【手続補正書】
【提出日】平成22年6月7日(2010.6.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルシウム塩の存在下で微生物の発酵培養により培養液中に生産された乳酸を分離して製造する方法であって、該培養液中のカルシウム成分を硫酸を加えて難溶性硫酸塩として除去して乳酸を含む分離液を得る工程Ａ、工程Ａで得られた乳酸を含む分離液をナノ濾過膜に通じて濾過し、カルシウム成分を除去して乳酸溶液を得る工程Ｂを含み、工程Ｂのナノ濾過膜のメタノールの除去率が１０％以下かつイソプロピルアルコールの除去率が２０％以上５０％以下かつクエン酸の除去率が７０％以上９５％以下かつショ糖の除去率が９５％以上であることを特徴とする乳酸の製造方法。
【請求項２】
前記ナノ濾過膜の膜素材が架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ、化学式１で示される構成成分を含有することを特徴とする請求項１に記載の乳酸の製造方法。
【化１】
2009034030.tif 000001
（式中、Ｒは−Ｈまたは−ＣＨ３、ｎは０から３までの整数を表す。）
【請求項３】
前記工程Ｂで得られる乳酸溶液を、さらに、１Ｐａ以上大気圧以下の圧力下において、２５℃以上２００℃以下で蒸留する工程Ｃを含む、請求項１または２に記載の乳酸の製造方法。
【請求項４】
前記工程Ｂで得られる乳酸溶液を、さらに、逆浸透膜で濾過して乳酸濃度を高める工程Ｄを含む、請求項１または２に記載の乳酸の製造方法。
【請求項５】
前記工程Ｄの後に前記工程Ｂで得られる乳酸溶液を、さらに、１Ｐａ以上大気圧以下の圧力下において、２５℃以上２００℃以下で蒸留する工程Ｃを含む、請求項４に記載の乳酸の製造方法。
【請求項６】
カルシウム塩の存在下で微生物の発酵培養により培養液中に生産された乳酸を分離して製造する際に用いられる乳酸の製造装置であって、乳酸を分離して製造する際には、該培養液中のカルシウム成分を硫酸を加えて難溶性硫酸塩として除去して乳酸を含む分離液を得る工程Ａ、工程Ａで得られた乳酸を含む分離液をナノ濾過膜に通じて濾過し、カルシウム成分を除去して乳酸溶液を得る工程Ｂを含み、工程Ｂのナノ濾過膜のメタノールの除去率が１０％以下かつイソプロピルアルコールの除去率が２０％以上５０％以下かつクエン酸の除去率が７０％以上９５％以下かつショ糖の除去率が９５％以上であることを特徴とする乳酸の製造装置。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
微生物発酵による乳酸の生産は、一般に、培養液中にアルカリ性物質を添加することで、微生物発酵に最適なｐＨに保持されながら行われる。微生物発酵により生産された酸性物質である乳酸の多くは、アルカリ性物質が添加されているために、培養液中では乳酸塩として存在している。この場合、フリーの乳酸は、発酵終了後、培養液に酸性物質を添加することで得られる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
本発明は、上述したような課題、すなわち、カルシウム塩の存在下で微生物発酵により乳酸を製造する場合において、培養液中のカルシウム成分を効果的に除去するという課題を解決し、効率よく乳酸を製造する方法を提供することを目的とする。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
すなわち、本発明は、次の（１）〜（６）から構成される。
（１）カルシウム塩の存在下で微生物の発酵培養により培養液中に生産された乳酸を分離して製造する方法であって、該培養液中のカルシウム成分を硫酸を加えて難溶性硫酸塩として除去して乳酸を含む分離液を得る工程Ａ、工程Ａで得られた乳酸を含む分離液をナノ濾過膜に通じて濾過し、カルシウム成分を除去して乳酸溶液を得る工程Ｂを含み、工程Ｂのナノ濾過膜のメタノールの除去率が１０％以下かつイソプロピルアルコールの除去率が２０％以上５０％以下かつクエン酸の除去率が７０％以上９５％以下かつショ糖の除去率が９５％以上であることを特徴とする乳酸の製造方法。
（２）前記ナノ濾過膜の膜素材が架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ、化学式１で示される構成成分を含有することを特徴とする（１）に記載の乳酸の製造方法。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
（式中、Ｒは−Ｈまたは−ＣＨ３、ｎは０から３までの整数を表す。）
（３）前記工程Ｂで得られる乳酸溶液を、さらに、１Ｐａ以上大気圧以下の圧力下において、２５℃以上２００℃以下で蒸留する工程Ｃを含む、（１）または（２）に記載の乳酸の製造方法。
（４）前記工程Ｂで得られる乳酸溶液を、さらに、逆浸透膜で濾過して乳酸濃度を高める工程Ｄを含む、（１）または（２）に記載の乳酸の製造方法。
（５）前記工程Ｄの後に前記工程Ｂで得られる乳酸溶液を、さらに、１Ｐａ以上大気圧以下の圧力下において、２５℃以上２００℃以下で蒸留する工程Ｃを含む、（４）に記載の乳酸の製造方法。
（６）カルシウム塩の存在下で微生物の発酵培養により培養液中に生産された乳酸を分離して製造する際に用いられる乳酸の製造装置であって、乳酸を分離して製造する際には、該培養液中のカルシウム成分を硫酸を加えて難溶性硫酸塩として除去して乳酸を含む分離液を得る工程Ａ、工程Ａで得られた乳酸を含む分離液をナノ濾過膜に通じて濾過し、カルシウム成分を除去して乳酸溶液を得る工程Ｂを含み、工程Ｂのナノ濾過膜のメタノールの除去率が１０％以下かつイソプロピルアルコールの除去率が２０％以上５０％以下かつクエン酸の除去率が７０％以上９５％以下かつショ糖の除去率が９５％以上であることを特徴とする乳酸の製造装置。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
ナノ濾過膜や逆浸透膜の分離性能は、一般に荷電反発の影響がある塩化ナトリウム水溶液や硫酸マグネシウムの濾過テストおよび荷電反発の影響がないメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、ホルマリン、尿素、ブドウ糖、ショ糖などの大きさの異なる有機物や、酢酸、クエン酸、エチレンジアミンなどの分子をｐＨを調整して非解離状態とした分子を含む水溶液の濾過テストによって評価される。分離性能は塩の除去率や分画分子量曲線で評価され、その際の濾過水量で透水性能が評価される。分離性能と透水性能は相反する性能で、すなわち分子の阻止性能を高めるために膜構造を緻密化すると透水性能が低下するので、単純に膜構造を平均的に緻密にすれば良いというものではなく、細かく種々の大きさの分子の阻止性能を評価・把握して、必要な分画曲線のシャープさ（均一性）を決めた上で、出来るだけ透水性能が高くなるような分子構造にする必要があるため、膜構造の設計は難易度が高い課題である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
ここで本発明のナノ濾過膜は、メタノールの除去率が１０％以下かつイソプロピルアルコールの除去率が２０％以上５０％以下かつクエン酸の除去率が７０％以上９５％以下かつショ糖の除去率が９５％以上であると、乳酸の透過率が高く、カルシウムイオンの阻止率および硫酸イオンの阻止率が高くなることを見出すに至った。図1に本発明のナノ濾過膜の分画分子量曲線を示す。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
メタノール、イソプロピルアルコール、クエン酸、ショ糖の分子径をＢ３ＬＹＰ／６−３１＋Ｇ（ｄ，ｐ）レベルの分子軌道計算によって分子の構造最適化を行った後、分子内の各原子間の距離を計算し、最も遠い原子間距離とすると、それぞれ０．２８ｎｍ、０．４３ｎｍ、０．７４ｎｍ、０．９６ｎｍとなる。一方、非解離の乳酸の大きさは０．５０ｎｍであるが、大きさ０．２８ｎｍのメタノールの除去率が１０％を超えたり、大きさ０．４３ｎｍのイソプロピルアルコールの除去率が５０％を超えたり、大きさ０．７４ｎｍのクエン酸の除去率が９５％を超えると乳酸の透過率と透水性能が低下してしまい、本発明用のナノ濾過膜として好ましくないことを見出した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
また、カルシウムイオンの水和イオン構造を分子動力学計算によって求めたところ、カルシウムイオンは水分子が２７水和した構造となっており、その水和イオンの大きさは１．２ｎｍであることを明らかにした。このことを考慮してカルシウムの除去率を検討した結果、ショ糖の除去率が９５％以上で、かつイソプロピルアルコールの除去率が２０％以上かつクエン酸の除去率が７０％以上であれば、カルシウムイオンやその対イオンである硫酸イオンの除去率が高くなることを見出した。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
したがって、図１に示すように本発明のナノ濾過膜のメタノールの除去率が１０％以下かつイソプロピルアルコールの除去率が２０％以上５０％以下かつクエン酸の除去率が７０％以上９５％以下かつショ糖の除去率が９５％以上であると、乳酸の透過率はおよそ４０％から６０％の間となり、カルシウムイオンの除去率はほぼ１００％に近い値になり好ましく、ナノ濾過膜の分画性能が特定の範囲になる様にナノ濾過膜を設計してやることで高効率に乳酸が精製できることを見出した。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
ここで、メタノール、イソプロピルアルコール、クエン酸、ショ糖の除去率の測定条件は次の通りである。膜面積３０ｃｍ２程度の平膜を用いて、原水濃度１，０００ｍｇ／Ｌ、原水温度２５℃、原水圧力０．７５ＭＰａで濾過して式１から求めた。原水ｐＨは、メタノール、イソプロピルアルコール、ショ糖は６．５、クエン酸は２．８とした。
除去率（％）＝（１−（透過水濃度／原水濃度））×１００‥‥‥（式１）
ナノ濾過膜の素材には、酢酸セルロース系ポリマー、ポリアミド、ポリエステル、ポリイミド、ビニルポリマー、ポリアクリロニトリル、スルホン化ポリスルホンなどの高分子素材を使用することができる。またその膜構造は、膜の少なくとも片面に緻密層を持ち、緻密層から膜内部あるいはもう片方の面に向けて徐々に大きな孔径の微細孔を有する非対称膜や、非対称膜の緻密層の上に別の素材で形成された非常に薄い機能層を有する複合膜のどちらでもよい。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
本発明の乳酸の製造方法の工程Ｂにおいて、ナノ濾過膜による濾過に供する分離液のｐＨは、４．５以下とするのが好ましい。ナノ濾過膜は、溶液中でイオン化している物質の方が、イオン化していない物質に比べて除去率が高い。したがって乳酸の解離定数ｐＫａが３．８６であることから、ｐＨを３．８６以上とすると、乳酸イオンと水素イオンに解離が進み、効率的な乳酸の透過が出来なくなってくる。ｐＨの上限については、乳酸の透過率の観点から検討した結果、ｐＨが４．５を超えると乳酸の透過率が効率的でなくなってくるので分離液のｐＨは４．５以下、好ましくは乳酸の解離定数ｐＫａより小さい３．８以下とすることが重要である。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
また、工程Ｂで得られる乳酸溶液を、さらに、逆浸透膜で濾過して乳酸濃度を高める工程Ｄに供することも好ましく採用できる。ここで逆浸透膜とは、被処理水の浸透圧以上の圧力差を駆動力にイオンや低分子量分子を除去する濾過膜である。ここで使用される逆浸透膜としては、例えば酢酸セルロースなどのセルロース系や、多官能アミン化合物と多官能酸ハロゲン化物とを重縮合させて微多孔性支持膜上にポリアミド分離機能層を設けた膜などが採用できる。逆浸透膜表面の汚れすなわちファウリングを抑制するために、酸ハライド基と反応する反応性基を少なくとも１個有する化合物の水溶液をポリアミド分離機能層の表面に被覆して、分離機能層表面に残存する酸ハロゲン基と該反応性基との間で共有結合を形成させた主に下水処理用の低ファウリング逆浸透膜なども好ましく採用できる。本発明の工程Ｂで二価のカルシウムイオンを大部分除去できているため、逆浸透膜面でのスケールの生成もなく安定した膜濃縮が行える。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
（ナノ濾過膜による分離実験）
次いで、図２に示す、膜濾過装置の原水槽１に上記で得られた濾液２Ｌを注入した。メタノールの除去率が１％かつイソプロピルアルコールの除去率が３５％かつクエン酸の除去率が８６％かつショ糖の除去率が９９．７％であるナノ濾過膜７（ピペラジンポリアミド半透膜ＵＴＣ６０、東レ社製）を直径６４ｍｍφに切り取り、図３のステンレス（ＳＵＳ３１６製）製のセルにセットし、高圧ポンプ３の圧力を４ＭＰａに調整し、透過水４を回収した。原水槽１、透過水４に含まれる、硫酸イオン、カルシウムイオンの濃度をイオンクロマトグラフィー（ＤＩＯＮＥＸ製）、乳酸濃度を、高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製）により分析した。結果を表３に示す。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
以上の実施例及び比較例の結果から、メタノールの除去率が１０％以下かつイソプロピルアルコールの除去率が２０％以上５０％以下かつクエン酸の除去率が７０％以上９５％以下かつショ糖の除去率が９５％以上であるナノ濾過膜により、培養液中の硫酸カルシウムおよび硫酸を高効率で除去できることが明らかとなった。すなわち、本発明によって、微生物培養液中の乳酸溶液中のカルシウム成分および硫酸イオンをナノ濾過膜によって高効率で除去することができ、濃縮してもカルシウム成分が析出せず、さらに、蒸留工程にかけてもラセミ化、オリゴマー化が進行しないことが明らかとなった。