(57)【要約】【課題】遺伝子及び生物学的解析のためのシステム及び方法、特に、感度が高く費用効率の高い、高度に並列な又はクローンの配列決定反応のためのシステム及び方法が必要である。【解決手段】  本開示は、核酸及び分子検出の高効率電子配列決定のためのシステム及び方法に関する。本開示の例示的な実施形態では、ナノニードルを使用して、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡハイブリダイゼーション、又はタンパク質検出等の対象の適用のための、ＤＮＡ若しくはタンパク質等の対象の生体分子に関連する対イオン濃度又はデバイ長の変調によって生じるインピーダンス変化を検出することができる。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体中の局所化学的又は電気的摂動を検知するためのデバイスであって、
反応キャリア上の化学反応又は生物学的反応に近接した流体のインピーダンス、電荷、ｐＨ、及び温度の１つ又は複数の変化を検出することにより、前記生物学的又は化学反応を示す信号を発生させるように構成された１つ又は複数のセンサと、
反応基質又は生物学的物質を含む流体を前記反応キャリア上に通すように構成された流体チャネルを備えた支持基板と、
少なくとも２つの電極と、
を備え、
前記電極が、反応事象に近接する環境で定常状態変化を測定し、任意選択により、少なくとも１つの過渡事象を測定し、
前記反応キャリアに対する少なくとも１つのセンサの形状及び／又は近接により、前記流体に関するインピーダンス、電荷、ｐＨ、及び／又は温度の前記変化を実質的に増加させるデバイス。
【請求項２】
前記定常状態変化が、前記化学反応又は生物学的反応に近接する環境又は流体周りのデバイ層の変調によるものである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
少なくとも１つのセンサの電極が、前記反応キャリアのデバイ長の範囲内にある、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４】
前記デバイスが略平面のナノセンサアレイである、請求項１〜３に記載のデバイス。
【請求項５】
前記定常状態又は過渡変化が、前記化学反応若しくは生物学的反応に近接する環境又は流体周りの、又は前記電極に近接するところの、イオン濃度の変化によるものである、請求項１〜４に記載のデバイス。
【請求項６】
前記生物学的反応又は化学反応に関連する前記イオン濃度の変化が、移動イオンからのものでも、固定イオンからのものでもよい、請求項５に記載のデバイス。
【請求項７】
前記反応がＤＮＡ配列決定反応であり、前記センサが、１つ又は複数のヌクレオチドのＤＮＡ鎖又はＤＮＡ鎖のクローン個体群への取り込みに関連するインピーダンスを測定する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項８】
前記反応がポリヌクレオチドの増幅である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項９】
前記化学反応が、前記反応キャリアに直接又は間接的に結合された標的生物学的物質を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１０】
前記反応キャリアがビーズである。請求項９に記載のデバイス。
【請求項１１】
前記ビーズが前記センサに近接して可逆的に保持される、請求項１０に記載のデバイス。
【請求項１２】
前記ビーズが凹み内で保持される、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１３】
前記センサ電極が、前記凹み及び／又はビーズの縁部に略一致する円弧を形成する、請求項１１又は１２に記載のデバイス。
【請求項１４】
少なくとも１つのセンサの電極が、前記ビーズを固定位置に配置し、前記センサの第２の電極が、前記ビーズ下の前記センサの表面に接触する、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１５】
少なくとも１つのセンサの２つの電極が、前記ビーズ下の基板に作製され、前記ビーズの形状にほぼ一致する傾斜を形成する、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１６】
前記ビーズが磁気ビーズである、請求項９〜１５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１７】
前記ビーズが少なくとも１つの電場又は磁場により保持される、請求項１６に記載のデバイス。
【請求項１８】
前記ビーズが物理的リンカーにより保持される、請求項９〜１５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１９】
前記センサの１つ又は複数の電極が、誘電体基板によりシールドされる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２０】
前記電極の一部が誘電体層により覆われる、請求項１９に記載のデバイス。
【請求項２１】
１つ若しくは複数の電極の先端が薄い誘電体層で被覆されるか、又は１つ若しくは複数の電極の前記先端が誘電体層により覆われないままである、請求項１９に記載のデバイス。
【請求項２２】
前記センサが、ＡＣモード、ＤＣモードの少なくとも１つ、又は両方で動作する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２３】
前記支持基板が接地層を含む、請求項２２に記載のデバイス。
【請求項２４】
前記接地層が電極上に位置し、誘電体層により囲まれる、請求項２２に記載のデバイス。
【請求項２５】
前記接地層が送信電極の一部を覆うが、受信電極を覆わない、請求項２３に記載のデバイス。
【請求項２６】
少なくとも１つの電極に関連する少なくとも１つの局所キャパシタをさらに備える、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２７】
前記センサがナノブリッジである、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２８】
前記ナノブリッジが前記ビーズ周りにリング構造を形成する、請求項２７に記載のデバイス。
【請求項２９】
前記ナノブリッジリングのサイズが前記信号対雑音比を実質的に増加させる、請求項２８に記載のデバイス。
【請求項３０】
前記ナノブリッジが、当該ナノブリッジの高濃度にドープされた領域に接続された導体を備える、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項３１】
前記ナノセンサがナノニードルである、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項３２】
前記ナノニードルが前記ビーズ周りにリング構造を形成する、請求項３１に記載のデバイス。
【請求項３３】
参照電極をさらに備える、請求項１〜３２のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項３４】
バックゲートをさらに備える、請求項３３に記載のデバイス。
【請求項３５】
前記バックゲートが分割される、請求項３４に記載のデバイス。
【請求項３６】
前記センサに一体化された積分器をさらに備える、請求項１〜３５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項３７】
前記積分器が前記センサに関連するキャパシタを備える、請求項３６に記載のデバイス。
【請求項３８】
任意選択により前記支持基板の１つ若しくは複数の角部又は側部に複数の読出しポートをさらに備える、請求項１〜３７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項３９】
ＦｉｎＦＥＴ、ナノニードル、ナノブリッジ、ＩＳＦＥＴ、ＣＨＥＭＦＥＴ、ｐＨセンサ、及びマイクロカンチレバから選択された少なくとも１つのセンサを備える、請求項１〜３８のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項４０】
帯電された標的分子を含む反応キャリアを、帯電された標的分子を含まない反応キャリアから分離するための濃縮モジュールをさらに備える、請求項１〜３９のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項４１】
前記濃縮モジュールが、微小流体チャネルと、前記反応キャリアを通すように構成された第１の流体入力と、緩衝液を通すように構成された第２の流体入力と、前記帯電された標的分子を含む反応キャリアを集める第１の出力ポートと、前記帯電された標的分子のない反応キャリアを集める第２の出力ポートと、前記帯電された標的分子を含む前記反応キャリアを前記第１の出力ポートに向けるための電場発生部品とを備える、請求項４０に記載のデバイス。
【請求項４２】
前記帯電された標的分子を有する反応キャリアを分離するための複数の出力ポートがある、請求項４１に記載のデバイス。
【請求項４３】
前記電場が流路に垂直に発生する、請求項４１又は４２に記載のデバイス。
【請求項４４】
前記帯電された標的分子がポリヌクレオチドである、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項４５】
各センサに関連し、電場の発生により閉込めセルを形成するように構成された複数の電極をさらに備える、請求項１〜４４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項４６】
前記少なくとも１つのセンサに関連する弛張発振器回路をさらに備える、請求項１〜４５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項４７】
流体中の局所化学的又は電気的摂動を検知するためのデバイスであって、
化学反応又は生物学的反応に近接した流体のインピーダンス、電荷、ｐＨ、及び温度の１つ又は複数の変化を検出することにより、前記生物学的又は化学反応を示す信号を発生させるように構成された１つ又は複数のセンサと、
反応基質又は生物学的物質を含む流体を前記反応キャリア上に通すように構成された流体チャネルを備えた支持基板と、
少なくとも２つの電極と、
を備え、
前記検出が、前記電極間の溶液の前記反応によるデバイ層の変調又は生物学的分子周りの移動イオン濃度の変化によって、前記電極間のインピーダンス変調を直接測定することにより行われ、
前記反応キャリアに対する少なくとも１つのセンサの形状及び／又は近接により、前記流体に関するインピーダンス、電荷、ｐＨ、及び／又は温度の前記変化を実質的に増加させるデバイス。
【請求項４８】
請求項１〜４７のいずれか一項に記載のデバイスに１つ若しくは複数の反応基質又は生物学的分子を含むバルク流体を通す工程と、
ｐＨ、電荷、インピーダンス、及び温度の変化の１つ又は複数を測定する工程と、
を含む、生物学的反応又は化学反応を検出するための方法。
【請求項４９】
前記反応がＤＮＡ配列決定反応である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記反応キャリア上のＤＮＡの長さに基づいて前記センサの電圧を調整する工程をさらに含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記センサ信号が定常状態インピーダンス測定を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
ＤＮＡ合成に適した緩衝液がヌクレオチド取込みのための反応に供給され、続いて、ヌクレオチド取込みを示す定常状態インピーダンス測定のための低イオン強度緩衝液が供給される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
差分測定を使用して、前記測定から生じる出力信号からの雑音を除去する工程をさらに含む、請求項４８〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記差分測定が１つ又は複数の特徴の無い反応キャリアを参照として使用する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記差分測定が、生物学的反応又は化学反応を有していない前記デバイスの領域を参照として使用する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記差分測定が反応キャリアのないセンサを参照として使用する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記反応キャリアが磁気ビーズである、請求項５３〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記差分測定が隣接センサを参照として使用する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５９】
前記差分測定が前記デバイス内のセンサ領域を参照として使用する、請求項５３〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
クロストークデコンボリューション関数行列を使用して前記出力信号から雑音を除去する工程をさらに含む、請求項５３〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記差分測定が、試薬スラグがフローセルを横切るのに必要な時間に基づいて使用される、請求項５３〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
センサ電子回路の読出しを、前記フローセルを通る試薬スラグの移動と同期させることによって、前記デバイスのデータ出力を減少させる工程をさらに含む、請求項４８〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
微小流体チャネルと、
キャリアビーズを通すように構成された第１の流体入力と、
緩衝液を通すように構成された第２の流体入力と、
より高い電荷密度を有するキャリアビーズを集める第１の出力ポートと、
より低い電荷密度を有するキャリアビーズを集める第２の出力ポートと、
より高い電荷密度を有するキャリアビーズを前記第１の出力ポートに向けるための電場発生部品と、
を備えたデバイス。
【請求項６４】
前記より高い電荷密度が、関連するポリヌクレオチドによるものである、請求項６３に記載のデバイス。
【請求項６５】
前記ポリヌクレオチドがポリヌクレオチドのクローン個体群である、請求項６４に記載のデバイス。
【請求項６６】
前記電場が流路に垂直に発生する、請求項６３又は６５に記載のデバイス。
【請求項６７】
前記微小流体チャネルが電気浸透流を減少させるように構成される、請求項６３〜６６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項６８】
緩衝液が電気浸透流を減少させるように構成される、請求項６３〜６７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項６９】
当該デバイスがナノセンサアレイに機能的に連結される、請求項６３〜６８のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項７０】
前記キャリアビーズが磁気ビーズである、請求項６９に記載のデバイス。
【請求項７１】
前記ナノセンサアレイが、少なくとも１つのセンサに近接して前記ビーズの１つを保持するようにそれぞれ構成された磁気領域のアレイを含む、請求項７０に記載のデバイス。
【請求項７２】
各センサが、電場閉込めセルを生成するように構成された複数の関連する電極を有する、請求項７１に記載のデバイス。
【請求項７３】
キャリアビーズ及び緩衝液を、請求項６３〜７２のいずれか一項に記載の微小流体チャネルに沿って通す工程と、
電場を印加して、より高い電荷密度を有するキャリアビーズを第１の出力ポートに向ける工程と、
を含む、より高い電荷密度を有するキャリアビーズをより低い電荷密度を有するキャリアビーズから分離するための方法。
【請求項７４】
磁気キャリアを保持するように構成された、基板上の複数の磁気構造と、
前記磁気構造に近接する帯電された物質を、電場によって閉じ込めるように構成された複数の電極と、
前記電場を発生させるために前記少なくとも１つの電極に接続された電気信号を供給するソースであって、前記電気信号が、前記磁気キャリアに近接する化学反応又は生物学的反応に実質的に干渉しない波形を有するソースと、
を備えた、流体内の帯電された物質を閉込めるため、又は濃縮するためのデバイス。
【請求項７５】
前記波形が、正弦曲線の上部近くで電圧が除去された修正正弦波形である、請求項７４に記載のデバイス。
【請求項７６】
前記信号が、サイクル中に１回〜複数回干渉される、請求項７４又は７５に記載のデバイス。
【請求項７７】
前記電気信号が、ＤＣ信号、ＡＣ信号、又はＡＣ成分及びＤＣ成分の両方を有する混合信号の少なくとも１つである、請求項７４〜７６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項７８】
１つ又は複数の内部電極及び１つ又は複数の外部電極を含む、請求項７７に記載のデバイス。
【請求項７９】
前記１つ又は複数の内部電極が交番する正電荷及び負電荷を有する、請求項７８に記載のデバイス。
【請求項８０】
前記１つ又は複数の外部電極が負電荷を有する、請求項７８に記載のデバイス。
【請求項８１】
前記電極の一部が誘電体材料で覆われる、請求項７４〜８０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項８２】
前記磁気キャリアに近接する前記電極の先端が薄い誘電体層で覆われる、請求項８１に記載のデバイス。
【請求項８３】
前記デバイスが微小流体チャネルを備える、請求項７４〜８２のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項８４】
チャネル高さが前記磁気キャリアの高さの少なくとも３〜５倍である、請求項８３に記載のデバイス。
【請求項８５】
前記磁気構造が強磁性又は常磁性である、請求項８３に記載のデバイス。
【請求項８６】
前記磁気構造が接着層で磁化される、請求項８５に記載のデバイス。
【請求項８７】
前記磁気構造がサンドイッチ層構成を有する、請求項８５に記載のデバイス。
【請求項８８】
前記サンドイッチ層が、非磁気材料及び磁気材料の交互の層から構成される、請求項８５に記載のデバイス。
【請求項８９】
前記非磁気材料及び磁気材料が、それぞれクロム及び白金である、請求項８５に記載のデバイス。
【請求項９０】
前記磁気構造が少なくとも１つの基層をさらに備える、請求項８５に記載のデバイス。
【請求項９１】
前記磁気構造が少なくとも１つの酸化物層をさらに備える、請求項８５に記載のデバイス。
【請求項９２】
複数の磁気構造が鋭い縁部を有する、請求項８５〜９１のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項９３】
閉込めセル内の複数の磁気構造が間隙を形成する、請求項７４〜９２のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項９４】
磁気キャリアが前記間隙内に載置される、請求項９３に記載のデバイス。
【請求項９５】
微小流体チャネルに関連し、前記電極に対向して位置する１つ又は複数の磁石があり、当該磁石が前記電極に関連する、請求項７４〜９２のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項９６】
前記微小流体チャネルに関連する前記磁石が磁気層である、請求項９５に記載のデバイス。
【請求項９７】
帯電された物質及び／若しくは反応基質を送達又は除去するためのトレンチをさらに備える、請求項７４〜９６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項９８】
前記トレンチが前記キャリアに関連し、前記帯電された物質に使用可能な前記キャリアの表面積を最大化する、請求項９７に記載のデバイス。
【請求項９９】
磁石が前記電極に接触し、前記電極上に位置する。請求項７４〜９８のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１００】
磁石が前記電極に接触し、前記電極下に位置する、請求項７４〜９８のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１０１】
前記帯電された物質がＤＮＡである、請求項７４〜１００のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１０２】
前記電場が誘電泳動又は電気泳動である、請求項７４〜１０１のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１０３】
複数の前記１つ又は複数の磁気構造により保持された磁気キャリアをさらに備える、請求項７４〜１０２のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１０４】
前記磁気キャリアが磁気ビーズである、請求項１０３に記載のデバイス。
【請求項１０５】
閉じ込められた前記帯電された物質が、ＤＮＡ又はｄＮＴＰの少なくとも１つである、請求項１０４に記載のデバイス。
【請求項１０６】
標的生物学的分子がリンカーにより前記キャリアに結合される、請求項１０５に記載のデバイス。
【請求項１０７】
請求項７４〜１０６のいずれか一項のデバイス、請求項１〜４７の１つ若しくは複数のデバイス、及び／又は請求項６３〜７２の１つ若しくは複数のデバイスを備えたシステム。
【請求項１０８】
微小流体チャンバにテンプレートＤＮＡのプライマー領域を供給する工程と、
前記微小流体チャンバに、取込み用のＤＮＡポリメラーゼ及び少なくとも１つのヌクレオチドを加える工程と、
取込み事象に近接した環境における定常状態変化を測定し、かつ任意選択により、少なくとも１つの過渡事象を測定する工程と、
を含む、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ塩基の取込みのプロファイルを測定するための方法。
【請求項１０９】
取込み反応の副産物の増加、流体環境のインピーダンス、ｐＨ、又は温度から選択された環境の変化を測定する工程を含む、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
ヌクレオチド取込みが、ヌクレオチド取込みに必要なイオン成分を含む緩衝液中で行われ、前記定常状態変化が低イオン強度緩衝液中で測定される、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１１】
配列決定反応を最大可能長さまで実行する工程と、伸長プライマー鎖を溶融させる工程と、新しいプライマーを導入する工程と、合成反応を続行する工程とをさらに含む、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
配列決定反応の成分をキャリア上で離間したＤＮＡテンプレートに接触させて立体障害を減少させる工程を含む、近接して複数の配列決定反応を実行するための方法。
【請求項１１３】
前記ＤＮＡテンプレートを、二本鎖又は一本鎖ＤＮＡとの複合体を形成する、ポリメラーゼよりも大きい結合部分に接触させ、かつ離間したＤＮＡテンプレートを、ヌクレオチド取込み条件下で前記ポリメラーゼに接触させることにより、前記ＤＮＡテンプレートが離間される、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記部分が進行性ポリメラーゼである、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
ｄＮＴＰｓが一度ずつ追加され、取込みが測定される、請求項１０８〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
並列の配列決定反応がアレイ上で進行する、請求項１０８〜１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
各反応がセンサ及び閉込めセルを伴い、前記閉込めセルが電場により形成される、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記配列決定反応がビーズアレイ上で行われる、請求項１１６又は１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記ビーズが磁気ビーズであり、磁気構造により前記センサに近接して保持される、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
センサ電極が前記ビーズのデバイ長の範囲内にある、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
複数のポリヌクレオチドに対するヌクレオチド取込みを検知するように構成された複数のセンサと、
それぞれ前記複数のセンサの１つに連結されて、前記複数のセンサのそれぞれにおいて雑音を減少させるように構成された複数の積分器と、
を備えた、ポリヌクレオチド配列決定のためのシステム。
【請求項１２２】
電流の代わりに電荷の蓄積を測定するように構成された、請求項１２１に記載のシステム。
【請求項１２３】
第１のポリメラーゼを用いてＤＮＡのヌクレオチド取込みを検知することにより、ＤＮＡ配列決定における立体障害を減少させるための方法であって、前記第１のポリメラーゼよりも大きい第２のポリメラーゼと、ＤＮＡに結合するタンパク質又は部分と、からなる群から選択された化合物を使用して、前記化合物がＤＮＡの間隔をあけるのを助けることにより立体障害を減少させるようにする工程を含む方法。
【請求項１２４】
前記第２のポリメラーゼが進行性ポリメラーゼである、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
２つの緩衝液を使用して、十分な緩衝及び低イオン強度を同時に提供する工程を含む、ポリヌクレオチドに対するヌクレオチドの取込みを検知するためのｐＨ測定への炭酸の影響を減少させるための方法。
【請求項１２６】
Ｔｒｉｓ及びＨＥＰＥＳの組合せを使用して緩衝に寄与する、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
ポリヌクレオチドキャリアの表面上のＳ０４の量を変化させる工程を含む、ポリヌクレオチドキャリアから電荷を減少させるための方法。
【請求項１２８】
前記ポリヌクレオチドキャリアの表面上の負電荷の量を追加する工程を含む、ポリヌクレオチドキャリアから電荷を減少させるための方法。
【請求項１２９】
前記負電荷の量が、前記ポリヌクレオチドキャリアの表面に結合するポリヌクレオチド又はヌクレオチドを減少させるのに十分であるが、前記ポリヌクレオチドキャリアに連結されたセンサのダイナミックレンジに影響を与えるには不十分である、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
４つのヌクレオチド又はヌクレオチド類似体をポリヌクレオチド上に供給する工程であって、４つのヌクレオチド又はヌクレオチド類似体のうちの３つが取込み不可能なヌクレオチド類似体である工程を含む、ポリヌクレオチドに対するヌクレオチド取込みを検知することによるポリヌクレオチド配列決定のための方法。
【請求項１３１】
前記取込み不可能なヌクレオチド又はヌクレオチド類似体が、ＰＮＡヌクレオチド、ＬＮＡヌクレオチド、アデノシン一リン酸、アデノシン二リン酸、アデノシン、デオキシアデノシン、グアニン一リン酸、グアニン二リン酸、グアノシン、デオキシグアノシン、チミン一リン酸、チミン二リン酸５−メチルピリジン、チミジン、シトシン二リン酸、ウリジン、及びデオキシシチジンの群から選択される、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体の濃度レベルが、相対ポリメラーゼ活性に一致する、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３３】
取込み不可能なヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の濃度レベルが、取込み可能なヌクレオチドについての等価なポリメラーゼ結合効率の濃度レベルよりも高い、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３４】
センサを弛張発振器回路に連結して、センサコンダクタンスに比例する周波数を有するクロック信号を発生させる工程を含む、センサを用いてポリヌクレオチドにおけるヌクレオチド取込みを検知するための方法。
【請求項１３５】
少なくとも２つの異なる試薬を使用する工程を含み、第１の試薬がポリメラーゼ精度の増加及びディフェージングの減少の少なくとも一方のために使用され、第２の試薬が検知デバイスの精度を増加させるため使用される、ポリヌクレオチド配列決定において試薬を使用するための方法。
【請求項１３６】
基板と、ポリヌクレオチドに対するヌクレオチド取込みを検知するように構成されたナノニードルデバイスとを備え、ナノニードルが第１及び第２の電極を備え、前記第１の電極が前記基板に直接取り付けられ、前記第２の電極がセンサ上に取り付けられ、前記センサを使用してポリヌクレオチドキャリアを略固定位に配置する、ポリヌクレオチド配列決定のためのシステム。
【請求項１３７】
基板と、ポリヌクレオチドに対するヌクレオチド取込みを検知するように構成されたナノニードルデバイスとを備え、ナノニードルが第１及び第２の電極を備え、前記第１の電極が前記基板又は接着層に直接取り付けられ、前記第２の電極が誘電体層上に配置され、前記誘電体層が前記第１の電極を覆う、ポリヌクレオチド配列決定のためのシステム。
【請求項１３８】
ポリヌクレオチドに対するヌクレオチド取込みを検知するように構成されたナノニードルデバイスを備え、前記ナノニードルが少なくとも１つのキャパシタに連結されて、ドライバ回路からのＤＣバイアスレベルの影響及びチップセンサからの漏れの少なくとも一方を減少させる、ポリヌクレオチド配列決定のためのシステム。
【請求項１３９】
ポリヌクレオチドに対するヌクレオチド取込みを検知するように構成されたナノブリッジセンサを備え、前記ナノブリッジセンサが活性領域を有し、前記活性領域がポリヌクレオチドキャリアを部分的に取り囲み、ポリヌクレオチドキャリアに密接する、ポリヌクレオチド配列決定のためのシステム。
【請求項１４０】
前記ポリヌクレオチドキャリアがビーズである、請求項１３９に記載のシステム。
【請求項１４１】
前記ビーズが磁性体である、請求項１４０に記載のシステム。
【請求項１４２】
前記活性領域の内側部分が前記ポリヌクレオチドキャリアのデバイ長の範囲内にある、請求項１３９に記載のシステム。
【請求項１４３】
前記活性領域が前記ポリヌクレオチドキャリアの直径よりも小さい、請求項１３９に記載のシステム。
【請求項１４４】
ポリヌクレオチドに対するヌクレオチド取込みを検知するように構成されたナノブリッジセンサを備え、前記ナノブリッジセンサが活性領域を有し、前記活性領域が高濃度にドープされてより良好な電気接続を提供する、ポリヌクレオチド配列決定のためのシステム。
【請求項１４５】
ポリヌクレオチドに対するヌクレオチド取込みによって生じる電荷、ｐＨ、及びインピーダンス変化の１つ又は複数を検出するように構成された複数のナノセンサを備え、前記複数のナノセンサが追加の参照電極を有して高ダイナミックレンジ及び高感度を提供する、ポリヌクレオチド配列決定のためのシステム。
【請求項１４６】
複数のナノセンサの前記参照電極及び活性領域間に可変電圧を印加可能である、請求項１４５に記載のシステム。
【請求項１４７】
前記複数のセンサが、ＣｈｅｍＦＥＴ及び非ブリッジの１つである、請求項１４５に記載のシステム。
【請求項１４８】
ヌクレオチド取込みの副産物を測定することにより、ポリヌクレオチドに対するヌクレオチド取込みを測定する工程を含む、ポリヌクレオチド配列決定のための方法。
【請求項１４９】
前記副産物がＰＰｉ及びヒドロニウムイオンの少なくとも１つを含む、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
副産物の測定が、主にヌクレオチド取込み中に行われる、請求項１４８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１１年１２月１日に出願された「ＧＥＮＩＵＳ  ＥＬＥＣＴＲＯＮＩＣ  ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＴＨＥＲＥＦＯＲ」と題する米国仮出願第６１／５６５，６５１号の優先権を主張する。米国仮出願第６１／５６５，６５１号の開示は、参照により本明細書に組み込まれている。
【０００２】
本出願の主題は、参照により本明細書に組み込まれている、２０１０年１０月４日に出願された米国仮出願第６１／３８９，４９０号、２０１０年１０月４日に出願された米国仮出願第６１／３８９，４８４号、２０１１年２月１５日に出願された米国仮出願第６１／４４３，１６７号、２０１１年５月２７日に出願された米国仮出願第６１／４９１，０８１号、２０１２年４月４日に出願された米国仮出願第６１／６２０，３８１号、２０１２年２月１５日に出願された米国出願第１３／３９７，５８１号、２０１２年１０月１日に出願された米国出願第１３／６３２，５１３号、及び２０１１年５月２７日に出願された米国出願第１３／１１８，０４４号に関する。
【０００３】
ナノブリッジは、参照により本明細書に組み込まれている、「ＢＩＯＳＥＮＳＯＲ  ＤＥＶＩＣＥＳ，ＳＹＳＴＥＭＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＴＨＥＲＥＦＯＲ」と題する米国特許出願公開第２０１２／０１３８４６０号に記載されたように、ｐＨセンサとして機能し得る。
【０００４】
本出願は、参照により本明細書に組み込まれているＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０５４７６９に関連する。
【０００５】
本出願はさらに、参照により本明細書に組み込まれているＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０３９８８０に関連する。
【背景技術】
【０００６】
ハイスループットＤＮＡ配列決定を含む迅速かつ費用効率の高い遺伝子及び生物学的解析のための方法が、依然として先端の個人用医薬診断試験の重要な局面となっている。現在のハイスループット又は小型システムには制限がある。例えば、光検出を使用するシステムを含むＤＮＡ配列決定のための現在のシステムは、扱いにくく高価であり、スループットが制限される。一部のシステムはセンサ及び配列決定フローセルを使用してこのような制限に対処するが、これらは一般に１回使用の使い捨てのものであるため、ユーザにとって実質的に費用が高くなり、センサを１回使用のために費用効率よく製造しなければならないため、センサの複雑性が制限される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
遺伝子及び生物学的解析のためのシステム及び方法、特に、感度が高く費用効率の高い、高度に並列な又はクローンの配列決定反応のためのシステム及び方法が必要である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】受信及び送信電極１００により検出可能な種々の経路を示す概略図である。
【図１Ｂ】ヌクレオチド取込みによる抵抗変化を測定するために、センサが、電極間のキャパシタンスの影響をなくすのを助けるよう中域周波数１１０で動作することができる。
【図１Ｃ】電極の長さが短くなると感度が高くなり得ることを示し、これは、反応、例えば、ＤＮＡ配列決定のためのヌクレオチド塩基対の取込みが進むと、基準電流を超える電流の割合の変化が大きくなることからわかる。
【図１Ｄ】一部の可能な電極の実施形態及び電極長さの例示的な範囲（１〜３μｍ）を示す。
【図１Ｅ】図１Ｅの電場線１６０は、ビーズから最も離れた電極の部分が、バルク溶液１８０の抵抗又はキャパシタンスの変化を主にどのように検知するかを示す。
【図２Ａ】凹みは、例えば基板２０２に堆積された誘電体層２０３等の材料から形成されていてもよく、凹みを形成する材料は、前記材料に形成された標的反応を検知するための活性領域２０５を有することができる。
【図２Ｂ】ビーズ２０１の表面積のより多くの部分がバルク溶液２００に晒されるように、より浅い凹みを有することを除いて、図２Ａと同様のさらなる実施形態を示す。
【図２Ｃ】活性領域２０５が、誘電体層２０３に形成された凹みの縁部、及びしたがってビーズの縁部に一致し得る円弧に形成された、ナノニードルセンサのさらなる実施形態の上面図である。
【図３】図３に示す「仮想ウェル」のアレイを作成することができる。
【図４Ａ】代替実施形態では、図４Ａに示すように、１つの電極４０５Ａを基板４０２に直接取り付けることができる。
【図４Ｂ】図４Ａに示すような実施形態の上面図が図４Ｂに示される。
【図４Ｃ】図４Ｃに示すように、ビーズ４０１又は粒子を基板４０２上で定位置に保持することができる。
【図４Ｄ】図４Ｄに示すように、ＤＮＡ鎖がヌクレオチドと組み合わさって、２つの電極間の検出可能なインピーダンスを変化させることができる。
【図５Ａ】図５Ａは、ナノニードルの拡大図（左）及びナノニードルアレイの上面図（右）である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、微小流体チャネル内のナノニードルセンサの一実施形態の上面図の顕微鏡写真である。
【図６】図６は、ナノニードルアレイの概略図であり、上部にナノニードルセンサ６００の拡大図を示す。
【図７】図７に示すように、ナノニードル又はナノブリッジセンサのアレイが、ＤＮＡ配列決定のためのＤＮＡ等の標的分子を結合するために、例えばビーズ７４０等のキャリアに関連付けられる。
【図８】一部の実施形態では、放電電位が水の放電電位よりも小さいためガスが発生しない化学物質を溶液に加えることにより、気泡の問題を克服することができる、ＨＱの加水分解電圧は水の加水分解電圧よりも小さい（それぞれ０．６Ｖ、１．２Ｖ）ため、図８に示すように放電電位が小さい。
【図９Ａ】図９Ａは「リング」ナノブリッジの側面図であり、活性領域９０５の内部が、ビーズ９０１又は粒子及びこれらに結合され得るＤＮＡのデバイ長の範囲内にある。
【図９Ｂ】図９Ｂに示すように、リング９０５及び支持構造９０３が、ビーズ９０１又は粒子の直径よりも小さくなるように寸法決めされて、特にビーズが磁気アレイ又は電場によって保持されるときにリング上に載置され得るようにし、リングがビーズ又は粒子及びこれに結合されたＤＮＡのデバイ長の範囲内に確実にあるようにする。
【図９Ｃ】図９Ｃは、リング構造と共に実装されるナノブリッジの上面図であり、ビーズ９０１がセンサの活性領域９０５に重なる様子と、活性領域９０５のインピーダンスを測定する手段を提供可能な導体９０４とを示す。
【図１０】一部の実施形態では、ナノニードルが、一実施形態の上面図が示される図１０にあるような修正リング構造を有するように構成されていてもよい。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ヌクレオチドの取込み及び結果として生じる信号出力によるＤＮＡの伸長を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、誤ったヌクレオチドがシステム（制御）に導入されている１１００か、正しいヌクレオチドが取り込まれている１１２０かに応じて信号出力に見られる差を示す。
【図１１Ｃ】過渡信号測定の図が図１１Ｃに示される。
【図１２Ａ】ｄＮＴＰを含む試薬スラグは、最初にフローセルに入ることができるが、図１２Ａに示すように、ｄＮＴＰがコロニーのいずれかに結合し組み合わさるのに十分なほど遠くまで、フローセル内でまだ移動していない。この時点で、データをまったく取らないことも可能となり得る。
【図１２Ｂ】試薬スラグが、フローセルに十分に入って第１の領域の１組のコロニーと相互作用する。この時点で、データを第１の領域のコロニーに関連する検出器から取ることができるが、フローセルの他の領域からは取ることができない。
【図１２Ｃ】試薬スラグがフローセルに十分に入って第２の領域の１組のコロニーと相互作用することができる。この時点で、データを第２の領域のコロニーに関連する検出器から取ることができ、かつ試薬スラグの速度及びポリメラーゼの速度に応じて、依然として第１の領域から取る必要があり得るが、フローセルの他の領域からは取る必要がないとされ得る。
【図１２Ｄ】試薬スラグはフローセルを通って十分に横切って、フローセル内の最後の組のコロニーと相互作用し始める。この時点で、最後の領域のコロニーと関連する検出器からデータを取ることができる。試薬スラグの速度、ポリメラーゼの速度、フローセルの長さ、及びコロニーのサイズに応じて、前記最後の組のコロニーのすぐ前の領域等の前の領域から、一部のデータを依然として取る必要があり得るが、フローセルの他の領域からは取る必要がないとされ得る。
【図１２Ｅ】図１２Ｅに示すように、一部の実施形態では、特徴の無い（ヌル）ビーズを差分測定の参照として使用することができる。
【図１２Ｆ】一部の実施形態では、図１２Ｆに示すように、空センサ（ビーズ無し）を参照として使用することにより、差分測定が行われる。
【図１２Ｇ】別の実施形態では、図１２Ｇに示すように、取込み反応のないビーズ又はセンサ領域により、空センサ又は特徴の無いビーズに対してより良好な参照を提供することができる。
【図１２Ｈ】一実施形態では、図１２Ｈに示すように、隣接する検出器を参照チャネルとして使用して、重合反応が起きている検出器に隣接する検出器である検出器でｐＨ又はイオン濃度が変化するときに、これらを測定する機会をデータ解析アルゴリズムに与える。
【図１２Ｉ】さらなる実施形態では、図１２Ｉに示すように、センサ領域１２２０を参照として使用することができる。
【図１２Ｊ】図１２Ｊは、一部の実施形態において、反応発生センサ１２１０のないに近接した、反応発生あるセンサ１２００を示す。
【図１２Ｋ】図１２Ｋは、実際には反応発生がないセンサ１２１０の「誤検出」信号１２１５Ｂを示す出力データ信号の一実施形態を示す。
【図１２Ｌ】一実施形態では、図１２Ｌに示すように、クロストークデコンボリューション関数行列を使用することにより、差分測定を行うことができる。
【図１２Ｍ】別の実施形態では、図１２Ｍに示すように、特徴の無いビーズ又は異なる配列を有するビーズが試料ビーズとのペアワイズで導入され、差分増幅器を使用して信号が判定される。
【図１２Ｎ】図１２Ｎのデータは、ナノニードルセンサにより測定されたＤＮＡ伸長による実験結果を示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂのヌクレオチド取込み反応は、定常状態検出方法を使用して、例えばヌクレオチド取込みにより生じる電荷（Ｑ）又はインピーダンスの変化等の反応周りの環境の変化を直接検出可能であることを示す。
【図１４】図１４は、定常状態検出モードで発生した信号の例示的な実施形態を示す。
【図１５】図１５は、２、４、１４及び３３塩基部分について０．５塩基よりも少ない非線形性を有する線形ホモポリマー読取りからの生の未処理データの別の実施形態を示す。
【図１６】一実施形態では、過渡状態検出中及び定常状態検出中に発生した信号の比較が図１６に示される。
【図１７】ナノニードルセンサにより定常状態検出中に生成された実験生データの例示的な実施形態が図１７に示され、図１７は、３塩基１７００、０塩基１７２０、及び５塩基１７４０の取込み後の検出についての信号出力の差を示す。
【図１８Ａ】定常状態検出方法に基づくＤＮＡ配列決定のための生データ出力の例示的な実施形態をさらに示す。
【図１８Ｂ】定常状態検出方法に基づくＤＮＡ配列決定のための生データ出力の例示的な実施形態をさらに示す。
【図１９Ａ】図１９Ａは、ナノニードルセンサによるＤＮＡ配列決定におけるホモポリマー読取りの結果を示す。
【図１９Ｂ】図１９Ｂの配列決定しているテンプレートは、Ａ  ＡＡＡ  ＡＡＣ  ＣＣＣ  ＣＣＴ  ＴＴＴ  ＴＴＡ  ＡＡＡ  ＴＴＴ  ＴＣＣ  ＣＣＡ  Ａである。
【図１９Ｃ】図１９Ｃは、異なるナノセンサによる図１９Ｂのホモポリマーランの繰返しランである。
【図２０】取り込まれたヌクレオチドが「ＡＴＧＧＡＡＴＴＧＧＧＡＡＡＡＡＴＡ」であることを示し、これは実験で使用されたＤＮＡテンプレートの配列に一致している。
【図２１】さらなる実施形態では、図２１に示すように、ナノニードル及びナノブリッジセンサを同一のピクセルで使用することができる。
【図２２Ａ】一実施形態では、図２２Ａに示すように、デバイス２２２５の両側に読出しポート２２００があってもよい。
【図２２Ｂ】他の実施形態では、図２２Ｂに示すように、チップの４辺すべてに沿ってポートがあり得るため、読出し速度を低下させ、関連して信号対雑音比を増加させることができる。
【図２３】一部の実施形態では、システムが、図２３に示すＦｉｎＦＥＴと同様に配置されたブリッジセンサ等のセンサを使用することができる。
【図２４】図２４は、一実施形態において、閉込めセル内で時間（ｔ）にわたって電場がＤＮＡ濃度に与える影響を示す。
【図２５】図２５に示すように、一部の実施形態では、閉込めセル２５２０に関連する磁石２５００がビーズ２５６０を保持する。
【図２６】一部の実施形態では、図２６に示すように、内部電極が交番する正及び負の極性又は電荷を有して、内部電極２６２０間に位置するビーズ２６００に近接してテンプレートＤＮＡ及び試薬を濃縮させるようにしてもよい。
【図２７Ａ】さらなる実施形態では、図２７Ａに示す通り、左右の写真を比較した際に交互に照明された領域によってわかるように、内部電極の正電荷及び負電荷を交番するプロセスが、隣接するセル２７００間で調整される。
【図２７Ｂ】一部の実施形態では、調整された交番電荷を持つ隣接セルの電極を有する効果が、図２７Ｂの２−Ｄに示され、ここでは、同一の電荷を有する隣接電極のため、隣接するセルの電場線（ＡＣ＝１Ｖ、２Ｈｚ；ＤＣ＝ＩＶ）が内側を向いている。
【図２７Ｃ】さらなる実施形態では、図２７Ｃは、図２７Ｂと同一の概念を３次元表示で示す。図の照明された領域は、異なるピクセルの隣接電極を示し、前記隣接電極は、同一時間中同一のものを有する。
【図２８】さらなる実施形態では、図２８に示すように、例えばチャネル上部等の閉込めセルの外側に１つ又は複数の電極が配置されていてもよい。
【図２９】一実施形態では、層の拡大図を示す図２９に示すように、磁石が「サンドイッチ」層構成を有することができる。
【図３０】図３０に示すように、一部の実施形態では、閉込めセルアレイ３０２０の長さに沿って延びる磁気棒３０００があってもよい。
【図３１】一部の実施形態において、閉込めセル３１２０に関連する磁気ビーズ３１６０が１つの磁石３１００の上方に位置する。
【図３２】間隙サイズは、ビーズ上の所望の磁気力を可能にするように最適化され得る。例えば、間隙サイズ等のパラメータを変化させることにより、図３２に示すようなビーズ捕捉効率等の要因を最適化することができる。
【図３３Ａ】図３３Ａでは、別の実施形態において、閉込めセル３３２０に位置する１つ又は複数の磁石３３００に加えて、閉込めセル３３２０の上部又は外側、例えば、チャネル３３３０上部に位置する１つ又は複数の外部磁石３３１０があってもよい。
【図３３Ｂ】図３３Ｂに示すように、さらなる実施形態では、１つ又は複数のトレンチ３３７０がビーズ３３６０の真下に位置して、ビーズ３３６０の底面を標的分子の送達又は結合のために使用できるようにしてもよい。
【図３３Ｃ】代替実施形態では、図３３Ｃに示すように、内部電極３３８０及び外部電極３３４０の両方の縁部が丸くても、内部電極が鋭い縁部を有し外部電極が鋭い縁部を有していなくてもよく、又はその逆も可能である。
【図３３Ｄ】代替実施形態では、図３３Ｄに示すように、閉込めセル３３２０が複数の内部電極３３８０を有し、例えば、閉込めセル３３２０は４つの内部電極３３８０から構成される。
【図３３Ｅ】さらなる実施形態では、図３３Ｅに示すように、内部電極３３８０が半円形で、外部電極３３４０も円形であってもよい。
【図３３Ｆ】図３３Ｆは、一部の実施形態において、１つの内部電極３３８０があり得、この内部電極３３８０に近接して、又は内部電極３３８０上方にビーズ３３６０が位置し、さらに前記内部電極３３８０を囲む外部電極３３４０があり得ることを示す。
【図３３Ｇ】図３３Ｇに示す一実施形態では、例えば、より小さい中央電極３３４５を囲む外部電極３３４０があり得、前記中央電極が１つの内部電極３３８０を囲む。
【図３３Ｈ】図３３Ｈに示すさらなる実施形態では、２つ以上の内部電極３３８０があってもよい。
【図３３Ｉ】図３３Ｉに示す別の実施形態では、閉込めセル３３２０の周囲に沿った外部電極３３４０と、２つの内部電極３３８０をブラケットで支えるさらに２つの中央電極３３４５があってもよい。
【図３３Ｊ】図３３Ｊでは、一実施形態において、磁石３３００を電極３３７５上部に位置させて、電極３３７５が露出される張出し部分があり、磁石３３００上に酸化物層３３０５があるようにしてもよい。
【図３３Ｋ】代替実施形態では、図３３Ｋに示すように、電極３３７５が磁石３３００上部にあって、磁石３３００を露出させる張出しがあり、磁石３３００が酸化物層３３０５に覆われるようになっている。
【図３３Ｌ】図３３Ｌは、基板３３３１上方の閉込めセル３３２０の一実施形態を示す。
【図３３Ｍ】図３３Ｍは、閉込めセルアレイ３３２５及び概念写真３３３５の対応する実証の一実施形態の図である。
【図３３Ｎ】図３３Ｎは、さらなる実施形態で、チャンバなし増幅のための微小流体チップの一部として配置された閉込めセルアレイ３３２５を示す。
【図３４Ａ】テンプレートが完全に装填されたビーズは、より高い電荷を有するため、プライマー又は少しのテンプレート、又は短い、若しくは不完全なＰＣＲ産物のみを有するビーズよりも電場内で遠くへ移動することができる。一部の実施形態では、図３４Ａ（正面図）及び図３４Ｂ（上面図）で示すように、モジュール３４００を通してこの分離を達成することができる。
【図３４Ｂ】テンプレートが完全に装填されたビーズは、より高い電荷を有するため、プライマー又は少しのテンプレート、又は短い、若しくは不完全なＰＣＲ産物のみを有するビーズよりも電場内で遠くへ移動することができる。一部の実施形態では、図３４Ａ（正面図）及び図３４Ｂ（上面図）で示すように、モジュール３４００を通してこの分離を達成することができる。
【図３４Ｃ】図３４Ｃに示すように、電気泳動力（電場）の印加により生じ得る１つの潜在的問題は、電気浸透流である。
【図３４Ｄ】図３４Ｄの一実施形態に示すように、電気浸透流に関連し得る円形パターンを防止するために、マイクロポール又は壁等の流れ制限部分３４２０の物理的バリアを微小流体チャネルに埋め込んで、流れが確実に線形のままであるよう助けることができる。
【図３４Ｅ】一部の実施形態では、図３４Ｅに示すように、濃縮モジュールがチップの一部であり、入口ポート３４０９Ａ、収集ポート３４０９Ｂ、右緩衝液ポート３４１４Ａ、左緩衝液ポート３４１４Ｂ、電極リザーバ３４１５、及び排水ポート３４１６があってもよい。
【図３５】代替実施形態では、図３５に示すように、ビーズ３５４０に付着可能な二本鎖又は一本鎖ＤＮＡ３５２０に結合する、適切なサイズの他のタンパク質３５００を使用してもよい。
【図３６Ａ】図３６Ａは、ＤＮＡライブラリー構成モジュール３６００、エマルジョンなし増幅モジュール３６２０、電気泳動濃縮モジュール３６４０、及びＤＮＡ配列決定モジュール３６６０から構成され得る一体型配列決定プラットフォームを示す。
【図３６Ｂ】図３６Ｂは、試料調製モジュール３６１０及びＤＮＡ配列決定モジュール３６６０が再利用可能な磁気電子チップ３６８０上で一体化され得る一部の実施形態を示す。
【図３７】図３７に示すように、チャンバなし手法を微小流体制御と組み合わせることができる。
【図３８Ａ】一実施形態において、図３８Ａに示すように、「チャンバなしナノリアクタ」チップの目的は、微小磁石のアレイ上に高密度で配置された単一のビーズに、クローン的に増幅されたテンプレートを生成することである。
【図３８Ｂ】図３８Ｂは、微小流体チャネルチップ３８００の拡大図の、概念写真３８００Ａの実証の例示的な実施形態を示す。
【図３８Ｃ】図３８Ｃは、チャンバなしナノリアクタチップ３８４０のプロトタイプ３８４０Ａの一実施形態の写真を示す。
【図３９】例示的な実施形態では、図３９に示すように、ナノセンサアレイ３９００を、流れ３９２０の方向と比較して１１度で配置することができる。
【図４０】図４０は、電極を有する微小磁気アレイのマスク配置を示す。
【図４１】図４１は、捕捉された常磁性ダイナビーズ４１２０を有する微小磁気アレイ４１００Ａの写真を示す。
【図４２】図４２は、磁気アレイ４２００Ａのセルのピッチサイズが１２μｍで、磁気アレイ４２００Ｂのセルのピッチサイズが２０μｍである実験データの２つの実施形態を示す。
【図４３Ａ】例示的な実施形態では、図４３Ａで、ビーズ４３００及び電極４３２０並びに電流の流路４３４０の１つの構成の側面図が示される。
【図４３Ｂ】電極４３２０及びビーズ４３００配置の別の構成の上面図も、アレイ構成の上面図として図４３Ｂに示される。
【図４４Ａ】図４４Ａは、ＤＮＡ分子の２次元濃度プロファイルを示す。
【図４４Ｂ】図４４Ｂは、対応する電場流線を示す。
【図４４Ｃ】図４４Ｃは、図４４Ａと図４４Ｂとのオーバーレイを示す。
【図４４Ｄ】図４４Ｄは、電場の印加によって生じ得るＤＮＡ濃度を示す２次元プロファイルを示す。
【図４５】電気泳動を使用する、アンプリコン陽性及びプライマー専用ＤＮＡビーズの電荷及び電場に基づく分離が、ビーズ分離モジュールの概略図によって示される図４５の例示的な実施形態に示される。
【図４６Ａ】図４６Ａは、ナノニードルセンサの一実施形態の上面顕微鏡写真を示す。
【図４６Ｂ】図４６Ｂは、２次元ナノニードル４６７０アレイの概略図を示す。
【図４６Ｃ】２次元ナノニードルアレイの対応する回路が図４６Ｃに示される。
【図４７Ａ】図４７Ａは、ゲート４７２０を検知のために支持する本体４７６０があり、且つソース４７４０及ビーズレイン４７００があるＭＯＳＦＥＴを示す。
【図４７Ｂ】図４７Ｂは、酸化物構造４７９０により支持された検知領域４７８０のある空乏モードナノレジスタを示す。
【図４７Ｃ】図４７Ｃは、ナノブリッジの電子顕微鏡法に基づく写真を示す。
【図４７Ｄ】例示的な実施形態では、図４７Ｄは、ＳＯＩ構造４７０５が微小流体チャネル４７０３に接触している、ナノブリッジセンサのより詳細な写真を示す。
【図４８】同一の印加電圧について、信号レベルの変化は、図４８のシミュレーションデータに示すように３〜４倍高くなり得る。
【図４９Ａ】例示的な実施形態では、図４９Ａが、微小磁気アレイの一部である閉込めセルのウェルなしビーズ捕捉構成の図を示す。
【図４９Ｂ】図４９Ｂに示すように、流れがウェル構造によって妨げられることがないため、例えばヌクレオチド、ポリメラーゼ等の試薬の流れを向上させることができる。
【図５０Ａ】図５０Ａに示すように、データをハードドライブに保存する前の、追加信号フィルタ処理及びオフセット調節を可能にするＬａｂＶｉｅｗのソフトウェアが開発されている。
【図５０Ｂ】図５０Ｂは、ブレッドボードの種々の部品、すなわち、Ｌａｂｖｉｅｗソフトウェアディスプレイ５０００、回路基板５０１０、流体制御５０２０、チップキャリア及び試薬ブロック５０３０、並びに組み立てられたシステム５０４０の例としての実施形態を示す。
【図５１】すべてのデータをＤＡＣカードにより取得することができ、ＤＡＣカードは、図５１に示すように、データ解析前にコンピュータのディスクにデータをバッファリングすることができる。
【図５２】図５２に示すように、初期実験は種々のモル濃度の塩溶液を用いて行われる。
【図５３Ａ】図５３Ａは、ストレプトアビジン常磁性ダイナＭ２７０ビーズがセンサ上で捕捉され得るＤＮＡ電荷誘起センサ応答（ボルトで表す）を示す。
【図５３Ｂ】図５３Ｂは、テンプレート完全伸長の信号を示す。
【図５４Ａ】図５４Ａは、ナノニードル電極５４００がビーズ５４２０に近接し、前記ビーズが磁気領域５４４０により保持される、ナノニードルセンサを使用する例示的な実施形態を示す。
【図５４Ｂ】図５４Ｂは、ビーズ５４２０に近接して位置し、前記ビーズが磁気領域５４４０により保持されるナノブリッジセンサ５４６０を示す。
【図５４Ｃ】図５４Ｃは、ナノブリッジセンサ５４６０及びナノニードル電極５４００の両方がビーズ５４２０に近接し、前記ビーズが磁気領域５４４０により保持される二重センサ構成を示す。
【図５５Ａ】一実施形態では、例示的な統合システムが、図５５Ａに示すような機器に含まれる。
【図５５Ｂ】図５５Ａの機器の代替図が図５５Ｂに示される。
【図５６】例示的な統合システムの機器の別の実施形態が図５６に示され、ここでは、信号情報を受信し、プロプライエタリソフトウェアを使用して出力を表示するコンピュータに、機器を接続することができる。
【図５７】前記機器のさらなる実施形態が図５７に示され、ここでは、機器のサイズがラップトップのサイズと比較される。
【図５８】一部の実施形態では、図５８に示すような弛張発振器回路を使用して、センサコンダクタンスに比例する周波数を有するクロック信号を発生させることができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
ナノニードル
ナノニードル型のバイオセンサを、抗体及び抗原等の生化学種の特性化のため、及び／又はＤＮＡ配列決定、ＤＮＡハイブリダイゼーション、リアルタイムＰＣＲ、タンパク質、又は他の生物種及び化学種検出の１つ又は複数を伴う適用のために使用することができる。
【００１０】
本開示の例示的な実施形態では、ナノニードルを使用して、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡハイブリダイゼーション、若しくはタンパク質検出等の対象の適用のための、ＤＮＡ若しくはタンパク質等の対象の生体分子に関連する対イオン濃度又はデバイ長の変調によって生じるインピーダンス変化を検出することができる。例えば、ＤＮＡ配列決定では、インピーダンス変化がヌクレオチドの取込みに関連し、この変化を使用して、取込み事象を検出しＤＮＡ配列を同定することができる。ヌクレオチドを既知の順序で注入して、インピーダンス測定を通した取込みの検出による相補的塩基の同定を可能にすることができる。一本鎖ＤＮＡ等の生体分子がビーズ等のキャリアに付着することができ、又は基板の表面に直接結合され得る。
【００１１】
ＤＮＡが結合されるビーズ等のキャリアへの近接に対するナノニードルの電極の物理的位置は、インピーダンス測定の感度に影響し得る。例えば、ナノニードルの電極とＤＮＡが結合されるビーズ等のキャリアとの物理的整合が十分でない場合、センサインピーダンスはバルク試薬のインピーダンスによって支配され得る。例えば、バルク試薬のインピーダンスが電極間の総インピーダンスの９０パーセントを構成し、ビーズ上のＤＮＡ及びその関連する対イオンのインピーダンスが電極間の総インピーダンスの１０パーセントを構成する場合、ＤＮＡ及び関連する対イオンのインピーダンスが１パーセント変化することにより、電極間の総インピーダンスが０．１パーセント変化する。バルク試薬のインピーダンスからの干渉を最小限にしながら、電極間の総インピーダンスの割合変化を測定するセンサの能力を最大化するために、センサ電極の位置をビーズからの距離に対して修正することができる。
【００１２】
図１Ａは、受信及び送信電極１００により検出可能な種々の経路を示す概略図である。Ｃｂ及びＲｂは、バルク溶液によるキャパシタンス及び抵抗をそれぞれ表す。ＲＤＮＡは、ビーズ１４０に固定されたテンプレートＤＮＡ鎖１２０に近接した領域による抵抗である。ＲＤＮＡは、固定ＤＮＡ鎖（ビーズ及び／又はＤＮＡ鎖のデバイ層中のもの）に近接し関連した移動イオンの濃度修正のため、Ｒｂとは異なっている。ビーズ１４０に固定されたテンプレートＤＮＡ鎖１２０へのヌクレオチド取込みによるＲＤＮＡの変調をナノニードルによって使用して、取込み事象、したがってＤＮＡ鎖１２０の配列を検出することができる。Ｃｄｌは、受信及び送信電極１００の周りの二重層キャパシタンスである。
【００１３】
ビーズ及びビーズに固定されたＤＮＡ鎖に関連するＣＤＮＡ（図示せず）があり、これは集中素子としてのモデルにおけるＲＤＮＡに有効に並列である。
【００１４】
次に図１Ｂを参照すると、ヌクレオチド取込みによる抵抗変化を測定するために、センサが、電極間のキャパシタンスの影響をなくすのを助けるよう中域周波数１１０で動作することができる。一部の実施形態では、図１Ｃに示すように、この動作条件は、電極のサイズ及び送信及び受信電極の間隔に依存する。この図は、電極の長さが短くなると感度が高くなり得ることを示し、これは、反応、例えば、ＤＮＡ配列決定のためのヌクレオチド塩基対の取込みが進むと、基準電流を超える電流の割合の変化が大きくなることからわかる。低周波では、二重層キャパシタンスがインピーダンスを支配することができ、抵抗変化に対するセンサの感度が小さくなり得る。非常に高周波では、２つの電極間の寄生キャパシタンスが優位になり得る。電流はその領域を直接通過し、抵抗変化に対する感度が低下する。したがって、電極のサイズ及び形状に基づいて、センサの最高感度について最適な動作条件を達成することができる。
【００１５】
図１Ｄは、一部の可能な電極の実施形態及び電極長さの例示的な範囲（１〜３μｍ）を示す。電極のサイズは、長さ、幅及び深さが７ｎｍ〜７０ｎｍ又は７０ｎｍ〜７００ｎｍ又は７００ｎｍ〜７μｍであり得る。図１Ｅの電場線１６０は、ビーズから最も離れた電極の部分が、バルク溶液１８０の抵抗又はキャパシタンスの変化を主にどのように検知するかを示す。ビーズから最も離れた電極の部分の電場線は、ビーズから離れる側を向く方向を有し、電流路がビーズの周りではなく試薬を通ることを示す。電極がより小さくビーズにより近い一部の実施形態では、電流のより大きい部分がビーズの周りを通るため、センサの感度を増加させることができる。ＤＮＡ取込み事象をより良好に検出するために、基準電流及び感度を増加させる最適な電極構成があり得る。
【００１６】
一部の実施形態では、ナノニードル電極とビーズ又は粒子との間に存在し得るバルク試薬体積の量を最小にするために、ナノニードル等のセンサ用のセンサ電極を、ビーズに近接させることが望ましいとされ得る。一実施形態は、磁場又は電場又はリンカーを介した取付けによって平坦面又は略平坦面に保持されたビーズを有することができる。一実施形態は、図２Ａ、図２Ｂ及び図２Ｃに示す凹みに保持されたビーズを有することができる。
【００１７】
図２Ａに示すように、凹みは、例えば基板２０２に堆積された誘電体層２０３等の材料から形成されていてもよく、凹みを形成する材料は、前記材料に形成された標的反応を検知するための活性領域２０５を有することができる。電極２０４の活性領域２０５は、標的分子及び／又は標的反応を検知することができる。凹みを使用して、バルク溶液２００に晒されたビーズ２０１等のキャリアを保持することができる。
【００１８】
図２Ｂは、ビーズ２０１の表面積のより多くの部分がバルク溶液２００に晒されるように、より浅い凹みを有することを除いて、図２Ａと同様のさらなる実施形態を示す。この実施形態は、ビーズ２０１の表面積がより多くバルク溶液２００に晒され、これにより、ビーズ表面へより効率的に試薬を送達することができ、より多くの標的分子を表面に結合させることができ、活性領域２０５により検出可能な標的反応からの信号を強化する可能性がある点で望ましいとされ得る。
【００１９】
図２Ｃは、活性領域２０５が、誘電体層２０３に形成された凹みの縁部、及びしたがってビーズの縁部に一致し得る円弧に形成された、ナノニードルセンサのさらなる実施形態の上面図である。活性領域２０５を電極２０４に接続することができ、このナノニードルの実施形態は、標的分子及び／又は反応の検出のためにバルク溶液２００に晒される。電極２０４は水平トレースを有することができ、又は読出回路、例えば下位層のＣＭＯＳ読出回路に直接下がることができる。ナノニードルセンサの高密度アレイでは、アレイ内のセンサの活性領域２０５によって検出され得る標的反応からの信号が、異なる形状及び／又はサイズを有することができる。センサのアレイは、アレイ毎に１００〜１０万のセンサ、１０万〜１００万、１００万〜１０００万、１０００万〜１億、又は１億〜１０億のセンサであってよい。
【００２０】
これにより、電極は、ビーズ又は粒子及びこれらに付着若しくは結合したＤＮＡの表面のデバイ長の範囲内にあり得る。ナノニードルデバイスにより、バルク試薬溶液によるナノニードル電極間の総インピーダンスへの影響を最小化することができ、ビーズ又は粒子の表面に付着又は結合したＤＮＡによる影響を最大化することができる。
【００２１】
一部の他の実施形態では、ビーズを凹みのない平坦面上に保持することができる。このような実施形態では、ナノニードルのセンサまた電極をＤＮＡ被覆ビーズに近接させることができるが、凹み又はキャビティがなく、ビーズが、限定されないが、磁場又は電場又は異なる力の組合せを含む仮想場力によって保持される平坦面又は略平坦面上に配置される。このように、さらなる実施形態では、図３に示す「仮想ウェル」のアレイを作成することができる。磁気力又は電気力が、一部の実施形態においてビーズ３２０上又はビーズ３２０近くにテンプレートＤＮＡ等の標的粒子を閉じ込めることができるため、この仮想ウェル３００を「閉込めセル」３００とも呼ぶこともできる。「仮想ウェル」又は「閉込めセル」の構造及び動作に応じて、これらは「３次元ケージ」又はリアクタとして動作することができる。リアクタを、増幅、分離、閉込め、濃縮、化学種又は生物種の検出等の異なる適用に使用することができる。例えば、リアクタを、ＤＮＡの高効率エマルジョンなし増幅、又は高効率ＤＮＡ若しくはＲＮＡ合成、又はＤＮＡハイブリダイゼーションアレイ等に使用することができる。
【００２２】
一実施形態では、図３に示すように、ビーズ３２０が閉込めセルに装填され、すでに付着したＤＮＡテンプレート等の標的粒子を有することができる。ヌクレオチド又は他の試薬を、仮想ウェル／閉込めセルのアレイに注入することができる。ＤＮＡ配列決定等の標的反応が完了し、ナノニードル又はナノブリッジ又は他のタイプのセンサ等のセンサにより検出された後、試薬、標的分子、及びビーズを洗浄することができる。この方法により、閉込めセル３００のアレイを再利用可能にすることができる。凹みに詰まるおそれがあり除去するのが困難になり得るビーズ、試薬、及び標的分子をより容易に洗浄することができるため、凹み又は物理的ウェルの代わりに閉込めセルを使用することが望ましいとされ得る。一実施形態では、電場が、ビーズ及び／又はテンプレートＤＮＡの周りのヌクレオチド、ＤＮＡ鎖、又は他の分子を含むことができ、又は移動させることができる。
【００２３】
さらなる実施形態では、ナノセンサアレイの基板の表面への物理的リンカーを通して、ビーズを配置することができる。
【００２４】
代替実施形態では、図４Ａに示すように、１つの電極４０５Ａを基板４０２に直接取り付けることができる。ビーズ４０１又は粒子を固定位置に配置するために使用されるセンサ４１３の一部に、ナノニードル上の第２の電極４０５Ｂを取り付けることができる。これにより、ビーズ又は粒子が両方の電極に接触して、ナノニードル電極４０５Ａ、４０５Ｂ間の総インピーダンスに対するバルク試薬溶液４００の影響を最小限にすることができる。これは、対象のインピーダンス測定における、ビーズ又は粒子、及びビーズ又は粒子に付着若しくは結合されたＤＮＡに関連するデバイ長の範囲内の対イオンから生じたインピーダンスとは対照的である。
【００２５】
図４Ａに示すような実施形態の上面図が図４Ｂに示される。この上面図は電極４０５Ａを示し、電極４０５Ａは、ビーズ４０１の下及びビーズ４０１に近接して基板４０２に直接取り付けられ得る。第２の電極４０５Ｂはセンサ４１３に接触することができ、センサ４１３はビーズ４０１を固定位置に配置するために使用される。
【００２６】
さらなる実施形態では、図４Ｃに示すように、ビーズ４０１又は粒子を基板４０２上で定位置に保持することができる。ナノニードルの第１の電極４０５Ａを、基板４０２に直接、又は前記基板に接着された接着層（図示せず）に取り付けることができる。その後、誘電体層４１４を、前記第１の電極を覆うように作製することができる。次に、ナノニードルの第２の電極４０５Ｂを、誘電体及びナノニードルの前記第１の電極の上方に作製することができる。第２の電極は第１の電極より短くてもよい。ビーズの湾曲に一致するように、電極間の長さの差によって傾斜を生じさせてもよい。長さの差は、ビーズ又は粒子の直径、並びに２つの電極及び電極間の誘電体の厚さの関数であり得る。このように、電極がビーズに接触し、又はビーズに非常に近接して、ビーズ又は粒子及びビーズ又は粒子に付着若しくは結合されたＤＮＡに関連するデバイ長の範囲内の対イオンから生じるインピーダンスが、バルク試薬溶液４００のインピーダンスよりも大きくなるようにすることができる。
【００２７】
一部の実施形態では、基板へのビーズ又は粒子の配置を、物理的ウェル又は凹みを介して行うことができ、又は、リンカー機構及び／若しくは化合物又は方法の２つ以上の組合せを通した磁気力若しくは電気力若しくは物理的結合によりビーズを保持することによって達成することができる。
【００２８】
誘電体基板を使用して電極をシールドすることによって、センサによるインピーダンス測定を最大化することもできる。基板は、ガラス、石英、プラスチック、又は任意の他の誘電体材料から構成又は作製され得る。一部の実施形態では、シリコン基板が、酸化ケイ素、窒化ケイ素、若しくは他の酸化物層、又はさらにポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ＳＵ８等のポリマー若しくは別のポリマー等の誘電体層により覆われていてもよい。このタイプの基板は、基板を通る電流の流れを最小にして、ビーズの周りのインピーダンス変化を増大させ、センサへの所望の信号出力を最大化するために使用される。
【００２９】
別の実施形態では、一方又は両方の電極の一部が誘電体層により覆われていてもよい。一部の実施形態では、ビーズ又はＤＮＡに最も近接した電極の部分が覆われないままになっている。これらの実施形態は、電極をシールドすることにより、センサのインピーダンス測定を最適化することができる。これらの構成は、バルク溶液からのインピーダンス測定の防止を助けることができる。
【００３０】
一実施形態では、一方又は両方の電極の先端が、薄い誘電体層で被覆される。この薄い誘電体層は、電極と溶液との間にバリアを提供し、腐食の量及び／又は速度を低下させる。このようにして、薄い誘電体層のない電極の寿命と比較して、被覆電極の有効寿命を延ばすことができる。層の厚さは０．３ｎｍ〜１０ｎｍであってよく、一部の実施形態では、厚さが１０ｎｍ超であってもよい。
【００３１】
この被覆により、バルク溶液に晒されたときに所望通りに機能しないおそれのある電極材料を、より広い範囲から選択できるようになる。例えば、腐食を受けやすいアルミニウム、銅、タングステン、又は他の材料を電極材料として選択して、薄い誘電体層で被覆することができる。これにより、ＣＭＯＳ作製プロセスと適合しないおそれのある材料を選択することも可能になる。さらに、これによって、より安価であり得る材料の選択が可能になる。この薄い誘電体層を、原子層堆積（ＡＬＤ）又は他の作製技術を介して被覆することができる。ナノニードルは交流電流（ＡＣ）モードで動作することができるため、信号が薄い誘電体層を通過することができる。実施形態では、電極材料をシリコン、又はドープポリシリコン若しくはドープ結晶シリコン等の他の半導体材料から作製することができる。材料は自然酸化物層又はドープ薄層を有することができる。
【００３２】
一部の実施形態では、電極近くの誘電体層に加えて、接地若しくはシールド層（又はシールドとして作用する低インピーダンス導電）があってもよい。さらなる実施形態では、接地／シールド層が基板の基層に位置し、例えば、シリコン基部に位置する。この接地／シールド層は、例えば銅、アルミニウム、白金、金、又は別の金属等の金属であってもよい。接地／シールド層は、バルク溶液から、又は基材からの信号干渉を減少させて、電極を通る信号を、ヌクレオチド取込みによるコンダクタンスの変化を測定するように最適化することができる。別の実施形態では、接地／シールド層を電極上に位置させて、誘電体層により囲むことができる。接地／シールド層は、バルク溶液の変動又は雑音が、センサに近接しない電極又は電極のトレースに影響しないようにすることができるように、バルク溶液からの信号干渉を減少させることができる。
【００３３】
一実施形態では、接地／シールド層が送信電極の一部を覆うことができるが、受信電極を覆うことはできない。別の実施形態では、２つの別個の接地／シールド層を使用して、受信電極の部分及び送信電極の部分を覆うことができる。送信電極及び受信電極のための２つの別個の接地／シールド層は、電極間にさらなる絶縁をもたらし、システムの感度をさらに増加させて、ヌクレオチド取込みによるコンダクタンスの変化を測定することができる。
【００３４】
一部の実施形態では、駆動回路からの直流電流（ＤＣ）バイアスレベルによる影響、又はチップセンサ内からの漏れが、出力信号に影響することを防止するために、ナノニードルを、一方又は両方の電極に関連した１つ又は複数の局所キャパシタに連結することができる。
【００３５】
ナノニードルを平面構造として作製することができ、又は同軸構造として作製することができる。ナノニードル構造をナノニードルのアレイとして作製することができ、多数の単一ＤＮＡ分子を同時に配列決定することが可能になる。ポリメラーゼ又はリンカー分子をセンサ表面、例えば２つの電極間の誘電体層又は電極の１つに取り付けることができ、その後、図４Ｄに示すように、ＤＮＡ鎖がヌクレオチドと組み合わさって、２つの電極間の検出可能なインピーダンスを変化させることができる。
【００３６】
代替実施形態では、他の分子及び分析物、特に、他の酵素反応等の単一分子反応の動態を検出可能なものを使用することができる。ナノニードル又はナノブリッジアレイを、ＤＮＡ配列決定のための単一又は複数の分子の検出に使用することができる。
【００３７】
一部の実施形態では、アレイが、図５Ａに示すナノニードルアレイであり、図５Ａは、ナノニードルの拡大図（左）及びナノニードルアレイの上面図（右）である。ナノニードルセンサの拡大図は、センサが、１μｍ幅で、標的分子が位置する微小流体チャネルに接触している一実施形態を示す。図５Ｂは、微小流体チャネル内のナノニードルセンサの一実施形態の上面図の顕微鏡写真である。一部の実施形態では、信号の増幅がチャネル内で生じ、ナノセンサにより検出される。このプロセスは、増幅が微小流体内で、又はナノセンサアレイを含むナノセンサチップに近接して生じるため、オンチップ増幅と呼ばれる。
【００３８】
一実施形態では、信号を増幅するための化学反応又はプロセスを使用して、このオンチップ増幅を行うことができる。一部の実施形態では、例えば、Ｔ４ポリメラーゼ等のポリメラーゼ酵素を、ビーズ及びセンサ近くの領域で、無機ピロリン酸又はＰＰｉ濃度の増幅に使用することができる。一実施形態では、例えば、ピロリン酸塩等の酵素を使用して、二リン酸塩又はピロリン酸塩を２つのリン酸基に分割することができ、異なるイオン濃度を生じさせる。ナノセンサによる信号検出を増加させるために、異なる化学増幅を使用してもよい。一部の実施形態では、信号の増幅が、ナノセンサ近くの局所増幅器により行われる。
【００３９】
図６は、ナノニードルアレイの概略図であり、上部にナノニードルセンサ６００の拡大図を示す。ナノニードルの一部の実施形態では、電極６２０が誘電体層６４０により部分的に覆われ、誘電体層６４０に載置される。一部の実施形態では、ナノニードルセンサが２つの内部円形又は「同軸先端」電極又は同様の形状から構成され得る。
【００４０】
さらなる実施形態では、図７に示すように、ナノニードル又はナノブリッジセンサのアレイが、ＤＮＡ配列決定のためのＤＮＡ等の標的分子を結合するために、例えばビーズ７４０等のキャリアに関連付けられる。ナノセンサ７００は、磁気ビーズ７４０を保持可能な磁気領域７２０に近接していてもよい。アレイがバルク溶液７６０に晒され、バルク溶液７６０には、ＤＮＡ及びヌクレオチド（ｄＮＴＰ）等の標的粒子並びに試薬が、例えばＤＮＡ配列決定等の対象の反応のために導入される。磁気領域７２０を、図７に示されるように構成された矩形棒又は任意の他の形状、例えば円形若しくは正方形若しくは他の形状に形成して、磁気領域上又は磁気領域に近接してビーズを捕捉することができる。
【００４１】
一部の実施形態では、ナノニードルはＤＣ信号を介して動作することができる。測定は、ＤＣ信号、例えば、電流の変化、及び／又は電場の変調、又は２つの電極間のイオン濃度の変化の検出により達成され得る。一実施形態では、電気分解（酸化還元反応）速度の変化を対象の反応発生の指標として使用することができ、例えば、ＤＮＡ配列決定において、この変化はヌクレオチドの取込みを示すことができる。この変化は、２つの電極間のイオン濃度に関連するインピーダンスの変調によって生じ得る。このイオン濃度の変化は、ＤＮＡ分子の負電荷の増加による、プロトン、無機ピロリン酸塩（ＰＰｉ）、又は対イオン濃度等のヌクレオチド取込みに関連する副産物から生じ得る。
【００４２】
一部の実施形態では、化学層を使用して信号又は酸化／還元効果を増幅することができる。これらの化学層は、電極における気泡形成を減らすことができる。このような実施形態について、可逆酸化還元特性を有するもの等の材料又はポリマー、例えば、ハイドロキノン（ＨＱ）及びｐ−ベンゾキノン（Ｑ）を使用することができる。
【００４３】
一部の実施形態では、ＨＱ及びＱの錯体であるキンヒドロン（ＱＨ）を、微小流体ナノアレイのフローストリームに加えることができる。ＱＨ濃度を高くして電流を増加させることにより、電極へのＱＨの薄膜形成及び堆積が生じ得る。ＨＱ濃度が高くなるほど、還元酸化（レドックス）反応のために電極近くで使用可能な分子が多くなり得る。ＨＱ濃度が低い場合には、短時間後に電極周りの領域から１つの生成物（例えば、陽極近くのＨ２Ｑ及び陰極近くのＱ）が使い尽くされ、反応がその時点で停止し得る。一部の実施形態では、反応を継続するために、陽極電極に近接して使用可能な、又は拡散された十分なＨ２Ｑが確実にあるように、濃度が十分に高いことが望ましいとされ得る。一実施形態では、ナノニードル等のセンサが非常に低周波で動作して、電極が陽極及び陰極の役割間で切り替わって、ＨＱ、Ｑ、及びＨ２Ｑを電極近くで常に使用できるようにしてもよい。低周波は、０．０１Ｈｚ〜１０Ｈｚ又は１０Ｈｚ〜１０００Ｈｚ以上であってよい。一部の実施形態では、この低周波を、ＨＱ生成物の濃度及び緩衝液中での拡散速度に基づいて最適化することができる。印加電圧は、低周波及び高周波信号の組合せであってよい。
【００４４】
ナノセンサアレイのセルの正極近くの水加水分解の場合、Ｏ２気泡及びＨ＋イオンが発生し得る。一部の実施形態では、放電電位が水の放電電位よりも小さいためガスが発生しない化学物質を溶液に加えることにより、気泡の問題を克服することができる、ＨＱの加水分解電圧は水の加水分解電圧よりも小さい（それぞれ０．６Ｖ、１．２Ｖ）ため、図８に示すように放電電位が小さい。これにより、ＨＱのない溶液と比較して同一であるか又は高くなり得る、結果として得られる信号により、電極を通してより低い電圧を印加することができる。ＨＱ−Ｑレドックス反応は気泡の問題に対処することができるが、レドックス反応はＨ＋イオンを発生し得るため、ｐＨを低下させる。さらなる実施形態では、例えば約７であるｐＨレベル等の所望のｐＨにより近くなり得るようにｐＨを調整するために、ＨＱを配列決定及び／又は増幅緩衝液に加えることにより、この問題に対処することができる。
【００４５】
一部の実施形態では、ヌクレオチド取込みを検出するための温度センサ及び／又はｐＨセンサとして動作するように、ナノニードルを構成することができる。この方法は、本明細書に組み込まれている、「Ｈｅａｔ  ａｎｄ  ｐＨ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ＤＮＡ」と題する米国特許出願公開第２００８／０１６６７２７号にさらに記載されている。
【００４６】
一部の実施形態では、センサがナノブリッジセンサであってもよく、ここでは、図９Ａ、図９Ｂ、及び図９Ｃに示すように、活性領域がビーズ又は粒子を部分的に取り囲み、前記ビーズ又は粒子に密接するように、活性領域が作製され得る。
【００４７】
図９Ａは「リング」ナノブリッジの側面図であり、活性領域９０５の内部が、ビーズ９０１又は粒子及びこれらに結合され得るＤＮＡのデバイ長の範囲内にある。活性領域は完全に前記ビーズ又は粒子のデバイ長の範囲内にあるため、活性領域全体のインピーダンスが、ビーズ若しくは粒子に結合され若しくは関連する電荷の変化、及び／又はヌクレオチド若しくはヌクレオチド類自体の取込み事象に応じて変化する。導体９０４が、活性領域９０５のインピーダンスを測定するための手段を提供する。リング及び関連する支持構造９０３の直径は、ビーズが前記リング内にぴったりと嵌入するようなサイズであってよく、基板９０２上に位置することができる。一部の実施形態では、ナノブリッジのコンダクタンス又はインピーダンスの変化は、イオン濃度変調の影響、例えば、プロトン等のイオンの放出、又はヌクレオチド取込みを介した無機ピロリン酸塩の放出による。
【００４８】
或いは、図９Ｂに示すように、リング９０５及び支持構造９０３が、ビーズ９０１又は粒子の直径よりも小さくなるように寸法決めされて、特にビーズが磁気アレイ又は電場によって保持されるときにリング上に載置され得るようにし、リングがビーズ又は粒子及びこれに結合されたＤＮＡのデバイ長の範囲内に確実にあるようにする。リング構造を他の構造のために使用してもよい。
【００４９】
図９Ｃは、リング構造と共に実装されるナノブリッジの上面図であり、ビーズ９０１がセンサの活性領域９０５に重なる様子と、活性領域９０５のインピーダンスを測定する手段を提供可能な導体９０４とを示す。
【００５０】
出力信号の所望の特徴に応じて、図９Ａに示す実施形態又は図９Ｂに示す実施形態を選択することができる。図９Ａに示す実施形態では、ナノブリッジの抵抗が、図９Ｂに示すナノブリッジの抵抗よりも大きくなり得る。これは、ビーズのより幅広部分の周りの配置から生じる、図９Ａに示すナノブリッジリングの周囲の増加によるものとされ得る。抵抗は、
【００５１】
【数１】
2015500640.tif 000003
で表されるように、面積に関連する。ここで、Ｌは長さ、Ａは横断面積、ｐは材料の抵抗率である。ナノブリッジリングの場合、Ｌはリングの円周又は２πｒであり、ｒはリングの半径を表す。
【００５２】
図９Ａのリングが球の最も幅広の点近くに配置されるため、リングの半径は、リングが最も幅広の点から離れて配置される図９Ｂのリングの半径よりも大きくなる。したがって、抵抗は、図９Ａの実施形態と同様の実施形態について、より大きくなる。ＤＮＡにより被覆されたビーズの表面積はブリッジに近いため、図９Ａに示すナノブリッジリングの「信号」は、図９Ｂに示すナノブリッジリングの信号よりも大きくなり得る。抵抗の増加に関連する熱雑音の増加もあり得る。この抵抗と関連する熱雑音との関係は、
【００５３】
【数２】
2015500640.tif 000004
で表される。ここでｋはボルツマン定数（１．３７４×１０−２３Ｊ／°Ｋ）、Ｔは絶対温度（°Ｋ）、Ｒは抵抗、Ｂは帯域幅（Ｈｚ）である。
【００５４】
したがって、ナノブリッジリング構造の円周及び位置は、信号対雑音比を最適化するように選択され得る。さらに、ビーズに対するリングの位置は、例えば、ヌクレオチドの送達、洗浄、作製、及びビーズ装填等のプロセスの他の部分に影響し得る。例えば、ビーズがバルク溶液により多く晒されるような位置にあるときに、溶液に対してより遠くに位置する場合とは対照的に、洗浄がより容易になり得る。一部の実施形態では、最適化のための所望の要因に応じて、他の実施形態に対して一実施形態でビーズを有することが好ましいとされ得る。
【００５５】
ナノニードルの実施形態に関して同様の考察が生じ得る。ビーズに対する電極の配置は、出力信号の振幅及び信号対雑音比に影響する。一部の実施形態では、ナノニードルが、一実施形態の上面図が示される図１０にあるような修正リング構造を有するように構成されていてもよい。ビーズ１００１に最も近い電極プロング１０１４の部分が、ビーズ１００１周りの「リング」を形成するが、接続することはできない。第２の電極プロング１０１４はセンサ１０１３に接触することができる。
【００５６】
ナノブリッジの一部の実施形態では、導体９０４が、ナノブリッジ（図示せず）の高濃度にドープされた領域に接続されて、ナノブリッジの活性領域９０５への電気接続をもたらすことができる。或いは、ナノブリッジの導体９０４は、仕事関数がナノブリッジの活性領域９０５の仕事関数に一致するようにナノブリッジ導体９０４を設計することにより、オーム接続を有するナノブリッジの活性領域９０５に直接接続されていてもよい。例えば、アルミニウムの仕事関数値は、低濃度にドープされたシリコンの仕事関数値に近いが、完全には一致しない。より密接に一致させるためには、アルミニウム合金、又は他の金属又はポリシリコン等を代わりに使用してもよい。一部の実施形態では、ナノブリッジを、シリコンオンインシュレータ又はＳＯＩ構造から作製することができる。
【００５７】
加えて又は或いは、バックゲート（図示せず）を略同じように使用することができる。さらなる改良では、センサアレイの異なる領域についてバックゲートの異なる部分があるようにバックゲートを分割してもよい。多くの部分があるため、各センサについて個々のバックゲートを有することができ、プライマーを伸長させる異なる配列依存速度を補償することができる。
【００５８】
一部の実施形態では、ナノブリッジセンサを使用して、ＤＮＡ配列決定のためのテンプレートＤＮＡにおけるヌクレオチドの取込みを検出する。図１１Ａ及び図１１Ｂは、ＤＮＡ伸長のためのナノブリッジセンサからのデータ出力の２つの実施形態を示す。図１１Ａは、ヌクレオチドの取込み及び結果として生じる信号出力によるＤＮＡの伸長を示す。図１１Ａの上部は、２つのナノブリッジセンサからの２つのデータ出力を示し、センサの一方がＤＮＡ被覆ビーズを有し、他方が参照ナノブリッジセンサとして使用される。図１１Ａの上部の結果は、ＤＮＡ被覆ビーズを持つナノブリッジからの出力信号が、ナノブリッジの電流中に明確な「スパイク」又は「ピーク」を有するのに対し、ここで参照として使用される他方のナノブリッジが電流信号に目に見える「ピーク」を有していないことを示す。図１１Ａの下部では、図１１Ａの上部の２つのセンサの２つの出力信号の差分測定が示され、これにより伸長信号又は「ピーク」がより見えるようになる。図１１Ｂは、誤ったヌクレオチドがシステム（制御）に導入されている１１００か、正しいヌクレオチドが取り込まれている１１２０かに応じて信号出力に見られる差を示す。正しいヌクレオチド１１２０の取込みにより、信号に目に見える「ピーク」が生じるが、検出システムに誤ったヌクレオチド１１００を追加すると、目に見えるピークがなくなる。ビーズに付着した鎖に複数のホモポリマー部分を有する一本鎖ＤＮＡテンプレートについての結果が示される。一実施形態では、ナノブリッジセンサへのオリゴヌクレオチド又はＤＮＡテンプレートの直接の付着を使用することができる。一部の実施形態では、単一分子又はポリクローンＤＮＡ配列決定を使用することができる。一実施形態では、単一分子テンプレートの増幅を、「ブリッジ増幅」又は「ローリングサークル増幅」技術又は他の増幅方法を通して行うことができる。
【００５９】
ナノブリッジ、ナノニードル、ＩＳＥＦＥＴ、ＣｈｅｍＦＥＴ等の電子センサを、一部のｐＨセンサと同様に、広いダイナミックレンジを有するように設計してもよい。或いは、電子センサを、小さいダイナミックレンジを有するが高い感度を有するように設計してもよい。一実施形態では、活性領域にバイアスを掛ける追加の要素をシステムに含むことによって、センサのダイナミックレンジ及びセンサの感度の両方を最適化することができる。要素は参照電極とすることができ、参照電極とナノブリッジ又はＣｈｅｍＦＥＴ等のセンサの活性領域との間に可変電圧を印加することができる。
【００６０】
電圧の調節により、センサと相互作用する電荷量の幅広い変化にもかかわらず、非常の感度の高い検出が可能になり得る。例えば、標的ＤＮＡが１００塩基対長さである配列決定反応を扱うように、センサを最適化することができる。標的ＤＮＡが１０００塩基対長さに変化すると、センサは、前記センサのダイナミックレンジ内で動作しなくなり得る。その後、前記参照電極及び活性領域間の電圧を調節して、センサがダイナミックレンジ内で動作できるようにしてもよい。配列決定反応中に、伸長プライマーが５００塩基対まで伸長されると、センサは再びダイナミックレンジ内にはなくなる。参照電圧を再び修正して、センサをダイナミックレンジ内に持ってくることができる。この方法を、センサがそのダイナミックレンジ内になくなるように、センサ周りの電荷蓄積の潜在的問題に対する解決法として使用することができる。この方法では、電荷濃度がセンサの感度に悪影響を与えるようなものになると、レンジが異なる基準に「リセット」され得る。
【００６１】
一部の実施形態では、測定緩衝液の塩又はイオン濃度及び／又は緩衝能の変化を使用して、読出しのダイナミックレンジを調節することもできる。この変化を使用して、例えば、ビーズに結合されたＤＮＡ分子周りの移動イオンの数及びイオン濃度を飽和させて、ヌクレオチド取込みによる導電性変化又はデバイ長の変調を少なくし得る電荷密集の影響を防止又は低下させることができる。例えば、センサ及び緩衝液及び「検知」と呼ばれる他の要因を、標的ＤＮＡが１０００塩基長さ又は標的ＤＮＡからの等価な電荷である配列決定反応を扱うように最適化することができる。例えば５００塩基のＤＮＡの第２の鎖の伸長後に標的ＤＮＡが１５００塩基に変化すると、検知は、前記検知の最適又はダイナミックレンジ内で行われなくなり得る。その後、測定緩衝液の塩又はイオン濃度及び／又は緩衝能を調節して、最適又はダイナミックレンジ内で検知を行うことができるようにする。配列決定反応中に、伸長プライマーが７５０塩基対（１つの鎖が１０００塩基で、伸長下の第２の鎖が７５０塩基である、ＤＮＡテンプレートの合計１７５０の塩基電荷）まで伸長されると、検知が再び最適又はダイナミックレンジ内にはなくなる。測定緩衝液の塩又はイオン濃度及び／又は緩衝能を再び修正して、検知をダイナミックレンジ内に持ってくることができる。この方法を、センサがダイナミックレンジ内になくなるように、センサ周りの電荷蓄積の潜在的問題に対する解決法として使用することができる。この方法では、電荷濃度が検知の感度に悪影響を与えるようなものになると、レンジを異なる基準にリセットすることができる。一部の実施形態では、最適な検知及びセンサ感度のための異なる調節の組合せを使用することができる。
【００６２】
一部の実施形態では、ＤＮＡ標的の配列を判定するために、ヌクレオチド取込みの測定を前記取込み中に行うことができる。取込みのプロファイルを適切に捕捉して測定し、例えばホモポリマーランに取り込まれた塩基の数を判定することを確実に行うために、複数の測定が必要となり得る。このような測定は、ＰＰｉ又はヒドロニウムイオン又は熱等の反応の副産物を測定することができる。これを、過渡信号検出モダリティとも呼ぶことができる。過渡信号検出モダリティでは、取込み若しくは伸長事象中又は直後に検出が行われる。
【００６３】
過渡信号測定の図が図１１Ｃに示される。図は、過渡信号検出モダリティの信号が、続いて取り込まれるヌクレオチドの正確な追加に応じてどのように変化するかを示す。図では、塩基が「Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ」（グラフのＸ軸に示される）の順序で追加され、追加される塩基が、配列決定されるＤＮＡ断片の相補的塩基になる毎に、目に見える「ピーク」がある。ここで、配列はＡＴＡＡとあり、ホモポリマー部分「ＡＡ」が、より大きいピークを有する信号を生じさせる。大きいセンサアレイについて、このような測定が非常に高いデータ収集率を必要とし得るため、センサの感度を脅かすおそれがあり、配列決定データに関連する所望の誤差率を提供するための十分な信号対雑音を妨げる。
【００６４】
加えて、位相誤差、及びしたがって読取り長さに関連する誤差と、どの塩基及びいくつの塩基が取り込まれたかを正確に測定することに関連する誤差との兼ね合いに関連する困難があり得る。これは、ポリメラーゼが移送誤差なしで正確に機能するように、最適なセンサ精度に対して低いイオン濃度、及びはるかに高い濃度を必要とする結果として当てはまり得る。
【００６５】
或いは、少なくとも１組の試薬条件が取込みのために使用される２つ以上の異なる試薬条件を使用することができ、試薬条件をポリメラーゼ精度及びディフェージングの最小化のために最適化することができ、例えばイオン強度の非常に低い緩衝液の使用によってセンサの精度を最適化する第２の試薬を使用することができる。取込み事象とは別にセンサを読み取ることにより、配列決定データ精度及び読取り長さを向上させることができる。これを定常状態検出と呼ぶことができる。定常状態検出では、取込み事象の「完了」後にセンサの読取りが生じる。例えば、１つのタイプのヌクレオチドがＤＮＡテンプレートに送達される場合、検出は、取込み事象が発生するのに十分な時間があった時点における信号測定に基づく。
【００６６】
定常状態変化は、ＤＮＡテンプレート周りの環境の変化、例えば、ヌクレオチド又は緩衝液送達の次のサイクルまで、そのままであり得る。例えば、ビーズ周りのインピーダンスの定常状態変化は、ヌクレオチド取込み後のＤＮＡテンプレートの電荷の変化、又は、例えば、ヌクレオチド取込み及び／又は負電荷塩基の追加後の、ＤＮＡ電荷の変化による固定ＤＮＡテンプレート周りの対移動イオンの濃度の変化によるものであり得る。
【００６７】
次世代配列決定及び種々の検出方法に関連する重要な問題は、大量のデータが発生することである。一部のシステムは、配列決定データの有用な各塩基について平均３０００以上のデータ点を発生し得る。データを保存し解析すると、次世代配列決定の全体的な費用が大きく増加する。一部の実施形態では、取得するデータを少なくするという最も簡単な方法で、データ削減を行う。ポリメラーゼ活性は、ｄＮＴＰを有する試薬をフローセル（ナノセンサアレイを有する微小流体構造）に完全に通すのに必要な時間よりもかなり急速に行われ得るため、フローセルの入口近くのＤＮＡコロニーは、ｄＮＴＰが前記フローセルの出口近くのコロニーに到達する前に次の合成を完全に終了させることができる。フローセル内のいずれかの場所で生じる反応を検出するのに必要な時間中に、フローセル全体についてデータが取得される場合、そのデータの多くは、反応が発生していないフローセルの領域からのものとなる。ｄＮＴＰ試薬スラグがフローセルを横切るのに必要な時間及び重合速度に応じて、フローセル内のコロニーの大部分が、ｄＮＴＰを取り込んで有用なデータを生成するのではなく、ｄＮＴＰを待つか、又は合成反応を完了させる。
【００６８】
一部の実施形態では、検出器電子回路の読出しが、フローセルを通る試薬スラグの移動と同期する。ｄＮＴＰを含む試薬スラグは、最初にフローセルに入ることができるが、図１２Ａに示すように、ｄＮＴＰがコロニーのいずれかに結合し組み合わさるのに十分なほど遠くまで、フローセル内でまだ移動していない。この時点で、データをまったく取らないことも可能となり得る。わずかに後の時点で、図１２Ｂに示すように、試薬スラグが、フローセルに十分に入って第１の領域の１組のコロニーと相互作用する。この時点で、データを第１の領域のコロニーに関連する検出器から取ることができるが、フローセルの他の領域からは取ることができない。後の第２の時点で、図１２Ｃに示すように、試薬スラグがフローセルに十分に入って第２の領域の１組のコロニーと相互作用することができる。この時点で、データを第２の領域のコロニーに関連する検出器から取ることができ、かつ試薬スラグの速度及びポリメラーゼの速度に応じて、依然として第１の領域から取る必要があり得るが、フローセルの他の領域からは取る必要がないとされ得る。後の第３の時点で、図１２Ｄに示すように、試薬スラグはフローセルを通って十分に横切って、フローセル内の最後の組のコロニーと相互作用し始める。この時点で、最後の領域のコロニーと関連する検出器からデータを取ることができる。試薬スラグの速度、ポリメラーゼの速度、フローセルの長さ、及びコロニーのサイズに応じて、前記最後の組のコロニーのすぐ前の領域等の前の領域から、一部のデータを依然として取る必要があり得るが、フローセルの他の領域からは取る必要がないとされ得る。
【００６９】
一部の実施形態では、例えば、緩衝液、温度、流体の流れ、溶液、キャリア、ｄＮＴＰ誤取込み、センサ電子回路等の要因によって発生し得る雑音を考慮するために、１つ又は複数の異なるタイプの差分測定を行うことができる。これらの差分測定はシステムの較正を助けることができ、又は雑音を最小にしてシステムの精度を高めるのを助けるために後処理の一部として、差分測定を使用することができる。
【００７０】
図１２Ｅに示すように、一部の実施形態では、特徴の無い（ヌル）ビーズを差分測定の参照として使用することができる。このような参照は、温度変動、バルク試薬の導電性若しくはｐＨの変動、導電性若しくはｐＨの局所的変動、又は他の変動を補償することができる。システムの制御は、位相誤差を制限し特定するのを助け、これにより読取り長さを延長させる。一部の実施形態では、図１２Ｆに示すように、空センサ（ビーズ無し）を参照として使用することにより、差分測定が行われる。図１２Ｅ及び図１２Ｆは、例として列「ｊ−１」及び「ｊ」それぞれからの差分測定を使用するが、差分測定をどの行又は列又はアレイから取ってもよい。
【００７１】
別の実施形態では、図１２Ｇに示すように、取込み反応のないビーズ又はセンサ領域により、空センサ又は特徴の無いビーズに対してより良好な参照を提供することができる。これは、ＤＮＡポリメラーゼ及びビーズが対象の体積で存在し、表面化学の変動とそれによるバックグラウンド対イオン濃度とがより良好に一致する可能性があるためである。ヌクレオチド注入の各サイクルで、ビーズの約１／４のみが、ＤＮＡ鎖と、そのサイクルでの取込みに必要な相補的塩基とを有し、ビーズの残りがそれらを有していない。この差分測定により、一般的な雑音及び変動を除去することができる。図１２Ｇは例として列「ｊ」からの「無反応」ビーズを使用するが、任意の行又は列又はアレイからの任意の他の１つ若しくは複数のビーズ（又は１つ若しくは複数のセンサ）を使用してもよい。
【００７２】
ビーズ又はセンサ領域の異なるコロニーが、コロニーＤＮＡ並びに／又はコロニーＤＮＡの長さとは異なる長さの伸長プライマー並びに／又は他のビーズ及び／若しくはセンサ領域に関連する伸長プライマーを有することができ、したがってセンサと相互作用し得る異なる量の電荷があり得る可能性がある。したがって、それらの電荷／信号は同一ではなく、これらの値が正規化され一般的な雑音を除去できるように、差分測定によってセンサのアレイにわたる平均化が可能になる。
【００７３】
別の実施形態では、差分センサが溶液に晒されず、誘電体層により覆われていてもよい。このようにして、差分センサが、ビーズに関連するＤＮＡ配列決定等の標的反応を検出可能なセンサと比較される。この方法により、差分センサが溶液に晒されないため、センサの電子回路及び読出回路に関連する雑音を除去することができる。
【００７４】
一部の実施形態では、参照電極を電子又はｐＨセンサ、例えばＦＥＴｐＨセンサに使用することができ、ＦＥＴｐＨセンサのアレイの一部の設計は、各検出チャネルについて参照チャネルを使用し、他の設計は１組の検出チャネルについて参照チャネルを有する。しかし、検出器の局所ｐＨは、ＤＮＡコロニーの存在により影響され、ＤＮＡの第２の鎖の長さが重合反応により伸長されるときに変化する。単一型のヌクレオチドが一度にフローセルに導入される化学作用を使用する際に、多くの検出器チャネルは、その検出器で反応が起きておらず、実際には、大部分の検出器チャネルで反応が起きない。したがって、一実施形態では、図１２Ｈに示すように、隣接する検出器を参照チャネルとして使用して、重合反応が起きている検出器に隣接する検出器である検出器でｐＨ又はイオン濃度が変化するときに、これらを測定する機会をデータ解析アルゴリズムに与える。図１２Ｈは、例として列「ｊ」からの隣接ビーズセンサを使用するが、任意の隣接する行又は列からの他の１つ若しくは複数のセンサを使用してもよい。列からの隣接するビーズ列があるが、これにより、例えば、ｐＨ若しくはイオン濃度レベル、又は対象の検出器に局所的な他の雑音源の変化を検出できるようになり、またクロストークの検出も可能になり、クロストークデコンボリューション機能をモニタ及び修正することができる。
【００７５】
さらなる実施形態では、図１２Ｉに示すように、センサ領域１２２０を参照として使用することができる。この参照センサ領域は、無特徴（ヌル）（関連するコロニーを持たず、ビーズ若しくはＤＮＡがあるか、又はない）であってもよく、或いは平均信号を発生させるために参照センサ領域を単に使用することができ、或いは両方の方法の何らかの組合せでもよい。一部の実施形態では、関連するキャリアを持つ複数のセンサを含む選択された領域に関連する平均出力データを計算することにより、差分測定を行う。このタイプの差分測定は、ＤＮＡ配列決定のための磁気ビーズ等の一部のキャリアが反応を受ける可能性があり、他のビーズが特徴の無いビーズであり得るため、測定のタイプを平均化する「ブラインド」として特性化され得る。隣接領域のビーズの平均測定を行うこの差分測定により、例えば溶液、緩衝液、試薬等についての一般的な雑音を除去することができる。領域１２２０は、単一の隣接センサ、センサの列、センサの行、又は任意の形状若しくはサイズのナノセンサアレイのセンサアレイを含む、任意の数のセンサから構成され得る。
【００７６】
別の実施形態では、差分測定が、ナノセンサアレイのセンサ及び関連するキャリアの特定の列からのデータ出力を平均化することによって達成され得る。このタイプの差分測定により、図１２Ａ〜図１２Ｄに示すように、ナノアレイのピクセルへの溶液及び試薬の送達に関連する時間的要因を考慮することができる。
【００７７】
溶液の送達を、ナノアレイの異なる列について異なる時間に行うことができるため、列に基づいて差分測定を行うことにより、時間に基づく較正が可能になる。検出器アレイにわたって、ｄＮＴＰを含む反応緩衝液の連続した流れがある。流れがコロニーを通過するとすぐに、取込みプロセスが始まり、緩衝液の導電性を変化させる。過渡状態では、この変化を、コロニー周りの局所ｐＨ又は導電性の変化に基づいて捕捉することができる。したがって、試薬スラグがコロニーを越えると、データ収集が行われる。反応時間後、データ収集を行って、局所導電性変化を捕捉し、取込みを検出することができる。
【００７８】
これらの測定を定常状態条件で行ってもよい。第１に、ｄＮＴＰを含む反応緩衝液をコロニー上に流すことができる。コロニーの一部の上で取込みを行うことができ、これはコロニー周りの導電性を変化させ得る。続いて、低導電性の測定緩衝液をコロニー上に流すことができる。取込みの結果、導電性はコロニーに近いほど増加し得、この導電性の変化をセンサにより検出することができる。コロニー上の試薬の流れ及び導電性の変化は、非常に急速に生じ得る。したがって、データ収集を、測定緩衝液の流れと同期させることができる。緩衝液スラグが各列を通ると、データ収集を行うことができる。この定常状態検出方法では、データ収集を任意の時間に行うことができる。一部の実施形態では、測定緩衝液及び反応緩衝液が同一の緩衝液であり、検出が、取込み事象後に導電性変化の測定によって行われる。
【００７９】
図１２Ｊは、一部の実施形態において、反応発生センサ１２１０のないに近接した、反応発生あるセンサ１２００を示す。図は、重なる信号領域１２１５Ａによって示されるように、センサ１２１０に関連するセンサ１２００の位置がセンサ間のクロストークを生じさせ得ることを示す。図１２Ｋは、実際には反応発生がないセンサ１２１０の「誤検出」信号１２１５Ｂを示す出力データ信号の一実施形態を示す。これは、センサ１２００とセンサ１２１０との間のクロストークによるものである。一実施形態では、この誤検出信号は、例えば、ＤＮＡ配列決定のための疑似ｄＮＴＰ取込み信号であり得る。センサは、誤検出信号を発生させるために互いに隣接する必要はなく、センサ間の種々の距離についてクロストークが生じ得る。例えばクロストークデコンボリューション関数行列等の差分測定方法を使用して、アレイの較正又は後処理を通じて出力データ信号から誤検出信号を除去することができる。
【００８０】
一実施形態では、図１２Ｌに示すように、クロストークデコンボリューション関数行列を使用することにより、差分測定を行うことができる。１つのピクセルが反応を受け、領域（ｎ×ｎ）内の他のピクセルが無特徴（ヌル）である対象の領域を選択することができる。このようにして、領域内の他のピクセルへの影響を測定することができ、これにより、１つのピクセルから残りのピクセルへのクロストークの量を定量化できるようになり得る。領域内のすべてのピクセル間でのクロストークを判定可能なｎ×ｎデータ行列が生じるまで、このプロセスをピクセルの残りについて繰り返すことができる。このクロストークデコンボリューション関数行列を、例えばＤＮＡ配列決定等の対象の反応が完了した後に、ナノセンサアレイからの生出力信号から取り出すことができる。このようにして、より正確な結果を生じさせるのを助けるために、ナノアレイのセンサ間のクロストークを考慮することができ、生データから除去することができる。
【００８１】
一部の実施形態では、差分測定を使用して、ＤＮＡ配列決定等の反応のためのヌクレオチドのポリメラーゼ誤取込みを考慮することができる。ＤＮＡテンプレートに付着又はアニールされた既知のオリゴヌクレオチド又はＤＮＡ断片を使用することができる。どのくらいの出力信号が「誤取込み」からのものであるかを見出すために、「誤った」ヌクレオチドを使用することができる。一部の実施形態では、出力信号の速度及ビーズのくらいの出力信号が誤取込みから生じるかを見出すために、取込み不可能なヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を使用することができる。このデータを使用して、最終信号が正確な取込みからのものであるように、出力データを最適化し処理することができる。
【００８２】
別の実施形態では、図１２Ｍに示すように、特徴の無いビーズ又は異なる配列を有するビーズが試料ビーズとのペアワイズで導入され、差分増幅器を使用して信号が判定されて、図１２Ｎに示すように、解析アルゴリズムがバックグラウンド及びクロストークの変動を直接デコンボリューションする必要がなくなる。ナノニードルセンサを、定常状態又は過渡信号検出モダリティに使用することができる。図１２Ｎのデータは、ナノニードルセンサにより測定されたＤＮＡ伸長による実験結果を示す。
【００８３】
種々のタイプの差分測定を使用することにより、より正確なデータ信号の発生を助けることができる。
【００８４】
一部の実施形態では、信号出力を向上させる方法が、定常状態検出方法の使用を通して行われる。一部の実施形態では、対象の化学反応がＤＮＡ配列決定のためのヌクレオチド取込みであり、これは図１３Ｂに示す定常状態検出方法により検出される化学反応である。図１３Ｂのヌクレオチド取込み反応は、定常状態検出方法を使用して、例えばヌクレオチド取込みにより生じる電荷（Ｑ）又はインピーダンスの変化等の反応周りの環境の変化を直接検出可能であることを示す。定常状態測定により、過渡検出モダリティにわたる複数の利点をもたらすことができる。必要なデータが少なくなるような方法でセンサを使用することができる。これは、センサがポリメラーゼ取込みに追いつくために高いデータ速度で読み取らなくてもよくなり、代わりに、１回で、又は時間平均間隔で読み取ることができ、電子回路が、センサ雑音を大きく減少させることができるよう十分な長さの時定数を有するからである。したがって、データ収集がはるかに簡単になり得る。
【００８５】
図１４は、定常状態検出モードで発生した信号の例示的な実施形態を示す。図は、６０塩基対の追加を超えても信号が線形であることを示す。この生データは、定常状態検出方法を、少なくとも６０塩基対にわたる塩基対読取りについて有効に使用することができる。他のデータは、定常状態検出が８０塩基対、２００塩基対、５００塩基対、１０００塩基対以上にわたる塩基対読取りに有効に使用され得ることを示す。
【００８６】
図１５は、２、４、１４及び３３塩基部分について０．５塩基よりも少ない非線形性を有する線形ホモポリマー読取りからの生の未処理データの別の実施形態を示す。ここでは、サイクル毎に取り込まれた塩基の数に基づいてデータが表示され、導電性と塩基対追加との間に近線形関係もある。この生データは、ビーズなしの制御センサについて訂正されているだけである。
【００８７】
前述したように、定常状態測定手法は過渡検出を超える利点を有することができる。信号が定常であるため、電子回路は、信号プロファイルの変形又は処理なしに信号平均を使用することができる。一部の実施形態では、検出されている電荷がビーズに結合されるため、検出が取込み事象とは別に行われ得る。これにより、取込み溶液を取込みのために最適化することができ、読取り溶液を読取りのために最適化することができる。電荷は拡散することができないため、センサ間のクロストークを最小化するか、又はなくすことができ、誤差源及び計算負荷を小さくする。過渡信号を捕捉するために、データ収集は、ｄＮＴＰ追加中にすべてのセンサ上の多くのデータ点を捕捉しなければならない。データは、時間遅延について曲線適合され調節されなければならない。
【００８８】
取込み時間中の検出により、複数の課題が生じ得る。緩衝液条件は、十分な感度検出を可能にするために十分に低い塩、緩衝液、及びｄＮＴＰ濃度を有することと、完全かつ正確な取込み事象を可能にするために十分に高い濃度を有することとの間で妥協しなければならない。反対に、定常状態測定方法は、一部の実施形態において、それぞれ単一のタスクのために最適化された、取込み化学作用のためのものと、検出のためのものとの２つの緩衝液条件を使用することができる。さらに、取込み化学作用によって、１つの塩基及び３つのリボヌクレオチド若しくは他の取込み不可能なヌクレオチドを使用する競合反応において天然塩基を使用する結果として、はるかに正確な取込みと、より少ないディフェージングが可能となり得る。
【００８９】
生物情報学の課題が、定常状態測定については複数の理由から非常に簡単になり得る。拡散の結果、測定される対イオンがＤＮＡに直接関連するため、有効なことにチャネル間にクロストークがなくなる可能性がある。潜在的な取込み事象を逃すことがないように常にモニタする必要がないとされ得るため、データ量を非常に少なくすることができる。この取込み事象は、フローセルを通る流量が非常に不均一であり得るため、異なる時間にフローセル内の異なる位置で、単一の列内でも発生し得る。データ点の数は、流体サイクル毎に１つ、場合によって２つのデータ点と少なくすることができる。ホモポリマー精度及び線形性がはるかに良好になる可能性がある。
【００９０】
一実施形態では、過渡状態検出中及び定常状態検出中に発生した信号の比較が図１６に示される。ヌクレオチドの取込み１６４０が検出される図に示すように、定常状態検出１６２０は、過渡検出１６００よりも簡単な方法であり得る。これは、生信号からの差分信号のより簡単な抽出及び計算が必要であり得、前述したように、定常状態検出が、過渡信号検出ほど時間依存ではなく、より高い線形性と配列決定及びホモポリマー検出の精度とが得られるからである。
【００９１】
ナノニードルセンサにより定常状態検出中に生成された実験生データの例示的な実施形態が図１７に示され、図１７は、３塩基１７００、０塩基１７２０、及び５塩基１７４０の取込み後の検出についての信号出力の差を示す。各矢印の開始点は、取込み緩衝液の洗浄工程の終了に対応し、取込み用と検出用との２つの異なる緩衝液が使用される。一部の実施形態では、カスタマイズされた緩衝システムを取込み及び検出用の異なる処方で使用することができるため、減結合の最適化を可能にする。０塩基の取込み１７２０により、変化のないフラット信号が生じるのに対して、３又は５塩基の追加（それぞれ１７２０及び１７４０）により、検出される塩基の数に比例する信号レベルの変化が生じる。比較のため、参照センサからのフラット信号１７６０も示す。
【００９２】
図１８Ａ及び図１８Ｂは、定常状態検出方法に基づくＤＮＡ配列決定のための生データ出力の例示的な実施形態をさらに示す。両方の図について、生データが上のグラフに示され、下のグラフは自動ゼロ化され拡大された同一のデータを示す。正確なヌクレオチドの取込みが矢印で示され、より多くの塩基が正確に取り込まれると、各信号の底部が上昇する。
【００９３】
過渡プロファイルは、ホモポリマー追加について異なり得るのに対して、定常状態は線形応答を示すことができるため、ホモポリマー誤差率が低下し得る理由があり得る。図１９Ａは、ナノニードルセンサによるＤＮＡ配列決定におけるホモポリマー読取りの結果を示す。ここでは、ヌクレオチドの正確な取込みがある（不正確な塩基対により、データ点が、前のデータ点とグラフ上で略同一の高さにとどまる）毎に差分信号が増加する。差分信号は、導電性が塩基対追加との近線形関係を有することを示す。差分信号は、ＤＮＡ伸長中の塩基追加毎に５．４ｍＶの変化を示す。プライマー後のホモポリマーテンプレートは、３’−ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＣＣＣ  ＣＣＣ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＡＡＡ  ＡＴＴ  ＴＴＣ  ＣＣＣ  ＡＡＣ  ＣＡＡ  ＣＣＣ  ＡＡＣ  ＴＣＡ  ＧＴＣ  ＧＴＣ  ＡＡＴ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  Ａ−５’であった。
【００９４】
図１９Ｂ及び図１９Ｃは、ホモポリマーランからの生の未処理データの別の実施形態を示し、図１９Ｃは、異なるナノセンサによる図１９Ｂのホモポリマーランの繰返しランである。図１９Ｂの配列決定しているテンプレートは、Ａ  ＡＡＡ  ＡＡＣ  ＣＣＣ  ＣＣＴ  ＴＴＴ  ＴＴＡ  ＡＡＡ  ＴＴＴ  ＴＣＣ  ＣＣＡ  Ａである。
【００９５】
さらなる実施形態では、例示的な配列決定実験で、ヌクレオチドが配列決定モジュールに注入される順序は、「Ｃ、Ａ、Ｔ、Ｇ」であり、配列決定データの結果は、図２０に示すように、取り込まれたヌクレオチドが「ＡＴＧＧＡＡＴＴＧＧＧＡＡＡＡＡＴＡ」であることを示し、これは実験で使用されたＤＮＡテンプレートの配列に一致している。
【００９６】
一実施形態では、配列決定反応を最大可能長さまで実行することにより、有効な読取り長さを増加させることができ、配列決定反応は、予め配列決定され、続いて条件を検出に適したものに変化させた塩基の数よりも統計的に少ない可能性があり得る塩基の数について、前記低イオン濃度を使用し、伸長プライマー鎖を溶融させ、新しいプライマー及びｄＮＴＰを導入し、かつ合成に最適なイオン濃度を使用しつつ合成反応を続行しながら行われる。予め配列決定され、続いて条件を検出に適したものに変化させた塩基の数よりも統計的に少ない可能性があり得る塩基の数について、伸長プライマー鎖を溶融させ、新しいプライマー及びｄＮＴＰを導入し、かつ合成に最適なイオン濃度を使用しつつ合成反応を続行する前記プロセスを、プロセスから有用なデータが生じなくなるまで複数回繰り返すことができる。使用する合成工程がいくつであるかを判定するのは統計に基づくため、プロセスを反転させて、合成に最適な条件で合成を行い、続いて検出に適した条件を使用して合成を行うことができる。これに続いて、伸長プライマー鎖の溶融、新しいプライマーの導入、及び検出に適したイオン濃度の使用を行うことができる。
【００９７】
さらなる実施形態では、図２１に示すように、ナノニードル及びナノブリッジセンサを同一のピクセルで使用することができる。一実施形態ではビーズを平坦面又は略平坦面上で保持することができる。一部の実施形態では、ビーズを凹みに位置させることができる。ナノニードルセンサ２１００を定常状態検出について最適化することができ、ナノブリッジセンサ２１２０を過渡信号検出について最適化することができる。図示するように、一実施形態では、２つのセンサが、ビーズに付着したテンプレートＤＮＡ２１８０のあるビーズ２１３０に近接し得る。ｄＮＴＰ及び他の試薬を、ＤＮＡプライマー２１４０等のバルク溶液２１１０を介して送達することができる。一部の実施形態では、ＤＮＡプライマー２１４０とテンプレートＤＮＡ２１８０との間のハイブリダイゼーション２１６０を行うことができる。次いで、ヌクレオチド取込み及びＤＮＡ伸長２１９０を行うことができる。ヌクレオチドの取込みにより、ｐＨの変化、Ｈ＋イオンの生成、ピロリン酸塩（ＰＰｉ）の生成、並びにインピーダンス（Ｚ）及び／又は電荷（Ｑ）及び／又はコンダクタンス（Ｙ）の変化の１つ又は複数が生じ得る。これらの変化の１つ又は複数を、ナノニードルセンサ２１００及びナノブリッジセンサ２１２０により検出することができる。出力信号を電圧（Ｖ）変化又は電流（Ｉ）変化として表すことができる。２つのセンサにより、相補的検出モダリティに基づく検出（定常状態及び過渡信号検出の両方）が可能になり、独立した信号確認が可能になり得、読取り精度を高めることができ、信号対雑音比を高めることができる。２つのセンサにより、２つの直交又は独立読出しに基づく検出が可能になり得る。一部の実施形態では、１つ又は複数のセンサを、異なる周波数等の異なる動作条件での検出に使用して、異なる、直交及び／又は独立読出し信号を提供することができる。例えば、ナノニードルを異なる周波数で使用して、例えば、主にコンダクタンス変調を測定する１つの周波数で異なるインピーダンス条件を測定し、別の周波数で、ヌクレオチド取込み中又は後の容量変化を検出することができる。
【００９８】
一部の実施形態では、各センサに与えられる時間量を最大化するため、かつ各センサの読取り雑音を減少させるために、積分器をセンサと組み合わせることができる。積分器は、アレイの各センサに関連するキャパシタを備えることができる。他の実施形態では、センサを、電流の流れがないが化学サイクル中に電荷の蓄積がある容量センサとして構成することができる。一部の実施形態では、積分デバイス又は容量デバイスを使用すると、センサが各ピクセルについての局所増幅電子回路を有することができる。
【００９９】
他の実施形態では、読出しポートに対するＣＣＤと同様の方法で、電荷又は信号を移動させることができる。ナノセンサアレイを含む各微小流体デバイスに関連した、１つ又は複数の読出しポートがあり得る。一部の実施形態では、読出しポートの回路が、アナログ／デジタル変換器、行セレクタ、列セレクタ、シフトレジスタ、シリアル読出し、マルチプレクサ等の１つ又は複数を備えることができる。一実施形態では、図２２Ａに示すように、デバイス２２２５の両側に読出しポート２２００があってもよい。この図は、２つ以上の読出しポートを使用することにより、サンプリング速度が低下し得、積分時間が増加し得ることを示す。矢印２２４０は、デバイス２２２５の両側で読出しポート２２００により覆われる距離を表す。２つの読出しポートがあるため、サンプリングしなければならないデバイスからのデータ量が、各チップについて半分になり、積分時間が２倍になる。各読出しポートについてのデータ量及びサンプリング速度を低下させることにより、信号の質を高め、信号対雑音比を増加させることができる。一部の実施形態では、デバイスの各角部が読出しポートを有し、他の実施形態では、図２２Ｂに示すように、チップの４辺すべてに沿ってポートがあり得るため、読出し速度を低下させ、関連して信号対雑音比を増加させることができる。ポートをチップの中央部分に割り当ててもよく、又はこれらの組合せであってもよい。
【０１００】
一部の実施形態では、システムが、図２３に示すＦｉｎＦＥＴと同様に配置されたブリッジセンサ等のセンサを使用することができる。一部の実施形態では、ＦｉｎＦＥＴ型センサは、酸化物層２３２０で覆われたシリコン基板２３００から構成される。酸化物層上のゲート２３４０、並びにセンサフィン２３１０、ソース２３６０及びドレイン２３８０があり得る。一部の実施形態では、例えば、フィン、チャネル、ビーズ等の表面に結合したＤＮＡ等の、周囲環境における標的分子と相互作用するために、３面ゲート２３４０にアクセス可能であり得る。センサフィン２３１０は基板２３００に垂直な縦寸法を有することができ、前記縦寸法は、フィン２３１０の水平横断面よりも大きい。このようなデバイスは、周囲環境にアクセス可能な単一の表面を有するデバイスよりも感度が高いとされ得る。ＦｉｎＦＥＴセンサを、シリコンオンインシュレータ又はＳＯＩ構造から、又はその上に作製することができる。
【０１０１】
チャンバなし増幅
仮出願第６１／４９１０８１号に記載されたチャンバなしシステムにおいてＤＮＡを増幅するプロセスでは、種々の要因が最適化を受ける可能性がある。出願で説明されたように、一部の実施形態において、電場を使用して、テンプレートＤＮＡ、ｄＮＴＰ、及びプライマーを「閉込めセル」領域又は「チャンバなし増幅」領域に引き付ける。その後、テンプレートＤＮＡが位置する各セルの領域で増幅が始まる。増幅プロセス中、電場は、アンプリコンを保持することにより増幅を受ける、異なる閉込めセル間の相互汚染の防止を助けることもできる。ポリクローン領域が確実に発生しないようにするために、大部分の閉込めセルが有する試料ＤＮＡ分子が１つ又はゼロであるように、入力ＤＮＡの濃度を十分に低くする必要があり得る。ＤＮＡ試料を、増幅方法に応じて一本鎖又は二本鎖にすることができる。一部の実施形態では、チャンバなし増幅アレイに装填する前に、ＤＮＡ分子をビーズに加えることができる。最適化を受ける可能性のある一部の要因として、ポリメラーゼ、テンプレートＤＮＡ、及び生成されたアンプリコンを閉じ込めるために使用される電場閉込めセルの周波数、電圧、信号入力のタイプ、信号入力の形状、電圧の絶対値、デューティサイクル、及び寸法が挙げられる。閉込めが唯一の考慮事項であれば、小さいサイズの前記アンプリコンに関係なく、略任意のサイズのアンプリコンを閉じ込めることが可能であろう。しかしながら、適切な閉込めを確実にするのに十分な強度の場は、ＰＣＲ又は等温増幅プロセス中の塩基のポリメラーゼ取込みの適切な活性を防止し得る。場及び印加電圧、周波数及びデューティサイクル及び反応条件における適切な配置によって、場がポリメラーゼ及び／又は伸長プライマーを標的ＤＮＡ伸長プライマー及びポリメラーゼの複合体から引くことが、確実になくなる可能性がある。
【０１０２】
一実施形態では、閉込めセルの周波数、電圧、及びサイズの組合せを、アンプリコンのサイズに応じて最適化することが望ましいとされ得る。例えば、閉込めセルのサイズは、長さ又は直径が１、３、５、１０、１２、２０、２５μｍ等であり、異なる形状、例えば正方形であり得る。周波数は、数Ｈｚ〜数ｋＨｚ又はＭＨｚのＤＣ信号（０Ｈｚ）〜ＡＣ信号であり得る。電圧は、１．２ＶのＤＣオフセットを伴う５００Ｈｚの周波数を有する１ＶのＡＣから構成され得る。チャンバなし増幅は、電気泳動場又は誘電泳動場又は両方を使用して達成され得る。
【０１０３】
誘電泳動を誘発するために、電極のアレイを使用して、不均一な電場を生じさせることができる。電極構成は閉込めセルの外側を画定する外部電極と内部電極とを含む種々の形状を取ることができ、又は、ビーズ、例えば、磁石がビーズを電極に近接して保持するように位置する磁気ビーズに近接した２つの内部電極があり得る。
【０１０４】
誘電泳動場を発生させるために、一般的に正弦波形が使用される。これは異なる種の閉込め又は分離に厳密に向けた適用については理想的であり得るが、生物化学反応が閉込め容積内で行われ得るシステムについては問題を生じさせるおそれがある。システムが正弦波形を使用すると、帯電した種の速度が閉込め容積の中心を通るときに最も高くなり得るため、ポリメラーゼ活性が行われるのに最も望ましいとされ得る点で、ポリメラーゼが意図したように機能できる可能性が最も低くなり得る。
【０１０５】
代替実施形態では、修正正弦波形を使用することができる。例えば、修正正弦波形は、電圧が正弦曲線の上部で除去されていてもよく、局所拡散、プライマーに対するアンプリコンのハイブリダイゼーションの許可、ポリメラーゼの二本鎖ＤＮＡへの結合、及びヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の結合及び取込みが可能になる。その後、適切な時間後に場を復元させることができる。同一のプロセスが、修正正弦波形の反対の符号を有するピークで行われ得る。或いは、サイクル毎に１回のみ、又は数サイクル毎若しくは多くのサイクルにつき１回、正弦波形が中断する可能性があるため、任意の「浮遊」アンプリコンを、最も低い電場強度を有する領域内に捕捉することができ、閉込め容積の主容積に戻すことができる。或いは、正方形、台形、非対称波形等の他の波形を使用してもよい。
【０１０６】
誘電泳動は、標的粒子の電圧要件及びサイズ制限に関する課題を呈し得る。より小さい粒子の有効な閉込め及び分離が問題となり得る。別の実施形態では、均一な電場の印加による種々の種の閉込め又は分離のために、電気泳動を単独で、又は誘電泳動と組み合わせて使用することができる。この方法により、小さい粒子に対するより効果的な制御が可能になり得る。
【０１０７】
一実施形態では、１つ又は複数の電極間にＤＣ信号を印加して、１つ又は複数のＤＣ電場を発生させる。さらに、ＡＣ信号を１つ又は複数の電極間に印加して、１つ又は複数のＡＣ電場を発生させる。発生した機能は、ＤＣ信号、ＤＣパルス、及びＡＣ信号の２つ以上の組合せであり得る。図２４は、一実施形態において、閉込めセル内で時間（ｔ）にわたって電場がＤＮＡ濃度に与える影響を示す。写真は、電場がオンになった後０秒（電場がない）〜７７秒の時間にわたるＤＮＡ濃度の異なる強度を示す。例えば、０秒の写真は７７秒の写真よりも、閉込めセル周りに、より少ない、より弱く照明された領域を有する。
【０１０８】
ＤＣパルスの周波数は、例えば１Ｈｚ〜１０ｋＨｚであり得る。電圧は、上部範囲で電気分解を可能にする、例えば、約＋／−１．３Ｖ間で振動し得る。このようにして、生物化学反応が潜在的な干渉なしに進行することができ、その後、場が適切な時間に復元し得るように、場を除去することができる。
【０１０９】
閉込めセルは、例えばＤＮＡ増幅のためのＤＮＡ等の対象の標的粒子を含んで濃縮させるように機能する。一実施形態では、磁気ビーズ等のキャリアが微小流体チャネルに装填される。図２５に示すように、一部の実施形態では、閉込めセル２５２０に関連する磁石２５００がビーズ２５６０を保持する。例えばＤＮＡテンプレート鎖、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー等の試薬が、その後、微小流体チャネルを通過し、閉込めセル２５２０の外部電極２５４０に含まれる。この外部電極２５４０は、閉込めセル２５２０の領域内に負に帯電したＤＮＡ分子を維持するために負電荷を有することができる。ビーズ２５６０は、２つの内部電極２５８０間に位置することができ、その一部が誘電体層により覆われないままとなり２５９０、ＤＮＡ及び試薬をその領域で濃縮させることができる。テンプレートＤＮＡを、ビオチン−ストレプトアビジン結合等のリンカーの使用によってビーズに結合することができる。次に、ＰＣＲ又は等温増幅等の技術を通して、ビーズ上でのテンプレートＤＮＡ鎖の増幅が発生し得る。例えば、ニック制限酵素及び鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを使用する等温増幅に基づく方法を使用することができる。アンプリコンが内部及び外部電極に含まれていてもよく、ビーズからの粒子の拡散を制限することによって、より有効な増幅プロセスを容易にする。
【０１１０】
さらなる実施形態では、大部分のビーズがビーズ毎に有するテンプレートＤＮＡ鎖が１又はゼロになるように、テンプレートＤＮＡ鎖が低濃度で送達される。代替実施形態では、ＤＮＡテンプレート鎖がビーズに結合されて、ビーズ毎に約１のＤＮＡテンプレート鎖があるように装填工程が修正される。その後、ビーズが微小流体チャネルに装填され、閉込めセルに関連する磁石により捕捉される。試薬送達／濃縮及びＤＮＡ増幅は、前の実施形態で説明したものと同一の方法で行われる。さらなる実施形態では、ＤＮＡ等の標的分子を基板の表面に結合することができ、又は溶液の一部として結合されないままにすることができる。
【０１１１】
一部の実施形態では、図２６に示すように、内部電極が交番する正及び負の極性又は電荷を有して、内部電極２６２０間に位置するビーズ２６００に近接してテンプレートＤＮＡ及び試薬を濃縮させるようにしてもよい。前記内部電極２６２０は、正電荷及び負電荷間で前後に交番する。このようにして、増幅のために使用されるＤＮＡ及び試薬を内部電極２６２０間で前後に通し、ビーズ２６００上又はビーズ２６００に近接した領域で濃縮させ、反対の電荷の電極への付着を防止することができる。負に帯電した外部電極２６４０により発生した電場は、追加のバリアであってもよく、負に帯電したＤＮＡが閉込めセル２６６０から離れて拡散するのを防止する。このようにして、ＤＮＡ及び試薬をビーズ上又はビーズ近くで濃縮させることができるため、増幅反応の効率を上げることができる。一部の実施形態では、ビーズ周りの局所ｐＨ変化の影響を、ビーズからの内部電極の距離によって制御することができる。
【０１１２】
さらなる実施形態では、図２７Ａに示す通り、左右の写真を比較した際に交互に照明された領域によってわかるように、内部電極の正電荷及び負電荷を交番するプロセスが、隣接するセル２７００間で調整される。このプロセスを調整して、隣接セルの隣接する電極が同一時間に同一の極性又は電荷（正若しくは負）を有することができ、その後、電極が同一時間に反対の極性又は電荷に切り替わることができるようにしてもよい。このようにして、隣接セル間の電場が内側を向き、閉込めセルの外側の粒子の拡散を防止する。
【０１１３】
一部の実施形態では、調整された交番電荷を持つ隣接セルの電極を有する効果が、図２７Ｂの２−Ｄに示され、ここでは、同一の電荷を有する隣接電極のため、隣接するセルの電場線（ＡＣ＝１Ｖ、２Ｈｚ；ＤＣ＝ＩＶ）が内側を向いている。
【０１１４】
さらなる実施形態では、図２７Ｃは、図２７Ｂと同一の概念を３次元表示で示す。図の照明された領域は、異なるピクセルの隣接電極を示し、前記隣接電極は、同一時間中同一のものを有する。
【０１１５】
標的粒子と電極との距離が十分でないと、潜在的問題が生じ得る。より高い電圧では、電気分解が起こる可能性があり、これによって、例えば、電極近くの領域における気泡及び／又はｐＨ低下等の問題が生じ得る。これらの変化は、対象のＤＮＡ増幅又は生物化学反応に影響を与え得る。さらなる実施形態では、電極と粒子との間に十分な距離があって、ｐＨ変化又は気泡形成による望ましくない相互作用を防止することができ、しかも電極が閉込め又は分離を可能にするために粒子に十分に近接するように電極が配置される。
【０１１６】
電極縁部の構成、内部電極の形状、寸法、構成、材料、数等に関する最適化があってもよい。一部の実施形態では、電極縁部が鋭くてもよい。他の実施形態では、縁部がより丸くてもよい。電極の全部又は一部が同一の縁部形状を有していても、すべての電極が異なる縁部形状を有していてもよい。電極の形状／鋭さは、関連する電場の強度及び方向に影響し得、対象の適用について最適化され得る。
【０１１７】
一部の実施形態では、電極が矩形形状を有していてもよい。他の実施形態では、電極が湾曲、円形、正方形等、又は任意の他の形状を有していてもよい。
【０１１８】
外部電極は、２μｍ、５μｍ、１０μｍ以下のピッチサイズを有することができ、又は１２μｍ、１５μｍ、２０μｍ、２５μｍ以上等のより大きいサイズを有していてもよい。ピッチサイズは、ＤＮＡ閉込めの有効性に影響を与え得る。同一の印加電圧について、より大きいピッチサイズの閉込めセルは、より小さいピッチサイズのセルの場強度と比べて、ピッチサイズに関連するより小さい電場強度を有する。閉込めセルの比率が同一の比を維持するように設計される場合、前記電場強度の差は、より大きいピッチサイズに対してより小さいピッチサイズのセルにおいて、互いに内部電極に近接することによって生じ得る。
【０１１９】
しかしながら、より大きいピッチサイズは、その比率が、閉込めセルの外側の標的分子の拡散のための経路をより長くする点で、望ましいとされ得る。さらに、ピッチサイズが大きいほど、関連する電場の範囲をより大きくすることができる。このようにして、チャネル上部に向かう標的分子の拡散を捕捉又は防止するために、より大きいピッチサイズが望ましいとされ得る。
【０１２０】
電極は、電気分解中の腐食を最小にするために、例えば、１０／２００ｎｍのＴｉ／Ｐｔから構成され得、又は、金、イリジウム等、若しくは別の金属若しくは材料から構成され得る。一部の実施形態では、隣接する電極、試薬、バルク溶液等からの望ましくない接触又は干渉を防止するために、内部又は外部電極の一部を誘電体材料で覆うことができる。電極上の誘電体層の形状及びサイズに関する最適化があってもよい。所望の電場強度に応じて、１つ又は複数の電極の覆われていない部分は、例えば、１００ｎｍ×１００ｎｍ、５００ｎｍ×５００ｎｍ、１μｍ×１μｍ、４μｍ×３μｍ等、又は別の寸法であってもよい。１つ又は複数の電極の覆われていない部分も、矩形、正方形、円形、又は任意の他の形状等に形状が変化し得る。
【０１２１】
一部の実施形態では、閉込めセルが外部電極及び２つの内部電極から構成される。外部電極は閉込めセルの外周を画定することができ、例えば、正方形の境界を形成する。この外部電極の厚さは、３０ｎｍ、１００ｎｍ、１μｍ、２μｍ、３μｍ等であってよい。さらなる実施形態では、１つ又は複数の内部電極を外部電極内に配置することができ、内部電極の寸法が、例えば、４ｎｍ×１２ｎｍ、６ｎｍ×１５ｎｍ、８０ｎｍ×２００ｎｍ、３μｍ×９μｍ、６μｍ×１１μｍ、１０μｍ×２５μｍ等、又は別の寸法であり得る。内部及び外部電極の寸法は、強度及び電場の範囲、したがって標的粒子の閉込めの有効性に影響し得る。
【０１２２】
さらなる実施形態では、図２８に示すように、例えばチャネル上部等の閉込めセルの外側に１つ又は複数の電極が配置されていてもよい。電極２８００は負電荷を有して、別の電場を与え、負に帯電したＤＮＡ分子２８２０を閉込めセル２８４０内及びビーズ２８６０上へ追い込むのを助けることができる。
【０１２３】
一部の実施形態では、ビーズの装填、ビーズの除去、試薬の注入、試薬の洗浄、理想的な流れ条件、チャネルの閉塞防止、電場範囲内での試薬の維持等、又は他の態様等の要因について、チャネル高さを最適化することができる。一実施形態では、閉塞又は他の潜在的問題を避けるのに必要な最小チャネル高さは、ビーズの高さの約３〜５倍である。他の実施形態では、より高いチャネル高さを使用してもよい。
【０１２４】
一部の実施形態では、１つ又は複数の磁石を使用して、例えば磁気ビーズ等の磁気キャリアを保持することができる。磁石は、例えば、Ｎｉ、Ｆｅ、Ｃｏ、ＣｏＰｔ、ＣｒＣｏＰｔ、ＮｉＣｏＰｔ、又は材料の別の組合せから構成され得る。所望の磁気力及び磁場を得るために、磁石の種々の態様を変更してもよい。最適化を受けるこのような態様としては、例えば、磁石材料、層の数、厚さ、長さ、縁部の鋭さ、形状、構成等が挙げられる。磁石は、常磁性材料、例えば、アルミニウム、白金等、又は任意の他の常磁性材料、或いは強磁性材料、例えば、鉄、ニッケル等、又は任意の他の強磁性材料、或いは材料の組合せから構成されていてもよい。
【０１２５】
接着層は、磁気層の堆積前に、例えば、「棒」形状の磁気領域の下又は上に堆積され得る。接着層は、例えば、クロム、チタン、又は別の接着材料から構成され得る。この接着層は、１、３、５、１０、１５、又は２０ｎｍの厚さ又は別の厚さとすることができる。棒を磁気層のスパッタリングを通して磁化することができる。磁気層は、例えば、白金又は任意の他の磁気材料から構成され得る。スパッタリングされた磁気層は、例えば、３０ｎｍ、５０ｎｍ、７０ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、４１０ｎｍ等の厚さより大きくても小さくてもよい。
【０１２６】
一部の実施形態では、ビーズの数が「ｎ＋１」になるように「ｎ」個の磁石があり得る。代替構成では、「ｎ」個のビーズ及び「ｎ＋１」個の棒、又はｎ個のビーズ及びｂ個の棒若しくはｎ個の棒を有する２×ｎ個のビーズ等の任意の他の組合せがあり得る。一部の実施形態では、所望の構成に応じて、磁石毎に例えば、１つ、２つ等のビーズがあってもよい。
【０１２７】
一実施形態では、層の拡大図を示す図２９に示すように、磁石が「サンドイッチ」層構成を有することができる。サンドイッチ層は、例えば、非磁気材料２９００及び磁気材料２９２０の交互の層から構成されていてもよい。この構成は、より強い磁気力を可能にすることができる。これは、交互の非磁気層の追加によって磁気層を絶縁することにより、磁区が、他の磁区からの干渉なしに場強度を最大化するように整合し得る可能性が高まるからである。これらの交互の層は、例えば、クロム及び／又は白金又は別の材料とすることができる。一部の実施形態では、磁気層が１０ｎｍ以下であり、非磁気層がそれぞれ２又は４ｎｍ、又は１２ｎｍ及び１０ｎｍ、又は任意の他の寸法であり得る。一部の実施形態では、磁気層が、２０ｎｍ、３５ｎｍ、７０ｎｍ等の１０ｎｍ超、又は任意の他の寸法であり得る。
【０１２８】
さらに、一部の実施形態では、例えば、３ｎｍ、６ｎｍ、８ｎｍ、１４ｎｍ等の厚さであり得るクロム／チタンから構成された基層２９４０があってもよい。
【０１２９】
一部の実施形態では、上部酸化物層２９６０と基部の付加層とを含み得る８個の層がある。
【０１３０】
さらなる実施形態では、磁石が、例えば、７０ｎｍ、７μｍ、１０μｍ、２０μｍ等の長さであってもよい。複数のサンドイッチ層から構成され得る磁石の高さは、１０ｎｍ、７０ｎｍ、２００ｎｍ、０．５μｍ、１μｍ、２．８μｍ、５μｍ、１０μｍ等であってもよい。
【０１３１】
１つ又は複数の磁石の縁部の鋭さは、所望の磁気力に応じて変化し得る。一部の実施形態では、より強い磁場及び／又は力が発生するように、磁石の縁部が鋭くてもよい。他の実施形態では、より小さい磁気力を達成するために、磁石の縁部があまり鋭くなくてもよい。磁気力の強度は、ビーズ捕捉の有効性及びビーズ洗浄の容易さに影響し得る。
【０１３２】
１つ又は複数の磁石の形状も変化し得る。ある実施形態では、例えば、磁石が正方形、矩形、円形等の形状を有することができる。形状は、磁場の力に影響を与えることもできる。図３０に示すように、一部の実施形態では、閉込めセルアレイ３０２０の長さに沿って延びる磁気棒３０００があってもよい。
【０１３３】
図３１Ａでは、一部の実施形態において、閉込めセル３１２０に関連する磁気ビーズ３１６０が１つの磁石３１００の上方に位置する。ビーズ３１６０は外部電極３１４０及び２つの内部電極３１８０に近接する。内部電極の一部３１９０は誘電体材料により覆われていなくてもよい。代替実施形態では、図２５に示すように、１つの閉込めセルに関連する２つの磁石がある。これら２つの磁石２５００はセル２５２０の中央を貫通することができ、磁石の端部がセルの中央又はその近くで互いに対向する。この構成により、セルの中央近くの２つの磁石間に間隙（図示せず）が生じ得る。磁気力がこの構成から生じ、ビーズ等のキャリアがこの力によって保持され、間隙上又は間隙内に載置され得る。この間隙サイズは、例えば、５０ｎｍ、１００ｎｍ、０．２５μｍ、１μｍ、１．５μｍ、２μｍ、２．５μｍ幅等であり得る。間隙サイズは、ビーズ上の所望の磁気力を可能にするように最適化され得る。例えば、間隙サイズ等のパラメータを変化させることにより、図３２に示すようなビーズ捕捉効率等の要因を最適化することができる。一実施形態では、図示するように、１．２５μｍの間隙サイズを使用することにより、直径２．８μｍのビーズサイズについて約９０％の単一のビーズ捕捉効率が得られる。一部の実施形態では、閉込めセル軸及び磁気棒の軸が、高効率磁気ビーズ捕捉及び充填率の最適化のために、例えば、１１°、１５°、１８°、又は３０°の角度を有することができる。
【０１３４】
図３３Ａでは、別の実施形態において、閉込めセル３３２０に位置する１つ又は複数の磁石３３００に加えて、閉込めセル３３２０の上部又は外側、例えば、チャネル３３３０上部に位置する１つ又は複数の外部磁石３３１０があってもよい。一実施形態では、チャネル３３３０上部の外部磁石３３１０が強磁性で、例えば、鉄から構成されていてもよい。代替実施形態では、外部磁石３３１０が、例えば、サマリウムコバルトから構成された希土類磁石であってもよい。外部磁石３３１０は流体チャネルの内側にあっても外側にあってもよい。
【０１３５】
さらなる実施形態では、外部磁石が、適切な時間に微小流体チャネルに近接して、又は微小流体チャネル内へ下降でき、その後、持ち上げるか、又は他の他方によってセルから離すことによって閉込めセルの範囲から取り出すことのできる機構の一部であり得る。
【０１３６】
一部の実施形態では、より広い領域に磁場を発生させるために、セルの外側の磁石が適切な時間に閉込めセルの内側の磁石と相互作用することができる。例えば、チャネル上部に配置された磁石は、磁場がチャネル上部に到達するように、閉込めセルの内側の磁石と相互作用することができる。この構成により、より大きい磁場範囲が可能になるため、ビーズ捕捉効率が上昇し得る。別の実施形態では、閉込めセルの外側の磁石が物理的磁石ではなく、代わりにチャネル上に堆積された磁気層であってもよい。
【０１３７】
一部の実施形態では、本明細書に記載の磁気領域又は場のいずれかを、電磁構造又は技術、例えば、通過電流又は他のタイプの電磁場発生を伴うコイルにより生じさせることができる。一部の実施形態では、永久磁石を使用してもよい。
【０１３８】
図３３Ｂに示すように、さらなる実施形態では、１つ又は複数のトレンチ３３７０がビーズ３３６０の真下に位置して、ビーズ３３６０の底面を標的分子の送達又は結合のために使用できるようにしてもよい。このようにして、追加の表面積を、ＤＮＡ増幅等の所望の反応のために使用できるようにする。トレンチ３３７０は、例えば、３×１μｍ、４×１μｍ、５×１μｍ、４×２μｍ等の寸法を有することができる。別の実施形態（図示せず）では、トレンチ３３７０が閉込めセルアレイ３３２５の長さを横切って延び、試薬の送達を容易にし洗浄を向上させることができる。
【０１３９】
閉込めセルの構成及び関連する態様についての複数の考えられる実施形態がある。
【０１４０】
一実施形態では、図２５に示すように、閉込めセル２５２０が１つの外部電極２５４０により囲まれた２つの内部電極２５８０から構成され、内部及び外部電極の両方が鋭い縁部を有する。代替実施形態では、図３３Ｃに示すように、内部電極３３８０及び外部電極３３４０の両方の縁部が丸くても、内部電極が鋭い縁部を有し外部電極が鋭い縁部を有していなくてもよく、又はその逆も可能である。
【０１４１】
代替実施形態では、図３３Ｄに示すように、閉込めセル３３２０が複数の内部電極３３８０を有し、例えば、閉込めセル３３２０は４つの内部電極３３８０から構成される。さらなる実施形態では、複数の内部電極の形状が変化し得、例えば、電極は円形、正方形、弓形等又は任意の他の形状であってもよい。
【０１４２】
さらなる実施形態では、図３３Ｅに示すように、内部電極３３８０が半円形で、外部電極３３４０も円形であってもよい。
【０１４３】
図３３Ｆは、一部の実施形態において、１つの内部電極３３８０があり得、この内部電極３３８０に近接して、又は内部電極３３８０上方にビーズ３３６０が位置し、さらに前記内部電極３３８０を囲む外部電極３３４０があり得ることを示す。
【０１４４】
代替実施形態では、外部、中央、及び内部電極がある入れ子電極構成があり得る。図３３Ｇに示す一実施形態では、例えば、より小さい中央電極３３４５を囲む外部電極３３４０があり得、前記中央電極が１つの内部電極３３８０を囲む。図３３Ｈに示すさらなる実施形態では、２つ以上の内部電極３３８０があってもよい。図３３Ｉに示す別の実施形態では、閉込めセル３３２０の周囲に沿った外部電極３３４０と、２つの内部電極３３８０をブラケットで支えるさらに２つの中央電極３３４５があってもよい。
【０１４５】
一部の実施形態では、閉込めセルが、図３３Ｂに示すようにトレンチ３３７０を有して設計されていても、図２５に示すようにトレンチ３３７０なしで設計されていてもよい。図２５に示すように、一部の実施形態は、ビーズ２５６０が載置され得る磁石２５００間の間隙があるか、又は磁石２５００が閉込めセル（図示せず）の表面と同一平面にあるようにセルが設計され得る構成を有することができる。
【０１４６】
また、電極の位置に対する磁石の位置について種々の考えられる構成があり得る。腐食を防止するか、又は遅らせるために、磁石のどの部分を酸化物層で覆うかについての最適化もある。図３３Ｊでは、一実施形態において、磁石３３００を電極３３７５上部に位置させて、電極３３７５が露出される張出し部分があり、磁石３３００上に酸化物層３３０５があるようにしてもよい。代替実施形態では、図３３Ｋに示すように、電極３３７５が磁石３３００上部にあって、磁石３３００を露出させる張出しがあり、磁石３３００が酸化物層３３０５に覆われるようになっている。電極の一部が絶縁層（図示せず）により覆われていてもよい。両方の例示的な実施形態では、ビーズ３３６０を、構成により形成された間隙内に位置させることができる。
【０１４７】
図３３Ｌは、基板３３３１上方の閉込めセル３３２０の一実施形態を示す。ここでは、例えばＤＮＡ増幅等の標的反応が発生し、閉込めセル３３２０の磁石３３００及び電極３３７５上方に位置するビーズ３３６０にアンプリコン３３１５が結合される。
【０１４８】
図３３Ｍは、閉込めセルアレイ３３２５及び概念写真３３３５の対応する実証の一実施形態の図である。一部の実施形態では、概念写真の実証に見られるように、磁気ビーズ３３６０がアレイに含まれる。
【０１４９】
図３３Ｎは、さらなる実施形態で、チャンバなし増幅のための微小流体チップの一部として配置された閉込めセルアレイ３３２５を示す。この微小流体チップ構成により、ＤＮＡ増幅のためのＤＮＡ、ヌクレオチド、プライマー等の試薬及び標的粒子の入力及び洗浄が可能になる。アレイ密度は、３０×３０又は１００×１００又は１０００×１０００又は任意の他の配置であり得る。
【０１５０】
前述した方法を、種々のＤＮＡ増幅方法、例えば、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）又は等温増幅と共に使用してもよい。増幅は、１つのプライマーがビーズ表面にあり、第２のプライマーが溶液中にある固相増幅であってもよく、又は増幅は、すべてのプライマーがビーズ上にある固相であってもよい。代替実施形態では、両方のプライマーが溶液中にあり、一方のプライマー又は両方のプライマーがビーズ上にもある増幅を行うことができる。増幅が行われた後、電場強度は、強度又は周波数を変化させることができ、場合によってオフにすることもできる。
【０１５１】
濃縮モジュール
クローンビーズを発生させるときに、ビーズの大部分がＤＮＡテンプレートを有していないことがあり得る。加えて、他のビーズの増幅が十分でないこともあり得る。これらのビーズは有用な配列決定データを提供しないため、効率を上げるためにはこれらのビーズを除去することが望ましいとされ得る。一部の実施形態では、電場を使用して、テンプレートのない、又は最少量のテンプレートを有するビーズを分離する濃縮モジュールを使用することができる。ビーズの電荷、電気的又は物理的特性を介した、クローンビーズからの「ヌル」ビーズの他の濃縮又は分離を使用してもよい。
【０１５２】
テンプレートが完全に装填されたビーズは、より高い電荷を有するため、プライマー又は少しのテンプレート、又は短い、若しくは不完全なＰＣＲ産物のみを有するビーズよりも電場内で遠くへ移動することができる。一部の実施形態では、図３４Ａ（正面図）及び図３４Ｂ（上面図）で示すように、モジュール３４００を通してこの分離を達成することができる。第１の流体入力３４１１Ａにより、混合ビーズの注入が可能になる。第２の入口３４１２Ａにより、ビーズのない緩衝液の注入が可能になる。第１の出口３４１１Ｂは、第２の入口３４１２Ａの下流であってもよい。ポート３４０９を通してモジュール内外へ流体を導くことができる。流体システムは、基板３４０２、及びＰＤＭＳ３４０８ガラス又は他の材料の層に形成されたチャネル３４１０を有することができる。
【０１５３】
より多くの液体が第２の入口に流入するように、流体流速度を流体抵抗又はポンピング速度により設定することができる。一実施形態では、入口及び出口幅を変化させて異なる流体抵抗を生じさせることができるが、異なる長さ又は高さ等の流体抵抗を修正する他の方法が予想される。同様に、第１の出口３４１１Ｂ及び第２の出口３４１２Ｂの流体抵抗を修正して、より多くの液体が第１の出口３４１１Ｂから流出するようにしてもよい。このような設定では、流れに垂直な小速度のないビーズが第１の出口ポート３４１１Ｂを介して出ることができる。追加の出力チャネルを加えて、テンプレートの中間レベルでのビーズの分離を容易にすることができる。
【０１５４】
一実施形態では、例えば、ビーズの表面電荷に結合されたＤＮＡ分子の異なる濃度又は長さによる、異なる電荷密度を有するビーズの分離について、ビーズは電場において異なる力を受け、したがって流れに垂直又は略垂直な異なる速度を受けることができる。このタイプの構成では、流れに垂直なより小速度のビーズが、第１の出口ポート３４１１Ｂを介して出ることができる。より高い電荷、及びしたがって流れに対してさらに垂直な速度のビーズにより、偏向が大きくなり、他の出口ポートから出ることができるため、異なる電荷密度の２つのビーズタイプを分離させる。同様に、追加の出力チャネルを加えて、テンプレートの中間レベルのビーズの分離を容易にすることができる。
【０１５５】
テンプレートが装填されたビーズが、第２の出口３４１２Ｂに向かって流路から出るように、流体流に垂直な電場を発生させることが可能な一対の電極３４１３を設けることができる。流体ポート３４０９により、システム配管への接続が可能になる。
【０１５６】
図３４Ｃに示すように、電気泳動力（電場）の印加により生じ得る１つの潜在的問題は、電気浸透流である。電場が微小流体チャネルに印加されると、溶液と微小流体チャネルの壁との界面に生じる二重層により、電気浸透流が発生し得る。これにより、微小流体チャネルの流体媒体３４９０が移動するが、生じ得る１つの問題は、流体媒体３４９０の部分３４９５に見られるように、流れが円形又は乱流になることである。
【０１５７】
図３４Ｄの一実施形態に示すように、電気浸透流に関連し得る円形パターンを防止するために、マイクロポール又は壁等の流れ制限部分３４２０の物理的バリアを微小流体チャネルに埋め込んで、流れが確実に線形のままであるよう助けることができる。図は、概念の成功した実証、及び電場がチャネルを通して印加されたときにビーズ分離３４３０が時間と共に進行する様子を示す。この分離は、ビーズの電荷密度に基づいていてもよい。
【０１５８】
別の考えられる実施形態では、電極の形状又は構造が、流体媒体内の電極の他の部分からの流れが、１つの部分により生じた電気浸透流の大部分を打ち消すように変化し得る。電極の形状、例えば三角形若しくは鋸歯等の形状、又は鋸刃形状若しくは他の形状により、この特性をもたらすことができる。他の実施形態では、ゲル又は他のポリマー材料を使用して、電気浸透流を減少又は防止することができる。
【０１５９】
一部の実施形態では、図３４Ｅに示すように、濃縮モジュールがチップの一部であり、入口ポート３４０９Ａ、収集ポート３４０９Ｂ、右緩衝液ポート３４１４Ａ、左緩衝液ポート３４１４Ｂ、電極リザーバ３４１５、及び排水ポート３４１６があってもよい。図は、濃縮モジュールチップを通る流れのチャネル側を示す。
【０１６０】
改良された検出の改良された化学作用
一般に、大部分のクローンＤＮＡ配列決定システムについて、取得可能な信号の量を最大化するために、表面にできるだけ多くのＤＮＡがあることが望ましい。ヌクレオチド取込みから生じる電荷又はインピーダンスの変化が測定される、合成システムによる配列決定では、例えば、センサ近くにあるＤＮＡが多いほど、ｄＮＴＰ取込みの結果としてより多くの電荷が蓄積し、結果として生じる信号が多くなる。表面は、平面、球形、結晶構造等を含む任意の形状のセンサ、磁気ビーズ、又は別のキャリアであってよい。しかしながら、ＤＮＡが表面にランダムに配置されるため、ＤＮＡの間隔により、重合反応の立体障害が生じ得る。分子の空間特性が、分子内又は分子近くで発生する生物化学反応を防止するか又は遅らせるときに、立体障害が生じる。ＤＮＡ及びＲＮＡポリメラーゼはサイズが約４ｎｍ〜１５ｎｍ以上に顕著に変化するため、所与の重合反応を最適化するためには、ポリメラーゼ活性のための十分な空間が必要である。ここで、このような間隔を設ける新規な方法を提示する。
【０１６１】
多くの異なる配列決定の適用で、標的ＤＮＡ又はプライマーが基板の表面に結合される。これらの標的分子を、共有結合を含むか、又は、例えば、ビオチン化されたＤＮＡがストレプトアビジン被覆されたビーズに結合されるビオチン−ストレプトアビジン等のリンカーを通した種々の方法で、基板の表面に結合することができる。付着方法の結果として、標的ＤＮＡ及びプライマーは、表面にランダムに配置され、ポリメラーゼ伸長について立体障害が発生する十分に近接した位置にあり得る。ビオチン−ストレプトアビジン結合が使用されても、ビーズ上のストレプトアビジンの濃度が高い場合、ストレプトアビジンのサイズ（３ｎｍ）は、ポリメラーゼのための空間（７〜１０ｎｍ）があるようにＤＮＡ分子を適切に離間させるのには不十分である。
【０１６２】
一実施形態では、立体障害が発生しないように標的ＤＮＡを適切に離間させることができる。これは、例えば、二本鎖ＤＮＡを有する複合体と、配列決定反応に使用されるポリメラーゼよりも大きいポリメラーゼとを使用することにより達成され得る。このようにして、ＤＮＡが配列決定できる状態になると、ＤＮＡは、配列決定で使用されるポリメラーゼが適切に機能するために十分な空間があるようにすでに配置されている。初期ポリメラーゼはＢＳＴ、Ｐｈｉ２９、Ｋｌｅｎｏｗ  ｅｘｏ−３’、Ｔ４等の１つ又は複数であり得、配列決定ポリメラーゼは、初期ポリメラーゼよりも小さいサイズになるように選択され得る。各ポリメラーゼのサイズの差は１ｎｍ〜１０ｎｍである。
【０１６３】
代替実施形態では、図３５に示すように、ビーズ３５４０に付着可能な二本鎖又は一本鎖ＤＮＡ３５２０に結合する、適切なサイズの他のタンパク質３５００を使用してもよい。このようなタンパク質としては、例えば、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子等が挙げられる。
【０１６４】
初期ポリメラーゼは、付着プロセス中に結合されたままになるように、進行性(processive)であってもよい。一部の例は、Ｂｓｔ及びＰｈｉ２９を含む。付着プロセスが行われた後、ポリメラーゼを除去、分解、又は洗浄して、配列決定反応が行われる適量の空間を残す。代替実施形態では、ポリメラーゼがスペーサとして使用されるためにＤＮＡ上にとどまることができ、別のポリメラーゼを使用してＤＮＡを配列決定することができる。さらなる実施形態では、ポリメラーゼをビーズ又はキャリア近くに付着させることができる。
【０１６５】
或いは、タンパク質以外の部分を使用して、ＤＮＡの間隔をあけてもよい。その後、これらの他の部分を除去することにより、立体障害を避けるように設計されたＤＮＡ分布を生じさせる。
【０１６６】
一部の実施形態では、デバイ長を最大化するために、非常に低いイオン強度の試薬を使用することが望ましいとされ得る。このような実施形態について、酵素反応に必要なものと同程度の塩を有する試薬を使用することが望ましいとされ得る。このような試薬について、例えば使用可能なＮａＣｌ又はＫＣｌの量を減少させ、又は最少にすることによって、かつ十分なＭｇを使用することによって、使用する塩の量を最少にすることが有利となり得る。十分なＭｇは、試薬で使用されるヌクレオチドの濃度に等しい濃度を含むことができ、追加のＭｇはＤＮＡに対する対イオンとして作用し、Ｍｇの残りはＤＮＡに関連するフローセル内でのポリメラーゼ機能のためのものである。したがって、必要な濃度は、フローセル内のＤＮＡの量及び長さ、ポリメラーゼ分子の数、ヌクレオチド濃度、及び使用する試薬の量の関数となる。
【０１６７】
イオン濃度が非常に低い一部の実施形態では、周囲空気、例えばｐＨを低下させる可能性のある、炭酸を形成するＣＯ２によりｐＨが影響され得る。緩衝試薬はイオン濃度に寄与するため、検出方法に応じて緩衝の量を最少化することも望ましいとされ得る。必要とする十分な緩衝間の対立を軽減し、しかも十分に低いイオン強度を有することは、考えられる複数の実施形態により達成され得る。一実施形態は２つの緩衝液を共に使用することを伴う。これらの緩衝液は、例えば、ＴＲＩＳ  ＨＣＬとは対照的にＴｒｉｓ及びＨＥＰＥＳの組合せであり、これにより、Ｔｒｉｓ及びＨＥＰＥＳの両方が緩衝に寄与できる。別の実施形態では、水と混合できる有機試薬、例えば、エタノール等のアルコールを使用してもよい。
【０１６８】
一部の実施形態では、ビーズに関連する電荷により、電荷又は導電性センサの範囲を縮小することができる。使用されるビーズはＭ２７０、Ｍ２８０、ダイナビーズ等であり得る。結果として、一部の実施形態では、ビーズ表面にある電荷の量を最少にすることが望ましいとされ得る。これは、例えば、ビーズ表面のＳ０４の量を変更することにより達成することができる。一部の実施形態では、ＤＮＡ又はヌクレオチドがビーズ表面に結合することを防止する少量の負電荷を有するが、センサのダイナミックレンジを大きく減少させる過剰量の電荷を有していないことが望ましいとされ得る。過剰量の負電荷により、ビーズ及びＤＮＡに関連する対イオンの数が増加するように電荷の蓄積が生じるため、センサ感度が低下する。
【０１６９】
移送誤差の減少
ポリメラーゼに単一のヌクレオチド又はヌクレオチド類似体が一度に供給されると、ｋｐｏｌ／ｋｄ，ａｐｐとして測定される触媒効率の大きな差にもかかわらず、４つのヌクレオチド又はヌクレオチド類似体のすべてが供給されるときよりも、誤差速度は一般的に非常に高くなる。この触媒効率は、一致したヌクレオチドに対して一致しないヌクレオチドについて４ログ以上低くなり得る。この大部分は、ｋｄ，ａｐｐの差によるものである。例えば、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼは、１０６〜１０８塩基毎に１つの塩基の誤取込み速度を有する。比較すると、単一の自然ｄＮＴＰの取込みを使用する現在の商用システムのポリメラーゼ伸長反応は、１００〜１０００塩基に限定される。このようなシステムのポリメラーゼは、その時間の略すべてを誤った塩基に晒されて過ごす。システムに追加されたヌクレオチドが、追加される次のヌクレオチドであるときでも、反応時間は、８以上のヌクレオチドと同じ長さであり得るホモポリマーについての反応を完了するか、又は立体障害のためにアクセスしにくいこれらのＤＮＡ鎖との反応を完了するのに十分な長さでなければならない。
【０１７０】
一部の実施形態では、４つのヌクレオチド又はヌクレオチド類似体すべてを提供することにより、反応を競合反応となるようにすることができ、４つのヌクレオチド又はヌクレオチド類似体のうちの３つが取込み不可能なヌクレオチド類似体である。その結果、ポリメラーゼが、その時間の大部分を、取込み不可能なヌクレオチドを正確に取り込もうと無駄に試みて過ごすことになる。取込み不可能なヌクレオチドは、ＰＮＡヌクレオチド、ＬＮＡヌクレオチド、アデノシン一リン酸、アデノシン二リン酸、アデノシン、デオキシアデノシン、グアニン一リン酸、グアニン二リン酸、グアノシン、デオキシグアノシン、チミン一リン酸、チミン二リン酸５−メチルピリジン、チミジン、シトシン一リン酸、シトシン二リン酸シチジン、デオキシシチジン、ウラシル一リン酸、ウラシル二リン酸、ウリジン、デオキシウリジン、又は結合可能であるがポリメラーゼによって取り込み不可能な他のヌクレオチド類似体であり得る。
【０１７１】
一実施形態では、異なるヌクレオチド又は取込み不可能なヌクレオチド類似体の濃度レベルを、ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体のそれぞれについての相対ポリメラーゼ活性に一致させることができる。例えば、ｄＴＴＰ結合速度は、他のヌクレオチドに対して２倍超で異なるように測定されている。他の３つのヌクレオチドはポリメラーゼ結合速度にはるかに近いが、依然として互いに１０パーセント超で変動する。自然ヌクレオチドに対して異なる取込み不可能なヌクレオチド類似体についてポリメラーゼ結合速度を比較する際に、差がさらに大きくなり得る可能性がある。
【０１７２】
さらなる実施形態では、取込み不可能なヌクレオチドの濃度が、配列決定反応に提供される１つ又は複数の取込み可能なヌクレオチド又はヌクレオチド類似体についての等価なポリメラーゼ結合効率に対する濃度よりも高くなり得る。本実施形態のヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の誤取込みの確率は、ポリメラーゼ結合速度が一致するように取込み不可能なヌクレオチドの濃度を提供する代替手法の場合、又は取込み不可能なヌクレオチド類似体が、取込み可能なヌクレオチド若しくはヌクレオチド類似体に対してより低いポリメラーゼ結合速度の濃度で提供される場合よりも低い。
【０１７３】
或いは、取込み可能なヌクレオチド又はヌクレオチド類似体に対してより低いポリメラーゼ結合速度の濃度で取込み不可能なヌクレオチド類似体を提供して、取込み不可能なヌクレオチドのポリメラーゼ結合速度が取込み可能なヌクレオチド類似体結合速度と同一又は高い場合に生じるものよりも高速で、反応が進行し得る。
【０１７４】
上記手法は、３つの取込み不可能なヌクレオチド類似体及び１つの取込み可能なヌクレオチド又はヌクレオチド類似体があるか、２つの取込み不可能なヌクレオチド類似体及び２つの取込み可能なヌクレオチド又はヌクレオチド類似体があるか、１つの取込み不可能なヌクレオチド類似体及び３つの取込み可能なヌクレオチド又はヌクレオチド類似体がある反応条件について使用可能である。
【０１７５】
取込み不可能なヌクレオチド類似体を使用する上記反応条件について使用可能な検出方法は、取込み又は取込み事象の任意の形の電子検知を含み得る。例えば、この電子検知方法として、ＩＳＦＥＴ、ＣＨＥＭＦＥＴ、ナノニードル、ナノブリッジ、カンチレバ式センサ、電子ｐＨセンサ、電荷センサ化学発光検出、蛍光検出（Ｑｄｏｔ又は他の非標準蛍光体の検出を含む）、並びに蛍光発生部分の使用による介在蛍光体の検出が挙げられる。
【０１７６】
リフェージング
同様に、米国仮出願第６１／４９１０８１号に記載のリフェージングを、４つの取込み可能なヌクレオチドを使用するもの、及びディフェージングの最小化に関して前述したものすべてを含む任意のクローン配列決定システムについて実行することができる。先の出願に記載されたように、リーディング又はラギング配列取込み誤差は、ヌクレオチドの誤った追加又は正確なヌクレオチドの追加の抜けによって生じ得る。これは、最適でない反応条件、立体障害、二次構造、又は他のポリメラーゼ阻害源のために生じ得る。他の方法で行う場合とは異なる順序での取込みヌクレオチドにより配列決定を行う、可逆ターミネータｄＮＴＰを使用する、分子「クランプ」を使用する、又はこれらの方法の任意の組合せ等の複数の方法を、リフェージングのために使用することができる。
【０１７７】
一部の実施形態では、リフェージングのために使用できるより短いハイブリダイゼーションプローブを可能にするために、ヒドララジン又は抗腫瘍抗生物質ｃｃ−１０６５等の安定化化合物を使用してもよい。同様に、プローブは、二本鎖ＤＮＡの溶融温度を高めるＬＮＡ、ＰＮＡ、又は他のヌクレオシド類似体を含むことができる。このプローブは、より密な結合を可能にし、かつ、例えばプローブの３末端でターミネータを使用することにより、プローブがポリメラーゼにより伸長されるのを防止する必要をなくすという二重の機能を提供することができる。プローブは、ある点を過ぎて取込み反応がテンプレートＤＮＡで発生することを阻止するように作用し得る。これにより、ラギング鎖の「巻返し」及びリーディング鎖が、プローブが結合されたある点を過ぎて取込みを進めることを一時的に阻止するように、リフェージングが可能となる。加えて、プローブは、一重鎖、標的ＤＮＡに対してハイブリダイゼーションされて、より安定した三重鎖を形成する二重鎖、又は標的ＤＮＡに対してハイブリダイゼーションされて四重鎖を形成する三重鎖であってもよい。
【０１７８】
周波数依存発振器
ナノニードル及びナノブリッジセンサの両方が、正確な速度コンダクタンス測定を必要とする。一部の実施形態では、図５８に示すような弛張発振器回路を使用して、センサコンダクタンスに比例する周波数を有するクロック信号を発生させることができる。定義された時間内で遷移数を数えることによって、この周波数を測定することができ、この計数値はセンサコンダクタンスに比例する。
【０１７９】
この手法は、ロックイン増幅器を使用する他の測定回路を上回る大きな利点を有する。弛張増幅器回路は、乗算器、アナログ／デジタル変換器、及びフィルタキャパシタがないため、大きなシリコン面積を必要としない。したがって、弛張増幅器回路を、各ピクセルの小さい面積上及び高密度アレイ内で適度に実施することができる。或いは、入力多重化を使用して、回路数を減少させることができる。
【０１８０】
キャパシタ（図５８のＣ１）を変化させることにより、公称周波数を調節することができる。キャパシタが小さいほど、小さい面積及び高い動作周波数の両方が可能になり、精度が高まる。小さいキャパシタを使用することにより、インピーダンスへの寄与が低下するため、ナノニードル二重層キャパシタが測定に雑音を与える能力を低下させることもできる。カウンタのビット数を増加させることにより、面積のわずかな増加のみを必要としながら、精度を高めこともできる。結果が比較的限られた範囲に入ることがわかっている場合、カウンタのビット数をより小さい回路について減少させることができる。その後、カウンタは測定中に数回、自由に転がることができ、可能な範囲が既知であるため、これらのビットは真の結果を導き出す必要がなくてもよい。ビット数は、予想可能なコンダクタンスレベル範囲を含むのに十分な大きさがありさえすればよい。
【０１８１】
シュミット回路、正のフィードバックを有する比較器を、２つのトランジスタ差分対増幅器を使用して実施することができる。しかしながら、追加ゲイン及び出力ステージを有するＣＭＯＳ差分増幅器を使用して、より良好な結果を達成できる可能性がある。カウンタ回路を、比較的小さいデジタルトランジスタを使用して実施することができる。カウンタは同期することができ、又はトランジスタの計数値を減少させる非同期（リップル）カウンタであってもよい。したがって、ビット毎に１つのフリップフロップのみで、カウンタ回路を実施することができる。
【０１８２】
一部の実施形態にもかかわらず、ナノニードルのためのデータ取得回路は、比較的大きい乗算器及びＡ／Ｄ変換器回路を必要とし得る。２つの弛張発振器によって、より小さいシリコン面積要件及び改良された高周波数雑音耐性が可能になる。この手法をナノブリッジに適用してもよく、図５８に示すように、この手法はキャパシタ値及びカウンタサイズのわずかな変化を必要とする。異なるタイプのセンサ及び検出器モダリティを、提案した実施形態に使用することができる。
【０１８３】
比較器出力は、センサコンダクタンスに比例する周波数を有する方形波であり得る。この周波数は、固定間隔中に起きる正のエッジの数を数えることにより測定され得る。したがって、カウンタ出力はセンサコンダクタンスに比例し得る。
【０１８４】
一実施形態では、Ｃ１を比較的小さくして、Ｃ１両端の電圧降下が二重層キャパシタ両端の電圧降下よりも大きくなるようにする。これにより、セルに必要なシリコン面積を減少させることもできる。Ｒｌ及びＲ２を使用して、公称周波数及びＣ１へのピーク間電圧を調節することができる。
【０１８５】
一部の実施形態では、カウンタが所望の範囲内にあることが予想される場合、ビット数を減少させることができ、読取りを行う前に、カウンタを数回リセットすることができる。これにより、カウンタ毎のビット数及びマルチプレクサ回路のバス幅が減少するため、より簡単な回路をより高い密度アレイについて実施することが可能になる。
【０１８６】
別の実施形態では、回路が単一のセルに対して大きすぎる場合、行毎又は列毎に単一のカウンタ及び場合によって比較器が存在するように回路を設計して、センサと回路との間でマルチプレクサを有効に移動させ、検出回路の数を１列又は１行におけるセンサの数まで有効に減少させることができる。
【０１８７】
そのときの１行又は１列を検出する技術、したがって行毎又は列毎に１つの検出回路を使用する技術は、本開示に挙げたすべての実施形態に適用可能であり、本実施形態のみに限定されない。
【０１８８】
別の実施形態では、アナログ回路を２、５、又は１０個等のトランジスタを使用して達成することができる。必要なカウンタビット数は、ビーズ装填及び必要な検知の変動に応じて決定され得る。３又は４又は他の数のトランジスタを使用するような、回路実施の代替構成が可能である。
【０１８９】
再利用可能な磁気アレイ及びナノ電子センサを有する例示的な配列決定システム
例としての実施形態では、例示的な配列決定システムが、ナノ磁気電子プラットフォームを使用する完全一体型ＤＮＡ増幅及び配列決定モジュールから構成される。
【０１９０】
図３６Ａは、以下で説明する例示的なシステムの一実施形態を示す。図３６Ａは、ＤＮＡライブラリー構成モジュール３６００、エマルジョンなし増幅モジュール３６２０、電気泳動濃縮モジュール３６４０、及びＤＮＡ配列決定モジュール３６６０から構成され得る一体型配列決定プラットフォームを示す。
【０１９１】
図３６Ｂは、試料調製モジュール３６１０及びＤＮＡ配列決定モジュール３６６０が再利用可能な磁気電子チップ３６８０上で一体化され得る一部の実施形態を示す。試料調製３６１０は、ＤＮＡライブラリー構成モジュール３６００、エマルジョンなし増幅モジュール３６２０、及び電気泳動濃縮モジュール３６４０から構成され得る。配列決定アレイの一実施形態の拡大図３６６５も図中に示される。
【０１９２】
一部の実施形態では、増幅後、ＤＮＡテンプレート運搬モノクローンビーズの濃縮が、ＤＮＡ電荷に基づく電気泳動「選別」によって達成され得る。その後、ビーズは、ＤＮＡ伸長反応の電子検出のためのセンサの高密度アレイから構成されたＣＭＯＳナノ電子配列決定チップと一体化された微小磁石棒を使用して移送され、保持され得る。
【０１９３】
エマルジョンなし増幅
システムは、隣接する反応に対する分離バリアを提供するために、各ビーズに近接してアンプリコンを含んで濃縮させる電場によって形成される、チャンバなしナノリアクタ（「閉込めセル」又は「仮想ウェル」とも呼ばれる）を使用することができる。チップは、図３３Ｎに示すように、アレイの１組の電極にそれぞれ関連する微小磁気部品から構成され得る。ＤＮＡ濃度及び分離のための電場を有する微小磁気捕捉機能の組合せによって、アンプリコンの局所化及び閉込めによる、一層効率的な増幅が可能になる。
【０１９４】
試料ライブラリーＤＮＡを電場によりビーズに対して導入して駆動することができ、ＤＮＡライブラリーの使用効率を高めると共に、全ゲノム増幅の必要をなくす可能性がある。電場は隣接する仮想ウェルを分離する。ビーズとライブラリーＤＮＡ分子との比は約１：１であり得、ビーズ毎に主に１つのテンプレートＤＮＡとなる。電場を使用して、ビーズ付近でＤＮＡアンプリコンを濃縮させることができる。増幅後、電気泳動分離を使用して任意の特徴の無いビーズを除去することができる。この分離プロセスは、増幅されたＤＮＡを有するビーズのみが配列決定プラットフォームに確実に移送されることを助ける。ビーズ装填を向上させ、必要な試薬の量を減少させるためにこの手法を使用することができる。
【０１９５】
チャンバなしナノリアクタ及びナノ電子センサ
例示的な実施形態において、配列決定プラットフォームは、試料調製及び増幅モジュールについて説明したように、同一の微小流体及びナノ磁気素子を使用することができる。ナノ電子センサは、１：１の比（センサ対ビーズ）で磁気アレイに追加され得る。この構成により、ナノ磁気素子を有する高密度ナノ電子センサアレイが得られる。チャンバなしナノリアクタアレイの例示的な実施形態の概念の実証が、図３３Ｍに示される。
【０１９６】
さらに、例示的な実施形態では、磁気素子により、各ＣＭＯＳベースの非ＦＥＴナノ電子センサについて単一のビーズの捕捉が可能になり得る。この構成は、図３に示すように、ウェル又は凹みをなくすことができ、図３は、凹み又はウェルのない閉込めセルアレイを示す。このようにして、平均して１０００塩基を超える読取り長さを達成することができる。これは、ハプロタイプの同定、コピー数の変化、及びゲノム再編成を助けることができる。
【０１９７】
図３７に示すように、チャンバなし手法を微小流体制御と組み合わせることができる。ビーズ及び付着した標的分子を入力ポート３７６０Ａを通して送達できるようにするために、微小流体チャネル層３７００をフローセル３７２０に接続してもよい。微小流体チャネル層３７００により、ヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇ）及び／又は緩衝液（Ｂ１、Ｂ２）等の試薬を試薬ポート３７６０Ｃを通して送達することも可能になる。検出器チップ３７４０をフローセル３７２０及び微小流体チャネル層３７００に接続して、例示的な実施形態ではＤＮＡ配列決定のためのヌクレオチド取込みであり得る、標的反応の検出を行う。標的反応及び検出の完了後、廃棄物が廃棄物ポート３７６０Ｂを通して除去され得る。より急な試薬及び洗浄液遷移、より高速なサイクル時間、より高い信号対雑音比、より小さい体積、より安価な試薬、及びより安価な洗浄提供（ＤＮＡ及び試薬の拡散の減少による）を達成するために、この構成を使用することができる。
【０１９８】
例示的な実施形態では、２つのタイプの電子ナノセンサ（ナノブリッジ及びナノニードル）により、異なる検出モード、すなわちａ）過渡ｐＨ信号又はｂ）定常状態検出の使用が可能になる。２つの検出モード信号出力が図１６で比較される。定常状態測定を使用すると、取込み用に最適化されたものと、検出用に最適化されたものとの２つの緩衝液条件を使用することができる。
【０１９９】
エマルジョンなしテンプレート増幅のためのチャンバなしナノリアクタチップ
最も一般的に使用される、配列決定のために試料を発生させる方法のいくつかは、配列決定反応のために十分なテンプレートが確実に使用可能になることを助けるために、少なくとも１つの増幅工程及び１つの濃縮工程を含む。エマルジョンＰＣＲが広く使用され、方法により、逆エマルジョンにおいて単一のビーズ及びテンプレート分子をＰＣＲ試薬で捕捉することが可能になる。この方法を使用して、クローン的に増幅したテンプレートを得ることができる。
【０２００】
しかしながら、この手法は、多数のビーズ及びＰＣＲ試薬を必要とし得るため、非効率的であり得る。エマルジョンＰＣＲは、入力ＤＮＡに大きな変動性を有することもあり得る。エマルジョンＰＣＲ小滴が１つのＤＮＡ分子を有する１つのビーズを含むときにのみ、有用なクローン配列決定テンプレートを形成することができる。この方法により、ビーズの０．３７２未満が使用可能なテンプレートを有する二重ポアソン分布の問題が生じ得、これをワークフローにおける費用の掛かる工程にする可能性がある。さらに、均一な小滴の形成を達成するのは困難になり得、体積の変動性によってＰＣＲ試薬の量が制限され得る。このことは、特により長いテンプレートの増幅について、ＰＣＲ効率に悪影響を与えるおそれがある。小滴サイズが制限されると、ヌクレオチドが限定的になった場合に塩基の誤取込みの速度も増加し得る。最後に、ビーズの大部分が多クローン性になるように二重ポアソン分布を斜めにすると、配列決定スループットを低下させるおそれがある。
【０２０１】
逆エマルジョンの代わりに、例示的な実施形態は、複数の試料処理工程を単一のデバイスにまとめることのできる、エマルジョンなしの、チップベースの手法を使用することができる。一実施形態において、図３８Ａに示すように、「チャンバなしナノリアクタ」チップの目的は、微小磁石のアレイ上に高密度で配置された単一のビーズに、クローン的に増幅されたテンプレートを生成することである。増幅アレイチップ３８２０を微小流体チャネルチップ３８００に埋め込んで、事実上すべての機能に対する高速かつ均一な試薬送達を確実にすることができる。増幅アレイチップ３８２０及び微小流体チャネルチップ３８００の組合せにより、チャンバなしナノリアクタチップ３８４０の形成が可能になり得る。
【０２０２】
プライマー機能化磁気ビーズを、個々のビーズ捕捉について何百万もの微小ロ磁場を有することのできる増幅アレイチップ３８２０に装填することができる。非常に低濃度のＤＮＡ配列決定テンプレートを加えて、修正ポアソン分布を使用して最適な単一のテンプレートビーズ個体群を形成することができる。その後、ＡＣ／ＤＣ電場が局所化されたチャンバなし閉込めセルを形成しつつ、ＤＮＡをチップ上で増幅することができる。印加電場により、単一のビーズ上の二本鎖配列決定テンプレートＤＮＡ及び増幅産物の濃縮、閉込め、及び効率的な捕捉が可能になり得る。この手法により、固有のバイアスを有する全ゲノム増幅をなくすことが可能になり得る。再利用可能なチャンバなしナノリアクタチップ３８４０の構成により、ビーズ数、ＤＮＡ装填、及びチップ全体にわたる均一な反応条件の制御を行うことができる。デバイスは、エマルジョンＰＣＲに固有の反応体積及び二重ポアソン分布の変動性をなくすことができる。
【０２０３】
図３８Ｂは、微小流体チャネルチップ３８００の拡大図の、概念写真３８００Ａの実証の例示的な実施形態を示す。図３８Ｃは、チャンバなしナノリアクタチップ３８４０のプロトタイプ３８４０Ａの一実施形態の写真を示す。
【０２０４】
例示的な実施形態では、図３９に示すように、ナノセンサアレイ３９００を、流れ３９２０の方向と比較して１１度で配置することができる。ナノセンサアレイ３９００の拡大図３９０５が示される。流れに対するアレイ配置の角度を変化させることにより、ビーズ装填及び試薬分布の最適化が可能になり得る。さらに、例示的な実施形態では、汚染を最小にするために、アレイのエッジに最も近いピクセルの行が磁石を有していなくてもよい。
【０２０５】
例示的な実施形態では、磁気アレイは、ウェーハ上に並べられ、微小磁石ビーズ捕捉ピクセルのそれぞれの下又は周りに位置する２つの金属電極を含むことができる。チャンバなしナノリアクタチップは、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、及び、例えばアンプリコン等の生成物等の反応体が含まれ、他のチャンバなしナノリアクタから分離され得る非常に多数の仮想反応位置（単一のビーズを有する）を有することができる。
【０２０６】
ａ）局所電極を有する微小磁石アレイの作製
例示的な実施形態では、再利用可能な磁気アレイの作製に、常磁性ビーズの捕捉のための薄膜永久磁気棒を使用することができる。これらのアレイは、１０４ビーズ／ｃｍ２〜約５×１０８ビーズ／ｃｍ２よりも大きい密度を提供することができ、試薬送達及び磁気ビーズの容易な捕捉／除去のための微小流体と統合され得る。１つの重要な特徴は、層流条件下で効率的なビーズ捕捉を可能にする際に役立ち得る互い違いの微小磁石配置であり得る。例示的な実施形態では、磁気構造を、ＡｒｃＮａｎｏ（Advanced Research Corporation、White Bear Lake、Minnesota;http://www.arconano.com）により、１００ｍｍシリコン酸化物ウェーハ上に、コバルト−クロム−白金を使用して作製することができ、棒サイズは、間隙サイズが１．２５〜２．５μｍ（０．２５μｍ刻み）である０．２５μｍ刻み（１、１．２５、１．５、２．０等）の１０×１〜１０×２μｍであり、又は間隙サイズが１．２５〜３．５μｍ（０．２５又は０．５μｍ刻み）である２０×μｍ〜２０×２μｍ、及びビーズ間距離２６．８μｍである。一部の実施形態では、ビーズサイズが１〜６μｍであってもよい。さらなる実施形態では、それぞれ３０×３０フィーチャを有するチャネル毎に４×４微小磁石アレイの構成を使用してもよい。
【０２０７】
加えて、ビーズ表面に近接して負に帯電したＤＮＡアンプリコンを濃縮させるため、及び負に帯電したｄＮＴＰ及びチャンバなしナノリアクタ内の他の軽イオンを分散させる（しかし、保持可能）ために、各微小磁気機能を、ビーズ周囲に電場を形成するように配置された２つの金属電極と組み合わせることができる。例示的な実施形態では、構造を以下のように作製することができる。層１：１μｍの均一な熱酸化物（ウェーハを備える）、層２：５０ｎｍのパターン化された金属電極格子、及び金属層を残りの表面から電気的に絶縁するための５０ｎｍのパターン化された酸化物、層３：１１５ｎｍの磁気ポリ層、層４：２００ｎｍの酸化物、層５：ナノリアクタの電場境界を形成するための５０ｎｍの金属電極格子。図４０は、電極を有する微小磁気アレイのマスク配置を示す。図４０Ａは、電極４０００及び磁気素子４０２０が３０×３０ピクセル配置に作製され得るマスク配置を示す。図４０Ｂは、３０×３０ピクセル配置の４×４アレイを示す。図４０Ｃは、４×４及び３０×３０ピクセルアレイにわたるＰＤＭＳチャネル４０４０を示す。図４０Ｄ、図４０Ｅは、電極を有する、作製された微小磁石アレイを示す。図４０Ｆは、別の向きのピクセルアレイを示す。
【０２０８】
ｂ）微小流体チャネル及び試薬送達
すべての機能的素子を８００μｍ×２０μｍ単一チャネルに埋め込むことができ、蛍光顕微鏡を使用して視覚化を行うことができる。流れ条件は、ビーズ捕捉、試薬送達、再利用のためのビーズ除去の効率に影響し得るため、チャンバなしナノリアクタチップの機能性に重要であり得る。ＰＤＭＳは、迅速なプロトタイピングという利点を有することができる。レプリカ成形により、サブミクロン寸法までの特徴サイズを有するチャネルを迅速に、高い忠実度で作製することができ、これにより、多数のパラメータの迅速な調査が可能となり得る。ＰＤＭＳはまた、ＰＭＭＡ、ＣＯＣ、及びＰＣ等の他のプラスチック材料と比較したときに、優れた光学特性を有し、最小の自己蛍光及び２９０〜１１００ｎｍの吸収を呈することにより、蛍光分子の高感度な検出が可能になる。
【０２０９】
ＰＤＭＳの弾力的性質により、試薬チャネルに直接隣接して配置され得る高密度内蔵バルブの作製も可能になり、これによりデッドボリュームを減少させることができる。例示的な実施形態では、流れ速度を０．０２μｌ／分〜１０μｌ／分に変化させて正確な試薬送達速度を可能にする６セレクタバルブを有するシリンジポンプによって、流体を駆動することができる。
【０２１０】
ｃ）ビーズ捕捉、洗浄及び放出
上記の方法により、高い充填速度（＞９０％）、ビーズ再配置の欠如、及びチップ再利用性のための１００％洗浄によって単一のビーズの効率的な捕捉が可能になり得る。微小磁気フィーチャサイズ及び磁気特性を関連付けることができ、ビーズ特性に一致させる必要があり得ることにより、有用な試薬流速度での効率的な捕捉及び除去を可能にする。図４１は、捕捉された常磁性ダイナビーズ４１２０を有する微小磁気アレイ４１００Ａの写真を示す。微小磁気アレイ４１００Ａの拡大図４１００Ｂ、４１００Ｃが示され、拡大図は異なる倍率であり、それぞれ３０×３０ピクセルの１０アレイを有する２つのチャネルがある。
【０２１１】
例としての実施形態では、２×２０μｍの棒及び２μｍの間隙サイズから構成された磁気アレイが、８００×１５μｍチャネルにおいて０．０２〜０．４５μｌ／分の流れ速度を使用して単一の４．５μｍビーズを捕捉することができる。ビーズの除去は、＜３μｌ／分の流れ速度で完了することができる。単一の入口ポートにより、チャネルの外側縁部に向かう流れの制約があり得る。１．０、２．８又は４．５μｍの常磁性ビーズを使用することができる。図４２は、磁気アレイ４２００Ａのセルのピッチサイズが１２μｍで、磁気アレイ４２００Ｂのセルのピッチサイズが２０μｍである実験データの２つの実施形態を示す。
【０２１２】
ｄ）チップ増幅の実証
ウェーハにおける単一のビーズ上の単一のテンプレート（クローン）の効率的な増幅は、ビーズ表面に捕捉された十分なテンプレートの発生にとって重要であり、これに続く濃縮及び配列決定を可能にすることができる。例としての実施形態では、ＰＣＲ循環のための商用サーモサイクラに装着された、機械加工金属アダプタを使用することができる。この構成を使用すると、ウェーハへの熱伝達が薄壁のＰＣＲ管についての熱伝達よりも非常にゆっくりになり、したがって循環条件を調節することができる。０〜１００コピーであるＤＮＡテンプレートの増幅をチップ上で行うことができ、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して増幅効率を試験することができる。一部の実施形態では、単一のチャネルが、２０％がクローンビーズであり得る約５×１０６ビーズまで試薬を最終的に送達することができるため、Ｍｇ２＋及びｄＮＴＰ等の小イオンの共有が可能になり、必要な濃度を低下させる。
【０２１３】
増幅条件が確立され、最適な微小磁石ビーズ構成が判定された後、ＤＮＡ運搬ビーズ（種々の開始濃度に較正されたもの）を、微小磁石によりチップ上に捕捉することができる。その後、増幅試薬をチップに均一に導入することができ、循環を行うことができる。ｑＰＣＲを使用して、生成されたアンプリコンの量を定量化することができる。例えば、ビーズ当たり１０５ＤＮＡコピーを超える公称濃度を使用してもよく、公称濃度を使用することにより、単一のビーズでの下流ナノセンサ電子配列決定信号検出が可能になり得る。代替実施形態では、等温増幅を使用してもよい。
【０２１４】
ｅ）電場介在濃縮及び増幅産物の閉込め
例としての実施形態では、単一のビーズ上にテンプレートＤＮＡ及び増幅産物を捕捉するために、均衡がとれているが非対称形の電場密度プロファイルを使用して、３次元電気「ケージ」を形成することができる。ＡＣ波形が、帯電された分子の浮遊を誘発することができる。
【０２１５】
例示的な実施形態では、図４３Ａで、ビーズ４３００及び電極４３２０並びに電流の流路４３４０の１つの構成の側面図が示される。電極４３２０及びビーズ４３００配置の別の構成の上面図も、アレイ構成の上面図として図４３Ｂに示される。
【０２１６】
構造は、チャネル底部に作製されて、負に帯電したアンプリコンを濃縮させ分離する複数の導電性電極を備えた微小流体チャネルから構成され得る。
【０２１７】
例示的な実施形態では、ＤＣオフセットを有するＡＣ電圧に接続され得る１μｍ電極の上に、単一のビーズを捕捉することができる。閉込めセル周囲の電極をビーズ電極に対して負にバイアスさせて、負に帯電したＤＮＡアンプリコンの拡散を防止することができる。例示的な実施形態では、１つのビーズから次のビーズまでの距離が２６．８μｍで、チャネルの高さが２０μｍであると推測される（８００μｍ幅により）。
【０２１８】
例示的な実施形態では、微小流体チャネルの電極格子へ電場を印加する数値シミュレーションが実行された。これにより、チャンバなしナノリアクタが形成される。図４４Ａは、ＤＮＡ分子の２次元濃度プロファイルを示す。図４４Ｂは、対応する電場流線を示す。図４４Ｃは、図４４Ａと図４４Ｂとのオーバーレイを示す。図４４Ｄは、電場の印加によって生じ得るＤＮＡ濃度を示す２次元プロファイルを示す。開始条件は、定義された体積で統一されたＤＮＡ濃度とすることができる。
【０２１９】
例示的な実施形態の数値シミュレーションが、以下のパラメータで実行された（ＣＯＭＳＯＬを使用して）。チャネル内のＤＮＡ濃度：１０ｅ−６Ｍ（均一）、ＤＮＡ：５００塩基、ＤＮＡの拡散係数：５．６ｅ−１２ｍ２／ｓ、２９８’ＫでのＤＮＡの移動性：２．２ｅ−１５モル＊ｓ／ｋｇ（移動性＝拡散係数／（８．３１（Ｊ／Ｋｍｏｌｅ）×Ｔ（’Κ）））、溶液の粘度：１．５×１０ｅ−３Ｎｓ／ｍ２、溶液の密度：１０ｅ３ｋｇ／ｍ３、溶液の導電性（５０ｍＭ  ＫＣＩ）：０．７Ｏｈｍ／ｍ。
【０２２０】
例示的な実施形態では、断片ライブラリー及びオンチップ増幅から予想されるものと同様の異なるＤＮＡ濃度及びサイズを有する溶液を、微小流体チャネルを介してチップに導入することができる。これに続いて、０．５〜３．０ＶのＤＣ電圧及び２００〜３００Ｈｚの周波数を有する１〜４ＶのＡＣ振幅を印加することができる。磁気ビーズ上でのクローンＤＮＡの増幅及び濃縮を開始するために、単一のＤＮＡ分子輸送ビーズを導入することができる。加えて、溶出及び定量的ＰＣＲを使用してオンビーズ濃度をモニタすることができる。電場により画定されたチャンバなしナノリアクタは、ＤＮＡを局所的に含み、９９％以上の効率で隣接ピクセルへの拡散を防止することができる。
【０２２１】
ｆ）テンプレートビーズの濃縮のための電場に基づくビーズ選別機
例示的な実施形態では、「ビーズ選別機」により、電気泳動を使用する、短いチャネルを通したアンプリコン運搬ビーズの効率的な濃縮が可能になり得る。負に帯電したＤＮＡビーズを、優先的かつ効率的に収集チャンバに分流させ、次にナノセンサＤＮＡ配列決定チップに装填することができる。一実施形態では、異なる電荷密度を有するビーズの分離が、例えば、ビーズに結合可能なＤＮＡ分子の異なる濃度又は長さによって発生し得、又はビーズの表面電荷によって発生し得る。ビーズは、電場内の異なる力を受け、したがって流れに垂直な異なる速度を受けることができる。これにより、ＤＮＡを有するビーズが、不良（ヌル）ビーズとは異なる出口ポート位置で出る。
【０２２２】
電気泳動を使用する、アンプリコン陽性及びプライマー専用ＤＮＡビーズの電荷及び電場に基づく分離が、ビーズ分離モジュールの概略図によって示される図４５の例示的な実施形態に示される。チャネル構造４５４０により支持される一対の電極４５００によって、分離チャネル４５６０内の流体流に垂直な電場力４５５０を発生させることができ、テンプレートが装填された配列決定ビーズ４５７０が、適切な出口ポート４５９０に向かって流路から移動するようにする。不良ビーズ４５８０も出口ポート４５９０から出るが、これは不良ビーズ４５８０の除去を可能にするように設計された異なる出口ポートである。ビーズ及び試薬が入口ポート４５１０を通って分離チャネル４５６０に入る。より詳細には、ビーズがビーズ入力４５３０を通って分離チャネル４５６０に入り、緩衝液が緩衝液入力４５２０を通って入ることができる。
【０２２３】
例としての実施形態では、濃縮チャネルが６ｍｍの活性領域長さ及び１ｍｍの幅を有する。入力チャネルは幅が２００及び４００μｍで、高さが０．０７５ｍｍである。電圧を１ｍｍの間隙にわたって印加することができ、電圧は５〜１０ＶＤＣであり得る。流体流速度をチャネル幅により制御することができ、同一の圧力源を使用して圧力駆動することができる。
【０２２４】
電子ナノセンサ及び微小磁気捕捉アレイを有する再利用可能な配列決定チップ
電気ナノセンサは、電荷及び電流の変化を生じさせる生物化学反応の無標識検出に依拠することができる。例としての実施形態の１つの変形では、ナノニードルが使用される。ナノニードルは、電流変化を介してインピーダンス変化の検出を可能にすることのできる、超高感度の局所インピーダンスバイオセンサであり、この電流変化は、例えば、ＤＮＡ取込み反応、タンパク質結合、ＤＮＡハイブリダイゼーション、ｐＨ変化、又は他の生物化学反応中のプロトン放出による局所溶液抵抗の摂動に続いて発生する。図４６Ａは、ナノニードルセンサの一実施形態の上面顕微鏡写真を示す。受動絶縁体４６００がナノニードルを囲んで、導電性電極４６２０を介したヌクレオチド取込み等の標的反応の検出を可能にする。標的反応は流体チャネル４６４０で発生し得、所望の領域で標的分子を濃縮させるために電場４６６０を発生させることができる。図４６Ｂは、２次元ナノニードル４６７０アレイの概略図を示し、２次元ナノニードルアレイの対応する回路が図４６Ｃに示される。
【０２２５】
例示的な実施形態では、活性（２０ｎｍ）二重電極先端が反応溶液に密接した形状によって、ナノニードルセンサの感度を高めることができる。ナノニードルセンサは、ｆＭ濃度レベルまでの抵抗の微小な変化を測定する能力を有することができる。一実施形態では、ナノニードルセンサを使用して、信号対雑音比が約５である状態で、ｐＨ配列決定のためのＤＮＡ伸長反応の過渡信号を検出することができる。
【０２２６】
例としての実施形態の第２の変形では、ナノブリッジを使用することができる。例示的な実施形態では、ナノブリッジがＮ＋／Ｎ／Ｎ＋タイプの空乏モードレジスタであり、電流を読出値として使用して電荷変調を検出することができる。ナノブリッジは、検知、信号発生、形状、及び動作モードに関して、ＦＥＴベースの設計とは大きく異なる。
【０２２７】
図４７Ａは、ゲート４７２０を検知のために支持する本体４７６０があり、且つソース４７４０及ビーズレイン４７００があるＭＯＳＦＥＴを示す。図４７Ｂは、酸化物構造４７９０により支持された検知領域４７８０のある空乏モードナノレジスタを示す。図４７Ａに示すＭＯＳＦＥＴと図４７Ｂに示す空乏モードナノレジスタとの概念的相違が、図４７Ａ及び図４７Ｂを比較することによってわかる。
【０２２８】
重要な相違の１つは、チャネル深さを大きく減少させる薄いＳＯＩ（シリコンオンインシュレータ）ウェーハ上の低濃度にドープされた半導体から、ナノブリッジを作製できる点である。結果として、チャネル深さはより浅くなり、デバイス感度はより高くなり得る。半導体「本体」にわたるドーピング深さは、ＭＯＳＦＥＴについて６００〜１０００ｎｍであるのに対して、ナノブリッジに対して６０ｎｍであり、これによって、より良好な信号対雑音比及び高速な反応時間が得られる。
【０２２９】
図４７Ｃは、ナノブリッジの電子顕微鏡法に基づく写真を示す。
【０２３０】
例示的な実施形態では、図４７Ｄは、ＳＯＩ構造４７０５が微小流体チャネル４７０３に接触している、ナノブリッジセンサのより詳細な写真を示す。共通の極性にドープされ得る３つの半導体領域を含み、挟まれた半導体領域４７６０が２つの外側半導体領域４７６５、４７６３間にあるナノブリッジの検知部分もある。２つの外側半導体領域４７６５、４７６３は、挟まれた半導体領域４７６０よりも高い濃度にドープされ得る。挟まれた半導体領域４７６０は、下にある微小流体チャネル４７０３側を向く面を有することができる。微小流体チャネル４７０３は、標的材料をチャネルに通すことができ、標的分子は、半導体の表面電位を変化させる電圧を誘起することができ、挟まれた領域は前記半導体領域のコンダクタンスを変化させることにより応答し得る。ＳＯＩ構造４７０５上にも、少なくともバイポーラトランジスタを備え得る増幅回路があり、バイポーラトランジスタは、基部４７１０、コレクタ４７１５、及び、エミッタ４７２５を備え、エミッタ４７２５は、挟まれた半導体領域４７６０を通過する電流を増幅することによって、微小流体チャネル４７０３を通って流れる標的材料の検知を容易にする。金属電極４７３５を使用して、電流をＳＯＩ構造４７０５の内外へ導くことができる。
【０２３１】
したがって、同一の印加電圧について、信号レベルの変化は、図４８のシミュレーションデータに示すように３〜４倍高くなり得る。このセンサを使用して、プローブＤＮＡが１０ｆＭの感度のセンサ表面に付着したときに、ｐＨ変化を検出し、ＤＮＡハイブリダイゼーション事象をモニタすることもできる。ナノレジスタ値は、センサ両端で５ＫＯｈｍ近くになり得る。
【０２３２】
例示的な実施形態では、ナノブリッジセンサチャネルが、高濃度にドープされた（Ｎ＋）領域と同一の極性を有することができる。したがって、ＦＥＴと対照的に、このデバイスは常に「オン」状態である。参照電極を使用して、線形範囲で一貫した測定を行うことができ、低いゲート電圧（Ｖｇ）における自然に線形の１−Ｖｇ応答のため、最小信号較正が必要となり得る。図４８に示すように、ドープレベル及びＳＯＩ（シリコンオンインシュレータ）厚さの両方が変数として使用される最大ΔΙ／Ιについて、設計を最適化することができ、ここでは長さが５μｍ、ゲート酸化物が６ｎｍ、及びソース／ドレイン電圧が１．５Ｖである。総電流が、ドープレベル及びシリコン厚さの増加に比例して増加する。応答の線形性は、この設計によって、低閾値と優れた信号対雑音比とを有する広い範囲にわたって電荷誘起変化の測定が可能になることを示す。
【０２３３】
代替例では、例示的な実施形態について、ナノニードル及びナノブリッジセンサの両方を組み合わせて使用することができる。２つのセンサを使用することは、相補的検出モダリティに基づく検出を可能にし、独立した信号確認を可能にし、読取精度を高めることができる。図２１に示すように、ナノニードル及びナノブリッジセンサの両方を互いに組み合わせて同一のナノセンサアレイで使用することができる。例示的な実施形態の検知方法は、二重検知又は多重検知検出であってもよく、この二重又は多重検知検出方法を「ＳｅｎｓｅＰｌｕｓ」と呼ぶことができる。
【０２３４】
例示的な実施形態における再利用可能な配列決定チップは、３つの主な機能部品から構成され得る。１）単一塩基の取込みの電子検出のための磁気捕捉ピクセル上のＣＭＯＳナノセンサ層。２）一本鎖配列決定テンプレートの＞１０６コピーが装填された単一の磁気ビーズの捕捉を可能にし得る微小磁石の層。３）最小のデッドボリューム及び高速の遷移時間を有する、単一のポート試薬送達のためのバルブ及びチャネル構成を使用する必要な流体制御を、センサアレイに直接提供可能なＰＤＭＳ微小流体構造。再利用可能な配列決定チップ、及び試薬／標的分子の入力及び出力流のための関連する微小流体チャネルの一実施形態は、図３８Ａに示すように、増幅アレイチップの代わりに配列決定アレイチップがあり得ることを除いて、再利用可能な増幅チップについてのものと同一の基本構造である。
【０２３５】
閉込めセルのアレイのウェルなしビーズ捕捉と組み合わせた効率的かつ均一な試薬送達及び洗浄により、ディフェージングを最小にすることができ、反応を均一にすることができ、より長い読取り及びより正確なデータが可能になり、チップの再利用が可能になり、試薬の消費及び費用を低下させる。例示的な実施形態では、図４９Ａが、微小磁気アレイの一部である閉込めセルのウェルなしビーズ捕捉構成の図を示す。このタイプの構造により、図４９Ｂに示すように、流れがウェル構造によって妨げられることがないため、例えばヌクレオチド、ポリメラーゼ等の試薬の流れを向上させることができる。図４９Ａのチャンバなし磁気保持構造により、ビーズがウェル内に位置する場合に考えられるものよりも良好な洗浄、完全な塩基の取込み、及び高速なサイクル時間が可能になり得る。図４９Ｂに示すようなウェル構造、ビーズ及び関連するＤＮＡが接近性及び流れを妨げる場合、より高い濃度のポリメラーゼ及びヌクレオチドをビーズのすべての部分に十分に拡散できることが必要となり得る。前記より高い濃度のｄＮＴＰ及びポリメラーゼにより、前記ポリメラーゼによる誤取込みのために誤差速度が増加し得、図４９Ａの構造等のチャンバなし構造で生じ得るものよりも高いレベルのリーディング位相誤差が生じる。
【０２３６】
電子回路
試料の実施形態では、各センサをシリコンセンサ上のボンドアウトに直接導くことができ、これらのそれぞれを、信号処理基板への中間物として作用し得るチップキャリアＰＣＢ基板の関連するパッドにワイヤ結合することができる。電流は、トランスインピーダンス増幅器により電圧に変換され得、続いて、例えば、参照減算、ＡＣを除去する乗算、フィルタ処理等の、センサタイプに必要な種々の線形変換を受けることができる。処理されたアナログ信号を、その後ＤＡＣカードに送り、そこから、この信号をハードディスクに保存することができる。
【０２３７】
図５０Ａに示すように、データをハードドライブに保存する前の、追加信号フィルタ処理及びオフセット調節を可能にするＬａｂＶｉｅｗのソフトウェアが開発されている。図５０Ｂは、ブレッドボードの種々の部品、すなわち、Ｌａｂｖｉｅｗソフトウェアディスプレイ５０００、回路基板５０１０、流体制御５０２０、チップキャリア及び試薬ブロック５０３０、並びに組み立てられたシステム５０４０の例としての実施形態を示す。
【０２３８】
例示的な実施形態では、データ取得と組み合わせて、又はデータ取得の後に、保存されたデータが基準とされ得、データは、データ上で実行される複数のデータ解析方法の１つを有して、センサに導入された電荷量又はコンダクタンス変化、したがって取込みが行われたかどうかを判定することができる。
【０２３９】
ヌクレオチド取込み信号の特徴時間及びアレイ毎のセンサ数は、データスループット要件を決める。１ｋＨｚより大きいサンプリング速度での２０の独立したチャネルのデータ取得は、市販のデータ取得（ＤＡＱ）カードの能力の範囲内に十分に含まれる。したがって、センサタイプに必要とされる個々のトランスインピーダンス増幅器、乗算器、及びフィルタによって、２０のセンサすべてを同時にモニタすることができる。データをすべてのセンサからすべてのサイクルについて取得することができる。反応のないこれらのセンサを参照として使用して、緩衝液イオン濃度の変動、システムへの温度の影響、又は他の体系的変数を除去することができる。すべてのデータをＤＡＣカードにより取得することができ、ＤＡＣカードは、図５１に示すように、データ解析前にコンピュータのディスクにデータをバッファリングすることができる。
【０２４０】
実験的手法：ヌクレオチド取込み信号の特徴
ナノニードル及びナノブリッジセンサを使用して、クローンＤＮＡテンプレートを用いたＤＮＡポリメラーゼによるヌクレオチドの取り込みを検出することができる。例示的なプロセスでは、ＤＮＡテンプレートが、ストレプトアビジン−ビオチン結合を介して磁気ビーズに付着されるか、又は配列決定プライマーに直接接合されハイブリダイゼーションされた。ＤＮＡポリメラーゼを有するこれらのビーズの前保温後に、ビーズはセンサデバイスに導入され、ｄＮＴＰ溶液が送達されて重合を開始した。複数及び単一塩基の取込みからの信号が記録された。センサの最適化は、総電流（Ｉ）、デルタ電流（ΔΙ）、ΔΙ／Ι、Ｓ／Ｎ、短期及び長期の安定性、並びに応答時間等の要因を含む。信号発生のための速度制限工程は、重合反応（平均２０ｍｓ）ではなくチャネルを通した試薬送達であった。信号強度は、ＤＮＡテンプレートの数、並びにポリメラーゼ、ヌクレオチド及び塩濃度に依存し得る。
【０２４１】
概念実証の研究について、微小流体チャネル、例えばＰＤＭＳベースのチャネルにおいて機能検知ユニットのアレイ（初期の設計については２０〜１００、次の行程では２百万以上）を有する、両方のセンサタイプのチップが作製された。センサアレイ内に内蔵された磁石のないチップに関して、センサチップの下の取り外し可能な磁石を使用して、チャネルに流入したビーズを捕捉した。単一のＤＮＡテンプレート、プライマー、及びＫｌｅｎｏｗ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼが予め装填され、続いてｄＮＴＰが注入されたビーズを使用して配列決定が行われた。ＢＳＴ、シクエナーゼ（Sequanase）、Ｐｈｉ２９、Ｔ４等の他のタイプのＤＮＡポリメラーゼを使用してもよい。
【０２４２】
予備データ：ナノニードルセンサチップ
例示的な実施形態では、ナノニードルセンサが、導電性変化に応答するように作製される。図５２に示すように、初期実験は種々のモル濃度の塩溶液を用いて行われる。塩濃度の変化に対する応答は０．０４ｍＭ〜２．０ｍＭで線形であり、これは、配列決定反応中に発生する変化の範囲内に十分に含まれる。
【０２４３】
この初期実験に続いて、ＤＮＡ電荷への応答の特性化が行われ、続いて、テンプレート／プライマーが装填されたビーズ上で配列伸長が行われる。図５３Ａは、ストレプトアビジン常磁性ダイナＭ２７０ビーズがセンサ上で捕捉され得るＤＮＡ電荷誘起センサ応答（ボルトで表す）を示す。これに続いて、７５塩基対ビオチン化ＤＮＡオリゴヌクレオチドが注入される。ＤＮＡ分子の結合により、負電荷の増加のために電圧増加が誘発される。応答は、７５塩基対の追加について約１．２Ｖであった。続いて、２１塩基対相補的配列決定プライマーを追加し、これは信号をさらに約４００ｍＶ（前の信号の１／３）増加させ、プライマーハイブリダイゼーションを示す。図５３Ｂは、テンプレート完全伸長の信号を示す。伸長信号は、（第１の２つのサイクル）前及び４つのデオキシヌクレオチドすべての注入後に、テンプレート、プライマー、及びＫｌｅｎｏｗＤＮＡポリメラーゼが予め装填されたストレプトアビジンビーズから得られて、完全伸長を誘発する。２つの実験の間の信号の大きさは、優れた相関関係を示す。
【０２４４】
図５３Ａはまた、例示的な実施形態が、例えばＤＮＡハイブリダイゼーション等の、ＤＮＡ配列決定以外の対象の反応で使用され得ることを示す。ナノセンサアレイをＤＮＡハイブリダイゼーションアレイとして使用することができる。図５３Ａに示すように、配列決定プライマーの追加によって、ナノセンサにより検出される電流変化が生じ得る。配列決定プライマーの追加は、本質的に、ＤＮＡハイブリダイゼーション発生の例であり、ＤＮＡの２つの相補鎖が互いに結合する。ＤＮＡの２つの相補鎖の結合により、電圧が大きく変化するため、例示的な実施形態はＤＮＡハイブリダイゼーションアレイとしても機能し得る。
【０２４５】
図１７及び図２０は、ＤＮＡ配列決定用のＤＮＡ取込みのナノセンサ検出のための信号出力を示す実験のさらなる実施形態を示す。図１７は、例示的なＤＮＡ配列決定ランのための生データを示し、ここでは、３及び５塩基の追加によって信号が変化するが、０塩基の追加については平坦なままである。図２０は、例示的な配列決定実験の一実施形態において、ヌクレオチドが配列決定モジュールに注入される順序がどのように「Ｃ、Ａ、Ｔ、Ｇ」になるかを示し、配列決定データの結果が、取り込まれるヌクレオチドが「ＡＴＧＧＡＡＴＴＧＧＧＡＡＡＡＡＴＡ」であることを示す。
【０２４６】
ナノニードル及びナノブリッジセンサは、負に帯電したＤＮＡ分子により誘起された電荷及び関連する対イオンの変化を検出することもできる。固定電荷の検出により、塩基取込みの定常状態検出が可能になり、出力プロファイルが図５３Ａ、図５３Ｂ、及び図１７のものに一致する。これは、複数の利点を有することができる。第１に、反応完了後の任意の時間に単一の測定のみが必要であり、柔軟性を与えて、データストリーム及び解析プロセスを大きく減少させる。第２に、反応条件を、長期の、誤差のない読取りについて最適化することができ、測定を低導電性緩衝液で行って、信号を最大化し信号対雑音比を減少させることができる。加えて、この手法により、過渡及び定常状態信号検出の両方が可能になり、同一の反応の２つの独立した測定が行われる。最後に、測定された電荷がセンサ上のビーズに物理的に関連するため、隣接センサとのクロストークがないとされ得る。
【０２４７】
高密度の微小磁石及びナノセンサアレイの組合せの作製及び試験
例示的な実施形態では、最終構成にある配列決定チップは、センサアレイに近接した微小磁石アレイを含むことができ、数百万のキャプチャ及びセンサピクセルから構成され得る。
【０２４８】
再利用可能な配列決定チップは、単一又は二重センサ構成に設計され得る。図５４Ａは、ナノニードル電極５４００がビーズ５４２０に近接し、前記ビーズが磁気領域５４４０により保持される、ナノニードルセンサを使用する例示的な実施形態を示す。図５４Ｂは、ビーズ５４２０に近接して位置し、前記ビーズが磁気領域５４４０により保持されるナノブリッジセンサ５４６０を示す。図５４Ｃは、ナノブリッジセンサ５４６０及びナノニードル電極５４００の両方がビーズ５４２０に近接し、前記ビーズが磁気領域５４４０により保持される二重センサ構成を示す。
【０２４９】
加えて、信号対雑音のさらなる最適化を、種々の反応条件を考慮し、試薬送達中の低デッドボリューム及び高速遷移のために微小流体部品を調節することによって行うことができる。ウェル構造をなくすことにより、試薬の送達及び除去のための拡散への依存を少なくすることができる。これにより、試薬及びサイクル時間を減少させることができ、反応をより均一にして、より良好な同期及びより高い信号対雑音比を生じさせる。
【０２５０】
ヌクレオチド取込み信号の特性化及びアレイチップ上での配列決定の実行
ヌクレオチド取込み信号をより良好に特性化するために、ビーズ上にあるＤＮＡの量に依存する個々のビーズ及びセンサから得られた信号を定義することができる。配列決定反応条件に応じて、単一のビーズテンプレート濃度のための範囲についていくらか最適化があり得る。この情報を、隣接するセンサから得られる信号と組み合わせて、「クロストーク」信号行列を展開することができる。
【０２５１】
システム部品の統合
モジュール（例えば、エマルジョンなし試料調製用の再利用可能なチップ、ビーズ分離／濃縮モジュール、ナノ電子配列決定プラットフォーム）の統合は、大きな課題を呈することはない。すべてのデバイスが、独立した機器として設計されているが、図３６Ａに示すように、費用及び質に関して配列決定ワークフローを最適化するように共同開発されるからである。
【０２５２】
例としての実施形態のための異なるモジュールの統合の選択肢が複数ある。第１の選択肢は、１つのモジュールから次のモジュールへ流体が押されること流体である。これは、３つのすべてのデバイスからの流速が互いに適合するように各モジュールをスケーリングすることによって達成され得る。或いは、セレクタバルブを有するシリンジシステムを使用して、１つのモジュールから別のモジュールへビーズを含む流体を吸引して分配することができる。流体体積が小さいため、ビーズはシリンジに入る必要がなく、サービスループ内へ吸引され得る。シリンジシステムは、システムの流速を非常に柔軟にすることのできる異なる速度で吸引及び分配することができる。複数のモジュールを、セレクタバルブにより、単一のシリンジ送達システムに接続することができる。すべての流体が低流速の水溶性であるため、インライン電気浸透又はＰＤＭＳ蠕動ポンプを使用して、試薬をポンピングすることができる。
【０２５３】
例示的な統合システムが機器に含まれていてもよく、この機器は種々の実施形態を有することができる。一実施形態では、例示的な統合システムが、図５５Ａに示すような機器に含まれる。図５５Ａの機器の代替図が図５５Ｂに示される。例示的な統合システムの機器の別の実施形態が図５６に示され、ここでは、信号情報を受信し、プロプライエタリソフトウェアを使用して出力を表示するコンピュータに、機器を接続することができる。前記機器のさらなる実施形態が図５７に示され、ここでは、機器のサイズがラップトップのサイズと比較される。
【図１Ａ】
2015500640.tif 000005
【図１Ｂ】
2015500640.tif 000006
【図１Ｃ】
2015500640.tif 000007
【図１Ｄ】
2015500640.tif 000008
【図１Ｅ】
2015500640.tif 000009
【図２Ａ】
2015500640.tif 000010
【図２Ｂ】
2015500640.tif 000011
【図２Ｃ】
2015500640.tif 000012
【図３】
2015500640.tif 000013
【図４Ａ】
2015500640.tif 000014
【図４Ｂ】
2015500640.tif 000015
【図４Ｃ】
2015500640.tif 000016
【図４Ｄ】
2015500640.tif 000017
【図５Ａ】
2015500640.tif 000018
【図５Ｂ】
2015500640.tif 000019
【図６】
2015500640.tif 000020
【図７】
2015500640.tif 000021
【図８】
2015500640.tif 000022
【図９Ａ】
2015500640.tif 000023
【図９Ｂ】
2015500640.tif 000024
【図９Ｃ】
2015500640.tif 000025
【図１０】
2015500640.tif 000026
【図１１Ａ】
2015500640.tif 000027
【図１１Ｂ】
2015500640.tif 000028
【図１１Ｃ】
2015500640.tif 000029
【図１２Ａ】
2015500640.tif 000030
【図１２Ｂ】
2015500640.tif 000031
【図１２Ｃ】
2015500640.tif 000032
【図１２Ｄ】
2015500640.tif 000033
【図１２Ｅ】
2015500640.tif 000034
【図１２Ｆ】
2015500640.tif 000035
【図１２Ｇ】
2015500640.tif 000036
【図１２Ｈ】
2015500640.tif 000037
【図１２Ｉ】
2015500640.tif 000038
【図１２Ｊ】
2015500640.tif 000039
【図１２Ｋ】
2015500640.tif 000040
【図１２Ｌ】
2015500640.tif 000041
【図１２Ｍ】
2015500640.tif 000042
【図１２Ｎ】
2015500640.tif 000043
【図１３Ｂ】
2015500640.tif 000044
【図１４】
2015500640.tif 000045
【図１５】
2015500640.tif 000046
【図１６】
2015500640.tif 000047
【図１７】
2015500640.tif 000048
【図１８Ａ】
2015500640.tif 000049
【図１８Ｂ】
2015500640.tif 000050
【図１９Ａ】
2015500640.tif 000051
【図１９Ｂ】
2015500640.tif 000052
【図１９Ｃ】
2015500640.tif 000053
【図２０】
2015500640.tif 000054
【図２１】
2015500640.tif 000055
【図２２Ａ】
2015500640.tif 000056
【図２２Ｂ】
2015500640.tif 000057
【図２３】
2015500640.tif 000058
【図２４】
2015500640.tif 000059
【図２５】
2015500640.tif 000060
【図２６】
2015500640.tif 000061
【図２７Ａ】
2015500640.tif 000062
【図２７Ｂ】
2015500640.tif 000063
【図２７Ｃ】
2015500640.tif 000064
【図２８】
2015500640.tif 000065
【図２９】
2015500640.tif 000066
【図３０】
2015500640.tif 000067
【図３１】
2015500640.tif 000068
【図３２】
2015500640.tif 000069
【図３３Ａ】
2015500640.tif 000070
【図３３Ｂ】
2015500640.tif 000071
【図３３Ｃ】
2015500640.tif 000072
【図３３Ｄ】
2015500640.tif 000073
【図３３Ｅ】
2015500640.tif 000074
【図３３Ｆ】
2015500640.tif 000075
【図３３Ｇ】
2015500640.tif 000076
【図３３Ｈ】
2015500640.tif 000077
【図３３Ｉ】
2015500640.tif 000078
【図３３Ｊ】
2015500640.tif 000079
【図３３Ｋ】
2015500640.tif 000080
【図３３Ｌ】
2015500640.tif 000081
【図３３Ｍ】
2015500640.tif 000082
【図３３Ｎ】
2015500640.tif 000083
【図３４Ａ】
2015500640.tif 000084
【図３４Ｂ】
2015500640.tif 000085
【図３４Ｃ】
2015500640.tif 000086
【図３４Ｄ】
2015500640.tif 000087
【図３４Ｅ】
2015500640.tif 000088
【図３５】
2015500640.tif 000089
【図３６Ａ】
2015500640.tif 000090
【図３６Ｂ】
2015500640.tif 000091
【図３７】
2015500640.tif 000092
【図３８Ａ】
2015500640.tif 000093
【図３８Ｂ】
2015500640.tif 000094
【図３８Ｃ】
2015500640.tif 000095
【図３９】
2015500640.tif 000096
【図４０】
2015500640.tif 000097
【図４１】
2015500640.tif 000098
【図４２】
2015500640.tif 000099
【図４３Ａ】
2015500640.tif 000100
【図４３Ｂ】
2015500640.tif 000101
【図４４Ａ】
2015500640.tif 000102
【図４４Ｂ】
2015500640.tif 000103
【図４４Ｃ】
2015500640.tif 000104
【図４４Ｄ】
2015500640.tif 000105
【図４５】
2015500640.tif 000106
【図４６Ａ】
2015500640.tif 000107
【図４６Ｂ】
2015500640.tif 000108
【図４６Ｃ】
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【図４７Ａ】
2015500640.tif 000110
【図４７Ｂ】
2015500640.tif 000111
【図４７Ｃ】
2015500640.tif 000112
【図４７Ｄ】
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【図４８】
2015500640.tif 000114
【図４９Ａ】
2015500640.tif 000115
【図４９Ｂ】
2015500640.tif 000116
【図５０Ａ】
2015500640.tif 000117
【図５０Ｂ】
2015500640.tif 000118
【図５１】
2015500640.tif 000119
【図５２】
2015500640.tif 000120
【図５３Ａ】
2015500640.tif 000121
【図５３Ｂ】
2015500640.tif 000122
【図５４Ａ】
2015500640.tif 000123
【図５４Ｂ】
2015500640.tif 000124
【図５４Ｃ】
2015500640.tif 000125
【図５５Ａ】
2015500640.tif 000126
【図５５Ｂ】
2015500640.tif 000127
【図５６】
2015500640.tif 000128
【図５７】
2015500640.tif 000129
【図５８】
2015500640.tif 000130
【手続補正書】
【提出日】平成26年8月4日(2014.8.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸試料を配列決定するための方法であって、
ａ．センサアレイに隣接して複数の粒子を供給する工程であって、前記複数の粒子の個々の粒子が前記センサアレイの個々のセンサに隣接して配置され、前記核酸試料から発生した核酸分子に結合されている工程と、
ｂ．プライマーを前記核酸分子にハイブリダイゼーションする工程と、
ｃ．ポリメラーゼの存在下で前記核酸分子及び前記プライマーをヌクレオチドに接触させることにより、プライマー伸長反応を実行する工程と、
ｄ．前記ヌクレオチドに関連する個々の取込み事象を示す定常状態信号を検出することにより、前記核酸試料を配列決定する工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
前記定常状態信号が前記個々の取込み事象のそれぞれの後で検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記定常状態信号が、前記個々の取込み事象のそれぞれが完了しているように選択された期間で検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記個々の取込み事象の完了に適した反応緩衝液の存在下で前記個々の取込み事象を実行する工程と、前記定常状態信号の検出に適した測定緩衝液の存在下で前記検出を実行する工程とをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記反応緩衝液及び前記測定緩衝液が異なる緩衝液である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記測定緩衝液の導電性が前記反応緩衝液の導電性よりも低い、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸分子が前記個々のヌクレオチドのそれぞれに１つずつ接触する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記信号が、前記プライマー伸長反応に伴うインピーダンス変化、電荷変化、イオン濃度変化、又は導電性変化を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記個々のセンサが、前記個々の粒子又は前記核酸分子のデバイ長の範囲内のインピーダンス、電荷、又は導電性変化を測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記個々のセンサが、前記個々の粒子又は前記核酸分子のデバイ長に電気的に結合された少なくとも２つの電極を備える、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記配列決定する工程が、前記ポリメラーゼによる、前記核酸分子に相補的な鎖への前記ヌクレオチドの取込みの配列を判定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記粒子が前記センサアレイに磁気的に固定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
差分測定からの信号により前記定常状態信号を処理する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記差分測定が、（ｉ）参照として、核酸を含まない少なくとも１つの粒子、（ｉｉ）参照として、粒子に隣接して配置されていないセンサ、（ｉｉｉ）参照として、ヌクレオチド取込み事象を受けない、前記センサアレイとは別の個々のセンサ、（ｖ）参照として、前記核酸分子に結合された既知の配列の別の核酸分子、又は（ｖｉ）クロストークデコンボリューション関数行列を使用する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記検出が、前記個々の取込み事象に伴う過渡ｐＨ信号を検出することを含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
センサのアレイであって、当該アレイの個々のセンサが、核酸分子が結合された粒子に隣接して配置されるアレイと、
前記センサのアレイと連通し、前記核酸分子によりプライマー伸長反応を実行するための試薬を送達する流体流チャネルと、
前記センサのアレイに結合され、前記プライマー伸長反応中に、前記核酸分子に相補的な鎖への個々のヌクレオチドの取り込みを示す定常状態信号を検出するコンピュータと、
を備える核酸配列決定システム。
【請求項１７】
前記個々のセンサが前記粒子又は前記核酸分子のデバイ長に結合されたときに、前記定常状態信号が検出される、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１８】
前記個々のセンサが少なくとも２つの電極を備える、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１９】
各電極が、前記粒子に関連する前記デバイ長に電気的に結合される、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
前記少なくとも２つの電極が、誘電体層により分離される第１の電極及び第２の電極を含む、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２１】
前記個々のセンサにおいて化学種、生物種、若しくはこれらの組合せの濃縮又は閉じ込めを実行するための別の電極をさらに備える、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２２】
前記個々のセンサが、前記粒子若しくは前記核酸分子に関連するインピーダンス、電荷、イオン濃度又は導電性変化を測定するように構成される、請求項１６に記載のシステム。
【請求項２３】
前記個々の取込み事象の完了に適した反応緩衝液と、前記定常状態信号の検出に適した測定緩衝液とをさらに含む、請求項１６に記載のシステム。
【請求項２４】
前記反応緩衝液及び前記測定緩衝液が異なる緩衝液である、請求項２３に記載のシステム。
【請求項２５】
前記測定緩衝液の導電性が前記反応緩衝液の導電性よりも低い、請求項２３に記載のシステム。
【請求項２６】
前記粒子が磁気粒子である、請求項１６に記載のシステム。
【請求項２７】
前記個々のセンサが、磁場を印加して前記粒子を磁気的に固定するように構成される、請求項１６に記載のシステム。
【請求項２８】
前記センサのアレイが略平坦面を有する、請求項１６に記載のシステム。
【請求項２９】
前記個々のセンサが、電場、磁場、又はこれらの組合せを発生させて、前記センサのアレイのうちの前記個々のセンサを他のセンサから分離する閉じ込めセルを提供するように構成される、請求項１６に記載のシステム。
【請求項３０】
前記核酸分子が前記粒子に結合された別の核酸分子により立体障害を受けないように、前記核酸分子が前記粒子に結合されている、請求項１６に記載のシステム。
【請求項３１】
前記個々のセンサがウェルを備える、請求項１６に記載のシステム。
【請求項３２】
前記粒子が前記ウェル内に保持される、請求項３１に記載のシステム。
【国際調査報告】
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