(57)【要約】  本発明は、ＨＥＲ２陽性乳癌、特に局所再発又は転移性のＨＥＲ２陽性乳癌と診断された患者のコントロールレベルと関連するＶＥＧＦＡ及び／又はＶＥＧＦＲ２の発現レベル、特に血漿発現レベルを決定したうえで化学療法レジメンにベバシズマブ（アバスチン（登録商標））を添加することにより、ＨＥＲ２陽性乳癌、特に局所再発又は転移性ＨＥＲ２陽性乳癌に罹患している患者の化学療法レジメンの治療効果を改善するための方法を提供する。本発明はまた、ＨＥＲ２陽性乳癌、特に局所再発又は転移性のＨＥＲ２陽性乳癌と診断された患者のコントロールレベルと関連するＶＥＧＦＡ及び／又はＶＥＧＦＲ２の発現レベル、特に血漿発現レベルを決定することにより、化学療法レジメンと併用するベバシズマブ（アバスチン（登録商標））に対する患者の感受性又は応答性を評価するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＥＲ２陽性乳癌と診断された患者が、抗ＶＥＧＦ抗体を含む抗癌療法によって、より適切に治療されるか又はあまり適切に治療されないかを決定する方法であって、
（ａ）  ＨＥＲ２陽性乳癌と診断された患者由来のサンプル中のＶＥＧＦＡ及び／又はＶＥＧＦＲ２の発現レベルを決定すること、
（ｂ）  前記患者を、（ａ）に従い、発現レベルに基づいて、抗ＶＥＧＦ抗体を含む抗癌療法によって、より適切に治療されるか又はあまり適切に治療されないか同定することであって、ＶＥＧＦＡ及び／又はＶＥＧＦＲ２の発現レベルが基準レベルか又はそれを上回るレベルであれば、前記患者が前記抗癌療法でより適切に治療されることを示し、又は、ＶＥＧＦＡ及び／又はＶＥＧＦＲ２の発現レベルが基準レベルを下回るレベルであれば、前記患者が前記抗癌療法であまり適切に治療されないことを示すこと
を含む方法。
【請求項２】
患者が抗癌療法によって適切に治療されているか否かが無増悪生存期間の観点から決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗癌療法で患者を治療することを更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗癌療法が抗ＶＥＧＦ抗体、抗Ｈｅｒ２抗体及びタキサンを含む、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
ＨＥＲ２陽性乳癌と診断された患者について、化学療法への抗ＶＥＧＦ抗体の追加に感受性があるか否かを決定する方法であって、
（ａ）  ＨＥＲ２陽性乳癌と診断された患者由来のサンプル中のＶＥＧＦＡ及び／又はＶＥＧＦＲ２の発現レベルを決定すること、
（ｂ）（ａ）に従い、発現レベルに基づいて、化学療法への抗ＶＥＧＦ抗体の追加に感受性がある患者を同定するものであり、ＶＥＧＦＡ及び／又はＶＥＧＦＲ２の発現レベルが基準レベルか又はそれを上回るレベルであれば、患者が化学療法レジメンへの抗ＶＥＧＦ抗体の追加に感受性であることを示すこと
を含む方法。
【請求項６】
化学療法レジメンへの抗ＶＥＧＦ抗体の追加に対する患者の感受性が無増悪生存期間の観点から決定される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記抗癌療法で患者を治療することを更に含む、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記化学療法レジメンが抗Ｈｅｒ２抗体及びタキサンを含む、請求項５から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記患者が局所再発又は転移性ＨＥＲ２陽性乳癌と診断されている、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記患者が以前に化学療法又は放射線治療を受けていない、請求項１から９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗ＶＥＧＦ  Ａ４．６．１抗体がエピトープと結合する、請求項１から１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗ＶＥＧＦ抗体がベバシズマブである、請求項１から１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗ＶＥＧＦ抗体が可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）を含み、ＶＨは配列番号２のアミノ酸配列を有し、ＶＬは配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項１から１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記タキサンがドセタキセル又はパクリタキセルである、請求項４、８から１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記タキサンがドセタキセルである、請求項４、８から１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗ＨＥＲ２抗体が４Ｄ５エピトープと結合する、請求項４、８から１５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗ＨＥＲ２抗体がトラスツズマブである、請求項４、８から１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗ＶＥＧＦ抗体が可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）を含み、ＶＨは配列番号４のアミノ酸配列を有し、ＶＬは配列番号３のアミノ酸配列を有する、請求項４、８から１７の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記発現レベルがタンパク質発現レベルである、請求項１から１８の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記サンプルが血漿サンプルである、請求項１から１９の何れか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記発現レベルがＶＥＧＦＡの発現レベルである、請求項１から２０の何れか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記発現レベルがＶＥＧＦＲ２の発現レベルである、請求項１から２１の何れか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ＨＥＲ２陽性乳癌と診断され、請求項１から４、９から２２の何れか一項に記載の方法により、抗ＶＥＧＦ抗体を含む抗癌療法を用いて、より適切に治療されると同定される患者の治療用のための抗ＶＥＧＦ抗体を含む医薬組成物。
【請求項２４】
ＨＥＲ２陽性乳癌と診断され、請求項５から２２の何れか一項に記載の方法により、化学療法への抗ＶＥＧＦ抗体の追加に感受性があると同定される患者の治療のための抗ＶＥＧＦ抗体を含む医薬組成物。
【請求項２５】
ＶＥＧＦＡ及び／又はＶＥＧＦＲ２の発現レベルを検出するための化合物のセット、具体的にはＶＥＧＦＡ及び／又はＶＥＧＦＲ２に結合することができる抗体を含んでいるセットを含む、請求項１から２２の何れか一項に記載の方法を実施するためのキット。
【請求項２６】
化学療法レジメンに抗ＶＥＧＦ抗体を追加することにより、ＨＥＲ２陽性乳癌と診断された患者における化学療法レジメンの治療効果を改善する、以下の方法：
（ａ）  ＨＥＲ２陽性乳癌と診断された患者由来のサンプル中のＶＥＧＦＡ及び／又はＶＥＧＦＲ２の発現レベルを決定し、
（ｂ）（ａ）に従い、発現レベルに基づいて、化学療法への抗ＶＥＧＦ抗体の追加に感受性がある患者を同定するものであり、ＶＥＧＦＡ及び／又はＶＥＧＦＲ２の発現レベルが基準レベルか又はそれを上回るレベルであれば、患者が化学療法レジメンに対する抗ＶＥＧＦ抗体の追加に感受性であることを示す。
（ｃ）（ｂ）に従い、化学療法への抗ＶＥＧＦ抗体の追加に対して感受性があると同定された患者に、化学療法レジメンの有効量と組み合わせた抗ＶＥＧＦ抗体の有効量を投与すること。
【請求項２７】
前記化学療法レジメンへの抗ＶＥＧＦ抗体の追加に対する患者の感受性が無増悪生存期間の観点から決定される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗癌療法が抗Ｈｅｒ２抗体及びタキサンを含む、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記患者が局所再発又は転移性ＨＥＲ２陽性乳癌と診断されている、請求項２６から２８の何れか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記患者が以前に化学療法又は放射線治療を受けていない、請求項２６から２９の何れか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗ＶＥＧＦ抗体がＡ４．６．１と結合する、請求項２６から３０の何れか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗ＶＥＧＦ抗体がベバシズマブである、請求項２６から３１の何れか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗ＶＥＧＦ抗体が可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）を含み、ＶＨは配列番号２のアミノ酸配列を有し、ＶＬは配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項２８から３２の何れか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記タキサンがドセタキセル又はパクリタキセルである、請求項２８から３３の何れか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記タキサンがドセタキセルである、請求項２８から３４の何れか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記抗ＨＥＲ２抗体が４Ｄ５エピトープと結合する、請求項２８から３５の何れか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記抗ＨＥＲ２抗体がトラスツズマブである、請求項２８から３６の何れか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗ＶＥＧＦ抗体が可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）を含み、ＶＨは配列番号４のアミノ酸配列を有し、ＶＬは配列番号３のアミノ酸配列を有する、請求項２８から３７の何れか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記発現レベルがタンパク質発現レベルである、請求項２６から３８の何れか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記試料が血漿サンプルである、請求項２６から３９の何れか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記発現レベルがＶＥＧＦＡの発現レベルである、請求項２６から４０の何れか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記発現レベルがＶＥＧＦＲ２の発現レベルである、請求項２６から４１の何れか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＥＲ２陽性乳癌と診断されたどのような患者が、抗ＶＥＧＦ抗体を含む抗癌療法を用いた治療で最も恩恵を受けるかを確認するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生は、癌の発生など良性及び悪性疾患の一因となっており、特に癌においては、原発性腫瘍増殖、侵襲性及び転移には必須である。腫瘍が増殖するためには、血管新生スイッチを受けねばならない。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、この血管新生スイッチを誘導するために必要とされる。ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ経路内の遺伝子は、癌の進行の重要なメディエーターと考えられている。ＶＥＧＦ遺伝子ファミリーは、ＶＥＧＦＡとも称するＶＥＧＦ遺伝子、胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＶＥＧＦＤを含むＶＥＧＦホモログ、ＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２（それぞれＦＬＴ１及びＦＬＫ１／ＫＤＲと称する）を含むＶＥＧＦ受容体、低酸素誘導因子のＨＩＦ１α、ＨＩＦ２αを含むＶＥＧＦの誘導物質、酸素センサーのＰＨＤ１、ＰＨＤ２及びＰＨＤ３を含む。
【０００３】
癌細胞増殖及び転移におけるこの経路の重要性が、癌治療で使用する抗血管新生剤の開発をもたらした。これらの治療法には、とりわけ、ベバシズマブ、ペガプタニブ、スニチニブ、ソラフェニブとバタラニブが含まれている。ベバシズマブなどの血管新生阻害剤を用いて得られた著しく延長された生存にもかかわらず、患者はなお癌で死亡する。更に、全ての患者が血管新生阻害剤治療に応答するわけではない。非応答性の根底にある機序は不明のままである。更に、血管新生阻害剤治療は、胃腸穿孔、血栓症、出血、高血圧及びタンパク尿などの副作用と関連する。
【０００４】
従って、どの患者が血管新生阻害剤治療に特によく応答するかを決定する方法に対する必要性が存在する。
【０００５】
近年、３件のアバスチン試験（ＨＥＲ２陰性の転移性乳癌におけるＡＶＡＤＯ試験（ＢＯ１７７０８）、転移性膵臓癌におけるＡＶＩＴＡ試験（ＢＯ１７７０６）及び転移性胃癌におけるＡＶＡＧＡＳＴ試験（ＢＯ２０９０４）で得られた血漿サンプルからＶＥＧＦＡ発現レベルが分析された。ＶＥＧＦＡ濃度の標本中央値が、患者群を（濃度の高値と低値に）分類するカットポイントとして事前に指定された。対照群と治療群のハザード比（ＨＲ）で測定した場合、高ＶＥＧＦ−Ａレベルを有する患者については、これらの試験全体で無増悪生存期間（ＰＦＳ）に対する著しい治療効果が認められた。また、ＢＯ１７７０６試験及びＢＯ２０９０４試験では、高ＶＥＧＦＡレベルを有する患者の全生存（ＯＳ）に対して著しい治療効果が認められた。本分析は、血漿ＶＥＧＦ−Ａがこれらの適応症におけるアバスチン治療に対する応答の予測因子となりうる可能性を示唆している。
【０００６】
また、ＨＥＲ２陰性の転移性乳癌におけるＢＯ１７７０８試験、及び転移性膵癌におけるＢＯ１７７０６試験での分析は、ベバシズマブ投与群が対照群と比較して、ＶＥＧＦＲ２レベルの高い患者で無増悪生存期間が延長していることを示した。
【発明の概要】
【０００７】
血管新生及び腫瘍形成に関連するバイオマーカーの状況の調査が、全バイオマーカー患者集団で測定されたコントロールレベルに比べてＶＥＧＦＲ及びＶＥＧＦＲ２の発現レベルが、ＨＥＲ２陽性の転移性乳癌患者における治療結果の改善に相関することが明らかになった。特に、全バイオマーカー患者集団で測定された基準レベルに比べて、ＶＥＧＦＡの高発現レベルを示す患者は、トラスツズマブ及びドセタキセル併用化学療法に対するベバシズマブの追加に応答して長期の無増悪生存を示した。全バイオマーカー患者集団で測定された基準レベルに比べて、ＶＥＧＦＲ２の高発現レベルを示す患者は、トラスツズマブ及びドセタキセル併用化学療法に対するベバシズマブの追加に応答して長期の無増悪生存を示した。
【０００８】
従って、本発明は、患者サンプル中のＶＥＧＦＡ及び／又はＶＥＧＦＲ２の発現レベルを決定することによって、ＨＥＲ２陽性乳癌と診断された患者が、化学療法レジメンへの抗ＶＥＧＦ抗体の追加に対して感受性であるか否かを決定する方法に関する。本発明はまた、ＨＥＲ２陽性乳癌と診断され、基準レベルと比較してＶＥＧＦＡ及び／又はＶＥＧＦＲ２の発現レベルが高い患者を治療するためのベバシズマブなどの抗ＶＥＧＦ抗体を含む医薬組成物に関する。本発明は、患者サンプル中のＶＥＧＦＡ及び／又はＶＥＧＦＲ２の発現レベルに基づいて、ベバシズマブなどの抗ＶＥＧＦ抗体を添加することによって、ＨＥＲ２陽性乳癌と診断された患者の化学療法の治療効果を改善するための方法に更に関する。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
１．定義
「投与」又は「投与すること」なる用語は、本明細書で用いられるように、血管新生阻害剤などの医薬組成物を、そのような治療又は当技術分野で周知の任意の適切な方法によって医学的介入を必要とする患者に投与することを意味する。投与の非限定経路は、経口、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、皮内、鼻腔内又は気管支内投与（例えば吸入より達成される）を含む。この発明の文脈において特に好ましいのは、非経口投与、例えば静脈内投与である。
【００１０】
「抗血管新生剤」又は「血管新生阻害剤」なる用語は、血管新生、脈管形成、又は望ましくない血管透過性を、直接的又は間接的に阻害する小分子量物質、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、単離されたタンパク質、組換えタンパク質、抗体、又はそれらの複合体又は融合タンパク質を指す。当然のことながら、抗血管形成剤には、結合して血管形成因子又はそのレセプターの血管形成活性をブロックするこれらの作用剤が含まれる。例えば、抗血管形成剤は、本明細書を通じて定義され又は当該分野で周知の血管新生剤に対する抗体又は他のアンタゴニスト、例えば、限定しないがＶＥＧＦ−Ａに対するか又はＶＥＧＦ−Ａレセプター（例えばＫＤＲレセプター又はＦｌｔ−１レセプター）に対する抗体、ＶＥＧＦ−トラップ、ＧｌｅｅｖｅｃＴＭ（イマチニブメシレート）などの抗ＰＤＧＦＲ阻害剤である。また、抗血管形成剤には、天然の血管形成阻害剤、例えば、アンジオスタチン、エンドスタチン等も含まれる。Klagsbrun及びD’Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39(1991);Streit及びDetmar, Oncogene, 22:3172-3179(2003)(例えば、悪性黒色腫の抗血管形成治療を記載している表３);Ferrara &Alitalo, Nature Medicine 5(12): 1359-1364 (1999);Toniniら., Oncogene, 22:6549-6556(2003)(例えば、周知の抗血管新生因子を記載している表２);及び、Sato Int. J. Clin. Oncol.,8:200-206 (2003)（例えば、臨床試験で用いられる抗血管形成剤を記載している表１）を参照。
【００１１】
「抗体」なる用語は、本明細書では最も広い意味で使用され、限定するものではないが、モノクローナル及びポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、単鎖抗体及び抗体断片及び断片コンストラクト、例えばＦ(ab')2断片、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖｓ）、二重特異性ｓｃＦｖｓ、ダイアボディ、単一ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）及びミニボディを含む。
【００１２】
「抗ＶＥＧＦ抗体」は、十分な親和性及び特異性でＶＥＧＦに結合する抗体である。選択される抗体は通常ＶＥＧＦに結合親和性を有し、例えば、抗体はｈＶＥＧＦにＫｄ値が１００ｎＭから１ｐＭの間で結合しうる。抗体の親和性は、表面プラズモン共鳴に基づくアッセイ（例えばＰＣＴ出願公開番号第２００５／０１２３５９号に記載されてビアコアアッセイなど）；酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）；及び競合アッセイ（例えばＲＩＡ）により決定することができる。ある実施態様において、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦ活性が関与している疾患又は症状を標的とすること及び妨げることにおける治療剤として使用することができる。また、抗体は、例えば治療としての有効性を評価するために、他の生物学的活性アッセイを施してもよい。このようなアッセイは、当技術分野で周知であり、標的抗原に依存し、抗体としての使用を意図している。例として、ＨＵＶＥＣ阻害アッセイ、腫瘍細胞増殖阻害アッセイ（例えば、国際公開第８９／０６６９２号に記載）；抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体媒介性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイ（米国特許第５，５００，３６２号）；及びアゴニスト活性又は造血アッセイ（国際公開第９５／２７０６２号を参照）。抗ＶＥＧＦ抗体は通常、ＶＥＧＦ−Ｂ又はＶＥＧＦ−Ｃなどの他のＶＥＧＦホモログにも、ＰＩＧＦ、ＰＤＧＦ又はｂＦＧＦなどの他の増殖因子にも結合しないであろう。
【００１３】
「ベバシズマブ（ＢＶ）」なる用語は、Prestaら Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)に従って作製された組換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体を指し、「ｒｈｕＭＡｂ  ＶＥＧＦ」又は「ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）」としても周知である。これは、ヒトＶＥＧＦのそのレセプターへの結合をブロックするマウス抗ヒトＶＥＧＦモノクローナル抗体Ａ４．６．１由来の抗原結合相補性決定領域と変異したヒトＩｇＧ１フレームワーク領域を含有する。ほとんどのフレームワーク領域を含む、ベバシズマブのおよそ９３％のアミノ酸配列はヒトＩｇＧ１由来のものであり、配列のおよそ７％はマウス抗体Ａ４．６．１由来である。ベバシズマブは、ハイブリドーマＡＴＣＣ  ＨＢ１０７０９によって産生されるモノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体Ａ４．６．１と同じエピトープに結合する。
【００１４】
「癌」なる用語は、未制御の細胞増殖によって典型的に特徴付けられる、哺乳動物における生理学的状態を指す。癌の例としては、限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病が含まれる。このような癌のより具体的な例には、扁平細胞癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、及び肺の扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）を含む）、腹膜癌、肝細胞癌、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）又は腹部（ｓｔｏｍａｃｈ）癌（例えば、消化器癌を含む）、膵臓癌（例えば、転移性膵臓癌を含む）、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、肝癌、乳癌（局所的進行型、再発性又は転移性ＨＥＲ−２陰性乳癌並びに局所再発性又は転移性ＨＥＲ−２陽性乳癌を含む）、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）又は腎（ｒｅｎａｌ）癌、肝臓癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝細胞癌、及び様々なタイプの頭頸部癌、並びにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽細胞性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小非分割細胞ＮＨＬ；バルキー疾患ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；エイズ関連リンパ腫；及びワルデンストロームのマクログロブリン病を含む）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球白血病（ＡＬＬ）；ヘアリー細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；及び移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、並びに、母斑症と関係する異常な血管性増殖、浮腫（脳腫瘍と関係するものなど）、メイグス症候群が含まれる。
【００１５】
「生理学的又は病理学的血管形成異常」の例としては、限定されないが、高悪性度神経膠腫、神経膠芽腫、ランデュ・オスラー・ウェーバー病、フォン・ヒッペル・リンドウ病、血管腫、乾癬、カポジ肉腫、眼内血管新生、関節リウマチ、子宮内膜症、アテローム性動脈硬化症、心筋虚血、末梢虚血、脳虚血及び創傷治癒が含まれる。
【００１６】
「化学療法剤」又は「化学療法レジメン」なる用語は、抗癌治療効果を提供することができる任意の活性剤を含み、特に、癌細胞又は腫瘍細胞に干渉することができる化学薬剤又は生物学的薬剤であってもよい。特定の活性薬剤は、悪性細胞の発生、成熟又は増殖を阻害又は防止する抗新生物（ケモトキシック又はケモスタティック）剤として作用するものである。化学療法剤の例は、ナイトロジェンマスタード等のアルキル化剤（例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン及びクロラムブシル）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、及びセムスチン（メチル−ＣＣＮＵ））、エチレンイミン／メチルメラミン（例えば、トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、トリエチレン、チオホスホルアミド（チオテパ）、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ、アルトレタミン））、スルホン酸アルキル（例えば、ブスルファン）、及びトリアジン（例えば、ダカルバジン（ＤＴＩＣ））；葉酸アナログ等の代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、トリメトレキサート）、ピリミジンアナログ（例えば、５−フルオロウラシル、カペシタビン、フルオロデオキシウリジン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ、シタラビン）、５−アザシチジン、２，２′−ジフルオロデオキシシチジン）、及びプリンアナログ（例えば、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アザチオプリン、２′−デオキシコホルマイシン（ペントスタチン）、エリスロヒドロキシノニルアデニン（ＥＨＮＡ）、リン酸フルダラビン、及び２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン、２−ＣｄＡ））；天然物に由来する有糸分裂阻害剤（例えば、パクリタキセル、ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン（ＶＬＢ）、ビンクリスチン、及びビノレルビン）、ドセタキセル、エストラムスチン、及びリン酸エストラムスチン）、エピポドフィロトキシン（例えば、エトポシド、テニポシド）、抗生物質（例えばアクチノマイシンＤ、ダウノマイシン（ルビドマイシン）、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、イダルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、マイトマイシンＣ、アクチノマイシン）、酵素（例えば、Ｌ−アスパラギナーゼ）、及び生体応答修飾物質（例えば、インターフェロン−α、ＩＬ−２、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ）；白金錯体複合体（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン）を含む種々の薬剤（ｍｉｓｃｅｌｌａｎｅｏｕｓ  ａｇｅｎｔｓ）、アントラセンジオン（例えば、ミトキサントロン）、置換尿素（即ちヒドロキシウレア）、メチルヒドラジン誘導体（例えば、Ｎ−メチルヒドラジン（ＭＩＨ）、プロカルバジン）、副腎皮質抑制剤（例えば、ミトタン（ｏ，ｐ′−ＤＤＤ）、アミノグルテチミド）；副腎皮質ステロイドアンタゴニストを含むホルモン及びアンタゴニスト（例えば、プレドニゾン及び等価物、デキサメタゾン、アミノグルテチミド）、プロゲスチン（例えば、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール）、エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロール、エチニルエストラジオール及��その等価物）；抗エストロゲン剤（例えば、タモキシフェン）、アンドロゲン（例えば、プロピオン酸テストステロン、フルオキシメステロン及びその等価物）、抗アンドロゲン剤（例えば、フルタミド、性腺刺激ホルモン放出ホルモンアナログ、リュープロリド）及び非ステロイド性抗アンドロゲン剤（例えば、フルタミド）、上皮成長因子阻害剤（例えば、エルロチニブ、ラパチニブ、ゲフィチニブ）抗体（例えば、トラスツズマブ）、イリノテカン、及びロイコボリンなどの他の薬剤を含む。局所再発性又は転移性ＨＥＲ−２陽性乳癌の治療のために、ベバシズマブ投与のための化学療法剤は、カペシタビン、パクリタキセル及びドセタキセル並びにそれらの組合せが挙げられる（本明細書で提供される実施例も参照）。
【００１７】
「ドセタキセル」なる用語は、遊離チューブリンに結合し、そのアセンブリを抑制しながら同時に、安定な微小管へのチューブリンのアセンブリを促進する抗新生物剤を指す。これは、正常な機能を有さない微小管束の形成及び微小管の安定化をもたらし、細胞周期のＭ期の細胞をブロックし、細胞死に至らしめる。
【００１８】
「有効量」なる用語は、哺乳動物における疾患又は障害を治療するために、単剤、又は他剤との併用、又は治療レジメンとして有効な量を指す。癌の場合、薬剤の治療的有効量は、癌細胞の数を減少させ；腫瘍の大きさを減少させ；末梢器官への癌細胞の浸潤を阻害し（即ち、ある程度遅延させ好ましくは停止させ）；腫瘍の転移を阻害し（即ち、ある程度遅延させ好ましくは停止させ）；ある程度腫瘍の増殖を阻害し；及び／又は疾患に関連した一以上の症状をある程度和らげる場合がある。ある程度まで既存の癌細胞の成長を防ぐ、及び／又は死滅させるため、それは細胞増殖抑制性及び／又は細胞障害性であり得る。癌治療の場合、インビボでの有効性は、例えば、生存期間、無増悪生存期間、応答率（ＲＲ）、応答期間、及び／又は生活の質を評価することによって測定され得る。
【００１９】
本明細書で使用する「発現レベル」なる用語はまた、試料中の本発明のマーカー／標識タンパク質の濃度又は量を指す可能性もある。
【００２０】
「エピトープ  Ａ４．６．１」なる用語は、「抗ＶＥＧＦ抗体ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））（Muller Y ら , Structure 15 September 1998 , 6 : 1153−1167を参照のこと）によって認識されるエピトープを指す。本発明の特定の実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体は、ハイブリドーマＡＴＣＣ  ＨＢ  １０７０９によって産生されるモノクローナル抗−ＶＥＧＦ抗体Ａ４．６．１と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体を含むが、これに限らず、Prestaら (1997)Cancer Res. 57: 4593-4599に従って生成される組み換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体が含まれる。
【００２１】
「エピトープ４Ｄ５」は、  出典明示により援用するＷＯ２００９／１５４６５１に記載されているように、抗体４Ｄ５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０４６３）及びトラスツズマブが結合するＨＥＲ２の細胞外ドメイン中の領域である。このエピトープはＨＥＲ２の膜貫通領域に近接しており、ＨＥＲ２のドメインＩＶ内（アミノ酸残基約４８９〜６３０  −  シグナルペプチドを除いて残基に付番）である。Garrettら、Mol. Cell. 11:495-505 (2003)、Choら、Nature 42l:756-760 (2003)、Franklinら、Cancer Cell 5:317-328 (2004)、及びPlowmanら、Proc. Natl. Acad. Sci. 90:1746-1750(1993)を参照されたい。４Ｄ５エピトープに本質的に結合する抗体をスクリーニングするために、例えばAntibodies,A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow及びDavid Lane(1988)に記載の通常の交差ブロッキングアッセイを行うことができる。あるいは、抗体がＨＥＲ２の４Ｄ５エピトープに本質的に結合するか否かを評価するために、エピトープマッピングを行うこともできる（例えば、約残基５２９から約残基６２５までを含む領域における任意の一又は複数の残基、ＨＥＲ２細胞外ドメインを含め、シグナルペプチドを含めて残基に付番）。
【００２２】
「ＨＥＲレセプター」は、ＨＥＲレセプターファミリーに属し、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４レセプターを含むレセプタータンパク質チロシンキナーゼである。ＨＥＲレセプターは、ＨＥＲリガンドと結合し、かつ／又は別のＨＥＲレセプター分子と二量体化できる細胞外ドメイン；親油性膜貫通ドメイン；保存された細胞内チロシンキナーゼドメイン；及びリン酸化されうるいくつかのチロシン残基を保有するカルボキシル末端シグナル伝達ドメインを一般に含むものである。ＨＥＲレセプターは、「天然配列」ＨＥＲレセプター又はその「アミノ酸配列変異体」でありうる。一実施態様では、ＨＥＲレセプターは天然配列のヒトＨＥＲレセプターである。「ＥｒｂＢ１」、「ＨＥＲ１」、「上皮成長因子レセプター」、及び「ＥＧＦＲ」なる用語は、本明細書において相互交換可能に使用され、例えばCarpenterら、Ann. Rev. Biochem.56:881-914 (1987)に開示されたＥＧＦＲを、その天然突然変異体形態（例えば、Humphreyら PNAS (USA) 87:4207-4211 (1990)にあるような欠失突然変異ＥＧＦＲ）を含めて指す。ｅｒｂＢ１はＥＧＦＲタンパク質産物をコードしている遺伝子を指す。
【００２３】
表現「ＥｒｂＢ２」及び「ＨＥＲ２」は本明細書において相互交換可能に使用され、ヒト抗原を指す。ＨＥＲ２タンパク質については、例えばSembaら、PNAS (USA)82:6497-6501 (1985)及びYamamotoら、Nature 319:230-234 (1986)（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号Ｘ０３３６３）に記載されている。「ｅｒｂＢ２」なる用語は、ヒトＥｒｂＢ２をコードしている遺伝子を指し、「ｎｅｕ」は、ラットｐｉ８５をコードしている遺伝子を指す。
【００２４】
「抗Ｈｅｒ２抗体」とは、ＨＥＲ２レセプターに結合する抗体である。場合によっては、ＨＥＲ抗体はＨＥＲの活性化又は機能を更に妨害する。一実施態様では、本発明の抗ＨＥＲ２抗体は、ＨＥＲ２ポリペプチド上の４Ｄ５エピトープに結合する抗ＨＥＲ２抗体であり、あるいは別の実施態様においては、トラスツズマブである。
【００２５】
ヒト化抗ＨＥＲ２抗体は、参考として本明細書に援用する米国特許第５８２１３３７号の表３に記載されるような、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−３、  ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−７及びｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８又はトラスツズマブ（即ち、ハーセプチン  （商標））を含む。本明細書の目的で、「トラスツズマブ」、「ハーセプチン（登録商標）」、及び「ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８」は、それぞれ配列番号３及び４の軽鎖及び重鎖アミノ酸配列を含む抗体を指す。
【００２６】
「ＨＥＲ２陽性」である癌又は癌細胞又は腫瘍は、同じ組織型の非癌細胞に比べて有意に高いレベルのＨＥＲレセプタータンパク質又は遺伝子を有するものである。そのような過剰発現は、遺伝子増幅により、又は転写もしくは翻訳の増加によって引き起こされることがある。ＨＥＲレセプターの過剰発現は、細胞の表面に存在するＨＥＲタンパク質の増加したレベルを評価することによって、診断又は予後アッセイで（例えば免疫組織化学アッセイ；ＩＨＣによって）決定することができる。又は、もしくは追加的に、例えば蛍光インサイツハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ；１９９８年１０月に公開されたＷＯ９８／４５４７９を参照されたい）、サザンブロット法、又は定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）などのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により細胞中のＨＥＲ２核酸レベルを測定することができる。血清などの生体液中の分断されたシェッド抗原（例えばＨＥＲ細胞外ドメイン）を測定することによって、ＨＥＲレセプターの過剰発現を研究することもできる（例えば、１９９０年６月１２日に発行された米国特許第４９３３２９４号；１９９１年４月１８日に公開された国際公開第９１／０５２６４号；１９９５年３月２８日に発行された米国特許第５４０１６３８号；及びSias等, J. Immunol. Methods 1990; 132: 73-80を参照のこと）。上記アッセイ以外に、様々な  インビボアッセイが当業者に利用できる。例えば検出可能なラベル、例えば放射性同位体で場合によりラベルした抗体に、患者の体内の細胞を曝露して、例えば放射能を外部スキャンすることにより、又は抗体に予め曝露された患者から採取した生検を分析することにより、その患者における細胞に対する抗体の結合を評価することができる。
【００２７】
「転移」又は「転移性」なる用語は、その原発部位から身体の他の部位に癌が広がることを指す。癌細胞は、原発腫瘍から剥離し、リンパ及び血管に浸透して、血流を介して循環し、身体の別の正常組織内の離れた病巣（転移）で成長する可能性がある。転移は、局所的又は離れた部位である可能性がある。転移は、原発腫瘍から剥離して、血流を介して移動し、遠隔部位で留まる腫瘍細胞に左右される連続的なプロセスである。新たな部位では、細胞が血液供給を樹立し、生命を脅かす腫瘤を形成するまでに成長する可能性がある。腫瘍細胞内の刺激性分子経路及び阻害性分子経路の両方が、この挙動を調節し、腫瘍細胞と遠隔部位における宿主細胞との間の相互作用も重要である。
【００２８】
「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」なる用語は、交換可能に使用され、２つ以上のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、好ましくは３つ以上からなる分子を指す。その正確な大きさは、オリゴヌクレオチドの最終的な機能又は使用に依存して、多くの要因に依存するであろう。オリゴヌクレオチドは、合成又はクローニングによって誘導することができる。デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドのキメラ体も本発明の範囲内にあり得る。
【００２９】
「全生存期間（ＯＳ）」なる用語は、治療の最中又は後に患者が生存する時間の長さを指す。当業者は理解するように、患者が、他の患者サブグループと比較して統計学的に有意に長い平均生存時間を有する患者のサブグループに属している場合、患者の全生存期間が改善又は延長される。
【００３０】
「患者」なる用語は、任意の単一動物、より具体的には治療が所望される哺乳動物（例えば、非ヒト動物、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウサギ、動物園の動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、及び非ヒト霊長類を含む）を意味する。更により具体的には、本明細書の患者はヒトである。
【００３１】
「罹患している患者」なる用語は、生理学的及び病理学的血管新生及び／又は腫瘍性疾患、乳癌などの、特に局所再発又は転移性ＨＥＲ２陽性乳癌に関する疾患に対して臨床徴候を示す患者を指す。
【００３２】
「薬学的組成物」なる用語は、医薬の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤を投与する被検体にとって許容できない毒性である追加成分を含まない無菌調製物を指す。
【００３３】
「無増悪生存期間（ＰＦＳ）」なる用語は、治療の間及びその後に、治療担当医師又は治験責任医師の評価によると、患者の病気は悪化しない、即ち進行しない時間の長さを指す。当業者は理解するように、患者が、同様の状況の患者の対照群の平均無増悪生存期間と比較して疾患が進行しないより長期間を有する患者のサブグループに属する場合、患者の無増悪生存期間が改善又は拡張される。
【００３４】
「ポリペプチド」なる用語は、所与の長さのアミノ酸鎖を包含するペプチド、タンパク質、オリゴペプチド又はポリペプチドに関し、アミノ酸残基は共有結合性ペプチド結合によって結合される。しかしながら、このようなタンパク質／ポリペプチドのペプチド模倣物もまた本発明により包含され、アミノ酸（一又は複数）及び／又はペプチド結合（一又は複数）が機能的アナログ、例えば２０の遺伝子コード化アミノ酸以外のアミノ酸残基、例えばセレノシステインによって置換されている。ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質は、ポリペプチドと称されうる。ポリペプチド及びタンパク質なる用語は、本明細書において互換的に使用される。ポリペプチドなる用語は、ポリペプチドの修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化等も指し除外しない。このような修飾は基礎的なテキスト、より詳細なモノグラフ、並びに膨大な研究文献によく記述されている。ポリペプチドなる用語はまた、「抗体」を意味し、本明細書で使用する用語「抗体」を包含する。
【００３５】
「応答性である」なる用語は、本発明の文脈において、乳癌、特に局所再発又は転移性ＨＥＲ２陽性乳癌に罹患している、又は罹患しやすいことが疑われる被験者／患者罹患がベバシズマブを含む化学療法レジメンへの応答を示すことを指す。当業者は、本発明の方法に従ってベバシズマブで治療した人が応答を示しているかどうかを判断する立場にある。例えば、応答は、腫瘍増殖の減少及び／又は停止、腫瘍の大きさの減少、及び／又は癌の一以上の症状の寛解など、乳癌、特に局所再発又は転移性ＨＥＲ２陽性乳癌の罹患の減少により反映され得る。好ましくは、転移の形成を予防又は転移の数又はサイズの減少などの応答は、乳癌の転移の変換の低下又は減少の指標として反映される場合がある（例えば、Eisenhauserら、固形がんの新効果判定規準:改訂RECISTガイドライン(version 1.1)Eur J Cancer 2009 45:228-247を参照）。
【００３６】
「基準レベル」なる用語は、ここでは予め決められた値を指す。当業者には理解されるように、基準レベルは予め決められており、例えば特異性及び／又は感受性の観点からその要件を満たすように設定される。これらの要件は、例えば規制機関から規制機関へと変化させることができる。アッセイの感度又は特異性が、それぞれ所定の限界、例えば、８０％、９０％又は９５％に設定されねばならないかもしれない。これらの要件は、正又は負の予測値を単位として定義することができる。それにもかかわらず、本発明に与えられた教示に基づいて、これらの要件を満たす基準レベルに到達することが常に可能となる。一実施態様にて、基準レベルは健常な個体にて決定される。一実施態様における基準レベルは、患者の属する疾患実体にて予め決められている。ある実施態様では、基準レベルは、調査される疾患実体における値の全体的分布の２５％から７５％の間の任意の割合に設定されることができる。他の実施態様では、基準レベルは、調査される疾患実体における値の全体的分布から決定された中央値、三分位数又は四分位数に例えば設定されることができる。一実施態様では、基準レベルは、調査される疾患実体における値の全体的分布から決定された中央値に設定される。
【００３７】
ある実施態様では、「増加」又は「上回る」なる用語は、ここに記述された方法によって検出される血漿のＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ２のレベルにおいて、基準サンプルからのＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ２のレベルに比べて、基準レベルを超えたレベル又は５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％又はそれ以上の全体的増加を指す。ある実施態様にて、その用語は、血漿のＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ２  レベルの増加を指し、その増加が、例えば基準サンプルから予め決められた血漿のＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ２  のレベルに比べて、少なくとも約１．５、１．７５、２  、３  、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、９０、又は１００倍高い。好ましい実施態様にて、「増加したレベル」なる用語は、基準レベルの値か又はそれを超えた値を指す。
【００３８】
ある実施態様では、「減少」又は「下回る」なる用語は、ここに記述された方法によって検出される血漿のＶＥＧＦＡ及び／又ＶＥＧＦＲ２のレベルにおいて、基準サンプルからのＶＥＧＦＡ及び／又ＶＥＧＦＲ２のレベルに比べて、基準レベルを下回るレベル又は５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の全体的減少を指す。ある実施態様において、「減少」なる用語は、ＶＥＧＦＡ及び／又ＶＥＧＦＲ２のレベルの減少を指し、ここでその減少レベルは、基準サンプルからのＶＥＧＦＡ及び／又ＶＥＧＦＲ２のレベルのたかだか約０．９倍、０．８倍、０．７倍、０．６倍、０．５倍、０．４倍、０．３倍、０．２倍、０．１倍、０．０５倍、又は０．０１倍である。
【００３９】
ある実施態様では、「基準レベルで」なる用語は、基準サンプルから、ここで記載の方法で検出されたＶＥＧＦＡ及び／又ＶＥＧＦＲ２のレベルと同じであるレベルを指す。
【００４０】
「再発」癌は、初期治療に応答した後、最初の原発部位又は遠隔部位のいずれかで再成長しているものである。
【００４１】
本発明の文脈において、「感受性である」なる用語は、乳癌、特に局所再発又は転移性ＨＥＲ２陽性乳癌に罹患した、罹患が疑われる、又は罹患しやすい被験者／患者が、化学療法レジメンと併用したベバシズマブ治療に対して何らかの方法で陽性反応を示すことを指す。上述のような「応答する」患者と比較した場合、患者の反応はあまり顕著でないかもしれない。例えば、患者は、腫瘍増殖又は転移性指標の減少は測定され得ないが、疾患に関連した苦痛が減る経験をする場合があり、及び／又は、化学療法レジメンと併用したベバシズマブに対する患者の反応は、ほんの一過性の性質である場合があり、即ち、（ａ）腫瘍及び／又は（ａ）転移の増殖が一時的に減少したか又は停止しているだけであり得る。
【００４２】
「生存」なる用語は、生存している被験者を指し、無増悪生存期間（ＰＦＳ）及び全生存率（ＯＳ）を含む。生存はカプラン・マイヤー法によって推定され得、生存率の違いは層別ログランク試験を用いて計算される。
【００４３】
「生存を延長させる」又は「生存の可能性を増大させる」とは、未治療の患者（即ち、ＶＥＧＦ抗体で治療されていない被験者に対して）と比較して、又はコントロール処置プロトコール、例えば化学療法剤のみ、例えばカペシタビン、タキサン、アントラサイクリン、パクリタキセル、ドセタキセル、パクリタキセルタンパク質結合粒子（例えば、アブラキサン（登録商標））、ドキソルビシン、エピルビシン、５−フルオロウラシル、シクロホスファミド、トラスツズマブ（例えば、ハーセプチン（登録商標））、又はその組合せのような局所再発又は転移性乳癌の標準治療に使用されるものによる治療と比較して、治療された被験者においてＰＦＳ及び／又はＯＳが増加していることを意味する。一実施態様では、局所再発又は転移性乳癌に対する標準治療は、トラスツズマブ及びドセタキセルを含む併用治療である。生存は、治療開始後又は最初の診断後、少なくとも約１ヶ月、２ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、又は少なくとも約１年、又は少なくとも約２年、又は少なくとも約３年、又は少なくとも約４年、又は少なくとも約５年、又は少なくとも約１０年等の間、モニターされる。
【００４４】
「ハザード比（ＨＲ）」なる用語は、イベントの割合に対する統計的定義である。本発明の目的において、ハザード比は、任意の特定の時点で実験群における事象の確率を対照群における事象の確率で割ったものを表すと定義されている。無増悪生存期間解析における「ハザード比」は、２つの無増悪生存期間曲線の間の差の概要であり、経過観察期間中にコントロールと比較した場合の治療における死亡リスクの減少を表す。
【００４５】
本明細書で用いられるように、「治療法」又は「治療」は、治療されている個体又は細胞の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の過程においてのいずれかで実行できる。治療の望ましい効果は、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。
【００４６】
「治療効果」なる用語は、用語「全生存期間」と「無増悪生存期間」を包含する。
【００４７】
「ＶＥＧＦＲ」なる用語は、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ受託番号  Ｐ３５９６８、Ｇｅｎｅ  ＩＤ（ＮＣＢＩ）：７４２２に示される配列番号２に例示される血管内皮増殖因子受容体５を指す。「ＶＥＧＦＡ」なる用語は、配列番号５のアミノ酸配列を有するタンパク質並びにそのホモログ及びアイソフォームを包含する。「ＶＥＧＦＡ」なる用語はまた、周知のアイソフォーム、例えばＶＥＧＦＡのスプライスアイソフォーム、例えば、ＶＥＧＦ１１１、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９及びＶＥＧＦ２０６、併せて天然に生じる対立遺伝子やそのプロセスされた形態をも包含し、Ferrara Mol. Biol. Cell 21:687 (2010) 及びLeungらのScience 246:1306 (1989)、及びHouckらのMol. Endocrin. 5:1806 (1991)に記載されるように、ＶＥＧＦ１６５のプラスミン開裂により生成する１１０アミノ酸ヒト血管内皮細胞増殖因子を含む。本発明の一実施態様では、  「ＶＥＧＦＡ」は、ＶＥＧＦ１２１及び／又はＶＥＧＦ１１０を指す。本発明の一実施態様では、  「ＶＥＧＦＡ」は、ＶＥＧＦ１１１を指す。本発明の文脈において、「ＶＥＧＦＡ」なる用語はまた、変異体タンパク質（アイソフォームを含む）、ホモログタンパク質、及び／又は断片が、一以上のＶＥＧＦＡ特異的抗体、例えば、Bender RELIATech and R&D Systemsから入手できる抗体クローン３Ｃ５及び２６５０３、及びKimら Growth Factors7(1): 53-64 (1992に記載のA4.6.1などによって認識されることを条件として、その変異体及び／又はホモログ並びにその配列の断片をも包含する。本発明の文脈において、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ−Ａの「アイソフォーム」なる用語は、スプライスアイソフォーム及び酵素開裂（例えばプラスミンによる）により生成される形態の両方を指す。
【００４８】
一実施態様において、「ＶＥＧＦＡ」は、「未修飾ＶＥＧＦ」を指す。本発明の文脈において、「未修飾の」ＶＥＧＦとはＶＥＧＦの未修飾アミノ酸配列、そのアイソフォーム及びその開裂産物に関する。未修飾のＶＥＧＦは、例えば合成で生成され、又は好ましくは大腸菌など原核生物の発現系での組換えにより生成される。未修飾のＶＥＧＦは、グリコシル化など、翻訳後修飾を保有しない。本発明の文脈において、「未修飾のＶＥＧＦ−Ａ」なる用語はまた、変異体タンパク質（アイソフォームを含む）、相同性タンパク質及び／又は断片が、未修飾のＶＥＧＦ−Ａ特異的抗体、例えば、ＲＥＬＩＡＴｅｃｈ  ＧｍｂＨ、Ｗｏｌｆｅｎｂｕｅｔｔｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙから入手できる抗体クローン３Ｃ５により認識されることを条件として、変異体及び／又はそのホモログ、並びにＶＥＧＦ−Ａの断片を包含する。
【００４９】
「ＶＥＧＦＲ２」なる用語は、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ受託番号  Ｐ３５９６８、Ｇｅｎｅ  ＩＤ（ＮＣＢＩ）：３７９１に示される配列番号２に例示される血管内皮増殖因子受容体６を指す。「ＶＥＧＦＲ２」なる用語は、配列番号６のアミノ酸配列を有するタンパク質並びにそのホモログ及びアイソフォームを包含する。本発明の文脈において、「ＶＥＧＦＲ２」なる用語はまた、変異体タンパク質（アイソフォームを含む）、相同性タンパク質及び／又は断片が、一以上のＶＥＧＦＲ２特異的抗体、例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ．から入手できる抗体クローン８９１１５及び８９１０９により認識されることを条件として、変異体及び／又はそのホモログ、並びにその配列の断片を包含する。
【００５０】
２．詳細な実施態様
本発明では、ＶＥＧＦＡ及び／又はＶＥＧＦＲ２  、抗血管新生療法による生存のためのマーカー又は予測バイオマーカーとして同定された。「マーカー」及び「予測的バイオマーカー」なる用語は、交換可能に使用されることができ、ＶＥＧＦＡ及び／又はＶＥＧＦＲ２の発現レベルのことを指す。
【００５１】
従って、本発明は、ＨＥＲ２陽性乳癌と診断された患者を概ね適切に、抗ＶＥＧＦ抗体、抗癌療法によって治療するか否かを決定する、以下の方法を提供する。
（ａ）  ＨＥＲ２陽性乳癌と診断された患者由来のサンプル中のＶＥＧＦＡ及び／又はＶＥＧＦＲ２の発現レベルを決定し、そして
（ｂ）（ａ）に従い、ＶＥＧＦＡ及び／又はＶＥＧＦＲ２の発現レベルが、基準レベルか又はそれを上回るレベルであれば、患者がより適切に抗癌療法で治療されていることを示し、又は、ＶＥＧＦＡ及び／又はＶＥＧＦＲ２の発現レベルが基準レベルを下回るレベルであれば、患者がより適切に抗癌療法で治療されていないことを示す、発現レベルに基づいて抗ＶＥＧＦ抗体を含む抗癌療法によって概ね適切に治療される患者を同定する。一実施態様において、患者が抗癌療法によって適切に治療されているか否かが無増悪生存期間の観点から決定される。一実施態様において、該方法は抗癌療法で患者を治療することを更に含む。一実施態様において、抗癌療法は、抗ＶＥＧＦ抗体、抗Ｈｅｒ２抗体及びタキサンを含む。
【００５２】
本発明は、ＨＥＲ２陽性乳癌と診断され、以下の方法により、抗ＶＥＧＦ抗体を含む抗癌療法を用いて、より適切に治療されると同定される患者の治療用のための抗ＶＥＧＦ抗体を含む医薬組成物を更に提供する。
（ａ）  ＨＥＲ２陽性乳癌と診断された患者由来のサンプル中のＶＥＧＦＡ及び／又はＶＥＧＦＲ２の発現レベルを決定し、そして
（ｂ）（ａ）に従い、ＶＥＧＦＡ及び／又はＶＥＧＦＲ２の発現レベルが、基準レベルか又はそれを上回るレベルであれば、患者がより適切に抗癌療法で治療されていることを示し、又は、ＶＥＧＦＡ及び／又はＶＥＧＦＲ２の発現レベルが基準レベルを下回るレベルであれば、患者がより適切に抗癌療法で治療されていないことを示す、発現レベルに基づいて抗ＶＥＧＦ抗体を含む抗癌療法によって概ね適切に治療される患者を同定する。一実施態様において、患者が抗癌療法によって適切に治療されているか否かが無増悪生存期間の観点から決定される。一実施態様において、抗癌療法は、抗ＶＥＧＦ抗体、抗Ｈｅｒ２抗体及びタキサンを含む。
【００５３】
本発明はまた、ＨＥＲ２陽性乳癌と診断された患者について、化学療法への抗ＶＥＧＦ抗体の追加に感受性があるか否かを決定する、以下の方法を提供する。
（ａ）  ＨＥＲ２陽性乳癌と診断された患者由来のサンプル中のＶＥＧＦＡ及び／又はＶＥＧＦＲ２の発現レベルを決定し、そして
（ｂ）（ａ）に従い、発現レベルに基づいて、化学療法に対する抗ＶＥＧＦ抗体の追加に感受性がある患者を同定するものであり、ＶＥＧＦＡ及び／又はＶＥＧＦＲ２の発現レベルが基準レベルか又はそれを上回るレベルであれば、患者が化学療法レジメンに対する抗ＶＥＧＦ抗体の追加に感受性であることを示す。一実施態様において、化学療法レジメンへの抗ＶＥＧＦ抗体の追加に対する患者の感受性は、無増悪生存期間の観点から決定される。一実施態様において、本方法は抗癌療法で患者を治療することを更に含む。一実施態様において、抗癌療法は、抗Ｈｅｒ２抗体及びタキサンを含む。
【００５４】
本発明は、ＨＥＲ２陽性乳癌と診断され、以下の方法により、化学療法への抗ＶＥＧＦ抗体の追加に感受性があると同定される患者の治療のための抗ＶＥＧＦ抗体を含む医薬組成物を更に提供する。
（ａ）  ＨＥＲ２陽性乳癌と診断された患者由来のサンプル中のＶＥＧＦＡ及び／又はＶＥＧＦＲ２の発現レベルを決定し、そして
（ｂ）（ａ）に従い、発現レベルに基づいて、化学療法への抗ＶＥＧＦ抗体の追加に感受性がある患者を同定するものであり、ＶＥＧＦＡ及び／又はＶＥＧＦＲ２の発現レベルが基準レベルか又はそれを上回るレベルであれば、患者が化学療法レジメンに対する抗ＶＥＧＦ抗体の追加に感受性であることを示す。一実施態様において、化学療法レジメンへの抗ＶＥＧＦ抗体の追加に対する患者の感受性は、無増悪生存期間の観点から決定される。一実施態様において、抗癌療法は、抗Ｈｅｒ２抗体及びタキサンを含む。
【００５５】
本発明はまた、化学療法レジメンに抗ＶＥＧＦ抗体を追加することにより、ＨＥＲ２陽性乳癌と診断された患者における化学療法レジメンの治療効果を改善する、以下の方法を提供する。
（ａ）  ＨＥＲ２陽性乳癌と診断された患者由来のサンプル中のＶＥＧＦＡ及び／又はＶＥＧＦＲ２の発現レベルを決定し、
（ｂ）（ａ）に従い、発現レベルに基づいて、化学療法に対する抗ＶＥＧＦ抗体の追加に感受性がある患者を同定するものであり、ＶＥＧＦＡ及び／又はＶＥＧＦＲ２の発現レベルが基準レベルか又はそれを上回るレベルであれば、患者が化学療法レジメンに対する抗ＶＥＧＦ抗体の追加に感受性であることを示し、そして
（ｃ）（ｂ）に従い、化学療法への抗ＶＥＧＦ抗体の追加に対して感受性があると同定された患者に、有効量の化学療法レジメンと有効量の抗ＶＥＧＦ抗体を併用して投与する。一実施態様において、化学療法レジメンへの抗ＶＥＧＦ抗体の追加に対する患者の感受性は、無増悪生存期間の観点から決定される。一実施態様において、抗癌療法は、抗Ｈｅｒ２抗体及びタキサンを含む。
【００５６】
一実施態様において、患者は、局所再発又は転移性ＨＥＲ２陽性乳癌と診断されている。一実施態様において、患者は、以前に化学療法又は放射線治療を受けていない。
【００５７】
一実施態様において、抗ＶＥＧＦ抗体は、Ａ４．６．１エピトープを結合する。より具体的には、抗ＶＥＧＦ抗体はベバシズマブであり、更により具体的には、抗ＶＥＧＦ抗体は可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）を含み、ＶＨは配列番号２のアミノ酸配列を有し、ＶＬは配列番号１のアミノ酸配列を有する。
【００５８】
一実施態様において、タキサンはドセタキセル又はパクリタキセルであり、より具体的には、ドセタキセルである。
【００５９】
一実施態様において、抗ＨＥＲ２抗体は、４Ｄ５エピトープを結合する。より具体的には、抗ＨＥＲ２抗体はトラスツズマブであり、更により具体的には、抗ＨＥＲ２抗体は可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）を含み、ＶＨは配列番号４のアミノ酸配列を有し、ＶＬは配列番号３のアミノ酸配列を有する。
【００６０】
一実施態様において、発現レベルはタンパク質発現レベルである。
【００６１】
一実施態様において、試料は血液サンプルであり、より具体的には、末梢血サンプルである。
【００６２】
一実施態様において、発現レベルはＶＥＧＦＡの発現レベルである。一実施態様では、ＶＥＧＦＡの発現レベルは、ＶＥＧＦ１１０の発現レベルである。一実施態様では、ＶＥＧＦＡの発現レベルは、ＶＥＧＦ１２１の発現レベルである。一実施態様では、ＶＥＧＦＡの発現レベルは、ＶＥＧＦ  １２１及びＶＥＧＦ１１０の発現レベルである。一実施態様では、ＶＥＧＦＡの発現レベルは、ＶＥＧＦ１１１の発現レベルである。一実施態様では、ＶＥＧＦＡの発現レベルは、未修飾ＶＥＧＦの発現レベルである。一実施態様において、発現レベルはＶＥＧＦＲ２の発現レベルである。一実施態様において、発現レベルはＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の発現レベルである。
【００６３】
一実施態様では、本発明の診断方法は、インビトロで行うことができる。
【００６４】
本明細書に記載される本発明の文脈において、ＶＥＧＦＡ及び／又はＶＥＧＦＲ２の発現レベルについては、特定のタンパク質の発現レベルを、発現プロファイル又はマーカーパネルのように、個々のマーカー又は二つ以上のグループで、別々に考えることができる。本明細書に記載される発明の文脈において、二つ以上のマーカーの発現プロファイルをまとめて考えることができる発現プロファイル又はマーカーパネルは、混合発現レベルと呼ぶ場合もある。例えば、二つ以上のマーカーの発現レベルは、共に添加され、同様に決定された制御混合発現レベルと比較することができる。従って、本発明の方法は、一以上のマーカーの発現レベルに基づき、混合発現レベルを含めた発現プロファイルの決定を包含する。
【００６５】
本明細書に記載の本発明の文脈において、そして、添付の例示的な実施例に従い、ＶＥＧＦＡ又はＶＥＧＦＲ２の別々の検討のために、以下の値を対応するマーカーの高い又は低い発現値として使用した。高ＶＥＧＦＡ（≧１２９．１  ｐｇ／ｍｌ）、低ＶＥＧＦＡ（＜１２９．１  ｐｇ／ｍｌ）、高ＶＥＧＦＲ２（≧１４．１  ｎｇ／ｍｌ）及び低ＶＥＧＦＲ２（＜１４．１  ｎｇ／ｍＬ）これらのレベルは、前向き分析計画に従って、サンプルの中央値として決定した。従って、特定のマーカーの高及び低発現との間のカットオフ値を構成する最適化されたレベルは、カットオフ上下の患者のサブセットが関連する統計的最適化基準を満たすまで、カットオフを変化させることによって決定する場合がある。例えば、最適なカットポイントは、サブセットの上下間の治療ハザード比の差が最大となるように、又は、１つのサブグループあるいは任意の他の関連する統計的基準における治療効果が最大となるように選択する場合がある。しかしながら、当業者は、特定のマーカーの発現のレベル、及び、それにより高い又は低い発現レベルを構成するものが、患者及び患者集団によって異なることを理解するであろう。従って、添付の例示的な実施例で説明した以外の検出方法を使用し、及び添付の例示的な実施例で説明した以外の患者及び患者集団を検討した場合、当業者が特定のバイオマーカーについて高発現及び／又は低発現レベルと考える値が、本明細書に記述されている値と異なる場合があることを、当業者は理解するであろう。当業者は、本明細書に記載される方法を踏まえて、特定のバイオマーカーの高い及び／又は低い発現レベルを構成するものを決定することができる。
【００６６】
当業者が理解するように、調査中の診断問題を改善するために２つ以上のマーカーの測定値を使用する多くの方法が存在する。非常に単純ではあるが、しばしば効果的なアプローチにおいて、試料を調べたマーカーの少なくとも１つについて陽性である場合、陽性の結果が仮定される。
【００６７】
しかし、マーカーの組み合わせもまた評価され得る。例えば、ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の、マーカーパネルのマーカー（又は混合発現レベル）について測定された値が数学的に組み合わされ、そして、組み合わされた値が基礎となる診断問題と関連付けられる。マーカー値は、任意の適切な最新の数学的手法によって組み合わされ得る。疾患又は治療効果とマーカーの組み合わせとを関連付けるための周知の数学的手法は、判別分析（ＤＡ）（即ち、線形−、二次−、正則化判別分析）、カーネル法（即ち、ＳＶＭ）、ノンパラメトリック法（即ち、ｋ−最近接分類）、ＰＬＳ（部分最小二乗）、ツリーベース法（即ち、ロジック回帰、ＣＡＲＴ、ランダムフォレスト法、ブースティング／バギング法）、一般化線形モデル（即ち、ロジスティック回帰）、主成分ベース法（即ち、ＳＩＭＣＡ）、一般化付加モデル、ファジーロジックベース法、ニューラルネットワーク及び遺伝的アルゴリズムベース法等の方法を用いる。当業者は、本発明のマーカー組み合わせを評価するために適切な方法を選択することに問題はないであろう。  本明細書で開示される本発明に従ったマーカーの組み合わせと、例えば、全生存率、無増悪生存期間、化学療法剤／化学療法レジメンへのベバシズマブの追加に対する応答性又は感受性の改善、及び／又は、ベバシズマブ（一つ以上の化学療法剤／化学療法レジメンに加えて  ）に対する応答性又は感受性の予測とを関連付けることに用いられる方法は、ＤＡ（即ち、線形−、二次−、正則化判別分析）、カーネル法（即ち、ＳＶＭ）、ノンパラメトリック法（即ち、ｋ−最近接分類）、ＰＬＳ（部分最小二乗）、ツリーベース法（即ち、ロジスティック回帰、ＣＡＲＴ、ランダムフォレスト法、ブースティング法）、又は一般化線形モデル（即ち、ロジスティック回帰）から選択される。これらの統計的方法に関する詳細は、以下の参考文献：Ruczinski , I. らのJ. of Computational and Graphical Statistics , 12 (2003) 475-511 ;Friedman , J. H. , J. of the American Statistical Association 84 (1989) 165-175; Hastie , Trevor , Tibshirani , Robert , Friedman ,Jerome , The Elements of Statistical Learning , Springer Series in Statistics ,2001 ; Breiman , L. , Friedman , J. H. , Olshen , R. A. , Stone , C. J. (1984) Classification and regression trees , California : Wadsworth ; Breiman ,L. , Random Forests , Machine Learning , 45 (2001) 5-32 ; Pepe , M. S. , The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction , Oxford Statistical Science Series , 28 (2003) ; 及びDuda , R. O. ,Hart , P. E. , Stork , D. G. , Pattern Classification , Wiley Interscience , 第2版 (2001)中に見られる。
【００６８】
従って、本明細書に開示される発明は、生物学的マーカーの基礎となる組み合わせのための最適化多変量カットオフを使用すること、並びに状態Ｂから状態Ａ、例えば化学療法レジメンへのベバシズマブ療法の追加に応答性又は感受性がない患者から化学療法レジメンへのベバシズマブの追加に応答性又は感受性がある患者を識別することに関する。この種の分析において、マーカーはもはや独立しておらず、マーカーパネル又は混合発現レベルを形成する。
【００６９】
３．  ＶＥＧＦＡ／ＶＥＧＦＲ２の発現レベルの検出
マーカーＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の１つ以上の発現レベルは、患者サンプル中の特定のタンパク質レベルの測定に適した当技術分野で周知の任意の方法によって評価することができ、好ましくは、一つ以上のＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２に特異的な抗体を用いて、ＥＬＩＳＡなどの免疫測定法によって決定される。このような方法は、当技術分野でよく知られており日常的に実行されており、かつ対応する市販の抗体及び／又はキットは、容易に入手可能である。例えば、ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２のための市販の抗体／試験キットが、クローン３Ｃ５及び２６５０３としてＢｅｎｄｅｒ  ＲＥＬＩＡＴｅｃｈ  ａｎｄ  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから、クローン８９１１５及び８９１０９としてＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから、並びにクローン２Ｄ６Ｄ５及び６Ａ１１Ｄ２としてロシュ・ダイアグノスティックス社から、それぞれ入手できる。好ましくは、本発明のマーカー／指標タンパク質の発現レベルが、抗体又はキットの製造業者の試薬及び／又はプロトコールの推奨を使用して評価される。当業者はまた、免疫アッセイ法によってＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の１つ以上の発現レベルを決定するための更なる手段を知っているであろう。従って、本発明のマーカー／指標の１つ以上の発現レベルは、当業者によって過度の負担なしに日常的にかつ再現可能に決定することができる。しかし、正確かつ再現可能な結果を確実にするために、本発明はまた、試験手順の検証を保証することができる特別な研究室における患者サンプルの試験をも包含する。
【００７０】
ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０  タンパク質は当該技術分野で周知の任意の方法を用いて検出することができる。例えば、哺乳動物由来の組織又は細胞サンプルは、例えば、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法等を使用して簡便にアッセイすることができる。上掲技術の適用における指針を与える多くの参考文献が利用可能である(Kohlerら Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980); Tijssen,Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985);Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984); Hurrell, MonoclonalHybridoma Antibodies: Techniques and Applications (CRC Press, Boca Raton, FL, 1982); 及びZola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques,頁147-1 58 (CRC Press, Inc., 1987))。
【００７１】
参照が、ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０の検出又はレベルに対してなされる場合、このことは両方の分子の合計が、例えばＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０の両方を検出するアッセイを用いて測定されることを意味する。ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０の両方の分子を検出するアッセイは、例えば、対応する他の形態に対して（即ち、それぞれもしＶＥＧＦ１１０がより良好に認識される場合、ＶＥＧＦ１２１に対して、又はもしＶＥＧＦ１２１がより良好に認識される場合、ＶＥＧＦ１１０に対して）感受性をもっているアッセイを含む。ある実施態様において、そのアッセイは、対応する他の形態に対する感受性が少なくとも５０％、７５％、８０％、８５％、９０％又はそれ以上を有する。一実施態様において、ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０の両方が本質的に同じ感受性で測定される。
【００７２】
ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０の検出に関して、様々なアッセイが利用可能である。例えば、サンプルは（例えば、サンドイッチアッセイにおいて）抗体又は抗体の組み合わせと優先的に接触され得、又は、長い天然に生じるＶＥＧＦ−ＡアイソフォームであるＶＥＧＦ１６５及びＶＥＧＦ１８９などのそれぞれと比較した場合、短いＶＥＧＦ−ＡアイソフォームであるＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０のそれぞれに特異的に結合する。好ましくは、長いアイソフォームと比較した場合、短いアイソフォームが、少なくとも３倍高い感受性で検出される。標準曲線が短いアイソフォーム（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより少なくとも９０％の純度及びＯＤ２８０ｎｍにより決定した濃度）を用いて樹立され、及び、長いアイソフォームについては、同じ試薬及び同じ標準曲線を用いて予め決められた濃度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより少なくとも９０％の純度及びＯＤ２８０ｎｍにより決定した濃度）での標準曲線の読み値が予想濃度のわずか３分の１以下である場合、少なくとも３倍高い感受性が認識される。また、短いアイソフォームに対する感受性は、長いアイソフォームと比較した場合、特にＶＥＧＦ１６５と比較した場合、少なくとも４倍、５倍、６倍、７倍、８倍又は９倍高いことが好まれる。
【００７３】
一実施態様では、ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０の両方の短いアイソフォームが特異的に検出される。そのような特異的検出は、もし、ＶＥＧＦ１２１のエキソン４及び８、又はＶＥＧＦ１１０の遊離Ｃ末端をそれぞれ連結することにより生成する配列に結合する抗体、特にモノクローナル抗体が使用され採用される場合に例えば可能である。そうしたＶＥＧＦ１１０抗Ｃ末端抗体は、長いポリペプチド鎖の一部としてアミノ酸１１０を含む任意のＶＥＧＦ−Ａアイソフォームに結合せず、又は例えばアミノ酸１０９が終端である短いＶＥＧＦ−Ａ断片に結合しない。ＶＥＧＦ１２１において、エキソン４及び８のそれぞれを連結することにより生成する配列に結合するモノクローナル抗体は、長いＶＥＧＦアイソフォーム１６５及び１８９のそれぞれに含まれるアミノ酸配列に対して、その中に他のアミノ酸が、エキソン４とエキソン７の連結，及びエキソン４とエキソン５の連結のそれぞれに起因して存在するために結合しないであろう  （例えば、  Ferrara, N., Mol. Biol. of the Cell 21 (2010) 687-690)。使用される抗体が短い断片と１０％未満の交差反応性を示し、抗ＶＥＧＦ１１０抗体においては、遊離Ｃ末端アミノ酸１１０を持たないＶＥＧＦ−Ａアイソフォーム、又は、抗ＶＥＧＦ１２１抗体においては、エキソン４及び８を連結することにより生成する配列を含まないアイソフォームと、１０％未満の交差反応性をそれぞれ示す場合に、上掲の意味での特異的結合は認識される。又、交差反応性が、短い断片、及び遊離Ｃ末端アミノ酸１１０の持たないＶＥＧＦ−Ａアイソフォームの両方、又はエキソン４とエキソン８それぞれを連結することにより生成する配列を含まないＶＥＧＦアイソフォームについて、それぞれ５％、４％、３％、２％及び１％未満であろうことが好まれる。
【００７４】
短いＶＥＧＦアイソフォームのＶＥＧＦ１２１又はＶＥＧＦ１１０のそれぞれと結合するだけの適切な特異的抗体は、標準的な手順に従って得ることができる。通常、ＶＥＧＦ１１０のＣ末端の最も少なくとも４、５、６、７、８、９又はそれ以上のアミノ酸を表すか、又は含むペプチド、又はＶＥＧＦ１２１のアミノ酸１１５のＣ末端及びＮ末端のそれぞれのアミノ酸を含む、少なくとも５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のアミノ酸を表すか又は含むペプチドが合成され、必要に応じて担体に結合させ、免疫化に用いられる。特異的ポリクローナル抗体は、適切な免疫吸着工程によって得ることができる。モノクローナル抗体はＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０それぞれとの反応性及び適切な低い交差反応性について、容易にスクリーニングすることができる。ＶＥＧＦ１１０特異的抗体に関して低い交差反応性は、ＶＥＧＦ１１０の短い断片（例えば、ＶＥＧＦ１１０のＣ末端アミノ酸を欠損）及び、ＶＥＧＦ１１０の遊離Ｃ末端アミノ酸を持たないＶＥＧＦ−Ａアイソフォームの両方について評価することができる。ＶＥＧＦ１２１特異的抗体の観点における低い交差反応性は、エキソン４とエキソン７の連結、及びエキソン４とエキソン５の連結のそれぞれの際に形成されるアミノ酸配列を含むＶＥＧＦアイソフォームを用いて評価することができる。
【００７５】
ＶＥＧＦ１１１タンパク質又は核酸は当該技術分野で周知の任意の方法を用いて検出することができる。例えば、哺乳動物由来の組織又はサンプルは、例えばウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡを使用してタンパク質について、ノーザンブロット、ドットブロット、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析、アレイハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイを用いて、又はＤＮＡ  ＳＮＰチップマイクロアレイを用いて、目的の遺伝子バイオマーカーからｍＲＮＡ又はＤＮＡについて都合良くアッセイすることができる。例えば、定量的ＰＣＲアッセイなどのリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイが当該分野で周知である。本発明の例示的な実施態様では、生物学的試料中の対象の遺伝子バイオマーカーからｍＲＮＡを検出する方法は、少なくとも一のプライマーを用いて逆転写によってサンプルからｃＤＮＡを生産し；そのようにして生産されるｃＤＮＡを増幅し；増幅されたｃＤＮＡの存在を検出することを含む。また、そのような方法は、（例えばアクチンファミリーメンバーのような「ハウスキーピング」遺伝子の比較コントロールｍＲＮＡ配列のレベルを同時に調べることによって）生物学的試料中のｍＲＮＡのレベルを決定することを可能にする一又は複数の工程を含みうる。場合によっては、増幅されたｃＤＮＡの配列を決定することができる。
【００７６】
上掲技術の適用における指針を与える多くの参考文献が利用可能である(Kohlerら Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980); Tijssen, Practice and Theory of EnzymeImmunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985); Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984); Hurrell,Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications (CRC Press, Boca Raton, FL, 1982); 及びZola,Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-1 58 (CRC Press, Inc.,1987)。
【００７７】
ＶＥＧＦ１１１タンパク質の検出については、様々なアッセイが利用可能であり、例えば、サンプルは、ＶＥＧＦ１６５及びＶＥＧＦ１８９，などそれぞれ長い天然に生じるＶＥＧＦ−Ａアイソフォームに対して比較した場合、ＶＥＧＦ１１１に優先的に又は特異的に結合する抗体又は抗体の組み合わせと接触され得る。好ましくは、長いアイソフォームと比較した場合、短いアイソフォームのＶＥＧＦ１１１が、少なくとも３倍高い感受性で検出される。標準曲線が短いアイソフォーム（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより少なくとも９０％の純度及びＯＤ２８０ｎｍにより決定した濃度）を用いて樹立され、及び、長いアイソフォームについては、同じ試薬及び同じ標準曲線を用いて予め決められた濃度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより少なくとも９０％の純度及びＯＤ２８０ｎｍにより決定した濃度）での標準曲線の読み値が予想濃度のわずか３分の１以下である場合、少なくとも３倍高い感受性が認識される。また好ましいことに、短いアイソフォームに対する感受性は、長いアイソフォームと比較した場合、少なくとも４倍、５倍、６倍、７倍、８倍又は９倍高い。
【００７８】
一実施態様において、アイソフォームＶＥＧＦ１１１が特異的に検出される。そのような特異的検出は、もし、ＶＥＧＦ１１１に固有のエクソンジャンクションに結合する抗体、特にモノクローナル抗体が使用され採用される場合に例えば可能である。そのような抗体は、特定のエクソンジャンクションを含まない他のＶＥＧＦ−Ａアイソフォーム又はその開裂産物に結合しない。上の意味での特異的結合は、使用される抗体が他のＶＥＧＦ−Ａアイソフォーム、固有のエクソンジャンクションを持たないＶＥＧＦ１２１又はＶＥＧＦ１６５それぞれと１０％未満の交差反応性を示す場合に認められる。また、例えばＶＥＧＦ１２１に対する交差反応性が、それぞれ５％未満、４％未満、３％未満、及び１％未満であるのが好ましい。
【００７９】
一実施態様においてＶＥＧＦ１１１に対する特異性が、ＶＥＧＦ１１１（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより少なくとも９０％の純度及びＯＤ２８０ｎｍにより決定した濃度）とＶＥＧＦ１２１（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより少なくとも９０％の純度及びＯＤ２８０ｎｍにより決定した濃度）を同じ試薬を用いて比較することにより評価される。  この比較において、ＶＥＧＦ１２１物質において得られたシグナルがＶＥＧＦ１１１物質で得られたシグナルのわずか１０分の１かそれ未満である場合、ＶＥＧＦ１２１に対する交差反応性は１０％未満である。当業者は理解するように、ＶＥＧＦ１２１のシグナルは、ＶＥＧＦ１１１についての最大シグナルの約５０％を生じる濃度で好ましくは読み取られる。
【００８０】
短いＶＥＧＦアイソフォームのＶＥＧＦ１１１と結合するだけの適切な特異的抗体は、標準的な手順に従って得ることができる。通常、ＶＥＧＦ１１１のアミノ酸１０５のＣ末端及びＮ末端のアミノ酸を表すか又は含むペプチドが合成され、必要に応じて担体に結合され、免疫化に用いられる。好ましくは、このようなペプチドは、長さが少なくとも６個のアミノ酸であり、少なくともＶＥＧＦ１１１のアミノ酸の１０５及び１０６を含むであろう。また、それは、ＶＥＧＦ１１１の少なくともアミノ酸１０４、１０５、１０６及び１０７を含んでなることが好ましい。当業者には理解されるように、ＶＥＧＦ１１１のアミノ酸１０５及び１０６の間のエクソンジャンクションのＮ末端及びＣ末端の例えば３、４、又はそれ以上のアミノ酸を含む長いペプチドもまたＶＥＧＦ１１１に特異的に結合する抗体を得るために使用することができる。
【００８１】
未修飾のＶＥＧＦタンパク質は当該技術分野で周知の任意の適切な方法を用いて検出することができる。好ましくは、抗体が、  ＲＥＬＩＡＴｅｃｈ  ＧｍｂＨ、Ｗｏｌｆｅｎｂｕｅｔｔｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙから商業的に入手可能なＭＡＢ  ３Ｃ５のような修飾型ＶＥＧＦに比べて、未修飾のＶＥＧＦに対して少なくとも優先的な結合特性を有するものが使用されるであろう。例えば、哺乳類由来の組織又は細胞サンプルは、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ法などを使用し、未修飾のＶＥＧＦタンパク質について簡便にアッセイすることができる。上掲技術の適用における指針を与える多くの参考文献が利用可能である(Kohlerら Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980); Tijssen,Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985);Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984); Hurrell, Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications (CRC Press, Boca Raton, FL, 1982); 及びZola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques,頁147-1 58 (CRC Press, Inc., 1987))。
【００８２】
未修飾のＶＥＧＦの検出又はレベルに対して申し述べる場合、これは例えばＭＡＢ  ３Ｃ５が結合した未修飾のＶＥＧＦ分子（アイソフォーム又は開裂産物）が測定されることを意味する。
【００８３】
未修飾のＶＥＧＦタンパク質の検出に関して、様々なアッセイが利用可能である。例えば、サンプルは、例えば患者のサンプルに天然に生じるような修飾型ＶＥＧＦと比較して、未修飾のＶＥＧＦに優先的又は特異的に結合する抗体又は抗体の組み合わせと接触され得る。好ましくは未修飾のＶＥＧＦは、未修飾のＶＥＧＦに特異的に結合する抗体、即ち、修飾型ＶＥＧＦ１６５に比較して未修飾のＶＥＧＦ１６５に対して少なくとも３倍高い感受性を有する抗体を用いて検出される。未修飾のＶＥＧＦに関するそうした少なくとも３倍高い感受性は、大腸菌で組換えにより生成されたＶＥＧＦ１６５と、ＨＥＫ細胞で組換えにより生成されたＶＥＧＦ１６５を（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより少なくとも９０％の純度及びＯＤ２８０ｎｍにより決定した濃度）同じ試薬を用いて比較することにより評価される。この比較において、ＨＥＫが生成した物質について得られたシグナルが、大腸菌に由来する物質で得られたシグナルのレベルのほんの三分の一又はそれ未満である場合、未修飾のＶＥＧＦが少なくとも３倍高い感受性で検出される。当業者は理解するように、シグナルは最大シグナルの約５０％で好ましくは読み取られる。この評価において好ましくは、実施例５のアッセイが用いられる。また好ましいのは、未修飾のＶＥＧＦ（大腸菌からのＶＥＧＦ１６５）に特異的に結合する抗体は、修飾型ＶＥＧＦの物質（ＨＥＫ細胞からのＶＥＧＦ１６５）と比較して、未修飾のＶＥＧＦを少なくとも４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、又は１０倍高い感受性で検出する抗体である。
【００８４】
一実施態様において、未修飾のＶＥＧＦは、市販のＭＡＢ  ３Ｃ５のような修飾型ＶＥＧＦと比較した場合、未修飾のＶＥＧＦに対して少なくとも同じ結合優先度を有する抗体を使用して特異的に検出される。一実施態様において、抗体の未修飾のＶＥＧＦに対する優先的結合に対する相対的な感受性がサンドイッチイムノアッセイで評価され、ここで未修飾のＶＥＧＦに対する抗体が捕捉抗体として使用され、かつ全ての主要ＶＥＧＦアイソフォーム又は開裂生成物に存在するエピトープに結合する検出抗体が使用される。一実施態様において、検出抗体がＭＡＢ  ３Ｃ５に対するエピトープ以外のエピトープに結合する、即ちそれはＶＥＧＦのアミノ酸３３から４３にまたがる合成ペプチドに含まれるエピトープには結合しないであろう。好ましくは、検出抗体は１から３２、４４から１０５にわたるアミノ酸に含まれるエピトープに結合するか、又はＭＡＢ  ３Ｃ５に結合されたエピトープと重複していない構造的エピトープに結合するであろう。一実施態様において、修飾型ＶＥＧＦと比較した場合に未修飾のＶＥＧＦに特異的に結合する抗体は、ＶＥＧＦのアミノ酸３３から４３にまたがる合成ペプチドに含まれるエピトープに結合する特性を有する。
【００８５】
未修飾のＶＥＧＦに特異的に結合する適切な特異的抗体は、標準的な手順に従って得ることができる。通常、大腸菌で組換えにより産生したか又は合成的に、例えば固相ポリペプチド合成により得られたＶＥＧＦのアイソフォーム、又は大腸菌で組換えにより産生したか又は合成的に、例えば固相ポリペプチド合成により得られたＶＥＦＧのエピトープを含むか又は代表するペプチドが免疫原として使用される。モノクローナル抗体は標準的プロトコールに従い容易に生成され、未修飾のＶＥＧＦとの反応性及び未修飾のＶＥＧＦとの適切な低い交差反応性についてスクリーニングできる。一つの簡便で好ましいスクリーニング法は、大腸菌で組換えにより生成されたＶＥＧＦ１６５（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより少なくとも９０％の純度及びＯＤ２８０ｎｍにより決定した濃度）、及びＨＥＫ細胞で組換えにより生成されたＶＥＧＦ１６５（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより少なくとも９０％の純度及びＯＤ２８０ｎｍにより決定した濃度）にそれぞれ基づいている。
【００８６】
ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の一以上の発現レベルは、生物学的サンプルである患者サンプルにおいて評価され得る。患者サンプルは、血液試料、血清試料又は血漿試料であってもよい。一実施態様では、サンプルは、ＥＤＴＡ−血漿である。一実施態様では、サンプルは、クエン酸血漿である。血液サンプル、血清サンプル及び血漿サンプルを得る方法は、当該分野で周知である。患者サンプルは、ネオアジュバント療法の前後、又はアジュバント療法の前後で患者から得てもよい。
【００８７】
４．治療の方法
本発明との関連において、ベバシズマブは、当該分野で周知の標準的な化学療法レジメンの一部として投与される一以上の化学療法剤による併用療法又は併用処置として又はそれらに加えて投与されるべきである。標準的な化学療法レジメンに含まれる薬剤の例としては、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカン、ゲムシタビン、エルロチニブ、カペシタビン、ドセタキセル及びパクリタキセルなどのタキサン、インターフェロンα、ビノレルビン、及びカルボプラチン、シスプラチン及びオキサリプラチンなどの白金系化学療法剤が挙げられる。添付の例示的な実施例で示すように、ベバシズマブの追加は、ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の１以上の発現レベルに応じて定義、選択された患者及び／又は患者集団において、無増悪生存期間を延長をもたらした。それゆえ、ベバシズマブは、添付の例示的な実施例に示されているドセタキセル療法のように、化学療法レジメンと併用することができる。
【００８８】
一般的な投与の様式には、ボーラス投与として、あるいは１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、７５分、９０分、１０５分、１２０分、３時間、４時間、５時間、又は６時間にわたる１日の全用量の投与など設定された期間での注入としての非経口投与が含まれる。例えば、体重の２．５ｍｇ／ｋｇから体重の１５ｍｇ／ｋｇのベバシズマブ（アバスチン（登録商標））を、治療される癌のタイプに応じて、毎週、２週間ごと、又は３週間ごとに投与することができる。投与量の例としては、毎週、２週間毎、又は３週間毎に与えられる、体重の２．５ｍｇ／ｋｇ、体重の５ｍｇ／ｋｇ、体重の７．５ｍｇ／ｋｇ、体重の１０ｍｇ／ｋｇ及び体重の１５ｍｇ／ｋｇが含まれる。投与量の更なる例としては、２週間毎に体重の５ｍｇ／ｋｇ、２週間毎に体重の１０ｍｇ／ｋｇ、３週間毎に体重の７．５ｍｇ／ｋｇ、及び３週間毎に体重の１５ｍｇ／ｋｇが挙げられる。本明細書に記載される発明の文脈において、低用量のベバシズマブは、例えば、毎週体重の２．５ｍｇ／ｋｇの用量、２週間毎に体重の５ｍｇ／ｋｇの用量、及び３週間毎に体重の７．５ｍｇ／ｋｇの用量を含む。本明細書に記載される発明の文脈において、高用量のベバシズマブは、例えば、毎週体重の５ｍｇ／ｋｇの用量、２週間毎に体重の１０ｍｇ／ｋｇの用量、及び３週間毎に体重の１５ｍｇ／ｋｇの用量を含む。
【００８９】
当業者は、ベバシズマブの投与の更なる様式が、特定の患者と化学療法レジメンによって決定される場合に本発明により包含され、そして投与と治療用量の特定の様式が  当技術分野で周知の方法に従って治療する医師により最良に決定されることを認識するであろう。
【００９０】
本発明の方法に従って選択された患者は、化学療法レジメンとの併用療法においてベバシズマブで治療され、一以上の更なる抗癌治療で治療される場合がある。ある態様において、一以上の更なる抗癌療法は放射線である。
【００９１】
５．キット
本発明はまた、一以上のＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の発現レベルを決定するために適したオリゴヌクレオチド又はポリペプチドを含む診断組成物又はキットに関する。本明細書に詳述したように、ＤＮＡ、ＲＮＡなどのオリゴヌクレオチド、又はＤＮＡとＲＮＡのプローブの混合物は、マーカー／標識タンパク質のｍＲＮＡレベルを検出するのに有用であり得るが、一方ポリペプチドは、特定のタンパク質  −  タンパク質相互作用を介して、マーカー／標識タンパク質のタンパク質レベルを直接検出するのに有用であり得る。本発明の好ましい態様において、一以上のＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の発現レベルについてのプローブとして網羅され、本明細書に記載のキット又は診断組成物に含まれるポリペプチドは、これらのタンパク質に特異的な抗体、又はホモログ、及び／又はその切断体に特異的な抗体である。
【００９２】
従って、本発明の更なる実施態様において、本発明は、一以上のＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の発現レベルの存在を決定し得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む、本明細書に記載の方法を実施するために有用なキットを提供する。オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載される一以上のマーカー／標識をコードするｍＲＮＡに特異的なプライマー及び／又はプローブを含み、ポリペプチドは、マーカー／標識タンパク質との特異的相互作用が可能なタンパク質、例えば、マーカー／標識特異的抗体又は抗体断片を含む場合がある。
【００９３】
上記の方法に加えて、本発明はまた、ウェスタンブロッティング法及びＥＬＩＳＡに基づく検出などによるＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の１つ以上の発現レベルを評価又は決定するための更なる免疫アッセイ法を包含する。当技術分野で理解されるように、本発明のマーカー／標識タンパク質の発現レベルはまた、ノーザンブロット法、リアルタイムＰＣＲ、ＲＴ及びＰＣＲのような当技術分野で周知の任意の適切な方法によって、ｍＲＮＡレベルで評価することができる。免疫アッセイ及びｍＲＮＡに基づく検出方法及びシステムは、当技術分野で周知であり、例えば、Lottspeich (Bioanalytik , Spektrum Akademisher Verlag , 1998)、又はSambrook and Russell (Molecular Cloning :A Laboratory Manual ,CSH Press , Cold Spring Harbor , NY , U.S.A. , 2001)  のような標準的な教科書から推定することができ  る。記載された方法は、乳癌、特に局所再発又は転移性のＨＥＲ２陽性乳癌と診断された集団で確立されたコントロールレベルと比較した患者又は患者群において、ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の発現レベルを決定するために特に有用である。
【００９４】
ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の一つ以上の発現レベルはまた、免疫凝集、免疫沈降（例えば、免疫拡散法、免疫電気泳動法、免疫固定法）、ウェスタンブロッティング技術（例えば、（インサイツ）免疫細胞化学法、アフィニティークロマトグラフィ法、酵素免疫測定法）などを利用することにより、タンパク質レベルで決定することができる。溶液中の精製されたポリペプチドの量はまた、例えば、  光度測定法などの物理的方法によって決定する場合がある。通常、混合物中の特定のポリペプチドを定量する方法は、例えば、抗体のなどの特異的結合に依存する。抗体の特異性を利用する特定の検出及び定量方法は、例えば、免疫アッセイ法を含む。例えば、患者サンプル中の本発明のマーカー／標識タンパク質の濃度／量は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定することができる。あるいは、ウエスタンブロット分析又は免疫染色を行うことができる。ウエスタンブロット法は、電気泳動によるタンパク質の混合物の分離と抗体を用いた特異的検出を組み合わせたものである。電気泳動は、このような２次元電気泳動のように多次元の場合がある。通常、ポリペプチドは、１次元に沿ったそれらの見かけの分子量、及び他の方向に沿ったそれらの等電点によって、２次元電気泳動で分離される。
【００９５】
上述したように、本発明に係るマーカー／標識タンパク質の発現レベルはまた、ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２をコードする対応遺伝子の発現の増加に反映され得る。したがって、従来の翻訳（例えば、スプライシングされたか、又はスプライシングされていない、あるいは部分的にスプライシングされたｍＲＮＡ）への遺伝子産物の定量的評価は、対応遺伝子の発現を評価するために行うことができる。当業者であれば、この文脈で使用される標準的な方法を知っているか、標準的な教科書（例えば、前掲のSambrook、2001）から、これらの方法を導き出すことができる。例えば、一つ以上のＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２をコードするｍＲＮＡの各濃度／量に関する定量的データは、ノーザンブロット、リアルタイムＰＣＲ等により得ることができる。
【００９６】
本発明のキットは、本発明の方法を実行するために有利に使用され得、とりわけ種々の適用、例えば診断分野において又は研究ツールとして使用され得る。本発明のキットの一部は、バイアル中、又は容器中もしくは複数の容器単位中の組合せ中の個々のパッケージであり得る。そのキットの製造は、好ましくは当業者に周知の標準的な手順に従う。キット又は診断組成物は、例えば本明細書に記載の免疫組織化学的方法を使用して、本発明の本明細書に記載される方法により一以上のＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の発現レベルの検出のために使用され得る。
【００９７】
本明細書に記載される検出方法における使用に関し、当業者は本発明に包含されるポリペプチド、例えば抗体、又はオリゴヌクレオチドを標識する能力を持つ。当技術分野において日常的に実施されるように、免疫アッセイ法において使用されるｍＲＮＡレベル及び／又は抗体又は抗体断片の検出に使用されるハイブリダイゼーションプローブは、当技術分野で知られる標準的な方法によって標識及び可視化でき、一般的に使用されるシステムの非限定的な例は、放射性標識、酵素標識、蛍光タグ、ビオチン−アビジン複合体、化学発光等を含む。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
図は以下を示す：
【図１】ＩＭＰＡＣＴチップ上で測定されるＶＥＧＦ１１１、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５及びＶＥＧＦ１８９の増加する濃度の測定。
【図２】自動化Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）アナライザー上でのＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）アッセイを使用して測定されるＶＥＧＦ１１０、ＶＥＧＦ１２１、及びＶＥＧＦ１６５の増加する濃度の測定。
【図３】ＩＭＰＡＣＴアッセイで２回測定された同一患者由来のＥＤＴＡサンプルとクエン酸塩サンプルからのデータＶＥＧＦＡ濃度は、ＥＤＴＡ−クエン酸塩法比較のスピアマン相関が約０．８で、クエン酸塩よりもＥＤＴＡ血漿が約４０％高い。
【図４】示されるのは、大腸菌又はＨＥＫ−細胞中で組換えにより生成されたＶＥＧＦ１６５の濃度が増加したときに測定されたカウント（ＥＣＬシグナル）であり、自動化Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）アナライザーで測定された。
【００９９】
本発明は以下の非限定的で例示的な実施例によって更に説明される。
【０１００】
実施例１  −  ＨＥＲ２陽性局所再発又は転移性乳癌患者のための第一選択治療として、トラスツズマブ／ドセタキセルのみと比較したトラスツズマブ／ドセタキセルと併用したベバシズマブ  −  ＡＶＥＲＥＬ試験
本明細書に開示された臨床試験の主な目的は、トラスツズマブ／ドセタキセルと併用したベバシズマブ  にランダム化された患者と、トラスツズマブ／ドセタキセルのみにランダム化された患者とで、無増悪生存期間（ＰＦＳ）を比較することであった。第二の目的は、生存期間（ＯＳ）；最良総合効果（ＯＲ）；奏効期間（ＤＲ）；治療成功期間（ＴＴＦ）；トラスツズマブ／ドセタキセルとベバシズマブとの併用の安全性及び忍容性；そして最終的に生活の質を評価することであった。
【０１０１】
具体的には、本明細書に記載される試験が、（１）  ３週間間隔で１５ｍｇ／ｋｇのベバシズマブ＋トラスツズマブを初回時に８ｍｇ／ｋｇ投与し、その後、６ｍｇ／ｋｇを３週間間隔で病勢進行まで投与＋ドセタキセル１００ｍｇ／ｍ２を３週間間隔での投与を少なくとも６サイクル行なうことが、トラスツズマブを初回時に８ｍｇ／ｋｇ投与し、その後、６ｍｇ／ｋｇを３週間間隔で病勢進行まで投与＋ドセタキセル１００ｍｇ／ｍ２を３週間間隔での投与を少なくとも６サイクル行なうことと比較して、ＰＦＳの主要変数にプラスの治療効果をもたらし、そして、（２）  ３週間間隔で１５ｍｇ／ｋｇのベバシズマブ＋トラスツズマブを初回時に８ｍｇ／ｋｇ投与し、その後、６ｍｇ／ｋｇを３週間間隔で病勢進行まで投与＋ドセタキセル１００ｍｇ／ｍ２を３週間間隔での投与を少なくとも６サイクル行なうことが、許容できる安全性プロファイル有していることを決定することである。
【０１０２】
試験デザイン
本試験は、無作為化、非盲検、２群間、多施設、第ＩＩＩ相試験であった。患者は中央ランダム化のプロセスを介して、治療群に１対１で無作為に割り当てた。乱塊法の手順を用いた。両治療群間の患者集団における重要な予後因子の不均衡を回避するため、患者は以下の基準に従って階層化した。
・  アジュバント／ネオアジュバント療法でのタキサンによる治療歴、アジュバント／ネオアジュバント化学療法の最終投与日から再発までの期間  タキサンによる前治療歴の（有無）によって、患者を最初に層別化した。「タキサンによる前治療歴がない」場合は、アジュバント／ネオアジュバント化学療法を受けたことがない、もしくは化学療法の最終投与から２ヶ月以上の経過で再発があったか、又は、化学療法の最終投与から１２ヶ月未満の経過で再発があったかで、２番目の層別化を行った。
・  アジュバン療法の一部としてのトラスツズマブ投与の有無
・  ホルモン受容体（ＥＲ／ＰｇＲ）の状態が、（陽性か陰性か）；そして
・  測定可能疾患で（あるか否か）
【０１０３】
患者は、以下の２群のいずれかに無作為に割り付けられた：
・Ａ群トラスツズマブを初回時に８ｍｇ／ｋｇ投与し、その後、６ｍｇ／ｋｇを３週間間隔で病勢進行まで投与＋ドセタキセル１００ｍｇ／ｍ２を少なくとも６サイクル、３週間間隔で（あるいは病勢進行又は容認できない毒性のいずれか早く発現した時点まで）投与する。６サイクル後に増悪又は毒性がなければ、治験責任医師の裁量で、サイクルを追加してドセタキセル投与が継続される場合がある。
・Ｂ群トラスツズマブを初回時に８ｍｇ／ｋｇ投与し、その後、６ｍｇ／ｋｇを３週間間隔で病勢進行まで投与＋ドセタキセル１００ｍｇ／ｍ２を少なくとも６サイクル、３週間間隔で（あるいは病勢進行又は容認できない毒性のいずれか早く発現した時点まで）投与する。６サイクル後に増悪又は毒性がなければ、治験責任医師の裁量でサイクルを追加して、ドセタキセルの投与＋ベバシズマブ１５ｍｇ／ｋｇを病勢進行まで３週間間隔での投与が継続される場合がある。
【０１０４】
2015502543.tif 000002
【０１０５】
試験期間
４２４例の患者は、約２９ヶ月間に６０の施設から募集され、主要評価項目（ＰＦＳ）で約２６ヶ月間追跡された。
【０１０６】
試験の終了
本試験は、ｅｖｅｎｔ−ｄｒｉｖｅｎ試験であった。無作為化された４２４例の患者において、３１０件のイベントが確認された時点で、一次エンドポイントの分析が行なわれた。全生存期間の追加の分析は、最後の患者のランダム化の約３６ヶ月後に行なった。そして、治験はこの時点で終了した。本試験に参加した最後の患者の最終訪問日に試験は終了し、最後の患者をランダム化した約３６ヶ月後に行われた最終的な全生存期間の分析と一致した。
【０１０７】
最終的な全生存期間の分析のため、本臨床試験のカットオフ日以降、試験治療の恩恵を受けた患者は、病勢進行が認められるまではベバシズマブ投与を受け続けることができた。
【０１０８】
治療群へ割り当てられる患者数として、４２４例が本治験の２群に無作為で１：１に割り付けられた：
・トラスツズマブ／ドセタキセル群（Ａ群）におけるＨＥＲ２陽性患者２０５例；及び
・ベバシズマブ＋トラスツズマブ／ドセタキセル治療群（Ｂ群）におけるＨＥＲ２陽性患者２０５例。
【０１０９】
患者は無作為に治療群に割り当てられた。患者は、ランダム化された日、ただし５業務日以内に試験治療の最初の投与を受けた。いかなる状況においても、本試験に登録された患者は、本試験に再ランダム化され、２コース目の治療に登録することは許可されなかった。
【０１１０】
適格患者登録基準
局所再発、又は転移性ＨＥＲ２陽性乳癌（原発腫瘍−Ｔ４Ｄ−炎症性乳癌を除く）を有する閉経前及び閉経後の女性及び男性患者。患者は、転移性乳癌（ＭＢＣ）のための放射線治療について、ランダム化の３週間前に完了し、骨髄を含む骨への照射が３０％程度であった場合には、過去に受けていた可能性がある。アジュバント放射線治療歴は、それがランダム化の少なくとも６ヶ月前に終了していた場合は許容された。
【０１１１】
アジュバント療法でトラスツズマブを受けた患者については、最後にトラスツズマブのアジュバント投与をしてから６ヶ月以上経過したことを条件として、登録を許可した。患者は、ベースライン時に、エコー検査又はＭＵＧＡのいずれかでの測定が適切な左心室駆出機能として定義された５０％を下回らないＬＶＥＦを有する必要があった。アジュバント病に対してアントラサイクリンで治療された患者は、最大累積線量がドキソルビシンで３６０ｍｇ／ｍ２より少ないか又は等しい場合、もしくはエピルビシンで７２０ｍｇ／ｍ２より少ないか又は等しい場合には、本試験に含まれる可能性があった。
【０１１２】
患者は、組織学的又は細胞学的にＨＥＲ２陽性と確認され、測定可能、又は非測定可能な局所再発又は転移性疾患を伴った、閉経前又は閉経後の乳腺癌を有する必要があった。患者は、パフォーマンスステータス（ＥＣＯＧ  ０−１）が良好で、正常な肝臓、腎臓及び骨髄の機能があり、プロトコールの遵守又は結果の解釈に影響を与える可能性のある他の重篤な疾患がない必要があった。患者は、消化管穿孔、高血圧、蛋白尿及び創傷治癒合併症、血栓塞栓症又は出血のリスクが高くなくてはならなかった。転移性ＣＮＳ疾患又は転移に起因する脊髄圧迫の患者は対象外とされた。患者は、過去５年以内に他の原発腫瘍を有していてはならなかった（適切に治療された子宮頸部ＣＩＳ、皮膚の扁平上皮癌  
又は基底細胞皮膚癌を除く）。妊娠中又は授乳中の女性は除外された。
【０１１３】
患者がランダム化された時点で、少なくとも２週間、抗凝固療法が安定したレベルにある限り、試験開始時での全抗凝固療法は許可された。
【０１１４】
適格基準：
１．    患者年齢≧１８歳；
２．    プロトコールを遵守できること；
３．    ＥＣＯＧのパフォーマンスステータス≦１；
４．    平均余命≧１２週間；
５．    測定可能又は測定不能な局所再発又は転移性病変（原発腫瘍−Ｔ４Ｄ−炎症性乳癌を除く）が組織学的又は細胞学的に確認された、閉経前又は閉経後の乳癌（腺癌）患者局所再発疾患は根治的切除の可能性がなかった。ＥＲ／ＰｇＲ及びＨＥＲ２の状態は報告されている必要があった。
６．    患者は、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって決定されたとおりのＨＥＲ２タンパクの過剰発現（３  ＋）を；  又、ランダム化の前に中央検査室で確認された原発腫瘍又は転移については、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）又は発色性インサイツハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）によって決定されたとおりのＨＥＲ２／ｃ−ｅｒｂＢ２の増幅を有していなければならない。以前にロシュ又はジェネンテック主催のトラスツズマブ補助療法の臨床試験に参加し、ＨＥＲ２の状態が一元的に確認されている患者については、中央研究所による原発腫瘍のＨＥＲ２陽性の確認は、本試験で必要とされなかった。（例えば、ＨＥＲＡ、ＢＣＩＲＧ００６、ＮＳＡＢＰ  Ｂ３１、又はＩｎｔｅｒｇｒｏｕｐ／ＮＣＣＴＧ／Ｈ２０６１ｓ試験）；
７．    アジュバント療法でトラスツズマブを受けた患者は、トラスツズマブの最終投与後６ヶ月以内に再発していなかった場合に限り対象とした。
８．    アジュバント又はネオアジュバント療法において、アントラサイクリンで治療された患者は、最後の投与をランダム化の６ヶ月前に受けた場合にのみ対象となる。最大累積投与量は、ドキソルビシンでは７２０ｍｇ／ｍ２、エピルビシンでは３６０ｍｇ／ｍ２を超えてはならない。
９．    ランダム化の１２ヶ月前に最後のアジュバント又はネオアジュバント化学療法を受けた患者の場合は、タキサンで治療された患者のみ対象となる。
１０．  ベースラインの左室駆出率（ＬＶＥＦ）が、心エコー検査又はＭＵＧＡのいずれかでの測定で５０％未満；
１１．  患者は、無作為化の時点で抗凝固レベルが少なくとも２週間安定している限り、総量の経口又は非経口抗凝固薬の使用が許可された：
・  ヘパリン治療を開始する前に、１．５倍から２．５倍の間のＵＬＮ又は患者値のベースラインのａＰＴＴを有していたヘパリン治療を受けている患者
・  １．５の一日量を受けた低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）の患者
・  添付文書に従った、２ｍｇ／ｋｇの（エノキサパリン）、又は対応する抗凝固剤の適切な用量
・  １日から４日の間隔での２回の連続した測定において、２．０から３．０の間のベースラインで評価されたＩＮＲを有していたクマリン誘導体の治療を受けている患者
・  抗凝固剤投与を受けていない患者は、ランダム化前の７日以内に、ＩＮＲが１．５以下、及びａＰＴＴがＵＬＮの１．５倍以下でなければならない。
【０１１５】
除外基準
１．    転移性又は局所再発乳癌に対する化学療法歴。ホルモン療法歴は許可されるが、少なくともランダム化の２週間前には中止されている必要がある。
２．    転移性乳癌治療のための放射線治療歴は、以下の場合では許可されなかった。
・  骨髄を含んだ骨の３０％以上が照射されていた
・  放射線治療の最後の分画は、ランダム化前の３週間以内に投与されていた。
乳癌のためのアジュバント放射線療法歴は、ランダム化の少なくとも６ヶ月前に中止されていた場合、許可された。
３．    インサイツで適切に治療された子宮頸癌、皮膚の扁平上皮癌、又は適切にコントロールされた限定的な基底細胞皮膚癌を除く、ランダム化前の直近５年以内の（原発性脳腫瘍を含む）原発腫瘍
４．    脊髄圧迫の証拠又は現在のＣＮＳ転移の証拠。脳転移の臨床的疑いがある場合には、ＣＴ又は脳のＭＲＩスキャン（ランダム化前４週以内に）が必須であった。
５．    例えば、抑制されない発作のような、（十分に標準的な医学療法で治療されない限りにおいて）（癌と関連のない）ＣＮＳ疾患の身体検査／神経学的検査での既往歴又は証拠
６．    大手術、試験開始前の２８日以内の直視下生検又は重大な外傷、又は試験治療期間中の大手術の必要性の見込み。
７．    既存の末梢神経障害＞ランダム化時のＣＴＣグレード２
８．    骨髄機能障害ＡＮＣ＜１．５  ｘ  １０９／Ｌ、血小板数＜１００×１０９／Ｌ及びヘモグロビン＜９ｇ／ｄＬ。
９．    肝機能障害
・  血清（総）ビリルビン＞ＵＬＮ
・  ＡＳＴ及びＡＬＴ＞２．５×ＵＬＮ
・  ベースライン時の血清アルカリホスファターゼレベル＞２．５×ＵＬＮ  であると同時に、ＡＳＴ又はＡＬＴ＞１．５×ＵＬＮ
１０．  腎機能障害：
ｉ．  血清クレアチニン＞２．０ｍｇ／ｄＬ、又は、１７７μｍｏｌ／Ｌ
ｉｉ．  尿蛋白≧２＋ベースラインでのディップスティック尿検査でタンパク尿が２＋以上の患者は、２４時間採尿を受ける必要があり、タンパク／２４時間は１ｇ未満を示さなければならない。
１１．  （吸入ステロイドを除く）コルチコステロイド（＞１０ｍｇ／日のメチルプレドニゾロンと同等の用量）による継続的な毎日の治療。
１２．  アスピリン（＞３２５ｍｇ／日）又はクロピドグレル（＞７５ｍｇ／日）による継続的な毎日の治療。
１３．  コントロール不良の高血圧（収縮期＞１５０ｍｍＨｇ  及び／又は、拡張期＞１００ｍｍＨ）又は臨床的に重大な（即ち活動性）心血管疾患：脳血管障害／脳卒中（≦ランダム化前６ヶ月）、  心筋梗塞（≦ランダム化前６ヶ月）、不安定狭心症、ニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ、付録６）クラス２以上のうっ血性心不全、又は薬剤を必要とする重篤な心不整脈
１４．  遺伝的な出血素因又は出血リスクがある凝固障害の既往歴又は証拠。
１５．  ランダム化前の６ヶ月以内の腹瘻、消化管穿孔、又は腹腔内膿瘍の既往歴。
１６．  ランダム化時に抗生物質の静脈注射を必要とした活動性感染症。
１７．  重篤な未治癒の創傷、消化性潰瘍、又は骨折。
１８．  任意の他の疾患、代謝性又は心理的機能障害、身体検査所見の証拠、又は治験薬の使用に禁忌を示すか、もしくは試験ルーチンが患者コンプライアンスに影響を与える可能性がある、又は患者の治療による合併症のリスクを高くする可能性のある疾患もしくは状態の合理的な疑いを示す臨床検査所見。
１９．  妊娠中又は授乳中の女性。  血清妊娠検査は、試験治療開始前の７日以内に評価され、又は試験治療開始前の７日以内に尿妊娠確認検査も行なっていれば１４日以内に評価される。
２０．  避妊の効果的な非ホルモン手段（子宮内避妊具、殺精子ゼリーと併用したバリア避妊法又は外科的に妊娠ができない）を使用していない妊娠の可能性のある患者（最後の月経から２年後の女性）。
２１．  現在又は最近（試験治療開始前の３０日以内）の他の試験薬での治療又は他の治験への参加。
２２．  試験薬又は賦形剤のいずれかに対する周知の過敏症。
２３．  チャイニーズハムスター卵巣細胞の産物又はその他の組換えヒト抗体又はヒト化抗体に対する過敏症。
【０１１６】
結果：
上述のように、プロトコールで規定された治療以外の治療については層別化及び打ち切りがされておらず、治験責任医師の評価によるＰＦＳの改善は、本試験対照群に比べて２．８ヶ月長く計算された。具体的には、表３にまとめたように、ＰＦＳ中央値は、対照群（Ａ群）で１３．７ヶ月、「ベバシズマブ」群（Ｂ群）で１６．５ヶ月であり、ハザード比０．８２、９５％ＣＩ（０．６５，１．０２）、ｐ値＝０．０７７５であった。
【０１１７】
2015502543.tif 000003
【０１１８】
更に、独立審査委員会（ＩＲＣ）は、プロトコールで規定された治療以外の治療について層別化及び打ち切りを行い、ＰＦＳの結果は統計的に有意であったと評価した。具体的には、表３にまとめたように、ＰＦＳ中央値は、対照群（Ａ群）で１３．９ヶ月、「ベバシズマブ」群（Ｂ群）で１６．８ヶ月であり、ハザード比０．７２、９５％ＣＩ（０．５４、０．９４）、ｐ値＝０．０１６２であった。全体的に、「Ｂ群」又は「ベバシズマブ」群のＰＦＳ中央値は、本試験対照群よりも２．９ヶ月長かった。
【０１１９】
2015502543.tif 000004
【０１２０】
本試験の客観的奏効率（ＯＲＲ）の結果は、治験責任医師が評価した結果（ＩＮＶ）及び独立審査委員会（ＩＲＣ）が評価した結果の両方を表４に示した。具体的には治験責任医師が評価したＯＲＲについて、本試験では、「ベバシズマブ」又はＢ群の７４．３％に対し対照群では６９．９％のＯＲＲを示した。両群の差は４．４３％、９５％ＣＩ（−５．２％、１４．０％）、ｐ値は０．３４９２ある。ＩＲＣが評価した結果について、本試験では、「ベバシズマブ」又はＢ群の７６．５％に対して、対照群では６５．９％のＯＲＲを示した。  両群の差は１０．５９％、９５％ＣＩ（１．０％、２０．２％）、ｐ値は０．０２６５である。
【０１２１】
2015502543.tif 000005
【０１２２】
暫定的な全生存期間（ＯＳ）の結果は表５にまとめられ、平均生存率は、１．０１のハザード比（ＨＲ）、９５％  ＣＩ（０．７４、１．３８）、及びｐ値が０．９５４３で、「ベバシズマブ」Ｂ群が３８．５ヶ月であったのに対し、対照群では３８．３ヶ月であったことを示した。
【０１２３】
2015502543.tif 000006
【０１２４】
更に、安全性の予備的評価は、本試験において患者によって示された新たな安全性シグナルがなかったことを実証した。
【０１２５】
実施例２  −  ＡＶＥＲＥＬ試験における探索的バイオマーカー解析
患者及び免疫化学的方法
本試験では、１６２例の患者からベースラインの血漿サンプルが入手可能であった。
【０１２６】
血漿の分析
バイオマーカーの発見及び検証のための血液サンプルは、試験ＢＯ２０２３１で同意した患者から採取した。血液サンプル（合計約２０ｍＬ）は、ベースライン（ランダム化後であるが、被験薬の初回投与前）及び病勢進行の時点で収集した。
【０１２７】
総計４．９ｍＬの血液はＳ−ｍｏｎｏｖｅｔｔｅ（登録商標）（ＥＤＴＡ）チューブで吸引した。それらはその後直ちにチューブを穏やかに反転させ、３０分以内に遠心機で約１５００ｇで遠心分離した（１０分間室温で）。この後直ちに、上清血漿を透明ポリプロピレン製５ｍＬの移送管に分注した。その後、血漿を２本のプラスチック製のストレージ管に（約１．２５ミリリットルずつ）分注した。サンプルは立てた状態でー７０℃で保存した。幾つかのケースでは、サンプルは、最大１ヶ月は−２０℃で保存し、その後−７０℃に移した。
【０１２８】
サンプルは、ロシュ・ダイアグノスティックス社（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）からの免疫学的マルチパラメータチップ技術（インパクト）（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ＭｕｌｔｉＰａｒａｍｅｔｅｒ  Ｃｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＩＭＰＡＣＴ）  ）を用いて、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、細胞接着分子１（ＩＣＡＭ−１）、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ受容体１（ＶＥＧＦＲ１）、ＶＥＧＦ受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、ＶＥＧＦ受容体３（ＶＥＧＦＲ３）塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血小板由来増殖因子−Ｃ（ＰＤＧＦ−Ｃ）、及びＥ−セレクチン  のレベルの測定に使用した。
【０１２９】
インパクトマルチプレックスアッセイ技術（ＩＭＰＡＣＴ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
ロシュプロフェッショナルダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）（ロシュ・ダイアグノスティックス社（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ））は、実施名称インパクト（ＩＭＰＡＣＴ）（免疫学的マルチパラメータチップ・テクニック）の下で、マルチマーカプラットフォームを開発した。この技術は、「血漿の分析」の項で上述したタンパク質マーカーの測定に使用した。本技術は、欧州特許第０９３９３１９号及び欧州特許第１６１０１２９号に開示された手順により製造された小さいポリスチレンチップに基づいている。チップ表面をストレプトアビジン層で被覆し、次いでその上にビオチン化抗体が全てのアッセイでスポットされた。各マーカーについて、抗体のスポットがチップ上に縦線でロードされた。アッセイ中に、アレイは特定の分析物を含む検体試料で探索した。
【０１３０】
一つのチップ上の全マーカーを測定するために、検体あたり必要な血漿容積はチップ１については２０μｌであり、チップ２及び３については８μＬである。（下記参照）サンプル容量は、チップあたり４０μｌの総反応体積とするため、インキュベーションバッファー（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｈｅｓｉｔ、０．５％ウシ血清アルブミン、及び防腐剤として０．１％のオキシピリオン（Ｏｘｙｐｙｒｉｏｎ））と一緒に適用された。１２分のインキュベーション及び洗浄バッファー  （５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ７．９、  ０．０１％  Ｔｈｅｓｉｔ及び０．００１％のオキシピリオン（Ｏｘｙｐｙｒｉｏｎ））を用いてチップを洗浄後に、ジゴキシゲニン化された検出抗体混合物を追加し（ジゴキシゲニンで標識した分析物に特異的な抗体の混合物を含むインキュベーション緩衝液４０μＬ）、捕獲した分析物に結合させるために、更に６分間インキュベートした。第二抗体が、蛍光ラテックスに結合した抗ジゴキシゲニン抗体複合体を含む試薬バッファー（６２．５ｍＭのＴＡＰＳ  ｐＨ８．７、１．２５ＭのＮａＣｌ、０．５％ウシ血清アルブミン、０．０６３％のＴｗｅｅｎ２０、０．１％オキシピリオン（Ｏｘｙｐｙｒｉｏｎ））４０μＬで洗った後に最終的に検出された。この標識を使用して、単一スポットで１０の独立した結合事象を検出することができ、ｎｍｏｌ／  Ｌの濃度に至るまで非常に高感度を与えた。チップは、検出部に運ばれ、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラが、専用のソフトウェアを使用して信号強度に変換された画像を生成した。個々のスポットは、自動的に所定の位置に配置され、画像解析によって定量化された。各マーカーについて、１０から１２のスポットの線はチップ上にロードし、そしてマーカーの濃度は、チップ上の各ラインから少なくとも５つのスポットの平均値として計算した。本技術の利点は、サンドイッチ形式又は競合形式において、最大１０までパラメーターを多重化する能力である。検量用試料及び患者サンプルは二重に測定した。一回の実行は、実行コントロールとして検量用試料及び２つのマルチコントロールを含む計１００の判定を含むように設計した。選択された分析物の一部はお互いに反応するため（即ち、ＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦはＶＥＧＦＲ１又はＶＥＧＲＦ２）、分析物は以下の３つの異なるチップ上に分けられた。
チップ１：ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｃ
チップ２：ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ｌ−８、ｂＦＧＦ、  
チップ３：Ｅセレクチン、ＩＣＡＭ−１
【０１３１】
2015502543.tif 000007
【０１３２】
統計解析
サンプルの中央値は、バイオマーカーの値を低（中央値未満）又は高（中央値以上）として二分するために使用された。
【０１３３】
高又は低バイオマーカーレベルの患者のサブグループにおける治療効果のハザード比は、比例ハザードコックス回帰分析を用いて推定された。
【０１３４】
更に、コックス比例ハザード回帰が、バイオマーカーレベルと治療効果との関連を評価するために使用された。本方法は以下の共変量を含んだ：試用版治療、バイオマーカーレベル、層別因子（ＥＲ／ＰｇＲの状態、ベースライン時に測定可能な疾患、アジュバント／ネオアジュバントタキサンの治療歴、アジュバント／ネオアジュバント化学療法の最終投与から再発までの経過時間、トラスツズマブによるネオアジュバントの治療歴）、バイオマーカーのレベルによる治療の相互作用項。相互作用項のためのＷａｌｄ検定は、バイオマーカーレベルと治療効果との間の関連性を決定するために使用された。０．０５未満のＰ値は有意であると考えられた。
【０１３５】
検定方法
分析集団
本試験においてバイオマーカーの評価可能な集団は、上述及び市販の抗体を用いて、任意の試験薬の成分を投与され、以下のバイオマーカーのいずれかを評価するためのベースラインでのマーカーレベルを持っていたすべての患者からなるものと定義した。ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｒ１、ＶＥＧＦ−Ｒ２、Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ、ＶＥＧＦＲ−３、ＩＬ−８、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＩＣＡＭ−１．
【０１３６】
多重性の調整
第１種過誤の増大を回避するため、以下に示すような階層をバイオマーカーに適用した。各バイオマーカーは、両側５％のαレベルで検定し、統計的有意性が満たされた場合にのみ、階層内の以下のバイオマーカーを検定した。
１．ＶＥＧＦ−Ａ
２．ＶＥＧＦ−Ｒ２
３．ＩＣＡＭ−１
４．ｂＦＧＦ
５．ＩＬ−８
６．ＶＥＧＦ−Ｒ１
７．ＰＤＧＦ−Ｃ
８．ＶＥＧＦ−Ｃ
９．ＶＥＧＦＲ−３
１０．Ｅ−セレクチン
【０１３７】
有効性の分析
ＰＦＳ及びＯＳは、試験ＢＯ２０２３１用のデータレポート分析マニュアル（ＤＲＡＭ）で指定されたとおりに定義されている。  バイオマーカーデータの分析は、最終ＰＦＳ分析の時点でのＰＦＳ（治験責任医師の評価）データに基づいている。バイオマーカー濃度の標本中央値が、患者群を（濃度の高値と低値に）分類するカットポイントとして使用された。
【０１３８】
無増悪期間の分析
以下の分析は、バイオマーカーの評価可能な集団のＰＦＳについて行った。
・  低い及び高いバイオマーカーレベルを有する患者のカプラン・マイヤー曲線から評価したＰＦＳ中央値（９５％ＣＩ）
・  低い及び高いバイオマーカーレベルの患者のＣｏｘモデルからの非層別化（及びＰＦＳの層別化）ハザード比（９５％ＣＩ）
・  バイオマーカーレベルの四分位によるＣｏｘモデルからの非層別化ハザード比（９５％ＣＩ）
・  バイオマーカーの評価可能な患者に対する相互作用試験は、ＨＥＲ２陽性局所再発又は転移性乳癌患者へのベバシズマブ投与のＰＦＳにおける治療上の利益をバイオマーカーが予測するか否かを評価するため、ベースラインのバイオマーカーレベル、治療、ベースライン予後因子との相互作用項を含むＣｏｘモデルを使用して行った。
【０１３９】
結果
血漿マーカー
バイオマーカーのベースラインの記述統計を表７に示す。
【０１４０】
2015502543.tif 000008
【０１４１】
表８は、治験責任医師が評価した無増悪生存における治療効果とＶＥＧＦＡ又はＶＥＧＦＲ２との関連性を解析した結果を示している。
【０１４２】
2015502543.tif 000009
【０１４３】
この解析において、ＶＥＧＦＡについては、低ＶＥＧＦＡ（＜１２９．１ｐｇ／ｍｌ）  及び高ＶＥＧＦＡ（≧１２９．１  ｐｇ／ｍｌ）、そして、ＶＥＧＦＲ２については、低ＶＥＧＦＲ２（＜１４．１ｎｇ／ｍｌ）及び高ＶＥＧＦＲ２（≧１４．１ｎｇ／ｍｌ）を使用した。
【０１４４】
高いベースラインの血漿ＶＥＧＦ−Ａを有する患者のサブグループにおけるＰＦＳ中央値は、トラスツズマブ＋ドセタキセル＋ベバシズマブ群の１６．６ヶ月に対して、トラスツズマブ＋ドセタキセル群で８．５ヶ月であった。低いベースラインの血漿ＶＥＧＦ−Ａを有する患者の間での対応する値は、それぞれ１３．６及び１６．５ヶ月であった。
【０１４５】
これらの結果は、治療効果のハザード比は、低ＶＥＧＦＡを持つ患者に比べて高ＶＥＧＦＡを持つ患者のサブセットで良好であることを示している。またこれらの結果は、治療効果のハザード比は、低ＶＥＧＦＲ２を持つ患者に比べて高ＶＥＧＦＲ２を持つ患者のサブセットで良好であることを示している。同じ傾向が低及び高用量のベバシズマブをプラセボに対して比較した場合に観察され、高及び低バイオマーカーサブグループ間の相違の統計的証拠は、低用量のベバシズマブで治療された患者においてより強い。従って、ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２は各々が、無増悪生存におけるベバシズマブ治療効果について独立した予測バイオマーカーである。
【０１４６】
実施例３：インパクトアッセイを用いるＶＥＧＦ−Ａの短いアイソフォームの検出
この例では、インパクトプラットフォーム上におけるＶＥＧＦ−Ａの検出のために使用される抗体に基づいて、ＶＥＧＦ−Ａの短いアイソフォームがＶＥＧＦ−Ａの長いアイソフォームに比べて優先的に測定されることを示している。
【０１４７】
上述のように、インパクト技術に関連するセクションで、「統計分析」セクションの前の表に記載された抗体を使用してアッセイを行った。
【０１４８】
４つの異なるＶＥＧＦ−Ａ型、即ち、ＶＥＧＦ１１１、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５及びＶＥＧＦ１８９が利用可能であって本解析で使用された。ＶＥＧＦ１１１及びＶＥＧＦ１２１（両方は大腸菌中での発現から由来）及びＶＥＧＦ１６５（昆虫細胞株において組換えにより得られた）は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＵＳＡから購入し、ＶＥＧＦ１８９は、ＲＥＬＩＡＴｅｃｈ、Ｗｏｌｆｅｎｂｕｅｔｔｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙから得た。ＶＥＧＦ１８９はやや不安定なように見え、その材料で得られたデータを当てにできないことが後で判明した。図１に示すように、１６５アミノ酸を有する長いアイソフォームと比較して、それぞれ、大腸菌で産生される、及び、例えば二次的修飾などのグリコシル化されていない、１１１アミノ酸又は１２１アミノ酸を有する短いアイソフォームのほうが良好に検出される。ＶＥＧＦ１６５は昆虫細胞株において得られ、少なくとも部分的にグリコシル化されている。
【０１４９】
生物学的に興味深いプラスミン切断産物のＶＥＧＦ１１０は、このアッセイが実行された時には試験のために入手できなかったが、このアイソフォームの検出は１１１アミノ酸を持つＶＥＧＦ分子で見られるものと匹敵するであろうことが期待されるに違いない。
【０１５０】
実施例４：Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒを使用する短いＶＥＧＦアイソフォームの検出
この実施例では、Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒを使用するアッセイ及び対応するアッセイは、ヒト血漿中の短いＶＥＧＦアイソフォームを検出するために使用することができることを実証する実験を説明する。
【０１５１】
ＶＥＧＦ−Ａアッセイはインパクト（ＩＭＰＡＣＴ）から自動化されたインビトロ診断システムのＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）（ロシュ・ダイアグノスティックス社、マンハイム（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ）へと移された。インパクトアッセイと同一の捕獲抗体、＜ｈＶＥＧＦ−Ａ＞−ｍ３Ｃ５（ＲＥＬＩＡＴｅｃｈ  Ｗｏｌｆｅｎｂｕｅｔｔｅｌ）  が用いられたが、一方、インパクトシステム上で使用された捕獲抗体＜ｈＶＥＧＦ−Ａ＞−ｍ２５６０３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス）は＜ｈＶＥＧＦ−Ａ＞−ｍＡ４．６．１（ジェネンテック、サウスサンフランシスコ）  で置き換えられた。
【０１５２】
自動化Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）システム上で実行されるイムノアッセイは信号生成技術として、電気化学発光（ＥＣＬＩＡ）を用いるイムノアッセイである。本サンドイッチアッセイでは、ビオチン化捕獲抗体がストレプトアビジン被覆、磁性微粒子に結合し、及びルテニル（ｒｕｔｈｅｎｙｌａｔｅｄ）検出抗体は、信号生成を可能とする。反応バッファー（５０ｍＭのトリス（ｐＨ  ７．４）、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のｔｈｅｓｉｔ、０．２％のウシＩｇＧ、１．０％ウシ血清アルブミン）中にある  １．５μｇ／ｍｌのビオチン化  ＜ＶＥＧＦ−Ａ＞−ｍ３Ｃ５を７５μｌ及び２μｇ／ｍｌのルテニル＜ＶＥＧＦ−Ａ＞Ｍ−Ａ．４．６．１を７５μｌは両方とも２０μｌのサンプルとともに９分間インキュベートした。３０μｌの微粒子懸濁がインキュベーションの最初の９分後に添加され、次いで、全混合物を更に９分間インキュベートした。これらのインキュベーション工程のあいだに、微粒子に結合する抗体検体の抗体サンドイッチが形成される。最後に、微粒子は、信号生成及び読み出し用Ｅｌｅｃｓｙｓシステムの検出チャンバーに移された。
【０１５３】
Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）ＶＥＧＦ−Ａアッセイの切断産物／アイソフォームの優先度を、精製された組換えタンパク質：ＶＥＧＦ１１０（ジェネンテック社、サウスサンフランシスコにて、プラスミン切断により生成）、ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１６５（両方ともＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリスにより、昆虫細胞株において産生され、提供された）で評価した。インパクト（登録商標）アッセイで見られた短いＶＥＧＦアイソフォームの優先的結合は  Ｅｌｅｃｓｙｓアッセイにて確認された。図２に示されるように、Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）アッセイにおいて、ＶＥＧＦ１２１及びプラスミン切断産物ＶＥＧＦ１１０のそれぞれのアイソフォームは、両方ともＶＥＧＦ１６５よりも約５倍高感度で検出された。
【０１５４】
実施例５：Ｎａクエン酸及びＥＤＴＡ中に回収される血漿中の短いＶＥＧＦアイソフォームの検出
一対の血漿サンプルが、ＥＤＴＡ  ｍｏｎｏｖｅｔｔｅ（５ｍＬ）−  及びクエン酸塩Ｍｏｎｏｖｅｔｔｅ採血管（５ｍＬ）の両方におけるＨＥＲ２＋を局所的に再発したか又は転移性乳癌から回収された。血液回収の３０分以内に、採血管を遠心分離機に入れ、細胞及び血漿が分離されるまで、１０分間室温で１５００ｇで回転させた。遠心分離後直ちに、血漿は注意深くプロピレン移送管に移され、ついでピペットを用いて２本の貯蔵管に（半分の容積で各々約１．２５ｍＬ）分注された。サンプル中のＶＥＧＦ−Ａのレベルが上述のインパクトアッセイを用いて測定された。図３に示されるように、ＶＥＧＦＡ濃度は、ＥＤＴＡクエン酸塩法比較についてスピアマン相関が治療前に回収されたベースラインサンプルにおいて約０．８であり、回収されたクエン酸塩中に保管された血漿サンプルに比べて回収されてＥＤＴＡ中保管された血漿サンプルにおいて約４０％高い。
【０１５５】
実施例６：Ｅｌｅｃｓｙｓ・アナライザーのおける未修飾型及び修飾型ＶＥＧＦ１６５の比較計測
この実施例では、Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒを使用するアッセイはヒト血漿中の未修飾のＶＥＧＦを検出するために使用することができることを実証する実験を説明する。
【０１５６】
ＶＥＧＦ−Ａアッセイはインパクト（ＩＭＰＡＣＴ）から自動化されたインビトロ診断システムのＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）（ロシュ・ダイアグノスティックス社、マンハイム（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ）へと移された。インパクトアッセイと同一の捕獲抗体、＜ｈＶＥＧＦ−Ａ＞−ｍ３Ｃ５（ＲＥＬＩＡＴｅｃｈ  ＧｍｂＨ、Ｗｏｌｆｅｎｂｕｅｔｔｅｌ）  が用いられたが、一方で、インパクトシステム上で使用された検出抗体＜ｈＶＥＧＦ−Ａ＞−ｍ２５６０３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス）は＜ｈＶＥＧＦ−Ａ＞−ｍＡ４．６．１（ジェネンテック、サウスサンフランシスコ）  に置き換えられた。
【０１５７】
自動化Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）システム上で実行されるイムノアッセイは信号生成技術として、電気化学発光（ＥＣＬＩＡ）を用いるイムノアッセイである。本サンドイッチアッセイでは、ビオチン化捕獲抗体がストレプトアビジン被覆、磁性微粒子に結合し、及びルテニル（ｒｕｔｈｅｎｙｌａｔｅｄ）検出抗体は、信号生成を可能とする。反応バッファー（５０ｍＭのトリス（ｐＨ  ７．４）、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のｔｈｅｓｉｔ、０．２％のウシＩｇＧ、１．０％ウシ血清アルブミン）中にある１．５μｇ／ｍｌのビオチン化  ＜ＶＥＧＦ−Ａ＞−ｍ３Ｃ５を７５μｌ及び２μｇ／ｍｌのルテニル＜ＶＥＧＦ−Ａ＞Ｍ−Ａ．４．６．１を７５μｌは両方とも２０μｌのサンプルとともに９分間インキュベートした。３０μｌの微粒子懸濁がインキュベーションの最初の９分後に添加され、次いで、全混合物を更に９分間インキュベートした。これらのインキュベーション工程のあいだに、微粒子に結合する抗体検体の抗体サンドイッチが形成される。最後に、微粒子は、信号生成及び読み出し用Ｅｌｅｃｓｙｓシステムの検出チャンバーに移された。
【０１５８】
Ｅｌｅｃｓｙｓ  ＶＥＧＦ−Ａアッセイの優先度を、精製された組換えタンパク質：ＶＥＧＦ１６５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈにより大腸菌中で組換えにより生成）、及びＶＥＧＦ１６５（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＧｅｒｍａｎｙでＨＥＫ細胞中で組換えにより生成）で評価した。インパクト（ＩＭＰＡＣＴ）アッセイで見られた未修飾のＶＥＧＦ１６５の優先的結合は  Ｅｌｅｃｓｙｓアッセイにて確認された。図４に示されるように、Ｅｌｅｃｓｙｓアッセイにおいて、未修飾のＶＥＧＦ１６５は修飾型ＶＥＧＦ１６５よりも約５倍高感度で検出された。
【図１】
2015502543.tif 000010
【図２】
2015502543.tif 000011
【図３】
2015502543.tif 000012
【図４】
2015502543.tif 000013
【配列表】
2015502543000001.app
【国際調査報告】
2015502543.tif 000014
2015502543.tif 000015
2015502543.tif 000016
2015502543.tif 000017
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