【手続補正書】
【提出日】平成21年12月8日(2009.12.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項９】
Trichoderma属由来であり（好ましくはTrichoderma viride、Trichoderma reesei、Trichoderma saturnisporum、Trichoderma ghanense、Trichoderma koningii、 Trichoderma hamatum、Trichoderma harzianum又はTrichoderma polysporum由来であり）、配列番号：11〜24のいずれか一に記載の塩基配列を含み、フラボノイド類の配糖化活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１０】
Trichoderma属由来であり（好ましくはTrichoderma viride、Trichoderma reesei、Trichoderma saturnisporum、Trichoderma ghanense、Trichoderma koningii、 Trichoderma hamatum、Trichoderma harzianum又はTrichoderma polysporum由来であり）、配列番号：11〜24のいずれか一に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる、フラボノイド類の配糖化活性を有するタンパク質。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
特許文献2は、カテキン類とグルコース−1−リン酸又はシュークロースとの混合液にシュークロースホスホリラーゼを作用させ、カテキン類配糖体を製造する方法を開示する。ここでは、シュークロースホスホリラーゼの起源として、Leuconostoc mesenteroides、Pseudomonas saccharophila、Pseudomonas putrefaciens、Clostridium pasteurianum、Acetobacter xylinum、Pullularia pullulansが挙げられている。ここでは、受容体として、カテキン類としては、（＋）−カテキン、（−）−エピカテキン、（−）−エピカテキン3-O-ガレート、（−）−エピガロカテキン、及び（−）−エピガロカテキン3-O-ガレートが挙げられているが、実施例として記載されているのは、（＋）−カテキンを受容体に用いて（＋）−カテキン 3'-O-α-D-グルコピラノシドを製造した例のみである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
特許文献5は、3'位、3'と5位及び3'と7位が配糖化されたカテキン類の配糖体を開示する。ここでは、そのための具体的な方法として、特許文献4と同様、カテキン類及びデキストリン、サイクロデキストリン、澱粉又はこれらの混合物に、Bacillus stearothermophilus由来のサイクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼを作用させる方法が記載されている。そして、糖供与体としてデキストリンを用いた上記方法による実施例においては、（-）-エピガロカテキン、（-）-エピガロカテキン3-O-ガレート、（-）-エピカテキン3-O-ガレートの配糖体については、分子吸光係数から、各ポリフェノール1分子当り平均で6〜8個グルコースが結合しているものも得られたと考察している。また、上記方法で得られた配糖体にリゾプス・ニベウス由来のグルコアミラーゼを作用させることで、3'，7-ジ-O-α-D-グルコピラノシル（-）-エピガロカテキン、3'，5-ジ-O-α-D-グルコピラノシル（-）-エピガロカテキン、3'-O-α-D−グルコピラノシル（-）-エピガロカテキン、3'，7-ジ-O-α-D-グルコピラノシル（-）-エピガロカテキン3-O-ガレート、3'-O-α-D-グルコピラノシル（-）-エピガロカテキン3-O-ガレート、3'-O-α-D-グルコピラノシル（-）-ガロカテキン、3'-O-α-D−グルコピラノシル（-）-エピカテキン3-O-ガレートの生成を確認している。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
本発明はまた、Trichoderma属由来であり、好ましくはTrichoderma viride、Trichoderma reesei、Trichoderma saturnisporum、Trichoderma ghanense、Trichoderma koningii、Trichoderma hamatum、Trichoderma harzianum又はTrichoderma polysporum由来であり、配列番号：11〜24のいずれか一に記載の塩基配列を含み、フラボノイド類の配糖化活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。このようなポリヌクレオチドの好ましい例は、配列番号：11〜24のいずれか一に記載の塩基配列を含み、配列番号：6、9又は25に記載の塩基配列と高い同一性を有し、かつフラボノイド類の配糖化活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
本発明はまた、Trichoderma属由来であり、好ましくはTrichoderma viride、Trichoderma reesei、Trichoderma saturnisporum、Trichoderma ghanense、Trichoderma koningii、Trichoderma hamatum、Trichoderma harzianum又はTrichoderma polysporum由来であり、配列番号：11〜24のいずれか一に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる、フラボノイド類の配糖化活性を有するタンパク質を提供する。このようなタンパク質の好ましい例は、配列番号：11〜24のいずれか一に記載の塩基配列を含み、配列番号：6、9又は25に記載の塩基配列と高い同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる、フラボノイド類の配糖化活性を有するタンパク質である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
本発明のタンパク質は、Trichoderma属に属する菌、例えばTrichoderma viride、Trichoderma reesei、Trichoderma saturnisporum、Trichoderma ghanense、Trichoderma koningii、Trichoderma hamatum、Trichoderma harzianum又はTrichoderma polysporumを公知の培養液で培養して得られる培養上清から単離・精製することができる。また、本発明のポリヌクレオチドを挿入した組換えベクターにより形質転換された形質転換体（例えば、形質転換酵母や形質転換大腸菌）により、組換えタンパク質として得ることができる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
そこで、トリコデルマと同じ子嚢菌類の糸状菌でゲノム配列が明らかになっている微生物のうち、Aspergillus nidulans、Neurospora crassa、Magnaporthe grisea、Fusarium graminearumのゲノム情報データベースから、プロテインファミリーデータベース(PFAM)のalpha-amylase, catalytic domain（accession No. PF00128）のモチーフを持つ推定ORFのアミノ酸配列をそれぞれ9個、6個、8個、6個抽出した。これらを配列相同性検索プログラムであるClustalWによりアライメントを作成し、系統樹作成プログラムであるTree viewにより系統樹を作成し、相同性をもとにグループ分けを行った。図2のグループ1の4つのアミノ酸配列（括弧内はGenebank アクセッションNo.）MG02772.4(EAA47529)、MG10209.4(EAA48146)、AN3388.2(EAA63356)、FG03842.1(EAA71544)をアライメントし、保存性の高い部分（図3、下線部）のアミノ酸配列に対応するオリゴDNAを合成した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
AMY-12f:
5'-TAYTGYGGNGGNACNTTYAARGGNYT-3'（配列番号：1）
AMY-15r:
5'-TTYTCNACRTGYTTNACNGTRTCDAT-3'（配列番号：2）
AMY-17r:
5'-GGTNAYRTCYTCNCKRTTNGCNGGRTC-3'（配列番号：3）
先に培養したT. viride IAM5141菌体約1gの湿菌体よりDNeasy plant Maxi Kit（QIAGEN）により、ゲノムDNAを抽出した。このゲノムDNA50ngを鋳型として、プライマーAMY-12fとプライマーAMY-15r、又はプライマーAMY-12fとプライマーAMY-17rを用いてPCR反応を行った。すなわち、ExTaq(タカラバイオ社製)を用いて、94℃  2分、（94℃  1分、50℃1分、72℃  1分）を30サイクル、72℃  10分の反応を行った。PCR産物をアガロースゲル電気泳動で分析したところ、プライマーAMY-12fとプライマーAMY-15rの組み合わせで約0.6kbp、プライマーAMY-12fとプライマーAMY-17rの組み合わせで約1.0kbpの断片が確認できた。そこで、これらのDNA断片をアガロースゲルから切り出し、GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（アマシャムバイオサイエンス）によりDNAを精製した。これをTOPO-TA cloning kit(インビトロジェン)にてクローニングし、塩基配列の解析をABI3100Avant（アプライドバイオシステムズ社製）にて行った。前者で得られた塩基配列は後者で得られた塩基配列に含まれていた。この塩基配列をGenBankに登録されているアミノ酸配列に対してBlastxにより相同性検索を行ったところ、MG10209.4(EAA48146)と最も高い相同性を示した。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
5-O-α-D-グルコピラノシル-(+)-カテキン：m/z 453.2、NMRδppm (D2O)；2.62 (1H, dd), 2.81 (1H, dd), 3.43 (1H, t), 3.45-3.55 (1H, m), 3.6-3.7 (3H, m), 3.83 (1H, t), 4.18 (1H, dd), 4.76 (1H, d), 5.61 (1H, d), 6.09 (1H, d), 6.31 (1H, d), 6.77 (1H, d), 6.8-6.9 (2H, m) 。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
〔実施例11：TRa2タンパク質表層発現酵母の活性確認〕
プラスミドpCAS-TRa2にて酵母S.cerevisiae EH1315株を形質転換した。得られた形質転換株をTRa2-2株とした。TRa2-2株及び、プラスミドpGA11のグルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナルとα-アグルチニンの3'側半分をコードする遺伝子の間にマルチクローニングサイトを挿入したプラスミドpCAS1にて酵母S.cerevisiae EH1315株を形質転換したコントロール株（C-2株）をYPD液体培地10mlに1白金耳植菌し、30℃で2日間培養した。遠心分離により菌体を回収し、PBSにて洗浄後、1ml PBSに懸濁した。この懸濁液を用いて実施例6及び実施例7と同様に、糖分解反応及び糖転移反応を行い反応生成物の分析を行った。その結果、TRa2-2株はデキストリン分解活性及びデキストリンを糖供与体とするカテキンへの糖転移活性を有するのに対し、C-2株ではこれらの活性がないことが確認できた。すなわち、TRa2-2株ではTRa2が活性を有する形で酵母表層に呈示されたことが示された。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
〔実施例12：Trichoderma属の各種菌株からのTRa2ホモログの取得〕
Trichoderma viride IFO31137株、Trichoderma viride SAM1427株、Trichoderma viride IFO31327株、Trichoderma viride IFO30498株、Trichoderma viride IFO5720株、Trichoderma reesei IFO31329株、Trichoderma reesei IFO31328株、Trichoderma reesei IFO31326株、Trichoderma saturnisporum IAM12535株、Trichoderma ghanense IAM13109株、Trichoderma koningii IAM12534株、Trichoderma hamatum IAM12505株、Trichoderma harzianum IFO31292株、Trichoderma polysporum SAM357株をそれぞれ、酵母エキス（Difco）1％、ポリペプトン（日本製薬）1％、デキストリン（ナカライテスク）2％の液体培地  10mlに植菌し、30℃で4日間振とう培養した。フィルターろ過により菌体を回収し、DNeasy plant mini Kit（QIAGEN）により、ゲノムDNAを抽出した。このゲノムDNA 50ngを鋳型として、プライマーAMY-12fとプライマーAMY-15rを用いてPCR反応をおこなった。すなわち、ExTaq(タカラバイオ社製)を用いて、94℃  2分、（94℃  1分、50℃1分、72℃  1分）を30サイクル、72℃  10分の反応を行った。PCR産物をアガロースゲル電気泳動で分析したところ、約0.6kbpの断片が確認できた。これらのDNA断片をアガロースゲルから切り出し、GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（アマシャムバイオサイエンス）によりDNAを精製した。これをTOPO-TA cloning kit(インビトロジェン)にてクローニングし、塩基配列の解析をABI3100Avant（アプライドバイオシステムズ社製）にて行った。その結果、配列番号：11〜24の配列が得られた。アライメント結果を図8に示す。TRa2遺伝子のこれらに相当する領域及びこれらの互いの相同性は63〜99.5％であった。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
これらの配列をもとに、T. viride IAM5141のTRa2遺伝子、cDNA全長を取得したときと同様の方法を用いれば、TRa2と同様な活性を持つTRa2ホモログを取得できる。
〔実施例13：TRa2の基質特異性解析〕
TRa2-1株をYPD培地10 mlにて、30℃で一晩振とう培養した。静止期に達した培養液を同培地に接種し（2%(v/v)）、30℃で3日間振とう培養した。培養後、遠心分離にて上清を回収し、5倍に濃縮してTRa2の粗酵素溶液を得た。酵素反応溶液（0.5 mM 及び 10 ｍM 糖受容体基質（（+）-カテキン、（-）-エピガロカテキン-3-O-ガレート、エスクレチン、ナリンゲニン、ケルセチン、ダイゼイン、ゲニステイン、ケンフェロール）、10 mg デキストリン、100 mM 酢酸バッファー (pH 5.2)、粗酵素溶液）100μlにて45℃、24 hr反応させ、HPLCにて分析した。結果を図9に示した。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
精製
培養液上清をBuffer S1［20 mM NaH2PO4-NaOH (pH 7.4)、10 mM イミダゾール、0.5 M NaCl、15 mM 2-メルカプトエタノール］にて平衡化したNi2+キレート済みのChelating Sepharose Fast Flow (5 ml、Pharmacia Biotech)カラムにアプライし、同バッファー（40 ml）で洗浄した。続いてBuffer E1［20 mM NaH2PO4-NaOH (pH 7.4)、200 mM イミダゾール、0.5 M NaCl、15 mM 2-メルカプトエタノール］によりカラムに結合したタンパク質を溶出した。活性画分を集め、VIVASPIN（30,000 MWCO、VIVASCIENCE）を用いて脱塩、濃縮した。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
酵素活性測定：
糖転移活性
反応液(10 mM カテキン、10 mg デキストリン、100 mM Acetate-NaOH(pH 5.3)、酵素溶液)100 μlを45℃、24 hr攪拌し、0.5% TFA 100 μlを添加することで反応を停止した。反応停止後のサンプルを遠心分離し、上清を回収した。生成物を以下のような条件でHPLCにて分析した。HPLC条件：溶離液A、0.1% TFA；溶離液B、90% アセトニトリル、0.08% TFA；分析カラム、Develosil C30-UG-5 (4.6 x 150 mm、NOMURA CHEMICAL)；流速、1 ml/min；分離モード、0 min-5%B、20 min-50%B、20.5 min-5%B、25 min-5%B  
加水分解活性
反応液(5 mM マルトテトラオース、20 mM KH2PO4-KOH(pH 6.0)、酵素溶液)100 μlを35℃、15min反応させ、熱処理（100℃、5 min）することで反応を停止した。反応停止後のサンプルを遠心分離し、上清を回収した。生成物を以下のような条件でHPLCにて分析した。HPLC条件：溶離液、68% アセトニトリル；分析カラム、SUPELCOSIL LC-NH2 (5 μm、4.6 x 250 mm、SUPELCO)；流速、1 ml/min；分離モード、isocratic  
温度安定性解析：
酵素溶液（±10 mMエピガロカテキンガレート）を20〜60℃の各温度で、1 hr処理後、4℃に冷却した。冷却後のサンプルに、10mMエピガロカテキンガレート、10 mg デキストリンを添加して反応（各温度，pH 5.3，24 hr）した。0.5% TFA添加で反応停止後、逆相HPLCにて分析した。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９９】
【図１】図１は、Trichoderma viride IAM 5141  粗酵素液でカテキンを処理した際の、HPLC分析チャートである。
【図２】図2は、Aspergillus nidulans、Neurospora crassa、Magnaporthe grisea、Fusarium graminearum のゲノム情報データベースから抽出した、alpha-amylase, catalytic domain（accession No. PF00128）のモチーフを持つ推定ORFのアミノ酸配列について、系統樹作成プログラムであるTree viewにより作成した系統樹を示した図である。
【図３】図3は、図2のグループ1の4つのアミノ酸配列をアライメントし、保存性の高い部分（下線部）を示した図である。
【図４】図4は、TRa2のゲノムDNA配列（配列番号6）とcDNA配列（配列番号9）を比較した図である。
【図５】図5は、TRa2のcDNA塩基配列、及びそれに対応する推定アミノ酸配列を示した図である。2重下線部は推定分泌シグナル配列。
【図６】図6は、TRa2の推定アミノ酸配列とタカアミラーゼ前駆体アミノ酸配列（GBNo.BAA00336）の一次構造を比較した図である。下線部：TRa2の推定分泌シグナル、破線下線部：タカアミラーゼの分泌シグナル、2重下線部：α‐アミラーゼファミリー酵素で高度に保存されている4つの領域、＊印アミノ酸残基：触媒部位に位置するアミノ酸残基。
【図７】図7は、T.viride IAM5141の培養上清の原液、又はその濃縮液に（+）-カテキン又は（-）-エピガロカテキン-3-O-ガレートと、デキストリンを加えて反応させた際の、反応液のHPLC分析チャートである。
【図８】図8は、Trichoderma属の各種菌株から調製されたゲノムDNAより得られた、TRa2ホモログの部分塩基配列のアライメント結果を示した図である。
【図９】図9は、形質転換体（TRa2-1株）の培養上清から調製したTRa2の粗酵素溶液に、各糖受容体基質（（+）-カテキン、（-）-エピガロカテキン-3-O-ガレート、エスクレチン、ナリンゲニン、ケルセチン、ダイゼイン、ゲニステイン、ケンフェロール）、デキストリンを加えて反応させた際の、配糖化活性を示したグラフである。
【図１０】図10は、TRa2の温度安定性及びpH安定性を示したグラフである。
【図１１】図11は、TRa2による糖質加水分解反応の、温度依存性及びpH依存性を示したグラフである。
【図１２】図12は、TRa2による糖転移反応の、温度依存性及びpH依存性を示したグラフである。
【図１３】図13は、（+）-カテキン又は4'-O-α-D-グルコピラノシル-(+)-カテキンを含む溶液を4〜100℃の各温度で0〜4時間処理した後の、それぞれの残存量を示したグラフである。
【図１４】図14は、（+）-カテキン及び5-O-α-D-グルコピラノシル-(+)-カテキンの水への溶解性を示したグラフである。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図７】
2008173075.tif 000001