(57)【要約】  本発明は、成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）に結合する拮抗抗体を提供する。本発明はさらに、ＩＧＦ−１レベルを低減させるためにこれらの抗体を使用するため、ならびに／または先端巨大症、巨人症、がん、糖尿病性腎症、関節炎、および肺炎症の処置を含む、過剰なＩＧＦ−１に関連した疾患の処置および／もしくは予防のための、治療的方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトおよびカニクイザルの成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）に特異的に結合し、対象に投与されたときに、前記対象の血液中のインスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）のレベルを低下させる、単離されたＧＨＲアンタゴニスト抗体。
【請求項２】
ヒトＧＨＲへの結合に関してモノクローナル抗体ＳＳ１と競合する抗原結合領域を含む、請求項１に記載の単離されたＧＨＲアンタゴニスト抗体。
【請求項３】
モノクローナル抗体ＳＳ１によって認識されるヒトＧＨＲ上のエピトープと同じであるかまたはオーバーラップするエピトープを認識する、請求項１に記載の単離されたＧＨＲアンタゴニスト抗体。
【請求項４】
約１０ｎＭ未満の平衡解離定数でヒトＧＨＲに結合する、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離されたＧＨＲアンタゴニスト抗体。
【請求項５】
重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の単離されたＧＨＲアンタゴニスト抗体。
【請求項６】
成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）に特異的に結合し、配列番号１、１５または１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号１１４または１１５のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号１１８のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、配列番号９９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む、単離されたＧＨＲアンタゴニスト抗体。
【請求項７】
成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）に特異的に結合し、配列番号８の重鎖可変領域（ＶＨ）配列のＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬを含む、単離されたＧＨＲアンタゴニスト抗体。
【請求項８】
ＶＬが、配列番号７のＶＬ配列のＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含む、請求項７に記載の単離されたＧＨＲアンタゴニスト抗体。
【請求項９】
ＶＨ  ＣＤＲ１が、配列番号１、１５または１６のアミノ酸配列を含み、ＶＨ  ＣＤＲ２が、配列番号２または１７のアミノ酸配列を含み、ＶＨ  ＣＤＲ３が、配列番号３のアミノ酸配列を含み、ＶＬ  ＣＤＲ１が、配列番号４のアミノ酸配列を含み、ＶＬ  ＣＤＲ２が、配列番号５のアミノ酸配列を含み、ＶＬ  ＣＤＲ３が、配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項６から８のいずれかに記載の単離されたＧＨＲアンタゴニスト抗体。
【請求項１０】
ＶＨが、配列番号８のアミノ酸配列またはＣＤＲ内ではない残基において１個または数個の保存的アミノ酸置換を有するその変異体を含み、ＶＬが、配列番号７のアミノ酸配列またはＣＤＲ内ではないアミノ酸において１個または数個のアミノ酸置換を有するその変異体を含む、請求項９に記載の単離されたＧＨＲアンタゴニスト抗体。
【請求項１１】
免疫学的に不活性の定常領域をさらに含む、請求項６から１０のいずれか一項に記載の単離されたＧＨＲアンタゴニスト抗体。
【請求項１２】
ＩｇＧ２、ＩｇＧ２Δａ、ＩｇＧ４、ＩｇＧ４Δｂ、ＩｇＧ４Δｃ、ＩｇＧ４Ｓ２２８Ｐ、ＩｇＧ４ΔｂＳ２２８ＰおよびＩｇＧ４ΔｃＳ２２８Ｐからなる群から選択されるアイソタイプを有する、請求項１１に記載の単離されたＧＨＲアンタゴニスト抗体。
【請求項１３】
定常領域が非グリコシル化Ｆｃである、請求項１１に記載の単離されたＧＨＲアンタゴニスト抗体。
【請求項１４】
配列番号１３４または１３３のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１３５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１０に記載の単離されたＧＨＲアンタゴニスト抗体。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体を含む医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体を組換えにより産生する細胞系。
【請求項１７】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードしている核酸。
【請求項１８】
それを必要とする個体の血液中のインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）のレベルを低減させるための方法であって、前記個体に治療有効量の請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体を投与するステップを含む方法。
【請求項１９】
ＩＧＦ−１のレベルを、少なくとも約４０％低減させる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＩＧＦ−１のレベルを、少なくとも約６０％低減させる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記個体が、先端巨大症、巨人症、がん、糖尿病性腎症、関節炎、および肺炎症からなる群から選択される疾患を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
それを必要とする個体において先端巨大症を処置するための方法であって、前記個体に治療有効量の請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体を投与するステップを含む方法。
【請求項２３】
それを必要とする個体において巨人症を処置するための方法であって、前記個体に治療有効量の請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体を投与するステップを含む方法。
【請求項２４】
それを必要とする個体においてがんを処置するための方法であって、前記個体に治療有効量の請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体を投与するステップを含む方法。
【請求項２５】
それを必要とする個体において糖尿病性腎症を処置するための方法であって、前記個体に治療有効量の請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体を投与するステップを含む方法。
【請求項２６】
それを必要とする個体において肺炎症を処置するための方法であって、前記個体に治療有効量の請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体を投与するステップを含む方法。
【請求項２７】
それを必要とする個体において関節炎を処置するための方法であって、前記個体に治療有効量の請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体を投与するステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の活性に拮抗する抗体、例えば、完全長抗体またはその抗原結合部分に関する。より詳細には、本発明は、アンタゴニストＧＨＲ抗体を含む組成物およびこれらの抗体を医薬として使用する方法に関する。アンタゴニストＧＨＲ抗体は、血漿および／または組織中のＩＧＦ−１レベルを低下させるために治療的に使用することができ、がん、糖尿病性腎症、関節炎、肺炎症、ならびに先端巨大症および巨人症を含む成長障害の予防および／または処置において使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
成長ホルモン（ソマトトロピン）（ＧＨ）は、下垂体前葉において合成されそこから分泌される、２２ｋＤａのタンパク質である。Ｋｏｐｃｈｉｃｋら、２００２、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、２３（５）：６２３〜６４６。ＧＨは、組織への直接作用と、肝臓および他の組織によるインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）の放出の刺激との両方による成長の中枢性内分泌制御因子として機能する。Ｏｋａｄａら、２００１、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７（３）：１２６〜１３２。続いて、ＩＧＦ−１は組織に作用して体の成長を刺激する。
【０００３】
ＧＨは、内因性チロシンキナーゼ活性を有さない１回膜貫通タンパク質である成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）を通してシグナルを送る。成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）は、クラス１サイトカイン受容体である。Ｗａｔｅｒｓら、２００６、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、３６、１〜７。ＧＨＲシグナリングは、ＳＴＡＴ、ＭＡＰＫ、およびＰＩ３−キナーゼ／Ａｋｔという少なくとも３つの主要な経路の役割に関与する。ＧＨＲシグナリングの現在の理解は、ＧＨＲが構成的なホモ二量体として存在し、リガンドに誘導される受容体サブユニット再編成によりシグナル伝達を行うというものである。Ｂｒｏｗｎ，Ｒ．Ｊ．ら、２００５、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：８１４〜８２１。現在のところ、ＧＨ結合が不活性の予め二量体化されたＧＨＲをその活性なシグナリング立体構造に変える機序は不明である。Ｙａｎｇら、２００８、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ２２（４）：９７８〜９８８。ＧＨの、二量体されたＧＨＲとの相互作用は、別個の親和性をそれぞれ有するＧＨ上の２つの非対称の結合部位によって媒介される。Ｙａｎｇら、２００８。
【０００４】
ＧＨＲはいたるところに分布している。もともとは肝臓組織において同定されたが、ＧＨＲは、肝臓、骨、腎臓、脂肪、筋肉、目、脳、および心臓において、ならびにＢ細胞、リンパ球、脾臓、および胸腺といった免疫組織において存在することが知られている。ペグビソマント（ＳＯＭＡＶＥＲＴ（登録商標））などのＧＨＲアンタゴニストが、例えば、先端巨大症を処置する薬物として使用するために開発されている（Ｋｏｐｃｈｉｃｋら、２００２）。
【０００５】
異常に高いＧＨレベルは、多くの疾患に関連している。高レベルのＧＨによって直接引き起こされる２つの典型的な障害は、先端巨大症および巨人症である。先端巨大症に伴う変化は、体毛が粗くなること、皮膚の肥厚および黒ずみ、患者が過剰な発汗および不快な体臭を高頻度で訴えるような皮脂腺および汗腺の肥大および過活動、下顎骨の過成長、声の低音化をもたらす喉頭軟骨の増殖、ならびに舌の肥大を含む。加えて、これらの患者における過剰のＧＨは、壊死およびびらんを起こす可能性がある関節軟骨の増殖、ならびに末梢性ニューロパチーを引き起こす神経内線維性増殖に関与する。過剰のＧＨはまた、リン酸の尿細管再吸収を増加させ、軽度の高リン酸血症につながる。これらの症状の多くはまた、巨人症の患者においても見られる。
【０００６】
先端巨大症および巨人症のための現在の処置は、典型的には、下垂体の破壊または薬物処置のいずれかによって、血漿および／または組織中のＩＧＦ−１レベルを低下させることを目指す。先端巨大症および巨人症などのＧＨに媒介される障害におけるＩＧＦ−１の役割は、よく認識されている。Ｍｅｌｍｅｄら、１９９４、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．９７：４６８〜４７３。
【０００７】
先端巨大症および巨人症のための現在の処置は、下垂体除去、放射線治療、メシル酸ブロモクリプチン（ｂｒｏｍｏｃｒｉｐｔｉｎｅ  ｍｅｓｙｌａｔｅ）、ソマトスタチン類似体、およびペグビソマントを含む。下垂体除去は外科的手技であり、あらゆる外科的手技と同様に、死亡を含む合併症の顕著なリスクを伴う。下垂体の放射線治療に伴うリスクも同様に存在する。加えて、放射線治療の効力は、数年間遅延することがある。さらに、これらの治療モダリティは、ＧＨを産生する下垂体のその部分に対して特異的でなく、隣接する組織にも悪影響を及ぼす可能性がある。メシル酸ブロモクリプチンは、ＧＨの産生を抑制するドーパミン様薬物である。最近、長時間作用性ソマトスタチン類似体であるオクトレオチドもまた、手術、放射線、および／またはメシル酸ブロモクリプチンに抵抗性である先端巨大症および巨人症の患者を処置するために使用されている。ソマトスタチン類似体は、インスリン分泌を長期間阻害し、インスリン抵抗性、インスリン分泌不全、および糖尿病のリスク増加を伴う。Ｂａｌｄｅｌｌｉら、２００３、Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．（Ｏｘｆ）．５９（４）：４９２〜４９９。ペグビソマントは、組換えにより生成されるＰＥＧ化ヒトＧＨ類似体を含むＧＨアンタゴニストである。ペグビソマントによる処置は現在、毎日の皮下投与を伴う。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
抗ヒトＧＨＲ抗体が記載されているが、ヒトおよび非ヒト霊長類動物の両方のＧＨＲに特異的に結合し、高親和性であり、高い特異性を有し、強力な拮抗活性を有するモノクローナル抗体を同定することは困難であった。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
非ヒト霊長類動物ＧＨＲにも特異的に結合する、ヒトＧＨＲに対する高親和性の拮抗抗体は、優れた治療剤をもたらすであろう。カニクイザルＧＨＲへの結合とともに高親和性を有する結合は、インスリン分泌に対する作用がなく、ペグビソマントと比較して低減した投与回数を有する治療薬をもたらし、これは、霊長類動物におけるこれらの結合ドメインの安全性、活性および／または薬物動態プロファイルの前臨床評価のため、および、同一の形態で、ヒトにおいて薬物として、両方で使用することができる。本発明は、ヒトＧＨＲ機能と選択的に相互作用し、それを阻害し、さらにカニクイザルＧＨＲに特異的に結合するアンタゴニスト抗体に関する。
【００１０】
いくつかの実施形態において、本発明は、ＧＨＲと相互作用し、個体に投与されたときに、個体の血漿および／または組織中のＩＧＦ−１レベルを低下させる、単離されたアンタゴニスト抗体を提供する。抗体は、例えば、モノクローナル抗体またはヒト、ヒト化、またはキメラ抗体とすることができる。
【００１１】
いくつかの実施形態において、本発明は、ヒトおよびカニクイザルのＧＨＲに特異的に結合し、対象に投与されたときに、前記対象の血液中のＩＧＦ−１のレベルを低下させる、単離されたＧＨＲアンタゴニスト抗体を提供する。
【００１２】
いくつかの実施形態において、ＧＨＲアンタゴニスト抗体は、ヒトＧＨＲへの結合に関してモノクローナル抗体ＳＳ１と競合する抗原結合領域を含むことができる。いくつかの実施形態において、ＧＨＲアンタゴニスト抗体は、モノクローナル抗体ＳＳ１によって認識されるヒトＧＨＲ上のエピトープと同じであるかまたはオーバーラップするエピトープを認識することができる。いくつかの実施形態において、ＧＨＲアンタゴニスト抗体は、約１０ｎＭ未満の平衡解離定数でヒトＧＨＲに結合することができる。いくつかの実施形態において、抗体は、約２５０ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満の平衡解離定数でヒトＧＨＲに結合することができる。
【００１３】
いくつかの実施形態において、ＧＨＲアンタゴニスト抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むことができる。
【００１４】
いくつかの実施形態において、本発明は、ＧＨＲに特異的に結合し、配列番号１、１５または１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号１１４または１１５のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号１１８のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、配列番号９９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む、単離されたＧＨＲアンタゴニスト抗体を提供する。
【００１５】
いくつかの実施形態において、本発明は、成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）に特異的に結合し、配列番号８の重鎖可変領域（ＶＨ）配列のＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬを含む、単離されたＧＨＲアンタゴニスト抗体を提供する。
【００１６】
いくつかの実施形態において、ＶＬは、配列番号７のＶＬ配列のＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含むことができる。
【００１７】
いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号１、１５または１６のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号２または１７のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含むことができる。
【００１８】
いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号８のアミノ酸配列またはＣＤＲ内ではない残基において１個または数個の保存的アミノ酸置換を有するその変異体を含むＶＨ、および配列番号７のアミノ酸配列またはＣＤＲ内ではないアミノ酸において１個または数個のアミノ酸置換を有するその変異体を含むＶＬを含むことができる。
【００１９】
いくつかの実施形態において、抗体は、免疫学的に不活性の定常領域をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、抗体は、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２Δａ、ＩｇＧ４、ＩｇＧ４Δｂ、ＩｇＧ４Δｃ、ＩｇＧ４Ｓ２２８Ｐ、ＩｇＧ４Δｂ  Ｓ２２８ＰおよびＩｇＧ４Δｃ  Ｓ２２８Ｐからなる群から選択されるアイソタイプを有することができる。いくつかの実施形態において、定常領域は非グリコシル化Ｆｃとすることができる。
【００２０】
いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号１３４または１３３のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１３５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含むことができる。
【００２１】
本発明はまた、本明細書において記載されているＧＨＲアンタゴニスト抗体のいずれかを含む医薬組成物を提供する。
【００２２】
本発明はまた、本明細書において記載されているＧＨＲアンタゴニスト抗体のいずれかを組換えにより産生する細胞株を提供する。
【００２３】
本発明はまた、本明細書において記載されているＧＨＲアンタゴニスト抗体のいずれかをコードしている核酸を提供する。本発明はまた、本明細書において記載されているＧＨＲアンタゴニスト抗体のいずれかの重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードしている核酸を提供する。
【００２４】
本発明はまた、有効量の本明細書において記載されているＧＨＲアンタゴニスト抗体のいずれかを含むキットを提供する。
【００２５】
ヒトおよびカニクイザルのＧＨＲに特異的に結合する抗体を同定するための方法もまた提供される。いくつかの実施形態において、方法は、ヒトＧＨＲに特異的に結合する抗体を配列番号１４５のアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させるステップ、および前記ポリペプチドへの前記抗体の結合を決定するステップを含む。いくつかの実施形態において、方法は、配列番号１４５のアミノ酸配列に特異的に結合する抗体を選択するステップをさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、結合の決定は、例えば、ＥＬＩＳＡ、バイオセンサー、またはアフィニティカラムを使用して行うことができる。
【００２６】
それを必要とする個体の血液中のインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）のレベルを低減させるための方法であって、前記個体に治療有効量の本明細書において記載されているＧＨＲアンタゴニスト抗体のいずれかを投与するステップを含む方法もまた提供される。それを必要とする個体の血液中のＩＧＦ−１のレベルを低減させるのに使用するためのＧＨＲアンタゴニスト抗体もまた提供される。いくつかの実施形態において、ＩＧＦ−１のレベルを、投与前のＩＧＦ−１レベルと比較して少なくとも約４０％低減させる。いくつかの実施形態において、ＩＧＦ−１のレベルを、投与前のＩＧＦ−１レベルと比較して少なくとも約６０％低減させる。
【００２７】
いくつかの実施形態において、ＧＨＲアンタゴニスト抗体は、非経口的に投与することができる。
【００２８】
個体において過剰なＩＧＦ−１発現に関連した疾患を処置するための方法であって、それを必要としている対象に有効量の本明細書において記載されているＧＨＲアンタゴニスト抗体のいずれかを投与するステップを含む方法もまた提供される。過剰なＩＧＦ−１に関連した疾患の処置または予防において使用するためのＧＨＲアンタゴニスト抗体もまた提供される。いくつかの実施形態において、疾患は、先端巨大症である。いくつかの実施形態において、疾患は、巨人症である。いくつかの実施形態において、疾患は、糖尿病性腎症である。いくつかの実施形態において、疾患は、関節炎である。いくつかの実施形態において、疾患は、肺炎症である。
【００２９】
いくつかの実施形態において、疾患は、がんである。いくつかの実施形態において、がんは、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、胃がん、膠芽腫、頭頸部がん、腎臓がん、口腔がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫からなる群から選択される。皮膚がんは、例えば、黒色腫であり得る。
【００３０】
いくつかの実施形態において、本発明は、腫瘍を有する個体において腫瘍成長または進行を阻害する方法であって、それを必要としている対象に有効量の本明細書において記載されているＧＨＲアンタゴニスト抗体のいずれかを投与するステップを含む方法を提供する。腫瘍を有する個体において腫瘍成長または進行を阻害するのに使用するためのＧＨＲアンタゴニスト抗体もまた提供される。
【００３１】
いくつかの実施形態において、本発明は、個体においてがん細胞の転移を阻害する方法であって、それを必要としている対象に有効量の本明細書において記載されているＧＨＲアンタゴニスト抗体のいずれかを投与するステップを含む方法を提供する。がん細胞の転移を阻害するのに使用するためのＧＨＲアンタゴニスト抗体もまた提供される。
【００３２】
いくつかの実施形態において、本発明は、腫瘍を有する個体において腫瘍退縮を誘導する方法であって、それを必要としている対象に本明細書において記載されているＧＨＲアンタゴニスト抗体のいずれかを投与するステップを含む方法を提供する。腫瘍退縮を誘導するのに使用するためのＧＨＲアンタゴニスト抗体もまた提供される。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明は、ＧＨとのその相互作用を含む細胞外ＧＨＲの機能に拮抗する抗体、ペプチドおよびアプタマーに関する。より詳細には、本発明は、アンタゴニストＧＨＲ抗体を製造する方法、これらの抗体を含む組成物、およびこれらの抗体を医薬として使用する方法に関する。アンタゴニストＧＨＲ抗体を使用して、血漿ＩＧＦ−１レベルを低下させることができ、例えば、巨人症、先端巨大症、糖尿病性腎症、関節炎、肺炎症、およびある特定のがんを含むＧＨ関連障害の予防および／または処置において使用することができる。
【００３４】
一般的技術
本発明の実施は、別途示されない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技術を用い、これは、当業者の技能範囲内である。そのような技術は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、およびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌら編、１９９３〜１９９８）Ｊ．ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓら編、１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ、１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．ＪａｎｅｗａｙおよびＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８８〜１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、２０００）；Ｕｓｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９）；Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編、Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５）などの文献において完全に説明されている。
【００３５】
定義
以下の用語は、別途示されない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする。「単離された分子」（分子が、例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体である場合）という用語は、その起源または誘導源によって、（１）そのネイティブな状態においてそれに付随する天然に伴う構成成分を伴わない、（２）同じ種の他の分子を実質的に含まない、（３）異なる種の細胞によって発現される、または（４）自然界に存在しない、分子である。したがって、化学的に合成される、またはそれが天然に由来する細胞とは異なる細胞系において発現される分子は、その天然に伴う構成成分から「単離」されているはずである。分子はまた、当技術分野においてよく知られている精製技術を使用した単離によって、天然に伴う構成成分を実質的に含まないようにしてもよい。分子純度または均質性は、当技術分野においてよく知られている多くの手段によってアッセイされてもよい。例えば、ポリペプチド試料の純度は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動および当技術分野においてよく知られている技術を使用したポリペプチドを可視化するためのゲルの染色を使用してアッセイしてもよい。ある特定の目的のために、ＨＰＬＣまたは精製のための当技術分野においてよく知られている他の手段を使用することによって、より高分解能をもたらしてもよい。
【００３６】
「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域中に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、糖質、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に特異的に結合することができる免疫グロブリン分子である。本明細書において使用される場合、この用語は、インタクトなポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、別途明記されていない限り、特異的結合についてインタクトな抗体と競合するその任意の抗原結合部分、別途明記されていない限り、抗原結合部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された立体配置もまた包含する。抗原結合部分は、例えば、限定はしないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ、例えば、サメおよびラクダ科動物抗体）、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む断片、単鎖型可変断片抗体（ＳｃＦｖ）、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲおよびｂｉｓ−ｓｃＦｖ、およびポリペプチドへの特異的抗原結合をもたらすのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部分を含有するポリペプチドを含む。抗体は、任意のクラスの抗体、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ（またはそれらのサブクラス）などを含み、抗体は任意の特定のクラスである必要はない。その重鎖の定常領域の抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２などにさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および３次元立体配置は、よく知られている。
【００３７】
抗体の「可変領域」は、単独のまたは組み合わせた、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を指す。当技術分野において知られているように、重鎖および軽鎖の可変領域はそれぞれ、超可変領域としても知られ、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって接続された４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなる。特にＣＤＲ領域の外側（すなわち、フレームワーク領域中）のアミノ酸残基中に置換を有する、対象可変領域の変異体が所望される場合、適切なアミノ酸置換、好ましくは、保存的アミノ酸置換は、対象可変領域を、対象可変領域と同じカノニカルクラスのＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列を含有する他の抗体の可変領域と比較することによって同定することができる（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６（４）：９０１〜９１７、１９８７）。
【００３８】
当技術分野において知られているように、抗体の「定常領域」は、単独のまたは組み合わせた、抗体軽鎖の定常領域または抗体重鎖の定常領域を指す。
【００３９】
可変ドメインの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ両方の蓄積、拡張型（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）、ＡｂＭ、接触、および／もしくは立体構造定義または当技術分野においてよく知られている任意のＣＤＲ決定方法に従って同定されている可変領域内のアミノ酸残基である。抗体ＣＤＲは、Ｋａｂａｔらによってもともと定義された超可変領域として同定されてもよく、例えば、Ｋａｂａｔら、１９９２、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、ＮＩＨ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．を参照されたい。ＣＤＲの位置はまた、Ｃｈｏｔｈｉａおよび他の研究者によって最初に記載されたループ構造として同定されてもよい。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ３４２：８７７〜８８３を参照されたい。ＣＤＲ同定のための他の手法は、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの中間物であり、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア（現在はＡｃｃｅｌｒｙｓ（登録商標））を使用して得られる「ＡｂＭ定義」、または、ＭａｃＣａｌｌｕｍら、１９９６、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６２：７３２〜７４５に記載されている、観察される抗原接触に基づくＣＤＲの「接触定義」を含む。本明細書においてＣＤＲの「立体構造定義」と称される他の手法では、ＣＤＲの位置は、抗原結合に対してエンタルピー的に寄与する残基として同定されてもよい。例えば、Ｍａｋａｂｅら、２００８、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８３：１１５６〜１１６６を参照されたい。なお他のＣＤＲ境界定義は、上記の手法の１つに厳密に従わなくてもよいが、特定の残基または残基群が抗原結合に顕著に影響を与えないという予測または実験的発見を考慮すると、それらが短く、または長くなることはあるが、ＫａｂａｔのＣＤＲの少なくとも一部分とやはりオーバーラップする。本明細書において使用される場合、ＣＤＲは、手法の組合せを含めて、当技術分野において知られている任意の手法によって定義されるＣＤＲを指し得る。本発明において使用される方法は、これらの手法のいずれかに従って定義されるＣＤＲを利用し得る。複数のＣＤＲを含有する任意の所与の実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、拡張型、ＡｂＭ、接触、および／または立体構造定義のいずれかに従って定義され得る。
【００４０】
「モノクローナル抗体」（Ｍａｂ）という用語は、例えば、任意の真核生物の、原核生物の、またはファージのクローンを含む単一のコピーまたはクローンから得られる抗体を指し、それが生成される方法は指さない。好ましくは、本発明のモノクローナル抗体は、均一なまたは実質的に均一な集団中に存在する。
【００４１】
本明細書において使用される場合、「ヒト化」抗体は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小の配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ‘）２または他の抗原に結合する抗体の部分配列など）である、非ヒト（例えばマウス）抗体の形態を指す。好ましくは、ヒト化抗体は、レシピエントのＣＤＲの残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する、マウス、ラット、またはウサギなどのヒト以外の種（ドナー抗体）のＣＤＲの残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。
【００４２】
「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体および／または本明細書において開示されているヒト抗体を製造するための技術のいずれかを使用して製造された抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に排除する。
【００４３】
「キメラ抗体」という用語は、可変領域配列が１種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体、例えば、可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体などを指すことを意図している。
【００４４】
「エピトープ」という用語は、抗体の抗原結合領域の１つまたは複数における、抗体が認識および結合することができる分子の部分を指す。エピトープはしばしば、アミノ酸または糖側鎖などの分子の表面グループからなり、特異的な３次元の構造的特性ならびに特異的な電荷特性を有する。いくつかの実施形態において、エピトープは、タンパク質エピトープであり得る。タンパク質エピトープは、一次構造または立体構造であり得る。線状エピトープにおいて、タンパク質と相互作用分子（例えば、抗体など）との間の相互作用点のすべては、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って線状に生じる。「非線状エピトープ」または「立体構造エピトープ」は、エピトープに特異的な抗体が結合する抗原性タンパク質内の非連続的なポリペプチド（またはアミノ酸）を含む。本明細書において使用される「抗原性エピトープ」という用語は、当技術分野においてよく知られている任意の方法によって、例えば、通常のイムノアッセイによって決定して、抗体が特異的に結合することができる抗原の部分と定義される。抗原上の所望のエピトープが決定されたら、例えば、本明細書において記載されている技術を使用して、そのエピトープに対する抗体を作製することが可能である。代替として、発見の過程で、抗体の作製および特徴付けにより、望ましいエピトープに関する情報を解明してもよい。この情報から、次いで、同じエピトープへの結合について抗体を競合的にスクリーニングすることが可能である。これを達成するための手法は、競合および交差競合試験を実施して、ＧＨＲへの結合について互いに競合または交差競合する抗体、例えば、抗原への結合について競合する抗体を見いだすことである。
【００４５】
本明細書において使用される場合、「ＧＨＲ」という用語は、ＧＨＲの活性の少なくとも一部を保持する任意の形態のＧＨＲおよびその変異体を指す。ヒトＧＨＲへの明確な言及などによって、そうではないと示されない限り、ＧＨＲは、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシなどの哺乳動物種のＧＨＲのすべてのネイティブ配列を含む。１つの例示的なＧＨＲは、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＡ５２５５５（配列番号１４０）として見いだされる。
【００４６】
本明細書において使用される場合、「ＧＨＲアンタゴニスト抗体」は、ＧＨＲの生物学的活性および／またはＧＨＲシグナリングによって媒介される下流の（１つまたは複数の）経路を阻害することができる抗体を指す。ＧＨＲアンタゴニスト抗体は、ＧＨＲシグナリングによって媒介される下流の経路を含むＧＨＲの生物学的活性、例えば、ＧＨ相互作用および／またはＧＨに対する細胞応答の誘発などをブロックする、それに拮抗する、それを抑制するまたは低減する（顕著な程度を含む任意の程度まで）抗体を包含する。本発明の目的のために、「ＧＨＲアンタゴニスト抗体」という用語は、すべての以前に特定されている用語、名称ならびに、ＧＨＲ自体、ＧＨＲの生物学的活性（インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）発現の任意の態様のその媒介能を含むがそれらに限定されない）、または生物学的活性の結果が、何らかの意味のある程度、実質的に無効になる、減少する、または中和される機能的状態および特性を包含することが明示的に理解されるであろう。いくつかの実施形態において、ＧＨＲアンタゴニスト抗体は、ＧＨＲに結合し、ＧＨとの相互作用を防止する。いくつかの実施形態において、ＧＨＲアンタゴニスト抗体は、ＧＨＲに結合し、ＧＨＲ二量体化を防止する。ＧＨＲアンタゴニスト抗体の例は、本明細書において示されている。
【００４７】
本明細書において使用される場合、「臨床的に意味のある」という用語は、ヒトにおける血清ＩＧＦ−１レベルの少なくとも１５％の低減またはマウスにおける総血清ＩＧＦ−１の少なくとも１５％の低減を意味する。血漿または血清中の測定は、血液中のレベル測定の代用物としての役割を果たすということが明らかである。
【００４８】
「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、任意の長さ、好ましくは、比較的短い（例えば、１０〜１００アミノ酸）アミノ酸の鎖を指すために本明細書において交換可能に使用される。鎖は、線状または分枝状であってもよく、これは、修飾アミノ酸を含んでいてもよく、および／または非アミノ酸によって中断されていてもよい。この用語はまた、天然に、または介入、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、もしくは任意の他の操作もしくは修飾、例えば、標識化構成成分とのコンジュゲーションなどによって、修飾されているアミノ酸鎖も包含する。例えば、１つまたは複数のアミノ酸類似体（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、ならびに当技術分野において知られている他の修飾を含有するポリペプチドもまた定義に含まれる。ポリペプチドは、単鎖または会合鎖として存在することができることが理解される。
【００４９】
当技術分野において知られているように、本明細書において交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」、または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドの鎖を指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドもしくは塩基、および／またはそれらの類似体、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによって鎖中に組み込むことができる任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびそれらの類似体などの修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、鎖のアセンブリの前または後に付与されてもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成成分によって中断されていてもよい。ポリヌクレオチドは、標識化構成成分とのコンジュゲーションなどによって、重合後にさらに修飾されていてもよい。他のタイプの修飾は、例えば、「キャップ」、天然に存在するヌクレオチドの１つまたは複数の類似体との置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電連結（例えば、メチルホスホネート、リン酸トリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）および荷電連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）によるもの、例えばタンパク質などのペンダント部分（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシンなど）を含有するもの、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）によるもの、キレーター（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された連結（例えば、αアノマー核酸など）によるもの、ならびにポリヌクレオチド（複数可）の非修飾形態を含む。さらに、糖中に通常存在するヒドロキシル基のいずれかは、例えば、ホスホン酸基、リン酸基によって置き換えられていても、標準的な保護基によって保護されていても、または追加のヌクレオチドに追加の連結を作るために活性化されてもよく、または固体支持体にコンジュゲートされていてもよい。５’および３’末端ＯＨは、リン酸化することができ、またはアミンもしくは１個から２０個までの炭素原子の有機キャッピング基部分で置換することができる。他のヒドロキシルもまた、標準的な保護基に誘導体化されていてもよい。ポリヌクレオチドはまた、例えば、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環式糖類似体、α−またはβ−アノマー糖、エピマー糖、例えば、アラビノース、キシロースまたはリキソースなど、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体および脱塩基ヌクレオシド類似体、例えば、メチルリボシドなどを含む、当技術分野において一般に知られているリボースまたはデオキシリボース糖の類似形態も含有することができる。１つまたは複数のホスホジエステル連結は、代替の連結基によって置き換えられていてもよい。これらの代替の連結基は、ホスフェートがＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）（式中、各ＲまたはＲ’は独立に、Ｈまたは、エーテル（−Ｏ−）連結、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはアラルジルを含有してもよい置換もしくは非置換アルキル（１〜２０Ｃ）である）によって置き換えられている実施形態を含むがこれらに限定されない。ポリヌクレオチド中のすべての連結が同一である必要はない。前述の記載は、本明細書において言及されるＲＮＡおよびＤＮＡを含むすべてのポリヌクレオチドに当てはまる。
【００５０】
本明細書において使用される場合、平衡解離定数が、本明細書の実施例２において開示されている方法によって測定して２０ｎＭ以下、好ましくは約６ｎＭ未満、より好ましくは約１ｎＭ未満、最も好ましくは約０．２ｎＭ未満であるとき、抗体はＧＨＲ「と相互作用する」。
【００５１】
エピトープに「優先的に結合する」または「特異的に結合する」（本明細書において交換可能に使用される）抗体は、当技術分野においてよく理解されている用語であり、そのような特異的なまたは優先的な結合を決定する方法もまた当技術分野においてよく知られている。分子は、代替の細胞または物質よりもより高頻度で、より急速に、より長い継続時間でおよび／またはより高い親和性で特定の細胞または物質と反応または会合する場合、「特異的結合」または「優先的な結合」を示すと言われる。抗体は、それが他の物質に結合するよりもより高い親和性、アビディティで、より容易に、および／またはより長い継続時間で結合する場合、標的に「特異的に結合する」または「優先的に結合する」。例えば、ＧＨＲエピトープに特異的にまたは優先的に結合する抗体は、それが、他のＧＨＲエピトープまたは非ＧＨＲエピトープに結合するよりもより高い親和性、アビディティで、より容易に、および／またはより長い継続時間でこのエピトープに結合する抗体である。この定義を読むことによって、例えば、第１の標的に特異的にまたは優先的に結合する抗体（または部分（ｍｏｉｅｔｙ）またはエピトープ）は、第２の標的に特異的にまたは優先的に結合してもよく、またはしなくてもよいこともまた理解される。したがって、「特異的結合」または「優先的な結合」は、独占的な結合を（含むことはできるが）必ずしも必要としない。必ずというわけではないが一般に、結合への言及は、優先的な結合を意味する。
【００５２】
本明細書において使用される場合、「実質的に純粋な」は、少なくとも５０％純粋な（すなわち、夾雑物を含まない）、より好ましくは、少なくとも９０％純粋な、より好ましくは、少なくとも９５％純粋な、いっそうより好ましくは、少なくとも９８％純粋な、最も好ましくは、少なくとも９９％純粋な材料を指す。
【００５３】
「宿主細胞」は、ポリヌクレオチドインサートの組み込み用の（１つまたは複数の）ベクターのレシピエントとすることができるまたはそれであった個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の後代を含み、後代は、天然の、偶発的な、または意図的な変異のために、もとの親細胞と必ずしも完全に同一（形態構造においてまたはゲノムＤＮＡ相補性において）ではない。宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチド（複数可）をｉｎ  ｖｉｖｏでトランスフェクトされた細胞を含む。
【００５４】
当技術分野において知られているように、「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。「Ｆｃ領域」は、ネイティブ配列Ｆｃ領域または変異体Ｆｃ領域であってよい。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は様々であり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６位のアミノ酸残基から、またはＰｒｏ２３０からそのカルボキシル末端まで伸びていると通常定義される。Ｆｃ領域中の残基の番号付けは、Ｋａｂａｔの通りのＥＵインデックスの番号付けである。Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．、１９９１。免疫グロブリンのＦｃ領域は一般に、２つの定常ドメイン、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。当技術分野において知られているように、Ｆｃ領域は、二量体または単量体の形態で存在することができる。当技術分野において知られているように、Ｆｃ領域は、二量体または単量体の形態で存在することができる。
【００５５】
当技術分野において使用されているように、「Ｆｃ受容体」および「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記載する。好ましいＦｃＲは、ネイティブ配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（γ受容体）に結合するものであり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を、これらの受容体の対立遺伝子変異体および選択的スプライシングされた形態を含めて含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、その細胞質ドメインが主に異なる類似したアミノ酸配列を有するＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）を含む。ＦｃＲは、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、１９９１、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９：４５７〜９２；Ｃａｐｅｌら、１９９４、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄ、４：２５〜３４；およびｄｅ  Ｈａａｓら、１９９５、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、１２６：３３０〜４１において概説されている。「ＦｃＲ」はまた、母親のＩｇＧの胎児への移行に関与する新生児受容体であるＦｃＲｎを含む（Ｇｕｙｅｒら、１９７６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１７：５８７；およびＫｉｍら、１９９４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４：２４９）。
【００５６】
「競合する」という用語は、抗体に関して本明細書において使用される場合、第１の抗体またはその抗原結合部分が、第２の抗体またはその抗原結合部分の結合に十分に類似するように、エピトープに結合し、その結果、第１の抗体のその同種のエピトープとの結合の結果が、第２の抗体の存在下で、第２の抗体の非存在下での第１の抗体の結合と比較して検出可能な程度に減少することを意味する。第１の抗体の存在下で、第２の抗体のそのエピトープへの結合もまた検出可能な程度に減少する代替形態は同様であってよいが、同様である必要はない。すなわち、第１の抗体は、第１の抗体のそのそれぞれのエピトープへの結合を阻害する第２の抗体がなくても、第２の抗体のそのエピトープへの結合を阻害することができる。しかしながら、各抗体が、その同種のエピトープまたはリガンドとの、他方の抗体の結合を検出可能な程度に阻害する場合、同じ、より大きい、またはより少ない程度のいずれにせよ、抗体は、それらのそれぞれのエピトープ（複数可）の結合について互いに「交差競合する」と言われる。競合抗体および交差競合抗体の両方が、本発明により包含される。そのような競合または交差競合が生じる機序（例えば、立体障害、立体構造変化、または共通のエピトープまたはその部分への結合）にかかわらず、当業者は、本明細書において示されている教示に基づいて、そのような競合抗体および／または交差競合抗体が包含され、本明細書において開示されている方法に有用であり得ることを認識するであろう。
【００５７】
「機能的Ｆｃ領域」は、ネイティブ配列Ｆｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能を有する。例示的な「エフェクター機能」は、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害；貪食；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）の下方制御などを含む。そのようなエフェクター機能は一般に、Ｆｃ領域を結合ドメイン（例えば抗体可変ドメイン）と組み合わせることを必要とし、そのような抗体エフェクター機能を評価するための当技術分野において知られている様々なアッセイを使用してアセスメントすることができる。
【００５８】
「ネイティブ配列Ｆｃ領域」は、自然界で見いだされるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。「変異体Ｆｃ領域」は、少なくとも１個のアミノ酸修飾によってネイティブ配列Ｆｃ領域のものとは異なるが、ネイティブ配列Ｆｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能をなお保持するアミノ酸配列を含む。好ましくは、変異体Ｆｃ領域は、ネイティブ配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して少なくとも１個のアミノ酸置換、例えばネイティブ配列Ｆｃ領域中のまたは親ポリペプチドのＦｃ領域中の約１個から約１０個までのアミノ酸置換、好ましくは約１個から約５個までのアミノ酸置換を有する。本発明における変異体Ｆｃ領域は、好ましくは、ネイティブ配列Ｆｃ領域と、および／または親ポリペプチドのＦｃ領域と、少なくとも約８０％の配列同一性、最も好ましくは、少なくとも約９０％のそれとの配列同一性、より好ましくは、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％のそれとの配列同一性を有する。
【００５９】
本明細書において使用される場合、「処置」は、有益なまたは所望の臨床結果を得るための手法である。本発明の目的のために、有益なまたは所望の臨床結果は、以下の１つまたは複数を含むがこれらに限定されない：過剰なＧＨ産生の結果として生じる異常なＩＧＦ−１レベルの発生率の低減または緩和、および先端巨大症、巨人症、またはがんの１つまたは複数の症状の発生率の低減または緩和。ＧＨの過剰産生は、例えば、下垂体腺腫、または肺、膵臓、副腎もしくは脳の他の部分の腫瘍を含む別の非下垂体腫瘍によって引き起こされる。
【００６０】
「発生率の低減」は、重症度の低減（これは、この状態に対して一般に使用される他の薬物および／または療法（例えば、それへの曝露）の必要性および／または量を低減させることを含み得る）、継続時間の低減、および／または頻度の低減のいずれかを意味する。当業者には理解されるように、個体は、処置に対するそれらの応答に関して様々であり得、したがって、例えば、「発生率を低減させる方法」は、そのような投与がその特定の個体において発生率のそのような低減をもたらす可能性が高いという妥当な予想に基づいて、α−毒素アンタゴニスト抗体の投与を反映する。
【００６１】
「緩和すること」は、ＧＨＲアンタゴニスト抗体を投与しないことと比較した１つまたは複数の症状の軽減または改善を意味する。「緩和すること」はまた、症状の継続時間の短縮または低減を含む。
【００６２】
本明細書において使用される場合、薬物、化合物、または医薬組成物の「有効投与量」または「有効量」は、任意の１つまたは複数の有益なまたは所望の結果をもたらすために十分な量である。予防的使用では、有益なまたは所望の結果は、疾患の生化学的症状、組織学的症状および／または行動症状、その合併症ならびに疾患の発症中に現れる中間の病理学的な表現型を含む疾患の、リスクを解消するまたは低減させること、その重症度を軽減すること、またはその開始を遅延させることを含む。治療的使用では、有益なまたは所望の結果は、例えば、血清ＩＧＦ−１レベルまたは先端巨大症、巨人症、もしくはがんの１つもしくは複数の症状を低減させること、疾患を処置するために必要とされる他の投薬の用量を減少させること、別の投薬の作用を増強すること、および／または患者の疾患の進行を遅延させることなどの臨床結果を含む。有効投与量は、１回または複数回の投与で投与することができる。本発明の目的のために、薬物、化合物、または医薬組成物の有効投与量は、直接または間接的に予防的または治療的処置を達成するために十分な量である。臨床状況において理解されるように、薬物、化合物、または医薬組成物の有効投与量は、別の薬物、化合物、または医薬組成物と併用して達成されてもよく、または達成されなくてもよい。したがって、「有効投与量」は、１種または複数の治療剤を投与する状況において考慮されてよく、単剤は、１種または複数の他の作用剤と併用して、望ましい結果が達成され得るまたは達成される場合、有効量で投与されることが考慮されてもよい。
【００６３】
「個体」または「対象」は、哺乳動物、より好ましくは、ヒトである。哺乳動物はまた、農場動物、競技用動物、愛玩動物、霊長類動物、ウマ、イヌ、ネコ、マウスおよびラットを含むがこれらに限定されない。
【００６４】
本明細書において使用される場合、「ベクター」は、対象とする１つまたは複数の遺伝子または配列（複数可）を送達する、好ましくは、宿主細胞においてそれを発現することができる構築物を意味する。ベクターの例は、ウイルスベクター、裸のＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン性縮合剤に関連したＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソーム中にカプセル化されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、およびプロデューサー細胞などのある特定の真核生物細胞を含むがこれらに限定されない。
【００６５】
本明細書において使用される場合、「発現調節配列」は、核酸の転写を導く核酸配列を意味する。発現調節配列は、プロモーター、例えば、構成的なまたは誘導可能なプロモーターなど、またはエンハンサーであり得る。発現調節配列は、転写される核酸配列に作動可能に連結されている。
【００６６】
本明細書において使用される場合、「薬学的に許容できる担体」または「薬学的に許容できる添加剤」は、活性成分と組み合わせたときに、成分が生物学的活性を保持することを可能にし、対象の免疫系と反応しない任意の材料を含む。例は、リン酸緩衝溶液、水、油／水型エマルジョンなどのエマルジョン、および様々なタイプの湿潤剤などの標準的な医薬担体のいずれかを含むがこれらに限定されない。エアロゾルまたは非経口投与のために好ましい賦形剤は、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）または生理（０．９％）食塩水である。そのような担体を含む組成物は、よく知られている従来の方法によって製剤化される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ、１９９０；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ第２０版  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０００を参照されたい）。
【００６７】
「ｋｏｎ」という用語は、本明細書において使用される場合、抗体の抗原との会合についての速度定数を指す。詳細には、速度定数（ｋｏｎおよびｋｏｆｆ）および平衡解離定数は、完全長および／またはＦａｂ抗体断片（すなわち一価）およびＧＨＲを使用して測定される。
【００６８】
「ｋｏｆｆ」という用語は、本明細書において使用される場合、抗体の抗体／抗原複合体からの解離についての速度定数を指す。
【００６９】
「ＫＤ」という用語は、本明細書において使用される場合、抗体抗原相互作用の平衡解離定数を指す。
【００７０】
本明細書における「約」のついたある値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータそれ自体を対象とする実施形態を含む（かつ記載する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記載は、「Ｘ」の記載を含む。数値範囲はその範囲の境界を定める数字を含む。
【００７１】
実施形態が「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉を用いて本明細書において記載されている場合はいつでも、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」および／または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という表現で記載されている他の点では類似の実施形態もまた提供されることが理解される。
【００７２】
本発明の態様または実施形態がマーカッシュ群または他の選択肢グループの表現で記載されている場合、本発明は、全体として、しかし群の各構成要素を個々に列挙された群全体および主群のすべての可能な部分群だけでなく、群の構成要素の１つまたは複数を欠く主群もまた包含する。本発明はまた、特許請求されている発明における群構成要素のいずれかの１つまたは複数の明示的な除外を想定する。
【００７３】
別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含めて本明細書が優先する。本明細書および特許請求の範囲の全体にわたって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、記述されている整数または整数の群を包含することを意味するが、他の整数または整数の群を除外することを意味しないことが理解されるであろう。文脈上別の解釈が必要とされない限り、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。「例えば（ｅ．ｇ．）」または「例えば（ｆｏｒ  ｅｘａｍｐｌｅ）」という用語に続く任意の例（複数可）は、網羅的または限定的であることを意味しない。
【００７４】
例示的な方法および材料が本明細書において記載されているが、本明細書に記載されているものと同様のまたは等価の方法および材料もまた、本発明の実施または試験において使用することができる。材料、方法および例は、単なる例示であり、限定的であることを意図しない。
【００７５】
過剰なＩＧＦ−１に関連した障害を予防または処置するための方法
一態様において、本発明は、個体において過剰なＩＧＦ−１に関連した障害の少なくとも１つの症状を処置または予防するための方法であって、前記個体に有効量のＧＨＲアンタゴニスト抗体を投与するステップを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、障害は先端巨大症である。別の実施形態において、障害は巨人症である。別の実施形態において、障害はがんである。
【００７６】
いくつかの実施形態において、方法は、過剰なＩＧＦ−１に関連した疾患のリスクがある個体を特定するステップを伴ってもよい。加えて、方法は、過剰なＩＧＦ−１に関連した疾患のリスク因子について個体を評価するステップ、過剰なＩＧＦ−１に関連した疾患の症状について個体を評価するステップ、または過剰なＩＧＦ−１に関連した疾患を有する個体を診断するステップを含んでもよい。ある特定の実施形態において、方法は、疾患が、先端巨大症、巨人症、またはがんであるステップを実行することを伴ってもよい。
【００７７】
有利には、抗体の治療的投与は、より低い血中ＩＧＦ−１をもたらす。好ましくは、血中ＩＧＦ−１は、投与前よりも少なくとも約１０％低い。より好ましくは、血中ＩＧＦ−１は、抗体の投与前よりも少なくとも約１５％低い。より好ましくは、血中ＩＧＦ−１は、抗体の投与前よりも少なくとも約２０％低い。いっそうより好ましくは、血中ＩＧＦ−１は、抗体の投与前よりも少なくとも３０％低い。有利には、血中ＩＧＦ−１は、抗体の投与前よりも少なくとも４０％低い。より有利には、血中ＩＧＦ−１は、抗体の投与前よりも少なくとも５０％低い。非常に好ましくは、血中ＩＧＦ−１は、抗体の投与前よりも少なくとも６０％低い。最も好ましくは、血中ＩＧＦ−１は、抗体の投与前よりも少なくとも７０％低い。
【００７８】
いくつかの実施形態において、ＧＨＲアンタゴニスト抗体の治療的投与は、有利には、例えば、限定はしないが、過剰なＩＧＦ−１レベル、大量の発汗、不快な体臭、皮膚の肥厚、皮膚の黒ずみ、脂性肌、皮膚の小突起（スキンタグ）、疲労、筋力低下、声帯の肥大および副鼻腔の拡大ならびに／または咽頭の軟骨増殖による声の低音化、重度のいびき、睡眠時無呼吸、視覚障害、頭痛、舌の肥大、背部痛、関節の痛み、関節の可動域制限、月経周期不順、性欲低下、勃起機能不全、手の肥大、足の肥大、大きく広がった顔貌、下顎の突出のため下歯列が上歯列より出ている（反対咬合）、肝臓肥大、心臓肥大、腎臓肥大、脾臓肥大、胸囲の増大（樽状胸）、粗い体毛の増加、食物中の糖の不適当なプロセシング、糖尿病、高血圧、尿中のカルシウムの増加、腎結石、胆石、甲状腺の腫脹（甲状腺腫）、心臓疾患、関節炎、結腸における前がん性の成長（ポリープ）、手根管症候群、下垂体機能低下症、子宮筋腫、神経内線維性増殖を結果として生じる末梢性ニューロパチー、増殖した関節軟骨の壊死／またはびらん、高リン酸血症、ならびに脊髄圧迫を含む、先端巨大症の１つまたは複数の症状の発生率の低減および／または緩和をもたらす。
【００７９】
先端巨大症に罹患している個体は、ＧＨＲアンタゴニスト抗体により処置することができる。ＧＨＲアンタゴニスト抗体療法に適している個体は、当技術分野においてよく知られている先端巨大症の臨床基準および予後指標を使用して選択される。先端巨大症の診断またはアセスメントは、当技術分野において十分に確立されている。先端巨大症重症度のアセスメントは、例えば、限定はしないが、血中ＩＧＦ−１レベルの測定、経口ブドウ糖試験の前後の成長ホルモンの測定、および下垂体腫瘍を検出するための脳の磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）を含む、当技術分野において知られている試験に基づいて実施され得る。いくつかの実施形態において、先端巨大症および／または先端巨大症の症状の緩和、調節、その発生率の低減、またはその発症もしくは進行の遅延は、血中ＩＧＦ−１レベルを試験することによって測定される。
【００８０】
いくつかの実施形態において、ＧＨＲアンタゴニスト抗体の治療的投与は、有利には、例えば、限定はしないが、過剰なＩＧＦ−１レベル、過剰な身長成長、過剰な筋肉成長、過剰な臓器の成長、思春期の遅延、複視、周辺視困難、前頭隆起、突出した顎、頭痛、発汗増加、月経不順、大きい手、大きい足、太い指、太い足指、母乳の放出、顔貌の肥厚、衰弱、副腎不全、尿崩症、性腺機能低下症、および甲状腺機能性低下症を含む、巨人症の１つまたは複数の症状の発生率の低減および／または緩和をもたらす。
【００８１】
巨人症に罹患している個体は、ＧＨＲアンタゴニスト抗体により処置することができる。ＧＨＲアンタゴニスト抗体療法に適している個体は、当技術分野においてよく知られている巨人症の臨床基準および予後指標を使用して選択される。巨人症の診断またはアセスメントは、当技術分野において十分に確立されている。巨人症重症度のアセスメントは、例えば、限定はしないが、下垂体腫瘍を検出するための頭部のコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）またはＭＲＩスキャン、経口ブドウ糖試験の前後の成長ホルモンの測定、血中プロラクチンレベルの測定、血中ＩＧＦ−１レベルの測定、血中コルチゾールレベルの測定、血中エストラジオールレベルの測定、血中テストステロンレベルの測定、および甲状腺ホルモンレベルの測定を含む、当技術分野において知られている試験に基づいて実施され得る。いくつかの実施形態において、巨人症および／または巨人症の症状の緩和、調節、その発生率の低減、またはその発症もしくは進行の遅延は、血中ＩＧＦ−１レベルを測定することによって測定される。
【００８２】
本明細書に記載されているすべての方法に関して、ＧＨＲアンタゴニスト抗体への言及はまた、１種または複数の追加の作用剤を含む組成物も含む。これらの組成物は、適した添加剤、例えば、当技術分野においてよく知られている、緩衝剤を含む薬学的に許容できる添加剤などをさらに含んでもよい。本発明は、単独でまたは他の従来の処置方法と組み合わせて使用することができる。
【００８３】
ＧＨＲアンタゴニスト抗体は、任意の適した経路を介して個体に投与することができる。本明細書において記載されている例は、限定的であることを意図しないが、利用可能な技術の例示であることが意図されることが、当業者に明らかであるべきである。したがって、いくつかの実施形態において、ＧＨＲアンタゴニスト抗体は、静脈内投与などの知られている方法によって、例えば、ボーラスとしてまたはある期間にわたる持続注入によって、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、経皮、皮下、関節内、舌下、滑液嚢内、インサフレーションを介する、髄腔内、経口、吸入または局部経路によって、個体に投与される。投与は全身性、例えば、静脈内投与、または限局的であり得る。ジェットネブライザーおよび超音波ネブライザーを含む、液体製剤のための市販されているネブライザーは、投与に有用である。液体製剤を直接噴霧することができ、凍結乾燥粉末を再構成の後に噴霧することができる。代替として、ＧＨＲアンタゴニスト抗体は、フルオロカーボン製剤および定量吸入器（ｍｅｔｅｒｅｄ  ｄｏｓｅ  ｉｎｈａｌｅｒ）を使用してエアロゾル化することができ、または凍結乾燥および粉砕された粉末として吸入させることができる。
【００８４】
いくつかの実施形態において、ＧＨＲアンタゴニスト抗体は、部位特異的なまたは標的化された局所送達技術を介して投与される。部位特異的なまたは標的化された局所送達技術の例は、様々な植込み可能なＧＨＲアンタゴニスト抗体のデポー供給源または局所送達カテーテル、例えば、注入カテーテル、留置カテーテル、またはニードルカテーテルなど、人工移植片、外膜ラップ、シャントおよびステントまたは他の植込み可能なデバイス、部位特異的担体、直接の注射、または直接の適用を含む。例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／５３２１１および米国特許第５，９８１，５６８号を参照されたい。
【００８５】
ＧＨＲアンタゴニスト抗体の様々な製剤が、投与のために使用されてもよい。いくつかの実施形態において、ＧＨＲアンタゴニスト抗体は、そのまま投与されてもよい。いくつかの実施形態において、ＧＨＲアンタゴニスト抗体および薬学的に許容できる添加剤は、様々な製剤中に存在してもよい。薬学的に許容できる添加剤は、当技術分野において知られており、薬理学的に有効な物質の投与を容易にする比較的不活性の物質である。例えば、添加剤は、形またはコンシステンシー（ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）を与えることができ、または賦形剤としての機能を果たすことができる。適した添加剤は、安定化剤、湿潤剤および乳化剤、容積モル浸透圧濃度を変えるための塩、カプセル化剤、緩衝剤、および皮膚浸透促進剤を含むがこれらに限定されない。非経口的および非腸管外薬物送達のための添加剤ならびに製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ第２０版Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００）において記載されている。
【００８６】
いくつかの実施形態において、これらの作用剤は、注射（例えば、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内など）による投与のために製剤化される。したがって、これらの作用剤は、薬学的に許容できるビヒクル、例えば、食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液などと組み合わせることができる。特定の投薬レジメン、すなわち、用量、タイミングおよび反復は、特定の個体およびその個体の病歴に依存するであろう。
【００８７】
ＧＨＲアンタゴニスト抗体は、注射（例えば、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内など）を含む任意の適した方法を使用して投与することができる。ＧＨＲ抗体はまた、本明細書において記載されている通り、吸入を介して投与することができる。一般に、ＧＨＲ抗体の投与では、最初の候補投与量は、約２ｍｇ／ｋｇとすることができる。本発明の目的のために、典型的な１日投与量は、上記に挙げた因子に応じて、約３μｇ／ｋｇ〜３０μｇ／ｋｇ〜３００μｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇ、〜３０ｍｇ／ｋｇ、〜１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上のいずれかの範囲であり得る。例えば、約１ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、および約２５ｍｇ／ｋｇの投与量が使用されてもよい。数日以上にわたる反復投与では、状態に応じて、所望の症状抑制が生じるまで、または、例えば血中ＩＧＦ−１レベルを低減させるために、十分な治療レベルが達成されるまで、処置を持続させる。例示的な投与レジメンは、約２ｍｇ／ｋｇの初回用量、続いて１週間に１回の約１ｍｇ／ｋｇの維持用量のＧＨＲ抗体、または続いて１週おきに約１ｍｇ／ｋｇの維持用量を投与することを含む。しかしながら、実践者が達成したい薬物動態学的減衰のパターンに応じて、他の投薬レジメンが有用である場合もある。例えば、いくつかの実施形態において、１週間に１回から４回投与することが意図される。別の実施形態では、１か月に１回または１か月おきまたは３か月ごとに１回投与することが意図される。この療法の経過は、従来の技術およびアッセイによって容易にモニターされる。投与レジメン（使用されるＧＨＲアンタゴニスト抗体を含む）は、時間とともに変わり得る。
【００８８】
本発明の目的のために、ＧＨＲアンタゴニスト抗体の適切な投与量は、用いられるＧＨＲアンタゴニスト抗体（またはその組成物）、処置される症状のタイプおよび重症度、作用剤が予防目的または治療目的のどちらのために投与されるか、以前の療法、患者の病歴および作用剤に対する応答、患者の血中ＩＧＦ−１レベル、ＩＧＦ−１についての患者の合成およびクリアランス速度、投与された作用剤についての患者のクリアランス速度、および担当医師の裁量に依存するであろう。典型的には、臨床医は、所望の結果を達成する投与量に達するまで、ＧＨＲアンタゴニスト抗体を投与するはずである。用量および／または頻度は、処置のコースにわたって変わり得る。半減期などの経験的な検討事項は、一般に、投与量の決定に寄与する。例えば、ヒト化抗体または完全ヒト抗体などのヒト免疫系と適合性の抗体を使用して、抗体の半減期を長くしてもよく、宿主の免疫系から抗体が攻撃されるのを防止してもよい。投与の頻度は、療法のコースにわたって決定および調整されてよく、必ずではないが一般に、症状、例えば過剰なＩＧＦ−１レベルの処置および／または抑制および／または緩和および／または遅延に基づく。代替として、ＧＨＲアンタゴニスト抗体の持続性の連続放出製剤が適切な場合がある。持続性放出を達成するための様々な製剤およびデバイスが、当技術分野において知られている。
【００８９】
一実施形態において、アンタゴニスト抗体についての投与量は、アンタゴニスト抗体の１回または複数回の投与を受けている個体において、経験的に決定され得る。個体は、徐々に増加する投与量のＧＨＲアンタゴニスト抗体を投与される。効力をアセスメントするために、疾患の指標を追跡することができる。
【００９０】
本発明における方法に従うＧＨＲアンタゴニスト抗体の投与は、例えば、レシピエントの生理的条件、投与の目的が治療であるか予防であるか、および当業者に知られている他の因子に応じて、連続的または間欠的であり得る。ＧＨＲアンタゴニスト抗体の投与は、予め選択された期間にわたって本質的に連続的であってもよく、または一連の間隔をあけた用量で行ってもよい。
【００９１】
いくつかの実施形態において、複数のアンタゴニスト抗体が存在してもよい。少なくとも１種の、少なくとも２種の、少なくとも３種の、少なくとも４種の、少なくとも５種の異なる、またはそれ以上のアンタゴニスト抗体が存在することができる。一般に、それらのＧＨＲアンタゴニスト抗体は、互いに不利な影響を及ぼさない相補的な活性を有し得る。ＧＨＲアンタゴニスト抗体はまた、他のＧＨＲアンタゴニストまたはＧＨアンタゴニストと併用して使用することができる。例えば、以下のＧＨＲアンタゴニストの１つまたは複数が使用されてもよい：ＧＨＲに対するアンチセンス分子（ＧＨＲをコードしている核酸に対するアンチセンス分子を含む）、ＧＨＲ阻害化合物（例えば、ペグビソマント）、およびＧＨＲ構造類似体。ＧＨＲアンタゴニスト抗体はまた、作用剤の有効性を増強および／または補完するのに役立つ他の作用剤と併用して使用することができる。
【００９２】
本発明に従って使用されるＧＨＲアンタゴニスト抗体の治療用製剤は、所望の程度の純度を有する抗体またはペプチドを、任意選択の薬学的に許容できる担体、添加剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ第２０版Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００））と混合することによって、凍結乾燥製剤または水性液剤の形態で、保管のために調製される。許容できる担体、添加剤、または安定剤は、用いられる投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、ホスフェート、シトレート、および他の有機酸などの緩衝剤；塩化ナトリウムなどの塩；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベンなど；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む単糖、二糖、および他の糖質；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩を形成する対イオン；金属複合体（例えばＺｎ−タンパク質複合体）；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含んでいてもよい。
【００９３】
ＧＨＲアンタゴニスト抗体を含有するリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４０３０（１９８０）；ならびに米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号などに記載されている、当技術分野において知られている方法によって調製される。増強された循環時間を有するリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号において開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いる逆相蒸発方法によって作製することができる。リポソームを、規定の細孔径の濾過により押し出して所望の直径を有するリポソームを得る。
【００９４】
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術によってまたは界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）において、またはマクロエマルジョンにおいて、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に封入されてもよい。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ第２０版Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００）において開示されている。
【００９５】
持続放出調製物が調製されてもよい。持続放出調製物の適した例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含み、このマトリックスは、成形物品、例えばフィルム、またはマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸および７エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドで構成される注射可能なミクロスフェア）など、イソ酪酸酢酸スクロース、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。
【００９６】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、例えば、滅菌濾過膜による濾過によって容易に達成される。治療用ＧＨＲアンタゴニスト抗体組成物は一般に、無菌のアクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって貫通可能な栓を有する静脈注射用溶液バッグまたはバイアルに入れる。
【００９７】
本発明に従う組成物は、経口、非経口または直腸投与、または吸入もしくはインサフレーションによる投与のための、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、液剤または懸濁剤、または坐剤などの単位投与形態であってよい。
【００９８】
錠剤などの固体組成物を調製するために、主要な活性成分を、医薬担体、例えば従来の錠剤化成分、例えば、コーンスターチ、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウムまたはガムなど、および他の医薬賦形剤、例えば水と混合して、本発明の化合物、または非毒性の薬学的に許容できるその塩の均一な混合物を含有する固体プレ製剤組成物を形成する。これらのプレ製剤組成物を均一と述べる場合、活性成分が組成物全体にわたって一様に分散しており、その結果、組成物が等しく有効な単位投与形態、例えば、錠剤、丸剤およびカプセル剤などに容易に細分され得ることを意味する。次いでこの固体プレ製剤組成物は、０．１〜約５００ｍｇの本発明の活性成分を含有する上記のタイプの単位投与形態に細分される。新規な組成物の錠剤または丸剤を、コーティングまたは別の方法で配合して、長時間の作用という利点をもたらす剤形を提供することができる。例えば、錠剤または丸剤は、内側投薬およびそれを覆う外皮の形態である外側投薬構成成分を含むことができる。２つの構成成分は、胃内での崩壊を阻止する役割を果たし、内側構成成分を無傷で十二指腸中に通過させ、または放出を遅延させる、腸溶性層によって分離することができる。そのような腸溶性層またはコーティングのために、様々な材料を使用することができ、そのような材料は、多くのポリマー酸ならびにポリマー酸とシェラック、セチルアルコールおよび酢酸セルロースのような材料との混合物を含む。
【００９９】
適した表面活性剤は、特に、非イオン性作用剤、例えば、ポリオキシエチレンソルビタン（例えばＴｗｅｅｎ（商標）２０、４０、６０、８０または８５）および他のソルビタン（例えばＳｐａｎ（商標）２０、４０、６０、８０または８５）などを含む。表面活性剤を含む組成物は、好都合には、０．０５から５％の間の表面活性剤を含み、０．１から２．５％の間であってもよい。必要であれば、他の成分、例えばマンニトールまたは他の薬学的に許容できるビヒクルが添加されてもよいことが理解されるであろう。
【０１００】
適した乳剤は、市販されている脂肪エマルジョン、例えば、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（商標）、Ｉｎｆｏｎｕｔｒｏｌ（商標）、Ｌｉｐｏｆｕｎｄｉｎ（商標）およびＬｉｐｉｐｈｙｓａｎ（商標）などを使用して調製され得る。活性成分は、予め混合された乳剤組成物中に溶解させるか、または代替として、油（例えば大豆油、ベニバナ油、綿実油、ゴマ油、トウモロコシ油または扁桃油）およびリン脂質（例えば卵リン脂質、大豆リン脂質または大豆レシチン）と混合することによって形成された乳剤および水中に溶解させてもよい。乳剤の張性を調整するために、他の成分、例えば、グリセロールまたはグルコースが添加されてもよいことが理解されるであろう。適した乳剤は、典型的には、２０％まで、例えば、５から２０％の間の油を含有する。脂肪エマルジョンは、０．１から１．０μｍ、特に０．１から０．５μｍの間の脂肪液滴を含み、５．５から８．０の範囲のｐＨを有することができる。
【０１０１】
乳剤組成物は、ＧＨＲアンタゴニスト抗体をＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）またはその構成成分（大豆油、卵リン脂質、グリセロールおよび水）と混合することによって調製されるものであり得る。
【０１０２】
吸入またはインサフレーションのための組成物は、薬学的に許容できる、水性または有機溶媒、またはそれらの混合物中の液剤および懸濁剤、ならびに散剤を含む。液体または固体組成物は、上記に述べた通りの適した薬学的に許容できる添加剤を含有してもよい。いくつかの実施形態において、組成物は、局所的なまたは全身の作用のために、経口または鼻呼吸経路によって投与される。好ましくは無菌の薬学的に許容できる溶媒中の組成物は、ガスの使用によって噴霧され得る。噴霧された液剤は、噴霧デバイスから直接吸い込まれてもよく、または噴霧デバイスをフェイスマスク、テントまたは間欠的陽圧呼吸装置に取り付けてもよい。液剤、懸濁剤または散剤組成物は、好ましくは経口的にまたは経鼻的に、製剤を適切に送達するデバイスから投与されてもよい。
【０１０３】
ＧＨＲアンタゴニスト抗体
本発明の方法は、ＧＨＲシグナリングによって媒介される下流の経路を含むＧＨＲの生物学的活性をブロックする、抑制するまたは低減させる（顕著に低減させることを含む）ＧＨＲアンタゴニスト抗体を使用する。ＧＨＲアンタゴニスト抗体は、以下の特性のいずれか１つまたは複数を示すべきである：（ａ）ＧＨＲに結合する；（ｂ）ＧＨＲ二量体化をブロックする；（ｃ）ＧＨＲのＧＨとの相互作用をブロックする；（ｄ）ＧＨＲに媒介されるＳＴＡＴ５リン酸化および／または他の下流のシグナリング事象をブロックするまたは減少させる；（ｅ）ＧＨＲに媒介されるＩＧＦ−１発現をブロックするまたは減少させる；および（ｆ）ＧＨＲの、他の同定されていない因子との相互作用をブロックする。
【０１０４】
本発明の目的のために、抗体は好ましくは、ＧＨＲシグナリング機能およびＧＨ相互作用を阻害するように、ＧＨＲと相互作用する。いくつかの実施形態において、ＧＨＲアンタゴニスト抗体は、ヒトおよび非ヒト霊長類動物ＧＨＲを特異的に認識する。いくつかの実施形態において、ＧＨＲアンタゴニスト抗体は、ヒトおよび非ヒト霊長類動物ＧＨＲに結合する。
【０１０５】
本発明において有用な抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃなど）、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヘテロコンジュゲート抗体、単鎖（ＳｃＦｖ）、それらの突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質（例えば、ドメイン抗体）、ヒト化抗体、および必要とされる特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された立体配置を、抗体のグリコシル化変異体、抗体のアミノ酸配列変異体、および共有結合により修飾された抗体を含めて、包含し得る。抗体は、マウス、ラット、ヒト、または任意の他の起源（キメラまたはヒト化抗体を含む）であってよい。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、ＧＨＲアンタゴニスト抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、抗体はヒト化またはヒト抗体である。
【０１０７】
ＧＨＲアンタゴニスト抗体は、当技術分野において知られている任意の方法によって製造され得る。ヒトおよびマウス抗体の生成のための全般的な技術は、当技術分野において知られており、および／または、本明細書において記載されている。
【０１０８】
ＧＨＲアンタゴニスト抗体およびその断片は、ＧＨＲの生物学的活性の低減、緩和、または中和が検出および／または測定される、当技術分野において知られている方法を使用して同定するまたは特徴付けることができる。いくつかの実施形態において、ＧＨＲアンタゴニスト抗体は、候補作用剤をＧＨＲとインキュベートし、結合および／または付随するＧＨＲの生物学的活性の低減もしくは中和をモニターすることによって同定される。結合アッセイは、精製されたＧＨＲポリペプチド（複数可）を用いて、またはＧＨＲポリペプチド（複数可）を天然に発現する、またはそれを発現するようにトランスフェクトされた細胞を用いて実施されてもよい。一実施形態において、結合アッセイは、候補抗体の、ＧＨＲ結合についての既知のＧＨＲアンタゴニストとの競合能が評価される競合的結合アッセイである。アッセイは、ＥＬＩＳＡフォーマットを含む様々なフォーマットにおいて実施され得る。いくつかの実施形態において、ＧＨＲアンタゴニスト抗体は、候補抗体をＧＨＲとインキュベートし、結合をモニターすることによって同定される。いくつかの実施形態において、ＳＴＡＴ５リン酸化を使用して、ＧＨＲアンタゴニスト抗体を同定する。例えば、候補抗体をＧＨＲを発現している細胞とインキュベートし、付随するＳＴＡＴ５リン酸化をモニターする。
【０１０９】
最初の同定に続いて、候補ＧＨＲアンタゴニスト抗体の活性を、標的化された生物学的活性を試験することが知られているバイオアッセイによってさらに確認および精密化することができる。代替として、バイオアッセイを使用して、候補を直接スクリーニングすることができる。ＧＨＲアンタゴニスト抗体を同定するおよび特徴付けるための方法のいくつかは、実施例において詳細に記載されている。
【０１１０】
本発明のＧＨＲアンタゴニスト抗体は、以下の特性の１つまたは複数を示す：（ａ）ＧＨＲに結合する；（ｂ）ＧＨＲ二量体化をブロックする；（ｃ）ＧＨＲのＧＨとの相互作用をブロックする；（ｄ）ＧＨＲに媒介されるＳＴＡＴ５リン酸化をブロックするまたは減少させる；（ｅ）ＧＨＲに媒介されるＩＧＦ−１発現をブロックするまたは減少させる；および（ｆ）ＧＨＲの、他の同定されていない因子との相互作用をブロックする。好ましくは、ＧＨＲ抗体は、これらの特徴の２つ以上を有する。より好ましくは、抗体は、上記特徴の３つ以上を有する。より好ましくは、抗体は、上記特徴の４つ以上を有する。より好ましくは、抗体は、上記特徴の５つ以上を有する。最も好ましくは、抗体は、すべての６つの特性を有する。
【０１１１】
ＧＨＲアンタゴニスト抗体は、当技術分野においてよく知られている方法を使用して特徴付けされ得る。例えば、１つの方法は、それが結合するエピトープを同定すること、または「エピトープマッピング」である。タンパク質上のエピトープの場所をマッピングするため、および特徴付けるための、当技術分野において知られている多くの方法があり、これらの方法は、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９９の１１章において記載されている、抗体抗原複合体の結晶構造の解明、競合アッセイ、遺伝子断片発現アッセイ、および、合成ペプチドベースのアッセイを含む。さらなる例において、エピトープマッピングを使用して、ＧＨＲアンタゴニスト抗体が結合する配列を決定することができる。エピトープマッピングは、様々な供給源、例えば、Ｐｅｐｓｃａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｅｄｅｌｈｅｒｔｗｅｇ１５、８２１９ＰＨ  Ｌｅｌｙｓｔａｄ、オランダ）から市販されている。エピトープは、線状エピトープ、すなわち、単一のアミノ酸ストレッチ中に含まれているか、または必ずしも単一のストレッチ中に含まれていなくてもよいアミノ酸の３次元相互作用によって形成された立体構造エピトープであり得る。様々に異なる長さ（例えば、少なくとも４〜６アミノ酸長）のペプチドを、単離または合成（例えば、組換えにより）し、ＧＨＲアンタゴニスト抗体を用いる結合アッセイに使用することができる。別の例において、ＧＨＲアンタゴニスト抗体が結合するエピトープは、システマティックなスクリーニングにおいて、ＧＨＲ配列から得られるオーバーラッピングペプチドを使用し、ＧＨＲアンタゴニスト抗体による結合を決定することによって、決定することができる。遺伝子断片発現アッセイによれば、ＧＨＲをコードしているオープンリーディングフレームを、ランダムにまたは特異的遺伝子の構築によって断片化し、発現されたＧＨＲ断片の、試験される抗体との反応性を決定する。遺伝子断片は、例えば、ＰＣＲによって生成され、次いで、放射性アミノ酸の存在下においてｉｎ  ｖｉｔｒｏでタンパク質に転写および翻訳され得る。次いで、抗体の、放射性標識されたＧＨＲ断片への結合を、免疫沈降およびゲル電気泳動によって決定する。ある特定のエピトープはまた、ファージ粒子（ファージライブラリー）または酵母（酵母ディスプレイ）の表面に提示されるランダムペプチド配列の大規模なライブラリーを使用することによって同定することができる。代替として、オーバーラッピングペプチド断片の規定のライブラリーを、単純な結合アッセイにおいて、試験抗体への結合について試験することができる。さらなる例において、抗原の突然変異誘発、ドメイン交換実験およびアラニンスキャニング突然変異誘発を実施して、エピトープ結合のために必要とされる、十分なおよび／または必要な残基を同定することができる。例えば、ドメイン交換実験は、ＧＨＲポリペプチドの様々な断片が、別の種のＧＨＲの、または密接に関連するが抗原性が別個のタンパク質の���列と置き換えられている（交換されている）突然変異体ＧＨＲを使用して実施することができる。抗体の突然変異体ＧＨＲへの結合をアセスメントすることによって、抗体結合にとっての特定のＧＨＲ断片の重要性をアセスメントすることができる。
【０１１２】
ＧＨＲアンタゴニスト抗体を特徴付けるために使用することができるさらに別の方法は、同じ抗原、すなわち、ＧＨＲ上の様々な断片に結合することが知られている他の抗体を用いて競合アッセイを使用して、ＧＨＲアンタゴニスト抗体が、他の抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定することである。競合アッセイは、当業者によく知られている。
【０１１３】
ＧＨＲアンタゴニスト抗体のＧＨＲへの結合親和性（ＫＤ）は、約０．００１〜約２００ｎＭであり得る。いくつかの実施形態において、結合親和性は、約２００ｎＭ、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、約６０ｐＭ、約５０ｐＭ、約２０ｐＭ、約１５ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、約２ｐＭ、または約１ｐＭのいずれかである。いくつかの実施形態において、結合親和性は、約２５０ｎＭ、約２００ｎＭ、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約２０ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、または約２ｐＭのいずれか未満である。
【０１１４】
抗体のＧＨＲへの結合親和性を決定する１つの方法は、抗体の単機能Ｆａｂ断片の結合親和性を測定することによるものである。単機能Ｆａｂ断片を得るために、抗体（例えば、ＩｇＧ）をパパインにより切断するまたは組換えにより発現することができる。抗体のＧＨＲ  Ｆａｂ断片の親和性は、予め固定化されたストレプトアビジンセンサーチップ（ＳＡ）を備えた、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ３０００（商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム、Ｂｉａｃｏｒｅ，ＩＮＣ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪ）によって、ＨＢＳ−ＥＰランニングバッファー（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％ｖ／ｖ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０）を使用して、決定することができる。ビオチン化ＧＨＲを、ＨＢＳ−ＥＰバッファー中に０．５μｇ／ｍＬ未満の濃度まで希釈し、多様な接触時間を使用して個々のチップチャネルに注入して、詳細な動態試験では５０〜２００応答単位（ＲＵ）、またはスクリーニングアッセイでは８００〜１，０００ＲＵのいずれかの、抗原濃度の２つの範囲を達成することができる。再生試験は、２５％ｖ／ｖエタノール中の２５ｍＭ  ＮａＯＨが、２００回を超える注入で、チップ上のＧＨＲの活性を保ちながら、結合したＦａｂを効率的に除去することを示している。典型的には、精製されたＦａｂ試料の連続希釈（０．１〜１０×推定ＫＤに及ぶ濃度）を１００ｍＬ／分で１分間注入し、２時間までの解離時間を許容する。Ｆａｂタンパク質の濃度を、ＥＬＩＳＡおよび／またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって、標準物質として既知の濃度（アミノ酸分析によって決定して）のＦａｂを使用して決定する。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎプログラムを使用して、データを１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．Ｒｏｏ、Ｈ．Ｆａｇｅｒｓｔａｍ，Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ，Ｂ．（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ６．９９〜１１０）に全体的に適合させることによって、動的会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）を同時に得る。平衡解離定数（ＫＤ）値は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算する。このプロトコールは、ヒトＧＨＲ、カニクイザル（ｃｙｎｏ）ＧＨＲ、およびマウスＧＨＲ、ならびに異なる形態のＧＨＲを含む任意のＧＨＲへの抗体の結合親和性を決定するのに使用するのに適している。抗体の結合親和性は一般に、２５℃で測定されるが、３７℃で測定することもできる。
【０１１５】
したがって、本発明は、以下の、表１に見られる部分的な軽鎖配列および部分的な重鎖配列を有する抗体またはそれを含む組成物（医薬組成物を含む）のいずれかを提供する。表１において、下線を引いた配列はＫａｂａｔによるＣＤＲ配列であり、太字の配列はＣｈｏｔｈｉａによるＣＤＲ配列である。抗体のヒトＧＨＲへの結合親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）分析によって決定し、表１に示す。
【０１１６】
【表１】
2015502975.tif 000002
【０１１７】
本発明はまた、ＧＨＲに対する抗体のＣＤＲ部分を提供する。ＣＤＲ領域の決定は、十分に当業者の技能範囲内である。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲの組合せ（「混合型ＣＤＲ」または「拡張型ＣＤＲ」とも呼ばれる）であり得ることが理解される。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、ＫａｂａｔのＣＤＲである。別の実施形態において、ＣＤＲは、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲである。別の実施形態において、ＣＤＲは、拡張型、ＡｂＭ、立体構造、または接触ＣＤＲである。言い換えると、複数のＣＤＲを含む実施形態において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、拡張型、ＡｂＭ、立体構造、接触ＣＤＲまたはその組合せのいずれかであってよい。
【０１１８】
表２は、本発明において提供されるＧＨＲアンタゴニスト抗体のＣＤＲ配列および結合親和性の例を示す。結合親和性は、アスタリスク（＊）が付いている場合を除いて２５℃で測定された。アスタリスクは、３７℃で測定された結合親和性を意味する。
【０１１９】
【表２−１】
2015502975.tif 000003
【０１２０】
【表２−２】
2015502975.tif 000004
【０１２１】
【表２−３】
2015502975.tif 000005
【０１２２】
【表２−４】
2015502975.tif 000006
【０１２３】
【表２−５】
2015502975.tif 000007
【０１２４】
【表２−６】
2015502975.tif 000008
【０１２５】
【表２−７】
2015502975.tif 000009
【０１２６】
【表２−８】
2015502975.tif 000010
【０１２７】
【表２−９】
2015502975.tif 000011
【０１２８】
【表２−１０】
2015502975.tif 000012
【０１２９】
【表２−１１】
2015502975.tif 000013
【０１３０】
【表２−１２】
2015502975.tif 000014
【０１３１】
【表２−１３】
2015502975.tif 000015
【０１３２】
【表２−１４】
2015502975.tif 000016
【０１３３】
【表２−１５】
2015502975.tif 000017
【０１３４】
【表２−１６】
2015502975.tif 000018
【０１３５】
【表２−１７】
2015502975.tif 000019
【０１３６】
【表２−１８】
2015502975.tif 000020
【０１３７】
【表２−１９】
2015502975.tif 000021
【０１３８】
【表２−２０】
2015502975.tif 000022
【０１３９】
【表２−２１】
2015502975.tif 000023
【０１４０】
【表２−２２】
2015502975.tif 000024
【０１４１】
【表２−２３】
2015502975.tif 000025
【０１４２】
【表２−２４】
2015502975.tif 000026
【０１４３】
【表２−２５】
2015502975.tif 000027
【０１４４】
【表２−２６】
2015502975.tif 000028
【０１４５】
【表２−２７】
2015502975.tif 000029
【０１４６】
【表２−２８】
2015502975.tif 000030
【０１４７】
【表２−２９】
2015502975.tif 000031
【０１４８】
【表２−３０】
2015502975.tif 000032
【０１４９】
【表２−３１】
2015502975.tif 000033
【０１５０】
【表２−３２】
2015502975.tif 000034
【０１５１】
【表２−３３】
2015502975.tif 000035
【０１５２】
【表２−３４】
2015502975.tif 000036
【０１５３】
【表２−３５】
2015502975.tif 000037
【０１５４】
【表２−３６】
2015502975.tif 000038
【０１５５】
【表２−３７】
2015502975.tif 000039
【０１５６】
【表２−３８】
2015502975.tif 000040
【０１５７】
【表２−３９】
2015502975.tif 000041
【０１５８】
【表２−４０】
2015502975.tif 000042
【０１５９】
【表２−４１】
2015502975.tif 000043
【０１６０】
【表２−４２】
2015502975.tif 000044
【０１６１】
【表２−４３】
2015502975.tif 000045
【０１６２】
【表２−４４】
2015502975.tif 000046
【０１６３】
本発明はまた、これらの抗体またはポリペプチドのいずれかを製造する方法を提供する。本発明の抗体は、当技術分野において知られている手順によって製造することができる。ポリペプチドは、抗体のタンパク質分解または他の分解によって、上述した組換え方法（すなわち、単一のまたは融合ポリペプチド）によって、または化学合成によって生成することができる。抗体のポリペプチド、特に約５０アミノ酸までのより短いポリペプチド、は、好都合には化学合成によって製造される。化学合成の方法は、当技術分野において知られており、市販されている。例えば、抗体は、固相方法を用いて自動ポリペプチド合成機によって生成され得る。米国特許第５，８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第６，３３１，４１５号もまた参照されたい。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、抗体は、ファージディスプレイ技術によって調製および選択され得る。例えば、米国特許第５，５６５，３３２号；同第５，５８０，７１７号；同第５，７３３，７４３号；および同第６，２６５，１５０号；ならびにＷｉｎｔｅｒら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３〜４５５、１９９４を参照されたい。代替として、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２〜５５３、１９９０）を使用して、免疫化されていないドナーの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからヒト抗体および抗体断片をｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成することができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、Ｍ１３またはｆｄなどの糸状バクテリオファージの主要なまたは微量のコートタンパク質遺伝子のいずれかにインフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面上に機能的抗体断片として提示される。糸状粒子は、ファージゲノムの単鎖ＤＮＡコピーを含有するため、抗体の機能的性質に基づく選択はまた、それらの性質を示す抗体をコードしている遺伝子の選択をもたらす。よって、ファージは、Ｂ細胞の性質の一部を模倣する。ファージディスプレイは、様々なフォーマットにおいて実施することができる；概説については、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ  Ｓ．およびＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ  Ｊ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５６４〜５７１、１９９３を参照されたい。ファージディスプレイのために、Ｖ−遺伝子セグメントのいくつかの供給源を使用することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら（Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４〜６２８、１９９１）は、免疫化したマウスの脾臓から得られるＶ遺伝子の小規模なランダムコンビナトリアルライブラリーから、抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。免疫化されていないヒトドナーのＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、抗原（自己抗原を含む）の多様なアレイに対する抗体を、Ｍａｒｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１〜５９７、１９９１、またはＧｒｉｆｆｉｔｈら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５〜７３４、１９９３によって記載されている技術に本質的に従って単離することができる。自然な免疫反応において、抗体遺伝子は、高い割合で変異を蓄積する（体細胞超変異）。導入される変化の一部は、より高い親和性を付与し、高親和性表面免疫グロブリンを提示しているＢ細胞は、その後の抗原チャレンジ中に優先的に複製および分化する。この自然なプロセスは、「鎖シャッフリング」として知られている技術を用いることによって模倣することができる。（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０：７７９〜７８３、１９９２）。この方法において、ファージディスプレイによって得られる「一次」ヒト抗体の親和性は、重鎖および軽鎖Ｖ領域遺伝子を、免疫化されていないドナーから得られるＶドメイン遺伝子の天然に存在する変異体のレパートリー（レパートリー）と逐次的に置き換えることによって改善され得る。この技術により、ｐＭ〜ｎＭ範囲の親和性を有する抗体および抗体断片の生成が可能となる。非常に大規模なファージ抗体レパートリー��「すべてのライブラリーの母体（ｔｈｅ  ｍｏｔｈｅｒ−ｏｆ−ａｌｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）」としても知られている）を製造するための戦略は、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：２２６５〜２２６６、１９９３によって記載されている。ヒト抗体が出発げっ歯類動物抗体と同様の親和性および特異性を有する遺伝子シャッフリングもまた、げっ歯類動物抗体からヒト抗体を得るために使用することができる。「エピトープインプリンティング」とも称されるこの方法によれば、ファージディスプレイ技術によって得られるげっ歯類動物抗体の重鎖または軽鎖Ｖドメイン遺伝子を、ヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーと置き換え、げっ歯類動物−ヒトキメラを作り出す。抗原による選択は、機能的抗原結合部位を回復させることができるヒト可変領域の単離をもたらし、すなわち、エピトープはパートナーの選択を支配する（刷り込みをする）。残りのげっ歯類動物Ｖドメインを置き換えるためにこのプロセスを反復すると、ヒト抗体が得られる（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／０６２１３を参照されたい）。ＣＤＲ移植による伝統的なげっ歯類動物抗体のヒト化とは異なり、この技術は、げっ歯類動物起源のフレームワークまたはＣＤＲ残基を有さない完全ヒト抗体を提供する。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、抗体は、ハイブリドーマ技術を使用して製造され得る。ヒトを含む任意の哺乳動物対象またはその抗体産生細胞を操作して、ヒトを含む哺乳動物のハイブリドーマ細胞株の生成のための基礎として機能を果たさせることができることが予想される。宿主動物の免疫化の経路およびスケジュールは一般に、本明細書においてさらに記載されているように、抗体刺激および産生のための確立されたおよび従来の技術に合わせる。典型的には、宿主動物に、腹腔内、筋肉内、経口的、皮下、足底内、および／または皮内に、本明細書に記載のものを含むある量の免疫原を接種する。
【０１６６】
ハイブリドーマは、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｂ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜４９７の、またはＢｕｃｋ，Ｄ．Ｗ．ら、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ、１８：３７７〜３８１、１９８２により修飾されている、一般的な体細胞ハイブリダイゼーション技術を使用して、リンパ球および不死化骨髄腫細胞から調製することができる。Ｘ６３−Ａｇ８．６５３およびＳａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、米国のものを含むがそれらに限定されない利用可能な骨髄腫株が、ハイブリダイゼーションにおいて使用されてもよい。一般に、この技術は、骨髄腫細胞およびリンパ球様細胞を、ポリエチレングリコールなどの融合因子（ｆｕｓｏｇｅｎ）を使用して、または当業者によく知られている電気的手段によって、融合させることを伴う。融合の後、細胞を、融合培地から分離し、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地などの選択的成長培地において成長させて、ハイブリダイズしていない親細胞を排除する。血清を補充したまたは補充していない、本明細書において記載されている培地のいずれかを、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを培養するために使用することができる。細胞融合技術の別の代替物として、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞を使用して、主題発明のＧＨＲモノクローナル抗体を生成してもよい。所望であれば、ハイブリドーマまたは他の不死化Ｂ細胞を拡大およびサブクローニングし、従来のイムノアッセイ手順（例えば、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、または蛍光発光イムノアッセイ）によって上清を抗免疫原活性についてアッセイする。
【０１６７】
抗体の供給源として使用されてもよいハイブリドーマは、ＧＨＲまたはその部分に特異的なモノクローナル抗体を産生するすべての誘導体、親ハイブリドーマの後代細胞を包含する。
【０１６８】
そのような抗体を産生するハイブリドーマは、知られている手順を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでまたはｉｎ  ｖｉｖｏで成長させてよい。モノクローナル抗体は、所望であれば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィー、および限外濾過などの従来の免疫グロブリン精製手順によって、培養培地または体液から単離され得る。望ましくない活性が存在する場合、例えば、調製物を、固相に付着させた免疫原でできた吸着剤上に流し、所望の抗体を免疫原から溶離または放出させることによって除去することができる。免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、または大豆トリプシン阻害剤に、二官能性または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介するコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、ＲおよびＲ１は異なるアルキル基である）を使用してコンジュゲートされた標的化アミノ酸配列を含有する、ＧＨＲポリペプチドまたは断片による宿主動物の免疫化により、抗体（例えば、モノクローナル抗体）の集団を得ることができる。
【０１６９】
所望であれば、対象とするＧＨＲアンタゴニスト抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）をシーケンシングしてもよく、次いでポリヌクレオチド配列を、発現または繁殖のためのベクター中にクローニングしてもよい。対象とする抗体をコードしている配列は、宿主細胞においてベクター中に維持されてもよく、次いで宿主細胞を拡大し、後で使用するために凍結することができる。細胞培養物中での組換えモノクローナル抗体の生成は、当技術分野において知られている手段によって、Ｂ細胞からの抗体遺伝子のクローニングによって行うことができる。例えば、Ｔｉｌｌｅｒら、２００８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３２９、１１２；米国特許第７，３１４，６２２号を参照されたい。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド配列を遺伝子操作に使用して、抗体を「ヒト化」してもよく、または抗体の親和性または他の特性を改善してもよい。抗体はまた、例えば、イヌ、ネコ、霊長類動物、ウマおよびウシにおいて使用するためにカスタマイズしてもよい。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、完全ヒト抗体は、特定のヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するように遺伝子工学的に改変されている市販のマウスを使用することによって得ることができる。より望ましい（例えば、完全ヒト抗体）またはより強い免疫反応を生じるように設計されているトランスジェニック動物もまた、ヒト化またはヒト抗体の作製に使用することができる。そのような技術の例は、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）のＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）ならびにＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）のＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅ（登録商標）およびＴＣ  Ｍｏｕｓｅ（商標）である。
【０１７２】
抗体は、まず、抗体および抗体産生細胞を宿主動物から単離し、遺伝子配列を得、遺伝子配列を使用して、宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）において抗体を組換えにより発現させることによって、組換えにより製造されてもよい。用いてもよい別の方法は、植物（例えば、タバコ）またはトランスジェニック乳において抗体配列を発現させることである。植物または乳において抗体を組換えにより発現させるための方法は、開示されている。例えば、Ｐｅｅｔｅｒｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：２７５６、２００１；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．およびＤ．Ｈｕｓｚａｒ  Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３：６５、１９９５；およびＰｏｌｌｏｃｋら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１４７、１９９９を参照されたい。抗体の誘導体、例えば、ドメイン、単鎖などを製造するための方法は、当技術分野において知られている。
【０１７３】
イムノアッセイおよび蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などのフローサイトメトリー選別技術もまた、ＧＨＲに特異的な抗体を単離するために用いることができる。
【０１７４】
モノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、通常の手順（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）を使用して容易に単離およびシーケンシングされる。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源としての機能を果たす。単離したら、ＤＮＡを発現ベクター（ＰＣＴ公開番号ＷＯ８７／０４４６２において開示されている発現ベクターなど）中に入れてよく、次いでこれを、本来は免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞中にトランスフェクトして、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得る。例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８７／０４４６２を参照されたい。ＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列を、相同なマウス配列の代わりに置換することによって（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１、１９８４）、または免疫グロブリンコード配列に、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列のすべてまたは一部を共有結合によりつなぐことによって、修飾されてもよい。そのようにして、本発明におけるＧＨＲモノクローナル抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体が調製される。
【０１７５】
抗体断片は、抗体のタンパク質分解または他の分解によって、上述した組換え方法（すなわち、単一のまたは融合ポリペプチド）によってまたは化学合成によって、生成することができる。抗体のポリペプチド、特に約５０アミノ酸までのより短いポリペプチドは、好都合には化学合成によって製造される。化学合成の方法は当技術分野において知られており、市販されている。例えば、抗体は、固相方法を用いて自動ポリペプチド合成機によって生成することができる。米国特許第５，８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第６，３３１，４１５号もまた参照されたい。
【０１７６】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、抗体ＳＳ１、ＳＳ３、ＳＳ４、ＴＭ１またはＴＭ９の重鎖および／または軽鎖可変領域をコードしている配列を含む。対象とする抗体をコードしている配列は、宿主細胞においてベクター中に維持されてもよく、次いで宿主細胞を拡大し、後で使用するために凍結することができる。ベクター（発現ベクターを含む）および宿主細胞は、本明細書においてさらに記載されている。
【０１７７】
本発明は、親和性成熟した実施形態を含む。例えば、親和性成熟した抗体は、当技術分野において知られている手順によって生成することができる（Ｍａｒｋｓら、１９９２、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９〜７８３；Ｂａｒｂａｓら、１９９４、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ  ９１：３８０９〜３８１３；Ｓｃｈｉｅｒら、１９９５、Ｇｅｎｅ、１６９：１４７〜１５５；Ｙｅｌｔｏｎら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５５：１９９４〜２００４；Ｊａｃｋｓｏｎら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５４（７）：３３１０〜９；Ｈａｗｋｉｎｓら、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２６：８８９〜８９６；およびＰＣＴ公開番号ＷＯ２００４／０５８１８４）。
【０１７８】
抗体の親和性を調整するため、およびＣＤＲを特徴付けるために、以下の方法が使用されてもよい。抗体のＣＤＲを特徴付けるおよび／または抗体などのポリペプチドの結合親和性を変更する（改善するなど）１つの方法は、「ライブラリースキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。一般に、ライブラリースキャニング突然変異誘発は、以下の通り機能する。ＣＤＲ中の１つまたは複数のアミノ酸の位置を、２種以上（３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０種など）のアミノ酸と、当技術分野で認識されている方法を使用して置き換える。これにより、２種以上の構成要素の複雑性（２種以上のアミノ酸が位置ごとに置換されている場合）をそれぞれ有するクローンの小規模なライブラリー（いくつかの実施形態において、分析されるアミノ酸の位置ごとに１つ）が作製される。一般に、ライブラリーはまた、ネイティブな（置換されていない）アミノ酸を含むクローンも含む。各ライブラリーから、少数のクローン、例えば、約２０〜８０個のクローン（ライブラリーの複雑性に応じて）を、標的ポリペプチド（または他の結合標的）への結合親和性についてスクリーニングし、結合が増加した、同じ、減少した、またはない候補を同定する。結合親和性を決定するための方法は、当技術分野においてよく知られている。結合親和性は、例えば、結合親和性の約２倍以上の差異を検出するＢｉａｃｏｒｅ（商標）表面プラズモン共鳴分析、Ｋｉｎｅｘａ（登録商標）バイオセンサー、シンチレーション近接アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＯＲＩＧＥＮ（登録商標）イムノアッセイ、蛍光消光、蛍光移動、および／または酵母ディスプレイを使用して決定してもよい。結合親和性はまた、適したバイオアッセイを使用してスクリーニングしてもよい。出発抗体がすでに比較的高い親和性で、例えば約１０ｎＭ以下のＫＤで結合する場合、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）は特に有用である。
【０１７９】
いくつかの実施形態において、当技術分野で認識されている突然変異誘発方法（そのいくつかは本明細書において記載されている）を使用して、ＣＤＲ中のアミノ酸の位置ごとに、すべての２０種の天然アミノ酸と置き換える（いくつかの実施形態において、１回に１つ）。これにより、２０種の構成要素の複雑性（すべての２０種のアミノ酸が位置ごとに置換されている場合）をそれぞれ有するクローンの小規模なライブラリー（いくつかの実施形態において、分析されるアミノ酸の位置ごとに１つ）が作製される。
【０１８０】
いくつかの実施形態において、スクリーニングされるライブラリーは、同じＣＤＲ中または２つ以上のＣＤＲ中であってもよい２つ以上の位置に置換を含む。よって、ライブラリーは、１つのＣＤＲ中の２つ以上の位置に置換を含んでいてもよい。ライブラリーは、２つ以上のＣＤＲ中の２つ以上の位置に置換を含んでいてもよい。ライブラリーは、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのＣＤＲ中に見いだされる３、４、５、またはそれ以上の位置に置換を含んでいてもよい。置換は、低い冗長性のコドンを使用して調製してもよい。例えば、Ｂａｌｉｎｔら、１９９３、Ｇｅｎｅ  １３７（１）：１０９〜１８の表２を参照されたい。
【０１８１】
ＣＤＲは、重鎖可変領域（ＶＨ）ＣＤＲ３および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ３であってもよい。ＣＤＲは、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、および／またはＶＬ  ＣＤＲ３の１つまたは複数であってもよい。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ、拡張型ＣＤＲ、ＡｂＭ  ＣＤＲ、接触ＣＤＲ、または立体構造ＣＤＲであってもよい。
【０１８２】
改善された結合を有する候補をシーケンシングし、それにより、改善された親和性（「改善された」置換とも呼ばれる）をもたらすＣＤＲ置換突然変異体を同定してもよい。結合する候補をまたシーケンシングして、それにより、結合を保持するＣＤＲ置換を同定してもよい。
【０１８３】
複数のラウンドのスクリーニングを実施してもよい。例えば、改善された結合を有する候補（１つまたは複数のＣＤＲの１つまたは複数の位置におけるアミノ酸置換をそれぞれ含む）はまた、少なくとももとのおよび置換されたアミノ酸を、各改善されたＣＤＲ位置（すなわち、置換突然変異体が改善された結合を示したＣＤＲ中のアミノ酸の位置）において含有する第２のライブラリーの設計に有用である。このライブラリーの調製、およびスクリーニングまたは選択は、下記にさらに論じられている。
【０１８４】
ライブラリースキャニング突然変異誘発はまた、結合が改善した、結合が同じ、結合が減少した、または結合がないクローンの頻度が、抗体抗原複合体の安定性のための各アミノ酸の位置の重要性に関する情報も提供する限り、ＣＤＲを特徴付けるための手段も提供する。例えば、ＣＤＲのある位置が、すべての２０種のアミノ酸に変化させたときに結合を保持するならば、その位置を抗原結合のために必要とされる可能性が低い位置と同定する。逆に、ＣＤＲのある位置が、低いパーセントの置換においてのみ結合を保持するならば、その位置を、ＣＤＲ機能にとって重要な位置と同定する。よって、ライブラリースキャニング突然変異誘発方法は、多くの異なるアミノ酸（すべての２０種のアミノ酸を含む）に変化させることができるＣＤＲ中の位置、および変化させることができないまたは少数のアミノ酸にのみ変化させることができるＣＤＲ中の位置に関する情報を作製する。
【０１８５】
改善された親和性を有する候補は、改善されたアミノ酸、その位置におけるもとのアミノ酸を含み、所望される、または所望のスクリーニングまたは選択方法を使用して許容されるライブラリーの複雑性に応じて、その位置における追加の置換をさらに含んでもよい第２のライブラリーにおいて組み合わせてもよい。加えて、所望であれば、隣接するアミノ酸の位置を、少なくとも２種以上のアミノ酸にランダム化することができる。隣接するアミノ酸のランダム化により、突然変異体ＣＤＲにおけるさらなる立体構造の柔軟性を許容することができ、これにより次に、より多数の改善する変異の導入を許容するまたは容易にすることができる。ライブラリーはまた、スクリーニングの第１ラウンドにおいて改善された親和性を示さなかった位置における置換を含んでもよい。
【０１８６】
第２のライブラリーを、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）表面プラズモン共鳴分析を使用するスクリーニング、ならびにファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、およびリボソームディスプレイを含む選択のための当技術分野において知られている任意の方法を使用した選択を含む当技術分野において知られている任意の方法を使用して、改善されたおよび／または変更された結合親和性を有するライブラリー構成要素についてスクリーニングまたは選択する。
【０１８７】
本発明のＧＨＲ抗体を発現させるために、ＶＨおよびＶＬ領域をコードしているＤＮＡ断片を、上記の方法のいずれかを使用してまず得ることができる。様々な修飾、例えば変異、欠失、および／または付加もまた、当業者に知られている標準的な方法を使用して、ＤＮＡ配列中に導入することができる。例えば、突然変異誘発は、ＰＣＲ産物が所望される変異を含むように変異ヌクレオチドがＰＣＲプライマー中に組み込まれるＰＣＲに媒介される突然変異誘発、または部位特異的変異誘発などの標準的な方法を使用して、行うことができる。
【０１８８】
本発明は、表１に示す可変領域に対する修飾および表２に示すＣＤＲを包含する。例えば、本発明は、機能的に等価の可変領域およびそれらの性質に顕著に影響を及ぼさないＣＤＲを含む抗体ならびに増強されたまたは減少した活性および／または親和性を有する変異体を含む。例えば、アミノ酸配列を変異させて、ＧＨＲへの所望の結合親和性を有する抗体を得てもよい。ポリペプチドの修飾は、当技術分野における常法通り実施され、本明細書において詳細に記載される必要はない。修飾されたポリペプチドの例は、アミノ酸残基の保存的置換、機能的活性を顕著に有害に変化させない、またはそのリガンドに対するポリペプチドの親和性を成熟させる（増強する）アミノ酸の１つまたは複数の欠失または付加を有するポリペプチド、または化学的類似体の使用を含む。
【０１８９】
アミノ酸配列挿入は、長さが１残基から１００残基以上を含むポリペプチドまでの範囲のアミノおよび／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一のまたは複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例は、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体またはエピトープタグと融合させた抗体を含む。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体のＮ末端またはＣ末端への、血液循環中での抗体の半減期を増加させる酵素またはポリペプチドの融合を含む。
【０１９０】
置換変異体は、除去される抗体分子中の少なくとも１個のアミノ酸残基およびその箇所に挿入される異なる残基を有する。置換の突然変異誘発について最も興味深い部位は、超可変領域を含むが、フレームワーク変更もまた意図される。保存的置換を、「保存的置換」の見出しで表３に示している。そのような置換が生物学的活性の変化をもたらすならば、表３において「例示的な置換」と命名される、またはアミノ酸クラスに関して下記にさらに記載されている、より実質的な変化が導入され、産物がスクリーニングされ得る。
【０１９１】
【表３】
2015502975.tif 000047
【０１９２】
抗体の生物学的特性の実質的な修飾は、（ａ）置換の区域におけるポリペプチドバックボーンの構造、例えば、β−シートまたはヘリックス立体構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の大きさ、の維持に対するそれらの作用が顕著に異なる置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は、共通の側鎖の性質に基づいて以下の群に分けられる。
（１）無極性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）電荷のない極性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性（負に荷電）：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性（正に荷電）：Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖方向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ。
【０１９３】
非保存的置換は、これらのクラスの１つの構成要素を別のクラスと交換することによって行う。
【０１９４】
例えば、行ってもよい置換の１つのタイプは、化学的に反応性であってもよい抗体中の１つまたは複数のシステインを、限定はしないが、アラニンまたはセリンなどの別の残基に変化させることである。例えば、非カノニカルなシステインの置換が存在し得る。可変ドメインのＣＤＲもしくはフレームワーク領域においてまたは抗体の定常領域において置換を行うことができる。いくつかの実施形態において、システインはカノニカルである。分子の酸化的安定性を改善するため、および異常な架橋を防止するために、抗体の適切な立体構造の維持に関与していない任意のシステイン残基をまた、一般にセリンと置換してもよい。逆に、特に抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合、その安定性を改善するために、システイン結合（複数可）を抗体に付加してもよい。
【０１９５】
抗体はまた、例えば、抗体の結合性を変更するために、例えば重鎖および／または軽鎖の可変ドメインにおいて、修飾されてもよい。可変領域における変化は、結合親和性および／または特異性を変更することができる。いくつかの実施形態において、１個以下から５個の保存的アミノ酸置換がＣＤＲドメイン内で行われる。別の実施形態において、１個以下から３個の保存的アミノ酸置換がＣＤＲドメイン内で行われる。例えば、ＧＨＲに対する抗体のＫＤを増加もしくは減少させるために、ｋｏｆｆを増加もしくは減少させるために、または抗体の結合特異性を変更するために、ＣＤＲ領域の１つまたは複数において変異を行ってもよい。部位特異的変異誘発における技術は、当技術分野においてよく知られている。例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらおよびＡｕｓｕｂｅｌら、上記を参照されたい。
【０１９６】
修飾または変異はまた、ＧＨＲ抗体の半減期を増加させるために、フレームワーク領域または定常領域において行われてもよい。例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／０９５６０を参照されたい。フレームワーク領域または定常領域における変異はまた、抗体の免疫原性を変更するため、別の分子への共有結合によるまたは非共有結合による結合のための部位を提供するため、または補体結合、ＦｃＲ結合および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害のような性質を変更するために、行うことができる。本発明によれば、単一の抗体は、可変ドメインのＣＤＲもしくはフレームワーク領域の任意の１つもしくは複数において、または定常領域において変異を有し得る。
【０１９７】
修飾はまた、グリコシル化および非グリコシル化ポリペプチド、ならびに例えば、異なる糖によるグリコシル化、アセチル化、およびリン酸化などの他の翻訳後修飾を有するポリペプチドも含む。抗体は、それらの定常領域中の保存された位置においてグリコシル化されている（ＪｅｆｆｅｒｉｓおよびＬｕｎｄ、１９９７、Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６５：１１１〜１２８；ＷｒｉｇｈｔおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ、１９９７、ＴｉｂＴＥＣＨ  １５：２６〜３２）。免疫グロブリンのオリゴ糖側鎖は、タンパク質の機能（Ｂｏｙｄら、１９９６、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：１３１１〜１３１８；ＷｉｔｔｗｅおよびＨｏｗａｒｄ、１９９０、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９：４１７５〜４１８０）ならびに、糖タンパク質の立体構造および提示される３次元表面に影響を及ぼし得る糖タンパク質の部分間の分子内相互作用（ＪｅｆｆｅｒｉｓおよびＬｕｎｄ、上記；ＷｙｓｓおよびＷａｇｎｅｒ、１９９６、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：４０９〜４１６）に影響を及ぼす。オリゴ糖はまた、所与の糖タンパク質を、特異的認識構造に基づいてある特定の分子に対して標的化する役割を果たし得る。抗体のグリコシル化はまた、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に影響を及ぼすことが報告されている。特に、バイセクティングＧｌｃＮＡｃの形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼであるβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）がテトラサイクリンにより発現制御されるＣＨＯ細胞により産生される抗体は、改善されたＡＤＣＣ活性を有することが報告された（Ｕｍａｎａら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６〜１８０）。
【０１９８】
抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ−連結またはＯ−連結である。Ｎ−連結は、糖質部の、アスパラギン残基の側鎖への付着を指す。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリン、アスパラギン−Ｘ−トレオニン、およびアスパラギン−Ｘ−システイン（Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）は、糖質部のアスパラギン側鎖への酵素的付着のための認識配列である。よって、ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を作り出す。Ｏ−連結グリコシル化は、糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの１つの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはトレオニンへの付着を指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンもまた使用されてもよい。
【０１９９】
抗体へのグリコシル化部位の付加は、好都合には、上述したトリペプチド配列の１つまたは複数を含むようにアミノ酸配列を変更すること（Ｎ−連結グリコシル化部位について）によって達成される。変更はまた、もとの抗体の配列への１つまたは複数のセリンまたはトレオニン残基の付加、またはそれによる置換（Ｏ−連結グリコシル化部位について）によって行ってもよい。
【０２００】
抗体のグリコシル化パターンはまた、基礎をなすヌクレオチド配列を変更することなく変更されてもよい。グリコシル化は主として、抗体を発現させるために使用される宿主細胞に依存する。潜在的な治療薬としての、組換え糖タンパク質、例えば抗体の発現のために使用される細胞タイプはネイティブ細胞であることがまれであるため、抗体のグリコシル化パターンの変動が予期され得る（例えば、Ｈｓｅら、１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：９０６２〜９０７０を参照されたい）。
【０２０１】
宿主細胞の選択に加えて、抗体の組換え産生中にグリコシル化に影響を及ぼす因子は、成長様式、培地処方、培養密度、酸素添加、ｐＨ、精製スキームなどを含む。オリゴ糖産生に関与するある特定の酵素を導入するまたは過剰発現させることを含む、特定の宿主生物において達成されるグリコシル化パターンを変更するための様々な方法が提案されている（米国特許第５，０４７，３３５号；同第５，５１０，２６１号および同第５，２７８，２９９号）。グリコシル化、またはある特定のタイプのグリコシル化は、例えば、エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ  Ｈ）、Ｎ−グリコシダーゼＦ、エンドグリコシダーゼＦ１、エンドグリコシダーゼＦ２、エンドグリコシダーゼＦ３を使用して、糖タンパク質から酵素的に除去され得る。加えて、組換え宿主細胞は、ある特定のタイプの多糖のプロセシングを欠くように、遺伝子工学的に改変することができる。これらのおよび同様の技術は、当技術分野においてよく知られている。
【０２０２】
他の修飾方法は、酵素的手段、酸化的置換およびキレート化を含むがこれらに限定されない当技術分野において知られているカップリング技術を使用することを含む。例えば、イムノアッセイのための標識の付着のために、修飾を使用することができる。修飾されたポリペプチドは、当技術分野において確立されている手順を使用して製造することができ、当技術分野において知られている標準的なアッセイを使用してスクリーニングすることができ、そのいくつかは、下記および実施例において記載されている。
【０２０３】
いくつかの実施形態において、抗体は、ヒトＦｃγ受容体への増加または減少した結合親和性を有する、免疫学的に不活性または部分的に不活性である、例えば、補体媒介性溶解を誘発しない、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を刺激しない、もしくは小膠細胞を活性化しない；または以下：補体媒介性溶解の誘発、ＡＤＣＣの刺激、もしくは小膠細胞の活性化、のうちの任意の１つまたは複数の低減した活性（非修飾抗体と比較して）を有する、修飾された定常領域を含む。定常領域の異なる修飾を使用して、エフェクター機能の最適なレベルおよび／または組合せを達成してもよい。例えば、Ｍｏｒｇａｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８６：３１９〜３２４、１９９５；Ｌｕｎｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５７：４９６３〜９１５７：４９６３〜４９６９、１９９６；Ｉｄｕｓｏｇｉｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６４：４１７８〜４１８４、２０００；Ｔａｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４３：２５９５〜２６０１、１９８９；およびＪｅｆｆｅｒｉｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １６３：５９〜７６、１９９８を参照されたい。いくつかの実施形態において、定常領域は、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９９、２９：２６１３〜２６２４；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１４４１；および／または英国特許出願番号９８０９９５１．８において記載されている通り修飾される。
【０２０４】
いくつかの実施形態において、抗体定常領域を修飾して、Ｆｃγ受容体ならびに補体および免疫系との相互作用を回避することができる。そのような抗体の調製のための技術は、ＷＯ９９／５８５７２において記載されている。例えば、抗体が臨床試験およびヒトの処置において使用される場合、定常領域を、ヒト定常領域により類似するように遺伝子工学的に改変して、免疫反応を回避してもよい。例えば、米国特許第５，９９７，８６７号および同第５，８６６，６９２号を参照されたい。
【０２０５】
いくつかの実施形態において、定常領域は、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９９、２９：２６１３〜２６２４；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１４４１；および／または英国特許出願番号９８０９９５１．８において記載されている通り修飾される。そのような実施形態において、Ｆｃは、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４であり得る。Ｆｃは、変異Ａ３３０Ｐ３３１〜Ｓ３３０Ｓ３３１（ＩｇＧ２Δａ）（アミノ酸残基は野生型ＩｇＧ２配列に関して番号付けされている）を含有するヒトＩｇＧ２であり得る。Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９９、２９：２６１３〜２６２４。いくつかの実施形態において、抗体は、以下の変異（Ａｒｍｏｕｒら、２００３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４０  ５８５〜５９３）：Ｅ２３３Ｆ２３４Ｌ２３５〜Ｐ２３３Ｖ２３４Ａ２３５（ＩｇＧ４Δｃ）（番号付けは野生型ＩｇＧ４に関する）を含むＩｇＧ４の定常領域を含む。さらに別の実施形態において、Ｆｃは、欠失Ｇ２３６を有するヒトＩｇＧ４  Ｅ２３３Ｆ２３４Ｌ２３５〜Ｐ２３３Ｖ２３４Ａ２３５（ＩｇＧ４Δｂ）である。別の実施形態において、Ｆｃは、ヒンジを安定化する変異Ｓ２２８〜Ｐ２２８を含有する任意のヒトＩｇＧ４  Ｆｃ（ＩｇＧ４、ＩｇＧ４ΔｂまたはＩｇＧ４Δｃ）である（Ａａｌｂｅｒｓｅら、２００２、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０５、９〜１９）。
【０２０６】
いくつかの実施形態において、抗体は、以下の変異を含むヒト重鎖ＩｇＧ２定常領域を含む：Ａ３３０Ｐ３３１〜Ｓ３３０Ｓ３３１（野生型ＩｇＧ２配列に関するアミノ酸番号付け）。Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９９、２９：２６１３〜２６２４。なお別の実施形態において、定常領域は、Ｎ−連結グリコシル化に関して非グリコシル化されている。いくつかの実施形態において、定常領域は、定常領域中のＮ−グリコシル化認識配列の一部であるオリゴ糖付着残基および／または隣接している残基を変異させることによって、Ｎ−連結グリコシル化に関して非グリコシル化されている。例えば、Ｎ−グリコシル化部位Ｎ２９７は、例えば、Ａ、Ｑ、Ｋ、またはＨに変異させてもよい。Ｔａｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４３：２５９５〜２６０１、１９８９；およびＪｅｆｆｅｒｉｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １６３：５９〜７６、１９９８を参照されたい。いくつかの実施形態において、定常領域は、Ｎ−連結グリコシル化に関して非グリコシル化されている。定常領域は、酵素により（酵素ＰＮＧアーゼによる糖質の除去など）、またはグリコシル化欠損宿主細胞における発現によって、Ｎ−連結グリコシル化に関して非グリコシル化されていてもよい。
【０２０７】
他の抗体修飾は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／５８５７２において記載されている通り修飾されている抗体を含む。これらの抗体は、標的分子に対する結合ドメインに加えて、ヒト免疫グロブリン重鎖の定常領域のすべてまたは一部と実質的に相同なアミノ酸配列を有するエフェクタードメインを含む。これらの抗体は、標的の顕著な補体依存性溶解、または細胞媒介性破壊を誘発することなく、標的分子に結合することができる。いくつかの実施形態において、エフェクタードメインは、ＦｃＲｎおよび／またはＦｃγＲＩＩｂに特異的に結合することができる。これらは、典型的には、２つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖ＣＨ２ドメインから得られるキメラドメインに基づく。このように修飾された抗体は、従来の抗体療法に対する炎症性のおよび他の有害な反応を回避するために、長期の抗体療法において使用するのに特に適している。
【０２０８】
いくつかの実施形態において、抗体は、非修飾抗体と比較して増加したＦｃＲｎに対する結合親和性および／または増加した血清半減期を有する修飾された定常領域を含む。
【０２０９】
「生殖系列化」として知られているプロセスにおいて、ＶＨおよびＶＬ配列中のある特定のアミノ酸は、生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列において天然に見いだされるものに一致するように変異させることができる。特に、ＶＨおよびＶＬ配列中のフレームワーク領域のアミノ酸配列は、抗体が投与されたときの免疫原性のリスクを低減させるために、生殖系列配列に一致するように変異させることができる。ヒトＶＨおよびＶＬ遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は、当技術分野において知られている（例えば、「Ｖｂａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベースを参照されたい；Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．ら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、米国保健福祉省（Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ＮＩＨ公開番号９１−３２４２；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６〜７９８；およびＣｏｘら、１９９４、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７〜８３６もまた参照されたい）。
【０２１０】
行ってもよい別のタイプのアミノ酸置換は、抗体中の潜在的なタンパク質分解部位を除去することである。そのような部位は、可変ドメインのＣＤＲもしくはフレームワーク領域中または抗体の定常領域中に存在し得る。システイン残基の置換およびタンパク質分解部位の除去は、抗体産物における不均質性のリスクを減少させ、よってその均質性を増加させ得る。別のタイプのアミノ酸置換は、潜在的な脱アミド部位を形成するアスパラギン−グリシン対を、残基の一方または両方を変更することによって排除することである。別の例において、本発明のＧＨＲ抗体の重鎖のＣ末端リシンは切断することができる。本発明の様々な実施形態において、ＧＨＲ抗体の重鎖および軽鎖は、シグナル配列を含んでもよい。
【０２１１】
本発明のＶＨおよびＶＬセグメントをコードしているＤＮＡ断片が得られたら、これらのＤＮＡ断片を、例えば、可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子に、Ｆａｂ断片遺伝子に、またはｓｃＦｖ遺伝子に変換するために、標準的な組換えＤＮＡ技術によってさらに操作することができる。これらの操作において、ＶＬまたはＶＨをコードしているＤＮＡ断片は、抗体定常領域または柔軟なリンカーなどの別のタンパク質をコードしている別のＤＮＡ断片に作動可能に連結されている。「作動可能に連結されている」という用語は、この状況において使用される場合、２つのＤＮＡ断片によってコードされているアミノ酸配列がインフレームのままであるように、２つのＤＮＡ断片がつながれていることを意味することが意図されている。
【０２１２】
ＶＨ領域をコードしている単離されたＤＮＡは、ＶＨをコードしているＤＮＡを、別の重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードしているＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、完全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野において知られており（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．ら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、米国保健福祉省（Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ＮＩＨ公開番号９１−３２４２を参照されたい）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域であり得るが、最も好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ２定常領域である。ＩｇＧ定常領域配列は、Ｇｍ（１）、Ｇｍ（２）、Ｇｍ（３）、およびＧｍ（１７）などの、様々な個体において存在することが知られている様々な対立遺伝子またはアロタイプのいずれかであり得る。これらのアロタイプは、ＩｇＧ１定常領域中の天然に存在するアミノ酸置換を表す。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子では、ＶＨをコードしているＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードしている別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することができる。ＣＨ１重鎖定常領域は、重鎖遺伝子のいずれかから得られ得る。
【０２１３】
ＶＬ領域をコードしている単離されたＤＮＡは、ＶＬをコードしているＤＮＡを軽鎖定常領域ＣＬをコードしている別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、完全長軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野において知られており（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．ら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、米国保健福祉省（Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ＮＩＨ公開番号９１−３２４２を参照されたい）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、κまたはλ定常領域であり得る。κ定常領域は、Ｉｎｖ（１）、Ｉｎｖ（２）、およびＩｎｖ（３）などの、様々な個体において存在することが知られている様々な対立遺伝子のいずれかであってよい。λ定常領域は、３つのλ遺伝子のいずれかから得られ得る。
【０２１４】
ｓｃＦｖ遺伝子を作り出すために、ＶＨおよびＶＬ配列を、ＶＬおよびＶＨ領域が柔軟なリンカーによってつながれた連続的な単鎖タンパク質として発現させることができるように、ＶＨおよびＶＬをコードしているＤＮＡ断片を、柔軟なリンカーをコードしている別の断片に作動可能に連結する（例えば、Ｂｉｒｄら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜４２６；Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９〜５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２〜５５４を参照されたい。連結ペプチドの例は、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号１４４）であり、これは一方の可変領域のカルボキシ末端と他方の可変領域のアミノ末端との間を約３．５ｎｍ橋かけする。他の配列のリンカーが設計され使用されている（Ｂｉｒｄら、１９８８、上記）。次に、リンカーは、薬物の付着または固体支持体への付着などの追加の機能のために修飾することができる。単鎖抗体は、単一のＶＨおよびＶＬのみが使用される場合は一価、２つのＶＨおよびＶＬが使用される場合は二価、または、２つより多いＶＨおよびＶＬが使用される場合は多価であり得る。ＧＨＲおよび別の分子に特異的に結合する二特異性のまたは多価の抗体が作製されてもよい。単鎖変異体は、組換えによりまたは合成的に生成することができる。ｓｃＦｖの合成的生成のために、自動合成機を使用することができる。ｓｃＦｖの組換え生成のために、ｓｃＦｖをコードしているポリヌクレオチドを含む適したプラスミドを、酵母、植物、昆虫または哺乳動物細胞などの真核生物の、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核生物の適した宿主細胞中に導入することができる。対象とするｓｃＦｖをコードしているポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーションなどの常法通りの操作によって製造することができる。結果として生じるｓｃＦｖは、当技術分野において知られている標準的なタンパク質精製技術を使用して単離することができる。
【０２１５】
ダイアボディなどの他の形態の単鎖抗体もまた包含される。ダイアボディは、ＶＨおよびＶＬが単一のポリペプチド鎖において、しかし同じ鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用して発現され、それによりドメインを別の鎖の相補的なドメインと対形成させ、２つの抗原結合部位を作り出す、二価の二重特異性抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４〜６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．ら、１９９４、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１〜１１２３を参照されたい）。
【０２１６】
２つの、共有結合によりつながれた抗体を含むヘテロコンジュゲート抗体もまた、本発明の範囲内である。そのような抗体は、免疫系細胞を好ましくない細胞に標的化するために（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染の処置のために（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／００３６０およびＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９）使用されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の好都合な架橋方法を使用して製造され得る。適した架橋剤および技術は、当技術分野においてよく知られており、米国特許第４，６７６，９８０号において記載されている。
【０２１７】
キメラまたはハイブリッド抗体もまた、架橋剤を伴うものを含む合成タンパク質化学の知られている方法を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製され得る。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を使用して、またはチオエーテル結合を形成することによって構築され得る。この目的のために適した試薬の例は、イミノチオレート（ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｔｅ）およびメチル−４−メルカプトブチルイミデートを含む。
【０２１８】
本発明はまた、本明細書において開示されている抗体の１つまたは複数の断片または領域を含む融合タンパク質も包含する。いくつかの実施形態において、別のポリペプチドに連結された本発明のＧＨＲ抗体のすべてまたは一部分を含む融合抗体が製造され得る。別の実施形態において、ＧＨＲ抗体の可変ドメインのみが、ポリペプチドに連結されている。別の実施形態において、ＧＨＲ抗体のＶＨドメインは、第１のポリペプチドに連結されており、一方、ＧＨＲ抗体のＶＬドメインは、ＶＨおよびＶＬドメインが互いに相互作用して抗原結合部位を形成することができるように第１のポリペプチドに関連している第２のポリペプチドに連結されている。別の好ましい実施形態において、ＶＨドメインは、ＶＨおよびＶＬドメインが互いに相互作用することができるように、リンカーによってＶＬドメインから分離されている。次いで、ＶＨ−リンカー−ＶＬ抗体は、対象とするポリペプチドに連結される。加えて、２つ（以上）の単鎖抗体が互いに連結されている融合抗体を作り出すことができる。これは、単一のポリペプチド鎖において二価または多価の抗体を作りたい場合、または二重特異性抗体を作りたい場合、有用である。
【０２１９】
いくつかの実施形態において、配列番号７、９、１１、１３もしくは１４に示す可変軽鎖領域の少なくとも１０個の連続的なアミノ酸および／または配列番号８、１０もしくは１２に示す可変重鎖領域の少なくとも１０個のアミノ酸を含む融合ポリペプチドが提供される。別の実施形態において、可変軽鎖領域の少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、もしくは少なくとも約３０個の連続的なアミノ酸および／または可変重鎖領域の少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、もしくは少なくとも約３０個の連続的なアミノ酸を含む融合ポリペプチドが提供される。別の実施形態において、融合ポリペプチドは、配列番号７および８、９および１０、１１および１２、１３および８、ならびに１４および８の中から選択される配列対のいずれかにおいて示されている、軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む。別の実施形態において、融合ポリペプチドは、１つまたは複数のＣＤＲを含む。なお別の実施形態において、融合ポリペプチドは、ＶＨ  ＣＤＲ３および／またはＶＬ  ＣＤＲ３を含む。本発明の目的のために、融合タンパク質は、１つまたは複数の抗体およびそれがネイティブな分子において付着しない別のアミノ酸配列、例えば、別の領域の非相同配列または相同配列を含有する。例示的な非相同配列は、ＦＬＡＧタグまたは６Ｈｉｓタグなどの「タグ」を含むがこれらに限定されない。タグは、当技術分野においてよく知られている。
【０２２０】
融合ポリペプチドは、当技術分野において知られている方法によって、例えば、合成的にまたは組換えにより作り出すことができる。典型的には、本発明の融合タンパク質は、本明細書に記載の組換え方法を使用して、それらをコードしているポリヌクレオチドを調製し発現させることによって製造されるが、それらはまた、例えば化学合成を含む、当技術分野において知られている他の手段によっても調製され得る。
【０２２１】
別の実施形態において、他の修飾された抗体は、ＧＨＲ抗体をコードしている核酸分子を使用して調製され得る。例えば、「カッパボディ」（Ｉｌｌら、１９９７、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１０：９４９〜５７）、「ミニボディ」（Ｍａｒｔｉｎら、１９９４、ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：５３０３〜９）、「ダイアボディ」（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、上記）、または「ヤヌシン（Ｊａｎｕｓｉｎ）」（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、１９９１、ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５〜３６５９およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、１９９２、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（Ｓｕｐｐｌ．）７：５１〜５２）は、標準的な分子生物学的技術を使用して、明細書の教示に従って調製され得る。
【０２２２】
例えば、二重特異性抗体、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体は、本明細書において開示されている抗体を使用して調製することができる。二重特異性抗体を製造するための方法は、当技術分野において知られている（例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、１９８６、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １２１：２１０を参照されたい）。例えば、二重特異性抗体または抗原結合断片は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片を連結することによって生成することができる。例えば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉおよびＬａｃｈｍａｎｎ、１９９０、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５〜３２１、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７〜１５５３を参照されたい。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生成は、２つの重鎖が異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づいていた（ＭｉｌｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、１９８３、Ｎａｔｕｒｅ  ３０５、５３７〜５３９）。加えて、二重特異性抗体は、「ダイアボディ」または「ヤヌシン」として形成されてもよい。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、ＧＨＲの２つの異なるエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、上記の修飾された抗体は、本発明において提供されるＧＨＲ抗体の可変ドメインまたはＣＤＲ領域の１つまたは複数を使用して調製される。
【０２２３】
二重特異性抗体を製造する１つの手法によれば、所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインを、免疫グロブリン定常領域配列に融合させる。融合は好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常領域による。融合体の少なくとも１つにおいて存在する、軽鎖結合のために必要な部位を含有する第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体および、所望であれば、免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別々の発現ベクター中に挿入し、適した宿主生物中に同時トランスフェクトする。このことは、構築において使用される３つのポリペプチド鎖の等しくない比が最適な収率をもたらす場合、実施形態における３つのポリペプチド断片の相互の比率の調整において大きな柔軟性をもたらす。しかしながら、等しい比での少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高い収率をもたらす場合、または上記比が特に重要でない場合、１つの発現ベクター中に２つまたはすべての３つのポリペプチド鎖のコード配列を挿入することが可能である。
【０２２４】
１つの手法において、二重特異性抗体は、一方のアーム中の第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他方のアーム中のハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性をもたらす）で構成される。二特異性分子の半分のみにおいて免疫グロブリン軽鎖を有するこの非対称の構造は、所望の二特異性化合物の、好ましくない免疫グロブリン鎖組合せからの分離を容易にする。この手法は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／０４６９０において記載されている。
【０２２５】
本発明はまた、固体支持体へのカップリングを容易にする作用剤（ビオチンまたはアビジンなど）にコンジュゲートされた（例えば、連結された）抗体を含む組成物を提供する。簡潔にするために、これらの方法は本明細書において記載されているＧＨＲ結合および／またはアンタゴニスト実施形態のいずれにも当てはまるという理解のもと、概して抗体に言及する。コンジュゲーションは一般に、本明細書に記載されている通りこれらの構成成分を連結することを指す。連結すること（これは一般に、少なくとも投与のためにこれらの構成成分を近接して会合した状態に固定することである）は、任意の数の方法で達成することができる。例えば、それぞれが他方と反応することができる置換基を有する場合、作用剤と抗体の間の直接反応が可能である。例えば、一方におけるアミノまたはスルフヒドリル基などの求核基は、無水物または酸ハロゲン化物などのカルボニル含有基と、または他方における良好な脱離基（例えば、ハロゲン化物）を含有するアルキル基と反応することが可能であり得る。
【０２２６】
抗体は、多くの異なる担体に結合させることができる。担体は、活性および／または不活性であり得る。よく知られている担体の例は、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、ガラス、天然のおよび修飾されたセルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよび磁鉄鉱を含む。担体の性質は、本発明の目的のために、可溶性または不溶性のいずれかであり得る。当業者は、抗体を結合させるための別の適した担体を知っているはずであり、または常法通りの実験を使用してそれを確かめることができる。
【０２２７】
本発明の抗体またはポリペプチドは、蛍光分子、放射性分子または当技術分野において知られている任意の他の標識などの標識化剤に連結されていてもよい。一般にシグナルを（直接または間接的のいずれかで）もたらす標識は、当技術分野において知られている。
【０２２８】
ポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞
本発明はまた、本明細書において記載されている抗体断片および修飾された抗体を含む抗体のいずれか、例えば、エフェクター機能の損なわれた抗体などをコードしているポリヌクレオチドを提供する。別の態様において、本発明は、本明細書において記載されているポリヌクレオチドのいずれかを製造する方法を提供する。ポリヌクレオチドは、当技術分野において知られている手順によって製造し発現することができる。したがって、本発明は、以下のいずれかをコードしている、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む医薬組成物を含む組成物を提供する：抗体ＳＳ１、ＳＳ３、ＳＳ４、ＴＭ１またはＴＭ９またはＧＨＲとの拮抗能を有する任意のその断片または一部。
【０２２９】
任意のそのような配列と相補的なポリヌクレオチドもまた、本発明により包含される。ポリヌクレオチドは、単鎖（コードまたはアンチセンス）または二重鎖であってよく、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成）またはＲＮＡ分子であってもよい。ＲＮＡ分子は、イントロンを含有し、１対１でＤＮＡ分子に対応するＨｎＲＮＡ分子、およびイントロンを含有しないｍＲＮＡ分子を含む。追加のコードまたは非コード配列は、本発明のポリヌクレオチド内に存在していてよいが、そうである必要はなく、ポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持体材料に連結されていてよいが、そうである必要はない。
【０２３０】
ポリヌクレオチドは、ネイティブ配列（すなわち、抗体またはその断片をコードしている内因性の配列）を含んでいてもよく、またはそのような配列の変異体を含んでいてもよい。ポリヌクレオチド変異体は、コードされているポリペプチドの免疫反応性がネイティブな免疫反応性分子と比べて減弱しないような、１つまたは複数の置換、付加、欠失および／または挿入を含有する。コードされているポリペプチドの免疫反応性に対する作用は一般に、本明細書に記載されている通りアセスメントされ得る。変異体は好ましくは、ネイティブな抗体またはその断片をコードしているポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは少なくとも約８０％の同一性、いっそうより好ましくは少なくとも約９０％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の同一性を示す。
【０２３１】
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、下記に記載する通り最大一致でアラインメントされたときに２つの配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が同じである場合、「同一」であると言われる。２つの配列間の比較は典型的には、配列を比較ウィンドウにわたって比較して、局所的な領域の配列類似性を同定および比較することによって実施する。本明細書において使用される「比較ウィンドウ」は、２つの配列が最適にアラインメントされた後に配列が同じ数の連続的な位置の参照配列と比較され得る少なくとも約２０、通常３０から約７５、または４０から約５０の連続的な位置のセグメントを指す。
【０２３２】
比較のための配列の最適なアラインメントは、バイオインフォマティクスソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ（登録商標）、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＬａｓｅｒｇｅｎｅ（登録商標）スイート中のＭｅｇＡｌｉｇｎ（登録商標）プログラムを使用して、デフォルトパラメータを使用して実施され得る。このプログラムは、以下の参考文献において記載されているいくつかのアラインメントスキームを包含する：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．、１９７８、Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ  Ｖｏｌ．５、Ｓｕｐｐｌ．３、３４５〜３５８ページ；Ｈｅｉｎ  Ｊ．、１９９０、Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ  ６２６〜６４５ページ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１８３、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．、１９８９、ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１〜１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ  Ｗ．、１９８８、ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１〜１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．、１９７１、Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ．  １１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．、Ｎｅｓ，Ｍ．、１９８７、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６〜４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．、１９７３、Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ、Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７２６〜７３０。
【０２３３】
好ましくは、「配列同一性パーセント」は、少なくとも２０の位置の比較ウィンドウにわたって２つの最適にアラインメントされた配列を比較することによって決定され、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントについて、参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して２０パーセント以下、通常５から１５パーセント、または１０から１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでいてもよい。パーセントは、両配列において同一な核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定して一致した位置の数を得、一致した位置の数を、参照配列中の位置の合計数（すなわちウィンドウサイズ）で割り、結果に１００を乗じて配列同一性パーセントを得ることによって計算する。
【０２３４】
変異体はさらに、または代替として、ネイティブな遺伝子、またはその部分もしくは相補鎖と実質的に相同であり得る。そのようなポリヌクレオチド変異体は、中程度にストリンジェントな条件下で、ネイティブな抗体（または相補的な配列）をコードしている天然に存在するＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができる。
【０２３５】
適した「中程度にストリンジェントな条件」は、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中で予洗すること；５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣで終夜ハイブリダイズすること；続いて０．１％ＳＤＳを含有する２×、０．５×および０．２×ＳＳＣのそれぞれで、６５℃で２０分間、２回洗浄することを含む。
【０２３６】
本明細書において使用される場合、「高度にストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」は、（１）洗浄に低イオン強度および高温を用いる、例えば０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを５０℃で用いる；（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミドなどの変性剤を用いる、例えば、０．１％ウシ血清アルブミンを含む５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含むｐＨ６．５の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を４２℃で用いる；または（３）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％デキストラン硫酸を４２℃で用いる、４２℃で０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５０％ホルムアミド中５５℃で洗浄する、続いてＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣからなる５５℃での高ストリンジェンシー洗浄を行う、条件である。当業者は、プローブ長などの因子を適応させるための必要に応じて、温度、イオン強度などを調整する方法を認識するはずである。
【０２３７】
遺伝子コードの縮重の結果として、本明細書に記載されているポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することが、当業者には理解されるであろう。これらのポリヌクレオチドの一部は、任意のネイティブな遺伝子のヌクレオチド配列に対する最小限の相同性を有する。それにもかかわらず、コドン使用頻度の差異のために様々であるポリヌクレオチドが、本発明によって明確に意図される。さらに、本発明において提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本発明の範囲内である。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加、および／または置換などの１つまたは複数の変異の結果として変更される内因性の遺伝子である。得られるｍＲＮＡおよびタンパク質は、変更された構造または機能を有してよいが、そうである必要はない。対立遺伝子は、標準的な技術（ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列比較など）を使用して同定され得る。
【０２３８】
本発明のポリヌクレオチドは、化学合成、組換え方法、またはＰＣＲを使用して得ることができる。化学的なポリヌクレオチド合成の方法は、当技術分野においてよく知られており、本明細書において詳細に記載される必要はない。当業者は、本明細書において示されている配列および所望のＤＮＡ配列を生成するための市販のＤＮＡ合成機を使用することができる。
【０２３９】
組換え方法を使用してポリヌクレオチドを調製するために、所望の配列を含むポリヌクレオチドを、適したベクター中に挿入することができ、次にベクターを、本明細書においてさらに論じられているように、複製および増幅のために適した宿主細胞中に導入することができる。ポリヌクレオチドは、当技術分野において知られている任意の手段によって、宿主細胞中に挿入され得る。細胞は、直接の取り込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、Ｆ−接合またはエレクトロポレーションによって、外因性ポリヌクレオチドを導入することによって形質転換される。導入されたら、外因性ポリヌクレオチドは、組み込まれていないベクター（プラスミドなど）として細胞内に維持することができ、または宿主細胞ゲノム中に組み込むことができる。そのように増幅されたポリヌクレオチドは、当技術分野内でよく知られている方法によって宿主細胞から単離することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照されたい。
【０２４０】
代替として、ＰＣＲによりＤＮＡ配列の複製が可能となる。ＰＣＲ技術は、当技術分野においてよく知られており、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号、同第４，７５４，０６５号および同第４，６８３，２０２号、ならびにＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ｍｕｌｌｉｓら編、Ｂｉｒｋａｕｓｗｅｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、１９９４において記載されている。
【０２４１】
ＲＮＡは、適切なベクターにおいて単離されたＤＮＡを使用し、それを適した宿主細胞中に挿入することによって得ることができる。細胞が複製し、ＤＮＡがＲＮＡに転写されると、その後、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、上記に記載されている、当業者によく知られている方法を使用してＲＮＡを単離することができる。
【０２４２】
適したクローニングベクターは、標準的な技術に従って構築することができ、または当技術分野において利用可能である多数のクローニングベクターから選択することができる。選択されるクローニングベクターは、使用されることが意図される宿主細胞によって様々であり得るが、有用なクローニングベクターは一般に、自己複製能を有し、特定の制限エンドヌクレアーゼの単一の標的を有してもよく、および／またはベクターを含有するクローンを選択するのに使用することができるマーカーの遺伝子を保有してもよい。適した例は、プラスミドおよび細菌ウイルス、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（例えば、ｐＢＳ  ＳＫ＋）およびその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ＰＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、ならびにｐＳＡ３およびｐＡＴ２８などのシャトルベクターを含む。これらのおよび多くの他のクローニングベクターは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎなどの商用ベンダーから入手可能である。
【０２４３】
発現ベクターがさらに提供される。発現ベクターは一般に、本発明によるポリヌクレオチドを含有する複製可能なポリヌクレオチド構築物である。発現ベクターは、エピソームとしてまたは染色体ＤＮＡの一体化した一部として、宿主細胞において複製可能でなければならないことが示される。適した発現ベクターは、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスを含むウイルスベクター、コスミド、およびＰＣＴ公開番号ＷＯ８７／０４４６２において開示されている発現ベクター（複数可）を含むがこれらに限定されない。ベクター構成成分は一般に、以下の１つまたは複数を含み得るがこれらに限定されない：シグナル配列；複製起点；１つまたは複数のマーカー遺伝子；適した転写調節エレメント（プロモーター、エンハンサーおよびターミネーターなど）。発現（すなわち、翻訳）のために、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、および終止コドンなどの１つまたは複数の翻訳調節エレメントもまた通常必要とされる。
【０２４４】
対象とするポリヌクレオチドを含有するベクターは、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、または他の物質を用いるトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および感染（例えば、ベクターがワクチニアウイルスなどの感染性病原体である場合）を含む多くの適切な手段のいずれかによって、宿主細胞中に導入することができる。導入するベクターまたはポリヌクレオチドの選択はしばしば、宿主細胞の特徴に依存する。
【０２４５】
本発明はまた、本明細書において記載されているポリヌクレオチドのいずれかを含む宿主細胞を提供する。対象とする抗体、ポリペプチドまたはタンパク質をコードしている遺伝子を単離する目的のために、異種ＤＮＡを過剰発現することができる任意の宿主細胞を使用することができる。哺乳動物宿主細胞の非限定的な例は、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、およびＣＨＯ細胞を含むがこれらに限定されない。ＰＣＴ公開番号ＷＯ８７／０４４６２もまた参照されたい。適した非哺乳動物宿主細胞は、原核生物（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）など）および酵母（Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅなど）、Ｓ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）；またはＫ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ））を含む。好ましくは、宿主細胞は、宿主細胞において存在する場合、対象とする対応する内因性の抗体またはタンパク質よりも、約５倍高い、より好ましくは１０倍高い、さらにより好ましくは２０倍高いレベルでｃＤＮＡを発現する。ＧＨＲまたはＧＨＲドメインへの特異的結合についての宿主細胞のスクリーニングは、イムノアッセイまたはＦＡＣＳによって実施される。対象とする抗体またはタンパク質を過剰発現する細胞は同定することができる。
【０２４６】
発現ベクターを使用して、ＧＨＲアンタゴニスト抗体の発現を導くことができる。当業者は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの外因性タンパク質の発現を得るための発現ベクターの投与について熟知している。例えば、米国特許第６，４３６，９０８号；同第６，４１３，９４２号；および同第６，３７６，４７１号を参照されたい。発現ベクターの投与は、注射、経口投与、粒子銃またはカテーテル挿入投与、および局部投与を含む、局所投与または全身投与を含む。別の実施形態において、発現ベクターは、交感神経幹または神経節に直接、または冠動脈、心房、心室、または心膜中に投与される。
【０２４７】
発現ベクターまたはサブゲノムポリヌクレオチドを含有する治療用組成物の標的化送達もまた使用することができる。受容体に媒介されるＤＮＡ送達技術は、例えば、Ｆｉｎｄｅｉｓら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９３、１１：２０２；Ｃｈｉｏｕら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｏｆ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ、Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ編、１９９４；Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８８、２６３：６２１；Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９４、２６９：５４２；Ｚｅｎｋｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９０、８７：３６５５；Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９１、２６６：３３８において記載されている。ポリヌクレオチドを含有する治療用組成物は、遺伝子療法プロトコールにおいて局所投与では約１００ｎｇから約２００ｍｇのＤＮＡの範囲で投与される。約５００ｎｇから約５０ｍｇ、約１μｇから約２ｍｇ、約５μｇから約５００μｇ、および約２０μｇから約１００μｇのＤＮＡの濃度範囲もまた、遺伝子療法プロトコール中で使用することができる。治療用ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、遺伝子送達ビヒクルを使用して送達することができる。遺伝子送達ビヒクルは、ウイルスまたは非ウイルス起源であり得る（概して、Ｊｏｌｌｙ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１９９４、１：５１；Ｋｉｍｕｒａ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１９９４、５：８４５；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１９９５、１：１８５；およびＫａｐｌｉｔｔ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９４、６：１４８を参照されたい）。そのようなコード配列の発現は、内因性の哺乳動物のまたは異種のプロモーターを使用して誘導することができる。コード配列の発現は、構成的であっても、または制御されていてもよい。
【０２４８】
所望のポリヌクレオチドの送達のためのウイルスベースのベクターおよび所望の細胞における発現は、当技術分野においてよく知られている。例示的なウイルスベースのビヒクルは、組換えレトロウイルス（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／０７９３６；ＷＯ９４／０３６２２；ＷＯ９３／２５６９８；ＷＯ９３／２５２３４；ＷＯ９３／１１２３０；ＷＯ９３／１０２１８；ＷＯ９１／０２８０５；米国特許第５、２１９，７４０号および同第４，７７７，１２７号；英国特許第２，２００，６５１号；および欧州特許第０３４５２４２号を参照されたい）、アルファウイルスベースのベクター（例えば、シンドビス（Ｓｉｎｄｂｉｓ）ウイルスベクター、セムリキ森林（Ｓｅｍｌｉｋｉ  ｆｏｒｅｓｔ）ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、ロスリバー（Ｒｏｓｓ  Ｒｉｖｅｒ）ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）およびベネズエラウマ脳炎（Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ  ＶＲ１２４９；ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２））、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９；ＷＯ９３／１９１９１；ＷＯ９４／２８９３８；ＷＯ９５／１１９８４およびＷＯ９５／００６５５を参照されたい）を含むがこれらに限定されない。Ｃｕｒｉｅｌ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１９９２、３：１４７において記載されている死菌アデノウイルスに連結されているＤＮＡの投与もまた用いることができる。
【０２４９】
死菌アデノウイルス単独に連結されているまたは連結されていないポリカチオン性の凝縮ＤＮＡ（例えば、Ｃｕｒｉｅｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１９９２、３：１４７を参照されたい）；リガンド連結ＤＮＡ（例えば、Ｗｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８９、２６４：１６９８５を参照されたい）；真核細胞送達ビヒクル細胞（例えば、米国特許第５，８１４，４８２号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／０７９９４；ＷＯ９６／１７０７２；ＷＯ９５／３０７６３；およびＷＯ９７／４２３３８を参照されたい）および核の電荷中和または細胞膜との融合を含むがこれらに限定されない、非ウイルス送達ビヒクルおよび方法もまた用いることができる。裸のＤＮＡもまた用いることができる。例示的な裸のＤＮＡ導入方法は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号において記載されている。遺伝子送達ビヒクルとして機能することができるリポソームは、米国特許第５，４２２，１２０号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／１３７９６；ＷＯ９４／２３６９７；ＷＯ９１／１４４４５；およびＥＰ０５２４９６８において記載されている。追加の手法は、Ｐｈｉｌｉｐ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１９９４、１４：２４１１、およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９４、９１：１５８１において記載されている。
【０２５０】
組成物
本発明はまた、有効量の、本明細書において記載されているＧＨＲ抗体を含む医薬組成物を提供する。そのような組成物、ならびに製剤化する方法の例もまた、本明細書において記載されている。いくつかの実施形態において、組成物は、１種または複数のＧＨＲ抗体を含む。別の実施形態において、ＧＨＲ抗体は、ＧＨＲを認識する。別の実施形態において、ＧＨＲ抗体はヒト抗体である。別の実施形態において、ＧＨＲ抗体はヒト化抗体である。いくつかの実施形態において、ＧＨＲ抗体は、抗体媒介性溶解またはＡＤＣＣなどの所望の免疫反応を誘発することができる定常領域を含む。別の実施形態において、ＧＨＲ抗体は、抗体媒介性溶解またはＡＤＣＣなどの好ましくないまたは望ましくない免疫反応を誘発しない定常領域を含む。別の実施形態において、ＧＨＲ抗体は、抗体の１つまたは複数のＣＤＲ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または、いくつかの実施形態において、すべての６つのＣＤＲなど）を含む。
【０２５１】
組成物は、複数のＧＨＲアンタゴニスト抗体（例えば、ＧＨＲの異なるエピトープを認識するＧＨＲアンタゴニスト抗体の混合物）を含むことができることが理解される。他の例示的な組成物は、同じエピトープ（複数可）を認識する複数のＧＨＲアンタゴニスト抗体、またはＧＨＲの異なるエピトープに結合する異なる種のＧＨＲアンタゴニスト抗体を含む。
【０２５２】
本発明において使用される組成物は、凍結乾燥製剤または水性液剤の形態で、薬学的に許容できる担体、添加剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ第２０版（２０００）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ編Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒ）をさらに含むことができる。許容できる担体、添加剤、または安定剤は、投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、ホスフェート、シトレート、および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベンなど；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストランを含む単糖、二糖、および他の糖質；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩を形成する対イオン；金属複合体（例えばＺｎ−タンパク質複合体）；ならびに／またはＴｗｅｅｎ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含んでいてもよい。薬学的に許容できる添加剤は、本明細書においてさらに記載されている。
【０２５３】
ＧＨＲアンタゴニスト抗体およびその組成物はまた、作用剤の有効性を増強および／または補完する役割を果たす他の作用剤と併用して使用することができる。
【０２５４】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドのいずれかを含む医薬組成物を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、組成物は、本明細書に記載されている抗体をコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。別の実施形態において、組成物は、本明細書において記載されている抗体のいずれかをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。なお別の実施形態において、組成物は、下記の配列番号１４２および配列番号１４３に示されているポリヌクレオチドのいずれかまたは両方を含む。ＳＳ１ｈＩｇＧ２Δａ  ＧＨＲアンタゴニスト抗体の重鎖および軽鎖をコードしている核酸配列を下記に示す。
ＳＳ１ｈＩｇＧ２Δａ重鎖：
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＣＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＣＴＧＡＧＣＴＧＣＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＧＡＣＧＣＣＴＧＧＡＴＧＧＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＧＧＣＣＧＡＧＡＴＣＡＧＡＡＧＣＡＡＧＧＣＣＡＡＣＴＡＴＣＡＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＧＣＣＧＡＧＡＧＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＣＧＧＧＡＣＧＡＣＡＧＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＡＡＡＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＡＣＣＣＴＧＡＴＴＡＧＡＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＴＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＡＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＡＣＴＴＣＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＣＡＧＴＴＧＡＧＣＧＣＡＡＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＧＡＧＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＧＧＣＡＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＡＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＴＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＧＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＡＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＡＣＣＴＣＣＣＡＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡ（配列番号１４２）
ＳＳ１ｈＩｇＧ２Δａ軽鎖：
ＧＡＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＧＧＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＡＧＣＣＣＴＧＧＣＧＡＧＡＧＡＧＣＣＡＣＣＣＴＧＡＧＣＴＧＴＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＣＴＧＡＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＣＡＧＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＡＴＣＣＣＣＧＡＣＡＧＡＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＣＧＧＣＴＧＧＡＡＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＣＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＧＡＡＧＣＡＣＣＣＣＣＡＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＴ（配列番号１４３）
【０２５５】
キット
本発明はまた、本明細書において記載されている抗体のいずれかまたはすべてを含むキットを提供する。本発明のキットは、本明細書において記載されているＧＨＲアンタゴニスト抗体および本明細書において記載されている本発明の方法のいずれかに従って使用するための指示を含む１つまたは複数の容器を含む。一般に、これらの指示は、上記の治療的処置のためのＧＨＲアンタゴニストの投与の説明を含む。いくつかの実施形態において、単一用量投与単位を生成するためにキットが提供される。ある特定の実施形態において、キットは、乾燥されたタンパク質が入った第１の容器および水性製剤が入った第２の容器の両方を含むことができる。ある特定の実施形態において、単一チャンバーおよびマルチチャンバーの充填済みシリンジ（例えば、液体シリンジおよびリオシリンジ）を含むキットが含まれる。
【０２５６】
いくつかの実施形態において、抗体はヒト抗体である。いくつかの実施形態において、抗体はヒト化抗体である。いくつかの実施形態において、抗体はモノクローナル抗体である。ＧＨＲ抗体の使用に関する指示は一般に、投与量、投与スケジュール、および意図される処置のための投与経路に関する情報を含む。容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば、マルチドーズパッケージ）または単位用量以下であり得る。本発明のキットにおいて提供される指示は、典型的には、ラベルまたは添付文書（例えば、キットに含まれる紙のシート）上の書面による指示であるが、装置読み取り可能な指示（例えば、磁気または光学記憶ディスクに記憶されている指示）もまた許容できる。
【０２５７】
本発明のキットは、適した包装中にある。適した包装は、バイアル、瓶、広口瓶、柔軟性の包装（例えば、密封したＭｙｌａｒまたはプラスチックバッグ）などを含むがこれらに限定されない。吸入器、鼻投与デバイス（例えば、アトマイザー）またはミニポンプなどの注入デバイスなどの特定のデバイスと組み合わせて使用するためのパッケージもまた意図される。キットは、無菌のアクセスポートを有してもよい（例えば、容器は静脈注射用溶液バッグ、または皮下注射針によって貫通可能な栓を有するバイアルであってよい）。容器もまた、無菌のアクセスポートを有してもよい（例えば、容器は静脈注射用溶液バッグまたは皮下注射針によって貫通可能な栓を有するバイアルを有してもよい）。組成物中の少なくとも１種の活性作用剤は、ＧＨＲ抗体である。容器は、第２の薬学的に活性な作用剤をさらに含んでもよい。
【０２５８】
キットは、緩衝剤などの追加の構成成分および解釈的情報を提供してもよい。通常、キットは、容器および容器表面のまたは容器に関連したラベルまたは添付文書（複数可）を含む。
【０２５９】
生物学的寄託
本発明の代表的な材料は、２０１１年１２月２２日に米国微生物系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（１０８０１Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０〜２２０９、米国）に寄託された。ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２３５２を有するベクターＳＳ１−ＨＣは、ＳＳ１重鎖可変領域をコードしているポリヌクレオチドであり、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２３５３を有するベクターＳＳ１−ＬＣは、ＳＳ１軽鎖可変領域をコードしているポリヌクレオチドである。寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約およびそれに従う規定（ブダペスト条約）の条項に従って行った。これにより、寄託日から３０年間、寄託物の生存可能な培養物の維持が保証される。寄託物は、ブダペスト条約の条項に基づいて、また、関連する米国特許の発行の後、または米国もしくは外国特許出願の公共への公開の後のいずれか早い方に、公共への寄託物の培養物の後代の永続的および制限のない利用可能性を保証し、米国特許法第１２２条およびこれに準じた特許庁長官規則（８８６ＯＧ６３８を特に参照して連邦規則法典第３７編規則１．１４を含む）によって、米国特許商標庁長官が権利を有すると決定したものへの後代の利用可能性を保証する、Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．とＡＴＣＣとの契約の対象の下でＡＴＣＣによって利用可能にされることになる。
【０２６０】
本願の代理人は、寄託した材料の培養物が、適した条件下で培養されたときに、死滅し、または失われ、または破壊された場合、通知により材料を別の同じものに速やかに置き換えることに同意している。寄託した材料の利用可能性は、任意の政府の権限下でその特許法に従って付与された権利に違反して本発明を実施することの承諾と解釈されるべきでない。
【０２６１】
以下の実施例は、例示的な目的のためだけに提供され、いかなる形であれ本発明の範囲を制限することは意図されていない。実際に、本明細書において示され記載されているものに加えて本発明の様々な修飾形態が、前述の記載から当業者に明らかとなり、添付の特許請求の範囲内に入る。
【実施例】
【０２６２】
（実施例１）
ＧＨＲアンタゴニスト抗体の作製およびスクリーニング
モノクローナル抗体を作製するために動物を免疫化するための一般手順：
Ｂａｌｂ／ｃマウスに、２５μｇの抗原ｈＧＨＲ／Ｆｃ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（商標）カタログ番号１２１０−ＧＲ−０５０を、４回、０、３、６、および９日目に注射した。最初の４回の注射用には、プロトコールに従って組換えタンパク質をＧｅｒｂｕアジュバントと混合し、ボルテックスすることによって、抗原を調製した。免疫原は、えり首、足蹠、および腹腔内への注射で与えた。１１日目に、アジュバント無しで、最終ブーストをｉ．ｖ．投与した。１５日目に、マウスを安楽死させ、その脾臓を摘出した。リンパ球を樹立細胞株と融合させることによって不死化して、標準的なハイブリドーマ技術を用いてハイブリドーマクローンを作製し、９６ウェルプレートに分注した。クローンを成長させ、次いで下記の免疫化抗原を用いたＥＬＩＳＡスクリーニングによって選択した。
【０２６３】
抗体のＥＬＩＳＡスクリーニング：
成長中のハイブリドーマクローンから得た上清培地を、別々に、組換えヒトＧＨＲ／ｈＦｃと結合するその能力についてスクリーニングした。アッセイは、抗原の１μｇ／ｍｌ溶液５０μｌで終夜コーティングされた９６ウェルプレートで行った。各ステップの間に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（商標）−２０を含有するＰＢＳで、過剰な試薬をウェルから洗浄した。上清をプレートに添加し、室温で２時間インキュベートした。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗マウスＦｃを添加して、抗原に結合したマウス抗体に結合させた。次いで、上清中に存在するマウス抗体の量を検出するために、ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）二アンモニウム塩）を、ＨＲＰの基質として添加した。抗体の相対的な量を、４０５ｎｍの吸光度をリーディングすることによって定量化した。ヒトＧＨＲ／ｈＦｃに結合することができる抗体を分泌したハイブリドーマクローンを選択した。ｈＦｃに対する抗体を検出する次のアッセイを行って、それらを避けることができるようにした。選択されたクローンを特徴付けるために、さらなる分析を行った。
【０２６４】
（実施例２）
抗体動態および結合親和性の決定
この実施例は、ヒトおよびｃｙｎｏ  ＧＨＲに対するＧＨＲ抗体の抗体動態および結合親和性の決定を例示する。
【０２６５】
２５℃におけるＧＨＲ／Ａｂ１３  ＩｇＧ相互作用の動態および親和性の決定
ヒトおよびｃｙｎｏ  ＧＨＲに対するマウス抗ＧＨＲ抗体、Ａｂ１３の親和性をＢｉａｃｏｒｅ（商標）２０００バイオセンサー（ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪ）で測定した。抗マウスＩｇセンサー表面は、製造業者が提供する取扱説明書を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）マウス抗体捕捉キット（ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）、カタログ番号ＢＲ−１００８−３８）のＢｉａｃｏｒｅ（商標）ＣＭ５チップおよび試薬を用いて調製した。
【０２６６】
動態アッセイは、Ｋａｒｌｓｓｏｎら、２００６、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３４９、１３６〜１４７に記載の動態タイトレーションの方法を用いて行った。マウス抗体Ａｂ１３を０．５μｇ／ｍＬで下流フローセルに、すなわち、フローセル２、３および４に、それぞれ、５μＬ／分の流速で１分間、２分間、および４分間捕捉した。フローセル１は参照表面として用いた。抗体を捕捉した後、ヒトＧＨＲまたはｃｙｎｏ  ＧＨＲ（ヒトまたはｃｙｎｏ  ＧＨＲの細胞外ドメインのアミノ酸３１〜２３５のｈｉｓタグ付き単量体）のいずれかを、低濃度から高濃度までの一連の注入において、３０μＬ／分ですべてのフローセルに注入した。最高濃度は、ヒトＧＨＲについては４００ｎＭ、ｃｙｎｏ  ＧＨＲについては２０００ｎＭであった。ここで、希釈係数は５倍であった。各ＧＨＲ注入は２分間であった。４００ｎＭのＰＣＳＫ９を注入した後の解離時間は１０分間であった。二重参照を目的として（Ｍｙｓｚｋａ、１９９９、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ  １２、２７９〜２８４に記載の二重参照）、同様のセットの注入を、ＧＨＲの代わりにランニングバッファーを用いて行った。各ＧＨＲ希釈系列を２連で行った。各分析サイクルの後、１０ｍＭグリシンｐＨ１．７の３分間の注入１回で、すべてのフローセルを再生させた。二重参照付きのセンサーグラムを、マストランスポート結合モデル（各フローセルの局所Ｒｍａｘパラメータを用いる）を用いた単純１：１  Ｌａｎｇｍｕｉｒにグローバルフィッティングさせた。
【０２６７】
実験は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）、Ｔｗｅｅｎ−２０（商標）、ｐＨ７．４のランニングバッファーを用いて２５℃で行った。研究の結果は下記表４ａにまとめられている。
【０２６８】
２５℃におけるＳＳ１およびＡｂ１３−ｈＦｃキメラのＧＨＲ／ＩｇＧ相互作用の動態および親和性の決定
ヒト化ＧＨＲ抗体ＳＳ１およびヒトＦｃドメインに融合したＡｂ１３のＦａｂを含むキメラ分子（「Ａｂ１３−ｈＦｃ」）の、ヒトおよびｃｙｎｏ  ＧＨＲに対する親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）２０００バイオセンサー（ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪ）で測定した。
【０２６９】
抗ヒトＦｃセンサーチップは、１０μＬ／分の流速で７分間、４００ｍＭエチル−Ｎ−（３−ジエチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標））および１００ｍＭ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標））の１：１（ｖ／ｖ）混合物でＢｉａｃｏｒｅ（商標）ＣＭ４センサーチップのすべてのフローセルを活性化することによって調製した。抗ヒトＦｃ試薬（ヤギＦ（ａｂ’）２断片抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ、Ｃａｐｐｅｌカタログ番号５５０５３）を、１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．０中に６０μｇ／ｍＬに希釈し、すべてのフローセルに、２０μＬ／分で７分間注入した。すべてのフローセルを、１０μＬ／分で７分間、１００ｍＭエチレンジアミンの１５０ｍＭホウ酸塩バッファーｐＨ８．５で遮断した。
【０２７０】
動態アッセイは、Ｋａｔｓａｍｂａら、２００６、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３５２、２０８〜２２１に記載されている様々な解離時間を用いた方法を用いて行った。抗体を４μｇ／ｍＬで、１０μＬ／分の流速で１分間、下流フローセル（フローセル２、３、および４）に捕捉した。各フローセルに異なった抗体を捕捉させた。フローセル１は参照表面として用いた。抗体を捕捉した後、分析物（バッファー、ヒトＧＨＲまたはｃｙｎｏ  ＧＨＲ）を３０μＬ／分で２分間すべてのフローセルに注入した。ＧＨＲ分析物には、ヒトまたはｃｙｎｏ  ＧＨＲの細胞外ドメインのアミノ酸３１〜２３５のｈｉｓタグ付き単量体を用いた。分析物注入後、解離を３０分間（４００ｎＭ  ＧＨＲサイクル用）または３０秒間（他のすべてのサイクル）モニターし、その後、７５ｍＭリン酸の３０秒間の注入２回ですべてのフローセルを再生させた。この方法を用いて、ＧＨＲの５員希釈系列を分析した。その際、最高濃度は４００ｎＭであり、希釈係数は３倍であった。二重参照を目的として、バッファーサイクルを３０分間および３０秒間の解離時間の両方で収集した。二重参照付きのセンサーグラムを、マストランスポート結合モデルを用いた単純１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒにグローバルフィッティングさせた。
【０２７１】
実験は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０（商標）、ｐＨ７．４のランニングバッファーを用いて２５℃で行った。研究の結果は、下記表４ａにまとめられている。
【０２７２】
【表４】
2015502975.tif 000048
【０２７３】
３７℃におけるＧＨＲ／Ｆａｂ相互作用の動態および親和性の決定（固定化Ｆａｂを用いる）
ヒトおよびｃｙｎｏ  ＧＨＲに対するＧＨＲ抗体ＳＳ１Ｆａｂの親和性をＢｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００バイオセンサー（ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪ）で測定した。
【０２７４】
抗ヒトカッパセンサーチップは、１０μＬ／分の流速で７分間、４００ｍＭ  ＥＤＣおよび１００ｍＭ  ＮＨＳの１：１（ｖ／ｖ）混合物で、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）ＣＭ４センサーチップのすべてのフローセルを活性化することによって調製した。抗ヒトカッパ試薬（ヤギＦ（ａｂ’）２断片抗ヒトカッパ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈカタログ番号２０６３−０１）を１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．５中に５０μｇ／ｍＬに希釈し、すべてのフローセルに、２０μＬ／分で７分間注入した。すべてのフローセルを、１０μＬ／分で７分間、１００ｍＭエチレンジアミンの１５０ｍＭホウ酸塩バッファーｐＨ８．５で遮断した。
【０２７５】
動態アッセイは、Ｋａｔｓａｍｂａら、同上に記載されている様々な解離時間を用いた方法を用いて行った。Ｆａｂを２μｇ／ｍＬで、１０μＬ／分の流速で２分間、下流フローセル（フローセル２、３および４）に捕捉した。各フローセルに異なったＦａｂを捕捉させた。フローセル１は参照表面として用いた。Ｆａｂを捕捉した後、分析物（バッファー、ヒトＧＨＲまたはｃｙｎｏ  ＧＨＲ）を３０μＬ／分で２分間すべてのフローセルに注入した。ＧＨＲ分析物には、ヒトまたはｃｙｎｏ  ＧＨＲの細胞外ドメインのアミノ酸３１〜２３５のｈｉｓタグ付き単量体を用いた。分析物注入後、解離を３０分間（１３３ｎＭおよび４００ｎＭ  ＧＨＲサイクル用）または６０秒間（他のすべてのサイクル）モニターし、その後、１０ｍＭグリシンｐＨ１．７の３０秒間の注入３回で再生させた。この方法を用いて、ＧＨＲの６員希釈系列を分析した。その際、最高濃度は４００ｎＭであり、希釈係数は３倍であった。二重参照を目的として、バッファーサイクルを３０分間および６０秒間の解離時間の両方で収集した。二重参照付きのセンサーグラムを、マストランスポート結合モデルを用いた単純１：１  Ｌａｎｇｍｕｉｒにグローバルフィッティングさせた。
【０２７６】
実験は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０（商標）、ｐＨ７．４のランニングバッファーを用いて３７℃で行った。研究の結果は、下記表４ｂにまとめられている。
【０２７７】
３７℃におけるＧＨＲ／Ｆａｂ相互作用の動態および親和性の決定（ｈＧＨＲ−ｈＦｃが固定されている場合）
ヒトおよびｃｙｎｏ  ＧＨＲに対するＧＨＲ抗体ＳＳ１Ｆａｂの親和性をＢｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００バイオセンサー（ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪ）で測定した。
【０２７８】
抗ヒトＦｃセンサーチップは、１０μＬ／分の流速で７分間、４００ｍＭ  ＥＤＣおよび１００ｍＭ  ＮＨＳの１：１（ｖ／ｖ）混合物で、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）ＣＭ４センサーチップのすべてのフローセルを活性化することによって調製した。抗ヒトＦｃ試薬（ヒトＩｇＧ  Ｆｃに対するヤギＦ（ａｂ’）２断片、Ｃａｐｐｅｌカタログ番号５５０５３）を１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．０中に６０μｇ／ｍＬに希釈し、すべてのフローセルに、２０μＬ／分で７分間注入した。すべてのフローセルを、１０μＬ／分で７分間、１００ｍＭエチレンジアミンの１５０ｍＭホウ酸塩バッファーｐＨ８．５で遮断した。
【０２７９】
動態アッセイは、Ｋａｔｓａｍｂａら、同上に記載されている様々な解離時間を用いた方法を用いて行った。ｈＧＨＲ−ｈＦｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（商標）、カタログ番号１２１０−ＧＲ）を２μｇ／ｍＬで下流フローセルに、すなわちフローセル２、３および４にそれぞれ１０μＬ／分の流速で３０秒間、１分間および２分間捕捉した。フローセル１は参照表面として用いた。ｈＧＨＲ−ｈＦｃを捕捉した後、分析物（バッファー、ＳＳ１ＦａｂまたはＡｂ１３Ｆａｂ）を３０μＬ／分で２分間すべてのフローセルに注入した。分析物注入後、解離を３０分間（４００ｎＭ  Ｆａｂサイクル）または６０秒間（他のすべてのサイクル）モニターし、その後、７５ｍＭリン酸の３０秒間の注入２回で再生させた。この方法を用いて、Ｆａｂの５員希釈系列を分析した。その際、最高濃度は４００ｎＭであり、希釈係数は３倍であった。二重参照を目的として、バッファーサイクルを３０分間および６０秒間の解離時間の両方で収集した。二重参照付きのセンサーグラムを、マストランスポート結合モデル（各フローセルの局所Ｒｍａｘパラメータを用いる）を用いた単純１：１  Ｌａｎｇｍｕｉｒにグローバルフィッティングさせた。
【０２８０】
実験は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０（商標）、ｐＨ７．４のランニングバッファーを用いて３７℃で行った。研究の結果は、下記表４ｂにまとめられている。
【０２８１】
【表５】
2015502975.tif 000049
【０２８２】
（実施例３）
ＳＴＡＴ５リン酸化のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
この実施例は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＳＴＡＴ５リン酸化アッセイにおける、ＧＨＲ抗体の影響を例示する。この実施例では、ＧＨＲ下流シグナルリングを遮断するＧＨＲ抗体の能力を、ヒトＧＨＲ過剰発現細胞およびｃｙｎｏ  ＧＨＲ過剰発現細胞を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。
【０２８３】
ＧＨは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を介してシグナリングする。ＧＨＲへのＧＨの結合は、二量体化した受容体の構造変化を引き起こす。この変化がＪＡＫ２（Ｊａｎｕｓ関連キナーゼ２）の細胞内リン酸化をもたらす。ＪＡＫ２のリン酸化は、次いでＳＴＡＴ５（シグナル伝達性転写因子５）のリン酸化を誘導する。リン酸化されたＳＴＡＴ５は核に移行し、核において、ＧＨ依存性遺伝子のプロモーター配列に結合する。
【０２８４】
ＧＨＲアンタゴニスト抗体Ａｂ１３を、それがＳＴＡＴ５を遮断する能力について、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで試験した。完全長ヒトＧＨＲ（配列番号１４０）をコードするＤＮＡまたは完全長ｃｙｎｏ  ＧＨＲ（配列番号１４１）をコードするＤＮＡでＨＥＫ２９３細胞を一時的にトランスフェクトした。試験する前に、細胞をｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地中で約６０時間培養した。細胞をＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝溶液）で洗浄し、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地中に再懸濁し、次いで血球計を用いて計数した。６ウェルプレートにおけるウェル当たり１×１０６個の細胞を、２ｍｌのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ培地中に播種した。細胞を３７℃で２時間インキュベートし、次いで５、５０または５００ｎＭのＡｂ１３抗体を含む培地で処置した。細胞を抗体と穏やかに混ぜながら、３７℃で５分間インキュベートした。次いで対照ウェル以外のすべてに４．５ｎＭのＧＨ（Ｇｅｎｏｔｒｏｐｉｎ）を添加した。細胞をＧＨと穏やかに混ぜながら３７℃で１０分間インキュベートした。
【０２８５】
ＧＨと共にインキュベートした後、１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）および１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム（ＢｉｏＬａｂｓ）を含む２ｍｌの氷冷ＤＰＢＳを各ウェルに添加し、プレートを氷上に置いた。細胞を５ｍｌチューブに移し、スピンダウンして細胞ペレットを生成させ、洗浄バッファーを吸引して、細胞ペレットを残した。
【０２８６】
細胞ペレットの溶解および処置には、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（登録商標）ＭＡＰ細胞シグナリングバッファーおよび検出キット（カタログ番号４８−６０２）の試薬を用いた。１×プロテアーゼ阻害剤カクテルおよび１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウムを含むＭｉｌｌｉｐｏｒｅ溶解バッファーを各ペレットに２００μｌ／ペレットの容積で添加した。細胞をボルテックスし、時々ボルテックスしながら室温で１５分間インキュベートした。次いで、１×プロテアーゼ阻害剤カクテルおよび１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウムを含むＭｉｌｌｉｐｏｒｅアッセイバッファー２を３００μｌ／ウェルで溶解物に添加した。
【０２８７】
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（登録商標）ＭＡＰ  Ｐｈｏｓｐｈｏ  ＳＴＡＴ５Ａ／Ｂ（Ｔｙｒ６９４／６９９）ＭＡＰｍａｔｅ（商標）ビーズ（カタログ番号４６−６４１）をアッセイバッファー２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）キットカタログ番号４８−６０２より）に再懸濁し、９６ウェルフィルタープレート（キット中に提供）上に２５μｌ／ウェルで添加した。２５μｌ／ウェルの試料溶解物をウェルにローディングし、ビーズと試料を暗中で振盪しながら４℃で終夜インキュベートした。
【０２８８】
次いで、真空マニホールドを用いて液体を吸引し、残っているビーズをＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）キット洗浄バッファーを用いて洗浄した。２５μｌのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）キット検出抗体を添加し、暗中で振盪しながら室温で１時間インキュベートした。検出抗体を真空処理し、キットのストレプトアビジン−フィコエリトリン２５μｌを添加し、振盪しながら暗中で１５分間インキュベートした。次いで、キットの増幅バッファー２５μｌを添加し、暗中で振盪しながら１５分間インキュベートした。真空マニホールドを用いて液体を吸引し、キットのアッセイバッファー２  １５０μｌ中にビーズを再懸濁し、５分間シェーカー上で混合した後プレートをリーディングした。
【０２８９】
Ｌｕｍｉｎｅｘ（商標）２００装置を用いてプレートをリーディングし、試料が発した蛍光シグナルを測定した。ＳＴＡＴ５アッセイの結果を表５および表６に示す。「Ａｖｅ」は、平均蛍光シグナルを示し、「ＳＥＭ」は標準誤差を示す。
【０２９０】
【表６】
2015502975.tif 000050
【０２９１】
【表７】
2015502975.tif 000051
【０２９２】
ヒトＧＨＲ（表５、第２行）またはｃｙｎｏ  ＧＨＲ（表６、第２行）のいずれかを発現する細胞において、ＧＨＲトランスフェクト細胞を４．５ｎＭのＧＨで処置したところ、ＳＴＡＴ５シグナリングが刺激された。Ａｂ１３はＳＴＡＴ５シグナリングを用量依存的に遮断した（表５、第３〜５行；表６、第３および４行）。
【０２９３】
Ａｂ１３に親和性成熟およびヒト化を行い、抗体ＳＳ３およびＳＳ１が選択された。ヒト化ＧＨＲアンタゴニスト抗体ＳＳ１およびＳＳ３の重鎖および軽鎖アミノ酸配列を以下に示す。
【０２９４】
ＳＳ１  ｈＩｇＧ２Δ重鎖アミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＡＷＭＤＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＥＩＲＳＫＡＮＹＨＡＴＹＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＴＬＩＲＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１３４）
Ｃ末端リシンが無いＳＳ１  ｈＩｇＧ２Δ重鎖アミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＡＷＭＤＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＥＩＲＳＫＡＮＹＨＡＴＹＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＴＬＩＲＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１３３）
ＳＳ１  ｈＩｇＧ２Δ軽鎖アミノ酸配列
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＴＡＴＳＳＶＳＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＨＱＹＨＲＳＴＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ  （配列番号１３５）
ＳＳ３  ｈＩｇＧ２Δ重鎖アミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＡＷＭＤＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＥＩＲＳＫＡＮＮＨＡＴＹＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＴＬＦＲＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ  （配列番号１３６）
ＳＳ３  ｈＩｇＧ２Δ軽鎖アミノ酸配列
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＴＡＴＳＳＶＳＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＨＱＹＨＲＦＴＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ  （配列番号１３７）
ＳＳ１  ＦｃＭ重鎖アミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＡＷＭＤＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＥＩＲＳＫＡＮＹＨＡＴＹＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＴＬＩＲＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＬＨＥＡＬＨＳＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ  （配列番号１３８）
ＳＳ１  ＦｃＭ軽鎖アミノ酸配列
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＴＡＴＳＳＶＳＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＨＱＹＨＲＳＴＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ  （配列番号１３９）
【０２９５】
抗体ＳＳ３およびＳＳ１（ｈＩｇＧ２Δａ）を、ＳＴＡＴ５リン酸化アッセイを用いて試験した。ＳＴＡＴ５アッセイには、完全長ヒトＧＨＲ過剰発現ＨＥＫ２９３細胞または完全長ｃｙｎｏ  ＧＨＲ過剰発現ＨＥＫ２９３細胞を培養し、自動セルカウンターで計数し、１２ウェルプレート中の暖かいｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地中に播種した（１ｍｌ培地中、５×１０５細胞／ウェル）。細胞を３７℃で３時間置いて、定着させ、次いで２．５、５、５０または５００ｎＭのＳＳ１またはＳＳ３を含む培地で処置した。細胞を抗体と穏やかに混ぜながら、３７℃で５分間インキュベートした。次いで対照ウェル以外のすべてに４．５ｎＭのヒト成長ホルモン（Ｐｆｉｚｅｒ）を添加した。細胞をＧＨと共に穏やかに混ぜながら３７℃で１０分間インキュベートした。
【０２９６】
ＧＨと共にインキュベートした後、１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）および１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム（ＢｉｏＬａｂｓ）を含む２ｍｌの氷冷ＤＰＢＳを各ウェルに添加し、プレートを氷上に置いた。細胞を５ｍｌチューブに移し、スピンダウンして細胞ペレットを生成させ、洗浄バッファーを吸引して、細胞ペレットを残した。
【０２９７】
細胞ペレットの溶解および処置には、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（登録商標）ＭＡＰ細胞シグナリングバッファーおよび検出キット（カタログ番号４８−６０２）の試薬を用いた。１×プロテアーゼ阻害剤カクテルおよびオルトバナジン酸ナトリウムを含むＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）溶解バッファーを各ペレットに１００μｌ／ペレットの容積で添加した。細胞をボルテックスし、時々ボルテックスしながら室温で１５分間インキュベートした。次いで、１×プロテアーゼ阻害剤カクテルおよび１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウムを含むＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）アッセイバッファー２を２００μｌ／ウェルで溶解物に添加した。
【０２９８】
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（登録商標）ＭＡＰ  Ｐｈｏｓｐｈｏ  ＳＴＡＴ５Ａ／Ｂ（Ｔｙｒ６９４／６９９）ＭＡＰｍａｔｅ（商標）ビーズ（カタログ番号４６−６４１）をアッセイバッファー２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅキットカタログ番号４８−６０２より）に再懸濁し、９６ウェルフィルタープレート（キット中に提供）上に２５μｌ／ウェルでローディングした。２５μｌ／ウェルの試料溶解物をウェルに添加し、ビーズと試料を暗中で振盪しながら４℃で終夜インキュベートした。
【０２９９】
次いで、真空マニホールドを用いて液体を吸引し、残っているビーズをＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）キット洗浄バッファーを用いて洗浄した。２５μｌのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）キット検出抗体を添加し、暗中で振盪しながら室温で１時間インキュベートした。検出抗体を真空処理し、キットのストレプトアビジン−フィコエリトリン２５μｌを添加し、振盪しながら暗中で１５分間インキュベートした。次いで、キットの増幅バッファー２５μｌを添加し、暗中で振盪しながら１５分間インキュベートした。真空マニホールドを用いて液体を吸引し、キットのアッセイバッファー２  １５０μｌ中にビーズを再懸濁し、５分間シェーカー上で混合した後プレートをリーディングした。
【０３００】
Ｌｕｍｉｎｅｘ２００装置を用いてプレートをリーディングし、試料が発した蛍光シグナルを測定した。ＳＴＡＴ５アッセイの結果を表７および表８に示す。
【０３０１】
【表８】
2015502975.tif 000052
【０３０２】
【表９】
2015502975.tif 000053
【０３０３】
ヒトＧＨＲ（表７、第２行）またはｃｙｎｏ  ＧＨＲ（表８、第２行）のいずれかを発現する細胞において、ＧＨＲトランスフェクト細胞を４．５ｎＭのＧＨで処置したところ、ＳＴＡＴ５シグナリングが刺激された。ヒト化ＧＨＲアンタゴニスト抗体ＳＳ１およびＳＳ３は共にＳＴＡＴ５シグナリングを用量依存的に遮断した（表７、第３〜１０行；表８、第３〜１０行）。
【０３０４】
（実施例４）
ＧＨＲアンタゴニスト抗体はカニクイザルの血中ＩＧＦ−１レベルを下げるのに有効である
この実施例は、カニクイザルの血中ＩＧＦ−１レベルに対するＧＨＲアンタゴニスト抗体の影響を例示する。
【０３０５】
ＧＨＲアンタゴニストモノクローナル抗体が、ＧＨＲの機能を阻害することによって、ｉｎ  ｖｉｖｏでＩＧＦ−１レベルに影響を与えることができるかどうか決定するために、カニクイザルで、マウス抗ヒトＧＨＲ抗体Ａｂ１３の影響を試験した。ＩＧＦ−１レベルは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける成長ホルモン活性のバイオマーカーである。ＧＨＲの遮断は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ベースラインレベルに比べてＩＧＦ−１レベルの低下をもたらすことが示されている。
【０３０６】
ＩＧＦ−１レベルの変化について試験するために、単回用量のＡｂ１３または陰性対照マウスＩｇＧ１を含む１×ＰＢＳを、５頭のナイーブの雌性カニクイザルにＩＶ注射した。１日目に、２頭のサルに３０ｍｇ／ｋｇのＡｂ１３を投与し、１頭に１０ｍｇ／ｋｇのＡｂ１３を投与し、２頭に３０ｍｇ／ｋｇの陰性対照マウスＩｇＧ１を投与した。すべての動物から、以下の時点で血清試料を採取した：投与前、投与後１ｈ、４ｈ、８ｈ、１２ｈ、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ、９６ｈ、１２０ｈ、１４４ｈ、１６８ｈ、２１６ｈ、２６４ｈおよび３１２ｈ。
【０３０７】
Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（商標）Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（商標）ヒトＩＧＦ−１免疫アッセイキット（カタログ番号ＤＧ１００）を用いて、ベースラインと比べたＩＧＦ−１レベルの変化について、血清試料を分析した。２４ｈから３１２ｈまでの範囲の時点についての研究の結果を表９に示す。
【０３０８】
【表１０】
2015502975.tif 000054
【０３０９】
表９のデータは、ＧＨＲアンタゴニスト抗体Ａｂ１３がカニクイザルの血清ＩＧＦ−１レベルを用量依存的に低減させることを示している。３０ｍｇ／ｋｇ  Ａｂ１３の単回用量を静脈内投与した９６時間後までに、血清ＩＧＦ−１レベルはベースラインの約６３％下にまで減少し、抗体投与の約１４４時間後まで、血清ＩＧＦ−１レベルはベースラインの約６３％下に維持された。１０ｍｇ／ｋｇのＡｂ１３の単回用量を静脈内投与した９６時間後までに、血清ＩＧＦ−１レベルは対照の約４８．８％下にまで減少した。３１２時間目までに、ＩＧＦ−１レベルはベースラインレベルに戻った。対照的に、３０ｍｇ／ｋｇの対照ＩｇＧ１を投与された動物の血清ＩＧＦ−１レベルは、研究を通して、ほぼベースラインレベルに維持された（表９）。これらの結果は、ＧＨＲアンタゴニスト抗体による処置が血中のＩＧＦ−１レベルを低下させるのに有効であり、その効果が用量依存的であることを実証している。
【０３１０】
（実施例５）
【０３１１】
ＧＨＲアンタゴニスト抗体は、カニクイザルにおいて血中のＩＧＦ−１、ＩＧＦＢＰ−３およびＡＬＳレベルを低下させるのに有効である
この実施例は、カニクイザルにおける血中のＩＧＦ−１、ＩＧＦ結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ−３）、および酸不安定サブユニット（ＡＬＳ）レベルに対するＧＨＲアンタゴニスト抗体の影響を例示する。
【０３１２】
ＧＨＲアンタゴニストモノクローナル抗体が、ＧＨＲの機能を阻害することによって、ｉｎ  ｖｉｖｏでＩＧＦ−１、ＩＧＦＢＰ−３およびＡＬＳレベルに影響を与えることができるかどうか決定するために、カニクイザルサルで、ヒト化抗ヒトＧＨＲ抗体ＳＳ１の影響を試験した。ＳＳ１の単回用量後におけるＩＧＦ−１、ＩＧＦＢＰ−３およびＡＬＳレベルの変化について試験するために、用量反応性研究を行った。単回用量のＳＳ１または陰性対照ヒトＩｇＧ２Δａを含む１×ＰＢＳ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０を、８頭のナイーブの雌性カニクイザルに静脈内注射した。１日目に、２頭のサルに３０ｍｇ／ｋｇのＳＳ１を投与し、２頭に１０ｍｇ／ｋｇのＳＳ１を投与し、２頭に３ｍｇ／ｋｇのＳＳ１を投与し、２頭に３０ｍｇ／ｋｇの陰性対照ヒトＩｇＧ２Δａを投与した。以下の時点にすべての動物から血清試料を採取した：投与前、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ、１２０ｈ、１４４ｈ、１９２ｈ、２４０ｈ、３３６ｈ、５２８ｈ、６９６ｈ。投与後８６４ｈにも、３０ｍｇ／ｋｇのＳＳ１処置動物および陰性対照処置動物から血清を採取した。
【０３１３】
Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（商標）Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（商標）ヒトＩＧＦ−１免疫アッセイキット（カタログ番号ＤＧ１００）を用いて、ベースラインと比べたＩＧＦ−１レベルの変化について、血清試料を分析した。２４ｈから８６４ｈまでの範囲の時点についての研究の結果を表１０に示す。
【０３１４】
【表１１】
2015502975.tif 000055
【０３１５】
表１０のデータは、ＧＨＲアンタゴニスト抗体ＳＳ１がカニクイザルの血清ＩＧＦ−１レベルを用量依存的に低減させることを示している。３０ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ１を投与された対照動物では、血清ＩＧＦ−１レベルは、対照ＩｇＧ１を投与した４８ｈ後にベースラインレベルの約４７％下にまで減少し、次いで投与後１４４ｈまでにベースラインレベルに戻り、研究の残りの期間を通して、ほぼベースラインレベルまたはベースラインレベルの上に維持された（表１０、最終行）。対照的に、３、１０または３０ｍｇ／ｋｇのＳＳ１の単回用量の静脈内投与後には、１２０時間までに、血清ＩＧＦ−１レベルがベースラインレベルの約７５％下にまで減少した。ＳＳ１で処置された動物の血清ＩＧＦ−１レベルは、用量投与後２４０時間（３ｍｇ／ｋｇ用量）、３３６時間（１０ｍｇ／ｋｇ用量）、または６９６時間（３０ｍｇ／ｋｇ用量）まで、ベースラインより実質的に低い値に維持された。これらの結果は、ＧＨＲアンタゴニスト抗体による処置が血中のＩＧＦ−１レベルを低下させるのに有効であり、その効果が用量依存的であることを実証している。
【０３１６】
Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（商標）Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（商標）ヒトＩＧＦＢＰ−３免疫アッセイキット（カタログ番号ＤＧＢ３００）を用いて、ベースラインと比べたＩＧＦＢＰ−３レベルの変化について、血清試料を分析した。２４ｈから３３６ｈまでの範囲の時点についての研究の結果を表１１に示す。
【０３１７】
【表１２】
2015502975.tif 000056
【０３１８】
表１１のデータは、ＧＨＲアンタゴニスト抗体ＳＳ１がカニクイザルの血清ＩＧＦＢＰ−３レベルを用量依存的に低減させることを示している。３、１０または３０ｍｇ／ｋｇのＳＳ１の単回用量の静脈内投与後、７２時間までに、それぞれベースラインの約３６％、３８％または２３％下にまで、血清ＩＧＦＢＰ−３レベルが減少した。投与の１４４時間後までに、３、１０または３０ｍｇ／ｋｇのＳＳ１で処置された動物の血清ＩＧＦＢＰ−３レベルは、それぞれベースラインの約４７％、５１％または４６％下にまで減少した。ＳＳ１抗体の単回用量で処置された動物の血清ＩＧＦＢＰ−３は、研究の終わりまでにベースラインレベルに戻った。３０ｍｇ／ｋｇの対照ＩｇＧ１を投与された動物の血清ＩＧＦＢＰ−３レベルは、研究を通して、ほぼベースラインレベルに維持された（表１１、最終行）。これらの結果は、ＧＨＲアンタゴニスト抗体による処置が血中のＩＧＦＢＰ−３レベルを低下させるのに有効であることを実証している。
【０３１９】
ＢｉｏＶｅｎｄｏｒ（商標）ヒトＡＬＳ  ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＲＭＥＥ３５Ｒ）を用いて、ベースラインと比べたＡＬＳレベルの変化について血清試料を分析した。２４ｈから３３６ｈまでの範囲の時点についての研究の結果を表１２に示す。
【０３２０】
【表１３】
2015502975.tif 000057
【０３２１】
表１２のデータは、ＧＨＲアンタゴニスト抗体ＳＳ１がカニクイザルの血清ＡＬＳレベルを低減させることを示している。３、１０または３０ｍｇ／ｋｇのＳＳ１の単回用量の静脈内投与後、９６時間までに、それぞれ約５１％、２４％または４９％に、血清ＡＬＳレベルが減少した。ＳＳ１抗体の単回用量で処置された動物の血清ＡＬＳは、研究の終わりまでにベースラインレベルに戻った。３０ｍｇ／ｋｇの対照ＩｇＧ１を投与された動物の血清ＡＬＳレベルは、研究を通して、ほぼベースラインレベルに維持された（表１２、最終行）。これらの結果は、ＧＨＲアンタゴニスト抗体による処置が血中のＡＬＳレベルを低下させるのに有効であることを実証している。
【０３２２】
ＳＳ１の皮下投与が血中のＩＧＦ−１レベルおよびＡＬＳレベルの低下をもたらすかどうか決定するために、動物に皮下投与した。単回用量のＳＳ１または陰性対照ヒトＩｇＧ２Δａを含む１×ＰＢＳ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０を、６頭のナイーブの雌性カニクイザルに静脈内または皮下に注射した。１日目に、２頭のサルに３ｍｇ／ｋｇのＳＳ１を静脈内に投与し、２頭に３ｍｇ／ｋｇのＳＳ１を皮下に投与し、２頭に３ｍｇ／ｋｇの陰性対照ヒトＩｇＧ２Δａを皮下に投与した。以下の時点にすべての動物から血清試料を採取した：投与前、２４ｈ、７２ｈ、１２０ｈ、１６８ｈ、２１６ｈ、２６４ｈ、３１２ｈ、３６０ｈ、４０８ｈ、４５６ｈおよび５０４ｈ。
【０３２３】
Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（商標）Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（商標）ヒトＩＧＦ−１免疫アッセイキット（カタログ番号ＤＧ１００）を用いて、ベースラインと比べたＩＧＦ−１レベルの変化について、血清試料を分析した。２４ｈから３６０ｈまでの範囲の時点についての研究の結果を表１３に示す。
【０３２４】
【表１４】
2015502975.tif 000058
【０３２５】
表１３のデータは、皮下（ＳＱ）または静脈内（ＩＶ）に投与した場合に、ＧＨＲアンタゴニスト抗体ＳＳ１がカニクイザルの血清ＩＧＦ−１レベルを用量依存的に低減させることを示している。血清ＩＧＦ−１レベルは、３ｍｇ／ｋｇのＳＳ１の単回用量を皮下（ＳＣ）または静脈内（ＩＶ）に投与した７２時間後までに、対照の約６３％下にまで減少した。ＳＳ１で処置された動物の血清ＩＧＦ−１レベルは、ＳＱまたはＩＶ投与の約２１６時間後まで、ベースラインレベルの６０％下に維持された。３ｍｇ／ｋｇの対照ＩｇＧ１を皮下投与された動物の血清ＩＧＦ−１レベルは、研究を通して、ほぼベースラインレベルに維持された（表１３、最終行）。これらの結果は、静脈内または皮下に投与されたＧＨＲアンタゴニスト抗体による処置が血中のＩＧＦ−１レベルを低下させるのに有効であることを実証している。
【０３２６】
ＢｉｏＶｅｎｄｏｒ（商標）ヒトＡＬＳ  ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＲＭＥＥ３５Ｒ）を用いて、ベースラインと比べたＡＬＳレベルの変化について血清試料を分析した。２４ｈから２６０ｈまでの範囲の時点についての研究の結果を表１４に示す。
【０３２７】
【表１５】
2015502975.tif 000059
【０３２８】
表１４のデータは、皮下（ＳＱ）または静脈内（ＩＶ）に投与した場合に、アンタゴニスト抗体ＳＳ１がカニクイザルの血清ＡＬＳレベルを用量依存的に低減させることを示している。血清ＡＬＳレベルは、３ｍｇ／ｋｇのＳＳ１の単回用量を皮下（ＳＣ）に投与した７２時間後までに、対照の約４３％下にまで減少した。３ｍｇ／ｋｇのＳＳ１の単回用量を静脈内（ＩＶ）に投与した７２時間後までに、ＡＬＳレベルは、対照の約３１％下にまで減少した。血清ＡＬＳレベルは、３１２時間目までにベースラインレベルに戻った。３ｍｇ／ｋｇの対照ＩｇＧ１を投与された動物の血清ＡＬＳレベルは、研究を通して、ベースラインレベルまたはベースラインより上に維持された（表１４、最終行）。これらの結果は、静脈内または皮下に投与されたＧＨＲアンタゴニスト抗体による処置が血中のＡＬＳレベルを低下させるのに有効であることを実証している。
【０３２９】
（実施例６）
イリノテカンと組み合わせたＧＨＲアンタゴニスト抗体は癌のマウスモデルにおける腫瘍を阻害するのに有効である
この実施例は、癌の同系マウスモデルにおける腫瘍成長に対するＧＨＲアンタゴニスト抗体の影響を例示する。
【０３３０】
ＧＨＲアンタゴニストモノクローナル抗体が腫瘍成長を阻害できるかどうか決定するために、マウス抗体Ａｂ１１の影響を同系腫瘍モデルで試験した。Ａｂ１１抗体は、マウスＧＨＲを遮断するマウスＩｇＧ１抗体である。結腸直腸癌の同系マウスモデルとしてＣＴ２６細胞株を用いた。マウスに腫瘍細胞を注射し、Ａｂ１１抗体を単独で、またはイリノテカンと組み合わせて投与した。陰性対照群およびイリノテカン単独群もこの研究に含まれていた。
【０３３１】
ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌ）は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ、ＵＳＡ）から入手し、Ｒｉｎａｔの動物施設で飼育した。研究に用いた時、動物は７週齢であり、初期体重が２２〜２３ｇであった。マウスは、マイクロアイソレーター（フィルタートップのケージ）において、病原体除去条件の下、１２ｈ明／１２ｈ暗のスケジュールで飼育され、実験期間を通して、オートクレーブされた標準固形飼料および水が与えられた。
【０３３２】
マウスの未分化結腸癌細胞株ＣＴ２６（ＣＲＬ−２６３８）は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）から入手した。ＣＴ２６細胞は、１０％ウシ胎仔血清（４３６４０）（ＪＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標），Ｉｎｃ．、Ｗｏｏｄｌａｎｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）および１％ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（３０−００２−ＣＩ）（Ｃｅｌｌｇｒｏ（商標）Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ（商標），Ｉｎｃ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）を含有し、Ｌ−グルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０、１×（１０−０４０−ＣＶ）（Ｃｅｌｌｇｒｏ（商標）Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ（商標），Ｉｎｃ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）で培養した。Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ａ６９６４−１００ＭＬ）（Ｓｉｇｍａ（商標）Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）と共に短時間インキュベートすることによって細胞を採取し、計数のため新しい培地中で洗浄した。細胞数および生存率（９５．８％）を、ＶｉＣｅｌｌ（商標）自動計数および生存率機を用いて評価した。注射用に、新しい培地中の最終細胞懸濁液を、ＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）マトリックス基底膜（３５６２３４）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）と１：２希釈した。
【０３３３】
腫瘍異種移植は、１０５個の細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスの左脇腹に皮下（ＳＣ）注射することによって開始した。７日後に、腫瘍は、約７５〜１５０ｍｍ３の体積にまで成長した。動物を、平均腫瘍体積と標準誤差がほぼ等しい４つの群に分け、受ける処置を無作為に割り当てた。対照群の動物には、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｄ２６５０−Ｓｉｇｍａ（商標）Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を含む１×ＰＢＳと１０ｍｇ／ｋｇのマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体を与えた。イリノテカン群の動物には、１００ｍｇ／ｋｇの塩酸イリノテカン（Ｉ１４０６−Ｓｉｇｍａ（商標）Ａｌｄｒｉｃｈ）と１０ｍｇ／ｋｇのマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体を与えた。Ａｂ１１群の動物には、１０ｍｇ／ｋｇのＡｂ１１と１０％ＤＭＳＯを含む１×ＰＢＳを与えた。組合せ群の動物には、１００ｍｇ／ｋｇのイリノテカンと１０ｍｇ／ｋｇのＡｂ１１を与えた。
【０３３４】
２日〜３日毎にマウスに腹腔内（ＩＰ）投与した。腫瘍体積および体重は少なくとも１週間に２回測定した。研究は盲検で行った。２８日目に、血清ＩＧＦ−１測定用に採血した。
【０３３５】
腫瘍は、２〜４日毎にデジタルカリパス（ｍｍ）で測定した。ベースライン腫瘍体積は、次の式を用いて計算した。Ｖ＝ｄ２２×（ｄ１／２）。式中、ｄ１は腫瘍の最長径であり、ｄ２は、ｄ１の垂線であった。研究の終わりにおいて、研究は依然として盲検のままであったが、アウトライアーを決定し、４つの群すべてから除いた。１４日目以降すべての日（１８、２２、２５、および２８日目）に３×平均値の標準誤差＜平均であった腫瘍および３×平均値の標準誤差＞平均であった腫瘍をアウトライアーと判定した。研究終了時の腫瘍の重さも測定した。
【０３３６】
血清ＩＧＦ−１は、マウス／ラットＩＧＦ−１ＥＬＩＳＡキット（ＭＧ１００）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（商標），Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）を用いたＥＬＩＳＡで測定した。
【０３３７】
マウス癌モデル研究から得たデータを下記表１６および１７に示す。表１６は、対照動物、ＧＨＲアンタゴニスト抗体Ａｂ１１で処置された動物、イリノテカンで処置された動物、およびＡｂ１１とイリノテカンの両方で処置された動物の平均腫瘍体積（ｍｍ３）を示す。表１７は、２８日目における、対照動物、ＧＨＲアンタゴニスト抗体Ａｂ１１で処置された動物、イリノテカンで処置された動物、およびＡｂ１１とイリノテカンの両方で処置された動物の平均腫瘍重量（グラム）を示す。表１５および１６には、対照ＩｇＧ１抗体、ＧＨＲアンタゴニスト抗体、イリノテカン、またはＧＨＲアンタゴニスト抗体とイリノテカンの組合せで処置された動物の群それぞれの平均である値が示されている。表１５および１６のデータについて、＊は対照に対してｐ＜０．０５であることを示し、＊＊は対照に対してｐ＜０．０１であることを示し、＊＊＊は対照に対してｐ＜０．００１であることを示す。
【０３３８】
【表１６】
2015502975.tif 000060
【０３３９】
【表１７】
2015502975.tif 000061
【０３４０】
表１５は平均腫瘍体積を示す。イリノテカンと組み合わせたＧＨＲアンタゴニスト抗体で処置された動物の平均腫瘍体積（１０９２．１ｍｍ３）は、対照動物の平均腫瘍体積（１９３９．７ｍｍ３）より有意に低かった。
【０３４１】
表１６は、２８日目の平均血清ＩＧＦ−１レベルを示す。ＧＨＲアンタゴニスト抗体で処置された動物の平均血清ＩＧＦ−１レベルは、単独（２９８．６ｎｇ／ｍＬ）でも、イリノテカン（２７８ｎｇ／ｍＬ）との組合せでも、対照動物の血清ＩＧＦ−１レベル（４１０．１ｎｇ／ｍＬ）に比べて有意に低かった。これらの結果は、ＧＨＲアンタゴニスト抗体による処置が、癌のマウスモデルにおける、血中のＩＧＦ−１レベルを低下させるのに有効であることを実証している。表１６は、２８日目における平均腫瘍重量も示している。イリノテカンと組み合わせたＧＨＲアンタゴニスト抗体で処置された動物における平均腫瘍重量（０．８ｇ）は、対照動物の平均腫瘍重量（１．９ｇ）に比べて有意に低かった。イリノテカン単独での処置では、平均腫瘍重量が１．２ｇになった。これらの結果は、イリノテカンと組み合わせたＧＨＲアンタゴニスト抗体による処置が、癌のマウスモデルにおける腫瘍成長を阻害するのに有効であることを実証している。
【０３４２】
（実施例７）
ＧＨＲアンタゴニスト抗体はコラーゲン誘発関節炎のマウスモデルにおける疾患の重症度を低減するのに有効である
この実施例は、コラーゲン誘発関節炎のマウスモデルにおける疾患の重症度に対するＧＨＲアンタゴニスト抗体の影響を例示する。
【０３４３】
ＧＨＲアンタゴニストモノクローナル抗体が関節炎の疾患の重症度を低減することができるかどうか決定するために、マウス抗体Ａｂ１１の影響をコラーゲン誘発関節炎のマウスモデルで試験した。
【０３４４】
４４匹の雄性マウス（株Ｂ１０．ＲＩＩＩ−Ｈ２ｒ  Ｈ２−Ｔ１８ｂｌ（７１ＮＳ）ＳｎＪストック番号０００４５７）をＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から購入し、到着後の数日間、順応させた。動物は研究開始時に約８週齢であった。マウスは、関節リウマチの誘発を受ける１０匹ずつの４群に無作為に割り当てた。４匹の健康で処置されないマウスの群を対照として分析した。０日目および１５日目に、疾患群の動物をイソフルランで麻酔し、２００μｇのウシタイプＩＩコラーゲン（Ｅｌａｓｔｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｏｗｅｎｓｖｉｌｌｅ、ＭＯ）を含む、４ｍｇ／ｍｌの結核菌（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）を補足した１００μｌのフロインド完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を皮内に注射した。−１日目に、Ａｂ１１試験品またはビヒクル対照の腹腔内（ＩＰ）注射を動物に予防的に与えた。その後、１か月間にわたって、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇのＡｂ１１抗体またはビヒクル対照注射（ＰＢＳ、０．０１％ポリソルベート２０、ＪＴ  Ｂａｋｅｒ、カタログ番号４１１６−０４、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ）を週２回ＩＰ投与した。−４日目、１５日目および２９日目に、マウスをイソフルランで麻酔し、血清のために眼窩静脈叢から採血した。血清試料は、分析時まで−２０℃以下に冷凍した。
【０３４５】
臨床スコアを４本の足すべてについて毎日観察し、記録した。投与群のアイデンティティーは、実験者から常に秘匿されていた。スコアは以下の判定規準に従って決定した。０＝健康；１＝後足または前足関節１つが冒されているか、最小限のびまん性紅斑および腫脹；２＝後足または前足関節２つが冒されているか、軽度のびまん性紅斑および腫脹；３＝後足または前足関節３つが冒されているか、中等度のびまん性紅斑および腫脹；４＝顕著なびまん性紅斑および腫脹、または４つの指関節が冒されている；５＝足全体が重度のびまん性紅斑および重度の腫脹、指が曲げられない。
【０３４６】
２９日目に、マウスの半分（疾患セットの群あたり５匹、健康対照セットから２匹のマウス）を屠殺し、それらの前足、後足およびひざを摘出し、中性緩衝ホルマリンに入れた。前足、後足、およびひざを１〜２日間固定し、次いで、脱灰液に移して４〜５日間置いた。これらの関節を包埋し、切片にし、トルイジンブルーで染色した。炎症、パンヌスの存在、軟骨損傷および骨損傷についての、足とひざの病理組織学的スコアリングを行った。組織のスコアリングには以下の判定規準を用いた。炎症：０＝正常；１＝罹患関節の滑膜および関節周囲組織における炎症性細胞の最小限の浸潤；２＝軽度の浸潤；足の場合、罹患関節に局限される；３＝中等度の浮腫を伴う中等度の浸潤；足の場合、罹患関節に局限される；４＝顕著な浮腫を伴い、ほとんどの領域を冒す顕著な浸潤；５＝重度の浮腫を伴う重度のびらん性浸潤。パンヌス：０＝正常；１＝軟骨および軟骨下骨におけるパンヌスの最小限の浸潤；２＝罹患関節における硬組織の辺縁帯破壊を伴う軽度の浸潤；３＝罹患関節における中等度の硬組織破壊を伴う中等度の浸潤；４＝関節構造の顕著な破壊を伴う顕著な浸潤、ほとんどの関節；５＝関節構造の全体的またはほぼ全体的な破壊を伴う重度の浸潤、すべての関節が冒されている。軟骨損傷：０＝正常；１＝最小限：罹患関節における明白な軟骨細胞の減失またはコラーゲン破壊が無い、トルイジンブルー染色の最小限または軽度の減失、２＝軽度：罹患関節における限局的な軽度（表層）の軟骨細胞減失および／またはコラーゲン破壊を伴うトルイジンブルー染色の軽度の減失；３＝中等度：罹患関節における多巣性で中等度（中間ゾーンまでの深さ）の軟骨細胞減失および／またはコラーゲン破壊を伴うトルイジンブルー染色の中等度の減失；４＝顕著：ほとんどの関節における多巣性で顕著（深いゾーンまでの深さ）の軟骨細胞減失および／またはコラーゲン破壊を伴うトルイジンブルー染色の顕著な減失；５＝重度：すべての関節における多巣性で重度（タイドマークまでの深さ）の軟骨細胞減失および／またはコラーゲン破壊を伴うトルイジンブルー染色の重度のびまん性減失。骨吸収：０＝正常；１＝最小限：最小限の吸収領域、低倍率では容易に明らかでない、罹患関節において破骨細胞はまれ；２＝軽度：より多くの吸収領域、低倍率では容易に明らかでない、罹患関節においてより多くの破骨細胞；３＝中等度：皮質における厚さ全体の欠損が無い髄様骨梁および皮質骨の明らかな吸収、一部の髄様骨梁の減失、低倍率で明らかな病変、罹患関節においてより多くの破骨細胞；４＝顕著：皮質骨の厚さ全体の欠損、残っている皮質表面のプロファイルの歪みをしばしば伴う、髄様骨の顕著な減失、多くの破骨細胞、ほとんどの関節が冒されている；５＝重度：皮質骨の厚さ全体の欠損およびすべての関節の関節構造の破壊。
【０３４７】
体重を毎日測定し、記録した。各群について、１４日目（疾患の顕在化）から２９日目までの体重変化のパーセントを計算した。２９日目に、マウスの半分（疾患セットの群あたり５匹、健康対照セットから２匹のマウス）を屠殺し、それらの後足を摘出し、秤量した。
【０３４８】
２９日目の血液収集物から得た血清を、Ａｂ１１治療用抗体のレベルについて分析した。Ｎｕｎｃ９６ウェルｍａｘｉｓｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレート（カタログ番号４４６６１２、デンマーク）を、１×ＰＢＳ（Ｃｅｌｌｇｒｏ−Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）中の５μｇ／ｍｌの組換えマウスＧＨＲ／Ｆｃキメラ１００μｌ／ウェルでコーティングした（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ。カタログ番号１３６０−ＧＲ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）。Ａｂ１１の２倍希釈系列を検量線に用いた。最高希釈物は０．０３μｇ／ｍＬであった。標準物質および試料を０．５％ＢＳＡ（カタログ番号Ａ７９０６、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含む１×ＰＢＳで構成されるアッセイバッファー中に希釈し、１００μｌ／ウェルでローディングした。ＨＲＰ結合ウサギ抗マウスＩｇＧ１（Ｚｙｍｅｄ、カタログ番号６１−０１２０、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）のアッセイバッファー中１：２０００希釈物を検出抗体として用いた。ＴＭＢ基質（カタログ番号５０−７６−０２／５０−６５−０２、ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いてＥｌｉｓａプレートを発色させ、１Ｍリン酸で停止させた。プレートをＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓマイクロプレートリーダーで４５０ｎｍにてリーディングした。
【０３４９】
研究１５日目および２９日目に収集した血清から、自己抗体を測定した。Ｎｕｎｃ  ＥＬＩＳＡプレートを５μｇ／ｍｌウシタイプＩＩコラーゲン（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、カタログ番号００１−００１−１０４）でコーティングした。ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  ｌａｂｓ。カタログ番号１１５−０３５−１４６、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）のアッセイバッファー中１：５０００希釈物を検出抗体として用いた。ＴＭＢ基質（カタログ番号５０−７６−０２／５０−６５−０２、ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いてＥＬＩＳＡプレートを発色させ、１Ｍリン酸で停止させた。プレートをＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓマイクロプレートリーダーで４５０ｎｍにてリーディングした。光学濃度スコアを各希釈物についてプロットした。
【０３５０】
ベースラインの１５日目および２９日目の血液収集物から得た血清を、ＩＧＦ−１レベルについて分析した。ＥＬＩＳＡは、ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅマウスＩＧＦ−１免疫アッセイキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ。カタログ番号ＭＧ１００、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を用いて行った。プレートをＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓマイクロプレートリーダーで４５０ｎｍにてリーディングした。ベースラインＩＧＦ−１からのパーセント変化を各時点について計算した。Ａｂ１１で処置された動物は、対照に比べて、ＩＧＦ−１レベルの用量依存的減少を示した（データは示されていない）。
【０３５１】
３１日目に、マウスの半分（疾患セットの群あたり５匹、健康対照セットから２匹のマウス）を屠殺し、それらの鼠蹊部リンパ節を収集し、ＦＡＣＳ分析を用いて特定の細胞型について分析した。流入領域リンパ節からの単細胞懸濁液は、３ｍｌシリンジのゴムプランジャーの端を用いて、リンパ系組織をワイヤーメッシュに穏やかに押して通すことによって作製した。収集後、細胞は染色バッファー（Ｍｇ２＋不含またはＣａ２＋不含ＤＰＢＳと１％熱不活性化ＦＣＳ、ｐＨ７．４〜７．６）中で洗浄し、抗ＣＤ１６−ＣＤ３２（２．４Ｇ２、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で遮断した。細胞を再度洗浄し、次いで、細胞表面マーカーＣＤ４（ＣＤ４−ＰｅｒＣＰ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５３０５２）、ＣＤ８（ＣＤ８−ＡＰＣ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５３０３５）、ＩｇＤ（ＩｇＤ−ＦＩＴＣ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５３４３９）およびＣＤ２５（ＣＤ２５−ＰＥ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５８６４２）に特異的な蛍光標識抗体を用いて暗中で３０分間、４℃で染色した。データは、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で取得し、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアで分析した。
【０３５２】
３１日目に、マウスの半分（疾患セットの群あたり５匹、健康対照セットから２匹のマウス）を屠殺し、それらの脾臓を収集し、ＦＡＣＳ分析を用いて特定の細胞型について分析した。脾細胞の単細胞懸濁液は、３ｍｌシリンジのゴムプランジャーの端を用いて、組織をワイヤーメッシュに穏やかに押して通すことによって作製した。収集後、細胞は染色バッファー（Ｍｇ２＋不含またはＣａ２＋不含ＤＰＢＳと１％熱不活性化ＦＣＳ、ｐＨ７．４〜７．６）中で洗浄し、抗ＣＤ１６−ＣＤ３２（２．４Ｇ２，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で遮断した。細胞を再度洗浄し、次いで、細胞表面マーカーＣＤ４（ＣＤ４−ＰｅｒＣＰ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５３０５２）、ＣＤ８（ＣＤ８−ＡＰＣ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５３０３５）、ＩｇＤ（ＩｇＤ−ＦＩＴＣ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５３４３９）およびＣＤ２５（ＣＤ２５−ＰＥ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５８６４２）に特異的な蛍光標識抗体を用いて暗中で３０分間、４℃で染色した。データは、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で取得し、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアで分析した。
【０３５３】
３１日目に、マウスの半分（疾患セットの群あたり５匹、健康対照セットから２匹のマウス）を屠殺し、ビヒクル処置マウス、３および１０ｍｇ／ｋｇ  Ａｂ１１処置マウスならびに健康対照マウスから全血を収集した。３０ｍｇ／ｋｇ処置マウスからは採血されなかった。ＡＤＶＩＡ１２０血液学システム（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ）を用いたフローサイトメトリーによって血液を分析した。白血球は、立方体ｍｍあたり１０００細胞の単位で計数および報告された。赤血球は、立方体ｍｍあたり１００万細胞の単位で計数および報告された。リンパ球および単球は、白血球に対するパーセントとして計数および報告された。好中球および好酸球は、パーセント白血球に対するパーセントとして計数および報告された。
【０３５４】
ＧＨＲアンタゴニスト抗体Ａｂ１１による処置は、対照との比較における、関節炎の臨床スコアの減少をもたらした。例えば、ＧＨＲアンタゴニスト抗体で処置された動物は、２１日目に、約０．５（３０ｍｇ／ｋｇ用量）、約０．７（３ｍｇ／ｋｇ用量）または約１．１（１０ｍｇ／ｋｇ用量）の臨床スコア（足）を有した。対照的に、対照動物は、２１日目に、約１．８の臨床スコアを有した。ＧＨＲアンタゴニスト抗体で処置された動物は、２９日目に、およそ２〜２．５の臨床スコア（足）を有した。対照的に、対照動物は、２９日目に、約３．５の臨床スコアを有した。
【０３５５】
これらの結果は、ＧＨＲアンタゴニスト抗体による処置が、コラーゲン誘発関節炎のマウスモデルにおける重症度を低減させるのに有効であることを実証している。
【０３５６】
上記および本出願における他の場所に引用したすべての特許、特許出願、Ｇｅｎｂａｎｋエントリー、参照マニュアルおよび出版物は、個々の出版物、特許および特許出願をそれぞれ参照によりそのように組み込むと明示的かつ個別に示した場合と同じ程度に、すべての目的について参照により全体として本明細書に組み込まれている。組み込まれている文献の１つまたは複数および同様のものが、定義された用語、用語の用法、記載の技法などを含むがそれらに限定されない本出願と相違している、または矛盾する場合は、本出願が優先される。
【配列表】
2015502975000001.app
【国際調査報告】
2015502975.tif 000062
2015502975.tif 000063
2015502975.tif 000064
2015502975.tif 000065