（例：［グループＡ］［グループＢ］）を含んでおり、これらサブ基の順序はここに提示された順序に限定されない（例：アルキルアリールはアリールアルキルとしても解釈する）。
【０１６８】
前記Ｚ、Ｚ＊、Ｒ、または、Ｒ＊は、分岐、および／または、任意選択の置換がなされていてもよい。前記Ｚ、Ｚ＊、Ｒ、または、Ｒ＊は、任意選択の置換がなされたアルキル部位を有しており、任意選択の置換基としては、前記アルキル鎖の−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲａ−、−Ｃ（Ｏ）−（即ち、カルボニル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（即ち、エステル）、および、−Ｃ（Ｏ）ＮＲａ−（即ち、アミド）から選択される基によって置換されており、Ｒａは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、カルボシクリル、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリールアルキル、および、アシルから選択される基によって置換されている。
【０１６９】
Ｘ価、Ｙ価、多価、または、二価「の」とは、それぞれ特定の基がＸ価、Ｙ価、多価、または、二価のラジカルであることを意味する。例えば、ｘまたはｙが２である場合、特定基が二価のラジカルであるという意味である。当業者であれば、より多価のものについてもこれに基づき判断できるであろう。
【０１７０】
分岐ポリマーの製造は一般的にエチレン性不飽和モノマーの重合を伴う。エチレン性不飽和モノマーの共重合性を判断する要素については本技術分野において各種文献がある。例えば、Ｇｒｅｅｎｌｅｅ，Ｒ．Ｚ．，ｉｎＰｏｌｙｍｅｒ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｂｒａｎｄｕｐ，Ｊ，ａｎｄ  Ｉｍｍｅｒｇｕｔ．Ｅ．Ｈ．Ｅｄｓ）Ｗｉｌｅｙ：ＮｅｗＹｏｒｋ、１９８９、ｐＩＩ／５３を参照されたい（全内容をここに引用して参照する）．
【０１７１】
前記分岐ポリマーの生成に適したエチレン性不飽和モノマーの例としては、下記式（ＩＩＩ）で表されるものが挙げられる。
【化９】
2015509129.tif 000010
上記式において、ＵおよびＷは、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｒ１、−ＣＯＲ１、−ＣＳＲ１、−ＣＳＯＲ１、−ＣＯＳＲ１、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨＲ１、−ＣＯＮＲ１２、水素、ハロゲンａｎｄ任意選択の置換がなされたＣ１−Ｃ４アルキルから独立に選択されるか、ＵおよびＷが共に、任意選択の置換のなされたラクトン、無水物、または、イミド環を形成している。任意選択の置換基は、ヒドロキシ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｒ１、−ＣＯＲ１、−ＣＳＲ１、−ＣＳＯＲ１、−ＣＯＳＲ１、−ＣＮ，−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨＲ１、−ＣＯＮＲ１２、−ＯＲ１、−ＳＲ１、−Ｏ２ＣＲ１、−ＳＣＯＲ１、および、−ＯＣＳＲ１から独立に選択される。
Ｖは、水素、Ｒ１、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｒ１、−ＣＯＲ１、−ＣＳＲ１、−ＣＳＯＲ１、−ＣＯＳＲ１、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨＲ１、−ＣＯＮＲ１２、−ＯＲ１、−ＳＲ１、−Ｏ２ＣＲ１、−ＳＣＯＲ１、および、−ＯＣＳＲ１から選択される。
また、上記式において各Ｒ１は、任意選択の置換がなされたアルキル、任意選択の置換がなされたアルケニル、任意選択の置換がなされたアルキニル、任意選択の置換がなされたアリール、任意選択の置換がなされたヘテロアリール、任意選択の置換がなされたカルボシクリル、任意選択の置換がなされたヘテロシクリル、任意選択の置換がなされたアリールアルキル、任意選択の置換がなされたヘテロアリールアルキル、任意選択の置換がなされたアルキルアリール、任意選択の置換がなされたアルキルヘテロアリール、および、任意選択の置換がなされたポリマー鎖から独立に選択される。
【０１７２】
上記式（ＩＩＩ）のモノマーの具体例としては、ＷＯ２０１０／０８３５６９、ＷＯ９８／０１４７８、ＭｏａｄＧ．；Ｒｉｚｚａｒｄｏ，Ｅ；ＴｈａｎｇＳ，Ｈ．Ｐｏｌｙｍｅｒ２００８，４９，１０７９−１１３１ａｎｄＡｕｓｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．，２００５，５８，３７９−４１０；Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．，２００６，５９，６６９−６９２、Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．，２００９，６２，１４０２−１４７２，Ｇｒｅｅｎｌｅｅ，Ｒ．Ｚ．，ｉｎＰｏｌｙｍｅｒ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｂｒａｎｄｕｐ，Ｊ，ａｎｄＩｍｍｅｒｇｕｔ．Ｅ．Ｈ．Ｅｄｓ）Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９，ｐＩＩ／５３、および、Ｂｅｎａｇｌｉａ  ｅｔ  ａｌ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．（４２），９３８４−９３８６，２００９の１以上の文献に記されているものが挙げられる（全内容をここに引用して参照する）．
【０１７３】
前記分岐ポリマー生成に使用するモノマーの種類を検討する上で、前記モノマーの特徴が親水性、疎水性、または、陽イオン性であるかを参考にすればよい。上記文脈で「特徴が」親水性、疎水性、陽イオン性であるとは、それぞれモノマーの重合により（直接または間接的に）前記ブロックコポリマーアームを形成する親水性、疎水性、および、陽イオン性ポリマーブロックをもたらすという意味である。例えば、ブロックコポリマーアームの一部を形成する親水性ポリマーブロックは、一般的に親水性モノマーを含むモノマーの重合化により生成される。
【０１７４】
目安として、親水性エチレン性不飽和モノマーの非限定的な例としては、アクリル酸、メタクリレート、ヒドロキシメタクリレートエチル、ヒドロキシメタクリレートプロピル、オリゴ（アルキレングリコール）メチルエーテル（ｍｅｔｈ）アクリレート（ＯＡＧ（Ｍ）Ａ）、アクリルアミドおよびメタクリルアミド、ヒドロキシエチルアクリレート、Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドおよびＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド、Ｎ−ヒドロキシプロピルメタクリルアミド、４−アクリロイルモルホリン、２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸、ホスホリルコリンメタクリレートおよびＮ−ビニルピロリドンが挙げられる。
【０１７５】
前述のとおり、前記モノマーが陽イオン性ポリマーブロックをもたらす場合、形成されたポリマーブロックは本質的に帯電陽イオン状態でないこともある。つまり、前記ポリマーブロックを帯電陽イオン性状態に変換するためには、１以上の化合物と反応させる必要がある場合もある。例えば、前記陽イオン性ポリマーブロック形成用に選択された前記モノマーは三級アミン官能基を含んでいてもよい。前記モノマーを重合して陽イオン性ポリマーブロックを形成した後、前記三級アミン官能基はその後正電荷状態に四級化してもよい。
【０１７６】
目安として、陽イオン性エチレン性不飽和モノマーの非限定的な例としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルアクリレート、２−アミノメタクリレートエチルヒドロクロリド、Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピル］メタクリルアミド、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミドヒドロクロリド、Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミド、Ｎ−［２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチル］メタクリルアミド、２−Ｎ−モルホリノエチルアクリレート、２−Ｎ−モルホリノメタクリレートエチル、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチルアクリレート、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）メタクリレートエチル、２−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）メタクリレートエチル、２−アクリルオキシエチルトリメチルアンモニウムクロリド、メタクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリド、２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）メタクリレートエチル、アリルジメチルアンモニウムクロリド、２−（ジエチルアミノ）エチルスチレン、２−ビニルピリジン、および、４−ビニルピリジンが挙げられる。
【０１７７】
目安として、疎水性エチレン性不飽和モノマーの非限定的な例としては、スチレン、アルファ−メチルスチレン、ブチルアクリレート、メタクリレートブチル、アミルメタクリレート、ヘキシルメタクリレート、ラウリルメタクリレート、ステアリルメタクリレート、エチルヘキシルメタクリレート、クロチルメタクリレート、シンナミルメタクリレート、オレイルメタクリレート、リシノレイルメタクリレート、コレステリルメタクリレートｓ、コレステリルアクリレート、酪酸ブチル、ビニルｔｅｒｔ−ブチレート、ビニルステアレート、および、ビニルラウレートが挙げられる。
【０１７８】
前記親水性エチレン性不飽和モノマーＯＡＧ（Ｍ）Ａの場合、前記アルキレン部位は一般的にＣ２−Ｃ６、例えば、Ｃ２またはＣ３、アルキレン部位である。当業者であれば、「（アルキレングリコール）」に伴う「オリゴ」命名法は、複数のアルキレングリコールユニットの存在を参照することを理解するであろう。一般的にＯＡＧ（Ｍ）Ａのオリゴ成分は、約２〜約２００、例えば、約２〜約１００、約２〜約５０、約２〜約２０のアルキレングリコール繰返し単位を含有している。
【０１７９】
前記ブロックコポリマーアームの前記親水性ポリマーブロックは、従って親水性エチレン性不飽和モノマーの重合残余物を含有していると表現される。
【０１８０】
前記ブロックコポリマーアームの前記陽イオン性ポリマーブロックは、陽イオン性エチレン性不飽和モノマーの重合残余物を含有していると表現される。
【０１８１】
前記ブロックコポリマーアームの前記疎水性ポリマーブロックは、疎水性エチレン性不飽和モノマーの重合残余物を含有していると表現される。
【０１８２】
フリーラジカル重合により１以上のエチレン性不飽和モノマーを重合して前記ブロックコポリマーアームの少なくとも一部を形成する場合、前記重合は通常フリーラジカルのソースによる開始を必要とする。
【０１８３】
開始ラジカルのソースは適切なフリーラジカル生成手段により製造すればよい。例えば、適切な化合物（過酸化物、過オキシエステル、アゾ化合物等の熱開始剤）の熱誘発ホモリティック分離、モノマー（例：スチレン）からの自然発生、酸化還元開始システム、光化学開始システム、または、電子線、Ｘ−またはガンマ線等の高エネルギー放射線があげられる。開始剤の例としては、例えばＷＯ２０１０／０８３５６９、および、Ｍｏａｄａｎｄ  Ｓｏｌｏｍｏｎ”Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｓａｔｉｏｎ”、Ｐｅｒｇａｍｏｎ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９９５、ｐｐ５３−９５を参照されたい（全内容をここに引用して参照する）．
【０１８４】
前記分岐ポリマーは、本技術分野で公知の技術を用いて構築してもよい。例えば、前記ポリマーのブロックコポリマーアームは、まず適切な重合反応により形成し、その後適切な支持部分に連結させても良い。この手法は、「Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｏｎｔｏ」アプローチとして知られている。
【０１８５】
また、前記ポリマーのブロックコポリマーアームを適切な支持部分から直接、モノマーを重合して形成してもよい。この手法は「Ｃｏｒｅ  ｆｉｒｓｔ」アプローチとして知られている。
【０１８６】
「Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｏｎｔｏ」アプローチと「Ｃｏｒｅ  ｆｉｒｓｔ」アプローチとを組み合わせることも可能である。この場合、例えば、適切な支持部分からモノマーを直接重合し、陽イオン性ポリマーブロックを形成する（ｃｏｒｅ  ｆｉｒｓｔ）。予め形成された親水性ポリマーブロックを前記陽イオン性ポリマーブロックに連結させてブロックコポリマーアームを形成する（ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｏｎｔｏ）。
【０１８７】
「ｃｏｒｅ  ｆｉｒｓｔ」アプローチの場合、一実施形態において前記分岐ポリマーは下記一般式（ＩＶ）のリビング重合剤により生成してもよい。
【化１０】
2015509129.tif 000011
上記式において、ＳＭは支持部分、（存在する場合）ＬＭは連結部分、ＬＰＧはリビング重合基、ｘは０または１、ｖは３以上の整数を表している。
【０１８８】
一実施形態において、ＬＰＧはリビングイオン重合、または、制御ラジカル重合を促進させる基から選択される。ＬＰＧが制御ラジカル重合を促進させる場合、当該ＬＰＧはＣＲＰＧとして示される。
【０１８９】
一実施形態において、ＣＲＰＧはイニファーター重合、ＳＦＲＰ重合、ＡＴＲＰ、または、ＲＡＦＴ重合を促進させる基から選択される。
【０１９０】
ＣＲＰＧが、ＲＡＦＴ重合を促進させる場合、上記式（ＩＶ）は下記式（Ｖ）のように表される。
【化１１】
2015509129.tif 000012
上記式において、ＳＭは支持部分、（存在する場合）ＬＭは連結部分、Ｒａは上記式（Ｉ）に関して定義した通りの二価のＲ＊を表し、Ｚは上記式（Ｉ）に関して定義した通り、ｘは０または１、ｖは３以上の整数を表す。上記一般式（Ｖ）からわかるように、ＬＭおよびＲａにより、ＲＡＦＴ部位（即ち、Ｓ−Ｃ（Ｓ）−Ｚ）を前記支持部分ＳＭに連結させることが可能となる。上記一般式（Ｖ）におけるＬＭの機能は従って、分子構造に存在するか、存在しない特徴として識別され、存在する場合、生分解性であってもなくてもよい。上記一般式（Ｖ）においてＲａも生分解性であるが、これについては必須ではない。これに対し、上記一般式（Ｖ）のＬＭ（存在する場合）は、特にオプションの場合、生分解性である。
【０１９１】
一実施形態において、一般式（Ｖ）の各特徴は独立に、アルキル、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、および、配位化合物から選択されるＳＭ、エステル、無水物、炭酸塩、過酸化物、過オキシエステル、リン酸塩、チオエステル、尿素、チオウレタン、エーテル、二硫化物、カルバミン酸塩（ウレタン）、および、ボロン酸エステルから選択される１以上の官能基を介して生分解性のＬＭ、二価の任意選択の置換がなされたアルキル、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール（好ましくは、ここに定義される任意選択の置換基、特にアルキル、および、シアノ）から選択されるＲａ、および、任意選択の置換がなされたアルキル、アリール、アルキルチオ、および、アリールチオ（好ましくは、ここ定義される任意選択の置換基、特にアルキル、および、シアノ）から選択されるＺにより定義される。
【０１９２】
ＬＭが「１以上の官能基を介して生分解性」であるとは、官能基が直接共有結合を提供する１連の原子列の一部を形成するという意味で有る。つまり、このような官能基の少なくとも１つの原子が、原子列に直接存在しポリマーの関連部位を共有結合的に結合する（例：支持部分をブロックコポリマー鎖に）。
【０１９３】
別の実施形態において、一般式（Ｖ）は下記構造（Ｖａ）または（Ｖｂ）を有している。
【化１２】
2015509129.tif 000013
【化１３】
2015509129.tif 000014
【０１９４】
本発明によれば、分岐ポリマーと核酸分子とを含む複合体も提供することが可能である。「複合体」とは、前記分岐ポリマーおよび核酸分子のイオン結合を伴うことを意味する。イオン結合は、分岐ポリマーの陽イオン性ポリマーブロックと核酸分子に伴う反対電荷のイオン間の静電引力によって起こる。このことから、陽イオン性ポリマーブロックが正電荷であり、核酸分子が負電荷であることにより必要とされる静電引力が促進され複合体が形成されることを理解できるであろう。
【０１９５】
核酸分子の正味の負電荷は、一般的に負電荷の核酸（例：リン酸塩基）そのものに由来する．核酸分子をどのように修飾しても、分岐ポリマーとのイオン結合により複合体が形成可能な程度の正味の負電荷が維持されるべきである。
【０１９６】
理論による限定ではなく、分岐ポリマーと核酸分子は、負電荷の核酸分子のバックボーンと分岐ポリマーの陽イオン性ブロクとの間のイオン性相互作用によりナノ粒子を形成すると考えられている。分岐ポリマーの陽イオン性電荷の数によって、ポリマーに１以上の核酸分子が伴い複合体を形成し、複合化された核酸分子の数がポリマーのアーム／分岐の数を増加させる。従って、分岐ポリマーは、線状の対応物と比較して、各分岐ポリマー分子に対してより多くの核酸分子が複合化される点において優れている。また、分岐ポリマーは、各ポリマー分子内の複数の陽イオン性ブロクにより、核酸分子が２つ以上の分岐ポリマー分子間の架橋分子として作用し巨大な複合構造を形成可能にする。
【０１９７】
前記分岐ポリマーと核酸分子とを含む複合体は、陽イオン性ポリマー／核酸分子複合体の形成に公知の手法を用いて生成することができる。例えば、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ登録商標等の還元型血清媒体を入れた容器に、水に懸濁したポリマーを必要な量供給する。その後、この溶液中に必要となる量の核酸分子を供給し、得られた混合物を適切な時間撹拌させることにより複合体を形成する。
【０１９８】
核酸分子は市販されているものであってもよく、本技術分野において公知の手法を用いて生成、または、分離してもよい。
【０１９９】
複合体の形成に使用する、分岐ポリマーと核酸分子との比率は特に限定されない。当業者であれば、分岐ポリマー、核酸、分子の（ゼータ電位として示される）電荷密度が分岐ポリマーと核酸分子都の比率とともに得られる複合体の帯電／中性状態に影響することを認識し得るであろう。
【０２００】
一実施形態において、前記複合体は正のゼータ電位である。別の実施形態において、複合体の正のゼータ電位は０ｍＶより高く約５０ｍＶ以下であり、例えば、約１０ｍＶ〜約４０ｍＶ、約１５ｍＶ〜約３０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約２５ｍＶの範囲である。
【０２０１】
本発明による複合体のゼータ電位はマルバーン社のゼータサイザーで計測したとおりである。前記ゼータ電位は、電界における粒子の移動性（電気泳動度）の計測とサンプル中の粒度分布から算出される。
【０２０２】
ここで「核酸分子」とは、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ）、（二重鎖または一本鎖の）オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ（センスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ＰｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小核小体ＲＮＡ（ＳｎｏＲＮＡ）、低分子核（ＳｎＲＮＡ）リボザイムｓ、アプタマー、ＤＮＡザイム、リボヌクレアーゼ−型複合体、および、ここに記載されるその他の分子を含む核酸分子のことである。疑義を回避するために、「核酸分子」とは非自然発生の修正型および自然発生型の双方を含む。
【０２０３】
実施形態には、核酸分子が約８〜約８０の核酸塩基（即ち、約８〜約８０の連続的に連結する核酸）を含むものもある。当業者であれば、本発明によって具現化される核酸分子には核酸塩基の長さが、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、または、８０のものが有ることを理解し得るであろう。
【０２０４】
「核酸分子」という用語には、オリゴヌクレオチド類似体、キメラ、ハイブリッド、擬態型等のその他のファミリーの化合物も含まれる。
【０２０５】
キメラ型オリゴマーの化合物は、非限定的にオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオシド、および、オリゴヌクレオチド擬態物を含む２つ以上の核酸分子の複合体構造として形成されてもよい。通常使用されるキメラ化合物として、非限定的ハイブリッド、ヘミマー、ギャップマー、拡張ギャップマー、反転ギャップマーおよびブロックマーが挙げられ、各種修飾ポイントおよび領域はネイティブまたは修飾ＤＮＡ、および、ＲＮＡ型ユニットおよび／または擬態型サブユニット、例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ、および、その他から選択される。このようなハイブリッド構造の生成は例えば、米国特許ＮＯ．５，０１３，８３０、５，１４９，７９７、５，２２０，００７、５，２５６，７７５、５，３６６，８７８、５，４０３，７１１、５，４９１，１３３、５，５６５，３５０、５，６２３，０６５、５，６５２，３５５、５，６５２，３５６、および５，７００，９２２に記載されており、各文献の内容をここに引用して参照する。
【０２０６】
ＲＮＡおよびＤＮＡアプタマーについても検討する。アプタマーは、クラシックワトソンークリック型塩基対以外との相互作用を介して、非核酸または核酸分子との特定の結合親和性を有する核酸分子である。アプタマーについては、例えば米国特許ＮＯ．５，４７５，０９６、５，２７０，１６３、５，５８９，３３２、５，５８９，３３２、および、５，７４１，６７９に記載されている。非核酸ターゲットを認識するより多くのＤＮＡとＲＮＡアプタマーを開発し特徴づけた（例えばＧｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６４：７６３−７９７．１９９５；Ｂａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ、３（６）：２６５−２７３、１９９８参照）。
【０２０７】
前記核酸分子をさらに修飾してもよく、いずれか１つの末端、選択された核酸塩基位置、糖位置、または、ヌクレオシド結合の一つに付随するコンジュゲート基を含んでいてもよい。
【０２０８】
本発明はまた核酸分子を細胞へ送達する方法であって、前記方法は、
（ａ）分岐ポリマーと核酸分子とを含有する複合体を提供する工程であって、前記分岐ポリマーは支持部分と支持部分と共有結合的に連結され延在する少なくとも三つのブロックコポリマー鎖とを含有し、
（ｉ）前記少なくとも三つのブロックコポリマー鎖のそれぞれが、（ａ）親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロック、または、（ｂ）親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された疎水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロックを含有し、
（ｉｉ）前記ブロックコポリマー鎖それぞれの前記共有結合の少なくとも１つが生分解性である、前記複合体を提供する工程と、
（ｂ）前記細胞へ前記複合体を送達する工程とを備えた方法。
【０２０９】
この方法は生体内、体外または生体外で行うことができる。
【０２１０】
本発明によると、ここに記載される本発明の核酸分子複合体の治療上効果的な量を必要とする対象に投与することを含む遺伝子治療の方法も提供される。
【０２１１】
例えば嚢胞性繊維症、血友病、および、鎌状赤血球貧血、ベータサラセミア等の異常グロビン症（ｇｌｏｂｉｎｏｐａｔｈｙ）等の遺伝性疾患について研究すると、遺伝子治療としてのＤＮＡ修復および媒介による組み換えの関連性が明確になる。例えば、標的遺伝子に遺伝子疾患の原因となる変異が含まれる場合、被験体の細胞に核酸分子を送達することにより、変異原性を修復し異常な標的遺伝子のＤＮＡ塩基配列を正常に復元することができる。また、被験体の細胞へ核酸分子を送達することにより遺伝子が発現するか、または、疾病状態の遺伝子発現が抑止または抑制することができる。上記核酸分子は、核酸分子そのものがサイレンシング遺伝子または抑制遺伝子をエンコードするか、或いは、核酸分子が標的とする抑制遺伝子またはサイレンシング遺伝子の転写または翻訳を促進する。
【０２１２】
当業者であれば、本発明による方法での治療対象となる疾病または病状が、遺伝子治療によって治療可能なあらゆる疾病または病状であり、使用する遺伝物質（即ち、核酸分子）については具体的な疾病または病状に応じて選択されることを明確に理解し得るであろう。治療可能な疾病または病状の非限定的な例としては癌（例：骨髄性疾患）、サラセミア、嚢胞性繊維症、難聴、視覚障害（例：レーバー先天性黒内障）、糖尿病、ハンチントン病、Ｘ連鎖重症複合免疫不全、および、心臓病等が挙げられる。また、遺伝子治療により例えば生体発光用の遺伝子等の非内因性の遺伝子を導入したり、内因性の遺伝子をノックアウト（例：ＲＮＡ干渉）する遺伝子を導入したりしてもよい。
【０２１３】
当業者であれば、前記核酸分子の性質が常に治療または予防の対象となる疾病または病状に依存することも理解し得るであろう。例えば、繊維性細胞外マトリクス物質（例：タイプＩＩコラーゲン）の蓄積に少なくとも部分的に起因する疾病または病状にたいしては、細胞外マトリクス物質をエンコードする遺伝子をサイレンシング可能な本発明の核酸分子（例：ｓｉＲＮＡ）の複合体を対象に（標的手法または非標的手法で）送達することにより治療または予防可能となる。また幾つかの実施形態において、前記疾病または病状は伝染病、炎症性疾患、または、癌である。
【０２１４】
本発明による核酸分子複合体を生体内的に細胞へ送達する場合、前記核酸分子複合体は状況に応じた任意の投薬経路を介して細胞に導入されてもよい。例えば、全身にたいする送達の場合、前記複合体は例えば静脈内的に、皮下的に、筋肉内的に、経口的に投与してもよい。また、前記複合体の標的を、当業者に周知の方法で特定される細胞または細胞型にしてもよい。標的化が望まれる理由としては、例えば癌細胞が標的となる場合、核酸分子が非癌細胞に対して許容範囲を超える程有害であるか、大量の投薬が必要となる等の理由が挙げられる。標的への送達は、受容体介在型標的化、または、標的細胞を含む組織への直接的な核酸複合体の投薬等、当業者に周知の手段によって行われるが、これに限定されない。
【０２１５】
受容体介在型の標的化は、例えば前記核酸分子にタンパク質配位子（例：ポリリジン）を接合させることによって行われてもよい。前記配位子は、一般的に標的細胞／組織型の表面上に、対応する配位子受容体が存在するものが選択される。接合された前記配位子と核酸分子は、本発明の分岐ポリマーに複合化して、必要に応じて全身に投与（例：静脈内的に）することにより、レセプター結合が発生し得る標的細胞／組織へ仕向けてもよい。
【０２１６】
一実施形態において、本発明による核酸分子は体外的に細胞に送達される。例えば、細胞を被験体から隔離し、本発明の核酸分子複合体を体外で導入し、外因性核酸分子を含む細胞を作成する。前記細胞を治療対象または同一遺伝子のホストから隔離する。その後、細胞を再度対象（同一遺伝子の受容体）に戻して治療または予防を行う。幾つかの実施形態において、前記細胞は造血前駆細胞または幹細胞である。
【０２１７】
一実施形態において、前記核酸分子は遺伝子発現をサイレンシング（または抑制）させるために細胞に送達される。幾つかの実施形態において、翻訳効率を下げたり、メッセージ安定性を下げたり、またはこれらの組合せ効果によって遺伝子発現をサイレンシングさせる。また、幾つかの実施形態において、非機能的、または、活動の鈍化したタンパク質の生成を引き起こす未処理ＲＮＡをスプライシングすることが目的となる。
【０２１８】
また幾つかの実施形態では、非限定的にｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、（一本鎖または二本鎖）ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡ分子を細胞に送達することで遺伝子発現を抑制する。
【０２１９】
また幾つかの実施形態では、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により遺伝子発現を抑制する。本発明を特定の理論や作用態様に限定することなく説明すると、一般的に「ＲＮＡ干渉」とは、例えば配列特異的にｍＲＮＡを分解またはｍＲＮＡの翻訳防止により遺伝子発現をサイレンシングさせるメカニズムである。当業者であれば、外因的に干渉するＲＮＡ分子によってｍＲＮＡが分解されるか、または、ｍＲＮＡの翻訳が抑制されることを理解し得るであろう。幾つかの実施形態において、ＲＮＡ干渉は読み枠を変更することにより、ナンセンス変異依存分解の原因となる１以上の不完全な終止コドンを導入する。
【０２２０】
ＲＮＡｉは、目標ｍＲＮＡ分解を経て遺伝子発現を配列特異的に減少させる二本鎖（センスおよびアンチセンス）ＲＮＡを伴う遺伝子サイレンシングの工程を含む。ＲＮＡｉは一般的に短二本鎖ｓｉＲＮＡ、または、一本鎖マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）によって媒介される。幾つかの実施形態において、ＲＮＡｉは、これら分子のいずれかのＲＮＡ鎖でＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれる複合体が形成されると開始され、前記ＲＩＳＣが相補性ＲＮＡを標的として翻訳を抑止する。この工程は研究目的および治療応用のために開発されている（例えばＩｚｑｕｉｅｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１２（３）：２１７−２７、２００５参照）。
【０２２１】
ＲＮＡのような特性を有する他のオリゴヌクレオチドについても記載があり、より多くの種類のＲＮＡｉが開発可能である。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドにより、エキソンを変更しｐｒｅ−ＲＮＡスプライシングの調整が行われてきた（例えば、Ｍａｄｏｃｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１２：１０１３−１０２２、２００５、および、Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓｅｔａｌ．、ＢＭＣ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ．、８：４３、２００７参照）。ここで、アンチセンスおよびｉＲＮＡ化合物は、二本鎖または一本鎖オリゴヌクレオチドであって、具体的に目的とする標的遺伝子のＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズする、ＲＮＡ、または、ＲＮＡ的な分子、或いは、ＤＮＡ、または、ＤＮＡ的な分子のオリゴヌクレオチドであってもよい。
【０２２２】
本発明での使用に適したＲＮＡ分子の非限定的な例としては、以下の物が挙げられる。
（ｉ）長二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）ーそれぞれが自身のベクターにより転写されたセンスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖をハイブリダイズすることにより得られたもの。一般的に前記二本鎖分子は、ヘアピンループで特徴付けられない。これら分子は、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の二本鎖を生成するために、ダイサー等の酵素によって開裂させる必要がある。上記開裂は、前記ｄｓＲＮＡが転写される細胞内で行われることが好ましい。
（ｉｉ）ヘアピン二本鎖ＲＮＡ（ヘアピンｄｓＲＮＡ）−これら分子はステムループ構造を有しており、一般的にイントロン等のヌクレオチドスペーサー領域により分離された逆位反復配列を有する構成を転写することにより得られる。これら分子は一般的により長いＲＮＡ分子であり、ｓｉＲＮＡの生成には、開裂されるヘアピンループとその結果として得られるダイサーという酵素によって開裂される線状二本鎖分子の双方が必要となる。この種の分子は単一のベクターによって発現可能である点において有利である。
（iii）短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）−これらは合成により生成されてもよく、または、自身のプロモーターおよび４〜５チミジン転写終始部位によって特徴付けられるタンデム型のセンスおよびアンチセンス鎖を含むベクターのプロモーターに基づく発現により組換的に発現させられてもよい。これにより、２つの別々の転写物が生成され、これら転写物が後にアニールされる。幾つかの実施形態において、これら転写物は長さが約２０〜２５ヌクレオチドであってもよい。従って、これら分子はさらに開裂を必要とすることなく、ＲＮＡ干渉経路においてその機能性を有効にすることができる。
（ｉｖ）ショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）−これら分子は「小ヘアピンＲＮＡ」としても知られており、一般的に長さがｓｉＲＮＡ分子と類似している。しかし、これら分子はＲＮＡ分子の逆反復配列を含んでおり、これら逆方向反復塩基配列はヌクレオチドスペーサーによって分離される。ヘアピン（ループ）領域を開裂させた後、機能的なｓｉＲＮＡ分子が生成される。
（ｖ）マイクロＲＮＡ／小分子ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ／ｓｔＲＮＡ）−ｍｉＲＮＡおよびｓｔＲＮＡは、一般的に自然発生型の内因的に発現される分子を表すと理解されている。従って、ｍｉＲＮＡの作用を模倣する分子の設計と投与は、合成により生成されるか組換的に発現させられたｓｉＲＮＡ分子という形態となるが、本発明においては、本質的に同一のＲＮＡ配列および全体的な構造によってｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、または、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ分子を模倣するオリゴヌクレオチドの設計と発現までを包含する。組換的に生成された分子は、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡと称される。
（vi）空間的発達（ｓｄＲＮＡ）、応力応答型（ｓｒＲＮＡ）、または、細胞周期（ｃｃ
ＲＮＡ）を媒介するｍｉＲＮＡ。
（vii）内因的に発現されたｍｉＲＮＡ、または、ｓｔＲＮＡ、外因的に導入されたｓｉＲ
ＮＡをハイブリダイズし機能を防止するＲＮＡオリゴヌクレオチド。幾つかの実施形態において、前記分子はＲＮＡ干渉メカニズムを引き起こすように設計されたものではなく、むしろ細胞内環境に存在するｍｉＲＮＡ、および／または、ｓｉＲＮＡ分子により、このような発現増加を防止するものであるということが理解できるであろう。ハイブリダイズされたｍｉＲＮＡの効果という点では、どちらかと言えば典型的なアンチセンス阻害に該当する。
【０２２３】
「ＲＮＡオリゴヌクレオチド」とは、二本鎖または一本鎖であり、標的遺伝子の発現をサイレンシングするためのＲＮＡ干渉メカニズムを誘発可能なＲＮＡ核酸分子と解釈するべきである。従って前記オリゴヌクレオチドは、直接ＲＮＡ干渉メカニズムを調整するか、（ｉ）ヘアピン領域の切除を必要とするヘアピン二本鎖ＲＮＡ、（ｉｉ）ダイサーによる開裂を必要とする、より長い二本鎖ＲＮＡ分子、または、（iii）同様に開裂を必要とするｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ等の前駆体分子のように更なる処理を必要とする。上記オリゴヌクレオチドは（ＲＮＡ干渉の効力という面で一般的な）二本鎖、または、（内因性の発現遺伝子との連結に適したＲＮＡオリゴヌクレオチドの生成のみを目的とする場合には）１本鎖である。
【０２２４】
別の実施形態において、前記核酸分子はスプライスドナー部位またはスプライスアクセプター部位に接合し、翻訳開始を抑止する。別の実施形態において、接合の修飾は読み枠を変更し、転写物の非センス媒介型の分解を開始する。
【０２２５】
当業者であれば、本発明、または、その他のいずれの場合でも使用に最適な核酸分子を判断することができるであろう。例えば、ＲＮＡ分子は標的核酸配列に対して１００％の相補性を示すことが好ましいが、配列特有的にＲＮＡ干渉反応を促進させるのに充分なハイブリダイズが行われるのであれば、前記ＲＮＡ分子がある程度のミスマッチを示しても良い。従って、前記ＲＮＡ分子の標的核酸配列に対する配列相補性は、少なくとも７０％であることが好ましく、より好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは９５％、９７％、９６％、９８％、９９％、または、１００％である。
【０２２６】
本発明での使用に適した核酸分子の設計に関連する別の例として、前記核酸分子が例えばｄｓＲＮＡ、ヘアピンｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、または、ここに記載されるその他の好適な態様のどれにするか等、特定の構成および分子の長さの判断は当業者のスキルの範囲である。例えば、ヘアピンｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等のステムループ型ＲＮＡ構造は一般的に遺伝子サイレンシングという点で、例えばセンスおよびアンチセンスＲＮＡ鎖を個別にコーディングする２つの構成を用いて生成する二本鎖ＤＮＡと比較して効率がよいと考えられている。また、介在スペーサー領域の性質および長さは、ステムループ型ＲＮＡ分子の機能性に影響し得る。さらに別の例として、短ｄｓＲＮＡ分子を使用する場合よりも長ｄｓＲＮＡを使用する場合により重要なリスクとなるインターフェロン反応が起こりうるリスクが特定の細胞環境において存在する場合、ダイサー等の酵素による開裂を必要とする長ｄｓＲＮＡ、または、短ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、または、ｓｈＲＮＡ）が関わってくる。さらに別の例として、一本鎖または二本鎖核酸分子の必要性については、求める機能的帰結による。例えば、アンチセンス分子で内因的に発現されるｍｉＲＮＡを標的とした場合、具体的に対象となるｍｉＲＮＡにハイブリダイズするのに適した一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計することが適切となる。ＲＮＡ干渉の促進までを目的とするならば、二本鎖ｓｉＲＮＡ分子が必要となる場合もある。また、幾つかの実施形態において、さらに開裂が行われる長ｄｓＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡとして設計してもよい。
【０２２７】
ここで「遺伝子」とは、最も広義の意味で用いられ、遺伝子のエキソンに対応するｃＤＮＡを含む。またここで、「遺伝子」とは、転写性および／または翻訳性制限配列、および／または、コーディング領域および／または非翻訳配列（即ち、イントロン、５’−および３’−非翻訳配列）を含む典型的なゲノム遺伝子、または、
コーディング領域（即ち、エキソン）、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、および、遺伝子の５’−および３’−非翻訳配列に対応するｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ分子としても解釈される。
【０２２８】
「発現」とは、広義での遺伝子発現を意味し、遺伝子または核酸分子から、前転写、転写および翻訳、翻訳後工程を経てタンパク質またはＲＮＡを作成する工程の全てを含む。
【０２２９】
また、ここで言う「細胞」とは、真核性細胞（例：動物細胞、植物細胞、および、菌類または原生生物の細胞）および原核性細胞（例：細菌類）を含む。一実施形態において、細胞はヒトの細胞である。
【０２３０】
ここでいう「被験体」とは、動物またはヒトの被験体である。「動物」とは、霊長類、家畜（牛、馬、羊、豚、山羊等）、コンパニオン動物（犬、猫、うさぎ、モルモット等）、捕獲された野生動物（一般的に動物園で見られる動物）、水生動物（魚や甲殻類等の淡水性または海水性動物）を意味する。好適な実験システムを提供し得ることから、うさぎ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター等の実験動物もまた含まれる。幾つかの実施形態において、前記被験体とはヒトの被験体である。
【０２３１】
被験体に対する複合体または組成物の「投与」とは、薬剤または組成物が被験体に提供または送達されるように提供することを意味する。投与の形態に関しては特に制限は無いが、経口投与、非経口投与（皮下、皮内、筋肉内、静脈内、髄こう内、髄腔内投与を含む）、吸入式投与（噴霧療法を含む）、直腸および膣内投与が一般的である。
【０２３２】
理論による拘束または限定されることなく説明すると、本発明の複合体がＲＮＡ分解酵素および／またはＤＮＡ分解酵素等の酵素により、核酸分子を分解から保護することがわかっている。
【０２３３】
本発明は、酵素的分解から核酸分子を保護する方法であって、前記方法は、支持部分と前記支持部分と共有結合的に連結され延在する少なくとも三つのブロックコポリマー鎖とを含む分岐ポリマーで前記核酸分子を複合化させる工程を備え、
（ｉ）前記少なくとも三つのブロックコポリマー鎖のそれぞれは、（ａ）親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロック、または、（ｂ）親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された疎水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロックを含み、
（ｉｉ）前記ブロックコポリマー鎖に伴う共有結合の少なくとも一つが生分解性である核酸分子保護方法を提供する。
【０２３４】
また、細胞に核酸分子を送達する複合体の用途であって、前記複合体は、分岐ポリマーと核酸分子とを含み、前記分岐ポリマーは支持部分と前記支持部分と共有結合的に連結され延在する少なくとも三つのブロックコポリマー鎖とを含んでおり、
（ｉ）前記少なくとも三つのブロックコポリマー鎖のそれぞれは、（ａ）親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロック、または、（ｂ）親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された疎水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロックを含んでおり、
（ｉｉ）前記ブロックコポリマー鎖に伴う共有結合の少なくとも一つが生分解性である、細胞に核酸分子を送達する複合体の用途を提供する。
【０２３５】
本発明はまた遺伝子の発現をサイレンシングさせる複合体の用途であって、前記複合体は分岐ポリマーと核酸分子とを含み、前記分岐ポリマーは支持部分と前記支持部分と共有結合的に連結され延在する少なくとも三つのブロックコポリマー鎖とを含み、
（ｉ）前記少なくとも三つのブロックコポリマー鎖のそれぞれは、（ａ）親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロック、または、（ｂ）親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された疎水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロックを含んでおり、
（ｉｉ）前記ブロックコポリマー鎖に伴う共有結合の少なくとも一つが生分解性である複合体の用途を提供する。
【０２３６】
一実施形態において、前記核酸分子は、ＤＮＡおよびＲＮＡから選択される。別の実施形態において、前記ＤＮＡおよびＲＮＡは、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、一本鎖または二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、センスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、小／短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ＰｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ／小分子ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ／ｓｔＲＮＡ）、小核小体ＲＮＡ（ＳｎｏＲＮＡ）、低分子核（ＳｎＲＮＡ）リボザイム、アプタマー、ＤＮＡザイム、リボヌクレアーゼ−型複合体、ヘアピン二本鎖ＲＮＡ（ヘアピンｄｓＲＮＡ）、空間的発達を媒介するｍｉＲＮＡ（ｓｄＲＮＡ）、応力応答型ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）、細胞周期ＲＮＡ（ｃｃＲＮＡ）および一本鎖または二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドから選択される。
【０２３７】
理論による拘束または限定されることなく説明すると、本発明の前記複合体は、ＲＮＡ分解酵素および／またはＤＮＡ分解酵素等の酵素による分解から核酸分子を保護することがわかっている。
【０２３８】
本発明はさらに、酵素的分解から核酸分子を保護する分岐ポリマーの用途であって、前記分岐ポリマーは、支持部分と前記支持部分と共有結合的に連結し、前記支持部分から延在する少なくとも三つのブロックコポリマー鎖とを含み、
（ｉ）前記少なくとも三つのブロックコポリマー鎖のそれぞれは、（ａ）親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロック、または、（ｂ）親水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された疎水性ポリマーブロックと共有結合的に連結された陽イオン性ポリマーブロックを含んでおり、
（ｉｉ）前記ブロックコポリマー鎖に伴う共有結合の少なくとも一つが生分解性である分岐ポリマーの用途を提供する。
【０２３９】
本発明はまた医薬組成物等の、本発明の核酸分子複合体を含む組成物にも関する。幾つかの実施形態において、前記組成物は本発明の核酸分子複合体と１以上の医薬的に許容可能なキャリア、希釈剤、および／または、付形剤を含む。
【０２４０】
本発明の前記組成物において、前記核酸分子複合体は一般的に有効な量の投与を行うために公式化されている。ここでいう前記核酸複合体の「有効な量」および「治療上有効な量」とは、一般的に少なくとも統計的に顕著な数の被験体において所望の治療または予防効果をもたらすのに充分な量の複合体という意味である。
【０２４１】
幾つかの実施形態において、ヒトの被験体に対する有効な量とは約０．１ｎｇ／ｋｇ体重／服用〜１ｇ／ｋｇ体重／服用の範囲である。幾つかの実施形態において、前記範囲は約１μｇ〜１ｇ、約１ｍｇ〜１ｇ、１ｍｇ〜５００ｍｇ、１ｍｇ〜２５０ｍｇ、１ｍｇ〜５０ｍｇ、または、１μｇ〜１ｍｇ／ｋｇ体重／服用である。投与量は、状況の緊急性によって調整され、治療または予防の最適な量に調整される。
【０２４２】
「医薬的に許容可能な」キャリア、付形剤、および／または、希釈剤とは、生物学的またはその他の観点から望ましい物質を含む薬剤溶媒であり、即ち、全くまたは実質的に有害反応を引き起こすことなく本発明の複合体とともに被験体に投与可能な物質のことである。
【０２４３】
本発明の一態様では、被験体の伝染病、炎症性疾患、または、癌を治療する方法であって、前記方法は前記被験体に本発明による複合体、または、本発明による医薬品組成物を投与する工程を含有する。
【０２４４】
本発明による分岐ポリマーの重要な特徴点は、生物学的環境における分解に影響を受けやすい生分解性共有結合の存在である。生分解性共有結合のタイプによっては、前記生物学的環境に存在する酸化的、還元的、加水分解性または、酵素的分解経路が、複合化された核酸の置かれた分子環境の変化とともに、結合の開裂を促し、前記分岐ポリマーの分子量を減少させる。例えば、ジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合を伴う分岐ポリマーは、細胞のエンドゾーム的な区画内における還元開裂に影響されやすい。このような分解はポリマー／核酸分子複合体の分離を引き起こすので、核酸分子をより効率的に開放し、例えば遺伝子サイレンシングでの役割を担いやすいと考えられている。さらに、分岐ポリマーの分子量を減らすことにより、前記核酸分子を送達後、細胞内環境からポリマーの残余物を排除する働きを強めることが可能となる。
【０２４５】
ここで単独または化合物名で用いられる「アルキル」とは、直鎖の、分岐状の、または、環状のアルキルを表し、好ましくはＣ１−２０アルキルである（例：Ｃ１−１０、または、Ｃ１−６）。直鎖状および分岐状アルキルの例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、１，２−ジメチルプロピル、１，１−ジメチル−プロピル、および、ヘキシルが挙げられる。環式アルキルの例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル等のモノ−または多環式アルキル基が挙げられる。アルキル基が一般的に「プロピル、ブチル」等のように称される場合、アルキル基が直鎖状の、分岐状の、および、環式の異性体と適切に解釈されるであろう。アルキル基は、ここで定義される１以上の任意選択の置換基により任意選択の置換がなされていてもよい。
【０２４６】
「アルケニル」とは、炭素同士の二重結合を少なくとも１つ含む直鎖状、分岐状の、または、環式の炭化水素の残余物から形成される基を表し、例えば上述したエチレン性モノ−、ジ−、または、ポリ不飽和アルキル、または、シクロアルキル基が挙げられ、好ましくはＣ２−２０アルケニル（例：Ｃ２−１０、または、Ｃ２−６）である。アルケニルの例としては、ビニル、アリル、１−メチルビニル、および、ブテニルが挙げられる。アルケニル基は、上述の通り１以上の任意選択の置換基によって任意選択の置換がなされていてもよい。
【０２４７】
「アルキニル」は、炭素同士の三重結合を少なくとも１つ含む直鎖状、分岐状の、または、環式の炭化水素の残余物から形成される基を表し、例えば上述したエチレン性モノ−、ジ−、または、ポリ不飽和アルキル、または、シクロアルキル基が挙げられる。炭素原子の数が特定されない限り、「アルキニル」とは、好ましくはＣ２−２０アルキニル（例：Ｃ２−１０、または、Ｃ２−６）のことである。エチニルの例としては、１−プロピニル、２−プロピニル、および、ブチニル異性体、および、ペンチニル異性体が挙げられる。アルキニル基は、上述のとおり１以上の任意選択の置換基によって任意選択の置換がなされていてもよい。
【０２４８】
「ハロゲン」（「ハロ」）とは、フッ素、塩素、臭素、または、ヨウ素（フルオロ、クロロ、ブロモ、または、ヨード）を表す。
【０２４９】
「アリール」（「カルボアリール」）とは、芳香族炭化水素環系（例：Ｃ６−２４、または、Ｃ６−１８）の複合化され融解した同一の多核性残余物を表す。アリールの例としては、フェニル、ビフェニル、テルフェニル、クアテルフェニル、および、ナフチルが挙げられる。アリール基は、上述のとおり１以上の任意選択の置換基によって任意選択の置換がなされていてもよい。「アリーレン」とは、二価のアリールを表す。
【０２５０】
「カルボシクリル」とは、非芳香性の単環式、多環式、融解、または、複合化炭化水素残余物を表し、好ましくはＣ３−２０（例：Ｃ３−１０、または、Ｃ３−８）である。前記環は飽和状態であってもよく（例：シクロアルキル）、１以上の二重結合（シクロアルケニル）および／または１以上の三重結合（シクロアルキニル）を有していてもよい。カルボシクリル基は、上述のとおり１以上の任意選択の置換基により任意選択の置換がなされていてもよい。「カルボシクリレン」とは、二価のカルボシクリルを表す。
【０２５１】
ここでいう「ヘテロ原子」または「ヘテロ」とは広義で、環状有機基のメンバーとなり得る炭素原子以外のあらゆる原子のことである。ヘテロ原子の具体例としては、窒素、酸素、硫黄、亜リン酸、ホウ素、シリコン、セレン、および、テルルが挙げられ、より具体的には窒素、酸素、および、硫黄が挙げられる。
【０２５２】
「ヘテロシクリル」は単体で使用しても、または、化合物名で使用しても、単環式、多環式、融解または複合化炭化水素残余物を表し、好ましくは非芳香性の残余物が得られるように１以上の炭素原子がヘテロ原子で置き換えられているＣ３−２０（例：Ｃ３−１０、または、Ｃ３−８）である。好適なヘテロ原子としては、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、および、Ｓｅ、特にＯ、ＮおよびＳが挙げられる。２つ以上の炭素原子が置換されている場合、２つ以上の同一のヘテロ原子または異なるヘテロ原子で置換されている。ヘテロシクリル基は、飽和状態であってもよく部分的に不飽和（つまり１以上の二重結合を有する）状態であってもでよい。ヘテロシクリル基は、上述のとおり１以上の任意選択の置換基により任意選択の置換がなされていてもよい。「ヘテロシクリレン」は二価のヘテロシクリルを表す。
【０２５３】
「ヘテロアリール」は、単環式、多環式、融解または複合化炭化水素残余物を包含し、芳香性の残余物が得られるように１以上の炭素原子がヘテロ原子で置換されている。好ましくは、ヘテロアリールは３−２０（例：３−１０）の環原子を有している。特に好ましいヘテロアリールは、５−６、および、９−１０のメンバーを有する二環式リングシステムである。好適なヘテロ原子としては、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、および、Ｓｅ、特にＯ、Ｎ、および、Ｓが挙げられる。２つ以上の炭素原子が置換されている場合、２つ以上の同一のヘテロ原子または異なるヘテロ原子で置換されている。ヘテロアリール基は、上述のとおり１以上の任意選択の置換基により任意選択の置換がなされていてもよい。「ヘテロアリレン」とは、二価のヘテロアリールを表す。
【０２５４】
「アシル」とは単独で、または、化合物名として用いるいずれの場合においても、Ｃ＝Ｏ部位を含む基を表しており（カルボン酸、エステル、または、アミドではない）、好ましいアシルはＣ（Ｏ）−Ｒｅであり、Ｒｅは、水素またはアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、カルボシクリル、または、ヘテロシクリルの残余物である。
【０２５５】
「スルホキシド」とは単独で、または、化合物名として用いるいずれの場合においても、−Ｓ（Ｏ）Ｒｆの基を表しており、Ｒｆは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、カルボシクリル、および、アラルキルから選択される。好ましいＲｆの例としては、Ｃ１−２０アルキル、フェニル、および、ベンジルが挙げられる。
【０２５６】
「スルホニル」とは単独で、または、化合物名として用いるいずれの場合においても、Ｓ（Ｏ）２−Ｒｆの基を表しており、Ｒｆは水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、カルボシクリル、および、アラルキルから選択される。
【０２５７】
「スルホンアミド」とは単独で、または、化合物名として用いるいずれの場合においても、Ｓ（Ｏ）ＮＲｆＲｆ基を表しており、各Ｒｆは独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、カルボシクリル、および、アラルキルから選択される。
【０２５８】
ここで言う「アミノ」とは本技術分野で解釈され得るもっとも広義の意味であり、式ＮＲａＲｂの基を含んでおり、ＲａおよびＲｂは独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、カルボシクリル、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリールアルキル、および、アシルから選択される。ＲａおよびＲｂはそれらに付随する窒素とともに単環式または多環式のリングシステムを形成する（例：３−１０メンバーのリング、特に５−６および９−１０メンバーのシステム）。
【０２５９】
ここで「アミド」とは本技術分野で解釈され得るもっとも広義の意味であり、式Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂの基を含み、ＲａおよびＲｂは上述の通りである。
【０２６０】
「カルボキシエステル」とは本技術分野で解釈され得るもっとも広義の意味であり、式ＣＯ２Ｒｇの基を含んでおり、Ｒｇはアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、カルボシクリル、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アラルキル、および、アシルから選択される。
【０２６１】
ここで使用されるとおり、「アリーロキシ」とは酸素橋を介して付随する「アリール」基のことである。アリーロキシ置換基の例としては、フェノキシ、ビフェニルオキシ、ナフチルオキシ等が挙げられる。
【０２６２】
ここで使用されるとおり、「アシルオキシ」とは「アシル」のことであり、酸素原子を介して順に付随する「アシル」基である。
【０２６３】
ここで使用されるとおり、「アルキルオキシカルボニル」とはカルボニル基を介して付随する「アルキルオキシ」基のことである。「アルキルオキシカルボニル」基の例としては、ブチルホルメート、ｓｅｃ−ブチルホルメート、ヘキシルホルメート、オクチルホルメート、デシルホルメート、シクロペンチルホルメート等が挙げられる。
【０２６４】
ここで使用されるとおり、「アリールアルキル」とは、芳香環で置換される直鎖状のまたは分岐状のアルカン鎖から形成される基のことである。アリールアルキルの例としては、フェニルメチル（ベンジル）、フェニルエチル、および、フェニルプロピルが挙げられる。
【０２６５】
ここで使用されるとおり、「アルキルアリール」とは直鎖または分岐状のアルカンで置換されるアリール基から形成される基のことである。アルキルアリールの例としては、メチルフェニルおよびイソプロピルフェニルが挙げられる。
【０２６６】
本明細書において、「任意選択の置換がなされている」とは、アルキル、アルケニル、アルキニル、カルボシクリル、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アシル、アラルキル、アルカリル、アルクヘテロシクリル、アルクヘテロアリール、アルクカルボシクリル、ハロ、ハロアルキル、ハロアルケニル、ハロアルキニル、ハロアリール、ハロカルボシクリル、ハロヘテロシクリル、ハロヘテロアリール、ハロアシル、ハロアリアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルケニル、ヒドロキシアルキニル、ヒドロキシカルボシクリル、ヒドロキシアリール、ヒドロキシヘテロシクリル、ヒドロキシヘテロアリール、ヒドロキシアシル、ヒドロキシアラルキル、アルコキシアルキル、アルコキシアルケニル、アルコキシアルキニル、アルコキシカルボシクリル、アルコキシアリール、アルコキシヘテロシクリル、アルコキシヘテロアリール、アルコキシアシル、アルコキシアラルキル、アルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アリーロキシ、カルボシクリルオキシ、アラルキルオキシ、ヘテロアリーロキシ、ヘテロシクリルオキシ、アシルオキシ、ハロアルコキシ、ハロアルケニルオキシ、ハロアルキニルオキシ、ハロアリーロキシ、ハロカルボシクリルオキシ、ハロアラルキルオキシ、ハロヘテロアリーロキシ、ハロヘテロシクリルオキシ、ハロアシルオキシ、ニトロ、ニトロアルキル、ニトロアルケニル、ニトロアルキニル、ニトロアリール、ニトロヘテロシクリル、ニトロヘテロアリ−ル、ニトロカルボシクリル、ニトロアシル、ニトロアラルキル、アミノ（ＮＨ２）、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルケニルアミノ、アルキニルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、アラルキルアミノ、ジアラルキルアミノ、アシルアミノ、ジアシルアミノ、ヘテロシクロアミノ、ヘテロアリールアミノ、カルボキシ、カルボキシエステル、アミド、アルキルスルホニルオキシ、アリールスルフェニルオキシ、アルキルスルフェニル、アリールスルフェニル、チオ、アルキルチオ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、アリールチオ、アラルキルチオ、カルボシクリルチオ、ヘテロシクリルチオ、ヘテロアリールチオ、アシルチオ、スルホキシド、スルホニル、スルホンアミド、アミノアルキル、アミノアルケニル、アミノアルキニル、アミノカルボシクリル、アミノアリール、アミノヘテロシクリル、アミノヘテロアリール、アミノアシル、アミノアラルキル、チオアルキル、チオアルケニル、チオアルキニル、チオカルボシクリル、チオアリール、チオヘテロシクリル、チオヘテロアリール、チオアシル、チオアラルキル、カルボキシアルキル、カルボキシアルケニル、カルボキシアルキニル、カルボキシカルボシクリル、カルボキシアリール、カルボキシヘテロシクリル、カルボキシヘテロアリール、カルボキシアシル、カルボキシアラルキル、カルボキシエステルアルキル、カルボキシエステルアルケニル、カルボキシエステルアルキニル、カルボキシエステルカルボシクリル、カルボキシエステルアリール、カルボキシエステルヘテロシクリル、カルボキシエステルヘテロアリール、カルボキシエステルアシル、カルボキシエステルアラルキル、アミドアルキル、アミドアルケニル、アミドアルキニル、アミドカルボシクリル、アミドアリール、アミドヘテロシクリル、アミドヘテロアリール、アミドアシル、アミドアラルキル、ホルミルアルキル、ホルミルアルケニル、ホルミルアルキニル、ホルミルカルボシクリル、ホルミルアリール、ホルミルヘテロシクリル、ホルミルヘテロアリール、ホルミルアシル、ホルミルアラルキル、アシルアルキル、アシルアルケニル、アシルアルキニル、アシルカルボシクリル、アシルアリール、アシルヘテロシクリル、アシルヘテロアリール、アシルアシル、アシルアラルキル、スルホキシドアルキル、スルホキシドアルケニル、スルホキシドアルキニル、スルホキシドカルボシクリル、スルホキシドアリール、スルホキシドヘテロシクリル、スルホキシドヘテロアリール、スルホキシドアシル、スルホキシドアラルキル、スルホニルアルキル、スルホニルアルケニル、スルホニルアルキニル、スルホニルカルボシクリル、スルホニルアリール、スルホニルヘテロシクリル、スルホニルヘテロアリール、スルホニルアシル、スルホニルアラルキル、スルホンアミドアルキル、スルホンアミドアルケニル、スルホンアミドアルキニル、スルホンアミドカルボシクリル、スルホンアミドアリール、スルホンアミドヘテロシクリル、スルホンアミドヘテロアリール、スルホンアミドアシル、スルホンアミドアラルキル、ニトロアルキル、ニトロアルケニル、ニトロアルキニル、ニトロカルボシクリル、ニトロアリール、ニトロヘテロシクリル、ニトロヘテロアリール、ニトロアシル、ニトロアラルキル、シアノ、硫酸塩、リン酸塩、トリアリールメチル、トリアリールアミノ、オキサジアゾール、および、カルバゾール基から選択される１つ、２つ、３つ以上の有機基および無機基により基が（縮合多環基を形成するように）置換または融解されていてもよくされていなくてもよいという意味である。任意選択の置換とは、また、鎖内の−ＣＨ２−基が−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲａ−、−Ｃ（Ｏ）−（即ち、カルボニル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（即ち、エステル）、および、−Ｃ（Ｏ）ＮＲａ−（即ち、アミド）から選択される基（Ｒａはここで定義される通り）で置換されると解釈してもよい。
【０２６７】
以下に、非限定的な実施例を参照しつつ本発明を説明する。
【０２６８】
実施例
【０２６９】
材料
アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）社から、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメタクリレートエチル（ＤＭＡＥＭＡ）およびオリゴ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート（ＯＥＧＭＡ４７５、Ｍｎ〜４７５ｇｍｏｌ−１）モノマーを購入し、使用前に、ヒドロキノンまたはヒドロキノンモノメチルエーテル（アルドリッチ社）用の抑制物質除去剤とともに３０分混合することにより精製した。α・’−アゾビス（イソブチロニトリル）（ＡＩＢＮ）（ＴＣＩ）は、使用前にメタノールから２度再結晶化させた。１，１′−アゾビス（シクロヘキサンカルボニトリル）（ＶＡＺＯ−８８）開始剤（ＤｕＰｏｎｔ）はそのまま使用した。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（ＡＲ  ｇｒａｄｅ、メルク社）に窒素を少なくとも１５分注入することにより脱気した。ジクロロメタン（ＤＣＭ）、ｎ−ヘプタン、ジイソプロピルエーテル、ヨウ化メチルおよびメタノールは市販の試薬であり、さらに精製することなく使用した。ペンタエリスリトールテトラキス（３−メルカプトプロピオネート）（アルドリッチ社）、２−メルカプトエタノール（アルドリッチ社）、２−メルカプトピリジン（アルドリッチ社）は、そのまま使用した。過酸化水素（３０％）（Ｂ．Ｄ．Ｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）はそのまま使用した。
【０２７０】
マルチアームＲＡＦＴ剤
前記４アーム星型ＲＡＦＴ剤（５）は以下に記載する手順に従って作成した。
４アーム星型ＲＡＦＴ剤（５）：
（４Ｓ、４’Ｓ）−１０，１０−ｂｉｓ（（Ｒ）−１４−シアノ−１４−メチル−３，１１−ジオキソ−１６−チオキソ−２、１０−ジオキサ−６，７，１５，１７−テトラチアノナコシル）−７，１３−ジオキソ−８，１２−ジオキサ−３，４，１６，１７−テトラチアノナデカン−１，１９−ジイルｂｉｓ（４−シアノ−４−（（（ドデシルチオ）カルボノチオイル）チオ）ペンタノアート）（５）
【化１４】
2015509129.tif 000015
【０２７１】
前記４アーム星型ＲＡＦＴ剤（５）の合成は下記の通りである。
【化１５】
2015509129.tif 000016
【０２７２】
ステップ１：（Ｓ）−２−（ピリジン−２−イルジスルファニル）エチル４−シアノ−４−（（（ドデシルチオ）カルボノチオイル）チオ）ペンタノアート（３）の合成
標記化合物（３）は、ＤＩＣカプリング剤および触媒量のジクロロメタン溶媒におけるＤＭＡＰが存在する中、ＲＡＦＴ酸、（Ｓ）−４−シアノ−４−（ドデシルチオカルボノチオイルチオ）ペンタン酸が存在する中で（１）および２−（ピリジン−２−イルジスルファニル）エタノール（２）の反応により合成した。
【０２７３】
ＲＡＦＴ酸（１）は文献Ｐｏｌｙｍｅｒ２００５、４６、８４５８−８４６８に記載の手順に従って作成した。化合物（１）はシグマ−アルドリッチ社またはストレムケミカルズ（Ｓｔｒｅｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）社から購入可能である。
【０２７４】
２−（ピリジン−２−イルジスルファニル）エタノール（２）は、Ｓ．Ｔｈａｙｕｍａｎａｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２００６、３９、５５９５−５５９７に記載の手順に従って作成した。
【０２７５】
ジクロロメタン（５０ｍＬ）およびＤＭＡＰ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン、触媒量）において、（Ｓ）−４−シアノ−４−（ドデシルチオカルボノチオイルチオ）ペンタン酸（１）（４．６０ｇ、１１．３９ｍｍｏｌ）、２−（ピリジン−２−イルジスルファニル）エタノール（２）（２．１３ｇ、１１．３９ｍｍｏｌ）、ＤＩＣ（ジイソプロピルカルボジイミド、１．５８ｇ、１２．５３ｍｍｏｌ）を室温で３時間混合した。溶媒を除去後、溶離液として酢酸エチルとｎ−ヘキサンを１：３（ｖ／ｖ）で用いて、シリカカラム上でカラムクロマトグラフィーで粗製反応混合物を精製し、黄色油状物質として標記産物（３）（５．５ｇ，８４％歩留り）を得た。１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）・（ｐｐｍ）０．８５（ｔ、３Ｈ、ＣＨ３）；１．２７（ｂｒｓ、１８Ｈ）；１．６８（ｍ、２Ｈ）；１．８５（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）；２．３５−２．６０（ｍ、４Ｈ、ＣＨ２ＣＨ２）；３．０５（ｔ、２Ｈ、ＣＨ２ＳＳ）；３．３５（ｔ、２Ｈ、ＣＨ２Ｓ）；４．３５（ｔ、２Ｈ、ＣＨ２Ｏ）；７．１０（ｍ、１Ｈ、ＡｒＨ）；７．６５（ｍ、２Ｈ、２ｘＡｒＨ）；８．４５（ｍ、１Ｈ、ＡｒＨ）．１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）・（ｐｐｍ）１４．１，２２．７、２４．９、２７．６、２８．９、２９．０、２９．３、２９．４、２９．５、２９．６（２Ｃ）、３１．９、３３．７、３７．１（２Ｃ）、４６．３、６２．７、１１８．９、１１９．９、１２０．９、１３７．０、１４９．８、１５９．５、１７１．１，２１６．０。
【０２７６】
ステップ２：（５）の合成
ステップ１の（Ｓ）−２−（ピリジン−２−イルジスルファニル）エチル４−シアノ−４−（（（ドデシルチオ）カルボノチオイル）チオ）ペンタノアート（３）（０．４７ｇ、８．２２ｘ１０−４ｍｏｌ）を、ジクロロメタン溶媒（２５ｍＬ）において、氷酢酸２滴とともにペンタエリスリトールテトラキス（３−メルカプトプロピオン酸）（４）（アルドリッチケミカルズより購入）（０．１０ｇ、２．０４ｘ１０−４ｍｏｌ）と反応させた。反応は、室温で一晩撹拌することによって行われた。溶媒を除去後、まず溶離液として酢酸エチルとｎ−ヘキサンを１：３（ｖ／ｖ）で用いて、シリカカラム上でカラムクロマトグラフィーで粗製反応混合物を精製して、未反応の（３）を除去し、その後酢酸エチルとｎ−ヘキサン２：３（ｖ／ｖ）の溶媒を用いて、黄色油状物質として所望の標記産物（５）（０．３６ｇ、７５．５％歩留り）を分離した。１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）・（ｐｐｍ）０．８６（ｔ、１２Ｈ、４ｘＣＨ３）；１．２７−１．４０（ｂｒｓ、７２Ｈ、４ｘ（ＣＨ２）９）；１．７０（ｍ、８Ｈ、４ｘＣＨ２）；１．８６（ｓ、１２Ｈ、４ｘＣＨ３）；２．３５（ｄｄ、４Ｈ、４ｘＣＨＣＣＮ）；２．５５（ｄｄ、４Ｈ、４ｘＣＨＣＣＮ）；２．６５（ｍ、８Ｈ、４ｘＣＨ２）；２．７６（ｍ、８Ｈ、４ｘＣＨ２）；２．９０（ｍ、１６Ｈ、４ｘＣＨ２ＳＳＣＨ２）；３．３０（ｔ、８Ｈ、４ｘＣＨ２ＳＣ（＝Ｓ））；４．１５（ｓ、８Ｈ、４ｘＯＣＨ２Ｃ）；４．３５（ｔ、８Ｈ、４ｘＣＨ２Ｏ）。
６アーム星型ＲＡＦＴ剤（６）：
【化１６】
2015509129.tif 000017
ＲＡＦＴ剤（６）は、文献Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．ｐｕｂｌｉｓｈｅｄｉｎＪ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．、２００３、１３、２６９６−２７００に記載の手順にしたがって作成された。
【０２７７】
マルチアーム星型ＲＡＦＴポリマーの例
実施例１：４アーム星型ブロックコポリマーＡＢＡ−Ｂ４Ｓ−１６／２４（ＴＬ４８Ａ）
ＡＢＡ−Ｂ４Ｓ−１６／２４：ＰＥＧ−ＤＭＡＥＭＡ−ＰＥＧ（ＴＬ４８Ａ）
手順：
ＰＥＧ−ＤＭＡＥＭＡ−ＰＥＧ４−アームブロックコポリマー
【０２７８】
ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）（ＰＤＭＡＥＭＡ）テレキーレックマクロＲＡＦＴ剤の合成とキャラクタリゼーション：
一般的な重合実験において、７８６ｍｇのＤＭＡＥＭＡモノマー（５．００×１０−３ｍｏｌ）、０．６６ｍｇのＶＡＺＯ−８８開始剤（２．７０×１０−６ｍｏｌ）、９２．３２ｍｇの４−アームＲＡＦＴ剤（５）（３．９６×１０−５ｍｏｌ）、および、６２０ｍｇのＤＭＦ（８．４９×１０−３ｍｏｌ）を計量してシュレンク管に供給する。凍結排気融解サイクルを４回繰り返すことにより溶液混合物を脱気し、９０℃で５時間かけて重合化した。
【０２７９】
モノマーからポリマーへの変換率は、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）により決定される７８％であった。変換率は、重合化溶液に、内部標準の１，３，５−トリオキサンを５ｍｇ／１ｍＬの割合で添加して算出した。１Ｈ−ＮＭＲの重合前後のスペクトルを比較した。トリオキサン５．１ｐｐｍの−ＯＣＨ２環の集積を、モノマー５．５−６ｐｐｍのＣＨ２＝Ｃプロトンの集積と比較した。１Ｈ−ＮＭＲに基づいて算出されるポリマーの分子量は１７．４ｋＤａであり、重合度９８に対応する。線状ポリスチレン標準に対するゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により決定されるポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）は１２．８ｋＤａ（分散度１．３）であった。
【０２８０】
得られたポリマーは、少量のＤＣＭに溶解させて、ヘプタンに沈殿させた。回収されたポリマーは、同じ手順でさらに２回沈殿させ、真空オーブンにて４０℃で一定重量に乾燥させた。
【０２８１】
ステップ２：ポリ（オリゴ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート）−ブロック−ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）−ブロック−ポリ（オリゴ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート）（Ｐ（ＯＥＧＭＡ４７５−ｂ−ＤＭＡＥＭＡ−ｂ−ＯＥＧＭＡ４７５）の合成とキャラクタリゼーション：（ＡＢＡ−Ｂ４Ｓ−１６／２４）（サンプルコード：ＴＬ４８Ａ）
一般的な重合実験において、ステップ１で得られた２８１ｍｇのＰＤＭＡＥＭＡテレキーレックマクロＲＡＦＴ剤（１．６２×１０−５ｍｏｌ），７１２ｍｇのＯＥＧＭＡ４７５（モノマー）モノマー（１．５０×１０−３ｍｏｌ）、０．７９２ｍｇのＶＡＺＯ−８８開始剤（３．２４×１０−６ｍｏｌ）、および、６９４０ｍｇのＤＭＦ（９．５０×１０−２ｍｏｌ）を計量してシュレンク管に供給した。凍結排気融解サイクルを４回繰り返すことにより溶液混合物を脱気し、９０℃で１２時間かけて重合化した。
【０２８２】
モノマーからポリマーへの変換率は、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）により決定される６８％であった。変換率は、重合化溶液に、内部標準の１，３，５−トリオキサンを５ｍｇ／１ｍＬの割合で添加して算出した。１Ｈ−ＮＭＲの重合前後のスペクトルを比較した。トリオキサン５．１ｐｐｍの−ＯＣＨ２環の集積を、モノマー５．５−６ｐｐｍのＣＨ２＝Ｃプロトンの集積と比較した。１Ｈ−ＮＭＲに基づく分子量は４７．７ｋＤａであった。線状ポリスチレン標準に対するゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により決定されるポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）は５０．２ｋＤａ（分散度１．２）であった。
【０２８３】
得られたポリマーは、少量のＤＣＭに溶解させて、ジイソプロピルエーテルに沈殿させた。回収されたポリマーは、同じ手順でさらに２回沈殿させ、真空オーブンにて４０℃で一定重量に乾燥させた。
【０２８４】
ＡＢＡブロックの第四級化
丸底フラスコにおいて、ＡＢＡブロックコポリマーをメタノールに１０％（ｗ／ｖ）で溶解した。ブロックコポリマーのＰＤＭＡＥＭＡ部分に対する２モル当量のヨウ化メチルを添加した。反応混合物は室温で４時間混合した。回転蒸発装置により揮発性物質を全て除去した後、真空オーブンにて４０℃でさらに乾燥させた。
【０２８５】
透析
脱イオン水にたいして透析（分画分子量３５００，  Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｐｏｒ，  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  ヒューストン、テキサス）お３日間行うことにより、ポリマー物質をさらに精製した。透析後、凍結乾燥によりポリマー溶液から水を除去した。
【０２８６】
実施例２：４アーム星型ブロックコポリマーＢＡＢ−Ｂ４Ｓ−２２／１０（ＴＬ６８Ｂ）
ＢＡＢ−Ｂ４Ｓ−２２／１０：ＤＭＡＥＭＡ−ＰＥＧ−ＤＭＡＥＭＡ（ＴＬ６８Ｂ）
手順：
【０２８７】
ポリ（オリゴ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート薬剤のテレキーレックマクロＲＡＦＴの合成とキャラクタリゼーション：
一般的な重合実験において、８８０ｍｇのＯＥＧＭＡ４７５モノマー（１．８５×１０−３ｍｏｌ）、２．９４ｍｇのＶＡＺＯ−８８開始剤（１．２１×１０−５ｍｏｌ）、１３７．００ｍｇの４−アームＲＡＦＴ剤（５）（５．８８×１０−５ｍｏｌ）、および、９８１８ｍｇのＤＭＦ（１．３４×１０−１ｍｏｌ）を計量してシュレンク管に供給した。凍結排気融解サイクルを４回繰り返すことにより溶液混合物を脱気し、９０℃で５時間かけて重合化した。
【０２８８】
モノマーからポリマーへの変換率は、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）により決定される４６％であった。変換率は、重合化溶液に、内部標準の１，３，５−トリオキサンを５ｍｇ／１ｍＬの割合で添加して算出した。１Ｈ−ＮＭＲの重合前後のスペクトルを比較した。トリオキサン５．１ｐｐｍの−ＯＣＨ２環の集積を、モノマー５．５−６ｐｐｍのＣＨ２＝Ｃプロトンの集積と比較した。１Ｈ−ＮＭＲに基づいて算出されるポリマーの分子量は２０．３ｋＤａであり、重合度〜４０（平均１０ＯＥＧＭＡ４７５ユニット／アーム）に対応する。線状ポリスチレン標準に対するゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により決定されるポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）は１０．９ｋＤａ（分散度１．１５）であった。
【０２８９】
得られたポリマーは少量のＤＣＭに溶解させてジー−イソプロピルエーテルに沈殿させた。回収されたポリマーは、同じ手順でさらに２回沈殿させ、真空オーブンにて４０℃で一定重量に乾燥させた。
【０２９０】
ステップ２：ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートｓ）−ブロック−ポリ（オリゴ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート−ブロック−ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）［Ｐ（ＤＭＡＥＭＡ−ｂ−ＯＥＧＭＡ４７５−ｂ−ＤＭＡＥＭＡ）］の合成およびキャラクタリゼーション：（ＢＡＢ−Ｂ４Ｓ−２２／１０）または（サンプルコード：ＴＬ６８Ｂ）
一般的な重合実験において、ステップ１で得られた２４１ｍｇのＰＯＥＧＭＡ４７５テレキーレックマクロＲＡＦＴ剤（１．６２×１０−５ｍｏｌ）、３４６ｍｇのＤＭＡＥＭＡモノマー（２．２０×１０−３ｍｏｌ）、１．１６ｍｇのＶＡＺＯ−８８開始剤（４．７５×１０−６ｍｏｌ）、および、７２０２ｍｇのＤＭＦ（９．８７×１０−２ｍｏｌ）を計量してシュレンク管に供給した。凍結排気融解サイクルを４回繰り返すことにより溶液混合物を脱気し、９０℃で４．５時間かけて重合化した。
【０２９１】
モノマーからポリマーへの変換率は、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）により決定される５６．８％であった。変換率は、重合化溶液に、内部標準の１，３，５−トリオキサンを５ｍｇ／１ｍＬの割合で添加して算出した。１Ｈ−ＮＭＲの重合前後のスペクトルを比較した。トリオキサン５．１ｐｐｍの−ＯＣＨ２環の集積を、モノマー５．５−６ｐｐｍのＣＨ２＝Ｃプロトンの集積と比較した。ＮＭＲに基づき算出された分子量は３６．９ｋＤａであった。線状ポリスチレン標準に対するゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により決定されるポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）は７．０ｋＤａ（分散度１．２３）であった。
【０２９２】
得られたポリマーを少量のＤＣＭに溶解し、ジ−イソプロピルエーテルに沈殿させた。得られた沈殿物は、同じ手順でさらに２回沈殿させ、真空オーブンにて４０℃で一定重量に乾燥させた。
【０２９３】
ＡＢＡブロックの第四級化
丸底フラスコにおいて、ＢＡＢブロックコポリマー（ＢＡＢ−Ｂ４Ｓ−２２／１０またはＴＬ６８Ｂ）をメタノールに１０％（ｗ／ｖ）で溶解させた。ブロックコポリマーのＰＤＭＡＥＭＡ部分に対する２モル当量のヨウ化メチルを添加した。反応混合物は室温で４時間混合した。回転蒸発装置により揮発性物質を全て除去した後、真空オーブンにて４０℃でさらに乾燥させた。
【０２９４】
透析
脱イオン水にたいして透析（分画分子量３５００，Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｐｏｒ，  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  ヒューストン、テキサス）を３日間行うことにより、ポリマー物質をさらに精製した。透析後、凍結乾燥によりポリマー溶液から水を除去した。
【０２９５】
表１：分子量、分散率、および、ＲＡＦＴ重合により作成されたスターブロックコポリマーの組成物
【表１】
2015509129.tif 000018
【０２９６】
実施例３
ｒＡＢ−６Ｓ（統計的ＤＭＡＥＭＡおよびＯＥＧＭＡ４７５６−アーム星型コポリマー）（サンプルコード：ＬＮ２００９／１７３５／７９Ｑ）
【化１７】
2015509129.tif 000019
手順：
【０２９７】
６アーム星型ＲＡＦＴ剤（６）存在下でのＲＡＦＴ共重合
５ｍＬのメスフラスコに、ＤＭＡＥＭＡ（１．０１ｇ、２．１３ｘ１０−３ｍｏｌ）、ＯＥＧＭＡ４７５（０．５ｇ、３．１８ｘ１０−３ｍｏｌ）、ＡＩＢＮ（４．５ｍｇ、２．７４ｘ１０−５ｍｏｌ）、および、６アームＲＡＦＴ剤（６）（７．４１ｍｇ、２．９５ｘ１０−６ｍｏｌ）をＤＭＦ溶媒に５ｍＬまで溶解した。この混合物を反応槽へ搬送し、凍結排気融解サイクル３回で脱気した後、真空状態に密封し６０℃で１６時間加熱した。精製したポリマーは、ＭｉｎｉＱ水で４８時間透析した。溶媒としてＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドを使用した、８６）線状ポリスチレン標準に対するゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により決定されるポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）は５３．１ｋＤａ（分散度１）であった。
【０２９８】
統計的６アーム星型コポリマーの第四級化
丸底フラスコに、６アーム星型ブロックコポリマーをメタノールに１０％（ｗ／ｖ）で溶解した。ブロックコポリマーのＰＤＭＡＥＭＡ部分に対し、ヨウ化メチルの超過分を添加した。反応混合物を室温で１６時間混合した。回転蒸発装置により揮発性物質を全て除去後、真空オーブンにて４０℃でさらに乾燥させた。
【０２９９】
実施例４
実施例１および２で作成されたＲＡＦＴブロックコポリマーと、異なる細胞株の毒性評価
【０３００】
材料
細胞：緑色蛍光タンパク質（ＣＨＯ−ＧＦＰ）を恒常的に発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞（オーストラリアＣＳＩＲＯ  ＣＭＨＴのＫ．Ｗａｒｋ氏提供）を、１０％のウシ胎児血清、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、０．０１％のペニシリン、および、０．０１％のストレプトマイシンで補いつつＭＥＭα修飾にて、３７℃、ＣＯ2５％の環境下で培養し、週２回継代培養した。
【０３０１】
ＧＦＰ（ＨＥＫ２９３−ＧＦＰ）を恒常的に発現するヒト胎児性腎臓細胞を、１０％のウシ胎児血清、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２ｍＭのグルタミン、０．０１％のペニシリン、、および、０．０１％のストレプトマイシンで補いながら、ＲＰＭＩ１６４０にて３７℃、ＣＯ2５％の環境下で成長させ週２回継代培養した。
【０３０２】
ＧＦＰ（Ｈｕｈ７−ＧＦＰ）を恒常的に発現するヒト肝細胞癌細胞を、１０％のウシ胎児血清、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２ｍＭのグルタミン、０．０１％のペニシリン、および、０．０１％のストレプトマイシンで補いながら、ＤＭＥＭにて３７℃、ＣＯ2５％の環境下で成長させ週２回継代培養した。
【０３０３】
毒性分析：ＣＨＯ−ＧＦＰを３ｘ１０４ＨＥＫ２９３−ＧＦＰに種付けし、Ｈｕｈ７−ＧＦＰ細胞を９６−ウェル組織培養皿に１ｘ１０４細胞／ウェルに種付けし、２００μｌの標準媒体にて、３７℃、ＣＯ2５％の環境下で一晩成長させた。
【０３０４】
続いて、ｓｉＲＮＡのないマルチアーム星型ＲＡＦＴブロックコポリマーを水で希釈し、９６ウェル培養皿の三つのウェルに添加し、各サンプルを７２時間培養した。ｓｉＲＮＡ有りのサンプルの毒性については下記実施例５に記載に従い準備した。サンプルを２００μｌのＯＰＴＩＭＥＭ内の細胞に添加し５時間培養した。前記ＯＰＴＩＭＥＭを、２００μｌの通常媒体に置き換え、６７時間培養した。製造元の案内に従い、アラマーブルー（ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ）試薬（米国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて毒性を計測した。端的に言うと、１０％のアラマーブルー試薬を含む１００μｌの標準媒体に媒体を置き換えて、細胞を４時間、３７℃、ＣＯ2５％の環境下で培養した。分析は、ＥＬ８０８吸収マイクロプレートリーダー（Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ；米国ＢＩＯＴＥＫ社）を用いて、５４０ｎｍおよび６２０ｎｍで行った。細胞生存能力は、５４０ｎｍでの計測値から６２０ｎｍでの計測値を差し引くことによって判定した。結果は、未処理細胞のパーセンテージとして示す。図２は、ＣＨＯ−ＧＦＰおよびＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用した際の、ｓｉＲＮＡのないマルチアーム星型コポリマーの細胞生存能力の結果を示す。図３は、ｓｉＲＮＡ有りのポリマーサンプルを伴う３つの細胞株における毒性を示す。
【０３０５】
ポリマーの毒性は、ｓｉＲＮＡ有りの３つの細胞株、および、ｓｉＲＮＡ無しの２つの細胞株で調査した。ＣＨＯ−ＧＦＰ細胞は、成長が早く強い細胞株である一方ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰ細胞は形質移入に敏感であり、Ｈｕｈ７−ＧＦＰ細胞は、前記二つの細胞株の間の特性を有する。毒性の許容レベルは、全細胞株の７０％超えの生存率とした。ポリマー濃度の範囲を分析した。ＢＡＢ−Ｂ４Ｓ−２２／１０（ＴＬ４８Ｂ）は、双方の細胞株における一連の希釈により分析した結果、ＡＢＡ−Ｂ４Ｓ−１６／２４（ＴＬ４８Ａ）より若干毒性が強いように見えた。ＭＲ４のＢＡＢ−Ｂ４Ｓ−２２／１０（ＴＬ４８Ｂ）は、３０μｇ／ｍｌのポリマーに対応する。この濃度は、ｓｉＲＮＡの有無に関わらず毒性がなかった。ＭＲ４のＡＢＡ−Ｂ４Ｓ−１６／２４（ＴＬ４８Ａ）は、５１μｇ／ｍｌのポリマーに対応する。この濃度は、いずれの細胞株においてもポリマーだけであれば毒性はないが、ｓｉＲＮＡを伴う場合にＨＥＫ−ＧＦＰ細胞において毒性を有する。これは、ｓｉＲＮＡの内部的な接合と、膜組織との相互作用により異なる細胞への影響を及ぼす異なる複合体によるものと考えられる。Ｈｕｈ７−ＧＦＰ細胞において、ポリマーはいずれもｓｉＲＮＡを伴うと毒性を有する。
【０３０６】
実施例５
合成ｓｉＲＮＡおよびＤＮＡオリゴヌクレオチド：ＱＩＡＧＥＮ（ＵＳＡ）からアンチ−ＧＦＰｓｉＲＮＡを得た。前記アンチ−ＧＦＰｓｉＲＮＡ配列は、センス５’ｇｃａａｇｃｕｇａｃｃｃｕｇａａｇｕｕｃａｕ３’、および、アンチセンス５’ｇａａｃｕｕｃａｇｇｇｕｃａｇｃｕｕｇｃｃｇ３’であり、ｓｉ２２と称す。二重鎖ｓｉＲＮＡのＭｎは、１５１９１Ｄａである。
【０３０７】
アンチ−ＧＦＰｓｉＲＮＡ配列に対応するＤＮＡオリゴヌクレオチドは、Ｇｅｎｅｗｏｒｋｓ社（南オーストラリア）から購入し、ｄｉ２２とした。オリゴヌクレオチドは、同じモル量のオリゴヌクレオチドを組み合わせることにより、アニーリングし、１０分間９５℃まで加熱し、その後室温まで徐々に冷却した。これらには、サイレンシング効果がないためネガティブ制御として用いられる。
【０３０８】
ポリマー／ｓｉＲＮＡ複合体の形成：５０ｎＭのｓｉＲＮＡまたはｓｉ２２に対するポリマーのモル比（ポリマーＭｎについては表１参照）を計算した。複合体は、ＯＰＴＩＭＥＭ媒体（米国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をエッペンドルフチューブに添加することによって形成した。水中に１０ｍｇ／ｍｌで再懸濁されたポリマーを必要量前記チューブに添加し、混合物を撹拌した。５０ｎＭのｓｉ２２またはｄｉ２２をチューブに加えサンプル撹拌した。ＲＴで複合体形成を１時間継続した。
【０３０９】
アガロースゲル電気泳動：ポリマー対５０ｎＭのｓｉＲＮＡの異なるモル比のサンプルを、ＴＢＥにおいて２％のアガロースゲル上で、１００ｖで４０分電気泳動させた。ｓｉＲＮＡは、カメラ付ＵＶトランスルミネーターで、ｇｅｌ  ｒｅｄ（Ｊｏｍａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いてビジュアル化した。画像はＧｅｎｅＳｎａｐプログラム（米国Ｓｙｎｇｅｎｅ社）によって記録した。
【０３１０】
上記作業によって、５０ｎＭのｓｉ２２によってアガロースゲルをビジュアル化が可能になり、リポフェクタミン２０００形質移入（データ図示せず）によってＣＨＯ−ＧＦＰ細胞におけるＥＧＦＰ信号の８０％を抑制させることができることがわかった。従ってｓｉ２２の上記量は、ＣＨＯ−ＧＦＰ細胞においてポリマーのｓｉＲＮＡを拘束してＥＧＦＰ発現を抑制させる能力の判定に用いることができる。ポリマー対ｓｉ２２のモル比は各ポリマーについて１：１〜７：１の範囲で公式化した。これは、毒性限界より低いレベルのポリマーが確実に使用されるようにするためである。これらサンプルに対して電気泳動が行われ、ｓｉＲＮＡを伴う能力の最小の違いを観測した（図４）。ｓｉＲＮＡの関連付けは、ｓｉＲＮＡが予想される２２ｎｔの泳動状態から、ゲルへの目立った侵入ができない状態へのシフトによって判定される。ＡＢＡ−Ｂ４Ｓ−１６／２４も、モル比が１でｓｉＲＮＡと接合することが可能であるが、マルチアーム星型ポリマーの両方双方は、２：１と低いモル比でｓｉＲＮＡと接合することが可能であった。ｓｉＲＮＡが有る場合と無い場合で、ポリマーｓｉＲＮＡ複合体のサイズおよびゼータ電位を判定した（実施例６参照）。
【０３１１】
実施例６
動的光散乱（ＤＬＳ）およびゼータ電位の計測：動的光散乱実験によりｓｉＲＮＡ／ブロックコポリマー複合体の流体力学的径（ＤＨ）を得た。実験には、i）６３２．８ｎｍで稼働する２２ｍＷのＨｅ−Ｎｅレーザーを有するマルバーン社のゼータサイザーナノシリーズＤＬＳ検出器、高量子効率のアバランシェフォトダイオード検出器、および、ＡＬＶ／ＬＳＥ−５００３マルチプルoデジタル相関器電子システムを用いた。Ｎ／Ｐ比を４．０に維持しつつサンプルを作成し、最小合計質量／量（即ち、ブロックコポリマーの質量＋ｓｉＲＮＡの質量／ｍＬ）の０．５ｍｇ／ｍＬを使用した。ＤＬＳで特性判定を行う前に、サンプルを１４０００ｒｐｍで、１０分間遠心分離機によりゴミを取り除いた。ＤＨ計測は全て、２５℃で３通り行い、複合体のサイズを、複合化されていないブロックコポリマーおよび純度の高いｓｉＲＮＡのサイズと比較した。
【０３１２】
標準の使い捨てゼータ電位フローセルの自動設定にて、ＨＥＰＥＳバッファでゼータ電位を計測した。
【０３１３】
表２．実施例１で作成されたＲＡＦＴポリマーから形成された複合体と、ｓｉＲＮＡの粒径およびゼータ電位。
【表２】
2015509129.tif 000020
注：＊ＤＬＳ計測により、二峰性粒度分布および報告された値が、粒子の約９９％を構成する小サイズ範囲のものである事がわかる。
【０３１４】
実施例７
【０３１５】
サイレンシング分析
９６−ウェル組織培養皿に、ＣＨＯ−ＧＦＰ細胞を３ｘ１０４細胞で３通りの種付けを行い、Ｈｕｈ７−ＧＦＰおよびＨＥＫ−ＧＦＰ細胞を１ｘ１０４細胞で３通りの種付けを行った。これら細胞を３７℃、ＣＯ2５％の環境下で一晩成長させた。ｓｉＲＮＡのポジティブおよびネガティブ制御のために、リポフェクタミン２０００（米国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を製造元の案内に従って使用し、ｓｉＲＮＡを細胞に形質移入させた。端的に言うと、５０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（米国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で希釈した、５０ピコモルの関連するｓｉＲＮＡ（２５０ｎＭに相当）と１μｌのリポフェクタミン２０００とを混合し、室温で２０分間培養した。ｓｉＮＡ：１００μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭにて、リポフェクタミン混合物を細胞に添加し４時間培養した。細胞媒体を置き換えて、さらに６７時間培養した。
【０３１６】
実施例５で作成したポリマー／ｓｉＲＮＡ複合体にから、細胞媒体を除去して２００μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭと置き換えた。ｓｉＮＡ：１０μｌのポリマー複合体を１サンプル当たり３つの細胞ウェルに添加して５時間培養した。細胞媒体を置換して、さらに６７時間培養した。
【０３１７】
細胞をＰＢＳで二度洗浄し、励起４８８ｎｍ、放射５１６ｎｍと設定したＢｉｏｔｅｋ  Ｈ１  ｓｙｎｅｒｇｙプレートリーダ（米国Ｂｉｏｔｅｋ社）で読み取った。ＥＧＦＰのサイレンシングを、ポリマー／ｄｉ２２複合体平均ＥＧＦＰ蛍光のパーセンテージとして分析した。結果を図５および表３に要約する。
【０３１８】
表３．Ｎ／Ｐ比、％ｓｉＲＮＡ結合、サイレンシング効果、および、異なるブロックコポリマー／ｓｉＲＮＡ複合体比のポリマー濃度。
【表３】
2015509129.tif 000021
ａ）Ｎ／Ｐ比；ｂ）％ｓｉＲＮＡ結合；ｃ）ＣＨＯ−ＧＦＰ細胞における％サイレンシング効果；ｄ）ポリマー濃度μｇ／ｍＬ．
【０３１９】
ＧＦＰ細胞は、４８８ｎｍの青色レーザーで励起されると約５１８ｎｍの緑色シグナルを放射する増強型緑色蛍光タンパク質を偏在的に発現する。これは、蛍光顕微鏡検査法および流動細胞計測法のどちらでも容易に検出可能である。ＥＧＦＰのサイレンシング効果は、流動細胞計測のプロットにおける細胞集団内でのシフト、および、平均ＧＦＰ蛍光の減少により容易に判定できる。ＢＡＢ−Ｂ４Ｓ−２２／１０（ＴＬ４８Ｂ）は、どのモル比であっても三つのテスト済み細胞株においてＧＦＰをサイレンシングできなかった。ＡＢＡ−Ｂ４Ｓ−１６／２４（ＴＬ４８Ａ）は、モル比３：１でＧＦＰが５１％サイレンシングされ、モル比を上げても変化は無かった。
【０３２０】
細胞収量
ｓｉ２２は、ＴｏＴｏ−３染料（米国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて製造元の案内に従ってラベリングを行った。端的にいうと、室温で１時間、各ｓｉＲＮＡに３つの染料分子を水中で結合させた。ＣＨＯ−ＧＦＰ細胞を９６−ウェル組織培養皿において１ｘ１０５細胞で３通りの種付けを行い、３７℃、ＣＯ2５％の環境下で一晩成長させた。ポジティブコントロール用に、リポフェクタミン２０００を前述の通り使用して、ラベリングされたｓｉ２２を細胞に形質移入した。ポリマーと、ラベリングされたｓｉＲＮＡ複合体とを上記の通り生産し細胞に添加した。細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理を行い、ＦＡＣＳ洗浄（ＰＢＳと１％のＦＢＳ）で２度洗浄した。細胞を流動細胞計測し、６４７ｎｍの放射でＴｏＴｏ−３蛍光を分析した。
【０３２１】
得られた結果（図６）は、ラベリングされたｓｉＲＮＡの最小収量を示しており、収量はＢＡＢ−Ｂ４Ｓ−１１／１０（ＴＬ４８Ｂ）のサイレンシング結果に対応している。従って、ポリマーが観測された。ＡＢＡ−Ｂ４Ｓ−１６／２４（ＴＬ４８Ａ）は、ラベリングされたｓｉＲＮＡの収量が良好であり、ｓｉＲＮＡの送達についてリポフェタミン２０００の場合と類似していた。にも関わらず、ＡＢＡ−Ｂ４Ｓ−１６／２４（ＴＬ４８Ａ）のサイレンシングについては、リポフェクタミン２０００ほど効率が良くなく、ｓｉＲＮＡ機能の損失が見られた。これは、恐らくリソソーム内での分解か、ポリマーからの分離が効率的でなかったためと考えられる。
【０３２２】
実施例８
血清安定性：ポリマーが、ｓｉＲＮＡの血清プロテアーゼによる分解から保護する能力について、必須の成長ホルモンを提供する組織培養物において、一般的に利用されるウシ胎児血清を用い生体外で行った。剥き出しのｓｉＲＮＡは、前記血清において数時間で分解した。結果によれば、モル比４：１の２つの異なるポリマー複合体に含まれるｓｉＲＮＡは、３７℃で血清５０％の環境で７２時間保護された（図７）。残りのサンプルをＣＨＯ−ＧＦＰ細胞に加え、前記ｓｉＲＮＡが無傷で活性状態で有るかを判定した。ＡＢＡ−Ｂ４Ｓ−１６／２４（ＴＬ４８Ａ）複合体においてサイレンシングが確認され、ＦＢＳ処理後も殆ど減少しなかった（図７ｄ）。ＢＡＢ−Ｂ４Ｓ−１１／１０（ＴＬ４８Ｂ）については、予想通りサイレンシングを確認できなかった。この目立った保護は、ポリマーによるものである。正電荷分子が血清タンパク質と結びつき溶液に沈殿する（データ図示せず）という懸念もあったが、血清において複合体の沈殿は確認できなかった。
【０３２３】
実施例９
実施例２に記載の実験手順に従い、ＲＡＦＴポリマーであるＡＢ−Ｂ４Ｓ−１６／２４を作成した。前記ポリマーの毒性、サイレンシング分析、血清の安定性は、実施例４、７、８にそれぞれ記載したとおり評価した。本実施例は、以下に記載する通り雛胚においてテストされた前記ポリマーの干渉反応を示す。
【０３２４】
生体内ＩＦＮ反応
オーストラリアのチャールズリバー研究所（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から市販の１０日目の鶏の雛胚を調達した。１０日目の有胚鶏卵の尿膜腔にポリマー複合体を注入した。前記卵を３７℃で６時間、または、２４時間培養した。コントロールとして、卵にＰＢＳおよびｓｉ２２単体を２ナノモル注入した。その後、尿膜および肝組織をＲＮＡに集め４°で保存した。ＲＮＡはトリゾール法で回収した。
【０３２５】
逆転写および定量的リアルタイムＰＣＲ
１マイクログラムの抽出されたＲＮＡをＤＮＡ分解酵素（米国Ｐｒｏｍｅｇａ社）で製造元の案内に従って処理し、Ｐｏｗｅｒ  Ｓｙｂｒ緑色ＲＮＡをＣＴ  ｋｉｔ（米国Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）に製造元の案内に従って使用して、定量的リアルタイムＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）実験を行い、サイトカインの発現レベルを計測した。鶏またはヒトＧＡＰＤＨに対して、全ての定量化データを正常化した。ＱＲＴ−ＰＣＲは、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイム−ＰＣＲシステム、９６ウェルプレートＲＴ−ＰＣＲ機材（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、以下の条件で行った。１ｘサイクルを３０分間５０℃で、その後１０分間９５℃で、４０ｘサイクルを１５秒間９５℃で、その後１分間６０℃で行った。比較閾値サイクル（Ｃｔ）法により、遺伝子発現のホールド変化を得た。
【０３２６】
Ｇｅｎｅｗｏｒｋｓ社（南オーストラリア）からプライマーを得た。
【０３２７】
病理組織学および尿膜収量
胎生期のニワトリ肝は、２４時間でのＩＦＮ反応の調査に使用した膜組織と同じ胚から得た。肝組織は、１０％のバッファ付ホルマリンに２４時間固定し、ルーチンのＨ＆Ｅ色付けのためにＡｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの病理学研究所に提出した。
【０３２８】
ポリマーｄｉ２２−ＦＡＭ複合体を注入してから２４時間後、胚から尿膜を取り除き４％のパラホルムアルデヒドに２時間固定した。膜組織はその後ＤＡＰＩで色付けした。
【０３２９】
生体内の条件は、培養組織とは大きく異なるので、ＡＢ−Ｂ４Ｓ−１６／２４の毒性、収量、および、雛胚モデルにおけるインフルエンザの複製をサイレンシングさせるためにインフルエンザポリメラーゼのＰＢ１サブユニットを標的にした抗インフルエンザｓｉＲＮＡ（ＰＢ１−２２５７）を運ぶ能力についてテストした。１０日目の雛胚に、ポリマープラスまたはマイナスｓｉＲＮＡを６時間または２４時間注入し、定量的ＰＣＲによる胚の免疫刺激（インターフェロンＩＦＮαおよびβ）と、ポリマーの存在に起因する肝組織へのダメージを２４時間病理組織学により評価した。６時間経過時点、または、２４時間経過時点において、尿膜（図８Ａ、Ｂ参照）または脾臓組織、ＩＦＮαまたはβメッセンジャー（ｍＲＮＡ）に目立った増加は見られなかった。Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの病理学研究所によるＨ＆Ｅ色付けによっても、２４時間経過時点での免疫細胞の流入または肝組織へのダメージが観測されなかった。このことから、胚のポリマーに対する短期間の充分な耐性が示された（図８Ｃ、Ｄ、Ｅ）．
【０３３０】
実施例１０
実施例２に記載の実験手順によりＲＡＦＴポリマーであるＡＢ−Ｂ４Ｓ−１６／２４を作成した。前記ポリマーの毒性、サイレンシング分析、血清の安定性は、実施例４、７、８にそれぞれ記載したとおり評価した。本実施例は、雛胚においてテストされた前記ポリマーによる、生体内でのインフルエンザＡ−ＰＲ８サイレンシングを示す。
【０３３１】
生体内インフルエンザＡ−ＰＲ８サイレンシング
１０日目の有胚鶏卵の尿膜腔にポリマー複合体を注入した。前記卵を３７℃で２４時間培養した。コントロールとしてＰＢＳを注入した。Ｈ１Ｎ１インフルエンザＰＲ８ウィルスは、１００μｌのＰＢＳで、５００ｐｆｕ／卵に希釈し、即座に１０日目の有胚鶏卵の尿膜腔に注入した。卵は３７℃で４８時間培養し、尿膜液を採取してウィルス力価を計測した。
【０３３２】
端的に言うと、尿膜液のＭＤＣＫ細胞に対するウィルス感染性を、１０倍希釈の一系列での細胞変性効果用の終点希釈により評価した。力価は、ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌとして表現される。
【０３３３】
胚に対して、ＦＡＭでラベリングされたｄｉ２２と複合化されたポリマーを注入し、インフルエンザ注入時に、インフルエンザ複製の主要部位となる尿膜の細胞に前記ポリマーが侵入するかを判定した。ＡＢＡ−Ｂ４Ｓ−１６／２４±が関連するｓｉＲＮＡを、１０日目の有胚鶏卵の尿膜液に注入し２４時間培養した。５００ｐｆｕのＰＲ８を各胚の尿膜液に注入し、３７℃で４８時間培養した。尿膜液を採取しＴＣＩＤ５０を行った。結果、ＰＢＳと比較して５雛胚／基±ＳＥＭ統計＊＊ｐ＜０．０１となった。一方向のパラメトリックなチューキー事後解析を伴う反復分散分析（ＡＮＯＶＡ）計測。ＦＡＭでラベリングされたＤＮＡオリゴヌクレオチドのみ注入した胚と比較して、力強い収量は、尿膜内の静脈を取り巻く細胞での集中的な収量を示し、その後２４時間後にこれら細胞から膜組織への分散が確認された（図９Ａ、Ｂ）。ＰＢＳを注入した胚と比較して、ポリマーのみ、または、関連性のないアンチ−ＧＦＰｓｉＲＮＡと複合化されたポリマーを注入した胚において、インフルエンザ複製の減少は見られなかった。一方、ＡＢ−Ｂ４Ｓ−１６／２４を注入した胚では、ウィルス生産に平均で二倍の大幅な減少が見られた（図９Ｃ）。
【０３３４】
実施例１１
実施例１１で使用される材料は、ＲＡＦＴ剤合成についての本明細書の実施例に記載のソースから得た。本明細書において前述したとおり４アームＲＡＦＴ剤（５）も合成した。
【０３３５】
ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）−ブロック−ポリ（オリゴ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート−ブロック−ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）［Ｐ（ＤＭＡＥＭＡ−ｂ−ＯＥＧＭＡ４７５−ｂ−ＤＭＡＥＭＡ）］、［ＢＡＢ−Ｂ４Ｓ−３０／１６：（ＴＬ４６）］無し、且つ、ＰｏｌｙＦｌｕｏｒ［ＢＡＢ−Ｂ４Ｓ−３１／１５（ＴＬ４７−ＰＦ）］有りの合成および特性判定
【０３３６】
ステップ１ａ：ポリ（オリゴ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート薬剤のテレキーレックマクロＲＡＦＴ合成および特性判定
手順：
一般的な重合実験において、１３１９ｍｇのＯＥＧＭＡ４７５モノマー（２．７８×１０−３ｍｏｌ）、３．２０ｍｇのＶＡＺＯ−８８開始剤（１．３１×１０−５ｍｏｌ）、１６９．６０ｍｇの４−アームｓＲＡＦＴ剤（５）（７．２７×１０−５ｍｏｌ）および１１９３０ｍｇのＤＭＦ（１．６３×１０−１ｍｏｌ）を計量してシュレンク管に供給した。凍結排気融解サイクルを４回繰り返すことにより溶液混合物を脱気し、９０℃で２１時間かけて重合化した。
【０３３７】
モノマーからポリマーへの変換率は、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）により決定される８２％であった。変換率は、重合化溶液に、内部標準の１，３，５−トリオキサンを５ｍｇ／１ｍＬの割合で添加して算出した。１Ｈ−ＮＭＲの重合前後のスペクトルを比較した。トリオキサン５．１ｐｐｍの−ＯＣＨ２環の集積を、モノマー５．５−６ｐｐｍのＣＨ２＝Ｃプロトンの集積と比較した。１Ｈ−ＮＭＲに基づいて算出されるポリマーの分子量は３１ｋＤａであり、重合度〜６６（平均１６ＯＥＧＭＡ４７５ユニット／アーム）に対応する。線状ポリスチレン標準に対するゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により決定されるポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）は２３ｋＤａ（分散度１．２５）であった。
【０３３８】
得られたポリマーを少量のＤＣＭに融解し、ジ−イソプロピルエーテルに沈殿させた。回収されたポリマーは、同じ手順でさらに２回沈殿させ、真空オーブンにて４０℃で一定重量に乾燥させた。
【０３３９】
ステップ１ｂ：ＰｏｌｙＦｌｕｏｒＴＭ５７０有りのポリ（オリゴ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート薬剤のテレキーレックマクロＲＡＦＴ合成および特性判定
一般的な重合実験において、１３５９ｍｇのＯＥＧＭＡ４７５モノマー（２．８６×１０−３ｍｏｌ）、３．２０ｍｇのＶＡＺＯ−８８開始剤（１．３１×１０−５ｍｏｌ）、１６８．７ｍｇの４−アームｓＲＡＦＴ剤（５）（７．２３×１０−５ｍｏｌ）、１９．８ｍｇのＰｏｌｙＦｌｏｕｒＴＭ５７０（２．９×１０−５ｍｏｌ）および１１９３０ｍｇのＤＭＦ（１．６３×１０−１ｍｏｌ）を計量してシュレンク管に供給した。凍結排気融解サイクルを４回繰り返すことにより溶液混合物を脱気し、９０℃で２１時間かけて重合化した。
【０３４０】
モノマーからポリマーへの変換率は、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）により決定される７８％であった。変換率は、重合化溶液に、内部標準の１，３，５−トリオキサンを５ｍｇ／１ｍＬの割合で添加して算出した。重合前後の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを比較した。トリオキサン５．１ｐｐｍの−ＯＣＨ２環の集積を、モノマー５．５−６ｐｐｍのＣＨ２＝Ｃプロトンの集積と比較した。１Ｈ−ＮＭＲに基づいて算出されるポリマーの分子量は３０ｋＤａであり、重合度〜６２（平均１６ＯＥＧＭＡ４７５ユニット／アーム）に対応していた。線状ポリスチレン標準に対するゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により決定されるポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）は２２ｋＤａ（分散度１．２５）であった。
【０３４１】
得られたポリマーを少量のＤＣＭに溶解し、ジ−イソプロピルエーテルに沈殿させた。回収されたポリマーは、同じ手順でさらに２回沈殿させ、真空オーブンにて４０℃で一定重量に乾燥させた。
【０３４２】
ステップ２：ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）−ブロック−ポリ（オリゴ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート−ブロック−ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）［Ｐ（ＤＭＡＥＭＡ−ｂ−ＯＥＧＭＡ４７５−ｂ−ＤＭＡＥＭＡ）］：ＢＡＢ−Ｂ４Ｓ−３０／１６：（ＴＬ４６）およびＢＡＢ−Ｂ４Ｓ−３１／１５：（ＴＬ４７−ＰＦ）の合成および特性判定
下記の手順に従ってＴＬ４６およびＴＬ４７−ＰＦ）を作成した。
【０３４３】
一般的な重合実験において、ステップ１ａまたは（ＰｏｌｙＦｌｏｕｒＴＭ５７０有り）１ｂの１５０３ｍｇのＰＯＥＧＭＡ４７５テレキーレックマクロＲＡＦＴ剤（４．７９７×１０−５ｍｏｌ）、１４４８ｍｇのＤＭＡＥＭＡモノマー（９．２１×１０−３ｍｏｌ）、０．５８６ｍｇのＶＡＺＯ−８８開始剤（２．４×１０−６ｍｏｌ）、および、７２２９ｍｇのＤＭＦ（９．８９×１０−２ｍｏｌ）を計量してシュレンク管に供給した。凍結排気融解サイクルを４回繰り返すことにより溶液混合物を脱気し、９０℃で１６時間かけて重合化した。
【０３４４】
モノマーからポリマーへの変換率は、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）により決定される６３％であった。変換率は、重合化溶液に、内部標準の１，３，５−トリオキサンを５ｍｇ／１ｍＬの割合で添加して算出した。１Ｈ−ＮＭＲの重合前後のスペクトルを比較した。トリオキサン５．１ｐｐｍの−ＯＣＨ２環の集積を、モノマー５．５−６ｐｐｍのＣＨ２＝Ｃプロトンの集積と比較した。ＮＭＲに基づいて算出され、線状ポリスチレン標準に対するゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により決定される分子量は表１に示す通りである。
【０３４５】
得られたポリマーを少量のＤＣＭに溶解し、ジ−イソプロピルエーテルに沈殿させた。回収された沈殿物は、同じ手順でさらに２回沈殿させ、真空オーブンにて４０℃で一定重量に乾燥させた。
【０３４６】
第四級化ブロックコポリマー
丸底フラスコにおいて、メタノールに１０％（ｗ／ｖ）でＢＡＢブロックコポリマー（ＢＡＢ−Ｂ４Ｓ−３０／１６またはＴＬ４６）を溶解させた。ブロックコポリマーのＰＤＭＡＥＭＡ部分に対する２モル当量のヨウ化メチルを添加した。反応混合物は室温で一晩混合した。回転蒸発装置により揮発性物質を全て除去後、真空オーブンにて４０℃でさらに乾燥させた。
【０３４７】
透析
脱イオン水に対して透析（分画分子量３５００，Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｐｏｒ，  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，ヒューストン、テキサス）を３日間行うことにより、ポリマー物質をさらに精製した。透析後、凍結乾燥によりポリマー溶液から水を除去した。
【０３４８】
表４：分子量、分散率、および、ＲＡＦＴ重合により作成されたスターブロックコポリマーの組成物
【表４】
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【０３４９】
本明細書および以下に続く請求項全体に亘り、文脈上で必要のない限り、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」や「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」等の変化形は、供述される整数、ステップ、整数群、または、ステップ群を含むことを暗示的に示唆しており、その他の整数、ステップ、整数群、または、ステップ群を除外するものではないと解釈するものとする。
【０３５０】
本明細書における、先の刊行物（またはそこから得られる情報）、または、あらゆる公知の事項の引用は、先の刊行物（またはそこから得られる情報）、または、公知の事項が、本明細書の関連する分野における共通の一般知識を形成するものと承認または認識するものではなく、またそのように解釈されるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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