(57)【要約】例えば血管拡張物質ペプチド（ＶＳＤＬ）などの組換えペプチドを産生する方法が開示され、これは、ペプチド切断部位によって隣接されているペプチドのコンカテマー型反復を含む融合ポリペプチドを発現する工程と、融合ポリペプチドからペプチドを切り出すために切断剤（または複数の切断剤）を用いてペプチド切断部位で融合ポリペプチドを切断する工程とを含む、特定の方法を含む。融合ポリペプチドを産生するための発現構築物および宿主細胞および組換えペプチドを精製するための方法もまた開示される。【選択図】図3ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドを含む融合ポリペプチドを発現する工程であって、前記ペプチドが、１つまたは２つ以上のペプチド切断部位（または複数の切断部位）によって隣接されており、および、そうではない場合、前記ペプチド切断部位（または複数の切断部位）が前記ペプチドに存在しない工程と、
前記ペプチド切断部位（または複数の切断部位）での切断を行う切断剤（または複数の切断剤）を用いて、前記融合ポリペプチドを前記ペプチド切断部位（または複数の切断部位）で切断する工程と
を含む組換えペプチドの産生方法であって、
融合ポリペプチドを切断する工程が、前記融合ポリペプチドから前記ペプチドを切り出す方法。
【請求項２】
ペプチド切断部位によって隣接されており、および、そうではない場合、前記ペプチド切断部位がペプチドに存在しないことを特徴とするペプチドのコンカテマー型コピーを含む融合ポリペプチドを発現する工程と、
前記ペプチド切断部位での切断を行う切断剤（または複数の切断剤）を用いて、前記融合ポリペプチドを前記ペプチド切断部位で切断する工程と
を含む組換えペプチドの産生方法であって、
前記融合ポリペプチドを切断する工程が、前記融合ポリペプチドから前記ペプチドを切り出す方法。
【請求項３】
前記ペプチドが、以下の式
Ｘ１−Ｘ２−…Ｘｎ−１−Ｘｎ−（Ｒ／Ｋ）（配列番号１）
であるアミノ酸配列を含み；
式中、Ｘは、アルギニンまたはリジン以外の任意のアミノ酸であり、Ｒ／Ｋは、アルギニンまたはリジンであり、および、ｎは、アミノ酸の任意の適切な数である
請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記ペプチドが、天然の配列を有する請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ペプチドが、血管拡張物質（ＶＳＤＬ）ペプチドまたはその変異体もしくは修飾ペプチドを含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＶＳＤＬペプチドである請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチド切断部位が、トリプシン切断部位である請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記切断剤が、トリプシンまたはトリプシン様酵素である請求項７記載の方法。
【請求項９】
１つまたは２つ以上のトリプシン切断部位によって隣接されており、および、そうではない場合、トリプシン切断部位が存在しないことを特徴とする少なくとも１つのＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）を含む融合ポリペプチドを発現する工程と、
前記トリプシン切断部位での切断を行う切断剤（または複数の切断剤）を用いて、前記融合ポリペプチドを前記トリプシン切断部位で切断する工程と
を含む組換え血管拡張物質（ＶＳＤＬ）ペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）の産生方法であって、
融合ポリペプチドを切断する工程が、前記融合ポリペプチドから前記ペプチドを切り出す方法。
【請求項１０】
前記ペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＶＳＤＬペプチドである請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記融合ポリペプチドを切断する工程が、前記融合ポリペプチドをトリプシンまたはトリプシン様酵素によって切断することを含む請求項９または１０記載の方法。
【請求項１２】
切断された融合ポリペプチドのｐＨを５未満に調整する工程と、
少なくとも１つのアニオン交換法を用いて、消化された融合ポリペプチドから前記ペプチドを精製する工程と
をさらに含む請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ペプチドを噴霧乾燥または凍結乾燥することをさらに含む請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記融合ポリペプチドが、前記ペプチドの２個〜２０個のコンカテマー型コピーを含む請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記融合ポリペプチドが、前記ペプチドの３個のコンカテマー型コピーを含む請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記融合ポリペプチドが、前記ペプチドの１０個のコンカテマー型コピーを含む請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ペプチドが、一末端に前記ペプチド切断部位を含む請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ペプチドが、Ｃ末端アルギニンまたはリジン残基を含む請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記融合ポリペプチドが、Ｃ末端ペプチド切断部位を有するリーダー融合パートナーを含む請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記リーダー融合パートナーが、Ｃ末端アルギニンまたはリジン残基を含む請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記融合ポリペプチドを発現する工程が、発現宿主として大腸菌を用いて行われる請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
Ｃ末端トリプシン切断部位を有するペプチドのコンカテマー型コピーをエンコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に融合されるリーダー融合パートナーをエンコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物。
【請求項２３】
Ｃ末端トリプシン切断部位を有するＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）をエンコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に融合されるリーダー融合パートナーをエンコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物。
【請求項２４】
前記リーダー融合パートナーが、Ｃ末端トリプシン切断部位を有する請求項２２または２３記載の発現構築物。
【請求項２５】
前記リーダー融合パートナーをエンコードしている前記ヌクレオチド配列が、前記ペプチドをエンコードしている前記ヌクレオチド配列の２個〜２０個のコンカテマー型コピーに連結されている請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の発現構築物。
【請求項２６】
ペプチドを組換えによって発現するための宿主細胞であって、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の発現構築物を含む宿主細胞。
【請求項２７】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法により産生される組換えペプチド。
【請求項２８】
Ｃ末端トリプシン切断部位を有するペプチドのコンカテマー型コピーに連結されたリーダー融合パートナーを含む組換え融合ポリペプチド。
【請求項２９】
前記リーダー融合パートナーが、Ｃ末端トリプシン切断部位を有する請求項２８記載のポリペプチド。
【請求項３０】
前記リーダー融合パートナーが、前記ペプチドの２個〜２０個のコンカテマー型コピーに連結されている請求項２８または２９記載のポリペプチド。
【請求項３１】
Ｃ末端トリプシン切断部位を有するペプチドのコンカテマー型コピーを含む、またはそれからなる組換え融合ポリペプチド。
【請求項３２】
前記ペプチドの２個〜２０個のコンカテマー型コピーを含む請求項３１記載のポリペプチド。
【請求項３３】
前記ペプチドの３個〜１０個のコンカテマー型コピーを含む請求項３２記載のポリペプチド。
【請求項３４】
前記ペプチドが配列内トリプシン切断部位をもたない請求項２８〜３３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
前記ペプチドが、ＶＳＤＬペプチドまたはその変異体もしくは修飾ペプチドである請求項２８〜３４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
前記ペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、またはそれからなるＶＳＤＬペプチドである請求項２８〜３５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド、特には組換えペプチドの産生方法に関する。ある特定の適用において、本方法は、ペプチドのコンカテマー型コピーを含む融合ポリペプチドの切断を含む。
【０００２】
参考文献の引用
本出願は、２０１２年３月１９日に出願された米国特許出願第６１／６１２８１７号に基づき優先権を主張する。同出願の全ての内容は参照によって本明細書中に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
組換えで産生されるペプチドの産業および臨床設定における重要性が高まっている。多様な発現系（例えば、細菌、イースト、昆虫、植物または哺乳類細胞などの様々な発現系で真核生物のタンパク質を組換えにより産生することは、合成ペプチド生産に代わる低コストな代替方法を提供する。しかし、組換え発現は予測不可能であり、かつ、多くの組換え発現ペプチドは十分に溶解性ではなく、不安定、ミスフォールドされているまたは不活性、および／または、低収率で発現され、このため、しばしば商業的価値のある十分に高い品質または収率では産生されないため、たびたび問題となる。低分子量の組換え発現ペプチドを発現することは、特に困難となり得る。適切なペプチド融合パートナーにペプチドを作動可能に融合することは、安定性および溶解性を向上させ得るが、治療用途を目的とするペプチド中に融合パートナーを存在させることは、一般的に望ましくない。
【０００４】
ペプチドは、例えば、酵素的な切断剤（すなわち、プロテアーゼ）および化学的な切断剤などを含む多数のペプチド切断剤によって切断され得る。多くのペプチド切断剤は、ペプチド内の特定のアミノ酸配列またはモチーフのアミノ酸を認識および切断する。ペプチドは通常、多くの異なるペプチド切断部位の複数のコピーを含む。例えば、成熟ヒトインターロイキン（ＩＬ）−１βペプチド（１５３アミノ酸ペプチド、Ｇｅｎｂａｎｋ  アクセッション番号  ＡＡＡ７４１３７．１を参照）は、少なくとも２０個の異なるペプチド切断剤によって切断されると予測される。成熟ＩＬ−１βペプチド配列は、３個のＡｒｇ−Ｃプロテイナーゼ予想切断部位、８個のＡｓｐ−Ｎエンドペプチダーゼ予想切断部位、６個の臭化シアン予想切断部位、８個のギ酸予想切断部位、３個のクロストリパイン予想切断部位、１７個のトリプシン予想切断部位などを含む。その結果、ペプチドはしばしばより小さなフラグメントへと切断されてしまい、これは望ましくないので、ペプチド切断剤は一般的に、ペプチドの組換え産生においては有用ではない。
【０００５】
本発明者らは、ある種のペプチドは、特定のペプチド切断部位をもたない、または、ペプチド末端に位置する特定のペプチド切断部位の単一配列を含むという点において独特であることに思い至った。例えば、本発明者らは、天然の血管拡張物質（ＶＳＤＬ）ペプチドは異例なことに、単一のトリプシン切断部位を含み、それはＶＳＤＬペプチドのＣ末端に位置していることに気付いた。
【０００６】
血管拡張物質（ＶＳＤＬ）は、１２６アミノ酸からなる心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ、心房ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）としても知られる）プロホルモン（ｐｒｏＡＮＰ；Ｖｅｓｅｌｙ、２００３））のプロセッシングを受けてｉｎ  ｖｉｖｏで産生される、天然に存在する３７アミノ酸（ａａ）からなるペプチドである。ＶＳＤＬは、ＡＮＰプロホルモンの３１〜６７番目のアミノ酸からなる。ＶＳＤＬの主要な生物活性は、ナトリウム利尿効果、利尿効果および血行力学的効果を媒介することにより健康な個体の血圧を調節することおよび血漿量を維持することである（Ｖｅｓｅｌｙ、２００３）。例えば、鬱血性心不全（ＣＨＦ）などの心疾患の処置のためのＶＳＤＬの使用についての研究が、前臨床試験およびヒト臨床試験の両方を介して行われてきた。ＶＳＤＬが、症候性副作用なしにナトリウム利尿、利尿および血行力学的パラメータを顕著に向上させ得ることが示されている。ＶＤＳＬは、血漿量および血圧（ＢＰ）を臨床的に許容可能な範囲内に、かつ深刻的な有害な副作用なしに調節しつつ、追加の有益なナトリウム利尿効果、利尿効果および腎臓に対する効果をともなう、有益な血行力学的効果を媒介するための安全かつ効果的な処置であると考えられている。そのため、急性非代償性うっ血性心不全（ＡＤＣＨＦ）の患者へのＶＳＤＬ投与が提案されている。さらに、ＶＤＳＬはまた、抗がん作用をもつことが判明しており（Ｓｋｅｌｔｏｎら、２０１１）、そして、急性腎不全の処置において有望であることが示されている（Ｖｅｓｅｌｙ、２００３）。よって、ＶＳＤＬは、多様な疾患の処置のための有望な候補であることが理解されるであろう。天然のＶＳＤＬ配列に基づいて合成的に生成されたＶＳＤＬが臨床試験において利用されており、そして、疾患治療において有用であることが判明している。しかし、ペプチドの合成的な生成は、特に商業規模で必要とされるペプチドのためには高価なプロセスである。
【０００７】
本発明者らは、融合ポリペプチドからのペプチド切断を用いる的確な組換え産生システムを設計した。
【発明の概要】
【０００８】
よって、第１の態様において、本発明は、
ペプチドを含む融合ポリペプチドを発現する工程であって、前記ペプチドが、１つまたは２つ以上のペプチド切断部位（または複数の切断部位）によって隣接されており、および、そうではない場合、前記ペプチド切断部位（または複数の切断部位）が前記ペプチドに存在しない工程と、
ペプチド切断部位（または複数の切断部位）での切断を行う切断剤（または複数の切断剤）を用いて、融合ポリペプチドをペプチド切断部位（または複数の切断部位）で切断する工程と
を含む組換えペプチドの産生方法であって、
融合ポリペプチドを切断する工程が、融合ポリペプチドから前記ペプチドを切り出す方法を提供する。
【０００９】
第２の態様において、本発明は、
１つまたは２つ以上のペプチド切断部位（または複数の切断部位）によって隣接されており、および、そうではない場合、前記ペプチド切断部位（または複数の切断部位）が前記ペプチドに存在しないことを特徴とするペプチドのコンカテマー型コピーを含む融合ポリペプチドを発現する工程と、
ペプチド切断部位（または複数の切断部位）での切断を行う切断剤（または複数の切断剤）を用いて、融合ポリペプチドをペプチド切断部位（または複数の切断部位）で切断する工程と
を含む組換えペプチドの産生方法であって、
融合ポリペプチドを切断する工程が、融合ポリペプチドから前記ペプチドを切り出す方法を提供する。
【００１０】
ある実施形態において、融合ポリペプチドは、ペプチドの２個〜２０個の（またはそれ以上の）コンカテマー型コピーを含む。ある実施形態において、融合ポリペプチドは、ペプチドの３個のコンカテマー型コピーを含む。さらなる実施形態において、融合ポリペプチドは、ペプチドの１０個のコンカテマー型コピーを含む。
【００１１】
ある実施形態において、ペプチドは、片方の末端にペプチド切断部位を含む。さらなる実施形態において、ペプチドは、Ｃ末端アルギニン（Ｒ）残基を含む。別の実施形態において、ペプチドは、式Ｘ１−Ｘ２−…Ｘｎ−１−Ｘｎ−（Ｒ／Ｋ）（配列番号１）であるアミノ酸配列を含み、式中、Ｘは、アルギニンまたはリジン以外の任意のアミノ酸であり、Ｒ／Ｋは、アルギニンまたはリジンであり、および、ｎは、アミノ酸の任意の適切な数である。ある実施形態において、ペプチドは、天然の配列を有する。別の実施形態において、ペプチドは、血管拡張物質（ＶＳＤＬ）ペプチドまたはその変異体を含む。特定の実施形態において、ＶＳＤＬペプチドは、配列番号２であるアミノ酸配列またはその変異型を含む。
【００１２】
ある実施形態において、融合ポリペプチドは、Ｃ末端ペプチド切断部位を有するリーダー融合パートナーを含む。好ましい実施形態において、リーダー融合パートナーは、Ｃ末端アルギニン残基を含む。ある具体的な実施形態において、リーダー融合パートナーは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。
【００１３】
ある実施形態において、ペプチド切断部位（または複数の切断部位）は、トリプシン切断部位（または複数の切断部位）である。ある実施形態において、切断剤は、トリプシンまたはトリプシン様酵素である。
【００１４】
第３の態様において、本発明は、
１つまたは２つ以上のトリプシン切断部位によって隣接されており、および、そうではない場合、トリプシン切断部位が存在しないことを特徴とする少なくとも１つのＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）を含む融合ポリペプチドを発現する工程と、
トリプシン切断部位での切断を行う切断剤（または複数の切断剤）を用いて、融合ポリペプチドをトリプシン切断部位で切断する工程と
を含む組換え血管拡張物質（ＶＳＤＬ）ペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）の産生方法であって、
融合ポリペプチドを切断する工程が、融合ポリペプチドから前記ペプチドを切り出す方法を提供する。
【００１５】
さらに別の態様において、本発明は、Ｃ末端トリプシン切断部位を有するＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）をエンコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に融合されるリーダー融合パートナー（Ｃ末端トリプシン切断部位を有する）をエンコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物を提供する。
【００１６】
ある実施形態において、リーダー融合パートナーをエンコードするヌクレオチド配列は、Ｃ末端トリプシン切断部位を有するＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）をエンコードするヌクレオチド配列の２個〜２０個の（またはそれ以上の）コンカテマー型コピーに作動可能に融合される。
【００１７】
さらにまた別の態様において、本発明は、ＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）を組換えによって発現するための宿主細胞であって、Ｃ末端トリプシン切断部位を有するＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）をエンコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に融合される、Ｃ末端トリプシン切断部位を有するリーダー融合パートナーをエンコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物を含む宿主細胞を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＶＳＤＬペプチドのアミノ酸配列、ならびに、Ｂ７２Ｒと規定されたリーダー融合パートナーと融合されたＶＳＤＬ１量体および３量体のアミノ酸配列を提供する。イタリック体で示される配列はリーダー融合パートナー（Ｂ７２Ｒ）を表し、および、トリプシン切断部位は矢印によって示される。
【図２】隣接する制限酵素切断部位を含む、Ｂ７２ＲおよびＢ７２（Ｑ）Ｒ−ＶＳＤＬ融合遺伝子のヌクレオチド配列を示す。タンパク質コード領域は太字で示され、イタリック体で示される配列はリーダー融合パートナーのヌクレオチド配列を示す。各融合遺伝子の長さは、括弧内に示される。
【図３ａ】ＶＳＤＬの３、６、８および１０個の直列型反復を含むＢ７２Ｒ−ＶＳＤＬおよびＢ７２Ｒベースの融合ポリペプチドの発現のためのプラスミドの概略のマップである。プラスミド機能は、複製起点（ＣｏｌＥ１  ｏｒｉ）、ｌａｃリプレッサー遺伝子（ｌａｃＩ）、ｔｒｃおよびｔａｃプロモーター、ＶＳＤＬ融合遺伝子、転写ターミネーター（ｒｒｎＢＴ１Ｔ２）およびカナマイシン耐性マーカー（Ｋｍ）である。
【図３ｂ】ＶＳＤＬの３、６、８および１０個の直列型反復を含むＢ７２Ｒ−ＶＳＤＬおよびＢ７２Ｒベースの融合ポリペプチドの発現のためのプラスミドの概略のマップである。プラスミド機能は、複製起点（ＣｏｌＥ１  ｏｒｉ）、ｌａｃリプレッサー遺伝子（ｌａｃＩ）、ｔｒｃおよびｔａｃプロモーター、ＶＳＤＬ融合遺伝子、転写ターミネーター（ｒｒｎＢＴ１Ｔ２）およびカナマイシン耐性マーカー（Ｋｍ）である。
【図３ｃ】ＶＳＤＬの３、６、８および１０個の直列型反復を含むＢ７２Ｒ−ＶＳＤＬおよびＢ７２Ｒベースの融合ポリペプチドの発現のためのプラスミドの概略のマップである。プラスミド機能は、複製起点（ＣｏｌＥ１  ｏｒｉ）、ｌａｃリプレッサー遺伝子（ｌａｃＩ）、ｔｒｃおよびｔａｃプロモーター、ＶＳＤＬ融合遺伝子、転写ターミネーター（ｒｒｎＢＴ１Ｔ２）およびカナマイシン耐性マーカー（Ｋｍ）である。
【図３ｄ】ＶＳＤＬの３、６、８および１０個の直列型反復を含むＢ７２Ｒ−ＶＳＤＬおよびＢ７２Ｒベースの融合ポリペプチドの発現のためのプラスミドの概略のマップである。プラスミド機能は、複製起点（ＣｏｌＥ１  ｏｒｉ）、ｌａｃリプレッサー遺伝子（ｌａｃＩ）、ｔｒｃおよびｔａｃプロモーター、ＶＳＤＬ融合遺伝子、転写ターミネーター（ｒｒｎＢＴ１Ｔ２）およびカナマイシン耐性マーカー（Ｋｍ）である。
【図３ｅ】ＶＳＤＬの３、６、８および１０個の直列型反復を含むＢ７２Ｒ−ＶＳＤＬおよびＢ７２Ｒベースの融合ポリペプチドの発現のためのプラスミドの概略のマップである。プラスミド機能は、複製起点（ＣｏｌＥ１  ｏｒｉ）、ｌａｃリプレッサー遺伝子（ｌａｃＩ）、ｔｒｃおよびｔａｃプロモーター、ＶＳＤＬ融合遺伝子、転写ターミネーター（ｒｒｎＢＴ１Ｔ２）およびカナマイシン耐性マーカー（Ｋｍ）である。
【図３ｆ】ＶＳＤＬの３、６、８および１０個の直列型反復を含むＢ７２Ｒ−ＶＳＤＬおよびＢ７２Ｒベースの融合ポリペプチドの発現のためのプラスミドの概略のマップである。プラスミド機能は、複製起点（ＣｏｌＥ１  ｏｒｉ）、ｌａｃリプレッサー遺伝子（ｌａｃＩ）、ｔｒｃおよびｔａｃプロモーター、ＶＳＤＬ融合遺伝子、転写ターミネーター（ｒｒｎＢＴ１Ｔ２）およびカナマイシン耐性マーカー（Ｋｍ）である。
【図４】Ｂ７２Ｒ−ＶＳＤＬおよびＢ７２Ｒ−（ＶＳＤＬ）３発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の画像である。分画培養サンプル（Ｐ：ペレット／不溶性画分、ＷＣＬ：全細胞溶解液、およびＳ：上澄み／可溶性画分）が、還元４〜１２％ＮｕＰＡＧＥ  ＭＥＳ  ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ、米国）に流され、そして、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（登録商標）Ｓａｆｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて染色された。予備染色されている標準タンパク質ＳｅｅＢｌｕｅ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が分子量マーカーとして用いられた。
【図５】Ｂ７２（Ｑ）Ｒ−ＶＳＤＬ融合ポリペプチド発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の画像である。示される培養サンプルは基準化され、そして細胞溶解液は、分子量マーカーとしての予備染色されている標準タンパク質ＳｅｅＢｌｕｅ（登録商標）に対して、還元４〜１２％ＮｕＰＡＧＥ  ＭＥＳゲル上に流され、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（登録商標）Ｓａｆｅを用いて染色された。
【図６】流加培養後のＢ７２Ｒ−ＶＳＤＬおよびＢ７２Ｒ−（ＶＳＤＬ）３発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の画像である。示される培養サンプルは基準化され、そして細胞溶解液は、分子量マーカーとしての予備染色されている標準タンパク質ＳｅｅＢｌｕｅ（登録商標）に対して、還元４−１２％ＮｕＰＡＧＥ  ＭＥＳゲル上に流され、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（登録商標）Ｓａｆｅを用いて染色された。
【図７】温での終夜消化後にＢ７２Ｒ−（ＶＳＤＬ）３溶解物（３ｇ／Ｌ融合ポリペプチド）から生成されたＶＳＤＬ量に添加された、ＴｒｙｐＺｅａｎ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＣｏ、ＳｔＬｏｕｉｓ  Ｍｏ、米国）の効果を示す図である。
【図８】消化された細胞溶解液からの組換えＶＳＤＬのクロマトグラフィーによる分離（Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ  ＣＧ３００Ｃ；Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  ＨａａｓＣｏｍｐａｎｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ＰＡ、米国）を示すトレースである。実線＝ＵＶ２８０の吸収および破線＝伝導度。
【図９】消化された細胞溶解液からの組換えＶＳＤＬのクロマトグラフィーによる分離（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＴＭＡＥ；Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｃ、ＷｈｉｔｅｈｏｕｓｅＳｔａｔｉｏｎ  ＮＪ、米国）を示すトレースである。実線＝ＵＶ２８０の吸収および破線＝伝導度。
【図１０】Ｃａｒｙ５０分光光度計（Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｃ、ＰａｌｏＡｌｔｏ  ＣＡ、米国）を用いて測定された、合成ＶＳＤＬペプチドおよび組み換えＶＳＤＬ（右側）のＵＶ２８０の吸収プロファイルを示す。
【図１１】温浸された細胞溶解液からの組換えＶＳＤＬのクロマトグラフィーによる分離（修飾Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ  ＣＧ３００Ｃ  プロトコル）を示すトレースであり、囲みは、プールされた溶出液画分を示す。
【図１２】Ｃｈｒｏｍａｓｏｒｂメンブレンろ過後の、消化された細胞溶解液からの組換えＶＳＤＬの分離を示すトレースであり、囲みは、様々なプールされた溶出液画分を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明者は、有利なことに、ある種のペプチドのアミノ酸配列は通常、ペプチドの片方の末端に位置する単一のペプチド切断部位を除き特定のペプチド切断部位をもたないこと、または、このような配列をもつように設計され得ることに気付いた。本発明者らはまた、融合ポリペプチドという状況においてペプチドを発現させることにより、さらなるペプチド切断部位が、発現された融合ポリペプチドの切断が融合ポリペプチドからペプチドを切り出すように、対象ペプチドの反対側の末端に提供され得ることを実現した。このような産生システムは、興味の対象であるペプチドを治療上の使用のために十分な品質および量で組換えによって産生するための手段を有利に提供し得るであろう。
【００２０】
よって、第１の態様において、本発明は、
ペプチドを含む融合ポリペプチドを発現する工程であって、前記ペプチドが、１つまたは２つ以上のペプチド切断部位（または複数の切断部位）によって隣接されており、および、そうではない場合、前記ペプチド切断部位（または複数の切断部位）が前記ペプチドに存在しない工程と、
ペプチド切断部位（または複数の切断部位）での切断を行う切断剤（または複数の切断剤）を用いて、融合ポリペプチドをペプチド切断部位（または複数の切断部位）で切断する工程と、
を含む組換えペプチドの産生方法であって、
融合ポリペプチドを切断する工程が、融合ポリペプチドから前記ペプチドを切り出す方法を提供する。
【００２１】
「組換え」という用語は、当業者であれば、２つ以上の起源をもつ遺伝物質を含むまたはそれ由来の生物学的物質を指すこと、例えば、組換えペプチドとは一般的に、第２の起源である適切な宿主細胞中で発現または産生される、第１の起源のペプチドをエンコードしているポリヌクレオチド分子から導かれるものであることこと、を把握するであろう。組換えペプチドを産生し得るさまざまな発現系、例えば特定のペプチドの発現に適した条件下での細胞培養での発現などが公知である。宿主細胞としては例えば、細菌細胞（例えば、大腸菌（Escherichia coli）、ストレプトマイセス種（Streptomyces sp.）、バチラス種（Bacillus sp.）、シュードモナス（Pseudomonas sp.）、スタフィロコッカス種（Staphylococcus sp.）（例えば、Ｓ．ティフィムリウム（S.Typhimurium）など）など）、例えば、酵母細胞（例えば、サッカロミケス  セレビシエSaccharomyces cerevisiae、ピキア  パストリス（Pichia pastorisなど）などの真菌細胞、カビまたは糸状菌（例えば、アスペルギルスAspergillus sp.など）、昆虫細胞（例えば、ショウジョウバエ  Ｓ２（Drosophila S2およびスポドプテラ  フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（例えば、スポドプテラ  Ｓｆ９細胞など）など、および、バキュロウイルスを用いた発現系など）、哺乳類細胞（チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）（Chinese Hampster Ovary）細胞、サル腎由来（ＣＯＳ）細胞、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞、ハムスター腎由来（ＢＨＫ）細胞、マウスメラノーマ細胞などを含む多数の細胞株が適切である）、および植物細胞などが挙げられる。代替として、組換えペプチドは、遺伝子組換え植物および動物で発現されてもよい。本発明において、融合ポリペプチドを発現させる工程が、発現宿主として大腸菌を用いて行なわれることが好ましい。
【００２２】
当業者であれば、「ペプチド（peptide）」なる用語は、第１のアミノ酸がアミノ（Ｎ）末端にあり、そして最後のアミノ酸がカルボキシル（Ｃ）末端であるようにペプチド結合によって相互結合されたアミノ酸の、枝分かれのない単鎖ポリマーを指すものとして熟知しているであろう。本発明の文脈において、本明細書中において用いられる「ペプチド」という用語は、発現され、そして、融合ポリペプチドの切断後に融合ポリペプチドから無傷（intact）で切り出されるであろう対象ペプチドを指すものとして理解されるべきである。ペプチドは、完全長ペプチド（すなわち、当業者によって理解されるように、エンコードしているヌクレオチド配列から転写されるであろう完全長のペプチド）であってもよい。しかし、ペプチドはまた、より大きなペプチドまたはポリペプチド由来であってもよく、例えば、ペプチドは、プレプロタンパク質の成熟ペプチド部分または多くのより小さなペプチドへとプロセッシングされ得るポリペプチドの一部分またはより大きなペプチドのフラグメントなどであってもよい。好ましくは、ペプチドは、エンコードしているヌクレオチド配列からその最終的な形へと翻訳され得る、すなわち、ペプチドは、本発明による切断剤（または複数の切断剤）による切断以外のいかなる追加の翻訳後プロセッシングをも受けない。しかし、本発明は、ペプチドが、より大きなペプチド、例えばプレプロタンパク質または多くのより小さなペプチドへとプロセッシングされ得るアミノ酸配列を含むポリペプチドなどの一部分である実施形態を除外することを意図している訳ではない（例えば、より大きなペプチドの一部分（または複数の部分）が、発現後にプロセッシングによって（例えば切断によって）除去され、ここでプロセッシングは、本発明による切断に加えて行われる）。ペプチドは、天然のペプチドまたは以下で記載されるように修飾されたペプチドであってもよい。
【００２３】
当業者であれば、「アミノ側（amino side）」または「アミノ方向（amino direction）」なる用語はペプチドに関連して用いられた場合、ペプチドのＮ末端への方向を指し、同様に、「カルボキシル側（carboxyl side）」または「カルボキシル方向（carboxyl direction）」なる用語はペプチドに関連して用いられた場合、ペプチドのＣ末端への方向を指しているということを理解するであろう。
【００２４】
本明細書中において用いられる「融合ポリペプチド（fusion polypeptide）」なる用語は、ペプチド結合によって相互結合されたアミノ酸の、枝分かれのない単鎖ポリマーへと互いに融合された少なくとも２つのペプチドを指し、これにより、第１のペプチドのＣ末端残基は、第２のペプチドのＮ末端残基に隣接する（任意には短いリンカー配列によって分離されていてもよい）。当業者であれば、多くのペプチドがこの形式で互いに融合され得、そしてこの場合、第２のペプチドのＣ末端残基が例えば第３のペプチドのＮ末端残基に隣接し得る、などを理解するであろう。
【００２５】
当業者であれば、用語「ペプチド切断部位（peptide cleavage site）」は、ペプチド主鎖が切断剤によって切断される部位であって、切断剤のための認識部位として機能する特定のアミノ酸またはアミノ酸の特定の配列と関連付けられる部位であることを熟知しているであろう。アミノ酸の、特定の認識配列の場合、切断剤は、その配列内の部位で、配列のＣ末端部もしくはＮ末端部で、またはその配列の外側で、すなわち配列からカルボキシルあるいはアミノ方向に外れたいくつかの残基で、ペプチド主鎖を切断し得る。
【００２６】
本発明によれば、前記ペプチドは、「１つまたは２つ以上のペプチド切断部位によって隣接される（flanked by one or more peptide cleavage sites）」。この文言は、ペプチド切断部位が、融合ポリペプチド内のペプチドの少なくとも１つの末端、より好ましくはペプチドの両末端（例えば、それぞれのペプチドのコピーに対して１つがＮ末端に、および１つがＣ末端に位置されているなど）に位置されており、これにより、前記ペプチドが、ペプチド切断部位において切断を行う切断剤を用いた融合ポリペプチドの切断の際に、融合ポリペプチドから遊離され得ることを意味することを意図している。
【００２７】
切断剤は、特異的な方法で、すなわち、特定のアミノ酸または特定のアミノ酸配列と関連付けられる特異的なペプチド切断部位でペプチドを切断する、当業者に公知の任意の適切な切断剤であり得る。切断剤は、化学的切断剤または酵素的切断剤であってもよい。本発明において利用され得る多くの切断剤が表１に挙げられている。
【００２８】
【表１】
2015510770.tif 000003
【００２９】
本明細書中、ペプチド切断部位は、切断剤のための認識部位として機能する単独の特定なアミノ酸のアミノ側もしくはカルボキシル側に配置されている矢印によって、または、アミノ側、カルボキシル側もしくは切断剤のための認識部位として機能する特定のアミノ酸配列内に配置されている矢印によって示される。ペプチド切断部位（および本明細書中の全てのアミノ酸配列）に関連して用いられる３文字または１文字アミノ酸コードを表２に示す。
【００３０】
【表２】
2015510770.tif 000004
【００３１】
好ましい実施形態において、切断剤は、トリプシンまたはトリプシン様酵素（すなわち、トリプシン切断部位において切断を行う酵素）である。
【００３２】
しかし、他の切断剤、例えば、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、キモトリプシン−高特異性、キモトリプシン−低特異性、因子Ｘａ、ギ酸、グルタミルエンドペプチダーゼ、グランザイムＢ、ヒドロキシルアミン、ヨード安息香酸、ＬｙｓＣ、ＬｙｓＮ、ＮＴＣＢ（２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸）、ペプシン（ｐＨ１．３）、ペプシン（ｐＨ＞２）、プロリン−エンドペプチダーゼ、プロテイナーゼＫ、ぶどう球菌ペプチターゼＩ、サーモリシン、ユビキチンプロテアーゼなどもまた、本発明において使用に適切であり得る。当業者であれば、本発明に従って他の切断剤が利用され得ることを理解し、そして、特定の切断剤を用いた切断にどのような条件が必要であるかを決定するための方法、適切な切断剤のためのペプチド切断部位を決定する方法を熟知しているであろう。
【００３３】
ある実施形態において、ペプチド切断部位は、ペプチドの両端に設けられ、そして、融合ポリペプチドからペプチドを切り出すために２つの切断剤が必要とされるかもしれない。
【００３４】
本発明者らの認識によれば、融合ポリペプチドは、有利には、ペプチドのコンカテマー型コピーを含んでいてもよく、ここでそれぞれのペプチドのコピーは、１つまたは２つ以上のペプチド切断部位によって隣接されている。
【００３５】
よって、第２の態様において、本発明は、
１つまたは２つ以上のペプチド切断部位（または複数の切断部位）によって隣接されており、および、そうではない場合、前記ペプチド切断部位（または複数の切断部位）が前記ペプチドに存在しないことを特徴とするペプチドのコンカテマー型コピーを含む融合ポリペプチドを発現する工程と、
ペプチド切断部位（または複数の切断部位）での切断を行う切断剤（または複数の切断剤）を用いて、融合ポリペプチドをペプチド切断部位（または複数の切断部位）で切断する工程と
を含む組換えペプチドの産生方法であって、
融合ポリペプチドを切断する工程が、融合ポリペプチドから前記ペプチドを切り出す方法を提供する。。
【００３６】
「ペプチドのコンカテマー型コピー（concatemeric copies of the peptide）」という文言は、直列型の頭尾結合配置で作動可能に連結された、２つ以上のペプチドを指すものとして理解されるべきである。これにより、第１のペプチドのＣ末端残基は、第２のペプチドのＮ末端残基に隣接する。いくつかの実施形態において、２個よりも多くのコンカテマー型ペプチドが企図され、例えば、第２のペプチドのＣ末端残基は、第３のペプチドのＮ末端に隣接する。好ましくは、１個のペプチドのＣ末端残基は、以下のペプチドのＮ末端残基に直接隣接する。しかし、当業者であれば、ペプチドは、ペプチドのコピーを共に結合するために用いることが可能な短リンカー配列によって結合することが可能であることを理解する。このような実施形態も、本発明の範囲内であることが理解されるべきである。
【００３７】
融合ポリペプチドが十分なレベルまで発現される限り、任意の数のペプチドのコピーが融合ポリペプチド内にコンカテマー型に配置され得る。ある実施形態において、融合ポリペプチドは、ペプチドの２個〜２０個の（またはそれ以上の）コンカテマー型コピーを含む。例えば、融合ポリペプチドは、ペプチドの２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個または２０個のコンカテマー型コピーを含み得る。ある実施形態において、融合ポリペプチドは、２個〜１０個のコンカテマー型ペプチドを含み得る。一実施形態において、融合ポリペプチドは、ペプチドの３個のコンカテマー型コピーを含む。別の実施形態において、融合ポリペプチドは、ペプチドの１０個のコンカテマー型コピーを含む。しかしながら、融合ポリペプチド中に特定の数のコピー、例えばペプチドの３個のコンカテマー型コピーなどがある場合、合計で３個のペプチドがポリペプチド中にあると理解されるべきである。よって、「ペプチドの３個のコンカテマー型コピー（concatemeric copies of the peptide）」とは、ペプチドの３個の「コピー」に加えて元のペプチドがあることを意味しているわけではない。コンカテマー型ペプチドを含む融合ポリペプチド（および前記融合ポリペプチドをエンコードしているポリヌクレオチド構築物）は、追加で、本明細書中において、例えば３個のコンカテマー型ペプチドが存在する場合「３量体（3-mer）」、６個のコンカテマー型ペプチドが存在する場合「６量体（6-mer）」などと示される。同様に、単一のペプチドを含む融合ポリペプチド（および前記融合ポリペプチドをエンコードしているポリヌクレオチド構築物）は、追加で、本明細書中において、「１量体（1-mer）」と示される。
【００３８】
本発明によれば、前記ペプチドは、「１つまたは２つ以上のペプチド切断部位によって隣接される（flanked by one or more peptide cleavage sites）」。ペプチドのコンカテマーコピーに関連して、この文言は、ペプチド切断部位が融合ポリペプチド内においてペプチドの全てのコピーのそれぞれの少なくとも１つの末端、より好ましくはペプチドの両端（例えば、ペプチドのそれぞれのコピーに関して１つがＮ末端におよびもう１つがＣ末端に配置される）に配置されることを意味することを意図しており、これにより、ペプチド切断部位で切断を行う切断剤を用いた融合ポリペプチドが切断にともない、前記ペプチドが融合ポリペプチドから切り出され得る。
【００３９】
好ましい実施形態において、ペプチド切断部位は、ペプチドのそれぞれのコピーの両末端に提供され、その配置は、ペプチドのそれぞれのコピーの間の単一のペプチド切断部位によって、前記部位における単一の切断剤によるペプチド切断が、ペプチドの１つのコピーのＣ末端および隣接したペプチドのコピーのＮ末端が同時に産生されるようなものである。本実施形態において、単一のペプチド切断部位がペプチドの全コピーのあいだで同じ型（例えば、Ｒ↓など）であることが好ましい。
【００４０】
本発明の第２の形態である方法は、配列内ペプチド切断部位をもたないことに特徴付けられる任意のペプチドを産生するために特に適しているであろう。
【００４１】
ある実施形態において、本発明のペプチドは、天然の配列を有する。本文脈において、「天然（native）」なる用語は、ペプチドの配列が天然で見られる、すなわち、例えばペプチド切断部位を除去するあるいはアミノ酸置換を導入するなどのために修飾されていないことを意味することが意図されている。しかしながら、ペプチドは、トランケートされた天然配列または天然の変異体配列を有していてもよい。
【００４２】
代替的な実施形態において、ペプチドは、修飾されていてもよい。本発明における使用のために適切な修飾ペプチドは、そのような変異（または複数の変異）が生物学的活性における実質的な減少または変化を（すなわち天然のペプチドと比較して）もたらさず、および、さらなるペプチド切断部位（または複数の切断部位）（好ましくは、さらなるトリプシン切断部位）を導入しないという条件で、アミノ酸配列中にマイナーな変異（または複数の変異）を含む、天然ペプチドの誘導体、変異体または模倣物を含み得る。これらの変異（または複数の変異）は、保存的アミノ酸置換を含み得る（例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ；およびＰｒｏ、Ｎα−アルキルアミノ酸および非保存的アミノ酸置換）。表３に、一般的な保存的アミノ酸置換を詳細に示す。
【００４３】
【表３】
2015510770.tif 000005
【００４４】
適切な修飾ペプチドは、当業者に公知の任意の方法を用いて得られ得る。例えば、ペプチドの模倣物は、二次および三次構造情報がない場合アミノ酸配列に基づき、当業者に公知の任意の方法を用いて設計され得る。（Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍら、１９９９）。
【００４５】
さらに、当業者であれば、既存の配列内ペプチド切断部位を除去するために（例えば、適切なアミノ酸の置換または欠失によって）ペプチドを設計することが可能であるかもしれないことを理解するであろう。例えば、（ＮＣＢＩの登録番号ＮＰ＿００２０４５であるヒトグルカゴンプレプロタンパク質のアミノ酸９８〜１２７由来の）天然ヒトグルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ）−１のアミノ酸配列は、Ｃ末端アルギニン（Ｒ）残基および２個の配列内リジン（Ｋ）残基を含む。これら２個の配列内リジン残基は、例えばグルタミン（Ｑ）またはアスパラギン（Ｎ）などに修飾され得、これは、配列内トリプシン切断部位を除去する。別の例において、いくつかの膜タンパク質は、細胞質タンパク質と比較して少数のアルギニンおよびリジン残基を有しており、そして、このような残基は、配列内ペプチド切断部位をもたないペプチドを作製するような修飾によって除去され得るであろう。
【００４６】
ある実施形態において、ペプチドのコンカテマー型コピーのそれぞれは、ペプチドの全ての他のコンカテマー型コピーと同一である。しかし、代替的な実施形態において、ペプチドの種々の変異体がコンカテマー内で発現されてもよい。すなわち、「ペプチドのコンカテマー型コピー（concatemeric copies of the peptide）」なる用語は、ペプチドの１つ（またはそれ以上）の「コンカテマー型コピー」が天然の変異体またはペプチドの別のコンカテマー型コピーと比較して修飾されたペプチドである状況を含んでいることを意図する。例えば、ペプチドのあるコンカテマー型コピーが、天然の配列を含んでいてもよく、一方、ペプチドの別のあるコンカテマー型コピーは、ペプチドの天然の変異体を含む。別の例において、ペプチドの種々のコンカテマー型コピーは、切断剤のための認識部位として機能するための一つの異なるアミノ酸または複数のアミノ酸の配列を作製するために、種々の天然のまたは修飾されたアミノ酸配列を含み得る。
【００４７】
ある実施形態において、ペプチド切断部位は、トリプシン切断部位である。
【００４８】
「トリプシン切断部位」なる用語は、当業者であれば、ペプチド主鎖がトリプシンによって切断される、トリプシンのための認識部位として機能する特定のアミノ酸または特定のアミノ酸配列と関連付けられる部位を示していると理解するであろう。トリプシンは、それらの直後にプロリン（Ｐ）がある場合を除いて、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）アミノ酸残基のカルボキシル側でペプチドを切断する傾向がある。しかし、リジンまたはアルギニン残基の周りの正確なアミノ酸残基は、トリプシン切断の効率に影響を及ぼし得る。トリプシンのための認識部位としては、例えば、ＤＲ↓Ｅ、ＱＲ↓Ｅ、ＳＫ↓Ｎなどが挙げられ、ここで、矢印は、ペプチド切断部位（すなわち、ペプチド主鎖が切断される部位）を指定している。しかし、当業者であれば、大部分のアルギニンまたはリジン残基が、トリプシンによるカルボキシル側切断のための部位として機能し得ることを理解するであろう。
【００４９】
切断工程は、当業者により理解されるであろうように、例えば、切断が行なわれるために適切な条件下、トリプシン切断部位で（すなわち、アルギニンまたはリジン残基のカルボキシル側で）切断する切断剤とともに融合ポリペプチドをインキュベートすることによりなされ得る。
【００５０】
ある実施形態において、切断剤はトリプシンである。トリプシンは、セリンプロテアーゼであり、そしてペプチドを切断するために研究室でしばしば用いられる。本発明による使用のためのトリプシンは、多数の種々の種（例えば、ウシ、ブタ、ヒトなどを含む）から単離され得、これらの全ては市販されており、および／または、組換えにより産生されたトリプシン（例えば、ウシ、ブタなどを含む）であって同様に市販されているトリプシンが使用されてもよい。さらに、トリプシンは、例えばトウモロコシ細胞などの植物細胞中で組換えにより産生され得る。ＴｒｙｐＺｅａｎ（登録商標）（例えば、ウシＴｒｙｐＺｅａｎ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）は、植物により産生された組換えトリプシンの例である。よって、ある実施形態において、切断剤は、植物細胞によって組換えにより産生されたトリプシンである。植物により産生される組換えトリプシンは、最終的なペプチド産物中に存在する、動物由来の望ましくない混入物の可能性を低減するために、治療上の使用を目的とするペプチドの切断において特に有用である。しかし、トリプシンが動物混入物を実質的に含まない（または受容可能なほどの低レベルでしか含まない）ような方法で産生される他のトリプシン産物も、治療上の使用のためのペプチドのために有用であり得る。例えば、切断剤は、酵母細胞で産成されたトリプシンであってもよい。好ましくは、切断剤は、組換えトリプシンである。
【００５１】
しかし、当業者であれば、本発明によるある状況下でトリプシン切断部位でペプチドを切断するためにまた適切であり得る、トリプシンまたはトリプシン様活性を有する多数の他の酵素（すなわちトリプシン切断部位で切断するトリプシン様酵素）があることを理解するであろう。例えば、トロンビンは、アミノ酸配列ＬＶＰＲ↓ＧＳ（配列番号７）を選択的に認識し、そしてアルギニン残基およびグリシン残基のあいだのペプチド切断部位（すなわち、アルギニン（Ｒ）残基のカルボキシル側）で切断するトリプシン様セリンプロテアーゼである。よって、トロンビンは、いくつかのトリプシン切断部位でペプチドを切断するであろう。別の例において、クロストリパイン（エンドプロテイナーゼＡｒｇ−ＣおよびクロストリジオペプチダーゼＢとしても知られる）は、主としてアルギニン残基で切断するが、より少ない程度でリジン残基でも切断し得る。したがって、クロストリパインは、トリプシン切断部位で切断を行うであろう。当業者であれば、本発明のトリプシン切断部位でペプチドを切断するために適切である他の切断剤もまたあることを理解するであろう。よって、ある実施形態において、切断剤は、トリプシンまたはトリプシン様酵素である。ある実施形態において、切断剤は、組換えトリプシンまたは組換えトリプシン様酵素である。
【００５２】
トリプシンによる消化時間は、必要に応じて変更され得る。例えば、融合ポリペプチドは、トリプシンまたはトリプシン様酵素によって、例えば５分間、１時間、２時間、６時間または終夜などで消化され得る。
【００５３】
ある実施形態において、ペプチドは、Ｃ末端トリプシン切断部位を含む。ある実施形態において、ペプチドは、以下の式
Ｘ１−Ｘ２−…Ｘｎ−１−Ｘｎ−（Ｒ／Ｋ）  （配列番号１）；
式中、Ｘはアルギニンまたはリジンを除く任意のアミノ酸であり、Ｒ／Ｋはアルギニンまたはリジンであり、およびｎはアミノ酸の任意の適切な数である
によるアミノ酸配列を含む。
【００５４】
ある実施形態において、ペプチドは、治療上の使用のために産生される。よって、ペプチドは、サイトカインもしくはホルモン（プロホルモン分子から切り出されるホルモンを含む）、またはエピトープもしくは抗原（例えばワクチンとしての使用のため）を含んでいてもよい。
【００５５】
ペプチドは、例えば、３〜１００個のアミノ酸長、より好ましくは５〜５０個のアミノ酸長、およびさらにより好ましくは１０〜４５個のアミノ酸長であり得る。好ましい実施形態において、ペプチドは、３０〜４０個のアミノ酸長であり、例えば、３３個、３４個、３５個、３６個および３７個のアミノ酸長などを含むペプチドである。好ましくは、ペプチドは、配列内トリプシン切断部位（または複数の部位）を持たない。
【００５６】
ある実施形態において、ペプチドは、配列内ペプチド切断部位（または複数の部位）を除去するために、必要ならば修飾される、心房ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）由来のペプチドから選択される。より好ましくは、ペプチドは、血管拡張物質ペプチド（ＶＳＤＬ）またはその変異体もしくは修飾ペプチド、または、配列内ペプチド切断部位、および好ましくは配列内トリプシン切断部位をもたない（すなわち、Ｃ末端アルギニンを除き、全アルギニンおよびリジン残基が、好ましくはヒスチジン（Ｈ）を用いた保存的アミノ酸置換によって、アミノ酸置換の対象とされている）修飾されたカリウム排泄利尿薬ペプチド（ＫＰ）である
【００５７】
よって、ある実施形態において、ペプチドは、（配列内トリプシン切断部位をもたない）修飾ＫＰペプチドであり、および好ましくは、（ヒト心房性ナトリウム利尿プロホルモン（ｐｒｏＡＮＰ））の残基７９〜９８由来の）以下のアミノ酸配列：
Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｘａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｘｂ−Ｓｅｒ−Ｘｃ−Ｌｅｕ−Ｘｄ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（配列番号２０）；
式中、Ｘはアルギニンまたはリジンを除く任意のアミノ酸である
を含む、またはそれからなる修飾ヒトＫＰである。
【００５８】
好ましい実施形態において、ペプチドは、ＶＳＤＬペプチドまたはその変異体もしくは修飾ペプチドである。本明細書中において用いられるように、ＶＳＤＬの変異体は、天然の変異体であり得る。あるいは、変異体ＶＳＤＬは、修飾されたＶＳＤＬペプチドであってもよい。修飾されたＶＳＤＬペプチドとしては、変異体ペプチド（すなわち、非天然の変異体）だけではなく、ＤＬＶｅｓｅｌｙによる米国特許第５，６９１，３１０号（参照により本明細書中に組み込まれる）に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管拡張アッセイ（大動脈片を用いた）によって、または、ＤＬＶｅｓｅｌｙにより記載の増加した環状ＧＭＰレベルのためのアッセイ（（Ｖｅｓｅｌｙら、１９８７）によって測定される、生物学的活性において実質的な減少または変化をもたらさず（それが由来するＶＳＤＬペプチドの生物学的活性において１０％以下の減少または変化しか示さないなど）、および、前記切断剤によって認識されるさらなるペプチド切断部位（好ましくは、さらなるトリプシン切断部位（または複数の部位））を含まないまたは導入しないマイナーな変異をアミノ酸配列中に含む天然のＶＳＤＬペプチドの誘導体および模倣物も含まれる。これらの変異としては、例えば上記の表３中に詳述される、保存的アミノ酸置換が挙げられ得る。ＶＳＤＬペプチド内の適切なアミノ酸置換のいくつかの具体的例としては、例えば、Ｐｒｏ→Ｇｌｎ（特には、ｐｒｏＡＮＰの４１番目の位置；すなわちＶＳＤＬペプチドの１０番目の位置における）、Ｔｈｒ→Ａｌａ（特には、ｐｒｏＡＮＰの５９番目の位置；すなわちＶＳＤＬペプチドの２８番目の位置における）、Ｇｌｕ→Ａｓｐ（特には、ｐｒｏＡＮＰの６１番目の位置；すなわちＶＳＤＬペプチドの３０番目の位置における）、およびＳｅｒ→Ａｓｎ（特には、ｐｒｏＡＮＰの６３番目の位置；すなわちＶＳＤＬペプチドの３２番目の位置における）が挙げられ得る。
【００５９】
より好ましくは、ペプチドは、例えば以下に示される、ヒトＶＳＤＬ（ヒトｐｒｏＡＮＰの残基３１〜６７由来）の天然の配列などの天然の配列を有するＶＳＤＬペプチドである：
Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−
Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ（配列番号２）。
【００６０】
他の適切な天然のＶＳＤＬペプチドとしては、例えば：
ポンゴ  ピュグマエウス（Pongob pygmaeus）（一般的にはオランウータン）
Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−
Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ（配列番号８）；
および
フェリス  カトウス（Felis catus）
Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−
Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ（配列番号９）。
【００６１】
最も好ましくは、ペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＶＳＤＬペプチドである。しかし、他の実施形態において、ＶＳＤＬペプチドは、代替的に、配列番号８または９に記載のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなっていもよい。
【００６２】
好ましくは、ＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）は、Ｃ末端アルギニン残基を含む。例えば、本明細書中に記載の天然のＶＳＤＬペプチドは、Ｃ末端アルギニン残基を含むが、配列内アルギニンまたはリジン残基は含まない。そのため、Ｃ末端アルギニン残基は、Ｃ末端に配置されるペプチド切断部位として機能し得る。すなわち、例えばトリプシンおよびトリプシン様酵素などの、アルギニン残基のカルボキシル側で切断するペプチド切断剤は、融合ポリペプチドから（例えばＶＳＤＬペプチドまたはその変異体もしくは修飾ペプチドの隣接するコピーから）ＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）を正確にＣ末端で切断するであろう。
【００６３】
しかし、ヒトＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）は、配列内アルギニン残基が欠失しているだけでなく、追加でアスパラギン酸、システイン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニンまたはチロシン残基が欠失している。よって、以下に記載されるように、本発明に従って、これらの部位の１つで、すなわち、例えば、ＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）に関してＮ末端に配置されているペプチド切断部位で切断するペプチド切断部位を用いることが可能であるかもしれない。代替的にまたは追加的に、ＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）のＣ末端アルギニン残基は、別のアスパラギン酸、システイン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニンまたはチロシン残基によって置換され得、これにより、ペプチドはこれらの残基の１つで切断する切断剤によって融合ポリペプチドから切断され得る。当業者であれば、本実施形態が、代替的に、本明細書中に記載の他の適切なペプチドに適用され得ることを理解するであろう。
【００６４】
ある実施形態において、融合ポリペプチドは、ペプチド切断部位を含む、ＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）に関してＮ末端に配置されている１つまたは２つ以上のアミノ酸を含む。好ましくは、Ｎ末端に配置されているペプチド切断部位は、ＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）の直接隣接するＮ末端に配置される。本発明の好ましい実施形態において、融合ポリペプチドは、ＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）に、Ｎ末端に配置されるペプチド切断部位を提供する、Ｃ末端ペプチド切断部位を有するリーダー融合パートナーを含む。
【００６５】
ある実施形態において、ＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）は、「トリプシン切断部位によって隣接される（flanked by trypsin cleavage sites）」。これは、トリプシン切断部位が、ＶＳＤＬペプチドまたはその変異体もしくは修飾ペプチドの両末端で融合ペプチド内に位置されること（すなわち、１つがＶＳＤＬペプチドのＮ末端部に、および、１つがＶＳＤＬペプチドのＣ末端部に）に配置され、これによって、ＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）が、トリプシン切断部位で切断する酵素を用いた消化により、融合ポリペプチドから切り出され得る。当業者であれば、切断が、トリプシン切断部位のアルギニンまたはリジン残基のカルボキシル側で起こる際に、アルギニンまたはリジン残基が、切り出しにともないＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）から除外され、一方、Ｃ末端に配置されているトリプシン切断部位は、アルギニンまたはリジンが切り出しの際にＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）中に含まれているであろう（すなわち、アルギニンまたはリジン残基は、切り出しにともないＶＳＤＬペプチドのＣ末端残基を形成するであろう）ことを意味することを理解するであろう。
【００６６】
好ましくは、融合ポリペプチドから切り出されるＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）は無傷（すなわち、完全長のＶＳＤＬペプチド）であるが、融合ポリペプチドは、トリプシン切断部位の位置を変化させることにより、トランケートされたまたは伸長されたＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）の変異体を切り出すように設計されてもよいことが理解されるべきである。例えば、本発明は、Ｎ末端に配置されたトリプシン切断部位が、ある特定の状況下で、ＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）のさらに上流（すなわちアミノ方向）に配置されており、酵素切断にともないＮ末端が延長されたＶＳＤＬペプチドを産生する、融合ポリペプチドの発現を含む。同様に、Ｃ末端が延長されたＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）は、Ｃ末端トリプシン切断部位の前に追加のアミノ酸を含むように設計され得る。代替的に、トランケートされたＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）が、当業者によって理解されるように、アミノ酸の欠失によって設計されてもよい。
【００６７】
ある実施形態において、融合ポリペプチドは、ＶＳＤＬペプチドのコンカテマー型コピー（すなわち、ＶＳＤＬペプチドのコンカテマー型繰り返し）またはその変異体もしくは修飾ペプチドを含む。好ましくは、ＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）のそれぞれのコピーは、それぞれのＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）のＣ末端にペプチド切断部位（例えば、トリプシン切断部位）を有し、これにより、ペプチド切断部位が追加で、コンカテマー型配置におけるＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）（融合ポリペプチド中の最後のＶＳＤＬペプチドを除く）のためのＮ末端に配置されるペプチド切断部位として機能し、これにより、それぞれのＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）は、本発明に従いペプチド切断部位によって隣接される。この配置は、それぞれのＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）が、切断剤を用いた切断に際して融合ポリペプチドから個々に切り出されるという有利な結果をもたらす。
【００６８】
融合ポリペプチドが十分なレベルまで発現される限り、ＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）の任意の数のコピーが、融合ポリペプチド内にコンカテマー型に配置され得る。ある実施形態において、融合ポリペプチドは、少なくとも０．０１ｇ／Ｌで発現されるが、好ましくは、融合ポリペプチドは、少なくとも０．５ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも２ｇ／Ｌ、より好ましくは５ｇ／Ｌ、またはより好ましくは１０ｇ／Ｌで発現される。好ましくは、融合ポリペプチドは、ＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）の２個〜２０個の（またはそれ以上の）コンカテマー型コピーを含む。例えば、融合ポリペプチドは、ＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）の２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個または２０個のコンカテマー型コピーを含み得る。ある実施形態において、融合ポリペプチドは、ＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）の２個〜１０個のコンカテマー型コピーを含む。ある好ましい実施形態において、融合ポリペプチドは、ＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）の３個のコンカテマー型コピーを含む。別の実施形態において、融合ポリペプチドは、ＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）の１０個のコンカテマー型コピーを含む。いくつかの実施形態において、ＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）の種々の変異体がコンカテマー型に発現され得る。
【００６９】
コンカテマー型ＶＳＤＬペプチドを含む融合ポリペプチド（および前記融合ポリペプチドをエンコードしているポリヌクレオチド構築物）またはその変異体もしくは修飾ペプチドは、追加で、本明細書中において、例えば３個のコンカテマー型ＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）が存在する場合「３量体」、６個のコンカテマー型ＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）が存在する場合「６量体」などと称される。同様に、単一のＶＳＤＬペプチドを含む融合ポリペプチド、またはその変異体もしくは修飾ペプチド（および前記融合ポリペプチドをエンコードしているポリヌクレオチド構築物）は、追加で、本明細書中において、「１量体」と称される。
【００７０】
ペプチドがＣ末端ペプチド切断部位を含む、本発明の実施形態において、本発明は、一連のコンカテマー型ペプチド中の第１のペプチドがＮ末端ペプチド切断部位をもたないために融合ポリペプチドから切り出されない状況をその請求の範囲内に含むことを意図する。同様に、ペプチドがＮ末端ペプチド切断部位を含む、本発明の実施形態において、本発明は、一連のコンカテマー型ペプチド中の最後のペプチドがＣ末端ペプチド切断部位をもたないために融合ポリペプチドから切り出されない状況をその請求の範囲内に含むことを意図する。しかし、好ましくは、融合ポリペプチドは、ペプチドのコンカテマー型コピーのそれぞれが融合ポリペプチドから切り出され得るように、ペプチド切断部位をさらに含む（すなわち、Ｃ末端ペプチド切断部位を含むペプチドのコンカテマー型コピーに関してＮ末端に配置される、代替的には、Ｎ末端ペプチド切断部位を含むペプチドのコンカテマー型コピーに関してＣ末端に配置される。
【００７１】
ある実施形態において、融合ポリペプチドは、融合パートナーを含み得る。有利には、融合パートナーはまた、増大した溶解性、安定性、活性（例えば、ミスフォールディングを低減させることによって）をもつ融合ポリペプチドを提供するおよび／または発現効率を向上させ得る。好ましくは、融合パートナーは、ペプチドがその一方の末端にペプチド切断部位を含むかまたは備えている場合に、本発明にしたがってペプチドがペプチド切断部位によって隣接されるように、隣接ペプチドの他方の末端に隣接したペプチド切断部位を提供する。ある実施形態において、融合ポリペプチドは、ペプチドと比較して異なるペプチド切断部位を含み得る。この場合、融合ポリペプチドからペプチドを放出するために２つの切断剤が必要になり得る。
【００７２】
ある実施形態において、融合ポリペプチドは、トレイリング融合パートナー、すなわち、ペプチドに関してまたはペプチドのコンカテマー型コピーに関してＣ末端に配置されているトレイリング融合パートナーを含む。トレイリング融合パートナーは、Ｃ末端に配置されるペプチド切断部位をペプチドに（例えば、Ｎ末端に配置されたペプチド切断部位を含み、このため本発明によるペプチド切断部位によって隣接されているペプチドに）提供するＮ末端ペプチド切断部位を含み得る。よって、ある実施形態において、トレイリング融合ペプチドは、Ｎ末端ペプチド切断部位を含む。当業者であれば、トレイリング融合パートナーのこのようなＮ末端ペプチド切断部位が、先頭の（leading）ペプチドのＣ末端に配置される（すなわち、トレイリング融合パートナーに関してＮ末端に配置される）ペプチド切断部位として機能し得るであろうことを理解するであろう。
【００７３】
代替的な実施形態において、融合ポリペプチドは、ペプチドまたはペプチドのコンカテマー型コピーに関してＮ末端に配置されるリーダー融合パートナーを含む。。リーダー融合パートナーは、Ｎ末端に配置されるペプチド切断部位をペプチドに（例えば、Ｃ末端に配置されたペプチド切断部位を含み、このため本発明によるペプチド切断部位によって隣接されているペプチドに）提供するＣ末端ペプチド切断部位を含み得る。よって、ある実施形態において、リーダー融合ペプチドは、Ｃ末端ペプチド切断部位を含む。当業者であれば、リーダー融合パートナーのこのようなＣ末端ペプチド切断部位が、次の（following）ペプチドのＮ末端に配置される（すなわち、リーダー融合パートナーに関してＣ末端に配置される）ペプチド切断部位として機能し得るであろうことを理解するであろう。
【００７４】
得られるペプチドが十分な品質および量で発現される限り、当業者に公知の任意の適切なペプチドが、融合パートナーとなり得る。公知の融合パートナーの例としては例えば、ユビキチン、ぶどう球菌プロテインＡ、チオレドキシン、マルトース結合タンパク質、グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ、プロキモシン、ベータ−ガラクトシダーゼ、Ｔ４由来ｇｐ５５などが挙げられる。例えばＨｉｓタグ、Ｂｔａｇ、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃタグ、プロテインＣタグ、Ｓ−タグ、メチオニンなどの公知の組換えタグもまた、融合パートナーを与え得る。融合パートナーは、任意には、追加のペプチド切断部位を含み得、その結果、融合ポリペプチドの切断にともない多数の小さなペプチドへと切断され、これは、所望のペプチドの精製を助けるかもしれない。
【００７５】
ある実施形態において、融合ポリペプチドは、インターロイキン（ＩＬ）−２、例えばウシＩＬ−２など由来のリーダー融合ポリペプチドを含む。より好ましくは、リーダー融合パートナーは、本明細書中においてＢ７２Ｒと称されるウシＩＬ−２由来７２アミノ酸フラグメントであり、以下のアミノ酸配列を有する：
Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｒｇ（配列番号３）。
【００７６】
よって、ある実施形態において、リーダー融合パートナーはＢ７２Ｒである。
【００７７】
ある実施形態において、Ｂ７２Ｒ融合パートナーの最後から２番目のアスパラギン酸残基は、グルタミン残基に置換されており（本明細書中、Ｂ７２（Ｑ）Ｒと称される）、以下のアミノ酸配列を有する：
Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ（配列番号１０）。
【００７８】
よって、ある実施形態において、リーダー融合パートナーは、Ｂ７２（Ｑ）Ｒである。
【００７９】
好ましい実施形態において、リーダー融合パートナーは、ペプチド、または代替的には、ペプチドの第１のコンカテマー型コピーの直前に置かれる。コンカテマー型ペプチドに関連する好ましい実施形態において、第１のペプチドは、第２のペプチドの直前に設けられる（以下同様に続く）。
【００８０】
例えば、Ｂ７２Ｒリーダー融合ペプチドおよび一つのＶＳＤＬペプチドを含む融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、以下のように表すことができる：
Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｒｇ（↓）Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ（↓）（配列番号１１）。
【００８１】
矢印は、トリプシン切断部位の位置を示す。
【００８２】
別の例において、Ｂ７２Ｒリーダー融合ペプチドおよび３個のコンカテマー型ＶＳＤＬペプチドを含む融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、以下のように表すことができる：
Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｒｇ（↓）Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ（↓）Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ（↓）Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ（↓）（配列番号１２）。
【００８３】
当業者であれば、より多くのコンカテマー型ＶＳＤＬペプチドが、本明細書中に記載されるように、融合ポリペプチド中に含まれていてもよいことを理解するであろう。例えば、Ｂ７２Ｒリーダー融合ペプチドおよび１０個のコンカテマー型ＶＳＤＬペプチドを含む融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、以下のように表されるであろう：
Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｒｇ（↓）Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ（↓）Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ（↓）Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ（↓）Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ（↓）Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ（↓）Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ（↓）Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ（↓）Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ（↓）Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ（↓）Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ（配列番号１３）、
（以下同様に続く）。
【００８４】
よって、ある実施形態において、単一のペプチド切断部位が、リーダー融合パートナーと次のペプチドとのあいだ（または、コンカテマー型ペプチドを含む融合ポリペプチドの場合、リーダー融合パートナーと第１のペプチドとのあいだ、および、ペプチドのコンカテマー型コピーのそれぞれのあいだ）に配置され得る。しかし、融合ポリペプチドが、ペプチドのコンカテマー型コピーのそれぞれのあいだに短いリンカー配列を含むことが可能であろうことが理解されるべきであり、ここで、リンカー配列はペプチド切断部位に隣接されており、これにより、無傷のペプチドが、本発明にしたがい、切断剤を用いた切断後に融合ポリペプチドから切り出される。
【００８５】
代替的または追加で、融合ポリペプチドがペプチドのそれぞれのあいだに短いリンカー配列を含むことが可能であるかもしれないことが理解されるべきであり、ここで、切断剤を用いた切断後、ペプチドがリンカーで伸長された形状で融合ポリペプチドから切り出されるように、そして、ペプチドがリンカー配列から切り出されるようにリンカー配列がその後任意には代替のペプチド切断部位を使用する第２の切断剤によってペプチドから切り出され得るように、リンカー配列はペプチドの一末端へ連結されたまま残る。
【００８６】
本発明の融合ポリペプチドをエンコードする発現構築物および組換え宿主細胞として大腸菌を用いて、本発明者らは、本発明による１個のＶＳＤＬペプチドならびにＶＳＤＬペプチドの３個、６個、８個および１０個のコンカテマー型コピーをもつ融合ポリペプチドを含む、溶解性の融合ポリペプチドの高レベルの発現を適切に得ることができた。さらに、本発明者らは、得られた融合ポリペプチドが、切り出されるＶＳＤＬペプチドを高い濃度で適切に得るために完全消化され得たことを示した。
【００８７】
本発明のある実施形態において、切り出されたペプチドは精製される。ペプチドの精製は、混入物（例えば、宿主細胞タンパク質、核酸、およびエンドトキシンを含む細胞成分など）を、治療上の使用に適する許容可能なレベルまで有利には減少させ得る。ペプチドは、当業者に公知の任意の適切な技術を用いて精製され得る。ある実施形態において、ペプチドは、融合ポリペプチドの切断剤を用いた切断に先立って精製される。ある実施形態において、ペプチドは、切断剤を用いた融合ポリペプチドの切断に続いて精製される。ペプチドが臨床に用いられる場合、精製方法が、ペプチドが高い濃度の毒性、揮発性または可燃性の溶媒（例えば、メタノールなど）中に溶出されることを必要としないならば有利である。
【００８８】
ある実施形態において、方法はさらに、切断される融合ポリペプチドから切り出されるペプチドを精製する工程を含む。当業者であれば、広範囲の精製法、例えばイオン交換法および他の分離法などが、切り出されるペプチドを精製するために適切であり得ることを認識するであろう。ペプチドを精製するために適切であり得るイオン交換法としては、例えば、ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（登録商標）メンブレン（Ｍｅｒｃｋ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、米国）、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）メンブレン（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ  ＡＧ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、ドイツ）、Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）メンブレン（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ、米国）、ＣＩＭ（登録商標）  ＱＡモノリスメンブレン（ＢＩＡ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  ＧｍｂＨ、Ｖｉｌｌａｃｈ、オーストリア）、逆相レジン、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ（マルチモーダルレジン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｗａｕｋｅｓｈａ、ＷＩ、米国）、ヒドロキシアパタイト（マルチモードレジン：ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ  ＣＡ、米国）、ＱおよびＤＥＡＥモノリス（アニオン交換樹脂；ＢＩＡ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）、Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ（登録商標）  ＨＱおよびＤＥＡＥ（アニオン交換樹脂；ＢｉｏＲａｄ）、ＰＯＲＯＳ（登録商標）ＨＱ、ＰＩおよびＤ（アニオン交換樹脂；ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ  ＭＡ、米国）、Ｎｕｖｉａ  Ｑ（アニオン交換樹脂；ＢｉｏＲａｄ）、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｑ（アニオン交換樹脂；ＢｉｏＲａｄ）、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦおよびＢＢ（アニオン交換樹脂；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（カチオン交換樹脂；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）  ＴＭＡＥ（アニオン交換樹脂；Ｍｅｒｃｋ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＭＥＰ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（登録商標）（マルチモード樹脂；Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）などの市販の樹脂およびメンブレンが挙げられる。切り出されるペプチドを精製するために適切であろう、イオン交換分離法を用いない方法としては例えば、Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）（疑アフィニティー樹脂；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社またはＶｙｄａｃ社から得られる多数のレジンなどが挙げられる。
【００８９】
ＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）の場合、一実施形態において、切り出されたＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）は、消化された融合ポリペプチドおよび他の宿主細胞混入物から、逆相クロマトグラフィーを用いて精製される。例えば、逆相クロマトグラフィーは、不溶性ポリスチレンジビニルベンゼンポリマーレジン、例えばＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍ  ＣＧ３００ＣまたはＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍ  ＸＴカラム（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ）などを利用してもよい。いくつかの実施形態において、切り出されたＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）は、４０〜２０％のイソプロパノール（ｖ／ｖ）を用いて、このようなレジンから溶出され得る。好ましくは、前記溶出は、酢酸の存在下で行われる。例えば、ＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）は、０．５％の酢酸の存在下、３０％のイソプロパノール中に溶出され得る。代替的な実施形態において、切り出されたＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）は、１０〜２０％のイソプロパノールを用いてこのような樹脂から溶出されてもよい。好ましくは、前記溶出は、わずかに塩基性であるｐＨで行われる。例えば、ＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）は、例えば２５  ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）の存在下など、ｐＨ８に緩衝された１５％イソプロパノール中に溶出され得る。有利なことに、このような低濃度のイソプロパノールは、大規模な組換えタンパク質産生で容認されると考えられる。
【００９０】
別の実施形態において、切り出されたＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）は、消化された融合ポリペプチドからアニオン交換クロマトグラフィーを用いて精製される。例えば、アニオン交換クロマトグラフィーは、例えばＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）  ＴＭＡＥカラム（Ｍｅｒｃｋ）などの架橋ポリメタクリル酸樹脂を利用する強力なアニオン交換クロマトグラフィーであってもよい。いくつかの実施形態において、ＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）は、酢酸ナトリウムを用いてこのようなレジンから高純度で溶出され得る。好ましくは、前記溶出は、酸性のｐＨ（例えば、ｐＨ５．０、ｐＨ４．０またはｐＨ３．５の１０ｍＭ  酢酸ナトリウム）で行われる。他の実施形態において、切り出されたＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）は、低濃度の塩酸（例えば１０ｍＭ  ＨＣｌなど）を用いてこのようなレジンから高純度で溶出され得る。
【００９１】
別の実施形態において、切り出されたＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）は、消化された融合ポリペプチドから逆相クロマトグラフィーを用いて精製される。例えば、逆相クロマトグラフィーは、不溶性ポリスチレンジビニルベンゼンポリマーレジン、例えばＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍ  ＣＧ３００ＣまたはＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍ  ＸＴカラム（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ）などを利用してもよい。ある実施形態において、ＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）は、１０〜２０％のイソプロパノールを用いて、このようなカラムから溶出され得る。好ましくは、前記溶出は、わずかに塩基性であるｐＨで行われる。例えば、ＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）は、例えば２５  ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）の存在下など、ｐＨ８に緩衝された１５％イソプロパノール中に溶出され得る。
【００９２】
追加的にまたは代替的に、切り出されたＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）は、Ｃｈｒｏｍａｓｏｒｂ（登録商標）メンブレンを用いて精製され、および、１０ｍＭ  塩酸で溶出されてもよい。
【００９３】
別の実施形態において、切り出されたＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）は、始めに逆相クロマトグラフィーを用いて、例えば不溶性ポリスチレンジビニルベンゼンポリマーレジンを用いて、消化された融合ポリペプチドから精製され、およびその後、強力なアニオン交換クロマトグラフィーを用いて（例えば、架橋ポリメタクリル酸樹脂を用いて）さらに精製されてもよい。
【００９４】
ある実施形態において、ペプチドは、イソプロパノール、ブタノールおよびアセトニトリルから選択される有機溶媒中に溶出され得る。
【００９５】
当業者であれば、他の精製方法も、切断剤を用いた融合ポリペプチドの切断に続く、ＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）の精製に適切であるかもしれないことを理解する。
【００９６】
ある実施形態において、精製されたペプチドは凍結乾燥されてもよい。凍結乾燥されたペプチドは、その後、再構成され得る。
【００９７】
ある実施形態において、精製されたペプチドは、薬学的または獣医学的に許容可能な賦形剤または担体と共に処方され得る。
【００９８】
第３の態様において、本発明は、
１つまたは２つ以上のトリプシン切断部位によって隣接されており、および、そうではない場合、トリプシン切断部位が存在しないことを特徴とする少なくとも１つのＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）を含む融合ポリペプチドを発現する工程と、
トリプシン切断部位での切断を行う切断剤（または複数の切断剤）を用いて、融合ポリペプチドをトリプシン切断部位で切断する工程と
を含む組換え血管拡張物質（ＶＳＤＬ）ペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）の産生方法であって、
融合ポリペプチドを切断する工程が、融合ポリペプチドから前記ペプチドを切り出す方法を提供する。
【００９９】
この第２の態様において、ＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）、融合ポリペプチドおよびトリプシン切断部位のそれぞれは、本発明の第１または第２の態様として上述されるように例示され得ることが理解されるべきである。例えば、融合ポリペプチドは、リーダー融合パートナーを含んでいてもよい；融合ポリペプチドは、ＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）のコンカテマー型コピーを含んでいてもよい；および／または、ＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）は、上記で例示されるような配列をもっていてもよい；などである。
【０１００】
第４の態様において、本発明は、
リーダー融合パートナー、および、１つまたは２つ以上のトリプシン切断部位によって隣接されている少なくとも１つのＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）を含む融合ポリペプチドを発現する工程と、
トリプシンまたはトリプシン様酵素を用いて融合ポリペプチドを切断する工程と、
切断された融合ポリペプチドのｐＨを５未満に調節する工程と、
アニオン交換法（または複数の交換法）を用いて消化された融合ペプチドからペプチドを精製する工程と
を含む組換え血管拡張物質（ＶＳＤＬ）ペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）の産生方法
を提供する。
【０１０１】
この第４の態様において、ＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）、融合ポリペプチド、リーダー融合パートナー、トリプシン切断部位、トリプシンまたはトリプシン様酵素などのそれぞれは、本発明の第１または第２の態様として上述されるように例示され得ることが理解されるべきである。例えば、融合ポリペプチドは、ＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）のコンカテマー型コピーをんでいてもよい；および／または、ＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）は、上記で例示されるような配列をもっていてもよい；などである。
【０１０２】
第５の態様において、本発明は、本発明の第１〜第４の態様のいずれか１つに規定されるような融合ポリペプチドをエンコードしているヌクレオチド配列を含む発現構築物を提供する。
【０１０３】
好ましくは、発現構築物は、Ｃ末端トリプシン切断部位を有するＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）をエンコードしている少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に融合されている、Ｃ末端トリプシン切断部位を有するリーダー融合パートナーをエンコードしているヌクレオチド配列を含む。
【０１０４】
本明細書中で用いられるように、用語「作動可能に融合される（operably fused）」は、ヌクレオチド配列が、終止コドンが存在しない場合、融合ポリペプチドのそれぞれのペプチドが翻訳されるように、同じ読み取りフレーム中の全ての融合ポリペプチドをエンコードすることを意味するものであると当業者によって理解されるであろう。
【０１０５】
ある実施形態において、Ｃ末端トリプシン切断部位を有するリーダー融合パートナーをエンコードしているヌクレオチド配列は、Ｃ末端トリプシン切断部位を有するＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）をエンコードしている１つのヌクレオチド配列に作動可能に融合されてもよい。別の実施形態において、Ｃ末端トリプシン切断部位を有するリーダー融合ペプチドをエンコードしているヌクレオチド配列は、Ｃ末端トリプシン切断部位を有するＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）をそれぞれエンコードしている任意の数のコンカテマー型ヌクレオチド配列に作動可能に融合されてもよい。好ましくは、Ｃ末端トリプシン切断部位を有するリーダー融合ペプチドをエンコードしているヌクレオチド配列は、Ｃ末端トリプシン切断部位を有するＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）をそれぞれエンコードしている２個〜２０個の（またはそれ以上の）コンカテマー型ヌクレオチド配列に作動可能に融合されてもよい。すなわち、ヌクレオチド配列は好ましくは、Ｃ末端トリプシン切断部位を有するＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）の２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個または２０個のコンカテマー型コピーに作動可能に融合されている、Ｃ末端トリプシン切断部位を有するリーダー融合ペプチドを含む融合ポリペプチドをエンコードする。
【０１０６】
好ましくは、Ｃ末端トリプシン切断部位は、Ｃ末端アルギニン残基である。
【０１０７】
ある実施形態において、ヌクレオチド配列は、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる融合ポリペプチドをエンコードする。
【０１０８】
当業者に公知であるように、発現構築物は、発現プラスミド内にあり得る。
【０１０９】
第６の態様において、本発明は、第５の態様の発現構築物を含むペプチドを組換えによって発現するための宿主細胞を提供する。好ましくは、ペプチドは、ＶＳＤＬペプチド（またはその変異体もしくは修飾ペプチド）である。組換えペプチドを産生し得るさまざまな発現系が、当業者に公知である。さらに、本発明の宿主細胞は、当業者が理解されるであろうような、任意の適切な宿主細胞であり得る。宿主細胞としては例えば、細菌細胞（例えば、大腸菌（Escherichia coli）、ストレプトマイセス種（Streptomyces sp.）、バチラス種（Bacillus sp.）、シュードモナス（Pseudomonas sp.）、スタフィロコッカス種（Staphylococcus sp.）（例えば、Ｓ．ティフィムリウム（S.Typhimurium）など）など）、例えば、酵母細胞（例えば、サッカロミケス  セレビシエSaccharomyces cerevisiae、ピキア  パストリス（Pichia pastorisなど）などの真菌細胞、カビまたは糸状菌（例えば、アスペルギルスAspergillus sp.など）、昆虫細胞（例えば、ショウジョウバエ  Ｓ２（Drosophila S2およびスポドプテラ  フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（例えば、スポドプテラ  Ｓｆ９細胞など）など、および、バキュロウイルスを用いた発現系など）、哺乳類細胞（チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）（Chinese Hampster Ovary）細胞、サル腎由来（ＣＯＳ）細胞、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞、ハムスター腎由来（ＢＨＫ）細胞、マウスメラノーマ細胞などを含む多数の細胞株が適切である）、および植物細胞。代替として、組換えペプチドは、遺伝子組換え植物および動物で発現されてもよく、および、したがって、宿主細胞は、適切な植物または動物細胞であってもよい。好ましくは、宿主細胞は大腸菌細胞である。
【０１１０】
さらなる態様において、本発明は、Ｃ末端トリプシン切断部位を有するペプチドのコンカテマー型コピー（例えば、ペプチドの２個〜２０個の、またはそれ以上のコンカテマー型コピー）に連結されているリーダー融合パートナーを含む組換え融合ポリペプチドを提供する。好ましくは、リーダー融合パートナーは、Ｃ末端トリプシン切断部位を有する。好ましくは、ペプチドは、配列内トリプシン切断部位を有さない。好ましくは、ペプチドは、ＶＳＤＬペプチドまたはその変異体もしくは修飾ペプチド、より好ましくは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＶＳＤＬペプチドである。
【０１１１】
さらなる別の態様において、本発明は、Ｃ末端トリプシン切断部位を有するペプチドのコンカテマー型コピー（例えば、ペプチドの２個〜２０個の、またはそれ以上のコンカテマー型コピー）を含むかまたはそれらからなる組換え融合ポリペプチドを提供する。好ましくは、ポリペプチドは、ペプチドの３個〜１０個のコンカテマー型コピーを含む。好ましくは、ペプチドは、配列内トリプシン切断部位を有さない。好ましくは、ペプチドは、ＶＳＤＬペプチドまたはその変異体もしくは修飾ペプチド、より好ましくは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＶＳＤＬペプチドである。
【０１１２】
本発明は、以下の非限定的な実施例および添付図面を参照することによって、以下に説明される。
【０１１３】
実施例
実施例１  大腸菌でのＶＳＤＬの組換え産生
ヒトＶＳＤＬ(実施例において、ＶＳＤＬと規定される)のアミノ酸配列は以下：
Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−
Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ
（配列番号２）
である。
【０１１４】
本実施例において、ＶＳＤＬの大腸菌での組換え発現が、ペプチド配列中の配列内アルギニン（Ｒ）およびリジン（Ｋ）残基の非在在、ならびに、トリプシンのための切断部位を簡便に提供するＣ末端アルギニン（Ｒ）の存在を利用しようとするストラテジーにおいて、融合ポリペプチドアプローチを用いて調査された。（図１）
【０１１５】
発現構築物の産生
はじめに、以下の２つの融合ポリペプチドが設計された：
（ｉ）Ｂ７２Ｒと規定される７３アミノ酸融合パートナーと融合された単一のＶＳＤＬ配列（Ｂ７２Ｒ−ＶＳＤＬと規定される、および、本明細書中において「１量体」とも称される）、ならびに
（ｉｉ）Ｂ７２Ｒと融合された三重のＶＳＤＬの繰り返し（Ｂ７２Ｒ−（ＶＳＤＬ）３と規定される、および、本明細書中において「３量体」とも称される）。
これらの融合ポリペプチドのアミノ酸配列を図１に示す。
【０１１６】
次に、融合パートナーの最後から２番目のアスパラギン酸残基（Ｄ）がグルタミン残基（Ｑ）によって置換され（Ｂ７２（Ｑ）Ｒと規定される）、および、エンコードされた融合ポリペプチドがＶＳＤＬペプチド配列の３個、６個、８個および１０個の直列型のコピーを含む、２回目の遺伝子融合を作成した。アスパラギン酸残基の置換が、融合パートナー／ＶＳＤＬ接合部での向上された切断をもたらし得ることが予測された。
【０１１７】
ＶＳＤＬ融合ポリペプチド遺伝子は、ｐＵＣ５７ベクターサブクローン（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪ、米国）として得た。融合遺伝子のヌクレオチド配列を図２に示す。ＶＳＤＬ遺伝子融合体が、制限酵素ＮｄｅIおよびＨｉｎｄIII（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ  ＩＮ、米国）を用いた消化によってそれぞれのｐＵＣ５７サブクローンから切り出された。プラスミド消化物は脱塩され、そしてその後、１６℃で終夜、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ）の存在下でのインキュベートによって、ｐＢＲＥ５０８発現ベクター（Ｈｏｓｐｉｒａ  Ａｄｅｌａｉｄｅ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ、ＴｈｅｂａｒｔｏｎＳＡ、オーストラリア）と直接ライゲーションされた。ライゲーション反応物がＸＬ１−Ｂｌｕｅエレクトロコンピテントセル（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ、ＳａｎｔａＣｌａｒａ  ＣＡ、米国）を形質転換するために使用され、および、陽性の形質転換株がカナマイシン（３０μｇ／ｍＬ）を含むＶＡプレート上において選択された。プラスミドＤＮＡが、個々の形質転換体から、製造業者の取扱説明書に従いＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  ＮＶ、Ｖｅｎｌｏ、オランダ）を用いて調製された。精製されたプラスミドは、その後、成功した候補クローンを特定するために、ＮｄｅI／ＨｉｎｄIIIを用いて消化された。種々のＶＳＤＬ遺伝子融合体に期待されるバンドパターンを示しているプラスミドクローンが、ｐＢＲＥ６０１〜ｐＢＲＥ６０６と規定された。ＶＳＤＬ発現構築物のマップが図３ａ〜図３ｆに示されている。
【０１１８】
小規模発現研究
初めの発現実験が１０ｍＬの振とうフラスコスケールで行われた。ＶＳＤＬ発現構築物、ｐＢＲＥ６０１（１量体）およびｐＢＲＥ６０２（３量体）で大腸菌宿主株ＢＲ０６７（Ｈｏｓｐｉｒａ  Ａｄｅｌａｉｄｅ；ＭＭ２９４  ＯｍｐＴ欠失）が形質転換され、および、形質転換株がカナマイシン（３０μｇ／ｍＬ）を含むＶＡプレート上において選択された。
【０１１９】
形質転換プレートからの単一のコロニーがカナマイシン（３０μｇ／ｍＬ）を含む３ｍＬのＣ２限定培地中に無菌的に移され、終夜培養のための３ｍＬ培養液が確立された。培養液は、回転式カルーセルを介して攪拌しながら、１６時間３７℃でインキュベートされた。それぞれの培養物０．８７５ｍＬを８０％グリセロール０．１２５ｍＬと混合し、−８０℃で保存することによってグリセロールストックが調製された。
【０１２０】
発現実験のため、終夜培養物（１ｍＬ）が、カナマイシン（３０μｇ／ｍＬ）を含む１０ｍＬのＣ２限定培地中で無菌的に継代培養された。これら培養液は、攪拌下３７℃で２．５時間インキュベートされ、そしてその後ＩＰＴＧ（０．２５ｍＭの最終濃度）で誘導された。さらに３時間インキュベートした後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルが調製された。分画されたＢＲ０６７（ｐＢＲＥ６０１）およびＢＲ０６７（ｐＢＲＥ６０２）培養物サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図４）は、高いレベルの、溶解性のＢＲ７２Ｒ−ＶＳＤＬおよびＢ７２Ｒ−（ＶＳＤＬ）３融合ポリペプチドの発現を示した。
【０１２１】
続いて、同等の発現実験が、ＶＳＤＬの３個、６個、８個および１０個の直列型コピーを含むＢ７２（Ｑ）Ｒ融合ポリペプチドをエンコードしている構築物を用いて行われた。図５に示されるように、培養物は同様に、高いレベルの、溶解性の融合ポリペプチド発現を示した。しかし、ＶＳＤＬ配列のコピーの数の増加と共に、融合ポリペプチドの異所転位挙動も非常に増加することが認められた（表４）。これは、ＶＳＤＬペプチド配列の強く負に帯電している性質の結果である可能性が高い。
【０１２２】
【表４】
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【０１２３】
流加発酵
流加培養が、ＢｉｏＳｔａｔ  Ｑｐｌｕｓ  バイオプロセス制御ユニット（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）へ連結された１Ｌの反応容器中で行われた。実験は、ＢＲ０６７（ｐＢＲＥ６０１）およびＢＲ０６７（ｐＢＲＥ６０２）細胞株それぞれの凍結されたグリセロールストックから開始された。栄養素供給は、バッチモードでの３７℃の終夜培養に続いて開始された。培養物のＯＤ６００が４０〜５０に達した時点で、培養物はＩＰＴＧの添加によって誘導され、そして、培養が５時間継続された。各細胞株において達成された最終のＯＤ６００は〜７０であり、そして、最終的なバイオマスの湿潤重量は〜８０ｇ／Ｌであった。図６に示される最終的な培養サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ＢＲ７２−ＶＳＤＬおよびＢ７２Ｒ−（ＶＳＤＬ）３の高レベルの発現がこれらの条件下で達成されることが示した。
【０１２４】
２つの細胞株の発酵バイオマスが遠心分離によって回収され、そして、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ８．０中に再懸濁された。その後、清澄細胞溶解液が、収集された細胞の高圧破砕（９２０バールで３回押し出し）および遠心分離（８０００ｒｐｍで１５分間）後に産生された。細胞溶解液はアリコートされ、および−８０℃で保存され、そして、この材料が後述される切断および精製実験に使用された。
【０１２５】
融合ポリペプチドの切断
Ｂ７２Ｒ−ＶＳＤＬおよびＢ７２Ｒ−（ＶＳＤＬ）３融合ポリペプチドを含む細胞溶解液が解凍された。シークエンシング用グレードの修飾ブタトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｖ５１１Ａ；Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｆｉｔｃｈｂｕｒｇ  ＷＩ、米国）が２５μｇ／ｍＬで添加され、室温で終夜インキュベートされた。サンプルは、１．０％Ｈ３ＰＯ４／０．２％ＴＦＡと１：１で混合され、そして、沈殿物を除去するために遠心分離された。上澄み液が、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ＨＰＬＣ分離モジュールおよびＵＶ検出器（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ  ＭＡ、米国）のＲＰ−ＨＰＬＣによって分析された。分析は、Ｅｍｐｏｗｅｒ  ２ソフトウェア（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｉｎｃ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ  ＣＡ、米国）の制御下、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４（２５０×２．１ｍｍ、５μｍ、３００  Ａカラム（＃３０２））で行われた。ＶＳＤＬ合成ペプチド（すなわち、化学的に合成されたＶＳＤＬ）の５、１０および２０μｇの３度の注入が、検量線を作成するために使用され、この検量線が、切断された細胞溶解液中に産生された組換えＶＳＤＬの量を定量するために使用された。
【０１２６】
両方の融合ポリペプチドは、３８分の保持時間で溶出し、一方、ＶＳＤＬは２８分で溶出した。組換えＶＳＤＬおよび合成ＶＳＤＬの保持時間は同等であった。融合ポリペプチドは、試験された条件下で消化された。先の実験は、ＲＰ−ＨＰＬＣによってより遅い保持時間で溶出する、部分的に消化された（Ｎ末端が延長されている）変異体（ＮＬＮＶＤＲ−ＶＳＤＬと規定される）の存在を明らかにした。消化物は、より緩やかな濃度勾配によって分析され、そして、顕著な量のこの変異体が残存していること；より多くの変異体が３量体消化物中よりも１量体消化物中に存在してることが確認された。
【０１２７】
０．５８ｇ／Ｌおよび１．４９ｇ／ＬのＶＳＤＬ濃度が、それぞれ、Ｂ７２Ｒ−ＶＳＤＬおよびＢ７２Ｒ−（ＶＳＤＬ）３消化物中でＲＰ−ＨＰＬＣによって測定された。消化が完了していたならば、すなわち、Ｎ末端が延長された変異体ＮＬＮＶＤＲ−ＶＳＤＬが全く存在しなくなるまでであったならば、ＶＳＤＬ濃度は、１量体および３量体消化物において、それぞれ、０．９１ｇ／Ｌおよび１．７６ｇ／Ｌへ増加するであろう。
【０１２８】
ＶＳＤＬおよび融合パートナーの相対的分子量を考慮に入れると、融合ポリペプチド濃度は、１量体細胞溶解液および３量体細胞溶解液中でそれぞれ、２．９１ｇ／Ｌおよび３．０４ｇ／Ｌであった。しかし、サンプル調製あいだに、酸性化は、顕著な量の沈殿物をもたらし、そして、未消化の細胞溶解液中でＲＰ−ＨＰＬＣによって測定された融合ポリペプチド濃度が上記で言及された数字よりもはるかに低いと見積もられたため、顕著な量のＢ７２Ｒ−ＶＳＤＬおよびＢ７２Ｒ−（ＶＳＤＬ）３融合ポリペプチドが、粗細胞溶解液中に存在する他の大腸菌由来タンパク質とともに沈殿しやすいのかもしれないことが考えられる。
【０１２９】
アミノ酸配列の調査は、切断が、融合パートナーＢ７２ＲのＣ末端のＶＤＲ↓Ｅである切断部位、および、ＶＳＤＬ配列（または複数の配列）のＣ末端のＡＱＲ↓Ｅである切断部位で起こる場合に、「標準の（authentic）」ＶＳＤＬ（すなわち、１量体融合ポリペプチドおよび３量体融合ポリペプチドのいずれかからのもの）が産生されることを明らかにしている（ここで、↓は、ペプチド切断部位の位置を示す）。これとは対照的に、Ｎ末端が延長された変異体（ＮＬＮＶＤＲ−ＶＳＤＬ）のペプチド切断部位はＰＳＫ↓Ｎである。ＶＤＲ↓Ｅにおける低い切断効率は、この部位に対するトリプシンの親和性を低下させ得る、アルギニン（Ｒ）切断部位の直前にあるアスパラギン酸残基（Ｄ）の存在に起因する可能性が高い。ＶＳＤＬおよびＮＬＮＶＤＲ−ＶＳＤＬのあいだの物理化学的特性における比較的小さな違いが、最終生成物から変異体を除去するための精製の困難性を増大させる可能性が高いため、融合パートナーのＣ末端の切断部位の、ＶＤＲ↓ＥからＶＱＲ↓Ｅへの修飾（ＶＳＤＬペプチド（または複数のペプチド）のＣ末端のアミノ酸残基と同じである、融合パートナーのＣ末端の末端および最後から２番目のアミノ酸残基）は、全体的な切断効率を向上させると仮定された。さらに、ＶＳＤＬ配列の数を増加させることはまた、変異体の分布率を低下させ得る一方、融合パートナーの融合ポリペプチドに対する質量比としての収率の増大は低下する。
【０１３０】
３量体融合ポリペプチド（すなわち、Ｂ７２Ｒ−（ＶＳＤＬ）３）は、４ｍＬの細胞溶解液を分取用ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４、２５０ｘ１０ｍｍ、５μｍ、３００Å）にロードすることにより精製された。融合ポリペプチドは、０．１％ＴＦＡの存在下、６０分間にわたる５〜６０％アセトニトリルの濃度勾配によって行われた。アセトニトリルおよびＴＦＡは、遠心式凍結乾燥機を用いてタンパク質からエバポレートされ、そして、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ８．０中、０．５ｍｇ／ｍＬに再構成された。組換えウシＴｒｙｐＺｅａｎ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の１０ｍｇバイアルが、５０％グリセロール／５０ｍＭ  酢酸中、５ｍｇ／ｍＬに再懸濁され、そして−２０℃で保存された。ＴｒｙｐＺｅａｎ（登録商標）が１：１２０の質量比で融合ポリペプチドに添加され、そして、消化が室温で終夜行われた。１０分後に、サンプルは、消化を終わらせるために１％酢酸を用いて酸性化された。消化されたおよび未消化のサンプルがＬＣ−ＭＳによって分析された。サンプルはまた、Ｂｒｕｋｅｒ  ＨＣＴｕｌｔｒａイオントラップ質量分析計に連結されたＺｏｒｂａｘ  Ｃ３カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を通されてクロマトグラフが行われ、１％酢酸の存在下、アセトニトリルの濃度勾配によって溶出された。未消化のサンプルは、２００９１．４Ｄａの質量を与え、これは、３量体融合ポリペプチドの理論質量（すなわち、２００９１．０Ｄａ）に匹敵する。消化後のサンプルは、３８７７．８Ｄａの質量を与え、これは、ＶＳＤＬの理論質量（すなわち、３８７８．３Ｄａ）に匹敵する。検出された他のペプチドは、融合パートナーの部分的に消化されたフラグメントに対応する。顕著なことに、ＶＳＤＬのコンカテマーまたは融合パートナーへの連結の証拠は無かった。ＮＬＮＶＤＲ−ＶＳＤＬ変異体の非存在は、ＲＰ−ＨＰＬＣによって確認され、そして、切断効率は、ＴｒｙｐＺｅａｎ（登録商標）の利用、および／または、消化に先立つ融合ポリペプチドの精製によって向上されることが示された。細胞溶解液を用いたその後の切断実験は、１：１２０（ｗ／ｗ）でのＴｒｙｐＺｅａｎ（登録商標）切断割合が、残渣ＮＬＮＶＤＲ−ＶＳＤＬを残存させないことを示した。
【０１３１】
ＴｒｙｐＺｅａｎ（登録商標）のための要件は、一定量のＢ７２Ｒ−（ＶＳＤＬ）３細胞溶解液（３ｇ／Ｌの融合ポリペプチド）に様々な量を添加し、そして、室温で終夜インキュベートすることによって決定された。切断されたＶＳＤＬの量は、Ｒｅｓｔｅｋ  Ｐｉｎｎａｃｌｅ  ＤＢＣ８、１００×２、１ｍｍおよび１．９μｍカラムを用いて、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＣＢＭ−２０Ａ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、京都、日本）のＲＰ−ＵＰＬＣによって決定された。合成ＶＳＤＬペプチドの５、１０および１５μｇの３回の注入が、検量線を作成するために使用され、この検量線が、組換えＶＳＤＬを定量するために使用された。６ｍｇ／Ｌを超えるＴｒｙｐＺｅａｎ（登録商標）では、これは１：４８０（ｗ／ｗ）のＴｒｙｐＺｅａｎ（登録商標）と融合ポリペプチドの比に相当するが、産生される組換えＶＳＤＬは、プラトーになり始めた（図７）。
【０１３２】
精製
この実験の目的は、
（１）１Ｌの発酵物あたり０．２５ｇより高い精製ＶＳＤＬの収率を与える、
（２）合成ＶＳＤＬペプチドに匹敵する純度プロファイルが示す、
（３）エンドトキシンを低いレベルに低下させる、
（４）１０ｍＭ  ＨＣｌ中にＶＳＤＬを処方する、
（５）大規模産生に使用できる有機溶媒の量を用いる、
（６）低圧クロマトグラフィー工程を用いる、および
（７）大規模に実現し得る
である精製プロセスを実証することであった。
【０１３３】
最初のプロセス
先の実験において、以下の工程を利用する精製プロセスが開発された
（１）トリプシン切断、（２）酸性化による宿主細胞由来不純物の沈殿、（３）酸／メタノールを用いた逆相分離、（４）ｐＨ８への調整、および（５）ＮａＣｌを用いたアニオン交換分離。
このプロセスは、１５ｍＬの消化された３量体細胞溶解液を、１ｍＬ  Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ  ＸＴ３０カラム（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ）上に、続いて、１ｍＬ  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＬｉｔｔｌｅＣｈａｌｆｏｎｔ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、英国）上にロードすることにより繰り返された。約１０ｍｇのＶＳＤＬが、Ｑカラムを用いて、１Ｌの発酵物あたり１．２３ｇの収率で精製された。精製されたＶＳＤＬの、ＲＰ−ＨＰＬＣによる溶出位置および不純物プロファイルは合成ＶＳＤＬペプチドと比較しても遜色なく、Ｎ末端が延長されているＮＬＮＶＤＲ−ＶＳＤＬ変異体は存在しなかった。しかし、この精製プロセスは、カラムから結合されたＶＳＤＬを溶出させるために１００％メタノールを利用し、そして、メタノールの揮発性、可燃性および毒性はしたがって、この精製プロセスが大規模産生のためには望ましくないかもしれないことを意味している。
【０１３４】
有機溶媒の利用の低減
Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ逆相レジンを用いた精製のあいだの有機溶媒の使用を低減させる可能性がまた調査された。
【０１３５】
消化された３量体細胞溶解液が、Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ  ＣＧ３００Ｃ（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ）にロードされ、そして、メタノールの濃度勾配を用いて溶出させた。ＸＴ３０としては、１００％メタノールがＶＳＤＬを溶出させるためには必要であった。しかし、以下の実験において、メタノールはイソプロパノールによって置換され、そして、ＶＳＤＬは、０．５％酢酸の存在下、３０％イソプロパノールを用いて高い純度で溶出され得ることが発見された。核酸混入物は、ＶＳＤＬの溶出に先立って、１５％イソプロパノールを用いてカラムより洗浄された。ｐＨ調整無しの細胞溶解液がまた、カラム上にロードされ、そして、イソプロパノールによる溶出が、０．５％酢酸ではなく２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）の存在下で行われた。予期せぬことに、ＶＳＤＬは、より高いｐＨにおいて１５％イソプロパノールで溶出された。明らかに、１５％イソプロパノールの可燃性は、３０％イソプロパノールよりも顕著に低く、そして実際、大規模組換えタンパク質産生に一般的に用いられている２０％エタノールとほぼ同じである（引火点は３５℃で同一であることに留意）。
【０１３６】
細胞溶解液は、１：１２０質量比のＴｒｙｐＺｅａｎ（登録商標）を用いて、室温で終夜消化した。次の日、宿主細胞由来不純物を沈殿させるために、１Ｍ酢酸を用いてｐＨを４．４へ調整した。沈殿物はその後、遠心分離によって固められ、そして、１３ｍＬの上澄みが、０．５％酢酸を用いて事前に平衡化されていた１ｍＬ  Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ  ＣＧ３００Ｃカラム上にロードされた。カラムは、０．５％酢酸、１５％イソプロパノール／０．５％酢酸、および、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８を用いて洗浄された（図８）。大きなピークが、１５％イソプロパノール／２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８で溶出した。このピーク中のペプチド内容物は１８．５ｍｇであり、これは、８１％の工程の回収率と解釈される。続いて、１ｍＬ  Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＴＭＡＥカラムが２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８によって事前に平衡化され、そして、６．９ｍｇのこの材料でロードされた。カラムはその後、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８および１０ｍＭ  酢酸ナトリウム  ｐＨ４．５を用いて洗浄された（図９）。大きなピークが、１０ｍＭ  ＨＣｌで溶出され、ペプチド内容物は５．８ｍｇであり、これは、８４％の工程回収率を示している。精製収率は、１Ｌ発酵物あたり１．３７ｇであった。
【０１３７】
Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ  ＣＧ３００ＣおよびＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＴＭＡＥのＶＳＤＬに対する結合能力はそれぞれ、〜２０ｍｇ／ｍＬおよび〜７ｍｇ／ｍＬであった。大きなピークが合成ＶＳＤＬペプチドと、ＲＰ−ＵＰＬＣ分析によって比較され、そして、９７．０％および９３．７％の純度がそれぞれ測定された。合成ＶＳＤＬペプチドと比較してＶＳＤＬに、新しい顕著な不純物ピークは存在しなかった。さらに、合成ＶＳＤＬペプチドおよび組換えＶＳＤＬのＵＶプロファイルは、ほぼ同じであった（図１０）。さらに、同様の様式で精製された、ＦｒａｃｔｏｇｅｌのＶＳＤＬピークのエンドトキシン量は低かった（５ＥＵ／ｍｇ）。
【０１３８】
結論
上記実施例に示される結果は、ＶＳＤＬを安定した融合ポリペプチドとして良好な収率で発現する細胞株の開発、および、大規模産生で使用可能な方法でのＶＳＤＬの精製プロセスを示している。
【０１３９】
これは、非動物由来の組換えタンパク質、ＴｒｙｐＺｅａｎ（登録商標）として入手可能である十分に特徴付けられている酵素であるトリプシンのための切断部位としてＶＳＤＬのＣ末端アルギニン残基（Ｒ）を利用するための融合ポリペプチドの設計を含んでいた。初めに、以下の２つの融合ポリペプチド：
Ｂ７２Ｒと融合された単一のＶＳＤＬ配列（１量体）および
Ｂ７２Ｒと融合された三重のＶＳＤＬ反復配列（３量体）
が設計され、これらは、溶解性型で発現され、これによって、単離された封入体からの発現タンパク質を精製する必要性が回避された。さらなる実験は、ＶＳＤＬがまた６量体、８量体および１０量体として高レベルで発現され得ることも立証した。
【０１４０】
実験室グレードのブタトリプシン原料を用いた予備的なトリプシン切断実験は、融合ポリペプチドがＶＳＤＬペプチドを与えるために完全消化され得、そしてそれは以下の工程：
（１）１：１２０のＴｒｙｐＺｅａｎ（登録商標）：融合ポリペプチド（ｗ／ｗ）を用いた終夜の消化、
（２）ｐＨ４．４への調整、
（３）遠心分離、
（４）Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ  ＣＧ３００Ｃ逆相クロマトグラフィー、および
（５）Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＴＭＡＥ  アニオン交換クロマトグラフィー
を含む精製プロセスによってその後回収され得ることを示した。フラクトゲル由来物質が、ＲＰ−ＵＰＬＣ分析によって合成ＶＳＤＬ調製物と比較され、そして、９７．０％および９３．７％の純度がそれぞれ測定された。重要なことに、組換えＶＳＤＬに、新しい顕著な不純物ピークは存在せず（すなわち、合成ＶＳＤＬペプチドと比較して）、そして、組換えおよび合成ＶＳＤＬのＵＶプロファイルは、ほぼ同一であった。さらに、精製された組換えＶＳＤＬのエンドトキシン量は、５ＥＵ／ｍｇと見積もられた。
【０１４１】
よって、精製プロセスが：
（１）１Ｌの発酵物あたり１．２〜１．４ｇである精製組換えＶＳＤＬ収率を与え、
（２）合成ＶＳＤＬ調製物に匹敵する純度プロファイルを示し、
（３）エンドトキシンを低いレベルへと減少させ、
（４）１０ｍＭ  ＨＣｌ中にＶＳＤＬが処方され、
（５）大規模産生使用できる有機溶媒の量を使用し、
（６）低圧クロマトグラフィー工程を用い、および
（７）大規模に実現し得る
ことが発見された。
【０１４２】
実施例２  大腸菌でのＶＳＤＬ  １０量体の組換え産生
細胞溶解液が、ＶＳＤＬペプチドの１０個のコンカテマー型体コピーを有するＢ７２Ｒ−（ＶＳＤＬ）１０融合ポリペプチド（すなわち１０量体）をエンコードする、実施例１に記載のｐＢＲＥ６０６発現構築物をもつＢＲ０６７大腸菌株の発酵物から、実施例１の「流加発酵」の項に記載されるように産生された。
【０１４３】
２７５ｍＬの１０量体細胞溶解液が解凍され、そしてｐＨが１Ｍ  ＮａＯＨを用いて８．０に調整された。（実施例１に記載されるように）ＴｒｙｐＺｅａｎ（登録商標）が融合ポリペプチドに質量比１：１２０で添加され、そして、消化が室温で２時間行われた。消化された細胞溶解液のｐＨは、不純物を沈殿させるために１Ｍ酢酸を用いて４．４に調整され、そしてその後、、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋Ｐｏｄ  ＬａｂスケールＤ０ＨＣフィルター（ＭＤ０ＨＣ０２７Ｈ２）０．０２７ｍ２を用いてデプスフィルターでろ過された。
【０１４４】
ろ液は、逆相Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ  ＣＧ３００Ｃレジンのカラム上に直接ロードすることにより精製された。カラムは約１５カラム当量の０．５％酢酸で、その後、約１０カラム当量の０．５％酢酸／１５％イソプロパノールで、その後、約１５カラム当量の２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８で洗浄された。カラムは、ＵＶ吸光度が主ピークの１０％に到達するまで、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１５％イソプロパノールを用いて溶出された。溶出物はその後、Ｃｈｒｏｍａｓｏｒｂメンブレン（Ｍｅｒｃｋ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上にロードされ、ＵＶベースラインに到達するまで１０ｍＭ  酢酸ナトリウム  ｐＨ５を用いて洗浄され、そしてその後、１０ｍＭ  酢酸ナトリウム／５０ｍＭ  塩化ナトリウム  ｐＨ５を用いて洗浄された。メンブレンはその後、ＵＶベースラインに到達するまで１０ｍＭ  酢酸ナトリウム／２００ｍＭ  塩化ナトリウムを用いて溶出された。Ｃｈｒｏｍａｓｏｒｂ溶出物はその後、フィルター上へ再度ロードされ、ＵＶベースラインに到達するまで１０ｍＭ  酢酸ナトリウム  ｐＨ５を用いて洗浄され、そしてその後、ＵＶベースラインに到達成するまで１０ｍＭ  ＨＣｌを用いて溶出された。ＶＳＤＬペプチド、約１ｍｇ／ｍＬ溶解物の収率で回収された。
【０１４５】
Ｃｈｒｏｍａｓｏｒｂ溶出物を複数のチューブ／バイアル中にアリコートし、そして−７０℃において約３０分間凍結した後、Ｌａｂｃｏｎｃｏ回転型凍結乾燥機へと、以下に記載の凍結乾燥のために移動された。サンプルは、Ｌａｂｃｏｎｃｏ中、摂氏−２５℃で３０分間凍結され、そしてその後、サンプルに減圧が適用された。第一の乾燥が−１５℃で２４時間行われた。第二の乾燥は＋１７℃で終夜で行われた。凍結乾燥されたチューブ／バイアルはその後−２０℃の冷凍庫中に保管された。
【０１４６】
凍結乾燥物は、０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ中で再構成され、そして、標準的な技術（表５）を用いる一連のアッセイによって分析された。
【０１４７】
【表５】
2015510770.tif 000007
【０１４８】
実施例３  大腸菌でのＶＳＤＬ  ３量体の組換え産生
ＢＲ０６７大腸菌株が、ＶＳＤＬペプチドの３個のコンカテマー型体コピーを有するＢ７２Ｒ−（ＶＳＤＬ）３融合ポリペプチド（すなわち３量体）をエンコードする、実施例１に記載のｐＢＲＥ６０２発現構築物をもつ点を除いて、ＶＳＤＬ細胞溶解液が実施例２と同様に取得された。
【０１４９】
Ｂ７２Ｒ−（ＶＳＤＬ）３細胞溶解液（１７５ｍＬ）が、１５〜２５°Ｃのあいだの温度に到達まで解凍された。１Ｍ  ＮａＯＨを用いて、細胞溶解液のｐＨが８．０±０．１に調整された。再構成されたＴｒｙｐＺｅａｎ（登録商標）が２５μｇ／ｍＬ細胞溶解液で添加された。消化物は５分間ゆっくり混合され、その後、室温で終夜静置された。消化物のｐＨは、１Ｍ酢酸を用いて４．４±０．１に調整された。溶液はマグネチックスターラーを用いてゆっくりと撹拌された。
【０１５０】
その後、細胞溶解液が、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋ＰｏｄＬａｂスケールＤ０ＨＣフィルター（ＭＤ０ＨＣ０２７Ｈ２）０．０２７ｍ２を用いて４．２ｍＬ／分でデプスフィルターでろ過され、そしてその後、Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ  ＣＧ３００Ｃカラム（内径１６ｍｍ、ベッド高に対するカラム長７．０ｃｍ）へ直接ロードされた。カラムは、約５０分間、４．２ｍＬ／分で０．５％酢酸を用いて、その後、約２５分間、４．２ｍＬ／分で０．５％酢酸／１５％イソプロパノールを用いて、その後、約３５分間、４．２ｍＬ／分で２５ｍＭ  Ｔｒｉｓを用いて、そしてその後４．２ｍＬ／分で２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／３％イソプロパノールを用いて洗浄された。ＵＶ吸光度が最大値から減少し始めたとき、洗浄は２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１５％イソプロパノールに切り替えられた。ＵＶ吸光度が主ピークの１０％に到達するまで、カラムは、４．２ｍＬ／分で２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１５％イソプロパノールを用いて溶出された。消化された細胞溶解液からのＶＳＤＬの分離を図１１に示す。
【０１５１】
実施例４  リーダー融合パートナーとしてＢ７２ＱＲを有する新規構築物の発酵物の分析
Ｂ７２Ｒ融合パートナーの最後から２番目のアスパラギン酸残基の、グルタミン残基との置換が、リーダーペプチドのＣ末端アルギニン残基におけるトリプシン切断の向上について調べられた。前記置換をもつリーダー融合ペプチドは、本明細書中においてＢ７２（Ｑ）Ｒと称される（配列番号１０を参照のこと）。実施例１に記載されるものと類似の技術を用いて、Ｂ７２（Ｑ）Ｒリーダーペプチドに融合されている、新規のＶＳＤＬ６量体、８量体および１０量体構築物が作製された。得られた構築物は、ＢＲ０６７大腸菌株へと形質転換され、そして、実施例１に記載されるようにスクリーニングされた。
【０１５２】
Ｂ７２Ｒ−（ＶＳＤＬ）３、Ｂ７２ＱＲ−（ＶＳＤＬ）６、Ｂ７２ＱＲ−（ＶＳＤＬ）８およびＢ７２ＱＲ−（ＶＳＤＬ）１０株が実施例１に記載されるように培養された。細胞溶解液は、ＴｙｐＺｅａｎ（登録商標）を用いて、１：１２０のモル比で室温で終夜インキュベートされた。ＶＳＤＬペプチドは、実施例１に記載されるようにＲＰ−ＵＰＬＣによって定量化された。高い濃度のＶＳＤＬ（２．５ｍｇ／ｍＬ）が、表６に示されるように、リーダー融合パートナーとしてＢ７２ＱＲとのＶＳＤＬ８量体および１０量体として記録された。
【０１５３】
【表６】
2015510770.tif 000008
【０１５４】
仮説例１  ＧＬＰの組換え産生
天然のヒトグルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ、ＮＣＢＩの登録番号ＮＰ＿００２０４５由来）をエンコードするヌクレオチド配列が、対応するアミノ酸配列から２つの配列内リジン（Ｋ）残基を除去し、リジン残基がグルタミン（Ｑ）残基へと変換されるように修飾される。天然のアミノ酸配列は生来、Ｃ末端アルギニン（Ｒ）残基を有する。Ｎ末端Ｈｉｓタグとその後に続く、修飾ＧＬＰヌクレオチド配列の３個のまたは８個のいずれかの数のコンカテマー型コピーに作動可能に連結されるアルギニン残基（トリプシン切断部位を提供するため）をエンコードする発現構築物が、標準の大腸菌発現ベクター内に作製される。発現ベクターは大腸菌に形質転換され、そして、形質転換体が選択され、そしてその後実施例１に記載されるように培養される。
【０１５５】
細胞溶解液は、１：１２０のモル比を用いたＴｒｙｐｚｅａｎとの終夜インキュベーションに切断される。融合ペプチドからの組換えＧＬＰの分離は、実施例１〜実施例４に記載されるように評価され得る。ＧＬＰの最適な精製は、標準の技術を用いて決定され得るる。
【０１５６】
本明細書中全体において、用語「含む（comprise）」またはその変化形である「含む（comprises）」または「含んでいる（comprising）」などは、記載される要素、整数もしくは工程、または、要素、整数またはス工程の群の包含を意味するが、任意の他の要素、整数もしくは工程、または、要素、整数または工程の群の除外を意味するものではないと理解されるであろう。
【０１５７】
本明細書中に記載される全ての文献は、参照によって本明細書中に組み込まれる。本明細書中に含まれている資料、行為、材料、装置、文献などについての説明は、ひとえに本発明における意味を提供することのみを目的とする。よって、これらの事項のうちのいくつかまたは全部が従来技術の基礎の一部形成する、または本発明に関連する技術分野における、本出願の各請求項の優先日以前にオーストラリアなどに存在していた技術常識であったという承認として認識されるべきではない。
【０１５８】
当業者であれば、多数の改変および／または変更が、広範に記載されるように、本発明の意図および範囲から逸脱することなく特定の実施形態で示される発明に行われ得ることを理解するであろう。よって、本実施形態は、全ての点において、例示的なものとして解釈されるべきであり、限定的なものとして解釈されるべきではない。
【０１５９】
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ＷｉｎｔｅｒｓＣＪ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ８０：４３８−４４９（１９８９）
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図３ｆ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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