(57)【要約】  酸化ストレスに関連する疾患の処置のための組成物および処置の方法が記載されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種のレドックスシグナル伝達物質（ＲＸＮ）とＰＰＡＲアゴニストとを含む組成物。
【請求項２】
ＰＰＡＲアゴニストが、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ＰＰＡＲアゴニストが、エイコサノイドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ＰＰＡＲアゴニストが、タゾリジンジオンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
ＰＰＡＲアゴニストが、フィブラートを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
ＰＰＡＲアゴニストが、二重アゴニストを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
二重アゴニストが、アレグリタザルを含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
二重アゴニストが、ムラグリタザルを含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
二重アゴニストが、テサグリタザルを含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
ＲＸＮとＰＰＡＲアゴニストとを含む組成物の、ＰＰＡＲ媒介性疾患の処置における使用。
【請求項１１】
ＰＰＡＲ媒介性疾患が、真性糖尿病である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
真性糖尿病が、１型糖尿病である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
真性糖尿病が、２型糖尿病である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１４】
ＰＰＡＲ媒介性疾患が、肥満症である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１５】
ＰＰＡＲ媒介性疾患が、がんである、請求項１０に記載の使用。
【請求項１６】
少なくとも１種のＲＸＮを含む組成物の、がんの処置における使用であって、ＰＰＡＲ経路を活性化する第１の治療と、ＰＰＡＲ経路を活性化しない少なくとも１種の他の作用因子とを含む、使用。
【請求項１７】
少なくとも１種の他の作用因子が、放射線照射を含む、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
少なくとも１種の他の作用因子が、化学療法剤を含む、請求項１６に記載の使用。
【請求項１９】
少なくとも１種のＲＸＮを含む組成物の、がんの処置における使用であって、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）を動員する第１の治療と、ＦＦＡを動員しない少なくとも１種の他の作用因子とを含む、使用。
【請求項２０】
少なくとも１種の他の作用因子が、放射線照射を含む、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
酸化ストレス関連障害を処置する方法であって、
Ｏ2、Ｈ2、Ｃｌ2、ＯＣｌ-、ＨＯＣｌ、ＮａＯＣｌ、ＨＣｌＯ2、ＣｌＯ2、ＨＣｌＯ3、ＨＣｌＯ4、Ｈ2Ｏ2、Ｎａ+、Ｃｌ-、Ｈ+、Ｈ-、ＯＨ-、Ｏ3、Ｏ4*-、1Ｏ、ＯＨ*-、ＨＯＣｌ−Ｏ2*-、ＨＯＣｌ−Ｏ3、Ｏ2*-、ＨＯ2*、ＮａＣｌ、ＨＣｌ、ＮａＯＨ、水クラスタまたはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの種を含む組成物を、酸化ストレスを受けている患者に投与するステップと、
酸化ストレス関連障害を処置するステップと
を含む方法。
【請求項２２】
ミトコンドリアＤＮＡ低減障害を処置する方法であって、
Ｏ2、Ｈ2、Ｃｌ2、ＯＣｌ-、ＨＯＣｌ、ＮａＯＣｌ、ＨＣｌＯ2、ＣｌＯ2、ＨＣｌＯ3、ＨＣｌＯ4、Ｈ2Ｏ2、Ｎａ+、Ｃｌ-、Ｈ+、Ｈ-、ＯＨ-、Ｏ3、Ｏ4*-、1Ｏ、ＯＨ*-、ＨＯＣｌ−Ｏ2*-、ＨＯＣｌ−Ｏ3、Ｏ2*-、ＨＯ2*、ＮａＣｌ、ＨＣｌ、ＮａＯＨ、水クラスタまたはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの種を含む組成物を、ミトコンドリアＤＮＡ低減障害を受けている患者に投与するステップと、
ミトコンドリアＤＮＡ密度を増やすステップと、
ミトコンドリアＤＮＡ低減障害を処置するステップと
を含む方法。
【請求項２３】
ミトコンドリアＤＮＡ低減障害が、サクロペニア、糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病、神経疾患、老化による筋肉減少、肥満症または循環器疾患である、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年９月２１日に出願された米国特許仮出願第６１／７０４，４０１号、２０１２年９月２７日に出願された米国特許仮出願第６１／７０６，６７０号および２０１２年９月２８日に出願された米国特許仮出願第６１／７０７，１４１号の利益を主張する。これらの仮出願はそれぞれ、その全体が参照により組み込まれている。
【０００２】
酸化ストレスおよびミトコンドリアＤＮＡの低減と関連する疾患の処置のために有用な組成物が開示される。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子の転写から構造物、タンパク質および酵素の生成まで、事実上全ての生化学反応は、塩水中で生じる。このことを考慮すれば、最も原始的な原核生物である細菌から最も進化した真核生物である哺乳動物細胞（植物さえも）まで全ての生命が、塩水を酸化および還元して、２つのクラスの反応性分子、すなわち「還元種」（ＲＳ）および「活性酸素種」（ＲＯＳ）を生成する能力を発展させたことは驚くことではない。これらの化学種はともに、塩水から生成され、哺乳動物細胞中に広く分布している。
【０００４】
哺乳動物細胞は、様々な生物プロセスにおいてＲＳ／ＲＯＳを利用する。ＲＳ／ＲＯＳは、糖の代謝中に、特にミトコンドリア中の酸化的リン酸化プロセスにより、細胞において大量に生成される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
実施形態は、レドックスシグナル伝達物質（ＲＸＮ）とペルオキシソーム増殖因子応答性受容体（ＰＰＡＲ）アゴニストとを含む組成物を含む。ある実施形態では、ＰＰＡＲアゴニストは、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）を含む。ある実施形態では、ＰＰＡＲアゴニストは、エイコサノイドまたはチアゾリジンジオンまたはフィブラートを含む。ある実施形態では、ＰＰＡＲアゴニストは、アレグリタザル、ムラグリタザルまたはテサグリタザルのような二重アゴニストを含む。実施形態は、１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠糖尿病を含む真性糖尿病、肥満症またはがんのようなＰＰＡＲ媒介性疾患の処置における、ＲＸＮとＰＰＡＲアゴニストとを含む組成物の使用を含む。がんの処置において有用な実施形態は、ＰＰＡＲ経路を活性化する第１の治療と、放射線照射または化学療法剤のようなＰＰＡＲ経路を活性化しない少なくとも１種の他の作用因子とを含みうる。がんの処置において有用な実施形態は、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）を動員する第１の治療と、放射線照射のようなＦＦＡを動員しない少なくとも１種の他の作用因子とを含みうる。
【０００７】
実施形態は、酸化ストレス関連障害を処置する方法であって、Ｏ2、Ｈ2、Ｃｌ2、ＯＣｌ-、ＨＯＣｌ、ＮａＯＣｌ、ＨＣｌＯ2、ＣｌＯ2、ＨＣｌＯ3、ＨＣｌＯ4、Ｈ2Ｏ2、Ｎａ+、Ｃｌ-、Ｈ+、Ｈ-、ＯＨ-、Ｏ3、Ｏ4*-、1Ｏ、ＯＨ*-、ＨＯＣｌ−Ｏ2*-、ＨＯＣｌ−Ｏ3、Ｏ2*-、ＨＯ2*、ＮａＣｌ、ＨＣｌ、ＮａＯＨ、水クラスタまたはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの種を含む組成物を、酸化ストレスを受けている患者に投与するステップと、酸化ストレス関連障害を処置するステップとを含む方法を含む。
【０００８】
実施形態は、ミトコンドリアＤＮＡ低減障害を処置する方法であって、Ｏ2、Ｈ2、Ｃｌ2、ＯＣｌ-、ＨＯＣｌ、ＮａＯＣｌ、ＨＣｌＯ2、ＣｌＯ2、ＨＣｌＯ3、ＨＣｌＯ4、Ｈ2Ｏ2、Ｎａ+、Ｃｌ-、Ｈ+、Ｈ-、ＯＨ-、Ｏ3、Ｏ4*-、1Ｏ、ＯＨ*-、ＨＯＣｌ−Ｏ2*-、ＨＯＣｌ−Ｏ3、Ｏ2*-、ＨＯ2*、ＮａＣｌ、ＨＣｌ、ＮａＯＨ、水クラスタまたはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの種を含む組成物を、ミトコンドリアＤＮＡ低減障害を受けている患者に投与するステップと、ミトコンドリアＤＮＡ密度を増やすステップと、ミトコンドリアＤＮＡ低減障害を処置するステップとを含む方法を含む。このような障害は、サルコペニア、糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病、神経疾患、老化による筋肉減少、肥満症または循環器疾患を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本明細書に記載するプロセスのフローチャートである。
【図２】電極での様々な分子の発生の例示の図を示す。電極間に記載されている分子は、初期反応物を示し、両電極の外側の分子は、電極にて生じる分子／イオンおよびそれらの電極電位を示す。
【図３】本記載に従って組成物を生成するためのプロセスおよびシステムの平面図を示す。
【図４】本明細書に記載する組成物にさらに処理するための水を調製するシステムの例を示す。
【図５】ＮａＣｌ、１２．４８のｐＨでのＮａＣｌＯ溶液および本明細書に記載する組成物（当該組成物は「ＡＳＥＡ」と表示する）のＣｌ３５スペクトルを示す。
【図６】本開示の組成物の1Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【図７】本明細書に記載する組成物と組み合わせたＤＩＰＰＭＰＯの３１Ｐ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【図８】２６４、２２２および１８０でのｍ／ｚピークを有するＤＩＰＰＭＰＯについての親ピークおよびフラグメンテーションパターンを示す質量スペクトルを示す。
【図９】水およびＮａＣｌＯと比較した本明細書に記載する組成物についての酸素／窒素比を示す（当該組成物は「ＡＳＥＡ」と表示する）。
【図１０】水およびＮａＣｌＯと比較した本明細書に記載する組成物についての塩素／窒素比を示す（当該組成物は「ＡＳＥＡ」と表示する）。
【図１１】水およびＮａＣｌＯと比較した本明細書に記載する組成物についてのオゾン／窒素比を示す（当該組成物は「ＡＳＥＡ」と表示する）。
【図１２】水およびＮａＣｌＯと比較した本明細書に記載する組成物の窒素に対する二酸化炭素の比を示す（当該組成物は「ＡＳＥＡ」と表示する）。
【図１３】自由電子についてのＥＰＲ分裂パターンを示す。
【図１４】実施例３に記載するマウス研究のフローチャートを示す（当該組成物処置群は「ＡＳＥＡ」と表示する）。
【図１５】マウスの準備および研究の全体的な概要を示すフローチャートである（用いられた組成物は「ＡＳＥＡ」と称する）。
【図１６】走行時間およびグリコーゲン枯渇に対する、プラセボおよびＡＳＥＡ（本明細書に記載する組成物）処置に群分けしたマウスを示す。
【図１７Ａ】種々のマウスの群のＡＳＥＡ（本明細書に記載する組成物）処置群に対する倍数変化を示す。
【図１７Ｂ】ＡＳＥＡ坐位（非走行）群とＡＳＥＡ走行群との間の倍数変化の差を示す。
【図１８】肝臓スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）の生成量に対する種々のマウス群を示す（実施形態として用いた組成物は「ＡＳＥＡ」と称する）。
【図１９】酸化されたグルタチオンに対する種々のマウス群（坐位／走行、処置／プラセボ）を示す（用いた組成物実施形態は「ＡＳＥＡ」と称する）。
【図２０】ＩＬ−６およびＴＮＦ−アルファについての倍数変化に対する種々のマウス群を示す（実施形態として用いた組成物は「ＡＳＥＡ」と称する）。
【図２１】摂取２４時間後の条件間のＡ−Ｂ比の比較を示す（実施形態として用いた組成物は「ＡＳＥＡ」と称する）。
【図２２】ヒト走行能力研究プロトコールのフローチャートを示す（プロトコールにおいて実施形態として用いた組成物は「ＡＳＥＡ」と称する）。
【図２３】実施例７のプロトコールに従って行った１２週間の無作為化試験のフローチャートを示す（プロトコールにおいて用いた実施形態の組成物は「ＡＳＥＡ」と称する）。
【図２４】実施例８における研究から得られたＶＣＯ2対ＶＯ2のグラフを示す（プロトコールにおいて用いた実施形態の組成物は「ＡＳＥＡ」と称する）。
【図２５】毒性についてのＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞ｐ６５サブユニットＮＦ−ｋＢスクリーニングの各培養の結果についての細胞の画像を示す（プロトコールにおいて用いた実施形態の組成物は「ＡＳＥＡ」と称する）。
【図２６】毒性についてのＰ−Ｊｕｎスクリーニングの結果を示す（プロトコールにおいて用いた実施形態の組成物は「ＡＳＥＡ」と称する）。
【図２７】１１分の期間にわたる酸化体の低減を示すグラフを示す（縦軸はＲＦＵ単位）。
【図２８】１１分の期間にわたる抗酸化活性を示すグラフを示す（プロトコールにおいて用いた実施形態の組成物は「ＡＳＥＡ」と称する）。
【図２９】ＮＲＦ２のＨＭＶＥＣ−Ｌ核蓄積の結果についての核染色パターンを示す（プロトコールにおいて用いた実施形態の組成物は「ＡＳＥＡ」と称する）。
【図３０】低濃度のＡＳＥＡ（本明細書に開示する組成物）に曝露した血清飢餓細胞培養物を示す。
【図３１】ＡＳＥＡ処理の後のＮＲＦ２核蓄積のウェスタンブロットによる確認を示す。
【図３２】ＡＳＥＡ処理後のネズミおよびＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞の増殖ならびにＬＤＨ活性の結果を示す。
【図３３】ＡＳＥＡ処理後のネズミおよびＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞の増殖ならびにＬＤＨ活性のさらなる結果を示す。
【図３４】高濃度のＡＳＥＡおよび漸増量のカケキシンストレス因子に曝露したＨＭＶＥＣ−Ｌ生存性の結果を示す（プロトコールにおいて用いた実施形態の組成物は「ＡＳＥＡ」と称する）。
【図３５】カケキシン傷害に対するＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞の濃度依存性応答の結果を示す（プロトコールにおいて用いた実施形態の組成物は「ＡＳＥＡ」と称する）。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
少なくとも１種のレドックスシグナル伝達物質（ＲＸＮ）を原則的に含む治療組成物が本明細書に記載される。ＲＸＮは、それらに限定されないが、スーパーオキシド：Ｏ2*-、ＨＯ2*；ハイポクロライト：ＯＣｌ-、ＨＯＣｌ、ＮａＯＣｌ；ハイポクロレート：ＨＣｌＯ2、ＣｌＯ2、ＨＣｌＯ3、ＨＣｌＯ4；酸素誘導体：Ｏ2、Ｏ3、Ｏ4*-、1Ｏ；水素誘導体：Ｈ2、Ｈ-；過酸化水素：Ｈ2Ｏ2；ヒドロキシルフリーラジカル：ＯＨ*-；イオン化合物：Ｎａ+、Ｃｌ-、Ｈ+、ＯＨ-、ＮａＣｌ、ＨＣｌ、ＮａＯＨ；塩素：Ｃｌ2；ならびに水クラスタ：イオンの周囲のｎ*Ｈ2Ｏ−誘導された双極性の層を含みうる。本明細書に記載するＲＸＮを含む組成物は、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）を動員させ、ミトコンドリア密度を増やしうる。ＦＦＡは、ペルオキシソーム増殖因子応答性受容体（ＰＰＡＲ）を活性化させることがある。
【００１１】
実施形態は、ＰＰＡＲアゴニストをさらに含みうる。ＰＰＡＲは、核受容体であり得る。ＰＰＡＲファミリーは、それぞれ異なる遺伝子によりコードされるアルファ、ガンマおよびデルタ（ベータともよばれる）と称する３つのアイソフォームを含む。核受容体および転写因子のスーパーファミリーの一部を形成するこれらの受容体は、脂質および炭水化物代謝の調節において主要な役割を演じることがある。ＰＰＡＲは、細胞分化、発達および代謝（炭水化物、脂質、タンパク質）の調節ならびに高等生物の腫瘍形成において重要な役割を演じることがある。
【００１２】
ＰＰＡＲ−アルファは、脂質代謝（肝臓および筋肉）およびグルコース恒常性を制御しうるし、脂質恒常性に関与するタンパク質をコードする遺伝子の転写の直接制御により脂質および糖の細胞内代謝に影響を与えることがある。ＰＰＡＲ−アルファは、抗炎症性および抗増殖性の効果も奏しうるし、コレステロールの流出を刺激することによりマクロファージ中のコレステロールの蓄積のアテローム生成促進性の効果を妨げることがある。ＰＰＡＲ−ガンマは、脂質生成の重要な調節因子である。成熟脂肪細胞の脂質代謝、グルコース恒常性、インスリン抵抗性、炎症、マクロファージレベルでのコレステロールの蓄積および細胞増殖に関与することもある。ＰＰＡＲ−ガンマは、よって、肥満症、インスリン抵抗性および糖尿病の病理発生において役割を演じることがある。ＰＰＡＲ−デルタは、脂質および炭水化物代謝の制御、エネルギー均衡化、神経変性、肥満症、泡沫細胞の形成ならびに炎症に関与することがある。
【００１３】
約１０ｇ  ＮａＣｌ／ｇａｌ、例えば１０．７５ｇ  ＮａＣｌ／ｇａｌの塩濃度を有する塩添加水を、約５０〜６０ａｍｐ、例えば５６ａｍｐのアンペア数を有する電極の組を用いて電気分解して、生命増進組成物を形成するステップを含み、水が、室温未満に冷却され、水が、電気分解中に循環する、治療組成物を作製する方法が記載される。
【００１４】
開示された組成物を生成する方法は、（１）塩化ナトリウムの超純粋均質水溶液の調製ステップ、（２）不活性触媒電極の組による温度制御および流量調節ステップ、ならびに（３）安定な分子体および複合体の形成をもたらす変調電気分解プロセスステップの１または複数を含みうる。一実施形態では、このようなプロセスは、これら全てのステップを含む。
【００１５】
塩類溶液は、通常、有機および無機のいずれの混入物も含まず、分子レベルまで均質である。特に、金属イオンは、電極触媒表面反応に干渉し得るので、金属を回避することが有用になることがある。一実施形態では、ブライン溶液を用いて水に塩を添加する。ブライン溶液は、約５４０ｇ  ＮａＣｌ／ｇａｌ、例えば５３７．５ｇ  ＮａＣｌ／ｇａｌのＮａＣｌ濃度を有してもよい。一実施形態では、組成物は、Ｏ2、Ｈ2、Ｃｌ2、ＯＣｌ-、ＨＯＣｌ、ＮａＯＣｌ、ＨＣｌＯ2、ＣｌＯ2、ＨＣｌＯ3、ＨＣｌＯ4、Ｈ2Ｏ2、Ｎａ+、Ｃｌ-、Ｈ+、Ｈ-、ＯＨ-、Ｏ3、Ｏ4*-、1Ｏ、ＯＨ*-、ＨＯＣｌ−Ｏ2*-、ＨＯＣｌ−Ｏ3、Ｏ2*-、ＨＯ2*、ＮａＣｌ、ＨＣｌ、ＮａＯＨ、水クラスタまたはそれらの組み合わせのような少なくとも１つの種を含みうる。
【００１６】
一実施形態では、組成物は、Ｈ2、Ｃｌ2、ＯＣｌ-、ＨＯＣｌ、ＮａＯＣｌ、ＨＣｌＯ2、ＣｌＯ2、ＨＣｌＯ3、ＨＣｌＯ4、Ｈ2Ｏ2、Ｏ3、Ｏ4*-、1Ｏ2、ＯＨ*-、ＨＯＣｌ−Ｏ2*-、ＨＯＣｌ−Ｏ3、Ｏ2*-、ＨＯ2*、水クラスタまたはそれらの組み合わせのような少なくとも１つの種を含みうる。
【００１７】
一実施形態では、組成物は、ＨＣｌＯ3、ＨＣｌＯ4、Ｈ2Ｏ2、Ｏ3、Ｏ4*-、1Ｏ2、ＯＨ*-、ＨＯＣｌ−Ｏ2*-、ＨＯＣｌ−Ｏ3、Ｏ2*-、ＨＯ2*、水クラスタまたはそれらの組み合わせのような少なくとも１つの種を含みうる。
【００１８】
一実施形態では、組成物は、Ｏ2を含みうる。一実施形態では、組成物は、Ｈ2を含みうる。一実施形態では、組成物は、Ｃｌ2を含みうる。一実施形態では、組成物は、ＯＣｌ-を含みうる。一実施形態では、組成物は、ＨＯＣｌを含みうる。一実施形態では、組成物は、ＮａＯＣｌを含みうる。一実施形態では、組成物は、ＨＣｌＯ2を含みうる。一実施形態では、組成物は、ＣｌＯ2を含みうる。一実施形態では、組成物は、ＨＣｌＯ3を含みうる。一実施形態では、組成物は、ＨＣｌＯ4を含みうる。一実施形態では、組成物は、Ｈ2Ｏ2を含みうる。一実施形態では、組成物は、Ｎａ+を含みうる。一実施形態では、組成物は、Ｃｌ-を含みうる。一実施形態では、組成物は、Ｈ+を含みうる。一実施形態では、組成物は、Ｈ-を含みうる。一実施形態では、組成物は、ＯＨ-を含みうる。一実施形態では、組成物は、Ｏ3を含みうる。一実施形態では、組成物は、Ｏ4*-を含みうる。一実施形態では、組成物は、1Ｏ2を含みうる。一実施形態では、組成物は、ＯＨ*-を含みうる。一実施形態では、組成物は、ＨＯＣｌ−Ｏ2*-を含みうる。一実施形態では、組成物は、ＨＯＣｌ−Ｏ3、Ｏ2*-を含みうる。一実施形態では、組成物は、ＨＯ2*を含みうる。一実施形態では、組成物は、ＮａＣｌを含みうる。一実施形態では、組成物は、ＨＣｌを含みうる。一実施形態では、組成物は、ＮａＯＨを含みうる。一実施形態では、組成物は、水クラスタを含みうる。実施形態は、これらの組み合わせを含みうる。
【００１９】
これを念頭に、このようなプロセス中のあるステップを図１に示す。１００は、任意選択の逆浸透手順１０２である。水は、それらに限定されないが、市水、ろ過水、ナノポア水などを含む様々な供給源から供給されうる。
【００２０】
逆浸透プロセスは、変動しうるが、約１０ｐｐｍ、約９ｐｐｍ、約８ｐｐｍ、約７ｐｐｍ、約６ｐｐｍ、約５ｐｐｍ、約４ｐｐｍ、約３ｐｐｍ、約２ｐｐｍ、約１ｐｐｍ未満などの全溶解固体含量を有する水をもたらしうる。
【００２１】
逆浸透プロセスは、約５℃、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃などの温度にて行われうる。逆浸透ステップは、必要により反復して、特定の全溶解固体レベルを達成してもよい。任意選択の逆浸透ステップを用いるかに関わらず、蒸留ステップ１０４が選択的に行われてもよい。
【００２２】
蒸留プロセスは、変動しうるが、約５ｐｐｍ、約４ｐｐｍ、約３ｐｐｍ、約２ｐｐｍ、約１ｐｐｍ、約０．９ｐｐｍ、約０．８ｐｐｍ、約０．７ｐｐｍ、約０．６ｐｐｍ、約０．５ｐｐｍ、約０．４ｐｐｍ、約０．３ｐｐｍ、約０．２ｐｐｍ、約０．１ｐｐｍ未満などの全溶解固体含量を有する水をもたらしうる。蒸留プロセスの温度は、約５℃、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃などの温度にて行われうる。
【００２３】
蒸留ステップは、必要により反復して、特定の全溶解固体レベルを達成してもよい。水を逆浸透、蒸留、その両方に供した後またはいずれにも供さずに、水中の全溶解固体のレベルは、約５ｐｐｍ、約４ｐｐｍ、約３ｐｐｍ、約２ｐｐｍ、約１ｐｐｍ、約０．９ｐｐｍ、約０．８ｐｐｍ、約０．７ｐｐｍ、約０．６ｐｐｍ、約０．５ｐｐｍ、約０．４ｐｐｍ、約０．３ｐｐｍ、約０．２ｐｐｍ、約０．１ｐｐｍ未満などであり得る。
【００２４】
逆浸透、蒸留、その両方の前にまたはいずれも行うことなく、炭素ろ過ステップが行われてもよい。
【００２５】
精製水は、本明細書に記載するシステムおよび方法に直接用いられうる。
【００２６】
一実施形態では、混入物は、以下の手順により、商業的供給源の水から除去されうる。水を活性炭フィルタに通して、芳香族および揮発性混入物を除去し、次いで、逆浸透（ＲＯ）ろ過を経て溶解固体とほとんどの有機および無機の混入物とを除去する。得られたろ過ＲＯ水が含有する溶解固体は、約８ｐｐｍ未満となる。ほとんどの残りの混入物は、蒸留プロセスにより除去でき、溶解固体量は１ｐｐｍ未満となる。蒸留は、混入物を除去することに加え、正しい構造および酸化還元電位（ＯＲＰ）の水に整えて、後続の電極触媒プロセスでの白金電極上の酸化および還元反応電位の実現を促進する役割を果たしうる。
【００２７】
水を逆浸透、蒸留、その両方に供した後またはいずれにも供さずに、加塩ステップ１０６において水に塩を加える。塩は、未精製、精製、ケーキ状にしたもの、ケーキ状をくずしたものなどであり得る。一実施形態では、塩は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）である。いくつかの実施形態では、塩は、添加剤を含み得る。塩添加剤は、それらに限定されないが、ヨウ化カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ素酸ナトリウム、ブドウ糖、フッ化ナトリウム、フェロシアン化ナトリウム、リン酸三カルシウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、脂肪酸、酸化マグネシウム、二酸化ケイ素、ケイ酸カルシウム、アルミノケイ酸ナトリウム、アルミノケイ酸カルシウム、フマル酸第一鉄、鉄または葉酸を含みうる。これらの添加剤のいずれも、この時点または記載するプロセス中の任意の時点にて加えられてもよい。例えば、上記の添加剤は、瓶詰めの直前に加えられてもよい。
【００２８】
塩は、ブライン溶液の形で水に加えてもよい。ブライン溶液を混合するために、物理的混合装置を用いてもよいし、循環もしくは再循環を用いてもよい。一実施形態では、純粋な製薬グレードの塩化ナトリウムを、準備した蒸留水に溶解して、１５ｗｔ％の飽和以下のブライン溶液を作製し、塩が完全に溶解し、＞０．１ミクロンの粒子が全て除去されるまで継続的に再循環およびろ過する。このステップは、数日間要することがある。ろ過し、溶解したブライン溶液を、次いで、蒸留水のタンクに約１：３５２の比（塩：水）で注入して、０．３％塩類溶液を形成する。一実施形態では、水１ガロンあたり１０．７５ｇの塩の比を用いて組成物を形成しうる。別の実施形態では、約３〜４ｇの水、例えば３．７８７５ｇの水中に１０．７５ｇの塩を用いて組成物を形成しうる。この溶液を、次いで、分子スケールでの均質性が達成されるまで再循環および拡散させてもよい。
【００２９】
一実施形態では、均質塩類溶液を約４．８±０．５℃まで低温化する。全電極触媒プロセス中の温度調節を採用してもよい。なぜなら、電気分解プロセス自体から生じる熱エネルギーは、加熱を引き起こすことがあるからである。一実施形態では、電極での処理温度は、常に冷却して、電気分解中ずっと約４．８℃に維持してもよい。
【００３０】
ブラインを、次いで、予め処理した水または新しい未処理の水に加えて、約１ｇ  ＮａＣｌ／ｇａｌ水から約２５ｇ  ＮａＣｌ／ｇａｌ水の間、約８ｇ  ＮａＣｌ／ｇａｌ水から約１２ｇ  ＮａＣｌ／ｇａｌ水の間、または約４ｇ  ＮａＣｌ／ｇａｌ水から約１６ｇ  ＮａＣｌ／ｇａｌ水の間のＮａＣｌ濃度を達成してもよい。適当な量のブラインを水に加えた後、溶液を十分に混合してもよい。混合中の液体の温度は、室温であってもよいし、または所望の温度もしくは温度範囲に制御してもよい。
【００３１】
溶液を混合するために、物理的な混合装置を用いてもよいし、または循環もしくは再循環を用いてもよい。塩溶液を、次いで、低温化ステップ１０８で低温化してもよい。
【００３２】
大量の組成物について、様々な低温化および冷却方法が採用されうる。例えば、液体窒素冷却ラインを用いる極低温冷却を用いてもよい。同様に、溶液をプロピレングリコール熱交換器に通して、所望の温度を達成してもよい。低温化時間は、液体の量、出発温度および所望の低温化温度に応じて変動しうる。
【００３３】
アノード反応からの生成物は、カソードに効率的に輸送して、カソード表面上で安定な複合体を形成するために必要な反応物を得ることができる。触媒表面間で循環する流体の均質性を高い程度に維持することも有用であり得る。大きいタンク中で２ｃｍ離れた典型的なメッシュ電極間距離で、約２〜８ｍＬ／ｃｍ2*ｓｅｃの定流量を用いることができる。この流量は、部分的に、電気分解中に電極から放出される気体の対流により維持されうる。
【００３４】
混合溶液は低温化されたか否かに関わらず、次いで、電気分解ステップ１１０において少なくとも１つの電極を用いることにより、電気化学処理を受けてもよい。各電極は、導電性金属であり得るかまたは導電性金属を含んでもよい。金属は、それらに限定されないが、銅、アルミニウム、チタン、ロジウム、白金、銀、金、鉄、それらの組み合わせまたは鋼もしくは真鍮のような合金を含んでもよい。電極は、それらに限定されないが、アルミニウム、金、白金または銀のような異なる金属で被覆またはめっきされてもよい。ある実施形態では、各電極は、チタン製であり、白金めっきされている。電極上の白金表面は、それ自体で、要求される反応を触媒するために最適であり得る。粗い二重層の白金めっきにより、確実に、局所的な「反応中心」（鋭くとがった突出）が活性を有し、反応物が下部にある電極チタン基体と接触しないようにできる。
【００３５】
一実施形態では、アノードとカソードとの間が例えば２．５ｃｍ以下、５ｃｍ以下、１０ｃｍ以下、２０ｃｍ以下または５０ｃｍ以下離れた、鉛直同軸円柱形状の粗い白金めっきメッシュ電極が最適であり得る。各電極に通すアンペア数は、約２ａｍｐから約１５ａｍｐの間、約４ａｍｐから約１４ａｍｐの間、少なくとも約２ａｍｐ、少なくとも約４ａｍｐ、少なくとも約６ａｍｐまたはこれらの値のいずれかを用いて創出される任意の範囲であり得る。一実施形態では、各電極で７ａｍｐを用いる。
【００３６】
上記アンペア数は、塩類溶液を電気分解するために十分な時間、電極に通してもよい。溶液は、電気化学プロセス中に低温化されてもよい。溶液は、電気化学プロセス中に混合されてもよい。この混合は、実質的に完全な電気分解を確実にするために行われうる。
【００３７】
電極間の電場は、イオンの動きを引き起こしうる。陰イオンは、アノードに向かって動き、陽イオンは、カソードに向かって動くことができる。このことにより、電極間で反応物と生成物の交換が可能になる。いくつかの実施形態では、電極間に仕切りは必要でない。
【００３８】
ミトコンドリアでは、ミトコンドリア電位の揺らぎ、特に電位の脈動が生じることが観察されている。同様に、本明細書に開示する組成物の生成ユニットの電源の電位の脈動を用いてもよい。整流電源中に平滑コンデンサがないことにより、１秒あたり１２０回電圧がゼロに落ちて、家庭電気系統の交流が極性を変える場合に、鮮明なスパイクをもたらしうる。この鮮明なスパイクは、フーリエ変換下で、大きな周波数帯域幅を放ちうる。本質的に、電圧は、高い電位からゼロまで１秒間に１２０回変動する。
【００３９】
溶液にアンペア数を十分な時間通した後に、電気分解された溶液が創出される。溶液は、貯蔵／試験ステップ１１２において貯蔵し、および／または特定の特性について試験されうる。
【００４０】
この電気分解プロセスの最終生成物は、塩類溶液内で反応して、多くの異なる化学体を生成しうる。本明細書に記載する組成物は、レドックスシグナル伝達物質またはＲＸＮとして知られるこれらの化学体の１または複数を含みうる。
【００４１】
電気分解された溶液の塩素濃度は、約５ｐｐｍから約３４ｐｐｍの間、約１０ｐｐｍから約３４ｐｐｍの間、または約１５ｐｐｍから約３４ｐｐｍの間であり得る。一実施形態では、塩素濃度は、約３２ｐｐｍである。
【００４２】
電気分解された溶液中の塩分濃度は、例えば、約０．１０％ｗ／ｖから約０．２０％ｗ／ｖの間、約０．１１％ｗ／ｖから約０．１９％ｗ／ｖの間、約０．１２％ｗ／ｖから約０．１８％ｗ／ｖの間、約０．１３％ｗ／ｖから約０．１７％ｗ／ｖの間、または約０．１４％ｗ／ｖから約０．１６％ｗ／ｖの間であり得る。
【００４３】
組成物は、一般的に、ヒト細胞中およびその周囲で見出される天然の塩水化合物のレドックスシグナル伝達分子組成物を模倣する純粋な塩類溶液の電気分解および／または触媒生成物を含みうる。組成物は、異なる生物学的媒体の分子組成を模倣または反映するように微調整されうる。組成物は、存在する塩素以外の反応性種を有してもよい。記載されているように、本明細書に記載する組成物中に存在する種は、それらに限定されないが、Ｏ2、Ｈ2、Ｃｌ2、ＯＣｌ-、ＨＯＣｌ、ＮａＯＣｌ、ＨＣｌＯ2、ＣｌＯ2、ＨＣｌＯ3、ＨＣｌＯ4、Ｈ2Ｏ2、Ｎａ+、Ｃｌ-、Ｈ+、Ｈ-、ＯＨ-、Ｏ3、Ｏ4*-、1Ｏ2、ＯＨ*-、ＨＯＣｌ−Ｏ2*-、ＨＯＣｌ−Ｏ3、Ｏ2*-、ＨＯ2*、ＮａＣｌ、ＨＣｌ、ＮａＯＨおよび水クラスタ、イオンの周囲のｎ*Ｈ2Ｏ−誘導された双極性の層などを含みうる。
【００４４】
本明細書に開示する組成物は、ＰＰＡＲアゴニスト、例えばＦＦＡ、フィブラート（フェノフィブラート、ベザフィブラート、シプロフィブラート、ゲムフィブロジル）、チアゾリジンジオン（ロシグリタゾンおよびピオグリタゾン）、Ｌ−１６５０４１、ＧＷ５０１５１６、ＫＤ３０１０、エイコサノイド、プロスタグランジン（Ｅ１−アルプロスタジル、Ｉ２−プロスタサイクリン、ＰＧＪ２）、プロスタサイクリン（エポプロステノール、トレプロスチニル、ＦＬＯＬＡＮ（登録商標）、ベレトリ、リモジュリン、ベンタビス（イロプロスト）、トロンボキサン（トロンボキサンＡ２、トロンボキサンＢ２）、ロイコトリエン（ＬＴＣ４、ＬＴＤ４、ＬＴＥ４およびＬＴＦ４）、ペルフルオロオクタン酸、ペルフルオロノナン酸、ベルベリン、ＲＳ５４４４などを含んでもよい。ＰＰＡＲアゴニストは、例えばアレグリタザル、ムラグリタザル、テサグリタザル、ＡＭ３１０２、ＣＡＹ１０５０６、ＣＰ７７５１４６、ＤＲＦ２５１９、（＋）−エトモキシルナトリウム塩水和物、ＧＳＫ３７８７、ＧＷ０７４２、ＧＷ１９２９、ＧＷ７６４７、ＧＷ１９２９水和物、Ｗ５０１５１６、Ｌ−１６５０４１、メチル−８−ヒドロキシ−８−（２−ペンチル−オキシフェニル）−オクト−５−イノエート、ＮＰＣ１５１９９、ｎＴＺＤｐａ、ＰＡｚ−ＰＣ、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン（カリウム塩）、ロシグリタゾン−ｄ３マレエート、Ｓ２６９４８、ＷＹ１４６４３などを含む「二重」、「均衡化」または「パン」ＰＰＡＲリガンド（「グリタザル」）であり得る。
【００４５】
実施形態では、ＰＰＡＲアゴニストは、少なくとも１種のＲＸＮを含むＲＸＮ組成物とは別に包装してもよい。例えば、ある実施形態では、ＰＰＡＲアゴニストをＲＸＮ組成物に、患者に投与する直前に加えてもよい。実施形態では、ＰＰＡＲアゴニストおよびＲＸＮを別々の組成物で投与してもよい。実施形態では、ＰＰＡＲアゴニストは、ＲＸＮ組成物内に懸濁したマイクロスフェア内に含まれうる。実施形態では、ＰＰＡＲアゴニスト／ＲＸＮ組成物は、ジェルキャップを含みうる。
【００４６】
ＰＰＡＲアゴニストおよび／またはＲＸＮ組成物の投与は、例えば非経口、注射により、皮膚上、吸入、注腸、点眼剤、点耳剤、体内の粘膜を通して、口（経口）から、胃栄養管、十二指腸栄養管、胃瘻造設、直腸、静脈内、動脈内、骨内注入、筋内、脳内、脳室内、皮下などを含む任意の適切な方法により達成されうる。
【００４７】
本発明の組成物は、例えばエアゾール剤、液剤、エリキシル剤、シロップ剤、チンキ剤、クリーム、軟膏剤、ローション剤、薄膜、固体、ジェルキャップ、マイクロスフェア懸濁剤、ゼラチン軟カプセル剤などの任意の適切な態様に製剤化されうる。
【００４８】
液体組成物として投与する場合、１日１回、２回、３回、４回以上摂取されうる。各投与は、約１ｏｚ、約２ｏｚ、約３ｏｚ、約４ｏｚ、約５ｏｚ、約６ｏｚ、約７ｏｚ、約８ｏｚ、約９ｏｚ、約１０ｏｚ、約１１ｏｚ、約１２ｏｚ、約１６ｏｚ、約２０ｏｚ、約２４ｏｚ、約２８ｏｚ、約３２ｏｚ、約３４ｏｚ、約３６ｏｚ、約３８ｏｚ、約４０ｏｚ、約４６ｏｚ、約１ｏｚから約３２ｏｚの間、約１ｏｚから約１６ｏｚの間、約１ｏｚから約８ｏｚの間、少なくとも約２ｏｚ、少なくとも約４ｏｚ、または少なくとも約８ｏｚであり得る。一実施形態では、組成物は、１日に約４ｏｚを２回の割合で投与されうる。
【００４９】
別の実施形態では、投与は、急性または長期であり得る。例えば、組成物は、１日、１週間、１カ月、１年またはそれ以上投与されうる。
【００５０】
本明細書に記載する組成物は、投与する場合、状態または疾患を処置するために用いられうる。例えば、運動とともに投与するかまたはそうでない場合、本明細書に記載する組成物は、ミトコンドリアＤＮＡの密度を増加しうる。例えば、組成物を摂取していない個体と比較して、約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３２％、約３４％、約３６％、約３８％、約４０％、約４５％、約１％から約４０％の間、約１％から約１０％の間、約２０％から約３０％の間、少なくとも約５％、少なくとも約１０％または少なくとも約２０％のミトコンドリアＤＮＡの増加。ミトコンドリアＤＮＡの増加は、血液中のフリーラジカルのレベルをより低くし、このことは、次いで、酸化ストレスの量の低減を導きうる。
【００５１】
本明細書に開示する組成物は、ミトコンドリアＤＮＡに関連する疾患の処置において有用であり得る。よって、記載する組成物は、それらに限定されないが、サクロペニア、パーキンソン病、神経関連老化疾患、肥満症、老化、心配により引き起こされるもののような生活ストレス、神経変性疾患、認知障害、肥満症、代謝率の低下、メタボリックシンドローム、真性糖尿病、循環器疾患、高脂血症、神経変性疾患、認知障害、気分障害、ストレスおよび不安障害、体重管理のため、または筋肉の性能もしくは精神的性能の増加のため、ＡＩＤＳ、認知症症候群、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、アルパース病、毛細血管拡張性運動失調症、バッテン病、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、カナバン病、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト−ヤコブ病、レビー小体型認知症、致死性家族性不眠症、前頭側頭葉変性症、ハンチントン病、ケネディ病、クラッベ病、ライム病、マシャド−ジョセフ病、多発性硬化症、多系統萎縮症、有棘赤血球舞踏病、ニーマン−ピック病、ピック病、原発性側索硬化症、進行性核上性麻痺、レフサム病、サンドホフ病、びまん性ミエリン破壊性硬化症、脊髄小脳変性症、亜急性連合性脊髄変性症、脊髄ろう、テイ−サックス病、中毒性脳症、伝達性海綿状脳症およびブルブルハリネズミ症候群（ｗｏｂｂｌｙ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、認知機能異常、知覚異常、注意障害、会話理解障害、読解障害、画像創出障害、学習障害、判断障害、気分障害、うつ病、産後うつ病、気分変調症、双極性障害、全般性不安障害、パニック障害、広場恐怖を伴うパニック障害、広場恐怖症、社会不安障害、強迫性障害、心的外傷後ストレス障害、筋骨格障害、体力欠如、持久力欠如、がん、動脈硬化病変、アテローム動脈硬化症、酸化ストレス、アテローム発生、高血圧症、高コレステロール血症および変性疾患のような状態または疾患を処置しうる。
【００５２】
本明細書に開示する組成物は、例えばメタボリックシンドローム、循環器疾患、糖尿病、肥満症、グルコース不耐症、高インスリン血症、高コレステロール血症、高トリグリセライド血症および高血圧症、炎症、血管機能、および血管リモデリング、がん、炎症、神経変性疾患、ミトコンドリア生合成に関わる疾患、老化などを含む、ＰＰＡＲ経路に関連する疾患の処置に有用であり得る。
【００５３】
実施形態では、本発明の組成物は、複数の機序により作用する治療成分を含みうる。例えば、二重作用性治療は、ＰＰＡＲ経路を活性化する第１の治療と、ＰＰＡＲ経路を活性化しない少なくとも１種の他の作用因子とを含みうる。実施形態では、第１の作用因子は、少なくとも１種のＲＸＮであり得る。実施形態では、少なくとも１種の他の作用因子は、ｍＡｂ、放射線照射、手術、血管新生阻害剤、移植、がんワクチン、遺伝子治療、レーザ処置、光線力学治療、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、有糸分裂阻害剤、副腎皮質ステロイド、ホルモン治療、免疫治療などである。
【００５４】
実施形態は、ＲＸＮを含む、スーパーオキシドおよび／または脂肪酸酸化（ＦＡＯ）酵素のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ基質を提供しうる。実施形態は、併用治療を含むがんを処置する方法であって、１つの治療が、ＦＦＡを増加する少なくとも１種のＲＸＮとＦＦＡを増加しない少なくとも１種の他の作用因子とを含む組成物を含む方法を含みうる。
【００５５】
他の実施形態では、酸化ストレス関連障害を処置する方法であって、Ｏ2、Ｈ2、Ｃｌ2、ＯＣｌ-、ＨＯＣｌ、ＮａＯＣｌ、ＨＣｌＯ2、ＣｌＯ2、ＨＣｌＯ3、ＨＣｌＯ4、Ｈ2Ｏ2、Ｎａ+、Ｃｌ-、Ｈ+、Ｈ-、ＯＨ-、Ｏ3、Ｏ4*-、1Ｏ、ＯＨ*-、ＨＯＣｌ−Ｏ2*-、ＨＯＣｌ−Ｏ3、Ｏ2*-、ＨＯ2*、ＮａＣｌ、ＨＣｌ、ＮａＯＨ、水クラスタまたはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの種を含む組成物を、酸化ストレスを受けている患者に投与するステップと、酸化ストレス関連障害を処置するステップとを含む方法が記載される。いくつかの実施形態では、投与は、１日２回または１日１回生じる。各投与は、１日あたり約１ｏｚから約１６ｏｚの間を含みうる。他の実施形態では、酸化ストレス関連障害は、糖尿病、循環器疾患または肥満症である。
【実施例１】
【００５６】
図３は、本記載に従う生命増進組成物を生成するためのプロセスおよびシステムの平面図を示す。当業者は、システムを変更して生命増進組成物を変化させうることを理解しており、これらの変更は、本記載の範囲内である。
【００５７】
流入水２０２を約１５〜２０℃の温度にて逆浸透システム２０４に供して、全溶解固体が約８ｐｐｍの精製水２０６を得ることができる。精製水２０６を、次いで、約１５〜２０℃の温度にて蒸留器２０８に供給し、処理して、全溶解固体が約０．５ｐｐｍの蒸留水２１０を得る。蒸留水２１０は、次いで、タンク２１２に貯蔵できる。
【００５８】
図４は、治療用飲料にさらに処理するための水を調製するためのシステムの例を示す。システム３００は、炭素フィルタ３０４に直接供給できる水供給源３０２を含みうる。油、アルコールおよび他の揮発性化学残渣および微粒子を炭素フィルタ３０４により除去した後に、水を、溶解鉱物を除去できる水軟化装置３０６内の樹脂床に向けることができる。次いで、上記のように、水は、逆浸透システム２０４および蒸留器２０８を通過できる。
【００５９】
必要に応じて、蒸留水２１０は、タンク２１２から塩類溶液貯蔵タンククラスタ２１４に、ライン２１６を用いて重力により送ることができる。塩類溶液貯蔵タンククラスタ２１４は、一実施形態では、１２個のタンク２１８を含みうる。各タンク２１８は、約１，３００ガロンまでの蒸留水２１０を充填できる。手持ち式計測器を用いて、蒸留水２１０の塩度を試験できる。
【００６０】
塩類溶液貯蔵タンククラスタ２１４に、次いで、ブラインシステム２２０を用いて加塩する。ブラインシステム２２０は、２つのブラインタンク２２２を含みうる。各タンクは、約５００ガロンの容量を有することができる。ブラインタンク２２２に、ライン２２４を用いて４７５ガロンまでの蒸留水２１０を充填し、次いで、ＮａＣｌを約５３７．５ｇ／液体ｇａｌの比でブラインタンク２２２に加える。この時点で、水は、約２，０００ｇａｌ／時間の速度で約４日間ブラインタンク２２２中を循環２２６する。
【００６１】
ブラインをタンク２１８に加える前に、タンク２１８中の水の塩度を、ＹＳＩ  ＥＣＯＳＥＮＳＥ（登録商標）ｅｃｐ３００（ＹＳＩ  Ｉｎｃ．、Ｙｅｌｌｏｗ  Ｓｐｒｉｎｇｓ、ＯＨ）のような手持ち式の導電率計測器を用いて試験できる。塩度測定に基づくいずれの補正もこの時点で行うことができる。ブライン溶液２２８を、次いで、タンク２１８に加えて、約１０．７５ｇ／ｇａｌの塩濃度を達成する。加塩された水は、約２，０００ｇａｌ／時間の速度で約７２時間以上タンク２１８中を循環２３０する。この循環は、室温にて行う。手持ち式のプローブをここでもまた用いて、塩添加溶液の塩度を試験できる。一実施形態では、塩度は、約２．８ｐｐｔｈである。
【００６２】
ブライン保持タンク中の塩水を充填および混合するある方法では、タンク中に残存する液体の量を測定する。タンク中に残存する液体の量は、タンクを支える床板からの液体レベルの高さをセンチメートルで記録し、その高さが表すガロンの数を参照することにより測定される。このことは、タンクが半透明であるならば、タンクの外側から行うことができる。両方に結ばれたタンク中の初期の液体の高さも測定できる。次いで、流出バルブが閉じられていることを確認した後に、蒸留水をポンプで入れることができる。保持タンク中にポンプで入れる蒸留水の量は、次いで、液体レベルの上昇を測定し、充填された高さから初めの高さを減じ、次いでこの差に既知の因数を乗じることにより算出できる。
【００６３】
タンクに加える塩の量は、次いで、タンクに加えた蒸留水１ガロンごとに１１グラムの塩を乗じることにより算出される。塩は、注意深く秤量し、タンクに投入する。
【００６４】
次いで、再循環ポンプの電源を入れ、次いでタンクの頂部および底部のバルブを開放することによりタンクを撹拌する。液体は、タンクの底部から頂部までポンプで運ばれる。タンクは３日間撹拌でき、その後に、タンクは、処理する準備ができている。
【００６５】
タンクを６時間より長く撹拌した後に、タンクから試料を採取してそれを試験することにより、塩度計測器を用いて塩度を確認する。塩または水を加えて、タンク内の塩度を調整できる。より多くの水またはより多くの塩を加えるならば、タンクをさらに６時間撹拌して、再び試験する。約３日間の撹拌の後に、タンクは、処理する準備ができている。
【００６６】
塩添加水２３２を、次いで、冷塩類溶液タンク２３４に移す。一実施形態では、４つの２５０ｇａｌタンクを用いる。移動する塩添加水２３２の量は、約１，０００ｇａｌである。１６トン低温化装置のような低温化装置２３６を用いて、熱交換器２３８を約０〜５℃に冷却する。塩添加水は、塩添加水の温度が約４．５〜５．８℃になるまでプロピレングリコールを循環する熱交換器中を循環２４０する。１，０００ｇａｌの塩添加水を低温化するのに、通常、約６〜８時間かかる。
【００６７】
冷塩添加水２４２を、次いで、処理タンク２４４に移す。一実施形態では、８つのタンクを用い、それぞれ約１８０ｇａｌの容量を有することができる。各処理タンク２４４は、約１２５ｇａｌまで充填する（合計で１，０００ｇａｌ）。熱交換器２４６を再び用いて、処理タンク２４４に加えた冷塩添加水２４２を低温化する。各処理タンクは、低温化用管の円筒を含むことができ、プロピレングリコールが循環できる。熱交換器は、４〜５トン低温化装置２４８で駆動できる。冷塩添加水２４２の温度は、処理中４．５〜５．８℃のままであり得る。
【００６８】
熟成させた塩水を処理タンクに移す前に、熟成させた塩水を約３０分間撹拌して、熟成させた塩水を十分に混合できる。次いで、再循環バルブを次いで閉じ、生成タンクの適当な流入バルブを開放し、塩水が冷却コイルを覆い、充填マークまで来る（およそ１２５ガロン）ようにタンクを充填する。
【００６９】
熟成させた塩水が生成温度に一旦達すると、ポンプの電源を消すが、低温化装置はつけたままにする。タンクは、電気化学処理の間中適切に撹拌または再循環し、温度は、その間中一定のままであるべきである。
【００７０】
各処理タンク２４４は、電極２５０を含む。電極２５０は、チタン製で、白金めっきされた３インチの高さの円形の構造物であり得る。冷塩添加水の電気化学処理は、８時間行うことができる。電源２５２を用いて、８つの電極（各処理タンク２４４中に１つ）にそれぞれ７ａｍｐ（合計で５６ａｍｐ）の電力を供給する。冷塩添加水は、電気化学処理中、約１，０００ｇａｌ／時間の速度で循環２５４する。
【００７１】
独立した電流計を用いて、電流を７．０Ａｍｐ付近に設定できる。電圧が１２Ｖを超えず、９Ｖより低くならないように注意を払われてもよい。通常の動作は、約１０Ｖであり得る。
【００７２】
運転計時装置を、所定の時間（約４．５から５時間）に設定できる。各生成タンクは、それぞれ個別の計時装置および／または電源を有することができる。電極は、計時装置が切れた後に停止するべきである。
【００７３】
生成タンクは、定期的に確認されうる。温度および／または電流は、実質的に一定に保つことができる。開始時に、電極は頂部から見ることができ、目視可能な泡を発する。約３時間後に、酸素飽和が生じるにつれて非溶解酸素の小さい泡がタンク中にたまり始めることがあり、電極が見えにくくなる。わずかな塩素の臭いは、正常であり得る。
【００７４】
８時間の電気化学処理が完了した後に、ｐＨが約６．８〜８．２、塩素が３２ｐｐｍ、１００％のＯＣｌ-および１００％のＯ-2の生命増進水２５６が創出される。組成物２５６を、貯蔵タンク２５８に移す。
【実施例２】
【００７５】
実施例１に記載するように生成した飲料の特徴決定
実施例１に記載するようにして生成し、商品名ＡＳＥＡ（登録商標）で販売される組成物を、様々な異なる特徴決定技術を用いて分析した。ＩＣＰ／ＭＳおよび35Ｃｌ  ＮＭＲを用いて、塩素含量を分析して定量した。ヘッドスペース質量分析を用いて、飲料中の吸着気体含量を分析した。1Ｈ  ＮＭＲを用いて、飲料中の有機分含量を検証した。31Ｐ  ＮＭＲおよびスピントラップ分子を利用するＥＰＲ実験を用いて、飲料のフリーラジカルを探索した。
【００７６】
組成物を受領し、不使用時は約４℃にて貯蔵した。
【００７７】
塩素ＮＭＲ
次亜塩素酸ナトリウム溶液を、異なるｐＨ値にて調製した。５％次亜塩素酸ナトリウム溶液は、ｐＨが１２．４８であった。濃硝酸を５％次亜塩素酸ナトリウム溶液に加えて、ｐＨが９．９９、６．９９、５．３２および３．２８の溶液を創出した。これらの溶液を、次いで、ＮＭＲ分光法により分析した。飲料は、測定ｐＨが８．０１であり、希釈せずにＮＭＲにより直接分析した。
【００７８】
ＮＭＲ分光法実験は、ＢＢＯプローブを備えた４００ＭＨｚ  Ｂｒｕｋｅｒ分光計を用いて行った。35Ｃｌ  ＮＭＲ実験は、単パルス実験を用いて３９．２ＭＨｚの周波数で行った。１０秒間のリサイクル遅延時間を用い、試料あたり１２８のスキャンを取得した。ＮａＣｌ水溶液を、外部化学シフト参照として用いた。全ての実験は、室温にて行った。
【００７９】
35Ｃｌ  ＮＭＲスペクトルを、ＮａＣｌ溶液、異なるｐＨ値に調整したＮａＣｌＯ溶液および組成物について収集した。図５は、ＮａＣｌ、ｐＨが１２．４８のＮａＣｌＯ溶液および組成物のＣｌ３５スペクトルを示す。化学シフト尺度は、Ｃｌ-ピークを０ｐｐｍに設定することにより参照にした。ｐＨ＝７より上のＮａＣｌＯ溶液は、およそ５．１ｐｐｍのピークを有する同一のスペクトルを有した。ｐＨ７．０未満では、ＣｌＯ-ピークは消失し、より広くてより同定しにくいピークで置き換えられた。組成物は、組成物中のＣｌＯ-からのおよそ４．７ｐｐｍの１つのピークを示した。このピークを積分して、組成物中のＣｌＯ-の濃度を見積もり、組成物中の２．９９ｐｐｔまたは０．１７ＭのＣｌＯ-と決定された。
【００８０】
プロトンＮＭＲ
１のＡＳＥＡ試料につき、５５０μＬのＡＳＥＡおよび５０μＬのＤ2Ｏ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をＮＭＲチューブに加え、試料を１０秒間ボルテックスすることにより調製した。1Ｈ  ＮＭＲ実験は、ＱＮＰ極低温冷却プローブを備えた７００ＭＨｚ  Ｂｒｕｋｅｒ分光計で行った。実験は、水共鳴実験での前飽和を用いる単パルスを用いた。合計で１０２４のスキャンを得た。全ての実験は、室温にて行った。
【００８１】
組成物の1Ｈ  ＮＭＲスペクトルを決定し、図６に示す。水と関連するピークだけが、このスペクトルから区別できた。このスペクトルは、あったとしても非常にわずかの有機物しか、この方法を用いては組成物中に検出できなかったことを示す。
【００８２】
リンＮＭＲおよび質量分析
ＤＩＰＰＭＰＯ（５−（ジイソプロポキシホスホリル）−５−１−ピロリン−Ｎ−オキシド）（ＶＷＲ）試料を、約５ｍｇのＤＩＰＰＭＰＯを２ｍＬの遠心管に計りとることにより調製した。この遠心管に、次いで、５５０μＬの組成物または水を加え、次いで５０μＬのＤ2Ｏを加えた。ＤＩＰＰＭＰＯを含まずに組成物を用いた溶液も調製した。これらの溶液をボルテックスし、分析のためにＮＭＲチューブに移した。質量分析のための試料は、約５ｍｇのＤＩＰＰＭＰＯを６００μＬの組成物に溶解してボルテックスし、次いで、バイアルに１００μＬの試料および９００μＬの水を加えてボルテックスすることにより試料を希釈することにより調製した。
【００８３】
ＮＭＲ実験は、ＱＮＰ極低温冷却プローブを備えた７００ＭＨｚ  Ｂｒｕｋｅｒ分光計を用いて行った。行った実験は、２８３．４ＭＨｚの31Ｐ周波数での３０°単パルスであった。２．５秒間のリサイクル遅延時間および１６３８４スキャンを用いた。リン酸を外部標準として用いた。全ての実験は、室温にて行った。
【００８４】
質量分析実験は、ＡＳＥＡ／ＤＩＰＰＭＰＯ試料をＷａｔｅｒｓ／Ｓｙｎａｐｔ飛行時間型質量分析計に直接注入することにより行った。試料を、ＬＣを迂回して、質量分析計に直接注入し、陽イオンモードおよび陰イオンモードの両方でモニタリングした。
【００８５】
31Ｐ  ＮＭＲスペクトルを、水中のＤＩＰＰＭＰＯ、組成物単独およびＤＩＰＰＭＰＯを加えた組成物について収集した。リン酸の外部参照を、化学シフト参照として用いた。図７は、組成物と組み合わせたＤＩＰＰＭＰＯの31Ｐ  ＮＭＲスペクトルを示す。２１．８ｐｐｍのピークは、ＤＩＰＰＭＰＯであると決定され、組成物を含むＤＩＰＰＭＰＯ（図７）および組成物を含まないＤＩＰＰＭＰＯ（図示せず）の両方のスペクトル中で見られる。２４．９ｐｐｍのピークは、他のＤＩＰＰＭＰＯ研究で決定されるようにＤＩＰＰＭＰＯ／ＯＨ・である可能性が最も高い。このピークは、組成物を含むＤＩＰＰＭＰＯ混合物および含まないＤＩＰＰＭＰＯ混合物の両方で見られうるが、組成物を含む溶液中でより高い濃度で検出される。組成物を含むＤＩＰＰＭＰＯ混合物中で、１７．９ｐｐｍにて別のピークがある。このピークは、ＯＯＨ・のような組成物中の別のラジカル種またはおそらく異なるラジカル複合体に由来する可能性がある。組成物／ＤＩＰＰＭＰＯ溶液中のスピントラップ複合体のおよその濃度は、以下のとおりである。
【００８６】
【表１】
2015530405.tif 000002
【００８７】
質量分析データを、未同定のラジカル種の組成を決定するための試みのために収集した。質量スペクトルは、図８で見られるように、２６４、２２２および１８０にてｍ／ｚピークを有する、ＤＩＰＰＭＰＯについての親ピークおよびフラグメンテーションパターンを示す。図８は、２８６、２４４および２０２ｍ／ｚにてＤＩＰＰＭＰＯ／Ｎａ付加物および後続のフラグメントについてのピークも示す。最後に、図８は、３２９のｍ／ｚを有する１つのＤＩＰＰＭＰＯ／ラジカル複合体についてのピークも証明する。陰イオンモード質量スペクトルも、対応するピークを３２７のｍ／ｚに有した。図８に示すように、より低い強度で３４９、３６７および３０２にてさらなるピークがある。これらのピークはいずれも、明確に確認できなかった。しかし、これらの質量パターンをもたらす可能性がある構造が存在する。３２９にて生じたピークについてのある可能性は、ＤＩＰＰＭＰＯと組み合わせたラジカルから形成される構造であり得る。このラジカル種の可能性は、空気からの窒素との反応の結果として飲料中で生成された可能性があるニトロキシル−過酸化物ラジカル（ＨＮＯ−ＨＯＯ・）を含む。３４９での別のピークも、ＤＩＰＰＭＰＯ／ラジカルの組み合わせの結果であり得る。ここで、このラジカルについての可能性は、次亜塩素酸−過酸化物（ＨＯＣｌ-ＨＯＯ・）である。しかし、このピークの強度が小さいことと、陰イオンモード質量スペクトル中の３４７での対応するピークの強度が小さいことは、これが非常に低濃度の不純物であり、ＡＳＥＡ組成物中に存在する化合物ではない可能性を示す。
【００８８】
ＩＣＰ／ＭＳ分析
試料を、Ａｇｉｌｅｎｔ７５００シリーズ誘導結合プラズマ質量分析計（ＩＣＰ−ＭＳ）で分析して、ＮＭＲにより決定された次亜塩素酸塩濃度を確認した。５％次亜塩素酸ナトリウムのストック溶液を用いて、脱イオンＭｉｌｌｉ−Ｑ水中の３００ｐｐｂ、１５０ｐｐｂ、７５ｐｐｂ、３７．５ｐｐｂ、１８．７５ｐｐｂ、９．３７５ｐｐｂ、４．６８７５ｐｐｂ、２．３４３７５ｐｐｂおよび１．１７１８７５ｐｐｂからなる一連の希釈物を調製した。これらの標準物質を用いて、標準曲線を確立した。
【００８９】
ＮＭＲ次亜塩素酸塩濃度データに基づいて、１６４．９８３５ｐｐｂ、８２．４９１７５ｐｐｂ、４１．２４５８７５ｐｐｂ、２０．６２２９３７ｐｐｂ、１０．３１１４６８ｐｐｂおよび５．１５５７３４ｐｐｂからなる一連の希釈物を調製した。これらの理論値を、次いで、ＩＣＰ−ＭＳ分析により決定した値と比較した。装置パラメータは、以下のとおりであった。
【００９０】
【表２】
2015530405.tif 000003
【００９１】
ＩＣＰ−ＭＳ分析の結果は、以下のとおりである。
【００９２】
【表３】
2015530405.tif 000004
【００９３】
希釈物を、ＩＣＰ−ＭＳシグナルと図において比較し、線形方程式にフィッティングさせた（Ｒ2＝０．９５２２）。ＩＣＰ−ＭＳシグナルが線形挙動すると仮定して、飲料中の次亜塩素酸塩の濃度は、３．０２ｐｐｔであると測定された。濃度の値は、初期の飲料の希釈物の濃度を算出し、初期の飲料の次亜塩素酸塩濃度が３ｐｐｔ（35Ｃｌ  ＮＭＲ分析から測定されるように）であると見積もることにより決定した。ＩＣＰ−ＭＳデータは、35Ｃｌ  ＮＭＲデータとよく相関し、およそ１／３％（３ｐｐｔ）の次亜塩素酸塩濃度を裏付けた。ＩＣＰ−ＭＳ分析は、溶液中の全塩素原子濃度を測定できるが、特定の塩素種ではないことに注意すべきである。ＮＭＲデータは、塩素が、主に飲料中にＣｌＯ-として存在することを示す。
【００９４】
気相四重極ＭＳ
試料調製
分析のために、３反復で３つの試料群を調製した：１）Ｍｉｌｌｉ−Ｑ脱イオン水、２）組成物および３）５％次亜塩素酸ナトリウム標準溶液。用いたバイアルは、磁気クリンプキャップを有する２０ｍＬヘッドスペースバイアル（ＧＥＲＳＴＥＬ）であった。各バイアル（ＶＷＲ）に小さい撹拌バーを、１０ｍＬの試料とともに入れた。バイアルに蓋をし、次いで、Ｂｒａｎｓｏｎモデル５５１０音波処理器に１時間、６０℃で供した。
【００９５】
音波処理器は、脱気するように設定され、このことにより、試料からのいずれの溶存気体もヘッドスペース中に放出させた。脱気の後に、試料を、加熱された撹拌機およびヘッドスペース注射器を備えたＣＴＣ  ＰＡＬオートサンプラーに載せた。撹拌機を７５０ｒｐｍおよび９５℃に設定し、注射器を７５℃に設定した。各バイアルを撹拌機に２０分間入れた後に、装置に注入した。バイアルから２．５ｍＬのヘッドスペース容量を回収し、装置に注入した。
【００９６】
装置パラメータ
用いた装置は、電子イオン化のために設定されたＡｇｉｌｅｎｔ５９７５Ｃ  ＥＩ／ＣＩシングル四重極質量選択検出器（ＭＳＤ）に接続されたＡｇｉｌｅｎｔ７８９０Ａ  ＧＣシステムであった。ＧＣオーブンは４０℃に設定し、前面注入口とトランスファーラインはそれぞれ１５０℃および１５５℃に設定した。用いたキャリアーガスは、ヘリウムであり、１５ＰＳＩの圧力に設定した。
【００９７】
ＭＳＤは、以下の分析物を検出するために単イオンモード（ＳＩＭ）に設定した。
【００９８】
【表４】
2015530405.tif 000005
【００９９】
イオン化源温度は２３０℃に設定し、四重極温度は１５０℃に設定した。電子エネルギーは１５Ｖに設定した。
【０１００】
質量分析データは、水、本組成物および次亜塩素酸塩溶液の気相ヘッドスペースの分析から得た。質量分析計から得た未処理の面積カウントを、窒素の面積カウントに標準化して、装置由来のシステム変動を排除した。窒素はヘッドスペースを占め、水は溶媒であるためにバイアル中に等しい容量で存在するので、窒素および水をともに標準物質として用いた。水および窒素の全体的な容量は、脱気の後に各試料について同じであると仮定した。この仮定が正しいためには、水に対する窒素の比は、各試料について同じでなければならない。５％のパーセント相対標準偏差（％ＲＳＤ）のカットオフ値を用いた。９つ全ての試料にわたって、４．２の％ＲＳＤが観察された。注目すべきことには、試料ＮａＣｌＯ-3は、孤立値であると見られ、よってこれを除外すると％ＲＳＤは３．４％に下落する。
【０１０１】
図９〜１１は、酸素／窒素、塩素／窒素およびオゾン／窒素の比を示す。本組成物から放出されたこれらの気体は、水または窒素のいずれかからよりも少なかったと見られる。オゾンおよび塩素の両方についてのシグナルは非常に弱かったことに注意すべきである。よって、これらのシグナルは、装置ノイズによるものであって、標的の分析に由来するものではない可能性がある。
【０１０２】
図１２は、窒素に対する二酸化炭素の比を示す。組成物から放出された二酸化炭素は、酸素よりも多かったと見られる。しかし、このことは、大気からのバックグラウンド汚染による可能性がある。
【０１０３】
上記のことに基づいて、本組成物からよりも多くの酸素が、水および次亜塩素酸ナトリウムから放出された。
【０１０４】
ＥＰＲ
２種の異なる組成物試料をＥＰＲ分析のために調製した。一方の試料は、何も加えない本組成物であった。他方の試料は、３１ｍｇのＤＩＰＰＭＰＯを２０ｍＬの本組成物（５．９ｍＭ）に加え、ボルテックスし、試料を終夜４℃の冷蔵庫に入れることにより調製した。両方の試料を小さい毛管に入れ、これを次いで分析のための通常の５ｍｍ  ＥＰＲチューブに挿入した。
【０１０５】
ＥＰＲ実験は、Ｂｒｕｋｅｒ  ＥＭＸ  １０／１２  ＥＰＲ分光計で行った。ＥＰＲ実験は、中心磁場３５００ガウスおよび掃引幅１００ガウスで９．８ＧＨｚにて行った。２０ｍＷのエネルギーパルスを、１００ｋＨｚの変調周波数および１Ｇの変調振幅とともに用いた。実験は、１００スキャンを用いた。全ての実験は、室温にて行った。
【０１０６】
ＥＰＲ分析は、溶液中にＤＩＰＰＭＰＯを混合したかまたは混合していない組成物に対して行った。図９は、組成物と混合したＤＩＰＰＭＰＯから生じたＥＰＲスペクトルを示す。組成物単独は、１００スキャンの後にＥＰＲシグナルを示さなかった（図示せず）。図１３は、自由電子についてのＥＰＲ分裂パターンを示す。この電子は、３つの異なる核により分裂すると見られる。このデータは、これが、ＤＭＰＯ（ＤＩＰＰＭＰＯと似ている）と相互作用するＯＨ・ラジカルの特徴的な分裂パターンであることを示す。このパターンは、ピークを３つの等しいピークに分裂する14Ｎと、そのパターンを２つの等しい三重項に分裂させる３結合離れた1Ｈにより説明できる。これらの分裂が同じであるならば、２つの真ん中のピークが外側のピークよりも２倍大きい四重項分裂を導く。このパターンは、図１３において２回、すなわち一方の四重項について３４５７および３４７１、ならびに他方の四重項について３５０４および３５１８でのより大きいピークとして見られる。この場合、14Ｎ分裂および1Ｈ分裂はともに、ＤＭＰＯと結合したＯＨ・ラジカルと同様に、ほぼ１４Ｇである。図１３中の２つの四重項パターンは、４７Ｇのさらなる分裂により創出される。この分裂は、31Ｐとのカップリングからの可能性が最も高く、同様のパターンは以前に見られた。図１３のＥＰＲスペクトルは、溶液中にＤＩＰＰＭＰＯ／ＯＨ・ラジカル種があることを示す。
【実施例３】
【０１０７】
運動しているマウスへの組成物の送達
マウスに８〜１０週間緑茶抽出物を補うことにより、対照マウスと比較して疲労困憊までのトレッドミル時間が増加したことが研究により示されている。より高い筋肉グリコーゲンおよび脂肪酸ベータ酸化の増加が、緑茶抽出物で処理した運動させたマウスで測定された。これらの研究に基づいて、疲労困憊までの時間、ＶＯ2maxなどのような身体的特性を増加できる他のサプリメントをさらに探索することが有用である可能性がある。
【０１０８】
マウスにおけるトレッドミル持久力、燃料基質利用、組織炎症および組織酸化ストレスに対する組成物（ＡＳＥＡ）摂取の効果を研究した。ＡＳＥＡが脂肪酸動員の増加を引き起こすならば、持久力は、ＡＳＥＡを摂取するマウスにおいて（プラセボと比較して）改善され得る。筋肉グリコーゲンの温存を、ＡＳＥＡを摂取する場合に見ることができる。マウスに、ヒトＡＳＥＡ用量の約半分に相当する量を与えた。
【０１０９】
６カ月齢の雄性特定病原体除去Ｃ５７ＢＬ／６実験用マウス（ｎ＝６０）は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。マウスを、図１４に示すように４つの処置群のそれぞれに無作為に割り当てた（それぞれｎ＝１５）。マウスの準備および研究の全体的な概要を図１５に示す。
【０１１０】
この特定の株およびモデルのマウスは、運動および栄養介入の両方の研究を伴う以前の研究で用いられた。よって、この株を用いることにより、他の研究からのデータとの比較が可能になった。マウスは、このタイプの研究についてヒトの適切な代用となり得る。なぜなら、マウスは、ヒトと遺伝子的に類似し、よってこの研究で得られるデータは、ヒト介入研究に解釈しなおすことができるからである。
【０１１１】
Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＣａｍｐｕｓにあるＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＬＡＳ）で行った全ての動物を用いる手順およびプロトコールは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によりレビューされ、承認された。
【０１１２】
ＡＳＥＡまたはプラセボ（独占権のあるシグナル伝達分子を加えない、ＡＳＥＡ組成物と同じ成分）を、マウスに、１日１回経管栄養により１週間投与した。研究の開始時の全てのマウスの平均体重および経管栄養に用いたＡＳＥＡの容量を決定したが、容量は、マウスあたり０．３ｍＬを超えなかった。経管栄養についての手引きは、以下のとおりである：「容量は、体重の１〜２％（＝２０ｇのマウスについて０．２〜０．４ｍＬ）を超えるべきでない」。よって、６カ月齢の３０ｇのマウスについて０．３ｍＬの容量は、この容量についての提案をかなり下回る。
【０１１３】
組成物は美味ではなく、マウスは自発的に組成物を飲まなかった。経管栄養は、単にマウスが本研究の組成物を飲まないことによりマウスが脱水状態とならないことを確実にするために許容される代替手段であった。経管栄養は、ＣＬＡＳでの畜産職員が行った。一実施形態では、マウスに、本明細書に記載するヒト１日用量と等価な量の本組成物を投与できる。
【０１１４】
１週間（７日間）の処理期間の後に、マウスを安楽死させ、結果測定のさらなる分析のために組織を採集した。４群のマウスについて、１日ずつずらして１週のプロトコールを開始した。例えば、群１が所定の日にプロトコールを開始したならば、群２はプロトコールを次の日に開始し、群３はさらに次の日に開始し、群４はその後に開始した。群１からのマウスを、次いで、最終のトレッドミル試験（処理７日目）の後に安楽死させ、群２、群３および群４はそれぞれ後続の日に安楽死させた。よって、マウスプロトコールのための合計時間は、１１日間であった。オリエンテーショントレッドミルの日と、最大トレッドミル試験および安楽死の日とはオーバーラップした。述べたように、安楽死の前に、群１および群３からのマウスは、以下の表にまとめるプロトコールを用いる疲労困憊までの持久力トレッドミル試験を受けた。
【０１１５】
【表５】
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【０１１６】
最大持久力試験に先立つ３日間の期間中、マウスをトレッドミルに１５分／日オリエンテーション（訓練）した。訓練日の速度は、それぞれ約１０ｍ／分、１５ｍ／分および１８ｍ／分であった。よって、処理の最終日に、マウスは、トレッドミルでの最大持久力試験を受けた。
【０１１７】
群２および群４からのマウスは、持久力試験に供さず、１週間処理の最後に安楽死させた。これらのマウスから採集した組織を回収して、運動介入がない場合の試験組成物の長期の影響を評価した。全ての血液／血漿および組織は、液体窒素中で瞬間凍結し、アッセイまで−８０℃にて貯蔵した。
【０１１８】
トレッドミルオリエンテーションおよび持久力プロトコールのために、後部にショックグリッドを備えたマルチレーンげっ歯類トレッドミル（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  ＯＨ）上でマウスを走らせた。各マウスをトレッドミルレーン中に一旦入れたら、１分間の休止期間を開始した。この時点で、マウスは、トレッドミルチャンバの内部に適合することができた。１分間の休止期間の後に、トレッドミルベルトを約１０ｍ／分の速度で開始し、その後は上記の表に記載するプロトコールに従った。
【０１１９】
マウスがもはやベルトについていけなくなり、後肢が約５秒間より長くショックグリッドにとどまるまで、マウスを走らせた。マウスがもはや走らない場合（５秒間より長く４本全ての肢がベルトから離れてショックグリッド上に坐ることにより評価される）、マウスをショックグリッドから直ちに移動させ、住みかのケージに戻した。次いで、オリエンテーション期間の後少なくとも約２０分間、回復についてマウスをモニタリングした。
【０１２０】
最大持久力試験は、マウスあたり１回だけ行い、試験の直後にマウスを安楽死させた。試験は、マウスが試験中のいずれの時点でもショックグリッドから離れてトレッドミル上で走ることができない場合、または疲労困憊の徴候（正常より上の心拍数および呼吸の徴候）が明らかであるならば、試験を終了した。
【０１２１】
用いた疲労困憊の徴候は、５秒間より長くマウスがショックグリッドに坐っていること、急速な呼吸、および／または心拍数の増加を含んだ。疲労していないマウスはこれらの徴候を示さず、停止してから５秒以内に走行を継続することが我々の経験からわかっている。これらの手順は、当該分野での研究に基づく国家推奨（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙのもの、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｂｏｏｋ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｘｅｒｃｉｓｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２００６）に従っている。試験中のいずれかの時点でマウスの足がショックグリッドとトレッドミルの間に捕捉されたならば、試験を直ちに終結した。マウスが負傷し、処置が必要であれば、適当な手順に従い、飼育職員に知らせた。マウスが負傷していないようであれば、回復させ、住みかのケージに戻し、次の日に再試験した。マウスがプロトコールを一旦完了したら、マウスを住みかのケージに戻した。全般的に、マウスは、持久力試験の後住みかのケージに再び戻した３０秒以内に通常に回復し、ケージの中を跳び回る。しかし、手順後２０〜６０分の間は数回マウスをモニタリングして、感情鈍麻または食物消費の減少のようないずれの異常についても記録を取った。
【０１２２】
特にオリエンテーション期間において、トレッドミル上でマウスを走らせるために何らかの形の動機づけが必要であった。様々な形の動機づけを用いることができる。３つの最も一般的な技術は、ショックグリッドの使用、空気吹きの使用およびマウスの尾を手で軽くたたくことである。空気吹きの使用は、効果がない可能性があり、データ分析を混乱させる可能性がある。このタイプの試験で用いる、トレッドミルが囲われた、標準的なげっ歯類トレッドミルに鑑みて、尾を手で軽くたたくことは理想的でなかった。よって、ショックグリッドは、トレッドミル上での運動への動機づけの最適な方法であった。
【０１２３】
ショックグリッドは、トレッドミルの後部に位置した。ショックグリッドは、１５０ボルトにて１．０ミリアンペアの平均電流のパルスショックを出力した（ショックグリッドは、０〜３．４ｍＡの範囲内で調整可能であった）。ショックグリッドは、確実に正しく機能するように、電流計を用いて定期的にチェックした。用いたショックレベルは、文献で許容されるものより２２倍小さかった。また、システムのアンペア数は、マウスにとっての致死レベルより１６７〜５００倍小さく、システムの全電力は、マウスにとっての致死レベルより６０倍小さかった。我々の提案する設定でのショックグリッドの使用が適切でないことを示唆する新しいデータまたはガイドラインは存在しなかった。
【０１２４】
同様の実験に基づいて、効果サイズは、１．６４７であると算出された。事前の検出力分析中の有意性としてｐ＝０．０１２５を用いて。Ｇ−Ｐｏｗｅｒを用いて以下の算出を行い、動物の最小有意数は１２個体／群と想定される。いずれかの動物がプロトコールを終えることができない場合の検出力の損失を埋め合わせるために、群あたり１５匹の動物を用いた（０．９５の推定検出力）。
【０１２５】
【表６】
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【０１２６】
マウス研究の結果に基づいて、結果を図１６〜２０に示す。図１６（ＡおよびＢ）は、ＡＳＥＡを投与されたマウスでは、疲労困憊までの走行時間が増加したことを示す。よって、ＡＳＥＡは、競技者が運動している場合の疲労困憊までの時間を増加させるために用いることができる。
【０１２７】
図１７Ａおよび１７Ｂは、異なるマウス群のＡＳＥＡに関する倍数変化を示す；Ｐ＝０．０４２。この測定は、１２ｓＲＮＡ（ミトコンドリアＤＮＡコピー数）を追跡する。坐位マウスでの１週間のＡＳＥＡ消費により、筋肉ミトコンドリア密度は増加しなかった。疲労困憊までの１回の長い持久力運動期間との間の相互作用が、ＡＳＥＡ対ＡＳＥＡ坐位で観察された（Ｐ＜０．０５）。倍数変化は、ＡＳＥＡが運動とともに送達された場合に増加したが、運動が存在しない場合に下落した。このことは、ＡＳＥＡが筋肉における酸化ストレスレベルの低下を助けたことを支持する。
【０１２８】
図１８は、肝臓で生成されたＳＯＤが、ＡＳＥＡを投与され、運動に供されたマウスにおいて減少することを示す。Ｕは、スーパーオキシドラジカルの５０％不均化を阻害するために必要な酵素の量である。短い期間の運動は、ＣｕＺｎＳＯＤ活性を活性化するが、ほとんどの研究は、そのｍＲＮＡおよび酵素タンパク質レベルに変化がないことを報告しており、このことは、活性の増加がＯ2-濃度の増加によるものであったことを示唆する。この結果は、運動と結びついたＡＳＥＡが、酸化ストレスを低減できることを示し得る。
【０１２９】
図１９Ａおよび１９Ｂは、酸化されたグルタチオンが、ＡＳＥＡを投与され、運動に供されたマウスにおいて減少することを示す。この結果は、運動と結びついたＡＳＥＡが、酸化ストレスを低減できることを示し得る。
【０１３０】
図２０は、運動が、ＩＬ−６およびＴＮＦ−アルファについてのｍＲＮＡ（遺伝子発現）を増加し、典型的な炎症誘発性応答を示したことを示す。ＡＳＥＡは、これらの炎症性サイトカインの遺伝子発現を低減する傾向にあった。
【実施例４】
【０１３１】
ヒト自転車こぎ運動研究
対象がＡＳＥＡ組成物を飲用する本システムおよび方法を用いて個体の代謝の増加を見積もるための研究を行った。研究は、Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃａｍｐｕｓ、Ｄａｖｉｄ  Ｈ．Ｍｕｒｄｏｃｋ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅおよびＡｐｐａｌａｃｈｉａｎ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙで行った。研究の目標は、補給に応答してシフトできる小分子（代謝産物）に対するＡＳＥＡの影響を測定することであった。栄養製品に依存する代謝産物のシフトは、炎症、酸化ストレスおよび生理的ストレスに対する効果を表し得る。
【０１３２】
２２名の対象が本研究に参加した。各対象を、ＶＯ2maxおよび体組成のベースライン値について試験した。次いで、１０名の参加者にＡＳＥＡ組成物を１日１回、７日間与え、１０名の対象にプラセボを１日１回、７日間与えた。
【０１３３】
研究の第１段階の日に、血液および尿を２２名全ての参加者から回収し、次いで、２２名の参加者はそれぞれ、自転車を７５ｋｍこいだ。７５ｋｍの自転車こぎを終了する直前およびその１時間後に血液および尿を回収した。結果を以下の表にする。
【０１３４】
参加者がＡＳＥＡ組成物を饗応しないウォッシュアウト期間を３週間経過した。３週間後に、参加者をクロスオーバーさせて、反対の組成物を７日間与えた。同じルーチンを再び行った（血液・尿、７５ｋｍの自転車こぎ、血液・尿、１時間後の血液・尿）。データを以下の表にする。
【０１３５】
７日間ＡＳＥＡを摂取した競技者は、高い血液遊離脂肪酸で７５ｋｍのサイクリング試験を開始し、脂肪酸化の増加およびアミノ酸（およびおそらく筋肉グリコーゲン）の節約が導かれた。
【実施例５】
【０１３６】
ヒト走行能力
７０％ＶＯ2maxに調整した速度で競技者がトレッドミル上を走行した場合に、本発明の組成物対プラセボの２週間にわたる摂取が、疲労困憊までの走行時間を改善するかを決定する研究。研究プロトコールのフローチャートを図２２に示す。
【０１３７】
血液および骨格筋生検試料を回収し、代謝産物およびグリコーゲン利用のシフトについてそれぞれ分析して、根底にある機構について研究する。
【０１３８】
代謝産物およびグリコーゲン利用は、本発明の組成物を運動とともに用いた場合に変化する。
【実施例６】
【０１３９】
過体重／肥満女性における疾患リスク因子変化に対するＡＳＥＡ摂取の効力
図２３のプロトコールに従う１２週間の無作為化試験を行う。本研究は、動脈の硬さ、炎症、コレステロール状態、血圧、酸化ストレスおよび酸化容量、空腹時血清中グルコースならびに代謝ホルモンに関連する疾患リスク因子を成人女性で改善する助けについて、１２週間の期間にわたるプラセボと比較した４ｆｌ  ｏｚ／日のＡＳＥＡの有効性を評価する。
【０１４０】
１２週間の期間にわたるＡＳＥＡの摂取は、動脈の硬さを低下させ、炎症を低下させ、コレステロール状態を改善し、血圧を低下させ、酸化ストレスおよび酸化容量を低下させ、空腹時血清中グルコースを低下させ、代謝ホルモンを変化させる。
【実施例７】
【０１４１】
運動競技能力に対する免疫支援サプリメントＡＳＥＡの効果
標準的なＶＯ2maxおよび換気性作業閾値（ＶＴ）運動競技持久力試験により測定される運動競技能力に対する免疫支援サプリメントの可能性のある効果を測定するために用いるパイロット研究について記載する。
【０１４２】
パイロット研究の目的は、（１）免疫支援サプリメントが運動競技能力に対して効果を有するとの全般的な観察結果を確認し、（２）運動の有酸素性および無酸素性の両方の段階中のこのサプリメントの経口摂取により影響される特定の生理的パラメータ、すなわち心拍数（ＨＲ）、Ｏ2摂取容量（ＶＯ2）、ＣＯ2排出容量（ＶＣＯ2）、呼気ガス容量（ＶＥ）、呼吸数（ＲＲ）、呼吸交換比（ＲＥＲ）、有酸素性作業閾値（ＡｅＴ）、無酸素性作業閾値（ＡＴ）、ＶＯ2maxおよび換気性作業閾値（ＶＴ）を決定することであった。
【０１４３】
免疫支援サプリメント、すなわち本発明の組成物は、細胞間の伝達チャネルの効率を増加し、免疫系および細胞治癒活動のより速い応答を可能にするといわれるレドックスシグナル伝達分子の均衡の取れた混合物を含有する。体内酵素も、これらのレドックスシグナル伝達分子を塩水および新生酸素に破壊する。運動競技能力に影響し得るレドックスシグナル伝達を伴う機構が２つ提案されている：（１）細胞の酸素吸収／利用効率の増加が有酸素代謝を延長する、および（２）より効率的な乳酸エネルギー貯蔵処理および組織修復機構が無酸素代謝を延長する。
【０１４４】
身体活動中、筋肉組織からの力の増加の要求は、利用可能なエネルギー貯蔵の代謝の増加を必要とする。糖の持続的な有酸素代謝は、血中に酸素および糖の適当な補充がある限り、このエネルギー要求を補充できる。筋肉組織に十分な酸素を送達する呼吸および循環器系の能力をエネルギー要求が超えると、炭水化物、クレアチン、ピルビン酸などの無酸素代謝を伴う方法が優勢になり始める。
【０１４５】
無酸素代謝は、エネルギーに対する超過の要求を補うが、ＣＯ2および乳酸の生成を伴う。長期にわたるまたは過剰な無酸素代謝は、利用可能なエネルギー貯蔵を、それらを新生するよりも速く消耗させる。ＣＯ2および乳酸の蓄積も有酸素代謝を妨げ、よって、エネルギー貯蔵が費やされれば、疲労困憊がもたらされる。
【０１４６】
無酸素代謝は、過剰のＣＯ2および乳酸生成を特徴とするので、運動中の過剰のＣＯ2排出または血中の乳酸の蓄積を測定することにより、これをモニタリングできる。換気性作業閾値（ＶＴ）は、呼気中に過剰のＣＯ2が最初に検出される点である。これは、無酸素代謝が優勢になり始める点と関連する。
【０１４７】
このパイロット研究では、ＶＴは、ＶＣＯ2対ＶＯ2グラフから図により決定した。ＶＣＯ2は、１分あたり排出されるＣＯ2の容量であり、ＶＯ2は、１分あたりのＯ２摂取容量である。ＶＯ2maxは、単純に、いずれかの所定の個体についての可能な１分あたりの最大Ｏ2摂取容量である。ＶＯ2maxは、ｍＬ／ｋｇ／分（１分あたり体重１キログラムあたりのＯ2のミリリットル）で測定される。ＶＯ2maxは、ＶＯ2曲線のピークにて測定される。有酸素性作業閾値（ＡｅＴ）は、ソフトウェアにより決定したが、脂肪燃焼代謝活動がいつ有酸素代謝により支配されるかを示す。無酸素性作業閾値（ＡＴ）も、ソフトウェアにより決定したが、無酸素代謝が完全に支配し始める点を示す。
【０１４８】
採用方法：標準的なＶＯ2max試験を、運動クラブに掲示した採用パンフレットおよび地域の競技トライアスロンチームに配った招待に応えた１８名の競技者に対して行った。参加者は、彼らが以下のことを肯定する適格性質問票からの回答に基づいて選択した。
１．平均で週に少なくとも５時間過酷な身体トレーニングを行う。
２．参加を妨げ得る医療状態を有さない。
３．食餌および水分補給の指示に従うことに同意する。
４．研究中、通常の日課だけを行う。
５．心臓の問題についての家族歴がない。
【０１４９】
最終的に選択された競技者は、採用パンフレットに示した期待よりもかなり高い度量の競技者であり、大多数の競技者は、定期的に運動競技会に参加している競技者であった。参加者は全て、研究前にこのサプリメントを摂取したことがなかった。
【０１５０】
参加者は、金銭的な報酬を受けなかったが、製品１ケースとＶＯ2max試験の結果を受けた。
【０１５１】
ＶＯ2max試験は、運動生理学の学位を有し、ＶＯ2試験を行う１０年を超える日常的な経験がある信任できる専門家が、運動クラブにて行った。参加者に、トレッドミルまたは固定式自転車のいずれで試験を行うか選択させた。ＣＡＲＤＩＯＣＯＡＣＨ（登録商標）代謝分析器は、心拍数（ＨＲ）、吸気ガスおよび呼気ガス（ＶＯ2、ＶＣＯ2、ＶＥ）を測定し、体重、身長、年齢および肥満度指数（ＢＭＩ）を記録した。トレッドミルまたは自転車での強度の設定は、毎分記録した。
【０１５２】
各参加者は、（１）ベースライン試験および（２）最終試験の２回のＶＯ2max試験を受けるように予定された。ベースライン試験は、初回のサプリメントを摂取する前に行った。参加者は、１日に４ｏｚ．のサプリメントを、ベースライン試験と最終試験（７〜１０日後）との間に飲用し、８ｏｚ．のサプリメントを最終試験開始１０分前に飲用した。ベースライン試験について、自転車またはトレッドミルの強度設定は、試験管理者が決定した。最終試験についての強度設定は、各参加者についてのベースライン試験の強度設定に厳密に一致させた。参加者を、彼らの通常の食餌および運動ルーチンを厳格に維持し、十分に水分補給（各試験の２時間前以内に少なくとも８ｏｚ．の水）して各試験に来るように奨励した。
【０１５３】
各参加者に呼吸マスクおよび心臓モニタを装着した。各ＶＯ2max試験は、管理者が決定した低強度設定にて参加者が歩行または自転車をこぐ１０分間のウォームアップ期間を含んだ。この後に、参加者の身体状態の評価に従って管理者が毎分強度設定を増加する立ち上げ期間と、ＲＥＲ（ＶＣＯ2／ＶＯ2）＞１．０になったときの最大ＶＯ2読み取りの兆しを管理者が発見したときまたは管理者の自由裁量での終結とが続いた。管理者は、この装置で一貫したＶＯ2maxの結果（過去５年間に約６％の試験間変動と見積もられる）を得るための十分な経験を有していた。
【０１５４】
未処理データ（ＨＲ、ＶＯ2、ＶＣＯ2、ＶＥ、強度設定）を、分析のためにＣＡＲＤＩＯＣＯＡＣＨ（登録商標）ソフトウェアから回収した。データ点は、ソフトウェアにより１５から２５秒間の呼吸間隔にわたって自動的に平均化され、ＶＯ2maxも、平均ＶＯ2ピーク法を用いてソフトウェアにより決定された。ＶＴは、ＶＣＯ2対ＶＯ2グラフの傾きから図により決定した。
【０１５５】
線形回帰法を用いて傾き、ＶＯ2の変化の間のＶＣＯ2の変化を決定した。理論的に、有酸素代謝が無酸素代謝に変わるときに、排出ＣＯ2容量（ＶＣＯ2）は、吸入Ｏ2容量（ＶＯ2）に比例して増加する。このことはＶＣＯ2対ＶＯ2グラフの傾きの増加に反映され、ＶＴ点の周囲のグラフの明確なよじれとして観察される。線形回帰を用いて、ＶＴの前後両方での傾きを決定した。傾きは、ＶＴを囲む点およびＶＯ2maxの付近の点を除くＶＴ点の前後のデータ点の直線領域の線形回帰により決定した。報告するＶＴ点は、前後の直線の交点を用いて決定した（図２４）。
【０１５６】
いずれの個別の参加者についてのＶＴ点を決定する方法も、ベースライン試験と最終試験とで一定とした。平均ＨＲは、開始の数分とデータセットの終了前の点を除く強度立ち上げ中のＨＲ増加の直線範囲で平均した。全ての場合において、各参加者についてベースライン試験について用いたのと同じデータ分析法を最終試験についても用いた。
【０１５７】
プロトコールの遵守は、遵守質問に対する回答によれば、参加者および管理者の両方で非常に高かった。１つのデータセットは、おそらくマスクが緩かったことによる低いＶＣＯ2の値のために廃棄した。この１名の参加者についての換気データは却下して、１７の有効データ換気データセットを残した。しかし、心拍数（ＨＲ）は、１８名全ての参加者について比較した。
【０１５８】
【表７】
2015530405.tif 000008
【０１５９】
全ての参加者（Ｎ＝１７）での平均ＶＯ2maxの読み取りは、６２．５ｍＬ／ｋｇ／分の比較的高い値で測定され、サンプル中の競技者の質を示した。４名の参加者だけが５５ｍＬ／ｋｇ／分を下回るＶＯ2max読み取りを有し、これら４名は、競争トレーニングプログラムに参加していなかった。
【０１６０】
データは、統計的な対応のあるｔ検定分析によれば生理的パラメータにおける２つの著しい変化が、本組成物の摂取を原因とし得ることを示す。ＶＯ2maxに到達するまでにかかる平均時間は、非常に高い信頼度（Ｐ＝０．００６）で１０％増加し、換気性作業閾値（ＶＴ）に到達するまでにかかる平均時間は、最低限度のレベルの信頼度（Ｐ＝０．０８）で１２％増加した。
【０１６１】
各参加者についてベースラインと最終試験との間の強度立ち上げ点が同一であったことに鑑みて、最終試験でＶＯ2maxおよびＶＴを得るための時間の増加は、そのような閾値でのより高い平均強度出力も示す。校正した強度出力測定を得ることはできなかった。しかし、最終試験の試験管理者は、最終試験についてのＶＯ2maxに参加者が達する前に、ベースライン試験について記録された最大の力に達する際の最大の力をたびたび超えた。
【０１６２】
その他全ての生理的パラメータ（ＶＯ2max、ＶＴ、ＡｅＴ、ＡＴ、開始時ＨＲ、ＡｅＴ時のＨＲ、ＡＴ時のＨＲ、ＶＯ2max時のＨＲおよび全体的な平均ＨＲ）は、サプリメント摂取により著しく変化しなかった。しかし、これらのパラメータについてのベースラインと最終試験との間の高いレベルの一貫性は、試験の再現性を支持する。テスト間の再現性は、全てのパラメータについて５％未満の推定標準偏差を有する。
【０１６３】
【表８】
2015530405.tif 000009
【０１６４】
研究での１７名の参加者のうち、７０％がＶＯ2maxまでの時間の著しい増加を経験し、参加者の１８％が２５％を超える増加を示し、４１％が１０％を超える増加を示し、参加者の１８％が著しい変化を示さず、１２％が穏やかな減少（１０％を下回る）を示した。
【０１６５】
「ＶＯ2maxまでの時間」の増加と「ＶＴまでの時間」の増加との間に中程度であるが有意な相関（相関係数０．３５）があり、このことは、ＶＯ2maxに達するまでの時間の増加が、ＶＴに達するまでにかかった時間の増加と中程度に比例するが常に比例するわけではなかったことを意味する。ＶＯ2maxまでの時間の増加と全体的な平均心拍数の減少との間に強い相関（相関係数−０．６７）があり、このことは、ＶＯ2maxまでの時間の増加が、全体的な平均心拍数の減少をほとんどの場合伴うことを意味する。
【０１６６】
試験サプリメント、すなわち本発明の組成物をＶＯ2max試験の前７〜１０日間および試験の直前に摂取することは、注意深く調節された同等の強度立ち上げ条件下でＶＯ2maxに達するまでに参加者の７０％がかかった時間の有意な増加を示した。ＶＴまでの時間も同様に有意に延長された。
【０１６７】
エネルギー増加の同様の要求下でのＶＴに達するまでの時間の延長は、エネルギーに対する要求が増加するにつれ有酸素段階の代謝が延長され、および／または無酸素段階がいくらか遅れたことを直接的に示す。
【０１６８】
生理的パラメータ（ＶＯ2max、ＶＴ、ＡｅＴ、ＡＴおよび関連する心拍数）に他に何らの変化もないことは、心血管容量、肺容量および血中酸素容量ならびに調節が影響を受けなかったことを示唆する。短期間のこの研究ではトレーニング効果の可能性が排除されていることに鑑みて、この仮定は理にかなっている。
【０１６９】
結果についての１つの可能性のある説明は、有酸素効率の増進にあり、同じ生理的状態にてより多くの有酸素エネルギーを抽出できるか、または乳酸もしくはＣＯ2のクリアランスがより効率的になり、これもまたより大きい有酸素効率を可能にすることを意味する。本研究では「ＡｅＴまでの時間」および「ＡＴまでの時間」を集めなかったが、これらのパラメータの変化が期待され、根底にある機構を決定するための手掛かりを与えたであろうことに注目されたい。
【０１７０】
このパイロット試験の結果は、運動競技能力増進を強く示す事例があり、さらなる調査が正当化されることを示す。換気および心拍数におけるより微妙な効果を、管理および校正された強度立ち上げ中の血中乳酸レベルの増加とともに測定するプラセボベースの二重盲検試験は、この効果についての弁護できる証拠と、この作用の根底にあるいくらかの具体的な機構についてのよりよい裏付けとを与えたと考えられる。
【実施例８】
【０１７１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性研究
生細胞と直接物理的に接触させた場合の本明細書に開示する組成物の生物活性を調査する、国立研究機関で行ったｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験からの様々な結果について記載する。具体的な調査は、マスター抗酸化物質であるグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）およびスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）の生細胞内部でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性および抗酸化物質の効率、ならびにヒト細胞での毒性応答および抗酸化物質生成を調節することが知られている２つのよく研究された転写因子（ＮＦ−ｋＢ、ＮＲＦ２）の移行を含む。濃度依存性についてのいくらかの予備研究も、ヒト細胞での誘導された酸化ストレスと関連するカウントである、細胞増殖とともに行った。
【０１７２】
調査の目的は、（１）ある種のレドックスシグナル伝達化合物であるＡＳＥＡの濃度の変動を生細胞との物理的接触にもたらした場合に、毒性のいずれかの徴候（ＮＦ−ｋＢ活性化）が現れるかを決定すること、（２）このような直接接触が、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）およびスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）の抗酸化効力に影響するかを決定すること、ならびに（３）このような接触が、ヒト内皮生細胞中の抗酸化物質の発現の増加に伴う移行性転写（ＮＲＦ２）を活性化するかを決定し、このような転写因子の発現をウェスタンブロット分析により検証すること、（４）ヒト細胞の増殖細胞数ならびに細胞生存性および健康についての関連するマーカー（ＬＤＨ）に対するこのレドックスシグナル伝達化合物の効果を決定すること、（５）サイトカイン（カケキシン）、放射線照射および血清飢餓でストレスを与えた細胞に対するこのレドックスシグナル伝達化合物の効果を決定することであった。
【０１７３】
免疫支援組成物は、ヒト細胞での様々な経路および受容体部位活性に関与するＲＸＮのレドックス均衡化混合物［活性酸素種（ＲＯＳ）および還元種（ＲＳ）の両方］を含有する。例えば、細胞が損傷を受けると、いずれの理由でも（例えば毒素、ＤＮＡ破壊または感染）、細胞内部の天然のレドックスシグナル伝達メッセンジャーが不均衡になり、ほとんどの場合、細胞内酸化体およびＲＯＳ（酸化ストレス）の蓄積として現れる。このような影響を受けた細胞は、正しいレドックスシグナル伝達恒常性および正しい細胞機能を回復することを目的として、防御および修復機構を活性化する。修復努力が成功せず、正常な恒常的レドックスバランスが回復できないならば、数時間以内に、このような細胞内の過剰の酸化体およびＲＯＳは、機能不全細胞を内部で消化して壊滅するためのアポトーシスプロセスを促進する。健常な近隣の細胞は、次いで、分裂してそれを置き換える。「レドックスシグナル伝達」とよばれる科学の完全な分野が、このようなプロセスを研究するために確立されており、事実上、何千という参考文献が利用可能である。
【０１７４】
不均衡になるかまたは孤立した場合に、曝露された生細胞中で即座の認識可能な毒性応答を誘発することは、ある種のレドックスシグナル伝達分子の性質である。過酸化水素は、このようなレドックスシグナル伝達分子の一例である。毒性物質に対する最前線の細胞応答は、炎症応答および他の防御機構の前駆体としてＮＦ−ｋＢを核に移行することを含む。核へのＮＦ−ｋＢの移動は、蛍光タグ分子の助けを用いて蛍光顕微鏡下で生細胞中において視覚的に追跡できる。ＮＦ−ｋＢの核移行の観察は、毒性応答が開始したことの確実なマーカーである。この汎用な方法を用いて、低レベルの毒性さえ検出可能である。低レベル濃度の過酸化水素は、例えば、容易に区別できる陽性の毒性応答を生じる。
【０１７５】
別の転写因子ＮＲＦ２は、低レベルの酸化ストレスに応答して核内に移動し、抗酸化物質の生成の増加を促進する。ここでもまた、蛍光タグの使用により、ＮＲＦ２の核移行を蛍光顕微鏡下で細胞内において見ることができる。ＮＲＦ２核移行は、保護酵素の生成ならびにグルタチオンペルオキシダーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼのような抗酸化物質の生成を増加させることが知られている第二選択の防御機構である。ＮＲＦ２の移行は、低レベルのＮＦ−ｋＢの活性化を頻繁に伴い、ＮＦ−ｋＢの活性化は、（ほぼ）常に、ＮＲＦ２の移行より前に起こる。微量のホメオパシー毒素のような低レベルの毒性を示す物質は、これらの天然の防御−修復−置き換え機構を刺激するために、ＮＲＦ２経路を活性化するために長く用いられている。
【０１７６】
グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）およびスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）のような抗酸化物質の酵素としての効力は、生細胞を所定の期間試験物質に曝露した後に細胞溶解物中に導入されたある種の酸化体の時間と関連する低減を測定する標準化されたＥＬＩＳＡ試験により決定できる。ＥＬＩＳＡ試験の試薬は、試験物質に干渉または試験物質と相互作用しないように選択しなければならない。曝露時間および濃度依存性のような他の重要な因子は、実験により決定しなければならない。
【０１７７】
ウェスタンブロット法も、細胞溶解物中のＧＰｘまたはＳＯＤの量を実験により決定するために存在する。これらのよく確立された分子分離技術は、このような抗酸化酵素の量が試料中で増加したかを直接検証するために用いることができる。測定された抗酸化物質の効率は、しかし、依然として細胞の抗酸化防御を最もよく示す。
【０１７８】
細胞増殖、細胞数および細胞死の化学的指標をモニタリングすることも、細胞生存性ならびに放射線照射、サイトカインおよび毒素のようなストレス因子に対する全体的な応答を決定するために一般的に用いられる。例えばカケキシンは、曝露された細胞での即座の毒性応答および酸化ストレスの蓄積を誘発する効力のある毒素、サイトカインである。このようにストレスを与えられた細胞は、アポトーシスを経て死ぬ傾向がより大きく、そのことにより、内在タンパク質（例えばＬＤＨ）を周囲血清に放出する。
【０１７９】
通常、このようなストレス因子および毒素の導入が細胞培養物において酸化ストレス状態を誘発する場合、細胞数は下落し、細胞増殖は静まり、血清ＬＤＨレベルは上昇し、細胞死が培養物中で起こっていることを示す。過酸化水素、放射線照射および血清飢餓も、同様の応答を誘発できる。上で概説したレドックスシグナル伝達メッセンジャーは、このようなストレス因子の細胞での受容およびこのようなストレス因子に対する応答に密接に関与する。レドックスメッセンジャーは、抗酸化物質生成および細胞を保護する作用の媒介、ＤＮＡおよび構造の損傷を修理するために必要な修復機構、ならびに細胞死をもたらすアポトーシスプロセスの媒介にも関与する。
【０１８０】
血清中でこのようなレドックスメッセンジャーの濃度の増加は、これらの通常の細胞プロセスの効率を増強する役に立つことがある。様々なレドックスシグナル伝達混合物の厳密な作用は、実験的に決定しなければならない。質量分析、蛍光分光法および電子スピン共鳴を伴う独立した発表されていない研究は、間違いなく、本明細書に記載する組成物中に数種のレドックスシグナル伝達分子が存在することを検証した。よく確立されたレドックス電気化学も、このようなレドックスシグナル伝達分子の存在を確認する。このレドックス均衡化混合物の安定性は、期待するよりも何桁も大きい。このサプリメント中の不安定部分の確認された保存は、ある種の安定分子複合体（これらのいくつかは、ラジカル相互作用を遮蔽できる質量分析により検証された）の存在により説明できる。しかし、知的財産上の契約により、詳細は開示できない。
【０１８１】
以下の研究を、国立の実験室にて上級研究員により最大限の努力をする方針の下で行われたが、この研究は、本発明の組成物をヒト細胞と直接接触させた場合の基本的な作用機序を評価するために設計されている。
【０１８２】
１．ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究のために計画した初期用量範囲は、ヒト試験からの１０ｍＬの本発明の組成物／ｋｇと等価な経口用量から外挿した。
【０１８３】
２．グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）およびスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）ＥＬＩＳＡを用いて、本発明の組成物がネズミ上皮（ＪＢ６）細胞での酵素活性を変化させるかを決定した。
【０１８４】
３．ＬＤＨ（非特異的細胞死）レベルおよび細胞増殖速度を、本発明の組成物に曝露した様々な細胞型について決定した。
【０１８５】
４．ヒト毛細血管内皮肺細胞（ＨＭＶＥＣ−Ｌ）を、本発明の組成物で処理し、細胞溶解物を、ＧＳＨ−ＰｘおよびＳＯＤ  ＥＬＩＳＡにより分析して、抗酸化酵素活性が変化するかを決定した。
【０１８６】
５．ＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞を、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）陰性対照、５％および２０％濃度の本発明の組成物ならびにカケキシン陽性対照で処理して、ＮＦ−ｋＢ（サイトカイン転写）のｐ６５サブユニットの核移行活性を、３０、６０、９０および１２０分の間隔にて決定した。蛍光顕微鏡技術を採用して、細胞応答を撮像した。
【０１８７】
６．Ｐ−Ｊｕｎの核移行活性をステップ４の拡張／検証として決定した以外はステップ（４）を反復した。
【０１８８】
７．ＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞の２つの培養物（一方は通常の無作為細胞周期のもの、他方は血清飢餓させたもの）を、＜１％の低濃度の本発明の組成物で処理して、ＮＲＦ２（抗酸化物質転写）の核活性を３０、６０、９０および１２０分の間隔で決定して、陰性（ＰＢＳ）対照と比較した。
【０１８９】
８．ウェスタンブロット分析を、分画遠心法により分離した、＜１％の本発明の組成物に曝露した血清飢餓ＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞培養物の核外および核内画分に対して行い、過酸化水素陽性対照と比較して、リン酸化事象（酸化体の作用）を核外画分において決定し、ＮＲＦ２（抗酸化物質転写）を核内画分において、０、３０、６０、９０および１２０分の間隔にて決定した。
【０１９０】
９．通常の無作為細胞段階のＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞を放射線照射に曝露し、次いで、本発明の組成物で処理した。細胞数をカウントして、生き残りを決定した。
【０１９１】
１０．カケキシン、ＰＢＳおよび本発明の組成物溶液の様々な混合物に曝露した細胞での細胞外および細胞内ＬＤＨ活性の変化により、集密段階および通常段階のＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞におけるカケキシン受容の効力を決定した。
【０１９２】
初代ヒト肺毛細血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ−Ｌ）での毒性応答を評価するために用いた実験方法：ＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞（カタログ＃ＣＣ−２５２７）は、Ｌｏｎｚａ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から、極低温保存細胞（Ｌｏｔ＃７Ｆ４２７３）として購入した。細胞を融解し、製造業者の指示に従って維持した。細胞培養培地（Ｌｏｎｚａにより提供される特許権のある処方）は、上皮増殖因子、ヒドロコルチゾン、ＧＡ−１０００、胎児ウシ血清、血管作動性内皮増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、インスリン増殖因子−１およびアスコルビン酸を含有した。
【０１９３】
通常の無作為細胞周期でのＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞培養物を、５％および２０％の濃度の、血清培地中の高濃度のＡＳＥＡに曝露し、非毒性陰性対照としてのリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）および陽性対照（毒性が高い）としてのカケキシン（５ｎｇ／ｍＬ）に曝露した培養物とともに分析した。０、３０、６０、９０および１２０分の間隔にて、各培養物からの細胞のアリコートを蛍光顕微鏡下に置き、ＮＦ−ｋＢのｐ６５サブユニットにタグ付加するように設計された蛍光色素により染色するとともに、コンピュータソフトウェアが核を発見する助けとなるＤＡＰＩ蛍光核染色を行った。コンピュータ自動化イメージング技術を用いて、いくつかの細胞にわたる蛍光分析により、核内へのＮＦ−ｋＢ移行の相対的程度を決定した。読者に思い出させるために、Ｐ６５  ＮＦ−ｋＢ移行は、毒性に対する第一段階の非特異的細胞性応答である。よって、顕微鏡画像において視覚的に観察される核へのＮＦ−ｋＢの移動は、全般的な毒性応答の感度の高い指標である。
【０１９４】
毒性についてのＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞ｐ６５サブユニットＮＦ−ｋＢスクリーニングの結果：典型的な細胞画像を、各培養物について以下に示す。ＮＦ−ｋＢのｐ６５サブユニットの核への移行は、高濃度の本発明の組成物に曝露したいずれの細胞培養物でも見られなかった。自動化分析によりこのことが確認され、０、３０、９０および１２０分にて毒性応答は示されなかった。対照的に、カケキシン曝露細胞は、即座の持続性の毒性応答を示した（図２５）。
【０１９５】
カケキシンは、陽性対照であり、ＮＦ−ｋＢのｐ６５サブユニットのサイトソルから核への移行を誘導する。ＤＡＰＩ染色は、これらの画像中の核の位置を示す（白色の矢印を参照されたい）。本発明の組成物（最終５および２０％ｖ／ｖ）は、３０、６０および１２０分の時点にてＮＦ−ｋＢの核移行を誘導しなかった。
【０１９６】
高濃度のＡＳＥＡへの曝露の後に毒性がないことが示されたことに鑑みて、別の試験を行って挙動を確認した。
【０１９７】
ＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞（Ｐ−Ｊｕｎ）の毒性応答を評価するためのさらなる方法：ＮＦ−ｋＢで採用したものと同様の方法論を採用して、抗ホスホＪｕｎ（ＡＰ−１  Ｐ−Ｊｕｎ）抗体インデックス（Ｐ−Ｊｕｎは、別の毒性関連レドックス応答性転写因子である）の核移行を決定した。ＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞を、ここでもまた、高濃度のＡＳＥＡに曝露した。Ｐ−Ｊｕｎ蛍光指示薬での置換と、感度を高めるために１００細胞について自動化測定を行ったこと以外は、全ての手順はＮＦ−ｋＢ分析と同様であった。さらにナイーブ（手をつけていない）培養物も分析した。
【０１９８】
毒性についてのＰ−Ｊｕｎスクリーニングの結果（図２６）：ＡＰ−１インデックスは、抗ホスホＪｕｎ（Ｐ−Ｊｕｎ）抗体を用いて決定した。ＡＰ−１は、核に局在しており、活性化によりＰ−Ｊｕｎのリン酸化状態が増加する。抗Ｐ−Ｊｕｎ抗体は、リン酸化形と結合し、蛍光強度の増加に反映される（カケキシン対照を参照されたい）。Ｐ−Ｊｕｎレベルの増加を反映する一貫した傾向は、５％または２０％のＡＳＥＡで処理した細胞について３０、６０および１２０分の時点にて観察されなかったが、カケキシン陽性対照では、核Ｐ−Ｊｕｎレベルが３０分にて著しく増加した。
【０１９９】
ここでもまた毒性応答は観察されなかった。高濃度の本発明の組成物に曝露した細胞培養物の核ではＰ−Ｊｕｎの著しい蓄積はなかった。自動化分析は、０、３０、９０および１２０分にて毒性応答を示さず、３０分の時点にて２０％の本発明の組成物についてわずかであるが著しくない増加を示した。他の時点では増加は検出されなかった。対照的に、カケキシン曝露細胞（陽性対照）は、期待されたように、即座の持続性の毒性応答を示した。
【０２００】
Ｐ−Ｊｕｎ分析の結果は、ＮＦ−ｋＢ分析で見られた応答と一致した。両方の試験では、健常無作為段階ＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞について本発明の組成物への曝露とＰＢＳ陰性対照への曝露との間に著しい差はなかった。混合物から単離されるとこれらのいくつかのものは即座の応答を誘発することが知られていることを考えると、この確認された毒性の欠如は、レドックスシグナル伝達分子のこの混合物についていくらか予期できないことであった。
【０２０１】
ＮＦ−ｋＢおよびＰ−Ｊｕｎの核移行は、典型的に、血清毒性に対する最初の応答因子であり、特に超敏感なヒト内皮細胞において炎症応答を開始することが知られているので、健常ヒト細胞は、本発明の組成物に直接曝露した場合に、防御挙動を示すことも炎症プロセス（例えば炎症性サイトカインの放出）を開始することも期待されない。このデータからは、曝露が炎症プロセスを抑制するかまたは反転させるかは明らかでない。
【０２０２】
このようなレドックスシグナル伝達分子の血清レベルは、全てのｉｎ  ｖｉｖｏ経口用途について、１％の血清濃度を超えず、典型的に０．１％未満である。血清レベルは、成分が酵素により分解されることにより経時的に下落すると期待される。独立したｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態研究は、ＡＳＥＡ中の有効成分が、血液中でおよそ１７分間の半減期を有し、よって、数時間以内に血中から効率的に消滅し得ることを示す。よって、このようなレベルにて健常ヒト細胞に曝露することにより毒性応答は期待されない。これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究では、ヒト細胞を２０％までの血清濃度に直接曝露しても、まだ良好な耐容性が見られることが示されている。ＰＢＳ対照に匹敵する毒性の完全な欠如は、非常に稀であり、この混合物の反応性にもかかわらず、ヒト組織はこの混合物によく耐容性があり、この混合物は細胞外環境にとって自然であるかまたは調和的であることを示す。
【０２０３】
グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）の抗酸化効力を決定するために用いた実験方法：標準的なネズミ上皮細胞（ＪＢ６）の細胞培養物を、様々な低濃度の本発明の組成物（１％未満）およびＰＢＳ溶液に２４時間曝露した。細胞溶解物を、市販のＥＬＩＳＡキット（ＧＰｘ活性キット、Ｃａｔ＃９００−１５８）を製造業者（Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）の指示に従って用いることでＧＰｘ酵素活性を測定するために調製した。ＧＰｘ酵素活性による酸化体の減少を、化学物質（クメンヒドロペルオキシド）が反応を開始した後１１分間の期間にわたってモニタリングした。酸化体の減少は、抗酸化効力の指標である。様々な濃度のＰＢＳまたは本発明の組成物のＧＰｘ効力を決定するために、試料中に残存する酸化体の３つの反復を２分ごとに読み取って、１分あたりの相対的蛍光単位（ＲＦＵ）（残存酸化体）の減少を示す傾きを得た。
【０２０４】
ＧＰｘ抗酸化効力試験の結果および所見：活性化の後に、以下のグラフ（縦軸にＲＦＵ単位）において見られるように、経時的な酸化体の低減はほぼ直線的であった。明確な傾きが、１１分間の間隔にわたって確立された（図２７）。抗酸化活性を、経時的な酸化体の低減により測定する（図２８）。
【０２０５】
ＰＢＳ対照（２番目のグラフ）と比較して、抗酸化活性の著しい増加が、ＡＳＥＡを注入した試料において見られた。
【０２０６】
濃度依存性は、しかし、５ｕｌ、１０ｕｌおよび２０ｕｌの注入の間で見られなかった。このことは、ＧＰｘ抗酸化活性が、５ｕｌ注入で示される濃度より低い濃度で飽和し得ることを示唆する。このような考察については後述する。
【０２０７】
以下の表は、先行するグラフに示すデータをまとめたものである。
【０２０８】
【表９】
2015530405.tif 000010
【０２０９】
未処理データは、ＡＳＥＡの注入に関連して抗酸化活性が１０倍より大きく増加することを見せる。実験的な不確実性を考慮しても、本発明の組成物を低濃度（＜１％）で血清に注入することが少なくとも８００％抗酸化効率を増加させたことは９８％確かである。この増加を確認し、これらの低レベルの血清濃度についての濃度依存性を探求するためにさらなる調査を行うべきである。
【０２１０】
スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）の抗酸化効力を決定するために用いた実験方法：ヒトＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞を、１０％リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ；ビヒクル対照）、５％または１０％の本発明の組成物で２４時間処理し、その時点で細胞溶解物を、市販のキット（ＳＯＤ活性、ｃａｔ＃９００−１５７）を用いて、製造業者（Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）の指示に従い、ＳＯＤ活性を測定するために調製した。細胞培養培地を、並行してＳＯＤ活性についてアッセイした。より低い濃度の本発明の組成物＜１％およびネズミ上皮細胞を用いる限定された試験も試みた。
【０２１１】
高血清濃度の本発明の組成物についてのＳＯＤ活性を決定するための最初の試みの方法の結果：希釈可溶化液は、本発明の組成物での処理と関連して、酵素活性のわずかな増加を示した。酵素活性の変化は、５〜１０％の本発明の組成物（最終濃度、ｖ／ｖ）の初期の範囲においてわずかであった。データは、本発明の組成物で処理した初代ＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞を用いてＳＯＤ活性を測定する最初の試みを表す。５〜１０％の本発明の組成物と関連するＳＯＤ活性の欠如が、高用量での非特異的阻害と関連し得ることが考えられる。主な懸念は、我々が初代ヒトＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞モデルについてほとんど理解しておらず、これらの細胞が本発明の組成物により誘導される抗酸化防御調節を調査するために最適であるのか決定できないことである。例えば、本発明の組成物Ａ中のある種のレドックスシグナル伝達複合体を破壊することが知られているアスコルビン酸は、培地中に補充され、培地組成のいくらかの改変（例えば経験的に規定される短い期間のアスコルビン酸の無添加）が本発明の組成物により調節される抗酸化防御を検出するためのより最適な条件を生じる可能性がある。モデルの感度を増加して最適化するためのあるアプローチとしてこれらの細胞を血清飢餓させる初期の努力は、成功せず、２４時間にわたって広く細胞死をもたらした。このことは、細胞が、細胞生存性を維持するために、細胞培養培地に補充された増殖因子に依存性することを示す。本発明の組成物の初期の濃度（５〜１０％）が高い（培地の酵素活性および細胞増殖の阻害に基づいて）と我々が解釈するならば、ここで観察された細胞溶解物と関連する酵素活性のわずかな増加は、より低い濃度で生じる可能性のある抗酸化防御調節を正確に反映していないのかもしれない。よく規定され堅牢なＮＲＦ２調節抗酸化防御応答とともにｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル系を用いることは、これらの不確実性のいくらかに対処する助けとなると考えられる。振り返ると、我々は、より低い濃度の本発明の組成物（１％）がＮＲＦ２転写因子の核移行を誘導することを観察した。さらに、転写調節を捕捉するｉｎ  ｖｉｔｒｏ調査のための一般的な時点として、２４時間の時点を初期スクリーニングのために選択したが、この時点は最適でなかった。
【０２１２】
低濃度の本発明の組成物（＜１％）でのＳＯＤ酵素活性についてのさらなる調査の結果：別の調査において、ＮＲＦ２核移行が（データおよび結果は、以下の節にある）、低用量の本発明の組成物（１％未満）にて生じ、曝露後約３０から１２０分にＳＯＤ抗酸化活性のピークを誘発したことが見出された。よって、低濃度の本発明の組成物への曝露によるＳＯＤ抗酸化活性を３０から１２０分の時点で測定すると、９０から１２０分の時点にて、ＧＰｘ酵素活性と同様の結果が、ネズミ上皮（ＪＢ６）細胞および血清飢餓ＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞の両方に見られた。ピーク時のＳＯＤ酵素活性の５００％の増加が、９５％の信頼度で、１２０分という短い期間において見積もられた。
【０２１３】
ＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞におけるＮＲＦ２の核移行を決定するために用いた実験方法およびウェスタンブロットによる検証：ＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞を、再度融解し、製造業者の指示に従って維持した。培養培地は、無作為周期培養物において、上皮増殖因子、ヒドロコルチゾン、ＧＡ−１０００、胎児ウシ血清、血管作動性内皮増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、インスリン増殖因子−１およびアスコルビン酸を含有した。アスコルビン酸は、血清飢餓培養物では用いなかった。
【０２１４】
通常の無作為細胞周期および血清飢餓の両方でのＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞培養物を、血清培地中の高濃度（５〜２０％）および低濃度（１％）のＡＳＥＡに曝露し、陰性対照としてリン酸塩緩衝塩水溶液（ＰＢＳ）だけに曝露した培養物とともに分析した。３０、６０、９０および１２０分の時点にて、各培養物からのアリコートの細胞を蛍光顕微鏡下に置き、ＮＲＦ２転写因子にタグ付加するように設計された蛍光色素により染色するとともに、コンピュータソフトウェアが核を発見する助けとなるＤＡＰＩ蛍光核染色を行った。コンピュータ自動化イメージング技術を用いて、いくつかの細胞にわたる蛍光分析により、ＮＲＦ２の核蓄積の相対的程度を決定した。ＮＲＦ２は、いくつもの第ＩＩ相抗酸化防御酵素の転写を調節し、グルタチオントランスフェラーゼのようなさらなる抗酸化防御酵素がＡＳＥＡへの曝露により発現される可能性を上昇させる。よって、顕微鏡画像において視覚的に観察される核内のＮＲＦ２の蓄積は、細胞での抗酸化物質発現の増加の指標である。
【０２１５】
ＮＲＦ２のＨＭＶＥＣ−Ｌ核蓄積の結果：ヒト内皮細胞の初期スクリーニングは、細胞の部分集団が、高濃度の本発明の組成物での処理の後に、核染色パターン（焦点）の増加を示したことを示唆する。核の位置は、下のパネルにＤＡＰＩ染色により示される。本発明の組成物で刺激した細胞において焦点はより明るいようであり、このことは、核においてＮＲＦ２転写因子のレベルがより高いことを示す。Ｈ2Ｏ2は、陽性対照として用いた。この効果は、核染色パターンに基づいて定量することは困難であった（図２９）。
【０２１６】
典型的な細胞画像を、低濃度の本発明の組成物に曝露した、記載する細胞培養物について以下に示す。核内でのＮＲＦ２の蓄積は、低濃度の本発明の組成物に曝露した血清飢餓細胞培養物において明確に見られた。自動化分析は、３０および６０分の時点において、血清飢餓細胞が陰性対照と比べて、強い時間依存性をもってＮＲＦ２を核に蓄積することを明らかにした（図３０）。
【０２１７】
核染色プロファイルは、最適成長培地で維持した細胞（無作為周期群）とは質的に異なっていた。３０、６０および１２０分の時点にて、これらの細胞において本発明の組成物に曝露することにより誘導されるＮＲＦ２の弱い質的な核蓄積があったが、効果は、血清飢餓培養物におけるほど明白ではなかった。しかし、血清飢餓は、著しい細胞死を誘導し、データの解釈を複雑にしている。傾向は弱いと見られ、ウェスタンブロットによる確認を必要とした。
【０２１８】
ＮＲＦ２核蓄積のウェスタンブロットによる確認のための実験方法：ＨＭＶＥＣ−Ｌを、１％の本発明の組成物で処理し、核抽出物を、核外サイトソルから３０、６０および１２０分にて遠心分画により分離し、ＮＲＦ２についてのウェスタンブロット分析に供した。ウェスタンブロット実験では、抗リン酸化セリン、トレオニンおよびチロシン抗体の組み合わせを用いて核外画分をリン酸化タンパク質について調べた。事実上全ての細胞プロセスは、翻訳後修飾により調節され、タンパク質リン酸化は、広く見られる機構である。タンパク質リン酸化の観察可能な変化は、本発明の組成物により混乱させられる細胞プロセスの機構の理解を導き、本発明の組成物によるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞機能の用量依存的な調節をよりよく定義するための明確な評価項目をもたらし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ−ｉｎ  ｖｉｖｏ相関を得るために用いることのできる分子マーカー候補をもたらしうる。過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）は、酸化的損傷についての陽性対照として含めた。
【０２１９】
ＮＲＦ２核蓄積のウェスタンブロット確認の結果：ＮＲＦ２レベルは、１％ＡＳＥＡで処理したＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞から調製した核抽出物において時間依存的な様式で増加した。Ｈ2Ｏ2（３０分）は、核ＮＲＦ２レベルを増加しなかった。対照的に、タンパク質リン酸化を核外画分（分画遠心により核から分離）において調べた場合に、我々は、ウェスタンブロット分析により単一バンドを観察し、このことは、細胞分画プロセス中の核外画分の希釈による（他のリン酸化タンパク質は、明らかに存在するが、これらの条件下での検出限界未満である）、または用いた抗リン酸化抗体の特異性が広い範囲のリン酸化タンパク質を検出するために不十分であったためである、可能性がある。しかし、我々は、Ｈ2Ｏ2処理の後に検出されるタンパク質のリン酸化の著しい増加を観察し、このことは、このリン酸化事象が、酸化的損傷に続くレドックス調節またはタンパク質キナーゼの活性化／タンパク質ホスファターゼ活性の不活性化に対する感受性が高いことを示した。細胞を１％の本発明の組成物で処理することにより、このタンパク質と関連するリン酸化レベルが、時間依存的な様式で減少した（図３１）。
【０２２０】
核外画分でのリン酸化タンパク質調節の低減は、核画分での時間依存性の強いＮＲＦ２蓄積とともに見られ、このことは、抗酸化物質発現の明確な時間依存性のアップレギュレーションを示した。
【０２２１】
この点で、ＮＲＦ２活性が、通常の事前のＮＦ−ｋＢ活性なしでの低濃度の本発明の組成物への曝露に伴って明確に検出されたことに言及する価値がある。このことは、第ＩＩ相抗酸化防御機構が、通常の事前の第Ｉ相毒性応答なしで刺激されたことを示唆する。この挙動は、前例がないか、または極めて稀である。このデータから、本発明の組成物は、事前の低レベルの第Ｉ相毒性応答を全く誘発することなく抗酸化物質発現を刺激できると見られる。
【０２２２】
ＡＳＥＡへの曝露によるネズミ（ＪＢ６）細胞およびＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞の増殖ならびにＬＤＨ活性を決定するための実験方法：ＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞を、５〜２０％のＡＳＥＡで７２時間処理し、細胞数を、コールターカウンタを用いて決定した。対照（０濃度群）は、２０％ＰＢＳで処理した。血清ＬＤＨレベルも、０から２０％の濃度の本発明の組成物／血清濃度での細胞培養物生存性の指標として測定した。より低い血清ＬＤＨ濃度は、より少ない細胞膜不全を示すことを思い起こされたい。同様の実験を、ネズミ（ＪＢ６）上皮細胞について行った。
【０２２３】
ネズミおよびＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞の増殖ならびにＬＤＨ活性の結果（図４１、４２）：初期のｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングは、血清中の高濃度の本発明の組成物が細胞増殖を（ネズミ上皮細胞［ＪＢ６］および初代ヒト肺毛細血管内皮細胞［ＨＭＶＥＣ−Ｌ］の両方について）５〜２０％の濃度範囲において阻害し得ることを示す。この濃度範囲では、我々は、ＬＤＨ酵素活性の直接的な阻害も観察した。このデータは、細胞数の減少は細胞死を示すが、より低い血清ＬＤＨレベルはより高い細胞膜完全性を示すので、いくらか矛盾する。試験した最高濃度（２０％ｖ／ｖ）にて、細胞増殖は、およそ２０％阻害された。
【０２２４】
増殖の低減の背後にある機構を推断することはできず、この機構は、増殖因子応答性の干渉または損傷細胞についてのプログラムされた細胞死（アポトーシス応答）の増進のような他の可能性のある解釈と関連し得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素増進研究について高い血清濃度の本発明の組成物は最適でなく、初期のスクリーニングが、本発明の組成物による抗酸化防御（ＳＯＤ）調節を過小評価したかまたは見過ごしさえし、よって、低濃度（＜１％）の本発明の組成物および／または短い曝露時間をこのような目的のために採用すべきであることを示す可能性があることは注目すべきことである。
【０２２５】
さらなる研究を行って、本発明の組成物；様々な化学的および環境的ストレス因子によるストレスの供給源に曝露することによるストレスを受けた細胞の作用を調査した。これらの調査は、可能性のある機構についての手掛かりを与える。
【０２２６】
カケキシンストレス因子および高濃度の本発明の組成物の様々な混合物に曝露したＨＭＶＥＣ−Ｌの細胞生存性を決定するための実験方法：通常の無作為細胞周期でのＨＭＶＥＣ−Ｌ培養物（ｐＳ）および集密に近づいている培養物（Ａ２）（これらは、一般的に、カケキシンに対する感受性がより低い）に、濃度を漸増させながらカケキシンストレス因子（０〜５ｎｇ／ｍＬ）を注入した。これらの培養物を、１０％ＰＢＳ対照または５〜１０％濃度の本発明の組成物のいずれかで２４時間前処理した。細胞生存性について２つの指標を採用した。血清ＬＤＨレベルは、膜完全性の指標として得て、ニュートラルレッド色素は、リソソーム完全性の指標として用いた。細胞膜が不全であると、ＬＤＨが血清培地中に放出されることを思い起こされたい。より低い量のＬＤＨは、より高い細胞生存性を示す。生存細胞の機能にとって必要なリソソームの完全性は、ニュートラルレッド色素染色の吸光度により測定される。より高い量のニュートラルレッド吸光度は、より高い細胞生存性を示す。
【０２２７】
高濃度の本発明の組成物および漸増量のカケキシンストレス因子に曝露したＨＭＶＥＣ−Ｌ生存性の結果（図３４）：集密（Ａ２）および通常（ｐＳ）のＨＭＶＥＣ−Ｌ培養物はともに、急性（５ｎｍ／ｍＬまで）カケキシン傷害後の本発明の組成物への曝露に関連するＬＤＨレベルの３０％までの改善（ＰＢＳ対照と比べて）を示した。ＬＤＨデータは、カケキシンによりストレスを受けたＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞が、本発明の組成物に曝露した後は、細胞膜不全により死滅する可能性がより低いことを示唆する。
【０２２８】
ニュートラルレッド吸光度により測定されるＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞でのリソソーム完全性の挙動は、細胞培養段階に依存する挙動を示した。期待されたように、ＰＢＳ対照中の集密（Ａ２）細胞は、ＰＢＳ対照通常無作為段階（ｐＳ）培養物における細胞よりもカケキシン傷害に対する感受性がかなり低かった。このことは、５ｎｇ／ｍＬカケキシンデータにおいて証明される。Ａ２細胞でのリソソームレベルは、５０％しか下落しないのに比較して、ｐＳ培養物では７０％下落した。通常（ｐＳ）培養物を本発明の組成物に曝露することは、同様のカケキシン傷害下でリソソーム完全性における差をほとんど生じなかったが、集密（Ａ２）細胞培養物をＡＳＥＡに曝露することにより、培養物はカケキシン傷害に対してかなり感受性が高くなり、通常の感受性がより高い（ｐＳ）細胞が示すのと同様の挙動に戻った。
【０２２９】
このことは、異常（カケキシン非感受性）ＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞を本発明の組成物に曝露することにより、これらの細胞の感受性をより高くできることを示唆する最初の証拠である。このデータは、カケキシンによりストレスを受けた集密（Ａ２）細胞が、本発明の組成物に曝露した場合により死滅する可能性が高く、これらの異常細胞は、ＡＳＥＡに曝露した場合に、カケキシンの存在下で通常により近い挙動を示すことを示唆する。この挙動は、最初は予期できなかった。なぜなら、本発明の組成物が、毒性傷害に対して細胞が細胞自体を保護する助けとなるということが実験の仮定であったからである。結局のところ、本発明の組成物への曝露は、通常の健常細胞が、酸化傷害に対して細胞自体を保護する助けとなるだけであり、カケキシンに対して細胞が自身を保護することを助けることはしないと見られる。本発明の組成物への曝露は、通常の生命サイクルの終わりに近い、ストレスを受けた細胞の死を促進する助けとさえなることができる。ちなみに、組織でのカケキシンの通常の役割は、損傷を受けた細胞の死および置き換えを促進することである。
【０２３０】
カケキシン傷害に対するＡ２およびｐＳ段階のＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞の本発明の組成物の濃度依存性応答を決定するための実験方法：生命サイクルの終わりにある集密Ａ２段階（典型的にカケキシン傷害に対して非感受性である段階）および通常の無作為周期ｐＳ段階の２つの段階に調製したＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞培養物を、２４時間、血清濃度（ｖ／ｖで２．５％、５％、１０％、１５％および２０％）のＰＢＳ対照または本発明の組成物のいずれかに曝露した。カケキシン応答性を、次いで、細胞内サイトソルおよび周囲の成長培地中の両方でＬＤＨ活性をモニタリングすることにより決定した。成長培地中のＬＤＨ活性の増加は、細胞膜破壊および死（ＬＤＨ放出）を示し、細胞内ＬＤＨ活性の減少は、細胞完全性の喪失を示すことを思い起こされたい。よって、カケキシン傷害に対して応答性をもつ細胞培養物は、培地ＬＤＨ活性の増加と細胞内ＬＤＨ活性の減少とを経験すると考えられる。
【０２３１】
手をつけていない細胞培養物対照のＬＤＨ活性を、考慮された本発明の組成物の各濃度について、５ｎｇ／ｍＬのカケキシンで傷害した細胞培養物のものと比較した。本発明の組成物の濃度依存性を、次いで、傷害した培養物および対照のそれぞれについてＬＤＨ活性に対してグラフにした。
【０２３２】
カケキシン傷害に対するＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞の濃度依存性応答の結果（図３５）：ＰＢＳ対照と比べて、正常ｐＳ細胞についてのカケキシン応答は、期待されたよりもかなり小さかった。ＰＢＳ対照培養物において細胞膜完全性のわずかな減少だけが見られ、細胞内ＬＤＨ活性は同じままであった。本発明の組成物に曝露すると、それ自体で、通常ｐＳ細胞培養物は、全体的な細胞完全性のわずかな減少と、細胞死の増加とを被った。カケキシンに対する対照ｐＳ細胞の期待される大きい応答が現れなかったので、本調査で用いたｐＳ細胞培養物は、集密に近いかまたは非応答状態に合った可能性があることに留意すべきである。
【０２３３】
しかし、様々な濃度の本発明の組成物に曝露したｐＳ細胞培養物にカケキシン傷害を加えると明確な応答があり、培養物は、細胞内ＬＤＨ機能および完全性の明確な喪失を示した。しかし、細胞死の兆しは伴われなかった。このことは、「通常のｐＳ」細胞が、本発明の組成物への曝露により、カケキシン受容に対してより感受性になったが、完全に細胞死に至るほどには感受性にならなかったことを示すと見られる。
【０２３４】
Ａ２細胞培養応答は、非常に明確であった。本発明の組成物への曝露は、カケキシンなしであっても、細胞内ＬＤＨ完全性の喪失を引き起こすと見られたが、これは、細胞死に影響しなかった。しかし、カケキシン傷害をこのようなＡ２培養物に加えた場合、本発明の組成物への曝露は、カケキシンによる受容細胞機能の迅速な減少を明らかに増幅し、濃度依存性の細胞死の明確な兆しもあった。本発明の組成物への曝露が、Ａ２細胞培養物においてカケキシン応答性を増加する強い証拠がある。
【０２３５】
これらの結果は、本発明の組成物への曝露が、Ａ２および境界線のｐＳ  ＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞培養物におけるカケキシン応答性を著しく増加することを意味する。おそらく興味深いことに、本発明の組成物への曝露単独では、Ａ２型細胞での細胞ＬＤＨ活性の完全性は低下し得る。幅広い濃度においてさえも無作為周期細胞ではゼロ毒性応答が検出されたので、毒性による効果は通常の細胞では期待されないことを思い起こされたい。本発明の組成物への曝露は、非応答性の集密細胞の除去を加速する傾向があると見られる。このことは、カケキシンが存在する場合に明らかに真実である。これらの結果は、本発明の組成物への高濃度での曝露が、細胞増殖を減じるようであるという観察にも関係し得る。このような傾向については、低濃度の曝露では試験しなかった。高濃度効果が、成長培地での本発明の組成物の干渉による単なるアーチファクトであるという可能性を割り引いて考えるのは難しいことに注意されたい。
【０２３６】
放射線照射および血清飢餓によりストレスを受けた細胞への５〜１０％の本発明の組成物の曝露の効果を決定するための実験方法：ネズミ（ＪＢ６）細胞培養物を、高レベルの放射線照射曝露（Ｘ線）に供し、別の調査において、培養物を、増殖因子の血清飢餓に２４時間供した。細胞を、次いで、このようなストレスを受けた細胞に対する本発明の組成物の曝露の効果を決定する手段として、５〜１０％のＡＳＥＡ曝露に曝露した。細胞数を、本発明の組成物への曝露の前後に計数した。
【０２３７】
放射線照射および血清飢餓ネズミ細胞に対する５〜１０％の本発明の組成物の曝露の効果の結果：定量分析は、これらの実験について収集しなかった。しかし、定性分析は、いくらか興味深い結果を明らかにする。放射線照射により損傷を受けた培養物について、即座の細胞死が、本発明の組成物への曝露により培養物の半分より多くで観察された。その後は、さらなる細胞死は見られなかった。顕微鏡下での検査により、残存生細胞は、正常で健常であるように見られた。本発明の組成物への曝露は、より深刻に損傷された細胞の細胞死を加速する助けとなり、健常または修復可能な細胞の生存を可能にしたと見られる。
【０２３８】
血清飢餓細胞培養物について、死亡率がほぼ２０％未満であって、細胞死がそれほどひどくなかったこと以外は、同様の観察結果が得られた。生き延びた細胞は、非常に強く生存力があるように見られた。しかし、同様の喪失が、後の実験で、本発明の組成物に曝露していない血清飢餓培養物でも見られた。
【０２３９】
本発明の組成物を生存能がある生存ＨＭＶＥＣ−Ｌヒト細胞およびネズミ上皮ＪＢ６細胞と直接接触させることを含むｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究から、レドックスシグナル伝達分子のある種の混合物の生物活性をよりよく理解した。以下のことを決定するために５つの具体的な目的を遂行した。
１）Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性（ＮＦ−ｋＢ、Ｐ−Ｊｕｎの移行に基づく）
２）抗酸化効力（ＧＰｘおよびＳＯＤについて）に対する効果
３）抗酸化物質転写活性（ＮＲＦ２）に対する効果
４）細胞増殖および生存性（細胞数）に対する効果
５）ストレスを受けた細胞（カケキシン、放射線照射、飢餓）に対する効果
【０２４０】
血清の高い濃度の本発明の組成物（２０％まで）への曝露により、通常の無作為段階でのいずれの健常細胞培養物（ＨＭＶＥＣ−ＬまたはＪＢ６）についても、毒性応答は観察されなかった。２つの方法、核でのＮＦ−ｋＢおよびＰ−Ｊｕｎの移行および蓄積を用いて毒性応答を決定した。これらの方法はともに、陽性対照により検証されるように、低レベルの毒性に対して感受性であることが知られている。毒性の兆しおよび／または炎症性サイトカインの完全な欠如が観察された。
【０２４１】
ＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞でのＧＰｘ抗酸化効力の８００％の増加が、低濃度の本発明の組成物（濃度依存性は見られなかった）からの２４時間の曝露の後に見られた。ＳＯＤ抗酸化効力の５００％までの一過性の増加が、これもまた低濃度の本発明の組成物（＜１％）への曝露の後に３０分から９０分の間で見られた。いずれの場合でも、低濃度の本発明の組成物は、経口投与から可能な血液濃度に匹敵したが、このことを確認できるデータは利用可能でない。非常な低濃度における濃度依存性は、注意深く調査すれば、観察される可能性がある。
【０２４２】
これに対して、高濃度の本発明の組成物への曝露は、ＧＰｘ抗酸化効力の小さい相対的増加だけを誘発し、これは濃度依存的でなかった。ＳＯＤ効力の増加は、高濃度の本発明の組成物または長い（２４時間）曝露後のいずれにおいても見られなかった。後続の調査では、この情報を用いて、濃度依存性を研究するために最適な濃度および時点を決定する（＜０．１％および０〜１２０分）。
【０２４３】
レドックス応答性転写因子の核移行を調べる研究は、本発明の組成物が、より低い濃度（１％未満）にて、ＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞におけるＮＲＦ２転写因子の核移行の２０〜３０％の増加を誘導することを示唆する（これは、一過性（３０〜６０分）であると見られる）。我々は、本発明の組成物が、核外タンパク質のリン酸化の並行した減少を誘導したことも観察したが、該タンパク質のリン酸化状態は、抗酸化物質の作用機序と一貫して、過酸化水素処理に応答して明確に増加する。
【０２４４】
感受性を増加するためのアプローチとしての、ＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞の血清飢餓は、本発明の組成物（１％）により誘導される核ＮＲＦ２シグナルを著しく増加した。しかし、血清飢餓は、細胞死を著しく誘導し、データの解釈を混乱させた。
【０２４５】
ＨＭＶＥＣ−ＬおよびＪＢ６の両方の細胞型についての細胞増殖（細胞数から決定される）は、高濃度（５〜２０％ｖ／ｖ）の本発明の組成物への曝露により阻害された。ＨＭＶＥＣ−Ｌ阻害は、明らかに濃度依存性であり、２０％の細胞数の喪失が２０％ＡＳＥＡ濃度にてあった。増殖の減少とは対照的に、血清ＬＤＨレベルは、５〜２０％の間の濃度の本発明の組成物を用いて著しく減少し、細胞膜完全性の増加を示した。これらの結果は、高濃度にて細胞増殖が減少し、細胞膜生存性が増加することを示すと見られる。このような挙動の背後にある機構をデータから推断することはできないが、さらなる証拠が次の節で見られる。
【０２４６】
カケキシンでストレスを与えた場合のＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞の応答は、細胞段階に依存する。通常の無作為周期のＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞（ｐＳ）は、カケキシンでストレスを与えた場合に典型的な挙動を示し、すなわち細胞死を伴う細胞生存性の減少を示した。生命サイクルの終わりの集密（Ａ２）および境界線のＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞は、期待されたように、カケキシン傷害に対して感受性がより低く、細胞生存性の減少がより小さく、細胞死もより少なかった。
【０２４７】
本発明の組成物への曝露は、カケキシンに対する通常の無作為周期ｐＳ細胞の応答の著しい変化を引き起こさなかった（同程度の細胞生存性の喪失および細胞死を示す）。しかし、本発明の組成物に曝露したＡ２細胞培養物は、カケキシンに対する感受性の増加を示し、通常の細胞のものと同様の挙動を回復した。この挙動は、濃度依存性を調べることにより、補強された。比較的小さいカケキシン応答を示す境界線のＡ２細胞、およびカケキシン傷害に対して通常は感受性でないＡ２細胞は、本発明の組成物に曝露した場合にカケキシンに対してかなりより強い応答を示し、ともに生存性の減少および細胞死の増加を示した。
【０２４８】
本発明の組成物への曝露は、Ａ２細胞死の速度を増加させ、このような生命サイクルの終わりの細胞においてカケキシンの自然な受容を増進すると見られる。しかし、本発明の組成物への曝露は、通常の細胞生存性のいずれの変化も引き起こすことが期待されない。
【０２４９】
カケキシンは、通常、損傷を受けたかまたは機能不全の組織において細胞死を引き起こし、周囲の健常細胞の分裂および空所の充填を可能にするために分泌される。よって、機能不全細胞におけるカケキシンに対する感受性の増加は、このようなプロセスを加速させる助けとなることがあり、常に有害というわけではない。
【０２５０】
細胞死の加速は、本発明の組成物への曝露と関連して、放射線照射および血清飢餓によりストレスを受けた組織においても見られる。
【０２５１】
本発明の組成物を用いてレドックスシグナル伝達分子のある種の均衡化混合物を生存ＨＭＶＥＣ−ＬおよびＪＢ６細胞培養物に注入することは、明確な生物活性を誘発することが観察されている。毒性または炎症性サイトカインの発現の兆しは観察されなかったが、抗酸化物質および保護酵素発現の増加（核ＮＲＦ２の増加により証明される）と、２つのマスター抗酸化物質ＧＰｘおよびＳＯＤの効力の大きい増加とがあった。この挙動は、本発明の組成物の注入が、このような細胞での毒性または炎症性の応答を誘導せずに酸化的防御機構を誘導および増進する傾向にありうることを示唆する。このような作用は、前例がないか、または極めて稀である。通常、低レベルの毒性は、わずかな酸化ストレスおよび炎症性応答を誘導し、これが次いで酸化的防御および細胞修復機構を誘導する。超低濃度の本発明の組成物の注入を用いてこの効果の濃度依存性を決定することは興味深い。
【０２５２】
本発明の組成物の注入により機能不全、ストレスを受けた、または損傷された細胞の培養物において細胞死を誘導することについても探索すべきである。自然の治癒プロセスは、修復または置き換え機構を含み、これにより、可能な場合には、わずかに損傷された細胞は修復され、細胞を修復できない場合には、プログラムされた細胞死であるアポトーシスを受け、健常な隣接細胞の有糸分裂により置き換えられる。本発明の組成物の注入が、それ自体で、曝露された細胞に直接的なストレスを引き起こさないことがはっきり明らかであるが、機能不全または損傷された細胞における細胞死を誘導するように設計されたある種のサイトカイン「死ドメイン」メッセンジャー（カケキシン）の効率を増加させる傾向にある可能性がある。ＮＲＦ２の核移行は、抗酸化物質、ＤＮＡ修復分子および他の既知の修復機構の発現を含む第ＩＩ相酸化的防御応答の一部と考えることができる。
【０２５３】
アポトーシスは、細胞が修復不可能な損傷を受け、除去して置き換えられなければならない場合の置き換え機構の一部である。抗酸化防御およびアポトーシス機構はともに、通常の組織修復および再生の中心である。レドックスシグナル伝達は、細胞がアポトーシスを受けるか否かを決定できる、ｐ５３遺伝子発現のような経路のいくつかに関与する。長期酸化ストレスは、細胞死に有利な傾向にある。確かに、カケキシンおよび他の死ドメインメッセンジャーの存在は、細胞死に有利である。本発明の組成物の注入がカケキシン受容を増進するという観察結果は、本発明の組成物の注入が、防御、修復または置き換え機構を活性化するかを決定するシグナル伝達プロセスにおけるメッセンジャーの受容を増進するようにも働くことを示しているのかもしれない。
【実施例９】
【０２５４】
２型糖尿病の処置
２型糖尿病と診断された４２歳の男性を、ＰＰＡＲ阻害剤（エイコサノイド）とレドックスシグナル伝達物質（ＲＸＮ）組成物とを含む本発明の組み合わせ製品を静脈内注射することにより処置する。約１週間後に、患者は、処置前と比較して、最小限のグルコース可動域でのより規則正しいグルコースプロファイルを維持する。
【実施例１０】
【０２５５】
１型糖尿病の処置
１型糖尿病と診断された２２歳の女性を、ＰＰＡＲ阻害剤（タゾリジンジオン）とレドックスシグナル伝達物質（ＲＸＮ）組成物とを含む本発明の組み合わせ製品を静脈内注射することにより処置する。約１週間後に、患者は、処置前と比較して、最小限のグルコース可動域でのより規則正しいグルコースプロファイルを維持する。
【実施例１１】
【０２５６】
がんの処置
がんと診断された３１歳の女性を、ＰＰＡＲ阻害剤（フィブラート）とレドックスシグナル伝達物質（ＲＸＮ）組成物とを含む本発明の組み合わせ製品を静脈内注射することにより処置する。約１カ月後に、患者は、症状の後退を示す。
【実施例１２】
【０２５７】
２型糖尿病の処置
２型糖尿病と診断された７２歳の男性を、ＰＰＡＲ阻害剤（エイコサノイド）とレドックスシグナル伝達物質（ＲＸＮ）組成物とを含む本発明の組み合わせ製品を経口投与することにより処置する。約１週間後に、患者は、処置前と比較して、最小限のグルコース可動域でのより規則正しいグルコースプロファイルを維持する。
【実施例１３】
【０２５８】
１型糖尿病の処置
１型糖尿病と診断された６１歳の女性を、ＰＰＡＲ阻害剤（タゾリジンジオン）とレドックスシグナル伝達物質（ＲＸＮ）組成物とを含む本発明の併用治療を経口投与することにより処置する。約１週間後に、患者は、処置前と比較して、最小限のグルコース可動域でのより規則正しいグルコースプロファイルを維持する。
【実施例１４】
【０２５９】
がんの処置
口腔癌と診断された３１歳の女性を、ＰＰＡＲ阻害剤（フィブラート）と本発明のレドックスシグナル伝達物質（ＲＸＮ）組成物とを含む組み合わせ製品を経口投与することにより処置する。約１カ月後に、患者は、症状の後退を示す。
【０２６０】
そうでないと示さない限り、本明細書および特許請求の範囲で用いる成分の量、分子量のような特性、反応条件などを示す全ての数値は、「約」との用語で全ての場合において修飾されていると理解される。したがって、そうでないと示さない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲に示す数値パラメータは、本発明により得ようとする所望の特性に応じて変動し得る近似である。最低限でも、そして特許請求の範囲の均等論の適用を制限する試みではなく、各数値パラメータは、報告される有効数字に鑑みて、そして通常の切り上げ／切り下げ法を用いることにより少なくとも解釈されるべきである。本発明の広い範囲を記載する数値範囲およびパラメータが近似であるにもかかわらず、具体的な実施例に記載する数値は、できる限り正確に報告される。任意の数値は、しかし、それぞれの試験での測定で見出される標準偏差に必然的に起因するある種の誤差を元来含有する。
【０２６１】
「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」、「ｔｈｅ（その）」との用語および本発明を記載する文脈（特に以下の特許請求の範囲の文脈）において用いる同様の言及は、本明細書にそうでないと示すかまたは文脈により明らかに矛盾するのでない限り、単数形および複数形の両方をカバーすると解釈される。本明細書での値の範囲の記載は、その範囲内にある別々の値のそれぞれに個別に言及することの省略法として働くことを単に意図する。本明細書にそうでないと示さない限り、それぞれの個別の値は、それが個別に本明細書に記載されるかの如く、本明細書に組み込まれている。本明細書に記載する全ての方法は、本明細書にそうでないと示すかまたは文脈により明らかに矛盾するのでない限り、任意の適切な順序で行われうる。任意のそして全ての例、または本明細書で示す例示的な言い回し（例えば「のような」）の使用は、本発明をよりよく説明することを単に意図し、特許請求する本発明の範囲を限定しない。本明細書中の言い回しはいずれも、特許請求の範囲には記載されていないが本発明の実行のために必須な何らかの要素を示すと解釈されるべきでない。
【０２６２】
本明細書に開示する本発明の代替要素または実施形態の群分けは、限定と解釈されてはならない。各群メンバーは、個別にまたはその群の他のメンバーもしくは本明細書で見出される他の要素との任意の組み合わせで言及し、特許請求されうる。群の１または複数のメンバーが、簡便性および／または特許性の理由から、群に含めるかまたは群から削除できることが予期される。そのようないずれの包含または削除が生じた場合でも、本明細書は、添付の特許請求の範囲で用いる全てのマーカッシュ群の書面での記載を充足する改変された群を含有すると見なされる。
【０２６３】
本発明を行うために本発明者らが知っている最良の形態を含む、本発明のあるいくつかの実施形態を本明細書に記載する。もちろん、これらの記載された実施形態に対する変動は、上記の記載を読むことにより当業者に明らかになる。本発明者は、当業者が、そのような変動を適当であれば採用することを期待し、本発明者らは、本明細書に具体的に記載する以外の方法で本発明が実行されることを意図する。したがって、本発明は、適用可能な法により許容されるように、添付の特許請求の範囲に記載する主題の全ての改変および等価物を含む。さらに、全ての可能な変動での上記の要素の任意の組み合わせは、本明細書にそうでないと示すかまたは文脈により明らかに矛盾するのでない限り、本発明に包含される。
【０２６４】
最後に、本明細書に開示する本発明の実施形態は、本発明の原理を説明するものであることを理解されたい。採用し得る他の改変も、本発明の範囲内である。よって、例えば、しかし限定しないが、本発明の代替の構成を、本発明での教示に従って利用できる。したがって、本発明は、提示され記載されたものに厳密に限定されるものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年5月27日(2015.5.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種のレドックスシグナル伝達物質（ＲＸＮ）とＰＰＡＲアゴニストとを含む組成物。
【請求項２】
ＰＰＡＲアゴニストが、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ＲＸＮとＰＰＡＲアゴニストとを含む組成物の、ＰＰＡＲ媒介性疾患の処置における使用。
【請求項４】
ＰＰＡＲ媒介性疾患が、真性糖尿病である、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
少なくとも１種のＲＸＮを含む組成物の、がんの処置における使用であって、ＰＰＡＲ経路を活性化する第１の治療と、ＰＰＡＲ経路を活性化しない少なくとも１種の他の作用因子とを含む、使用。
【請求項６】
少なくとも１種のＲＸＮを含む組成物の、がんの処置における使用であって、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）を動員する第１の治療と、ＦＦＡを動員しない少なくとも１種の他の作用因子とを含む、使用。
【請求項７】
少なくとも１種の他の作用因子が、放射線照射を含む、請求項６に記載の使用。
【国際調査報告】
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