(57)【要約】【課題】  臨床で使用可能な動脈硬化に対する遺伝子治療の方法は開発されておらず、臨床での動脈硬化治療が可能な遺伝子が求められていた。遺伝子導入により効果的に動脈硬化治療可能な薬剤を実現する。【解決手段】  動脈疾患治療用薬剤において、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号２に示されるタンパク質Ｐｉｍ−１のドミナントネガティブ変異体である変異タンパク質または当該変異タンパク質をコードする遺伝子を含む。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質Ｐｉｍ−１の機能を阻害する成分を含む事を特徴とする動脈疾患治療用薬剤。
【請求項２】
配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質Ｐｉｍ−１のドミナントネガティブ変異体である変異タンパク質または当該変異タンパク質をコードする遺伝子を含む事を特徴とする請求項１に記載の動脈疾患治療用薬剤。
【請求項３】
上記変異タンパク質が、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、ＡＴＰ結合ドメイン中の１以上のアミノ酸を欠失、置換、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなる事を特徴とする請求項２に記載の動脈疾患治療用薬剤。
【請求項４】
上記変異タンパク質が、配列番号２に示されるアミノ酸配列の６７番目のリシンを他のアミノ酸に置き換えたものである事を特徴とする請求項３に記載の動脈疾患治療用薬剤。
【請求項５】
上記変異タンパク質をコードする遺伝子が配列番号１に示される塩基配列を改変してなるものである事を特徴とする請求項２から４のいずれか１項に記載の動脈疾患治療用薬剤。
【請求項６】
上記変異タンパク質が、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子にコードされるタンパク質Ｐｉｍ−１のドミナントネガティブ変異体である事を特徴とする請求項２に記載の動脈疾患治療薬剤。
【請求項７】
上記遺伝子が、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、タンパク質Ｐｉｍ−１のドミナントネガティブ変異体である変異タンパク質をコードする事を特徴とする請求項２に記載の動脈疾患治療薬剤。
【請求項８】
上記遺伝子を含有する発現ベクターを含む事を特徴とする請求項１から７のいずれか１項に記載の動脈疾患治療用薬剤。
【請求項９】
上記発現ベクターを包含するアデノウィルスを含むことを特徴とする請求項８に記載の動脈疾患治療用薬剤。
【請求項１０】
標的動脈にて、血管平滑筋細胞の増殖を抑制することを特徴とする請求項１から９のいずれか１項に記載の動脈疾患治療用薬剤。
【請求項１１】
動脈内壁の傷害に起因する動脈内壁の肥厚を抑制することを特徴とする請求項１から１０のいずれか１項に記載の動脈疾患治療用薬剤。
【請求項１２】
動脈硬化を治療するものであることを特徴とする請求項１から１１のいずれか１項に記載の動脈疾患治療用薬剤。
【請求項１３】
標的動脈に注入されるものである事を特徴とする請求項９から１２のいずれか１項に記載の動脈疾患治療用薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動脈疾患を治療する薬剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来から、動脈硬化による動脈の狭窄や閉塞に対して、薬物を中心にさまざまな治療法が試みられてきた。しかしながら、いずれも十分な効果をあげているとは言いがたく、より有効な動脈疾患の治療方法あるいは予防方法が求められている。
【０００３】
近年、動脈の狭窄や閉塞による動脈疾患、特に動脈硬化について、発症機序が徐々に解明されてきており、これに基づいた動脈疾患の治療方法あるいは予防方法の研究開発が行われている。
【０００４】
たとえば、血管壁の傷害に起因する動脈硬化では、増殖やアポトーシスの際に発現する癌原遺伝子（proto-oncogenge）ｐｉｍ−１が関与している事がわかった。この癌原遺伝子ｐｉｍ−１は、細胞分裂を促進する種々の刺激により合成・放出され、転写因子ｃ−Ｍｙｂやｃ−Ｍｙｃを活性化して、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）の増殖に重要な役割を担う。
【０００５】
ｐｉｍ−１は、血球系の細胞の分化・増殖に関わる因子として注目されていたが（非特許文献１、２参照）、最近ではｃ−Ｍｙｂの転写活性を上昇させること（非特許文献３参照）、ｃ−Ｍｙｃと協調作用を示すこと(非特許文献４参照)、ＣＤＫインヒビターｐ２１の作用に影響すること(特許文献５参照)などが報告されている。
【０００６】
このｐｉｍ−１によりもたらされるＶＳＭＣの増殖は動脈内膜の肥厚をもたらし、動脈硬化進展をさせるものである。また、冠血管の狭窄や閉塞の治療として行われる経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）やバイパス手術後の再狭窄も、同様にｐｉｍ−１が働いているものと考えられる（非特許文献６参照）。
【０００７】
つまり、動脈硬化においては、動脈内の血管平滑筋細胞の増殖に由来する、動脈内膜の肥厚が主要な原因となっており、この動脈内膜の肥厚を制御することで、動脈硬化、動脈の狭窄・閉塞を制御できると考えられる。そして、この動脈内膜の肥厚の制御は、このＶＳＭＣの増殖をコントロールすることによって行うことができる。
【０００８】
ところで、近年、血管壁へ外来遺伝子を導入して発現させることが可能であるとの報告がされており、再狭窄への遺伝子治療の適用が期待されるようになった。そこで、上記ＶＳＭＣの細胞増殖をコントロールするために、細胞に増殖をコントロールする遺伝子を導入する方法、つまり遺伝子治療を行うことが考えられる。治療に用いる遺伝子としては、内皮細胞の再生促進をするものや、分泌拡散因子遺伝子、細胞増殖シグナルの伝達阻害を行う遺伝子を使用する方法が検討されている。
【非特許文献１】「ザジャーナルオブバイオロジカルケミストリー」（"THE JOURNALOF BIOLOGICAL CHEMISTRY"）,(アメリカ合衆国),1988年，第263巻，第33号，p.17615-17620
【非特許文献２】「オンコジーン」（"Oncogenge"）,(イギリス),1992年，第7巻，p.727-732
【非特許文献３】「モレキュラーセル」（"Molecular Cell"）,(アメリカ合衆国),1998年，第２巻，p.417-425
【非特許文献４】「イミュニティ」（"Immunity"）,(アメリカ合衆国),1999年，第11巻，p.709-719
【非特許文献５】「アーカイブスオブバイオケミストリーアンドバイオフィジックス」（"ARCHIVES OF BIOCHEMISTRY ANDBIOPHYSICS"）,(アメリカ合衆国),1996年，第330巻，第２号，p.259-265
【非特許文献６】米満吉一、古森公浩，「平滑筋増殖制御をターゲットとした遺伝子治療」，分子心血管病，2000年，第１巻，第３号，ｐ．252-262
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、現在のところ、臨床で使用可能な動脈硬化に対する遺伝子治療の方法は開発されておらず、臨床での動脈硬化治療が可能な遺伝子が求められていた。
【００１０】
上記癌原遺伝子ｐｉｍ−１は上述したように、血球系の細胞の分化・増殖に関わる因子として研究されてきたが、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）の増殖に関わる転写因子ｃ−Ｍｙｂやｃ−Ｍｙｃに作用することから、動脈硬化の発症になんらかの影響を与えることが強く示唆される。もしｐｉｍ−１が動脈硬化に関与するのであれば、その機能を抑える機能を有する遺伝子があれば、この遺伝子を用いた遺伝子治療が可能となり、動脈硬化の有効な治療方法を実現することが期待できる。
【００１１】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、遺伝子導入により効果的に動脈硬化治療可能な薬剤を実現することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明に係る動脈疾患治療用薬剤は、上記課題を解決するために、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質Ｐｉｍ−１の機能を阻害する成分を含む事を特徴とする。
【００１３】
上記成分としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質Ｐｉｍ−１のドミナントネガティブ変異体である変異タンパク質または当該変異タンパク質をコードする遺伝子であることが好ましい。
【００１４】
また、上記アミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加配される個所は、配列番号２に示されるアミノ酸配列におけるＡＴＰ結合ドメイン中のアミノ酸配列であることが好ましい。さらに、配列番号２に示されるアミノ酸配列における６７番目のリシンを他のアミノ酸に置き換えることがより好ましい。なお、このような変異タンパク質をコードする遺伝子は、配列番号１に示される塩基配列を改変してなるものが好ましい。
【００１５】
また、上記変異タンパク質は、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子にコードされるタンパク質Ｐｉｍ−１のドミナントネガティブ変異体であってもよい。
【００１６】
また、上記遺伝子は、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、タンパク質Ｐｉｍ−１のドミナントネガティブ変異体である変異タンパク質をコードするものであってもよい。
【００１７】
また、本発明に係る動脈疾患治療用薬剤は、上記遺伝子を含有する発現ベクターを含むものであることが好ましい。また、本発明に係る動脈疾患治療用薬剤は、上記発現ベクターを含有するアデノウィルスを含むものであることが好ましい。  
【００１８】
さらに、本発明に係る動脈疾患治療用薬剤は、標的動脈にて、血管平滑筋細胞の増殖を抑制することを特徴としている。また、本発明に係る動脈疾患治療用薬剤は、動脈内壁の傷害に起因する動脈内壁の肥厚を抑制する事を特徴としている。
【００１９】
また、本発明に係る動脈疾患治療用薬剤は、動脈硬化を治療するものであることを特徴としている。
【００２０】
また、本発明に係る動脈疾患治療用薬剤は、標的動脈に注入されるものである事を特徴としている。
【発明の効果】
【００２１】
本発明に係る動脈疾患治療用薬剤は、以上のように、タンパク質Ｐｉｍ−１のドミナントネガティブ変異体である変異タンパク質または当該変異タンパク質をコードする遺伝子を含んでいる。上記ドミナントネガティブ変異体とは、正常遺伝子産物に対し優性に働き、正常遺伝子産物が機能することを阻害するものである。したがって、動脈疾患患部に、当該変異タンパク質を送り込む、あるいは、当該変異タンパク質をコードする遺伝子を動脈疾患患部送り込んで変異タンパク質を発現させることで、Ｐｉｍ−１が機能することを阻止できる。
【００２２】
なお、上記変異タンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列におけるＡＴＰ結合ドメイン中のアミノ酸配列を改変することで、ドミナントネガティブ変異体とすることができ、タンパク質Ｐｉｍ−１の機能を阻止できる。
【００２３】
特に、配列番号２に示されるアミノ酸配列における６７番目のリシンを他のアミノ酸に置き換えることで、有効にタンパク質Ｐｉｍ−１の機能を阻止できる。なお、このような変異タンパク質をコードする遺伝子は、たとえば、配列番号１に示される塩基配列を改変することで容易に作製できる。
【００２４】
タンパク質Ｐｉｍ−１は、動脈において転写因子の発現を制御し、血管平滑筋細胞の増殖を促して動脈内膜を肥厚させ、動脈の狭窄または閉塞をもたらすものである。したがって、本発明の動脈疾患治療用薬剤を、動脈疾患患部に投与することで、タンパク質Ｐｉｍ−１が機能することを阻止できるので、血管平滑筋細胞の増殖を抑え、動脈の狭窄または閉塞を防ぐという効果を奏する。
【００２５】
また、本発明に係る動脈疾患治療用薬剤は、以上のように、上記遺伝子を含有する発現ベクターを含むので、動脈疾患治療用薬剤を動脈疾患患部細胞に送り込むと、発現ベクターが上記遺伝子を発現させ、動脈疾患患部細胞内にてタンパク質Ｐｉｍ−１のドミナントネガティブ変異体を機能させられる。
【００２６】
さらに、本発明に係る動脈疾患治療用薬剤は、以上のように、上記発現ベクターを有するアデノウィルスを含むので、動脈疾患患部近傍に注入することで、動脈疾患患部の細胞に発現ベクターを感染させることができる。
【００２７】
本発明に係る動脈疾患治療用薬剤は、以上のように、標的動脈にて、血管平滑筋細胞の増殖を抑制するものであり、また、動脈内壁の傷害に起因する動脈内壁の肥厚を抑制するものであるので、動脈の狭窄、閉塞を治療または予防できる。
【００２８】
また、本発明に係る動脈疾患治療用薬剤は、特に動脈硬化を治療するために使用することで、有効な治療を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明の実施の形態について以下に説明するが、本発明は以下の記載に限定されるものではない。
【００３０】
（１）本発明に係る遺伝子ＤＮ−ｐｉｍ−１、およびそのタンパク質ＤＮ−Ｐｉｍ−１  本発明に係るタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号２に示されるタンパク質Ｐｉｍ−１のドミナントネガティブ変異体である変異タンパク質（以下、ＤＮ−Ｐｉｍ−１と称する）である。また、本発明にかかる遺伝子は、当該変異タンパク質をコードする遺伝子（以下、ＤＮ−ｐｉｍ−１と称する）である。
【００３１】
なお、本発明に係る「遺伝子」は、少なくともゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡを含む意味であり、アミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有するｃＤＮＡや、このｃＤＮＡの塩基配列に対応する塩基配列を有するｍＲＮＡや、このｍＲＮＡの転写元のゲノムＤＮＡが含まれる。また、ＤＮＡは２本鎖のみならず、それを構成するセンス鎖、アンチセンス鎖といった１本鎖でもよい。さらに、上記「遺伝子」は、前記タンパク質ＤＮ−Ｐｉｍ−１をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００３２】
さらに、本発明に係る「遺伝子」は、上記配列番号１に示される塩基配列をＯＲＦ領域として有する遺伝子に限定されるものではなく、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子が含まれる。同様に、本発明に係るタンパク質は、上記配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子にコードされるタンパク質Ｐｉｍ−１のドミナントネガティブ変異体も含まれる。なお、上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７％の同一性が配列間に存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。
【００３３】
上記ハイブリダイゼーションは、J.Sambrook et al. Molecular Cloning,A LaboratoryManual,2d Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory（1989）に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる（ハイブリダイズし難くなる）。
【００３４】
動脈硬化の発症・進展の重要なメカニズムの一つとして、種々の刺激によって、平滑筋細胞が中膜より内膜に遊走、増殖することにより内膜肥厚をきたし、血管内腔を狭窄することがあげられる。ここで、その原因遺伝子としてｐｉｍ−１が関わっている可能性がある。これは、Ｐｉｍ−１が、転写因子ｃ−Ｍｙｂやｃ−Ｍｙｃの発現に関与することで、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）の増殖に関わっていると考えられるからである。本発明の変異タンパク質は、このＰｉｍ−１タンパク質のドミナントネガティブ変異である。すなわち、本発明のＤＮ−Ｐｉｍ−１は正常なＰｉｍ−１に対し優性に働き、Ｐｉｍ−１の機能を阻害するものである。したがって、本発明に係るＤＮ−Ｐｉｍ−１は、Ｐｉｍ−１の機能を阻害することで、ＶＳＭＣの増殖を抑制することができる。したがって、動脈硬化の治療や予防のための薬剤として、有効に利用できると考えられる。
【００３５】
実際に、後述する実施例で説明するとおり、ＤＮ−Ｐｉｍ−１を発現させた動脈では、動脈壁損傷により動脈硬化を誘導した場合の内膜肥厚が抑えられた。また、ＤＮ−Ｐｉｍ−１を発現させた培養ＶＳＭＣでは、ストレスによる細胞増殖が抑えられ、細胞はＤＮＡ合成および分裂のサイクルに入らず、細胞分裂が休止していた。  
【００３６】
（２）本発明に係る遺伝子、タンパク質の利用方法
上記ＤＮ−Ｐｉｍ−１は、以上のように、動脈硬化の発症の原因となるＶＳＭＣの増殖を抑える効果がある。したがって、上記ＤＮ−Ｐｉｍ−１は、動脈硬化の治療、予防のための薬剤として有用である。
【００３７】
Ｐｉｍ−１のドミナントネガティブ変異体ＤＮ−Ｐｉｍ−１を作製するにあたっては、配列番号２に示すＰｉｍ−１タンパク質アミノ酸配列のＡＴＰ結合ドメイン配列中の１以上のアミノ酸を改変することが好ましい。特に、Ｐｉｍ−１の６７番目のリシンを他のアミノ酸に改変することが好ましく、特に配列番号４に示すようにメチオニンに置換することがより好ましい。なお、このｐｉｍ−１の６７番目のリシンをメチオニンに改変したタンパク質では、上記ＶＳＭＣの増殖、動脈内膜の肥厚を抑えることができた。したがって、動脈硬化の治療および予防に有効であると言える。
【００３８】
なお、このような効果は、ＶＳＭＣの増殖に起因する種々の動脈疾患にたいして発揮され、たとえば、経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）やバイパス手術後の冠動脈の再狭窄や、閉塞性動脈硬化症の治療、防止にも有効である。
【００３９】
また、本発明に係るタンパク質は、Ｐｉｍ−１タンパク質のヒトホモログを改変したものであってもよく、Ｐｉｍ−１タンパク質のヒトホモログのドミナントネガティブ変異体を対象とする細胞内で共発現させることにより動脈疾患を防ぐものであってもよい。
【００４０】
以下では、本発明に係る遺伝子、タンパク質の具体的な利用方法について説明する。
【００４１】
本発明に係る変異遺伝子ＤＮ−ｐｉｍ−１は、目的の細胞中に導入して、本発明に係る上記タンパク質を発現させることができる。細胞への遺伝子導入方法としては、遺伝子が組み込まれた発現ベクターをエンドサイトーシスによって目的細胞に導入する方法（リン酸カルシウム法、リポフェクタミン法）や、電気パルス刺激により細胞膜に穿孔を開け、遺伝子を流入させる方法（エレクトロポレーション法、遺伝子銃法）、超音波法、単純拡散法、電荷を有する脂質を用いる方法、リポソーム法、あるいは、ウィルスＤＮＡに目的の遺伝子を組み込み、感染性ウィルスを生成して遺伝子導入を行う方法、などがあり、このうち適当な方法によって遺伝子を導入し細胞内発現させればよい。
【００４２】
上記遺伝子を動脈疾患患部の細胞内で発現させるにあたっては、特に非増殖型アデノウィルスのＤＮＡに組み込むことが好ましく、また、当該アデノウィルスを動脈に注入することが好ましい。
【００４３】
上記発現ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、目的の細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、細胞の種類に応じて、確実に遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係る遺伝子を各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。さらに、上記発現ベクターには、プロモーター配列だけでなくターミネーター配列を含めてもよい。
【００４４】
上記ＤＮ−ｐｉｍ−１遺伝子やその産物であるタンパク質、またはそのホモログを目的の細胞に導入して動脈疾患治療用薬剤として使用する場合、遺伝子やタンパク質以外に、これらを効率よく細胞内に導入するための運搬体（ベクター、外被タンパク質等）を含むものであってもよく、また、各種の試薬や反応液、酵素などと組み合わせて使用してもよい。
【００４５】
また、目的細胞に直接タンパク質を送り込む場合は、ホスト細胞にＤＮ−ｐｉｍ−１遺伝子を導入してタンパク質を発現させた上で、このタンパク質を回収して目的細胞に導入してもよい。上記ホスト細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Escherichia
coli）等の細菌、酵母（出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeや分裂酵母Schizosaccharomyces pombe）、ア
フリカツメガエル（Xenopas laevis）の卵母細胞、各種哺乳動物の培養細胞、あるいは昆虫の培養細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【００４６】
また、上記変異タンパク質にHIV遺伝子産物のTat蛋白の一部であるPTD(Protein
Transduction Domain)を結合させ、上記変異たんぱく質を直接細胞内へ送り込むこともできる。この方法を用いると、通常は細胞膜を通過できないタンパク質が、細胞膜を透過して、細胞内へ入り込むことができる。なお、細胞内に入り込んだタンパク質は、速やかに分解され、副作用は少ない。
【００４７】
上記遺伝子がホスト細胞に導入されたか否か、さらにはホスト細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、ＦＬＡＧ、ＨＡ、Ｍｙｃ等のエピトープをコードする塩基配列を付加してもよい。この場合、各エピトープを認識する抗体を用いることによって、本発明に係る遺伝子の発現を容易に確認することができる。あるいは、遺伝子の発現を観察するため、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Green
Fluorescent Protein）と本発明に係るタンパク質との融合タンパク質を発現させてもよい。
【００４８】
（３）本発明に係る遺伝子、タンパク質の取得方法
以上、本発明のタンパク質、遺伝子について説明したが、以下では、本発明に係るタンパク質、遺伝子の取得方法について説明する。
【００４９】
本発明のタンパク質をコードする遺伝子は、ｐｉｍ−１遺伝子を改変してなるものであるが、ｐｉｍ−１を取得する方法は、特に限定されるものではなく、前述の開示された配列情報等に基づいて種々の方法により、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ断片を単離し、クローニングすることができる。
【００５０】
また、上記タンパク質Ｐｉｍ−１のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたドミナントネガティブ変異体を作製する方法としては、上記タンパク質Ｐｉｍ−１をコードする遺伝子ｐｉｍ−１に対して人工的に突然変異を起こさせる方法がある。例えば、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入し変異タンパク質を作製する方法や、部位特異的突然変異誘発法（hashimoto-Gotoh,Gene
152,271-275(1995)他）等が挙げられる。また、文献「細胞工学別冊  新細胞工学実験プロトコール  秀潤社  241-248 (1993)」に記載の方法、さらには、市販のキット（例えば、Quikchange
Site-Directed Mutagenesis Kit  ストラタジーン社製）を利用する方法も可能である。
【００５１】
例えば、配列番号１に示す塩基配列を有する遺伝子において、配列番号２に示すように２００番目のＡ（アデニン）をＵ（ウラシル）に変換させると、産物のタンパク質が、Ｐｉｍ−１タンパク質において６７番目のリシンをメチオニンに置換された変異タンパク質となる。この変異タンパク質は、Ｐｉｍ−１のドミナントネガティブ変異体である。
【００５２】
なお、遺伝子ｐｉｍ−１の改変は、このような機能阻害を起こすためのもの以外の変異を含んでいてもよく、たとえば、さらに、サイレント変異（アミノ酸配列は変わらず、塩基配列のみが変化する変異）を含んでいてもよい。
【００５３】
以下では、実施例によって本発明についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、前述した様々な態様が可能であることはいうまでもない。
【実施例１】
【００５４】
〔バルーン傷害モデルラットの頚動脈におけるＰｉｍ−１発現の誘導〕
１０週齢のオスのスプレーグドーリーラット（ＳＤラット）の左の総頚動脈（ＣＣＡ）を、先が風船状になったカテーテル（バルーンカテーテル、２Ｆ  Ｆｏｇａｒｔｙ，Ｂａｘｔｅｒ）で膨張させることにより、頚動脈内皮をこすって傷をつけた。以下、この頚動脈内皮を損傷したラットをバルーン傷害モデルラットと称する。頚動脈内皮の傷害は、動脈硬化を誘発する。
【００５５】
動脈硬化の進行における、Ｐｉｍ−１の関連性を調査するため、このバルーン傷害ラットの頚動脈において、Ｐｉｍ−１の免疫化学染色を行った。方法としては、動脈を血清でブロッキングした後、切片を、１：１００で希釈した、抗Ｐｉｍ−１抗体（Ｃ−２０）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）と共に、４℃で一晩インキュベートした。そして、さらに、ベクタステインエリートＡＢＣキット（Vector）により、ビオチン化した２次抗体と共にインキュベートした。
【００５６】
結果を図１に示している。図１（ａ）はバルーン傷害を施していないラットの動脈切片を免疫化学染色したものを示し、図１（ｂ）はバルーン傷害を施した１４日後のラットの動脈切片を免疫化学染色したものを示している。図１中には、ＩＥＬ（内弾性板）の位置が示されているが、図１（ａ）ではＩＥＬが動脈の最も内側に位置しており、図１（ｂ）ではＩＥＬより内腔側に新生内膜が形成されていることがわかる。さらに、図１（ｂ）の新生内膜が強く免疫化学染色されており、新生内膜にてＰｉｍ−１が発現していることがわかる。
【００５７】
つまり、動脈をバルーン傷害されることで、新生内膜形成がはっきりと現れ、このとき傷害動脈の新生内膜でＰｉｍ−１発現が誘導されている。
【００５８】
次に、ヒトの新生内膜において、Ｐｉｍ-1が発現しているかどうかを調べるため、検死解剖で得られたヒトの冠動脈をサンプルとして、上記と同様にＰｉｍ−１の免疫化学染色を行った。なお、本研究における試験実施計画は、国立循環器病センターの倫理委員会の承認および患者の遺族のインフォームド・コンセントを得ている。
【００５９】
結果を図２に示している。図２（ａ）は、検死解剖年齢が６２歳、死因は急性心筋梗塞、図２（ｂ）は、検死解剖年齢が８３歳、死因は大動脈瘤、図２（ｃ）は、検死解剖年齢が３２歳、死因は肺高血圧症の、それぞれヒトの冠動脈を免疫化学染色したものを示している。いずれの剖検例においても新生内膜の領域において、強く免疫化学染色されており、種々の疾病及び年齢のヒト新生内膜においてＰｉｍ−１が発現していることがわかる。  
【実施例２】
【００６０】
（１）バルーン損傷ラット動脈へのアデノウィルス感染
Ｐｉｍ−１活性を抑制した場合の動脈硬化の進行における効果を調査するため、ＤＮ−Ｐｉｍ−１発現アデノウィルス（Ａｄ−ＤＮ−Ｐｉｍ−１）を準備した。以下にその作製方法を説明する。
【００６１】
非特許文献４を参照し、アデノ−Ｘ発現システム（Clontech）により、ＡＴＰ結合ドメイン中のリシン−６７をメチオニンに置き換えられたドミナントネガティブＰｉｍ−１（ＤＮ−Ｐｉｍ−１）を発現するアデノウィルス（Ａｄ−ＤＮ−Ｐｉｍ−１）を構築した。つまり、６×ｃ−Ｍｙｃ−ｔａｇｇｅｄ−ＤＮ−ｐｉｍ−１  ｃＤＮＡをシャトルベクター中にクローン化し、得られたプラスミドをｐＡｄｅｎｏ−Ｘアデノウィルスベクターにクローン化した。そして、アデノウィルス粒子を２９３細胞中で増殖させ、塩化セシウム勾配により精製した。
【００６２】
そして、このＡｄ−ＤＮ−Ｐｉｍ−１、５０μｌ（１×１０９ＰＦＵ／ｍｌ）をバルーン傷害ラット頚動脈の末端に注入し、感染させた。図３は、バルーン傷害ラットの頚動脈切片、および、バルーン傷害ラットをアデノウィルスに感染させた１４日後の頚動脈切片を観察したものである。
【００６３】
図３（ａ）および図３（ｂ）は、アデノウィルスの感染力を確かめるため、Ａｄ−ＤＮ−Ｐｉｍ−１の代わりに、ＧＦＰ発現アデノウィルス（Ａｄ−ＧＦＰ）を同様の方法で感染させた実験の結果を表すものである。ここでは、アデノウィルス（Ａｄ−ＧＦＰ）が頚動脈の血管壁細胞に感染した場合、細胞が光学顕微鏡下で緑色蛍光を発する。結果によると、図３（ａ）のＡｄ−ＧＦＰ未感染ラットがほとんど緑色蛍光を発していないのに比べ、図３（ｂ）の感染ラットは新生内膜形成部分にて強い緑色蛍光が認められる。つまり、頚動脈新生内膜の細胞に対してアデノウィルスが感染可能であることがわかる。
【００６４】
また、図３（ｃ）および図３（ｄ）は、頚動脈にＤＮ−Ｐｉｍ−１発現アデノウィルス（Ａｄ−ＤＮ−Ｐｉｍ−１）を感染させたあと、ＤＮ−Ｐｉｍ−１を免疫染色したものである。これによると、図３（ｃ）の未感染ラットではＤＮ−Ｐｉｍ−１をほとんど発現していないのに対し、図（ｄ）の感染ラットは新生内膜形成部分にてＤＮ−Ｐｉｍ−１を発現していることがわかる。つまり、バルーン傷害動脈は、アデノウィルス（Ａｄ−ＤＮ−Ｐｉｍ−１）にさらされたあと、その新生内膜ＶＳＭＣにてＤＮ−Ｐｉｍ−１の発現を誘導されたことがわかる。
【００６５】
さらに、図３（ｅ）に示すウェスタンブロッティングの図面は、未感染の頚動脈からの抽出タンパク質、ＧＦＰ発現アデノウィルスにより感染された頚動脈からの抽出タンパク質、ＤＮ−Ｐｉｍ−１発現アデノウィルスが感染した頚動脈からの抽出タンパク質、のそれぞれを、抗ＤＮ−Ｐｉｍ−１抗体でウェスタンブロッティングしたものである。ウェスタンブロッティングは、タンパク質５０μｇを１次抗体（抗Ｐｉｍ−１抗体、Ｓｉｇｍａ）と、ホースラディッシュぺルオキシダーゼと結合した２次抗体とを用いて行われた。検出は、エンハンスド化学発光プロトコル（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）にて行った。
【００６６】
これによれば、ＤＮ−Ｐｉｍ−１発現アデノウィルスが感染した頚動脈壁の細胞でのみＤＮ−Ｐｉｍ−１が発現していることがわかる。
【００６７】
（２）ＤＮ−Ｐｉｍ−１過剰発現による新生内膜の薄層化
図４は、バルーン傷害を施した１４日後のラット頚動脈を示している。バルーン傷害直後に食塩水にさらしたもの（図４（ａ）未感染）あるいはＡｄ−ＧＦＰ（図４（ｂ））にさらしたものでは、その１４日後に同心円状の新生内膜の形成が著明であった。一方、１４日後にＤＮ−Ｐｉｍ−１発現アデノウィルスを感染させ、ＤＮ−Ｐｉｍ−１を過剰発現させた頚動脈では、新生内膜の形成が劇的に抑制された（図４（ｃ））。
【００６８】
図４（ｄ）は、図４（ａ）〜図４（ｃ）のそれぞれの新生内膜の面積をグラフにあらわしたものである。なお、この結果は６つの試料の平均を示している。また、この解析は、ヘマトキシリンおよびエオシンにて染色し、自動化コンピューターベースド画像解析ソフトウェアパッケージ（ＮＩＨイメージ）で面積測定した。これにより、外弾性ラミナ（ＥＥＬ領域）と内弾性ラミナ（ＩＥＬ領域）とルーメン（lumen）領域とを測定し、内側領域（つまり、動脈内腔領域）、新生内膜領域は、これらの測定結果に基づき、
内側面積＝ＥＥＬ領域−ＩＥＬ領域
新生内膜領域＝ＩＥＬ領域−ルーメン領域
として、計算された。
【００６９】
１４日後に食塩水にさらした頚動脈では、新生内膜面積は０．１２４±０．０５４ｍｍ２であった。また、Ａｄ−ＧＦＰにさらしたものの新生内膜面積は、０．１１５±０．００５６ｍｍ２であった。これに対し、Ａｄ−ＤＮ−Ｐｉｍ−１を感染させたものの新生内膜は、０．０４±０．０２ｍｍ２と有意に低かった。
【００７０】
また、Ａｄ−ＤＮ−Ｐｉｍ−１にさらされた動脈では、新生内膜と中膜との面積比を示すＩ／Ｍ比が０．２９±０．１０であり、他の、食塩水にさらされた動脈（０．８８±０．３７）や、Ａｄ−ＧＦＰにさらされた動脈（０．８５±０．２６）と比べて、有意に（ｐ＜０．０１）抑制された。
【００７１】
さらに、図４（ｅ）では中膜の面積（ｍｅｄｉａｌ  ａｒｅａ）をグラフにあらわしている。この面積については、上記３つの間に著しい差はなかった。
【００７２】
（３）ＤＮ−Ｐｉｍ−１過剰発現細胞におけるＰＣＮＡ、Ｋｉ６７の検出
Ａｄ−ＤＮ−Ｐｉｍ−１処理を行った動脈で新生内膜形成の抑制が起こる背景を調べるため、ＶＳＭＣの細胞増殖率に対するＤＮ−Ｐｉｍ−１過剰発現の影響を調査した。
【００７３】
ネガティブコントロールとしてのＡｄ−ＧＦＰ処理動脈と、Ａｄ−ＤＮ−Ｐｉｍ−１処理した動脈とに対して、抗ＰＣＮＡ抗体、抗Ｋｉ６７抗体にて免疫染色を行った。結果を図５および図６に示す。図６（ａ）は、Ａｄ−ＧＦＰ処理した動脈切片を抗ＰＣＮＡ抗体にて免疫染色を行ったものであり、図６（ｂ）は、Ａｄ−ＤＮ−Ｐｉｍ−１処理した動脈切片を抗ＰＣＮＡ抗体にて免疫組織化学染色を行ったものである。免疫組織化学染色では、血清でブロッキングした後、切片を、１：１００で希釈した、抗ＰＣＮＡ抗体（ＰＣ１０）、あるいは、抗Ｋｉ６７抗体、（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）と共に、４℃で一晩インキュベートした。そして、さらに、ベクタステインエリートＡＢＣキット（Vector）により、ビオチン化した２次抗体と共にインキュベートした。
【００７４】
これによれば、図６（ｂ）ではほとんど染色が認められないのに対し、図６（ａ）では新生内膜にＰＣＮＡ陽性細胞が認められた。同様に、図６（ａ）は、Ａｄ−ＧＦＰ処理した動脈切片を抗Ｋｉ６７抗体にて免疫染色を行ったものであり、図６（ｂ）は、Ａｄ−ＤＮ−Ｐｉｍ−１処理した動脈切片を抗Ｋｉ６７抗体にて免疫染色を行ったものである。図６においても、図６（ｂ）ではほとんどＰＣＮＡ陽性細胞が認められないのに対し、図６（ａ）では新生内膜にＰＣＮＡ陽性細胞が認められた。このように、ＰＣＮＡポジティブ細胞およびＫｉ６７ポジティブ細胞は、Ａｄ−ＧＦＰ処理した動脈にのみ観察され、Ａｄ−ＤＮ−Ｐｉｍ−１処理した動脈では観察されなかった。
【００７５】
加えて、ＤＮ−Ｐｉｍ−１過剰発現をさせた動脈にＴＵＮＥＬアッセイを行ったところ、アポトーシスが増えていなかったことがわかった。したがって、ＤＮ−Ｐｉｍ−１による新生膜形成の抑制は、アポトーシスの増加でなく、細胞の増殖が減ったことによるものである可能性が高い。
【実施例３】
【００７６】
[培養ＶＳＭＣ細胞に対して酸化ストレスまたは血清刺激を与えることによるＰｉｍ発現の誘導]
動脈硬化の進行に、酸化ストレス、および血清中の種々の成長因子が関与していることがよく知られている。そこで、Ｐｉｍ−１発現がＨ２Ｏ２あるいは血清刺激により調整されているかを調査した。
【００７７】
ここで用いる培養ＶＳＭＣは、４週齢のＳＤラットの大動脈から単離され、ペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミン、必須でないアミノ酸、ＦＣＳを添加したダルベッコ改良イーグルメディウム（ＤＭＥＭ）で維持したものである。
【００７８】
図７では、培養ＶＳＭＣ細胞に対しＨ２Ｏ２を加えたあと、抗Ｐｉｍ−１抗体にて免疫染色を行い、Ｐｉｍ−１の位置で蛍光を発するようにして観察を行った。その方法としては、ＶＳＭＣをＬａｂ−Ｔｅｃ組織培養チャンバースライド（Life
Technologies）で培
養し、氷冷メターノル中で固定し、抗Ｐｉｍ−１抗体、ＦＩＴＣ結合２次抗体と反応させた。染色した細胞は蛍光顕微鏡にて観察された。
【００７９】
これによると、図７（ａ）はＨ２Ｏ２を添加していないネガティブコントロールで、ほとんど蛍光が認められないのに対し、図７（ｂ）に示す５μＭのＨ２Ｏ２で処理した場合、図７（ｃ）に示す１０μＭのＨ２Ｏ２で処理した場合では、Ｈ２Ｏ２の濃度の比例して強く蛍光を発していることが認められる。
【００８０】
また、図８は、０、２．５、５、１０μＭのＨ２Ｏ２で処理した培養細胞における、Ｐｉｍ−１、アクチンのウェスタンブロッティング結果を示す図面である。これによるとすべての培養細胞でアクチンがほぼ同じ濃度のバンドを示したのに対し、Ｐｉｍ−１は処理したＨ２Ｏ２に比例してバンドの濃度が濃くなっている。
【００８１】
上記図７、図８の結果から、Ｈ２Ｏ２の添加に依存して、Ｐｉｍ−１発現が起こっていることが示された。同様に、血清（１０％ＦＣＳ）による刺激に対してもＰｉｍ−１発現は顕著に強められた。
【実施例４】
【００８２】
[ＤＮ−Ｐｉｍ−１過剰発現により培養ＶＳＭＣの増殖を弱められる]
（１）培養ＶＳＭＣに対するアデノウィルス感染
ＶＳＭＣ増殖におけるＰｉｍ−１の役割をさらに追跡するため、Ａｄ−ＤＮ−Ｐｉｍ−１を、ラットから分離したＶＳＭＣに感染させた。アデノウィルス感染には、感染効率（ＭＯＩ）を１００として、１時間アデノウィルスにさらした。
【００８３】
感染から４８時間後、ウェスタンブロッティングを行った結果を図９に示す。なお、ウェスタンブロッティングでは、ネガティブコントロールとして、アデノウィルス感染を行っていないもの（未感染）、ベータガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）を発現するアデノウィルス（Ａｄ−ｌａｃＺ）を感染させたもの、のウェスタンブロッティングも行っている。図９によれば、Ａｄ−ＤＮ−Ｐｉｍ−１を感染させたＶＳＭＣでのみＤＮ−Ｐｉｍ−１の導入を示すバンドが認められ、Ａｄ−ｌａｃＺを感染させたＶＳＭＣでのみβ−ｇａｌを示すバンドが認められた。
【００８４】
また、図９では、同様に未感染、Ａｄ−ｌａｃＺを感染させたもの、Ａｄ−ＤＮ−Ｐｉｍ−１を感染させたものについて、図７と同じ方法で、抗ＤＮ−Ｐｉｍ−１抗体にて免疫染色を行った。これによれば、未感染（図１０（ａ））およびＡｄ−ｌａｃＺを感染させたもの（図１０（ｂ））ではほとんど染色されていないのに対し、Ａｄ−ＤＮ−Ｐｉｍ−１を感染させたＶＳＭＣ（図１０（ｃ））は強く蛍光を発していた。このとき、Ａｄ−ＤＮ−Ｐｉｍ−１を感染させたＶＳＭＣの９５％以上の細胞がポジティブであった。
【００８５】
また、図１１にてβ−ｇａｌを染色するＸ−Ｇａｌ染色を行った。これによれば、未感染（図１１（ａ））およびＡｄ−ＤＮ−Ｐｉｍ−１を感染させたもの（図１１（ｃ））ではほとんど染色されていないのに対し、Ａｄ−ｌａｃＺを感染させたＶＳＭＣ（図１１（ｂ））は核が青く濃染した。このとき、Ａｄ−ｌａｃＺを感染させたＶＳＭＣの９５％以上の細胞がポジティブであった。
（２）ＤＮ−Ｐｉｍ−１過剰発現による細胞数増殖の抑制
さらに、ＤＮ−Ｐｉｍ−１の過剰発現が、血清あるいはＨ２Ｏ２で刺激することによる細胞増殖を抑制するかを調べた。ここでは、Ａｄ−ＤＮ−Ｐｉｍ−１を感染させたＶＳＭＣに対し、血清（１０％ＦＣＳ）あるいは１０μＭＨ２Ｏ２にて刺激し、細胞数の変化を計測した。なお、コントロールとして、未感染、Ａｄ−ｌａｃＺを感染させたＶＳＭＣに対しても同様に刺激した。
【００８６】
図１２では、横軸に刺激後の日数を、縦軸に細胞数を示しており、刺激として、図１２（ａ）は１０％ＦＣＳを、図１２（ｂ）では１０μＭＨ２Ｏ２を用いた。図１２（ａ）によると、未感染、Ａｄ−ｌａｃＺを感染させたＶＳＭＣでは、１０％ＦＣＳで刺激時（このときの細胞数は１０×１０４個）から１日後に約２０×１０４個、２日後に約３５×１０４個に増殖するのに対し、Ａｄ−ＤＮ−Ｐｉｍ−１を感染させたＶＳＭＣではほぼ１０×１０４個に保たれており、有意に細胞数の増殖が抑えられていた。同様に、図１２（ｂ）によると、未感染、Ａｄ−ｌａｃＺを感染させたＶＳＭＣでは、Ｈ２Ｏ２刺激時（このときの細胞数は１０×１０４個）から２日後に２０×１０４個近くまでに増殖するのに対し、Ａｄ−ＤＮ−Ｐｉｍ−１を感染させたＶＳＭＣではほぼ１３×１０４個程度に保たれており、有意に細胞数の増殖が抑えられていた。
（３）ＤＮ−Ｐｉｍ−１過剰発現によるＤＮＡ合成の抑制
次に、ＤＮ−Ｐｉｍ−１の過剰発現が、血清あるいはＨ２Ｏ２で刺激することによるＤＮＡ合成に影響を与えるのかを調べた。その方法を説明すると、Ａｄ−ＤＮ−Ｐｉｍ−１を感染させたＶＳＭＣ（２４ウェルプレートの各ウェルに５×１０３個の細胞となるようにする）に対し、血清（１０％ＦＣＳ）あるいは１０μＨ２Ｏ２にて刺激したあと、[３Ｈ]−チミジン（Amersham）を１μＣｉ／ｍｌ濃度で加え、４時間このままに保った。このときの４時間は、２４時間の刺激期間の最後の４時間となるようにした。そして、５％トリクロロ酢酸とともに４℃で２０分間培養した。そのあと、放射性を液体シンチレーション計測により決定した。なお、コントロールとして、未感染、Ａｄ−ｌａｃＺを感染させたＶＳＭＣに対しても同様に刺激し、ＤＮＡ合成を観察した。
【００８７】
結果を図１３に示す。図１３（ａ）は、上記した各ＶＳＭＣに血清刺激を与えたもの（＋）与えていないもの（−）における、[３Ｈ]−チミジンの取り込み量を、未感染（−）の取り込み量を１００として表したものである。これによると、血清刺激により、未感染、Ａｄ−ｌａｃＺを感染させたＶＳＭＣでは[３Ｈ]−チミジンの取り込み量が２倍以上になっていたのに対し、Ａｄ−ＤＮ−Ｐｉｍ−１を感染させたＶＳＭＣでは取り込み量に変化がなかった。つまり、血清により誘導された[３Ｈ]−チミジンの取り込みは、Ａｄ−ＤＮ−Ｐｉｍ−１処理のＶＳＭＣで完全に抑制された（ｐ＜０．０５）が、未感染、Ａｄ−ｌａｃＺを感染させたＶＳＭＣでは抑制されなかった。
【００８８】
図１３（ｂ）は、未感染ＶＳＭＣにＨ２Ｏ２を０、５、１０μＭ濃度で、あるいは１０μＭ＋ＮＡＣ（抗酸化ＮアセチルＬシステイン）与えたものと、Ａｄ−ｌａｃＺ、Ａｄ−ＤＮ−Ｐｉｍ−１処理のＶＳＭＣに１０μＭのＨ２Ｏ２刺激を与えたものについて、[３Ｈ]−チミジンの取り込み量を計測したものである。これによると、未感染、Ａｄ−ｌａｃＺを感染させたＶＳＭＣではＨ２Ｏ２濃度にしたがって、[３Ｈ]−チミジンの取り込み量が上昇しているのに対し、ＮＡＣ処理をしたもの、あるいは、Ａｄ−ＤＮ−Ｐｉｍ−１を感染させたＶＳＭＣでは取り込み量が上昇しなかった。つまり、Ｈ２Ｏ２の酸化ストレスより誘導された[３Ｈ]−チミジンの取り込みは、Ａｄ−ＤＮ−Ｐｉｍ−１処理された、あるいはＮＡＣにより酸化を防止されたＶＳＭＣで抑制された。
【００８９】
さらに、Ａｄ−ＤＮ−Ｐｉｍ−１が細胞周期（セルサイクル）に影響するかを調べるため、ＦＡＣＳ分析を行った。ここでは、Ａｄ−ＤＮ−Ｐｉｍ−１処理を行った細胞にヨウ化プロピジウム（５０μｇ／ｍｌ）で処理したあと、ＦＡＣＳｃａｎ装置（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にてフローサイトメトリック分析を行った。そして、ＭｏｄＦｉｔＬＴプログラムを使用し、データから細胞周期分布の分析を行った。
【００９０】
図１４に示すグラフは、未感染、Ａｄ−ｌａｃＺを感染させたもの、Ａｄ−ＤＮ−Ｐｉｍ−１を感染させたＶＳＭＣについて、血清（図１４（ａ））あるいはＨ２Ｏ２（図１４（ｂ））で刺激した後の細胞を、細胞の分裂活動を休止しているＧ０−Ｇ１期（図１４の白の棒グラフ）、細胞の分裂Ｇ２−Ｍ期（図１４の黒の棒グラフ）、ＤＮＡの合成を行うＳ期（図１４の斜線の棒グラフ）に分類し、その割合を調べたものである。これによると、血清あるいはＨ２Ｏ２で刺激することで、Ｓ期およびＧ２−Ｍ期の細胞の割合が顕著に上昇するが、Ａｄ−ＤＮ−Ｐｉｍ−１の過剰発現がこの現象を相殺し、有意にＳ期およびＧ２−Ｍ期にある細胞の増加を防いでいた。この結果から、ＤＮ−Ｐｉｍ−１過剰発現による増殖抑制は、主に細胞周期の進行を妨げることによってもたらされていると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明の動脈疾患治療用薬剤は、動脈の狭窄または閉塞をもたらすタンパク質Ｐｉｍ−１の機能を抑制する、Ｐｉｍ−１のドミナントネガティブ変異体タンパク質を細胞内に導入することができるので、動脈の狭窄、閉塞を防ぐことができ、動脈疾患、特に、動脈硬化の治療または予防の効果を得られる。したがって、本発明は、各種医薬品産業等、広く医療の発展に寄与するものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】ラットの動脈切片を抗Ｐｉｍ−１抗体で免疫化学染色した結果を示す図面であり、図１（ａ）はバルーン傷害を施していないラットを、図１（ｂ）はバルーン傷害を施した１４日後のラットを示している。
【図２】ヒトの冠動脈切片を抗Ｐｉｍ−１抗体で免疫化学染色した結果を示す図面であり、図２（ａ）は、検死解剖年齢が６２歳、死因は急性心筋梗塞、図２（ｂ）は、検死解剖年齢が８３歳、死因は大動脈瘤、図２（ｃ）は、検死解剖年齢が３２歳、死因は原発性肺高血圧症であるヒトを示している。
【図３】ラットの動脈壁にアデノウィルスを感染させた結果を示す図面であり、図３（ａ）および図３（ｂ）は、Ａｄ−ＧＦＰを感染させた実験の結果を示し、図３（ｃ）および図３（ｄ）は、Ａｄ−ＤＮ−Ｐｉｍ−１を感染させた実験を示し、図３（ｅ）は未感染の、あるいはＧＦＰ発現アデノウィルスおよびＤＮ−Ｐｉｍ−１発現アデノウィルスが感染した頚動脈から抽出したタンパク質をウェスタンブロッティングした結果を示す。
【図４】バルーン傷害を施した１４日後のラット頚動脈を示しており、図４（ａ）は未感染の、図４（ｂ）はＡｄ−ＧＦＰを感染させた、図４（ｃ）はＡｄ−ＤＮ−Ｐｉｍ−１を感染させた頚動脈であり、図４（ｄ）はそれぞれの新生内膜の面積を、図４（ｅ）では中膜の面積（ｍｅｄｉａｌ  ａｒｅａ）を表したグラフである。
【図５】動脈切片を抗ＰＣＮＡ抗体にて免疫染色を行った結果を示す図面であり、図５（ａ）はＡｄ−ＧＦＰを感染させた、図５（ｂ）はＡｄ−ＤＮ−Ｐｉｍ−１を感染させた動脈切片を示す。
【図６】動脈切片を抗Ｋｉ６７抗体にて免疫染色を行った結果を示す図面であり、図６（ａ）はＡｄ−ＧＦＰを感染させた、図６（ｂ）はＡｄ−ＤＮ−Ｐｉｍ−１を感染させた動脈切片を示す。
【図７】培養ＶＳＭＣ細胞に対しＨ２Ｏ２を加えたあと、抗Ｐｉｍ−１抗体にて免疫染色を行った結果を示す図面であり、図７（ａ）はＨ２Ｏ２を添加していない、図７（ｂ）は５μＭのＨ２Ｏ２で処理した、図７（ｃ）は１０μＭのＨ２Ｏ２で処理した培養ＶＳＭＣ細胞を示す。
【図８】０、２．５、５、１０μＭのＨ２Ｏ２で処理した培養細胞のＰｉｍ−１、アクチンのウェスタンブロッティングを示す。
【図９】Ａｄ−ＤＮ−Ｐｉｍ−１を感染させた培養ＶＳＭＣ細胞に対しウェスタンブロッティングを行った結果を示す図面である。
【図１０】培養ＶＳＭＣ細胞に対し抗ＤＮ−Ｐｉｍ−１抗体にて免疫染色を行った結果を示す図面であり、図１０（ａ）は未感染の、図１０（ｂ）はＡｄ−ｌａｃＺを感染させた、図１０（ｃ）はＡｄ−ＤＮ−Ｐｉｍ−１を感染させたＶＳＭＣを示す。
【図１１】培養ＶＳＭＣ細胞に対しＸ−Ｇａｌ染色を行った結果を示す図面であり、図１１（ａ）は未感染の、図１１（ｂ）はＡｄ−ｌａｃＺを感染させた、図１１（ｃ）はＡｄ−ＤＮ−Ｐｉｍ−１を感染させたＶＳＭＣを示す。
【図１２】培養ＶＳＭＣ細胞に対し、血清あるいは１０μＨ２Ｏ２にて刺激し、細胞数を計測した結果を示す図面であり、図１２（ａ）は血清で、図１２（ｂ）はＨ２Ｏ２にて刺激した図面である。
【図１３】培養ＶＳＭＣ細胞に対し、血清あるいはＨ２Ｏ２にて刺激し、[３Ｈ]−チミジンの取り込み量を測定した結果を示す図面であり、図１３（ａ）は血清刺激を与えたものであり、図１３（ｂ）はＨ２Ｏ２にて刺激したものである。
【図１４】培養ＶＳＭＣ細胞に対し、血清あるいはＨ２Ｏ２で刺激した後の、Ｇ０−Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２−Ｍ期にある細胞の割合を計測した結果を示し、図１４（ａ）は血清刺激を与えたものであり、図１４（ｂ）はＨ２Ｏ２にて刺激したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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