(57)【要約】  本発明は、標的タンパク質を含む溶液からウイルスおよび／またはウイルスＤＮＡを選択的に除去するための方法に関し、それにより、標的タンパク質と同様に、ウイルスおよび／またはウイルスＤＮＡを沈殿させるための沈殿剤としても、アセトンが使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的タンパク質を含む水溶液からウイルスおよび／またはウイルスＤＮＡを選択的に除去するための方法であって、前記方法は、
ａ）前記ウイルスおよび／またはウイルスＤＮＡを選択的に沈殿させる濃度でアセトンを前記溶液に添加することと、
ｂ）沈殿した物質を前記標的タンパク質を含む前記溶液から分離する分離工程を行うことと、
ｃ）前記標的タンパク質を沈殿させる最終濃度に達するように追加量のアセトンを前記溶液に添加することと、
ｄ）沈殿した前記標的タンパク質を前記溶液から回収することと
を含む、方法。
【請求項２】
工程ａ）におけるアセトンの前記濃度が、約１２〜４０％（ｖ／ｖ）、好ましくは約１２〜３０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約１４〜３０％（ｖ／ｖ）、さらにより好ましくは約１５〜２０％（ｖ／ｖ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ａ）におけるアセトンの前記濃度が、約１５％（ｖ／ｖ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程ｃ）におけるアセトンの前記最終濃度が、４５〜９５％、好ましくは６０〜７０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約６６％（ｖ／ｖ）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記標的タンパク質が、哺乳動物供給源から得られたものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記標的タンパク質が、トリプシンである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
工程ａ）における前記選択的沈殿が、１５℃未満の温度で行われる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程ｂ）における前記分離が、濾過および／または遠心分離を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
工程ｂ）における前記分離が、深層濾過を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
工程ｄ）が、濾過および／または遠心分離を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ウイルスが、無エンベロープウイルスである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ウイルスが、ＰＣＶ２である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的タンパク質の２５％未満が、工程ｂ）で分離される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ウイルスＤＮＡの少なくとも５０％、好ましくは少なくとも９０％が、工程ｂ）で分離される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
標的タンパク質を含む水溶液からウイルスＤＮＡを選択的に除去するための方法である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質を精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物供給源から単離されるタンパク質は、そのタンパク質が例えば食品または薬学的製品において使用されるべきである場合に望ましくないウイルス粒子および／またはウイルスＤＮＡによる汚染を受け易い。そのようなタンパク質を精製する方法であって、ウイルス粒子および／またはウイルスＤＮＡのレベルを減少させもする方法（例えば、クロマトグラフィー、濾過、遠心分離、抽出または沈殿）が知られている。しかしながら、対象とするタンパク質の精製が、困難であり、時間がかかり、かつ／または高価である場合がある。したがって、本発明の目的は、あらゆる汚染ウイルス粒子および／またはウイルスＤＮＡを対象とするタンパク質から除去するための方法を提供することである。そのような方法は、迅速であり、工業規模で有用であり、安価でかつ効果的であるべきである。
【０００３】
トリプシン（ＥＣ３．４．２１．４）は、多くの脊椎動物の消化器系において見出されるセリンプロテアーゼであり、タンパク質を加水分解する。トリプシンは、哺乳動物の膵臓において多量に利用可能であり、例えば、ブタおよびウシのトリプシンは、かなり容易に精製され得る。したがって、トリプシンは、種々のバイオテクノロジープロセスにおいて広く使用されている。さらに、トリプシンは、ベビーフードにおいて、タンパク質を前消化するために使用される。
【０００４】
ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）は、真核細胞において自己複製する小型の無エンベロープウイルスである。これは、ブタにおける新興性の多因性疾患である、離乳後多臓器性発育不良症候群（Ｐｏｓｔｗｅａｎｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｗａｓｔｉｎｇ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＰＭＷＳ））の病原体である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、ブタ膵臓腺から抽出されたトリプシンからＰＣＶ２ウイルス粒子および／またはウイルスＤＮＡを除去するための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、標的タンパク質を含む水溶液からウイルスおよび／またはウイルスＤＮＡを選択的に除去するための方法であって、前記方法は、
ａ）ウイルスおよび／またはウイルスＤＮＡを選択的に沈殿させる濃度でアセトンをその溶液に添加することと、
ｂ）沈殿した物質を標的タンパク質を含む溶液から分離する分離工程を行うことと、
ｃ）標的タンパク質を沈殿させる最終濃度に達するように追加量のアセトンをその溶液に添加することと、
ｄ）沈殿した標的タンパク質をその溶液から回収することと
を含む方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明は、標的タンパク質を含む水溶液からウイルスおよび／またはウイルスＤＮＡを選択的に除去するための方法であって、前記方法が、
ａ）ウイルスおよび／またはウイルスＤＮＡを選択的に沈殿させる濃度でアセトンをその溶液に添加することと、
ｂ）沈殿した物質を標的タンパク質を含む溶液から分離する分離工程を行うことと、
ｃ）標的タンパク質を沈殿させる最終濃度に達するように追加量のアセトンをその溶液に添加することと、
ｄ）沈殿した標的タンパク質をその溶液から回収することと
を含む方法を提供する。
【０００８】
あらゆる起こり得る疑義を回避するために述べると、これらの工程は、記述された順序で行われる。すなわち、工程ｂ）における分離は、工程ａ）の沈殿した物質を標的タンパク質を含む溶液から分離するために行われる。工程ｃ）において、追加量のアセトンが、工程ｂ）で得られた溶液に添加される。そして工程ｄ）において、工程ｃ）の沈殿した標的タンパク質が、溶液から回収される。
【０００９】
標的タンパク質は、任意のタンパク質であり得る。標的タンパク質は、微生物から（例えば、細菌細胞または真菌細胞から）単離されたタンパク質であり得る。標的タンパク質は、植物から単離されたタンパク質であり得る。好ましくは、標的タンパク質は、動物供給源から単離されたタンパク質である。そのようなタンパク質は、例えばそこからそのタンパク質が発現された供給源生物体に由来する、ウイルス粒子および／またはウイルスＤＮＡにより汚染されたものとなり易いものであり得る。
【００１０】
標的タンパク質は、哺乳動物供給源から得られたものであり得る。標的タンパク質は、哺乳動物組織から（例えば、哺乳動物腺から）得られたものであり得る。好ましい実施形態において、標的タンパク質は、ウシまたはブタの膵臓から得られたものである。より好ましい実施形態において、標的タンパク質は、ブタ膵臓から得られたものである。
【００１１】
標的タンパク質は、酵素、好ましくは活性酵素または再活性化され得る酵素であり得る。
【００１２】
哺乳動物膵臓から（例えば、ブタ膵臓から）得られ得る酵素としては、プロテアーゼ（トリプシン、キモトリプシン、キモトリプシンＢ、膵ペプチダーゼＥ、カルボキシペプチダーゼＡおよびカルボキシペプチダーゼＢが挙げられるが、これらに限定されない）；リパーゼ（グリセロールエステルヒドロラーゼ（リパーゼ）、ホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２およびステロールエステルヒドロラーゼが挙げられるが、これらに限定されない）；ヌクレアーゼ（リボヌクレアーゼおよびデオキシリボヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない）；アミラーゼ（α−アミラーゼが挙げられるが、これに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１３】
好ましい実施形態において、標的タンパク質は、プロテアーゼ、好ましくは哺乳動物供給源から（例えば、膵臓から、好ましくはウシまたはブタの膵臓から、より好ましくはブタ膵臓から）得られるプロテアーゼである。
【００１４】
より好ましい実施形態において、標的タンパク質は、トリプシン、好ましくは膵臓から得られたトリプシン、より好ましくはウシまたはブタの膵臓から得られたトリプシン、さらにより好ましくはブタ膵臓から得られたトリプシンである。
【００１５】
標的タンパク質を含む水溶液は、好ましくは、例えば３ｍＳ未満または１ｍＳ未満の、低い導電率を有する。これは、例えばダイアフィルトレーションにより、例えば１０，０００Ｄａのカットオフを有する膜を用いて得られ得る。標的タンパク質を含む水溶液は、好ましくは、約２〜５（例えば約３〜４、好ましくは約３．１〜３．９（例えば、約３．５））のｐＨを有する。
【００１６】
水溶液の乾燥物質濃度は、約８〜２０％（例えば、約８〜１５％（例えば、約１０％））であり得る。
【００１７】
本発明の方法において、ウイルスおよび／またはウイルスＤＮＡは、標的タンパク質を含む水溶液から選択的に除去される。ウイルスは、ウイルス粒子であり得る。すなわち、好ましい実施形態において、当該方法は、標的タンパク質を含む水溶液からウイルス粒子および／またはウイルスＤＮＡを選択的に除去するためのものである。より好ましい実施形態において、当該方法は、標的タンパク質を含む水溶液からウイルスＤＮＡを選択的に除去するためのものである。
【００１８】
ウイルスは、感染性ウイルス、例えば、ブタ供給源において見出される感染性ウイルスであり得る。
【００１９】
ウイルスは、ＤＮＡウイルス、例えば一本鎖ＤＮＡウイルス（例えば、一本鎖環状ＤＮＡを有するウイルス）であり得る。ウイルスは、ＲＮＡウイルスであり得る。
【００２０】
ウイルスは、無エンベロープウイルス、例えば、小型の無エンベロープウイルスであり得る。ウイルスは、無エンベロープＤＮＡウイルスまたは無エンベロープＲＮＡウイルスであり得る。
【００２１】
ウイルスは、真核細胞において自己複製するウイルスであり得る。
【００２２】
好ましい実施形態において、ウイルスは、無エンベロープＤＮＡウイルス、例えば、小型の無エンベロープＤＮＡウイルスである。
【００２３】
ウイルスは、ＰＣＶ２（ブタサーコウイルス２）、ＰＣＶ１（ブタサーコウイルス１）、ＰＰＶ（ブタパルボウイルス）、ＥＭＣＶ（ブタ脳心筋炎ウイルス）、ＨＥＶ（ブタＥ型肝炎ウイルス）およびＳＶＤＶ（ブタ水疱病ウイルス）からなる群から選択され得る。好ましい実施形態において、ウイルスは、ＰＣＶ２である。
【００２４】
本発明の方法の工程ａ）において、アセトンは、ウイルスおよび／またはウイルスＤＮＡを選択的に沈殿させる濃度で標的タンパク質を含む溶液に添加される。沈殿するのは、ウイルスＤＮＡを含むまたはウイルスＤＮＡと会合したウイルス粒子であり得る。かつ／または、沈殿するのは、ウイルスＤＮＡそのもの（例えば、遊離したウイルスＤＮＡ）であり得る。
【００２５】
選択的沈殿とは、ウイルスおよび／またはウイルスＤＮＡは大部分、すなわち５０％より多くが沈殿するのに対して、標的タンパク質は５０％未満が沈殿するということを意味する。
【００２６】
好ましくは、ウイルスＤＮＡの少なくとも６０％（例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％）が工程ａ）で沈殿させられる。より好ましくは、ウイルスＤＮＡの少なくとも９５％（例えば、少なくとも９９％または少なくとも９９．９％）が工程ａ）で沈殿させられる。
【００２７】
好ましくは、標的タンパク質の４０％未満（例えば、３０％未満）が工程ａ）で沈殿させられる。より好ましくは、標的タンパク質の２５％未満（例えば、２０％未満、１０％未満または５％未満）が工程ａ）で沈殿させられる。
【００２８】
当業者には、工程ａ）で使用されるべきアセトンの濃度をどのように決定すべきか分かるであろう。好ましい実施形態において、工程ａ）におけるアセトンの濃度は、約１２〜４０％（ｖ／ｖ）、好ましくは約１２〜３０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約１４〜３０％（ｖ／ｖ）、さらにより好ましくは約１５〜２０％（ｖ／ｖ）である。より好ましい実施形態において、標的タンパク質はトリプシンであり、工程ａ）におけるアセトンの濃度は、約１２〜４０％（ｖ／ｖ）、好ましくは約１２〜３０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約１４〜３０％（ｖ／ｖ）、さらにより好ましくは約１５〜２０％（ｖ／ｖ）である。さらにより好ましい実施形態において、標的タンパク質はトリプシンであり、ウイルスはＰＣＶ２であり、工程ａ）におけるアセトンの濃度は、約１２〜４０％（ｖ／ｖ）、好ましくは約１２〜３０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約１４〜３０％（ｖ／ｖ）、さらにより好ましくは約１５〜２０％（ｖ／ｖ）である。
【００２９】
好ましくは、工程ａ）における選択的沈殿は、１５℃未満の温度で行われる。
【００３０】
本発明の方法における工程ｂ）は、工程ａ）において沈殿させられた物質が、標的タンパク質を含む溶液から分離される分離工程である。そのような分離は、当該技術分野において知られている任意の方法によって行われ得る。分離は、濾過および／または遠心分離を含み得る。好ましい実施形態において、工程ｂ）における分離は、深層濾過を含む。
【００３１】
好ましくは、ウイルスＤＮＡの少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％）が工程ｂ）で分離される。より好ましくは、ウイルスＤＮＡの少なくとも９５％（例えば、少なくとも９９％または少なくとも９９．９％が工程ｂ）で分離される。
【００３２】
１つの好ましい実施形態において、沈殿した物質が工程ｂ）で分離された後の標的タンパク質を含む溶液中に、ウイルスＤＮＡは全く検出され得ない。
【００３３】
好ましくは、標的タンパク質の４０％未満（例えば、３０％未満）が工程ｂ）で分離される。より好ましくは、標的タンパク質の２５％未満（例えば、２０％未満、１０％未満または５％未満）が工程ｂ）で分離される。
【００３４】
好ましくは、標的タンパク質の６０％より多く（例えば、７０％より多く）が、工程ｂ）における分離後の溶液中に回収される。より好ましくは、標的タンパク質の７５％より多く（例えば、８０％より多く、９０％より多くまたは９５％より多く）が、工程ｂ）における分離後の溶液中に回収される。
【００３５】
好ましくは標的タンパク質の６０％より多く（例えば、７０％より多く）が、工程ｂ）における分離後の溶液中にその活性形態で回収される。より好ましくは、標的タンパク質の７５％より多く（例えば、８０％より多く、９０％より多くまたは９５％より多く）が、工程ｂ）における分離後の溶液中に活性形態で回収される。
【００３６】
工程ｂ）後に、濾液のｐＨは、例えば約ｐＨ４〜５（例えば、約ｐＨ４．５）に調整され得る。任意の塩基、好ましくは弱塩基（例えば、アンモニア水）が使用され得る。
【００３７】
本発明の方法における工程ｃ）において、追加量のアセトンが、標的タンパク質を含む溶液に添加される。アセトンは、標的タンパク質を沈殿させる最終濃度に達するように添加される。
【００３８】
好ましくは、工程ｂ）後の溶液中に存在する標的タンパク質の６０％より多く（例えば、７０％より多くまたは８０％より多く）が工程ｃ）で沈殿させられる。より好ましくは、工程ｂ）後の溶液中に存在する標的タンパク質の９０％より多く（例えば、９５％より多く、９８％より多くまたは９９％より多く）が工程ｃ）で沈殿させられる。
【００３９】
当業者には、工程ｃ）で使用されるべきアセトンの濃度をどのように決定すべきか分かるであろう。好ましい実施形態において、工程ｃ）におけるアセトンの最終濃度は、４５〜９５％、好ましくは６０〜７０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約６６％（ｖ／ｖ）である。別の好ましい実施形態において、工程ａ）におけるアセトンの濃度は、約１２〜４０％（ｖ／ｖ）、好ましくは約１２〜３０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約１４〜３０％（ｖ／ｖ）、さらにより好ましくは約１５〜２０％（ｖ／ｖ）であり、そして工程ｃ）におけるアセトンの最終濃度は、４５〜９５％、好ましくは６０〜７０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約６６％（ｖ／ｖ）である。より好ましい実施形態において、標的タンパク質はトリプシンであり、工程ａ）におけるアセトンの濃度は、約１２〜４０％（ｖ／ｖ）、好ましくは約１２〜３０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約１４〜３０％（ｖ／ｖ）、さらにより好ましくは約１５〜２０％（ｖ／ｖ）であり、そして工程ｃ）におけるアセトンの最終濃度は、４５〜９５％、好ましくは６０〜７０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約６６％（ｖ／ｖ）である。さらにより好ましい実施形態において、標的タンパク質はトリプシンであり、ウイルスはＰＣＶ２であり、工程ａ）におけるアセトンの濃度は、約１２〜４０％（ｖ／ｖ）、好ましくは約１２〜３０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約１４〜３０％（ｖ／ｖ）、さらにより好ましくは約１５〜２０％（ｖ／ｖ）であり、そして工程ｃ）におけるアセトンの最終濃度は、４５〜９５％、好ましくは６０〜７０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約６６％（ｖ／ｖ）である。
【００４０】
好ましくは、工程ｃ）は、１５℃未満の温度で行われる。
【００４１】
本発明の方法における工程ｄ）において、沈殿した標的タンパク質が、溶液から回収される。沈殿した標的タンパク質のそのような回収は、当該技術分野において知られている任意の方法によって行われ得る。沈殿した標的タンパク質の回収は、濾過および／または遠心分離を含み得る。
【００４２】
回収された後、標的タンパク質は洗浄され、乾燥され、粉砕され、かつ／または標準化され得る。
【００４３】
好ましい実施形態において、本発明は、ブタトリプシン、好ましくはブタ膵臓トリプシンの調製物からＰＣＶ２ウイルスおよび／またはＰＣＶ２ウイルスＤＮＡを選択的に除去するための方法であって、前記方法が、
ａ）トリプシンを含む水溶液に１２〜３０％（ｖ／ｖ）のアセトン濃度に達するようにアセトンを添加することと、
ｂ）沈殿した物質をトリプシンを含む溶液から分離する分離工程を行うことと、
ｃ）４５〜９５％（ｖ／ｖ）、好ましくは６０〜７０％（ｖ／ｖ）の最終濃度に達するように追加量のアセトンをその溶液に添加することと、
ｄ）沈殿したトリプシンをその溶液から回収することと
を含む方法に関する。
【００４４】
好ましくは、ウイルスＤＮＡの少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％）が、本発明の方法によって標的タンパク質から分離される。より好ましくは、ウイルスＤＮＡの少なくとも９５％（例えば、少なくとも９９％または少なくとも９９．９％）が、本発明の方法によって標的タンパク質から分離される。
【００４５】
好ましくは、本発明の方法によって精製された標的タンパク質は、本方法の工程ａ）およびｂ）がない以外は同じやり方で精製された標的タンパク質と比べて５０％未満のウイルスＤＮＡを含む。より好ましくは、本発明の方法によって精製された標的タンパク質は、本方法の工程ａ）およびｂ）がない以外は同じやり方で精製された標的タンパク質と比べて４０％未満（例えば、３０％未満、２０％未満または１０％未満）のウイルスＤＮＡを含む。さらにより好ましくは、本発明の方法によって精製された標的タンパク質は、本方法の工程ａ）およびｂ）がない以外は同じやり方で精製された標的タンパク質と比べて５％未満（例えば、１％未満、０．５％未満または０．１％未満）のウイルスＤＮＡを含む。
【００４６】
１つの好ましい実施形態において、工程ｄ）で回収された沈殿した標的タンパク質は、検出可能なウイルスＤＮＡを全く含まない。
【００４７】
ウイルスＤＮＡの検出または定量化は、当該技術分野において知られている任意の方法によって行われ得る。リアルタイムＰＣＲが使用され得る。
【００４８】
ＤＮＡは、溶解インキュベーションを用い、続いて等容量のクロロホルム中でのＤＮＡ抽出を用いて抽出され得る。ＤＮＡは、最後に市販のＤＮＡキットを用いて精製および濃縮され得る。ウイルスＤＮＡの存在は、続いてリアルタイムＰＣＲを用いて検出され得る。
【００４９】
好ましい実施形態において、ウイルスはＰＣＶ２であり、リアルタイムＰＣＲは市販のＰＣＶ２検出キットを用いて行われる。
【００５０】
リアルタイムＰＣＲによるＤＮＡ定量化の一般原理は、対数スケールで蛍光をサイクル数に対してプロットすることに依拠している。ＤＮＡに基づく蛍光の検出についての閾値は、バックグラウンドより僅かに上に設定され、サイクル閾値（Ｃｔ）は、蛍光シグナルが閾値を横切る（すなわち、バックグラウンドレベルを超える）のに要するサイクル数として定義される。指数増幅期の間、ＤＮＡ標的配列は、１サイクル毎に２倍になる。例えば、Ｃｔが別の試料のものよりも３サイクル前にあるＤＮＡ試料は、２3＝８倍多くの鋳型を含有していた。
【００５１】
１つの実施形態において、工程ｄ）で回収される沈殿した標的タンパク質から抽出される全ＤＮＡ中に検出され得るウイルスＤＮＡの量は、４０サイクルの増幅を行いかつ関連ウイルスＤＮＡに特異的なプライマーを用いるリアルタイムＰＣＲアッセイで分析される場合に、少なくとも３８、好ましくは少なくとも３９、より好ましくは４０のＣｔ値という結果になるものである。
【００５２】
４０というＣｔ値は、４０サイクルの増幅後に、ＤＮＡに基づく蛍光の検出についての閾値が超えない、すなわちシグナルが少しも検出されないということを意味する。また、４０よりも僅かに低いＣｔ値は、偽陽性である可能性が非常に高く、したがって、ウイルスＤＮＡの検出に値しない。
【００５３】
好ましい実施形態において、ウイルスはＰＣＶ２であり、工程ｄ）で回収される沈殿した標的タンパク質から抽出される全ＤＮＡ中に検出され得るＰＣＶ２ＤＮＡの量は、４０サイクルの増幅を行いかつＰＣＶ２ＤＮＡに特異的なプライマーを用いるリアルタイムＰＣＲアッセイで分析される場合に、少なくとも３８、好ましくは少なくとも３９、より好ましくは４０のＣｔ値を結果としてもたらすものである。
【実施例】
【００５４】
実施例１
供給源：ブタ膵臓腺の水抽出によって得られたＰＣＶ２陽性トリプシンバッチ。
【００５５】
このトリプシンバッチを、１１％溶液となるように冷水道水に溶解させた。溶液中のｐＨを、塩酸の添加によって３．５に調整した。アセトンを２０％ｖ／ｖの最終濃度になるように添加し、続いて１％の濾過助剤（Ｋｉｅｓｅｌｇｕｈｒ  Ｈｙｆｌｏ  Ｓｕｐｅｒ  Ｃｅｌ（登録商標））を添加した。アセトンおよび濾過助剤の添加中、溶液を撹拌し、温度を１５℃未満に維持した。次に、濁った溶液を、耐アセトン性濾布（ポリプロピレン）および細菌濾過シート（Ｓｅｉｔｚ  ＥＫＳ）を備えたフィルタープレスで濾過した。濾過の間、圧力を１．８バール未満に維持した。フィルター上に保持された不純物を排出した。澄んだ濾液をタンク中に回収し、アンモニア水でｐＨを４．５に調整した。アセトンを、６６％ｖ／ｖの最終濃度になるように添加した。アセトンの添加中、溶液を撹拌し、温度を１５℃未満に維持した。沈殿物が出現した（トリプシン）。この沈殿物を、耐アセトン性濾布（ポリプロピレン）を備えたフィルタープレスでの濾過によって回収した。濾過の間、圧力を３．５バール未満に維持した。最後に沈殿物を真空乾燥器中で乾燥させた。最終圧力は０．５ミリバールであり、最終温度は３８℃であった。
【００５６】
ＤＮＡを、溶解インキュベーションを用い、続いて等容量のクロロホルム中でのＤＮＡ抽出を用いて抽出した。最後に市販のＤＮＡキットを用いてＤＮＡを精製および濃縮した。続いてＰＣＶ２ＤＮＡの存在を、市販のＰＣＶ２検出キットを用いてリアルタイムＰＣＲ機器で分析した。乾燥させたトリプシンは、ＰＣＶ２陰性であることが分かった。
【００５７】
実施例２
供給源：ブタ膵臓腺の水抽出によって得られたＰＣＶ２陽性液体トリプシンバッチ。濾過助剤（Ｋｉｅｓｅｌｇｕｈｒ  Ｈｙｆｌｏ  Ｓｕｐｅｒ  Ｃｅｌ（登録商標））が添加され、Ｓｅｉｔｚ  ＨＳ９０００濾過パッドを備えたフィルタープレスで濾過が行われた。その濾液が、導電率が１ｍＳ未満になるまで（１０，０００Ｄａのカットオフを有する膜を用いて）ダイアフィルトレーションされた。濃度は１０％乾燥物質になるように調整され、ｐＨは塩酸で３．５に調整された。このバッチを２つの等量部分に分けた。
【００５８】
ａ）アセトンを、１５％ｖ／ｖの最終濃度になるように添加し、続いて１％の濾過助剤（Ｋｉｅｓｅｌｇｕｈｒ  Ｈｙｆｌｏ  Ｓｕｐｅｒ  Ｃｅｌ（登録商標））を添加した。アセトンおよび濾過助剤の添加中、溶液を撹拌し、温度を１５℃未満に維持した。次に、濁った溶液を、耐アセトン性濾布（ポリプロピレン）および細菌濾過シート（Ｓｅｉｔｚ  ＥＫＳ）を備えたフィルタープレスで濾過した。濾過の間、圧力を１．８バール未満に維持した。フィルター上に保持された不純物を排出した。澄んだ濾液をタンク中に回収し、アンモニア水でｐＨを４．５に調整した。アセトンを、６６％ｖ／ｖの最終濃度になるように添加した。アセトンの添加中、溶液を撹拌し、温度を１５℃未満に維持した。沈殿物が出現した（トリプシン）。この沈殿物を、耐アセトン性濾布（ポリプロピレン）を備えたフィルタープレスでの濾過によって回収した。濾過の間、圧力を３．５バール未満に維持した。最後に沈殿物を真空乾燥器中で乾燥させた。最終圧力は０．５ミリバールであり、最終温度は３８℃であった。
【００５９】
ＤＮＡを、溶解インキュベーションを用い、続いて等容量のクロロホルム中でのＤＮＡ抽出を用いて抽出した。最後に市販のＤＮＡキットを用いてＤＮＡを精製および濃縮した。続いてＰＣＶ２ＤＮＡの存在を、市販のＰＣＶ２検出キットを用いてリアルタイムＰＣＲ機器で分析した。乾燥させたトリプシンは、ＰＣＶ２について陰性（Ｃｔ：４０）であることが分かった。
【００６０】
ｂ）１％の濾過助剤（Ｋｉｅｓｅｌｇｕｈｒ  Ｈｙｆｌｏ  Ｓｕｐｅｒ  Ｃｅｌ（登録商標））を、溶液に添加した。濾過助剤の添加中、溶液を撹拌し、温度を１５℃未満に維持した。次に、濁った溶液を、耐アセトン性濾布（ポリプロピレン）および細菌濾過シート（Ｓｅｉｔｚ  ＥＫＳ）を備えたフィルタープレスで濾過した。濾過の間、圧力を１．８バール未満に維持した。フィルター上に保持された不純物を排出した。澄んだ濾液をタンク中に回収し、アンモニア水でｐＨを４．５に調整した。アセトンを、６６％ｖ／ｖの最終濃度になるように添加した。アセトンの添加中、溶液を撹拌し、温度を１５℃未満に維持した。沈殿物が出現した（トリプシン）。この沈殿物を、耐アセトン性濾布（ポリプロピレン）を備えたフィルタープレスでの濾過によって回収した。濾過の間、圧力を３．５バール未満に維持した。最後に沈殿物を真空乾燥器中で乾燥させた。最終圧力は０．５ミリバールであり、最終温度は３８℃であった。
【００６１】
ＤＮＡを、溶解インキュベーションを用い、続いて等容量のクロロホルム中でのＤＮＡ抽出を用いて抽出した。最後に市販のＤＮＡキットを用いてＤＮＡを精製および濃縮した。続いてＰＣＶ２ＤＮＡの存在を、市販のＰＣＶ２検出キットを用いてリアルタイムＰＣＲ機器で分析した。乾燥させたトリプシンは、ＰＣＶ２について陽性（Ｃｔ：３６）であることが分かった。
【００６２】
実施例３
供給源：ブタ膵臓腺の水抽出によって得られたＰＣＶ２陽性液体トリプシンバッチ。濾過助剤（Ｋｉｅｓｅｌｇｕｈｒ  Ｈｙｆｌｏ  Ｓｕｐｅｒ  Ｃｅｌ（登録商標））が添加され、Ｓｅｉｔｚ  ＨＳ９０００濾過パッドを備えたフィルタープレスで濾過が行われた。その濾液が、導電率が１ｍＳ未満になるまで（１０，０００Ｄａのカットオフを有する膜を用いて）ダイアフィルトレーションされた。濃度は１０％乾燥物質になるように調整され、ｐＨは塩酸で３．５に調整された。このバッチを２つの等量部分に分けた。
【００６３】
ａ）アセトンを、１０％ｖ／ｖの最終濃度になるように添加し、続いて１％の濾過助剤（Ｋｉｅｓｅｌｇｕｈｒ  Ｈｙｆｌｏ  Ｓｕｐｅｒ  Ｃｅｌ（登録商標））を添加した。アセトンおよび濾過助剤の添加中、溶液を撹拌し、温度を１５℃未満に維持した。次に、濁った溶液を、耐アセトン性濾布（ポリプロピレン）および細菌濾過シート（Ｓｅｉｔｚ  ＥＫＳ）を備えたフィルタープレスで濾過した。濾過の間、圧力を１．８バール未満に維持した。フィルター上に保持された不純物を排出した。澄んだ濾液をタンク中に回収し、アンモニア水でｐＨを４．５に調整した。アセトンを、６６％ｖ／ｖの最終濃度になるように添加した。アセトンの添加中、溶液を撹拌し、温度を１５℃未満に維持した。沈殿物が出現した（トリプシン）。この沈殿物を、耐アセトン性濾布（ポリプロピレン）を備えたフィルタープレスでの濾過によって回収した。濾過の間、圧力を３．５バール未満に維持した。最後に沈殿物を真空乾燥器中で乾燥させた。最終圧力は０．５ミリバールであり、最終温度は３８℃であった。
【００６４】
ＤＮＡを、溶解インキュベーションを用い、続いて等容量のクロロホルム中でのＤＮＡ抽出を用いて抽出した。最後に市販のＤＮＡキットを用いてＤＮＡを精製および濃縮した。続いてＰＣＶ２ＤＮＡの存在を、市販のＰＣＶ２検出キットを用いてリアルタイムＰＣＲ機器で分析した。乾燥させたトリプシンは、ＰＣＶ２について陽性（Ｃｔ：３５）であることが分かった。
【００６５】
ｂ）１％の濾過助剤（Ｋｉｅｓｅｌｇｕｈｒ  Ｈｙｆｌｏ  Ｓｕｐｅｒ  Ｃｅｌ（登録商標））を、溶液に添加した。濾過助剤の添加中、溶液を撹拌し、温度を１５℃未満に維持した。次に、濁った溶液を、耐アセトン性濾布（ポリプロピレン）および細菌濾過シート（Ｓｅｉｔｚ  ＥＫＳ）を備えたフィルタープレスで濾過した。濾過の間、圧力を１．８バール未満に維持した。フィルター上に保持された不純物を排出した。澄んだ濾液をタンク中に回収し、アンモニア水でｐＨを４．５に調整した。アセトンを、６６％ｖ／ｖの最終濃度になるように添加した。アセトンの添加中、溶液を撹拌し、温度を１５℃未満に維持した。沈殿物が出現した（トリプシン）。この沈殿物を、耐アセトン性濾布（ポリプロピレン）を備えたフィルタープレスでの濾過によって回収した。濾過の間、圧力を３．５バール未満に維持した。最後に沈殿物を真空乾燥器中で乾燥させた。最終圧力は０．５ミリバールであり、最終温度は３８℃であった。
【００６６】
ＤＮＡを、溶解インキュベーションを用い、続いて等容量のクロロホルム中でのＤＮＡ抽出を用いて抽出した。最後に市販のＤＮＡキットを用いてＤＮＡを精製および濃縮した。続いてＰＣＶ２ＤＮＡの存在を、市販のＰＣＶ２検出キットを用いてリアルタイムＰＣＲ機器で分析した。乾燥させたトリプシンは、ＰＣＶ２について陽性（Ｃｔ：３６）であることが分かった。
【国際調査報告】
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