(57)【要約】  本発明は、少なくとも１種の免疫刺激剤および容量性カップリングを用いた高周波からなるワクチンおよびその方法に関し、特に、原発性がんおよび現時点で利用可能な画像方法では検出することができない播種性の細胞状態であってもその転移を治療するための、あるいはがん疾病の再発を予防するためのｉｎ−ｓｉｔｕおよびｉｎ  ｖｉｖｏワクチン接種方法に関し、また特にがん細胞を認識して死滅させるがん疾病の再発防止についての記憶を確立するために患者自身の免疫システムに可能性を与えて支援するためのワクチン接種法に関する。
2015530379.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンデンサ装置における容量性カップリングを用いた高周波と共に用いる場合に、原発性がんおよびその転移に非侵襲性治療を施こすか、あるいは前記がん疾病の再発を防止する免疫刺激剤。
【請求項２】
前記コンデンサ装置が少なくとも１個の電極および少なくとも１個の対極からなり、患者はそれらの間の誘電体である請求項１に記載の免疫刺激剤。
【請求項３】
前記高周波を適用するために、放射性カップリングを用いたＲＦ装置のようにアンテナを使用しない請求項１または請求項２に記載の免疫刺激剤。
【請求項４】
前記高周波が全身に適用される前記請求項のいずれか１項に記載の免疫刺激剤。
【請求項５】
前記適用した高周波が、前記患者の体温を上昇させないか、または前記患者の治療部位の温度を上昇させない、前記請求項のいずれか１項に記載の免疫刺激剤。
【請求項６】
前記免疫刺激剤は、前記患者の免疫システムを活性化し、コンデンサ装置における容量性カップリングを用いて適用した高周波と共にがん細胞を認識しかつ死滅させるための記憶細胞を成長させてがん細胞に対するワクチン効果を提供する、前記請求項のいずれか１項に記載の免疫刺激剤。
【請求項７】
前記免疫刺激剤は以下の群から選ばれる前記請求項のいずれか１項に記載の免疫刺激剤：リポ多糖類、カルメット・ゲラン杆菌の抽出物、ピシバニール、アンセール（Ａｎｃｅｒ）、シャオーエイピン（Ｘｉａｏ−Ａｉｐｉｎｇ）、Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）（サルグラモスチム；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子組換え体）、死滅したコルネバクテリウム・パルヴム細菌およびその抽出物、イピリムマブ（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原−４の抗体）、レバミゾール、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）、低用量シスプラチンまたはカルボプラチン（＜０．４ｍｇ／ｋｇ）、十全大補湯（ＪＴ４８）およびデオキシコール酸（ＤＣＡ）。
【請求項８】
前記転移および原発性がんは以下の群から選ばれる前記請求項のいずれか１項に記載の免疫刺激剤：腺がん、脈絡膜メラノーマ、急性白血病、聴神経腫、膨大部がん、肛門がん、星細胞腫、基底細胞がん、膵臓がん、デスモイド腫瘍、膀胱がん、気管支がん、非小細胞性肺がん（ＮＳＣＬＣ）、乳がん、バーキットリンパ腫、体がん、ＣＵＰ症候群（未知の原発腫瘍）、結腸直腸がん，小腸がん、小腸腫瘍、卵巣がん、子宮内膜がん、上衣腫、卵巣がん種、ユーイング腫瘍、消化管腫瘍、胃がん、胆嚢がん（ｃａｎｃｅｒ）、胆嚢がん（ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ）、子宮がん、子宮頸がん、頸部ｃｅｒｖｉｘ、膠芽腫、婦人科腫瘍、耳、鼻および咽頭腫瘍、血液の腫瘍（ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  ｎｅｏｐｌａｓｉａｓ）、有毛細胞白血病，尿道がん、皮膚がん、皮膚精巣がん、脳腫瘍（神経膠腫）、脳転移、睾丸がん、下垂体腫瘍、カルチノイド、カポジ肉腫、喉頭がん、胚細胞腫瘍、骨肉腫、結腸直腸がん、頭頸部がん（耳、鼻、喉のがん）、結腸がん、頭蓋咽頭腫、口腔がん（口および唇のがん）、中枢神経系がん、肝臓がん、肝転位、白血病、まぶた腫瘍、肺がん、リンパ節がん（ホジキンおよび非ホジキン）、リンパ種、胃がん、悪性黒色腫、悪性新生物、悪性胃腸管腫瘍、乳がん、直腸がん、髄芽腫，黒色腫、髄膜腫、ホジキン病、菌状息肉腫、鼻腔がん、神経鞘腫、神経芽細胞腫，腎臓がん、腎細胞がん、非ホジキンリンパ腫、乏突起膠腫、食道がん、骨融解性がんおよび骨形成性がん、骨肉腫、扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫（菌状息肉腫）、胸腺腫、一次性卵管がん、眼腫瘍、尿道がん、泌尿器腫瘍，尿路上皮がん、外陰がん、いぼの外観、軟組織腫瘍、軟部肉腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸がんおよび舌がんで、特に治療に適切なのは、例えば、星状細胞腫、グリア芽腫、膵臓がん、気管支がん、乳がん、結腸直腸がん、卵巣がん、胃がん、喉頭がん、悪性黒色腫，食道がん、子宮頸がん、腎臓がん、膀胱がん、および腎細胞がん。
【請求項９】
原発性がんおよびその転移を治療するための、あるいはがん疾病の再発を予防するための少なくとも１種の免疫刺激剤およびコンデンサ装置における容量性カップリングを用いた高周波からなるワクチン。
【請求項１０】
前記免疫刺激剤は以下の群からなる請求項９に記載のワクチン：  リポ多糖類、カルメット・ゲラン杆菌の抽出物、  ピシバニール、アンセール（Ａｎｃｅｒ）、シャオーエイピン（Ｘｉａｏ−Ａｉｐｉｎｇ）、Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）（サルグラモスチム；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子組換え体）、死滅したコルネバクテリウム・パルヴム細菌およびその抽出物、イピリムマブ（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原−４の抗体）、レバミゾール、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）、低用量シスプラチンまたはカルボプラチン（＜０．４  ｍｇ／ｋｇ）、十全大補湯（ＪＴ４８）およびデオキシコール酸（ＤＣＡ）。
【請求項１１】
前記ワクチンは、ｉｎ−ｓｉｔｕワクチン接種に用いられる請求項９または１０に記載のワクチン。
【請求項１２】
がんになる危険性が高まった人々へのワクチン接種および／または首尾よく治療されたがん疾病の再発を予防するための患者へのワクチン接種のための請求項９乃至請求項１１のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１３】
前記コンデンサ装置が少なくとも１個の電極および少なくとも１個の対極からなり、患者はそれらの間の誘電体である請求項９乃至１２のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１４】
前記適用した高周波が、前記患者の体温を上昇させないか、または前記患者の治療部位の温度を上昇させない、請求項９乃至１３のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１５】
前記転移あるいは前記がんは以下の群から選ばれる請求項９乃至１４のいずれか１項に記載のワクチン：腺がん、脈絡膜メラノーマ、急性白血病、聴神経腫、膨大部がん、肛門がん、星細胞腫、基底細胞がん、膵臓がん、デスモイド腫瘍、膀胱がん、気管支がん、非小細胞性肺がん（ＮＳＣＬＣ）、乳がん、バーキットリンパ腫、体がん、ＣＵＰ症候群（未知の原発腫瘍）、結腸直腸がん，小腸がん、小腸腫瘍、卵巣がん、子宮内膜がん、上衣腫、卵巣がん種、ユーイング腫瘍、消化管腫瘍、胃がん、胆嚢がん（ｃａｎｃｅｒ）、胆嚢がん（ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ）、子宮がん、子宮頸がん、頸部ｃｅｒｖｉｘ、膠芽腫、婦人科腫瘍、耳、鼻および咽頭腫瘍、血液の腫瘍（ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  ｎｅｏｐｌａｓｉａｓ）、有毛細胞白血病，尿道がん、皮膚がん、皮膚精巣がん、脳腫瘍（神経膠腫）、脳転移、睾丸がん、下垂体腫瘍、カルチノイド、カポジ肉腫、喉頭がん、胚細胞腫瘍、骨肉腫、結腸直腸がん、頭頸部がん（耳、鼻、喉のがん）、結腸がん、頭蓋咽頭腫、口腔がん（口および唇のがん）、中枢神経系がん、肝臓がん、肝転位、白血病、まぶた腫瘍、肺がん、リンパ節がん（ホジキンおよび非ホジキン）、リンパ種、胃がん、悪性黒色腫、悪性新生物、悪性胃腸管腫瘍、乳がん、直腸がん、髄芽腫，黒色腫、髄膜腫、ホジキン病、菌状息肉腫、鼻腔がん、神経鞘腫、神経芽細胞腫，腎臓がん、腎細胞がん、非ホジキンリンパ腫、乏突起膠腫、食道がん、骨融解性がんおよび骨形成性がん、骨肉腫、扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫（菌状息肉腫）、胸腺腫、一次性卵管がん、眼腫瘍、尿道がん、泌尿器腫瘍，尿路上皮がん、外陰がん、いぼの外観、軟組織腫瘍、軟部肉腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸がんおよび舌がんで、特に治療に適切なのは、例えば、星状細胞腫、グリア芽腫、膵臓がん、気管支がん、乳がん、結腸直腸がん、卵巣がん、胃がん、喉頭がん、悪性黒色腫，食道がん、子宮頸がん、腎臓がん、膀胱がん、および腎細胞がん。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、少なくとも１種の免疫刺激剤および容量性カップリング（静電結合）を使用した高周波（ラジオ波）からなるワクチンおよび方法に関し、特に原発性がんおよびそれが現時点で利用可能な画像方法では検出することができない播種性の細胞状態であってもその転移を治療するための、あるいはがん疾病の再発を予防するためのｉｎ−ｓｉｔｕおよびｉｎ  ｖｉｖｏワクチン接種方法に関し、また特にがん細胞を認識して死滅させるがん疾病の再発防止についての記憶（メモリー）を確立するために患者自身の免疫システムに可能性を与えて支援するためのワクチン接種法に関する。
【０００２】
本発明は患者自身固有の腫瘍特異性抗原を使用する。しかしながらこれらの抗原は潜伏しており、免疫細胞および後に生ずる反応について認識することができない。これにより免疫攻撃から悪性腫瘍を予防し、さらに身体は腫瘍を自己組織の修復だと認識する。免疫システムは腫瘍細胞に対して沈黙している。本発明は、悪性腫瘍に対して特異な免疫反応を発動するような抗原提示細胞 (ＡＰＣｓ)により認識される腫瘍抗原を取り除くことができるワクチンを提供する。本発明のワクチンにより特別な効果が提供されるが、それはすなわち潜伏する抗原の顕在化、ＡＰＣｓ（特に樹状細胞)による認識の促進、および前記ＡＰＣｓおよび腫瘍を根絶するための特異的免疫反応を確立するための完全な免疫システムの形成である。従って本発明のワクチンはナチュラルプロセス（自然過程）を発生させる。
【０００３】
端的に言うと、本発明のワクチンによって生ずる免疫原性細胞死は、がん細胞と戦うために適応した免疫システムの活性化により生ずる。免疫刺激剤は、本発明のワクチン成分として、この戦いを支援するのでその効果は長期的な記憶を持った完全に全身的なものである。
［発明の背景］
定義
本明細書で用いられる用語「潜伏腫瘍細胞」または「非免疫原性腫瘍」とは、表面的には腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）の発現が少ないかまたは発現がないために免疫システムの検出を逃れた腫瘍および腫瘍細胞を指す。潜伏腫瘍細胞は、「休眠腫瘍細胞」、播種性細胞および微小がん組織の転移を含む。休眠腫瘍細胞は、検査しても悪性の特性を示さずかつ化学的抵抗を有するが耐熱性はない。播種性細胞は低濃度で血液内を循環する。その血液中の少ない抗体の提示レベルおよび低い濃度のためにその検出は不可能である。微小がん組織の転移は一般的に最も危険性がありその進行が見えない部分でもある。現行の画像システムの解像度では、微小がん組織の転移はそれらが数百万の細胞からなる凝集体を形成した後にのみ検出することができる。
【０００４】
本明細書中で使用される用語「ｉｎ  ｖｉｖｏワクチン接種」は、免疫付与に必要な抗原が患者の体内で生成されることを意味する。大部分の腫瘍―ワクチン接種は、人工的に生産された抗原、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験室条件を用いて作成され患者に再注入された患者自身の抗原を用いる。しかしながら、本発明では、免疫付与に必要な適切な抗原はｉｎ  ｖｉｖｏ、すなわち患者の身体内で生成される。従って本発明のワクチン接種法は、ｉｎ  ｖｉｖｏワクチン接種法とも呼ばれる。
【０００５】
本明細書で用いられる「ｉｎ−ｓｉｔｕワクチン接種」は免疫付与、すなわち特異的なＴＳＡの認識が実際に腫瘍内で行われることを意味する。大部分の「古典的な」腫瘍−ワクチン接種では、抗原は活性分子作用が予期される位置から遠く離れた体内に置かれる。しかしながら、本発明によれば、免疫付与の過程はｉｎ−ｓｉｔｕ、すなわち腫瘍部位で行われる。従って本発明のワクチン接種法はｉｎ−ｓｉｔｕワクチン接種法とも呼ばれる。
【０００６】
本明細書で用いられる用語「適度な全身温熱療法（ハイパーサーミア）」は、３８℃から３９℃の温度で全身を温めることを言う。当業者にとって「加温範囲全身温熱療法」としても知られており、一般的に免疫システムを強めるために用いられる。３つのタイプの全身温熱療法に分けられる：
−  穏やかな全身温熱療法は、約３８℃の温度で全身を温めることを言う；
−  適度の全身温熱療法は、上に定義した通りである；
−  極端な全身温熱療法は、４０℃から４１℃の温度、時には４２℃まで上昇させた温度で全身を温めることを言う。
【０００７】
また本明細書で用いられる用語「がんの危険性（リスク）の高い人々」は、遺伝子の突然変異による遺伝の結果として、がんに対する顕著に高い罹病性を持って生まれた人々のことを指す。遺伝子突然変異は、人々が１種以上のがんの罹病率を大きく増加させるのに十分であり、かつこの罹病性は世代間を超えて受け継がれる。このような突然変異の遺伝では、家族内において多数の個人がある種の型のがんを発生することになる。遺伝性がんに対応する公知の遺伝子には乳がんの危険性を高める変型ＧＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２遺伝子ならびに大腸がんに結びつくＨＮＰＣＣ遺伝子が含まれる。さらに用語「がんの危険性の高い人々」はまた結果としてがんに対する危険性の高い生活環境発がん物質に曝されることによってある種の突然変異が起こるかまたは高い確率で起こる人々のことを指す。がん発生の危険因子への曝露には、長時間または繰り返し放射能に曝されたり、喫煙したり、発生原因となる化学薬品に曝されたり、さらにヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）のようながんウイルスに感染することが含まれる。がんの成長の引き金となる可能性を持つ化学薬品及び放射線は「発がん性物質」と呼ばれる。発がん性物質は、一連の遺伝子変異（「突然変異」）を始動するように作用し、細胞を増殖するように刺激する。発がん性物質への露出とがん発症との間には数十年の遅れがある。露出と疾病発症との間の期間はラグタイムである。従って、本発明の一つの局面は、発がん性物質への曝露により生じたがんの増大する危険性を持った人々を、このラグタイムの終了時またはその近傍において治療することにある。従って、この範疇にある人々にとって本発明によるワクチン接種法は特に重要である。
【０００８】
高周波に基づく方法とがん
最近では、がん治療のために高周波電流を用いた方法として、本発明とは全く異なる高周波除去法（ＲＦＡ）がある。ＲＦＡ法は、ＲＦを用いて患部を焼切る侵襲的な方法である。ＲＦＡ法では、無針形式の「アンテナ」を適用し（図１参照)、それを固形腫瘍中の腫瘍内に挿入するものであり、適用される局所電流が非常に大きくなるので腫瘍は焼かれてそれにより激しい壊死（ネクローシス）を起こすのである。
【０００９】
このような状態は、本発明によって厳しく避けられる。ＲＦＡ法は、心臓の電気伝導システムの一部である医療処置であり、医学的障害を治療するために、腫瘍あるいはその他の機能不全を生じた組織を高周波交流から発生する熱を用いて切除するものである。ＲＦ電流の利点(従来使用されている低周波ＡＣまたはＤＣパルスを超えた)は、直接神経または心臓筋肉を刺激することはないので、頻繁に使用される一般的な麻酔薬の必要がないことである。ＲＦＡによる処置は、麻酔医、介入放射線医、心臓医学生理学医のような介入疼痛スペシャリストによる画像ガイダンス（Ｘ線スクリーニング、ＣＴスキャンまたは超音波）の下で実施される。
【００１０】
がんを治療するための高周波電流を用いた別の医学的処置は、パルス高周波での心臓内刺激である（ＷＯ２０１１/０７８６７６参照）。この方法は、固形腫瘍および血液媒介腫瘍の両者の治療に有効であり、血管中に１０００Ωよりも低いインピーダンスを持つ針状電極を挿入し、０．１から１００ｍｓの持続時間および１／ｓから２０／ｓのバースト周波数を持ったパルスバーストで０.１から８０Ｖの電圧の高周波範囲の電流パルスの電気信号を供給することを含む。血管内のパルス高周波刺激は、リンパ球を刺激しかつ引き付けることにより免疫システムを強化し、それが腫瘍細胞を攻撃する結果となることが記載されている。血管内高周波刺激は侵襲的であり、全身内で血液を温める。さらに、血管内高周波刺激により誘発された免疫反応は特異的ではない。それ故、非免疫反応は「潜伏的」腫瘍細胞を標的とし医療処置によって左右されない。
【００１１】
ＷＯ２０１１／０７８６７６もまたワクチン接種と組み合わせた高周波パルスを使った血管内刺激を用いる可能性について開示している。しかしながら、このＷＯ２０１１／０７８６７６では、高周波パルスを使った血管内刺激の役割は免疫システムを増強するものであり、ワクチン接種治療によって引き起こされる免疫反は拡大される。我々の認識では、現在までの数種のがんワクチンは会社によって開発されているが、たった１種の製品のみが末期前立腺がんのために完全に承認（ＦＤＡにより）されている。プロベンジ（Ｐｒｏｖｅｎｇｅ（登録商標）（または、シピュルーセルーＴ（ｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ−Ｔ））は、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいてＰＡＰ−ＧＭ−ＣＳＦ溶融タンパク質でｅｘ  ｖｉｖｏ培養された患者自体の血液細胞の混合物からなる前立腺がんの免疫療法である。これまでは「潜伏」がん細胞に対するがんのワクチン接種は開発されていなかった。それ故、ＷＯ２０１１／０７６６７６で開示された方法では、非侵襲的な方法で使用したパルス高周波は、どのようにがん細胞に対する記憶と全身的な免疫反応を提供しワクチン接種治療法として用いられたのかについて、いかなる情報も提供していない。
【００１２】
免疫システムおよびがん
免疫システムは複雑な構造であり、そのプロセスは有機体（生物）を障害と疾病から保護するものである。それは２つの基本的なサブシステム、先天性免疫システムおよび適応免疫システムを有する。先天性免疫システムは、殆ど全ての生物体に見られ、免疫記憶は成長せず、作用(反応）は非特異的でかつ迅速である。先天性免疫システムの主たる細胞構造は、マクロファージ(食菌可能である)、肥満細胞（炎症プロモータを放出する)、顆粒細胞（炎症に反応する３種の細胞型からなる群）、樹状細胞(適応免疫細胞で抗原を提示する)、ナチュラルキラー細胞(病原体に罹病して細胞を破壊する)である。顎口虫症（顎を持つ脊椎動物）に見られる適応システムは、免疫原記憶と一般的な反応のラグタイム)を持っている。適応システムに属する主な細胞群は、侵入菌を無効にするような抗体を生成するＢ細胞と、感染細胞の破壊または免疫細胞の調整に特化したＴ細胞である。
【００１３】
免疫システムの役割の１つは、腫瘍を識別し、かつ破壊することである。その認識は、健康な細胞には現れない腫瘍特異抗原および腫瘍細胞の表面上の腫瘍関連抗原により可能である。遺伝子の突然変異が腫瘍抗原として作用することができるので、どのようなタンパク質でも、変形細胞を持つ腫瘍細胞内で生成される。あるいは、極めて低い生産量で通常生産されるが腫瘍細胞内では生産量が増加するタンパク質は、時として免疫反応を誘発する。このようなタンパク質の一例として、酵素チロシナーゼがある。このタンパク質は内因性タンパク質であるので免疫反応は稀であるが、細胞膜上の抗原濃度が十分に高いと、がん細胞を認識し特異的Ｔ細胞により破壊することができる。
【００１４】
別の重要な部類の腫瘍抗原は、免疫システムの発生が完了する前に胚発生の早期段階においてのみ正常的に得られるので、これらのタンパク質または抗原に対する自己耐性は成長しない。さらに、オンコウイルス（例えばＥＢＶおよびＨＰＶ）に感染した細胞は、転写されるウイルス性ＤＮＡを含み、このようにして得られたタンパク質またはＤＮＡは、免疫反応を生ずる。
【００１５】
腫瘍細胞に対する特異的免疫反応はＴ細胞を使用する。腫瘍細胞は、しばしば認識可能な構造を減少させるか、または認識可能な構造を隠すことさえあるが、それはＡＰＣｓにより認識することができる。幾つかの腫瘍は、例えば潜伏ＴＧＦ−βなどによる免疫反応を妨げる。さらに免疫寛容を発達させることができ、さらなる免疫反応ががん細胞に対して向けられることはない。腫瘍は、また幾つかのケースでは、腫瘍の成長を促進するマクロファージのような矛盾を生じ得る。
【００１６】
基本の理論的な処方では、がんの免疫監視、発がん性の阻止および細胞恒常性の有効性保持について提案している。それにより個人が自身の免疫システムによってがんの成長に対して防衛する方法は免疫編集と呼ばれる。炎症を起こさせることは年配者では主な腫瘍の成長を促すもの（プロモータ）の１つである。
【００１７】
現在のがん治療は、化学治療(化学薬品)、放射線治療(イオン化ビーム）、外科手術。およびこれらの組合わせなどの、所謂「黄金の標準（ｇｏｌｄ  ｓｔａｎｄａｒｄ）」に主に焦点があてられている。新しいがんの治療の方法が出現しているが、、これらの中で免疫治療が有望な治療として出現している。
【００１８】
化学ー熱的―治療法(化学的治療と組み合わせた全身温熱療法)では、シャペロンの役割は重要である。シャペロン（ストレスタンパク質、あるいは熱ショックタンパク質のような）は長期保存のタンパク質であり、それは殆ど全ての生体細胞中に存在し、非共有結合の折りたたみ（フォルディング）または非折りたたみ（非フォルディング）および他の高分子構造の集合または非集合を助ける。シャペロンは進化の段階に拘わりなく実質的に全ての生体に見られる。シャペロンは、正常なまたは病態生理学的な状態下で偏在的に示されるが、細胞生命の動的平衡におけるどのような種類の変化(熱のような環境的ストレス、種々の病原体の進行、疾病など)も調節し、その合成の大部分を活性化する。シャペロンの排泄作用は、それ自体を新しい挑戦に適応させるための細胞のストレス反応である。細胞成長の上昇、およびそれによる悪性細胞のタンパク質発現の増加の結果として、分子シャペロンは、がん細胞における発現性が高く、かつこのような細胞タイプを残存させるために不可欠である。熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）は、細胞が高温または他のストレスにさらされた場合に高い発現性を有するシャペロンの一群である。その上、種々のＨＳＰ（ＨＳＰ２７、ＨＳＰ７０およびＨＳＰ９０）の誘発が多数の転移中に見られ、かつＨＳＰ９０の同族体、ＧＲＰ９４が転移発生の仲介物として作用する。その上、ストレスタンパク質および熱ショックタンパク質は、悪性腫瘍を取り除かねばならない全ての腫瘍学的（オンコロジカル）治療法により誘発される。従って、強力なシャペロン合成物は、従来の温熱化学治療、放射線治療またさらには光力学的治療の後に検知された。ストレス順応の途中で、ストレスタンパク質の誘発または過剰発現は、一般的にアポトーシス（自死）に対する細胞の効果的な防衛を提供する。しかしながら、細胞外発現は反対に作用し、免疫システムと実際の細胞の欠陥にも信号を送る。さらに温熱治療は多薬耐性も導くことができる。
【００１９】
非温度依存性効果(主として電磁場ストレス)もまた  シャペロン物を生成することができる。がん組織の生体組織検査におけるＨＳＰの顕在化は、治療反応として良好な臨床的兆候とすることができる。
【００２０】
一方において、シャペロンＨＳＰ７０は、実際の動的平衡の凍結(現状維持)を助け、それにより細胞外電解液における細胞コミュニケーションを再構築しようとする。細胞膜上のシャペロンＨＰＳ７０の発現は、アポトーシス信号を得て免疫反応を高めることで知られている。ＨＳＰ７０は、ｐ５３腫瘍抑制因子の活性化に関与し、網膜芽細胞腫タンパク質の腫瘍抑制因子と関連している。
【００２１】
ＨＰＳ７０の膜再局在化はアポトーシスを促進し、かつ機能性維持のために膜「流動性」において(他のシャペロンに比べて)極めて重要な役割を持つ。主として膜のコレステロール豊富な微小ドメインにおけるＨＳＰ７０の腫瘍特異膜局在化は、免疫反応におけるＮＫ細胞の活性化に効果がある。広帯域（０．２−２０ＭＨｚ）電磁場はＨＳＰ７０の発現を増加させる。温度によるＨＳＰ７０発現の同様な増加量の生成には、１４倍より大きな摂動を必要とし、それは要約すればＨＳＰ７０の発現について電界の非温度依存性効果が温度依存性効果よりも大きな利点を有することを示す。細胞外ＨＳＰ７０の役割は、バイオシステムの免疫反応全体において関心が増加している話題である。
【００２２】
細胞溶解と細胞壊死に対する毒素特性の解放は、勿論変形方法の制限を生ずる。しかしながら、アポトーシス細胞死または他の何れかの全身的な免疫作用は、より自然にまたシステムを毒性の問題から解放するであろう。熱的に誘引されたアポトーシスおよびナチュラルキラー細胞の活性化の両者はこの問題を解決するのに好適である。
【００２３】
従って、がん治療においては、腫瘍細胞、特に認識可能な構造の発現が少ないか、またはＡＰＣｓにより認識することができる構造が隠れている非免疫原性腫瘍細胞を容易に認識するための免疫システムを支援するための可能性を提供することは有用である。このような可能性はまた、転移および通常は治療不能な転移を発症した患者を首尾よく治療することができる。
【００２４】
本発明の目的は上述した可能性を提供することである。
この目的は独立請求項に教示するところにより解決される。さらに有利な特徴および実施形態は、明細書、実施例および従属請求項から明らかである。
［発明の説明］
本発明は、原発性がんおよびがんを有する患者におけるその転移の非侵襲性治療のための方法、または患者に首尾よく治療されたがん疾病の再発を防止するための方法に関し、それは患者にコンデンサ装置における容量性カップリングを用いた高周波と共に免疫刺激剤を与えるものである。
【００２５】
従って、原発性がんおよび／または転移を有するか、または好首尾ながん治療後に再発の危険性を有する患者は、免疫刺激剤で局所的にまたは全身的に治療され、加えてコンデンサ装置における容量性カップリングを用いた高周波での温熱療法を施される。コンデンサ装置における容量性カップリングを用いた高周波での温熱療法は、日に１度、隔日、または週に１度、または必要に応じて、または医師の定めたスケジュールに従い施されるが、通常１セッションごとに１から数時間施される。
【００２６】
本明細書で用いられる「容量性カップリング」とは、電磁エネルギをキャパシタのような装置を構築して電界優位性を用いた負荷に送達することを言う。負荷は、この場合治療すべき患者を指すが、キャパシタの一部であり、かつキャパシタ（コンデンサ）の最低の誘電物として作用する。電極はそのインピーダンス(電気抵抗）により適合される。本発明において用いられる方法は、「導電性の」容量性カップリングを有し、不完全な誘電物質において導電部分を支配し、大部分がジュール熱を生成する。電極が緩やかに結合される場合には、カップリングは一層放射性であり、それによりジュール熱容量が失われる。
【００２７】
免疫刺激剤および本発明による容量性カップリングを用いた高周波による温熱療法との組合せは、患者自身の免疫システムが原発性がん細胞および転移および転移したがん細胞および再発中に形成された単一がん細胞の認識を可能にし、この認識後にこれらのがん細胞を効果的に死滅させることを可能にする。従って、本発明の好ましい実施形態では、ｉｎ―ｓｉｔｕおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの患者（患者はがんを患うかまたは本発明の方法に依るかまたは依るらない方法で首尾よくがんを治療した患者）へのワクチン接種法、またはがん発生の危険性の高い人々へのワクチン接種法について言及する。
【００２８】
本発明によるがんおよび転移の治療方法または再発の予防法においては、高周波は少なくとも１個の電極および対極からなるコンデンサ装置の容量性カップリングを使用して与えられるが、患者はその間における誘電体である。
【００２９】
本発明によるがんの非侵襲性治療法および予防法の利点の１つは、高周波の付与は放射線カップリングを持つＲＦ装置におけるようなアンテナの使用を必要としないことである。本発明の方法の従来法に対する他の重要な利点は、付与された高周波は患者の体温または患部の温度を上昇させないことである。
【００３０】
本発明の好ましい実施形態では、がんの治療およびがんの再発予防の方法は、コンデンサ装置における容量性カップリングを用いた高周波の全身的な付与である。
上記の方法では、好ましくは免疫刺激剤は以下の群から選ばれるか、あるいは以下の群からなる：バクテリア製剤、リポ多糖類、カルメット・ゲラン杆菌の抽出物、ピシバニール、アンセール（Ａｎｃｅｒ）、シャオ−エイピン（Ｘｉａｏ−Ａｉｐｉｎｇ）、Ｌｅｕｋｉｎｅ（リューカイン）（登録商標）（サルグラモスチム；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子組換え体）、死滅したコルネバクテリウム・パルヴム細菌およびその抽出物、サイトカイン、穏やかな全身温熱療法、ＴＬＲ受容体作用薬、ＴＬＲ経路に作用するあらゆる天然薬または合成薬、イピリムマブ、ハーブ化合物（エキナセア（ｅｃｈｉｎａｃｅａ）など）およびレバミゾール。
【００３１】
本発明の方法は、がん発病の危険性が高い人々にワクチン接種を行う場合に特に有効であり、それはこの方法が、がん細胞、特に腫瘍特異抗原を隠すことで免疫システムを免れようとするがん細胞を認識するための免疫システムの記憶を発生させるからである。
【００３２】
さらに本発明の方法は、再発の可能性が高いと思われるがん疾病について効果的に治療されたものと推定された患者に対するワクチン接種に対して極めて効果的である。従って、用語「再発」はがん疾病の復帰、またはがんを検出しなかった改善期間の後のがん疾病の兆候または症状を言う。おそらく再発は初めの治療で生き残った幾つかの原がん（ｏｒｉｇｉｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）細胞によるものである。時として、これはがん細胞が身体の他の部分に広がったためであり、また治療後ただちに行われる再検査（フォローアップ）に際して小さすぎて検出できなかったためである(微小がん組織の転移)。本発明の方法は、がん細胞、特にまた広がった細胞に対する記憶と全身的反応を提供することができ、ワクチン接種治療として用いることができる。従って上記の方法は、本発明に依る方法または本発明に依らない方法により成功裏であると推定されるがん治療を施した後の再発を予防するのに特に有用である。
【００３３】
本発明による発明は、原発性がんおよびその転移の治療、およびがんの再発防止に適切であり、それらのがん、原発性がん、転移あるいはがん細胞は、以下の群から選ばれる：腺がん、脈絡膜メラノーマ、急性白血病、聴神経腫、膨大部がん、肛門がん、星細胞腫、基底細胞がん、膵臓がん、デスモイド腫瘍、膀胱がん、気管支がん、非小細胞性肺がん（ＮＳＣＬＣ）、乳がん、バーキットリンパ腫、体がん、ＣＵＰ症候群（未知の原発腫瘍）、結腸直腸がん，小腸がん、小腸腫瘍、卵巣がん、子宮内膜がん、上衣腫、卵巣がん種、ユーイング腫瘍、消化管腫瘍、胃がん、胆嚢がん（ｃａｎｃｅｒ）、胆嚢がん（ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ）、子宮がん、子宮頸がん、頸部ｃｅｒｖｉｘ、膠芽腫、婦人科腫瘍、耳、鼻および咽頭腫瘍、血液の腫瘍（ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  ｎｅｏｐｌａｓｉａｓ）、有毛細胞白血病，尿道がん、皮膚がん、皮膚精巣がん、脳腫瘍（神経膠腫）、脳転移、睾丸がん、下垂体腫瘍、カルチノイド、カポジ肉腫、喉頭がん、胚細胞腫瘍、骨肉腫、結腸直腸がん、頭頸部がん（耳、鼻、喉のがん）、結腸がん、頭蓋咽頭腫、口腔がん（口および唇のがん）、中枢神経系がん、肝臓がん、肝転位、白血病、まぶた腫瘍、肺がん、リンパ節がん（ホジキンおよび非ホジキン）、リンパ種、胃がん、悪性黒色腫、悪性新生物、悪性胃腸管腫瘍、乳がん、直腸がん、髄芽腫，黒色腫、髄膜腫、ホジキン病、菌状息肉腫、鼻腔がん、神経鞘腫、神経芽細胞腫，腎臓がん、腎細胞がん、非ホジキンリンパ腫、乏突起膠腫、食道がん、骨融解性がんおよび骨形成性がん、骨肉腫、扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫（菌状息肉腫）、胸腺腫、一次性卵管がん、眼腫瘍、尿道がん、泌尿器腫瘍，尿路上皮がん、外陰がん、いぼの外観、軟組織腫瘍、軟部肉腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸がんおよび舌がんで、特に治療に適切なのは、例えば、星状細胞腫、グリア芽腫、膵臓がん、気管支がん、乳がん、結腸直腸がん、卵巣がん、胃がん、喉頭がん、悪性黒色腫，食道がん、子宮頸がん、腎臓がん、膀胱がん、および腎細胞がんである。本発明による発明は、特に非免疫原腫瘍あるいはがんの治療に適切である。
【００３４】
本発明の方法による好ましい実施形態は、がんを有する患者における原発性がんおよびそのがんの転移の非侵襲的治療のための、またはコンデンサ装置における容量性カップリングを使用した高周波とともにシャオーエイピン（Ｘｉａｏ−Ａｉｐｉｎｇ）を患者に与えることにより成功裏に治療を行った患者のがん疾病の再発予防のための方法に関する。
【００３５】
本発明の他の局面は、原発性がんおよびがんを有する患者におけるその転移の治療のため、またはがん疾病を成功裏に治療した人々におけるがん疾病の再発を予防するため、またはがんの進行に対する高い危険性を持った人々におけるがんの予防のために、少なくとも１種の免疫刺激剤およびコンデンサ装置における容量性カップリングを使用した高周波からなるワクチンに関する。
【００３６】
従って、本発明は、がんおよびその転移の治療のための治療薬の製剤のための免疫刺激剤の使用に関するものであり、免疫刺激剤はコンデンサ装置における容量性カップリングを用いた高周波と共に付与される。さらに、本発明は、がんを有する哺乳動物の治療のための治療薬の製剤のための、またはがん疾病が成功裏に治療されたと思われる哺乳動物におけるがん疾病の再発予防のための免疫刺激剤の使用に関するものであり、免疫刺激剤はコンデンサ装置における容量性カップリングを用いた高周波と共に患者に付与される。その結果、免疫刺激剤は、多数の非特異的免疫反応を活性化し、また容量性カップリングを用いた高周波の局所的効果を全身的効果に転換する。
【００３７】
さらに別な局面として、本発明は、がんを持つ患者における原発性がんおよびその転移の治療のため、またはがん疾病を成功裏に治療した人々におけるがん疾病の再発を予防するため、またはがんの発達に対する高い危険性を持った人々におけるがんの予防のためのワクチンを製剤するための免疫刺激剤の使用に関し、免疫刺激剤はコンデンサ装置における容量性カップリングを用いた高周波と共に患者に付与される。このワクチンは、特にｉｎーｓｉｔｕでのワクチン接種に有用で上記の型のがんに好ましい。
【００３８】
ワクチンの免疫刺激剤は、好ましくは以下の群から選ばれるか、あるいは以下の群からなる：バクテリア製剤、リポ多糖類、カルメット・ゲラン杆菌の抽出物、ピシバニール、アンセール（Ａｎｃｅｒ）、シャオ−エイピン（Ｘｉａｏ−Ａｉｐｉｎｇ）、Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）（サルグラモスチム；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子組換え体）、死滅したコルネバクテリウム・パルヴム細菌およびその抽出物、サイトカイン、穏やかな全身温熱療法、ＴＬＲ受容体作用薬、ＴＬＲ経路に作用するあらゆる天然薬または合成薬、イピリムマブ、ハーブ化合物（エキナセア（ｅｃｈｉｎａｃｅａ）など）およびレバミゾール。
【００３９】
本発明によるワクチンは、少なくともシャオーエイピンおよび原発性がんおよびがんを有する患者におけるその転移の治療のため、またはがん疾病を成功裏に治療した人々におけるがん疾病の再発を予防するため、またはがんの進行に対する高い危険性を持った人々におけるがんの予防のために、少なくともシャオーエイピンおよびコンデンサ装置における容量性カップリングを使用した高周波からなるワクチンである。
【００４０】
本発明の方法の他の局面は、コンデンサ装置における容量性カップリングを使用した高周波を共に用いた場合の、がんを有する患者における原発性がんおよびそのがんの転移を非侵襲的治療するための、またはがん疾病の再発を防止するための免疫刺激剤に関する。従って、本発明は、原発性がんおよびそのがんの転移の非侵襲的治療、またはがん疾病の再発を防止するための免疫刺激剤に関し、前記免疫刺激剤はコンデンサ装置における容量性カップリングを用いた高周波と共に投与される。さらに本発明は、がんを有する哺乳動物の治療のための、またはがん疾病が成功裏に治療されたと思われる哺乳動物におけるがん疾病の再発予防のための免疫刺激剤に関し、前記免疫刺激剤はコンデンサ装置における容量性カップリングを用いた高周波と共に患者に付与される。それにより前記免疫刺激剤は、多数の非特異的免疫反応を活性化し、また容量性カップリングを用いた高周波の局所的効果を全身的効果に転換する。
【００４１】
本発明のさらなる局面は、コンデンサ装置内の容量性カップリングを用いた高周波と共に使用した場合の、原発性がんおよびその転移の非侵襲治療およびがん疾病の再発の予防のための、シャオーエイピンに関する。従って、本発明の好ましい実施例では、原発性がんおよびその転移の非侵襲治療およびがん疾病の再発の予防のためのシャオーエイピンに関し、前記シャオーエイピンはコンデンサ装置における容量性カップリングを使用した高周波と共に投与される。さらに、本発明は、がんを有する哺乳動物の治療、またはがん疾病の成功裏と思われる治療が施された哺乳動物におけるがん疾病の再発の予防のためのシャオ―エイピンに関し、前記免疫刺激剤は、コンデンサ装置における容量性カップリングを使用した高周波と共に投与される。
【００４２】
意外なことに、通常の免疫刺激剤は、コンデンサ装置における容量性カップリングを使用した高周波と共に使用した場合には、原発性がんおよびその転移の治療およびがん疾病の再発の予防に極めて効果的である。発明者らは、コンデンサ装置における容量性カップリングを使用した高周波のみでは、遠い位置に存在するがんや転移には全く効果がないことを明らかにした。免疫刺激剤（ＬＰＳ、シャオーエイピン）の投与もまた腫瘍後退の効果がない。しかしながら、容量性カップリングを使用した高周波と共に免疫刺激剤を投与すると遠達効果があり、遠く離れて存在する腫瘍が収縮する結果が得られた。従って、容量性カップリングを使用した高周波と免疫刺激剤の共与は全身的な効果を与えた。
【００４３】
本発明は放射性カップリングでは作用しない。それは放射性カップリングは細胞を焼くからである。従って、放射性カップリングを持ったＲＦにおける様に無アンテナの装置が、本発明による免疫刺激剤と共に高周波を付与するために用いられる。
本発明による高周波は、少なくとも１つの電極および少なくとも１つの対極からなりコンデンサ装置を用いて付与され、患者がその中間における誘電体である。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態は、全身的に付与された高周波と共に用いられた免疫刺激剤に関する。
本発明によるコンデンサ装置における容量性カップリングを用いた高周波は患者の体温または治療部位の温度を上昇させない。
【００４５】
本発明では全ての一般的な免疫刺激剤が使用できる。免疫刺激剤または免疫刺激促進剤は、その全ての成分について活性を誘発させることで、または活性を増加させることで、免疫システムに刺激を与える物質である。本発明では、抗原特異性に関わりなく、他の抗原の免疫反応を増強させるか、または抗原特異性なしで免疫システムの成分を刺激するように作用する非特異的免疫刺激剤が好ましい。本発明において有効であり得る免疫刺激剤の例は、リポ多糖類、カルメット・ゲラン杆菌の抽出物、ピシバニール、アンセール（Ａｎｃｅｒ）、シャオーエイピン（Ｘｉａｏ−Ａｉｐｉｎｇ）、Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）（サルグラモスチム；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子組換え体）、死滅したコルネバクテリウム・パルヴム細菌およびその抽出物、穏やかな全身温熱療法、イピリムマブ（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原−４の抗体）、レバミゾール、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）、低用量シスプラチンまたはカルボプラチン（＜０．４ｍｇ／ｋｇ）、十全大補湯（ＪＴ４８）およびデオキシコール酸（ＤＣＡ）である。本発明による免疫刺激剤は以下の群から選ばれるか、あるいは以下の群からなることができる：バクテリア製剤、生体応答調節剤、ＴＬＲ受容体作用薬、ＴＬＲ経路に作用するあらゆる天然薬または合成薬、薬草および薬草抽出物、伝統的中国医薬（ＴＣＭ）、十全大補湯（ＪＴ４８）などの漢方（中国医薬の日本適応）。特に好ましい免疫刺激剤はシャオーエイピン（Ｘｉａｏ−Ａｉｐｉｎｇ）、リューカイン（登録商標）である。
【００４６】
実施例１４において、免疫刺激剤ＪＴ４８が使用され、その結果が図４８中に示されている。コンデンサ装置における容量性カップリングを使用した高周波を付与せず単独で刺激剤（ＪＴ４８）を付与しても殆ど効果がなく、一方ＲＦ治療（ＯＴＭ：腫瘍温熱（オンコサーミア）（Ｏｎｃｏｔｈｅｒｍｉａ）治療)単独ではかなりの効果が見られるが、両者を合わせた場合、すなわち腫瘍温熱療法を伴った免疫刺激剤では著しい効果を示す。前記パラグラフ中の免疫刺激剤など本明細書に記載される他の免疫刺激剤を用いても同様な効果が得られる。
【００４７】
バクテリア製剤は、好ましくは以下の群から選ばれるか、または以下の群からなる：リポ多糖類、カルメット・ゲラン杆菌の抽出物、ピシバニール（ＯＫ−４３２）、死滅したコルネバクテリウム・パルヴム細菌およびその抽出物。
【００４８】
生体反応調節剤、（生物学的製剤；ＢＲＭｓ）は、人体が自然に生成する物質であるが、バイオ技術の方法および他の方法でも同一または極めて類似したものを生成することができる。これらの物質は、感染に対して体の反応を引き起こす。生物学的製剤は、好ましくは以下の群から選ばれるか、または以下の群からなる：モノクローナル抗体、インターロイキン−２、インターフェロン、種々のタイプのコロニー刺激因子（ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ）、ヒトＴＮＦ受容体、胸腺タンパク質Ａまたは胸腺体液性因子（ＴＨＦ）などの体の胸腺から生成される物質、およびイピリムマブ（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原−４の抗体）。
【００４９】
薬草および薬草抽出物は、好ましくは以下の群から選ばれるか、または以下の群からなる：エキナセアａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ（紫のコーンフラワー）、高麗人参、シャオ―エイピン（Ｍａｒｓｄｅｎｉａ  ｔｅｎａｃｉｓｓｉｍａの抽出物）、十全大補湯（ＪＴ４８）および中国ゲンゲ属の根（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ａｓｔｒａｇａｌｕｓ  ｒｏｏｔ）。
【００５０】
生体中における性ホルモン水準の変化は特別な症候を示す。これらの症候は人によって異なる。症候は穏やかであるが，人によっては激しいので治療を必要とする。ある種のがん（乳がん、前立腺がん）はホルモンに敏感であり、その成長にはエストロゲンまたはテストステロンを必要とする。それ故、本発明による免疫刺激剤は、ホルモンがないことが好ましく、さらには性ホルモンがないことが好ましい。
【００５１】
本明細書で記載される本発明の免疫刺激剤は、患者の免疫システムを活性化し、コンデンサ装置における容量性カップリングを使用した高周波と共用することで、がん細胞を認識し死滅させるための記憶を形成することによりがん疾病に対するワクチン効果を提供し、これによってがん疾病の再発を防止するものである。
【００５２】
本明細書で用いられる用語「ワクチン効果」とは、コンデンサ装置における容量性カップリングを使用した高周波と共同した免疫刺激剤の投与に続く患者により展開された免疫反応を言い、免疫反応はがん細胞の抗原の認識を可能にし、がん細胞を完全に根絶するための防衛メカニズムの活性化を可能にする。
【００５３】
また本発明の別の局面は、原発性がんおよびがんを有する患者におけるその転移の治療のための、またはがんを成功裏に治療した患者におけるがんの再発を防止するための、コンデンサ装置における容量性カップリングを使用した高周波と共に免疫刺激剤を患者に付与することによる非侵襲的方法に関する。
【００５４】
本明細書で用いられる用語「がんの成功裏の治療」とは、初期がん（ｉｎｉｔｉａｌ  ｃａｎｃｅｒ）治療後の改善が見られ、かつもはやがんが検出されない期間における患者を言う。これらの患者はがん疾病が再発する危険性が高い。このように、がんの成功裏の治療においては、実際のところ最初の治療において、例えば身体の他の部分に広がっているとか、現在の診断法では検出できないほど微細であるとかによって原がん細胞の少量が生き残っている可能性がある。腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原は検出可能であり免疫システムにより攻撃されるので、腫瘍細胞または悪性細胞を持たない完全に治癒した哺乳動物は、本発明のワクチン接種効果を成長させることはできない。それにも拘わらず、再発の可能性が著しく高いので、現在のところ通常の抗がん治療の後、成功した外科手術後でも、再発防止のために多くの患者に放射線を照射している。本発明の方法の１つの利点は、がんのみに疑いがある人々の治療および本発明の治療の全身的な効果の副作用を減少させるので、患者の身体中の何処に存在するか判らない広がった細胞をも治療することができる。従って本発明による方法は、初期がん治療後においてがん細胞を完全に取り切れない危険性を持った患者に対して有効である。
【００５５】
原発性がんおよび／または転移を患っている患者、または成功したがん治療後に再発の危険性を有するかまたは再発した患者は、局所的または全身的に免疫刺激剤で治療され、さらにコンデンサ装置における容量性カップリングを使用した高周波で温熱治療を施される。コンデンサ装置における容量性カップリングを使用した高周波での温熱治療は、例えば日に１度、または隔日ごとに、または週に１度、または医師によるスケジュールで、必要に応じて施される。容量性カップリングを使用した高周波での温熱療法は、通常は１回のセッションで１から数時間施される。免疫刺激剤もまた必要に応じて施される。原発性がんおよびその転移の非侵襲治療またはがん疾病の再発予防のための免疫刺激剤は、コンデンサ装置における容量性カップリングを使用した高周波と並行して、または連続して投与される。従って、並行して、とは免疫刺激剤およびコンデンサ装置における容量性カップリングを使用した高周波を、同日(１２時間内)に患者に与えることを指すが、しかしまた免疫刺激剤の投与および高周波の適用は（１２乃至４８時間の間隔で）交互になされる実施の仕組みのことも指す。連続した適用とは免疫刺激剤を高周波の前か後に投与することを指すが温熱治療の前であることが好ましい。
【００５６】
本発明の好ましい実施形態では、最初にコンデンサ装置における容量性カップリングを使用した高周波の付与が行われれ、この最初の時点でコンデンサ装置における容量性カップリングを使用した高周波のみを付与した後、付加的に免疫刺激剤を付与する。例えば、コンデンサにおける容量性カップリングを使用した高周波の最初の付与の４８時間後、より好ましくは付与の７２時間後に初めて免疫刺激剤が付与される。従って、免疫刺激剤と高周波の両者の付与は並行付与である。それ故本発明は原発性がんおよびその転移の非侵襲性治療またはがん疾病の再発の予防のための免疫刺激剤が、コンデンサ装置における容量性カップリングを使用した高周波と共に使用され、最初の間合いにおいて高周波のみが付与されるものであり、引き続く間合いにおいては免疫刺激剤が高周波と同時に付与される。免疫刺激剤およびコンデンサ装置における容量性カップリングを使用した高周波の付与は、治療中毎日、２日おきまたは３日おきに繰り返し行われる。完全な治療の継続時間は、患者の状態（再発予防のためには短いが、恐らく突然変異に基づく危険性が増加した患者ではより長くするか繰り返し行う)、がんの種類または原発性がんの大きさなどの他のパラメータによって定められる。
【００５７】
がん治療における温熱療法は従来技術においてよく知られている。しかしながら高度に個人化したｉｎ−ｓｉｔｕワクチン接種が生じるという点で患者の後天免疫システムの活性化については、従来の技術文献では全く報じられていない。
【００５８】
従って、本発明の好ましい実施形態は、がんを有する患者か、または本発明に依る方法かまたは依らない方法で成功裏にがんの治療をした患者か、またはがんの危険性が高い患者のｉｎ―ｓｉｔｕおよびｉｎ−ｖｉｖｏワクチン接種方法に関する。
【００５９】
本発明によるがんまたはその転移の治療またはがんの再生を予防する方法では、少なくとも１個の電極および対極からなるコンデンサ装置における容量性カップリングを使用した高周波が付与され、患者がその間の誘電体となる。
【００６０】
本発明のがんの非侵襲的治療および予防方法の利点の１つは、高周波の付与が放射性カップリングを用いたＲＦ装置におけるようなアンテナの使用を必要としないことである。本発明の方法の従来法に対する別の重要な利点は、付与される高周波が患者の体温や治療部位の温度を上げないことである。
【００６１】
本発明の好ましい実施形態においては、がんの治療および再発予防の方法は、コンデンサ装置における容量性カップリングを用いたした高周波の全身的付与が含まれる。  
さらにまた本発明は、原発性がんおよびその転移またはがん疾患の再発防止のための、少なくとも１種の免疫刺激剤とコンデンサ装置における容量性カップリングを用いた高周波からなるワクチンである。少なくとも１種の免疫刺激剤と容量性カップリングを使用した高周波の組合わせは、原発性がんおよびその転移またはがん疾病の再発予防のために有効である。
【００６２】
従って本発明はまた、少なくとも１種の前記免疫刺激剤をコンデンサ装置における容量性カップリングを用いた高周波と組み合わせて付与した場合に、患者おけるがん細胞に対してワクチン接種を達成するための少なくとも１種の免疫刺激剤の使用に関する。また本発明は、少なくとも１種の前記免疫刺激剤をコンデンサ装置における容量性カップリングを用いた高周波と組み合わせて用いた場合に、患者おけるがん細胞に対してワクチン接種を達成するための少なくとも１種の免疫刺激剤の使用に関する。またさらに本発明は、少なくとも１種の前記免疫刺激剤をコンデンサ装置における容量性カップリングを用いた高周波と組み合わせて使用した場合に、患者おけるがん細胞に対してワクチン接種を達成するために使用されたか、または有効である少なくとも１種の免疫刺激剤に関する。
【００６３】
従って、本発明は原発性がんおよびがんを有する患者のその転移の治療のための、またはがんの疾病を成功裏に治療した患者における再発予防のためのワクチン製剤のための免疫刺激剤の使用に関し、免疫刺激剤は、コンデンサ装置における容量性カップリングを使用した高周波と共に患者に投与される。このワクチンは、特にｉｎーｓｉｔｕでのワクチン接種に有用で上記の型のがんに好ましい。本発明のワクチンは、がんの進行の危険性の高い人々のワクチン接種および／または成功裏に治療されたがん疾病の再発予防のためのワクチン接種に特に有効である。
【００６４】
本発明の他の局面は、原発性がんおよびがんを有する患者のその転移の治療のための、またはがん疾病を成功裏に治療した患者におけるがんの再発の予防のためのワクチン製剤のためのシャオーエイピンの使用に関し、免疫刺激剤はコンデンサ装置における容量性カップリングを使用した高周波とともに患者に投与される。
【００６５】
重要なことであるが、本明細書に開示された本発明の如何なる使用または方法でも、高周波の適用および／または付与については進歩性を含まない。高周波は、患者の体内、血流中または組織中へ電極またはアンテナ装置を挿入または埋植する必要がなく、体外から適用する。さらに、放射性カップリングは用いず、好ましくは熱を直接適用したり発生させて使用したり関与させない（図１を参照）。本発明で使用される波長は、１０ｋＨｚ乃至５０ＭＨｚの間、より好ましくは１３０ｋＨｚ乃至４２ＭＨｚの間、最も好ましい値は、１３５．６ｋＨｚ±５％、３３９ｋＨｚ±５％、６７８ｋＨｚ±５％、１３５６ＭＨｚ±５％、３．３９ＭＨｚ±５％、６．７８ＭＨｚ±５％、１３．５６ＭＨｚ±５％、２７．１２ＭＨｚ±５％、および４０．６８±５％である。
【００６６】
さらに本発明は、アンテナ装置を有する放射カップリングによって行われるようなフェーズアレイ（位相配列）調整を行わない。高周波はコンデンサ装置における電極間（すなわち少なくとも１個の電極および少なくとも１個の対極間）で形成され、該装置では患者の体は誘電物質（ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃｕｍ）である。
【００６７】
加えて、本発明は少なくとも１種の免疫刺激剤および容量性カップリングを用いた高周波からなるワクチンの投与により患者にワクチン接種を行う方法に関する。このようなワクチン接種により患者の免疫システムは、今まで認識できなかったがん細胞を認識することができ、またさらに、特に転移形成の間に身体の他の部分でもがん細胞を認識するための、また患者の成功裏のがん治療後の新しいがんの再発を認識するための、患者の免疫システムで記憶を発生させることができる。多くの学際的な方法によってｉｎ−ｓｉｔｕおよびｉｎ−ｖｉｖｏでの個人化された腫瘍ワクチン接種法を生じさせ、かつがん疾病の発生前にがん細胞特に単一がん細胞を認識し排除するための、転移を根絶するための、また成功裏のがん治療後に再発した新しいがん細胞を認識して排除するための、免疫システム、特に後天性免疫システムを可能にする。従って本発明は、免疫システムにがん細胞および以前には認識されていなかった転移を認識させそれによってがん細胞を死滅させ、最終的に原発性がんおよびその転移の治療および悪性の転移性疾患の再発予防を成功に導くことができる。
【００６８】
本発明のワクチンの作用形態は、大体以下に概要として説明されるだろう。本発明のワクチンは、免疫刺激剤のみの場合に比べて、特定の方法で免疫システムを刺激する。悪性の病変は先天性免疫システムでは攻撃されず、後天性免疫システムは腫瘍を認識ことができずそのまま作用しない。簡単な免疫刺激では成長した悪性腫瘍を効果的に破壊することができないのはこのためである。コンデンサ装置における容量性カップリングを使用した高周波(オンコサーミア)は、全身的に適用した場合には単独で免疫システムを刺激するので、免疫刺激剤と同様な非特異性に直面する。局所的に適用されたオンコサーミアは、アポトーシスおよび局所的効果を生じるが、しかし平均した悪性細胞の蔓延力および転移の形成はこの治療の目的外である。ワクチンまたは少なくとも１種の免疫刺激剤および容量性カップリングを使用した高周波からなる本発明の組合わせは、全身的に悪性細胞を攻撃する。
【００６９】
従って、本発明のワクチンは免疫反応を誘発しかつ免疫システムを活性化するので、原発性がんおよびその転移、および弱い免疫システムまたは抑制された免疫システムを持った患者におけるがん疾病の再発を防止するのにも高い効果を有する。
【００７０】
以下に、腫瘍免疫治療の可能性についての現状、特に抗腫瘍ワクチン接種法についての現状の要約を示す、図１は、本発明の抗腫瘍ワクチン接種の可能性を示す幾つかの臨床試験を要約したものである(Ｍ．Ｖｅｒｇａｔｉ，Ｃ．Ｉｎｔｒｉｖｉｃｉ．Ｎ−Ｙ．Ｈｕｅｎ，Ｊ．Ｓｃｈｌｏｍ，Ｋ．Ｙ．Ｔｓａｎｇ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１０．Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ５９６４３２，ｄｏｌ：１０．１１５５／２０１０／５９６４３２)。
［表１］
腫瘍―ワクチン接種についての臨床研究結果
（略語：ＯＳ＝全生存期間；ＲＲ＝応答率；ＰＦＳ＝無再発生存期間；ＢＳＣ＝緩和ケア；ＤＦＳ＝無病生存期間）
【００７１】
【表１】
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表１に示されたような複合がんワクチン接種は、非常に複雑なｏｆｆ−ｓｉｔｕ方法、またはロボット利用のＤＣ培養が開発された。しかしながら、上記のがんワクチンは非常に限られた条件で適用することができる。従来法によるがんワクチン接種が不成功でありかつ有効性が低い主な理由は、一般的な場合では、免疫原活性が低いことによる。前記免疫システムは腫瘍細胞を認識または識別することができず、そのためがん細胞を排除することができない。特異的免疫識別法(例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＴＮＦなどを使ったサイトカイン治療法)のない免疫刺激剤は、望ましい効果を達することができない、本明細書においては、本発明によるがんのワクチン接種法は、公知の従来のワクチン接種法よりも優れている。本発明はｉｎ−ｓｉｔｕおよびｉｎ−ｖｉｖｏワクチン接種法に関し、以下の有利な効果を生じる：
１．本発明中で適用されるＲＦ電界、より具体的には振幅変調(ＡＭ)ＲＦ電界は，免疫原性細胞死（免疫原性の高い細胞死）を誘導する。
プルーフ：
１．１．アポトーシス小体形成によるアポトーシス細胞死(図１４参照)
１．２．免疫原ＤＡＭＰ（損傷関連分子パターン）／ＳＡＭＰ（ストレス関連分子分子パターン）の形成：
１．２．１．ＨＳＰの過剰発現および外在化（図３、１８、２８および３０参照）
１．２．２．ＤＲ５（ＴＲＡＩＬ）の過剰発現（図１７参照）
１．２．３．ＨＭＧＢ１（高い機動性グループ・ボックス1（ｈｉｇｈ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ  ｂｏｘ））の外在化（図１５参照）
１．２．４．カルレチクリンの外在化（図１６参照）
２．容量性カップリングを使用したＲＦ波により誘発された免疫原細胞の死滅は、腫瘍に対して強い局所的反応を生じる。露出した腫瘍抗体は、ＡＰＣｓによって認識される。ＲＦ波は免疫原細胞の死滅を誘発するので、患者独特のＴＳＡ（腫瘍特定抗原）は、患者の悪性腫瘍に対して特異的免疫反応を生じて、樹状細胞（ＤＣｓ）からＴ細胞に提示される。
【００７２】
プルーフ：
２．１．破壊された腫瘍細胞の周りの白血球侵入リング
２．２．このリング内のＴ細胞の存在
３．容量性カップリングを使用した局所的に誘発されたＲＦ波と組み合わせた細菌由来の免疫刺激剤（例えば，ピシバニール、アンセール（Ａｎｃｅｒ）、Ｃ.パルバム（Ｃ．ｐａｒｖｕｍ）、コーリー抽出物、Ｌｅｕｋｉｎｅ、他のＬＰＳ抽出物など）などの免疫刺激剤の効果は、全身的である。従って、遠方の転移はＴＳＡ（腫瘍特定抗原）を負荷した樹状細胞により活性化された細胞傷害性Ｔ細胞によって破壊される。
【００７３】
プルーフ： 
３．１．ＬＰＳ研究、ヒト遠達効果、実験的な遠達作用（図４、５、６、２９および４０を参照）。
【００７４】
本発明のワクチンならびに方法は、全身的な効果を生じ（後天性免疫システムが全身に作用する）、そしてこれは発明のワクチンの最も重要な利点の１つあり、すわなち局所治療を全身的に施すようにするのものである。 本発明の全身的に作用するワクチンは、容量性カップリングを使用した高周波の適用の下で提示されて潜伏する腫瘍抗原を見つけ、極端な人工的な発熱を引き起こすことなくがんを治療する。本発明のワクチンは、人工的な発熱を引き起こすことなく、また衰弱した患者に余計な負担をかけずに、免疫をサポートする。 
【００７５】
従って本発明は、高周波が提示されしかもコンデンサ装置における容量性カップリングが使用される場合、あるいはその条件下で、原発性がんおよび現行の画像システムでは検出不可能な播種性細胞状態にある転移さえも治療するための有効な免疫刺激剤で、またがん疾病の再発予防するための有効な免疫刺激剤に関する。この条件下での免疫刺激剤は、免疫システム、特に人口的に発熱を生ずることなく後天性免疫システムを活性化する全身的ワクチン接種を生じ、これは従来の方法では検出不可能な転移や原発性がんの治療に有効であり、また特に成功裏に治療されたがんの再発防止に有効である。
これに加えて、本発明は、患者に免疫刺激剤を施し、かつ容量性カップリングを使用した高周波を患者与えることで、免疫刺激剤が患者の免疫システムを刺激しながら、原発性がんおよび現行の画像システムでは検出不可能な播種性細胞状態にある転移さえも治療するための方法、およびがん疾病の再発予防するために有効な方法に関する。従って、免疫刺激剤は患者の身体内で作用する間に、容量性カップリングを使用した高周波を適用する。
このような効果は、免疫を刺激するための方法だけでは達成することはできない。 本発明によれば、免疫刺激のために、以下の実施手順が使用される：
・  免疫刺激剤の全身（皮下  筋肉内）投与
・  免疫刺激剤の局所（腫瘍内）投与（ＴＬＲ経路、クロスプレセンテーション、および二次発生のサイトカイン刺激作用を介しての直接局所刺激）
・  腫瘍内注射
・  リポソーム（電気感光性リポソーム）による腫瘍への標的化合物の輸送。
【００７６】
本発明のこれらの免疫刺激剤は、直接腫瘍病変に注射するか、または全身的（経口、静脈内または筋肉内注射）に使用することができる。 全身的に使用される場合、それらは特別な腫瘍標的法（例えば、リポソームキャリア、磁性標的法、ナノキャリアなど）によって腫瘍病変に直接向けることができる。免疫刺激剤（例えば、細菌内毒素、ＬＰＳｓまたはＬＰＳ類似材料）がＴＬＲ受容体経路を経て作用する場合、直接標的化することでクロスプライミングを強く増強する。前記の免疫刺激剤は、ＴＳＡｓと共にＡＰＣ細胞（例えばＤＣ）と結合するので、より強くまたより長く効果的な免疫反応を誘発ずる。リポソーム輸送の場合、何らかの免疫原補助剤（例えば酸化アルミニウム（アルミナ）、ゼオライトのようなもの）を添加することができる。
【００７７】
本発明の方法の全身的な効果は、腫瘍に対してがん疾患の再発を防止しする強力な免疫記憶を生成する。従って、本発明のワクチンは予防法のような効果を有する。 例えば、結腸直腸がんまたは膵臓がんは９０％より多く（＞９０％）が肝臓内に転移を生ずる。 これらの場合では、たとえ原発性がんの手術が終わった場合でも、転移を疑われる箇所は局所的に治療することができる。本発明のワクチンは、たとえ転移存在の画像証拠がなくても、転移の形成または再発が予想されれば、使用することができる。このことは、たとえそれが完全寛解後であっても殆どの原発性がんの治療において重要なことである。臨床反応としての完全寛解は、完全治癒を意味するものではなく、現在の画像システムで特定な場所と特定な時間に悪性腫瘍を発見できないことを意味する。
【００７８】
本発明者らは、容量性カップリングを使用した高周波は、身体的な刺激剤として有用であり、より詳細にはがん細胞に対して特異的な防衛免疫反応を引き起こすることで、原発性がんおよびその転移の治療ならびにがん疾患の再発の予防のため有用であることを見出した。特に容量性カップリングを使用した高周波は、通常の免疫システムでは認識されないがん細胞を根絶するためのワクチン接種法として有用である。 
【００７９】
従来技術による方法と本発明内で使用される容量性カップリングを使用したＲＦ波の最も重要な相違点を以下にまとめる：
ＲＦＡ法（従来技術）：
−  短波長と高周波との交流電流（１３０ＭＨｚ−２４００ＮＨｚ）の使用; 
−  侵襲的方法（針の腫瘍内挿入）であること； 
−  局所治療のみが可能；
−  病変が焼失する/腫瘍が燃焼する； 
−  熱のみが治療効果をもたらす； 
−  猛烈な壊死を起こす； 
−  針形の「アンテナ」を使用する；
−  放射性カップリングを使用する； 
−  チューニングのために位相配列調整を必要とする； 
−  針は、患者体内の超音波またはＸ線スクリーニングやＣＴスキャンのような画像方法により案内される； 
−  固形腫瘍にのみ有効である。 
【００８０】
ＷＯ２０１１／０７８６８６に記載された血管内パルス高周波刺激作用は、以下を特徴とする： 
−  侵襲的な方法である（針状電極が血管内に導入される）；
−  リンパ球を刺激し誘引することで免疫システムの強化をもたらす非特異的血液治療法である；
−  直接加熱をもたらす； 
−  最大１ＭＨｚの高周波を使用する；
−  マクロ領域の加熱をもたらす； 
−  アポトーシス細胞死を誘発しない。 
【００８１】
本発明者らは、容量性カップリングおよびコンデンサ装置を使用したＲＦ波（ＷＯ２００９／００９２６１２、ＷＯ２０１０／０４３７３７）は本発明による効果的なワクチン接種法に適切であるとする以下の利点を有することを見出した：
−  ＲＦ波は、好ましくは１０ｋＨｚから５０ＭＨｚ、好ましくは１３．５６ＭＨｚの範囲で５０ＭＨｚを超えず、より好ましくは１０ｋＨｚから４５ＭＨｚ、最も好ましくは１３．５６ＭＨｚ、または整数による加減乗除、好ましくは４０による除数によって得られた値が使用される。従って、以下の周波数が最も好ましい：１３．５６ＭＨｚ、またはこの値の１／１００、１／４０、１／２０、１／１０、１／２倍、２倍、３倍、など(すなわち、６．７８ＭＨｚ、２７．１２ＭＨｚまたは４０．６８ＭＨｚ）である。  
−  侵襲的な方法ではない； 
全身治療が可能である； 
−  免疫刺激剤と組み合わせた熱を使用し、かつ活性化した患者自身の免疫システム      はがん細胞に対する戦いに成功するので患者の免疫システムと熱の相乗効果が利用できる；
−（望ましくない）副作用を引き起こさない； 
−  化学療法および放射線療法などの一般的ながん療法と組み合わせて使用することができる。
【００８２】
−  腫瘍細胞のアポトーシスを引き起す； 
−  腫瘍細胞壊死を生じない； 
−  コンデンサ装置を使用し、電極間の患者の身体が誘電体材料でありかつ導電性回路の一部とする；    
−  容量性カップリングを使用する； 
−  超音波または任意の画像法による支援を必要としない； 
−  単一がん細胞を破壊するのに特に有用であり、従って初期の状態で極めて初期の段階にあるがんを治療し、初期の状態で極めて初期の段階にある再発を治療するのに有用である；
−  がん細胞を認識するための免疫システムの能力を引き出す。より詳細には、がん細胞を認識するための後天性免疫システムを誘因するので、がん細胞を認識するための後天性免疫システムにおける長期記憶を確立し、それによりがん細胞に対するワクチンを提供する。これは、全ての公知のがん治療方法とは最も重要な違いであろう。
【００８３】
このように、本発明のワクチン接種法は、この予期していなかった有益な効果を持つこの分野での最初のワクチン接種方法であり「潜伏した」腫瘍細胞の根絶のために特に有用である。 当業者には知られているように「潜伏した」腫瘍細胞は、それ自体が認識されているか全く認識されていないに拘わらず、免疫システムとして最も攻撃的な行動を示す。 潜伏した腫瘍細胞は、３つのカテゴリに区別することができる： 
−   第１で最悪のカテゴリは、研究中には悪性の性質を示さず、化学抵抗性はあるが耐熱性がない 「休眠腫瘍細胞」を含む。 これらの細胞は、主に腫瘍塊内にあるので、それらは遠方からの加熱によっては影響を受けない。従って、循環血液量の多い集中的熱交換により、熱力学的意味で射程距離の短い効果を持つＰＲＦ血管内刺激作用は「休眠腫瘍細胞」に対しては何らの影響も持たない。 しかしながら、これらの細胞は、本発明によるワクチン接種法にとっては標的となる。  
−  潜伏する細胞の第２のカテゴリは、血液中を循環している播種性細胞である。 それらは低濃度であるために、現在ではその血液中での存在は検出できない。
−  潜伏的細胞の第３のカテゴリは、微小転移である。  微小転移は悪性発生物の中で最も危険な目に見えない部分である。 その解像度はミリメートルの範囲であるので、現在使用される画像システム（例えばＰＥＴ、ＭＲＩ、ＣＴ、ＳＥＣＴ、Ｕサウンなど）の解像度では、微小転移の検出はそれらの細胞が数百万からなる凝集体（塊）を形成した後にのみ可能となる。 我々の知る限りでは、従来技術の方法で微小転移に影響を及ぼすものはない。 しかしながら、本発明のワクチン接種方法は、これらのがん細胞に対して恩恵効果を提供する。 
【００８４】
さらに、本発明は、現在の画像化方法では検出することが不可能な場合であっても、転移を治療するための； またはがん疾患の再発予防のための免疫刺激剤に関し、この免疫刺激剤は容量性カップリングを使用した高周波波と共に使用される。高周波は、好ましくは１３．５６ＭＨｚのＲＦ電流を用いて、その全表面にわたって等電位である少なくとも２つの電極を有するコンデンサ装置において、高周波（ＲＦ）波形を使用した任意の従来のＲＦ温熱療法装置により生成することができる（ＷＯ２００９／０９２６１２またはＷＯ２０１０／０４３７３７２参照）。 少なくとも1つのＲＦ電極と少なくとも1つの対向電極は、電磁エネルギー伝達手段であり、標的物にエネルギーを向けるためのコンデンサの一部分である。本発明に使用されるＲＦ温熱療法装置は、容量性カップリング、交流（ＡＣ）および高周波（ＲＦ）を使用する。 
【００８５】
高周波温熱療法装置により使用される高周波（ＲＦ）の周波数は低く、５０ＭＨｚを超えることはない。 対照的に、放射線温熱療法装置は、少なくとも１００ＭＨｚの高周波を使用する必要があり、使用しない場合には、正確な焦点合わせは不可能となる。 一般的に、アンテナ（放射性）は５０オーム（これは受け入れ可能な標準である）に最適化されなければならない。 この機能調整はチューナにより行われる。 本発明では、６．７８ＭＨｚ，１３．５６ＭＨｚ、２７．１２ＭＨｚまたは４０．６８ＭＨｚ、またはその間の任意の値の低周波数であることが好ましい。 これとは対照的に、一般的な放射線温熱療法では、７０かＭＨｚから２４００Ｍｈｚの範囲の短波長と高周波数を使用する。 
【００８６】
高周波（ＲＦ）温熱療法装置自体は、少なくとも高周波源、増幅器、センサ、任意でフィードバック増幅器と変調信号発生器を備える。 適切なＲＦ温熱療法装置は、例えば、米国特許出願１３／１２３８３８または米国特許出願１２／８６３４１８に開示されている。 以下に概説するように、本発明内で使用されるＲＦ温熱療法装置は、従来技術の温熱療法装置とは全く異なる。 
【００８７】
従来技術による温熱療法装置はＵＳ２００４／０２３０２６３Ａに記載されている。 以下の特徴で、それは本発明で使用されるＲＦ温熱療法装置と異なる：
−  ＵＳ２００４／０２３０２６３Ａ１の装置では、ダイポールアンテナ（放射カップリング）が使用される。  放射性ＲＦは、吸収ＲＦ放射線を使用して患者を介して、より具体的には標的組織を介して、付与される。
−  放射性溶液中では、標的物は回路から独立し、フィードバックは正方向電力と比較して反射電力を測定する定在波比（ＳＷＲ）のみにより行われる。 本発明で使用されるＲＦ温熱療法装置は、ダイポールアンテナを使用せず、コンデンサ電極間の患者の身体が導電性回路の一部である誘電体材料となるコンデンサ装置を使用する。このことは、回路の一部として、標的物を直接制御することを可能にし、本方法を制御するためのより精密でより正確なフィードバックが得られる。 本発明に使用されるＲＦ温熱療法装置は、個々の身体断面部を介してＲＦ波を適用をするようなコンデンサ電極（容量性カップリング）を使用する。 
−  従来の温熱療法装置は、アンテナ間の位相変異干渉（インターフィアランス）と、所望の領域に焦点を調整するための定在波放射の干渉を誘発する。本発明で使用される装置は、個々の組織の導電率差（例えば、悪性腫瘍の組織は健康な組織よりも高い導電率を示す）を用いて、悪性腫瘍組織への焦点の自動選択が行われる。これによって、肺や心臓などの拡張可能な臓器について、または患者が治療最中に１時間を超える動く場合、瞬時の結果が得られる。 
−  さらに、従来装置における焦点は、以前に焦点とした位置上に残り、腫瘍の実際の位置から離れており、本発明によって用いられる装置は、ＲＦ電流が自動的に正しい方向に追従するためにどのような標的の動きに対しても追従する。 
−  従来の温熱療法装置では標的物は、放射性エネルギーを吸収し、それにより火傷や猛烈な壊死を引き起こすような電気的に独立した物体のように扱われる。 本発明で標的物は、共振回路におけるコンデンサの誘電体材料のように、電気回路の一部として使用する。 結果として、温熱工程は全く別の手法で実施されて制御される。従来の温熱療法装置では、腫瘍を加熱し腫瘍細胞を焼くことで、有効な効果を得るための加熱メカニズムとしてＳＡＲ（比吸収率）吸収エネルギーを使用する。本発明では、電流を熱に変換することで得られるジュール熱（Ｑ＝Ｉ２Ｒ）ならびに電界効果による電位差を使用し、それによってがん細胞にアポトーシスを生じさせて、免疫システムに免疫反応を誘因させる。 従って、患者自身の免疫システムは、認識された単一のがん細胞に対する戦いを始め、戦いは付与された免疫刺激剤によって支援されるので、特に既知の診断法では検知されないようながん発生の極めて初期段階のがん治療に、また治療が全身的で従来の技術に依るように局所的でないという事実から転移のがん治療に効果的である。
−  従来の温熱療法装置では、治療を再生し標準化するためのツールとしてのみ温度制御を行う。 対照的に、本発明に使用される装置では、治療条件を厳密に制御するために、吸収エネルギー（Ｊ／ｋｇ）および患者の導電率（Ｓ＝１／Ｒ）を使用する。 従来の温熱療法装置は、治療の成功は達成した温度についての熱効果のみに依存することを暗黙裡に前提としている。 このような方法では、標的組織中で主として壊死が起こる。しかしながら、本発明による装置では、 電界効果がより低い温度でアポトーシスを引き起こすので、壊死が起こるような高温を達成する必要がない。 従って、本発明で使用するＲＦ温熱療法装置は、腫瘍組織または悪性組織、がん、腫瘍、特に転移性および単一がん細胞を、アポトーシスを誘発および／または発生させて、また戦いを始めるために免疫細胞にがん細胞を認識させて、治療する。一方、放射性カップリングを使用した通常の装置は、壊死を生じさせ、転移およびがん発生の初期状態である単一がん細胞、あるいはがん再発の初期状態を治療することさえできない。本発明で用いられるＲＦ温熱療法装置は、放射性カップリングを使用せず、容量性カップリングを使用し、患者は電気回路の一部としての誘電体または誘電体物質（ｄｉｅｌｅｃｔｉｃｕｍ）である。
【００８８】
違いは以下に要約することができる：
１．ＲＦＡ装置はＲＦ放射／吸収を使用する； 
２．本発明のワクチン接種法は、ＲＦ電流伝導を使用する； 
３．ＲＦＡ装置は放射性カップリング用のアンテナとして針を使用する； 
４．本発明のワクチン接種法は容量性カップリングのための電極を使用する； 
５．ＲＦＡ装置は 高い周波数(１３０ＭＨｚより大きい)を必要とする； 
６．本発明のワクチン接種は５０ＭＨｚより低い、好ましくは６．７８ＭＨｚ、１３．５６ＭＨｚ、２７．１２ＭＨｚ、または４０．６８ＭＨｚ、最も好ましくは１３．５６ＭＨｎｚの周波数を必要とする；
７．ＲＦＡ装置は壊死を生ずる（ワクチン接種は不可能）； 
８．本発明のワクチン接種法は、がん細胞のアポトーシスおよび認識を引き起こし、従って、ワクチン接種につながる； 
９．ＲＦＡ装置は、侵襲的および局所的に使用される； 
１０．本発明のワクチン接種法は非侵襲的および全身的に使用される；；
１１．ＲＦＡ装置は、固形腫瘍を治療するためにのみ有用である；
１２．本発明のワクチン接種法は、転移およびがん発生の初期段階などの、離れたまたは広がったがん細胞を治療するために特に有用である。 
【００８９】
一般的な免疫治療ワクチン接種法は、従来技術による非常に限られた条件下で適用可能である。 モダリティ（治療法）は、現代のさまざまな時代的要求に直面しており、それは以下のようであるべきである： 
・効果的で
・個人的で（特異的で） 
・全ての腫瘍病変に適用可能で
・適切に再発と転移を阻止し
・シンプルに適用可能で 
・あまりに高価ではない。 
【００９０】
これらの基準は従来技術による腫瘍ワクチン接種法では実現できない。 適用された治療は一般的に効果がなく、ある種の特殊な分野のみで効果があった。この不成功および低い有効性の主な理由は、一般的な事例において腫瘍細胞の低い免疫原活性による。 免疫システムは腫瘍細胞を認識しなかったので、腫瘍細胞を除去するように作用しなかった。特異的免疫識別法（例えば、ＩＬ-２、ＩＬ-８、ＴＮＦを有するサイトカイン療法など）を施さない免疫刺激は、遥かに所望の効果に達することができなかった。 殆どの治療法は、ｏｆｆ−ｓｉｔｕで作業をし、患者から免疫潜在性引き出し、前記細胞をｏｆｆ−ｓｉｔｕで操作し、および前記ｏｆｆ−ｓｉｔｕ操作による細胞または作業により作られた（ｌａｂｏｒ−ｍａｄｅ）ワクチンを患者に戻すものである。０ｆｆ−ｓｉｔｕ療法は、非常に複雑で、非常に高価で冗漫であるが、その時間のほとんどが十分に効果的でない。  
【００９１】
前記ｏｆｆ−ｓｉｔｕ細胞の「異質性」および低濃度ならびにさらなる再生産性（操作の継続性）の欠落は作用の完全性を制約する。
本発明の方法（またはワクチン接種法とも呼ばれる）は、ダイポールアンテナではなく容量性カップリングにより生成された高周波電界を適用するもので、この高周波電界または高周波により、治療した患者の免疫システムが、これまで認識しなかったがん細胞を認識できるようにするものである。これは容量性カップリングにより発生した高周波電界またはこの高周波電界による高周波のそれぞれが、がん細胞中でストレスを生じ、がん細胞が表面認識配列または構造を隠し続けることをできなくなるか、および／またはがん組織中の高周波により発生する熱で破壊されるか、および／または高周波電界または高周波よってアポトーシスを起こさせ、それにより、患者の免疫システムがもはや隠されていない表面構造、または破壊されたかアポトーシス化したがん細胞の分解生成物を認識できるようになる。高周波電界／高周波に加えて投与された免疫刺激剤は、さらに免疫システムが効果的にがん細胞を攻撃し破壊することを助ける。加えて、免疫システムの記憶が形成されるので、免疫システムはがん細胞、特に身体の他の部分における単一細胞を認識できるようになる。従って、本発明は、方法またはワクチン接種法に関し、それはまた直接がん細胞を死滅させるが、まず第１に患者自身の免疫システムががん細胞を認識できるようにし、次にがん細胞を効果的に死滅させるものである。従って、本発明の方法またはワクチン接種法は、免疫システムががん細胞、つまりがん疾病と戦うことを助け、またそのためにがん、特に原発性がん、単一がん細胞、および転移を治療するための、およびがん疾病の再発を防止するための間接的方法とみなすことができる。
【００９２】
本発明は、患者自身の免疫システムに隠れたがん細胞を認識させ、認識したがん細胞を死滅させることを助けることで、原発性癌、および転移を治療し、また特にがん疾病を成功裏に治療した後でがん疾病の再発を防止する免疫刺激剤、ワクチおよびワクチン接種法を提供する。本発明のワクチン接種法は極めて敏感であり、何らかの分析技術によって検出できる前に免疫システムにがん細胞を認識させる。さらに、本明細書で開示されたワクチン接種法の非常に低い毒性と非常に低い副作用のために、前記方法は、がんの再発を防止するためにがん疾病の治療後に使用することができる。
【００９３】
学術専門用語における「ｉｎ  ｖｉｖｏ」は、適切な抗原が患者の体内に形成されることを意味するので、侵襲プロセスは関与しない。 従って、本発明のワクチン接種法は、ｉｎ  ｖｉｖｏワクチン接種法とも呼ぶことができる。 「ｉｎ−ｓｉｔｕ」という学術専門用語は、免疫性の付与、すなわち特異的ＴＳＡの認識が実際に腫瘍内で進行することを意味する。従って本発明のワクチン接種法は、ｉｎ−ｓｉｔｕワクチン接種法、またはｉｎ−ｓｉｔｕおよびｉｎ  ｖｉｖｏワクチン接種法とも呼ぶことができる。 
【００９４】
本明細書で用いられるように、「個人化」という用語は、免疫性の付与が患者自身のＴＳＡ（腫瘍特異抗原）を用いて行われることを意味する。 上記のように、腫瘍ワクチン接種の大部分は人工的な抗原を使用するが、これは多くの場合に患者自身の腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）と同一ではない。 殆どの場合、主な試みは、一部の患者および幾つかの種類のがんに対して有効な免疫効果が得られるような一般的な（個人的なものではない）タンパク質またはタンパク質反応混液（タンパク質カクテル）の使用についてなされているが、全てには遠く及ばない。 これらの状況は、治療をコントロール不可能なものにし、予期できないものにする。本発明によれば、ワクチン接種法は人工的なものではなく、患者の悪性腫瘍細胞の自己独自のタンパク質分子パターンを使用する。本発明のワクチン接種法は、実際の正確な免疫同一のための患者自身が作り出す非常に個人的で比類のないＴＳＡ「カクテル」である。従来の方法では、このような個人的で、単純（シンプル）で安価な腫瘍ワクチン接種法はない。既存の方法は、あまりにも洗練され過ぎ、非常に複雑であり、非常に高価であり、さらに効果は稀である。例えば、ＴＳＡは、操業外の試料（サンプル）から得ることができる。樹状細胞（ＤＣ）を使ったｉｎ−ｖｉｖｏ認識工程の後、および特別な免疫活性化の後、「ワクチン」は腫瘍に直接注入されるかまたは全身的に患者に投与される。 本発明のワクチン接種法は、高率で特異的免疫原性細胞死を誘発する。 本発明のワクチン接種法は、個人化ｉｎ−ｓｉｔｕワクチン接種法、または個人化されたｉｎ−ｖｉｖｏワクチン接種法、または個人化されたｉｎ−ｓｉｔｕおよびｉｎ−ｖｉｖｏワクチン接種法とも呼ぶことができる。 
【００９５】
用語「アポトーシスの誘発」：本発明のワクチンは、アポトーシス小体の形成を伴う特異的免疫原性アポトーシスを誘発することができる。  （完全に患者自身のＴＳＡを含む、腫瘍細胞成分を持った）アポトーシス小体は、適切なＡＰＣ（抗原提示細胞、樹状細胞）により容易に食菌され得る。 過去の研究結果は、ストレス誘発アポトーシスの主要な免疫刺激効果を示す。 このプロセスで生成したアポトーシス小体は、特異的ＴＳＡと共に大量のＨＳＰを含む。 ＡＰＣによるそれらの食菌作用は、強力かつ特異的免疫反応を誘導する。 
【００９６】
用語「ダンプ／サンプ（ＤＡＭＰ/ ＳＡＭＰ）」：本発明のワクチンは、一方の側は腫瘍細胞の免疫刺激作用であり、他方の側は腫瘍細胞の免疫認識を促進することができる腫瘍細胞内の損傷（ダメージ）関連分子パターン分子（ＤＡＭＰ）およびストレス関連分子パターン分子（ＳＡＭＰ）のようなユニークな分子変化を誘導することができる。急速に食菌された場合、アポトーシス細胞は、免疫応答を引き起こすことなく静かな死を受入れているものと考えられていたが、近年では、免疫原性細胞死（ＩＣＤ）の新しい概念が登場した。 ＩＣＤの免疫原性の特性は、主に表面に露出したカルレティキュリン（ＣＲＴ）、分泌されたＡＴＰおよび放出された高移動性タンパク質Ｂ１（ＨＭＧＢ１）を含むダメージ関連分子パターン（ＤＡＭＰｓ）によって媒介される。
【００９７】
用語「ＨＳＰの過剰発現」：ＨＳＰのシャペロン（同伴）タンパク質は、腫瘍免疫学プロセスにおいて重要かつ主要な役割を担っている。  Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ９０のような細胞質基質のＨＳＰｓ、およびｇｐ９６のようなＥＲのＨＳＰｓｈは、細胞内で生成された抗原ペプチドと結合する。これらの抗原性ペプチドは、リンパ球へ提示するために細胞表面に存在するＭＨＣクラスＩ分子へＨＳＰｓによって輸送される。さらにＨＳＰに同伴されたペプチドは細胞外に放出され、これらのＨＳＰ-ペプチド複合体は、受容体により媒介された取り込み作用を介して、例えばマクロファージおよび樹状細部などのＡＰＣｓによって取り込まれる。従って、ＨＳＰはＡＰＣによる抗原認識を促進する。 用語「ＨＳＰの過剰発現」と「ＨＳＰ外面化」とは、以下を参照されたい：容量性カップリングを用いた高周波と共に免疫刺激剤を使用することで、幾つかのＨＳＰタンパク質は（未治療の細胞の速度を超えた）早い速度で悪性細胞中に発現し、さらに多くのＨＰＳｓが前記細胞の表面に提示されるか、またはこれらの細胞によって分泌される。 
【００９８】
用語「ＴＲＡＩＬ（ＤＲ５）過剰発現」は、ＴＲＡＩＬをコード化する遺伝子の発現の増加を言う：多くの刊行物によると、この分子は、抗腫瘍免疫反応において重要な役割を持っている。本発明のワクチンによって生ずる腫瘍のひずみは、先のＤＡＭＰおよびＳＡＭＰを生ずるが、それは結果として患者自身の腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）の解放によって主要な腫瘍特異的免疫反応を生ずる。このようにワクチン接種はｉｎ−ｓｉｔｕで行い、その達成には何ら人手を要しない。本発明によるワクチン接種法は、特に他の免疫刺激法と共に適用するときは、上記にリストされたワクチン接種法の要求事項の全てを満たすものである、本発明のワクチン接種法は、全身的（遠達効果またはバイスタンダー効果）に影響し、その治療は、特に他の免疫刺激法と共に適用した場合に、播種性悪性細胞および遠い位置に形成された転移にも作用する。また誘発された免疫反応は適切な免疫記憶を形成し、疾病、すなわちがん疾病の再発を阻止する。 
【００９９】
本発明のワクチンの利点を以下に要約する：
・  免疫原性アポトーシス小体形成 
・  ＴＳＡ−ＨＳＰクロスプライミング 
・  ＡＰＣｓによる効果的な抗原認識 
・  ＡＰＣ細胞の活性化および成熟 
・  ＡＰＣｓによる特異的細胞傷害性Ｔ細胞の活性化 
・  治療した腫瘍からの遠隔転移の破壊
・  腫瘍再発とがん再発を防ぐ特異的免疫記憶の展開。 
【０１００】
本発明のワクチン接種法は、一般的ながん治療戦略では達成することができなかった効果を実現する。本発明の作用の１つの態様は以下のように説明できる：本発明のワクチン接種法によって生成したアポトーシス小体中のＴＳＡｓは、ＡＰＣにより到達可能となった 。ＴＳＡの識別と本発明のワクチンによる治療の強いストレスによるアジュバントＨＳＰの濃縮によって、ＡＰＣは以下を含む顕著な免疫反応を誘発する：
１．患者の特異的ＴＳＡ情報を得るためのＣＴＬ(細胞障害性Ｔリンパ球)システムの活性化。 この免疫反応は、はるかに遠隔に転移している悪性細胞や播種性状態の悪性細胞を発見し破壊することができる。 
２．結果として悪性腫瘍の後日の再発を阻止する効果的な免疫記憶の創出。 
【０１０１】
完全な方法は、局所的な効果を全身的な効果に変換する免疫刺激剤によって促進される。アブスコパル （バイスタンダー）効果は、配向されて制御される。
本発明により、以下のタイプの原発性がんの治療を達成することができ、以下のタイプのがんの転移を治療することができ、さらに以下のタイプのがんの再発を防止することができる：腺がん、脈絡膜メラノーマ、急性白血病、聴神経腫、膨大部がん、肛門がん、星細胞腫、基底細胞がん、膵臓がん、デスモイド腫瘍、膀胱がん、気管支がん、非小細胞性肺がん（ＮＳＣＬＣ）、乳がん、バーキットリンパ腫、体がん、ＣＵＰ症候群（未知の原発腫瘍）、結腸直腸がん，小腸がん、小腸腫瘍、卵巣がん、子宮内膜がん、上衣腫、卵巣がん種、ユーイング腫瘍、消化管腫瘍、胃がん、胆嚢がん（ｃａｎｃｅｒ）、胆嚢がん（ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ）、子宮がん、子宮頸がん、頸部ｃｅｒｖｉｘ、膠芽腫、婦人科腫瘍、耳、鼻および咽頭腫瘍、血液の腫瘍（ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  ｎｅｏｐｌａｓｉａｓ）、有毛細胞白血病，尿道がん、皮膚がん、皮膚精巣がん、脳腫瘍（神経膠腫）、脳転移、睾丸がん、下垂体腫瘍、カルチノイド、カポジ肉腫、喉頭がん、胚細胞腫瘍、骨肉腫、結腸直腸がん、頭頸部がん（耳、鼻、喉のがん）、結腸がん、頭蓋咽頭腫、口腔がん（口および唇のがん）、中枢神経系がん、肝臓がん、肝転位、白血病、まぶた腫瘍、肺がん、リンパ節がん（ホジキンおよび非ホジキン）、リンパ種、胃がん、悪性黒色腫、悪性新生物、悪性胃腸管腫瘍、乳がん、直腸がん、髄芽腫，黒色腫、髄膜腫、ホジキン病、菌状息肉腫、鼻腔がん、神経鞘腫、神経芽細胞腫，腎臓がん、腎細胞がん、非ホジキンリンパ腫、乏突起膠腫、食道がん、骨融解性がんおよび骨形成性がん、骨肉腫、扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫（菌状息肉腫）、胸腺腫、一次性卵管がん、眼腫瘍、尿道がん、泌尿器腫瘍，尿路上皮がん、外陰がん、いぼの外観、軟組織腫瘍、軟部肉腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸がんおよび舌がんで、特に治療に適切なのは、例えば、星状細胞腫、グリア芽腫、膵臓がん、気管支がん、乳がん、結腸直腸がん、卵巣がん、胃がん、喉頭がん、悪性黒色腫，食道がん、子宮頸がん、腎臓がん、膀胱がん、および腎細胞がん。
【０１０２】
換言すると、本明細書に開示されたワクチン接種法は、患者の免疫システムが、上記がんタイプと戦うことを、または上記のがんタイプのがん細胞を死滅させることを可能にし、支援するためのものである。 
【０１０３】
さらに、本発明のワクチンは、いかなる重要な副作用も持たず、また副作用を引き起こすことなく、以下の１種以上の化学療法剤による化学療法などの一般的ながん治療と併用するのに適している：アクチノマイシンＤ、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール（ａｎａｓｔｒｏｚｏｌ）、プリンおよびピリミジン塩基の拮抗剤、アントラサイクリン、アロマターゼ阻害剤、アスパラギナーゼ、抗エストロゲン、ベクサロテン（ｂｅｘａｒｏｔｅｎ）、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カンプトテシン誘導体、カペシタビン、カルボプラテン、カルムスチン、クロラムブチル、クラドリビン（ｃｌａｄｒｉｂｉｎ）、シクロホスファミド、シタラビン、シトシナロビンシド（ｃｙｔｏｓｉｎａｒａｂｉｎｓｉｄｅ）、アルキル化細胞増殖抑制剤、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ドキソルビシンリポ、エピルビシン、エストラムスチン、エトポシド、エクセメスタン、フルダラビン、フルオロウラシル、葉酸拮抗剤、フォルメスタン、ゲムシタビン、グルココルチコイド、ゴセレリン、ホルモン拮抗剤、ハイカムチン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、イリノテカン、レトロゾール、リュープロレリン、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎ）、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミルテフォシン（ｍｉｌｔｅｆｏｓｉｎ）、マイトマイシン、有糸分裂阻害剤、ミトキサントロン、ニムスチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペントスタチン、プロカルバジン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストラクトン、チオテパ、チオグアニン、トポイソメラーゼ阻害剤、トポテカン、トレオスルファン、トレチノイン、トリプトレリン、トロフォスファミド、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、細胞傷害活性を持つ抗生物質。  
略語：  
ＡＰＣ：抗原提示細胞  
ＣＴＬ：細胞傷害性Ｔ細胞
ＤＡＭＰ：損傷（ダメージ）関連分子パターン  
ＤＣ：樹状細胞  
ＤＲ５（ＴＲＡＩＬ）：細胞死受容体（ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド）  
ＧＭ−ＣＳＦ：顆粒球マクロファージコロニー刺激因子  
ＨＭＧＢ１：高移動性タンパク質Ｂ１
ＨＳＰ：熱ショックタンパク質  
ＩＨＣＨ：免疫組織化学的分析
ＩＬ：インターロイキン  
ＬＰＳ：リポ多糖  
ＮＫ：ナチュラルキラー細胞  
ＯＴＭ：オンコサーミア（コンデンサー配置におけるの容量性カップリングを使    った高周波）
ＳＡＭＰ：ストレス関連分子パターン  
ＴＡＡ：腫瘍関連抗原  
ＴＬＲ：Ｔｏｌｌ様受容体  
ＴＮＦ：腫瘍壊死因子  
ＴＳＡ：腫瘍特異的抗原  
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】図１は、ＲＦＡ法がどにように作用するかを示すものである：アンテナ針を固形腫瘍の中に挿入し、局所的にＲＦ電流を流すことによって熱を発生させ、その熱が腫瘍を燃焼し、激しい壊死を起こす。 ＲＦＡは、熱を発生させるＲＦ電流を使用するので、放射性カップリングを使用したアンテナ装置によりアブレージョンを起こす侵襲的な方法である。
【図２】図２は、切開した腫瘍のスライド上のＨＥ染色を示す。 明らかに腫瘍の周りに浸潤リング（矢印）が生じていることが判る。従って、本発明に従って治療した後に強い免疫反応が発生する。
【図３Ａ】図３は、本発明に従って治療された腫瘍における異なるＨＳＰ（図３Ａ：ＨＳＰＡ１Ａ、図３Ｂ：ＨＳＰＡ６、図３Ｃ：ＨＳＰＡ８、図３Ｄ：ＨＳＰＤ）の過剰な発現を示す。ＨＳＰ産生はｍＲＮＡレベルで測定した（Ｂは処理された腫瘍におけるＨＳＰの産生に対応し(黒)、Ａは未処理腫瘍においてＨＳＰの産生に対応し(グレー)、ＣＴＲＬは未処理コントロール）。グレーラインは変わらないレベルに対応する。
【図３Ｂ】図３は、本発明に従って治療された腫瘍における異なるＨＳＰ（図３Ａ：ＨＳＰＡ１Ａ、図３Ｂ：ＨＳＰＡ６、図３Ｃ：ＨＳＰＡ８、図３Ｄ：ＨＳＰＤ）の過剰な発現を示す。ＨＳＰ産生はｍＲＮＡレベルで測定した（Ｂは処理された腫瘍におけるＨＳＰの産生に対応し(黒)、Ａは未処理腫瘍においてＨＳＰの産生に対応し(グレー)、ＣＴＲＬは未処理コントロール）。グレーラインは変わらないレベルに対応する。
【図３Ｃ】図３は、本発明に従って治療された腫瘍における異なるＨＳＰ（図３Ａ：ＨＳＰＡ１Ａ、図３Ｂ：ＨＳＰＡ６、図３Ｃ：ＨＳＰＡ８、図３Ｄ：ＨＳＰＤ）の過剰な発現を示す。ＨＳＰ産生はｍＲＮＡレベルで測定した（Ｂは処理された腫瘍におけるＨＳＰの産生に対応し(黒)、Ａは未処理腫瘍においてＨＳＰの産生に対応し(グレー)、ＣＴＲＬは未処理コントロール）。グレーラインは変わらないレベルに対応する。
【図３Ｄ】図３は、本発明に従って治療された腫瘍における異なるＨＳＰ（図３Ａ：ＨＳＰＡ１Ａ、図３Ｂ：ＨＳＰＡ６、図３Ｃ：ＨＳＰＡ８、図３Ｄ：ＨＳＰＤ）の過剰な発現を示す。ＨＳＰ産生はｍＲＮＡレベルで測定した（Ｂは処理された腫瘍におけるＨＳＰの産生に対応し(黒)、Ａは未処理腫瘍においてＨＳＰの産生に対応し(グレー)、ＣＴＲＬは未処理コントロール）。グレーラインは変わらないレベルに対応する。
【図４】図４は、本発明のワクチンがマウスに全身的な効果を提供することを証明する。ＬＰＳ（大腸菌から産生されたリポ多糖、１００μｌのＳａｌｓｏｌ溶液中に１００μｇのＬＰＳ）の全身投与は、結果として未治療の遠距離にある腫瘍の広範囲な細胞殺傷効果も生ずる。
【図５】図５は、実験に使用したマウスモデルを示す：メスのヌードマウスＢＡＬＢ／ｃ（ｎｕ／ｎｕ）で、腫瘍増殖を誘導するのに適切な無血清培地の６×１０６細胞を両足の大腿部に与えることで対称的で遠距離にある腫瘍が誘発された。対称的でほぼ同じ大きさの腫瘍を発生するマウスのみを使用した。右側の腫瘍のみ治療した。
【図６】図６は、ヒトの治療に用いた場合の本発明の全身的な効果を示す。患者は、非小細胞性肺がんと診断され、首部、腰部領域、腋部など、原発性がんの位置から遠く離れて存在する様々な位置への転移があることを示す：原発性がんのみが、容量性カップリングを用いた高周波で治療されたが（３０分、４２℃での単一シュート (シングル・シュート)（single shoot））、容量性カップリングを用いた高周波と共にＧＭ−ＧＳＦ（Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標））を投与すると、結果として遠く離れた転移に対しても優れた薬効のある全身的効果をもたらし、転移は姿を消す。
【図７】図７は、ヌードマウスにおける治療した腫瘍および遠方の腫瘍の両者でのカスパーゼ−３活性の増加を示す。 アポトーシス信号伝達経路の重要なマーカーであるカスパーゼ−３活性は、ヌードマウスでの治療された腫瘍および遠方の未処理腫瘍の両方で増加し、従って本発明のワクチン接種の全身的効果を示す。
【図８】図８は、単一シュート、３０分、４２℃を施したヌードマウス異種移植（ＨＴ２９ヒト結腸直腸）の時系列を示す。 すべての点で２つの腫瘍を担った３匹の動物を表す。 動物の処分は治療後に行われる（Ｘ軸に示す）。 アポトーシスは２４時間後に開始されることが観察され（挿入は最初の８時間では効果を示さない）、および治療された腫瘍と遠方の未治療の腫瘍との間の腫瘍死滅の違いの差は低く、作用は局所的治療から遠く離れて開始された。
【図９】図９は以下を示す：Ａ．動物（マウス）の治療のために使用される実験設備； Ｂ．温度測定センサプローブを用いた治療のアプリケータシステム。 第１の対電極は光沢があり動物を横たえるもので、また第２の電極は治療範囲に移動できる動物上に置かれる円形アプリケータである。
【図１０Ａ】図１０は、試料評価法を総括したものである。Ａは腫瘍の切開法、Ｂは腫瘍試料の分析スキームであり、膨大な数のｍＲＮＡ転写の解析、３５アポトーシス関連タンパク質、全てのＤＡＭＰ関連タンパク質の配置を伴った形態的要因を含む。
【図１０Ｂ】図１０は、試料評価法を総括したものである。Ａは腫瘍の切開法、Ｂは腫瘍試料の分析スキームであり、膨大な数のｍＲＮＡ転写の解析、３５アポトーシス関連タンパク質、全てのＤＡＭＰ関連タンパク質の配置を伴った形態的要因を含む。
【図１１】図１１は測定された分子についての経時的研究の典型的なセットを示す。
【図１２】図１２は、アポトーシスの証拠として、ＴＵＮＥＬ法の結果を示す。 青色は標準ＤＡＰＩ染色（細胞核）であり、また緑はＴＵＮＥＬ  ＦＩＴＣ である。
【図１３】図１３は、経時的調査は、時間スケール作用に完全に対応するアポトーシス工程を証明する方法を示す。
【図１４】図１４は、アポトーシス小体が、オンコサーミア治療後に誘導される方法を示す。膨大な数のアポトーシス小体は、未処理の細胞と比較して、処理した細胞で観察することができる。
【図１５】図１５は、ＨＭＧＢ１の提示とオンコサーミア治療後の細胞外マトリックスへの放出を示す。
【図１６】図１６は、カルレティキュリンの発現（４Ｈ、治療後）を示す。  カルレティキュリンは、ＤＡＭＰに最適な条件を作成し、オンコサーミア（容量性カップリングを使用した高周波）で治療した細胞の細胞膜上に発現される。
【図１７】図１７は、タンパク質レベルを測定し免疫蛍光を検出することでＴＲＡＩＬ−Ｒ２の発現を示す：Ａ．オンコサーミア（コンデンサ装置における容量性カップリングを使用した高周波）治療後８時間の、アポトーシスのタンパク質アレイで測定された、ＨＴ２９異種移植腫瘍試料中のＴＲＡＩＬ−Ｒ２の発現量の増加（アップレギュレーション）。二重のドットブロットは複製された抗体プローブを表し、破線は未治療コントロールでの関連ＴＲＡＩＬ−Ｒ２の発現を表す。  Ｂ．反対側の脚部の未処置の腫瘍（下段）と比較して治療後８時間（上段）での腫瘍細胞膜におけるＴＲＡＩＬ−Ｒ２タンパク質の強い発現（Ａｌｅｘａ５６４、赤色蛍光）。長方形の範囲は、より高い倍率（中央列）に挿入図でハイライト表示されている。左列では、線は、信号強度がＨｉｓｔｏＱｕａｎｔソフトウェア（右列）で測定した標準陽性閾値（マスク領域）を超えた範囲を囲んでいる。相対的なマスク領域（ｒＭＡ）は、全体の領域平均値をＭＡｓの平均値で割ることによって計算される。  棒グラフは、左列（左柱）に５０μｍ、中央列に１５μｍ、右列で１０μｍを示している。Ｃ．グラフは、治療後８時間および１４時間の両方で、未治療腫瘍（灰色カラム）と比較して、ＲＭＡ値（＊＊はｐ＜０．０１）で治療済み腫瘍（黒色カラム）におけるＴＲＡＩＬ−Ｒ２タンパク質発現のＲＭＡ値（＊＊はｐ＜０．０１）の著しい増加を示す。
【図１８】図１８はＨＳＰ７０の免疫蛍光検出結果を示す：Ａ）コンデンサ装置における容量性カップリングを使用した高周波で治療後１４時間のＨＳＰ７０の発現；Ｂ）コンデンサ配置における容量性カップリングを使用した高周波で治療後７２時間の細胞外マトリックスへのＨＳＰ７０の放出。
【図１９】図１９はＤＡＭＰ形成中のＨＳＰ７０の動態を示す。  ＨＳＰ７０の完全な時刻歴が総括され、かつ２個の独立した発現が観察された。 −  最初の発現は、容量性カップリングを使用した高周波による治療から４８時間以上経過後であり、直接ＨＳＰ７０の熱誘導に結合される。 −  ２番目の発現はその後開始され、ＤＡＭＰの一部として免疫原性細胞死に寄与する。
【０１０５】
【図２０】図２０は、６５００の遺伝子を有しまたそれらの４７０００の転写物を有するヒトゲノムのＤＮＡチップを示し、容量性カップリングを使用した高周波での治療後４時間に解析された。
【図２１】図２１はプロテオームプロファイラ（Ｐｔｏｔｅｏｍｅ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ）（登録商標）ヒトアポトーシスアレイキット（Ｈｕｍａｎ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｒｒａｙ  ｋｉｔ）スキームを示す：Ａ．アレイチップ上の試料を測定；Ｂ．アレイ上タンパク質を試験；Ｃ．タンパク質発現レベルの解析のための定量法。
【図２２】図２２は、細胞死誘導経路に含まれるタンパク質の発現における高周波を用いた治療の効果を示す。 これらは細胞膜関連するアポトーシス経路を実現するためのさらなる証拠（エビデンス）を構成する。
【図２３】図２３は、ＨＴ２９細胞に対する容量性カップリングを使用した高周波による（３０分、４２℃での）シングルシシュート（単一シュート）治療後の経過時間（時間、ｈ）の観察を総括を示す。治療によって誘発した最も重要なタンパク質を同定した。 表示するように、アポトーシスは治療後４８時間に終了し、遷移ゾーンを経た後免疫反応が観察された。
【図２４】図２４は、測定装置と実験の温度パターンを示す。
【図２５】図２５は、サンプルの評価例を示す。
【図２６Ａ】図２６は、本発明によって提供される典型的な遠達効果の証拠を示す。
【０１０６】
Ａ.研究グループにおける腫瘍の平均相対死滅範囲。 
Ｂ.研究グループにおける腫瘍の治療/未治療の相対死滅範囲比 
従って、シャオーエイピンと容量性カップリングを使用した高周波（Ｘｉ―ＯＴＭ）の組合せ投与が両腫瘍に有益な効果を有し、一方１つの腫瘍のみが容量性カップリングを使用した高周波のみで治療された（オンコサーミアーＯＴＭ）。容量性カップリングを使用した高周波での治療（オンコサーミア―ＯＴＭ治療）は、治療済みの腫瘍にのみ効果を有する。シャオーエイピン（Ｘｉ）での治療は、コントロール（ＣＴＲＬ）と比べて結果を有しない。
【図２６Ｂ】図２６は、本発明によって提供される典型的な遠達効果の証拠を示す。
【０１０７】
Ａ.研究グループにおける腫瘍の平均相対死滅範囲。 
Ｂ.研究グループにおける腫瘍の治療/未治療の相対死滅範囲比 
従って、シャオーエイピンと容量性カップリングを使用した高周波（Ｘｉ―ＯＴＭ）の組合せ投与が両腫瘍に有益な効果を有し、一方１つの腫瘍のみが容量性カップリングを使用した高周波のみで治療された（オンコサーミアーＯＴＭ）。容量性カップリングを使用した高周波での治療（オンコサーミア―ＯＴＭ治療）は、治療済みの腫瘍にのみ効果を有する。シャオーエイピン（Ｘｉ）での治療は、コントロール（ＣＴＲＬ）と比べて結果を有しない。
【図２７】図２７は、ＯＴＭのみで治療したグループからのＨＥ染色腫瘍試料を示す。
【０１０８】
【図２８】図２８は、オンコサーミアのみで治療したグループ（細胞核：青色）からの腫瘍試料におけるＨＳＰ７０（赤色）のＩＨＣＨの検出を示す。
【図２９】図２９は、ＯＴＭ＋Ｘｉ治療グループからのＨＥ染色腫瘍試料を示す。
【図３０】図３０は、ＯＴＭ＋Ｘｉ治療グループ（細胞核：青色）からの腫瘍試料におけるＨＳＰ７０（赤）のＩＨＣＨ検出結果を示す。
【図３１】図３１は、オンコサーミアのみで治療したグループ（細胞核：青色）からの腫瘍試料におけるＣＤ３＋Ｔ細胞（赤）のＩＨＣＨ検出、ＴＵＮＥＬ反応（緑色）を示す（核ＴＵＮＥＬ反応の共局在性は、プログラム細胞死を意味する）。
【図３２】図３２は、プログラム細胞死の証明として、容量性カップリングを使用した高周波（オンコサーミア治療）での治療によって誘発された、核の共局在性及び核酸の断片化（ＴＵＮＥＬ）を示す。青色は、標準ＤＡＰＩ染色（細胞核）であり、緑色はＴＵＮＥＬ  ＦＩＴＣある。
【図３３】図３３は、プログラム細胞死の証明として、容量性カップリングを使用した高周波（オンコサーミア治療）での治療によって誘発された、核の共局在性及び核酸の断片化（ＴＵＮＥＬ）を示す。青色は、標準ＤＡＰＩ染色（細胞核）であり、緑色はＴＵＮＥＬ  ＦＩＴＣある。
【図３４】図３４は、ＯＴＭ＋Ｘｉで治療したグループ（細胞核：青色）からの腫瘍試料におけるＣＤ３＋Ｔ細胞（赤）のＩＨＣＨ検出、ＴＵＮＥＬ反応（緑色）を示す（核ＴＵＮＥＬ反応の共局在性は、プログラム細胞死を意味する）。
【図３５】図３５は、プログラム細胞死の証明として、容量性カップリングを使用した高周波（オンコサーミア治療）での治療によって誘発された、核の共局在性及び核酸の断片化（ＴＵＮＥＬ）を示す。青色は、標準ＤＡＰＩ染色（細胞核）であり、緑色はＴＵＮＥＬ  ＦＩＴＣある。
【図３６】図３６は、プログラム細胞死の証明として、容量性カップリングを使用した高周波（オンコサーミア治療）での治療によって誘発された、核の共局在性及び核酸の断片化（ＴＵＮＥＬ）を示す。青色は、標準ＤＡＰＩ染色（細胞核）であり、緑色はＴＵＮＥＬ  ＦＩＴＣある。
【図３７】図３７は、非小細胞性肺がん患者（７２歳の男性）に、本発明によるワクチン接種法を適用して得られた結果を示す。 局所腫瘍は、容量性カップリングを使用した振幅変調高周波および並行して免疫刺激剤としてＬｅｕｋｉｎｅ（商標登録）を投与することで治療が行われた。 原発性腫瘍は収縮し始め、一方転移は消失した。
【図３８】図３８は、ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍試料から組織マルチブロックを作成する方法を示す：損傷および無傷の腫瘍境界部（１および２）および損傷さした腫瘍中心部 (３）から選択された直径２ｍｍのコアから各試料が採取される。
【図３９】図３９は、定量デジタル顕微鏡法を用いたＴＤＲおよびＴＤＥの計算法のスキームを示す：損傷した腫瘍範囲（Ｄをラベル付けし赤色で囲む；インナーサークル）および全腫瘍範囲（Ｗをラベル付けし青色で囲む；アウターサークル）は、ソフトウエアで測定された。腫瘍破壊率（ＴＤＲ）は、治療済みの腫瘍（ｔ）および未治療の腫瘍（ｕ）の両方において、Ｗ値をＤ値で割ることで計算される。腫瘍破壊効率（ＴＤＥ）は治療済みと未治療の腫瘍のＴＤＲ値間で相関する。
【図４０Ａ】単一ショット治療の２４時間後に腫瘍破壊を誘導するオンコサーミア（コンデンサ装置における容量性カップリングを使用した高周波）治療の定性的組織形態学的外観を示す。
【図４０Ｂ】腫瘍破壊率（ＴＤＲ）の定量分析の結果：グラフは、未治療の腫瘍（灰色箱状）に比べて治療された腫瘍（黒色箱状）は、著しく高いＴＤＲ値（＊ｐ＜０．０５）を示す。
【図４０Ｃ】オンコサーミア（コンデンサ装置における容量性カップリングを使用した高周波）治療に関連した腫瘍破壊（ＴＤＥ）の定量的分析の結果：グラフは、治療に関連したＴＤＡ値の増加は７２時間で７倍増大することを示す。
【図４１】図４１は、治療後４８時間の腫瘍全体の断面におけるＴＵＮＥＬ陽性の定性的な観察である。 腫瘍の中央の破壊領域で高いＴＵＮＥＬ陽性であることに留意されたい。
【図４２】図４２は、（４８時間での）定性的な観察やＴＵＮＥＬ陽性の定量的測定および治療後２４時間および４８時間における腫瘍全体の断面におけるアポトーシス小体形成の定量的な測定を示す： Ａ．ＴＵＮＥＬ法により明らかにされたＤＮＡ断片の重要な正面図（切り抜かれた上段の写真における緑蛍光色）、４８時間経過後の未治療の腫瘍（下段）と比較したオンコサーミア（コンデンサ装置における容量性カップリングを使用した高周波）治療済み腫瘍（上段）における、核収縮およびアポトーシス小体（Ｈ＆Ｅ染色、切り抜かれた下段の写真中の矢印）。切り抜き写真は、高倍率での長方形内の範囲のシングルチャンネルビューを示す。ＴＵＮＥＬおよびＤＡＰＩ（青色：中央の写真）の二重陽性は、同一細胞内の核ＤＮＡ染色を１−３でレベル付けしたことを確認する。未治療の腫瘍細胞（例えば、１−２でラベル付け）は、基本的な緑蛍光色のみを示す。棒グラフは、左列（左柱）では５０μｍ、右列（右柱）では１５μｍを示す。Ｂ．グラフは、治療後２４時間および４８時間のＴＵＮＥＬ陽性細胞（黒柱）の平均数の著しい増加を示す。
【０１０９】
Ｃ．グラフは、未治療のコントロール（灰色柱）と比べた治療後４８時間および７２時間（黒柱）アポトーシス小体の平均数の著しい増加を示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。
【０１１０】
【図４３】図４３は、治療後１４時間および２４時間のＨＭＧＢ１の免疫蛍光検出を示す。これは、オンコサーミア（コンデンサ装置における容量性カップリングを使用した高周波）で治療した細胞において、ＨＭＧＢ１が細胞外マトリックスに放出されることを明瞭に可視化したものである。
【図４４】図４４は、以下を示す。
【０１１１】
Ａ. ＨＥは、治療後７２時間に腫瘍全体の断面を染色した。 矢印は浸潤リングの形成を示す。 
Ｂ. ＨＥは、治療後１６８時間に腫瘍全体の断面を染色した。 矢印は明確に画定された浸潤リングを示す。 
【図４５Ａ】ＴＭＡのマルチブロックからミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）のＩＨＣＨ検出を示す。ＭＰＯは、好中球（顆粒球）のマーカーである。破壊された腫瘍範囲の周りで７２時間で現れて１６８時間で非常に特徴的となる、白血球浸潤リングは、大きな数のＭＰＯ陽性細胞（好中球）を含む。
【図４５Ｂ】ＴＭＡのマルチブロックサンプルからＭＰＯ＋細胞の半定量分析を示す。オンコサーミアで治療した腫瘍サンプルは、未治療およびコントロールよりもより多くの数のＭＰＯ＋細胞（好中球）を含む。
【図４５Ｃ】ＴＭＡマルチブロックからＣＤ３＋陽性細胞のＩＨＣＨ検出を示す。浸潤リングは、治療後１６８時間に大量のＣＤ３＋Ｔ細胞を含む。
【図４５Ｄ】ＴＭＡマルチブロックサンプルからのＣＤ３＋Ｔ細胞の半定量分析を示す。オンコサーミアで治療した腫瘍サンプルは、未治療およびコントロールよりも著しくより多いＣＤ３＋細胞（Ｔリンパ球）を含む。
【図４６】図４６は、組織形態学的分析方法を示す。
【図４７】図４７は、本発明によるワクチンの全身的な効果を示す。 治療部位から遠くに位置する転移の退縮が認められる。
【図４８】図４８は、本発明によるワクチンによって提供された同所性４Ｔ１腫瘍モデルにおける腫瘍容量の減少に有益な効果を示す。 実施例１４に記載されるように、ＴＪ-４８ と共にオンコサーミア（コンデンサ装置における容量性カップリングを使用した高周波）を付与する。
【発明を実施するための形態】
【０１１２】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。 これらの実施例に開示される技術は、当業者により理解されるべきものであり、それらは本発明の実施が十分に機能するように本発明者によって発見された技術を表すものであって、従ってそれらを実施するための好ましい様式を構成しているものと考えることができる。しかしながら、当業者は、本発明の開示に照らして、多くの変更は、開示された特定の実施形態においてなされ得ること、本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得ることを理解すべきである。
【０１１３】
さらなる修正および本発明の様々な局面の別の実施形態は、本明細書の記載に鑑みて当業者には明らかであろう。 従って、本明細書の記載は、例示としてのみ解釈されるべきであり、当業者が本発明を実施するための一般的な方法を教示する目的のためにある。 本明細書に示されかつ記載された本発明の形態は実施形態の例として解釈されるべきであることを理解されたい。 要素および材料は本明細書に例示および記載されるものに置換してもよく、部品およびプロセスは逆にすることもでき、本発明の特定の特徴は独立して利用することもできるように、全ては本発明の記載から利益を得た後当業者には明らかであろう。変更は、本発明の精神および以下の特許請求の範囲に記載した範囲から逸脱することなく、本明細書に記載された要素で行うことができる。  
【０１１４】
腫瘍モデル
細胞株
１０％の熱不活性ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および１％のストレプトマイシンーペニシリン（５０００ユニットのペニシリンおよび１ｍｌあたり５ｍｇのストレプトマイシン）を含む、ダルベッコ変法イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）＋Ｇｌｕｔａｍａｘ、高グルコース (４．５ｇ/ｌ)培地において、ＨＴ２９浸潤性大腸がん細胞株（チロリアンがん研究所、インスブルック、オーストリア（Ｔｙｒｏｌｅａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅｒａｃｅｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｉｎｎｓｂｒｕｃｋ、  Ａｕｓｔｒｉａ）より供与）を増殖させた。細胞は、０．２５％トリプシン＋エチレンジアミンエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、０．２２ｍｇ/ｍｌ）を使用して，５分間半集密単一層から放出され、そして必要な１０７/ｍｌ細胞濃度になるように無血清培地に浮遊させた。全ての試薬はＧＩＢＣＯ(インビトロジェン社、カールスバッド、米国（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ, Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）)から購入した。
【０１１５】
動物モデル
メスのヌードＢａｌｂ／ｃ（ｎｕ／ｎｕ）  マウス（実験動物ハウス放射線生物学とＲａｄｉｏｈｙｇｉｅｎｅ技術研究所（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｏｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｒａｄｉｉｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｈｙｇｉｅｎｅ）  、ブタペスト、ハンガリーから供与）を無菌環境で維持し、１２時間の明暗周期で無菌フードと水を自由摂取させ続けた。生後６から８週間のマウスの両大腿部に１０７／ｍｌの濃度のＨＴ２９細胞の懸濁液０．１ｍｌを皮下注射した。動物（異種移植モデル）は、移植した腫瘍の直径が〜１．５ｃｍの大きさに達した場合に、ＨＴ２９細胞を投与されてから１８日間治療した。両大腿部に対称的な腫瘍を持つマウスのみを治療に用いた。実験用動物は、実験動物の保護と福祉に関するハンガリー法第ＸＸＶＩＩＩ／１９９８およびＬＸＶＩＩ／２００２の関連セクションおよび欧州連合の定める実験動物福祉法を遵守して保持および治療した。政府の倫理委員会はこの研究をＮｏ．２２．１／６６／００１／２０１０として承認した。
【０１１６】
コンデンサー装置における容量性カップリングを用いた高周波による異種移植の治療
治療は、動物の右大腿部の腫瘍のみに体系的に行われ、一方、左大腿部は個別のコントロール（対照区）のために維持された（図５参照）。右大腿部に腫瘍を移植したＢａｌｂ／ｃ（ｎｕ／ｎｕ）マウスは、平行平面の電気回路用のコンデンサに置かれた（図９参照）。腫瘍を含む治療された組織の誘電体により、セットアップは、５０オームに回路のインピーダンスを保持することで即時の電気制御を可能とした。電極配置は非対称であった。動物を７２．０ｃｍ２の研磨されたアルミニウムで形成された三角形の接地された（より低い）電極上に横たえ、治療の間３７℃を保った。可撓性のある織物（銅−銀−錫で被膜された織布、Ｌｏｒｉｘ社製、Ｂａｊｎａ、ハンガリー）で作成された活性（反対の）上部２．５ｃｍ２の円形の電極を、治療した足のために皮膚全体に接触するように腫瘍部位上に置いた。上部電極の全表面は、ウエットバッドで外側から冷却された。１／ｆの振幅変調を用いて、１３．５６ＭＨｚの無線周波数で電磁界を発生した（ＬａｂＥＨＹ、Ｏｎｃｏｔｈｅｍ社製、パティ（Ｐａｔｙ）、ハンガリー。パラメータは、腫瘍内温度を治療側で４１−４２℃、コントロール（対照区）側で〜３６℃に保つように調整した。電極の下部の腫瘍内温度(皮下温度)は、〜４０℃に保ち、直腸温度は〜３７℃であった。温度は、上記の局在で光センサ（ラクストロンＦＯＴラボキット（Ｌｕｘｔｒｏｎ  ＦＯＴ  Ｌａｂ  Ｋｉｔ）、ルマセンス  テクノロジー社（ＬｕｍａＳｅｎｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州、米国（ＬｕｍａＳｅｎｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．ＣＡ、ＵＳＡ））によりモニターした。
【０１１７】
この動物モデルでは、がん移植は、容量性カップリング、すなわちコンデンサ電極間に置かれて電気回路部分で行われた。（容量性カップリングを通過する電気回路部分を構成するようにコンデンサの電極間に載置された。〜２５ＭＨｚ未満で組織への効果的な浸透を達成することができるので、変調した無線周波数１３．５６ＭＨｚが使用された。本発明により印加された、適用高周波は、イオンおよび循環の結果得られた双極性分子グループと相互作用すること（非熱効果）、さらにまた≦４２℃の熱を発生することができる（熱効果）ことが期待される。適用された制御下では、周波数１３．５６ＭＨｚは、神経における活動電位を含む通常の組織を損傷するリスク、あるいは電気通信または電気計器による妨害のリスクはない。
【０１１８】
研究計画
治療グループは３３匹の動物からなり（図１１）、ケタミン１００ｍｇ／ｋｇおよびキシラジン１０ｍｇ／ｋｇで麻酔をして、平均電力４Ｗで、３０分間、コンデンサ装置における容量性カップリングを用いて動物に高周波のワンショットを与えた。経時的研究が行われた。ワンショットで治療した後、各グループで３匹のマウスを使って、治療後０、１、４、８、１４、２４、４８、７２、１２０、２１６時間でサンプル採取を行った。追加で未治療の腫瘍を移植した動物５匹を、治療後２４時間および７２時間の治療済みマウスとともに処分した。
【０１１９】
腫瘍サンプル処理
サンプル採取時に、１回治療した動物は処分し、コントロールと治療した腫瘍の両方は取り除き、組にして研究した（図１０Ａ参照）。切り取った腫瘍の半分は、１０％のホルマリンに固定し、脱水状態にして、規定通りにパラフィンワックス（ＦＦＰＥ）に埋め込んだ。残りの半分は、窒素の液体中で新鮮凍結させ、さらに試験をするまで低温フリーザで−８０℃に保った。腫瘍サンプルは異なる種類の方法を用いて分析された（図１０Ｂ）。
【０１２０】
組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）法
腫瘍サンプルが極めて大きな数のため、１つのブロックで多くのサンプルの正確な免疫組織化学反応を行うために、組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）技術が用いられた（図１０Ｂ）。マルチブロックは多くの小さな（２ｍｍ）代表的な腫瘍組織サンプルを含むので、全てのサンプルで同一および非常に標準的な免疫組織化学反応を行うことができる。これはこの技術の実際上の有利な点である。ＴＭＡｓは、コンピュータを駆使したＴＭＡマスター（３ＤＨＩＳＴＥＣＨ  Ｌｔｄ、ブタペスト、ハンガリー）を使用して、各ドナーブロックに、標準エリアからサンプルリングされた直径２ｍｍの３つのコアを含み、２つは退化し無傷な腫瘍の境界（ボーダー）の縁部から、また１つは退化した中央部から（図３８）作成されたコアである。
【０１２１】
免疫組織化学法および蛍光抗体法
免疫組織化学のために、４μｍの厚さの切片が脱ろう、再水和され、次に、２０分間メタノール中で３％の過酸化水素を使って、免疫蛍光部以外の内因性ペルオキシダーゼ酵素がブロックされた。抗原性賦活化が、０．０１Ｍのクエン酸ナトリウム−クエン酸（クエン酸塩、ｐＨ６．０；切断されたカスパーゼ−３用）または０．１Ｍのトリス塩基および０．０１ＭのＥＤＴＡ（Ｔ−Ｅ、ｐＨ９．０；他の全ての抗体用）で作成されたバッファー中で、〜１０５℃の電気圧力クッカー（Ａｖａｉｒ  Ｉｄａ  ＹＤＢ５０−９０Ｄ、Ｂｉａｔｌｏｎ  ｋｆｔ、Ｐｅｃｓ、  Ｈｕｎｇａｒｙ）  内で行われ、そして次にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）―アジ化物（１％，シグマーアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、セントルイス、ミズーリ州（Ｓｔ  Ｌｕｉｓ，  ＭＯ））により、プロテインブロックが２０分間行われた。切片は、以下の一次抗体とともに、湿潤チェンバ内で室温で１６時間培養された：
１．多クローンウサギ抗ヒト切断されたカスパーゼ−３（１：１００、セルシグナリング社、ダンバース、マサチューセッツ州（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｄａｎｖｅｒｓ  ＭＡ））、
２．ミエロペルオキシダーゼ  （１：２００，シグマ−アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））
３．ＡＩＦ（１：５０，セルシグナリング社（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ））
４．ＴＲＡＩＬ−Ｒ２（１：５０、セルシグナリング社（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ））
５．カルレティキュリン（１：２００、セルシグナリング社（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ））
６．ＨＭＧＢ１（１：２００、セルシグナリング社（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ））
７．ＣＤ３（１：２、ダコ社、グロストラップ、デンマーク（Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）  
次に、エンビシン（ＥｎＶｉｓｉｏｎ）ポリマーペルオキシダーゼ検出システム（ダコ社）が３０分間使用された。酵素を展開するために、３，３‘−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ、ブラウン）キット（ＲＥ７１０５、レイカーノボカストラ（Ｌｅｉｃａ−ＮｏｖｏＣａｓｔｒａ）社、ニューキャッスル、英国）あるいはアミノエチルカルボザール（ＡＥＣ、レッド）キットが使用された。培養の途中で、スライドはトリス緩衝食塩水緩衝液（ＴＢＳ）中で３ｘ２分洗浄され、最後にヘマトキシリンを使って対比染色した。
【０１２２】
免疫蛍光（ＩＦ）のために、１次抗体は、抗ウサギＩｇＧ（１：２００）と結合させたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６（オレンジ―赤）あるいは抗マウスＩｇＧ（１：２００）と結合させたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（緑）を用いて９０分間検出し、細胞核は、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を用いて青色になった（全てインビトロジェン社／分子プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））。明るい領域の画像はスキャンされ、一方ＩＦ画像は、スライドスキャナーシステムでスキャンされるか、あるいはニコンエクリプスｅ−６００が使用された。
【０１２３】
アポトーシス関連タンパク質分析法
タンパク質は抽出バッファ（２０ｍＭのトリス、２ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａｃｌ、１％のトリトンＸ１００、１０μｌ/ｍｌのホスファターゼ阻害剤、および５μｌ/ｍｌのプロテナーゼ阻害剤）を使用して氷上で３０分間凍結サンプルから分離し、次に、１５，０００ｒｐｍで４℃で１５分遠心分離した。タンパク質濃度はブラッドフォード分析法により測定した。
【０１２４】
アポトーシスアレイ
プロテオームプロファイラ（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ）（登録商標）ヒトアポトーシスアレイキット（Ｒ＆Ｄ社、ミネアポリス、ミネソタ州）のニトロセルロースメンブレンを使用して、治療済みおよび未治療のサンプルにおいて３５のアポトーシス関連タンパク質の発現を同時にテストした（図２１ＡおよびＢ）。アレイは、シェイカー上で１，２００μｇ／ｍｌタンパク質溶解物の２５０μｌを４℃で一晩培養し、次にビオチン化抗ヒトＩｇＧで６０分、そしてストレプトアビジンー西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体で３０分培養し、化学発光ＥＣＬキット（スーパーシグナル（登録商標）ウェストピコ化学発光キット、サーモサイエンティフィック社、ロックフォード、イリノイ州）を使用して１０分間コダック画像ステーション４０００ｍｍ（ロチェスタ−、ニューヨーク（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，  ＮＹ））で可視化した。ＩｍａｇｅＪ  １．４５ｓ  （ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／)を使用して半定量分析を行った。
【０１２５】
ウェスタン免疫ブロット
ウェスタン免疫ブロットには、タンパク質抽出物を、５％の２−メルカプトエタノールを含む５ｘ  レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）サンプルバッファと混合し９５℃に５分間加熱した。３０μｇのタンパク質は、１２％のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ―ＰＡＧＥ）の各ウエル中に装填し、１５０Ｖで１時間電気泳動を行った。次にタンパク質を７５ｍＡで４℃で一晩二フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に免疫ブロットした。免疫検出に、膜はタンパク質のブロックとして６０分間５％の半スキムミルクで連続して培養し、次にウサギ抗ヒトＡＩＦ（１：１０００；セルシグナリング社、ダンベール、マサチューセッツ州）、ＲＩＰ（受容体相互作用タンパク質キナーゼ；１：１０００、シグマーアルドリッチ社）抗体を４℃で１６時間培養した。装填をコントロールするために、ウサギ抗βアクチン（１：２００、サーモ社）を６０分間使用した。次に、西洋わさびペリオキシターゼ（ＨＲＰ）−結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：１０００；セルシグナリング社）で６０分間、コダックイメージステーションとその４．１ソフトウエアを使ってスーパーシグナル化学発光強化（ＥＣＬ）キット（サーモ社）で１０分間シグナルを検出した。プレシジョンプラスプロテインスタンダードラダーの２５０ｋＤａ、  １５０−、  １００−、  ７５−、５０−、  および３７ｋＤａでバンドを生成した。全ての試薬は特段の記載がない限り、バイオーラッドラボラトリーズ社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）（ハーキュリーズ、カリフォルニア州）から入手した。  
【０１２６】
ＴＵＮＥＬ法
ＴＭＡ断面の事前の選別（プレスクリーン）に基づき、治療後２４時間及び４８時間に収集したコンデンサ装置における容量性カップリングを用いた高周波で治療した腫瘍の全ての断面およびそれらに合致するコントロール（対照区）に、さらにＴＵＮＥＬ法を行った。ＴＵＮＥＬ法は末端デオキシヌクレオチジル転移酵素（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）  （ＴｄＴ）を使って、ＤＮＡニック端を蛍光色素で標識されたデオキシウリジン三リン酸塩（ｄＣＴＰ）に結合する。従って、細胞核内の蛍光シグナルは、プログラム細胞死を示す断片化ＤＮＡの量に比例する。製造者の指示に従って、「Ｃｌｉｃｋ  ｉｔ  ＴＵＮＥＬ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ａｓｓａｙ（インビトロジェン社）」が用いられた。手短に言うと、脱ろう再水和されたスライドは、クエン酸塩ベースのｐＨ６．０の抗原の賦活化（アンマスキング）液（Ｈ−３３００、ベクトールラボ、バーリンガム、カリフォルニア州（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂ，  Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ））で（上記のように）電圧器を用いて加熱された。次に、スライドは、アルキン混合物代替ｄＵＴＰおよびＴｄＴで３７℃で６０分間培養し、その後室温で蛍光色素を３０分間ｄＵＴＰと結合させた。最後に、核ＤＮＡをＤＡＰＩで染色した。
【０１２７】
デジタル顕微鏡法：
スライド走査工程：
全ての断面およびＴＭＡサンプルをヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、免疫組織化学またはＴＵＮＥＬ法は、２０ｘ対物レンズでパノラミック（Ｐａｎｎｏｒａｍｉｃ）デジタルスライドスキャナシステム（３ＤＨＩＳＴＥＣＨ社、ブタペスト、ハンガリー）を使用してデジタル化された。
【０１２８】
デジタル顕微鏡画像と分析：
腫瘍組織の画像は、パノラミック（Ｐａｎｎｏｒａｍｉｃ）ビューアのソフトウエアを使用して行った。画像の倍率はデジタルで調整され、全ての画像腫瘍サンプルはインジケータスケールバーを含む。サンプルの定量分析は、画像カラーおよび強度セグメンテーションに基づき、手動またはパノラミック（Ｐａｎｎｏｒａｍｉｃ）ビューアのソフトウエアのＨｉｓｔｏＱｕａｎｔモジュール（全て３ＤＨＩＳＴＥＣＨ社、ブタペスト、ハンガリー）を使用して行った。オンコサーミア治療に関連する腫瘍破壊率（ＴＤＲ）は、破壊された腫瘍組織の範囲（Ｄ）を全ての断面において測定された全腫瘍範囲（Ｗ）で割って計算された。治療に関連する腫瘍破壊効率（ＴＤＥ）は、同じ動物の治療された腫瘍のＴＤＲを未治療の腫瘍のＴＤＲで割って評価した（図３９）。統計的分析のために、ＳＰＳＳ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｖ．２０ソフトウエア（ＩＢＭ社、ニューヨーク、ニューヨーク州）のクラスカル・ワリス（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ）検定を使用した。
【０１２９】
マーカー陽性細胞、細胞核あるいはアポトーシス小体の数は、３つの治療および３つの未治療サンプルを各テストの時点でｘ１００対物倍率で１０の異なる顕微鏡視野（ＦＯＶ）で数えた。核局在はＡＩＦおよびＴＵＮＥＬ染色サンプルの両方で重要な意味をもつので、検証のためＤＡＰＩ共染色法が用いられた。シトクロムｃにより、形態的に無傷の腫瘍範囲中でのみ細胞シグナルの拡散のある染色細胞が数えられた。アポトーシス小体はＨ＆Ｅスライド上で数えられた。ＴＲＡＩＬ―Ｒ２および切断されたカスパーゼ−３の染色スライドは、ＨｉｓｔｏＱｕａｎｔソフトウエアを使用して評価された。相対マスク範囲（ｒＭＡ）は、マーカー陽性範囲を全ての注釈付き範囲で割ることで画定された。統計として、コルモゴルフ・スミルノフ正規性検定を実施し、次にＳＰＳＳ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｖ２０を使用して、独立ｔ検定を行った。ミエロペルオキシダーゼおよびＣＤ３の染色スライドには、陽性細胞の頻度をスコアするために１０スケールシステムが設定され、結果はクラスカル・ワリス検定を使用して分析された。
【０１３０】
［実施例］
実施例１：腫瘍破壊
ＨＴ２９異種移植のＨ＆Ｅ染色断面において、腫瘍の損傷した中央ゾーンは、青白い範囲として画定された（図４０Ａの矢印）。デジタルスライドビューアーソフトウエアは、μｍ２で正確な範囲を測定可能とした。腫瘍破壊率（ＴＤＲ）である全て（Ｗ）の腫瘍範囲あたりの損傷（Ｄ）の割合は、未治療腫瘍と比べると治療済み腫瘍で極めて高い（＊ｐ＜０．０５）（図４０Ｂ参照）。またオンコサーミア治療に関連する腫瘍細胞破壊（ＴＤＥ）は、治療後２４時間からは劇的な増加を見せ、治療後７２時間（図４０Ｃ）で７倍のピークを観察した。
【０１３１】
実施例２：ＤＮＡ断片化
ＴＵＮＥＬ法は、治療後２４時間（＊ｐ＜０．０５）と４８時間（＊＊ｐ＜０．０１）で未治療腫瘍と比べて治療済み腫瘍の全ての断面（図４１）においてＤＮＡ断片化に関連して、プログラム細胞死が極めて多いことを証明した（図４２Ａ−Ｂ）。これに一致して、治療後２４時間（＊ｐ＜０．０５）と４８時間（＊＊ｐ＜０．０１）で未治療腫瘍と比べて治療済み腫瘍において核収縮（核濃縮）と高密度クロマチン断片（アポトーシス小体）の蓄積の程度は極めて高かった（図４２ＡおよびＣ）。
【０１３２】
実施例３：アポトーシス小体の形成
ＴＵＮＥＬ法により測定されたＤＮＡ断片化の著しい高まりと、核収縮およびアポトーシス小体（図１４参照）は、腫瘍破壊を引き起こすオンコサーミア（コンデンサ装置における容量性カップリングを使用した高周波）の背後の主要なメカニズムとしてプログラム細胞死を証明した。
【０１３３】
実施例４：カルレティキュリン発現
カルレティキュリン（ＣＲＴ）は、ＩＣＤの工程中で最も重要な分子の１つである。ＣＲＴが腫瘍細胞膜上に現れる場合には、死にかけている腫瘍細胞を攻撃するために樹状細胞（ＤＣ）を含む食細胞に強いシグナルを生成する。これは免疫細胞に対して最も重要な「ｅａｔ  ｍｅ」シグナルである。オンコサーミア（コンデンサ装置における容量性カップリングを使用した高周波）治療は、治療のすぐ後で、ＣＲＴの膜発現を極めて上昇させることができる（図１６）。
【０１３４】
実施例５：ＨＭＧＢ１発現
ＨＭＧＢ１は、ＩＣＤの別の重要な特徴である。通常の状態では、ＨＭＧＢ１は細胞核に存在し、細胞核を安定化して多くの遺伝子の転写を調節する。著しく多くの証拠によりアポトーシス細胞からＨＭＧＢ１が放出されることが示唆されている。細胞外ＨＭＧＢ１のサイトカインとして作用し、ＤＣｓ（ＴＬＲ４を通じて）を活性化するので、そのため抗腫瘍Ｔ細胞反応を誘導して、ＩＣＤを仲介することができる。プログラム細胞死を誘導するオンコサーミア（コンデンサ装置における容量性カップリングを使用した高周波）治療は、細胞外マトリックスに対してその解放を促進し（図１５および図４３）、ＤＣｓを活性化して抗腫瘍免疫反応工程を仲介することに寄与する。
【０１３５】
実施例６：ＴＲＡＩＬ発現
分子細胞死を誘導するオンコサーミアの分子バックグラウンドをテストするために、タンパク質に関係する３５のプログラム細胞死の抗体を含むプロテオームプロファイラニトロセルロースアレイが用いられた。タンパク質アレイは、未治療のコントロールと比較して、治療後８時間で細胞死受容体ＴＲＡＩＬ−Ｒ２の著しい発現増加が明らかになった（図１７Ａ）。また自動画像分析法で免疫蛍光染色をテストした場合には、治療済み腫瘍のＴＲＡＩＬ−Ｒ２タンパク質の細胞膜発現の著しい増加はまた８時間後と１４時間後の双方で確認された（図１７Ｂ−Ｃ）。
【０１３６】
実施例７：ＨＳＰ７０発現
ＨＳＰ７０シャペロンは、複雑な機能を有する。細胞中で、ＨＳＰｓは細胞の統一性を維持しようとするが、細胞膜に発現（図１８Ａ）あるいはＥＣＭに解放（図１８Ｂ）されると、免疫細胞に強いシグナルを発信する。ＨＳＰｓは、クロス・プライミング（ｃｒｏｓｓ−ｐｒｉｍｉｎｇ）およびコ・プレゼンテーション（ｃｏ−ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）の工程で認識される腫瘍特異抗原あるいは腫瘍関連抗原において重要な役割を果たす。
【０１３７】
実施例８：局所免疫反応の組織形態学的サイン
オンコサーミア治療済み腫瘍の治療後７２時間の破壊された範囲の周囲で、白血球の浸潤リングが現れ（図４４Ａ）、それは1回のオンコサーミア治療を行った１２０時間後と１６８時間後にはさらに強くなった（図４４Ｂ）。
【０１３８】
実施例９：浸潤リングにおける白血球の免疫組織化学的（ＩＨＣＨ）識別
形態学的に、浸潤リングの異なる免疫細胞は識別することはできない。免疫細胞集団の構成を明らかにするために複雑な免疫組織化学的検知が必要であった。ミエロペロオキシターゼ（ＭＰＣ）は、好中球の重要な（キー）マーカーであり（図４５ＡおよびＢ）、ＣＤ３はナイーブＴ細胞のマーカーである（図４５ＣおよびＤ）。
【０１３９】
実施例１−９に提示された結果に照らして、以下の通りに結論する：
１．オンコサーミア治療は、腫瘍でプログラム細胞死を誘導することができ、それは多くのアポートシス小体を形成する。破壊された細胞死組織中のアポートシス小体の存在は免疫反応を引き起こすために非常に重要である。
２．細胞死を引き起こすオンコサーミア治療は、免疫原性である。免疫原性の腫瘍細胞死を特徴とする全ての重要な分子パターンの動的変化を示す。
３．オンコサーミア治療は、オンコサーミア治療の後に長期間、治療部位において強くかつ非常に独特な局所免疫反応を引き起こすことができる。
４．オンコサーミア治療の局所抗腫瘍免疫反応は、宿主が無傷な免疫システムを持ち適切な免疫刺激剤が投与される場合には、全身性である。この工程は、バイスタンダー効果により遠隔転移をコントロールでき、局所治療で悪性疾患の全身性コントロールを可能とする。
【０１４０】
実施例１０：シャオ−エイピン（Ｘｉａｏ−Ａｉｐｉｎｇ）と組み合わせて容量性カップリングを使った高周波の付与
伝統的な中国医学（ＴＣＭ）でシャオ−エイピン注射（Ｘ）が使用される。この注射は、Ｍａｒｓｄｅｎｉａ  ｔｅｎａｃｉｓｓｉｍａの煎薬で、フラボノイド、クロロゲン酸およびポリダチオン（ｐｏｌｙｄａｔｉｎ）を含む。従来のメスＢＡＬＢ−Ｃマウスを１グループ４匹で、４グループ使って実験が行われた：
Ｃ：シャムコントロール（ｓｈａｍ  ｃｏｎｔｒｏｌ）。
Ｘｉ：Ｘｉ注射で治療、剤量：７．５ｍｌ/ｂｗｋｇ/日、腹腔内に４日間
ＯＴＭ：右大腿部の腫瘍に３０分間一度のオンコサーミア治療  
ＯＴＭ＋Ｘｉ：Ｘｉ注射で治療、剤量：７．５ｍｌ/ｂｗｋｇ/日、腹腔内に４日間、４日目に右大腿部の腫瘍に３０分間一度のオンコサーミア治療  
移植組織（同種移植片）は、動物の両大腿部に１０６に培養されたＣ２６結腸腺がん細胞を皮下に注射することで生成された。１４日後、オンコサーミア治療のためにおよびＸｉおよびその組み合わせ治療の全身性効果を調べるために、この対称的なダブル腫瘍モデルは、インターナルコントロールを使用する機会を提供した（治療済み及び未治療腫瘍）。
【０１４１】
ＯＴＭ治療、実験のセットアップ（図２４）
・ＲＦパラメータ：
―  １３．５６ＭＨｚ
―  振幅を１/ｆノイズで変調
―  容量性カップリング―インピーダンスを調整
・システム：
―  ＬＡＢ−ＥＨＹ  １００（Ｏｎｃｏｔｈｅｒｍ，  Ｐａｔｙ）
・  期間：３０分
出力：１−３Ｗ
最後の治療の２４時間後に動物は処分し、腫瘍組織は切除してホルマリン固定した。
【０１４２】
サンプルの組織病理学的および免疫組織化学的検査が行われた：
―  組織病理学：Ｈ＆Ｅスライド
―  免疫組織化学
・ＴＵＮＥＬアッセイ法  （核酸断片化）（ＦＩＴＣ）
・ＣＤ３（リンパ球）（ローダミン）
・ＨＳＰ７０（ローダミン）    
―  評価：各グループにおける組で比較した関連死滅範囲
（ＨｉｓｔｏＱｕａｎｔ、３ＤＨｉｓｔｅｃｈ社）（図３９）
結果として、Ｘｉセラピーのみでは効果はないが、オンコサーミア治療との組み合わせにより、オンコサーミア治療済み側および未治療側においても両方で腫瘍が広範囲に破壊された。オンコサーミア単独治療では、治療済み腫瘍のみが破壊されたが、その一方未治療腫瘍および見せかけの（ｓｈａｍ）治療済み同種異種片の間に大きな違いはなかった（図２６ＡおよびＢ）。
【０１４３】
結果によれば、テストした動物では、多数の局所的腫瘍に対してＯＴＭ−Ｘｉ組み合わせ治療は全身的な効果がある。未治療側の腫瘍に対する破壊効果のレベルは、同一のグループあるいはＯＴＭ単独治療のグループのどちらでも統計的に治療済み側で経験した効果と同じであった。組織病理学的および免疫組織化学的結果は図２７−３６に示した。
【０１４４】
実施例１１：低量カルボプラチンと共にコンデンサ装置における容量性カップリングを使用した高周波
この報告は、免疫刺激剤と共にオンコサーミア治療が全身的効果を提供し、治療部位から遠方の転移を全滅させる能力があることを支持するものである。
ケース番号：１１４６１、コッカ―スパニエル、８歳、去勢済みオス
診断：肺転移のあるメラノーマ。原発性がんは右後脚に位置し、外科手術で取り除いた。５カ月後に肺に転移し、その時点で治療を始めた。
治療：
オンコサーミア（２週間の期間に１０回）
低量カルボプラチン２回（１００ｍｇ/ｍ２）
（カルボプラチンの処方量はイヌで３００ｍｇ/ｍ２）
最初に処方したカルボプラチンよりも少ない量のカルボプラチンは、免疫刺激特徴を有する。この効果は、より低量ではがん細胞に対してこの薬剤の細胞毒性効果はあまり重要ではないが、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ；以前は抑制性Ｔ細胞として知られていた）機能の機能を効果的にブロックすることができる、として説明される。Ｔｒｅｇ細胞は、免疫反応の強度をコントロールすることができるので、Ｔｒｅｇ細胞の数が減少すると免疫システムの通常の活動がやや上方制御される（正常に機能しないＴｒｅｇ細胞機能を持つ患者は、深刻な自己免疫疾患の発現を引き起こす）。
【０１４５】
ＯＴＭ治療部位は胸部で、正確には心臓線である。多くの腫瘍退縮が、治療部位のみならず、ＣＴ画像シリーズに見られるように直接ＯＴＭ治療をした範囲の外側にも観察された（図４７参照）。
【０１４６】
実施例１２
典型的な経時変化測定実験は以下のように行われた：
―  メスのヌードマウスＢＡＬＢ/ｃ（ｎｕ/ｎｕ）を使用した；
―  細胞株、ＨＴ２９、ヒト結腸直腸がん；
―  ２つの大腿部領域における異種移植モデル、１つのみ治療；
―  経時変化実験  ０→２１６時間、３９匹の動物（７８の腫瘍）；
―  使用した治療は、容量性カップリングを使用した高周波（オンコサーミア）、単一ショット、３０分、４２℃である；
―  使用周波数、１３．５６ＭＨｚ、ピンクノイズを変調；
―  ＷＯ２００９/０９２６１９によれば、電極の性質は可撓性がある。
―  前述したようにしてデータは分析され、免疫刺激剤：大腸菌リポ多糖免疫刺激剤（１００μＬのＳａｌｓｏｌ溶液中に１００μｇのＬＰＳ）を、容量性カップリングを使用した高周波（オンコサーミア治療）を与える２４時間前に、動物の背部に皮下注射した。
【０１４７】
典型的な経時変化測定の要約を図１１に示す。この研究には、形態学的に確認するために完全な断面を使用する。典型的な治療結果は、腫瘍細胞のアポトーシスで（図１２参照）、それは以下に開示するように、複数の研究および異なる検出法により証明されている。
【０１４８】
アポトーシスの顕著な存在は、図１２に示すようにＤＮＡ断片化を示すＴＵＮＥＬアッセイ法（前記のように実施された）により実験的に証明される。図１３に示すように、アポトーシスのタイムスケールは、経時変化実験により良好に維持される。
【０１４９】
まず最初に、免疫アポトーシス細胞死を全体的にマーカー付けして、アポトーシス小体を含む抗原を良好に観察可能とするが（図１４参照）、これは本発明によるワクチン接種法の基礎である。この容量性カップリングを使用して高周波を与える治療（オンコサーミア治療）の特徴（顕著なアポトーシス細胞死）は、ワクチン接種効果の主要な要因である。損傷関連分子パターンの形成および完全な免疫反応への刺激作用は、免疫細胞死の２つの必要条件である。
【０１５０】
必要なＤＡＭＰ構成要素に対するオンコサーミアの誘発効果は、実験的に証明される。従って、容量性カップリングを使用した高周波を使った治療は、結果としてＨＭＧＢ１が示されて細胞外マトリックスへ放出される（図１５参照）。さらに、治療後４時間、細胞膜上にカルレティキュリンの発現が見られる（図１６参照）。
【０１５１】
さらに、がん細胞の容量性カップリングを使用した高周波の治療は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５）発現を誘発し（図１７参照）、さらに細胞外スペースにまた細胞の膜表面にＨＳＰ７０発現を誘発する（図１８参照）。
【０１５２】
腫瘍容積におけるＨＳＰ７０の平均相対パーセンテージの評価は、２つの独立した発生を示す（図１９参照）：
―  第１の発生は、容量性カップリングを使用した高周波の治療から４８時間以上後であり、直接ＨＳＰ７０熱誘導に結合する。
―  第２の発生は、その後に始まり、ＤＡＭＰの一部として免疫細胞死に貢献する。
【０１５３】
容量性カップリングを使用した高周波での治療後４時間でのｍＲＮＡ発現の評価では、以下のタンパク質の合成を誘発するための本発明による治療能力の要点を示す：ＨＳＰ４，  ＨＳＰＡ８，  ＢＡＧ３，  ＨＳＰＢ１，  ＤＮＡＪＢ１，  ＨＳＰＡ１Ａ，ＨＳＰ９０ＡＡ１，  ＤＮＡＪＢ４，  ＨＳＰＡ６，  ＨＳＰＤ１，  ＨＳＰ１Ｌ  （図２０および図３参照）。
【０１５４】
さらなる細胞死のアポトーシスメカニズムの研究のために、ヒトアポトーシスプロテオームプロファイラアッセイを行った。その結果を図２１に要約する。図２２に示すようにＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５）、ＦＡＳおよびＦＡＤＤなどの、死誘導経路に関連するタンパク質の発現への高周波を使った治療の効果は、細胞膜アポトーシス経路の実際のメカニズムにおけるさらなる見識を提供するものである。
【０１５５】
従って、容量性カップリングを使用した高周波の治療による腫瘍細胞アポトーシスの誘発に関連する最も重要なタンパク質が確認された。さらに、容量性カップリングを使用した高周波の治療への免疫反応は、区別された：よって、図２３に示すように、治療済みがんのアポトーシス事象は、治療後４８時間前に無効となり、転位期間の後に免疫システムが強い活性を示し、それは結果として免疫がん細胞死を引き起こす。
【０１５６】
図４に示すように、本発明による抗腫瘍ワクチンは、全身的効果を提供する：他方の手足にある未治療腫瘍は、他方の手足に存在する腫瘍に行った治療に呼応して縮小する。実験室での支援（アシスト）が、遠隔（免疫支援）効果に必要であった場合に、従来の技術文献では、off-situ（本来の場所以外）での免疫サポートのみが示されている。本発明による治療では、要点はin-situでの応用である。オンコサーミア（容量性カップリングを使用した高周波）のみでは、はるか遠方にある腫瘍への効果はない。またＬＰＳ投与もまた腫瘍の退縮効果をもたない。しかしながら、ＬＰＳにアシストされた容量性カップリングを使用した高周波を与えることは、アプスコパル(遠達)効果を提供し、さらにはるか遠方にある腫瘍を縮小させる：従って、オンコサーミア（容量性カップリングを使用した高周波）およびＬＰＳ投与は、結果として局所的オンコサーミアの長距離効果（全身的効果）が得られる結果となる。
【０１５７】
実施例１３：Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）と共にコンデンサー装置における容量性カップリングを使用した高周波
７２歳の男性患者は、分類不可能な非小細胞肺がんと診断された。最初の診断での腫瘍の分類は、ｃＴ２Ｎ２Ｍ０でステージＩＩＩＢであった。進行したケースにもかかわらず患者はいかなる治療も拒んだ。５か月後、患者は補完代替医療の外来診療科を訪れ、喀血および労作時の呼吸困難が４週間前から徐々に悪化したことを訴えた。患者は臨床腫瘍科に呼ばれ再検査のために入院した。
【０１５８】
胸部ＣＴおよびＰＥＴスキャンを含む精密検査で、複数の領域の転移性リンパ節のある右中葉に９．５ｃｍの大きさの空洞のある腫瘍を示した。患者には併存症も病歴もなかった。しかしながら、患者は依然として化学療法を拒み、同時に患者の家族は他の実施可能な治療オプション（選択肢）を求めた。
【０１５９】
これらの状況で、遠達(アブスコパル)効果を誘導することを期待して、我々はオンコサーミアとＧＭ−ＣＳＦとを組み合わせた放射線治療を行った。肺の腫瘍への局所場放射線治療を１．７ｃＧｙ量で１日２８フラクションで１週間に５、６回行った。次に、放射線を１週間に３回照射した。２週間のオンコサーミア治療の後、１日１回、１０日間、ＧＭ−ＣＳＦ（２５０μｇ、Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標、米国）を皮下投与した。ＧＭ−ＣＳＦ（１２５μｇ／ｍ２）を、放射線治療の１週間後に１４日間投与した。ＧＭ−ＣＳＦの使用で支持された結果は、実行可能でありまた免疫療法を高める効果があった。
【０１６０】
治療は合併症などの問題が生じることなく行われた。患者は、治療期間の最後でグレード１の疲労を除いて深刻な副作用はなかった。フォローアッププロセスにより、一連の放射線治療が終わったすぐ後で、ＰＥＴスキャンは複数のリンパ節転移のほとんど完全な寛解を示したが、それは放射線治療の領域から遠い場所であった。原発性（治療済み）腫瘍は縮小し、遠方への転移は消えた（図３７参照）。
【０１６１】
患者は満足し無事に退院した。患者のフォローアップは継続している。この場合は、オンコサーミアとＧＭ−ＣＳＦ免疫刺激剤とを組み合わせた局所的放射線治療を使った遠達効果が成功したことを物語っている。この試みは放射線治療単独よりも免疫反応においてより効果があったと思われた。
【０１６２】
実施例１４：十全大補湯（ＴＪ−４８）と共にコンデンサ装置における容量性カップリングを使用した高周波
容量性カップリングを使用した高周波と組み合わせた十全大補湯（ＴＪ−４８）のワクチン効果は４Ｔ１（ｌｕｃ２）正位腫瘍モデル上で評価された。
【０１６３】
十全大補湯（ＴＪ−４８）（株式会社ツムラ、東京、日本）は、日本の薬草で貧血症を和らげるのに用いられている。１０種の伝統的な薬草の抽出物を含み、免疫システムに対して効き目のある生体応答調節剤効果を有する。
【０１６４】
腫瘍細胞株：４Ｔ１（ｌｕｃ２）  この細胞株のクローンは、ルシフェラーゼ酵素を含む。酵素の基質が腹腔内投与される場合には、腫瘍とその転移は弱い光を放射することができ、さらに高感度カメラシステム（ＩＶＩＳ２０００  ｉｎ  ｖｉｖｏ  生物発光画像システム）を使って画像化（および定量化）できる。
【０１６５】
実験計画
腫瘍誘発：−１４日
ＴＪ−４８投与：−３日目から１８日目の間（５０ｍｇ/日、毎日、経口投与）
オンコサーミア（コンデンサ装置における容量性カップリングを使用した高周波）治療：０日目および６日目（１−２週  到達腫瘍深部温度  ４１−４２℃、合計治療時間２５分）
マウスは２０日目に処分し、肺は転移を調べるためｅｘ  ｖｉｖｏで画像化した。以前に記載した通りに原発性腫瘍および肺への転移の組織形態学検査を行った。
【０１６６】
実験動物グループ：
１．未治療コントロール（マウス４匹）
２．ＴＪ−４８グル―プ：マウスはＴＪ４８だけで治療した（マウス４匹）；ＴＪ−４８は胃プローブを使って経口投与した。
３．オンコサーミア（コンデンサ装置における容量性カップリングを使用した高周波）グループ：マウスは容量性カップリングを使用した高周波だけで０日目と６日目に治療した（マウス４匹）。
４．オンコサーミア＋ＴＪ−４８グループ：マウスはＴＪ−４８とオンコサーミア（コンデンサ装置における容量性カップリングを使用した高周波）で０日目と６日目に治療した（マウス４匹）。
【０１６７】
０日目から１３日目まで誘発原発性腫瘍の腫瘍容積が評価された。図４８に示すように、ＴＪ−４８と共にオンコサーミア（コンデンサ装置における容量性カップリングを使用した高周波）の投与により、結果として腫瘍容積が著しく減少した。
【０１６８】
実施例１５：本発明による方法のワクチン接種効果の実験的実証
実験計画、腫瘍モデル（４Ｔ１）および実験動物グループは、実施例１４に記載したものと同一である。
本明細書で用いられる略語：
評価方法：
Ｉ．実験グループにおける動物の生存期間の調査
オンコサーミアと免疫刺激剤で治療したグループの生存期間の著しい上昇は、間接的に本発明の方法のワクチン接種効果を立証している。
ＩＩ．ＥＬＩＳＰＯＴ測定法（アッセイ）を使用したワクチン接種の有効性の評価
酵素結合免疫吸着スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）測定法は、人間および動物の免疫反応をモニターするための一般的な方法である。ＥＬＩＳＰＯＴ測定法は、ＥＬＩＳＡ免疫測定法に基づき、ＥＬＩＳＡ免疫測定法の修正版から発達した。ＥＬＩＳＰＯＴ測定法は元来、抗原特異的抗体を分泌するＢ細胞を列挙して発達し、その後種々の作業（タスク）のために、特に単細胞レベルでサイトカイン産生細胞を識別して列挙するように適合してきた。簡単に言うと、ＥＬＩＳＰＯＴ測定法は、適切な条件で個々の活性細胞あるいは反応性細胞の分泌生成物を視覚化できるようにする。測定法中で発達した各スポットは、単一反応細胞を表す。従って、ＥＬＩＳＰＯＴ測定法は、定性的（免疫タンパク質のタイプ）および定量的（反応性細胞の数）の両方を提供する。抗腫瘍ワクチン接種の評価のために、ＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＰＯＴ測定法が広く用いられ、方法が認められている。
【０１６９】
ＥＬＩＳＰＯＴ研究の計画についての短い記述（ＢＤバイオサイエンス社から市販されているマウス用ＥＬＩＳＰＯＴ測定法キット）：
１．実験グループの動物からの対象細胞の収集（末梢血単核球（ＰＢＭＣ）あるいは脾臓由来細胞）。サンプルは、実験グループに従い個々の動物から貯蔵（プール）した。実験グループ：未治療コントロール動物；オンコサーミア治療動物；免疫刺激剤で治療した動物；オンコサーミア治療と免疫刺激剤治療の組合せ。
２．４Ｔ１腫瘍細胞を使った対象細胞からのサンプルの培養。
３．製造者のプロトコールに従ったＥＬＩＳＰＯＴ測定法の実施。
４．研究の評価：ワクチン接種効果が認められる場合には、この測定法でＯＴＭ−ＣＩＳサンプルは最も多くの数のスポットを示す。
ＩＩＩ．フローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳ）を使ったワクチン接種の有効性の評価
ＰＢＭＣからのＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団は、フローサイトメトリー解析および適切な抗体を使用して調査することができる。この実験ではまた血液サンプルは貯蔵することができる。ワクチン接種が有効な場合には、他のグループと比較してＯＴＭ＋ＣＩＳグループでＣＤ４＋およびＣＤ８＋陽性細胞は極めて多くなる。
ＩＶ．腫瘍および転移サンプルにおけるＩＨＣＨ分析を使ったワクチン接種の有効性の評価（Ｔ細胞反応）
原発性腫瘍の浸潤およびその転移は効力のある抗腫瘍免疫反応のホールマークである（すなわち、有効な抗腫瘍ワクチン接種）。
【０１７０】
浸潤Ｔ細胞集団のＩＨＣＨ調査は、ワクチン接種工程の成果についての重要な支えとなる情報を提供することができる。原発性腫瘍中に、あるいは特に転移にＣＤ８陽性が高い場合には、より強い抗腫瘍免疫反応とより高いワクチン接種効果を意味する。
【図３８】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３９】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４０Ｃ】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４５Ｃ】
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【図４５Ｄ】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【国際調査報告】
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